(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる化合物であって、前記活性化合物が、官能基により、アジピン酸ジヒドラジド、ポリペプチド、ペプチド、脂質、及びアミノ酸からなる群から選択される１つのリンカーを介して前記グリコサミノグリカン、その誘導体、又はその塩のカルボキシル酸基に間接的にコンジュゲートされて、共有結合によるコンジュゲーションを形成し、前記活性化合物が、フェキソフェナジン、及びステロイドのうちの何れかからなり、前記ステロイドが、ブデソニドスクシナート及びプレドニゾロンスクシナートからなる群から選択される化合物。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が、５ｋＤａから２０００ｋＤａまでの範囲に含まれる平均分子量を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
急性又は慢性炎症の治療に使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記炎症が、感染症、傷害、自己免疫疾患、又はアレルギーにより誘導又は引き起こされる、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
炎症を治療するための方法であって、請求項１に記載のグリコサミノグリカン及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる治療上有効量の化合物を、その必要性のある対象体（ヒトを除く）に投与するステップを含む方法。
【請求項８】
前記炎症が、感染症、傷害、自己免疫疾患、又はアレルギーにより誘導又は引き起こされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせて、請求項１に記載のグリコサミノグリカン及び活性化合物に由来する少なくとも１つのコンジュゲート体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が炎症を治療するためもののである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記炎症が、感染症、傷害、自己免疫疾患、又はアレルギーにより誘導又は引き起こされる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、経口投与用又は注射可能な投与用に設計されている、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカンの薬物とのコンジュゲート体からなる化合物及びその調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、刺激に応答して細胞機能及び相互作用を制御する相互作用分子の動的集合体である。１つのクラスの細胞外マトリックス巨大分子であるグリコサミノグリカンは、細胞遊走、分化、増殖、免疫応答、及び細胞骨格形成を含む、多様な正常及び異常両方の生物学的プロセスに関与することが知られている分子である。
【０００３】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、二糖単位の繰り返しで構成される非分岐鎖である。これら二糖単位は、ほとんどの場合で硫酸化されているアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を常に含み、第２の糖は、通常はウロン酸（グルクロン酸又はイズロン酸）である。ＧＡＧは、それらの糖残基のほとんどにカルボキシル基又は硫酸基が存在するため、高度に負に荷電されている。そのため、それらは、非常に親水性である。
ＧＡＧは、高度に伸長したコンフォメーションを取り、空間充填性で、圧縮力に耐性であるマトリックスを形成する傾向がある。４つの主要なグループのＧＡＧが、それらの糖残基、それら残基間の連結のタイプ、並びに硫酸基の数及び位置により区別されている。それらには以下のものが含まれる。（１）ヒアルロナン、（２）コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸、（３）ヘパラン硫酸及びヘパリン、及び（４）ケラタン硫酸。
【０００４】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸又はヒアルロナート又はＨＡとも呼ばれる）は、ＧＡＧの中で最も単純なものである。ヒアルロナンは、非硫酸化二糖単位、具体的にはＮ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の規則的な繰返し配列からなる。その分子量は、４００ダルトン（二糖）から数百万ダルトンを超える範囲であり得る。
ヒアルロナンは、皮膚、軟骨、及び眼等の、全ての組織にて様々な量で見出され、成体動物では、全てではないとしても、ほとんどが流体である。ヒアルロナンは、特に初期胚に豊富に存在する。関節軟骨では、ＨＡは、軟骨の機能にとって重要な大型凝集体を形成することができる。更に、細胞運動性及び免疫細胞接着は、細胞表面受容体ＲＨＡＭＭ（ヒアルロナン媒介性運動性受容体）及びＣＤ４４により媒介される。
【０００５】
ＨＡは、細胞表面の内膜で直接合成され、成長中の高分子は、合成される共に膜を介して細胞外部に押し出される。合成は、単一のタンパク質酵素、ヒアルロナンシンテターゼ（ＨＡＳ）により媒介される。対照的に、他のＧＡＧは、細胞内部のゴルジ装置で合成され、恐らくは、あるコアタンパク質と結合し、その後、エキソサイトーシスにより放出される。脊椎組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＡ分解は、ヒアルロニダーゼ、及び糖を順番に除去するエキソグリコシダーゼにより媒介される。
哺乳類型ヒアルロニダーゼは、加水分解活性及びトランスグリコシダーゼ活性を両方とも有しており、ＨＡ及びコンドロイチンを分解することができる。結合組織では、ＨＡに結合している水和水は、組織間に空間を生み出し、したがって、細胞運動及び増殖に資する環境が生み出される。ＨＡは、迅速な発育、再生、修復、胚形成、発生学的発生、創傷治癒、血管新生、及び腫瘍形成を含む、細胞運動に関連する生物学的現象に重要な役割を果たす。
【０００６】
ＣＤ４４（Ｐｇｐ−１、Ｈｅｒｍｅｓ−３、ＨＣＡＭ、ＥＣＭＲ  ＩＩＩとしても知られている）は、８５〜９０ｋＤａの分子量を有する、広範に発現される糖タンパク質である。ＣＤ４４は、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）の主要な細胞表面受容体である。
ＣＤ４４は、特異的にＨＡと結合するが、あるコンドロイチン硫酸含有プロテオグリカンも認識される場合がある。ＣＤ４４は、ＨＡへの接着及び遊走、ＨＡ分解、及び腫瘍転移を含む、種々の細胞機能及び生理機能に役割を果たす。また、ＣＤ４４は、細胞外マトリックス結合、細胞遊走、リンパ球活性化、リンパ球ホーミング、及び気管支平滑筋細胞の増殖に役割を果たすことが示されている（非特許文献１）。ＣＤ４４受容体は、細胞外ドメインのその可変領域で、複雑なパターンの選択的スプライシングを示す。
ＣＤ４４は、ＨＡの特に重要な白血球受容体であると考えられており、したがって、喘息の病因に関与している可能性がある。加えて、ＨＡのレベルは、対照マウスでは実験的喘息中に増加するが、抗体処置マウスでは著しく低減され、ＣＤ４４が、ＨＡ代謝に（具体的には、高分子量ＨＡの炎症促進性低分子量形態への分解）に関与していることが支持される。これは、ＨＡ由来オリゴ糖がトール様受容体と結合及び活性化することができるため、特に重要であり得る。明らかに、上記結果の中で最も印象的な側面は、抗ＣＤ４４処置の有益効果の大きさが著しいことである。
【０００７】
ＨＡ−ＣＤ４４相互作用は、発育、炎症、Ｔ細胞動員及び活性化、肺炎症、並びに腫瘍増殖及び転移に重要な役割を果たす場合がある。
【０００８】
標準的ＣＤ４４及び全てのアイソフォームを標的欠失させたマウスは、正常に発育する。研究によると、関節リウマチ、及び組織炎症の部位へのＴ細胞の血管外漏出等の炎症状態にＣＤ４４が重要な役割を果たすことが示唆されている。ＣＤ４４は、マウスのアレルゲン誘導性気管炎症での炎症細胞の動員に重要な役割を有する場合がある。ＣＤ４４は、慢性炎症の調節に重大な役割を果たすことが示唆されており、ＣＤ４４が、ＨＡとの相互作用とは無関係にマクロファージ活性化の調節に重大な役割を有する場合があることが示唆される（非特許文献２）。
【０００９】
炎症応答及び免疫応答を制御する能力は、幅広い範囲の疾患の療法の要である。ＣＤ４４は、活性化リンパ球の内皮及び平滑筋細胞への接着を支援する。更に、ＣＤ４４のライゲーションは、炎症細胞及び血管細胞の活性化を両方とも誘導する。ＣＤ４４の主要なリガンドであるＨＡは、ａｐｏＥ−欠損マウスのアテローム性動脈硬化病巣では上方制御され、ＨＡの低分子量炎症促進性形態は、ＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１）発現及び培養初代大動脈平滑筋細胞の増殖を刺激するが、ＨＡの高分子量形態は、平滑筋細胞増殖を阻害する。Ｇａｌ−９（ガレクチン−９）は、ＡＨＲ（気道過敏性）並びにＴｈ２関連気道炎症を低減することができる。更に、Ｇａｌ−９並びに抗ＣＤ４４モノクローナル抗体の投与は、末梢血Ｔｈ２細胞の気管への浸潤を阻害した。興味深いことには、Ｇａｌ−９は、ＣＤ４４接着分子と直接結合し、ＨＡとの相互作用を阻害した。
