(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）及び霊長類ＴｆＲに結合する単離された抗体であって、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合を阻害せず、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３、並びにＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、それぞれが、
ａ）配列番号５３、５４及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；
ｂ）配列番号５３、１５６及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；
ｃ）配列番号５３、１５７及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；又は
ｄ）配列番号５３、５４及び５５、並びに配列番号５０、５１及び１５５
のアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項２】
ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する単離された抗体であって、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合を阻害せず、かつ抗体の一以上の特性が、抗体で治療された被験体又は哺乳動物において、網状赤血球に対する抗体の影響を低下させるか又は排除するように、及び／又は急性の臨床症状の重症度又は存在を減少させるように改変されており、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３、並びにＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、それぞれが、
ａ）配列番号５３、５４及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；
ｂ）配列番号５３、１５６及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；
ｃ）配列番号５３、１５７及び５５、並びに配列番号５０、５１及び５２；又は
ｄ）配列番号５３、５４及び５５、並びに配列番号５０、５１及び１５５
のアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する抗体断片である、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、
ａ）配列番号１０８、１５３、又は１５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；又は
ｂ）配列番号１０５又は１５１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は
ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列；又は
ｄ）配列番号１０８、１５３、又は１５４のＶＨ配列；又は
ｅ）配列番号１０５又は１５１のＶＬ配列
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ａ）配列番号１０８のＶＨ配列及び配列番号１０５のＶＬ配列；
ｂ）配列番号１５３のＶＨ配列及び配列番号１０５のＶＬ配列；
ｃ）配列番号１５４のＶＨ配列及び配列番号１０５のＶＬ配列；
ｄ）配列番号１０８のＶＨ配列及び配列番号１５１のＶＬ配列
を含む、抗体。
【請求項８】
一以上の特性が、抗体のＦｃ領域のエフェクター機能、抗体の補体活性化機能、抗体の半減期及びＴｆＲに対する抗体の親和性から選択される、請求項２から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
一以上の特性が、抗体のＦｃ領域のエフェクター機能及び抗体の補体活性化機能から選択され、エフェクター機能又は補体活性化機能が、同じアイソタイプの野生型抗体と比較して低下されているか又は排除されている、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
エフェクター機能が、抗体のグリコシル化の減少、エフェクター機能を天然に低下させるか又は排除しているアイソタイプへの抗体アイソタイプの改変、及びＦｃ領域の改変から選択される方法により、低下されるか又は排除される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体のグリコシル化が、野生型グリコシル化を許容しない環境における抗体の産生；抗体上に既に存在する炭水化物基の除去、及び野生型グリコシル化が生じないような抗体の改変から選択される方法により減少される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体のＦｃ領域が、２９７位の野生型アスパラギン残基がその位置でのグリコシル化を妨げる別のアミノ酸で置き換えられるような、２９７位での変異を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
Ｆｃ領域の全て又は一部の欠失により、又はエフェクター機能若しくは補体活性化機能に適格なＦｃ領域又は非Ｆｃ領域を含まないように抗体を遺伝子工学的に操作することにより、エフェクター機能が低下されるか又は排除される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
改変が、２３４位、２３５位、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、一以上のＦｃ受容体との結合を損なわせるＦｃ領域の点変異；２７０位、３２２位、３２９位及び３２１位から選択されるＣ１ｑとの結合を損なわせるＦｃ領域の点変異；Ｆｃ領域の一部又は全てを排除すること；及びＣＨ１ドメインの１３２位での点変異から選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
改変が、Ｎ２９７Ｇであるか、Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａであるか、又はＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ｇであるか、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
半減期が、２５２位、２５４位、２５６位、４３４位及び４３６位から選択される位置での抗体のＦｃＲｎ結合ドメインにおける改変により増加される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１７】
改変が、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅであるか、又はＮ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉである、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が、治療用化合物と結合している、請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、多重特異性抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
治療用化合物が、多重特異性抗体の一部を形成する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
多重特異性抗体が、ＴｆＲと結合する第一の抗原結合部位及び脳の抗原に結合する第二の抗原結合部位を含む、請求項１９又は２０に記載の抗体。
【請求項２２】
脳の抗原が、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
多重特異性抗体が、ＴｆＲ及びＢＡＣＥ１の両方に結合するか、又はＴｆＲ及びＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
治療用化合物が、神経障害薬である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６の宿主細胞を培養して抗体を産生することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項２８】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤。
【請求項３０】
医薬として使用のための、請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
神経障害の治療における使用のための、請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
神経障害が、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
ＢＢＢを通過しての一以上の化合物の輸送における使用のための、請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
被験体においてＢＢＢを通過して化合物を輸送するための薬剤であって、請求項１８から２４の何れか一項に記載の抗体を含み、抗体が、それに結合した化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、該薬剤がＢＢＢに曝露される、薬剤。
【請求項３５】
被験体のＣＮＳの化合物への曝露を増加させるための薬剤であって、請求項１８から２４の何れか一項に記載の抗体を含み、抗体が、それに結合した化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、該薬剤がＢＢＢに曝露される、薬剤。
【請求項３６】
被験体に投与される化合物のＣＮＳにおける保持を増加させるための薬剤であって、請求項１８から２４の何れか一項に記載の抗体を含み、化合物のＣＮＳにおける保持が増加するように、該薬剤がＢＢＢに曝露される、薬剤。
【請求項３７】
哺乳動物における神経障害を治療するための医薬であって、請求項１８から２４の何れか一項に記載の抗体を含む、医薬。
【請求項３８】
神経障害が、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
ＢＢＢ又は神経障害がヒト被験体にあり、且つ投与量及び／又は投与頻度が、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される、請求項３４から３６の何れか一項に記載の薬剤、又は請求項３７又は３８に記載の医薬。
【請求項４０】
被験体が赤血球の枯渇について更にモニタリングされる、請求項３９に記載の薬剤又は医薬。
【請求項４１】
化合物に結合する抗体が、治療用量で投与され、治療用量がＴｆＲ−飽和である、請求項３９に記載の薬剤又は医薬。
【請求項４２】
化合物に結合する抗体が、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正された用量及び／又は投与頻度で投与される、請求項３９に記載の薬剤又は医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗トランスフェリン受容体抗体及びその使用方法に関する。
【０００２】
関連出願
この出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年５月２０日に出願された米国仮出願番号６１／８２５４７７の利益を主張する。
【０００３】
配列表
配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、明細書と同時に提出され、ファイル名は「Ｐ５６４１Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ」、作成日は２０１４年５月１６日、ファイルサイズは１５４５９９バイトである。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で出願された配列表は、明細書の一部であり、参照することにより本明細書にその全体が援用される。
【背景技術】
【０００４】
大きな分子薬物の脳への浸透は、不浸透性が大きな血液脳関門（ＢＢＢ）により厳しく限定される。この障害を克服するための多くの戦略としては、脳毛細血管内皮で発現される内在性の受容体のトランスサイトーシス輸送経路を利用することが挙げられる。大きな分子の脳への受容体媒介性送達を可能にするために、これらの受容体に対するモノクローナル抗体などの組換えタンパク質が設計されてきた。脳への取り込みを最大にする一方、血液中に戻る逆トランスサイトーシスを最小限にするための、及び治療的投与後の蓄積の程度も最大にするための戦略は、ＢＢＢ受容体に対する親和性が低い抗体により、ＢＢＢ輸送、及び関連する治療用部分／分子のＣＮＳへの保持が、そのような受容体に対する典型的な高親和性抗体と比較して実質的に増加する可能性がもたらされるという知見で対処されてきた（Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44）。しかし、これらの抗体は、ヒト及び霊長類ＴｆＲには特異的に結合しなかった。
【発明の概要】
【０００５】
要旨
モノクローナル抗体には神経疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療するための非常に大きな治療的な可能性があるが、それらの脳内への移動は血液脳関門（ＢＢＢ）によって制限される。過去の試験により、血流内を循環しているＩｇＧのうちＢＢＢを越えてＣＮＳ内に入るものの百分率は非常に小さい（およそ０．１％）ことが示されており（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)）、その場合、ロバストな効果を可能にするためには抗体のＣＮＳへの濃縮が不十分であり得る。ＣＮＳ内に分配される抗体の百分率は、ＢＢＢ受容体（すなわち、トランスフェリン受容体、インスリン受容体など）（例えば、国際公開第９５０２４２１号を参照されたい）を利用することによって改善することができることが以前に見いだされた。例えば、抗ＢＢＢ受容体抗体を多特異性にしてＣＮＳ内の１種又は複数種の所望の抗原を標的とすることもでき、１種又は複数種の異種分子と抗ＢＢＢ受容体抗体とをカップリングすることもでき、いずれの場合も、抗ＢＢＢ受容体抗体は、治療用分子をＣＮＳ内にＢＢＢを通して送達することに役立ち得る。
【０００６】
しかし、従来の特異的な高親和性抗体を用いたＢＢＢ受容体の標的化では、一般に、もたらされるＢＢＢ輸送の増加は限られたものであった。後に、出願人らは、試験した抗ＢＢＢ抗体の中で、ＣＮＳ内に取り込まれ分配される抗体の規模がＢＢＢ受容体に対するその結合親和性と反比例することを見いだした。例えば、治療量レベルで投与された、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する親和性が低い抗体により、親和性が高い抗ＴｆＲ抗体と比較して抗ＴｆＲ抗体のＢＢＢ輸送及びＣＮＳへの保持が著しく改善され、及びＣＮＳ内への治療的濃縮をより容易に実現することが可能になる（Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011)）。そのようなＢＢＢ輸送の証明を、ＴｆＲとアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）の両方に結合する二重特異性抗体を使用して実現した。本発明の方法体系を使用して操作した二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の単回全身投与により、抗体が脳内に有意に取り込まれただけでなく、脳内Ａβ１−４０のレベルが単一特異性抗ＢＡＣＥ１単独と比較して劇的に低下し、これにより、ＢＢＢへの浸透度が抗ＢＡＣＥ１の効力に影響を及ぼすことが示唆された。（Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra44 (2011)）。
【０００７】
これらのデータ及び実験により、低親和性抗体による手法を使用してＣＮＳ内への抗体の取り込みを増加させることの背景にある、いくつかの原因となる機構が強調された。第１に、高親和性抗ＢＢＢ受容体（ＢＢＢ−Ｒ）抗体（例えば、上掲のＡｔｗａｌら及びＹｕらによる抗ＴｆＲＡ）により、脳脈管構造内のＢＢＢ−Ｒが直ちに飽和することによって脳への取り込みが限定され、したがって脳内に取り込まれる抗体の総量が減少し、及び脈管構造へのその分配も制限される。驚くべきことに、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性を低下させることにより、脳への取り込み及び分配が改善され、脈管構造からＣＮＳ内に分配されたニューロン及び関連するニューロピルへの局在化のロバストなシフトが観察された。第２に、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の全体的な親和性が低く、及び抗体がＣＮＳ区画内に急速に分散されることに起因してＢＢＢのＣＮＳ側への抗体の局所的な濃度は飽和しないことから、抗体が膜のＣＮＳ側からＢＢＢ−Ｒを介してＢＢＢの血管側に戻ることを減損させるために、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性をより低くすることが提唱される。第３に、インビボにおいて、及びＴｆＲ系について観察された通り、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低い抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が高い抗体ほど効率的には系から取り除かれず、したがって、それらの高親和性対応物よりも循環濃度が高いままである。これは、低親和性抗体の循環している抗体のレベルが、高親和性抗体よりも長い期間にわたって治療レベルで持続し、したがって、脳内への抗体の取り込みがより長い期間にわたって改善されるので、有利である。更に、血漿曝露及び脳曝露の両方におけるこの改善により、診療所における投与の頻度を減らすことができ、これには、患者のコンプライアンス及び利便性に関してだけでなく、抗体及び／又はそれとカップリングした治療用化合物のいかなる潜在的な副作用又はオフターゲットの作用を減らすことにおいても利益がある可能性がある。
【０００８】
トランスフェリンとＴｆＲの間の天然の結合への干渉を回避するために、したがって、潜在的な鉄輸送に関連する副作用を回避するために、上で参照されている研究に記載されている低親和性ＢＢＢ−Ｒ抗体を選択／操作した。それにもかかわらず、ある特定のこれらの抗体をマウスに投与した際にいくつかの顕著な副作用が観察された。マウスは、急性臨床症状の急速な発症を伴う網状赤血球集団のロバストな枯渇という一次応答を示した。マウスはやがて急性臨床症状及び網状赤血球レベルの低下のどちらからも回復したが、抗ＴｆＲ抗体を治療用分子として安全に使用することができるようにするためには、網状赤血球に対するこの影響を回避すること又はそうでなければ軽減することが明白に望ましい。抗ＴｆＲ投与に対する一次応答（ロバストな網状赤血球枯渇及び急性臨床徴候）は主に抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性によって駆動され、一方、残りの網状赤血球の枯渇作用は補体経路によって媒介されることが見いだされた。
【０００９】
これらの先行研究は、マウスのＴｆＲに特異的に結合するが、霊長類又はヒトのＴｆＲを特異的には認識しないマウスの抗体を利用した。従って、本発明は、ヒトにおける治療又は診断用途の前に抗体を用いた霊長類における安全性及び有効性の研究を容易にするために、霊長類及びヒトのＴｆＲの両方を特異的に認識する抗体及びその機能性部分を提供する。本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体で処置されたヒト赤芽球細胞株及び一次骨髄細胞を用いたインビトロ研究は、ＴｆＲ陽性赤血球細胞の強固な枯渇は、マウスにおいてそうであるようにヒト／霊長類の細胞系でも観測可能であることを実証した（例えば、実施例４を参照のこと）。従って、また本明細書で提供されるのは、治療濃度で投与された抗ヒト／霊長類ＴｆＲ抗体によって提供される、増強されたＢＢＢ輸送、増加したＣＮＳ分布及びＣＮＳ保持をなお可能にしつつ、抗ＴｆＲを投与する際のＴｆＲ発現網状赤血球集団の不必要な減少を大幅に低下させる又は排除する、本発明の抗体に対する改変である。原発性及び残留網状赤血球枯渇の両方における本発明の抗ＴｆＲ抗体の観察された効果を軽減する幾つかの一般的なアプローチが本明細書において提供され、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００１０】
１つの手法では、ＡＤＣＣ活性を低下させる又は排除するために、抗ヒト／カニクイザル抗体のエフェクター機能を低下させる又は排除する。別の手法では、抗体と網状赤血球集団の相互作用のその集団に対する有害性が低くなるように、抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体のヒト又は霊長類ＴｆＲに対する親和性を更に低下させる。第３の手法は、血漿中に存在する抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体の量を減少させて、網状赤血球集団の、潜在的に有害な濃度の抗体への曝露を減らすことを対象とする。第４の手法では、網状赤血球集団を保護、安定化及び／又は補給し、その結果、抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体を投与することによる循環中又は骨髄中のいかなる潜在的な網状赤血球集団の枯渇も回避、減少又は軽減することが試みられる。
【００１１】
本明細書に記載のエフェクター機能の低下又は排除は、（ｉ）抗体の野生型哺乳動物グリコシル化を低下させること若しくは排除することによって（例えば、そのようなグリコシル化が起こり得ない環境で抗体を作製することによって、抗体がグリコシル化され得ないように１つ若しくは複数の炭水化物結合点を変異させることによって、又は抗体がグリコシル化された後に１つ若しくは複数の炭水化物を抗体から化学的又は酵素的に除去することによって）；（ｉｉ）抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体のＦｃ受容体結合能を低下させること若しくは排除することによって（例えば、Ｆｃ領域の変異によって、Ｆｃ領域内の欠失によって、又はＦｃ領域の排除によって）；又は（ｉｉｉ）エフェクター機能が最小である又はエフェクター機能がないことが公知の抗体のアイソタイプ（すなわち、これだけに限定されないがＩｇＧ４を含めたもの）を利用することによって実現することができる。
【００１２】
本明細書に記載の抗体による補体活性化の低下は、抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体のＣ１ｑ結合能を低下させること若しくは排除することによって（例えば、Ｆｃ領域の変異によって、Ｆｃ領域内の欠失によって、Ｆｃ領域の排除によって、又は抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体の非Ｆｃ部分の改変によって）、又は補体系の活性化又は活性を他のやり方で抑制すること（例えば、１種又は複数種の補体経路活性化阻害剤又は補体経路活性阻害剤を同時投与すること）によって実現することができる。
【００１３】
本明細書に例示した抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体と同様に、網状赤血球又は高レベルのＴｆＲを発現する他の細胞型上のヒト又はカニクイザルＴｆＲへの抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体の結合がそれらの枯渇をトリガーする場合、網状赤血球又は他の細胞型上のヒト又はカニクイザルＴｆＲに対する抗体の結合の減少は、今後は、抗体投与の際に観察される循環中又は骨髄中の網状赤血球又は他の細胞型の枯渇の量を減少させるはずである。霊長類又はヒトＴｆＲに対する抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体の親和性は、本明細書に記載される方法の何れかを使用して実施例に示されるように改変することができる。
【００１４】
抗体の潜在的に有害な濃度に対する網状赤血球集団の曝露を低減するために、血漿中の抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体の存在量を減少させることは、幾つかの方法で達成することができる。１つの方法は、単に投与する抗体の量を減らし、潜在的にそれと同時に投与の頻度も増加させ、血漿中の最大濃度は低下させるが有効性のために十分な血清中レベルは維持する一方で、それでも細胞が枯渇する副作用の閾値を下回るようにすることである。投与の改変と組み合わせることができる別の方法は、ＴｆＲに対するｐＨ感受性結合性を有し、その結果ｐＨ７．４で血漿中の細胞表面ＴｆＲに結合し、本明細書に記載の通り親和性が望ましく低いが、エンドソーム区画内に内部移行すると、その区画の比較的低いｐＨ（ｐＨ５．５−６．０）においてそのようなＴｆＲとの結合が急速及び著しく低下するように抗ＴｆＲ抗体を選択又は操作することである。そのような解離により、抗体を抗原媒介性クリアランスから保護する、又はＣＮＳに送達されるか又はＢＢＢを戻って再利用される抗体の量を増加させることができ、いずれの場合も、抗体の投与用量を増加させずに、そのようなｐＨ感受性を有さない抗ＴｆＲ抗体と比較して抗体の有効濃度が増加し、今度は付随する副作用のリスクが低下した抗体のより低い用量を可能にする。
【００１５】
網状赤血球集団の保護、安定化及び／又は補給は、薬学的方法又は物理的方法を使用して実現することができる。抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体に加えて、網状赤血球集団に対する抗体の負の副作用を軽減する少なくとも１種の別の治療剤を同時投与（同時に又は逐次的に）することができる。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸、及びビタミンＢ１２が挙げられる。赤血球（すなわち、網状赤血球）を物理的に交換することも、例えば、同様の血液型の別の個体由来であってもよく、抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体を投与する被験体から予め抽出したものであってもよい同様の細胞を用いて輸血することによって可能である。
【００１６】
前述の方法の任意の組合せを使用して、（ｉ）抗体及び任意のコンジュゲート化合物のＣＮＳ内への輸送が最大になるような、霊長類又はヒトＴｆＲに対する望ましく低い親和性；（ｉｉ）治療効果を有するためにＣＮＳ内に存在する必要がある化合物の量に関連するので、コンジュゲート化合物（非限定的な例として、抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体における第２の又は別の抗原結合特異性を含む）のＣＮＳ抗原に対する親和性；（ｉｉｉ）抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体のクリアランス速度；（ｉｖ）ＢＢＢのＣＮＳ／脳側でのコンジュゲート化合物の放出を容易にする低ｐＨでの抗ＴｆＲ／コンジュゲート化合物の不安定性；及び（ｖ）網状赤血球集団に対する影響の間の平衡が最適である抗体（及び／又はその投与レジメン）を操作することができることが当業者には理解されよう。
【００１７】
抗ＴｆＲ抗体を投与することの、本発明で理解される網状赤血球の枯渇作用は、網状赤血球の過度の増殖が問題である任意の疾患又は障害の治療において有用であり得ることも理解されよう。例えば、先天性赤血球増加症又は新生物性真性赤血球増加症では、例えば網状赤血球の過剰増殖に起因する赤血球数の上昇により、血液が濃くなり、同時に生理的症状が生じる。本発明の抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体を、抗体の少なくとも部分的なエフェクター機能を保存して投与することにより、ＣＮＳへの正常なトランスフェリン輸送に影響を及ぼすことなく、未成熟の網状赤血球集団を選択的に除去することが可能になる。そのような抗体の投与は、当技術分野において十分に理解されている通り、急性臨床症状が最小限になり得るように調節することができる（すなわち、非常に低用量で又は間隔を広く空けて投与することによって）。
【００１８】
抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａはそれぞれアルツハイマー病を治療するための有望及び新規の治療薬候補である。更に、受容体媒介性輸送（ＲＭＴ）に基づく二重特異性標的化技術により、ＣＮＳ疾患に対する広範囲の潜在的な治療薬に対する扉が開かれた。本発明は、治療薬のＢＢＢを通した輸送及びＣＮＳへの分配が、網状赤血球を枯渇させることなく著しく改善される、ＢＢＢ浸透性治療薬を操作する方法を提供する。
【００１９】
従って、第一の実施態様では、本発明は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）及び霊長類ＴｆＲに結合する単離された抗体を提供し、ここで前記抗体は、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合を阻害しない。一態様において、結合は特異的結合である。別の態様において、抗体は、ヒト血色素症タンパク質（「ＨＦＥ」）のＴｆＲへの結合を更に阻害しない。一態様において、結合は特異的結合である。一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体はヒト抗体である。別の態様において、抗体はヒト化抗体である。別の態様において、抗体はキメラ抗体である。別の態様において、抗体は、ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する抗体断片である。別の態様において、霊長類ＴｆＲは、カニクイザル由来である。
【００２０】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３１、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３６、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３６、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４２、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３１、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４６、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６２、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６８、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７３、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７９、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７９、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８７、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９３、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９９、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号１２７、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、１５６及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、１５７及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号１５５、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２１】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３７、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７４、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８０、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８０、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８８、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９４、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号１００、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、１５６及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、１５７及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２２】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４１、３０及び４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４５、３０及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５６、５７及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６０、６１及び６２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６０、６４及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６６、６７及び６８のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７１、７２及び７３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８５、８６及び８７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９１、９２及び９３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９７、９８及び９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び１５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２３】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号４１、３０及び４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３７、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号４５、３０及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５６、５７及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６０、６１及び６２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６０、６４及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６６、６７及び６８のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７１、７２及び７３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号７４、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８０、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８０、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号８５、８６及び８７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８８、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号９１、９２及び９３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号９４、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号９７、９８及び９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号１００、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、１５６及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、１５７及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び１５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２４】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４７、５３、又は１００のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号４８、６９、１０１、１５６又は１５７のＨＶＲ−Ｈ２配列；配列番号４９、７６、又は１０２のＨＶＲ−Ｈ３配列；配列番号４５、６６又は９７のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３０、６７又は９８のＨＶＲ−Ｌ２配列；及び配列番号４６、６８又は１０２のＨＶＲ−Ｌ３配列からなる配列の群から選択される少なくとも一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２又はＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
