(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、前記農作物から抽出された抽出液に対して、前記抽出液中に含まれる前記残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用して前記残留農薬を定量するに当たって、当該定量を実施する前に前記抽出液に対して実施されるイムノアッセイ法を用いた残留農薬検査のための前処理方法であって、
前記抽出液にカゼインを混合処理する前処理方法。
【請求項２】
前記ポリフェノールは、カテキン及びタンニンのいずれか一方又は両方である
請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
前記カゼインは、スキムミルク由来のカゼインである
請求項１又は請求項２に記載の前処理方法。
【請求項４】
前記残留農薬は、水溶性の農薬である
請求項１−請求項３のいずれか一項に記載の前処理方法。
【請求項５】
前記水溶性の農薬は、ネオニコチノイド系の農薬である
請求項４に記載の前処理方法。
【請求項６】
前記ネオニコチノイド系の農薬は、アセタミプリド、チアクロプリド、イミダクロプリド、チアメトキサム、クロチアニジン、ジノテフラン、ニテンピラムである
請求項５に記載の前処理方法。
【請求項７】
前記ポリフェノールを含む農作物は、茶である
請求項１−請求項６のいずれか一項に記載の前処理方法。
【請求項８】
ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、前記農作物から抽出された抽出液に対して、前記抽出液中に含まれる前記残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用した定量方法で前記残留農薬を定量する残留農薬検査方法であり、
前記定量を実施する前に、前記抽出液にカゼインを混合処理する
残留農薬検査方法。
【請求項９】
前記定量方法は、エライザ法（間接競合法）、エライザ法（直接競合法）、イムノクロマト法、及び、表面プラズモン共鳴法のうちいずれか１つである
請求項８に記載の残留農薬検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノールを含む農作物に対する残留農薬検査の前処理方法、及び前記農作物の残留農薬検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物に残留する農薬検査の自主検査において、イムノアッセイ法による検査は、機器分析法と比べ、迅速、簡便かつ安価な測定法であるため、注目されている。しかし、農作物に含まれる成分による測定の妨害が指摘されている。
【０００３】
例えば、茶の抽出液中の有機塩素系殺菌剤クロロタロニルをエライザ法により測定する場合、茶に由来する成分の影響により、クロロタロニルの抗体との反応性が変化することが明らかになっている。このような夾雑成分を取り除く手段として、ミニカラム（Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ６０ｍｇ、ｗａｔｅｒｓ社製）による前処理方法がある。このミニカラムを用いた前処理方法を用いて、クロロタロニルのような脂溶性の農薬に対する検査が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】畠山えり子、外３名、「エライザ法による茶葉中のクロロタロニルの残留分析」、日本農薬学会誌、日本農薬学会、平成２０年１１月２０日、第３３巻、第４号、ｐｐ．３８７−３９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、水溶性の農薬については、エライザ法を含むイムノアッセイ法を用いた前処理方法は確立されておらず、夾雑成分の影響により農薬の測定が妨害されるという問題があった。
【０００６】
このような問題を解決するために、本発明者らは、茶に含まれる夾雑成分を捕捉する技術について検討し、その結果、農薬の測定が可能となる簡便な方法を見出した。
以下に説明する技術は上記知見に基づいて完成されたものであり、その目的の一つはポリフェノールを含む農作物に対する残留農薬検査のための前処理方法、及び前記農作物の残留農薬検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に説明する前処理方法は、ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、農作物から抽出された抽出液に対して、抽出液中に含まれる残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用して残留農薬を定量するに当たって、当該定量を実施する前に抽出液に対して実施されるイムノアッセイ法を用いた残留農薬検査のための前処理方法であって、抽出液にカゼインを混合処理することを特徴とする。
