(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の非照射部位またはわずかに照射を受けた部位から採取した細胞から得られた細胞サンプルの有する、電離放射線に対する放射線感受性の特性を特定するための方法であって、
サンプリングされた前記細胞は増幅され、当該増幅された細胞が前記「細胞サンプル」を構成し、
（ｉ）  前記細胞サンプルについて、マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭまたはＭＲＥ１１を使用して観察時間ｔにおいて得られた核病巣の平均個数を判定し、これらの平均個数をそれぞれ、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）とし、前記観察時間ｔは、０分すなわち非照射状態を表すｔ０および、吸収線量Ｄでの照射後の観察時間ｔ１とｔ２とｔ３とｔ４から選択される少なくとも１つであり、
（ｉｉ）  少なくとも前記平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）およびｔｘがｔ４またはｔ３である前記平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔｘ）を使用しての、ＣＴＣＡＥ分類に沿った放射線治療後の組織反応の重症度グレードと
前記平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、およびＮＭＲＥ１１（ｔ）を使用しての、前記サンプルの放射線感受性と
からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを判定し、
前記ｔ４は、ＤＮＡ切断の比率がその残留値に到達するまでの所要時間を表す固定値であり、
前記ｔ３は、ｔ２の３倍〜５倍となるよう、ただし、２．５時間以上６時間以下となるよう選択され、
前記ｔ２は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、
ｔ１は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞内で、認識されたＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、
前記ＣＴＣＡＥ分類に沿った前記重症度グレードが判定され、無次元パラメータとして、
ＣＴＣＡＥ＝５−Ｍａｘ［ＮｐＡＴＭ（ｔ１）；ＮｐＡＴＭ（ｔ２）］／１０
で表され、
前記放射線感受性が、
（ａ）  ＮｐＨ２Ａｘ（ｔ４）＜２、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ、Ａ＜１０、且つ、Ｂ＜５、且つ、Ｃ＜２であり、但し
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数
であるとき、サンプルは放射線抵抗性を有すると見なされ、
（ｂ）  （ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）
であるとき、サンプルは高放射線感受性を有すると見なされ；
（ｃ）  その他のすべての条件の場合は、サンプルは中等度の放射線感受性を有すると見なされる、手順に従い判定される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ｔ４は、ｔ３の６倍〜８倍となるよう、ただし、１２時間以上となるよう選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記ｔ４は１２時間〜４８時間である
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３において、
前記ｔ４は２４時間である
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１において、
前記ｔ３は３時間〜５時間である
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５において、
前記ｔ３は４時間である
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１において、
前記ｔ２はｔ１の５倍〜７倍となるよう、ただし、３５分以上９０分以下となるよう選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７において、
前記ｔ２は４５分以上７５分以下である
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８において、
前記ｔ２は６０分である
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１において、
前記ｔ１は照射の終了から５分〜１５分となるよう選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記ｔ１は７．５分〜１２．５分である
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記ｔ１は１０分である
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１において、
前記細胞サンプルについて、時間ｔにおいて、細胞１００個について観察される小核の平均個数（％で表す）もまた判定され、この数値をＮＭＮ（ｔ）をとし、前記時間ｔは、少なくとも非照射であるｔ０および吸収線量Ｄでの照射後のｔ４である
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１つにおいて、
ｔ＝ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ４における前記平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）と、ｔ＝ｔ０，ｔ１，ｔ２における前記個数ＮｐＡＴＭ（ｔ）と、ｔ＝ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ３における前記個数ＮＭＲＥ１１（ｔ）とが判定される
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１つにおいて、
前記サンプリングされた細胞が、患者の皮膚生検材料から採取された線維芽細胞である
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１つにおいて、
前記吸収線量Ｄが０．５Ｇｙ〜４Ｇｙである
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１つにおいて、
ｔ１が８分〜１２分になるよう設定され、ｔ２が５０分〜７０分になるよう設定され、ｔ３が３．５時間〜４．５時間になるよう設定され、ｔ４が２２時間〜２６時間になるよう設定される
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７において、
ｔ１が１０分、ｔ２が６０分、ｔ３が４時間、ｔ４が２４時間であり、Ｄが２Ｇｙである
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか１つにおいて、
ＮｐＨ２ＡＸ、ＮｐＡＴＭ、および／またはＮＭＲＥ１１の判定には、免疫蛍光試験を伴う
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１つにおいて、
放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞は、吸収線量２Ｇｙでの照射の後に示すインビトロのクローン原性生存率が５５％よりも高い細胞として選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか１つにおいて、
放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞は、放射線治療中または治療後に重大な組織反応を示さなかった患者から採取した細胞として選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか１つにおいて、
放射線感受性グループスコア（ＧＲＯＵＰ）もまた、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ
Ａ＜１０、且つ
Ｂ＜５、且つ
Ｃ＜２であり
但し、
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数；
であるとき、放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ基準）は、「グループI（放射線抵抗性細胞）」と見なされ；
（ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）
であるとき、前記ＧＲＯＵＰ基準は「グループIII（放射線感受性の高い細胞）」と見なされ、
その他のすべての条件の場合は、前記ＧＲＯＵＰ基準は、「グループII（中程度の放射線感受性を有する細胞）」と見なされる、手順に従い判定される
