(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの励起光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査される励起光を試料に集光する一方、各走査位置で試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系により集光された蛍光を検出する検出器と、
該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された蛍光を部分的に遮断する遮光部材と、
該遮光部材と前記試料における励起光の集光点との位置関係を、該集光点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係と、前記集光点から発せられる焦点蛍光が前記集光点から発せられる焦点蛍光を通過させた前記遮光部材と同一の遮光部材を通過しない非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、
該切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を演算する演算部とを備える顕微鏡。
【請求項２】
前記切替部が、前記遮光部材に対する前記試料における前記励起光の前記集光点の位置を相対的に変更する請求項１記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記切替部が、前記光源と前記スキャナとの間に配置され、前記スキャナへの励起光の入射角度を切り替える偏向素子を備える請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記切替部が、前記遮光部材を光軸に交差する方向に移動する請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記光源が励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
前記切替部が、前記励起光を複数の光路に分岐して前記スキャナに異なる角度かつ異なる位相で入射させる空間光学系を備える請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記光源が励起光を連続的に射出し、
前記切替部が、前記光源からの励起光の偏光状態を周期的に切り替える光学素子と、該光学素子から出力された励起光を偏光状態に応じて複数の光路に分岐する分波部を備え、該分波部により分岐された励起光を前記スキャナに異なる角度かつ異なる位相で入射させる空間光学系とを備える請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記光源が励起光を連続的に射出し、
前記切替部が、複数の光路に分岐する分波部と、該分波部により分岐された各前記光路に設けられ同期して駆動され励起光強度を周期的に変化させる光学素子と、前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射させる空間光学系とを備える請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記光源が励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、
前記切替部が、前記励起光を複数の光ファイバに分岐し、分岐された励起光を前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射するように、前記光ファイバの長さおよび射出角度を設定してなる請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記光源が複数備えられ、複数の前記光源を同期して任意の繰り返し波形で発振させ、
前記切替部が、各光源からの励起光を前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射させる請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記演算部が、前記切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号により生成された２種類の画像の差分を演算する請求項２から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記演算部が、前記切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を画素毎に演算する請求項２から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１２】
スキャナにより走査された励起光を対物光学系によって試料に集光し、各走査位置で試料において発生した蛍光を対物光学系によって集光し、遮光部材を通過した蛍光を検出器により検出する顕微鏡観察方法であって、
