(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−クロロ−１−［（６−ベンゾチアゾリル）スルホニル］−１Ｈ−インドール−２−ブタン酸を含有する線維性疾患治療用医薬組成物。
【請求項２】
上記線維性疾患が、心臓、肺、肝臓、腎臓、胃腸管、皮膚など、線維症を発症する可能性がある臓器に影響を及ぼす疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記線維性疾患が、肝線維症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性腎臓病、肺線維性疾患、全身性強皮症から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記線維性疾患が肺線維性疾患である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記肺線維性疾患が特発性肺線維症である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記線維性疾患が全身性強皮症である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記線維性疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
経口投与、非経口投与、局所投与、吸入投与又は鼻腔内投与用の組成物である請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維性疾患の治療のためのＰＰＡＲパンアゴニスト又は上記アゴニストを含む医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維症は、様々な細胞型の複雑な相互作用の結果である。その特徴は、慢性損傷に応答した炎症細胞の動員及び肝星状細胞（ＨＳＣ）の活性化であり、その結果、細胞外基質の蓄積が生じる。脂肪肝は、一般的に肝臓炎症及び肝細胞損傷を併発している。全ての慢性肝臓病において、その病因に関わらず、酸化ストレスの増加が線維症を発症させる共通因子である。損傷した肝細胞、ＨＳＣ及び浸潤性炎症細胞は活性酸素種（ＲＯＳ）の主要供給源である。実際、酸化ストレスによって炎症細胞の動員及びＨＳＣの活性化が誘導される。したがって、慢性肝損傷に関しては、肝細胞損傷、ＲＯＳ産生、ＨＳＣ活性化及び炎症細胞動員という悪循環が起こり、損傷に対する線維形成応答が増幅されることとなる。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の肝線維性疾患に対する有効な治療手段は未だ不充分である。ＮＡＳＨを患う患者に対する治療は確立されておらず、いくつかの治療選択肢が臨床試験で試験されている（非特許文献１及び２）。これらの研究では、多くの様々な化合物クラス（フィブラート、チアゾリジンジオン、ビグアニド、スタチン、カンナビノイド）及び治療標的（核受容体、アンジオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）が使用されている。近年、チアゾリジンジオン（ロシグリタゾン及びピオグリタゾン）を用いる研究から、これらの薬剤は肝臓の状態を改善する可能性があるものの、これら薬剤による治療は、鬱血性心不全及び骨粗鬆症のリスクが高まったり、患者への心理的影響に伴い体重増加が起こったりなど、望ましくない影響が見られないものではないことが示されている（非特許文献２、３及び４）。カンナビノイド投与を行う臨床試験から精神神経疾患の懸念が高まっている（非特許文献１）。現在進行中の他の治療法は、ＮＡＳＨ薬における抗酸化剤として評価しようとするものであるが、これら治療法ではいずれも未だ説得力のある結果が示されていない（非特許文献５）。肝臓病の治療のための候補物質が特許文献１及び２に開示されている。しかしながら、肝臓病の治療に好適な化合物、特に、脂肪肝、炎症及びコラーゲン沈着等の線維化過程のいくつかの要素を標的とし、かつ、現在評価中の薬剤に見られる副作用がない化合物が依然として求められている。
【０００４】
慢性の腎臓疾患として知られる慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、何ヶ月あるいは何年にもわたって腎機能の低下が進行する。ＣＫＤは当該分野において広義で用いられ、それにより腎実質の破壊、機能的ネフロン若しくは糸球体の欠損及び腎臓に影響を及ぼす各種疾患が分類される。また、ＣＫＤは様々な原因から引き起こされ得るが、最終経路は腎線維症のままであることに留意されたい。ＣＫＤの病因としては、例えば心臓血管疾患、高血圧症、糖尿病、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎及び腎移植拒絶反応が挙げられるが、これらに限定されない。腎線維症は、糸球体硬化及び尿細管間質性線維症により特徴づけられ、広範な慢性腎臓病に共通して見られる症状である。腎線維症の病態形成は、本質的には、細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰蓄積及び沈着に特徴づけられる単調な過程である。腎線維症は、透析又は腎移植を必要とする破壊的な疾患である末期腎不全へと最終的に至る進行性過程である。しかしながら、慢性腎臓病の悪化を遅らせることがはっきりと示された特定の治療法は存在しない。腎臓損傷は、損傷細胞又は浸潤性細胞によるサイトカイン／成長因子（ＴＧＦ−β、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）等）の放出と関連している。ＴＧＦ−β産生の増加は、腎線維化の病態形成で最も重要な機構の１つである。ＴＧＦ−β１は、線維芽細胞活性化を促進し、ＴＧＦ−β受容体との相互作用によって基質発現を誘導する。ＴＧＦ−β受容体は、主に２つのタンパク質群、すなわちＩ型（ΤβＲＩ）受容体及びＩＩ型（ΤβＲＩＩ）受容体からなる。ＴＧＦ−β１がΤβＲＩＩと結合することにより、ＴβＲＩ動員が起こり、ＴＧＦ−β受容体異種複合体が形成される。この複合体は、線維化促進イベントを媒介する２種類の主要ＳｍａｄであるＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化して活性化する。また、他の信号伝達経路（例えば細胞外調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２））がＴＧＦ−β受容体活性化に応答して活性化され得る。活性化されたＥＲＫ１／２は、閉塞性腎臓での尿細管細胞アポトーシスに寄与する。ＴＧＦ−β信号伝達の活性化は、線維芽細胞の活性化及び線維症の進行を直接的に促進する主要な機構であると考えられるため、この経路への治療的介入は腎線維症を停止又は予防するための方策と見なすことができる。ＣＫＤの治療のための候補物質が特許文献３及び４に開示されている。しかしながら、ＣＫＤの治療に好適な化合物が依然として求められている。
【０００５】
急性呼吸困難症候群、慢性閉塞性肺疾患及び喘息等の肺疾患では肺の線維化リモデリングが起こる。肺線維症は、間質での細胞外基質の過剰な沈着を特徴とし、呼吸不全を引き起こす。肺線維症は、サルコイドーシス、過敏性肺炎、コラーゲン血管病及び吸入抗原暴露を含む多くの異なる条件により引き起こされる。かなりの数の患者では肺線維症の根本原因が見つからない。病因が不明なこれらの疾患は、特発性間質性肺炎と呼ばれている。特発性間質性肺炎の最も一般的なものは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。ＩＰＦの主要な病理組織学的所見は、通常の間質性肺炎の所見に加え、線維芽細胞の病巣（すなわち新しい線維症）、炎症、蜂巣状変化（すなわち古い線維症）及び正常な肺構造（すなわち線維症エビデンスなし）を有する各間質性線維症領域が交互に現れるという一時的な不均一性を伴うものである。ＩＰＦ治療のための候補物質は特許文献５に開示されている。肺線維性疾患の治療のための候補物質は特許文献６に開示されている。近年、ロシグリタゾン等のチアゾリジンジオンを用いた研究から、これらの薬剤は肺線維症を改善する可能性があるものの、これらの薬剤による治療は、鬱血性心不全のリスクが高まる等、望ましくない影響が見られないものではないことが示されている（非特許文献６）。ピルフェニドン（５−メチル−１−フェニル−２−（１Ｈ）−ピリドン）は抗線維化特性を示し、欧州及び日本ではＩＰＦの治療に承認されている。しかしながら、肺線維性疾患の治療に好適な代替化合物が依然として求められている。
【０００６】
線維性疾患は、様々な組織でのコラーゲン及び他の細胞外基質（ＥＣＭ）成分の異常かつ過剰な沈着により特徴づけられる。その病因論は非常に多様であるが、線維性疾患に典型的なのは、患部組織において活性化された表現型を示すＥＣＭ産生線維芽細胞が存在することである。線維芽細胞の活性化の特徴は、Ｉ型、ＩＩＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンをコードする遺伝子の転写活性の顕著な増加、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現開始並びにＥＣＭ分解活性の低下である。最も頻繁に見られる全身性線維性疾患は全身性線維症であるが、この疾患は原因が分からない希少な慢性疾患である。皮膚、内臓及び血管壁の結合組織に影響を及ぼす臨床的に異種の全身性疾患である。微小血管系の変化、免疫系の妨害並びに結合組織でのコラーゲン及び他の基質物質の大量沈着により特徴づけられる。様々な細胞型（内皮細胞、Ｔリンパ球、単球、線維芽細胞、肥満細胞）の基本的機能に加え、サイトカイン、成長因子及び接着分子の産生及び効果がこの疾患の発症に関与していることが知られている。全身性線維症は強皮症と呼ばれることが多い。強皮性疾患のスペクトラムには、モルフェア（パッチ状、線状及び全身性）、偽性強皮症、及び、類似の皮膚徴候及び病理組織学的徴候を有する重複症候群等の広範囲の臨床単位が含まれる。また、遺伝因子、環境因子、血管及び免疫系の機能に加え、線維芽細胞及び基質物質や複雑な内臓合併症が関与する全身性線維症の複雑な病態生理によって、自己免疫疾患又は結合組織病として研究されることが多い強皮性疾患が引き起こされる。したがって、全身性線維症は、診断手順及び治療計画の点で臨床医の課題となっている。全身性線維症の臨床診断は、複数の学問分野（皮膚科医、リウマチ専門医、呼吸器科医、腎臓専門医及び胃腸科専門医等）からの注意を要することが多く、確認のための線維化組織及び／又は皮膚の生検など、侵襲的手技が用いられることがある。全身性線維症の治療のための候補物質は、特許文献７及び８に開示されている。しかしながら、全身性線維症の治療に好適な代替化合物が依然として求められている。
【０００７】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、遺伝子発現を調節する転写因子として機能する核受容体タンパク質群である。ＰＰＡＲは、細胞分化、発生及び代謝（炭水化物、脂質、タンパク質）の調節に重要な役割を果たしている。以下の３つのＰＰＡＲ亜型が同定されている。
・ＰＰＡＲα：主に肝臓、腎臓、心臓、筋肉、脂肪組織及び肺で発現する。
・ＰＰＡＲγ：実質的に全ての組織で発現する。
・ＰＰＡＲδ：特に心臓血管系、泌尿器系、呼吸器系、消化器系及び筋骨格系において様々な組織／細胞で観察される。
【０００８】
ＰＰＡＲアゴニストはＰＰＡＲに作用する薬剤である。代謝疾患の症状の治療、主にトリグリセリド及び血糖を下げるために用いられる。ＰＰＡＲαアゴニストは本質的にフィブラート群（フェノフィブラート等）からなる。ＰＰＡＲγアゴニストは本質的にチアゾリジンジオン（ロシグリタゾン及びピオグリタゾン等）からなる。ＰＰＡＲδアゴニストとしてはＧＷ５０１５１６が挙げられるが、この候補化合物は安全性の問題により結局打ち切りになった。
【０００９】
線維性疾患ではＰＰＡＲ受容体発現が変化している。例えば、皮膚生検や、全身性強皮症患者から外植した皮膚線維芽細胞ではＰＰＡＲγの発現低下が再現性よく示されている（非特許文献７）。また、強皮症患者由来の肺線維芽細胞でもＰＰＡＲγの発現低下が報告された（非特許文献８）。ＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾン及びピオグリタゾンは、インビボでブレオマイシン誘導皮膚線維症及び肺線維症から齧歯類を保護し、線維芽細胞株及び初代線維芽細胞においてインビトロで線維化促進経路及び過程の活性化を防止する（非特許文献９及び１０）。ＰＰＡＲα受容体はまた、各種刺激に対する線維化促進反応を変調させる。肺では、特定のＰＰＡＲαアゴニストであるフェノフィブラートによってブレオマイシン誘導線維症が予防された（非特許文献１０）。さらに、ＰＰＡＲδアゴニストであるＧＷ０７４２によって、マウスにおいてブレオマイシン点滴で誘導された肺炎症が抑制されることが示された（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０６４３５０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／１０８５７３号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１２／１５９１０７号
【特許文献４】国際公開第２０１４／０１３００５号
【特許文献５】国際公開第２００４／１０３２９６号
【特許文献６】国際公開第２００９／１４９１８８号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１３／０２８７７９４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１４／００３８９５６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖｕｐｐａｌａｎｃｈｉ  Ｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌａｓａｎｉ  Ｎ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００９，４９（１）：３０６−３１７
【非特許文献２】Ｄｏｗｍａｎ  Ｊ．Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１０，１０３（２）：７１−８３
【非特許文献３】Ｓｈｉｒｉ−Ｓｖｅｒｄｌｏｖ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００６，４４：７３２−４１
【非特許文献４】Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００３，３８：１００８−１０１７
【非特許文献５】Ｎｅｌｓｏｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００９，４３：９９０−９９４
