(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦからなる群より選択される少なくとも１つの黄色ブドウ球菌の二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体であって、当該抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む少なくとも１つの抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、及びＣＤＲ４、ＣＤＲ５及びＣＤＲ６配列を含む少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むものであり、以下のｉ）〜vii）からなる群より選択され；
ｉ）    
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
ii）
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＡＤＭＤＶ（配列番号１１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
iii）
ａ）アミノ酸配列 ＹＰＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＲＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
iv）
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＲＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号８）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
ｖ）
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＡＶＤＭＤＶ（配列番号１２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
vi）
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＤ（配列番号５）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＥＧ（配列番号９）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
vii）
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＤ（配列番号５）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＰＬＥＳ（配列番号１０）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；及び
ｄ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｅ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｆ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含む抗体：
ここで、前記抗体は、
ｉ）コード配列がＤＳＭ２６７４８の下に寄託された宿主細胞中に含まれる、＃ＡＢ-２４-ＬＣと称される抗体軽鎖と、
ii）コード配列がＤＳＭ２６７４７の下に寄託された宿主細胞中に含まれる、＃ＡＢ-２４-ＨＣと称される抗体重鎖
とを含む抗体＃ＡＢ-２４ではない。
【請求項２】
配列番号２０〜３１からなる群より選択される抗体重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び、配列番号３９の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号２７のＶＨアミノ酸配列、及び、配列番号３９のＶＬアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号４０〜５１からなる群より選択される抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、又はＣ末端アミノ酸が欠失した配列番号４０〜５１のアミノ酸配列のいずれか、及び、配列番号５２の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号４７のＨＣアミノ酸配列、及び、配列番号５２のＬＣアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦからなる群より選択される少なくとも１つの黄色ブドウ球菌の二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体であって、当該抗体は、配列番号２０〜３１からなる群より選択されるＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列を含む親抗体の機能的に活性な変異抗体であり、当該機能的に活性な変異抗体は、配列番号２０〜３１又は配列番号３９のいずれかにおいて、任意のフレームワーク領域（ＦＲ）に少なくとも１つの点変異を含み、且つ、各毒素と、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を有する、交差中和抗体。
【請求項７】
全長モノクローナル抗体、前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は、前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか又は当該感染を患っている被験体を治療する際に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体であって、当該治療は、被験体における感染を限定するのに有効な量の抗体を被験体に投与して、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、又は肺炎、敗血症、菌血症、創傷感染、膿瘍、手術部位感染、眼内炎、フルンケル症、カルブンケル症、心内膜炎、腹膜炎、骨髄炎又は関節感染等の黄色ブドウ球菌疾患の発病を阻害することを含む、抗体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬品であって、好ましくは、非経口又は粘膜用製剤を含み、任意に薬学的に許容されるキャリアー又は賦形剤を含有する、医薬品。
【請求項１０】
高毒素産生ＭＲＳＡ感染を含む任意の黄色ブドウ球菌感染、例えば壊死性肺炎、ならびにフルンケル症及びカルブンケル症における毒素産生を検出する診断使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
任意で、標識を含む抗体及び／又は標識を含むさらなる診断試薬を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の診断用製剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖及び重鎖を発現するコード配列を含む、組換え発現カセット又はプラスミド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現カセット又はプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を、前記抗体を産生するための条件下で培養又は維持する方法。
【請求項１６】
配列番号２０〜３１の任意のＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列を含む親抗体の、機能的に活性な抗体変異体を産生する方法であって、当該方法は、変異抗体を得るために配列番号２０〜３１又は配列番号３９のいずれかの内の、任意のフレームワーク領域（ＦＲ）又は定常ドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）において少なくとも１つの点変異を設計すること、及び
−黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦからなる群より選択される少なくとも１つの黄色ブドウ球菌の二成分毒素のそれぞれに、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満のＫｄで結合する親和性、及び／又は
−親抗体と競合する、Ｈｌａ及び／又は前記少なくとも１つの二成分毒素への前記変異抗体の結合、
のいずれかによって、前記変異抗体の機能的活性を測定することを含み、
ここで、当該機能的活性の測定により、機能的に活性な変異体が、組換え産生方法による産生のために選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の単離パラトープ、又は当該パラトープを含む結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸配列を特徴とする、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）感染は、重大な満たされていない医療ニーズを代表する。黄色ブドウ球菌は、肺炎、菌血症及び／又は敗血症を発症する患者の中で特に高い死亡率を伴う、医療関連感染の最も多い原因の一つである。抗生物質耐性クローン（病院及びコミュニティ関連メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ＨＡ-及びＣＡ-ＭＲＳＡ）の蔓延は、さらなる懸念事項であり、新しい治療アプローチの必要性を強調する。
【０００３】
新しい抗生物質は、主に、急速に発達する薬剤耐性及び抗生物質が病原性メカニズム（例えば、重症感染患者における疾患進行と死亡率の一因となる細胞溶解作用）に対抗できないことに起因して、この医療問題に対処できそうではない。予防ワクチン接種又は受動免疫（すなわち、モノクローナル抗体ｍＡｂの投与）のどちらかによって防御免疫を誘導する複数の試みがなされてきた。これらの努力は、オプソニン作用取り込み及び食細胞による殺傷を増強させることを目的とし、いまだ臨床条件における黄色ブドウ球菌感染の予防又は治療には十分ではない。
【０００４】
黄色ブドウ球菌感染の発症機序に対する外毒素の多大な貢献に関する最近の発見は、新しい免疫性の予防的及び治療的アプローチにつながる。アルファ溶血素（Ｈｌａ、又はアルファ毒素）は、上皮及び内皮細胞を損傷する主要な病原性因子であることが示され、黄色ブドウ球菌疾患の動物モデルにおいて、ワクチン抗原及びモノクローナル抗体標的として確認され、ＢｅｒｉｂｅとＢｕｂｅｃｋ Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇによって概説された（Berube BJ, Toxins (Basel). 2013 5(6):1140）。つい最近、Ｈｌａは、ヒトによる治験で、能動及び受動免疫状況の両方について評価された。
【０００５】
Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇら（The Journal of Experimental Medicine 2008, 205（2）: 287-294）は、細孔を形成できず、抗原特異的免疫グロブリンＧ応答を産生する、Ｈｌａの突然変異型に基づくワクチンによる能動免疫について記載する。
【０００６】
Ｌｉｎら（Expert Review of Clinical Pharmacology 2010, 3(6): 735-767）は、ブドウ球菌性感染の病原性因子及び発症機序、及びワクチンを含む最近の開発について記載する。
【０００７】
Ｈｅｖｅｋｅｒら（Human Antibodies and Hybridomas 1994, 5(1-2): 18-24）は、ハイブリドーマ技術によって確立されたブドウ球菌性アルファ毒素に対するヒトモノクローナル抗体について記載する。二成分毒素は、アルファ毒素を含まず、アルファ毒素と異なると見なされるため、そのような抗-アルファ毒素抗体によって、黄色ブドウ球菌の二成分毒素はいずれも標的化されない。
【０００８】
Ｒａｇｌｅら（Infection and Immunity 2009, 77(7): 2712-2718）は、安定なアルファ毒素オリゴマーの形成を遮断できる抗-アルファ毒素モノクローナル抗体について記載する。この場合もやはり、そのようなアルファ毒素抗体は、二成分毒素を標的としないであろう。
【０００９】
二成分細胞毒素ファミリーのメンバーである、ガンマ溶血素（ＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ）、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ＰＶＬ又はＬｕｋＳＦ）、ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＧＨ/ＬｕｋＡＢは全てヒト食細胞を溶解でき、それゆえ先天免疫の回避、黄色ブドウ球菌発症機序の特徴と関係付けられてきた。さらに、ＨｌｇＡＢはヒト赤血球の強力な毒素であり、ＬｕｋＥＤは最近、ＣＸＣ５レセプターによりヒトＴ細胞を標的にすることが報告された（Alonzo, Nature 2013, 493:51-55）。ＨｌｇＡＢ及びＬｕｋＥＤは、マウスの全身感染症及び膿瘍モデルにおける黄色ブドウ球菌の病原性の一因であり、他方、ＰＶＬ/ＬｕｋＳＦはウサギモデルでのみ活性である（Alonzo PLoS Pathog. 2013, 9(2):e1003143により概説）。
【００１０】
大多数の黄色ブドウ球菌の臨床分離株は、Ｈｌａ、ＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢを発現し、それらの約４０〜７５％がＬｕｋＥＤである。ＬｕｋＳＦ/ＰＶＬ毒素は、菌株の５〜１０％に存在するファージによってコードされ、より重度な疾患の徴候に関連付けられる（Vandenesch, Front Cell Infect Microbiol. 2012, 2:12により概説）。
【００１１】
ヒト黄色ブドウ球菌疾患に対するこれらの外毒素の寄与は、遺伝子有病率と血清疫学的研究に基づいて関係付けられ、後者は、２つの独立した研究グループによって報告された高い血清抗体レベルと好ましい臨床転帰の間の相関性を示唆する（Adhikari, J Infect Dis. 2012, 206:915; Fritz, Clin Infect Dis. 2013, 56(11):1554）。それゆえ、外毒素中和モノクローナル抗体でヒト血清抗体レパートリーを補充することは、特にこれらの毒素中和ＩｇＧの内在性レベルが低い患者において、死亡率を減少させることが予想される。
【００１２】
ロイコシジンのサブユニットであるＳ及びＦ-成分（不活性形態で個々に分泌される）は、構造的に高い関連性を有し、最大８０％のアミノ酸相同性を有する。二成分毒素サブユニットとＨｌａは全て、標的細胞に結合するとバレル様オリゴマー孔複合体を形成し、低アミノ酸配列保存（＜２８％）にもかかわらず、類似した構造を有する。
【００１３】
Ｇｏｕａｕｘら（Protein Science 1997, 6: 2631-2635）は、アルファ毒素、ガンマ溶血素及びロイコシジンの構造における配列と類似性の違いを説明する。
【００１４】
Ｈｌａ、ＬｕｋＳ、ＬｕｋＦ、ＨｌｇＡ及びＨｌｇＢの結晶構造が決定されており、そしてＨｌａ及び二成分毒素サブユニット間のアミノ酸相同性が１６〜２８％アミノ酸同一性という低レベルであるにも関わらず、ある程度の構造相同性が明らかになった（Galdiero, Protein Sci, 2004:1503; Pedelacq, Structure, 1999:277; Menestrina, FEBS Letters, 2003:54）。すべてのこれらの毒素は、オリゴマー化サブユニットによって形成される環状構造を形成し、細胞膜内のポア形成及びそれに続く細胞溶解を導く。Ｈｌａの場合、孔は七量体であることが示されたが、二成分毒素に関しては、六量体（Comai, Mol Microbiol, 2002,44:1251）、七量体及び八量体（Yamashita, PNAS, 2011,108:17314）ヘテロオリゴマーが報告された（Kaneko, Biosci Biotechnol Biochem, 2004,68: 981で詳細に概説）。
【００１５】
この毒素ファミリーの異なるＦ成分及びＳ成分は、同族対（これらは、ＬｕｋＳ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＣ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＡ−ＨｌｇＢ及びＬｕｋＨ−ＬｕｋＧである）のみ形成可能なのではなく、非同族対もまた形成可能であり、こうした対の多くがＧｒａｖｅｔら（Gravet, FEBS Letters, 1998, 436: 202）によって、そしてガンマ溶血素及びＬｕｋＳに関しては、Ｄａｌｌａ Ｓｅｒｒａら（Dalla Serra, J Chem Inf Model, 2005, 45:1539）によって報告されている。この毒素ファミリーの重複性及び乱交雑な性質のため、単一の成分を不活性化しても、黄色ブドウ球菌感染と戦うには有効ではない可能性が高い。この知見は、単一の二成分毒素を中和しても、表現型には部分的な影響しかないという文献に報告される観察によって裏付けられる（例えば、Ventura, PloS ONE, 2010, 5:e11634; Malachowa, PloS ONE, 2011, 6: e18617）。動物研究は、インビボ実験に採用したモデル又は用いた種に応じて、生存に対する多様な二成分毒素の異なる影響を示した。複数の毒素を欠失させた際、例えば毒素発現の包括的な制御因子であるａｇｒクオラムセンシング系が不活性化されている黄色ブドウ球菌のノックアウト株を用いた感染のウサギモデルにおいて、疾患重症度の最も顕著な減少が観察された（Kobayashi, J Infect Dis, 2011, 204: 937）。したがって、より多くの毒素を中和する抗体カクテルは、単一毒素に対するｍＡｂよりも有意な利点を提供すると期待される。しかしながら、３より多い成分を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）カクテルは、開発が困難である。
【００１６】
ＵＳ ２０１１/２７４６９２ Ａ１は、ＬｕｋＡ又はＬｕｋＢのどちらかに特異的である抗体について記載し、これらの抗体の交差反応性については記載していない。
【００１７】
アルファ溶血素及び任意の二成分毒素の間で交差反応する単一抗体を発見する可能性は、Ｈｌａと二成分毒素間の配列相同性が低い（＜２８％）ことに基づき、低いと見なされていた。Ｓ成分及びＦ成分間で交差反応性である単一抗体を発見する機会は、ＬｕｋＧＨ（Ｓ成分又はＦ成分と３０〜４０％のアミノ酸相同一性を有する）を除いて、配列相同性がより高いレベル（６８〜８２％）であるため、より高いと期待される。ＬｕｋＳで免疫された動物由来の過免疫血清がＨｌｇＣを認識可能であることが記載されているが、これは、ポリクローナル血清において異なる特異性が存在するためである。Ｌａｖｅｎｔｉｅら（Laventie, PNAS, 2011, 108:16404）は、ＨｌｇＣと交差反応するＬｕｋＳに対する二重特異性抗体を記載した。要約すると、異なる二成分黄色ブドウ球菌毒素に対する、又はアルファ溶血素及び任意の二成分毒素に対する交差反応性ｍＡｂは、今日まで報告されていない。
【００１８】
黄色ブドウ球菌の複雑な発症機序を前提として、複数の外毒素を不活性化でき、抗-黄色ブドウ球菌治療の効力を有意に増加させる抗体の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、向上した交差反応能及び交差中和能を持つ、異なる黄色ブドウ球菌細胞毒素に対する抗体を提供することである。特に、前記目的は、少なくとも２，３又は４つの異なる毒素分子（特に、Ｈｌａ、 ＨｌｇＢ、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤ）にナノモル又はナノモル以下の親和性を有するモノクローナル抗体を提供することである。特に、前記目的は、関連する動物モデルにおいて、単一の毒素特異的抗体と比べて、Ｈｌａ及び複数の二成分ロイコシジンに対する高い中和能（インビトロ）と向上した保護作用を有する抗体に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この目的は、本発明の主題によって解決される。
【００２１】
本発明によって、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体が提供され、当該抗体は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含み、ここで、
Ａ）前記抗体は、
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；
を含むか、又は
Ｂ）前記抗体は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ１；又は
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ２；又は
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ３；
の少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変異体を含み、
ここで、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、親ＣＤＲ配列における少なくとも１つの点変異を含み、且つ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【００２２】
具体的に言うと、前記抗体は、ＤＳＭ２６７４８の下に寄託されたホスト細胞及びＤＳＭ２６７４７の下に寄託された宿主細胞によって産生されるような従来技術の抗体ではない。特に、本発明の抗体は、以下を含む宿主細胞によって産生された抗体＃ＡＢ-２４ではない。
ｉ）コード配列がＤＳＭ２６７４８の下に寄託された宿主細胞中に含まれる、＃ＡＢ-２４-ＬＣと称される抗体軽鎖、及び
ii）コード配列がＤＳＭ２６７４７の下に寄託された宿主細胞中に含まれる、＃ＡＢ-２４-ＨＣと称される抗体重鎖。
【００２３】
その上で、本発明の抗体は、例えば、ＦＲ配列のいずれか及び／又はＣＤＲ配列のいずれかにおいて異なるアミノ酸配列を有するような任意の従来技術の抗体の機能的変異体であってもよい。特に、本発明の抗体は、抗体＃ＡＢ-２４と同じエピトープ特異性を有する、抗体＃ＡＢ-２４の任意の機能的変異体であってもよい。
【００２４】
＃ＡＢ-２４と称される抗体の特異変異体は、特に本特許請求の範囲の主題に包含され、以下を含むが、これらに限定されたない：ＣＤＲ変異体、ＦＲ変異体、マウス、キメラ、ヒト化又はヒト変異体、又は任意の抗体ドメインの組み合わせ（前記寄託物質のＬＣ及びＨＣから構成される組み合わせ以外）、例えば、同じＣＤＲ１〜６又はＶＨ/ＶＬ組み合わせを含み、その上で、異なるＦＲ配列を有する抗体、例えば、様々な種類の全長抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどを含む。
【００２５】
特定の側面では、本発明は、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素 （Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む単離モノクローナル抗体を提供する。例えば、＃ＡＢ-２４と称される抗体と同じ結合特異性を有するもの、又は、＃ＡＢ-２４と称される抗体と交差競合するものであって、＃ＡＢ-２４と称される抗体から派生したもの、又は、＃ＡＢ-２４と称される抗体の機能的に活性な変異体、好ましくは、前記＃ＡＢ-２４と称される抗体は、以下を特徴とする。
ａ）抗体軽鎖であって、そのコード配列は宿主細胞を形質転換するために使用されたプラスミド中に含まれており、形質転換された宿主細胞はＤＳＭ２６７４８の下に寄託されている；及び／又は
ｂ）抗体重鎖であって、そのコード配列は宿主細胞を形質転換するために使用されたプラスミド中に含まれており、形質転換された宿主細胞はＤＳＭ２６７４７の下に寄託されている。
【００２６】
具体的には、前記＃ＡＢ-２４と称される抗体は、ＤＳＭ２６７４８の下に寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされた、可変領域又はＬＣを含む抗体軽鎖、及び、ＤＳＭ２６７４７の下に寄託された大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされた、可変領域又はＨＣを含む抗体重鎖で構成される。
【００２７】
具体的には、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、少なくとも以下の１つを含む：
ａ）親ＣＤＲ配列中の１，２又は３つの点変異；又は
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端あるいは４つのＮ末端、又は４つの中心アミノ酸位のいずれかにおける１又は２つの点変異。
【００２８】
具体的には、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、以下のいずれかである：
ａ）ＹＰＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号４）、及びＹＳＩＳＳＧＭＧＷＤ（配列番号５）からなる群より選択されるＣＤＲ１配列；又は
ｂ）ＳＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６）、ＲＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７）、ＲＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号８）、ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＥＧ（配列番号９）及びＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＰＬＥＳ（配列番号１０）からなる群より選択されるＣＤＲ２配列；又は
ｃ）ＡＲＤＡＧＨＧＡＤＭＤＶ（配列番号１１）、及びＡＲＤＡＧＨＡＶＤＭＤＶ（配列番号１２）からなる群より選択されるＣＤＲ３配列
【００２９】
具体的には、前記抗体は前記ＣＤＲ配列を特徴とし、ここで、
ａ）ＶＨ ＣＤＲ１における５位で、アミノ酸残基がＳ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＨ、Ｒ及びＷのいずれかである；
ｂ）ＶＨ ＣＤＲ１における７位で、アミノ酸残基がＭ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＷからなる群より選択され、好ましくはＫ、Ｒ又はＷのいずれかである；
ｃ）ＶＨ ＣＤＲ２における３位で、アミノ酸残基がＤ及びＲからなる群より選択される；
ｄ）ＶＨ ＣＤＲ２における７位で、アミノ酸残基がＳ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＤ、Ｈ、Ｋ、Ｎ又はＱのいずれかであり、より好ましくはＱである；
ｅ）ＶＨ ＣＤＲ２における９位で、アミノ酸残基がＹ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ及びＲからなる群より選択され、好ましくはＲである；
ｆ）ＶＨ ＣＤＲ３における５位で、アミノ酸残基がＧ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹのいずれかである；
ｇ）ＶＨ ＣＤＲ３における６位で、アミノ酸残基がＨ、Ｅ、Ｑ及びＳからなる群より選択され、好ましくはＥ又はＱのいずれかである；
ｈ）ＶＨ ＣＤＲ３における７位で、アミノ酸残基がＧ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷからなる群より選択され、好ましくはＷである；及び／又は
ｉ）ＶＨ ＣＤＲ３における８位で、アミノ酸残基がＶ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、好ましくはＭ又はＲのいずれかである。
【００３０】
特定の実施形態では、前記抗体は、以下からなる群より選択される；
ａ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号６のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号１１のＣＤＲ３配列；
