(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体をコードする遺伝子と、
配列番号１１及び配列番号１３からなるＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列、及びＣａｓ９ｎヌクレアーゼをコードする配列番号３を含むベクターと
を含む抗体産生細胞。
【請求項２】
前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される、
請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ  −ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）由来の昆虫細胞系、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属からなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
ＣＨＯ細胞であり、
前記抗体が、抗Ｈｅｒ２抗体である、
請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体産生細胞を得る方法であって、
配列番号１１及び配列番号１３からなるＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列、及びＣａｓ９ｎヌクレアーゼをコードする配列番号３を含むベクターを、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体をコードする遺伝子を有する細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む、
上記方法。
【請求項６】
前記細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を有する抗体をコードする遺伝子を含み、
前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択され、
Ｃａｓ９ｎヌクレアーゼが細胞のＦｕｔ８遺伝子を破壊し、Ｆｕｔ８遺伝子の配列が、エクソン７における切断により破壊され、そして
細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ  −ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）由来の昆虫細胞系、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属からなる群より選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アフコシル化タンパク質を得る方法であって、請求項５に記載の方法により得られたフコースノックアウト細胞により発現されるタンパク質を得るステップを含む上記方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体であり、
前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フコースノックアウト細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）由来の昆虫細胞系、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオテクノロジー、遺伝子工学、及び免疫学の分野に関する。特に、本開示は、特定の生物学的経路が改変される細胞系の開発に関する。そのような改変は、細胞の酵素、特にタンパク質のグリコシル化に関与する酵素内に存在する。本開示によれば、タンパク質グリカン鎖の特異的改変を実現するタンパク質発現系が開発される。グリカン鎖の特異的改変により、抗体を含め、アフコシル化タンパク質が生成する。本開示は、タンパク質産生細胞系、特に抗体産生細胞系において、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）技術を利用する。得られたモノクロナール抗体は、完全にアフコシル化されており、より高度の抗体依存性細胞傷害を示す。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景及び先行技術
真核生物におけるグリコシル化は、最も一般的な共有結合性の翻訳後タンパク質修飾機構として、数十年にわたり集中的に試験されてきた。ヒトトランスクリプトーム（約２５０〜５００個の糖鎖遺伝子）の約１〜２％が、グリコシル化に関与するタンパク質を翻訳するものと予測されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＹａｒｅｍａ、２００５年）。細胞タンパク質のグリコシル化は、多くの生物学的機能、例えばタンパク質フォールディング、安定性、細胞内及び細胞間の輸送、細胞−細胞相互作用及び細胞マトリックス相互作用等において重要な役割を演じている。
【０００３】
糖タンパク質には４つの異なる群：Ｎ−結合型、Ｏ−結合型、グリコサミノグリカン、及びグリコシルフォスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質が存在する。Ｎ−結合型のグリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖アミド窒素を介して生じ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアミノ酸配列内で行われるが、この場合、Ｘは、プロリン及びアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸であり得る（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ及びＡｅｂｉ、２００４年）。Ｏ−結合型のグリコシル化は、セリン又はトレオニン残基の側鎖内の酸素原子を利用する。
【０００４】
フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）は、脊椎動物、無脊椎動物、植物、及び細菌内に存在する多くの糖タンパク質及び糖脂質中に存在する単糖である。フコシル化は、フコース残基を様々なタンパク質及びオリゴ糖に転移させるプロセスである。フコシル化は、フコシルトランスフェラーゼ、グアノシンジホスファート（ＧＤＰ）−フコース合成酵素、及びＧＤＰ−フコーストランスポーター（複数可）を含むいくつかの分子により制御される。フコシル化糖タンパク質の多数は、細胞表面上の分泌タンパク質又は膜タンパク質である。
【０００５】
過去２０年における抗腫瘍薬開発の最も顕著な変化は、古典的な細胞傷害性薬から、「モノクロナール抗体」又はｍＡｂとして知られている、癌に関わるシグナリング路に影響を及ぼす薬物への移行であった。本明細書に記載する技術を介してモノクロナール抗体治療を改善すれば、そのような改善は、患者にとってより良好な臨床転帰をもたらす道標となる。
【０００６】
ヒトＩｇＧ１抗体は、高度にフコシル化した糖タンパク質である。フコース、ガラクトース、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン、及びシアル酸が様々に付加したコアヘプタサッカライドからなる２つのＮ−結合型二分岐オリゴ糖が、ＩｇＧ１のＡｓｎ−２９７に存在する。抗体のグリコシル化は、「エフェクター機能」−抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られている特有の生物学的機能をもたらす。
【０００７】
ＩｇＧ分子のエフェクター機能は、抗体Ｆｃ領域とＦｃγＲとして知られている白血球受容体との相互作用、又は補体成分との相互作用により定義される。オリゴ糖構造の構成は、ＦｃγＲ結合を介したエフェクター機能にとってきわめて重要である（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年；Ｎｉｗａら、２００４年；Ｎｉｗａ、Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａら、２００４年；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、２００４年）。ヒトＩｇＧ１の結晶構造解析により、オリゴ糖鎖とＣＨ２ドメインとの複雑な相互作用が明らかにされた（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８年；Ｒａｄａｅｖら、２００１年）。
【０００８】
ＡＤＣＣ機構の効率は、抗体のフコシル化レベルに顕著に依存する。フコシル化度が低いほど、ＡＤＣＣの速度は高まる。したがって、フコシル化の喪失は、重大な生物学的結果を引き起こす。喪失は、フコシルトランスフェラーゼ酵素の機能欠如に起因し、その結果、細胞タンパク質の非フコシル化を引き起こす。プライマリーＮ−アセチルグルコサミン由来のフコースが存在しないと、結果として、ＦｃγＲＩＩＩα受容体に対する結合親和力が高まったＩｇＧ１抗体が得られ、その結果ＡＤＣＣの効率が５０〜１００倍高まる。非フコシル化ＩｇＧによるＡＤＣＣの改善は、ＦｃγＲＩＩＩαに対するアフィニティーの上昇と直接比例し、非フコシル化ＩｇＧのＦｃが正常血清中の高濃度のフコシル化ＩｇＧとの競合を克服できるようにする。非フコシル化ＩｇＧのＦｃのＦｃγＲＩＩＩａに対するアフィニティー上昇に関する妥当な根拠として、受容体−リガンド界面における立体阻害の低下又は欠如を挙げることができる（Ｈａｒｒｉｓ、１９９８年；Ｒａｄａｅｖ、２００１年）。