ＣＤ４４−ＨＡ相互作用は、Ｔ細胞の肺内への遊走を媒介するという概念の通り、Ｇａｌ−９は、ＢＷ５１４７マウスＴ細胞のＨＡへのＣＤ４４依存性接着を阻止した。Ｇａｌ−９は、細胞外マトリックスのＣＤ４４依存性白血球認識を調節することにより、気道のアレルギー性炎症及びＡＨＲを阻害すると結論付けられた（非特許文献３）。
【００１０】
ＣＤ４４は、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚筋炎、血管炎、及びベーチェット病のような自己免疫疾患で発現されるだろう。全身性エリトマトーデスは、多臓器系に影響を及ぼすプロトタイプの自己免疫疾患である。ヒアルロナン及びその細胞表面受容体ＣＤ４４とのその相互作用が、ＳＬＥの発症機序の媒介に重要な役割を果たすことを示唆する根拠が蓄積されている（非特許文献４）。関節リウマチ（ＲＡ）は、患者の滑膜関節の炎症をもたらす一般的な自己免疫障害である。ＲＡは、人口のおよそ１％に影響を及ぼし、自己免疫障害と分類されるが、耐性の回避を開始する分子事象（複数可）は、依然として推測であり、確認されていない（非特許文献５）。
シェーグレン症候群（ＳＳ）は、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）及び関節リウマチ（ＲＡ）等の関連自己免疫障害よりも一般的であるが、ＳＳの科学的及び医学的研究は、著しく遅れている。これは、ＳＳ遺伝学の分野において特に当てはまり、現在までの努力は、候補遺伝子手法に極度に依存している（非特許文献６）。強直性脊椎炎（ＡＳ）は、中軸骨格の偏好を示す一般的な炎症性リウマチ疾患であり、人口の０．２％に影響を及ぼす。現行の診断基準は、臨床的変化及び放射線学的変化の複合に依存し、平均診断時間は５〜１０年である（非特許文献７）。結果は、活性化ＣＤ４４を坦持するＴリンパ球の循環は、慢性炎症条件下で上昇し、これらは、自己免疫又は慢性炎症性疾患の活性の信頼できるマーカーを供給することができる活性化循環細胞の病因的に重要な亜集団を代表することができることを示唆する（非特許文献８）。
クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、臨床的特徴及び免疫学的特徴が乾癬と共通している。ゲノムワイド関連研究により、共通の感受性遺伝子が見出された。しかしながら、乾癬、乾癬性関節炎、及びＩＢＤのリスク間の関連性を評価する疫学的データは希である。この研究は、米国女性における、乾癬、乾癬性関節炎、並びに付随的なＣＤ及びＵＣ間の関連性を評価することを目的としていた。乾癬性関節炎を伴う乾癬は、付随的なＣＤのリスク増加と関連している（非特許文献９）。
皮膚筋炎（ＤＭ）は、筋肉及び皮膚の炎症を特徴とする多発性筋炎（ＰＭ）と関連する結合組織疾患である。ＤＭは、最も頻繁に皮膚及び筋肉に影響を及ぼすが、関節、食道、肺、及びあまり一般的ではないが心臓にも影響を及ぼす場合のある全身性障害である。血管炎は、炎症により血管を破壊する一群の障害である。動脈及び血管は両方とも影響を受ける。血管炎の病態生理は、十分に理解されていないが、続いて起こる炎症応答は、一般的に十分に説明されている（非特許文献１０）。ベーチェット病（ＢＤ）は、あらゆるサイズの動脈及び血管の両方に関与する唯一の全身性血管炎である。リューマチ診療所では、ベーチェット病が頻繁に見受けられる。ベーチェット病は、いくらか重症な病的状態、及びある場合には致命的転帰さえも示す（非特許文献１１）。
【００１１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートされたインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）は、週１回の注射製剤として、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症の治療に広く使用されている。しかしながら、ペグ化ＩＦＮαは、恐らくはペグ化による非特異的送達のため、注射を繰り返すと３９％の低効力及び副作用を示す。したがって、標的特異的長期作用性ヒアルロン酸−インターフェロンアルファ（ＨＡ−ＩＦＮα）コンジュゲート体が、ＨＣＶ感染症の治療のために開発された。ＨＡ−ＩＦＮαコンジュゲート体は、アルデヒド修飾ＨＡとＩＦＮαのＮ末端基との結合反応により合成された。ＩＦＮα含有量は、単一ＨＡ鎖当たり２〜９分子の範囲で制御することができ、生体コンジュゲーション効率は９５％よりも高い。
【００１２】
幾つかの研究によると、ＣＤ４４は、細菌と宿主細胞との直接的相互作用、並びに宿主細胞を変更し、感染症により罹りやすくするシグナル伝達事象に関与するとされている。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、そのヒアルロナン豊富な多糖類莢膜（又は細胞壁）を介して細胞に結合する。ＨＡは、ＣＤ４４に結合し、次いで、それにより、幾つかの宿主細胞タンパク質のチロシンリン酸化、並びにひだ形成及び葉状仮足の伸長を引き起こす細胞骨格の再編成が誘発される。その結果、細胞間接着は、密着結合及びＥ−カドヘリンの数減少のため緩められ、このプロセスは、細菌の上皮下組織への進入を可能にする。
【００１３】
特許文献１には、炎症の治療又は癌転移の検出におけるＣＤ４４の使用が記載されている。著者らは、ＣＤ４４が炎症性条件で上方制御され、ＣＤ４４ペプチドが、Ｔ細胞活性化を阻害することができることを示している。ＣＤ４４による転移の阻害に関するデータ又は請求項は示されておらず、腫瘍増殖又は血管新生を阻害するためのＣＤ４４の使用に向けた請求項は存在しない。
特許文献２には、癌及び血管新生依存性疾患を阻害するための、ＣＤ４４を含むＨＡ結合タンパク質及びペプチドの使用が開示されている。この刊行物では、Ｂ１６マウス黒色腫及びルイス肺癌の肺転移を阻害するために、メタスタチン、軟骨リンクタンパク質の３８ｋＤａ断片、並びにこの断片に由来するＨＡ結合ペプチドが使用される。ＨＡ結合ペプチドの場合、ニワトリＣＡＭでのＢ１６黒色腫の増殖、及びＨＡでの内皮細胞遊走が阻害されている。両刊行物では、ＨＡ結合ペプチドの使用は、ヒアルロン酸に結合するそれらの能力と直接的に関連する。
【００１４】
特許文献３には、可溶性組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４ＨＡＢＤ）が、ニワトリ及びマウスにおいて血管新生をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害し、それにより、由来が様々なヒト腫瘍増殖を阻害することが示されている。上記発明は、血管細胞表面受容体の標的化に基づく新規のクラスの血管形成阻害剤としての、可溶性非グリコシル化ＣＤ４４組換えタンパク質を開示するものである。
【００１５】
したがって、この従来技術では、あらゆる効果がＨＡ−ＣＤ４４相互作用に依存することを特定するための、ＣＤ４４の潜在的使用が開示されている。結果的に、これまでＣＤ４４−ＨＡコンジュゲート体に帰するとされている有用性は全て、ヒアルロン酸に結合するそれらの能力に直接的に依存する。
【００１６】
しかしながら、幾つかの薬物は、ＨＡとのコンジュゲートが依然として成功しておらず、更なる実験を行って、活性化合物の部位送達キャリアとしてのＨＡの潜在的有用性が確認されるべきである。特に、従来技術では、ＣＤ４４の過剰発現を特徴とする疾患において、活性化合物を標的送達するために、表面細胞受容体ＣＤ４４と、ＨＡとそのような活性化合物とのコンジュゲート体との相互作用を活用することが有益であり、それの有効な治療向上を得ることができることは示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第９４／０９８１１号
【特許文献２】国際公開第９９／４５９４２号
【特許文献３】米国特許第８，１９２，７４４号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｇｕｎｔｈｅｒｔら、１９９１年、Ａ  ｎｅｗ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＤ４４  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｒａｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ、５；６５巻（１号）：１３〜２４頁
【非特許文献２】Ｄｉａｎｈｕａ  Ｊｉａｎｇ、ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００７年；２３巻：４３５〜６１頁
【非特許文献３】Ｓｈｉｇｅｋｉ  Ｋａｔｏｈら、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＣＤ４４−Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ａｓｔｈｍａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７年７月１日；１７６巻（１号）：２７〜３５頁
【非特許文献４】Ｙｕｎｇ  Ｓ及びＣｈａｎ  ＴＭ、２０１２年、Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ＣＤ４４  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓ．２０１２巻（２０１２年），論文ＩＤ  ２０７１９０、９頁