【非特許文献６】Ｋｕｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．２０１２，１１（４）：５６５−５７９
【非特許文献７】Ｌａｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｍａｙ  １；１４（３）
【非特許文献８】Ｂｏｇａｔｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ  ２０１２；２０１２
【非特許文献９】Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．２００９；７７（３）：３１１−９
【非特許文献１０】Ｓａｍａｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２  Ａｕｇ  １５；６８９（１−３）
【非特許文献１１】Ｇａｌｕｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；２３（４）：１０３３−４６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
現在、ＰＰＡＲパンアゴニスト、すなわち３つのＰＰＡＲ受容体（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ）全てを活性化する化合物が様々な線維性疾患の治療で有益な効果を発揮することが分かっている。したがって、本発明は、線維性疾患の治療法に用いられるＰＰＡＲパンアゴニストを提供する。本発明はまた、線維性疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、上記線維性疾患は、線維症を発症する可能性がある臓器、例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、胃腸管、皮膚等に影響を及ぼす疾患である。
【００１４】
他の実施形態では、上記線維性疾患は、肝線維症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性腎臓病、肺線維性疾患（特発性肺線維症等）及び全身性強皮症から選択される。
【００１５】
上記実施形態と組み合わせてもよい他の実施形態では、上記ＰＰＡＲパンアゴニストは経口投与用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスの血漿トリグリセリド濃度を示す。
【図２】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのコラーゲン沈着量を示す。
【図３】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのＴＧＦβ−１発現量を示す。
【図４】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのＣｏｌ１ａ発現量を示す。
【図５】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのα−ＳＭＡ発現量を示す。
【図６】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのＭＣＰ−１発現量を示す。
【図７】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したＣＣｌ４暴露マウスのフィブロネクチン発現量を示す。
【図８】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスの血清尿素濃度を示す。
【図９】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスの尿量を示す。
【図１０】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスの尿アルブミン量を示す。
【図１１】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスのオステオポンチン量を示す。
【図１２】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスのＭＣＰ−１量を示す。
【図１３】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスのＴＧＦβＲ１発現量を示す。
【図１４】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスのＣｏｌ１ａ発現量を示す。
【図１５】媒体、カプトプリル、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスのＣｏｌ３ａ発現量を示す。
【図１６】媒体及び化合物Ａで処置した抗ＧＢＭ暴露マウスの病的糸球体数を示す。
【図１７】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのコラーゲン沈着量を示す。
【図１８】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＴＩＭＰ−１量を示す。
【図１９】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＭＣＰ−１量を示す。
【図２０】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのオステオポンチン量を示す。
【図２１】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＴＧＦβＲ１発現量を示す。
【図２２】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＣｏｌ１ａ発現量を示す。
【図２３】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＣｏｌ３ａ発現量を示す。
【図２４】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＴＩＭＰ−１発現量を示す。
【図２５】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのＭＣＰ−１発現量を示す。
【図２６】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのオステオポンチン発現量を示す。
【図２７】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのフィブロネクチン発現量を示す。
【図２８】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスの真皮の厚さを示す。
【図２９】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのヒドロキシプロリン量を示す。
【図３０】媒体、化合物Ａ及びロシグリタゾンで処置したブレオマイシン暴露マウスのコラーゲン量を示す。
【図３１】化合物ＡによるヒトＰＰＡＲα、γ及びδ受容体の活性化を上記化合物の濃度の関数として示す。
【図３２】化合物ＡによるマウスＰＰＡＲα、γ及びδ受容体の活性化を上記化合物の濃度の関数として示す。
【図３３】初代ヒト肺線維芽細胞のＰＤＧＦ誘導性増殖に及ぼす化合物Ａ、フェノフィブリン酸及びロシグリタゾンの効果を示す
【図３４】初代ヒト皮膚線維芽細胞のＰＤＧＦ誘導性増殖に及ぼす化合物Ａ、フェノフィブリン酸及びロシグリタゾンの効果を示す。
【図３５】初代ヒト肺線維芽細胞のＴＧＦβ誘導性ＦＭＴに及ぼす化合物Ａ、フェノフィブリン酸及びロシグリタゾンの効果を示す。
【図３６】初代ヒト皮膚線維芽細胞のＴＧＦβ誘導性ＦＭＴに及ぼす化合物Ａ、フェノフィブリン酸及びロシグリタゾンの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１〜図７の凡例：オイル群では、バーは左から右に媒体、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンを表す。ＣＣｌ４群では、バーは左から右に媒体、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンを表す。
図８〜図１５の凡例：バーは左から右に対照マウス、媒体で処置した抗ＧＢＭ暴露マウス、カプトプリルで処置した抗ＧＢＭ暴露マウス、ロシグリタゾンで処置した抗ＧＢＭ暴露マウス、ピオグリタゾンで処置した抗ＧＢＭ暴露マウス、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置した抗ＧＢＭ暴露マウス及び化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した抗ＧＢＭ暴露マウスを表す。
図１６の凡例：バーは左から右に媒体で処置した抗ＧＢＭ暴露マウス及び化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置した抗ＧＢＭ暴露マウスを表す。
図１７〜図２７の凡例：生理食塩水群では、バーは左から右に媒体、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンを表す。ブレオマイシン群では、バーは左から右に媒体、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンを表す。
図２８〜図３０の凡例：Ｂｌｅｏ＝ブレオマイシン；ＩＶＡ３０＝化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）；ＩＶＡ１００＝化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）；Ｒｏｓ＝ロシグリタゾン。
図３３〜図３６の凡例：Ｒｏｓｉ＝ロシグリタゾン；Ｆｅｎｏ＝フェノフィブリン酸。
【００１８】
図１〜図３６において、化合物Ａは５−クロロ−１−［（６−ベンゾチアゾリル）スルホニル］−１Ｈ−インドール−２−ブタン酸である。
【００１９】
脂肪、アルコール、ウイルス又は化学物質によって引き起こされる慢性肝損傷は、肝星状細胞の活性化を誘導して多量の細胞外基質（コラーゲン等）を分泌させ得るため、細胞外基質の過剰沈着の結果として肝線維症が発症し得る。
【００２０】
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、腎臓への様々な侵襲の結果であり、正常集団の約１０％に影響を及ぼす。該疾患は間質性線維症を特徴とする進行性過程である。ＣＫＤ患者の治療の主要な目的は、ＣＫＤの進行を防止する又は少なくとも遅らせることである。
【００２１】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）、びまん性間質性肺線維症、炎症性肺線維症又は線維性肺胞炎とも呼ばれる肺線維症は、炎症性肺疾患であり、肺胞炎によって引き起こされる肺胞間の線維組織の異常形成を特徴とする異種疾患群であり、肺胞中隔への炎症性細胞の浸潤が起こり、その結果、線維症が発症する。ＩＰＦの影響は、慢性かつ進行性で、多くの場合は致死的である。肺線維症に関する多くの研究から、肺でのいくつかのサイトカインの発現の持続及び増加が、炎症細胞の動員及び細胞外基質成分の蓄積と、その後の肺構造のリモデリングに関与していることが示されている。特に、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びインターロイキンＩＬ−ｌβ等）が肺臓炎及び肺線維症の形成に大きな役割を果たすことが明らかとなった。また、線維化促進性サイトカイン（ＴＧＦ−α及びＣＴＧＦ等）も肺線維症の病態形成に重要な役割を果たす。
【００２２】
強皮症は、小血管障害及び免疫媒介性線維症の結果、皮膚が厚くなり、様々な度合いの臓器機能障害が引き起こされる疾患である。この疾患の臨床的徴候は極めて不均一であり、内臓合併症の存在及び度合いに依存する。患者は、限局性皮膚線維症のみ（限局性強皮症）から皮膚及び内臓合併症の両方を伴う全身性疾患までにわたる疾患スペクトラムを示し得る。限局性強皮症には、内臓合併症を伴わない様々な皮膚硬化が含まれる。これらの形態の強皮症は、外観を損なう可能性はあるものの、疾患活性を制御するために全身性治療が必要となることは極めてまれである。全身性強皮症は、皮膚及び内臓合併症の度合いに応じてさらに２つの疾患亜型に分けられる。びまん性全身性硬化症の存在は、四肢近位部、躯幹及び顔にわたって広範な皮膚硬化が見られることを示す。限局性全身性硬化症の患者は、手、前腕、足、脚及び顔に限定された線維症を有する。びまん性及び限局性全身性硬化症はいずれも内臓合併症を伴うが、びまん性全身性硬化症患者の方が、臨床的に有意な主要臓器機能不全のリスクが高い。限局性全身性硬化症患者の一部は、さらに、石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び皮膚毛細血管拡張症を伴うＣＲＥＳＴ症候群を有するものとして分類される。硬化を伴わない強皮症は希少疾患であって、患者は皮膚硬化の非存在下で内臓に血管損傷及び線維性損傷を発症する。全身性硬化症の病態生理は血管損傷及び線維芽細胞の活性化を含み、様々な組織でコラーゲン及び他の細胞外タンパク質が過剰産生される。強皮症は、免疫系の活性化、内皮機能不全及び線維芽細胞活性の増加により特徴づけられる。全身性硬化症の発症につながる正確な誘導イベントは現在のところ不明である。インターロイキン−４及びトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含むいくつかのサイトカインが、強皮症患者の線維芽細胞の活性化に関わっている。これらのサイトカインは、活性化された免疫細胞、線維芽細胞及び内皮細胞から放出される。活性化された線維芽細胞は、皮膚及び各種内臓で構造的に正常なコラーゲン及び他の細胞外基質タンパク質を産生する。
【００２３】
本発明は、ＰＰＡＲパンアゴニストが上述したような線維性疾患の治療に有益な効果を発揮するという知見に基づいている。本発明では、「ＰＰＡＲパンアゴニスト」とは、ＰＰＡＲα受容体、ＰＰＡＲγ受容体及びＰＰＡＲδ受容体のそれぞれを有意に活性化する化合物、すなわちそれぞれのＥＣ５０値に基づいて個々にＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト及びＰＰＡＲδアゴニストと見なされる化合物を意味するものである。本発明によれば、ＰＰＡＲα受容体、ＰＰＡＲγ受容体及びＰＰＡＲδ受容体の有意な活性化が達成されるのは、各受容体のＥＣ５０が１０−６Ｍ以下の場合である。３つの受容体亜型のＥＣ５０の差は、２桁未満（すなわち、２つの受容体亜型のＥＣ５０の比率が１００未満又は０．０１超のいずれか）であることが好ましい。一実施形態では、上記ＰＰＡＲパンアゴニストはベザフィブラートではない。
【００２４】
したがって、一態様では本発明は、線維性疾患の治療に用いられるＰＰＡＲパンアゴニストを提供する。