ｂ）以下を含む抗体
ａ．配列番号４のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号７のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｃ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号８のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｄ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号２のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号１２のＣＤＲ３配列；
ｅ）以下を含む抗体
ａ．配列番号５のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号９のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｆ）以下を含む抗体
ａ．配列番号５のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号１０のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列
【００３１】
特定の側面によれば、前記抗体は、配列番号２０〜３１からなる群より選択されるＶＨアミノ酸配列を含む。
【００３２】
特定の側面によれば、前記抗体は、配列番号４０〜５１からなる群より選択される抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、又はＣ末端アミノ酸が欠失した（特にＣ末端リジンが欠失した）配列番号４０〜５１のアミノ酸配列のいずれかを有する。
【００３３】
具体的には、配列番号４０〜５１は、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３４】
具体的には、配列番号４０は、配列番号２０のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３５】
具体的には、配列番号４１は、配列番号２１のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３６】
具体的には、配列番号４２は、配列番号２２のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３７】
具体的には、配列番号４３は、配列番号２３のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３８】
具体的には、配列番号４４は、配列番号２４のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００３９】
具体的には、配列番号４５は、配列番号２５のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４０】
具体的には、配列番号４６は、配列番号２６のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４１】
具体的には、配列番号４７は、配列番号２７のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４２】
具体的には、配列番号４８は、配列番号２８のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４３】
具体的には、配列番号４９は、配列番号２９のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４４】
具体的には、配列番号５０は、配列番号３０のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４５】
具体的には、配列番号５１は、配列番号３１のＶＨアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＨＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＨ又はＨＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００４６】
特定の側面によれば、前記ＨＣ配列のそれぞれは、定常領域において末端が延長されていても、欠失されていてもよい（例えば、Ｃ末端アミノ酸の一以上の欠失）。
【００４７】
具体的には、Ｃ末端リジン残基を含む前記ＨＣ配列のそれぞれが、好ましくはそのようなＣ末端リジン残基の欠失とともに利用される。
【００４８】
特定の実施形態によれば、前記抗体はさらに、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ４〜ＣＤＲ６）を含み、好ましくはここで、
Ａ）前記抗体は、
ａ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含むか、又は、
Ｂ）前記抗体は、
ａ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ４；又は
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ５；又は
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ６；
の少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変異体を含み、
ここで、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、親ＣＤＲ配列における少なくとも１つの点変異を含み、且つ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【００４９】
具体的には、前記抗体は、前記ＣＤＲ配列を特徴とし、ここで、
ａ）ＶＬ ＣＤＲ４における７位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＬ、Ｍ、Ｒ又はＷのいずれかであり、より好ましくはＲである；
ｂ）ＶＬ ＣＤＲ５における１位で、アミノ酸残基が、Ａ及びＧからなる群より選択される；
ｃ）ＶＬ ＣＤＲ５における３位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ及びＷからなる群より選択される；
ｄ）ＶＬ ＣＤＲ５における４位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、好ましくはＫ、Ｎ、Ｑ及びＲのいずれかである；
ｅ）ＶＬ ＣＤＲ６における３位で、アミノ酸残基が、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群より選択される；
ｆ）ＶＬ ＣＤＲ６における４位で、アミノ酸残基が、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｒ及びＷからなる群より選択される；
ｇ）ＶＬ ＣＤＲ６における５位で、アミノ酸残基が、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＷからなる群より選択される；及び／又は
ｈ）ＶＬ ＣＤＲ６における６位で、アミノ酸残基が、Ｆ及びＷからなる群より選択される。
【００５０】
特定の側面によれば、本発明の抗体は、当該抗体がなお機能的に活性であるという条件で、図１に挙げられたＣＤＲの組み合わせを含む。
【００５１】
具体的には、本発明の抗体は、図１に挙げられた抗体の任意のＣＤＲ１〜６を含む。しかしながら、別の実施形態では、前記抗体は、異なるＣＤＲの組み合わせを含んでもよい。例えば、この際、図１に挙げられた抗体は、ある抗体の１、２、３、４、５、又は６ＣＤＲ配列のような少なくとも１つのＣＤＲ配列、及び図１に挙げられた任意の抗体の異なる抗体のさらなるＣＤＲ配列を少なくとも１つ含む。特定の例によれば、前記抗体は、１、２、３、４、５、又は６ＣＤＲ配列を含み、この際、当該ＣＤＲ配列は、２以上の抗体、例えば２、３、４、５、又は６の異なる抗体のＣＤＲの組み合わせである。例えば、前記ＣＤＲ配列は、好ましくは、図１に挙げられた任意の抗体のＣＤＲ１〜３の１，２又は３全て、及び、図１に挙げられた同じ又は任意の他の抗体のＣＤＲ４〜６の１，２又は３全てを含むために、組み合わせられてもよい。
【００５２】
ここで具体的には、ＣＤＲ１，２及び３と番号を付されたＣＤＲは、ＶＨドメインの結合領域を表し、ＣＤＲ４、５及び６はＶＬドメインの結合領域を表すと理解される。
【００５３】
特定の側面では、本発明の抗体は、図１に示される任意のＨＣ及びＬＣアミノ酸配列の組み合わせ、又はＨＣ及びＬＣアミノ酸配列のそのような組み合わせによって形成される結合部位を含む。また、当該抗体がなお機能的に活性であることを条件として、２つの異なる抗体の免疫グロブリン鎖の組み合わせが使用されてもよい。例えば、ある抗体のＨＣ配列は、別の抗体のＬＣ配列と組み合わされてもよい。さらに特定の実施形態によれば、図１に提供されたフレームワーク領域のいずれかが、ここに記載されたＣＤＲ配列及び／又はＶＨ/ＶＬ組み合わせのいずれかへのフレームワークとして使用されてもよい。
【００５４】
本発明の抗体は、任意で、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有する図１のアミノ酸配列を含むことが理解される。
【００５５】
特定の側面によれば、図１の配列の各々は、定常領域において末端が延長されていても欠失されていてもよい（例えば、Ｃ末端アミノ酸の一以上の欠失）。
【００５６】
図１は、ＣＤＲ１、２及び／又は３のいずれかに類似性を有する１２の異なるＨＣ配列及び１つのＬＣ配列を示し、そして、任意のＨＣ/ＬＣの組み合わせをサポートし、ここで、あるＨＣのＣＤＲ１〜３の１つ、例えばＣＤＲ１は、第二及び任意で第三のＨＣの任意の他のＣＤＲ配列、例えば第二及び第三ＨＣのＣＤＲ２及びＣＤＲ３それぞれ、と組み合わされる。
【００５７】
特定の側面によれば、前記抗体は、配列番号３９のＶＬアミノ酸配列又は配列番号５２の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸を含む。
【００５８】
具体的には、配列番号５２は、配列番号３９のＶＬアミノ酸配列を含み、且つ、シグナル配列によってＮ末端が延長されたＬＣ配列を示す。前記特異抗体は、それぞれのシグナル配列を有する又は有さない、あるいは代わりのシグナル又はリーダー配列を有するＶＬ又はＬＣアミノ酸配列を含むと理解される。
【００５９】
特定の側面によれば、本発明の抗体は、配列番号２０〜３１のＶＨアミノ酸配列のいずれか、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列、又はＶＨ及びＶＬアミノ酸配列のそのような組み合わせによって形成される結合部位を含む。
【００６０】
特定の側面によれば、本発明の抗体は、配列番号４０〜５１のＨＣアミノ酸配列のいずれか、及び配列番号５２のＬＣアミノ酸配列、又はＨＣ及びＬＣアミノ酸配列のそのような組み合わせによって形成される結合部位を含む。
【００６１】
本発明によれば、さらに、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体が提供され、ここで、当該抗体は、配列番号２０のＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列の多特異性結合部位を含む親抗体の、機能的に活性な変異抗体であり、当該機能的に活性な変異抗体は、配列番号２０又は配列番号３９のいずれかにおいて任意のフレームワーク領域（ＦＲ）又は定常ドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）に少なくとも１つの点変異を含み、各毒素と、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満、好ましくは１０-10Ｍ未満、好ましくは１０-11Ｍ未満のＫｄで結合する親和性（例えば、ピコモル範囲の親和性）を有する。
【００６２】
具体的には、前記機能的に活性な変異抗体は、本発明の機能的に活性なＣＤＲ変異体の少なくとも１つを含む。
【００６３】
具体的には、前記機能的に活性な変異体は、親抗体、例えば図１に挙げられた任意の抗体と、アミノ酸配列において（好ましくはＣＤＲにおいて）少なくとも１つの点変異にて異なり、ここで、前記ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれにおける点変異の数は、０，１，２又は３のいずれかである。
【００６４】
具体的には、前記抗体はそのような抗体に由来し、それぞれのＣＤＲ配列、又はＣＤＲ変異株（機能的に活性なＣＤＲ変異体を含む、例えば、あるＣＤＲループ内に、例えば、５〜１８アミノ酸ＣＤＲ長の内に、例えば５〜１５アミノ酸又は５〜１０アミノ酸のＣＤＲ領域の内に１，２又は３つの点変異を有する）を利用する。また、機能的に活性なＣＤＲ変異体を含む抗体を提供するために、１つのＣＤＲループ内、例えばアミノ酸５未満のＣＤＲ長内に、１〜２の点変異があってもよい。特定のＣＤＲ配列は短くてもよい（例えば、ＣＤＲ２又はＣＤＲ５配列）。特定の実施形態によれば、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、４又は５未満のアミノ酸からなる任意のＣＤＲ配列中に１又は２つの点変異を含む。
【００６５】
特定の側面によれば、本発明の抗体は、ＣＤＲ及びフレームワーク配列を含み、ここで、前記ＣＤＲ及びフレームワーク配列の少なくとも１つは、ヒトの、ヒト化の、キメラの、マウスの又は親和性成熟配列を含み、ここで、好ましくは前記フレームワーク配列は、ＩｇＧ抗体のもの、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプのもの、又はＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体のものである。
【００６６】
特定の抗体は、例えば、親抗体の製造可能性又は耐容性を改良するため、例えば、親抗体と比較してＣＤＲ配列及び／又はフレームワーク配列のいずれかに変異を有するヒト化抗体のような、低い免疫原性を有する改良された（変異型）抗体を提供するために、フレームワーク変異抗体として提供される。
【００６７】
さらに特定の抗体は、例えば、抗体の親和性を改良するため及び／又は親抗体によって標的にされるエピトープ付近の同じ１つのエピトープ又は複数のエピトープを標的化するために（エピトープ・シフト）、ＣＤＲ変異抗体として提供される。
【００６８】
従って、図１に挙げられた抗体はいずれも、改良型を設計するために、親抗体として使用されてもよい。
【００６９】
特に、前記機能的に活性な変異抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
【００７０】
特定の側面によれば、前記少なくとも１つの点変異は、一以上のアミノ酸の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入のいずれかである。
【００７１】
特に、前記少なくとも１つの点変異は、以下のアミノ酸置換のいずれかである。
−ＣＤＲ２におけるＳ５１Ｒ又はＳ５１Ｋ；又は
−ＣＤＲ３におけるＧ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ又はＶ１０４Ｓ
【００７２】
特に、本発明の抗体によって標的にされる二成分毒素は、ガンマ溶血素（ＨｌｇＡＢＣ）、ＰＶＬ毒素（ＬｕｋＳＦ）及びＰＶＬ様毒素のＦ及びＳ成分の同族及び非同族対（好ましくはＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＧＨ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＧ−ＨｌｇＡ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦのいずれか）からなる群より選択される。
【００７３】
特定の側面によれば、前記抗体は、Ｈｌａ及び少なくとも１つの前記二成分毒素のＦ成分又はそのようなＦ成分を含む毒素（好ましくは少なくとも２つ又は３つ）、好ましくはＨｌａ及び少なくとも３つの前記二成分毒素のＦ成分、又はそのようなＦ成分を含む毒素に結合する交差特異性を有する。
【００７４】
特に、前記Ｆ成分は、ＨｌｇＢ、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤからなる群より選択されるか、又は、ガンマ溶血素、ＰＶＬ毒素及びＰＶＬ様毒素のＦ及びＳ成分の同族及び非同族対（好ましくはＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦ）の任意のＦ成分である。
【００７５】
特に、本発明の抗体によって標的にされるＦ成分は、ＨｌｇＢ、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤのいずれか１つ、２つ又は３つである。
【００７６】
好ましくは、  前記結合部位は、少なくとも２つ又は少なくとも３つの二成分毒素、好ましくは、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ及びＬｕｋＥＤの任意の少なくとも２つ又は３つ、好ましくはＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ及びＬｕｋＥＤの全てに結合する。
【００７７】
特定の側面によれば、前記抗体は、一以上の前記毒素が、ホスホコリン又はホスファチジルコリンに、特に哺乳類細胞膜のホスファチジルコリンに結合するのを阻害する。
【００７８】
特定の側面によれば、抗体は、ｍＡｂ：毒素比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）１００：１未満、好ましくは５０：１未満、好ましくは２５：１未満、好ましくは１０：１未満、より好ましくは１：１未満のＩＣ５０で、細胞に基づくアッセイにおいてインビトロ中和能を示す。
【００７９】
さらなる特定の側面によれば、前記抗体は、ヒト及び非ヒト動物の両方を含む動物において、標的毒素を中和し、そしてインビボにおける黄色ブドウ球菌発病、好ましくは肺炎、菌血症、敗血症、膿瘍、皮膚感染症、腹膜炎、カテーテル及び補綴具が関与する感染及び骨髄炎の任意のモデルを阻害する。
【００８０】
特定の側面によれば、前記抗体は、全長モノクローナル抗体、結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は、結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質である。好ましくは前記抗体は、マウス、キメラ、ヒト化又はヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＬのような）からなる群より選択され、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。
【００８１】
本発明は、さらに、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現するコード配列を含む発現カセット又はプラスミドを提供する。
【００８２】
本発明は、特に、
ａ）本発明の抗体のＶＨ及び／又はＶＬ；又は
ｂ）本発明の抗体のＨＣ及び／又はＬＣ
を発現するためのコード配列を含む発現カセット又はプラスミドを提供する。
【００８３】
本発明はさらに、本発明の発現カセット又はプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
【００８４】
特に、ＤＳＭ２６７４７又はＤＳＭ２６７４８の下に寄託された、プラスミド及び宿主細胞は排除される。そのような寄託は、プラスミドで形質転換された大腸菌宿主細胞であり、ＤＳＭ２６７４８の下に寄託されている宿主細胞は、＃ＡＢ−２４−ＬＣと称される抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドで形質転換され；ＤＳＭ２６７４７の下に寄託されている宿主細胞は、＃ＡＢ−２４−ＨＣと称される抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドで形質転換されている。
【００８５】
特に好ましいのは、宿主細胞及びこうした宿主細胞を使用する産生方法であって、ここで宿主細胞は
抗体軽鎖を発現するコード配列を組み込んだ、本発明のプラスミド又は発現カセット；
及び
抗体重鎖を発現するコード配列を組み込んだ、本発明のプラスミド又は発現カセット
を含む。
【００８６】
本発明は、さらに、本発明に係る抗体を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を、前記抗体を産生する条件下で培養するか又は維持する方法を提供する。
【００８７】
本発明はさらに、親抗体（本発明の抗体であって、例えば図１に示された抗体、又は図１に示されたＨＣ及びＬＣアミノ酸配列の組み合わせのいずれかを含む、又はＨＣ及びＬＣアミノ酸配列のそのような組み合わせによって形成された結合部位を含む、又は、配列番号２０〜３１のいずれかのＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列の多特異性結合部位を含む抗体）の機能的に活性な抗体変異体を産生する方法を提供し、当該方法は、変異抗体を得るために配列番号２０〜３１又は配列番号３９のいずれか内の、任意のフレームワーク領域（ＦＲ）又は定常ドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）において少なくとも１つの点変異を設計すること、及び以下のいずれかによって、前記変異抗体の機能的活性を測定することを含む；
−黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素のそれぞれに、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満、好ましくは１０-10Ｍ未満の、好ましくは１０-11未満のＫｄで、結合する親和性（例えばピコモル範囲の親和性）、及び／又は
−親抗体と競合する、Ｈｌａ又は前記少なくとも１つの二成分毒素への前記変異抗体の結合、
ここで、当該機能的活性の測定により、機能的に活性な変異体が、組換え産生方法による産生のために選択される。
【００８８】
機能的に活性な変異抗体は、ＶＨ又はＶＬ配列のいずれかで異なってもよく、又は共通のＶＨ又はＶＬ配列を有してもよく、及び、それぞれのＦＲにおける改変を含んでもよい。突然変異誘発による前記親抗体由来の変異抗体は、当該分野において周知の方法で産生されてもよい。
【００８９】
代表的な親抗体は、以下の実施例セクション及び図１に記載される。特に、前記抗体は、図１に挙げられた親抗体の機能的に活性な誘導体である。１以上改変されたＣＤＲ配列を有する、及び／又は１以上改変されたＦＲ配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４配列等）、又は改変された定常ドメイン配列を有する変異体が、設計されてもよい。
【００９０】
本発明は、さらに、本発明の抗体を産生する方法であって
（ａ）本明細書で定義されるエピトープの三次元構造で、非ヒト動物を免疫し；
（ｂ）単離Ｂ細胞から不死化細胞株を形成し；
（ｃ）ｂ）で得られた細胞株をスクリーニングして、前記エピトープに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し；及び
（ｄ）モノクローナル抗体、あるいは当該抗体のヒト化型又はヒト型、あるいは当該モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を持つその誘導体を産生する
工程を含む、方法を提供する。
【００９１】
さらなる側面によれば、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって
（ａ）黄色ブドウ球菌のアルファ毒素及び／又は少なくとも１つの二成分毒素で、非ヒト動物を免疫し、そして抗体を産生するＢ細胞を単離し；
（ｂ）単離Ｂ細胞から不死化細胞株を形成し；
（ｃ）細胞株をスクリーニングして、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素及び少なくとも１つの二成分毒素に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し；及び
（ｄ）モノクローナル抗体、あるいは当該抗体のヒト化型又はヒト型、あるいは当該モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を持つその誘導体を産生する
工程を含む、方法を提供する。
【００９２】
本発明はさらに、医学的使用のための本発明の抗体、特に、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか又は当該感染を患っている被験体を治療する際に使用するための抗体を提供し、当該治療は、被験体における感染を限定するのに有効な量の抗体を被験体に投与して、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、又は黄色ブドウ球菌疾患の発病（肺炎、敗血症、菌血症、創傷感染、膿瘍、手術部位感染、眼内炎、フルンケル症、カルブンケル症、心内膜炎、腹膜炎、骨髄炎又は関節感染等）を阻害することを含む。
【００９３】
具体的には、前記抗体は、黄色ブドウ球菌感染に対する防御のために提供される。
【００９４】
それゆえ本発明は、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか又は当該感染を患っている被験体を治療する方法であって、被験体における感染を限定するのに有効な量の抗体を被験体に投与することによって、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、又は黄色ブドウ球菌疾患の発症（肺炎、敗血症、菌血症、創傷感染、膿瘍、手術部位感染、眼内炎、フルンケル症、カルブンケル症、心内膜炎、腹膜炎、骨髄炎又は関節感染等）を阻害して治療する、方法を提供する。
【００９５】
具体的には、病原性黄色ブドウ球菌に対する防御のための治療法を提供する。
【００９６】
本発明はさらに、本発明の抗体を含む医薬品であって、好ましくは、非経口又は粘膜用製剤を含み、任意に薬学的に許容されるキャリアー又は賦形剤を含有する、医薬品を提供する。
【００９７】
そのような医薬組成物は、前記抗体を唯一の活性物質として含んでもよく、あるいは他の活性物質との組み合わせで、あるいは活性物質のカクテルとして含んでもよく（例えば少なくとも２つ又は３つの異なる抗体の組み合わせ又はカクテル）、例えば、ここで前記他の活性物質は、さらに黄色ブドウ球菌を標的にする（例えば少なくとも１種の他の毒素を標的とするＯＰＫ抗体又は抗体）。具体的には、前記抗体のカクテルは、本発明の抗体を１つ以上含み、その各々が毒素を標的とし、当該組み合わせは、カクテル中の単一抗体と比べて、より様々なエピトープ又は毒素を標的とする。
【００９８】
本発明はさらに、高毒素産生ＭＲＳＡ感染を含む任意の黄色ブドウ球菌感染、例えば壊死性肺炎、ならびにフルンケル症及びカルブンケル症における毒素産生を検出する診断使用のための本発明の抗体を提供する。
【００９９】
本発明はさらに、本発明の抗体の診断用製剤であって、任意で標識を含む抗体及び／又は標識を含むさらなる診断試薬を含有する、製剤を提供する。
【０１００】
具体的には、前記抗体は、本発明による診断使用のために提供され、当該抗体と被験体の体液試料を接触させることによって、当該被験体における黄色ブドウ球菌による全身感染が生体外で決定され、ここで抗体の特異的免疫反応が、感染を決定する。
【０１０１】
それゆえ、本発明はさらに、被験体において黄色ブドウ球菌感染を診断するそれぞれの方法に言及し、特に当該方法では、被験体における黄色ブドウ球菌による全身感染症が決定される。
【０１０２】
本発明はさらに、Ｈ１ａモノマーによって形成される結晶であって、Ｘ線照射を回折し、本発明の抗体、又はその結合フラグメント、好ましくはＦａｂフラグメントと接触しているＨｌａ縁領域（rim domain）の三次元構造を表す回折パターンを生じ、以下のセル定数を有するものを提供する：２８５．０５Å、１５０．９４Å、１１５．２５Å、空間群Ｐ２1２1２、場合によって０．００Å及び２．００Åの間のずれを有する。
【０１０３】
本発明はさらに、ＬｕｋＤモノマーによって形成される結晶であって、Ｘ線照射を回折し、本発明の抗体、又はその結合フラグメント、好ましくはＦａｂフラグメントと接触しているＬｕｋＤ縁領域（rim domain）の三次元構造を表す回折パターンを生じ、以下のセル定数を有するものを提供する：１１２．０Å、１１２．０Å、４０９．３Å、空間群Ｈ３２、場合によって０．００Å及び２．００Åの間のずれを有する。
