(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の発現を増加させるための組成物であって、
ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物およびローズマリーの抽出物の有効量を含み、前記抽出物は、必要とする対象に投与するために製剤され、前記有効量は、前記対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の発現を増加させるために十分な量である、
組成物。
【請求項２】
前記タンパク質は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＳＩＲＴ１、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質はＳＩＲＴ１ではない、請求項１または２項に記載の組成物。
【請求項４】
前記抽出物は１０重量％以上のウルソール酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／９０３，４３４号および２０１３年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／９０３，４４０号に従属してこれらの出願に基づく優先権を主張し、これらの出願の各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、ローズマリーまたはＨｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ（ワスレグサ）の抽出物を含む栄養補助食品（ダイエタリー・サプリメント）組成物、および、概日リズムに関連する状態の治療または予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラン藻類から哺乳類にいたるまで、生きた生命体は、多数の生理的および行動的プロセスにおいて概日リズム（すなわち、２４時間周期の振動）を示す。これらのリズムはほぼ全ての生きた生命体において見出される。概日リズムは内因的に発生し、綿密に調節された遺伝子制御の下で機能する。
【０００４】
概日リズムは、睡眠／覚醒サイクル、体温、ホルモン分泌、胃腸機能、代謝的グルコース恒常性、および免疫学的機能を含む様々な生物学的プロセスを統制する。概日リズムを示す生物時計は実質的に全ての組織に存在し、一連の時計遺伝子が、それら自身の合成に対するタンパク質フィードバック効果を通してリズムを生成している。
【０００５】
これら複数の内因性時計は生命体の全ての細胞に分布しており、これにより各器官が独自の調節された概日リズムを有することがもたらされ得る。活性化とフィードバックとの複雑な機序が、概日性タンパク質の発現、翻訳後修飾、位置変動、および分解を制御する。転写因子複合体ＣＬＯＣＫ-ＢＭＡＬ１は、哺乳類において概日性の遺伝子発現および生理を駆動する分子時計機構の中核的成分である。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１は、それぞれ、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ＰＡＳドメイン転写因子であり、これらが一緒になって中心的振動ループの正の要素を形成する。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１は、標的遺伝子のプロモーターにおけるＥ−ボックス配列に結合するヘテロ二量体を形成する。ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１による転写制御下にある第一次的遺伝子のいくつかは、３つのＰｅｒｉｏｄ（ピリオド）（ｍＰｅｒ１、ｍＰｅｒ２、およびｍＰｅｒ３）タンパク質および２つのＣｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ（クリプトクロム）遺伝子（ｍＣｒｙ１および ｍＣｒｙ２）タンパク質をコードする。これらＰｅｒおよびＣｒｙタンパク質は、翻訳後に核に移動し、そこでＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１誘導性遺伝子転写の強力な抑制因子として作用し、負のフィードバックループを形成して多くの遺伝子のリズム性発現を制御する。ＰＥＲＩＯＤタンパク質ｍＰＥＲ２は、その遺伝子もＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１転写調節下にあるものであるが、Ｂｍａｌ１転写の刺激因子として機能し、正のフィードバックループを形成してＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１活性を増強する。これら正および負のフィードバックループの制御が、細胞内で概日リズムを制御する。
【０００６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性サーチュインであるＳＩＲＴ１は、哺乳類細胞においてアポトーシスまたは細胞老化を抑制することにより細胞生存を促進することが示されてきた。最近の研究で、ＳＩＲＴ１の細胞代謝機能と概日リズム（ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１機構により統制される）との間の関連が明らかになり、そこでは、ＳＩＲＴ１が概日時計回路網を統制して細胞生存を促進することが示され、加齢性腫瘍との繋がりが提示された。また、正常マウスにおいて概日性機能は加齢とともに減衰し、脳においてＳＩＲＴ１のレベルを引き上げると、この減衰を防止し得る。逆に、若いマウスにおいてＳＩＲＴ１機能を消失させると概日性統制が損なわれ、正常な加齢において起こることが模倣される。さらに、ＳＩＲＴ１は、この統制を、中心的概日時計の２つの主要な番人である遺伝子ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫ を制御することにより行使していることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
血圧から睡眠／覚醒サイクルまで、恒常性を維持するための無数の生理的プロセスにおいて、そして健康および疾患において重要な役割を果たす細胞シグナル伝達経路において、酸素および概日周期性は非常に重要である。酸化ストレスは調節不全の概日リズム引き起こし得る。従って、適正なタンパク質発現および概日リズムを制御するための新規な組成物および方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下の発明の概括は、本発明特有の革新的特徴のいくつかについての理解を促進するために提供されるものであり、完全な説明であることは意図されていない。本発明の様々な側面の完全な理解は、明細書の全て、特許請求の範囲、図面、および要約を全体として捉えることにより得ることができる。
【０００９】
正常な恒常性の維持は、健康的な生理機能にとって重要である。対象におけるストレスは、この恒常性を破壊する生理的変化をもたらし得る。本発明は、ストレスに対する生理的応答を逆転させる特定の組成物の投与により、対象におけるストレスの影響を寛解または予防する方法を提供する。
【００１０】
概日リズム関連タンパク質の発現に関連する疾患または状態の治療または予防のための方法および組成物であって、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分もしくは活性成分、またはそれらの組合せの有効量を含み、前記抽出物は、概日リズムに関連する疾患または状態の処置を必要とする対象に投与して、前記対象における前記疾患または状態の症状を寛解、予防、または調節するために製剤され、ここで前記有効量は、前記対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変させるために十分であるものが提供される。
【００１１】
この方法または組成物において、抽出物は任意で水抽出物でありうる。抽出物またはその活性部分もしくは活性成分は、任意で、栄養補助食品（サプリメント）の一部であるか、あるいは単独で栄養補助食品（サプリメント）として使用されうる。いくつかの側面では、抽出物は、１０重量％以上、任意で２５重量％以上のウルソール酸を含む。抽出物は、任意で、ウルソール酸のみでありうる。いくつかの側面では、ウルソール酸は、抽出物の活性成分または活性部分である。任意で、組成物は、ウルソール酸を含むかまたはウルソール酸からなる。
【００１２】
組成物は、任意で、光に晒される−４時間〜１２時間後においてまたはその間に、投与されうる。いくつかの側面では、投与時間は、光に晒される０時間〜１２時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される１時間〜３時間後においてもしくはその間に起こり、または、光に晒される１０〜１４時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される前の−４時間〜０時間においてもしくはその間に起こる。投与は任意で１日あたり１回、１日あたり２回、もしくはそれより頻繁に、または必要に応じてなされうる。投与は任意で２週間以上の期間に渡ってなされ、任意で４週間以上、任意で３ヶ月間以上の期間に渡ってなされうる。
【００１３】
治療または予防される疾患または状態は、任意で、時差ぼけでありうる。時差ぼけの治療または寛解は、任意で、時差が関わる旅行の前または後における投与によって達成されうる。
【００１４】
いくつかの側面では、疾患または状態は二日酔いである。抽出物、その活性部分、またはその成分は、任意で、アルコールを消費する前、間、もしくは後、またはそれらの組合せにおいて投与される。
【００１５】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する代謝性状態である。代謝性状態は、任意で、コレステロールのレベルの異常、肥満、メタボリック症候群もしくはその要素、高血糖、低血糖、インスリン産生の異常、または糖尿病である。
【００１６】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する炎症性障害である。
【００１７】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する神経性障害である。神経性障害は任意でアルツハイマー病でありうる。
【００１８】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する筋障害である。筋障害は任意で筋ジストロフィーまたはミオパチーでありうる。
【００１９】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する睡眠障害である。睡眠障害は、任意で、不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）、睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）、非２４時間睡眠覚醒障害、または不規則型睡眠・覚醒パターンでありうる。睡眠障害に関しては、投与は、任意で、光に晒される−４時間〜１２時間後においてまたはその間になされうる。いくつかの側面では、投与時間は、光に晒される０時間〜１２時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される１時間〜３時間後においてもしくはその間に起こり、または、光に晒される１０〜１４時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される前の−４時間〜０時間においてもしくはその間に起こる。投与は任意で１日あたり１回、１日あたり２回、もしくはそれより頻繁に、または必要に応じてなされうる。
