(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２糖以上５糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする受精卵成長促進剤。
【請求項２】
前記受精卵が哺乳動物受精卵である請求項１記載の受精卵成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療や畜産の分野に利用される受精卵成長促進剤及び受精卵の成長促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の晩婚化の影響等により、不妊に悩む人は多く、人工授精や体外受精など、生殖補助医療の利用が増加している。また、畜産の分野では、体外受精は優良家畜の効率的な繁殖に欠かせない技術となっている。
【０００３】
従来、医療や畜産の現場では、受精卵が正常に成長しないと母体に定着しないという問題があった。また、いわゆる高齢出産では受精が成立しても卵子老化のためその後の成長が止まってしまい出産にまでいたらないことが多い。すなわち、受精卵が順調に成長し母体に安定的に定着しないと妊娠率の向上や不妊の改善・治療につながらない。家畜においても同様な事情で繁殖を効率的に行うことができない。このような問題に関連して、例えば、下記特許文献１や下記非特許文献１には、哺乳動物受精卵の発生培地に対し、所定濃度の血管内皮成長因子（特許文献１）や顆粒球単球コロニー刺激因子（非特許文献１）などを添加して培養を行い、哺乳動物受精卵の正常発生率を高める方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０５８５０９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tevkin S, Lokshin V, Shishimorova M, Polumiskov V.「The frequency of clinical pregnancy and implantation rate after cultivation of embryos in a medium with granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in patients with preceding failed attempts of ART.」Gynecol Endocrinol. 2014 Oct;30 Suppl 1:9-12.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）や非特許文献１に記載の顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ―ＣＳＦ）などの成長因子は蛋白質であり、その安定性等の面で扱いにくいという問題があった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、新たな有効成分に基づいた、受精卵成長促進剤及び受精卵の成長促進方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、ヒアルロン酸オリゴ糖に、受精した受精卵の成長を促進する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する受精卵成長促進剤及び受精卵の成長促進方法を提供するものである。
【００１０】
［１］  ２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする受精卵成長促進剤。
［２］  前記受精卵が哺乳動物受精卵である上記［１］記載の受精卵成長促進剤。
［３］  受精卵に、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を添加して、前記受精卵に前記ヒアルロン酸オリゴ糖を所定期間作用させることを特徴とする受精卵の成長促進方法。
［４］  前記受精卵が哺乳動物受精卵である上記［３］記載の受精卵の成長促進方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の受精卵成長促進剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分とするので、受精した受精卵の成長を促し、これにより母体に安定的に定着させることができる。また、母体に対する安全性にも優れている。よって、妊娠率の向上や不妊の改善・治療、優良家畜の効率的な繁殖などのために好適に用いられる。
【００１２】
本発明の受精卵の成長促進方法によれば、受精卵に、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を添加して、前記受精卵に前記ヒアルロン酸オリゴ糖を所定期間作用させるので、受精した受精卵の成長を促し、これにより母体に安定的に定着させることができる。また、母体に対する安全性にも優れている。よって、妊娠率の向上や不妊の改善・治療、優良家畜の効率的な繁殖などのために好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１においてヒアルロン酸オリゴ糖（４糖）が受精卵の成長に与える影響を調べた結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（ヒアルロン酸オリゴ糖）
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成単位である、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとがグリコシド結合してなる二糖単位を少なくとも含み、２糖以上２０糖以下のサイズのものを意味する。具体的には、下記式（１）、式（２）、式（３）又は式（４）で表わされる構造を有するヒアルロン酸オリゴ糖である。
【００１５】
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ−ＧｌｃＮＡｃ    …（１）
（式（１）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ    …（２）
（式（２）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ−ＧｌｃＡ    …（３）
（式（３）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ    …（４）
（式（４）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
