(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターが、以下の［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなる請求項１記載のベクター。
［Ａ１］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ２］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ａ３］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
【請求項３】
前記ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載のＤＮＡからなる請求項１又は２記載のベクター。
［Ｆ１］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ２］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ３］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ４］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ５］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ６］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項１、２、又は３に記載のベクターが導入された形質転換植物。
【請求項５】
請求項１、２、又は３に記載のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのイソプレノイド産生植物から採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。
【０００４】
ところで、近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に所望の外来遺伝子を導入することによって形質の改変を図ることが可能となってきている。
天然ゴムは、パラゴムノキやインドゴムノキなどの特定のイソプレノイド産出植物の乳管で生産される乳液から得られるものであることから、乳液の生産性を向上させて天然ゴムの生産量を向上させることを目的として、遺伝子組換え技術の開発が検討されているが、未だ改善の余地があった。
【０００５】
このように、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、天然ゴムの生産量を向上させることができる技術の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記課題を解決し、遺伝子組換え技術により植物体に導入することでポリイソプレノイドの生産量を向上させることができるベクターを提供することを目的とする。また、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、天然ゴムの生産量を向上させる方法について、種々検討を行う中で、遺伝子組換え技術に着目し、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を増強し、結果的にポリイソプレノイドの生産量を向上させることで、天然ゴムの生産量の向上した形質転換植物を作出することを目指して研究、開発を行い、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターの制御下となるように、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を連結した塩基配列を含むベクターを構築した。そして、当該構築したベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれるポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができることを見出した。
【０００８】
本発明は、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターに関する。
【０００９】
上記ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターが、以下の［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ａ１］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ２］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ａ３］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
【００１０】
上記ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子、及び、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であることが好ましい。
【００１１】
上記ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｂ１］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ２］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｂ３］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１２】
上記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｃ１］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ２］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｃ３］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１３】
上記３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｄ１］〜［Ｄ１２］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｄ１］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ２］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ３］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ４］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ５］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ６］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ７］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ８］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ９］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ１０］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ１１］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ１２］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１４】
上記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｅ１］〜［Ｅ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｅ１］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｅ２］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｅ３］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１５】
上記ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｆ１］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ２］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ３］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ４］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ５］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ６］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１６】
上記Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子が、以下の［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｇ１］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｇ２］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｇ３］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１７】
上記Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子が、以下の［Ｈ１］〜［Ｈ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｈ１］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｈ２］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｈ３］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１８】
本発明はまた、上記いずれかのベクターが導入された形質転換植物に関する。
【００１９】
本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のベクターは、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイドの生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。そして、該ベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図２】図２は、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図３】図３は、ポリイソプレノイドの生合成経路の上流であるメバロン酸経路の一部を示す模式図である。
【図４】図４は、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図５】図５は、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図６】図６は、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図７】図７は、実施例１で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図８】図８は、実施例２で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図９】図９は、実施例３、８、９、又は１０で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施例４で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図１１】図１１は、実施例５又は１１で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図１２】図１２は、実施例６で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施例７で用いるアグロバクテリウムに導入される発現ベクターのＴ−ＤＮＡ領域を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（ベクター）
本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＭＹＣ１転写因子（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能となる。これは、乳液の生産性向上のために導入した外来遺伝子の発現が乳管以外の部位で促進されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷がかかり、悪影響を及ぼすためと推測される。
なお、本明細書において、ＭＹＣ１転写因子（ＭＹＣ１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のポリイソプレノイド産出植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、転写因子とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性を有するタンパク質を意味する。すなわち、本明細書において、ＭＹＣ１転写因子は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも１種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性（転写因子活性）を有するタンパク質のことである。
【００２３】
なお、本明細書において、プロモーターが乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するとは、所望の遺伝子を当該プロモーターと機能的に連結させて植物に導入した場合に、当該所望の遺伝子が乳管で特異的に発現されるように遺伝子発現を制御する活性を有することを意味する。ここで、乳管特異的に遺伝子が発現するとは、当該遺伝子が植物中、乳管以外の部位では全く又はほとんど発現せず、当該遺伝子が実質的に乳管でのみ専ら発現しているといえる状態を意味する。また、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。
【００２４】
本発明のベクターは、一般的に植物の形質転換用ベクターとして知られているベクターに、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列、及び、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。本発明のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。
【００２５】
本発明のベクターは、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列、及び、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
【００２６】
上記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、上記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等が挙げられる。
【００２７】
（ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産出植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、グアユール、ロシアンタンポポ、セイタカアワダチソウ、ノゲシ、レタス、又はヒマワリ由来であることが更に好ましい。特に好ましくは、パラゴムノキ由来である。
なお、本明細書において、ポリイソプレノイド産出植物とは、ポリイソプレノイドを産出可能な植物を意味し、その具体例は後述する。
【００２８】
上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ａ１］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ２］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ａ３］配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
