(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の培養細胞を、当該培養細胞に含まれる少なくとも一つの標的成分の周期構造の存在について検査する方法であって、
−  検査対象となる複数の培養細胞を用意するステップと、
−  前記培養細胞に含まれる前記少なくとも一つの標的成分に何らかの構造があればそれを維持しつつ、前記検査対象となる複数の培養細胞を固定するステップと、
−  前記固定された培養細胞に含まれる前記少なくとも一つの標的成分を、前記少なくとも一つの標的成分に結合するとともに刺激に応答して第１波長の光を発光可能な第１着色剤を用いて、着色するステップと、
−  前記第１着色剤を刺激して、前記第１波長の光を発光させるステップと、
−  前記第１着色剤が前記第１波長の光を発光している状態の前記固定された培養細胞の二次元画像（２）を撮影するステップと、
−  前記固定された培養細胞のこの二次元画像から、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分を含む部分のみを明るく示す二次元の第１のフィルター処理済画像（５）を抽出するステップと、
−  前記第１のフィルター処理済画像（５）を自己相関させることで、あるいは、前記固定された培養細胞の前記二次元画像から抽出された、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分を含む部分以外の部分のみを明るく示す第２の二次元のフィルター処理済画像と前記第１のフィルター処理済画像を相互相関させることで、二次元相関画像（３）を取得するステップと、
−  前記相関画像（３）の中に、明るさにおける最大値（３０）と最小値（３１）の周期構造があるか否かを判定することによって、前記固定された培養細胞に含まれる前記少なくとも一つの標的成分の周期構造の有無を判定するステップと
を有し、
前記二次元の相関画像（３）の前記明るさを全周にわたって特定の半径で平均化すること、そして、前記全周にわたる前記明るさの平均化を異なる半径で実行して一変量の相関関数（６）を取得すること、そして、当該一変量の相関関数（６）から、前記固定された培養細胞の前記二次元画像（２）におけるストライプ状態の度合いを、明るさの隣接する２つの最大値（６０）の間の距離を求めることによって、または、前記一変量の相関関数の明るさの最大値（６０）と隣接最小値（６１）との間の距離を求めることによって、および、隣接する２つの最大値（６０）の明るさの大きさの比率、または、前記一変量の相関関数（６）の最大値（６０）と隣接する最小値（６１）との明るさの大きさの比率を求めることによって取得すること、を特徴とする方法。
【請求項２】
前記二次元の第１および第２のフィルター処理済画像を抽出するステップは、前記固定された培養細胞の前記二次元画像のリッジ−ヴァレー・フィルター処理を実行して、
前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分のストライプ状構造の明るさを強め、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分に、ストライプ状構造以外に何らかの構造があればその明るさを弱めた二次元リッジ画像（５）を生成して前記第１のフィルター処理済画像とするとともに、
前記第１着色剤が結合した前記標的成分のストライプ状構造の間に配置されたストライプ状構造の明るさを強め、前記第１着色剤が結合した前記ストライプ状構造の間に配置されたストライプ状構造以外の構造の明るさを弱めた二次元ヴァレー画像を生成して前記第２のフィルター処理済画像とする
ことを含み、前記リッジ画像（５）および前記ヴァレー画像が相互相関して前記相関画像（３）を形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相関画像（３）が、
−  前記第１のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像を取得し、当該フーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像を自乗して二次元のフーリエ変換済の相関画像を取得し、または、
−  前記第１のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行し、前記第２のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の第２のフィルター処理済画像を取得し、前記フーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像と前記フーリエ変換済の第２のフィルター処理済画像とを掛け合わせて、二次元のフーリエ変換済の相関画像を取得し、
−  前記フーリエ変換済の相関画像の逆フーリエ変換を実行して前記二次元の相関画像（３）を取得する
ことによって生成されることを特徴とする先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２のフィルター処理済画像の前記フーリエ変換を実行するステップおよび前記フーリエ変換済の相関画像の前記逆フーリエ変換を実行するステップが、高速フーリエ変換アルゴリズムを用いて実行されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二次元の相関画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の相関画像（４）を取得するステップをさらに有し、当該フーリエ変換済の相関画像（４）から、明るさの隣接する２つの最大値（４０）の間の距離（ｋ，Ｋ）が、前記培養細胞の前記二次元画像（２）におけるストライプ状構造の間の距離の尺度として決定されること、および、さらに、明るさの前記隣接する最大値が配置されている角度（φ，α）が、前記周期的なストライプ状構造（２０）が前記培養細胞の前記二次元画像（２）に配置されるグローバルな配向（２１）を表すものとして決定されること、を特徴とする先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記二次元の相関画像（３）のフーリエ変換を実行するステップが、高速フーリエ変換アルゴリズムを用いて実行されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の損傷を伴う筋肉の疾患または心筋層の疾患を治療するための薬品候補となり得る物質を特定する方法であって、
−  サルコメア構造を有する複数の生きた筋細胞または心筋細胞を用意するステップと、
