(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物、
（Ｂ）架橋剤、
（Ｃ）酸化合物、及び
（Ｄ）溶剤
を含有する繊維製造用組成物。
【化１】
0006504508.tif 000020
〔式中、
Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０のアルキル基又は炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基を示す。〕
【化２】
0006504508.tif 000021
〔式中、
Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
【請求項２】
上記Ｑ２が、一般式（５）で表される、請求項１に記載の組成物。
【化３】
0006504508.tif 000022
〔式中、Ｑ３は、Ｎ−スクシンイミド基、ｐ−ニトロフェニル基又はペンタフルオロフェニル基を示す。〕
【請求項３】
上記高分子化合物の重量平均分子量が、１，０００〜１，０００，０００である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
上記溶剤が、極性溶剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を紡糸する工程を含む、繊維の製造方法。
【請求項６】
上記紡糸が、電界紡糸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
紡糸した繊維を、７０〜３００℃の範囲で加熱する工程を含む、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
さらに細胞接着物質を固定化する工程を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法で製造される繊維。
【請求項１０】
請求項９記載の繊維を含む、細胞培養足場材料。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性エステル基とヒドロキシ基を側鎖に有する高分子化合物、架橋剤、酸化合物、及び溶剤を含有する繊維製造用組成物、該組成物を紡糸して（好ましくは、更に加熱して）得られる、有機溶剤耐性に優れた繊維、並びに該繊維を用いた細胞培養足場材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の骨髄や基底膜において、細胞はコラーゲンなどのナノレベルの繊維状構造で構成された細胞外マトリクス中で生育し、増殖している。そのため、細胞医療や再生医療で必要な細胞を提供するためには、生体外において効率よく細胞を培養する細胞培養用の足場材料が求められている。このような細胞培養足場材料は、細胞を取り囲む生体内環境をできるだけ模倣することが好ましい。【０００３】
細胞を生体外にて培養する場合、従来は生体から抽出したコラーゲンなどのマトリクス構成物質をゲルやスポンジ状構造体として加工し、これを培養用の足場とする検討が進められてきた（特許文献１参照）。しかしながら、主にタンパク質からなるこれら生体由来の物質については、オートクレーブやγ線などの滅菌処理に耐えられないことや、使用するまでの長期保存に対する安定性の問題、および力学的な強度や形状安定性などの問題がある。また、これらコラーゲンなどの生体由来物質は、一般的に牛や豚などの動物から抽出されるため、これら動物から感染性物質が混入する危険性がある。【０００４】
そのため、最近では生体から抽出した物質に代わり、合成高分子を材料として使用し、発泡体、ゲル、繊維などの構造体を作製し、これを培養足場とする研究も進められている（特許文献２〜特許文献５参照）。特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）アクリレートエステルモノマー、親水性モノマー、および架橋剤を含む合成ポリマーを細胞培養基材表面に適用することが開示されている（特許文献６参照）。
このうち、電界紡糸法（エレクトロスピニング）と呼ばれる高電圧をかけながら繊維を吹き付ける方法によって、ナノレベルの繊維径を持つナノ繊維（ナノファイバー）で構成された構造体が細胞培養足場材料として注目を浴びている。そのナノ繊維上で細胞医療や再生医療に使用する機能細胞や多能性幹細胞の未分化性を保持したまま培養する試みが多数なされている（非特許文献１〜非特許文献３参照）。しかしながら、このような合成高分子由来の繊維は細胞接着性や増殖性を付与することが難しく、生体内の環境を模倣しているとは言えない。【０００５】
この点を改善するため、ＲＧＤを含む細胞接着性ペプチドを固定化したナノ繊維も検討されている（非特許文献４参照）。この場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルのような活性エステル基を含む合成高分子に細胞接着性ペプチドを固定化するが、高分子が水に溶解しないように、親・疎水性を考慮した共重合体を用いて検討されている。これよりＮＨＳの導入量が制限され、固定化できる細胞接着物質の量も制限され、結果的に細胞培養足場材料の細胞接着性も制限されてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−５０２９３６号公報
【特許文献２】特開昭６２−１２２５８６号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５５９３号公報
【特許文献４】特開２００５−６０５７０号公報
【特許文献５】特開２００７−３２５５４３号公報
【特許文献６】米国特許第８３６２１４４号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６  ｐ５１５８（２００５）
【非特許文献２】Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  １１  ｐ１１４９  （２００５）
【非特許文献３】Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４  ｐ７０１（２０１２）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａ  １００Ａ  ｐ７９４（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化でき、さらに有機溶剤耐性、液体培地耐性を保持する繊維製造のための繊維製造用組成物、該組成物を紡糸して得られる繊維、及び該繊維を用いた細胞培養足場材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、活性エステル基とヒドロキシ基を側鎖に有する高分子化合物、架橋剤、酸化合物、及び溶剤を含有する繊維製造用組成物を紡糸して製造した繊維は、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化でき、また十分な有機溶媒耐性を有し、更には優れた細胞培養足場材料としての機能を有することを見出した。
また本発明者らは、上記繊維製造用組成物の紡糸は、活性エステル基とヒドロキシ基を側鎖に有する高分子化合物を架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することから、高分子化合物に含まれるヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより、高分子化合物同士が架橋する結果、有機溶剤耐性、液体培地耐性を有する繊維が得られることを見出した。
また、本発明者らは、本発明の繊維製造用組成物を紡糸して製造した繊維は、加熱処理を施すことにより、より優れた有機溶剤耐性、液体培地耐性を発現することを見出した。
これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。【００１１】
［１］  （Ａ）一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物、
（Ｂ）架橋剤、
（Ｃ）酸化合物、及び
（Ｄ）溶剤
を含有する繊維製造用組成物。【００１２】
【化１】
0006504508.tif 000002
【００１３】
〔式中、
Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０のアルキル基又は炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基を示す。〕【００１４】
【化２】
0006504508.tif 000003
【００１５】
〔式中、
Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
［２］  上記Ｑ２が、一般式（５）で表される、上記［１］に記載の組成物。【００１６】
【化３】
0006504508.tif 000004
【００１７】
〔式中、Ｑ３は、Ｎ−スクシンイミド基、ｐ−ニトロフェニル基又はペンタフルオロフェニル基を示す。〕
［３］  上記高分子化合物の重量平均分子量が、１，０００〜１，０００，０００である、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］  上記溶剤が、極性溶剤である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］  上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の組成物を紡糸する工程を含む、繊維の製造方法。
［６］  上記紡糸が、電界紡糸である、上記［５］記載の方法。
［７］  紡糸した繊維を、７０〜３００℃の範囲で加熱する工程を含む、上記［５］又は［６］記載の方法。
［８］  さらに細胞接着物質を固定化する工程を含む、上記［５］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］  上記［５］〜［８］のいずれか１つに記載の方法で製造される繊維。
［１０］  上記［９］記載の繊維を含む、細胞培養足場材料。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化でき、さらに有機溶剤耐性、液体培地耐性を保持する繊維製造のための繊維製造用組成物、該組成物を紡糸して得られる繊維、及び該繊維を用いた細胞培養足場材料を提供できる。かかる繊維は、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化することより、細胞培養足場材料としてより優れた機能を発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で１０分間加熱処理した後のＳＥＭ写真である。