【０００９】
哺乳動物発現系では、フコシル化に必須の基質であるＧＤＰ−フコースが、デノボ経路及びサルベージ経路を介して細胞質内で合成される。フコシル化のデノボ経路では、ＧＤＰ−フコースが、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を介して合成されるが、この合成は、酵素ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）により触媒される。このＧＤＰ−フコースは、次にゴルジ内部に輸送され、そして酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８遺伝子によりコードされる）によりタンパク質をフコシル化するための基質として用いられる。
【００１０】
哺乳動物プラットフォームにおいて開発された治療抗体の非フコシル化形態は、フコースの生合成に障害が生じた場合に生ずるが、標的腫瘍細胞に対するＡＤＣＣの効率強化に起因して、フコシル化した形態よりも臨床的長所を有し得る。
【００１１】
歴史的には、遺伝子ノックアウトシステムは、相同的組換え（ＨＲ）により媒介される標的突然変異である欠損、及び／又は挿入に完全に依存した。ＨＲシステムは非常に特異的であるものの、１つの突然変異したクローンを見つけ出すのに数千ものクローンをスクリーニングする必要があるので非常に非効率的である。更に、対立遺伝子変異を除去するには、一層多くの時間がかかり、より大規模なスクリーニングとなる。
【００１２】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、遺伝子破壊において最も頻繁に用いられる技術の１つである。同酵素は、ジンクフィンガータンデムアレイ毎に、ＤＮＡレベルの３つの塩基を必要とする。更に、ジンクフィンガーアレイ内の個々のフィンガー間で標的部位が重なり合い、そして相互応答するので、配列特異的ＺＦＮの生成は顕著に複雑化する。更に、ＺＦＮの主な欠点として、特異的ＤＮＡ配列認識に関するＺＦＮモチーフを識別するための、労力と時間のかかる実験的選択プロセスが挙げられる。
【００１３】
Ｆｕｔ８ゲノム座位を破壊する方法が、先行技術に認められる。但し、そのいずれの方法も、アフコシル化タンパク質のためにコードする細胞からアフコシル化タンパク質を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ技術により、ＦＵＴ８ゲノム座位上の特定箇所を標的とするものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ＦＵＴ８ゲノム座位上の特異的箇所を標的とすることにより、先行技術の方法と関連した欠点又は限界を克服するが、その結果、遺伝子及び関連機能が完全に破壊され、非フコシル化タンパク質を産生する細胞が得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示の記載事項
したがって、本開示は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体をコードする遺伝子を含む細胞、並びに配列番号１１及び配列番号１３、又はその組合せからなる群より選択されるＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインを含むベクター；フコースノックアウト細胞を得る方法であって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む上記方法；アフコシル化タンパク質を得る方法であって、上記のような方法により得られたフコースノックアウト細胞が発現したタンパク質を得るステップを含む上記方法；アフコシル化タンパク質；任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、上記のようなタンパク質を含む組成物；がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害の管理における使用のための上記のようなアフコシル化タンパク質；並びにがん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害を管理する方法であって、上記のようなアフコシル化タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む上記方法に関する。
【００１６】
本開示の特徴は、添付図面を参照しながら、以下の記載から十分に明らかとなる。図面は、本開示に従っていくつかの実施形態を示すに過ぎないこと、したがってその範囲の制限とはみなされないことを念頭に置きつつ、本開示は、添付図面の使用を介して、更なる特殊性及び詳細について記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】Ｆｕｔ８遺伝子ゲノム構造を示す図である。
【図１Ｂ】Ｆｕｔ８エクソン７ゲノム座位、それぞれのアミノ酸配列、及び重要な構造的モチーフの位置、及びＣＲＩＳＰＲ標的箇所を示す図である。
【図２】ＦＵＴ８遺伝子のＣＨＯ−Ｓゲノム分析を示す図である。各エクソンを矢印で表す。
【図３Ａ】ＦＵＴ８遺伝子のエクソン７を標的とする、ＦＵＴ８  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物のｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）を示す図である。
【図３Ｂ】ＦＵＴ８エクソン７の標的配列を示す図であり、ＣＲＩＳＰＲ認識配列は下線を引く。
【図４】赤色蛍光タンパク質発現プラスミドによるＣＨＯ  Ｓ細胞系のトランスフェクション効率を示す図である。データは、高レベルのトランスフェクション効率を示唆する。パネルＡは、明視野顕微鏡画像を表す。パネルＢは、蛍光画像を表す。パネルＣは、多数の赤色蛍光細胞を示す、オーバーレイ画像を表す。
【図５Ａ】ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣアッセイにおいて観察された蛍光シフトを示す図である。複数の単一のクローン細胞系、及びミニプール細胞系のプロファイルは、フコースノックアウト表現型を示唆する。
【図５Ｂ】ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞のＬＣＡ−ＦＩＴＣアッセイにおいて観察された蛍光シフトを示す図である。単一細胞由来のクローン細胞系、及びミニプール細胞系は、１／４〜１／５への蛍光低下を示し、これら細胞系のフコースノックアウト表現型を示す。
【図６】複数世代にわたるフコースノックアウト表現型の安定性を示す、トランスフェクトしたプールを複数回継代したときのＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合プロファイルを示す図である。
【図７】親ＣＨＯ  Ｓ細胞系と比較して、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現する代表的なフコースノックアウトＣＨＯ−Ｓ細胞系の増殖プロファイルを示す図である。
【図８Ａ】ＦＵＴ８座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞系の対立遺伝子におけるヌクレオチドの長い挿入及び欠損を示す、ＦＵＴ８座位におけるゲノムデータ分析を示す図である。
【図８Ｂ】ＦＵＴ８座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞系の対立遺伝子におけるヌクレオチドの欠損を示す、ＦＵＴ８座位におけるゲノムデータ分析を示す図である。
【図９】フレームシフト突然変異及び終止コドンの導入を示す、ＦＵＴ８座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞系の対立遺伝子に関するアミノ酸配列分析を示す図である。これらの突然変異は、非機能的ＦＵＴ８遺伝子をもたらした。
【図１０】図１０Ａは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系の細胞数プロファイルを示す図である。図１０Ｂは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養物中で、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系の生存率プロファイルを示す図である。
【図１１】図１１Ａは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系の浸透圧プロファイルを示す図である。図１１Ｂは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系の抗体力価プロファイルを示す図である。
