(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
該標的核酸セグメントの部分群を含む核酸組成物をクロスリンクさせるステップと;
該クロスリンクされた核酸組成物を断片化させるステップと;
該断片の末端をビオチンでマーキングするステップと;
該断片化された核酸セグメントを連結して、連結された断片を生成するステップと;
該クロスリンキングを逆転するステップと；
該断片をせん断し、その後、末端修復するステップと；
断片をストレプトアビジンでプルダウンするステップと；
アダプターライゲーション、その後、PCRを行うステップと；
該標的核酸セグメントの部分群と結合する単離用核酸分子の追加によりプロモーター捕捉を行うステップであって、ここでは、該単離用核酸分子は、結合対の第一の半分で標識される、前記ステップと;
該単離用核酸分子と結合された該標的核酸セグメントの部分群を含有する連結された断片を、該結合対の第二の半分を使用することによって単離するステップと;
PCRを用いて増幅するステップと；
配列決定して、該標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記標的核酸分子の部分群が、エンハンサー、サイレンサー、又はインスレーターから選択される調節エレメントを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記単離用核酸分子が、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから得られる、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記単離用核酸分子が、RNAである、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記結合対の第一の半分が、ビオチンを含み、前記結合対の第二の半分が、ストレプトアビジンを含む、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
前記核酸組成物が、ヒト細胞核などの哺乳類の細胞核由来である、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記核酸組成物が、マウス細胞核又は植物細胞核などの、非ヒト細胞核由来である、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
特定の病的状態の徴候である1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
a)ある特定の病的状態を伴う個体から得られる核酸組成物に対して、請求項1から7のいずれか1項記載の方法を実施することと;
b)核酸セグメントと標的核酸セグメントとの相互作用の頻度を数量化することと;
c)前記病的状態を伴う個体由来の核酸組成物における相互作用の頻度と、健康な対象由来の正常対照の核内組成物における相互作用の頻度とを比較し、その結果、該核酸組成物における相互作用の頻度の差が、特定の病的状態を示すこと、
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記病的状態が、癌、自己免疫疾患、発達障害、又は遺伝性障害から選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項1から7のいずれか1項記載の方法を実施することが可能な緩衝液及び試薬を含む、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するための方法、特に、標的核酸セグメントの部分群(sub-group)と相互作用する核酸セグメントを特定するための方法、並びに、前記方法を実施するためのキットに関する。本発明はまた、ある特定の病的状態の徴候である1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
調節エレメントは、生物の遺伝的制御における中心的役割を果たし、(例えば癌及び自己免疫異常において)健康及び疾患に寄与することが示されている。これらの調節エレメントの特定は、分子生物学における、例えば、発現系及び遺伝的改変技術における、潜在的用途を有することもできる。しかし、マウス及びヒトゲノムにおいて、何千もの調節エレメントがマッピングされてきた一方で、その調節エレメントが、どの標的遺伝子を調節するかを決定することは、重要な課題である。調節DNA配列(例えばエンハンサー)は、かなり大きなゲノム距離を埋めて、その標的遺伝子と相互作用することができることが実証されている。遺伝子とその調節領域との染色体上の接触は、捕捉することができるが、ゲノム規模で、遺伝子を、その調節配列と結びつける方法は、現在、見つけられていない。
【０００３】
ゲノム遺伝子座の間の相互作用を明らかにするために開発された第一の方法の1つは、染色体高次構造捕捉(Chromosome Conformation Capture)(3C)技術であった(Dekkerらの文献、Science(2002)295:1306-1311)。これは、以下によって3Cライブラリを作製することを含んでいた:核内組成物をクロスリンクさせて、空間的に近接しているゲノム遺伝子座が結びつけられるようにすること;消化によって、クロスリンク間の介在DNAループを除去すること;及び相互作用領域を連結及び逆転クロスリンクさせて、3Cライブラリを作製すること。次いで、このライブラリを使用して、公知の配列間の相互作用の頻度を算出することができる。しかし、この方法は、関心対象の相互作用領域を検出するために、相互作用の事前知識を必要とする。
【０００４】
それ以来、3C法を用いる限界を試す及び克服するために、技術がさらに開発されている。例えば、4C法は、インバースPCRを使用して、具体的な相互作用が知られていないベイト(bait)配列の相互作用を明らかにする(Simonisらの文献、Nat.Genet.(2006)38:1341-1347;及びZhaoらの文献、Nat.Genet.(2006)38:1348-1354)。しかし、この方法は、時間も供給源の費用もかさみ、1つだけのベイト・ゲノム遺伝子座との相互作用を検出するように設計され、半定量的であるに過ぎない。
【０００５】
Hi-C法は、ジャンクションマーカーを使用して、細胞中の連結された相互作用配列をすべて単離する(WO 2010/036323及びLieberman-Aidenらの文献、Science(2009)326:289-93を参照のこと)。これは、ある特定の時点で核内組成物内に存在するすべての相互作用に関する情報を提供するが、(例えば、Hi-Cライブラリ作製のために、HindIII又はBglIIなどの、6塩基対認識部位をもつ制限酵素が使用されているならば)1細胞あたりおよそ800,000個の連結可能断片が存在し、これは、ライブラリを過度に複雑にし、個々の特定の領域間の相互作用の照合を妨げる。
【０００６】
したがって、現在利用可能な方法の限界を克服する、核酸相互作用を明らかにするための改良された方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
(発明の概要)
本発明の第一の態様によれば、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
(a)該標的核酸セグメントの部分群を含む核酸組成物を得るステップと;
(b)該核酸組成物をクロスリンクさせるステップと;
(c)該クロスリンクされた核内組成物を超音波処理によって断片化させるステップと;
(d)ステップ(c)から得られた断片化された核酸セグメントを連結して、連結された断片を生成するステップと;
(e)該標的核酸セグメントの部分群と結合する単離用核酸分子の追加(ここでは、前記単離用核酸分子は、結合対の第一の半分で標識される)と;
(f)該単離用核酸分子と結合された該標的核酸セグメントの部分群を含有する連結された断片を、結合対の第二の半分を使用することによって単離するステップと;
(g)ステップ(f)の単離された連結された断片を配列決定して、該標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するステップ。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、ある特定の病的状態の徴候である1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって、以下を含む前記方法が提供される:
a)ある特定の病的状態を伴う個体から得られる核酸組成物に対して、本明細書で定義される方法を実施することと;
b)核酸セグメントと標的核酸セグメントとの相互作用の頻度を数量化することと;
c)前記病的状態を伴う個体由来の核酸組成物における相互作用の頻度と、健康な対象由来の正常対照の核酸組成物における相互作用の頻度とを比較する(その結果、核酸組成物における相互作用の頻度の差が、ある特定の病的状態の徴候である)こと。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義する方法を実施することが可能な緩衝液及び試薬を含む、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
(図面の簡単な説明)
【図１】図1は、本明細書に記載する本発明の一実施態様の図解による概要である。
【図２】図2は、本明細書に記載する方法を使用して得られた結果である。図2(A)は、CD34+細胞における、MYC遺伝子の周囲のゲノム領域、及びMYC遺伝子の染色体上相互作用プロフィールを示す。図2(B)は、CD34+細胞核のDNA FISHの例を示す。図2(C)は、3C法を使用する、MYCプロモーターと、その遺伝子の1.8Mb下流の領域との間の相互作用の検証を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
(発明の詳細な説明)
本発明の第一の態様によれば、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
(a)該標的核酸セグメントの部分群を含む核酸組成物を得るステップと;
(b)該核酸組成物をクロスリンクさせるステップと;
(c)該クロスリンクされた核酸組成物を超音波処理によって断片化させるステップと;
(d)ステップ(c)から得られた断片化された核酸セグメントを連結して、連結された断片を生成するステップと;
(e)該標的核酸セグメントの部分群と結合する単離用核酸分子の追加(ここでは、前記単離用核酸分子は、結合対の第一の半分で標識される)と;
(f)該単離用核酸分子と結合された該標的核酸セグメントの部分群を含有する連結された断片を、結合対の第二の半分を使用することによって単離するステップと;
(g)ステップ(f)の単離された連結された断片を配列決定して、該標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するステップ。
【００１２】
言及することができる本発明の第二の態様によれば、ある標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
(a)該標的核酸セグメントを含む核酸組成物を得るステップと;
(b)該核酸組成物をクロスリンクさせるステップと;
(c)該クロスリンクされた核内組成物を断片化させるステップと;
(d)ステップ(c)から得られた断片化された核酸セグメントを連結して、連結された断片を生成するステップと;
(e)該標的核酸セグメントと結合するように構成された単離用核酸分子の追加(ここでは、前記単離用核酸分子は、結合対の第一の半分で標識される)と;
(f)該単離用核酸分子と結合された標的核酸セグメントを含有する連結された断片を、結合対の第二の半分を使用することによって単離するステップと;
(g)ステップ(f)の単離された連結された断片を配列決定して、該標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するステップ。
【００１３】
本発明の方法は、標的核酸セグメントを単離するための単離用核酸分子、特に標的核酸セグメントの部分群を単離する単離用核酸分子を使用することによって、相互作用配列を特定するための手段を提供する。これは、非常に複雑なライブラリ内の特定の相互作用に関するデータに焦点を合わせるのを助け、また、これを使用して情報を、使用される単離用核酸分子(例えば、プロモーター相互作用を明らかにするためのプロモーター)の種類に応じて、様々なサブセットにまとめることができる。次いで、特定のサブセット内の染色体上相互作用に関する詳細な情報を得ることができる。
【００１４】
4Cなどの従来の技術が、1つ又は少数のプロモーターのゲノム規模での相互作用の捕捉を可能にするのに対して、本明細書に記載する方法は、一回の実験で、22,000を超えるプロモーター、及びその相互作用するゲノム遺伝子座を捕捉することができる。さらに、本発明の方法は、有意に多い量の読み取り値をもたらす。
【００１５】
ゲノムワイド関連解析(Genome-Wide Association Studies)(GWAS)によって、疾患と関連する何千もの一塩基多型(SNP)が特定されてきた。しかし、これらのSNPの多くが、遺伝子から遠く離れた場所に位置していることから、これらのSNPがどの遺伝子に作用するのかを予測することは非常に困難となる。したがって、本発明の方法は、相互作用核酸セグメントを、たとえゲノム内で互いに離れた場所に位置しているとしても特定する手段を提供する。
【００１６】
本明細書で使用される「核酸セグメント」に対する言及は、「核酸配列」に対する言及と同等であり、ヌクレオチド(すなわち、例えば、アデニン(A)、チミジン(T)、シトシン(C)、グアノシン(G)、及び/又はウラシル(U))のあらゆるポリマーを指す。このポリマーは、機能性のゲノム断片又は遺伝子をもたらしてももたらさなくてもよい。核酸配列の組み合わせは、究極的には染色体を含むことができる。デオキシリボヌクレオシドを含む核酸配列は、デオキシリボ核酸(DNA)と呼ばれる。リボヌクレオシドを含む核酸配列は、リボ核酸(RNA)と呼ばれる。RNAは、さらに、いくつかのタイプ、例えば、タンパク質コーディングRNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、長鎖ノンコーディングRNA(lnRNA)、長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA(lincRNA)、アンチセンスRNA(asRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、核内低分子(snRNA)、及び核小体低分子RNA(snoRNA)に特徴付けることができる。