【非特許文献５】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｊ．Ｍｏｔｔ、ＣＤ４４  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１３年、８巻（６号）：ｅ６５８０５
【非特許文献６】Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｉｃｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｒａ、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２０１２年８月；３９巻（１〜２号）：５７〜６３頁
【非特許文献７】Ｒｏｍａｎ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、２０１１年、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１２年２月；１１巻（２号）：Ｍ１１１．０１３９０４
【非特許文献８】Ｅｓｔｅｓｓ  Ｐら、１９９８年、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ＣＤ４４  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８年９月１５日；１０２巻（６号）：１１７３〜８２頁
【非特許文献９】Ｗｅｎ−Ｑｉｎｇ  Ｌｉ、２０１３年、Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ，ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ＵＳ  ｗｏｍｅｎ、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．２０１３年７月；７２巻（７号）：１２００〜５頁
【非特許文献１０】Ｈｅｎｒｙ  Ｓ．Ｓｕ、２０１２年、Ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、２０１２年１月；２６２巻（１号）：１８１〜９０頁
【非特許文献１１】Ｍ．Ｂ．Ｏｗｌｉａ、２０１２年、Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ＩＳＲＮ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０１２年：７６０４８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、表面細胞受容体ＣＤ４４を過剰発現する疾患において、活性化合物の部位送達に好適な、ＨＡとそのような活性化合物とのコンジュゲーションに基づく新しい化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、本発明は、グリコサミノグリカンを薬物とコンジュゲートさせた化合物であって、上記薬物が、ＣＤ４４の発現と高度に関連する炎症の疾患を治療するために使用される化合物を提供する。
【００２１】
第１の態様では、本発明の目的は、グリコサミノグリカン及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる化合物であって、上記活性化合物が、官能基により、グリコサミノグリカン、その誘導体、又はその塩のカルボキシル酸基にコンジュゲートされて、共有結合によるコンジュゲーションを形成し、上記活性化合物が、抗炎症薬、抗アレルギー薬、及びステロイドを含む化合物である。
【００２２】
本発明によるコンジュゲート体のグリコサミノグリカンは、好ましくはヒアルロン酸である。
【００２３】
更に、本発明によるグリコサミノグリカンコンジュゲート体は、好ましくは、炎症疾患を治療するために使用されるものである。
【００２４】
したがって、第２の態様では、本発明の更なる目的は、炎症を治療するための、及び上記治療処置用の医薬組成物を調製するための、グリコサミノグリカン及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる化合物の使用であって、上記活性化合物が、官能基により、グリコサミノグリカン、その誘導体、又はその塩のカルボキシル酸基にコンジュゲートされて、共有結合によるコンジュゲーションを形成し、上記活性化合物が、セレコキシブ、フェキソフェナジン、ブデソニド、及びプレドニゾロンからなる使用である。
【００２５】
また更なる態様では、本発明の目的は、グリコサミノグリカン及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる化合物を調製するための方法であって、上記活性化合物が、官能基により、グリコサミノグリカン、その誘導体、又はその塩のカルボキシル酸基に結合されて、共有結合によるコンジュゲーションを形成し、上記活性化合物が、セレコキシブ、フェキソフェナジン、ブデソニド、及びプレドニゾロンからなる方法である。
【００２６】
本発明を適切に説明するために、その実施形態への参照が、添付の図面に示されている。添付されているこれら図面は、本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図面は、それらの範囲を限定するとみなされるできではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】正常結腸組織及び傷害結腸組織におけるヒアルロン酸（ＨＡ）の親和性を、蛍光インデックスにより示す図である。
【図２Ａ】ＨＣＴ１５細胞系及びＨＴ２９細胞系に作用するＨＡ−色素化合物の蛍光結果の、６時間のＨＣＴ１５細胞系を表わす図である。
【図２Ｂ】ＨＣＴ１５細胞系及びＨＴ２９細胞系に作用するＨＡ−色素化合物の蛍光結果の、１２時間のＨＣＴ１５細胞系を表わす図である。
【図２Ｃ】ＨＣＴ１５細胞系及びＨＴ２９細胞系に作用するＨＡ−色素化合物の蛍光結果の、６時間のＨＴ２９細胞系を表わす図である。
【図２Ｄ】ＨＣＴ１５細胞系及びＨＴ２９細胞系に作用するＨＡ−色素化合物の蛍光結果の、１２時間のＨＴ２９細胞系を表わす図である。
【図３】ＨＡ−セレコキシブコンジュゲート体の構造を示す図である。
【図４】対照、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、ＨＡ、セレコキシブ（Ｃｅｌｅ）、及びＨＡ−セレコキシブコンジュゲート体（ＨＡ−ｃｅｌｅ）のＲａｗ２６４．７細胞系に対する抗炎症効果を示す図である。ここでの炎症インデックスは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）量の変化割合である。
【図５】ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドコンジュゲート体の構造を示す図である。
【図６】対照（ｃｔｒｌ）、ＬＰＳ、ＨＡプラスＬＰＳ（ＨＡ＋ＬＰＳ）、ブデソニド（ｂｕｄｅ．）、ブデソニドプラスＬＰＳ（ｂｕｄｅ＋ＬＰＳ）、ＨＡ−ブデソニドコンジュゲート体（ＨＡ−ｂｕｄｅ、「ＨＡ−ｂｕｄｅ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニド」を表わす）、及びＨＡ−ブデソニドコンジュゲート体プラスＬＰＳ（ＨＡ−ｂｕｄｅ＋ＬＰＳ）のＲＡＷ２５４．７細胞系に対する抗炎症効果を示す図である。ここでの炎症インデックスは、亜硝酸塩（ＮＯ）濃度の変化である。
【図７】ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジンコンジュゲート体の構造を示す図である。
【図８】対照、ＬＰＳ、ＨＡ、フェキソフェナジン（Ｆｅｘｏ）、及びＨＡ−フェキソフェナジンコンジュゲート体（ＨＡ−ｆｅｘｏ、「ＨＡ−ｆｅｘｏ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジン」を表わす）のＲａｗ２６４．７細胞系に対する抗炎症効果を示す図である。ここでの炎症インデックスは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）量の変化割合である。
【図９】ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンコンジュゲート体の構造を示す図である。
【図１０】対照、ＬＰＳ、ＨＡ、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ）、及びＨＡ−プレドニゾロンコンジュゲート体（ＨＡ−ｐｒｅｄ、「ＨＡ−ｐｒｅｄ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロン」を表わす）のＲａｗ２６４．７細胞系に対する抗炎症効果を示す図である。ここでの炎症インデックスは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）量の変化割合である。