【０１０４】
本発明は、さらに本発明の抗体の単離パラトープ、又は前記パラトープを含む結合分子を提供する。
【０１０５】
本発明はさらに、本発明の抗体によって認識される単離立体構造エピトープであって、Ｈｌａ、 ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ又はＨｌｇＢの縁領域の三次元構造を特徴とするエピトープを提供する。そのようなエピトープは、単一のエピトープからなってもあるいはエピトープ変異体を含むエピトープの混合物からなってもよく、そのそれぞれが本発明の抗体によって認識される。
【０１０６】
本発明はさらに、以下からなる群より選択される三次元構造を特徴とする、本発明のエピトープを提供する：
ａ）配列番号５４の接触アミノ酸残基１７９-１９１、１９４、２００、２６９及び２７１の構造座標を特徴とする三次元Ｈｌａ構造；
ｂ）配列番号５５の接触アミノ酸残基１７６-１８８、１９１、１９７及び２６７の構造座標を特徴とする三次元ＬｕｋＦ構造、好ましくは配列番号５８のアミノ酸残基１７６-１７９、１８１-１８４、１８６-１８８、１９１、１９７及び２６７を有する；
ｃ）配列番号５４の接触アミノ酸残基１７６-１８８、１９１、１９７及び２６７の構造座標を特徴とする三次元ＬｕｋＤ構造、好ましくは配列番号６２のアミノ酸残基１７６-１７９、１８１-１８４、１８６-１８８、１９１、１９７及び２６７を有する；
ｄ）配列番号５６のアミノ酸接触残基１７７-１８９、１９２、１９８及び２６８の構造座標を特徴とする三次元ＨｌｇＢ構造、好ましくは配列番号６８のアミノ酸残基１７７-１８０、１８２-１８５、１８７-１８９、１９２、１９８及び２６８を有する；
ｅ）本発明の結晶の三次元Ｈｌａ縁領域構造；
ｆ）本発明の結晶の三次元ＬｕｋＤ縁領域構造；及び
ｇ）ａ）〜ｆ）のいずれかの相同体である三次元構造、ここで当該相同体は、接触アミノ酸残基の骨格原子からの平均二乗偏差０．００Ａ〜２．００Ａを有する結合部位を含む。
【０１０７】
具体的には、前記エピトープは結合分子によって結合される。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明のエピトープに特異的に結合する結合剤又は結合分子であって、好ましくはタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、オリゴペプチド、アプタマー及び小分子化合物、好ましくは抗体、前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質、からなる群より選択される結合剤又は結合分子を提供する。
【０１０９】
具体的には、前記結合剤又は結合分子は、黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合剤である。
【０１１０】
具体的には、前記結合剤又は結合分子は、毒素がホスホコリンに結合するのを妨げ、本発明の抗体と競合する。
【０１１１】
本発明はさらに、本発明のエピトープに特異的に結合又は本発明のエピトープを特異的に認識する結合剤を同定するためのスクリーニング法又はアッセイであって、
−候補化合物を本明細書に定義するエピトープの三次元構造と接触させる工程、及び、
−前記候補化合物と前記三次元構造間の結合を評価する工程、ここで、前記候補化合物と前記三次元構造間の結合は、当該候補化合物が、黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素と結合する多特異性結合剤であることを同定する
を含むスクリーニング法又はアッセイを提供する。例えば、前記候補化合物と前記三次元構造又は前記エピトープ間の、正の機能的結合反応は、前記化合物が防御的結合剤であることを特定する。
【０１１２】
さらなる側面によれば、本発明は：
（ａ）本発明のエピトープ；
（ｂ）任意で、（ａ）のエピトープと天然には会合しないさらなるエピトープ；及び
（ｃ）キャリアー
を含む、免疫原を提供する。
【０１１３】
具体的には、キャリアーは、薬学的に許容されるキャリアーであり、好ましくはバッファー及び／又はアジュバント物質を含む。
【０１１４】
本発明の免疫原は、好ましくは、ワクチン製剤中で、好ましくは非経口使用のために提供される。
【０１１５】
具体的には、本発明の免疫原は、医学的使用のために、特に、黄色ブドウ球菌感染から被験体を防御するか、前記感染から生じる疾患状態を阻止するか、又は黄色ブドウ球菌肺炎の発病を阻害するのに有効な量の前記免疫原を投与することによって、被験体を治療する際に使用するために、提供される。
【０１１６】
具体的には、本発明の免疫原は、防御免疫応答を誘発するために提供される。
【０１１７】
特定の側面によれば、黄色ブドウ球菌感染のリスクがある被験体を治療する治療法であって、被験体における感染を防止する、特に病原性黄色ブドウ球菌に対して防御するのに有効な量の免疫原を被験体に投与する工程を含む方法がさらに提供される。
【０１１８】
さらなる側面によれば、本発明は、本発明の抗体をコードするか、又は本発明のエピトープをコードする、単離核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
［図１］Ｈｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂのアミノ酸配列及びＦａｂ ＫD親和性
重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列、ＦＲ配列及び全長配列情報（それぞれのＦＲ及びＣＤＲ配列（配列番号１〜３９）の複合配列である）が示され、親のＡＢ-２８ｍＡｂに対するアミノ酸の変更が、太字及び下線で示される。Ｆａｂ ＫD親和性は、Sector Immager 2400 instrument（Meso Scale Discovery）を使用するＭＳＤ法によって測定された。典型的には、２０ｐＭのビオチン化抗原が、様々な濃度のＦａｂと、室温で１６時間インキュベートされ、非結合抗原が固定化ＩｇＧで捕獲された。例えば、Estepらによる“High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning”, MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)も参照。Ｆａｂ ＫD親和性は、各抗体について及び各毒素成分についてｐＭで示される。
図１で使用される命名法は、以下の意味を有する：
ＶＨ ＣＤＲ１＝ＣＤＲ１；
ＶＨ ＣＤＲ２＝ＣＤＲ２；
ＶＨ ＣＤＲ３＝ＣＤＲ３；
ＶＬ ＣＤＲ４＝ＣＤＲ４＝ＶＬ ＣＤＲ１；
ＶＬ ＣＤＲ５＝ＣＤＲ５＝ＶＬ ＣＤＲ２；
ＶＬ ＣＤＲ６＝ＣＤＲ６＝ＶＬ ＣＤＲ３；
［図２］Ｈｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂの毒素中和能は、個々の毒素成分への親和性が向上するにつれて増加した。
Ａ：ウサギの血液細胞に対するＨｌａ[１２．２ｎＭ]溶血抑制アッセイ  Ｂ：ヒト多形核細胞（ＰＭＮ）のＬｕｋＳＦ [２.９４ｎＭ] 中毒  Ｃ：ヒトＰＭＮのＬｕｋＥＤ [７.３５ｎＭ] 中毒  Ｄ：ヒトＰＭＮのＨｌｇＣＢ[２.９４ｎＭ]中毒  Ｙ軸：Sector Immager 2400 instrument（Meso Scale Discovery）を使用するＭＳＤ法によって測定されたＦａｂ ＫＤ親和性  典型的には、２０ｐＭのビオチン化抗原が、様々な濃度のＦａｂと、室温で１６時間インキュベートされ、非結合抗原が固定化ＩｇＧで捕獲された。例えば、Estepらによる“High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning”, MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)も参照。  Ｘ軸：毒素による細胞溶解の最大阻害の５０％におけるｍＡｂと毒素のモル比として表されたＩＣ５０値  親のＡＢ-２８ｍＡｂの親和性及び効力のレベルは、点線で示される。
［図３］全ての標的毒素に高い親和性を有するＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂは、組換えロイコシジンの併用効果の結果生じた細胞溶解を効果的に阻害する。
Ａ：ＨｌｇＡＢ[２.９４ｎＭ]、ＨｌｇＣＢ[２.９４ｎＭ]、ＬｕｋＳＦ[２.９４ｎＭ]及びＬｕｋＥＤ[７.３５ｎＭ]の混合物で中毒されたヒトＰＭＮの溶解の阻害  Ｂ：Ｈｌａ[１２.１２ｎＭ]及びＨｌｇＡＢ[２.９４ｎＭ]、ＨｌｇＡ-ＬｕｋＤ[２.９４ｎＭ]、ＬｕｋＥＤ[２.９４ｎＭ]及びＬｕｋＳＦ[２.９４ｎＭ]の混合物による処理で誘導されたウサギ赤血球溶血の阻害  Ｃ：ウサギ赤血球に対するＨｌａ[１２.１２ ｎＭ]溶血抑制アッセイ  Ｄ：Ｈｌａ[３.０３ ｎＭ]、ＨｌｇＣＢ[２.９４ ｎＭ]、ＬｕｋＳＦ[２.９４ ｎＭ]及びＬｕｋＥＤ[７.３５ ｎＭ]の混合物で中毒されたヒトＰＭＮの溶解の阻害  ｍＡｂの効力は、毒素による細胞溶解の最大阻害の５０％におけるｍＡｂと毒素のモル比で表される。  ＊検出可能な効力なし
［図４］マウスのＨｌｇＡＢ毒素負荷モデルにおけるＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂによる防御
致死量のＨｌｇＡ-ＨｌｇＢ毒素（両方とも０．２μｇ／マウス量で添加される）を静脈内負荷される２４時間前に、マウスは、２００μｇ（０．４ｍｇ／ｍｌ）の表示されたｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ量）で腹腔内処理された。マウスの生存は１０日間追跡された。カプラン・マイヤー生存曲線は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ-Ｃｏｘ）検定を使用して、統計的に有意に異なることが見出された。コントロールマウスは、無関係の抗原に対して産生されたヒトＩｇＧ１で処置された。
［図５］マウスのＨｌｇＡ-ＬｕｋＤ毒素負荷モデルにおけるＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂによる防御は、より高いＬｕｋＤ結合親和性に応じて向上した。
致死量のＨｌｇＡ-ＬｕｋＤ毒素（両方とも１μｇ／マウス量で添加される）を静脈内負荷される２４時間前に、マウスは、１００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ）の表示されたｍＡｂ（５ｍｇ／ｋｇ量）で腹腔内処理された。マウスの生存は１０日間追跡された。カプラン・マイヤー生存曲線は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ-Ｃｏｘ）検定を使用して、統計的に有意に異なることが見出された。コントロールマウスは、無関係の抗原に対して産生されたヒトＩｇＧ１で処置された。
［図６］マウスの肺炎モデルにおけるＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂによる防御
致死量のＴＣＨ１５１６（４０μｌ中６×１０8ｃｆｕ、１．５×１０10ｃｆｕ／ｍｌに対応）を鼻腔内負荷される２４時間前に、マウスは、１００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ）の表示されたｍＡｂ（５ｍｇ／ｋｇ量）で腹腔内処理された。マウスの生存は１０日間追跡された。カプラン・マイヤー生存曲線は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ-Ｃｏｘ）検定を使用して、統計的に有意に異なることが見出された。コントロールマウスは、ビヒクルだけで処置された。
［図７］アミノ酸配列情報：  ＡＢ-２８、ＡＢ-２８-３、ＡＢ-２８-４、ＡＢ-２８-５、ＡＢ-２８-６、ＡＢ-２８-７、ＡＢ-２８-８、ＡＢ-２８-９、ＡＢ-２８-１０、ＡＢ-２８-１１、ＡＢ-２８-１２、ＡＢ-２８-１３のＨＣ（配列番号４０〜５１）、及びＡＢ-２８のＬＣ（配列番号５２）
［図８］本明細書で参照される黄色ブドウ球菌毒素配列
配列番号５３：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌａヌクレオチド配列（ジェンバンク、受入番号 ＣＰ０００７３０）；
配列番号５４：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌａアミノ酸配列；
配列番号５５：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＳヌクレオチド配列；
配列番号５６：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＳアミノ酸配列；
配列番号５７：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＦヌクレオチド配列；
配列番号５８：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＦアミノ酸配列；
配列番号５９：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＥヌクレオチド配列；
配列番号６０：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＥアミノ酸配列 ；
配列番号６１：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＤヌクレオチド配列；
配列番号６２：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＤアミノ酸配列；
配列番号６３：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＡヌクレオチド配列；
配列番号６４：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＡアミノ酸配列；
配列番号６５：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＣヌクレオチド配列；
配列番号６６：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＣアミノ酸配列；
配列番号６７：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＢヌクレオチド配列；
配列番号６８：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＨｌｇＢアミノ酸配列；
配列番号６９：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＨヌクレオチド配列；
配列番号７０：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＨアミノ酸配列；
配列番号７１：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＧヌクレオチド配列；
配列番号７２：ＵＳＡ３００ ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＧアミノ酸配列；
配列番号７３：ＭＲＳＡ２５２株（ジェンバンク、受入番号ＢＸ５７１８５６）のＬｕｋＨヌクレオチド配列；
配列番号７４：ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＨアミノ酸配列；
配列番号７５：ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＧヌクレオチド配列；
配列番号７６：ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＧアミノ酸配列；
配列番号７７：ＭＳＨＲ１１３２株（ジェンバンク、受入番号ＦＲ８２１７７７）のＬｕｋＨヌクレオチド配列；
配列番号７８：ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＨアミノ酸配列；
配列番号７９：ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＧヌクレオチド配列；
配列番号８０: ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＧアミノ酸配列
［図９］Ａ．Ｈｌａ：ＡＢ-２８複合体の構造；Ｈｌａは球として表され、ＡＢ-２８のＦａｂフラグメントは、軽鎖が黒色カートンで重鎖が灰色カートンで表される。Ｂ．球で示されたＡＢ-２８エピトープ（接触残基）を有するＨｌａモノマー（黒：Ｈｌａ、 ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で完全に保存されるアミノ酸）。
［図１０］Ａ．ＬｕｋＤ:ＡＢ-２８複合体の構造；ＬｕｋＤは球として表され、ＡＢ-２８のＦａｂフラグメントは、軽鎖が黒色カートンで重鎖が灰色カートンで表される。Ｂ．球で示されたＡＢ-２８エピトープ（接触残基）を有するＬｕｋＤモノマー（黒：Ｈｌａ、 ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で完全に保存されるアミノ酸）。
［図１１］ＡＢ-２８の存在下及び不存在下（抗体なし）でのＦｏｒｔｅＢｉｏにおけるビオチン化毒素へのホスホコリン（ＰＣ４-ＢＳＡ）の結合
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体ドメインからなるか又は抗体ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質を指すものとし、抗体ドメインは、リンカー配列を伴う又は伴わない、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常及び／又は可変ドメインと理解される。ポリペプチドは、ループ配列によって連結される抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインと理解される。抗体ドメインは、天然構造でもよいし、あるいは突然変異誘発又は誘導体化によって修飾されて、例えば抗原結合特性又は任意の他の特性、例えば安定性又は機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎ及び／又はＦｃガンマ受容体への結合が修飾されてもよい。
【０１２１】
本明細書で使用される抗体は、１以上の抗原、あるいはこうした抗原の１以上のエピトープに結合する、特異的結合部位を有し、特に単一可変抗体ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨ）のＣＤＲ結合部位、あるいは可変抗体ドメイン対（例えばＶＬ／ＶＨ対）の結合部位、ＶＬ／ＶＨドメイン対及び定常抗体ドメインを含む抗体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、あるいは全長抗体を含む。
【０１２２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に、単一可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨ、あるいは連結配列又はヒンジ領域を伴う又は伴わない、可変及び／又は定常抗体ドメインの組み合わせを含むか、あるいはこれらからなる、抗体形式を指すものとし、可変抗体ドメイン対（例えばＶＬ／ＶＨ対）、ＶＬ／ＶＨドメイン対及び定常抗体ドメインを含むか又はこれらからなる抗体、例えば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）2、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、又は全長抗体、例えばＩｇＧタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体が含まれる。用語「全長抗体」は、Ｆｃドメインの少なくとも大部分、及び天然存在抗体モノマーに一般的に見られる他のドメインを含む、任意の抗体分子を指すために使用されることができる。この句は、本明細書において、特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられる。
【０１２３】
用語「抗体」には、特に、単離型の抗体（異なる標的抗原に対して向けられるか、又は抗体ドメインの異なる構造配置を含む他の抗体を実質的に含まない）が含まれるものとする。なお、単離抗体は、例えば少なくとも１つの他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを含む、単離抗体の組み合わせを含有する、組み合わせ調製物に含まれることも可能である。
【０１２４】
用語「抗体」は、ヒト種を含む動物起源、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシ及びウマ、又は鳥類、例えば雌鶏を含む哺乳動物の抗体に適用されるものとし、この用語は、特に、動物起源の配列、例えばヒト配列に基づく組換え抗体を含むものとする。
【０１２５】
用語「抗体」は、さらに、異なる種起源の配列、例えばマウス及びヒト起源の配列を持つキメラ抗体に適用される。
【０１２６】
用語「キメラ」は、抗体に関して用いられる際、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列各々の１つの部分が、特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同である一方、鎖の残りのセグメントが、別の種又はクラスの対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の１種由来の抗体可変領域を模倣し、一方、定常部分は、別の種由来の抗体配列に相同である。例えば、可変領域は、非ヒト宿主生物由来の、容易に入手可能なＢ細胞又はハイブリドーマを用いて、現在知られる供給源から得ることができ、定常領域（例えばヒト細胞調製物由来の）と組み合わせられる。
【０１２７】
用語「抗体」は、さらに、ヒト化抗体に適用される。
【０１２８】
用語「ヒト化」は、抗体に関して用いた際、非ヒト種由来の免疫グロブリンから実質的に得られる抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、又は可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含むことも可能である。抗原結合部位は、野生型でもよいし、あるいは例えば１以上のアミノ酸置換によって、修飾されていてもよく、好ましくは、ヒト免疫グロブリンにより近似するように修飾される。ヒト化抗体のいくつかの型は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の型は、元の抗体に関して改変されている１以上のＣＤＲを有する。
【０１２９】
用語「抗体」は、さらにヒト抗体に適用される。
【０１３０】
用語「ヒト」は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むと理解される。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばランダム又は部位特異的突然変異誘発によってインビトロで、あるいは体細胞突然変異によってインビボで導入される突然変異）が含まれてもよい（たとえば、ＣＤＲ中に）。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物から、単離される抗体が含まれる。
【０１３１】
用語「抗体」は、特に、任意のクラス又はサブクラスの抗体に適用される。重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの主要なクラスに割り当て可能であり、そしてこれらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられうる。
【０１３２】
当該用語は、さらに、モノクローナル又はポリクローナル抗体、特に組換え抗体に適用され、こうした用語には、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか又は単離されるすべての抗体及び抗体構造が含まれ、例えば、異なる起源由来の遺伝子又は配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物から生じる抗体、例えばマウス、キメラ、ヒト化抗体、又はハイブリドーマ由来抗体が含まれる。さらなる例は、抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から単離される抗体、あるいは抗体又は抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離される抗体、あるいは他のＤＮＡ配列に抗体遺伝子配列をスプライシングすることを含む、任意の他の手段によって、調製されるか、発現されるか、生成されるか、又は単離される抗体を指す。
【０１３３】
用語「抗体」はまた、抗体の誘導体、特に機能的に活性な誘導体も指すと理解される。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメイン又は抗体及び／又は融合タンパク質の任意の組み合わせと理解され、ここで、抗体の任意のドメインは、１以上の他のタンパク質（例えば他の抗体、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドであってもよいが、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素等でもよい）の任意の位置で、融合させてもよい。多様な化学的技術、例えば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合等による、他の物質への会合又は結合によって、抗体の誘導体を得てもよい。抗体に結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機及び無機分子又はその任意の組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグ又は薬剤）であってもよい。特定の実施形態において、抗体は、生物学的に許容されうる化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む誘導体である。本発明で使用可能なタグに関しては、抗体のターゲットへの結合に対して、まったく負の影響がないか又は許容されうる負の影響しかない限り、特別な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリン・タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、及びＳタグが含まれる。別の特定の実施形態において、抗体は、標識を含む誘導体である。本明細書で使用される「標識」という用語は、「標識」抗体を生成するような、抗体に直接又は間接的に複合化された、検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体検出可能であってもよく、例えば放射性同位体標識又は蛍光標識であってもよく、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してもよい。
【０１３４】
本明細書に記載する好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、且つ誘導体化されていない抗体と同様に、好ましくは黄色ブドウ球菌を中和する能力を有し、及び／又は防御抗体である。
【０１３５】
親の抗体又は抗体配列、例えば親のＣＤＲ又はＦＲ配列から派生した抗体は、本明細書において、特に、例えば、インシリコの又は組換え工学によって、あるいは化学的誘導体化又は合成によって得られた変異株又は変異体と理解される。
【０１３６】
特に、本発明の抗体から誘導された抗体は、少なくとも１以上のそのＣＤＲ領域又はＣＤＲ変異体を含んでもよく、例えば、重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲ及び／又は軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを有し、前記ＣＤＲ又はＦＲ領域、あるいはＨＣ又はＬＣの定常領域の少なくとも１つに、少なくとも１つの点変異を有し、機能的に活性である（例えば、毒素を認識する多特異性結合部位に特異的に結合する）。
【０１３７】
用語「抗体」はまた、抗体の変異体も指すと理解され、これには、親ＣＤＲ配列の、機能的に活性なＣＤＲ変異体を有する抗体、及び親抗体の機能的に活性な変異抗体も含まれる。
【０１３８】