【００１７】
「一塩基多型」又は「SNP」は、生物学的種のメンバー間で、又は対合される染色体間で異なる、ゲノム内の単一のヌクレオチド変異(すなわちA、C、G、又はT)である。
【００１８】
「標的核酸セグメント」とは、使用者に知られている関心対象の配列をいうことが理解されよう。標的核酸セグメントを含有する連結された断片のみを単離することは、関心対象のある特定の遺伝子との特定の相互作用を明らかにするデータに焦点を合わせるのに役立つ。
【００１９】
用語「相互作用する」又は「相互作用」に対する本明細書での言及は、2つのエレメント間の関連、例えば、本発明の方法では、核酸セグメントと標的核酸セグメントとの間のゲノム相互作用を指す。この相互作用によって、通常、一方の相互作用エレメントが、他方に対する影響(例えば、それが結合するエレメントを抑制又は活性化すること)を有するようになる。この相互作用は、互いに近くに位置する、又は直線的ゲノム配列上では遠く離れている、2つの核酸セグメント間に存在することができる。
【００２０】
用語「核酸組成物」に対する本明細書での言及は、核酸及びタンパク質を含むあらゆる組成物を指す。核酸組成物内の核酸は、染色体に統合され得、ここでは、タンパク質(すなわち、例えばヒストン)が、調節機能を有する染色体と関連するようになる可能性がある。一実施態様では、核酸組成物は、核内組成物を含む。こうした核内組成物には、一般的に、核内ゲノム組織又はクロマチンが含まれ得る。
【００２１】
本明細書で使用される「クロスリンキング」又は「クロスリンク」に対する言及は、2つの化合物の間の、これらの化合物が、ある単位としてさらに処理可能となるような、あらゆる安定な化学的結合を指す。こうした安定性は、共有及び/又は非共有結合(例えばイオン結合)に基づくものであり得る。例えば、核酸及び/又はタンパク質は、これらが通例の実験室的手順(すなわち、例えば抽出すること、洗浄すること、遠心分離など)の間にその空間関係を維持するように、化学薬品(すなわち、例えば固定液)、熱、圧力、pHの変化、又は放射線によってクロスリンクさせることができる。本明細書で使用されるクロスリンキングは、用語「固定すること」又は「固定」と同等であり、ありとあらゆる細胞過程を固定化するあらゆる方法又はプロセスに適用される。したがって、クロスリンクされた/固定された細胞は、固定時の核酸組成物内の成分間の空間関係を厳密に維持する。限定はされないが、ホルムアルデヒド、ホルマリン、又はグルタルアルデヒドを含めた多くの化学物質が、固定を提供可能である。
【００２２】
本明細書で使用される用語「断片」に対する言及は、それが由来する配列よりも短いあらゆる核酸配列を指す。断片は、数メガベース及び/又はキロベースからほんの数ヌクレオチド長に及ぶ、あらゆるサイズであり得る。断片は、適切には、5ヌクレオチド塩基超の長さ、例えば10、15、20、25、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、5000、又は10000ヌクレオチド塩基の長さである。断片は、さらに長い、例えば、1、5、10、20、25、50、75、100、200、300、400、又は500ヌクレオチドキロベースの長さも可能である。本発明の第二の態様では、核酸組成物を断片化するために、制限酵素消化、超音波処理、酸インキュベーション、塩基インキュベーション、顕微溶液化などの方法をすべて使用することができる。
【００２３】
用語「連結された」に対する本明細書での言及は、ホスホジエステル結合を通常含む、2つの核酸セグメントのあらゆる結合を指す。この結合は、通常、補助因子試薬及びエネルギー源(すなわち、例えばアデノシン三リン酸(ATP))の存在下で、触媒的酵素(すなわち、例えばT4 DNAリガーゼなどのリガーゼ)の存在によって促進される。本明細書に記載する方法では、単一の連結された断片を生成するために、クロスリンクされている2つの核酸セグメントの断片が連結される。
【００２４】
「単離用核酸分子」に対する本明細書での言及は、標的核酸セグメントと結合する核酸の形成された分子を指す。例えば、単離用核酸分子は、標的核酸セグメント(これは、その後、該標的核酸セグメントのヌクレオチド塩基との相互作用をなす(すなわち塩基対(bp)を形成する)こととなる)に対して相補的な配列を含有することができる。単離用核酸分子、例えばビオチン標識されたRNAは、相補的相互作用をなし、かつ、これを核酸組成物から単離するために、標的核酸セグメントの相補配列全体を含有する必要がないことが理解されよう。単離用核酸分子は、少なくとも10ヌクレオチド塩基長、例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、130、150、170、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、又は5000ヌクレオチド塩基長であり得る。
【００２５】
「結合対」に対する本明細書での言及は、付着をなすために互いを特異的に認識する、少なくとも2つの部分(すなわち第一の半分と第二の半分)を指す。適切な結合対としては、例えば、ビオチンとアビジン、又はビオチンとアビジンの誘導体(ストレプトアビジン及びニュートラアビジンなど)が挙げられる。
【００２６】
「標識すること」又は「標識された」に対する本明細書での言及は、マーカーを付着させることによって標的を識別するプロセスを指す。ここでは、マーカーは、あるリガンドに対する独特の親和性を有する特異的部分(すなわちアフィニティタグ)を含む。例えば、標識は、単離用核酸配列を選択的に(すなわち、例えばアフィニティクロマトグラフィーによって)精製するのに役立つことができる。こうした標識には、限定はされないが、ビオチン標識、ヒスチジン標識(すなわち6His)、又はFLAG標識が含まれ得る。
【００２７】
一実施態様では、標的核酸分子、すなわち標的核酸分子の部分群は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はインスレーターから選択される。さらなる実施態様では、標的核酸分子は、プロモーターである。さらなる代替実施態様では、標的核酸分子は、インスレーターである。
【００２８】
用語「プロモーター」に対する本明細書での言及は、作動可能に連結された翻訳領域の転写の開始を促進する核酸配列を指す。プロモーターは時々、「転写開始領域」とも呼ばれる。調節エレメントは、転写を活性化又は抑制するために、しばしば、プロモーターと相互作用する。
【００２９】
本発明者らは、本発明の方法を使用して、何千ものプロモーター相互作用(プロモーターあたり10から20の相互作用が存在する)を明らかにしてきた。本明細書に記載する方法によって、いくつかの相互作用が、細胞特異的である又は様々な病的状態と関連することが明らかにされている。相互作用核酸セグメント間の幅広い分離距離も明らかにされている-大抵の相互作用は100キロベース内であるが、2メガベース超にまで及ぶ可能性があるものもある。興味深いことには、この方法を使用して、活性遺伝子と不活性遺伝子の両方が相互作用をなすことも示されている。
【００３０】
プロモーターと相互作用することが明らかにされた核酸セグメントは、適切な遺伝子制御のために必要とされる調節エレメントの候補である。その破壊は、転写アウトプットを変え、疾患の一因となる可能性があるので、これらのエレメントをその標的遺伝子に結びつけることは、新規治療法のための潜在的な新規薬物標的を提供するであろう。
【００３１】
どの調節エレメントがプロモーターと相互作用するかということを明らかにすることは、遺伝的相互作用を理解するのに不可欠である。本発明の方法はまた、ある特定の時点での核酸組成物内の相互作用を眺めるスナップショットも提供し、したがって、この方法が、一連の、時点又は発達状態又は実験条件に対して実施されて、細胞の核酸組成物内の相互作用の変化の像を作り上げるであろうということが想定される。
【００３２】
一実施態様では、標的核酸セグメントが、調節エレメントを含む核酸セグメントと相互作用することが理解されよう。さらなる実施態様では、調節エレメントは、エンハンサー、サイレンサー、又はインスレーターを含む。
【００３３】
本明細書で使用される用語「調節遺伝子」は、あるタンパク質をコードするあらゆる核酸配列を指す。ここでは、該タンパク質は、同じ又は異なる核酸配列と結合し、それによって、転写速度を調節する、又は前記同じ又は異なる核酸配列の発現レベルに影響を与える。本明細書で使用される用語「調節エレメント」は、別のゲノムエレメントの活性状態に影響を与えるあらゆる核酸配列を指す。例えば、種々の調節エレメントには、限定はされないが、エンハンサー、アクチベーター、リプレッサー、インスレーター、プロモーター、又はサイレンサーが含まれ得る。
【００３４】
一実施態様では、標的核酸分子は、クロマチン免疫沈降(ChIP)シークエンシングを介して特定されたゲノム部位である。ChIPシークエンシング実験は、核酸組成物内のタンパク質-DNA複合体をクロスリンクすることによって、タンパク質-DNA相互作用を分析する。次いで、このタンパク質-DNA複合体を、(免疫沈降によって)単離した後、該タンパク質が結合するゲノム領域を配列決定する。
【００３５】
いくつかの実施態様では、前記核酸セグメントは、標的核酸セグメントと同じ染色体上に位置することが予想されることとなる。或いは、前記核酸セグメントは、標的核酸セグメントとは異なる染色体上に位置する。
【００３６】
この方法を使用して、遠距離相互作用、近距離相互作用、又は近接相互作用を明らかにすることができる。本明細書で使用される用語「遠距離相互作用」は、直線的ゲノム配列内から遠く離れた相互作用核酸セグメントの検出を指す。この種類の相互作用は、例えば、同じ染色体の異なるアーム上に位置する、又は異なる染色体上に位置する2つのゲノム領域を特定することができる。本明細書で使用される用語「近距離相互作用」は、互いにゲノム内の比較的近くに位置する相互作用核酸セグメントの検出を指す。本明細書で使用される用語「近接相互作用」は、直線的ゲノム内の互いに非常に近い、例えば、同じ遺伝子の一部である、相互作用核酸セグメントの検出を指す。
【００３７】
SNPは、偶然によって期待されるであろうよりも頻繁に相互作用核酸セグメント内に位置していることが、本発明者らによって示されているので、本発明の方法を使用して、どのSNPが、特定の遺伝子と相互作用する、また、それゆえに該遺伝子を調節する可能性が高いかを明らかにすることができる。
【００３８】
一実施態様では、単離用核酸分子は、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから得られる。さらなる実施態様では、単離用核酸分子は、細菌人工染色体(BAC)から得られる。
【００３９】
一実施態様では、単離用核酸分子は、DNA、cDNA、又はRNAである。さらなる実施態様では、単離用核酸分子は、RNAである。
【００４０】
単離用核酸分子は、溶液ハイブリダイゼーション選択(WO2009/099602参照)などの適切な方法において用いることができる。この方法では、一連の「ベイト」配列を作製してハイブリダイゼーション混合物を形成し、これを使用して、試料(すなわち「ポンド(pond)」)から標的核酸の部分群を単離することができる。
【００４１】
一実施態様では、結合対の第一の半分は、ビオチンを含み、結合対の第二の半分は、ストレプトアビジンを含む。
【００４２】
一実施態様では、断片化(すなわち本発明の第二の態様のステップ(c))は、制限酵素又は超音波処理を使用して実施される。さらなる実施態様では、本発明の第二の態様のステップ(c)は、制限酵素を使用して実施される。誤解を避けるために、本発明の第一の態様のステップ(c)は、超音波処理を使用して実施されるということを理解されたい。
【００４３】
本明細書で使用される用語「制限酵素」とは、特定の塩基対配列で核酸を切断するあらゆるタンパク質をいう。切断は、選択した制限酵素の種類に応じて、平滑又は粘着末端をもたらす可能性がある。制限酵素の例としては、限定はされないが、EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、DpnII、BglII、NcoI、TaqI、NotI、HinfI、Sau3A、PvuII、SmaI、HaeIII、HgaI、AluI、EcoRV、KpnI、PstI、SacI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、XbaIが挙げられる。一実施態様では、制限酵素は、HindIIIである。
【００４４】
一実施態様では、該方法は、ステップ(d)中に、ジャンクションマーカーを、連結された断片に組み込むことをさらに含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ジャンクションマーカー」とは、核酸内に組み込むことが可能であり、かつ選択的精製のための基盤を提供することができる、あらゆる化合物又は化学物質部分をいう。例えば、ジャンクションマーカーには、限定はされないが、標識されたヌクレオチドリンカー(例えばビオチン)、標識された及び/又は修飾されたヌクレオチド、ニックトランスレーション、プライマーリンカー、又はタグ付けされたリンカーが含まれ得る。
【００４６】
ジャンクションマーカーは、連結された断片が単離ステップ(f)の前に精製されるのを可能にする。したがって、これは、連結されていない(すなわち非相互作用)断片ではなく、連結された配列のみが、単離用核酸分子によって結合されることを確実にする。
【００４７】
一実施態様では、ジャンクションマーカーは、標識されたヌクレオチドリンカー(すなわち、例えばビオチン)を含む。さらなる実施態様では、ジャンクションマーカーは、ビオチンを含む。一実施態様では、ジャンクションマーカーは、修飾されたヌクレオチドを含む。一実施態様では、ジャンクションマーカーは、プライマーリンカーを含む。
【００４８】
一実施態様では、ジャンクションマーカーを添加せずに、核酸断片は、ステップ(d)において互いに連結することが妨げられる、すなわち、ジャンクションマーカーは、リンカー配列を含有することとなる。
【００４９】
一実施態様では、該方法は、ステップ(e)の前にクロスリンキングを逆転することをさらに含む。クロスリンクを逆転するための、当技術分野で公知のいくつかの手段が存在し、かつ、これは、そのクロスリンクが元々形成された手段に依存することとなることが理解されよう。例えば、クロスリンクは、クロスリンクされた核酸組成物を高熱、例えば50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃超、又はそれ以上の高温にさらすことによって逆転することができる。さらに、クロスリンクされた核酸組成物は、1時間よりも長く、例えば、少なくとも5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、若しくは12時間、又はそれ以上の時間、高熱にさらすことを必要とする可能性がある。一実施態様では、ステップ(e)の前にクロスリンキングを逆転することは、クロスリンクされた核酸組成物を、プロテイナーゼKの存在下で65℃で少なくとも8時間(すなわち一晩)インキュベートすることを含む。
