(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該転写因子の機能が欠損し、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該菌体外酸性プロテアーゼの機能が欠損し、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該菌体外酸性カルボキシペプチダーゼの機能が欠損していることを特徴とする麹菌変異株。
【請求項２】
請求項１記載の麹菌変異株において、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９８０）であることを特徴とする麹菌変異株。
【請求項３】
アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該転写因子の機能が欠損し、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該菌体外酸性プロテアーゼの機能が欠損し、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより該菌体外酸性カルボキシペプチダーゼの機能が欠損している麹菌変異株に、糖化酵素遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項４】
請求項３記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子であることを特徴とする形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子であることを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項３〜請求項５のいずれか１項記載の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、染色体中に導入されていることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体培養に好適であり、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株及び、該麹菌変異株から得られた形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、稲わら、コーンストーバ等のリグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖を微生物（アルコール発酵菌）により発酵させてエタノール等のアルコールを製造する方法が知られている。
【０００３】
また、前記リグノセルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化する際に、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等の麹菌に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体を用いることが知られている。前記形質転換体は、例えば、前記リグノセルロース系バイオマスを用いて固体培養されることにより糖化酵素を生産し、該糖化酵素により該リグノセルロース系バイオマスが糖化される。
【０００４】
ところが、前記アスペルギルス・オリゼはプロテアーゼ遺伝子を有しており、プロテアーゼを生産するので、前記形質転換体により生産される異種酵素が該プロテアーゼにより分解されてしまうという問題がある。
【０００５】
前記問題を解決するために、前記アスペルギルス・オリゼのプロテアーゼ遺伝子を欠損させることにより異種酵素の生産量を向上させることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins, Appl Microbiol Biotechnol(2011)89:747-759
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記プロテアーゼ遺伝子を欠損させたアスペルギルス・オリゼでは異種酵素の生産量を十分に向上させることができず、さらに改良が望まれる。
【０００８】
本発明は、かかる事情に鑑み、糖化酵素遺伝子を導入して形質転換することにより異種酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる麹菌変異株及び、該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる目的を達成するために、本発明の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部が欠損していることを特徴とする。
【００１０】
本発明の麹菌変異株によれば、前記ｐｒｔＲ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより、プロテアーゼ遺伝子の発現を正に制御する転写因子を発現することができず、複数のプロテアーゼ遺伝子の発現が抑制される。また、本発明の麹菌変異株によれば、前記ｐｅｐＡ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子の発現が抑制される。さらに、本発明の麹菌変異株によれば、前記ｃｐＩ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子の発現が抑制される。
【００１１】
この結果、本発明の麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して形質転換体としたときに、該形質転換体が生産する糖化酵素（異種酵素）の菌体外酸性プロテアーゼを含む複数のプロテアーゼ及び菌体外酸性カルボキシペプチダーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。
【００１２】
本発明の麹菌変異株は、前記形質転換体とするために、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９８０）であることが適している。
【００１３】
本発明の形質転換体は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部が欠損している麹菌変異株に、糖化酵素遺伝子が導入されていることを特徴とする。
【００１４】
本発明の形質転換体によれば、前記ｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｃｐＩ遺伝子の全長又は一部が欠損していることにより、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子を含む複数のプロテアーゼ遺伝子及び菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子の発現が抑制される。そこで、本発明の形質転換体によれば、導入された糖化酵素遺伝子により生産される糖化酵素（異種酵素）の菌体外酸性プロテアーゼを含む複数のプロテアーゼ及び菌体外酸性カルボキシペプチダーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。
