(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質において、
（ａ）配列番号１（ＥＳＡＴ６）、配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）及び配列番号６（Ｒｖ３８７２）、又は
（ａ）の中の配列の何れか１つと少なくとも９０％の配列同一性があり、同時に免疫原性があるアミノ酸配列アナログ、
から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質において、硫黄架橋形成及びタンパク質凝集を回避するために、システインが別のアミノ酸で置換されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項３】
請求項２に記載の融合タンパク質において、前記システインがセリンで置換されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の融合タンパク質において、融合パートナー同士がリンカー分子で結合していることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載の融合タンパク質において、配列番号１８（Ｈ６４）、配列番号１９（Ｈ６８）、配列番号２０（Ｈ６９）、配列番号２１（Ｈ７０）、又は配列番号２２（Ｈ７１）から選択されるアミノ酸配列を伴うことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項６】
毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）によって引き起こされる感染に対するワクチン接種用の医薬組成物を調製するための、請求項１乃至５の何れか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項７】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項７に記載のワクチンにおいて、アジュバントをさらに含むことを特徴とするワクチン。
【請求項９】
請求項８に記載のワクチンにおいて、前記アジュバントが、カチオン性リポソーム（例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、Ｑｕｉｌ  Ａ、ｐｏｌｙ  ｌ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイント不完全アジュバント、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナート（ＴＤＢ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びモノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）又はこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）によって引き起こされる結核に対してヒトを含む動物を免疫するための、請求項７乃至９の何れか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の、Ｅｓｘ−１が関与する、ｅｓｘファミリーのポリペプチドに基づいた、新規な免疫原性組成物を開示する。
【背景技術】
【０００２】
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する免疫は、幾つかの基本的特徴、即ち、特異的に感作されたＴリンパ球が防御を仲介し、最も重要なメディエーター分子がインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）のようである、ということを特徴とする。
【０００３】
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、新規なＴＢワクチンの生成に関係する可能性のある数種のタンパク質を保有し、分泌もする。１９９８年に、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の全ゲノム配列を発表し、約４０００のオープンリーディングフレームの存在を予測した１。しかし、重要なことであるが、この配列情報は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡが翻訳され、タンパク質として発現するかどうかを予測するために使用することはできない。ゲノム配列は、ＲＮＡ発現解析用のＤＮＡアレイをデザインするため、及びプロテオーム研究において、発現したタンパク質を同定するために広く使用されてきた。発現データの量は膨大で、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測ツールの進歩はめざましいが、得られた配列が免疫原性の分子をコードするであろうと確実に予測することは今なお不可能である。結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の感染中又は感染後に、ある分子が免疫系に認識されるかどうかを判定する唯一の方法は、その分子を生成し、本明細書に記載する適切なアッセイでそれを試験することである。
【０００４】
現在臨床試験中の新規なＴＢワクチンが数種ある。しかし、これらは主に感染の初期段階で発現する限定数の抗原に基づく標準的な予防ワクチンである。発現動態の直接的な結果として、Ｔ細胞に提示されるエピトープパターンは経時で極端に変化し、これは、新規なワクチンがいかにデザインされるべきであるかを示唆する。例えば、一時的に発現した初期の抗原、Ａｇ８５Ｂについては、２つの別個のＴ細胞移入試験によって、感染から３〜４週間後にＡｇ８５ＢはもはやＴ細胞に提示されておらず、結果として、感染の時点でもその後の時点でも、Ａｇ８５Ｂに特異的なサイトカイン、ケモカインなどは産生されないことが示された２、３。したがって、宿主との長期的な共存を確立する慢性疾患には、ワクチン接種をし、感染の短期間にのみ発現するタンパク質中のエピトープに特異的な記憶Ｔ細胞を誘導する価値は限られている。
【０００５】
したがって、ワクチンの開発には、感染の後期に多く発現する抗原を同定し、その中で、免疫原性があり、防御に貢献できるものを選択し、この特異的なタンパク質のサブセットをＴＢワクチンに含めることがきわめて重要である。そうすることによって、ワクチンの効力及びエピトープの適用範囲を改善することが可能であるだけでなく、潜伏感染を標的にすることも可能となる。
【０００６】
マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の分泌系は、タンパク質の細胞外環境への排出を担っている。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、幾つかの異なるタイプの分泌系を有し、そのうちＥＳＸ分泌系（タイプＶＩＩ）が本発明に関連した重要性をもつ。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）にはこの系が５つあり、ＥＳＸ−１〜ＥＳＸ−５と命名されている。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の６−ｋＤａ初期分泌抗原性標的（ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔ）（ＥＳＡＴ−６）及び１０−ｋＤａ培養濾液抗原（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＦＰ−１０）は、ＥＳＡＴ−６分泌系１（ＥＳＸ−１）によって分泌されるタンパク質であり、最も免疫優性の結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）抗原の一部である。このような属性により、これらは結核（ＴＢ）ワクチンの開発に重要となる。この知見に基づき、発明者らは、ＥＳＸ−１が関与する他のタンパク質を、有望なＴＢワクチン抗原として試験した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、場合により潜伏ポリペプチドを含む、Ｅｓｘ−１が関与する、ｅｓｘファミリーのポリペプチドから選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原を含む、融合タンパク質又は抗原カクテルの使用による、結核菌群の種（結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、アフリカ型結核菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ネズミ型結核菌（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ・カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ）、Ｍ・ピンニペディ（Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）、マイコバクテリウム・ムンギ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｎｇｉ））が引き起こす感染の予防及び処置に関する。融合タンパク質又は抗原カクテルは、ワクチンに入れて、好ましくはアジュバント及び／又は免疫調節剤とともに使用される。
【０００８】
本発明は、融合タンパク質又は抗原カクテルにおいて、
（ａ）配列番号１（ＥＳＡＴ６）、配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）及び配列番号６（Ｒｖ３８７２）、若しくは
（ｂ）配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）及び配列番号６（Ｒｖ３８７２）、若しくは
（ｃ）配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）、配列番号６（Ｒｖ３８７２）及び配列番号７（Ｒｖ３６１６）、若しくは
（ｄ）配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）、配列番号６（Ｒｖ３８７２）、配列番号７（Ｒｖ３６１６）及び配列番号８（Ｒｖ３８８１ｃ）、若しくは
（ｅ）配列番号２（Ｒｖ３６１４ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、配列番号４（Ｒｖ３８６５）、配列番号５（Ｒｖ３８４９）、配列番号６（Ｒｖ３８７２）及び配列番号８（Ｒｖ３８８１ｃ）、若しくは
（ｆ）配列番号９（Ｒｖ３８９１ｃ）、配列番号１０（Ｒｖ３８９０）、配列番号１１（Ｒｖ０２８７）、配列番号１２（Ｒｖ０２８８）、配列番号１３（Ｒｖ３６２０ｃ）及び配列番号１４（Ｒｖ３６１９）、若しくは
（ｇ）配列番号１１（Ｒｖ０２８７）、配列番号１２（Ｒｖ０２８８）、配列番号１３（Ｒｖ３６２０ｃ）、配列番号１４（Ｒｖ３６１９）、番号７（Ｒｖ３６１６ｃ）及び配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）、若しくは
（ｈ）配列番号１１（Ｒｖ０２８７）、配列番号１２（Ｒｖ０２８８）、配列番号１３（Ｒｖ３６２０ｃ）、配列番号１４（Ｒｖ３６１９）、番号７（Ｒｖ３６１６ｃ）、配列番号３（Ｒｖ３６１５ｃ）及び配列ＩＤ９（Ｒｖ３８８１ｃ）、若しくは
（ｉ）配列番号１（ＥＳＡＴ６）、配列番号１５（Ａｇ８５Ｂ）及び配列番号１６（Ｒｖ１２８４）、又は
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）の中の配列の何れか１つと少なくとも８０％の配列同一性があり、同時に免疫原性があるアミノ酸配列アナログ、
から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質又は抗原カクテルを開示する。
【０００９】
本発明に係る融合タンパク質中のシステインは、スルフル（ｓｕｌｈｕｒ）架橋形成及びタンパク質凝集を回避するために、別のアミノ酸で置換されていることが好ましい。好ましい置換アミノ酸はセリンである。
【００１０】
本発明に係る融合タンパク質の融合パートナー同士は、好ましくはリンカー分子で結合して、タンパク質フォールディング及び二量体形成を可能にする。
【００１１】
本発明に係る好ましい融合タンパク質は、配列番号１８（Ｈ６４）、配列番号１９（Ｈ６８）、配列番号２０（Ｈ６９）、配列番号２１（Ｈ７０）、配列番号２２（Ｈ７１）、配列番号２３（Ｈ６５）、配列番号２４（Ｈ７２）、配列番号２５（Ｈ７３）又は配列番号２６（Ｈ６７）として提案される。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、本発明に係る抗原カクテル、例えば、上記のアミノ酸配列（ａ）〜（ｉ）（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６を含む）を、ポリペプチドを一緒に融合せずに使用することである。
