(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロピリン２（ＮＲＰ２）には結合せず、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）に特異的に結合するペプチドであって、前記ペプチドは配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは腫瘍浸透性または新血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）阻害活性を表すことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、リンカーペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記リンカーペプチドは５個ないし５０個のアミノ酸からなることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記リンカーペプチドは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列からなり、ここで、ｎはそれぞれ独立に整数１ないし２０中の一つであることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、配列番号４ないし６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含む融合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質は抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体及び化学的に改質されたタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ペプチドは、ニューロピリン１に２価（ｂｉａｖａｌｅｎｔ）以上で結合することを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合はリンカーペプチドによることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体の断片はそれぞれ、抗体の重鎖不変領域断片（Ｆｃ）、重鎖不変領域ドメイン（ＣＨ１，ＣＨ２，またはＣＨ３)断片、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆａｂ））、単一鎖抗体断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ））、重鎖可変領域断片（ＶＨ）、軽鎖不変領域断片（ＣＬ）または、軽鎖可変領域断片（ＶＬ）であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が抗体である場合、ペプチドは抗体の重鎖不変領域ＦｃのＣ―末端に結合されていることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記結合はリンカーペプチドに介されることを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含むナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含むリポソーム。
【請求項１７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含む小分子薬物。
【請求項１８】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチド、前記ペプチドが融合され、これを含む融合タンパク質、前記ペプチドが融合され、これを含むナノ粒子、前記ペプチドが融合され、これを含むリポソーム、または前記ペプチドが融合され、これを含む小分子薬物を含む、癌または新生血管関連疾患の治療または予防医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチド、前記ペプチドが融合され、これを含む融合タンパク質、前記ペプチドが融合され、これを含むナノ粒子、前記ペプチドが融合され、これを含むリポソーム、または前記ペプチドが融合され、これを含む小分子薬物を含む、癌または新生血管関連疾患の診断用組成物。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドをスクリーニングする方法であって、
（１）ＮＲＰ１のｂ１領域のＶＥＧＦ−結合部位（またはアルギニン結合ポケット）と相互作用することができるペプチドライブラリーをデザインする段階；
（２）前記段階（１）のペプチドライブラリーを抗体重鎖不変領域Ｆｃに融合させる段階；
（３）前記段階(２)のＦｃ融合ライブラリーを、競合物としての多量のＮＲＰ２−ｂ１ｂ２の存在下で、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２と結合させる段階；及び
（４）前記段階（３）で結合された、Ｆｃ融合ライブラリーとＮＲＰ１−ｂ１ｂ２間の結合親和性に基づいて、所望のＦｃ融合ペプチドをスクリーニングする段階；を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ＮＲＰ１、ニューロピリン１）に特異的に結合するペプチド（ＴＰＰ，ｔｕｍｏｒ  ＰＥｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に関するものである。具体的に本発明のペプチドはニューロピリン１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１，ＮＲＰ１）とニューロピリン２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ２，ＮＲＰ２）に同時に結合するペプチドの突然変異のライブラリーを構築してスクリーニングした、ＮＲＰ１にだけ高親和度で選択的に結合するペプチドに関するものである。
【０００２】
また、本発明は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに関するものである。
【０００３】
また、本発明は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供するものである。
【０００４】
また、本発明は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド、またはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連の疾患の治療または予防用薬学的組成物に関するものである。
【０００５】
また、本発明は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド、またはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連の疾患の診断用組成物に関するものである。
【０００６】
また、本発明は抗体重鎖の不変部位Ｃ−末端にペプチドライブラリーを酵母細胞表面に構築し、ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを選別する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００７】
抗体は抗原に対する高特異性、高親和度で結合して抗原を中和させる作用をするタンパク質である。また、抗体の重鎖不変部位の機能である抗体−依存性細胞媒介細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）及び補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有し、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合を通じて血液内の長い半減期（ｌｏｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を持つ。抗原に対する高特異性、高親和度で結合する特性で好ましくない副作用を減らすことができて、抗体-依存性細胞媒介細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）及び補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）で疾病誘発細胞の死滅を誘導することができ、血液内の長い半減期は長時間の間持続される抗体の効果を期待することができる。このような抗体の特性のために、これを治療用タンパク質として開発しようとする研究が活発である。
【０００８】
現在までに開発された癌治療用の抗体は固形癌（Ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）治療用、及び血液癌（Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ）治療用抗体、二つの分類に分けられる。ここで各分類の抗体を単独投与時、治療反応率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅｓ）がこの二つの抗体で違いを見せる。現在、市販されているいくつかの抗体の統計で血液癌治療用抗体の単独投与時、治療反応率は３０〜５１％に達する一方、固形癌治療用抗体の単独投与時、治療反応率は８〜１５％で比較的に低い治療反応率を示している。これは血液癌治療用抗体の場合、血液にある癌細胞をターゲットにすることとは違って、固形癌治療用抗体の場合、治療効果を示すためには１）システム的な静脈注射または皮下注射後、血管を流れ固形癌組織にある腫瘍血管に到達しなければならず（ｔｕｍｏｒ  ｈｏｍｉｎｇ段階）、２）腫瘍血管で癌組職の方に抜け出して（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ段階）、３）癌組織内でも血管がない組織内部への浸透（ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ段階）、４）癌細胞に発現された抗原に結合して作用する（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＆  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ段階）という過程が成り立たなければならないためである。（Ｓｃｏｔｔ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。このような一連の過程で固形癌治療用抗体が癌組織の蓄積及び癌組織内部へ浸透して組織内部の癌細胞に到達するのに存在する様々な妨害要素のために、実際ヒトの生体内で腫瘍組織内に蓄積される抗体の量は０．０１〜０．０００１％投与量／１ｇ腫瘍組織（ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ  ｐｅｒ  ｇｒａｍ  ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ）で非常に低くて、低い治療反応率を示すようになる（Ｔｈｕｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｋ．，２００８）。従って抗体が腫瘍組織に選択的に蓄積されて腫瘍組織内部への高浸透性を持つようにする抗体技術の開発は固形癌治療用の抗体の治療効果を高めることができて非常に重要である。
【０００９】
抗体が組織へ浸透がよくならない原因としては大きく、１）抗体の本質的な特性（大きさ（〜１５０ｋＤａ）、抗原結合特性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒ）など（Ｔｈｕｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，２０１２））、及び２）正常組織とは異なる腫瘍組織の微細組織学的／生理学的特性（例えば、不完全で非正常的な血管生成、非常に低いリンパ線の形成、高い細胞密度、高い細胞外の基質密度など）の二つに起因するとみることができる（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，２０１０）。従って、抗体の大きさ及び抗原結合特異性を調節する抗体工学技術を利用するか、抗体の腫瘍組織浸透を増進させる分子（所為ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ａｇｅｎｔｓ）との併用投与方法など色々な方法を利用して抗体の腫瘍組織浸透性を増進させる努力が競走されてきた。
【００１０】
抗体は１２個のドメインからなっている１５０ｋＤａの大きい分子であるために、血液にある抗体が拡散または対流を通じて腫瘍組織へ伝達されにくい（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。従って、これを克服するために大きさが減少された抗体の抗原と結合する抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆａｂ），５０ｋＤａ）、単一鎖抗体断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ），３０ｋＤａ）、重鎖可変部位の単一ドメイン（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＶＨ），１４ｋＤａ）のような抗体の断片だけ投与する試みがあった。ただし、抗体の断片はＦｃ部分がなく、大きさが小さくて、生体内投与時、多量が腎臓へ抜け出して半減期（Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ）が短くなり抗体の効能が大きく向上されなかった（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００１１】
抗体が組織内にたくさん分布することができないもう一つの原因は抗体の抗原結合能である。固形癌治療用の抗体は腫瘍に関連された抗原（Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、または腫瘍に過発現されて腫瘍の成長に重要なターゲットに対して高い親和度を有する。抗体は特定抗原がある組織に到達しても、抗原発現量が多い細胞からなった腫瘍組織では抗体の高い親和度のために抗体が腫瘍組織表面の細胞に発現された抗原に結合されたまま腫瘍組織の表面に留まるようになる（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｔａｎｎｏｃｋ，２０１０）。また、結合後抗原と一緒に細胞内へ流入（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）されて細胞内で破壊される。結果的に抗体が腫瘍組織表面に位置することができるが、過発現されている腫瘍抗原に結合して破壊されるために、結局、腫瘍組織内部への効率的な浸透が起こらない。従って、腫瘍血管から遠く離れた組織内部の腫瘍細胞抗原には抗体が到達することができなくて、腫瘍成長抑制の活性が減少し、抗体耐性と腫瘍再発を誘導することができる。これを克服するために、親和度を調節するか、半減期を増やすための研究が進行されている（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１２】
抗体の腫瘍組織内部への浸透及び分布を妨害する腫瘍組織の生理学的性質は大きく４つに分類することができ、これは内皮障壁（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ）、高い腫瘍組織内流体圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、基質障壁（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔ）、上皮障壁（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ）である。
【００１３】
内皮障壁（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ）において、腫瘍は急激に成長する速度に応じて多量の栄養分の供給を受けるために血管周囲に位置した血管内皮細胞の生長を促進させる因子（Ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）を過発現及び分泌する。これによって新生血管が不均一に多量生成されて全体的な血流の速度が減少するようになる。これを克服するために溢血（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を増加させて治療剤が血管から抜け出して組織に分布されるようにする方法である。溢血と関連した炎症反応サイトカインであるＴＮＦ−αとＩＬ−２、溢血を促進する化学物質（Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）と治療剤を併用投与（Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）して腫瘍組織へ薬物伝達を増進させた事例がある（ｍａｒｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかし、このような試みは抗体及び溢血促進剤の二つの物質を生産しなければならないという点で実用化及び臨床実験に困難がある。
【００１４】
高い腫瘍組織内流体圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は薬物が血管から組織へ対流されるための圧力差が小さいかその上組織の流圧が血液の流圧より高い状況から引き起こされる。これは正常組織とは違って、腫瘍組織にリンパ管が不在して組織内部流体が蓄積されることによって主に発生し、非正常的な血管生成（ａｂｎｏｒｍａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）も寄与する。これを克服するために血管内皮細胞の生長を促進させる因子、特に血管内皮細胞の生長因子−Ａ(ＶＥＧＦ１６５Ａ)の作用を防いで新生血管の生成を抑制して血管を正常化する方法または血管の流圧を増加させる方法が試みられた。血管の流圧を増加させる方法は血漿タンパク質であるアルブミンを抗体と併用投与して血管の浸透圧を増加させて抗体の腫瘍組織伝達効果を向上させた事例がある（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００１５】
基質障壁（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｎｔ）は抗体が微細血管から抜け出して組織へ対流されるとき会う細胞外基質障壁（Ｅｃｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｂａｒｒｉｅｒ）として主にコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）とヒアルロナン（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）で構成されている。細胞外基質によって腫瘍の模様は大きく影響を受ける。これにより薬物がよく分布されるところとそうではないところの差異が生じるために薬物分布が不均一になる。また、細胞外基質の発現量が多くなると固形癌圧迫（Ｓｏｌｉｄ  ｓｔｒｅｓｓ）で高い細胞密度による腫瘍組織流圧が上昇するようになる。これを克服するための接近方法は腫瘍組織細胞の死滅を誘導して腫瘍組織内の細胞密度を減らす方法がある。また、腫瘍組織のコラーゲンを分解する酵素（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を処理して固形癌圧迫を減らして対照群と比較して薬物伝達効果を約２倍高めた事例がある（Ｅｉｋｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１６】
上皮障壁（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ）は腫瘍組織上皮細胞の細胞−細胞間接着因子が稠密に細胞間隙を満たしており治療剤が細胞の間へ拡散または対流が起こらないようになる。Ｅ-カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）はこのような細胞−細胞間接着の主要因子で知られている。このようなＥ-カドヘリンを減少させる物質がウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−３）で発見されて、ウイルスを構成するタンパク質中、細胞のＥ−カドヘリンを減少させる活性を有する部分（ＪＯ−１）のみ抗体と併用投与して抗体の抗癌効果を増進させた事例がある（Ｂｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００１７】
また、抗体の腫瘍組織浸透を増進させるために腫瘍血管細胞及び腫瘍細胞に過発現されるニューロピリン(ＮＲＰ,  Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ)に結合するペプチドを利用する方法がある。ニューロピリンに結合するペプチドを利用する方法中の一つはｉＲＧＤペプチドを抗体と一緒に併用投与（Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）することである（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら、ペプチド併用投与方法の場合、ペプチドの小さい分子の大きさから起因した薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）で非常に短い半減期（Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ）のために実際に患者に投与する量と投与回数が非常に多くなければならない。さらに併用投与の不可避的な過程で治療剤及び腫瘍透過作用物質を各々生産しなければならないところ、産業的に実用可能性は低い。これを克服するための最近の技術は単一クローン抗体の重鎖Ｃ−末端にニューロピリンと結合するＡ２２ｐペプチドを融合して、抗体の長い半減期をそのまま利用して、抗体の腫瘍組織浸透を増進させた例がある（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；大韓民国特許出願１０−２０１４−００６１７５１；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２０１４／００４５７１）。
【００１８】