【００２９】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン若しくはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００３０】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００３１】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件を挙げることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件を挙げることができる。
【００３２】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００３３】
また、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１で表される塩基番号１−１６１０の塩基配列との配列同一性としては、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３４】
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３  （１９９０）］を用いて決定することができる。
【００３５】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、上記したＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有するＤＮＡが、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡであることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法である、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をレポーター遺伝子としたレポーターアッセイなどにより確認する方法が挙げられる。
【００３６】
また、上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）法によりゲノムＤＮＡを抽出する。次に既知のＭＹＣ１をコードする遺伝子の塩基配列を基に特異的なプライマーと、ランダムプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＴＡＩＬ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）−ＰＣＲ法を行って、ＭＹＣ１のプロモーターを含む遺伝子の増幅を行い、塩基配列を同定する。
【００３７】
（ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質）
上記ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子は、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子、及び、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子であることが好ましい。なかでも、ポリイソプレノイドの生産量をより向上させることができることから、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子、及び、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子がより好ましく、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子、又は、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子が更に好ましく、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が特に好ましい。
【００３８】
本発明者らは、ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を増強し、結果ポリイソプレノイドの生産量を向上させることで、天然ゴムの生産量の向上した形質転換植物を作出することを目指したが、まず、ポリイソプレノイドの生合成経路のなかでも、重要物質の１つであるイソプレニル二リン酸（ＩＰＰ）を生合成する経路として、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２種類の経路が知られている。ＭＶＡ経路に着目し、ＭＶＡ経路及びその下流の経路の一部を増強すべく、ポリイソプレノイドの生合成経路に関与している様々な蛋白質の中から、重要な働きをしていると予想される複数の蛋白質を選定した。
【００３９】
具体的には、アリル性の基質にＩＰＰを連結していき、イソプレン単位を順次つなげていく反応に関わるプレニルトランスフェラーゼであり、天然ゴムの開始基質と考えられるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を合成するファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）；ＭＶＡ経路の律速段階である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；ＩＰＰとジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の異性化に関わるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）；イソプレノイド化合物の鎖長伸張に関わるとされているｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）；ポリイソプレノイドの生合成に関与していることが知られているＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）及びＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）の７種の蛋白質を選定した。そして、これらの蛋白質をコードする遺伝子それぞれをＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターの制御下となるように連結した塩基配列を含むベクターを構築し、当該構築したベクターを植物に導入することにより、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能であった。
【００４０】
なお、上述のように、ポリイソプレノイドの生合成経路では、アリル性基質に順次イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が連結される反応が進行する。この反応を触媒する酵素は、イソプレン単位を順次つなげていくという意味からプレニルトランスフェラーゼと総称されている。なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼとは、ＩＰＰとイソプレニル二リン酸（イソプレン単位がｎ個）（アリル性基質）との間の縮合反応を触媒し、イソプレン単位が１単位増えた新たなイソプレニル二リン酸（イソプレン単位がｎ＋１個）を合成する酵素の総称を意味する。
【００４１】
プレニルトランスフェラーゼは、イソプレン単位を連結することにより、各テルペノイドの基本的前駆体となるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ：Ｃ１０）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ：Ｃ１５）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ：Ｃ２０）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ：Ｃ２５）、ヘキサプレニル二リン酸（ＨＰＰ：Ｃ３０）などの各種のイソプレニル二リン酸を合成する酵素群であり、テルペノイド生合成の主流に位置している。ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）や、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）などがプレニルトランスフェラーゼに分類される。
【００４２】
なお、本明細書において、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を基質としてファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の生合成反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）及びファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の生合成反応を触媒する酵素である。
【００４３】
また、本明細書において、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧＲ）は、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）の律速酵素の一つであり、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ  （ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ  １．１．１．３４）と３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．８８）の両方を含む。
また、本明細書において、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ、ＩＰＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）と、その異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の間の異性化反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ、ＣＰＴ）は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。ここで、本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えばｃｉｓ−ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
また、本明細書において、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のポリイソプレノイド産出植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
また、本明細書において、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のポリイソプレノイド産出植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
【００４４】
（遺伝子）
上記ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子は、いずれもその由来は特に制限されず、植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産出植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、グアユール、ロシアンタンポポ、セイタカアワダチソウ、ノゲシ、レタス、又はヒマワリ由来であることが更に好ましい。特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
【００４５】
上記ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｂ１］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ２］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｂ３］配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００４６】
上記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｃ１］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ２］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｃ３］配列番号４で表される塩基番号１−１１１３の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００４７】
上記３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、以下の［Ｄ１］〜［Ｄ１２］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｄ１］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ２］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ３］配列番号６で表される塩基番号１−１７２８の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ４］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ５］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ６］配列番号７で表される塩基番号１−１７６１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ７］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ８］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ９］配列番号８で表される塩基番号１−１８２１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ１０］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ１１］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ１２］配列番号９で表される塩基番号１−１５８１の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００４８】
上記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、以下の［Ｅ１］〜［Ｅ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｅ１］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｅ２］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｅ３］配列番号１４で表される塩基番号１−７０５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００４９】
上記ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、以下の［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｆ１］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ２］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ３］配列番号１６で表される塩基番号１−８７３の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ４］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｆ５］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｆ６］配列番号６６で表される塩基番号１−８５５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００５０】
上記Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子は、以下の［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｇ１］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｇ２］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｇ３］配列番号１８で表される塩基番号１−６１５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
