(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる、配列最適化ダイアボディであって、
前記ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
Ａ．前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）（配列番号２１）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ｂ）
を含み、前記サブドメイン１Ａ及び前記サブドメイン１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）又はＫコイルドメイン（配列番号３５）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によって前記ドメイン１から分離されている、ドメイン２
を含み；
Ｂ．前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２２）を含むサブドメイン（１Ｂ）
を含み、前記サブドメイン１Ａ及び前記サブドメイン１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）又はＥコイルドメイン（配列番号３４）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によって前記ドメイン１から分離されており；かつ前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２
を含み、かつ；
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する、配列最適化ダイアボディ。
【請求項２】
前記第１のポリペプチド鎖は更に、ペプチドリンカー（配列番号３１）を介して前記ドメイン２に連結した、アルブミン結合ドメイン（配列番号３６）を含む、請求項１に記載のダイアボディ。
【請求項３】
前記第２のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、
前記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３３）を介して前記ドメイン１に連結する、請求項１に記載のダイアボディ。
【請求項４】
前記第１のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、
前記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３３）を介して前記ドメイン１に連結する、請求項１に記載のダイアボディ。
【請求項５】
前記第２のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、
前記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３２）を介して前記ドメイン２に連結する、請求項１に記載のダイアボディ。
【請求項６】
前記第１のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、
前記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３２）を介して前記ドメイン２に連結する、請求項１に記載のダイアボディ。
【請求項７】
前記ダイアボディは更に、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１１）を含む第３のポリペプチド鎖を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項８】
前記ダイアボディは更に、前記免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＮ末端にシステイン含有ペプチド（配列番号５５）を含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項９】
前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）であり、前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）であり、前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項１１】
前記ダイアボディは、ヒト及び霊長類両方のＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質と交差反応できる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項１２】
ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性ダイアボディであって、
前記ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、
前記ダイアボディは：
Ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；及び
Ｂ．配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含み、
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する、ダイアボディ。
【請求項１３】
ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性ダイアボディであって、
前記ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、
前記ダイアボディは、更に第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ダイアボディは：
Ａ．配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；
Ｂ．配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；及び
Ｃ．配列番号５４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖
を含み、
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する、ダイアボディ。
【請求項１４】
ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性ダイアボディであって、
前記ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、
前記ダイアボディは、更に第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ダイアボディは：
Ａ．配列番号１７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；
Ｂ．配列番号１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；及び
Ｃ．配列番号５４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖
を含み、
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する、ダイアボディ。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項１６】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療において使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のダイアボディ。
【請求項１７】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項１６に記載のダイアボディ。
【請求項１８】
前記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１７に記載のダイアボディ。
【請求項１９】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、炎症状態である、請求項１６に記載のダイアボディ。
【請求項２０】
前記炎症状態は：自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；喘息；及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項１９に記載のダイアボディ。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のダイアボディ及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のダイアボディ又は請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、炎症状態である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記炎症状態は：自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；及び喘息からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６１／８６９，５１０号（２０１３年８月２３日出願；係属中）、米国特許出願第６１／９０７，７４９号（２０１３年１１月２２日出願；係属中）、及び米国特許出願第６１／９９０，４７５号（２０１４年５月８日出願；係属中）、並びに欧州特許出願第１３１９８７８４号（２０１３年１２月２０日出願）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、書類及びコンピュータ可読媒体の両方において開示されており、上記書類及びコンピュータ可読型開示は、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に結合できるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、並びに血液悪性腫瘍の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
Ｉ．ＣＤ１２３
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体α、ＩＬ‐３Ｒａ）は、４０ｋＤａ分子であり、インターロイキン３受容体複合体の一部である（非特許文献１）。インターロイキン３（ＩＬ‐３）は、赤血球、骨髄及びリンパ系前駆細胞の細胞への、多能性幹細胞の初期分化を開始させる。ＣＤ１２３は、ＣＤ３４＋コミット前駆細胞上に発現する（非特許文献２）が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８‐正常造血幹細胞によって発現されない。ＣＤ１２３は、好塩基球、肥満細胞、形質細胞様樹状細胞によって発現され、単球、マクロファージ及び好酸球によってある程度発現され、好中球及び巨核球によってはあまり又は全く発現されない。いくつかの非造血組織（胎盤、精巣のライディッヒ細胞、特定の脳細胞要素及びいくつかの内皮細胞）はＣＤ１２３を発現するが、発現の大半は細胞質内である。
【０００５】
ＣＤ１２３は、白血病性芽球及び白血病幹細胞（ＬＳＣ）によって発現されることが報告されている（非特許文献３、４）（図１）。ヒト正常前駆細胞集団において、ＣＤ１２３は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）のサブセットによって発現され、正常造血幹細胞（ＨＳＣ）によって発現されない。ＣＤ１２３はまた、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球によっても発現され、またこれより程度は低いが、単球及び好酸球によっても発現される（非特許文献５〜９）。
【０００６】
ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）を含む広範な血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現することが報告されている（非特許文献７）。ＣＤ１２３の過剰発現は、ＡＭＬにおける比較的良好でない予後に関連する（非特許文献１０）。
【０００７】
ＡＭＬ及びＭＤＳは、白血病幹細胞（ＬＳＣ）の小さな集団によって発生して永続するものと考えられ、上記白血病幹細胞は一般に休眠細胞であり（即ち急速分裂細胞ではなく）、従って細胞死（アポトーシス）及び従来の化学療法薬に耐性を有する。ＬＳＣは、正常なヒト骨髄中の対応する正常造血幹細胞集団中には存在しない、高いレベルのＣＤ１２３発現を特徴とする（非特許文献４、３）。ＣＤ１２３は、ＡＭＬの４５％〜９５％、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）の８５％、及び急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）の４０％において発現する。ＣＤ１２３発現は、他の多数の悪性腫瘍／前悪性腫瘍：慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）前駆細胞（急性転化ＣＭＬを含む）；ホジキンリードスタンバーグ（ＲＳ）細胞；形質転換非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；いくつかの慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（ＣＤ１１ｃ＋）；急性Ｔリンパ芽球性白血病（Ｔ‐ＡＬＬ）（１６％、最も未成熟、主に成人）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（ＤＣ２）悪性腫瘍、及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８‐骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）骨髄細胞悪性腫瘍のサブセットにも関連する。
【０００８】
ＡＭＬは、骨髄中の形質転換骨髄幹細胞の増殖及び蓄積を特徴とする、クローン性疾患であり、これは最終的には造血不全につながる。ＡＭＬの発生は年齢とともに増加し、老齢の患者は典型的には、より若年の患者よりも治療結果が悪い（非特許文献１１）。不幸なことに、現在、ＡＭＬを有する大半の成人がこの疾患によって死亡する。
【０００９】
ＡＭＬの治療はまず、寛解の導入に焦点を合わせている（導入療法）。寛解が達成されると、治療はこのような寛解の保全に焦点を合わせるようシフトし（寛解後又は強化療法）、いくつかの例では維持療法にシフトする。ＡＭＬに関する標準的な寛解導入方法論は、アントラサイクリン／シタラビンの組み合わせを用いた化学療法と、それに続き、集中治療に耐える患者の能力及び化学療法単独での治癒の可能性に応じて、（通常は導入期間中に使用したものと同一の薬剤を更に高い用量で使用する）強化化学療法又はヒト幹細胞移植とである（例えば非特許文献１２参照）。
【００１０】
導入療法に頻繁に使用される作用剤としては、シタラビン及びアントラサイクリン類が挙げられる。シタラビンはＡｒａＣとしても知られ、これはＤＮＡ合成に干渉することによって癌細胞（及び他の急速分裂型正常細胞）を殺滅する。ＡｒａＣ治療に関連する副作用としては：白血球細胞産生の減少の結果である感染への耐性の低下；血小板産生の減少の結果としての出血；及び赤血球細胞の潜在的減少による貧血症が挙げられる。他の副作用としては、吐き気及び嘔吐が挙げられる。アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシン）は、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害、ＤＮＡの高次構造の破壊及び細胞損傷性フリー酸素ラジカルの産生を含む、複数の作用態様を有する。アントラサイクリン類の最も重大な悪影響は心毒性であり、これは投与される生涯用量を大幅に制限し、またその有用性をある程度制限する。
【００１１】
従って不運にも、新規に診断されたＡＭＬの治療における有意な進展にもかかわらず、患者の２０％〜４０％は、標準的な導入化学療法によって寛解を達成せず、最初の完全な寛解状態を得た患者の５０％〜７０％は３年以内に再発するものと予測される。再発時の、又は抵抗性疾患を有する患者に対する、最適な戦略は、不明確なままである。幹細胞移植は、最初の寛解又はその後の寛解における、ＡＭＬを有する患者の抗白血病療法の最も効果的な形態として確立されていることが分かっている（非特許文献１２）。
【００１２】
ＩＩ．ＣＤ３
ＣＤ３は、４つの別個の鎖で構成されたＴ細胞補助受容体である（非特許文献１３）。哺乳類において、この複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知である分子と連動して、Ｔリンパ球の活性化信号を生成する。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（非特許文献１４）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しないことが知られている（非特許文献１５、１６、１７）。
【００１３】
ＩＩＩ．二重特異性ダイアボディ
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬ及びＶＨドメイン）の存在に左右される。ダイアボディの設計は、単鎖Ｆｖ構造（ｓｃＦｖ）に基づく（例えば非特許文献１８；特許文献１；特許文献２；非特許文献１９；非特許文献２０；特許文献３；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５参照）。
【００１４】
抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。対照的に、ｓｃＦｖ構造は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、２価分子を形成し、この２価分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと関連する（非特許文献２６において概説されている）。
【００１５】
天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち単一特異性）が、これらはその種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を呈する）。本技術分野は、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えば非特許文献１８；特許文献１；特許文献２；非特許文献１９；非特許文献２０；特許文献３；非特許文献２７；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５参照）。
【００１６】
非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（co‐ligate）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原に対するアビディティーの上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献２８）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献２９、非特許文献３０）。
【００１７】
ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４等のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基も指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（非特許文献３０、非特許文献３１、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えば非特許文献３２参照）。
【００１８】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（非特許文献２４）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような（即ちホモ二量体形成を防止するような）方法で達成しなければならない（非特許文献２４）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的関連を教示している（例えば非特許文献２１、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２０参照）。
【００１９】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に関連したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えば非特許文献２０参照）。
【００２０】
この課題に直面して、本技術分野は、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５参照）。このようなアプローチは、１つ又は複数のシステイン残基を、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第２００４／００５８４００号
【特許文献２】米国特許第２００４／０２２０３８８号
【特許文献３】国際公開第０２／０２７８１号
【特許文献４】国際公開第２００６／１１３６６５号
【特許文献５】国際公開第２００８／１５７３７９号
【特許文献６】国際公開第２０１０／０８０５３８号
【特許文献７】国際公開第２０１２／０１８６８７号
【特許文献８】国際公開第２０１２／１６２０６８号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Stomski, F.C. et al. (1996) “Human Interleukin‐3 (IL‐3) Induces Disulfide‐Linked IL‐3 Receptor Alpha‐ And Beta‐Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High‐Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035‐3046
【非特許文献２】Taussig, D.C. et al. (2005) “Hematopoietic Stem Cells Express Multiple Myeloid Markers: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia,” Blood 106:4086‐4092
【非特許文献３】Jordan, C.T. et al. (2000) “The Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777‐1784
【非特許文献４】Jin, W. et al. (2009) “Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603‐6610
【非特許文献５】Lopez, A.F. et al. (1989) “Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte‐Macrophage Colony‐Stimulating Factor To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022‐7026
【非特許文献６】Sun, Q. et al. (1996) “Monoclonal Antibody 7G3 Recognizes The N‐Terminal Domain Of The Human Interleukin‐3 (IL‐3) Receptor Alpha Chain And Functions As A Specific IL‐3 Receptor Antagonist,” Blood 87:83‐92
【非特許文献７】Munoz, L. et al. (2001) “Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261‐1269
【非特許文献８】Masten, B.J. et al. (2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung,” J. Immunol. 177:7784‐7793
【非特許文献９】Korpelainen, E.I. et al. (1995) “Interferon‐Gamma Upregulates Interleukin‐3 (IL‐3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL‐3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production,” Blood 86:176‐182
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
このような成功にもかかわらず、安定した機能性ヘテロ二量体の非単一特異性ダイアボディは、採用したポリペプチド鎖のうちの１つ又は複数中のシステイン残基に関する注意深い考察及びその配置によって、更に最適化できる。このように最適化されたダイアボディは、最適化されていないダイアボディよりも高い収率で、また高い活性を有して産生できる。従って本発明は、ヘテロ二量体性ダイアボディを形成するために特別に設計及び最適化されたポリペプチドを提供するという課題を対象としている。本発明は、例示的な最適化されたＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディを提供することによって、この課題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に結合できるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ、並びに疾患、特に血液悪性腫瘍の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。
【００２５】
本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含み、これらはヘテロ二量体として互いに関連して、ＣＤ１２３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する。従って本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディは、ＣＤ１２３のエピトープの１つのみの複製及びＣＤ３のエピトープの１つのみの複製に結合できるという点で１価であるが、単一のダイアボディがＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに対して同時に結合できるという点で二重特異性である。このダイアボディの個々のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。特定の実施形態では、本発明のダイアボディは更に、免疫グロブリンＦｃドメイン又はアルブミン結合ドメインを有し、これによりインビボでの半減期が延長される。
【００２６】
詳細には、本発明はまた、ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを提供し、このダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）（配列番号２１）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み、サブドメイン１Ａ及び１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）又はＫコイルドメイン（配列番号３５）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によってドメイン１から分離されている、ドメイン２
を含み；
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２２）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み、サブドメイン１Ａ及び１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）又はＥコイルドメイン（配列番号３４）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によってドメイン１から分離されており；かつ第１及び第２のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２
を含み、かつ：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。
【００２７】
本発明はまた、ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる、非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを提供し、このダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）（配列番号２３）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）（配列番号２８）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み、サブドメイン１Ａ及び１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）又はＫコイルドメイン（配列番号３５）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によってドメイン１から分離されている、ドメイン２
を含み；
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２４）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み、サブドメイン１Ａ及び１Ｂはペプチドリンカー（配列番号２９）によって互いから分離されている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）又はＥコイルドメイン（配列番号３４）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号３０）によってドメイン１から分離されており；かつ第１及び第２のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と；
を含み、かつ：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。
【００２８】
本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディの実施形態を提供し、第１又は第２のポリペプチド鎖は更に、ペプチドリンカー（配列番号３１）を介して、Ｃ末端においてドメイン２に、又はＮ末端においてドメイン１に連結した、アルブミン結合ドメイン（配列番号３６）を含む。
【００２９】
本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディの実施形態を提供し、第１又は第２のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、上記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３３）を介して、Ｎ末端においてドメイン１Ａに連結する。
【００３０】
本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディの実施形態を提供し、第１又は第２のポリペプチド鎖は更に、免疫グロブリンＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３７）を含むドメイン３を含み、上記ドメイン３は、ペプチドリンカー（配列番号３２）を介して、Ｃ末端においてドメイン２に連結する。
