(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異キシラナーゼであって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるセリン；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるセリン、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。
【請求項２】
前記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置にセリンを有する、請求項１記載の変異キシラナーゼ。
【請求項３】
さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置におけるセリン；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるセリン；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアラニン；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項１又は２記載の変異キシラナーゼ。
【請求項４】
さらに糖質結合モジュールを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。
【請求項５】
変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。
【請求項６】
前記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基をセリンに置換することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。
【請求項９】
前記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基をセリンに置換することを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１記載のポリヌクレオチド又は請求項１２記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項記載の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤。
【請求項１５】
請求項１４記載のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異キシラナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源である。その中でもセルロース系バイオマスが注目を浴びている。セルロースを分解することで糖を製造し、得られた糖から化学変換や微生物を用いた発酵技術により石油資源の代替物やバイオ燃料などの有用資源を製造する技術の開発が、世界中で行われている。
【０００３】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主成分として構成される。このようなバイオマスは、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼなどが相乗的に作用することにより、複雑なプロセスで分解されることが知られている。セルロース系バイオマスの有効活用にあたっては、セルロースやヘミセルロースを高効率に分解可能な糖化酵素の開発が必要となる。
【０００４】
セルロース系バイオマスの糖化においては、糖化酵素が基質であるセルロースやヘミセルロースに吸着し、それらを分解することによって糖が生産される。こうした糖の生産に関わるセルロースやヘミセルロース基質への該酵素の吸着は、生産的吸着と呼ばれる。対照的に、糖化酵素により分解されない成分、例えばリグニン、灰分、その他成分などへの該酵素の吸着は、非特異的吸着と呼ばれる。酵素の糖化効率は、酵素の比活性、耐熱性、非特異的吸着などの因子に左右されると考えられており、糖化酵素の開発にあたっては、これらの因子が着目される。
【０００５】
セルロース系バイオマスを糖化酵素で糖化した後の残渣成分は、リグニンが主成分である。しかし、セルロース系バイオマス中のリグニンに糖化酵素が吸着することにより、糖化効率が低下することが知られている。セルロース系バイオマス糖化において、糖化酵素のリグニンへの非特異的吸着性は好ましくない性質である。
【０００６】
リグニン存在下での酵素活性が向上した糖化酵素が報告されている。特許文献１には、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ等のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）IIにおいて、負電荷のアミノ酸への置換、正電荷のアミノ酸の除去等の改変により、非セルロース素材への非特異的吸着が低減したことが開示されている。特許文献２には、リグニンによる不活性化が低減したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｆａｍｉｌｙ  ６セルラーゼの変異体が開示されている。特許文献３には、リンカーペプチドを改変した、リグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたセルラーゼ変異体が開示されている。特許文献４には、リグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｃｅｌ６Ａの糖質結合モジュール（ＣＢＭ）の変異体が開示されている。また、特許文献５には、バイオマスの糖化効率の高い酵素として、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ由来のキシラナーゼが開示されている）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１１−５２３８５４号公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１０／０１２１０２号
【特許文献３】国際公開公報第２０１０／０９６９３１号
【特許文献４】国際公開公報第２０１０／０９７７１３号
【特許文献５】特表２０１３−２４３９５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）１１に属するキシラナーゼ（以下、ＧＨ１１キシラナーゼということがある）は、セルロース系バイオマスの糖化に利用可能なヘミセルラーゼである。しかし、ＧＨ１１キシラナーゼは、糖化残渣やリグニンへの吸着性が高いものが多く、バイオマス糖化に用いた場合、非特異的吸着による糖化率低下をもたらすという欠点がある。ＧＨ１１キシラナーゼが糖化残渣やリグニンに吸着するしくみの詳細は未だ不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）由来のＧＨ１１キシラナーゼのアミノ酸配列において、特定部位の塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に置換することによって、当該酵素の糖化残渣又はリグニンへの吸着性を低減することができることを見出した。
【００１０】
したがって、一態様において本発明は、変異キシラナーゼであって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼを提供する。
【００１１】
別の一態様において、本発明は、変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、上記バイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、糖化残渣やリグニンへの吸着性が低減した変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼを使用することにより、従来のキシラナーゼと比較して、リグニンを含むバイオマスをより効率的に糖化することができ、またより効率的かつ安価にバイオマスから糖を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１．定義）
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２０】
本明細書において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２１】
さらに、当業者であれば、必要に応じて、上記で得られたアラインメントを、最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基又はヌクレオチドは「相当する位置のアミノ酸残基」又は「相当する位置のヌクレオチド」と称される。