前記遮光部材と前記試料における励起光の集光点との位置関係を、該集光点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係に配置して前記検出器により蛍光を検出する第１のステップと、
前記遮光部材と前記試料における励起光の集光点との位置関係を、前記集光点から発せられる焦点蛍光が前記集光点から発せられる焦点蛍光を通過させた前記遮光部材と同一の遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係に配置して前記検出器により蛍光を検出する第２のステップと、
前記第１のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号から前記第２のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光信号を減算する第３のステップとを含む顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡および顕微鏡観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、焦点外蛍光の共焦点ピンホール内への漏れ込みにより、試料の深部の観察が困難になるのを防止するために、複数のピンホールを持つ分離部材と複数の光検出器によって焦点蛍光と焦点外蛍光とを弁別する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７４５９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記したように特許文献１の顕微鏡は、複数のピンポールを持つ分離部材と複数の光検出器により焦点蛍光と焦点外蛍光を弁別しており、異なる光束に対して異なる検出器で焦点蛍光と焦点外蛍光を検出している。このため、焦点外蛍光を精度よく検出し、焦点蛍光から焦点外蛍光を除去することが困難である。【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料の焦点から焦点外蛍光を精度よく検出し、焦点蛍光から焦点外蛍光を除去して鮮明な蛍光画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からの励起光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査される励起光を試料に集光する一方、各走査位置で試料において発生した蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された蛍光を検出する検出器と、該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された蛍光を部分的に遮断する遮光部材と、該遮光部材と前記試料における励起光の集光点との位置関係を、該集光点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係と、前記集光点から発せられる焦点蛍光が前記集光点から発せられる焦点蛍光を通過させた前記遮光部材と同一の遮光部材を通過しない非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、該切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を演算する演算部とを備える顕微鏡を提供する。
【０００７】
本態様によれば、光源からの励起光がスキャナにより走査され、対物光学系によって試料に集光されることにより、試料における励起光の集光点において蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は対物光学系によって集光された後に検出器により検出され、検出された蛍光の強度と走査位置とを対応づけることにより蛍光画像が生成される。【０００８】
この場合において、切替部の作動により、検出器の前段に設けられた遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係が共役な位置関係に切り替えられると、焦点蛍光および焦点外蛍光とが検出器により検出される。また、切替部の作動により、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係が非共役な位置関係に切り替えられると、焦点蛍光は遮光部材を通過できずに焦点外蛍光のみが検出器により検出される。そして、演算部によりこれら蛍光信号の差分が演算されることにより、焦点外蛍光が除去された焦点蛍光を得ることができ、鮮明な蛍光画像を取得することができる。【０００９】
上記態様においては、前記切替部が、前記遮光部材に対する前記試料における前記励起光の前記集光点の位置を相対的に変更することにしてもよい。