【００２５】
一実施形態では、上記線維性疾患は、心臓、肺、肝臓、腎臓、胃腸管、皮膚など、線維症を発症する可能性がある臓器に影響を及ぼす疾患である。
【００２６】
さらなる実施形態では、上記線維性疾患は、肝線維症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性腎臓病、肺線維性疾患、全身性強皮症から選択される。
【００２７】
さらなる実施形態では、上記線維性疾患は、肝臓病、好ましくは肝線維症、脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎である。
【００２８】
さらなる実施形態では、上記線維性疾患は慢性腎臓病である。この疾患は、とりわけ、腎症（膜性腎症、糖尿病性腎症及び高血圧性腎症等）、糸球体腎炎（膜性糸球体腎炎及び膜性増殖性糸球体腎炎（例えば急速進行性糸球体腎炎）等）、間質性腎炎、ループス腎炎、特発性ネフローゼ症候群（微小変化型ネフローゼ症候群及び巣状分節状糸球体硬化等）、閉塞性尿路障害、多発性嚢胞腎（常染色体優性多発性嚢胞腎及び常染色体劣性多発性嚢胞腎等）及び腎移植拒絶反応（急性及び慢性腎拒絶反応等）から選択される。
【００２９】
さらなる実施形態では、上記線維性疾患は、肺線維性疾患、好ましくは特発性肺線維症である。
【００３０】
さらなる実施形態では、上記線維性疾患は、全身性強皮症等の皮膚線維症である。
【００３１】
上記実施形態のいずれかと組み合わせてもよいさらなる実施形態では、上記ＰＰＡＲパンアゴニストは経口投与用である。
【００３２】
上記ＰＰＡＲパンアゴニストは、投与用医薬組成物に製剤化することができる。
【００３３】
したがって、別の態様では本発明は、本発明の第１の態様の様々な実施形態で上述した線維性疾患の治療に用いられる、薬学的に許容される賦形剤と共にＰＰＡＲパンアゴニストを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、上記組成物は、治療上有効量のＰＰＡＲパンアゴニストを含む。本発明では、「治療上有効量」とは、所望の効果をもたらすのに充分な量のＰＰＡＲパンアゴニストを意味する。最終的には、主治医が適切な量及び投薬計画を決定する。
【００３４】
さらに他の態様では本発明は、本発明の第１の態様の様々な実施形態で上述した線維性疾患の治療のための薬剤の製造でのＰＰＡＲパンアゴニストの使用を提供する。
【００３５】
さらに他の態様では本発明は、本発明の第１の態様の様々な実施形態で上述した線維性疾患を治療する方法を提供する。上記方法は、必要とする対象に治療上有効量のＰＰＡＲパンアゴニストを投与することを含む。上記対象は、典型的には哺乳類、好ましくはヒトである。「治療上有効量」とは上記と同じ意味である。
【００３６】
上記ＰＰＡＲパンアゴニストは、通常、１種以上の薬学的に許容される賦形剤と関連させて製剤として投与される。本明細書で「賦形剤」とは、上記ＰＰＡＲパンアゴニスト以外の任意の成分を表すのに用いられる。賦形剤の選択は、大体において、具体的な投与方法、賦形剤の溶解度及び安定性に及ぼす効果、投与形態の特性等の各要因に依存する。
【００３７】
上記ＰＰＡＲパンアゴニストの送達に好適な医薬組成物及びその製造方法は、当業者であればすぐに分かるであろう。そのような組成物及びその製造方法は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３８】
経口投与
上記ＰＰＡＲパンアゴニストは経口投与してもよい。経口投与では、化合物が胃腸管に入るよう飲み込んでもよく、及び／又は、化合物が口から直接血流に入るよう口腔投与、経舌投与又は舌下投与してもよい。経口投与に好適な製剤としては、固形、半固形及び液状システムが挙げられ、例えば錠剤；多粒子、ナノ粒子、液体若しくは粉末を含むソフト若しくはハードカプセル；トローチ剤（液体充填物を含む）；咀嚼錠；ゲル；高速分散投与形態；フィルム；腟坐薬；スプレー；及び口腔／粘膜付着性パッチ等が挙げられる。
【００３９】
液体製剤としては、懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシル剤が挙げられる。そのような製剤は、ソフト又はハードカプセル（ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース製など）の充填剤として使用してもよく、通常、担体（水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース又は好適なオイル等）と、１種以上の乳化剤及び／又は懸濁剤を含む。また、液体製剤は、小袋等に入った固体を再構成して調製してもよい。
【００４０】
錠剤又はカプセル投与形態では、投与量により異なるものの、上記薬剤は、投与形態の１重量％〜８０重量％、より典型的には投与形態の５重量％〜６０重量％を占めていてもよい。上記薬剤に加えて、錠剤は通常は崩壊剤を含む。崩壊剤としては、例えばデンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、澱粉、アルファ化澱粉及びアルギン酸ナトリウムが挙げられる。崩壊剤は、通常、投与形態の１重量％〜２５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％である。
【００４１】
通常はバインダを用いて錠剤製剤に凝集性を付与する。好適なバインダとしては、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然ゴム及び合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化澱粉、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。また、錠剤は希釈剤を含んでいてもよく、例えばラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物等）、マンニトール、キシリトール、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、微結晶性セルロース、澱粉及び二塩基性リン酸カルシウム二水和物が挙げられる。
【００４２】
また、錠剤又はカプセルは、必要に応じて界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０等）及び流動促進剤（二酸化ケイ素、タルク等）を含んでいてもよい。含まれる場合、界面活性剤は錠剤の０．２重量％〜５重量％であってもよく、流動促進剤は錠剤の０．２重量％〜１重量％であってもよい。
【００４３】
また、錠剤は通常は潤滑剤を含み、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物が挙げられる。潤滑剤は、通常、錠剤の０．２５重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜３重量％である。
【００４４】
その他の考えられる成分としては、抗酸化剤、着色剤、フレーバー剤、保管料及び矯味剤が挙げられる。
【００４５】
例えば、錠剤は、約８０重量％以下の薬剤、約１０重量％〜約９０重量％のバインダ、約０重量％〜約８５重量％の希釈剤、約２重量％〜約１０重量％の崩壊剤及び約０．２５重量％〜約１０重量％の潤滑剤を含む。
【００４６】
錠剤ブレンドを直接又はローラーを用いて圧縮して錠剤を形成してもよい。あるいは、錠剤ブレンド又はブレンドの一部に湿式造粒、乾式造粒、溶融造粒、溶融凝固又は押し出し成形を行ってから打錠してもよい。最終製剤は、１つ以上の層を含んでいてもよく、コーティングされていてもいなくてもよく、さらには、カプセルに封入されていてもよい。
【００４７】
非経口投与
上記ＰＰＡＲパンアゴニストはまた、血流、筋肉又は内臓に直接投与してもよい。好適な非経口投与手段としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、尿道内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、滑液嚢内投与及び皮下投与が挙げられる。非経口投与に好適な装置としては、針（マイクロニードルを含む）付き注入器、針なし注入器及び輸液技術が挙げられる。
【００４８】
非経口製剤は、典型的には、賦形剤（塩、炭水化物及び緩衝液等）を（好ましくはｐＨ３〜９まで）含んでいてもよい水溶液であるが、いくつかの用途では、滅菌した非水溶液、又は、好適な媒体（発熱物質を含まない滅菌水等）と共に用いられる乾燥剤形としてより好適に製剤化できる。
【００４９】
凍結乾燥等の滅菌条件での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的医薬品技術を用いて容易に行うことができる。
【００５０】
非経口溶液の調製で使用されるＰＰＡＲパンアゴニストの溶解度は、溶解度向上剤の配合やＳＭＥＤＤＳ（自己微小乳化型薬物送達システム）等の技術など、適切な製剤化方法を用いて高めることができる。
【００５１】
非経口投与用製剤は、即時放出型及び／又は放出調節型として製剤化してもよい。放出調節型製剤には、遅延放出型、徐放型、パルス放出型、制御放出型、標的放出型及びプログラム放出型が含まれる。上記ＰＰＡＲパンアゴニストは、活性化合物の放出調節を行う移植デポー剤として投与される懸濁剤、固体、半固体又は揺変性液体として製剤化してもよい。そのような製剤としては、例えば、薬剤でコーティングしたステントや、薬剤を充填したポリ（ｄｌ−乳酸−ｃｏグリコール）酸（ＰＧＬＡ）マイクロスフェアを含む半固体及び懸濁剤が挙げられる。
【００５２】
吸入／鼻腔内投与
ＰＰＡＲパンアゴニストはまた、鼻腔内投与すなわち吸入により投与してもよく、典型的には、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独又は混合物（ラクトースとの乾燥ブレンド又はリン脂質（例えばホスファチジルコリン）等と混合した混合成分粒子等））の形態で、好適な噴霧剤（１，１，１，２−テトラフルオロエタン又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン等）を使用した又は使用しない加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは電気流体力学を用いて微細な霧を形成するアトマイザー）又はネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、あるいは点鼻薬として投与してもよい。鼻腔内投与で使用する場合、上記粉末は、生体接着剤（キトサン又はシクロデキストリン等）を含んでいてもよい。
【００５３】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー又はネブライザーは、例えばエタノール、エタノール水溶液、又は、活性剤を分散、可溶化又は持続放出させるのに好適な別の物質、溶媒としての噴霧剤及び必要に応じて界面活性剤（三オレイン酸ソルビタン、オレイン酸又はオリゴ乳酸等）を含むＰＰＡＲパンアゴニストの溶液又は懸濁剤を含む。
【００５４】
乾燥粉末又は懸濁剤製剤で使用する前に、上記薬剤物質は、吸入による送達に好適なサイズ（典型的には５μｍ未満）まで微粉末化される。これは、らせんジェットミル法、流動層ジェットミル法、ナノ粒子を形成する超臨界流体処理法、高圧均質化法又はスプレー乾燥法等の適切な粉砕方法により達成できる。
【００５５】
吸入器又は吹き付け器に用いるカプセル（ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース製など）、ブリスター及びカートリッジは、ＰＰＡＲパンアゴニスト、好適な粉末基剤（ラクトース、澱粉等）及び特性調節剤（ｌ−ロイシン、マンニトール又はステアリン酸マグネシウム等）の粉末ミックスを含むように製剤化してもよい。ラクトースは、無水物又は一水和物の形態であってもよく、後者が好ましい。その他の好適な賦形剤としては、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース及びトレハロースが挙げられる。
【００５６】
電気流体力学を用いて微細な霧を形成するアトマイザーに使用される好適な溶液製剤は、作動１回につき１μｇ〜２０ｍｇのＰＰＡＲパンアゴニストを含んでいてもよく、作動体積は１μｌ〜１００μｌの範囲で変化してもよい。典型的な製剤は、ＰＰＡＲパンアゴニスト、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含んでいてもよい。プロピレングリコールの代わりに使用してもよい別の溶媒としては、グリセリン及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００５７】
吸入／鼻腔内投与用の本発明の製剤には好適なフレーバー剤（メントール、レボメントール等）又は甘味料（サッカリン、サッカリンナトリウム等）を添加してもよい。
【００５８】
吸入／鼻腔内投与用製剤は、ＰＧＬＡ等を用いて即時放出型及び／又は放出調節型として製剤化してもよい。放出調節型製剤には、遅延放出型、徐放型、パルス放出型、制御放出型、標的放出型及びプログラム放出型が含まれる。
【００５９】
乾燥粉末吸入器及び噴霧器の場合、投与単位は定量を送達するバルブによって決定される。本発明において単位は、典型的には１μｇ〜１０ｍｇのＰＰＡＲパンアゴニストを含む定量又は「パフ」を投与するように設定される。１日の全投与量は、典型的には１μｇ〜２００ｍｇの範囲であり、単回投与してもよいが、より典型的には複数回に分けて１日を通して投与する。
【００６０】
局所投与
上記ＰＰＡＲパンアゴニストはまた、皮膚又は粘膜へ局所投与、皮膚（内）投与又は経皮投与してもよい。この目的のための典型的な製剤としては、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤、被覆材、発泡体、フィルム、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、線維、包帯及びマイクロエマルションが挙げられる。リポソームを使用してもよい。典型的な担体としては、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールが挙げられる。浸透促進剤を配合してもよい。
【００６１】
その他の局所投与手段としては、電気穿孔法、イオン泳動、フォノフォレシス、ソノフォレーシス及びマイクロニードルを使用した又は使用しない（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（ＴＭ）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（ＴＭ）等）注入による送達が挙げられる。
【００６２】
局所投与用製剤は、即時放出型及び／又は放出調節型として製剤化してもよい。放出調節型製剤には、遅延放出型、徐放型、パルス放出型、制御放出型、標的放出型及びプログラム放出型が含まれる。
【００６３】