ニューロピリンは膜透過性糖タンパク質（ｔｒａｎｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）として、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）及びニューロピリン２（ＮＲＰ２）の二つの形態がある（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ニューロピリン１と２は各々９２３と９３１のアミノ酸で構成されており、約４４％のアミノ酸配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を示して、色々な構造的な面と生物学的活性を共有する。ニューロピリン１／２は共通的に細胞外ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ＭＡＭドメインと細胞内ＰＤＺ結合ドメインで構成さている（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ニューロピリンは正常細胞に非常に微弱に発現する一方、大部分の腫瘍血管内皮細胞、固形癌細胞、血液腫瘍細胞に過発現されている（Ｇｒａｎｄｃｌｅｍｅｎｔ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｏｒｇ  ２０１１）。ニューロピリンはＶＥＧＦファミリーリガンド結合によりＶＥＧＦＲｓ（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の共受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）に作用する。特にＮＲＰ１はＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３の共受容体として作用して多様なＶＥＧＦリガンドと結合することで、腫瘍組織で新血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、細胞生存、移動／付着（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ＆  ａｄｈｅｓｉｏｎ）及び浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）などに寄与する。一方、ＮＲＰ２はＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３の共受容体として作用してリンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び細胞付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）に寄与する。また、ニューロピリン１／２はＰｌｅｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓの共受容体として作用して分泌されたセマフォリン３系列（ｃｌａｓｓ３  ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ：Ｓｅｍａ３Ａ，Ｓｅｍａ３Ｂ，Ｓｅｍａ３Ｃ，Ｓｅｍａ３Ｄ,Ｓｅｍａ３Ｅ,Ｓｅｍａ３Ｆ，Ｓｅｍａ３Ｇ)リガンドと結合する。ニューロピリンは機能性細胞内ドメインがなく、リガンドが結合しても単独では活性がなく、共受容体であるＶＥＧＦ受容体またはプレキシンの共同受容体を通じて信号が伝達されると知られている。Ｓｅｍａ３はニューロピリン、プレキシン受容体は２：２：２で結合して作用する。しかしながら、多くの研究結果がニューロピリンタンパク質がＶＥＧＦ受容体またはプレキシンの共同受容体との相互作用なしでも単独的な信号伝達をすることができることを示している。しかしながら、これに対する正確な分子機構はまだ不明確である。
【００１９】
ニューロピリンと共受容体の作用がニューロピリンのみターゲティングした時にも抑制される事例が報告されている。例えば、抗−ニューロピリン１抗体の場合、ＶＥＧＦＲ２とニューロピリン１に結合すると知られたＶＥＧＡ−Ａとニューロピリン１にのみ競争的に結合して、ＶＥＧＦＲ２の作用である新血管生成(ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)、細胞生存、移動／付着（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ＆  ａｄｈｅｓｉｏｎ）及び浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の抑制機能を有すると報告されている（Ｐａｎ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。抗−ニューロピリン２抗体の場合、ＶＥＧＦＲ３とニューロピリン２に同時に結合すると知られたＶＥＧＡ−Ｃとニューロピリン２に競争的に結合して、ＶＥＧＦＲ３の作用であるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び細胞付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）の抑制機能を有すると報告されている（Ｃａｕｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【００２０】
ニューロピリン１と２に結合するＶＥＧＦリガンドファミリー及びＳｅｍａ３系列リガンドのＣ−末端部位はニューロピリン１／２に共通的に存在するｂ１ドメインにある所為、アルギニン結合ポッケト（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合する（ＭＷ  Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。この時、アルギニン結合ポッケトとの結合はニューロピリン結合リガンドのＣ−末端部位に共通的にＲ／Ｋ−ｘ−ｘ−Ｒ／Ｋ（Ｒ＝Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｋ＝ｌｙｓｉｎｅ，ｘ＝ａｎｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）モチーフによって起きる。上記、モチーフから脱するアミノ酸配列で突然変異を誘導するとリガンドはニューロピリンとの結合が減少するか結合ができなくて生物学的活性がなくなる。特に、Ｃ−末端残基に陽イオン性アルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）は結合にとっても必修的で、これを他のアミノ酸残基に置換すると、ニューロピリンとの結合が消失され、生物学的活性がなくなる。従って、このようなニューロピリンリガンドのＣ−末端部位のＲ／Ｋ−ｘ−ｘ−Ｒ／Ｋモチーフの必須性をＣ−末端規則（Ｃ−ｅｎｄ  ｒｕｌｅ／ＣｅｎｄＲ）と称する（Ｔｅｅｓａｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。Ｃ−末端規則の配列を有するタンパク質あるいはペプチドはＣ−末端のアルギニン（Ａｒｇ）或いはリジン（Ｌｙｓ）残基でニューロピリンと結合することができる（Ｚａｎｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
【００２１】
ＶＥＧＦリガンド及びＳｅｍａ３系列リガンドのＣ−末端部位はＲ／Ｋ−ｘ−ｘ−Ｒ／Ｋモチーフを共通的に有しており、大部分のリガンドがニューロピリン１及び２に選択的に一つに結合するよりは、二つのタンパク質にすべて結合する特性を示す。
【００２２】
ニューロピリンに結合するリガンドの他にも、ニューロピリンに結合する多くのペプチドが選別されたりデザインされ、報告されているが、すべてＲ／Ｋ−ｘ−ｘ−Ｒ／Ｋモチーフを有して、上記ペプチドがニューロピリン１／２のｂ１ドメインのアルギニン結合ポッケト（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合することで考えられる。また、ニューロピリン１／２に結合して併用投与した薬物の腫瘍組織浸透性を増加させるｉＲＧＤペプチド（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）と抗体の重鎖末端に融合されて融合抗体の腫瘍組織浸透性を増加させるＡ２２ｐペプチドも（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）上記ＣｅｎｄＲ規則を従うアミノ酸配列を有する。
【００２３】
また、上記ニューロピリンに結合するペプチドはすべてニューロピリン１または２の二つのうちの一つに特異的に結合するペプチドは報告されたことがなく、ＣｅｎｄＲ配列モチーフを有していてニューロピリン１と２のアルギニン結合ポケット（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）にすべて結合する。
【００２４】
上述したことのようにニューロピリン１は主に新生血管に過発現され、新生血管生成に重要な役割をして、ニューロピリン２はリンパ管に発現されてリンパ管生成に寄与する。したがって、ニューロピリン１またはニューロピリン２に選択的に高親和度で結合するペプチドは各ニューロピリンの生物学的活性を特異的に調律することができる特性を有することができるが、これに対する先行報告はない。また、ニューロピリン１と２は同種二量体（ｈｏｍｏ  ｄｉｍｅｒ）または異種二量体（ｈｅｔｅｒｏ  ｄｉｍｅｒ）の形態で活性化されるが、既存ペプチドの場合単一分子（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）の形態で開発され、生物学的活性の調律効能が非常に弱く、ニューロピリン１を同種二量体（ｈｏｍｏ  ｄｉｍｅｒ）の形態で結合して生物学的活性を調律するペプチドの形態が好ましい。また、ニューロピリン１の場合は、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）に過発現され、ＶＥＧＦリガンドの刺激を受けて新血管生成に重要な役割をして、ニューロピリン１にのみ高特異的／高親和度（ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ／ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）に結合し、ＶＥＧＦリガンドとの競争的な結合をするペプチドは、腫瘍組織蓄積（ｈｏｍｉｎｇ  ＆  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）機能や新血管生成阻害能を有することができる。また、ニューロピリン１は腫瘍組織血管及び腫瘍細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）に過発現されて、ＶＥＧＦリガンドの刺激を受けて腫瘍成長及び新生血管生成に重要な役割をして、ニューロピリン１にのみ特異的に結合し、ＶＥＧＦリガンドとの競争的に結合するペプチドは、腫瘍成長を阻害する活性を持つことができる。
また、ニューロピリン１が活性化された時、内皮細胞障壁（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｂｒｒｉｅｒ）)であるＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の減少、上皮細胞障壁（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ）であるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を減少させる活性があり、ニューロピリン１にのみ特異的に結合して、血管内皮細胞のＶＥ−カドヘリンと腫瘍細胞のＥ−カドヘリンの量を減少させる活性を有するペプチドは、このペプチドが融合（ｆｕｓｉｏｎ）されるか、同時投与（Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）されたタンパク質、抗体、ナノ粒子、小分子薬物などの腫瘍組織溢血（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を増加させて、腫瘍組織内でも組織透過性（ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を増加させることができる。
【００２５】
従って、本発明者は既存のニューロピリン１及び２のすべてに結合するペプチドの限界を克服しようと、ニューロピリン２には結合せず、ニューロピリン１にのみ選択的に、高親和度で結合する新規なペプチドを発掘しようとした。また、ニューロピリン１のｂ１ドメインのアルギニン結合ポケット（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に二価結合（ｂｉａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）をして、ニューロピリン１を細胞内に入らせるように活性化させる信号伝達を誘導して、融合されたり、同時投与されたタンパク質、抗体などの腫瘍組織の分布及び蓄積を増加させ、腫瘍組織内部への血管外流出（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を促進して、腫瘍組織内部でも腫瘍組織透過性を有する新規なペプチドを発掘しようとした。従って、常に同一二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）で存在する抗体重鎖不変部位のＣ−末端に融合されて活性を有する新規なペプチドを開発しようとした。
【００２６】
このため、抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）のカルボキシ末端（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に融合されたペプチドライブラリーをデザインし、これを酵母細胞表面に発現させてＦｃ-融合ペプチドライブラリーを構築した後、ニューロピリン１のｂ１ドメインに結合するクローンを選別しようとした。ニューロピリン１にのみ結合するペプチドを選別するため、選別過程でニューロピリン２を競争者として使用した。選別されたクローンのうち、腫瘍組織浸透能があり、ニューロピリン１ｂ１ドメインに結合するクローンを発掘しており、このペプチドを抗体の重鎖Ｃ−末端に融合させて２価の形態（ｂｉａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）で抗体−ペプチドが融合された単一分子で抗体の固有機能はそのままに保持した融合抗体を作製した。この融合抗体技術はニューロピリン１を過発現する腫瘍組織に選択的に蓄積され、腫瘍組織内部への浸透能が増進させた。また、血管生長因子−Ａ(ＶＥＧＦ１６５Ａ)のニューロピリン１に対する結合を妨害して、新生血管形成を抑制させる融合抗体技術を開発するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明の一様相は、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）及びニューロピリン２（ＮＲＰ２）にすべて結合する既存のリガンド及びペプチドとは違って、ニューロピリン１にのみ高特異的/高親和度で結合するペプチド、特に腫瘍浸透性ペプチド（ＴＰＰ，ｔｕｍｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を提供することである。具体的に本発明の一様相は、ニューロピリン１にのみ高特異的/高親和度で結合するペプチドがニューロピリン１と結合するＶＥＧＦリガンドなどと競争的に結合して、腫瘍で新血管生成を阻害する活性と腫瘍浸透性活性を同時に有するペプチドを提供することである。
【００２８】
また、本発明の一様相は、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを提供することである。
【００２９】
また、本発明の一様相は、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供することである。
【００３０】
また、本発明の他の様相は、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド、またはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾患の治療または予防用医薬組成物を提供することである。
【００３１】
また、本発明のさらに他の様相は、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを含む癌または新生血管関連疾患の診断用の組成物を提供することである。
【００３２】
また、本発明の他の様相は、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドをスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明の一様相はニューロピリン１にのみ高特異的/高親和度（ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ／ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）に結合するペプチド、特に腫瘍浸透性ペプチド（ＴＰＰ，ｔｕｍｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を提供する。このようなニューロピリン１特異的ペプチドは、既存のニューロピリン１（ＮＲＰ１）及びニューロピリン２（ＮＲＰ２）にすべて結合するリガンド及びペプチドとは異なる配列を有するペプチドを提供する。
【００３４】
以下本発明について具体的に説明する。
【００３５】
本発明による上記ペプチドは５個ないし５０個のアミノ酸からなり；上記ペプチドのＣ末端はＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４で、ここで、上記Ｘ１はアルギニン、リジン、または任意のアミノ酸配列であり、上記Ｘ２及びＸ３は各々独立的に任意のアミノ酸配列であり、上記Ｘ４はアルギニンまたはリジンのことである。
【００３６】
本発明の具体例では抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）のＣ−末端（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に融合されたペプチドライブラリーをデザインし、これを酵母細胞表面に発現させてＦｃ−融合ペプチドライブラリーを構築した後、ニューロピリン１のｂ１ドメインに選択的に結合するクローンを選別して導出されたペプチドを分離、同定した。
【００３７】
上記Ｆｃ-ペプチドライブラリーでニューロピリン１に特異的で高親和度で結合するペプチドを分離するため、ニューロピリン１のｂ１ｂ２ドメインタンパク質を利用して選別すると同時にニューロピリン２のｂ１ｂ２ドメインタンパク質を競争者（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）と利用して、選別過程を進行した。
【００３８】
また、本発明の一具体例ではニューロピリン１にのみ高特異的/高親和度で結合するペプチドが２価の形態でニューロピリン１と結合して生物学的活性を有するように、抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）のＣ−末端（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に１５個の（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）Ｘ３アミノ酸配列からなるリンカーで融合されたＦｃ-融合ペプチドを構築して、腫瘍浸透性活性と新血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻害する活性を同時に有しているペプチドを分離、同定した。
【００３９】
本発明で使用する用語「腫瘍浸透性」とは例えば１）腫瘍特異血管内皮細胞、腫瘍細胞または組織を特異的に認識して蓄積したり、２）腫瘍血管内皮細胞の細胞間隙を広げて血管外への流出（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を促進させたり、３）腫瘍内部で腫瘍細胞間隙を調節して腫瘍内部に深く浸透を促進する特性のうち、一つ以上の特性を有することを意味する。
【００４０】
本発明で使用する用語「新血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）阻害」は、例えばニューロピリン１に結合して新血管生成を促進するＶＥＧＦリガンドなどとニューロピリンとの結合を競争的に結合してリガンドの活性を阻害して、究極的に腫瘍組織内で新血管生成抑制能（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を示す特性を意味する。
【００４１】
本発明の上記ペプチドは５個ないし５０個のアミノ酸からなることができて、好ましくは７個ないし３０個以下からなることができる。
【００４２】
本発明の上記ペプチドはＮ−末端からＸ３を構成するアミノ酸の配列が任意のアミノ酸配列であることができるが、好ましくはセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、プロリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、または停止コドンであることができ、さらに好ましくはヒスチジン、グリシン、アスパラギン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、アルギニン、プロリン、イソロイシン、アラニン及びリジンでなる群から選択されることができる。また、本発明の上記ペプチドは望ましくはＮ−末端がヒスチジン−トレオニン−プロリン−グリシン（Ｈ−Ｔ−Ｐ−Ｇ）でなることができる。
【００４３】
本発明の具体例で、上記ペプチドは配列番号１ないし３のアミノ酸配列からなることができて、配列番号１ないし３の具体的な配列情報は下記のようである。
0006470849.tif 000002
【００４４】
本発明による上記ペプチドの最も好ましい例は上記配列番号３のＴＰＰ１１である。
【００４５】
上記一様相のＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドはリンカーペプチドを追加で含むことができる。上記リンカーペプチドは１個ないし５０個のアミノ酸からなることができて、好ましくは４個ないし２０個、さらに好ましくは４個ないし１５個のアミノ酸からなることができる。また、上記リンカーペプチドはグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、またはセリン（ｓｅｒｉｎｅ）で構成されることができ、好ましくは、上記リンカーペプチドの配列は（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列からなること(但し、上記ｎは各々独立的に整数１ないし２０中の一つである)ができ、より好ましくは（ＧＧＧＧＳ）３のアミノ酸配列からなることができる。
【００４６】
本発明の具体例で、リンカーペプチドが結合した状態のペプチド配列は配列番号４ないし６のアミノ酸配列からなることができる。
【００４７】
その具体的な配列情報は下記のようである。
0006470849.tif 000003
【００４８】