【００３１】
本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、第１のポリペプチド鎖のドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）であり、第２のポリペプチド鎖のドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）である。
【００３２】
本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、第１のポリペプチド鎖のドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３４）であり、第２のポリペプチド鎖のドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号３５）である。
【００３３】
本発明は更に、ＣＤ１２３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる上述の二重特異性１価ダイアボディの実施形態を提供し、このダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、上記二重特異性ダイアボディは：
Ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖；及び
Ｂ．配列番号３のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、上記第１のポリペプチド鎖及び上記第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する。
【００３４】
本発明のダイアボディは、以下で更に詳細に説明するように、予想を超えて増大した機能的活性を呈する。
【００３５】
本発明のダイアボディは好ましくは、ヒト及び霊長類両方のＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質、好ましくはカニクイザルＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質と交差反応できる。
【００３６】
本発明のダイアボディは好ましくは、インビトロ細胞ベースアッセイにおいて、ＰＢＭＣ初代培養物から形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、約１ｎｇ／ｍｌ以下、約０．８ｎｇ／ｍｌ以下、約０．６ｎｇ／ｍｌ以下、約０．４ｎｇ／ｍｌ以下、約０．２ｎｇ／ｍｌ以下、約０．１ｎｇ／ｍｌ以下、約０．０５ｎｇ／ｍｌ以下、約０．０４ｎｇ／ｍｌ以下、約０．０３ｎｇ／ｍｌ以下、約０．０２ｎｇ／ｍｌ以下又は約０．０１ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で枯渇させることができる。好ましくは、上記ＩＣ５０は約０．０１ｎｇ／ｍｌ以下である。上述のアッセイにおいて、ＰＢＭＣ初代培養物はカニクイザル由来のものであってよく、この場合、上記枯渇は、カニクイザル形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に関するものである。任意に、本発明のダイアボディは、上述のようにＰＢＭＣ初代培養物から形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）枯渇させることができるものであってよく、上記アッセイは、本明細書に記載の実施例１４のプロトコルによって若しくは実施例１４のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって実施される。
【００３７】
本発明のダイアボディは好ましくは、インビトロＫａｓｕｍｉ‐３アッセイにおいて、約０．０５ｎｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で細胞毒性を呈する。好ましくは、上記ＥＣ５０は約０．０４ｎｇ／ｍＬ以下、約０．０３ｎｇ／ｍＬ以下、約０．０２ｎｇ／ｍＬ以下又は約０．０１ｎｇ／ｍＬ以下である。任意に、本発明のダイアボディは、上述のような細胞毒性を呈してよく、上記アッセイは、本明細書に記載の実施例３のプロトコルによって若しくは実施例３のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって実施される。
【００３８】
本発明のダイアボディは好ましくは、インビトロＭｏｌｍ‐１３アッセイにおいて、約５ｎｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で細胞毒性を呈する。好ましくは、上記ＥＣ５０は約３ｎｇ／ｍＬ以下、約２ｎｇ／ｍＬ以下、約１ｎｇ／ｍＬ以下、約０．７５ｎｇ／ｍＬ以下又は約０．２ｎｇ／ｍＬ以下である。任意に、本発明のダイアボディは、上述のような細胞毒性を呈してよく、上記アッセイは、本明細書に記載の実施例３のプロトコルによって若しくは実施例３のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって実施される。
【００３９】
本発明のダイアボディは好ましくは、マウスのＭＯＬＭ‐１３腫瘍異種移植片の成長を阻害できる。好ましくは、本発明のダイアボディは、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約４μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６μｇ／ｋｇ又は少なくとも約０．４μｇ／ｋｇの濃度で、マウスのＭＯＬＭ‐１３腫瘍異種移植片の成長を阻害できる。本発明の好ましい抗体は、マウスのＭＯＬＭ‐１３腫瘍異種移植片の成長を、少なくとも２５％阻害するが、ＭＯＬＭ‐１３腫瘍成長を一定期間後に少なくとも約４０％以上、少なくとも約５０％以上、少なくとも約６０％以上、少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％以上、少なくとも約９０％以上、若しくは完全に阻害する場合もあり、又は腫瘍の退行若しくは消失をもたらす場合もある。この阻害は、少なくともＮＳＧマウス系統において発生する。任意に、本発明のダイアボディは、本明細書に記載の実施例６のプロトコルによって若しくは実施例６のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって、上述のようにマウスのＭＯＬＭ‐１３腫瘍異種移植片の成長を阻害できるものであってよい。
【００４０】
本発明のダイアボディは好ましくは、マウスのＲＳ４‐１１腫瘍異種移植片の成長を阻害できる。好ましくは、本発明のダイアボディは、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも約０．００４ｍｇ／ｋｇの濃度で、マウスのＲＳ４‐１１腫瘍異種移植片の成長を阻害できる。本発明の好ましい抗体は、マウスのＲＳ４‐１１腫瘍異種移植片の成長を、少なくとも約２５％阻害するが、ＲＳ４‐１１腫瘍成長を一定期間後に少なくとも約４０％以上、少なくとも約５０％以上、少なくとも約６０％以上、少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％以上、少なくとも約９０％以上、若しくは完全に阻害する場合もあり、又は腫瘍の退行若しくは消失をもたらす場合もある。この阻害は、少なくともＮＳＧマウス系統において発生する。任意に、本発明のダイアボディは、本明細書に記載の実施例６のプロトコルによって若しくは実施例６のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって、上述のようにマウスのＲＳ４‐１１腫瘍異種移植片の成長を阻害できるものであってよい。
【００４１】
本発明のダイアボディは好ましくは、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、白血病芽細胞をインビトロで枯渇させることができる。好ましくは、本発明のダイアボディは、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０８ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で、白血病芽細胞をインビトロで枯渇させることができる。好ましくは、本発明のダイアボディは、任意に約１２０時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０８ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で、初代白血病芽細胞の総数の２０％未満まで、白血病芽細胞をインビトロで枯渇させることができる。好ましくは、白血病芽細胞は、約１２０時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、約０．０１ｎｇ／ｍｌ又は０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で、初代白血病芽細胞の総数の２０％未満まで枯渇される。
【００４２】
本発明のダイアボディは好ましくは、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中においてＴ細胞集団の膨張をインビトロで誘発できる。好ましくは、このような膨張は、アッセイにおいて膨張させることができる最大のＴ細胞集団の約７０％以上であってよい。好ましくは、本発明のダイアボディは、任意に約１２０時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０８ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で、アッセイにおいて膨張させることができる最大のＴ細胞集団の約７０％以上までのＴ細胞集団の膨張をインビトロで誘発できるものであってよい。好ましくは、Ｔ細胞集団は、約１２０時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、約０．０１ｎｇ／ｍｌ又は０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で、アッセイにおいて膨張させることができる最大のＴ細胞集団の約７０％以上まで膨張される。
【００４３】
本発明のダイアボディは好ましくは、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中においてＴ細胞集団の活性化をインビトロで誘発できる。このような活性化は、任意に約７２時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０８ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で発生し得る。このような活性化は、ＣＤ２５等のＴ細胞活性化マーカの発現によって測定できる。好ましくは、ＣＤ２５の発現によって測定される、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中におけるインビトロでのＴ細胞集団の活性化は、約７２時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、約０．０１ｎｇ／ｍｌ又は０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で発生し得る。
【００４４】
本発明のダイアボディは好ましくは、任意に約１２０時間に亘るダイアボディを用いた初代培養物のインキュベーションの経過後、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．０８ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌのダイアボディ濃度で、白血病芽細胞を、初代白血病芽細胞の総数の２０％未満までインビトロで枯渇させることができ、同時にアッセイにおいて膨張させることができる最大のＴ細胞集団の約７０％以上までのＴ細胞集団の膨張をインビトロで誘発できる。好ましくは、ダイアボディ濃度は約０．０１ｎｇ／ｍｌ又は約０．１ｎｇ／ｍｌであり、初代培養物はダイアボディを用いて約１２０時間に亘ってインキュベートされる。
【００４５】
本発明のダイアボディは、本明細書に記載の実施例８のプロトコルによって若しくは実施例８のプロトコルにしたがって、又は当業者に理解されるであろうアッセイの修正形態によって、又は当業者に公知の他の手段によって、ＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中において白血病芽細胞をインビトロで枯渇させることができ、及び／又はＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中においてＴ細胞集団の膨張をインビトロで誘発でき、及び／又はＡＭＬ骨髄細胞の初代培養物中においてＴ細胞の活性化をインビトロで誘発できるものであってよい。
【００４６】
念のため記載しておくと、本発明のダイアボディは、本明細書に記載の機能的属性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ以上又は全てを呈してよい。従って本発明のダイアボディは、本明細書に記載の機能的属性のいずれの組み合わせを呈してよい。
【００４７】
本発明のダイアボディは、医薬として使用するためのものであってよい。好ましくはこのダイアボディは、ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療において使用するためのものである。本発明はまた、好ましくはＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療のための、医薬組成物の製造における、本発明のダイアボディの使用にも関する。
【００４８】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態は、癌であってよい。例えばこの癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択してよい。
【００４９】
ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態は、炎症状態であってよい。例えばこの炎症状態は：自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；喘息；及び関節リウマチからなる群から選択してよい。
【００５０】
本発明は更に、上述のダイアボディのいずれか及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物を提供する。
【００５１】
本発明は更に、ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、上述の医薬組成物の使用を提供する。
【００５２】
本発明は特に、ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態が癌（特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択された癌）である、このような使用の実施形態を対象とする。
【００５３】
本発明は特に、ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とする疾患又は状態が炎症状態（特に自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；喘息；及び関節リウマチからなる群から選択される炎症状態）である、このような使用の実施形態も対象とする。
【００５４】
「約（ａｂｏｕｔ）」のような用語は、文脈によって必然的にそうでない場合を除いて、明記されている値の１０％以内、より好ましくは５％以内として解釈されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ＣＤ１２３が白血病幹細胞上で発現することが知られていることを示す。
【図２】図２は、本発明の２鎖ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖の構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の３鎖ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖のあるバージョンの構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の３鎖ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の別のバージョンの構造を示す。
【図４】図４（パネルＡ〜Ｅ）は、異なるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの、様々な量のＣＤ１２３を示す標的細胞のＴ細胞再指向殺滅を媒介する能力を示す。この図は、複数の標的細胞：ＲＳ４‐１１（パネルＡ）；ＴＦ‐１（パネルＢ）；Ｍｏｌｍ‐１３（パネルＣ）；Ｋａｓｕｍｉ‐３（パネルＤ）；及びＴＨＰ‐１（パネルＥ）において、Ｅ：Ｔ（エフェクタ：標的）比１０：１で、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を有する（「ｗ／ＡＢＤ」）配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ａ」）が、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）又は非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ｂ」）よりも高い細胞毒性を呈することを示す、用量‐応答曲線を提供する。
【図５】図５（パネルＡ〜Ｄ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ）、及び免疫グロブリンＩｇＧ  Ｆｃドメイン（Ｆｃ）を有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ）の、標的細胞の再配向殺滅中のＴ細胞活性化を媒介する能力を示す。この図は、Ｋａｓｕｍｉ‐３（パネルＡ）及びＴＨＰ‐１（パネルＢ）細胞、並びに精製されたＣＤ８Ｔ細胞において、Ｅ：Ｔ（エフェクタ：標的）比１０：１（１８時間インキュベーション）で、ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ及びＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃによって媒介される細胞毒性を示す、用量‐応答曲線を提示する。パネルＣ、Ｄは、標的細胞の存在下（パネルＤ）及び不在下（パネルＣ）における、ＣＤ８Ｔ細胞に対してマーカＣＤ２５を使用したＴ細胞活性化の、用量‐応答曲線を示す。
【図６】図６（パネルＡ〜Ｂ）は、Ｋａｓｕｍｉ‐３標的細胞及び休止Ｔ細胞の存在下における、Ｅ：Ｔ比１０：１での、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）（パネルＡ）、又は対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）（パネルＢ）を用いた治療後の、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞中のグランザイムＢ及びパーフォリンレベルを示す。
【図７】図７（パネルＡ〜Ｂ）は、ナノグラム／キログラム用量レベルにおける配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）のインビボ抗腫瘍活性を示す。ＭＯＬＭ‐１３細胞（中間ＣＤ１２３発現）をＴ細胞と共混合して、ＮＳＧマウスに皮下埋入した（Ｔ：Ｅ＝１：１）。静脈注射治療を埋入時に開始して、８日間に亘って１日１回行った（ＱＤ×８）。様々な濃度のＤＡＲＴ‐Ａを対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）と比較した。パネルＡは、Ｍｏｌｍ‐１３細胞単独又はＭｏｌｍ‐１３細胞及びＴ細胞と、３０日を超える期間にまで及ぶ、腫瘍体積に対する様々な用量のＤＡＲＴ‐Ａの効果とを示す。パネルＢは、０〜１８日の時間推移に亘る、ＭＯＬＭ‐１３細胞及びＴ細胞を受容したＮＳＧマウスにおいて見られる、腫瘍体積に対する用量を増大させたＤＡＲＴ‐Ａの効果を示す。
【図８】図８は、ＲＳ４‐１１細胞（単球性を有するＡＬＬ）に対する、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）のインビボ抗腫瘍活性を示す。細胞をＴ細胞と共混合して、ＮＳＧマウスに皮下埋入した（Ｔ：Ｅ＝１：１）。静脈注射治療を埋入時に開始して、４日間に亘って１日１回行った（ＱＤ×４）。様々な濃度のＤＡＲＴ‐Ａを対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）と比較した。
【図９】図９（パネルＡ〜Ｂ）は、Ｋａｓｕｍｉ‐３ＡＭＬ細胞株（パネルＢ）と比較した、ＡＭＬ患者１からの骨髄単核球（ＢＭ  ＭＮＣ）及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（パネルＡ）におけるＣＤ１２３＋芽球を示す。
【図１０】図１０（パネルＡ〜Ｃ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、１２０時間の時点において初代ＡＭＬ中の芽球の低減を媒介する能力（パネルＡ）、１２０時間の時点において初代ＡＭＬ中のＴ細胞の膨張を開始させる能力（パネルＢ）、並びに４８時間及び７２時間の時点においてＡＭＬ中のＴ細胞活性化を誘発する能力（パネルＣ）を示す。
【図１１】図１１（パネルＡ〜Ｈ）は、ＡＬＬ  ＰＢＭＣの初代サンプル中の、ＣＤ１２３＋芽球集団の識別を示す。パネルＡ、Ｅは、正常なＰＢＭＣ（パネルＡ）及びＡＬＬ  ＰＢＭＣ（パネルＥ）の投入集団の前方及び側方散乱を示す。パネルＢ、Ｆは、初代Ｂ細胞（パネルＢ）及び白血病芽細胞（パネルＦ）としての、リンパ球集団の識別を示す。パネルＣ、Ｇは、ＣＤ１２３＋であるリンパ球の集団の識別を示す。パネルＤ、Ｈは、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ１２３＋細胞の識別を示す。
【図１２】図１２（パネルＡ〜Ｂ）は、ＡＬＬ  ＰＢＭＣの初代サンプル中の、Ｔ細胞のＣＤ４及びＣＤ８集団の識別を示す。パネルＡは、投入されたＡＬＬ  ＰＢＭＣの前方及び側方散乱を示す。パネルＢは、サンプル中に存在するＴ細胞のＣＤ４又はＣＤ８集団を示す。これらの数字は、ＣＤ４Ｔ細胞がＡＬＬ  ＰＢＭＣサンプル中に存在する全細胞のおよそ０．５％であり、ＣＤ８Ｔ細胞がＡＬＬ  ＰＢＭＣサンプル中に存在する全細胞のおよそ０．４％であることを示している。
【図１３】図１３（パネルＡ〜Ｈ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、自己ＣＴＬによるＡＬＬ芽球の枯渇を媒介する能力を示す。パネルＡ、Ｅは、正常なＰＢＭＣ（パネルＡ）及びＡＬＬ  ＰＢＭＣ（パネルＥ）の投入集団の前方及び側方散乱を示す。ＰＢＭＣは処置されない（パネルＢ、Ｆ）か、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）で処置された（パネルＣ、Ｇ）か、又はＤＡＲＴ‐Ａで処置され（パネルＤ、Ｈ）、７日間に亘ってインキュベートされた後、ＣＤ３４及びＣＤ１９について染色された。
【図１４】図１４（パネルＡ〜Ｌ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、正常なＰＢＭＣ（パネルＡ〜Ｆ）及びＡＬＬ  ＰＢＭＣ（パネルＧ〜Ｌ）中での、Ｔ細胞膨張（パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）及び活性化（パネルＤ、Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）を媒介する能力を示す。細胞は処置されない（パネルＡ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）か、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）で処置された（パネルＢ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）か、又はＤＡＲＴ‐Ａで７日間に亘って処置された（パネルＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。
【図１５】図１５（パネルＡ〜Ｃ）は、初代ＡＭＬサンプル中のＡＭＬ芽球集団及びＴ細胞の識別を示す。パネルＡは、投入されたＡＭＬ  ＰＢＭＣの前方及び側方散乱を示す。パネルＢは、ＡＭＬサンプル中のＡＭＬ芽球集団の識別を示す。パネルＣは、ＡＭＬサンプル中のＴ細胞集団の識別を示す。
【図１６】図１６（パネルＡ〜Ｃ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、自己ＣＴＬによるＡＭＬ芽球の枯渇及びＴ細胞膨張を媒介する能力を示す。患者２からの初代ＡＭＬ  ＰＢＭＣを、ＰＢＳ、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）又はＤＡＲＴ‐Ａを用いて１４４時間に亘ってインキュベートした。芽細胞（パネルＡ）、ＣＤ４Ｔ細胞（パネルＢ）、ＣＤ８Ｔ細胞（パネルＣ）を計数した。
【図１７】図１７（パネルＡ〜Ｄ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、ＡＭＬ中におけるＴ細胞の活性化を媒介する能力を示す。ＣＤ２５（パネルＡ）及びＫｉ‐６７（パネルＢ）の発現を、ＡＭＬ患者２からのＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞に関して決定した後、自己ＰＢＭＣと共に対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）又はＤＡＲＴ‐Ａを用いてインキュベートした。パーフォリン（パネルＣ）及びグランザイムＢ（パネルＤ）のレベルを、ＡＭＬ患者２からのＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞に関して決定した後、自己ＰＢＭＣと共に対照ＤＡＲＴ又はＤＡＲＴ‐Ａを用いてインキュベートした。
【図１８】図１８（パネルＡ〜Ｄ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）が、ヒト及び霊長類両方のＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質と交差反応できることを示す。これらのパネルは、ヒト（パネルＡ、Ｃ）及び非ヒト霊長類（パネルＢ、Ｄ）のＣＤ３（パネルＡ、Ｂ）及びＣＤ１２３（パネルＣ、Ｄ）タンパク質に結合するＤＡＲＴ‐Ａの能力を分析するために実施された分析の結果の、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ｓｅｎｓｏｇｒａｍグラフを示す。ＫＤ値が提供される。
【図１９】図１９（パネルＡ〜Ｂ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣを用いたインビトロ自己単球枯渇を媒介する能力を示す。これらのパネルは、初代ヒトＰＢＭＣ（パネルＡ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（パネルＢ）を用いたＤＡＲＴ‐Ａ媒介細胞毒性の用量‐応答曲線の結果を提示する。
【図２０】図２０（パネルＡ〜Ｎ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、全身サイトカイン誘導なしに、カニクイザルにおけるｐＤＣの枯渇を媒介する能力を示す。パネルＡ〜Ｄは、ビヒクル及びキャリアを用いて４時間及び４日の時点で得られた対照結果を示す。パネルＥ〜Ｈは、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を用いて４時間及び４日の時点で得られた対照結果を示す。パネルＩ〜Ｎは、１０ｎｇ／ｋｇ／日のＤＡＲＴ‐Ａを用いて４時間及び４日の時点で得られた結果、並びに３０ｎｇ／ｋｇ／日のＤＡＲＴ‐Ａを用いて４日の時点で得られた結果を示す。
【図２１】図２１（パネルＡ〜Ｄ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、カニクイザルにおけるｐＤＣの用量依存性枯渇を媒介する能力を示す。カニクイザルに、０．１、１、１０、３０、１００、３００又は１０００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与した。ＰＢＭＣを指示されている時点において評価し、Ｂ細胞（パネルＡ）、単球（パネルＢ）、ＮＫ細胞（パネルＣ）及びｐＤＣ（パネルＤ）の総数を計数した。
【図２２】図２２（パネルＡ〜Ｄ）は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の、カニクイザルにおいてＴ細胞を断続的に調節する能力を示す。カニクイザルに、０．１、１、１０、３０、１００、３００又は１０００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与した。ＰＢＭＣを指示されている時点において評価し、Ｔ細胞（パネルＡ）、ＣＤ４Ｔ細胞（パネルＢ）、ＣＤ６９細胞（パネルＣ）及びＣＤ８Ｔ細胞（パネルＤ）の総数を計数した。
