(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）前記原発腫瘍をヒト以外の免疫不全の動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで継代することであって、前記原発腫瘍の細胞および前記原発腫瘍の継代された細胞は、免疫単離を受けていない；および
（ｂ）少なくとも１つの抗原について、前記原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団におけるレベルと、前記原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団におけるレベルとを比較することであって、継代された細胞の前記第１の集団のｉｎ  ｖｉｖｏにおける継代の回数が１０回以上であり、腫瘍細胞の前記第２の集団が、
（ｉ）前記ヒト原発腫瘍の非継代細胞である、または
（ｉｉ）前記ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞であって、前記腫瘍細胞の前記第２の集団が、継代された腫瘍細胞の前記第１の集団よりも少なくとも１回少ない回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代されたものである、
ことを含み、
腫瘍細胞の前記第２の集団中の前記抗原の量に対する、腫瘍細胞の前記第１の集団中の前記抗原の量の増加を、前記ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーの指標とする、方法。
【請求項２】
前記抗原がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドの量の増加が、細胞あたりの前記ポリペプチドの発現レベルの増加である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドの量の増加が、前記ポリペプチドを発現する細胞数の増加である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドの量の増加が、細胞あたりの前記ポリペプチドの発現レベルの増加および前記ポリペプチドを発現する細胞数の増加である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記原発腫瘍が小児腫瘍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記原発腫瘍が、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、ユーイング肉腫、血管筋脂肪腫、胸膜肺芽腫およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも１０〜３０回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも１０〜２０回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記継代がマウスにおいて行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記継代が、前記原発腫瘍の異種移植の組織試料の非解離細胞を前記動物中に埋め込むことによって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記継代が、前記原発腫瘍の異種移植の単一細胞懸濁液を前記動物中に埋め込むことによって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の抗原の前記発現の決定をｍＲＮＡレベルで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の抗原の前記発現の決定をタンパク質レベルで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
対象におけるがんの処置のための薬剤を選択する方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法にしたがって前記対象由来の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること；ならびに
（ｂ）前記がん幹細胞マーカーの発現を下方調節する、および／またはその活性を阻害する薬剤を選択することによって、がんの処置のための薬剤を選択すること
を含む方法。
【請求項１６】
対象におけるがん処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法にしたがって前記対象由来の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること、ならびに
（ｂ）前記がん処置後に前記対象由来の前記腫瘍中の前記がん幹細胞マーカーの量を分析すること
を含み、前記処置の前の前記がん幹細胞マーカーの量に対する前記腫瘍中の前記がん幹細胞マーカーの量の減少が有効ながん処置の指標となる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、原発腫瘍中のがん幹細胞を富化および同定し、場合により、それから単離する方法に関する。次いで、がん幹細胞を、原発腫瘍中に存在する他のがん細胞から区別するマーカーを同定して、がんの診断を補助することができる。さらに、マーカーをがんの処置のために標的化することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、固形腫瘍におけるがん開始／がん幹細胞（ＣＳＣ）の刺激的な発見を目のあたりにした。幹細胞研究から確立された原理を適用して、ヒトＣＳＣは、異種移植（Ｘｎ）マウスモデルを使用してがんを再生するその高い能力によって機能的に定義される。正常な幹細胞と同様、ＣＳＣはそれ自身、自己再生のプロセスによって再生することができ、連続移植アッセイにおいて研究することができる。さらに、精製されたＣＳＣに由来するがんは、ＣＳＣの分化能力を反映して、それらが由来した親がんの異種表現型を反復する。ＣＳＣの有望な単離は、細胞培養の前にフローサイトメトリーによる幹細胞の高度に精製された集団の反復的単離を可能にする、表面マーカー発現に基づいて実施された。
【０００３】
悪性ラブドイド腫瘍は、幼児における最も侵攻的で高度に悪性の胚芽腫である。これらの腫瘍は、腎臓（ラブドイド腫瘍と呼ばれる）、腎臓外組織または中枢神経系（ＡＴＲＴと呼ばれる）中で生じ得る。それらは、第２２染色体の長腕の領域１１．２（２２ｑ１１．２）に位置するＳＷＩ／ＳＮＦクロマチン再モデリング複合体のコア成分であるＳＭＡＲＣＢ１のほぼ完全な喪失率を特徴とする。生殖系列突然変異は記載されており、診断時の非常に早い年齢、様々な位置での同時性および異時性腫瘍ならびに最悪の予後と相関する。ＳＷＩ／ＳＮＦ機能の喪失に起因する異常な遺伝子発現は、サイトカインシグナリング、分化、多能性および自己再生におけるクロマチン再モデリングの重要な役割と一致して、発がんにおいて主要な役割を果たすと考えられる。外科手術、化学療法および放射線などの最適化された現在利用可能な医療にもかかわらず、ラブドイド腫瘍は非常に不良な予後を維持しており、全生存率は約２５％である。治癒率を改善し、短期および長期の死亡率を低下させるために、腫瘍の起源の我々の理解の継続的拡大、腫瘍がん調査のためのモデルの開発、および新規なより寛容性の生物学的に標的化される療法の開発が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pode-Shakked et al.、 EMBO Molecular Medicine, Volume 5, Issue 1, pages 18-37, 2013およびMetildi et al、Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr 4960. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4960
【発明の概要】
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）原発腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで継代すること；および
（ｂ）原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団中の少なくとも１つの抗原のレベルと、原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団とを比較することであって、腫瘍細胞の第２の集団が、
（ｉ）ヒト原発腫瘍の非継代細胞；または
（ｉｉ）腫瘍細胞の第２の集団が、継代された腫瘍細胞の第１の集団よりも少なくとも１回少ない回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代された、ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞
である、第１の集団中の少なくとも１つの抗原のレベルと第２の集団とを比較すること
を含み、
腫瘍細胞の第２の集団中の抗原の量と比較した腫瘍細胞の第１の集団中の抗原の量の増加が、ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを示す、方法が提供される。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、がんの処置を必要とする対象のがんを処置する方法であって、対象に、抗原の発現を下方調節する、および／または抗原の活性を阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含み、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原の量と腫瘍の原発細胞中の抗原の量との比が、所定のレベルよりも上である、方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがんを診断する方法であって、対象の腫瘍中の抗原のレベルを分析することを含み、抗原の存在ががんを示し、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原の量と、腫瘍の原発細胞中の抗原の量との比が所定のレベルよりも上である、方法が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがん処置をモニタリングする方法であって、がん処置の投与後に対象の原発腫瘍中の抗原のレベルを分析することを含み、がん処置の投与前の抗原のレベルと比較した抗原の量の減少が治療的処置を示し、対象の腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原の量と、対象の腫瘍の原発細胞中の抗原の量との比が所定のレベルよりも上である、方法が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがんの処置のための薬剤を選択する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の方法にしたがって対象の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること；ならびに
（ｂ）がん幹細胞マーカーの発現を下方調節する、および／またはその活性を阻害する薬剤を選択することによって、がんの処置のための薬剤を選択すること
を含む方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）腫瘍の処置を必要とする対象における非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）腫瘍を処置する方法であって、対象に、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）からなる群から選択されるポリペプチドに結合する、および／またはその発現を下方調節する治療有効量の薬剤を投与することによって、ＡＴＲＴを処置することを含む、方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがん処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）本明細書に記載の方法にしたがって対象の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること；
（ｂ）がん処置後に対象の腫瘍中のがん幹細胞マーカーの量を分析すること
を含み、処置の前のがん幹細胞マーカーの量と比較した腫瘍中のがん幹細胞マーカーの量の減少が有効ながん処置を示す、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがんを診断する方法であって、本明細書に記載の方法にしたがって対象の生物試料中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定することを含み、がん幹細胞マーカーの存在ががんを示す、方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代された細胞の第１の集団の継代回数は、少なくとも２回の連続する継代について有意に増加しない見かけの腫瘍侵攻表現型が存在するように選択される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、第１の集団の継代回数は、継代された細胞の第１の集団の５０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始する頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するように選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代された細胞の第１の集団の継代回数は、継代された細胞の第１の集団中のがん幹細胞と、非がん幹細胞との比が１：１０００より大きくなるように選択される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原はポリペプチドである。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドの量の増加は、細胞あたりのポリペプチドの発現レベルの増加である。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドの量の増加は、ポリペプチドを発現する細胞の量の増加である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドの量の増加は、細胞あたりのポリペプチドの発現レベルの増加およびポリペプチドを発現する細胞の量の増加である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団中のがん幹細胞の頻度：腫瘍細胞の第２の集団中のがん幹細胞の頻度は、５：１より大きい。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、原発腫瘍は小児腫瘍である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、原発腫瘍は、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、ユーイング肉腫、血管筋脂肪腫、胸膜肺芽腫およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代された腫瘍細胞の第１の集団は、最小でも２回の継代にわたって継代される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、５回以下の継代にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に継代される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代された腫瘍細胞の第１の集団は、少なくとも５回の継代にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代は、マウスにおいて行われる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代は、原発腫瘍の異種移植の組織試料の非解離細胞を動物中に埋め込むことによって行われる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代は、原発腫瘍の異種移植の単一細胞懸濁液を動物中に埋め込むことによって行われる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドの発現の決定は、ｍＲＮＡレベルで行われる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドの発現の決定は、タンパク質レベルで行われる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がん細胞侵攻性表現型は、がん細胞マーカーのレベル、遺伝子発現プロファイル、異種移植にかかる時間、異種移植の生成に必要な細胞数、移動する能力、非がん性組織に侵襲する能力および増殖のレベルからなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、免疫単離を受けていない。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は、本明細書に記載の方法にしたがって同定されたがん幹細胞マーカーである。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原はポリペプチドである。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、原発腫瘍中でのポリペプチドの発現と、ｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中でのポリペプチドの発現の比は少なくとも１：５である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞は、少なくとも３回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けた細胞を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドはリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がん幹細胞マーカーが、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）からなる群から選択される場合、がんはＡＴＲＴである。
【００３８】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が制御するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態を、ほんの一例として、添付の画像を参照して本明細書に記載する。ここで、図面を特に詳細に参照して、示される項目が例であり、本発明の実施形態の例示的考察のためのものであることが強調される。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態を実施することができる方法を当業者に明らかにするものである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ．１Ｂ】図１Ａ〜ＤはＭＲＴの長期的増殖がＣＳＣ頻度の増加と関連することの図である。図１Ａは、連続的Ｘｎ増殖は、より侵攻性の表現型に向かう腫瘍挙動の変化を示しており、腫瘍生着までのより短い時間（青色）および重量の増加と切除までの時間の比（赤色）と相関している。図１Ｂは、原発性ＭＲＴ、早期の継代のＸｎ（Ｐ２）、中間の継代のＸｎ（Ｐ７）および後期の継代のＸｎ（Ｐ１４）のＨ＆Ｅ染色を示す。Ｘｎ腫瘍細胞は、基本的なラブドイド様細胞形態を維持するが、いくつかの形態学的相違には、紡錘状細胞の獲得、広範囲の壊死、アポトーシス小体が少ないこと、および有糸分裂が多いことが挙げられる（白い矢印）。スケールバーは１００μｍ（上）および５０μｍ（下）である。
【図１Ｃ】サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、神経線維タンパク質（ＮＦＰ）およびビメンチンの連続切片における原発ＭＲＴ、早期の継代のＸｎ（Ｐ２）、中間の継代のＸｎ（Ｐ７）および後期の継代のＸｎ（Ｐ１４）のＩＨＣを示す。高世代のＸｎは、分化マーカーの喪失を示すが（上の３つのパネル）、原発腫瘍およびＸｎ組織はビメンチンを強く発現する（下のパネル）。スケールバーは２００μｍである。