本発明のほかの様相は、上記のＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド(配列番号１ないし６)が融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを提供する。
【００４９】
上記のタンパク質は抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体、または化学的に改質されたタンパク質などであるができる。
【００５０】
本発明において小分子薬物は約１０００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有して、疾病の治療剤として活性度を有する有機化合物、無機化合物または有機金属化合物を示すもので、本願で広範囲に使用される。本願で小分子薬物はオリゴペプチド及び約１０００ダルトン未満の分子量を有するその他のバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
【００５１】
本発明において、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、直径１ないし１０００ｎｍの大きさを有する物質からなった粒子を意味し、上記ナノ粒子は金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コア及び上記コアを取り囲む金属シェルで構成される金属/金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コア及び上記コアを取り囲む非金属シェルで構成される金属/非金属コアシェルまたは非金属ナノ粒子コア及び上記コアを取り囲む金属シェルで構成される非金属/金属コアシェルの複合体であることができる。一具体例によると、上記金属は金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄及びその酸化物から選択されるものであることができるが、これに限定することではなく、上記非金属はシリカ、ポリスチレン、ラテックスやアクリルレート系の物質から選択されるものであることができるが、これに限定することではない。
【００５２】
本発明において、リポソームは自ら会合することができる、水性内部区画を取り囲む一つ以上の脂質二重層膜で構成される。リポソームは、膜タイプ及びその大きさにより特定されることができる。小さいユニラメラ小胞(ＳＵＶ)は、単一膜を有し、２０ｎｍないし５０ｎｍの直径を有することができる。大きいユニラメラ小胞(ＬＵＶ)は、５０nm以上の直径を有することができる。オリゴラメラ大きい小胞及びマルチラメラ大きい小胞は、多重、通常的に同心円の膜層を有し、直径が１００ｎｍ以上であることができる。幾つかの非同心円膜を有するリポソーム、すなわち、より大きい小胞内で含まれる幾つかの小型小胞は、マルチ小胞性小胞(ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ)と呼ばれる。
【００５３】
また、上記ペプチドはニューロピリン１に２価（ｂｉａｖａｌｅｎｔ）またはそれ以上に結合することができる。
【００５４】
本発明において「融合」は機能または構造が異なったり、同一な二つの分子を一体化することで、上記タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに上記ペプチドが結合することができるすべての物理、化学的または生物学的方法による融合であることができる。上記の融合は好ましくはリンカーペプチドによることができて、このリンカーペプチドは、例えば抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）断片のＣ−末端に結合することができる。
【００５５】
本発明の具体例にで、上記融合タンパク質は上記ペプチドが結合した完全な形態の抗体であることができる。
【００５６】
本発明で完全な抗体は２個の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）の軽鎖及び２個の全長重鎖を持つ構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ，ＳＳ−ｂｏｎｄ）抗体の不変領域は重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域はガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)及びイプシロン(ε)タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１(γ１)、ガンマ２(γ２)、ガンマ３(γ３)、ガンマ４(γ４)、アルファ１(α１)及びアルファ２(α２)を有する。軽鎖の不変領域はカッパ(κ)及びラムダ(λ)タイプを有する。
【００５７】
「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」は抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）及び３つの不変領域ドメインＣＨ１（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  １）、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」は抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）及び不変領域ドメインＣＬ（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉ  ｃｏｂｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む全長軽鎖及びこの断片をすべて含む意味で解釈される。
【００５８】
本発明において、抗体の断片は抗体の重鎖または軽鎖の各々のドメインまたはその断片を意味し、例えば、抗体の重鎖不変領域断片（ＣＨ１，ＣＨ２，またはＣＨ３)、重鎖可変領域断片（ＶＨ）、軽鎖不変領域断片（ＣＬ）、軽鎖可変領域断片（ＶＬ）、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆａｂ））、単一鎖抗体断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ））またはこれらの断片であるができる。望ましくは、上記抗体の断片は抗体の蝶番（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２−ＣＨ３からなる重鎖不変領域（ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆｃ））断片であることができる。
【００５９】
また、上記抗体の断片は単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、二量体（ｄｉｍｅｒ）または多量体であることができる。
【００６０】
上記抗体は、単一クローン抗体、非特異的抗体、非−ヒト抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ(抗−Ｉｄ)抗体、そして上記抗体のエピトープ−結合断片を含むが、これに限定されることではない。
【００６１】
上記単一クローン抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであることができて、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ５、またはＩｇＤタイプであることができて、ＩｇＧ１タイプであることができる。また、上記抗体の軽鎖不変領域はλまたはκ形であることができる。
【００６２】
上記ペプチドは抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)の断片に結合されることができ、好ましくはＦｃのＣ−末端に結合することができて、上記結合はリンカーペプチドによるものであることができる。
【００６３】
また、本発明の他の様相は、上記記述したペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
上記「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は単一鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ(ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ)及びこれから転写されるＲＮＡ配列を包括して、特別に他の言及がない限り天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
【００６５】
上記ポリヌクレオチドは、上記記述したペプチドをコーディングするヌクレオチド配列だけではなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。上記相補的な配列は完璧に相補的な配列だけではなく、実質的に相補的な配列も含む。これは当業界に公知された過酷な条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｕｓ）下で、例えば、配列番号１ないし３及び配列番号４ないし６のうちいずれか一つのアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列と混成化されることができる配列を意味する。
【００６６】
また、上記ポリヌクレオチドは変形されることができる。上記変形はヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換または保存的置換を含む。上記アミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドは上記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。上記実質的な同一性は、上記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限に対応されるようにアラインして、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％%の相同性、最小９０％の相同性または最小９５％の相同性を示す配列であることができる。
【００６７】
本発明の他の様相は、上記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供することができる。
【００６８】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター及びバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−連関ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。上記組換えベクターに使用されることができるベクターは当業界でたびたび使用されるプラスミド(例えば、ｐＳＣ１０１，ｐＧＶ１１０６，ｐＡＣＹＣ１７７，ＣｏｌＥ１，ｐＫＴ２３０，ｐＭＥ２９０，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ８／９，ｐＵＣ６，ｐＢＤ９，ｐＨＣ７９，ｐＩＪ６１，ｐＬＡＦＲ１，ｐＨＶ１４，ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など)、ファージ(例えば、λｇｔ４λＢ，λ−Ｃｈａｒｏｎ，λΔｚ１及びＭ１３など)、またはウイルス(例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０など)を操作して製作されることができる。
【００６９】
上記組換えベクターで配列番号１ないし３及び配列番号４ないし６のうちいずれか一つのアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドはプロモーターに作動的につながることができる。用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」はヌクレオチド発現調節配列(例えば、プロモーター配列)と他のヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。従って、これにより上記調節配列は、上記他のヌクレオチド配列の転写及び／または解読を調節することができる。
【００７０】
上記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。上記発現用ベクターは当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。上記組換えベクターは当業界に公知された多様な方法を通じて構築されることができる。
【００７１】
上記組換えベクターは原核細胞または真核細胞を宿主として構築されることができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター(例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど)、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点はｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点及びＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されることではない。また、哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーター(例えば、メタロチオニンプロモーター)または哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター)が利用されることができて、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００７２】
一方、上記のベクターは本発明のＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドだけではなく、このペプチドが融合された抗体の断片または抗体を発現することができる。ペプチドが融合された抗体、または抗体の断片の場合、ベクターはペプチドと抗体またはこの断片が一つのベクターで同時に発現されるベクターシステムであるか、または各々の別途のベクターで発現させるシステムすべてが可能である。後者の場合、二つのベクターは同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）を通じて宿主細胞に導入されることができる。
【００７３】
本発明の組換えベクターは、例えば、図６、または図２０に記載された開裂地図を有することができる。
【００７４】
本発明のまた他の様相は、上記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することができる。
【００７５】
宿主細胞は当業界に公知されたいかなる宿主細胞も利用することができ、原核細胞では、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラチフィリウム、セラチアマルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株などが利用されることができる。
【００７６】
本発明のまた他の様相は、上記宿主細胞を培養する段階を含む、ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドの製造方法を提供することができる。
【００７７】
上記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界で広く知られた挿入方法を使用することができる。上記運搬方法は例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスファート沈澱法、電気穿孔法、リポソームー媒介形質感染法及び遺伝子ボンバードなどを使用することができるが、これに限定することではない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）問題によってインタクト（ｉｎｔａｃｔ）したＩｇ形態の抗体産生には適当ではないが、Ｆａｂ及びＦｖのような抗原結合断片の生産には使用することができる。
【００７８】
上記形質転換された宿主細胞を選別する方法は選択マーカーによって発現される表現型を利用して、当業界に広く知られた方法によって容易に実施することができる。例えば、上記選択マーカーが特定の抗生剤耐性遺伝子である場合には、上記の抗生剤が含まれた培地で形質転換体を培養することによって、形質転換体を容易に選別することができる。
【００７９】
上記一様相はＮＲＰ１に特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチド（ＮＲＰ１ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＴＰＰ）だけではなく、このペプチドが融合した抗体またはこの断片の製造を含む概念である。
【００８０】
ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド、即ち腫瘍浸透性ペプチド（ＴＰＰ）が融合された抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）断片を製造する方法に対する例は以下のようである。
１)上記製造された抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質を抗体の重鎖不変部位蝶番（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２−ＣＨ３-ｌｉｎｋｅｒ−ＴＰＰの核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）をクローニングした組換えＴＰＰ融合重鎖不変部位発現ベクターを製造する段階；
２）上記製造された発現ベクターを細胞に形質転換して組換え抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質を発現する段階；及び
３）上記発現された組換え抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質を精製、回収する段階。
【００８１】
また、本発明のペプチドが融合した抗体の製造方法に対する例は以下のようである。
１）上記製造された抗体ＩｇＧ−ＴＰＰをＶＨ−ＣＨ１−蝶番（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２−ＣＨ３-ｌｉｎｋｅｒ−ＴＰＰの核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）をクローニングした組換えＴＰＰ融合ＩｇＧの重鎖部位及びＶＬ−ＣＬの核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）をクローニングしたベクターを製造する段階；
２）上記製造された重鎖、軽鎖の発現ベクターを細胞に共同形質転換して組換えＩｇＧ−ＴＰＰタンパク質を発現する段階；及び
３）上記発現された組換えＩｇＧ−ＴＰＰタンパク質を精製、回収する段階。
【００８２】
また、本発明の一様相は、上記ペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ペプチド、ナノ粒子またはリポソームを含む癌の治療または予防用医薬組成物を提供する。
【００８３】
本発明によるＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドはＮＲＰ１と特異的に結合することにとって、腫瘍に特異的に分布し、腫瘍内部へ浸透される効能を示す。
【００８４】
また、上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドはニューロピリン１と特異的に結合することによって、ＶＥＧＦ１６５Ａがニューロピリン１に結合するものと競争する。これによってＶＥＧＦ１６５Ａがニューロピリン１に結合して有する新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の機能を抑制することによって、癌治療だけではなく、血管新生関連疾病に対する治療効果を期待することができる。
【００８５】
本発明によるＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された抗体は野生型抗体と類似な生産収率を示し、抗体が結合する抗原や上記ペプチドが結合するニューロピリン１の２種の抗原を同時に標的することができる二重特異性抗体の特性を有し、これによって高効率で抗体を腫瘍組織へ到達することができる特性を有することによって、癌治療に高い効果を期待することができる。
【００８６】
上記癌は扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓腫瘍、乳房癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌及び頭頸部癌からなる群より選択されるものであることができる。
【００８７】
上記血管新生関連疾病としては糖尿病性網膜症、黄斑変性、老人性黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管性緑内障及び後水晶体線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、コンタクトレンズの過渡着用、アトピー性角膜炎、上角膜輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン症侯群、紅斑性ニキビ、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂肪変性症、化学的熱傷、細菌性潰瘍、菌類潰瘍、ヘルペス単純疱疹感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁性角膜変性症、辺縁性角質溶解症、精神的外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開術および角膜移植拒否群から選択されるものであることができる。
【００８８】
上記組成物が癌の予防または治療用の医薬組成物で製造される場合、上記組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。上記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は製剤時に通商的に利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。上記医薬組成物は上記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。
【００８９】
上記癌の予防または治療用医薬組成物は経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤型化されなければならない。また、上記組成物は活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されることができる。
