(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列とを含有する、抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体のコード配列を準備する；
ｂ）工程ａ）で得られるヌクレオチド配列を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする；
ｃ）培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する。
ここで、前記宿主細胞が真核哺乳類細胞ＣＨＯ細胞であり；
細胞培養のｐＨが６．５〜７．０であり；
細胞培養の温度が３４°Ｃ〜３７°Ｃであり；
細胞培養の浸透圧が２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇである：
【請求項２】
前記組換えプラスミドが前記組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体のコード配列および前記コード配列に作動可能に連結される発現調節配列とを含み、前記組換えプラスミドが、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲの中のいずれか１つから選択される、請求項１に記載の新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】
前記組換えプラスミドがｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）である、請求項２に記載の新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４】
前記宿主細胞は真核哺乳動物細胞ＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-であることを特徴とする、請求項１に記載の新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
無血清培養方式により宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載の新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法により調製された新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により調製された新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬を治療するための薬物の製造における使用。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬を治療するための薬物の製造における使用。
【請求項９】
前記請求項６に記載の組成物が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬を治療するための他の薬物と併用される、請求項７または８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有する組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体のコード配列を準備する；
ｂ）工程ａ）で得られるヌクレオチド配列を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングし、前記宿主細胞が真核哺乳類細胞であるCHO-CR-GS-/-である；
ｃ）動物由来成分フリーの無血清培地における培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する；
ただし、細胞培養のｐＨは：６．７であり；
細胞培養の温度は：３５℃であり；
細胞培養の浸透圧は：３４５ｍＯｓｍ／ｋｇである：
【請求項１１】
動物由来成分フリーの無血清培養方式により宿主細胞を培養する、請求項１０に記載の新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１２】
水と、配列番号２に示されるアミノ酸の軽鎖および配列番号４に示されるアミノ酸の重鎖を含有し、Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌの末端ガラクトース結合形態およびＮＧＮＡの末端シアル酸修飾を有しない組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体とを含む組成物。
【請求項１３】
関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬を治療するための薬物の製造における、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
関節リウマチを治療するための薬物の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
強直性脊椎炎を治療するための薬物の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
乾癬性関節炎を治療するための薬物の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
斑状乾癬を治療するための薬物の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬を治療するための他の薬物と併用投与することをさらに含む、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
前記他の薬物はメトトレキサートである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に属し、更に具体的には、本発明は新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法及び用途を開示する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）は慢性・対称性多発性関節炎を主な臨床症状とする自己免疫疾患であり、病状は遷延を繰り返す。その臨床的発現は四肢関節の赤み、腫れ、痛みであり、患者の生活の質に深刻な影響を与え、治療が遅れると、普通は２年間以内で関節強直奇形を引き起こし、最後は身体障害を引き起こす。関節滑膜炎症はその主な病的変化であり、四肢関節は最も侵されやすい部位である。その慢性炎症は関節および関節周囲組織に限らず、心、肺、血管などの臓器と組織にも発症する。
【０００３】
関節リウマチは世界的な疾患であり、米国ではこの病気の発症率が１％に近く、年齢に従って発症率も高くなり、３５歳以下の成人の発症率は約０．３％であるが、６５歳以上の者の発症率は１０％を超える。中国ではその発症率がやや低く、約０．３％程度であるが、我が国の基礎人口を考えると、発症する総患者数は依然としてかなり高い（約４百万人が発症する）。
【０００４】
関節リウマチは一般的かつ破壊性の極めて高い慢性関節炎症であり、完治することができず、長期予後が劣ることから、個人・社会の経済・生活コストを大いに増加させる。治療されないままだと、８０％の患者は徐々に運動能力を喪失し、寿命が平均で３〜１８年短縮し、ひとりの患者の毎年の治療費用は、米国では５９１９ドルになり、イギリスでは２６００ポンドになる。現在、臨床において用いられている抗リウマチ薬は、効果があらわれるのが遅く、治療効果が限定的で、副作用が比較的多く、且つ長期予後が劣る。
【０００５】
関節リウマチの治療は、一般的に以下のように分けられる。
薬物治療：
関節リウマチの従来の一般的な治療薬物としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、病状を緩和する抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）、糖質コルチコイド（ＧＣＳ）などがある。
【０００６】
非ステロイド性抗炎症薬は、関節リウマチの治療において最も一般的な薬物であり、効果があらわれるのがが速く、且つ関節リウマチの関節における腫れおよび全身的症状を明らかに緩和できることを特徴とし、ジクロフェナクのような従来のＮＳＡＩＤｓおよびメロキシカム、ナブメトンのようなＣＯＸ−２阻害剤を含む。このタイプの薬物の欠点は、症状を緩和することしかできず、組織・滑膜病理変化の進行を明らかに抑制する作用がないということにある。使用時、副作用の増加を避けるように、２種類の経口投与剤型のＮＳＡＩＤｓを同時に投与しないように注意しなければならない。この種類の薬物は比較的に強い胃腸管副作用を発生させやすい。次世代のＣＯＸ−２阻害剤の長期使用により、心血管イベントが発生する確率は増加する。
【０００７】
病状を緩和する抗リウマチ薬は、関節リウマチを完全に緩和できる薬物であり、効果があらわれるのが遅く、作用が長持ちし、関節リウマチによる滑膜破壊を阻止または緩和できることを特徴とする。一般的には、症状が軽い場合、１種類のＤＭＡＲＤを選択して使用することができるが、比較的に重篤な患者の場合、ＤＭＡＲＤｓの併用投与によって病状を制御し、完全に緩和した後に、減量して或いは１種のＤＭＡＲＤに変えて、治療を続けることが考慮されなければならない。この種類の薬としては、主にメトトレキサート、サラゾスルファピリジン、ペニシラミン、オーラノフィン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドなどがある。
【０００８】
関節リウマチ治療において、糖質コルチコイド類薬物は、本格的な治療によっても依然として緩和できない難治性関節リウマチを適応症として、症状を一時的に緩和するための一時的な治療および関節腔内投与とされる。ホルモン類薬物の長期投与による副作用（高血圧、骨粗鬆症、感染など）は更に厄介である。この種類の薬物としては、主にプレドニゾン、酢酸プレドニゾンなどがある。長期で小投与量のホルモンを服用することによる関節リウマチ療法の得失はまだ結論がでておらず、根拠に基づく医療による適確な証拠がなければ、提唱するのは好ましくない。
【０００９】
薬物を用いる内科的治療は、早期投与、病理変化を緩和する抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）の適正な使用、および個別化治療計画の原則に従う。各種の治療計画および治療ガイドラインは、早期に診断して早期に治療することを強調しながら、治療強度を強化し、なるべく早く病状の進行を制御するように、診断の直後にＤＭＡＲＤｓの併用投与を行おうと提案する。しかしながら、実際の治療中において、一部の患者の関節破壊は依然としてさらに進行する場合があるため、従来の薬物による治療効果はあまり望ましくない。
【００１０】
生物学的製剤：
ＴＮＦ−αおよびインターロイキン−１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１、ＩＬ−１）は、関節リウマチの発症メカニズム中の最も重要サイトカインであり、近年では、ＴＮＦ−αやＩＬ−１などを標的とする生物学的製剤は、より多くの選択肢をＲＡ患者に提供した。この種類の薬物は直接に免疫系内の特定の炎症メディエータを対象とし、これによって炎症の進行を急速に制御することに関与し、痛みや硬直などの症状を著しく緩和できる上に、関節損傷をさらに防止することもできる。海外で既に市販されているこの種類の薬物としては、米国Ｃｅｎｔｏｃｏｒ社によって開発・生産されるインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、商品名「Ｒｅｍｉｃａｄｅ(商標)」）、腫瘍壊死因子受容体−抗体融合タンパク質（エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、商品名「Ｅｎｂｒｅｌ(商標)」、米国Ａｍｇｅｎ社）、および組換え抗ＴＮＦ−α完全ヒト型モノクローナル抗体（アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、商品名「Ｈｕｍｉｒａ(商標)」、米国Ａｂｂｏｔｔ社）がある。中国国内で市販されているものとしても、注射用組換えＩＩ型腫瘍壊死因子受容体−抗体融合タンパク質（商品名「益賽普(登録商標)」、中信国健；商品名「強克」、上海賽金）、西安ヤンセンによって輸入される注射用インフリキシマブモノクローナル抗体（商品名：「類克(登録商標)」）がある。上記の３種類のＴＮＦ−α阻害剤は、リウマチ因子と抗環状シトルリン化ペプチド抗体（ＣＣＰ）の力価を著しく低下することができ、統計によると、この３種類の薬物によるＲＡ治療の総有効率は５０〜７０％である。