【００５１】
上記Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子は、以下の［Ｈ１］〜［Ｈ３］のいずれかに記載のＤＮＡからなることが好ましい。
［Ｈ１］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｈ２］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｈ３］配列番号６０で表される塩基番号１−４１７の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
【００５２】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
【００５３】
また、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、ある蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様の酵素活性を有する場合があることが知られている。酵素活性を維持するための、配列番号２で表される塩基番号１−１０２９の塩基配列との配列同一性としては、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。配列番号４、６〜９、１４、１６、１８、６０、６６で表される塩基配列についても、配列同一性としては上記範囲同様である。
【００５４】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、上記したＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有するＤＮＡが、所定の酵素活性等の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００５５】
また、上記蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列及び上記蛋白質のアミノ酸配列を同定する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【００５６】
（蛋白質）
上記ファルネシル二リン酸シンターゼの具体例としては、下記［ｂ１］が挙げられる。該［ｂ１］で表される蛋白質は、上記［Ｂ１］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｂ１］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３４２のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００５７】
上記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの具体例としては、下記［ｃ１］が挙げられる。該［ｃ１］で表される蛋白質は、上記［Ｃ１］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｃ１］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３７０のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００５８】
上記３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの具体例としては、下記［ｄ１］〜［ｄ４］のいずれかが挙げられる。該［ｄ１］〜［ｄ４］で表される蛋白質はそれぞれ、上記［Ｄ１］、［Ｄ４］、［Ｄ７］及び［Ｄ１０］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｄ１］配列番号１０で表されるアミノ酸番号１−５７５のアミノ酸配列からなる蛋白質
［ｄ２］配列番号１１で表されるアミノ酸番号１−５８６のアミノ酸配列からなる蛋白質
［ｄ３］配列番号１２で表されるアミノ酸番号１−６０６のアミノ酸配列からなる蛋白質
［ｄ４］配列番号１３で表されるアミノ酸番号１−５２６のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００５９】
上記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼの具体例としては、下記［ｅ１］が挙げられる。該［ｅ１］で表される蛋白質は、上記［Ｅ１］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｅ１］配列番号１５で表されるアミノ酸番号１−２３４のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００６０】
上記ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼの具体例としては、下記［ｆ１］又は［ｆ４］が挙げられる。該［ｆ１］、［ｆ４］で表される蛋白質は、上記［Ｆ１］、［Ｆ４］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｆ１］配列番号１７で表されるアミノ酸番号１−２９０のアミノ酸配列からなる蛋白質
［ｆ４］配列番号６７で表されるアミノ酸番号１−２８４のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００６１】
上記Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎの具体例としては、下記［ｇ１］が挙げられる。該［ｇ１］で表される蛋白質は、上記［Ｇ１］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｇ１］配列番号１９で表されるアミノ酸番号１−２０４のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００６２】
上記Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒの具体例としては、下記［ｈ１］が挙げられる。該［ｈ１］で表される蛋白質は、上記［Ｈ１］で表されるＤＮＡにコードされている蛋白質である。
［ｈ１］配列番号６１で表されるアミノ酸番号１−１３８のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００６３】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記蛋白質の具体例としてはそれぞれ、下記［ｂ２］、［ｃ２］、［ｄ５］、［ｄ６］、［ｄ７］、［ｄ８］、［ｅ２］、［ｆ２］、［ｆ５］、［ｇ２］、［ｈ２］も挙げられる。
［ｂ２］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３４２のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｃ２］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３７０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ５］配列番号１０で表されるアミノ酸番号１−５７５のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ６］配列番号１１で表されるアミノ酸番号１−５８６のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ７］配列番号１２で表されるアミノ酸番号１−６０６のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ８］配列番号１３で表されるアミノ酸番号１−５２６のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｅ２］配列番号１５で表されるアミノ酸番号１−２３４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｆ２］配列番号１７で表されるアミノ酸番号１−２９０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｆ５］配列番号６７で表されるアミノ酸番号１−２８４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｇ２］配列番号１９で表されるアミノ酸番号１−２０４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
［ｈ２］配列番号６１で表されるアミノ酸番号１−１３８のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
【００６４】
なお、上記酵素活性を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜６８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜５１個のアミノ酸、更により好ましくは１〜３４個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１７個のアミノ酸、最も好ましくは１〜７個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６５】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜７４個のアミノ酸、更に好ましくは１〜５６個のアミノ酸、更により好ましくは１〜３７個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１９個のアミノ酸、最も好ましくは１〜７個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜４個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６６】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜１１５個のアミノ酸、更に好ましくは１〜８６個のアミノ酸、更により好ましくは１〜５８個のアミノ酸、特に好ましくは１〜２９個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１２個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６７】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜１１７個のアミノ酸、更に好ましくは１〜８８個のアミノ酸、更により好ましくは１〜５９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜２９個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１２個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６８】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜１２１個のアミノ酸、更に好ましくは１〜９１個のアミノ酸、更により好ましくは１〜６１個のアミノ酸、特に好ましくは１〜３０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１２個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６９】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０５個のアミノ酸、更に好ましくは１〜７９個のアミノ酸、更により好ましくは１〜５３個のアミノ酸、特に好ましくは１〜２６個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１１個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７０】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１５で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜４７個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３５個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２３個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１２個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７１】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４４個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７２】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号６７で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５７個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４３個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２８個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１４個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７３】
また、ＳＲＰＰとしての機能、すなわちラテックスに存在するゴム粒子に結合する機能を維持するためには、配列番号１９で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜４１個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３１個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜４個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７４】
また、ＲＥＦとしての機能、すなわちラテックスに存在するゴム粒子に結合する機能を維持するためには、配列番号６１で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜２８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜２１個のアミノ酸、更により好ましくは１〜１４個のアミノ酸、特に好ましくは１〜７個のアミノ酸、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸、より最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００７５】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００７６】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記蛋白質の具体例としてはそれぞれ、下記［ｂ３］、［ｃ３］、［ｄ９］、［ｄ１０］、［ｄ１１］、［ｄ１２］、［ｅ３］、［ｆ３］、［ｆ６］、［ｇ３］、［ｈ３］も挙げられる。
［ｂ３］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３４２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｃ３］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３７０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ９］配列番号１０で表されるアミノ酸番号１−５７５のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ１０］配列番号１１で表されるアミノ酸番号１−５８６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ１１］配列番号１２で表されるアミノ酸番号１−６０６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｄ１２］配列番号１３で表されるアミノ酸番号１−５２６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｅ３］配列番号１５で表されるアミノ酸番号１−２３４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｆ３］配列番号１７で表されるアミノ酸番号１−２９０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｆ６］配列番号６７で表されるアミノ酸番号１−２８４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［ｇ３］配列番号１９で表されるアミノ酸番号１−２０４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