用語「変異体」は、特に、例えば突然変異誘発法によって、特に特定の抗体アミノ酸配列又は領域において欠失、交換、挿入物導入を行い、あるいはアミノ酸配列を化学的に誘導体化して、例えば定常ドメインにおいて、抗体安定性、エフェクター機能又は半減期を操作するか、あるいは可変ドメインにおいて、例えば当該技術分野において利用可能なアフィニティ成熟技術によって抗原結合特性を改善して、得られる変異抗体又は抗体フラグメントなどの抗体を指すものとする。任意の既知の突然変異誘発法が使用可能であり、これには、例えばランダム化技術によって得られる、所望の位置での点変異が含まれる。いくつかのケースでは、位置はランダムに選択される（例えば任意のありうるアミノ酸で、又は抗体配列をランダム化する好ましいアミノ酸の選択を用いて）。用語「突然変異誘発」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を改変するための、当該技術分野で認識される任意の技術を指す。好ましいタイプの突然変異誘発には、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、又は他の部位特異的突然変異誘発が含まれる。
【０１３９】
用語「変異体」は、特に、機能的に活性な変異体を含むものとする。
【０１４０】
本明細書で使用されるＣＤＲ配列の「機能的に活性な変異体」という用語は、本明細書で使用される抗体の「機能的に活性なＣＤＲ変異体」及び「機能的に活性な変異体」と理解され、「機能的に活性な抗体変異体」と理解される。機能的に活性な変異体は、この配列（親抗体又は親配列）の１以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換、あるいはアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基、あるいはヌクレオチド配列内のヌクレオチド、あるいは配列の遠位端のいずれか又は両方（例えば、ＣＤＲ配列中のＮ末端及び／又はＣ末端の１，２，３あるいは４つのアミノ酸）、及び／又は中心の１，２，３あるいは４つのアミノ酸（すなわち、ＣＤＲ配列の中央）の化学的誘導体化から生じる配列であって、そしてこうした修飾がこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）配列を意味する。選択される標的抗原に特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性である変異体は、なお、あらかじめ決定された結合特異性を有するであろうが、これを変化させてもよく、例えば特定のエピトープに対する優れた特異性、親和性、結合活性、Ｋｏｎ又はＫｏｆｆ速度等を変化させてもよい。例えば、親和性成熟抗体は、特に機能的に活性な変異抗体と理解される。このように、親和性成熟抗体中の修飾ＣＤＲ配列は、機能的に活性なＣＤＲ変異体と理解される。さらなる修飾が、例えば、交差特異性を広げて親抗体よりも多くの毒素又は毒素成分を標的とするために、又は、１以上の毒素又は毒素成分とのその反応性を高めるために、突然変異誘発を通じておこなわれてもよい。
【０１４１】
特に、本発明の抗体の機能的に活性な変異体は、本明細書にさらに記載するように、黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する、多特異性結合部位を有する。機能的活性のさらなる指標は、細胞膜、特にホスホコリンへの任意の毒素の競合的な結合である。
【０１４２】
機能的活性は、好ましくは細胞溶解毒素に対する抗体の中和能を測定するためのアッセイによって決定され、たとえば、所定の毒素に感受性である細胞の増加した生存能又は機能性を測定することによる標準アッセイで決定される。例えば、抗体が細胞アッセイにおけるインビトロ中和能として、１００：１（ｍＡｂ：毒素の比[ｍｏｌ／ｍｏｌ]）未満、好ましくは５０:１未満、好ましくは２５：１未満、好ましくは１０：１未満、より好ましくは１：１未満のＩＣ５０を示す場合、機能的活性と判定される。中和は典型的には、抗体がある場合及びない場合の生存可能細胞のパーセントで表される。強力な抗体では、中和能を表す好ましい方法は、抗体：毒素のモル比であり、より低い値はより高い効力に対応する。１０未満の値は、高い機能的活性を規定する。場合によっては、値は最も厳密なアッセイにおいて、１と１０の間である。
【０１４３】
機能的に活性である変異体は、例えば親抗体、例えば結合部位（すなわちＣＤＲ領域によって形成される、又は配列番号２０の配列を有するＶＨ、及び配列番号３９の配列を有するＶＬによって形成される、又はそれぞれのＣＤＲ領域によって形成される結合部位）を含む抗体の配列を変化させることによって得られてもよく、このような親抗体又は配列は、その交差反応性を特徴とするが、結合部位以外の抗体領域内に修飾を有し、又は、結合部位内の修飾によって、そのような親抗体から誘導され、それは抗原結合性を損なわず、そして好ましくは親抗体に類似する生物学的活性（黄色ブドウ球菌又は黄色ブドウ球菌毒素を標的とする特異的結合アッセイ又は機能性試験によって測定される、黄色ブドウ球菌毒素に結合する能力及び／又は特異的効力で、例えば、実質的に同じ生物学的活性で黄色ブドウ球菌を中和する能力を含む）を有する。
【０１４４】
特に、任意の以下のＣＤＲ配列が、以下を含むように修飾されてもよい。
ａ）ＶＨ ＣＤＲ１における５位で、アミノ酸残基がＳ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＨ、Ｒ及びＷのいずれかである；
ｂ）ＶＨ ＣＤＲ１における７位で、アミノ酸残基がＭ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＷからなる群より選択され、好ましくはＫ、Ｒ又はＷのいずれかである；
ｃ）ＶＨ ＣＤＲ２における３位で、アミノ酸残基がＤ及びＲからなる群より選択される；
ｄ）ＶＨ ＣＤＲ２における７位で、アミノ酸残基がＳ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＤ、Ｈ、Ｋ、Ｎ又はＱのいずれかであり、より好ましくはＱである；
ｅ）ＶＨ ＣＤＲ２における９位で、アミノ酸残基がＹ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ及びＲからなる群より選択され、好ましくはＲである；
ｆ）ＶＨ ＣＤＲ３における５位で、アミノ酸残基がＧ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹのいずれかである；
ｇ）ＶＨ ＣＤＲ３における６位で、アミノ酸残基がＨ、Ｅ、Ｑ及びＳからなる群より選択され、好ましくはＥ又はＱのいずれかである；
ｈ）ＶＨ ＣＤＲ３における７位で、アミノ酸残基がＧ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷからなる群より選択され、好ましくはＷである；及び／又は
ｉ）ＶＨ ＣＤＲ３における８位で、アミノ酸残基がＶ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、好ましくはＭ又はＲのいずれかである；
【０１４５】
特に、任意の以下のＣＤＲ配列が、以下を含むように修飾されてもよい。
ａ）ＶＬ ＣＤＲ４における７位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｗ及びＹからなる群より選択され、好ましくはＬ、Ｍ、Ｒ又はＷのいずれかであり、より好ましくはＲである；
ｂ）ＶＬ ＣＤＲ５における１位で、アミノ酸残基が、Ａ及びＧからなる群より選択される；
ｃ）ＶＬ ＣＤＲ５における３位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ及びＷからなる群より選択される；
ｄ）ＶＬ ＣＤＲ５における４位で、アミノ酸残基が、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、好ましくはＫ、Ｎ、Ｑ及びＲのいずれかである；
ｅ）ＶＬ ＣＤＲ６における３位で、アミノ酸残基が、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群より選択される；
ｆ）ＶＬ ＣＤＲ６における４位で、アミノ酸残基が、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｒ及びＷからなる群より選択される；
ｇ）ＶＬ ＣＤＲ６における５位で、アミノ酸残基が、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＷからなる群より選択される；及び／又は
ｈ）ＶＬ ＣＤＲ６における６位で、アミノ酸残基が、Ｆ及びＷからなる群より選択される。
【０１４６】
本明細書で使用される「実質的に同じ生物学的活性」という用語は、同等の又は親抗体に関して決定される活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、又は少なくとも１２５％、又は少なくとも１５０％又は少なくとも１７５％、又は例えば最大２００％である、実質的に同じ活性によって示されるような活性を指す。
【０１４７】
本明細書で記載される好ましい変異体又は誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは個々の毒素に特異的に結合する能力を有し、そして、標的毒素ではない他の抗原には有意に結合せず、例えば、少なくとも２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ｌｏｇのＫｄ値の差を有する。機能的に活性な変異体による抗原結合は、典型的には障害されず、親抗体又は配列、又は配列変異体を含む抗体と実質的にほぼ同じ結合親和性に相当し、例えば、２ｌｏｇ未満、好ましくは３ｌｏｇ未満のＫｄ値の差を有し、しかしながら、さらに向上した親和性を有する可能性もある（例えば、少なくとも１ｌｏｇ、好ましくは少なくとも２ｌｏｇのＫｄ値の差）。
【０１４８】
好ましい実施形態では、親抗体の機能的に活性な変異体は、
ａ）抗体の生物学的活性フラグメントであり、当該フラグメントは、分子の配列の少なくとも５０％を含み、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％又は９９％を含み；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加及び／又は欠失によって、抗体から得られ、ここで、機能的に活性な変異体は、分子又はその部分に配列同一性を有し、例えば少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する抗体；及び／又は
ｃ）抗体又はその機能的に活性な変異体、及びポリペプチド又はヌクレオチド配列に対して異種であるさらに少なくとも１つのアミノ酸又はヌクレオチドからなる。
【０１４９】
本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明に係る抗体の機能的に活性な変異体は、本質的には、上述した変異体と同一であるが、異なる種の相同配列から得られている点で、それぞれ、そのポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異なる。これらは、天然存在変異体又は類似体と称される。
【０１５０】
用語「機能的に活性な変異体」には、天然存在対立遺伝子多型、ならびに変異体又は任意の他の天然に存在しない変異体も含まれる。当該技術分野で知られるように、対立遺伝子多型は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には改変しない、１以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有することを特徴とする、（ポリ）ペプチドの代替型である。
【０１５１】
機能的に活性な変異体は、例えば１以上の点変異によって、ポリペプチド又はヌクレオチド配列中の配列改変によって得ることも可能であり、ここで、配列改変は、本発明と組み合わせて用いられた際、改変されないポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。こうした配列改変には、（保存的）置換、付加、欠失、変異及び挿入が含まれうるが、これらに限定されない。
【０１５２】
特定の機能的に活性な変異体は、ＣＤＲ変異体である。ＣＤＲ変異体には、ＣＤＲ領域中の少なくとも１つのアミノ酸によって修飾されたアミノ酸配列が含まれ、ここで、前記修飾は、アミノ酸配列の化学的又は部分的改変であってもよく、修飾は、変異体が非修飾配列の生物学的特性を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的改変は、１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５アミノ酸の欠失又は置換によるか、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５アミノ酸の付加又は挿入、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４又は５アミノ酸の化学的誘導体化、あるいはその組み合わせであってもよい。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば１つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸に関する置換であってもよい。
【０１５３】
保存的置換は、側鎖及び化学的特性において関連するアミノ酸ファミリー内で行われる置換である。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小側鎖、巨大側鎖等を含むアミノ酸である。
【０１５４】
点変異は、特に、１以上の単一の（非連続的）又は二つ組のアミノ酸の異なるアミノ酸に関する置換又は交換、欠失又は挿入において、操作されないアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の発現を生じる、ポリヌクレオチドの操作と理解される。
【０１５５】
好ましい点変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関連して、アミノ酸は、６４の３つ組コドンによってコードされる２０の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０アミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、及び陰性電荷を有するものに分類できる。
【０１５６】
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字及び１文字コード及び極性とともに、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；及び
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、陽性（１０％）中性（９０％）。
【０１５７】
「陽性」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、陽性；及び
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、陽性。
【０１５８】
「陰性」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、陰性；及び
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、陰性
【０１５９】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体配列及び本明細書記載の相同体に関して、配列を整列させ、そして最大配列同一性パーセントを達成するために、必要であればギャップを導入した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、整列を測定するための適切なパラメータを決定することが可能であり、これには、比較しようとする配列の全長に渡って、最大整列を達成するために必要ないかなるアルゴリズムも含まれる。
【０１６０】
抗体変異体は、特に、例えば糖鎖工学によって産生される、機能性であり、そして機能的等価物として働きうる（例えば特定の標的に結合し、機能的特性を有する）、特異的グリコシル化パターンを持つ相同体、類似体、フラグメント、修飾又は変異体を含むと理解される。本明細書に記載する好ましい変異体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは黄色ブドウ球菌を中和する能力を有し、及び／又は防御抗体である。
【０１６１】
本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示してもよいし、又は示さなくてもよい。作用様式は、主に、Ｆｃエフェクター機能を持たない中和抗体によって仲介されるが、Ｆｃは、補体を補充し、そして免疫複合体の形成を通じて、循環からの標的抗原、例えば毒素の除去を補助することも可能である。
【０１６２】
特異的抗体は、活性Ｆｃ部分を欠き、したがって、抗体のＦｃ部分を含有しないか、又はＦｃガンマ受容体結合部位を含有しない抗体ドメインで構成されてもよいし、あるいは例えばＦｃエフェクター機能を減少させる、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を抑止するか又は減少させる修飾によって、Ｆｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含んでもよい。代替抗体を操作して、Ｆｃエフェクター機能を増加させる、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を増強する修飾を組み込むことも可能である。
【０１６３】
こうした修飾は、突然変異誘発、例えばＦｃガンマ受容体結合部位の変異によって、あるいは抗体形式のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性に干渉する誘導体又は剤によって、達成可能であり、こうしてＦｃエフェクター機能の減少又は増加を達成することも可能である。
【０１６４】
Ｆｃエフェクター機能の有意な減少は、典型的には、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性によって測定される、非修飾（野生型）形式の１０％未満のＦｃエフェクター機能、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を指すと理解される。
【０１６５】
Ｆｃエフェクター機能の有意な増加は、典型的には、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性によって測定される、非修飾（野生型）形式の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％又は５０％のＦｃエフェクター機能の増加を指すと理解される。
【０１６６】
用語「糖鎖操作」変異体は、抗体配列に関して、糖鎖工学の結果として、修飾された免疫原性特性、免疫調節性（例えば、抗炎症性）特性、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有するグリコシル化変異体を指すものとする。すべての抗体は、重鎖定常領域において、保存された位置で炭水化物構造を含有し、各アイソタイプは、Ｎ連結炭水化物構造の異なるアレイを所有し、これはタンパク質アセンブリ、分泌又は機能活性に可変的に影響を及ぼす。ＩｇＧ１タイプの抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に包埋され，ポリペプチド主鎖との広範な接触を形成し、そしてその存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を仲介するために必須である。例えば、Ｎ２９７の例えばＡへの変異、又はＴ２９９を通じて、Ｎ２９７のＮ−グリカンを除去すると、典型的には、ＡＤＣＣが減少した脱グリコシル化抗体形式が生じる。特に、本発明の抗体は、グリコシル化された、糖鎖操作された、又は脱グリコシル化された抗体であってもよい。
【０１６７】
抗体グリコシル化の大きな相違は細胞株間で生じ、そして異なる培養条件下で増殖された所定の細胞株に関してもわずかな相違が見られる。バクテリア細胞における発現は、典型的には、脱グリコシル化抗体を提供する。テトラサイクリンが制御する、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒する糖転移酵素であるβ(１，４)-Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素III（ＧｎＴIII）の発現を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地処方、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。
【０１６８】
用語「抗原結合部位」又は「結合部位」は、抗原結合に関与する抗体部分を指す。抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び／又は軽（Ｌ）鎖のＮ末端可変（Ｖ）領域、あるいはその可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様なストレッチは、フレームワーク領域として知られる、より保存された隣接ストレッチの間に挿入される。抗原結合部位は、結合エピトープ又は抗原の三次元表面に相補的な表面を提供し、そして超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される。ＣＤＲ中に組み込まれた結合部位は、本明細書において、「ＣＤＲ結合部位」とも称される。
【０１６９】
具体的には、本明細書で言及されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ命名法（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services.(1991)参照）に従って決定される、抗体のアミノ酸配列と理解される。
【０１７０】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、用語「標的」又は「標的抗原」と互換的に用いられ、全標的分子又は抗体の結合部位によって認識されるこうした分子のフラグメントを指すものとする。具体的には、免疫学的に関連した、一般的に「エピトープ」、例えばＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープと称される、抗原の部分構造、例えばポリペプチド又は炭水化物構造は、こうした結合部位によって認識されうる。
【０１７１】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成してもよいし、又は特異的結合パートナーの一部であってもよい、分子構造を指すものとする。エピトープは、炭水化物、ペプチド性構造、脂肪酸、有機、生化学的又は無機物質又はその誘導体、及びその任意の組み合わせのいずれで構成されてもよい。エピトープが、ペプチド性構造、例えばペプチド、ポリペプチド又はタンパク質で構成される場合、通常、これには、少なくとも３つのアミノ酸、好ましくは５〜４０のアミノ酸、そしてより好ましくは約１０〜２０の間のアミノ酸が含まれるであろう。エピトープは直鎖又は立体構造エピトープのいずれかであってもよい。直鎖エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。直鎖エピトープは近接していても又は重複していてもよい。
【０１７２】
立体構造エピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによってまとめられたアミノ酸又は炭水化物で構成され、アミノ酸は、直鎖配列においては、互いに必ずしも隣接しない。具体的には、ポリペプチド抗原に関しては、立体構造エピトープ又は不連続エピトープは、一次配列中では分離されているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原にフォールディングした際には分子表面上の一貫した構造を構築する、２以上の別々のアミノ酸残基の存在によって特徴付けられる。具体的には、立体構造エピトープは、非線形に整列する一連のアミノ酸残基から構成されたエピトープであり、当該残基は、ポリペプチド配列の長さに沿って非連続的様式で、間隔を空け又は集合している。そのような立体構造エピトープは、接触アミノ酸残基及び／又は結晶学的解析によって、例えば、特異抗体又はＦａｂフラグメントに結合されたエピトープの免疫複合体によって形成される結晶の解析によって測定される、特異的構造座標を有する三次元構造を特徴とする。
【０１７３】
特に、エピトープに寄与する結合残基は、本明細書において、接触アミノ酸残基と理解される。
【０１７４】
用語「構造座標」は、結晶形の抗原又は免疫複合体の原子、すなわち散乱中心によるＸ線の単色ビームの回折で得られるパターンに関連がある数学的方程式から派生したデカルト原子座標を指す。回折データは、結晶の反復単位の電子密度マップを計算するために使用される。電子密度マップはその後、例えば特異抗体又はＦａｂによって結合されるような、エピトープの個々の原子を確立するために使用される。抗原の一組の構造座標は、三次元の形状を規定する点の相対的な一組であると理解される。個々の座標のわずかな違いは、全体の形状にほとんど影響を与えないであろう。本発明の目的のために、抗原の構造座標によって記載された関連する骨格原子に重ね合わされた際、０．００Ａと２．００Ａの間の保存残基骨格原子の平均二乗偏差を有する三次元構造は、同一又は実質的に同一とみなされる。本発明の目的のために、構造座標は、たとえわずかな変化が個々の座標中に存在しても、これらが前記構造座標によって規定される全体形状に影響を与えない場合、同一又は実質的に同一とみなされる。
【０１７５】
本明細書において、用語「エピトープ」は、特に、抗体に認識される単一のエピトープ、又は、それぞれが交差反応性抗体によって認識されるエピトープ変異体を含むエピトープ混合物を指すものとする。
【０１７６】
本明細書に記載される交差反応性抗体は、毒素の縁（ｒｉｍ）領域、特に可溶性の毒素モノマー又は毒素成分を特異的に認識する。前記縁領域は、宿主細胞膜の外葉に並置される毒素のドメインと理解され、当該縁領域は、細胞膜結合に関与する。このように縁部分は、膜アンカーとして働く。本発明の抗体によって標的にされるエピトープは、前記縁部分又は縁領域に位置し、それゆえ、免疫に関連する、すなわち、能動的又は受動的免疫療法による防御に関連する可能性がある。
【０１７７】
本発明で同定されたエピトープに基づいて、さらにそれぞれのパラトープ、例えば本発明の抗体のパラトープ、例えばエピトープを認識する全長抗体の一部等、抗体の抗原結合部位を提供することも実現可能である。それは典型的には、抗体のＦｖ領域の１５〜２２アミノ酸の狭い領域である。そのようなパラトープは、所望の交差反応性結合特性を有する特異的結合剤又は結合分子を得るために、適切なスキャホールド内に組み込まれて、スキャホールド-タイプの分子、例えば融合タンパク質又は人工スキャホールドを得てもよい。
【０１７８】
本明細書で使用される「結合分子」という用語は、標的を特異的に認識し、特に標的毒素への交差特異性を示す、エピトープ-結合分子又は抗原-結合分子と理解される。結合分子の具体例は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、オリゴペプチド、アプタマー及び小分子化合物、好ましくは抗体、前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質、からなる群より選択される。
【０１７９】
結合分子は、例えば、結合剤の適切なライブラリー、例えば抗体ライブラリー、又は他の化合物あるいはスキャホールドのライブラリー、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、ＨＥＡＴリピートタンパク質、ＡＲＭリピートタンパク質、テトラトリコペプチド・リピートタンパク質及び天然起源のリピートタンパク質に基づく他のスキャホールドから、候補化合物を得るために適切なスクリーニング法によって選択されてもよく、その後さらにその結合特性に関する特性を明らかにされる。
【０１８０】
用語「発現」は、以下のように理解される。発現産物（例えば本明細書に記載の抗体等）の望ましいコード配列を含有する核酸分子、及び制御配列（例えば機能可能なリンケージ内のプロモーター等）を、発現目的のために用いてもよい。これらの配列で形質転換されたか又はトランスフェクションされた宿主は、コードされるタンパク質を産生可能である。形質転換を達成するため、発現系はベクター中に含まれていてもよいが、適切なＤＮＡは宿主染色体内に組み込まれてもよい。具体的には、当該用語は、例えばベクターによって所持され、そして宿主細胞に導入される、外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のために適切な条件下にある、宿主細胞及び適合性ベクターを指す。