【図１２】図１２Ａは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系のグルコースプロファイルを示す図である。図１２Ｂは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系のグルタミンプロファイルを示す図である。
【図１３】図１３Ａは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系のアンモニアプロファイルを示す図である。図１３Ｂは、２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養における、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を産生するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系の乳酸プロファイルを示す図である。
【図１４】フコースノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞クローンの２リットルバイオリアクターフェッドバッチ培養からのアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体精製を示す図である。パネルＡは、プロテインＡ精製によるアフィニティークロマトグラフィーを表す。パネルＢは、陰イオン交換クロマトグラフィーを表す。パネルＣは、陽イオン交換クロマトグラフィーを表す。
【図１５】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のＩＥＦ試験の比較を示す図である。
【図１６】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ試験の比較を示す図である。
【図１７】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のウェスタンブロット分析の比較を示す図である。
【図１８】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のＨｅｒ２結合ＥＬＩＳＡ試験の比較を示す図である。データは、非常に類似したＨＥＲ２抗原結合プロファイルを示唆する。
【図１９】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の細胞に基づくＥＬＩＳＡ試験の比較を示す図である。パネルＡは、ＳＫＢＲ３細胞系による実験を表す。パネルＢは、ＢＴ４７４細胞系による実験を表す。
【図２０】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体による、プロテインＡ液体クロマトグラフィーの比較を示す図である。データは、非常に類似したクロマトグラムを示唆する。
【図２１】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のイオン交換クロマトグラフィーの比較を示す図である。データは、いずれの場合においても、非常に類似した主要ピーク、酸性及び塩基性変異体を示唆する。
【図２２】トラスツズマブ、及びフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓクローンから産生されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のグリカン分析の比較を示す図である。主要なグリカンピークを識別及び比較する。下段パネルにおいて、ピークがアフコシル化グリカン位置まで完全にシフトしていることにより表されるように、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のグリカン分析は、主要なグリカンが完全にアフコシル化されたことを示す。
【図２３】アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物のフローサイトメトリー分析を示す図である。データより、両産物とＨｅｒ２抗原との結合は同等であることが明らかであり、抗体をアフコシル化しても、産物によるＨｅｒ２抗原認識は変化しなかったことを示す。
【図２４】アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を示す図である。パネルＡは、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物のＨｅｒ２リガンドとの結合反応速度を示す。パネルＢは、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物とＣＤ１６ａリガンドとの結合反応速度を示す。
【図２５】ＢＴ４７４細胞系を使用する、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物の抗増殖アッセイを示す図である。データは、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の相対的細胞増殖抑制効力は、トラスツズマブに匹敵することを示唆する。
【図２６】標的細胞系としてＢＴ４７４細胞系、及びエフェクターとして単離されたＰＢＭＣを１：２０の比で使用する、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブ産物の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを示す図である。データは、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のＡＤＣＣ効率において、約９倍の改善を示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体をコードする遺伝子を含む細胞、並びに配列番号１１及び配列番号１３、又はその組合せからなる群より選択されるＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ結合ドメインを含むベクターに関する。
【００１９】
本開示の一実施形態では、ベクターは、ヌクレアーゼを更に含む。
【００２０】
本開示の別の実施形態では、細胞は、抗体産生細胞である；並びに抗体は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される。
【００２１】
本開示のなおも別の一実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００２２】
本開示のまた別の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞であり、また抗体は抗Ｈｅｒ２抗体である。
【００２３】
本開示は、フコースノックアウト細胞を得る方法とも関連し、前記方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む。
【００２４】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体をコードする遺伝子を含む。
【００２５】
本開示の別の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される。
【００２６】
本開示のなおも別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ構築物は、配列番号１１及び配列番号１３、又はその組合せからなる群より選択されるＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００２７】
本開示のまた別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物は、細胞のＦｕｔ８遺伝子を破壊し、またＦｕｔ８遺伝子配列は、エクソン７における切断により破壊される。
【００２８】
本開示のまた別の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００２９】
本開示は、アフコシル化タンパク質を得る方法とも関連し、前記方法は、上記のような方法により得られたフコースノックアウト細胞により発現されるタンパク質を得るステップを含む。
【００３０】
本開示の一実施形態では、タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体である。
【００３１】
本開示の別の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される。
【００３２】
本開示のなおも別の実施形態では、抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体である。
【００３３】
本開示のまた別の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＳ（−／−）、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）由来の昆虫細胞系、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属からなる群より選択される。
