(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖システムにおいて接着細胞を投入する方法であって、該方法は、
複数の接着細胞を有する流体を、第１流量で、細胞増殖システムのバイオリアクター内を循環させるステップと、
流体の循環を前記第１流量から減少させるステップと、
第１所定期間の間、前記バイオリアクターを、第１方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第１の部分を沈殿させるステップと、
前記第１所定期間の後、前記バイオリアクターを、前記第１方向から１８０度回転した第２方向に回転させるステップと、
前記バイオリアクターを回転させるステップの後、流体を、前記第１流量よりも低い第２流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
前記循環を前記第２流量から減少させるステップと、
第２所定期間の間、前記バイオリアクターを、第２方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第２の部分を沈殿させるステップと、
前記バイオリアクターにおいて、前記複数の接着細胞のうち少なくとも前記第１の部分と前記第２の部分とを増殖させるステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、該方法はさらに、前記第２所定期間の後、
流体を、前記第２流量よりも低い第３流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
流体の循環レートを前記第３流量から減少させるステップと、
第３所定期間の間、前記バイオリアクターを前記第２方向に維持し、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第３の部分を沈殿させるステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、該方法はさらに、前記第３所定期間の後、
流体を、前記第３流量よりも低い第４流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
流体の循環を前記第４流量から減少させるステップと、
第４所定期間の間、前記バイオリアクターを前記第２方向に維持し、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第４の部分を沈殿させるステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記第１所定期間、前記第２所定期間、前記第３所定期間、前記第４所定期間は、同じであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記第１所定期間と前記第２所定期間とは同じ長さであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記第１所定期間は、１０分よりも短いことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記第１所定期間は、８分よりも短いことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記バイオリアクターは、中空糸膜を備えることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、該方法はさらに、前記第２所定期間の後で且つ前記増殖させるステップの前に、前記バイオリアクターを１８０度回転して、前記第１方向にするステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
接着細胞を増殖させるシステムであって、該システムは、
バイオリアクターと、
前記バイオリアクターに接続され前記バイオリアクターを回転させる少なくとも１つのモータと、
前記バイオリアクターと流体的に結合された少なくとも１つの流体循環路と、
前記少なくとも１つの流体循環路と前記バイオリアクターとにおいて流体を循環させる少なくとも１つのポンプと、
プロセッサ実行可能命令を実行するプロセッサと、
プロセッサ実行可能命令を記憶するメモリと、
を備えたシステムであって、
前記プロセッサ実行可能命令は、前記プロセッサによって実行される場合、
前記少なくとも１つのポンプを作動させて、複数の接着細胞を有する流体を、第１流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
前記少なくとも１つのポンプを停止するステップと、
第１所定期間の間、前記バイオリアクターを第１方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第１の部分を沈殿させるステップと、
前記第１所定期間の後、前記少なくとも１つのモータを作動させて、前記バイオリアクターを、前記第１方向から１８０度回転した第２方向に回転させるステップと、
前記バイオリアクターを回転させるステップの後、前記少なくとも１つのポンプを作動させて、流体を、前記第１流量よりも低い第２流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
前記少なくとも１つのポンプを停止させるステップと、
第２所定期間の間、前記バイオリアクターを、第２方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第２の部分を沈殿させるステップと、
前記少なくとも１つのポンプを作動させて、前記バイオリアクターを介して流体を循環させ、前記バイオリアクターにおいて、前記接着細胞を増殖させるステップと、
を有する方法を実行することを特徴とするシステム。
【請求項１１】
請求項１０記載のシステムにおいて、前記プロセッサ実行可能命令はさらに、
前記第２所定期間の後、
前記少なくとも１つのポンプを作動させて、流体を、前記第２流量よりも低い第３流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
前記少なくとも１つのポンプを停止させるステップと、
第３所定期間の間、前記バイオリアクターを、前記第２方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第３の部分を沈殿させるステップと、
を行うための命令を有することを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項１１記載のシステムにおいて、前記プロセッサ実行可能命令はさらに、
前記第３所定期間の後、
前記少なくとも１つのポンプを作動させて、流体を、前記第３流量よりも低い第４流量で、前記バイオリアクター内を循環させるステップと、
前記少なくとも１つのポンプを停止させるステップと、
第４所定期間の間、前記バイオリアクターを、前記第２方向に維持して、前記複数の接着細胞のうち少なくとも第４の部分を沈殿させるステップと、
を行うための命令を有することを特徴とするシステム。
【請求項１３】
請求項１２記載のシステムにおいて、前記第１流量は、１５０ｍｌ／分から２５０ｍｌ／分の間にあることを特徴とするシステム。
【請求項１４】
請求項１３記載のシステムにおいて、前記第２流量は、５０ｍｌ／分から１５０ｍｌ／分の間にあることを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項１４記載のシステムにおいて、前記第３流量は、２５ｍｌ／分から１００ｍｌ／分の間にあることを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項１５記載のシステムにおいて、前記第４流量は、５０ｍｌ／分より小さいことを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１０記載のシステムにおいて、前記バイオリアクターは中空糸膜を備えることを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１７記載のシステムにおいて、前記中空糸膜は、複数の中空糸を備えることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／９０５，１８２号明細書（タイトル：細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入・分配方法）の優先権を主張するものであり、該米国特許仮出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
種々の治療や療法における幹細胞の使用可能性に対して特に注目が集まっている。細胞増殖システムを使用することにより、幹細胞や、骨髄細胞のようなその他のタイプの細胞を増殖（例えば、成長）させることができる。ドナー細胞から増殖した幹細胞を使用することで、損傷を受けた又は欠陥のある組織を修復又は交換することができ、広範囲な疾病に対する幅広い臨床応用が存在する。再生医療分野における近年の前進により、幹細胞は、増殖能力、自己再生能力、未分化状態を維持する能力及び特定の条件下で特殊化した細胞に分化する能力といった特性を有することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞増殖システムは、細胞を増殖させるための１以上の分室、例えば、細胞成長チャンバー（「バイオリアクター」とも称される）を有している。細胞を増殖させるため、通常、初期量の細胞を、バイオリアクターに投入し分配する。従って、細胞増殖システムに関連付けられたバイオリアクターにおける細胞の投入・分配方法の要求が存在する。本発明は、上記及び他の要求に対応するためになされた。
【０００４】
本発明の実施形態は、これら及びその他を考慮してなされた。しかしながら、上述の課題によって、本発明の実施形態の他の問題への適用が制限されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本節は、本発明のいくつかの実施形態の態様を簡単な形式で説明するためのものであり、主張される本発明の重要な又は必須の要素を特定することを意図していないし、また、請求項の範囲を制限することを意図しているものでもない。
【０００６】
本発明は、様々な異なる実施形態を含むと理解されるべきであり、また本節は、本発明を限定するものでないし、またそれら全ての実施形態を含むものでもない。本節では、実施形態に含まれる特徴が概略的に記載されるが、それ以外の実施形態に含まれる他の特徴のより具体的な記載を含む場合もある。
【０００７】
１以上の実施形態は一般には、細胞増殖システムのバイオリアクターにおける接着細胞の投入・分配のための方法及びシステムに関する。従って、実施形態には、細胞増殖システムのバイオリアクター内において第１レートで循環する流体に、複数の接着細胞を付加することを行う方法が含まれる。ある実施形態では、バイオリアクターは、複数の中空糸を有する中空糸膜を備えてもよい。接着細胞や他の流体は、該中空糸を介して循環する。まず、流体がバイオリアクターの中空糸膜を循環させられ、循環する流体に、接着細胞が付加される。この流体は、第１所定循環レートで循環する。循環中は、バイオリアクターは水平位置に置かれる。循環流体に付加することによって、接着細胞を投入した後、接着細胞は、中空糸膜の中空糸に対して流入・流出を行いながら、システム全体にわたって循環し均一に分配される。そして、循環が停止される。接着細胞は、重力の影響により沈殿し、バイオリアクターの中空糸の第１部分に付着する。ある実施形態では、接着細胞は、第１所定期間の間、沈殿する。いくつかの実施形態では、所定の期間を選択することによって、接着細胞を中空糸の第１部分に付着させる。
【０００８】
前記第１所定期間経過後、流体を第１所定循環レートよりも低い第２所定循環レートでバイオリアクター内を循環させる。また、バイオリアクターを１８０度回転させる。バイオリアクターの回転後、バイオリアクター内の接着細胞を再度沈殿させる。そして、流体の循環を第２所定循環レートから減少させて、接着細胞を、中空糸の対向部分に、第２所定期間だけ沈殿させる。第２所定期間は、接着細胞が対向部分に付着するように選択される。第２所定期間経過後、バイオリアクターを、元の水平位置に戻し、接着細胞に対して増殖プロセスを行う。
【０００９】
いくつかの実施形態において、投入プロセスは、付加工程を有する。いくつかの実施形態において、バイオリアクターを元の水平位置に戻した後、循環を再度始める。その際の循環レートは、前記第１所定循環レートよりも低いレートに設定される。循環を行うと、表面に付着しなかった接着細胞は再び分配される。この循環は、第３所定期間の間、行われ、未付着の接着細胞が、バイオリアクターを含むシステム全体にわたって均一に分配されるようになる。そして、循環を停止し、バイオリアクター内の接着細胞を沈殿させ、中空糸の部分への付着を再度行う。
【００１０】
接着細胞を再度沈殿させるための第４所定期間の後、バイオリアクターを１８０度回転させる。バイオリアクターの回転の後、バイオリアクター内の接着細胞は、再び沈殿する。そして、接着細胞は、中空糸の対向部分に付着可能なように設定された第５所定期間の間、中空糸の対向部分に向かって沈殿する。第５所定期間の後、バイオリアクターを元の水平位置に戻す。
【００１１】
上記プロセスを、システム内における接着細胞の循環により繰り返し行って、未付着の接着細胞を再度均一に分配させる。しかしながら、循環を再始動するたびごとに、前回の循環レートよりも低い循環レートで行う。循環を停止させ、接着細胞を沈殿・付着させる。そして、バイオリアクターを１８０度回転させて、接着細胞を沈殿・付着させる。そして、バイオリアクターを元の位置に戻す。循環、沈殿、回転、沈殿、回転のこれらステップは、所定の回数繰り返され、その後、層状に付着した接着細胞が、バイオリアクターにおいて増殖される。
【００１２】
他の実施形態はまた、細胞増殖システムのバイオリアクターにおける接着細胞の投入及び分配のための方法及びシステムに関する。実施形態には、細胞増殖システムのバイオリアクター内において第１レートで循環する流体に複数の接着細胞を付加することを行う方法が含まれる。ある実施形態では、該バイオリアクターは、複数の中空糸を有する中空糸膜を備えてもよい。接着細胞や他の流体は、該中空糸を介して循環する。まず、流体がバイオリアクターの中空糸膜を循環させられ、循環する流体に、接着細胞が付加される。この流体は、第１所定循環レートで循環する。循環中は、バイオリアクターは水平位置に置かれる。循環流体に付加することによって、接着細胞を投入した後、接着細胞は、中空糸膜の中空糸に対して流入・流出を行いながら、システム全体にわたって循環し均一に分配される。そして、循環が停止される。接着細胞は、重力の影響により沈殿し、バイオリアクターの中空糸の第１部分に付着する。ある実施形態では、接着細胞は、第１所定期間の間、沈殿する。いくつかの実施形態では、所定の期間を選択することによって、接着細胞を中空糸の第１部分に付着させる。
【００１３】
前記第１所定期間経過後、バイオリアクターを１８０度回転させる。バイオリアクターの回転後、接着細胞に対して、増殖プロセスを行う。理解されるように、先に付着した接着細胞は、中空糸の頂部にある。接着細胞が増殖すると、接着細胞は重力の影響を受けて、中空糸底部に向かう細胞成長が促される。
【００１４】
ここで提示される実施形態におけるさらなる効果は、以下の記載、添付図面から容易に理解されよう。
【００１５】
本発明の上記及びその他の効果及び特徴をさらに明確にするため、添付の図面における具体的な実施形態を参照して、本発明がより具体的に説明される。これら図面は、本発明の代表的な実施形態を示すだけであり、従って、本発明の範囲を制限するものではない。以下では、添付図面を用いて、本発明が詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一実施形態の図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＥＳの第２実施形態の図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＥＳの第３実施形態の図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＣＥＳ動作中に細胞成長チャンバーを回転方向又は横方向に動かす揺動装置の一実施形態の図である。
【図２Ａ】図２Ａは、中空糸型細胞成長チャンバーの一実施形態の側面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの中空糸型細胞成長チャンバーの実施形態の一部切欠側面図である。
【図３】図３は、循環路を示したバイオリアクターの他の実施形態の切欠側面図である。
【図４】図４は、一実施形態に係る、脱着可能なバイオリアクターを有するＣＥＳの一部の斜視図である。
【図５】図５は、一実施形態に係るＣＥＳにおいて細胞を増殖する方法のフローチャートである。
【図６】図６は、いくつかの実施形態において、図５で示されたフローチャートの方法に用いられるステップを有する、細胞の投入、分配、付着及び増殖のためのプロセスのフローチャートである。
【図７】図７は、いくつかの実施形態において、図５で示されたフローチャートの方法に用いられるステップを有する、細胞の投入、分配、付着及び増殖のためのプロセスのフローチャートである。
【図８】図８は、第１の姿勢における一実施形態に係るバイオリアクターの正面図である。
【図９】図９は、図８の状態からバイオリアクターを９０度回転させた場合のバイオリアクターの正面図である。
【図１０】図１０は、図８の状態からバイオリアクターを１８０度回転させた場合のバイオリアクターの正面図である。
【図１１】図１１は、図８のバイオリアクターを回転させて図８に示す元の位置へ戻した場合のバイオリアクターの正面図である。