【図２】実施例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を８０℃で２４時間加熱処理した後のＳＥＭ写真である。
【図３】実施例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で３０分間加熱処理した後のＳＥＭ写真である。
【図４】実施例１の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で１０分間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図５】実施例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を８０℃で２４時間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図６】実施例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で３０分間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図７】実施例５の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を８０℃で２４時間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図８】比較例２の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を８０℃で２４時間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図９】比較例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で１０分間加熱処理した後、エタノールに１０秒間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図１０】実施例４の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で３０分間加熱処理した後、液体培地に７日間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【図１１】比較例１の繊維製造用組成物から電界紡糸法にて得られた繊維を１８０℃で１０分間加熱処理した後、液体培地に７日間浸漬処理した後のＳＥＭ写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．繊維製造用組成物
本発明の繊維製造用組成物（以下、「本発明の組成物」とも称する）は、（Ａ）一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物、（Ｂ）架橋剤、（Ｃ）酸化合物、及び（Ｄ）溶剤を含有することを、主たる特徴とする。
【００２１】
［成分Ａ］
本発明の組成物は成分Ａとして、一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物（以下、「成分Ａの高分子化合物」又は単に「成分Ａ」とも称する）を含有する。成分Ａに含まれる一般式（１）で表される単位構造は、側鎖にヒドロキシ基を有するため、成分Ａを架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することにより、ヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより高分子化合物同士が架橋し、有機溶剤耐性を有する繊維が得られる。また、成分Ａに含まれる一般式（２）で表される単位構造は、側鎖に活性エステル基を有するため、任意のアミン（タンパク質、ペプチド、有機アミンなど）との求核付加反応によって、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質（細胞接着物質）を固定化することができる。一般式（２）で表される単位構造の活性エステル基と任意のアミンとの反応は、繊維製造用組成物の調製時に行うことが可能であり、さらに繊維製造用組成物を紡糸後、加熱処理後でも行うことが可能である。
【００２２】
【化４】
0006504508.tif 000005
【００２３】
〔式中、
Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
Ｒ２は、少なくとも１個のヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０のアルキル基又は炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基を示す。〕
【００２４】
【化５】
0006504508.tif 000006
【００２５】
〔式中、
Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
【００２６】
一般式（１）及び一般式（２）における各基の定義について、以下に詳述する。
【００２７】
Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示す。
【００２８】
Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、成分Ａの高分子化合物の溶剤に対する溶解性の観点から、好ましくはエステル結合である。
【００２９】
Ｑ２は、活性エステル基を示す。本発明において「活性エステル基」とは、エステル基の片方に電子求引性の置換基を有することによってカルボニル基が活性化された（求核攻撃を受けやすい）エステル基をいい、具体的には、一般式（５）で表されるエステル基である。
【００３０】
【化６】
0006504508.tif 000007
【００３１】
式中、Ｑ３は活性エステル基を形成する１価の有機基（電子求引性基）を示し、その具体例としては、Ｎ−スクシンイミド基、ｐ−ニトロフェニル基及びペンタフルオロフェニル基が挙げられるが、細胞親和性の観点から、好ましくは、Ｎ−スクシンイミド基である。
【００３２】
Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０のアルキル基又は炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基を示す。該炭素原子数１〜１０のアルキル基は直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、その具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。該アルキル基の炭素原子数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜４である。
また、Ｒ２における少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基の「炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基」としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。
Ｒ２は、繊維製造時における架橋反応効率や、製造された繊維の細胞親和性の観点から、好ましくは、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０（より好ましくは１〜６、特に好ましくは１〜４）のアルキル基又は少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されているフェニル基である。
【００３３】
Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示す。
【００３４】
一般式（１）で表される単位構造は、Ｒ１が、水素原子又はメチル基であり、Ｑ１が、エステル結合であり、Ｒ２が、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１〜１０（より好ましくは１〜６、特に好ましくは１〜４）のアルキル基又は少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されているフェニル基であることが好ましい。
【００３５】
一般式（１）で表される単位構造は、好ましくは、一般式（３）で表される単位構造である。
【００３６】
【化７】
0006504508.tif 000008
【００３７】
［式中、Ｒ４は上記Ｒ１と同義であり、Ｒ５は上記Ｒ２と同義である。］
【００３８】
一般式（２）で表される単位構造は、好ましくは、一般式（４）で表される単位構造である。
【００３９】
【化８】
0006504508.tif 000009
【００４０】
［式中、Ｒ６は水素原子又はメチル基である。］
【００４１】
成分Ａの高分子化合物において、一般式（１）で表される単位構造の組成比と一般式（２）で表される単位構造との組成比は、合成のしやすさ、溶剤に対する溶解性、繊維形成のしやすさ、任意のアミンを固定化した際の効果の観点から、（一般式（１）で表される単位構造）／（一般式（２）で表される単位構造）＝（３５〜９５モル％）／（５〜６５モル％）が好ましい。これらの単位構造の組成比は、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定される。