【００５０】
一実施態様では、該方法は、ステップ(e)の前に、核酸組成物を精製して、ジャンクションマーカーを含有しないあらゆる断片を除去することをさらに含む。
【００５１】
「精製すること」に対する本明細書での言及は、様々な他の成分を除去するための処理(すなわち、例えば断片化)が施されており、かつ、その組成物がその発現される生物活性を実質的に保持している、核酸組成物を指すことができる。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この呼称は、核酸が、その組成物の主な成分をなす、例えばその組成物の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%(すなわち、例えば、重量/重量及び/又は重量/体積)、又はそれ以上を構成する組成物を指すこととなる。
【００５２】
一実施態様では、該方法は、ステップ(g)の前に、ペアエンドアダプター配列を、単離された標的連結断片の末端に連結することをさらに含む。
【００５３】
本明細書で使用される用語「ペアエンドアダプター」とは、自動ハイスループットシークエンシングが同時に両端から読むのを可能にする、あらゆるプライマー対セットをいう。例えば、これらのアダプターと適合性のあるこうしたハイスループットシークエンシング装置としては、限定はされないが、Solexa(Illumina社)、454 System、及び/又はABI SOLIDが挙げられる。例えば、該方法は、ポリA鎖を連結したユニバーサルプライマーを使用することを含むことができる。
【００５４】
一実施態様では、該方法は、ステップ(g)の前に、単離された標的連結断片を増幅することをさらに含む。さらなる実施態様では、増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施される。
【００５５】
一実施態様では、核酸組成物は、哺乳類の細胞核に由来する。さらなる実施態様では、哺乳類の細胞核は、ヒト細胞核であり得る。本明細書に記載する方法における使用のために、多くのヒト細胞、例えばGM12878(ヒトリンパ芽球様細胞株)又はCD34+(ヒト・エクスビボ造血前駆細胞)が、当技術分野で利用可能である。
【００５６】
本明細書に記載する方法が、ヒトだけでなく様々な生物における有用性を見いだすということを理解されたい。例えば、本発明の方法はまた、植物及び動物におけるゲノム相互作用を明らかにするために使用することもできる。
【００５７】
したがって、代替実施態様では、核酸組成物は、非ヒト細胞核に由来する。一実施態様では、非ヒト細胞は、限定はされないが、植物、酵母、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、又はヒツジを含めた群から選択される。一実施態様では、非ヒト細胞核は、マウス細胞核又は植物細胞核である。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、ある特定の病的状態の徴候である1以上の相互作用核酸セグメントを明らかにする方法であって、以下を含む前記方法が提供される:
a)ある特定の病的状態を伴う個体から得られる核酸組成物に対して、本明細書で定義される方法を実施することと;
b)核酸セグメントと標的核酸セグメントとの相互作用の頻度を数量化することと;
c)前記病的状態を伴う個体由来の核酸組成物における相互作用の頻度と、健康な対象由来の正常対照の核酸組成物における相互作用の頻度とを比較する(その結果、核酸組成物における相互作用の頻度の差が、ある特定の病的状態の徴候である)こと。
【００５９】
本明細書で使用される「相互作用の頻度」又は「相互作用頻度」に対する言及は、核酸組成物(すなわち試料)内で特定の相互作用が起こる回数を指す。ある場合において、健康な対象由来の正常対照の核酸組成物と比較して、核酸組成物における相互作用の頻度が、より低いことは、(すなわち、核酸セグメントが、より低頻度で相互作用しているという理由で)ある特定の病的状態の徴候である。或いは、健康な対象由来の正常対照の核酸組成物と比較して、核酸組成物における相互作用の頻度が、より高いことは、(すなわち、核酸セグメントが、より高頻度で相互作用しているという理由で)ある特定の病的状態の徴候である。ある場合においては、差は、少なくとも0.5倍の差、例えば、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7倍、又は10倍の差で表されることとなる。
【００６０】
本発明の一態様では、相互作用の頻度を使用して、2つの異なる核酸セグメントの空間的近接を決定することができる。相互作用頻度が増大すると、2つのゲノム領域が、3D核空間内で互いに物理的に近接している可能性が高くなる。逆に、相互作用頻度が低下すると、2つのゲノム領域が、3D核空間内で互いに物理的に近接している可能性が低くなる。
【００６１】
数量化することは、患者からの核酸組成物、或いは核酸組成物試料の精製物若しくは抽出物、又はそれらの希釈物における相互作用の頻度を算出するのに適した任意の方法によって実施することができる。例えば、ハイスループットシークエンシングの結果はまた、ある特定の相互作用の頻度の検討を可能にする。本発明の方法では、数量化することは、試料(1又は複数)における標的核酸セグメント又はライゲーション産物の濃度を測定することによって実施することができる。核酸組成物は、生体試料(これには、脳脊髄液(CSF)、全血、血清、血漿、或いはこれらからの抽出物若しくは精製物、又はそれらの希釈物が含まれ得る)中の細胞から得ることができる。一実施態様では、生体試料は、脳脊髄液(CSF)、全血、血清、又は血漿であり得る。生体試料としては、生きている対象からの、又は死後に採取される、組織ホモジネート、組織切片、及び生検標本も挙げられる。これらの試料は、調製する、例えば、必要に応じて希釈又は濃縮し、通常の方式で保管することができる。
【００６２】
一実施態様では、病的状態は、以下から選択される:癌、自己免疫疾患、発達障害、遺伝性障害、糖尿病、循環器疾患、腎疾患、肺疾患、肝疾患、神経疾患、ウイルス感染、又は細菌感染。さらなる実施態様では、病的状態は、癌又は自己免疫疾患である。一層さらなる実施態様では、病的状態は、癌、例えば、乳癌、腸癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、又は子宮癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、又はメラノーマである。
【００６３】
「自己免疫疾患」に対する本明細書での言及には、自分自身の身体を標的にする免疫応答から生じる状態、例えば、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、強直性脊椎炎、ベーチェット病、セリアック病、クローン病、1型糖尿病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎が含まれる。
【００６４】
「発達障害」に対する本明細書での言及には、通常、小児期に起源をもつ状態、例えば、学習障害、コミュニケーション症、自閉症、注意欠陥多動障害(ADHD)、及び発達性協調運動症が含まれる。
【００６５】
「遺伝性障害」に対する本明細書での言及には、ゲノムの1以上の異常に起因する状態、例えば、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色覚異常、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、及びターナー症候群が含まれる。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義した方法を実施することが可能な緩衝液及び試薬を含む、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットが提供される。
【００６７】
言及することができる本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義した方法を実施することが可能な緩衝液及び試薬を含む、標的核酸セグメントと相互作用する核酸セグメントを特定するためのキットが提供される。
【００６８】
該キットは、該方法の実施のための1以上の物品及び/又は試薬を含むことができる。例えば、本明細書に記載した方法における使用のためのオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は増幅プライマー対は、分離された形態で提供することができ、また、例えば、その内容物が外部環境から保護されるバイアルなどの適切な容器に入った、キットの一部であり得る。該キットは、本明細書に記載した方法のプロトコルに従う使用のための説明書を含むことができる。核酸が、PCRにおける使用を意図されるキットは、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液などの、反応に必要とされる1以上の他の試薬を含むことができる。
【００６９】
該キットに含まれることとなる緩衝液及び試薬の種類の例は、本明細書に記載した実施例で見ることができることが理解されよう。
【００７０】
次の研究及びプロトコルは、本明細書に記載した方法の実施態様を例示する:
【００７１】
略語:
【表１】
0006514210.tif 000002
【実施例】
【００７２】
(実施例1:プロモーター捕捉Hi-Cプロトコル)
(第1日:細胞の固定、HindIII消化)
1.  3×107〜4×107細胞から開始する。室温のDMEM/10% FBSで37mlにする。
2.  ホルムアルデヒドを添加して2%の最終濃度にし、ロッカー(rocker)上で混合しながら、室温で厳密に10分間固定させる。
3.  6mlの冷1Mグリシン(最終0.125M)を添加することによって反応を停止させる。
4.  室温で5分間、続いて氷上で15分間インキュベートする。
5.  4℃で10分間、1500rpm(400×g)で遠心する。
6.  上清を捨て、ペレットを冷1×PBSに注意深く再懸濁し、冷1×PBSを添加して50mlの最終体積にする。
7.  4℃で10分間、1500rpm(400×g)で遠心し、次いで上清を捨てる。細胞を、液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保管することができる。
8.  細胞を50mlの氷冷溶解緩衝液(10mM Tris-HCl pH 8、10mM NaCl、0.2% Igepal CA-630)に再懸濁し、1錠のプロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche社のコンプリート、EDTAフリー、11873580001)を添加する。使用直前に新たに作る。
9.  いくつかの細胞タイプについては、以下が、任意ではあるが推奨される:細胞を、30分のインキュベート中にダウンス型ホモジナイズを行う(細胞を氷上に維持しながら、2×10ストローク、合間に5分の中断)(下のステップ10参照)。
10.  時折混合しながら、氷上で30分間インキュベートする。
11.  クロマチンを、4℃で5分間、1800rpmでスピンさせ、上清を捨てる。
12.  細胞ペレットの上に、約500μlの1.25×NEBuffer 2を注意深く重ねたが、再懸濁はさせなかった。このステップは、あらゆる残留する溶解緩衝液を除去するためである。上清を捨てる。
13.  このペレットを、5から6 Mio細胞あたり250μlの1.25×NEBuffer 2に再懸濁する。例えば、30 Mio細胞から開始する場合、ペレットを1.5mlの1.25×NEBuffer 2に再懸濁する。
14.  それぞれ5から6 Mio細胞(開始時)に相当する、250μlの一定分量に分ける。例えば、30 Mio細胞から開始する場合、それぞれ250μlを有する6つの一定分量に分ける。
15.  これらの一定分量のそれぞれに、108μlの1.25×NEBuffer 2を添加する(最終体積358μl)。
16.  チューブあたり11μlの10% SDSを添加し、注意深く混合し、950rpmで回転させながら、37℃で60分間インキュベートする。このステップによって、DNAと直接クロスリンクされなかったタンパク質が除去される。
17.  チューブあたり75μlの10% Triton X-100を添加することによってSDSを排除し、950rpmで回転させながら、37℃で60分間インキュベートする。
18.  チューブあたり1500単位のHindIII(NEB社、R0104T)を添加することによってクロマチンを消化し、回転させながら(950rpm)37℃で一晩インキュベートする。
【００７３】
(第2日:DNA末端のビオチン標識、ライゲーション)
注意:ライゲーション緩衝液ミックスを調製してからこの日を開始する(第2日、ステップ5参照)が、10×ライゲーション緩衝液を添加するのは、使用の直前だけである。
1.  チューブを氷上に置く。下に記載する通りに、Hi-C試料を用いるビオチン標識ステップを実施する。
2.  制限断片オーバーハングを埋め、かつビオチンでDNA末端をマークするために、6μl 10×NEB2、2μl H2O、1.5μl 10mM dCTP、1.5μl 10mM dGTP、1.5μl 10mM dTTP、37.5μl 0.4mM ビオチン-14-dATP(Life Technologies社、19524-016)、及び10μl 5U/μl Klenow(DNAポリメラーゼIラージ断片、NEB社、M0210L)を添加する。注意深く混合し、37℃で60分間インキュベートする。回転はさせないが、気泡を避けながら(約10分おきに)注意深くピペッティングを行って混合する。
3.  チューブを氷上に置く。酵素を失活させるために、すべてのチューブに86μl 10% SDS(最終濃度1.47%)を添加する。
4.  950rpmで厳密に30分間、65℃で酵素をインキュベートし、その後すぐに、チューブを氷上に置く。
5.  インキュベーション(第2日、ステップ4)中に、7.61mlライゲーションミックス(745μl 10% Triton X-100、820μl 10×ライゲーション緩衝液(NEB社、B0202S)、82μl 10mg/ml BSA(NEB社、B9001S)、及び5.965mlの水)をそれぞれ含む、試料あたり1本の15mlファルコンチューブを調製する。それぞれの消化されたクロマチン混合物(第2日、ステップ4)を、対応する15mlチューブに移す。