【００２３】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」とは、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されるアミノ酸残基をいう。本明細書において、「非塩基性アミノ酸残基」とは、上記に挙げた２０種のアミノ酸残基のうち、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基をいう。
【００２４】
本明細書において、「グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）１１」（又はＧＨ１１ということがある）とは、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ−ＡＣＴＩＶＥ  ＥＮＺＹＭＥ  ＣＡＺＹ−Ｈｏｍｅ（［ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／］）にて分類されるファミリーの第１１族を意味する。本明細書において、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼ（又はＧＨ１１キシラナーゼ）とは、アミノ酸２００個程度のタンパク質でβジェリーロール構造を有し、エンド− β−１，４−キシラナーゼ活性又はエンド− β−１，３−キシラナーゼ活性を有するヘミセルラーゼファミリーである（バイオマス分解酵素研究の最前線−セルラーゼ・へミセルラーゼを中心として−近藤昭彦、天野良彦、田丸浩  株式会社シーエムシー出版）。
【００２５】
本明細書において、「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性をいう。タンパク質のキシラナーゼ活性は、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。例えば、タンパク質のキシラナーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、キシランから生成した糖の還元末端を定量化することによって測定することができる。より詳細には、可溶キシラン、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び対象タンパク質を混合し、５０℃で反応させた後、ＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム、ジニトロサリチル酸、酒石酸ナトリウムカリウムを含む溶液）を添加して９９．９℃で反応させ、次いで反応液の波長５４０ｎｍでの吸光度を測定する。測定値を、キシロースを用いて作成した検量線により標準化することにより、生成糖の還元末端を定量化することができる。ＤＮＳ法によるキシラナーゼ活性測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００２６】
本明細書において、「キシラナーゼ」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を有する（すなわちキシラナーゼ活性を有する）ポリペプチドをいう。より詳細には、「キシラナーゼ触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ；ＣＤ）」、又はリンカーを介して結合されたＣＤと「糖質結合モジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ）」からなる酵素をいう。
【００２７】
本明細書において、「キシラナーゼ触媒ドメイン」又は単に「触媒ドメイン」（いずれもＣＤということがある）とは、キシラナーゼに含まれる、キシラナーゼ活性を保有するドメインをいう。
【００２８】
本明細書において、「糖質結合モジュール（ＣＢＭ）」とは、ＣＤにリンカーを介して共有結合されている、キシラナーゼの触媒反応の基質（例えば、キシラン）と結合するドメインをいう。
【００２９】
本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類、藻類などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００３０】
本明細書において、「糖化残渣」とは、バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースを糖化酵素で糖化した後の残存固形分をいう。キシラナーゼの「糖化残渣吸着性」の高さは、例えば、糖化残渣とキシラナーゼとを反応させて、該糖化残渣にキシラナーゼを吸着させた後、反応液の上清に残存するキシラナーゼ活性を測定し、該糖化残渣と反応させなかった場合のキシラナーゼ活性に対する相対活性を求めることによって算出することができる。例えば、糖化残渣吸着率は以下の式で表すことができる。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣との反応後の酵素試料のキシラナーゼ活性／糖化残渣と未反応の酵素試料のキシラナーゼ活性）×１００
上記相対比活性がより低いキシラナーゼほど、より高い糖化残渣吸着性を有する。糖化残渣としては、例えば、リグニン、又は公知のセルラーゼ若しくはセルラーゼ製剤（例えば、ノボザイムズ社製Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２）を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を用いることができる。糖化残渣とキシラナーゼとの反応には、例えば、５０℃で１時間の処理を採用することができる。キシラナーゼの糖化残渣吸着性の測定のための具体的手順の例は、後述の実施例に詳述されている。
【００３１】
（２．変異キシラナーゼ及びその製造方法）
本発明は、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するキシラナーゼを改変して、所定の位置の塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に置換することによって製造することができる。
【００３２】
したがって、一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、変異キシラナーゼを提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼの製造方法を提供する。当該方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。
【００３４】
好ましくは、本発明の変異キシラナーゼにおいては、配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。
【００３５】
また好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び／又は１５８位に相当する位置のアミノ酸残基に加えて、配列番号２の１０位、４０位及び５６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。より好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基と、配列番号２の１０位、４０位及び５６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基とが、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。さらに好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。
【００３６】
好ましくは、本発明の変異キシラナーゼにおける配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置のアミノ酸残基と置換される非塩基性アミノ酸残基は、セリン及びアラニンより選択される。より好ましくは、当該配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置の各アミノ酸残基と置換される非塩基性アミノ酸残基は、それぞれ以下のとおりである。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
【００３７】
本明細書においては、上記アミノ酸置換を行う前の、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを、本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼ（又は単に親キシラナーゼ）ということがある。