成分Ａの高分子化合物は、本発明の目的を損なわない限り、一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造以外の単位構造を含んでもよいが、成分Ａの高分子化合物の重合性の観点から、成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する一般式（１）で表される単位構造の割合（モル％）は、３５〜９５モル％が好ましく、一般式（２）で表される単位構造の割合（モル％）は、５〜６５モル％が好ましい。また成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する一般式（１）で表される単位構造の割合と一般式（２）で表される単位構造の割合との合計（モル％）は、成分Ａの高分子化合物の重合性の観点から、９０モル％を超えることが好ましく、９５モル％以上がより好ましく、１００モル％が特に好ましい。成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する各単位構造の割合は、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定される各単位構造の組成比から算出できる。
【００４２】
成分Ａの重量平均分子量は、上記組成物を使用した繊維の有機溶媒耐性の観点から、好ましくは１，０００〜１，０００，０００の範囲であり、より好ましくは５，０００〜５００，０００の範囲であり、特に好ましくは１０，０００〜３００，０００の範囲である。本発明において「重量平均分子量」とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて測定される、ポリスチレン換算の分子量をいう。
【００４３】
成分Ａは、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。例えば、一般式（１）で表される単位構造に対応する単量体及び一般式（２）で表される単位構造に対応する単量体を、適当な溶媒（例、アセトニトリル等）中で、適当な重合開始剤（例、２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル等）を使用して重合すること等により製造できるが、これに限定されない。市販品を使用してもよい。
【００４４】
一般式（１）で表される単位構造に対応する単量体としては、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：８６８−７７−９の化合物）、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：９２３−２６−２の化合物）、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：２４７８−１０−６の化合物）、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：９２３−０２−４の化合物）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：５２３８−５６−２の化合物）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：２６０９９−０９−２の化合物）、ｐ−ヒドロキシ（メタ）アクリルアニリド（例えば、ＣＡＳ番号：１９２４３−９５−９の化合物）等が挙げられ、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート又は２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートが好ましく、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートが最も好ましい。
なお、本発明において「（メタ）アクリレート化合物」とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方をいう。例えば、（メタ）アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸の両方をいう。
【００４５】
一般式（２）で表される単位構造に対応する単量体としては、ｐ−ニトロフェニル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：１６５２２−４１−１の化合物）、ペンタフルオロフェニル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：１３６４２−９７−２の化合物）、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＣＡＳ番号：３８８６２−２４−７の化合物）、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＣＡＳ番号：３８８６２−２５−８の化合物）が好ましく、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレートが最も好ましい。
【００４６】
本発明の組成物における成分Ａの含有割合は、適度な太さを有する繊維製造の観点から、５〜５０重量％が好ましく、１０〜４０重量％がより好ましい。
【００４７】
［成分Ｂ］
本発明の組成物は成分Ｂとして、架橋剤（以下、「成分Ｂの架橋剤」又は単に「成分Ｂ」とも称する）を含有する。成分Ｂは、後述の成分Ｃと併用することにより、成分Ａのヒドロキシ基同士を、成分Ｂ自身を介して架橋させることで、繊維に有機溶剤耐性を付与することができる。
【００４８】
成分Ｂの架橋剤としては、例えば、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル、１，３，４，６−テトラキス（ブトキシメチル）グリコールウリル等のアミノプラスト架橋剤；２，２−ビス（４−ヒドロキシ−３，５−ジヒドロキシメチルフェニル）プロパン等のフェノプラスト架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート架橋剤；１，４−ビス（ビニルオキシ）ブタン等のビニルエーテル架橋剤；等が挙げられる。
【００４９】
成分Ｂは、好ましくはアミノプラスト架橋剤であり、好ましくは１，３，４，６−テトラキス（ヒドロキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５３９５−５０−６）、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：１７４６４−８８−９）、１，３，４，６−テトラキス（エトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：６５９５２−０６−９）、１，３，４，６−テトラキス（１−メチルエトキシ）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５０８２２０−６９−７）、１，３，４，６−テトラキス（１，１−ジメチルエトキシ）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５４７７４４−０８−１）又は１，３，４，６−テトラキス（ブトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：１５９６８−３７−３）であり、より好ましくは１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリルである。
【００５０】
成分Ｂは単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００５１】
成分Ｂの架橋剤は、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。また、市販品を用いてもよい。
【００５２】
本発明の組成物における成分Ｂの含有割合は、成分Ａとの反応効率の観点から、０．１〜５重量％が好ましく、０．２〜３重量％がより好ましい。
【００５３】
本発明の組成物に含まれる成分Ａと成分Ｂの重量比（成分Ａの重量／成分Ｂの重量）は、繊維製造時の反応効率の観点から、５〜６５が好ましく、５〜２５がより好ましい。
【００５４】
［成分Ｃ］
本発明の組成物は成分Ｃとして、酸化合物（以下、「成分Ｃの酸化合物」又は単に「成分Ｃ」とも称する）を含有する。当該酸化合物は塩の態様であってもよく、即ち、本発明における「酸化合物」なる用語は、塩をも包含する概念である。成分Ｃは、成分Ｂと併用することにより、成分Ａのヒドロキシ基同士が成分Ｂを介して架橋反応する際にその架橋反応を促進させることができる。
【００５５】
成分Ｃの酸化合物としては、例えば、スルホン酸化合物、カルボン酸化合物等の有機酸化合物；塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸化合物等が挙げられる。
【００５６】
成分Ｃは、好ましくは有機酸化合物であり、より好ましくはスルホン酸化合物である。スルホン酸化合物としては、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート、トリフルオロメタンスルホン酸等が挙げられ、好ましくはピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナートである。
【００５７】
成分Ｃは単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００５８】
成分Ｃの酸化合物は、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。また、市販品を用いてもよい。
【００５９】
本発明の組成物における成分Ｃの含有割合は、架橋反応速度、架橋反応効率の観点から、０．０１〜１．０重量％が好ましく、０．０５〜０．５重量％がより好ましく、０．０７〜０．４重量％が特に好ましい。
【００６０】
本発明の組成物に含まれる成分Ａと成分Ｃの重量比（成分Ａの重量／成分Ｃの重量）は、架橋反応速度、架橋反応効率の観点から、２０〜１２０が好ましく、８０〜１１５がより好ましい。
【００６１】
［成分Ｄ］
本発明の組成物は成分Ｄとして、溶剤（以下、「成分Ｄの溶剤」又は単に「成分Ｄ」とも称する）を含有する。
【００６２】
成分Ｄの溶剤は、少なくとも上記成分Ａ〜Ｃを均一に溶解又は分散し得、且つ、各成分と反応しないものであれば特に制限されないが、成分Ａ〜Ｃの溶解性の観点から、極性溶剤が好ましい。
当該極性溶剤としては、例えば、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が挙げられ、組成物の紡糸し易さのため、好ましくはアセトンとジメチルアセトアミドの混合溶媒であり、その好ましい混合比率（重量％）は、アセトン／ジメチルアセトアミド＝（９０重量％〜６０重量％）／（１０重量％〜４０重量％）である。
【００６３】