【図１１】対照（賦形剤）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ）、プレドニゾロンとコンジュゲートされたＨＡ（ＨＡ−ＡＤＨ−Ｐｒｅｄ）、及びＨＡによる、関節リウマチ（ＲＡ）の治療効果を示す図である。ここでの治療インデックスは、足掌の厚さ（平均±ＳＥ）の変化割合である。ラットには、Ｄ１〜Ｄ１３の間、ＲＡを誘導する餌が与えられ、Ｄ１４で投薬した。データは、ノンパラメトリック統計により算出した。賦形剤群に対して、＊ｐ＜０．０５；Ｐｒｅｐ群に対して、＃ｐ＜０．０５、及びＨＡ群に対して、＆ｐ＜０．０５。
【図１２】対照（賦形剤）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ）、プレドニゾロンとコンジュゲートされたＨＡ（ＨＡ−ＡＤＨ−Ｐｒｅｄ）、及びＨＡによる、関節リウマチ（ＲＡ）の治療効果を示す図である。ここでの治療インデックスは、足首周囲（平均±ＳＥ）の変化割合である。ラットには、Ｄ１〜Ｄ１３の間、ＲＡを誘導する餌が与えられ、Ｄ１４で投薬した。データは、ノンパラメトリック統計により算出した。賦形剤群に対して、＊ｐ＜０．０５；Ｐｒｅｐ群に対して、＃ｐ＜０．０５、及びＨＡ群に対して、＆ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の他の目的、利点、及び新規な特徴は、添付図面を参照した、以下の詳細な説明からより明白になるだろう。
【００２９】
一般的に、経口投与された又は循環系に注射された薬物は、その標的治療領域に直接到着しなければならない。したがって、標的疾患及び正常器官に対する薬効は、標的部位での濃度及び特異性がそれほど高くないため、非常に類似したものになり、安全性プロフィールにより制限を受ける。
【００３０】
良好な安全性プロフィールを有するものを組み合わせて治療効力を向上させるための１つの戦略は、薬物をキャリアと共有結合で結合させることにより、疾患領域に対してより標的選択的になるように薬物を修飾することである。これは、以前に予期されているように、抗炎症療法の分野で特に求められている必要性である。
【００３１】
この目的で、本発明者は、活性物質を標的送達するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）とその受容体ＣＤ４４との相互作用を活用するという着想を得た。
【００３２】
正常組織又は正常器官よりも標的部位においてより高い薬物の濃度を維持するという発想は、本発明者が、ＨＡに関する長期研究及び実験を続けたことにより確立されたものである。
【００３３】
本発明はその結果から生み出されたものであるが、それらは、実施例で十分に説明されており、以下に簡便に要約されている。
【００３４】
実際、本発明では、異なる平均分子量（ＭＷ）を有するヒアルロン酸が、正常組織よりも傷害組織でより高い付着インデックスを示し、低平均分子量を有するＨＡが、高平均分子量を有するＨＡよりも良好な性能を示すことが見出されている。特に、図１に示されているように、傷害結腸組織に付着した３つの平均分子量のＨＡの違いを比較すると、傷害結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡの付着の蛍光インデックスは、他の２つの平均分子量（２０００ＫＤａ＝２ＭＤａ）及び（１０００ＫＤａ＝１ＭＤａ）のＨＡよりも高かった。更に、正常結腸組織又は傷害結腸組織の場合でさえも、１ＭＤａ  ＨＡの付着の蛍光インデックスは、２ＭＤａ  ＨＡよりも高かった。この結果により、ＨＡは、より特異的に炎症部位に付着することができることが確認された。
これを受けて、本発明者は、更に本発明を発明し、その表面細胞受容体ＣＤ４４とのＨＡの相互作用によると考えられる、ヒアルロン酸の組織付着のこの独特の特徴を、このグリコサミノグリカンが他の化合物とコンジュゲートされた場合に維持することができるかどうかを検証する。したがって、更に、本発明者は、ＨＡを標的送達媒体として使用して、薬物をＣＤ４４豊富な部位に導くことができるかどうかを検証するために、薬物をＨＡにコンジュゲートさせる。前述したように、ＣＤ４４が、炎症、感染症、又は癌が存在する状況中に過剰発現される場合、関連薬物は、リガンドＨＡが受容体ＣＤ４４に結合するため、標的部位に容易に到着し、標的部位で相対的に高い濃度を保持することができる。
炎症部位又はＣＤ４４豊富な部位に対するＨＡの付着効果に伴って、コンジュゲート薬物は、標的部分に特に凝集し、その部位での薬物の濃度が比較的より高くなるため療法効力が増強され、したがって、使用される薬物の量が減少され、安全性プロフィールがより良好になるはずである。薬物又は色素のＨＡとのコンジュゲーションが成功したことを確認し、更にＨＡ結合効果を確認するために、本発明の発明者は、色素をＨＡにコンジュゲートさせ（ＨＡ−色素）、細胞系及びマウスを別々に処置することを含む実験を実施した。
図２Ａ及び図２Ｂは、細胞系ＨＣＴ１５（ＣＤ４４がより少ない結腸直腸腺癌）における様々な作用時間での実験を示し、図２Ｃ及び図２Ｄは、細胞系ＨＴ２９（ＣＤ４４が豊富な結腸直腸腺癌）における様々な作用時間での実験を示す。ＨＴ２９（図２Ｃ及び図２Ｄ）の結果は、ＨＡ−色素のコンジュゲーションが成功し、ＨＴ２９のＣＤ４４豊富な領域に結合し（図２Ｃ）、更にＨＴ２９細胞内に進入したことを示す（図２Ｄ）。これは、本発明の発想が適切及び有効であることを意味し、薬物又は色素をＨＡにコンジュゲートさせることができ、ＨＡは、ＣＤ４４に結合するその能力を保持することも意味する。
【００３５】
４週間の、マウスのＨＴ２９及びＨＣＴ１５４の細胞系での遊離色素及びＨＡ−色素の結合条件を実施した。遊離色素をマウスの尾静脈に注射した。結果は、２つの異なるＣＤ４４発現癌細胞の結合結果に差異が一切ないことを示した。ＨＴ２９の結合面積の比率は、５０．１５％である一方で、ＨＣＴ１５は、４９．８６％である。しかしながら、ＨＡコンジュゲート色素をマウス尾静脈に注射した場合、より多くのＣＤ４４を発現する癌細胞ＨＴ２９は、ＨＡコンジュゲート色素の著しい濃度を示したが、より少ないＣＤ４４を発現するＨＣＴ１５は、非常に限定的な結果を示した。
ＨＴ２９の結合面積の比率は、７４．１５％であるが、ＨＣＴ１５は、２５．８５％である。結果は、色素をＨＡとコンジュゲートさせた場合、色素の濃度は、ＨＡがＣＤ４４豊富な部位に結合するため、増加したことを示すことができる。
【００３６】
ＣＤ４４と高度に関連する疾患には、癌、感染症、及び炎症が含まれる。感染性病原体には、これらに限定されないが、幾つかのウイルス、細菌、真菌、原虫、多細胞寄生生物、及びプリオンとして知られている異常タンパク質が含まれる。これら病原体は、病原体が存在しないと感染性流行が生じないという意味で、疾患流行の原因である。
好ましい実施形態では、感染症には、下気道感染症、ＨＩＶ／エイズ、下痢性疾患、結核、マラリア、麻疹、百日咳、破傷風、髄膜炎、梅毒、Ｂ型肝炎、敗血症、及び熱帯病が含まれる。炎症性異常は、非常に様々なヒト疾患の根底にある障害の大きなグループである。好ましい実施形態では、炎症性疾患は、尋常性ざ瘡、アレルギー性疾患、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、及び間質性膀胱炎が含まれる。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲では、用語「薬物」又は「化合物」又は「作用剤」は、本発明で使用される場合、抗喘息薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬物、抗炎症薬、抗アレルギー薬、抗ウイルス薬、免疫抑制剤、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）、及びステロイドを含んでいてもよい。それらの中で、抗アレルギー薬、抗感染症薬、抗炎症薬、及びステロイドが好ましい。
大多数の抗アレルギー薬は、フェキソフェナジン、セチリジン、マレイン酸クロルフェニラミン、プソイドエフェドリン、及びブデソニド等の、抗ヒスタミン、抗炎症剤、うっ血除去薬、及びステロイドに分割することができる。大多数の抗感染症薬は、皮膚又は粘膜に外部的に使用され、血流に進入せず、肝臓で新陳代謝されない局所的抗感染症手段、及び経口又は注射投与で内臓感染症を治療するために使用される全身性抗感染症手段に分割することができる。大多数の抗炎症薬は、非ステロイド抗炎症剤、又はＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ−２アンタゴニスト、及びステロイドに分割することができる。
【００３８】
別の実施形態では、適切な薬物の例は、抗喘息薬、抗真菌薬、抗ヒスタミン薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、ＮＳＡＩＤ、及びそのステロイドである。好ましい実施形態では、サルブタモールを含む抗喘息薬、ニメスリド、セレコキシブ、メロキシカム、ジクロフェナク、及びピロキシカムを含むＮＳＡＩＤ、フェキソフェナジンを含む抗アレルギー薬、アムホテリシンＢを含む抗真菌薬、リバビリンを含む抗ウイルス薬、並びにブデソニド及びプレドニゾロンを含むステロイドのＨＡとのコンジュゲーションが好ましい。更に、ＣＯＸ−２アンタゴニストは、セレコキシブを含む。
【００３９】