【０００８】
また、残留農薬検査方法は、ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、農作物から抽出された抽出液に対して、抽出液中に含まれる残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用した定量方法で残留農薬を定量する残留農薬検査方法であり、定量を実施する前に、抽出液にカゼインを混合処理することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）は、実施例１で得られたスキムミルク未処理の試料（試料１〜１０）の測定結果を示すグラフである。図１（ｂ）は、実施例１で得られたスキムミルク処理を行った試料（試料１１〜２０）の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２（ａ）は、実施例２でアセタミプリド０ｐｐｂの濃度から調製された試料の測定結果を示すグラフである。図２（ｂ）は、実施例２でアセタミプリド５０ｐｐｂの濃度から調製された試料の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３で得られた試料（試料５０〜６１）の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４はイムノアッセイにおけるスキムミルク処理を行った模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明の作用効果を検証するために行った実施形態について説明するが、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。
なお、以下に説明する実施形態においては、別に記載しない限り、以下の材料を用いる。アセタミプリドとしては、林純薬工業株式会社の５２２２０を用いる。カテキンの粉末としては、和光純薬工業株式会社のコードＮｏ．０３２−１８２３１、カテキン混合物、緑茶由来を用いる。カゼインとしては、カゼインを含有するスキムミルクの粉末を用い、スキムミルクの粉末としては、和光純薬工業株式会社のコードＮｏ．１９８−１０６０５、スキムミルク粉末を用いる。
【００１１】
［実施例１：茶の浸出液に対するアセタミプリドの濃度の測定］
検体試料は、ポリフェノールを含む農作物として茶を用い、一般的に市販されている緑茶を用意した。茶の抽出方法は、まず、１００℃で湯煎しながら、茶葉３ｇに１００℃の沸騰水５０ｍＬ加え、５分放置した。その後、湯煎から外し、室温で１時間静置した後、４℃で一晩静置した。このような抽出方法によって湯中に抽出される茶の成分には、カテキンやタンニンなどのポリフェノールが含まれるものと考えられる。５０００ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、上清を茶の浸出液（以下、浸出液Ａと称する）とした。
【００１２】
なお、厚生労働省医薬品食品局食品安全部長通知第０１２４００号における通知法では、１００℃の沸騰水５０ｍＬに検体試料１ｇを浸出させた抽出方法がある。以下に記載の実施形態では、この通知法よりもあえて濃度の高い茶の浸出液Ａを用いた。これにより、抗原抗体反応を利用した残留農薬の測定において、夾雑成分による測定の妨害と、その夾雑成分の影響を排除する効果とを明瞭にし、また、各種茶に対応可能なことを確認した。
【００１３】
以下の手順１−１、手順１−２、手順１−３、手順１−４、手順１−５、手順１−６、手順１−７、手順１−８を順に行い、各試料を対象にして吸光度を測定した。
手順１−１．蒸留水を使用して、蒸留水中のアセタミプリドの濃度が０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂとなるように試料を調製した。
手順１−２．上記浸出液Ａを使用して、浸出液Ａ中のアセタミプリドの濃度が０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂとなるように試料を調製した。
手順１−３．上記手順１−１で調製したアセタミプリド濃度０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂの各試料と、蒸留水とをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、それぞれ試料１、２、３、４、５とした。この試料１〜５をエライザ測定のサンプル液とした。