【００９０】
上記癌の予防または治療用医薬組成物の適合な投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。上記組成物の好ましい投与量は成人基準として０．００１―１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。用語「薬学的有効量」は癌を予防または治療するために、または血管新生による疾患の予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００９１】
上記組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することで、単位容量形態に製造されるかまたは多用量の容器内に入れて製造されることができる。この時、剤型はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることができ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。一方、上記組成物は抗体または抗原結合断片を含むので、免疫リポソームで剤型化されることができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造されることができる。上記免疫リポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として、逆相蒸発法により製造されることができる。例えば、抗体のＦａｂ'  断片は、ジスルフィド−交替反応を通じてリポソームに接合されることができる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加でリポソーム内に含まれることができる。
【００９２】
また、上記組成物は個別治療剤で投与したり、癌を治療、予防または処理するのに通商的に使用されてきた治療法と併用して投与されることができる。上記組成物は治療法と併用して投与されることができ、従来の治療法とは順次的または同時に投与されることができる。
【００９３】
通常的治療法の例は、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法及び免疫療法を含むが、これに限定されていない。また、本発明の組成物は好ましくない血管新生と関連されるか、これによって特徴される癌以外の疾病か障害の予防または治療するために利用されることができるが、そのような治療、または予防が必要な患者に治療的にまたは予防的に効果的な量の特定薬物またはこの薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水化物、立体異性体、包接化合物またはこれらのプロドラッグを投与するものを含む。本発明の一具体例では上記組成物は他の薬物(「２次薬物」)または癌を治療、処理または予防する方法と併用して投与される。２次薬物は、その種類を制限せず、タンパク質、抗体、小分子薬物、リポソーム、ナノ粒子、幹細胞などであることができる。
【００９４】
また、本発明の一様相は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドまたはこのペプチドが融合された融合タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームを含む癌の診断用組成物を提供する。
【００９５】
本明細書で使用された「診断」は病態生理の存在または特徴を確認するものを意味する。本発明での診断は癌が発病するかどうか及び経過を確認するものである。
【００９６】
上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドは映像を通じて癌を診断するための分子映像用の蛍光体と結合することができる。
【００９７】
上記分子映像用の蛍光体は蛍光を発生させるあらゆる物質をいい、赤色か近赤外線（ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）の蛍光を発光するものが好ましくて、陽子収得量（ｑｕａｎｔｕｍ  ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光体がさらに好ましいがこれに限定されない。
【００９８】
上記分子映像用の蛍光体は上記ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドと結合することができる蛍光体、蛍光タンパク質またはそのほかの映像用物質が好ましいがこれに限定されない。
【００９９】
蛍光体はフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディパイ（ＢＯＤＹＰＹ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｒｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｐｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロピコシアニン（ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）またはこれらの誘導体が好ましいがこれに限定されない。
【０１００】
蛍光タンパク質はＤｒｏｎｐａタンパク質、蛍光発色遺伝子（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光プロテイン（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲＦＰ）、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５．５またはその他の蛍光タンパク質が好ましいがこれに限定されない。
【０１０１】
その他の映像用の物質は酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいがこれに限定されず、ＭＲ，ＰＥＴのような映像装備に応用することができる。
【０１０２】
また、本発明は上記のようなペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
【０１０３】
具体的に、上記方法は（１）ＮＲＰ１−ｂ１ドメインのアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）と相互作用することができるライブラリーをデザインする段階；
（２）上記段階（１）のライブラリーを抗体重鎖不変部位に融合させる段階；
（３）上記段階(２)の抗体重鎖不変部位に融合されたライブラリーをＮＲＰ２−ｂ１ｂ２と競争させながらＮＲＰ１−ｂ１ｂ２と結合させる段階；及び
（４）上記段階（３）で結合されたライブラリーとＮＲＰ１−ｂ１ｂ２間の結合力を測定する段階を含む、上記のペプチドをスクリーニングする方法である。
【０１０４】
本発明の具体例で、（１）段階のライブラリーの製作は既存の抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)断片及びセマフォリン３由来の配列を鋳型としたプライマーを使用してＰＣＲを遂行して、自然界に存在しないアミノ酸配列を有するペプチドライブラリーをデザインすることである。
【０１０５】
上記セマフォリン３由来の配列を鋳型としたプライマーは下記のような配列からなることができる。
【０１０６】
抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）に融合させたペプチドライブラリー構築のためのオリゴヌクレオチド塩基配列
0006470849.tif 000004
【０１０７】
また、本発明の具体例で、上記（２）段階では（１）段階で製作したライブラリーを抗体重鎖不変部位に融合させる。また、上記（３）段階では上記重鎖不変部位に融合されたライブラリーを酵母細胞表面に発現させた後、標的分子であるＮＲＰ１−ｂ１ｂ２と結合させる。この時、同時に、ＮＲＰ２−ｂ１ｂ２タンパク質と競争的に結合させてＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１にのみ結合されるペプチドを選別する。
【発明の効果】
【０１０８】
本発明による、ＮＲＰ２に結合せず、ＮＲＰ１にのみ特異的に結合するペプチドはＮＲＰ１に特異的に結合することができるアミノ酸配列を提供する。本発明によるＮＲＰ１に特異的に結合するペプチド及びこのペプチドが融合されたタンパク質はＮＲＰ１と特異的に結合する特性を有するようになって、腫瘍組織に特異的に蓄積され、腫瘍血管内皮細胞の細胞間隔を広げて、血管外へ流出を増進させて、腫瘍組織内部でも細胞間隙を調節して腫瘍組織内部への浸透が顕著に増加する。また、ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが、抗体または抗体の断片に融合された融合抗体は、ペプチドが融合されていない対照群抗体に比べて、同じ容量で投与された時、腫瘍組織に特異的に蓄積され、腫瘍組織内部への浸透が増加し、生体内で顕著に増加された腫瘍抑制活性を示す。
【０１０９】
本発明によるＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された抗体または、その断片は、元来抗体固有の抗原結合能を維持しながら、高効率で融合抗体を腫瘍組織に蓄積されて、腫瘍組織内部への浸透を促進させる特性を有することで、腫瘍治療及び診断に高い効果を期待することができる。また、本発明によるＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された抗体の断片は、ＶＥＧＦ１６５ＡのＮＲＰ１との結合を抑制してＶＥＧＦ１６５Ａによる新生血管形成を抑制する特性を有することにより、腫瘍の生長と転移、年齢関連黄斑変性、糖尿病性綱膜病症、関節リウマチなどのような疾病などの多様な疾病の治療及び診断にも活用を期待することができる。
【０１１０】
本発明によるペプチドが融合された抗体または、その断片はペプチドが融合されていない野生型抗体と類似な生産収率を示して、融合抗体またはその断片は、元来野生型抗体が有する抗原結合能、重鎖不変部位（Ｆｃ）の固有機能であるｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇに対する結合能が保存され、生産において既存抗体に比べ、追加される費用がなく抗体の抗癌活性を維持する特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図1はニューロピリン１及び２の構造を図式化したものである。（Ａ）、（Ｂ）はニューロピリンが大きく5つのドメインで構成されているが、Ｎ−末端から、ａ１、ａ２ドメインはＣＵＢドメインに分類され、セマフォリンのＩｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分が結合する部分である。特にこの部位はプレキシンと複合体を形成してセマフォリン-プルレクシンとの結合力を増加させる役割をする。ｂ１、ｂ２ドメインはＦＶ/ＶＩＩＩドメインとして分類されており、ＶＥＧＦやセマフォリン３系列のリガンドのＣ−末端部位が結合する。特にこの部分にはヘパリンが結合することができる部位が存在し、（＋）を示す残基が多いリガンドの結合を容易にする。また、ＭＡＭはオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導する一方、ＴＭ（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）はニューロピリンが細胞表面に固定されることができるようにして、細胞内ドメイン（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）にはＰＤＺ（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５，Ｄｉｓｋ  ｌａｒｇｅ，Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ  １）ドメインと結合できる部位が存在する。
【図２】図２はＮＲＰ１と抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質及び抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質とニューロピリン1の結合複合体を図式化したものである。二量体(dimer)の形態でＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１ｂ１ドメインのアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に特異的に結合するクローンを導出しようとする。
【図３】図３はＮＲＰ１とＮＲＰ２に同時に結合するＡ２２ｐペプチド（Ｎ末端−ＨＴＰＧＮＳＮＫＷＫＨＬＱＥＮＫＫＧＲＰＲＲ−Ｃ末端)を基盤に、Ｃ−末端から１８個の残基が該当する部分に（５−２２）同義性コードン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｃｏｄｏｎ）であるＮＨＢ（ＡＴＧＣ／ＡＣＴ／ＴＣＧ）を入れてライブラリーを構築したものの模式図である。Ｆｃ-融合ペプチドライブラリーは抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)のＣ−末端（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に１５個の（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）Ｘ３アミノ酸配列からなったリンカーを融合して構築した。構築されたＦｃ-融合ペプチドライブラリーは、下段の図式のように酵母細胞表面にＡｇａ１ｐ−Ａｇａ２ｐに融合されて発現し、ペプチドライブラリーは抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)断片のＣ−末端部に存在する。
【図４】図4はＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを選び出すために使用されたタンパク質とＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ分析結果である。（Ａ）はＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを選別するために使用されたビオチン化されたニューロピリン１ｂ１ｂ２タンパク質とニューロピリン２ｂ１ｂ２タンパク質の構造を図式化したものである。また、発現精製ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（Ｂ）は、構築されたライブラリーでビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２を結合抗原で使用して、競争抗原としてビオチン化されなかったＮＲＰ２−ｂ１ｂ２を１０倍濃度高く使用して、ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳを遂行してＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合したｐｏｏｌに対して選別過程ごとにｐｏｏｌを分析したＦＡＣＳ分析結果である。これは抗体の重鎖不変部位(Ｆｃ)の発現程度とビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合能を分析することができ、酵母細胞表面にＦｃ−Ａ２２ｐが発現された細胞と比較して、ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳを重ねることにつれビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合し、抗体の重鎖不変部位(Ｆｃ)の発現に影響を与えないクローンの数の割合が増加することを示す。
【図５】図５（Ａ）、図５（Ｂ）は選別された単一クローンのビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合をＦＡＣＳで同定した結果である。（Ａ）は計５０個の単一クローンをＡ２２ｐと比較分析して、各クローンの１００ｎＭビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２結合力をＦＡＣＳで示された平均蛍光強度（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で同定しており、その中で上位の平均蛍光強度を示したＴＰＰ１、ＴＰＰ８、ＴＰＰ１１と命名したクローンで配列が収斂された。（Ｂ）は、酵母細胞表面に発現されたＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１に１００ｎＭＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合ＦＡＣＳ分析結果を示す。
【図６】図６は抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたＦｃ-融合ペプチドＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質を動物細胞ＨＥＫ２９３細胞で発現するためのベクターの裂開地図の例である。
【図７】図７は抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質の図式と発現精製ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（Ａ）は抗体重鎖不変部位はＮ−末端に蝶番（ｈｉｎｇｅ）から始まり、２つのジスルフィド結合を維持させて二量体を形成しやすいように製作した。抗体重鎖不変部位のＣＨ３末端に１５個のアミノ酸（（Ｇ４Ｓ）３）のペプチドリンカーを利用してＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを融合して制作した。（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で各クローンの二量体形成と精製時、純度を確認することができる。また、リンカー及びＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを導入したほど大きさの差異を確認することができる。
【図８】図８は、動物細胞で発現、精製された抗体重鎖不変部位とＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された形態であるＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１のＮＲＰ１に対する結合力を測定したＥＬＩＳＡ実験結果である。（Ａ）は、濃度依存的なＥＬＩＳＡを遂行した結果、Ｆｃ−Ａ２２ｐと比較して、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＮＲＰ１−ｂ１ｂ２ドメインに約１０倍から６０倍ほど向上された親和度を有する。（Ｂ）はＦｃ−Ａ２２ｐと比較して、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＮＲＰ２−ｂ１ｂ２タンパク質には結合せず、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に特異的に結合する。対照群であるＶＥＧＦＲ２には結合しない。Ｆｃに融合されていない合成ペプチドＴＰＰ１１はＦｃ−ＴＰＰ１１に比べて、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２タンパク質に対して１００倍以上の低い親和度を示している。これはＦｃ−ＴＰＰ１１がアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）効果で高い親和度を有することを示している。
【図９】図9はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質が細胞表面に発現されたＮＲＰ１に特異的な結合可否を、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）表面に発現されたＮＲＰ１との重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の分析を観察した結果である。Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を対照群(ＰＢＳバッファー)、Ｆｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐと同一に処理して、細胞表面に結合した程度を染色して観察した結果、Ｆｃとは違って、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は細胞表面のＮＲＰ１と重畳されることにより、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質がＮＲＰ１に特異的に結合することを確認した。
【図１０】図１０はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質が細胞表面に発現されたＮＲＰ１に特異的に結合してＮＲＰ１を活性化させ、細胞内部流入能（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した結果である。血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対照群(ＰＢＳバッファー)、Ｆｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐ、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を同一な条件で処理し、細胞内へ流入された程度を染色して観察した結果、Ｆｃとは違って、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＮＲＰ１と重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）され、細胞内へ流入になったことを観察した。これはＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１と特異的に結合してＮＲＰ１を活性化させることを意味する。