本発明の目標は、ＨＡのカルボキシル基、ヒドロキシル基、又はアミノ基により、リンカー又はスペーサーを用いて又は用いずに、ＨＡを前述の薬物と結合又はコンジュゲートさせて、特定の位置及び特定の時間で作用効果を達成することである。したがって、豊富なＣＤ４４を有する特定部位に薬物を運ぶ標的送達媒体としてのＨＡは、より良好な治療効力及び安全性をもたらすことができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、一般的に、用語「リンカー」又は「スペーサー」は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄等の原子、ＳＳ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ等の単位、又は１つ若しくは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）により中断又は終了されていてもよい置換又は非置換アルキル等の原子の鎖を含む。本発明の用語「リンカー」又は「スペーサー」は存在しなくともよく、化学的に、酵素的に除去されてもよく又は自然に分解してもよい、薬物とＨＡとの間に存在する任意の化学化合物を指す。また、用語「リンカー」又は「スペーサー」は、薬物を連結するのに有用な少なくとも１つの他の基、例えば、アミノ基、チオール基、更にはカルボキシル基等も含む。リンカー又はスペーサーは、ポリペプチド、ペプチド、又は脂質であってもよい。
【００４１】
好適なリンカー又はスペーサーは、例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、直鎖又は分岐、脂肪族、芳香族、又は芳香脂肪族Ｃ２〜Ｃ２０ジカルボン酸、アミノ酸、ペプチドである。
【００４２】
リンカーの役割は、存在する場合はいつでも、ヒアルロン酸と薬物との間にアーム又はスペーサーを生成することにある。リンカーは、一方の側では、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、又はアミノ基連結によりＨＡと結合し、他方の側では、任意の考え得る共有結合型の結合により薬物と結合する。
【００４３】
リンカー又はスペーサーがジカルボン酸である場合、薬物とエステル結合を形成するカルボキシル基は、化合物のヒドロキシル基であってもよい。リンカー又はスペーサーがジヒドラジドである場合、ＨＡとアミド結合を形成するアミノ基は、ＨＡの自由カルボキシル基であってもよい。好ましいリンカー又はスペーサーは、薬物に対してはコハク酸、ＨＡに対してはアジピン酸ジヒドラジドである。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明は、グリコサミノグリカン、好ましくはヒアルロン酸、及び活性化合物に由来するコンジュゲート体からなる化合物であって、上記活性化合物が、官能基により、グリコサミノグリカン、その誘導体、又はその塩のカルボキシル酸基にコンジュゲートされて、共有結合によるコンジュゲーションを形成し、上記活性化合物が、抗炎症薬、抗アレルギー薬、及びステロイドからなる化合物を提供する。
【００４５】
活性化合物である、ＣＯＸ−２アンタゴニストであるセレコキシブを含む抗炎症薬、フェキソフェナジンを含む抗アレルギー薬、並びにブデソニド及びプレドニゾロンを含むステロイドは、好ましくは、ＨＡの官能性カルボキシル基及び活性化合物の−ＮＨ２基により、好ましくは直接的に又はリンカーを介して間接的に結合されていてもよい。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、直接的又はリンカーを介して間接的のいずれでもよい、ＨＡ及び活性化合物の官能性カルボキシル基の１つとの間の共有結合によるコンジュゲーションは、アミド結合又はエステル結合のいずれでもよい。
【００４７】
リンカーによる間接的コンジュゲーションの場合、上記リンカーは、ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ポリペプチド、ペプチド、脂質、アミノ酸、又は直鎖若しくは分岐、脂肪族、芳香族、又は芳香脂肪族Ｃ２〜Ｃ２０ジカルボン酸から選択される。
【００４８】
コンジュゲーション用の好ましいＨＡは、５ｋＤａから２０００ｋＤａまでを含む範囲の平均分子量を有し、コンジュゲーションには、ＨＡのカルボキシル基の少なくとも４０％が関与する。
【００４９】
感染症、傷害、自己免疫疾患、又はアレルギー、及び関節リウマチを含む自己免疫疾患により誘導又は引き起こされる急性又は慢性炎症を治療するためには、本発明の製剤又は剤形の好ましい実施形態は、経口使用用又は循環系使用用の投与剤形を製剤化するための賦形剤及び／又は希釈剤を含む。経口剤形のより好ましい実施形態は、固形剤形、これらに限定されないが、懸濁液を含む溶液、これらに限定されないが、制御放出錠剤含む錠剤、及びこれらに限定されないが、腸コーティングカプセルを含むカプセルからなる群から選択される。循環系又は全身性投与形態のより好ましい実施形態は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、及び皮下（ＳＣ）からなる群から選択される。
【００５０】
以下の例は、本発明の種々の実施形態を示す目的で挙げられおり、いかなる様式でも本発明を限定することは意図されていない。
【００５１】
実施例
実施例１：結腸組織でのＨＡの付着（ＩＶＩＳ画像システム−バージョン３）  手順：
１．  ０．２５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＨＨＡ；Ｍｖ：２ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ社）及び０．２５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＬＨＡ；Ｍｖ：０．３５ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ社）を、それぞれ５０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）に添加して、０．５％の溶液を形成し、その後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。０．２５ｇの中分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＭＨＡ；Ｍｖ：１ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ社）を、５０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に添加し、その後、粉末が完全に溶解し、下記ステップで使用する準備ができるまで、６時間撹拌した。
【００５２】
２．  
（１）蛍光性ＨＡ（ＨＡ−ｆ）を、０．３９ｇのＭＥＳ遊離酸（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）により調製し、１００ｍＬのｄｄ水に溶解した。
（２）溶液Ａ：６５ｍｇのフルオレセインアミン粉末（アイソマーＩ、Ｆｌｕｋａ社）を、９ｍＬの９５％ＥｔＯＨ溶液に溶解し、その後、光が禁止された条件下で１０分間撹拌した。
（３）溶液Ｂ：３５９ｍｇのＥＤＣ粉末（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｓｉｇｍａ社）を、９ｍＬのＭＥＳ緩衝液に溶解し、その後１０分間撹拌した。
（４）溶液Ｃ：２１６ｍｇのＮＨＳ粉末（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、Ｓｉｇｍａ社）を、９ｍＬのＭＥＳ緩衝液に溶解し、その後、１０分間撹拌した。
（５）３ｍＬの溶液Ａを、５０ｍＬの０．５％ＨＡ溶液にゆっくりと落下させ、その後、光が禁止された条件下で１０分間撹拌した。
（６）３ｍＬの溶液Ｂ及び５ｍＬの溶液Ｃを、ステップ（５）の溶液に別々に落下させ、その後、光が禁止された条件下で１０分間撹拌した。
（７）０．０２ＭのＭＥＳ緩衝液を、容積が１００ｍＬになるまで、ステップ（６）の溶液にゆっくりと添加し、その後、光が禁止された条件下で室温にて２４時間撹拌した。
（８）透析溶液としての５Ｌのｄｄ水中の透析チューブ（ＭＷ：１２０００〜１４０００）に、反応後の産物を注ぎ、その後、光が禁止された条件下で４℃にて５日間、１２時間毎に透析溶液を換え、透析溶液が蛍光を示さなくなるまで撹拌した。
（９）透析後の液体を、５０ｃｃのプラスチック遠心分離管に配分し、その後、−２０℃の冷蔵庫で一晩保存し、次に、光が禁止された条件下にて凍結乾燥機で乾燥した。
（１０）乾燥したＨＡ−ｆ粉末を、−２０℃の冷蔵庫で保存した。
（１１）５０ｍｇのＨＡ−ｆ粉末を、１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液にゆっくりと添加し、その後、粉末が完全に溶解するまで、６時間撹拌した。
【００５３】
３．  ７〜８週歳のＳＤ−ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）の結腸組織をメスで切断し、その後ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次に３〜４ｃｍの長さに切断し、最終的にＰＢＳ緩衝液に浸漬した。
【００５４】
４．  歯ブラシで縦に２０回ブラシをかけ、その後ＰＢＳ緩衝液に浸漬することにより、傷害結腸組織を調製した。
【００５５】
５．  正常結腸組織及び傷害結腸組織を、１２ウエルプレートに入れ、その後１ｍＬの０．５％ＨＡ−ｆ溶液を各ウエルに添加し、室温で２時間振とうした。余分のＨＡ−ｆ溶液を、２時間後にチップで吸引し、その後ＰＢＳ緩衝液に１０分間浸漬し、次に３回繰り返してＰＢＳ緩衝液を除去した。
