(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗サイトケラチン抗体及び抗ポドプラニン抗体を含むカクテル抗体と、弾性線維染色剤と、を有することを特徴とする２重染色キット。
【請求項２】
前記弾性線維染色剤は、ビクトリアブルー染色試薬及びヘマトキシリン−エオジン染色試薬を含むことを特徴とする請求項１に記載の２重染色キット。
【請求項３】
前記抗サイトケラチン抗体は、AE1/AE3及びCK18の少なくとも何れか一方を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の２重染色キット。
【請求項４】
前記抗ポドプラニン抗体は、抗D2-40抗体であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の２重染色キット。
【請求項５】
前記抗サイトケラチン抗体の濃度は10〜3000μg/Lであり、前記抗ポドプラニン抗体の濃度は40〜2500μg/Lであることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の２重染色キット。
【請求項６】
前記AE1/AE3の濃度は10〜3000μg/Lであり、前記CK18の濃度は0.1〜50mg/Lであることを特徴とする請求項３に記載の２重染色キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理診断において判定者によるばらつきや見逃しを防止する２重染色キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
病理診断は、生体標本の形態観察のみならず、免疫組織化学染色法によっても行われる（特許文献１）。免疫組織化学染色法は、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法であり、特定の抗原を認識させる抗体を組織と反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。免疫組織化学染色法には、抗原に対する特異的抗体である一次抗体に色素又は酵素を直接結合させて可視化する直接法と、一次抗体に対する抗体である二次抗体を用いて可視化する間接法が含まれる。
【０００３】
病理診断において、腫瘍の種類、腫瘍の部位、大きさ、分化度、腫瘍の数、核分裂像の多寡、リンパ節転移の有無、遠隔転移の有無などの種々の因子が、腫瘍の悪性度及び予後と関連している。そこには、動静脈侵襲やリンパ管侵襲、神経周囲侵襲の有無及び多寡も含まれる。
【０００４】
従来、弾性線維染色にて動静脈侵襲を判定し、ポドプラニン免疫染色にてリンパ管侵襲を判定していたが（特許文献２）、侵襲細胞が、腫瘍細胞か炎症細胞であるか、区別が難しく、判定者によるばらつきや見逃しがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１３０８６６号公報
【特許文献２】特開２０１１−１７５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、時間的・経済的に有利であり、しかも、病理診断において判定者によるばらつきや見逃しを防止することができ、特に侵襲細胞が腫瘍細胞か炎症細胞であるかの区別が容易な２重染色キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明にかかる２重染色キットは、抗サイトケラチン抗体及び抗ポドプラニン抗体を含むカクテル抗体と、弾性線維染色剤と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、病理診断において判定者によるばらつきや見逃しが生じにくい。即ち、本発明によれば、抗サイトケラチン抗体にて腫瘍細胞が染色されるため、炎症細胞や血管内皮細胞、繊維芽細胞と容易に区別され、従来の方法による判定困難性、見逃しが解決される。腫瘍細胞が染色された上での弾性線維染色により、動静脈侵襲が容易に正確に判定され、腫瘍細胞が染色された上でのポドプラニン免疫染色により、リンパ管侵襲が容易に正確に判定され、腫瘍細胞が染色された上での弾性線維染色により神経周囲侵襲が容易に正確に判定される。腫瘍細胞が染色され間質細胞が染色されないことから、腫瘍細胞の簇出（budding）も容易に正確に判定される。本発明により、以上のいずれもが同時に解決され、本発明を用いた、動静脈侵襲・リンパ管侵襲・神経周囲侵襲の判定が標準化されうる。
【０００９】
また、本発明によれば、追加スライド1枚で、動静脈侵襲、リンパ管侵襲、神経周囲侵襲のすべてを同時に完了でき、切片作製が少なく、時間的・経済的に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】胃癌症例におけるビクトリアブルーHE染色である。
【図２】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  1x)＋+(AE1/AE3  1x)である。
【図３】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。
【図４】胃癌症例におけるHE染色である。
【図５】胃癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(D2-40  1x)である。
【図６】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  1x)＋(AE1/AE3  1x)である。
【図７】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1x)である。
【図８】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/2x)である。
【図９】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1x)＋(CK18  1x)である。
【図１０】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。