【０１８１】
コードＤＮＡは、例えば抗体のような特定のポリペプチド又はタンパク質のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、制御するか、あるいは他の方式で仲介するか又は調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、又は異なる遺伝子由来であってもよく、そして同じ又は異なる生物由来であってもよい。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニング又は発現のための１以上の複製系、宿主における選択のための１以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１以上の発現カセットが含まれるであろう。
【０１８２】
本明細書で使用される「ベクター」は、適切な宿主生物において、クローン化組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、及びそのｍＲＮＡの翻訳に必要な、ＤＮＡ配列と定義される。
【０１８３】
「発現カセット」は、規定される制限部位でベクター内に挿入可能な発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列又はＤＮＡセグメントを指す。カセット制限部位は、適切なリーディングフレームでのカセットの挿入を確実にするよう設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１以上の制限部位で挿入され、その後、ベクターによって、伝達性ベクターＤＮＡとともに、宿主細胞内に運ばれる。挿入された又は付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列、例えば発現ベクターは「ＤＮＡ構築物」とも称される。
【０１８４】
発現ベクターは発現カセットを含み、さらに通常、宿主細胞又はゲノム組込み部位における自律複製起点、１以上の選択可能マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子、あるいは抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写終結因子を含み、これらの成分は、機能可能に共に連結される。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、自己複製ヌクレオチド配列、ならびにゲノム組込みヌクレオチド配列を含む。ベクターの一般的なタイプは「プラスミド」であり、これは一般的に、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れ可能であり、そして適切な宿主細胞内に容易に導入可能である、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子である。プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するのに適した１以上の制限部位を有する。具体的には、用語「ベクター」又は「プラスミド」は、宿主を形質転換し、そして導入した配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞内に導入可能であるビヒクルを指す。
【０１８５】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、特定の組換えタンパク質、例えば本明細書記載の抗体を産生するよう形質転換された一次対象細胞、及びその任意の子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞と正確に同一ではないが（計画的な又は偶発性の突然変異、あるいは環境の違いに起因する）、こうした改変された子孫は、子孫が元来形質転換された細胞のものと同じ機能性を保持する限り、これらの用語に含まれると理解されなければならない。用語「宿主細胞株」は、組換え抗体などの組換えポリペプチドを産生する組換え遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞の細胞株を指す。 本明細書で使用される「細胞株」という用語は、長期間に渡って増殖する能力を獲得した、特定の細胞タイプの樹立されたクローンを指す。こうした宿主細胞又は宿主細胞株は細胞培養中で維持されてもよく、及び／又は組換えポリペプチドを産生するために培養されてもよい。
【０１８６】
組成物（例えば、抗原又はエピトープを含む、本明細書において「免疫原」とも称される免疫原性組成物）、あるいは本明細書に記載のワクチンに対する「免疫応答」は、関心の対象となる組成物又はワクチンに対する、細胞及び／又は抗体媒介性免疫応答の、宿主又は被験体における発展である。通常、こうした応答は、関心の対象となる組成物又はワクチン中に含まれる単数又は複数の抗原に対して特異的に向けられる、被験体が産生する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞からなる。
【０１８７】
「防御免疫応答」は、非免疫集団のものと比較して、誘導されたあるいは天然の感染または毒素負荷に対し、有意に優れた結果を提供する免疫応答と理解される。毒素に対する防御免疫応答は、主に、高い親和性を有する（例えば１０-8Ｍ未満のＫｄを有する）中和抗体によって媒介される。毒素中和の利点は、標的細胞の保護及び炎症の防止である。Ｆｃ介在性免疫複合体形成は、循環から毒素を除去する（ＲＥＳ細胞を介する）ことによっても寄与できる。
【０１８８】
免疫原又は免疫原性組成物は、通常、抗原又はエピトープ及びキャリアーを含み、特にアジュバントを含んでもよい。用語「アジュバント」は、抗原と組み合わせて投与された際、抗原に対する免疫応答を増大及び／又は再指示するが、単独で投与された際には、抗原に対する免疫応答を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球補充、Ｂ及び／又はＴ細胞刺激、ならびにマクロファージ刺激を含む、いくつかのメカニズムによって、免疫応答を増大させうる。代表的なキャリアーは、リポソーム又は陽イオン性ペプチドであり；代表的なアジュバントは、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム、ＭＦ５９又はＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【０１８９】
核酸、抗体又は他の化合物に関して本明細書で使用される「単離された」又は「単離」という用語は、「実質的に純粋な」型で存在するように、こうした化合物が天然に会合するであろう環境から十分に分離されている化合物を指すものとする。「単離された」は、他の化合物又は物質との人工的な又は合成混合物、あるいは基本的活性に干渉せず、例えば不完全な精製のために存在しうる不純物の存在の排除を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子は、化学的に合成されたものも含むことを意図している。
【０１９０】
本発明の核酸に関連して、用語「単離された核酸」が時に用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用された際、由来する生物の天然存在ゲノムにおいて直接隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター内に挿入されたか、あるいは原核又は真核細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことも可能である。ＲＮＡに適用された際、用語「単離された核酸」は、主に、上に定義するような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、当該用語は、天然状態で（すなわち細胞又は組織において）会合するであろう他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指すことも可能である。「単離された核酸」（ＤＮＡ又はＲＮＡいずれか）は、さらに、生物学的又は合成的手段によって直接産生され、そしてその産生中に存在する他の成分から分離されている分子を表すことも可能である。
【０１９１】
ポリペプチド又はタンパク質、例えば本発明の単離抗体又はエピトープに関連して、用語「単離された」は、特に、天然環境において、あるいはこうした調製がインビトロ又はインビボで実施される組換えＤＮＡ技術による場合、調製される環境（例えば細胞培養）において、ともに見られる他の化合物などの、天然に会合している物質を含まないか又は実質的に含まない、化合物を指すものとする。単離された化合物を、希釈剤又はアジュバントとともに配合してもよく、そしてなお、単離される実際的な目的のため、例えば、診断又は治療に用いる際には、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを薬学的に許容されるキャリアー又は賦形剤と混合してもよい。
【０１９２】
用語「中和性」又は「中和」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして中和が達成されるメカニズムに関わらず、病原体、例えば黄色ブドウ球菌に、被験体が感染するのを阻害するか、又は病原体が強力なタンパク質毒素を産生することによって感染を促進するのを阻害するか、又は毒素が被験体において標的細胞を損傷するのを阻害する、任意の分子を指す。中和は、例えば、標的細胞上の同族受容体と黄色ブドウ球菌毒素（単数又は複数）の結合及び／又は相互作用を阻害する抗体によって、達成可能である。特定の実施形態において、本明細書記載の抗体は、毒素活性を中和させることも可能であり、ここで、毒素と標的細胞（例えば赤血球）の間の相互作用のインビボ又はインビトロ効果は、減少するか又は除去される。中和はさらに、活性毒素の形成を阻害することによって、例えば黄色ブドウ球菌二成分細胞溶解素の場合、Ｓ及びＦ成分の結合、又は細胞膜におけるオリゴマー性孔の形成の阻害によって、生じることも可能である。
【０１９３】
細胞溶解毒素に対する抗体の中和能は、典型的には、所定の毒素に感受性である細胞の増加した生存能又は機能性を測定することによって、標準アッセイにおいて決定される。中和は、抗体を含む及び含まない生存細胞のパーセントによって表すことができる。強力な抗体に関しては、中和能を表す好ましい方式は、抗体：毒素モル比であり、ここで、より低い値はより高い効力に対応する。１０未満の値は高い効力を、１未満の値は非常に高い効力を定義する。
【０１９４】
本明細書で使用される「交差中和性」という用語は、いくつかの毒素（例えば交差反応性又は多特異性抗体によって認識される交差反応性エピトープを有する毒素）の中和を指すものとする。
【０１９５】
用語「黄色ブドウ球菌」又は「Ｓ．アウレウス」又は「病原性黄色ブドウ球菌」は、以下のように理解される。黄色ブドウ球菌細菌は、通常、人間及び動物の皮膚上又は鼻中に見られる。当該細菌は、切り傷又は他の創傷を通じて体内に入らない限り、一般的には無害である。典型的には、感染は、健康な人々においては、重要でない皮膚の問題である。歴史的には、感染は、メチシリンのような広域抗生物質によって治療された。しかし、現在、メチシリン及び他のベータ−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン及びセファロスポリンに耐性である特定の株が出現してきている。これらはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（多剤耐性黄色ブドウ球菌、あるいは「ＭＲＳＡ」としても知られる）と呼ばれる。
【０１９６】
黄色ブドウ球菌は、重要なヒト病原体であり、多数の分泌毒素（外毒素）を発現する。これらは、赤血球、好中性顆粒球及び他の免疫細胞、ならびに肺又は皮膚の上皮細胞を含む、多様な宿主細胞タイプを攻撃しうる。黄色ブドウ球菌毒素の主なメンバーは、リンパ球、マクロファージ、肺上皮細胞及び肺内皮細胞に対して細胞溶解機能を発揮する、アルファ溶血素（Ｈｌａ）である。
【０１９７】
ＭＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌感染は、一般的には、面皰、おでき又はクモの咬傷に似た小さな赤い隆起として始まる。これらの隆起又は傷は、急速に、外科的排出を必要とする、深く有痛性の膿瘍に変わりうる。細菌は時に皮膚に限局されたままである。ときおり、これらは体内深くに掘り進み、皮膚、軟組織、骨、関節、外科的創傷、血流、心臓弁、肺、又は他の臓器を含む、広い範囲のヒト組織において、潜在的に生命を危うくする感染を引き起こしうる。このように、黄色ブドウ球菌感染は、潜在的に致死性の疾患、例えば壊死性筋膜炎、心内膜炎、敗血症、菌血症、腹膜炎、毒素性ショック症候群、及び壊死性肺炎を含む多様な型の肺炎、ならびにフルンケル症及びカルブンケル症における毒素産生といった、関連する疾患状態をもたらしうる。ＭＲＳＡ感染は、患者が開放性創傷、侵襲的デバイス、及び弱った免疫系のリスクにあるか、又はこうしたものに対する傾向があり、それゆえ、一般人よりも感染のリスクがより大きい、病院又は老人ホームの状況においては、特に厄介である。
【０１９８】
黄色ブドウ球菌毒素を中和する抗体は、病原体及び病原性反応に干渉し、したがって、感染を限定するか又は防止し、及び／又はこうした感染から生じる疾患状態を寛解させるか、あるいは黄色ブドウ球の発病、特に肺炎、腹膜炎、骨髄炎、菌血症及び敗血症の発病を阻害することが可能である。これに関連して、「防御抗体」は、本明細書において、能動免疫又は受動免疫において観察される、感染病原体に対する免疫を担う中和抗体と理解される。特に、本明細書に記載する防御抗体は、分泌される病原性因子（外毒素）の毒性効果（例えば細胞溶解、標的細胞による炎症促進性サイトカイン発現の誘導）を中和することが可能であり、それゆえ、黄色ブドウ球菌の病変形成能に干渉する。
【０１９９】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、「遺伝子工学によって調製されるか又は遺伝子操作の結果」を意味するものとする。組換え宿主は、特に、発現ベクター又はクローニングベクターを含むか、あるいは特に宿主に対して外来性であるヌクレオチド配列を使用して、組換え核酸配列を含有するよう遺伝子操作されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、又は単離される抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入又は染色体導入した動物（例えばマウス）あるいはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル・ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、任意の他の手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか又は単離される抗体が含まれる。こうした組換え抗体は、例えば抗体成熟中に生じる再編成及び変異を含むよう操作される抗体を含む。
【０２００】
本明細書で使用される、用語「特異性」又は「特異的結合」は、分子の不均一集団において、関心対象の同族リガンドを決定する結合反応を指す。したがって、明示される条件（例えばイムノアッセイ条件）下で、抗体は，特定のターゲットに特異的に結合し、そして試料中に存在する他の分子には、有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、ターゲット同一性、高い、中程度又は低い結合親和性又は結合活性に関して選択性であることを意味する。選択的結合性は、通常、他の抗原と比較して、結合定数又は結合動力学が少なくとも１０倍異なる場合（少なくとも１ｌｏｇ異なると理解される）、好ましくは相違が少なくとも１００倍である場合（少なくとも２ｌｏｇ異なると理解される）、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合（少なくとも３ｌｏｇ異なると理解される）、達成される。
【０２０１】
用語「特異性」又は「特異的結合」は、１以上の分子に結合する結合剤、例えば交差特異性結合剤にも適用されると理解される。少なくとも２つの異なる抗原を標的にするか、あるいは少なくとも２つの異なる抗原上の交差反応性エピトープを標的とする好ましい交差特異性（多特異性又は交差反応性とも呼ばれる）結合剤は、実質的に類似する結合親和性を有する抗原（例えば、１００倍未満の差、あるいは１０倍未満の差を有する）と特異的に結合する。
【０２０２】
例えば、交差-特異抗体は、交差反応性エピトープを保有する様々な抗原に結合できるであろう。少なくとも２つの異なる抗原又は少なくとも２つの異なる抗原の交差反応性エピトープに結合する特異性を有する抗体の結合部位及び抗体はそれぞれ、多特異性又は交差特異的結合部位及び抗体とも呼ばれる。例えば、抗体は、本質的に同じ構造の立体構造エピトープを提供できる、エピトープ内の配列相同性及び／又は構造的類似性を有する複数の異なる抗原に交差反応性である（例えば、黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び二成分毒素に少なくとも交差反応性である）エピトープに特異的に結合する多特異性結合部位を有していてもよい。
【０２０３】
交差反応性結合配列に抗体が示す、抗体の免疫特異性、その結合能及び付随する親和性は、抗体が免疫反応する（結合する）交差反応性結合配列によって決定される。交差反応性結合配列特異性は、少なくとも部分的に、抗体の免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸残基によって、及び／又は軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって、定義されうる。
【０２０４】
用語「同じ特異性を有する」、「同じ結合部位を有する」又は「同じエピトープに結合する」の使用は、同等のモノクローナル抗体が、同じ又は本質的に同じ、すなわち類似の免疫応答（結合）特性を示し、そしてあらかじめ選択された標的結合配列への結合に関して競合することを示す。特定の標的に対する抗体分子の相対的特異性は、競合アッセイによって、相対的に決定可能である（例えば、Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988に記載されるように）。
【０２０５】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、温血哺乳動物、特にヒト又は非ヒト動物を指すものとする。ＭＲＳＡは、非常に重要なヒト病原体であり、これはまた、獣医学においても新たに発生している懸念である。それは、広い範囲の非ヒト動物種に存在する。したがって、用語「被験体」は、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ及び家禽を含む動物もまた特に指す可能性がある。特に、本発明の医学的使用又はそれぞれの治療法は、黄色ブドウ球菌感染に関連する疾患状態の予防又は治療が必要な被験体に適用される。被験体は、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか、あるいは初期又は後期疾患を含む疾患を患っている患者であってもよい。用語「患者」には、予防的又は治療的処置のいずれかを受けているヒト及び他の哺乳動物被験体が含まれる。用語「治療」は、したがって、予防的及び治療的処置の両方を含むと意図される。
【０２０６】
被験体は、例えば、黄色ブドウ球菌疾患状態の予防又は治療のために処置される。特に、感染の、あるいはこうした疾患又は疾患再発を発症するいずれかのリスクがある被験体、あるいはこうした感染及び／又はこうした感染に関連する疾患を患う被験体が治療される。
【０２０７】
特に、用語「予防」は、発病（病態形成）の開始の防止又は発病のリスクを減少させる予防的手段を含むよう意図される、防御手段を指す。
【０２０８】
特に、本明細書に記載する被験体における疾患状態を治療するか、防止するか、又は遅延させるための方法は、状態の原因病原体としての黄色ブドウ球菌の病態形成を妨げることにより、ここで病態形成には、例えば特定の病原性因子又は毒素による、被験体の細胞膜上のポア形成工程が含まれる。
【０２０９】
本明細書で使用される「毒素」という用語は、黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び二成分毒素を指すものとする。本発明の抗体によって標的とされる毒素は、毒素（例えば黄色ブドウ球菌によって発現される、可溶性単量体毒素あるいはポア形成毒素の形態等）、又は毒素成分（二成分毒素の成分等）のいずれかであることが、特に理解される。それゆえ、本明細書で使用される「毒素」という用語は、免疫関連エピトープを有する毒素又は毒素成分の両方を指すものとする。
【０２１０】
黄色ブドウ球菌の病原性は、細菌が真核細胞膜に接着することを可能にする表面会合タンパク質、オプソニン化貪食作用から細菌を保護する莢膜多糖類、及びいくつかの外毒素を含む、多くの病原性因子の組み合わせに起因する。黄色ブドウ球菌は、主に、分泌される病原性因子、例えば溶血素、エンテロトキシン及び毒素性ショック症候群毒素の産生を通じて疾患を引き起こす。これらの分泌される病原性因子は、宿主における多くの免疫学的メカニズムを不活性化させることによって、免疫応答を抑制し、そして組織破壊を引き起こし、そして感染確立を補助する。後者は、ポア形成毒素群によって達成され、このうち最も顕著なものが、黄色ブドウ球菌肺炎の重要な病原性因子であるＨｌａである。
【０２１１】
黄色ブドウ球菌は、この細菌が様々な種類の免疫細胞、特に体の主な防御システムを構成する白血球の亜集団による攻撃に対抗及び抵抗することを可能にする、多様なアレイのさらなる病原性因子及び毒素を産生する。これらの病原性因子及び毒素の産生は、黄色ブドウ球菌が感染状態を維持することを可能にする。これらの病原性因子のうち、黄色ブドウ球菌は、いくつかの二成分ロイコトキシンを産生し、これは、２つの関連しないタンパク質又はサブユニットの相乗作用によって、宿主防御細胞及び赤血球の膜を損傷する。これらの二成分毒素のうち、ガンマ溶血素（ＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＣＢ）及びパントン-バレンタイン・ロイコシジン（ＰＶＬ）が最もよく特徴が明らかになっている。
【０２１２】
哺乳動物細胞に対するロイコシジンの毒性は、二成分の作用を伴う。最初のサブユニットはクラスＳ成分と称され、そして第二のサブユニットはクラスＦ成分と称される。Ｓ及びＦサブユニットは相乗的に作用して、単球、マクロファージ、樹状細胞及び好中球（まとめて、貪食細胞として知られる）を含む白血球上に孔を形成する。ガンマ溶血素、特にＨｌｇＡＢ及びＨｌｇＡ-ＬｕｋＤは赤血球にも作用し、ＬｕｋＥＤはＴ細胞に作用する。黄色ブドウ球菌によって産生される二成分ロイコトキシンのレパートリーは、Ｆ及びＳ成分の同族及び非同族対を含むことが知られ、これには、例えば本明細書に記載する好ましい標的である、ガンマ溶血素、ＰＶＬ毒素及びＰＶＬ様毒素が含まれ、これにはＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＧＨ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＧ−ＨｌｇＡ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦが含まれる。
【０２１３】
本明細書で使用される「実質的に純粋」又は「精製された」という用語は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の化合物、例えば核酸分子又は抗体を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適した方法によって測定される（例えばクロマトグラフィ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）。
【０２１４】
本明細書で使用される「治療的に有効な量」という用語は、化合物、例えば本発明の抗体又は免疫原の「有効量」又は「十分量」という用語のいずれとも互換的に用いられ、被験体に投与された際、有益な又は望ましい結果（臨床的な結果を含む）を達成するのに十分な量又は活性であり、そしてこうしたものとして、有効量又はその同義語は、適用される状況によって決まる。
【０２１５】
有効量は、こうした疾患又は障害を治療するか、予防するか又は阻害するのに十分である化合物の量を意味するよう意図される。疾患の状況において、本明細書に記載する抗体の治療的有効量は、特に、疾患又は状態を治療するか、調節するか、減弱させるか、逆転させるか、又は影響を及ぼすように用いられ、黄色ブドウ球菌又は黄色ブドウ球菌病態形成の阻害による恩恵を受ける。
【０２１６】
こうした有効量に対応する化合物の量は、多様な要因、例えば所定の薬剤又は化合物、製剤処方、投与経路、疾患又は障害のタイプ、治療される被験体又は宿主の同一性等に応じて変化するであろうが、にもかかわらず、当業者によってルーチン的に決定可能である。
【０２１７】
本発明の抗体又は免疫原は、黄色ブドウ球菌感染の開始を阻害するため予防的に用いられてもよく、又は黄色ブドウ球菌感染（特に、抵抗性であることが知られるか、又は特定の被験体において、他の慣用的な抗生物質療法での治療に抵抗性であることが立証されている、ＭＲＳＡなどの黄色ブドウ球菌感染）を治療するために治療的に用いられてもよい。
【０２１８】
治療の必要があるヒト患者に提供される、本明細書記載の抗体の治療的有効量は、特に、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは最大２０ｍｇ／ｋｇ、最大１０ｍｇ／ｋｇ、最大５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、例えば、急性疾患状態を治療するために、より高い用量が指示されてもよい。
【０２１９】
さらに、治療的有効量の本発明の抗体での被験体の治療又は予防レジメンは、単回投与からなることも可能であるし、あるいは一連の処理を含んでもよい。例えば、抗体を少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回又は少なくとも１ヶ月に１回投与してもよい。しかし、別の態様において、所定の治療のため、１週間に約１回からほぼ毎日の投与で、抗体を被験体に投与してもよい。治療期間の長さは、多様な要因、例えば疾患の重症度、急性又は慢性疾患であるか、患者の年齢、抗体形式の濃度及び活性によって決まる。治療又は予防に用いられる有効投与量は、特定の治療又は予防レジメンの経過に渡って増加させても又は減少させてもよいことも、認識されるであろう。投与量変化は、当該技術分野に知られる標準的診断アッセイによって生じ、そして明らかになりうる。いくつかの例では、長期投与が必要かもしれない。
【０２２０】
黄色ブドウ球菌感染と関連する疾患状態を発症するリスクがある患者に提供される場合などの、本明細書に記載される免疫原の有効量は、特に、１用量あたり、１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【０２２１】
例えば、プライム-ブースト免疫化スキームにしたがって、免疫原を最初の用量として投与して、その後、特定の時間枠内で、１以上のブースター用量（単数又は複数）を投与して、黄色ブドウ球菌感染に対する長期持続性の有効な免疫応答を誘導してもよい。好ましいワクチン接種スケジュールは、３回の用量、例えば０日目の最初の用量、５〜４０日目の第二の用量、及び１０〜１００日目の第三の用量、好ましくは０日目、２８日目及び９０日目の投与を含むであろう。好ましい加速スケジュールにしたがって、投与は０日目、７日目及び１４日目であってもよい。加速スケジュールは、予防のため、例えば待機手術に直面している患者のために指示されうる。通常、ミョウバンがアジュバントとして、例えばリン酸塩又は水酸化物として、用いられる。
【０２２２】
それゆえ、本発明は特に、黄色ブドウ球菌のアルファ溶血素及び二成分毒素の両方を交差中和する抗体に言及する。配列相同性が低レベルであるため、これは驚くべきことであった。Ｈｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素を交差中和するｍＡｂが生じる可能性は、低いと予期された。そのような交差中和抗体は、大きな潜在的価値がある。
【０２２３】
多重二成分特異性抗体を記載する唯一の刊行物（Laventie, PNAS, 2011, 108:16404）は、ＬｕｋＳ及びＨｌｇＣのみを標的とするために設計されたため、本発明とは関連しないと見なされる。