【図２３】図２３は、還元条件下（左）及び非還元条件下（右）での、精製したＤＡＲＴ‐Ａタンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａ、２４Ｂは、精製したＤＡＲＴ‐Ａの生理化学的特性決定を示す。図２４Ａは、較正したＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷｘＬカラム上でのＤＡＲＴ‐Ａタンパク質のＳＥＣプロファイルである。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａタンパク質の質量スペクトルである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、固定化されたヒトＣＤ１２３へのＤＡＲＴ‐Ａの結合のＳＰＲ分析を示す。破線は、ＤＡＲＴ‐Ａ濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭ（実線）において得られた、実験による結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、固定化されたカニクイザルＣＤ１２３へのＤＡＲＴ‐Ａの結合のＳＰＲ分析を示す。破線は、ＤＡＲＴ‐Ａ濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭ（実線）において得られた、実験による結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、固定化されたヒトＣＤ３へのＤＡＲＴ‐Ａの結合のＳＰＲ分析を示す。破線は、ＤＡＲＴ‐Ａ濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭ（実線）において得られた、実験による結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、固定化されたカニクイザルＣＤ３へのＤＡＲＴ‐Ａの結合のＳＰＲ分析を示す。破線は、ＤＡＲＴ‐Ａ濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭ（実線）において得られた、実験による結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｅは、ＤＡＲＴ‐Ａが、ＣＤ３及びＣＤ１２３の両方に同時に結合できることを示す。図２６Ａは２機能性ＥＬＩＳＡの結果を提供し、ＤＡＲＴ‐Ａの、両標的抗原の同時結合を実証する。ＥＬＩＳＡプレートはヒトＣＤ１２３でコーティングされた。ＤＡＲＴ‐Ａ及び対照ＤＡＲＴ濃度の滴定に続いて、ヒトＣＤ３‐ビオチンを用いた検出を行った。結合は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ分子のＥコイル及びＫコイル領域に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは２機能性ＥＬＩＳＡの結果を提供し、ＤＡＲＴ‐Ａの、両標的抗原の同時結合を実証する。ＥＬＩＳＡプレートはカニクイザルＣＤ１２３でコーティングされた。ＤＡＲＴ‐Ａ及び対照ＤＡＲＴ濃度の滴定に続いて、ヒトＣＤ３‐ビオチンを用いた検出を行った。結合は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ分子のＥコイル及びＫコイル領域に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ＤＡＲＴ‐Ａの、ＣＤ１２３＋  Ｍｏｌｍ‐１３標的細胞に対する細胞表面結合を実証する。結合は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ分子のＥコイル及びＫコイル領域に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａの、ヒトＴ細胞に対する細胞表面結合を実証する。結合は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ分子のＥコイル及びＫコイル領域に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、ＤＡＲＴ‐Ａの、カニクイザルＴ細胞に対する細胞表面結合を実証する。結合は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ分子のＥコイル及びＫコイル領域に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｈは、ＤＡＲＴ‐Ａの、ＣＤ１２３＋  Ｋａｓｕｍｉ‐３白血病細胞株に対するヒト又はサルエフェクタ細胞による再指向標的細胞殺滅を媒介する能力を示し、この分子の、ｐＤＣを含む正常な循環白血球及び単球のサブセットに結合する能力を実証し、この分子の、単球（ＣＤ１４＋細胞）に影響を与えずにＣＤ１４‐ＣＤ１２３high細胞（ｐＤＣ及び好塩基球）を枯渇させる能力を実証する。図２７Ａは、ＱＦＡＣＳ分析によって決定されるＵ９３７及びＫａｓｕｍｉ‐３白血球細胞株上の相対的な抗ＣＤ１２３‐ＰＥ結合部位を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、図２７Ａに示すように相対的に少ないＣＤ１２３結合部位を有するＡＭＬ細胞株（Ｕ９３７細胞）に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴによって媒介される相対的に低い％細胞毒性を示す。Ｅ：Ｔ比は１０：１である。細胞毒性は、GraphPad PRISM（登録商標）ソフトウェアを用いて決定したＥＣ５０値を用いて、ＬＤＨ放出によって決定した。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、図２７Ａに示すように有意な数のＣＤ１２３結合部位を有するＡＭＬ細胞株（Ｋａｓｕｍｉ‐３細胞）に対する、（エフェクタ細胞としての）精製されたヒトＴ細胞の存在下でＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴによって媒介される％細胞毒性を示す。Ｅ：Ｔ比は１０：１である。細胞毒性は、GraphPad PRISM（登録商標）ソフトウェアを用いて決定したＥＣ５０値を用いて、ＬＤＨ放出によって決定した。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、Ｋａｓｕｍｉ‐３細胞に対する、（エフェクタ細胞としての）精製されたカニクイザルＰＢＭＣの存在下でＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴによって媒介される％細胞毒性を示し（Ｅ：Ｔは１５：１である）、ＤＡＲＴ‐ＡがカニクイザルＴ細胞に結合できることを実証している。細胞毒性は、GraphPad PRISM（登録商標）ソフトウェアを用いて決定したＥＣ５０値を用いて、ＬＤＨ放出によって決定した。
【図２７Ｅ】図２７Ｅは、ＱＦＡＣＳ分析によって決定されるような、Ｋａｓｕｍｉ‐３細胞、ヒト単球、ヒト形質細胞様樹状細胞（「ｐＣＤ」）、カニクイザル単球及びカニクイザル形質細胞様樹状細胞に対する、相対的な抗ＣＤ１２３‐ＰＥ結合部位を示す。
【図２７Ｆ】図２７Ｆは、ＤＡＲＴ‐Ａの、ヒトＣＤ１４‐ＣＤ１２３lo細胞を枯渇させる能力を示す。
【図２７Ｇ】図２７Ｇは、ＤＡＲＴ‐Ａの、ヒトＣＤ１４‐ＣＤ１２３Hi細胞を枯渇させる能力を示す。
【図２７Ｈ】図２７Ｈは、ＤＡＲＴ‐Ａの、カニクイザルＣＤ１４‐ＣＤ１２３Hi細胞を枯渇させる能力を示す。
【図２８】図２８は、ＤＡＲＴ‐Ａの薬物動態パラメータを推定するための、２区画モデルの使用を示す。このデータは、１００ｎｇ／ｋｇ／日、３００ｎｇ／ｋｇ／日、６００ｎｇ／ｋｇ／日及び１０００ｎｇ／ｋｇ／日の用量で９６時間の点滴を受けた後の、カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの点滴後（ＥＯＩ）血清濃度を示す。各点は別個の動物を表し、水平の線は、用量グループに関する平均値を表す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、サイトカイン、ＩＬ‐６の産生に対するＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａを用いて点滴されたサルの血清ＩＬ‐６レベル（平均±ＳＥＭ）を、治療グループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、サイトカイン、ＩＬ‐６の産生に対するＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａを用いて点滴されたサルの血清ＩＬ‐６レベル（平均±ＳＥＭ）を、治療グループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２〜５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、サイトカイン、ＩＬ‐６の産生に対するＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａを用いて点滴されたサルの血清ＩＬ‐６レベル（平均±ＳＥＭ）を、治療グループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２〜５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、ＣＤ３０３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ３０３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ｅ】図３０Ｅは、ＣＤ３０３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ３０３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２〜５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３０Ｆ】図３０Ｆは、ＣＤ３０３＋細胞の枯渇に対する、ＤＡＲＴ‐Ａ点滴の効果を示す。ＣＤ３０３＋の循環レベルの平均±ＳＥＭを、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、Ｔ細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数及びグループ毎の全循環Ｔ細胞の絶対数の平均±ＳＥＭを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、Ｔ細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２〜５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数及びグループ毎の全循環Ｔ細胞の絶対数の平均±ＳＥＭを示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、Ｔ細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数及びグループ毎の全循環Ｔ細胞の絶対数の平均±ＳＥＭを示す。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３１Ｅ】図３１Ｅは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３１Ｆ】図３１Ｆは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３１Ｇ】図３１Ｇは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３１Ｈ】図３１Ｈは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３１Ｉ】図３１Ｉは、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した４日間に亘る点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａを受容した、ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。Ｔ細胞は、発生し得るＤＡＲＴ‐Ａの干渉を排除するために、標準的なＣＤ３ではなくＣＤ４及びＣＤ８マーカによって計数された。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。研究日数毎及びグループ毎の、ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の相対値（平均％±ＳＥＭ）を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ２に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ３に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ４に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ２に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ３に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３２Ｆ】図３２Ｆは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＴｉｍ‐３＋の平均±ＳＥＭ％を、グループ４に関して研究日数毎に示す。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ＣＤ２５＋（灰色の正方形）；ＣＤ６９＋（灰色の三角形）；ＰＤ‐１＋（白色の三角形）；Ｔｉｍ‐３＋（白色の正方形）。
【図３３Ａ】図３３Ａは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ２に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ３に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ３）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ４＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ４に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ４）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ２に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ２）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３３Ｅ】図３３Ｅは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ３に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ３）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、連続的な７日間のＤＡＲＴ‐Ａの点滴中及び後に、Ｔ  ＣＤ８＋細胞集団において観察される変化を示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、グループ４に関して研究日数毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ４）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３４】図３４は、ナイーブなサル又はＤＡＲＴ‐Ａの複数回の点滴によって処置されたサルからのＰＢＭＣによる、Ｋａｓｕｍｉ‐３細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ媒介細胞毒性を示す。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ４＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３５Ｄ】図３５Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴で処置された（グループ１）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３５Ｅ】図３５Ｅは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ５）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３５Ｆ】図３５Ｆは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇したことを示す。ＣＤ８＋集団中の、ＣＤ４＋ナイーブ（ＣＤ９５‐／ＣＤ２８＋）、ＣＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８＋）及びＥＭＴ（ＣＤ９５＋／ＣＤ２８‐）Ｔ細胞の平均±ＳＥＭ％を、研究日数毎及びグループ毎に示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いて８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａで処置された（グループ６）。処置間隔を灰色で塗り潰されたバーで示す。凡例：ナイーブ（白色の三角形）；ＣＭＴ（黒色の三角形）；ＥＭＴ（灰色の正方形）。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の循環ＲＢＣレベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の循環ＲＢＣレベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の循環ＲＢＣレベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３６Ｄ】図３６Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の網状赤血球レベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３６Ｅ】図３６Ｅは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の網状赤血球レベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３６Ｆ】図３６Ｆは、ＤＡＲＴ‐Ａの、該分子の点滴を受容したサルにおける赤血球パラメータに対する効果を示す。ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収したサンプル中の網状赤血球レベル（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図３７Ａ】図３７Ａは、ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収した骨髄サンプル中のＬｉｎ‐細胞集団中の、ＣＤ１２３＋細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴（グループ１）、又は８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａ（グループ２〜５）、又は８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａ（グループ６）で処置された。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａで処置したサルから指示されている時点において回収した骨髄サンプル中のＬｉｎ‐細胞集団中の、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８‐／ＣＤ４５‐／ＣＤ９０＋細胞）の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。カニクイザルは、１日目にビヒクル対照で処置され、続いてビヒクルの週１回４週間に亘る点滴（グループ１）、又は８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に開始した週４日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａ（グループ２〜５）、又は８日目に開始した４週間に亘る週７日の点滴として投与されたＤＡＲＴ‐Ａ（グループ６）で処置された。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に結合できるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、並びに血液悪性腫瘍の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。非最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは十分に機能性であるが、コドン最適化によって遺伝子発現において得られる改善（例えばGrosjean, H. et al. (1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon‐Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes” Gene 18(3):199‐209参照）と同様に、配列を修飾又は改良することによって、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの安定性及び／又は機能を更に向上させることができる。
【００５７】
本発明の好ましいＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖からなり、これらは互いに関連して、ＣＤ１２３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する（図２）。このダイアボディの個々のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。各ポリペプチド鎖は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体化ドメインを含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから分離する。第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ１２３又はＣＤ３）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ１２３又はＣＤ３）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ＣＤ１２３及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。
【００５８】
第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体化ドメインによって開始させることができる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖上にＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号５０）（又はＶＥＰＫＳＣ；配列番号５１）、及び他方のポリペプチド鎖上にＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号５２）（又はＦＮＲＧＥＣ；配列番号５３）を含む（米国特許第２００７／０００４９０９号）。あるいはこのようなドメインは、反対の電荷のコイルを含有するように加工できる。ポリペプチド鎖のうちの一方のヘテロ二量体化ドメインは、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも８個の正荷電アミノ酸の配列を含み、ポリペプチド鎖のうちの他方のヘテロ二量体化ドメインは、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも８個の負荷電アミノ酸の配列を含む。例えば第１又は第２のヘテロ二量体化ドメインは好ましくは、８個の正荷電アミノ酸の配列を含むことになり、他方のヘテロ二量体化ドメインは好ましくは、８個の負荷電アミノ酸の配列を含むことになる。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。
【００５９】
本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、上述のような第１及び第２のポリペプチド鎖が、その長さに沿ってシステイン残基を介して互いに共有結合するように、加工される。このようなシステイン残基は、ポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインを分離する介在リンカーに導入してよい。あるいは更に好ましくは、第２のペプチド（リンカー２）を各ポリペプチド鎖に、例えばポリペプチド鎖のアミノ末端に、又はヘテロ二量体化ドメインと軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインとの間の位置に導入する。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは更に、免疫グロブリンＦｃドメイン又はアルブミン結合ドメインを有し、これによりインビボでの半減期が延長される。
【００６１】
免疫グロブリンＦｃドメインを含む本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（即ちＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖からなる。第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに関連して、ＣＤ１２３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する。第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は互いに関連して、免疫グロブリンＦｃドメインを形成する（図３Ａ、図３Ｂ）。二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。
【００６２】
第１及び第３のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。第１及び第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体化ドメインを含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから分離する。第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ１２３又はＣＤ３）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ３又はＣＤ１２３）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ＣＤ１２３及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、完全な免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体、並びにシステイン含有ペプチドを含有する。ＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体は、関連して、本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディの免疫グロブリンＦｃドメインを形成する。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、例えばポリペプチド鎖のシステイン含有ペプチド内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。
【００６３】
Ｉ．配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ「ＤＡＲＴ‐Ａ」
本発明は、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に特異的に結合できる配列最適化二重特異性ダイアボディ（「ＣＤ１２３×ＣＤ３」二重特異性ダイアボディ、即ちＤＡＲＴ‐Ａ）を提供する。以下で議論するように、ＤＡＲＴ‐Ａは、同様の組成の他の非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディに対して増強された機能的活性を呈することが分かっており、従って「配列最適化」ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディと呼ばれる。
【００６４】
配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む。二重特異性ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）（ＶＬCD3）、介在リンカーペプチド（リンカー１）、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）（ＶＨCD123）、及びＣ末端を含むことになる。上記ＶＬCD3ドメインに関する好ましい配列は、配列番号２１：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG
TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT
KLTVLG
である。
【００６５】
ＶＬCD3の抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号３８：RSSTGAVTTSNYAN）、ＣＤＲ２（配列番号３９：GTNKRAP）及びＣＤＲ３（配列番号４０：ALWYSNLWV）を含む。
【００６６】
上記リンカー１に関する好ましい配列は、配列番号２９：GGGSGGGGである。上記ＶＨCD123ドメインに関する好ましい配列は、配列番号２６：
EVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDII
PSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRA
SWFAYWGQGTLVTVSS
である。
【００６７】
ＶＨCD123の抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号４７：DYYMK）、ＣＤＲ２（配列番号４８：DIIPSNGATFYNQKFKG）及びＣＤＲ３（配列番号４９：SHLLRAS）を含む。
【００６８】
第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）、介在リンカーペプチド（例えばリンカー１）、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）、及びＣ末端を含むことになる。上記ＶＬCD123ドメインに関する好ましい配列は、配列番号２５：
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF
GQGTKLEIK
である。
【００６９】
ＶＬCD123の抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号４４：KSSQSLLNSGNQKNYLT）、ＣＤＲ２（配列番号４５：WASTRES）及びＣＤＲ３（配列番号４６：QNDYSYPYT）を含む。
【００７０】
上記ＶＨCD3ドメインに関する好ましい配列は、配列番号２２：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIR
SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNF
GNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
である。
【００７１】
ＶＨCD3の抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号４１：TYAMN）、ＣＤＲ２（配列番号４２：RIRSKYNNYATYYADSVKD）及びＣＤＲ３（配列番号４３：HGNFGNSYVSWFAY）を含む。
【００７２】
本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、上述のような第１及び第２のポリペプチドが、その長さに沿ってシステイン残基を介して互いに共有結合するように、加工される。このようなシステイン残基は、ポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインを分離する介在リンカー（例えばリンカー１）に導入してよい。あるいは更に好ましくは、第２のペプチド（リンカー２）を各ポリペプチド鎖に、例えば上記ポリペプチド鎖のＶＬドメインに対するＮ末端又はＶＨドメインに対するＣ末端の位置に、導入する。上記リンカー２に関する好ましい配列は、配列番号３０：GGCGGGである。
【００７３】
ヘテロ二量体の形成は、反対の電荷のポリペプチドコイルを含有するように上記ポリペプチド鎖を更に加工することによって開始させることができる。従って好ましい実施形態では、ポリペプチド鎖のうちの一方は、残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３４：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK）を含有するように加工され、その一方で上記２つのポリペプチド鎖のうちのもう一方は、残基がｐＨ７において正の電荷を形成する「Ｋコイル」ドメイン（配列番号３５：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE）を含有するように加工される。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連が促進され、従ってヘテロ二量体化が促進される。
【００７４】
第１又は第２のポリペプチド鎖にどのコイルを提供するかは重要ではない。しかしながら、本発明の好ましい配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ａ」）は、以下の配列（配列番号１）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG
TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT
KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR
QAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEV
AALEKEVAALEK
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
【００７５】
ＤＡＲＴ‐Ａ鎖１は：配列番号２１‐配列番号２９‐配列番号２６‐配列番号３０‐配列番号３４からなる。ＤＡＲＴ‐Ａ鎖１をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号２：
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg
tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc
caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggt
acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg
gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccga
ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca
aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc
tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc
ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg
caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg
gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga
caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat
acagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg
cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg
tggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtc
gctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa
である。
【００７６】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、以下の配列（配列番号３）：
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF
GQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN
WVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNS
LKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEK
VAALKEKVAALKEKVAALKE
を有する。
【００７７】
ＤＡＲＴ‐Ａ鎖２は：配列番号２５‐配列番号２９‐配列番号２２‐配列番号３０‐配列番号３５からなる。ＤＡＲＴ‐Ａ鎖２をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号４：
gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc
gggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca
gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg
ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg
gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga
ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc
ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg
aggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccct
gagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaat
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggt
ccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagatt
caccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagc
ctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcg
gcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgac
tgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaa
gttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccc
tgaaagag
である。
【００７８】
以下で議論するように、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）は、ヒト及びサル細胞によって配列されるように、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に結合できる能力を有することが分かった。ＤＡＲＴ‐Ａの提供は、Ｔ細胞活性化を引き起こすこと、芽球の削減を媒介すること、Ｔ細胞膨張を開始させること、Ｔ細胞活性化を誘発すること、及び標的癌細胞の再指向殺滅を引き起こすことが分かった。
【００７９】
ＩＩ．比較例である非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ、「ＤＡＲＴ‐Ｂ」
ＤＡＲＴ‐Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａと同様の全体的構造を有する非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）、介在リンカーペプチド（リンカー１）、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）、介在リンカー２、Ｅコイルドメイン、及びＣ末端を含むことになる。ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖のＶＬCD3ドメインは、以下の配列（配列番号２３）：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSK
VASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE
LK
である。ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖のＶＨCD123ドメインは、以下の配列（配列番号２８）：
QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDII
PSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRA
SWFAYWGQGTLVTVSS
である。
【００８０】
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ鎖１は：配列番号２３‐配列番号２９‐配列番号２８‐配列番号３０‐配列番号３４からなる。ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖の配列は（配列番号５）：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSK
VASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE
LKGGGSGGGGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPG
QGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY
YCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALE
KEVAALEK
である。
【００８１】
ＤＡＲＴ‐Ｂ鎖１をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号６：
gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaga
aggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggta
ccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaa
gtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcat
actctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactg
ccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggag
ctgaaaggaggcggatccggcggcggaggccaggtgcagctggtgcagtccg
gggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccag
tggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccagga
cagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttct
acaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaag
cactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtac
tattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggac
agggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggc
cgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaa
aaggaggtcgcagccctggagaaa
である。
【００８２】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）、介在リンカーペプチド（リンカー１）、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）、介在リンカー２、Ｋコイルドメイン、及びＣ末端を含むことになる。
【００８３】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖のＶＬCD123ドメインは、以下の配列（配列番号２７）：
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF
GQGTKLEIK
を有する。ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖のＶＨCD3ドメインは、以下の配列（配列番号２４）：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYIN
PSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHY
CLDYWGQGTTLTVSS
を有する。
【００８４】
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ鎖２は：配列番号２７‐配列番号２９‐配列番号２４‐配列番号３０‐配列番号３５からなる。ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖の配列は（配列番号７）：
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF
GQGTKLEIKGGGSGGGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMH
WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKE
KVAALKEKVAALKE
である。
【００８５】
ＤＡＲＴ‐Ｂ鎖２をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号８：
gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc
gggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca
gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg
ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg
gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga
ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc
ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg
atatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagt
gaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaggtacacgatgcac
tgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatc
ctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacatt
gactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgaca
tctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattact
gccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctccggaggatg
tggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagag
aaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
である。
【００８６】
ＩＩＩ．配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の修飾された変形例
Ａ．アルブミン結合ドメインを有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＡＢＤを有するＤＡＲＴ‐Ａ、「ｗ／ＡＢＤ」）
本発明の第２の実施形態では、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）は、このダイアボディのポリペプチド鎖の一方又は両方に、１つ又は複数のアルブミン結合ドメイン（「ＡＢＤ」）を備えることになる（ＡＢＤを有するＤＡＲＴ‐Ａ、「ｗ／ＡＢＤ」）。
【００８７】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。この目的のために特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が特に好ましい。
【００８８】
連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。
【００８９】
従って、アルブミン結合ドメインを有する上記配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、第３のリンカー（リンカー３）を含有し、これは上記ポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）をアルブミン結合ドメインから分離する。このようなリンカー３に関する好ましい配列は、配列番号３１：GGGSである。好ましいアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、以下の配列（配列番号３６）：
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP
を有する。
【００９０】
従って、アルブミン結合ドメインを有する配列最適化CD123×CD3二重特異性ダイアボディの好ましい第１のポリペプチド鎖は、以下の配列（配列番号９）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG
TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT
KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR
QAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEV
AALEKEVAALEKGGGSLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKA
LIDEILAALP
を有する。
【００９１】
アルブミン結合ドメインを有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディは：配列番号２１‐配列番号２９‐配列番号２６‐配列番号３０‐配列番号３４‐配列番号３１‐配列番号３６からなる。このようなアルブミン結合ドメイン誘導体を有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０：
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg
tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc
caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggt
acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg
gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccga
ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca
aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc
tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc
ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg
caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg
gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga
caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat
acagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg
cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg
tggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtc
gctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctgg
ccgaagcaaaagtgctggccaaccgcgaactggataaatatggcgtgagcga
ttattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagca
ctgattgatgaaattctggccgccctgcct
である。
【００９２】
このようなアルブミン結合ドメインを有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、上述の配列（配列番号３）を有し、配列番号４の配列を有するポリヌクレオチドによってエンコードされる。
【００９３】
Ｂ．ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（Ｆｃを有するＤＡＲＴ‐Ａ、「ｗ／Ｆｃ」）
第３の実施形態では、本発明は、３つのポリペプチド鎖からなり、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（Ｆｃを有するＤＡＲＴ‐Ａ、「ｗ／Ｆｃ」バージョン１及びバージョン２）を提供する（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【００９４】
このようなＩｇＧ  Ｆｃドメインを形成するために、このダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：システイン含有ペプチド（最も好ましくは、アミノ酸配列（配列番号５５）：DKTHTCPPCPを有するペプチド１）；完全な免疫グロブリンＦｃドメインの、ＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体；並びにＣ末端を含有する。ＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体は、関連して、本発明の二重特異性１価Ｆｃドメイン含有ダイアボディの免疫グロブリンＦｃドメインを形成する。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、例えばポリペプチド鎖のシステイン含有ペプチド内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。
【００９５】
第１及び第３のポリペプチドのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の錯体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」とペアにすることができる。このような一連の変化は、二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
【００９６】
第１のポリペプチド鎖中に存在する抗体ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、以下（配列番号５６）：
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
である。
【００９７】
第３のポリペプチド鎖中に存在する抗体ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、以下（配列番号１１）：
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQ
KSLSLSPGK
である。
【００９８】
Ｃ．ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造
このようなＦｃダイアボディを例示するために、本発明は、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造を提供する。ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に：Ｎ末端；ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）；リンカー２；Ｅコイルドメイン；リンカー５；ペプチド１；ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド；並びにＣ末端を含む。好ましいリンカー５は、以下の配列（配列番号３２）：GGGを有する。ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する好ましいポリペプチドは、以下の配列（配列番号３７）：
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
を有する。
【００９９】
従って、このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第１のポリペプチドは：配列番号２５‐配列番号２９‐配列番号２２‐配列番号３０‐配列番号３４‐配列番号３２‐配列番号５５‐配列番号３７からなる。
【０１００】
このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第１のポリペプチドの好ましい配列は、以下の配列（配列番号１３）：
DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTF
GQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN
WVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNS
LKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKE
VAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
を有する。
【０１０１】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下（配列番号１４）：
gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagc
gggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatca
gaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactg
ctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcg
gcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccga
ggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttc
ggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcg
aggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccct
gagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaat
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggt
ccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagatt
caccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagc
ctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcg
gcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgac
tgtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagag
gttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccc
tggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacc
tgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac
accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtga
gccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggt
gcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt
gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagt
acaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccat
ctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccca
tcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaag
gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc
ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtct
tctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag
cctctccctgtctccgggtaaa
である。
【０１０２】
ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第２の鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）；リンカー２；Ｋコイルドメイン；及びＣ末端を含む。従ってこのようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第２のポリペプチドは：配列番号２１‐配列番号２９‐配列番号２６‐配列番号３０‐配列番号３５からなる。このようなポリペプチドは、以下の配列（配列番号１５）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG
TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT
KLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVR
QAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKV
AALKEKVAALKE
を有する。
【０１０３】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列（配列番号１６）：
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactg
tgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgc
caattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggt
acaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgg
gcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccga
ttactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcaca
aaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagc
tggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtc
ttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcagg
caggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacg
gggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtgga
caaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagat
acagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttg
cttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcgg
tggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtc
gccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
を有する。
【０１０４】
このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン１構造の第３のポリペプチド鎖は、ＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことになる。好ましいポリペプチドは、ペプチド１（配列番号５５）並びにＦｃドメイン（配列番号１１）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなり、配列番号５４の配列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
HEALHNRYTQKSLSLSPGK
を有する。
【０１０５】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列（配列番号１２）：
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac
cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg
gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag
gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac
cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc
aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgac
caagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgac
atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca
cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcac
cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg
catgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgg
gtaaa
を有する。
【０１０６】
Ｄ．ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン２構造
このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃダイアボディの第２の例として、本発明は、３鎖ダイアボディ、即ち「ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃダイアボディバージョン２」を提供する（図３Ｂ）。
【０１０７】
ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン２構造の第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に：Ｎ末端；ペプチドリンカー（ペプチド１）；ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）に（リンカー４を介して）連結されたＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド；介在リンカーペプチド（リンカー１）；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）；リンカー２；Ｋコイルドメイン；並びにＣ末端を含む。
【０１０８】
ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する好ましいポリペプチドは、以下の配列（配列番号３７）：
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
を有する。
【０１０９】
「リンカー４」は好ましくはアミノ酸配列（配列番号５７）：APSSSを含むことになる。好ましい「リンカー４」は、配列（配列番号３３）：APSSSPMEを有する。従って、このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン２構造の第１のポリペプチドは：配列番号５５‐配列番号３７‐配列番号３３‐配列番号２５‐配列番号２９‐配列番号２２‐配列番号３０‐配列番号３５からなる。このような配列を有するポリペプチドは、以下（配列番号１７）：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSPGKAPSSSPMEDFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKS
SQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF
TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESG
GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYAT
YYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWF
AYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
である。
【０１１０】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列（配列番号１８）：
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac
cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg
gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag
gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac
cgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc
aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc
agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgac
caagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac
atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca
cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcac
cgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg
catgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg
gtaaagccccttccagctcccctatggaagacttcgtgatgacacagtctcc
tgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagc
tcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtacc
agcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccag
ggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagatttt
accctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtc
agaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaat
taaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctggg
ggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctg
gattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaa
ggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacc
tactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaa
agaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgt
gtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggttt
gcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcg
gtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggt
cgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
を有する。
【０１１１】
このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン２構造の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に：ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；及びＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）を含む。上記分子のこの部分は、（リンカー２を介して）Ｅコイルドメインに連結される。従って、このようなＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ  バージョン２構造の第３のポリペプチドは：配列番号２１‐配列番号２９‐配列番号２６‐配列番号３０‐配列番号３４からなる。このような配列を有するポリペプチドは（配列番号１）であり、好ましくは配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドによってエンコードされる。
【０１１２】
第３のポリペプチド鎖は、ＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことになる。好ましいポリペプチドは、ペプチド１（配列番号５５）並びにＦｃドメイン（配列番号１１）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなり、配列番号５４の配列を有する。
【０１１３】
上述のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ、ＤＡＲＴ‐Ｂ）の活性を評価するために、対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を産生した。対照ＤＡＲＴは、ＦＩＴＣ及びＣＤ３に同時に結合できる。その２つのポリペプチド鎖はそれぞれ以下のような配列を有する：
対照ＤＡＲＴ鎖１（配列番号１９）：
DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVL
IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFG
GGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNW
VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSL
KTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEV
AALEKEVAALEKEVAALEK
対照ＤＡＲＴ鎖２（配列番号２０）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGG
TNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGT
KLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVR
QSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRV
EDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAA
LKEKVAALKE
【０１１４】
ＩＶ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ、及び特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物も包含する。
【０１１６】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０１１７】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０１１８】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本発明はまた、単独で又は上述の薬学的に許容可能なキャリアと併せて、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディで充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０１２０】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０１２１】
Ｖ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０１２２】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０１２３】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；５，９８５，３２０号；５，９８５，３０９号；５，９３４，２７２号；５，８７４，０６４号；５，８５５，９１３号；５，２９０，５４０号；４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；９７／３２５７２号；９７／４４０１３号；９８／３１３４６号；９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０１２５】
凍結乾燥された本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。
【０１２６】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０１２７】
本発明が包含する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディに関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、受容者である被験体の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。投与される投薬量は典型的には、少なくとも約０．３ｎｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約３ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３０ｎｇ／ｋｇ／日〜約９０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ／日〜約３００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２００ｎｇ／ｋｇ／日〜約６００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３００ｎｇ／ｋｇ／日〜約９００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４００ｎｇ／ｋｇ／日〜約８００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｋｇ／日である。
【０１２８】
別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明が包含する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの用量を投与しない）ことを含む。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超えるコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。
【０１２９】
別の実施形態では、投与される用量は、本発明が包含する配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。
【０１３０】
表１は、典型的な治療コースに関する上述の様々な用量設定レジメンの５つの例を提供する。
【０１３１】
【表１】
0006524087.tif 000002
【０１３２】
本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの投与の投薬量及び頻度は、例えば脂質化等の修飾によって、上記配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの取り込み及び組織貫通を増進することにより、低減又は変更してよい。
【０１３３】
患者に投与される本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの用量は、単一作用剤療法としての使用に関して計算してよい。あるいは、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、他の治療用組成物と併用され、患者に投与される用量は、上記分子を単一作用剤療法として使用する場合よりも低い。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜（sialastic）等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０１３５】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527‐1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez‐Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353‐365(1989); Lopez‐Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０１３６】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；  国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201‐240;Buchwald et al.(1980)“Long‐Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507‐516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574‐579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled‐Release Diphosphonate,” Science 228:190‐192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion‐Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105‐112）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115‐138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、ダン他（米国特許第５，９４５，１５５号参照）に従って使用できる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治��効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０１３７】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527‐1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‐Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372‐397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１３８】
本発明の組成物が、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディをエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードする配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１３９】
治療的又は予防的有効量の本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【０１４０】
ＶＩ．本発明の組成物の使用
本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、ＣＤ１２３の発現に関連する又はＣＤ１２３の発現を特徴とするいずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。従ってこのような分子は、限定するものではないが：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫（実施例２参照）；自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；喘息並びに慢性関節リウマチの診断又は治療において採用してよい。本発明の二重特異性ダイアボディは更に、上述の状態の治療のための薬品の製造に使用してよい。
【０１４１】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１  ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ及び対照タンパク質の構築
表２は、発現及び精製後の二重特異性ダイアボディのリストを含む。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）及び非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ｂ）は、ＣＤ１２３及びＣＤ３に同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）は、ＦＩＴＣ及びＣＤ３に同時に結合できる。これら二重特異性ダイアボディは、挙げられているアミノ酸配列のヘテロ二量体又はヘテロ三量体である。二重特異性ダイアボディを形成するための方法は：国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／１６２０６７号において提供される。
【０１４３】
【表２】
0006524087.tif 000003
【０１４４】
実施例２  定量的ＦＡＣＳ（ＱＦＡＣＳ）のための標的細胞の抗体標識
合計１０6個の標的細胞を培地から採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１０％ヒトＡＢ血清（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｎａアジド）中に再懸濁し、Ｆｃ受容体をブロックするために５分間インキュベートした。異なる抗体結合性能を有するマイクロスフェア（Quantum（商標）Simply Cellular（登録商標）（ＱＳＣ）、Bangs Laboratories,Inc.,インディアナ州フィッシャーズ）及び標的細胞の抗体標識を、製造元の指示に従って抗ＣＤ１２３  ＰＥ抗体（BD Biosciences）で標識した。要するに、１滴の各ＱＳＣマイクロスフェアを５ｍＬポリプロピレンチューブに添加し、ＰＥ標識抗ＣＤ１２３抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で標的細胞及びマイクロスフェアの両方に添加した。チューブを暗所において４℃で３０分間インキュベートした。２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して２５００×Ｇで５分間遠心分離することによって、細胞及びマイクロスフェアを洗浄した。洗浄後に、１滴のブランクマイクロスフェア集団を添加した。マイクロスフェアを、まずフローサイトメトリーで分析して、試験専用の機器設定（ＰＭＴ電圧及び補償）を設定した。同一の機器設定を用いて、マイクロスフェア及び標的細胞の幾何学的平均蛍光値を記録した。マイクロスフェア集団上の抗体結合部位の標準曲線を、マイクロスフェア集団の幾何学的平均蛍光値から生成した。標的細胞上の抗体結合部位を、ＱｕｉｃｋＣａｌスプレッドシート（Bangs Laboratories）内でマイクロスフェアに関して生成された上記標準曲線を用いて、標的細胞の幾何学的平均蛍光値に基づいて算出した。
【０１４５】
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを評価するために好適な標的細胞株を決定するために、標的株Ｋａｓｕｍｉ‐３（ＡＭＬ）、Ｍｏｌｍ１３（ＡＭＬ）、ＴＨＰ‐１（ＡＭＬ）、ＴＦ‐１（赤白血病）及びＲＳ４‐１１（ＡＬＬ）上でのＣＤ１２３表面発現レベルを、定量的ＦＡＣＳ（ＱＦＡＣＳ）によって評価した。ＱＦＡＣＳキットを用いて、細胞表面上のＣＤ１２３抗体結合部位の絶対数を算出した。表３に示すように、これら細胞株上のＣＤ１２３抗体結合部位の絶対数は、Ｋａｓｕｍｉ‐３（高）＞Ｍｏｌｍ１３（中）＞ＴＨＰ‐１（中）＞ＴＦ‐１（中低）＞ＲＳ４‐１１（低）の順となった。発現が多い方から３つの細胞株は、ＡＭＬ細胞株、即ちＫａｓｕｍｉ‐３、ＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ‐１であった。非ＡＭＬ細胞株、即ちＴＦ‐１及びＲＳ４‐１１はそれぞれ、ＣＤ１２３の中低／低発現を有していた。
【０１４６】
【表３】
0006524087.tif 000004
【０１４７】
実施例３  ＣＴＬ細胞毒性アッセイ（ＬＤＨ放出アッセイ）
接着性標的腫瘍細胞を、０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液を用いて引き離し、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収した。懸濁した標的細胞株を培地から採取し、アッセイ媒体で洗浄した。細胞濃度及び生存力を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ‐Ｃｅｌｌカウンタを使用して、トリパンブルー除外によって測定した。標的細胞を、アッセイ媒体中で４×１０5細胞／ｍＬに希釈した。希釈した細胞懸濁液５０μＬを、９６ウェルＵ字型底細胞培養処置済みプレート（BD Falcon Cat#353077）に添加した。
【０１４８】
標的最大放出（ＭＲ）、抗体独立性細胞毒性（ＡＩＣＣ）及び標的細胞自然放出（ＳＲ）を測定するための対照の３つのセットを、以下のように構成した、
１）ＭＲ：ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを有しない２００μＬのアッセイ媒体及び５０μＬの標的細胞；実験の最後に洗浄剤を添加して、最大ＬＤＨ放出を決定する。
２）ＡＩＣＣ：ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを有しない５０μＬのアッセイ媒体、５０μＬの標的細胞、及び１００μＬのＴ細胞。
３）ＳＲ：ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを有しない１５０μＬのアッセイ媒体及び５０μＬの標的細胞。
【０１４９】
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ及びＤＡＲＴ‐Ｂ）並びに対照を、まず４μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、その後、最終濃度０．００００４ｎｇ／ｍＬ（即ち４０ｆｇ／ｍＬ）までの段階希釈物を調製した。５０μＬの希釈物を、５０μＬ標的細胞／ウェルを含有するプレートに添加した。
【０１５０】
精製したＴ細胞をアッセイ媒体で１回洗浄し、細胞密度２×１０6細胞／ｍＬでアッセイ媒体中に再懸濁した。１００μＬ中の２×１０5個のＴ細胞を各ウェルに添加し、最終的なエフェクタ対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を１０：１とした。プレートを５％ＣＯ2中において３７℃で約１８時間インキュベートした。
【０１５１】
インキュベーション後、１０×細胞溶解液２５μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ１８２Ａ）又はジギトニン１ｍｇ／ｍＬを最大放出対照ウェルに添加し、３回のピペッティングによって混合し、プレートを１０分間インキュベートして、標的細胞を完全に溶解した。これらのプレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液５０μＬを各アッセイプレートウェルから平底ＥＬＩＳＡプレートに移し、ＬＤＨ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ１７８０）５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを暗所において室温（ＲＴ）で１０〜２０分間インキュベートし、停止液５０μＬを添加した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、Victor2 Multilabel plate reader（Perkin Elmer#1420‐014）上で１時間以内に４９０ｎｍにおいて測定した。以下で説明するように％細胞毒性を算出し、GraphPad PRISM5（登録商標）ソフトウェアを用いて用量‐応答曲線を生成した。