【図１１】図11はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質がＨＵＶＥＣでの生物学的機作を確認した結果である。（Ａ）はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質のＨＵＶＥＣでの生物学的機作を確認するためのウエスタンブロット結果である。対照群でＶＥＧＦ１６５Ａの場合、Ｆｃとは違って、ＨＵＶＥＣで透過能の向上効果を示して、これはＶＥ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）の減少で確認することができる。対照群であるＶＥＧＦ１６５ＡがＶＥ−カドヘリンを減少させて、ＮＲＰ１特異的に選別された、単一クローンのうちＦｃ−ＴＰＰ１１が最も効果的にVＥ−カドヘリンを減少させた。また、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＦｃ−Ａ２２ｐタンパク質に比べて１０倍低い濃度で、さらに効果的にＶＥ−カドヘリンを減少させることを確認した。（Ｂ）はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質が血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の透過能を向上させるか確認するために、トランスウエルアッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ）を遂行した結果である。その結果、ＶＥＧＦ１６５Ａ、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１が効果的に透過能を増加させた。一方、ＶＥ−カドヘリン減少能がないＦｃ−ＴＰＰ１は透過能を向上させなかった。これは図１１（Ａ）の結果と密接な連関性がある結果である。
【図１２】図１２はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質が腫瘍組織への蓄積及び組織浸透性を免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で同定した結果である。人間表皮癌細胞株であるＡ４３１をヌードマウスに移植して育てた後、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質を尾静脈に注入した後、Ｆｃ融合蛋白質の分布を血管(ＣＤ３１)との二重染色を通じて確認した結果、対照群であるＦｃとは違って、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質が腫瘍組織に選択的に到達し、腫瘍組織内へ効果的に浸透したことを確認した。特にＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＦｃ−Ａ２２ｐタンパク質に比べて顕著に向上された腫瘍組織内へ効果的に浸透されたことを確認した。右の棒グラフは腫瘍組織蓄積を定量化したものである。
【図１３】図１３はＦｃ−ＴＰＰ１１の上皮癌由来腫瘍細胞及び組織における活性を測定したものである。（Ａ）はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１タンパク質の人間頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕでＥ−カドヘリンの変化をウエスタンブロットを遂行した結果である。その結果、Ｆｃとは違って、ＮＲＰ１に特異的に選別された単一クローンの中でＦｃ−ＴＰＰ１１が最も効果的にＥ−カドヘリンの減少を誘導し、Ｆｃ−Ａ２２ｐより１０倍低い濃度でＥ−カドヘリンを減少させた。（Ｂ）はＦｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１に結合して上皮組織の細胞間隙を調節して腫瘍組織浸透能を有しているか確認するため、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍浸透分析を通じて観察した結果である。対照群Ｆｃの場合、腫瘍組織内へ浸透できない一方、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は血管がなくてもＮＲＰ１による細胞接着因子である、ＶＥ−カドヘリンやＥ−カドヘリンの減少を通じて細胞間隙を調節して腫瘍組織浸透能を有することを確認した。
【図１４】図１４はＴＰＰ１１ペプチドがＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に競争的に結合するかを評価した実験である。（Ａ）はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＦｃ−Ａ２２ｐに比べて非常に低い濃度でも、ＶＥＧＦ１６５ＡのＮＲＰ１結合を競争的に結合して阻害する結果である。これはＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合する位置がＶＥＧＦ１６５Ａのようなアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）であることを示唆する。（Ｂ）は合成したＴＰＰ１１ペプチドがＮＲＰ１−ｂ１に位置するアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合するＲＰＡＲＰＡＲペプチド（Ｔｅｅｓａｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）とＶＥＧＦ１６５ＡリガンドとＮＲＰ１に対して、結合競争ＥＬＩＳＡを遂行した結果である。合成されたＴＰＰ１１ペプチドがＮＲＰ１−ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合すると知られたＲＰＡＲＰＡＲペプチド及びＶＥＧＦ１６５Ａとの結合競争を確認し、これはＴＰＰ１１がＮＲＰ１ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合することを証明する。
【図１５】図１５はＦｃ−ＴＰＰ１１の新生血管生成阻害（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）活性を測定した結果である。（Ａ）はＦｃ−ＴＰＰ１１のＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のチューブ形成（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が抑制されるかを確認するため、チューブ形成アッセイ（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を遂行した結果である。その結果、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＶＥＧＦ１６５Ａによって誘導された内皮細胞のチューブ形成を効果的に抑制させた。（Ｂ、Ｃ）はマウスの生体内でＶＥＧＦ１６５Ａによって誘導された新生血管形成をＦｃ−ＴＰＰ１１が抑制することができるかを調べるため、マトリゲルプラグ分析（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）を遂行した結果である（Ｂ）血管生成は免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を通じ、抗ＣＤ３１抗体で血管の密度を測定した。（Ｃ）右図は、イメージを定量した結果である。その結果、Ｆｃ−Ａ２２ｐとＦｃ−ＴＰＰ１１がマウス生体内でＶＥＧＦ１６５Ａによって誘導される血管の形成を抑制した。特に、Ｆｃ−Ａ２２ｐよりＦｃ−ＴＰＰ１１がさらに效果的に血管の形成を抑制することを確認した。
【図１６】図１６はＦｃ−ＴＰＰ１１のＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞の移住（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）や浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制活性を測定した結果である。（Ａ）はＦｃ−ＴＰＰ１１がＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞の移住作用を抑制するかを確認するための傷の治癒（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）分析結果である。対照群ＶＥＧＦ１６５Ａの場合、血管内皮細胞の移住作用を増加させて、Ｆｃと違って、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は血管内皮細胞の移住作用を抑制した。(Ｂ)はＶＥＧＦ１６５Ａによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の浸潤をＦｃ−ＴＰＰ１１が抑制することをトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）アッセイを通じて確認した結果である。対照群ＶＥＧＦ１６５Ａと違ってＦｃ−ＴＰＰ１１は血管内皮細胞の浸潤作用を抑制した。
【図１７】図１７はＦｃ−ＴＰＰ１１のマウス生体内で腫瘍成長抑制活性と腫瘍組織の新生血管生成抑制能を測定した結果である。(Ａ)はＦｃ−ＴＰＰ１１の新生血管生成抑制能が実際に生体内で癌細胞の成長抑制に影響を及ぼすかを確認するためのヌードマウスモデルでの癌成長阻害の実験結果である。ＦａＤｕ細胞をヌードマウスに移植した後、Ｆｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を注入した結果ＰＢＳ、Ｆｃに比べてＦｃ−ＴＰＰ１１が癌細胞の成長を阻害することを確認した。(Ｂ)は、上記実験時のマウスの重さを測定した結果である。ＰＢＳ、Ｆｃを注入したマウスと比較した時、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を注入したマウスの重さには大きな差異がなかった。これはＦｃ−ＴＰＰ１１がマウスに他の毒性がないことを間接的に証明した結果である。（Ｃ）は、上記実験の腫瘍抑制能が新生血管生成の抑制能による効能であるかを確認するために、上記実験の腫瘍を摘出して免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した結果である。その結果、対照群であるＰＢＳ、Ｆｃと比較してＦｃ−ＴＰＰ１１を注射したマウスの腫瘍組織は血管密度が減り、また血管や周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）の重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が減少した。
【図１８】図１８(Ａ)はＦｃ−ＴＰＰ１１と併用投与したドキソルビシンの腫瘍組織内浸透能を確認するために、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の実験を遂行した結果である。その結果、対照群であるＦｃと比較してＦｃ−ＴＰＰ１１をドキソルビシンと併用投与した場合、ドキソルビシンの腫瘍組織浸透能が増加した。(Ｂ)は、組織内のドキソルビシンの蓄積量を定量的に確認した結果である。
【図１９】図１９はＦｃ−ＴＰＰ１１の効能を総合的に示した模式図である。Ｆｃ−ＴＰＰ１１は、ＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１−ｂ１ドメインに位置したアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に高親和度、高特異性で結合する。上記特性でＦｃ−ＴＰＰ１１はＮＲＰ１に対する生体内に注入時、腫瘍組織選択的到達が可能であり、腫瘍組織の血管外の流出を増加させて、腫瘍組織内部での浸透が増加される。また、血管生成因子ＶＥＧＦとのＮＲＰ１に対する競争的結合で、ＶＥＧＦによる新生血管形成を抑制する。
【図２０】図２０はＩｇＧ重鎖-ＴＰＰ１１を発現するためのベクターの開裂地図の例である。
【図２１】図２１はＩｇＧ軽鎖を発現するためのベクターの開裂地図の例である。
【図２２】図２２の(Ａ)は、既存の抗−ＥＧＦＲ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂの重鎖Ｃ−末端にＴＰＰ１１を導入して構築された抗体を図式化した図である。(Ｂ)はＨＥＫ２９３F細胞に共同形質転換を通じて、一時的に発現及び精製した後、還元性及び非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で大きさ及び純度を分析した結果である。（Ｃ）はＥＬＩＳＡを通じてＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１がＣｅｔｕｘｉｍａｂの本来の抗原であるＥＧＦＲとの結合能に差がないことを確認した結果で、ＴＰＰ１１の融合が既存の抗体の抗原結合力に影響を与えないことを示している。
【図２３】図２３はＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１の腫瘍組織内浸透能を確認するための免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の実験結果である。ＥＧＦＲが発現されているヒト表皮癌細胞株であるＡ４３１をヌードマウスに移植した後、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ-Ａ２２ｐとＣｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１を静脈注射した後、組織内浸透能を血管(ＣＤ３１)との二重染色を通じて確認した。その結果、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの場合、血管周辺だけに浸透される一方、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−Ａ２２ｐとＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１の場合、血管からもう少し遠い組織内部に浸透されたことを確認した(左側パネル)。特に、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１がＣｅｔｕｘｉｍａｂ−Ａ２２ｐより更に効果的に組織内部に浸透された。これを、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して定量化した(右側パネル)。これはＴＰＰ１１が完全ＩｇＧ抗体の腫瘍組織蓄積及び浸透性を増加させる活性を持っていることを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
［実施例］
以下本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので本発明の範囲がこれらの実施例に限られることではない。
【０１１３】
実施例１：ＮＲＰ１−ｂ１のアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に特異的に結合するペプチドライブラリーデザイン及び構築
図１の(Ａ)及び(Ｂ)で示されたことのように、ニューロピリンは大きく５つのドメインで構成されており、Ｎ−末端から、ａ１、ａ２ドメインはＣＵＢドメインとして分類されて、セマフォリンのＩｇ−ｌｉｋｅ  Ｃ２  ｔｙｐｅ部分が結合する部分である。特にこの部位はプルレクシンと複合体を形成してセマフォリン−プルレクシンとの結合力を増加させる役割をする。ｂ１、ｂ２ドメインはFV/VIIIドメインとして分類されて、ＶＥＧＦやセマフォリン３系列のリガンドのＣ−末端部位が結合する。特にこの部分にはヘパリンが結合できる部位が存在し、（＋）を示す残基が多いリガンドの結合を容易にする。また、ＭＡＭはオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導して、ＴＭ（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）はニューロピリンが細胞表面に固定されることができるようにして、細胞内ドメイン（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）にはＰＤＺ（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５，Ｄｉｓｋ  ｌａｒｇｅ，  Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ  １）ドメインと結合できる部位が存在する。このドメインらのうち、特にｂ１ドメインはＣ−末端規則（Ｃ−ｅｎｄ  ｒｕｌｅ／ＣｅｎｄＲ）が結合することができる袋形の構造を有して、実際に図２のニューロピリンｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合するリガンドであるＳｅｍａ３ｓ及びＶＥＧＦファミリーのＣ−末端配列を解析した時、すべてＣ−末端規則である−Ｒ／Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｒ／Ｋに該当する配列がある。
【０１１４】
ニューロピリンと相互作用し、腫瘍の組織透過能を増進させるという自然のリガンドはＶＥＧＦ１６５ＡあるいはＳｅｍａ３ＡすべてＮＲＰ２よりはＮＲＰ１に好まれて相互作用すると知られている。従って、本発明者はＮＲＰ２よりはＮＲＰ１が腫瘍組織透過能とさらに密接な関係があると予想し、ＮＲＰ１がより好ましいターゲットで予想した。従って、図２に示したことのように、ＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１−ｂ１のアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に特異的に結合する腫瘍組織浸透ペプチド（ＴＰＰ、ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合されたＦｃ−ＴＰＰを選別しようとした。
【０１１５】
上記の目的を達成するために図３に示したことのように、既存Ａ２２ｐの配列を（ＨＴＰＧＮＳＮＫＷＫＨＬＱＥＮＫＫＧＲＰＲＲ）鋳型としてＣ−末端から１８個の残基が該当になる部分の（５−２２）をセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、プロリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸から構成された同義性コードン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｃｏｄｏｎ）であるＮＨＢ（ＡＴＧＣ／ＡＣＴ／ＴＣＧ）が含まれた逆方向始発者を合成した。また、抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)断片のＣＨ３部分に正方向始発者を合成した。この正方向始発者と逆方向始発者には酵母細胞で相同性組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）ができるように５０塩基対がベクターの配列と同一な部分を含む。抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたペプチドライブラリーの構築に使用した始発者の塩基配列は下記表１のようである。
【０１１６】
［表１］Ｆｃ−融合ペプチドライブラリー構築に使用されたオリゴヌクレオチド塩基配列
【表１】
0006470849.tif 000005
【０１１７】
ライブラリーＤＮＡはＰＣＲを遂行して準備された。Ｆｃ−Ａ２２ｐ酵母表面発現ベクター（ｐＣＴＣＯＮ，Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を鋳型にして上記正方向及び逆方向の始発者を利用してＤＮＡを増幅して、増幅されたＤＮＡ（計３００μｇ、１０μｇ／１回形質転換）はＦｃ酵母表面発現ベクターをＢｓｒＧＩとＸｈｏＩ制限酵素を処理して準備したベクターＤＮＡ（１μｇ／１回形質転換)と一緒に酵母に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を３０回繰り返してライブラリーを構築した。続いて、図３のように相同性接合（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を通じて酵母細胞内でライブラリーとベクターを結合した。抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたペプチドライブラリーの大きさは階段式希釈した後、ベクターに存在する選別因子による選択培地で育ったコロニーの数を測定して２Ｘ１０７であることを確認した。
【０１１８】
実施例２：構築された抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたＦｃ−ペプチドライブラリーでＮＲＰ１にのみ特異的に結合する単一クローンの選別
ターゲットタンパク質であるＮＲＰ１-ｂ１ｂ２（２７３−５８６）タンパク質と競争タンパク質であるＮＲＰ２-ｂ１ｂ２（２７５−５９５）を既存方法と同一に９０％以上の純度で準備した（ＢＡ  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ターゲットタンパク質であるＮＲＰ１-ｂ１ｂ２は、図４のようにビオチン化させた（ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））。
【０１１９】
図４(Ａ)はＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを選別するために使用されたビオチン化されたニューロピリン1ｂ１ｂ２タンパク質とニューロピリン２ｂ１ｂ２タンパク質の構造を図式化したものである。また、発現精製ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した。
【０１２０】
図４(Ｂ)は、構築されたライブラリーをＭＡＣＳ及びＦＡＣＳを遂行したｐｏｏｌに対して選別過程ごとにｐｏｏｌを分析したＦＡＣＳである。これは抗体の重鎖不変部位(Ｆｃ)の発現程度とビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合能を分析することができ、酵母細胞表面にＦｃ−Ａ２２ｐが発現された細胞と比較し、ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳを重ねることにつれビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合し、抗体の重鎖不変部位(Ｆｃ)の発現に影響を与えないクローンの数の割合が増加することを示す。
【０１２１】