【００１１】
上記薬物を除き、ＨＬＡ−ＤＲ４ポリペプチド、ＩＤＥＣ−１３１、ＣＩＩコラーゲンポリペプチド、ＨＬＡ−ＤＲｂ１ワクチンなど、異なった研究段階にある多種の生物学的薬物もあり、それらは全てＲＡを治療する有効薬物として有望視されている。
【００１２】
免疫除去療法：
本格的な内科的治療によっても顕著な効果がなく、血清に高力価の自己抗体がある難治性関節リウマチ患者に対しては、免疫吸着やリンパ球除去などの免疫除去療法を採用することができるが、該方法はＤＭＡＲＤｓとの併用によって初めて病状を長期に緩和できる。該方法は血漿交換、免疫吸着やリンパ球除去などを含む。
【００１３】
外科的手術治療：
手術治療としては、滑膜切除術、関節癒合術、骨切り術および人工関節置換術があり、通常は人工関節置換術と滑膜切除術が常用である。しかし、関節置換術は末期の奇形で且つ正常機能を失った関節に適用する。人工関節の寿命は１５〜２０年であることから、一般的には年齢が５０歳超の患者にしか適用されず、常用の場所は膝、股関節および肩部関節である。手術治療は疾患を完治できず、関節の機能の改善および患者のセルフケア能力の向上しかできない。
【００１４】
他の治療方法：
他の治療方法としては、一般的な治療方法、植物薬による治療、末梢血幹細胞移植、遺伝子治療などの方法がある。
【００１５】
一般的な治療とは、原因療法以外の療法、例えば心理療法、運動療法（回復期）、関節制動、床上安静、理学療法と食事療法などを指す。関節リウマチの予後には重大な影響がある。
【００１６】
植物薬中のシャクヤクの総グルコシドおよびタイワンクロヅルなどの植物製剤は既に関節リウマチの治療に用いられている。
幹細胞移植法は重症・難治性のＲＡに用いられる。遺伝子治療は、スタートが比較的に遅いが、ヒトゲノムプロジェクトの完成につれて、該方法もＲＡの治療において特に有用になる。
【００１７】
従来の研究によって、ＴＮＦ−αが関節リウマチの発症過程において重要な役割を担うことは見出された。ＴＮＦ−αは重要な炎症性サイトカインであり、正常な免疫機能および炎症プロセスを惹起するカスケード反応に重要な役割を担う。関節リウマチ患者の関節滑液には、ＴＮＦ−αおよび他の炎症因子が大量に発現される。ＴＮＦ−αは肝心な炎症因子として、炎症プロセスのカスケード反応におけるその役割および関節リウマチにおけるその可能なメカニズムは、（１）ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどの他の炎症性因子の合成を誘導すること；（２）プロスタグランジンＥ２やロイコトリエンＢ４などの炎症メディエータの生成を刺激すること；（３）Ｅ−セレクチン、血管細胞接着分子および細胞内接着分子のアップレギュレーションにより、白血球を活性化し且つ白血球の炎症部位への浸透を補助すること；（４）好中性顆粒球と線維芽細胞を刺激してコラーゲナーゼとマトリックスメタロプロテアーゼを生成させること；を含む。また、ＴＮＦ−αは細胞アポトーシスを誘導すること、および急性期反応を発生させることができる。従って、ＴＮＦ−αの生成と作用を阻害することで、他のサイトカイン（例えばＩＬ−１）を阻害することに比べて、関節リウマチの進行をより全面的・効果的に抑制できる。
【００１８】
ＴＮＦ−α阻害剤は関節リウマチ治療の新時代を切り開いた。ＴＮＦ−α阻害剤、特に抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体は、効果があらわれるのが速く、治療効果が確実であり、現在で関節リウマチを治療するための最も有効な治療手段である。しかし、最初に調製して得られたものはマウス由来抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体であり、ＴＮＦ−αの中和による関節リウマチの治療に用いられた。しかし、研究によって、マウス由来モノクローナル抗体は治療薬物として多くの欠陥が存在し、マウス由来モノクローナル抗体は人体に適用されると、強烈な免疫原性を有し、生体内で速く除去され、半減期が短く、それにより臨床での治療効果が限定的で、副作用が大きいことが見出された。ヒト化モノクローナル抗体技術は、マウス由来抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の欠陥を一部克服した。ただし、ヒト・マウスキメラ抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ＲｅｍｉｃａｄｅR）は、遺伝子工学の上流の構築技術で調製したものであり、その可変領域は依然としてマウス由来抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体から取られたものであって、腫瘍壊死因子の可溶性断片および膜貫通領域との結合の特異性および親和性（Ｋａ＝１０10Ｍ-1）を残したと共に、その定常領域はヒトＩｇＧ1の定常領域に置換されたもので、インビボ半減期は大きく延長した。
【００１９】
インフリキシマブは可溶な膜貫通型ＴＮＦ−αと高親和性に結合することにより、ＴＮＦ−αの生物学的活性を中和し、ＴＮＦ−αとその受容体の結合を遮断する。それと共に、インフリキシマブは抗体依存性細胞傷害作用および補体依存性細胞傷害作用により、さらにＴＮＦ−α発現細胞を殺す。しかし、インフリキシマブはＴＮＦ−αと同一の受容体を共用するサイトカインであるＴＮＦβ（リンホトキシンともいう）の作用を中和しない。
【００２０】
Ｒｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)はヒトＴＮＦ−αをターゲットとするヒト・マウスキメラモノクローナル抗体であり、マウス由来の可変領域とヒト由来の定常領域（ＩｇＧ1）を含み、ヒトＴＮＦ−αと特異的に結合し（親和定数１０10Ｍ-1）、分子量が１４９ＫＤａであり、静脈内注入用の無菌で白色の凍結乾燥粉末注射剤として、１瓶につき１００ミリグラムのインフリキシマブ、５００ミリグラムのショ糖、０．５ミリグラムのポリソルベート８０、２．２ミリグラムのリン酸二水素ナトリウムおよび６．１ミリグラムのリン酸水素二ナトリウムを含有し、防腐剤を含有しない。使用前に、１０ミリリットルのＵＳＰ無菌注射用水で溶解し、ｐＨを７．２とし、再び生理食塩水で希釈した後、静脈内点滴する。Ｒｅｍｉｃａｄｅは１９９８年８月２４日に米国ＦＤＡによって初めて市販を許可され、中等度・重度の活動性クローン病および瘻孔クローン病の治療に用いられた。その後、また欧州連合で市販を認可れ、且つ関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬性関節炎、斑状乾癬、潰瘍性大腸炎および６歳以上の児童の潰瘍性大腸炎を含む新しい適応症について次々と認可された。該抗体は遺伝子組換え技術および哺乳動物細胞連続灌流培養技術によって生産される組換えタンパク質である。
【００２１】
グリコシル化修飾は細胞発現系およびサブクローンの選択に高度に依存し、細胞培養過程における多くの要素（例えば培地の成分、培養条件）はいずれもグリコシル化に影響し、ひいては治療用タンパク質の生物学的活性、治療効果、免疫原性および薬物動態に影響する(Efren Pacis, Marcella Yu, Jennifer Autsen, et al. Effects of Cell Culture Conditions on Antibody N - linked Glycosylation - What Affects High Mannose 5 Glycoform. Biotechnology and Bio engineering, 2011; 108 (10):2348-2358; Patrick Hossler, Sarwat F Khattak, Zheng Jian. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology, 2009; 19 (9), 936-949; Hodoniczky J, Zheng YZ, James DC. Control of recombinant monoclonal antibody effector functions by Fc N-glycan remodeling in vitro. Biotechnol Prog, 2005; 21 (6):1644-1652)。
【００２２】
現在で市販されている治療用モノクローナル抗体のうち、ほとんどはＤＮＡ組換え技術によって実現されるものであり、ほとんどはインビトロ細胞培養技術によるものである(Goldenberg MM. Trastuzumab, a recombinant DNA-derived humanized monoclonal antibody, a novel agent for the treatment of metastatic breast cancer. Clin Ther, 1999; 21 (2):309-18; Mariel Donzeau, Achim Knappik. Recombinant Monoclonal Antibodies. Methods in Molecular Biology, 2007; 378:15-31)。哺乳動物細胞の構造、機能および遺伝子発現調節の複雑性により、哺乳動物細胞中における外来遺伝子の発現は原核生物中における発現と大きく異なることから、哺乳動物細胞中における外来遺伝子の高効率発現に必要な要素も、原核生物細胞中における発現に必要なものと異なっている。哺乳動物細胞中における外来遺伝子の発現は、遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳および翻訳後修飾などの過程を含み、翻訳後修飾は、主にタンパク質のグリコシル化、リン酸化、オリゴマーの形成およびタンパク質分子内または分子間のジスルフィド結合の形成を含み、タンパク質の機能にとって非常に重要であり、生物学的機能を有するタンパク質（例えば膜タンパク質、抗体、および特異的触媒機能を有する酵素）の発現は、哺乳動物細胞中で行わなければならない場合もある。ＣＨＯ細胞およびマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０、ＳＰ２／０）における発現系は、現在治療に用いられている抗体およびＦｃ融合タンパク質の至適基準である工学的哺乳動物細胞になっている(Alain Beck, Elsa Wagner-Rousset, Marie-Claire Bussat. Trends in Glycosylation, Glycoanalysis and Glycoengineering of Therapeutic Antibodies and Fc - Fusion Proteins. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2008; 9 (6):482-501)。ポリペプチド鎖の完全性は異なる発現系および培養条件の下においては変化しないように見えるが、グリコシル化タイプの重大な変更は無視できない。
【００２３】