【００２５】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、（ａ）配列番号７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、２０、２５、２６、２７、２８、１０８、１１４、１２０、１２６、１５３又は１５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号４、５、６、１１、１２、１３、１４、１９、２１、２２、２３、２４、１０５、１１１、１１７、１２３又は１５１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む。一つのこのような態様において、抗体は、配列番号４のＶＬ配列及び配列番号７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号５のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号５のＶＬ配列及び配列番号９のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号６のＶＬ配列及び配列番号１０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１のＶＬ配列及び配列番号１５のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１２のＶＬ配列及び配列番号１６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１３のＶＬ配列及び配列番号１７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１４のＶＬ配列及び配列番号１８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１９のＶＬ配列及び配列番号２０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２５のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２２のＶＬ配列及び配列番号２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２３のＶＬ配列及び配列番号２７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２４のＶＬ配列及び配列番号２８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１０５のＶＬ配列及び配列番号１０８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１１のＶＬ配列及び配列番号１１４のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１７のＶＬ配列及び配列番号１２０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１２３のＶＬ配列及び配列番号１２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１０５のＶＬ配列及び配列番号１５３のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１０５のＶＬ配列及び配列番号１５４のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１５１のＶＬ配列及び配列番号１０８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、（ａ）配列番号１０８、（ｂ）配列番号１１４、（ｃ）配列番号１２０又は（ｄ）配列番号１２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、（ａ）配列番号１０５、（ｂ）配列番号１１１、（ｃ）配列番号１１７又は（ｄ）配列番号１２３のＶＬ配列を含む。
【００２６】
上記実施態様の一態様において、抗体は、抗体７Ａ４、８Ａ２、１５Ｄ２、１０Ｄ１１、７Ｂ１０、１５Ｇ１１、１６Ｇ５、１３Ｃ３、１６Ｇ４、１６Ｆ６、７Ｇ７、４Ｃ２、１Ｂ１２、及び１３Ｄ４からなる群から選択される。一つのこのような態様において、抗体は７Ａ４である。別のこのような態様において、抗体は８Ａ２である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｄ２である。別のこのような態様において、抗体は１０Ｄ１１である。別のこのような態様において、抗体は７Ｂ１０である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｇ５である。別のこのような態様において、抗体は１３Ｃ３である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｇ４である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６である。別のこのような態様において、抗体は７Ｇ７である。別のこのような態様において、抗体は４Ｃ２である。別のこのような態様において、抗体は１Ｂ１２である。別のこのような態様において、抗体は１３Ｄ４である。
【００２７】
前述の何れかの一態様では、抗体は更に親和性成熟される。一つのこのような態様において、抗体は、１５Ｇ１１．ｖ１、１５Ｇ１１．ｖ２、１５Ｇ１１．ｖ３、１５Ｇ１１．ｖ４、１５Ｇ１１．ｖ５、７Ａ４．ｖ１、７Ａ４．ｖ２、７Ａ４．ｖ３、７Ａ４．ｖ４、７Ａ４．ｖ５、７Ａ４．ｖ６、７Ａ４．ｖ７、７Ａ４．ｖ８、７Ａ４．ｖ９、７Ａ４．ｖ１０、７Ａ４．ｖ１１、７Ａ４．ｖ１２、７Ａ４．ｖ１３、７Ａ４．ｖ１４、７Ａ４．ｖ１５、７Ｇ７．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ２、１６Ｆ６．ｖ３、１６Ｆ６．ｖ４、１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａ、１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａ及び１５Ｇ１１．Ｗ９２Ａからなる群から選択される。一つのこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ５である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ５である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ６である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ７である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ８である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ９である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１０である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１１である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１２である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１３である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１４である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１５である。別のこのような態様において、抗体は７Ｇ７．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａである。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａである。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｗ９２Ａである。
【００２８】
上記実施態様の一態様において、抗体は、ＶＨ又はＶＬ内の一以上のアミノ酸位置で、図４Ｅ−１及び４Ｅ−２にその位置について示されるアミノ酸に改変される。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるもの又は明記されるものの一以上に対応する配列又は一以上のＨＶＲを含む。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるものに対応するＶＨ又はＶＬ配列を含む。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるものの一以上に対応する一以上のＨＶＲ配列を含む。
【００２９】
上記実施態様の一態様において、抗体は、治療用化合物と結合している。上記実施態様の別の態様において、抗体は、造影剤又は標識と結合している。一つのこのような態様において、抗体は、多重特異性抗体であり、治療用化合物は、任意で多重特異性抗体の一部を形成する。一つのこのような態様において、多重特異性抗体は、ＴｆＲと結合する第一の抗原結合部位及び脳の抗原に結合する第二の抗原結合部位を含む。一つのこのような態様において、脳の抗原は、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のこのような態様において、多重特異性抗体はＴｆＲ及びＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のこのような態様において、多重特異性抗体はＴｆＲ及びＡｂｅｔａの両方に結合する。別のこのような態様において、治療用化合物は、神経障害薬である。
【００３０】
上記実施態様の一態様において、本発明は、前述の抗体の何れかをコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、このような核酸を含む宿主細胞を提供する。別の態様において、本発明は、かかる宿主細胞を培養して抗体を産生すること、任意で更に宿主細胞から抗体を回収することを含む、前述の抗体の何れかを産生する方法を提供する。
【００３１】
上記実施態様の一態様において、本発明は、前述の抗体の何れかを含む薬学的製剤及び薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００３２】
上記実施態様の一態様において、本発明は、医薬として使用のための前述の抗体の何れかを提供する。上記実施態様の一態様において、本発明は、神経障害を治療するための医薬の製造における前述の抗体の何れかの使用を提供する。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。
【００３３】
上記実施態様の別の態様において、本発明は、神経障害の治療において使用のための前述の抗体の何れかを提供する。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。
【００３４】
上記実施態様の別の態様において、本発明は、ＢＢＢを通過して一以上の化合物を輸送することに使用のための前述の抗体の何れかを提供する。上記実施態様の別の態様において、ＢＢＢを通過して一以上の化合物を輸送するための医薬の製造における前述の抗体の何れかの使用が提供される。
【００３５】
上記実施態様の一態様において、抗体が、それに結合された化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、ＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、被験体においてＢＢＢを通過して化合物を輸送する方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００３６】
上記実施態様の一態様において、抗体が、それに結合された化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、ＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、化合物に対する被験体のＣＮＳの曝露を増加する方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００３７】
上記実施態様の別の態様において、化合物のＣＮＳにおける保持が増加するようにＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、被験体に投与される化合物のＣＮＳにおける保持を増加させる方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００３８】
上記実施態様の別の態様において、前述の抗体の何れかにより哺乳動物を治療することを含む、哺乳動物において神経障害を治療する方法が提供される。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。別のこのような態様において、神経障害はヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００３９】
別の実施態様において、本発明は、ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体はトランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻害せず、かつ抗体で治療された被験体又は哺乳動物において、網状赤血球に対する抗体の影響を低下させ又は排除し、及び／又は急性の臨床症状の重症度又は存在を減少させるように、抗体の一以上の特性が改変されている。一態様において、結合は特異的結合である。別の態様において、抗体は更に、ＴｆＲへのＨＦＥの結合を阻害しない。一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体はヒト抗体である。別の態様において、抗体はヒト化抗体である。別の態様において、抗体はキメラ抗体である。別の態様において、抗体は、ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する抗体断片である。別の態様において、霊長類ＴｆＲは、カニクイザル由来である。
【００４０】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３１、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３６、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３６、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４２、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３１、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４６、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６２、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５２、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６８、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７３、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７９、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７９、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８７、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９３、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９９、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号１２７、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００４１】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３７、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５３、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７４、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８０、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８０、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８８、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９４、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号１００、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００４２】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４１、３０及び４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４５、３０及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号５６、５７及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６０、６１及び６２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６４、６４、及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号６６、６７及び６８のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７１、７２及び７３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号８５、８６及び８７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９１、９２及び９３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号９７、９８及び９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４３】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号３５、３０及び３６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、４０及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号４１、３０及び４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３７、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び３１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号４５、３０及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５０、５１及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号５６、５７及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６０、６１及び６２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６３及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６０、６４及び５２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６５及び５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号６６、６７及び６８のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号５３、６９及び７０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７１、７２及び７３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号７４、７５及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８０、８１及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号７７、７８及び７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８０、８３及び８４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号８５、８６及び８７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号８８、８９及び９０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号９１、９２及び９３のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号９４、９５及び９６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号９７、９８及び９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号１００、１０１及び１０２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記の実施態様の別の態様において、抗体は、配列番号２９、３０及び１２７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００４４】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、配列番号４７、５３又は１００のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号４８、６９又は１０１のＨＶＲ−Ｈ２配列；配列番号４９、７６又は１０２のＨＶＲ−Ｈ３配列；配列番号４５、６６又は９７のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３０、６７又は９８のＨＶＲ−Ｌ２配列；及び配列番号４６、６８又は１０２のＨＶＲ−Ｌ３配列からなる配列の群から選択される少なくとも一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２又はＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
【００４５】
上記の実施態様の一態様において、抗体は、（ａ）配列番号７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、２０、２５、２６、２７、２８、１０８、１１４、１２０又は１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号４、５、６、１１、１２、１３、１４、１９、２１、２２、２３、２４、１０５、１１１、１１７又は１２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む。一つのこのような態様において、抗体は、配列番号４のＶＬ配列及び配列番号７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号５のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号５のＶＬ配列及び配列番号９のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号６のＶＬ配列及び配列番号１０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１のＶＬ配列及び配列番号１５のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１２のＶＬ配列及び配列番号１６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１３のＶＬ配列及び配列番号１７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１４のＶＬ配列及び配列番号１８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１９のＶＬ配列及び配列番号２０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２５のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２２のＶＬ配列及び配列番号２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２３のＶＬ配列及び配列番号２７のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号２４のＶＬ配列及び配列番号２８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１０５のＶＬ配列及び配列番号１０８のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１１のＶＬ配列及び配列番号１１４のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１１７のＶＬ配列及び配列番号１２０のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、配列番号１２３のＶＬ配列及び配列番号１２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、（ａ）配列番号１０８、（ｂ）配列番号１１４、（ｃ）配列番号１２０又は（ｄ）配列番号１２６のＶＨ配列を含む。別のこのような態様において、抗体は、（ａ）配列番号１０５、（ｂ）配列番号１１１、（ｃ）配列番号１１７又は（ｄ）配列番号１２３のＶＬ配列を含む。
【００４６】
上記実施態様の一態様において、抗体は、抗体７Ａ４、８Ａ２、１５Ｄ２、１０Ｄ１１、７Ｂ１０、１５Ｇ１１、１６Ｇ５、１３Ｃ３、１６Ｇ４、１６Ｆ６、７Ｇ７、４Ｃ２、１Ｂ１２、及び１３Ｄ４からなる群から選択される。一つのこのような態様において、抗体は７Ａ４である。別のこのような態様において、抗体は８Ａ２である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｄ２である。別のこのような態様において、抗体は１０Ｄ１１である。別のこのような態様において、抗体は７Ｂ１０である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｇ５である。別のこのような態様において、抗体は１３Ｃ３である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｇ４である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６である。別のこのような態様において、抗体は７Ｇ７である。別のこのような態様において、抗体は４Ｃ２である。別のこのような態様において、抗体は１Ｂ１２である。別のこのような態様において、抗体は１３Ｄ４である。
【００４７】
前述の何れかの一態様では、抗体は更に親和性成熟される。一つのこのような態様において、抗体は、１５Ｇ１１．ｖ１、１５Ｇ１１．ｖ２、１５Ｇ１１．ｖ３、１５Ｇ１１．ｖ４、１５Ｇ１１．ｖ５、７Ａ４．ｖ１、７Ａ４．ｖ２、７Ａ４．ｖ３、７Ａ４．ｖ４、７Ａ４．ｖ５、７Ａ４．ｖ６、７Ａ４．ｖ７、７Ａ４．ｖ８、７Ａ４．ｖ９、７Ａ４．ｖ１０、７Ａ４．ｖ１１、７Ａ４．ｖ１２、７Ａ４．ｖ１３、７Ａ４．ｖ１４、７Ａ４．ｖ１５、７Ｇ７．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ２、１６Ｆ６．ｖ３及び１６Ｆ６．ｖ４からなる群から選択される。一つのこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．ｖ５である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ５である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ６である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ７である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ８である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ９である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１０である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１１である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１２である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１３である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１４である。別のこのような態様において、抗体は７Ａ４．ｖ１５である。別のこのような態様において、抗体は７Ｇ７．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ１である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ２である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ３である。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａである。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａである。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ４である。別のこのような態様において、抗体は１５Ｇ１１．Ｗ９２Ａである。別のこのような態様において、抗体は１６Ｆ６．ｖ４である。
【００４８】
上記実施態様の一態様において、抗体は、ＶＨ又はＶＬ内の一以上のアミノ酸位置で、図４Ｅ−１及び４Ｅ−２にその位置について示されるアミノ酸に改変される。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるもの又は明記されるものの一以上に対応する配列又は一以上のＨＶＲを含む。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるものに対応するＶＨ又はＶＬ配列を含む。上記実施態様の別の態様において、抗体は、図３及び４並びに図４Ｅ−１及び４Ｅ−２のクローンの何れか一について明記されるものの一以上に対応する一以上のＨＶＲ配列を含む。
【００４９】
上記実施態様の一態様において、抗体の一以上の特性は、抗体のＦｃ領域のエフェクター機能、抗体の補体活性化機能及びＴｆＲに対する抗体の親和性から選択される。一つのそのような態様において、特性は抗体のＦｃ領域のエフェクター機能である。別のそのような態様において、特性は抗体の補体活性化機能である。別のそのような態様において、特性はＴｆＲに対する抗体の親和性である。一つのそのような態様において、エフェクター機能又は補体活性化機能は、同じアイソタイプの野生型抗体と比較して低下され又は排除される。一態様において、エフェクター機能は、抗体のグリコシル化の減少、エフェクター機能を天然に低下させ又は排除しているアイソタイプへの抗体アイソタイプの改変、及びＦｃ領域の改変から選択される方法により低下され又は排除される。
【００５０】
一つのそのような態様において、エフェクター機能は抗体のグリコシル化の減少により低下され又は排除される。一つのそのような態様において、抗体のグリコシル化は、野生型グリコシル化を許容しない環境における抗体の産生；抗体上に既に存在する炭水化物基の除去；野生型グリコシル化が生じないような抗体の改変から選択される方法により減少される。一つのそのような態様において、抗体のグリコシル化は、非哺乳動物細胞の生産系における産生など野生型グリコシル化を許容しない環境における又は抗体が合成的に生成される抗体の生成により減少される。一つのそのような態様において、抗体は、非哺乳動物細胞の産生系で生成される。別のこのような態様において、抗体は合成的に生成される。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域が、２９７位の野生型アスパラギン残基が２９７位でグリコシル化を妨げる別のアミノ酸で置き換えられるような２９７位での変異を含むなど、抗体のグリコシル化は、野生型グリコシル化が生じないような抗体の改変により減少される。
【００５１】
別のそのような態様において、エフェクター機能はＦｃ領域の少なくとも一の改変により低下され又は排除される。一つのそのような態様において、Ｆｃ領域の全て又は一部の欠失により、又はエフェクター機能若しくは補体活性化機能に適格なＦｃ領域又は非Ｆｃ領域を含まないように抗体を遺伝子工学的に操作することにより、エフェクター機能又は補体活性化機能が低下され又は排除される。一つのそのような態様において、Ｆｃ領域の少なくとも一の改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、一以上のＦｃ受容体との結合を損なわせるＦｃ領域の点変異；２７０位、３２２位、３２９位及び３２１位から選択されるＣ１ｑとの結合を損なわせるＦｃ領域の点変異；Ｆｃ領域の一部又は全てを排除すること；及びＣＨ１ドメインの１３２位での点変異から選択される。一つのそのような態様において、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。一つのそのような態様において、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。一つのそのような態様において、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように遺伝子工学的に操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。一つのそのような態様において、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される別のそのような態様において、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。一つのそのような態様において、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。一つのそのような態様において、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 38217-38223を参照されたい）。
【００５２】
一態様において、抗体の抗体半減期は、ＦｃＲｎ結合領域における改変によって増加される。一態様において、改変は、２５１位、２５６位、２８５位、２９０位、３０８位、３１４位、３８５位、３８９位、４２８位、４３４位、４３６位、２３８位、２６５位、２７２位、２８６位、３０３位、３０５位、３０７位、３１１位、３１２位、３１７位、３４０位、３５６位、３６０位、３６２位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、４１３位、４２４位又は４３４位から選択されるアミノ酸の置換である。一態様において、改変は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉから選択される置換である。
【００５３】
一態様において、抗体は、網状赤血球レベル又は急性の臨床症状への影響を軽減する又はその低下に寄与する更なる化合物と組み合わされる。一つのそのような態様において、更なる化合物は、網状赤血球を抗体に関連する枯渇から保護し、又は網状赤血球の増加、発達、若しくは回復を支援する。別のそのような態様において、更なる化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択され、又は赤血球若しくは網状赤血球である。
【００５４】
上記実施態様の一態様において、ＴｆＲに対する抗体の親和性は、ＴｆＲに対する親和性を低下させていない同じアイソタイプの野生型抗体と比較して測定される場合、低下している。一つのそのような態様において、抗体は、約１ｐＭから約１００μＭの、ＴｆＲに対するＫＤ又はＩＣ５０を有する。別の態様において、抗体の投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露されるその抗体の濃度を低減するために調節される。
【００５５】
上記実施態様の一態様において、抗体は、治療用化合物と結合している。上記実施態様の別の態様において、抗体は、造影剤又は標識と結合している。一つのこのような態様において、抗体は、多重特異性抗体であり、治療用化合物は、任意で多重特異性抗体の一部を形成する。一つのこのような態様において、多重特異性抗体は、ＴｆＲと結合する第一の抗原結合部位及び脳の抗原に結合する第二の抗原結合部位を含む。一つのこのような態様において、脳の抗原は、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のこのような態様において、多重特異性抗体はＴｆＲ及びＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のこのような態様において、多重特異性抗体はＴｆＲ及びＡｂｅｔａの両方に結合する。別のこのような態様において、治療用化合物は、神経障害薬である。
【００５６】
上記実施態様の一態様において、本発明は、前述の抗体の何れかをコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、このような核酸を含む宿主細胞を提供する。別の態様において、本発明は、かかる宿主細胞を培養して抗体を産生すること、任意で更に宿主細胞から抗体を回収することを含む、前述の抗体の何れかを産生する方法を提供する。
【００５７】
上記実施態様の一態様において、本発明は、前述の抗体の何れかを含む薬学的製剤及び薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００５８】
上記実施態様の一態様において、本発明は、医薬として使用のための前述の抗体の何れかを提供する。上記実施態様の一態様において、本発明は、神経障害を治療するための医薬の製造における前述の抗体の何れかの使用を提供する。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。
【００５９】
上記実施態様の別の態様において、本発明は、神経障害の治療において使用のための前述の抗体の何れかを提供する。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。
【００６０】
上記実施態様の別の態様において、本発明は、ＢＢＢを通過して一以上の化合物を輸送することにおける使用のための前述の抗体の何れかを提供する。上記実施態様の別の態様において、ＢＢＢを通過して一以上の化合物を輸送するための医薬の製造における前述の抗体の何れかの使用が提供される。
【００６１】
上記実施態様の一態様において、抗体が、それに結合された化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、ＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、被験体においてＢＢＢを通過して化合物を輸送する方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００６２】