【００１３】
好ましい抗原カクテルは、配列番号１６及びＨ１（配列番号１７）を含み、Ｈ１は、配列番号１と配列番号１５との融合である。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、上記で定義した融合タンパク質又は抗原カクテルを含む免疫原性組成物又は医薬組成物を、好ましくはワクチンの形態で開示する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）によって、例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アフリカ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ネズミ型結核菌（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ・カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ）、Ｍ・ピンニペディ（Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ）又はマイコバクテリウム・ムンギ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｎｇｉ）によって引き起こされる結核に対して、ヒトを含む動物を免疫する方法を開示し、当該方法は、上記で定義したポリペプチド、本発明に係る免疫原性組成物、又は本発明に係るワクチンを動物に投与するステップを含む。
【００１６】
本発明に係るワクチン、免疫原性組成物及び医薬組成物は、毒性マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染していない対象に予防的に、又は毒性マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に既に感染している対象に治療的に使用することができる。
【００１７】
定義
ポリペプチド
本発明における「ポリペプチド」という用語は、その通常の意味を有するものとする。それは、全長タンパク質、オリゴペプチド、短鎖ペプチド及びこれらのフラグメントを含む任意の鎖長のアミノ酸鎖であり、アミノ酸残基同士は共有ペプチド結合で結合している。
【００１８】
ポリペプチドは、グリコシル化されること、脂質付加されること（例えば、Ｍｏｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１に記載されているパルミトイルオキシスクシンイミドでの化学的脂質付加、又はＬｕｓｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．１９７６に記載されているドデカノイルクロリドでの化学的脂質付加）、補欠分子族を含むこと、又は追加のアミノ酸、例えば精製タグ（例えばｈｉｓタグ）又はシグナルペプチドを含有することにより、化学修飾され得る。精製タグは、高純度のタンパク質製剤を得るために使用され、例えば、Ｈｉｓタグは、Ｎ末端に使用されるとメチオニンを第１のアミノ酸として、その後に６〜８個のヒスチジンを含み、Ｃ末端に使用されると、６〜８個のヒスチジン、その後に終止コドンを含む。Ｎ末端に使用されると、ポリペプチド融合体をコードする遺伝子におけるメチオニン開始コドンは、翻訳開始部位の誤りを回避するために除去することができる。遺伝子が、選択的な開始コドンＧＵＧ又はＵＵＧのうち１つを含有する場合に同様のことが当てはまる。ＧＵＧ又はＵＵＧは、それぞれ通常はバリン及びロイシンをコードするが、開始コドンとしては、メチオニン又はホルミルメチオニンとして翻訳される。
【００１９】
各ポリペプチドは、特異的な核酸配列によってコードされている。当然のことながら、係る配列は、そのアナログ及び変異形を含み、これらにおいて、係る核酸配列は、１種又は複数種の核酸の置換、挿入、付加又は欠失によって修飾されている。置換は、コドン使用頻度におけるサイレント置換が好ましく、これはアミノ酸配列には何ら変化をもたらさないであろうが、タンパク質の発現を増強するために導入してもよい。
【００２０】
分泌系
タイプＶＩＩ分泌系（Ｔ７ＳＳ）は、細菌の分泌系において最近発見され、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において最初に同定されたものである。対応する遺伝子群は、ＥＳＸ（ＥＳＡＴ−６分泌系）領域と呼称された４〜６。結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖのゲノムは、遺伝子重複イベントを通して進化し、Ｔ７ＳＳ分泌機構の構成要素を含む５つの遺伝子群を含有する。これらの群は、ＥＳＡＴ−６分泌系（ＥＳＸ）１〜５と呼ばれる。ＥＳＸ系は、従来のシグナルペプチドを欠くタンパク質を分泌することが示されている。さらに、ＥＳＸ１〜５によって分泌されるタンパク質の大部分は分泌について相互依存に従う７。
【００２１】
Ｅｓｘ−ファミリー
Ｒｖ３０１７ｃ（ｅｓｘＲ）を除き、ＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質をコードする遺伝子は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖ染色体上の１１座で、縦列対で配列され、ｐｅ−ｐｐｅ遺伝子対がそれに先行する場合が多い。それらは、アミノ酸約１００個の鎖長でＥＳＸ１〜５系によって分泌されるタンパク質をコードする。
【００２２】
本明細書を通して、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又はその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、記載した要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、他の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の何れの排除も意味するものではないことが理解されるであろう。
【００２３】
免疫原性のポリペプチドとは、毒性マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に現在感染している、又は過去に感染した生体試料又は個体において免疫応答を誘導するポリペプチドと定義される。
【００２４】
免疫応答は、以下の方法のうち１つによってモニターすることができる。
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞応答は、毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）に現在感染している、又は過去に感染した動物又はヒトから取り出したリンパ球からの、ＩＦＮ−γなどの関連するサイトカインの放出によって、又はこれらのＴ細胞の増殖の検出によって測定される。ポリペプチド又は免疫原性部分を、ウェル当たり１×１０５個の細胞〜３×１０５個の細胞を含む懸濁液に添加することによって実施される誘導。血液、脾臓、肝臓又は肺から単離される細胞、及び懸濁液１ｍｌ当たり２０μｇ以下の濃度になるポリペプチド又は免疫原性部分の添加、並びに２日〜５日実施される刺激。細胞増殖のモニタリングには、放射性標識したチミジンで細胞をパルス標識し、インキュベーションの１６〜２２時間後、液体シンチレーション計数による増殖の検出。バックグラウンドプラス２標準偏差より高い応答である陽性応答。ＩＦＮ−γの放出は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。バックグラウンドプラス２標準偏差より高い応答である陽性応答。ＩＦＮ−γ以外のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＧＦ−βは、ポリペプチドに対する免疫学的応答をモニターする際に関連し得る。サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の存在を測定する別のさらに高感度な方法はＥＬＩＳＰＯＴ法であり、血液、脾臓、肝臓又は肺から単離された細胞を１〜４×１０６個の細胞／ｍｌの好ましい濃度に希釈し、１ｍｌ当たり２０μｇ以下の濃度になるポリペプチド又は免疫原性部分の存在下で１８〜２２時間インキュベートする。その後、細胞懸濁液を１〜２×１０６／ｍｌに希釈し、抗ＩＦＮ−γでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移し、好ましくは４〜１６時間インキュベートする。ＩＦＮ−γを産生する細胞を、標識した抗ＩＦＮ−γ二次抗体及びスポットを生じさせる関連の基質の使用によって判定し、解剖顕微鏡を使用してこれを計数することができる。関連するサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を、ＰＣＲ技術の使用によって判定することも実現可能である。通常、例えばＰＣＲ、ＥＬＩＳＰＯＴ又はＥＬＩＳＡを利用して、１種又は複数種のサイトカインを測定することになろう。当業者には理解されるであろうが、特定のポリペプチドによって誘導されるこれらのサイトカインの何れかの量における有意な増加又は減少は、ポリペプチドの免疫学的な活性の評価に使用することができる。
【００２５】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞応答は、免疫のある個体又は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した個人に由来するＴ細胞株を使用することによって測定することもでき、この場合、Ｔ細胞株は、生マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、細菌細胞からの抽出物、又はＩＬ−２を添加した１０〜２０日間の培養濾液で誘導されたものである。懸濁液１ｍｌ当たり２０μｇ以下のポリペプチドを、ウェル当たり１×１０５個の細胞〜３×１０５個の細胞を含有するＴ細胞株に添加することによって実施される誘導、及び２〜６日実施されるインキュベーション。ＩＦＮ−γの誘導又は別の関連するサイトカインの放出は、ＥＬＩＳＡで測定する。Ｔ細胞の刺激は、上記の放射性標識したチミジンを使用して細胞増殖を測定することによってモニターすることもできる。両アッセイについて、バックグラウンドプラス２標準偏差より高い応答である陽性応答。
【００２６】
・１００μｇ以下のポリペプチド又は免疫原性部分の皮内注射又は局所施用貼付剤を、毒性マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に顕性感染又は不顕性感染している個体に施した後、陽性ＤＴＨ応答として測定することができるｉｎ  ｖｉｖｏ細胞応答、注射又は施用の７２〜９６時間後に少なくとも５ｍｍの直径を有する陽性応答。
【００２７】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏ体液性応答は、免疫のある、又は感染した個体における特定の抗体応答によって測定される。抗体の存在は、ＥＬＩＳＡ技術又はウェスタンブロットによって判定することができ、この場合、ポリペプチド又は免疫原性部分は、ニトロセルロース膜又はポリスチレン表面に吸収される。血清をＰＢＳ中に１：１０〜１：１００で希釈し、吸収されたポリペプチドに添加するのが好ましく、インキュベーションを１〜１２時間実施する。標識した二次抗体の使用により、ＯＤを測定することによって、例えばＥＬＩＳＡによって特定の抗体の存在を判定することができ、陽性応答は、バックグラウンドプラス２標準偏差より高い応答、或いはウェスタンブロットにおける視覚応答である。
【００２８】
・別の関連するパラメーターは、アジュバント中のポリペプチドを伴うワクチン接種の後、又はＤＮＡワクチン接種の後に誘導される、動物モデルにおける防御の測定である。好適な動物モデルには、毒性マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染に曝露させた、霊長類、モルモット又はマウスが含まれる。防御が誘導されたことの読み取り情報は、非ワクチン接種の動物と比較して標的器官における細菌負荷の減少、非ワクチン接種の動物と比較して生存期間の長期化、及び非ワクチン接種の動物と比較して体重減少幅の減少とすることができよう。
【００２９】
免疫原性部分