−  ストレス付与物質を、前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えた後で、前記破壊または少なくとも大幅に減少させたサルコメア構造を有する前記複数の筋細胞または心筋細胞に、候補物質を加えるステップと、
−  前記候補物質を加えた後で、前記筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達したか否かを判定するステップと、
−  前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達した場合に、前記候補物質を、薬品候補となり得る物質と評価するステップと、
を有し、前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達したか否かを判定するステップは請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いることを特徴とする方法。
【請求項８】
筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の損傷を伴う筋肉の疾患または心筋層の疾患に対する保護効果を有する、薬品候補となり得る物質がもつ能力を特定する方法であって、
−  サルコメア構造を有する複数の生きた筋細胞または心筋細胞を用意するステップと、
−  前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に、候補物質を加えるステップと、
−  前記候補物質を加えた後で、ストレス付与物質を、前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えた後で、前記筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞において前記サルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えたことが、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させることにならなかった場合に、前記候補物質を、薬品候補となり得る物質と評価するステップと、
を有し、前記物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップは請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いることを特徴とする方法。
【請求項９】
生きた人工多能性幹細胞から得られた生きた筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の存在を判定する方法であって、
−  複数の生きた人工多能性幹細胞を用意するステップと、
−  前記生きた人工多能性幹細胞を生きた筋細胞または心筋細胞に分化させるステップと、
−  前記生きた筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記培養された筋細胞または心筋細胞がサルコメア構造を有するか否かを判定するステップと
を有し、前記培養された生きた筋細胞または心筋細胞がサルコメア構造を有するか否かを判定するステップは、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いることを特徴とする方法。
【請求項１０】
−  前記生きた筋細胞または心筋細胞を培養する前に、前記生きた筋細胞または心筋細胞にストレス付与物質を加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を実行した後で、前記ストレス付与物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞において前記サルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップと
をさらに有する請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］  本発明は、複数の培養細胞を、当該培養細胞に含まれる少なくとも一つの標的成分（たとえば、一つ以上のタンパク質）の周期構造の存在について検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景］  心筋層の、あるいは骨格筋の、重篤な疾患の種々の表現型は、それぞれ、心筋細胞あるいは筋細胞におけるサルコメア（筋節）構造の損傷と関連している。説明を簡単明解にするため、以下、心筋細胞のみに言及する。心筋細胞において、サルコメアは、収縮および弛緩が可能な最小のサブユニットである。  
【０００３】
サルコメアを、図１（弛緩状態）および図２（収縮状態）に、模式的に示す。サルコメア１は、２つのＺ盤１０が境界をなし、さらに、２つの交互嵌合したフィラメント系を備えている。２つの交互嵌合したフィラメント系のうち第１のフィラメント系に属する細いフィラメントは、六量体アクチン鎖から構成され、２つの交互嵌合したフィラメント系のうち第２のフィラメント系に属する太いフィラメントは、六量体ミオシン鎖１２から構成されている。このミオシン鎖１２は、タンパク質タイチンからなる２つの弾性要素１３を介して、前記２つのＺ盤１０に結合している。ＡＴＰ（アデノシン三リン酸：adenosinetriphosphate）が加水分解すると、ミオシン鎖１２のモータータンパク質ミオシンが構造変化し、この構造変化がパワーストロークに変換されてアクチン鎖１１を変位させ、サルコメア１を収縮させる（図２参照）。このようなサルコメア１が大量に収縮すると、心筋層を収縮させ、逆のプロセスが起こると、心筋層を弛緩させる。  
【０００４】
この収縮運動は、すでに、自発的な同調した拍動を示す生きた成熟培養心筋細胞において観察することができる。そして、生きた心筋細胞の、この自発的で同調した拍動は、生きた心筋細胞の成熟した発達状態を示す特徴として利用することができる。  
【０００５】
固定した心筋細胞において、サルコメア構造の構造的完全性は、心筋細胞の成熟した発達状態を示す。心筋細胞の固定は、たとえば、生きた心筋細胞に洗浄剤を加える（それによって生きた心筋細胞の細胞膜が損傷し、生きた心筋細胞が殺される）ことによって、および、ホルムアルデヒドを加える（それによって心筋細胞に含まれるタンパク質が架橋されるが心筋細胞内のタンパク質の構造は維持され固定されたままとなる）ことによって実現することができる。  
【０００６】