［ｈ３］配列番号６１で表されるアミノ酸番号１−１３８のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
【００７７】
なお、上記酵素活性等蛋白質としての本来の機能を維持するためには、配列番号３、５、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１９、６１、６７のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００７８】
所定の酵素活性等の機能を有する蛋白質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００７９】
（形質転換体）
本発明のベクター（ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイドの生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクター）を植物に導入することにより、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質を乳管特異的に発現するように形質転換された生物体（形質転換体）が得られる。そして、当該形質転換体では、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質が乳管特異的に発現することにより、本発明のベクターが導入された植物体内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性等の機能が乳管内で増強されてポリイソプレノイドの生合成経路の一部が増強され、結果的に植物体でのポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
【００８０】
上記形質転換体に用いられる宿主としては、植物であれば特に制限されないが、ポリイソプレノイドを産出可能な植物であることが好ましく、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃ  ａｒｐａｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕ���属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることがより好ましい。特に好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物であり、最も好ましくはパラゴムノキである。
【００８１】
本発明のベクターを植物に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。中でも、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム法）を用いて本発明のベクターを植物に導入して形質転換体を作製するのが好ましい。この場合、本発明のベクターをアグロバクテリウム属菌に導入し、当該アグロバクテリウム属菌を通常行われる方法により培養（例えば、培養温度２０〜３５℃で、ＹＥＢ培地で１０〜３０時間振とう培養）、増殖させた後、カルス、植物組織片又は幼植物体に感染させることで、本発明のベクターに含まれる所定の遺伝子の導入された形質転換体を作製することができる。
【００８２】
上記した本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の方法により作製することができるが、例えば、アグロバクテリウム属菌の有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組換え可能なプラスミドに、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列、及び、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列等を挿入した遺伝子組換えベクターを本発明のベクターとして作製し、当該ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入する方法や、上述したバイナリーベクターに、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列、及び、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列等を挿入した遺伝子組換えバイナリーベクターを本発明のベクターとして作製し、当該ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入する方法などが挙げられる。
また、上記アグロバクテリウム属菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株（Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＧＶ３１０１等）を用いることができる。
【００８３】
以上の方法等により、上記形質転換体（形質転換植物細胞）が得られる。
【００８４】
本発明はまた、本発明のベクターが導入された形質転換植物を提供するものである。該形質転換植物は、形質転換植物細胞を有する植物であれば特に限定されず、例えば、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、本発明のベクターに含まれるＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列、及び、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列がゲノム内に導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物を量産することも可能である。
【００８５】
形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特開２０００−３１６４０３号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）、  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）、  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）、  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
【００８６】
以下において、本発明の形質転換植物を作製する方法の一例について具体的に説明する。
本発明の形質転換植物を作製する方法の一例としては、植物由来の組織をカルス誘導化条件で５〜９週間培養（誘導工程）して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該ベクターの導入されたカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程（再生誘導工程）とを含む方法が挙げられる。このような作製方法では、上記感染工程と、上記選択培養工程とにより、形質転換植物細胞（形質転換されたカルス）を作成した後、上記再生誘導工程により、該カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養してカルスを植物に再生し、形質転換植物を作成することができる。カルスを植物に再生する方法としては、より具体的には、カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、シュートを形成させ、該シュートを培養することにより、カルスを植物に再生すればよい。
【００８７】
より具体的には、植物由来の組織をカルス誘導化条件で５〜９週間培養して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該ベクターの導入されたカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む方法であることが好ましく、植物由来の組織をカルス誘導化条件で５〜９週間培養して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該ベクターの導入されたカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む方法であることがより好ましい。
【００８８】
次に、本発明の形質転換植物を作製する方法の各工程について説明する。
【００８９】
（誘導工程）
まず、カルスの調製方法（誘導工程）について説明する。
誘導工程では、例えば、植物の組織片（組織）を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００９０】
上記組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎が好ましい。
【００９１】
上記誘導工程では、まず、植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄してもよい。
【００９２】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００９３】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培地が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【００９４】
上記植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００９５】
上記オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸がより好ましい。
【００９６】
上記サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン（ＫＩ）、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、カイネチンがより好ましい。
【００９７】
上記炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。また、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等の糖アルコールであってもよい。なかでも、スクロースが好ましい。
【００９８】
上記誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持及び細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００９９】
上記誘導培地は、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、ｌ−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましい。
【０１００】
上記誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。上記固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル等が挙げられる。
【０１０１】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１０２】
上記誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは２０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０１０３】
上記誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
なお、本明細書において、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類（培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類）は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることが好ましい。
【０１０４】
上記誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１０５】
上記誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【０１０６】
上記誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。また、該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１０７】
上記誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。また、該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。
【０１０８】
上記誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１０９】
上記誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１１０】
上記誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【０１１１】
上記誘導培地が固体培地である場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。また、該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１１２】
上述の条件のなかでも、特に、植物がパラゴムノキの場合、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌであり、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【０１１３】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。
【０１１４】
本発明の形質転換植物を作製する方法では、例えば、植物由来の組織をカルス誘導化条件（上記誘導培地）で５〜９週間培養して得られたカルスを用いることができる。植物由来の組織をカルス誘導化条件で培養を開始した後、アグロバクテリウム属菌感染までの培養期間は、特に限定されるものではなく、植物の種類、カルス誘導の材料とする植物組織（組織片）の種類や量、感染に用いるアグロバクテリウム属菌の量等を考慮して、適宜決定することができる。好ましくは、植物由来の組織をカルス誘導化条件で５〜９週間培養して得られたカルス、より好ましくは、植物由来の組織をカルス誘導化条件で６〜８週間培養して得られたカルス、特に好ましくは、植物由来の組織をカルス誘導化条件で８週間培養して得られたカルスを用いる。
【０１１５】
なお、例えば、植物由来の組織をカルス誘導化条件で８週間培養して得られたカルスとは、植物由来の組織をカルス誘導培地（上記誘導培地）に移してから８週間培養して得られたカルスを意味する。
【０１１６】
（感染工程）
感染工程では、植物由来の組織をカルス誘導化条件で例えば５〜９週間培養して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる。
【０１１７】
上記感染工程では、植物由来の組織をカルス誘導化条件で例えば５〜９週間培養して得られたカルス（誘導工程により得られたカルス）に、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌（調製方法の例は、上述のとおり）を感染させる。
【０１１８】
上記感染工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。例えば、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染培地中に懸濁させた懸濁液中に、カルスを浸漬させることにより、感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、カルスをろ紙等で分離すればよい。なお、浸漬中は、静置してもよく、振とうしてもよいが、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させやすいことから、振とうすることが好ましい。
【０１１９】
上記懸濁液における菌濃度は、アグロバクテリウム属菌の種類や増殖活性、感染させるカルスのカルス誘導後の培養期間、浸漬時間等を考慮して適宜決定することができる。例えば、カルス６ｇに対し、６００ｎｍで測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．０１〜０．４（好ましくは０．０５〜０．２、より好ましくは０．０８〜０．１２）のアグロバクテリウム属菌懸濁溶液１０〜５０ｍＬ（好ましくは２０〜４０ｍＬ、より好ましくは２５〜３５ｍＬ）に相当する菌体数のアグロバクテリウム属菌を接触させることが好ましい。これにより、カルスへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換植物細胞を効率的に作成できる。