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用放射線生物学の分野に関し、より具体的には、放射線生物学的臨床検査方法の分野に関する。本発明は、複数の細胞パラメータと酵素パラメータの判定および相関に基づいて、細胞的、組織的、且つ臨床的な放射線感受性を予測するための新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線治療を受けるがん患者の約１〜１５％には、組織反応（例えば、皮膚炎または直腸炎）が現われる。この組織反応は、治療の良好な提供に影響を及ぼし得、想定されたプロトコルが終了する前に、医師が放射線治療の中止を決定してしまうこともある。また、上記の組織反応は、患者が電離放射線に対して特に高い感受性をもつことの指標でもある。さらに、放射線治療は、目に見える最初の組織兆候が現われたときに中断したとしても、治療後の合併症の罹患率だけでなく、患者の死亡率さえも上昇させ得る。この原因は、治療を早期に中止したために治療対象のがんを完全に根絶することができなかったことに加え、放射線自体によって健康な組織に付帯的な損傷が誘発されることである。
【０００３】
電離放射線に対する組織の感受性の問題が、ＤＮＡ損傷の修復メカニズムの問題と切り離すことができないことも知られている。実際、細胞レベルでは、電離放射線はフリーラジカルを発生することにより（特に、過剰酸化により）およびＤＮＡ損傷の原因であるその他の反応種を発生することにより、複数種の化学結合を切断し得る。内因性または外因性攻撃（例えば、電離放射線およびフリーラジカルによる攻撃）が引き起こすＤＮＡの損傷は、特に蓄積されたエネルギーに応じて、塩基の損傷、一本鎖切断、および二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢ）といった、さまざまな種類のＤＮＡ損傷につながり得る。未修復のＤＳＢは、細胞の死滅、毒性、および、より具体的には放射線感受性に関係する。不十分に修復されたＤＳＢは、ゲノム不安定性、変異促進性現象、およびがん素因に関係する。身体は、ＤＮＡ損傷の種類ごとに特定の修復システムを備えている。ほ乳類は、２つの主要なＤＳＢ修復様式、すなわち、縫合（ｓｕｔｕｒｅ）による修復（鎖の結紮）と、組替えによる修復（相同鎖または非相同鎖の挿入）とを備える。
【０００４】
電離放射線に対する組織の感受性は、器官ごとに大きく変化し、また、個人差も大きいことが知られている。１９８１年に、FertilおよびMalaiseにより、「固有放射線感受性」の概念が説明された。さらに、放射線治療の治療効果と副作用についての各種の研究により、放射線抵抗性が特に高い個人と、これとは対照的に、臨床的に認識できる副作用を招き得るが、致命的な作用はもたらさない程度の放射線感受性を示す個人とが存在することが分かっている。その遺伝的起源が証明されたと思われる、極端な放射線感受性をもつ特定のまれな例を除いても、放射線感受性は概して遺伝的素因に由来し、したがって、個人に特有のものであると考えられている。このため、任意の患者がリスクを伴わずに受けることができる最大蓄積線量を判定できるように、予測的検査方法があることが望ましい。この問題は、主に高電離線量の放射線治療において起こるものである。しかし、放射線治療に使用されるものと同様に、これ以外の強電離線量のあらゆる種類の被ばくについても、問題となりやすい。
【０００５】
一般にＡＴＭおよびＡＴＲとして公知の、キナーゼのファミリーのうちの２つのタンパク質が、ＤＳＢの検出、修復、およびシグナリングに関係していることが知られている。これらの作用には、少なくとも、ＢＲＣＡ１という呼称で知られるタンパク質の存在と、種々のＡＴＭ基質の順序づけられたリン酸化のカスケード（cascade de phosphorylations ordonnee)の存在が必要である(N. Foray他、“A subset of ATM-and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA 1 protein”、TheEMBOJournal、2003年、vol. 22(11), p.2860-2871を参照）。細胞の放射線感受性の説明モデルにＡＴＭ酵素を使用する試みが行われ（Joubert他、“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?”，lnt. J. Radiat. Biol.2008年、vol. 84(2)、p. 107-125を参照）、これにより、３種類の放射線感受性の識別が可能になった。すなわち、放射線抵抗性を有する細胞（グループＩ放射線感受性と呼ぶ）、中等度の放射線感受性を有する細胞（グループII放射線感受性と呼ぶ）、および、極端に放射線感受性が高い細胞（グループIII放射線感受性と呼ぶ）の３種類である。しかし、これに基づく予測モデルは提案されていない。特に、臨床データ（組織重症度０〜５）と放射線生物学的データとの間の定量的関係は確立されていない。同様に、“Rencontres Nucleaire & Sante” (2008年1月25日(XP55131242)におけるN. Forayの発表“Les reparatoses: nouveaux concepts sur la prediction de la radiosensibilite”では、放射線起因の二本鎖切断の数を説明するために、異なるマーカーｐＨ２ＡＸおよびＭＲＥ１１の役割とその経時的変化が論じられている。この発表では、臨床レベルで観察される放射線感受性レベルを定量化および列挙する組織重症度については言及されていない。
【０００６】
ＡＴＭがＤＮＡ損傷の検出と修復に寄与可能となる条件については、多くの文献に記載されている。国際公開第２００４／０１３６３４号（KUDOS Pharmaceuticals Ltd）には、ＭＲＥ１１／Ｒａｄ５１／ＮＢＳ１複合体を含む他の応答因子と相互作用する、ＡＴＭ依存性ＤＮＡ損傷のシグナル伝達経路の要素の識別が記載されている。米国特許出願公開第２００７／００７２２１０号明細書（OuchiおよびAglipay）には、ＤＮＡ損傷への応答を促進する有力な治療剤をスクリーニングする方法が提案されている。この方法では、ＢＡＡＴ１として知られるタンパク質（ＢＲＣＡ１遺伝子と関連する乳がん素因に関係する）が、ＡＴＭタンパク質と候補化合物とに混合され、候補化合物を含まない対照混合物に対して、ＡＴＭのリン酸化が増大すれば、後者がＤＮＡ修復を促進する潜在的な有効成分として識別される。欧州特許出願公開第２４６６３１０号明細書（Helmholtz Zentrum Muenchen）には、Ｈ２ＡＸヒストンのリン酸化型（ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸまたはｇ−Ｈ２ＡＸとして知られる）存在下での、ＤＮＡの二本鎖切断の修復が記載されている。国際公開第００／４７７６０号および米国特許第７２７９２９０号明細書（St. Jude’s Children’s Research Hospital）には、ＤＮＡ修復における、ＡＴＭのキナーゼ官能基の役割について記載されている。
【０００７】
したがって、これらの文献には修復経路についての記載はあるものの、臨床データとの関連を確証する相関については何らの提示もない。
【０００８】
欧州特許第１６１６０１１号明細書（International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology）には、ＤＮＡ修復における遺伝的欠陥を診断する方法が開示されている。この方法は、検査対象のサンプルから分離した細胞の培養、キメラポリペプチドを使用しての上記細胞のインキュベーション、および細胞応答の特性判定の、３つの工程に基づく。この細胞応答は、細胞内タンパク質、具体的には、ｐ５３タイプ、ＡＴＭ，Ｃｈｋ１，Ｃｈｋ２，ＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２，Ｎｂｓ１，ＭＲＥ１１，Ｒａｄ５０，Ｒａｄ５１、およびヒストンからなる生化学的マーカーの発現率である。しかし、放射線起因の発現では、上記タンパク質の官能性を予測することはできない（ある種の症候群は、タンパク質が変異していても、正常な発現率を示す）。これらの手順は、機能的な検査とは言えない。
【０００９】
国際公開第０１／９０４０８号、国際公開第２００４／０５９００４号、および国際公開２００６／１３６６８６号（Commissariat al’Energie Atomique）には、電離性放射線照射の後のＤＮＡ損傷の観察方法が記載されている。最初の文献は、ＤＮＡ損傷の切開についての活性を開示しているが、ＤＮＡの除去と再合成の酵素活性の定量化や、ＤＳＢ修復の定量化を可能にするものではない。その他の２つの文献には、超らせん状円形二本鎖ＤＮＡを使用した、生物培地のＤＮＡの修復性能についての定量的評価の記載がある（３番目の文献によれば、多孔性ポリアクリルアミドヒドロゲル膜における固定）。これらの方法は、生理学的環境における生体内原位置の（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ＤＳＢには直接関連せず、これらの方法の臨床的適用を評価するための相関は存在しない。
【００１０】
韓国公開特許第２００３００３３５１９号公報には、触媒活性またはスーパーオキシドジスムターゼの活性から放射線感受性を推定することが提案されており、韓国公開特許第２００３００３３５１８号公報では、グルタチオンペルオキシダーゼまたはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼが使用されている。このような方法は、ＤＮＡの損傷または修復に直接関連したマーカーを検出するものではない。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１１／３１２５１４号明細書（Dana Farber Cancer Institute）には、ＦＡＮＣＤ２病巣の検出をマーカーとして利用することが提案されている。米国特許出願公開第２００７／０２６４６４８号明細書（National Institute of Radiological Sciences）には、ＤＮＡオリゴマーを利用して、放射線治療中の副作用の出現を予測することが提案されている。しかし、ＦＡＮＣＤ２病巣の濃度が正常であっても、ある程度の放射線感受性が観察され得る。