ビオチン化なった１μＭのＮＲＰ１-ｂ１ｂ２を酵母細胞表面に発現された抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたペプチドライブラリーと３７℃で１時間の間結合させた。ビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２と結合した酵母細胞表面に発現された抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたペプチドライブラリーをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，  Ｄｅｒｍａｎｙ）と４℃で１０分間結合させた後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用してビオチン化されたＮＲＰ１-ｂ１ｂ２に結合したクローンを選別した。次の過程は１μＭのＮＲＰ１−ｂ１ｂ２を酵母細胞表面に発現された抗体重鎖不変部位(Ｆｃ)に融合させたペプチドライブラリーと３７℃で１時間の間結合させた後、ＰＥが接合されたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＡ−ＰＥ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)とＦＩＴＣが接合された抗−Ｆｃ抗体（ａｎｔｉ−Ｆｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，  ｇｏａｔ，(Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ｃｏ．，ＵＳＡ)）を４℃で２０分間結合させた後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用してＦｃ発現量が多く、ビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合力が高いクローンを選別した。以後、２回ＦＡＣＳ過程は上記過程と同じく、ビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２の量を０．５μＭで使用した。そしてＭＡＣＳ、ＦＡＣＳ全過程でビオチン化されたＮＲＰ１−ｂ１ｂ２の競争タンパク質としてビオチン化されていないＮＲＰ２−ｂ１ｂ２を１０倍高い濃度で競争結合させ、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合する個別クローンを選別した。
【０１２２】
また、図５(Ａ)、図５(Ｂ)のようにＦＡＣＳ分析を通じてビオチン化された１００ｎＭのＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合力が高い個別クローンをＰＥ信号によって分類しており、ＴＰＰ１、ＴＰＰ８、ＴＰＰ１１に名称したクローンが選別された。
【０１２３】
選別された各個別クローンは酵母細胞からＤＮＡを回収して配列分析を通じてＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を確認した。
【０１２４】
下記表２はＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１に特異的に結合するように選別されたペプチドの配列を示す。
【０１２５】
［表２］抗体重鎖不変部位（Ｆｃ）に融合させたペプチライブラリーから選別された個別クローンのアミノ酸配列及びｐＩ
【表２】
0006470849.tif 000006
【０１２６】
下記表３は選別されたペプチドを抗体重鎖不変部位に融合する時に使用されたリンカーまで含まれた配列を示す。
【０１２７】
［表３］リンカーが連結されたＮＲＰ１ターゲットペプチド配列
【表３】
0006470849.tif 000007
【０１２８】
実施例３：ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された抗体重鎖不変部位の構築及び発現精製
上記実施例２で選別された個別クローンを動物細胞で発現するために酵母細胞から回収したＤＮＡで抗体の重鎖不変部位のＣＨ３とＮＲＰ１と特異的に結合するペプチド部分をＢｓｒＧＩとＨｉｎｄＩＩ制限酵素を処理して得て、得られたＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．４ベクターに図６のようにクローニングした。
【０１２９】
ＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して上記構築された各々の抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質をエンコーディングするプラスミドを一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を利用してタンパク質を発現させた。振盪フラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプラスミド及びポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ)（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物でトランスフェクションした。振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００ｍｌトランスフェクション時、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０Ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種し、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。その後、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質をエンコーディングするプラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ)で希釈して、ＰＥＩ  ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ)を希釈した１０ｍｌの培地と混合して室温で１０分間、反応させた。その後、反応させた混合培地を予め１００ｍｌに播種した細胞に入れて4時間の間１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して７日間培養した。上澄み液は７日後に採取した。
【０１３０】
標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄み液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液を利用してｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液を利用してサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画はＰｉｅｒｃｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（５Ｋ  ＭＷＣＯ）を利用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を交換した後、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  （１０  ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を使用して濃縮して、精製された抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質は２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。精製された抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質は還元性及び非還元性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【０１３１】
図７(Ａ)は抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたＦｃ−ＴＰＰタンパク質を図式化する。抗体重鎖不変部位はＮ−末端に蝶番（ｈｉｎｇｅ）から始まり、２つのジスルフィド結合を維持するようにして二量体を形成しやすいように製作した。抗体の重鎖不変部位ＣＨ３末端に（ＧＧＧＧＳ）Ｘ３のリンカーペプチドを利用してＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドを融合した形態である。
【０１３２】
図７(Ｂ)は精製されたＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の還元性及び非還元性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ相を分析した結果である。図７(Ｂ)ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で各クローンの二量体形成と純度を確認することができる。
【０１３３】
下記表４は、精製されたＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の培養１Ｌ当たり生産されるタンパク質の収率を示す。３回随行して得る結果を統計処理しており、±は標準偏差値を示す。得られたタンパク質の収率は野生型Ｆｃタンパク質と対照群であるＦｃ−Ａ２２ｐ融合蛋白質との大きな差はなかった。
【０１３４】
［表４］Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＨＥＫ２９３細胞での生産収率
【表４】
0006470849.tif 000008
【０１３５】
実施例４：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＮＲＰ１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合能の評価
精製されたＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＮＲＰ１及び２のｂ１ｂ２ドメインに対する結合能をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）で確認した。
【０１３６】
図８のように対照群であるＦｃ−Ａ２２ｐ及びライブラリーを通じて選別されたＮＲＰ１に特異的な個別クローンの抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合された形態であるＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１のＮＲＰ１に対する結合力を測定したＥＬＩＳＡ実験結果である。Ｆｃ−Ａ２２ｐよりライブラリーから選別されたＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合タンパク質は１０倍から６０倍ほど向上された親和度を有するものと確認した。
【０１３７】
ＮＲＰ１に対する特異性を確認するため、対照群でＶＥＧＦ１６５Ａ及びＦｃ、Ａ２２ｐと各々の抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質をＮＨＳ−ビオチンキット（Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を利用してビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）させた。
【０１３８】
ＮＲＰ１-ｂ１ｂ２（２７３−５８６）タンパク質及びＮＲＰ２−ｂ１ｂ２（２７５−５９５）タンパク質と対照群であるＶＥＧＦＲ２（４６−７５３）を９６  ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎ．，  ＵＳＡ）に１μｇずつ１時間の間、常温で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間、３回洗い流した。５％スキームミルク（Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）（５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で1時間の間結合した後、０．１％  ＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間3回洗い流した。対照群でビオチン化されたＶＥＧＦ１６５Ａ及びＦｃ、Ａ２２ｐ、実験群でニューロピリン１に特異的に選別されたＴＰＰ１１ペプチドとＦｃ−ＴＰＰ１１を[１０ｎＭ](あるいはペプチド[１００ｎＭ])の濃度で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴに1１０分間、３回洗い流した。ＡＰが接合された抗ビオチン抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ｍＡｂ，Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を結合させた後、ｐＮＰＰ（ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ，  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で反応させて４０５ｎｍ吸光度を定量した。ＡＰ−ｐＮＰＰを３０分間反応させて得たＥＬＩＳＡ結果を通じて発現精製したＦｃ−ＴＰＰのＮＲＰ１及び２のｂ１ｂ２タンパク質に対する結合能を確認した。
【０１３９】
図８(Ｂ)のようにＦｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１に高親和度、高特異性でＮＲＰ１に結合することを確認した。
【０１４０】
また、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＮＲＰ１及びＮＲＰ２ｂ１ｂ２タンパク質に対する結合力をさらに定量的に分析するためにＢｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を利用してＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を随行した。
【０１４１】
具体的には、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２ｂ１ｂ２タンパク質各々を１０ｍＭ  Ｎａ−アセテート緩衝液（ｐＨ４．０）に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）に約１０００  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液［１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，３ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ａｎｄ  ０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ｐＨ７．４），ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析して、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質を１００  ｎＭで０．４ｎＭの濃度で分析した。対照群でＦｃ−Ａ２２ｐを使用した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＯＨ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して施行された。結合３分、解離3分で得られた各センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、ブランクセル（ｂｌａｎｋ  ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び削減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
【０１４２】
表５はＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を利用してＦｃ−ＴＰＰタンパク質のＮＲＰ１-ｂ１ｂ２及びＮＲＰ２-ｂ１ｂ２タンパク質に対する親和度の分析結果を示す。
【０１４３】
［表５］抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質のＮＲＰ１-ｂ１ｂ２及びＮＲＰ２-ｂ１ｂ２に対する親和度及び特異性の分析
【表５】
0006470849.tif 000009
【０１４４】
表５で示したことのように、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２ｂ１ｂ２タンパク質に結合するＦｃ−Ａ２２ｐとニューロピリン１に特異的に結合するＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を比較した時、ＮＲＰ１に対する親和度が約６０倍ほど親和度の差が示されて、ＮＲＰ１に対する特異性はＮＲＰ２に対する親和度値を分析した時、約６０倍から１０００倍程度向上された。分析時少なくとも５つのセンサーグラムを利用して分析しており、３回随行して得た結果を統計処理した。±は独立的な実験結果の標準偏差値を示した。
【０１４５】
実施例５：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の細胞表面に発現されたＮＲＰ１との特異的結合及びＮＲＰ１を通じた細胞内流入能の評価
ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドの生物学的同定のための実験ではＮＲＰ１が過発現されたＨＵＶＥＣ(ヒト血管内皮細胞株)を使用した。
【０１４６】
図９はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質が細胞表面に発現されたＮＲＰ１とも結合するかを確認するため、細胞表面のＮＲＰ１との重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するかを共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。
【０１４７】
具体的には、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５Ｘ１０４個のＨＵＶＥＣ細胞をＥＧＭ２(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ)培地０．５ｍｌに入れて２４時間の間５％  ＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化すれば、各ウェルをＰＢＳ０．５ｍｌを利用して洗浄し、その後ＥＭＢ２(Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ)培地に変えて４時間培養した後、ＥＭＢ２培地０．５ｍｌにＦｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐ及びＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を１μＭで希釈して３０分間、４℃条件で培養した。その後、培地を除去して冷たいＰＢＳで洗浄した後、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質の場合、ＦＩＴＣ(緑色蛍光)が結合されているＦｃを特異的に認知する抗体(Ｓｉｇｍａ)で染色し、ＮＲＰ１はＮＲＰ１を認知する１次抗体（ａｂｃａｍ）とＴＲＩＴＣ(赤色蛍光)が結合されている２次抗体(Ｓｉｇｍａ)を利用して染色した。ＤＡＰＩを利用して核を染色(青色蛍光)して共焦点顕微鏡で分析した。
【０１４８】
図９に示したことのように、Ｆｃ−Ａ２２ｐ及びＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１の場合、Ｆｃとは違って、ＨＵＶＥＣ細胞表面にあるＮＲＰ１と結合することを確認した。
【０１４９】
また、他のニューロピリンリガンドの細胞流入能のように、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質もＮＲＰ１により細胞内流入能を有しているかを確認するために、細胞内流入の可否及びＮＲＰ１との重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）可否を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。Ｆｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐ及びＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を１μＭで希釈して１０分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した後、上記のようにＦｃ及び抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質とＮＲＰ１を染色して共焦点顕微鏡で分析した。
【０１５０】
図１０はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＮＲＰ１を通じた細胞内への特異的な流入能を確認するため、共焦点顕微鏡分析を通じて抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質とＮＲＰ１との重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を観察した結果である。図１０で示したことのように、対照群であるＦｃの場合、細胞内流入がならず、比較的にＮＲＰ１及び２に結合するＦｃ−Ａ２２ｐよりＮＲＰ１に特異的に結合するＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がさらに多く細胞内に流入されてＮＲＰ１ともっとたくさん重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることを確認した。これは、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１による特異的な流入能を有することを意味する。
【０１５１】
実施例６：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の細胞透過能向上の評価
６−１：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＨＵＶＥＣでの生物学的機作を調べるためのウエスタンブロット
セマフォリン３ＡまたはＶＥＧＦ１６５ＡはＮＲＰ１を共-受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）で利用して血管透過能（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を向上させると知られている。このような過程で、内皮細胞のＶＥ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）の減少、リン酸化などの変化が起こるようになる。つまり、ＶＥ−カドヘリンまたはＥ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）−カドヘリンは内皮細胞間あるいは上皮細胞間の細胞間隙を成す接着因子であり、この分子の減少は細胞−細胞間隙を稠密にして物質の移動を妨害する。
【０１５２】