このようにすることで、集光位置又は遮光部材の位置を切替えることにより、集光点の相対的な位置を所望の位置とすることができる。【００１０】
上記態様においては、前記切替部が、前記光源と前記スキャナとの間に配置され、前記スキャナへの励起光の入射角度を切り替える偏向素子を備えていてもよい。
このようにすることで、偏向素子の作動により、光源からの励起光が可動ミラーの角度に応じて入射角度を切り替えて異なるタイミングでスキャナに入射される。これにより、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１１】
また、上記態様においては、前記切替部が、前記遮光部材を光軸に交差する方向に移動することにしてもよい。
このようにすることで、励起光の集光点からの蛍光が通過する位置と、励起光の集光点からの蛍光を通過させない位置とに遮光部材を移動させることにより、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１２】
また、上記態様においては、前記光源が励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記切替部が、前記励起光を複数の光路に分岐して前記スキャナに異なる角度かつ異なる位相で入射させる空間光学系を備えていてもよい。【００１３】
このようにすることで、光源からの励起光が、空間光学系において、２つの光路に分岐され、光路長の異なる２つの光路を通過することにより、位相が異ならされてスキャナに入射される。２つの光路を通過した励起光は空間光学系によりスキャナへの入射角度を異ならされているので、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１４】
また、上記態様においては、前記光源が励起光を連続的に射出し、前記切替部が、前記光源からの励起光の偏光状態を周期的に切り替える光学素子と、該光学素子から出力された励起光を偏光状態に応じて複数の光路に分岐する分波部を備え、該分波部により分岐された励起光を前記スキャナに異なる角度かつ異なる位相で入射させる空間光学系とを備えていてもよい。【００１５】
このようにすることで、光源から連続的に射出された励起光が、光学素子によって周期的に偏光状態を切り替えられて空間光学系に入射されることにより、分波部によって偏光状態に応じて２つの光路に分岐され、異なる角度かつ異なる位相でスキャナに入射される。これにより、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１６】
また、上記態様においては、前記光源が励起光を連続的に射出し、前記切替部が、前記励起光を複数の光路に分岐する分波部と、該分波部により分岐された各光路に設けられ同期して駆動される励起光強度を周期的に変化させる光学素子と、前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射させる空間光学系とを備えていてもよい。
このようにすることで、光源から連続的に射出された励起光が、空間光学系に入射されることにより、分波部によって複数の光路に分岐された後に、各光路に設けられた光学素子を同期させることにより異なる角度かつ異なる位相でスキャナに入射される。これにより、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１７】
また、上記態様においては、前記光源が励起光を任意の繰り返し波形で発振させ、前記切替部が、前記励起光を複数の光ファイバに分岐し、分岐された励起光を前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射するように、前記光ファイバの長さおよび射出角度を設定してなっていてもよい。【００１８】
このようにすることで、光源から射出された明滅する励起光が、複数の光ファイバに分岐され、異なる長さおよび射出角度に設定された光ファイバを導光させられた後に、スキャナに異なる角度かつ異なる位相で入射させられる。これにより、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００１９】
また、上記態様においては、前記光源が複数備えられ、複数の前記光源を同期して任意の繰り返し波形で発振させ、前記切替部が、各前記光源からの励起光を前記スキャナに異なる角度および異なる位相で入射させてもよい。
このようにすることによっても、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置関係と非共役な位置関係とに容易に切り替えることができる。【００２０】
また、上記態様においては、前記演算部が、前記切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号により生成された２つの画像の差分を演算してもよい。
また、上記態様においては、前記演算部が、前記切替部により切り替えられた２種類の位置関係において前記検出器により取得された蛍光信号の差分を画素毎に演算してもよい。