【図１Ｄ】原発腫瘍、早期の継代のＸｎ（Ｐ３）と後期の継代のＸｎ（Ｐ１７）との間でのＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現レベルを比較するｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。上皮マーカーであるＥ−カドヘリンの発現は、連続増殖を通して下方調節されるが、ビメンチンの発現は永続的なままである。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、原発腫瘍細胞の値を使用して正規化し（したがって＝１）、他の全ての値をそれらと比較して算出した。結果を、３つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示する。＊ｐ＜０．０５である、また、図１Ｄは、単一の細胞懸濁液上でのＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ５６、ＣＤ３２６およびＡＬＤＨ１抗原を含むいくつかのＣＳＣマーカーの発現に関する、低い、中間の、および高いＭＲＴ継代からのＸｎ細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。結果は、ＡＬＤＨ１がＭＲＴ  ＣＳＣマーカーのための良好な候補であり、Ｘｎ継代を介して発現増加のパターンを提示することを示した。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｅは、腫瘍開始活性の増強と関連する全遺伝子特徴が推定ＣＳＣバイオマーカーおよび新しい治療標的を説明する図である。図２Ａは、いくつかの異なる試料：１．原発ＭＲＴ、２．早期のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ２）、３．中間のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ７）、４．後期のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ１７）、５．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、６．胎児腎臓（ＦＫ）、７．成人腎臓（ＡＫ）、８．胎児脳（ＦＢ）、９．成人脳（ＡＢ）を比較するマイクロアレイ遺伝子発現分析を説明する図である。教師なし階層的クラスタリングは、ＭＲＴ後期継代とｈＥＳＣとの間で高い類似性を示し、その未分化の性質を強調していた。
【図２Ｂ】ＭＲＴ組織の比較は、２つの異なる遺伝子発現パターンを示した；継代を通して上方調節された遺伝子（赤色）および下方調節された遺伝子（緑色）。
【図２Ｃ】１０の最も上方調節された遺伝子が、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）を含むＭＲＴにおけるＣＳＣ機能の増大と関連していた。
【図２Ｄ．２Ｅ】図２Ｄは、異なるＭＲＴ試料間でいくつかの増殖マーカー（例えば、ＫＩ６７、ＣＤＣ２０、ＣＤＫ１およびＣＣＮＡ２）の発現パターンを比較する遺伝子ヒートマップは、高継代が高度に増殖性であることを示した。図２Ｅは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（著作権）機能分析は、原発腫瘍および低継代Ｘｎと比較して高継代Ｘｎにおいて細胞の壊死、細胞死および分化の減少を示した。
【図３Ａ．３Ｂ】図３Ａ〜Ｅは、ＡＬＤＨ１がＭＲＴ  ＣＳＣの推定マーカーであることの図である。図３Ａは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＭＲＴの連続増殖がＡＬＤＨ１発現細胞の富化をもたらすスキームを説明する図である。図３Ｂは、様々なＭＲＴ  Ｘｎ継代の代表的なＦＡＣＳ分析を説明する図である。腫瘍が進行するにつれて、ＡＬＤＨＡ１発現細胞の割合は有意に増加し、Ｐ４に由来する細胞中では４％であり（左）、Ｐ１０細胞に由来する細胞中では２５％であった（右）が、これは、Ｘｎ連続増殖によるＡＬＤＨ１＋発現細胞中での富化を示している。
【図３Ｃ】ＡＬＤＨ１に関する原発ＭＲＴ、中間継代Ｘｎ（Ｐ７）および後期継代Ｘｎ（Ｐ１３）のＩＨＣは、Ｘｎ連続増殖と共に発現の増加を示す図である。スケールバーは２００μｍである。
【図３Ｄ．３Ｅ】図３Ｄは、高ＡＬＤＨ１発現細胞が主に大きいラブドイド細胞であることを実証するＡＬＤＨ１に関する原発ＭＲＴの高倍率ＩＨＣを示す。スケールバーは２００μｍである。図３Ｅは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証は、後期継代において高いＡＬＤＨ１発現を示し、原発腫瘍と比較して約４０倍高かったことを説明する図である。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、原発腫瘍細胞の値を使用して正規化し（したがって＝１）、他の全ての値をそれに応じて算出した。結果を、３つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、ＭＲＴ  ＣＳＣバイオマーカーとしてのＡＬＤＨ１の機能的検証の図である。図４Ａ：コロニー形成能力を、ＡＬＤＨ１＋とＡＬＤＨ１−ＭＲＴ細胞との間で比較した。ＡＬＤＨ１＋細胞によって形成されたコロニーの数は、ＡＬＤＨ１−細胞と比較して有意により多かった（左上の棒グラフ；ｐ＝０．００８３）。細胞／コロニーの数は、ＡＬＤＨ１−細胞と比較してＡＬＤＨ１＋細胞において有意により多かった（左下の棒グラフ；ｐ＝０．００２４）。ＡＬＤＨ１＋およびＡＬＤＨ−細胞から形成されたコロニーの代表的な画像を、右に提示する。実験を３回実施した。
【図４Ｂ．４Ｃ．４Ｄ】図４Ｂ：ＡＬＤＨ１＋細胞から生じた腫瘍をさらに、第２のレシピエントに連続的に移植することができ、この集団における腫瘍開始能力の存在と一致して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの自己再生能力を実証している。図４Ｃ：ＲＮＡ配列決定実験は、ＡＬＤＨ−細胞と比較したＡＬＤＨ＋細胞中で最も上方調節された遺伝子が原発腫瘍と比較して後期Ｘｎ継代において有意に過剰発現される遺伝子（例えば、ＡＮＸＡ１、ＧＰＭ６Ａ、ＨＧＦおよびＬＯＸ）であったことを示す。図４Ｄ：ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証は、ＡＬＤＨ−細胞と比較して選別されたＡＬＤＨ＋において高いＬＯＸ発現を示した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＡＬＤＨ−細胞に関する値を使用して正規化し（したがって＝１）、他の全ての値をそれに応じて算出した。結果を、３つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示する；＊ｐ＜０．０５である。
【図５Ａ．５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、可能なＭＲＴ治療標的としてのＬＯＸ阻害剤の機能的検証の図である。図５Ａ：ＬＯＸに関する原発腫瘍、早期（Ｐ２）、中間（Ｐ７）および後期（Ｐ１４）ＭＲＴ継代のＩＨＣ染色を示す。この染色は、Ｘｎ連続増殖に沿った広く高い発現を示した。スケールバーは１００μｍである。図５Ｂ：マウス中で連続増殖された腎臓の一般的な小児固形腫瘍であるウィルムス腫瘍（ＷＴ）Ｘｎ細胞に対するＢＡＰＮの効果を説明する図である。結果は、ＷＴ細胞増殖に対する効果がないことを実証し、ＭＲＴ細胞に対するＬＯＸ阻害の特異的効果を示している。＊＊ｐ＜０．０１である。
【図５Ｃ．５Ｄ】図５Ｃ：ＢＡＰＮ処置は、核凝縮および細胞嚥下（ｃｅｌｌ  ｓｗａｌｌｏｗｉｎｇ）などのＭＲＴ細胞上での形態学的変化を誘導した。スケールバーは１００μｍ（上）および５０μｍ（下）である。図５Ｄ：移動アッセイは、４８ｈにわたる１００μＭのＢＡＰＮ処置が、未処置の細胞と比較して、ＭＲＴ細胞の移動能力を有意に阻害することを示した。スケールバーは１０００μｍである。
【図６】ＡＴＲＴ  Ｘｎモデルの確立のスキームの図である。原発腫瘍移植片を、免疫不全マウス中への２〜５ｍｍの腫瘍小片の皮下移植によって形成させた。取った腫瘍を、腫瘍増殖を可能にする全てのマウスにおいて観察した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中でのＡＴＲＴ  Ｘｎの連続増殖を、固定数の１ｘ１０６個の細胞を利用する組織試料移植または単一細胞懸濁液移植によって実施した。連続増殖により、本発明者らは、低継代（＜Ｐ５）、中継代（Ｐ５〜Ｐ１０）および高継代（Ｐ１０〜Ｐ１５）のＡＴＲＴ  Ｘｎ継代を確立することができた。また、組織断片を、ＩＨＣ染色、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質単離のために使用した。また、接着細胞を、腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験のために使用した。
【図７Ａ．７Ｂ．７Ｃ．７Ｄ】図７Ａ〜ＤはＡＴＲＴ  ＣＩＣ／ＣＳＣ治療剤としてのＬＯＸ阻害剤の機能的検証の図である。図７Ａ：処理後の細胞生存能力アッセイを示す。細胞生存能力を検査するＭＴＳ分析を、様々な濃度のＢＡＰＮ（１０〜１０００ｆμＭ）で４８ｈ増殖させたＰ２  Ｘｎ細胞上で実施した。処理は、１００μＭのＢＡＰＮによる処理後に増殖の有意な低減（ＵＴ細胞と比較して４７％）をもたらした。＊＊ｐ＜０．０１である。図７Ｂ：ＢＡＰＮ処理は、ＡＴＲＴ細胞上での形態学的変化を誘導した。特に、処理後に観察された変化は、核凝縮および細胞嚥下である。スケールバーは１００μｍ（上）および５０μｍ（下）である。図７Ｃ：ＢＡＰＮ処理は細胞移動を阻害することを示す。移動アッセイにより、４８ｈにわたる１００μＭのＢＡＰＮ処理が、未処理の細胞と比較して、ＡＴＲＴ細胞の移動能力を有意に阻害することが示された。スケールバーは１０００μｍである。図７Ｄ：ＢＡＰＮは、ＡＴＲＴ細胞中でｌｏｘ活性を効率的に阻害することを示す。ＬＯＸ活性定量キットは、Ｐ３およびＰ１０細胞上での１００μＭのＢＡＰＮによる処理後に有意な阻害を示す（それぞれ、８１％および６３％）。
【図８】腫瘍が異種移植片の継代の機能として出現するまでの平均日数のグラフの図である。連続Ｘｎ増殖は、ユーイング肉腫（図８Ａ）とウィルムス腫瘍（図８Ｂ）の両方において腫瘍生着までのより短い時間と相関していたが、これは、より侵攻性の表現型に向かう腫瘍挙動の変化を示している。
【図９】転移性挙動を予測する、侵襲性遺伝子特徴と共に、自己再生遺伝子の上方調節を提示する、高度に増殖性のものとしての腫瘍異種移植片の後期継代を示す遺伝子ヒートマップの図である。
【図１０Ａ．１０Ｂ】図１０Ａ：Ｘｎ連続増殖と共に発現が増加することを示すＮＣＡＭ１に関するいくつかのＸｎ継代（Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１７）の免疫組織化学分析（ＩＨＣ）の図である。スケールバーは２００μｍである。図１０Ｂ：成人肺対照と比較した原発腫瘍における高いＮＣＡＭ１発現（右）および成体肺と比較した胎児肺における高いＮＣＡＭ１発現（左）を示すｑＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。結果を、３つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示する。＊ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ．１１Ｂ】図１１Ａ：Ｘｎ連続増殖と共に発現が増加することを示すＣＤ４４に関するいくつかのＸｎ継代（Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１７）のＩＨＣの図である。スケールバーは２００μｍである。図１１Ｂ：高ＣＤ４４発現細胞が腫瘍に沿って散乱することを実証するＣＤ４４に関する原発ＰＰＢの高倍率ＩＨＣの図である。スケールバーは２００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、原発腫瘍中のがん幹細胞を富化および同定し、場合により、それから単離する方法に関する。次いで、がん幹細胞を、原発腫瘍中に存在する他のがん細胞から区別するマーカーを同定して、がんの診断を補助することができる。さらに、マーカーを、がんの処置のために標的化することができる。
【００４２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が以下の説明に記載されるか、または実施例により例示される詳細にその適用が限定されるとは限らないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態を可能とするか、または様々な方法で実施もしくは実行することができる。
【００４３】
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍開始および自己再生を選択的に行うことができ、分化を介して非腫瘍形成性がん細胞子孫の大集団を生じる、階層的に組織化された腫瘍中の悪性細胞サブセットである。
【００４４】
生理的幹細胞の薬物耐性表現型の観察の当然の結果として、ＣＳＣは化学療法および放射線療法に対する耐性の増大を特徴とするがん内のサブ集団でもあると仮定されている。かくして、特定のマーカーによりＣＳＣを標的化するがん処置は、再発および播種のリスクを低減させることによって、現在の形態の療法の効能を潜在的に増加させることができる。がん幹細胞の同定は、特に、それらが典型的には腫瘍細胞中で非常に少ない数で発現されるという事実を考慮すれば、複雑な仕事である。
【００４５】
小児固形腫瘍においては、複数の新鮮な腫瘍標本への限られたアクセスが、この問題を悪化させ、ロバストＣＳＣ分析および新規治療戦略の効率的な開発をさらに阻害している。
【００４６】
本発明者らは、高侵攻性および致死性の小児新生物であるヒト非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）の長期的なｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖と、免疫不全マウスにおける限界希釈異種移植とを組み合わせて、ＣＳＣ表現型を発見した。この方法を使用して、本発明者らは、低継代異種移植と比較して４０倍少ない、わずか５０個の細胞を使用してＡＴＲＴを生成することができた。
【００４７】
本発明者らは、異種移植の連続サイクルを使用して、さらなるＣＳＣ表現型について選択することができ、この方法ががんの診断と処置の両方にとって価値ある手段であることを、これらの実験から推定した。
【００４８】
ＡＴＲＴと同様、本発明者らは、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍および胸膜肺芽腫（ＰＰＢ）の連続増殖が、腫瘍生着までのより短い時間と相関し、腫瘍増殖を促進する異種移植片（Ｘｎ）を生成し、継代に沿った腫瘍侵攻性の促進を示すことを示した。したがって、本発明者らは、ＣＳＣの同定を、上記の方法を使用して複数のがんに対して実行することができると推定する。
【００４９】
特定の腫瘍に関するＣＳＣの知識は、新しい処置の開発の助けとなる。これを、個別化されたレベルで（すなわち、特定の対象の腫瘍中のＣＳＣを探し、それに応じて処置すること）またはより一般的なレベルで（特定のがんのための治療剤の開発）行うことができる。
【００５０】
本発明の態様によれば、ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）いくつかの継代にわたって原発腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで継代して、継代された腫瘍細胞の第１の集団を生成すること；および
（ｂ）原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団中の少なくとも１つの抗原のレベルと、原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団とを比較することであって、腫瘍細胞の第２の集団が、
（ｉ）ヒト原発腫瘍の非継代細胞；または
（ｉｉ）腫瘍細胞の第２の集団が、継代された腫瘍細胞の第１の集団よりも少なくとも１回少ない継代回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代された、ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞
である、第１の集団中の少なくとも１つの抗原のレベルと第２の集団とを比較すること
を含み、
腫瘍細胞の第２の集団中の抗原の量と比較した腫瘍細胞の第１の集団中の抗原の量の増加が、ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを示す、方法が提供される。
【００５１】
本明細書で使用される用語「がん幹細胞」（「ＣＳＣ」とも呼ばれる）とは、異種移植（Ｘｎ）マウスモデルを使用してがんを再生させる能力を有する細胞を指す。ＣＳＣは、連続移植アッセイにおいて試験することができる、自己再生のプロセスを介してそれ自身で再生することができる。さらに、精製されたＣＳＣに由来するがんは、ＣＳＣの分化能力を反映して、それらが由来した親がんの異種表現型を反復する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「腫瘍」とは、誤調節された細胞増殖により形成される細胞群または組織群を指す。腫瘍は、構造組織および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は、良性または悪性であってもよい異なる組織塊を形成し得る。一実施形態において、腫瘍という用語は、悪性腫瘍を指す。一実施形態によれば、用語「腫瘍細胞」はまた、白血病細胞などの非固形がんの細胞も含む。別の実施形態によれば、非固形がんのそれぞれの細胞は、用語「腫瘍細胞」によって包含されない。
【００５３】
特定の実施形態によれば、腫瘍は、胚性幹細胞起源である固形腫瘍（例えば、小児）である。
【００５４】
そのような固形腫瘍の例としては、限定されるものではないが、肉腫および癌腫、例えば、限定されるものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、胸膜肺芽腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝がん、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。小児固形腫瘍の例としては、限定されるものではないが、ウィルムス腫瘍／腎芽細胞腫、横紋筋肉腫、ユーイングファミリーの腫瘍／未分化神経外胚葉性腫瘍、骨肉腫、末梢神経外胚葉性腫瘍、小児胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、腎臓がん、肝臓がん、神経芽細胞腫、卵巣がん、網膜芽細胞腫、肉腫、より具体的には、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、肝芽腫、胚細胞腫瘍、神経芽細胞腫および髄芽細胞腫が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される語句「原発腫瘍」とは、腫瘍進行が始まり、がん性塊をもたらすように進行した解剖学的部位から得られる細胞を指す。
【００５６】
抗原は、異種移植（Ｘｎ）マウスモデルを使用して、がんを再生させる能力を有さず、自己再生のプロセスによってそれ自身を再生することができない同じ腫瘍のがん細胞と比較した場合、ＣＳＣ中に異なる量で存在する任意の分子であってもよい。
【００５７】
かくして、例えば、ＣＳＣマーカーは、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド、またはＲＮＡ分子であってもよい。
【００５８】
抗原は、細胞の表面上にあってもよく、または細胞内分子であってもよい。
【００５９】
特定の実施形態によれば、ＣＳＣマーカーはポリペプチドである。
【００６０】
ポリペプチドは、細胞表面タンパク質（すなわち、膜タンパク質）であってもよい。特定の実施形態によれば、細胞表面タンパク質は、炭水化物結合分子（例えば、レクチン）である。
【００６１】
別の実施形態によれば、タンパク質は細胞内タンパク質（例えば、可溶性タンパク質）である。
【００６２】
ポリペプチドは、ある機能、例えば、転写因子、経路関連マーカーなどを果たしてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される語句「ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代」とは、最初に動物（例えば、マウス）中に原発腫瘍を埋め込むこと、二次性腫瘍が生じるまで一定期間待つこと、腫瘍細胞を採収すること、およびこれらの腫瘍細胞を第２の動物に埋め込むこと（すなわち、連続移植）を含むプロセスを指す。次いで、その後の連続継代を実行することができる。本発明は、少なくとも１回の継代、少なくとも２回の継代、少なくとも３回の継代、少なくとも４回の継代、少なくとも５回の継代、少なくとも６回の継代、少なくとも７回の継代、少なくとも８回の継代、少なくとも９回の継代、少なくとも１０回の継代、少なくとも１１回の継代、少なくとも１２回の継代、少なくとも１３回の継代、少なくとも１４回の継代、少なくとも１５回の継代、少なくとも１６回の継代、少なくとも１７回の継代、少なくとも１８回の継代、少なくとも１９回の継代、少なくとも２０回の継代にわたって継代することを企図する。
【００６４】
特定の実施形態によれば、継代は、５回以上の継代、例えば、５〜３０回の継代、または５〜２０回の継代にわたる。
【００６５】
特定の実施形態によれば、継代は、１０回以上の継代、例えば、１０〜３０回の継代、または１０〜２０回の継代にわたる。
【００６６】
特定の実施形態によれば、腫瘍細胞（腫瘍細胞の第１の集団および／または腫瘍細胞の第２の集団）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの継代を受けていない。