サルコメア構造の損傷と関連する心筋細胞の疾患に対する潜在的に効力を持つ薬品の候補物質を特定するために、心筋細胞を殺すことなく心筋細胞がその拍動能力を失うまでグルコースおよび／またはエンドセリンのような物質を加えることによって生きた心筋細胞にストレスを付与するインビトロでの実験（心筋症シミュレーション）が行われる。その後、そのストレスを付与した心筋細胞に薬品の候補物質を加えて、その薬品の候補物質が心筋細胞に拍動を再開させる回復効果があるか否かを検査する。この検査のため、心筋細胞の小さな動画が録画され、心筋細胞が拍動を再開させたかについて解析される（拍動の収縮とそれに続く弛緩のサイクルは、動画解析によってのみ評価可能である）。しかし、このような動画の解析は、人が動画を見ることによってなされなければならず、それには時間と人員が必要である。また、動画を見て解析する人は、必要な教育とスキルがなければならない。  
【０００７】
別の選択肢として、薬品の候補物質を生きた心筋細胞に加えた後、そして、続けてそれらを固定させた後に、固定された心筋細胞を、サルコメアの周期構造の存在について検査する。そのようなサルコメアの周期構造は、心筋細胞が固定に先立って回復していたことを表している。検査は、固定された心筋細胞の画像（これは、光学的検査を通じて人が注意深く解析しなければならない）を撮影することによって実施することができる。これも、非常に時間と人員が必要であり、光学的検査を実施する人は、必要な教育とスキルがなければならない。教育とスキルがあったとしても、画像解析は非常に難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、培養細胞を、一般に培養細胞中の特定の成分の周期構造の存在について検査する改善された方法を提案することを目的とする。特に、本発明は、筋肉の疾患、または、サルコメア構造の損傷に伴う心筋層の疾患を治療するための薬品候補となり得る物質を特定する方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様によれば、本発明は、複数の培養細胞を、当該培養細胞に含まれる少なくとも一つの標的成分の周期構造の存在について検査する方法を提案する。この方法は、  −  検査対象となる複数の培養細胞を用意するステップと、  −  前記培養細胞に含まれる少なくとも一つの標的成分に何らかの構造があればそれを維持しつつ、前記検査対象となる培養細胞を固定するステップと、  −  前記固定された培養細胞に含まれる前記少なくとも一つの標的成分を、前記少なくとも一つの標的成分に結合するとともに刺激に応答して第１波長の光を発光可能な第１着色剤を用いて、着色するステップと、  −  前記第１着色剤を刺激して、前記第１波長の光を発光させるステップと、  −  前記第１着色剤が前記第１波長の光を発光している状態の前記固定された培養細胞の二次元画像を撮影するステップと、  −  前記固定された培養細胞のこの二次元画像から、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分を含む部分のみを明るく示す二次元の第１のフィルター処理済画像を抽出するステップと、  −  前記第１のフィルター処理済画像を自己相関させることで、あるいは、前記固定された培養細胞の前記二次元画像から抽出された、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分を含む部分以外の部分のみを明るく示す二次元の第２のフィルター処理済画像と前記第１のフィルター処理済画像を相互相関させることで、二次元相関画像を取得するステップと、  −  前記二次元相関画像の中に、明るさにおける最大値と最小値の周期構造があるか否かを判定することによって、前記固定された培養細胞に含まれる前記少なくとも一つの標的成分の周期構造の有無を判定するステップと  を有する。  
【００１０】
一般に、前記方法は、任意のタイプの細胞を、当該細胞内に何らかの周期構造があればその存在について、インビトロで検査することができるが、筋細胞、特に心筋細胞を、サルコメアの周期構造の存在について検査する場合に特に適合的である。したがって、例示として、以下の説明においては、心筋細胞をサルコメアの周期構造の存在について検査することに関し説明する。  
【００１１】
一般に、検査対象となる培養心筋細胞は、たとえば、その拍動能力を喪失させるためにグルコースおよび／またはエンドセリン（または何か他の適当な物質があればそれ）によりストレスが付与され（心筋症のシミュレーション）、続けて薬品候補物質が加えられた、生きた心筋細胞は、固定される。心筋細胞の固定は、細胞膜を傷つけ、心筋細胞を「殺す」ことになるが、心筋細胞中に含まれる何らかの周期的なサルコメア構造があればそれは、その固定するステップの間、保持される。検査対象の心筋細胞は、もはや生きていないが、乾燥を防ぐため中性の液体中に保存しておくとよい。  
【００１２】
前記固定された心筋細胞のサルコメアの少なくとも一つの成分、たとえば、固定された心筋細胞のサルコメアのＺ盤に含まれるタンパク質アクチニンが、次に着色される。そのために、固定された心筋細胞に、適切な着色剤が加えられてもよい。そのような適切な着色剤としては、刺激に応答して所定波長の光を発することができるラベルを備えたアクチニン抗体が使用できる。ラベルを備えたアクチニン抗体が心筋細胞に含まれるタンパク質アクチニンに結合すると、着色剤が刺激され、ラベルに所定波長の光を発光させる。  
【００１３】
所定波長の光の発光中、培養心筋細胞の二次元画像が撮影される。固定された培養心筋細胞のこの二次元画像から、二次元の第１のフィルター処理済画像が抽出される。この第１のフィルター処理済画像は、ラベルを備えたアクチニン抗体が結合したタンパク質アクチニンを含む固定された培養心筋細胞の画像の部分のみを明るく示す。  
【００１４】
一般に、そのとき、２つのオプションがある。第１のオプションは、二次元相関画像を生成するために、第１のフィルター処理済画像を自己相関させることである。第２のオプションは、第１のフィルター処理済画像を第２のフィルター処理済画像と相互相関させることである。第２のフィルター処理済画像も、固定された培養心筋細胞の二次元画像から抽出された二次元画像である。もっとも、第１のフィルター処理済画像とは異なり、第２のフィルター処理済画像は、固定された培養心筋細胞のうち着色されたタンパク質アクチニンの部分以外の部分のみを明るく示す。その後、第１のフィルター処理済画像および第２のフィルター処理済画像は、相互相関されて、二次元相関画像を生成する。  
【００１５】
数学用語で、第１のフィルター処理済画像の自己相関は、第１のフィルター処理済画像の個別ピクセルの強度の第１のフィルター処理済画像の個別ピクセルの強度とのたたみ込みに対応する。あるいは、別の言葉で言い換えれば、自己相関とは、第１のフィルター処理済画像の自己とのたたみ込みである。第１のフィルター処理済画像および第２のフィルター処理済画像（複数）の相互相関は、第１および第２のフィルター処理済画像の個別ピクセルの明るさにおける強度（定義上明らかに、ゼロ空間変位において反相関関係にある）のたたみ込みに対応する。しかし、個別ピクセルの明るさにおける強度の数学的たたみ込みをコンピュータに実行させると、非常に演算処理の負荷が高くなってしまう。原理上、これは可能ではあるが、数学的たたみ込みを実行するよりも効率的な方法があり、そのようなより効率的な方法は、同じ結果に到達するが、演算負荷はずっと小さい。そのようなより効率的な方法のための例を、以下に、詳しく検討する。  