上記実施態様の一態様において、抗体が、それに結合された化合物をＢＢＢを通過して輸送するように、ＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、化合物に対する被験体のＣＮＳの曝露を増加する方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００６３】
上記実施態様の別の態様において、化合物のＣＮＳにおける保持が増加するようにＢＢＢに前述の抗体の何れかを曝露することを含む、被験体に投与される化合物のＣＮＳにおける保持を増加させる方法が提供される。別のこのような態様において、ＢＢＢはヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００６４】
上記実施態様の別の態様において、前述の抗体の何れかにより哺乳動物を治療することを含む、哺乳動物において神経障害を治療する方法が提供される。一つのこのような態様において、神経障害は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳの炎症からなる群から選択される。別のこのような態様において、神経障害はヒト被験体にある。別のこのような態様において、投与量及び／又は投与頻度は、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減するために調節される。別のこのような態様において、本方法は、赤血球の枯渇について被験体をモニタリングする工程を更に含む。別のこのような態様において、化合物に結合する抗体は、治療用量で投与される。一つのこのような態様において、治療用量はＴｆＲ−飽和である。別のこのような態様において、抗体の投与は、抗体投与の急性の臨床症状を最小限にするように較正される用量及び／又は投与頻度である。
【００６５】
別の実施態様において、本発明は、抗体７Ａ４、８Ａ２、１５Ｄ２、１０Ｄ１１、７Ｂ１０、１５Ｇ１１、１６Ｇ５、１３Ｃ３、１６Ｇ４、１６Ｆ６、７Ｇ７、４Ｃ２、１Ｂ１２、１３Ｄ４、１５Ｇ１１．ｖ１、１５Ｇ１１．ｖ２、１５Ｇ１１．ｖ３、１５Ｇ１１．ｖ４、１５Ｇ１１．ｖ５、７Ａ４．ｖ１、７Ａ４．ｖ２、７Ａ４．ｖ３、７Ａ４．ｖ４、７Ａ４．ｖ５、７Ａ４．ｖ６、７Ａ４．ｖ７、７Ａ４．ｖ８、７Ａ４．ｖ９、７Ａ４．ｖ１０、７Ａ４．ｖ１１、７Ａ４．ｖ１２、７Ａ４．ｖ１３、７Ａ４．ｖ１４、７Ａ４．ｖ１５、７Ｇ７．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ１、１６Ｆ６．ｖ２、１６Ｆ６．ｖ３、１６Ｆ６．ｖ４  １５Ｇ１１．Ｎ５２Ａ、１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａ及び１５Ｇ１１Ｗ９２Ａからなる群から選択される抗体とＴｆＲ上の同一エピトープに結合する単離された抗体を提供する。
【００６６】
別の実施態様において、本発明は、被験体に投与した化合物のクリアランスを低下させる方法であって、化合物とＴｆＲと低親和性で結合する抗体とが結合され、その結果、化合物のクリアランスが低下し、及び被験体に化合物と結合した抗体を投与した際の被験体における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。
【００６７】
別の実施態様では、本発明は、化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を、被験体のＣＮＳにおいて効果的になるように最適化する方法であって、化合物とＴｆＲと低親和性で結合する抗体とが結合され、抗体は、化合物と結合後のＴｆＲに対する抗体の親和性が、化合物とコンジュゲートした抗体のＢＢＢを通過した輸送量がＣＮＳにおける化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を最適化するように選択され、被験体に化合物と結合した抗体を投与した際の被験体における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。
【００６８】
本発明の前述の方法及び組成物はいずれも、互いと及び／又は本明細書に記載の本発明の別の態様と組み合わせることができることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ＰＤＢファイル３ＳＭ９に基づいたＴｆとの複合体中のＴｆＲ二量体の三次元結晶構造を示す。ＴｆＲの非Ｔｆ結合先端領域が標識されている。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−図２Ｂは、１μＭのヒトホロ−Ｔｆの存在下において２９３細胞で一過性に発現されるヒト及びカニクイザルのＴｆＲに結合するマウスハイブリドーマ親クローン上清のＦＡＣＳ分析を示す。特に明記しない限り、各グラフにおける灰色で満たされたトレースは、検出抗体からのバックグラウンドであり、中間灰色のトレースは、ヒトＴｆＲの基礎レベルを内因的に発現する２９３細胞への結合であり、太い黒のトレースは一過性に発現されたヒトＴｆＲへの結合を表し、薄い灰色のトレースは一過性に発現されたカニクイザルＴｆＲへの結合を表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１に記載したように、ヒト／カニクイザル交差反応性抗体の競合アッセイの結果を示す。１４クローンのうち９は、ファージ上に提示された頂端結合抗体の結合を遮断することが見出された。
【図３Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ】図３Ａ−１、図３Ａ−２、図３Ｂ−１、図３Ｂ−２、図３Ｃ−１、図３Ｃ−２、図３Ｄ−１及び図３Ｄ−２は、ＴｆＲの頂端領域及び非頂端領域に結合するハイブリドーマクローンの重鎖及び軽鎖可変領域配列を示す。配列は更に、エピトープ及び配列類似性によって、クラスＩ−ＩＩＩ（頂端バインダー）及びクラスＩＶ（非頂端バインダー）に更に分割することができる。Ｋａｂａｔに従ったＨＶＲが下線で示される。
【図４Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ】図４Ａ−１、図４Ａ−２、図４Ｂ−１、図４Ｂ−２、図４Ｃ−１、図４Ｃ−２、図４Ｄ−１及び図４Ｄ−２は、（Ａ）１５Ｇ１１、（Ｂ）７Ａ４／８Ａ２、（Ｃ）７Ｇ７及び（Ｄ）１６Ｆ６についてのヒト化配列のアラインメントを示す。各マウスの軽鎖又は重鎖可変ドメイン配列（二行目）最も近いヒト生殖細胞系列又はコンセンサス可変ドメイン（一行目）と整列される。各抗体のためのヒト化バージョンは一番下（三行目）に示される。ヒト生殖細胞又はコンセンサス配列からの差異は網掛けされている。ヒトフレームワークに移植されたＨＶＲ配列は四角で囲んである。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲの定義が示される。
【図４Ｅ１−２】図４Ｅ−１及び４Ｅ−２は、抗体のクラスＩ−ＩＩＩグループについて、ＦＲの一以上の残基において改変を有する抗体の変異体形態は、親和性及び結合特異性を保持していたことを示す。
【図５】図５は、６．３μＭのホロ−Ｔｆの存在下でのｈｕＴｆＲへのｈｕ７Ａ４．ｖ１５、ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５及びｈｕ７Ｇ７．ｖ１の結合を示す。６．３μＭのホロＴｆの存在下（白い記号と破線）又は非存在下（黒い記号と実線）において、固定化ｈｕＴｆＲに結合する抗体が示される。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ−Ｂは、実施例１に記載されるＨＦＥ−ＨｕＴｆＲ結合及びＨＦＥ遮断アッセイの結果を示す。図６Ａは、固定化されたＨＦＥを介して捕捉された増加する濃度のｈｕＴｆＲへの抗体の結合を示す。図６Ｂは、増加する濃度の抗体の存在下における固定化ＨＦＥへのｈｕＴｆＲの結合を示す。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ−Ｂは、カニクイザル及びヒトＴｆＲにおける１５Ｇ１１．ｖ５及び７Ａ４．ｖ５ＩｇＧ及びＦａｂ Ａｌａ変異体の結合分析を示し、実施例２に記載したように、固定化されたヒト又はカニクイザルのＴｆＲに対して、ＥＬＩＳＡ結合によりＩｇＧとして及びＳＰＲ解析によりＩｇＧ又はＦａｂとして評価された各抗体のＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＡｌａ変異の親和性への影響を実証する。
【図８Ａ−Ｂ−９Ａ−Ｂ】図８Ａ−Ｂ及び図９Ａ−Ｂは、実施例４に記載されるように、初代ヒト骨髄単核細胞又はヒト赤芽球細胞株における抗ヒトＴｆＲ（「抗ｈＴＦＲ」）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価する実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、実施例５に記載される霊長類研究のための投与及びサンプリングスキームを示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、実施例５に記載される実験の薬物動態学的結果、特に、カニクイザルにおいて３０ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶボーラス投与後の血清（図１１Ａ）及びＣＳＦ（図１１Ｂ）における時間に対する個体及びグループの平均の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１及び抗ｇＤの血清濃度を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、実施例５に記載される実験の薬力学的結果、特に、カニクイザルにおいて３０ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶボーラス投与後の時間に対する個体及びグループの平均の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１及び抗ｇＤの血漿濃度（Ａ）又はＣＳＦ（Ｂ−Ｆ）濃度を示す。上のパネルは、経時的な血漿中（図１２Ａ）及びＣＳＦ中（図１２Ｂ）のＡｂｅｔａ１−４０レベルを示し、一方下のパネルは、経時的な可溶性ＡＰＰαレベル（図１２Ｃ）、可溶性ＡＰＰβレベル（図１２Ｄ）、及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの比（図１２Ｅ）を示す。
【図１３Ａ−１３Ｄ】図１３Ａ−１３Ｄは、実施例５に記載される研究の間に実行された血液サンプリングの結果を示す。示された時間点の各々において、総網状赤血球（図１３Ａ）、赤血球（図１３Ｂ）、ヘモグロビン（図１３Ｄ）、総網状赤血球プール内の未成熟な網状赤血球の割合（図１３Ｃ）は標準的な技術を用いて測定された。
【図１４】図１４は、実施例６に記載される霊長類研究のための投与及びサンプリングスキームを示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、実施例６に記載される実験の薬力学的な結果（Ａ）及び脳の抗体濃度（Ｂ）を示す。具体的には、図１５（Ａ）は、カニクイザルにおいて３０ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶボーラス投与後の時間に対する個体及びグループの平均の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗のＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１、抗−ＧＤ、及び抗ＢＡＣＥ１のＣＳＦ中のｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの比を示す。図１５Ｂは、投与後２４時間での様々な脳の領域内の抗体の個々の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１、抗ｇＤ、及び抗ＢＡＣＥ１濃度を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、天然の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＹＷ４１２．８から得た抗ＢＡＣＥ１クローンＹＷ４１２．８の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す。図１６Ａは、可変軽（ＶＬ）配列アラインメント（配列番号１３２−１３７）を示す。図１６Ｂは、可変重（ＶＨ）配列アラインメント（配列番号１３８−１３９）を示す。両方の図において、各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域で示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｌ１（図１６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ１（図１６Ｂ）を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｌ２（図１６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ２（図１６Ｂ）を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｌ３（図１６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ３（図１６Ｂ）を示す。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａ−Ｂは、合成の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＦａｂ１２から得た抗ＢＡＣＥ１抗体クローンＦａｂ１２の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す。図１７Ａは、軽鎖配列アラインメント（配列番号１４０−１４３）を示す。図１７Ｂは、重鎖配列アラインメント（配列番号１４４）を示す。両方の図において、各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域で示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｌ１（図１７Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ１（図１７Ｂ）を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｌ２（図１７Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ２（図１７Ｂ）を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｌ３（図１７Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ３（図１７Ｂ）を示す。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ−Ｂは、例示的な抗Ａｂｅｔａ抗体の重鎖（図１８Ａ；配列番号１４５）及び軽鎖（図１８Ｂ；配列番号１４６）を示す。
【図１９】図１９は、実施例５に記載されるように、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗Ｔｆｒ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１の薬物動態学的特性を示す。
【図２０】図２０は、実施例７に記載されるように、Ｆｃエフェクター機能ＬＡＬＡＰＧ変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１及び抗ｇＤ抗体の薬物動態特性を示す。
【図２１】図２１は、実施例７に記載されるように、Ｆｃエフェクター機能ＬＡＬＡＰＧ変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１及び抗ｇＤ抗体の５０ｍｇ／ｋｇの用量の投与後２４時間のマウスにおける合計の未成熟網状赤血球数を示す。
【図２２】図２２は、実施例８に記載されるように、ヒトトランスフェリン受容体ノックインマウスにおいて、抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１（Ｎ２９７Ｇ）、抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１（ＬＡＬＡＰＧ）、抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１（ＬＡＬＡＰＧ／ＹＴＥ）、ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１（ＬＡＬＡＰＧ／ＡＩ）抗体の５０ｍｇ／ｋｇの用量の投与後２４時間のマウスにおける網状赤血球数の総計を示す。
【図２３】図２３は、実施例８に記載されるように、初代ヒト骨髄単核細胞又はヒト赤芽球細胞株における、抗ＴｆＲ／ｇＤ、抗ＴｆＲと／ＢＡＣＥ１（Ｎ２９７Ｇ）、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１（ＬＡＬＡＰＧ）、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１（Ｎ２９７Ｇ／４３４Ａ／４３６Ｉ）及び抗のＴｆＲ／ＢＡＣＥ１（ＬＡＬＡＰＧ／ＹＴＥ）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価する実験の結果を示す。
【図２４】図２４は、１５１１Ｇｖ．５（軽鎖−配列番号１０５及び重鎖−配列番号１０８）及び親和性変異体１５Ｇ１１．５２Ａ（軽鎖−配列番号１０５及び重鎖−配列番号１５３）、１５Ｇ１１．５３Ａ（軽鎖−配列番号１０５及び重鎖−配列番号１５４）及び１５Ｇ１１．９２Ａ（軽鎖−配列番号１５１及び重鎖−配列番号１０８）の重鎖及び軽鎖可変領域配列を示す。Ｋａｂａｔに従ったＨＶＲが下線で示される。
【図２５】図２５は、実施例１に記載されるように、１５Ｇ１１ｖ．５及び抗ＴｆＲＣ１２の間の競合アッセイを示す。
【００７０】
本発明の実施態様の詳細な説明
定義
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的には解離定数（ＫＤ、ＸのＹからの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ又はＫｏｆｆ）のＸのＹに対する会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ又はＫｏｎ）の比である）によって表すことができる。標的に対する一以上の抗体の親和性の代替測定は、既知のリガンドの抗体標的への結合を阻害するためにどの程度の抗体が必要とされるかの尺度である、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）である。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び典型的な実施態様を本明細書に記載する。「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮原形質膜内の密着結合によって形成され、脳内への分子の輸送を、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子さえも、制限する強固な障壁を作りだす末梢循環と脳及び脊髄（ずなわち、ＣＮＳ）の間の生理的障壁を指す。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、ＣＮＳ内における連続的な毛細血管障壁であり、ここに総称して血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢはまた、障壁が毛細血管内皮細胞よりむしろ上衣細胞で構成される、血液脳脊髄液関門を（脈絡叢）をも包含する。
【００７１】
本明細書において互換的に使用される用語「アミロイドベータ」、「ベータアミロイド」、「Ａｂｅｔａ」、「アミロイドβ」、及び「Ａβ」は、ＡＰＰのβセクレターゼ１（「ＢＡＣＥ１」）切断の際に生成されるアミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）の断片、並びに限定されないが、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２を含むその改変、断片及び任意の機能的等価物を指す。Ａβは、単量体形態で存在し、並びに会合してアミロイドプラークの構成員として見出され得るオリゴマー及びフィブリル構造を形成することが知られている。Ａβペプチドの構造及び配列は当業者に周知であり、前記ペプチドを生産する方法又はそれらを脳及び他の組織から抽出する方法は、例えば、Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129: 885-890 (1984)に記載されている。更に、Ａβペプチドは様々な形態で市販されてもいる。
【００７２】
「抗Ａｂｅｔａ免疫グロブリン」、「抗Ａｂｅｔａ抗体」、及び「Ａｂｅｔａに結合する抗体」は、本明細書において交換可能に使用され、具体的には、ヒトのＡｂｅｔａに特異的に結合する抗体を指す。抗Ａｂｅｔａ抗体の非限定的な例は、クレネズマブ（ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）である。抗Ａｂｅｔａ抗体の他の非限定的な例としては、ソラネズマブ（ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、バピネオズマブ（ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、アデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、ポネズマブ（ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、及び次の出版物：国際公開第２０００１６２８０１号、国際公開第２００２０４６２３７号、国際公開第２００２００３９１１号、国際公開第２００３０１６４６６号、国際公開第２００３０１６４６７号、国際公開第２００３０７７８５８号、国際公開第２００４０２９６２９号、国際公開第２００４０３２８６８号、国際公開第２００４０３２８６８号、国際公開第２００４１０８８９５号、国際公開第２００５０２８５１１号、国際公開第２００６０３９４７０号、国際公開第２００６０３６２９１号、国際公開第２００６０６６０８９号、国際公開第２００６０６６１７１号、国際公開第２００６０６６０４９号、国際公開第２００６０９５０４１号、国際公開第２００９０２７１０５号に開示された任意の抗Ａｂｅｔａ抗体。
【００７３】
用語「クレネズマブ」及び「ＭＡＢＴ５１０２Ａ」は、本明細書において交換可能に使用され、Ａｂｅｔａの単量体、オリゴマー及びフィブリル形態に結合し、ＣＡＳ登録番号１０９５２０７と関連する特定の抗Ａｂｅｔａ抗体を指す。一実施態様において、そのような抗体は図１８Ａ及び１８Ｂに明記される配列を含む。
【００７４】
本明細書において「アポリポタンパク質Ｅ４陽性」又は「ＡｐｏＥ４陽性」と互換的に使用される「アポリポタンパク質Ｅ４キャリア」又は「ＡｐｏＥ４キャリア」は、少なくとも一つアポリポタンパク質Ｅ４（又は「ＡｐｏＥ４」）対立遺伝子を有する個体を指す。ＡｐｏＥ４対立遺伝子がゼロである個体は、本明細書において、「ＡｐｏＥ４陰性」又は「ＡｐｏＥ４非キャリア」であると呼ばれる。また、Prekumar, et al., 1996, Am. J Pathol. 148:2083-95を参照。
【００７５】
用語「脳血管原性浮腫「は、脳の細胞内又は細胞外空間における血管内液又はタンパク質の過剰蓄積を指す。脳血管原性浮腫は、限定されないが、例えばＦＬＡＩＲ ＭＲＩを含む脳のＭＲＩによって検出可能であり、無症候性（「無症候性血管原性浮腫」）であるか又は混乱、めまい、嘔吐、及び嗜眠（「症候性血管原性浮腫」）など神経学的症状を伴う場合がある（Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011を参照）。
【００７６】
用語「脳の巨大出血（ｍａｃｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）」は、直径約１ｃｍを超える領域の頭蓋内出血又は脳内における出血を指す。脳の巨大出血は、限定されないが、例えばＴ２＊強調ＧＲＥ ＭＲＩを含む脳のＭＲＩにより検出可能であり、無症候性（「無症候性巨大出血」）であるか、又は一過性若しくは恒久的な局所運動又は感覚障害、運動失調、失語症、及び構音障害などの症状（「症候性巨大出血」）を伴う場合がある（例えば、Chalela JA, Gomes J. Expert Rev. Neurother. 2004 4:267, 2004 and Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011を参照）。
【００７７】
用語「脳の微小出血（ｍｉｃｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）」は、直径約１ｃｍ未満の領域の頭蓋内出血又は脳内における出血を指す。脳の微小出血は、限定されないが、例えばＴ２＊強調ＧＲＥ ＭＲＩを含む脳のＭＲＩにより検出可能であり、無症候性（「無症候性微小出血」）であるか、又は一過性若しくは恒久的な局所運動又は感覚障害、運動失調、失語症、及び構音障害などの症状（「症候性微小出血」）を潜在的に伴う場合がある例えば、Greenberg, et al., 2009, Lancet Neurol. 8:165-74を参照。
【００７８】
用語「溝浸出」は、脳の溝（ｆｕｒｒｏｗ）、又は溝（ｓｕｌｃｉ）内の液体の浸出を指す。溝浸出は、例えば、限定されないがＦＬＡＩＲ ＭＲＩを含む脳のＭＲＩによって検出可能である。Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011を参照。
【００７９】
用語「中枢神経系の表在性鉄沈着症」とは、脳のクモ膜下腔への出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）又は出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）を指し、限定されないが、例えばＴ２＊強調ＧＲＥ  ＭＲＩを含む脳のＭＲＩにより検出可能である。中枢神経系の表在性鉄沈着症を示す症状は、感音難聴、小脳性運動失調、及び錐体路兆候が含まれる。Kumara-N, Am J Neuroradiol. 31:5, 2010を参照。
【００８０】
本明細書において使用される用語「アミロイドーシス」は、アミロイド若しくはアミロイド様タンパク質に関連するか又は引き起こされる疾患及び障害の群を指し、限定されないが、アミロイドプラークによるものを含み、モノマー、フィブリル、若しくは高分子状態、又は３つの任意の組み合わせのアミロイド様タンパク質の存在若しくは活性により引き起こされる疾患及び障害を含む。そのような疾患は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）などの認知記憶能力の消失によって特徴付けられる疾患又は状態、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症などの神経疾患を含むが、これらに限定されない疾患などの続発性アミロイドーシス及び加齢性アミロイドーシス；及び進行性核上性麻痺、多発性硬化症などのアミロイド様タンパク質に基づく又はそれに関連する他の疾患；クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病、内分泌腫瘍、及び老人性心アミロイドーシス；ならびにβ−アミロイド沈着による黄斑変性症、ドルーゼン関連性の視神経症、及び白内障を含む様々な眼疾患を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
緑内障は、視神経障害の特徴的パターンにおける網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の損失を伴う視神経の疾患の群である。ＲＧＣは、眼からの脳へ視覚信号を伝達する神経細胞である。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−８は、アポトーシスのプロセスにおける２つの主要な酵素であり、ＲＧＣのアポトーシスに至るプロセスで活性化される。カスパーゼ３はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断し、Ａｂｅｔａを含む神経毒性断片を生成する。ＡＰＰの保護効果がなければ、網膜神経節細胞層におけるＡｂｅｔａの蓄積はＲＧＣの死及び視覚の不可逆的な喪失をもたらす。
【００８２】
緑内障は、常にではないが、しばしば、水の循環又はその排水の閉塞の結果である可能性がある増加した眼圧を伴う。上昇した眼圧は、緑内障を発症する重要な危険因子であるが、緑内障を引き起こす決定要因であろう眼内圧の閾値を定義することはできない。損傷はまた、神経の構造の弱点とされる重要な視神経線維への血液供給不足及び／又は神経繊維自体の健康状態における問題によって引き起こされ得る。未治療の緑内障は、失明に進行する可能性がある、視神経の永久的な損傷と結果として起こる視野の喪失をもたらす。
【００８３】
本明細書で使用される用語「軽度のアルツハイマー病」又は「軽度のＡＤ」（例えば、「軽度のＡＤと診断された患者」）は、ＭＭＳＥスコアが２６から２０によって特徴付けられるＡＤの段階を指す。
【００８４】
本明細書で使用される用語「軽度から中等度のアルツハイマー病」又は「軽度から中等度のＡＤ」は、軽度及び中等度のＡＤの両方を包含し、ＭＭＳＥスコアが１８から２６によって特徴付けられる。
【００８５】
本明細書で使用される用語「中等度のアルツハイマー病」又は「中等度のＡＤ」（例えば、「中等度のＡＤと診断された患者」）は、ＭＭＳＥスコアが１９から１８によって特徴付けられるＡＤの段階を指す。
【００８６】
「中枢神経系」又は「ＣＮＳ」は、身体機能を制御する神経組織の複合体を意味し、脳と脊髄が含まれる。
【００８７】
「血液脳関門受容体」（ここでは「ＢＢＢ−Ｒ」と略す）は、血液脳関門を通して分子を輸送することができる脳内皮細胞に発現される膜貫通受容体である。ＢＢＢ−Ｒの例としては、これだけに限定されないが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、これだけに限定することなく、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含めた低密度リポタンパク質受容体、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）並びにヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本発明の例示的なＢＢＢ−Ｒはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
【００８８】
本明細書で使用される「トランスフェリン受容体」又は「ＴｆＲ」は、他に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物起源からの任意の天然型ＴｆＲを指す。その用語は、「完全長」のプロセシングを受けていないＴｆＲ並びに細胞におけるプロセシングにより生じた任意の形態のＴｆＲを包含する。この用語は、ＴｆＲの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。ＴｆＲは、脊椎動物において鉄取り込みに関与する、２つのジスルフィド結合したサブユニット（それぞれの見かけの分子量が約９０，０００である）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量が約１８０，０００である）である。一実施態様では、本明細書におけるＴｆＲは、例えば、Schneider et al. Nature 311: 675 - 678 (1984)に記載されているアミノ酸配列、例えば（配列番号１）を含むヒトＴｆＲ（「ｈＴｆＲ」）である。別の実施態様において、本明細書におけるＴｆＲはＧｅｎｂａｎｋの参照ＡＦＤ１８２６０．１に記載のアミノ酸配列（配列番号２）を含む霊長類ＴｆＲ（「ｐＴｆＲ」）である。比較のために、マウスのＴｆＲ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＡＡＨ５４５２２．１（配列番号３）に見出すことができる。
【００８９】
「神経障害」とは、本明細書で使用される場合、ＣＮＳに影響を及ぼし、及び／又は病因がＣＮＳにある疾患又は障害を指す。例示的なＣＮＳ疾患又は障害としては、これだけに限定されないが、ニューロパチー、アミロイドーシス、がん、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が挙げられる。本出願の目的に関して、ＣＮＳは、通常は血液網膜関門によって体の残りの部分から隔離されている眼を包含するものと理解されよう。神経障害の特定の例としては、これだけに限定されないが、神経変性疾患（これだけに限定されないが、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性を含む）、タウオパチー（これだけに限定されないが、アルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（これだけに限定されないが、牛海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、ゲルストマンシュトロイスラーシャインカー病、慢性消耗性疾患、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（ｈｅｔｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（これだけに限定されないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデンスパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュナイハン症候群、及びウンフェルリヒトルントボルク病を含む）、認知症（これだけに限定されないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、がん（例えば、体内の他の箇所の癌に由来する脳転移を含めたＣＮＳの癌）が挙げられる。
【００９０】
「神経障害薬」とは、１種又は複数種の神経障害を治療する薬物又は治療剤である。本発明の神経障害薬としては、これだけに限定されないが、抗体、ペプチド、タンパク質、ＣＮＳ標的（一又は複数）の天然のリガンド、ＣＮＳ標的（一又は複数）の天然のリガンドの改変型、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は前述のものの何れかの活性断片が挙げられる。本発明の例示的な神経障害薬は、本明細書に記載されており、それらとしては、これだけに限定されないが、例えば、これだけに限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質若しくはその一部、アミロイドベータ、ベータ−セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、ｔａｕ、アルファ−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫又は他のＣＮＳ癌マーカー、及びニューロトロフィンなどのＣＮＳ抗原又は標的分子それ自体である、又はそれを特異的に認識し、及び／又はそれに作用する（すなわち、それを阻害する、活性化する、又は検出する）抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸及び小分子、並びに、前述のものの何れかの活性断片が挙げられる。神経障害薬及びそれらを使用して治療することができる障害の非限定的な例が以下の表１において提供される。
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【００９１】
「造影剤」とは、その存在及び／又は位置を直接的に又は間接的に検出することが可能になるような１つ又は複数の性質を有する化合物である。そのような造影剤の例としては、検出を可能にする標識部分が組み入れられたタンパク質及び小分子化合物が挙げられる。
【００９２】
「ＣＮＳ抗原」又は「脳抗原」とは、脳を含めたＣＮＳにおいて発現される抗原であり、抗体又は小分子を用いて標的することができる。そのような抗原の例としては、限定することなく、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６が挙げられる。一実施態様において、抗原はＢＡＣＥ１である。
【００９３】
「ＢＡＣＥ１」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含めた任意の脊椎動物を供給源とする任意の天然型ベータ−セクレターゼ１（β−部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、膜関連アスパラギン酸プロテアーゼ２、メマプシン２、アスパルチルプロテアーゼ２又はＡｓｐ２とも称される）を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングを受けていないＢＡＣＥ１並びに細胞におけるプロセシングにより生じた任意の形態のＢＡＣＥ１を包含する。この用語は、ＢＡＣＥ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なＢＡＣＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、全体が出典明示により本明細書に援用されるVassar et al., Science 286:735-741 (1999)において報告されているヒトＢＡＣＥ１、アイソフォームＡの配列である。ヒトＢＡＣＥ１には、アイソフォームＢ、アイソフォームＣ及びアイソフォームＤを含めたいくつかの他のアイソフォームが存在する。全体が出典明示により本明細書に援用されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｐ５６８１７を参照されたい。
【００９４】
「抗ベータ−セクレターゼ抗体」、「抗ＢＡＣＥ１抗体」、「ベータ−セクレターゼに結合する抗体」及び「ＢＡＣＥ１に結合する抗体」という用語は、ＢＡＣＥ１と十分な親和性で結合することができる抗体を指し、したがって、当該抗体は、ＢＡＣＥ１の標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用である。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体と無関係非ＢＡＣＥ１タンパク質の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、抗体とＢＡＣＥ１の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）である。ある特定の実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は、異なる種及びアイソフォーム由来のＢＡＣＥ１の間で保存されているＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１が結合したＢＡＣＥ１上のエピトープに結合する抗体が提供される。他の実施態様では、ＢＡＣＥ１の触媒ドメインに位置するＢＡＣＥ１内のエキソサイトに結合する抗体が提供される。一実施態様では、全体が出典明示により本明細書に援用されるKornacker et al., Biochem. 44:11567-11573 (2005)において同定されているペプチド（すなわち、ペプチド１、２、３、１−１１、１−１０、１−９、１−８、１−７、１−６、２−１２、３−１２、４−１２、５−１２、６−１２、７−１２、８−１２、９−１２、１０−１２、４、５、６、５−１０、５−９、スクランブル、Ｙ５Ａ、Ｐ６Ａ、Ｙ７Ａ、Ｆ８Ａ、Ｉ９Ａ、Ｐ１０Ａ及びＬ１１Ａ）とＢＡＣＥ１との結合について競合する抗体が提供される。例示的なＢＡＣＥ１抗体の配列が図１５Ａ−Ｂ及び図１６Ａ−Ｂに示されている。本発明の例示的な抗体の１つは、抗体ＹＷ４１２．８．３１の可変ドメインを含む（例えば図１５Ａ−Ｂの場合と同様に）。