【図１２】図１２は、図８の状態から９０度回転させ、図９の状態から１８０度回転させた場合のバイオリアクターの正面図である。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、一実施形態に係るバイオリアクターにおける細胞の分配、付着及び増殖のプロセスの工程を経て進行中にある、バイオリアクターの一部である中空糸の（中心軸に対して垂直な）断面図である。図１３Ｄ〜図１３Ｅは、一実施形態に係るバイオリアクターにおける細胞の増殖のプロセスの工程を経て進行中にある、バイオリアクターの一部である中空糸の（中心軸に対して平行な）断面図である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、他の実施形態に係るバイオリアクターにおける細胞の分配、付着及び増殖のプロセスの工程を経て進行中にある、バイオリアクターの一部である中空糸の（中心軸に対して垂直な）断面図である。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｆは、さらに他の実施形態に係るバイオリアクターにおける細胞の分配、付着及び増殖のプロセスの工程を経て進行中にある、バイオリアクターの一部である中空糸の（中心軸に対して垂直な）断面図である。
【図１６】図１６は、複数の中空糸及び細胞含有流体がそれぞれ異なる流量で循環する各中空糸ゾーンを示すバイオリアクターの断面図である。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態を実施するために使用される基本的なコンピュータのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の原理は、以下の詳細な説明及び添付図面に示される実施形態を参照することで、さらに理解されよう。詳細な実施形態において具体的な特徴が示され説明されるが、本発明は、以下で説明される実施形態に限定されないと理解されるべきである。本開示は一般には、細胞増殖システムのバイオリアクターにおける複数の細胞の分配方法に関するものである。以下で記載されるように、バイオリアクター内での細胞の分配方法は、バイオリアクターへの細胞の投入、バイオリアクターの回転、及びバイオリアクターのある特定の姿勢における保持を含んでよい。
【００１８】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一例が、図１Ａに概略的に示される。ＣＥＳ１０は、第１流体循環路１２と第２流体循環路１４とを有する。第１流体流路１６は、中空糸型細胞成長チャンバー２４（「バイオリアクター」とも呼ばれる）に流体的に関連付けられた少なくとも両端部１８、２０を有する。詳細には、端部１８は、細胞成長チャンバー２４の第１入口２２と流体的に関連付けられ、端部２０は、細胞成長チャンバー２４の第１出口２８と流体的に関連付けられる。第１循環路１２において、流体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空糸膜の中空糸の内部を通る（細胞成長チャンバー及び中空糸膜は以下でより詳細に説明される）。また、第１流量コントローラ３０が、第１流体流路１６に動作可能に接続され、第１循環路１２における流体の流れを制御する。
【００１９】
第２流体循環路１４は、第２流体流路３４と、細胞成長チャンバー２４と、第２流量コントローラ３２と、を有する。第２流体流路３４は、少なくとも両端部３６、３８を有する。第２流体流路３４の端部３６は、細胞成長チャンバー２４の入口ポート４０に、端部３８は、出口ポート４２にそれぞれ流体的に関連付けられる。細胞成長チャンバー２４を流れる流体は、細胞成長チャンバー２４の中空糸膜の外側と接触する。第２流体循環路１４は、第２流量コントローラ３２と動作可能に接続される。
【００２０】
このように、第１及び第２流体循環路１２、１４は、中空糸膜によって、細胞成長チャンバー２４において分離されている。第１流体循環路１２の流体は、細胞成長チャンバーにおいて中空糸の毛細管内側（ＩＣ）空間を流れる。従って、第１流体循環路１２を「ＩＣループ」と呼ぶ。第２流体循環路１４の流体は、細胞成長チャンバーにおいて中空糸の毛細管外側（ＥＣ）空間を流れる。従って、第２流体循環路１４を「ＥＣループ」と呼ぶ。第１流体循環路１２の流体は、第２流体循環路１４の流体の流れに対して、並流方向又は逆流方向のどちらを流れてもよい。
【００２１】
流体入口路４４は、第１流体循環路１２に流体的に関連付けられる。流体入口路４４によって、流体は第１流体循環路１２に導入され、流体出口路４６によって、流体は、ＣＥＳ１０から排出される。第３流量コントローラ４８が、流体入口路４４に動作可能に関連付けられる。或いは、第３流量コントローラ４８は、流体出口路４６に関連付けられてもよい。
【００２２】
ここで使用される流量コントローラとしては、ポンプ、バルブ、クランプ、又はそれらの組み合わせが可能である。複数のポンプ、複数のバルブ、複数のクランプを、任意に組み合わせて配置してもよい。種々の実施形態において、流量コントローラは、蠕動ポンプであるか又は蠕動ポンプを含む。他の実施形態において、流体循環路、入口ポート、出口ポートは、任意の材料の配管で構成されてよい。
【００２３】
種々の部材に対して、「動作可能に関連付けられた」と記載されているが、ここで使用される「動作可能に関連付けられた」とは、動作可能な方式で互いに連結された部材を指し、部材が直接連結されている実施形態や、２つの連結された部材の間に別の部材が配置されている実施形態等も包含する。「動作可能に関連付けられた」部材は、「流体的に関連付けられる」ことができる。「流体的に関連付けられた」とは、流体が部材間を移動可能なように互いに連結された部材を指す。「流体的に関連付けられた」という用語は、２つの流体的に関連付けられた部材間に別の部材を配置する実施形態や、部材を直接接続する実施形態等を包含する。流体的に関連付けられた部材は、流体と接触しないが他の部材と接触することにより、システムを操作する部材を含んでもよい（例えば、可撓性の管の外側を圧縮することにより、該管を介して流体をポンピングする蠕動ポンプ等）。
【００２４】
一般に、緩衝液、タンパク質含有流体、細胞含有流体のように、如何なる種類の流体でも、循環路、入口路、出口路を流れることが可能である。本明細書で使用される用語「流体」「培地」「流体培地」は交換可能に使用される。
【００２５】
図１Ｂは、細胞増殖システム８００をより詳細に示している。ＣＥＳ８００は、第１流体循環路８０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路８０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路８０６は、第１流体循環路８０２を介して、細胞成長チャンバー８０１に流体的に関連付けられる。流体は、ＩＣ入口ポート８０１Ａを介して細胞成長チャンバー８０１に流入し、細胞成長チャンバー８０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート８０１Ｂを介して流出する。圧力センサ８１０は、細胞成長チャンバー８０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、センサ８１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。培地は、培地流量（例えば、ＩＣループにおける循環レート）を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ８１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ８１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート８０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループ８０２に流入する培地は、バルブ８１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ８００の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。
【００２６】
ＩＣループ８０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル８１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート８０１Ａに戻って、流体循環路８０２を完了する。細胞成長チャンバー８０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー８０１から流し出され、バルブ８９８及びライン８９７を介して収穫バッグ８９９に入る。或いは、バルブ８９８が閉じている場合、細胞は、チャンバー８０１に再分配され（例えば、循環して戻され）、さらに成長されるか又は投入される。
【００２７】
第２流体循環路８０４において、流体は、ＥＣ入口ポート８０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー８０１に入り、ＥＣ出口ポート８０１Ｄを介して細胞成長チャンバー８０１を離れる。ＥＣループ８０４では、培地は、細胞成長チャンバー８０１の中空糸の外側と接触し、それによって、チャンバー８０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００２８】
培地が細胞成長チャンバー８０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路８０４に配置された圧力／温度センサ８２４によって、該培地の圧力及び温度が測定される。培地が細胞成長チャンバー８０１を離れた後、センサ８２６によって、第２流体循環路８０４の培地の圧力及び温度が測定される。ＥＣループ８０４に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート８３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００２９】
細胞成長チャンバー８０１のＥＣ出口ポート８０１Ｄを離れた後、第２流体循環路８０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ８２８を通って、ガス輸送モジュール８３２に至る。ＥＣ循環ポンプ８２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路８２２は、ガス輸送モジュール８３２の入口ポート８３２Ａ及び出口ポート８３２Ｂを介してガス輸送モジュール８３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート８３２Ａを介して、ガス輸送モジュール８３２に流入し、出口ポート８３２Ｂを介して、ガス輸送モジュール８３２から流出する。ガス輸送モジュール８３２は、ＣＥＳ８００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路８０４における培地は、ガス輸送モジュール８３２に入るガスと平衡状態にある。ガス輸送モジュール８３２は、当分野で知られているような、酸素供給又はガス輸送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ８３８を介してガス輸送モジュール８３２に流入し、フィルタ８４０を介して、酸素供給器又はガス輸送装置８３２から流出する。フィルタ８３８、８４０は、酸素供給器８３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ８００からパージされた空気又はガスは、ガス輸送モジュール８３２を介して大気にベント可能である。
【００３０】
ＣＥＳ８００として示された該構成において、第１流体循環路８０２及び第２流体循環路８０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー８０１を流れる。ＣＥＳ８００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００３１】
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのようなソースからの）細胞を含む培地は、取り付け点８６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点８４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路８０６を介して第１流体循環路８０２に導入される。取り付け点８６２は、バルブ８６４を介して、第１流体流路８０６と流体的に関連付けられる。取り付け点８４６は、バルブ８５０を介して、第１流体流路８０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点８４４に流体的に関連付けて、バルブ８４８を介して流体入口路８４２に関連付けてもよいし、又はバルブ８４８及び８７２を介して第２流体入口路８７４に関連付けてもよい。
【００３２】
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）８５６が、第１循環路８０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー８５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー８５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー８５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ８００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー８５６と流体的に関連付けられたライン８５８を通って、エアバルブ８６０から大気中へベント可能である。
【００３３】
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点８６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点８６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に付加される。取り付け点８６６は、バルブ８７０と流体的に関連付けられる。バルブ８７０は、バルブ８７２及び第１流体入口路８４２を介して第１流体循環路８０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ８７０を開け、バルブ８７２を閉じることにより、取り付け点８６６は、第２流体入口路８７４及びＥＣ入口路８８４を介して第２流体循環路８０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点８６８は、バルブ８７６と流体的に関連付けられる。バルブ８７６は、第１流体入口路８４２及びバルブ８７２を介して第１流体循環路８０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ８７６を開け、バルブ８７２を閉じることにより、流体容器８６８は、第２流体入口路８７４と流体的に関連付けることができる。
【００３４】
ＩＣループ８０２において、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ８５４によって送られる。ＥＣループ８０４では、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ８７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器８８０がＥＣ入口路８８４と関連付けられてもよい。
【００３５】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路８０２、８０４は、廃棄ライン８８８と接続される。バルブ８９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン８８８を流れ、廃棄バッグ８８６に至る。同様に、バルブ８９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ８８６に流れる。
【００３６】
細胞が細胞成長チャンバー８０１にて成長した後、該細胞は、細胞収穫路８９７を介して収穫される。細胞成長チャンバー８０１からの細胞は、バルブ８９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路８９７を介して、細胞収穫バッグ８９９に収穫される。
【００３７】
ＣＥＳ８００の各部品は、細胞増殖機のような装置又はハウジング８９９内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。ある実施形態において、ＣＥＳ８００の部品は、ＣＥＳ１０（図１Ａ）又はＣＥＳ９００（図１Ｃ）のような他のＣＥＳと組み合わせてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、本開示の範囲内において、図１Ａ〜図１Ｃに示されるよりも少ない部品を含んでもよい。
【００３８】
図１Ｃは、ＣＥＳの他の実施形態を示す。ＣＥＳ９００は、第１流体循環路９０２（「毛細管内側（ＩＣ）ループ」とも呼ぶ）と、第２流体循環路９０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。
【００３９】
第１流体流路９０６は、第１流体循環路９０２を介して、細胞成長チャンバー９０８と流体的に関連付けられる。流体は、入口ポート９１０を通って、細胞成長チャンバー９０８に流入し、細胞成長チャンバー９０８内の中空糸を通り、出口ポート９０７を介して外に出る。圧力計９１７は、細胞成長チャンバー９０８を離れる培地の圧力を測定する。培地は、バルブ９１３及びポンプ９１１を介して流通する。バルブ９１３及びポンプ９１１は、培地の流量を制御するために使用される。培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート９０５又はサンプルコイル９０９から得ることができる。第１流体循環路９０２に配置された圧力／温度計９１５によって、動作中における培地圧力及び培地温度が検知できる。培地は、入口ポート９１０に戻って、流体循環路９０２を完了する。細胞成長チャンバー９０８で増殖した細胞は、細胞成長チャンバー９０８から流し出されるか又はさらなる成長のために中空糸内に再分配される。