本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドの免疫原性部分、例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞に対するエピトープを含む。ポリペプチドの免疫原性部分はポリペプチドの一部であり、動物又はヒトにおいて、及び／又は本明細書に記載する生物学的アッセイの何れかによって測定される生体試料において、免疫応答を引き出す。ポリペプチドの免疫原性部分は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープであり得る。免疫原性部分は、ポリペプチドの１個又は数個の比較的小さい部分に関連している可能性があり、ポリペプチド配列全体にわたって分散していたり、ポリペプチドの特定の部分に位置していたりする可能性がある。数種のポリペプチドについては、エピトープが、ポリペプチドの全配列にわたる全域に分散していることが示されている（Ｒａｖｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。
【００３０】
免疫応答中に認識される、関連するＴ細胞エピトープを同定するために、「総当たり（ｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ）」法を使用することが可能である。即ち、Ｔ細胞エピトープは直鎖状であるため、ポリペプチドの欠失変異体が系統的に構築されれば、例えばこの欠失変異体に、例えば本明細書に記載するＩＦＮ−γアッセイを施すことによって、ポリペプチドのどの領域が免疫認識に不可欠であるかがわかるであろう。別の方法では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの検出のために、オーバーラップオリゴペプチドを、好ましくは合成の、例えばポリペプチド由来の鎖長がアミノ酸残基２０個のものを利用する。これらのペプチドは、生物学的アッセイ（例えば、本明細書に記載するＩＦＮ−γアッセイ）で試験することができ、このうち幾つかは、ペプチド中にＴ細胞エピトープが存在する証拠として、陽性応答（且つこれによって免疫原性の）を示すであろう。ＭＨＣクラスＩエピトープの検出については、結合が見込まれるペプチドを予測することが可能であり（Ｓｔｒｙｈｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、その後、これらのペプチドを合成で生成し、関連する生物学的アッセイ、例えば、本明細書に記載するＩＦＮ−γアッセイでこれらを試験することが可能である。ポリペプチド由来の、好ましくは鎖長が例えばアミノ酸残基８〜１１個のペプチド。Ｂ細胞エピトープは、例えばＨａｒｂｏｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８に記載されている、対象のポリペプチドを含むオーバーラップペプチドに対するＢ細胞の認識を解析することによって判定することができる。
【００３１】
Ｔ細胞エピトープの最小鎖長は少なくともアミノ酸６個であることが示されているが、係るエピトープが、これより長い長さのアミノ酸で構成されることは普通である。
【００３２】
ポリペプチドの免疫原性部分は、遺伝学的に異型遺伝子のヒト集団の広範部（高頻度）にも少数部（低頻度）にも認識され得る。さらに、高い免疫学的応答（優性）を誘導する免疫原性部分もあれば、それより低いが、それでもなお重要な応答（準優性）を誘導する免疫原性部分もある。高頻度＞＜低頻度は、広範に分布したＭＨＣ分子（ＨＬＡタイプ）に結合する免疫原性部分に関連するか、又は複数のＭＨＣ分子によるものでありさえする可能性がある（Ｋｉｌｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ  １９８８）。
【００３３】
しかし、結核に対する新規なワクチン用の候補分子を提供するという状況において、サブドミナット（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｔ）エピトープは、ドミナット（ｄｏｍｉｎａｔ）エピトープと同様に関連した重要性をもつ。なぜなら、係るエピトープは、準優性であっても防御を誘導できることが示されている（国際公開第２００８０００２６１号パンフレット）からである。
【００３４】
本発明のポリペプチドの共通の特徴は、実施例で例示するとおりの免疫学的応答を誘導する能力である。当然のことながら、置換、挿入、付加又は欠失によって生成する本発明のポリペプチドの変異体も、本明細書に記載するアッセイの何れかによって測定される免疫原性がある。
【００３５】
融合タンパク質
「融合タンパク質」という用語は、任意の長さ及び配列のアミノ酸リンカー／スペーサーを伴って、又は伴わずに融合した、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の順不同の２つ以上の免疫原性のポリペプチド又はそのアナログのことと理解される。下流生成でのタンパク質凝集を回避するために、融合タンパク質中の全てのシステインが任意のアミノ酸で置換され得るが、セリンは、その構造がシステインと類似性が高いため、好ましい置換基である。
【００３６】
リンカー
リンカー又はスペーサーは、融合タンパク質中のポリペプチドパートナー同士の間に生じる短鎖ペプチド配列である。リンカーは、グリシン及びセリンのような可動性残基から構成されることが多いため、隣接するタンパク質ドメイン同士は互いに対して、分泌／産生中の独立した固有のフォールディングのために自由に動く。２つの隣接するドメインが、互いを立体的に干渉しないように確実にする必要がある場合、長めのリンカーが使用される。
【００３７】
パラログ、オルトログ（ｏｒｔｏｌｏｇｕｅ）及びホモログ
「パラログ」という用語は、祖先が共通で、その後１つ又は複数の重複事象が生じたために、ある程度の相同性をもつタンパク質又は遺伝子のことであると理解される。パラログはゲノム内の重複が関連する遺伝子であり、一方、共通祖先遺伝子から種分化によって進化した異なる種における相同遺伝子であるオルソログ。ホモログという用語は、種分化の事象によって分離した遺伝子間の関係に適用される（オルソログ）か、又は遺伝子重複の事象によって分離した遺伝子間の関係に適用される（パラログ）。
【００３８】
アナログ
配列アナログという用語は、互いが構造的且つ免疫原性的に類似しているが、アミノ酸組成において異なるポリペプチドを意味する。
【００３９】
ワクチン
本発明の別の部分は、本発明に係る融合タンパク質を含むワクチン組成物に関する。融合タンパク質本発明が動物に認識される有効なワクチンは、動物モデルにおいて、毒性マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染に曝露させた後、非ワクチン接種の動物と比較して、標的器官において細菌負荷を減少させ、生存期間を長期化させ、且つ／又は体重減少幅を減少させることが可能であろう。
【００４０】
係るワクチン組成物は、その最適性能を確保するために、免疫学的に且つ薬学的に許容できる担体、ビヒクル又はアジュバントを含むことが好ましい。
【００４１】
好適な担体は、ポリペプチドが疎水性非共有相互作用によって結合するポリマー、例えばポリスチレンなどのプラスチック、若しくはポリペプチドが共有結合するポリマー、例えば多糖など、又はポリペプチド、例えばウシ血清アルブミン、オボアルブミン又はキーホールリンペットヘモシアニンからなる群から選択される。好適なビヒクルは、希釈剤及び懸濁化剤からなる群から選択される。アジュバントは、カチオン性リポソーム（例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、Ｑｕｉｌ  Ａ、ｐｏｌｙ  ｌ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイント不完全アジュバント、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナート（ＴＤＢ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びモノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）又はこれらの組合せからなる群から選択されるのが好ましい。
【００４２】
ワクチンにアジュバント効果を実現する他の方法には、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどの作用剤（アラム）、糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）の使用が含まれ、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体での再活性化による凝集、Ｃ．パルバム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）などの細菌細胞又はグラム陰性菌のエンドトキシン若しくはリポ多糖成分との混合物、生理学的に許容できる油性ビヒクル中乳剤、例えばマンニドモノオレイン酸（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）、又は遮断代用物（ｂｌｏｃｋ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）として使用されるペルフルオロカーボンの２０パーセント溶液（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）を伴う乳剤を使用することもできる。他の可能性として、サイトカイン又は合成ＩＦＮ−γ誘導物質、例えばｐｏｌｙ  ｌ：Ｃなどの免疫調節物質を、上記のアジュバントと組み合わせて使用することが挙げられる。
【００４３】
アジュバント効果を実現する別の興味深い可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（これを参照によって本明細書に組み込む）に記載されている技術を使用することである。端的に言えば、本発明の抗原などの関係する抗原は、単球／マクロファージ上のＦｃγ受容体に対して、抗体にコンジュゲートされ得る（又は抗原は抗体フラグメントに結合する）。
【００４４】
ワクチンは、投薬製剤に適合した方法で、治療的に有効で免疫原性が見込まれる量で投与される。投与する量は処置する対象、例えば、個体の免疫系が免疫応答を開始する能力、及び所望される防御の程度などに応じて決まる。好適な投与量範囲は、１ワクチン接種につき数百マイクログラムの活性成分で、順番に、好ましい範囲は約０．１μｇ〜１０００μｇ、例えば約１μｇ〜３００μｇの範囲、特に約１０μｇ〜５０μｇの範囲である。初回投与及び追加接種に好適なレジメンも不定であるが、代表的なものは、初回投与の後の次の接種又は他の投与である。
【００４５】
施用方法は多種多様であり得る。従来のワクチン投与方法の何れかが適用可能である。従来の方法には、固形の生理学的に許容できる基剤で、又は生理学的に許容できる分散液での経口施用、注射などによって非経腸的に、などが含まれると考えられる。ワクチンの投与量は投与経路に依存するであろうし、ワクチン接種される個人の年齢、及び重要性は低いが、ワクチン接種される個人の体の大きさに応じて変化するであろう。
【００４６】
ワクチンは、慣用的には、注射によって、例えば皮下又は筋肉内に非経腸的に投与される。他の投与形態に好適なさらなる製剤には、坐剤、及び場合により経口製剤が含まれる。坐剤については、従来の結合剤及び担体として、例えば、ポリアルカレン（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ）グリコール又はトリグリセリドを挙げることができる。係る坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。経口製剤として、例えば、医薬品グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常使用される賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤又は散剤の形態をとり、１０〜９５％の、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有するのが有利である。
【００４７】
多くの場合、ワクチンを複数回投与することが必要になるであろう。特に、ワクチンは、毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の感染を予防するため、且つ／又は確立したマイコバクテリア感染症を処置するために投与することができる。感染を予防するために投与する場合、ワクチンは、感染症の確定的な臨床徴候又は症状が現れる前に予防的に与えられる。
【００４８】
本発明は、毒性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）によって引き起こされるＴＢに対して、ヒトを含む動物を免疫する方法にも関し、当該方法は、本発明のポリペプチド、若しくは上記の本発明のワクチン組成物、又は上記の生ワクチンを動物に投与するステップを含む。
【００４９】
治療ワクチン
本発明は、ワクチンとして投与されると、実験動物において結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症の重症度を減少させ、又は以前の感染の再活性化を予防するその能力に基づいて、治療ワクチンとして使用するための本発明の融合タンパク質の使用にも関する。治療ワクチン用に使用される組成物は、ワクチンについて上に記載したとおりに調製することができる。