【００６７】
さらに別の実施形態によれば、腫瘍細胞は、１より多い回数のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの継代を受けていない。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代のために使用される動物の例としては、線形動物、ミバエ、ゼブラフィッシュが挙げられる；好ましくは、実験動物、例えば、マウス（ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、Ｂｅｉｇｅ／ＳＣＩＤマウス）、ラット、または霊長類（例えば、ヒト）が使用される。一実施形態によれば、免疫不全動物が使用される。別の実施形態によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代のためにヒトが使用される。
【００６９】
典型的には、各ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代のために、同じ種の動物が使用される。かくして、例えば、初期の埋込みのために免疫不全マウスが使用される場合、その後の継代のために免疫不全マウスが使用される。
【００７０】
原発腫瘍が第２の動物において二次性腫瘍発症を開始させる限り、任意の量の原発腫瘍を埋め込むことができる。特定の実施形態によれば、原発腫瘍は小片（例えば、１〜１０ｍｍの小片）に切断される。好ましくは、原発腫瘍の細胞を、酵素を使用して解離させない。さらに、原発腫瘍を、好ましくは細断または粉砕しない。
【００７１】
特定の実施形態によれば、原発腫瘍の細胞は、埋込みの前に精製（例えば、ＮＣＡＭに特異的に結合する抗体を使用するフローサイトメトリーなどによる免疫単離）を１回も受けていない。さらに、その後のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代中の異種移植の細胞もまた、好ましくは、精製（例えば、ＮＣＡＭに特異的に結合する抗体を使用するフローサイトメトリーなどによる免疫単離）を１回も受けていない。
【００７２】
腫瘍発達を開始させる限り任意の方法で腫瘍を動物中に埋め込むことができる。一実施形態によれば、腫瘍を、皮下的に埋め込む。
【００７３】
典型的には、腫瘍は、埋込みの約１〜３ヶ月後に、または腫瘍が１〜３ｃｍのサイズ、例えば、１．５ｃｍの直径に達した時に採収される。
【００７４】
その後の異種移植片増殖を、異種移植片の単一細胞懸濁液または異種移植組織の小片を埋め込むことによって行うことができる。
【００７５】
単一細胞懸濁液について、解離した細胞の数は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代において使用される動物および腫瘍の侵攻性に依存する。典型的には、新鮮に回収されたＸｎ組織に由来する約０．５〜３ｘ１０６個の解離した細胞が使用される。
【００７６】
異種移植組織の小片は、典型的には、１〜１０ｍｍの間、より好ましくは２〜５ｍｍの間である。
【００７７】
単一細胞懸濁液を、適切な培地（好ましくは、抗生物質も含有する）中で細断、粉砕または分散した後、コラゲナーゼなどのプロテアーゼ酵素で処理することによって取得することができる。次いで、酵素処理された組織を、適切な培地中で磨砕することができる。
【００７８】
特定の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、ヒト原発腫瘍の非継代細胞である。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、１回の継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、２回の継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、３回の継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、４回の継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第２の集団は、５回を超える継代は受けていない。
【００７９】
腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも１回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも２回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも３回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも４回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも５回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも６回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも７回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも８回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも９回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも１０回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも１５回受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を少なくとも２０回受けている。
【００８０】
典型的には、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度がヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００８１】
本明細書で使用される用語「異種移植」とは、ある種、属または科の個体から、別の種、属、または科の個体への組織または臓器の外科的移植またはグラフトを指す。
【００８２】
好ましくは、より後の世代の異種移植を開始させる頻度は、統計的に有意な数が達成されるように、少なくとも２体の動物、例えば、３体の動物、５体の動物またはより好ましくはさらに１０体の動物中で決定される。
【００８３】
かくして、例えば、腫瘍細胞の第２の集団が試験した１０匹のマウスのうちの１匹においてより後の世代の異種移植を開始させる場合、腫瘍細胞の第１の集団は、より後の世代の異種移植が同じ数の腫瘍細胞を使用して１０匹のマウスのうちの少なくとも５匹において開始されるように十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けるべきである。典型的には、より後の世代の異種移植を開始させるために使用される腫瘍細胞は、単一細胞懸濁液中にある。
【００８４】
より後の世代の異種移植が開始されたかどうかを試験することは、当業者の専門知識の範囲内にある。異種移植が開始されたかどうかを決定するために使用することができる例示的な方法としては、全腫瘍触診、カリパス、超音波誘導画像化などが挙げられる。
【００８５】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも１０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００８６】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも２０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００８７】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００８８】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも１０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００８９】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１０００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも２０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９０】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９１】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも１０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９２】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも２０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９３】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９４】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも１０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９５】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の１００個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも２０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９６】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも５倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９７】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも１０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９８】
一実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、継代された細胞の前記第１の集団の５０個の細胞を使用してより後の世代の異種移植を開始させる頻度が、ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して少なくとも２０倍増加するような十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を受けている。
【００９９】
典型的には、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも１回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも２回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも３回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも４回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも５回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも６回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも７回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも８回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも９回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも１０回多くの継代を受けている。別の実施形態によれば、腫瘍細胞の第１の集団は、腫瘍細胞の第２の集団よりも１１回以上多くの継代を受けている。
【０１００】
一実施形態においては、腫瘍細胞の第１の集団は、少なくとも２回の連続する継代にわたって有意に増加しない見かけの腫瘍侵攻性表現型が存在するように継代されている。
【０１０１】
初期の継代の間、腫瘍侵攻性表現型の増加速度は高いことが理解される。その後の継代にわたって、腫瘍侵攻性表現型の増加速度は、特定の継代において、プラトーに達するまで減速する。この点で、腫瘍侵攻性表現型のレベルは一定のままであるか、またはその後の継代にわたってさらに低減してもよい。
【０１０２】
本発明者らは、腫瘍侵攻性表現型がプラトーに達するような継代回数にわたって腫瘍を継代することを企図する。プラトーでの腫瘍侵攻性の変化は、好ましくは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、またはさらには１％以下である。
【０１０３】
本発明のこの態様にしたがって測定することができる腫瘍侵攻性表現型の例としては、限定されるものではないが、がん細胞マーカーのレベル、遺伝子発現プロファイル、侵襲性のレベル、転移する能力、転移のレベル、異種移植にかかる時間（すなわち、異種移植が動物モデルにおいて特定のサイズの腫瘍を生成する時間）、動物モデルにおける特定のサイズの異種移植の生成に必要な細胞数が挙げられる。測定することができるさらなる腫瘍侵攻性表現型としては、特に、染色体安定性、キナーゼ活性、細胞接着、アポトーシス、がん細胞増殖、サイクリン産生、細胞増殖、がん細胞増殖、クローン形成能の測定（軟寒天アッセイ）、固定非依存的増殖の測定、細胞周期調節の測定、がん細胞運動性の測定、血管新生の測定、および細胞死の測定が挙げられる。
【０１０４】
測定を、ｉｎ  ｖｉｖｏで（すなわち、動物モデルにおいて）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、細胞培養物中で）行うことができる。
【０１０５】
細胞増殖アッセイとしては、限定されるものではないが、ＭＴＴアッセイ（例えば、ＶｙｂｒａｎｔＲＴＭＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））；ＢｒｄＵ組込みアッセイ（例えば、Ａｂｓｏｌｕｔｅ−Ｓ  ＳＢＩＰアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））；細胞内ＡＴＰレベルの測定（市販型のアッセイとしては、ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）−Ｍ、１，０００アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）およびＡＴＰ細胞生存能力アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ））；ＤｉＯｃ１８アッセイ、膜透過性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ（例えば、Ｖｉｂｒａｎｔ細胞毒性アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））；細胞ＬＤＨ活性の測定；ならびに３Ｈ−チミジン取込みおよびＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【０１０６】
細胞周期の進行を、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）取込みによりアッセイすることができる。そのようなアッセイは、新しく合成されたＤＮＡへのＢＲＤＵの取込みによりＤＮＡ合成を受けている細胞集団を同定する。次いで、新しく合成されたＤＮＡを、抗ＢＲＤＵ抗体を使用して（Hoshino et al.、 1986、int. J. Cancer 38, 369；Campana et al.、 1988、J. Immunol. Meth. 107, 79）、または他の手段によって検出することができる。ヒストンＨ３のリン酸化による有糸分裂を受けている細胞集団を同定する、ホスホ−ヒストンＨ３染色により、細胞増殖をアッセイすることもできる。ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を使用して、セリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化を検出する（Chadlee, D. N. 1995、J. Biol. Chem. 270:20098-105）。また、３Ｈ−チミジン取込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403；Jeoung, J.、 1995、J. Biol. Chem. 270:18367-73）。このアッセイは、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的特徴付けを可能にする。このアッセイにおいて、ＤＮＡを合成する細胞は、３Ｈ−チミジンを新しく合成されたＤＮＡに取り込む。次いで、シンチレーションカウンター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８００  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）中での放射性同位体の計数などによる標準的な技術によって、取込みを測定することができる。別の増殖アッセイは、生細胞中で還元された時に蛍光を発し、細胞数の間接的な測定を提供する、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ染料（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）を使用する（Voytik-Harbin S L at al.、 1998、In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。さらに別の増殖アッセイであるＭＴＳアッセイは、工業化学物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性評価に基づくものであり、可溶性テトラゾリウム塩であるＭＴＳを使用する。ＭＴＳアッセイは商業的に入手可能であり、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６．ＲＴＭ．ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（カタログ番号Ｇ５４２１）を含む。細胞増殖を、軟寒天中でのコロニー形成によってアッセイすることもできる（Sambrook at al.、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)）。代謝的に活性な細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定することによって、細胞増殖をアッセイすることもできる。そのようなアッセイは商業的に入手可能であり、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ．（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。フローサイトメトリーによって細胞周期増殖をアッセイすることもできる（Gray J W at al. (1986) Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 49:237-55）。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメーター中で評価して、様々な段階の細胞周期で細胞の蓄積を測定することができる。
【０１０７】
測定することができる腫瘍侵攻性表現型の別の例は、障壁を通過する能力である。好ましくは、腫瘍細胞は、障壁を通過できない。腫瘍細胞のための障壁は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの人工的な障壁またはｉｎ  ｖｉｖｏでの天然の障壁であってもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの障壁としては、限定されるものではないが、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの、細胞外マトリックス被覆膜が挙げられる。かくして、その後、Parish, C. R., et al.、「A Basement-Membrane Permeability Assay which Correlates with the Metastatic Potential of Tumour Cells」、Int. J. Cancer (1992) 52:378-383によって詳細に記載されたＭａｔｒｉｇｅｌ侵襲アッセイ系における腫瘍細胞侵襲を阻害するその能力について、腫瘍細胞を試験することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ｂＦＧＦに結合し、局在化するペルレカンなどの硫酸ヘパランプロテオグリカン、ビトロネクチンならびにトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびプラスミノゲン活性化因子阻害剤１型（ＰＡＩ−１）として公知のセルピンを含有する再構成される基底膜である。転移に関する他のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、先行技術に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる１９９９年８月１０日に発行された米国特許第５，９３５，８５０号明細書を参照されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの障壁とは、対象の身体に存在する細胞障壁を指す。