【００３８】
本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）ＹＸ由来キシラナーゼの触媒ドメインが挙げられる。
【００３９】
親キシラナーゼの別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつキシラナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。当該ポリペプチドの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインが挙げられる。
【００４０】
親キシラナーゼのさらに別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキシラナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。なお、本明細書において、１〜数個とは、１〜１９個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
好ましくは、親キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置に、それぞれグルタミン酸残基を有する。これらの位置に存在するグルタミン酸残基は、キシラナーゼ活性に関与すると考えられている（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，２００６，６２：７８４−７９２）。
【００４２】
また好ましくは、親キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び／又は１５８位に相当する位置に、塩基性アミノ酸残基を有する。より好ましくは、配列番号２の４０位、５６位、１２９位、及び１５８位に相当する位置に、塩基性アミノ酸残基を有する。さらに好ましくは、配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位、及び１５８位に相当する位置に塩基性アミノ酸残基を有する。親キシラナーゼの配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位及び１５８位に相当する位置の塩基性アミノ酸残基は、好ましくはヒスチジン又はアルギニンであり、より好ましくはアルギニンである。
【００４３】
本発明の変異キシラナーゼは、実質的にキシラナーゼの触媒ドメインからなるものであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメインのＣ末端側にリンカーを介して連結されたＣＢＭ（糖質結合モジュール）をさらに含んでいてもよい。あるいは、本発明の変異キシラナーゼは、キシラナーゼ触媒ドメインのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。
【００４４】
本発明の変異キシラナーゼがＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む場合は、該変異キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインにおいて、上述した所定の位置のアミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基へと置換し、次いで該変異した触媒ドメインをＣＢＭ又はシグナルペプチドと連結することによって製造することができる。あるいは、触媒ドメインとＣＢＭ又はシグナルペプチドとを含むキシラナーゼのポリペプチドにおいて、上述した所定の位置のアミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基へと置換することによって、ＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む本発明の変異キシラナーゼを製造することができる。
【００４５】
したがって、本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼは、実質的にキシラナーゼ触媒ドメインからなるキシラナーゼであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメインとそのＣ末端側にリンカーを介して連結されたＣＢＭとを含むキシラナーゼであってもよく、キシラナーゼ触媒ドメインとそのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドとを含むキシラナーゼであってもよく、又はキシラナーゼ触媒ドメインと、そのＣ末端側及びＮ末端側にそれぞれ連結されたＣＢＭ及びシグナルペプチドを含むキシラナーゼであってもよい。
【００４６】
本発明の変異キシラナーゼのためのＣＢＭの例としては、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼのＣＢＭ（配列番号５）、及びこれとアミノ酸配列において少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するＣＢＭが挙げられる。また、本発明の変異キシラナーゼのためのシグナルペプチドの例としては、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼのシグナルペプチド（配列番号６）、及びこれとアミノ酸配列において少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するシグナルペプチドが挙げられる。
【００４７】
ＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む親キシラナーゼの例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼ、配列番号４の１〜２０２位で示されるアミノ酸配列からなる、キシラナーゼ触媒ドメインとシグナルペプチドを含むポリペプチド、配列番号４の４３〜３３８位で示されるアミノ酸配列からなる、キシラナーゼ触媒ドメインとＣＢＭを含むポリペプチド、及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼ遺伝子にコードされたポリペプチドが挙げられる。
【００４８】
（３．キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法）
本発明においては、親キシラナーゼのアミノ酸配列の上記に挙げた位置における塩基性アミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換する。これによって、親キシラナーゼの糖化残渣吸着性を低減することができる。
【００４９】
したがって、別の態様において、本発明は、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法を提供する。当該方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。上記アミノ酸置換に供されるべき親キシラナーゼ、上記置換すべき位置のうちの好ましい位置、上記置換すべき位置に加えて置換され得るさらなる位置、それらの位置における好ましい置換後のアミノ酸残基については、上述したとおりである。
【００５０】
本発明の変異キシラナーゼは、変異前のキシラナーゼ（すなわち親キシラナーゼ）と比べて、糖化残渣吸着性が低減されている。より詳細には、後述の参考例４〜６に従って、ノボザイムズ社製セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を糖化残渣とし、該糖化残渣１０ｍｇ／ｍＬと本発明の変異キシラナーゼとを５０℃で１時間反応させて糖化残渣吸着率を算出した場合、本発明の変異キシラナーゼの糖化残渣吸着率は、親キシラナーゼの糖化残渣吸着率を１００％としたときの相対値として、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、なお好ましくは６０％以下である。
【００５１】
（４．ベクター及び形質転換体）
本発明の変異キシラナーゼは、例えば、上記本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有する本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドが発現して、本発明の変異キシラナーゼが生産される。生産された変異キシラナーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異キシラナーゼを取得することができる。