【図１１】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。
【図１２】胃癌症例におけるHE染色である。
【図１３】胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。
【図１４】直腸癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。
【図１５】腎癌症例におけるHE染色である。
【図１６】腎癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(CAM5.2  1x)である。
【図１７】腎癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1x)である。
【図１８】腎癌症例において、ヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/16x)である。
【図１９】腎癌症例において、ヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
本実施形態にかかる２重染色キットは、抗サイトケラチン抗体及び抗ポドプラニン抗体を含むカクテル抗体と、弾性線維染色剤と、を有する。ここで２重染色とは、同時に２種類の抗原を同じ組織切片の異なる位置で検出する染色を意味する。
【００１３】
抗サイトケラチン抗体は、サイトケラチン分子を抗原として認識する抗体である。サイトケラチン(CKs)は上皮細胞及び上皮由来細胞に発現する、中間径フィラメント構成タンパク質のひとつである。20種類以上のサイトケラチンファミリータンパク質が知られており、CK1からCK8までがタイプI、CK9からCK23までがタイプIIサブファミリーに分類される。タイプIとタイプIIのサイトケラチンはヘテロ２量体を形成して機能しており、この固有の組み合わせは、各上皮細胞によって異なる。癌細胞でのサイトケラチンの発現を検討することにより癌細胞の起源や亜型分類の類推が可能となるため、サイトケラチン発現検討は診断的意義が大きい。抗サイトケラチン抗体にて腫瘍細胞が染色されるため、炎症細胞や血管内皮細胞、線維芽細胞等との区別が容易となる。
【００１４】
抗サイトケラチン抗体は、特に限定されるものではないが、例えばAE1/AE3及びCK18の少なくとも何れか一方を含有するものであり、好適にはAE1/AE3及びCK18の組み合わせからなることが好ましい。AE1がTypeIのCK10/12/14/15/16/19を、AE3がTypIIのCK1/3/4/5/6/7/8を認識するため大半の上皮細胞・癌細胞に反応し、低分化癌・未分化癌と非上皮性悪性腫瘍との鑑別に有用である。CK18は、分子量45kDaの低分子ケラチンで、ある種の腺癌や扁平上皮癌といった癌細胞で発現していることが知られている。またそれ以外にも、子宮頸膣部や食道のような角質化していない層状化した上皮及び基底細胞といった正常細胞でも発現している。
【００１５】
AE1/AE3やCK18の単独使用よりも、AE1/AE3及びCK18の組み合わせの方が有利な理由は、表１及び表２に示されるように、相互に補完しあう腫瘍の存在が多数存在するからである（表１及び表２−pubmed上の、ホルマリン固定パラフィン包埋切片における、AE1/AE3免疫染色とCK18免疫染色の施行されたすべての症例のデータ）。なお、例えば、AE1/AE3の濃度は10〜3000μg/Lであり、CK18の濃度は0.1〜50mg/Lとすることが可能である。
【００１６】
【表１】
0006468961.tif 000002
【００１７】
【表２】
0006468961.tif 000003
【００１８】
抗ポドプラニン抗体は、リンパ管内皮細胞マーカーとして知られており、血管からリンパ管を確実に見分けるために用いられる。ポドプラニンは様々にクローニングされ、様々な名前が付いている。具体的には、抗体名D2-40(抗原名M2A)、抗体名NZ-1(抗原名Aggrus)、抗体名anti-podoplanin(抗原名podoplanin)等が使用され、好適にはD2-40である。
【００１９】
D2-40は、リンパ管内皮、胎児精巣、精巣胚細胞性腫瘍の細胞表面上のＯ-linked sialoglycoprotein (約40kDa)と反応するモノクローナル抗体のクローン名である。開発時にはこの抗体の認識する抗原蛋白は不明で、「M2A」と呼ばれていたが、現在はPodoplanin（Gene：1p36.21，PDPN，62aa，36-45kDa）を認識するとされている。Lymphatic endothelial markerと呼ばれリンパ管と血管（末梢動・静脈）の鑑別やリンパ管内皮に由来する腫瘍の鑑別に有用とされるが、一部の血管内皮細胞の腫瘍にも陽性例がある。精上皮腫など胚細胞性腫瘍の確認のほか、中皮腫（上皮型）の診断に用いられることもあるが、脳腫瘍、扁平上皮癌、肺腺癌などのほか結腸癌での発現の報告もある。
【００２０】
なお、例えば、抗サイトケラチン抗体の濃度は10〜3000μg/Lであり、抗ポドプラニン抗体の濃度は40〜2500μg/Lとすることが可能である。
【００２１】
弾性線維染色剤は弾性線維を染める染色剤であり、特に限定されるものではないが例えばエラスチカ・マッソン染色、エラスチカ・ワンギーソン染色、ビクトリアブルー染色、オルセイン染色、ウエルホフ染色等であり、好ましくはビクトリアブルーついでHE染色である。腫瘍細胞が染色された上でのビクトリアブルー染色により動静脈侵襲が正確に判定でき、また腫瘍細胞が染色された上でのHE染色により神経周囲侵襲が正確に判定できる。なお、本発明においては、リンパ管侵襲を正確に判定するカクテル抗体として、「抗サイトケラチン抗体及び抗ポドプラニン抗体を含むカクテル抗体」を規定することも可能である。D2-40免疫染色がリンパ管侵襲の評価に有用であること自体は公知であるが、D2-40免疫染色ではしばしば腫瘍間質が非特異的に染色される結果、リンパ管侵襲の評価が正確にできない問題点が指摘されていた（“内視鏡的切除大腸粘膜下組織浸潤(sm)癌リンパ管侵襲検出におけるD2-40免疫染色の有用性”、日消外会誌40(3):247-252,2007年）。しかしながら本件発明によれば、抗サイトケラチン抗体にて腫瘍細胞が染色された上で抗ポドプラニン抗体によりリンパ管侵襲が判定できるため、そのような問題点を解決できる。