【０１０８】
腫瘍の増殖特徴は、腫瘍侵攻性表現型（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化への継代）としても働き得る。遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲ））を使用して、腫瘍侵攻性表現型を分析することもできる。
【０１０９】
本発明によって企図されるさらなるアッセイは、その内容が参照により本明細書に組み込まれるPouliot N, Pearson HB, Burrows A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. In: Madame Curie Bioscience Database [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience; 2000にまとめられている。
【０１１０】
腫瘍侵攻性と相関して増加するがん細胞マーカーの例としては、増殖マーカー（例えば、ＫＩ６７、Ｅ２Ｆ２およびＣＤＫ１）、自己再生ポリコーム遺伝子（例えば、ＢＭＩ１、ＴＯＰ２Ａ、およびＥＺＨ２）、ならびに転移シグナチャー遺伝子（例えば、ＳＰＡＲＣ、ＣＸＣＲ４およびＬＴＢＰ１）が挙げられる。
【０１１１】
本発明のこの態様による方法を実施することは、がん細胞の第２の集団に関してがん細胞の第１の集団中でのがん幹細胞の富化を可能にすることが理解される。本発明は、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはさらには１００倍を超えたがん幹細胞の富化レベルを企図する。
【０１１２】
腫瘍細胞の第２の集団中のがん幹細胞の数は、腫瘍の１０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の２０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の３０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の４０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の５０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の６０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の７０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の８０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の９０００個の細胞のうちの１個未満、腫瘍の１０，０００個の細胞のうちの１個未満であってもよい。
【０１１３】
腫瘍細胞の第１の集団中のがん幹細胞の数は、典型的には、腫瘍の１０００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の９００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の８００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の７００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の６００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の５００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の４００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の３００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の２００個の細胞のうちの１個より多い、腫瘍の１００個の細胞のうちの１個より多い、またはさらには腫瘍の１０個の細胞のうちの１個より多い。
【０１１４】
好ましくは、腫瘍細胞の第１の集団中のがん幹細胞：非がん幹細胞の比（すなわち、がん幹細胞の頻度）は、許容可能なシグナル：ノイズ比で遺伝子発現分析によってマーカーを検出することができるようなものである。抗原量の増加は、細胞あたりの抗原量（例えば、細胞あたりのポリペプチドの発現レベル）の増加に起因する、および／または抗原を含む細胞の頻度（例えば、ポリペプチドを発現する細胞の数）の増加に起因するものであってもよいことが理解される。
【０１１５】
腫瘍細胞の第２の集団中の抗原量と比較した腫瘍細胞の第１の集団中の抗原量の全体的な増加は、典型的には、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍またはさらには少なくとも５倍である。
【０１１６】
抗原を含む細胞の頻度の増加は、２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加、５倍の増加、６倍の増加、７倍の増加、８倍の増加、９倍の増加、１０倍の増加、２０倍の増加、３０倍の増加、４０倍の増加、５０倍の増加、６０倍の増加、７０倍の増加、８０倍の増加、９０倍の増加、１００倍の増加またはそれ以上であってもよい。
【０１１７】
タンパク質の発現について分析する方法は、本明細書の以下に提供される。該方法をＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで実施することができることが理解される。
【０１１８】
〔ＲＮＡの発現レベルを検出する方法〕
本発明のいくつかの実施形態の細胞中のＲＮＡの発現レベルを、当業界で公知の方法を使用して決定することができる。
【０１１９】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物中の特定のＲＮＡの検出を含む。ＲＮＡ試料を、塩基対間の水素結合を防止する薬剤（例えば、ホルムアルデヒド）を用いる処理によって変性させ、全てのＲＮＡ分子がアンフォールディングされた線状構成を有することを確保する。次いで、個々のＲＮＡ分子を、ゲル電気泳動によってサイズにしたがって分離し、変性されたＲＮＡが付着するニトロセルロースまたはナイロンに基づく膜に移す。次いで、膜を、標識されたＤＮＡプローブに曝露する。放射性同位体または酵素結合ヌクレオチドを使用して、プローブを標識することができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光を使用するものであってもよい。この方法により、特定のＲＮＡ分子の量の定量化と、電気泳動の間のゲル中での移動距離を示す膜上での相対位置によるその同一性の決定との両方が可能になる。
【０１２０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法は、比較的稀なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を使用するものである。第１に、ＲＮＡ分子を細胞から精製し、逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴなど）およびオリゴｄＴ、ランダムヘキサマーまたは遺伝子特異的プライマーなどのプライマーを使用する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。次いで、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを適用することにより、ＰＣＲ増幅反応をＰＣＲ装置中で実行する。当業者であれば、遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列ならびに特異的ＲＮＡ分子を検出するのに好適であるＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数など）を選択することができる。ＰＣＲのサイクル数を調整し、増幅産物を公知の対照と比較することにより、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いることができることが理解される。
【０１２１】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色：この方法においては、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、細胞中に存在するＲＮＡ分子に結合させる。一般には、細胞を最初に顕微鏡スライドに固定して、細胞構造を保持し、ＲＮＡ分子の分解を防止した後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーションバッファーにさらす。ハイブリダイゼーションバッファーは、プローブの非特異的結合を回避しながら、ｉｎ  ｓｉｔｕでＤＮＡまたはＲＮＡプローブとそれらの標的ｍＲＮＡ分子との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、ホルムアミドおよび塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬を含む。当業者であれば、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度など）を、特異的プローブおよび細胞の種類に対して調整することができる。ハイブリダイゼーションの後、いかなる未結合のプローブも洗浄除去し、結合したプローブを公知の方法を使用して検出する。例えば、放射標識プローブを使用する場合、スライドを、放射標識されたプローブを使用して生成されるシグナルを明らかにする写真乳剤にさらす；プローブを酵素で標識した場合、比色反応の形成のために酵素特異的基質を添加する；プローブを、蛍光標識を使用して標識する場合、結合したプローブを、蛍光顕微鏡を使用して明らかにする；プローブを、タグ（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチンなど）を使用して標識する場合、結合したプローブを、公知の方法を使用して検出することができるタグ特異的抗体との相互作用後に検出することができる。
【０１２２】
Iｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ染色：この方法は、Nuovo GJ, et al. [Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90]およびKomminoth P, et al. [Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25]に記載されている。簡単に述べると、標識されたヌクレオチドをＰＣＲ反応に組み込むことにより、固定された細胞上でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する。反応を、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）から入手可能なレーザー捕捉顕微解剖ＰｉｘＣｅｌｌ  Ｉ  ＬＣＭシステムなどの特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ装置を用いて実行する。
【０１２３】
ＤＮＡマイクロアレイ／ＤＮＡチップ：特定の発生プロセスまたは生理学的応答の間の生物の完全な転写プログラムの分析を可能にするＤＮＡマイクロアレイを使用して、数千個の遺伝子の発現を同時に分析することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、顕微鏡スライドガラスなどの支持体の表面上の密接に包装された領域に結合した数千個の個々の遺伝子配列からなる。ＤＮＡマイクロアレイを調製するための様々な方法が開発されている。１つの方法では、分析のための各遺伝子のコード領域の約１キロベースの断片を、個別にＰＣＲ増幅させる。ロボット装置を用いて、それぞれの増幅されたＤＮＡ試料を、顕微鏡スライドガラスの表面上の密集した領域に適用した後、熱および化学処理によって加工して、ＤＮＡ配列を支持体の表面に結合させ、それらを変性させる。典型的には、そのようなアレイは、約２ｘ２ｃｍであり、個々の核酸の約６０００個のスポットを含有する。技術の変形において、数万個の同一のオリゴヌクレオチドが、支持体の表面上の小さい四方の領域中で合成されるように、通常は２０ヌクレオチド長の複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを、支持体の表面に共有結合させた最初のヌクレオチドから合成する。単一の遺伝子に由来する複数のオリゴヌクレオチド配列を、その遺伝子の発現の分析のためにスライドの近隣領域中で合成する。したがって、数千個の遺伝子を、１つのスライドガラス上に表示させることができる。合成オリゴヌクレオチドのそのようなアレイを、当業界では、上記のような「ＤＮＡマイクロアレイ」とは反対に、「ＤＮＡチップ」と呼ぶことができる［Lodish et al. (eds.). Chapter 7.8: DNA Microarrays: Analyzing Genome-Wide Expression. In: Molecular Cell Biology, 4th ed., W. H. Freeman, New York. (2000)］。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ：この方法では、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを、固相表面（例えば、ガラスウェハー）に結合させる。各オリゴヌクレオチドプローブは、約２０〜２５核酸長のものである。特定の細胞試料（例えば、血液細胞）中の本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、ＲＮＡを、当業界で公知の方法（例えば、ＴＲＩＺＯＬ溶液、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＵＳＡを使用する）を使用して細胞試料から抽出する。ハイブリダイゼーションは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５’−ビオチン化プローブ）または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の標識された断片を使用して行ってもよい。簡単に述べると、二本鎖ｃＤＮＡを、全て製造業者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、ＵＳＡ）にしたがって、逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＲＮＡから調製する。標識されたｃＲＮＡを調製するために、二本鎖ｃＤＮＡを、例えば、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）を使用して、ビオチン化されたヌクレオチドの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写反応にさらす。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたｃＲＮＡを、９４℃で３５分間、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ酢酸カリウムおよび３０ｍＭ酢酸マグネシウム中でＲＮＡをインキュベートすることにより断片化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルを、プローブアレイに結合した標識ｃＲＮＡにより放出される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナーを使用して走査する。
【０１２５】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）においては、アレイ上の各遺伝子は、各プローブ対が完全一致オリゴヌクレオチドと不一致オリゴヌクレオチドとからなる、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって示される。完全一致プローブは特定の遺伝子と正確に相補的な配列を有し、かくして、特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするが、不一致プローブは中心塩基位置で単一塩基置換によって完全一致プローブと異なる。ハイブリダイゼーションシグナルを、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーを使用して走査し、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは不一致プローブから得られる非特異的シグナルを、完全一致プローブから得られるシグナルから差し引く。
【０１２６】
〔タンパク質の発現および／または活性を検出する方法〕
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞中で発現されるタンパク質の発現および／または活性レベルを、当業界で公知の方法を使用して決定することができる。
【０１２７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、マイクロタイタープレートのウェルなどの表面への、タンパク質基質を含有する試料（例えば、固定された細胞またはタンパク質性溶液）の固定を含む。酵素にカップリングされた基質特異的抗体を適用し、基質に結合させる。次いで、抗体の存在を検出し、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって定量する。この方法において一般的に用いられる酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。良好に較正され、直線的な応答範囲内にある場合、試料中に存在する基質の量は、生成される色の量に比例する。定量精度を改善するために、一般的には基質標準を用いる。
【０１２８】
ウェスタンブロット：この方法は、アクリルアミドゲルを用いた他のタンパク質からの基質の分離、次いで、膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）への基質の転写を含む。次いで、基質の存在を、基質に特異的な抗体によって検出し、次に、抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡ、または他の抗体であってもよい。抗体結合試薬を、上記に記載されたように放射標識するか、または酵素結合させることができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によるものであってもよい。この方法は、基質の量の定量化と、電気泳動の間のアクリルアミドゲル中での移動距離を示す膜上での相対位置によるその同一性の決定との両方を可能にする。
【０１２９】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）：１つのバージョンにおいて、この方法は、アガロースビーズなどの沈降性担体上に固定された特異的抗体および放射標識抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）との所望のタンパク質（すなわち、基質）の沈降を含む。沈降したペレット中の計数は、基質の量に比例する。
【０１３０】
代替バージョンのＲＩＡにおいては、標識された基質および未標識の抗体結合タンパク質を用いる。未知量の基質を含有する試料を、変化する量で添加する。標識された基質からの沈降した計数の減少は、添加された試料中の基質の量に比例する。
【０１３１】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的抗体による細胞中ｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出を含む。基質特異的抗体は、フルオロフォアに連結される。検出は、細胞が光ビームを通過するにつれて、各細胞から放出される光の波長を読み取る細胞選別装置によるものである。この方法は、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１３２】
免疫組織化学分析：この方法は、基質特異的抗体による固定された細胞中、ｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出を含む。基質特異的抗体を、酵素結合させるか、またはフルオロフォアに結合させることができる。検出は、顕微鏡および主観的または自動的評価によるものである。酵素結合した抗体を用いる場合、比色反応が必要であり得る。免疫組織化学、次いで、例えば、ヘマトキシリンまたはギムサ染色を使用する細胞核の対抗染色が行われることが多いことが理解される。