【００２０】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する精神障害である。精神障害は、任意で、うつ、季節性感情障害、認知症、または急速交代型双極性障害でありうる。
【００２１】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する心血管障害である。任意で、心血管障害は、血圧異常または心拍異常でありうる。いくつかの側面では、心血管障害はアテローム性動脈硬化症または心筋症である。
【００２２】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する肝毒性である。
【００２３】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する脳障害である。任意で、脳障害は、脳卒中、またはフリーラジカルによる脳変性でありうる。
【００２４】
いくつかの側面では、疾患または状態は、肥満である。
【００２５】
いくつかの側面では、疾患または状態は、細胞増殖性障害であり、任意で癌でありうる。
【００２６】
組成物は、任意で、１０％以上のウルソール酸を含み、任意で２５％以上のウルソール酸を含む。組成物は、任意で、ウルソール酸からなる。任意で、組成物は、実質的にウルソール酸からなり、疾患の治療または予防のために有用な他の組成物を排除する。組成物は、任意で、栄養補助食品（サプリメント）またはその成分として提供されうる。栄養補助食品（サプリメント）は、任意で、粉末、ゲル、液体、食品、固形物、またはその他の形態でありうる。
【００２７】
これらの組成物は、概日リズム関連タンパク質の発現に関連する疾患または状態の予防または治療のために、本質的に上述されたとおりに、方法における使用にも同様に適している。方法は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の発現に関連する疾患または状態の治療または寛解を必要とする対象に、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分もしくは活性成分、またはそれらの組合せの有効量を含む組成物を投与することを含む。組成物は、任意で、ウルソール酸を１０重量％以上、任意で２５％以上含み、任意でウルソール酸のみを含み、または、疾患もしくは状態の治療もしくは予防のための唯一の活性成分としてウルソール酸を含みうる。組成物は、任意で、栄養補助食品（サプリメント）またはその成分として提供されうる。栄養補助食品（サプリメント）は、任意で、粉末、ゲル、液体、食品、固形物、またはその他の形態でありうる。
【００２８】
多様な状態のうちの１つまたは複数の治療または予防のための方法が提供される。治療または予防される疾患または状態は、任意で、時差ぼけでありうる。時差ぼけの治療または寛解は、任意で、時差が関わる旅行の前または後における投与によって達成されうる。
【００２９】
いくつかの側面では、疾患または状態は二日酔いである。抽出物、その活性部分、またはその成分は、任意で、アルコールを消費する前、間、もしくは後、またはそれらの組合せにおいて投与されうる。
【００３０】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する代謝性状態である。代謝性状態は、任意で、コレステロールのレベルの異常、肥満、メタボリック症候群もしくはその要素、高血糖、低血糖、インスリン産生の異常、または糖尿病である。
【００３１】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する炎症性障害である。
【００３２】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する神経性障害である。神経性障害は任意でアルツハイマー病でありうる。
【００３３】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する筋障害である。筋障害は任意で筋ジストロフィーまたはミオパチーでありうる。
【００３４】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する睡眠障害である。睡眠障害は、任意で、不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）、睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）、非２４時間睡眠覚醒症候群、または不規則型睡眠・覚醒パターンでありうる。睡眠障害に関しては、投与は、任意で、光に晒される−４時間〜１２時間後においてまたはその間になされうる。いくつかの側面では、投与時間は、光に晒される０時間〜１２時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される１時間〜３時間後においてもしくはその間に起こり、または、光に晒される１０〜１４時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される前の−４時間〜０時間においてもしくはその間に起こる。投与は任意で１日あたり１回、１日あたり２回、もしくはそれより頻繁に、または必要に応じてなされうる。
【００３５】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する精神障害である。精神障害は、任意で、うつ、季節性感情障害、認知症、または急速交代型双極性障害でありうる。
【００３６】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する心血管障害である。任意で、心血管障害は、血圧異常または心拍異常でありうる。いくつかの側面では、心血管障害はアテローム性動脈硬化症または心筋症である。
【００３７】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する肝毒性である。
【００３８】
いくつかの側面では、疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する脳障害である。任意で、脳障害は、脳卒中、またはフリーラジカルによる脳変性でありうる。
【００３９】
いくつかの側面では、疾患または状態は、肥満である。
【００４０】
いくつかの側面では、疾患または状態は、細胞増殖性障害であり、任意で癌でありうる。
【００４１】
組成物は、任意で、光に晒される−４時間〜１２時間後においてまたはその間に、投与されうる。いくつかの側面では、投与時間は、光に晒される０時間〜１２時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される１時間〜３時間後においてもしくはその間に起こり、または、光に晒される１０〜１４時間後においてもしくはその間に起こり、任意で、光に晒される前の−４時間〜０時間においてもしくはその間に起こる。投与は任意で１日あたり１回、１日あたり２回、もしくはそれより頻繁に、または必要に応じてなされうる。投与は任意で２週間以上の期間に渡ってなされ、任意で４週間以上、任意で３ヶ月間以上の期間に渡ってなされうる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃ６細胞におけるＣＬＯＣＫタンパク質発現に対するＲＭＥおよびＨＦＥの効果を示す。
【００４３】
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃ６細胞におけるＣＬＯＣＫタンパク質発現に対するＲＭＥおよびＨＦＥの効果を示す。
【００４４】
【図２Ａ】図２Ａは、４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ：oxygen-glucose deprivation）および２時間の再灌流で処理されたＣ６細胞において、ＲＭＥがＢＭＡＬ１タンパク質レベルを上昇させたことを示す。
【００４５】
【図２Ｂ】図２Ｂは、４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）および２時間の再灌流で処理されたＣ６細胞において、ＲＭＥがＦＢＸＬ２１タンパク質レベルを上昇させたことを示す。
【００４６】
【図３Ａ】図３Ａは、ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方で処理されたＯＧＤラットＬ−６細胞においてＳＩＲＴ１レベルが上昇したことを示す。
【００４７】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＯＧＤ処理ラットＬ−６細胞におけるＳＩＲＴ１レベルの定量可能な上昇を示す。
【００４８】
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方で処理されたＯＧＤラットＬ−６細胞においてＣＬＯＣＫタンパク質レベルが上昇したことを示す。
【００４９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方による、ＯＧＤ処理ラットＬ−６細胞におけるＣＬＯＣＫレベルの定量可能な上昇を示す。
【００５０】
【図５Ａ】図５Ａは、ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方で処理されたＯＧＤラットＬ−６細胞においてＢｍａｌ１タンパク質レベルが上昇したことを示す。
【００５１】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方による、ＯＧＤ処理ラットＬ−６細胞におけるＢｍａｌ１レベルの定量可能な上昇を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
下記における特定の側面の記述は、単に例示的な性質のものであって、けっして本発明の範囲、その適用、または使用を限定することを意図するものではなく、それらは言うまでもなく異なり得る。本発明は、本明細書に含まれる非限定的な定義および用語との関係で記述される。これらの定義および用語は、本発明の範囲または実施に対する限定として機能するように意図されたものではなく、説明および記述の目的のためだけに提示されるものである。方法または組成物は、個々の工程の順序として、あるいは特定の物質を使用するものとして記述されるが、工程または物質は相互転換可能であり、従って本発明の記述は、当業者に容易に理解されるように多くのやり方でアレンジされる複数の部分または工程を含み得ることが理解される。
【００５３】
対象における概日リズム機構成分に関連する疾患または状態を治療、予防、または調節するための方法が提供される。概日リズム機構成分を改変することは、対象における１つ以上の種類の細胞において２４時間サイクルまたはその他の規則的サイクルに通常関与するタンパク質の、発現レベル、翻訳後修飾状態、核もしくは細胞質における位置もしくは位置変化（トランスロケーション）、またはＲＮＡ発現率を改変させること、任意で増加させることとして理解される。概日機構成分は、任意で、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＳＩＲＴ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、もしくはそれらの組合せであるかまたはそれをコードする、ＲＮＡもしくはタンパク質またはそれらの修飾でありうる。
【００５４】