手順１−４．上記手順１−２で調製したアセタミプリド濃度０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂの各試料と、蒸留水とをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、それぞれ試料６、７、８、９、１０とした。この試料６〜１０をエライザ測定のサンプル液とした。
手順１−５．上記手順１−１で調製したアセタミプリド濃度０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂの各試料と、４％スキムミルクとをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、それぞれ試料１１、１２、１３、１４、１５とした。この試料１１〜１５をエライザ測定のサンプル液とした。
手順１−６．上記手順１−２で調製したアセタミプリド濃度０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂの各試料と、４％スキムミルクとをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、それぞれ試料１６、１７、１８、１９、２０とした。この試料１６〜２０をエライザ測定のサンプル液とした。
手順１−７．また、アセタミプリドを含有しない試料も用意した。具体的には、蒸留水に、蒸留水又は４％スキムミルクをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、エライザ測定のサンプル液とした。さらに、浸出液Ａに、蒸留水又は４％スキムミルクをそれぞれ等量ずつ混合した後、５分ゆっくり振とうし、エライザ測定のサンプル液とした。
手順１−８．上記手順１−３、上記手順１−４、上記手順１−５、上記手順１−６、上記手順１−７から得られたエライザ測定のサンプル液を対象にして、エライザ法（間接競合法）により吸光度を測定した。なお、エライザ法（間接競合法）については後から詳述する。
【００１４】
その結果を図１（ａ）及び図１（ｂ）に示す（ただし、図１（ａ）及び図１（ｂ）は横軸が対数目盛のグラフであるため、各グラフ中には０．１、１、１０、１００、１０００ｐｐｂの各試料について表記した）。なお、図１中の測定結果は、平均±標準偏差（ｎ＝４）で示した。
【００１５】
図１（ａ）に示すようにスキムミルク未処理の場合（試料１〜１０）、試料６〜１０の吸光度は、試料１〜５の吸光度に比べて、低かった。この吸光度の低下は、アセタミプリドを抗原とする抗原抗体反応の反応性の低下を意味し、茶の浸出液Ａ中のカテキン、タンニンなどの成分が抗原抗体反応を妨害していることが考えられた。一方、図１（ｂ）に示すスキムミルク処理を行った場合（試料１１〜２０）、試料１６〜２０の吸光度は、試料１１〜１５の吸光度とほとんど一致した。このことは、スキムミルク処理を行うことにより、アセタミプリドが、茶の浸出液Ａ中に存在していても、蒸留水中に存在しているときとほとんど同じ抗原抗体反応の反応性を示すことを意味する。すなわち、スキムミルク未処理の場合、茶の浸出液Ａ中のカテキン、タンニンなどの夾雑成分により抗原抗体反応の妨害が生じるが、スキムミルク処理を行うことにより、この妨害が回避された。
【００１６】
さらに、試料１６〜２０の吸光度に基づいて検量線を作成したところ、試料１１〜１５の吸光度に基づいて作成された検量線とほぼ一致する検量線が得られた。したがって、スキムミルク処理を施せば、茶の浸出液Ａ中の夾雑成分の影響を排除することができ、アセタミプリドの正確な測定が可能になるものと考えられる。つまり、アセタミプリド濃度が既知の試料に対してスキムミルク処理を施してから吸光度を測定し、その測定結果に基づいて検量線を作成すれば、茶の浸出液中のアセタミプリド濃度を定量するに当たっては、既知の試料に対して施したスキムミルク処理と同等なスキムミルク処理を茶の浸出液に対して施してから吸光度を測定し、その測定結果と上述の検量線とに基づいて、茶の浸出液中のアセタミプリド濃度を定量することができる。
【００１７】
［実施例２：カテキン溶液に対するアセタミプリドの濃度の測定］
以下の手順２−１、手順２−２、手順２−３、手順２−４を順に行い、各試料を対象にして吸光度を測定した。
手順２−１．１０％メタノール溶液を使用して、１０％メタノール溶液中のカテキンの濃度が０、１００、３００、４００、５００、８００、１０００、３０００μｇ／ｍＬとなるように試料を調製した。
手順２−２．４％スキムミルク溶液を利用して、４％スキムミルク溶液中のアセタミプリドの濃度が０、５０ｐｐｂとなるように試料を調製した。