【００５２】
したがって、本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。さらに本発明は、該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。さらに本発明は、当該形質転換体を培養することを含む、変異キシラナーゼの製造方法を提供する。
【００５３】
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、キシラナーゼ触媒ドメインのみをコードするポリヌクレオチドであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメイン及びＣＢＭをコードするポリヌクレオチドであってもよい。さらに該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする領域や、非翻訳領域（ＵＴＲ）などを含んでいてもよい。本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
【００５４】
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、該変異キシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、親キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド（以下、親キシラナーゼ遺伝子ともいう）において、配列番号２の１２９位又は１５８位に対応する位置のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を、置換後の非塩基性アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）へと変異させることによって、調製することができる。当該変異したポリヌクレオチドを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望の非塩基性アミノ酸残基に置換された変異キシラナーゼを得ることができる。
【００５５】
親キシラナーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００５６】
あるいは、親キシラナーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親キシラナーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後の非塩基性アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し、選択することができる。
【００５７】
例えば、親キシラナーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。
【００５８】
親キシラナーゼ遺伝子の例としては、配列番号２で示されるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼの触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、ならびに配列番号４で示されるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼの全長配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）が挙げられる。当該ポリヌクレオチドは、当該分野で用いられる任意の方法により取得することができる。例えば、サーモビフィダ・フスカＹＸの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１の配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的核酸を選択的に増幅し、増幅した核酸を精製することで、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００５９】
あるいは、親キシラナーゼ遺伝子の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチドに対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって調製することができる。例えば、配列番号１で示されるポリヌクレオチドに上記公知の方法で突然変異導入し、得られた変異ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのキシラナーゼ活性を調べ、所望のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ポリヌクレオチドを選択することによって、親キシラナーゼ遺伝子を得ることができる。
【００６０】
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）などを好適に用いることができる。
【００６１】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、上記本発明の変異キシラナーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、本発明のベクターを導入する宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養をコードする遺伝子を含むベクターを用いてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、当該遺伝子が当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
【００６２】
キシラナーゼをコードする配列と上記制御配列やマーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。プラスミドベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。
【００６３】
上記制御配列の例としては、Ｓ２３７ｅｇｌプロモーター及びシグナル配列（Ｂｉｏｓｃｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（１１）：２２８１−２２８９）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。あるいは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。
【００６４】
上記ベクターを導入する形質転換体の宿主の例としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５−１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７−１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。
【００６５】
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【００６６】
斯くして得られた、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、当該ベクター上の遺伝子が発現して、本発明の変異キシラナーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
【００６７】
あるいは、本発明の変異キシラナーゼは、無細胞翻訳系を使用して変異キシラナーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【００６８】
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異キシラナーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドと分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたキシラナーゼは菌体外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたキシラナーゼは、公知の手段でさらに精製されてもよい。
【００６９】
（５．バイオマス糖化方法又は糖の製造方法）
本発明の変異キシラナーゼは、糖化残渣の吸着率が低いため、バイオマスを効率よく糖化することができる。したがって、本発明の変異キシラナーゼは、バイオマスの糖化のため、又はバイオマスからの糖の製造のために好適に使用することができる。