疾患または状態（例えば障害）は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＳＩＲＴ１、ＦＢＸＬ３、もしくはＦＢＸＬ２１のうちの１つ以上またはそのようなタンパク質の１つ以上をコードするＲＮＡによって直接的または間接的に引き起こされる、変則性、望ましくない発現特性、またはその他の要素によるものである。方法は、望ましくない概日リズム機能に関連する疾患または状態を有しそのような処置を必要とする対象に、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分、もしくはそれらの組合せの有効量、または、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分、もしくはそれらの組合せを全体にもしくは部分的に含有する栄養補助食品（サプリメント）の有効量を投与することを含む。そのような投与は投与時間においてなされる。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分、もしくはそれらの組合せ、またはそれを含有する栄養補助食品（サプリメント）の投与は、対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはそれらの組合せのタンパク質の発現特性を改変する。このようにして、本発明は、細胞において概日リズムに関与するタンパク質の１つまたは複数の発現特性の改変または調節により直接的または間接的に引き起こされる状態を治療、予防、またはその他のかたちで調節するという有用性を有する。
【００５５】
本明細書において単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に排除される場合を除き、複数形への言及を含むことが理解される。「含む」という用語は、「〜を含むがそれに限定されない」という意味で使用される。
【００５６】
「発現特性」とは、概日リズムタンパク質をコードする遺伝子の転写、概日リズムタンパク質をコードするＲＮＡの翻訳、概日リズムタンパク質をコードするＲＮＡの局在、タンパク質の機能、タンパク質の局在、タンパク質の翻訳後修飾、または、タンパク質の発現および機能に関する技術分野において認知されているその他のパラメータである。
【００５７】
いくつかの側面では、疾患または状態は睡眠障害であり、任意で、不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）、睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）、非２４時間睡眠覚醒症候群、または不規則型睡眠・覚醒パターンでありうる。いくつかの側面では、疾患または状態は、概日リズムに関連する精神障害であり、任意で、うつ状態でありうる。いくつかの側面では、疾患または障害は、概日リズム要素を伴う神経疾患であり、任意でアルツハイマー病または神経性無食欲症でありうる。いくつかの側面では、疾患または障害は血圧異常である。いくつかの側面では、疾患または障害は心拍異常である。いくつかの側面では、疾患または障害は喘息である。いくつかの側面では、疾患または障害は、その治療が代謝物のレベル（例えばＮＡＤ、ＮＡＭ、またはＮＭＮのレベル）の上昇または低下により利益を受けるものである。いくつかの側面では、疾患または状態は、脂肪組織の過剰、肥満度指数（ボディ・マス・インデックス）の上昇、またはその他の体重障害である。いくつかの側面では、疾患または状態は、例えば虚血性脳卒中によるもののような脳損傷、またはそのリスクの上昇である。いくつかの側面では、疾患または状態は、フリーラジカルにより引き起こされる脳組織変性に関連するものである。いくつかの側面では、疾患または状態は、適正未満の筋量である。いくつかの側面では、疾患または状態は、運動後の筋肉回復の必要性である。いくつかの側面では、疾患または状態はコルチゾール抑制である。いくつかの側面では、疾患または状態は、望ましくないテストステロンレベルである。いくつかの側面では、疾患または状態は、二日酔い、または水分もしくは塩分のレベルの異常に関連するその他の状態である。いくつかの側面では、疾患または状態は、１つ以上の部位にける過剰な炎症または全身性炎症である。いくつかの側面では、疾患または状態はアテローム性動脈硬化である。いくつかの側面では、疾患または状態は、高血糖または低血糖である。いくつかの側面では、疾患または状態は、対象における毒素の存在であり、または、毒素の存在に起因もしくは関連する肝障害である。いくつかの側面では、疾患または障害は神経性無食欲症である。いくつかの側面では、疾患または状態は血圧異常である。いくつかの側面では、疾患または状態は心拍異常である。いくつかの側面では、疾患または状態は心拍異常である。いくつかの側面では、疾患または状態は喘息である。いくつかの側面では、疾患または状態は代謝障害である。いくつかの側面では、代謝障害は、糖尿病、インスリン分泌異常、血漿グルコースレベルの異常、肥満、またはメタボリック症候群（もしくはその要素）である。いくつかの側面では、疾患または状態は癌である。いくつかの側面では、治療は、疾患または状態の症状を寛解させることを含む。
【００５８】
いくつかの側面では、疾患または状態は代謝障害である。具体的な代謝障害、疾患、または状態は、任意で、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病関連の状態もしくは障害、またはメタボリック症候群を含みうる。
【００５９】
いくつかの側面では、疾患または状態は心血管疾患である。治療または予防され得る心血管疾患としては心筋症または心筋炎が挙げられ、例として、特発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬物誘発性心筋症、虚血性心筋症、および高血圧性心筋症が含まれる。いくつかの側面では、心血管疾患は、大動脈もしくはその他の冠状動脈、頸動脈、脳血管動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、または膝窩動脈のような主要血管のアテローム性障害（大血管性疾患）である。治療または予防され得るその他の血管性疾患としては、網膜細動脈、糸球体細動脈、神経脈管、心臓細動脈、ならびに、眼、腎臓、心臓、および中枢神経系および末梢神経系の付随毛細血管床に関連する疾患が挙げられる。
【００６０】
いくつかの側面では、疾患または状態は神経性疾患である。神経性疾患には、例として、神経変性疾患が含まれ、これには、任意で、脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＤ；ルー・ゲーリック病）、びまん性レビー小体病、有棘赤血球舞踏病、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、フリートライヒ運動失調症、脳室周囲白質軟化症（ＰＶＬ）、グアムのＡＬＳ・パーキンソン病・認知症複合、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺（スティール・リチャードソン症候群）、延髄性（bulbar）および仮性球（pseudobulbar）麻痺、糖尿病性網膜症、多発脳梗塞性認知症、黄斑変性症、ピック病、びまん性レビー小体病、プリオン病（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、クールー病、および致死性家族性不眠症）、原発性側索硬化症、変性運動失調、マシャド・ジョセフ病／脊髄小脳失調症３型およびオリーブ橋小脳変性症、脊髄性および球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）、家族性痙性対麻痺、ウォールファート・クーゲルベルク・ヴェランダー病、テイ・サックス病、多システム変性症（シャイ・ドレーガー症候群）、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット病、家族性自律神経失調症（ライリー・デイ症候群）、クーゲルベルク・ヴェランダー病、亜急性硬化性全脳炎、ウェルドニッヒ・ホフマン病、シヌクレイン病（多系統萎縮症を含む）、サンドホフ病、皮質基底核変性症、痙性対麻痺、原発性進行性失語、進行性多巣性白質脳症、線条体黒質変性症、家族性痙性疾患、神経変性に関連する慢性的てんかん性状態、ビンスワンガー病、ならびに認知症（認知症の根底にある全ての病因を含む）が含まれる。
【００６１】
いくつかの側面では、疾患または状態は筋疾患である。筋疾患は、例として、筋ジストロフィーおよびミオパチーのような神経筋疾患を含む。
【００６２】
いくつかの側面では、疾患または状態はミトコンドリア性疾患である。ミトコンドリア性疾患は、任意で、ＫＳＳ（慢性進行性外眼筋麻痺）、ＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；福原症候群）、ＭＥＬＡＳ、レーバー病、リー（Ｌｅｉｇｈ）脳症、およびピアソン病を含む。
【００６３】
いくつかの側面では、疾患または状態はインスリン関連状態である。インスリン抵抗性障害は、インスリン抵抗性により引き起こされ、またはインスリン抵抗性が寄与する、あらゆる疾患または状態を含む。代表的な非限定的例としては、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、インスリン抵抗性症候群、シンドロームX、インスリン抵抗性、高血圧、血圧上昇、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、動脈硬化性疾患（卒中、冠動脈疾患、または心筋梗塞を含む）、高血糖、高インスリン血症および／または高プロインスリン血症、耐糖能障害、インスリン放出遅延、糖尿病合併症（冠動脈心疾患を含む）、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症における認知機能、網膜症、末梢神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、ある種の癌（例えば子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌）、妊娠の合併症、女性生殖系の問題（例えば月経不順、不妊、排卵障害、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）等）、リポジストロフィー、コレステロール関連障害（例えば胆石、胆嚢炎、および胆石症）、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸性の問題、変形性関節症、ならびに骨量減少（例えば骨粗しょう症）の予防および治療が挙げられる。
【００６４】
ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分、またはそれらの組合せのような、植物性抽出物の形態の物質が、単独でまたは栄養補助食品（サプリメント）の一部分として提供され、これは、対象において概日リズムに関与するタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変するという有用性を有する。この抽出物、その活性部分、または栄養補助食品（サプリメント）は、例えば錠剤、咀嚼剤、坐薬、丸剤、カプセル、粉末、液体、または懸濁液のような、固形状、半固形状、または液状の投与形態の医薬栄養補助食品（サプリメント）組成物であり得、単一投与に適したユニット投与量において提供され得る。有効な投与製剤として徐放性調製物も企図される。組成物は、任意で薬学的に許容される担体と組み合わされる、選択されるローズマリー抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ抽出物、その活性部分、またはそれらの組合せの有効量を含み得、さらに、その他の医薬剤、医薬品、担体、または希釈剤を含み得る。