【００３４】
本開示は、アフコシル化タンパク質とも関連する。
【００３５】
本開示の一実施形態では、タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関与する抗体である。
【００３６】
本開示の別の実施形態では、タンパク質は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＥｐＨＡ３抗体、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＣＶ中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される抗体である。
【００３７】
本開示のなおも別の実施形態では、抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体である。
【００３８】
本開示のまた別の実施形態では、タンパク質は、上記のような方法より得られる。
【００３９】
本開示は、任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、上記のようなタンパク質を含む組成物とも関連する。
【００４０】
本開示は、がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害の管理における使用のための、上記のようなアフコシル化タンパク質とも関連する。
【００４１】
本開示は、がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害を管理する方法とも関連し、前記方法は、上記のようなアフコシル化タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
【００４２】
本開示の一実施形態では、障害を管理する方法、及び障害を管理する際の使用は、ヒトを含む好適な対象におけるものである。
【００４３】
本開示では、フコシル化活性を有さない細胞は、「フコースノックアウト」又は「ＦＫＯ」細胞とも呼ばれる。
【００４４】
用語「非フコシル化抗体」、「アフコシル化抗体」、「０％フコシル化抗体」、「アフコシル化モノクロナール抗体」、「アフコシル化Ｍａｂ」、及び「１００％非フコシル化抗体」は、同一の範囲と意味を有し、本開示全体を通じて交換可能に用いられる。
【００４５】
本開示は、非フコシル化又はアフコシル化タンパク質を、前記タンパク質をコードする細胞から生成することに関する。
【００４６】
一実施形態では、細胞は、非フコシル化モノクロナール抗体を産生する。
【００４７】
非限定的な実施形態では、非フコシル化抗体は、ＩｇＧ１モノクロナール抗体である。
【００４８】
非限定的な実施形態では、非フコシル化抗体は、抗Ｈｅｒ２モノクロナール抗体である。
【００４９】
用語「イノベーター」、「Ｈｅｒｃｌｏｎ」、「トラスツズマブイノベーター」、「イノベーターＨｅｒｃｌｏｎ」は、同一の意味と範囲を有し、交換可能に用いられる。全ての用語は抗Ｈｅｒ２抗体と関連し、同抗体は、乳がんでの使用を目的として最初に利用可能な商品化抗体である。
【００５０】
本開示は、Ｆｕｔ８遺伝子を破壊し、非フコシル化タンパク質を生成するのに、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用する。
【００５１】
ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもって、クラスター化された、短鎖反復回文配列）システムは、順応性のある天然の免疫機構であり、多くの細菌で、ウイルス又はプラスミド等の外来核酸からその身を守るために用いられている。ＣＲＩＳＰＲは、塩基配列の短い反復を含有する原核生物ＤＮＡのセグメントであり、「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントがそれに続く。このスペーサーＤＮＡは、細菌ウイルス又はプラスミドに過去に曝露して得られた外来のＤＮＡである。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）酵素と呼ばれる一連の酵素は、これらのＣＲＩＳＰＲ配列に関連して見出され、Ｃａｓは、ＤＮＡを正確に剪断できるヌクレアーゼである。
【００５２】
バクテリアは、各スペーサーＤＮＡ内の遺伝物質をＲＮＡ分子にコピーする。Ｃａｓ酵素は、次にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子のうちの１つを取り込む。これらは共に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを形成する。システムが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと一致するウイルスに由来するＤＮＡに遭遇すると、ＲＮＡは、該ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、次にＣａｓ酵素はＤＮＡを２つに切断し、ウイルスの複製を阻止する。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲと連携して働く様々なＣａｓ酵素が存在するが、最も周知され、遺伝子工学で頻繁に利用されるのはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。ＣＲＩＳＰＲとＣａｓ酵素は、共にＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを形成する。
【００５４】
Ｃａｓ９は、特定のＣＲＩＳＰＲ機構、特に１つのＣａｓタンパク質のみを必要とするＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて重要な役割を演じていることが明らかにされている。このシステムでは、エンドヌクレアーゼＣａｓ９が、標的ＤＮＡの切断に関与する。Ｃａｓ９の機能は、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわちタンパク質のアミノ末端に位置するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、及び中間領域内に存在するＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの存在に依存する。
【００５５】
部位特異的なＤＮＡの認識及び切断の場合、ヌクレアーゼＣａｓ９は、２つのＲＮＡ配列、すなわちｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）、及びｃｒＲＮＡに対して部分的に相補的な、別のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒＲＮＡ）と複合体形成しなければならない。ｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のプレｃｒＲＮＡをコードする一次転写物がｃｒＲＮＡに成熟するのに必要とされる。これは、ＲＮａｓｅＩＩＩ及びＣａｓ９の存在下で生ずる。標的ＤＮＡの切断期間中に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＨＮＨ及びＲｕｖＣ様のヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡ鎖を両方切断し、二本鎖切断物（ＤＳＢ）が生成する。認識部位は、関連するｃｒＲＮＡ転写物内の２０個のヌクレオチド標的配列により定義される。ＨＮＨドメインは、相補鎖を切断する一方、ＲｕｖＣドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性は、プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）として知られている短い保存性の配列、（２〜５ｎｔ）が、標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡ相補配列の３’側の直後に続くことも要件とする。ＰＡＭ配列要件は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能にとって必須である。
【００５６】
一般的に、２つのベクターシステム、１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、並びに２）ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ）からなる複合体が、ＣＲＩＳＰＲが関係する遺伝子編集に用いられる。これら２つの構築物が、哺乳動物細胞内で同時発現すると、複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、合体してキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成するが、これは、Ｃａｓ９が遺伝子配列を標的とするようにガイドするという機能と同じ機能を有する。