過敏性反応が発生したほとんどの患者の血清には、α−Ｇａｌに特異的な薬物特異的ＩｇＥ抗体が存在する。 更なる研究によって、マウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０を含む）は余分のα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを含有し、主にα配座のＵＤＰ−Ｇａｌから末端ガラクトシル残基へのガラクトシル残基の転移を仲介し、ひいてはα−Ｇａｌを生成させることは見出された。α−Ｇａｌは好ましくない非ヒト型二糖であり、一部のｍＡｂ、特にマウス由来の細胞株において発現されるｍＡｂの多糖に存在している（Galili U. The alpha-gal epitope (Gal alpha 1-3 Gal beta 1-4GlcNAc-R) in xenotransplantation. Biochimie, 2001; 83 (7):557-563；Dor FJ, Alt A, Cooper DK. Gal alpha 1,3 Gal expression on porcine pancreatic islets, testis, spleen, and thymus. Xenotransplantation, 2004; 11 (1):101-106；  Magnusson S, Mansson JE, Strokan V, et al. Release of pig leukocytes during pig kidney perfusion and characterization of pig lymphocyte carbohydrate xenoantigens.）。一部の患者の生体内には高レベルの抗α−Ｇａｌ  ＩｇＥ抗体が存在しており、多糖中にα−Ｇａｌ単位が含有されるｍＡｂを用いて治療すると、重篤な過敏性反応が発生してしまう。また、マウス由来の細胞系（ＳＰ２／０を含む）におけるグリコシル化は、ヒトＩｇＧにおけるグリコシル化との相違点として、α−Ｇａｌエピトープを生成するタンパク質生物合成メカニズムを有するが（Larsen RD, Rajan VP, Ruff MM, et al. Isolation of a cDNA encoding a murine UDP galactose: beta-D-galactosyl- 1,4-N-acetyl-D-glucosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase: expression cloning by gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989; 86 (21):8227-8231；Sheeley DM, Merrill BM, Taylor LC. Characterization of monoclonal antibody glycosylation: comparison of expression systems and identification of terminal alpha-linked galactose. Anal Biochem, 1997; 247 (1):102-110）、その一方で、マウス由来の細胞系（ＳＰ２／０を含む）はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）ではなく、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を生成する。ＮＧＮＡとＮＡＮＡの違いは、ＮＧＮＡが余分の酸素原子を１つ有することにあり、且つ糖タンパク質中にＮＧＮＡ残基を含有すると、人体内におけるその免疫原性に密接に関わっていると考えられる(T. Shantha Raju. Glycosylation Variations with Expression Systems and Their Impact on Biological Activity of Therapeutic Immunoglobulins; BioProcess International APRIL 2003： 44-53).。一部の市販されている治療用糖タンパク質はＮＧＮＡ残基を含有するので、患者の生体内で重篤な副作用を引き起こす。
【００２４】
Ｒｅｍｉｃａｄｅは１９９８年に米国で市販されてから、常に生物抗体類薬物の旗頭であり、販売額４０億ドル超の"スーパー大ヒット"レベルの薬物である。２０１３年、全世界で最も売れる薬物のうち、Ｒｅｍｉｃａｄｅは第三位であり、販売額が８０億ドルを超えた。Ｒｅｍｉｃａｄｅに用いられる宿主細胞は、マウス骨髄腫細胞系であって、レトロウイルス粒子が分泌されると知られているＳＰ２／０細胞である。該製品の市販が早かったので、開発者のＣｅｎｔｏｃｏｒ社はまだ無血清培養技術を築いておらず、該薬品の生産過程においてウシ血清の添加が必要な培地を使用した。Ｒｅｍｉｃａｄｅは十数年間の使用において良好な治療効果と耐性を示し、全世界で該抗体が適用された患者は合計で１００万人を超えたが、従来のＤＭＡＲＤｓよりも重篤な副作用が見られなかった。しかし、ＳＰ２／０細胞におけるレトロウイルスの明確な存在、および生産過程におけるウシ血清の使用により、該製品にはウイルスによる汚染のリスクが常に存在している。また、ＳＰ２／０宿主細胞では、抗体の翻訳後修飾過程において、主に（ＮＧＮＡ、Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌ）および高比率の高マンノース修飾などを含む多種の非ヒト型グリコシル化修飾が発生し、使用中で免疫原性をもたらす恐れがある。
【００２５】
発明の内容
本発明は上記課題を解決し、ウイルスによる汚染のリスクを低下させ、免疫原性を低減させるために、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法を提供して、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体ＣＭＡＢ００８を獲得した。該抗体は市販されている同類の薬物に似ている生物活性を有し、且つ本発明の製品ＣＭＡＢ００８は、高マンノース型の割合が低く、Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌの末端ガラクトース結合形態が見られず、ＮＧＮＡの末端シアル酸修飾が見られず、使用過程において免疫原性を低減させることができ；本発明において、ウイルスによる汚染のリスクを低下させるように、動物由来成分フリーの無血清培地で培養する。
【００２６】
本発明によれば、
１．下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【００２７】
ａ）新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する軽鎖と、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する重鎖とを含有させる；
ｂ）工程ａ）で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする；
ｃ）培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する。
【００２８】
２．ハムスターに最適化したコドンに基づいて、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖を設計・合成することを特徴とする、前記新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【００２９】
３．新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の核酸分子と、前記核酸分子の配列に作動可能に連結される発現調節配列とを含むベクターであって、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲの中の１つであってもよいベクター。
【００３０】
４．ｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）である前記ベクター。
５．前記宿主細胞は真核哺乳動物細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-であることを特徴とする、前記新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【００３１】
６．動物由来成分なしの動物由来成分フリーの無血清培養方式により宿主細胞を培養することを特徴とする、前記新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
【００３２】
７．前記新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
８．前記新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
【００３３】
９．前記組成物の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
１０．関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物と併用投与することをさらに含む、前記のいずれかの使用。
【００３４】
１１．下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
ａ）新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる；
ｂ）工程ａ）で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする；
ｃ）培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する；
ただし、細胞培養のｐＨは：６．５〜７．０で、最も好ましくはｐＨ６．７である；細胞培養の温度は：３４℃〜３７℃で、最も好ましくは３５℃である；細胞培養の浸透圧は：２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇで、最も好ましい浸透圧は３４５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００３５】
１２．水と、配列番号２に示されるアミノ酸の軽鎖および配列番号４に示されるアミノ酸の重鎖を含有し、Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌの末端ガラクトース結合形態およびＮＧＮＡの末端シアル酸修飾を有しない組換え抗ＴＮＦ−αキメラモノクローナル抗体とを含む組成物。
【００３６】
１３．前記組成物の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
１４．関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物、例えば非ステロイド性抗炎症薬、病状を緩和する抗リウマチ薬、糖質コルチコイドなどと併用投与することをさらに含む、前記使用。
【００３７】
１５．前記の併用投与する薬物はメトトレキサートである、前記使用。
が開示される。
【００３８】
本発明はＣＨＯ細胞を抗体の発現細胞とし、ＣＨＯ細胞におけるグリコシル化のメカニズムはヒトのＩｇＧのグリコシル化メカニズムと非常に似ている。早期の研究によると、ＣＨＯ細胞にはα−Ｇａｌエピトープ含有糖蛋白質を合成する生物合成メカニズムが欠けていると考えられていた（Sheeley DM, Merrill BM, Taylor LC. Characterization of monoclonal antibody glycosylation: comparison of expression systems and identification of terminal alpha-linked galactose. Anal Biochem, 1997; 247 (1):102-110 .   Jenkins N, Parekh RB, James DC. Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol, 1996;14 (8):975-981. Spellman MW, Leonard CK, Basa LJ, et al. Carbohydrate structures of recombinant soluble human CD4 expressed in Chinese hamster ovary cells. Biochemistry, 1991; 30 (9):2395-2406. Kagawa Y, et al. Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem, 1988; 263 (33):17508-17515）。最近の研究により、ＣＨＯ細胞にはα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が存在するが、この遺伝子はクローンのスクリーニング過程において無発現または低発現の状態にあることが報告された(Carlos J Bosques, Brian E Collins, James W Meador III. Chinese hamster ovary cells can produce galactose-α-1,3-galactose antigens on proteins. Nature Biotechnology, 2010; 28 (11):1153-1156)。よって、ＣＨＯ細胞で発現される抗体は通常、α−Ｇａｌのグリコシルを含有しない。本発明はハムスターに最適化したコドンに基づいて、ＣＭＡＢ００８抗体の軽鎖と重鎖を設計・合成し、真核細胞高効率発現ベクターに連結し、軽鎖と重鎖の真核発現ベクターを得る。本発明はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によりＣＨＯ−Ｋ１のＧＳ遺伝子をノックアウトし、得られる細胞系をＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-と名づけて、内因性ＧＳの発現をなくし、高発現細胞クローンのスクリーニングにとってより有利になる。ＣＭＡＢ００８遺伝子を含有する発現ベクターをＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする。