【００６５】
抽出物は、抽出物の活性部分として、または抽出物の唯一の部分として、有効成分を含むことが認識される。「有効成分」は、抽出物中に存在する成分であって、意図する抽出物の作用を直接的または間接的にもたらすものを指す。いくつかの側面では、有効成分はウルソール酸である。水質、加熱温度、乾燥温度、加熱時間、乾燥時間、および濾過プロセスのような抽出パラメータは全て、抽出プロセスの質および効率に寄与する。水質は有効成分（複数可）の濃度に直接的に影響する。質の悪い水は、抽出プロセスの際またはその後に、有効成分（複数可）の分解または酸化を引き起こし得る。
【００６６】
ローズマリーまたはｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａは様々な資源から得ることができる。ローズマリー、あるいはＲｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓは、地中海地方原産の灌木である。ローズマリーの抽出物は、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ種から作ることができ、好ましくは生のローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．およびその栽培品種）の葉および若い開花時の先端部分から作られる。ローズマリー抽出は、ローズマリーの植物の葉を収穫し、例えば切り刻むことなどによってサイズを減少させて溶媒浸透性を向上させることによって実行され得る。典型的な粒子サイズは、任意で、０．５〜５．０ｍｍあるいはその間のあらゆる値もしくは範囲でありうる。いくつかの側面では、葉は、０．５ｍｍ未満の粒子サイズを有する粉末タイプの物質に切り刻まれる。切り刻まれた植物材料は、水および／または低分子量アルコール（例えばＣ４〜Ｃ６アルコール）、例えばエタノールのような、適切な抽出溶媒と組み合わされる。植物材料は、１８〜３６時間の抽出時間に渡って溶媒と組み合わされる。抽出温度は任意で１０℃〜４５℃の範囲でありうる。得られた抽出液は固形物質から分離され、任意で滅菌フィルターを用いて、濾過される。任意で、得られた抽出液は非付着性のトレー上に流し出され、８０〜９０℃にて乾燥される。乾燥手順には減圧噴霧乾燥装置が任意で使用されうる。得られた乾燥抽出物粉末は秤量される。抽出比は、乾燥抽出物粉末の重量（ｇ）をｗとして、ｗ／２０ｘ１００％として計算される。試料と水の比、加熱時間、２回目の抽出における水の体積は、抽出に使用される原材料の量によって変動し得る。
【００６７】
Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物は、任意で、水および／または低分子量アルコール、例えばエタノールのような抽出溶媒における抽出から得られる。ユリ（Ｌｉｌｉａｌｅｓ）目、ユリ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）科のワスレグサ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）属に属する植物から調製される抽出物が使用される。そのような植物の例としては、アキノワスレナグサ（Ｈｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ  Ｍ．  ＨｏｔｔａまたはＨｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ  Ａｒａｋｉ）、ホンカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｆｕｌｖａ）、ノカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｌｏｎｇｉｔｕｂａ  ＭａｘｉｍまたはＨｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ  Ｍｉｑ．）、およびヤブカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｋｗａｎｓｏ  Ｒｅｇａｌ）が挙げられる。抽出物は、任意で、植物全体から、または、葉、茎、および根のような植物部分から調製されうる。
【００６８】
いくつかの側面では、抽出物は、植物材料を乾燥させ、任意でその材料を抽出用に適切なサイズ（例えばローズマリーについて説明したサイズ）に切断することにより調製される。その植物材料は、６０℃〜１００℃の温度に予め加熱された抽出溶媒（例えば水、水性緩衝液、低分子量アルコール、またはこれらの組合せ）と、典型的には２０〜９０分間である抽出時間に渡って組み合わされる。それから粒状の物質を重力分離、遠心分離、または濾過（任意で無菌濾過に適したフィルターサイズを伴うもの）により除去する。得られた抽出物は任意で非付着性のトレー上に流し出され、８０〜９０℃にて乾燥される。乾燥手順には減圧噴霧乾燥装置が任意で使用されうる。得られた乾燥抽出物粉末は秤量される。抽出比は、乾燥抽出物粉末の重量（ｇ）をｗとして、ｗ／２０ｘ１００％として計算される。試料と水の比、加熱時間、抽出における水の体積は、抽出に使用される原材料の量によって変動し得る。
【００６９】
いくつかの側面では、任意で同じ抽出パラメータまたは異なる抽出パラメータを使用して、いずれかの植物材料の２回目の抽出が行われる。任意で、２回目の抽出は、任意でＣ２〜Ｃ４のものでありうる低分子量アルコールにて行われうる。任意で１回目および２回目の抽出溶液を一緒に組み合わせて乾燥させうる。
【００７０】
いくつかの側面では、抽出物は、有効成分としてのウルソール酸を含むかまたはウルソール酸からなる。ウルソール酸は、任意で、１０重量％以上の濃度で抽出物中に存在しうる。いくつかの側面では、ウルソール酸は、２５重量％以上の濃度で抽出物中に存在しうる。任意で、ウルソール酸は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９重量％以上の濃度で存在しうる。
【００７１】
ウルソール酸は、抽出物の成分として、あるいは抽出物を表すものとして記述されるが、「抽出物」という用語はいくつかの側面では他のやり方で単離され、精製され、または化学的に合成されたウルソール酸を包含し得ることが理解される。従って、「抽出物」は、いくつかの側面では、天然もしくは非天然の原料からの抽出によって得られたウルソール酸であるか、または、化学的に合成されたウルソール酸として使用される。
【００７２】
意図される投与の態様に応じて、抽出物は、例えば錠剤、坐薬、丸剤、カプセル、粉末、液体、または懸濁液のような、固形状、半固形状、または液状の投与形態のかたちで医薬組成物中に含まれ得、単一投与に適したユニット投与量において提供され得る。徐放性調製物も有効な投与製剤として特に企図される。組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わされる、選択される抽出物の有効量を含み、さらに、その他の医薬剤、医薬品、担体、または希釈剤を含み得る。
【００７３】
固形状組成物の側面において、従来型の無毒性固形担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムを含み得る。液状の医薬的投与可能な組成物は、例えば、活性化合物を、最適な医薬補助剤と共に、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、またはエタノールのような賦形剤中に溶解または分散させて溶液または懸濁液を形成することによって調製され得る。例えば、医薬組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤（例えば酢酸ナトリウムまたはオレイン酸トリエタノールアミン）のような少量の無毒性補助物質を含有し得る。そのような投与形態を調製する実際の方法は、当業者に知られているかまたは明らかになるであろう。例えばRemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy（第２０版）を参照のこと。
【００７４】
経口投与の側面では、抽出物の細かい粉末もしくは顆粒、または液状抽出物が、希釈剤、分散剤、または界面活性剤を含み得る。抽出物は、水中もしくはシロップ中に、乾燥状態でカプセルもしくは小袋中に、または非水性の溶液もしくは懸濁液中に提供され得る。錠剤中に懸濁剤も含まれていてよく、その錠剤は懸濁状態の結合剤および潤滑剤を含み得る。着香剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤、または乳化剤を含ませて組成物の味および質感を調節してもよい。経口投与のために提供される錠剤および顆粒は、消化を容易にするためにさらに被覆されていてもよい。
【００７５】
いくつかの側面では、栄養補助食品（サプリメント）組成物を含む抽出物は、１つ以上の他の活性剤と組み合わされ得る。活性剤は、任意で、抽出物物質と相乗的に機能しうる。活性剤には、例として、ビタミン（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、またはビタミンＫ）、抗酸化物質（例えばアサイー、クコ、アルファリポ酸、アスタザンシン、またはフコキサンチン）、もしくは１つ以上の概日リズムタンパク質の他の制御因子（例としてレスベラトロールまたはポリゴナム）、または上記のもののあらゆる組合せが含まれる。本発明による抽出物は、食品への添加物として利用可能である。例としては、液状、半液状、固形状、ペースト状、またはゼリー状の食品が挙げられる。
【００７６】
対象における概日リズムタンパク質の発現特性に直接的または間接的に関連する状態を治療、予防、または調節するための方法が提供される。本明細書において、対象とは、生物（例えばヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、マウス、またはその他の哺乳類）または細胞として定義される。細胞の代表的な例としては、神経細胞、筋細胞、または、概日機構成分タンパク質を内因的もしくは外因的に発現するあらゆるその他の細胞が挙げられる。
【００７７】
本発明者らは、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せの投与が、概日リズムタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変することを思いがけず発見した。概日リズムタンパク質の発現は、細胞（任意で生物中の細胞）が、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せにより接触されたときに改変される。タンパク質の代表的な例としては、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸｌ２１、ＳＩＲＴ１タンパク質が挙げられる。いくつかの側面では、タンパク質はサーチュインタンパク質ではない。
【００７８】
Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｃｙｃｌｅｓ  Ｋａｐｕｔ（ＣＬＯＣＫ）タンパク質は、本発明のいくつかの側面で、１つまたは複数の発現特性において任意で改変される。任意で、細胞質中のＣＬＯＣＫタンパク質発現、またはトランスロケーション後の核におけるレベルが、本発明の方法において増加する。任意で、抽出物は、ＣＬＯＣＫタンパク質の発現を増加させるローズマリーの抽出物である。任意で、抽出物は、ＣＬＯＣＫタンパク質の発現を増加させるｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物である。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せに細胞を接触させると、投与の２時間以内にＣＬＯＣＫタンパク質の発現を増加させることが示されている。例として、ＣＬＯＣＫタンパク質発現は、５％〜３００％もしくはそれを超える数値だけ、またはその間のあらゆる数値もしくは範囲で、増強（例えば増加）される。任意で、ＣＬＯＣＫタンパク質発現は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれより多く、増強されうる。