【００１５】
本発明の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子であることが好ましい。
【００１６】
前記糖化酵素遺伝子は、より具体的には、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の形質転換体において、前記糖化酵素遺伝子は、染色体中に導入されていることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の麹菌変異株の形質転換体と、他の麹菌変異株の形質転換体との糖化酵素生産量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００２０】
本実施形態の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部が欠損しているものである。
【００２１】
アスペルギルス・オリゼＨＯ２株は、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手可能）のｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株であるアスペルギルス・オリゼＨＯ１株に対し、さらにｌｉｇＤ遺伝子を欠損させた変異株である。
【００２２】
アスペルギルス・オリゼＨＯ１株、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株は、本出願人により、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている（寄託日：平成２５年１１月１２日）。受託番号は、アスペルギルス・オリゼＨＯ１株がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７４９であり、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０である。
【００２３】
アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部を欠損する方法は、プロトプラスト−ＰＥＧ法、自然変異法等の微生物の遺伝子組み換えにおいて用いられる公知の技術の中から適宜選択して用いることができる。
【００２４】
本出願人は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部が欠損している麹菌変異株を、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託した（寄託日：平成２６年１２月９日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９８０）。
【００２５】
また、本実施形態の形質転換体は、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株の染色体に、糖化酵素遺伝子が導入されている。
【００２６】
前記糖化酵素遺伝子は、例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である。
【００２７】
また、前記糖化酵素遺伝子は、より具体的には、アクレモニウム・セルロリティカス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である。
【００２８】
前記形質転換体は、前記糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットを組み込んだ発現ベクターをアスペルギルス・オリゼＨＯ４株の染色体に導入することにより得ることができる。ここで、前記発現カセットとは、構造遺伝子を発現させるために必要なＤＮＡの組合せであり、構造遺伝子と宿主細胞内で機能するプロモーター及びターミネーターを含む。前記発現カセットには、さらに、５´−非翻訳領域、３´−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。
【００２９】
また、前記発現カセットを組み込む発現ベクターとしては、アスペルギルス・オリゼを初めとする麹菌に対する形質転換に使用可能な公知のベクターの中から適宜選択して、必要に応じて適宜改変したものを用いることができる。
【００３０】
発現ベクターをアスペルギルス・オリゼＨＯ４株の染色体に導入する形質転換方法は、特に限定されるものではなく、アスペルギルス・オリゼを初めとする麹菌に対する遺伝子導入を行う際に使用される各種方法により行うことができる。前記形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、ＰＥＧ−カルシウム法（Mol.Gen.Genet., vol.218, p.99-104(1989)）、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等をあげることができる。
【００３１】
本実施形態の形質転換体によれば、ｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子のそれぞれの全長又は一部が欠損していることにより、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子を含む複数のプロテアーゼ遺伝子及び菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子の発現が抑制される。そこで、本実施形態の形質転換体によれば、導入された糖化酵素遺伝子により生産される糖化酵素（異種酵素）の菌体外酸性プロテアーゼを含む複数のプロテアーゼ及び菌体外酸性カルボキシペプチダーゼによる分解が低減し、該糖化酵素の生産量を飛躍的に向上させることができる。
【００３２】
次に、本発明の実施例及び比較例を示す。
【実施例】
【００３３】
〔実施例１〕
本実施例では、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、次のようにしてｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子が欠損している麹菌変異株であるアスペルギルス・オリゼＨＯ４株を構築した。
【００３４】
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、次のようにしてｐｒｔＲ遺伝子が欠損している第１の麹菌変異株を構築した。
【００３５】
アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１、２にてｐｒｔＲ遺伝子の上流配列、プライマー３、４にて下流配列、プライマー５、６にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー７、８にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD FX neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計４つの遺伝子断片を取得した。