【０２２４】
本発明は、特に、同じ結合部位によって複数の毒素を標的とする抗体に言及し、これは本明細書において多特異性結合部位と称され、異なる毒素、例えば４つの異なる毒素（四重反応性）であるアルファ毒素及びガンマ溶血素、パンテン・バレンタイン・ロイコシジン（ＰＶＬ、ＬｕｋＳＦ）及びＬｕｋＥＤのＦ成分に結合可能である。ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＳＦに対する高いアミノ酸相同性に基づいて、四重反応性ｍＡｂは、ウシＬｕｋＭロイコシジンにも結合する可能性が高い。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、Ｈｌａ上のエピトープを認識し、そしてＨｌｇＢと交差反応する本発明の抗体は、ＬｕｋＦ’-ＰＶ、ＬｕｋＦ-ＰＶ、ＬｕｋＤｖ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ-Ｉ、及びＬｕｋＧなどの、他のブドウ球菌ロイコシジンＦ成分とさらに交差反応性を有することも可能である。本発明の交差反応性抗ＨｌｇＢ抗体は、ＨｌｇＢ活性を阻害するか又は減少させることも可能である。いくつかの実施形態において、交差反応性抗ＨｌｇＢ抗体は、ＨｌｇＢ活性を中和する（例えば実質的に除去する）。
【０２２６】
特定の側面によれば、同じエピトープに結合する抗体が提供され、当該用語には、配列番号２０のＶＨアミノ酸配列と配列番号３９のＶＬアミノ酸配列によって、あるいは配列番号４０のＨＣアミノ酸配列と配列番号５２のＬＣアミノ酸配列によって形成される多特異性結合部位を特徴とする親抗体と、本質的に同じエピトープに結合する変異体が含まれる。そのような抗体は、例えば、親抗体のそれぞれのＣＤＲ又は抗体配列を修飾することによって得られる機能的に活性な変異抗体であってもよい。
【０２２７】
代表的な親抗体は、以下の実施例セクション及び図１に記載される。＃ＡＢ-２８と称される抗体は、例えば、１以上の修飾ＣＤＲ配列を有する機能的に活性なＣＤＲ変異体、及び１以上の修飾ＦＲ配列（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３あるいはＦＲ４の配列）、又は定常ドメイン配列を有する、及び／又は１以上の修飾ＣＤＲ配列を有する機能的に活性な抗体変異体を産生するための親抗体として使用される。突然変異誘発によって親抗体から誘導された変異抗体は、以下に例証され、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３と称される（図１参照）。これらの変異抗体は、共通のＶＬ配列である配列番号３９を共有するが、例えば、機能的に活性であり、各ＦＲ又はＣＤＲ配列内に修飾を有する変異ＶＬ鎖も使用可能である。
【０２２８】
同じ結合部位を含むさらなる抗体変異体も実現可能であり、当該用語には、＃ＡＢ-２８と称される抗体と本質的に同じ結合部位を含む変異体が含まれる。＃ＡＢ-２８抗体及び機能的に活性な変異体は、Ｈｌａを強力に中和し、そしてＬｕｋＳ-ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥ-ＬｕｋＤ、及びＨｌｇＢ-ＨｌｇＣの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの同族毒素対、ならびに場合によってさらなる二成分毒素を交差中和する結合部位を特に含むであろう。
【０２２９】
具体的には、＃ＡＢ-２８と称される抗体の可変領域を含む抗体が提供され、特に、少なくとも１つのＣＤＲ配列、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのＣＤＲ配列を含む抗体、又は機能的に活性なそのＣＤＲ変異体が提供される。より具体的には、＃ＡＢ-２８、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３と称される抗体が提供される。
【０２３０】
具体的には、＃ＡＢ-２８抗体又は機能的に活性なその変異体は、本明細書に提示される配列を使用して、組換え手段によって製造されることができ、任意にさらなる免疫グロブリン配列が、例えばＩｇＧ抗体を産生するために用いられる。
【０２３１】
ある側面では、本発明はこのような機能的に活性な変異抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体を提供し、それらは重鎖及び軽鎖を含んでおり、ここで、重鎖あるいはＶＨ可変領域又はそれぞれのＣＤＲのいずれかは、＃ＡＢ-２８、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３抗体の一つである親抗体から、少なくとも１つのＦＲ又はＣＤＲ配列を修飾することによって、誘導されたアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
ある側面では、本発明はこのような機能的に活性な変異抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体を提供し、それらは重鎖及び軽鎖を含んでおり、ここで、任意の軽鎖あるいはＶＬ可変領域又はそれぞれのＣＤＲは、＃ＡＢ-２８である親抗体から、少なくとも１つのＦＲ又はＣＤＲ配列を修飾することによって、誘導されたアミノ酸配列を含む。
【０２３３】
ある側面では、本発明はこのような変異抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体を提供し、それらは重鎖及び軽鎖を含んでおり、ここで、任意の重鎖及び軽鎖、又はＶＨ/ＶＬ可変領域、又はそれぞれのＣＤＲは、＃ＡＢ-２８、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３抗体の一つである親抗体から、少なくとも１つのＦＲ又はＣＤＲ配列を修飾することによって、誘導されたアミノ酸配列を含む。
【０２３４】
ある面では、本発明は、上記親抗体から誘導された、可変配列及び／又はＣＤＲ配列等の、それぞれの結合配列を含む変異抗体も提供し、ここで、結合配列又はＣＤＲは、親抗体から誘導されたアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、当該変異体は機能的に活性な変異体である。
【０２３５】
特に、機能的な活性は、特定の毒素を標的とする交差反応性によって、例えば、それぞれの親抗体と同じエピトープ又は実質的に同じエピトープとの結合によって、測定される。
【０２３６】
抗体は、所定の時点で１つの抗体のみがエピトープに結合可能であるように、抗体が交差競合する場合、すなわち１つの抗体が他方の結合又は調節効果を妨げる場合、「同じエピトープに結合する」か、又は「同じ結合部位を含む」か、又は「本質的に同じ結合」特性を有すると言われる。
【０２３７】
本明細書で使用される「競合する」又は「交差競合する」という用語は、抗体に関して用いられる場合、同族エピトープと第一抗体の結合の結果が、第二抗体の非存在下での第一抗体の結合に比較して、第二抗体の存在下で、検出可能に減少するように、第一抗体、又はその抗原結合部分が、第二抗体、又はその抗原結合部分の結合に十分に類似の方式でエピトープに結合することを意味する。これとは別に、エピトープへの第二抗体の結合がまた、第一抗体の存在下で検出可能に減少する場合もありうるが、そうである必要はない。すなわち、第一抗体は、第二抗体がそれぞれのエピトープに対する第一抗体の結合を阻害することを伴わずに、そのエピトープへの第二抗体の結合を阻害可能である。しかしながら、各抗体が、同じ、より高い又はより低い程度のいずれであっても、同族エピトープとの他の抗体の結合を検出可能に阻害する場合、抗体は、それぞれのエピトープ（単数又は複数）の結合に関して互いに「交差競合する」と言われる。競合及び交差競合抗体はどちらも、本発明に含まれる。
【０２３８】
本明細書における競合は、例えば実施例セクションに記載されるように、競合ＥＬＩＳＡ分析又はＦｏｒｔｅＢｉｏ分析で決定した際、約３０％より大きい相対阻害を意味する。特定の状況において、例えば競合分析を用いて、黄色ブドウ球菌のさらなる又は他の毒素の結合に目的とする機能を持つように設計される新規抗体を選択するか又はスクリーニングする場合、何が競合の適切なレベルであるかの基準として、相対阻害のより高い閾値を設定することが望ましいかもしれない。したがって、例えば、競合結合に関して、基準を設定することが可能であり、ここで、抗体が十分に競合性であると見なされる前に、少なくとも４０％の相対阻害が検出されるか、あるいは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又はさらに少なくとも１００％が検出される。
【０２３９】
本明細書に記載されるように、ある面では、本発明は、例えば、Ｈｌａ、 ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ及びＨｌｇＣＢのいずれかとの結合に関して、又はＨｌａ、 ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢのそれぞれとの結合に関して、＃ＡＢ-２８、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３抗体のいずれかと競合する能力によって特徴付けられる、抗体分子を提供する。
【０２４０】
本発明の好ましい抗体は、前記の個々の抗原に、高い親和性で、特に高いオン及び／又は低いオフ速度で、あるいは結合の高い結合活性で、結合する。抗体の結合親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ又はＫD）として知られる、抗原結合部位の半数が占有される抗体濃度の観点から特徴付けられる。通常、結合剤は、Ｋｄ＜１０-8Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０-9Ｍで高親和性結合剤と見なされ、さらにより好ましくはＫｄ＜１０-10Ｍである。
【０２４１】
それにもかかわらず、特定の好ましい実施形態において、個々の抗原結合親和性は、例えば少なくとも２つの抗原に結合する際、中程度の親和性である（例えば１０-6未満、最大１０-8ＭのＫｄを有する）。
【０２４２】
本発明によれば、好ましくは、親和性成熟プロセスと組み合わせて（必要であれば）、中程度の親和性の結合剤を提供してもよい。
【０２４３】
親和性成熟は、標的抗原に対して増加した親和性を持つ抗体が産生されるプロセスである。本明細書に開示する、本発明の多様な実施形態にしたがって、親和性成熟抗体を生成するため、当該技術分野で入手可能な親和性成熟ライブラリーを調製し及び／又は用いる、任意の１以上の方法を使用してもよい。代表的な親和性成熟法及び使用法（例えばランダム突然変異誘発、細菌ミューテーター株継代、部位特異的突然変異誘発、変異ホットスポットターゲティング、簡潔（parsimonious）突然変異誘発、抗体シャフリング、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ１突然変異誘発）、ならびに本明細書に開示する本発明の多様な実施形態にしたがった方法及び使用の実施を受け入れ可能な親和性成熟ライブラリーを作成し用いる方法は、例えば：Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352；  ＷＯ２０１２／００９５６８；  ＷＯ２００９／０３６３７９；  ＷＯ２０１０／１０５２５６；  ＵＳ２００２／０１７７１７０；  ＷＯ２００３／０７４６７９に開示されるものを含む。
【０２４４】
抗体の構造変化（アミノ酸突然変異誘発、又は免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果を含む）と共に、抗原に対する結合部位の変異体が産生され、より高い親和性のために選択される。親和性成熟抗体は、親抗体より数ｌｏｇ倍大きい親和性を示しうる。単一の親抗体を親和性成熟に供してもよい。標的抗原に対して類似の結合親和性を持つ抗体の別のプールは、親和性成熟単一抗体又はこうした抗体の親和性成熟プールを得るために変化された親構造と見なされうる。
【０２４５】
本発明にかかる抗体の好ましい親和性成熟変異体は、結合親和性の少なくとも２倍増加、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００倍増加を示す。親分子のそれぞれのライブラリーを使用する選択キャンペーンの経過において、結合親和性Ｋｄ＜１０-8Ｍの特異的標的結合特性を有する本発明の抗体を得るため、中程度の結合親和性を有する任意の抗体とともに親和性成熟を使用してもよい。あるいは、本発明にかかる抗体の親和性成熟によって、親和性をさらにより増加させて、１０-9Ｍ未満、好ましくは１０-10Ｍ未満、又はさらに１０-11Ｍ未満、最も好ましくはピコモル範囲のＫｄに対応する高い値を得ることも可能である。
【０２４６】
ある実施形態では、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。ある実施形態では、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ又はＭＳＤアッセイによって測定される。ある実施形態では、結合親和性は、キネティック法で測定される。ある実施形態では、結合親和性は、平衡／溶液法によって測定される。
【０２４７】
補体の活性化を使用する別の経路を通じて、食作用性エフェクター細胞を活性化してもよい。微生物上の表面抗原に結合する抗体は、Ｆｃ領域との補体カスケードの最初の成分を誘引し、そして「古典的」補体系の活性化を開始する。これらは、食作用性エフェクター細胞の刺激を生じ、これは最終的に、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって標的を殺す。
【０２４８】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、標準的ＡＤＣＣ又はＣＤＣアッセイにおいて測定されるように、免疫エフェクター細胞の存在下で、細胞傷害性活性を有する。コントロールと比較した際、細胞溶解の割合に有意な増加があれば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣアッセイのいずれかによって決定される細胞傷害活性を、本発明の抗体に関して示してもよい。ＡＤＣＣ又はＣＤＣに関連する細胞傷害活性は、好ましくは、絶対パーセント増加として測定され、これは好ましくは５％より高く、より好ましくは１０％より高く、さらに好ましくは２０％より高い。補体固定化は特に関係がある可能性があり、このメカニズムは、形成された免疫複合体の除去によって、感染部位又は血液から毒素を除去できる。
【０２４９】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ＩｇＧのＦｃ部によって発揮される免疫調節機能を有する。シアリル化量を増加させる改変グリコシル化（例えば末端ガラクトース残基上の）は、場合によっては、ＤＣ-ＳＩＧＮシグナル伝達を経て抗炎症作用を有する。Ｉａ、IIａ及びIII Ｆｃガンマ受容体を超える、優先的なＦｃガンマ受容体IIｂ（抑制性）への結合は、場合によっては、抗炎症作用を提供する。
【０２５０】
本発明は、特に、多重特異性を持つ中和抗体を同定するプロセスによって、例えば交差反応性発見選択スキームによって得られる、交差反応性抗体を提供する。したがって、２つの標的、標的Ａ及びＢとの反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーをまず、標的の１つ、例えば標的Ａとの反応性に関して選択し、その後、他方の標的、例えば標的Ｂとの反応性に関して選択してもよい。各連続選択ラウンドは、生じるプールの反応強度を、両方の標的に向けて強化する。したがって、この方法は、２つの異なる標的に対する交差反応性、及び病原体を交差中和する能力を持つ抗体を同定するために特に有用である。当該方法を拡張して、さらなる標的（単数又は複数）に向かう濃縮のさらなるラウンドを含めることによって、さらなる標的に対して反応性を示す抗体を同定することも可能である。
【０２５１】
交差反応性抗体は、いくつかの例で、単一の抗原に対するスクリーニングを通じて明らかになる。交差反応性クローンを単離する可能性を増加させるため、多数の抗原に対する前進性のスクリーニングによって、多数の選択圧が適用されるであろう。特別なｍＡｂ選択戦略は、交互の様式で、異なる毒素成分を使用する。例えば、中和抗Ｈｌａ ｍＡｂは、黄色ブドウ球菌感染における二成分毒素の主な標的を代表する、ヒト好中球上のＰＶＬ及びＰＶＬ様毒素への結合に関して試験される。
【０２５２】
図７の各配列を使用する組換え技術によって産生される組換え毒素、又は黄色ブドウ球菌培養上清から単離された毒素は、抗体ライブラリー（例えば、酵母ディスプレイ抗体ライブラリー）から抗体を選択するために使用されることができる。これらは、例えば、Blaise L，Wehnert A，Steukers MP，Van den Beucken T，Hoogenboom HR，Hufton SEによる、"Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8"；Boder ET，Wittrup KDによる"Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7"；Kuroda K，UEDA Mによる"Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9"参照。概説；Lauer TM，Agrawal NJ，Chennamsetty N，Egodage K，Helk B，Trout BLによる" Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J Pharm Sci. 2012 Jan;101(1):102-15"；Orcutt K.D.及びWittrup K.D.による(2010), 207-233 doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15；Rakestraw JA，Aird D，Aha PM，Baynes BM，Lipovsek Dによる"Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30"；米国特許第６,４２３,５３８号、米国特許第６,６９６,２５１号；米国特許第６,６９９,６５８号；国際公開公報ＷＯ２００８１１８４７６参照。
【０２５３】
どちらの場合でも、交差反応性は、当該技術分野で知られる抗体最適化法によって、さらに改善されうる。例えば、本明細書記載の免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域を、軽鎖シャフリング、デスティネーショナル（destinational）突然変異誘発、ＣＤＲ融合（amalgamation）、ならびに選択したＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域の定方向突然変異誘発を含む、１以上の最適化戦略に供してもよい。
【０２５４】
所望の中和特性を持つ抗体を同定するためのスクリーニング法は、標的細胞への毒素結合の阻害、二量体又はオリゴマー形成の阻害、孔形成の阻害、細胞溶解の阻害、サイトカイン、リンホカイン、及び任意の炎症促進性シグナル伝達の誘導の阻害、及び／又は動物に対するインビボ効果（死亡、溶血、オーバーシュート炎症、臓器不全）の阻害であってもよい。例えば標準アッセイを用いて、所望の毒素への直接結合に基づいて、反応性を評価してもよい。
【０２５５】
所望の特性を有する交差中和抗体が同定されたら、抗体によって認識される単数又は複数のドミナントエピトープを決定してもよい。エピトープマッピングのための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、"Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001"に開示されている。
【０２５６】
エピトープマッピングは、抗体が結合するエピトープの同定に関する。タンパク質上のエピトープの位置を決定するために当業者に知られる多くの方法があり、これには、抗体−抗原複合体の結晶学分析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、及び合成ペプチドに基づくアッセイが含まれる。参照抗体と「同じエピトープに結合する」抗体は、本明細書において、以下の方式で理解される。２つの抗体が、同一であるか又は立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、同じ又は本質的に同じ、あるいは実質的に同じエピトープと結合すると称される。２つの抗体が、同一の又は立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための、一般的に用いられる方法は、競合アッセイであり、当該方法は、標識抗原又は標識抗体のいずれかを用いて、多くの異なる形式のすべてに設計可能である。通常、抗原を９６ウェルプレート上に固定して、そして放射性又は酵素標識を用いて、非標識抗体が、標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。
【０２５７】
望ましい交差中和特性を有する抗体が同定されたら、抗体フラグメントを含むこうした抗体を、当該技術分野で周知の方法によって産生することも可能であり、例えば、こうした方法には、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術が含まれる。
【０２５８】
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターを免疫して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか又は産生することが可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。その後、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０２５９】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して定量する。好ましくは、免疫沈降によって、又はインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。
【０２６０】
組換えモノクローナル抗体は、例えば、必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、そして周知の組換え発現ベクター、例えば抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミド又は発現カセット（単数又は複数）を用いて、発現のためのコード配列で、組換え宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生可能である。組換え宿主細胞は、上述した原核及び真核細胞であってもよい。
【０２６１】
特定の側面によれば、遺伝子操作のためにヌクレオチド配列を用いて、抗体をヒト化するか、あるいは抗体の親和性又は他の特性を改善することも可能である。例えば、抗体を臨床試験及びヒトにおける治療に用いる場合、定常領域を操作して、免疫応答を回避するために、ヒト定常領域により似せてもよい。抗体配列を遺伝子操作して、標的毒素に対するより高い親和性及び黄色ブドウ球菌に対するより高い有効性を得ることが望ましい可能性もある。当業者には、１以上のポリヌクレオチド変化を抗体に作製して、なお、標的毒素に対する結合能を維持することが可能であることが明らかであろう。
【０２６２】
多様な手段による抗体分子産生は、一般的によく理解されている。米国特許６３３１４１５（Ｃａｂｉｌｌｙら）は、例えば、単一細胞において、単一のベクターから、又は２つの別個のベクターから、同時に重鎖及び軽鎖が発現される、抗体の組換え産生のための方法を記載する。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒら（1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202）およびＬｅｅとＫｗａｋ（2003, J. Biotechnology 101 :189-198）は、大腸菌の別個の培養において発現されるプラスミドを用いた、別個に産生される重鎖及び軽鎖からのモノクローナル抗体の産生を記載する。抗体産生に関連する様々な他の技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗらによる"ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1988)"において提示される。
【０２６３】
必要に応じて、本発明の抗体、例えば、＃ＡＢ-２８、＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３抗体のいずれかは、配列決定されてもよく、そして、当該ポリヌクレオチド配列はその後、発現あるいは増殖のためのベクター内でクローン化されてもよい。前記抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター内で維持されてもよく、そして当該宿主細胞はその後、将来の使用のために、増やされ及び凍結されてもよい。細胞培養物における組換えモノクローナル抗体の産生は、当該技術分野において既知の手段によって、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングを通じて実施されることができる。
【０２６４】
別の側面において、本発明は、本発明の組換え抗体の産生のためのコード配列を含む単離核酸を提供する。
【０２６５】
別の側面において、本発明は、本発明の組換えエピトープの産生のためのコード配列を含む単離核酸、又は本発明のこうしたエピトープを含む分子を提供する。しかしながら、本発明のエピトープはまた、例えば当該技術分野において周知の合成法のいずれかを通じて、合成的に産生されてもよい。
【０２６６】
抗体又はエピトープをコードする核酸は、任意の適切な特性を有し、そして任意の適切な特徴又はその組み合わせを含むことも可能である。したがって、例えば、抗体又はエピトープをコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのハイブリッドの形であってもよく、そしてこれには、非天然存在塩基、修飾主鎖、例えば核酸の安定性を促進するホスホロチオエート主鎖、又はその両方が含まれてもよい。核酸は、好適には、標的宿主細胞（単数又は複数）において所望の発現、複製、及び／又は選択を促進する特徴を含む、本発明の発現カセット、ベクター又はプラスミド中に取り込まれてもよい。こうした特徴の例には、複製起点成分、選択遺伝子成分、プロモーター成分、エンハンサー要素成分、ポリアデニル化配列成分、終結成分等が含まれてもよく、これらの多くの適切な例は既知である。
【０２６７】
本開示はさらに、本明細書記載の１以上のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換え構築物を、任意の開示する抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されているベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ又はウイルスベクターと組み合わせて用いる。
【０２６８】
培養中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を用いて、モノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を調製するために適した方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒらのハイブリドーマ法（1975, Nature 256:495-497）及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001；及びBrodeur et al.,1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63）が含まれる。
【０２６９】
本発明はさらに、本明細書に記載するような抗体又は免疫原及び薬学的に許容されるキャリアー又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物を、ボーラス注射又は注入として、あるいは持続注入によって、本発明にしたがって投与してもよい。投与のこうした手段を促進するのに適した薬学的キャリアーが当該技術分野において周知である。
【０２７０】