【００９５】
本明細書における「天然配列」タンパク質は、タンパク質の天然に生じる変異体を含み、天然に見出されるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を言う。本明細書で使用される用語は、天然源から単離されるか又は組換えにより生産されるタンパク質を含む。
【００９６】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００９７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、当該分野で周知であり（例えば、Nelson, MAbs (2010) 2(1): 77-83を参照）、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ；ダイアボディ；線状抗体；限定されないが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、リンカーを含むか又は含まない（及び必要に応じてタンデムで）軽鎖及び／又は重鎖の抗原結合ドメインの融合物を含む一本鎖抗体分子；及び抗体断片（限定されないが、Ｆｃ領域を欠いている複数の可変ドメインから構築される多重特異性抗体を含む）から形成される単一特異性又は多重特異性抗原結合分子を含む。
【００９８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体製剤の製造時に生じ得る可能性のある変異体であって、一般的に少量で存在している変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、何れかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)を参照）、組換えＤＮＡ法（参照、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載される技術を使用）及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含み、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が本明細書に記載される。本明細書におけるモノクローナル抗体の具体的な例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を、それらの抗原結合断片を含み、包含する。
【００９９】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそのような抗体の断片（但し、それらが所望の生物学的活性を示すことを条件とする）であり得る（米国特許第４８１６５６７号；Ｍorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)）。
【０１００】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬのヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【０１０１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらに記載のサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらに記載のサブグループＩＩＩである。
【０１０２】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などのヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト抗体（レシピエント抗体）である。例えば、ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）の全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲの残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するためになされる。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、上記のＦＲの置換（複数可）を除いて、ヒト抗体のものであるヒト化抗体は、任意で、抗体の定常領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト抗体のそれをやはり含むであろう。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
【０１０３】
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含む抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。そうした抗体は、様々な技術により同定され又は作成することができ、限定されないが、免疫感作時に、内在性免疫グロブリン産生の欠失下でヒト抗体を産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）の生産（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；及び米国特許第５５９１６６９号、第５５８９３６９号及び第５５４５８０７号を参照））；ヒト抗体又はヒト抗体断片を発現するファージディスプレイライブラリーからの選択（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)；米国特許第５５６５３３２号及び第５５７３９０５号）；インビトロで活性化されたＢ細胞を介する生成（米国特許第５５６７６１０号及び第５２２９２７５号）；及びヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含む。
【０１０４】
本明細書において「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。典型的な多重特異性抗体は、ＴｆＲと脳抗原の両方に結合することができる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。２つ、３つ又はそれ以上（例えば４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体もまた考慮される（例えば米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号、Miller et al.を参照）。多重特異性抗体は、全長抗体として又は抗体断片として調製することができる。
【０１０５】
本明細書における抗体は、改変された抗原結合又は生物学的活性を有する「アミノ酸配列変異体」を含む。そのようなアミノ酸の変化としては、例えば、抗原に対する親和性が増強された抗体（例えば、「親和性成熟」抗体）、及び改変されたＦｃ領域を有する抗体、もし存在する場合には、例えば、改変された（増加した又は減少した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を持つ抗体（例えば国際公開第００／４２０７２号、Presta, L.及び国際公開第９９／５１６４２号、Iduosogie et al.）；及び／又は血清の半減期が増加又は減少した抗体を包含する。
【０１０６】
「親和性修飾変異体」は、親和性を変更する（増加又は減少させる）親抗体（親のキメラ、ヒト化又はヒト抗体など）の一つ又は複数の置換された超可変領域又はフレームワーク残基を有する。そのような置換変異体を生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを使用する。簡潔には、幾つかの超可変領域部位（例えば６−７部位）が各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成するために変異される。こうして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から一価の様式で提示される。ファージディスプレイされる変異体は、その後、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発が、抗原結合に有意に寄与する超可変領域の残基を同定するために行うことができる。代わりに、又は更に、抗体とその標的との接触点を同定するために抗原抗体複合体の結晶構造を解析することは有益である。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルはスクリーニングに供され、改変された親和性を有する抗体が更なる開発のために選択され得る。
【０１０７】
「ｐＨ感受性抗体変異体」とは、第１のｐＨにおける標的抗原に対する結合親和性が、異なるｐＨにおけるその標的抗原に対する結合親和性と異なる抗体変異体である。非限定的な例として、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲに対してｐＨ感受性結合性を有し、したがって、ｐＨ７．４では血漿中の細胞表面ＴｆＲに望ましい低親和性（本明細書に記載の通り）で結合するが、エンドソーム区画内に内部移行すると、比較的低いｐＨ（ｐＨ５．５−６．０）においてＴｆＲから急速に解離するように選択又は操作することができる。そのような解離により、抗体を抗原媒介性クリアランスから保護すること、及びＣＮＳに送達されるか又はＢＢＢを通って再利用される抗体の量を増加させることができ、いずれの場合も、そのようなｐＨ感受性を有さない抗ＴｆＲ抗体と比較して抗体の有効濃度が増加する（例えば、Chaparro-Riggers et al. J. Biol. Chem. 287(14): 11090-11097; Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11): 1203-1208を参照されたい）。血清ｐＨにおける親和性とエンドソーム区画ｐＨにおける親和性の所望の組合せは、ＴｆＲ及びコンジュゲート化合物について当業者が容易に決定することができる。
【０１０８】
本明細書における抗体は、例えば半減期又は安定性を向上させるか、あるいは抗体を改善するために、「異種分子」とコンジュゲートされてもよい。例えば、抗体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体などの様々な非タンパク質ポリマーの１つに連結することができる。１つ以上のＰＥＧ分子に連結される、例えばＦａｂ’などの抗体断片は、本発明の典型的な実施態様である。別の例では、異種分子は治療用化合物又は可視化剤（すなわち、検出可能な標識）であり、抗体はそのような異種分子をＢＢＢを通して輸送するために使用される。異種分子の例としては、これだけに限定されないが、化学化合物、ペプチド、ポリマー、脂質、核酸、及びタンパク質が挙げられる。
【０１０９】
本発明の抗体は「グリコシル化バリアント」であってよく、したがって、Ｆｃ領域に結合した炭水化物が存在する場合に、その何れかが変更されており、存在するかしないかが改変されているか、又は種類が改変されている。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）も参照のこと。抗体のＦｃ領域に付着した糖鎖において二分するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が、国際公開第２００３／０１１８７８号、Jean-Mairet et al. 及び米国特許第６６０２６８４号、Umana et al.で参照されている。抗体のＦｃ領域に付着されているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、国際公開第１９９７／３００８７号、Patel et al.に報告されている。Ｆｃ領域に付着した改変された糖を持つ抗体に関して、国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）も参照。修飾されたグリコシル化を有する抗体を記載する米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）も参照。Ｆｃ領域内のコンセンサスグリコシル化配列（２９７−２９９位のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘはプロリンではあり得ない）の変異を、例えば、２９８位にＰｒｏを配置させることによって、又は２９９位をＳｅｒ又はＴｈｒ以外の任意のアミノ酸に改変することによってこの配列のＡｓｎを任意の他のアミノ酸に変異させることにより、その位置におけるグリコシル化が抑止されるはずである（例えば、Fares Al-Ejeh et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:5519s-5527s; Imperiali and Shannon, Biochemistry (1991) 30(18): 4374-4380; Katsuri, Biochem J. (1997) 323(Pt 2): 415-419; Shakin-Eshleman et al., J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366を参照されたい）。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成するか、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。本明細書における典型的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ
を含む。
【０１１１】
一実施態様において、ＨＶＲ残基は、図３Ａ−Ｄ又は４Ａ−Ｄ、表４又は表５において、又は本明細書の他の箇所で同定されるものを含む。
【０１１２】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従って本明細書において番号が付けられる。
【０１１３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。ある実施態様において、例えば、結合を増強するために、一以上のＦＲ残基が、抗体の安定性を調節するために、又は抗体の一以上のＨＶＲの三次元位置を調節するために改変され得る。
【０１１４】
「完全長抗体」は、抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。
【０１１５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０１１６】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分又は放射性標識）にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【０１１７】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。
【０１１８】
抗体の「エフェクター機能」とは、補体経路の活性化以外の免疫系の活性化をもたらす抗体の生物活性を指す。そのような活性は、主に抗体のＦｃ領域（ネイティブな配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）において見いだされる。抗体のエフェクター機能の例としては、例えば、Ｆｃ受容体結合性及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が挙げられる。一実施態様では、本発明の抗体は、本質的にエフェクター機能を欠く。別の実施態様では、本発明の抗体は最小限のエフェクター機能を保持する。エフェクター機能を改変又は排除する方法は当技術分野で周知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、エフェクター機能に関与するＦｃ領域の全部又は一部を排除すること（すなわち、抗体又は抗体断片を、例えば、これだけに限定されないが、本明細書に記載されており当技術分野で公知のＦａｂ断片、単鎖抗体などのＦｃ領域の全部又は一部を欠く形式で使用すること）；Ｆｃ領域を１つ又は複数のアミノ酸位で改変してエフェクター機能を排除すること（Ｆｃ結合に影響する：２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２５６位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３１１位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位、及び４３９位）、並びに、抗体のグリコシル化を改変すること（これだけに限定されないが、抗体を野生型哺乳動物グリコシル化が可能にならない環境で作製すること、すでにグリコシル化された抗体から１つ又は複数の炭水化物基を除去すること、及び抗体を１つ又は複数のアミノ酸位で改変して抗体がその位置でグリコシル化される能力を排除すること（これだけに限定されないが、Ｎ２９７Ｇ及びＮ２９７Ａ及びＤ２６５Ａを含む）を含む）が挙げられる。
【０１１９】
抗体の「補体活性化」機能、又は「補体経路の活性化」を可能にする若しくは誘発する抗体の性質とは、互換的に使用され、被験体における免疫系の補体経路を伴う又は刺激する抗体の生物活性を指す。そのような活性としては、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられ、これは、抗体のＦｃ部分と非Ｆｃ部分のどちらによっても媒介され得る。補体活性化機能を改変又は排除する方法は当技術分野で周知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、補体活性化に関与するＦｃ領域の全部又は一部を排除すること（すなわち、抗体又は抗体断片を、例えば、これだけに限定されないが、本明細書に記載され当技術分野で公知のＦａｂ断片、単鎖抗体などのＦｃ領域の全部若しくは一部を欠く形式で使用すること、又はＦｃ領域を、１つ若しくは複数のアミノ酸位、例えば、Ｃ１ｑ結合に関与することが公知の２７０位、３２２位、３２９位及び３２１位などで改変して補体構成成分との相互作用若しくは補体構成成分を活性化する能力を排除する若しくは減らすこと）、及び補体活性化に関与する非Ｆｃ領域の一部を改変又は排除すること（すなわち、１３２位でＣＨ１領域を改変することが挙げられる（例えば、Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 38217-38223)を参照されたい）。
【０１２０】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、完全長抗体は、種々のクラスに割り当てることができる。完全長抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、そしてこれらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ、及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は当該技術分野で良く知られている。
【０１２１】
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞により発現される抗体（例えばキメラ、ヒト化、又がヒト抗体或いはその抗原結合断片など）を指す。
【０１２２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。組換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例は、（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞とＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞及びベロ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ＳＦ９、ＳＦ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ属（例えば、ニコチアナタバクム）に属する植物；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（例えば、出芽酵母）、又はアスペルギルス属（例えば、クロコウジカビ）；（５）細菌細胞、例えば大腸菌細胞又は枯草菌細胞などを含む。
【０１２３】
本明細書で使用される「特異的に結合」又は「特異的に結合する」とは、抗体の抗原に対する選択的又は優先的結合を意味する。結合親和性は、一般に、スキャッチャード分析又は表面プラズモン共鳴技術などの標準的アッセイを用いて（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用して）決定される。
【０１２４】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する。一実施態様では、本発明の二重特異性又は多重特異性抗体の一つを形成する抗ＢＡＣＥ１抗体は、ＹＷ４１２．８．３１が結合するＢＡＣＥ１エピトープに結合する。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【０１２５】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【０１２６】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【０１２７】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【０１２８】
本明細書で使用する用語「ＦｃＲｎ受容体」又は「ＦｃＲｎ」は、ヒト又は霊長類の胎盤又は卵黄嚢（ウサギ）を介して胎児へ、又は小腸を経て初乳から新生児への母性ＩｇＧの移動に関与することが知られているＦｃ受容体を指す（「ｎ」は新生児を示す）。また、ＦｃＲｎはＩｇＧ分子に結合し、血清中にそれらをリサイクルすることによる一定の血清ＩｇＧレベルの維持に関与していることが知られている。「ＦｃＲｎ結合領域」又は「ＦｃＲｎ受容体結合領域」は、その部分をＦｃＲｎ受容体と相互作用する抗体のその部分を指す。
【０１２９】
抗体のＦｃＲｎ結合領域内の特定の修飾は、ＦｃＲｎに対する抗体又はその断片の親和性を増加させ、また分子のインビボでの半減期を増加させる。以下のアミノ酸位置、２５１位、２５６位、２８５位、２９０位、３０８位、３１４位、３８５位、３８９位、４２８位、４３４位及び４３６位の一以上におけるアミノ酸置換は、ＦｃＲｎ受容体との抗体の相互作用を増加させる。以下のアミノ酸位置、２３８位、２６５位、２７２位、２８６位、３０３位、３０５位、３０７位、３１１位、３１２位、３１７位、３４０位、３５６位、３６０位、３６２位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、４１３位、４２４位又は４３４位での置換、例えば（米国特許第７３７１８２６号）の置換もまたＦｃＲｎ受容体との抗体の相互作用を増加させる。
【０１３０】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、標識又は細胞傷害性薬物を含む。必要に応じてこのようなコンジュゲーションはリンカーを介してである。
【０１３１】
本明細書で使用する「リンカー」は、抗ＴｆＲ抗体を異種分子に共有結合又は非共有結合で連結する構造である。ある実施態様において、リンカーはペプチドである。他の実施態様において、リンカーは化学的リンカーである。
【０１３２】
「標識」は、本明細書の抗体と結合し、検出又はイメージングのために使用されるマーカーである。このような標識の例には、放射性標識、フルオロフォア、発色団、又はアフィニティータグが挙げられる。一実施態様において、標識は、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの医療画像に使われる放射標識である。
【０１３３】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
【０１３４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【０１３５】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【０１３６】
「抗ＴｆＲ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【０１３７】
用語「添付文書」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【０１３８】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０１３９】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍。
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【０１４０】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【０１４１】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【０１４２】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１４３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを有し、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【０１４４】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【０１４５】
組成物及び方法
Ａ．抗ＴｆＲ抗体及びコンジュゲートの製造
一態様において、本発明は、所望の分子をＢＢＢを通過して輸送するために使用することができる抗ＴｆＲ抗体に一部基づいている。ある実施態様において、ヒトＴｆＲに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、脳及び／又はＣＮＳに影響を与える疾患の診断又は治療のために有用である。
【０１４６】
Ａ．例示的な抗ＴｆＲ抗体
一態様において、本発明はＴｆＲに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ヒトＴｆＲ及び霊長類ＴｆＲの両方に特異的に結合する。あるこのような実施態様において、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合を阻害しない。あるこのような実施態様において、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲの頂端ドメインに結合する。あるこのような実施態様において、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲの非頂端ドメインに結合する。ある態様において、抗ＴｆＲ抗体は、一以上のコンジュゲート造影化合物又は治療用化合物をＢＢＢを通過して輸送するために使用することができる。
【０１４７】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ａ及び表３に示されるように、クローン７Ａ４である。
【０１４８】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ａ及び表３に示されるように、クローン８Ａ２である。
【０１４９】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ａ及び表３に示されるように、クローン１５Ｄ２である。
【０１５０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ａ及び表３に示されるように、クローン１０Ｄ１１である。
【０１５１】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ａ及び表３に示されるように、クローン７Ｂ１０である。
【０１５２】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｂ及び表３に示されるように、クローン１５Ｇ１１である。
【０１５３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｂ及び表３に示されるように、クローン１６Ｇ５である。
【０１５４】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｂ及び表３に示されるように、クローン１３Ｃ３である。
【０１５５】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｂ及び表３に示されるように、クローン１６Ｇ４である。
【０１５６】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｃ及び表３に示されるように、クローン１６Ｆ６である。
【０１５７】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｄ及び表３に示されるように、クローン７Ｇ７である。
【０１５８】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｄ及び表３に示されるように、クローン４Ｃ２である。
【０１５９】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｄ及び表３に示されるように、クローン１Ｂ１２である。
【０１６０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図３Ｄ及び表３に示されるように、クローン１３Ｄ４である。
【０１６１】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。別の態様において、抗体は、図４Ｂ及び表４に示されるように、クローン７Ａ４．ｖ１５である。
【０１６２】
クローンは、ＨＶＲ内に配列類似性を有する、４つの相補群に分類される。表３に示されるように、コンセンサス配列は、各ＨＶＲにおいて提供された抗体配列から容易に誘導可能である。非限定的な一例として、クラスＩ抗体のコンセンサスＨＶＲは以下の通りである：
ＨＶＲ−Ｌ１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−［Ｓｅｒ又はＡｓｐ］−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−［Ａｓｎ又はＰｒｏ］−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号４５）；
ＨＶＲ−Ｌ２：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号３０）；
ＨＶＲ−Ｌ３：Ｇｌｎ−［Ｇｌｎ又はＨｉｓ］−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−［Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＡｓｐ］−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号４６）；
ＨＶＲ−Ｈ１：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−［Ａｌａ又はＧｌｙ］−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号４７）；
ＨＶＲ−Ｈ２：［Ｇｌｙ又はＶａｌ］−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−［Ｔｈｒ、Ｐｈｅ又はＰｒｏ］−Ｔｙｒ−［Ｐｈｅ又はＳｅｒ］−Ｇｌｙ−［Ａｒｇ又はＬｙｓ］−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−［Ａｓｎ又はＳｅｒ］−Ｇｌｎ−［Ｌｙｓ又はＡｓｎ］−Ｐｈｅ−［Ｌｙｓ又はＭｅｔ］−Ｇｌｙ（配列番号４８）；
ＨＶＲ−Ｈ３：Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−［Ｔｙｒ又はＰｈｅ］−Ｖａｌ−［Ｍｅｔ又はＶａｌ］−Ａｓｐ−［Ｔｙｒ又はＰｈｅ］（配列番号４９）。（表４を参照）。クラスＩＩ及びＩＶに対するコンセンサス配列はまた表３に提供される。
【０１６３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。
【０１６４】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。
【０１６５】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＴｆＲ抗体を提供する。一態様において、抗体は、上記に列挙されたＨＶＲ配列の六つ全てを含む。
【０１６６】
一態様において、本発明は、上述される抗体の何れかの少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の実施態様において、抗体は、上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。更なる実施態様において、抗体は、上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ３及びＨＶＲ−Ｈ２配列を含む。別の実施態様において、抗体は、上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。別の態様において、本発明は、上述される抗体の何れかの少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１６７】
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｈ１，  ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列から選択される少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）上述される抗体の何れか一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列から選択される少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１６８】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＴｆＲ抗体はヒト化される。一実施態様において、抗ＴｆＲ抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の実施態様において、抗ＴｆＲ抗体は、上記実施態様の何れかに記載されるＨＶＲを含み、更に、一以上のＦＲ領域に一以上のアミノ酸置換を含むＶＨ又はＶＬを含む。本明細書の実施例２につき、出願人は、上記のものから選択されるある種の抗体においてアラニンスキャニングを実施し、選択されたＦＲ位置でのアミノ酸の改変にもかかわらず、類似又は改善された結合が得られたと判断した。本明細書の図６−１及び６−２並びに実施例２に示されるように、抗体のクラスＩ−ＩＩＩグループについて、ＦＲの一以上の残基において改変を有する抗体の変異体形態は親和性及び結合特異性を保持していた。例えば、抗体１５Ｇ１１において、軽鎖ＦＲ２における４３位及び４８位、重鎖ＦＲ２における４８位及び重鎖ＦＲ３における６７位、６９位、７１位及び７３位を図６−１及び６−２に示されるように改変することができ、得られた抗体は依然としてヒト／霊長類ＴｆＲに対する特異性及び強い結合親和性を保持していた。別の例において、抗体７Ａ４において、軽鎖ＦＲ３の５８位及び６８位、重鎖ＦＲ１における２４位及び重鎖ＦＲ３における７１位を図６−１及び６−２に示されるように改変することができ、得られた抗体は依然としてヒト／霊長類ＴｆＲに対する特異性及び強い結合親和性を保持していた。第三の例において、抗体１６Ｆ６において、軽鎖ＦＲ２の４３位及び４４位及び重鎖ＦＲ３の７１位及び７８位を図６−１及び６−２に示されるように改変することができ、得られた抗体は依然としてヒト／霊長類ＴｆＲに対する特異性及び強い結合親和性を保持していた。その他の態様において、抗ＴｆＲ抗体は、配列番号７−１０、１５−１８、２０、２５−２８、１０８、１１４、１２０及び１２６の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴｆＲ抗体はＴｆＲへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号７−１０、１５−１８、２０、２５−２８、１０８、１１４、１２０及び１２６において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＴｆＲ抗体は、配列番号７−１０、１５−１８、２０、２５−２８、１０８、１１４、１２０及び１２６の何れか一のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、特定の抗体のＶＨは、上記及びその特定の抗体に関する表３又は４に明記されるＨＶＲから選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。本発明の抗体のＶＨ配列は、本明細書の図３及び４に示される。
【０１６９】
別の態様において、抗ＴｆＲ抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号４−６、１１−１４、１９、２１−２４、１０５、１１１、１１７  及び１２３の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴｆＲ抗体はＴｆＲへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号４−６、１１−１４、１９、２１−２４、１０５、１１１、１１７及び１２３において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＴｆＲ抗体は、配列番号４−６、１１−１４、１９、２１−２４、１０５、１１１、１１７及び１２３の何れかのＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、ＶＬは、上記及びその特定の抗体に関する表４又は５に明記されるＨＶＲから選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。本発明の抗体のＶＬ配列は、本明細書の図３及び４に示される。
【０１７０】
別の態様において、抗ＴｆＲ抗体が提供され、抗体は、上記の実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記の実施態様の何れかに記載のＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号４及び７；５及び８；５及び９；６及び１０；４及び７；１１及び１５；１２及び１６；１３及び１７；１４及び１８；１９及び２０；２１及び２５；２２及び２６；２３及び２７；２４及び２８；１０５及び１０８；１１１及び１１４；１１７及び１２０；及び１２３及び１２６のぞれぞれのＶＬ及びＶＨ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【０１７１】