【００５７】
相同的組換えが関係する遺伝子編集技術は、遺伝子編集で用いられるその種の技術として最初に挙げられる。但し、ＨＲを用いたときの成功事象頻度は非常に稀であり、細胞３×１０４個につき１回である。
【００５８】
今日では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、より高い標的特異性を可能とし、突然変異体成功事象の頻度もより高いので、一般的となってきた。この方法は、ＤＮＡに結合し、部位特異的ＤＳＢを形成するヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡ結合タンパク質を利用する。有効ではあるが、このような方法は、成功させるために多岐にわたるタンパク質工学ツールを必要とし、これにより複雑なゲノム配列を標的とする際の自由度が制限される。ＣＲＩＳＰＲを哺乳動物細胞に適合させることにより、ゲノム編集は一新され、正確性は一層高まり、設計も容易となった。ＺＦＮとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、標的とされる遺伝子毎にタンパク質工学を必要としない。
【００５９】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするのに、いくつかの単純なＤＮＡ構築物を必要とするのみである。
【００６０】
２０ｂｐのｇＲＮＡ配列が、ゲノム全体を通じて複数の部位で１００％の相同性を有するのは稀であるが、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体は、その標的内のいくつかのミスマッチについて寛容である。Ｃａｓ９は、ゲノム内の複数箇所で非特異的に結合することが報告されているが、但しそのような部位のごく一部においてのみＤＮＡ二本鎖切断が形成される。また、実験データより、ＤＮＡ標的部位にある程度のミスマッチが生じても、ＤＮＡ二本鎖切断が可能であることも示唆される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの特異性を高める戦略が追及される。
【００６１】
１つのそのような観察所見として、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への突然変異という点突然変異が挙げられ、二本鎖切断ではなく、一本鎖切断（ニック）を引き起こす。Ｃａｓ９突然変異体は、Ｃａｓ９ｎとして公知である。２つの隣接するＤＮＡ標的部位でＣａｓ９ｎを用いることにより、近接したＤＮＡニックの形成が可能となり、また、標的部位に適切な間隔が置かれる場合には、Ｃａｓ９ｎは二本鎖切断を形成する。
【００６２】
したがって、ＤＳＢ形成の特異性はより高くなるが、該ＤＳＢは、ＮＨＥＪ機構により最終的に修復される。非特異的に結合したＣａｓ９ｎは、ニックのみを形成するが、該ニックは、ＨＲにより媒介される修復を介して一般的に修復され、また稀に突然変異又はオフターゲット効果を引き起こす。本開示では、Ｃａｓ９ｎ及びＣＲＩＳＰＲは、Ｆｕｔ８遺伝子をノックアウトするのに用いられる。
【００６３】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体で使用されるヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。
【００６４】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体で使用されるヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
【００６５】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体で使用されるヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ｎ  ヌクレアーゼである。
【００６６】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ構築物である。
【００６７】
本開示では、細胞内での発現で得られるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供する。
【００６８】
本開示では、用語ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、同一の意味と範囲を有し、交換可能に用いられる。
【００６９】
本開示は、細胞内のフコシル化機構を破壊又は不活性化することにより、非フコシル化タンパク質を得る方法に関する。
【００７０】
一実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【００７１】
好ましい、但し非限定的な実施形態では、抗体は、モノクロナール抗体である。
【００７２】
最も好ましい実施形態では、抗体は、抗Ｈｅｒ２モノクロナール抗体である。
【００７３】
本開示は、細胞内のＦＵＴ８遺伝子の破壊又は不活性化と特に関連する。ＦＵＴ８遺伝子は、酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする。
【００７４】
本開示の一実施形態では、細胞は、タンパク質をすでに発現する細胞である。
【００７５】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体をすでに発現する細胞である。
【００７６】
本開示の一実施形態では、細胞は、タンパク質を発現することが公知の細胞である。
【００７７】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体を発現することが公知の細胞である。
【００７８】
本開示の一実施形態では、細胞は、抗体を発現する細胞であり、また抗体をコードする遺伝子が該細胞に導入される。
【００７９】
一実施形態では、本開示の方法により産生される抗体は、治療抗体である。
【００８０】
一実施形態では、細胞は、真核細胞である。
【００８１】
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００８２】
本開示の実施形態では、細胞系は、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＹＢ２３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ｐｅｒＣ６、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される。
【００８３】
非限定的な実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００８４】
非限定的な実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣Ｓ（ＣＨＯ−Ｓ）細胞である。
【００８５】
本開示の非限定的な実施形態では、細胞は、グルタミンシンテターゼがノックアウトされた（ＧＳ−／−）細胞、好ましくはグルタミンシンテターゼがノックアウトされた（ＧＳ−／−）ＣＨＯ  Ｓ細胞である。
【００８６】
一実施形態では、ＣＨＯ  Ｓ細胞は、抗体産生細胞である。
【００８７】
一実施形態では、ＣＨＯ  Ｓ細胞は、抗Ｈｅｒ２モノクロナール抗体を産生する。
【００８８】
本開示の実施形態で使用されるＧＰＥｘ（登録商標）技術は、周知の技術であり、標的細胞を１００％トランスフェクトする、非常に効率的なレトロウイルスベクターに基づく。ＧＰＥｘ（登録商標）の長所として、
・ベクターのコピー毎に単一の組み込み部位を有すること
・選択マーカーを必要としないこと
が挙げられる。
【００８９】
当業者は、本開示の方法と共にＧＰＥｘ（登録商標）技術を使用する方法を知っている。
【００９０】
一実施形態では、本開示の方法は、フコースＫＯ細胞系を得るために、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現する親ＣＨＯ−Ｓ細胞系を使用すること、及びその後アフコシル化された抗Ｈｅｒ２抗体製品を開発することに関し、方法は、
ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ構築物のトランスフェクションにより、フコースノックアウト細胞系を得るステップと、
ｂ）フローサイトメトリーアッセイを介して、細胞系のフコースノックアウト状態を確認するステップと、
ｃ）最適化培地及びフィード組成物を使用して、発酵装置中で抗Ｈｅｒ２モノクロナール抗体を発現するフコースノックアウト細胞系を増殖させるステップと、
ｄ）フコースノックアウトクローン細胞系から産生された抗Ｈｅｒ２モノクロナール抗体を精製するステップと、
ｅ）精製されたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を分析するステップと
を含む。
【００９１】
本開示の方法は、機能性のためにＡＤＣＣを必要とする標的に対して開発された任意のモノクロナール抗体を開発するのに有用である。これらの標的のいずれかが、ＣＨＯ  Ｓ（又はその他の細胞型）内で産生される場合、本開示の方法で認められるような、類似したフコースノックアウト戦略が採用され得る。