【００３６】
次に、プラスミドｐＲＩ９１０（タカラバイオ株式会社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ株式会社製）にて３０℃で処理し、前記精製キットにて精製してプラスミドを線状化したもの（以下、「第１の線状化プラスミド」と略記する）を取得した。
【００３７】
次に、前記上流配列、ｐｙｒＧ遺伝子発現カセット、線状化プラスミド配列の３つの遺伝子断片をクローニングキット（タカラバイオ株式会社製、商品名：In-Fusion（登録商標） HD Cloning kit）にて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株（タカラバイオ株式会社より入手）に形質転換し、プラスミドｐＲＩ９１０のＳｍａＩサイト部分に、前記上流配列とｐｙｒＧ遺伝子発現カセットとを導入したプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ１：：ｐｙｒＧを取得した。
【００３８】
次に、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ１：：ｐｙｒＧを制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ株式会社製）にて３７℃で処理し、前記精製キットにて精製して、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ１：：ｐｙｒＧを線状化したもの（以下、「第２の線状化プラスミド」と略記する）を取得した。
【００３９】
次に、前記マーカーリサイクリング用配列、前記下流配列、第２の線状化プラスミド配列の３つの遺伝子断片を、前記クローニングキットにて処理してＥ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株に形質転換し、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ１：：ｐｙｒＧのｐｙｒＧ遺伝子発現カセットの下流に前記マーカーリサイクリング用配列、前記下流配列を導入したプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ：：ｐｙｒＧＲを取得した。
【００４０】
次に、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｒｔＲ：：ｐｙｒＧＲを鋳型に、プライマー９、１０を用い、前記ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して麹菌形質転換用の遺伝子断片を取得した。
【００４１】
次に、ＰＥＧ−カルシウム法により定法に従って、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片を用い、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株を形質転換した。
【００４２】
次に、前記形質転換したアスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、ＣＤ培地にて生育できる株を選択し、ｐｒｔＲ遺伝子欠損株を取得した。
【００４３】
次に、得られたｐｒｔＲ遺伝子欠損株の胞子懸濁液を、ＣＤ培地に終濃度１ｍｇ／１ｍＬの５−フルオロオロチン酸一水和物（和光純薬工業株式会社製）と終濃度２０ｍＭのウリジン（シグマアルドリッチ社製）とを加えたプレート培地に、１×１０６個／プレートになるように植菌し、生育できる株を選択して、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える第１の麹菌変異株を取得した。
【００４４】
プライマー１〜１０の塩基配列を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0006473339.tif 000002
【００４６】
次に、前記第１の麹菌変異株から、次のようにしてさらにｐｅｐＡ遺伝子が欠損している第２の麹菌変異株を構築した。
【００４７】
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１１、１２にてｐｅｐＡ遺伝子の上流配列、プライマー１３、１４にて下流配列、プライマー１５、１６にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー７、８にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD -plus- neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計４つの遺伝子断片を取得した。
【００４８】
次に、前記４つの遺伝子断片を用いた以外は、前記アスペルギルス・オリゼＨＯ２株の形質転換と全く同一にして、該第１の麹菌変異株を形質転換した。
【００４９】
次に、前記形質転換した第１の麹菌変異株から、ＣＤ培地にて生育できる株を選択し、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株を取得した。
【００５０】
次に、得られたｐｅｐＡ遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、前記アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から前記第１の麹菌変異株を取得した場合と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子とｐｅｐＡ遺伝子との２遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える第２の麹菌変異株を取得した。
【００５１】
プライマー１１〜１６の塩基配列を表２に示す。
【００５２】
【表２】
0006473339.tif 000003
【００５３】
次に、前記第２の麹菌変異株から、次のようにしてさらにｃｐＩ遺伝子が欠損している麹菌変異株であるアスペルギルス・オリゼＨＯ４株を構築した。
【００５４】
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１７、１８にてｃｐＩ遺伝子の上流配列、プライマー１９、２０にて下流配列、プライマー２１、２２にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー７、８にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD -plus- neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計４つの遺伝子断片を取得した。
【００５５】
次に、前記４つの遺伝子断片を用いた以外は、前記アスペルギルス・オリゼＨＯ２株の形質転換と全く同一にして、前記第２の麹菌変異株を形質転換した。