このようにすることで、画素毎に短い時間差で取得された蛍光信号の差分を演算するので、動きの速い被写体に対してもブレの少ない鮮明な画像を取得することができる。【００２１】
また、本発明の他の態様は、スキャナにより走査された励起光を対物光学系によって試料に集光し、各走査位置で試料において発生した蛍光を対物光学系によって集光し、遮光部材を通過した蛍光を検出器により検出する顕微鏡観察方法であって、前記遮光部材と前記試料における励起光の焦点との位置関係を、該集光点から発せられる焦点蛍光が前記遮光部材を通過する光学的に共役な位置関係に配置して前記検出器により蛍光を検出する第１のステップと、前記遮光部材と前記試料における励起光の焦点との位置関係を、前記集光点から発せられる焦点蛍光が前記集光点から発せられる焦点蛍光を通過させた前記遮光部材と同一の遮光部材を通過しない光学的に非共役な位置関係に配置して前記検出器により蛍光を検出する第２のステップと、前記第１のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光から前記第２のステップにおいて前記検出器により検出された蛍光を減算する第３のステップとを含む顕微鏡観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、空間光変調器のようなデバイスを利用することなく、散乱の大きな試料であっても焦点外蛍光を除去して鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡の光源から顕微鏡本体に入射される２種類の励起光のパターンの一例を示す図である。
【図３】図１の顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。
【図４】図３の顕微鏡のさらなる変形例を示す全体構成図である。
【図５】図１の顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。
【図６】図１の顕微鏡の第３の変形例を示す全体構成図である。
【図７】図１の顕微鏡の第４の変形例を示す全体構成図である。
【図８】図１の顕微鏡の第５の変形例を示す全体構成図である。
【図９】図１の顕微鏡の第６の変形例であって、ピンホールが（ａ）共役な位置、（ｂ）非共役な位置に配置された全体構成図である。
【図１０】図１の顕微鏡の第７の変形例を示す全体構成図である。
【図１１】図３の顕微鏡の空間光学系の変形例を示す図である。
【図１２】図１１の空間光学系のさらなる変形例を示す図である。
【図１３】図３の顕微鏡の空間光学系の他の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光源２からの励起光を交互に射出される２種類の励起光に切り替える切替部３と、該切替部３により切り替えられた２種類の励起光を標本Ａに照射して、標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体４と、該顕微鏡本体４において検出された蛍光を用いて演算により画像を生成する演算部５と、該演算部５により生成された画像を表示するモニタ６とを備えている。
【００２５】
顕微鏡本体４は、切替部３からの励起光を２次元的に走査するスキャナ７と、該スキャナ７により走査された励起光を標本Ａに照射し、標本Ａからの蛍光を集光する対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光され、スキャナ７を経由して戻る蛍光を励起光の光路から分岐するダイクロイックミラー９と、該ダイクロイックミラー９によって分岐された蛍光を集光する結像レンズ１０と、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたピンホール（遮光部材）１１と、該ピンホール１１を通過した蛍光を検出する光検出器１２とを備えている。なお、遮光部材としてピンホール１１を例示したが、これに代えて、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を通過させ、非共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を遮断する任意の遮光部材を採用してもよい。その他、遮光部材としてはマイクロミラーデバイスや空間光変調器が挙げられる。
【００２６】
スキャナ７は、例えば、非平行な軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラーを近接配置してなる近接ガルバノミラーである。光検出器１２は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。
【００２７】
レーザ光源２は、励起光を連続的に射出する光源である。