【００４０】
第２流体循環路９０４は、細胞成長チャンバー９０８とループ状で流体的に関連付けられた第２流体流路９１２を有する。第２流体循環路９０４において、流体は、入口ポート９１４を介して細胞成長チャンバー９０８に入り、出口ポート９１６を介して細胞成長チャンバー９０８を離れる。培地は、細胞成長チャンバー９０８内の中空糸の外側と接触することにより、小分子が、中空糸へ及び中空糸から拡散可能となる。
【００４１】
培地が細胞成長チャンバー９０８のＥＣ空間に入る前に、第２循環路９０４に配置された圧力／温度計９１９によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が細胞成長チャンバー９０８を離れた後、圧力計９２１によって、第２循環路９０４において該培地の圧力が測定可能である。
【００４２】
第２流体循環路９０４において、流体は、細胞成長チャンバー９０８の出口ポート９１６を離れた後、ポンプ９２０及びバルブ９２２を通って、酸素供給器９１８へ至る。第２流体流路９１２は、酸素供給器入口ポート９２４及び酸素供給器出口ポート９２６を介して酸素供給器９１８と流体的に関連付けられる。動作において、流体培地は、酸素供給器入口ポート９２４を通って、酸素供給器９１８に流入し、酸素供給器出口ポート９２６を通って、酸素供給器９１８から流出する。
【００４３】
酸素供給器９１８は、ＣＥＳ９００の培地に酸素を付加する。種々の実施形態において、第２流体循環路９０４の培地は、酸素供給器９１８に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器は、当分野で知られる如何なる酸素供給器でもよい。ガスは、フィルタ９２８を通って、酸素供給器９１８に入り、フィルタ９３０を通って、酸素供給器９１８から出る。フィルタ９２８、９３０は、酸素供給器９１８及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。
【００４４】
ＣＥＳ９００として示された構成において、第１循環路９０２及び第２循環路９０４における流体培地は、細胞成長チャンバー９０８を同じ方向（並流構成）に流れる。ＣＥＳ９００は、対向流構成にしてもよいことは、当業者であれば理解できよう。また、入口ポート及び出口ポートは、細胞成長チャンバー９０８において如何なる箇所に配置してもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００４５】
細胞と流体培地は、第１流体入口路９３２を介して流体循環路９０２に導入される。流体容器９３４はバルブ９３８を介して、流体容器９３６はバルブ９４０を介して、それぞれ第１流体入口路９３２と流体的に関連付けられる。同様に、細胞容器９４２は、バルブ９４３を介して、第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。いくつかの実施形態において、細胞及び流体は、熱交換器９４４、ポンプ９４６を通って、ドリップチャンバー９４８に導入される。細胞容器９４２からの細胞を熱交換器９４４に通す実施形態では、追加ライン（図示せず）を用いて、細胞容器９４２を熱交換器９４４に接続してもよい。ドリップチャンバー９４８は、第１循環路９０２と流体的に関連付けられる。ドリップチャンバー９４８からのオーバーフローは、バルブ９５２を介してオーバーフローライン９５０から流れ出す。
【００４６】
流体容器９５４及び９５６から、流体が、第１及び第２流体循環路９０２、９０４に追加される。流体容器９５４は、バルブ９５８と流体的に関連付けられる。バルブ９５８は、バルブ９６４、流路９６０及び流路９３２を介して第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。また、流体容器９５４は、第２流体入口路９６２とも流体的に関連付けられる。同様に、流体容器９５６は、バルブ９６６と流体的に関連付けられ、バルブ９６６は、第１流体入口路９６０を介して第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。また、流体容器９５６は、第２流体入口路９６２とも流体的に関連付けられる。
【００４７】
第２流体入口路９６２は、流体がドリップチャンバー９７０に入る前に熱交換器９４４及びポンプ９６８を流れるように構成される。第２流体入口路９６２は、第２流体循環路９０４へと続く。流体のオーバーフローは、バルブ９７４を通って、オーバーフローライン９７２を経由して、廃棄容器９７６へ向かう。
【００４８】
細胞は、細胞収穫路９７８を介して収穫される。細胞成長チャンバー９０８からの細胞は、バルブ９８２を開けた状態で、該細胞を含む培地をポンピングすることにより、細胞収穫路９７８を通って、細胞収穫バッグ９８０へ収穫される。
【００４９】
第１及び第２流体循環路９０２、９０４は、接続路９８４によって、接続される。バルブ９８６を開けると、培地は、接続路９８４を介して、第１循環路９０２と第２循環路９０４との間を流れることができる。同様に、ポンプ９９０は、別の接続路９８８を介して、第１流体循環路９０２と第２流体循環路９０４との間において、培地をポンピングすることができる。
【００５０】
ＣＥＳ９００の各部品は、インキュベーター９９９に収容される。インキュベーター９９９は、細胞及び培地を一定温度に保つ。
【００５１】
当業者であれば理解できるように、任意の数の流体容器（例えば、培地バッグ）を、任意の組み合わせで、ＣＥＳ９００と流体的に関連付けることができる。さらに、ドリップチャンバー９４８の位置又はドリップチャンバー９４８とは独立のセンサの位置は、ＣＥＳ９００において、入口ポート９１０の前の任意の位置にしてよい。
【００５２】
ＣＥＳ８００及び９００は、他の部品を含んでもよい。例えば、ＣＥＳにおける蠕動ポンプの位置に、１以上のポンプループ（図示せず）を付加することができる。ポンプループは、例えばポリウレタン（ＰＵ）（Ｔｙｇｏｔｈａｎｅ  Ｃ−２１０Ａとして市販）から形成することができる。また、蠕動ポンプ用の配管ループを含む、配管ラインを構成するためのカセットを、使い捨ての部分として、含んでもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態において、着脱可能な流れ回路（「着脱式循環モジュール」とも呼ぶ）を設けてもよい。着脱可能な流れ回路は、ＣＥＳの永久固定された部分に取り付けるように構成された細胞増殖モジュールの一部であってもよい。通常、ＣＥＳの固定部分は、蠕動ポンプを含む。種々の実施形態において、ＣＥＳの固定部分は、バルブ及び／又はクランプを含むことができる。
【００５４】
着脱可能な流れ回路は、少なくとも２つの端部を有する第１流体流路を含むことができる。第１流体流路の第１の端部は、細胞成長チャンバーの第１端部と流体的に関連付けられるように構成され、第１流体流路の第２の端部は、細胞成長チャンバーの第２端部と流体的に関連付けられるように構成される。
【００５５】
同様に、着脱可能な流れ回路は、少なくとも２つの端部を有する第２流体流路を含むことができる。着脱可能な流れ回路の一部は、酸素供給器及び／又はバイオリアクターと流体的に関連付けられるように構成することができる。着脱可能な流れ回路は、酸素供給器及び細胞成長チャンバーと流体的に関連するように構成される第２流体流路を含むことができる。
【００５６】
種々の実施形態において、着脱可能な流れ回路は、取り外し可能に且つ使い捨て方式で、流量コントローラに取り付けてよい。着脱可能な流れ回路は、ＣＥＳのいくつかの部分に接続する着脱可能な流体管（例えば、可撓性チューブ）を含むことができる。
【００５７】
他の実施形態において、着脱可能な流れ回路は、細胞成長チャンバーと、酸素供給器と、培地及び細胞を含むバッグとを含む。種々の実施形態において、各部品は、一体に接続されていてもよいし、別体でもよい。さらに、着脱可能な流れ回路は、バルブ、ポンプ及びそれらの組み合わせのような流体流量コントローラが取り付けられるように構成された１以上の部分を含むことができる。蠕動ポンプを使用する形態においては、着脱可能な流れモジュールは、配管の蠕動部分の周りに取り付けられるように構成された蠕動ループを含む。他の実施形態では、蠕動ループは、循環路、入口路、出口路と流体的に関連付けられるように構成される。着脱可能な流れ回路は、ポンプやバルブのような流体流量コントローラへの組み付けのための説明書に従って、キットの形式で組み立てられてもよい。
【００５８】
実施形態においては、細胞をＣＥＳのバイオリアクターに導入するために種々の方法が用いられる。以下で詳細に説明するように、実施形態は、細胞の着実な増殖を促進するために、バイオリアクター内において細胞を分配する方法及びシステムを含む。
【００５９】
実施形態によれば、細胞は、ＩＣループ又はＥＣループにおいて、成長（増殖）される。接着性懸濁細胞及び非接着性懸濁細胞が増殖される。一実施形態において、細胞成長チャンバーの中空糸の内腔は、フィブロネクチンがコーティングされる。２価陽イオンを含まない（例えば、カルシウム及びマグネシウムを含まない）ＰＢＳがＣＥＳシステムに付加される。接着性細胞が細胞成長チャンバー（例えば、チャンバー２４、８０１、９０８）に導入された後、それら細胞が中空糸に付着するように、十分な時間で培養される。ＩＣ及びＥＣ培地は、十分な栄養が細胞に確実に供給されるように、循環させられる。
【００６０】
ＩＣループ及びＥＣループの流量は、ある特定の値に調整される。種々の実施形態において、ＩＣループ及びＥＣループの流量はそれぞれ独立に、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、又は約５００ｍＬ／分に設定される。種々の実施形態において、ＩＣ回路ループの流量は、約１０〜約２０ｍＬ／分に、ＥＣ回路ループの流量は、約２０〜約３０ｍＬ／分（培地が酸素供給器を流れて酸素レベルを回復可能な程度）に設定される。ガス交換／酸素供給器８３２及び９１８のようなガス交換モジュールを通じて蒸発する培地を補うため、追加の培地が、低い流量（例えば、いくつかの実施形態では０．１ｍＬ／分）で、ＣＥＳ内にポンピングされてよい。種々の実施形態において、ＥＣループは細胞廃棄物（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｗａｓｔｅ）を除去し、ＩＣループは培地内に成長因子を含む。
【００６１】
これらＣＥＳは、様々な成長条件及び成長基準において、大きな自由度を提供できる。培地を連続循環させることによって、細胞を、ＩＣループ内において、懸濁状態にしておくことができる。又は、培地循環を停止することで、細胞を沈殿（ｓｅｔｔｌｅ）させることもできる。限外濾過によって、新鮮な培地をＩＣループに付加して、細胞を取り去ることなく、余剰体積を調整することができる。ＥＣ培地循環によって、ガス、栄養、廃棄物の交換を可能とし、また、細胞を取り去ることなく、新しい培地の付加が可能となる。
【００６２】
当分野において、増殖される細胞としては、接着性細胞、非接着性細胞、又はそれら細胞を任意の組み合わせで共培養したものが挙げられる。実施形態に係るＣＥＳにおいて成長される細胞の例としては、限定はされないが、例えば、幹細胞（例えば、間葉細胞、造血細胞等）、線維芽細胞、角化細胞、前駆細胞、その他の完全分化細胞、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
実施形態において、接着性細胞を収穫するため、ＩＣ培地及びＥＣ培地を、２価陽イオンを含まない培地（例えば、２価陽イオンフリーＰＢＳ）に置換する。一実施形態において、トリプシンを第１循環路に投入し、ある時間の間（いくつかの実施形態では、約５分から約１０分）、接着性細胞を培養する。そして、該トリプシンをシステムから排出する。細胞成長チャンバーにおける流量を増やすことによって、細胞にせん断力を付加し、細胞成長チャンバーから離脱される接着性細胞を、細胞収穫バッグへポンピングする。
【００６４】
非接着性細胞を増殖する場合、該細胞は、循環しているＩＣ回路から放出することができる。非接着性細胞を取り出しながら、接着性細胞は細胞成長チャンバー内に維持している。
【００６５】
前記ＣＥＳを用いて、様々な細胞増殖方法を実行することができる。一実施形態において、播種した細胞集団を増殖させることができる。細胞は、ＣＥＳに、導入すなわち播種される。ある状況では、細胞接着が可能となるように、中空糸の内腔状態が調整される。そして、細胞は細胞成長チャンバーに付加され、接着性細胞が中空糸に接着し、非接着性細胞（例えば、造血幹細胞すなわちＨＳＣ）は接着しない。非接着性細胞は、システムから放出される。ある時間の間、培養した後、接着性細胞は、取り離され収穫される。
【００６６】
実施形態において、細胞増殖システムの細胞成長チャンバーは、中空糸膜を有する。該中空糸膜は、複数の半透過性中空糸から構成され、第１流体循環路と第２流体循環路とを分離している。
【００６７】
ＣＥＳは、回転方向及び／又は横方向揺動装置に取り付けることによって、細胞増殖システムの他の部品に対して細胞成長チャンバーを動かす、すなわち「揺らす」ように構成された装置を有する。図１Ｄは、そのような装置の１つを示す。該装置において、バイオリアクター４００は、２つの回転方向揺動部品に回転するように接続され、さらに１つの横方向揺動部品に接続されている。
【００６８】
第１回転方向揺動装置部品４０２は、バイオリアクター４００を、バイオリアクターの中心軸４１０を中心に回転させる。バイオリアクター４００は、横方向揺動装置４０４にも接続されている。回転方向揺動装置部品４０２は、バイオリアクター４００に、回転するように関連付けられる。そして、回転方向揺動装置４０２は、バイオリアクター４００を、バイオリアクターの中心軸４１０を中心に回転させる。回転は、時計回り又は反時計回りの方向に可能である。バイオリアクター４００は、中心軸４１０を中心に、単一の方向（時計回り方向又は反時計回り方向）に連続して回転させることができる。或いは、バイオリアクター４００は、中心軸４１０を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることも可能である。
【００６９】
ＣＥＳはまた、バイオリアクター４００を回転軸４１２中心に回転させる第２回転方向揺動部品を有する。回転軸４１２は、バイオリアクター４００の中心点を通り、中心軸４１０に対して垂直である。バイオリアクター４００は、回転軸４１２を中心に、時計回り方向又は反時計回り方向のいずれかの単一方向に連続回転可能である。或いは、バイオリアクター４００は、回転軸４１２を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることが可能である。種々の実施形態において、バイオリアクター４００を、回転軸４１２を中心に回転させることが可能であり、重力に対して水平方向姿勢に又は垂直方向姿勢に配置することができる。
【００７０】
横方向揺動部品４０４は、バイオリアクター４００と横方向に動くように関連付けられる。横方向揺動部品４０４の平面は、Ｘ方向及びＹ方向に動く。これにより、バイオリアクター４００における細胞の沈殿は、中空糸内の細胞含有培地の動きに伴って、減らされる。
【００７１】
揺動装置の回転方向及び／又は横方向の動きによって、装置内における細胞の沈殿が減らされ、また、バイオリアクター４００のある部分に細胞が捕獲される可能性も抑えられる。細胞成長チャンバー（例えば、バイオリアクター４００）における細胞の沈殿速度は、ストークスの式に従って、細胞と懸濁培地との密度差に比例する。ある実施形態において、上述のように、１８０度回転（速い）と休止（合計時間３０秒）を繰り返すことにより、非接着性の赤血球の懸濁状態を維持する。いくつかの実施形態では、約１８０度の最小回転が行われる。しかしながら、他の実施形態では、３６０度以上の回転を行うこともできる。異なる揺動部品を別個に又は組み合わせて使用してもよい。例えば、バイオリアクター４００を中心軸４１０中心に回転させる揺動部品を、バイオリアクター４００を軸４１２中心に回転させる揺動部品と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心に時計回り及び反時計回りを独立に組み合わせて行うこともできる。
【００７２】
上述の揺動装置及び該装置の部品は、適当な構造を用いることで、実施形態において実行することができる。例えば、実施形態において、１以上のモータを揺動装置として、又は揺動装置の部品（例えば、４０２及び４０４）として使用できる。一実施形態において、揺動装置は、２０１３年３月１９日発行の米国特許第８，３３９，２４５号明細書（タイトル：細胞増殖システムの細胞成長チャンバ用回転システム及びその使用方法）に示される実施形態を用いて、実施することもできる。該米国特許の全体は、ここでの開示により本出願に組み込まれる。
【００７３】
細胞成長チャンバーの一実施形態が、図２Ｂ及び図２Ａに示される。「バイオリアクター」と呼ばれる中空糸型細胞成長チャンバー２００が一部切欠側面図で示されている。細胞成長チャンバー２００は、細胞成長チャンバーハウジング２０２に収納されている。細胞成長チャンバーハウジング２０２は、４つの開口部すなわち４つのポート（入口ポート２０４、出口ポート２０６、入口ポート２０８、出口ポート２１０）を有する。
【００７４】
第１循環路の流体は、入口ポート２０４を通って細胞成長チャンバー２００に入り、複数の中空糸２１２の毛細管内側（中空糸膜の毛細管内側（ＩＣ）又はＩＣ空間とも呼ぶ）を通って、出口ポート２０６を介して細胞成長チャンバー２００から出る。用語「中空糸」、「中空糸毛細管」、及び「毛細管」は、交換可能である。複数の中空糸２１２は集合的に「膜」と呼ばれる。第２循環路の流体は、入口ポート２０８を通って細胞成長チャンバーに入り、中空糸２１２の外側（膜のＥＣ側又はＥＣ空間とも呼ぶ）と接触し、出口ポート２１０を介して細胞成長チャンバー２００から出る。細胞は、第１循環路又は第２循環路に含ませることが可能であり、膜のＩＣ側又はＥＣ側のどちらにも存在させることができる。