6.  時折混合しながら、37℃で60分間インキュベートする。
7.  各チューブに、50μl 1U/μl T4 DNAリガーゼ(Invitrogen社、15224-025)を添加する。チューブをひっくり返すことによって混合し、16℃で4時間インキュベートする。
8.  室温でさらに30分インキュベートする。
9.  クロスリンクは逆転し、チューブあたり60μl 10mg/mlプロテイナーゼK(Roche社、03115879001)を添加することによって、タンパク質を分解し、チューブを65℃で一晩インキュベートする。
【００７４】
(第3日:DNA精製パートI)
1.  一晩インキュベートした後、チューブあたり60μlの追加の10mg/mlプロテイナーゼKを添加し、さらに2時間、65℃でインキュベーションを続ける。
2.  反応混合物を室温に冷却する。12.5μlの10mg/ml RNase A(Roche社、10109142001)を添加し、37℃で60分間インキュベートする。
3.  フェノール抽出を実施することによって、これらのチューブ中でDNAを精製する。反応混合物を50mlファルコンチューブに移し、8mlフェノールpH8.0(Sigma社、P4557)を添加する。1分間ボルテックスにかけ、チューブを3500rpmで10分間スピンし、次いで、できるだけ多くの水相を、新しい50mlファルコンチューブに注意深く移す。
4.  「逆抽出」:2.5mlの1×TE(10mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA)を、第3日、ステップ3からの下相を含有するチューブに移す。1分間ボルテックスにかけ、チューブを3500rpmで10分間スピンし、次いで、できるだけ多くの水性の上相を、第3日、ステップ3からの対応するチューブ内の上清に注意深く移す。
5.  第3日、ステップ3に記載したステップに従って、10mlフェノールpH8.0:クロロホルム(Sigma社、P3803)を使用して抽出を繰り返す。
6.  DNAを沈殿させるために、各チューブに1000μl 3M酢酸ナトリウムpH5.2、及び25mlの氷冷100%エタノールを添加する。-20℃で一晩インキュベートする。
【００７５】
(第4日:DNA精製パートII)
1.  4℃で3500rpmで30分間スピンする。
2.  上清を捨て、各ペレットを400μl 1×TEに再懸濁する。必要であればこのステップで、DNAを-20℃で保管する。
3.  2回のフェノール:クロロホルム抽出を行うことによって、別のラウンドの精製を実施する。450μlフェノール pH 8.0:クロロホルム(1:1)を添加し、1分間ボルテックスにかける。チューブを14,000rpmで10分間遠心し、水相を新しいチューブに移す。第二の抽出後、0.1×体積の3M酢酸ナトリウムpH 5.2及び2.5×体積の100%エタノールを添加することによってDNAを沈殿させ、-20℃で一晩インキュベートする。
【００７６】
(第5日:DNA精製パートIII)
1.  沈殿したDNAを遠心沈殿(14,000rpm、4℃で30分間)させた後、各DNAペレットを、70%エタノールで3回洗浄し、各DNAペレットを25μl 1×TEに再懸濁した。
2.  すべてのHi-C チューブの内容物をプールする。
3.  Quant-iT PicoGreen(Life Technologies社、P7589)分析を使用して、DNA収量を決定する。Hi-Cライブラリのそれぞれに対して、1:200、1:500、及び1:1000希釈を施す。
【００７７】
(第6+7日:Hi-Cライゲーション効率及び品質管理)
1.  ライブラリの質及び量を確認するために、Hi-Cライブラリからの1:10希釈物の2μl及び6μlの一定分量を、0.8%アガロースゲル上で流す。ライブラリは、10kb超のかなりタイトなバンドとして流れるはずである。
2.  Hi-Cマーキング及びHi-Cライゲーション効率を、PCR消化分析によって確認する。HindIII部位
【化１】
0006514210.tif 000003
の成功裏の充填及びライゲーションによって、制限酵素NheIのための部位
【化２】
0006514210.tif 000004
が作製される。
5つの(同一の)25μl PCR反応を準備して、近距離ライゲーション産物(2つの近くの制限断片から形成される)、例えばFraser lab Calr対照を増幅する。鋳型として、200ngの各Hi-Cライブラリを使用する。次いで、PCR産物をプールし、精製し(Qiagen社、PCR精製キット)、濃度を決定する(Nanodrop)。続いて、4種の試料(非消化、HindIIIで消化、NheIで消化、HindIIIとNheIの両方で消化)に分ける。1消化あたり500から600ngのPCR産物を狙う。消化させた試料を1.5%ゲル上に流した後、3C及びHi-Cライゲーション事象の相対数を、切断及び非切断バンドの強度を数量化することによって推定することができる。
3.  Hi-Cライブラリにおけるマウス赤血球細胞におけるHbbとErafなどの、公知の遠距離相互作用について確認する。
【００７８】
(第8日:連結されていないDNA末端からのビオチンの除去)
1.  連結されていないDNA末端のビオチン-14-dATPを、T4 DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いて除去する。各反応物(合わせて40μgに相当する、Hi-Cライブラリあたり合計で少なくとも8種の反応を準備する)について、5μgのHi-Cライブラリを、0.5μl 10mg/ml BSA、5μl 10×NEBuffer 2、2μl 2.5mM dATP、及び5μl T4 DNAポリメラーゼ(NEB社、M0203L)(総体積50μl)と混合する。20℃で4時間インキュベートする。
2.  各チューブに2ml 0.5 M EDTA pH 8.0を添加することによって反応を停止させる。
3.  それぞれ第8日、ステップ1の2種の反応物(DNAの総量は現段階では試料あたり約10μgである)をプールする。
DNAを精製するために、第4日、ステップ3に記載した通りに、フェノール:クロロホルム抽出、それに続いてエタノール沈殿を行う。-20℃で、数時間ないし一晩、インキュベートする。
4.  試料を、4℃で14,000rpmで30分間スピンする。上清を捨て、70%エタノールで1回洗浄する。上清を捨て、DNAペレットを風乾させ、試料あたり130μl H2Oに再懸濁する(この段階では、各試料は、およそ10mgのDNAを含有するはずである)。
【００７９】
(第9日:DNAせん断及び末端修復)
1.  超音波処理のために、Covaris E220を使用する。DNAせん断の準備を整え、ピークがおよそ400bpである断片を得る:
衝撃係数 10%
ピーク放射電力(w):140
サイクル/バースト:200
時間:55秒
2.  超音波処理後、各試料(130μl)の全体積を新たなエッペンドルフチューブに移す。次のものを添加する:
18μl 10×ライゲーション緩衝液(NEB社、B0202S)
18μl 2.5mM dNTPミックス
6.5μl T4 DNAポリメラーゼ(NEB社、M0203L)
6.5μl T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼ(NEB社、M0201L)
1.3μl Klenow(NEB社、M0210L)
室温で30分間インキュベートする。
3.  各試料を、2つに分ける(それぞれ、およそ5μgのDNAを含有し、これは、下で使用するカラムの最大容量である)。
製造業者の指示書に従ってMinEluteカラム(Qiagen社、28004)を用いてDNAを精製する。各カラムを15μl TLE(10mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA)で溶出し、別の15μl TLEで溶出を繰り返す。
【００８０】
(第10日:dATPの添加、SPRIビーズサイズ選択)
1.  第9日、ステップ3からのせん断されかつ末端修復されたDNA(30μl)に、次のものを添加する:
5μlのNEBuffer 2 10×
11.5μl dATP 1mM
3.5μl Klenow exo-(NEB社、M0212L)
37℃で30分間インキュベートする。
2.  酵素を失活させるために、65℃で20分間インキュベートし、その後すぐに氷上に置く。
3.  両側(double-sided)SPRIビーズサイズ選択(0.6×、それに続いて0.9×)によって、200から650塩基対の断片をサイズ選択する。ボルテックスにかけることによって、SPRIビーズ(Beckman Coulter Ampure XP beads A63881)をよく混合し、少なくとも30分間、室温に保つ。
a)第10日、ステップ1からの2つのA鎖付加試料(総体積は現段階では100μl)を、新たなチューブ(A)にプールする。
b)各試料について、180μl SPRIビーズ溶液を含む1つのチューブ(B)を調製する。
c)チューブ(B)からの60μlのSPRIビーズ溶液を、100μlのDNA溶液(0.6×)を含むチューブ(A)に添加する。十分に混合し、室温で10分間インキュベートし、磁気分離器上に置き、所望のサイズ範囲のDNAを含有する非結合上清を、新たなチューブ(チューブC)に回収する。ビーズを含有するチューブ(A)を捨てる。
d)SPRIビーズを濃縮する:チューブ(B)(溶液中に120μlのSPRIビーズを含有する)を磁石上に置き、30μlの上清以外はすべて除去する(すなわち、およそ90μlの上清を捨てる)。チューブ(B)を磁石から外し、ビーズを残りの30μl体積に再懸濁する。
e)チューブ(B)からの30μlの濃縮されたビーズ(上記参照)を、チューブ(C)に添加する(0.9×SPRIビーズ、すなわち、溶液中のDNAとSPRIビーズとの比は現段階では1:0.9である)。よく混合し、室温で少なくとも10分インキュベートし、磁石上に置き、上清を捨てる。新たに調製した70%エタノールで2回洗浄する。チューブ(B)を捨てる。
4.  チューブ(C)内のビーズ結合DNAを50μl TLE(Tris low-EDTA;10mM Tris、0.1mM EDTA)に再懸濁し、室温で5分間インキュベートし、磁石上に置き、上清(自分のサイズ選択されたDNAを含有する)を新たなチューブ(D)に移す。ビーズを含有するチューブ(C)を捨てる。
5.  すべてのHi-Cライブラリ試料をプールする。
【００８１】
(第11日:ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン及びアダプターライゲーション)
1.  Quant-iT PicoGreen(Life Technologies社、P7589)分析を使用して、DNA収量を決定する。自分の試料(1又は複数)に対して、1:20及び1:50希釈物を調製する。40μgの出発材料からの期待される収量は、約10μgである。
ビーズを過装填するのを避けるために(第11日、ステップ4参照)、150μlのストレプトアビジンビーズにつき、2.5μgという最大値よりも多いDNAを使用しないことが推奨される。
2.  PEアダプタープライマー1と2:
【化３】
0006514210.tif 000005
をアニーリングすることによって、PEアダプターを作製する。15μlの各PEアダプタープライマーを70μl H2Oと混合する(総体積100μl)。PCR装置においては、次のプログラムを実行する:95℃で5分間、次いで1分につき1℃の温度低下(4℃に達するまで)。
10から20μlのPEアダプターの一定分量(15μM)を作製し、-20℃で保管し、使用の直前に一定分量を解凍する。
3.  緩衝液を調製する:
a)TB(Tween緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl、0.05% Tween
試料あたり1600μlを調製する
b)NTB(Tweenを含まない緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl
試料あたり600μlを調製する
c)NTB 2×:10mM Tris、1mM EDTA、2M NaCl
試料あたり300μlを調製する
d)ライゲーション緩衝液(10×ライゲーション緩衝液、NEB社、B0202S):1×
試料あたり150μlを調製する
e)NEBuffer 2:1×
試料あたり300μlを調製する
4.  150μlのDynabeads MyOne ストレプトアビジンC1ビーズ(Life Technologies社、650.01)懸濁液を、低吸着(lowbind)1.5mlエッペンドルフチューブに移す。
第11日、ステップ1で決定した通り、2μgから2.5μgのDNAあたり1つの反応を準備する。
5.  ビーズを400μl TBで2回洗浄する。洗浄ステップは、常に、以下である:
a)試料を磁気分離器上に置き、ビーズを回収する
b)上清を捨てる
c)新しい緩衝液を添加し、十分に混合し、試料を新しいチューブに移す
d)試料を室温で3分間回転させる
e) a)を参照のこと
6.  ビーズを300μlのNTB 2×に再懸濁する。Hi-C DNA(第11日、ステップ1参照)の体積を、TLEで300μlにする。
Hi-CライブラリDNAの量が、2.5μg(第11日、ステップ1及び4参照)を超える場合、それぞれが総体積300μlのTLE中に最大2.5μgのDNAを含有する、適切な数のHi-C 試料を調製する。
これらのビーズを、Hi-C DNA(総体積600μl)と合わせる。室温で30分間、ゆっくりと回転させる。
7.  試料を磁気分離器上に置き、結合されたHi-C DNAを用いてビーズを回収し、上清を捨て、400μl NTBで1回洗浄し、続いて200μlの1×ライゲーション緩衝液でもう1回洗浄する。
8.  50μl 1×ライゲーション緩衝液に再懸濁し、新たなチューブに移す。4μlのアニーリングされた15μM PEアダプター(第11日、ステップ2参照)、及び4μlのT4 DNAリガーゼ(NEB社、M0202S)を添加する。室温で2時間、ゆっくりと回転させる。
9. 試料を磁気分離器上に置き、Hi-C結合ビーズを回収し、それぞれ400μl TBで2回洗浄する。
10.  200μl 1×NTBで洗浄し、次いで、200μl 1×NEBuffer 2で洗浄する。
11.  60μl 1×NEBuffer 2で洗浄し、次いで、ビーズを40μl 1×NEBuffer 2に再懸濁し、新たなチューブに移す。1つのHi-Cライブラリあたり2以上のストレプトアビジン-ビオチンプルダウンを実施した場合は(すなわち、Hi-Cライブラリの開始量が2.5μg DNAを超える(第11日、ステップ1及び4を参照)場合は)、すべての反応物をプールする。4℃で保管する。