【００５０】
Ｈ６４、Ｈ６８、Ｈ６９、Ｈ７０及びＨ７１：ＥＳＸ−１が関与するポリペプチドを含む融合タンパク質
マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の分泌系は、細胞外環境へ、又は直接的に宿主細胞中へ、毒性因子を排出することを担っており、このため、細菌の毒性及び生存にきわめて重要な役割をする。ＥＳＸ−１分泌系の一部は、弱毒化ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ及び病原性マイコバクテリア種の比較ゲノム解析中に同定された８。主なゲノムの差異の１つは、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ゲノムにおける、分泌抗原ＣＦＰ１０及びＥＳＡＴ−６をコードする領域を含んだ大幅な欠失であった。この領域は、毒性に特に寄与することが観察され、この領域を修復すると、ＥＳＡＴ−６の分泌が可能になっただけでなく、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧにおいて毒性が増大した４。
【００５１】
ＥＳＸ−１分泌系は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群内の全ての病原性マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む成長の遅いマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の中で保存され、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の生存に必要である。分泌されたエフェクター分子の機能は、肉芽腫形成及びファゴソーム成熟の開始に必要であり、ファゴソームからの脱出、細胞溶解及び細胞間伝播、カスパーゼ活性化によるアポトーシス並びにＴＬＲ２シグナル伝達の妨害による免疫調節に必須である６、９。
【００５２】
今日では、ＥＳＸ−１分泌系は、３つの異なる座、即ちＥＳＸ−１の座、ｅｓｐＡオペロン、及び転写制御因子ＥｓｐＲの座によってコードされていることがわかっている１０、１１。ＥＳＸ−１分泌に関与している構成成分の正確な数は今なお議論中であり、異なるマイコバクテリア種間で変化するようである。現在のところ、以下の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子のＥＳＸ−１系に対する関係性が示されている。ｅｓｐＲ、ｅｓｐＡ、ｅｓｐＢ、ｅｓｐＣ、ｅｓｐＤ、ｅｓｐＦ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、ｍｙｃＰ１、ＰＥ３５、Ｒｖ３８６２（ＷｈｉＢ６）、Ｒｖ３８６６、Ｒｖ３８６８、Ｒｖ３８６９、Ｒｖ３８７０、Ｒｖ３８７１、Ｒｖ３８７６、Ｒｖ３８７７、Ｒｖ３８７９ｃ、Ｒｖ３８８１ｃ、Ｒｖ３８８２ｃ、並びにＭＣＥ１タンパク質ＭｃｅｌＢ、Ｍｃｅ１Ｃ、ＭＣｅ１Ｆ及びＲｖ０１７７１２、１３。
【００５３】
実験的に検証された６つのＥＳＸ−１の基質、Ｒｖ３６１６ｃ（ＥｓｐＡ）、Ｒｖ３６１５ｃ（ＥｓｐＣ）、Ｒｖ３８４９（ＥｓｐＲ）、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０及びＲｖ３８８１ｃ（ＥｓｐＢ）は、分泌に対して互いに相互依存している７。
【００５４】
ＥＳＸ−１が分泌する既知の全ての基質は、例えば感染の直後に下方制御されるＡｇ８５及び他の代謝関連の抗原とは対照的に、感染の様々な段階で発現性の高い、強力な抗原である。
【００５５】
ＥＳＸ−１が関与する多くのタンパク質の、感染中の様々な時点での発現性の高さ、及び免疫原性の高さを考慮して、ＥＳＸ−１が関与するタンパク質のうち６つを基にＨ６４骨格の融合タンパク質を作製し、この骨格からＨ６８、Ｈ６９、Ｈ７０及びＨ７１融合タンパク質を作製した。
【００５６】
Ｈ６４融合タンパク質は、実験的に証明された３つのＥＳＸ−１基質（ＥＳＡＴ−６、ＥｓｐＲ、ＥｓｐＣ）とＥＳＸ−１が関与する３つの分泌タンパク質（ＥｓｐＤ、ＰＥ３５及びＥｓｐＦ）とからなる。Ｈ６４融合物中のタンパク質の順序は、ＥＳＡＴ−６、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＣ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＲ、ＰＥ３５であるが、他の何れの順序を使用してもよい。Ｈ６４はアミノ酸７１６個からなり、理論的分子量は７５６９８ｇ／ｍｏｌであり、等電点は４．５６である。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）染色体からコードされる野生型配列において、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＣ及びＥｓｐＲには１つのシステインがある。リフォールディング中の硫黄架橋形成及びタンパク質凝集を伴う問題を回避するため、３つ全てのシステインはアミノ酸セリンで置換されている。
【００５７】
Ｈ６４中の個々のタンパク質についての情報：
ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）は、ＣＦＰ１０と一緒に、ヘテロ二量体としてＥＳＸ−１によって分泌される１４。
ＥｓｐＲ（Ｒｖ３８４９）は、それ自身の発現の転写活性化因子であり、ＥｓｐＡ（Ｒｖ３６１６ｃ）、Ｃ及びＤを含むオペロンである。ＥｓｐＲタンパク質は、ＥＳＸ−１によって分泌される１５。
ＥｓｐＣ（Ｒｖ３６１５ｃ）の遺伝子発現は、ＥｓｐＲによって制御される。ＥｓｐＣは、ＥＳＸ−１によって分泌される１１。
ＥｓｐＤ（Ｒｖ３６１４ｃ）の遺伝子発現は、ＥｓｐＲによって制御される。ＥｓｐＤは、ｅｓｐＣと共転写される。ＥｓｐＤの分泌ではなく発現は、ＥｓｘＡの分泌に必要である。ＥｓｐＤは、ＥｓｐＡ〜ＥｓｐＣの複合体を安定化させる。ＥｓｐＤの分泌は、ＥＳＸ−１系を必要とするだけというわけではない１６。
ＰＥ３５（Ｒｖ３８７２）は分泌ＰＥタンパク質である。遺伝子ｐｅ３５（Ｒｖ３８７２）を不活性化するとＣＦＰ−１０及びＥＳＡＴ−６の発現が損なわれ、これは調節における役割を示唆するものであった。
ＥｓｐＦ（Ｒｖ３８６５）は、分泌タンパク質である。ＥｓｐＦのアミノ酸配列は、ＥｓｐＣと３６％同一である。ＥｓｐＦタンパク質を不活性化するとマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）が弱毒化し、それが生存に重要であることが確認されている。結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＥｓｐＦ変異体の弱毒化の原因は、ＥＳＡＴ−６の分泌の欠如ではなく、むしろ、ＥＳＸ−１系の未知の別の機能による妨害である１７。
【００５８】
Ｈ６８融合タンパク質は、Ｈ６４と同じタンパク質を含むが、ＥＳＡＴ−６については、これが結核の診断において重要であるため、この構築物中では除外している。即ち、Ｒｖ３６１４ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３８６５−Ｒｖ３８４９−ＰＥ３５を含む。
【００５９】
Ｈ６９融合タンパク質は、Ｈ６８と同じタンパク質を含むが、ＥｓｐＣ（Ｒｖ３６１６ｃ）を追加している。即ち、Ｒｖ３６１４ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３６１６ｃ−Ｒｖ３８６５−Ｒｖ３８４９−ＰＥ３５を含む。
【００６０】
Ｈ６９中の追加のタンパク質についての情報
ＥｓｐＣ（Ｒｖ３６１６ｃ）遺伝子発現は、ＥｓｐＲによって制御される。ＥｓｐＣは、ＥＳＸ−１によって分泌される１１。
【００６１】
Ｈ７０融合タンパク質は、Ｈ６９と同じタンパク質を含むが、ＥｓｐＢ（Ｒｖ３８８１ｃ）を追加している。即ち、Ｒｖ３８８１ｃ−Ｒｖ３６１４ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３６１６ｃ−Ｒｖ３８６５−Ｒｖ３８４９−ＰＥ３５を含む。
【００６２】
Ｈ７０中の追加のタンパク質についての情報
ＥｓｐＢ（Ｒｖ３８８１ｃ）は、ＥＳＸ−１分泌系によって分泌される。それは、分泌過程中に膜に固定化されたプロテイナーゼＭｙｃＰ１によって開裂される１８。
【００６３】
Ｈ７１融合タンパク質は、Ｈ６８と同じタンパク質を含むが、ＥｓｐＢ（Ｒｖ３８８１ｃ）を追加している。即ち、Ｒｖ３８８１−Ｒｖ３６１４−Ｒｖ３６１５−Ｒｖ３８６５−Ｒｖ３８４９−ＰＥ３５を含む。
【００６４】
Ｈ６５、Ｈ７２及びＨ７３：ＥＳＡＴ−６ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質
マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来の幾つかの分泌タンパク質は、強力な細胞免疫応答を誘導することが示されている１８。認識される頻度が最も高い、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の２つのＴ細胞抗原は、低分子分泌タンパク質、ＥＳＡＴ−６（６−ｋＤａ初期分泌抗原性標的）及びＣＦＰ−１０（１０ｋＤａ培養濾液タンパク質）であり、Ｅｓｘファミリーのプロトタイプである１９。ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０をコードする遺伝子は、互いに直接隣接する位置にあり、共転写される２０。結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖゲノム配列の解析により、パラロガスなＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質をコードする１１対のタンデム遺伝子が明らかになった１。
【００６５】
ＥＳＡＴ−６（ｅｓｘ）ファミリーは、２３メンバー（１１の遺伝子対及び１個の単一遺伝子、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ１０３７ｃ、Ｒｖ１０３８ｃ、Ｒｖ１１９７、Ｒｖ１１９８、Ｒｖ１７９２、Ｒｖ１７９３、Ｒｖ２３４６ｃ、Ｒｖ２３４７ｃ、Ｒｖ３０１７ｃ、Ｒｖ３０１９ｃ、Ｒｖ３０２０ｃ、Ｒｖ３４４４ｃ、Ｒｖ３４４５ｃ、Ｒｖ３６１９ｃ、Ｒｖ３６２０ｃ、Ｒｖ３８７４、Ｒｖ３８７５、Ｒｖ３８９０ｃ、Ｒｖ３８９１ｃ、Ｒｖ３９０４ｃ及びＲｖ３９０５ｃ）を有する。配列同一性はＥｓｘタンパク質間で３５％〜９８％変化するが、その全てがＷＸＧ１００ファミリーに属し、アミノ酸約１００個のサイズ及びＴｒｐ−Ｘａａ−Ｇｌｙ（Ｗ−Ｘ−Ｇ）モチーフの存在を特徴とする２１。これまで、ＥＳＡＴ−６ファミリーメンバーの正確な生物学的機能は解明されていないが、これらは毒性因子である。
【００６６】
ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０は、相互作用して１：１ヘテロ二量体を形成し、これは、ＥＳＸ−１分泌系によるこれらの分泌に必須である２２。他の２組のパラロガスな遺伝子対、ＥｓｘＲ−ＥｓｘＳ及びＥｓｘＨ−ＥｓｘＧにコードされるタンパク質も１：１複合体を形成し、これが全てのＥｓｘタンパク質対に典型的であり得ることを示唆している２３、２４。
【００６７】
ＥｓｘＨ−ＥｓｘＧ複合体は、ＥＳＸ−３によって分泌される。それはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長に必須であり、鉄／亜鉛ホメオスタシスに関与し２５、２６、鉄依存性転写抑制因子ＩｄｅＲ及び亜鉛取り込み制御因子Ｚｕｒによって制御される２７、２８。
【００６８】
ＥＳＸ−５は、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）におけるＰＥタンパク質及びＰＰＥタンパク質の分泌、及びマクロファージ破壊に必要であることが知られている２９  ３０。まず間違いなく、それは、５つのＥＳＡＴ−６パラログ、ｅｓｘｌ（ｒｖ１０３７ｃ）、ｅｓｘＬ（ｒｖ１１９８）、ｅｓｘＯ（ｒｖ２３４６ｃ）、ｅｓｘＶ（ｒｖ３６１９ｃ）及び５つのＣＦＰ１０パラログ、ｅｓｘＪ（ｒｖ１０３８ｃ）、ｅｓｘＫ（ｒｖ１１９７）、ｅｓｘＰ（ｒｖ２３４７ｃ）、ｅｓｘＷ、（ｒｖ３６２０ｃ）の分泌も担っている。Ｍ・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）における、ＥＳＸ−５が仲介するタンパク質分泌の機能は、中等度及び持続性の感染症を確立することである３１。ＥＳＸ−５を欠損したマイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）は、過度に毒性で、ＥＳＸ−５は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）にも見られる。