【００５６】
次に、前記形質転換した第２の麹菌変異株から、ＣＤ培地にて生育できる株を選択し、ｃｐＩ遺伝子欠損株を取得した。
【００５７】
次に、得られたｃｐＩ遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、前記アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から前記第１の麹菌変異株を取得した場合と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子と、ｐｅｐＡ遺伝子と、ｃｐＩ遺伝子との３遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株として、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株を取得した。
【００５８】
プライマー１７〜２２の塩基配列を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0006473339.tif 000004
【００６０】
〔比較例１〕
本比較例では、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、次のようにしてｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子の３つの遺伝子が欠損している第３の麹菌変異株を構築した。
【００６１】
まず、実施例１と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子の２つの遺伝子が欠損している前記第２の麹菌変異株を取得した。次に、前記第２の麹菌変異株から、次のようにしてさらにｔｐｐＡ遺伝子が欠損している第３の麹菌変異株を構築した。
【００６２】
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー２３、２４にてｔｐｐＡ遺伝子の上流配列、プライマー２５、２６にて下流配列、プライマー２７、２８にてマーカーリサイクリング用配列、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー７、８にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD -plus- neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計４つの遺伝子断片を取得した。
【００６３】
次に、前記４つの遺伝子断片を用いた以外は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から前記第１の麹菌変異株を取得した場合と全く同一にして、前記第２の麹菌変異株を形質転換した。
【００６４】
次に、前記形質転換した第２の麹菌変異株から、ＣＤ培地にて生育できる株を選択し、ｔｐｐＡ遺伝子欠損株を取得した。
【００６５】
次に、得られたｔｐｐＡ遺伝子欠損株の胞子懸濁液を用いた以外は、前記アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から前記第１の麹菌変異株を取得した場合と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子と、ｐｅｐＡ遺伝子と、ｔｐｐＡ遺伝子との３遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える第３の麹菌変異株を取得した。
【００６６】
プライマー２３〜２８の塩基配列を表４に示す。
【００６７】
【表４】
0006473339.tif 000005
【００６８】
〔比較例２〕
本比較例では、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、次のようにしてｐｒｔＲ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子の３つの遺伝子が欠損している第４の麹菌変異株を構築した。
【００６９】
まず、実施例１と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株からｐｒｔＲ遺伝子が欠損している前記第１の麹菌変異株を取得した。次に、前記第２の麹菌変異株に代えて前記第１の麹菌変異株を用いた以外は実施例１と全く同一にして、該第１の麹菌変異株からさらにｃｐＩ遺伝子が欠損している第５の麹菌変異株を取得した。
【００７０】
次に、前記第２の麹菌変異株に代えて前記第５の麹菌変異株を用いた以外は比較例１と全く同一にして、該第５の麹菌変異株からさらにｔｐｐＡ遺伝子が欠損している第４の麹菌変異株を取得した。
【００７１】
前記第４の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子と、ｃｐＩ遺伝子と、ｔｐｐＡ遺伝子との３遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株である。
【００７２】
〔比較例３〕
本比較例では、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株から、次のようにしてｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子の４つの遺伝子が欠損している第６の麹菌変異株を構築した。
【００７３】
まず、実施例１と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子が欠損している麹菌変異株としてアスペルギルス・オリゼＨＯ４株を取得した。
【００７４】
次に、前記第２の麹菌変異株に代えてアスペルギルス・オリゼＨＯ４株を用いた以外は比較例１と全く同一にして、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株からさらにｔｐｐＡ遺伝子が欠損している第６の麹菌変異株を取得した。
【００７５】
前記第６の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子と、ｐｅｐＡ遺伝子と、ｃｐＩ遺伝子と、ｔｐｐＡ遺伝子との４遺伝子欠損株であり、ウリジン要求性を備える麹菌変異株である。
【００７６】
〔形質転換体の構築〕
次に、セロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子を導入する場合を例として、形質転換体の構築方法について説明する。
【００７７】
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー２９、３０にてｐｙｒＧ遺伝子の上流配列、プライマー３１、３２にて下流配列、プライマー３３、３４にてｔｅｆｌプロモーター遺伝子、プライマー３５、３６にてａｇｄＡターミネーター遺伝子、アクレモニウム・セルロリィティカスＨ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１５０８）のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー３７、３８にてセロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー３９、４０にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD -plus- neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計６つの遺伝子断片を取得した。