したがって、本発明はさらに、上記本発明の変異キシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマス糖化方法を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
【００７０】
本発明の変異キシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤は、好ましくはバイオマス糖化用の酵素組成物（以下、本発明の酵素組成物ということもある）である。本発明の酵素組成物は、本発明の変異キシラナーゼを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくはさらにセルラーゼを含む。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明の酵素組成物に使用されるセルラーゼの例としては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。本発明の酵素組成物において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。
【００７１】
本発明の変異キシラナーゼと併用され得るセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、該変異キシラナーゼの触媒ドメインの質量に換算して、好ましくは０．５〜７０質量％、より好ましくは１〜５０質量％、さらに好ましくは２〜４０質量％、さらにより好ましくは２〜３０質量％である。
【００７３】
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０〜９９質量％、より好ましくは３０〜９５質量％、さらに好ましくは５０〜９５質量％である。また、本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．５〜２０質量％である。
【００７４】
本発明の酵素組成物における、本発明の変異キシラナーゼと上記セルラーゼとのタンパク質量比は、糖化効率向上の観点から、[本発明のキシラナーゼの触媒ドメイン／セルラーゼ]の質量比として、好ましくは０．０１〜１００、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．０５〜１、よりさらに好ましくは０．０５〜０．５である。
【００７５】
本発明によるバイオマスからの糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明の酵素組成物で糖化する工程を含む。本発明の糖の製造方法では、糖化残渣吸着性の低い本発明の変異キシラナーゼを用いることによって、キシラナーゼの非特異的吸着が低減することによりキシラン糖化率が向上する。さらに本発明の糖の製造方法では、セルロース糖化効率も向上する。このセルロース糖化効率向上の理由は明らかではないが、本発明の変異キシラナーゼを用いることにより、バイオマス中のヘミセルロースが効率的に分解されて、糖化酵素がセルロースに接触しやすい状態となり、全体として糖化効率が向上するためであると推測される。
【００７６】
本発明の酵素組成物が適用される、又は本発明の糖の製造方法で用いられるバイオマスの例としては、（１．定義）の章で前述したとおりである。入手容易性、原料コスト、及び糖化効率向上の観点からは、当該バイオマスとしては、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉又は果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。当該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また当該バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００７７】
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマスの粉砕効率向上、及び糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、バイオマスを本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。
【００７８】
上記前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。
【００７９】
上記アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。当該アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法（以下、「浸漬処理」ということがある）や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法（以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある）などが挙げられる。
【００８０】
上記粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。また、当該粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。当該粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。当該粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。当該粉砕処理は、アルカリ処理の前又は後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理、例えば上述したアルカリ混合粉砕処理を行ってもよい。アルカリ混合粉砕処理では、例えば、アルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく（湿式粉砕）、又は固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが（乾式粉砕）、このうち、乾式粉砕が好ましい。
【００８１】
上記水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。当該水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。好ましくは、当該水熱処理では、バイオマスの粗粉砕物を、水に分散した水スラリーの状態とし、これを加熱処理する。水スラリー中のバイオマスの含有量は、スラリーの流動性向上の観点から、好ましくは１〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは８〜３００ｇ／Ｌである。
【００８２】
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマス、好ましくは上記前処理されたバイオマスを、本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物で糖化する工程（本明細書において「糖化処理」ということがある）を含む。
【００８３】
上記糖化処理の条件は、本発明の変異キシラナーゼ及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。
【００８４】
上記糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。
【００８５】
上記懸濁液に対する本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物の使用量は、上記前処理条件、ならびに併用する酵素の種類及び性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、該変異キシラナーゼの触媒ドメインの質量に換算して、好ましくは０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である。
【００８６】
上記糖化処理の反応ｐＨとしては、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である。
【００８７】
上記糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらにより好ましくは４０〜７５℃、なお好ましくは４５〜６５℃、なおより好ましくは５０〜６５℃、さらになお好ましくは５０〜６０℃である。当該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。