【００６９】
ＥＳＸ−２及びＥＳＸ−４の機能は、依然として解明されていないが、他のＥＳＸ分泌系との機能的及び物理的相同性を基にすると、これらはそれぞれｅｓｘＣ−ｅｓｘＤ複合体及びｅｓｘＴ−ｅｓｘＵ複合体を分泌しているようである。
【００７０】
ＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染中に発現性が高く、免疫原性が高く、実験データはワクチン接種後のその防御効果を裏付けているため３２、３３、６つのＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質を基にＨ６５融合タンパク質を構築した。ワクチンを現在の診断検査に適合させるため、最も主要なファミリーメンバー−ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０−を含めなかった。
【００７１】
Ｈ６５融合物中のＥＳＡＴ−６タンパク質の順序は、Ｒｖ３８９１ｃ−Ｒｖ３８９０ｃ−Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８−Ｒｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃであるが、何れの順序を使用してもよい。３組のタンパク質結合対のそれぞれの間に９個のアミノ酸ＧＬＶＰＲＧＳＴＧリンカー配列を挿入して、タンパク質フォールディング及び二量体形成を可能にする。Ｒｖ３８９０ｃとＲｖ０２８７の間に２０個のアミノ酸ＬＩＧＡＨＰＲＡＬＮＶＶＫＦＧＧＡＡＦＬリンカーを挿入し、Ｒｖ０２８８とＲｖ３６３０ｃの間に２０個のアミノ酸ＬＧＦＧＡＧＲＬＲＧＬＦＴＮＰＧＳＷＲＩリンカーを挿入する。双方の２０個のアミノ酸リンカーの配列は、Ｒｖ１８８６Ｍ．ツベルロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｌｏｓｉｓ）ＨＲｖ３７タンパク質配列に由来し、このタンパク質中のアミノ酸ポスション（ｐｏｓｔｉｏｎ）６１〜８０及び１６１〜１８０に対応する３４。これらのリンカーを含めた理由は、これらがヒトエピトープであることが示されており、これらに対するＴ細胞応答が多量のサイトカインＩＬ−２を分泌するからである。ＩＬ−２は、Ｔ細胞の成長、増殖及びエフェクターＴ細胞になるための分化に必要である。ワクチンが誘導したＴ細胞プールの多様性を増加させることに加えて、これらのＩＬ−２を分泌するＴ細胞は、他のＴ細胞がナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へ分化するのにサイトカインの助けを供与し得る。
【００７２】
Ｈ７２融合物中のＥＳＡＴ−６タンパク質の順序は、Ｒｖ３６１６ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃ−Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８−であるが、何れの順序を使用してもよい。
【００７３】
Ｈ７３融合物中のＥＳＡＴ−６タンパク質の順序は、Ｒｖ３８８１ｃ−Ｒｖ３６１６ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃ−Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８−であるが、何れの順序を使用してもよい。
【００７４】
Ｈ６７：潜伏ポリペプチドＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１２８４を含む融合タンパク質
Ｈ１ワクチン、Ａｇ８５Ｂ及びＥＳＡＴ−６（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６）のタンパク質融合物は、一次感染に対してきわめて効率的なワクチンであるが、２つの抗原の発現プロファイルのため、それは感染の初期段階に主要な効果を有する。感染の初期及び後期の両段階において有効な（持続性及び潜伏からの再活性化）ワクチンを開発するために、Ｈ１融合タンパク質にＲｖ１２８４を豊富に含めた。発現試験では、後期段階の感染症をシミュレートするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、Ｒｖ１２８４の発現が強力であることが示された。したがって、Ｒｖ１２８４を加えることによって、初期感染段階におけるＨ１の防御効果を高めるだけでなく、その効果を感染の後期段階に拡張することが可能であるはずである。
【００７５】
Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６及びＲ１２８４を基にＨ６７融合タンパク質をデザインした。これらはタンパク質の順序を反映するものであるが、何れの順序のポリペプチドを使用してもよい。Ｈ６７はアミノ酸５４９個からなり、理論的分子量は５９５４８ｇ／ｍｏｌであり、等電点は５．３６である。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）染色体からコードされる野生型配列において、Ａｇ８５Ｂには３つのシステインがあり、Ｒｖ１２８４には３つのシステインがある。リフォールディング中の硫黄架橋形成及びタンパク質凝集に関する問題を回避するため、３つのシステインの全てがアミノ酸セリンで置換されている。
【００７６】
Ｈ６７中の個々のタンパク質についての情報：
Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６ｃ）は、ミコリルトランスフェラーゼ８５Ｂ、細胞外タンパク質であり、融合タンパク質の中で最も免疫原性のタンパク質として選択され、Ａｇ８５Ｂ発現において初期の一過的な増加を特徴とするが、感染から１０日後には既に、細菌のＡｇ８５Ｂ発現レベルはＣＦＵにつき約１５倍低下し、この低レベルは感染から少なくとも１００日後まで維持される３５。
ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）は、ＣＦＰ１０と一緒に、ヘテロ二量体としてＥＳＸ−１によって分泌される。ＥＳＸ−１の基質ＥＳＡＴ−６は、感染中の様々な時点で高い発現性を示し、高い免疫原性を呈する。
Ｒｖ１２８４は、β−炭酸脱水酵素をコードしており、この遺伝子は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に必須であることが示されている。この遺伝子の発現は、栄養素の不足した培養物において１４〜４０倍増加することが以前に報告されている３６。
0006470179.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、単一抗原の予防ワクチン接種後のマウスにおけるマイコバクテリア負荷。エアゾール曝露から６週間後に、個々のマウスの肺において、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌数を計数した。曝露の前に、マウスの各群に個別の抗原又はＢＣＧのワクチン接種をし、１つの群には生理食塩水注射を施した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、テューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して、曝露から６週間後に、ワクチン接種した群における細菌数が、生理食塩水対照群の動物の肺の中より有意に少ないか（＊＊＊ｐ＜０．０１）どうかの統計的検定を行った。平均及び標準誤差（ＳＥＭ）を各群について示す。
【図２】図２は、Ｈ６４ワクチン接種後の、免疫応答及びマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）負荷。ＣＡＦ０１アジュバント（ＤＤＡ／ＴＤＢ）中融合タンパク質Ｈ６４又はＨ５６（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ２６６０ｃ）のワクチン接種の後、２つの融合物中の個々のタンパク質に対するＴ細胞応答を試験した（Ａ）。単一抗原で３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激をした後、分泌されたＩＦＮ−ｇを読み取った。結核菌（Ｍ．ｔｂ）に曝露してから６週間後に、肺の中の細菌負荷を測定し、一元配置ＡＮＯＶＡをテューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して群間比較した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５。平均及びＳＥＭを各群について示す。
【図３】図３は、曝露後のＲｖ３６１４又はＲｖ３６１５ｃのワクチン接種が、ワクチンに特異的な有意な免疫応答をもたらした。ワクチン接種から１週間後に、マウスの肺から得られたリンパ球を使用して、ワクチンが誘導したＴ細胞免疫応答を評価した。ワクチン抗原、即ち（Ａ）Ｒｖ３６１４又は（Ｂ）Ｒｖ３６１５ｃで５時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激をした後、細胞培養物中のサイトカイン陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の発現頻度（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α又は何れかの組合せを発現）を読み取った。感染が引き起こす免疫応答のための対照抗原としてＴＢ１０．４を含めた。データは平均として示し、４匹のマウスのプールを表す。
【図４】図４は、曝露後のＨ６４のワクチン接種。ワクチン応答及び防御効果。曝露後のＨ６４のワクチン接種の後、個々のタンパク質及び／又は融合物全体に対するＴ細胞応答を試験した（Ａ、Ｂ及びＤ）。単一抗原又は融合タンパク質全体で３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後、ＩＦＮ−γ分泌について、ワクチン接種したＦｖＢマウス（Ａ）とＣＢ６Ｆ１マウス（Ｄ）の両方、及び対照マウス（Ｂ）で読み取りを行った。（Ｃ）結核菌（結核菌（Ｍ．ｔｂ．））曝露から３７週間後（最後のワクチン接種から２１週間後）、肺の中の細菌負荷を測定し、一元配置ＡＮＯＶＡを、テューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して、群間比較した。平均及びＳＥＭを各群について示す。
【図５】図５は、単一抗原の予防ワクチン接種後に、マウスにマイコバクテリアの結核を負荷。エアゾール曝露から６週間後に、個々のマウスの肺において、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌数を計数した。曝露の前に、マウスの各群に個別の抗原又はＢＣＧのワクチン接種をし、１つの群には生理食塩水注射を３回施した。Ａ及びＢにはＢ６Ｃ３Ｆ１マウス系統を使用し、ＣにはＣＢ６Ｆ１系統を使用した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、テューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して、曝露から６週間後に、ワクチン接種した群における細菌数が、生理食塩水対照群の動物の肺の中より有意に少ないか（＊＊＊ｐ＜０．０１）どうかの統計的検定を行った。平均及び標準誤差（ＳＥＭ）を各群について示す。
【図６】図６は、ＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、動物１匹につきワクチン接種一巡当たりタンパク質用量０．０１〜２５μｇを使用してＨ６４融合タンパク質を、又は５μｇのＨ５６融合タンパク質を、３回ワクチン接種した。３回目のワクチン接種から３週間後に、ワクチン抗原で再刺激することによって、ワクチンに特異的なＴ細胞応答を、脾臓中（Ａ）（ｎ＝３）及び血液中（Ｂ）で測定した。ワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｂ）株エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。感染から６週間後に、個々のマウスの肺において、結核菌（Ｍ．ｔｂ）細菌数を計数した（Ｃ）。ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を使用して、ワクチン接種した群における細菌数が、生理食塩水対照群の動物の肺の中より有意に少ないか（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）どうかの統計的検定を行った。