【００７９】
脳と筋肉のＡｒｎｔ様タンパク質１（ＢＭＡＬ１；ＭＯＰ３あるいはＡｒｎｔ３としても知られる）は、概日リズムを制御することが知られる転写因子である。任意で、細胞質中のＢＭＡＬ１タンパク質発現、またはトランスロケーション後の核におけるレベルが、本発明の方法において増加する。任意で、抽出物は、ＢＭＡＬ１タンパク質の発現を増加させるローズマリーの抽出物である。任意で、抽出物は、ＢＭＡＬ１タンパク質の発現を増加させるｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物である。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せに細胞を接触させると、投与の２時間以内にＢＭＡＬ１タンパク質の発現を増加させることが示されている。例として、ＢＭＡＬ１タンパク質発現は、５％〜３００％もしくはそれを超える数値だけ、またはその間のあらゆる数値もしくは範囲で、増強（例えば増加）される。任意で、ＢＭＡＬ１タンパク質発現は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれより多く、増強される。
【００８０】
Ｆボックス／ＬＲＲ反復タンパク質３（ＦＢＸＬ３）は、リン酸化依存性ユビキチン化において機能するＦボックスタンパク質ファミリーの一員である。任意で、細胞質中のＦＢＸＬ３タンパク質発現、またはトランスロケーション後の核におけるレベルが、本発明の方法において増加する。任意で、抽出物は、ＦＢＸＬ３タンパク質の発現を増加させるローズマリーの抽出物である。任意で、抽出物は、ＦＢＸＬ３タンパク質の発現を増加させるｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物である。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せに細胞を接触させると、投与の２時間以内にＦＢＸＬ３タンパク質の発現を増加させることが示されている。例として、ＦＢＸＬ３タンパク質発現は、５％〜３００％もしくはそれを超える数値だけ、またはその間のあらゆる数値もしくは範囲で、増強（例えば増加）される。任意で、ＦＢＸＬ３タンパク質発現は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれより多く、増強される。
【００８１】
Ｆボックス／ＬＲＲ反復タンパク質２１（ＦＢＸＬ２１）は、リン酸化依存性ユビキチン化において機能するＦボックスタンパク質ファミリーの一員である。任意で、細胞質中のＦＢＸＬ２１タンパク質発現、またはトランスロケーション後の核におけるレベルが、本発明の方法において増加する。任意で、抽出物は、ＦＢＸＬ２１タンパク質の発現を増加させるローズマリーの抽出物である。任意で、抽出物は、ＦＢＸＬ２１タンパク質の発現を増加させるｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物である。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せに細胞を接触させると、投与の２時間以内にＦＢＸＬ２１タンパク質の発現を増加させることが示されている。例として、ＦＢＸＬ２１タンパク質発現は、５％〜３００％もしくはそれを超える数値だけ、またはその間のあらゆる数値もしくは範囲で、増強（例えば増加）される。任意で、ＦＢＸＬ２１タンパク質発現は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれより多く、増強される。
【００８２】
サーチュイン１（サイレント接合型情報制御２ホモログ１）（ＳＩＲＴ１）は、細胞制御に貢献するタンパク質の脱アセチル化に関わるタンパク質である。任意で、細胞質中のＳＩＲＴ１タンパク質発現、またはトランスロケーション後の核におけるレベルが、本発明の方法において増加する。任意で、抽出物は、ＳＩＲＴ１タンパク質の発現を増加させるローズマリーの抽出物である。任意で、抽出物は、ＳＩＲＴ１タンパク質の発現を増加させるｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物である。ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはこれらの組合せに細胞を接触させると、投与の２時間以内にＳＩＲＴ１タンパク質の発現を増加させることが示されている。例として、ＳＩＲＴ１タンパク質発現は、５％〜３００％もしくはそれを超える数値だけ、またはその間のあらゆる数値もしくは範囲で、増強（例えば増加）される。任意で、ＳＩＲＴ１タンパク質発現は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれより多く、増強される。
【００８３】
概日タンパク質発現を検出し任意で定量化することは、本技術分野において知られる多くの方法のいずれによっても達成され得る。例として、概日タンパク質発現は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、ウェスタンブロット、ゲル電気泳動（任意で、例えばクーマシーブリリアントブルーもしくは銀染色等、または標的特異的染色によって染色することと組み合わされる）、フローサイトメトリー、免疫沈降、または本技術分野において知られるその他の方法によって、検出され、任意で定量化される。いくつかの側面では、ＥＬＩＳＡを使用して概日タンパク質発現を検出し任意で定量化する。例えば、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ２のためのＥＬＩＳＡキットをペンシルバニア州プリマスミーティングのエンゾライフサイエンス社から入手できる。他のサーチュインのためのキットも同様に市販されている。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光、またはその他のアプリケーションにおける使用に適したＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、およびＳＩＲＴタンパク質に対する抗体はカリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー社から入手できる。抗ＦＢＸＬ２１および抗ＦＢＸＬ３抗体はマサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム社から入手できる。
【００８４】
方法は、任意で、抽出物または抽出物含有栄養補助食品（サプリメント）を、疾患もしくは状態を治療し、あるいはそのような疾患もしくは状態の症状をその他のかたちで調節もしくは寛解するために有効な量において、投与時間において投与することを含む。投与は、任意で１日あたり１回、１日あたり２回、またはそれより多くてもよい。投与は、任意で、１日１回、２回、３回、４回、またはそれより多い回数行ってもよい。任意で、投与は、必要に応じて行われうる。任意で、不定期に、または週毎に行われる。任意で、投与は、１週間に１回または２回、例えば、対象が旅行、交代勤務、週末から出勤へのスケジュール、もしくは出勤から週末へのスケジュール等のために１つのスケジュールから別のスケジュールへと移行するとき、またはその他の必要なとき等に行われうる。任意で、投与時間は運動の後である。任意で、投与時間は、疾患もしくは状態の１つ以上の症状が存在するとき、または、そのような症状が予測されるか起こり得るという状態が存在するときである。任意で、投与は、食事、間食、または食品もしくは栄養ドリンクのその他の消費の、前において、後において、途中において、またはそれらの代わりとして、行われる。任意で、投与は、アルコール消費の前、途中、または後に行われる。
【００８５】
投与時間は、任意で、光に晒される−４時間〜１２時間後において行われる。任意で、投与は、光に晒される０時間〜１２時間後である。任意で、投与時間は、時刻あるいは光曝露の開始に依存せず、起床時になされる。任意で、投与時間は、夕方である。本発明者らは、ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、またはそれらの組合せの有効量の投与が、いくつかの概日プロセスに関与するいくつかのタンパク質の発現を増加させることを明らかにした。投与時間は、そのようなタンパク質またはタンパク質群の発現が、対象の睡眠・覚醒サイクルを調節するように、または、所望の時間における覚醒状態を改善させるように、所望の時間に適応させることができ、その覚醒状態の改善は、任意で、休息状態の改善には因らないものでありうる。いくつかの側面では、抽出物は、特定の時間に放出される形態において、任意で長時間放出形態において、周期的放出形態において、または時間制御ポンプを用いて、投与される。
【００８６】
典型的な投与計画では、抽出物質は、１日あたり１回〜３回、経口摂取されるが、他の投与ルートも利用し得る。また、本発明の抽出物は、誘導体の形態でも利用され得ることに留意すべきである。例えば、抽出物は、合成ポリマー、リポソーム、有機小分子、キチン、キトサン、その他の生体高分子等のような、他の化学種および成分と化学的にまたは物理的に結合され得る。本明細書で示される教示を考慮すれば、さらなる他の組合せも当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００８７】
選択された抽出物サプリメントの各投与量が、概日タンパク質の発現特性に作用するために適した活性剤の量を送達するように、ある量の組成物が対象に投与される。様々な投与計画が有効である。いくつかの例では、単一投与量処置が治療効果を生むうえで有効であり得、他の例では、例えば６週間から３ヶ月もしくは６ヵ月またはそれを超える範囲の処置期間が使用され得る。組成物は、経口的に、非経口的に、または静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経皮注射により、または細胞もしくは組織への接触により（例えば浸漬その他の接触形態により）、投与され得る。注射剤は、従来的なかたちで、すなわち液状の溶液もしくは懸濁液、注射前の溶解もしくは液中懸濁に適した固体形態、または乳濁液として調製され得る。
【００８８】
抽出物は、滅菌形態で提供され得、対象への投与に適した重量または体積のユニットにおいて、望まれる応答を生じさせるための１つまたは複数の物質の有効量を含み得る。対象に投与される、抽出物または１つ以上のその抽出物を含有する栄養補助食品（サプリメント）の投与量は、使用される投与の態様および対象の状態に応じて、異なるパラメータに基づいて選択され得る。その他の要素としては、望まれる処置期間が挙げられる。適用された最初の投与量に対して、対象における応答が不十分である場合には、患者耐容能が許容する限りにおいて増加投与量（あるいは、より局所的な異なる送達ルートによる、事実上の増加投与量）が適用され得る。医薬剤の投与量は個々の医師または獣医師によって調節され得、特に何らかの併発症が生じた場合には調節され得る。
【００８９】