【００１２】
米国特許出願公開第２００８／２３４９４６号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０４１９０８号明細書（University of South Florida他）は、健康な細胞ではなく、がん細胞の放射線感受性を予測する方法が記載されているが、これはゲノムデータに基づくものであり、機能試験に基づくものではない。
【００１３】
国際公開第２０１４／１５４８５４号（Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier）には、対象の放射線感受性を、少なくとも１種の放射線感受性バイオマーカーを使用して予測する方法が記載されている。この方法は、ＤＮＡの損傷または修復に直接関連したマーカーを検出するものではなく、また、プロテオミクスデータに基づくものである。さらに、この特許出願は、放射線生物学的データと組織反応との重症性の定量的関係については説明していない。
【００１４】
国際公開第２０１３／１８７９７３号（University of California）には、細胞の放射線感受性および／または対象の放射線感受性を、対照群に比して判定するためのシステムと方法とが記載されている。より具体的には、この方法は、生物学的サンプルへの照射と、赤血球細胞内、リンパ球内、または一次細胞内の放射線起因病巣の検出および定量化とを含む。これらは、抗ｐＨ２ＡＸ、抗ＭＲＥ１１、および抗ＡＴＭを含む一組のマーカーから選択される１種以上の検出マーカーを使用して、血液サンプルから得られる結果である。照射後の各観察時間（２時間以内）における放射線起因病巣の定量化により、その修復動態の判定ができ、これが実験的に対象の放射線感受性と相関される。しかし、リンパ球細胞内の病巣の分析は、その核が小さいために、非常に困難である。さらに、上記の方法では、医師は患者の治療について決断をすることができない。
【００１５】
米国特許第８２６９１６３号明細書（New York University School of Medicine）には、患者を分類して適切な緊急治療を受けさせることを目的として、人を対象としていた電離放射線への偶発的曝露の重大性を簡単且つ迅速に評価する際にマーカーとして使用可能な多数のタンパク質が記載されている。この特許は、生物学的線量測定（偶発的線量の判定）に関し、一方、放射線感受性は、分かっている線量を使用して検出される。
【００１６】
国際公開第２０１０／８８６５０号（University of Texas）には、特定の放射線治療に対して感受性または耐性を有するがん細胞を識別するための方法および組成物が記載されている。したがって、この文献は、すべての放射線治療に適用可能ではない。
【００１７】
国際公開第２０１０／１３６９４２号（Philips）には、バイオマーカーを使用して、放射線治療中に患者をモニタリングするための包括的方法が記載されている。この方法は、撮像工程から抽出された画像から少なくとも１つのディスクリプタを得る工程を含む。このディスクリプタは、放射線治療の関心組織か、この目標部位の近傍の組織に属するものである。この方法は、さらに、関心組織領域における放射線治療の副作用を検出または定量化するのに適した、疾病に特有の生物学的マーカーを少なくとも１種選択する工程を含む。この方法は、さらに、選択した疾病に特有のバイオマーカーのインビトロでの測定値を少なくとも１つ得る工程を含む。さらには、上記少なくとも１種のバイオマーカーのインビトロ測定値の少なくとも１つのディスクリプタを、相関技術により処理する工程を含み、関心組織領域における放射能毒性を示すシグナルが出力される。しかし、この特許の教示は、組織の依存性毒性を考慮するのみであって、個人の依存毒性については考慮しないものであり、主に画像解析に基づいている。
【００１８】
国際公開第２０１０／１０９３５７号には、正常な組織における合併症の確率と、各患者に特有のマーカーに従った腫瘍制御の確率との最適化に基づいて、適用性のある放射線治療プロトコルを計画するための方法および装置が記載されている。正常な組織に関連するマーカーの値は、インビトロ検査値と、タンパク質の質量分析シグネチャーと、患者の病歴データとを含む。インビトロ検査値は、細胞的、プロテオミクス的、および遺伝的起源のものであってもよく、種々の細胞計数、ＨＢ、ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＴＮＦ−アルファ、フェリチン、トランスフェリン、ＬＤＨ、ＩＬ−６、へプシジン、クレアチニン、グルコース、ＨｂＡｌｃ、およびテロメアの長さなどであるが、これに限定されない。患者の病歴からのマーカーは、これまでの腹部手術、ホルモン薬剤または抗凝固剤の投与、糖尿病、年齢、および腫瘍増殖に関連する測定値を含む。各種の切除または化学療法薬剤に関連するバイオマーカーなどの、放射線毒性に関連しないバイオマーカーも想定される。しかし、個人の放射線感受性は考慮されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
出願人は、このような多彩な従来技術が存在するにもかかわらず、上記の特許には、放射線治療後の組織反応のリスクの評価を可能にし、且つ、どんな患者にも、また、ＤＳＢを誘発可能ないかなる種類の電離放射線にも使用され得る、予測可能な、個人の放射線感受性の定量化の方法が記載されていないことに注目した。すなわち、個人の放射線感受性を予測する方法を提供するという課題には、実効的な解決手段がまだない。本発明は、組織的および臨床的射線感受性を予測する新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明者らは以下の知見を得、本発明の方法はこの知見から考案された。すなわち、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）は、それが修復されないときには、放射線感受性を最もよく予測する放射線起因の損傷の種類を表し、修復が不十分なときには、ゲノム不安定性を最もよく予測する放射線起因損傷の種類を表す、という知見である。発明者らは、ＤＳＢが、縫合（ｓｕｔｕｒｅ）と呼ばれる主要な修復様式により、および／または、ＭＲＥ１１依存性組替えと呼ばれる非主要で不完全な修復様式により対処されることを発見した。これら２つの修復様式のバランスは、ＡＴＭタンパク質により制御される。マーカーｐＨ２ＡＸは、縫合修復様式により認識されたＤＳＢを示す。マーカーＭＲＥ１１は、不完全なＭＲＥ１１依存性組替えにより処置されたＤＳＢ部位を示す。マーカーｐＡＴＭは、Ｈ２ＡＸのリン酸化とＭＲＥ１１依存性経路の阻害とによる縫合経路の活性化についての情報を提供する。
【００２１】
発明者らは、また、ＡＴＭタンパク質の細胞質型が、酸化的ストレス、特に、ＤＳＢを誘発する電離放射線に関係するストレスの後に、細胞核内に移動することを観察した。
【００２２】
外因性攻撃によるＤＮＡ損傷を観察するためには、ＤＮＡの自然な状態と放射線起因の状態との両方を考慮する必要がある。さらに、放射線照射後には、ＤＮＡ修復を考慮する必要があるが、このＤＮＡ修復の動態は、修復メカニズムに依存するため、放射線起因損傷の種類に依存する。さらには、ＤＮＡ修復の有効性とスピードには個人差があること、また、例外的な放射線感受性につながる特定の遺伝的条件が存在することも知られている。
【００２３】
本発明によれば、上記の問題は、１）非形質転換細胞、特に、皮膚生検材料の細胞の増幅と、２）ヒトの休止期細胞に有効な機構モデルと、３）治療方法の如何に関わらず有効な、ＤＳＢの認識、修復、およびシグナリングの機能検査とに基づく方法により解決される。
【００２４】
本発明の第１の主題は、患者から採取された細胞サンプルの有する、電離放射線に対する細胞放射線感受性の特性を特定するための方法であり、上記患者の非照射部位またはわずかに照射を受けた部位から採取した細胞から開始される方法である。この方法においては、
（ｉ）  サンプリングされた上記細胞は増幅され、当該増幅された細胞が上記「細胞サンプル」を構成し、
（ｉｉ）  上記細胞サンプルに関し、マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１のうちの少なくとも２種を使用して観察時間ｔにおいて得られた核病巣の平均個数を判定し（これらの平均個数をそれぞれ、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）とする）、上記観察時間ｔは、０分である時間ｔ（ｔ０、すなわち非照射状態）および、吸収線量Ｄで照射した後の観察時間ｔ１とｔ２とｔ３とｔ４から選択される少なくとも１つであり、
（ｉｉｉ）  少なくとも平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）およびｔｘが好ましくはｔ４またはｔ３である平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔｘ）を使用しての、ＣＴＣＡＥ分類に準じた放射線治療後の組織反応の重症度と
平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、およびＮＭＲＥ１１（ｔ）を使用しての、上記サンプルの放射線感受性と
からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを判定し、
