(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞を含む採取された対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とを有することを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項２】
上記対象液が、骨髄液、臍帯血、又は末梢血であることを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項３】
上記培養工程は、上記間葉系幹細胞を複数の群に分けてそれぞれ細胞培養するようになっており、またサンプリング工程は、複数の群に分けられた間葉系幹細胞の一部をそれぞれサンプリングするようになっていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項４】
上記継代培養工程において、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α未満の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞の群を継代培養しないことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項５】
上記継代培養工程において、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値β以下の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を治療剤とすることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項６】
上記継代培養工程によって継代培養された間葉系幹細胞について、該間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、該サンプリング工程によってサンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４の量を測定する測定工程と、該測定工程によって測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とが設けられており、これらの工程が１回以上繰り返されることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項７】
上記継代培養工程は、上記間葉系幹細胞を複数の群に分けてそれぞれ継代培養するようになっていることを特徴とする請求項６に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項８】
上記アデニレートキナーゼ４の量が、アデニレートキナーゼ４のｍＲＮＡ発現量であることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞を含む採取された対象液から間葉系幹細胞を含む液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とを有することを特徴とする肝機能障害用治療剤の製造方法。
【請求項１０】
上記対象液が、骨髄液、臍帯血、又は末梢血であることを特徴とする請求項９に記載の肝機能障害用治療剤の製造方法。
【請求項１１】
上記アデニレートキナーゼ４の量が、アデニレートキナーゼ４のｍＲＮＡ発現量であることを特徴とする請求項９または請求項１０のいずれかに記載の肝機能障害用治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療の間葉系幹細胞を培養する分野に関するものであり、より詳しくは、間葉系幹細胞の培養方法と、さらに肝機能障害用治療剤の製造方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野において、間葉系幹細胞を利用して人体の各組織の治療を行うことが注目を浴びている。
間葉系幹細胞は骨髄液、臍帯血、末梢血等に含まれており、骨、軟骨、脂肪、心臓、神経、肝臓などの多種類の細胞へ分化可能な多分化能を有する細胞である。しかしながら間葉系幹細胞は、例えば骨髄液中にはその存在率が０.０５％程度であり直接臨床に使用するには大量に採取する必要があり、生体への負担が大きいことから、生体組織から採取した間葉系幹細胞を継代培養して用いることが望ましい。
採取した骨髄液について初代培養、継代培養を行って目的とする量まで間葉系幹細胞を増殖させることは、従来既に公知である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−６７１７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１では単に継代培養を行い所定量の間葉系幹細胞を培養するものであるが、培養された間葉系幹細胞の活性（品質）についてはなにも考慮されていない。
特許文献１にも記載されているように、間葉系幹細胞は培養を重ねるに従って活性が低下する（老化する）ことが知られている。また、継代培養はひとつの容器で培養された間葉系幹細胞を複数の容器に分割して培養することを繰り返すため各容器により培養状態が異なり、最終的に培養された間葉系幹細胞を集めても、中には老化したもの、死滅したものが含まれており、臨床に十分必要な質や量が得られない可能性があった。
本発明はそのような事情に鑑み、培養された間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度を評価する評価方法を用いた間葉系幹細胞の培養方法と、さらに肝機能障害用治療剤の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち請求項１の発明は、間葉系幹細胞の培養方法に関するもので、間葉系幹細胞を含む採取された対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とを有することを特徴とするものである。
請求項９の発明は、肝機能障害用治療剤の製造方法に関するもので、間葉系幹細胞を含む採取された対象液から間葉系幹細胞を含む液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とを有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００６】