【００８２】
(第12日:Hi-Cライブラリ増幅のための条件を決定するための試験PCR)
1.  Hi-Cライブラリに対するPCRサイクルの最適数を決定するために、6、9、12、及び15増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む4つの反応を準備する:
【表２】
0006514210.tif 000006
PE PCRプライマー1.0:
【化４】
0006514210.tif 000007
PE PCRプライマー2.0:
【化５】
0006514210.tif 000008
2.  nサイクルに対する、次の条件を用いる4つの異なるPCRを実行する:
【表３】
0006514210.tif 000009
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9(場合によっては6)サイクルの増幅でほぼ視認可能であり、PCRサイクルの数の増大に伴って強度が増すはずである。
【００８３】
(第13日:Hi-Cライブラリの最終PCR増幅)
1.  あるPCR条件(すなわちサイクル数)を用いる、第12日、ステップ1に記載した通りに、それぞれ25μlを含むｘ個のPCR反応物(HiCライブラリの残りの体積を因数2.5で割ったもの)を準備する。PCRサイクルの数は、Hi-Cライブラリの利用可能量、及び試験PCR(第12日)に依存することとなるが、一般的には、6から7サイクルが、捕捉Hi-C(下記参照)に必要とされる約500ngのHi-Cライブラリを得るのに十分であるはずである。
2.  第13日、ステップ1からの、それぞれのPCR反応物をすべてプールする。磁気分離器上に置き、上清を新たな1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。このストレプトアビジンビーズを当初の量の1×NEBuffer 2(第11日、ステップ11を参照)に再懸濁し、予備としてとっておく。増幅されたHi-Cライブラリを含有する上清の体積を決定し、製造業者の指示書に従って1.8×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter社、Ampure XPビーズA63881)を添加することによって精製する。100μlのTLEに再懸濁する。
3.  180μlのSPRIビーズを、第13日、ステップ2からの100μlのHi-Cライブラリに添加することによって、SPRIビーズ精製を(第13日、ステップ2に記載した通りに)繰り返す。最終体積20μlのTLEに再懸濁する。
4.  Bioanalyzer(Agilent社)によって、Hi-Cライブラリの質及び量を確認する。50ngから100ngのHi-Cライブラリを、次世代シークエンシングのためにとっておく。
【００８４】
(第14日:Hi-Cライブラリとビオチン-RNAとのハイブリダイゼーション)
1.  Hi-Cライブラリ(ポンド)を調製する:500ngのHi-Cライブラリと同等の体積を1.5mlエッペンドルフチューブに移し、SpeedVacを使用して濃縮する。50ngから100ngのHi-Cライブラリを、次世代シークエンシングのためにとっておく。すべての液体の蒸発後、Hi-C DNAペレットを3.4μlのH2Oに再懸濁する。次の成分を添加する:
2.5μlカスタムブロッカー(custom blocker)1(Agilent Technologies社)
2.5μlカスタムブロッカー2(Agilent Technologies社)
0.6μlカスタムブロッカー3(Agilent Technologies社)
十分に再懸濁し、PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、氷上に保持する。
2.  次の成分を混合することによって、ハイブリダイゼーション緩衝液(49μl/捕捉 Hi-C試料)を調製する:
25μl SureSelectハイブリダイゼーション溶液1(Agilent Technologies社)
1μl SureSelectハイブリダイゼーション溶液2(Agilent Technologies社)
10μl SureSelectハイブリダイゼーション溶液3(Agilent Technologies社)
13μl SureSelectハイブリダイゼーション溶液4(Agilent Technologies社)
十分に混合し、65℃で5分間加熱し、PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、室温に保つ。
3.  ビオチン-RNA(ベイト)を調製する:5μlビオチン標識RNA(100ng/μl、特注、Agilent Technologies社)を1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。
ヌクレアーゼフリー水を使用して、SureSelect RNase Block(Agilent Technologies社)の1:4希釈物を調製し、2μlのRNase Block希釈物をビオチン標識RNAに添加する。よく混合し、PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、氷上に保持する。
4.  ハイブリダイゼーション反応:PCR装置(PTC-200、MJ Research社)を次のプログラムに設定する:
1. 95℃、5分間
2. 65℃、ずっと
PCR装置の蓋は、加熱されなければならない。手順全体を通して、素早く作業を行い、PCR装置の蓋を開ける時間が最小限になるようにする。試料の蒸発は、最適以下のハイブリダイゼーション条件をもたらすことになる。
【００８５】
ポンドHi-Cライブラリ(DNA;第14日、ステップ1)を含むPCRストリップを、下の黒色でマークした場所でPCR装置に移し、PCRプログラムを開始する。
【化６】
0006514210.tif 000010
【００８６】
わずか5分あまり後(いったん温度が65℃に到達したら)、ハイブリダイゼーション緩衝液(第14日、ステップ2から)を含むPCRストリップを、下の灰色でマークした場所でPCR装置に移す。5分間インキュベートする。
【化７】
0006514210.tif 000011
【００８７】
5分(PCRプログラムの開始の10分)後、ビオチン標識RNAベイト(第14日、ステップ3参照)を含むPCRストリップを、下の平行線模様でマークした場所でPCR装置に移す。2分間インキュベートする。
【化８】
0006514210.tif 000012
【００８８】
2分後、ハイブリダイゼーション緩衝液を含有するPCRストリップ及びビオチン標識RNAベイトを含有するPCRストリップから蓋を外す。13μlのハイブリダイゼーション緩衝液を、7μlのRNAベイトに(灰色を平行線模様に)ピペットで入れる。ハイブリダイゼーション緩衝液を含有するPCRストリップを捨てる。直ちに次のステップに進む。
【化９】
0006514210.tif 000013
【００８９】
ポンドHi-Cライブラリ(DNA)を含有するPCRストリップから蓋を外す。9μlのHi-Cライブラリを、ハイブリダイゼーション緩衝液をともなう20μlのRNAベイトに(黒色を平行線模様に)ピペットで入れる(蒸発が原因で、若干少なくてもよい)。Hi-Cライブラリを含有していた空のPCRストリップを捨てる。
【化１０】
0006514210.tif 000014
【００９０】
残りのPCRストリップ(現段階ではHi-Cライブラリ/ハイブリダイゼーション緩衝液/RNAベイトを含有する)を、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で直ちに閉じ、65℃で24時間インキュベートする。
【化１１】
0006514210.tif 000015
【００９１】
(第15日:ストレプトアビジン-ビオチンプルダウン及び洗浄)
1.  緩衝液を調製する:
結合緩衝液(BB、Agilent Technologies社)、室温
洗浄緩衝液I(WB I、Agilent Technologies社)、室温
洗浄緩衝液II(WB II Agilent Technologies社)、65℃
NEB2 1×(NEB社、B7002S)、室温
2.  磁気ビーズを洗浄する:Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1(Life Technologies社、65601)を十分に混合し、その後、捕捉Hi-C 試料あたり60μlを、1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに添加する。ビーズを次の通りに洗浄する(すべての後続の洗浄ステップについて同じ手順):
a)200μl BBを添加する
b)ボルテックスで(低(low)から中(medium)設定で)5秒間混合する
c)チューブをDynal磁気分離器(Life Technologies社)上に置く
d)ビーズを回収し、上清を捨てる
合計3回の洗浄について、ステップa)からd)を繰り返す。
3.  ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン:ストレプトアビジンビーズを、新たな低吸着エッペンドルフチューブ内の200μl BBに入れ、(PCR装置を実行させながら)PCR装置の蓋を開け、全ハイブリダイゼーション反応物を、ストレプトアビジンビーズを含有するチューブにピペットで入れる。
室温で30分間、回転ホイール上でインキュベートする。
4.  洗浄:30分後、試料を磁気分離器上に置き、上清を捨て、ビーズを500μl WB Iに再懸濁し、新たなチューブに移す。室温で15分間インキュベートする。2から3分おきに各5秒間ボルテックスにかける。
ビーズと緩衝液を磁気分離器上で分離し、上清を除去する。500μl WB II(65℃に予め温められている)に再懸濁し、新たなチューブに移す。
65℃で10分間インキュベートし、2から3分おきに5秒間(低から中設定で)ボルテックスにかける。WB IIにおいて、すべて65℃で、合計3回の洗浄について繰り返す。
5.  上清を除去した後、200μl 1×NEB2に再懸濁し、直ちに新しいチューブに移す。磁気分離器上にまっすぐに置き、上清を除去する。
6.  30μl 1×NEB2に再懸濁し、新たなチューブに移す。ビーズ上のRNA/DNA混合物ハイブリッド「キャッチ(catch)」は、この時点で、PCR増幅の準備ができている。
【００９２】
(第16日:捕捉Hi-Cライブラリ増幅のためのPCR条件を決定する)
1.  Hi-Cライブラリに対するPCRサイクルの最適数を決定するために、6、7、及び9増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む3つの反応を準備する:
【表４】
0006514210.tif 000016
PE PCRプライマー1.0:
【化１２】
0006514210.tif 000017
PE PCRプライマー2.0:
【化１３】
0006514210.tif 000018
2.  nサイクルに対する、次の条件を用いる3つの異なるPCRを実行する:
【表５】
0006514210.tif 000019
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、6から7サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずである。
【００９３】
(第17日:捕捉Hi-Cライブラリの最終PCR増幅)
1.  第16日、ステップ1に記載した通りに、あるPCR条件(すなわちPCRサイクルの選択された数)を用いる、それぞれ25μlを含むｘ個のPCR反応物(捕捉HiCライブラリの残りの体積を因数2.5で割ったもの)を準備する。一般的には、4 PCRサイクルが、Illuminaシークエンシングに適した捕捉Hi-Cライブラリ量を得るのに十分であるはずである。
2.  第17日、ステップ1からの、それぞれのPCR反応物をすべてプールする。磁気分離器上に置き、上清を新たな1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。このストレプトアビジンビーズを当初の量の1×NEBuffer 2(第15日、ステップ6を参照)に再懸濁し、予備としてとっておく。捕捉Hi-Cライブラリの体積を決定し、製造業者の指示書に従って1.8×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter社、Ampure XPビーズA63881)を添加することによって精製する。100μlのTLEに再懸濁する。
3.  180μlのSPRIビーズを、第17日、ステップ2からの100μlのHi-Cライブラリに添加することによって、SPRIビーズ精製を(第17日、ステップ2に記載した通りに)繰り返す。最終体積20μlのTLEに再懸濁する。
4.  シークエンシングの前に、Bioanalyzer(Agilent社)及び定量PCRによって、捕捉Hi-Cライブラリの質及び量を確認する。
【００９４】
(実施例2:ベイト遺伝子座と相互作用領域の配列捕捉(SCRiBL)Hi-Cプロトコル)
この研究は、SCRiBL Hi-Cの、次の3つの変形を記載する(これらのうちの2つ(下のb及びc)は、試料のバーコーディング及びマルチプレキシング(multiplexing)を可能にする):
a)従来のSCRiBL Hi-C(非バーコーディング)
b)捕捉前バーコーディングSCRiBL Hi-C
c)捕捉後バーコーディングSCRiBL Hi-C
実施例1におけるプロトコルの第1日から第10日に従い、次いで、次のステップを続ける:
【００９５】
(a)従来のSCRiBL Hi-C)
実施例1におけるプロトコルの第11日から第13日に従い、次いで、下のステップ14を続ける。
【００９６】
(b)捕捉前バーコーディング SCRiBL Hi-C)
(第11日:ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン及びアダプターライゲーション)
1.  Quant-iT PicoGreen(Life Technologies社、P7589)分析を使用して、DNA収量を決定する。試料(1又は複数)に対して、1:20及び1:50希釈物を調製する。40μgの出発材料からの期待される収量は、約10μgである。
ビーズを過装填するのを避けるために(第11日、ステップ4参照)、150μlのストレプトアビジンビーズにつき、2.5μgという最大値よりも多いDNAを使用しないことが推奨される。