成分Ｄは単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００６４】
本発明の組成物は、本発明の目的を著しく損なわない限り、成分Ａ〜Ｄ以外に、繊維製造用組成物に通常使用される添加剤を必要に応じて含んでもよい。当該添加剤としては、例えば、界面活性剤、レオロジー調整剤、薬剤、微粒子等が挙げられる。
【００６５】
本発明の組成物は、上記の成分Ａ〜Ｄを、あるいは、成分Ａ〜Ｄ及び上記の添加剤を、混合することにより調製できる。混合方法は特に制限されず、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって混合すればよい。
【００６６】
本発明の組成物は、繊維製造のために用いられる。本発明の組成物を用いて製造される繊維の種類は特に制限されないが、例えば、生体適合材料（例、細胞培養足場材料等）等に使用する場合は、ナノ繊維、マイクロ繊維等が好ましく、ナノ繊維がより好ましい。本発明において「ナノ繊維」とは、ナノメートルオーダー（例、１〜１０００ｎｍ）の直径を持つ繊維をいい、また「マイクロ繊維」とは、マイクロメートルオーダー（例、１〜１０００μｍ）の直径を持つ繊維をいう。
【００６７】
本発明の組成物を用いて形成される繊維の直径は、繊維の用途等に応じて適宜調整すればよいが、本発明の組成物の濃度、及び紡糸のし易さの観点から、１〜１０００ｎｍが好ましく、１０〜１０００ｎｍがより好ましい。本発明において、繊維の直径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）にて測定される。
【００６８】
２．繊維の製造方法、該製造方法で製造される繊維
本発明の繊維の製造方法（以下、「本発明の方法」とも称する）は、本発明の組成物を紡糸する工程を含むことを、主たる特徴とする。
【００６９】
本発明の組成物の紡糸方法は繊維を形成できるものであれば特に制限されないが、例えば、メルトブロー法、複合溶融紡糸法、電界紡糸法等が挙げられ、繊維形成能の観点から、電界紡糸法が好ましい。
【００７０】
電界紡糸法は、公知の紡糸方法であり、公知の電界紡糸装置を用いて行うことができる。本発明の組成物をノズル（例、ニードル等）の先端から吐出する速度（吐出速度）；印加電圧；本発明の組成物を吐出するノズルの先端から、これを受け取る基板までの距離（吐出距離）等の各種条件は、製造する繊維の直径等に応じて適宜設定できる。吐出速度は、通常０．１〜１００μｌ／ｍｉｎであり、好ましくは０．５〜５０μｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは１〜２０μｌ／ｍｉｎである。印加電圧は、通常０．５〜８０ｋＶであり、好ましくは１〜６０ｋＶであり、より好ましくは３〜４０ｋＶである。吐出距離は、通常１〜６０ｃｍであり、好ましくは２〜４０ｃｍであり、より好ましくは３〜３０ｃｍである。
【００７１】
本発明の方法は、本発明の組成物を紡糸した後に、該紡糸した繊維を、特定の温度で加熱する工程を更に含むことが好ましい。紡糸した繊維を特定の温度で加熱することにより、より優れた有機溶剤耐性を発現させることができる。
【００７２】
紡糸した繊維を加熱する温度は、通常７０〜３００℃の範囲であり、成分Ｂの架橋剤の反応性、及び成分Ａの高分子化合物の耐熱性の観点から、好ましくは８０〜２５０℃であり、より好ましくは９０〜２００℃である。当該温度が７０℃未満であると、成分Ａ同士の架橋反応が不十分であり、製造した繊維の有機溶媒耐性が低くなる傾向があり、３００℃を超えると、成分Ａの高分子化合物自体が熱による分解又は溶解等を起こし繊維が形成できない。
【００７３】
紡糸した繊維の加熱方法は、上記の加熱温度で加熱し得るものであれば特に制限されず、自体公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜加熱することができる。該加熱方法の具体例としては、大気下にてホットプレート又はオーブン等を使用する方法等が挙げられる。
【００７４】
紡糸した繊維を加熱する時間は、加熱温度等に応じて適宜設定し得るが、架橋反応速度、生産効率の観点から、１分間〜４８時間が好ましく、５分間〜３６時間がより好ましく、１０分間〜２４時間が特に好ましい。
【００７５】
本発明の方法で製造される繊維（以下、「本発明の繊維」とも称する）の種類は特に制限されないが、例えば、生体適合材料（例、細胞培養足場材料等）等に使用する場合は、ナノ繊維、マイクロ繊維等が好ましく、ナノ繊維がより好ましい。
【００７６】
本発明の繊維の直径は、繊維の用途等に応じて適宜調整すればよいが、例えば、細胞培養足場材料として使用する場合は、細胞培養効率の観点から、１〜１０００ｎｍが好ましく、１０〜１０００ｎｍがより好ましい。
【００７７】
本発明の繊維の用途は特に制限されないが、後述の実施例に示されるように、本発明の繊維は優れた有機溶剤耐性を有しており、細胞培養足場として十分な機能を有することから、細胞培養足場材料に適している。
【００７８】
細胞の接着・増殖・分化などに有効な担持物質（細胞接着物質）は、本発明の繊維に存在する活性エステル基と、細胞接着物質との反応により、前記繊維に固定化できる。
活性エステル基は、中性の条件で遊離一級アミノ基と反応する。一級アミンの塩基性は、芳香族アミンよりアルキルアミンが強く、アルキルアミンは活性エステルとの反応により適している。蛋白質及びペプチドを、それらのアミノ基を介して共有結合的に繊維に付加させる場合には、水系での反応が必須であり、反応溶液のｐＨが中性から弱アルカリ性領域にある場合や、反応温度が氷冷下から３７℃程度である場合に、短時間に反応が進む。水溶性の低い一級アミンの場合には、エタノールやジメチルスルホキシド等のような有機溶剤に溶解して反応させることが好ましい。
好ましい反応条件は０℃〜３７℃で１〜４８時間、さらに好ましくは０℃〜３７℃で１〜２４時間である。
【００７９】
本発明の繊維に固定化できる物質（細胞接着物質）としては、例えば、蛋白質、生理活性物質及び化合物等が挙げられる。前記蛋白質としては、例えば、癌胎児性抗原、扁平上皮癌関連抗原、サイトケラチン１９フラグメント、シアル化糖鎖抗原  ＫＬ−６、ナトリウム利尿ペプチド、トロポニン、ミオグロビン等の疾患マーカー、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、インシュリン、成長ホルモン等の細胞増殖因子、及びコラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン等の細胞接着因子、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の各種抗体等が挙げられる。
前記生理活性物質としては、例えば、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、ノイラミン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等の糖類、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチルウレア（ＤＣＭＵ）、アトラジン、リニュロン及びシマジン等が挙げられる。
前記化合物としては、例えば、アンジオテンシンＩ乃至IV、ブラジキニン、フィブリノペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ウロディラチン、グアニリン、エンドセリン１乃至３、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、ニューロフィジン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エンドルフィン、リポトロピン、ウロコルチン１乃至３、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、コルチスタチン、プロラクチン放出ペプチド、メタスチン、タキキニン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジン、ゼニン、グレリン、オベスタチン、メラニン凝集ホルモン、オレキシン、ニューロペプチド、ダイノルフィン、ネオエンドルフィン、エンドモルフィン、ノシセプチン、ピログルタミル化ＲＦ  アミドペプチド、ガラニン、ガストリン、コレシストキニン、セクレチン、リラキシン、グルカゴン、グリセンチン、アドレノメデュリン、アミリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ディフェンシン、チモシン、ＹＩＧＳＲペプチド等のペプチド；アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ジヒドロキシフェニルアラニン、チロキシン、フォスフォセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γ−アミノ酪酸、テアニン、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸等のアミノ酸；２−ジメチルアミノエチルアミン（ＣＡＳ番号：１０８−００−９の化合物）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（ＣＡＳ番号：１１１−４１−１の化合物）、Ｎ−（２−アミノエチル）ピペラジン（ＣＡＳ番号：１４０−３１−８の化合物）、４−（２−アミノエチル）モルホリン（ＣＡＳ番号：２０３８−０３−１の化合物）、１−（２−アミノエチル）−２−イミダゾリドン（ＣＡＳ番号：６２８１−４２−１の化合物）、トリプトアミン（ＣＡＳ番号：６１−５４−１の化合物）、ヒスタミン二塩酸塩（ＣＡＳ番号：５６−９２−８の化合物）、チラミン（ＣＡＳ番号：５１−６７−２の化合物）、ドーパミン（ＣＡＳ番号：５１−６１−６の化合物）等の一級アミン；エチレンジアミン二塩酸塩（ＣＡＳ番号：３３３−１８−６の化合物）、１，６−ジアミノヘキサン（ＣＡＳ番号：１２４−０９−４の化合物）、Ｎ，Ｎ’−ビス（アミノプロピル）ピペラジン（ＣＡＳ番号：７２０９−３８−３の化合物）の一級ジアミン等が挙げられる。
この中で特に好ましい細胞接着物質は、ラミニン５１１、ラミニン５２１又はＹＩＧＳＲペプチドである。
【００８０】
３．細胞培養足場材料
本発明の細胞培養足場材料は、本発明の繊維を含むことを、主たる特徴とする。本発明において「細胞培養足場材料」とは、細胞に対して悪影響を及ぼさず、細胞培養が可能な材料をいう。
【００８１】