【０１５２】
特定の細胞の溶解は、以下の式を用いてＯ．Ｄ．データから算出した：
細胞毒性（％）＝１００×（サンプルのＯＤ‐ＡＩＣＣのＯＤ）／（ＭＲのＯＤ‐ＳＲのＯＤ）
【０１５３】
ＣＤ１２３表面レベルが異なる標的細胞株の再指向殺滅
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、高いＣＤ１２３発現を有する標的細胞株Ｋａｓｕｍｉ‐３（ＥＣ５０＝０．０１ｎｇ／ｍＬ）（図４パネルＤ）、中程度のＣＤ１２３発現を有する標的細胞株Ｍｏｌｍ１３（ＥＣ５０＝０．１８ｎｇ／ｍＬ）及びＴＨＰ‐１（ＥＣ５０＝０．２４ｎｇ／ｍＬ）（それぞれ図４パネルＣ及びＥ）、並びに中低程度の又は低いＣＤ１２３発現を有する標的細胞株ＴＦ‐１（ＥＣ５０＝０．４６ｎｇ／ｍＬ）及びＲＳ４‐１１（ＥＣ５０＝０．５ｎｇ／ｍＬ）（それぞれ図４パネルＢ及びＡ）におけるＣＤ３エピトープ結合特異性（ＤＡＲＴ‐Ａ対ＤＡＲＴ‐Ｂ）とは無関係に、５０％の最大活性（ＥＣ５０）を達成するために必要なｎｇ／ｍｌ以下の範囲での濃度を用いて、潜在的な再指向殺滅能力を呈した。同様に、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性分子媒介性再指向殺滅は、異なる供与体からのＴ細胞を有する複数の標的細胞株を用いて観察され、またＣＤ１２３を発現しない細胞株では再指向殺滅活性は観察されなかった。結果を表４にまとめる。
【０１５４】
【表４】
0006524087.tif 000005
【０１５５】
この例を複製する必要がある場合、当業者は合理的かつ許容可能な範囲内で、上述のプロトコルを、上述の結果を複製するために適切な様式で変化させることができることが理解されるであろう。従って、例示したプロトコルに対して、正確に厳密な様式で固執することは意図されていない。
【０１５６】
実施例４  配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ及びＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ）による再指向殺滅中のＴ細胞活性化
配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、高いＣＤ１２３発現を有する標的細胞株Ｋａｓｕｍｉ‐３及び中程度のＣＤ１２３発現を有するＴＨＰ‐１（それぞれ図５パネルＡ及びＢ）において、半減期延長技術の存在又は不在に関係なく（ＤＡＲＴ‐Ａ対ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ対ＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／Ｆｃ）、潜在的な再指向殺滅能力を呈した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ媒介性再指向殺滅プロセス中のＴ細胞活性化を特性決定するために、再指向殺滅アッセイからのＴ細胞を、Ｔ細胞活性化マーカＣＤ２５に関して染色し、ＦＡＣＳで分析した。図５パネルＤに示すように、ＣＤ２５は、ＣＤ８Ｔ細胞中において用量依存的に発現増加され、これは配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディが、再配向殺滅のプロセスにおいてＴ細胞活性化を誘発することを示している。対照的に、標的細胞の不在時、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化は発生せず（図５パネルＣ）、これは、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディが、標的細胞の不在時にＴ細胞を活性化させないことを示している。同様に、ＣＤ８Ｔ細胞は、標的細胞及び対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を用いてインキュベートした場合に活性化されず（図５パネルＤ）、これは、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを用いてＴ細胞及び標的細胞を架橋する必要があることを示している。
【０１５７】
実施例５  グランザイムＢ及びパーフォリンに関する細胞内染色
Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内レベルを決定するために、ＣＴＬアッセイを上述のように構築した。約１８時間後、４℃で３０分間インキュベートすることにより、アッセイプレートからの細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色した。表面染色に続いて、細胞を、１００μＬの固定及び易透化緩衝液（BD BioSciences）中において４℃で２０分間インキュベートした。細胞を易透化／洗浄緩衝液（BD BioSciences）で洗浄し、（１×易透化／洗浄緩衝液中で調製した）グランザイムＢ及びパーフォリン抗体混合物５０μＬ中において、４℃で３０分間インキュベートした。続いて細胞を、２５０μＬの易透化／洗浄緩衝液で洗浄して、ＦＡＣＳ取得のために易透化／洗浄緩衝液中に再懸濁した。
【０１５８】
再指向殺滅中のＴ細胞における、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）によるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現増加
Ｔ細胞による配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）媒介性細胞毒性に関する可能性のある機序を調査するために、再指向殺滅後のＴ細胞において、細胞内グランザイムＢ及びパーフォリンレベルを測定した。ＤＡＲＴ‐Ａを用いたＴ細胞及びＫａｓｕｍｉ‐３のインキュベーション後、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞両方において、グランザイムＢ及びパーフォリンレベルの用量依存的発現増加が観察された（図６パネルＡ）。興味深いことに、発現増加はＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ４Ｔ細胞に比べて略２倍高かった（図６パネルＡ）。グランザイムＢ及びパーフォリン阻害剤の存在下でアッセイを実施した場合、細胞殺滅は観察されなかった。Ｔ細胞をＫａｓｕｍｉ‐３標的細胞及び対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）でインキュベートした場合、ＣＤ８又はＣＤ４Ｔ細胞においてグランザイムＢ又はパーフォリンの発現増加は発生しなかった（図５パネルＢ）。これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ媒介性標的細胞殺滅が、グランザイムＢ及びパーフォリン機序を通して媒介され得ることを示している。
【０１５９】
実施例６  配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）のインビボ抗腫瘍活性
ヒト全血からのＰＢＭＣ及びＴ細胞の単離
Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いて、健康なヒト供与体からのＰＢＭＣを全血から単離した。要約すると、全血を無菌ＰＢＳで１：１に希釈した。希釈した血液３５ｍＬを、５０ｍＬチューブ中の１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓに積層し、このチューブを１４００ｒｐｍで２０分間、制動を外して遠心分離した。２つの相の間の軟膜層を５０ｍＬチューブ内に回収し、４５ｍＬのＰＢＳを用いて、このチューブを６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間遠心分離することにより洗浄した。上清液を廃棄し、細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、トリパンブルー染料排除によって生存細胞数を決定した。ＰＢＭＣを、完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ１００μ／１００μ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））中で、２．５×１０6細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
【０１６０】
Ｔ細胞単離
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ未結合ヒトＴ細胞単離キット（Life Technologies）を製造元の指示に従って使用して、ヒト全血からのＰＢＭＣからのネガティブ選択によって、未結合Ｔ細胞を単離した。単離後、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ媒体中でＴ細胞を一晩培養した。
【０１６１】
腫瘍モデル
ヒトＴ細胞及び腫瘍細胞（Ｍｏｌｍ１３又はＲＳ４‐１１）を１：５の比（それぞれ１×１０6及び５×１０6）で組み合わせ、２００μＬの無菌食塩水中に懸濁し、研究日数０日目（ＳＤ０）に皮下（ＳＣ）注射した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）又は対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を、表５（ＭＯＬＭ１３）及び表６（ＲＳ４‐１１）に概説したような１００μＬの尾静脈注射によって静脈内（ＩＶ）投与した。
【０１６２】
【表５】
0006524087.tif 000006
【０１６３】
【表６】
0006524087.tif 000007
【０１６４】
データ収集及び統計的分析
動物の体重‐個々の動物の体重を、腫瘍細胞注射時に開始して研究の完了まで１週間に２回記録した。
【０１６５】
瀕死／死亡率
動物を、全体的な瀕死状態に関して１週間に２回、死亡率に関して毎日観察した。動物の死は、全体的観察及び体重減少を含む、薬剤関連又は技術的ベース因子として評価した。動物の死を毎日記録した。
【０１６６】
腫瘍体積
個々の腫瘍体積を、腫瘍埋入の１週間以内に開始して１週間に２回記録し、研究の完了まで継続した。
【０１６７】
【数１】
0006524087.tif 000008
【０１６８】
技術的な又は薬剤関連の死を経験した動物を、データ算出から削除した。
【０１６９】
腫瘍成長阻害
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）値を、処置される動物を包含する各グループに関して、以下の式を用いて算出した。
【０１７０】
【数２】
0006524087.tif 000009
【０１７１】
部分的な若しくは完全な応答を経験した動物、又は技術的な若しくは薬剤関連の死を経験した動物を、ＴＧＩ算出から除外した。化合物活性に関する国立癌研究所基準は、ＴＧＩ＞５８％である（Corbett et al. (2004) Anticancer Drug Development Guide;Totowa, NJ:Humana 99-123）。
【０１７２】
部分的な／完全な腫瘍応答
１日目に１ｍｍ3未満と測定された腫瘍を有する個々のマウスを、部分的応答（ＰＲ）を有するものとして分類し、％腫瘍退縮（％ＴＲ）値を、以下の式を用いて決定した。
【０１７３】
【数３】
0006524087.tif 000010
【０１７４】
触知可能な腫瘍を有しない個々のマウスを、完全な応答（ＣＲ）を経たものとして分類した。
【０１７５】
腫瘍体積の統計
処置対象のグループと対照グループとの間で統計的分析を実施し、腫瘍体積を比較した。これらの分析に関して、分散の双方向分析及びこれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポスト試験を採用した。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（バージョン５．０２）を用いて実施した。技術的な又は薬剤関連の死を経験した個々の動物からの重量及び腫瘍データを分析から削除した。しかしながら、部分的な又は完全な応答が報告された動物からの腫瘍データはこの算出に含めた。
【０１７６】
ＭＯＬＭ１３の結果
ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１３を、活性化したＴ細胞と予備混合し、上述のようにＳＤ０において、ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）ノックアウトマウス（Ｎ＝８／グループ）にＳＣ埋入した。ビヒクル処置グループのＭＯＬＭ１３腫瘍（ＭＯＬＭ１３細胞単独、又はＴ細胞と共に）は、インビボで比較的激しい成長プロファイルを示した（図７パネルＡ及びＢ）。ＳＤ８において、ビヒクル処置グループの腫瘍の平均体積は１２９．８±２９．５ｍｍ3であり、ＳＤ１５までに腫瘍は平均体積７８６．４±１５６．７ｍｍ3に達した。ＳＤ１８における実験の終了までに、腫瘍は１３９８．８±２３６．９ｍｍ3に達した。
【０１７７】
ＤＡＲＴ‐Ａを用いた処置は、腫瘍細胞／Ｔ細胞混合物を埋入した日［（ＳＤ０）］と同じ日に開始され、続いて１日１回の注射を更に７日間、合計８回の注射を行った。動物を、９個の用量レベル（０．５、０．２、０．１、０．０２及び０．００４ｍｇ／ｋｇ、並びに２０、４、０．８及び０．１６μｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置した。結果を図７パネルＡ（０．５、０．２、０．１、０．０２及び０．００４ｍｇ／ｋｇ）並びに図７パネルＢ及び（２０、４、０．８及び０．１６μｇ／ｋｇ）に示す。研究日数１１日目までに、ＭＯＬＭ１３腫瘍の成長は、０．１６、０．５、０．２、０．１、０．０２及び０．００４ｍｇ／ｋｇ用量レベルにおいて有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。更に、ＭＯＬＭ１３腫瘍保有マウスの、２０及び４μｇ／ｋｇ用量レベルでの処置により、それぞれ８／８及び７／８のＣＲが得られた。ＳＤ１８における実験の終了までに、０．８〜２０μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置された腫瘍の平均体積は、７１３．６．０±２６７．４〜０ｍｍ3となり、全ての腫瘍は、ビヒクル処置対照グループの腫瘍よりも有意に小さかった。ＴＧＩ値は、２０、４及び０．８μｇ／ｋｇ用量グループに関してそれぞれ１００、９４及び４９％であった。ビヒクル処置ＭＯＬＭ１３腫瘍細胞グループと比較すると、２０及び４μｇ／ｋｇ用量レベルでＤＡＲＴ‐Ａを受容したグループは、ＳＤ１５までに統計的有意差に到達し、その一方で０．８μｇ／ｋｇを用いて処置されたグループはＳＤ１８において有意差に到達した。
【０１７８】
ＲＳ４‐１１の結果
ＡＬＬ細胞株ＲＳ４‐１１を、活性化したＴ細胞と予備混合し、上述のようにＳＤ０において、ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマノックアウトマウス（Ｎ＝８／グループ）にＳＣ埋入した。ビヒクル処置グループのＲＳ４‐１１腫瘍（ＲＳ４‐１１細胞単独、又はＴ細胞と共に）は、インビボで比較的激しい成長プロファイルを示した（図８）。
【０１７９】
ＤＡＲＴ‐Ａを用いた処置は、腫瘍細胞／Ｔ細胞混合物を埋入した日［（ＳＤ０）］と同じ日に開始され、続いて１日１回の注射を更に３日間、合計４回の注射を行った。動物を、５個の用量レベル（０．５、０．２、０．１、０．０２及び０．００４ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置した。結果を図８に示す。
【０１８０】
投薬を埋入の日に開始して、連続３日以上継続した場合、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）は、Ｗｉｎｎモデルの文脈でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＳＣ埋入されたＭＯＬＭ１３  ＡＭＬ及びＲＳ４‐１１  ＡＬＬ腫瘍の両方の成長を効果的に阻害した。国立癌研究所によって確立された基準に基づいて、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベル（ＴＧＩ＞５８）のＤＡＲＴ‐Ａは、ＲＳ４‐１１モデルにおいて活性であると考えられ、０．００４ｍｇ／ｋｇ以上のＤＡＲＴ‐Ａ用量はＭＯＬＭ１３モデルにおいて活性であった。ＭＯＬＭ１３モデルの腫瘍成長の阻害に関連する、ＲＳ４‐１１モデルと比較してより低いＤＡＲＴ‐Ａ用量は、ＭＯＬＭ１３細胞がＲＳ４‐１１細胞よりも高いレベルのＣＤ１２３発現を有すること（これはＭＯＬＭ１３細胞におけるインビトロのＤＡＲＴ‐Ａ媒介性細胞毒性に対する感受性の上昇と相関する）を示すインビトロデータと矛盾しない。
【０１８１】
この例を複製する必要がある場合、当業者は合理的かつ許容可能な範囲内で、上述のプロトコルを、上述の結果を複製するために適切な様式で変化させることができることが理解されるであろう。従って、例示したプロトコルに対して、正確に厳密な様式で固執することは意図されていない。
【０１８２】
実施例７  ＡＭＬ患者１からの初代組織サンプル中の白血病芽細胞及び幹細胞におけるＣＤ１２３表面発現
ＡＭＬ患者１初代サンプルにおけるＣＤ１２３発現パターンを定義するために、低温保存された初代ＡＭＬ患者骨髄及びＰＢＭＣサンプルを、白血病芽細胞におけるＣＤ１２３表面発現に関して評価した。
【０１８３】
ＡＭＬ骨髄サンプル‐臨床報告
年齢：４２
性別：女性
ＡＭＬのサブタイプ：Ｍ２
形態に基づく癌細胞の百分率：６７．５％
骨髄免疫表現型検査：
ＣＤ１５＝１９％、ＣＤ３３＝９８．５％、ＣＤ３８＝２８．８％、ＣＤ４５＝８１．８％、ＣＤ６４＝３９．７％、ＣＤ１１７＝４２．９％、ＨＬＡ‐ＤＲ＝１７％、ＣＤ２＝１．８％、ＣＤ５＝０．５３％、ＣＤ７＝０．２％、ＣＤ１０＝０．４１％、ＣＤ１９＝１．１％、ＣＤ２０＝１．４％、ＣＤ２２＝０．７１％、ＣＤ３４＝０．８２％
【０１８４】
骨髄単核球（ＢＭ  ＭＮＣ）中の白血病芽細胞におけるＣＤ１２３発現
ＡＭＬ患者１からの合計０．５×１０6個の骨髄単核球（ＢＭ  ＭＮＣ）及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ１２３発現に関して評価した。Ｋａｓｕｍｉ‐３細胞株を対照として含めた。白血病芽細胞を、骨髄マーカＣＤ３３を用いて識別した。図９パネルＡに示すように、患者１からのＡＭＬ骨髄からの細胞の８７％がＣＤ１２３及びＣＤ３３を発現した。ＣＤ１２３発現レベルは、ＣＤ１２３高発現Ｋａｓｕｍｉ‐３  ＡＭＬ細胞株よりも僅かに低かった（図９パネルＢ）。
【０１８５】
実施例８  ＡＭＬ患者初代試験片を使用した自己ＣＴＬ殺滅アッセイ
ＡＭＬ患者１からの低温保存された初代ＡＭＬ試験片（骨髄単核球（ＢＭＮＣ）及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ））を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０中で解凍し、５％ＣＯ2中で３７℃において一晩回復させた。細胞をアッセイ媒体（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で洗浄し、トリパンブルー染料排除によって生存細胞数を決定した。１５０μＬのアッセイ媒体中の１５０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルＵ字型底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）を０．１ｎｇ／ｍＬ及び０．０１ｎｇ／ｍＬまで希釈し、各希釈物５０μ＋を各ウェルに添加した（最終体積＝２００μＬ）。対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を０．１ｎｇ／ｍＬまで希釈し、各希釈物５０μＬを各ウェルに添加した（最終体積＝２００μＬ）。別個のアッセイプレートを各時点（４８、７２、１２０及び１４４時間）に関して構築し、プレートを５％ＣＯ2インキュベータ中において３７℃でインキュベートした。各時点において、細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ３３及びＣＤ１２３抗体で染色した。標識された細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ取得ソフトウェア、バージョン５．２．１（BD Biosciences）を備えるＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析した。Ｆｌｏｗｊｏ  ｖ９．３．３ソフトウェア（Treestar, Inc）を用いてデータ分析を実施した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に対するゲーティングによってＴ細胞膨張を測定し、ゲーティングされたＣＤ４＋及びＣＤ８＋集合に関してＣＤ２５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって活性化を決定した。白血病芽細胞集団を、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ゲーティングによって識別した。
【０１８６】
ＡＭＬ患者１からの初代試験片における配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）による自己腫瘍細胞枯渇、Ｔ細胞膨張及び活性化
ＡＭＬ患者１における配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）媒介性活性を決定するために、患者のサンプルを、０．１ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａを用いてインキュベートし、この処置後の異なる時点において、白血病芽細胞及びＴ細胞の百分率を測定した。白血病芽細胞は、ＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ゲーティングによって識別した。ＤＡＲＴ‐Ａを用いた初代ＡＭＬ骨髄サンプルのインキュベーションは、白血病細胞集団の経時的枯渇をもたらし（図１０パネルＡ）、これは残留Ｔ細胞の同時膨張（図１０パネルＢ）及びＴ細胞活性化マーカの誘導（図１０パネルＣ）を伴った。ＤＡＲＴ‐Ａ処置済みサンプルにおいて、Ｔ細胞は１２０時間までに約７％から約８０％まで膨張した。ＣＤ４及びＣＤ８細胞上でのＣＤ２５の発現によって測定されるＴ細胞活性化は７２時間においてピークに達し、１２０時間の時点までに低下した。
【０１８７】
この例を複製する必要がある場合、当業者は合理的かつ許容可能な範囲内で、上述のプロトコルを、上述の結果を複製するために適切な様式で変化させることができることが理解されるであろう。従って、例示したプロトコルに対して、正確に厳密な様式で固執することは意図されていない。
【０１８８】
実施例９  ＡＬＬ患者からの初代組織サンプル中の白血病芽細胞及び幹細胞上におけるＣＤ１２３表面発現
ＡＬＬ患者初代サンプル中のＣＤ１２３発現パターンを定義するために、低温保存された初代ＡＬＬ患者ＰＢＭＣサンプルを、白血病芽細胞上のＣＤ１２３表面発現に関して評価した。
【０１８９】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中の白血病芽細胞におけるＣＤ１２３発現
健康な供与体及びＡＬＬ患者からの合計０．５×１０6個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ１２３発現に関して評価した。図１１パネルＥ〜Ｈに示すように、ＡＬＬ骨髄からの細胞の大半はＣＤ１２３を発現した。対照的に、正常な供与体において予想されたように、Ｂ細胞はＣＤ１２３ネガティブであり、ｐＤＣ及び単球はＣＤ１２３ポジティブであった（図１１パネルＤ）。
【０１９０】
細胞をＣＤ４及びＣＤ８に関して染色することによって、Ｔ細胞集団をＡＬＬ患者サンプル中で識別した。図１２パネルＢに示すように、ＡＬＬ患者サンプル中の全ＰＢＭＣのごく一部のみがＴ細胞である（約０．５％がＣＤ４Ｔ細胞であり、約０．４％がＣＤ８Ｔ細胞である）。
【０１９１】
実施例１０  ＡＬＬ患者初代試験片を用いた自己ＣＴＬ殺滅アッセイ
低温保存された初代ＡＬＬ試験片（末梢血単核球（ＰＢＭＣ））を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０中で解凍し、５％ＣＯ2中で３７℃において一晩回復させた。細胞をアッセイ媒体（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で洗浄し、トリパンブルー染料排除によって生存細胞数を決定した。１５０μＬのアッセイ媒体中の１５０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルＵ字型底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）を１０ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬまで希釈し、各希釈物５０μＬを各ウェルに添加した（最終体積＝２００μＬ）。別個のアッセイプレートを各時点（４８、７２、１２０及び１４４時間）に関して構築し、プレートを５％ＣＯ2インキュベータ中において３７℃でインキュベートした。各時点において、細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ３３及びＣＤ１２３抗体で染色した。標識された細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ取得ソフトウェア、バージョン５．２．１（BD Biosciences）を備えるＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析した。Ｆｌｏｗｊｏ  ｖ９．３．３ソフトウェア（Treestar, Inc）を用いてデータ分析を実施した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に対するゲーティングによってＴ細胞膨張を測定し、ゲーティングされたＣＤ４+及びＣＤ８+集合に関してＣＤ２５  ＭＦＩを測定することによって活性化を決定した。白血病芽細胞集団を、ＣＤ４５+ＣＤ３３+ゲーティングによって識別した。
【０１９２】
ＡＬＬ患者からの初代試験片における配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）による自己腫瘍細胞枯渇、Ｔ細胞膨張及び活性化
ＡＬＬ患者初代サンプルにおける配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）媒介性活性を決定するために、患者のサンプルを、１ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａを用いてインキュベートし、この処置後の異なる時点において、白血病芽細胞及びＴ細胞の百分率を測定した。白血病芽細胞は、ＣＤ４５+／ＣＤ３３+ゲーティングによって識別した。ＤＡＲＴ‐Ａを用いた初代ＡＬＬ骨髄サンプルのインキュベーションは、処置されていない対照又は対照ＤＡＲＴに比べて、白血病細胞集団の経時的枯渇をもたらした（図１３パネルＦ及びＧに対する図１３パネルＨ）。Ｔ細胞を計数し（ＣＤ８及びＣＤ４染色）、活性化（ＣＤ２５染色）を分析したとき、処置されていない又は対照ＤＡＲＴ試料（それぞれ図１４パネルＨ、Ｇ、Ｋ、Ｊ）に比べて、ＤＡＲＴ‐Ａサンプル中において（それぞれ図１４パネルＩ及びＬ）Ｔ細胞は膨張しており、活性化されていた。
【０１９３】
実施例１１  ＡＭＬ患者２からの初代組織サンプル中の白血病芽細胞及び幹細胞上におけるＣＤ１２３表面発現
ＡＭＬ患者２初代サンプル中のＣＤ１２３発現パターンを定義するために、低温保存された初代ＡＭＬ患者ＰＢＭＣサンプルを、白血病芽細胞上のＣＤ１２３表面発現に関して評価した。
【０１９４】
骨髄単核球（ＢＭＮＣ）中の白血病芽細胞におけるＣＤ１２３発現
ＡＭＬ患者２からの合計０．５×１０6個の骨髄単核球（ＢＭ  ＭＮＣ）及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、白血病芽細胞識別に関して評価した。白血病芽細胞を、骨髄マーカＣＤ３３及びＣＤ４５を用いて識別した。図１５パネルＢに示すように、ＡＭＬ骨髄からの細胞の９４％は白血病芽細胞である。Ｔ細胞集団を、ＣＤ３発現によって識別した。図１５パネルＣに示すように、ＡＭＬ骨髄及びＰＢＭＣサンプルからの細胞の約１５％はＴ細胞である。
【０１９５】
実施例１２  ＡＭＬ患者２初代試験片を用いた自己ＣＴＬ殺滅アッセイ
ＡＭＬ患者２からの低温保存された初代ＡＭＬ試験片（骨髄単核球（ＢＭ  ＭＮＣ）及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ））を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０中で解凍し、５％ＣＯ2中で３７℃において一晩回復させた。細胞をアッセイ媒体（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で洗浄し、トリパンブルー染料排除によって生存細胞数を決定した。１５０μＬのアッセイ媒体中の１５０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルＵ字型底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）及び対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を０．１ｎｇ／ｍＬ及び０．０１ｎｇ／ｍＬまで希釈し、各希釈物５０μＬを各ウェルに添加した（最終体積＝２００μＬ）。別個のアッセイプレートを各時点（４８、７２、１２０及び１４４時間）に関して構築し、プレートを５％ＣＯ2インキュベータ中において３７℃でインキュベートした。各時点において、細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ３３及びＣＤ１２３抗体で染色した。標識された細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ取得ソフトウェア、バージョン５．２．１（BD Biosciences）を備えるＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析した。Ｆｌｏｗｊｏ  ｖ９．３．３ソフトウェア（Treestar, Inc）を用いてデータ分析を実施した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に対するゲーティングによってＴ細胞膨張を測定し、ゲーティングされたＣＤ４＋及びＣＤ８＋集合に関してＣＤ２５  ＭＦＩを測定することによって活性化を決定した。白血病芽細胞集団を、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ゲーティングによって識別した。
【０１９６】
ＡＭＬ患者２からの初代試験片における自己腫瘍細胞枯渇、Ｔ細胞膨張及び活性化
ＡＭＬ患者２初代サンプルにおける配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）媒介性活性を決定するために、患者のサンプルを、０．１又は０．０１ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａを用いてインキュベートし、この処置後の異なる時点において、白血病芽細胞及びＴ細胞の百分率を測定した。ＤＡＲＴ‐Ａを用いた初代ＡＭＬ骨髄サンプルのインキュベーションは、白血病細胞集団の経時的枯渇をもたらし（図１６パネルＡ）、これは残留Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８の両方）の同時膨張（それぞれ図１６パネルＢ及び図１６パネルＣ）を伴った。Ｔ細胞が活性化されたかどうかを決定するために、共にＴ細胞活性化のマーカであるＣＤ２５又はＫｉ‐６７に関して細胞を染色した。図１７パネルＡ及びＢに示すように、ＤＡＲＴ‐Ａを用いた初代ＡＭＬ骨髄サンプルのインキュベーションにより、Ｔ細胞の活性化が得られた。これらのデータは１４４時間の時点に対応している。