【０１２０】
上記感染工程におけるアグロバクテリウム属菌とカルスの共存時間、すなわち、アグロバクテリウム属菌とカルスを接触させる時間は、０．５〜６０分が好ましく、１〜４０分がより好ましく、２５〜３５分が更に好ましい。これにより、カルスへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換植物細胞を効率的に作成できる。なお、該共存時間は、例えば、アグロバクテリウム属菌懸濁液中に、カルスを浸漬させる場合、浸漬時間を意味する。
【０１２１】
上記アグロバクテリウム属菌を懸濁させる感染培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地がより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、炭素源としては、スクロースが更に好ましい。
【０１２２】
好適な感染培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１２３】
上記感染培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。また、該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは５質量％以下である。
【０１２４】
カルスの状態を良好化できるという理由から、上記感染培地がアミノ酸含有培地であることが好ましい。アミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン等が挙げられる。なかでも、アスパラギン酸、グルタミンが好ましく、アスパラギン酸、グルタミンを併用することが好ましい。
【０１２５】
上記感染培地中のアミノ酸の濃度は、好ましくは５００ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは７００ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１０００ｍｇ／ｌ以上である。また、該アミノ酸の濃度は、好ましくは５０００ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは２０００ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１３００ｍｇ／ｌ以下である。
【０１２６】
上記アミノ酸含有培地において、アスパラギン酸、グルタミンを併用する場合、感染培地中のアスパラギン酸の濃度は、好ましくは１００〜７００ｍｇ／ｌ、より好ましくは２００〜５００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは２５０〜４００ｍｇ／ｌである。一方、感染培地中のグルタミンの濃度は、好ましくは１００〜１５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは５００〜１２００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは７００〜１１００ｍｇ／ｌである。
【０１２７】
カルスがアグロバクテリウムに感染しやすくなるという理由から、上記感染培地はアセトシリンゴン含有培地であることが好ましい。感染培地中のアセトシリンゴンの濃度は、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｌ、更に好ましくは５〜１５ｍｇ／ｌである。
【０１２８】
カルスの状態及びカルスの生長を良好化できるという理由から、上記感染培地はカザミノ酸含有培地であることが好ましい。感染培地中のカザミノ酸の濃度は、好ましくは５０〜６００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは２００〜４００ｍｇ／ｌである。
【０１２９】
上記感染培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。感染させる温度（感染培地の温度）は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２２〜２４℃が更に好ましい。感染工程は、暗所で行っても明所で行ってもよい。
【０１３０】
以上のように、感染工程では、例えば、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染培地中に懸濁させた懸濁液中に、誘導工程により得られたカルスを浸漬させることにより、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、カルスをろ紙等で分離し、分離したカルスは、次の共存培養工程に使用される。
【０１３１】
（共存培養工程）
共存培養工程では、例えば、感染工程により得られたカルス（アグロバクテリウム属菌が感染したカルス）を共存培養培地中で培養する。これにより、感染によりカルスに導入された本発明のベクターに含まれる遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換植物細胞を得ることができる。
【０１３２】
なお、共存培養培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、安定した形質転換植物細胞を得ることができるため、固体培養が好ましい。また、共存培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１３３】
共存培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。具体的には、上記感染培地と同様の培地を同様の好適な態様で好適に使用できる。
【０１３４】
共存培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１３５】
培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、暗所で培養を行うことが好ましく、暗所の照度は、０〜０．１ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、２〜４日間培養することが好ましい。
【０１３６】
固体培地の場合、共存培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１３７】
以上のように、共存培養工程では、感染工程により得られたカルス（アグロバクテリウム属菌が感染したカルス）を上記共存培養培地中で培養することにより、感染によりカルスに導入された本発明のベクターに含まれる遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換植物細胞を得ることができる。この共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）は、次の選択培養工程に使用される。
【０１３８】
（選択培養工程）
選択培養工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【０１３９】
選択培養工程では、まず、アグロバクテリウム属菌を滅菌するために、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地にカルベニシリンを加えたものを使用して、共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）の洗浄を行う。なお、滅菌の前に、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地により予め共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）を洗浄しておいてもよい。
【０１４０】
次に、カルベニシリンにより滅菌されたカルスは、選択培養培地中で培養される。選択培養工程の培養条件は、形質転換植物細胞（本発明のベクターに含まれる所定のプロモーター及び所定の蛋白質をコードする遺伝子を獲得したカルス）が選択的に生育できる条件であれば、特に限定されない。
【０１４１】
なお、選択培養培地は、液体であっても固体であってもよい。また、選択培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１４２】
選択培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に、マーカー遺伝子（本発明のベクターに含めたマーカー遺伝子）に対応する物質を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えたものが好ましく、ＭＳ培地に上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えたものがより好ましい。なお、必要に応じて、カルベニシリンを加えてもよい。また、必要に応じて植物生長ホルモンを加えてもよい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【０１４３】
上記マーカー遺伝子に対応する物質としては、特に限定されないが、当業者であれば、使用したマーカー遺伝子に応じて適宜選択することができる。例えば、上記マーカー遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した場合には、ハイグロマイシンを培地に添加してカルス（カルベニシリンにより滅菌されたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物））を培養することにより、形質転換されたカルスは、所定のプロモーター及び所定の蛋白質をコードする遺伝子と共にハイグロマイシン耐性遺伝子も導入されているため当該培地中で生育することができるが、形質転換されていないカルスは、当該培地中で生育することがない。このように、上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えた培地で、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物を培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができる。
【０１４４】
選択培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１４５】
選択培養培地のｐＨは、特に限定されないが、５．０〜７．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、暗所で培養を行うことが好ましく、暗所の照度は、０〜０．１ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜４週間おきに継代培養することが好ましい。
【０１４６】
固体培地の場合、選択培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１４７】
以上のように、選択培養工程では、共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）をカルベニシリン含有溶液により洗浄し、アグロバクテリウム属菌を滅菌する。次に、カルベニシリンにより滅菌されたカルスを、選択培養培地中で培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができ、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【０１４８】
このように上記方法により、形質転換植物細胞（形質転換されたカルス）を効率的に作成できる。次に、形質転換されたカルスを再生誘導工程に用い、安定的に植物に再生することができる。
【０１４９】
（再生誘導工程）
再生誘導工程では、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、形質転換されたカルス（形質転換されたカルスを増殖させたものであってもよい）を培養することにより不定胚及びシュートを形成させる。カルスから不定胚を誘導（形成）し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートの形成を行うことができるため、再生誘導工程の培養条件は、カルスから不定胚を誘導できる条件であれば、特に限定されない。
【０１５０】
再生誘導工程では、形質転換されたカルスを再生誘導培地中で培養して不定胚を誘導する。なお、再生誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、不定胚を誘導しやすいため、固体培養が好ましい。また、再生誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１５１】
再生誘導培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、不定胚の誘導に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【０１５２】
再生誘導培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１５３】
好適な再生誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１５４】
再生誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１５５】
再生誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは５×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは０．０３ｍｇ／ｌ以下、より最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。
【０１５６】
再生誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上、より最も好ましくは１．０ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が上記範囲内の場合に、特に、不定胚を好適に誘導でき、好適にシュートを形成できる。
【０１５７】
再生誘導培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０ヶ月（特に好ましくは、３〜６ヶ月）培養することが好ましい。なおその場合、１〜４週間おきに継代培養することが好ましい。
【０１５８】
固体培地の場合、再生誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．１５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下、特に好ましくは０．３質量％以下である。
【０１５９】
パラゴムノキの場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のスクロースの濃度が２〜４質量％、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸の濃度が１×１０−３〜０．０３ｍｇ／ｌ、カイネチンの濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．３質量％であることが好ましい。
【０１６０】
以上のように、再生誘導工程では、カルスを上記再生誘導培地中で培養することにより、不定胚及びシュートを形成させることが可能である。この再生誘導工程により形成されたシュートは、次の伸長工程に使用される。次の伸長工程に移るタイミングとしては、シュートが視認され、その後安定して成長していることが確認できた後が好ましい。なお、次の伸長工程を省略して、再生誘導工程により形成されたシュートを直接発根工程に使用してもよい。
【０１６１】
（伸長工程）
伸長工程では、形成されたシュートを伸長培地で培養することによりシュートを伸長させる。
【０１６２】
伸長工程では、例えば、再生誘導工程により形成されたシュートを伸長培地中で培養してシュートを伸長させる。なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、シュートを伸長させやすいため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１６３】
伸長培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、シュートを好適に伸長できるという理由から、例えば、再生誘導培地と同様の培地とすることができ、なかでも、伸長培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地であることがより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【０１６４】
伸長培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１６５】
伸長工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の条件である。
【０１６６】