経口及び非経口投与は、線維性疾患の種類に関わらず好適である。上記線維性疾患が例えば全身性強皮症である場合、局所投与が好適である。上記線維性疾患が例えば肺線維症又は全身性強皮症である場合、吸入／鼻腔内投与が好適である。
【００６４】
経口投与の場合、上記ＰＰＡＲパンアゴニストを１日あたり約１００ｍｇ〜約３，０００ｍｇ、好ましくは１日あたり約５００ｍｇ〜約３，０００ｍｇの範囲の投与量で患者に投与することができる。１日の総投与量は、単回投与又は複数回に分けて投与してもよい。本発明に係る医薬組成物は、典型的にはＰＰＡＲパンアゴニストを約１００〜約１０００ｍｇ、例えば１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ又は１０００ｍｇ含んでいてもよい。
【００６５】
典型的には、１％メチルセルロース溶液中のＰＰＡＲパンアゴニストの懸濁液及び１％メチルセルロース＋０．５％ポロキサマー中のＰＰＡＲパンアゴニストの懸濁液を調製した。また、ＰＰＡＲパンアゴニストを２５ｍｇ、５０ｍｇ又は２００ｍｇ含むカプセルも調製した。また、ＰＰＡＲパンアゴニストを３０％／７０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４００／０．０５Ｍリン酸バッファー緩衝液（ｐＨ８、２５〜１００μｇ／ｍｌ）に溶解させたＩＶ製剤も調製した。
【００６６】
本発明の態様のいずれかの上記実施形態のいずれかと組み合わせてもよいさらなる実施形態では、上記ＰＰＡＲパンアゴニストは５−クロロ−１−［（６−ベンゾチアゾリル）スルホニル］−１Ｈ−インドール−２−ブタン酸（「化合物Ａ」とも言う）である。化合物Ａ及びその製造方法はＷＯ２００７／０２６０９７に記載されている。化合物Ａは、ＰＰＡＲα受容体、ＰＰＡＲγ受容体及びＰＰＡＲδ受容体のそれぞれを活性化することが分かっている。本発明では化合物Ａは、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物のいずれかの形態で用いることができる。本明細書で「溶媒和物」とは、化合物Ａと１種以上の薬学的に許容される溶媒分子（エタノール等）とを含む分子錯体を表すのに用いられる。「水和物」とは、上記溶媒が水である場合に用いられる。化合物Ａの薬学的に許容される塩としては、その酸付加塩及び塩基塩が挙げられる。
【００６７】
好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩及びキシナホ酸塩が挙げられる。
【００６８】
好適な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。例としては、アルミニウム塩、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオールアミン塩、グリシン塩、リシン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩及び亜鉛塩が挙げられる。
【００６９】
また、酸及び塩基のヘミ塩、例えばヘミ硫酸塩及びヘミカルシウム塩等を形成してもよい。
【００７０】
化合物Ａの薬学的に許容される塩は、以下の３つの方法のうち１つ以上により調製してもよい。
（ｉ）上記化合物を所望の酸又は塩基と反応させる。
（ｉｉ）上記化合物の好適な前駆体から酸又は塩基に不安定な保護基を除去する、あるいは、所望の酸又は塩基を使用して好適な環状前駆体（ラクトン、ラクタム等）を開環させる。
（ｉｉｉ）適切な酸又は塩基と反応させるか、あるいは好適なイオン交換カラムを用いることにより、上記化合物の塩を別の塩に変換する。
【００７１】
３つ反応はいずれも、典型的には溶液中で行われる。得られた塩を析出させてろ過により回収してもよく、あるいは溶媒を蒸発させて回収してもよい。得られる塩の電離度は、完全電離からほとんど非電離まで様々であってもよい。
【００７２】
本発明を以下の実施例により例示する。
【実施例】
【００７３】
実施例１：マウスでの四塩化炭素誘導肝線維症の発症に及ぼす化合物Ａの効果及び公知ＰＰＡＲγアゴニストとの比較
四塩化炭素（ＣＣｌ４）が、マウスモデルにおいて肝細胞ミトコンドリア機能不全及び酸化ストレスを誘導して、コラーゲン沈着及び肝線維症を引き起こすことが報告されている（Ｙａｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４  Ｓｅｐ；２６７（３  Ｐｔ  １）：Ｇ４７６−８４）。したがって、化合物Ａ及び公知ＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾンの効果をＣＣｌ４誘導肝線維症のマウスモデルで評価した。
【００７４】
２つの異なる投与量（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）の化合物Ａ又は５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＡＲγ基準化合物ロシグリタゾンを２２日間毎日マウスに経口投与した。この処置の終了時にマウスを屠殺し、血漿試料及び肝臓を採取した。肝炎及び線維症に関与していることが知られている遺伝子の発現及びコラーゲン沈着を定量化し、いくつかの関連する血漿バイオマーカーを測定した。
【００７５】
２２日間媒体を経口投与したＣＣｌ４暴露マウスは、肝臓組織のコラーゲン量の統計的に有意な増加に示されるように肝線維症を呈した。化合物Ａでの処置では、肝線維症が８０％（３０ｍｇ／ｋｇ／日）、８９％（１００ｍｇ／ｋｇ／日）有意に低下し、関連するマーカーの多くが改善した。ロシグリタゾンでの処置では、肝線維症が５４％しか低下せず、ほとんどのマーカーが変化しなかったか、あるいは悪化さえした。
【００７６】
材料及び方法
実験は、５６匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＡＮＶＩＥＲ  ＬＡＢＳ社（フランス国サン＝ベルトヴァンＣ．Ｓ．４１０５））を用いて行った。実験開始時のマウス体重は２１〜２４ｇであった。マウスを３〜１０匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ（床面積＝１０３２ｃｍ２）で標準的な条件下、すなわち室温（２２±２℃）、湿度（５５±１０％）、明暗サイクル（１２時間／１２時間）、換気（１５〜２０体積／時）、水及び餌（ＳＤＳ、ＲＭ１）の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも５日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
【００７７】
化合物Ａ（３ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ）及びロシグリタゾン（０．５ｍｇ／ｍＬ）の調製済懸濁液を５±３℃で保管した。媒体（メチルセルロース（４００ｃＰ）１％＋０．１％ポロキサマー１８８）の調製済製剤も５±３℃で保管した。四塩化炭素（ＣＣｌ４）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（フランス国サン＝カンタン＝ファラヴィエ））は、ヒマワリ油（ｖ／ｖ＝１／１１）を用いて各投与日に新しく調製した。
【００７８】
投与
マウスを以下の群に割り当てた。
１．ヒマワリ油（３週間週２回腹腔内投与）／媒体（２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
２．ヒマワリ油（３週間週２回腹腔内投与）／化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
３．ヒマワリ油（３週間週２回腹腔内投与）／ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ／日を２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
４．ＣＣｌ４（３．５ｍＬ／ｋｇを３週間週２回腹腔内投与）／媒体（２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
５．ＣＣｌ４（３．５ｍＬ／ｋｇを３週間週２回腹腔内投与）／化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日を２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
６．ＣＣｌ４（３．５ｍＬ／ｋｇを３週間週２回腹腔内投与）／化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
７．ＣＣｌ４（３．５ｍＬ／ｋｇを３週間週２回腹腔内投与）／ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ／日を２２日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
【００７９】
３週間の間、週に２日午前中に１００μＬのＣＣｌ４（ヒマワリ油中３．５ｍＬ／ｋｇ（ｖ／ｖ＝１／１１））又は１００μＬのヒマワリ油をマウスに腹腔内投与した。並行して、２２日間の間（０日目〜２１日目）、１日１回マウスに媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンを経口投与した。媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンとＣＣｌ４を共に投与する日は、ヒマワリ油又はＣＣｌ４を投与する６時間前に媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンを投与した。試験化合物の投与容量は、経口投与で１０ｍＬ／ｋｇ（体重）であった。
【００８０】
最終採血
２１日目の投与２時間後に、ペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で動物に麻酔をかけ、心穿刺により採血した。動物毎に正確な投与時間及び試料採取時間を記した。血液試料（全血０．９ｍＬ）を予め冷却しておいた２ｍＬ容リチウム−ヘパリン採血管に入れた。この血液試料を穏やかに混合し、砕いた氷上に置き、採血３０分以内に約＋４℃、約１５００×ｇで１０分間遠心分離した。血液試料毎に、得られた血漿を２等分（それぞれ少なくとも１００μＬ）し、使い捨てプラスチック材料を用いてポリプロピレン管に移した。試料を直立させた状態ですぐに冷凍庫に移して−２０℃に保った。
【００８１】
最終採血後、肝臓組織を摘出した。
・第１の組織試料（約５０ｍｇ）を採取し、パラホルムアルデヒドで固定し、５±３℃とした。
・第２の組織試料（２００ｍｇ）を液体窒素中で冷凍し、−２０℃に保った。
【００８２】
測定パラメータ
コラーゲン
コラーゲンの定量は、切片をピクロシリウスレッドで染色し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。全てのスライドをデジタル化し、ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（バージョン１．４２、米国国立衛生研究所）により３つの異なる切片の５つの重なっていない視野を無作為に分析した。全てのスライドは、厳密に同じ条件で一人の実験者により分析した。
【００８３】
遺伝子発現
少量の凍結肝臓試料（５０〜１００ｍｇ）のｍＲＮＡ抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ３００装置で大理石（２×５ｍｎ）と１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ製、参照番号７９３０６）を用いて試料を均質化した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ｌｉｐｉｄ  Ｋｉｔ（参照番号７４８０４）を用いて製造者の指示に従って肝臓ホモジネートのＲＮＡ抽出を完了した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ特性をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で確認した。
【００８４】
Ｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｂｉｏｒａｄ社、参照番号１７０−８８９１）を用いて製造者の指示に従って全ＲＮＡ１００ｎｇについてランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成を行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００配列検出システム（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）でＩｑ  ＩＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｏｘ（参照番号１７２５１２４、Ｂｉｏｒａｄ社）と専用ＱＰＣＲプライマーを用いて７．５ｎｇＲＮＡ当量のリアルタイムＰＣＲを行った。いくつかのｍＲＮＡ転写物には、蛍光色素ＦＡＭで標識したＴａｑＭａｎプローブとＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社、参照番号４３２４０２０）を用いて定量を行った。アッセイに用いたプライマーを以下の表に示す。
【００８５】
【表１】
0006557684.tif 000002
【００８６】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００装置でリアルタイムＰＣＲを行った。ＡＢＩ７９００からの生データをテキスト形式で書き出した。エクセル解析を行い、標準化のためにハウスキーピング遺伝子としてＲｐｌｐ０を使用し、基準対照として無処置動物（媒体群）の平均データを用いて転写物の相対量を「デルタデルタＣＴ法」（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１）により算出した。各ＲＮＡ試料を逆転写し、３連で定量した。
【００８７】
肝臓バイオマーカー
肝臓タンパク質抽出プロトコル：
Ｔ−ＰＥＲ（Ｒ）を用いた抽出：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（製品番号７８５１０（ロット：ＮＧ１７４００４）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とＨａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＥＤＴＡフリー（１００×）、製品番号７８４２５（ロット番号ＮＬ１７８０５１）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ社）
【００８８】