【００５６】
６．  洗浄した結腸組織を、１２ウエルプレートの内側組織の上に配置し、その後ＩＶＩＳ（ｉｎ  ｖｉｖｏ画像システム、ＸＥＮＯＧＥＮ社）のドックに配置した。初期設定パラメーターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）として設定したが、励起は４６５ｎｍであり、発光は５００ｎｍだった。その後、画像をソフトウェアでキャプチャした。
【００５７】
７．  値は全て、ｎ回観察の平均として算出されている。組織学的インデックスは、スチューデントのｔ検定で分析した。
【００５８】
結果：蛍光インデックスを定量化し、図１のように整理した。正常結腸組織の蛍光インデックスを１と定義した。他の結腸組織試験は、定義された値で較正した。結果は、同じ平均Ｍｗを有するＨＡは、正常結腸組織でよりも明らかにより高い蛍光インデックスで、傷害結腸組織に付着したことを示した（Ｐ＜０．０１）。傷害結腸組織に付着した３つの異なる平均分子量のＨＡ間の違いを比較すると、傷害結腸組織による３５０ＫＤａ  ＨＡの付着の蛍光インデックスは、他の２つの平均分子量（２ＭＤａ）及び（１ＭＤａ）のＨＡよりも明らかに高かった。更に、正常結腸組織又は傷害結腸組織の場合でさえも、１ＭＤａ  ＨＡの付着の蛍光インデックスは、２ＭＤａ  ＨＡよりも高かった。
【００５９】
実施例２：ＨＡ−色素コンジュゲーションプロセス及びＨＡ−色素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ画像
ＨＡ−色素コンジュゲーションの以下の全プロセスは、暗所で維持されなければならない。
ＨＡ−ＡＤＨの合成
１．  ＨＡ（０．３４ＭＤａ、５０ｍｇ）を水に溶解して、４ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。
２．  ５倍過剰のＡＤＨ（１１４．８ｍｇ）をこの溶液に添加した。
３．  反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加することにより４．７５に調整した。
４．  次に、１当量のＥＤＣ（２５．１ｍｇ）を固体形態で添加した。反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加することにより４．７５に調整した。
５．  １５分の反応後、０．１ＮのＮａＯＨを添加することにより反応を停止させ、反応混合物のｐＨを７．０に調整した。
６．  その後、反応混合物を、前処理した透析チューブ（Ｍｗカットオフ３５００）に移し、１００ｍＭのＮａＣｌに対して、次に２５％ＥｔＯＨ／水の４サイクル、最後に水に対して、徹底的に透析した。その後、この溶液を、０．２μｍセルロースアセテート膜でろ過し、瞬間凍結し、凍結乾燥した。
７．  ＡＤＨの置換度を、１ＨＮＭＲで測定した。
【００６０】
ＨＡ−ＡＤＨ−ＦＩＴＣの合成
１．  ８８ｍｇのＨＡ−ＡＤＨ（ＤＳ＝３６％）を、３５ｍＬの水に溶解した。
２．  ９．５ｍｇのＦＩＴＣを、１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。
３．  ＨＡ−ＡＤＨ溶液及びＦＩＴＣ溶液を混合する。
４．  室温で４８時間撹拌した後、ＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析バッグを使用して、溶液を、０．３ＭのＮａＣｌ及び純水で交互に３日間透析した。
５．  その後、この溶液を２日間凍結乾燥した。
６．  最後に、置換度を、ＵＶスペクトラムで決定した。
【００６１】
ＨＡ−色素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ画像
（１）１×１０５個のＨＴ２９細胞及びＨＣＴ１５細胞（ヒト結腸癌、ＣＤ４４陽性細胞）を、３．５ｃｍディッシュ内の顕微鏡スライドに接種した。
（２）示されている色素濃度、１μＭのＨＡ−色素（ＨＡ：０．３４ＭＤａ）を、示されている時間、細胞にそれぞれ添加した。
（３）インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後３．７％ホルムアルデヒドで固定した。
（４）ＨＡ−色素と細胞との相互作用の観察を、共焦点顕微鏡で実施した。
【００６２】
結果：蛍光観察は、ＨＣＴ１５（図２Ａ及び図２Ｂ）及びＨＴ２９（図２Ｃ及び図２Ｄ）に対する色素の付着部位及び量を示すことができる。結果は、色素のＨＡとのコンジュゲーションが成功し、ＨＡが、ＨＴ２９のＣＤ４４豊富な部位でのＨＡ−色素濃度を増強するが、ＨＴ２９は、ＨＣＴ１５が有するよりも豊富なＣＤ４４に合致する、より強い蛍光を示すことを明らかにする。ＨＡ−色素が細胞に進入することができることさえ証明された（２Ｄ図）。ＨＡ−色素は、ＨＴ２９（より多くのＣＤ４４）では、６時間の処理後に蓄積され、１２時間の処理の後に内在化された。そのような現象は、ＨＣＴ１５（より少ないＣＤ４４）では、６時間又は１２時間のＨＡ−色素の処理後に観察されなかった。
【００６３】
実施例３：ＨＡ−セレコキシブコンジュゲート体の合成
手順：
１．  １００ｍｇのＨＡ（１０Ｋ〜７００ＫＤａ）を２５ｍＬのＤＤ水に溶解した。
２．  ０．８当量の水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ−ＯＨ）を、ＨＡ溶液に添加し、１６時間撹拌した。
３．  この溶液を乾燥し、ＨＡ−ＴＢＡ白色固形物を得た。
４．  ４０ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを、１ｍＬのＤＤ水に溶解し、その後、この溶液に３０ｍｇのＥＤＣ及び１８ｍｇのＮＨＳ粉末を添加し、室温で５分間撹拌した。
５．  ４ｍｇのセレコキシブを、２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に溶解した。
６．  この混合物（ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＣ、ＮＨＳ、及びセレコキシブ）を、室温で７２時間撹拌した。
７．  透析器バッグ（ＭＷＣＯ：１２００〜１４００）を使用することにより、混合物を、割合が２対１であるＤＭＳＯ及びＤＤ水に対して１日間透析した。溶液は３回交換した。
８．  その後、透析器バッグ（ＭＷＣＯ：１２００〜１４００）を使用することにより、混合物を、０．３ＭのＮａＣｌに対して２日間透析した。溶液は、１日２回交換した。
９．  ＨＡ−セレコキシブ溶液を凍結乾燥機で脱水することにより、ＨＡ−セレコキシブ粉末を得た。
図３には、ＨＡ−セレコキシブコンジュゲート体の構造が示されている。
【００６４】
実施例４：ＨＡ−セレコキシブのＲＡＷ２６４．７細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗炎症効果。
手順：
１．  ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６細胞／ウェル、１０００μＬ）を、２４ウエル培養プレートで、２４時間３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で培養した。
２．  １０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに培地を変更し、細胞を、種々の濃度の化合物（１００ｎＭセレコキシブ、ＨＡ−セレコキシブ（１００ｎＭセレコキシブと等しい）、及び４．９μｇ／ｍＬのＨＡ）で４時間処理し、その後１μｇ／ｍＬのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で２４時間処理した。
３．  細胞培地を収集し、ＰＧＥ２の測定に使用した。
４．  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ９６ウエルプレートを、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ二次抗体でコーティングした。
５．  細胞培地の分割量を、一次ＰＧＥ２モノクローナル抗体及びトレーサＰＧＥ２アセチルコリンエステラーゼを有する免疫プレートに、暗所で室温にて一晩添加した。
６．  翌日、ウエルを吸引し、１００μＬの洗浄緩衝液（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、アンアーバー、ミシガン州、米国）で５回洗浄した。
７．  ２００μＬのエルマン試薬を各ウエルに添加し、直射日光を避けて室温にて６０〜９０分インキュベートした。
８．  穏やかな回転／振とうを使用して、発色に必要な時間を減少させた。
９．  吸光度を４１２ｎｍで測定した。
１０．  各試料のＰＧＥ２濃度を、ＰＧＥ２標準曲線から算出した。
１１．  ＰＧＥ２量パーセントは、ＬＰＳ処理された対照群の１つで除算し、次にこの値に１００を掛けた、各試料のＰＧＥ２レベルの関数としてであった。
１２．  ＰＧＥ２の実際の量は、ＬＰＳ処理した対照群の場合、１３７０ｎｇ／ｍＬであると推定した。
【００６５】
結果：図４に示されているように、インデックスがＰＧＥ２の量であるため、ＬＰＳによる炎症の誘導は成功した。薬物のみの群（セレコキシブ）は、治療効果を示す。しかしながら、ＨＡをセレコキシブでコンジュゲートすると（ＨＡ−ｃｅｌｅ）、薬物のみよりも良好な治療効果を示す。