ｔ４は、ＤＮＡ切断の比率がその残留値に到達するまでの所要時間を表す固定値であり、好適には、ｔ３の６倍〜８倍となるよう、ただし、１２時間以上、好ましくは１２時間〜４８時間、より好ましくは約２４時間となるよう選択され、
ｔ３は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞の二本鎖切断（ＤＳＢ）の約２５％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ２の３倍〜５倍となるよう、ただし、２．５時間以上６時間以下、好ましくは３時間〜５時間、より好ましくは約４時間となるよう選択され、
ｔ２は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した上記対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ１の５倍〜７倍となるよう、ただし、３５分以上９０分以下、好ましくは４５分〜７５分、より好ましくは約６０分となるよう選択され、
ｔ１は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞内で、認識されたＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、好適には、照射の終了から５分〜１５分、好ましくは７．５分〜１２．５分、より好ましくは約１０分となるよう選択される。
【００２５】
ある実施形態では、ｔ１が８分〜１２分になるよう設定され、ｔ２が５０分〜７０分になるよう設定され、ｔ３が３．５時間〜４．５時間になるよう設定され、ｔ４が２２時間〜２６時間になるよう設定される。
【００２６】
ある実施形態では、上記細胞サンプルに関し、時間ｔに細胞１００個について観察された核病巣の平均個数（％で表す）が判定され、この数値をＮＭＮ（ｔ）をとする。時間ｔは、少なくとも非照射であるｔ０および吸収線量Ｄでの照射後のｔ４である。
【００２７】
上記の電離放射線は本来、治療用のものである。特に、吸収線量Ｄが０．５Ｇｙ〜４Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、より好ましくは１．７Ｇｙ〜２．３Ｇｙ、さらに好ましくは２Ｇｙである。
【００２８】
好適な実施形態では、ｔ１が１０分、ｔ２が６０分、ｔ３が４時間、ｔ４が２４時間であり、Ｄが２Ｇｙである。
【００２９】
本発明によれば、電離放射線に対する患者の細胞反応の特徴を特定するためのパラメータは、ＣＴＣＡＥ分類に準じた重症度であり、無次元パラメータとして、
ＣＴＣＡＥ＝５−Ｍａｘ［ＮｐＡＴＭ（ｔ１）；ＮｐＡＴＭ（ｔ２）］／１０
で表される。
【００３０】
本発明に係る上記の式を使うことにより、ＣＴＣＡＥ分類に準じた重症度の判定が可能になり、この判定を行うと小数の数字が求められる。本発明で得られる最終的なＣＴＣＡＥの値は、計算で得られた値を算術的に丸めたものに相当する整数である。本発明により判定され、本願で示されるＣＴＣＡＥは、上記数字または整数である。
【００３１】
実際には、この数式はタイプIIの放射線感受性グループ（中等度の放射線感受性）に属する患者の重症度の判定に特に適している。タイプIIIの放射線感受性グループに属する患者（放射能感受性を有する患者）に対しては、放射線治療は禁止である。
【００３２】
ある実施形態では、放射線感受性グループが、以下のように決定される。すなわち、
（ａ）  ＮｐＨ２Ａｘ（ｔ４）＜２、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ、Ａ＜１０、且つ、Ｂ＜５、且つ、Ｃ＜２であり、
但し、
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数
であるとき、サンプルは放射線抵抗性を有すると見なされ、
（ｂ）  （ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）
であるとき、サンプルは高い放射線感受性を有すると見なされ、
（ｃ）  その他のすべての条件の場合は、サンプルは中等度の放射線感受性を有すると見なされる。
【００３３】
一部の患者については、がんに罹患しやすい患者に一般的に見られる高頻度組替え現象が原因となって、ＤＮＡの一本鎖切断（ＳＳＢ）が連続的に自然発生することにより、ＤＮＡの修復が阻害され得る。ＳＳＢの自発的な過剰生産は、矛盾しない２つの影響をもち得る。すなわち、自然状態において、ｐＨ２ＡＸによる標識により、通常見られるｐＨ２ＡＸ病巣よりも小さ  い核病巣が出現し得るが、これらは多数のＤＳＢの存在を反映する（「小巣」現象）。同様に、ＳＳＢの過剰生産はクロマチンの脱凝縮につながることがあり、これにより、細胞核が大きくなる（概して、１５０μｍ２を超える大きさ；「大核」現象に相当）。これらの２つの現象は、ゲノム不安定性が高いことを反映している。
【００３４】
ＮｐＨ２ＡＸ、ＮｐＡＴＭ、および／またはＮＭＲＥ１１の判定には、好適には、免疫蛍光試験を伴う。
【００３５】
好適な実施形態では、放射線抵抗性を有する患者から採取した上記対照細胞は、吸収線量２Ｇｙでの照射の後に示すインビトロのクローン原性生存率が５５％よりも高い細胞として選択される。
【００３６】
別の実施形態では、放射線抵抗性を有する患者から採取した上記対照細胞は、放射線治療中または治療後に重大な組織反応を示さなかった患者から採取した細胞として選択される。
【００３７】
本発明の方法は、好ましくは線維芽細胞からなる健康な組織サンプルを少なくとも１つ使用する。この線維芽細胞は、好ましくは、患者の結合組織からサンプリングされる。このサンプリングは、生検により行ってもよい。したがって、好適な実施形態においては、上記のサンプリングされた細胞は、患者の皮膚生検材料から採取された線維芽細胞である（典型的には、「皮膚パンチ生検」として知られる方法に従ってサンプリングされる）。この組織サンプルを、適切な培地で培養する。
【００３８】
細胞のサンプリング（具体的には、好ましい実施形態では、線維芽細胞株での生検の実施）の後に行われる本発明の方法の第１の工程では、ＤＮＡの自然状態（ｔ０における状態）、言い換えれば、照射を受けない状態の特徴を特定する。この工程は、特に、核の大きさ、小核の存在、潜在的な自発的アポトーシス体、複数の損傷を有する複数の細胞についての調査を含んでいてもよい。細胞は、蛍光顕微鏡で観察される。ＤＡＰＩ染料（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩についてはＣＡＳ  Ｎｏ．  ２８７１８−９０−３）を使用すると、ゲノム不安定性の指標である、細胞１００個についての小核の比率が判定される。アポトーシス体の個数も判定される。その存在がクロマチンの脱凝縮を示す、異常に大きい核の集団も判定される。
【００３９】
電離放射線は、吸収線量（Ｄと呼称され、グレイで表されるパラメータ）により定義される。本発明によれば、吸収線量Ｄは、０．５Ｇｙ〜４Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、より好ましくは１．７Ｇｙ〜２．３Ｇｙ、さらに好ましくは２Ｇｙである。これらの範囲は、典型的には、個別の放射線治療セッション、部位に応じたセッションの回数、および、腫瘍の進行の時間と状態に対応する。
【００４０】
本発明の方法においては、すべての時間値ｔ１、ｔ２、ｔ３、およびｔ４を、一連の検査の開始時に（つまり、少なくとも１人の任意の患者につき、好ましくは、この方法を統計的に意義のある一群の観察に対して較正するためには、複数の患者につき）定義すること、および、これら時間値が上記時間間隔を表す全パラメータの判定すべてについて同じであることが重要である。
【００４１】
本発明の方法では、ｔ１は、好適には８分〜１２分であり、および／または、ｔ２は、好適には５０分〜７０分であり、および／または、ｔ３は、好適には３．５時間〜４．５時間であり、および／または、ｔ４は、好適には２２時間〜２６時間である。４つの条件すべてが満足されるのが好ましい。
【００４２】
本発明の方法における、特に興味深く、また標準化が簡単な変形例では、ｔ１が１０分、ｔ２が６０分、ｔ３が４時間、ｔ４が２４時間であり、Ｄが２Ｇｙである。
【００４３】
放射線抵抗性を有する患者からの対照細胞が、臨床的検査を通じて、放射線治療中または治療後に重大な組織反応を示さなかった患者として選択された患者からの細胞として選択され得る。上記対照細胞は、また、吸収線量２Ｇｙでの照射の後に示すインビトロのクローン原性生存率が、５５％よりも高い細胞として選択されてもよい。
【００４４】
以下、典型的な実施形態について説明する。
【００４５】
マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭおよび／またはＭＲＥ１１を有する細胞を、観察時間ｔにおいて観察した（上記の平均個数をそれぞれ、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）およびＮＭＲＥ１１（ｔ）とする）。また、吸収線量Ｄでの照射の後に、ｔ１、ｔ２、ｔ３、およびｔ４から選択される少なくとも１つの観察時間で観察する。ある実施形態では、マーカーｐＨ２ＡＸを有し、複数の損傷細胞の存在する病巣数が判定される。ｐＡＴＭタンパク質の位置とＭＲＥ１１タンパク質の位置（核内（ｎｕｃｌｅａｒ）または細胞質内（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ））が記録される。
【００４６】
この第１の工程により、自然状態における潜在的なゲノム不安定性が識別できる。
【００４７】