切替部３は、図１に示されるように、揺動角度を変化させる可動ミラー（偏向素子）１３と、該可動ミラー１３を駆動する周波数を決定する周波数発振器１４とを備え、周波数発振器１４により発振される周波数に同期して、レーザ光源２からの励起光のスキャナ７への入射角度を交互に切り替えるようになっている。図中符号１５はミラーである。なお、偏向素子として可動ミラーを例示したが、音響光学偏向器や電気光学偏向器などのデバイスを使用することもできる。
【００２８】
これにより、顕微鏡本体４に対して、入射角度の異なる２種類の励起光が交互に入射させられるようになっている。すなわち、顕微鏡本体４に入射してくる２種類の励起光は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、反転したタイミングを有する矩形波状に形成されている。なお、ここでは２種類の励起光として反転したタイミングを有する矩形波状の光を例示したが、これに代えて、正弦波状等の任意の繰り返し形状を有し、位相の異なる励起光を採用してもよい。
【００２９】
図２（ａ）に示される一方の励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１と光学的に共役な位置に焦点を結び、図２（ｂ）に示される他方の励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１と光学的に非共役な位置に焦点を結ぶようになっている。入射角度の切替周波数は、各画素位置において２種類の励起光を少なくとも１回明滅させることができる周波数に設定されている。
【００３０】
２種類の励起光は交互に標本Ａに照射されるので、発生する蛍光も、交互に異なる時刻に光検出器１２により検出されるようになっている。
演算部５は、同一の画素位置において、光検出器１２により検出された、２種類の励起光により発生した蛍光の強度の差分を算出するようになっている。演算部５は、例えば、ロックインアンプを備えている。
【００３１】
ロックインアンプは、励起光を明滅させるための周波数発振器１４により発生された周波数に同期して光検出器１２から出力された２種類の蛍光信号の差分をハードウェア的に算出するようになっている。
そして、演算部５は、画素毎に算出された差分とスキャナ７による走査位置とを対応づけて記憶することにより、画像を生成するようになっている。
【００３２】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、顕微鏡本体４のステージ（図示略）に標本Ａを配置して、対物レンズ８の焦点位置を標本Ａに一致するように調節した状態で、レーザ光源２から連続した励起光を発生させる。
【００３３】
そして、周波数発振器１４によって発振された所定の周波数に従って、切替部３において可動ミラー１３の角度を変化させることにより、顕微鏡本体４に、入射角度の異なる２種類の励起光を交互に入射させる。
【００３４】
その結果、一方の励起光は、ピンホール１１と共役な標本Ａ内の位置に集光させられるので、その焦点位置近傍において発生した蛍光が、対物レンズ８によって集光され、スキャナ７を経由して戻る途中でダイクロイックミラー９によって分離され、結像レンズ１０によって集光されてピンホール１１を通過し、光検出器１２により検出される（第１のステップ）。
【００３５】
この場合において、標本Ａに励起光が照射されると、励起光は対物レンズ８の焦点位置に至る経路の途中においても標本Ａを通過することにより蛍光物質を励起するので、蛍光は対物レンズ８の焦点位置のみならず該焦点位置に至る経路の途中においても発生する。特に、標本Ａが散乱物質からなる場合には、励起光の散乱により蛍光が焦点位置以外の部位において蛍光が発生し易い。
【００３６】
また、特に、高精細な観察を行うために標本Ａに入射される励起光のＮＡを増大させると、焦点位置に至るまでに励起光が通過する領域が増えるため、焦点位置以外の部位で発生する蛍光が増大する。また、同様に深部観察時にも励起光が通過する領域が増加するため焦点外蛍光が増加する。さらに深部観察には散乱の影響を補償するために励起光を強める必要があり焦点外蛍光の影響が特に顕著である。
【００３７】
標本Ａにおいて発生した蛍光の内、対物レンズ８の焦点位置から発生した蛍光は、光学的に共役な位置に配置されているピンホール１１を容易に通過するので光検出器１２により信号光として検出されるが、焦点位置以外の部位から発生した蛍光はサンプルにより散乱され、その一部がピンホール１１を通過して光検出器によりノイズとして検出されてしまう。したがって、一方の励起光の照射により検出される蛍光には、対物レンズ８の焦点位置において発生した、信号として取得すべき蛍光と、他の部位において発生した、信号として取得すべきでない蛍光（焦点外蛍光）とが含まれている。
【００３８】
また、他方の励起光は、標本Ａ内のピンホール１１とは非共役な位置に集光させられて、対物レンズ８の焦点位置および焦点位置に至るまでの経路の途中において蛍光物質を励起することにより蛍光を発生させる。