これをもとに、血管透過性の増進を間接的に確認することができる実験方法として、ウエスタンブロットを通じたＶＥ-カドヘリンの変化を確認した。具体的には、６ウェルプレートにＨＵＶＥＣ細胞をウェル当たり５Ｘ１０５個の細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間培養した後、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質を０．１μＭに１０分間処理してウエスタンブロットを遂行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行したゲルをＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移して各々ＶＥ−カドヘリンとβ−ａｃｔｉｎを認知する1次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とＨＲＰが結合された２次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を利用して検出しており、分析はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００  ｍｉｎｉ  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した。
【０１５３】
図１１(Ａ)はＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質のＨＵＶＥＣでの生物学的機作を調べるためのウエスタンブロット結果である。図１１(Ａ)に示したことのように、対照群であるＶＥＧＦ１６５ＡとＦｃ−Ａ２２ｐの場合、Ｆｃとは違って、ＶＥ−カドヘリンの減少が観察され、ＮＲＰ１に特異的なＦｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１もＶＥ−カドヘリンの減少が観察された。一方、Ｆｃ−ＴＰＰ１の場合、ＶＥ−カドヘリンの減少が微弱であった。Ｆｃ−Ａ２２ｐの場合、１μＭ処理時、ＶＥ−カドヘリンが著しく減少した。ＮＲＰ１に特異的に強い結合を有するＦｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はＦｃ−Ａ２２ｐより10倍低い0.1μMでも顕著なＶＥ−カドヘリン減少が観察された。その中でもＦｃ−ＴＰＰ１１の場合、ＶＥ−カドヘリンの減少程度が最も効果的に誘導されることが観察された。
【０１５４】
６−２：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の血管内皮細胞透過能を確認するためのトランスウエルアッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ）
上記の実験結果をもとに、血管内皮細胞の透過能の向上可否を確認するための実験でＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質を処理してトランスウエルアッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ）を遂行した。
【０１５５】
具体的には、血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)をトランスウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェル当たり５x１０４個の細胞をＥＧＭ２培地を利用して上位チャンバ（ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）にシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、３日間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。その後、ＥＢＭ培地に変えた後、対照群でＶＥＧＦ１６５Ａは約１．３ｎＭで、Ｆｃ−Ａ２２ｐと実験群Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は１μＭで３０分間処理した。その後、Ｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ(Ｓｉｇｍａ)５０μｇを上位チャンバ（ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）に入れて、血管内皮細胞の透過性が向上された場合、下位チャンバ（ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）で蛍光物質が観察される原理を利用して、３０分後、下位チャンバの培地をサンプリングして蛍光を測定した。
【０１５６】
図１１(Ｂ)はＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の透過能を向上させるか確認するために、トランスウエルアッセイを遂行した結果である。図１１(Ｂ)に示したことのように、ＶＥＧＦ１６５ＡとＦｃ−Ａ２２ｐの場合、血管内皮細胞透過能が向上されたことを確認し、ＮＲＰ１に特異的なＦｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１の場合、Ｆｃと違って血管内皮細胞の透過能が向上されたことを確認した。一方、Ｆｃ−ＴＰＰ１は血管内皮細胞の透過能の向上が非常に微弱であった。結果を総合すると、図１１の(Ａ)と(Ｂ)の結果が密接な連関性があり、抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質中Ｆｃ−ＴＰＰ１１が最も効果的なＮＲＰ１腫瘍浸透性ペプチド（ＴＰＰ）で効果を確認した。
【０１５７】
６−３：マウスモデルでＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の透過能向上を確認するための免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）実験
上記実施例６の（１）ないし（２）ではｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質が血管内皮細胞の透過能を向上させることを確認した。従って、マウスモデルでＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の透過能向上を確認するため、ＩＨＣ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した。
【０１５８】
腫瘍組織内のＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の透過能向上を確認するための実験で、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにニューロピリン１を発現しているＡ４３１  ｃｅｌｌをマウス当たり５Ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入させ、約９日後腫瘍の体積が約３００−４００ｍｍ３程度になった時、各々ＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐ、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を１０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。注射後、各々１５時間後マウスから腫瘍を摘出し、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した。摘出した腫瘍は凍結切片（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）方法で２０μｍの厚さに切り、１次抗体であるＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とこれを認知するＴＲＩＴＣ(赤色蛍光)が結合された２次抗体で血管を染色して、組織内に分布されているＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質を観察するため、Ｆｃを認知するＦＩＴＣ(緑色蛍光)が結合された抗体を使用した。
【０１５９】
図１２は実際の腫瘍組織内のＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドの浸透能を確認するための免疫組織化学の結果である。図１２に示したことのように、対照群であるＰＢＳ、Ｆｃとは違って、Ｆｃ−Ａ２２ｐの場合、腫瘍組織に選択的に到達し、ＮＲＰ１に特異的なＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１も腫瘍組織内へ浸透されたことを確認した。また、Ｆｃ−Ａ２２ｐよりＮＲＰ１に対する選択性と結合能が高いＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がさらに效果的に組織内へ浸透されることを確認した。一方、Ｆｃ−ＴＰＰ８は腫瘍組織内へ浸透されなかった。Ｆｃ−ＴＰＰ１及びＦｃ−ＴＰＰ１１はＮＲＰ１に対する高親和度を持っているために、ＮＲＰ１発現腫瘍組織へ選択的に到達し、Ｆｃ−ＴＰＰ１よりはＦｃ−ＴＰＰ１１が追加的に腫瘍組織浸透能があるために腫瘍組織からさらに広い範囲に存在することを確認した。
【０１６０】
６−４：Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の癌細胞での透過性増進効果の確認
Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１融合蛋白質の透過性増進効果を癌細胞でも確認するために、ＮＲＰ１を発現しているヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕで、上記実験のような条件でＥ-カドヘリンの変化をウエスタンブロットを通じて確認した。
【０１６１】
図１３(Ａ)は、ヒト頭頸部癌細胞株であるＦａＤｕでＥ-カドヘリンの変化をウエスタンブロットを遂行した結果である。図１３(Ａ)で示したことのように、Ｆｃ−Ａ２２ｐの場合、Ｅ-カドヘリンの減少を誘導した。また、ＮＲＰ１に特異的なＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ８、Ｆｃ−ＴＰＰ１１でもＥ-カドヘリンの減少を観察した。上記実施例６の（１）ないし（２）でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ上の結果と同様に、Ｆｃ−ＴＰＰ１１が最も効果的にＥ-カドヘリンの減少を誘導した。
【０１６２】
６−５：癌細胞での腫瘍浸透性を確認するためのｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍浸透アッセイ（Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
追加的に、Ｆｃ-TPPが血管がなくても、上皮組織の細胞間隙を緩和させ腫瘍組織内へ浸透するのかを確認するために、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍浸透アッセイを遂行した。実験方法ではＢａｌｂ／ｃヌードマウス(ナラバイオ、４週齢、ｆｅｍａｌｅ）にＦａＤｕ  ｃｅｌｌをマウス当たり５Ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入して、約１０余日後、腫瘍の体積が約３００−４００ｍｍ３程度になった時、腫瘍組織を摘出した。摘出後、１％ＢＳＡ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が添加されたＭＥＭ培地に組織を洗浄した後、対照群としてＰＢＳ、Ｆｃ、実験群としてはＦｃ−ＴＰＰ１１を３μＭで２時間３０分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養させた。そして１％ＢＳＡが添加されたＭＥＭ培地で、10分ずつ2度洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで固定させた後免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した。腫瘍は凍結切片（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）方法で２０μｍの厚さに切り、Ｆｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を観察するため、Ｆｃを認知するＦＩＴＣ（緑色蛍光）が結合された抗体を使用して染色した。
【０１６３】
図１３(Ｂ)はＦｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１を媒介腫瘍組織浸透活性で血流によって生ずる対流（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）とは独立的に組織内に浸透することができるかを確認するために、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍浸透アッセイを通じて観察した結果である。図１３(Ｂ)で示したことのように、対照群Ｆｃの場合、腫瘍組織内へ浸透されない一方、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は血管がなくても腫瘍組織内へ浸透されることを観察した。これはＦｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１によってＥ-カドヘリンの減少を通じて上皮組織の細胞間隙を緩和させ腫瘍組織浸透能を有することを意味する。
【０１６４】
実施例７：ＴＰＰ１１ペプチドがＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に競争的な結合評価
ＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１にのみ特異的に結合するＴＰＰ１１ペプチドがＮＲＰ１−ｂ１ドメインのアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合すると知られたＶＥＧＦ１６５Ａ及びＲＰＡＲＰＡＲペプチドの競争結合を評価するために結合競争ＥＬＩＳＡを遂行した。
【０１６５】
具体的には、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２（２７３−５８６）タンパク質を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートあるいは９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡブラック（Ｂｌａｃｋ）プレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎ．，ＵＳＡ）に1時間の間、常温で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴ(０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間、３回洗い出した。５％Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ（５％Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で１時間の間結合した後、０．１％ＰＢＳＴ(０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間３回洗い出した。Ｆｃ−Ａ２２ｐ［５０ｎＭ］及びＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１［３ｎＭ］とＶＥＧＦ１６５Ａ（２５ｎＭから０．０２ｎＭ）を濃度別に混ぜた混合物を生成してＮＲＰ１−ｂ１ｂ２タンパク質に結合させた。ＡＰが接合された抗ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で結合させた後、ｐＮＰＰ（ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ＣＯ．，ＵＳＡ）で反応させて４０５  ｎｍ吸光度を定量した。ＥＬＩＳＡ結果を通じてＶＥＧＦ１６５ＡとＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に対する結合を競争することで確認した。
【０１６６】
図１４(Ａ)はＦｃ−Ａ２２ｐ、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１に対して、ＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１に競争して結合するかを確認した結果である。Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１、Ｆｃ−Ａ２２ｐがＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１に結合する部位が重なることを確認し、Ｆｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１が高い親和度を有することを確認した。これはＦｃ−ＴＰＰ１、Ｆｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１−ｂ１ｂ２に結合する位置がＶＥＧＦ１６５Ａのようなアルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）であることを示唆する。
【０１６７】
図１４(Ｂ)はＮＲＰ１−ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合すると知られたＲＰＡＲＰＡＲ及びＶＥＧＦ１６５ＡとＴＰＰ１１ペプチドをＮＲＰ１に対する競争結合を確認したものである。小さなペプチド形態のＴＰＰ１１ペプチドがＲＰＡＲＰＡＲペプチド及びＶＥＧＦ１６５のＮＲＰ１に対する結合を阻害することを確認した。これはＴＰＰ１１がＮＲＰ１ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合することを証明する。
【０１６８】
実施例８：Ｆｃ−ＴＰＰ１１の新生血管形成の抑制能評価
８−１：Ｆｃ−ＴＰＰ１１のＨＵＶＥＣでのチューブ形成の抑制能確認のためのチューブ形成アッセイ（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
ＶＥＧＦ１６５ＡはＮＲＰ１を共-受容体として利用して、新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）させると知られている。これをもとに新生血管形成をin  vitroで確認することができる実験方法で、チューブ形成アッセイを遂行した。実験方法としては５０μｌのＥＣＭａｔｒｉｘを９６ウェルプレートに注入し、３７℃で２時間ポリマー化した。２時間後に、ＨＵＶＥＣ細胞をＥＭＢ２培地を利用して懸濁させてＶＥＧＦ１６５Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１（１μＭ）と混ぜてＥＣＭａｔｒｉｘ上にウェル当たり１Ｘ１０４個ずつプレーティングして８時間培養した。培養された細胞を顕微鏡で観察してイメージを得た。
【０１６９】
図１５(Ａ)はチューブ形成の抑制能をチューブ形成アッセイを通じて確認した結果である。図１５(Ａ)に示したことのようにＶＥＧＦ１６５Ａ処理した細胞ではチューブ形成が増加されて、Ｆｃとは違って、Ｆｃ−ＴＰＰ１１はチューブ形成を抑制したことを確認した。
【０１７０】
８−２：Ｆｃ−ＴＰＰ１１の新生血管の形成抑制能を確認するためのマトリゲルプラグアッセイ（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）
追加的に、新生血管形成の抑制能をin  vivoでも確認するために、マトリゲルプラグアッセイを遂行した。実験方法は６−８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下にマウス当たりＡ４３１  ｃｅｌｌ  ７．５Ｘ１０６個の細胞と２００μｇのＦｃ、Ｆｃ−Ａ２２ｐまたはＦｃ−ＴＰＰ１１、そして０．４ｍｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を注入した後、８日後にマトリゲルプラグを摘出して次のイメージを撮影した後(図１５(Ｂ))、凍結切片方法で２０μｍの厚さに切り、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した。１次抗体であるＣＤ３１抗体とこれを認知するＴＲＩＴＣ（赤色蛍光）が結合された２次抗体で血管を染色して血管の密度を測定した。図１５（Ｃ）はＦｃ−ＴＰＰ１１がマウスの生体内でＶＥＧＦ１６５Ａによって誘導される血管の形成を抑制することができることを確認した結果である。
【０１７１】
８−３：Ｆｃ−ＴＰＰ１１のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇアッセイを通じた血管内皮細胞の移住（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）作用抑制能の確認
上記実施例８−１ないし８−２の結果に追加的に、ＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞の移住（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）作用に対するＦｃ−ＴＰＰ１１の抑制能を確認するために、ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇアッセイを遂行した。実験方法はＨＵＶＥＣ細胞を６ウェルプレートに５Ｘ１０５個ずつ接種した後１μｇ／ｍｌ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  ｃが添加された０．５％血清ＥＭＢ２培地で1時間の間培養して細胞がプレートに飽和された(９５％以上）状態になるようにした。Ｙｅｌｌｏｗ  ｃｈｉｐを利用してｄｉｓｈの底を一直線に引いて均一な幅でｉｎｊｕｒｙ  ｌｉｎｅを作った。そしてＰＢＳで、細胞が底から離れないようにしながら洗った後、ＰＢＳを除去した後に培地をゆっくり入れてＶＥＧＦ１６５Ａを０、２０ｎｇ／ｍｌで処理したＨＵＶＥＣ細胞にＦｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１[1μＭ]で処理して、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養させた。顕微鏡で０、１８時間帯に写真を撮って比較して顕微鏡（Ｐｒｉｍｏ  ｖｅｒｔ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に内蔵されているコンピュータプログラム（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＬＥ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定された二つの両端間の距離を統計的に処理した。