【００７５】
細胞成長チャンバーハウジング２０２は、円筒状として図示されているが、当分野で知られるような任意の形状が可能である。細胞成長チャンバーハウジング２０２は、任意のタイプの生体適合性ポリマー材料から作製することができる。細胞成長チャンバーハウジングは、異なる形状、異なるサイズでもよい。
【００７６】
用語「細胞成長チャンバー」が用いられるが、ＣＥＳにおいて成長又は増殖される全ての細胞が細胞成長チャンバーで成長されるとは限らないことは、当業者であれば理解できよう。多くの実施形態において、接着性細胞は、成長チャンバーに配置された膜に接着するか、又は関連する配管内において成長する。非接着性細胞（「懸濁細胞」とも呼ぶ）も同様に成長される。細胞は、第１又は第２流体循環路内の他の領域で成長されることもできる。
【００７７】
例えば、中空糸２１２の端部は、接続材（本明細書で「ポッティング」又は「ポッティング材」とも呼ぶ）によって細胞成長チャンバー２００の側部にポッティングされる。ポッティング材は、培地及び細胞の中空糸内への流れを妨害しないのであれば且つＩＣ入口ポートを介して細胞成長チャンバー２００に流入する液体を中空糸２１２だけに流入させるようにできるのであれば、中空糸２１２を束ねるのに適する任意の材料でよい。ポッティング材の例として、ポリウレタン又は他の適切な結束材又は接着材が挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態において、流体がＩＣ側に対して流入及び流出可能となるように、中空糸２１２及びポッティングは、各端部において、中空糸２１２の中心軸に対して垂直に切断されてよい。端部キャップ２１４及び２１６が、細胞成長チャンバーの端部に配置される。
【００７８】
入口ポート２０８を通って細胞成長チャンバー２００に入る流体は、中空糸２１２の外側に接触する。中空糸型細胞成長チャンバーのこの部分は、「毛細管外側（ＥＣ）空間」と呼ばれる。小分子（例えば、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸２１２を通じて中空糸の内部からＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸２１２を通過できず、中空糸のＩＣ空間内にとどまる。細胞をＩＣ空間で成長させる実施形態の場合、ＥＣ空間は、栄養を細胞に供給し細胞代謝の副生成物を取り去るための培地貯蔵部として使用される。培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給装置を通じて循環させて、ガスを交換してもよい。
【００７９】
種々の実施形態において、細胞は、注射器を含む任意の方法で、中空糸２１２に投入される。細胞は、細胞成長チャンバーと流体的に関連付けられるバッグのような流体容器から細胞成長チャンバー２００に導入されてもよい。
【００８０】
中空糸２１２は、毛細管内側空間内で（すなわち、中空糸内腔内で）細胞を成長できるように構成される。中空糸２１２は、培地の中空糸内腔における流れを妨げることなく、細胞が内腔に接着できる程度に十分な大きさである。種々の実施形態において、中空糸の内径は、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、約１０００、約９００、約８００、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、又は約１００μｍ以上である。同様に、中空糸の外径は、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、約１０００、約９００、約８００、約７００、約６５０、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、又は約１００μｍ以下である。中空糸の壁厚は、いくつかの実施形態において、小分子が拡散するのに十分な厚さであるべきである。
【００８１】
中空糸が細胞成長チャンバーの入口ポート及び出口ポートと流体的に関連付けられることができるのであれば、細胞成長チャンバーにおいて、任意の数の中空糸を使用することができる。種々の実施形態において、細胞成長チャンバーは、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、又は約１２０００以上の数の中空糸を有する。他の実施形態において、細胞成長チャンバーは、約１２０００、約１１０００、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、又は約２０００以下の数の中空糸を有する。他の実施形態において、中空糸の長さは、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、又は約９００ｍｍ以上である。実施形態において、細胞成長チャンバーは、平均長約２９５ｍｍ、平均内径２１５μｍ、平均外径約３１５μｍの中空糸を約９０００本、有する。
【００８２】
中空糸は、細胞成長チャンバーの入口ポートから出口ポートへ液体が移動可能な糸（ｆｉｂｅｒ）を形成できる程度に十分なサイズを構成することが可能な任意の材料で構成することができる。種々の実施形態において、中空糸は、接着性幹細胞（例えば、ＭＳＣ）のような、ある特定のタイプの細胞を結合可能なプラスチックの接着性材料から構成可能である。種々の実施形態において、中空糸は、フィブロネクチンのような化合物で処理されて、接着性表面が形成される。
【００８３】
ある実施形態において、中空糸は、半透過性の生体適合性ポリマー材料から作製される。そのようなポリマー材料としては、ポリアミドとポリアリルエーテルスルホンとポリビニルピロリドンの混合物（ここでは、「ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ」と呼ぶ）がある。半透過性膜によって、栄養、廃棄物、溶存ガスは該膜を通じてＥＣ空間とＩＣ空間との間で移動可能となる。種々の実施形態において、中空糸膜の分子移動特性は、代謝廃棄生成物が膜を通じて中空糸内腔側に拡散して取り出されるようにすると同時に、細胞成長に必要とされる高価な試薬（成長因子、サイトカイン等）の中空糸からの損失を最小限にするように選択される。
【００８４】
ある変形例では、ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ中空糸の外側層は、規定の表面粗さを有する一様な細孔構造によって特徴付けられる。細孔の開口は、約０．５μｍから約３μｍの範囲のサイズであり、中空糸の外側表面の細孔数は、１平方ミリメートル当たり約１０，０００から約１５０，０００の範囲の数である。この外側層は、約１μｍから約１０μｍの厚さを有する。次の層は、スポンジ構造を有する第２層であり、ある実施形態では、約１μｍから約１５μｍの厚さを有する。この第２層は、前記外側層の支持体として機能する。第２層の隣の第３層は、指状構造を有する。この第３層によって機械的安定性が得られ、また、分子の膜移動抵抗が低くなるような高い空隙容量が提供される。使用中は、指状空隙は流体で満たされ、該流体によって、拡散及び対流における抵抗は、空隙容量が小さいスポンジ充填（ｓｐｏｎｇｅ−ｆｉｌｌｅｄ）構造を有するマトリックスの場合よりも、低くなる。この第３層は、約２０μｍから約６０μｍの厚さを有する。
【００８５】
他の実施形態において、中空糸膜は、約６５重量％から約９５重量％の少なくとも１つの疎水性ポリマーと、約５重量％から約３５重量％の少なくとも１つの親水性ポリマーと、を有する。疎水性ポリマーは、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアラミド（ＰＡＡ）、ポリアリルエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアリルスルホン（ＰＡＳＵ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリエーテルイミド、及びポリエーテルスルホンのような任意の上記ポリマーの共重合体混合物、又はポリアリルエーテルスルホンとポリアミドの混合物からなる群から選択されることができる。親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコールモノエステル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｍｏｎｏｅｓｔｅｒ）、水溶性セルロース誘導体、ポリソルベート、ポリエチレン−ポリプロピレンオキサイド共重合体からなる群から選択されることができる。
【００８６】
細胞成長チャンバーで増殖させる細胞のタイプに応じて、高分子糸は、フィブロネクチンのような物質によって処理され、細胞成長及び／又は細胞の膜への接着が高められる。
【００８７】
図３は、他の細胞成長チャンバー例、バイオリアクター３００、の切欠側面図を示す。バイオリアクター３００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、バイオリアクターハウジング３０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、バイオリアクターハウジング３０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート３０８、ＩＣ出口ポート３２０、ＥＣ入口ポート３２８、ＥＣ出口ポート３３２を有する。
【００８８】
第１循環路内の流体は、バイオリアクター３００の第１の長手方向端３１２におけるＩＣ入口ポート３０８を通ってバイオリアクター３００に進入し、複数の中空糸３１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、バイオリアクター３００の第２の長手方向端３２４に位置するＩＣ出口ポート３２０を通ってバイオリアクター３００の外に出る。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート３２８を通ってバイオリアクター３００に進入し、中空糸３１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート３３２を通ってバイオリアクター３００の外に出る。ＥＣ入口ポート３２８を通ってバイオリアクターに入った流体は、中空糸の外側に接触する。小分子（例えば、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸を通じて中空糸の内部からＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸のＩＣ空間内にとどまる。培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給装置を通じて循環させて、ガスを交換してもよい。細胞は、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、該膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。一例として、限定するものではないが、一実施形態において、バイオリアクター３００は、約２１５×１０-6ｍの内径（ＩＤ）を有する約１１５２０本の糸を有してもよい。
【００８９】
バイオリアクターハウジング３０４は、円筒形状として示されているが、例えば、直方体のように、種々の形状を取ることができる。バイオリアクターハウジング３０４は、任意の種類の生体適合性高分子材料で作製されることができ、該材料は、複数の中空糸３１６のうちの１本以上の中空糸やバイオリアクターハウジング３０４内に存在する流体を観察できるように略透明な材料で作製されてもよい。その他種々のバイオリアクターハウジングは、様々な形状及びサイズを有してよい。
【００９０】
図４は、ＣＥＳ４３０の一部を示す斜視図である。ＣＥＳ４３０の一部は、ＣＥＳ４３０の本体４０８の後部４３４を含む。明確にするため、本体４０８の前部は示さないが、前部は、例えば、蝶番４３８によって後部４３４に取り付けられる。これにより、前部は、ＣＥＳ４３０のバイオリアクター３００にアクセスするために開けることが可能なドア又はハッチを備えることが可能となる。バイオリアクター３００には、配管のためのスプール４１６とサンプリングポート４２０が取り付けられる。バイオリアクター３００の周りの環境は、細胞成長に適した条件となるように温度調整される。
【００９１】
図５は、ＣＥＳを用いた細胞増殖プロセスの一実施形態のフローチャート５００を示す。該プロセスは、以下で記載するように、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター３００）に細胞を投入・分配することに関するステップを含む。ＣＥＳ（例えば、ＣＥＳ４３０）の特徴が、フローチャート５００のいくつかのステップを実行するように記載されるが、本発明はそれらに限定されない。本明細書では記載されないが（例えば、ＣＥＳ１０、８００、９００では記載されないが）、異なる特徴を有する他のＣＥＳが、他の実施形態において、使用されてもよい。従って、バイオリアクター３００のようなＣＥＳ４３０の特徴に対する言及は、あくまで例示のためであって、フローチャート５００が、如何なる特定のＣＥＳにおける使用に限定されるものではない。
【００９２】
フローチャート５００は、ステップ５０２で始まり、ステップ５０４において、バイオリアクター３００及び関連する配管、関連する構造を本体４０８に取り付けて、ＣＥＳ４３０を操作可能な状態にする。本体４０８に接続したら、ステップ５０８において、生理食塩水のような適当なプライミング流体を用いて、バイオリアクター３００、関連する配管、関連する構造に対して、プライミングを行う。ステップ５１２において、細胞を、バイオリアクター３００に投入・分配する。
【００９３】
実施形態において、細胞の投入・分配は、いくつかのサブステップを含む。例えば、ある実施形態において、ステップ５１２は、バイオリアクター３００を第１方向に合わせて配置するオプションであるサブステップ５１６と、バイオリアクター３００において細胞を投入・分配するオプションであるサブステップ５２０と、を有する。オプションである、サブステップ５２４では、細胞は、バイオリアクターに付着させられる。
【００９４】
細胞をバイオリアクター３００に投入・分配した後、ステップ５２８において、細胞増殖が行われる。すなわち、バイオリアクター３００内の細胞を増殖、すなわち成長及び／又は繁殖させる。ステップ５３２において、細胞をバイオリアクター３００に追加する必要があるかどうか、及び／又は、バイオリアクター３００内で細胞を分配させるためにバイオリアクター３００を回転させる必要があるかどうか、について判断が行われる。細胞をバイオリアクター３００に追加投入する必要がある場合、及び／又は細胞をバイオリアクター３００において分配させる必要がある場合、フローチャート５００は、ステップ５１２に戻る。細胞を追加する必要がない場合、及び／又は、バイオリアクター３００を回転させる必要がない場合、ステップ５３６において、細胞増殖ステップ５２８が完了したかどうかが、判断される。ここでは、十分な細胞数及び／又は細胞特徴の変化が達成された場合、細胞増殖プロセスは完了したと判断される。細胞増殖ステップ５２８が完了した場合、ステップ５４０において、細胞は収穫される。細胞増殖ステップ５２８が完了していない場合、細胞増殖ステップ５２８が続けられる。フローチャート５００は、ステップ５４４で終了する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、バイオリアクター及びＣＥＳにおいて細胞を投入、分配、増殖させるために使用されるプロセス（例えば、ステップ５１２、ステップ５２８（図５））について、さらに詳細な説明がなされる。図６及び図７は、細胞を投入、分配、付着及び増殖させるために用いられるプロセスのフローチャートを示す。これらプロセスは、フローチャート５００のプロセスの一部として、例えば、上述のステップにおけるサブステップ（例えば、ステップ５１２、ステップ５２８）として、実行される。他の実施形態において、フローチャート６００、７００に記載されるプロセスは、フローチャート５００のステップとは関係なく、行われてもよい。さらに、以下で示すように、フローチャート６００及び７００のステップは、部品（例えば、揺動部品４０２、４０４として使用されるモータ）やバイオリアクター（例えば、バイオリアクター２４、３００、４００、８０１、９０８）又はバイオリアクターの一部を含むＣＥＳ又はそれら（例えば、ＣＥＳ１０、８００、９００）の一部によって、又はそれらに対して行われてよい。ここでの記載は、フローチャート６００及び７００に限定することは意図していない。他のシステム、装置、部品、特徴等によって、又はそれらに対して行われるステップを有してもよい。
【００９６】
フローチャート６００は、ステップ６０４で始まり、ステップ６０８において、細胞を有する流体が、バイオリアクター３００（図３及び図８〜図１２参照）のようなバイオリアクター内を循環させられる。ある実施形態では、ステップ６０８において、１以上のポンプを作動させて、バイオリアクター３００内における流体の循環を行う。例えば、ＩＣ循環ポンプ（例えば、８１２又は９１１）を作動させて、流体を、第１循環流量で、バイオリアクター３００のＩＣ側において循環させてもよい。少なくとも１つの実施形態において、細胞を運ぶ流体は、バイオリアクター３００の中空糸を介して、ＩＣ側からＥＣ側へと移動する。他の実施形態では、細胞は、バイオリアクター３００のＥＣ側に投入され、該細胞を運ぶ流体をＥＣ側からＩＣ側へと流す。これら実施形態において、ＥＣ循環ポンプ（例えば、８２８、９７４）を作動させて、第１循環流量で、バイオリアクター３００のＥＣ側において循環させてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ステップ６０８は、バイオリアクター３００及びバイオリアクター３００に流体的に関連づけられたＣＥＳの循環路において細胞の分配を促進するため、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる工程を伴う。循環又は投入において細胞の分配を促進するために、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる実施形態の例は、２０１０年１２月１５日に出願された米国特許出願公開第１２／９６８，４８３号明細書（タイトル：細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入及び分配方法）に記載されている。該米国特許出願の全体は、ここでの開示により本出願に組み込まれる。他の実施形態において、循環ステップ６０８は、バイオリアクター３００をある時間で回転させ、さらに、バイオリアクター３００をある時間の間、静止させる工程を伴ってもよい。
