(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のターゲット領域を１つの反応液で特異的に増幅させる方法であって、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応に添加し、該反応液がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを含み、該ターゲット領域が１ｋｂ以上の領域であるものを少なくとも１つ含むことを特徴とする該生体試料中の標的核酸増幅法。
【請求項２】
上記ターゲット領域が１ｋｂ以上の領域であるものを少なくとも５つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ターゲット領域が１０ｋｂ以上の領域であるものを少なくとも５つ含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記ターゲット領域が１０箇所以上の領域である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が血液である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
増幅産物のコピー数のバイアスが１００倍以内である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、マルチプレックスＰＣＲ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００３】
核酸増幅法は現在までに様々な方法が開発されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭ Ｐ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。
【０００４】
中でも、ＤＮＡの特異的配列の増幅に用いられるＰＣＲ法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、ＰＣＲ法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００５】
ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、少なくとも一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２０〜５０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（特許文献１）。
【０００６】
一般的に、ＰＣＲ法は１対のプライマーセットを加えて行われる。しかし、増幅産物を同時に検出したい場合、試薬、機材や時間の節約したい場合、および鋳型サンプル量が限定される場合など、多数のプライマーセットを用いて複数のターゲット領域を同時に増幅させるＰＣＲ法、いわゆるマルチプレックスＰＣＲ法が行われる（非特許文献１）。
【０００７】
マルチプレックスＰＣＲ法は一般的に１ｋｂ以下の短鎖のマルチプレックスＰＣＲが行われている。しかし、最近では次世代シーケンサー（ＮＧＳ）のリシーケンス解析などで１ｋｂ以上の長鎖ターゲット対してマルチプレックスＰＣＲが行われるようになってきており、長鎖ターゲットマルチプレックスＰＣＲの需要が増加しつつある。
【０００８】
しかし、マルチプレックスＰＣＲでは、非特異増幅やプライマーダイマーが発生しやすくなる、また、各ターゲットの増幅効率に隔たりが出やすいといった問題が生じる。さらに、ターゲットが長くなるほど、ターゲット配列に難配列（高ＧＣ含量もしくは高ＡＴ含量）を含む可能性が高くなり、任意のターゲット領域を増幅させた際の増幅成功率が低下する。これらの問題点を解決するマルチプレックスＰＣＲが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−３２８７０９号
【特許文献２】特願２０１２−１１６９２６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍ. Ｃ. Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｒ. Ａ. Ｇｉｂｂｓ, Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．,  ３,  ６５−７５（１９９４）
【非特許文献２】Ａｌａｎ  Ｈ．Ｂｅｇｇｓ  ｅｔ ａｌ．, Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ,  ８６,   ４５−４８（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、非特異増幅やプライマーダイマーの発生を抑制し、各ターゲットの増幅効率に隔たりが出にくいマルチプレックスＰＣＲ法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討した結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、非特異増幅やプライマーダイマーの発生が少ないことはもちろんのこと、長鎖ターゲットの増幅成功率が高く、ターゲットにクルード成分が共存していても増幅阻害を受けにくいマルチプレックスＰＣＲを行うことができることを見出し、この知見を基に上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．
２以上のターゲット領域を１つの反応液で特異的に増幅させる方法であって、反応液にファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法。
項２．
上記ターゲット領域が１ｋｂ以上の領域であるものを少なくとも1つ含む、項１に記載の方法。
項３．
上記ターゲット領域が１０ｋｂ以上の領域であるものを少なくとも５つ含む、項１に記載の方法。
項４．
上記ターゲット領域が１０箇所以上の領域である、項１から３に記載の方法。
項５．
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来である項１から４に記載の方法。
項６．
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する項１から５に記載の方法。
項７．
前記生体試料が血液である項６記載の方法。
項８．
増幅産物のコピー数のバイアスが１００倍以内である項１から７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、マルチプレックスＰＣＲに対して適用される増幅長の範囲を拡張させ、かつ均一に増幅させることができる。さらに、血液などの生体試料から前処理なしでマルチプレックスＰＣＲが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】１００ｂｐ〜１ｋｂの範囲のマルチプレックスＰＣＲを評価した図である。
【図２】１ｋｂ〜１０ｋｂの範囲のマルチプレックスＰＣＲを評価した図である。
【図３】血液をテンプレートとして１００ｂｐ〜１ｋｂの範囲のマルチプレックスＰＣＲを評価した図である。
【図４】血液をテンプレートとして１ｋｂ〜１０ｋｂの範囲のマルチプレックスＰＣＲを評価した図である。
【図５】１０ｋｂのターゲットに対して作成した検量線を表す図である。
【図６】１０ｋｂのターゲットに対して作成した検量線を表す図である。
【図７】１０ｋｂのターゲットに対して作成した検量線を表す図である。