実験中ずっと、肝臓試料及び上澄みを氷上に保った。抽出に関して、製造者は１００μｌのＴ−Ｐｅｒ＋１μｌの「Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（１００×）に対して１０ｍｇの組織の使用を推奨している。
【００８９】
５０ｍｌのＴ−Ｐｅｒ緩衝液を調製し、これに５００μｌの「Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（１００×）を添加し、混合物を氷上に保った。解凍したばかりの肝臓試料を５０〜７０ｍｇ秤取り、細かく刻み、１ｍｌの冷ＰＢＳを添加して組織を洗浄した。この混合物を４℃で５分間５００ｇで遠心分離し、上澄みを捨てた。１００μｌ／１０ｍｇのＴ−Ｐｅｒ＋アンチプロテアーゼ（１００×）を添加し、肝臓をポッター型ホモジナイザーで５、６回ねじり上下させて破砕した。この混合物を４℃で５分間１００００ｇで遠心分離した。上澄みを取り出し、等分し、その後のバイオマーカー測定まで−２０℃で保った。１０μｌの試料を用いて、ＭＯＳ：ＢＡＰ−０３−０６２−０１（Ｋｉｔ  ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、参照番号２３２２５）に記載の手順に従ってＭＱ水で１／１０に希釈した後、ＢＣＡ法によりタンパク質を定量した。
【００９０】
全てのタンパク質をＥＬＩＳＡキットで製造者の指示に従って定量した。
ＴＩＭＰ−１：マウスＴＩＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＴＭ１００）
ＴＧＦ−β１：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅマウス／ラット／ブタ／イヌＴＧＦ−β１免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＭＢ１００Ｂ）
【００９１】
データ処理及び統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア（バージョン５．１）を用いて全てのパラメータを解析した。パラメータは以下のようにして解析した。
・独立した試料に対してスチューデントのｔ検定を用いて第１群と第４群を比較して実験（ＣＣｌ４の効果）を確認した。
・独立した試料に対してスチューデントのｔ検定を用いて第１群と第２群、第１群と群３を比較して化合物Ａ又はロシグリタゾン単独の効果を調べた。
・一元配置分散分析（処置）を用いて第４群と化合物Ａ処置群（５、６）を比較してＣＣｌ４誘導肝線維症に及ぼす化合物Ａの効果を調べた。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いた。
・独立した試料に対してスチューデントのｔ検定を用いて第４群とロシグリタゾン処置群（第７群）を比較してＣＣｌ４誘導肝線維症に及ぼすロシグリタゾンの効果を調べた。
【００９２】
図１〜図７において、＊はｐ値＜０．０５、＊＊はｐ値＜０．０１、＊＊＊はｐ値＜０．００１を表す。
【００９３】
結果
１／血漿トリグリセリド
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって血漿トリグリセリドが媒体と比べて有意に低下した（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったものの血漿トリグリセリドが増加した（図１）。
【００９４】
２／コラーゲン沈着
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってコラーゲン量が媒体と比べて有意に低下し（それぞれ−８０％（ｐ＜０．０１）、−８９％（ｐ＜０．００１））、ロシグリタゾンでもコラーゲン量が有意に低下した（−５４％（ｐ＜０．０５））（図２）。
【００９５】
３／ＴＧＦβ−１発現
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＴＧＦβ−１発現が媒体と比べて有意に阻害された（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。一方、ロシグリタゾンではＴＧＦβ−１発現が有意に上方制御された（ｐ＜０．００１）（図３）。
【００９６】
４／Ｉ型コラーゲンαＩ（Ｃｏｌ１ａ）発現
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＣｏｌ１ａ発現が媒体と比べて有意に阻害された（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＣｏｌ１ａ発現が上方制御された（図４）。
【００９７】
５／α−ＳＭＡ発現
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののα−ＳＭＡ発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののα−ＳＭＡ発現が上方制御された（図５）。
【００９８】
６／ＭＣＰ−１発現
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＭＣＰ−１発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。一方、ロシグリタゾンでは効果が見られなかった（図６）。
【００９９】
７／フィブロネクチン発現
ＣＣｌ４暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってフィブロネクチン発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののフィブロネクチン発現が上方制御された（図７）。
【０１００】
これらの結果から、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２２日間化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日又は１００ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与することによって、ＣＣｌ４誘導肝線維症が抑制されたことが分かる。該化合物では用量依存効果が得られ、１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与した化合物Ａでは最大９０％のコラーゲン量の低下が見られ、関連マーカーのほとんどが有意に改善した。それに対して、ロシグリタゾンではそれほど顕著な効果は見られず、ほとんどの場合、他のマーカーにも効果が見られなかった。
【０１０１】
実施例２：マウスでの抗ＧＢＭ誘導糸球体腎炎の発症に及ぼす化合物Ａの効果並びに公知ＰＰＡＲγアゴニスト及び公知ＩＣＥとの比較
マウスの抗ＧＢＭ（糸球体基底膜）誘導糸球体腎炎は、ＣＫＤを防ぐ新規化学物質の可能性を評価するためのインビボモデルとして一般的に用いられている。したがって、化合物Ａ、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン（公知ＰＰＡＲγアゴニスト）並びにカプトプリル（公知ＩＣＥ（（アンジオテンシン）変換酵素阻害剤））の効果を上記モデルで評価した。
【０１０２】
２つの異なる投与量（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）の化合物Ａ、ＰＰＡＲγ基準化合物であるロシグリタゾン（３ｍｇ／ｋｇ／日）及びピオグリタゾン（３０ｍｇ／ｋｇ／日）並びに１０ｍｇ／ｋｇ／日の基準ＩＣＥ化合物カプトプリルを７日間毎日マウスに経口投与した。この処置の終了時にマウスを屠殺し、血漿試料及び腎臓を採取した。ＣＫＤに関与していることが知られている遺伝子の発現を定量化し、腎臓パラメータの血漿濃度を測定した。
【０１０３】
７日間媒体を経口投与した抗ＧＢＭ暴露マウスは、媒体と比較した尿中尿素、アルブミン尿、腎臓オステオポンチン、腎臓ＭＣＰ−１タンパク質量、Ｃｏｌ１及びＣｏｌ３ｍＲＮＡ発現量の統計的に有意な増加によって示されるように、糸球体腎炎及び線維症を呈した。７日間３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａで処置することによって、尿中尿素、アルブミン尿、腎臓オステオポンチン、腎臓ＭＣＰ−１量、Ｃｏｌ１及びＣｏｌ３ｍＲＮＡ発現量が媒体と比べて低下した（１００ｍｇ／ｋｇ／日では有意）。それに対して、カプトプリルでは、尿中尿素、アルブミン尿、腎臓オステオポンチン、腎臓ＭＣＰ−１タンパク質量については化合物Ａと類似した効果が見られたが、Ｃｏｌ１及びＣｏｌ３発現量が有意に低下することはなかった。しかしながら、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンでは、腎臓オステオポンチン及び腎臓ＭＣＰ−１量が媒体と比べて有意に増加した。
【０１０４】
材料及び方法
実験開始時に８〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＣＥＲＪ  Ｊａｎｖｉｅｒ社（フランス国ルジュネスト＝サン＝ティスル、シェンセク通り））を用いて実験を行った。体重に基づいて３〜４匹からなる各群に分けてマウスを無作為にポリプロピレン製ボックス（床面積＝１０３２ｃｍ２）に割り当てた。マウスは個々に耳に印を付けた。実験前にマウスを標準的な条件下、すなわち室温（２２±２℃）、湿度（５５±１０％）、明暗サイクル（１２時間／１２時間）、換気（１５〜２０体積／時）、水及び餌（ＳＤＳ、ＲＭ１）の自由摂取で１週間馴化した。
【０１０５】
媒体［１％メチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ  ＳＭ４００、４００Ｃｐｓ）＋０．１％ポロキサマー１８８］中の化合物Ａ（３ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの投与量に相当）の調製済懸濁液を使用するまで５℃で保管した。
【０１０６】
媒体中のロシグリタゾン（０．３ｍｇ／ｍＬ、投与量３ｍｇ／ｋｇに相当）の調製済懸濁液を使用するまで５℃で保管した。
【０１０７】
媒体中のピオグリタゾン（３ｍｇ／ｍＬ、投与量３０ｍｇ／ｋｇに相当）の調製済懸濁液を使用するまで５℃で保管した。
【０１０８】
媒体中のカプトプリル（１ｍｇ／ｍＬ、投与量１０ｍｇ／ｋｇに相当）の調製済懸濁液を使用するまで５℃で保管した。
【０１０９】
ヒツジＩｇＧ抗体（ａｂ３７３８５、Ａｂｃａｍ社）を氷上４℃で調製した。この抗体を生理学的血清中に溶解させて４ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。別に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）をボルテックスで均質化した。５ｍｌルアーロック注射器に２．５ｍｌのＣＦＡを充填した。別の５ｍｌルアーロック注射器に２．５ｍｌのヒツジＩｇＧ溶液を充填した。両方の注射器をマイクロエマルションニードルで連結して、注意深く全ての気泡を取り除いた。ヒツジＩｇＧ溶液をＣＦＡに注入した。顕著な抵抗の増加が観察されるまで５分間２つの注射器間で混合を繰り返した。そして、マイクロエマルションニードルをｉｎｏｘ製メス型ルアーコネクター／メス型ルアーに付け替えた。再度、数分間２つの注射器間で混合した。そして、水中で表面張力を試験した。１ｍｌルアーロック注射器を充填して、注意深く気泡を除去した。２３Ｇ針を付けて注射器を使用するまで４℃で保管した。
【０１１０】
ヒツジ抗ラット糸球体（ＧＢＭ）血清（ＰＴＸ−００１Ｓ、Ｐｒｏｂｅｔｅｘ社）を使用するまで５℃で保管した。
【０１１１】
投与
マウスを以下の群に割り当てた。
【０１１２】
【表２】
0006557684.tif 000003
【０１１３】
抗ＧＢＭ抗体投与の５日前にＯ２／イソフルラン（１Ｌ／３％）麻酔下で動物の３つの部位（各臀部で１つ、首筋で１つ）に１００μｌのヒツジＩｇＧ／ＣＦＡ乳液（２００μｇのヒツジＩｇＧ／５００μｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ）を皮下注射して免疫化した。
【０１１４】
０日目にマウスの体重を測定し、約２０〜３０分間加熱灯傾斜台下に置いて、尾静脈を血管拡張させて注射時に見えやすいようにした。各動物を注射用円錐で拘束した。マウスに３００μｌの抗ＧＢＭ抗体血清を静脈内注射した。そして、マウスに化合物Ａ、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及びカプトプリルを経口投与し、さらに７日間１日１回（午前中）処置を継続した。約１日おきにマウスの体重を測定した。
【０１１５】
６日目にマウスの体重を測定し、利尿ボックスに移して２４時間置いた。利尿前後にビブ（ｂｉｂ）の重さを計って水の摂取量を求めた。７日目にマウスの体重を測定し、経口投与し、最初のボックスに戻した。尿を採取し、遠心分離し、測定した。等分したもののいくつかはその後のアッセイ（尿素、クレアチニン、アルブミン．．．）のために−８０℃で冷凍した。
【０１１６】
７日目の午後にＯ２／イソフルラン（１Ｌ／３％）混合物でマウスに麻酔をかけ、パスツールピペットを用いて後眼窩洞より採血した。全血４００μｌを乾いた微細管に移した。凝固３０分後に血清を採取し、４℃で１５分間６０００ｒｐｍで２回遠心分離した。血清を等分し、その後のアッセイ（尿素、クレアチニン、タンパク質、アディポネクチン）のために−８０℃で冷凍した。そして、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、腎臓を採取し、重量を測定した。マウスにつき１個の腎臓の皮質を単離した。以下で詳述するその後のＲＮＡ発現分析のために小片を保管した。残りは、その後のアッセイ（ＴＧＦβ−１、ＯＰＮ、ＭＣＰ−１．．．）のためにそのまま液体窒素中で冷凍した。残りの腎臓のうち、半分は組織学的分析のために２４時間１０％緩衝ホルマリン中の個別の組織学用カセットに入れた。
【０１１７】
測定パラメータ
遺伝子発現
少量の凍結肝臓試料（５０〜１００ｍｇ）のｍＲＮＡ抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ３００装置で大理石（２×５ｍｎ）と１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ製、参照番号７９３０６）を用いて試料を均質化した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ｌｉｐｉｄ  Ｋｉｔ（参照番号７４８０４）を用いて製造者の指示に従って肝臓ホモジネートのＲＮＡ抽出を完了した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ特性をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で確認した。
【０１１８】
Ｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｂｉｏｒａｄ社、参照番号１７０−８８９１）を用いて製造者の指示に従って全ＲＮＡ１００ｎｇについてランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成を行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００配列検出システム（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）でＩｑ  ＩＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｏｘ（参照番号１７２５１２４、Ｂｉｏｒａｄ社）と専用ＱＰＣＲプライマーを用いて７．５ｎｇＲＮＡ当量のリアルタイムＰＣＲを行った。いくつかのｍＲＮＡ転写物には、蛍光色素ＦＡＭで標識したＴａｑＭａｎプローブとＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社、参照番号４３２４０２０）を用いて定量を行った。アッセイに用いたプライマーを以下の表に示す。
【０１１９】
【表３】
0006557684.tif 000004
【０１２０】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００装置でリアルタイムＰＣＲを行った。ＡＢＩ７９００からの生データをテキスト形式で書き出した。エクセル解析を行い、標準化のためにハウスキーピング遺伝子としてＲｐｌｐ０を使用し、基準対照として無処置動物（媒体群）の平均データを用いて転写物の相対量を「デルタデルタＣＴ法」（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１）により算出した。各ＲＮＡ試料を逆転写し、３連で定量した。
【０１２１】
尿、血漿及び腎臓バイオマーカー
血清及び尿アッセイ（尿素、クレアチニン、アルブミン及びタンパク質）をＫｏｎｅｌａｂ装置及び対応する比色分析試験を用いて行った。
【０１２２】
微量アルブミン尿を蛍光キットＡｌｂｕｍｉｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、参照番号１５００２）を用いて測定した。
【０１２３】
全ての腎タンパク質をＥＬＩＳＡキットで製造者の指示に従って定量した。
・オステオポンチン：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスオステオポンチン免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＭＯＳＴ００）
・ＭＣＰ−１：ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＭＪＥ００）
【０１２４】
データ処理及び統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア（バージョン５．１）を用いて全てのパラメータを解析した。一元配置分散分析（処置）を用いてこれらパラメータを解析して、各群（１、２、３、４、５、６及び７）を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第２群と他の全ての群とを比較した。
【０１２５】
図８〜図１６において、＊はｐ値＜０．０５、＊＊はｐ値＜０．０１、＊＊＊はｐ値＜０．００１を表す。
【０１２６】
結果
１／血清尿素
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって尿素量が媒体と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０１）。一方、カプトプリルでは、有意水準に達することはなかったものの尿素量が低下し、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったものの尿素量が増加した（図８）。
【０１２７】
２／尿量
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったものの尿量が媒体と比べて低下した。一方、カプトプリルでも、有意水準に達することはなかったものの尿量が低下し、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったものの尿アルブミンが増加した（図９）。
【０１２８】
３／尿アルブミン
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が媒体と比べて低下した。一方、カプトプリルでも、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が低下し、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののアルブミン量が増加し、ピオグリタゾンではアルブミン量が有意に増加した（ｐ＜０．００１）（図１０）。
【０１２９】
４／腎臓オステオポンチン
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってオステオポンチン量が媒体と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０５）。一方、カプトプリルでもオステオポンチン量が有意に低下し（ｐ＜０．０５）、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもオステオポンチン量が有意に増加した（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）（図１１）。
【０１３０】
５／腎臓ＭＣＰ−１
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＭＣＰ−１量が媒体と比べて有意に低下した（ｐ＜０．００１）。一方、カプトプリルでもＭＣＰ−１量が有意に低下し（ｐ＜０．０１）、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもＭＣＰ−１量が有意に増加した（ｐ＜０．０５）（図１２）。
【０１３１】
６／ＴＧＦβＲ−１発現
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＴＧＦβＲ−１発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０１）。一方、カプトプリルではＴＧＦβ−Ｒ１発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれも、有意水準に達することはなかったもののＴＧＦβＲ−１発現が上方制御された（図１３）。
【０１３２】
７／Ｉ型コラーゲンαＩ（Ｃｏｌ１ａ）発現
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＣｏｌ１ａ発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０１）。一方、カプトプリルではＣｏｌ１ａ発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンではいずれもＣｏｌ１ａ発現が有意に上方制御された（ｐ＜０．００１）（図１４）。
【０１３３】
８／ＩＩＩ型コラーゲンαＩ（Ｃｏｌ３ａ）発現
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＣｏｌ３ａ発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。一方、カプトプリルではＣｏｌ３ａ発現に何ら効果が見られず、ロシグリタゾンではＣｏｌ３ａ発現が有意に上方制御され（ｐ＜０．０５）、ピオグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＣｏｌ３ａ発現が上方制御された（図１５）。
【０１３４】
９／病的糸球体
抗ＧＢＭ暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって病的糸球体数が有意に低下した（ｐ＜０．００１）（図１６）。
【０１３５】
実施例３：マウスでのブレオマイシン誘導肺線維症の発症に及ぼす化合物Ａの効果及び公知ＰＰＡＲγアゴニストとの比較
マウスのブレオマイシン誘導肺線維症は、新規化学物質の抗線維化作用の可能性を評価するのに一般的に用いられるインビボモデルである（Ｃｏｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｍａｎｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。したがって、化合物Ａ及び公知ＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾンの効果を上記モデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを選択して試験化合物の効果を評価したが、これはブレオマイシン投与により胃で初期炎症反応が生じて線維化リモデリングが起こる傾向があるためである。
【０１３６】
２つの異なる投与量（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）の化合物Ａ及び５ｍｇ／ｋｇ／日のロシグリタゾンを１５日間毎日マウスに経口投与した。この処置の終了時に動物を屠殺し、血漿試料及び肝臓を採取した。肺炎症過程に関与していることが知られている遺伝子の発現を定量化し、肺パラメータの血漿濃度を測定した。
【０１３７】
１５日間媒体を経口投与したブレオマイシン暴露マウスは、肺オステオポンチン量、肺ＭＣＰ−１量及び肺ＴＩＭＰ−１量の統計的に有意な増加によって示されるように、肺線維症を呈した。１５日間３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａで処置することによって、肺ＴＩＭＰ−１量が媒体と比べて有意に低下し、肺ＭＣＰ−１量及びオステオポンチン量も、統計的有意水準に達することはなかったものの媒体と比べて低下した。それに対して、ブレオマイシン暴露マウスに１５日間毎日５ｍｇ／ｋｇ／日のロシグリタゾンを経口投与した場合、肺オステオポンチン量、肺ＭＣＰ−１量及び肺ＴＩＭＰ−１量が、統計的有意水準に達することはなかったものの媒体と比べて増加した。
【０１３８】
材料及び方法
７７匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＡＮＶＩＥＲ  ＬＡＢＳ社（フランス国Ｆ−５３９４１サン＝ベルトヴァン、Ｃ．Ｓ．４１０５））を用いて実験を行った。実験開始時にマウスの体重は２０〜２５ｇであった。マウスを３〜１０匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ（床面積＝１０３２ｃｍ２）で標準的な条件下、すなわち室温（２２±２℃）、湿度（５５±１０％）、明暗サイクル（１２時間／１２時間）、換気（１５〜２０体積／時）、水及び餌（ＳＤＳ、ＲＭ１）の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも５日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
【０１３９】
調製済懸濁液として、化合物Ａ（３ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ）及びロシグリタゾン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を１％メチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ  ＳＭ４００、４００Ｃｐｓ）＋０．１％ポロキサマー１８８を用いて製剤化し、試験中は５±３℃で保管した。媒体として１％メチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ  ＳＭ４００、４００Ｃｐｓ）＋０．１％ポロキサマー１８８を使用し、試験中は５±３℃で保管した。使用する直前にブレオマイシン（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｂｅｌｌｏｎ社）を０．９％ＮａＣｌ（ＣＤＭ  Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ社（フランス国））に溶解させた。
【０１４０】
投与
マウスを以下の群に割り当てた。
１．０．９％ＮａＣｌ＋媒体（１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝１１
２．０．９％ＮａＣｌ＋化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝１１
３．０．９％ＮａＣｌ＋ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ／日を１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝１１
４．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋媒体（１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝１０
５．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日を１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝９
６．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
７．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ／日を１５日間１日１回経口投与）、ｎ＝６
【０１４１】
１日目にエトミデート（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）でマウスに麻酔をかけてから、ブレオマイシン硫酸塩（０．９％ＮａＣｌ中０．３ｍｇ（３００ＩＵ）、５０μＬ／マウス（２５μＬ／鼻孔））又は０．９％ＮａＣｌ（５０μＬ／マウス（２５μＬ／鼻孔））を鼻腔内投与した。マウスに媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンを１５日間（０日目〜１４日目）１日１回経口投与した。１日目の媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンの投与は、０．９％ＮａＣｌ又はブレオマイシンを投与する６時間前に行った。試験化合物の投与容量は、経口投与では１０ｍＬ／ｋｇ（体重）であった。
【０１４２】
最終採血