【００８８】
上述した本発明の別の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。
【００８９】
＜１＞変異キシラナーゼであって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。
【００９０】
＜２＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置に、非塩基性アミノ酸残基を有する、＜１＞記載の変異キシラナーゼ。
【００９１】
＜３＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、上記＜１＞又は＜２＞記載の変異キシラナーゼ。
【００９２】
＜４＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。
【００９３】
＜５＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置の非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜４＞記載の変異キシラナーゼ。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
【００９４】
＜６＞好ましくは、さらに糖質結合モジュールを含む、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。
【００９５】
＜７＞好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。
【００９６】
＜８＞変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
【００９７】
＜９＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換される、上記＜８＞記載の方法。
【００９８】
＜１０＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記＜８＞又は＜９＞記載の方法。
【００９９】
＜１１＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜８＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
【０１００】
＜１２＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基を置換する非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜１１＞記載の方法。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
【０１０１】
＜１３＞好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜８＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０２】
＜１４＞キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
【０１０３】
＜１５＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換される、上記＜１４＞記載の方法。
【０１０４】
＜１６＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記＜１４＞又は＜１５＞記載の方法。
【０１０５】
＜１７＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜１４＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０６】
＜１８＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基を置換する非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜１７＞記載の方法。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
【０１０７】
＜１９＞好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０８】
＜２０＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【０１０９】
＜２１＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１１０】
＜２２＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチド又は上記＜２１＞記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
【０１１１】
＜２３＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチド又は上記＜２１＞記載のベクターを含む形質転換体。
【０１１２】
＜２４＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤。
【０１１３】
＜２５＞好ましくはセルラーゼをさらに含む、＜２４＞記載のバイオマス糖化剤。
【０１１４】
＜２６＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼを用いる、バイオマス糖化方法。
【０１１５】
＜２７＞好ましくはさらにセルラーゼを用いる、＜２６＞記載の方法。
【０１１６】
＜２８＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼのバイオマス糖化のための使用。
【０１１７】
＜２９＞好ましくはセルラーゼと併用される、＜２８＞記載の使用。
【０１１８】
＜３０＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ、又は上記＜２４＞若しくは＜２５＞記載のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【０１２０】
＜参考例１  ＰＣＲ反応＞
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）又はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマーとアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを１０μＬ添加して、反応液総量を２０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５〜６０℃で１０秒間及び７２℃で１０〜９０秒間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１０秒）の３段階の温度変化を３０回繰り返すことにより行った。
【０１２１】
＜参考例２  タンパク質濃度測定  （Ｌｏｗｒｙ法）＞
タンパク質の定量にはＬｏｗｒｙ法を用いた。酵素溶液は適切な濃度にイオン交換水で希釈した後、ＤＣプロテインアッセイ（バイオラッド）を用いて定量した。Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ  １ｍＬに対してＲｅａｇｅｎｔ  Ｓを２０μＬの割合で混合し、タンパク質５μＬに対してこの混合液を２５μＬ添加した。さらにＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ（発色液）を１５８μＬ添加し、１５分間室温で静置した。マイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｓａ  ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で７５０ｎｍの吸光度を測定し、ＢＳＡの検量線からタンパク質の濃度を定量した。
【０１２２】
＜参考例３  キシラナーゼ活性の測定＞