手順２−３．蒸留水を利用して、蒸留水中のアセタミプリドの濃度が０、５０ｐｐｂとなるように試料を調製した。
手順２−４．上記手順２−１で調製した各試料と、上記手順２−２で調製した各試料とを等量ずつ混合した後、１５分静置し、エライザ測定のサンプル液とした。また、上記手順２−１で調製した各試料と、上記手順２−３で調製した各試料とを等量ずつ混合した後、１５分静置し、エライザ測定のサンプル液とした。これらのサンプル液を対象にして、エライザ法（間接競合法）により吸光度を測定した。なお、エライザ法（間接競合法）については後から詳述する。
【００１８】
その結果を図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す。
図２（ｂ）に示されるように、アセタミプリドを含有する試料の場合、スキムミルク処理を行わないと（図２（ｂ）中の左側にあるグラフ参照。）、カテキン濃度０μｇ／ｍＬに比べ、カテキン濃度が高くなるにしたがい、吸光度が大きく低下した。この吸光度の低下は、アセタミプリドを抗原とする抗原抗体反応の反応性が変化したことを意味する。アセタミプリドを含有する溶液では、カテキンの濃度が高くなるにしたがい抗原抗体反応の反応性が変化することから、カテキンが抗原抗体反応を妨害したと考えられた。一方、アセタミプリドを含有する試料の場合、スキムミルク処理を行うと（図２（ｂ）中の右側にあるグラフ参照。）、カテキンの濃度が高くなっても、試料の吸光度はほとんど低下せず、カテキン濃度が０μｇ／ｍＬのときの吸光度とほぼ同じ値を示した。このことは、スキムミルク処理を行えば、カテキン溶液の濃度が高くなっても、抗原抗体反応の反応性が変化しないことを意味する。すなわち、アセタミプリドを含有する溶液では、スキムミルク未処理の場合、夾雑成分であるカテキンにより抗原抗体反応の妨害が生じるが、スキムミルク処理を行うことにより、この抗原抗体反応の妨害が回避された。
【００１９】
また、図２（ａ）に示されるように、アセタミプリドを含有しない試料の場合も、アセタミプリドを含有する試料の場合（図２（ｂ））と同様の吸光度の変動が示された。このようにアセタミプリドを含有していても含有していなくても、同様の吸光度の変動が示されたことから、スキムミルク処理を行わない場合（図２（ａ）中の左側及び図２（ｂ）中の左側にあるグラフ参照。）、カテキン濃度が高くなるにしたがい、吸光度が低下するという原因が抗原抗体反応の低下である可能性が示された。
【００２０】
さらに、このような抗原抗体反応の妨害の回避は、正確なアセタミプリドの濃度の定量を実現可能とする。つまり、アセタミプリド濃度が既知の試料に対してスキムミルク処理を施してから吸光度を測定し、その測定結果に基づいて検量線を作成すれば、カテキン溶液中のアセタミプリド濃度を定量するに当たっては、既知の試料に対して施したスキムミルク処理と同等なスキムミルク処理をカテキン溶液に対して施してから吸光度を測定し、その測定結果と上述の検量線とに基づいて、カテキン溶液中のアセタミプリド濃度を定量することができる。
【００２１】
［実施例３：スキムミルク処理後、限外ろ過処理を行った試料に対するアセタミプリドの濃度の測定］
以下の手順３−１、手順３−２、手順３−３、手順３−４、手順３−５、手順３−６、手順３−７、手順３−８、手順３−９、手順３−１０を順に行い、各試料を対象にして吸光度を測定した。
手順３−１．まず、遠心ろ過デバイス（略称：マイクロセップ１０Ｋ、製品名：マイクロセップ  アドバンス  遠心ろ過デバイスマイクロセップ１０Ｋ、製造元コード：ＭＣＰ０１０Ｃ４１、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）に１０００μｇ／ｍＬのカテキン溶液４ｍＬを添加した後、７５００ｇで５分間遠心分離した。さらに、蒸留水４ｍｌを添加した後、７５００ｇで５分間遠心分離して洗浄を行い、遠心ろ過デバイスのプレトリートメントを行った（プレトリートメントを行った遠心ろ過デバイスを、以下、遠心ろ過デバイスＰと称する）。このプレトリートメントは、次に続く手順の限外ろ過処理において、茶成分中のカテキン及びタンニンなどの夾雑成分が、遠心ろ過デバイスに吸着するのを防ぐために行った。
手順３−２．蒸留水、実施例１で抽出した茶の浸出液Ａ、１０００μｇ／ｍＬカテキン溶液の各溶液に対して、蒸留水を等量ずつ混合し、混合液を作製し、それぞれ混合液Ｂ、混合液Ｃ、混合液Ｄとした。次に、この混合液Ｂ、Ｃ、Ｄに対して、遠心ろ過デバイスＰを用いて限外ろ過の処理を行う場合と限外ろ過の処理を行わない場合に分けた。
手順３−３．蒸留水、実施例１で抽出した茶の浸出液Ａ、１０００μｇ／ｍＬカテキン溶液の各溶液に対して、４％スキムミルク溶液を等量ずつ混合し、混合液を作製し、それぞれ混合液Ｅ、混合液Ｆ、混合液Ｇとした。次に、この混合液Ｅ、Ｆ、Ｇに対して、遠心ろ過デバイスＰを用いて限外ろ過の処理を行う場合と限外ろ過の処理を行わない場合に分けた。