【００９８】
ステップ６０８の後、ステップ６１２において、流体循環レートを減少させる。循環レートは、略ゼロ（０）ｍｌ／分に減らしてもよいし、他の実施形態では、ゼロ（０）ｍｌ／分以上だが、細胞がバイオリアクター３００（例えば、バイオリアクター３００の中空糸３１６の内側表面）において沈殿・付着できる程度のレートに減らしてもよい。ある実施形態では、ステップ６１２において、ステップ６０８で使用した１以上のポンプを停止して、流体を循環させてもよい。
【００９９】
フローチャートは、ステップ６１２からオプションとしてのステップ６１６に進む。該ステップでは、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター３００）を初期方向に位置づけるステップが行われる。ある実施形態では、バイオリアクターは、すでに初期方向にある場合もある。その場合は、ステップ６１６は不要である。ステップ６１６を行う場合は、１以上のモータによって行うことができる。
【０１００】
図８〜図１２を参照すると、図８には、初期方向にあるバイオリアクター３００が示されている。オプションとしてのステップ６１６の一部として、バイオリアクターの長手方向軸ＬＡ−ＬＡを始動方向（例えば、図８に示されるような、第１水平方向）に合わせるようにして、バイオリアクター３００を位置付けるようにしてもよい。
【０１０１】
フローチャートは、ステップ６１６からステップ６２０に進む。該ステップでは、バイオリアクターを、第１方向に維持し、細胞を沈殿させて、バイオリアクター３００の第１部分に付着させる。ステップ６２０は、第１所定期間の間、行われる。
【０１０２】
図１３Ａ〜図１３Ｃは、バイオリアクター３００の複数の中空糸３１６のうちの１つの中空糸１３００の（中空糸１３００の中心軸及びバイオリアクター３００の中心軸に垂直な）断面図を示す。これらの図面は、フローチャート６００のあるステップ中に起こり得るであろう中空糸３１６内における細胞の配置を示している。図１３Ａに示されるように、ステップ６１２において循環レートを減少させる前は、各中空糸１３００内における細胞は、中空糸１３００の容積全体にわたって、均一に分布している。循環レートを減少させると、細胞は、重力１３０４の影響によって、沈殿を始める。
【０１０３】
ある実施形態では、バイオリアクター３００が第１水平方向（図８）にある場合、バイオリアクター３００内の細胞は、バイオリアクターの第１部分に沈殿していく。図１３Ｂに示されるように、バイオリアクター３００の該第１部分は、中空糸１３００の少なくとも１部分１３０８を有する。細胞は、沈殿するだけではなく、中空糸１３００の該部分１３０８に付着するように選択された第１所定期間（フローチャート６００のステップ６２０）の間、沈殿させられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、第１所定期間は、細胞が沈殿し、該部分１３０８に付着するような十分な時間長さがよい。これらの実施形態において、細胞は、中空糸１３０８の内径の距離を移動しさえすればよい。例えば、中空糸の内径が、約１５０μｍ〜約３００μｍである実施形態の場合、第１所定期間は、約２０分より短いか、約１５分より短いか、又は約１０分より短くてよい。他の実施形態では、第１所定期間は、約１分より長いか、約２分より長いか、約３分より長いか、又は約４分より長くてよい。一実施形態において、第１所定期間は、約３分〜約８分の間であればよい（例えば、約５分）。
【０１０５】
他の実施形態において、第１所定期間は、細胞が沈殿して中空糸に付着するだけではなく、付着した細胞が成長するような長さの時間でもよい。これらの実施形態において、横方向の抵抗が最も小さいため、細胞は横方向に成長する。すなわち、部分１３０８上の細胞が中空糸壁から上方向に成長しようとする場合、細胞は重力１３０４に抗して成長することになるであろうという理由によって、細胞は、少なくとも初期の段階では、横方向に成長すると考えられる。これら実施形態において、細胞を付着後に成長させる場合、第１所定期間は、約５時間より長いか、約１０時間より長いか、約１５時間より長いか、約２０時間より長いか、又は約２４時間より長くてよい。他の実施形態において、第１所定期間は、約６０時間より短いか、約５５時間より短いか、約５０時間より短いか、又は約４５時間より短くてよい。一実施形態において、第１所定期間は、約１０時間〜約４８時間の間であればよい。
【０１０６】
図６に戻って、いくつかの実施形態では、ステップ６２０の後、フローチャートは、ステップ６４０に進む。そこでは、バイオリアクター３００を、第１水平方向から約１８０度回転した第２水平方向へ回転させる。図８〜図１０に示すように、バイオリアクターは、まず、第１水平方向（図８）から、該第１水平方向から約９０度回転させた第１鉛直方向へ回転させられる（例えば、ＬＡ−ＬＡ軸を鉛直方向にするように（図９））。そして、バイオリアクター３００を、さらに９０度回転させて（図１０）、第２水平方向への回転を完了させる。
【０１０７】
ある実施形態では、第２水平方向への回転の後、フローチャート６００は、ステップ６４４へ進む。該ステップにおいて、第２水平方向にあるバイオリアクター３００において細胞増殖が行われる。図１３Ｃは、第２水平方向において、中空糸１３００に付着した細胞が、中空糸１３００内側頂部に位置している状態を示す。ステップ６４４は、流体をバイオリアクター内で循環させて、バイオリアクター内に付着した細胞に栄養素を供給するような、複数のサブステップを含んでもよい。理解されるように、ステップ６４４は、増殖させるために、細胞に酸素を供給するサブステップを含んでもよい。バイオリアクターにおけるその他複数のパラメータを制御することで、増殖、すなわち細胞の成長、を最適化することができる。いくつかの実施形態では、ステップ６４４において、流体を循環させて細胞に栄養を与える工程を、約２４時間又は約３６時間又は約４８時間又は約６０時間又は約７２時間、行ってもよい。いくつかの実施形態において、細胞に栄養を与えるステップをステップ６４４の一部として、約１２０時間より短い期間又は約１０８時間より短い期間又は約９６時間より短い期間又は約８４時間より短い期間又は約７２時間より短い期間、行うようにしてもよい。そして、フローチャート６００は、ステップ６４８で終了する。
【０１０８】
理論に束縛されるものではないが、細胞を図１３Ｃに示されるように重力の影響下において成長させると、細胞増殖は改善されると考えられる。細胞は、中空糸１３００において下向きに、細胞が存在しない中空糸の部分に向かって、成長する。細胞は、中空糸のうち、頂部１３０８の下方に位置する部分のように（図１３Ｃ参照）、抵抗が最も少ない部分に向かって成長すると考えられる。重力の影響下における成長は、従来のプロセスと比較すると、細胞の収率を改善し、細胞倍加時間を減少させる。
【０１０９】
他の実施形態において、フローチャート６００は、他のステップを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ６２０の後に、フローチャート６００は、ステップ６２４に進み、該ステップにおいて、バイオリアクター６２８を鉛直方向に回転させる。例えば、バイオリアクター３００を、図９に示すように、第１鉛直方向に回転させる。ステップ６２４の後、フローチャートは、ステップ６２８に進み、該ステップにおいて、バイオリアクターを、第２所定期間の間、第１鉛直方向に維持する。
【０１１０】
図１３Ｄ及び図１３Ｅは、バイオリアクター３００の複数の中空糸３１６のうちの１つである中空糸１３００の（中空糸１３００の中心軸及びバイオリアクター３００の中心軸に平行な）断面図を示す。図１３Ｄ及び図１３Ｅは、ステップ６２０後の中空糸１３００を示す。そこでは、細胞は、沈殿して、中空糸１３００のある部分に付着する。図１３Ｄに示されるように、バイオリアクター３００が第１鉛直方向に回転すると、中空糸１３００の第１端部１３１２は、第２端部１３１６の上方に位置する。
【０１１１】
上述したように、理論に束縛されるものではないが、中空糸１３００に付着した細胞は、重力１３０４に影響を受け、端部１３１６に向かって長手方向に、成長、すなわち増殖を始める。従って、ステップ６２８（第１鉛直方向の維持）は、細胞が長手方向に成長ができるような十分な時間長さである第２所定期間の間、行われる。いくつかの実施形態では、第２所定期間は、約５時間より長いか又は約１０時間より長いか又は約１５時間より長いか又は約２０時間より長いか又は約２４時間より長くてよい。他の実施形態では、第２所定期間は、約６０時間より短いか又は約５５時間より短いか又は約５０時間より短いか又は約４５時間より短くてよい。一実施形態において、第２所定期間は、約１０時間〜約４８時間の間であればよい。
【０１１２】
ステップ６２８の後、フローチャートは、ステップ６３２に進む。該ステップにおいて、バイオリアクターは第２鉛直方向に回転される。第２鉛直方向にあるバイオリアクター３００の一例が図１２に示される。ステップ６２４の後、ステップ６３６に進む。該ステップにおいて、バイオリアクターは、第３所定期間の間、第２鉛直方向に維持される。
【０１１３】
図１３Ｅは、ステップ６３２後の中空糸１３００を示す。そこでは、細胞は沈殿して、中空糸１３００のある部分に付着し、バイオリアクター３００は、第１鉛直方向から第２鉛直方向へと回転させられ、第２鉛直方向に維持されている。図１３Ｅに示されるように、バイオリアクター３００が第２鉛直方向に回転すると、中空糸１３００の第１端部１３１２は、第２端部１３１６の下方に位置する。
【０１１４】
ステップ６２８（第１鉛直方向の維持）と同様に、中空糸１３００に付着した細胞は、重力１３０４に影響を受け、端部１３１２に向かって長手方向に、成長、すなわち増殖を始めると考えられるので、ステップ６３６（第２鉛直方向の維持）が行われる。ステップ６３６は、図１３Ｅに示されるように、細胞が端部１３１２に向かって長手方向に成長ができるような十分な時間長さである第３所定期間の間、行われる。いくつかの実施形態では、第３所定期間は、約５時間より長いか又は約１０時間より長いか又は約１５時間より長いか又は約２０時間より長いか又は約２４時間より長くてよい。他の実施形態では、第３所定期間は、約６０時間より短いか又は約５５時間より短いか又は約５０時間より短いか又は約４５時間より短くてよい。一実施形態において、第３所定期間は、約１０時間〜約４８時間の間であればよい。
【０１１５】
フローチャート６００に戻って、ステップ６３６の後、ステップ６４０に進む。該ステップでは、上述したように、バイオリアクターは、図１１に示すような第２水平位置に回転される。上述したように、フローチャートは、ステップ６４０からステップ６４４へ進み、細胞が増殖、すなわち繁殖される。そして、フローチャートは、ステップ６４８で終了する。
【０１１６】
図７に目を向けると、フローチャート７００は、ステップ７０４から始まり、ステップ７０８に進む。該ステップでは、細胞を含む流体が、バイオリアクター３００（図３、図８〜図１２参照）のようなバイオリアクター内を循環させられる。ある実施形態では、ステップ７０８において、１以上のポンプを作動させて、バイオリアクター３００内における流体の循環を行う。例えば、ＩＣ循環ポンプ（例えば、８１２又は９１１）を作動させて、流体を、第１循環流量で、バイオリアクター３００のＩＣ側において循環させてもよい。少なくとも１つの実施形態において、細胞を運ぶ流体は、バイオリアクター３００の中空糸を介して、ＩＣ側からＥＣ側へと移動する。他の実施形態では、細胞は、バイオリアクター３００のＥＣ側に投入され、該細胞を運ぶ流体をＥＣ側からＩＣ側へと流す。これら実施形態において、ＥＣ循環ポンプ（例えば、８２８、９７４）を作動させて、第１循環流量で、バイオリアクター３００のＥＣ側において循環させてもよい。
【０１１７】
ある実施形態では、第１循環流量は、比較的高い流量でよい。ある実施形態では、第１循環流量は、約５００ｍｌ／分よりも小さいか又は約４００ｍｌ／分よりも小さいか又は約３００ｍｌ／分よりも小さくてよい。他の実施形態では、第１循環流量は、約５０ｍｌ／分よりも大きいか又は約１００ｍｌ／分よりも大きいか又は約１５０ｍｌ／分よりも大きくてよい。一実施形態において、第１循環流量は、約１００ｍｌ／分〜約３００ｍｌ／分の間、例えば、約２００ｍｌ／分である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ステップ７０８は、バイオリアクター３００及びバイオリアクター３００に流体的に関連づけられたＣＥＳの循環路において細胞の分配を促進するため、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる工程を伴う。他の実施形態において、循環ステップ７０８は、バイオリアクター３００をある時間で回転させ、さらに、バイオリアクター３００をある時間の間、静止させる工程を伴ってもよい。
【０１１９】
ステップ７０８の後、ステップ７１２において、流体循環レートを減少させる。循環レートは、略ゼロ（０）ｍｌ／分に減らしてもよいし、他の実施形態では、ゼロ（０）ｍｌ／分以上だが、細胞がバイオリアクター３００（例えば、バイオリアクター３００の中空糸３１６の内側表面）において沈殿・付着できる程度のレートに減らしてもよい。ある実施形態では、ステップ７１２において、ステップ７０８で使用した１以上のポンプを停止して、流体を循環させてもよい。
【０１２０】
フローチャートは、ステップ７１２からオプションとしてのステップ７１６に進む。該ステップでは、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター３００）を初期方向に位置づけるステップが行われる。ある実施形態では、バイオリアクターは、すでに初期方向にある場合もある。その場合は、ステップ７１６は不要である。いくつかの実施形態において、ステップ７１６を行う場合は、１以上のモータによって行うことができる。
【０１２１】
図８〜図１２を参照すると、図８には、初期方向にあるバイオリアクター３００が示されている。オプションとしてのステップ７１６の一部として、バイオリアクターの長手方向軸ＬＡ−ＬＡを始動方向（例えば、図８に示されるような、第１水平方向）に合わせるようにして、バイオリアクター３００を位置付けるようにしてもよい。
【０１２２】
フローチャートは、ステップ７１６からステップ７２０に進む。該ステップでは、バイオリアクターを、第１方向に維持し、細胞を沈殿させて、バイオリアクター３００の第１部分に付着させる。ステップ８２０は、第１所定期間の間、行われる。
【０１２３】
図１４Ａ〜図１４Ｄ及び図１５Ａ〜図１５Ｆは、バイオリアクター３００の複数の中空糸３１６のうちの１つの中空糸１４００の（中空糸１４００の中心軸及びバイオリアクター３００の中心軸に垂直な）断面図を示す。これらの図面は、フローチャート７００のあるステップ中に起こり得るであろう中空糸３１６内における細胞の配置を示している。図１４Ａに示されるように、ステップ７１２において循環レートを減少させる前は、各中空糸１４００内における細胞は、中空糸１４００の容積全体にわたって、均一に分布している。循環レートを減少させると、細胞は、重力１４０４の影響によって、沈殿を始める。図１５Ａもまた、中空糸１５００及び重力１５０４に対して同様の状況を示している。
【０１２４】
ある実施形態では、バイオリアクター３００が第１水平方向（図８）にある場合、バイオリアクター３００内の細胞は、バイオリアクターの第１部分に沈殿していく。図１４Ｂ及び図１５Ｂに示されるように、バイオリアクター３００の該第１部分は、中空糸１４００の少なくとも１部分１４０８及び／又は中空糸１５００の少なくとも１部分１５０８を有する。ある実施形態では、細胞は、沈殿するだけではなく、中空糸１４００の該部分１４０８（及び中空糸１５００の該部分１５０８）に付着するように選択された第１所定期間の間、沈殿させられる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、第１所定期間は、細胞が沈殿し、該部分１４０８及び１５０８に付着するよう長さの期間でよい。これらの実施形態において、細胞は、中空糸１４００又は１５００の内径の距離を移動しさえすればよい。例えば、中空糸の内径が、約１５０μｍ〜約３００μｍである実施形態の場合、第１所定期間は、約２０分より短いか、約１５分より短いか、又は約１０分より短くてよい。他の実施形態では、第１所定期間は、約１分より長いか、約２分より長いか、約３分より長いか、又は約４分より長くてよい。一実施形態において、第１所定期間は、約３分〜約８分の間であればよい（例えば、約５分）。
【０１２６】