【００１６】
相関画像が、明るさにおける最大値と最小値の周期構造を示す場合、それは、固定された心筋細胞のサルコメアのＺ盤に含まれるタンパク質アクチニンの周期構造があることを意味する。相関画像内の周期構造がどのように見えるかによって、その相関画像から、心筋細胞に含まれる周期的サルコメア構造（詳細は具体例を援用して後述する）に係る結論を導くことができる。  
【００１７】
総体として、本発明による方法は、先行技術の方法（動画を記録し、その動画を光学分析し、心筋細胞が拍動しているか否かを判定する）に必須の時間と手間のかかるステップをもはや必要としない（固定された培養細胞の複雑な光学分析が、まったく不要な場合もある）、培養細胞を、当該培養細胞に含まれる周期構造の存在について検査するための、改良されたインビトロの方法（たとえば、方法は、標準規格品のマイクロプレートのウェル（くぼみ）に入れて実行することができる）を提供するものである。代替するものとして、本発明による方法は、固定された培養細胞の前記した二次元画像を撮影し、この二次元画像から一ないし複数のフィルター処理済画像を抽出し、これらのフィルター処理済画像を相関させて相関画像を生成し、当該相関画像の中に、明るさにおける最大値と最小値の周期構造があるか否かを判定することによって、培養細胞中の周期構造の有無を判定することを提案するものである。これらのステップは、完全に自動的に実行することができる。  
【００１８】
本発明による方法のいくつかの実施形態において、前記二次元の第１および第２のフィルター処理済画像を抽出するステップは、前記固定された培養細胞の前記二次元画像のリッジ−ヴァレー・フィルター処理を実行して、二次元リッジ画像を生成するとともにヴァレー画像を生成することを含む。リッジ画像において、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分のストライプ状構造の明るさは強められ、前記第１着色剤が結合した前記少なくとも一つの標的成分のストライプ状構造以外の構造の明るさは弱められている。リッジ画像は第１のフィルター処理済画像を形成する。ヴァレー画像において、前記第１着色剤が結合した前記標的成分のストライプ状構造の間に配置されたストライプ状構造の明るさは強められ、前記第１着色剤が結合した前記ストライプ状構造の間に配置されたストライプ状構造以外の構造の明るさは弱められている。このヴァレー画像は第２のフィルター処理済画像を形成する。そして、リッジ画像およびヴァレー画像は、相互相関して、相関画像を形成する。  
【００１９】
本発明による方法のこの実施形態は、リッジ−ヴァレー・フィルター処理によってストライプ状構造のみの明るさを強め、ストライプ状構造以外に何らかの構造があればそれを弱めるので、心筋細胞中のサルコメア構造のようなストライプ状構造の検出に有利である。したがって、固定された培養細胞の画像中に含まれるストライプ状構造以外の構造が抑制される。心筋細胞のサルコメアのＺ盤に含まれる着色されたタンパク質アクチニンに関連する前述の例についていえば（固定された心筋細胞が損なわれていない状態のサルコメア構造を含んでいると仮定すると）、このことは、リッジ画像が、着色されたアクチニンタンパク質（Ｚ盤）の構造のみの明るさを強め、培養細胞の画像に含まれる何らかの他のストライプ状情報があればそれは、リッジ画像中で抑制される（対応するピクセルが、リッジ画像中、暗くなる）ことを意味する。もっとも、この情報は、着色されたアクチニンタンパク質のストライプ状構造の間のストライプ状構造を強めるヴァレー画像中に含まれている。この情報も利用するためには、相関画像を生成するときに、リッジ画像をヴァレー画像と相互相関させて相関画像を生成する。しかし、一般には、リッジ画像を自己相関させるだけで相関画像を生成することも想定可能である。とはいえ、この場合には、リッジ画像で抑制された情報が失われ、相関画像にはもう含まれていないことになる。したがって、リッジ画像とヴァレー画像とを相互相関させることが、リッジ画像を自己相関させるよりも有利である。  
【００２０】
本発明による方法のいくつかの他の実施形態において、相関画像は、
−  前記第１のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像を取得し、当該フーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像を自乗して二次元のフーリエ変換済の相関画像を取得し、または、
−  前記第１のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像を取得し、前記第２のフィルター処理済画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の第２のフィルター処理済画像を取得し、前記フーリエ変換済の第１のフィルター処理済画像と前記フーリエ変換済の第２のフィルター処理済画像とを掛け合わせて、二次元の掛け合わせたフーリエ変換済の相関画像を取得し、
−  前記掛け合わせたフーリエ変換済の相関画像の逆フーリエ変換を実行して前記二次元の相関画像を取得する
ことによって生成される。
【００２１】
この実施形態は、第１のフィルター処理済画像の自己相関を通じて、または、第１のフィルター処理済画像および第２のフィルター処理済画像の相互相関を通じて、相関画像を取得するための演算負荷を大幅に減少するものであるという点で有利である。上述のように、自己相関または相互相関とは、数学用語においては、実行されるたたみ込みを意味する。相関画像を取得する計算負荷のこのような非常に顕著な減少について例示するため、以下に一つの例を検討する。
【００２２】
0006524598.tif 000002
【００２３】
0006524598.tif 000003
【００２４】
これは、リッジ画像およびヴァレー画像の一つの特定の相対変位（ｄｘ，ｄｙ）に対する相関画像の強度値を取得するためには、その特定の変位（ｄｘ，ｄｙ）に対する強度値（明るさ）を、上に概略を示した等式（たたみ込み）にしたがって計算しなければならない。したがって、すべての相対変位（ｄｘ，ｄｙ）に対する相関画像における強度値を取得するためには、リッジ画像およびヴァレー画像を用いて実行するべき多くの演算処理がある。しかし、この演算処理は、リッジ画像およびヴァレー画像のフーリエ変換後に大幅に減少する。上に概略を示したリッジ画像およびヴァレー画像のたたみ込みは、フーリエ変換済の相関画像を取得するためのフーリエ変換済のリッジおよびヴァレー画像（相対変位なし）の１回の掛け合わせに対応し、そして、相関画像を取得するためには、フーリエ変換済の相関画像の逆フーリエ変換のみを実行しなければならない。