本発明の方法の第２の工程は、所望の吸収線量Ｄ（例えば２Ｇｙ）での放射線照射と、電離放射線に対する細胞応答の評価とを含む。
【００４８】
ａ）  第１の実施形態では、放射線起因ＤＳＢの縫合（ｓｕｔｕｒｅ）による修復を調べる。縫合は、ＤＳＢの主要な修復様式である。細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣の数がｔ４において判定され、さらに、必要に応じてｔ１、ｔ２において、場合によってはｔ３においても判定される。ｔ３での判定により、ｔ１からｔ４までの動態速度の定義を強固にできる。好適な実施形態においては、ｔ４の経過の後、放射線起因の小核の比率を推定するために、小核の比率の判定も行う。これにより、未修復ＤＳＢの数に基づいた放射線感受性の推定ができる。
【００４９】
ｂ）  第２の実施形態では、ＡＴＭ依存性のキナーゼ活性化の機能性の測定を通して、電離放射線に対する細胞応答についてより詳細な調査が行われる。放射線抵抗性の対照細胞においては、ＡＴＭタンパク質のリン酸化型（ｐＡＴＭ）は、自然状態では、細胞質内にある（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）ことが知られている。出願人は、照射後状態では、ＡＴＭタンパク質のリン酸化型が、核内にある（ｎｕｃｌｅａｒ）傾向があることを発見した。一旦、核に移動すると、ｐＡＴＭ型は、縫合による修復メカニズムを活性化し、不完全なＭＲＥ１１依存性修復の経路を阻害する。
【００５０】
一例として、放射線照射（例えば、吸収線量２Ｇｙ）の後、ｐＡＴＭ型が細胞質局在性を示す場合には、ｐＡＴＭ型は細胞質から核に移行しない、または、正常に移行できないと結論づけることができる。この理由としては、ＡＴＭの変異、または、放射線照射後にＡＴＭが核に移行するのを補助するＡＴＭのパートナータンパク質いずれかの変異が考えられる。いずれにせよ、このことは、相当高い放射線感受性を示すものである。
【００５１】
このｐＡＴＭタンパク質の位置判定は、少なくともｔ１およびｔ２において行われ、必要に応じて、ｔ３およびｔ４においても行われる。
【００５２】
ｃ）  第３の実施形態は、上記の実施形態と組み合わせ可能であり、電離放射線に対する細胞応答の、ＭＲＥ１１依存性経路による調査が拡大される。縫合による主要な修復経路については、その能力をｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査により定量化可能であるが、この修復経路に加え、出願人は、別の修復経路を識別した。この別の修復経路は、縫合の代替手段であり、遺伝子欠損の場合には、縫合に代わって使用される。これが、ＭＲＥ１１依存性組替えによる修復である。この経路の能力は、ＭＲＥ１１病巣の免疫蛍光検査の動態研究により定量化可能である。この測定は、少なくともｔ１、ｔ２、およびｔ３において行われ、必要に応じてｔ４においても行われる。出願人が得た知見によると、放射線抵抗性の対照株においては、ＭＲＥ１１は細胞質内にあり、ＭＲＥ１１病巣の個数は、線量２Ｇｙの後４時間までは、非常に少ない（典型的には、ＭＲＥ１１病巣の個数は７±２）。放射線照射後約２４時間で、標識（ｍａｒｋｉｎｇ）は細胞内となる。
【００５３】
最後の工程では、放射線起因の損傷の状態および／または患者の放射線感受性、特に、患者のＣＴＣＡＥを予測するために、結果がスコア計算によって評価される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
図１（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ、非照射細胞からの（Ａ）小核病巣の個数の変化、（Ｂ）マーカーｐＨ２ＡＸの個数の変化、（Ｃ）マーカーｐＡＴＭの個数の変化を、ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度と関連させて示す。非照射細胞の小核、ｐＨ２ＡＸ病巣、およびｐＡＴＭ病巣からは、放射線感受性は予測できない。
【００５５】
組織反応の重症度については、２つの異なる尺度、すなわち、ＣＴＣＡＥ分類とＲＴＯＣ分類がある。
【００５６】
ＣＴＣＡＥ（Common Terminology Criteria for Adverse Events,仏語では“Criteres d’evaluation de la morbidite selon la classification du National Cancer Institute”）として知られる分類は、米国国立がん研究所（National Cancer Institute of the United States of America）によって２００６年に発表された、がん治療における有害事象（特に、副作用）の用語基準である。
【００５７】
有害事象とは、有害で意図的でない何らかの兆候、症状、または疾病に相当し、医学的治療または医学的処置の使用に時間的に関連し、当該治療または当該医学的処置に関係があると見なされる場合も見なされない場合もある。有害事象は、医療用文書管理のため、また、科学的分析中に使用される、特定の事象を独自の形で表したものである。
【００５８】
ＣＴＣＡＥでは、有害事象の意味を明確にする目的で、各有害事象が簡潔に定義されている。この尺度は、他の遺伝毒性ストレス（例えば、火傷）にも有効であるが、特に放射線治療において使用される。
【００５９】
グレードは、有害事象の重症度を示す。ＣＴＣＡＥには、５つの重症度グレード（１〜５）が報告されており、各有害事象の重症度について、独自の臨床的説明がされている。これを以下の表１に示す。各重症度グレードは、特定された組織反応により定義される。
【００６０】
【表１】
0006524108.tif 000002
これら５つのグレードに、組織への影響がないことに相当するグレード０が加わる。
【００６１】
１９８４年に放射線治療腫瘍学グループ（Radiation Therapy Oncology Group、RTOC）により提案された、ＲＴＯＧとして知られる歴史的な分類は、放射線治療後の実質的にあらゆる種類の毒性を網羅している。
【００６２】
しかし、ＲＴＯＧ分類はある種のがんには適用不可であり、一方、ＣＴＣＡＥ分類はあらゆる種類のがんに使用される。
【００６３】
図２（Ａ）および図２（Ｂ）には、放射線照射後２４時間の小核の個数の変化を、ＣＴＣＡＥ（図２（Ａ））またはＲＴＯＧ（図２（Ｂ））の重症度グレードと関連させて示す。小核は、ＤＡＰＩ蛍光マーカーを使用して標識し、その後、蛍光シグナル分析によって定量化した。図２中、放射線感受性グループ（I、II、III）は、ローマ数字で示す。
【００６４】
放射線照射後２４時間の小核の個数によって予測できるのは、グループIII放射線感受性のみである。
【００６５】
図３（Ａ），（Ｂ），および（Ｃ）には、放射線照射後２４時間のｐＨ２ＡＸ病巣の個数の変化を、ＣＴＣＡＥ（図３（Ｂ））またはＲＴＯＧ（図３（Ｃ））の重症度グレードと関連させて示す。図３（Ａ）は、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して得られた平均病巣数の経時的動態を示す。
【００６６】
放射線照射後２４時間にＣＴＣＡＥまたはＲＴＯＧ（組織反応の２つの異なる重症度尺度）の重症度グレードと関連させて得られたｐＨ２ＡＸ病巣数によって予測できるのは、グループI、II、またはIIIの放射線感受性のみであり、重症度グレードの予測はできない。
【００６７】
図４（Ａ）は、収集した患者のサンプル（皮膚線維芽細胞）のすべての細胞株について、２Ｇｙでの放射線照射後１０分にマーカーｐＨ２ＡＸを使用して得られた平均病巣数を示す。破線は、ＤＳＢの正常な発生率、すなわち、細胞１個についての、１Ｇｙあたりの４０のＤＳＢを示す。
【００６８】
図４（Ａ）は、グループII放射線感受性を有する患者由来のすべての細胞が、２Ｇｙの後に予想されたよりも少ないｐＨ２ＡＸ病巣（ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ））で特徴付けられることを示している。このことは、ＤＳＢが不十分にしか認識されていない事実により説明される。
【００６９】
図４（Ｂ）は、線量２Ｇｙの放射線照射の後の各時間（０分、１０分、および１時間）での、細胞質内および核内でのｐＡＴＭの発現を示している。非照射細胞と、２Ｇｙの放射線照射後１０分の細胞とについて、対応する免疫蛍光法データが示されている。
【００７０】
図４（Ｂ）に示すデータは、ｐＡＴＭ病巣の個数に関連し、ＡＴＭの「細胞−核移行（ｃｙｔｏ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｉｔ）」を示唆している。
【００７１】
図４（Ｃ）は、マーカーｐＡＴＭを使用して上記の収集した細胞から経時的に得られた平均病巣数の動態を示す。便宜上、１０分、１時間、４時間、および２４時間にて実施された測定に関連するエラーバーは省略した。図４（Ａ）および図４（Ｃ）において、各点は、個別の３回の繰返しの平均を表し、エラーバーは各カテゴリーについての標準偏差を表す。
【００７２】
図５は、２Ｇｙの放射線照射後１０分でのｐＡＴＭ病巣の個数の変化（図５（Ａ））と、１時間でのｐＡＴＭ病巣の個数の変化（図５（Ｂ））とを、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと関連させて示す。図５（Ｃ）は、図５（Ａ）と５（Ｂ）とにそれぞれ示した、２Ｇｙの放射線照射後１０分および２４時間に得られた２つの値の間のｐＡＴＭ病巣数の最大値を、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと関連させて示す。
【００７３】
図５（Ｂ）には、グレード０、すなわち、組織への影響がないことが示されている。