伸長培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜１０週間培養することが好ましい。
【０１６７】
固体培地の場合、伸長培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１６８】
以上のように、伸長工程では、形成されたシュートを上記伸長培地中で培養することにより、シュートを伸長させることが可能である。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは、次の発根工程に使用される。次の発根工程に移るタイミングとしては、シュートが２〜３ｃｍ程度の大きさに伸長した後が好ましい。
【０１６９】
（発根工程）
発根工程では、シュートを発根培地で培養することにより発根させる。ここで、シュートとしては、伸長工程により伸長させたシュートを使用してもよく、再生誘導工程により形成されたシュートを直接使用してもよい。
【０１７０】
発根工程では、例えば、伸長工程により伸長させたシュート又は再生誘導工程により形成されたシュートを発根培地中で培養して発根させる。なお、発根培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、発根させやすいため、固体培養が好ましい。また、発根培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１７１】
発根培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、好適に発根できるという理由から、発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まない１／２ＭＳ培地がより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、伸長培地と発根培地の組成が同一であってもよい。また、伸長工程において既に発根している場合には、この発根工程を省略してもよい。
【０１７２】
発根培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１７３】
発根工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の条件である。
【０１７４】
発根培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、４〜１０週間培養することが好ましい。
【０１７５】
固体培地の場合、発根培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．３質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１７６】
以上のように、発根工程では、伸長したシュートを上記発根培地中で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（幼植物（形質転換植物））が得られる。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、バーミキュライト等の人工土壌に移して馴化してから土壌に移植することが好ましい。
【０１７７】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【０１７８】
本発明では、本発明のベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれるポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再生された形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、ポリイソプレノイドを製造することができる。本発明の形質転換植物では、導入された蛋白質により乳管においてポリイソプレノイドの生合成経路の一部が増強されるので、該蛋白質（酵素）が機能し、生合成する化合物の乳管での生合成量を向上させることができ、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【０１７９】
ここで、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴム、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸などの重合体が挙げられる。なかでも、イソプレン単位で構成され、重量平均分子量が１０００以上の重合体であることが好ましく、イソプレン単位で構成され、重量平均分子量が１００００以上の重合体であることがより好ましく、イソプレン単位で構成され、重量平均分子量が１０万以上の重合体であることが更に好ましい。
なお、上記重量平均分子量は、実施例に記載された方法により測定できる。
【０１８０】
ポリイソプレノイド産出植物では、図１に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ファルネシル二リン酸シンターゼは、図１中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素である。そこで、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｂ１］〜［ｂ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にファルネシル二リン酸シンターゼ活性が上昇し、結果、乳管でのファルネシル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
【０１８１】
ポリイソプレノイド産出植物では、図２に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼは、図２中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素である。そこで、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｃ１］〜［ｃ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性が上昇し、結果、乳管でのゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。そして更には、生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させることもできる。このように、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより、該植物において生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させる方法もまた、本発明の１つである。
【０１８２】
ポリイソプレノイド産出植物では、図１に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路の上流であるメバロン酸経路は図３に示すような経路であり、メバロン酸経路のうち、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、図３中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素であり、メバロン酸経路の律速酵素である。そこで、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｄ１］〜［Ｄ１２］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｄ１］〜［ｄ１２］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性が上昇し、結果、乳管でのメバロン酸の生合成量を向上でき、それがイソペンテニル二リン酸の生合成量の向上に繋がり、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量も向上させることができる。そして更には、生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させることもできる。このように、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより、該植物において生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させる方法もまた、本発明の１つである。
【０１８３】
ポリイソプレノイド産出植物では、図４に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼは、図４中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素である。そこで、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｅ１］〜［Ｅ３］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｅ１］〜［ｅ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性が上昇し、結果、乳管でのイソペンテニル二リン酸若しくはジメチルアリル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
【０１８４】
ポリイソプレノイド産出植物では、図５に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼは、図５中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられており、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｆ１］〜［ｆ６］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ活性が上昇し、結果、乳管でのｃｉｓ型イソプレノイドの生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。そして更には、生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させることもできる。このように、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより、該植物において生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させる方法もまた、本発明の１つである。
【０１８５】
ポリイソプレノイド産出植物では、図６に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によりポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎは、図６中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素の触媒反応に関与すると考えられており、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｇ１］〜［ｇ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎの発現量が増加し、結果、乳管でのｃｉｓ型イソプレノイドの生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。そして更には、生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させることもできる。このように、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより、該植物において生産されるポリイソプレノイドの重量平均分子量を増大させる方法もまた、本発明の１つである。
【０１８６】
また、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒも、図６中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素の触媒反応に関与すると考えられており、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、［Ｈ１］〜［Ｈ３］のいずれかに記載の遺伝子、又は［ｈ１］〜［ｈ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を植物に導入することにより、乳管特異的にＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒの発現量が増加し、結果、乳管でのｃｉｓ型イソプレノイドの生合成量を向上でき、ひいては当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
【０１８７】
本発明では、上記７種の蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１種の遺伝子を植物に導入することにより、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることができるが、上記７種の蛋白質をコードする遺伝子のうち、２種以上の遺伝子を植物に導入することにより、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量はより向上し、７種すべての遺伝子を植物に導入することにより本発明の効果が最も顕著に発揮される。
【実施例】
【０１８８】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１８９】
（ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列の調製）
パラゴムノキの葉由来のＭＹＣ１転写因子（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子とそのプロモーターを含むＤＮＡ断片を以下の手順でクローニングした。まず、パラゴムノキの葉からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出はＣＴＡＢ法で行った。ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子の増幅は、下記プライマー１〜２に示すようなランダムプライマーとＭＹＣ１をコードする遺伝子に対応したプライマーを用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により行った。
（プライマー１：配列番号２０）
５′−ＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＴＣＡＣＣ−３′
（プライマー２：配列番号２１）
５′−ＴＧＡＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣ−３′
【０１９０】
上記プライマーを使用して得られたＤＮＡ断片の塩基配列を調べた結果、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列が得られた。ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列の塩基配列を配列番号１に示した。
【０１９１】
（ベクターに導入するためのプロモーター配列の増幅）
植物用ベクターに組み込むことができるように制限酵素サイトを付加した下記プライマー３、４を設計し、ＰＣＲを行って、上記同定されたＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列−１〜−１６１０ｂｐを増幅した。
（プライマー３：配列番号２２）
５′−ＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＴＣＡＣＣＴＣ−３′
（プライマー４：配列番号２３）
５′−ＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡＣＣＴＴＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧ−３′
【０１９２】
（パラゴムノキにおけるポリイソプレノイド生合成経路に関わる酵素群の目的蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の同定）
パラゴムノキの葉よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。
次にパラゴムノキのＤＮＡデータベースを基に、下記プライマー５〜２２、４１〜４２、４５〜４６を設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、目的蛋白質の全長のＤＮＡ断片を増幅し、そのＤＮＡ断片の塩基配列及び目的蛋白質の全長のアミノ酸配列を同定した。それぞれの目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２、４、６〜９、１４、１６、１８、６０、６６に、当該目的蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３、５、１０〜１３、１５、１７、１９、６１、６７に示した。