【図７】図７は、単一抗原の予防ワクチン接種後のマウスにおけるマイコバクテリア負荷。エアゾール曝露から６週間後に、個々のマウスの肺において結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌数を計数した。曝露の前に、マウスの各群にＲｖ３８９１、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０又はＢＣＧのワクチン接種、又は生理食塩水注射を施した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、テューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して、細菌負荷を群間比較した（生理食塩水群に対して＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、ＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質の二量体融合物。６つの融合体の概略図（Ａ）。ＣＦＰ１０パラログは、Ｒｖ３８９１ｃ、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ３４４５ｃ、Ｒｖ３６２０ｃ、Ｒｖ３９０５ｃ又はＣＦＰ１０である。ＥＳＡＴ−６パラログは、Ｒｖ３８９０ｃ、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ３４４４ｃ、Ｒｖ３６１９ｃ、Ｒｖ３９０４ｃ又はＥＳＡＴ−６である。リンカーのアミノ酸配列は、６つの構築物の全てにおいて、ＧＬＶＰＲＧＳＴＧである。エアゾール曝露から６週間後に、個々のマウスの肺における防御効果を、ＣＢ６Ｆ１マウスについて（Ｂ）、及びＢ６Ｃ３Ｆ１マウスについて（Ｃ）測定した。ワクチンが誘導した応答をＢ６Ｃ３Ｆ１マウスにおいて、３回目のワクチン接種から３週間後に単離したＰＢＭＣを刺激することによって判定した。（Ｄ）各パネルは１つのワクチン接種群の結果を説明する。各群のＰＢＭＣを、ワクチン抗原又は対照タンパク質（ＢＳＡ）で刺激した。
【図９】図９は、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスへのＨ６５のワクチン接種。９ａａリンカー（Ｌ）又は２０ａａリンカー（ＬＬ１及びＬＬ２）によって分割されている６つのＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質からなるＨ６５融合物の概略図（Ａ）。９ａａリンカーは、二量体融合物に使用されるリンカーと同一である（ＧＬＶＰＲＧＳＴＧ）。ＬＬ１リンカーの配列は、ＬＩＧＡＨＰＲＡＬＮＶＶＫＦＧＧＡＡＦＬであり、ＬＬ２リンカーについてはＬＧＦＧＡＧＲＬＲＧＬＦＴＮＰＧＳＷＲＩである。フローサイトメトリ（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉ）によって測定した、３回目のＨ６５ワクチン接種から３週間後に単離した脾細胞中の、ＥＳＸ−２（Ｒｖ３８９１−ｃ−Ｒｖ３８９０ｃ）、ＥＳＸ−３（Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８）及びＥＳＸ−５（Ｒｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃ）二量体基質の各々に対するサイトカイン応答（Ｂ）。Ｈ６５又はＢＣＧの予防ワクチン接種後のＢ６Ｃ３Ｆ１マウスにおけるマイコバクテリア負荷（Ｃ）。エアゾール曝露から６週間後に、個々のマウスの肺において、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌数を計数した。一元配置ＡＮＯＶＡを、テューキーの多重比較検定と組み合わせて使用して、細菌負荷を群間比較した（生理食塩水群に対して＊ｐ＜０．１）。
【図１０】図１０は、ＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＨ６５ワクチン接種−免疫応答及び防御効果。３回目のＨ６５／ＣＡＦ０１のワクチン接種（Ａ）又は３回目の生理食塩水の注射（Ｂ）から３週間後に単離した脾細胞による、サイトカインＩＦＮ−γの、抗原に特異的な分泌。曝露から６週間後（Ｃ）及び２４週間後（Ｄ）の４群のＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＣＦＵ。
【図１１】図１１は、曝露後のＨ６５のワクチン接種の後にワクチンが誘導した免疫応答。曝露後のＨ６５のワクチン接種の後、個々のタンパク質及び／又は融合物全体に対するＴ細胞応答を試験した（Ａ〜Ｃ）。ＣＢ６Ｆ１マウス系統に単一抗原で３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後（Ｃ）、及びＦｖＢマウス系統に単一抗原と融合タンパク質全体の両方で３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後のＩＦＮ−γ分泌を読み取った（Ａ：ワクチン接種、及びＢ：対照）。
【図１２】図１２は、２つのマウス系統におけるＲｖ１２８４（ｃａｎＡ）ワクチン接種。ＰＢＭＣを、２μｇのＲｖ１２８４若しくはＲｖ０２８７、又は緩衝液対照で７２時間インキュベートした後、分泌されたサイトカインＩＦＮ−γを細胞培地中で測定した。３回目のＲｖ１２８４／ＣＡＦ０１ワクチン接種から２週間後に、ＰＢＭＣを、ＣＢ６Ｆ１マウス（Ａ）又はＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（Ｂ）から単離した。Ｍｔｂ曝露から６週間後に、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の数をＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃ）又はＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（Ｄ）において測定した。
【図１３】図１３は、Ｈ１＋Ｒｖ１２８４ワクチン接種。Ｍｔｂのエアゾール曝露から６週間後の、ＦＶＢマウスの各群における細菌負荷（ＣＦＵ）。マウスに、５μｇのＨ１（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６）／ＣＡＦ０１、ＣＡＦ０１中に配合した５μｇ（合計）のＨ１（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６）＋Ｒｖ２８４を３回ワクチン接種、又は生理食塩水を３回注射した（対照群）。
【図１４】図１４は、曝露後の、抗原Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６又はＲｖ１２８４のワクチン接種の後の免疫応答。ワクチン接種から１週間後に、マウスの肺から得られたリンパ球を使用して、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６−又はＲｖ１２８４、Ｈ６７の全ての構成成分に対してワクチンが誘導したＴ細胞免疫応答を評価した。ワクチン抗原で５時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激をした後、細胞培養物中のサイトカイン陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の発現頻度（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α又は何れかの組合せを発現）を読み取り、（Ａ）Ａｇ８５Ｂ、（Ｂ）ＥＳＡＴ６及び（Ｃ）Ｒｖ１２８４について示している。感染が引き起こす免疫応答のための対照抗原としてＴＢ１０．４を含めた。データは平均として示し、４匹のマウスのプールを表す。
【図１５】図１５は、対数期及び飢餓条件の培養濾液タンパク質の２Ｄ  ＤＩＧＥ画像。番号をつけたタンパク質のスポットを、銀染色した後の２Ｄ  ＤＩＧＥゲルから摘出し、ＭＳによる同定を行った。スポット＃１６６６及び１６６９は、それぞれＰＭＦ及びＭＳ／ＭＳによって、Ｒｖ１２８４であると同定された。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
実施例
実施例１：予防ＴＢワクチン接種モデルにおける単一タンパク質及び防御
ＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した組換えタンパク質のうち１つ５μｇを３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図１）。個々のＥＳＸ−１が関与するタンパク質−Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３６１４ｃ及びＲｖ３８４９−のワクチン接種は、結核に対して同等で有意な防御を誘導し、このように、ＢＣＧのレベルほどではなかった。
【００７９】
実施例２：Ｈ６４融合タンパク質−予防ＴＢワクチン接種モデルにおける免疫応答及び防御
ＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した融合タンパク質Ｈ５６又はＨ６４のうち１つ５μｇを３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から３週間後に、動物から採血し、ＰＢＭＣを単離し、ワクチンが誘導したＴ細胞応答を測定した。５×１０６個のＰＭＢＣを、２つの融合タンパク質中に存在する個々のタンパク質２μｇで３日間インキュベートし、分泌されたＩＦＮ−ｇを培地中でＥＬＩＳＡによって測定した（図２Ａ）。Ｈ５６をワクチン接種した動物では、Ａｇ８５Ｂ及びＥＳＡＴ−６の認識が強く、第３のタンパク質、Ｒｖ２６６０ｃの認識は弱い。Ｈ６４をワクチン接種した動物は、ＥＳＡＴ−６及びＲｖ３６１４に特異的な応答が強く、ＰＥ３５（Ｒｖ３８７２）及びＲｖ３８４９に対する応答は中程度である。この近交系マウスでは、Ｒｖ３８６５及びＲｖ３６１５ｃに対する応答はない。生理食塩水を注射した動物に応答はなく、これらの応答はワクチンに特異的であることが確認された。
【００８０】
３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖ（図２Ｂ）又は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）（図２Ｃ）にエアゾールで曝露した。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図２Ｂ及び２Ｃ）。
【００８１】
両実験において、Ｈ６４又はＨ５６のワクチン接種は、生理食塩水対照群と比較して有意な防御を誘導した。さらに、Ｈ５６及びＨ６４をワクチン接種した動物におけるＣＦＵを統計的に比較すると、Ｈ３７Ｒｖ曝露後に、Ｈ６４はＨ５６より有意に細菌数を減少させたことが明らかになった（図２Ｂ）。
【００８２】
実施例３：曝露後ＴＢワクチン接種モデルにおけるワクチン接種後のＲｖ３６１４ｃ及びＲｖ３６１５ｃの免疫応答
曝露後ＴＢワクチン接種モデルにおいて、最初にマウスをエアゾール経路で結核菌（Ｍ．ｔｂ．）に曝露する。感染の潜伏段階を模倣するため、感染後（ｐ．ｉ．）６〜１２週間、抗生物質を飲料水に入れてマウスに自由に与える。感染から１０週間後、１３週間後及び１６週間後に、マウスの各群にリポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した５μｇの組換えタンパク質又は等しい体積の塩水（２００μｌ）をワクチン接種した。最後のワクチン接種から１週間後（感染後１７週間）、ワクチンが誘導した免疫応答を肺において評価し、肺リンパ球をワクチン−抗原又はＴＢ１０．４で６時間再刺激した後、細胞内サイトカイン染色によって判定した。（図３）。Ｒｖ３６１４ｃ又はＲｖ３６１５ｃのワクチン接種は、対照マウスの肺において同等のレベルでの測定が不可能なほど有意な、ワクチンに特異的な免疫応答を誘導した。
【００８３】
実施例４：Ｈ６４融合タンパク質−曝露後ＴＢワクチン接種モデルにおける免疫応答及び防御
曝露後ＴＢワクチン接種モデルを、実施例３に記載したとおりに作製し、これを使用してＨ６４融合タンパク質での曝露後免疫処置の効果を評価した。マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した５μｇのＨ６４を３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。Ｈ６４の免疫原性を、ＣＢ６Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＢＡＬＢ／ｃ）マウス（図Ａ〜Ｃ）及びＦｖＢマウス（図４Ｄ）の両方で評価した。３回免疫処置した後、リンパ球をマウスの肺から得、個々の構成成分及び／又は融合タンパク質でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した。感染から１７週間後に、ワクチンが誘導した応答を測定したが、感染が引き起こす応答は、生理食塩水注射した対照群において測定すると、ごくわずかしかなかった（図４Ｂ）。これは、ワクチン接種した群において測定したＩＦＮ−γ応答（図４Ａ及びＤ）とは対称的である。予測どおり、認識パターンは、２つの異なるマウス系統、ＦｖＢ（図４Ａ）とＣＢ６Ｆ１（図４Ｄ）とで異なっていた。ＦｖＢマウスのＨ６４ワクチン接種は、主に、Ｒｖ３６１５ｃに対するＩＦＮ−γ応答を誘導したが、一方、ＣＢ６Ｆ１マウスでは、応答は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ３６１４ｃ、Ｒｖ３８４９、及びこれらより程度は低いがＲｖ３８７２に対して誘導された。したがって、Ｈ６４は、相当量のＩＦＮ−γの産生をもたらす、免疫原性の高いワクチンである。感染から３７週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々のマウスの肺における細菌数を、肺ホモジネートの連続希釈物をプレーティングし、３７℃で２〜３週間インキュベートしてからコロニーの数を計数することによって求めた。この時点で、対照動物の平均細菌負荷は４．０２１ｌｏｇ１０ＣＦＵで、ＢＣＧワクチン接種後の平均細菌負荷（３．８０７ｌｏｇ１０ＣＦＵ）とあまり変わらず、一方、Ｈ６４をワクチン接種したものの細菌負荷はそれより幾分低かった（２．９１７ｌｏｇ１０ＣＦＵ）（図４Ｃ）。