【０１７２】
図１６(Ａ)はＦｃ−ＴＰＰ１１がＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞の移住作用を抑制したことをｗｏｕｎｆ  ｈｅａｌｉｎｇアッセイを通じて確認した結果である。対照群ＶＥＧＦ１６５Ａの場合、血管内皮細胞の移住作用を増加させ、Ｆｃと違ってＦｃ−ＴＰＰ１１は血管内皮細胞の移住作用を抑制した。これはＦｃ−ＴＰＰ１１がニューロピリン１に特異的に結合することによって、ＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に結合を抑制してＶＥＧＦ１６５Ａの血管内皮細胞の移住作用を抑制することを意味する。
【０１７３】
８−４：Ｆｃ−ＴＰＰ１１のトランスウェルアッセイを通じた血管内皮細胞の浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）作用抑制能の確認
追加的に、ＶＥＧＦ１６５Ａによる血管内皮細胞の浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）に対するＦｃ−ＴＰＰ１１の阻害能を調べるため、トランスウエルアッセイを遂行した。８−ｍｍのポアサイズのポリカーボネートメンブレンのトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）を利用した。上記フィルターの下層表面に１：１０の割合でマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）をコーティングして３７℃、５％ＣＯ２条件で２時間の間ポリマー化させた後、上層ウェルにＨＵＶＥＣ細胞とＦｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１[１μＭ]をＥＭＢ２培地に５Ｘ１０４個で接種する。そして下層ウェルにはＶＥＧＦ１６５Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）が含まれたＥＭＢ２培地を注入した。３７℃、５％ＣＯ２条件で１２時間培養した後、上層ウェルの移動しない細胞は綿で除去して４％ホルムアルデヒドで細胞を固定する。そしてＣｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔで細胞を染色した。移動した細胞は顕微鏡で観察し、移動した細胞数を測定した。
【０１７４】
図１６(Ｂ)はＶＥＧＦ１６５Ａにより誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の浸潤をＦｃ−ＴＰＰ１１が抑制することをトランスウェルアッセイを通じて確認した結果である。対照群ＶＥＧＦ１６５Ａの場合、血管内皮細胞の浸潤作用を増加させ、Ｆｃと違ってＦｃ−ＴＰＰ１１は血管内皮細胞の浸潤作用を抑制した。これはＦｃ−ＴＰＰ１１がＮＲＰ１ｂ１アルギニン結合部位（Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ）に特異的に結合することによって、ＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１の結合を抑制してＶＥＧＦ１６５Ａの血管内皮細胞の浸潤作用を抑制することを意味する。
【０１７５】
実施例９：Ｆｃ−ＴＰＰ１１の生体内で腫瘍成長抑制能及び新生血管生成抑制能の
評価
上記実施例８でＦｃ−ＴＰＰ１１の新生血管生成の抑制能を確認した。従って、マウスモデルでＦｃ−ＴＰＰ１１の新生血管生成の抑制能による腫瘍成長の抑制能を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＦａＤｕをマウス当たり５Ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入させた後、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を注射した。具体的に、細胞を移植してから約５日後、腫瘍の体積が約６０ｍｍ３程度になった時、ＦｃとＦｃ−ＴＰＰ１１を２０ｍｇ／ｋｇに３日間隔、６回の静脈注射をした（Ｎ＝６）。
【０１７６】
図１７(Ａ)で示したことのように、対照群であるＰＢＳ、Ｆｃに比べて、Ｆｃ−ＴＰＰ１１は癌細胞の成長を抑制した。また、図１７(Ｂ)で示したことのように、ＰＢＳ、Ｆｃと比較してＦｃ−ＴＰＰ１１が大きく体重の変化がないことを確認しており、これによって毒性はないと判断された。
【０１７７】
図１７（Ｃ）は、上記図１７(Ａ)のＦｃ−ＴＰＰ１１の腫瘍成長の抑制が新生血管生成の抑制能による効能と考えられて、上記実験の腫瘍を摘出してＩＨＣ実験を遂行した結果である。新生血管を示す血管をＣＤ３１抗体で染色して、血管を覆っているペリサイト（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）をα−ＳＭＡに染色して共焦点顕微鏡で観察した。その結果、対照群であるＰＢＳ、Ｆｃと比較してＦｃ−ＴＰＰ１１を注射したマウスの腫瘍組織は血管密度が減り、それによって血管やペリサイト（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）の重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が減少した。これはＦｃ−ＴＰＰ１１が腫瘍から生成されるＶＥＧＦ１６５Ａによる新生血管の生成を抑制することを意味する。
【０１７８】
上記実験結果を総合してみると、図１９に図式されたことのようにＮＲＰ２には結合せず、ＮＲＰ１に特異的に結合する抗体重鎖不変部位と融合されたペプチド(Ｆｃ−ＴＰＰ)を選別して、ＮＲＰ１にのみ特異的に結合してもＶＥ-カドヘリンやＥ-カドヘリンの減少などの信号伝達の傾向性を確認した。また、ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが単一の形態としては、ＮＲＰ１の信号伝達を大きく誘導しなかったが、２価結合形態であるＦｃ−ＴＰＰタンパク質で処理したときは信号伝達を効果的に誘導することを確認しており、これはＮＲＰ１による信号伝達は抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質の融合形態である時、ＮＲＰ１に２価結合（ｂｉａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）して効果的な生物学的活性を有することを意味する。また、ＮＲＰ１に特異的なＦｃ−ＴＰＰタンパク質はＶＥＧＦ１６５ＡとＮＲＰ１について結合競争をしてＶＥＧＦ１６５Ａによる新生血管の抑制能を有して、これによって生体内で腫瘍成長の抑制活性を有する。選別したペプチド中でもＴＰＰ１１が融合された形態であるＦｃ−ＴＰＰ１１の腫瘍浸透能が最も効果的であった。
【０１７９】
実施例１０：Ｆｃ−ＴＰＰ１１の併用投与された小分子薬物の腫瘍組織の蓄積及び透過能の増進評価
上記実験で構築されたＦｃ−ＴＰＰ１１を小分子薬物と併用投与したときに腫瘍組織内の小分子薬物の浸透を確認するために、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を遂行した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＦａＤｕをマウス当たり５Ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入させ、約１５日後腫瘍の体積が約３００−４００ｍｍ３程度になった時、抗癌剤であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）１０ｍｇ／ｋｇと各々ＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を２．５ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。注射１時間後、マウスの心臓を通じてＰＢＳに灌流させた後、４％パラポルムアルデヒドで灌流させて組織を固定させた。その後、腫瘍組織を摘出し、免疫組織化学実験を遂行した。摘出した腫瘍は凍結切片（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）方法で２０μｍの厚さに切り、１次抗体であるＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とこれを認知するＦＩＴＣ(緑色蛍光)が結合された２次抗体で血管を染色し、組織内に分布されているドキソルビシンは自体的に赤色蛍光を帯びることを確認した。
【０１８０】
図１８(Ａ)はＦｃ−ＴＰＰ１１と併用投与したドキソルビシンの腫瘍組織内浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。ＦａＤｕ癌細胞組織でドキソルビシンの場合、赤色蛍光がほとんど観察されない一方、Ｆｃ−ＴＰＰ１１と併用投与したドキソルビシンの場合、ドキソルビシン単独と比較した時、血管からもう少し遠い組織内部へ浸透されたことが確認された。対照群でＦｃとドキソルビシンを併用投与した時は浸透能に影響がないことを確認した。
【０１８１】
図１８(Ｂ)は組織内のドキソルビシンの蓄積量を定量的に確認するために、摘出した腫瘍組織を破砕（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）して腫瘍組織内のドキソルビシンの蛍光値を測定した。図１８(Ａ)と同一な方法でドキソルビシンとＰＢＳ、Ｆｃ、Ｆｃ−ＴＰＰ１１を静脈注射した後、マウスの心臓を通じてＰＢＳに灌流させ、腫瘍組織を摘出した。摘出した組織を１ｍｌの１％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）と１ｍＭ硫酸が入った溶解バッファーに入れて破砕させる。そしてｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍとｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌを１：１で混ぜて溶解された組織と２：１で混ぜた後、−８０℃で凍らせる。その後、３７℃で溶かして遠心分離を通じて上澄み液を得て蛍光（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ４８５ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ５２８ｎｍ）を測定して、ドキソルビシンが透過された量を定量化した。
【０１８２】
上記の結果はＮＲＰ１特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチドが多様な小分子薬物について一般的な適用が可能であることを示す。
【０１８３】
実施例１１：ＴＰＰ１１が融合された完全抗体(ｍＡｂ-ＴＰＰ１１)の構築及び生産
上記実施例７、８でｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ上で抗体重鎖不変部位と選別されたＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質が血管内皮細胞の透過能を向上させることを確認した。従って、マウスモデルでＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドの効果を検証するためのｍＡｂ−ＮＲＰ１に特異的に結合するペプチドのモデル抗体で固形癌治療用の抗体である抗−ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに選定した。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１を構築するため、上記実施例３のＴＰＰ１１ペプチドと抗体の重鎖不変部位(Ｆｃ)が融合されたタンパク質を生産するためのベクターでＢｓｒＧＩとＨｉｎｄＩＩ制限酵素を処理して得た抗体の重鎖不変部位ＣＨ３でＴＰＰ１１が融合された部分のＤＮＡを野生型Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ重鎖をエンコーディングするベクターに置換した。図２０は構築されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ重鎖-ＴＰＰ１１の模式図で、図２１は野生型Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの軽鎖をエンコーディングするベクターである。
【０１８４】
図２２(Ａ)はＴＰＰ１１ペプチドが融合された完全ＩｇＧ、単一クローン抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１模式図を示す。発現及び精製は上記実施例３で遂行した方法でＨＥＫ２９３Ｆで遂行し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて純度を確認した。図２２(Ｂ)はＨＥＫ２９３F細胞に共同形質転換を通じて、一時的に発現及び精製した後、還元性及び非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で大きさ及び純度を分析した結果である。
【０１８５】
下記表６は精製されたＴＰＰ１１が融合された抗体の培養１Ｌ当たり生産されるタンパク質の収率を示す。３回随行して得る結果を統計処理しており、±は標準偏差値を示しす。得られたタンパク質の収率(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１)は野生型タンパク質(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ)の収率と比較して大きな差がなかった。
【０１８６】
［表６］ＴＰＰ１１ペプチドが融合された抗体と野生型抗体の発現精製収率の比較
【表６】
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【０１８７】
図２２（Ｃ）は上記実施例４のようにＥＧＦＲに対する結合能をＥＬＩＳＡを通じてＴＰＰ１１が融合されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１と野生型抗体(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ)を比較したものである。本来ＴＰＰ１１ペプチドが融合されてもＣｅｔｕｘｉｍａｂの抗原であるＥＧＦＲに対する結合能に影響を与えないことを確認した。
【０１８８】
実施例１２：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１抗体の組織浸透能の向上確認
上記実験で構築されたＴＰＰ１１ペプチドが融合された抗体の腫瘍組織内の抗体の浸透を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＦａＤｕをマウス当たり５Ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入させ、約９日後腫瘍の体積が約３００−４００ｍｍ３程度になった時、各々ＰＢＳ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ-ＴＰＰ１１を１．２５ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。注射３時間後、マウスから腫瘍を摘出し、免疫組織化学実験を遂行した。実施例６と同一に組織を染色して観察した。
【０１８９】
図２３はＴＰＰ１１ペプチドが融合されたＣｅｔｕｘｉｍａｂの腫瘍組織内の浸透能を確認するためのＩＨＣ結果である。ＦａＤｕ癌細胞組織でＣｅｔｕｘｉｍａｂの場合、血管周囲にだけ緑色蛍光が観察される一方、ＴＰＰ１１が融合されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１の場合、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと比較した時、血管からもう少し遠い組織内部へ浸透されたことが確認され、これを定量化するためにＩｍａｇｅＪプログラムを使用した。特に、ＮＲＰ１に結合力がさらに高いＴＰＰ１１が融合されたＣｅｔｕｘｉｍａｂ−ＴＰＰ１１の場合、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−Ａ２２ｐより更に効果的に組織内部へ浸透された。上記の結果はＮＲＰ１特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチドが多様な抗原を認知する様々な単一クローン抗体について一般的な適用が可能であることを示す。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
ニューロピリン２（ＮＲＰ２）には結合せず、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）に特異的に結合するペプチドであって、前記ペプチドは５個ないし５０個のアミノ酸を含み；前記ペプチドのＣ末端はＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４で表され、ここで、前記Ｘ１はアルギニン、リジン、または任意のアミノ酸残基であり、前記Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基であり、前記Ｘ４はアルギニンまたはリジンである、ペプチド。
[項目２]
前記ペプチドのＮ−末端からＸ３を構成するアミノ酸の配列はヒスチジン、グリシン、アスパラギン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、アルギニン、プロリン、イソロイシン、アラニン及びリジンからなる群より選択されることである、項目１に記載のペプチド。
[項目３]
前記ペプチドは腫瘍浸透性または新血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）阻害活性を表すことを特徴とする、項目１に記載のペプチド。
[項目４]
前記ペプチドは、配列番号１ないし３の何れか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目１に記載のペプチド。
[項目５]
前記ペプチドは、リンカーペプチドをさらに含むことを特徴とする、項目１に記載のペプチド。
[項目６]
前記リンカーペプチドは５個ないし５０個のアミノ酸からなることを特徴とする、項目５に記載のペプチド。
[項目７]
前記リンカーペプチドは（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列からなり、ここで、ｎはそれぞれ独立に整数１ないし２０中の一つであることを特徴とする、項目５に記載のペプチド。
[項目８]
前記ペプチドは、配列番号４ないし６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目７に記載のペプチド。
[項目９]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含む融合タンパク質。
[項目１０]
前記タンパク質は抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体及び化学的に改質されたタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、項目９に記載の融合タンパク質。
[項目１１]
前記ペプチドは、ニューロピリン１に２価（ｂｉａｖａｌｅｎｔ）以上で結合することを特徴とする、項目９に記載の融合タンパク質。
[項目１２]
前記融合はリンカーペプチドによることを特徴とする、項目９に記載の融合タンパク質。
[項目１３]
前記抗体の断片はそれぞれ、抗体の重鎖不変領域断片（Ｆｃ）、重鎖不変領域ドメイン（ＣＨ１，ＣＨ２，またはＣＨ３)断片、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆａｂ））、単一鎖抗体断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ））、重鎖可変領域断片（ＶＨ）、軽鎖不変領域断片（ＣＬ）または、軽鎖可変領域断片（ＶＬ）であることを特徴とする、項目１０に記載の融合タンパク質。
[項目１４]
前記タンパク質が抗体である場合、ペプチドは抗体の重鎖不変領域Ｆｃ）のＣ―末端に結合されていることを特徴とする、項目１０に記載の融合タンパク質。
[項目１５]
前記結合はリンカーペプチドに介されることを特徴とする、項目１４に記載の融合タンパク質。
[項目１６]
前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群より選択されることを特徴とする、項目１４に記載の融合タンパク質。
[項目１７]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含むナノ粒子。
[項目１８]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含むリポソーム。
[項目１９]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチドが融合され、これを含む小分子薬物。
[項目２０]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[項目２１]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチド、前記ペプチドが融合され、これを含む融合タンパク質、前記ペプチドが融合され、これを含むナノ粒子、前記ペプチドが融合され、これを含むリポソーム、または前記ペプチドが融合され、これを含む小分子薬物を含む、癌または新生血管関連疾患の治療または予防医薬組成物。
[項目２２]
項目１〜８の何れか一項に記載のペプチド、前記ペプチドが融合された融合タンパク質、前記ペプチドが融合されたナノ粒子、前記ペプチドが融合されたリポソーム、または前記ペプチドが融合された小分子薬物を含む癌または新生血管関連疾患の診断用組成物。
[項目２３]
項目１に記載のペプチドをスクリーニングする方法であって、
（１）ＮＲＰ１のｂ１領域のＶＥＧＦ−結合部位（またはアルギニン結合ポケット）と相互作用することができるペプチドライブラリーをデザインする段階；
（２）前記段階（１）のライブラリーを抗体重鎖不変領域Ｆｃに融合させる段階；
（３）前記段階(２)のＦｃ融合ライブラリーを、競合物としての多量のＮＲＰ２−ｂ１ｂ２の存在下で、ＮＲＰ１−ｂ１ｂ２と結合させる段階；及び
（４）前記段階（３）で結合された、Ｆｃ融合ライブラリーとＮＲＰ１−ｂ１ｂ２間の結合親和性に基づいて、所望のＦｃ融合ペプチドをスクリーニングする段階；を含む、前記方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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