この場合において、非共役な焦点位置において発生した蛍光はピンホール１１を通過することができずに遮断される一方、焦点位置以外の部位から発生した蛍光の一部はサンプルにより散乱され、先のステップ同様に同じピンホール１１を通過して光検出器１２により検出される（第２のステップ）。
【００３９】
したがって、他方の励起光の照射により検出される蛍光には、対物レンズ８の焦点位置以外の部位において発生した焦点外蛍光のみが含まれている。
そして、演算部５において、これらの２種類の励起光の照射により検出された蛍光の差分が演算される（第３のステップ）。これにより、対物レンズ８の焦点位置以外の部位において発生した、信号として取得すべきでない焦点外蛍光が除去された蛍光を取得することができる。
【００４０】
２種類の励起光が照射されることにより蛍光が発生する範囲は厳密には一致していないが、多くの部分において一致しているため、また同じピンホールを用いて検出を行っていることにより、そのまま減算しても大部分の焦点外蛍光を除去することができる。特に、励起光のＮＡを大きくして高精細な観察を行う場合には、蛍光発生範囲の重複率が増大するので、さらに効果的に焦点外蛍光を除去することができる。
【００４１】
このように本実施形態に係る顕微鏡１によれば、対物レンズ８の焦点位置において発生した蛍光を高いＳ／Ｎ比で検出することができ、ノイズの少ない鮮明な画像を取得することができるという利点がある。特に、励起光のＮＡが大きな高精細の観察時、および、標本が強い散乱物質であって焦点外蛍光が発生し易い場合に効果が高い。
【００４２】
また、本実施形態においては、画素毎に極めて短い時間差で取得した２種類の蛍光の差分を演算しているので、高速に移動する標本であってもブレの少ない蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００４３】
なお、本実施形態においては、スキャナ７への入射角度が異なりかつ反転したタイミングで明滅する２種類の励起光を発生させる切替部３として、レーザ光源２からの連続的な励起光の顕微鏡本体４への入射角度を異ならせる可動ミラー１３を備えるものを例示したが、これに代えて、図３に示されるように、レーザ光源２からの励起光を２つの光路に分岐して、スキャナ７への入射角度が異なりかつ位相が異なる２種類の励起光を生成する空間光学系（切替部）３５を採用してもよい。
【００４４】
この場合、レーザ光源２は、周波数発振器１４に接続され、該周波数発振器１４により発生される所定の周波数で励起光を図２（ａ）に示されるような繰り返し波形で発振させるようになっている。レーザ光源２の周波数は、各画素位置において少なくとも１周期繰り返される周波数である。
空間光学系３５は、図３に示されるように、レーザ光源２からの励起光を２つの光路に分岐する分波部１６（例えば、偏光ビームスプリッタ）と、該分波部１６により分岐された２つの光路の光路長を異ならせるミラー１７，１８と、分波部１６により分岐された２つの光路を通過した２種類の励起光を概略合流させる合波部（例えば、偏光ビームスプリッタ）１９とを備えている。
【００４５】
ミラー１７，１８は、分波部１６により分岐された２つの光路を通過した励起光が、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、明滅のタイミングを反転させられ、かつ、スキャナ７に対して角度を異ならせて入射させるように位置および角度が設定されている。
【００４６】
これにより、分波部１６を透過する一方の光路を通過した励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１と光学的に共役な位置に焦点を結ぶようになっている。その一方で、分波部１６により２つに分岐され、ミラー１７，１８を介して迂回させられる他方の光路を通過した励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１とは光学的に非共役な位置に焦点を結ぶようになっている。
【００４７】
ピンホール１１と光学的に共役な位置に焦点を結ぶ励起光と、非共役な位置に焦点を結ぶ励起光とは、明滅のタイミングが反転させられているので、発生する蛍光も、位相が反転し、異なる時刻に光検出器１２により検出されるようになっている。
【００４８】
このように構成された顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、対物レンズ８の焦点位置を標本Ａに一致するように調節した状態で、周波数発振器１４によって所定の繰り返し周波数で発振している励起光をレーザ光源２から射出させる。
【００４９】
レーザ光源２から発せられた励起光は、空間光学系３５に入射されると、分波部１６によって２つの光路に分岐させられる。分波部１６を透過した励起光は一方の光路を経由して合波部１９に直接入射し、該合波部１９を透過して顕微鏡本体４に入射される。
【００５０】