手順３−４．限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−２で混合した混合液Ｂを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｈを取り出した。また、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−２で混合した混合液Ｃを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｉを取り出した。また、同様に、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−２で混合した混合液Ｄを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｊを取り出した。
手順３−５．限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−３で混合した混合液Ｅを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｋを取り出した。また、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−３で混合した混合液Ｆを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｌを取り出した。また、同様に、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスＰに、１ｍＬの上記手順３−３で混合した混合液Ｇを添加した後、７５００ｇで５０分間遠心分離し、ろ液Ｍを取り出した。
手順３−６．上記手順３−２で混合した混合液Ｂを利用して、混合液Ｂ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５０とした。また、上記手順３−２で混合した混合液Ｃを利用して、混合液Ｃ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５４とした。また、同様に、上記手順３−２で混合した混合液Ｄを利用して、混合液Ｄ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５８とした。これらの試料５０、５４、５８をエライザ測定のサンプル液とした。
手順３−７．上記手順３−３で混合した混合液Ｅを利用して、混合液Ｅ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５２とした。また、上記手順３−３で混合した混合液Ｆを利用して、混合液Ｆ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５６とした。また、同様に、上記手順３−３で混合した混合液Ｇを利用して、混合液Ｇ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料６０とした。これらの試料５２、５６、６０をエライザ測定のサンプル液とした。
手順３−８．上記手順３−４で限外ろ過処理をしたろ液Ｈを利用して、ろ液Ｈ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５１とした。また、上記手順３−４で限外ろ過処理をしたろ液Ｉを利用して、ろ液Ｉ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５５とした。また、同様に、上記手順３−４で限外ろ過処理をしたろ液Ｊを利用して、ろ液Ｊ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５９とした。これらの試料５１、５５、５９をエライザ測定のサンプル液とした。
手順３−９．上記手順３−５で限外ろ過処理をしたろ液Ｋを利用して、ろ液Ｋ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５３とした。また、上記手順３−５で限外ろ過処理をしたろ液Ｌを利用して、ろ液Ｌ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料５７とした。また、同様に、上記手順３−５で限外ろ過処理をしたろ液Ｍを利用して、ろ液Ｍ中のアセタミプリドの濃度が５０ｐｐｂとなるように試料を調製し、試料６１とした。これらの試料５３、５７、６１をエライザ測定のサンプル液とした。