更なる態様において、本発明は、本明細書に提供される抗ＴｆＲ抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、抗体は、配列番号４及び７；５及び８；５及び９；６及び１０；４及び７；１１及び１５；１２及び１６；１３及び１７；１４及び１８；１９及び２０；２１及び２５；２２及び２６；２３及び２７；２４及び２８；１０５及び１０８；１１１及び１１４；１１７及び１２０；又は１２３及び１２６のぞれぞれのＶＬ及びＶＨ配列を含む抗ＴｆＲ抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。一態様において、抗体は、ＴｆＲへの結合について、クラスＩ中の抗体の何れか（すなわち、クローン７Ａ４、８Ａ２、１５Ｄ２、１０Ｄ１１、若しくは７Ｂ１０、又はこれらの抗体の何れかの親和性成熟バージョン）と競合する。別の態様において、抗体は、ＴｆＲへの結合について、クラスＩ中の抗体の何れか（すなわち、クローン１５Ｇ１１、１６Ｇ５、１３Ｃ３若しくは１６Ｇ、又はこれらの抗体の何れかの親和性成熟型バージョン）と競合する。別の態様において、抗体は、ＴｆＲへの結合について、クローン１６Ｆ６又はその親和性成熟型バージョンと競合する。別の態様において、抗体は、ＴｆＲへの結合について、クラスＩＶ中の抗体の何れか（すなわち、クローン７Ｇ７、４Ｃ２、１Ｂ１２若しくは１３Ｄ４、又はこれらの抗体の何れかの親和性成熟型バージョン）と競合する。
【０１７２】
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＴｆＲ抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＴｆＲ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
【０１７３】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＴｆＲ抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１７４】
１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０１７５】
本発明のある態様において、本発明の「低親和性」抗ＴｆＲ抗体は、実施例５及びＴｆＲに対するこのような低親和性抗体が、改善されたＣＮＳ（例えば、脳）取り込み及び／又は脳／ＣＮＳにおける持続を呈することを示したAtwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011) and Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44の結果に基づいて選択される。このような低親和性抗体を同定するために、限定されないが、スキャッチャードアッセイ及び表面プラズモン共鳴技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する）を含む、抗体親和性を測定するための様々なアッセイが利用できる。本発明の一実施態様によれば、抗体は、約５ｎＭから、又は約２０ｎＭから、又は約１００ｎＭから、約５０μＭまで、又は約３０μＭまで、又は約１０μＭまで、又は約１μＭまで、又は約５００ｎＭまでのヒト又は霊長類ＴｆＲに対する親和性を有する。従って、親和性は、例えばスキャッチャード分析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定される場合、約５ｎＭから約５０μＭの範囲内、又は約２０ｎＭから約３０μＭの範囲内、又は約３０ｎＭから約３０μＭの範囲内、又は約５０ｎＭから約１μＭの範囲内、又は約１００ｎＭから約５００ｎＭの範囲内であってもよい。本発明の別の実施態様では、抗体は、競合結合分析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定して、１分未満、２分未満、３分未満、４分未満、５分未満、又は１０分未満から約２０分まで、又は約３０分までの解離半減期を有する。
【０１７６】
従って、本発明は、神経障害薬を血液脳関門を通過して輸送するために有用な抗体を製造する方法であって、抗体を、ＴｆＲに対する抗体のパネルから、約５ｎＭから、又は約２０ｎＭから、又は約１００ｎＭから、約５０μＭまで、又は約３０μＭまで、又は約１０μＭまで、又は約１μＭまで、又は約５００ｍＭまでの範囲のＴｆＲに対する親和性を有することを理由に選択することを含む方法を提供する。従って、親和性は、例えばスキャッチャード分析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定される場合、約５ｎＭから約５０μＭの範囲内、又は約２０ｎＭから約３０μＭの範囲内、又は約３０ｎＭから約３０μＭの範囲内、又は約５０ｎＭから約１μＭの範囲内、又は約１００ｎＭから約５００ｎＭの範囲内であってもよい。当業者によって理解されるように、抗体が、抗体の元のターゲットとは異なる抗原に結合する一以上のアームを持つ多重特異的に作成される場合、例えば、一つの結合アームの立体障害又は排除が原因で、抗体に異種分子／化合物をコンジュゲートさせることは、多くの場合、その標的に対する抗体の親和性を減少させる。一実施態様において、抗ＢＡＣＥ１にコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定される場合ＴｆＲに対するＫｄがおよそ３０ｎＭであった。別の実施態様において、ＢＡＣＥ１にコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定される場合ＴｆＲに対するＫｄがおよそ６００ｎＭであった。別の実施態様において、ＢＡＣＥ１にコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定される場合ＴｆＲに対するＫｄがおよそ２０μＭであった。別の実施態様において、ＢＡＣＥ１にコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定される場合ＴｆＲに対するＫｄがおよそ３０μＭであった。
【０１７７】
一実施態様において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原により実施される。例えば、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物は、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕獲プレートへと移される。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。それぞれ最大結合の２０％以下の濃度のＦａｂを選択して競合結合アッセイに用いる。
【０１７８】
一態様において、ＲＩＡは、スキャッチャード分析である。例えば、目的の抗ＴｆＲ抗体はラクトペルオキシダーゼ法（Bennett and Horuk, Methods in Enzymology 288 pg.134-148 (1997)）を用いてヨウ素化することができる。放射性標識抗ＴｆＲ抗体はＮＡＰ−５カラム用いたゲルろ過によって遊離の１２５Ｉ−Ｎａから精製され、その比放射能が測定される。ヨウ素化抗体の一定濃度と段階希釈された非標識抗体の減少する濃度を含有する５０μＬの競合反応混合物を９６ウェルプレート中に配置する。ＴｆＲを一時的に発現する細胞が、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬグルタミンと１×ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からなる増殖培地で、３７℃で５％のＣＯ２中で培養される。細胞は、シグマ細胞解離溶液を使用して、皿から剥離し、結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳを、ｐＨ７．２、及び０．２％アジ化ナトリウムを有するＤＭＥＭ）で洗浄する。洗浄した細胞を、５０μＬの競合反応混合物を含有する９６ウェルプレートに結合緩衝液０．２ｍＬ中およそ２０万細胞の密度で添加する。細胞との競合反応物の非標識抗体の最終濃度は、１０００ｎＭで開始し、次いで１０の濃度に対して１：２培希釈により減少させ、無添加の緩衝液のみの試料を含み、変化させる。非標識抗体の各濃度について細胞との競争反応を３回アッセイする。細胞との競合反応物を室温で２時間インキュベートする。２時間のインキュベーション後に、競争反応は、フィルタープレートに移し、結合したヨウ素化抗体から解放し分離するために結合緩衝液で４回洗浄する。フィルターは、ガンマカウンターでカウントされ、結合データは、抗体の結合親和性を決定するためにMunsonとRodbard (1980)のフィッティングアルゴリズムを用いて評価される。
【０１７９】
本発明による組成物を用いる典型的なＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析は以下の通りである。Ｋｄは、抗ヒトＦｃキット（ＢｉＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定した。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質のおよそ１００００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入された。抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学測定では、単一特異性又は多重特異性抗ＴｆＲ抗体変異体を、約２２０ＲＵ程度に達するようにＨＢＳ−Ｐに注入し、次いでＭｕＴｆＲ−Ｈｉｓ（０．６１ｎＭから１５７ｎＭ）の二倍段階希釈を約３０μｌの／分の流速で２５℃でＨＢＳ−Ｐに注入した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。
【０１８０】
別の実施態様によれば、Ｋｄは、抗ヒトＦｃキット（ＢｉＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）による表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質のおよそ１００００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定では、抗ＴｆＲ抗体変異体を、約２２０ＲＵ程度に達するようにＨＢＳ−Ｐに注入し、次いでＴｆＲ−Ｈｉｓ（０．６１ｎＭから１５７ｎＭ）の二倍段階希釈を約３０μｌの／分の流速で２５℃でＨＢＳ−Ｐに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。
【０１８１】
所与の化合物についてＩＣ５０を決定するいくつかの方法が当該技術分野で知られており；一般的な方法は、競合結合アッセイ、例えば本明細書に記載されるアッセイを行うことである。一般に、高いＩＣ５０とは、より多くの抗体が既知のリガンドの結合を阻害するために必要であり、従ってそのリガンドに対する抗体の親和性は比較的低いことを示している。一般に、低いＩＣ５０とは、より少ない抗体が既知のリガンドの結合を阻害するために必要であり、従ってそのリガンドに対する抗体の親和性は比較的高いことを示している。
【０１８２】
ＩＣ５０を測定する典型的な競合ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ＴｆＲ又は抗ＴｆＲ／脳抗原（即ち、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａなど）変異体抗体の濃度を増加させることがＴｆＲへの結合について既知のビオチン化ＴｆＲＡ抗体に対して競合することに用いられるものである。抗ＴｆＲ競合ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌの精製されたマウスＴｆＲ細胞外ドメインにより４℃で一晩被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ，Ｎ．Ｊ．）で実行された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。個々の抗ＴｆＲ又は抗ＴｆＲ／脳抗原の各々（即ち抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａ）の滴定（１：３段階希釈）が既知のビオチン化抗ＴｆＲＡと組み合わされ（０．５ｎＭの最終濃度）、室温で１時間プレートへ添加された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）がプレートに加えられ、室温で１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、プレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲ抗体がＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。
【０１８３】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１８４】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１８５】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号（Ｂ１）を参照）。
【０１８６】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による産生を含む。
【０１８７】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなど）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「プリミタイズド（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる（米国特許第５６９３７８０号）。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１８８】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１８９】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１９０】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１９１】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１９２】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ  技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１９３】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【０１９４】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１９５】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１９６】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１９７】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＴｆＲに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＴｆＲの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた、ＴｆＲを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１９８】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１９９】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＴｆＲ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０２００】
本発明の一実施態様によれば、「結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」は多重特異性抗体（二重特異性抗体など）を生成することによって達成される。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原又はエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一実施態様において、多重特異性抗体は、ＴｆＲに結合する第一の抗原結合部位及び脳抗原、例えばβ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）又はＡｂｅｔａなど、及び本明細書に開示される他の脳抗原に結合する第二の抗原結合部位を含む。
【０２０１】
そのような二重特異性／多重特異性抗体によって結合される典型的な脳抗原はＢＡＣＥ１であり、それに結合する典型的な抗体は本明細書の図１６Ａ−ＢのＹＷ４１２．８．３１抗体である。
【０２０２】
別の実施態様において、脳抗原はＡｂｅｔａであり、典型的なそのような抗体は国際公開第２００７０６８４１２号，国際公開第２００８０１１３４８号、国際公開第２００８０１５６６２２号及び国際公開第２００８１５６６２１号に記載されており、図１１Ａと１１Ｂのそれぞれの重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列を含むＩｇＧ４ ＭＡＢＴ５１０２Ａ抗体を含む典型的なＡｂｅｔａ抗体とともに、参照により本明細書に明確に援用される。
【０２０３】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１））；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」；技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994）を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０２０４】
「オクトパス抗体」又は「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号及びWu et al. Nature Biotechnology (2007)を参照）。
【０２０５】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が検討される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
【０２０６】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、表２の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表２の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
0006612214.tif 000003
【０２０７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２０８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うこととなる。
【０２０９】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２１０】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接触する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し再選択すことによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーが、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するする別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０２１１】
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲ中の抗原と接触する残基以外であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０２１２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２１３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２１４】
ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０２１５】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０２１６】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指すが；しかしながら、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ａ１）、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号（Ａ１）、Ａdams et al., 特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０２１７】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６６０２６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記述される。
【０２１８】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０２１９】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464頁の表3に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. ら、Blood 101:1045-1052 (2003)；並びにCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０２２０】
エフェクター機能が減少した抗体の非限定的な例は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一又は複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２２１】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０２２２】
ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する一以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０２２３】
幾つかの実施態様において、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記述されるように、改変された（即ち、改善され又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされる。
【０２２４】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Hintonら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
【０２２５】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２２６】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。ある実施態様において、置換された残基は、抗体の接触可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体の接触可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、以下の残基の何れか又は複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０２２７】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０２２８】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２２９】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＴｆＲ抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＴｆＲ抗体を作成する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０２３０】
抗ＴｆＲ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０２３１】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
【０２３２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０２３３】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０２３４】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０２３５】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977）に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０２３６】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＴｆＲ抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０２３７】
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
抗体とＴｆＲの結合を決定するための種々の技法が利用可能である。そのようなアッセイの１つは、ヒトＴｆＲ（及び脳抗原）に結合する能力を確認するための酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイによると、抗原（例えば組換えＴｆＲ）でコーティングしたプレートを抗ＴｆＲ抗体を含む試料と一緒にインキュベートし、抗体と対象の抗原の結合を決定する。
【０２３８】
一態様では、本発明の抗体をその抗原結合活性について、例えば、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによって試験する。
【０２３９】
別の態様において、ＴｆＲへの結合について本発明の抗体の何れかと競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。特定の実施態様において、そのような競合抗体は、本発明の抗体の何れか、より具体的には、本明細書に記載されるクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶ中の抗体によって特異的に結合されるエピトープの何れかによって結合される同じエピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）に結合する（例えば、実施例１及び表４を参照）。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)のMorris (1996) “Epitope Mapping Protocols,"に提供される。
【０２４０】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＴｆＲは、ＴｆＲに結合する第一の標識された抗体（例えば本明細書に開示される一以上の抗体）、及びＴｆＲへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＴｆＲが、未標識の第二の抗体でなく、標識された第一の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ＴｆＲへの第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたＴｆＲに結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたＴｆＲに結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＴｆＲへの結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２４１】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＴｆＲ抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、抗体に結合した／コンジュゲートした化合物を、ＢＢＢを通過させて脳及び／又はＣＮＳ中に輸送することを含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０２４２】
ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【０２４３】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＴｆＲ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２４４】
一実施態様において、本明細書における抗ＴｆＲ抗体は、より効率的に薬物、化学療法剤及び／又は造影剤をＢＢＢを通過して輸送するために、神経障害薬、化学療法剤及び／又は造影剤と結合している。
【０２４５】
共有結合は、直接又はリンカーを介してすることができる。ある実施態様において、直接コンジュゲーションは、タンパク質融合（すなわち、抗ＴｆＲ抗体と例えば神経障害薬をコードする２つの遺伝子の遺伝子融合、及び単一タンパク質としての発現による）の構築による。ある実施態様において、直接コンジュゲーションは、抗ＴｆＲ抗体の２つの部分の片方の反応基と例えば神経薬の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合を形成することによる。ある実施態様において、直接コンジュゲーションは、適切な条件下でコンジュゲートすべき他の分子に共有結合を形成する反応性基を（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基など）を含めるために、コンジュゲートすべき２分子の一方の改変（すなわち、遺伝子組み換え）によるものである。非限定的な一例としては、所望の反応基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）を抗ＴｆＲＲ抗体中に導入することができ、ジスルフィド結合が例えば神経薬と形成され得る。タンパク質への核酸の共有結合のための方法もまた、当技術分野で知られている（すなわち、光架橋、例えば、Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)を参照）。
【０２４６】
非共有結合は、当業者によって容易に理解されるであろうように、疎水結合、イオン結合、静電相互作用などを含む、任意の非共有結合方法によって行うことができる。
【０２４７】
コンジュゲーションはまたさまざまなリンカーを使って行うことができる。例えば、抗ＴｆＲ抗体と神経薬は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを使ってコンジュゲートされ得る。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。ペプチド結合により連結した１から２０個のアミノ酸から成るペプチドリンカーもまた使用することができる。ある実施態様において、アミノ酸は２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。他の特定のこのような実施態様では、アミノ酸の１つ以上が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選ばれる。リンカーは、脳への送達の際に神経薬の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であって良い。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０２４８】
本明細書の発明は、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に熟慮している。
【０２４９】
一実施態様において、免疫複合体は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、そこでは、抗体が、限定されないが、マイタンシノイド（例えば、米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（例えば、米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（例えば、米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）、及びオルタタキセルなどのタキサン；及びＣＣ１０６５を含む、一又は複数の薬物に結合している。
【０２５０】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
【０２５１】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２５２】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＴｆＲ抗体の何れかは、生物学的試料中のＴｆＲの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば血液（すなわち、未成熟赤血球）、ＣＳＦ、及びＢＢＢを含有する組織を含む。
【０２５３】
一実施態様において、診断又は検出の方法において使用のための抗ＴｆＲ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＴｆＲの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＴｆＲ抗体のＴｆＲへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＴｆＲ抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗ＴｆＲ抗体とＴｆＲとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であり得る。一実施態様において、例えばＴｆＲが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＴｆＲ抗体が抗ＴｆＲ抗体を用いた治療に好適な被検体を選択するために使用される。
【０２５４】
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害は、ＴｆＲが網状赤血球内で発現され、従って本発明の抗体の何れかにより検出可能であという事実によって、未成熟赤血球が関与する障害を含む。かかる障害は、網状赤血球の減少したレベルに起因する貧血及び他の障害、又は、例えば網状赤血球の過剰増殖に起因する赤血球数の上昇により、血液が濃くなり、同時に生理的症状が生じる、先天性赤血球増加症若しくは新生物性真性赤血球増加症を含む。
【０２５５】
ある実施態様において、標識された抗ＴｆＲ抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０２５６】
一実施態様において、インタクトな抗体はエフェクター機能を欠失している。別の実施態様において、インタクトな抗体は減少したエフェクター機能を有する。別の実施態様において、インタクトな抗体は減少したエフェクター機能を有するように操作される。一態様において、抗体はＦａｂである。別の態様において、抗体は、エフェクター機能を低下させ又は排除する一以上のＦｃ変異を有する。別の態様において、抗体は、例えば、正常なヒトのグリコシル化酵素を欠いた系で抗体を産生することにより、グリコシル化を改変させている。別の態様において、Ｉｇ骨格は、自然に、制限されたエフェクター機能を保有するか又は全くエフェクター機能を保有しないものに改変される。
【０２５７】
抗体とＴｆＲの結合を決定するための種々の技法が利用可能である。そのようなアッセイの１つは、ヒトＴｆＲ（及び脳抗原）に結合する能力を確認するための酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイによると、抗原（例えば組換えＴｆＲ）でコーティングしたプレートを抗ＴｆＲ抗体を含む試料と一緒にインキュベートし、抗体と目的の抗原の結合を決定する。
【０２５８】
全身投与された抗体の取り込み及び抗体の他の生物学的活性を評価するためのアッセイを、本実施例に開示されるように又は目的の抗ＣＮＳ抗原抗体について知られているように行うことができる。
【０２５９】
一態様において、生物学的活性を有する抗ＢＡＣＥ１抗体に（共有結合又は非共有結合で）コンジュゲートした抗ＴｆＲ抗体を同定するためにアッセイが提供される。生物活性は、例えば、ＢＡＣＥ１のアスパルチルプロテアーゼ活性の阻害を含むことができる。例えば、均一時間分解蛍光ＨＴＲＦアッセイ又は合成基質ペプチドを用いるマイクロ流体キャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）アッセイによって、あるいはＡＰＰなどのＢＡＣＥ１基質を発現する細胞株においてインビボで評価される場合に、インビボ及び／又はインビトロでそうした生物活性を持つ抗体も与えられる。
【０２６０】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＴｆＲ抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２６１】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２６２】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患の障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害又はＣＮＳの炎症を治療するための一以上の活性成分を更に提供することが望まれ得る。典型的なそうした医薬が以下に議論される。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２６３】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系に（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。１種又は複数種の治療剤を抗ＴｆＲ抗体とカップリングしたリポソームに封入することができる（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）。
【０２６４】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。徐放性マトリックスの非限定的な例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）から構成される注射用ミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２６５】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより達成することができる。