【実施例】
【００２２】
各種条件にて染色を施行した。手順は下記に示す通りであった。
１．脱パラフィン
(i)薄切切片スライドを乾燥させる。
(ii)70℃孵卵器にてパラフィン融解（10分以上）
(iii)Tissue Tek Prisma（サクラファインテック社製）使用
-1. 乾燥：：1分×1
-2. キシレン：5分×1
キシレン：3分×3
-3. 100%アルコール（ドライゾール）：3分×1
100%アルコール（ドライゾール）：2分×2
-4. 水洗（水道水）：1分×1
-5. 終了（蒸留水中）
２．ビクトリアブルー染色（用手法）（ビクトリア青：武藤化学）
-1. 70%アルコール：：3分
-2. ビクトリアブルー染色液：4時間〜over night
-3. 70%アルコール：：3分まで（青色の染色性を見ながら）
-4. 水洗（水道水）
-5. 終了（蒸留水中）
３．HE染色
（GMヘマトキシリン：武藤化学、ピュアエオジン：武藤化学、エオジン希釈液：95%アルコール）
Tissue Tek Prisma（サクラファインテック社製）使用
-1. 水洗（水道水）：30秒
-2. GMヘマトキシリン液：1分
-3. 水洗（水道水）：30秒
-4. 温水：1分
-5. 水洗（水道水）：3分
-6. 100%アルコール：：15秒×2
-7. エオジン液（8倍希釈）：30秒
-8. 100%アルコール：：15秒×2
100%アルコール：：30秒×1
100%アルコール：：1分30秒×1
100%アルコール：：2分×1
-9. キシレン：：2分×2
キシレン：：3分×1
４．IHC
（ロッシュ社製・自動免疫染色装置Ventana BenchMark XT）使用
-1. スライド（EZPrep）75℃：4分
-2. リンス（EZPrep）×2
-3. スライド（EZPrep）76℃：4分
-4. リンス（EZPrep）×1
-5. スライド常温に戻す
-6. conditioning（Cell Conditioner Medium）：8分
-7. スライド（Cell Conditioner Medium）95℃：8分
-8. conditioning（Cell Conditioner Medium）：30分
-9. スライド（Cell Conditioner Medium中）100℃：4分
-10. conditioning（Cell Conditioner Medium中）：60分
-11 スライド常温に戻す
-12. リンス（Reaction Buffer）×2
-13. スライド（Reaction Buffer）37℃：4分
-14. リンス（Reaction Buffer）×1
-15. スライド（I-VIEW INHIBITOR）（37℃）：4分
-13. リンス（Reaction Buffer）×1
-14. スライド（Reaction Buffer）37℃：4分
-15. リンス（Reaction Buffer）×1
-16. スライド（一次抗体）37℃：32分
-17. リンス（Reaction Buffer）×1
-18 スライド（Reaction Buffer）37℃：4分
-19. リンス（Reaction Buffer）×1
-20. スライド（I-VIEW BIOTIN Ig）（37℃）：8分
-21. リンス（Reaction Buffer）×1
-22. スライド（I-VIEW SA-HRP）（37℃）：8分
-23. リンス（Reaction Buffer）×2
-24. スライド（I-VIEW DAB and I-VIEW H2O2）（37℃）：8分
-25. リンス（Reaction Buffer）×1
-26. スライド（I-VIEW COPPER）（37℃）：4分
-27. リンス（Reaction Buffer）×1
-28. スライド（HEMATOXYLIN II）（37℃）：16分
-29. リンス（Reaction Buffer）×2
-30. スライド（BLUING REAGENT）（37℃）：4分
-31. リンス（Reaction Buffer）×2
（ビクトリアブルーHE染色併用IHCでは、上記1〜27まで）
1倍の一次抗体濃度は下記であった。
【００２３】
抗ポドプラニン抗体（DAKO社製・clone：D2-40）マウスモノクローナル：480μg/L
AE1/AE3抗体（DAKO社製・clone：AE1/AE3）マウスモノクローナル：610μg/L
CK18抗体（DAKO社製・clone：DC10）マウスモノクローナル：12mg/L
CAM5.2抗体（Leica社製・clone：CAM5.2）マウスモノクローナル：希釈済
図１は、胃癌症例におけるビクトリアブルーHE染色である。ビクトリアブルー染色により動静脈壁が視認可能であった。静脈内への腫瘍細胞の浸潤は認識不可能であった。実線は動脈を示し、破線は静脈を示す。
【００２４】
図２は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  1x)＋+(AE1/AE3  1x)である。ビクトリアブルー染色により動静脈壁が視認可能であった。図中の１に示されるように、ケラチン免疫染色により静脈内への腫瘍細胞の浸潤を容易に認識できた。実線は動脈を示し、破線は静脈を示す。
【００２５】
図３は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。ビクトリアブルー染色により動静脈壁が視認可能であった。図中の１に示されるように、ケラチン免疫染色により静脈内への腫瘍細胞の浸潤を容易に認識できた。実線は動脈を示し、破線は静脈を示す。
【００２６】
図４は、胃癌症例におけるHE染色である。腫瘍細胞の炎症細胞との区別は難しく、さらに、リンパ管、動静脈壁は認識不可能であった。
【００２７】