【００１６】
なお、上記式中のＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃにおけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡにおけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
【００１７】
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、上記基本構造を有すればよく、その糖部分が修飾されていることに、特に制限はない。例えば、糖の水酸基の一部またはすべては、エステル化、エーテル化等を受けていてもよい。グルクロン酸のカルボキシル基の一部またはすべては、エステル化、アミド化等を受けていてもよい。非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。
【００１８】
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、そのサイズが２糖以上２０糖以下であるので、受精卵の成長促進の効果に優れている。また、低粘度のため製剤化にも適している。そのサイズは、２糖以上１０糖以下であることがより好ましく、２糖以上５糖以下であることが更により好ましい。
【００１９】
本発明においては、ヒアルロン酸オリゴ糖の薬学的に許容される塩を用いることもできる。その塩としては、例えば、アルカリ金属塩であるナトリウム塩やカリウム塩などが挙げられる。また、無水塩のみならず含水塩が含まれてもよい。その塩は、原料に由来するものであったり、また、ヒアルロン酸オリゴ糖の調製時に持ち込まれたりする場合もある。これらの塩は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸オリゴ糖と同様に機能する。
【００２０】
本発明においては、ヒアルロン酸オリゴ糖の薬学的に許容される溶媒和物を用いることもできる。溶媒和物としては、水和物等が挙げられる。例えば、大気中に放置したり、再結晶することにより、水分を吸収したり、吸着水が付いたりして、水和物となる場合がある。また、ヒアルロン酸オリゴ糖の調製時に持ち込まれる場合もある。これらの溶媒和物は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸オリゴ糖と同様に機能する。
【００２１】
ヒアルロン酸オリゴ糖、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物は、その１種類のみを用いてもよく、その２種以上の複数を用いてもよい。すなわち、ヒアルロン酸オリゴ糖のサイズや分子構造が単一であってもよく、それらの異なるヒアルロン酸オリゴ糖を併用し、又はそれらの異なるヒアルロン酸オリゴ糖の複数を含有する複合物を用いてもよい。更に、塩や溶媒和物についても、単一種であってもよく、それらの異なる複数種を併用し、又はそれらの異なる複数種を含有する複合物を用いてもよい。
【００２２】
（ヒアルロン酸オリゴ糖の製造方法）
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたものであってよく、また、化学的もしくは酵素的に合成されたものを使用してもよい。好ましくは、例えば鶏冠、臍体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法によって得ることができるヒアルロン酸を酵素分解、酸分解、塩基分解、加熱処理、超音波処理などの分解処理した後、公知の精製法によってヒアルロン酸オリゴ糖を精製することにより製造することができる。また、乳酸菌やストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によって生成されるヒアルロン酸を出発原料として同様に製造することができる。更には、市販の高分子量のヒアルロン酸を出発原料としてもよい。
【００２３】
酵素分解の方法によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合、国際公開第２００２／４４７１号パンフレットや、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１２巻、第７号、第４２１−４２６頁に開示される方法に準じて製造することができる。高分子量ヒアルロン酸塩を、溶液のｐＨが５付近になるように緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液）に溶解し、ヒアルロニダーゼを添加して加水分解を行う。加水分解の温度は、３７℃付近が好ましく、１〜２４時間程度反応させる。反応後、１０、０００ｒｐｍ程度で遠心分離して上清を回収し、この上清をイオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。
【００２４】
酸加水分解によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合、高分子量ヒアルロン酸塩を、濃塩酸の５０％水溶液中において、４０℃〜還流温度で１〜５時間程度反応させる。反応後、イオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。また、ＤＭＳＯの溶媒中に０．０５〜１Ｍ程度の塩酸を用いて加熱することにより、より緩和な条件下で加水分解を行うこともできる。
【００２５】
一方、Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779には、固相合成法によって、下記のようなヒアルロン酸オリゴ糖を、その糖サイズごとに効率よく製造する方法が開示されているので、そのような方法によって製造することもできる。
【００２６】
【化１】
0006519055.tif 000002
【００２７】
なお、上記のうち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）の基本的糖構成を有するヒアルロン酸オリゴ糖は、ヒアルロン酸を出発原料にしてそれを分解処理することによっては、ほとんど得られないか、あるいは非常に収率の悪いヒアルロン酸オリゴ糖である。
【００２８】
（剤形等）
本発明の受精卵成長促進剤は、上記に説明したヒアルロン酸オリゴ糖、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物（以下、単に「ヒアルロン酸オリゴ糖」という。）を、その有効成分として含有するものである。製剤形態に特に制限はない。例えば、用時溶解型の凍結乾燥製剤などが挙げられる。