【００２５】
上述の方法の好ましい実施形態によれば、前記第１および第２のフィルター処理済画像（前記した例においては、リッジ画像およびヴァレー画像）の前記フーリエ変換を実行するステップおよび前記フーリエ変換済の相関画像の前記逆フーリエ変換を実行するステップは、高速フーリエ変換アルゴリズムを用いて実行される。これらは、フーリエ変換および逆フーリエ変換を非常に効率的に実行するための周知の数値アルゴリズムである。
【００２６】
本発明による方法のいくつかの実施形態において、前記二次元の相関画像の前記明るさを全周にわたって特定の半径で平均化すること、そして、前記全周にわたる前記明るさのこのような平均化を異なる半径で実行して一変量の相関関数を取得する。この一変量の相関関数から、前記固定された培養細胞の前記二次元画像におけるストライプ状態の度合いが、明るさの隣接する２つの最大値の間の距離を求めることによって、または、前記一変量の相関関数の明るさの最大値と隣接最小値との間の距離を求めることによって、および、隣接する２つの最大値の明るさの大きさの比率、または、前記一変量の相関関数の最大値と隣接する最小値との明るさの大きさの比率を求めることによって取得される。
【００２７】
この実施形態は、固定された培養細胞の二次元画像の中のストライプ構造の分布が等方的である（ランダムに配向している）場合に有利である。なぜなら、この場合、相関画像中の一つの特定の半径においては、強度はその特定の半径において円周に沿って実質的に均一に分布しているため平均化することで消去される情報はないからである。一変量の相関関数とは、ストライプ構造を含む細胞の数と、それらストライプの変調の大きさと、それらの周期性の均一性とのたたみ込みである。一変量の相関関数において、明るさの隣接する２つの最大値の間の距離の間または最大値と隣接最小値との間の距離、および、２つの隣接する最大値の間の明るさの大きさの比率または最大値と隣接する最小値との間の明るさの大きさの比率は、固定された培養細胞の二次元画像におけるストライプ状態の度合いに関して報告する関連する特徴である。
【００２８】
本発明による方法のいくつかの実施形態は、前記二次元の相関画像のフーリエ変換を実行して二次元のフーリエ変換済の相関画像を取得するステップをさらに有する。このフーリエ変換済の相関画像から、明るさの隣接する２つの最大値の間の距離が、前記培養細胞の前記二次元画像におけるストライプ状構造の間の距離の尺度として決定される。さらに加えて、明るさの前記隣接する最大値が配置されている角度が、前記周期的なストライプ状構造が前記培養細胞の前記二次元画像に配置されるグローバルな配向（global orientation）を表すものとして決定される。
【００２９】
0006524598.tif 000004
【００３０】
ここでも、前記二次元の相関画像のフーリエ変換を実行するステップは、好ましくは、前述した周知の高速フーリエ変換アルゴリズムを用いて実行される。
【００３１】
固定された培養細胞の二次元画像に何らかのストライプ状構造が含まれているときそれが等方的である（ランダムに配向している）か、（グローバルに）配向されているかをあらかじめ予測することはできないので、好適な実施形態においては、一変量の相関関数と、相関画像のフーリエ変換済の画像とをともに解析して、そのどちらが、固定された培養細胞の二次元画像に含まれるストライプ状態に関するより明白な情報を含むものであるかを判定する。
【００３２】
すでに上で述べたように、本発明による方法は、一般に、細胞中に含まれる周期構造の存在について、任意のタイプの細胞を検査するのに適しているが、特に、筋細胞または心筋細胞が周期的なサルコメア構造を含んでいるか否かを判定するのに適している。
【００３３】
したがって、本発明の他の態様は、筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の損傷を伴う筋肉の疾患または心筋層の疾患を治療するための薬品候補となり得る物質を特定する方法に関連する。この方法は、
−  サルコメア構造を有する複数の生きた筋細胞または心筋細胞を用意するステップと、
−  ストレス付与物質を、前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えた後で、前記破壊または少なくとも大幅に減少させたサルコメア構造を有する前記複数の筋細胞または心筋細胞に、候補物質を加えるステップと、
−  前記候補物質を加えた後で、前記筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達したか否かを判定するステップと、
−  前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達した場合に、前記候補物質を、薬品候補となり得る物質と評価するステップと、
を有する。前記候補物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が再び発達したか否かを判定するステップは、上述の諸実施形態のうちのいずれかにより培養細胞を検査する方法を用いること含んでいる。
【００３４】
本発明の他の態様は、筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の損傷を伴う筋肉の疾患または心筋層の疾患に対する保護効果を有する、薬品候補となり得る物質がもつ能力を特定する方法に関連する。この方法は、
−  サルコメア構造を有する複数の生きた筋細胞または心筋細胞を用意するステップと、
−  前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に、候補物質を加えるステップと、
−  前記候補物質を加えた後で、ストレス付与物質を、前記複数の生きた筋細胞または心筋細胞に加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えた後で、前記筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞において前記サルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップと、
−  前記ストレス付与物質を加えたことが、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させることにならなかった場合に、前記候補物質を、薬品候補となり得る物質と評価するステップと、