【００７４】
図５（Ｃ）は、患者１００人について、放射線生物学的パラメータとＣＴＣＡＥ分類に準じた重症度グレードとの関連を示す。つまり、図５（Ｃ）は、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと、２Ｇｙの放射線照射後１０分および１時間に得られた２つの値の間のｐＡＴＭ病巣数の最大値との間に存在する相関関係の臨床評価を表している。
【００７５】
図５中、放射線感受性グループ（I、II、IIIaおよびIIIb）は、ローマ数字で示されている。図５（Ａ）、５（Ｂ）、および５（Ｃ）については、各点は、各カテゴリーにおける個別の３回の繰返しの平均を示す。
【００７６】
（２Ｇｙ＋１０分）中のｐＡＴＭ病巣の最大数、または、（２Ｇｙ＋１時間）中のｐＡＴＭ病巣の最大数により、反応の重症度グレードのみならず、すべてのグループをも予測することができる。
【００７７】
図６（Ａ）には、マーカーｐＡＴＭを使用して得られた病巣の最大数を、先ほど図３（Ｂ）および図５（Ｃ）に示したｐＨ２ＡＸ病巣数と関連させて表している。
【００７８】
図６（Ｂ）は、図６（Ａ）のものと同じデータを示し、様々なヒト放射線感受性グループ（グループI、グループII、およびグループIII）を表す、明確に画定された信頼領域が図示されている。放射線感受性は、二本鎖切断の認識と修復により判定される。
【００７９】
図６（Ｃ）には、グループ種類ごとのグループ発生数を示す。任意のグループの出現率は対応する信頼領域に反比例するので、各グループの正規化頻度が図６（Ｃ）中の棒グラフで表されている。点線は、データ（ｒ＝０．９）に最もよく合致するガウスに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
発明の説明
全般的な定義
「放射線起因の損傷」、「放射線起因の」「放射線感受性」「放射線抵抗性」「放射線毒性」、および「放射線治療」という用語はすべて、電離放射線、特に、アルファ（α）粒子またはベータ（β）粒子からなる粒子放射線、あるいは、高エネルギー電磁放射線、特に、ガンマ（γ）線放射またはＸ線放射について言う。
【００８１】
「ＡＴＭの細胞−核移行」という用語は、ＡＴＭタンパク質の、特に放射線照射後の、細胞質から核への移動のことを言う。
詳細な説明
以下、複数の変形例を有する実施形態について説明する。この実施形態は、ヒト患者に適する。
検査準備
細胞のサンプリングおよび細胞サンプルの操作の前に、（例えば、細胞学的分析研究施設に所属する）各オペレータは、（典型的には、医師から）患者のＨＩＶまたはＣ型肝炎への感染の可能性について通知を受ける。この通知の目的は、オペ−レータが、サンプリング中、操作中、および細胞培養の管理中に、適度に高められた生物学的安全対策を取ることができるようにすることである。
【００８２】
次に、オペレータは、患者から細胞サンプルを採取する。オペレータは、生検により皮膚サンプルを採取することが好ましい。このサンプルは、好適には、「皮膚パンチ生検」と呼ばれる公知の方法により、採取可能である。細胞サンプルは、２０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ無菌培地に置く。直ちに、サンプルを専門検査室に移す。これは、サンプルを３８時間を越える時間、室温に置いてはならないからである。
【００８３】
検査室へ移動するとすぐに、細胞サンプル（典型的には生検材料）を、ウイルス性または化学的転換剤を使用せずに、増幅可能な細胞株として樹立させる。この操作は、Elkin M.他による刊行物“The radiobiology of cultured mammalian cells”(Gordon and Breach (1967年)）で強調されたような、培養検査室では公知の補助的手技に従って行う。細胞の個数が十分になったら（１〜３週間）、本発明の方法を使用して、最初の試験を行う。細胞を、ペトリ皿内のスライドガラスに接種する。上記スライドガラスのうちの一部には、医療用照射器内で、公認線量測定法に従い、吸収線量Ｄ（例えば、２Ｇｙ）で照射を行う。別の一部のスライドガラスには照射を行わず、自然状態を表すものとする（吸収線量は０Ｇｙ）。
【００８４】
放射線照射は、例えば、３Ｇｙ  ｍｉｎ−１の吸収線量率で、６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施可能である。照射後は、後述する修復時間を経るために、細胞は培養インキュベーター内で３７℃に維持される。
【００８５】
照射済みの細胞について、放射線起因の状態に対応する特徴を、複数の修復時間（照射後修復時間）の後に取得する。好ましくは、少なくとも２つの時点、さらに好ましくは少なくとも３つの時点、具体的には、ｔ１、ｔ２、ｔ３およびｔ４が必要である。上記の特徴は、マーカーｐＨ２ＡＸに対応する病巣により表される。
【００８６】
次いで、スライドガラス上の細胞を固定し、溶解し、ハイブリダイズする。これには、公知の手順（引用のBodgi他の刊行物を参照）が使用できる。具体的に、細胞を、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定し、２０ｍＭのｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤、ＣＡＳ  Ｎｏ．  ９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３分間透過処理した。その後、カバースライドを、免疫学的着色剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、頭文字を取ってＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶで知られる；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄を行った。一次抗体である抗ｐＨ２ＡＸは、１：８００の濃度で使用し、他の一次抗体は１：１００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。核を標識するために、スライドガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩを使用した着色も、間接的に、フェーズＧ１にある細胞（ＤＡＰＩ着色が均一な細胞）の個数、フェーズＳにある細胞（多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する細胞）の個数、フェーズＧ２にある細胞（ＤＡＰＩ着色が不均一な細胞）の個数、および中期（染色体が見える状態）の判定を可能にする。
【００８７】
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）を用いて、上記スライドガラスから結果を得る。読取りは、直接的（典型的には、各点につき、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントする）であってもよく、専用の画像解析ソフトウェアを使用してもよく、または、自動顕微鏡で行ってもよい。ソフトウェアまたは自動顕微鏡方法は、手動作業で較正されることが好ましい。
【００８８】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、少なくとも３回の個別の一連の試験（照射）を行い、規定の時間につき、各病巣数の平均を計算する。
生物学的および臨床的パラメータの判定
全般的情報および使用するマーカー
本発明は、とりわけ、ｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭおよびＭＲＥ１１の３種類のマーカーのうちの少なくとも２種類について、非照射細胞（自然状態）および照射済み細胞（放射線起因状態）に関して得られたデータの使用に基づく。本発明の方法は、修復の継続時間と関連した、上記マーカーによる標識の動態調査に基づく。つまり、サンプルは、放射線照射の終了からの規定の期間後に標識され、サンプルの免疫蛍光が調査される。例えば、好適には、ｔ０、ｔ１（好ましくは１０分）、ｔ２（好ましくは１時間）、ｔ３（好ましくは４時間）、およびｔ４（好ましくは２４時間）に位置する５つの点で表される全動態曲線を計測できる。ここで、ｔ０は照射前の状態（自然状態）である。
【００８９】
しかし、出願人は、ある特定の点（ある特定の修復時間に相当する）は、その他の点よりも重要であり、ある特定の点は予測的ではない、ということを発見した。任意の時間に判定されたパラメータを適切に選択することで、測定の回数を減らすこともでき、よって、本方法の予測性能を低減させることなく、診断にかかるコスト全体が削減される。この簡便化された方法が、本発明の予測的方法の基本を成す。
【００９０】
サンプリングがｎ＝３（標準誤差タイプＳＥのガウス標準偏差はない）であれば、それぞれのマーカーによる各点と各線量の平均は、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を使用して計算される。
【００９１】
（ｉ）  ｐＨ２ＡＸは、ヒストンＨ２ＡＸのＸ変異体のセリン４３９におけるリン酸化型を指し、本願出願人の知見によれば、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を標識する。ＤＳＢは、主要な修復様式、すなわち、縫合により認識される。実質的に、マーカーｐＨ２ＡＸは、もっぱら核病巣の形で核内にあり、病巣の個数と大きさのみが分析される。
【００９２】