【００３９】
本発明はＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-に対する汎用基本培地を開発し、培地のタイプは化学成分限定的（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ、ＣＤ）培地、即ち細胞成長の需要に応じて一定の比率でアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースと微量元素などを組み合わせてなる基本培地である。基本培地はスクリーニングで得られる工学的細胞の成長の需要を基本的に満たすことができるが、工学的細胞の目的抗体の生成量をさらに高めるために、基本培地に対して、ホルモンや遺伝子工学組換え増殖因子の添加、アミノ酸の量の調整を含む最適化調整を行った。比較と最適化を繰り返したことにより、一つの好ましい実施例において、ＣＭＡＢ００８抗体工学的細胞の大規模培養に適切な動物由来成分フリーの無血清培地（ＣＨＯＭ−Ｂ０８）と補足培地（ＣＨＯＭ−Ｓ０８）が決定され、工学的細胞は最適化した培地中で、発現量が３０ｐｇ／ｃｅｌｌ．ｄａｙを超え、流加（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養法を利用して、２週間の培養周期で採取した培養物上清中において、目的抗体の生成量は３ｇ／Ｌ以上になった。該方法で生成するＣＭＡＢ００８抗体のグリコシル化修飾は、比較的少ない高マンノース型を含有し、Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌの末端ガラクトース結合形態およびＮＧＮＡの末端シアル酸修飾などの非ヒト型グリコシル化修飾を有しない。インビトロとインビボの実験により、ＣＭＡＢ００８は、生物学的活性がＲｅｍｉｃａｄｅと顕著には相違しないが、安全性と免疫原性が顕著に低減したことは検証された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＣＭＡＢ００８抗体の分離精製の結果。
【図２】ＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-工学的細胞の電子顕微鏡像であり、ウイルス粒子はない。
【図３】ＳＰ２／０細胞の電子顕微鏡像であり、ここで矢印で示すのはウイルス粒子である。
【図４】ＣＭＡＢ００８オリゴ糖の２−ＡＢ標識後の蛍光スペクトル（糖型構造は一段質量分析の質量数で同定する）。
【図５】Ｒｅｍｉｃａｄｅオリゴ糖の２−ＡＢ標識後の蛍光スペクトル（糖型構造は一段質量分析の質量数で同定する）検出から分かるように、赤い円で標記されるように、Ｒｅｍｉｃａｄｅは多種の糖型を含有すると共に、高レベルのヘテロ糖型および免疫原性のある糖型を含有し、最後の赤い円の糖型はＮＧＮＡおよびＧａｌ−α−Ｇａｌ含有糖型である。
【図６】ＣＭＡＢ００８とＲｅｍｉｃａｄｅの生物活性の比較結果図。
【図７】ＣＭＡＢ００８とＲｅｍｉｃａｄｅのＥＬＩＳＡ検出結果図。
【図８】Ｒｅｍｉｃａｄｅ群生存曲線図  Ｒｅｍｉｃａｄｅを５００μｇ／匹で注射してから７２時間後でｒｈ−ＴＮＦα−および１８ｍｇのＤ（＋）−ガラクトサミンを腹腔内注射する；１群：２０μｇ／匹；２群：１０μｇ／匹；３群：５μｇ／匹；４群：２．５μｇ／匹；５群：１．２５μｇ／匹；６群：賦形剤対照。
【図９】ＣＭＡＢ００８群生存曲線図  Ｒｅｍｉｃａｄｅを５００ｇ／匹で注射してから７２時間後でｒｈ−ＴＮＦα−および１８ｍｇのＤ（＋）−ガラクトサミンを腹腔内注射する；１群：２０μｇ／匹；２群：１０μｇ／匹；３群：５μｇ／匹；４群：２．５μｇ／匹；５群：１．２５μｇ／匹；６群：賦形剤対照。
【実施例】
【００４１】
実施例１、ＣＭＡＢ００８ベクターの構築
用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞発現系で、より高効率の発現が得られるように、ハムスターに最適化したコドンを選択して真核生物高効率発現ベクターを構築した。ハムスター最適化コドンは表１に示す。
【００４２】
【表１−Ａ】
0006514789.tif 000002
【００４３】
【表１−Ｂ】
0006514789.tif 000003
【００４４】
シグナルペプチド：チャイニーズハムスターＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質β鎖由来のシグナルペプチドを選択した。アミノ酸配列：MATMVPSSVPCHWLLFLLLLFSGSS、ヌクレオチド配列：ATG GCC ACC ATG GTG CCC TCT TCT GTG CCC TGC CAC TGG CTG CTG TTC CTG CTG CTG CTG TTC TCT GGC TCT TCT。該シグナルペプチドは抗体の分泌発現をよりうまく実現できる。
【００４５】
ハムスターに最適化したコドンに基づいて設計・合成したＣＭＡＢ００８軽鎖配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＭＡＢ００８重鎖配列は、配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のアミノ酸配列を有する。上記軽鎖と重鎖を真核細胞高効率発現ベクターに連結し、軽鎖と重鎖の真核発現ベクターを得た。
【００４６】
実施例２、宿主細胞の選択と改変
生物製薬分野において、宿主細胞の選択には、以下のいくつかの重要な方面に注目する必要がある：グリコシル化および他の翻訳後修飾のタイプは免疫原性をもたらすことを避けられること；宿主細胞はバイオリアクターでの大規模培養に適し、且つ動物由来成分フリーの化学成分限定的（chemically defined and animal component free、ACDF）培地中で高密度まで成長できること；ウイルス安全性；ＡＣＤＦ中で行われるクローニングおよびストレススクリーニングに適すること。
【００４７】
既にＦＤＡ、ＥＭＡの承認をもらった治療用モノクローナル抗体の多くは、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を選択したが、他の一部は例えばＮＳ０やＳＰ２／０−Ａｇ１４のようなマウス骨髄腫細胞系を選択した。ＦＤＡの報告によると（]Erik K R,Jun T P,Kurt A B.Division of Monoclonal Antibodies.This article is a U.S.Govern ment work and is in the public domain of the USA,2011,5(4):213-219）、マウス骨髄腫細胞系（ＮＳ０とＳＰ２／０）において発現する抗体の糖型には４〜６％のａ（１−３）ガラクトースが含有されるのに対し、人体の血液循環系にはａ（１−３）ガラクトースに対する抗体が１％あることから、該糖鎖構造を持つ抗体は免疫過敏性反応を引き起こしやすい。（alili U, Anaraki F,Thall A, et al.One percent of human circulating B lymphoc ytes are capable of producing the natural anti-gal antibody. Blood,1993,82(8): 2485-2493.）。従来の研究により、ＥＧＦＲキメラ抗体セツキシマブによる治療中に起きる過敏性反応が、抗αガラクトースのＩｇＥによって仲介されるものであることは検証された(Chung CH, Mirakhur B, Chan E, et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. N Engl J Med, 2008; 358 (11):1109-1117)。一方、マウス由来の細胞系（ＮＳ０とＳＰ２／０）はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）ではなく、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を生成する。ＮＧＮＡとＮＡＮＡの区別は、ＮＧＮＡが余分の酸素原子を１つ有することにあり、且つ糖タンパク質中にＮＧＮＡ残基を含有すると、人体内におけるその免疫原性に密接に関与すると考えられる。一部の市販されている治療用糖タンパク質はＮＧＮＡ残基を含有するので、患者の生体内で重篤な副作用を引き起こす（O'Neil BH, Allen R, Spigel DR, et al. High incidence of cetuximab-related infusion reactions in Tennessee and NorthCarolina; association with atopic history. J Clin Oncol, 2007; 25 (24):3644-3648）。上記のＣＨＯ細胞とマウス骨髄腫細胞系（ＮＳ０とＳＰ２／０）はグリコシル化修飾の点で相違するからこそ、ＣＨＯ細胞をＣＭＡＢ００８の発現宿主として選択した。
【００４８】
産業上で最も一般的に使用されるのＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１およびＣＨＯ−ＤＧ４４である。ＣＨＯ−Ｋ１は初代ＣＨＯに似ているが、ＤＸＢ１１とＤＧ４４はランダム突然変異を経ってＤＨＦＲ遺伝子が欠失しているため、代謝欠陥標識によって遺伝子増幅をすることができる。ＣＨＯ−Ｋ１はＧＳスクリーニングシステムを利用するが、ＧＳはＣＨＯ−Ｋ１中に内因性発現があるので、スクリーニングの効率は低下する。本発明はＣＨＯ−Ｋ１を適切に改変した。われわれはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によりＣＨＯ−Ｋ１のＧＳ遺伝子をノックアウトし、得られる細胞系をＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-と名づけて、内因性ＧＳの発現をなくすことで、高発現細胞クローンのスクリーニングにとってより有益なものになった。
【００４９】
実施例３、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする
リポソーム法でＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-をコトランスフェクトし、ＧＳスクリーニングシステムでストレススクリーニングし、抗ＴＮＦ−αキメラ抗体を高効率で発現する安定な細胞クローンを得た。複数回のトランスフェクションおよびスクリーニングにより、発現量が３０ｐｇ／ｃｅｌｌ．ｄａｙを超える細胞クローンを得た。
【００５０】
実施例４、動物由来成分フリーの無血清培地への適応および培地の最適化
われわれはＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-細胞株に対する汎用基本培地に基づき、ＣＭＡＢ００８を高効率で発現させるための特殊培地を開発した。基本培地のタイプは動物由来成分フリーの化学成分限定的（chemically defined and animal component free、ＡＣＤＦ）培地、即ち細胞成長の需要に応じて一定の比率でアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースと微量元素などを組み合わせてなる基本培地である。基本培地はスクリーニングで得られる工学的細胞の成長の需要を基本的に満たすことができるが、抗体のグリコシル化修飾のタイプと度合いを制御すると共に、工学的細胞の目的抗体の生成量をさらに高めるために、基本培地に対して、ホルモンや遺伝子工学組換え増殖因子の添加、アミノ酸の仕込み比率の調整を含む最適化調整を行ったところ、最終に抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体工学的細胞の動物由来成分フリーの無血清大規模培養に適切な特殊培地（ＣＨＯＭ−Ｂ０８）および特殊補足培地（ＣＨＯＭ−Ｓ０８）の配合を得た。ＣＭＡＢ００８工学的細胞株の大規模培養条件について、培養ｐＨ、温度および浸透圧などの面で調査したところ、最終に５００Ｌ発酵体積で高発現発酵条件を以下のように決定した：培養ｐＨは：６．５〜７．０で、最も好ましくはｐＨ６．７である；培養温度は：３４℃〜３７℃で、最も好ましくは３５℃である；浸透圧は：２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇで、最も好ましい浸透圧は３４５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００５１】
ＣＭＡＢ００８を発現するＣＨＯ工学的細胞株は最適化した特殊培地中で、発現量が３０ｐｇ／ｃｅｌｌ．ｄａｙを超え、流加（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養法を利用して、２週間の培養周期で収穫する培養上清中で、目的抗体の生成量は３ｇ／Ｌ以上になった。
【００５２】
実施例５、ＣＭＡＢ００８抗体の分離精製
スクリーニングされた高発現クローンを動物由来成分フリーの無血清培地で増幅培養し、上澄を収集し、９０００ｒｐｍ×２０ｍｉｎ、４℃で遠心し、沈殿した細胞と破片を捨てた；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の５０ＫＤ限外濾過カセットで限外濾過濃縮を行った後、さらに９０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、細胞破片を除去した；０．４５μｍ濾過膜で濾過し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（組換えタンパク質Ａ）アフィニティークロマトグラフィーで予備精製を行った；同所洗浄緩衝液は６Ｍ  ＧｕＣｌで、カラム用結合緩衝液は２０ｍＭ  ＰＢ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０であった；カラム体積の３〜５倍量で平衡化した後、カラム体積の３〜５倍量の溶出緩衝液２０ｍＭ  Ｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ（クエン酸緩衝液）  ｐＨ３．０で溶出し、高純度の目的タンパク質ＣＭＡＢ００８を収集して獲得し、そのアフィニティークロマトグラフィースペクトルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は図１に示す。
【００５３】
獲得した目的タンパク質に対して、Ｈｉｔｒａｐ  Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩、緩衝液交換を行い、カラム溶出緩衝液をＰＢＳ（２０ｍＭＰＢ＋１５０ｍＭＮａＣｌ  ｐＨ７．０）とし、in situ洗浄液を０．５Ｍ  ＮａＯＨとした。以上の精製ステップは全て氷上で行い、精製で得られたＣＭＡＢ００８を５０ＫＤ限外濾過遠心チューブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、最終に紫外線吸収法により２８０ｎｍ  ＯＤ値を測定して定量し、ＣＭＡＢ００８の紫外線に対するＯＤ２８０吸収係数は１．３５であることから、測定したＯＤ値を１．３５で割ることで、その濃度が得られた（ｍｇ／ｍｌ）。
【００５４】
実験例１、工学的細胞の透過型電子顕微鏡像
結果から分かるように、該製品の製造に用いられるＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-工学的細胞にはレトロウイルス粒子が見られなかった（図２）が、対照コントロールであるＳＰ２／０細胞にはレトロウイルス粒子が明らかに見られた（図３）。これは、ＳＰ２／０細胞で発現されるＲｅｍｉｃａｄｅがウイルスによって汚染されるリスクは、ＣＨＯで発現されるＣＭＡＢ００８よりも高いことを表す。
【００５５】
実験例２、ＣＭＡＢ００８抗体のグリコシル化解析
ＣＨＯで発現されるＣＭＡＢ００８とＳＰ２／０で発現されるＲｅｍｉｃａｄｅのグリコシル化修飾後のグリコシル化のタイプ、部位、度合いの相違を比較するために、ＨＰＬＣ／ＭＳ方法によりそれらのグリコシル化修飾状態を検出した。具体的な方法は以下の通りであった： ｐＨ：８．０、濃度５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3で抗体サンプルを溶解させ、且つ分注した組換えグリコシダーゼと混合し、１００ｕｌの反応系を設計し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００５６】
２−ＡＢ蛍光標識オリゴ糖の調製：
【００５７】
【表２】
0006514789.tif 000004
【００５８】
検出カラムとしてＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ３００  Ａｍｉｄｅ  １．７ｍ  ２．１×１００ｍｍを採用し、蛍光検出器で検出し、ＬＣ−ＭＳ質量分析で糖型を確認し、結果は図４、図５に示す。図５において、赤い円で標記されるのは、ヘテロ糖型および免疫原性のある糖型であり、最後の赤い円の糖型はＮＧＮＡおよびＧａｌ−α−Ｇａｌ含有糖型である。
【００５９】
検出結果から分かるように、高マンノース型について、ＣＭＡＢ００８における高マンノース型の割合が低かった；ＣＭＡＢ００８にはＧａｌ−α１，３−Ｇａｌの末端ガラクトース結合形態が見られなかった；ＣＭＡＢ００８にはＮＧＮＡの末端シアル酸修飾が見られなかった。
【００６０】
ＣＭＡＢ００８産物の糖型数量および糖型構造はＣＨＯ細胞産物の表現に一致し、Ｒｅｍｉｃａｄｅと大いに異なった。Ｒｅｍｉｃａｄｅには、多くのヘテロ糖型およびＮＧＮＡ含有糖型が含有された。その相対比は５％を超え、フコシル化のヘテロ糖型の割合は２％に近かったと共に，ＮＧＮＡおよびＧａｌ−α−Ｇａｌ修飾を有する糖型は１％を超えた。これらの非ヒト型糖型には免疫原性をもたらすリスクがある。（Biotechnology and Genetic Engineering Reviews - Vol. 28, 147-176 (2012)）。
【００６１】
Ｒｍｉｃａｄｅは高レベルのヘテロ糖型および免疫原性のある糖型を含有するが、ＣＭＡＢ００８はこれらの糖型を含有しないことから、それが良好な細胞半減期および低い免疫原性を有すると推測され（臨床試験から分かるように、ＣＭＡＢ００８の局所輸液反応は、報告されたＲｅｍｉｃａｄｅの輸液反応よりも遥かに小さかった、具体的には実験例７を参照する）、この点は選択される細胞の起源並びに最適化された培養条件および培地のいずれにも密接に関わっている。
【００６２】
実験例３、親和力解析
ＣＨＯで発現されるＣＭＡＢ００８とＳＰ２／０で発現されるＲｅｍｉｃａｄｅの結合活性の相違を比較するために、バイオレイヤー干渉技術（ＢＬＩ）により、Ｏｃｔｅｔ生体分子間相互作用ワークステーション（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  米国）でＣＭＡＢ００８とＲｅｍｉｃａｄｅの親和定数を測定して比較した。ＴＮＦ−αはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入し（カタログ番号：２１０−Ｔ／ＣＦ）、タンパク質センサーはサンプル希釈液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍＭリン酸塩緩衝液、０．０５％アジ化ナトリウム）中で少なくとも５分間水和した。全てのサンプルは緩衝液で希釈した：ＲｅｍｉｃａｄｅおよびＣＭＡＢ００８モノクローナル抗体は１０μｇに希釈した。ＴＮＦ−αはサンプル希釈液で所要の濃度に希釈した。
【００６３】
実験は以下の通りに設定した：サンプル希釈液で５分間（ベースラインとし）、ＲｅｍｉｃａｄｅまたはＣＭＡＢ００８モノクローナル抗体溶液で６０分間（ローディングし）、サンプル希釈液で１０分間（洗浄し）、サンプル希釈液で１０分間（洗浄し）、サンプル希釈液で１５分間（ベースラインとし）、ＴＮＦ−α溶液で４０分間（結合し）、並びにサンプル希釈液で６０分間緩衝した（分離した）。結果をｆｏｒｔｅｂｉｏ解析プログラムで解析・計算して得られたＣＭＡＢ００８の親和定数は２．０３Ｅ−１０であるが、Ｒｅｍｉｃａｄｅの親和定数は２．３３Ｅ−１０であり、両者には有意な差がなかった。具体的な測定結果は下表２、表３に示す。
【００６４】
【表３】
0006514789.tif 000005
【００６５】
【表４】
0006514789.tif 000006
【００６６】
実験例４、Ｌ９２９細胞の生物活性解析
ＣＨＯにおいて発現されるＣＭＡＢ００８とＳＰ２／０において発現されるＲｅｍｉｃａｄｅのＴＮＦ−αに対する中和活性の相違を比較するために、ＴＮＦ−αによるＬ９２９殺傷実験により、異なるＴＮＦ−α抗体のＴＮＦ−αに対する中和作用を測定した。具体的な方法は以下の通りであった：
（１）対数増殖期のＬ９２９細胞を取り、トリプシンで消化し、カウントし、１回の検出につき（１枚の９６ウェルプレートにつき）約２×１０6個の細胞を取り、遠心して上澄を捨て、培養液Ｂを加えて細胞密度を１．５×１０5／ｍｌに調整し、０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、一晩（１８〜２４ｈ）培養した。９６ウェルプレートの外周のウェルを使わないように注意するが、これらのウェルには無菌水を入れる（マルチウェルプレートのエッジ効果を防止するため）。
【００６７】
（２）翌日、１２ｍＬの培養液Ｃで０．４８ｍｌのダクチノマイシンＤ母液を最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるまで希釈し、その２ｍｌを対照用として取り（培養液Ｄ）、残りの１０ｍｌに２．４５μｌのｒｈ  ＴＮＦ−α母液を濃度が４．９ｎｇ／ｍｌになるまで加えた（培養液Ｅ）。
【００６８】
（３）Ｒｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)を取り、培養液Ｅで段階的に１０００ｎｇ／ｍｌに希釈した。
（４）ＣＭＡＢ００８を培養液Ｅで段階的に１０００ｎｇ／ｍｌに希釈した。
【００６９】
（５）１０個の１．５ｍｌ無菌遠心チューブ中でそれぞれ培養液Ｅで標準品またはサンプルの希釈液を連続で段階希釈した（即ち、希釈後、全てのチューブには同じ濃度のＴＮＦ−αとダクチノマイシンＤが含有されるが、ＴＮＦモノクローナル抗体の濃度が異なった）。（計算時、次のステップで同体積の培養液を含むウェルに入れられるので、実際の希釈度は今の希釈度の２倍になることを注意すべきである）。
【００７０】
（６）前のステップの全ての遠心チューブ内の希釈液を十分に均一に混合し、１０，０００ｒｐｍで３０秒遠心し、液体をチューブ底部に集中させた。
（７）培養液Ｅと培養液Ｄをそれぞれ陰性対照と陽性対照とした（培養液Ｄが入れたウェルでは、細胞がＴＮＦによって殺傷されない；培養液Ｅが入れたウェルでは、細胞が最大限で殺傷される）。
【００７１】
（８）Ｌ９２９細胞を接種した９６ウェルプレート中に、希釈されたサンプル又は輸入対照品を０．１ｍｌ／ウェルで入れ、或いは陰性、陽性対照用培養液を入れた。１つの点につき２個の重複ウェルを設けた。５％ＣＯ2、３７℃のインキュベーターに置いて培養した。
【００７２】