【００６６】
実施例５：ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドコンジュゲート体の合成
手順：
ＨＡ−ＡＤＨの合成：
１．  ＨＡ（５０ｍｇ）を水に溶解して、４ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。
２．  ５倍過剰のＡＤＨ（１１４．８ｍｇ）をこの溶液に添加した。
３．  反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加することにより４．７５に調整した。
４．  次に、１当量のＥＤＣ（２５．１ｍｇ）を固体形態で添加した。反応混合物のｐＨを、０．１ＮのＨＣｌを添加することにより４．７５に調整した。
５．  １５分の反応後、０．１ＮのＮａＯＨを添加することにより反応を停止させ、反応混合物のｐＨを７．０に調整した。
６．  その後、反応混合物を、前処理した透析チューブ（Ｍｗカットオフ３５００）に移し、１００ｍＭのＮａＣｌに対して、次に２５％ＥｔＯＨ／水の４サイクル、及び最後に水に対して徹底的に透析した。その後、この溶液を、０．２μｍセルロースアセテート膜でろ過し、瞬間凍結し、凍結乾燥した。
７．  ＡＤＨの置換度は、１ＨＮＭＲで測定した。
【００６７】
ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドの合成：
１．  ＥＤＣ及びＮＨＳを使用して、ブデソニドスクシナートのカルボキシル基をＨＡ−ＡＤＨのアミン基と化学コンジュゲーションすることにより、ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドスクシナートを形成した。
２．  ７．４ｍｇのブデソニドスクシナートを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、１４．５μｍｏｌのＥＤＣ及び１４．５μｍｏｌのＮＨＳを含有する１ｍＬの純水と５分間反応させた。
３．  ５分後、混合溶液を、２０ｍｇのＨＡ−ＡＤＨを含有する８ｍＬの水：ＤＭＳＯ＝１：１（ｖ／ｖ）に滴加した。
４．  混合溶液を、室温（約３０℃）で２４時間撹拌した。
５．  ２４時間後、ＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析バッグを使用して、この溶液を、０．３ＭのＮａＣｌ及び純水で交互に３日間透析した。
６．  その後、この溶液を２日間凍結乾燥し、４℃で保管した。
７．最後に、置換度を、１Ｈ−ＮＭＲで決定した。
結果：図５には、ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドコンジュゲート体の構造が示されている。
【００６８】
実施例６：ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニドのＲＡＷ２６４．７細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗炎症効果
手順：
１．  Ｒａｗ２６４．７細胞を、フェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社、ウィーン、オーストリア）を含まない培養培地に懸濁し、１０６細胞／ｍＬに調整し、１０μＭのブデソニド、３７８μｇ／ｍＬのＨＡ、及びＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニド（１０μＭブデソニドと等しい）で処理した。
２．  薬物で４時間処理した後、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを、２４時間培地に添加した。
３．  培地で処理した細胞は、陰性対照群としての役割を果たしたに過ぎず、陽性対照群としてＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。
４．  その後、培養上清を除去し、誘導型ＮＯＳ活性を測定するために、グリース反応により酸化窒素を蓄積させた。
５．  １００μＬのグリース試薬（２．５％のリン酸中の１％スルファニルアミド、０．１％のナフチルエチレンジアミン二塩酸塩）を、１００μＬの培養上清に添加し、発色は、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２ｅマルチモードプレートリーダ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国）を用いて５５０ｎｍで評価した。
６．  フェノールレッドを含まない培養培地に溶解した亜硝酸ナトリウムの系列希釈を用いて標準曲線を生成した。
結果：図６に示されているように、ＬＰＳのみの群と比較すると、ＨＡ＋ＬＰＳ、ｂｕｄｅ．＋ＬＰＳ、及びＨＡ−ｂｕｄｅ＋ＬＰＳ（「ＨＡ−ｂｕｄｅ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−ブデソニド」を表わす）、群ＨＡ＋ＬＰＳ及びＨＡ−ｂｕｄｅ＋ＬＰＳは、治療効果を示している。炎症インデックスは、ここでは亜硝酸塩である。
【００６９】
実施例７：ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジンコンジュゲート体の合成
手順：
１．  ＥＤＣ及びＮＨＳを使用して、フェキソフェナジンのカルボキシル基をＨＡ−ＡＤＨのアミン基と化学コンジュゲートすることにより、ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジンを合成した。
２．  ７．８ｍｇのフェキソフェナジンを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、７３．３μｍｏｌのＥＤＣ及び７３．９μｍｏｌのＮＨＳを含有する１ｍＬの純水と５分間反応させた。
３．  ５分後、混合溶液を、２０ｍｇのＨＡ−ＡＤＨを含有する８ｍＬの水：ＤＭＳＯ＝１：１（ｖ／ｖ）に滴加した。
４．  混合溶液を、室温（約３０℃）で２４時間撹拌した。
５．  ２４時間後、ＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析バッグを使用して、この溶液を、０．３ＭのＮａＣｌ及び純水で交互に３日間透析した。
６．  その後、この溶液を２日間凍結乾燥し、４℃で保管した。
７．  最後に、置換度を、１Ｈ−ＮＭＲで決定した。
結果：図７には、ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジンコンジュゲート体の構造が示されている。
【００７０】
実施例８：ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジンのＲＡＷ２６４．７細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗炎症効果。
手順：
１．  ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６細胞／ウェル、１０００μＬ）を、３７℃にて２４時間、５％ＣＯ２の存在下で２４ウエル培養プレートにてインキュベートした。
２．  １０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに培地を変更し、細胞を、種々の濃度の化合物（１００μＭフェキソフェナジン、ＨＡ−ＡＤＨフェキソフェナジン（１００μＭフェキソフェナジンと等しい）で４時間処理し、その後１μｇ／ｍＬのＬＰＳで２４時間処理した。
３．  細胞培地を収集し、ＰＧＥ２の測定に使用した。
４．  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ９６ウエルプレートを、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ二次抗体でコーティングした。
５．  細胞培地の分割量を、一次ＰＧＥ２モノクローナル抗体及びトレーサＰＧＥ２アセチルコリンエステラーゼを有する免疫プレートに、暗所で室温にて一晩添加した。
６．  翌日、ウエルを吸引し、１００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
７．  ２００μＬのエルマン試薬を各ウエルに添加し、直射日光を避けて室温にて６０〜９０分インキュベートした。
８．  穏やかな回転／振とうを使用して、発色に必要な時間を減少させた。
９．  吸光度を４１２ｎｍで測定した。
１０．  各試料のＰＧＥ２濃度を、ＰＧＥ２標準曲線から算出した。
１１．  ＰＧＥ２量パーセントは、ＬＰＳ処理された対照群の１つで除算し、次にこの値に１００を掛けた、各試料のＰＧＥ２レベルの関数としてであった。
１２．  ＰＧＥ２の実際の量は、ＬＰＳ処理した対照群の場合、１３７０ｎｇ／ｍＬであると推定した。
結果：図８に示されているように、薬物のみの群（フェキソフェナジン）は、治療効果を示した。しかしながら、ＨＡをフェキソフェナジンとコンジュゲートすると（ＨＡ−ｆｅｘｏ、「ＨＡ−ｆｅｘｏ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−フェキソフェナジン」を表わす）、薬物のみよりも良好な治療効果を示す。