組成物の投与量は、対象の年齢、体重、全般的状態によって変わり得る。例えば、１日あたり乾燥抽出物粉末１〜１，０００ｍｇに相当する投与量の範囲は有効な範囲であり得る。いくつかの側面では、投与量は、１日あたり１０〜８００ｍｇ、任意で１日あたり１００〜６００ｍｇ、任意で１日あたり２００〜４００ｍｇ、任意で１日あたり４００ｍｇである。投与は、任意で、１日あたり１回、２回、３回、４回、またはそれより多い回数である。任意で、投与は１日あたり２回である。任意で、投与は、１日あたり２００ｍｇを２回である。抽出物はまた、組成物の乾燥重量の０．０１％〜１００％を構成し得る。例えば、栄養補助食品（サプリメント）組成物は、２０％〜５０％の抽出物組成物の乾燥重量を含み得る。「有効量」は、概日タンパク質またはそれをコードする遺伝子の１つまたは複数の発現特性を、対照と比較して改変することができる量として定義される。
【００９０】
抽出物は、任意で、栄養補助食品（サプリメント）組成物であるか、またはその一部分をなしうる。抽出物は、任意で、栄養補助食品（サプリメント）組成物中に、１０〜１００重量％、任意で２０〜５０重量％、任意で３０〜４０重量％存在し、または、その組成物の乾燥重量の１０〜１００％の間のあらゆる数値もしくは範囲にて存在しうる。
【００９１】
本発明の様々な側面を以下の非限定的な実施例により説明する。実施例は説明の目的のものであり、本発明の実施についての限定ではない。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく改変および修正をなし得ることは理解されるであろう。
【実施例】
【００９２】
［実験的事項］
免疫蛍光法およびウェスタンブロッティング分析を使用して、正常ラットＣ６神経膠腫細胞およびＩＰＥＣ−１（ブタ腸上皮細胞株）において、ローズマリーの抽出物（ＲＭＥ：extract of rosemary）およびｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物（ＨＦＥ：extract of hemerocallis fulva）が、鍵となる概日タンパク質発現を調節するか否かを調べた。血圧および睡眠／覚醒サイクルから、健康と疾患とにおいて重要な役割を果たす細胞性シグナル伝達経路に至るまで、恒常性を維持するための無数の生理的プロセスにおいて、酸素および概日リズム性が必須である。酸化ストレスは概日リズムの調節不全を引き起こし得る。本発明者らは、ＲＭＥおよびＨＦＥが、酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）によるこれらのタンパク質発現のダメージを減弱するか否かも試験する。
【００９３】
乾燥したローズマリー抽出物とｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ抽出物はインテグリティ・ニュートラシューティカル・インターナショナル（米国テネシー州スプリングヒル）によって提供された。各抽出物の乾燥粉末は、２５％のウルソール酸を含む。より純粋な抽出物画分を得るために、乾燥したローズマリーまたはｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの粉末（１ｇ）を水性リン酸緩衝溶液０．０１Ｍ、ｐＨ７．４（５ｍＬ）と共に６０℃にて４時間インキュベートし、それから６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。上清を４０μｍフィルターメッシュによりフィルター処理し、濃度評価のために取り置いた。ＲＭＥおよびＨＦＥのアリコートを１０ｍｇ／ｍＬにて調製し、以降の研究における使用のために−２０℃にて保存した。
【００９４】
Ｃ６神経膠腫細胞（ＣＣＬ−１０７）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；ヴァージニア州マナサス）から購入した。培養細胞は、１０％ウマ血清および２％ウシ胎仔血清で補足され５％ＣＯ２／９５％空気を用いて３７℃にて維持したＦ−１２Ｋ培地（ギブコ／インビトロジェン）中で増殖させた。培養物を７５ｍｍフラスコ中で８５％集密度まで増殖させ、トリプシン処理後、３５ｍｍ培養皿または６ウェルプレートに播種し、実験期間のあいだ集密状態まで増殖させた。全ての培養物は第２２〜３２継代のあいだに実験に用いた。プレートに播いた細胞を２日間培養した後、抽出物または対照により処理した。
【００９５】
ＩＰＥＣ−１細胞の培養は５％ＣＯ２を含む雰囲気中で３７℃にて行った。未分化ＩＰＥＣ−１細胞を、増殖培地（ＧＭ）（５％ＦＢＳ、インスリン、トランスフェリン（ＩＴＳプレミックス）、上皮成長因子、ペニシリン、およびストレプトマイシンで補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で連続継代にて維持した。実験のためには、細胞を血清含有ＧＭ中に４８時間維持した。
【００９６】
全てマサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム社から提供される以下の一次抗体を使用して標的タンパク質についての染色を行うことにより、細胞中でＲＭＥまたはＨＦＥの効果を調べた。ＳＩＲＴ１はａｂ１１０３０４マウスモノクローナル［１９Ａ７ＡＢ４］により検出した。ＫＡＴ１３Ｄ／ＣＬＯＣＫはａｂ１３４１６５ウサギモノクローナル［ＥＰＲ６２２７］を使用して検出した。ＢＭＡＬ１はＣ末端認識抗体ａｂ１４０６４６ウサギモノクローナル［ＥＰＲ８３５５（２）］  を使用して検出した。ＦＢＸＬ３はａｂ９６６４５ウサギポリクローナルを使用して検出した。ＦＢＸＬ２１はａｂ５７３０２マウスモノクローナルを使用して検出した。それぞれの免疫蛍光実験のために、細胞を、注目している標的に対する一次抗体で染色し、それからＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲート正常ウサギＩｇＧ（緑）またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート正常マウスＩｇＧ（赤）と共にインキュベートした。
【００９７】
Ｃ６細胞は、培地中で３７℃にて２時間（２ｈ）にわたり、ＲＭＥ（２０、５０、および１００μｇ／ｍＬ）もしくはＨＦＥ（５０、１００、および２００μｇ／ｍＬ）を含有するかまたは含有しない食塩水で処理された。Ｃ６神経膠腫細胞におけるｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋａｐｕｔ（ＣＬＯＣＫ）タンパク質発現に対するローズマリー抽出物（ＲＭＥ）およびｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ抽出物（ＨＦＥ）の影響を免疫蛍光法により決定する。ＲＭＥまたはＨＦＥによる２ｈ処理は、対照と比較して、ＣＬＯＣＫの免疫蛍光の強度の増加を有意に誘導し、増強されたＣＬＯＣＫタンパク質発現が示された。
【００９８】
ＣＬＯＣＫタンパク質発現に対するＲＭＥおよびＨＦＥの同様の結果がＩＰＥＣ−１細胞においても観察された。ＩＰＥＣ−１細胞は、培地中で３７℃にて６時間にわたり、ＲＭＥ（２０、５０、および１００μｇ／ｍＬ）もしくはＨＦＥ（５０、１００、および２００μｇ／ｍＬ）を含有するかまたは含有しない食塩水で処理された。６ｈのＲＭＥおよびＨＦＥ処理は、対照と比較して、ＣＬＯＣＫの免疫蛍光の強度を有意に引き上げた。
【００９９】
図１は、Ｃ６細胞中のＣＬＯＣＫ（図１Ａ）およびＢＭＡＬ１（図１Ｂ）のタンパク質発現に対するＲＭＥおよびＨＦＥの影響を図示している。Ｃ６細胞は、培地中で３７℃にて７時間にわたり、ＲＭＥ（２０および５０μｇ／ｍＬ）もしくはＨＦＥ（５０および１００μｇ／ｍＬ）を含有するかまたは含有しない食塩水で処理された。代表的な免疫ブロットにより、ＲＭＥおよびＨＦＥで処理されたＣ６細胞における発現の上昇が示されている。
【０１００】
Ｐａｎｉｃｋａｒら（２００９ａ）により記述されたように、培養物において酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）を誘導した。手短に述べると、以下の組成（ｍＭ表示）を有する平衡塩類溶液（ＢＳＳ）で培養物を２回洗浄した：ＮａＣｌ  １１６、ＫＣｌ  ５．４、ＣａＣｌ２  １．８、ＭｇＳＯ４  ０．８、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．８３、ＮａＨＣＯ３  ２４、および  フェノールレッド０．００１ｗ／ｖ；ｐＨ７．４）。洗浄の後、培養物にＢＳＳを追加し、気密容器（ビラップスチェンバー；ビラップス・ローゼンバーグ社、カリフォルニア州デル・マール）中に置き、５時間に渡り９５％Ｎ２／５％ＣＯ２を連続的に流した。ＯＧＤの後、ＢＳＳを除去し、その直後に通常の培地を加えた。
【０１０１】
ＩＰＥＣ−１細胞において、酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）誘導により減少したＣＬＯＣＫ発現は、ＲＭＥおよびＨＦＥにより逆転され、さらに増強される。ＲＭＥおよびＨＦＥは、４時間のＯＧＤのあいだ培地に添加され、３７℃において４時間のＯＧＤの終了の直後のさらなる３時間において通常の培地に添加された。４時間ＯＧＤおよび３時間再灌流の後の、正常対照（ＣＯＮ）、ＯＧＤ、および、ＯＧＤ＋ＲＭＥまたはＨＦＥの２つの投与量（１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）におけるＣＬＯＣＫ蛍光の試料顕微鏡写真は、対照およびＯＧＤ処理細胞と比較してＣＬＯＣＫ発現が増加していることを示している。
【０１０２】
免疫蛍光測定は、４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）および２時間の再灌流で処理したＣ６神経膠腫細胞において、ＲＭＥおよびＨＦＥがそれぞれＦＢＸＬ３タンパク質のレベルを上昇させたことを示した。ＲＭＥまたはＨＦＥは、４時間のＯＧＤのあいだ培地に添加され、３７℃において４時間のＯＧＤの終了の直後のさらなる２時間において通常の培地に添加された。４時間ＯＧＤおよび２時間再灌流の後の、ＯＧＤ、ならびに、ＯＧＤ＋ＲＭＥおよびＨＦＥの２つの投与量（５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）におけるＦＢＸＬ３蛍光の試料顕微鏡写真は、抽出物の存在により増強されたＦＢＸＬ３の発現を示している。
【０１０３】
免疫蛍光により示されているように、４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）および２時間の再灌流で処理されたＩＰＥＣ−１細胞において、ＲＭＥ（Ａ）およびＨＦＥ（Ｂ）はどちらもＦＢＸＬ３タンパク質のレベルを上昇させた。ＲＭＥおよびＨＦＥは、４時間のＯＧＤのあいだ培地に添加され、３７℃において４時間のＯＧＤの終了の直後のさらなる３時間において通常の培地に添加された。４時間ＯＧＤおよび３時間再灌流の後の、ＯＧＤ、および、ＯＧＤ＋ＲＭＥまたはＨＦＥ（５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌのいずれか）におけるＦＢＸＬ３蛍光の試料顕微鏡写真は、抽出物への曝露により増強されたＦＢＸＬ３タンパク質の発現を示している。
【０１０４】