本発明の細胞培養足場材料は、例えば、ガラス、金属、及びポリスチレンのようなプラスチック上に本発明の繊維を吹付けた細胞培養基材（例えば、６穴平底マイクロプレート等）、本発明の繊維を導入した培養バック等が挙げられる。さらに、活性エステル基を介して固定化する物質（細胞接着物質）によって、細胞増殖の促進、細胞の分化誘導等が可能である。
【００８２】
本発明の細胞培養足場材料を用いて培養される細胞に関しては特に制限が無く、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、単核細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞、及び各種細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ）等が挙げられる。
【００８３】
本発明の細胞培養足場材料は、本発明の繊維を原材料の一つとして使用し、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明に係る具体例を説明するが、これによって本発明は何ら限定されるものではない。【００８５】
［高分子化合物１〜６の重量平均分子量の測定］
下記の高分子化合物１〜６の重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。測定に用いた装置、測定条件は次の通りである。
装置：ＴＯＳＯＨ  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＫＦ−８０３Ｌ、ＫＦ−８０２及びＫＦ−８０１
カラム温度：４０℃
溶離液：ＤＭＦ
流量：０．６ｍｌ／分
検出器：ＲＩ
標準試料：ポリスチレン【００８６】
［成分Ａの高分子化合物の１３Ｃ−ＮＭＲ測定］
下記成分Ａの高分子化合物の単位構造の組成比は、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定した。測定及び解析に用いた装置、条件は次の通りである。
装置：日本電子株式会社  ＪＮＭ−ＥＣＡ５００、Ｄｅｌｔａ  Ｖ５．０
測定核：１３Ｃゲートデカップリング
積算回数：１８０００
測定温度：室温
検出ピーク：６９〜７１ｐｐｍ（ＨＰＭＡ由来）、
２５〜２７ｐｐｍ（ＮＳｕＭＡ由来）
測定溶剤：重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）、７５０ｕＬ
サンプル量：０．１ｇ
緩和試薬：クロム（ＩＩＩ）アセチルアセトナート、４ｍｇ【００８７】
＜合成例（高分子化合物１〜６の合成）＞
（合成例１：高分子化合物１）
２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）１０．５ｇ、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）１．５ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０１ｇをアセトニトリル２８．３ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル２０．２ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物１を７．７１ｇ得た。当該高分子化合物１の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で２１７，０００であった。１３Ｃ−ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝９１モル％／９モル％であった。【００８８】
（合成例２：高分子化合物２）
２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）１０．６ｇ、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）１．５ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．７２ｇをアセトニトリル３０．０ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル２１．４ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物２を１２．０ｇ得た。当該高分子化合物２の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で１３，０００であった。１３Ｃ−ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝９２モル％／８モル％であった。【００８９】
（合成例３：高分子化合物３）
２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）３３．０ｇ、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）１８．０ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０５ｇをアセトニトリル１１９．２ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル８５．２ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液を１００ｍｌ程度の量まで濃縮し、ジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物３を３６．０ｇ得た。当該高分子化合物３の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で１８２，０００であった。１３Ｃ−ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝６２モル％／３８モル％であった。【００９０】
（合成例４：高分子化合物４）
２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）８．３ｇ、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）７．０ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０１ｇをアセトニトリル３５．７ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル２５．５ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物４を１１．０ｇ得た。当該高分子化合物４の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で２６５，０００であった。１３Ｃ−ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝５０モル％／５０モル％であった。【００９１】
（合成例５：高分子化合物５）
２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）５．５ｇ、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）７．０ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０１ｇをアセトニトリル２９．２ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル２０．９ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物５を８．９ｇ得た。当該高分子化合物５の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で１１３，０００であった。１３Ｃ−ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝３７モル％／６３モル％であった。【００９２】
（合成例６：高分子化合物６）
メチルメタクリレート（ＭＭＡ；東京化成工業株式会社製）１０．０ｇ、及び２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０１ｇをアセトニトリル２３．４ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル１６．７ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１７時間反応させた。その後、この反応混合液にジエチルエーテルを加えてポリマーを析出させた。ポリマーをろ取した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物６を５．３ｇ得た。当該高分子化合物６の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で２３０，０００であった。【００９３】
前記高分子化合物１〜５において、重合反応後、均一な高分子溶液となっていた場合を「良好」とし、均一な高分子溶液とならない場合を「不良」として表１にまとめた。【００９４】
【表１】
0006504508.tif 000010
【００９５】
＜実施例（繊維製造用組成物（溶液）の調製）＞
（実施例１）
高分子化合物１；０．５０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０３ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００５ｇ、ジメチルアセトアミド０．４９ｇ、及びアセトン１．４８ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例１の繊維製造用組成物を得た。実施例１の繊維製造用組成物における高分子化合物１の含有割合は、約２０重量％である。【００９６】
（実施例２）
高分子化合物２；０．７０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０４ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００７ｇ、ジメチルアセトアミド０．３１ｇ、及びアセトン０．９４ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例１の繊維製造用組成物を得た。実施例２の繊維製造用組成物における高分子化合物２の含有割合は、約３５重量％である。【００９７】