分波部１６において２つに分岐された内の一方の励起光は、ミラー１７，１８によって迂回される他方の光路を経由した後、合波部１９によって合波されて顕微鏡本体４に入射される。このとき、他方の光路を通過した励起光は、一方の光路より長い光路長を経由することによって、時間的な遅れを生じ、一方の光路を経由して顕微鏡本体４に入射される励起光とは位相が反転させられる。
【００５１】
また、他方の光路を通過した励起光は、合波部１９により合波されることにより、一方の光路を通過した励起光と略同等の光路に戻されるが、ミラー１８の角度および位置が設定されることにより、スキャナ７に入射する際の角度が異ならされる。
【００５２】
その結果、一方の光路を通過した励起光は、ピンホール１１と共役な標本Ａ内の位置に集光させられるので、その焦点位置近傍において発生した蛍光が、対物レンズ８によって集光され、スキャナ７を経由して戻る途中でダイクロイックミラー９によって分離され、結像レンズ１０によって集光されてピンホール１１を通過し、光検出器１２により検出される。
【００５３】
この場合においても、上記実施形態と同様にして、一方の光路を通過した励起光の照射により検出される蛍光には、対物レンズ８の焦点位置において発生した蛍光と、他の部位において発生した焦点外蛍光とが含まれている。また、他の光路を通過させられた励起光の照射により検出される蛍光には、焦点外蛍光のみが含まれている。
【００５４】
そして、演算部において、これらの２つの光路を通過した励起光の照射により検出された蛍光の差分が演算されることにより、焦点外蛍光が除去された焦点蛍光を検出することができる。
本実施形態によれば、可動ミラー１３によって２種類の励起光を交互に切り替える場合と比較して、極めて迅速に励起光を切り替えることができるという利点がある。
【００５５】
本実施形態においては、分波部１６および合波部１９として偏光ビームスプリッタを例示したが、これに代えて、ハーフミラーのような無偏光ビームスプリッタを用いてもよい。また、合波部１９としては、図４に示されるようにミラー１９を用いてもよい。図中符号２６は光路を形成するためのミラーである。
【００５６】
また、本実施形態においては、スキャナ７への入射角度が異なりかつ反転した位相を与えられた２種類の励起光を発生させる空間光学系３５に代えて、図５に示されるように、光ファイバ２０を用いてもよい。
【００５７】
図５に示す例では、レーザ光源２からの明滅する励起光を入射させる第１の光ファイバ２０ａを、ファイバビームスプリッタ２０ｂによって２つの第２の光ファイバ２０ｃ，２０ｄに分岐し、２つの第２の光ファイバ２０ｃ，２０ｄの長さを異ならせるとともに、射出端の角度を異ならせることにしている。
２つの第２の光ファイバ２０ｃ．２０ｄの長さは、導光後に射出される励起光の位相を完全に反転させる程度の光路長差を生じさせる程度に相違している。
第２の光ファイバ２０ｃは、図５に示されるように巻かれることによりコンパクトに構成でき、装置の小型化を図ることができる。
【００５８】
また、単一のレーザ光源２からの励起光から２種類の励起光を作ることに代えて、図６に示されるように、位相差発生器２７によって、相互に同期して、反転位相で発振する励起光を射出する２つのレーザ光源２１，２２を使用し、ミラー１８および合波部１９によって、各レーザ光源２１，２２からの励起光のスキャナ７への入射角度を異ならせることにしてもよい。この場合、位相差発生器２７、ミラー１８および合波部１９により切替部３が構成される。
このようにすることで、ビームを２つに分離しないため最大レーザ出力を維持することができ、励起光強度を大きく設定することができる。また、レーザの同期により位相差を与えるためコンパクトな構成が可能である。
【００５９】
また、本実施形態においては、レーザ光源２として、所定の周期で発振する励起光を発生するものに代えて、図７に示されるように、連続的に励起光を発生するレーザ光源２と、該レーザ光源２から射出された励起光の偏光比率を任意の繰り返し波形に変化させる光学素子２３（例えば、電気光学素子）とを備えたものを採用してもよい。この場合、光学素子２３を駆動する周波数と演算部の周波数とを同期させればよい。
【００６０】
この場合には、第１のビームスプリッタとしては偏光ビームスプリッタ（分波部）２４を使用する。
このようにすることで、光路長によって明滅のタイミングを反転させる必要がないので、光路長差を大きく確保する必要がなく、装置をコンパクト化できるという利点がある。また、光学素子２３によれば、可動ミラー１３による場合よりも高速に切り替えることができる。
【００６１】
また、光学素子２３に代えて、励起光強度を周期的に変化させる光学素子（例えば、音響光学素子）２８を使用する場合には、図８に示されるように、分波部１６により分岐された２つの光路にそれぞれ光学素子２８を配置し、周波数発振器１４によって２つの音響光学素子２８を同期させて励起光の強度を位相が反転するように変調する。これによっても、光学素子２３の場合と同様に、光路長によって明滅のタイミングを反転させる必要がないので、光路長差を大きく確保する必要がなく、装置をコンパクト化できるという利点がある。また、可動ミラー１３による場合よりも高速に切り替えることができる。