薬学的に許容されるキャリアーには、一般的に、本発明によって提供される抗体又は関連組成物又は組み合わせと生理学的に適合する、あらゆる適切な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容されるキャリアーのさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びその任意の組み合わせが含まれる。
【０２７１】
１つのこうした側面において、抗体を、所望の投与経路に適した１以上のキャリアーと組み合わせてもよく、抗体を、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合してもよく、そして場合によって、慣用的投与のため、さらに錠剤化するか又はカプセル化してもよい。あるいは、抗体を、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド性溶液、エタノール、コーン油、ピーナツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、及び／又は多様な緩衝剤中に溶解してもよい。他のキャリアー、アジュバント、及び投与様式は、薬学分野において周知である。キャリアーには、徐放物質又は時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのみ、又はワックスと合わせたもの、あるいは当該技術分野に周知の他の物質が含まれてもよい。
【０２７２】
さらなる薬学的に許容されるキャリアーが当該技術分野において既知であり、例えば、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES」に記載される。液体製剤は、溶液、エマルジョン又は懸濁物であることも可能であり、そしてこれには、懸濁剤、溶解剤、界面活性剤、保存剤、及びキレート剤などの賦形剤が含まれてもよい。
【０２７３】
医薬組成物は、その中に、本発明の抗体又は免疫原及び１以上の治療的活性薬剤が処方されていることが意図される。所望の程度の純度を有する前記免疫グロブリンを、場合によって薬学的に許容されるキャリアー、賦形剤又は安定化剤と、凍結乾燥調合物又は水溶液の形で混合することによって、本発明の抗体又は免疫原の安定な製剤を保存のために調製する。インビボ投与に用いる製剤は、特に、無菌であり、好ましくは無菌水溶液の形である。これは、無菌濾過膜又は他の方法を通じた濾過によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体及び他の治療的活性薬剤は、イムノリポソームとして製剤化され、及び／又は微小カプセル中に封入されることも可能である。
【０２７４】
本発明の抗体又は免疫原を含む医薬組成物の投与を、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内（intraotically）、経皮、粘膜、局所（例えばジェル、軟膏、ローション、クリーム等）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば吸入技術又は肺送達系を使用して）、膣内、非経口、直腸、又は眼内を含む多様な経路で行ってもよい。
【０２７５】
非経口投与に用いられる代表的な製剤には、例えば無菌溶液、エマルジョン又は懸濁物のような、皮下、筋内又は静脈内注射に適したものが含まれる。
【０２７６】
１つの実施形態では、本発明の抗体又は免疫原は、例えば疾患を改変するか又は防止する単独療法として、被験体に投与される、唯一の治療的活性薬剤である。
【０２７７】
別の実施形態では、本発明の抗体又は免疫源は、例えば疾患を改変するか又は防止する併用療法として、カクテル中でさらなる抗体又は免疫原と併用され、例えば、前記カクテルが被検体に投与される二以上の治療的活性薬剤を含むように、黄色ブドウ球菌を標的とする混合物又はキット内で併用される。
【０２７８】
あるいは、本発明の抗体又は免疫原を、限定されるわけではないが、標準的治療（例えば抗生物質、ステロイド性及び非ステロイド性炎症阻害剤、及び／又は他の抗体に基づく療法、例えば抗菌又は抗炎症剤を使用する）を含む、１以上の他の治療又は予防剤と組み合わせて投与する。
【０２７９】
併用療法は、特に、例えばＭＲＳＡ感染を治療するのに用いられる、標準レジメンを使用する。これには、抗生物質、例えばチゲサイクリン、リネゾリド、メチシリン及び／又はバンコマイシンが含まれうる。
【０２８０】
併用療法では、抗体を混合物として、あるいは１以上の他の治療レジメンと組み合わせて、例えば同時療法の前に、同時に、又は後にのいずれかで投与してもよい。
【０２８１】
いくつかの場合、免疫原の予防的投与は、本発明の免疫原を含むワクチン、すなわち一価ワクチンを使用してもよい。にもかかわらず、同じ又は異なる標的病原体に対する免疫応答を誘導するため、異なる免疫原を含む多価ワクチンを使用してもよい。
【０２８２】
本発明の抗体、免疫原又はそれぞれの医薬品の生物学的特性を、細胞、組織、及び全生物実験において、生体外で特徴付けてもよい。当該技術分野で知られるように、薬剤はしばしば、疾患又は疾患モデルに対する治療に関する薬剤の有効性を測定するため、あるいは薬剤の薬物動態、薬力学、毒性、及び他の特性を測定するため、動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及びサルを含むが、これらに限定されない）において、インビボで試験される。動物は、疾患モデルと称されることも可能である。治療法は、しばしば、限定されるわけではないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、及びトランスジェニックマウス（ノックイン及びノックアウトを含む）を含むマウスで試験される。こうした実験は、抗体が、能動又は受動免疫療法に際して、適切な半減期、エフェクター機能、（交差）中和活性及び／又は免疫応答を伴う治療剤として又は予防剤として、使用される能力の決定のための意義あるデータを提供しうる。任意の生物、好ましくは哺乳動物が、試験に使用可能である。例えば、ヒトに対する遺伝的類似性のため、霊長類、サルが適切な療法モデルである可能性もあり、したがって、これらを用いて、対象となる剤又は組成物の有効性、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期、又は他の特性を試験することも可能である。ヒトにおける試験は、最終的には、薬剤としての認可に必要であり、したがって、もちろん、これらの実験が熟慮される。したがって、本発明の抗体、免疫原及びそれぞれの医薬組成物を、ヒトにおいて試験して、治療的又は予防的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態学、及び／又は他の臨床特性を決定してもよい。
【０２８３】
本発明はまた、診断目的のため、例えば生物学的液体試料中の免疫試薬又は標的としての毒素又は抗体を検出し、そしてその濃度を定量的に決定する方法において使用するための、本発明の対象抗体も提供する。
【０２８４】
本発明はまた、生物学的試料、例えば体液において、毒素又は黄色ブドウ球菌感染のレベルを検出するための方法であって、本発明の抗体と試料を接触させる工程を含む方法も提供する。本発明の抗体を、任意の既知のアッセイ法、例えば競合的結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、ならびに酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用してもよい。
【０２８５】
本発明に従って用いられる体液には、被験体の生物学的試料、例えば組織抽出物、尿、血液、血清、便及び痰が含まれる。
【０２８６】
１つの態様において、方法は、固体支持体を、標的（例えば本発明の抗体によって標的とされる毒素の少なくとも１つ）と複合体を特異的に形成する、特定のタイプの抗体フラグメントの過剰量と、抗体が前記固体支持体の表面に付着するのを可能にする条件下で、接触させる工程を含む。得られた抗体が付着している固体支持体を、次いで、生物学的液体中の標的が抗体に結合し、そして標的−抗体複合体を形成するように、生物学的液体試料と接触させる。複合体を検出可能マーカーで標識してもよい。あるいは、複合体の形成前に、標的又は抗体のいずれかを標識してもよい。例えば、検出可能マーカー（標識）を抗体に抱合させてもよい。その後、複合体を検出し、定量的に決定し、それによって、生物学的液体試料中の標的を検出し、そしてその濃度を定量的に決定することも可能である。
【０２８７】
特定の用途のため、本発明の抗体を、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド性金及びその混合物からなる群より選択される、標識又はレポーター分子に抱合させる。標識又はレポーター分子に抱合された抗体を、例えばアッセイ系又は診断法において用いて、例えば黄色ブドウ球菌感染又はそれに関連する疾患状態を診断してもよい。
【０２８８】
本発明の抗体を、例えば結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）及び結合研究において、前記抱合体の単純な検出を可能にする他の分子に抱合してもよい。
【０２８９】
本発明の別の側面は、１以上の抗体に加えて、多様な診断又は治療剤を含んでもよい、抗体含有キットを提供する。キットにはまた、診断又は治療法において使用するための説明書が含まれてもよい。こうした説明書は、例えば、キット中に含まれているデバイス、例えば診断目的のために生物学的試料を調製するための、例えば、疾患を診断するためにそれぞれの毒素（単数又は複数）を測定する前に、細胞及び／又はタンパク質含有分画を分離するためのツール又はデバイス上に提示されてもよい。好適には、こうしたキットには、本明細書記載の多様な診断法の１以上で使用できる抗体及び診断剤又は試薬が含まれる。別の好ましい実施形態では、キットには、抗体（例えば凍結乾燥型の）と、近い将来の投与のために使用前に混合して注射用組成物を形成する薬学的に許容されるキャリアー（単数又は複数）とが組み合わせて含まれる。
【０２９０】
＃ＡＢ-２８と称される抗体は、特に、図１に示されるアミノ酸配列によって、具体的には、配列番号２０のＶＨ配列と配列番号４０のＨＣ配列それぞれによって、特にＶＨ ＣＤＲ配列である配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、配列番号３のＣＤＲ３によって特徴付けられ、さらに、ＶＨ ＦＲ配列である配列番号１３のＦＲ１、配列番号１５のＦＲ２、配列番号１７のＦＲ３、配列番号１９のＦＲ４によって特徴付けられ、さらに配列番号３９のＶＬ配列と配列番号５２のＬＣ配列それぞれによって特徴付けられ、特に、ＶＬ ＣＤＲ配列である配列番号３２のＣＤＲ４、配列番号３３のＣＤＲ５、配列番号３４のＣＤＲ６によって、及びさらにＶＬ ＦＲ配列である配列番号３５のＦＲ１、配列番号３６のＦＲ２、配列番号３７のＦＲ３、配列番号３８のＦＲ４によって特徴付けられる。
【０２９１】
＃ＡＢ-２８-３、＃ＡＢ-２８-４、＃ＡＢ-２８-５、＃ＡＢ-２８-６、＃ＡＢ-２８-７、＃ＡＢ-２８-８、＃ＡＢ-２８-９、＃ＡＢ-２８-１０、＃ＡＢ-２８-１１、＃ＡＢ-２８-１２、又は＃ＡＢ-２８-１３と称される抗体変異体は、図１に示されるアミノ酸配列、具体的にはそれぞれのＶＨ又はＨＣ配列、及びさらにＶＬ又はＬＣ配列（図１に記載のＦＲ及びＣＤＲ配列を含む）によって特徴付けられる。
【０２９２】
＃ＡＢ-２４と称される抗体、特に抗体軽鎖及び／又は重鎖は、本明細書に示される寄託番号の下に、「DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE)」に寄託される生物学的物質によって、さらに特徴付けられる。
【０２９３】
ＤＳＭ ２６７４７は、＃ＡＢ-２４重鎖（ＡＢ-２４-ＨＣ）のコード配列を含むプラスミドで形質転換された大腸菌宿主細胞である：大腸菌ＤＨ５アルファＡＢ-２４-ＨＣ＝ＤＳＭ ２６７４７、寄託日：２０１３年１月８日；寄託者：オーストリア・ウィーンのアルサニス・バイオサイエンスズ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング。
【０２９４】
ＤＳＭ ２６７４８は、＃ＡＢ-２４軽鎖（ＡＢ-２４-ＬＣ）のコード配列を含むプラスミドで形質転換された大腸菌宿主細胞である：大腸菌ＤＨ５アルファＡＢ-２４-ＬＣ＝ＤＳＭ ２６７４８、寄託日：２０１３年１月８日；寄託者：オーストリア・ウィーンのアルサニス・バイオサイエンスズ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング。
【０２９５】
以下の定義の主題は、本発明の実施形態と見なされる：
１．黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体であって、当該抗体は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含み、ここで、
Ａ）前記抗体は、
ａ）アミノ酸配列 ＹＳＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号１）を含むか又はそれからなるＣＤＲ１；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ２；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＡＲＤＡＧＨＧＶＤＭＤＶ（配列番号３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ３；
を含むか、又は
Ｂ）前記抗体は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ１；又は
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ２；又は
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ３；
の少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変異体を含み、
ここで、前記機能的に活性なＣＤＲ変異体は、親ＣＤＲ配列における少なくとも１つの点変異を含み、且つ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【０２９６】
２．前記機能的に活性なＣＤＲ変異体が、少なくとも以下の１つを含む、定義１の抗体；
ａ）親ＣＤＲ配列中の１，２又は３つの点変異；又は
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端あるいは４つのＮ末端、又は４つの中心アミノ酸位のいずれかにおける１又は２つの点変異。
【０２９７】
３．前記機能的に活性なＣＤＲ変異体が以下のいずれかである、定義１又は２の抗体：
ａ）ＹＰＩＳＳＧＭＧＷＧ（配列番号４）、及びＹＳＩＳＳＧＭＧＷＤ（配列番号５）からなる群より選択されるＣＤＲ１配列；又は
ｂ）ＳＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６）、ＲＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７）、ＲＶＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号８）、ＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＳＬＥＧ（配列番号９）及びＳＩＤＱＲＧＳＴＹＹＮＰＰＬＥＳ（配列番号１０）からなる群より選択されるＣＤＲ２配列；又は
ｃ）ＡＲＤＡＧＨＧＡＤＭＤＶ（配列番号１１）、及びＡＲＤＡＧＨＡＶＤＭＤＶ（配列番号１２）からなる群より選択されるＣＤＲ３配列
【０２９８】
４．以下からなる群より選択される、定義１〜３のいずれかの抗体；
ａ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号６のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号１１のＣＤＲ３配列；
ｂ）以下を含む抗体
ａ．配列番号４のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号７のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｃ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号８のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｄ）以下を含む抗体
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号２のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号１２のＣＤＲ３配列；
ｅ）以下を含む抗体
ａ．配列番号５のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号９のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
ｆ）以下を含む抗体
ａ．配列番号５のＣＤＲ１配列；及び
ｂ．配列番号１０のＣＤＲ２配列；及び
ｃ．配列番号３のＣＤＲ３配列；
【０２９９】
５．配列番号２０〜３１からなる群より選択されるＶＨアミノ酸配列を含む、定義１〜３のいずれかの抗体。
【０３００】
６．配列番号４０〜５１からなる群より選択される抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、又はＣ末端アミノ酸が欠失した配列番号４０〜５１のアミノ酸配列のいずれかを有する、定義１〜３のいずれかの抗体。
【０３０１】
７．抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ４〜ＣＤＲ６）をさらに含む定義１〜６のいずれかの抗体であって、好ましくはこの際
Ａ）前記抗体が、
ａ）アミノ酸配列 ＲＡＳＱＧＩＲＷＬＡ（配列番号３２）を含むか又はそれからなるＣＤＲ４；及び
ｂ）アミノ酸配列 ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）を含むか又はそれからなるＣＤＲ５；及び
ｃ）アミノ酸配列 ＱＱＧＹＶＦＰＬＴ（配列番号３４）を含むか又はそれからなるＣＤＲ６；
を含むか、又は、
Ｂ）前記抗体が、
ａ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ４；又は
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ５；又は
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列からなる親ＣＤＲ６；
の少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変異体を含み、
ここで、当該機能的に活性なＣＤＲ変異体は、親ＣＤＲ配列における少なくとも１つの点変異を含み、且つ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【０３０２】
８.１．配列番号３９のＶＬアミノ酸配列又は配列番号５２の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸を含む、定義７の抗体。
【０３０３】
８.２．任意でＣ末端リジンが欠失した、配列番号４０〜５１からなる群より選択されるＨＣアミノ酸配列を含む、及びさらに配列番号５２のＬＣアミノ酸を含む、定義１〜３のいずれかの抗体。
【０３０４】
９．黄色ブドウ球菌のアルファ毒素（Ｈｌａ）及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合部位を少なくとも１つ含む交差中和抗体であって、当該抗体は、配列番号２０のＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列の多特異性結合部位を含む親抗体の機能的に活性な変異抗体であり、当該機能的に活性な変異抗体は、配列番号２０又は配列番号３９のいずれかにおいて任意のフレームワーク領域（ＦＲ）又は定常ドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）に少なくとも１つの点変異を含み、且つ、各毒素と、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を有する、交差中和抗体。
【０３０５】
１０．前記機能的に活性な変異抗体が、定義１〜３のいずれかに規定の機能的に活性なＣＤＲ変異体を少なくとも１つ含む、定義９の抗体。
【０３０６】
１１．前記機能的に活性な変異抗体が、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する、定義９又は１０の抗体。
【０３０７】
１２．前記少なくとも１つの点変異が、１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入のいずれかである、定義１〜１１のいずれかの抗体。
【０３０８】
１３．前記少なくとも１つの点変異は、以下のアミノ酸置換のいずれかである、定義１〜１２のいずれかの抗体：
−ＣＤＲ２におけるＳ５１Ｒ又はＳ５１Ｋ；又は
−ＣＤＲ３におけるＧ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ又はＶ１０４Ｓ。
【０３０９】
１４．Ｈｌａ及び少なくとも１つの前記二成分毒素のＦ成分、好ましくはその少なくとも２つ又は３つに結合する交差特異性を有する、定義１〜１３のいずれかの抗体。
【０３１０】
１５．前記Ｆ成分が、ＨｌｇＢ、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤからなる群より選択されるか、又は、ガンマ溶血素、ＰＶＬ毒素及びＰＶＬ様毒素のＦ及びＳ成分の同族及び非同族対（好ましくはＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ−ＬｕｋＤ又はＨｌｇＣ−ＬｕｋＦ）の任意のＦ成分である、定義１４の抗体。
【０３１１】
１６．前記毒素の一以上がホスホコリンへ結合するのを阻害する、定義１〜１５のいずれかの抗体。
【０３１２】
１７．全長モノクローナル抗体、結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は、結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質である、定義１〜１６のいずれかの抗体。
【０３１３】
１８．定義１〜１７のいずれかの抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現するコード配列を含む発現カセット又はプラスミド。
【０３１４】
１９．定義１８の発現カセット又はプラスミドを含む宿主細胞。
【０３１５】
２０．定義１９の宿主細胞が、前記抗体を産生するための条件下で培養又は維持される、定義１〜１７のいずれかに記載の抗体を産生する方法。
【０３１６】
２１．親抗体の機能的に活性な変異体を産生する方法であって、親抗体は配列番号２０〜３１の任意のＶＨアミノ酸配列、及び配列番号３９のＶＬアミノ酸配列の多特異性結合部位を含む任意の抗体であり、当該方法は、変異抗体を得るために配列番号２０〜３１又は配列番号３９のいずれかの内の、任意のフレームワーク領域（ＦＲ）又は定常ドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）において少なくとも１つの点変異を設計すること、及び以下のいずれかによって、前記変異抗体の機能的活性を測定することを含む；
−黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素のそれぞれに、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満のＫｄで、結合する親和性、及び／又は
−親抗体と競合する、Ｈｌａ及び／又は前記少なくとも１つの二成分毒素への前記変異抗体の結合、
ここで、前記機能的活性の測定により、機能的に活性な変異体が、組換え産生方法による産生のために選択される。
【０３１７】
２２．黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか又は当該感染を患っている被験体を治療する際に使用するための、定義１〜１６のいずれかの抗体であって、当該治療は、被験体における感染を限定するのに有効な量の抗体を被験体に投与して、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、又は黄色ブドウ球菌疾患の発病（肺炎、敗血症、菌血症、創傷感染、膿瘍、手術部位感染、眼内炎、フルンケル症、カルブンケル症、心内膜炎、腹膜炎、骨髄炎又は関節感染等）を阻害することを含む。
【０３１８】
２３．定義１〜１６のいずれかの抗体を含む医薬品であって、好ましくは、非経口又は粘膜用製剤を含み、任意に薬学的に許容されるキャリアー又は賦形剤を含有する、医薬品。
【０３１９】
２４．定義１〜１６のいずれかの抗体であって、高毒素産生ＭＲＳＡ感染を含む任意の黄色ブドウ球菌感染、例えば壊死性肺炎、ならびにフルンケル症及びカルブンケル症における毒素産生を検出するための診断使用のための抗体。
【０３２０】
２５．任意で、標識を含む抗体及び／又は標識を含むさらなる診断試薬を含む、定義１〜１６のいずれかの抗体の診断用製剤。
【０３２１】
２６．Ｈ１ａモノマーによって形成される結晶であって、Ｘ線照射を回折し、定義１〜１６のいずれかの抗体、又はその結合フラグメント、好ましくはＦａｂフラグメントと接触しているＨｌａ縁領域の三次元構造を表す回折パターンを生じ、以下のセル定数を有する結晶：２８５．０５Å、１５０．９４Å、１１５．２５Å、空間群Ｐ２1２1２、場合によって０．００Å及び２．００Åの間のずれを有する。
【０３２２】
２７．ＬｕｋＤモノマーによって形成される結晶であって、Ｘ線照射を回折し、定義１〜１６のいずれかの抗体、又はその結合フラグメント、好ましくはＦａｂフラグメントと接触しているＬｕｋＤ縁領域の三次元構造を表す回折パターンを生じ、以下のセル定数を有する結晶：１１２．０Å、１１２．０Å、４０９．３Å、空間群Ｈ３２、場合によって０．００Å及び２．００Åの間のずれを有する。
【０３２３】
２８．定義１〜１６のいずれかの抗体の単離パラトープ、又は当該パラトープを含む結合分子。
【０３２４】
２９．定義１〜１６のいずれかの抗体によって認識される単離立体構造エピトープであって、Ｈｌａ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ又はＨｌｇＢの縁領域の三次元構造を特徴とするエピトープ。
【０３２５】
３０．以下からなる群より選択される三次元構造を特徴とする、定義２９のエピトープ：
ａ）配列番号５４の接触アミノ酸残基１７９-１９１、１９４、２００、２６９及び２７１の構造座標を特徴とする三次元Ｈｌａ構造；
ｂ）配列番号５５の接触アミノ酸残基１７６-１８８、１９１、１９７及び２６７の構造座標を特徴とする三次元ＬｕｋＦ構造、好ましくは配列番号５８のアミノ酸残基１７６-１７９、１８１-１８４、１８６-１８８、１９１、１９７及び２６７を有する；
ｃ）配列番号５４の接触アミノ酸残基１７６-１８８、１９１、１９７及び２６７の構造座標を特徴とする三次元ＬｕｋＤ構造、好ましくは配列番号６２のアミノ酸残基１７６-１７９、１８１-１８４、１８６-１８８、１９１、１９７及び２６７を有する；
ｄ）配列番号５６のアミノ酸接触残基１７７-１８９、１９２、１９８及び２６８の構造座標を特徴とする三次元ＨｌｇＢ構造、好ましくは配列番号６８のアミノ酸残基１７７-１８０、１８２-１８５、１８７-１８９、１９２、１９８及び２６８を有する；
ｅ）定義２６の結晶の三次元Ｈｌａ縁領域構造；
ｆ）定義２７の結晶の三次元ＬｕｋＤ縁領域構造；及び
ｇ）ａ）〜ｆ）のいずれかの相同体である三次元構造、ここで当該相同体は、接触アミノ酸残基の骨格原子からの平均二乗偏差０．００Ａ〜２．００Ａを有する結合部位を含む。
【０３２６】
３１．結合分子によって結合される、定義２９又は３０のエピトープ。
【０３２７】
３２．定義２９又は３０のエピトープに特異的に結合する結合分子であって、好ましくはタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、オリゴペプチド、アプタマー及び小分子化合物、好ましくは抗体、前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、又は前記結合部位を含む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質、からなる群より選択される結合分子。
【０３２８】
３３．黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素に結合する多特異性結合剤である、定義３２の結合分子。
【０３２９】