2.  TruSeqユニバーサルアダプタープライマーとTruSeqインデックス付きアダプタープライマー:
【化１４】
0006514210.tif 000020
(「NNNNNN」がバーコードであることに留意するべきである)
【化１５】
0006514210.tif 000021
をアニーリングすることによって、TruSeqアダプターを作製する。15μlの各TruSeqアダプタープライマーを70μl H2Oと混合する(総体積100μl)。PCR装置においては、次のプログラムを実行する:95℃で5分間、次いで1分につき1℃の温度低下(4℃に達するまで)。
10から20μlのTruSeqアダプターの一定分量(15μM)を作製し、-20℃で保管し、使用の直前に一定分量を解凍する。
3.  緩衝液を調製する:
a)TB(Tween緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl、0.05% Tween
試料あたり1600μlを調製する
b)NTB(Tweenを含まない緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl
試料あたり600μlを調製する
c)NTB 2×:10mM Tris、1mM EDTA、2M NaCl
試料あたり300μlを調製する
d)ライゲーション緩衝液(10×ライゲーション緩衝液、NEB社、B0202S):1×
試料あたり150μlを調製する
e)NEBuffer 2:1×
試料あたり300μlを調製する
4.  150μlのDynabeads MyOne ストレプトアビジンC1ビーズ(Life Technologies社、650.01)懸濁液を、低吸着1.5mlエッペンドルフチューブに移す。
第11日、ステップ1で決定した通り、2μgから2.5μgのDNAあたり1つの反応を準備する。
5.  ビーズを400μl TBで2回洗浄する。洗浄ステップは、常に、以下である:
a)試料を磁気分離器上に置き、ビーズを回収する
b)上清を捨てる
c)新しい緩衝液を添加し、十分に混合し、試料を新しいチューブに移す
d)試料を室温で3分間回転させる
e) a)を参照のこと
6.  ビーズを300μlのNTB 2×に再懸濁する。Hi-C DNA(第11日、ステップ1参照)の体積を、TLEで300μlにする。
Hi-CライブラリDNAの量が、2.5μg(第11日、ステップ1及び4参照)を超える場合、それぞれが総体積300μlのTLE中に最大2.5μgのDNAを含有する、適切な数のHi-C試料を調製する。
これらのビーズを、Hi-C DNA(総体積600μl)と合わせる。室温で30分間、ゆっくりと回転させる。
7.  試料を磁気分離器上に置き、結合されたHi-C DNAを用いてビーズを回収し、上清を捨て、400μl NTBで1回洗浄し、続いて200μlの1×ライゲーション緩衝液でもう1回洗浄する。
8.  50μl 1×ライゲーション緩衝液に再懸濁し、新たなチューブに移す。4μlのアニーリングされた15μM TruSeqアダプター(第11日、ステップ2参照)、及び4μlのT4 DNAリガーゼ(NEB社、M0202S)を添加する。室温で2時間、ゆっくりと回転させる。
9.  試料を磁気分離器上に置き、Hi-C結合ビーズを回収し、それぞれ400μl TBで2回洗浄する。
10.  200μl 1×NTBで洗浄し、次いで、200μl 1×NEBuffer 2で洗浄する。
11.  60μl 1×NEBuffer 2で洗浄し、次いで、ビーズを40μl 1×NEBuffer 2に再懸濁し、新たなチューブに移す。1つのHi-Cライブラリあたり2以上のストレプトアビジン-ビオチンプルダウンを実施した場合は(すなわち、Hi-Cライブラリの開始量が2.5μg DNAを超える(第11日、ステップ1及び4を参照)場合は)、すべての反応物をプールする。4℃で保管する。
【００９７】
(第12日:Hi-Cライブラリ増幅のための条件を決定するための試験PCR)
1.  Hi-Cライブラリに対するPCRサイクルの最適数を決定するために、6、9、12、及び15増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む4つの反応を準備する:
【表６】
0006514210.tif 000022
TruSeq PCRプライマー1.0:
【化１６】
0006514210.tif 000023
TruSeq PCRプライマー2.0:
【化１７】
0006514210.tif 000024
2.  nサイクルに対する、次の条件をを用いる4つの異なるPCRを実行する:
【表７】
0006514210.tif 000025
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9(場合によっては6)サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずであり、PCRサイクルの数の増大に伴って強度が増すはずである。
【００９８】
(第13日:Hi-Cライブラリの最終PCR増幅)
1.  あるPCR条件(すなわちサイクル数)を用いる、第12日、ステップ1に記載した通りに、それぞれ25μlを含むｘ個のPCR反応物(HiCライブラリの残りの体積を因数2.5で割ったもの)を準備する。PCRサイクルの数は、Hi-Cライブラリの利用可能量、及び試験PCR(第12日)に依存することとなるが、一般的には、6から7サイクルが、捕捉Hi-C(下記参照)に必要とされる約500ngのHi-Cライブラリを得るのに十分であるはずである。
2. 第13日、ステップ1からの、それぞれのPCR反応物をすべてプールする。磁気分離器上に置き、上清を新たな1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。このストレプトアビジンビーズを当初の量の1×NEBuffer 2(第11日、ステップ11を参照)に再懸濁し、予備としてとっておく。増幅されたHi-Cライブラリを含有する上清の体積を決定し、製造業者の指示書に従って1.8×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter社、Ampure XPビーズA63881)を添加することによって精製する。100μlのTLEに再懸濁する。
3.  180μlのSPRIビーズを、第13日、ステップ2からの100μlのHi-Cライブラリに添加することによって、SPRIビーズ精製を(第13日、ステップ2に記載した通りに)繰り返す。最終体積20μlのTLEに再懸濁する。
4. Bioanalyzer(Agilent社)によって、Hi-Cライブラリの質及び量を確認する。50ngから100ngのHi-Cライブラリを、次世代シークエンシングのためにとっておく。
第14日に進む。
【００９９】
(c)捕捉後バーコーディングSCRiBL Hi-C)
(第11日:ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン及びアダプターライゲーション)
1. Quant-iT PicoGreen(Life Technologies社、P7589)分析を使用して、DNA収量を決定する。試料(1又は複数)に対して、1:20及び1:50希釈物を調製する。40μgの出発材料からの期待される収量は、約10μgである。
ビーズを過装填するのを避けるために(第11日、ステップ4参照)、150μlのストレプトアビジンビーズにつき、2.5μgという最大値よりも多いDNAを使用しないことが推奨される。
2.  SCRiBLアダプタープライマー1と2:
【化１８】
0006514210.tif 000026
をアニーリングすることによって、SCRiBLアダプターを作製する。
15μlの各SCRiBLアダプタープライマーを70μl H2Oと混合する(総体積100μl)。PCR装置においては、次のプログラムを実行する:95℃で5分間、次いで1分につき1℃の温度低下(4℃に達するまで)。
10から20μlのSCRiBLアダプターの一定分量(15μM)を作製し、-20℃で保管し、使用の直前に一定分量を解凍する。
3.  緩衝液を調製する:
a)TB(Tween緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl、0.05% Tween
試料あたり1600μlを調製する
b)NTB(Tweenを含まない緩衝液):5mM Tris、0.5mM EDTA、1M NaCl
試料あたり600μlを調製する
c)NTB 2×:10mM Tris、1mM EDTA、2M NaCl
試料あたり300μlを調製する
d)ライゲーション緩衝液(10×ライゲーション緩衝液、NEB社、B0202S):1×
試料あたり150μlを調製する
e)NEBuffer 2:1×
試料あたり300μlを調製する
4.  150μlのDynabeads MyOneストレプトアビジンC1ビーズ(Life Technologies社、650.01)懸濁液を、低吸着1.5mlエッペンドルフチューブに移す。
第11日、ステップ1で決定した通り、2μgから2.5μgのDNAあたり1つの反応を準備する。
5.  ビーズを400μl TBで2回洗浄する。洗浄ステップは、常に、以下である:
a)試料を磁気分離器上に置き、ビーズを回収する
b)上清を捨てる
c)新しい緩衝液を添加し、十分に混合し、試料を新しいチューブに移す
d)試料を室温で3分間回転させる
e) a)を参照のこと
6.  ビーズを300μlのNTB 2×に再懸濁する。Hi-C DNA(第11日、ステップ1参照)の体積を、TLEで300μlにする。
Hi-CライブラリDNAの量が、2.5μg(第11日、ステップ1及び4参照)を超える場合、それぞれが総体積300μlのTLE中に最大2.5μgのDNAを含有する、適切な数のHi-C 試料を調製する。
これらのビーズを、Hi-C DNA(総体積600μl)と合わせる。室温で30分間、ゆっくりと回転させる。
7.  試料を磁気分離器上に置き、結合されたHi-C DNAを用いてビーズを回収し、上清を捨て、400μl NTBで1回洗浄し、続いて200μlの1×ライゲーション緩衝液でもう1回洗浄する。
8.  50μl 1×ライゲーション緩衝液に再懸濁し、新たなチューブに移す。4μlのアニーリングされた15μM SCRiBLアダプター(第11日、ステップ2参照)、及び4μlのT4 DNAリガーゼ(NEB社、M0202S)を添加する。室温で2時間、ゆっくりと回転させる。
9.  試料を磁気分離器上に置き、Hi-C結合ビーズを回収し、それぞれ400μl TBで2回洗浄する。
10.  200μl 1×NTBで洗浄し、次いで、200μl 1×NEBuffer 2で洗浄する。
11.  60μl 1×NEBuffer 2で洗浄し、次いで、ビーズを40μl 1×NEBuffer 2に再懸濁し、新たなチューブに移す。1つのHi-Cライブラリあたり2以上のストレプトアビジン-ビオチンプルダウンを実施した場合は(すなわち、Hi-Cライブラリの開始量が2.5μg DNAを超える(第11日、ステップ1及び4を参照)場合は)、すべての反応物をプールする。4℃で保管する。
【０１００】
(第12日:Hi-Cライブラリ増幅のための条件を決定するための試験PCR)
1.  Hi-Cライブラリに対するPCRサイクルの最適数を決定するために、6、9、12、及び15増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む4つの反応を準備する:
【表８】
0006514210.tif 000027
SCRiBL捕捉前PCRプライマー1.0:
【化１９】
0006514210.tif 000028
SCRiBL捕捉前PCRプライマー2.0:
【化２０】
0006514210.tif 000029
2.  nサイクルに対する、次の条件を用いる4つの異なるPCRを実行する:
【表９】
0006514210.tif 000030
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9(場合によっては6)サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずであり、PCRサイクルの数の増大に伴って強度が増すはずである。
【０１０１】
(第13日:Hi-Cライブラリの最終PCR増幅)
1.  あるPCR条件(すなわちサイクル数)を用いて、第12日、ステップ1に記載した通りに、それぞれ25μlを含むｘ個のPCR反応物(HiCライブラリの残りの体積を因数2.5で割ったもの)を準備する。PCRサイクルの数は、Hi-Cライブラリの利用可能量、及び試験PCR(第12日)に依存することとなるが、一般的には、6から7サイクルが、捕捉Hi-C(下記参照)に必要とされる約500ngのHi-Cライブラリを得るのに十分であるはずである。
2.  第13日、ステップ1からの、それぞれのPCR反応物をすべてプールする。磁気分離器上に置き、上清を新たな1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。このストレプトアビジンビーズを当初の量の1×NEBuffer 2(第11日、ステップ11を参照)に再懸濁し、予備としてとっておく。増幅されたHi-Cライブラリを含有する上清の体積を決定し、製造業者の指示書に従って1.8×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter社、Ampure XPビーズA63881)を添加することによって精製する。100μlのTLEに再懸濁する。
3.  180μlのSPRIビーズを、第13日、ステップ2からの100μlのHi-Cライブラリに添加することによって、SPRIビーズ精製を(第13日、ステップ2に記載した通りに)繰り返す。最終体積20μlのTLEに再懸濁する。
4.  Bioanalyzer(Agilent社)によって、Hi-Cライブラリの質及び量を確認する。50ngから100ngのHi-Cライブラリを、次世代シークエンシングのためにとっておく。
第14日に進む。
【０１０２】
(標的濃縮のためのビオチン標識RNAの作製)
(従来のSCRiBL Hi-C、捕捉前バーコーディングSCRiBL Hi-C、及び捕捉後バーコーディングSCRiBL Hi-Cのために)
【０１０３】
(第14日:細菌人工染色体(BAC)の消化)
1.  関心対象のゲノム領域をカバーする細菌人工染色体(BAC)を選択及び注文する。製造業者の指示書に従ってMacherey Nagel NucleoBond BAC 100キット(REF 740579)を使用して、BAC DNAを調製する。
2.  等モル量のBAC DNA(合計で20から25μl)を、NEB緩衝液2(1×最終)中の400U HindIIIで、200から250μlの総体積で、37℃で一晩消化する。