１４日目の投与２時間後に、ペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で動物に麻酔をかけ、心穿刺により採血した。動物毎に正確な投与時間及び試料採取時間を記した。血液試料（全血０．９ｍＬ）を予め冷却しておいた２ｍＬ容リチウム−ヘパリン採血管に入れた。この血液試料を穏やかに混合し、砕いた氷上に置き、採血３０分以内に約＋４℃、約１５００×ｇで１０分間遠心分離した。血液試料毎に、得られた血漿を２等分（それぞれ少なくとも１００μＬ）し、使い捨てプラスチック材料を用いてポリプロピレン管に移した。試料を直立させた状態ですぐに冷凍庫に移して−２０℃に保った。
【０１４３】
肺摘出
最終採血後、肺組織を摘出した。
・第１の組織試料（中葉）を採取し、パラホルムアルデヒドで固定し、５±３℃に保った。
・第２の組織試料（右葉）を液体窒素中で冷凍し、−２０℃に保った。
【０１４４】
測定パラメータ
コラーゲン
コラーゲンの定量は、切片をピクロシリウスレッドで染色し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。全てのスライドをデジタル化し、ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（バージョン１．４２、米国国立衛生研究所）により３つの異なる切片の５つの重なっていない視野を無作為に分析した。全てのスライドは、厳密に同じ条件で一人の実験者により分析した。
【０１４５】
遺伝子発現
少量の凍結肺試料（５０〜１００ｍｇ）のｍＲＮＡ抽出を行った。簡単に説明すると、乳鉢と乳棒を用いて試料を低温ですり潰した。次いで、Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ３００装置で大理石（２×５ｍｎ）と１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ製、参照番号７９３０６）を用いて試料を均質化した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ｌｉｐｉｄ  Ｋｉｔ（参照番号７４８０４）を用いて製造者の指示に従って肺ホモジネートのＲＮＡ抽出を完了した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ特性をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で確認した。
【０１４６】
Ｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｂｉｏｒａｄ社、参照番号１７０−８８９１）を用いて製造者の指示に従って全ＲＮＡ１００ｎｇについてランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成を行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００配列検出システム（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）でＩｑ  ＩＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｏｘ（参照番号１７２５１２４、Ｂｉｏｒａｄ社）と専用ＱＰＣＲプライマーを用いて７．５ｎｇＲＮＡ当量のリアルタイムＰＣＲを行った。いくつかのｍＲＮＡ転写物には、蛍光色素ＦＡＭで標識したＴａｑＭａｎプローブとＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社、参照番号４３２４０２０）を用いて定量を行った。アッセイに用いたプライマー及びプローブを以下の表に示す。
【０１４７】
【表４】
0006557684.tif 000005
【０１４８】
【表５】
0006557684.tif 000006
【０１４９】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００装置でリアルタイムＰＣＲを行った。ＡＢＩ７９００からの生データをテキスト形式で書き出した。エクセル解析を行い、標準化のためにハウスキーピング遺伝子としてＲｐｌｐ０を使用し、基準対照として無処置動物（媒体群）の平均データを用いて転写物の相対量を「デルタデルタＣＴ法」（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１）により算出した。各ＲＮＡ試料を逆転写し、３連で定量した。
【０１５０】
肺タンパク質バイオマーカー
肺タンパク質抽出プロトコル：
Ｔ−ＰＥＲ（Ｒ）を用いた抽出：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（製品番号７８５１０（ロット：ＮＧ１７４００４）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とＨａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＥＤＴＡフリー（１００×）、製品番号７８４２５（ロット番号ＮＬ１７８０５１）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ社）
【０１５１】
実験中ずっと、肺試料及び上澄みを氷上に保った。抽出に関して、製造者は１００μｌのＴ−Ｐｅｒ＋１μｌの「Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（１００×）に対して１０ｍｇの組織の使用を推奨している。
【０１５２】
５０ｍｌのＴ−Ｐｅｒ緩衝液を調製し、これに５００μｌの「Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（１００×）を添加し、混合物を氷上に保った。解凍したばかりの肺試料を５０〜７０ｍｇ秤取り、細かく刻み、１ｍｌの冷ＰＢＳを添加して組織を洗浄した。この混合物を４℃で５分間５００ｇで遠心分離し、上澄みを捨てた。１００μｌ／１０ｍｇのＴ−Ｐｅｒ＋アンチプロテアーゼ（１００×）を添加し、肺をポッター型ホモジナイザーで５、６回ねじり上下させて破砕した。この混合物を４℃で５分間１００００ｇで遠心分離した。上澄みを取り出し、等分し、その後のバイオマーカー測定まで−２０℃で保った。１０μｌの試料を用いて、ＭＯＳ：ＢＡＰ−０３−０６２−０１（Ｋｉｔ  ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、参照番号２３２２５）に記載の手順に従ってＭＱ水で１／１０に希釈した後、ＢＣＡ法によりタンパク質を定量した。
【０１５３】
全てのタンパク質をＥＬＩＳＡキットで製造者の指示に従って定量した。
・オステオポンチン：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスオステオポンチン免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号：ＭＯＳＴ００）
・ＭＣＰ−１：ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＭＪＥ００）
・ＴＩＭＰ−１：マウスＴＩＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ）、参照番号ＴＭ１００）
【０１５４】
データ処理及び統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア（バージョン５．１）を用いて全てのパラメータを解析した。これらパラメータは以下のようにして解析した。
・一元配置分散分析（処置）を用いて各群（１、２及び３）を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第１群と第２群及び第３群とを比較した。
・一元配置分散分析（処置）を用いて各群（１、４、５、６及び７）を比較した。分散分析が有意であると分かれば、ダネットの検定を用いて第１群と第４群、第５群、第６群及び第７群とを比較した。
【０１５５】
図１７〜図２７において、＊はｐ値＜０．０５、＊＊はｐ値＜０．０１、＊＊＊はｐ値＜０．００１を表す。
【０１５６】
結果
１／コラーゲン沈着
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってコラーゲン沈着量が媒体と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０５）。ロシグリタゾンでもコラーゲン量が有意に低下した（ｐ＜０．０５）（図１７）。
【０１５７】
２／肺ＴＩＭＰ−１
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＴＩＭＰ−１量が媒体と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０５）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＴＩＭＰ−１量が増加した（図１８）。
【０１５８】
３／肺ＭＣＰ−１
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののＭＣＰ−１量が媒体と比べて低下した。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＭＣＰ−１量が増加した（図１９）。
【０１５９】
４／肺オステオポンチン
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののオステオポンチン量が媒体と比べて低下した。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののオステオポンチン量が増加した（図２０）。
【０１６０】
５／ＴＧＦβＲ−１発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＴＧＦβＲ−１発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。ロシグリタゾンでもＴＧＦβ−１発現が有意に阻害された（ｐ＜０．０５）（図２１）。
【０１６１】
６／Ｉ型コラーゲンαＩ（Ｃｏｌ１ａ）発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＣｏｌ１ａ発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＣｏｌ１ａ発現が上方制御された（図２２）。
【０１６２】
７／ＩＩＩ型コラーゲンαＩ（Ｃｏｌ３ａ）発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってＣｏｌ３ａ発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＣｏｌ３ａ発現が阻害された（図２３）。
【０１６３】
８／ＴＩＭＰ−１発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののＴＩＭＰ−１発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンではＴＩＭＰ−１発現が有意に上方制御された（ｐ＜０．０５）（図２４）。
【０１６４】
９／ＭＣＰ−１発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によって、有意水準に達することはなかったもののＭＣＰ−１発現が媒体と比べて阻害された。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののＴＩＭＰ−１発現が上方制御された（図２５）。
【０１６５】
１０／オステオポンチン発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってオステオポンチン発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。一方、ロシグリタゾンではオステオポンチンに何ら効果が見られなかった（図２６）。
【０１６６】
１１／フィブロネクチン発現
ブレオマイシン暴露マウスにおいて、化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）によってフィブロネクチン発現が媒体と比べて有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。一方、ロシグリタゾンでは、有意水準に達することはなかったもののフィブロネクチン発現が上方制御された（図２７）。
【０１６７】
これらの結果から、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日又は１００ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与することによって、肺でのブレオマイシン点滴により誘導された炎症性／線維化バイオマーカー量の増加が抑制されたが、一方、ロシグリタゾンではこれらバイオマーカーに何ら効果が見られなかったか、あるいは悪影響さえ見られたことが分かる。まとめると、これらデータは、化合物Ａがマウスのブレオマイシン誘導肺線維症を抑制したことを示している。
【０１６８】
実施例４：マウスでのブレオマイシン誘導皮膚線維症の発症に及ぼす化合物Ａの効果及び公知ＰＰＡＲγアゴニストとの比較
ブレオマイシン誘導皮膚線維症のマウスモデルで化合物Ａを試験した。２つの異なる投与量（３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日）の化合物Ａ及び５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＡＲγ基準化合物ロシグリタゾンを２１日間毎日マウスに経口投与した。この処置の終了時にマウスを屠殺し、皮膚試料を採取した。全身性線維症経路に関与していることが知られている遺伝子の発現を定量化し、真皮の厚さ及びコラーゲン量を測定した。
【０１６９】
２１日間媒体を経口投与したブレオマイシン暴露マウスは、真皮の厚さ及びコラーゲン量の統計的に有意な増加によって示されるように、皮膚線維症を呈した。２１日間３０ｍｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａで処置することによって、真皮の厚さ及びコラーゲン量が媒体と比べて有意に減少した。２１日間毎日５ｍｇ／ｋｇ／日のロシグリタゾンを経口投与したブレオマイシン暴露マウスでも同様の効果が見られたが、その効果は真皮の厚さに関してはあまり顕著なものではなかった。
【０１７０】
材料及び方法
６週齢の雄性Ｃ５６ＢＬ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ社（フランス国ルジュネスト＝サン＝ティスル））で実験を行った。マウスを３〜１０匹からなる各群に分けてポリプロピレン製ケージ（床面積＝１０３２ｃｍ２）で標準的な条件下、すなわち室温（２２±２℃）、湿度（５５±１０％）、明暗サイクル（１２時間／１２時間）、換気（１５〜２０体積／時）、水及び餌（ＳＤＳ、ＲＭ１）の自由摂取で飼育した。実験前の少なくとも５日間はマウスを馴化した。消えない標識を尾に付けてマウスに番号を付けた。