【００８４】
実施例５：２つの予防ＴＢワクチン接種モデルにおける、エアゾールＴＢ曝露に対する、７つのＥＳＸ−１抗原の単一タンパク質による防御
ＣＢ６Ｆ１マウス又はＢ６Ｃ３Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した組換えタンパク質のうち１つ５μｇを３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図５Ａ〜Ｃ）。
【００８５】
Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統において（図５Ａ及びＢ）、ＥＳＸ−１が関与する７つの個々のタンパク質−Ｒｖ３６１６ｃ、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３６１４ｃ、Ｒｖ３８６５、ＥＳＡＴ−６、Ｒｖ３８４９又はＲｖ３８７２−のワクチン接種は、生理食塩水対照群に対して、個々の動物の肺における細菌負荷が０．３０〜１．３１ｌｏｇ１０減少値の範囲の様々な程度の防御を誘導した。どの単一タンパク質も、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧワクチン接種後に得られた１．５３ｌｏｇ１０減少値には届かなかった。ＣＢ６Ｆ１マウス系統において（図５Ｃ）、７つのタンパク質のうち４つ、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３６１４ｃ、ＥＳＡＴ−６及びＲｖ３８４９のワクチン接種は、０．２４〜０．５２ｌｏｇ１０の間のＣＦＵ減少をもたらす防御免疫応答を誘導した。
【００８６】
実施例６：ＣＢ６Ｆ１マウス系統へのＨ６４の至適予防ワクチン接種用量は、ＣＡＦ０１中５μｇのタンパク質である。
ＣＢ６Ｆ１又はマウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した種々の用量の組換えＨ６４融合タンパク質を３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。免疫処置から３週間後に、脾臓（図６Ａ）及び血液（図６Ｂ）中に存在する、ワクチンに特異的な可能性のあるＴ細胞を、単離したＰＢＭＣ及び脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激することによって測定した。ワクチン用量が多いほど、Ｔ細胞応答が強いという一般的傾向。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図６Ｃ）。５μｇのＨ６４での免疫処置により、細菌数が最も少ないが、最良の防御がもたらされた。
【００８７】
実施例７：予防ＴＢワクチン接種モデルにおける単一タンパク質及び防御
ＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した組換えタンパク質のうち１つ５μｇを３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図７）。ＥＳＸ−２及びＥＳＸ−５の個々の分泌タンパク質−Ｒｖ３８９１、Ｒｖ３６１９及びＲｖ３６２０−のワクチン接種は、結核に対して同等で有意な防御を誘導したが、ＢＣＧのレベルほどではなかった。
【００８８】
実施例８：ＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６ファミリー融合物−予防ＴＢワクチン接種モデルにおける免疫応答及び防御
パラロガスなＥＳＡＴ−６ファミリータンパク質のうち１２個を、６つのタンパク質二量体として融合した：ＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６、Ｒｖ３８９１ｃ−３８９０ｃ、Ｒｖ０２８７−０２８８、Ｒｖ３４４５ｃ−３４４４ｃ、Ｒｖ３６２０ｃ−３６１９ｃ及びＲｖ３９０５ｃ−３９０４ｃ（図８Ａ）。全てのコンストラックス（ｃｏｎｓｔｒｕｃｓ）において、２つのタンパク質を、アミノ酸９個の長さのスペーサー配列（ＧＬＶＰＲＧＳＴＧ）によって分割した。ＣＢ６Ｆ１マウス又はＢ６Ｃ３Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した組換え二量体タンパク質の各々５μｇを３回ワクチン接種、等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射、又はＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の間隔は２週間とし、３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露した。曝露から６週間後に全てのマウスを安楽死させ、個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図８Ｂ及びＣ）。ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて、ＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６、Ｒｖ３８９１ｃ−３８９１ｃ又はＲｖ０２８７−０２８８のワクチン接種により、肺における細菌数のｌｏｇ１０減少値は０．２５〜０．４５の間になった（図８Ｂ）。同じ３つの二量体融合物及びＲｖ３６２０ｃ−３６１９ｃは、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを防御した（図８Ｃ）。２つの系統の何れにおいても、試験した二量体融合物の防御効果は、ｌｏｇｌ０減少値１．４及び０．８５を誘導した生ワクチンＢＣＧのレベルではなかった。Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスでは、ＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６、Ｒｖ０２８７−０２８８、Ｒｖ３４４５ｃ−３４４４ｃ、Ｒｖ３６２０ｃ−３６１９ｃ及びＲｖ３９０５ｃ−３９０４ｃのワクチン接種をした群で、３回目のワクチン接種から３週間後に、ワクチンに特異的な応答が血液中に見られた（図８Ｄ）。
【００８９】
実施例９：Ｈ６５融合タンパク質−予防ＴＢワクチン接種モデルにおける免疫応答及び防御
Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスの各群に、ＣＡＦ０１アジュバント中に配合した５μｇのＨ６５（図９Ａ）を３回、又は生ワクチンウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧを１回ワクチン接種した。ＥＳＸが分泌した３つの二量体の各々に対してワクチンが誘導する応答を確認するため、３回目のワクチン接種から３週間後に脾細胞を単離した。５×１０６個のスペノサイツ（ｓｐｅｎｏｃｙｔｅｓ）をＲｖ３８９１ｃ−Ｒｖ３８９０ｃ、Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８又はＲｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃの各二量体融合タンパク質の何れか２μｇで６時間刺激した。抗原刺激に応答した、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γサイトカインのＣＤ４  Ｔ細胞発現を、多色フローサイトメトリで測定した（図９Ｂ）。応答の順位はＲｖ３８９１ｃ−Ｒｖ３８９０ｃ＞Ｒｖ０２８７−Ｒｖ０２８８＞Ｒｖ３６２０ｃ−Ｒｖ３６１９ｃであったが、３つの二量体タンパク質の全てについて、ＩＬ−２＋、ＴＮＦ−α＋、ＩＦＮ−γ＋及びＩＬ−２＋、ＴＮＦ−α＋のＣＤ４  Ｔ細胞を含む、ワクチンに特異的な多機能性のＴ細胞が観察された。３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露し、その６週間後に安楽死させた。個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図９Ｃ）。Ｈ６５及びＢＣＧの両方が有意な防御を誘導した（ｌｏｇ１０減少値約０．７）。
【００９０】
ＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、ＣＡＦ０１アジュバント中に配合した５μｇのＨ６５（図９Ａ）又はＨ５６（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６とＲｖ２６６０ｃとの融合物）を３回、又は生ワクチンウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧを１回ワクチン接種した。Ｈ６５中の６つの抗原のうちどれがＣＢ６Ｆ１近交系マウスにおいて免疫原性であるかを確証するため、３回目のワクチン接種から３週間後にスプレニオサイツ（ｓｐｌｅｎｉｏｃｙｔｅｓ）を単離した。５×１０６個のスペノサイツ（ｓｐｅｎｏｃｙｔｅｓ）を、Ｒｖ３８９１ｃ、Ｒｖ３８９０ｃ、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ３６２０ｃ又はＲｖ３６１９ｃの各単一タンパク質２μｇで７２時間刺激した（図１０Ａ）。Ｈ６５をワクチン接種した動物から単離し、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ３６２０ｃ又はＲｖ３６１９ｃで刺激した細胞の培地には相当量のＩＦＮ−γが放出されたが、一方、Ｒｖ３８９１ｃに対してもＲｖ３８９０ｃに対しても応答はなかった（図１０Ａ）。生理食塩水を注射した動物では、刺激後、６つの抗原の何れにも応答はなかった（図１０Ｂ）。
【００９１】
３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露し、その６週間後又は２４週間後に安楽死させた。個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図１０Ｃ及びＤ）。曝露から６週間後に（図９Ｃ）、Ｈ６５及びＨ５６は両方とも同様の有意な防御をもたらした（ｌｏｇ１０減少値約０．８）。曝露から２４週間後に（図１０Ｄ）、Ｈ６５又はＨ５６のワクチン接種は、依然として肺における細菌数の同等の減少を誘導したが、対照群（ＣＡＦ０１）と比較すると、その差はもはや統計的に有意なものではなかった（ｌｏｇ１０減少値＝Ｈ６５で０．３７及びＨ５６で０．３４）。
【００９２】
実施例１０：Ｈ６５融合タンパク質−２つのマウス系統における曝露後ワクチン接種後の免疫応答
曝露後ＴＢワクチン接種モデルにおいて、最初にマウスをエアゾール経路で結核菌（Ｍ．ｔｂ．）に曝露する。感染の潜伏段階を模倣するため、感染後（ｐ．ｉ．）６〜１２週間、抗生物質を飲料水に入れてマウスに自由に与える。ＦｖＢマウス又はＣＢ６Ｆ１マウスの各群に、リポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合した５μｇのＨ６５を３回ワクチン接種、又は等しい体積の塩水（２００μＬ）を３回注射した。
【００９３】
感染から１７週間後、Ｈ６５の構成成分（Ｒｖ３８９１ｃ、Ｒｖ３８９０ｃ、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ３６２０ｃ、Ｒｖ３６１９ｃ）に特異的な、感染が引き起こす免疫応答を、感染したＦｖＢマウスの肺において測定したが、応答はほとんど検出されなかった（図１１Ｂ）。ワクチン接種後、ＦｖＢマウス系統において、Ｒｖ３６１９ｃに対する肺の中の明白な応答を測定した（図１１Ａ）。ＣＢ６Ｆ１マウス系統では、さらに、Ｒｖ０２８７及びＲｖ０２８８に対して生じた応答があった（図１１Ｃ）。したがって、Ｈ６５融合タンパク質は免疫原性が高く、ワクチンに特異的なＩＦＮ−γ放出を強く誘導する。感染から３７週間後に、細菌数を個々のマウスにおいて計数した（図１０Ｄ）。Ｈ６５ワクチン接種群と陰性対照群を比較すると、Ｈ６５をワクチン接種した動物にはＣＦＵの減少が見られる。防御レベルは陽性対照（Ｈ５６）と同等で、ＢＣＧワクチンについてよりも顕著であった。