【０１３３】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ活性アッセイ：この方法によれば、発色基質を、活性酵素を含有する細胞上に適用し、この酵素は、基質が分解されて光学または蛍光顕微鏡によって視認できる発色生成物を生成する反応を触媒する。
【０１３４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイ：これらの方法においては、特定の酵素の活性を、細胞から抽出されるタンパク質混合物中で測定する。活性を、比色方法を使用して分光光度計ウェル中で測定するか、または非形成アクリルアミドゲル（すなわち、活性ゲル）中で測定することができる。電気泳動後、ゲルを、基質および比色試薬を含有する溶液中に浸す。得られる染色バンドは、目的のタンパク質の酵素活性に対応する。良好に較正され、直線的な応答範囲内にある場合、試料中に存在する酵素の量は、生成される色の量に比例する。定量精度を改善するために、一般的には酵素標準を用いる。
【０１３５】
一度、がん幹細胞マーカーが同定されたら、本発明者らは、がん幹細胞の単離のためにそのようなマーカーを使用することができると提唱する。企図される方法としては、遠心分離に基づく方法、水簸、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パンニング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫学に基づく系；免疫親和性交換；所望の細胞を分離するために特定の細胞型に結合する抗体被覆磁気粒子を使用する磁気細胞選別などの非光学的細胞選別方法が挙げられる。
【０１３６】
さらに、本発明者らは、処置の目的のためにＣＳＣマーカーを標的化することを企図する。
【０１３７】
さらに、本発明者らは、診断のためにマーカーの存在および／もしくはレベルについて分析すること、最適な処置を決定すること、処置の効能をモニタリングすること、ならびに／またはステージングを行うことを提唱する。
【０１３８】
かくして、本発明の別の態様によれば、対象におけるがんを診断する方法であって、対象の腫瘍中の抗原の存在について分析することを含み、抗原の存在ががんを示し、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原の量：腫瘍の原発細胞の比が所定のレベルより上である、方法が提供される。
【０１３９】
本明細書で使用される用語「診断すること」は、がんを有すると対象を分類することを指し、がんを分類すること、がんの重症度（等級または段階）を決定すること、がんの進行をモニタリングすること、がんの転帰および／または回復の見込みを予見することを含む。
【０１４０】
本発明の方法は、外見上は健康な個体における初期段階のがんを検出するのに特に有用である。
【０１４１】
対象は、日常的な健康診断を受けている健康な動物またはヒト対象であってもよい。あるいは、対象は、がんを有するリスクがあり得る（例えば、遺伝的な素因のある対象、がんの病歴および／もしくは家族歴を有する対象、発がん物質、職業上の危険、環境的危険に曝露された対象ならびに／またはがんの疑わしい臨床兆候（例えば、糞便中の血液もしくは下血、原因不明の痛み、発汗、原因不明の発熱、食欲不振に至るまでの原因不明の体重減少、用便習慣（便秘および／または下痢）の変化、テネスムス（特に、直腸がんについては、不完全な排便の意味）、貧血および／もしくは全身の脱力感）を示す対象）。
【０１４２】
ＣＳＣの量は、がんの種類およびステージに依存する。いくつかの実施形態においては、ＣＳＣマーカーのレベルは、がんを示す。他の実施形態においては、ＣＳＣマーカーの存在（そのレベルとは無関係である）は、がんを示す。
【０１４３】
腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原：腫瘍の原発細胞の発現比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、５０：１またはさらには１００：１よりも少なくとも大きい。
【０１４４】
腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞は、好ましくは、少なくとも１回の継代、少なくとも２回の継代、少なくとも３回の継代、少なくとも４回の継代、少なくとも５回の継代、少なくとも６回の継代、少なくとも７回の継代、少なくとも８回の継代、少なくとも９回の継代、少なくとも１０回の継代、少なくとも１１回の継代、少なくとも１２回の継代、少なくとも１３回の継代、少なくとも１４回の継代、少なくとも１５回の継代、少なくとも１６回の継代、少なくとも１７回の継代、少なくとも１８回の継代、少なくとも１９回の継代、少なくとも２０回の継代にわたって継代されている。
【０１４５】
ＣＳＣマーカーの発現の分析を、本明細書に上記された方法を使用して実施することができる。
【０１４６】
特定の実施形態によれば、分析は、ＣＳＣマーカーを認識する抗体を用いて行われる。
【０１４７】
様々な型の検出可能部分またはリポーター部分を、抗体にコンジュゲートさせることができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、放射性同位体（［１２５］ヨウ素など）、リン光化学物質、化学発光化学物質、蛍光化学物質（フルオロフォア）、酵素、蛍光ポリペプチド、親和性タグ、およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）により検出される分子（造影剤）が挙げられる。
【０１４８】
好適なフルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ５などが挙げられる。フルオロフォア選択、フルオロフォアを様々な型の分子に連結する方法に関するさらに指針については、Richard P. Haugland、「Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994」、5th ed., Molecular Probes, Inc. (1994)、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ  Ｉｎｃ．の米国特許第６，０３７，１３７号明細書；Hermanson、「Bioconjugate Techniques」、Academic Press New York, N.Y. (1995)；Kay M. et al.、 1995. Biochemistry 34:293；Stubbs et al.、 1996. Biochemistry 35:937；Gakamsky D. et al.、「Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer」in 「Receptors: A Practical Approach」、2nd ed., Stanford C. and Horton R. (eds.), Oxford University Press, UK. (2001)およびＴａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．の米国特許第６，３５０，４６６号明細書を参照されたい。蛍光検出部分にコンジュゲートされた場合に抗体を検出するために使用することができる蛍光検出法としては、例えば、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光共焦点顕微鏡、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が挙げられる。
【０１４９】
いくつかの型の酵素を抗体［例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）］に結合させ、酵素にコンジュゲートされた抗体の検出を、ＥＬＩＳＡ（例えば、溶液中）、酵素結合免疫組織化学アッセイ（例えば、固定された組織中）、酵素結合化学発光アッセイ（例えば、電気泳動により分離されたタンパク質混合物中）または当業界で公知の他の方法を使用して実施することができる（例えば、Khatkhatay MI. and Desai M.、 1999. J Immunoassay 20:151-83；Wisdom GB.、 1994. Methods Mol Biol. 32:433-40；Ishikawa E. et al.、 1983. J Immunoassay 4:209-327；Oellerich M.、 1980. J Clin Chem Clin Biochem. 18:197-208；Schuurs AH. and van Weemen BK.、 1980. J Immunoassay 1:229-49を参照されたい）。
【０１５０】
例示的な同定可能な部分としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ヒスチジンタグ、ビオチン、橙色蛍光タンパク質およびストレプトアビジンが挙げられる。
【０１５１】
ＣＳＣの同定は、がんの処置を個別に最適化すること、対象における抗がん処置をモニタリングすること、対象のための抗がん処置を決定すること、およびがんを処置することができる薬剤を同定することに関連する様々な適用を有することが理解される。
【０１５２】
かくして、本発明の別の態様によれば、対象におけるがん処置をモニタリングする方法であって、がん処置の投与後に対象の原発腫瘍中の抗原の量を分析することを含み、がん処置の投与前の抗原のレベルと比較した抗原のレベルの低下が治療処置を示し、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の抗原の量：腫瘍の原発細胞中の抗原の量が所定のレベルより上である、方法が提供される。
【０１５３】
本発明のこの態様にしたがって分析されるがん処置は、本明細書の以下でさらに説明されるような薬剤または状態であってもよい。
【０１５４】
本明細書で用いられる用語「薬剤」とは、生物学的薬剤または化学的薬剤を含む試験組成物を指す。
【０１５５】
本発明の方法による潜在的な抗がん剤として試験することができる生物学的薬剤の例としては、限定されるものではないが、核酸、例えば、ポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス分子（限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸、ならびに骨格および／もしくは基本構造が変化した、または他の化学的改変を有するポリヌクレオチド類似体を含む）；タンパク質、ポリペプチド（例えば、ペプチド）、炭水化物、脂質および「低分子」薬物候補が挙げられる。「低分子」は、例えば、天然化合物（例えば、植物抽出物、微生物培地などに由来する化合物）または約１０，０００ダルトン未満、好ましくは約５，０００ダルトン未満、最も好ましくは約１，５００ダルトン未満の分子量を有する合成有機もしくは有機金属化合物であってもよい。
【０１５６】
本発明の方法による潜在的な抗がん剤として試験することができる状態の例としては、限定されるものではないが、放射線曝露（ガンマ照射、ＵＶ照射、Ｘ線照射など）が挙げられる。
【０１５７】
本発明のこの態様の実施形態によれば、「ＣＳＣマーカー」はまた、比較を処置の前後に行うことができるように、がん処置との接触の前にアッセイされる。
【０１５８】
本発明のこの態様の別の実施形態によれば、薬剤を、抗がん効果を有するのに十分に長い期間にわたってがん細胞にさらす。
【０１５９】
記載のように、がん幹細胞マーカーの同定はまた、そのようなマーカーを発現するがんの処置を可能にする。
【０１６０】
本明細書で使用される用語「処置すること」は、状態の進行を無効化すること、実質的に阻害すること、減速または逆転させること、状態の臨床もしくは美的症状を実質的に寛解すること、または状態の臨床もしくは美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【０１６１】
がん幹細胞マーカーが細胞表面抗原である場合、本発明者らは、マーカーに結合することができる分子（例えば、抗体）を使用してこれらの細胞に治療部分を標的化することを企図すると理解する。治療部分は、例えば、細胞毒性部分、毒性部分、サイトカイン部分および本発明の抗体に対する異なる特異性を含む第２の抗体部分であってもよい。
【０１６２】
好ましくは、抗体は、ＣＳＣマーカーの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原性決定基を指す。
【０１６３】
エピトープ決定基は通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特異的な３次元構造特徴、ならびに特異的電荷特徴を有する。
【０１６４】
本発明において使用される用語「抗体」は、無傷の分子ならびにマクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどのその機能的断片を含む。これらの機能的抗体断片は、以下のように定義される：（１）全抗体をパパイン酵素で消化して、無傷の軽鎖と１つの重鎖の一部とを得ることによって生成することができる、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片であるＦａｂ；（２）全抗体をペプシンで処理した後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを得ることによって取得することができる抗体分子の断片であるＦａｂ’；抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる；（３）全抗体をその後の還元なしにペプシン酵素で処理することによって取得することができる抗体の断片である（Ｆａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である；（４）２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片と定義されるＦｖ；ならびに（５）遺伝的に融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーにより連結される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された分子である一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）。
【０１６５】
本発明の抗体にコンジュゲートさせることができる治療部分の非限定例を、以下の表１に提供する。
【表１】
0006587288.tif 000002
【０１６６】
治療部分を、当業界で広く実施される標準的な化学合成技術［例えば、hypertexttransferprotocol://worldwideweb (dot) chemistry (dot) org/portal/Chemistryを参照されたい］を使用して、例えば、ペプチド結合（機能的部分がポリペプチドである場合）を介する、またはリンカーペプチドもしくは有機ポリマーなどの他の化学部分などの介在リンカーエレメントへの共有結合を介する、直接的もしくは間接的な、任意の好適な化学的結合を使用して、本発明の抗体に結合させることもできる。キメラペプチドを、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）もしくはアミノ（Ｎ）末端での結合を介して、または直鎖状、分枝状もしくは環状側鎖などの内部化学基、内部炭素もしくは窒素原子などへの結合を介して連結することができる。抗体の蛍光標識の説明は、米国特許第３，９４０，４７５号明細書；米国特許第４，２８９，７４７号明細書および米国特許第４，３７６，１１０号明細書に詳細に提供されている。
【０１６７】
ＣＳＣマーカーを認識する抗体を、細胞毒性剤を含む粒子に結合させることができる。
【０１６８】
本明細書で使用される語句「封入粒子」とは、１つまたは複数の内部空隙を形成する脂質および／または脂肪酸から製剤化された１つまたは複数の壁または膜の存在を特徴とする実体を指す。壁または膜は、同心的またはその他であってもよい。ベシクルの壁または膜は実質的に固体（均一）であってもよく、または例えば、リポソーム、リポスフェア、ナノリポソーム、粒子、ミセル、バブル、マイクロバブル、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ構造、マイクロバルーン、マイクロカプセル、エアロゲル、クラスレート結合ベシクル、六角形／立方体／六角形ＩＩ相構造などと呼んでもよい。
【０１６９】
封入粒子中に含まれる脂質成分は、公知の方法にしたがって、標的化分子で誘導体化された脂質、または予め形成された粒子中の標的化分子で誘導体化することができる極性頭部化学基を有する脂質を含んでもよい。
【０１７０】
封入粒子への標的化部分の共有結合のための他の方法としては、アミド、エステル、またはエーテル結合の使用、ストレプトアビジンおよびビオチン（例えば、米国特許第５，１７１，５７８号明細書を参照されたい）、ならびにカルボジイミドによるポリペプチドの活性化、次いで、活性化されたカルボキシル基へのカップリング（米国特許第５，２０４，０９６号明細書）が挙げられる。ポリペプチドを脂質に共有結合させるために使用することができる方法の他の例は、米国特許第５，２５８，４９９号明細書に開示されている。
【０１７１】
さらに、本発明は、がんの処置のためにＣＳＣマーカーの発現を下方調節する薬剤を用いて、それを行うことを企図する。
【０１７２】
下方調節を、タンパク質レベル（例えば、中和抗体を使用して）またはＲＮＡレベル（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡザイム、リボザイム、ｍｉＲＮＡなどを使用して）で行うことができる。
【０１７３】
本発明の特定の態様によれば、がんは非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）である。このがんの処置のために使用することができる例示的薬剤は、以下のポリペプチド：セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）の少なくとも１つを標的化する（および下方調節する）ことによってＡＴＲＴを処置するものである。
【０１７４】
かくして、ＡＴＲＴの処置のために使用することができる例示的な薬剤は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、例えば、β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）を標的化する（および下方調節する）ものである。
【０１７５】
薬剤を、そのまま、または医薬組成物の一部として投与することができる。
【０１７６】
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分と一緒の、本明細書に記載の１つまたは複数の活性成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１７７】
ここで、用語「活性成分」とは、生物学的効果を担う成分を指す。
【０１７８】
以後、互換的に使用することができる語句「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性および特性を無効化しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句の下に含まれる。
【０１７９】
ここで、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１８０】
薬物の製剤化および投与のための技術を、参照により本明細書に組み込まれる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに見出すことができる。
【０１８１】
好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸または筋肉内、皮下および髄内注射ならびにくも膜下、直接脳室内、例えば、右もしくは左心室腔、一般的な冠動脈への心臓内、静脈内、腹腔内、鼻内、もしくは眼内注射などの非経口送達を含んでもよい。
【０１８２】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の手法としては、神経外科戦略（例えば、大脳内注射または脳室内輸注）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用する試みにおける薬剤の分子的操作（例えば、自身ではＢＢＢを横断することができない薬剤と共に、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の生成）；薬剤の脂質溶解性を増加させるように設計された薬学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲーション）；および高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の輸注またはアンギオテンシンペプチドなどの生物活性薬剤の使用から得られる）が挙げられる。しかしながら、これらの戦略はそれぞれ、侵襲的外科手順と関連する固有のリスク、内因性輸送系において固有の制限による課されるサイズ制限、ＣＮＳの外部で活性であり得る担体モチーフを含むキメラ分子の全身投与と関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが破壊され、最適ではない送達方法にする、脳の領域内での脳損傷の可能性のあるリスクなどの制限を有する。