【００９２】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）は細胞媒介型の免疫系であり、免疫細胞（ナチュラルキラー細胞等）が、細胞表面抗原に対する抗体を介して識別された標的細胞を溶解する。当業者は、どの抗体がＡＤＣＣ機構に関与しているか知っている。
【００９３】
本開示の方法を使用して生成され得る特異的抗体の例は、腫瘍学分野に該当し、すなわちＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＬＡＧ３、ＣＤ４０、ＥｐＨＡ３等の標的に対するモノクロナール抗体である。
【００９４】
モノクロナール抗体は、自己免疫障害であるリウマチ性関節炎の治療を目的として生成される場合もある。
【００９５】
また、ＨＩＶ、ＨＣＶ、デング熱、及び感染性生物がＡＤＣＣ機構を介して除去されるその他の疾患の抗原に対する中和抗体も、本開示の方法により産生され得る。
【００９６】
本開示では、障害を「管理すること（ｍａｎａｇｉｎｇ）」、又はその「管理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」、又はそれを「管理する（ｍａｎａｇｅ）」という用語は、治療的及び予防的活性を含む。同用語は、疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害の弊害若しくは副作用の治療及び治癒を含む。また、同用語は、疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害の弊害若しくは副作用の更なる進行予防も含む。同用語は、個人の最適な状態の維持を更に含む。
【００９７】
本開示の一実施形態では、本開示のアフコシル化モノクロナール抗体は、
・ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞死を標的とする任意のモノクロナール抗体を用いた併用療法、
・二重特異性抗体に基づく療法、
・キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）媒体を用いた、異質遺伝子的ＮＫ細胞に基づく療法、
・自己ＮＫ細胞移植、
・サイトカイン刺激性ＮＫ細胞に基づく療法、及び
・キメラ抗原受容体−Ｔ細胞療法による併用療法（ＣＡＲ−Ｔ細胞療法）
で用いられる。
【００９８】
一実施形態では、細胞は、「フコースノックアウト」細胞若しくは「ＦＫＯ」細胞、又は「フコースノックアウト」プラットフォーム若しくは「ＦＫＯ」プラットフォームと呼ばれる。
【００９９】
一実施形態では、細胞は、組換え細胞と呼ばれる。
【０１００】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体が、細胞のフコシル化経路を破壊又は不活性化するのに用いられる。
【０１０１】
フコシル化のデノボ経路では、ＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を介して合成されるが、この合成は、酵素ＧＤＰ−マンノース−４、６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）により触媒される。このＧＤＰ−フコースは、次にゴルジ内部に輸送され、そして酵素α−１，６−フコシルトランスフェラーゼによりタンパク質をフコシル化するための基質として用いられる。該酵素は、フコース部分をＧＤＰ−フコースからＮ−グリカン鎖のＮ−アセチルグルコサミンに転移させる。
【０１０２】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体）が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＦｕｔ８遺伝子を破壊するのに用いられる。
【０１０３】
本開示の一実施形態では、フコシルトランスフェラーゼ酵素のＮ末端触媒領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体による標的とされる。
【０１０４】
特定の実施形態では、Ｆｕｔ８の遺伝子配列のエクソン７が、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ複合体による標的とされる。
【０１０５】
本開示の一実施形態では、フコシルトランスフェラーゼ酵素が、β２鎖のアミノ酸配列、及び３Ｈ２へリックス領域のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸位置で突然変異するが、いずれの配列もエクソン７コーディング配列によりコードされる。
【０１０６】
得られたクローンは、翻訳が未成熟終止する場合があり、したがって下流のアミノ酸、例えばＡｒｇ−３６５、Ａｒｇ−３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、Ｓｅｒ−４６９、及びその組合せ等は存在せず、Ｆｕｔ８遺伝子は機能しない。
【０１０７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物は、一般的に２つのベクターシステムとして設計される。１つの構築物はＣａｓ９エンドヌクレアーゼ発現をコードし、また第２のベクターは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡからなるｇＲＮＡを発現する。ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＰＡＭ配列、及びｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡの機能的複合体が正しく配置すると、それに応じて標的配列を認識する、長さがヌクレオチド２０個の断片として、ｃｒＲＮＡは通常設計される。場合によっては、１つの単一ベクターが、より高い活性及び利便性が得られるように、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の両方を発現する。標的認識特異性は、ｃｒＲＮＡ設計に由来する。
【０１０８】
本開示の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ認識ドメインとも呼ばれる。
【０１０９】
本開示の一実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をコードするポリヌクレオチドも、前記ポリヌクレオチドを含む細胞と同様に提供される。
【０１１０】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドが提供される。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のヌクレアーゼドメインをコードするヌクレオチドが提供される。
【０１１１】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【０１１２】
別の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ｎ（ニッカーゼ）Ｄ１０Ａ突然変異体である。
【０１１３】
本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＦＵＴ８遺伝子内の標的部位を認識する。本開示の一実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。別の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの特異性は、非天然の標的部位に結合するように工学的に作出可能であることも公知である。更に、代表的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅｌＹ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。その認識配列は公知である。
【０１１４】
一実施形態では、上記ヌクレアーゼのうちの１つ又は複数の組合せが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質複合体のＤＮＡ結合ドメインと共に用いられる。
【０１１５】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を細胞に導入するのに、トランスフェクションが用いられる。リポフェクションプロトコールが、代表的な実施形態として提供されるが、当業者にとって公知の任意のトランスフェクション法が、本開示の方法に同じように適用可能である。
【０１１６】
別の実施形態では、本開示は、任意の宿主細胞内で組換えタンパク質を生成する方法を提供し、該宿主細胞は内因性のＦＵＴ８遺伝子を発現しており、これがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術により標的とされ、本明細書に記載するように、内因性のＦＵＴ８遺伝子は破壊される。得られた細胞系は、ＦＵＴ８遺伝子の発現につき無効化されており、また対象とする遺伝子を発現させるために更に用いられる。
【０１１７】