を有する。前記物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞においてサルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップは、上述の諸実施形態のうちのいずれか一つにより培養細胞を検査する方法を用いることを含んでいる。
【００３５】
この方法は、筋細胞または心筋細胞のサルコメア構造の部分的または完全な破壊に繋がりかねない物質（たとえば、グルコースおよび／またはエンドセリン）に筋細胞または心筋細胞が曝された場合に、筋細胞または心筋細胞のストレス反応を妨げるもしくは少なくとも大幅に減少させるという点で防護効果を有するかもしれない薬品候補となり得る物質を特定するのに役立つ。このような薬品候補となり得る物質は、その後すぐに、それらの防護または予防処置の一部を構成し得るような薬品へと開発される可能性についてさらに評価することができる。
【００３６】
本発明のさらに他の態様は、生きた人工多能性幹細胞から得られた生きた筋細胞または心筋細胞におけるサルコメア構造の存在を判定する方法に関連する。この方法は、
−  複数の生きた人工多能性幹細胞を用意するステップと、
−  前記生きた人工多能性幹細胞を生きた筋細胞または心筋細胞に分化させるステップと、
−  前記生きた筋細胞または心筋細胞を培養するステップと、
−  前記培養された筋細胞または心筋細胞がサルコメア構造を有するか否かを判定するステップと
を有し、前記培養された生きた筋細胞または心筋細胞がサルコメア構造を有するか否かを判定するステップは、上述の諸実施形態のうちのいずれか一つにより培養細胞を検査する方法を用いることを含んでいる。
【００３７】
この方法は、人工多能性幹細胞の、生きた筋細胞または心筋細胞への分化成功を評価することを可能にする。人工多能性幹細胞は、たとえば、再プログラミングおよび分化を通じて、真皮細胞から得られる。そのように得られた筋細胞または心筋細胞に含まれるサルコメアの構造的完全性は、筋細胞または心筋細胞の成熟発達を示しており、この場合には、そのとき、多能性幹細胞の筋細胞または心筋細胞への分化が成功したことを示している。
【００３８】
この方法のさらに他の実施形態は、追加ステップとして、
−  前記生きた筋細胞または心筋細胞を培養する前に、前記生きた筋細胞または心筋細胞にストレス付与物質を加えて、前記サルコメア構造を破壊または少なくとも大幅に減少させるステップと、
−  上述の諸実施形態のうちのいずれか一つにより培養細胞を検査する方法を実行した後で、前記ストレス付与物質を加えたことで、前記培養された筋細胞または心筋細胞において前記サルコメア構造が破壊または少なくとも大幅に減少したか否かを判定するステップと
をさらに有する。
【００３９】
方法のこの実施形態によれば、上述の方法で得られた筋細胞または心筋細胞のストレス反応に関する情報を得ることができる。もしも、筋細胞または心筋細胞のストレス反応が、適切に機能している筋細胞または心筋細胞から予想される反応であった場合は、方法のこの実施形態は、診断方法の一部を構成する。そのような診断方法においては、たとえば、真皮細胞が、患者から採取され、再プログラミングされて、筋細胞または心筋細胞へと分化されるものであってもよい。そのようにして得られた筋細胞または心筋細胞は、そのとき、その患者が、特定の物質（たとえば、グルコースおよび／またはエンドセリン）に曝されたときにサルコメア構造の損傷を伴う筋肉または心筋層の疾患に罹りやすいかもしれないか否かを判定するために利用される。そのような方法は、患者に負担にならない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明のさらに他の有利な態様は、次の図面を援用してする本発明の諸実施形態に係る以下の説明から明らかになるであろう。
【００４１】
【図１】弛緩状態のサルコメアの模式図を示す。
【図２】収縮状態の図１のサルコメアを示す。
【図３】グローバルに配向させたサルコメア構造を備え、固定された心筋細胞の模式化された画像を示す。
【図４】図３の固定された心筋細胞の画像から抽出されたリッジ画像およびヴァレー画像の相関を通じて生成された相関画像を示す。
【図５】フーリエ変換済の図４の相関画像を示す。
【図６】ランダムに配向された（等方性の）サルコメア構造を備えた固定された心筋細胞の模式化された画像を示す。
【図７】図６の固定された心筋細胞の画像から抽出されたリッジ画像およびヴァレー画像の相互相関を通じて生成された相関画像を示す。
【図８】フーリエ変換済の図７の相関画像を示す。
【図９】サルコメア構造を持たない固定された心筋細胞の模式化された画像を示す。
【図１０】図９の固定された心筋細胞の画像から抽出されたリッジ画像およびヴァレー画像の相互相関を通じて生成された相関画像を示す。
【図１１】フーリエ変換済の図１０の相関画像を示す。
【図１２】グローバルに配向したサルコメア構造を有する真正心筋細胞のアクチニン着色画像を示す。
【図１３】図１２の真正心筋細胞の画像から抽出されたリッジ画像およびヴァレー画像の相互相関を通じて生成した相関画像を示す。
【図１４】フーリエ変換済の図１３の相関画像を示す。
【図１５】図１３の相関画像から生成した一変量相関関数を示す。
【図１６】サルコメア構造を持たない真正心筋細胞のアクチニン着色画像を示す。
【図１７】図１６の心筋細胞画像から抽出されたリッジ画像およびヴァレー画像の相互相関を通じて生成した相関画像を示す。
【図１８】フーリエ変換済の図１７の相関画像を示す。
【図１９】図１７の相関画像から生成した一変量相関関数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
サルコメア１および図１および図２に示したその一般構造についてはすでに上述したので、この説明はここでは繰り返さない。固定された筋細胞または心筋細胞の画像２は、周期的なサルコメア構造２０を示しており、これは図３に示した心筋細胞の模式化された二次元画像２に示されているように、グローバルな配向をもって配置されている。心筋細胞の画像２中の周期的なサルコメア構造のグローバルな配向の向き２１は、直線（これは、心筋細胞の画像２の一部ではない）で示されている。
【００４３】
図３に示した心筋細胞の二次元画像２は、その後、リッジ−ヴァレー・フィルター処理演算に掛けられる。これによって、二次元リッジ画像が生成され、心筋細胞の画像２中に何らかのストライプ状のサルコメア構造が含まれていればそれを明るく示す。ストライプ状のサルコメア構造以外に何らかの構造があればそれは、リッジ・フィルター処理演算によって抑制される。また、ヴァレー画像が生成され、リッジ画像のストライプ状構造間に何らかのストライプ状構造が配置されていればそれを明るく示し、それら以外の構造は、ヴァレー・フィルター処理演算によって抑制される。リッジ画像およびヴァレー画像は、それ自体解析されることのない中間画像に過ぎないのでここでは図示されていない（リッジ画像は、たとえば、図１２に示されている）。これらは、定義上明らかに反相関関係にあり、これらの目的は、画像中に含まれるストライプ状構造を強調し、ストライプ状構造以外の構造を抑制することにより、心筋細胞の画像２中に含まれる周期構造が、得られた相関画像におけるそのような周期構造の存在を示すより明白な特徴になる。