図５は、胃癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(D2-40  1x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できたが、リンパ管内の細胞が、腫瘍細胞か炎症細胞かの判定は困難であった。
【００２８】
図６は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  1x)＋(AE1/AE3  1x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できたが、図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞と染色が重なっており、リンパ管侵襲がやや視認困難であった。
【００２９】
図７は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できた。図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞と染色が重なっているが、図６と比較してD2-40の抗体濃度が倍となっており、ややリンパ管が視認しやすいものであった。
【００３０】
図８は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/2x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できた。図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞を認識できた。図６と比較してD2-40の抗体濃度が倍、サイトケラチンの抗体濃度が1/2倍となっており、リンパ管と腫瘍細胞の区別が容易であった。
【００３１】
図９は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1x)＋(CK18  1x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できたが、図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞と染色が重なっており、リンパ管侵襲がやや視認困難であった。
【００３２】
図１０は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できた。図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞を認識できた。図９と比較してサイトケラチンの抗体濃度が1/8倍となっており、リンパ管と腫瘍細胞の区別が容易であった。
【００３３】
図１１は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管を認識できた。図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞を認識できた。図９と比較してAE1/AE3が1/4倍、CK18が1/32倍となっており、リンパ管と腫瘍細胞の区別が容易であった。
【００３４】
図１２は、胃癌症例におけるHE染色である。神経線維束内に浸潤している細胞が、腫瘍細胞か炎症細胞かの判定は困難であった。なお、破線は神経線維束を示す。
【００３５】
図１３は、胃癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/8x)＋(CK18  1/8x)である。図中の１に示されるように、サイトケラチン免疫染色により神経線維束内に浸潤している細胞が腫瘍細胞であることを容易に認識できた。なお、破線は神経線維束を示す。
【００３６】
図１４は、直腸癌症例において、ビクトリアブルーHE染色＋(D2-40  2x)＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。図中の１に示されるように、D2-40免疫染色によりリンパ管が視認できた。図中の２に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞が視認できた。図中の３に示されるように、サイトケラチン免疫染色により腫瘍細胞の簇出（budding）を容易に視認できた。
【００３７】
図１５は、腎癌症例におけるHE染色である。腫瘍胞巣、被膜、正常腎皮質を確認できた。腎皮質内には、糸球体、尿細管が含まれる。
【００３８】
図１６は、腎癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(CAM5.2  1x)である。サイトケラチンCAM5.2免疫染色では、腫瘍細胞のみが染色されており、腎尿細管上皮、糸球体は染色されていない。
【００３９】
図１７は、腎癌症例におけるヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1x)である。サイトケラチンAE1/AE3免疫染色では、腎尿細管上皮のみが染色され、腫瘍細胞、糸球体は染色されていない。
【００４０】
図１８は、腎癌症例において、ヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/16x)である。サイトケラチンAE1/AE3＋CK18カクテル抗体免疫染色では、腫瘍細胞と腎尿細管上皮が染色され、糸球体は染色されていない。
【００４１】
図１９は、腎癌症例において、ヘマトキシリン染色＋(AE1/AE3  1/4x)＋(CK18  1/32x)である。サイトケラチンAE1/AE3＋CK18カクテル抗体免疫染色では、腫瘍細胞と腎尿細管上皮が染色され、糸球体は染色されていない。図１８と比較してCK18の抗体濃度が1/2倍となっているが、良好な染色性が保たれていた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
病理診断に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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