（９）９６ウェルプレートをインキュベーターで１４〜１６ｈ連続にインキュベートし、新しく調製した２０：１で混合されたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液をウェルに入れ（２０μｌ／ウェル）、さらにインキュベーターで１〜４時間連続にインキュベートし、マイクロプレートリーダーでそのＡ４９０〜Ａ６３０値を測定した。
【００７３】
（１０）ロジスティック回帰：横座標は標準品濃度で、縦座標は吸光度値の平均数（Ａ４９０〜Ａ６３０）である。
回帰方程式：Y = (A-B)/[1+(X/C)D] + B
該方程式により、Ｃの数値は半数効果濃度（ＥＤ５０）である。
【００７４】
相対中和活性 (％)=標準品ED50(ng/mL)/試験サンプルED50(ng/mL)*100％
三回のインビトロ中和実験の結果は表４に示す：
【００７５】
【表５】
0006514789.tif 000007
【００７６】
そのうち、１回目のインビトロ中和実験の結果は表５に示す：
【００７７】
【表６】
0006514789.tif 000008
【００７８】
その回帰曲線の結果は図６に示す。
結論：インビトロ中和実験の結果から分かるように、Ｒｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)とＣＭＡＢ００８の両者は、ＴＮＦ−αとダクチノマイシンＤのＬ９２９細胞に対する殺傷を中和する半数効果濃度がそれぞれ１７．３２ｎｇ／ｍｌと１６．５７ｎｇ／ｍｌであり、統計学的な差はない。
【００７９】
実験例５、競合ＥＬＩＳＡ検出による生物活性解析
競合法によりＣＭＡＢ００８の相対的な親和力を測定し、文献で報告されているＲｅｍｉｃａｄｅの親和定数および親和定数の計算方法に基づき、ＣＭＡＢ００８の親和定数を算出し、且つＲｅｍｉｃａｄｅと比較した。具体的な実験方法は以下の通りであった。
【００８０】
（１）ＰＢＳでＴＮＦ−αを０．１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れた。
（２）３７℃で２時間コーティングした。
【００８１】
（３）ウェル中の液を捨て、ＰＢＳＴで３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた。
（４）ＰＢＳでウシ血清アルブミンを３％に希釈し、満水になるまでＥＬＩＳＡプレートに入れた。
【００８２】
（５）３７℃で２時間ブロッキングした。
（６）ウェル中の液を捨て、ＰＢＳＴで３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた。
【００８３】
（７）ＰＢＳでＨＲＰ標記ＣＭＡＢ００８を０．３４μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳでＲｅｍｉｃａｄｅを１０μｇ／ｍｌに希釈し、さらに両者を同体積で均一に混合した。
（８）ＰＢＳでＨＲＰ標記ＣＭＡＢ００８を０．３４μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳでＣＭＡＢ００８を１０μｇ／ｍｌに希釈し、さらに両者を同体積で均一に混合した。
【００８４】
（９）ＰＢＳでＨＲＰ標記ＣＭＡＢ００８を０．１７μｇ／ｍｌに希釈し、且つ該溶液を用いて、上記２ステップにおけるＲｅｍｉｃａｄｅおよびＣＭＡＢ００８液を２倍の倍率で段階希釈した。
【００８５】
（１０）段階希釈したＲｅｍｉｃａｄｅおよびＣＭＡＢ００８を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れた。さらに、０．１７μｇ／ｍｌのＨＲＰ標記ＣＭＡＢ００８を最強呈色反応対照とし、ＰＢＳを最弱呈色反応対照とした。
【００８６】
（１１）３７℃で１時間インキュベートした。
（１２）ウェル中の液を捨て、ＰＢＳＴで３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた。
【００８７】
（１３）ＴＭＢ呈色基質ＡとＢを同体積で混合し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れた。
（１４）室温で１０分間遮光下で反応させた。
【００８８】
（１５）１ウェルにつき濃度０．５Ｍの硫酸を５０μｌ加えて反応を終了させた。
（１６）６３０ｎｍを基準波長として、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍを測定した。
【００８９】
実験結果は表６にまとめた。
【００９０】
【表７】
0006514789.tif 000009
【００９１】
そのうち、１回目の実験結果の生データは表７に示す：
【００９２】
【表８】
0006514789.tif 000010
【００９３】
計算により、該試験において、Ｒｅｍｉｃａｄｅの回帰方程式は、
Y = (0.61842 - 0.07665) / [1+(X/0.14889)1.38126] + 0.07665
ＣＭＡＢ００８の回帰方程式は、
Y = (0.59358 - 0.07187) / [1+(X/0.1439)1.34198] + 0.07187
である。
【００９４】
文献の報告(Ravinder N Maini and Marc Feldmann. How does infliximab work in rheumatoid arthritis? Arthritis Res 2002, 4(Suppl 2):S22-S28.)によると、Ｒｅｍｉｃａｄｅの親和定数（Ｋａ）は１０10Ｍ-1である。文献(Berzofsky JA and Berkower IJ. 1984. Fundamental Immunology. In Paul WE ed. Raven New York, pp. 595-644)で報告された計算方法により、Ｒｅｍｉｃａｄｅを基準品として、試験したＣＭＡＢ００８抗体の親和定数を算出した、式は：
[X]-[R] = (1/KX)-(1/KR)
である。
【００９５】
ただし、［Ｘ］は試験サンプルの競合阻害曲線のＥＣ５０濃度で、［Ｒ］は同条件下における基準品のＥＣ５０濃度で；ＫＸは試験サンプルの親和定数で、ＫＲは既知の基準品の親和定数である。
【００９６】
本試験において、試験サンプルのＥＣ５０濃度平均値は０．１４６μｇ／ｍｌで、基準品ＲｅｍｉｃａｄｅのＥＣ５０濃度平均値は０．１３９μｇ／ｍｌであり、両者の差は０．００７μｇ／ｍｌになり、該モノクローナル抗体の分子量を１５０ｋＤａとして計算すると、０．０４７ｎＭに該当した；したがって、上記試験から分かるように、試験サンプルＣＭＡＢ００８の親和定数（Ｋａ）は約０．６８×１０10Ｍ-1であり、両者の抗原に対する親和力はほとんど同様である。
【００９７】
実験例６．ＣＭＡＢ００８およびＲｅｍｉｃａｄｅの生体内でＴＮＦ−αを中和する作用の研究
ＣＭＡＢ００８およびＲｅｍｉｃａｄｅの生体内でヒトＴＮＦ−αを中和する作用を比較するために、昆明マウスの体内に両者の抗体をそれぞれ注射し、それらのｒｈ−ＴＮＦ−αの毒性に対する阻害作用を検出した。
【００９８】
実験材料：
昆明マウス（メスとオスはそれぞれ半分）、４〜６週齢、２０±２ｇ／匹。第二軍医大学動物センターより購入された。
【００９９】
ｒｈＴＮＦ−αは、大腸菌により発現・精製された天然型組換えヒトＴＮＦ−αであった。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入された（カタログ番号：２１０−Ｔ／ＣＦ）。
ＣＭＡＢ００８：上海張江生物技術株式会社より提供された試験サンプルで、１００ｍｇ／本であった。ロット番号20040601。１０ｍｌ無菌注射用水で溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。４℃で保管した。
【０１００】
Ｒｅｍｉｃａｄｅ（陽性対照薬）：１００ｍｇ／本。ロット番号101514。１０ｍｌ無菌注射用水で溶解させ、濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。４℃で保管した。
陰性対照：５％ショ糖、０．０５ｍｇ／ｍｌＴｗｅｅｎ  ８０を含有する１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液であり、ｐＨ７．２で、濾過して除菌した後、２〜８℃で保管した。ＣＭＡＢ００８およびＲｅｍｉｃａｄｅの賦形剤成分はいずれもそれと同様であった。
【０１０１】
Ｄ（＋）−ガラクトサミン：Ｓｉｇｍａの製品。
方法と結果：
ｒｈ−ＴＮＦ−αの毒性投与量の測定
種の違いのため、ヒトＴＮＦ−αのマウスに対する毒性投与量はマウス由来のＴＮＦ−αよりも遥かに高く、報告によると、ヒトＴＮＦ−αのマウスに対するＬＤ５０は約４〜８ｍｇ／ｋｇであり、凡そ１匹のマウスにつき８０〜１６０μｇ注射することに該当する[1-4]。１９８７年、ドイツの学者Ｌｅｈｍａｎｎらはマウスの処理にＤ（＋）−ガラクトサミンを使用することで、ヒトＴＮＦ−αのマウスに対する毒性作用を１，０００倍程度高めることができ、ＬＤ５０は僅か０．１〜１．０μｇ／匹であることを初めて報告した[5]。そのため、Ｄ（＋）−ガラクトサミンをＴＮＦ−αの増感剤に用いて構築したマウス毒性モデルは既に研究界で広く使用されている。
【０１０２】
昆明マウスを１２０匹取り（１８〜２２ｇ）、無作為に６群に分け（１群につき１０匹のメスと１０のオスが含まれる）、それぞれ０、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０μｇ／匹の異なる投与量でｒｈＴＮＦ−αを腹腔内注射し、薬物はいずれもＰＢＳに溶解して、体積はいずれも０．１ｍｌとし、Ｄ（＋）−ガラクトサミンも同時に１８ｍｇ／匹で腹腔内注射した。１４日間観察し、動物の一般状態（摂食、活動、精神、毛色などを含む）および生存状態を記録した。
【０１０３】
実験結果は表８に示す：
【０１０４】
【表９】
0006514789.tif 000011
【０１０５】
ＳＰＳＳソフトウェアによる計算で統計解析したところ、昆明マウスはｒｈ−ＴＮＦ−αおよび１８ｍｇのＤ（＋）−ガラクトサミンを腹腔内注射された後、ｒｈ−ＴＮＦ−αのＬＤ５０は０．４６［０．３０〜０．６０］μｇ／匹に、ＬＤ９０は０．９９［０．７７〜１．８３］μｇ／匹になった。
【０１０６】
臨床使用投与量のＣＭＡＢ００８およびＲｅｍｉｃａｄｅの生体内でのｒｈ−ＴＮＦ−αに対する中和作用の測定
Ｒｅｍｉｃａｄｅの臨床使用量は３ｍｇ／ｋｇであり、体表面積相当量で計算すると、マウスへの投与量は２７ｍｇ／ｋｇであるはずなので、平均体重が約２０ｇのマウスの場合、１匹の投与量は約５００μｇになる（予測投与量の５倍に該当する）。該投与量のＣＭＡＢ００８の中和能を初歩的に調査する必要がある。
【０１０７】
１群につき４匹で、メスとオスをそれぞれ半分にして、１６匹の昆明マウスを無作為に４群に分け、４群についてそれぞれ、各マウスに５００μｇのＣＭＡＢ００８またはＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、各動物に１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射すると同時に、５μｇまたは１０μｇのｒｈＴＮＦ−αを腹腔内注射した。
【０１０８】
結果：ＴＮＦ−αの注射から２日間後、１０μｇのｒｈＴＮＦ−αを注射した動物では、ＣＭＡＢ００８群では２匹が生存し、Ｒｅｍｉｃａｄｅ群では１匹が生存した。一方で５μｇのｒｈＴＮＦ−αを注射した動物としては、ＣＭＡＢ００８群では４匹が生存し、Ｒｅｍｉｃａｄｅ群では３匹が生存した。これにより、５００μｇのＣＭＡＢ００８またはＲｅｍｉｃａｄｅは５．０μｇ程度のｒｈ−ＴＮＦ−αによる急性毒性作用を完全に中和できるが、１０μｇのｒｈ−ＴＮＦ−αによる急性毒性作用は一部しか中和できないとおおよそ推定される。ＲｅｍｉｃａｄｅおよびＣＭＡＢ００８を予め適用した後のｒｈ−ＴＮＦ−αの毒性投与量を測定した。
【０１０９】
予備実験の結果に基づき、下記試験を設計した：２４０匹の昆明マウスを無作為に２群に分け、各群をさらに１つのグループにつき２０匹で、メスとオスをそれぞれ半分にして、６つのグループに分けた、各グループはそれぞれ以下のようであった：
Ｒｅｍｉｃａｄｅ群
Ａ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、０．１ｍｌのＰＢＳを腹腔内注射した。