手順３−１０．上記手順３−６、上記手順３−７、上記手順３−８、上記手順３−９、から得られたエライザ測定のサンプル液を対象にして、エライザ法（間接競合法）により吸光度を測定した。なお、エライザ法（間接競合法）については後から詳述する。
【００２２】
その結果を図３に示す。なお、図３中の測定結果は、平均±標準偏差（ｎ＝４）で示した。
図３の結果について、スキムミルク処理と限外ろ過処理とをともに行わなかった場合、スキムミルク処理を行わずに限外ろ過処理を行った場合、スキムミルク処理を行った後に限外ろ過処理を行わなかった場合、及び、スキムミルク処理を行った後に限外ろ過処理を行った場合、をそれぞれ、条件１、条件２、条件３、条件４と称して、以下に説明する。
【００２３】
図３に示すように、スキムミルク処理を行った試料５２の吸光度は、スキムミルク処理後に限外ろ過処理を行う（条件４）（試料５３）ことにより、吸光度が上がった。この結果から、スキムミルクは遠心ろ過デバイスに残渣として残り、試料からスキムミルクが除去されたことが分かった。
【００２４】
また、試料５４の吸光度は、試料５０の吸光度に比べて低下し、試料５４に限外ろ過処理を行うと（試料５５）、吸光度は上がるが、試料５１の吸光度まで上昇しなかった。試料５４の吸光度が試料５０の吸光度に比べて低下したことは、茶の浸出液Ａ中のカテキン、タンニンなどの成分が測定の妨害を行ったことによる。そして、茶由来のカテキンの吸着を防止する遠心ろ過デバイスのプレトリートメント処理をしたにもかかわらず、限外ろ過処理を行うと（試料５５）、茶由来のカテキンが遠心ろ過デバイスに少し吸着することにより、吸光度が限外ろ過未処理の場合（試料５４）に比べて少し上がり、測定の妨害が少なくなった。しかし、その上昇は試料５１の吸光度まで上昇しなかったことから、遠心ろ過デバイスが茶由来の夾雑成分を完全には吸着せず、試料には夾雑成分が残っていることが分かった。
【００２５】
一方、試料５６の吸光度は、試料５２の吸光度とほとんど同じ値を示した。このことは、スキムミルク処理により茶の浸出液Ａ中のカテキン、タンニンなどの成分による測定の妨害が回避され、蒸留水と同等の影響を受けたと考えられる。そして、試料５６に限外ろ過処理を行うと（試料５７）、吸光度は上昇し、試料５３の吸光度にまで上昇した。つまり、スキムミルク処理後に限外ろ過処理を施すことにより（条件４）、測定の妨害が回避されたことは、スキムミルクと茶の浸出液Ａ中のカテキン、タンニンなどの夾雑成分とが、遠心ろ過デバイスに残渣として残ったことを意味する。この点と上述のスキムミルクは遠心ろ過デバイスに残渣として残る点、及び、夾雑成分は遠心ろ過デバイスにほとんど吸着しないという点から、夾雑成分がスキムミルクに吸着することが分かった。そのため、試料５６からカテキン、タンニンなどの夾雑成分を除去することができ、夾雑成分による測定への影響が省かれた。
【００２６】
さらに、試料５８〜６１のカテキンの場合の結果は、試料５４〜５７の茶の場合の結果と同じような傾向を示した。したがって、カテキンがスキムミルクに吸着し、試料からカテキンを除去することにより、カテキンによる測定の妨害が回避されたことが分かった。また、試料５４〜５７の吸光度の変化が現れる要因は、茶中の成分であるカテキン及びカテキンと似た性質であるタンニンが含まれる、と推測された。
【００２７】
［エライザ法（間接競合法）］
本実施形態で用いたエライザ法（間接競合法）の手順について以下に記載する。手順４−１、手順４−２、手順４−３、手順４−４、手順４−５、手順４−６、手順４−７を順に行い、エライザ法（間接競合法）によるサンプル液の測定を行った。
手順４−１．アセタミプリド−ＢＳＡ溶液を０．０１μｇ／ｍＬの濃度で５５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）に溶解した。この溶液を溶液４−１とした。なお、アセタミプリド−ＢＳＡ溶液の作製方法については後から詳述する。
手順４−２．マイクロプレート（製品名：Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ、カタログ番号４４２４０４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）の各ウェルに、１００μＬずつ溶液４−１を添加した。４℃で１晩静置し、アセタミプリド−ＢＳＡをマイクロプレートに固相化した。１晩静置後の溶液を溶液４−２とした。
手順４−３．各ウィル内の溶液４−２を除き、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄液（略称：ＰＢＳ、製品名：リン酸緩衝生理食塩水）で５回洗浄した。その後、ブロッキング液（略称：ＳＢ、製品名：Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号３７５３９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製））を各ウェルに３００μＬ添加して、室温で３０分間静置した。静置後の溶液を溶液４−３とした。