【００２９】
ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量は、本発明の効果を発揮することができれば特に限定されるものではない。最終製剤の受精卵成長促進剤の総質量に対して、１×１０-１０質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、１×１０-１０質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、１×１０-１０質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。ヒアルロン酸オリゴ糖以外のｐＨ調整剤、アルブミン等の成分を含んでもよいが、受精卵の成長に悪影響を及ぼす成分を含まないことが必要である。例えば、エンドトキシンフリーの品質であることが好ましく、より具体的には、使用時にエンドトキシン濃度０．００６（ＥＵ／ｍＬ）以下となるようにすることがより好ましい。
【００３０】
（使用形態等）
本発明においては、上記に説明したヒアルロン酸オリゴ糖を受精卵に添加し、受精卵にヒアルロン酸オリゴ糖を所定期間作用させることにより、受精した受精卵の成長を促し、これにより母体に安定的に定着させることができる。その態様に特に制限はなく、有効成分たるヒアルロン酸オリゴ糖を、少なくとも受精卵が母体への着床に至るまでの期間、その受精卵に作用させるように使用すればよい。例えば、人工授精や体外受精の処置のときに取り扱われる受精卵に適用可能である。人工授精では、精子を母体に注入するとき、いっしょにヒアルロン酸オリゴ糖を母体に注入することにより、その後受精に至った受精卵にヒアルロン酸オリゴ糖を作用させることができる。この場合、ヒアルロン酸オリゴ糖を母体に１〜１００００ｍｇ／１回の投与量で投与することが好ましく、１〜２００ｍｇ／１回の投与量で投与することがより好ましい。また、体外受精では、受精卵を体外で培養するときの培養液にヒアルロン酸オリゴ糖を含有せしめることにより、その受精卵にヒアルロン酸オリゴ糖を作用させることができる。この場合、ヒアルロン酸オリゴ糖を母体に１ｐｇ〜１０００μｇ／培養液１ｍＬの添加量で添加することが好ましく、１ｎｇ〜１００μｇ／培養液１ｍＬの添加量で添加することがより好ましい。
【００３１】
本発明が適用される受精卵の種類に、特に制限はない。好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス等の哺乳動物である。
【実施例】
【００３２】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
＜試験例１＞  
マウス体外受精のプロトコールは、常法に従い、以下のとおり採精、採卵、媒精を行う要領で実施した。
【００３４】
（採精）
前日からインキュベーター内にて１．５ｍＬの遠心チューブに４５０μＬのＴＹＨ培養液を平衡化させておく。
雄マウス１０−１５週齢を用いて頚椎脱臼後に精巣上体尾部のみを摘出し、キムタオルの上で血液と脂肪組織を除去する。
ピンセットで精巣上体尾部をつまみ、２３Ｇ注射針を膨大部分に尖刺して出てきた精子塊を針先へ集めて遠心チューブ内へ移す。
インキュベーター内へ戻して１５分ほど前培養する。
【００３５】
（採卵）
雌マウス４週齢に、体外受精３日前に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）の５ＩＵを腹腔内投与し、その４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の５ＩＵを腹腔内投与して過排卵処理を行う。
前日に、ＴＹＨ培養液を３５ｍｍシャーレに３０μＬマイクロドロップしミネラルオイルで覆ったものをインキュベーター内で平衡化させておく（採卵用ディッシュ）。
頚椎脱臼後に雌マウスから卵管だけを摘出し、キムタオル上で血液と脂肪を除去してから採卵用ディッシュのミネラルオイルの中へ浸ける。
ピンセットで卵管を保持して、２７Ｇの針先で卵管膨大部に切れ目を入れ、出てきた卵子−卵丘細胞塊を採卵用ドロップ培養液内へ針先で移動させる。
基本的に３０μＬ採卵用ドロップ培養液に雌マウス６匹から採取した卵丘−卵子複合体（１匹あたりおよそ３０個の卵子を含む）を入れる。
【００３６】
（媒精）
前培養した精巣上体尾部精子を２〜３×１０５／ｍＬになるように採卵用ディッシュの培養液へピペットで添加する。
培養開始後に新しい３５ｍｍディッシュにＫＳＯＭ培養液を３０μＬマイクロドロップしてミネラルオイルで覆いインキュベーター内で平衡化させておく（培養用ドロップ）。
媒精６時間後に、ガラスキャピラリーを用いて卵子をピックアップし、新鮮な培養用ドロップの培養液に移し替える。この際卵子に接着している精子をガラスキャピラリーで吸い吐きさせることで除去する。
体外受精の翌日も新鮮な培養用ドロップの培養液に移し替え、その後１日おきに液替えをする。
【００３７】
（被検物質）
被検物質として、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）１−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、４糖サイズのヒアルロン酸オリゴ糖（商品名「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ４ＥＦ−５」、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）（以下、「ＨＡ４」という。）を用いた。
【００３８】
（試験の手順）
媒精時に、濃度が１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬとなるように上記ＨＡ４を培地に添加した。また、比較のため、何も添加しない対照群や９００ｋＤａヒアルロン酸を濃度が１０００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した比較群を設定した。なお、これら各被検部物質の添加は、卵子を新鮮な培養液に移すごとに行った。
【００３９】
各群およそ３０個の卵子のうち、精子添加２４時間後に２細胞期になっている胚数をカウントした。また、精子添加４８時間後に桑実胚期になっている胚数をカウントした。そして（桑実胚期の胚数／２細胞期の胚数）×１００を成長率（％）として算出した。
【００４０】
図１に示されるように、ＨＡ４を添加した培養液で受精卵を培養することによって、受精後、桑実胚期までの成長が、対照群に比べ、顕著に促進された。一方、９００ｋＤａヒアルロン酸では、そのような効果は得られなかった。
【図１】
0006519055.tif 000003