【０１１０】
Ｂ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、２０μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１１】
Ｃ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、１０μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１２】
Ｄ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１３】
Ｅ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、２．５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１４】
Ｆ．５００μｇ／匹でＲｅｍｉｃａｄｅを静脈内注射し、７２時間後、１．２５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１５】
ＣＭＡＢ００８群
Ａ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、０．１ｍｌのＰＢＳを腹腔内注射した。
【０１１６】
Ｂ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、２０μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１７】
Ｃ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、１０μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１８】
Ｄ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１１９】
Ｅ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、２．５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１２０】
Ｆ．５００μｇ／匹でＣＭＡＢ００８を静脈内注射し、７２時間後、１．２５μｇ／匹で（０．１ｍｌ、ＰＢＳ溶解）ｒｈ−ＴＮＦ−αを腹腔内注射すると同時に、１８ｍｇのＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射した。
【０１２１】
観察指標：ｒｈＴＮＦ−α注射後、正常条件下で動物を飼養し、７２ｈ以内で動物の生存状況を観察した。
Ｒｅｍｉｃａｄｅ群の実験結果は表９に示す：
【０１２２】
【表１０】
0006514789.tif 000012
【０１２３】
Ｒｅｍｉｃａｄｅを５００μｇ／匹で静脈内注射してから７２時間後にｒｈ−ＴＮＦ−αおよび１８ｍｇのＤ（＋）−ガラクトサミンを腹腔内注射した昆明マウスの統計解析によると、ｒｈ−ＴＮＦ−αのＬＤ５０は８．５６［３．８５〜１１．３０］μｇ／匹であった。生存曲線の結果は図８に示す。
【０１２４】
ＣＭＡＢ００８群の実験結果は表１０に示す：
【０１２５】
【表１１】
0006514789.tif 000013
【０１２６】
ＣＭＡＢ００８を５００μｇ／匹で静脈内注射してから７２時間後にｒｈ−ＴＮＦ−αおよび１８ｍｇのＤ（＋）−ガラクトサミンを腹腔内注射した昆明マウスの統計解析によると、、ｒｈ−ＴＮＦ−αのＬＤ５０は８．７１［５．５９〜１１．４２］μｇ／匹であった。生存曲線の結果は図９に示す。
【０１２７】
以上の結果で実証されたように、ＲｅｍｉｃａｄｅまたはＣＭＡＢ００８を５００μｇ／匹で静脈内注射すると、昆明マウスに対するｒｈ−ＴＮＦ−αの半数致死量は、０．４６μｇ／匹からそれぞれ８．５６μｇ／匹（１８．６倍）と８．７１μｇ／匹（１８．９倍）に向上した。両者には統計学的な差がない。
【０１２８】
実験例７、臨床安全性の評価
第I相単回投与の研究方法：組入れ・除外基準に合致する健康な被験者２７名を１群につき９名で、無作為に３群に分けた。低投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を１ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴し；中投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を３ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴し；高投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴した。輸液時間は２時間とした。静脈内点滴前および静脈内点滴終了後の１、２８および５６日目に、一般血液検査、一般尿検査、生化学的血液検査、生命兆候検査、心電図、胸部Ｘ線写真および一般症状観察を行い、常に有害事象を密接に観察・記録した。１、３、１０ｍｇ／ｋｇの第I相単回投与において、選択された２７名は、研究室における各指標はほとんど正常であり、副作用率が高いほうから順番に目眩、筋肉痛、発熱、腹痛などであるが、いずれの反応も軽微であり、注射関連反応は明らかではなかった。
【０１２９】
２７例の患者群のうち、７例に有害事象が現れ、有害事象発生率は２５．９％であり、結果は表１１に示す。
【０１３０】
【表１２】
0006514789.tif 000014
【０１３１】
第I相反復投与の研究方法：関節リウマチ患者を９名選択し、第II相臨床試験で定められる治療投与量（３ｍｇ／ｋｇ）を採用し、０、２、６、１０、１４週目に静脈内点滴し、輸液時間を２時間とし、毎回の投与前および最終の投与後の、２、１２週目に臨床観察した。試験の間、何らの重篤な有害事象も発生せず、注射部位で反応（赤み、腫れ、斑状出血または皮膚発疹）は発生せず、１例においては吐き気・嘔吐が表れたが、２０分間で緩和し、副作用率は１１．１％であった。ＣＭＡＢ００８の連続反復静脈内点滴後に発生した有害事象の結果を表１２に示す。
【０１３２】
【表１３】
0006514789.tif 000015
【０１３３】
第II／第III相臨床研究方法： プラシーボを対照として、ＭＴＸを基本治療として、層別・ブロック別無作為化、二重盲検シングルダミー、多施設共同、並行群間試験デザインの優越性試験であった。試験群と対照群の症例数は３：１：１の比率で構成され、即ち、２つの試験群はそれぞれ３３０例と１１０例にし、対照群は１１０例にした。試験群Ａは０、２、６、１４週目にそれぞれ、１回につき３ｍｇ／Ｋｇで、静脈内注射により１回投与し、治療コースは１８週間にした。試験群Ｃは０、２、６週目にそれぞれ、１回につき３ｍｇ／Ｋｇで、静脈内注射により１回投与し、１４週目にプラシーボを投与し、治療コースは１８週間にした。対照群Ｂは０、２、６、１４週目にそれぞれ静脈内注射により１回投与するが、いずれもプラシーボを投与し、治療１クールは１８週間にした。各群の副作用の発生状況は表１３に示す。
【０１３４】
試験中において、薬物関連副作用の発生率は、試験Ａ群が３４．８５％（１１５／３３０）で、対照Ｂ群が２２．７３％（２５／１１０）で、試験Ｃ群が３４．５５％（３８／１１０）であり、３群間の差は統計学的に有意なものではなかった（Ｐ＝０．０５４３）；発生率が最も高い副作用は輸液反応であり：試験Ａ群が９．７０％（３２／３３０）で、対照Ｂ群が１．８２％（２／１１０）で、試験Ｃ群が７．２７％（８／１１０）であり、３群間の差は統計学的に有意なものであった（Ｐ＝０．０２６３）。輸液反応は輸液中および輸液終了後の２時間内で発生し、症状は、皮膚発疹、蕁麻疹、掻痒、しびれ、目腫れ、唇腫れ、顔面浮腫、咳嗽、胸内苦悶、息切れ、気管トーヌス、頭痛、目眩、嘔吐、低血圧などの１種または多種の症状、及び/又は発熱・寒気などの非特異的な症状を含んでいた。ほとんどの輸液反応は軽度〜中等度で、５／４２例（１１．９１％）のみが重度であり、６／４２例（１４．２９％）は輸液反応によって輸液治療を中止し、１２／４２例（２８．５７％）は輸液反応によって試験をやめ、輸液反応が発生した全ての被験者は、治療処置があろうとなかろうと、輸液反応は全て緩和した。
【０１３５】
発生率が５％を超えた副作用は順に、上気道感染症、試験Ａ群が８．４８％（２８／３３０）で、対照Ｂ群が１０．９１％（１２／１１０）で、試験Ｃ群が９．０９％（１０／１１０）であった；白血球減少症、試験Ａ群が７．５８％（２５／３３０）で、対照Ｂ群が３．６４％（４／１１０）で、試験Ｃ群が７．２７％（８／１１０）であった；肝機能障害、試験Ａ群が７．２７％（２４／３３０）で、対照Ｂ群が４．５５％（５／１１０）で、試験Ｃ群が９．０９％（１０／１１０）であった；３群間の差はいずれも統計学的に有意なものではなかった。
【０１３６】
発生率が１％超５％未満の副作用は順に、泌尿器系（尿路感染症）、皮膚および付属物（皮膚発疹、蕁麻疹、真菌性皮膚炎）、身体防御（発熱、ウイルス感染、蜂窩織炎、リンパ節結核、結核病、耳下腺炎、歯肉炎）、全身性（だるさ、腫れ）、胃腸管系（無食欲症、嘔吐）、中枢および末梢神経系（目眩）であった。嘔吐、目眩についての３群間の差は統計学的に有意なものであった以外、他の副作用について、３群間の差はいずれも統計学的に有意なものではなかった。嘔吐（２例）や目眩（３例）は個別の症例であり、且つ単一の症状だけで疾患を明確に診断できないことから、該統計学的な差は偶発的な要因のものであり、臨床的には意味のないものである。
【０１３７】
発生率が１％未満の副作用は順に、赤血球（貧血）、末梢血管（斑状出血）、心拍数および心調律（動悸）、心血管（高血圧）、眼部および視力（結膜炎）、筋肉骨格系（大腿骨頭壊死症）、その他（月経不順）であり、３群間の差はいずれも統計学的に有意なものではなかった。
【０１３８】
ほとんどの副作用は軽度〜中等度で、投与を停止する必要がなく、ただ症状に対して治療するだけで、病状が緩和した。重度の副作用は合計で７／１７８例（３．９３％）であったが、治療処置により全て緩和された：５例は輸液反応（４例は投与を停止して試験をやめた）、１例は目眩（投与を停止して試験をやめた）、１例は尿路感染症（試験をやめずに投与を続けた）。
【０１３９】
Ｒｅｍｉｃａｄｅを中国で登録するための多施設共同試験において、その有害事象発生率は６５．５％（侯勇ら  インフリキシマブによる関節リウマチ治療の無作為・二重盲検・並行・多施設共同臨床試験、《中華リウマチ学雑誌》  ２００６年１１期）であった。 ＣＭＡＢ００８の副作用率はＲｅｍｉｃａｄｅよりも遥かに低かった。
【０１４０】
【表１４−Ａ】
0006514789.tif 000016
【０１４１】
【表１４−Ｂ】
0006514789.tif 000017
【０１４２】
【表１４−Ｃ】
0006514789.tif 000018
【０１４３】
３群間の発生率の比較にはＣＭＨ検定が採用され、ＣＭＨ検定が採用されると、統計量はＣＭＨカイ二乗値である。
【０１４４】
実験例８、免疫原性の測定
（１）単回投与：
研究方法：選択基準・除外基準に合致する健全健康な被験者２７名を１群につき９名で、無作為に３群に分けた。低投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を１ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴し；中投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を３ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴し；高投与量群の被験者には、注射用ＣＭＡＢ００８を１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内点滴した。輸液時間は２時間とした。
【０１４５】
被験者がＣＭＡＢ００８を受けた後の血清における抗ＣＭＡＢ００８抗体（ＡＤＡ）の生成状況を検出するために、投与前、投与後の１４、２８、５６日目に血清サンプルを採集した；
血清ＡＤＡ検出実験は以下の通りであった：
実験ステップ：
１）リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）でＣＭＡＢ００８抗体を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）に入れた；