【０１９７】
グランザイムＢ及びパーフォリンに関する細胞内染色
Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内レベルを決定するために、ＣＴＬアッセイを構築した。約１８時間後、４℃で３０分間インキュベートすることにより、アッセイプレートからの細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色した。表面染色に続いて、細胞を、１００μＬの固定及び易透化緩衝液中において４℃で２０分間インキュベートした。細胞を易透化／洗浄緩衝液で洗浄し、１×易透化／洗浄緩衝液中で調製したグランザイムＢ及びパーフォリン抗体混合物５０μＬ中において、４℃で３０分間インキュベートした。続いて細胞を、２５０μＬの易透化／洗浄緩衝液で洗浄して、ＦＡＣＳ取得のために易透化／洗浄緩衝液中に再懸濁した。
【０１９８】
再指向殺滅中のＴ細胞における、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）によるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現増加
Ｔ細胞による配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）媒介性細胞毒性に関する可能性のある機序を調査するために、再指向殺滅後のＴ細胞において、細胞内グランザイムＢ及びパーフォリンレベルを測定した。対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を用いてＴ細胞をインキュベートした場合、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現増加は発生しなかった。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）を用いて、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞の両方におけるグランザイムＢ及びパーフォリンレベルの発現増加が観察された（図１７パネルＣ及びＤ）。興味深いことに、発現増加はＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ４Ｔ細胞に比べて略２倍高かった（図１７パネルＣ及び図１７パネルＤ）。これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ媒介性標的細胞殺滅が、グランザイムＢ及びパーフォリン経路を通して媒介されることを示している。
【０１９９】
実施例１３  配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの、非ヒト初代ＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質との交差反応
配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）とヒト又はカニクイザルＣＤ３との間の結合の程度を定量化するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を実施した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、解離オフレートｋｄを測定する。抗体とその標的との間の結合アフィニティ（ＫＤ）は、式：ＫＤ＝［ｋｄ］／［ｋａ］に従った、会合に関する動力学定数（オンレート、ｋa）及び解離（オフレート、ｋｄ）の関数である。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、表面プラズモン共鳴を使用して、これらの動力学的パラメータを直接測定する。組み換えヒト又はカニクイザルＣＤ３を支持体に直接固定した。精製されたヒト又はカニクイザルＣＤ１２３を捕捉して支持体に固定した。解離の期間を測定し、データの２価フィットを実施した。結合定数及びアフィニティを、１：１結合フィットを用いて得た。ヒト対カニクイザルＣＤ１２３及びＣＤ３タンパク質への結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析の結果を、図１８に示す。カニクイザルＣＤ１２３（図１８Ｄ）及びＣＤ３（図１８Ｂ）タンパク質への結合アフィニティは、ヒトＣＤ１２３（図１８Ｃ）及びＣＤ３（図１８Ａ）タンパク質に関する結合アフィニティに匹敵する。
【０２００】
実施例１４  ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣを用いたインビトロでの自己単球枯渇
ヒト又はカニクイザル全血サンプルからのＰＢＭＣを、アッセイ媒体１５０μＬ中に２００，０００細胞／ウェルの細胞密度で、Ｕ字型底プレートに添加した。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ又はＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ）の希釈物を、アッセイ媒体中で調製した。ＤＡＲＴ‐Ａ又はＤＡＲＴ‐Ａ  ｗ／ＡＢＤ希釈物それぞれ５０μＬを、複製ウェル中にＰＢＭＣを含有するプレートに添加した。プレートを３７℃で〜１８〜２４時間に亘ってインキュベートした。上清液を用いて、上述のように細胞毒性を決定した。図１９（パネルＡ及びＢ）に示すように、ｐＤＣ細胞の枯渇を、ヒトＰＢＭＣ（図１９パネルＡ）及びカニクイザルＰＢＭＣ（図１９パネルＢ）において観察した。これらの結果は、循環ｐＤＣを、カニクイザルにおける前臨床毒性研究に関する薬物動態マーカとして使用できることを示している。
【０２０１】
この例を複製する必要がある場合、当業者は合理的かつ許容可能な範囲内で、上述のプロトコルを、上述の結果を複製するために適切な様式で変化させることができることが理解されるであろう。従って、例示したプロトコルに対して、正確に厳密な様式で固執することは意図されていない。
【０２０２】
実施例１５  配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）で処置されたカニクイザルにおける形質細胞様樹状細胞の枯渇
用量範囲を見出すための毒性研究の一部として、カニクイザルに、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）を、０．１、１、１０、３０、１００、３００又は１０００ｎｇ／ｋｇの用量での４日間の点滴として投与した。対照ＤＡＲＴを１００ｎｇ／ｋｇで投与した。カニクイザルＰＢＭＣ中のｐＤｃ及び単球集団を識別するために、細胞をＣＤ１４‐ＦＩＴＣ抗体で標識した。単球はＣＤ１４+集団として識別され、ｐＤＣはＣＤ１４‐ＣＤ１２３+集団として識別された。図２０パネルＫ及びＬに示すようにｐＤＣは、僅か１０ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを用いた４日間の点滴後すぐに枯渇した。対照二重特異性ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）で処置されたサル、又はビヒクル＋キャリアで処置されたサルにおいては、４日目の時点でｐＤＣの枯渇は見られなかった（それぞれ図２０パネルＧ、Ｈ、Ｃ及びＤ）。インターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ６、ＩＬ５、ＩＬ４及びＩＬ２のサイトカインレベルを、点滴後４時間の時点で決定した。ＤＡＲＴ‐Ａで処置された動物においては、対照ＤＡＲＴ又はビヒクルで処置された動物と比べて、サイトカインレベルの上昇は殆ど又は全く見られなかった。
【０２０３】
図２１及び図２２は、Ｂ細胞（ＣＤ２０+）（図２１パネルＡ）、単球（ＣＤ１４+）（図２１パネルＢ）、ＮＫ細胞（ＣＤ１５９+ＣＤ１６+）（図２１パネルＣ）、ｐＤＣ（ＣＤ１２３HI、ＣＤ１４-）（図２１パネルＤ）及びＴ細胞（合計、ＣＤ４+及びＣＤ８+）（それぞれ図２２パネルＡ、図２２パネルＢ及び図２２パネルＤ）に関するＦＡＣＳ分析の結果を提供する。
【０２０４】
対照ＤＡＲＴを用いたサルの処置は、Ｔ又はＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球及びｐＤＣに対して知覚可能な影響を有しなかった。１０ｎｇ／ｋｇ／日以上の用量のＤＡＲＴ‐Ａを用いたサルの処置は、ｐＤＣの抑止をもたらした（図２１パネルＤ）。ｐＤＣの枯渇は完全かつ永続的であり、投薬完了後数週間で投薬前レベルに戻った。Ｔリンパ球の循環レベルはＤＡＲＴ‐Ａ投与後すぐに低下するが、１週間単位の各サイクルの終わりまでに投薬前レベルに戻り、これは真の枯渇ではなく輸送の変化を示唆している。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球はいずれも同一のパターンに従った。Ｔリンパ球活性化マーカＣＤ６９（図２２パネルＣＤ）は循環細胞中のごく一部のみについてポジティブであり、ＤＡＲＴ‐Ａ投薬とは関連しなかった。Ｂリンパ球、単球及びＮＫ細胞は、ＤＡＲＴ‐Ａ投薬期間全体に亘って変動し、複数のサル間で有意な変化が観察された。Ｂリンパ球及び単球の循環レベルが上昇する傾向が、最も高い用量の両方のサルにおいて観察された。
【０２０５】
要約すると、以上の結果は、配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）の治療効能を実証している。配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）は：ＡＭＬ；ＡＢＬ（ＡＬＬ）；ＣＬＬ；ＭＤＳ；ＰＤＣＬ；マントル細胞白血病；ヘアリー細胞白血病；ＣＬＬのリヒター転化；ＣＭＬ、ＢＬＬ（サブセットがＣＤ１２３＋である）の急性転化（実施例２を参照）；自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー（好塩基球がＣＤ１２３＋である）；喘息等の多数の疾患及び状態の治療のための治療剤として採用できる。
【０２０６】
実施例１６  配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ）及び非配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ｂ）の特性比較
配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの予期しない利点及び属性
以上で議論したように、ＤＡＲＴ‐Ａ及びＤＡＲＴ‐Ｂは同様に設計され、これら両方の構成の第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）、介在リンカーペプチド（リンカー１）、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD123）、リンカー２、Ｅコイルドメイン、及びＣ末端を含む。同様に、これら両方の構成の第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ１２３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD123）、介在リンカーペプチド（リンカー１）、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）、リンカー２、Ｋコイルドメイン、及びＣ末端を含む。
【０２０７】
実施例１において示されているように、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは両方共、ＣＤ３及びＣＤ１２３に同時に結合できることが分かった。更に実施例３並びに図４パネルＣ及びＤにおいて開示されているように、これら２つのＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、高いＣＤ１２３発現を有する標的細胞株におけるＣＤ３エピトープ結合特異性（ＤＡＲＴ‐Ａ対ＤＡＲＴ‐Ｂ）とは無関係に、５０％の最大活性（ＥＣ５０）を達成するために必要なｎｇ／ｍＬ以下の範囲での濃度を用いて、潜在的な再指向殺滅能力を呈した。従って、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの特定の配列の僅かな変化は、生物活性を完全に無効化しない。
【０２０８】
しかしながら、試験された全ての細胞株において、ＤＡＲＴ‐Ａは、ＤＡＲＴ‐Ｂよりも活性が高く、再指向殺滅に関してより強力であることが分かった（例えば図４パネルＡ、Ｃ及びＤを参照）。よってＤＡＲＴ‐Ａは、同様のＤＡＲＴ‐Ｂに対して予期しない利点を呈した。
【０２０９】
実施例１７  血液悪性腫瘍の治療のための、ＤＡＲＴ‐Ａの非ヒト霊長類の薬理学
インターロイキン３（ＩＬ‐３）受容体α鎖、ＣＤ１２３は、広範な血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現し（Munoz, L. et al.(2001)“Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261‐1269; Testa, U. et al.(2014)“CD123 Is A Membrane Biomarker And A Therapeutic Target In Hematologic Malignancies,” Biomark. Res. 2:4）、これは良好でない予後に関連する（Vergez, F. et al. (2011) “High Levels Of CD34+CD38low/‐CD123+ Blasts Are Predictive Of An Adverse Outcome In Acute Myeloid Leukemia: A Groupe Ouest‐Est Des Leucemies Aigues Et Maladies Du Sang (GOELAMS) Study,” Haematologica 96:1792‐1798）。更に、ＣＤ１２３は、白血病幹細胞（ＬＳＣ）によって発現されることが報告されており（Jordan, C.T. et al.(2000)“The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777‐1784; Jin, L. et al. (2009) “Monoclonal Antibody‐Mediated Targeting Of CD123, IL‐3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31‐42）、これは、このような疾患の根本的な原因を標的とすることができる魅力的な特徴である。この結論に矛盾せず、ＣＤ１２３はまた、ＩＬ‐３自己分泌ループの一翼を担い、上記ＩＬ‐３自己分泌ループは、ＣＤ１２３ブロッキングモノクローナル抗体の、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のマウスモデルにおいて白血病幹細胞の生着を減少させて生存率を改善する能力によって示されるように、白血病誘発に耐える（Jin, L. et al. (2009) “Monoclonal Antibody‐Mediated Targeting Of CD123, IL‐3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31‐42）。しかしながら、ハイリスクＡＭＬ患者の段階１の研究では、モノクローナル抗体は抗白血病活性を呈しなかった（Roberts, A. W. et al. (2010) “A Phase I Study Of Anti‐CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28(Suppl):e13012）。よって、枯渇戦略を含む代替的なＣＤ１２３標的化アプローチが必要とされている。ＣＤ１２３は、正常な造血前駆細胞（ＨＰＣ）のサブセットによって発現されるが、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ１２３を殆ど又は全く発現せず（Jordan, C.T. et al.(2000)“The Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777‐1784; Jin, W. et al.(2009) “Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603‐6610）、これは、ＣＤ１２３細胞枯渇戦略が、正常な造血による再構成を可能とすることを示している。
【０２１０】
患者自身のＴリンパ球が白血病細胞を標的とすることができるようにすることは、血液悪性腫瘍の治療のための有望な免疫治療戦略の典型となる。このアプローチの治療可能性は、Ｂ細胞リンパ腫及びＢ前駆細胞急性リンパ性白血病を有する患者においてブリナツモマブ（ＣＤ３及びＢ細胞ＣＤ１９抗原に結合する能力を有する二重特異性抗体ベースＢｉＴＥ）を用いて試みられている（Klinger, M. et al.(2012)“Immunopharmacologic Response Of Patients With B‐Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell‐Engaging CD19/CD3‐Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab,” Blood 119:6226‐6233; Topp, M.S. et al.(2012)“Long‐Term Follow‐Up Of Hematologic Relapse‐Free Survival In A Phase 2 Study Of Blinatumomab In Patients With MRD In B‐Lineage ALL,” Blood 120:5185‐5187; Topp, M.S. et al.(2011)“Targeted Therapy With The T‐Cell‐Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy‐Refractory Minimal Residual Disease In B‐Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia‐Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493‐2498）。
【０２１１】
ＤＡＲＴ‐Ａ等の本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ分子は、改善された安定性、及びより堅牢な製造特性を提供する、代替的な二重特異性の抗体ベースのモダリティを備える（Johnson, S. et al.(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv‐Based Dual‐Affinity Re‐Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B‐Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436‐449; Moore, P.A. et al.(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T‐Cell Killing Of B‐Cell Lymphoma,” Blood 117:4542‐4551）。
【０２１２】
本発明のＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ分子の優位性及び有効性を実証するために、白血病のインビトロ前臨床モデルにおける上述のＤＡＲＴ‐Ａの生物活性を確認し、白血病の前臨床モデルを確認し、カニクイザル（Macaca Fascicularis）におけるその薬物動態、薬力学及び安全な薬理学を、（ＣＤ３及びフルオレセインに関して二重特異性である）上述の対照ＤＡＲＴ又はＣＤ１２３及びフルオレセインに関して二重特異性である「対照ＤＡＲＴ‐２」に関して評価した。
【０２１３】
「対照ＤＡＲＴ‐２」の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（ＣＤ１２３ＶＬ‐リンカー‐４‐４２２０ＶＨ‐リンカー‐Ｅコイル；リンカーに下線を施す）（配列番号５８）：
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY
PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG GEVKLDETGG GLVQPGRPMK LSCVASGFTF
SDYWMNWVRQ SPEKGLEWVA QIRNKPYNYE TYYSDSVKGR FTISRDDSKS
SVYLQMNNLR VEDMGIYYCT GSYYGMDYWG QGTSVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
【０２１４】
「対照ＤＡＲＴ‐２」の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（４４２０ＶＬ‐リンカー‐ＣＤ１２３ＶＨ‐リンカー‐Ｋコイル）（配列番号５９）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT
DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
【０２１５】
２機能性ＥＬＩＳＡ
重炭酸塩緩衝液中の可溶性ヒト又はカニクイザルＩＬ３Ｒ‐α（０．５μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングされたＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、室温で３０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ；０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）を用いてブロックした。ＤＡＲＴ‐Ａ分子を塗布し、続いてヒトＣＤ３εδ‐ビオチン及びストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を順次添加した。基材としてのテトラメチルベンジジン（ＢｉｏＦＸ）の５分間の変換によってＨＲＰ活性を検出し、４０μＬ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4によって反応を停止させ、４５０ｎｍにおいて吸光度を読み取った。
【０２１６】
表面プラズモン共鳴分析
ＤＡＲＴ‐Ａの、ヒト及びカニクイザルＣＤ３又はＣＤ１２３タンパク質に結合する能力を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００バイオセンサ（GE、Hralthcare）を用いて、Johnson, S. et al.(2010)(“Effector Cell Recruitment With Novel Fv‐Based Dual‐Affinity Re‐Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B‐Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436‐449)及びMoore, P.A. et al.(2011)(“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T‐Cell Killing Of B‐Cell Lymphoma,” Blood 117:4542‐4551)に記載されているように分析した。要約すると、ＣＭ５センサチップ上のカルボキシル基は、０．２ＭのＮ‐エチル‐Ｎ‐（３ジエチルアミノ‐プロピル）カルボジイミド、及び０．０５ＭのＮ‐ヒドロキシ‐スクシンイミドによって活性化された。可溶性ＣＤ３又はＣＤ１２３（１μｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０、流量５μＬ／分）中で、活性化されたＣＭ５表面全体に亘って注射し、続いて不活性化のために１Ｍエタノールアミンを注射した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％  Ｐ２０界面活性剤中で結合実験を実施した。固定化された受容体表面の再生成を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５のパルス注射によって実施した。ＫＤ値は、ラングミュア１：１結合モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ４．１）に対する結合曲線のグローバルフィットによって決定した。
【０２１７】
細胞殺滅アッセイ
細胞殺滅アッセイのために使用される細胞株を、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（ヴァージニア州マナサス）から得た。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓキット（GE Healthcare）を用いて健康な供与体の血液から単離し、Ｔ細胞を、ネガティブ選択キット（Life Technologies）を用いて精製した。ＣＤ１２３細胞表面密度を、Quantum Simply Cellular beads（Bangs Laboratories,Inc.,インディアナ州フィッシャーズ）を用いて決定した。細胞毒性アッセイを、Moore, P.A. et al. (2011) (“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T‐Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542‐4551)に記載されているように実施した。要約すると、標的細胞株（１０5細胞／ｍＬ）を、示されているエフェクタ細胞：標的細胞比での、Ｔ細胞の存在下でのＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴタンパク質の連続希釈によって処置し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞殺滅を、培養物上清液中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出として決定した。フローベースの殺滅のために、標的細胞をＣＭＴＭＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、細胞殺滅を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータを用いて監視した。データは、ＰＲＩＳＭ（登録商標）５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して分析し、％細胞毒性として提示した。
【０２１８】
カニクイザルの薬理学
非ヒト霊長類の実験を、Charles River Laboratories（ネバダ州レノ）において、その地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って実施した。バッテリ駆動プログラマブル点滴ポンプ（ＣＡＤＤ‐Ｌｅｇａｃｙ（登録商標）、ＳＩＭＳ  Ｄｅｌｔｅｃ，  Ｉｎｃ．，ミネソタ州セントポール）を用いた、大腿及び頸静脈ポートを通した静脈内点滴により、研究用に繁殖させた中国産のナイーブなカニクイザル（Macaca fascicularis）（年齢２．５〜９歳、体重２．７〜５ｋｇ）にビヒクル又はＤＡＲＴ‐Ａを供給した。示されている時点において、末梢血又は骨髄サンプルを抗凝固剤含有チューブに回収した。４８８ｎｍ、６４０ｎｍ及び４０５ｎｍレーザ並びに以下の抗体：ＣＤ４‐Ｖ４５０、ＣＤ８‐Ｖ４５０、ＣＤ１２３‐ＰＥ‐Ｃｙ７、ＣＤ４５‐ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４‐ＡＰＣ‐Ｈ７、ＣＤ８‐ＦＩＴＣ、ＣＤ２５‐ＰＥ‐Ｃｙ７、ＣＤ６９‐ＰｅｒＣＰ、ＰＤ‐１‐ＰＥ、ＴＩＭ３‐ＡＰＣ、ＣＤ３‐ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ＣＤ９５‐ＡＰＣ、ＣＤ２８‐ＢＶ４２１、ＣＤ１６‐ＦＩＴＣ、ＣＤ３‐Ａｌｅｘａ４８８、ＣＤ３８‐ＰＥ、ＣＤ１２３‐ＰＥ‐Ｃｙ７、ＣＤ１１７‐ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５、ＣＤ３４‐ＡＰＣ、ＣＤ９０‐ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＡ‐ＡＰＣ‐Ｈ７及びＣＤ３３‐ＡＰＣ（BD Biosciences）を備えたＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａアナライザ（BD Biosciences）を用いて、細胞表面表現型分析を実施した。ＴｒｕＣＯＵＮＴ（BD Biosciences）を用いて細胞の絶対数を決定した。非ヒト霊長類Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビードアレイキット（BD Biosciences）を用いて、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐γサイトカインの血清レベルを測定した。電気化学発光検出によるサンドイッチイムノアッセイ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＭＳＤ、メリーランド州ロックヴィル）を用いて、サル血清サンプル中のＤＡＲＴ‐Ａの濃度を測定した。要約すると、アッセイプレート（ＭＳＤ）は、組み換えヒトＩＬ‐３Ｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）でコーティングし、５％ＢＳＡでブロックした。較正標準又は希釈試験サンプルを適用し、続いて、本分子の上述のＥコイル（配列番号３４）及びＫコイル（配列番号３５）ドメインに対する特異的結合を呈するビオチン化モノクローナル抗体を添加した。ＳＵＬＦＯ‐ＴＡＧ（商標）標識ストレプトアビジンコンジュゲート（ＭＳＤ）を添加し、錯体の構成をＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）イメージャで分析した。５パラメータロジスティックモデルに光強度データをフィッティングすることによって生成された標準曲線から、ＤＡＲＴ‐Ａ濃度を決定した。
【０２１９】
精製されたＤＡＲＴ‐Ａの生理化学的特性決定は、分子質量５８．９ｋＤａの均質なヘテロ二量体を示し（図２３、図２４Ａ〜２４Ｂ）、これはＰＢＳ中において２〜８℃で最長１２ヶ月間安定であった。ＳＰＲ分析は、対応する可溶性ヒト及びカニクイザルＣＤ３及びＣＤ１２３抗原に対する、ＤＡＲＴ‐Ａの略同一の結合アフィニティを示した（図２５Ａ〜２５Ｄ及び表７）。更に、ＤＡＲＴ‐Ａは、捕捉のためにヒト又はサルＣＤ１２３、検出のためにヒトＣＤ３を採用したＥＬＩＳＡフォーマットにおいて両方の抗原に同時に結合し（図２６Ａ〜２６Ｂ）、ヒト及びサルＴリンパ球への同様の結合を示した（図２６Ｃ〜２６Ｅ）。表７のデータは、それぞれ二重に実施された３回の独立した実験の平均である。
【０２２０】
【表７】
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【０２２１】
ＤＡＲＴ‐Ａはヒト又はカニクイザルＴリンパ球による再指向殺滅を媒介する
ＤＡＲＴ‐Ａは、ヒト又はサルエフェクタ細胞による、ＣＤ１２３＋Ｋａｓｕｍｉ‐３白血病細胞株に対する再指向標的細胞殺滅を媒介し（図２７Ａ〜２７Ｄ）、これは活性化マーカの誘発を伴った。ＣＤ１２３‐ネガティブ標的（Ｕ９３７細胞）に対しては、又は対照ＤＡＲＴを用いると、活性は観察されず、これはＴ細胞活性化が厳密に標的細胞エンゲージメントによるものであること、及びＤＡＲＴ‐ＡによるＣＤ３の１価エンゲージメントはＴ細胞活性化をトリガするには不十分であることを示している。ＣＤ１２３は、ｐＤＣ及び単球を含む正常な循環白血球のサブセットによって発現されるため（図２７Ｅ）、正常なヒト及びサルのＰＢＭＣにおいてＤＡＲＴ‐Ａの効果を更に調査した。
【０２２２】