ステップ７２０の後、フローチャートは、ステップ７２４に進む。そこでは、バイオリアクター３００を、第１水平方向から約１８０度回転した第２水平方向へ回転させる。図８〜図１０に示すように、バイオリアクターは、まず、第１水平方向（図８）から、該第１水平方向から約９０度回転させた第１鉛直方向へ回転させられる（例えば、ＬＡ−ＬＡ軸を鉛直方向にするように（図９））。そして、バイオリアクター３００を、さらに９０度回転させて（図１０）、第２水平方向への回転を完了させる。いくつかの実施形態において、ステップ７２４は、バイオリアクター３００に接続された１以上のモータによって行われてもよい。これらモータは、揺動装置の一部であってもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７２４からステップ７３６に進む。該ステップにおいて、中空糸１４００の部分１４１２（図１４Ｃ）や中空糸１５００の部分１５１２（図１５Ｃ）のような、バイオリアクターの第２部分に細胞が沈殿するように、第２所定期間の間、バイオリアクター３００を第２水平方向（図１０）に維持する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７３６を実行する前に、オプションのステップ７２８、７３２を有してもよい。ステップ７０８と同様に、ステップ７２８は、流体をバイオリアクター３００中において循環させる。ある実施形態では、ステップ７２８において、１以上のポンプを作動させて、バイオリアクター３００内における流体の循環を行う。上述のように、ＩＣ循環ポンプ（例えば、８１２又は９１１）を作動させて、流体を、第２循環流量で、バイオリアクター３００のＩＣ側において循環させてもよい。少なくとも１つの実施形態において、細胞を運ぶ流体は、バイオリアクター３００の中空糸を介して、ＩＣ側からＥＣ側へと移動する。他の実施形態では、細胞は、バイオリアクター３００のＥＣ側に投入され、該細胞を運ぶ流体をＥＣ側からＩＣ側へと流す。これら実施形態において、ＥＣ循環ポンプ（例えば、８２８、９７４）を作動させて、第２循環流量で、バイオリアクター３００のＥＣ側において循環させてもよい。
【０１２９】
ある実施形態では、第２循環流量は、第１循環流量よりも低くてよい。ある実施形態では、第２循環流量は、約４００ｍｌ／分よりも小さいか又は約３００ｍｌ／分よりも小さいか又は約２００ｍｌ／分よりも小さくてよい。他の実施形態では、第２循環流量は、約２５ｍｌ／分よりも大きいか又は約５００ｍｌ／分よりも大きいか又は約７５ｍｌ／分よりも大きくてよい。一実施形態において、第２循環流量は、約５０ｍｌ／分〜約１５０ｍｌ／分の間、例えば、約１００ｍｌ／分である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ステップ７２８は、ステップ７０８で行われる循環とは異なる方向の循環を行ってもよい。すなわち、いくつかの実施形態において、ステップ７０８では、流体を反時計回り方向に循環させてもよい（図８及び図９のＩＣループ参照）。いくつかの実施形態において、ステップ７２８における循環は時計回り方向でもよい。すなわち、循環は、ステップ７０８における循環と反対方向の流れでもよい。他の実施形態において、ステップ７０８における循環は、ステップ７０８と同じ方向、つまり時計回り方向か反時計回り方向でもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、オプションとしてのステップ７２８は、バイオリアクター３００及びバイオリアクター３００に流体的に関連づけられたＣＥＳの循環路において細胞の分配を促進するため、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる工程を伴う。他の実施形態において、循環ステップ７２８は、バイオリアクター３００をある時間で回転させ、さらに、バイオリアクター３００をある時間の間、静止させる工程を伴ってもよい。
【０１３２】
オプションとしてのステップ７２８の後、ステップ７３２において、流体循環レートを再度減少させる。循環レートは、略ゼロ（０）ｍｌ／分に減らしてもよいし、他の実施形態では、ゼロ（０）ｍｌ／分以上だが、細胞がバイオリアクター３００（例えば、バイオリアクター３００の中空糸３１６の内側表面）において沈殿・付着できる程度のレートに減らしてもよい。ある実施形態では、ステップ７３２において、ステップ７２８で使用した１以上のポンプを停止して、流体を循環させてもよい。
【０１３３】
ステップ７３６では、バイオリアクターを第２水平方向に維持することによって、細胞を、部分１４０８に対向する側の部分１４１２（又は図１５Ｃの１５１２）に沈殿させる。例えば、部分１４０８（又は１５０８）を「底部」と呼び、部分１４１２（又は図１５Ｃの１５１２）を「頂部」と呼ぶことにする。図１４Ｃ及び図１５Ｃでは、細胞は、部分１４１２及び１５１２に沈殿しているが、いくつかの実施形態では、逆である。ある実施形態において、細胞は、沈殿するだけではなく、中空糸１４００の部分１４１２（又は中空糸１５００の部分１５１２）に付着するように選択された第２所定期間の間、沈殿させられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、第２所定期間は、細胞が沈殿し、該部分１４１２（図１５Ｃの該部分１５１２）に付着するような十分な時間長さがよい。これらの実施形態において、細胞は、中空糸１４００又は１５００の内径の距離を移動すればよい。例えば、中空糸の内径が、約１５０μｍ〜約３００μｍである実施形態の場合、第２所定期間は、約２０分より短いか、約１５分より短いか、又は約１０分より短くてよい。他の実施形態では、第２所定期間は、約１分より長いか、約２分より長いか、約３分より長いか、又は約４分より長くてよい。一実施形態において、第２所定期間は、約３分〜約８分の間であればよい（例えば、約５分）。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ステップ７３６の後に、フローチャート７００は、ステップ７７２に進む。該ステップでは、細胞が増殖される。ステップ７７２は、流体をバイオリアクター内で循環させて、バイオリアクター内に付着した細胞に栄養素を供給するような、複数のサブステップを含んでもよい。理解されるように、ステップ７７２は、増殖させるために、細胞に酸素を供給するサブステップを含んでもよい。バイオリアクターにおけるその他複数のパラメータを制御することで、増殖、すなわち細胞の成長、を最適化することができる。いくつかの実施形態では、ステップ７７２において、流体を循環させて細胞に栄養を与える工程を、約２４時間又は約３６時間又は約４８時間又は約６０時間又は約７２時間、行ってもよい。いくつかの実施形態において、細胞に栄養を与えるステップをステップ７７２の一部として、約１２０時間より短い期間又は約１０８時間より短い期間又は約９６時間より短い期間又は約８４時間より短い期間又は約７２時間より短い期間、行うようにしてもよい。図１４Ｄは、本実施形態における中空糸１４００を示す。そして、フローチャート７００は、ステップ７７６で終了する。
【０１３６】
他の実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７４０へ進む。該ステップでは、バイオリアクター３００は、最初の第１水平方向に戻される。図１１は、第１水平方向に戻されたバイオリアクター３００を示す。ステップ７４０は、バイオリアクター３００に接続された１以上のモータによって行われてよい。これらモータは、揺動装置の一部でよい。ある実施形態では、ステップ７４０からステップ７７２へ進み、細胞の増殖が行われる。そして、フローチャート７００は、ステップ７７６にて終了する。
【０１３７】
他の実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７４０からステップ７４４へ進む。或いは、ステップ７３６からステップ７４４へ直接進む（この場合、追加の回転は行われない）。該ステップでは、第３循環流量で、流体が循環される。ステップ７０８、７２８と同様に、流体はバイオリアクター３００を循環させられる。ある実施形態では、ステップ７４４において、１以上のポンプを作動させて、バイオリアクター３００内における流体の循環を行う。上述のように、ＩＣ循環ポンプ（例えば、８１２又は９１１）を作動させて、流体を、第３循環流量で、バイオリアクター３００のＩＣ側において循環させてもよい。少なくとも１つの実施形態において、細胞を運ぶ流体は、バイオリアクター３００の中空糸を介して、ＩＣ側からＥＣ側へと移動する。他の実施形態では、細胞は、バイオリアクター３００のＥＣ側に投入され、該細胞を運ぶ流体をＥＣ側からＩＣ側へと流す。これら実施形態において、ＥＣ循環ポンプ（例えば、８２８、９７４）を作動させて、第３循環流量で、バイオリアクター３００のＥＣ側において循環させてもよい。
【０１３８】
ある実施形態では、第３循環流量は、第２循環流量よりも低くてよい。ある実施形態では、第３循環流量は、約２００ｍｌ／分よりも小さいか又は約１５０ｍｌ／分よりも小さいか又は約１００ｍｌ／分よりも小さくてよい。他の実施形態では、第３循環流量は、約１０ｍｌ／分よりも大きいか又は約２０ｍｌ／分よりも大きいか又は約３０ｍｌ／分よりも大きくてよい。一実施形態において、第３循環流量は、約２０ｍｌ／分〜約１００ｍｌ／分の間、例えば、約５０ｍｌ／分である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ステップ７４４は、ステップ７２８で行われる循環とは異なる方向の循環を行ってもよい。すなわち、いくつかの実施形態において、ステップ７２８では、流体を時計回り方向に循環させてもよい。いくつかの実施形態において、ステップ７４４における循環は、ステップ７０８と同様でよく、反時計回り方向でよい（図８及び図９のＩＣループ参照）。すなわち、ステップ７４４における循環は、ステップ７２８における循環と反対方向の流れであり、ステップ７０８の循環方向と同じ方向でもよい。他の実施形態において、ステップ７０８、７２８、７４４における循環は、時計回り方向或いは反時計回り方向の同じ方向でもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、オプションとしてのステップ７４４は、バイオリアクター３００及びバイオリアクター３００に流体的に関連づけられたＣＥＳの循環路において細胞の分配を促進するため、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる工程を伴う。他の実施形態において、循環ステップ７４４は、バイオリアクター３００をある時間で回転させ、さらに、バイオリアクター３００をある時間の間、静止させる工程を伴ってもよい。
【０１４１】
ステップ７４４からステップ７４８に進む。該ステップにおいて、流体循環レートを再度減少させる。循環レートは、略ゼロ（０）ｍｌ／分に減らしてもよいし、他の実施形態では、ゼロ（０）ｍｌ／分以上だが、細胞がバイオリアクター３００（例えば、バイオリアクター３００の中空糸３１６の内側表面）において沈殿・付着できる程度のレートに減らしてもよい。ある実施形態では、ステップ７４８において、ステップ７４４で使用した１以上のポンプを停止して、流体を循環させてもよい。
【０１４２】
ステップ７４８からステップ７５２へ進む。該ステップでは、バイオリアクターが水平方向に維持される。ステップ７４４（第１方向への回転）を含む実施形態では、ステップ７５２は、第１水平方向に維持する工程を含む。ステップ７４０の回転を含まない実施形態では、ステップ７５２は、第２水平方向に維持する工程を含む。いかなる場合においても、ステップ７５２は、細胞を、例えば部分１５０８に再び沈殿させるために行われる（回転ステップ７４０を行う場合は、図１５Ｄ及び図１５Ｅを参照）。ある実施形態において、細胞は、沈殿するだけではなく、付着するように選択された第３所定期間の間、沈殿させられる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、第３所定期間は、細胞が沈殿し、部分１５０８に付着する程度に十分な時間長さでよい。これらの実施形態において、細胞は、中空糸１５００の内径の距離を移動すればよい。例えば、中空糸１５００の内径が、約１５０μｍ〜約３００μｍである実施形態の場合、第３所定期間は、約２０分より短いか、約１５分より短いか、又は約１０分より短くてよい。他の実施形態では、第３所定期間は、約１分より長いか、約２分より長いか、約３分より長いか、又は約４分より長くてよい。一実施形態において、第３所定期間は、約３分〜約８分の間であればよい（例えば、約５分）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７５２からステップ７７２へ進む。該ステップにおいて、細胞の増殖が行われる。図１５Ｆは、これら実施形態における中空糸１５００を示す。そして、フローチャートはステップ７７６で終了する。
【０１４５】
他の実施形態において、以下で記載するように、フローチャート７００は、細胞を増殖させるステップ７７２へ進む前に、追加の回転ステップ（７５６）、循環ステップ（７６０）、循環レート減少ステップ（７６４）、方向維持ステップ（７６８）を有してもよい。これら実施形態において、フローチャート７００は、ステップ７５２からステップ７５６に進む。ステップ７５６において、ステップ７４０において第１水平方向に回転していた場合は、バイオリアクター３００は、第２水平方向に戻る。図１０は、第２水平方向にあるバイオリアクター３００を示す。ステップ７５６は、バイオリアクター３００に接続された１以上のモータによって行われてよい。これらモータは、揺動装置の一部でよい。いくつかの実施形態において、バイオリアクターを第１水平方向に回転させるステップ７４０が行われなかった場合は、このステップは必要ないこともある。
【０１４６】
フローチャート７００は、ステップ７６０へ進む。該ステップでは、第４循環流量で、流体が再度循環される。ステップ７０８、７２８、７４４と同様に、流体はバイオリアクター３００を循環させられる。ある実施形態では、ステップ７４４において、１以上のポンプを作動させて、バイオリアクター３００内における流体の循環を行う。上述のように、ＩＣ循環ポンプ（例えば、８１２又は９１１）を作動させて、流体を、第４循環流量で、バイオリアクター３００のＩＣ側において循環させてもよい。少なくとも１つの実施形態において、細胞を運ぶ流体は、バイオリアクター３００の中空糸を介して、ＩＣ側からＥＣ側へと移動する。他の実施形態では、細胞は、バイオリアクター３００のＥＣ側に投入され、該細胞を運ぶ流体をＥＣ側からＩＣ側へと流す。これら実施形態において、ＥＣ循環ポンプ（例えば、８２８、９７４）を作動させて、第４循環流量で、バイオリアクター３００のＥＣ側において循環させてもよい。
【０１４７】
ある実施形態では、第４循環流量は、第３循環流量よりも低くてよい。ある実施形態では、第４循環流量は、約１００ｍｌ／分よりも小さいか又は約７５ｍｌ／分よりも小さいか又は約５０ｍｌ／分よりも小さくてよい。他の実施形態では、第４循環流量は、約５ｍｌ／分よりも大きいか又は約１０ｍｌ／分よりも大きいか又は約１５ｍｌ／分よりも大きくてよい。一実施形態において、第４循環流量は、約１５ｍｌ／分〜約３５ｍｌ／分の間、例えば、約２５ｍｌ／分である。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ステップ７６０は、ステップ７４４で行われる循環とは異なる方向の循環を行ってもよい。すなわち、いくつかの実施形態において、ステップ７４４では、流体を反時計回り方向に循環させてもよい。いくつかの実施形態において、ステップ７６０における循環は、ステップ７２８と同様でよく、時計回り方向でよい。すなわち、ステップ７６０における循環は、ステップ７４４における循環と反対方向の流れであり、ステップ７２８の循環方向と同じ方向でもよい。他の実施形態において、ステップ７０８、７２８、７４４、７６０における循環は、時計回り方向或いは反時計回り方向の同じ方向でもよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ステップ７６０は、バイオリアクター３００及びバイオリアクター３００に流体的に関連づけられたＣＥＳの循環路において細胞の分配を促進するため、ある特定のシーケンスでバイオリアクター３００を回転させる工程を伴う。他の実施形態において、循環ステップ７６０は、バイオリアクター３００をある時間、回転させ、さらに、バイオリアクター３００をある時間の間、静止させる工程を伴ってもよい。
【０１５０】
ステップ７６０からステップ７６４に進む。該ステップにおいて、流体循環レートを再度減少させる。循環レートは、略ゼロ（０）ｍｌ／分に減らしてもよいし、他の実施形態では、ゼロ（０）ｍｌ／分以上だが、細胞がバイオリアクター３００（例えば、バイオリアクター３００の中空糸３１６の内側表面）において沈殿・付着できる程度のレートに減らしてもよい。ある実施形態では、ステップ７６４において、ステップ７６０で使用した１以上のポンプを停止して、流体を循環させてもよい。
【０１５１】
ステップ７６４からステップ７６８へ進む。該ステップでは、バイオリアクターを第２水平方向に維持して、細胞を、例えば部分１５１２に再び沈殿させる（図１５Ｆを参照）。ある実施形態において、細胞は、沈殿するだけではなく、再び付着するように選択された第４所定期間の間、沈殿させられる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、第４所定期間は、細胞が沈殿し、付着する程度に十分な時間長さがよい。これらの実施形態において、細胞は、中空糸（例えば、中空糸１５００）の内径の距離を移動すればよい。例えば、中空糸１５００の内径が、約１５０μｍ〜約３００μｍである実施形態の場合、第４所定期間は、約２０分より短いか、約１５分より短いか、又は約１０分より短くてよい。他の実施形態では、第４所定期間は、約１分より長いか、約２分より長いか、約３分より長いか、又は約４分より長くてよい。一実施形態において、第４所定期間は、約３分〜約８分の間であればよい（例えば、約５分）。
【０１５３】
ステップ７６８の後、フローチャート７００は、ステップ７７２へ進む。該ステップにおいて、バイオリアクター３００（例えば、バイオリアクターの中空糸）へ沈殿・付着した細胞が増殖、すなわち繁殖される。そして、フローチャート７００は、ステップ７７６において終了する。
【０１５４】
理論に束縛されるものではないが、ある実施形態において、フローチャート７００のステップが行われる場合、細胞増殖は改善されると考えられる。これら実施形態によって、細胞増殖を行う前に、バイオリアクターのより多くの部分（例えば、バイオリアクター内の中空糸の表面）に対して細胞を播種することを確実に行えると考えられる。これにより、従来のプロセスと比較して、より多くの細胞を初期段階で播種可能となり、最終的に、細胞の収率が改善され、細胞倍加時間を減少できる。