【０１９３】
目的蛋白質がファルネシル二リン酸シンターゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー５：配列番号２４）
５′−ＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧ−３′
（プライマー６：配列番号２５）
５′−ＧＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣ−３′
【０１９４】
目的蛋白質がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー７：配列番号２６）
５′−ＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧ−３′
（プライマー８：配列番号２７）
５′−ＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＣ−３′
【０１９５】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー９：配列番号２８）
５′−ＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＧ−３′
（プライマー１０：配列番号２９）
５′−ＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＡＣＴＡＡＧＡＴＧＣ−３′
【０１９６】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ３であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１１：配列番号３０）
５′−ＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＧ−３′
（プライマー１２：配列番号３１）
５′−ＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧ−３′
【０１９７】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ４であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１３：配列番号３２）
５′−ＣＡＧＴＣＧＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣ−３′
（プライマー１４：配列番号３３）
５′−ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧ−３′
【０１９８】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ５であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１５：配列番号３４）
５′−ＣＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣ−３′
（プライマー１６：配列番号３５）
５′−ＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＣ−３′
【０１９９】
目的蛋白質がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１７：配列番号３６）
５′−ＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣ−３′
（プライマー１８：配列番号３７）
５′−ＴＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＡＴＣＧ−３′
【０２００】
目的蛋白質がｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１９：配列番号３８）
５′−ＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧ−３′
（プライマー２０：配列番号３９）
５′−ＴＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣ−３′
【０２０１】
目的蛋白質がｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ２であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー４５：配列番号６８）
５′−ＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧ−３′
（プライマー４６：配列番号６９）
５′−ＴＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣ−３′
【０２０２】
目的蛋白質がＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２１：配列番号４０）
５′−ＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧ−３′
（プライマー２２：配列番号４１）
５′−ＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′
【０２０３】
目的蛋白質がＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー４１：配列番号６２）
５′−ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣ−３′
（プライマー４２：配列番号６３）
５′−ＡＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣＴＴＡＧＣ−３′
【０２０４】
（ベクターに導入するための、目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列の増幅）
植物用ベクターに組み込むことができるように制限酵素サイトを付加した下記プライマー２３〜４０、４３〜４４、４７〜４８を設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、目的蛋白質をコードする遺伝子の全長を増幅した。
【０２０５】
目的蛋白質がファルネシル二リン酸シンターゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２３：配列番号４２）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＣ−３′
（プライマー２４：配列番号４３）
５′−ＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＣ−３′
【０２０６】
目的蛋白質がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２５：配列番号４４）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧ−３′
（プライマー２６：配列番号４５）
５′−ＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣ−３′
【０２０７】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２７：配列番号４６）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣ−３′
（プライマー２８：配列番号４７）
５′−ＧＧＴＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＴＣＴＴＴＧＣ−３′
【０２０８】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ３であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２９：配列番号４８）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣ−３′
（プライマー３０：配列番号４９）
５′−ＧＧＴＡＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＴＴＴＴＧＣ−３′
【０２０９】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ４であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３１：配列番号５０）
５′−ＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣ−３′
（プライマー３２：配列番号５１）
５′−ＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３′
【０２１０】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ５であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３３：配列番号５２）
５′−ＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣ−３′
（プライマー３４：配列番号５３）
５′−ＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＧＴＣ−３′
【０２１１】
目的蛋白質がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３５：配列番号５４）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＧ−３′
（プライマー３６：配列番号５５）
５′−ＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＡＴＣＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′
【０２１２】
目的蛋白質がｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３７：配列番号５６）
５′−ＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧ−３′
（プライマー３８：配列番号５７）
５′−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣ−３′
【０２１３】
目的蛋白質がｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ２であるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー４７：配列番号７０）
５′−ＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧ−３′
（プライマー４８：配列番号７１）
５′−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣ−３′
【０２１４】
目的蛋白質がＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３９：配列番号５８）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧ−３′
（プライマー４０：配列番号５９）
５′−ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′
【０２１５】
目的蛋白質がＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒであるときに用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー４３：配列番号６４）
５′−ＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣ−３′
（プライマー４４：配列番号６５）
５′−ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣＴＴＡＧＣ−３′
【０２１６】
（発現ベクターの構築）
ｐＨ３５ＧＳバイナリーベクター(ＩＮＰＬＡＮＴＡ  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ社製)を制限酵素ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩで消化し、（ベクターに導入するためのプロモーター配列の増幅）で増幅したＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列を同様に制限酵素処理して、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて結合させた。
また、（ベクターに導入するための、目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列の増幅）で増幅した目的蛋白質をコードする遺伝子（塩基配列）を制限酵素で消化し、Ｇａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクター（Ｅｖｏｒｏｇｅｎ社製）を同様に制限酵素処理して、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて結合させた。
そして、作製したバイナリーベクターとエントリークローンベクターとを、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて反応させ、エントリークローン上の目的蛋白質をコードする遺伝子配列及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子の塩基配列をｐＨ３５ＧＳに挿入した。これにより、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列（ＨｂＭＹＣ１  ｐｒｏ）に、目的蛋白質をコードする遺伝子配列及びＧＦＰ遺伝子の塩基配列が機能的に連結された発現ベクターを構築した。なお、ｐＨ３５ＧＳベクターは、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）を有している。
【０２１７】
なお、目的蛋白質がファルネシル二リン酸シンターゼである場合には、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩで消化した。構築した発現ベクターを図７に示す。図７中、ＨｂＦＰＳは、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２１８】
目的蛋白質がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼである場合には、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した。構築した発現ベクターを図８に示す。図８中、ＨｂＧＧＰＳは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２１９】
目的蛋白質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１、３、４、又は５である場合には、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１、３、４、又は５をコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩ、又はＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化した。構築した発現ベクターを図９に示す。図９中、ＨｂＨＭＧＲは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２２０】
目的蛋白質がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼである場合には、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩで消化した。構築した発現ベクターを図１０に示す。図１０中、ＨｂＩＰＩは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２２１】
目的蛋白質がｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１又は２である場合には、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１又は２をコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した。構築した発現ベクターを図１１に示す。図１１中、ＨｂＣＰＴは、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２２２】