図２は、４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）および２時間の再灌流で処理されたＣ６細胞において、ＲＭＥがＢＭＡＬ１（Ａ）およびＦＢＸＬ２１（Ｂ）タンパク質のレベルを上昇させたことを示している。ＲＭＥは、４時間のＯＧＤのあいだ培地に添加され、３７℃において４時間のＯＧＤの終了の直後のさらなる２時間において通常の培地に添加された。ブロットのバンドはオデッセイ（登録商標）ウェスタンブロッティングにより検出されている。手短に述べると、ブロットをウサギ抗ＢＭＡＬ１またはマウス抗ＦＢＸｌ２１でプローブし、続けてＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｐ／Ｎ  ９２６−３２２３１）またはＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤヤギ抗マウスＩｇＧ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｐ／Ｎ  ９２６−６８０７０）を用いて検出を行った。４時間ＯＧＤおよび２時間再灌流の後の、ＯＧＤとＯＧＤ＋ＲＭＥの２つの投与量とにおけるＦＢＸＬ２１蛍光の試料顕微鏡写真を示す。
【０１０５】
４時間の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）および２時間の再灌流で処理されたＣ６細胞において、ＳＩＲＴ１タンパク質発現に対するＲＭＥまたはＨＦＥの影響を免疫蛍光法により調べた。ＲＭＥまたはＨＦＥは、４時間のＯＧＤのあいだ培地に添加され、３７℃においてＯＧＤの終了の直後のさらなる２時間において通常の培地に添加された。４時間ＯＧＤおよび２時間再灌流で処理したＣ６細胞において、５０μｇ／ｍｌあるいは１００μｇ／ｍｌのいずれにおいてもＲＭＥおよびＨＦＥではＳＩＲＴ１蛍光が増加した。
【０１０６】
ラットＬ−６筋原細胞株（ＡＴＣＣ）は、５％ＣＯ２を用いた加湿インキュベーター内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を伴うＤＭＥＭ中で３７℃において単層として増殖させた。Ｌ−６細胞（０．５ｘ１０６）を６ウェルプレートに播いた。プレートに播いた４８時間後に実験を開始した。Ｌ−６細胞の酸素・グルコース欠乏（ＯＧＤ）のためには、培養培地を低糖性培地に置き換え、気密ビラップスチェンバー中に置き、４時間に渡り９５％Ｎ２／５％ＣＯ２を流した。ＯＧＤ処理の後、低糖性培地を通常の培地に置き換え、ＲＭＥ、ＨＦＥ、もしくはＲＭＥ／ＨＦＥの混合物を加えて、または加えないで、インキュベーターに２０時間戻した。処理後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの溶解バッファー中でこそぎ取ることによって収穫した。ブラッドフォードアッセイ（バイオ・ラッドタンパク質アッセイキット）によって測定された８０マイクログラムのタンパク質を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを使用して電気泳動分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＳＩＲＴ１（１：５００）、ＣＬＯＣＫ（１：２０００）、Ｂｍａｌ１（１：１０００）、またはβ−アクチン（１：１０００）のうちのいずれか１つに対する一次抗体を含む、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０含有オデッセイブロッキングバッファー中において、メンブレンを室温にてインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、メンブレンを、抗マウスまたは抗ウサギＩＲＤｙｅ二次抗体（１：１０，０００）と共に１時間室温でインキュベートした。オデッセイＣＬｘ画像装置を用いて定量的ＩＲウェスタンブロット検出を行った。データは、一元配置分散分析により分析した後、フィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定により群間平均差の事後分析を行った。異なる上付き記号は群間の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１０７】
図３Ａに示すように、ＯＧＤ処理されたＬ−６細胞において、ＳＩＲＴ１レベルはＲＭＥおよび／またはＨＦＥによって上昇する。タンパク質の定量化された量は図３Ｂに示されており、これは、対照と比較して有意に増加したＳＩＲＴ１レベルの量を実証している。個別のＲＭＥまたはＨＦＥのみで処理された細胞と比較して、ＲＭＥ＋ＨＦＥの混合物で処理された細胞においてはＳＩＲＴ１発現に対する追加的な効果が観察されている。
【０１０８】
図４は、ＯＧＤ処理されたＬ−６細胞において、ＣＬＯＣＫタンパク質レベルがＲＭＥおよび／またはＨＦＥによって上昇したことを示している。ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方は、ＯＧＤ処理されたＬ６骨格筋細胞においてＣＬＯＣＫタンパク質発現を有意に増強させている。個別のＲＭＥまたはＨＦＥのみで処理された細胞と比較して、ＲＭＥ＋ＨＦＥの混合物で処理された細胞においてはＣＬＯＣＫ発現に対しても追加的な効果が観察されている。
【０１０９】
図５は、ＯＧＤ処理されたＬ−６細胞において、Ｂｍａｌ１タンパク質レベルがＲＭＥおよび／またはＨＦＥによって上昇したことを示している。ＲＭＥ、ＨＦＥ、またはその両方は、ＯＧＤ処理されたＬ６骨格筋細胞においてＢｍａｌ１タンパク質発現を有意に増強させている。個別のＲＭＥまたはＨＦＥのみで処理された細胞と比較して、ＲＭＥ＋ＨＦＥで処理された細胞においては追加的な効果が観察されている。
【０１１０】
全体として、概日リズム障害に関係する５つの重要なタンパク質（ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、およびＳＩＲＴ１）の発現を制御する方法が記述され、この方法は、ラットＣｒ脳神経膠腫細胞、ラットＬ−６筋原細胞、およびＩＰＥＣ−２細胞において、平常条件および酸化ストレス条件下で発現を調節するという性質を有する。ＲＭＥ、ＨＦＥのどちらの抽出物も、それぞれ、すべての細胞種において概日時計タンパク質の発現を有意に調節し、酸化ストレスにより誘導され、概日リズムに関係する重要タンパク質の低減により同定される、細胞ダメージを逆転させる。これらの結果は、ＲＭＥおよびＨＦＥの抽出物が、対象において概日リズムの破損を減弱させる、または、概日リズムを調節するための新規アプローチとして有用であることを示している。
【０１１１】
［ウルソール酸は概日リズムタンパク質の発現を増強させる］
ｉＰＥＣ−１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および必要な補助剤を伴うＤＭＥＭ中で３７℃にて、５％ＣＯ２を用いた加湿インキュベーター内で、単層として増殖させた。ｉＰＥＣ−１細胞を３５ｍｍ皿上に播いた。プレートに播いた４８時間後に実験を開始した。培地中、食塩水または３つの異なる量（１μＭ、５μＭ、および２０μＭ）のウルソール酸で、３７℃において２４時間細胞を処理した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温において１０分間固定し、それから０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％正常ヤギ血清ブロッキング溶液を含むＰＢＳ中で細胞を１時間インキュベートした。標的特異的抗体（ＳＩＲＴ１、ＣＬＯＣＫ、およびＢｍａｌ１）を用いて４℃で一晩、細胞を免疫蛍光染色に付した。それから細胞を冷ＰＢＳで３分間ずつ３回洗浄し、Ａｌｅｘａ標識二次抗体（インビトロジェン）と共に室温で１時間インキュベートした。蛍光顕微鏡（ニコンＴＥ２０００−Ｓ顕微鏡、ニコン社、日本国東京）によって細胞を調べた。
【０１１２】
ウルソール酸との２４時間のインキュベーションは、免疫蛍光染色により証明されるように、試験されたウルソール酸の３つの濃度の全てにおいて、対照と比較してＳＩＲＴ１、ＣＬＯＣＫ、およびＢｍａｌ１の免疫蛍光の強度を有意に引き上げた。
【０１１３】
本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者に通常理解される意味を有することが意図される。そのような用語は、様々な標準的参考文献において定義され文脈での使用が示されており、そのような標準的参考文献の例としては、J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001；F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002；B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002；D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004；Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3rd Ed., Elsevier Science, 2005；Gosling, J. P., Immunoassays: A Practical Approach, Practical Approach Series, Oxford University Press, 2005；Antibody Engineering, Kontermann, R. and Dubel, S. (Eds.), Springer, 2001；Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988；Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002；J. D. Pound (Ed.) Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press; 2nd ed., 1998；B.K.C. Lo (Ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003；およびKohler, G. and Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)が挙げられ、これら各々の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
従来的な生物学的技術が関わる方法が本明細書に記述される。そのような技術は本技術分野において一般的に知られており、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001；Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な更新あり）；およびShort Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., 52 ed., Wiley-Interscience, New York, 2002のような方法論専門書に詳細に説明されている。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降、および免疫ブロッティング）は、例えばCurrent Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, New York, 1991；およびMethods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, New York, 1992に記述されている。
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20. Hardeland R, Coto-Montes A, Poeggeler B: Circadian rhythms, oxidative stress, and antioxidative defense mechanisms. Chronobiol.Int. 20:921-962, 2003.