【０１８３】
あるいは、当業者であれば、全身様式よりもむしろ局部的な様式で、例えば、患者の組織領域中への直接的な医薬組成物の注射により、医薬組成物を投与することができる。
【０１８４】
本発明の医薬組成物を、当業界で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【０１８５】
かくして、本発明による使用のための医薬組成物を、薬学的に使用することができる調製物への活性成分のプロセッシングを容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の様式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１８６】
注射のために、医薬組成物の活性成分を、水性溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩バッファーなどの生理学的に適合するバッファー中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、障壁を透過させるのに好適な浸透剤を、製剤化において使用する。そのような浸透剤は当業界で一般に公知である。
【０１８７】
経口投与のために、医薬組成物を、活性化合物を、当業界で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、患者による経口摂取のために、錠剤、ピル剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして医薬組成物を製剤化することができる。経口使用のための薬学的調製物を、固体賦形剤を使用し、場合により、得られる混合物を粉砕し、必要に応じて、好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって作製することができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加することができる。
【０１８８】
糖衣錠コアを、好適なコーティングと共に提供する。この目的のために、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい濃縮糖溶液を使用することができる。活性化合物用量の異なる組合せの同定のため、またはそれを特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０１８９】
経口的に使用することができる医薬組成物としては、ゼラチン製の押し込み式カプセル剤ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られる軟質密閉カプセルが挙げられる。押し込み式カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により、安定剤と混合した活性成分を含有してもよい。軟質カプセル剤においては、活性成分を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択される投与経路にとって好適な用量にあるべきである。
【０１９０】
頬投与のために、組成物は従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ってもよい。
【０１９１】
鼻吸入による投与のために、本発明による使用のための活性成分は、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用と共に加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、ディスペンサー中での使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０１９２】
本明細書に記載の医薬組成物を、例えば、ボーラス注射または連続輸注による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤を、例えば、場合により、保存剤が添加された、アンプルまたは複数用量容器中で、単位用量形態で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液であってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。
【０１９３】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水性溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な油性または水に基づく注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、好適な安定剤または活性成分の溶解度を増加させて高濃縮溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。
【０１９４】
あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱源を含まない水に基づく溶液で構成させるために粉末形態にあってもよい。
【０１９５】
本発明の医薬組成物を、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物中で製剤化することもできる。
【０１９６】
本発明の文脈における使用にとって好適な医薬組成物は、活性成分が意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。より具体的には、治療有効量は、障害の症状を防止する、軽減する、もしくは寛解する、または処置される対象の生存を延長するのに有効な活性成分の量を意味する。
【０１９７】
治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示に照らせば、良好に当業者の能力の範囲内にある。
【０１９８】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または用量を、最初はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、用量を、動物モデルにおいて処方して、所望の濃度または力価を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１９９】
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、細胞培養物または実験動物中での標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を製剤化する際に使用することができる。用量は、用いられる投与形態および利用される投与経路に応じて変化してもよい。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Fingl, et al.、 1975、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、Ch. 1 p.1を参照されたい）。
【０２００】
投与量および間隔を個別に調整して、生物学的効果を誘導または抑制するのに十分である活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、各調製物について変化するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。
【０２０１】
処置される状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、数日から数週間続く処置の経過と共に、または治癒が行われるか、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまで、１回または複数回の投与のものであってもよい。
【０２０２】
投与される組成物の量は、勿論、処置される対象、苦痛の重症度、投与の様式、処方する医師の判断などに依存する。
【０２０３】
本発明の組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つまたは複数に単位剤形を含有してもよい、ＦＤＡに認可されたキットなどのパックまたはディスペンサーデバイス中で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属製またはプラスチック製ホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための指示書を添付してもよい。また、パックまたはディスペンサーに、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による認可を反映する、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって処方された形態の容器と関連する通知書を収容することもできる。そのような通知書は、例えば、処方薬に関する米国食品医薬品局により認可されたラベルまたは認可された製品挿入物のものであってもよい。上記でさらに詳述されたように、適合性の医薬担体中で製剤化される本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器中に入れ、示された状態の処置のために標識することもできる。
【０２０４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０２０５】
語句「本質的にからなる」は、組成物または方法がさらなる成分および／またはステップが特許請求される組成物または方法の基本的および新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみ、さらなる成分および／またはステップを含んでもよいことを意味する。
【０２０６】
本明細書で用いられる単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確にそうでないと区別しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、その混合物などの複数の化合物を含んでもよい。
【０２０７】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提供することができる。範囲形式での記載は単に便宜上かつ簡潔にするためのものであることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能なサブ範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示されるサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を有すると考えるべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【０２０８】
数値範囲が本明細書で示される場合はいつでも、それは示される範囲内の任意の引用される数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数との「間の範囲」という語句と、第１の指示数「から」第２の指示数「まで」の「範囲」は、本明細書では互換的に使用され、第１と第２の指示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０２０９】
本明細書で用いられる用語「方法」とは、限定されるものではないが、化学、薬学、生物学、生化学および医学の分野の当業者には公知の、または当業者によって公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるそれらの様式、手段、技術および手順を含む、所与の仕事を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【０２１０】
単語「例示的な」は、「例、実例または例示として役立つこと」を意味するように本明細書で使用される。「例示的」として記載される任意の実施形態は、必ずしも、他の実施形態よりも好ましい、もしくは有利であると解釈される、および／または他の実施形態からの特徴の組込みを排除するものではない。
【０２１１】
単語「場合により」は、「いくつかの実施形態では提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味するように本明細書で使用される。本発明の任意の特定の実施形態は、そのような特徴が矛盾しない限り、複数の「場合による」特徴を含んでもよい。
【０２１２】
明確性のために、別々の実施形態の文脈で記載される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特徴を、別々に、もしくは任意の好適なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載される実施形態において好適なものとして提供することもできる。様々な実施形態の文脈で記載されるある特定の特徴は、その実施形態がこれらの要素なしには動作不能でない限り、これらの実施形態の必須の特徴であると考えられるべきではない。
【０２１３】
上記で説明され、以下の特許請求の範囲で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的支持を得る。
【実施例】
【０２１４】
ここで、上記の説明と一緒に、非限定的な様式で本発明のいくつかの実施形態を例示する、以下の実施例を参照する。
【０２１５】
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」Sambrook et al.、 (1989)；「Current Protocols in Molecular Biology」Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al.、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore, Maryland (1989)；Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、John Wiley & Sons、New York (1988)；Watson et al.、「Recombinant DNA」、Scientific American Books、New York；Birren et al. (eds) 「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」、Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書および米国特許第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法；「Cell Biology: A Laboratory Handbook」、Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」by Freshney、Wiley-Liss, N. Y. (1994)、 Third Edition；「Current Protocols in Immunology」Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), 「Basic and Clinical Immunology」(8th Edition)、 Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds)、「Selected Methods in Cellular Immunology」、W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特許第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書および米国特許第５，２８１，５２１号明細書を参照されたい；「Oligonucleotide Synthesis」、Gait, M. J.、 ed. (1984)；「Nucleic Acid Hybridization」、Hames, B. D., and Higgins S. J.、 eds. (1985)；「Transcription and Translation」、Hames, B. D., and Higgins S. J.、 eds. (1984)；「Animal Cell Culture」、Freshney, R. I.、 ed. (1986)；「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press, (1986)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal, B., (1984) and 「Methods in Enzymology」Vol. 1-317, Academic Press；「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」、Academic Press、San Diego、CA (1990)；Marshak et al.、「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」CSHL Press (1996)を参照されたい（これらは全て、あたかも完全に本明細書に記載されたかのように参照により組み込まれる）。他の一般的な参考文献は、本文献を通して提供される。その中の手順は、当業界で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。そこに含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０２１６】
〔がん幹細胞を同定、単離および標的化するためのプラットフォームとしてのヒト非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍異種移植モデルの長期的増殖〕
【０２１７】
〔材料および方法〕
原発性非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍試料：原発性ＡＴＲＴ試料を、手術の１ｈ以内に患者から取得した。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって関与する患者の法的保護者によって与えられた。
【０２１８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植片形成：動物実験を、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにしたがって実施した。５〜８週齢、メスの非肥満糖尿病免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスへの初期のＡＴＲＴ異種移植を、以前に記載のように実施した（Dekel et al.、 2006a）。簡単に述べると、原発ＡＴＲＴ組織を、２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。マウスを、病原体を含まない環境で維持し、腫瘍増殖について毎週モニタリングした。二次性腫瘍を触診によって毎週検出した。腫瘍を、埋込みの約１〜３ヶ月後に、またはそれらが１．５ｃｍ直径のサイズに達した時に採収した。生着までの時間、切除までの時間、各生着したＸｎの重量および体積を記録した。Ｘｎ組織をすぐに小片に切断し、以下のようにさらなる実験のためにプロセッシングした：（ｉ）抽出された分析のその後の分子的特徴付けのための簡易凍結；（ｉｉ）将来の免疫組織化学（ＩＨＣ）試験のためのホルマリン固定およびパラフィン包埋；（ｉｉｉ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹への皮下的な組織埋込み；ならびに（ｉｖ）その後のＸｎ増殖およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験、限界希釈アッセイおよびＦＡＣＳ選別）のための以下に記載される単一細胞懸濁液の調製。
【０２１９】
単一細胞懸濁液を、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの培地のＩｓｃｏｖｅの改変物（ＩＭＤＭ）中で試料を細断した後、３７℃で２ｈ、コラゲナーゼＩＶで処理することにより取得した。酵素処理された組織を、コラゲナーゼ溶液の容量の２倍のＩＭＤＭを使用して磨砕し、懸濁液を濾過（１００μｍの細胞ストレーナー）し、抗生物質を含有するＩＭＤＭで２回洗浄した。赤血球をＡＣＫ  ＲＢＳ溶解バッファーにより除去した。
【０２２０】
Ｘｎ連続継代を、２つの方法を使用して形成させた：１．新鮮に回収されたＡＴＲＴ  Ｘｎからの約１ｘ１０６個の解離された細胞の連続注射；細胞を、１００μｌの１：１無血清培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中に注射した。２．ＡＴＲＴ  Ｘｎ組織を２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。
【０２２１】
腫瘍増殖細胞の相対頻度の見積もり：低および高継代からのＸｎ細胞の腫瘍形成活性を評価および比較するために、１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁された細胞の連続希釈液（１ｘ１０６〜５０個の細胞）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下的に注射した。がん増殖細胞の相対頻度の見積もりを、ＥＬＤＡソフトウェアオンライン（bioinfdotwehidotedudotau/software/elda/）を使用してオンラインで算出した。