（実施例３）
高分子化合物３；０．２３ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０１ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００２ｇ、ジメチルアセトアミド０．５０ｇ、及びアセトン１．５２ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例３の繊維製造用組成物を得た。実施例３の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約１０重量％である。【００９８】
（実施例４）
高分子化合物３；０．６０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０３ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００６ｇ、ジメチルアセトアミド０．５９ｇ、及びアセトン１．７７ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例４の繊維製造用組成物を得た。実施例４の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約２０重量％である。【００９９】
（実施例５）
高分子化合物３；０．４０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０６ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００４ｇ、ジメチルアセトアミド０．３８ｇ、及びアセトン１．１５ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例５の繊維製造用組成物を得た。実施例５の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約２０重量％である。【０１００】
（実施例６）
高分子化合物４；０．５０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０３ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００５ｇ、ジメチルアセトアミド０．４９ｇ、及びアセトン１．４８ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例６の繊維製造用組成物を得た。実施例６の繊維製造用組成物における高分子化合物４の含有割合は、約２０重量％である。【０１０１】
（実施例７）
高分子化合物５；０．５０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０３ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００５ｇ、ジメチルアセトアミド０．４９ｇ、及びアセトン１．４８ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、実施例７の繊維製造用組成物を得た。実施例７の繊維製造用組成物における高分子化合物５の含有割合は、約２０重量％である。【０１０２】
（比較例１）
高分子化合物３；０．７０ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００７ｇ、ジメチルアセトアミド０．７０ｇ、及びアセトン２．０９ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、比較例１の繊維製造用組成物を得た。比較例１の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約２０重量％である。【０１０３】
（比較例２）
高分子化合物３；０．７０ｇ、１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．０３５ｇ、ジメチルアセトアミド０．６９ｇ、及びアセトン２．０７ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、比較例２の繊維製造用組成物を得た。比較例２の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約２０重量％である。【０１０４】
（比較例３）
高分子化合物３；０．７０ｇ、ジメチルアセトアミド０．７０ｇ、及びアセトン２．１０ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、比較例３の繊維製造用組成物を得た。比較例３の繊維製造用組成物における高分子化合物３の含有割合は、約２０重量％である。【０１０５】
（比較例４）
高分子化合物６；０．２６ｇ、ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート０．００３ｇ、ジメチルアセトアミド１．７０ｇ、及びアセトン０．９６ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ−５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、比較例４の繊維製造用組成物を得た。比較例４の繊維製造用組成物における高分子化合物６の含有割合は、約８．９重量％である。【０１０６】
実施例１〜７、比較例１〜４の繊維製造用組成物の構成を表２−１及び２−２に示す。【０１０７】
【表２−１】
0006504508.tif 000011
【０１０８】
【表２−２】
0006504508.tif 000012
【０１０９】
註）ＰＬ−ＬＩ：１，３，４，６−テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル、ＰｙＰＴＳ：ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート、ＤＭＡｃ：ジメチルアセトアミド【０１１０】
［電界紡糸法による繊維の製造］
下記の試験例１〜４において、電界紡糸法による繊維の製造は、エスプレイヤーＥＳ−２０００（株式会社フューエンス製）を用いて実施した。繊維製造用組成物は、１ｍｌのロック式ガラス注射筒（アズワン株式会社製）に注入し、針長１３ｍｍのロック式金属製ニードル２４Ｇ（武蔵エンジニアリング株式会社製）を取り付けた。ニードル先端から繊維を受け取る基板までの距離（吐出距離）は２０ｃｍとした。印加電圧は２５ｋＶとし、吐出速度は１０μｌ／ｍｉｎとした。【０１１１】
［繊維形状の確認方法］
下記の試験例１〜４において、繊維形状の確認は、イオンスパッター（Ｅ−１０３０、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）にてＰｔ−Ｐｄを繊維に１分間蒸着した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ−４８００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を使用して、拡大倍率１０，０００倍で観察することにより行った。
繊維形状が維持されている場合は「良好」とし、繊維形状が維持されない場合は「不良」とした。【０１１２】
［繊維径の測定方法］
下記の試験例１〜４において、繊維径（繊維の太さ）の測定は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ−４８００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を使用して、拡大倍率１０，０００倍の画像を撮影及び保存した後、付属の測長ツールにより行った。【０１１３】
＜試験例１：加熱処理及び溶剤耐性試験＞
実施例１〜７及び比較例１〜４の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、得られた繊維に、表３に示す条件で加熱処理を施し、加熱処理後の繊維形状を確認した。結果を表３に示す。
実施例１〜７及び比較例１〜４の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、表４に示す条件で加熱処理を施した繊維をエタノールに１０秒間浸漬した後、再び繊維形状を確認し、繊維径を測定した。結果を表４に示す。
実施例４及び比較例１〜３の繊維製造用組成物を、調製後すぐに、電界紡糸法によりアルミ箔上に紡糸した後、表５に示す条件で加熱処理を施した繊維を液体培地であるＩＳＣＯＶＥ’Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＭＥＤＩＵＭ（シグマ社製）に７日間浸漬した後、水洗及びエタノール洗浄を経て、再び繊維形状を確認し、繊維径を測定した。結果を表５に示す。【０１１４】
【表３】
0006504508.tif 000013
【０１１５】
【表４】
0006504508.tif 000014
【０１１６】
【表５】
0006504508.tif 000015
【０１１７】
表３の結果より、実施例１〜７及び比較例１〜４の繊維製造用組成物を用い、電界紡糸法にて製造した繊維は、加熱処理のみを行った場合、ＮＳｕＭＡ／ＨＰＭＡ組成比、高分子化合物の分子量及び高分子化合物の含有量、及び架橋剤の含有量にかかわらず良好な形状であった。
表４の結果より、実施例１〜７の繊維製造用組成物を用いて製造した繊維は、加熱処理後、さらにエタノールに１０秒間浸漬後においても良好な形状を示した。実施例７においては、良好な繊維形状を示したが、広範囲の繊維径が観察された。さらに実施例４及び実施例５の結果より、加熱処理における加熱温度が８０℃であっても、良好な繊維形状を示した。
表５の結果より、実施例４の繊維製造用組成物を用いて製造した繊維は、細胞培養用液体培地に７日間浸漬後であっても、良好な繊維形状を示した。
つまり、本発明の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を製造する場合、良好な繊維形状を示し、且つ有機溶剤耐性及び培地耐性に優れた繊維とするためには、８０℃以上で加熱処理することが望ましい。