目的蛋白質がＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎである場合には、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した。構築した発現ベクターを図１２に示す。図１２中、ＨｂＳＲＰＰは、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２２３】
目的蛋白質がＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒである場合には、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子及びＧａｔｅｗａｙ  ｓＧＦＰ  エントリークローンベクターは、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した。構築した発現ベクターを図１３に示す。図１３中、ＨｂＲＥＦは、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子の塩基配列を表している。
【０２２４】
（発現ベクター導入アグロバクテリウムの調製）
（発現ベクターの構築）で構築した各種発現ベクターをそれぞれアグロバクテリウムに感染させ、発現ベクター導入アグロバクテリウムを作製した。具体的には、エレクトロポレーション法により、発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、ＹＥＢ培地にて２８℃で２４時間振とう培養した。その後、培養液を遠心分離してアグロバクテリウムを回収し、Ｏ．Ｄ．６００＝０．６の濃度となるように懸濁液（ＭＳ培地）に懸濁した。
【０２２５】
〔実施例１〜１１〕
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＩＢＡ：インドール酪酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＫＩ：カイネチン
パラゴムノキ：東京大学大学院農学生命科学研究科附属科学の森教育研究センター樹芸研究所より入手
【０２２６】
（カルスの誘導（誘導工程））
パラゴムノキから葉を採取した。次に、採取した葉の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０２２７】
次に、滅菌した葉の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、カイネチン（ＫＩ）、スクロースをそれぞれ２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０２２８】
パラゴムノキの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２５℃、暗所（０〜０．１ｌｘ）で８週間培養し、パラゴムノキの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。
【０２２９】
（感染工程、共存培養工程）
（発現ベクター導入アグロバクテリウムの調製）で作製した発現ベクター導入アグロバクテリウムを含む懸濁液（ＭＳ培地）に、誘導したカルスを３０分間接触させた後、カルスをＭＳ培地で暗所条件下、２８℃で３日間培養した。
ここで、実施例１では図７で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例２では図８で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例３では図９で表される発現ベクターのうちＨＭＧＲ１を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例４では図１０で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例５では図１１で表される発現ベクターのうちＣＰＴ１を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例６では図１２で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例７では図１３で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例８では図９で表される発現ベクターのうちＨＭＧＲ３を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例９では図９で表される発現ベクターのうちＨＭＧＲ４を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例１０では図９で表される発現ベクターのうちＨＭＧＲ５を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例１１では図１１で表される発現ベクターのうちＣＰＴ２を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、それぞれ用いた。
【０２３０】
（選択培養工程）
次いで、カルベニシリンにより滅菌されたカルスをハイグロマイシン耐性ＭＳ選択培地に移し、２８℃で１６時間日長培養を２ヶ月行い、形質転換体を作製した。
【０２３１】
（不定胚及びシュート形成（再生誘導工程））
次に、形質転換体（選択培養工程で生存していたカルス）を用いて、該カルスからＭＳ培地により不定胚及びシュートを形成させた（再生誘導工程）。すなわち、形質転換体を該培地上で培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で３〜６ヶ月培養した。なお、１ヶ月培養する毎に培地を交換した。その結果、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。
【０２３２】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、再生誘導培地と同様の組成の培地で継代培養した。すなわち、培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。これにより、良好なシュートの伸長が観察された。
【０２３３】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、１／２ＭＳ培地に移植した。培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。これにより、良好に発根が観察され、形質転換植物体が得られた。
【０２３４】
（ポリイソプレノイドの生産量の算出、ポリイソプレノイドの重量平均分子量の測定）
実施例１〜７において得られた形質転換植物体の茎を傷つけた際に漏出する乳液を２００μｌ回収し、そのうちの１００μｌに対して、９９％エタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、ポリイソプレノイドを精製回収した。そして、製造されたポリイソプレノイド（回収したトルエン抽出物）の量（形質転換植物体内に蓄積されているポリイソプレノイドの量（ポリイソプレノイド細胞内蓄積量）、すなわちポリイソプレノイドの生産量）を算出した。
ポリイソプレノイドの蓄積量は、回収したトルエン抽出物を乾燥させた後、該形質転換植物体から精製回収したポリイソプレノイドの量の、野生型（非組み換え体；「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とも称する。）のポリイソプレノイド蓄積量に対する割合（質量％）として算出した。結果を表１に示す。
ポリイソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。結果を表１に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍｌ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリスチレン
【０２３５】
〔比較例１〜７〕
プロモーターとして、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの代わりに、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを用いた以外、すなわち、（ベクターに導入するためのプロモーター配列の増幅）で増幅したＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター配列を導入しなかった以外は、実施例１〜７と同様にして形質転換植物体を得、ポリイソプレノイドの蓄積量を算出し、ポリイソプレノイドの重量平均分子量を測定した。結果を表１に示す。
【０２３６】
【表１】
0006557989.tif 000002
【０２３７】
なお、表１中の略号は以下の通りである。
ＭＹＣ１  ｐｒｏ：ＭＹＣ１（ＭＹＣ１転写因子）をコードする遺伝子のプロモーター
３５Ｓ：カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター
ＦＰＳ：ファルネシル二リン酸シンターゼ
ＧＧＰＳ：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ
ＨＭＧＲ１：３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１
ＩＰＩ：イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ
ＣＰＴ１：ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１
ＳＲＰＰ：Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＲＥＦ：Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ
【０２３８】
表１の結果から、ＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を導入した形質転換植物体では、野生型（非組み換え体）や、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの代わりにカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを用いた形質転換植物体に比べて、植物体内に蓄積されるポリイソプレノイドの量が増加していることが確認できた（実施例１〜７）。
また特に、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質として、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ又はＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子を導入した形質転換植物体では、野生型（非組み換え体）や、ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターの代わりにカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを用いた形質転換植物体に比べて、植物体内に蓄積されるポリイソプレノイドの重量平均分子量が増大していることも確認された（実施例２、３、５、６）。
【０２３９】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＭＹＣ１転写因子をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：パラゴムノキ由来のファルネシル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号６：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ３をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号８：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ４をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１０：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ１のアミノ酸配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ３のアミノ酸配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ４のアミノ酸配列
配列番号１３：パラゴムノキ由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ５のアミノ酸配列
配列番号１４：パラゴムノキ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１５：パラゴムノキ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列
配列番号１６：パラゴムノキ由来のｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１７：パラゴムノキ由来のｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ１のアミノ酸配列
配列番号１８：パラゴムノキ由来のＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  ＰａｒｔｉｃｌｅＰｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１９：パラゴムノキ由来のＳｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  ＰａｒｔｉｃｌｅＰｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列
配列番号２０：プライマー１
配列番号２１：プライマー２
配列番号２２：プライマー３
配列番号２３：プライマー４
配列番号２４：プライマー５
配列番号２５：プライマー６
配列番号２６：プライマー７
配列番号２７：プライマー８
配列番号２８：プライマー９
配列番号２９：プライマー１０
配列番号３０：プライマー１１
配列番号３１：プライマー１２
配列番号３２：プライマー１３
配列番号３３：プライマー１４
配列番号３４：プライマー１５
配列番号３５：プライマー１６
配列番号３６：プライマー１７
配列番号３７：プライマー１８
配列番号３８：プライマー１９
配列番号３９：プライマー２０
配列番号４０：プライマー２１
配列番号４１：プライマー２２
配列番号４２：プライマー２３
配列番号４３：プライマー２４
配列番号４４：プライマー２５
配列番号４５：プライマー２６
配列番号４６：プライマー２７
配列番号４７：プライマー２８
配列番号４８：プライマー２９
配列番号４９：プライマー３０
配列番号５０：プライマー３１
配列番号５１：プライマー３２
配列番号５２：プライマー３３
配列番号５３：プライマー３４
配列番号５４：プライマー３５
配列番号５５：プライマー３６
配列番号５６：プライマー３７
配列番号５７：プライマー３８
配列番号５８：プライマー３９
配列番号５９：プライマー４０
配列番号６０：パラゴムノキ由来のＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６１：パラゴムノキ由来のＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒのアミノ酸配列
配列番号６２：プライマー４１
配列番号６３：プライマー４２
配列番号６４：プライマー４３
配列番号６５：プライマー４４
配列番号６６：パラゴムノキ由来のｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ２をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６７：パラゴムノキ由来のｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ２のアミノ酸配列
配列番号６８：プライマー４５
配列番号６９：プライマー４６
配列番号７０：プライマー４７
配列番号７１：プライマー４８
【図１】
0006557989.tif 000003
【図２】
0006557989.tif 000004
【図３】
0006557989.tif 000005
【図４】
0006557989.tif 000006
【図５】
0006557989.tif 000007
【図６】
0006557989.tif 000008
【図７】
0006557989.tif 000009
【図８】
0006557989.tif 000010
【図９】
0006557989.tif 000011
【図１０】
0006557989.tif 000012
【図１１】
0006557989.tif 000013
【図１２】
0006557989.tif 000014
【図１３】
0006557989.tif 000015
【配列表】
0006557989000001.app