いずれの発明においても、測定されたアデニレートキナーゼ４の量から間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度を評価することができ、例えば測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α以上の場合には、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が低く老化が進んでいないので、継代培養するのに適した間葉系幹細胞であると評価することができ、この場合にはサンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程を実行することができる。
これとは逆に、測定されたアデニレートキナーゼ４の量が所定のしきい値α未満の場合には、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高く老化が進んでいるので、継代培養に用いるには好ましくない。またこの場合には、当該間葉系幹細胞を治療剤として用いるのに好適であると評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】間葉系幹細胞を酸素１％の条件下で細胞培養した場合と、酸素２０％の条件下で細胞培養した場合とのそれぞれについて、アデニレートキナーゼ４の量を測定した結果を示す実験結果図。
【図２】アデニレートキナーゼ４の量と培養工程との関係を説明する説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ４（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ４）の量を測定し、測定されたアデニレートキナーゼ４の量によって、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度を評価することを特徴とするものである。
アデニレートキナーゼは、生体が増殖、分化、運動、代謝などの機能を正常に発揮するために必要な細胞内アデニンヌクレオチドの恒常性維持に重要な役割を担っており、以下の可逆的反応を触媒する酵素である。
２ＡＤＰ（アデノシン２リン酸）⇔ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）＋ＡＭＰ（アデノシンリン酸）
【０００９】
アデニレートキナーゼには４種類のアイソザイムがあり、アデニレートキナーゼ１（ＡＫ１）は細胞質に存在し、アデニレートキナーゼ２（ＡＫ２）はミトコンドリア内膜に存在する。またアデニレートキナーゼ３（ＡＫ３）とアデニレートキナーゼ４（ＡＫ４）はミトコンドリアマトリックスに存在する。
近年、ＡＫ１、ＡＫ２、ＡＫ３についてはそれらの機能が徐々に明らかになってきているが、ＡＫ４の機能についてはよく知られていない。
【００１０】
本発明者らは、ＡＫ４について種々の実験を行った結果、ＡＫ４の量から、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度を評価できるという知見を得て本発明を完成した。
図１は骨髄液から採取したヒト間葉系幹細胞を酸素１％の条件下で細胞培養した場合と、酸素２０％の条件下で細胞培養した場合とのそれぞれについて、マイクロアレイ解析によりＡＫ４の量（発現量）を測定した結果を示すものである。
同図から明らかなように、酸素２０％の条件下で細胞培養した間葉系幹細胞におけるＡＫ４の量は１（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ以下ａ．ｕ．と略す）であるのに対し、酸素１％の条件下で細胞培養した間葉系幹細胞におけるＡＫ４の量は１．５０（ａ．ｕ．）であった。間葉系幹細胞は、酸素２０％の条件下の方が酸素１％の条件下よりもミトコンドリア活性が高いことはよく知られており、このことから、ＡＫ４の量が多い場合は、ミトコンドリア活性が低いことが理解できる。また、ＡＫ４の量が少ない場合は、ミトコンドリア活性が高いことが理解できる。
上記ＡＫ４の量は、ウエスタンブロッティングで評価できる。また市販されているフラックスアナライザー（例えばＳｅａｈｏｒｓｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製ＸＦｅ９６）によって推測することができる。
【００１１】
本発明においては、測定されたＡＫ４の量から間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度を評価することができるので、この評価を次のように用いることができる。
第１に、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が高い方が治療剤としての効果が高いので、活性の高い間葉系幹細胞を選定してこれを治療剤として用いることができる。
【００１２】
第２に、採取した間葉系幹細胞を所定量まで増殖させるために継代培養が必要な場合には、細胞培養された間葉系幹細胞のＡＫ４の発現が多すぎると治療剤として使用する頃には増殖能が阻害されるために、ＡＫ４の発現が多すぎないものを継代培養するのが好ましい。
具体的には、骨髄液、臍帯血、末梢血等の間葉系幹細胞を含む対象液を採取する場合、採取された上記対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のＡＫ４の量を測定する測定工程とにより、測定されたＡＫ４の量が少ない場合には当該間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高いので継代培養には用いず、他方、ＡＫ４の量が多い間葉系幹細胞はそのミトコンドリア活性の程度が低いので、これを継代培養に用いることができる。
この場合、ひとつの容器で培養された間葉系幹細胞を複数の容器に分割して培養する継代培養を所要回繰り返した際に、各容器毎の培養状態を可及的に均質かつ良質に保つために、ＡＫ４の量が多く、かつ、ＡＫ４の量が揃った複数の間葉系幹細胞を選択してもよい。これにより、臨床に充分必要な量の等質で良質な間葉系幹細胞を得ることが可能となる。
【００１３】