【図８】１０ｋｂのターゲットに対して作成した検量線を表す図である。
【図９】１０ｋｂ×１０ターゲットのマルチプレックスＰＣＲ増幅産物のコピー数とバイアスを評価した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、２以上のターゲット領域を１つの反応液で特異的に増幅させる方法であって、反応液にファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法である。
【００１７】
「ターゲット領域」とはプライマーセットによって増幅される目的の核酸配列領域である。本発明の方法では、対象となるターゲットの長さに制限はないが、１ｋｂ以上、さらには１０ｋｂ以上の領域を含む長鎖ターゲットに対してもマルチプレックスＰＣＲを行うことができる。また、本発明の方法では、対象となるターゲットの数は２箇所以上であれば特に制限はないが、５箇所以上、さらには１０箇所以上であってもマルチプレックスＰＣＲを行うことができる。なお、ターゲット数の上限は特に制限されないが、１０００箇所以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明の方法では、マルチプレックスＰＣＲ法において、ＤＮＡポリメラーゼとしてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする。
一般的に、ＰＣＲには増幅効率が良く、条件設定が容易という点からファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼが用いられていた。しかし、最近では反応組成など様々な検討によりファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼでも容易に条件設定が可能となっている。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、正確性が高い点や熱安定性が高い点、また反応系に持ち込まれる阻害物質に強いといった特徴を持つ。
【００１９】
本発明におけるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＰｏｌ  Ｉ型又はＰｏｌ  ＩＩ型のいずれかに属する。本発明においては、好ましくはＰｏｌ  Ｉ型に属するＤＮＡポリメラーゼである。ファミリーＢのＰｏｌ  Ｉ型に属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｒｉｏｓｕｓ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｗｏｅｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｓｓｕ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。好ましくはＫＯＤポリメラーゼである。
【００２０】
本発明の方法におけるＰＣＲ反応液のその他の構成は特に限定されないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００２１】
本発明の方法において、鋳型となる核酸は特に限定されない。合成ＤＮＡ、生体試料等から精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写反応により得たｃＤＮＡなどが挙げられる。また、精製されている必要性はなく、鋳型となる核酸を含む生体試料の粗精製サンプルや、生体試料そのものを使用することもできる。
【００２２】
本発明において使用する１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとは、増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであり、２種またはそれ以上のプライマーを使用することが好ましい。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、その伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能することができるように選択される。
【００２３】
１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体は、ＰＣＲ反応において基質として使用される。この基質として、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２４】
ＰＣＲ反応液にはさらに緩衝剤を含むことが好ましい。前記緩衝剤として、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。
また、前記緩衝液中には、１〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
【００２５】
さらに、ＰＣＲ反応液中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００２６】
本発明において、一本鎖結合タンパク質あるいはミスマッチ結合タンパク質の共存下、核酸増幅反応を行ってもよい。
【００２７】
バイアスとはマルチプレックスＰＣＲでの増幅産物の中で、最も増幅量の多いターゲットと最も増幅量の少ないターゲットとの増幅量の差を表す。バイアスが大きいほど、増幅量の隔たりが大きくなる。本発明の方法における増幅量の差は特に限定されないが、最も増幅量の多いターゲットの増幅量が最も増幅量の少ないターゲットの増幅量の３００倍以内であることが好ましく、１００倍以内であることがさらに好ましく、５０倍以内であることがさらに好ましい。
【００２８】
＜マルチプレックスＰＣＲの評価方法（ターゲット長１００ｂｐ〜１ｋｂ）＞
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製、ＫＯＤポリメラーゼを使用）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌずつのプライマー（配列番号１〜１８、非特許文献２）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製する。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行う。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認する。
【００２９】
＜マルチプレックスＰＣＲの評価方法（ターゲット長１ｋｂ〜１０ｋｂ）＞
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９〜３８）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製する。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、１０分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認する。
【００３０】
本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であってもよい。
【００３１】
精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法がある。本発明における核酸増幅法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅してもよい。
【００３２】
「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。
【００３３】
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：１００ｂｐ〜１ｋｂマルチプレックスＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲの評価方法として、１００〜１ｋｂ範囲にあるターゲットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで比較した。
【００３６】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌずつのプライマー（配列番号１〜１８、非特許文献２）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００３７】
結果を図１に示す。ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏが最も均一な増幅を示すことを確認することができた。
【００３８】
実施例２：１ｋｂ〜１０ｋｂマルチプレックスＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲの評価方法として、１ｋｂ〜１０ｋｂの範囲にあるターゲットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで比較した。
【００３９】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９〜３６）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、１０分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４０】
結果を図２に示す。ＫＯＤポリメラーゼは他のポリメラーゼで困難であった１０ｋｂのターゲットの増幅も増幅することができ、最も均一な増幅が確認された。
【００４１】
実施例３：血液からの１００ｂｐ〜１ｋｂマルチプレックスＰＣＲ
実施例１のマルチプレックスＰＣＲの鋳型を、精製したヒトゲノムからヒト血液に変えて同様に実験を行った。
【００４２】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌずつのプライマー（配列番号１〜１８、非特許文献２）、鋳型として２．５μｌのヒト血液、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４３】
結果を図３に示す。ヒト血液からの増幅においても、すべてのターゲットで均一な増幅が確認された。
【００４４】
実施例４：血液からの１ｋｂ〜１０ｋｂマルチプレックスＰＣＲ
実施例２のマルチプレックスＰＣＲの鋳型を、精製したヒトゲノムからヒト血液に変えて同様に実験を行った。
【００４５】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９〜３６）、鋳型として２．５μｌのヒト血液、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、１０分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４６】
結果を図４に示す。ヒト血液からの増幅においても、すべてのターゲットで均一な増幅が確認された。
【００４７】
実施例５：１０ｋｂ×１０ターゲットのマルチプレックスＰＣＲ
増幅長１０ｋｂである１０種類のプライマーセットをマルチプレックスＰＣＲにて増幅し、増幅産物をリアルタイムＰＣＲで定量することでバイアスを比較した。
【００４８】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、酵素液（ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３５、３６、５７〜７４）、鋳型として５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、１０分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
【００４９】
次に定量を行うために、リアルタイムＰＣＲでの検量線の作成を行った。リアルタイムＰＣＲは、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用い、１×ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ、５０×ＲＯＸおよび各４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３７および３８、３９および４０、４１および４２、４３および４４、４５および４６、４７および４８、４９および５０、５１および５２、５３および５４、５５および５６）を含み、検量線の希釈水準として４０００コピー、２０００コピー、１０００コピー、５００コピー、２５０コピー、１２５コピー、６２，５コピーのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）を鋳型とした２０μｌの反応液をそれぞれ調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて行った。それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、目的ピークを確認し、検量線を作成した。
【００５０】
作成した検量線を図５に示す。
【００５１】
増幅産物のコピー数の定量を行い、バイアスを比較した。リアルタイムＰＣＲは、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用い、１×ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ、５０×ＲＯＸおよび各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３７および３８、３９および４０、４１および４２、４３および４４、４５および４６、４７および４８、４９および５０、５１および５２、５３および５４、５５および５６）を含み、１０６希釈した１０ｋｂ×１０ターゲットのマルチプレックスＰＣＲ産物１μｌを鋳型とした２０μｌの反応液をそれぞれ調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて行った。それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。
【００５２】
コピー数を図６に示す。ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏでは、バイアスであるマルチプレックスＰＣＲ産物量比が４．５８倍であり、低バイアスであった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、マルチプレックスＰＣＲ法を、より確実・正確に行うことが可能となり、バイオ分野における研究や診断などの分野に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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