注意:使用される制限酵素は、実施例1 Hi-Cライブラリ作製の第1日から第13日と同じでなければならない。
【０１０４】
(第15日:T7プロモーターアダプターの消化されたBAC DNAへのライゲーション)
1.  フェノールクロロホルム抽出、それに続いてクロロホルム抽出を実施する。0.1体積の3M酢酸ナトリウム及び2.5体積の100%エタノールを用いて、-20℃で最低2時間(又は-20℃で一晩)沈殿させる。
2.  4℃で20分間、14,000rpmでスピンさせる。800μl 70%エタノールで洗浄し、再びスピンさせ、エタノールを除去し、ペレットを風乾させる。
3.  25μl 10mM Tris、pH7.5に再懸濁する。Nanodropによって濃度を決定する。収量は、15から20μg DNAであるはずである。
4.  T7プロモーターアダプターを調製するために、「Luo T7 HindIII」と「Luo T7 HindIII rc」プライマー(100μM)との両方をそれぞれ20μlと、60μlオリゴアニーリング緩衝液(10mM Tris、pH8.0;50mM NaCl;1mM EDTA)とを、最終アダプター濃度が20μMとなるように混合する。
HPLC精製されたプライマーを使用する。このプロトコルのこのパートの最後に、プライマー配列を載せている。
5.  PCR装置でアダプターをアニーリングさせる:95℃で5分間、次いで1分につき1℃の速度の温度低下(4℃に達するまで)。アニーリングされたアダプターは、一定分量で凍結されるべきである。実験の前に氷上で解凍し、直ちに使用する。
6.  1X T4 DNAリガーゼ緩衝液(NEB社、B0202S)、12μl(400U/μl)T4 DNAリガーゼ(NEB社、M0202S)(最終体積150μl)中のDNAに、15倍のモル過剰のアダプター(20μgのBAC DNAと仮定すれば6.2μl、約4kb断片)を添加する。16℃で一晩インキュベートする。
【０１０５】
(第16日:消化されたT7プロモーター-DNAの超音波処理)
1.  65℃で10分間加熱することによってT4 DNAリガーゼを失活させ、氷上で冷却する。
2.  DNA(T7プロモーターに連結されたBAC HindIII断片)は、現段階では、150μl中であり得る。120μl H2Oを添加して270μlにする。10μlを取り出して、ゲル上で流し(超音波処理前試料)、残りの体積を、それぞれ130μl(Covaris E220による超音波処理に必要とされる体積)の2つの試料に分ける。
3.  セプタムを介して金属蓋のcovaris社のネイキッドDNAチューブにピペットで入れて、超音波処理の妨げになる可能性がある気泡が発生するのを避ける。
4.  次のCovaris E220条件を使用して、200塩基対にピークをもつ断片を作製する:
10% 衝撃係数   
175W ピーク放射電力
200 サイクル/バースト
180秒 処理時間
7℃
5.  超音波処理後、covaris社のチューブからの試料を、新たなエッペンドルフチューブに移す。
6.  任意:2%アガロースゲル上で超音波処理前及び後の一定分量を流して、断片化を評価する。
【０１０６】
(第17日:末端修復及びSPRIビーズサイズ選択)
1.  超音波処理されたDNAの回収された体積は、試料あたり130μlであるはずである。17μl 2.5mM dNTP混合物、9.5μl 10×NEBリガーゼ緩衝液(NEB社、B0202S)(最終濃度1×にする)、6μl T4 DNAポリメラーゼ(NEB社、M0203L)、6μlポリヌクレオチドキナーゼ(NEB社、M0201L)、1.5μl Klenow(NEB社、M0210L)を添加して、反応あたり170μlの最終体積にする。室温で30分間インキュベートする。
2.  2つの170μl反応物をそれぞれ、(後続のステップにおけるQiagen精製カラムの過装填を避けるために)それぞれ85μlを含有する2つのエッペンドルフチューブに分離する。Qiagen PCR精製キット(Qiagen 28104)を使用して、4つのチューブすべてにおけるDNAを精製し、それぞれ50μlで溶出し、次いで、最終の溶出の後に、2つの試料それぞれを合わせる（最後の総体積は、2つの試料について合計100μlであるはずである）。
3.  両側SPRIビーズ(Agencourt AMPure XPビーズA63881)サイズ選択(0.7×、それに続いて1.0×)を実施して、180から300 bpのサイズ範囲のBAC-T7プロモーターDNAを単離する。超音波処理及び修復されたDNAの回収された体積は、現段階では100μlであるはずである(チューブA)。SPRIビーズをボルテックスにかけることによってよく混合し、180μlのSPRIビーズを新たなエッペンドルフチューブ(チューブB)に移す。これらの180μlのSPRIビーズの70μlを、チューブ(A)内の100μlのDNAに添加し(0.7×)、十分に混合し、室温で10分間インキュベートし、磁気分離器上に置き、所望のサイズ範囲のDNAを含有する非結合上清を新たなチューブ(チューブC)に回収する。ビーズを含有するチューブ(A)を捨てる。
4.  このステップは、ビーズを濃縮するためのものである。チューブ(B)(110μlのSPRIビーズを含有する)を磁石上に置き、30μlの上清以外はすべて除去する(すなわち、およそ80μlの上清を捨てる)。チューブ(B)を磁石から外し、ビーズを残りの30μl体積に再懸濁する。
5.  チューブ(B)からの30μlの濃縮されたビーズを、チューブ(C)に添加する(1.0×SPRIビーズ、すなわち、溶液中のDNAと溶液中のSPRIビーズとの比は現段階では1:1である)。よく混合し、室温で少なくとも10分インキュベートし、磁石上に置き、上清を捨てる。チューブ(B)を捨てる。
6.  チューブ(C)内のビーズ結合DNAを25μl TLE(Tris low-EDTA;10mM Tris、0.1mM EDTA)に再懸濁し、室温で5分間インキュベートし、磁石上に置き、上清(自分のサイズ選択されたDNAを含有する)を新たなチューブ(D)に移す。ビーズを含有するチューブ(C)を捨てる。
7.  サイズ選択されたDNAの濃度を決定する。
【０１０７】
(第18日:ビオチン-UTPを用いるインビトロ転写)
1.  ビオチンRNA標識ミックス(Roche社; Cat.No.11 685 597 910)と共に、又はビオチン-UTP(Roche社;Cat.No.11 388 908 910)(より安価な選択肢)と共に、T7 MegaScriptキット(Ambion社;AM1333)を使用し、標準のrNTPと混合する。次の反応を準備する:
2μl 10×緩衝液
5.5μl DNA鋳型(一般的に100から500ng)
5μl ビオチン-UTP(Roche社11 388 908 910、ストックは10mMである)
1μl 非標識rUTP(100mM ストック)
1.5μl rATP(100mM ストック)
1.5μl rCTP(100mM ストック)
1.5μ rGTP(100mM ストック)
2μl 酵素ミックス
注意:これによって、各ヌクレオチドについて7.5mMという最終のヌクレオチド濃度がもたらされ、標識されたUTPと非標識UTPの比は、1:2である。
2.  反応物を37℃で一晩(12から16時間)インキュベートする。
【０１０８】
(第19日:ビオチン標識RNAの精製)
1.  鋳型DNAを除去するために、1μl Turbo DNAse(Life Technologies社、AM2238)で、37℃で15分間処理する。
2.  製造業者の指示書に従ってAmbion MEGAclearキット(AM1908M)を使用してRNAを精製する。50μlの最終体積に溶出する。5から10μlの一定分量を作製し、できるだけ早く凍結する。期待される収量は、一般的に、Nanodropによって決定される場合に20μgから50μgのRNAとなるであろう。この量は、(実験あたり500ngのビオチン標識RNAベイトを使用する)40から100の個々のSCRiBL Hi-C反応にとって十分である。
3.  2%アガロースゲル上に1から2μgのRNAを流すことによって、得られたRNAのサイズ及び完全性を確認する(Ambion MegaScriptキットと共に提供されるホルムアミドローディング染料を使用する)。
アダプタープライマー(他の制限酵素を使用する場合、下線を引いたHindIII 5’-オーバーハングは適切に変更される):
【化２１】
0006514210.tif 000031
【０１０９】
(Hi-Cライブラリの溶液ハイブリッド捕捉)
(第20日:Hi-Cライブラリとビオチン-RNA標的ベイトとのハイブリダイゼーション)
1.  Hi-Cライブラリ(ポンド)を調製する:500ngのHi-Cライブラリ(第13日、実施例1のステップ4)と同等の体積を1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移し、SpeedVacを使用して濃縮する。
50ngから100ngのHi-Cライブラリを、次世代シークエンシングのためにとっておく。
すべての液体の蒸発後、Hi-C DNAペレットを3.5μlのH2Oに再懸濁し、新たな1.5ml低吸着チューブ(単一のSCRiBL反応あたり)に移す。次の成分を添加する:
2.5μl cot1 DNA(マウスcot-1 DNA、Invitrogen社、18440-016、1mg/ml;合計2.5μg)
1μlサケ精子DNA(せん断されている、Ambion AM9680、10mg/ml ストック; 1:4希釈(2.5mg/ml)を行い、その結果、添加される最終量は、2.5μgとなる)。
次のブロッキングオリゴを添加する:
【０１１０】
(a)従来のSCRiBL Hi-C)
標準のPEアダプター、及び増幅のためのPE PCR 1.0及びPE PCR 2.0を使用して作製されるHi-Cライブラリについては、次の2種のブロッキングオリゴを使用する:
1.5μl PEブロッキングオリゴ1(200μMストック;配列がPE PCR 1.0と同一):
【化２２】
0006514210.tif 000032
1.5μl PEブロッキングオリゴ2(200μM ストック;配列がPE PCR 2.0と同一):
【化２３】
0006514210.tif 000033
【０１１１】
(b)捕捉前バーコーディングSCRiBL Hi-C)
Illumina TruSeqアダプター、及びTruSeq PCRプライマー1.0及びTruSeq PCRプライマー2.0を用いて増幅されるPCRを使用して作製されるHi-Cライブラリについては、次の2種のブロッキングオリゴを使用する:
1.5μl TruSeqユニバーサルブロッキングオリゴ(200μMストック;配列がTruSeqユニバーサルアダプターと同一):
【化２４】
0006514210.tif 000034
1.5μl TruSeqブロッキングオリゴインデックスx(200μM ストック;TruSeqアダプターインデックスxの逆相補体):
【化２５】
0006514210.tif 000035
注意:Hi-Cライブラリを作製するために使用するTruSeqアダプターインデックスに対応するTruseqブロッキングオリゴインデックスを使用する。例えば、Hi-Cライブラリ作製のために、自分がTruSeqアダプターインデックス6:
【化２６】
0006514210.tif 000036
を使用しているならば、この場合、ブロッキングオリゴとしてTruSeqブロッキングオリゴインデックス6(TruSeqアダプターインデックス6の逆相補体):
【化２７】
0006514210.tif 000037
を使用する。
【０１１２】
(c)捕捉後バーコーディング SCRiBL Hi-C)
SCRiBL アダプター、及びSCRiBL捕捉前PCRプライマー1.0及びSCRiBL捕捉前PCRプライマー2.0を用いて増幅されるPCRを使用して作製されるHi-Cライブラリについては、次の4種のブロッキングオリゴを使用する:
0.75μl SCRiBLブロッキングオリゴ1(200μMストック):
【化２８】
0006514210.tif 000038
0.75μl SCRiBLブロッキングオリゴ2(200μMストック):
【化２９】
0006514210.tif 000039
0.75μl SCRiBLブロッキングオリゴ3(200μMストック):
【化３０】
0006514210.tif 000040
0.75μl SCRiBLブロッキングオリゴ4(200μMストック):
【化３１】
0006514210.tif 000041
* SCRiBLブロッキングオリゴ1及び4は、3’ジデソキシ(didesoxy)修飾を含有する
十分に再懸濁し、PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、氷上に保持する。
【０１１３】
2. 2.23×ハイブリダイゼーション緩衝液(SCRiBL Hi-C試料あたり30μl)を調製する:
11.15×SSPE(ストック 20×;Gibco社15591-043)
11.15×Denhardt’s(ストック 50×;Invitrogen社750018)
11.15mM EDTA(ストック 500mM;Gibco社15575-038)
0.223% SDS(ストック 10%;Promega社V6551)
十分に混合し、65℃で5分間加熱し、PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、室温に保つ。
3.ビオチン-RNA(ベイト)を調製する:500ngのビオチン標識RNA(第19日、ステップ2)を1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移し、H2Oで5.5μlの体積にする。1.5μlのSUPERase-In(Ambion AM2694、20単位/μl)を添加する。PCRストリップ(Agilent社、410022)に移し、PCRストリップチューブの蓋(Agilent社、オプティカルキャップ8×ストリップ401425)で閉じ、氷上に保持する。(体積は、現段階では7μlであるはずである)。
4.ハイブリダイゼーション反応:PCR装置(PTC-200、MJ Research社)を次のプログラムに設定する(PCR装置の蓋は、全体を通して加熱されなければならない):
1. 95℃、5分間
2. 65℃、ずっと
PCRストリップの移動について、実施例1の第14日、ステップ4と同じ説明書に従う。
【０１１４】
(第21日:ストレプトアビジン-ビオチンプルダウン及び洗浄)
1.  緩衝液を調製する:
a)結合緩衝液(BB):
1M NaCl
10mM Tris-HCl pH 7.5
1mM EDTA
SCRiBL試料あたり800μlを調製し、室温に保つ。
b)洗浄緩衝液I(WBI):
1×SSC(SSC 20×ストック:Invitrogen社15557-044)