第３に、採取した間葉系幹細胞を所定量まで増殖させるために継代培養が必要な場合に、予め継代培養の回数が予測できる場合には、最後の継代培養が終了した時点で、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が治療剤として良好な効果が得られる程度に充分に活性しているように、各継代培養の開始時におけるＡＫ４の量を選択することが可能である。
つまり継代培養をする際に、必ずしもＡＫ４の量が最も多い間葉系幹細胞を選択するのではなく、間葉系幹細胞の老化が進んだＡＫ４の量が最も少ない間葉系幹細胞と最も多い間葉系幹細胞との間の、継代培養の回数を考慮した最適なＡＫ４の量を有する間葉系幹細胞を選択することが可能である。
上記継代培養をする際のＡＫ４の量は、細胞培養の期間及び継代培養の回数により、どの時点で活性の高いものがよいか、活性の低いものがよいかの判断することができる。
【実施例】
【００１４】
（初代培養工程）
（１）骨髄細胞より調整した間葉系幹細胞に培養液を加え全量を３０ｍＬとし、フラスコ３本にそれぞれ１０ｍＬずつ藩種しインキュベータ内で培養を開始する（培養工程：図２参照）。
つまり本実施例では、採取した間葉系幹細胞を培養条件の異なるフラスコ３本による３つの群に分けて、細胞培養している。
（２）培地は２〜３日ごとに全量交換する（培地交換工程）。
【００１５】
（継代培養工程：１回目）
（１）初代培養工程における３本のフラスコから間葉系幹細胞をそれぞれ１万個ずつサンプリングする（サンプリング工程）。
（２）サンプリングされたそれぞれの細胞内のＡＫ４の量を測定する（測定工程）。ＡＫ４の量は、上述したようにフラックスアナライザーによって推定することができる。またはウエスタンブロッティングやｍＲＮＡの発現解析で正確に測定できる。
（３）測定されたＡＫ４の量が所定のしきい値α以上であるか否かを確認する。このしきい値αとして、例えば図１の１．１ａ．ｕ．という値を採用することができる。この値以上であれば、初代培養された間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が低く老化が進んでいないので、継代培養するのに適した間葉系幹細胞であると評価することができる。
他方、測定されたＡＫ４の量が所定のしきい値α未満の場合には、当該間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高いと推測されるので、継代培養には用いない。
図２では、３本のフラスコに分けられた間葉系幹細胞のうち、左右の間葉系幹細胞におけるＡＫ４の量はそれぞれ上記しきい値α以上であるので、これらについて継代培養を行い（◎印参照）、中央のフラスコの間葉系幹細胞におけるＡＫ４の量は上記しきい値α未満であるので、これについては継代培養を行なわない（×印参照）。但し、継代培養を行わない中央のフラスコの間葉系幹細胞は、この時点では廃棄することなく、インキュベータ内で引き続き培養を継続する。
他方、継代培養することとした左右の間葉系幹細胞については、それぞれ３本のフラスコに藩種しインキュベータ内で細胞培養する。つまり本実施例では、初代培養された間葉系幹細胞を６つの群に分けて、第１回目の継代培養が行われる。
【００１６】
（継代培養工程：２回目）
（１）上記６本の各フラスコから間葉系幹細胞をそれぞれ１万個ずつサンプリングする（サンプリング工程）。
（２）サンプリングされた細胞内のＡＫ４の量を測定する（測定工程）。
（３）測定されたＡＫ４の量が上述したしきい値α以上の場合には、サンプリングされたフラスコの細胞をさらに３本のフラスコに藩種しインキュベータ内で第２回目の継代培養を行う。
図２に示す場合では、第１回目の継代培養の際に６つの群に分けられた間葉系幹細胞のうち、◎印が付された４つの群における間葉系幹細胞のＡＫ４の量は上記しきい値α以上となっているので、これら４つの群については第２回目の継代培養を行う。×印が付された残りの２つの群における間葉系幹細胞のＡＫ４の量は上記しきい値α未満であるので、これについては継代培養を行なわない。但し、継代培養を行わない２つの群の間葉系幹細胞については、この時点では廃棄することなく、引き続きインキュベータ内で培養を継続する。
他方、継代培養することとした４つの群における間葉系幹細胞については、各群の間葉系幹細胞をそれぞれ３本のフラスコに藩種しインキュベータ内で細胞培養する。つまり合計１２本の群に分けて第２回目の継代培養が行われる。
【００１７】
（細胞懸濁液調整工程）
（１）上記１２本のフラスコから間葉系細胞をそれぞれ１万個ずつサンプリングする。また、継代培養を行わなかった他の３本のフラスコについても同様に間葉系幹細胞をそれぞれ１万個ずつサンプリングする。
（２）サンプリングされた細胞内のＡＫ４の量を確認する。
（３）測定されたＡＫ４の量が所定のしきい値β以下の場合に、例えばしきい値β＝１．４ａ．ｕ．以下の場合には、これらの間葉系幹細胞についてはフラスコの細胞洗浄分離を行い、薬剤及び生理食塩水を加え全量２００ｍＬの細胞懸濁液を調整して、これを治療剤として用いることができる。
他方、測定されたＡＫ４の量がしきい値βを超えるような場合には、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が低く増殖能が低下するため治療剤として用いてもその効果が期待できないので、そのような間葉系幹細胞は廃棄する。しかしながら条件によっては、例えば治療剤の総量が不足するような場合には、ミトコンドリア活性の程度が低い間葉系幹細胞であってもこれを廃棄するよりは治療剤として用いることが望ましい。
【００１８】
なお、患者の負担を少なくするためには継代培養によって細胞を増殖させることが望ましいが、充分な量の間葉系幹細胞を採取できる場合には、初代細胞培養を行った後、当該間葉系幹細胞のＡＫ４の量を測定し、測定されたＡＫ４の量が上記しきい値β以下のものについて、継代培養を行うことなく、治療剤として用いることができる。
また、上記ＡＫ４の量のしきい値α、βの数値は一例であって、治療剤として使用される箇所や継代培養の必要な回数など、必要とされる条件に応じて適宜最適な値に変更・調整できることは勿論である。
【図１】
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【図２】
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