【０２６６】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＴｆＲ抗体の何れかを、治療方法で使用することができる。一態様では、医薬として使用するための抗ＴｆＲ抗体が提供される。例えば、本発明は、治療用化合物を、赤血球集団に対する影響を低下させ又は排除して血液脳関門を通して輸送する方法であって、治療用化合物（例えばＴｆＲと脳抗原の両方に結合する多重特異性抗体）とカップリングした抗ＴｆＲ抗体をＢＢＢに曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした治療用化合物がＢＢＢを通過して輸送されることを含む方法を提供する。別の例では、本発明は、神経障害薬を血液脳関門を通過して輸送する方法であって、脳障害薬（例えばＴｆＲと脳抗原の両方に結合する多重特異性抗体）とカップリングした本発明の抗ＴｆＲ抗体をＢＢＢに曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした神経障害薬がＢＢＢを通過して輸送され、赤血球集団に対する影響は低下する又は排除されることを含む方法を提供する。一実施態様では、ＢＢＢは哺乳動物（例えばヒト）、例えば、これだけに限定することなく、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、外傷性脳損傷などを含めた神経性障害を有する哺乳動物（例えばヒト）におけるものである。
【０２６７】
一実施態様では、神経性障害は、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌（例えばＣＮＳ又は脳に関与する）、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症（例えばＣＮＳ又は脳の炎症）、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、リソソーム蓄積症などから選択される。本発明の抗体は、一以上の結合した活性成分／カップリングした治療用化合物をＢＢＢを通過させて、神経障害がその分子性、細胞性、又はウイルス性／微生物性の基礎を見出すようなＣＮＳ／脳へと輸送するその能力のために、神経障害の治療に特に適している。
【０２６８】
ニューロパチー障害は、神経シグナル伝達が不適切である若しくは制御されていない、又はそれを欠くことを特徴とする神経系の疾患又は異常であり、それらとして、これだけに限定されないが、慢性疼痛（侵害受容性疼痛を含む）、癌に関連する疼痛を含めた体組織への傷害によって引き起こされる疼痛、神経因性疼痛（神経、脊髄、又は脳における異常によって引き起こされる疼痛）、及び心因性疼痛（完全に又は大部分が心理学的障害に関連する）、頭痛、片頭痛、ニューロパチー、並びに多くの場合そのようなニューロパチー障害に付随する症状及び症候群、例えば、眩暈又は悪心などが挙げられる。
【０２６９】
神経障害性障害については、神経薬は、限定されないが、オピオイド／麻薬性鎮痛薬（すなわち、モルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、メペリジン、メタドン、オキシモルフォン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、トラマドール、コデイン、オキシコドン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（すなわち、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、及びトルメチン）、コルチコステロイド（すなわち、コーチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンやトリアムシノロン）、抗片頭痛剤（すなわち、スマトリプタン、アルモトリプタン、フロバトリプタン、スマトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、ゾルミトリプタン、エレトリプタンとエルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン）、アセトアミノフェン、サリチル酸塩（すなわち、アスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、ジフルニサル、そしてサルサラート）抗痙攣（すなわち、カルバマゼピン、クロナゼパム、ガバペンチン、ラモトリジン、プレガバリン、チアガビン、及びトピラマート）、麻酔薬（すなわち、イソフルラン、トリクロロエチレン、ハロタン、セボフルラン、ベンゾカイン、クロロ、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、ノボカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、アルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、サキシトキシンとテトロドトキシン）、及びＣＯＸ−２阻害剤（すなわち、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ）を含む鎮痛剤から選択することができる。眩暈を伴うニューロパチー障害に対しては、これだけに限定されないが、メクリジン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン及びジアゼパムを含めた、抗眩暈剤である神経薬を選択することができる。悪心を伴うニューロパチー障害に対しては、これだけに限定されないが、プロメタジン、クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、及びメトクロプラミドを含めた、制吐剤である神経薬を選択することができる。
【０２７０】
アミロイドーシスは、ＣＮＳにおける細胞外タンパク性沈着に関連する疾患及び障害のグループであり、限定されないが、続発性アミロイドーシス、加齢に伴うアミロイドーシス、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）；パーキンソン認知症症候群、脳アミロイド血管症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、ＨＩＶ関連認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、及びβ−アミロイド沈着（に関連する眼疾患（すなわち、黄斑変性症、ドルーゼ関連視神経症、白内障）を含む。
【０２７１】
アミロイドーシスについては、神経薬を選択することができ、限定されないが、抗体、又は、βセクレターゼ、タウ、プレセニリン、そのアミロイド前駆体タンパク質又はその部分、アミロイドβペプチド又はそれらのオリゴマー又は線維、細胞死受容体６（ＤＲ６）、糖化最終産物に対する受容体（ＲＡＧＥ）、パーキン、そしてチンチン、コリンエステラーゼ阻害剤（すなわち、ガランタミン、ドネペジル、リバスチグミン及びタクリン）；ＮＭＤＡ受容体拮抗薬（すなわち、メマンチン）、モノアミン枯渇薬（すなわち、テトラベナジン）；メシル酸エルゴロイド、抗コリン抗パーキンソン剤（すなわち、プロシクリジン、ジフェンヒドラミン、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、ビペリデン及びトリヘキシフェニジル）；ドーパミン作動性抗パーキンソン剤（すなわち、エンタカポン、セレギリン、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ロチゴチン、セレギリン、ロピニロール、ラサギリン、アポモルフィン、カルビドパ、レボドパ、ペルゴリド、トルカポンとアマンタジン）；テトラベナジン；抗炎症薬（限定されないが、非ステロイド性抗炎症薬（すなわち、インドメタシン及び上記の他の化合物）を含む；ホルモン（すなわち、エストロゲン、プロゲステロン及びロイプロリド）；ビタミン（すなわち、葉酸、ニコチンアミド）；ジメボリン；ホモタウリン（すなわち、３−アミノプロパンスルホン酸；３ＡＰＳ）；セロトニン受容体活性のモジュレーター（すなわち、キサリプロデン）；インターフェロン、及びグルココルチコイド、から選択される標的に特異的に結合する他の結合分子（限定されないが、小分子、ペプチド、アプタマー、又は他の蛋白質結合を含む）を含む。
【０２７２】
ＣＮＳの癌は、一つ以上のＣＮＳの細胞（すなわち、神経細胞）の異常増殖によって特徴づけられ、限定されないが、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、及び硬膜外、硬膜内髄内又は腫瘍を含む。
【０２７３】
癌に対しては、化学療法剤である神経薬を選択することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）を含む）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマＩＩ及びカリチアマイシンオメガＩＩなど（例えば、Agnew, Chem Intl. Engl.編、33: 183-186 (1994)を参照されたい）；ジネミシンＡを含めたジネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む��、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎ホルモン（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充物、例えば、フォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、クレモホールを含まない、アルブミンで操作したパクリタキセルのナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；薬学的に許容される塩、上記の何れかの酸又は誘導体；並びに上記の２つ以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、及びオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせて用いる治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。
【０２７４】
癌の成長を促進し得るホルモンの影響を調節する、低下させる、遮断する、又は阻害するように作用する抗ホルモン剤も化学療法剤のこの定義に包含され、これらは、多くの場合、全身治療（ｓｙｓｔｅｍｉｃ，又はｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の形態である。抗ホルモン剤はホルモン自体であってよい。例として、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含めた抗エストロゲン剤及び選択的なエストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制する又は活動停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプトレリンなど；他の抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなど、並びに副腎におけるエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが挙げられる。更に、そのような化学療法剤の定義は、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネートなど；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係づけられるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ジトシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても公知のＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）、及び薬学的に許容される塩、上記の何れかの酸又は誘導体を包含する。
【０２７５】
癌を治療又は予防するための神経薬として選択することができる化合物の別の群は、抗癌免疫グロブリン（これだけに限定されないが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ及びリツキシマブを含む）である。いくつかの場合には、これだけに限定されないが、トシツモマブと１３１Ｉ放射標識、又はトラスツズマブエムタンシンを含めた、抗体と毒性標識の組み合わせ又はコンジュゲートを使用して、所望の細胞（すなわち、癌細胞）を標的化し、死滅させることができる。
【０２７６】
眼疾患又は障害は、眼の疾患又は障害であり、本明細書における目的においてＢＢＢによって分離されるＣＮＳの器官と見なされる。眼の疾患又は障害は、本発明の目的に関して、ＢＢＢによって隔離されたＣＮＳ臓器と考えられる眼の疾患又は障害である。眼の疾患又は障害としては、これだけに限定されないが、強膜、角膜、虹彩及び毛様体の障害（すなわち、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜剥離、雪眼炎、アーク眼、タイゲソン点状表層角膜症、角膜血管新生、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎及びぶどう膜炎）、水晶体の障害（すなわち、白内障）、脈絡膜及び網膜の障害（すなわち、網膜剥離、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、黄斑変性症（滲出型又は萎縮型）、網膜上膜、網膜色素変性症及び黄斑浮腫）、緑内障、飛蚊症、視神経及び視覚路の障害（すなわち、レーベル遺伝性視神経症及び視神経乳頭ドルーゼン）、眼筋／両眼運動／遠近調節／屈折の障害（すなわち、斜視、眼麻痺、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、遠視、近視、乱視、不同視、老視及び眼筋麻痺）、視覚障害及び視覚消失（すなわち、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、色覚異常（ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）、色覚異常（ａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ）、夜盲症、視覚消失、河川盲目症及び小眼球症／コロボーマ）、赤目、アーガイル・ロバートソン瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症及び無虹彩症が挙げられる。
【０２７７】
眼の疾患又は障害に対しては、眼科抗血管新生薬（すなわち、ベバシズマブ、ラニビズマブ及びペガプタニブ）、眼科緑内障薬（すなわち、カルバコール、エピネフリン、臭化デメカリウム、アプラクロニジン、ブリモニジン、ブリンゾラミド、レボブノロール、チモロール、ベタキソロール、ドルゾラミド、ビマトプロスト、カルテオロール、メチプラノロール、ジピベフリン、トラボプロスト及びラタノプロスト）、炭酸脱水素酵素阻害剤（すなわち、メタゾラミド及びアセタゾラミド）、眼科抗ヒスタミン薬（すなわち、ナファゾリン、フェニレフリン及びテトラヒドロゾリン）、眼科潤滑剤、眼科ステロイド（すなわち、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デキサメタゾン、ジフルプレドナート、リメキソロン、フルオシノロン、メドリゾン及びトリアムシノロン）、眼科麻酔薬（すなわち、リドカイン、プロパラカイン及びテトラカイン）、眼科抗感染薬（すなわち、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、クロラムフェニコール、バシトラシン／ポリミキシンｂ、スルファセタミド、トブラマイシン、アジスロマイシン、ベシフロキサシン、ノルフロキサシン、スルフイソキサゾール、ゲンタマイシン、イドクスウリジン、エリスロマイシン、ナタマイシン、グラミシジン、ネオマイシン、オフロキサシン、トリフルリジン、ガンシクロビル、ビダラビン）、眼科抗炎症薬（すなわち、ネパフェナク、ケトロラク、フルルビプロフェン、スプロフェン、シクロスポリン、トリアムシノロン、ジクロフェナク及びブロムフェナク）、並びに眼科抗ヒスタミン薬又は充血除去薬（すなわち、ケトチフェン、オロパタジン、エピナスチン、ナファゾリン、クロモリン、テトラヒドロゾリン、ペミロラスト、ベポタスチン、ナファゾリン、フェニレフリン、ネドクロミル、ロドキサミド、フェニレフリン、エメダスチン及びアゼラスチン）である神経薬を選択することができる。
【０２７８】
ＣＮＳのウイルス又は微生物感染症としては、これだけに限定されないが、急性又は慢性であり得る髄膜炎、脳炎、脊髄炎、血管炎及び膿瘍を含めたＣＮＳ病態生理を生じる、ウイルス（すなわち、インフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹）、細菌（すなわち、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）の種、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）の種、及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、並びに真菌などの他の微生物（すなわち、酵母、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、寄生生物（すなわち、トキソプラズマ原虫）又はアメーバによる感染症が挙げられるが、これだけに限定されない。
【０２７９】
ウイルス性疾患又は微生物性疾患に対しては、これだけに限定されないが、抗ウイルス化合物（これだけに限定されないが、アダマンタン抗ウイルス薬（すなわち、リマンタジン及びアマンタジンを含む）、抗ウイルスインターフェロン（すなわち、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（すなわち、マラビロク）、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（すなわち、ラルテグラビル）、ノイラミニダーゼ阻害剤（すなわち、オセルタミビル及びザナミビル）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（すなわち、エファビレンツ、エトラビリン、デラビルジン及びネビラピン）、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（テノホビル、アバカビル、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、エンテカビル、エムトリシタビン、アデホビル、ザルシタビン、テルビブジン及びジダノシン）、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ダルナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル及びサクイナビル）、プリンヌクレオシド（すなわち、バラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、リバビリン、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドホビル）、及び種々雑多な抗ウイルス薬（すなわち、エンフビルチド、ホスカルネット、パリビズマブ及びホミビルセン））、抗生物質（これだけに限定されないが、アミノペニシリン系抗生物質（すなわち、アモキシシリン、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロサキシリン、フルクロキサシリイン、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラリシン及びバカンピシリン）、セファロスポリン系抗生物質（すなわち、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、及びセフォキシチン）、カルバペネム／ペネム系抗生物質（すなわち、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム及びドリペネム）、モノバクタム系抗生物質（すなわち、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンＡ及びタブトキシニン−ベータ−ラクタム、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤（すなわち、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタム）と別のベータ−ラクタム系抗生物質の組合せ、アミノグリコシド系抗生物質（すなわち、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、及びパロモマイシン）、アンサマイシン系抗生物質（すなわち、ゲルダナマイシン及びハービマイシン）、カルバセフェム系抗生物質（すなわち、ロラカルベフ）、グリコペプチド系抗生物質（すなわち、テイコプラニン及びバンコマイシン）、マクロライド系抗生物質（すなわち、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン及びスペクチノマイシン）、モノバクタム系抗生物質（すなわち、アズトレオナム）、キノロン系抗生物質（すなわち、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン及びテマフロキサシン）、スルホンアミド系抗生物質（すなわち、マフェニド、スルホンアミドクリソイジン（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール）、テトラサイクリン系抗生物質（すなわち、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン及びオキシテトラサイクリン）、抗新生物性又は細胞傷害性抗生物質（すなわち、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ペントスタチン及びバルルビシン）、並びに種々雑多な抗細菌化合物（すなわち、バシトラシン、コリスチン及びポリミキシンＢ））、抗真菌薬（すなわち、メトロニダゾール、ニタゾキサニド、チニダゾール、クロロキン、ヨードキノール及びパロモマイシン）、並びに駆虫薬（これだけに限定されないが、キニーネ、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アーテミシニン、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、リファンピン、アンホテリシンＢ、メラルソプロール、エフロルニチン及びアルベンダゾールを含む）を含む神経薬を選択することができる。
【０２８０】
ＣＮＳの炎症は、限定されないが、ＣＮＳへの損傷によって引き起こされる炎症であり、物理的な損傷（すなわち、事故、手術、脳外傷、脊髄損傷、脳震盪により）及びＣＮＳの一つ以上の他の疾患又は障害（すなわち、膿瘍、癌、ウイルスや細菌感染）に起因するか又は関連する傷害であり得る。
【０２８１】
ＣＮＳの炎症については、神経薬は、炎症そのものを解決すること（すなわち、イブプロフェンやナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症薬）、又は炎症の根本的な原因を扱うもの（すなわち、抗ウイルスや抗がん剤）を選択することができる。
【０２８２】
ＣＮＳの虚血は、本明細書で使用される場合、異常な血流や脳内の血管の挙動又はその原因に関連する疾患群を指し、従って、局所脳虚血、全脳虚血、脳卒中（すなわち、くも膜下出血や脳内出血）及び動脈瘤を含むが、これらに限定されない。
【０２８３】
虚血については、神経薬は、限定されないが、血栓溶解剤（すなわち、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼとテネクテプラーゼ）、血小板凝集阻害剤（例えば、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、プラスグレルとジピリダモール）、スタチン（すなわち、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及びピタバスタチン）、血流や血管の柔軟性を向上させるための化合物、例えば血圧の薬を含むものから選択され得る。
【０２８４】
神経変性疾患はＣＮＳ内の神経細胞の機能の喪失及び死に関連する疾患及び障害のグループであり、限定されないが、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパーズ症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、アミロイドーシスに起因するか又は関連付けられている変性、フリードライヒ失調症、前頭側頭葉変性症、ケネディ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、横断性脊髄炎、レフサム病、脊髄小脳失調を含む。
【０２８５】
神経変性疾患において、神経薬は、成長ホルモンや神経栄養因子から選択することができ、例としては、限定されないが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。
【０２８６】
ＣＮＳの発作性疾患及び障害は、ＣＮＳにおいて不適切及び／又は異常な電気伝導を伴い、限定されないが、てんかん（すなわち、欠神発作、脱力発作、良性ローランドてんかん、小児欠、間代発作、複雑部分発作、前頭葉てんかん、熱性けいれん、乳児痙攣、若年性ミオクロニーてんかん、若年欠神てんかん、レノックス・ガストー症候群、ランダウＫｌｅｆｆｎｅｒ症候群、Ｄｒａｖｅｔ（ドラベ）症候群、大田原症候、ウエスト症候群、ミオクロニー発作、ミトコンドリア病、進行性ミオクローヌスてんかん、心因性発作、反射てんかん、ラスムッセン症候群、単純部分発作、二次性全般化発作、側頭葉てんかん、強直間代発作、強直発作、精神運動発作、辺縁系てんかん、部分てんかん発作、全身てんかん発作、てんかん重積状態、腹部てんかん、無動発作、自律神経発作、重度の両側性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、くず折れ発作、感情的な発作、焦点発作、笑い発作、ジャクソンマーチ、ラフォラ病、運動発作、多発性発作、夜間発作、感光性発作、擬似発作、感覚発作、微妙な発作、シルヴァン発作、離脱性痙攣、及び視覚反射発作）を含む。
【０２８７】
発作性疾患については、ＣＮＳ活性化合物は、抗けいれん薬又は抗てんかん薬から選択され得、限定されないが、バルビツレート系抗けいれん薬（すなわち、プリミドン、メタルビタール、メホバルビタール、アロバルビタール、アモバルビタール、アプロバルビタール、アルフェナール、バルビタール、ブラロバルビタール及びフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン系抗けいれん薬（すなわち、ジアゼパム、クロナゼパム、及びロラゼパム）、カルバメート抗けいれん薬（すなわちフェルバメート）、炭酸脱水酵素阻害薬の抗けいれん薬（すなわち、アセタゾラミド、トピラマートとゾニサミド）、ジベンズアゼピン抗けいれん薬（すなわち、ルフィナマイド、カルバマゼピン、そしてオクスカルバゼピン）、脂肪酸誘導体の抗痙攣薬（すなわち、ジバルプロックスとバルプロ酸）、γ−アミノ酪酸類似体（すなわち、プレガバリン、ガバペンチン及びビガバトリン）、γ−アミノ酪酸再取り込み阻害剤（すなわち、チアガビン）、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ阻害剤（すなわち、ビガバトリン）、ヒダントイン抗けいれん薬（例えば、フェニトイン、エトトイン、ホスフェニトイン及びメフェニトイン）、その他の抗けいれん薬（すなわち、ラコサミド、硫酸マグネシウム）、プロゲスチン（すなわち、プロゲステロン）、オキサゾリジンの抗けいれん薬（すなわち、パラメタジオン及びトリメタジオン）、ピロリジン抗けいれん薬（すなわち、レベチラセタム）、スクシンイミド抗けいれん薬（すなわち、エトスクシミド及びメトスクシミド）、トリアジン抗けいれん薬（すなわち、ラモトリジン）、及び尿素抗けいれん薬（すなわち、フェナセミド及びフェネトライド）を含む。
【０２８８】
行動障害とは、罹患している被験者の一部の異常な行動によって特徴づけられるＣＮＳの障害であり、限定されないが、睡眠障害（すなわち、不眠、睡眠時随伴症、夜驚症、概日リズム睡眠障害、ナルコレプシー）、気分障害（すなわち、うつ病、自殺、うつ病、不安、慢性的な情動障害、恐怖症、パニック発作、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、慢性疲労症候群、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害、双極性障害）、摂食障害（すなわち、食欲不振や過食症）、精神病、発達行動障害（すなわち、自閉症、レット症候群、アスペルガー症候群）、人格障害及び精神病性障害（すなわち、統合失調症、妄想性障害など）を含む。
【０２８９】
行動障害については、神経薬は、限定されないが、非定型抗精神薬（すなわち、リスペリドン、オランザピン、アリピプラゾール、クエチアピン、パリペリドン、アセナピン、クロザピン、イロペリドン及びジプラシドン）、フェノチアジン系抗精神病薬（すなわち、プロクロルペラジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、トリフルオ、チオリダジン及びメソリダジン）、チオキサンテン（すなわち、チオチキセン）、その他の抗精神病薬（すなわち、ピモジド、リチウム、モリンドン、ハロペリドールとロキサピン）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（すなわち、シタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチンやセルトラリン）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害薬、抗うつ薬（すなわち、デュロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、三環系（すなわち、ドキセピン、クロミプラミン、アモキサピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、トリミプラミン、イミプラミン、プロトリプチリンとデシプラミン）、四環系抗うつ薬（すなわち、ミルタザピン及びマプロチリン）、抗うつフェニルピペラジン（すなわち、トラゾドンとネファゾドン）、モノアミン酸化酵素阻害薬（すなわち、イソカルボキサジド、フェネルジン、セレギリン及びトラニルシプロミン）、ベンゾジアゼピン（すなわち、フルラゼパム、クロナゼパム、ロラゼパム、ジアゼパム、エスタゾラム、アルプラゾラム）、ノルエピネフリンドーパミン再取り込み阻害剤（すなわち、ブプロピオン）、中枢神経系の興奮剤（すなわち、フェンテルミン、ジエチル、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、アンフェタミン、メチルフェニデート、デクスメチルフェニデート、リスデキサンフェタミン、モダフィニル、ペモリン、フェンジメトラジン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン、アルモダフィニル、ジエチルプロピオン、カフェイン、アトモキセチン、ドキサプラム、及びマジンドール）、鎮静剤／抗不安薬／催眠薬（限定されないが、バルビツレート（すなわち、セコバルビタール、フェノバルビタールとメホバルビタール）、ベンゾジアゼピン（前述のとおり）、及びその他の鎮静剤／抗不安薬／催眠薬（つまりジフェンヒドラミン、ナトリウムオキシベート、ザレプロン、ヒドロキシジン、抱水クロラール、ゾルピデム、ブスピロン、ドキセピン、ゾピクロン、ラメルテオン、メプロバメートとエトクロルビノール）を含む）、セクレチン（例えば、Ratliff-Schaub et al. Autism 9: 256-265 (2005)を参照）、オピオイドペプチド（例えば、Cowen et al., J. Neurochem. 89:273-285 (2004)を参照）、及び神経ペプチド（例えば、Hethwa et al. Am. J. Physiol. 289: E301-305 (2005)を参照）を含む行動改質化合物から選択することができる。
【０２９０】
リソソーム蓄積症は、いくつかの場合にはＣＮＳに関連する又はＣＮＳに特異的な症状がある代謝障害であり、そのような障害としては、これだけに限定されないが、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型）、糖原病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質ジストロフィー、及び神経セロイドリポフスチン沈着症１型及び２型、ニーマンピック病、ポンペ病、及びクラッベ病が挙げられる。
【０２９１】
リソソーム蓄積症について、神経薬は、それ自体が又は別の方法で、病気で損なわれている酵素の活性を模倣するものが選択され得る。リソソーム蓄積症の治療のための例示的な組換え酵素は、限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２１４１号に記載されるもの（即ち、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、β−グルクロニダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−ガラクトセレブロシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、アスパルトアシラーゼ、パルミトイル−プロテインチオエステラーゼ１、及びトリペプチジルアミノペプチダーゼ１）を含む。
【０２９２】
別の実施態様では、赤血球の不適切な過剰産生に関連する又はそれによって引き起こされる疾患、又は赤血球の過剰産生が疾患の影響であるような疾患を、本発明で理解される、少なくとも部分的なエフェクター機能を保持する抗ＴｆＲ抗体の網状赤血球枯渇作用によって予防又は治療することができる。例えば、先天性又は新生物性の真性赤血球増加症では、例えば、網状赤血球の過剰増殖に起因して赤血球数が上昇することにより、血液が濃くなり、同時に生理的症状が生じる（d’Onofrio et al., Clin. Lab. Haematol. (1996) Suppl. 1: 29-34）。少なくとも抗体の部分的なエフェクター機能が保存されている本発明の抗ＴｆＲ抗体を投与することにより、ＣＮＳへの正常なトランスフェリン輸送に影響を及ぼすことなく、未成熟の網状赤血球集団を選択的に除去することが可能になる。そのような抗体の投与は、当技術分野において十分に理解されている通り、急性臨床症状が最小限になり得るように調節することができる（すなわち、非常に低用量で又は間隔を広く空けて投与することによって）。
【０２９３】
一態様では、神経性障害を症状が発症する前に検出するために、及び／又は疾患若しくは障害の重症度若しくは持続時間を評価するために本発明の抗体を使用する。一態様において、抗体は、Ｘ線撮影、断層撮影、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）による撮像を含む、神経障害の検出及び／又は画像化を可能にする。
【０２９４】
一態様では、医薬として使用するための本発明の低親和性抗ＴｆＲ抗体が提供される。別の態様では、神経性の疾患又は障害（例えば、アルツハイマー病）を、赤血球（すなわち、網状赤血球）を枯渇させることなく治療することにおいて使用するための低親和性抗ＴｆＲ抗体が提供される。ある実施態様では、本明細書に記載の治療方法において使用するための改変された低親和性抗ＴｆＲ抗体が提供される。ある特定の実施態様では、本発明は、神経性の疾患又は障害を有する個体を治療する方法であって、個体に有効量の抗ＴｆＲ抗体（任意選択的に、神経性障害薬とカップリングした）を投与することを含む方法において使用するための安全性が改善されるように改変された低親和性抗ＴｆＲ抗体を提供する。そのような実施態様の１つでは、方法は、個体に少なくとも１種の追加的な治療剤を有効量で投与することを更に含む。さらなる実施態様では、本発明は、神経性の疾患又は障害（例えば、アルツハイマー病）のリスクがある又はそれに罹患している患者におけるアミロイド斑の形成を減少させる又は阻害することにおいて使用するための安全性が改善されるように改変された抗ＴｆＲ抗体を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、任意でヒトである。ある特定の態様では、本発明の方法において使用するための本発明の抗ＴｆＲ抗体により、抗体とカップリングした神経性障害薬の取り込みが改善される。
【０２９５】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の低親和性抗ＴｆＲ抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は神経疾患又は障害の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、神経疾患又は障害を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、神経疾患又は障害を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。
【０２９６】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、アルツハイマー病を有する個体に、ＢＡＣＥ１とＴｆＲの両方又はＡｂｅｔａとＴｆＲの両方に結合する本発明の多重特異性抗体を有効量で投与することを含む。そのような実施態様の１つでは、方法は、個体に少なくとも１種の追加的な治療剤を有効量で投与することを更に含む。上記の実施態様の何れかによる「個体」はヒトであってよい。
【０２９７】
本発明の抗ＴｆＲ抗体は、療法において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせての何れかで使用することができる。例えば、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、少なくとも１種の追加的な治療剤と同時投与することができる。ある特定の実施態様では、追加的な治療剤は、治療のために使用される抗ＴｆＲ抗体と同じ又は異なる神経障害を治療するために有効な治療剤である。例示的な追加の治療剤としては、限定されないが、上述した種々の神経薬、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、及びタクリンなど）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えばメマンチン）、アミロイドβペプチドの凝集阻害剤、酸化防止剤、γ−セクレターゼモジュレーター、神経成長因子（ＮＧＦ）模倣物又はＮＧＦ遺伝子治療、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＨＭＳ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡ受容体拮抗薬、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤、静脈注射用免疫グロブリン、ムスカリン受容体アゴニスト、ニコチン受容体モジュレーター、能動的又は受動的アミロイドβペプチド免疫化、ホスホジエステラーゼ阻害剤、セロトニン受容体拮抗薬及び抗アミロイドβペプチド抗体を含む。ある実施態様において、神経薬の一つ又はそれ以上の副作用を軽減する能力に関して、少なくとも１つのさらなる治療剤が選択される。
【０２９８】