本開示では、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体でトランスフェクトした後に生成した１２０例に満たないクローン細胞系のスクリーニングから、１７例のＦＵＴ８ノックアウトクローン細胞系が生み出される。比較として、当技術分野の報告によれば、約１２０，０００個のクローン細胞系から、たった３例のＦＵＴ８−／−細胞系が選択可能であった。
【０１１８】
特異性、安全、及びプロトコールの単純性は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び方法によりもたらされる、先行技術の方法に勝る長所の一部である。ＣＲＩＳＰＲにより媒介される遺伝子破壊により、カスタマイズされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、複雑性の度合いを問わずユーザー定義の標的配列を認識できるようにする、標的座位の特異性という特有の長所が得られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ゲノム編集効率に関してＺＦＮよりも効率的であり、また毒性は有意に低く、これにより特定の座位に対してより高い突然変異体クローン生成効率を可能にする。本開示では、ＦＵＴ８ゲノム座位は、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡを介して配列特異的改変を行うための標的となる。
【０１１９】
本明細書に記載する方法は、抗Ｈｅｒ２抗体を発現するＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｓ細胞系の生成において、成功率３％を超える効率を実現した。本開示の方法及び特異的ＣＲＩＳＰＲ構築物に続くこのような予期しない成果により、ＦＵＴ８ノックアウト細胞系の開発は大いに改善された。
【０１２０】
また、一実施形態では、本開示は、抗Ｈｅｒ２抗体発現細胞系のＦＵＴ８  ＤＮＡ配列内の非常に特異的な遺伝子位置を標的とする一揃いのＣＲＩＳＰＲ構築物のみを使用した。驚くべきことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的とされたアミノ酸の破壊を引き起こすだけでなく、長い欠損も生成し、そのような欠損によりフレームシフト突然変異及び未成熟終止コドンが導入された。これにより、本開示は、標的座位ではＤＮＡ改変が極めて少ない一方、標的とされたＦＵＴ８ではゲノムレベルで大規模に改変されたＦＵＴ８ノックアウト細胞系を、抗Ｈｅｒ２抗体発現細胞系から実現した。フコースノックアウト表現型についてスクリーニングされたクローン集団の数が少数であったことを考慮すれば、そのように多数のＦＵＴ８ノックアウト細胞系が生成するとは予想されない。この驚くべき成果により、任意のモノクロナール抗体発現細胞系が、フコースノックアウト細胞系の生成に使用可能であり、これによりアフコシル化モノクロナール抗体産物が生成可能である独自の方法が提供される。該方法により、ほんのわずかな細胞系をスクリーニングしさえすれば、複数のＦＵＴ８ノックアウト細胞系が実現し、アフコシル化モノクロナール抗体を過剰発現するための最良のクローン系を確立することが可能となる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、細胞系のＦＵＴ８遺伝子を不活性化すると、タンパク質をより高いレベルで生成する細胞系が得られる。
【０１２２】
特定の実施形態では、ＦＵＴ８遺伝子を不活性化すると、ＦＵＴ８遺伝子が不活性化されていない細胞内で産生されたタンパク質と比較して、タンパク質の１つ又は複数の活性（機能）が高まった細胞系が得られる。
【０１２３】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも優れたエフェクター機能を示す。
【０１２４】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも有効な治療特性を示す。
【０１２５】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも高い抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示す。
【０１２６】
一実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも最大約７〜２０倍高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【０１２７】
非限定的な実施形態では、非フコシル化抗体は、対応するフコシル化抗体よりも約８．９５倍高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【０１２８】
本開示において、開示されるタンパク質に関する方法、調製、及び使用では、別途明示しない限り、分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び関連分野における従来技術が利用される。このような技術、その原理、及び要件は、文献で説明されており、当業者にとって公知である。核酸及びアミノ酸配列の同一性を判断する技術は当業者にとって公知である。
【０１２９】
本開示において、フコシル化機構が破壊された細胞は、抗体を自然に産生する細胞である。
【０１３０】
タンパク質、ポリペプチド、又は核酸の「機能的断片」とは、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸とは同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同一の機能をなおも保持するタンパク質、ポリペプチド、又は核酸である。
【０１３１】
本明細書で用いられる用語「抗体」には、ポリクロナール抗体調製物及びモノクロナール抗体調製物の両方が含まれ、またキメラ抗体分子、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）断片、Ｆｖ分子、一本鎖Ｆｖ分子（ＳｃＦｖ）、二量体及び三量体抗体断片、ミニボディ、ヒト化モノクロナール抗体分子、ヒト抗体、抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、並びにこれらの分子から派生したあらゆる機能的断片も含まれ、この場合、派生分子は、親抗体分子の免疫学的機能性を保持する。
【０１３２】
本開示内の用語「モノクロナール抗体」は、均質な抗体母集団を有する抗体組成物を意味する。抗体は、抗体の種若しくは起源に、又は抗体の作製方式により制限を受けない。この用語には、免疫グロブリン全体の他、断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びその他の断片等、並びに親モノクロナール抗体分子の免疫学的結合特性を示すキメラ及びヒト化均質抗体母集団が含まれる。
【０１３３】
本開示のクローン／細胞は、ＣＲ２ＴＭＣＨＯ１Ａ、ＣＲ２ＴＭＣＨＯ１Ｂ等の用語で呼ばれるが、それは内部の名称であり、また細胞の何らかの具体的特性を表すものではないことに留意されたい。これらの細胞系は、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて開発される。
【０１３４】
一実施形態では、非フコシル化抗体を含む組成物は、任意選択的に、薬学的に許容される担体、又は添加物、又は添加剤と共に提供される。薬学的に許容される担体、又は添加物、又は添加剤は、投与される組成物により、並びに組成物を投与するのに用いられる具体的方法により決定されるが、また当業者にとって公知である。
【０１３５】
本開示に提示する全ての配列は、別途記載しない限り、５’から３’の方向で表記される。
【０１３６】
添加剤は、タンパク質の安定化を実現し、また生物学的製剤のその他の品質を改善する上で重要である。様々な添加剤が、タンパク質の安定化、抗菌剤としての作用、剤形の製造支援、薬物送達の制御又は標的化、及び注射時の疼痛を最低限に抑えることを目的として組成物に添加される。
【０１３７】
添加剤は、その作用機序に基づき、大きく５つのカテゴリーに分けることができる：
１．タンパク質安定剤：この添加剤は、タンパク質の本来の立体構造を安定化する。例として、ポリオール、糖、アミノ酸、アミン、及び塩析用の塩が挙げられる。スクロース及びトレハロースが、最も頻繁に用いられる糖であり、また大型のポリオールが、小型のポリオールよりも良好な安定剤である。
２．ポリマー及びタンパク質：親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、及び不活性タンパク質等が、タンパク質を安定化するのに非限定的に用いられ、またタンパク質の会合を増強する。例として、デキストラン、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＴＡ）、ＰＥＧ−４０００、及びゼラチンが挙げられる。