【００９４】
実施例１１：Ｒｖ１２８４タンパク質の発現量は栄養飢餓で増加する
Ｒｖ１２８４は、以前、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）溶解物中でプロテオミクスによって同定された３７。栄養飢餓でのタンパク質の発現量を調査するため、二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ  ＤＩＧＥ）を施用して、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖ細菌の培養濾液（ＣＦ）及び溶解物プロテオームを、正常な対数期成長において、及び６週間の栄養飢餓の後で調査した。
【００９５】
変法ソートン培地２００ｍｌを含有するエルレンマイヤーフラスコに、ｍｌ当たり２×１０６個の細菌を播種し、３７℃の標準的な振盪培養器に入れた。対数期への７日間の成長の後、培養物をペレット状にし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ２００ｍｌ中に再懸濁させ、次いで、振盪せずに６週間インキュベートした。対照対数期培養物を、５００ｍｌフラスコに入れた変法ソートン培地２００ｍｌ中で、３７℃にて振盪条件で７日間培養した後に得た。培養物を収集してから、細菌ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、１０ｍＭトリス、２５０ｍＭスクロース緩衝液、ｐＨ７．０中に再懸濁させ、Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒを使用して、ガラスビーズで破砕した。溶解物を滅菌濾過し、タンパク質濃度を２−ＤＱｕａｎｔキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。さらに、培養培地を回収し、滅菌濾過し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３限外濾過装置で約１６０倍に濃縮した。
【００９６】
溶解物及びＣＦ試料を、２つの別々の実験で分析した。各２Ｄ  ＤＩＧＥ実験に、三通りの対数期及び飢餓試料を含めた。各試料５０μｇを２Ｄ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２Ｄ  ＤＩＧＥ用に調製し、３０ｍＭトリス、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５中に再溶解した。Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５のミニマルラベリングを１２５ｐｍｏｌの各ＣｙＤｙｅで実施し、次いでｐＨ４〜７のＩＰＧストリップで等電点電気泳動を実施した。Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５で標識した試料を、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０．５％ＩＰＧ緩衝液、１８ｍＭ  ＤＴＴ中での再水和ステップ中に施用した。第２次元分離を１０〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル中で実施した。電気泳動の後で、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ９４１０ゲルイメージャーでスキャンし、スポット画像をＩｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ２．０ソフトウェアで分析した。体積比で１．５倍の差を超えたスポット、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）を選択して同定した。２Ｄ  ＤＩＧＥゲルを銀染色し、スポットを摘出してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ解析を行った。２つのスポット（図１２の＃１６６６及び＃１６６９）で、対数期培養物と比較して、６週間栄養飢餓を施した培養物のＣＦにおける発現量の増加が見られた。これらのスポットは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによってＲｖ１２８４と同定された。同時に、これらのスポットは、栄養飢餓の培養物由来の溶解物において増加したとしても選択され、ＭＳによってＲｖ１２８４であると確認された。
【００９７】
実施例１２：予防ＴＢワクチン接種モデルにおけるＲｖ１２８４の免疫応答及び防御。
ＣＢ６Ｆ１マウス及びＢ５Ｃ３Ｆ１マウスの各群に、ＣＡＦ０１アジュバント中に配合した５μｇのＲｖ１２８４を３回、又は生ワクチンウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧを１回ワクチン接種した。ワクチンが誘導した応答を測定するため、３回目のワクチン接種から２週間後に、個々のアニアムスル（ａｎｉａｍｓｌ）から血液を採取し、ＰＢＭＣを単離した。５×１０６個のＰＢＭＣを２μｇのワクチン抗原（Ｒｖ１２８４）又は対照抗原（Ｒｖ０２８７）で７２時間刺激し、放出されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって細胞培地中で測定した（図１３Ａ及びＢ）。両マウス系統において、Ｒｖ１２８４のワクチン接種は、抗原に特異的な有意な免疫応答を誘導した。
【００９８】
３回目のワクチン接種から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露し、その６週間後に安楽死させた。個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図１３Ｃ及びＤ）。Ｒｖ１２８４のワクチン接種は、両系統において、生理食塩水対照群と比較して細菌数を有意に減少させた（ｌｏｇ１０減少値＝ＣＢ６Ｆ１で０．４３及びＢ６Ｃ３Ｆ１で０．５４）。
【００９９】
実施例１３：予防ＴＢワクチン接種モデルにおけるＨ１＋Ｒｖ１２８４の防御効果。
ＦＶＢ（Ｈ２＾ｑ）マウスの各群に、ＣＡＦ０１アジュバント中に配合した５μｇのＨ１融合タンパク質又はＨ１＋Ｒｖ１２８４を３回ワクチン接種した。対照群に３回の生理食塩水注射を施した。３回目のワクチン接種／注射から６週間後に、全ての動物を毒性結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）にエアゾールで曝露し、その６週間後に安楽死させた。個々の動物の肺における細菌数を、肺ホモジネートの希釈物をプレーティングし、コロニーの数を計数することによって求めた（図１４）。ＦＶＢマウスへのＨ１融合タンパク質のワクチン接種は細菌数を半減させただけであったが（ｌｏｇ１０減少値＝０．３２）、Ｈ１＋Ｒｖ１２８４の混合物は細菌数を６．６倍減少させた（ｌｏｇ１０減少値＝０．８２）。統計的に、Ｈ１＋Ｒｖ１２８４をワクチン接種した動物は、生理食塩水を注射した群とＨ１をワクチン接種した群の両方より、細菌負荷が有意に低かった。
【０１００】
実施例１４：曝露後単一タンパク質のワクチン接種後の、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６及びＲｖ１２８４の免疫応答
実施例３に記載したプロトコルに従って、マウスを感染させ、抗生物質で処置し、ワクチン接種した。ここでは、マウスの各群に、全てリポソーム系アジュバントＣＡＦ０１中に配合したＡｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６又はＲｖ１２８４を３回ワクチン接種した。対照マウスを同様に塩水でワクチン接種した。最後のワクチン接種から１週間後に、リンパ球を肺から得、感染が引き起こす応答の測定として、それぞれのワクチン抗原、即ちＡｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６又はＲｖ１２８４、及びＴＢ１０．４で６時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に使用した。ワクチン−又は感染−が引き起こす応答を、細胞内サイトカインの染色によって測定し、ＣＤ４  Ｔ細胞レスポンダーの累積度数、発現、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α又はこの３つの任意の組合せを判定した。Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６又はＲｖ１２８４のワクチン接種は全て、対照動物において同等のレベルでの測定が不可能なほど有意な、ワクチンに特異的なＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導した（図１５）。ＴＢ１０．４感染が引き起こすＣＤ４  Ｔ細胞応答は、比較すると低いが、この特定の時点では細菌負荷がまだ比較的低いことを考慮すると、これは予測されることである。
【０１０１】
参考文献
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８．  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｓ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｌｅ  ｂａｃｉｌｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｒｒａｙｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２，  ６４３−６５５  （１９９９）．
９．  Ｇａｏ，  Ｌ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ＲＤ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ，  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＥＳＡＴ−６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３，  １６７７−  １６９３  （２００４）．
１０．  ＭａｃＧｕｒｎ，  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｃｏｘ，  Ｊ．Ｓ．  Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  
ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＸ−１  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７５，  ２６６８−２６７８  （２００７）．
１１．  ＭａｃＧｕｒｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｒａｇｈａｖａｎ，  Ｓ．，  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｓ．Ａ．  ＆  Ｃｏｘ，  Ｊ．Ｓ．  Ａ  ｎｏｎ−ＲＤ１  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｎｍ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５７，  １６５３−  １６６３  （２００５）．
１２．  Ｂａｈｋ，  Ｙ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：  
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，  ３２９９−３３０７  （２００４）．
１３．  Ｄａｓ，  Ｃ，  Ｇｈｏｓｈ，  Ｔ．Ｓ．  ＆  Ｍａｎｄｅ，  Ｓ．Ｓ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＸ−１  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，  ｅ２７９８０  （２０１  １  ）．
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１５．  Ｒａｇｈａｖａｎ，  Ｓ．，  Ｍａｎｚａｎｉｌｌｏ，  Ｐ．，  Ｃｈａｎ，  Ｋ．  ，  Ｄｏｖｅｙ，  Ｃ．  ＆  Ｃｏｘ，  Ｊ．Ｓ．  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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