手順４−４．各ウェル内の溶液４−３を除き、上述の実施例１〜３におけるエライザ測定のサンプル液を５０μＬと、ブロッキング液で２μｇ／ｍＬに希釈した抗アセタミプリドモノクローナル抗体を５０μＬと、を添加し、カバー用フィルムを貼り、２時間室温で静置した。静置後の溶液を溶液４−４とした。
手順４−５．各ウェル内の溶液４−４を除き、洗浄液で５回洗浄後、ブロッキング液で１００００倍希釈した２次抗体（製品名：ＥＣＬ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ）、カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を１００μＬ添加し、１時間室温で静置した。静置後の溶液を溶液４−５とした。
手順４−６．各ウェル内の溶液４−５を除き、洗浄液で５回洗浄後、発色基質（略称：ＴＭＢ、製品名：Ｓｕｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、商品コード５３−００−０１、ＫＰＬ製）を１００μＬ添加し、暗所で３０分静置した。静置後の溶液を溶液４−６とした。
手順４−７．溶液４−６に対して、反応停止液（製品名：ＴＭＢストップソリューション、商品コード５０−８５−０５、ＫＰＬ製）を１００μＬ添加し、プレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
【００２８】
［エライザ法（間接競合法）：アセタミプリド−ＢＳＡ溶液の作製方法］
エライザ法（間接競合法）で用いたアセタミプリド−ＢＳＡ溶液の作製方法について以下に記載する。このアセタミプリド−ＢＳＡ溶液は、エライザ法（間接競合法）で使用されるマイクロプレートの固相化のために用いられた。手順５−１、手順５−２、手順５−３、手順５−４を順に行い、アセタミプリド−ＢＳＡ溶液を作製した。
手順５−１．アセタミプリドにカルボキシル基を導入した誘導体をジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液を溶液５−１とした。
手順５−２．溶液５−１の液を２００μＬと、ＤＭＳＯで調製した８０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（略称：ＥＤＣ）を１００μＬと、ＤＭＳＯで調製した８０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（略称：ＮＨＳ）を１００μＬと、を添加した。１．５時間室温でゆっくり撹拌し、溶液５−２とした。
手順５−３．１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍのホウ酸緩衝液（略称：ＢＢ）（ｐＨ８．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（略称：ＢＳＡ）０．５ｍＬに溶液５−２を２００μＬゆっくり添加し、室温で１晩ゆっくり撹拌した。この溶液を溶液５−３とする。
手順５−４．溶液５−３を遠心ろ過デバイス（略称：マイクロセップ１０Ｋ、製品名：マイクロセップ  アドバンス  遠心ろ過デバイスマイクロセップ１０Ｋ、製造元コード：ＭＣＰ０１０Ｃ４１、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）と１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（略称：ＰＢ）を用いて限外ろ過により精製し、アセタミプリド−ＢＳＡ溶液とした。
【００２９】
［イムノアッセイにおけるスキムミルク処理を行った模式図］
上記の結果を、図４の模式図を用いて以下に説明する。
アセタミプリド−ＢＳＡ溶液により、アセタミプリド―タンパク、すなわち、農薬―タンパクを固相化したエライザのプレートを用いる。このプレートに農薬のアセタミプリド、及び、抗農薬抗体である抗アセタミプリドモノクローナル抗体、又は、茶の浸出液Ａを添加する。茶の浸出液Ａを添加しない場合、抗アセタミプリドモノクローナル抗体は、抗原であるアセタミプリドと結合し、抗原抗体反応を生じる。一方、茶の浸出液Ａを添加する場合、茶の浸出液Ａ中のカテキン等の夾雑成分が、抗アセタミプリドモノクローナル抗体や農薬―タンパクなどに付着する等により、抗原抗体反応を妨害する。