【０２２２】
ＡＬＤＨ高細胞中での腫瘍増殖細胞の相対頻度の見積もり：ＡＬＤＨ低細胞と比較したＡＬＤＨ高細胞中での腫瘍増殖細胞の頻度を決定するために、上記のように限界希釈アッセイを使用した。簡単に述べると、Ｘｎから得られた細胞中でのＡＬＤＨＡ１高発現による細胞選別後、選別された集団［ＡＬＤＨ１ｈｉ、ＡＬＤＨ１ｌｏｗおよび選別されていない細胞（ＵＳ）］を、滅菌ＤＭＥＭに収集した。１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中に細胞を再懸濁し、連続希釈液中でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下的に注射した。
【０２２３】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析：原発ＡＴＲＴ細胞およびその後の新鮮なＸｎ由来細胞のＦＡＣＳ分析を、以前に記載のように実施した（Dekel et al.、 2006a）。腫瘍小片を単一細胞に解離させ、４℃で２分間、１ｍｌ／５ｍｌの細胞懸濁液比でＲＢＣ溶解溶液（二重蒸留されたＨ２Ｏ中の８．３ｇのＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇのＫＨＣＯ３、１．８ｍｌの５％ＥＤＴＡを含む）中で洗浄した。次いで、細胞を３０μｍのナイロンメッシュを通して濾過した後、最終的に遠心分離した。全ての細胞を、ＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）および０．０２％アジ化ナトリウムからなるＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。表面マーカー抗原［ＣＤ２４（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、１２０２４７−４２）、ＣＤ３４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、３００８１００）、ＣＤ５６（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、１２０５９４２）、ＣＤ９０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ３６００Ｕ）］を、暗室中、４℃で３０分間、１０６個の細胞あたり５μｇの抗体の濃度の蛍光色素コンジュゲート化抗体と共にインキュベートすることによって標識し、抗体の内在化を防止した。さらに、７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７ＡＡＤ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、生細胞ゲーティングのために使用した。全ての洗浄ステップを、ＦＡＣＳバッファー中で実施した。全ての定量測定を、ＩｇＧアイソタイプ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と比較して行った。高ＡＬＤＨ１酵素活性を有する細胞の検出を、以前に記載されたように（Christophe Ginestier et al.、 2007；Dylla et al.、 2008）、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、米国）を使用して実施した。細胞を、ＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）、非荷電ＡＬＤＨ１基質を含有するＡｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイバッファー中に懸濁した後、暗室中、３７℃で３０〜４５分間インキュベートした。ＢＡＡＡは、受動拡散を介して生細胞によってのみ取り込まれた後、ＡＬＤＨ１によって、高レベルのＡＬＤＨ１を発現する細胞の内部に保持される負に荷電した反応生成物であるＢＯＤＩＰＹ−アミノアセテート中に細胞内で変換され、その結果、これらの細胞は明るく蛍光を発するようになる。これらのＡＬＤＨ１発現細胞（ＡＬＤＨ１＋）の蛍光を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の緑色蛍光チャネル（５２０〜５４０ｎｍ）によって検出することができる。陰性対照として、細胞の各試料について、同じ条件で処理されたアリコートを、特異的ＡＬＤＨ１阻害剤であるジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）と共にさらにインキュベートした。ＤＥＡＢを添加せずに細胞をＢＡＡＡと共にインキュベートした場合、ＡＬＤＨ＋集団を規定するＢＡＡＡ蛍光のシフトが得られた。無傷の細胞膜を有する細胞のみがＡｌｄｅｆｌｕｏｒ反応生成物を保持することができるため、生きているＡＬＤＨ１＋細胞のみが同定された。
ＦＡＣＳ選別：細胞を上記のように採収し、３０μｍのナイロンメッシュを通して濾過した後、最終的に遠心分離し、次いで、ＦＡＣＳバッファーまたはＡＬＤＥＦＬＵＯＲバッファー中に再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを使用して、表面マーカーおよびＡＬＤＨ１高活性を発現する細胞について富化した。１００μｍのノズル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、平方インチあたり（ＰＳＩ）２０〜２５ポンドのシース圧、および１秒あたり１，０００〜３，０００の事象の獲得率を、ＡＴＲＴ細胞選別のために最適化された条件として使用した。単一の生細胞を、７ＡＡＤに基づいてゲート化した後、その後の全ての実験について収集チューブ中に物理的に選別した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、データをさらに分析し、提示した。
【０２２４】
チップアレイ：チップアレイデータは、公共ライブラリー（ＧＥＯ）に預託されている。全ての実験を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ  ＧＥＮＥ１．０ｓｔオリゴヌクレオチドアレイ（Pode-Shakked et al.、 2009）を使用して実施した。各試料からの全ＲＮＡを使用して、製造業者の推奨にしたがって、ビオチン化された標的ＤＮＡを調製した。各試料から生成された標的ｃＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、製造業者の推奨にしたがってプロセッシングした。品質対照測定の詳細を、オンラインで見出すことができる。有意に変化した遺伝子を、少なくとも２倍変化したものとしてフィルタリングした（ｐ値：０．０５）。
【０２２５】
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析−遺伝子発現分析：定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実行して、遺伝子の選択の発現における倍数変化を決定した。細胞からの全ＲＮＡを、製造業者の指示書にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して単離した。ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  米国）を使用、全ＲＮＡ上で合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ７９００ＨＴ配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）の存在下で実施した。ＰＣＲ増幅を、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｅ−Ｍａｄｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して実施した。それぞれの分析反応を３回実施した。ＨＰＲＴ１またはＧＡＰＤＨを、実験分析を通して内部対照として使用した。ＰＣＲの結果を、ＳＤＳ  ＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．２ソフトウェアを使用して分析した。統計分析を、対応のない両側Ｔ検定を使用して実施した。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５と考えた。
【０２２６】
Ｈ＆Ｅ染色：パラフィン包埋された組織のＨ＆Ｅ染色：パラフィン包埋された組織の５μｍ切片を、スーパーフロスト／プラスガラス上に載せ、６０℃で４０分間インキュベートした。脱パラフィン化の後、スライドをＭａｙｅｒのヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中でインキュベートし、７０％エタノール中の１％ＨＣｌと共に１分間インキュベートした。次いで、スライドを、エオシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１０秒間インキュベートした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１ＴＦを使用して画像を生成した。
【０２２７】
原発ＡＴＲＴおよびＡＴＲＴ  Ｘｎの免疫組織化学染色：４μｍの厚さの切片を、免疫組織化学分析のために原発ＡＴＲＴおよびＡＴＲＴ  Ｘｎから切断した。以前に記載のように免疫染色を実施した（Dekel et al.、 2006b）。簡単に述べると、切片をプロセッシングして、抗原の酸化を回避した。免疫染色の前に、切片を、抗原回収のために１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６．０で、９７℃で１０分間処理した後、３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理した。次いで、スライドを、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ  ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用する標識ストレプトアビジン−ビオチン（ＬＡＢ−ＳＡ）法を使用して染色した。ＨＲＰに基づく色原体／基質系（液体ＤＡＢ基質キット−Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）により、免疫反応を可視化した。抗ヒトＡＬＤＨ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃６１１１９５）を、１：１００の希釈率で使用した。ＨＲＰに基づく色原体／基質系（液体ＤＡＢ基質キット−Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）により、免疫反応を可視化した。また、全ての切片を、従来の免疫組織化学手順を使用して、ビメンチン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＡＥ１／ＡＥ３、ＮＦＰおよびＩＮＩ１について染色した。全ての抗体希釈を、染色抗体の製造業者によって推奨されるように実行した。
【０２２８】
ＬＯＸ活性アッセイ：以前に記載のように（１５８４３３７１）、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ蛍光アッセイ（ＡＡＡ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、１５２５５）を使用して、ＬＯＸ酵素活性を測定した。アッセイ反応混合物は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．２）、１．２Ｍ尿素、５０＿Ｍ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．１ユニット／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ、および１０ｍＭ  １，５−ジアミノペンタン（カダベリン）基質からなっていた。タンパク質試料を、１００μＭのＢＡＰＮの存在下または非存在下で、反応混合物に添加した後、３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光生成物を、吸光度マイクロプレートリーダーを使用して５９０ｎｍで測定した。
【０２２９】
ＭＴＳ−細胞生存能力アッセイ：５ｘ１０３個の細胞を３回播種し、９６ウェルプレート中で終夜増殖させた。次の日、培地を交換し、様々な濃度のＢＡＰＮを添加し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。製造業者の指示書にしたがってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞増殖を測定した。簡単に述べると、細胞を、ＭＴＳ溶液と共に３７℃で３時間インキュベートし、４９２ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して決定した。３回の独立した実験を実行した。
【０２３０】
細胞移動アッセイ：細胞を終夜増殖させた後、培地を交換し、１００μＭのＢＡＰＮを添加した。４８時間後、プラスチック製の１ｍｌピペットチップを用いて、集密単層を介して擦り取った。次いで、処理された細胞および対照細胞を、同一の時点（２４および４８時間）で写真撮影した。
【０２３１】
統計分析：別途指摘しない限り、結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表す。ＡＴＲＴ細胞集団間での遺伝子発現の統計的差異を、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を使用して評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験における統計的差異を、ＡＮＯＶＥ／カイ二乗検定を使用して算出した。全ての統計分析について、別途指摘しない限り、有意性のレベルをｐ＜０．０５と設定した。
【０２３２】
〔結果〕
ＭＲＴ異種移植モデルの確立および細胞培養物の特徴付け：ヒト悪性ラブドイド腫瘍試料を、新生男児の左頸部腫瘤から取得した。原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色により、丸い核、微細なクロマチンおよび大きい好酸性核小体を有する中程度から大きい多角形の腫瘍細胞が実証された。免疫組織化学的プロファイルと共に、腫瘍細胞の形態学的特徴により、悪性ラブドイド腫瘍の診断が確認された。実際、多くの腫瘍細胞は、ＩＮＩ−１タンパク質の発現を示さなかった。フローサイトメトリー分析を、原発腫瘍細胞に対して実施したところ、サイズが異なる２つの細胞集団が示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付けのために、細胞を２つの異なる条件で増殖させた：１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと、増殖因子を添加した無血清培地。２つの形態学的に異なる型の細胞が観察された：接着性線維芽細胞様細胞と、以前に記載されたように培養物中でのＭＲＴ細胞の形態と一致する、接着細胞に緩く結合した丸い細胞。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した場合、有意な細胞増殖が観察された。原発腫瘍の培養物中での形態は、約８回の継代にわたって維持された。原発腫瘍グラフトを、４匹の免疫不全マウスへの２〜５ｍｍの腫瘍小片の皮下移植によって形成させた（図６）。４／４のマウスにおいて腫瘍生着が観察され、さらなる腫瘍増殖が可能になった。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＭＲＴ  Ｘｎの連続増殖を、組織試料移植または固定数の１ｘ１０６個の細胞を利用する単一細胞懸濁移植によって実施した（表２および図６）。連続増殖により、本発明者らは低（＜Ｐ５）、中（Ｐ５〜Ｐ１０）および高継代（Ｐ１０〜Ｐ１６）のＭＲＴ  Ｘｎ継代を確立することができ、ＭＲＴ  ＣＳＣ表現型の特徴付けおよびＭＲＴ開始能力と関連する発症経路の解明のために試験した（以下の表２、および図６）。
【表２】
0006587288.tif 000003
【０２３３】
連続１ｘ１０６＊個の細胞注射および組織移植に由来する原発ヒトＡＴＲＴ  Ｘｎの作成。原発腫瘍組織を、新生児のＡＴＲＴから取得した。
【０２３４】
〔ＭＲＴの長期的増殖はＣＳＣ頻度の増加と関連する〕
【０２３５】
固定細胞数の１ｘ１０６個の細胞を用いるＭＲＴ  Ｘｎの連続増殖は、腫瘍生着までのより短い時間と相関し、腫瘍増殖を促進した（図１Ａおよび表３）が、これは、継代と共に腫瘍侵攻性が促進されることを示している。
【表３】
0006587288.tif 000004
【０２３６】
表は、ＡＴＲＴ  Ｘｎから得られ、さらに増殖させた１ｘ１０６個の細胞からの二次腫瘍形成の頻度および特徴をまとめたものである。ＡＴＲＴ  Ｘｎの連続増殖の間に、腫瘍生着までのより短い時間および腫瘍増殖の促進が分かった。低継代と中間継代Ｘｎとの間の比較において、＊ｐ＜０．０１である。
【０２３７】
本発明者らは次に、ＣＳＣ能力がＭＲＴ増殖と共に機能的に増強されるかどうかを調査した。本発明者らは、低、中間および高継代Ｘｎに由来するＭＲＴ細胞を用いる限界希釈異種移植実験を実施した。この分析は、高継代ＸｎにおけるＣＳＣ頻度に関する有意な陽性選択を示す（表４）。
【表４】
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【０２３８】
高継代ＭＲＴ  Ｘｎはより多数のＣＳＣについて富化することが観察されたので、継代に沿ったＣＳＣ表現型の獲得を伴う組織学的および免疫組織化学的変化を分析した（図１Ｂ〜Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色により、Ｘｎ由来腫瘍が基本的なラブドイド様細胞形態を維持することが明らかになった。それにもかかわらず、紡錘状細胞形態の獲得、広範囲の壊死、アポトーシス小体が少ないこと、および有糸分裂がより多いことなどのいくつかの形態学的差異が高世代Ｘｎにおいて観察された（図１Ｂ）。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、原発腫瘍とＸｎ組織の両方が間葉マーカーであるビメンチンを強く発現することが開示された（図１Ｃ）。しかしながら、原発腫瘍とは対照的に、高世代Ｘｎは、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３および神経線維タンパク質（ＮＦＰ）を含む分化マーカーの喪失を示した（図１Ｃ）。ＩＨＣの結果を検証するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを原発腫瘍、早期および後期Ｘｎに対して実施した。遺伝子発現分析により、上皮分化マーカーであるＥ−カドヘリンの喪失と同時に、ビメンチンの維持が実証された（図１Ｄ）。かくして、ＣＳＣ頻度の増強は、類似する組織病理学的ラブドイド特徴を保持し、間葉表現型に向かう脱分化を示すＭＲＴ  Ｘｎと関連していた。
【０２３９】
〔増強された腫瘍開始活性と関連する全体的遺伝子シグナチャーは推定ＣＳＣバイオマーカーを明らかにする〕
【０２４０】
本発明者らは次に、ＣＳＣ表現型に関する選択を伴う連続ＭＲＴ  Ｘｎの全体的分子プロファイルを特徴付けようとした。この目的のために、本発明者らは、いくつかの異なる試料を比較するマイクロアレイ遺伝子発現分析を実施した：１．原発ＭＲＴ、２．早期のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ２）、３．中間のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ７）、４．後期のＭＲＴ  Ｘｎ（Ｐ１６）、５．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、６．胎児腎臓（ＦＫ）、７．成人腎臓（ＡＫ）、８．胎児脳（ＦＢ）、９．成人脳（ＡＢ）。全体的発現分析により、増殖したＭＲＴ  Ｘｎ細胞は、階層的クラスタリングにより例示されるように、起源となる原発腫瘍よりもむしろｈＥＳＣと密接にクラスター化した（図２Ａ）。さらに、Ｘｎ組織とヒト胎児組織とのより高い類似性があった。総合すると、これらの結果は、腫瘍増殖中の幹細胞表現型のための選択を確認するものである。原発ＭＲＴおよび連続ＭＲＴ  Ｘｎ（低、中および高継代）のより厳密な検査により、継代を通して上方調節および下方調節される遺伝子の２つの主要なクラスターを含む、様々な遺伝子発現パターンが同定された（図２Ｂ）。上方調節された遺伝子のコホートは、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）などの観察されたＣＳＣ表現型の獲得に伴う分子を含んでいた（図２Ｃ）。この遺伝子発現プロファイルはまた、より後の継代を高増殖性として示す遺伝子ヒートマップ（例えば、ＫＩ−６７、ＣＤＫ１およびＡＵＲＫＡ）により表される継代に沿った腫瘍生物学を検証することもできた（図２Ｄ）。さらに、ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（著作権）機能分析により、壊死、細胞死および細胞の分化の減少が実証され（図２Ｅ）、両方とも、原発腫瘍および低継代Ｘｎと比較して高継代Ｘｎにおいてアポトーシスの減少、有糸分裂の増加および分化マーカーの喪失を実証したＨ＆ＥおよびＩＨＣ染色から得られた結果を支持する。かくして、連続Ｘｎ増殖モデルは、継続的な腫瘍開始および増殖ならびにＭＲＴにおけるＣＳＣ表現型獲得に関与する推定バイオマーカー分子を生成した。