３４．毒素がホスホコリンに結合するのを妨げ、定義１〜１６のいずれかの抗体と競合する、定義３２又は３３の結合分子。
【０３３０】
３５．定義２９又は３０のエピトープに特異的に結合する結合剤を同定するためのスクリーニング法又はアッセイであって、
−候補化合物を定義２９又は３０の三次元構造と接触させる工程、及び、
−前記候補化合物と前記三次元構造間の結合を評価する工程、ここで、前記候補化合物と前記三次元構造間の結合は、当該候補化合物が、黄色ブドウ球菌のＨｌａ及び少なくとも１つの二成分毒素と結合する多特異性結合剤であることを特定する
を含むスクリーニング法又はアッセイ。
【０３３１】
３６．免疫原であって、
（ａ）定義２９又は３０のエピトープ；
（ｂ）任意で、（ａ）のエピトープと天然には会合しないさらなるエピトープ；及び
（ｃ）キャリアー、好ましくは薬学的に許容されるキャリアーであって、好ましくはバッファー及び／又はアジュバント物質を含む
を含む、免疫原。
【０３３２】
３７．ワクチン製剤中の、好ましくは非経口使用のための、定義３６の免疫原。
【０３３３】
３８．定義３６又は３７の免疫原であって、黄色ブドウ球菌感染から被験体を防御するか、前記感染から生じる疾患状態を阻止するか、又は黄色ブドウ球菌肺炎の発病を阻害するのに有効な量の前記免疫原を投与することによって、被験体を治療する際に使用するための、免疫原。
【０３３４】
３９．防御免疫応答を誘発するための、定義３８の免疫原。
【０３３５】
４０．定義１〜１６のいずれかの抗体又は定義２９又は３０のエピトープをコードする単離核酸。
【０３３６】
前述の説明は、以下の実施例を参照して、より完全に理解されるであろう。しかしながら、そのような実施例は、単に、本発明の１以上の実施形態を実施する方法の代表であり、本発明の範囲を限定すると理解してはならない。
【実施例】
【０３３７】
実施例１．個々の毒素成分に高親和性で結合するＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂの生成
方法：
組換え毒素の生成
Ｓ成分及びＦ成分の遺伝子が、ＴＣＨ１５１６ ＵＳＡ３００株から取り出され、大腸菌発現のためにコドン最適化され、遺伝子合成（米国、Genescript社）によって生成され（図７参照）、ｐＥＴ４４ａ中でクローン化され、シグナルペプチド配列（PrediSiプログラムを使用して決定;  Hiller, Nucleic Acids Res., 2004, 32: W375-W379）を伴わないＢＬ２１ Ｒｏｓｅｔｔａ又はＴｕｎｅｒ ＤＥ３株中で、タンパク質が産生された。
【０３３８】
ＬｕｋＳ、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＣ及びＨｌｇＢが、最初の精製工程後にタンパク質分解的に除去される、Ｎ末端ＮｕｓＡ/Ｈｉｓ6タグ付きの可溶型で発現された。精製は、典型的には、３つのクロマトグラフィ工程、１）ＩＭＡＣ（固定金属アフィニティカラム）、２）陽イオン交換又はＩＭＡＣ、及び３）サイズ排除クロマトグラフィ、を含む。精製された細胞抽出物は、金属イオンアフィニティーカラム（IMAC 5ml, GE Healthcare、又はNi-IDA, 15 ml, Novagen）に充填され、融合タンパク質が、５００ｍＭのイミダゾールで溶出された。切断バッファー（20 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2）へのバッファー交換及びエンテロキナーゼ（New England Biolabs）による消化後、成熟タンパク質（Ｎ末端に２つの追加アミノ酸「ＳＬ」を含む）が、金属イオンアフィニティー又は陽イオン交換（SP-Sepharose FF, 5 ml, GE Healthcare、又はEMD SO3-, XK16 column, Merk）クロマトグラフィーによって、ＮｕｓＡ/Ｈｉｓ6タグから分離された。５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５＋３００ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化されたゲル濾過カラム（Superdex 75 16/60, GE Healthcare）での最終精製工程は、ドデシル硫酸ナトリム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）によって純粋（＞９５％）と判断されるタンパク質をもたらした。前記タンパク質は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって純度を、サイズ排除クロマトグラフィーによって単量体状態を、円偏光二色性によって二次構造を、インビトロ毒素効力アッセイで機能性を分析された。
【０３３９】
抗体選択のために、タンパク質が、製造者の説明書に従って、アミノ反応性試薬スルホ-ＮＨＳ-ＬＣビオチン（Thermo-Scientific）により標識され、１−２.５ビオチン／タンパク質のビオチンレベルが得られた。
【０３４０】
モノクローナル抗体の選択
毒素-特異的抗体は、インビトロ酵母選択システム及び関連方法を使用して、全長ヒトＩｇＧ１抗体ライブラリーから単離された（WO2009/036379A2；WO2010105256；WO2012009568）。毒素-結合ｍＡｂは、ビオチン標識Ｈｌａ又はロイコシジンモノマーを、抗体発現酵母細胞と様々な濃度でインキュベートすること、続く磁気ビーズ選択、及びいくつかの連続する選択周期でストレプトアビジン二次試薬を使用する蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって同定された。Ｈｌａ及び二成分毒素交差反応性ｍＡｂは、異なる毒素ベイトを交互に使用することによって選択された。抗体はその後、選択された酵母クローンによって産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
【０３４１】
ｍＡｂの様々な毒素への結合は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ装置（Pall Life Sciences）を用いたインターフェロメトリー測定によって、確認された。ビオチン化抗原又は抗体をセンサー上に固定し、そして抗体Ｆａｂフラグメントの又は抗原の会合及び解離を、それぞれ（典型的には２００ｎＭ）、溶液中で測定した。Ｆａｂ ＫＤ親和性は、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍｍａｇｅｒ ２４０装置（Meso Scale Discovery）を用いたＭＳＤ法で測定した。典型的には、２０ｐＭのビオチン化抗原が、室温で１６時間、様々な濃度のＦａｂとインキュベートされ、非結合抗原は固定化ＩｇＧ上に捕獲された。例えば、Ｅｓｔｅｐらによる“High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning”, MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)も参照。
【０３４２】
結果：
毒素交差反応性ｍＡｂであるＡＢ-２８が、Ｈｌａを用いた最初の選択の連続的な周期、続いて酵母の表面に発現される全長ヒトＩｇＧ１（多様性約〜１０-10）ライブラリーから得たＨｌｇＢ、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤを抗原として用いた交互照合によって発見された。ＡＢ-２８は、Ｈｌａ及びＨｌｇＢへの高い親和性を示すが（＜１０ｐＭ）、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤ結合親和性は１及び２ｌｏｇ低い（それぞれ、＞１００ｐＭ及び＞１ｎＭ）。それゆえ、ＡＢ-２８は、ＡＢ-２８ＣＤＲ配列に基づいて産生されたヒトＩｇＧ１ライブラリーを使用する最適化に供された。親和性が向上した抗体が、低濃度で使用されたＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ、ＨｌｇＢ及びＨｌａを用いる連続的選択によって得られた。ＬｕｋＦ及び／又はＬｕｋＤへの向上した結合親和性を有する抗体が、ＦｏｒｔｅＢｉｏ又はＭＳＤに基づく結合アッセイによって同定された。いくつかの抗体は、ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤの両方に対して有意な親和性向上を示す一方、Ｈｌａ及びＨｌｇＢへの１桁ピコモルの親和性を維持した。そのような抗体の例が図１に示される。親和性向上は、図１に示すように、ＣＤＲ領域中の単一アミノ酸置換によって達成された。
【０３４３】
実施例２．ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤに対するＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂの結合親和性の向上は、インビトロ毒素中和能の高さと関連する。
方法：
毒素による細胞溶解を測定するためのインビトロアッセイ
標的細胞への毒素効力は、中毒細胞（多形核細胞[ＰＭＮ]、分化型ＨＬ６０又はＡ５４９細胞）のＡＴＰレベル又は赤血球への溶血活性を測定することによって評価された。手短に説明すると、Ｈｌａ又はＦ成分及びＳ成分の等モル混合物は、アッセイ培地中で連続的に希釈されて、細胞の中毒のために使用された。ＰＭＮ、分化型ＨＬ６０及びＡ５４９細胞の細胞生存率がその後、製造者の説明書に従って、市販のキット（Cell Titer-Glo[登録商標] Luminescent Cell Viability Assay；米国、Promega社）を使用して検査された。生存率のパーセントは、偽処理コントロールと比較して計算された。
【０３４４】
Ｈｌａのために、２つの異なるインビトロアッセイが、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９又はウサギ赤血球のどちらかを使用して行われた。  Ａ５４９細胞（HPACC #86012804）は、トリプシン処理され、前日に１０％ＦＣＳ及びＰｅｎ/Ｓｔｒｅｐを補充されたＦ１２Ｋ培地（米国、Gibco社）中に、ウェル（９６ウェル半面積発光プレート；オーストリア、Greiner社）あたり２０，０００細胞密度で蒔かれた。細胞を、５％ＦＣＳ及びＰｅｎ/Ｓｔｒｅｐを補充されたＦ１２Ｋ培地中で、３７℃＋５％ＣＯ2にて６時間中毒させた。
【０３４５】
ウサギ赤血球アッセイのため、ニュージーランド・ホワイト・ウサギ（ドイツ、Preclinics社）からウサギＥＤＴＡ−全血を得た。血液を１：１で、ＰＢＳ Ｃａ++／Ｍｇ++不含（オーストリア、PAA Laboratories社）で希釈し、そして５０ｍｌポリプロピレン試験管中、１５ｍｌのＬＳＭ １０７７（オーストリア、PAA Laboratories社）上に１５ｍｌの希釈血液を重層することによって、勾配を調製した。６８０ｘｇ（ＲＴ、ブレーキなし）での遠心分離後、血小板、血漿、ＰＢＭＣ及びＦｉｃｏｌｌを吸引によって除去し、廃棄した。残ったＲＢＣペレットを４０ｍｌ ＰＢＳ Ｃａ++／Ｍｇ++不含で、２回洗浄し（６８０ｘｇで遠心分離、ＲＴ、ブレーキなし）、そして最後に、２０ｍｌ ＰＢＳ Ｃａ++／Ｍｇ++不含に再懸濁した。赤血球の完全性及び細胞数を標準的血球計数器で決定した。溶血アッセイは、３７℃＋５％ＣＯ2にてＸ時間、ＰＢＳ Ｃａ++／Ｍｇ++不含中に希釈された５×１０7のウサギ赤血球を用いて実施された。
【０３４６】
二成分毒素の殺白血球活性を測定するために、ヒトＰＭＮ細胞又は分化型ＨＬ-６０細胞のどちらかが、組換え毒素あるいは黄色ブドウ球菌培養上清によって誘導される細胞溶解を測定するために使用された。ＰＭＮ単離用の新鮮なヒト血液を、赤十字（ヘパリン処理済）から得るか、又は正常で健康なボランティアから静脈穿刺によって、Ｋ-ＥＤＴＡ又はヘパリンバキュテナー管（米国、ＢＤ）中に得た。赤血球を凝集させるため、１部のＨｅｔａＳｅｐ溶液（フランス、Stem Cell Technologies社）を５部の血液に添加し、混合し、血漿／赤血球界面が総体積のおよそ５０％になるまで、３７℃でインキュベートした。白血球濃縮血漿層を、２工程Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（ＨＢＳＳ中で希釈された７３％及び６３％Ｐｅｒｃｏｌｌプラス、GE Healthcare）上に注意深く重層し、そして６８０ｘｇ、ＲＴで３０分間、ブレーキなしで遠心分離した。回転後の勾配の第一の層及び第二の層（主に血清及び単球）を吸引によって除去した。ＰＭＮを第二の不透明層から採取し、５０ｍｌ ＨＢＳＳ（米国、Gibco社）＋１０ｍＭグルコース中で２回洗浄した。血球計数器で、トリパンブルー色素排除を用いて、生存細胞数を計数した。ＰＭＮ ＡＴＰアッセイのため、細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び０.１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（PAA/GE Healthcare）を補充した好中球培地ＲＰＭＩ １６４０（オーストリア、PAA Laboratories社）中に再懸濁した。前記したように（２１，２２）、ＨＬ-６０（ATCC CCL-240TM）ヒト前骨髄球性白血病細胞株を、好中球培地中で培養し、１００ｍＭ ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、Fisher BioReagents）又は４．３ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ（ジブチリル環状ＡＭＰ; Sigma-Aldrich）を用いて分化した。分化は、ブリリアント・バイオレット４２１抱合抗-ＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４、BioLegend）及びＰＥ-抱合抗-ＣＤ７１モノクローナル抗体（クローンＯＫＴ９、eBioscience）を用いたＣＤ７１の消失とＣＤ１１ｂ染色の出現によって測定した。ＰＭＮ／ＨＬ６０溶解アッセイは、半面積発光プレート（オーストリア、Greiner社）中の好中球培地中の２５，０００細胞／ウェル希釈にて、３７℃＋５％ＣＯ2で４時間行われた。
【０３４７】
抗体の毒素中和活性の測定
ＰＭＮ／ＨＬ６０細胞アッセイのために、抗体は、好中球培地中で連続的に希釈され、図の説明文に示される固定濃度の毒素と混合された。生存率アッセイは、抗体-毒素結合を可能にする１時間のプレ-インキュベーション工程の後に開始された。以下の式：阻害％＝［(毒素のみの生存度−阻害された活性)／(毒素のみの生存度)］×１００を用いて、毒素活性の阻害％が計算された。グラフ中の中和活性は、ＩＣ５０ ｍＡｂ濃度におけるｍＡｂ：毒素のモル比で表される。酵母細胞によって発現され、無関係の抗原（ニワトリ卵白リゾチーム）に対して産生されたヒトＩｇＧ１コントロールｍＡｂは、全てのアッセイで含まれた。
【０３４８】
Ａ４５９ Ｈｌａ-中和アッセイのため、細胞はトリプシン処理され、前日に、１０％ＦＣＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充されたＦ１２Ｋ培地（ＵＳＡ、Gibco社）中に、ウェル（９６ウェル半面積発光プレート、オーストリア、Greiner社）あたり２０，０００細胞密度で蒔かれた。抗体は、別の希釈プレートにおいて、５％ＦＣＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＦ１２Ｋ培地（＝Ａ５４９細胞アッセイ培地）中で連続希釈され、そして固定された濃度［３．０３ｎＭ］で、アルファ溶血素と混合された。室温での１時間のプレ-インキュベーション工程の後、接着性Ａ５４９細胞上の植え付け培地を廃棄し、ｍＡｂ：毒素混合物によって置換した。細胞は３７℃＋５％ＣＯ2で６時間中毒され、次いで、ＡＴＰ測定（ＰＭＮ／ＨＬ６０のために記載した通り）にかけられた。
【０３４９】
モノクローナル抗体を用いたＲＢＣ溶血抑制アッセイのために、抗体は、ＰＢＳ中で連続的に希釈され、図の説明文に示す固定濃度の毒素と混合された。溶血アッセイは、抗体-毒素結合を可能にする１時間のプレインキュベーション工程の後に開始された。以下の式：阻害％＝［(毒素のみの溶血−阻害された活性)／(毒素のみの溶血)］×１００を用いて、毒素活性の阻害％が計算された。グラフ中の中和活性は、ＩＣ５０ ｍＡｂ濃度におけるｍＡｂ：毒素のモル比で表される。
【０３５０】
結果：
抗体の毒素中和能は、組換えＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ及びＨｌｇＣＢを用いたヒトＰＭＮの中毒、又はＨｌｇＡＢを用いたヒト赤血球の中毒又はＨｌａを用いたヒト肺上皮細胞（Ａ５４９細胞株）の中毒によって測定された。図２に示すように、様々な毒素への結合親和性は、ｍＡｂの毒素中和能を非常に良好に予測した。ＡＢ-２８-６、ＡＢ-２８-７、ＡＢ-２８-８及びＡＢ-２８-９によって例証された、ＬｕｋＤで＜８００ｐＭ及びＬｕｋＦで＜５５ｐＭのＫD値を有する最も良いＨｌａ-ＬｕｋＦ-ＬｕｋＤ-ＨｌｇＢ四重交差反応性抗体は、全ての標的毒素の中和に高い有効性を示した。
【０３５１】
Ｆ成分特異的ｍＡｂの効力は、４つの同族毒素対に限定されなかったが、ＨｌｇＡ-ＬｕｋＤのような非同族対形成によって形成されたロイコシジンに対して等しく明白であった。
【０３５２】
向上した毒素交差反応性の利益は、個々の毒素によって１００％の細胞溶解を生じさせるのに十分な濃度で添加された、ある細胞型に対して活性な組換えロイコシジンの混合物を用いて行われた中毒アッセイの結果によって強調される。毒素の１つのみに対してさえ認識できる活性を欠く抗体は、細胞溶解に対する防御を提供しなかった。Ｆ成分とＨｌａに対する最も高い総合親和性を有するｍＡｂは、−ＡＢ-２８-６、ＡＢ-２８-７、ＡＢ-２８-８及びＡＢ-２８-９によって例証されるように−これらの組み合わせ毒素アッセイにおいて優れた効力を有することが見出された（図３参照）。
【０３５３】
実施例３．ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤに対するＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂの向上した結合親和性は、インビトロにおける防御の高さと関連する。
方法：
モノクローナル抗体を用いたマウスの受動的防御
抗-黄色ブドウ球菌毒素抗体の防御効果が、複数のマウスモデルで評価された。ｍＡｂでの受動免疫は、組換え毒素による致死性曝露の２４時間前に、腹腔内で行われた。５匹のマウス（ＢＡＬＢ/ｃ）の群に、ＰＢＳ中で希釈した個々のｍＡｂを５又は１０ｍｇ／ｋｇ量（それぞれ、１００又は２００μｇ／マウス）で投与した。コントロール群には、ＰＢＳのみ、又はアイソタイプマッチした非特異的ｍＡｂの同量を投与した。暴露は、それぞれ、マウスあたり０．２及び１μｇ量（各成分）のＨｌｇＡ-ＨｌｇＢ又はＨｌｇＡ-ＬｕｋＤ毒素対を用いて静脈内で行われた。
【０３５４】
結果：
ＨｌｇＢへの親和性が＜２０ｐＭの交差反応性Ｈｌａ ｍＡｂ（図４に示されるように、ｍＡｂ ＡＢ-２８-３(ＫD＝１８ｐＭ)及びＡＢ-２８-９(ＫD＝５ｐＭ)を用いた）は、組換えＨｌｇＡＢへの暴露に起因する致死を防止するのに非常に有効であった。
【０３５５】
交差反応性ｍＡｂは、ＬｕｋＤに対して、８５ｐＭ〜２．２ｎＭの広範な範囲の親和性を示した。図５に示すように、それぞれ、４００、２９０及び７８０ｐＭのＫD値及び７５、１００及び３５％生存率を有するＡＢ-２８-９、ＡＢ-２８-７及びＡＢ-２８-８によって例証されるように、ＣＤＲ領域のあるアミノ酸を変更することによってＡＢ-２８親ｍＡｂから産生された、試験した子孫は、有意に防御的であり、親和性とインビボ有効性の間の強い相関性を伴う。
【０３５６】
実施例４：黄色ブドウ球菌ＴＣＨ１５１６による鼻腔内細菌暴露に対するＨｌａ-二成分毒素交差反応性ｍＡｂによって媒介される防御
方法：
モノクローナル抗体を用いたマウスの受動的防御
抗-黄色ブドウ球菌毒素抗体の防御効果が、マウスの肺炎モデルで評価された。ｍＡｂでの受動免疫は、生細菌による致死性の鼻腔内曝露の２４時間前に、腹腔内で行われた。５匹のマウス（ＢＡＬＢ/ｃ）の群に、ＰＢＳ中で希釈した個々のｍＡｂを５ｍｇ／ｋｇ量（１００μｇ；０．２ｍｇ／ｍｌ）で投与した。コントロール群には、ＰＢＳのみを投与した。マウスを１０％ケタミン-２％Ｒｏｍｐｕｎで麻酔した後、６×１０8ｃｆｕの細菌懸濁液４０μｌを鼻孔に塗布した。
【０３５７】
結果：
交差反応性Ｈｌａ ｍＡｂは、肺炎モデルにおいて黄色ブドウ球菌ＴＣＨ１５１６によって誘発される致死を防ぐのに非常に有効であった。全ての抗体は、ビヒクルのみを投与されたコントロール群（２０％生存）と比較して、高レベルの防御を示した。
【０３５８】
実施例５．Ｈｌａ：ＡＢ-２８及びＬｕｋＤ：ＡＢ-２８複合体の結晶構造及びホスホコリン結合アッセイを用いた抗体のエピトープ・マッピング／結合
ＡＢ-２８のＦａｂフラグメントとの複合体中のＨｌａ及びＬｕｋＤそれぞれの結晶構造から、Ｈｌａ及びＬｕｋＤ分子中のＡＢ-２８抗体のエピトープ残基が同定された。エピトープは、Ｆａｂ残基と接触している（すなわち、Ｐｙｍｏｌ[PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schroedinger, LLC]で測定される、任意のそれらの非水素原子間の距離が、４．０Å以下である）、Ｆａｂ-毒素界面での毒素残基と定義される。
【０３５９】
図９Ａに示されるＨｌａエピトープは、Ｈｌａの縁領域（球で表示）に見受けられ、ＡＢ-２８ Ｆａｂの可変領域の軽鎖（黒色カートン）及び重鎖（灰色カートン）両方の残基に結合している。Ｈｌａ結晶構造から決定されたＨｌａ接触残基（図８Ｂ、球）はアミノ酸１７９-１９１、１９４、２００、２６９及び２７１である。配列アラインメント及び利用可能な構造データに基づくと、これらの中で、アミノ酸１７９-１８２、１８４-１８６、１９１、２００、２６９及び２７１（図９Ｂ，黒球）は、Ｈｌａ、 ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で完全に保存されており、アミノ酸１８３、１９０及び１９４は、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で保存されており、アミノ酸１８９は、Ｈｌａ、 ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で保存されている。アミノ酸１７９（Ｈｌａ中のＴｒｐ）は、ＬｕｋＤ及びＬｕｋＦ（Ｔｙｒ）及びＨｌｇＢ（Ｐｈｅ）中の別の芳香族残基と対応している。ＬｕｋＦ及びＬｕｋＤ中の対応アミノ酸は、１７６-１８８、１９１、１９７、２６５及び２６７であり、ＨｌｇＢ中の対応アミノ酸は、１７７-１８９、１９２、１９８、２６６及び２６８である。
【０３６０】
ＬｕｋＤ中の、ＬｕｋＤ：ＡＢ-２８結晶構造（図１０Ａ、図８Ａと同じ表示）から決定された接触アミノ酸は；１７６-１７９、１８１-１８４、１８６-１８８、１９１、１９７及び２６７（図１０Ａ、接触残基は球、完全保存残基は黒）であり、１８４（Ｈｌａ及びＨｌｇＢでは異なる）、１８７及び１９１（Ｈｌａでは異なる）を除いて、Ｈｌａ、 ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で完全に保存されている。
【０３６１】
縁領域に結合しているホスホコリンは、Ｈｌａ、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で保存されたポケット内にあり、Ｈｌａ（Science 1996, 274, 1859）、ＨｌｇＢ（Nat.Struct.Biol. 1999, 6, 134）及びＬｕｋＦ（Structure, 1999, 7, 277-287）について結晶学的に観察された。ＬｕｋＦ内でホスホコリン結合に関与するアミノ酸は、Ａｓｎ-１７３、Ｔｒｐ-１７６、Ｔｙｒ-１７９、Ｇｌｕ-１９１及びＡｒｇ-１９７であり、後者４つは、Ｈｌａ、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢ間で完全に保存されており、結晶構造におけるＬｕｋＤ（及びＨｌａ）とＡＢ-２８間の接触残基も同様である。毒素へのホスホコリンの結合は、ＦｏｒｔｅＢｉｏに基づく測定において、ストレプトアビジンセンサー上にビオチン化毒素を固定化し、そして、溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中のホスホコリン-ＢＳＡアダクト（PC4-BSA, Biosearch Technologies）の結合を測定することによって評価された。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェア・バージョン７を用いた応答値測定から判断されるように、ＰＣ４-ＢＳＡの、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ及びＨｌｇＢへの測定可能な結合が存在し、しかしネガティブコントロールＳ成分ＨｌｇＡには存在しない（図１１）。ＡＢ-２８ ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）のビオチン化毒素への結合は、続くホスホコリンの結合を妨げ（図１１）、これはＡＢ-２８が、毒素とホスホコリンの結合を打ち負かすことを示す。
【０３６２】
実施例６．Ｈｌａ：ＡＢ-２８複合体及びＬｕｋＤ：ＡＢ-２８複合体の結晶構造を使用した変異アミノ酸のインシリコ分析
１つ又は両方の毒素への結合が向上した変異体を予測するために、Ｈｌａ及びＬｕｋＤとの複合体におけるＡＢ-２８ Ｆａｂフラグメントの結晶構造を用いて、全ての接触位置のため、並びにＦａｂ接触残基のインシリコ突然変異誘発のため、結合エネルギーが計算された。
【０３６３】
構造体は、ＹＡＳＡＲＡ（Krieger E, Vriend G. YASARA View-molecular graphics for all devices-from smartphones to workstations. Bioinformatics. 2014 Oct 15;30(20):2981-2）を用いて調製され、イオン及び水分子が取り除かれ、水素が添加され最適化された（最急降下最小化が使用された）。総合結合エネルギーへの各残基の寄与が、Ｒｏｓｅｔｔａスコア１２・ファンクション（Kaufmann KW, Lemmon GH, Deluca SL, Sheehan JH, Meiler J. Practically useful:what the Rosetta protein modeling suite can do for you. Biochemistry. 2010 Apr 13;49(14):2987-98）を使用して、さらなる最適化なしで計算された。
【０３６４】
各接触残基のエネルギー論が以下の表１に示される。接触には複数の位置があるが、特に突然変異誘発により親和性を増加する機会を提供できるＶＬ ＣＤＲ５では、総合結合エネルギーへの寄与は低い。複数の方法が、インシリコ突然変異誘発プロトコルのために試験され、ＡＢ-２８変異体の既知の結合特性と最もよく定性的な一致を示す方法が選択された。選択された接触位置は、Ｃｙｓ及びＰｒｏを除くすべてのアミノ酸に変異され、各変異の結合エネルギー変化が以下の表２．１及び２．２に示される。
【０３６５】
【表１】
0006473746.tif 000002
【０３６６】
【表２．１】
0006473746.tif 000003
【０３６７】
【表２．２】
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【０３６８】
インシリコ突然変異誘発は、複数のＡＢ-２８接触残基の変更が、Ｈｌａ及びＬｕｋＤの両方への結合の改善をもたらしうることを示した（すなわち、ＶＬ ＣＤＲ４中のＳ７Ｒ、及びＶＨ ＣＤＲ２中のＳ７Ｑ、ＶＨ ＣＤＲ３中のＶ８Ｍ、Ｖ８Ｒ）。多数の他の変異：ＶＬ ＣＤＲ４中のＳ７Ｗ、Ｓ７Ｍ、Ｓ７Ｌ、ＶＬ ＣＤＲ５中のＳ４Ｑ、Ｓ４Ｎ、Ｓ４Ｋ、及びＶＨ ＣＤＲ１中のＭ７Ｈ、Ｍ７Ｒ、ＶＨ ＣＤＲ２中のＳ７Ｄ、Ｓ７Ｈ、Ｓ７Ｎ、Ｙ９Ｒは、ＬｕｋＤへの結合に影響を与えることなく、Ｈｌａへの結合をより良くすると予測される。同様に、ＶＬ ＣＤＲ５中のＡ１Ｇ置換、及びＶＨ ＣＤＲ１中のＳ５Ｈ、Ｓ５Ｒ、Ｓ５Ｗ、Ｍ７Ｋ置換、ＶＨ ＣＤＲ２中のＳ７Ｋ置換は、Ｈｌａへの結合に影響を与えることなく、ＬｕｋＤへの結合をより良くする可能性がある。他方、ＶＬ ＣＤＲ５中のＳ４Ｒ置換及び、ＶＨ ＣＤＲ３中のＨ６Ｅ、Ｈ６Ｑ置換は、ＬｕｋＤへの結合を改善するが、Ｈｌａへの結合を減少させると予期される。ＬｕｋＤ又はＨｌａのどちらかへの結合に影響を与えない比較的多数の変異も存在し（ΔΔＧ値＜０．５）、これらの変異体は、ＡＢ-２８と同様の結合特性を示すことが予期される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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