また、上記条件にて電界紡糸を行なった場合、製造される繊維の繊維径は、成分Ａの高分子化合物の重量平均分子量と、繊維製造用組成物における成分Ａの高分子化合物の含有割合とに依存することが示唆された。従って、成分Ａの高分子化合物の重量平均分子量、及び繊維製造用組成物における成分Ａの高分子化合物の含有割合を調整することで、所望の繊維径の繊維を得ることが可能である。【０１１８】
＜試験例２：細胞培養評価１＞
実施例１及び比較例４の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、以下において、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。【０１１９】
［実施例１の繊維の製造］
実施例１の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に２０分間吹付けた後、１８０℃３０分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス（マツナミガラス株式会社製）（Φ３２ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍ）を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。実施例１の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約４３０ｎｍであった。
尚、以下において、実施例１の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「実施例１の繊維基板」と称する。【０１２０】
［比較例４の繊維の製造］
比較例４の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に２０分間吹付けた後、１８０℃１０分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス（マツナミガラス株式会社製）（Φ３２ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍ）を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。比較例４の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約４４０ｎｍであった。
尚、以下において、比較例４の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「比較例４の繊維基板」と称する。【０１２１】
［細胞の調製］
細胞は、ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ（Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（和光純薬工業株式会社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ１０ｍＬで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業株式会社製）１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにて懸濁した。本懸濁液を遠心分離（株式会社トミー精工製、ＬＣ−２００、１０００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。なお、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。【０１２２】
［基材の滅菌］
６穴平底マイクロプレート（アズワン株式会社製）に、実施例１の繊維基板、比較例４の繊維基板、及び対照として未処理のガラス基板を配置し、７０％エタノール２ｍＬを添加し、室温で５分間浸漬した後、風乾した。【０１２３】
［細胞接着物質の固定化］
６穴平底マイクロプレートに、実施例１の繊維基板を配置し、７０％エタノール２ｍＬを添加し、室温で５分間浸漬した。この溶液を除いて風乾した後、ラミニン５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ株式会社製）／ＰＢＳ溶液（２０μｇ／ｍＬ）を１ウェルあたり２ｍＬ添加した。３７℃インキュベーターにて２時間静置しラミニンを固定化した後に溶液を除き、１ウェルあたり２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。【０１２４】
［細胞培養］
６穴平底マイクロプレートに、滅菌した実施例１の繊維基板、比較例４の繊維基板、未処理のガラス基板、及びラミニン５２１を固定化した実施例１の繊維基板を配置し、培地２ｍＬで２回洗浄した。その後、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに調製したＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）の細胞懸濁液を各２ｍＬ加えた後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で２４時間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１２５】
［ＷＳＴ−８を用いた細胞数計測］
２４時間の細胞培養の後、各繊維基板、及び未処理のガラス基板（対照）の上清を除き、ＰＢＳ２ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを除いた後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＥＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、さらに１００μＬのＷＳＴ−８試薬（キシダ化学株式会社製）を添加した。３７℃で１００分ＣＯ２インキュベーター内にて静置した後、反応溶液１００μＬを９６穴平底マイクロプレートに移し、吸光度計（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１２６】
各細胞数計測の結果（ｎ＝２の平均値）を表６に示す。【０１２７】
【表６】
0006504508.tif 000016
【０１２８】
表６の結果から、１８０℃で加熱した実施例１の繊維基板上でＨＥＫ２９３細胞が増殖することが分かり、実施例１の繊維製造用組成物を用いて製造した繊維は、生体に対して無害であることが示された。また、ラミニン５２１を固定化した実施例１の繊維基板上で細胞増殖率が約２倍向上した。これより、本発明の繊維に細胞培養に有効な物質を固定化することで、細胞増殖性が向上することがわかった。【０１２９】
＜試験例３：細胞培養評価２＞
実施例５の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、細胞培養方法は、試験例２に準じて行った。【０１３０】
［実施例５の繊維の製造］
実施例５の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、Φ３０ｍｍポリスチレン（ＰＳ）基板上に２０分間吹付けた後、８０℃２４時間加熱処理した。Φ３０ｍｍＰＳ基板は、アクリサンデー株式会社製「プラバン」（商品名；厚さ０．２ｍｍ）から自作した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。実施例５の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約４７０ｎｍであった。
尚、以下において、実施例５の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したＰＳ基板を、便宜上「実施例５の繊維基板」と称する。【０１３１】
［細胞接着物質の固定化］
６穴平底マイクロプレートに、実施例５の繊維基板を配置し、ＹＩＧＳＲペプチド（株式会社ベックス社製）／ＰＢＳ溶液（０．０５重量％）を１ウェルあたり２ｍＬ添加した。室温２４時間静置してペプチドを固定化した後に溶液を除き、１ウェルあたり２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。【０１３２】
［基材の滅菌］
６穴平底マイクロプレート（アズワン株式会社製）に、実施例５の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例５の繊維基板、及び対照として未処理のＰＳ基板を配置し、７０％エタノール２ｍＬを添加し、室温で５分間浸漬した後、風乾した。【０１３３】
［細胞培養］
６穴平底マイクロプレートに、滅菌した実施例５の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例５の繊維基板、及び対照として未処理のＰＳ基板を配置し、培地２ｍＬで２回洗浄した。その後、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに調製したＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）の細胞懸濁液を各２ｍＬ加えた後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で２４時間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１３４】
［ＷＳＴ−８を用いた細胞数計測］
２４時間の細胞培養の後、細胞培養を行った実施例５の繊維基板、ペプチドを固定化した実施例５の繊維基板、及び未処理のＰＳ基板（対照）の上清を除き、ＰＢＳ２ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを除いた後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＥＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、さらに１００μＬのＷＳＴ−８試薬（キシダ化学株式会社製）を添加した。３７℃で１００分ＣＯ２インキュベーター内にて静置した後、反応溶液１００μＬを９６穴平底マイクロプレートに移し、吸光度計（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１３５】