【００４４】
リッジ画像およびヴァレー画像は相互相関している。すでに述べたように、リッジ画像およびヴァレー画像の相互相関は、相関画像の生成中に、リッジ画像およびヴァレー画像のいずれかに含まれるストライプ状構造に関する何らかの情報があればそれが確実に考慮されるようにすることを目的として実行される。代替的に、一般に、たとえば、リッジ画像の自己相関を行うだけにすることも可能である。しかし、リッジ画像の自己相関とは、ヴァレー画像中に含まれリッジ画像中には（そこでは抑制されているので）含まれないストライプ状構造に関する情報があってもそれは相関画像生成時に何ら考慮されないということを意味しているに過ぎない。
【００４５】
リッジ画像およびヴァレー画像の相互相関とは、上述の通り、リッジ画像およびヴァレー画像のたたみ込みが実行されなければならないことを意味する。このたたみ込みというのは、上述の通り、大量の演算負荷を伴う数学的演算である。しかし、リッジ画像とヴァレー画像のたたみ込みは、フーリエ変換済のリッジ画像とフーリエ変換済のヴァレー画像とをフーリエスペースで掛け合わせることに対応するので、この大量の演算負荷は、リッジ画像の、そしてヴァレー画像の、フーリエ空間へのフーリエ変換を実行することによって、そして、フーリエ変換済のリッジ画像をフーリエ変換済のヴァレー画像と（より精確には、フーリエ変換済のリッジ画像とフーリエ変換済のヴァレー画像のピクセルの明るさの値を）掛け合わせることによって大幅に減少させることができる。フーリエ変換済のリッジ画像をフーリエ変換済のヴァレー画像と掛け合わせることで、フーリエ変換済の相関画像が得られるが、その逆フーリエ変換を、図４に示す相関画像を得るために実行しなければならない。あるいは、上述のように、この相関画像を（フーリエ変換されていない）リッジ画像とヴァレー画像のたたみ込みを通じて取得することもできる。
【００４６】
図４に示した相関画像３（上に概要を説明したように、リッジ画像とヴァレー画像との相互相関を通じて生成されたもの）は、明るさの最大値３０と最小値３１の周期的な配置を示すものである。このような明るさの最大値３０と最小値の周期的な配置は、ほぼグローバルに揃えられており、心筋細胞の画像２中の周期的なサルコメア構造２０（図３参照）と同じ方向３２（図４において直線で示されている；この直線は相関画像の一部ではない）を向いている。明るさの大きさは、固定された心筋細胞の画像２中の周期的なサルコメア構造１（図３）のコヒーレンスに依存する。
【００４７】
0006524598.tif 000005
【００４８】
図６に示す固定された筋細胞または心筋細胞の画像２も周期的なサルコメア構造２０を含むものだが、これらの周期的なサルコメア構造２０は、グローバルに配向させた配置ではなく異なる方向にランダムに配向している（等方的である）。その結果、リッジ画像とヴァレー画像の相互相関を通じて生成された図７に示す相関画像３は、明るさの最大値３０と最小値３１を示すものではあるが、画像２において周期的なサルコメア構造がすべての方向にランダムに配向（すなわち、等方的に配向）しているので、それらの最大値３０と最小値３１は、相関画像の中で明るさの大きさが徐々に減少する複数のリングを形成する（これらのリングは、すべての方向に構造が分布していることを示している）。明るさの大きさは、周期的なサルコメア構造の「パッチ」の数に依存し、リングの幅は、個々の周期的なサルコメア構造の幅とジッターに依存する。したがって、図８に示すフーリエ変換済相関画像４は、好ましい方向を示してはいないが、最大値４０は、なお前記ｋｘ，ｋｙ−空間に、上述の距離で配置されている。
【００４９】
図９に、固定された筋細胞または心筋細胞の画像２を示すが、ここには、周期的なサルコメア構造は一切示されていない。したがって、相関画像３は、最大値と最小値の周期構造を示すものではなく（図１０参照）、これは、フーリエ変換済の相関画像４にも当てはまる（図１１参照）。
【００５０】
図１２は、サルコメア構造を含む現実の固定された心筋細胞のリッジ画像５を示す。図１２においてサルコメア構造は明るく示されている。図１３に、心筋細胞のリッジ画像５（図１２）と心筋細胞のヴァレー画像（図示せず）の相互相関を通じて生成された現実の相関画像３を示し、図１４は、対応するフーリエ変換済の相関画像４と、心筋細胞の画像内のサルコメア構造の配向のグローバルな方向の角度α（この角度αは、上述の例ではφで指示されている）を示す。このフーリエ変換済の相関画像４から、矢印で示されているように、値Ｋ（この値Ｋは、心筋細胞の画像に含まれるサルコメア構造の「波長」を表しており、上述の例ではこの値Ｋはｋで指示されている）を求めることができる。アクチニン着色画像５はサルコメア構造を示すので、図１４の配向の方向が正しいことは明らかである（この配向の向きは、図１３の相関画像３を見ても認めることができる）。図１５には、一変量相関関数６が示されている。この一変量相関関数６は、特定の半径で全周にわたって相関画像の明るさを平均化し、異なる半径でこの平均化を繰り返すことによって得ることができる。いくつかの特定の半径においては、相関画像３内に強められた明るさが含まれて存在しているが、一方で他の特定の半径においては、実質的にゼロないしほんの小さな明るさしか存在していないので、一変量相関関数は、明るさの最大値６０および最小値６１を示すものである。もっとも、特定の半径において全周にわたって平均化が行われているので、周期的なサルコメア構造の向きについての何らかの情報があってもそれは相関関数６には含まれていない。一変量相関関数６の明るさにおける２つの隣接する最大値６０または最小値６１の間の距離と、２つの隣接する最大値６０の明るさの大きさの比率もしくは最大値６０と隣接する最小値６１の大きさの比率と、最大値６０および最小値６１の周期性の均一性とが、心筋細胞の画像に含まれるストライプ状態の度合いについて報告するものとなっている。
【００５１】
すでに上で説明したように、固定された心筋細胞の画像中にランダムに分布した周期的なサルコメア構造がある場合、実際上、周期構造の好ましい配向は存在しないため、この場合は平均化プロセスが多くは情報を取り除かないので、相関関数６は、より描写的かつより明白な特徴を含むものとなる。固定された心筋細胞の画像中にグローバルに配向した周期的なサルコメア構造がある場合、相関関数６を得るために平均化が実行され、配向の好ましい方向に関する情報は取り除かれるので、相関関数のフーリエ変換済の画像４は、より描写的かつより明白な特徴を含むものとなる。どちらの解析がより見込みがあるかは予め予測することができないので、相関関数６の解析とフーリエ変換済の相関画像４の解析とをともに実行し、両方の解析結果から、どちらの方がより描写的な解析かを判定することができる。