（ｉｉ）  ｐＡＴＭは、キナーゼタンパク質ＡＴＭのセリン１９８１におけるリン酸化型を指す。本願出願人の知見によると、ＡＴＭは、放射線照射後、正常な条件下（放射線抵抗性状態）では、細胞質から核に移動する。ｐＡＴＭは、細胞質において主に濃縮物を生成し、ＤＳＢ部位を標識する。マーカーｐＡＴＭは、局在により特徴付けられるが、これは核病巣を伴わない均一な細胞質内局在（細胞質病巣はない）か、核病巣のみの形でもっぱら核内にある局在（均一な核内局在はない）か、あるいは、細胞質病巣および核病巣であり得る。
【００９３】
（ｉｉｉ）  ＭＲＥ１１は、ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。本願出願人の知見によれば、ＭＲＥ１１は、修復プロセス完了時に修復が不十分なＤＳＢを標識する。マーカーＭＲＥ１１は、病巣を伴わず細胞質内にあるか、または、病巣を伴わず細胞質内および核内にあるか、または、病巣を伴って細胞質内および核内にある。
【００９４】
ＤＡＰＩ（当業者には公知のＤＮＡマーカー）による対比着色により、細胞質内局在化または核局在化の位置特定をするための、核の位置特定が可能になる（この修復は、電離放射線の影響下で、ＭＲＥ１１およびｐＡＴＭについて変更される）。これの目的は、病巣についてのデータに対する追加的な細胞マーカーである、小核、アポトーシス体、および核の大きさを定量化することである。
生物学的パラメータ
次の事項が、以下のように定義および判定される。
・ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）：マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１を使用して、観察時間ｔ０（非照射）または放射線照射（吸収線量：２Ｇｙ）後の観察時間ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４において、得られる核病巣の平均個数。但し、パラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の判定は本発明の方法において必須であるのに対し、他のパラメータＮｐＡＴＭ（ｔ）およびＮＭＲＥ１１（ｔ）の判定は任意であるが、好適である。
・ＮＭＮ（ｔ）：自然状態（ｔ＝ｔ０、すなわち、放射線照射なし）、または、吸収線量２Ｇｙでの放射線照射後のｔ＝ｔ４のときに、細胞１００個につき観察される小核の個数（％で表す）。
予測的評価
測定した生物学的データから、臨床的パラメータまたは放射線治療パラメータを予測することを目的とする。２つの診断レベルが提案される。
【００９５】
ａ）  スコアの数学的値またはスコアを関連付ける数式から直接的に得られる定量的診断。スコアは、次の２つの基準に関係する。
【００９６】
（ｉ）  グループI、IIまたはIIIへの患者の分類（「ＧＲＯＵＰ」と呼ばれる基準）
放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ）の定義は、本発明によるスコアおよび患者の臨床表から、医師が既知の遺伝的症候群との類似性を判定する際の手助けになる。これらのグループは、上記で引用したJoubert他による刊行物に定義されている。
・本発明によれば、次のように考えられる：
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ
Ａ＜１０、且つ
Ｂ＜５、且つ
Ｃ＜２であり、
但し
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数；
であれば、放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ基準）は、「グループI」と見なされ、当該の細胞は、放射線抵抗性を有する。
【００９７】
（ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）であれば、
放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ基準）は、「グループIII」と見なされ、当該の細胞の放射線感受性は高い。
【００９８】
その他すべての条件については、ＧＲＯＵＰ基準が「グループII」であると見なされ、当該の細胞は、中等度の放射線感受性を示す。
【００９９】
（ｉｉ）  急性ＣＴＣＡＥ分類に沿った、予想される組織反応の重症度グレード（ＣＴＣＡＥ基準と呼ぶ）
ＣＴＣＡＥ（Common Terminology Criteria for Adverse Events;仏語では“Criteres d’evaluation de la morbidite selon la classification du National Cancer Institute”として知られる）と呼ばれる分類は、２００６年に米国国立がん研究所により発表された、がん治療における有害事象（特に、副作用）の用語基準である。
【０１００】
本発明によれば、このグレードは次の等式により決定される：
ＣＴＣＡＥ＝５−［ｍａｘ（ＮｐＡＴＭ（ｔ１）；ＮｐＡＴＭ（ｔ２）］／１０
ｂ）  上記定量的診断に影響されるが、医師の注意を喚起する潜在的な臨床要素を考慮した、より定量的な診断
分析方法およびレベル
第１の実施形態では、試験によって計測されたすべてのパラメータが、（一部）数学的に接続される。スコア間に矛盾がある場合には、特定の試験または判定が繰り返されるか、別の試験または判定が追加される。ある種のパラメータのレベルは、１つのスコアと１つの診断を確立するだけで十分である。
【０１０１】
第２の実施形態は、例えば、点ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ３）、ＮｐＡＴＭ（ｔ３およびｔ４）といった特定の点はどんなスコアも予測できないという所見を考慮したものである。この理由で、ｐＨ２ＡＸについては点ｔ０、ｔ１、ｔ２、およびｔ４だけが、ｐＡＴＭについては点ｔ０、ｔ１、およびｔ２だけが、ＭＲＥ１１については点ｔ０、ｔ１、ｔ２、およびｔ３だけが使用される、限定的な分析が想定され得る。
【０１０２】
ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレードを判定するためのこの予測的方法は、健康な組織に応用されてきた。これら組織の大半は、線維芽細胞タイプの結合組織である。この方法は、あらゆる種類のがんに応用できる。ｐＡＴＭとＣＴＣＡＥとの間で得られる、ＣＴＣＡＥ分類に沿った患者の重症度グレードの判定を可能とする相関（図５（Ｃ）参照）については、本願で説明してきたが、この相関が、乳がん、縦隔のがん、全種類のＥＮＴがん、神経芽腫、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、および直腸がんに苦しむ患者に有効であることがわかった。
【０１０３】
本発明にかかる、患者から採取したサンプルの放射線感受性を判定するための方法は、腫瘍細胞タイプの組織、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、全種類のＥＮＴがん、グリア芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、骨肉腫、および黒色腫に苦しむ患者の細胞に応用されてきた。
【０１０４】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、これらの実施例は本願をなんら限定するものではない。これらの実施例は、患者の細胞株の分析に焦点をあてており、重症度グレードと患者の属する放射線感受性グループとの判定を可能にするものである。
実施例
検査準備
当業者に公知の「皮膚パンチ生検」法を使用した生検により、皮膚細胞サンプルを患者から採取した。この細胞サンプルを、２０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ無菌培地に置いた。その後、細胞サンプルが３８時間を越えて室温に置かれることを避けるため、サンプルを直ちに専門検査室に移動させた。
【０１０５】
検査室へ移動するとすぐに、培養研究機関と当業者とには公知の方法で、生検で得られた細胞サンプルを増幅可能な細胞株として樹立させた。特に、トリプシン分散によって、細胞は、新しい培地内で再度希釈され、所望の個数の細胞が得られるまでこれを繰り返す。十分な個数の細胞を得たのち（概して３週間後）、本発明の方法を使用して最初の試験を行った。細胞を、ペトリ皿内のスライドガラスに接種した。上記スライドガラスのうちの一部には、医療用照射器内で、公認線量測定法に従い、２Ｇｙの吸収線量Ｄで照射を行った。別の一部には照射を行わず、自然状態を表すものとした（吸収線量は０Ｇｙ）。
自然状態および吸収線量２Ｇｙの照射後修復の１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４）におけるｐＨ２ＡＸ病巣、ＭＲＥ１１病巣、およびｐＡＴＭ病巣の個数、自然状態および吸収線量２Ｇｙの照射後の修復時間２４時間で細胞１００個について観察された小核の個数ＮＭＮ（ｔ）（％で表す）、自然状態での細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数、ならびに、ｔ０における大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のパーセンテージの判定
照射対象の細胞については、放射線照射は、３Ｇｙ  ｍｉｎ−１の吸収線量率で、６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施した。
【０１０６】