ヒトＰＢＭＣにおいて段階的な効果が観察され、処置開始後僅か３時間で、ＣＤ１４‐ＣＤ１２３high細胞の用量依存性の迅速な枯渇が観察され、一方で単球（ＣＤ１４＋細胞）はこの時点では影響を受けないままであった（図２７Ｆ〜２７Ｇ）。ＣＤ１４‐ＣＤ１２３high細胞の枯渇は、全てのＤＡＲＴ‐Ａ分子濃度に亘って経時的に増大したが、単球は６時間の時点までに僅かしか減少せず、濃度１ｎｇ／ｍＬ超において１８時間後にやっと枯渇した。ＤＡＲＴ‐ＡによるサルＰＢＭＣのインキュベーションは、ＣＤ１４‐ＣＤ１２３high細胞の相当な用量依存性枯渇をもたらし（図２７Ｈ）、ＤＡＲＴ‐Ａの薬理学に関するこの種の妥当性を更に支持した（ＣＤ１４＋サル細胞はＣＤ１２３を殆ど又は全く発現せず、枯渇しなかった）。
【０２２３】
カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの薬物動態
カニクイザルは、前駆細胞ｍＡｂを用いた免疫組織化学的検査に基づき、公開されている情報（Munoz, L. et al.(2001)“Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261‐1269; Korpelainen, E.I. et al. (1996) “IL‐3 Receptor Expression, Regulation And Function In Cells Of The Vasculature,” Immunol. Cell Biol. 74:1‐7）の通り、この種において２つの標的抗原両方がヒトに比べて均等に分布していることに基づいて、ＤＡＲＴ‐Ａ分析のための適切な薬学的モデルとして選択された。
【０２２４】
本発明により、１グループにつき８体（オス４体、メス４体）のカニクイザルからなる６つの処置グループを含む研究が実施された（表８）。全てのグループは、第１の点滴でビヒクル対照を受容し、続いてビヒクル又はＤＡＲＴ‐Ａが１週間単位のサイクル４回に亘って静脈内投与された。グループ１の動物は、４回の後続の点滴全てに関してビヒクル対照を受容し、グループ２〜５は、後続の点滴全てに関して、１週間毎に段階的に用量が増大するＤＡＲＴ‐Ａを週４日受容した。グループ６の動物は、７日間連続して、かつ全ての点滴に関してＤＡＲＴ‐Ａの用量を毎週段階的に増大させて処置された。４日オン／３日オフスケジュール及び７日オンスケジュールは、ＤＡＲＴ‐Ａの投与に関連する永続的効果と一時的効果とを区別するために設計された。処置段階の終了時（３６日目）に、１グループにつき２体のオス及び２体のメスを殺処分し、残りのサルは４週間の回復後（６５日目）に剖検した。サルのサブセットは、ＣＤ３及びＣＤ１２３の両方のヒト化Ｆｖを指向する抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を発現し、ＡＤＡの出現によって生じるデータポイントをＰＫ分析から排除した。研究期間中、全てのサルをＤＡＲＴ‐Ａに曝露した。
【０２２５】
【表８】
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【０２２６】
２区画モデルを用いてＰＫパラメータを推定した（表９及び図２８）。Ｔ1/2αは短く（４〜５分）、これは循環標的への迅速な結合を反映している。Ｔ１／２βもまた、このサイズの分子に関して予想されるように迅速であり、これは腎クリアランスに従う。グループ６のサルから各点滴の最後に回収された血清サンプルの分析により、ＤＡＲＴ‐Ａ  Ｃmaxの用量依存性増大が示された。表９では、ビヒクルは、０．１ｍｇ／ｍＬの組み換えヒトアルブミン、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ‐８０を含有するｐＨ６．０のＰＢＳであり、点滴を行う各週の最初の４日間は０．２４％ベンジルアルコールを全てのビヒクル点滴に使用し、続いて１週間の点滴それぞれの残りの３日間は、ベンジルアルコールを含まない同一の処方を使用した。ＤＡＲＴ‐Ａは、示している時点において、０．１ｍｇ／ｍＬの組み換えヒトアルブミン、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ‐８０及び０．２４％ベンジルアルコールを含有するｐＨ６．０のＰＢＳの溶液の持続ＩＶ点滴として投与された。
【０２２７】
【表９】
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【０２２８】
ＤＡＲＴ‐Ａ処置カニクイザルにおけるサイトカイン放出
ＤＡＲＴ‐ＡのＴ細胞活性化特性を仮定すると、点滴によって発生する循環サイトカインの増大が予想され、従って同様の化合物を用いた過去の実験に基づき、「脱感作」戦略として、低い開始用量を使用した（例えばTopp, M.S. et al.(2011) “Targeted Therapy With The T‐Cell‐Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy‐Refractory Minimal Residual Disease In B‐Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia‐Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493-2498; Bargou, R. et al.(2008)“Tumor Regression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-Engaging Antibody,” Science 321:974‐977を参照）。試験対象のサイトカインについて、ＩＬ‐６は、最小量の点滴によって、実際には一過性のものではあるが最大の変化を示し、動物個体間及びグループ間の変動が大きかった（図２９Ａ〜２９Ｃ）。また、ビヒクル点滴（グループ１の全ての点滴及び１日目の全ての点滴）後にはＩＬ‐６の小さな一時的増加が観察され、これはこのサイトカインの、操作によるストレスに対する感受性を示している。それにも関わらず、血清ＩＬ‐６のＤＡＲＴ‐Ａ依存性の増加（＜８０ｐｇ／ｍＬ）が、最初のＤＡＲＴ‐Ａ点滴（１００ｎｇ／ｋｇ／日）の後に一部のサルにおいて観察され、これは７２時間後までにベースラインに戻った。興味深いことに、用量レベルを最大１０００ｎｇ／ｋｇ／日まで上昇させた場合でさえ、連続的なＤＡＲＴ‐Ａ点滴それぞれによってＩＬ‐６放出の量は低下した。血清ＴＮＦ‐αの極微で一時的なＤＡＲＴ‐Ａ関連増加（＜１０ｐｇ／ｍＬ）も観察され、ＩＬ‐６と同様に、ＴＮＦ‐α放出の最大量は、最初の点滴の後に観察された。ＩＬ‐５、ＩＬ‐４、ＩＬ‐２又はＩＦＮ‐γのレベルにおいては、研究全体を通して、対照に比べてＤＡＲＴ‐Ａ関連の変化は発生しなかった。結論として、ＤＡＲＴ‐Ａを用いたサルの処置に応答したサイトカイン放出は極微で一時的であり、最初の投薬による効果を被験体内での用量の段階的上昇によって管理できることが示された。
【０２２９】
循環ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３+白血球のインビボでのＤＡＲＴ‐Ａ媒介性枯渇
ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋細胞の循環絶対レベルを、薬力学的エンドポイントとして研究全体を通して測定した。対照グループ１のＣＤ１２３+細胞の数が経時的に安定したままであるのに対して、ＤＡＲＴ‐Ａ処置は、全てのアクティブな処置グループ全体の全ての動物において、最初のＤＡＲＴ‐Ａ点滴（１００ｎｇ／ｋｇ／日）の開始後に測定された最初の時点（７２時間）から観察可能な、循環ＣＤ１４‐／ＣＤ１２３＋細胞の大幅な枯渇（研究前ベースラインから９４〜１００％）に関連した（図３０Ａ〜３０Ｃ）。この枯渇は、グループ２〜５の週３日の投薬を行わない日の間にも持続するため、永続的なものであり、長期の回復期間中にやっとベースラインレベルに戻った。ＤＡＲＴ‐ＡがＣＤ１２３をマスキング又は変調する可能性（これは低い循環ＤＡＲＴ‐Ａレベルの場合には発生しにくい状況である）を排除するために、直交マーカＣＤ３０３によってｐＤＣを計数した。ＣＤ１２３のデータと矛盾することなく、ＣＤ３０３＋ｐＤＣは、ＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置されたサルにおいて同様に枯渇した（図３０Ｄ〜３０Ｆ）。
【０２３０】
循環Ｔリンパ球レベル、活性化及びサブセット分析
循環ＣＤ１２３＋細胞の持続性枯渇とは対照的に、４日オン／３日オフスケジュール（グループ２〜５）で投与されたＤＡＲＴ‐Ａは、循環Ｔ細胞の週単位での変調に関連し、その一方で７日連続の点滴としての投与は同様に、最初の投与に続いて循環Ｔ細胞レベルの低下をもたらし、これは投薬期間中であっても変動することなく徐々に回復した（図３１Ａ〜３１Ｃ）。これら２つの投薬戦略間のこのような違いは、Ｔリンパ球に対するＤＡＲＴ‐Ａの効果が、枯渇ではなく輸送及び／又は辺縁趨向に整合するものであることを示している。投薬の注視後、Ｔ細胞は、回復期間の間にベースラインの約２倍高いレベルまでリバウンドした。ＤＡＲＴ‐Ａの点滴は、特にＣＤ４＋細胞において、Ｔ細胞が後期活性化マーカＰＤ‐１を発現する、曝露量依存性の、漸進的に上昇する頻度に関連しており、投薬グループ６が最も高い全体的なレベルを示した（図３１Ｄ〜３１Ｉ及び図３２Ａ〜３２Ｆ及び図３３Ａ〜３３Ｆ）。Ｔ細胞の消耗に関連するマーカであるＴｉｍ‐３はＣＤ４＋Ｔ細胞では検出されず、ＣＤ８＋細胞では低い頻度（５．５〜９．７％）に留まり、ＣＤ８＋／ＰＤ‐１＋二重陽性細胞の２０．５〜３５．５％を含んでいた。早期Ｔ細胞活性化マーカＣＤ６９については一貫した変化は見られず、循環細胞中のＣＤ２５発現については穏やかな変動しか見られなかった。
【０２３１】
インビボ曝露後の消耗を除外するために、ＤＡＲＴ‐Ａの複数回の点滴を受容したカニクイザルから単離されたエフェクタ細胞のエクスビボ細胞毒性を、ナイーブなサルからの細胞と比較した。図３４に示すように、ＤＡＲＴ‐Ａで処置されたサルから単離されたＰＢＭＣは、ナイーブなサルから単離された細胞と同等の細胞毒性を示し、これは、ＤＡＲＴ‐Ａへのインビボでの曝露が、Ｔ細胞の標的細胞を殺滅する能力にマイナスの影響を与えないことを示している。
【０２３２】
ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露により、対応するナイーブＴ細胞集団を犠牲にして、セントラルメモリＣＤ４細胞及びエフェクタメモリＣＤ８＋細胞の相対頻度が上昇し（図３５Ａ〜３５Ｆ及び図３２Ａ〜３２Ｆ及び図３３Ａ〜３３Ｆ）、これは、ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露がこれらの細胞の膨張及び／又は可動化を促進したことを示している。
【０２３３】
造血及び骨髄前駆細胞に対する効果
ＤＡＲＴ‐Ａは、試験した全ての用量においてサルにおいて十分に許容されたが、最も高い用量においては、赤血球パラメータの可逆的な低下が観察された（図３６Ａ〜３６Ｃ）。ビヒクルで処置された動物は赤血球量の減退が穏やかであったため、頻繁な血液のサンプリングが潜在的な寄与因子であった可能性がある。網状赤血球応答が全ての動物において観察された。しかしながら、曝露量が最高の場合（グループ６）、上記応答は、赤血球量の同様の減少に関して、僅かに堅牢性が低かった（図３６Ｄ〜３６Ｆ）。研究全体を通しての骨髄塗抹標本の形態学的分析は、特筆すべきものではなかった。しかしながら、フローサイトメトリー分析によって、未熟系統ネガティブ（Ｌｉｎ‐）骨髄集団内のＣＤ１２３＋細胞の頻度は、ＤＡＲＴ‐Ａで処置された動物において、投薬期間の終了時に低下しており、回復期間の終了までにベースラインレベルに戻った（図３７Ａ〜３７Ｂ）。（Lin‐/CD34+/CD38‐/CD45RA‐/CD90+細胞(Pang, W.W. et al.(2011) “Human Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells Are Increased In Frequency And Myeloid‐Biased With Age,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108:20012‐20017）として定義される）ＨＳＣは、大きなグループ間変動を示した。グループ４〜６のＤＡＲＴ‐Ａで処置されたサルは、対応する投薬前レベルに比べてある程度明らかな減少を示すが、全ての処置グループにおいて、ビヒクルで処置された動物に比べて減少は見られなかった。これらのデータは、ＨＳＣが、ＤＡＲＴ‐Ａによる標的化を受けにくいことを示しており、また、造血に対するＤＡＲＴ‐Ａ処置の負の影響の観察された可逆性と整合する。
【０２３４】
ここまでで実証されたように、４日オン／３日オフ週間スケジュール、又は開始用量１００ｎｇ／ｋｇ／日を１週間毎に３００、６００及び１０００ｎｇ／ｋｇ／日へと段階的に増大させる７日オンスケジュールでの、４週間に亘る点滴に関して、カニクイザルへのＤＡＲＴ‐Ａの投与は十分に許容できるものであった。全ての用量及びスケジュールにおいて、ｐＤＣを含む循環ＣＤ１２３＋細胞の枯渇は、最初の投与の開始後に観察され、研究全体を通して持続した。骨髄ＣＤ１２３＋前駆体の可逆性の減少も観察された。ＣＤ３標的治療の安全性に関する重大な懸念材料であるサイトカイン放出は、管理可能であり、かつ最初の投薬による効果と適合するようであった。最高用量において穏やかな可逆性の貧血症が認められたが、他のいかなる（オンターゲット又はオフターゲットの）有害事象も認められなかった。
【０２３５】
カニクイザルは、オルソログ間の高い相同性、及びＤＡＲＴ‐Ａ抗原に同様のアフィニティで結合して両方の種におけるＴ細胞の再指向殺滅を媒介する能力により、薬理学的評価のための適切な動物モデルである。更に、両抗原は、サル及びヒトにおいて同様に発現し、これは、造血前駆細胞による、及び複数の組織の内皮の細胞質における同様の発現を含む。僅かな例外としては、ヒト精巣ライディッヒ細胞において発現するもののサルにおいては発現しないこと、及びサルの単球中にはヒトに比べてＣＤ１２３が少ないか又は存在しないことがある。
【０２３６】
Ｔ細胞活性化を伴う治療戦略に関連する主要な懸念材料としては、サイトカインの放出及びオフターゲット細胞毒性効果が挙げられる。２価ＣＤ３認識によるＣＤ３×ＣＤ１２３二重特異性ｓｃＦｖ免疫融合構造を用いた最近の研究は、インビトロでの抗白血病活性を実証しているが、Ｔ細胞及びＩＦＮ‐γ分泌の非特異的活性化を引き起こす（Kuo, S.R. et al.(2012)“Engineering A CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells,” Protein Eng. Des. Sel. 25:561‐569）。各結合アームの１価性及びＤＡＲＴ‐Ａの極めて均質な単量体形態により、Ｔ細胞活性化が、標的細胞エンゲージメントに排他的に依存することが保証され、標的細胞の不在下において、又はＣＤ３標的化アームしか含まない対照ＤＡＲＴ分子を使用した場合、Ｔ細胞活性化は観察されなかった。更に、高用量（最高１００μｇ／ｋｇ／日）の対照ＤＡＲＴ分子は、カニクイザルにおいてサイトカイン放出をトリガしなかった。
【０２３７】
ＤＡＲＴ‐Ａ分子の開始用量１００ｎｇ／ｋｇ／日は十分に許容され、極微なサイトカイン放出をもたらした。しかしながら、高い開始用量（５μｇ／ｋｇ／日）ではサイトカイン急増が発生した。ただしこのような用量は、１週間毎の段階的な用量増加によって安全に達成できたものであり、これはＤＡＲＴ‐Ａ媒介性サイトカイン放出が主に最初の投薬による効果であるらしいことを示している。ＣＤ１２３＋標的細胞の枯渇（これによってＣＤ３連結のソースが排除される）は、上記最初の投薬による効果を説明できる。僅か３〜１０ｎｇ／ｋｇ／日の用量においてＣＤ１２３＋細胞の略完全な枯渇が観察され、これは、インビボでのサイトカイン放出が、細胞毒性に比べて変化が大きい用量応答に従うことを示している。また、細胞毒性及びヒトＴ細胞によるサイトカイン放出の用量応答プロファイルは、この観察に適合した。
【０２３８】
ＤＡＲＴ‐Ａ誘導性ＰＤ１発現増加が作用し得るＴ細胞脱感作もまた、ＤＡＲＴ‐Ａの最初の点滴後のサイトカイン放出の制限に寄与すると思われる。最近の研究により、抗原が誘発する炎症部位におけるＴ細胞の停止後のＰＤ‐１発現の増大は、ＰＤ‐Ｌ１との相互作用によって、停止信号の中断並びにこれに伴う細胞の解放及び脱感作に寄与することが示されている（Honda, T. et al.(2014) “Tuning Of Antigen Sensitivity By T Cell Receptor‐Dependent Negative Feedback Controls T Cell Effector Function In Inflamed Tissues,” Immunity 40:235‐247; Wei, F. et al.(2013)“Strength Of PD‐1 Signaling Differentially Affects T‐Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480‐E2489）。ＴＣＲ信号伝達強度のＰＤ‐１による抑制は不均一である。増殖及びサイトカイン産生はＰＤ‐１の阻害に対して極めて高い感受性を有するようであるが、細胞毒性は最も影響を受けない（Wei, F. et al.(2013)“Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T‐Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480‐E2489）。一貫して、ＤＡＲＴ‐Ａの複数回の点滴に曝露されたサルからのＴ細胞のエクスビボ細胞毒性は、ＰＤ‐１レベルが上昇しているにもかかわらず、ナイーブなサルからのＴ細胞と同等であった。更に、ＰＤ‐１発現増加は、ＣＤ３抗体を用いた長期のシミュレーション又は慢性感染症に曝露されたＴ細胞に関して示されているように、Ｔ細胞消耗の証拠であるＴＩＭ３発現を伴わなかった（Gebel, H.M. et al.(1989)“T Cells From Patients Successfully Treated With OKT3 Do Not React With The T‐Cell Receptor Antibody,” Hum. Immunol. 26:123‐129; Wherry, E.J. (2011) “T Cell Exhaustion,” Nat. Immunol. 12:492‐499）。
【０２３９】
ＤＡＲＴ‐Ａで処置されたサルにおける循環ＣＤ１２３＋細胞の枯渇は迅速であり、４日オン／３日オフスケジュールのうちの投薬を行わない日の間にも持続し、これは標的細胞の除去に適合していた。対照的に、循環Ｔ細胞の一時的な変動は、ＤＡＲＴ‐Ａの機能としての組織及びリンパから／への輸送の結果である可能性が高かった。ＤＡＲＴ‐Ａへの曝露は、抗原発現後のＴリンパ球の膨張及び／又は可動化を促進し、これは優先的に組織へと向かい、より迅速に細胞毒性エフェクタ機能を発揮する（Mirenda, V. et al.(2007)“Physiologic And Aberrant Regulation Of Memory T‐Cell Trafficking By The Costimulatory Molecule CD28,” Blood 109:2968‐2977; Marelli‐Berg, F.M. et al.(2010)“Memory T‐Cell Trafficking: New Directions For Busy Commuters,” Immunology 130:158‐165）。
【０２４０】
ＣＤ１２３＋正常細胞の枯渇は、潜在的な不利をもたらし得る。ｐＤＣ及び好塩基球は、単球及び好酸球における比較的低いレベルと比べて高いレベルのＣＤ１２３を発現する（Lopez, A.F. et al.(1989)“Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte‐Macrophage Colony‐Stimulating Factor To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022‐7026; Munoz, L. et al.(2001)“Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261‐1269; Masten, B.J. et al.(2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung,” J. Immunol. 177:7784‐7793; Korpelainen, E.I. et al.(1995)“Interferon‐Gamma Upregulates Interleukin‐3 (IL‐3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL‐3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production,” Blood 86:176‐182）。ｐＤＣは、マウス又はサル感染症モデルにおいて特定のウイルスを制御する役割を果たすことが分かっているが、インフルエンザへの免疫応答の制御に関しては重要なものではないようである（Colonna, M. et al. (1997) “Specificity And Function Of Immunoglobulin Superfamily NK Cell Inhibitory And Stimulatory Receptors,” Immunol. Rev. 155:127‐133; Smit, J.J. et al. (2006) “Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibit Pulmonary Immunopathology And Promote Clearance Of Respiratory Syncytial Virus,” J. Exp. Med. 203:1153‐1159）。腫瘍モデルでは、ｐＤＣは腫瘍成長及び転移を促進でき、その一方でｐＤＣの枯渇は腫瘍の阻害をもたらす（Sawant, A. et al.(2012)“Depletion Of Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibits Tumor Growth And Prevents Bone Metastasis Of Breast Cancer Cells,” J. Immunol. 189:4258‐4265）。ＤＡＲＴ‐Ａで処置された一部のサルにおいて、一時的で穏やかな、用量非依存性の顔面膨張が観察されたが、これらのサルにおいてヒスタミンレベルの上昇は観察されなかった。又はヒト好塩基球はＤＡＲＴ‐Ａ媒介性Ｔ細胞殺滅によって溶解しなかった。単球の枯渇は感染リスクの上昇をもたらす場合があり、従ってヒトにおけるｐＤＣ、好塩基球又は好酸球枯渇の結果を監視する必要がある。
【０２４１】
骨髄性共通前駆細胞（ＣＭＰ）（Jordan, C.T. et al.(2000)“The Interleukin‐3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777‐1784; Rieger, M.A. et al.(2012)“Hematopoiesis,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4:a008250）等の、ＣＤ１２３を発現する委任造血前駆細胞は、ＤＡＲＴ‐Ａの標的となり得、これにより、最高用量のＤＡＲＴ‐Ａの投与後に観察された穏やかな貧血症を説明できると思われる。赤血球生成網状赤血球応答は、全てのＤＡＲＴ‐Ａ用量レベルにおいて機能していたようであるが、赤血球パラメータの相当な降下に関して、最高のＤＡＲＴ‐Ａ曝露を受けた動物（グループ６、７日オンの点滴）は、網状赤血球応答の低下を示し、これは、前駆細胞（例えばＣＭＰ）に対して発生し得る細胞毒性活性を示唆している。この効果は、ＤＡＲＴ‐Ａによる処置の停止後には可逆性であり、これは、残りの低ＣＤ１２３／ＣＤ１２３ネガティブＨＳＣからの再増殖に適合した。
【０２４２】
ＣＤ１２３＋細胞の枯渇のための代替的なアプローチとしては：第２世代ＣＤ１２３特異性Ｆｃ増強モノクローナル抗体（Jin, L. et al.(2009)“Monoclonal Antibody‐Mediated Targeting Of CD123, IL‐3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31‐42; Roberts, A. W. et al.(2010)“A Phase I Study Of Anti‐CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28(Suppl):e13012）；ＩＬ‐３結合ジフテリア毒素（Frankel, A. et al.(2008)“Phase I Clinical Study Of Diphtheria Toxin‐Interleukin 3 Fusion Protein In Patients With Acute Myeloid Leukemia And Myelodysplasia,” Leuk. Lymphoma 49:543‐553）；ＣＤ１２３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するサイトカイン誘発性キラー（ＣＩＫ）細胞（Tettamanti, S. et al.(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine‐Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123‐Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389‐401）；及びＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Gill, S. et al.(2014)“Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor‐Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343‐2354; Mardiros, A. et al.(2013)“T Cells Expressing CD123‐Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138‐3148）が挙げられる。最近のある研究は、ＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞移入後にヒトＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおける正常な造血の抑制を報告している（Gill, S. et al.(2014)“Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor‐Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343‐2354）が、他にはインビトロ又はインビボで同様の効果は観察されていない（Tettamanti, S. et al.(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123‐Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389‐401; Pizzitola, I. et al.(2014)“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。これまでに議論した実験では、ＣＤ１２３＋骨髄前駆細胞集団の枯渇が観察されたが、これは回復中に逆転された。更に、この少数集団の枯渇は、試験された全てのＤＡＲＴ‐Ａ用量レベルにおいて、骨髄細胞充実性又は赤血球対骨髄細胞（Ｅ：Ｍ）比に変化をもたらさなかった。これらの違いは、細胞治療に対するＤＡＲＴ‐Ａの潜在的な利点を強調するものであるというのは、制御が比較的困難となり得る「過剰供給された（supercharged）」エクスビボ形質導入細胞とは対照的に、自己Ｔ細胞に基づく滴定可能なシステムが提供されるためである。ＣＤ１２３は、ＡＭＬ、有毛細胞白血病、芽球型形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、Ｂ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病のサブセット、ホジキン病リード‐スタンバーグ細胞、並びに骨髄異形成症候群及び全身性肥満細胞症を含む、いくつかの血液悪性腫瘍において過剰発現する（Kharfan‐Dabaja, M.A. et al.(2013)“Diagnostic And Therapeutic Advances In Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm: A Focus On Hematopoietic Cell Transplantation,” Biol. Blood Marrow Transplant. 19:1006‐1012; Florian, S. et al.(2006)“Detection Of Molecular Targets On The Surface Of CD34+/CD38‐‐ Stem Cells In Various Myeloid Malignancies,” Leuk. Lymphoma 47:207‐222; Munoz, L. et al.(2001)“Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261‐1269; Fromm, J.R.(2011)“Flow Cytometric Analysis Of CD123 Is Useful For Immunophenotyping Classical Hodgkin Lymphoma,” Cytometry B Clin. Cytom. 80:91‐99）。非ヒト霊長類において観察された、予想可能な薬力学活性及び管理可能な安全性プロファイルは更に、これらの障害のための免疫治療としてのＤＡＲＴ‐Ａの臨床的有用性及び有効性をサポートする。
【０２４３】
要約すると、ＤＡＲＴ‐Ａは、ＴＣＲのＣＤ３εサブユニットにエンゲージして、いくつかの血液悪性腫瘍において発現増加するＣＤ１２３を発現する細胞に対してＴリンパ球を再指向させる、抗体ベース分子である。ＤＡＲＴ‐Ａは、ヒト及びカニクイザル両方の抗原に同様のアフィニティで結合し、両方の種からのＴ細胞を、ＣＤ１２３＋細胞を殺滅するように再指向させる。１週間に４日又は７日、１週間毎に用量を段階的に増大させたＤＡＲＴ‐Ａを点滴されたサルは、処置開始後７２時間の時点で循環ＣＤ１２３＋細胞の枯渇を示し、これは投薬スケジュールにかかわらず、４週間の処置全体を通して持続した。循環Ｔ細胞の減少も発生したが、４日投薬スケジュールのサルでは後続の点滴の前にベースラインまで回復し、これはＤＡＲＴ‐Ａ媒介性可動化に適合している。ＤＡＲＴ‐Ａの投与により、循環ＰＤ１＋Ｔ細胞は増加したが、ＴＩＭ‐３＋Ｔ細胞は増加しなかった。更に、処置されたサルからのＴ細胞のエクスビボ分析により、変化しない再指向標的細胞の溶解が示され、これは消耗が存在しないことを示す。毒性は、ＤＡＲＴ‐Ａの最初の点滴後のサイトカインの極微な一時的放出と、ＣＤ１２３＋骨髄前駆細胞の付随的減少を伴う赤血球量の極微かつ可逆性の減少とに限定され、上記一時的放出は、用量を段階的に増大させた場合であっても後続の投与の後ではなかった。血液悪性腫瘍におけるＤＡＲＴ‐Ａの臨床試験は、正当性が保証されたもののようである。
【０２４４】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３１Ｇ】
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【図３１Ｈ】
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【図３１Ｉ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｆ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３６Ｆ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【配列表】
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