【０１５５】
フローチャート７００には、バイオリアクターの回転、循環、循環レート減少、方向維持のための特定の数のステップが含まれるが、他の実施形態は、これら特定の数のステップに限定されない。他の実施形態において、ステップ７６８の後にさらに、バイオリアクターを再び回転させ、循環を再度行い、循環レートを減らして、細胞を沈殿させ、ある特定の時間だけ方向を維持させて、バイオリアクターのある部分に細胞を付着させてもよい。これらステップは、何度行ってもよい。ある実施形態では、循環を再始動するたびに、前回の循環よりも低いレートで行う。他の実施形態では、循環を始動するごとに、循環レートは同じでもよい。さらに他の実施形態では、まず、第１方向で循環を行い、循環を停止して、細胞を沈殿・付着させ、続いて、第１方向とは反対の方向（時計回り方向に対する反時計回り方向のように）で循環させ、再度停止して細胞を沈殿させるというように、循環方向を変化させてもよい。
【０１５６】
図１６は、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター３００）の（中心軸に垂直な）断面図１６００を示す。断面図１６００は、ハウジング１６０４に収容された複数の中空糸１６０８を示す。断面図１６００は、バイオリアクターの一端側から描かれており、中空糸１６０８の他に、中空糸１６０８を一体に保持する（上記でポッティング材と呼んだ）マトリクス材１６２８も示されている。
【０１５７】
図１６では、複数のゾーン１６１２、１６１６、１６２０、１６２４が示されている。これら各ゾーンにおける中空糸では、流体は異なる流量で循環する。すなわち、理論に束縛されるものではないが、循環ステップ７０８や７２８（図７）におけるレートのように、比較的高い流量での循環は、主にゾーン１６１２における中空糸中を流れると考えられる。理論に束縛されるものではないが、高い流量であれば、流体は、外側のゾーンの中空糸内に均等に流れる程十分には分散することはできないと考えられる。ステップ７４４や７６０のように、流量を減らすと、ゾーン１６１６、１６２０、１６２４のような外側のゾーンの中空糸に分散していくと考えられる。
【０１５８】
従って、理論に束縛されるものではないが、ステップ７０８、７２８、７４４、７５２において異なる流量で循環させることにより、単一の流量を用いた場合と比べて、流体は、より多くの中空糸１６０８を流れるようになると考えられる。フローチャート７００に従うプロセスの一実施形態において、（上記した流量である）ステップ７０８では、流体は、ゾーン１６１２の中空糸を流れる。（上記した流量である）ステップ７２８では、レートが遅くなり、流体がそれに伴って、より分散するので、流体は、ゾーン１６１２とゾーン１６１６の中空糸を流れる。（上記した流量である）ステップ７４４では、レートがさらに遅くなり、それに伴ってさらに分散するので、流体は、ゾーン１６１２、１６１６、１６２０内の中空糸を流れる。（上記した流量である）ステップ７５２では、レートはより一層遅くなり、それに伴って、全てのゾーンの全ての中空糸に分散するので、流体は、全てのゾーン１６１２、１６１６、１６２０、１６２４内の中空糸を流れる。従って、単一の高流量レートで循環させる場合と比較すると、一連の異なる流量を用いることによって、細胞を有する流体は、より多くの中空糸を流れるようになると考えられる。
【０１５９】
さらに、異なる流量によって、バイオリアクターに沿った（例えば、中空糸に沿った）細胞の長手方向分布が影響を受けると考えられる。すなわち、より高い流量であれば、細胞は、中空糸内部に沿って、より遠くに流れる。例えば、より高い流量では、流体によって運ばれる細胞は、中空糸の長さの半分を超えた位置に到達するであろう。より低い流量では、流体によって運ばれる細胞は、中空糸の長さの半分の位置に到達するであろう。さらに低い流量では、流体によって運ばれる細胞は、中空糸の長さの半分よりも手前の位置に到達するであろう。従って、いくつかの実施形態において、異なる流量を用いることによって、バイオリアクター（例えば、中空糸）の長さに沿った細胞の長手方向の分布が改善されると考えられる。
【０１６０】
フローチャート５００、６００、７００について記載された実施形態は、限定はされないが、例えば、幹細胞（間葉細胞、造血細胞等）、線維芽細胞、角化細胞、前駆細胞、内皮細胞、その他の完全分化細胞、及びそれらの組み合わせのような、如何なるタイプの細胞の増殖においても使用できる。フローチャート５００、６００及び／又は７００について上述したステップを含み、また異なる特徴、及びそれら特徴の組合せを含むプロセスを用いることにより、異なる細胞に対して増殖を行うことができる。
【０１６１】
フローチャート５００（図５）、６００（図６）、７００（図７）を、複数のステップをある特定の順序で例示して説明してきたが、本発明は、それらに限定されない。他の実施形態において、ステップは、異なる順序で、或いは並行して、或いは任意の回数で（例えば、別のステップの前後）、行われてもよい。上述のように、フローチャート５００、６００、７００は、いくつかのオプションとしてのステップやサブステップを含む。しかしながら、オプションとして示されなかった上記それらのステップは、本発明にとって必須と考えられるべきではなく、ある実施形態では行われ、他の実施形態では行われない。
【０１６２】
図１７は、本発明の実施形態が実行される基本的なコンピュータシステム１７００の構成要素例を示す。コンピュータシステム１７００は、細胞を投入・分配する方法のいくつかのステップを実行する。システム１７００は、増殖のために細胞を投入・分配する上述のＣＥＳシステム１０、４３０、８００、９００の構成要素や特徴事項（例えば、流量制御装置、ポンプ、バルブ、バイオリアクターの回転、モータ等）を制御するためのコントローラである。
【０１６３】
コンピュータシステム１７００は、出力装置１７０４、及び／又は入力装置１７０８を有する。出力装置１７０４は、ＣＲＴ、ＬＣＤ、プラズマディスプレイのような、１以上のディスプレイを有してよい。出力装置１７０４は、プリンター、スピーカ等を有してもよい。入力装置１７０８は、キーボード、タッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等を含んでよい。
【０１６４】
本発明の実施形態において、基本的なコンピュータシステム１７００は、処理装置１７１２、及び／又はメモリ１７１６を有してもよい。処理装置１７１２は、メモリ１７１６に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理装置１７１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、各プロセッサは、別個に命令を読み込んで実行するための１以上のコアを有するマルチコアプロセッサが可能である。プロセッサは、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
【０１６５】
本発明の実施形態において、メモリ１７１６は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の有形媒体を含んでよい。メモリ１７１６は、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク記憶装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。実施形態において、システム１７００を使用して、バイオリアクター３００の回転、及び／又はＣＥＳシステムの種々の流量制御装置、ポンプ、バルブ等を制御する。メモリ１７１６は、循環ポンプ、バルブ、バイオリアクターの回転等の操作を制御する、バイオリアクターにおいて細胞を投入・分配するためのプロトコル及びプロシージャのような、プロトコル１７２０及びプロシージャ１７２４を記憶することができる。
【０１６６】
記憶装置１７２８は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置１２２０は、メモリ１７１６と関連して記載されたシステムのうちの１以上を含んでよい。記憶装置１７２８は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。システム１７００は、ＣＥＳシステムの一部分であり、記憶装置１７２８は、種々のタイプの細胞の投入、分配、付着、増殖、収穫を行うためにＣＥＳシステムを利用するための種々のプロトコルを記憶できる。
【０１６７】
実施例
以下では、本発明の実施形態に係るいくつかの例が記載される。しかしながら、以下の実施形態において、例えば、ＣＥＳ（すなわち、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム）のプログラミングを行うために、パラメータ、特徴事項及び／又は値が以下で記載されるが、それらはあくまでも例示のためであり、本発明は、以下で記載されるそれら特定の事項に限定されない。
【０１６８】
実施例１
ここでの目的は、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システムにおいて２つの特徴的な細胞播種方法を用いたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の増殖を説明することである。
【０１６９】
事前に選択したｈＭＳＣｓに対して、ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システムにおいて現在用いられている細胞投入プロシージャでは、均一な細胞懸濁液を介して、バイオリアクター内に細胞が分配される。細胞は、ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システムのＩＣ循環ループ内に投入され、比較的高い流量（２００ｍＬ／分）で２分間循環される。この循環方法では、設定されたバイオリアクターの動作も同時に行うことで、均一な細胞懸濁液が得られる。細胞が均一に懸濁されると、循環及びバイオリアクターの動きは停止され、細胞は、バイオリアクター表面に沈殿する。
【０１７０】
この細胞投入プロシージャの限界の１つは、バイオリアクターの中空糸の谷状部分（ｔｒｏｕｇｈ）にしか、細胞を播種できないことである。ｈＭＳＣｓはしばしば、ある指定された細胞密度（例えば、５００細胞数／ｃｍ2）で播種される。指定された播種密度を達成するために、投入すべき適正な細胞数を決定する際、バイオリアクター表面の略５０％のみしか考慮することができない。５００細胞数／ｃｍ2の場合、ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システムバイオリアクターには、１０．５Ｅ＋０６細胞数（５００細胞数／ｃｍ2×２１０００ｃｍ2）が播種される。しかしながら、現在の細胞投入プロトコルの上述の機構によって、バイオリアクター表面積のうちの５０％のみしか「播種可能」とみなすことができない。さらに、「播種不可能」表面を利用するため、バイオリアクターの「播種不可能」表面に移動していって、細胞が増殖するには、重力に打ち勝つ必要がある。移動する細胞は、最も抵抗の少ない経路をとると考えられ、その結果、フラスコにおける同様の増殖と比較して、細胞集団内においてコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が急速に起こると考えられる。
【０１７１】
バイオリアクターを有する滅菌したＱｕａｎｔｕｍ  ＣＥＳディスポーザブルセットを合計７つ用意し、フィブロネクチンコート（５ｍｇ）を一晩行う。全てのＱｕａｎｔｕｍシステムに、前培養したｈＭＳＣｓを播種する。１つのＱｕａｎｔｕｍ細胞増殖システムに対しては、現状で行われている循環・投入タスク（Ｌｏａｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ）を用い、対照実験とする。３つのＱｕａｎｔｕｍ細胞増殖システムに対しては、循環・投入タスク：変形例１（変形例１）を用い、さらに別の３つのＱｕａｎｔｕｍ細胞増殖システムに対しては、循環・投入タスク：変形例２（変形例２）を用いる。
【０１７２】
ディスポーザブルセット：全てのバイオリアクターは、ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システム（ＣＥＳ）ディスポーザブルセットに統合され、エチレンオキシドによって滅菌される。
【０１７３】
細胞源及び密度：使用するバイオリアクターの内側（ＩＣ）表面面積は、２．１ｍ2である。従って、対照フラスコに対する播種密度の調整は、ＩＣループのバイオリアクター容積率に基づいて行う必要がある。全てのバイオリアクターには、同じ細胞源の直接再投入によって（既存の経路１−３）最大で２０Ｅ＋６の事前に選択されたＭＳＣｓが均一に投入される。単一のドナーからの細胞が好ましい。比較の目的のため、バイオリアクターとして、単位面積ｃｍ2当たり同じ密度でｈＭＳＣｓを３つのＴ２５対照フラスコに播種する。
【０１７４】
ＣＥＳ培地ＩＣ入力Ｑ管理及び収穫：グルコースレベルが７０ｍｇ／ｄＬを下回る場合、培地供給レート（ＩＣ入力Ｑ）を２倍にする。グルコースレベルが７０ｍｇ／ｄＬを下回り続ける場合、ＩＣ入力Ｑは、１日の間に２回、２倍にする。全てのディスポーザブルセットは、同時に収穫され、可能性のある細胞凝集を制限するため、８日目より遅くしない。細胞収穫時間は、細胞培養によって示される代謝特性によって決定する。目標収穫時間は、細胞の対数増殖期の後がよい。
【０１７５】
収穫後評価：各収穫物に対して評価を行う。これら評価には、細胞数及び生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が含まれる。
【０１７６】
Ｑｕａｎｔｕｍ  ＣＥＳ細胞投入  変形例１
【０１７７】
現状で行われている細胞投入プロシージャを、太字で示された以下の変更点を付加して行う。細胞を５分間付着させた後、全てのバイオリアクターを１８０度回転させ、付着していない細胞を中空糸膜の頂部に向けて、さらに５分間沈殿させる。そして、バイオリアクターをホームポジションである水平位置に戻し、増殖プロトコルを行う。変更点を行うことの理由は、細胞をバイオリアクター中空糸の全表面積に分布させることである。
【０１７８】
０日目（Ｄａｙ：０）  １回転して細胞を付着
【０１７９】
目的：接着細胞をバイオリアクター膜に付着させると同時にＥＣ循環ループを流す。ＩＣループに対するポンプ流量はゼロに設定される。
【０１８０】
表１は、細胞付着を行う際に各ラインに取付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０１８１】
表１：変形例１の細胞付着のための溶液
【０１８２】
【表１】
0006612227.tif 000002
【０１８３】
細胞経路：タスク＞投入及び付着＞細胞付着
【０１８４】
プロトコル表２ａ−ｃに示される細胞付着の各設定値を入力。
【０１８５】
【表２】
0006612227.tif 000003
【０１８６】
【表３】
0006612227.tif 000004
【０１８７】
【表４】
0006612227.tif 000005
【０１８８】
Ｑｕａｎｔｕｍ  ＣＥＳ細胞投入  変形例２
【０１８９】
現状で行われている細胞投入プロシージャ、事前に選択したＭＳＣ増殖プロトコルを、太字で示された以下の変更点を付加して行う。細胞付着フェーズの間（１８〜２４時間）、バイオリアクターを１８０度位置に回転させ、細胞を中空糸の頂部に付着させる。そして、バイオリアクターをホームポジションに戻し、増殖プロトコルを行う。変更点を行うことの理由は、細胞増殖中に、重力によって、空いている成長表面へと細胞を移動させることを促すことである。
【０１９０】
重力を用いて、増殖中の細胞移動に影響を及ぼす。これは、現状の細胞投入プロシージャで記載されるように細胞を播種して、増殖中、バイオリアクターを１８０度回転させることによって実現される。この場合、バイオリアクターのうち占められていない成長表面は、播種された細胞の下方にある。そして、細胞は、最も抵抗の少ない方向（例えば、重力に促進される下方向）に増殖する。
【０１９１】
０日目（Ｄａｙ：０）  １回転して細胞を付着
【０１９２】
目的：接着細胞をバイオリアクター膜に付着させると同時にＥＣ循環ループを流す。ＩＣループに対するポンプ流量は、ゼロに設定される。
【０１９３】
表５は、細胞付着を行う際に各ラインに取付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０１９４】
【表５】
0006612227.tif 000006
【０１９５】
細胞経路：タスク＞投入及び付着＞細胞付着
【０１９６】
【表６】
0006612227.tif 000007
【０１９７】
結果は以下のとおりである。
【０１９８】
【表７】
0006612227.tif 000008
【０１９９】
【表８】
0006612227.tif 000009
【０２００】
【表９】
0006612227.tif 000010
【０２０１】
実施例２
本発明において中心となる細胞投入プロシージャは、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システムのバイオリアクター内において、より均一な細胞分布を可能にすることによって、また播種プロセスにおいて失われる細胞数を減らすことによって、細胞収率を増加するように設計された一連のステップである。
【０２０２】
ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システムのための本発明において中心となる細胞投入技術は、バイオリアクターに播種するために一般に使用されている（ソフトウェアバージョン２．０のＱｕａｎｔｕｍ細胞増殖システムマニュアル）「均一懸濁液による細胞投入（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）」プロトコルを含み且つさらに該プロトコルに付加される一連のステップを提供する。均一懸濁液による細胞投入（ＬＣＷＵＳ）では、懸濁された細胞は、細胞懸濁液が２００ｍＬ／分でＩＣループを循環した後、バイオリアクターのある１つの中空糸の内側表面に入って付着するには唯１度の機会があるのみである。本発明の細胞投入技術では、最初の懸濁後に付着しない細胞及びバイオリアクター内というよりもＩＣループ内に残った細胞は、再度懸濁され、次の付着のために、バイオリアクター内の別の中空糸へと運ばれる。