吸収線量２Ｇｙでの照射の後、細胞を培養インキュベーター内で３７℃で維持した。照射済み細胞（放射線起因状態）については、サンプルを規定の期間（照射後修復時間）後、具体的には、放射線照射の終了から１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、２４時間後（ｔ４）に標識した。得られた核病巣の平均個数を、上記の各照射後修復時間（１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４））において、マーカーｐＨ２ＡＸ、ＭＲＥ１１、およびｐＡＴＭを使用して獲得した。上記サンプルの免疫蛍光分析によって、吸収線量２Ｇｙでの照射後２４時間後に観察された、細胞１００個あたりの小核の個数ＮＭＮ（ｔ）（％で表す）も判定した。
【０１０７】
非照射細胞（自然状態、すなわちｔ０の細胞）については、自然状態の細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数、ｔ０における大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のパーセンテージ、および、自然に観察された小核の個数に加えて、自然状態のｐＨ２ＡＸ病巣の平均個数も、この細胞を免疫蛍光分析することにより得た。
【０１０８】
その後、非照射細胞および照射を受けた細胞を、スライドガラス上で、固定し、溶解し、ハイブリダイズした。これら細胞は、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定され、２０ｍＭのｐＨ  ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤、ＣＡＳ  Ｎｏ．  ９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３分間透過処理した。その後、カバースライドを、免疫学的着色剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（頭文字のＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶで知られる；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行い、その後、ＰＢＳでの洗浄を行った。一次抗体である抗ｐＨ２ＡＸは、１：８００の濃度で使用し、他の一次抗体は１：１００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。
【０１０９】
次に、核を標識するために、スライドガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩを使用した着色によっても、間接的に、休止期Ｇ０／Ｇ１にある細胞（ＤＡＰＩ着色が均一な細胞）の個数、合成期Ｓにある細胞（多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する細胞）の個数、休止期Ｇ２にある細胞（ＤＡＰＩ着色が不均一な細胞）の個数、および有糸分裂期Ｍ（染色体が見える状態）の判定が可能であった。ＤＡＰＩでの対比着色により、特に、細胞質内局在化または核局在化の位置特定をするための、核の位置特定ができ、したがって、存在する小核の定量化ができた。
【０１１０】
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）を用いて、スライドガラスから結果を得た。読取りは、別々のマーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１を使用して、各点においてＧ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞で得られた病巣をカウントすることにより直接的に行うとともに、専用の画像解析ソフトウェア（ｉｍａｇｅＪ）を使用して行った。
【０１１１】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を備える結果を得るために、一連の照射を個別に３回実施した。自然状態（ｔ０）、照射後修復の１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４））における各病巣数の平均と平均標準誤差（ＳＥＭ）とを計算した。各種の患者皮膚細胞サンプルについての計算結果を、次の表に示す（表２参照）。
【０１１２】
【表２】
0006524108.tif 000003
サンプルの重症度グレードおよび放射線感受性の予測的評価
１９７０年代から今日に至るまで、照射後の死亡ケース（ＣＴＣＡＥ分類の重症度グレード５）については文献に記載があり、系統的には、毛細血管拡張性失調症のケースか、リガーゼ４の突然変異が生じた患者のケースに相当する（A. Joubert他、“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response: At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?” International Journal of Radiation Biology, 2008年，vol. 84(2), p107-125を参照）。これらの遡及的データに基づき、且つ、これらの放射線治療セッション中の合計蓄積線量を考慮して、対応する未修復二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を対比できた。実際には、未修復二本鎖切断の数は、多数の失調株において、および、ＬＩＧ４突然変異（１８０ＢＲ細胞株）ケース１つについて計測した。これらの細胞株は、系統的に、１回の照射量後の致死限界値を超える未修復切断の比率を示した。表２に示した、ＡＴ患者および１８０ＢＲ患者からの細胞株との値には、そこを超えると未修復切断の数が患者にとって致命的となる閾値を判定するための証拠が含まれている。これらの特殊なケースに相当するＣＴＣＡＥ重症度グレードは５（＝死亡）である。
【０１１３】
重症度グレード２〜４は、組織反応（例えば、皮膚炎、直腸炎、など）に対応する。重症度グレード１は、耐えられる程度の副作用を伴うものであり、医師によっては、重症度０（影響なし）と混同されることも多い。図６（Ａ）は、照射後修復２４時間後にマーカーｐＨ２ＡＸによって得られた病巣の最大数を、異なる複数の患者のｐＡＴＭ病巣の最大数と関連させて表すが、ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレードとこれらのパラメータとの間に相関があることを示している。
【０１１４】
したがって、種々の患者皮膚細胞サンプル（表２参照）について、ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレードが、上記の数式、すなわち
ＣＴＣＡＥ＝５−Ｍａｘ［ＮｐＡＴＭ（ｔ１）；ＮｐＡＴＭ（ｔ２）］／１０
を使って判定された。
【０１１５】
この式は、タイプIIの放射線感受性グループ（中等度の放射線感受性）に属する患者の重症度グレードを判定するのに特に適している。タイプIIIの放射線感受性グループ（放射線感受性患者）に属するすべての患者は、重症度グレード５を示すか、または、示すはずである。放射線感受性を有するこれら患者については、放射線治療が禁止される。
【０１１６】
実際には、患者に正確な重症度グレードの値を割り当てるために、患者の属する放射線感受性グループは、ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレードに先だって判定される。現在、１つの細胞株のケースだけは、上記の数式による重症度グレードを判定するための数式を実証していない。これは、タイプIII放射線感受性グループに属する、細胞株（１８０ＢＲ）のケースである。これについては、ＣＴＣＡＥに沿った重症度グレードは、上記数式に基づき値１を取るように計算した。しかし、好適には、上記の重症度グレードを予測する数式は、患者の放射線感受性グループ（グループI、IIまたはIII）の判定後に使うべきである。したがって、本発明によれば、１８０ＢＲ患者は、実際は、グループIII（高放射線感受性）に属し、そのため、いかなる理由があっても、放射線を受けるべきではない。一方、患者の重症度は、その他すべての細胞株について、有効であった。
【０１１７】
サンプルの放射線感受性グループは、上記の数式を使って、以下の方法で判定された。
【０１１８】
（ａ）  ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ、Ａ＜１０、且つ、Ｂ＜５、且つＣ＜２、但し
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数
であれば、サンプルは放射線抵抗性を有すると見なされ、
（ｂ）  （ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）
であれば、サンプルは高放射線感受性を有すると見なされ、
（ｃ）  その他のすべての条件の場合は、サンプルは中等度の放射線感受性を有すると見なされる。
【０１１９】
ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレードと、サンプルの放射線感受性との定量値は、表２に示されている。
【図１】
0006524108.tif 000004
【図２】
0006524108.tif 000005
【図３】
0006524108.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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