【００７１】
実施例９：ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンコンジュゲート体の合成
手順：
１．  プレドニゾロン２１−ヘミエステルの合成：
２．  ピリジン（８ｍＬ）中のプレドニゾロン（１ｇ；２．７７ｍｍｏｌ）及び無水コハク酸（１．１２５ｇ；１２．５５ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で撹拌した。
３．  ２４時間後、反応混合物を、氷（２５ｇ）、水（２５ｍＬ）、及び濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）の混合物に注いだ。
４．  分離した結晶をろ過で収集し、水で洗浄し、乾燥し、トルエンから再結晶させ、再び一晩乾燥した。
５．  調製したヘミエステルを、１Ｈ−ＮＭＲ分光法で特徴付けた。
【００７２】
ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンヘミエステルの合成：
１．  溶液１：７３．３μｍｏｌ（１４ｍｇ）のＥＤＣ及び７３．９μｍｏｌ（８．５ｍｇ）のＮＨＳを、１ｍＬの水に添加した。
２．  溶液２：１４．５μｍｏｌ（６．４ｍｇ）のプレドニゾロンヘミエステルを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。
３．  溶液３：２０ｍｇ（ＡＤＨ：１４．５μｍｏｌ）のＨＡ−ＡＤＨ（Ｄ．Ｓ＝３１％）を、８ｍＬの共溶媒（水：ＤＭＳＯ＝１：１）に溶解した。
４．  溶液１＆２を混合し、５分間撹拌して、プレドニゾロンヘミエステルのカルボニル基を活性化する。
５．  ５分後、混合物を、撹拌混合下で溶液３に滴加した（１ｍＬ／分）。
６．  混合溶液を、室温（約３０℃）で２４時間撹拌した。
７．  ２４時間後、ＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析バッグを使用して、この溶液を、０．３ＭのＮａＣｌ／純水で交互に３日間透析した。
８．  その後、この溶液を２日間凍結乾燥した。
９．  最後に、ＨＡ−ＡＤＨ−Ｐｒｅｄの置換度を、１Ｈ−ＮＭＲで決定した。
結果：図９には、ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンコンジュゲート体の構造が示されている。
【００７３】
実施例１０：ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンのＲＡＷ２６４．７細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗炎症効果。
１．  ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６細胞／ウェル、１０００μＬ）を、２４時間３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で、２４ウエル培養プレートにてインキュベートした。
２．  １０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに培地を変更し、細胞を、種々の濃度の化合物（８６．７μＭプレドニゾロン、ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロン（８６．７μＭプレドニゾロンと等しい）、及び７０μｇ／ｍＬのＨＡ）で４時間処理し、その後１μｇ／ｍＬのＬＰＳで２４時間処理した。
３．  細胞培地を収集し、ＰＧＥ２の測定に使用した。
４．  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ９６ウエルプレートを、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ二次抗体でコーティングした。
５．  細胞培地の分割量を、一次ＰＧＥ２モノクローナル抗体及びトレーサＰＧＥ２アセチルコリンエステラーゼを有する免疫プレートに、暗所で室温にて一晩添加した。
６．  翌日、ウエルを吸引し、１００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
７．  ２００μＬのエルマン試薬を各ウエルに添加し、直射日光を避けて室温にて６０〜９０分インキュベートした。
８．  穏やかな回転／振とうを使用して、発色に必要な時間を減少させた。
９．  吸光度を４１２ｎｍで測定した。
１０．  各試料のＰＧＥ２濃度を、ＰＧＥ２標準曲線から算出した。
１１．  ＰＧＥ２量パーセントは、ＬＰＳ処理した対照群の１つで除算し、次にこの値に１００を掛けた、各試料のＰＧＥ２レベルの関数としてであった。
１２．  ＰＧＥ２の実際の量は、ＬＰＳ処理した対照群の場合、１３７０ｎｇ／ｍＬであると推定した。
結果：図１０に示されているように、薬物のみの群（プレドニゾロン）は、治療効果を示す。しかしながら、ＨＡを、プレドニゾロンとコンジュゲートすると（ＨＡ−ｐｒｅｄ、「ＨＡ−ｐｒｅｄ」は、「ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロン」を表わす）、薬物のみよりも良好な治療効果を示す。
【００７４】
実施例１１：ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロンによる関節リウマチ（ＲＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果
手順：
１．  ３０匹の８週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｅｌｙラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  ＣＯ．，Ｌｔｄ．）を準備した。ラットを、無作為に４つの群に分割した（賦形剤群及びプレドニゾロン群は、ｎ＝９、ＨＡ−ＡＤＨ−プレドニゾロン群及びＨＡ群は、ｎ＝６）。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのげっ歯動物設備の１つのケージに、ラットを２匹ずつ入れた。
２．  １０ｍｇ／ｍＬの加熱死ミコバクテリウムを含有する０．１ｍＬのＣＦＡ（完全フロイントアジュバント、１０ｍｇ／ｍＬ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．社）を右後肢の足蹠に皮下注射する。
３．  針は、足蹠の皮膚下に足首に向かって挿入されるべきである。これにより、流入膝窩リンパ節に対するアジュバントの送達が最大化される。
４．  重症及び急性炎が、注射の３０数分以内に観察され、３〜４日以内にピークに達し、２０〜２５日間続くことが多い。
５．  アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）の誘導後の１４日目に、プレドニゾロン又はＨＡ−プレドニゾロン（両方とも１０ｍｇ／ｋｇ）、又は対照としての生理食塩水を静脈内注射することにより、ラットを処置した。
６．  処置後の２０日目にラットを犠牲にし、その後、組織を単離した。
関節炎測定：
足掌の厚さ及び足首周囲：足掌の厚さは、Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ社製デジマチックカリパス等のカリパスを使用して、足掌直径を測定することにより決定した。足首周囲は、２つの垂直な直径、側方−横方向の直径（ａ）及び前後方向の直径（ｂ）をデジタルカリパスで測定し、以下の式を使用することにより決定した。
【００７５】
【数１】
0006433494.tif 000002
【００７６】
結果：図１１に示されているように、ＲＡの誘導は成功した。薬物を投与する日（１４日目）の始めでは、ＨＡのみの群は、足掌の厚さの変化としてのこの種類のインデックスが、対照群（賦形剤）と比較してほとんど同じ傾向を示す。薬物のみの群（プレドニゾロン）は、治療効果を示した。しかしながら、薬物をＨＡとコンジュゲートさせると（ＨＡ−ＡＤＨ−Ｐｒｅｄ群）、その治療効果は、薬物のみよりも更に良好であった。これは統計的に有意である。
また、図１２に示されているように、ＨＡのみでさえ、この種類のインデックス（足首周囲の変化）の点で、ＲＡ症状を強化した。しかしながら、薬物をＨＡとコンジュゲートさせると（ＨＡ−ＡＤＨ−Ｐｒｅｄ群）、その治療効果は、薬物のみよりも更に良好であった。これは統計的に有意である。
【図１】
0006433494.tif 000003
【図２Ａ】
0006433494.tif 000004
【図２Ｂ】
0006433494.tif 000005
【図２Ｃ】
0006433494.tif 000006
【図２Ｄ】
0006433494.tif 000007
【図３】
0006433494.tif 000008
【図４】
0006433494.tif 000009
【図５】
0006433494.tif 000010
【図６】
0006433494.tif 000011
【図７】
0006433494.tif 000012
【図８】
0006433494.tif 000013
【図９】
0006433494.tif 000014
【図１０】
0006433494.tif 000015
【図１１】
0006433494.tif 000016
【図１２】
0006433494.tif 000017