各細胞数計測の結果（ｎ＝２の平均値）を表７に示す。【０１３６】
【表７】
0006504508.tif 000017
【０１３７】
表７の結果から、未処理のＰＳ基板上と比較して、実施例５の繊維基板上ではＨｅｋ２９３細胞が２．５倍多く増殖した。さらに、ペプチドを固定化した実施例５の繊維基板上では４．０倍多く増殖した。これより、本発明の繊維は細胞増殖性を有すること、及び細胞培養に有効な物質を本発明の繊維に固定化することで、細胞増殖性が向上することが分かった。【０１３８】
＜試験例４：細胞培養評価３＞
実施例４及び比較例４の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸した後、得られた繊維上にて細胞培養評価を行った。なお、以下において、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。【０１３９】
［実施例４の繊維の製造］
実施例４の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に２０分間吹付けた後、１８０℃３０分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス（マツナミガラス株式会社製）（Φ３２ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍ）を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。実施例４の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約４５０ｎｍであった。
尚、以下において、実施例４の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「実施例４の繊維基板」と称する。【０１４０】
［比較例４の繊維の製造］
比較例４の繊維製造用組成物を電界紡糸法により紡糸し、ガラス基板上に２０分間吹付けた後、１８０℃１０分間加熱処理した。ガラス基板には、マイクロカバーガラス（マツナミガラス株式会社製）（Φ３２ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍ）を使用した。得られた繊維をエタノールで洗浄して風乾した後、繊維形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。比較例４の繊維製造用組成物から得られた繊維の繊維径は約４４０ｎｍであった。
尚、以下において、比較例４の繊維製造用組成物を紡糸して繊維を形成したガラス基板を、便宜上「比較例４の繊維基板」と称する。【０１４１】
［細胞の調製］
マウス繊維芽細胞（ＭＥＦ；日本ＳＬＣ社製Ｅ１２．５  ＩＣＲマウスから採取・調整）またはマトリゲル  ヒトＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）上で培養したヒトＥＳ細胞（Ｈ９株）またはヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤ−ＰＢＳ（−）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にて２回洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １ｍＬを加えて３７℃で５分間静置した。ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを吸引除去した後、最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬株式会社製）を含むｍＴｅＳＲ１（株式会社ベリタス製）（以下、ｍＴｅＳＲ１／１０μＭ  Ｙ２７６３２）培地で細胞を回収した。細胞懸濁液をピペッティングにてシングルセルにした後、回転数１０００ｒｐｍ／３分間、室温で遠心分離を行った。上清を除去した後、細胞ペレットをｍＴｅＳＲ１／１０μＭ  Ｙ２７６３２培地に再度懸濁し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−２００（以下、ＮＣ−２００；ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃＡＳ製）にて細胞数を計測した。【０１４２】
［基材の滅菌］
６穴平底マイクロプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、実施例４の繊維基板、及び比較例４の繊維基板を配置し、１００％エタノール１ｍＬにて３回洗浄した後、風乾した。その後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）溶液１ｍＬにて３回洗浄した。【０１４３】
［細胞接着物質の固定化］
６穴平底マイクロプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、実施例４の繊維基板、及び未処理のガラス基板を配置し、１００％エタノール１ｍＬにて３回洗浄し、風乾後、Ｄ−ＰＢＳ（−）またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２溶液１ｍＬにて３回洗浄した。実施例４の繊維基板には、Ｄ−ＰＢＳ（−）によって最終濃度１００μｇ／１０ｍＬに調製したラミニン５１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ製）溶液を１ｍＬ添加し、３７℃２時間または４℃一晩静置後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２溶液１ｍＬにて１回洗浄した。ガラス基板には、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２にて７５倍で希釈したマトリゲル溶液を１ｍＬ添加し、３７℃２時間または４℃一晩静置後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２溶液１ｍＬにて１回洗浄した。【０１４４】
［細胞培養］
６穴平底マイクロプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、滅菌した実施例４の繊維基板、滅菌した比較例４の繊維基板、ラミニン５１１を固定化した実施例４の繊維基板、及びマトリゲル（コーニング社製）をコートしたガラス基板を配置した後、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞の懸濁液を１．５〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように添加した。３７℃２４時間後（培養１日目）、ｍＴｅＳＲ１／１０μＭ  Ｙ２７６３２培地１．５ｍＬにて培地交換を行った。培養２日目から培養４日目は、ｍＴｅＳＲ１培地１．５ｍＬにて培地交換を行った。培養期間中は、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃でＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１４５】
［細胞数の計測］
培養４日後、培地を除去し、Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞層を洗浄した。その後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ０．５ｍＬを添加し、３７℃１分間または３分間静置した。細胞を回収した後、回転数１０００ｒｐｍ／３分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをＤＭＥＭ／Ｆ−１２溶液にて再度懸濁した後、ＮＣ−２００にて細胞数と生存率を計測した。細胞増殖効率は、培養４日目の細胞数／播種した細胞数より算出した。【０１４６】
各細胞の増殖効率の結果（ｎ＝２の平均値）を表８（ヒトＥＳ細胞）及び表９（ヒトｉＰＳ細胞）に示す。【０１４７】
【表８】
0006504508.tif 000018
【０１４８】
【表９】
0006504508.tif 000019
【０１４９】
表８及び表９の結果から、実施例４の繊維基板は、比較例４の繊維基板より、ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の培養に有効であることがわかった。また、ラミニン５１１を固定化した実施例４の繊維基板における細胞増殖率・BR>ヘ、マトリゲルをコートしたガラス基板における細胞増殖率と同程度であることがわかり、繊維基板に細胞接着物質を固定化することは、細胞培養に効果的であることがわかった。
さらに、表９のヒトｉＰＳ細胞生存率の結果から、ラミニン５１１を固定化した実施例４の繊維基板、及び実施例４の繊維基板の細胞生存率は、マトリゲルをコートしたガラス基板より約２０％高かった。この結果より、細胞培養には本発明の繊維が有効であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明によれば、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化するために好適であり、さらに有機溶剤耐性を保持する繊維製造のための繊維製造用組成物、該組成物を紡糸して得られる繊維、及び該繊維を用いた細胞培養足場材料を提供できる。かかる繊維は、細胞の接着・増殖・分化などに有効な物質を固定化することより、細胞培養足場材料としてより優れた機能を発現する。  【０１５１】
本出願は、日本で出願された特願2014-027044（出願日：2014年2月14日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
0006504508.tif 000023
【図２】
0006504508.tif 000024
【図３】
0006504508.tif 000025
【図４】
0006504508.tif 000026
【図５】
0006504508.tif 000027
【図６】
0006504508.tif 000028
【図７】
0006504508.tif 000029
【図８】
0006504508.tif 000030
【図９】
0006504508.tif 000031
【図１０】
0006504508.tif 000032
【図１１】
0006504508.tif 000033