しかし、スキムミルクを添加する処理を行うと、スキムミルクがカテキンなどの夾雑成分を捕捉することにより、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害を回避することができる。このことから、茶抽出液中の残留農薬を定量する前にスキムミルク処理を行わなかった場合、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害により正確な残留農薬の定量ができないが、スキムミルク処理を行うことにより、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害が回避し、正確な定量が実現可能となる。つまり、ポリフェノールを含む農作物から抽出された抽出液中の農薬を定量する場合、スキムミルク処理を施してから吸光度を測定すれば、農薬が既知の試料も同様のスキムミルク処理を施してから作成された検量線に基づいて、農薬を定量することができる。
【００３０】
［その他の実施形態］
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の具体的な一実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
【００３１】
例えば、上記実施例では、検体試料の抽出液として、検体試料から浸出させる方法の例を示したが、抽出方法はこれに限定されるものではなく、他の抽出方法を用いてもよい。他の抽出方法としては、例えば、以下の方法などを用いることができる。検体試料の茶に倍量の水を加えフードプロセッサーなどで細切し均一化する。この細切し均一化したものをコニカルチューブに分取し、５倍量のメタノールを添加した後、３０分、振とうさせながら抽出する。１８８０ｇで１０分遠心分離し、上清を回収する。この上清をメタノール濃度が５％になるように希釈し、検体試料の抽出液とした。
【００３２】
また、検体試料として、緑茶の例を示したが、検体試料はこれに限定されるものではなく、ポリフェノールを含む農作物であればよい。ポリフェノールを含む農作物の例としては、例えば茶、ブドウ、リンゴ、ブルーベリー、柿、バナナ、イチゴ、ソルダム、ラズベリー、プルーン、桃、紫タマネギ、タマネギ、オリーブ、ホウレンソウ、ブロッコリー、クルミ、オレガノ、セージ、ローズマリー、アーモンド、ココアパウダー、及び、チョコレートなどが挙げられる。茶の例としては、例えば、日本茶（緑茶）、中国茶、及び、紅茶などが挙げられる。
【００３３】
また、ポリフェノールとして、カテキン、タンニンの例を示したが、ポリフェノールはこれに限定されるものではなく、他のポリフェノールであってもよい。
また、農薬として、アセタミプリドの例を示したが、残留農薬はこれに限定されるものではなく、イムノアッセイ法を用いて検査される農薬であればよい。イムノアッセイ法で用いられる農薬の例としては、例えば、アゾキシストロビン、エマメクチン、フェニトロチオン、イソキサチオン、マラチオン、トリフルミゾール、クロロフェナピル、イプロジオン、カルバリル、イソプロチオラン、ミクロブタニル、フルトラニル、ビテルタノール、ボスカリド、トルクロホスメチル、フィプロニル、クロラントラニリブロール、ピリダリル、メパニピリム、クレソキシムメチル、スピノサド、フルフェノクスロン、ブプロフェジン、ジペルメトリン、フェンバレレート、プロシミドン、メチダチオン、クロルピリホス、及び、ホスチアゼートなどが挙げられる。また、残留農薬は、水溶性の農薬及び脂溶性の農薬が挙げられる。水溶性の農薬の例としては、例えばネオニコチノイド系の農薬などが挙げられる。ネオニコチノイド系の農薬の例としては、例えばアセタミプリド、チアクロプリド、イミダクロプリド、チアメトキサム、クロチアニジン、ジノテフラン、ニテンピラムなどが挙げられる。
【００３４】
また、前処理方法として、スキムミルクの混合処理の例を示したが、前処理方法はこれに限定されるものではなく、カゼインを含む溶液の混合処理であればよい。
上記実施例では、４％のスキムミルクを用いたが、１％−２０％に調製されてもよく、特に１％−１０％であってもよい。カゼインは０．３％−７％で使用してもよい。
【００３５】
また、イムノアッセイ法として、エライザ法（間接競合法）を用いたが、イムノアッセイ法はこれに限定されるものではなく、他のイムノアッセイを用いてもよい。他のイムノアッセイ法としては、例えば、エライザ法（直接競合法）、イムノクロマト法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、免疫比濁法、及び、ルミネックス法などを用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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