21. 米国出願公開第2011/0076349号
22. 国際公開第2001/080818 A1号
【０１１５】
上記説明の技術分野における当業者には、本明細書中に示され説明されたものに加えて本発明の様々な改変が明らかになるであろう。そのような改変も添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
【０１１６】
全ての試薬は、特に指定されない限り、本技術分野において知られる供給源により入手可能であることが理解される。
【０１１７】
本明細書において言及される特許、刊行物、および出願は、本発明が関係する技術分野の当業者の水準を示すものである。これらの特許、刊行物、および出願は、個々の特許、刊行物、または出願がそれぞれ参照により本明細書において特定されかつ個別に組み入れられている場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１８】
上記説明は本発明の特定の側面を例示するものであるが、その発明の実施についての限定として意図されるものではない。下記の特許請求の範囲（その全ての等価物を含む）が本発明の範囲を規定することが意図される。
＜付記＞
＜１＞
概日リズム関連タンパク質の発現に関連する疾患または状態の治療または予防のための組成物であって、
ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分もしくは活性成分、またはそれらの組合せの有効量を含み、前記抽出物は、概日リズムに関連する疾患または状態の処置を必要とする対象に投与して前記対象における前記疾患または状態の症状を寛解、予防、または調節するために製剤され、前記有効量は、前記対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変させるために十分な量である、
組成物。
＜２＞
抽出物は水抽出物である、＜１＞に記載の組成物。
＜３＞
抽出物がサプリメントにおける成分である、＜１＞に記載の組成物。
＜４＞
前記投与は１日あたり１回である、＜１＞に記載の組成物。
＜５＞
前記抽出物はローズマリーの抽出物であり、前記タンパク質はＢＭＡＬ１タンパク質である、＜１＞に記載の組成物。
＜６＞
前記抽出物はローズマリーの抽出物であり、前記タンパク質はＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはそれらの組合せである、＜１＞に記載の組成物。
＜７＞
前記抽出物はローズマリーの抽出物であり、前記タンパク質はＳＩＲＴ１である、＜１＞に記載の組成物。
＜８＞
前記抽出物はｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物であり、前記タンパク質はＣＬＯＣＫである、＜１＞に記載の組成物。
＜９＞
前記抽出物はｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物であり、前記タンパク質はＢＭＡＬ１である、＜１＞に記載の組成物。
＜１０＞
前記抽出物はｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物であり、前記タンパク質はＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはそれらの組合せである、＜１＞に記載の組成物。
＜１１＞
前記抽出物はｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物であり、前記タンパク質はＳＩＲＴ１である、＜１＞に記載の組成物。
＜１２＞
前記疾患または状態は時差ぼけである、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜１３＞
前記投与は、時差が関わる旅行の前または後における投与である、＜１２＞に記載の組成物。
＜１４＞
前記疾患または状態は二日酔いである、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜１５＞
前記抽出物は、アルコールを消費する前、間、もしくは後、またはそれらの組合せにおいて投与される、＜１４＞に記載の組成物。
＜１６＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する代謝性状態である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜１７＞
前記代謝性状態は、コレステロールのレベルの異常、肥満、メタボリック症候群もしくはその要素、高血糖、低血糖、インスリン産生の異常、または糖尿病である、＜１６＞に記載の組成物。
＜１８＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する炎症性障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜１９＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する神経性障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜２０＞
前記神経性障害はアルツハイマー病である、＜１９＞に記載の組成物。
＜２１＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する筋障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜２２＞
前記筋障害は筋ジストロフィーまたはミオパチーである、＜２１＞に記載の組成物。
＜２３＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する睡眠障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜２４＞
前記睡眠障害は、不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退症候群（ＤＳＰＳ）、睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）、非２４時間睡眠覚醒障害、または不規則型睡眠・覚醒パターンである、＜２３＞に記載の組成物。
＜２５＞
前記投与は、光に晒される−４時間〜１２時間後において、または０時間〜１２時間後においてなされる、＜２４＞に記載の組成物。
＜２６＞
前記投与は、光に晒される１時間〜３時間後において、または光に晒される１０〜１４時間後においてなされる、＜２４＞に記載の組成物。
＜２７＞
前記投与は、光に晒される４時間〜０時間前においてなされる、＜２４＞に記載の組成物。
＜２８＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する精神障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜２９＞
前記精神障害は、うつ、季節性感情障害、認知症、または急速交代型双極性障害である、＜２８＞に記載の組成物。
＜３０＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する心血管障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３１＞
前記心血管障害は、血圧異常または心拍異常である、＜３０＞に記載の組成物。
＜３２＞
前記心血管障害は、アテローム性動脈硬化症または心筋症である、＜３０＞に記載の組成物。
＜３３＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する肝毒性である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３４＞
前記疾患または状態は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、またはＳＩＲＴ１のうちの１つまたは複数の発現特性に関連する脳障害である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３５＞
前記脳障害は、脳卒中、またはフリーラジカルによる脳変性である、＜３４＞に記載の組成物。
＜３６＞
前記組成物は必要に応じて投与される、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３７＞
前記タンパク質はＳＩＲＴ１ではない、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３８＞
前記抽出物は１０重量％以上のウルソール酸を含む、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜３９＞
前記抽出物は２５重量％以上のウルソール酸を含む、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４０＞
前記抽出物はウルソール酸からなる、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４１＞
前記投与は２週間以上の期間に渡ってなされる、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４２＞
前記投与は４週間以上に渡ってなされる、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４３＞
前記投与は３ヶ月間以上に渡ってなされる、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４４＞
前記投与は１日あたり１回、２回、３回、または４回なされる、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４５＞
前記サプリメントは、粉末、ゲル、液体、食品、固形物、またはその他の形態である、＜３＞に記載の組成物。
＜４６＞
必要とする対象において肥満を治療または予防するための組成物であって、
ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分もしくは活性成分、またはそれらの組合せを含み、前記抽出物は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せの発現特性に関連する肥満の治療または予防を必要とする対象に投与し、前記対象において肥満を寛解、予防、または調節するためのものであり、前記有効量は、前記対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変させるために十分な量である、
組成物。
＜４７＞
必要とする対象において癌を治療または予防するための組成物であって、
ローズマリーの抽出物、ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａの抽出物、その活性部分もしくは活性成分、またはそれらの組合せを含み、前記抽出物は、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せの発現特性に関連する癌の治療または予防を必要とする対象に投与し、前記対象において癌を寛解、予防、または調節するためのものであり、前記有効量は、前記対象において、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ２１、ＳＩＲＴ１、またはこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の１つまたは複数の発現特性を改変させるために十分な量である、  組成物。
＜４８＞
実質的に本明細書に記載されている通りの方法。
＜４９＞
実質的に本明細書に記載されている通りの組成物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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