本明細書において例示されている通り、ある特定の抗ＴｆＲ抗体は、抗ＴｆＲ抗体を用いて治療される対象における網状赤血球集団に負の影響を及ぼす副作用を有し得る。したがって、ある特定の実施態様では、そのような網状赤血球集団に対する負の副作用を軽減する能力に関して選択された少なくとも１種の別の治療剤を本発明の抗ＴｆＲ抗体と同時投与する。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、赤血球（すなわち、網状赤血球）集団を増加させるための薬剤、赤血球（すなわち、網状赤血球）の成長及び発生を支持するための薬剤、及び赤血球集団を抗ＴｆＲ抗体の影響から保護するための薬剤が挙げられ、そのような薬剤としては、これだけに限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸、及びビタミンＢ１２、並びに、例えば、同様の血液型の別の個体由来であってもよく、抗ＴｆＲ抗体を投与する被験体から予め抽出したものであってもよい同様の細胞を用いて輸血することによる赤血球（すなわち、網状赤血球）の物理的交換が挙げられる。いくつかの場合には、現存する赤血球（すなわち、網状赤血球）を保護することが意図された薬剤は、抗ＴｆＲ抗体療法の前に又はそれと同時に対象に投与されることが好ましいが、一方、赤血球又は血液細胞集団（すなわち、網状赤血球又は網状赤血球集団）の再成長／発生を支持する又は開始させることが意図された薬剤は、そのような血液細胞を抗ＴｆＲ抗体による治療の後に補給することができるように、抗ＴｆＲ抗体療法と同時に又はその後に投与されることが好ましいことが当業者には理解されよう。
【０２９９】
ある特定の他のそのような実施態様では、少なくとも１種の別の治療剤を、抗ＴｆＲ抗体を投与した際の補体経路の活性化を阻害又は防止する能力に関して選択する。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、抗ＴｆＲ抗体の補体経路に結合する又はそれを活性化する能力に干渉する薬剤、及び補体経路内の１つ又は複数の分子相互作用を阻害する薬剤が挙げられ、一般に、その内容が出典明示により明白に本明細書に援用されるMollnes and Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121に記載されている。
【０３００】
上記のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別々の製剤中に２種以上の治療剤が含まれる）及び個別投与を包含し、その場合、本発明の抗体の投与は、追加的な治療剤及び／又はアジュバントを投与する前に、それと同時に、及び／又はその後に行われてよい。一実施態様において、抗ＴｆＲ抗体の投与、及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。本発明の抗体は、例えば、これだけに限定されないが、放射線療法、行動療法、又は当技術分野で公知であり、治療又は予防される神経性障害に適した他の療法などの他の介入的療法と組合せて使用することもできる。
【０３０１】
本発明の抗ＴｆＲ抗体（及び任意の追加的な治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに、局所的な治療のために望ましい場合には病巣内投与を含めた任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、ある程度は投与が短期であるか又は慢性的であるかに応じて、任意の適切な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものであってよい。これだけに限定されないが、種々の時点にわたる単回投与又は多数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含めた種々の投与スケジュールが本発明において意図されている。
【０３０２】
本発明の抗体は、適正医療規範に適合するように製剤化され、用量決定され、投与される。この場合の考察の因子としては、特定の治療されている障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療実践者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、必ずしもではないが、任意選択的に、問題の障害を予防若しくは治療するために、又は抗体投与の１つ又は複数の副作用を予防する、軽減する若しくは好転させるために現在使用されている１つ又は複数の作用剤と一緒に製剤化される。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記の他の因子に左右される。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投与量及び投与経路を用いて、又は本明細書に記載の投与量の約１％から９９％までの投与量で、又は、適切であることが経験的／臨床的に決定される任意の投与量及び任意の経路によって使用される。
【０３０３】
疾患を予防又は治療するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、又は１種又は複数種の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、以前の療法、患者の臨床的病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の自由裁量に左右される。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の投与量が、患者に投与されうる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が抗体の約２投与量から約２０投与量、例えば約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。抗ＴｆＲ抗体を投与することによる網状赤血球集団に対する影響を減少させるための１つの方法は、投与の量又はタイミングを、網状赤血球と相互作用する、血流中に存在する循環している抗体の分量が全体的に低くなるように改変することであることが理解されよう。非限定的な一例では、低用量の抗ＴｆＲ抗体を、高用量の場合よりも高い頻度で投与することができる。使用される投与量は、ＣＮＳに送達することが必要な抗体の量（それ自体が抗体のＣＮＳ抗原特異的部分の親和性に関連する）、その抗体のＴｆＲに対する親和性、並びに、赤血球（すなわち、網状赤血球）を保護する化合物（一又は複数）、成長及び発生を刺激する化合物（一又は複数）、又は補体経路を阻害する化合物（一又は複数）を抗体と一緒に又は段階的に投与するかどうかの間で平衡させることができる。この療法の進行は、本明細書に記載され当技術分野で公知の従来の技法及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０３０４】
上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ＴｆＲ抗体の代わりか又は抗ヘマグルチニン抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０３０５】
Ｈ．製造品
本発明の別の態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
【０３０６】
上記の製造品の何れかは、抗ＴｆＲ抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０３０７】
実施例１：ヒト／カニクイザル交差反応性抗ＴＦＲ抗体の生成、特性評価及びヒト化
最初に、ナイーブ抗体ファージパニングのプロセスは、ＴｆＲへの結合についてＴｆと更に競合しないカニクイザル（「カニクイザル」）からのヒトＴｆＲ及びＴｆＲの両方と交差反応性である抗体を同定するための試みにおいて実施された（Lee et al. JMB (2004) 1073-1093）。そのような交差反応性、非ＴＦ−競合クローンは、このファージパニングプロセスからは同定されなかった。しかし、その後生成されたハイブリドーマクローンを特徴づけるのに有用である２つの抗体が同定された。
【０３０８】
ヒト又はカニクイザルのＴｆＲへの結合についてＴｆと競合する種交差反応性抗体が同定された（Ｔｆ競合性抗体）。ヒトＴｆＲに特異的な別のクローンのエピトープが、マウス／ヒトキメラＴｆＲ受容体を使用してｈｕＴｆＲの頂端ドメインにマッピングされた（図１）。この頂端ドメイン結合クローンは、頂端ドメインにおけるマウスのＴｆＲ配列がｈｕＴｆＲへと置換されるとｈｕＴｆＲへの結合を喪失した。
【０３０９】
次に、交差反応性抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ抗体を生成する免疫化に基づくアプローチが実施された。Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むヒトＴｆＲ細胞外ドメイン（「ｅｃｄ」）及びヒトヘモクロマトーシスタンパク質（「ＨＦＥ」）が記述されるように発現され精製された（Bennet et al, Nature (2000) 403, 46-53）。類似したカニクイザルＴＦＲ ｅｃｄ構築物もまた作製された。カニクイザルのＴｆＲは同様に発現され精製された。５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを、カニクイザルＴｆＲ及びｈｕＴｆＲ ｅｃｄのそれぞれを２μｇ含む６つの用量（週２回）で足蹠に免疫化することによって、ヒト及びカニクイザル交差反応性ＴｆＲ抗体が生成された。全てのマウスの血清はＦＡＣＳ陽性であり、全てのマウスが融合された。スクリーニングされた１６３２ハイブリドーマのうち、１１１はヒト及びカニクイザルＴｆＲの両方への結合に対してＥＬＩＳＡ陽性であった。
【０３１０】
得られたＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマは、ヒト又はカニクイザルＴｆＲを一過性に発現する２９３細胞への結合について、１μＭのヒトホロ−ＴＦの存在下でＦＡＣＳによりスクリーニングされた。簡潔には、ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳ分析前の４８〜７２時間、リポフェクタミン２０００プラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して完全長ヒト又はカニクイザルＴｆＲによりトランスフェクトされた２９３細胞を用いて実施された。トランスフェクトされていない（対照）及びトランスフェクトされた２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、（１０μｇ／ｍｌに正規化した）ハイブリドーマ上清５０μｌが、１μＭのヒトホロ−ＴＦの存在下で２９３細胞に添加され、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞はＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄され、ＰＥ−ヤギ抗マウスＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の５０μｌが細胞に添加され、それらは３０分間氷上でインキュベートされた。細胞はＦＡＣＳ緩衝液で洗浄され、分析のために１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁された。
【０３１１】
１４のクローンが、ヒト及びカニクイザルＴｆＲの両方への結合について陽性であった（図２Ａ及び図２Ｂ）。これらのクローンは更にサブクローニングされ、ＥＬＩＳＡによりヒト及びカニクイザルＴｆＲの両方への結合について評価され、エピトープは、上記で同定された頂端結合ファージクローンを使用してｈｕＴｆＲにマッピングされた。簡潔に述べると、頂端ドメインのファージ競合ＥＬＩＳＡが、４℃で一晩、ＰＢＳ中の精製されたヒト又はカニクイザルＴｆＲの２μｇ／ｍｌによりコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの中で実施された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、カゼインを含むスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）を使用して遮断された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。（１０μｇ／ｍｌに正規化された）ハイブリドーマ上清の３０μｌアリコートが、４５分間各ウェルに添加された。この後に、ＯＤ０．０５で１５分間、３０μｌの頂端ドメイン結合ファージが添加された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−マウス抗Ｍ１３（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、結合したファージがＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。１４クローンのうち９は、ファージ上に提示された頂端結合抗体の結合を遮断することが見出された（図２Ｃを参照）。
【０３１２】
抗体親和性は、表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定された。抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）が６０００から８０００ＲＵの間でＢＩＡＣＯＲＥＴＭ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｊ）の４つの異なるフローセル上に結合された。固定化は、製造業者によって提供されたプロトコルを使用して、アミノ基を介したランダムな結合により達成された。１０ＸＨＢＳ−Ｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は水で希釈され、希釈及びランニング緩衝液として役割を果たした。精製されたヒト又はカニクイザルＴｆＲは捕獲され、単一サイクルの動力学法を用いて、３０ｍｌ／分の流速で注入されたＩｇＧ又はＦａｂの３倍希釈系列が続いた。親和定数は１：１ラングミュア結合モデルを用いて又はＫｏｎ又はｋｏｆｆが検出限界を超えた場合定常状態モデルを用いて決定された。平衡解離定数（ＫＤ）が会合速度定数（Ｋｏｎ）と解離速度定数（Ｋｏｆｆ）との比として算出された。結果を図２に示す。
【０３１３】
各ハイブリドーマがクローニングされた。全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてハイブリドーマから単離された。ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴ５’ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して製造元の指示に基づいて生成された。各抗体の可変領域は、キットに提供されたＵＰＭ（５’オリゴ）及び定常領域にアニールする３’オリゴを使用して増幅された。全ＰＣＲ産物は、次いで、配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。配列解析の後、ハイブリドーマは４つのグループに更に分割することができた（図３Ａ−３Ｄ）。頂端結合する抗体と競合するクローンは、３つの関連配列クラスに分類された（図３Ａ−Ｃ）。４つの非頂端クローン（図３Ｄ）は、２つの関連クローンと２つの他のユニークな配列から成っていた。各クローンの軽鎖及び重鎖ＣＤＲは表３に提供される。
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【０３１４】
各クラスからの代表的なクローン（１５Ｇ１１、７Ａ４、１６Ｆ６及び７Ｇ７）が、ヒト化及びさらなる特徴付けのために本明細書に例示される。ヒト化は、以下及び図４Ａ−４Ｅに概説するように、選択バーニア位置の包含とともにＨＶＲ移植片を使用して達成された。１５Ｇ１１はＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１及びＩＧＨＶ１−３＊０１ヒト可変ドメインへＨＶＲを移植することによってヒト化された。図４Ｅに概説されるように、異なるマウスバーニア位置の組み合わせがヒト化変異体に含まれていた。ヒト化１５Ｇ１１変異体１５Ｇ１１．ｖ５は、図４Ａに概説されるように、ＶＬ（４３及び４８位）及びＶＨ（４８、６７、６９、７１及び７３位）に選択されたバーニア位置を含む。また、ＶＨのＮ末端は、ＱからＥに変更された。７Ａ４のヒト化のために、ＨＶＲ移植片は、７Ａ４重鎖及び８Ａ２軽鎖ＨＶＲを用いて作製された（７Ａ４及び８Ａ２は関連したクローンである、図３Ａ）。ＨＶＲはＩＧＫＶ４−１＊０１及びＩＧＨＶ１−２＊０２ヒト可変ドメインに移植された。図４Ｅに概説されるように、異なるマウスバーニア位置の組み合わせがヒト化変異体に含まれていた。図４Ｂに概説されるように、ヒト化７Ａ４変異体、７Ａ４．ｖ１５は、ＶＬ（６８位）及びＶＨ（２４及び７１位）に選択されたバーニア位置を含み、かつＣＤＲ−Ｌ３の改変Ｇ９４Ａを含む。７Ｇ７は、図４Ｃに概説されるように、カッパ４及びサブグループＩヒトコンセンサス可変ドメインにＶＨの選択されたバーニア位置（９３位）と共にＨＶＲを移植することによってヒト化された。このヒト化変異体は７Ｇ７．ｖ１と呼ばれる。１６Ｆ６はＩＧＫＶ１−９＊０１及びＩＧＨＶ４−５９＊０１ヒト可変ドメインへＨＶＲを移植することによってヒト化された。図４Ｅに概説されるように、異なるマウスバーニア位置の組み合わせがヒト化変異体に含まれていた。図４Ｄに概説されるように、ヒト化１６Ｆ６変異体１６Ｆ６．ｖ４は、ＶＬに２つの変化（Ｉ４８Ｌ及びＦ７１Ｙ）並びにＶＬ（４３及び４４位）及びＶＨ（７１及び７８位）に選択されたバーニア位置を含む。
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【０３１５】
ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対するヒト化変異体の親和性は、ＩｇＧとしてＳＰＲによって決定した（図４Ｅ）。選択されたクローンもまた一価の親和性を評価するためＦａｂとしてＳＰＲにより分析された（表７）。両方の場合において、ＳＰＲ実験は上記のように実施された。
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【０３１６】
抗体の結合エピトープは以下のように再確認された。ＴＦ−ＴｆＲブロッキングＥＬＩＳＡが、４℃で一晩、ＰＢＳ中の精製されたヒトＴｆＲの２μｇ／ｍｌによりコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの中で実施された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。１２．５μＭのヒトホロＴｆ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ）の５０μｌが、４０分間プレートに添加された。ｈｕ７Ａ４．ｖ１５、ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５、Ｔｆ競合抗体、及びｈｕ７Ｇ７．ｖ１の５０μｌの滴定（１０μｇ／ｍｌで開始、１：３段階希釈）がプレートに添加され、２０分間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。
【０３１７】
ＨＦＥ−ＴｆＲ結合ＥＬＩＳＡが、４℃で一晩、ＰＢＳ中のＨＦＥの１μｇ／ｍｌによりコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの中で実施された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。ヒトＴｆＲの滴定（１００ｕｇ／ｍｌで開始、１：３段階希釈）がプレートに添加され、１時間インキュベートされた。次いで、ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５、ｈｕ７Ａ４．ｖ１５又はｈｕ７Ｇ７．ｖ１の１μｇ／ｍｌが１時間プレートに添加された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。ＨＦＥ−ＴｆＲブロッキングＥＬＩＳＡが、４℃で一晩、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのＨＦＥによりコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの中で実施された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。ＮＵＮＣＴＭプレート中で、ｈｕ７Ａ４．ｖ１５、ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５、Ｔｆ競合抗体、ヒトホロＴｆ及び対照ＩｇＧ（全抗体について４００μｇ、ホロトランスフェリンについては８０００μｇ／ｍｌ、１：３段階希釈）がビオチン化ヒトＴｆＲの２μｇ／ｍｌと混合され、１時間インキュベートされた。混合物は次いでＨＦＥコーティングされたプレートに室温で１時間添加された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−ストレプトアビジン（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、プレートに結合したビオチン化ヒトＴｆＲがＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。
【０３１８】
これらのヒト化変異体のＴｆＲへの結合は、６．３μＭのホロＴｆの存在によって影響を受けなかったが、一方ＴｆＲのＴＦ結合部位に結合するＴｆ競合抗体の結合は阻害された（図５）。更に、ヒト化７Ａ４．ｖ１５、１５Ｇ１１．ｖ５及び７Ｇ７．ｖ１はなおＨＦＥ捕獲ｈｕＴｆＲに結合することができ、それらは固定化ＨＦＥへのｈｕＴｆＲの結合に影響しなかったことを示している（図６Ａ）。関連する実験では、７Ａ４．ｖ１５及び１５Ｇ１１．ｖ５は、ビオチン化ＴｆＲが固定化ＨＦＥへ結合するのをブロックしなかった。対照的に、この相互作用は、Ｔｆ競合抗体及びホロＴｆによってブロックされた（図６Ｂ）。ＨＦＥ及びＴｆはＴｆＲ上で類似のエピトープを共有することが知られている（Bennet et al, Nature (2000) 403, 46-53）。
【０３１９】
固定化１５Ｇ１１ｖ．５及び抗ＴｆＲＣ１２は、ビオチン化ヒトＴｆＲ ＥＣＤ又はヒトＴｆＲ頂端ドメインを呈する一価のＭ１３ファージへの結合について評価された。抗ＴｆＲＣ１２は、ヒトＴｆＲ ＥＣＤに対してパニングされた合成抗体ファージライブラリーから誘導され、トランスフェリン結合と競合するヒトＴｆＲ上の部位に結合する。抗体は、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上でＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌでコーティングされた。結合したビオチン化ヒトのＴｆＲ ＥＣＤ又はＴｆＲ−頂端ドメインファージは、それぞれ、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ，ＲＰＮ ４４０１Ｖ）又はＨＲＰ抗Ｍ１３（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ，２７−９４２１−０１）で検出された。図２５は、１５Ｇ１１ｖ．５が、ヒトＴｆＲの頂端ドメインに結合することを示す。１５Ｇ１１ｖ．５結合部位は、ＴｆＲリガンド結合部位から離れた部位である頂端ドメインにマッピングされた。
【０３２０】
実施例２：親和性操作ヒト／カニクイザル交差反応性抗ＴＦＲ抗体
上述のヒト化変異体に加えて、更なる親和性操作変異体が作製された。本明細書に例示されるのは、１５Ｇ１１．ｖ５及び７Ａ４．ｖ１５の親和性操作である。親和性変異体は、標準的な技術を用いて、ＣＤＲ−Ｌ３又はＣＤＲ−Ｈ３内の個々のアラニン置換を行うことによって生成された。これらの変異体は、ヒト及びカニクイザルＴｆＲへの結合に重要な位置を同定するためＥＬＩＳＡ及びＳＰＲによってＩｇＧとしてスクリーニングされた；Ｆａｂとして選択された変異体の一価親和性も測定された。Ａｌａスキャン変異体のＩｇＧ又はＦａｂは、２９３細胞で発現され、ヒト又はカニクイザルＴｆＲへの結合が、一晩４℃で、ＰＢＳ中のヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１．８μｇ／ｍｌでコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレート中でＥＬＩＳＡによって定量化された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。発現したＩｇＧを含む上清は連続的に１：５希釈され、１時間プレートに添加された。精製されたｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５又はｈｕ７Ａ４．ｖ１５が標準として使用された（１ｕｇ／ｍｌで開始し１：５希釈された）。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−ヤギ抗カッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。上記のように、結合はＳＰＲによって評価された。結果は、図７Ａ（１５Ｇ１１．ｖ５変異体）及び７Ｂ（７Ａ４．ｖ１５変異体）に示される。
【０３２１】
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２における位置での個々のアラニン置換を有する１５Ｇ１１．ｖ５の更なる変異体はまた生成され、発現され、ＥＬＩＳＡによってヒト及びカニクイザルのＴｆＲへの結合についてスクリーニングされた（表６）。Ｈｕ／Ｃｙ結合ＥＬＩＳＡが、４℃で一晩、ＰＢＳ中の精製されたヒト又はカニクイザルＴｆＲの２μｇ／ｍｌによりコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの中で実施された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ中でスーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液を使用してブロックされた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）。発現されたＡｌａスキャン変異体のＩｇＧを含む細胞培養上清が１：５段階希釈され、１時間、ウェルに添加された。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、１：１０００希釈されたＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）がプレートに添加され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を用いて検出された。
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【０３２２】
選択された変異体は、次いで精製され、ヒト又はカニクイザルＴｆＲに対するそれらの一価の親和性がＳＰＲによって評価された（表７）。
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【０３２３】
実施例３：二重特異性抗ヒトＴｆＲ抗体の構築及びインビトロ分析
前述の抗体変異体の一部は、ＢＡＣＥ１に特異的に結合する第二のアームを有する二重特異性抗体として再フォーマットされた。抗ヒトＴｆＲ抗体Ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５、Ｈｕ１５Ｇ１１．ＬＣ９２Ａ、Ｈｕ１５Ｇ１１．ＨＣ５２Ａ及びＨｕ１５Ｇ１１．ＨＣ５３Ａが、「ノブインホール」二重特異性抗体構築技術を使用して二重特異性のＴｆＲ結合アームを操作するために使用された（Carter, P. (2001) J. Immunol. Methods 248, 7-15; Ridgway, J. B., Presta, L. G., and Carter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621; Merchant, A. M., Zhu, Z., Yuan, J. Q., Goddard, A., Adams, C. W., Presta, L. G., and Carter, P. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677-681; Atwell, S., Ridgway, J. B., Wells, J. A., and Carter, P. (1997) J. Mol. Biol. 270, 26-35）。抗ＴｆＲ（ホール）及び抗ＢＡＣＥ１（ノブ）に対するＦｃのノブ及びホール変異に加えて、全ての半抗体は、エフェクター機能を抑制するＦｃ領域中の変異（Ｎ２９７Ｇ）を含み、Ｈｕ１５Ｇ１１．ｖ５及びＨｕ１５Ｇ１１．ＬＣ９２Ａはエフェクター機能を抑制する更なるＦｃ変異（Ｄ２６５Ａ）を含んでいた。ノブ及びホール半抗体は大腸菌から別々に精製され、抗ＴｆＲホモ二量体の形成を防ぐために、抗ＴｆＲの１：１．１の比率で結合された。二重特異性抗体の組み立ては、抗体に対して１００×の比率での還元型グルタチオン及び２００ｍＭのアルギニンｐＨ８．０を含む緩衝液中で、室温で少なくとも３日間の還元アニーリングによって完了した。組み立て後、二重特異性抗体は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製された。組立体は、液体クロマトグラフィー質量分析法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。精製された抗体は、サイズ排除及び多角度レーザー光分光法により、均一及び単分散であることが確認された。
【０３２４】
得られた二重特異性抗体は、１５Ｇ１１．ｖ５（抗ＴｆＲ１）、１５Ｇ１１．Ｗ９２Ａ（１５Ｇ１１．ＬＣ９２Ａ又は抗ＴｆＲ２）、Ｈｕ１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａ（抗ＴｆＲ５２Ａ）及びＨｕ１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａ（抗ＴｆＲ５３Ａ）と呼ばれた。ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対する一価の親和性及び動力学は、ＳＰＲによって１１５Ｇ１１．ｖ５及び１１５Ｇ１１．Ｗ９２Ａについて上記のように測定された（表９を参照）。抗ＴｆＲ１及び抗ＴｆＲ２は、抗ＴｆＲＡ及び抗ＴｆＲＤがマウスＴｆＲへの結合に対して有するのと類似した一価結合親和性を有している（Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44を参照）。
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【０３２５】
更に、抗ＴｆＲ１、抗ＴｆＲ２、Ｈｕ１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａ及びＨｕ１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａ二重特異性抗体の結合親和性が、前述のように、ＳＰＲにより、ヒト及びカニクイザルのＴｆＲに対して測定された。表９に示されるように、抗ＴｆＲ５２Ａ及び抗ＴｆＲ５３Ａは、ＴｆＲ１ｈ１５Ｇ１１．ｖ５とＴｆＲ２ＬＣ９２Ａとの間のヒト及びカニクイザルＴｆＲに対する結合親和性を有する。
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【０３２６】
実施例４：エフェクターを含む及びエフェクターを含まない単一特異性及び二重特異性抗体のヒト赤白血病細胞株及び初代骨髄単核細胞に対する影響
マウスでの以前の研究は、エフェクター機能及び／又は補体結合能を有するマウスＴｆＲに結合する抗体は、ＴｆＲ発現網状赤血球を選択的に枯渇させると判断していた。マウスの研究で観察された枯渇は、マウス系に固有であるかどうかを確認するために、更なる実験がヒトＴｆＲに結合する抗ＴｆＲを利用し実施された。
【０３２７】
ＡＤＣＣアッセイは、エフェクター細胞として健常ヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて行った。ヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ、ＡＴＣＣ）及び初代ヒト骨髄単核細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ｉｎｃ．）が標的細胞として使用された。ＦｃγＲＩＩＩＡ中の残基１５８位でのアロタイプの違いから潜在的に生じ得るドナー間の変動を最小限に抑えるために、実験の第一組において、献血者は、ヘテロ接合ＲｃγＲＩＩＩＡ遺伝子型（Ｆ／Ｖ１５８）を有するものに限定された（図８Ａ−Ｂ）。実験の第二組において（図９Ａ−Ｂ）、Ｆ／Ｖ１５８遺伝子型又はＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型の何れかを運ぶ健常なヒトドナーからのＰＢＭＣとともに、ＨＥＬ細胞のみが標的細胞として使用された。Ｖ／Ｖ１５８の遺伝子型も、増加したＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣ活性との既知の関連並びにＩｇＧ４抗体を結合する能力に起因して、このＡＳＳＡに含まれた（Bowles and Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008）。製造元の指示に従って細胞が計数され、生存率は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａ）により決定した。
【０３２８】
ＰＢＭＣを、Ｕｎｉ−ＳｅｐＴＭ血液分離管を用いた密度勾配遠心分離によって単離した（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）。アッセイ培地（１％ＢＳＡ及び１００単位／ｍＬのペニシリン並びにストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）５０μＬの中の標的細胞が、９６ウェルの丸底プレート中に４×１０４／ウェルで播種された。試験及び対照抗体の段階希釈液（５０μＬ／ウェル）が、標的細胞を含むプレートに添加され、オプソニン化を可能にするために、３０分間、５％ＣＯ２を含む３７℃でインキュベートされた。合計１０個のデータ点に対して５倍の段階希釈後に、抗体の最終濃度は、０．００５１から１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。インキュベーション後、アッセイ培地１００μＬ中１．０×１０６のＰＢＭＣエフェクター細胞が各ウェルに添加され、エフェクター：標的細胞の比２５：１を与え、プレートは更に４時間インキュベートされた。プレートはインキュベーションの最後で遠心分離され、上清はＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｎｅｃｅ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性について試験された。ＬＤＨ反応混合物が上清に添加され、プレートは振盪しながら室温で１５分間インキュベートされた。反応は、１ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプラスマイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を４９０ｎｍで測定した（６５０ｎｍで測定したバックグラウンドは各ウェルについて差し引かれた）。標的細胞のみを含むウェルの吸光度はバックグランドの対照としての役割を果たしたが（低対照）、一方トリトンＸ１００で溶解した標的細胞を含むウェルは利用可能な最大のシグナルを与えた（高対照）。抗体非依存性細胞性細胞傷害（ＡＩＣＣ）は、抗体を添加することなく、標的及びエフェクター細胞を含むウェル中で測定された。特定のＡＤＣＣの程度は以下のように計算された：
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試料希釈物のＡＤＣＣ値が抗体濃度に対してプロットされ、用量応答曲線はＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを使用して４パラメーターモデルに適合させた。
【０３２９】
実験の第一組では、種々の抗ヒトのＴｆＲ構築物のＡＤＣＣ活性が、標的細胞としてヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ細胞）又は初代ヒト骨髄単核細胞の何れかを用いて評価された。二価のＩｇＧ１エフェクター機能−コンピテント抗ヒトＴｆＲ１抗体１５Ｇ１１、及びエフェクター機能を抑制するＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ｇ変異を含むヒトＩｇＧ１フォーマット中に抗ＢＡＣＥ１アームを有するこの抗体の二重特異性形態（実施例３を参照）が、陰性対照として抗ｇＤ ＷＴのＩｇＧ１、陽性対照としてマウス抗ヒトＨＬＡ（クラスＩ）を用いて、ＡＤＣＣアッセイにおいて種々の濃度で試験された。結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。標的としてＨＥＬ細胞（図８Ａ）又は標的として骨髄単核細胞（図８Ｂ）の何れかにより、単一特異性、エフェクター陽性抗ヒトＴｆＲ抗体１５Ｇ１１は有意なＡＤＣＣ活性を誘発した。この活性は、骨髄単核細胞における陽性対照と比較して強いがなお低いレベルで、ＨＥＬ細胞における陽性対照抗ヒトＨＬＡ抗体のものと同様であった。骨髄単核細胞の実験で観察された若干低いレベルは、実験に用いた骨髄及び赤血球系統のＰＢＭＣ細胞の異種混合物の一部のみが高レベルのＴｆＲを発現するという事実に起因する可能性が高いが、一方ＨＥＬ細胞はクローン細胞集団全体を通じて一貫して高いＴｆＲ発現を有する。際だって対照的に、二重特異性のエフェクターを有しない（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）抗ヒトＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、陰性対照に類似して、ＨＥＬ又は骨髄単核細胞の何れかにおいて任意のＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【０３３０】
実験の第二組では、このアッセイ系における抗体アイソタイプをスイッチングする影響を評価した。ＡＤＣＣアッセイ手順は、全ての標的細胞がＨＥＬ細胞であり、かつエフェクター細胞が、ヘテロ接合のＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ／Ｆ１５８遺伝子型又はホモ接合のＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型の何れかを保有する健康なヒトのドナーからのＰＢＭＣである例外を除いて上述されるものと同一であった。試験した全ての抗ヒトＴｆＲは、三つの異なるＩｇバックボーン：野生型ヒトＩｇＧ１、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１、及びヒトＩｇＧ４において、抗−ｇＤと二重特異性であった。ヒトＩｇＧ４骨格を有する抗Ａｂｅｔａ抗体も試験され、マウス抗ヒトＨＬＡ（クラスＩ）が陽性対照とされた。結果を図９Ａ及び９Ｂに示す。エフェクター細胞の活性化及びＶ／Ｖ１５８遺伝子型との間の既知の関連性に基づいて予想されるように（Bowles and Weiner 2005）、ＡＤＣＣ活性は、Ｆ／Ｖ１５８ドナー（影響を受けた標的細胞の〜２５％）と比較してＶ／Ｖ１５８ドナーＰＢＭＣ（影響を受けた標的細胞の〜４５％）によってより強く誘発された（図９Ｂに対して図９Ａを比較のこと）。野生型ＩｇＧ１を有する抗ＴｆＲ／ｇＤは、ＨＥＬ細胞で強いＡＤＣＣを誘導したが、エフェクターを有しないＩｇＧ１を有する抗ＴｆＲ／ｇＤは、ＨＥＬ細胞において任意のＡＤＣＣ活性を示さず、実験の第一組からの結果を再現していた。注目すべきことに、１００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、ＩｇＧ４アイソタイプの抗ＴｆＲ／ｇＤは穏やかなＡＤＣＣ活性を示した。この活性は、抗ＡｂｅｔａＩｇＧ４の結果では観察されず、ＴｆＲ結合はＡＤＣＣ活性に必要であることを示している。この知見は、ＩｇＧ４が最小限の、しかし測定可能な、エフェクター機能を有するという以前の報告と相関している（Adolffson et al., J. Neurosci. 32(28):9677-9689 (2012); van der Zee et al. Clin Exp. Immunol. 64: 415-422 (1986)); Tao et al., J. Exp. Med. 173:1025-1028 (1991)）。