【０１７１】
調製済懸濁液として、化合物Ａ（３ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ）及びロシグリタゾン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を１％メチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ  ＳＭ４００、４００Ｃｐｓ）＋０．１％ポロキサマー１８８を用いて製剤化し、試験中は５±３℃で保管した。媒体として１％メチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ  ＳＭ４００、４００Ｃｐｓ）＋０．１％ポロキサマー１８８を使用し、試験中は５±３℃で保管した。
【０１７２】
投与
マウスを以下の群に割り当てた。
１．０．９％ＮａＣｌ＋媒体（２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
２．０．９％ＮａＣｌ＋化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
３．０．９％ＮａＣｌ＋化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日を２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
４．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ／日を２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝８
５．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋媒体（２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝６
６．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ／日を２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
７．ブレオマイシン（０．３ｍｇ）＋化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ／日を２１日間１日１回経口投与）、ｎ＝７
【０１７３】
毎日ブレオマイシン注射（０．９％ＮａＣｌ（ＣＤＭ  Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ社（フランス国））にブレオマイシン（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｂｅｌｌｏｎ社（フランス国））を濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解させた溶液１００μＬを週に６日、背中上部の所定領域１ｃｍ２に投与）して皮膚線維症を誘導した。０．９％ＮａＣｌを対照として用いた（１００μＬを皮下注射）。
【０１７４】
マウスに媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンを２１日間１日１回経口投与した。１日目の媒体、化合物Ａ又はロシグリタゾンの投与は、０．９％ＮａＣｌ又はブレオマイシンを投与する４時間前に行った。
【０１７５】
皮膚採取
２１日目にマウスを頸椎脱臼により屠殺し、皮膚試料を採取し、分析のために処理した。
【０１７６】
測定パラメータ：
真皮及び脂肪層の厚さ
病変皮膚領域を切除し、４％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋した。厚さ５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。各マウスの病変皮膚の４つの部位において表皮真皮境界部と真皮皮下脂肪境界部の間の長さを測定して真皮の厚さを１００倍の倍率で分析した。測定値に１０％超の変動が生じる場合に備えて２人の独立した実験者が評価を行って意見を一致させた。
【０１７７】
皮膚コラーゲン量
ヒドロキシプロリンアッセイ
ヒドロキシプロリンアッセイにより病変皮膚試料のコラーゲン量を調べた。パンチ生検（Φ３ｍｍ）を６Ｍ  ＨＣｌ中、１２０℃で３時間消化した後、６Ｍ  ＮａＯＨで試料をｐＨ７に調整した。その後、試料を０．０６ＭクロラミンＴと混合し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、３．１５Ｍ過塩素酸及び２０％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加し、試料をさらに２０分間６０℃でインキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ１９０マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社（米国カリフォルニア州サニーヴェイル））を用いて５５７ｎｍで吸光度を測定した。
【０１７８】
Ｓｉｒｃｏｌアッセイ
Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）を用いて細胞培地の上澄み中の全可溶性コラーゲンを定量した。簡単に説明すると、細胞培地の上澄みを室温で３０分間シリウスレッド色素と混合した。遠心分離後、ペレットをアルカリ試薬に溶解させた。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ１９０マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて５４０ｎｍの波長で測定を行った。
【０１７９】
データ処理及び統計分析
データは、平均±平均の標準誤差として表した。統計分析にはスチューデントのｔ検定を用いた。０．０５未満のｐ値は統計的に有意な結果と見なした。
【０１８０】
図２８〜図３０において、＊はｐ値≦０．０５、＊＊はｐ値＜０．０１、＊＊＊はｐ値＜０．００１を表す。
【０１８１】
結果
マウスにブレオマイシンを注射すると、ＮａＣｌを投与したマウスと比べて真皮の厚さが増加した（図２８を参照：ＮａＣｌ＋媒体群と比べてブレオマイシン＋媒体群では５７％増加）。ロシグリタゾン及び化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）によって、ブレオマイシン暴露マウスの真皮の厚さが媒体と比べて有意に減少した（ｐ≦０．０５）。化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）によって、ブレオマイシン暴露マウスの真皮の厚さが媒体と比べてさらに有意に減少した（ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
真皮の厚さの減少と一致して、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンで処置したマウスの病変皮膚中のヒドロキシプロリン量は、媒体で処置したマウスの病変皮膚よりも有意に少なかった。化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）はロシグリタゾンよりも効果が高かった（図２９）。
【０１８３】
また、化合物Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）及びロシグリタゾンによって、コラーゲン量が媒体と比べて有意に低下した（図３０）。
【０１８４】
まとめると、これらの結果から、化合物Ａが皮膚線維症を予防するのに効率的であることが分かる。化合物Ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、真皮の厚さに対してロシグリタゾンよりも優れた効果を発揮さえした。
【０１８５】
実施例５：化合物Ａによるヒト及びマウスＰＰＡＲ受容体の活性化
３つのＰＰＡＲ受容体亜型全てを活性化する化合物Ａの能力を一過性トランス活性化アッセイにより測定した。この細胞アッセイは、キメラヒト又はマウスＰＰＡＲα−Ｇａｌ４受容体発現プラスミド（又はＰＰＡＲδ−Ｇａｌ４又はＰＰＡＲγ−Ｇａｌ４）及び５Ｇａｌ４ｐＧＬ３ＴＫ  ＬｕｃレポータープラスミドをトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞を用いて行った。トランスフェクションは化学剤（Ｊｅｔ  ＰＥＩ）で行った。トランスフェクト細胞を３８４ウェルプレートに分配し、２４時間置いて回収した。次いで、培地を除去し、試験対象の化合物を含む新しい培地（５μＭ）を添加した（最終濃度は１０−４Ｍ〜３  １０−１０Ｍの範囲）。一晩インキュベート後、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造者の指示に従って添加してルシフェラーゼ発現を測定した。基準物質として１０−５Ｍのフェノフィブリン酸、１０−８ＭのＧＷ５０１５１６及び１０−６Ｍのロシグリタゾンを用いた。結果は、基準物質（ＰＰＡＲαではフェノフィブリン酸、ＰＰＡＲγではロシグリタゾン、ＰＰＡＲδではＧＷ５０１５１６）を１００％とした活性％で表した。ヒト受容体では結果は６回の実験（各回４連）の平均である。マウス受容体では結果は５回（ＰＰＡＲδ）又は６回（ＰＰＡＲα及びγ）の実験（各回４連）の平均である。Ａｓｓａｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（ＭＤＬ社）を用いて用量効果曲線及びＥＣ５０を算出した。結果を以下の表、図３１及び図３２に示す。
【０１８６】
【表６】
0006557684.tif 000007
【０１８７】
これらの結果から、化合物Ａが３つのＰＰＡＲ受容体亜型を全て活性化し、各亜型のＥＣ５０が１μＭ未満であることが分かる。さらに、化合物Ａが３つのＰＰＡＲ受容体亜型に対してバランスよく活性を示すことが分かる。
【０１８８】
概して実施例１〜５の結果は、汎抗線維化効果を発揮するためには、ＰＰＡＲαアゴニスト及びＰＰＡＲγアゴニストの活性と共に良好なＰＰＡＲδアゴニスト活性が必要であることを示唆している。
【０１８９】
実施例６：肺線維芽細胞及び皮膚線維芽細胞の増殖に及ぼす化合物Ａの効果並びに公知ＰＰＡＲγアゴニスト及びＰＰＡＲαアゴニストとの比較
ＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）取り込みアッセイを行ってＰＤＧＦ誘導性肺及び皮膚線維芽細胞増殖を阻害する化合物Ａの能力を測定した。このアッセイは初代ヒト肺線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を用いて行った。これらの細胞を９６ウェルプレート中の完全増殖培地に蒔いて２４時間後、無血清培地で２４時間飢餓状態とした。次いで、この培地をＰＤＧＦ及び試験対象の化合物Ａ（濃度：１０−４Ｍ〜４．５  １０−８Ｍの範囲）を含む新しい培地と交換してさらに２４時間置いた。ＥｄＵを細胞に加えて該化合物処置をあと１６時間行った。次いで、培地を除去し、細胞をホルムアルデヒドで固定し、蛍光Ｃｌｉｃｋ−ｉｔアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて製造者の指示に従って分裂細胞のＤＮＡに取り込まれたＥｄＵを定量した。基準物質として、３  １０−４Ｍ〜１．４  １０−７Ｍの範囲の各濃度のフェノフィブリン酸（ＰＰＡＲα）及び３  １０−５Ｍ〜１．４  １０−８Ｍの範囲の各濃度のロシグリタゾン（ＰＰＡＲγ）を用いた。結果は、全細胞数に対するＥｄＵ陽性細胞の％として表した。結果は生物学的反復３回の平均を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量効果曲線及びＩＣ５０値を算出した。結果を以下の表、図３３及び図３４に示す。
【０１９０】
【表７】
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【０１９１】
実施例７：肺線維芽細胞及び皮膚線維芽細胞の線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行に及ぼす化合物Ａの効果並びに公知ＰＰＡＲγアゴニスト及びＰＰＡＲαアゴニストとの比較
筋線維芽細胞マーカーであるα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）について免疫細胞化学アッセイを行って、ＴＧＦβ誘導性の肺及び皮膚線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）を阻害する化合物Ａの能力を測定した。このアッセイは初代ヒト肺又は皮膚線維芽細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を用いて行った。これらの細胞を９６ウェルプレート中の完全増殖培地に蒔いて２４時間後、無血清培地で２４時間飢餓状態とした。次いで、この培地をＴＧＦβ及び試験対象の化合物Ａ（濃度：１０−４Ｍ〜４．５  １０−８Ｍの範囲）を含む新しい培地と交換してさらに４８時間置いた。次いで、培地を除去し、細胞をホルムアルデヒドで固定し、マウスα−ＳＭＡ一次抗体（Ｓｉｇｍａ社）及び蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。Ｍｅｔａ  Ｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてα−ＳＭＡ発現を定量化した。基準物質として、３  １０−４Ｍ〜１．４  １０−７Ｍの範囲の各濃度のフェノフィブリン酸（ＰＰＡＲα）及び３  １０−５Ｍ〜１．４  １０−８Ｍの範囲の各濃度のロシグリタゾン（ＰＰＡＲγ）を用いた。結果は、全細胞数に対するα−ＳＭＡ陽性細胞の％として表した。ＴＧＦβ処置のみのものを１００％としてデータを標準化した。結果は生物学的反復３回の平均を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量効果曲線及びＩＣ５０値を算出した。結果を以下の表、図３５及び図３６に示す。
【０１９２】
【表８】
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【０１９３】
まとめると、これらのインビトロ機能データから、化合物Ａが、初代ヒト肺及び皮膚線維芽細胞でのＰＤＧＦ誘導性増殖及びＴＧＦβ誘導性筋線維芽細胞移行を効率的に阻害するため、インビボで見られた抗線維化効果と関連していることが明らかである。また、これらの結果は、ＰＰＡＲパンアゴニズムが、２つの主要線維形成経路の標的細胞における抗線維化効果について単一のＰＰＡＲ活性化よりも優れていることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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