【０２４１】
〔ＭＲＴ  ＣＳＣバイオマーカーとしてのＡＬＤＨ１の機能的検証〕
【０２４２】
本明細書に開示される分子スクリーンがＭＲＴにおけるＣＳＣ表現型獲得のマーカーとしてＡＬＤＨ１を独立に正確に示すことが観察されたので、本発明者らは、その発現および機能的役割をさらに検査した。重要なことに、ＡＬＤＨ１はＣＳＣマーカーと示唆され、したがって、手法を検証することができた。発現分析により、ＡＬＤＨ１の割合が腫瘍増殖と共に有意に増加することが実証された（図３Ａ）。異なる段階のＸｎ増殖におけるＡＬＤＨ１集団の割合を定量するためのＦＡＣＳ分析により、後期継代（継代１０）中での２５％の細胞と比較して、低継代Ｘｎ細胞（継代４）中では、わずか４％の細胞がＡＬＤＨ１＋であることが明らかになった（図３Ｂ）。さらに、ＡＬＤＨ１  ＩＨＣ染色により、継代と共にＡＬＤＨ１の発現が増加することが実証された（図３Ｃ）。さらに、ＡＬＤＨ１ｈｉｇｈ発現細胞は、主に大きいラブドイド細胞であった（図３Ｄ）。遺伝子発現レベルで、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、後期継代において高いＡＬＤＨ１発現を示し、原発腫瘍と比較して約４０倍高かった（図３Ｅ）。次いで、本発明者らは、ＡＬＤＨ１＋画分がＣＳＣとしての資格があるかどうかを決定するために、それらを選別した。がん幹細胞の決定的な特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでクローンを形成するその機能的能力である。コロニー形成アッセイは、ＣＳＣ表現型と一致してＡＬＤＨ１−ＭＲＴ細胞と比較してＡＬＤＨ１＋において、有意により多い数のクローンおよびより大きいコロニーを示した（図４Ａ）。さらに、ＣＳＣは、免疫不全マウスへの移植時に腫瘍を再形成するその能力によって定義される。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＬＤＨ１＋細胞の腫瘍形成性を調査するために、減少量のＦＡＣＳ精製されたＡＬＤＨ１＋およびＡＬＤＨ１−細胞を、限界希釈分析を使用してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹に注射した（１８）。未選別の細胞を、対照として注射した（表２）。低継代（Ｐ３）においては、２０００個以下のＡＬＤＨ１＋細胞を注射された６匹のマウスのうちの４匹が、ＡＬＤＨ１−細胞を注射したマウスの０匹と比較して腫瘍を形成した（ｐ＜０．０５）。高継代（Ｐ１２）においては、１０００個以下のＡＬＤＨ１＋細胞を注射した全てのマウスが二次腫瘍を形成したが、ＡＬＤＨ１−細胞を注射した１１匹のマウスのうちのわずか２匹が腫瘍を生じ（ｐ＜０．００１）、この集団が腫瘍開始細胞を相対的に枯渇させたことを示唆する（表２）。重要なことに、ＡＬＤＨ１＋細胞から生じた腫瘍を、この集団中での腫瘍開始能力の存在と一致して、第２のレシピエント中に連続的に移植することができ、ＡＬＤＨ＋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの自己再生能力を実証した（図４Ｂ）。総合すると、これらのデータは、ＡＬＤＨ１が、本発明者らが長期的増殖と共に定義したＣＳＣ表現型獲得と、ＡＬＤＨ１などの特定の分子との関連を検証するＭＲＴ  ＣＳＣのためのマーカーであることを示している。分子レベルで選別されたＡＬＤＨ＋ＣＳＣをより良好に特徴付け、それらが長期的増殖によって予測されるＣＳＣバイオマーカーについて富化するかどうかを決定するために、ＭＲＴ  Ｘｎから得られた選別されたＡＬＤＨ＋およびＡＬＤＨ−細胞上でのＲＮＡ配列決定実験を実施した（図４Ｃ）。興味深いことに、ＡＬＤＨ−細胞と比較してＡＬＤＨ＋細胞中で最も上方調節される遺伝子は、原発腫瘍と比較して後期Ｘｎ継代において有意に過剰発現される遺伝子（例えば、ＡＮＸＡ１、ＧＰＭ６Ａ、ＨＧＦおよびＬＯＸ）であると分かった（図４Ｃ）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、ＡＬＤＨ−細胞と比較してＡＬＤＨ＋中での高いＬＯＸ発現を検証した（図４Ｅ）。これらの結果は、腫瘍侵攻性およびＣＳＣ頻度と関連する分子および経路を同定するためのモデルとしての本発明者らのＸｎ増殖技術の正当性を強調する。進行性ＭＲＴ  Ｘｎおよび選別されたＡＬＤＨ＋ＣＳＣ画分におけるＬＯＸの高発現により、本発明者らはＬＯＸが治療標的として役立ち得るかどうかを検査した。
【０２４３】
〔ＭＲＴ  ＣＳＣ治療剤としてのＬＯＸ阻害剤の機能的検証。〕
細胞外マトリックス再モデリング酵素であるＬＯＸは、クロマチン圧縮（１９）、遺伝子転写（２０、２１）、ならびに初期細胞分化および組織発生（２２）などの事象を調節し、したがって、同様の活性を調節するＩＮＩ−１喪失を特徴とするＭＲＴと関連する。最近の研究により、ＬＯＸが乳、結腸および膵臓腫瘍などのいくつかの悪性腫瘍において過剰発現され（２３、２４）、腫瘍の進行および転移と関連する（２５）ことが示された。原発ＭＲＴ、早期（Ｐ２）、中間（Ｐ７）および後期（Ｐ１４）Ｘｎ継代におけるＬＯＸの発現を分析するＩＨＣ染色により、ラブドイド細胞中での有意な発現と共に継代を通じて広い発現増加が確認された（図５Ａ）。以前、ＬＯＸ阻害剤であるＢＡＰＮは様々ながん細胞に対する好ましい効果を有することが示された（２３）。ＬＯＸ遺伝子は増殖およびＣＳＣ表現型選択中のＸｎおよび選別されたＭＲＴ  ＣＳＣ中で上方調節されたため、本発明者らは、ＬＯＸ阻害がＭＲＴ細胞に対する効果を有するかどうかを検査しようとした。第１に、Ｘｎ細胞を、異なる濃度のＢＡＰＮ中で４８時間増殖させた。細胞生存能力を検査するＭＴＳ分析により、３つの異なる実験において１００μＭのＢＡＰＮによる処置後に増殖の有意な減少が実証された（データは示さない）。次に、本発明者らは、マウスにおいて連続増殖させた腎臓の一般的な小児固形腫瘍であるＷＴ  Ｘｎ細胞に対するＢＡＰＮの効果を検査した。その結果、ＭＲＴ細胞に対するＬＯＸ阻害の特異的効果を示す、ＷＴ細胞増殖に対する効果は実証されなかった（図５Ｂ）。本発明者らは次に、ＢＡＰＮ処理の結果としてのＭＲＴ細胞の形態を検査し、処理が核凝縮および細胞嚥下などの形態学的変化を誘導することを示した（図５Ｃ）。重要なことに、移動アッセイにより、４８時間にわたるＢＡＰＮ処理が、未処理の細胞と比較して、ＭＲＴ細胞移動能力を有意に阻害することが明らかになった（図５Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は全て中間Ｘｎ継代（Ｐ１０）を使用して得られたため、本発明者らは、ＢＡＰＮが原発腫瘍とより類似する細胞に対する類似する効果を有するかどうかを決定することにした。同様の実験をＰ２細胞に対して行ったところ、同じ結果が示された（図７Ａ〜Ｃ）。ＬＯＸ活性測定は、１００μＭのＢＡＰＮがＬＯＸ活性を実際に有意に阻害することを検証した（図７Ｄ）。これらの結果は、新規ＭＲＴ  ＣＳＣバイオマーカーの標的化が腫瘍増殖を無効化することができることを示唆し、ＬＯＸを可能なＭＲＴ治療標的として正当化する。
【０２４４】
〔実施例１の参考文献〕
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【実施例２】
【０２４５】
〔ヒトウィルムス腫瘍およびユーイング肉腫異種移植片の長期的増殖〕
【０２４６】
〔材料および方法〕
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの異種移植片形成および生着までの時間の算出：動物実験を、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにしたがって実施した。５〜８週齢のメスの非肥満糖尿病免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスへの腫瘍異種移植を、本明細書に上記されたように実施した。簡単に述べると、原発腫瘍組織を、２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。マウスを、病原体を含まない環境中で維持し、腫瘍増殖について毎週モニタリングした。二次腫瘍を、毎週、触診によって検出した。腫瘍が１．５ｃｍの直径のサイズに達した時、それらを採収した。それぞれの生着したＸｎの生着までの時間、切除までの時間、重量および体積を記録した。Ｘｎ組織をすぐに小片に切断し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹への皮下的な組織埋込みおよびその後のＸｎ増殖のための以下に記載のような単一細胞懸濁液の調製のためにプロセッシングした。単一細胞懸濁液を、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの培地のＩｓｃｏｖｅの改変物（ＩＭＤＭ）中で試料を細断した後、３７℃で２時間、コラゲナーゼＩＶで処理することにより取得した。酵素処理された組織を、コラゲナーゼ溶液の容量の２倍のＩＭＤＭを使用して磨砕し、懸濁液を濾過（１００μｍの細胞ストレーナー）し、抗生物質を含有するＩＭＤＭで２回洗浄した。赤血球をＡＣＫ  ＲＢＳ溶解バッファーにより除去した。
【０２４７】
Ｘｎ連続継代を、２つの方法を用いて形成させた：１．新鮮に回収されたＸｎからの約１ｘ１０６個の解離された細胞の連続注射；細胞を、１００μｌの１：１無血清培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中に注射した。２．Ｘｎ組織を２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。
【０２４８】
〔結果〕
ユーイング肉腫（図８Ａ）およびウィルマウス腫瘍（図８Ｂ）Ｘｎの連続増殖は、腫瘍生着までのより短い時間と相関したが、これはより侵攻性の表現型に向かう腫瘍挙動の変化を示している。
【実施例３】
【０２４９】
〔ヒト胸膜肺芽腫（ＰＰＢ）異種移植片の長期的増殖〕
【０２５０】
〔材料および方法〕
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの異種移植片形成および生着までの時間の算出：動物実験を、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにしたがって実施した。５〜８週齢のメスの非肥満糖尿病免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスへの腫瘍異種移植を、本明細書に上記されたように実施した。簡単に述べると、原発腫瘍組織を、２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。マウスを、病原体を含まない環境中で維持し、腫瘍増殖について毎週モニタリングした。二次腫瘍を、毎週、触診によって検出した。腫瘍が１．５ｃｍの直径のサイズに達した時、それらを採収した。それぞれの生着したＸｎの生着までの時間、切除までの時間、重量および体積を記録した。Ｘｎ組織をすぐに小片に切断し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹への皮下的な組織埋込みおよびその後のＸｎ増殖のための以下に記載のような単一細胞懸濁液の調製のためにプロセッシングした。単一細胞懸濁液を、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの培地のＩｓｃｏｖｅの改変物（ＩＭＤＭ）中で試料を細断した後、３７℃で２時間、コラゲナーゼＩＶで処理することにより取得した。酵素処理された組織を、コラゲナーゼ溶液の容量の２倍のＩＭＤＭを使用して磨砕し、懸濁液を濾過（１００μｍの細胞ストレーナー）し、抗生物質を含有するＩＭＤＭで２回洗浄した。赤血球をＡＣＫ  ＲＢＳ溶解バッファーにより除去した。
【０２５１】
Ｘｎ連続継代を、２つの方法を用いて形成させた：１．新鮮に回収されたＸｎからの約１ｘ１０６個の解離された細胞の連続注射；細胞を、１００μｌの１：１無血清培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中に注射した。２．Ｘｎ組織を２〜５ｍｍの小片に切断し、マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。
腫瘍増殖細胞の相対頻度の見積もり：低および高継代からのＸｎ細胞の腫瘍形成活性を評価および比較するために、１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁された細胞の連続希釈液（１ｘ１０６〜５０個の細胞）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下的に注射した。がん増殖細胞の相対頻度の見積もりを、ＥＬＤＡソフトウェアオンライン（bioinfdotwehidotedudotau/software/elda/）を使用してオンラインで算出した。
【０２５２】
チップアレイ：全ての実験を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ  ＧＥＮＥ１．０ｓｔオリゴヌクレオチドアレイを使用して実施した。各試料からの全ＲＮＡを使用して、製造業者の推奨にしたがって、ビオチン化された標的ｃＤＮＡを調製した。各試料から生成された標的ｃＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、製造業者の推奨にしたがってプロセッシングした。品質対照測定の詳細を、オンラインで見出すことができる。有意に変化した遺伝子を、少なくとも２倍変化したものとしてフィルタリングした（ｐ値：０．０５）。
【０２５３】
ＰＰＢ  Ｘｎの免疫組織化学染色：４μｍの厚さの切片を、免疫組織化学分析のために原発ＰＰＢおよびＰＰＢ  Ｘｎから切断した。本明細書に上記されたように免疫染色を実施した。簡単に述べると、切片をプロセッシングして、抗原の酸化を回避した。免疫染色の前に、切片を、抗原回収のために１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６．０で、９７℃で１０分間処理した後、３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理した。次いで、スライドを、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ  ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用する標識ストレプトアビジン−ビオチン（ＬＡＢ−ＳＡ）法を使用して染色した。ＨＲＰに基づく色原体／基質系（液体ＤＡＢ基質キット−Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）により、免疫反応を可視化した。抗ヒトＮＣＡＭ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃６１１１９５）を、１：１２００の希釈率で使用した。ＨＲＰに基づく色原体／基質系（液体ＤＡＢ基質キット−Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）により、免疫反応を可視化した。
【０２５４】
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析−遺伝子発現分析：定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実行して、ＮＣＡＭの発現における倍数変化を決定した。細胞からの全ＲＮＡを、製造業者の指示書にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して単離した。ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡ上で合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ７９００ＨＴ配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国を適用）の存在下で実施した。ＰＣＲ増幅を、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｅ−Ｍａｄｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国を適用）を使用して実施した。各分析反応を３回実施した。ＨＰＲＴ１またはＧＡＰＤＨを、実験分析を通して内部対照として使用した。ＰＣＲの結果を、ＳＤＳ  ＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．２ソフトウェアを使用して分析した。統計分析を、対応のない両側Ｔ検定を使用して実施した。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５と考えた。
【０２５５】
〔結果〕
ＰＰＢ  Ｘｎの連続増殖は、腫瘍生着までのより短い時間と相関し、腫瘍増殖を促進し、継代に沿った腫瘍侵攻性の促進を示した。早期（継代１〜４）と後期Ｘｎ（継代７〜１２）との比較において、腫瘍生着までの継代時間は、以下の表５に示されるように、５８日から３３日まで減少した（ｐ＜０．０２）。
【表５】
0006587288.tif 000006
【０２５６】
限界希釈異種移植実験を、早期および後期継代Ｘｎに由来するＰＰＢ細胞を用いて実施した。この分析は、高継代ＸｎにおけるＣＳＣ頻度に関する有意な陽性選択を示す。早期と後期Ｘｎ継代との間の比較において、ＣＳＣ頻度は、以下の表６に示されるように、１／１５８１から１／３０４の細胞まで上昇した（ｐ＝０．００９）。
【表６】
0006587288.tif 000007
【０２５７】
異なるＰＰＢ試料、成人肺（ＡＬ）と胎児肺（ＦＬ）との間での、いくつかの増殖マーカー（例えば、ＫＩ６７、Ｅ２Ｆ２、およびＣＤＫ１）、自己再生ポリコーム遺伝子（例えば、ＢＭＩ１、ＴＯＰ２Ａ、およびＥＺＨ２）、ならびに転移シグナチャー遺伝子（例えば、ＳＰＡＲＣ、ＣＸＣＲ４およびＬＴＢＰ１）の発現パターンを比較する遺伝子ヒートマップを図９に提供し、これは、高継代が高度に増殖性であり、侵襲的遺伝子シグナチャーと共に、自己再生遺伝子の上方調節を提示することを示し、転移挙動を予測する。
【０２５８】
ＮＣＭＡ１に関するいくつかのＸｎ継代（Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１７）の免疫組織化学（ＩＨＣ）は、図１０Ａに例示されるように、Ｘｎ連続増殖と共に発現の増加を明らかにする。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、成人肺対照と比較した原発腫瘍中での高いＮＣＡＭ１発現（右）および成人肺と比較した胎児肺における高いＮＣＡＭ１発現（左）を明らかにし、これは、ＮＣＡＭ１が発がんおよび発生中に重要な役割を果たすという事実を強調するものである（図１０Ｂ）。
【０２５９】
ＣＤ４４に関するいくつかのＸｎ継代（Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１７）のＩＨＣは、図１１Ａ〜Ｂに例示されるように、Ｘｎ連続増殖と共に発現の増加を明らかにする。
【０２６０】
本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの変化、改変および変更が当業者には明らかであることが明確である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲の中にある全てのそのような変化、改変および変更を包含することが意図される。
【０２６１】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認と解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される程度で、それらは必ずしも限定と解釈されるべきではない。
【図１Ａ．１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ．２Ｅ】
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【図３Ａ．３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ．３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ．４Ｃ．４Ｄ】
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【図５Ａ．５Ｂ】
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【図５Ｃ．５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ．７Ｂ．７Ｃ．７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ．１０Ｂ】
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【図１１Ａ．１１Ｂ】
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