【０３３１】
実施例５：インビボの二重特異性抗ヒトＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体の評価
Ａ．薬物動態、薬力学的及び安全性の試験
薬物濃度、薬力学効果、及びインビボでの二重特異性抗ヒトＴｆＲ抗体の安全性を評価するために、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、前の実施例で使用された同一の抗ＢＡＣＥ１アームと対合した抗ＴｆＲ抗体クローン１５Ｇ１１（抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１）又は前の実施例で使用された同一の抗ＢＡＣＥ１アームと対合したクローン１５Ｇ１１１５Ｇ１１．ＬＣ９２Ａ（抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１）又はＨｕ１５Ｇ１１．Ｎ５２Ａ（抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１）及びＨｕ１５Ｇ１１．Ｔ５３Ａ（抗ＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１）を使用した二重特異性抗体が投与された。これらの二重特異性抗体は、前述のように、エフェクター機能を抑制するＮ２９７Ｇ又はＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマットであった。対照として、ヒトＩｇＧ１上の抗ｇＤ分子が使用された。この研究では、非ヒト霊長類の抗ＴｆＲ抗体の交差反応性は非ヒト霊長類及びヒトに限定されるため、非ヒト霊長類で行われた。更に、研究は、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血漿コンパートメント間の薬物輸送機構は、ヒトと霊長類の間で類似していている可能性があることを示した（Poplack et al, 1977）。抗体は、留置大槽カテーテルによって意識のあるカニクイザルに３０ｍｇ／ｋｇの用量で伏在静脈へ単回静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって投与された。投与後最大６０日までの種々の時点で、血漿、血清、及び（ＣＳＦ）が採取された。試料分析は、血液（全血）、臨床化学（血清）、抗体濃度（血清及びＣＳＦ）、及び抗体（血漿及びＣＳＦ）に対する薬力学的応答を含んでいた。詳細なサンプリング方式については、図１０を参照のこと。
【０３３２】
カニクイザル血清及びＣＳＦ中の投与された抗体の濃度は、ヒツジ抗ヒトＩｇＧサル吸着型抗体コーティングを使用し、血清試料の添加が１：１００の希釈で開始され、検出のためのサルに吸着させた西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の添加により終了するＥＬＩＳＡにより測定された。アッセイは、０．７８−５０ｎｇ／ｍＬでの標準曲線の範囲及び０．０８／ｍｌの検出限界を有していた。この検出限界以下の結果は、報告可能未満（ＬＴＲ）として報告された。
【０３３３】
図１１Ａ−Ｂは、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１についての薬物動態学的分析の結果を示す。抗ｇＤについての薬物動態プロファイルは、３．９８ｍＬ／日／ｋｇの平均クリアランスを有し、カニクイザルにおける典型的なヒトＩｇＧ１抗体について予想されるものであった。抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は両方とも、末梢性の標的媒介性クリアランスに起因する可能性が高く、抗ｇＤよりも速く消失した。抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１は、ＴｆＲに対して最高の結合親和性を有することと一致し、最速のクリアランスを有していたが、一方抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１は、ＴｆＲに対するその親和性の減少に起因する可能性が高く、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１と比較して改善された薬物動態プロファイル（すなわち、血清中の長期曝露）を示した。抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１のクリアランスは、それぞれ１８．９ｍＬ／日／ｋｇ及び８．１４ｍＬ／日／ｋｇであった。全ての抗体は、血清濃度の約１０００分の１で、ＣＳＦで検出された。しかし、分子全体にわたってＣＳＦ抗体の濃度に高い変動性及び全体的に検出不能な差があった。
0006612214.tif 000012
【０３３４】
図１９は、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１の薬物動態学的分析の結果を示す。全ての抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、末梢性の標的媒介性クリアランスに起因する可能性が高く、抗ｇＤよりも速く消失した。抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１は、ＴｆＲに対して最高の結合親和性を有することと一致し、最速のクリアランスを有していたが、一方抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及びＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１は、抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１のＴｆＲに対する親和性の減少に起因する可能性が高く、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１と比較して改善された薬物動態プロファイル（すなわち、血清中の長期曝露）を示した。
【０３３５】
抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１投与に応答した薬力学的効果を検討するために、我々はカニクイザル血漿及びＣＳＦ中のＡｂｅｔａ１−４０及びｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβレベルを測定した。Ａｂｅｔａ１−４０は、抗Ａｂｅｔａ１−４０特異的ポリクローナル抗体コーティングを使用し、試料を添加し、検出のために西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたマウス抗ヒトＡｂｅｔａ１−４０モノクローナル抗体を添加することにより終了するＥＬＩＳＡにより測定された。アッセイは、血漿について６０ｐｇ／ｍｌ及びＣＳＦについて１４０ｐｇ／ｍｌの検出限界を有する。この濃度未満の結果は、報告可能未満（ＬＴＲ）として報告された。ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβのＣＳＦ濃度は、ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβマルチスポットアッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を使用して測定した。ＣＳＦは、氷上で解凍し、次いでＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１％ＢＳＡに１：１０希釈された。アッセイは、製造業者のプロトコルに従って行った。アッセイは、ｓＡＰＰαについて０．０５ｎｇ／ｍｌ及びｓＡＰＰβについて０．０３ｎｇ／ｍＬの検出限界を有する。
【０３３６】
図１２Ａ−Ｅは、抗体の薬力学挙動をまとめたものである。末梢では、血漿Ａｂｅｔａ１−４０レベルは、抗Ｄの投与後に変化しないままであったが、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の投与後一過性に減少した。両方の変異体が血漿Ａｂｅｔａ１−４０レベルを減少させ、５０％の最大阻害を投与後１日で達成した。血漿Ａｂｅｔａ１−４０レベルは徐々に回復し、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１を与えられた動物では投与後約１４日後にＡｂｅｔａ１−４０レベルをベースラインに戻した。Ａｂｅｔａ１−４０レベルは、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１で処置された動物において、投与後約２１日から３０日の間でベースラインに戻した。両方の抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体が、抗ｇＤを投与した動物で観察された変化を伴わずにＣＳＦのＡｂｅｔａ１−４０レベルを減少させた。抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１投与は、ＣＳＦ Ａｂｅｔａ１−４０レベルを、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１のそれ（平均最大阻害はベースラインの２０％）よりもより有意な減少をもたらした（平均最大阻害はベースラインの５０％）。
【０３３７】
ｓＡＰＰβの生成は、抗ＴｆＲと／ＢＡＣＥ１で処置された動物において阻害されたが、抗ｇＤを投与された動物では阻害されなかった。Ａβ４０の結果と同様に、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１は、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１よりもｓＡＰＰβ生成に対してより強い阻害効果を有していた。ｓＡＰＰαの生成は、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１の両方によって、ＢＡＣＥ１阻害の間に刺激され、応答はｓＡＰＰβ及びＡｂｅｔａ１−４０で観察された阻害のレベルと逆相関していた。ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の一次プロセシング産物であり、それらのレベルは非常に相関している。ｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの比率は、基礎ＡＰＰ発現の潜在的な変化又はＣＳＦ収集物及び研究の過程にわたる取り扱いにおける潜在的な分析前の相違に対して結果を正規化する。抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１によるＣＳＦ ｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの比率は、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１よりもより強いＰＤ効果を実証した。このように、これらの結果は。抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体による標的（すなわちＢＡＣＥ１）会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を支持している。
【０３３８】
また抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ５３Ａ／ＢＡＣＥ１についてのＰＤ応答は、抗体曝露の期間と相関し、低下した親和性のＴｆＲアームは、Ａβ４０の減少の増加を示した（データ非表示）。これらのデータはまた、これらの二重特異性抗体による標的会合（ｔａｒｇｅｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を支持している。
【０３３９】
全体的に、これらの結果は、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１と抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１の親和性の間のヒトＴｆＲに対する親和性を有する二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、おそらくは望ましい薬物動態／薬力学的なバランスを持っているであろうことを示唆している。
【０３４０】
安全性シグナルは、本研究では全く観察されなかった。投与後最大６０日まで投与される任意の二重特異性抗体を３０ｍｇ／ｋｇ与えられたサルの任意の血液学又は臨床化学パラメーターには明らかな影響は認められなかった。重要なことは、網状赤血球レベルは、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１又はＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１の何れかによる処置によって、影響を受けなかった（図１３）。これらの抗体はエフェクター機能が損なわれており、高いＴｆＲレベルを有する循環性初期網状赤血球の全体的なレベルは、正常な霊長類では非常に低い（実施例４を参照のこと）ことを理由として予想したとおりであった。
【０３４１】
実施例６：インビボの二重特異性抗ヒトＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体の評価
ＣＳＦ中の抗体薬力学及び脳内の薬物動態の関係を調べるために、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、前の実施例のように、二重特異性抗体の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１又は抗のＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１を投与された。これらの二重特異性抗体は、エフェクター機能を抑制するＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマットであった。対照として、ヒトＩｇＧ１上の抗ｇＤ分子が使用された。比較のために、我々はまた、二重特異性抗体に使用したのと同じクローンである二価の抗ＢＡＣＥ１抗体を投与した。抗体は、留置大槽カテーテルによって意識のあるカニクイザルに３０ｍｇ／ｋｇの用量で伏在静脈へ単回静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって投与された。ベースラインＣＳＦ試料は、投与前の２４時間及び４８時間で収集され、別のＣＳＦ試料は投与後２４時間で収集された（図１４に概略的に示される）。投与後２４時間でのＣＳＦ収集後、動物は、生理食塩水で灌流し、脳を抗体濃度の分析のために回収した。様々な脳の領域が、完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳ中の１％ＮＰ−４０（Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）でホモジナイズされた。ホモジナイズされた脳試料を、２０分間、１４，０００ｒｐｍで回転させる前に、１時間４℃で回転させた。上清が、前の実施例に記載のＥＬＩＳＡ法を用いた脳の抗体測定のために単離された。血液はまた、末梢曝露及び薬力学応答（実施例５に記載の我々の観察と同様であった）を確認するために収集された。
【０３４２】
ＣＳＦ中で評価される抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１の薬力学的効果はまた、前の実施例で観察されたものと同様であった。図１５は、ＣＳＦのｓＡＰＰβ／のｓＡＰＰαの比率が、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１の投与後確実に減少していることを実証している。抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１は、この研究において投与後２４時間では明らかな減少を示さなかった。抗ＢＡＣＥ１も効果を示さなかった。抗体の脳内濃度の分析は、対照ＩｇＧ及び抗ＢＡＣＥ１抗体は両方とも、我々のアッセイにおいて検出をちょうど上回るレベル（平均〜６７０ｐＭ）で脳内への取り込みを制限していたことを明らかにした。抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１は、対照ＩｇＧに対して〜３倍改善された脳取り込みを有しており（平均〜２ｎＭ）、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１は対照ＩｇＧよりも〜１５倍大きい最良の脳取り込みを有していた（平均〜１０ｎＭ）。我々の研究では、異なる抗体の脳の抗体濃度は、ＣＳＦで見られた薬力学応答と相関しており、抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１は最高の脳への取り込みと最も強い薬力学作用を有し、抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１は少ない脳取り込みとより控えめな効果を有していた。
【０３４３】
これらの結果は、ＴｆＲ結合二重特異性抗体が非ヒト霊長類の脳内取り込みを改善することを実証する我々の以前の知見を拡張している。霊長類では、マウスのように、脳への取り込みとＴｆＲ媒介クリアランスのバランスを最良にとるＴｆＲに対する最適な親和性がある可能性がある。この実施例では、より高い親和性の抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１が良好な脳取り込みを示し、末梢標的媒介クリアランスにより影響を受ける。減少した親和性のＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１は、クリアランス特性を改善したが、ＴｆＲにより効率的に輸送されることができないようにＴｆＲに対してこのような低い結合を有するように見える（米国特許出願公開第２０１２／０１７１１２０号の最低の親和性の抗ＴｆＲ抗体ＴｆＲＥが、親和性が非常に低いので抗体とＴｆＲの間の十分な相互作用を許容することができず、その結果ＴｆＲが転移プロセスを開始したときに抗体がＴｆＲと会合したままであるような、親和性閾値をいくらか上回るのとほぼ同じように）。この実験の結果から、ＴｆＲ１とＴｆＲ２の間のＴｆＲに対する親和性を有する抗ヒト／カニクイザルＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、この系において抗ＴｆＲ１／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１の何れかよりも改善された取り込み及びクリアランス特性を有することが予測されるであろう。
【０３４４】
実施例７：二重特異性トランスフェリン受容体抗体との関連における更なるエフェクターを有しない変異の作成
Ｎ２９７ＧとＤ２６５Ａに加えて、エフェクター機能を抑制するＦｃ領域中の他の変異は、ＴｆＲ発現網状赤血球の枯渇を減少させるか又は阻止する能力について試験された。具体的には、参照により本明細書に援用される米国出願公開番号２０１２／０２５１５３１に記載されるＦｃ変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰＧ」）が抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体（全体が参照により本明細書に援用される国際出願公開公報ＷＯ２０１３／１７７０６２に記載される）に組み込まれた。
【０３４５】
マウスにおける単一の抗体投与後の薬物動態分及び網状赤血球の計数は以下のように行われた。全ての試験に６〜８週齢の野生型雌Ｃ５７Ｂ／６マウスを使用した。動物の世話は施設のガイドラインに従った。マウスに、ＬＡＬＡＰＧ変異を有する抗ｇＤ抗体（マウスＩｇＧ２ａ）、ＬＡＬＡＰＧ変異を有する抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体（ラット／マウスキメラ）の何れかを５０ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内注射した。総注射体積は２５０μＬを越えず、必要な場合には抗体をＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した。２４時間後、全血を採取した後に、ＥＤＴＡ ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に灌流し、室温で３０分静置し、５０００×ｇで１０分、遠心沈澱を行った。抗体を測定するために血漿の上層を新しいチューブに移した。
【０３４６】
マウス血漿中の総抗体濃度は、抗マウスＩｇＧ２ａ（アロタイプａ）／抗マウスＩｇＧ２ａ（アロタイプａ）ＥＬＩＳＡを用いて測定された。ＮＵＮＣ ３８４−ウェル Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮＪ）を、アロタイプＡ特異的抗体であるマウス抗マウスＩｇＧ２ａアロタイプＡ（ＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡを用いて２５℃で１時間ブロッキングした。各抗体（抗ｇＤ及び抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥｌ二重特異性変異体）をそれぞれの抗体濃度を定量化するための標準物質として使用した。プレートを、マイクロプレートウォッシャー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、標準物質及び試料を、０．５％ＢＳＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に希釈し、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、２５℃で２時間置いた。結合した抗体を、アロタイプＡ特異的抗体であるビオチンコンジュゲートマウス抗マウスＩｇＧ２ａアロタイプＡ（ＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａ）を用いて検出した。結合したビオチンコンジュゲート抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅｌａｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて検出した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して試料を展開し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）で４５０ｎｍにおける吸収を測定した。４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して標準曲線から濃度を決定した。アッセイの定量化の下限（ＬＬＯＱ）値は血清では７８．１３ｎｇ／ｍｌであった。実験群間の差異の統計解析を、対応のない両側ｔ検定を使用して実施した。
【０３４７】
ＬＡＬＡＰＧのＦｃ変異を含有する抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体の投与の際に、完全なエフェクター機能を有する抗体を用いて以前観察されたようにマウスは臨床症状を示さなかった。 Couch et al., Sci. Trans. Med. 5:183ra57 (2013)を参照。図２０は、薬物動態分析の結果を示す。
【０３４８】
また、未成熟及び総網状赤血球数は、製造業者の指示に従ってＳｙｓｍｅｘＸＴ２０００ｉＶ（Ｓｙｓｍｅｘ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）を用いて決定された。投与後２４時時間で、図２１に見られるように、試験した任意の抗体により、未熟網状赤血球画分及び総網状赤血球数には相違が観察されなかった。これらの結果は、ＬＡＬＡＰＧ変異は抗体のエフェクター機能を抑制するだけでなく、エフェクターを有しない抗体フレームワークにおいても見られる補体結合及び補体媒介性網状赤血球のクリアランスを減少させることを示唆している（Couch et al. 2013）。このことは、ヒトＩｇＧ１上のＬＡＬＡ変異の組み込みは、補体結合を制限することができるとする別の報告と一致している（Hessell et al. Nature 449:101-104 (2007)）。
【０３４９】
実施例８−ＦｃＲｎＨＩＧＨ二重特異性変異体の作成
二重特異性抗体の半減期を増加させ、それによって潜在的に、脳中の抗体の濃度を増加させるために、ＩｇＧ定常ドメインに突然変異具体的にはＦｃ受容体新生児（ＦｃＲｎ）結合ドメイン（ＦｃＲｎＨＩＧＨ変異）を含む二重特異性変異体を作成した。ＦｃＲｎ結合ドメインは、抗体の母体−胎児の移送に関与している。Story et al., J. Exp. Med., 180:2377 2381, 1994を参照。ＦｃＲｎ結合ドメイン中のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎに対する定常ドメインの親和性を増加させ、それにより抗体の半減期を増加させる。
【０３５０】
ＦｃＲｎ結合を増加させ、したがって、抗体の半減期を増加させるＦｃＲｎ結合ドメイン変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）が記載されている。米国公開特許出願番号第２００３／０１９０３１１号及びDall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)を参照。加えて、ＦｃＲｎ結合ドメイン変異Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ（ＡＩ）が、ＦｃＲｎ結合を増加させることが記載されている。Yeung et al., J. Immunol. 182: 7663-7671 (2009)を参照。ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）及びＡＩ（Ｎ４３４／Ｙ４３６Ｉ）の変異は、ＷＴヒトＩｇＧ１又はエフェクターを有しないＬＡＬＡＰＧ又はＮ２９７Ｇ変異の何れかを含む抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ２／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体の両方に組み込まれた。更に、ＦｃＲｎＨＩＧＨ変異は対照として抗ｇＤ ｈＩｇＧ１抗体において作製された。変異は、クンケル突然変異誘発を用いて構築され、抗体は、ＣＨＯ細胞で一過性に発現され、タンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィー、続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製された。
【０３５１】
ＦｃＲｎへのＦｃＲｎＨＩＧＨ変異体抗体の結合は、ビアコアを用いて測定された。ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎタンパク質は、ＣＨＯで発現されＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。データは、ビアコアＴ２００装置で取得された。シリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．ＢＲ１００５３０）は、供給者の指示に従って、ＥＤＣ及びＮＨＳ試薬を用いて活性化され、抗Ｆａｂ抗体（Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＢ ＳＥ−７５１８４，ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が約１０，０００反応単位（ＲＵ）を達成するように結合され、その後１メタノールアミンにより未反応の基をブロックした。親和性測定のために、抗体は、最初に１０μＬ／分の流速で注入され、ＦＣ１（参照）を除いた３つの異なるフローセル（ＦＣ）に約１０００ＲＵを捕獲し、次いでｐＨ６の緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム）中のヒトＦｃＲｎ（又はカニクイザルのＦｃＲｎ）の低（１ｎＭ）から高（２５μＭ）への２倍段階希釈液が、注入の間に再生を伴わない同一サイクルで次々と注入された（流速：３０μｌ／分）。センサーグラムが記録され、ビアコアＴ２００評価ソフトウェア（バージョン２．０）を使用して評価する前に参照及び緩衝液の減算を受けた。親和性は、１：１結合モデルに基づいた定常状態での結合のレベルを分析することによって決定された。抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１のＬＡＬＡＰＧ、Ｎ２９７Ｇ、ＬＡＬＡＰＧ．ＹＴＥ、及びＬＡＬＡＰＧ．ＡＩ変化に対する結合親和性は、以下の表１１に示される。データはＦｃＲｎＨＩＧＨ変異体は、ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎに対してエンドソーム（ｐＨ６）で親和性を向上させることを示している。
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【０３５２】
選択されたＦｃＲｎＨＩＧＨ変異体は、ＦｃＲｎの親和性の増強が、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の薬物動態学的特性を高め、改善し、及び／又は脳曝露を増加することができるかどうかを決定するためにカニクイザルで試験された。
【０３５３】
エフェクターを有しないＦｃＲｎＨＩＧＨ変異の安全性を評価するために、特定の二重特異性抗体が、ヒトトランスフェリン受容体を発現するヒトトランスフェリン受容体ノックインマウスに投与された。以下のようにｈｕＴｆＲノックインマウスが作製された。ＥＳ細胞におけるＣ５７ＢＬ／６ Ｔｆｒｃ座にヒトＴＦＲＣのｃＤＮＡを標的とする構築物は、リコンビニアリング（Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18) pp. 6913-22 2006; Liu et al Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84）及び標準的な分子クローニング技術の組み合わせを用いて作製された。
【０３５４】
簡潔には、マウスＴｆｒｃ遺伝子に対する短い相同性によって隣接されるカセット（ヒトＴＦＲＣのｃＤＮＡ、ＳＶ４０ ｐＡ、及びｆｒｔ−ＰＧＫ−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ＢＧＨｐＡ−ｆｒｔ）が、コンビニアリングによってＴｆｒｃ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＢＡＣＲＰ２３ ＢＡＣライブラリー）を改変するために使用された。ヒトＴＦＲＣのｃＤＮＡカセットが内因性ＡＴＧに挿入され、ＴＦＲＣのエクソン２の残り部分とイントロン２の開始部分が削除された。ＢＡＣにおける標的化領域は、その後、ＥＳ細胞を標的とするために相同性アームとして隣接するゲノムＴｆｒｃ配列と共にｐＢｌｉｇｈｔ−ＴＫに回収された（Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18) pp. 6913-22 2006）。具体的には、２９５０ｂｐの５’相同性アームは（アセンブリＮＣＢＩ３７／ｍｍ９９）：ｃｈｒ．１６：３２，６１０，３３３−３２，６１３，２８２に対応し、２５９９ｂｐの３’相同性アームは、ｃｈｒ．１６：３２，６１３，３２０−３２，６１５，９１８に対応する。最終的なベクターは、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０３５５】
Ｔｆｒｃ／ＴＦＲＣ ＫＩベクターはＮｏｔＩを用いて線状化され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｃ２ ＥＳ細胞は、標準的な方法（Ｇ４１８陽性及びガンシクロビル陰性選択）を用いて標的化された。陽性クローンは、ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ分析を用いて同定され、改変された遺伝子座の配列決定によって確認された。正しく標的化されたＥＳ細胞は、Ｎｅｏを除去するためにＦｌｐｅプラスミドでトランスフェクトされ、次いでＥＳ細胞は標準的な技術を用いて胚盤胞に注入された。生殖細胞系伝達は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌とのキメラを生じる交差後に得られた。
【０３５６】
具体的には、以下の表にリストされる抗体が、ｈｕＴｆＲノックインマウスに単一５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、２４時間後に血液が採取され、網状赤血球．ｈｕＩｇ１、Ｎ２９７Ｇ
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【０３５７】
抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１ ＬＡＬＡＰＧ、ＬＡＬＡＰＧ／ＹＴＥ又はＬＡＬＡＰＧ／ＡＩ抗体（表１２のグループ３〜５）の投与後に、ヒトのＴｆＲノックインマウスは、完全なエフェクター機能を有する抗ＴｆＲ抗体を用いて以前に観察されるように（Couch et al. 2013）、臨床症状又は網状赤血球の喪失を示さなかった（図２２）。これらの結果は、ヒトＩｇＧ１フレームワークにおけるＬＡＬＡＰＧ変異の組み込みはまた、エフェクター機能を抑制することを示し、更に、ＹＴＥ又はＡＩの何れかのＦｃＲｎＨＩＧＨ変異の追加は、抗体をエフェクターを有しないようにするＬＡＬＡＰＧ変異の所望の特性と干渉しないことを示唆している。
【０３５８】
ヒト由来細胞株において、ＡＤＣＣアッセイもまた、ＬＡＬＡＰＧ、ＬＡＬＡＰＧ／ＹＴＥ及びＬＡＬＡＰＧ／Ａｉ変異の組み合わせのエフェクターを有しない状態を確認するために実施された。以前のように、Ｆ／Ｖ１５８遺伝子型又はＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型の何れかを運ぶ健常なヒトドナーからのＰＢＭＣとともに、ヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ、ＡＴＣＣ）が標的細胞として使用された。Ｖ／Ｖ１５８の遺伝子型も、増加したＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣ活性との既知の関連並びにＩｇＧ４抗体を結合する能力に起因して、このＡＳＳＡに含まれた（Bowles and Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008）。製造元の指示に従って細胞が計数され、生存率は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａ）により決定した。
【０３５９】
ＰＢＭＣを、Ｕｎｉ−ＳｅｐＴＭ血液分離管を用いた密度勾配遠心分離によって単離した（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）。アッセイ培地（１％ＢＳＡ及び１００単位／ｍＬのペニシリン並びにストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）５０μＬの中の標的細胞が、９６ウェルの丸底プレート中に４×１０４／ウェルで播種された。試験及び対照抗体の段階希釈液（５０μＬ／ウェル）が、標的細胞を含むプレートに添加され、オプソニン化を可能にするために、３０分間、５％ＣＯ２を含む３７℃でインキュベートされた。合計１０個のデータ点に対して５倍の段階希釈後に、抗体の最終濃度は、０．００５１から１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。インキュベーション後、アッセイ培地１００μＬ中１．０×１０６のＰＢＭＣエフェクター細胞が各ウェルに添加され、エフェクター：標的細胞の比２５：１を与え、プレートは更に４時間インキュベートされた。プレートはインキュベーションの最後で遠心分離され、上清はＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｎｅｃｅ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性について試験された。ＬＤＨ反応混合物が上清に添加され、プレートは振盪しながら室温で１５分間インキュベートされた。反応は、１ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプラスマイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を４９０ｎｍで測定した（６５０ｎｍで測定したバックグラウンドは各ウェルについて差し引かれた）。標的細胞のみを含むウェルの吸光度はバックグランドの対照としての役割を果たしたが（低対照）、一方トリトンＸ１００で溶解した標的細胞を含むウェルは利用可能な最大のシグナルを与えた（高対照）。抗体非依存性細胞性細胞傷害（ＡＩＣＣ）は、抗体を添加することなく、標的及びエフェクター細胞を含むウェル中で測定された。特定のＡＤＣＣの程度は以下のように計算された：
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試料希釈物のＡＤＣＣ値が抗体濃度に対してプロットされ、用量応答曲線はＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを使用して４パラメーターモデルに適合させた。
【０３６０】
ＡＤＣＣアッセイの結果は図２３に示される。予想されるように、エフェクター陽性抗ＴｆＲ抗体（抗ＴｆＲ１／ｇＤ ＩｇＧ１ ＷＴ）は、ＨＥＬ細胞に有意なＡＤＣＣ活性を誘発した。対照的に、ＬＡＬＡＰＧ、ＬＡＬＡＰＧ／ＹＴＥ、又はＬＡＬＡＰＧ／ＡＩ変異を含む抗ＴｆＲ５２Ａ／ＢＡＣＥ１抗体変異体は、陰性対照抗ＴｆＲ５２Ａ／ｇＤ Ｎ２９７Ｇ抗体と類似して、ＨＥＬ細胞において任意のＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【０３６１】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図３Ｄ−１】
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【図３Ｄ−２】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｅ−１】
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【図４Ｅ−２】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【配列表】
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