【００５２】
図１６は、周期構造を含まない現実の固定された細胞のアクチニン着色画像５を示す。したがって、図１７に示されている相関画像３と、図１８に示されているフーリエ変換済の相関画像４と、図１９に示されている一変量相関関数６とは、解析に利用することができる具体的な特徴を何ら表示していないため、結果として、固定された細胞の画像中に含まれる周期構造は存在しないこととなる。
【００５３】
すでに説明したように、培養細胞を検査する方法の前記諸実施形態は、最初に、サルコメア構造を含む生きた筋細胞または心筋細胞がグルコースまたはエンドセリンなどのような一つないし複数の物質を追加することによってストレスを付与してサルコメア構造を破壊もしくは少なくとも大幅に減少させることが可能で、その後、薬品候補となり得る物質を追加することができるので、筋細胞または心筋細胞内のサルコメア構造の損傷を伴う筋肉の疾患または心筋層の疾患の治療のための薬品の候補となり得る物質の検出において特に有利な応用領域がある。その後、筋細胞または心筋細胞は再び培養されて、そのように培養された細胞は、固定され前記諸実施形態にしたがって、解析される。
【００５４】
［実施例］
ゼラチンまたはフィブロネクチンでコーティングされたべクトン・ディキンソン・ファルコンの薄底９６ウェルのマイクロプレートに、ヒトの心筋細胞を、各ウェルあたり３５０００個播種する。心筋細胞は、２日間接着させておく。媒質を取り除き、１０ｍＭのグルコースと１０ｎＭのエンドセリンを含む新しい媒質を２日間加えておく。次に、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間、固定化処理が行われ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０で１５分間、透過化処理が行われる。その後、着色が行われる。以下の抗体が用いられる：抗ヒトαアクチニン一次抗体ＡＢ９４６５クローンＥＡ５３−モノクローナルの１／１２０希釈液（英国、ケンブリッジ、アブカム社（Abcam plc）３３０から入手可能），ウサギの抗ヒトトロポニンＴ一次抗体ＡＢ４５９３２ポリクローナルの１／１２０希釈液（英国、ケンブリッジ、アブカム社から入手可能），二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  Ａ１１０２９の１／２００希釈液（米国カリフォルニア州カールズバッド、ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）から入手可能），二次抗体ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７  Ａ−１１０２９の１／２００希釈液（米国、カリフォルニア州、カールズバッド、ライフ・テクノロジーズ社から入手可能）。すべての着色ステップは、３０分間室温で行われ、続けてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３度洗浄される。アクチニンの抗体着色は、成熟した筋細胞においては拡張された周期的なストライプパターンを生成するが、未成熟ないし欠陥のある細胞においては着色されないか構造化された着色にならない。
【００５５】
Ｏｐｅｒａ（商標）ＱＥＨＳハイコンテンツ・スクリーニング・システム（パーキンエルマー・セルラー・テクノロジー社（PerkinElmer Cellular Technologies）から購入可能）で画像が撮影される。このシステムは、マルチウェルプレート用の多色自動回転ディスク共焦点顕微鏡を含む。６４０ｎｍ、４８８ｎｍ、４０５ｎｍの３つのレーザーにより、倍率＝２０ｘ、ＮＡ＝０．７の水浸対物レンズを介して励起が起こる。露光時間を、トロポニンＣマーカー（赤チャンネル）、アクチニンマーカー（緑マーカー）、ヘクストＤＮＡマーカー（青チャンネル）に対してそれぞれ２ｓ、１ｓ、０．８ｓとして、各マーカーチャンネルごとに一枚の画像が続けて記録される。最大検出効率と最小クロストークのトレードオフによって、発光フィルターが選択される。
【００５６】
次に、Ｏｐｅｒａ（商標）ＱＥＨＳハイコンテンツ・スクリーニング・システムに含まれている著作権保護されたスクリプト言語Ａｃａｐｅｌｌａ（商標）を用いて、画像解析が実行される。調節パラメーターのユーザー定義による設定後、全画像に対して同じ方法で、人間が介在することなく、解析が実行される。
【００５７】
２つの細胞骨格マーカーチャンネルであるアクチニンとトロポニンＣは、同じ範囲とコントラストでストライプパターンを示すことはない。ストライプパターンの定量化のためにより明白に表せるアクチニンシグナルを選択した。アクチニン画像は、明るい線と暗い線を強調するリッジ画像およびヴァレー画像を抽出するために、Ａｃａｐｅｌｌａ（商標）テクスチャー抽出ライブラリー（パーキンエルマー）の“ＳＥＲ（）”関数（“Ｓｐｏｔｓ，Ｅｄｇｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｄｇｅｓ”）に由来する著作権保護されたリッジ・アンド・ヴァレー・フィルターを用いてフィルター処理した。そして、これらリッジ画像およびヴァレー画像を、高速フーリエ変換アルゴリズムを用いてフーリエ変換することによって相関させ、フーリエ変換されたリッジ画像およびヴァレー画像を掛け合わせてフーリエ変換済相関画像を生成し、逆フーリエ変換を実行して相関画像を生成する。相関画像と、フーリエ変換済相関画像と、一変量相関関数とが生成され、上述したように解析される。
【００５８】
本発明の諸実施形態を、上に、図面および実施例を援用して説明した。しかし、本発明は、これらの実施形態に限定されず、むしろ、本発明の教示から逸脱せず様々な変形および変更が想定可能である。したがって、保護の範囲は、前記実施形態により限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲により定義されるものである。
【図１】
0006524598.tif 000006
【図２】
0006524598.tif 000007
【図３】
0006524598.tif 000008
【図４】
0006524598.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006524598.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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