【０２０３】
本発明の投入方法は、ＩＣループの循環を通じてバイオリアクターに導入される細胞懸濁液は、ＩＣループ内の細胞懸濁液の循環レートによって、異なる中空糸セットを通過するという原理に基づいている。
【０２０４】
均一懸濁液による細胞投入（ＬＣＷＵＳ）では、初期的には、２００ｍＬ／分で懸濁液の循環が行われる。そのような状態の後に、ＩＣループにおける細胞懸濁液を、循環方向を正方向と逆方向と交互に変えて行い、同時に順次に循環レートを下げて行う（すなわち、−１００ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、−２５ｍＬ／分のように）。ＩＣループの循環を徐々に遅くすることによって、懸濁液に残留している細胞には、バイオリアクター中空糸の内側表面に入って付着するためのさらに別の機会を与えることができる。
【０２０５】
ＩＣループでの流体の各サイクルの後、ＩＣ循環レートをゼロにする細胞付着期間が７分間行われる。ＱＵＡＮＴＵＭ細胞増殖システムにおいて使用されるバイオリアクターでは、ＭＳＣ細胞は、中空糸の内側表面に、５分以内に付着することが実証されている。従って、７分間の付着期間では、５分間で細胞の付着が可能となり、さらに２分間で、より遅く付着する細胞にも対応できる。ＩＣループにおける細胞懸濁及び細胞付着の合計で４回のサイクルの後、２４時間の付着期間を維持し、その後、必要に応じて、適切な細胞フィーディングスケジュールを投入してもよい。
【０２０６】
１日前（Ｄａｙ：−１）バイオリアクターのコーティング
【０２０７】
目的：バイオリアクター膜を試薬にてコーティングする
【０２０８】
ステップ１：バッグが空になるまで、ＩＣループ内に試薬を投入。
【０２０９】
ステップ２：ＡＲＣから試薬をＩＣループ内に追い込む。
【０２１０】
ステップ３：試薬をＩＣループ内で循環させる。
【０２１１】
このタスクが始まる前に、以下の条件を満足させる。
【０２１２】
細胞投入バッグ内に少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０２１３】
表１０は、バイオリアクターコーティングを行う際に各ラインに取り付けて使用される溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２１４】
【表１０】
0006612227.tif 000011
【０２１５】
バイオリアクターコーティング経路：タスク＞システム管理＞バイオリアクターコーティング
【０２１６】
表１１に示されるステップ１の各設定のための値を入力する。
【０２１７】
【表１１】
0006612227.tif 000012
【０２１８】
表１２に示されるステップ２の各設定のための値を入力する。
【０２１９】
【表１２】
0006612227.tif 000013
【０２２０】
表１３に示されるステップ３の各設定のための値を入力する。
【０２２１】
【表１３】
0006612227.tif 000014
【０２２２】
０日目（Ｄａｙ：０）  ＩＣ・ＥＣ洗浄
【０２２３】
目的：ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループの両方における流体を交換する。交換容積は、交換されるＩＣ体積及びＥＣ体積の数によって指定される。表１４は、ＩＣ・ＥＣ洗浄を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２２４】
【表１４】
0006612227.tif 000015
【０２２５】
ＩＣ・ＥＣ洗浄経路：タスク＞洗浄＞ＩＣ・ＥＣ洗浄
【０２２６】
表１５に示されるＩＣ・ＥＣ洗浄のための各設定の値を確認する。
【０２２７】
【表１５】
0006612227.tif 000016
【０２２８】
０日目（Ｄａｙ：０）  培地調整
【０２２９】
このタスクの説明書に従って、細胞を投入する前に、培地を、規定のガス供給と平衡になるようにする。このタスクは、２つのステップを有する。
【０２３０】
ステップ１：高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地とガス供給とを迅速に接触させる。
【０２３１】
ステップ２：オペレータが細胞投入をできる状態になるまで、システムを適切な状態に維持する。
【０２３２】
表１６は、培地調整を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２３３】
【表１６】
0006612227.tif 000017
【０２３４】
培地調整経路：タスク＞システム管理＞培地調整
【０２３５】
表１７に示されるステップ１の各設定のための値を入力する。
【０２３６】
【表１７】
0006612227.tif 000018
【０２３７】
表１８に示されるステップ２の各設定のための値を入力する。
【０２３８】
【表１８】
0006612227.tif 000019
【０２３９】
０日目（Ｄａｙ：０）  均一懸濁液による細胞の投入
【０２４０】
目的：バッグが空になるまで、細胞投入バッグから、細胞をバイオリアクター内に投入する。このタスクでは、ＩＣ循環のみを使用して、細胞を分配させ、細胞を、ラインからバイオリアクター内へは追い込まない。このタスクは、３つのステップを有する。
【０２４１】
ステップ１：細胞投入バッグから細胞をバイオリアクター内へ投入する。
【０２４２】
ステップ２：ＡＲＣから、細胞をバイオリアクターへ追い込む。追い込み体積（ｃｈａｓｅ  ｖｏｌｕｍｅｓ）が大きい程、細胞を分散させ、ＩＣ出口へと移動させる。
【０２４３】
ステップ３：ＩＣ入口ひいては限外濾過によらず、ＩＣ循環によって、膜への細胞分配を促進する。
【０２４４】
このタスクを始める前に、以下の条件を満足させる。
【０２４５】
細胞投入バッグ内に少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０２４６】
表１９は、均一懸濁液による細胞投入を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２４７】
【表１９】
0006612227.tif 000020
【０２４８】
均一懸濁液による細胞投入経路：タスク＞投入及び付着＞均一懸濁液による細胞投入
【０２４９】
表２０に示されるステップ１の各設定のための値を確認する。
【０２５０】
【表２０】
0006612227.tif 000021
【０２５１】
表２１に示されるステップ２の各設定のための値を確認する。
【０２５２】
【表２１】
0006612227.tif 000022
【０２５３】
表２２に示されるステップ３の各設定のための値を確認する。
【０２５４】
【表２２】
0006612227.tif 000023
【０２５５】
０日目（Ｄａｙ：０）  中心となる（Ｂｕｌｌ‘ｓ  Ｅｙｅ）細胞付着
【０２５６】
目的：ＥＣ循環ループのフローを行いながら、接着細胞を、バイオリアクターに付着させる。ＩＣループに対するポンプ流量は、ゼロに設定される。
【０２５７】
ステップ１：１８０度の状態で、バイオリアクターの内側表面に、細胞を、７分間付着させる。
【０２５８】
ステップ２：最初の投入方向とは反対の方向に、高レートで、ＩＣ流体及び残留懸濁細胞を循環させる。
【０２５９】
ステップ３：このステップは、細胞をさらに付着させるための、第２の７分間付着期間である。ＩＣループから或いはバイオリアクターの別の領域から移動してきた細胞に、バイオリアクターに沈殿・付着する機会が与えられる。
【０２６０】
ステップ４：ＩＣループに残留している細胞及び表面にまだ付着していない細胞を再度循環させる。循環は正方向に行われ、すでに付着した細胞が離れることを避けるため、また、これまでのステップで播種されなかったバイオリアクターの領域に優先的に播種させるため、循環レートは低くする。
【０２６１】
ステップ５：このステップは、細胞をさらに付着させるための、第３の７分間付着期間である。ＩＣループから或いはバイオリアクターの別の領域から移動してきた細胞に、バイオリアクターに沈殿・付着する機会が与えられる。
【０２６２】
ステップ６：ＩＣループに残留している細胞及び表面にまだ付着していない細胞を再度循環させる。循環は負方向に行われ、すでに付着した細胞が離れることを避けるため、循環レートは低くする。
【０２６３】
ステップ７：２４時間の細胞付着期間。フィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）が始まる前に、細胞を、２４時間かけて、バイオリアクターに堅固に固着させる。
【０２６４】
表２３は、本発明において中心となる細胞付着を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２６５】
【表２３】
0006612227.tif 000024
【０２６６】
中心となる細胞付着経路：タスク＞カスタム＞カスタム
【０２６７】
表２４に示される各設定のための値を入力する。
【０２６８】
【表２４】
0006612227.tif 000025
【０２６９】
表２５に示される各設定のための値を入力する。
【０２７０】
【表２５】
0006612227.tif 000026
【０２７１】
表２６に示される各設定の値を入力する。
【０２７２】
【表２６】
0006612227.tif 000027
【０２７３】
表２７に示される各設定のための値を入力する。
【０２７４】
【表２７】
0006612227.tif 000028
【０２７５】
表２８に示される各設定の値を入力する。
【０２７６】
【表２８】
0006612227.tif 000029
【０２７７】
表２９に示される各設定のための値を入力する。
【０２７８】
【表２９】
0006612227.tif 000030
【０２７９】
表３０に示される各設定の値を入力する。
【０２８０】
【表３０】
0006612227.tif 000031
【０２８１】
１日目（Ｄａｙ：１）  細胞フィード
【０２８２】
目的：ＩＣ循環ループ及び／又はＥＣ循環ループに対して、連続して低い流量を与える。このタスク中にシステムに付加される流体を除去するために使用できる出口用の設定がいくつかある。
【０２８３】
表３１は、細胞フィードを行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２８４】
【表３１】
0006612227.tif 000032
【０２８５】
細胞フィード経路：タスク＞フィード及び付加＞細胞フィード
【０２８６】
表３２に示されるステップ１の各設定のための値を確認する。
【０２８７】
【表３２】
0006612227.tif 000033
【０２８８】
必要であれば、ＩＣ投入レートを増やす。
【０２８９】
接着細胞の剥離及び収穫
【０２９０】
目的：細胞を膜から剥離させ、ＩＣループに放ち、ＩＣ循環ループから懸濁状態の細胞（バイオリアクター内の細胞も含む）を収穫バッグへ移送する。
【０２９１】
ステップ１：試薬付加に備えて、ＩＣ・ＥＣ洗浄タスクを行う。例えば、システムにおいて、ＩＣ・ＥＣ培地をＰＢＳに置換して、トリプシン付加に備えて、タンパク質、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を除去する。
【０２９２】
ステップ２：バッグが空になるまで、システムに試薬を投入。
【０２９３】
ステップ３：試薬をＩＣループに追い込む。
【０２９４】
ステップ４：ＩＣループ内で試薬を混ぜる。
【０２９５】
ステップ５：ＩＣ循環ループから懸濁状態の細胞（バイオリアクター内の細胞も含む）を収穫バッグへ移送する。
【０２９６】
このタスクを始める前に、以下の条件を満足させる。
【０２９７】
細胞投入バッグに少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０２９８】
表３３は、接着細胞の剥離及び収穫を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、このタスク用のデフォルトの設定に基づいている。
【０２９９】
【表３３】
0006612227.tif 000034
【０３００】
接着細胞の剥離経路：タスク＞剥離及び収穫＞接着細胞の剥離及び収穫
【０３０１】
表３４に示されるステップ１のための各設定の値を確認する。
【０３０２】
【表３４】
0006612227.tif 000035
【０３０３】
表３５に示されるステップ２の各設定のための値を確認する。
【０３０４】
【表３５】
0006612227.tif 000036
【０３０５】
表３６に示されるステップ３の各設定のための値を確認する。
【０３０６】
【表３６】
0006612227.tif 000037
【０３０７】
表３７に示されるステップ４の各設定のための値を確認する。
【０３０８】
【表３７】
0006612227.tif 000038
【０３０９】
表３８に示されるステップ５の各設定のための値を確認する。
【０３１０】
【表３８】
0006612227.tif 000039
【０３１１】
結果は以下である。
【０３１２】
【表３９】
0006612227.tif 000040
【０３１３】
本発明の投入技術が、４つの異なるドナーからのＭＳＣを用いて評価される。本発明に係る投入の収穫数に基づく収率は、ＬＣＷＵＳを用いて投入し同条件で培養した場合の収率よりも、一貫して高い。ＬＣＷＵＳ（ｎ＝４）に対する本発明（ｎ＝６）を用いた場合の平均細胞収率増加は、２５％である。
【０３１４】
本発明に係る投入を行った直後にＩＣループから取り出したＭＳＣサンプルの生存率は１００％である。本発明の収穫数に基づくＭＳＣの生存率は、全てのサンプルにおいて、９８％を超えている。本発明を用いた収穫によるＭＳＣは、培養下において典型的な形態を示し、フローサイトメトリーによって測定したＭＳＣバイオマーカーは全て、ＩＳＣＴ標準に適合している。
【０３１５】
実施例３
実施例２で記載された同じプロトコルを用いて、本発明の中心となる付着プロトコルの変更例を研究した。上記形態及び上記プロトコルに対する変形（実施形態２）は、循環レート（１００ｍｌ／分；−５０ｍｌ／分；２５ｍｌ／分）後の付着期間の省略である。すなわち、上記した７分間停止の条件の代わりに、停止条件を省略して、次の循環レートが前回の循環レートの直後に続く。対照実験及び実施例２の本発明実験（実施形態１）も比較として行った。
【０３１６】
結果は以下のとおりである。
【０３１７】
【表４０】
0006612227.tif 000041
【０３１８】
種々の構成要素は、ここにおいて、「動作可能に関連付けられている」と言及される場合がある。ここに使用される「動作可能に関連付けられている」とは、構成要素が動作可能な方式で相互に結合されていることを指し、これは、構成要素が直接結合された実施形態及び２つの結合された構成要素の間に付加的な構成要素が置かれる実施形態をも包含する。
【０３１９】
本発明の１以上の実施形態の上述の記載は、本発明を例示する目的でなされたものであり、本発明を、限定するものではない。上述の詳細な説明において、例えば、本発明の１以上の実施形態の種々の特徴は、本発明の開示の理解容易性のために、グループ化されている。しかしながら、このような開示の手法は、各請求項の範囲に明示される特徴より多くの特徴を本発明の実施形態が必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、本出願の請求項の範囲が記載するように、本発明の態様は、ここで開示した一実施形態の全ての特徴よりは少ない。従って、請求項の範囲は、詳細な説明に含まれるものであり、各請求項の範囲は、本発明の実施形態とは離れて、それ自身で成り立つものである。
【０３２０】
さらに、本発明の記載は、１以上の実施形態及びある変更形態、ある改変形態の記載を含むが、その他の変更形態、改変形態も本発明の範囲にある（例えば、本発明を理解した後の当業者の技能及び知識の範疇なので、当業者であれば理解できよう）。許容される範囲において、すなわち他の、交換可能な、及び／又は同等な、構造、機能、範囲、工程が、開示されているか否かにかかわらず、特許可能な主題を公にすることだけを意図しているのではなく、そのような構造、機能、範囲、工程を有する他の実施形態をも含む権利を取得することを意図する。
【図１Ａ】
0006612227.tif 000042
【図１Ｂ】
0006612227.tif 000043
【図１Ｃ】
0006612227.tif 000044
【図１Ｄ】
0006612227.tif 000045
【図２Ａ】
0006612227.tif 000046
【図２Ｂ】
0006612227.tif 000047
【図３】
0006612227.tif 000048
【図４】
0006612227.tif 000049
【図５】
0006612227.tif 000050
【図６】
0006612227.tif 000051
【図７】
0006612227.tif 000052
【図８】
0006612227.tif 000053
【図９】
0006612227.tif 000054
【図１０】
0006612227.tif 000055
【図１１】
0006612227.tif 000056
【図１２】
0006612227.tif 000057
【図１３Ａ】
0006612227.tif 000058
【図１３Ｂ】
0006612227.tif 000059
【図１３Ｃ】
0006612227.tif 000060
【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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