【００６２】
また、上記各実施形態においては、顕微鏡本体４に入射させる励起光として２種類の励起光を用意したが、これに代えて、図９（ａ），（ｂ）に示されるように、１種類の励起光を入射させるとともにピンホール１１を直動機構２５によって光軸に交差する方向に移動させることにより、対物レンズ７の焦点位置とピンホール１１との共役な位置関係と非共役な位置関係とを切り替えることにしてもよい。
【００６３】
また、本実施形態においては、光検出器１２により取得された蛍光の差分を画素毎に演算することとしたが、画像毎に演算してもよい。
また、演算部３においては、ロックインアンプによってハードウェア的に減算することとしたが、これに代えて、演算部３をコンピュータにより構成し、信号処理等のソフトウェアを用いて差分を演算してもよい。
【００６４】
また、本実施形態においては、対物レンズ８により集光した蛍光を、スキャナ７を介して戻す途中で検出する共焦点顕微鏡を例示したが、これに代えて、図１０に示されるように、多光子励起顕微鏡に適用してもよい。この場合には、レーザ光源２として極短パルスレーザ光源を使用し、フェムト秒オーダーのパルス幅より十分に大きな周波数で発振あるいは切り替えることにすればよい。また、多光子励起顕微鏡においても、光検出器１２の前段の、対物レンズ７の焦点位置と光学的に共役な位置にピンホール１１を配置すればよい。
【００６５】
また、上記各実施形態においては、スキャナ７による各走査位置において、ピンホール１１と光学的に共役な位置に焦点を結んだ励起光により発生した蛍光と、ピンホール１１と光学的に非共役な位置に焦点を結んだ励起光により発生した蛍光の２つの蛍光の差分を演算することとしたが、これに限定されるものではなく、複数点の蛍光を検出して演算することにしてもよい。例えば、図１１に示されるように、図３の空間光学系３５として、分波部１６により分岐された他方の光路をさらに分岐する第２の分波部３６および分岐された２つの光路を通過した励起光を合波する第２の合波部３７を備えるものを採用してもよい。
【００６６】
光路を形成するためのミラー２６の角度を適当に調節することにより、標本Ａにおける集光点とピンホール１１とを非共役な位置関係とするようにスキャナ７に異なる角度で入射させられる２つの励起光を作ることができる。これらの２つの励起光Ｌ１，Ｌ２の位相は、相互に同一位相を有しかつ一方の光路を通過してきた励起光Ｌ３とは反転した位相を有している。また、２つの励起光Ｌ１，Ｌ２の強度は、励起光Ｌ３の半分である。したがって、下式のように演算部では、励起光Ｌ３を照射したときに得られた蛍光Ｆ３から、励起光Ｌ１，Ｌ２を照射したときに得られた蛍光Ｆ１，Ｆ２の和を減算して蛍光Ｆを算出することが行われればよい。
Ｆ＝Ｆ３−（Ｆ１＋Ｆ２）
【００６７】
また、例えば、図１２に示されるように、ピンホール１１と励起光の集光点とを共役な位置関係とする励起光Ｌ３の光路に、分波部３８および合波部３９を設け、レーザ光源２から入射される励起光の２倍の周波数で発振する励起光Ｌ３を生成してもよい。この場合には励起光Ｌ３の強度は励起光Ｌ１，Ｌ２と同じとなる。したがって、下式のように、演算部では、励起光Ｌ３を照射したときに得られた蛍光Ｆ３から、その直後に励起光Ｌ１，Ｌ２を照射したときに得られた蛍光Ｆ１，Ｆ２をそれぞれ減算したものの平均により蛍光Ｆを算出することが行われればよい。
Ｆ＝｛（Ｆ３−Ｆ１）＋（Ｆ３−Ｆ２）｝／２
【００６８】
なお、励起光Ｆ１，Ｆ２が２つの場合を例示したが、３以上に分岐されてもよい。
また、上記各実施形態においては、スキャナ７への励起光の入射角度を異ならせて、励起光の集光点を光軸に交差する方向に移動させることで、ピンホール１１と励起光の集光点との位置関係を光学的に非共役な位置関係に切り替えることとしたが、これに代えて、図１３に示されるように、分波部１６によって分岐された一方の光路にレンズ４０を配置することにより、励起光の集光位置を標本Ａの深さ方向に移動させて非共役な位置関係を成立させることにしてもよい。
【符号の説明】
【００６９】
Ａ  標本（試料）
１  顕微鏡
２  レーザ光源（光源）
３  切替部
５  演算部
７  スキャナ
８  対物レンズ（対物光学系）
１１  ピンホール（遮光部材）
１２  光検出器（検出器）
１３  可動ミラー（偏向素子）
１５  空間光学系（切替部）
１６  分波部
２０  光ファイバ
２０ｂ  ファイバビームスプリッタ（切替部）
２０ｃ，２０ｄ  第２の光ファイバ（光ファイバ）
２１，２２  レーザ光源（光源）
２３  光学素子
２４  変更ビームスプリッタ（分波部）
２５  直動機構（切替部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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