２）３７℃インキュベーターに２時間置き、若しくは４℃で一晩置いた；
３）ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた；
４）３％ウシ血清アルブミン（上海生工生物工学株式会社）（ＰＢＳで希釈）を満水になるまで（約３５０μｌ／ウェルで）ＥＬＩＳＡプレートに入れ、３７℃インキュベーターに２時間置き、若しくは４℃で一晩置いた；
５）ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた；
６）ＰＢＳでウサギ抗ＣＭＡＢ００８ポリクローナル抗体（本研究室の自作品、ＣＭＡＢ００８でウサギを免疫し、抗血清を取り、ＣＭＡＢ００８アフィニティークロマトグラフィーで精製して得た溶出ピーク）を１０μｇ／ｍｌに希釈し、希釈された陽性対照、陰性対照（健康なボランティアの混合血清、１０倍希釈）、空白対照（ＰＢＳ）および試験サンプル（１０倍希釈）を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れ、重複ウェルを設け、３７℃インキュベーターに２時間置いた；
７）ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた；
８）ＨＲＰ標識ＣＭＡＢ００８（本研究室の自作品、Ｐｉｅｒｃｅ社のＨＲＰ標識キットでＣＭＡＢ００８を標識し、且つゲルパーミエーションクロマトグラフィーで精製して得られたもの）を１：５００で希釈し（ＰＢＳ）、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れ、置于３７℃インキュベーターに４５分間置いた；
９）ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた；呈色基質ＡとＢ（晶美生物工学株式会社）を同体積で均一に混合し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れ、室温で５〜２０分間遮光下で反応させた（呈色状況に応じて呈色時間を決定した）；
１０）終了液を５０μｌ／でＥＬＩＳＡプレートに入れ、速やかに均一に混合した；マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍを読み取り、６３０ｎｍを基準波長とした。
【０１４６】
結果の判断：
１回につき、プレートあたりに２つの空白対照、２つの陰性対照、３つの陽性対照を設ける必要がある。
【０１４７】
空白対照のＯ．Ｄ．値は≦０．１０となる必要がある。
空白対照のＯ．Ｄ．値を引いた後、０≦２つの陰性対照のＯ．Ｄ値≦０．１５となるべ必要がある。
【０１４８】
空白対照のＯ．Ｄ．値を引いた後、３つの陽性対照のうち、少なくとも２つのＯ．Ｄ値が、０．６≦Ｏ．Ｄ値≦２．０になる必要がある。
２つ以上の陽性対照のＯ．Ｄ．値の差は３０％以上になってはならず、そうならない場合には、検出し直す必要がある。
【０１４９】
陽性対照のＯ．Ｄ．平均値と陰性対照のＯ．Ｄ．平均値の差が０．５０未満になってはならない。
Ｃ．Ｏ．＝２．１×（陰性対照Ｏ．Ｄ．−空白対照Ｏ．Ｄ．）
（サンプルＯ．Ｄ．−空白対照Ｏ．Ｄ．）／Ｃ．Ｏ．≧１であれば、陽性と判別した。
【０１５０】
１ｍｇ／ｋｇ投与量群の９名の被験者のうち、２名（７＃、８＃）の血清中ＡＤＡの検出結果は陽性であり、具体的な結果は表１４に示す：
【０１５１】
【表１５】
0006514789.tif 000019
【０１５２】
ＡＤＡ検出結果が陽性であったサンプルについて、さらにそれにおける中和抗体を検出した。具体的な方法およびスクリーニング基準は以下の通りであった：
方法：
１）対数増殖期のＬ９２９細胞を取り、培地を加えて細胞密度を１．５×１０5／ｍｌに調整し、０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、一晩（１８〜２４ｈ）培養した。
【０１５３】
２）翌日、培養液でダクチノマイシンＤを最終濃度が２０μｇ／ｍＬになるまで希釈し、ＴＮＦ−αを濃度が２０ｎｇ／ｍＬになるまで加え、２００ｎｇ／ｍｌのＣＭＡＢ００８抗体を加えた（希釈液、一部を空白対照として取った）。
【０１５４】
３）希釈液で陰性対照血清（健康なボランティアの混合血清）を１００倍希釈し、陰性対照サンプルとした。
４）希釈液で陽性対照サンプルを１μｇ／ｍｌに希釈した。
【０１５５】
５）希釈液で受試血清を１００倍希釈した。
６）上記の試験サンプル、陰性、陽性および空白対照サンプルを０．１ｍＬ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、重複ウェルを設け、一晩（１８〜２４ｈ）培養した。
【０１５６】
（７）エンドポイントの測定：９６ウェルプレートをインキュベーターで１４〜１６ｈ連続にインキュベートした後、新しくに調製した２０：１で混合されたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液を２０μｌ／ウェルで加え、インキュベーターで１〜４時間連続にインキュベートし（９６ウェルプレートに蓋をすることなく）、マイクロプレートリーダーでそのＡ４９０〜Ａ６３０値を測定した。
【０１５７】
結果の判断：
１回につき、プレートあたりに２つの空白対照、２つの陰性対照、３つの陽性対照を設ける必要がある。
【０１５８】
空白対照のＯ．Ｄ．値は≧０．８０である必要がある。
２つの陰性対照のＯ．Ｄ．値は≧０．８０である必要がある。
３つの陽性対照のうち、少なくとも２つのＯ．Ｄ値は≦０．４０とある必要がある。
【０１５９】
２つ以上の陽性対照のＯ．Ｄ．値の差は３０％以上になってはならず、そうでないなら、検出し直す必要がある。
陽性対照のＯ．Ｄ．平均値と陰性対照のＯ．Ｄ．平均値の差は０．４０未満になってはならない。
【０１６０】
Ｃ．Ｏ．＝０．５×陰性対照Ｏ．Ｄ．
サンプルＯ．Ｄ．／Ｃ．Ｏ．＜１であれば、陽性と判別した。
７＃、８＃の被験者の血清中における中和抗体の検出結果はいずれも陰性であり、具体的な結果は表１５に示し、＃７、＃８の被験者の血清中におけるＣＭＡＢ００８の血中薬物濃度を解析したところ、他の被験者の血清中における薬物濃度との有意な差は見られなかった。
【０１６１】
【表１６】
0006514789.tif 000020
【０１６２】
３ｍｇ／ｋｇ投与量群および１０ｍｇ／ｋｇ投与量群の被験者の血清中における抗ＣＭＡＢ００８抗体の検出結果はいずれも陰性であった。結果は下記表１６、表１７に示す。
【０１６３】
【表１７】
0006514789.tif 000021
【０１６４】
【表１８】
0006514789.tif 000022
【０１６５】
（２）反復投与：
研究方法：関節リウマチ患者を９名選択し、第II相臨床試験で定められる治療投与量（３ｍｇ／
ｋｇ）を採用し、０、２、６、１０、１４週目に静脈内点滴し、輸液時間を２時間とし、毎回の投与前および最終投与後の２、１２週目に臨床観察した。被験者がＣＭＡＢ００８抗体を反復投与された後の血清における抗ＣＭＡＢ００８抗体（ＡＤＡ）の生成状況を検出するために、毎回の点滴前および最終の点滴の終了後の１、２、４、６、８、１２週目に採血し、血清における抗ＣＭＡＢ００８抗体（ＡＤＡ）の検出を行った。ＡＤＡ検出および中和抗体検出の具体的な実験ステップおよびスクリーニング基準は単回投与試験と同様であった。
【０１６６】
結果から分かるように、１名の被験者Ｊのみが、３、４、５回目の点滴前および５回目の点滴後の１週目、２週目、４週目に、血清中における抗ＣＭＡＢ００８抗体の検出結果が陽性であった。具体的な結果は表１８に示す；更なる検出により、いずれも非中和抗体であることが判った。結果は表１９に示す。
【０１６７】
【表１９】
0006514789.tif 000023
【０１６８】
【表２０】
0006514789.tif 000024
【０１６９】
該被験者Ｊの血清中におけるＣＭＡＢ００８の血中薬物濃度を解析したところ、他の被験者の血清中における薬物濃度との間において有意な差は見られなかった。
（３）第III相臨床研究：
研究方法：無作為・二重盲検・並行・多施設共同試験。患者は組入れられる前に、少なくとも３ヶ月のＭＴＸ治療を受け、且つＭＴＸ投与量が７．５〜２０ｍｇ／週に保持されたが、病状はうまく抑えられなかった。被験者は０、２、６、１４週目に、それぞれ３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブまたはプラシーボの静脈内点滴を受けると同時に、毎週で同様の所定投与量でＭＴＸを飲んだ。それぞれ試験の０、２、６、１４、１８週目に被験者の様子を追跡調査し、治療効果および副作用を評価した。
【０１７０】
免疫原性分析を行った有効被験者は合計で３３９名であった（被験者は試験薬物群の者であるべきで、投与前の血清サンプルおよび少なくとも一つの投与後の血清サンプルを収集すべきであり、即ち、投与前の血清サンプル（Ｔ１）を収集しなければならず、投与後の血清サンプルＴ２とＴ３のうちの少なくとも一つを収集すべきである）。ＡＤＡ検出の具体的な実験ステップおよびスクリーニング基準は単回投与試験と同様であった。測定により、合計８名の被験者は投与後においてＣＭＡＢ００８抗体に対する抗体を生成した。結果は表２０に示す。抗体生成率は２．３６％であったが、Ｒｅｍｉｃａｄｅの抗体生成率は１６％であった（J Turon etal. Su2013 Clinical Outcome of Pediatric IBD Patients After Measurement of Infliximab Drug and Anti-Drug Antibody Levels . Gastroenterology. 144:5, May 2013, S-531）。ＡＤＡ陽性被験者血清にはいずれも中和ＡＤＡが存在した。結果は表２１に示す。
【０１７１】
【表２１−Ａ】
0006514789.tif 000025
【０１７２】
【表２１−Ｂ】
0006514789.tif 000026
【０１７３】
【表２１−Ｃ】
0006514789.tif 000027
【０１７４】
【表２１−Ｄ】
0006514789.tif 000028
【０１７５】
【表２１−Ｅ】
0006514789.tif 000029
【０１７６】
【表２１−Ｆ】
0006514789.tif 000030
【０１７７】
【表２１−Ｇ】
0006514789.tif 000031
【０１７８】
【表２１−Ｈ】
0006514789.tif 000032
【０１７９】
【表２１−Ｉ】
0006514789.tif 000033
【０１８０】
無効被験者は上表に入れず、ＮＤは該サンプルが欠けたことを表す
血清における中和抗体の検出（Ｌ９２９細胞によるＴＮＦ−α毒性阻害試験）：
具体的な実験ステップおよびスクリーニング基準は単回投与と同様であった。
【０１８１】
実験結果は下表に示したように、ＡＤＡ陽性被験者血清にはいずれも中和抗体が存在した。
【０１８２】
【表２２】
0006514789.tif 000034
【０１８３】
表２０、表２１に示すように、有効被験者は合計で３３９名であった（被験者は試験薬物群の者でなければならず、投与前の血清サンプルおよび少なくとも一つの投与後における血清サンプルを採取しなければならず、即ち、Ｔ１を収集しなければならず、Ｔ２とＴ３のうちの少なくとも一つを採取しなければならないる）。測定により、合計８名の被験者はＣＭＡＢ００８の注入後にＣＭＡＢ００８抗体に対する抗体を生成し、抗体生成率は２．３６％であった。一方、Ｒｅｍｉｃａｄｅの抗体生成率は１６％であった（J Turon etal. Su2013 Clinical Outcome of Pediatric IBD Patients After Measurement of Infliximab Drug and Anti-Drug Antibody Levels . Gastroenterology. 144:5, May 2013, S-531）。ＣＭＡＢ００８のＡＤＡ生成率はＲｅｍｉｃａｄｅよりも顕著に低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006514789.tif 000042
【図９】
0006514789.tif 000043
【配列表】
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