【００７８】
次に、プラスミドｐＭＤ２０（タカラバイオ株式会社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ株式会社製）にて３０℃で処理し、前記精製キットにて精製してプラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
【００７９】
前述のようにして得られた各遺伝子断片を、順次クローニングキット（タカラバイオ株式会社製、商品名：In-Fusion（登録商標） HD Cloning kit）にて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株（タカラバイオ株式会社製）に形質転換し、プラスミドｐＰＰT１−ＣＢＨ１を取得した。
【００８０】
次に、得られたプラスミドｐＰＰT１−ＣＢＨ１を鋳型として、プライマー４１、４２にて、前記ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して麹菌形質転換用の遺伝子断片（ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片）を取得した。
【００８１】
次に、ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片（ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片）を用い、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（参考例）、アスペルギルス・オリゼＨＯ４株（実施例１）、第３の麹菌変異株（比較例１）、第４の麹菌変異株（比較例２）、第６の麹菌変異株（比較例３）をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。
【００８２】
次に、得られた形質転換体からＣＤプレート培地で生育できる株を選択し、参考例、実施例１、比較例１〜３の麹菌変異株にそれぞれ対応する形質転換体を得た。前記形質転換体は、いずれも染色体にセロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子が導入されており、セロビオハイドロラーゼを生産することができる。以下、セロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子が導入されて、セロビオハイドロラーゼを生産することができる形質転換体を「ＣＢＨ１生産株」と記載する。
【００８３】
プライマー２９〜４２の塩基配列を表５に示す。
【００８４】
【表５】
0006473339.tif 000006
【００８５】
〔セロビオハイドロラーゼ生産量の測定〕
次に、参考例、実施例１、比較例１〜３の麹菌変異株にそれぞれ対応するＣＢＨ１生産株によるセロビオハイドロラーゼ生産量の測定方法について説明する。
【００８６】
前記各ＣＢＨ１生産株によるセロビオハイドロラーゼ生産量を測定するために、まず、前記各ＣＢＨ１生産株を、ＣＤプレート培地にて１週間培養して胞子を形成させ、０．０１％ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ２０（和光純薬工業社製）を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。
【００８７】
次に、１００ｍＬ三角フラスコにＰＤ液体培地（２質量／容量％デキストリン、１質量／容量％ポリペプトン、０．１質量／容量％カザミノ酸、０．５質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．０５質量／容量％硫酸マグネシウム、０．１質量／容量％硝酸ナトリウム）３０ｍＬを取り、これに前記胞子を最終胞子濃度１×１０４／ｍＬとなるように植菌し、３０℃で６日間の液体培養を行い、目的酵素であるセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ１）が培地中に分泌発現されたＣＢＨ１生産株の培養液を得た。
【００８８】
次に、各培養液中のＣＢＨ１濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。タンパク質濃度の基準とするために、０．２５μｇ、０．５μｇ及び２μｇのＢＳＡを同時に泳動し、酵素サンプル１０μＬ中のＣＢＨ１濃度をChemiDoc（登録商標）XRS+システムを用いた画像解析により算出した。
【００８９】
結果を図１及び表６に示す。
【００９０】
【表６】
0006473339.tif 000007
【００９１】
図１及び表１から、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（参考例）の形質転換体のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ１）生産量の相対値を１．０とすると、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株の転写因子をコードするｐｒｔＲ遺伝子、菌体外酸性プロテアーゼ遺伝子をコードするｐｅｐＡ遺伝子、菌体外酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子をコードするｃｐＩ遺伝子の３つの遺伝子を欠損させたアスペルギルス・オリゼＨＯ４株（実施例１）の形質転換体のＣＢＨ１生産量の相対値は１．２４となり、参考例の形質転換体を大きく上回ることがわかる。
【００９２】
また、図１及び表１から、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子を欠損させた第３の麹菌変異株（比較例１）、ｐｒｔＲ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子を欠損させた第４の麹菌変異株（比較例２）、ｐｒｔＲ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｃｐＩ遺伝子、ｔｐｐＡ遺伝子を欠損させた第６の麹菌変異株（比較例３）の形質転換体のＣＢＨ１生産量の相対値は１．０２〜１．１３であり、いずれも実施例１の形質転換体に及ばないことがわかる。
【００９３】
従って、実施例１のアスペルギルス・オリゼＨＯ４株の形質転換体によれば、糖化酵素であるＣＢＨ１の生産量を飛躍的に向上させることができることが明らかである。
【符号の説明】
【００９４】
符号なし
【図１】
0006473339.tif 000008
【配列表】
0006473339000001.app