キシラナーゼ活性の測定は３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、生成糖の還元末端を定量化した。終濃度可溶キシラン１％（ｗ／ｖ）（２％（ｗ／ｖ）ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１分間煮沸し、室温に静置後、遠心分離により得られた上清を可溶キシランとした）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、酵素１０μＬを混合し、５０℃で１０分間反応させた。反応終了後、１００μＬのＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム（和光純薬工業）１．６％（ｗ／ｖ）、ジニトロサリチル酸（和光純薬工業）０．５％（ｗ／ｖ）、酒石酸ナトリウムカリウム（和光純薬工業）３０．０％（ｗ／ｖ））を添加し、９９．９℃で１０分間反応させた。マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン）で波長５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、生成糖の還元末端を定量化した。検量線にはキシロースを用いた。
【０１２３】
＜参考例４  バイオマスの調製＞
（１）バガス調製
バガス（サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％）を減圧乾燥機ＶＯ−３２０（アドバンテック東洋）中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量２．０質量％の乾燥バガスを得た。
（２）混合粉砕処理
得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」（東ソー社製）８．８ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）を、バッチ式振動ミルＭＢ−１（中央化工機：容器全容積３．５Ｌ、媒体としてφ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、２時間粉砕処理することでバガス粉砕物（平均粒子径約１６．６μｍ）を得た。
【０１２４】
＜参考例５  糖化残渣＞
参考例４で調製したアルカリ混合粉砕バガス５％（ｗ／ｖ）、セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社）５ｍｇ／ｇ−バイオマス、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン塩酸塩（ｗａｋｏ）、０．６μｇ／ｍＬエリスロマイシン（ｗａｋｏ）を含む１０ｍＬの液を、２５ｍＬの自立型遠沈管中で５０℃、１５０ｒｐｍ（タイテック：ＢＲ−４０Ｆ）にて２４時間反応させ、バガスを糖化させた。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ×１０分）により上清を除去し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で２回洗浄し、固形分を回収した。得られた糖化残渣を（以下、ＣＴｅｃ２糖化残渣という）を、以下のキシラナーゼ吸着性解析に用いた。
【０１２５】
＜参考例６  糖化残渣に対する吸着性解析＞
参考例５で調製した糖化残渣を基質として用い、キシラナーゼの吸着挙動を解析した。参考例５で調製した糖化残渣の質量を検量線より算出し、所定濃度の糖化残渣（基質）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、キシラナーゼ５０〜１５８μｇ／ｍＬを含む０．５〜１ｍＬの反応液を、２ｍＬのエッペンドルフチューブ又は９６穴ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＩＥＮＴＩＦＩＣ）で、５０℃、１５０ｒｐｍにて１時間振盪した。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、キシラナーゼ活性を前述のＤＮＳ法で測定した。下記式で示すように、基質濃度０ｍｇ／ｍＬの場合の活性を１００とし、基質と反応させた反応液の上清のキシラナーゼ相対比活性を算出した。得られた活性値を１００から減算することでキシラナーゼの糖化残渣吸着率を算出した。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣を添加した反応液上清のキシラナーゼ活性／糖化残渣未添加の反応液上清のキシラナーゼ活性）×１００
【０１２６】
＜実施例１  変異キシラナーゼの調製＞
（１）キシラナーゼ遺伝子含有ベクターの作製
サーモビフィダ・フスカ  ＹＸ株（Ｔｆｕ）をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ培地（３．０％Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ、２．０％Ａｇａｒ）に植菌し、２８℃にて１日間培養した。培養で得られた菌体から、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＭｉｃｒｏｂｉａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
【０１２７】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号８）とリバースプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号９）を用いて、Ｔｆｕキシラナーゼ（Ｔｆｕ−Ｘｙｎ）遺伝子領域（配列番号３）の約１．０ｋｂｐ断片（Ａ）を含むベクターを作製した。
【０１２８】
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７アルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号７）をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７  Ｆ（配列番号１０）とリバースプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７  Ｒ（配列番号１１）を用いてＳ２３７アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く領域の約５．６ｋｂｐ断片（Ｂ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。
【０１２９】
精製されたＤＮＡ断片（Ａ）１μＬとＤＮＡ断片（Ｂ）１μＬ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）に含まれる５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉ×２μＬ、ＤＮａｓｅフリーの水６μＬを混合し、５０℃で１５分反応させ、キシラナーゼ遺伝子の断片をベクターにクローニングした。その後、反応液２μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。形質転換体の再生培地には、５０ｐｐｍアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）、２．０％アガー（和光純薬工業）を含むＬＢ寒天培地を用いた。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体は同様のＬＢ寒天培地を用いて培養後（３７℃、１日間）、得られた菌体からプラスミドをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて回収、精製した。
【０１３０】
（２）キシラナーゼ触媒ドメイン遺伝子の調製
キシラナーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）をコードする遺伝子の発現ベクターを作製するために、上述のＴｆｕ−Ｘｙｎ遺伝子が挿入された組み換えプラスミドを鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号１２）とリバースプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号１３）を用いたＰＣＲにて、Ｔｆｕ−ＸｙｎのＣＤをコードする遺伝子を含む約５．６〜６．０ｋｂｐ断片を増幅した。プライマーの作製はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）のマニュアルに従った。遺伝子断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。精製したＰＣＲ断片２μＬを用いてコンピテンとセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。以下において、Ｔｆｕ由来キシラナーゼ触媒ドメインをＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎということがある。