0.1% SDS
SCRiBL試料あたり500μlを調製し、室温に保つ。
c)洗浄緩衝液II(WB II):
0.1×SSC(SSC 20×ストック:Invitrogen社15557-044)
0.1% SDS
SCRiBL試料あたり1500μlを調製し、65℃に加熱し、この温度に保つ。
d)NEB2 1×(10×ストック;NEB社 B7002S)
SCRiBL試料あたり230μlを調製し、室温に保つ。
2.  磁気ビーズを洗浄する:Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1(Life Technologies社、65601)を十分に混合し、その後、SCRiBL Hi-C試料あたり60μlを、1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに添加する。ビーズを次の通りに洗浄する(すべての後続の洗浄ステップについて同じ手順):
a)200μl BBを添加する
b)ボルテックスで(低から中設定で)5秒間混合する
c)チューブをDynal 磁気分離器(Life Technologies社)上に置く
d)ビーズを回収し、上清を捨てる
合計3回の洗浄について、ステップa)からd)を繰り返す。
3.  ビオチン-ストレプトアビジンプルダウン:ストレプトアビジンビーズを、新たな低吸着 エッペンドルフチューブ内の200μl BBに入れ、(PCR装置を依然として実行させながら)PCR装置の蓋を開け、全ハイブリダイゼーション反応物を、ストレプトアビジンビーズを含有するチューブにピペットで入れ、よく混合する。
この時点でのハイブリダイゼーション反応の体積を確認する。20μl未満の体積は、過度の蒸発が、最適以下のハイブリダイゼーション条件をもたらした可能性が高いことを意味する。
室温で30分間、回転ホイール上でインキュベートする。
4.  洗浄:30分後、試料を磁気分離器上に置き、上清を捨て、ビーズを500μl WB Iに再懸濁し、新たなチューブに移す。室温で15分間インキュベートする。2から3分おきに各5秒間ボルテックスにかける。
ビーズと緩衝液を磁気分離器上で分離し、上清を除去する。500μl WB II(65℃に予め温められている)に再懸濁し、新たなチューブに移す。
65℃で10分間インキュベートし、2から3分おきに5秒間(低から中設定で)ボルテックスにかける。WB IIにおいて、すべて65℃で、合計3回の洗浄について繰り返す。
5.  上清を除去した後、200μl 1×NEB2に再懸濁し、直ちに新しいチューブに移す。磁気分離器上にまっすぐに置き、上清を除去する。
6.  30μl 1×NEB2に再懸濁し、新たなチューブに移す。ビーズ上のRNA/DNA混合物ハイブリッド「キャッチ」は、この時点で、PCR増幅の準備ができている。
【０１１５】
(第22日:SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅のためのPCR条件を決定する)
(a)従来のSCRiBL Hi-C)
1.  SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅に対するPCRサイクルの最適数を決定するために、7、9、及び12増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む3つの反応を準備する:
【表１０】
0006514210.tif 000042
PE PCRプライマー1.0:
【化３２】
0006514210.tif 000043
PE PCRプライマー2.0:
【化３３】
0006514210.tif 000044
2.  nサイクルに対する、次の条件を用いる3つの異なるPCRを実行する:
【表１１】
0006514210.tif 000045
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずである。
【０１１６】
(第22日:SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅のためのPCR条件を決定する)
(b)捕捉前バーコーディング SCRiBL Hi-C)
1.  SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅に対するPCRサイクルの最適数を決定するために、7、9、及び12増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む3つの反応を準備する:
【表１２】
0006514210.tif 000046
2. nサイクルに対する、次の条件を用いる3つの異なるPCRを実行する:
【表１３】
0006514210.tif 000047
3. 1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずである。
【０１１７】
(第22日:SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅のためのPCR条件を決定する)
((c)捕捉後バーコーディングSCRiBL Hi-C)
1.  SCRiBL Hi-Cライブラリ増幅に対するPCRサイクルの最適数を決定するために、7、9、及び12増幅サイクルを伴う試験PCRを準備する。それぞれ以下を含む3つの反応を準備する:
【表１４】
0006514210.tif 000048
SCRiBL捕捉後PCRプライマー1.0:
【化３４】
0006514210.tif 000049
SCRiBL捕捉後PCRプライマー2.0:
【化３５】
0006514210.tif 000050
(「NNNNNN」がバーコードであることに留意するように)
2.  nサイクルに対する、次の条件を用いる3つの異なるPCRを実行する:
【表１５】
0006514210.tif 000051
3.  1.5%アガロースゲル上で全反応物(25μl)を流すことによって、増幅されたDNAの量を確認する。通常、300から600bpの範囲内のスメアは、9サイクルの増幅でほぼ視認可能であるはずである。
【０１１８】
(第23日:SCRiBL Hi-Cライブラリの最終PCR増幅)
1.  あるPCR条件(すなわちPCRサイクルの選択された数)を用いて、上記（第22日、ステップ1）の通りに、それぞれ25μlを含むｘ個のPCR反応物(ｘはSCRiBL HiCライブラリの残りの体積を因数2.5で割ったものに等しい)を準備する。一般的には、6 PCRサイクルが、Illuminaシークエンシングに適したSCRiBL Hi-Cライブラリ量を得るのに十分であるはずである。
2.  第23日、ステップ1からの、それぞれのPCR反応物をすべてプールする。磁気分離器上に置き、上清を新たな1.5ml低吸着エッペンドルフチューブに移す。このストレプトアビジンビーズを当初の量の1×NEBuffer 2(第21日、ステップ6を参照)に再懸濁し、予備としてとっておく。SCRiBL Hi-Cライブラリを含有する上清の体積を決定し、製造業者の指示書に従って1.8×体積のSPRIビーズ(Beckman Coulter社、Ampure XPビーズA63881)を添加することによって精製する。100μlのTLEに再懸濁する。
3.  180μlのSPRIビーズを、第23日、ステップ2からの100μlのHi-Cライブラリに添加することによって、SPRIビーズ精製を(第23日、ステップ2に記載した通りに)繰り返す。最終体積20μlのTLEに再懸濁する。
4.  シークエンシングの前に、Bioanalyzer(Agilent社)及び定量PCRによって、SCRiBL Hi-Cライブラリの質及び量を確認する。
【０１１９】
(実施例3:MYC遺伝子プロモーター相互作用の研究)
本明細書に記載した方法は、同時に何千ものプロモーターに関する染色体上相互作用の捕捉を可能にし、続いて、これを別々に分析することができる。一例として、MYC遺伝子の周囲のゲノム相互作用をここに示す。この結果は、本明細書に示した通りの図2を参照して説明することができる。
【０１２０】
図2(A)は、MYC遺伝子の周囲のゲノム領域を示す。図2(A)は、本発明の方法によって特定される、CD34+造血前駆細胞における、MYCプロモーターと相互作用する領域の位置を示す。アスタリスクは、下に記載した通りに裏付けられた遺伝子の1.8Mb下流に位置する相互作用領域の位置を示す。
【０１２１】
図2(B)は、CD34+細胞核のDNA FISHの例を示す。これらの実験では、MYC遺伝子座内の領域(図2(A)においてバーとして示された位置)に特異的である蛍光標識されたDNAプローブを、固定されたCD34+細胞核内のゲノムとハイブリッド形成させた。これらのプローブ間の相対的な分離距離を、935遺伝子座について測定した。これらの距離の定量を、箱ひげグラフとして示す。カラム1は、MYCプロモーターと遠位相互作用領域との間の分離距離を示す。その分離距離は、それぞれカラム2及び3によって示した通り、MYCプロモーターと、本発明の方法において相互作用を示さなかった介在領域との距離、又は介在領域と、遠位相互作用領域との距離よりも有意に近い。P値＜0.001。
【０１２２】
図2(C)は、公知の3C方法を使用する、MYCプロモーターと、該遺伝子の1.8Mb下流の領域との間の相互作用の検証を示す。MYCプロモーター、遠位相互作用エレメント、及び介在領域に特異的なプライマーを使用して、本発明の方法において相互作用が検出されなかった、CD34+細胞及びGM12878細胞からの3つの独立に調製された3C相互作用ライブラリを増幅した。限られたサイクルのPCRからの増幅産物を、アガロースゲル上に流した。L、DNAラダーマーカー;Co、対照増幅産物;GM、3つのGM12878 3Cライブラリからの増幅;CD、3つのCD34+3Cライブラリからの増幅。図2(C)のグラフは、GM12878細胞(左)及びCD34+細胞(右)に関する、介在領域(黒色バー)及び相互作用領域(灰色バー)とのMYCプロモーター相互作用の、対照増幅産物に対して基準化されたゲルの定量を示す。
【０１２３】
したがって、図2(B)及び2(C)に示したデータは、図2(A)に示された結果の検証の役割を果たす。まとめると、これらの結果は、MYC遺伝子の1.8Mb下流に位置する領域が、本発明の方法によって予測された通り、直線的ゲノム配列上の非常に近い領域よりも有意に高い頻度でMYCプロモーターと相互作用することを示唆する。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。 
（構成１）
標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定する方法であって:
(a)該標的核酸セグメントの部分群を含む核酸組成物を得るステップと;
(b)該核酸組成物をクロスリンクさせるステップと;
(c)該クロスリンクされた核酸組成物を超音波処理によって断片化させるステップと;
(d)ステップ(c)から得られた断片化された核酸セグメントを連結して、連結された断片を生成するステップと;
(e)該標的核酸セグメントの部分群と結合する単離用核酸分子の追加(ここでは、前記単離用核酸分子は、結合対の第一の半分で標識される)と;
(f)該単離用核酸分子と結合された該標的核酸セグメントの部分群を含有する連結された断片を、結合対の第二の半分を使用することによって単離するステップと;
(g)ステップ(f)の単離された連結された断片を配列決定して、該標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するステップ、
を含む、前記方法。
（構成２）
前記標的核酸分子の部分群が、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、又はインスレーター、例えばプロモーターから選択される、構成1記載の方法。
（構成３）
前記単離用核酸分子が、細菌人工染色体(BAC)、フォスミド、又はコスミドから得られる、構成1又は構成2記載の方法。
（構成４）
前記単離用核酸分子が、RNAである、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成５）
前記結合対の第一の半分が、ビオチンを含み、前記結合対の第二の半分が、ストレプトアビジンを含む、構成1から4のいずれか1項記載の方法。
（構成６）
ステップ(d)中に、前記連結された断片にジャンクションマーカーを組み込むことをさらに含む、構成1から5のいずれか1項記載の方法。
（構成７）
前記ジャンクションマーカーがビオチンを含む、構成6記載の方法。
（構成８）
ステップ(e)の前に、前記クロスリンキングを逆転することをさらに含む、構成1から7のいずれか1項記載の方法。
（構成９）
ステップ(e)の前に、前記ジャンクションマーカーを含有しない、いかなる断片も除去するために、前記核酸組成物を精製することをさらに含む、構成6から8のいずれか1項記載の方法。
（構成１０）
ステップ(g)の前に、ペアエンドアダプター配列を、前記単離された標的連結断片の末端に連結することをさらに含む、構成1から9のいずれか1項記載の方法。
（構成１１）
ステップ(g)の前に、前記単離された標的連結断片を増幅することをさらに含む、構成1から10のいずれか1項記載の方法。
（構成１２）
前記増幅することが、PCRによって実施される、構成11記載の方法。
（構成１３）
前記核酸組成物が、ヒト細胞核などの哺乳類の細胞核由来である、構成1から12のいずれか1項記載の方法。
（構成１４）
前記核酸組成物が、マウス細胞核又は植物細胞核などの、非ヒト細胞核由来である、構成1から12のいずれか1項記載の方法。
（構成１５）
特定の病的状態の徴候である1以上の相互作用核酸セグメントを特定する方法であって:
a)ある特定の病的状態を伴う個体から得られる核酸組成物に対して、構成1から14のいずれか1項記載の方法を実施することと;
b)核酸セグメントと標的核酸セグメントとの相互作用の頻度を数量化することと;
c)前記病的状態を伴う個体由来の核酸組成物における相互作用の頻度と、健康な対象由来の正常対照の核内組成物における相互作用の頻度とを比較し、その結果、核酸組成物における相互作用の頻度の差が、特定の病的状態を示すこと、
を含む、前記方法。
（構成１６）
前記病的状態が、癌、自己免疫疾患、発達障害、又は遺伝性障害から選択される、構成15記載の方法。
（構成１７）
構成1から14のいずれか1項記載の方法を実施することが可能な緩衝液及び試薬を含む、標的核酸セグメントの部分群と相互作用する核酸セグメントを特定するためのキット。
【図１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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