【０１３１】
【表１】
0006470967.tif 000002
【０１３２】
（３）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎの変異キシラナーゼを作製した。上記（２）のＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表２記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、それぞれ、配列番号２の１２９位又は１５８位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓと表記する）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。すなわち、Ｒ１２９Ｓについては、配列番号３の５１１〜５１３番ヌクレオチドｃｇｔ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ１５８Ｓについては、配列番号３の５９８〜６００番ヌクレオチドａｇａ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。
さらに、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓの両変異を含む変異キシラナーゼ（Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片も作製した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
【０１３３】
（４）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
表３記載のプライマーを用いて、上記（３）と同様の手順で、配列番号２の１０位、４０位、又は５６位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｈ１０Ｓ、Ｒ４０Ｓ、及びＲ５６Ａと表記する）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。すなわち、Ｈ１０Ｓについては、配列番号３の１５４〜１５６番ヌクレオチドｃａｔ（ヒスチジン；Ｈ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ４０Ｓについては、配列番号３の２４４〜２４６番ヌクレオチドａｇａ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ５６Ａについては、配列番号３の２９２〜２９４番ヌクレオチドｃｇｇ（アルギニン；Ｒ）をｇｃａ（アラニン；Ａ）へ置換した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
【０１３４】
（５）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
さらに、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表３記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓとともに、Ｈ１０Ｓ、Ｒ４０Ｓ又はＲ５６Ａの変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｈ１０Ｓ、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｒ４０Ｓ、及びＲ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｒ５６Ａと表記する）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
【０１３５】
【表２】
0006470967.tif 000003
【表３】
0006470967.tif 000004
【０１３６】
（６）変異キシラナーゼ生産
上記（３）〜（５）で精製したプラスミドを、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）に従って、宿主菌に導入した。宿主には、枯草菌１６８株から９つの菌体外プロテアーゼを欠損させたＫＡ８ＡＸ、又は１６８株から８つの菌体外プロテアーゼを欠損させ、タンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を使用した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有ＤＭ３再生寒天培地（バクトカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、コハク酸二ナトリウム六水和物（和光純薬工業）４．０５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二カリウム（和光純薬工業）０．３５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム（和光純薬工業）０．１５％（ｗ／ｖ）、グルコース（和光純薬工業）０．１％（ｗ／ｖ）、塩化マグネシウム（和光純薬工業）２０ｍＭ、牛血清アルブミン（和光純薬工業）０．０１％（ｗ／ｖ）、トリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ）、テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業）０．００５％（ｗ／ｖ）、カルボキシメチルセルロース１．０％（ｗ／ｖ）、寒天１．０％（ｗ／ｖ））を用いた。
【０１３７】
ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体をＬＢ（１５μｇ／ｍＬテトラサイクリン・大試験管）５ｍＬに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで１６時間振盪培養した。培養液６００μＬを２×Ｌ  Ｍａｌ培地３０ｍＬ（バクトトリプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業）７５ｐｐｍ、マルトース一水和物（和光純薬工業）７．５％（ｗ／ｖ）、テトラサイクリン塩酸塩１５ｐｐｍ）に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍにて２〜３日間振盪培養（ＰＲＥＣｉ：ＰＲＸＹｇ−５６−Ｒ型）した。得られた培養液は遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分）により上清を回収した。得られた上清はＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により脱塩、バッファー置換した。置換用のバッファーには５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーを用いた。
【０１３８】
＜実施例２  変異キシラナーゼの糖化残渣吸着性＞
実施例１で調製した変異キシラナーゼについて、参考例６記載の手順（糖化残渣濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）にて、糖化残渣に対する吸着率を解析した。結果を表４〜表６に示す。キシラナーゼ変異体Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓは、野生型（Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ）と比較して、糖化残渣吸着率が大きく低減していた。また、両変異を組み合わせた二重変異体Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓでは、糖化残渣吸着率はさらに低減した（表４）。キシラナーゼ変異体Ｒ４０Ｓ及びＲ５６Ａも、野生型と比較して糖化残渣吸着率が低減していた（表５）。Ｒ４０Ｓ又はＲ５６Ａと、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率の低減がさらに顕著であった（表６）。一方、Ｈ１０Ｓの単独変異体では、糖化残渣吸着率の低減は観察されなかった（表５）が、Ｈ１０ＳとＲ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率が顕著に低減した（表６）。
【０１３９】
【表４】
0006470967.tif 000005
【表５】
0006470967.tif 000006
【表６】
0006470967.tif 000007
【配列表】
0006470967000001.app