３．界面活性剤：非イオン性界面活性剤が、タンパク質の安定化、凝集の抑制、またタンパク質のリフォールディング支援を目的として幅広く用いられる。ポリソルベート８０及びポリソルベート２０は、それぞれツイーン８０及びツイーン２０として知られており、ｍＡｂ治療薬で一般的に用いられる。その他の例として、Ｂｒｉｊ３５、トリトンＸ−１０、プルロニックＦ１２７、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
４．アミノ酸：この添加剤は、様々な機構によりタンパク質を安定化させる。例としてヒスチジン、アルギニン、及びグリシンが挙げられる。処方物添加剤として用いられるその他のアミノ酸には、メチオニン、プロリン、リシン、グルタミン酸、及びアルギニン混合物が含まれる。
５．防腐剤：この化合物は、微生物の増殖を防止するために、処方物に含まれる。例として、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、及びフェノールが挙げられる。
【０１３８】
本開示で用いられる生体物質は、インド国外から得られる。
【０１３９】
ＦＵＴ８座位内の特定ゲノム配列を標的とする根拠
ＦＵＴ８は、３つのドメイン、すなわちＮ末端コイルドコイルドメイン、触媒ドメイン、及びＣ末端ＳＨ３ドメインを含む。
【０１４０】
Ｆｕｔ８タンパク質構造は、酵素のアミノ酸配列の機能的ドメインを理解するために、広範に研究されている。ＦＵＴ８酵素の３次元結晶構造から、１５個の鎖及び１６個のへリックスが明らかにされた。少なくとも３つの領域、すなわちＮ末端（６８〜１０７番残基）、Ｃ末端（５７３〜５７５）、及び不規則な３６８〜３７２番残基が存在する。
【０１４１】
ＦＵＴ８酵素の推定触媒ドメインは、２つのドメイン、すなわちオープンシートα／βドメイン、及びヌクレオチド結合領域として幅広く知られているロスマンフォールドから構成される。α／βドメインは、５つのへリックス及び３つのβ鎖から構成され、それぞれα４、３Ｈ１、３Ｈ２、３Ｈ３、β１、β２、及びβ３鎖である。ドメインは、タンパク質配列のＮ末端に位置する。Ｎ末端触媒ドメインがどのように酵素の機能性に関わるか、その様式について明確なエビデンスは存在しない。
【０１４２】
ロスマンフォールドは、３５９〜４９２番残基の下流に位置し、いくつかのαヘリックス及びβ鎖を含有する。一連の残基、Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、ＦＵＴ８酵素の触媒ドメインにおいて重要な役割を演ずる。
【０１４３】
ヒトＦＵＴ８酵素タンパク質の１０個のアミノ酸残基、Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、脊椎動物、昆虫、線虫、及びホヤ類を含む様々な種の間で保存される。
【０１４４】
ＣＨＯ  Ｓ細胞系内のＦＵＴ８遺伝子を標的とする根拠
フコースノックアウトプラットフォームは、非フコシル化モノクロナール抗体の分子を実現するのに有用である。多くの事例では、完全に非フコシル化された抗体を開発することが好ましい結果であり、したがって、フコース生合成経路遺伝子の完全ノックアウトを生み出す戦略が、本開示において策定される。
【０１４５】
Ｆｕｔ８酵素は、ＧＤＰ−フコース生合成ステップの下流で機能し、またゴルジ内での細胞タンパク質のフコシル化における最後の酵素ステップである。デノボ経路及びサルベージ経路の両方に由来するフコシル化前駆体は、最終的なフコース部分の転移においてＦＵＴ８酵素を利用する。したがって、Ｆｕｔ８遺伝子をノックアウトすると、細胞タンパク質のフコシル化におけるデノボ経路及びサルベージ経路の両方が実質的に停止する。このアプローチは、Ｆｕｔ８ノックアウト細胞系内で産生されたモノクロナール抗体を含め、タンパク質の１００％脱フコシル化を引き起こす。
【０１４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的配列が、この領域において標的化される。Ｆｕｔ８エクソン７ゲノム座位、各アミノ酸配列、及び重要な構造的モチーフの位置、及びＣＲＩＳＰＲ標的箇所を図１Ｂに示す。
【０１４７】
この標的化は、無作為選択ではなく、本開示では、トランケートされた又は部分的に機能を有する酵素により引き起こされる部分的フコシル化が回避されることそこを破壊するとが確実となる、遺伝子又は酵素上の極めて特異的な箇所を決定する実験法により見出された。
【０１４８】
一方、ロスマンフォールドは、３５９〜４９２番残基の下流に位置し、いくつかのαヘリックス及びβ鎖を含有する。一連の残基Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９が、ＦＵＴ８酵素の触媒ドメインにおいて重要な役割を演ずる。
【０１４９】
したがって、酵素活性部位と同等の領域を標的とすればＦｕｔ８遺伝子の完全破壊が確実となり、Ｆｕｔ８遺伝子上の正確な箇所を標的とすることが不可能な技術、又はＦｕｔ８遺伝子上の別の箇所を標的とするような技術は、Ｆｕｔ８遺伝子及び酵素活性の部分的破壊を引き起こすおそれがあるが、そのような技術と比較して、それよりも効率的な結果が得られる。フコシル化機構が部分的に機能的である細胞は、非フコシル化タンパク質と比較して、それよりも低い治療機能を示す部分的フコシル化タンパク質を生成する。
【０１５０】
本開示の方法により生み出された細胞は、１００％非フコシル化された抗体を含む、完全に又は１００％非フコシル化されたタンパク質を産生する。
【０１５１】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を介して、ＦＵＴ８コドン配列の触媒部位に存在する重要なアミノ酸位置に突然変異を導入する。ＣＲＩＳＰＲデザインの狙いは、一本鎖切断を組み込むことにより、Ｎ末端触媒ドメイン、特にβ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域を主に標的とすることにある。細胞のＤＮＡ修復システムは、一本鎖切断の修復を行う間にヌクレオチド変化を導入し、非機能的ＦＵＴ８酵素を生ずる。
【０１５２】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、局所的に欠損及び挿入を引き起こすことが周知であり、したがって標的とされるエクソン７においてフレームシフト突然変異が生じ、また終止コドンが挿入される。終止コドンが挿入されると、未成熟の翻訳終止が確実となり、下流のロスマンフォールドが酵素構造から除去され、その結果、非機能的ＦＵＴ８酵素が生み出される。
【０１５３】
本開示の一実施形態では、改変されたＣＨＯ−Ｓ細胞系について、後続するゲノムＤＮＡ分析を行うことにより、欠損、挿入、終止コドン、並びにフレームシフト突然変異が明らかとなる。したがって、本開示は、欠損、挿入、及び／又はフレームシフト突然変異を介して、β２鎖及び３Ｈ２ヘリックス内のアミノ酸位置を標的とすることによりＦｕｔ８遺伝子及びフコシルトランスフェラーゼ酵素が破壊されるものと予想する。
【０１５４】
得られたクローンは、未成熟の翻訳終止を引き起こすと考えられ、したがって重要な下流配列、例えばＡｒｇ−３６５、Ａｒｇ−３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、Ｓｅｒ−４６９、及びその組合せ等において大規模な変化を引き起こす。
【０１５５】
本開示では、ＣＨＯ−Ｓゲノムデータベースから入手したＦＵＴ８アミノ酸配列を分析し、これらの重要なアミノ酸は、ＣＨＯ−Ｓ細胞系に由来するＦＵＴ８遺伝子内でもやはり保存されていることを確認している。配列特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、これらのアミノ酸モチーフの上流にある遺伝子配列を標的として、ゲノム改変が導入されるように設計される。重要なＦＵＴ８酵素触媒ドメインの上流にあるアミノ酸配列を変化させると、酵素機能がどのように破壊されるか分析される。
【０１５６】
これらの重要なアミノ酸が突然変異すると、ＦＵＴ８遺伝子の機能性が完全に破壊されることが記載されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を利用する遺伝子標的化は、フコースノックアウト細胞系プラットフォームを形成するための新規アプローチである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓがトランスフェクトされた細胞について、ＦＵＴ８遺伝子の機能性アッセイ法を介してスクリーニングする。選択されたクローンは、突然変異についてゲノムＦＵＴ８座位を配列決定することにより確認される。突然変異体フコースノックアウトＣＨＯ−Ｓ細胞系は、次に非フコシル化治療用モノクロナール抗体又は抗体の一部分を含め、非フコシル化治療用タンパク質を発現するのに用いられる。
【０１５７】
遺伝子位置内のアミノ酸コドン配列を特異的に標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物が設計され、及びＣａｓ９遺伝子の種類に応じて、発現ベクター、例えばｐＤ１４０１又はｐＤ１３０１にクローン化される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＣＨＯ−Ｓ細胞中に一時的にトランスフェクトされ、該細胞は、単一コロニーを生成させるために９６ウェルプレートに播種される。各クローンは、次にレンズマメアグルチニンアッセイ法（ＬＣＡ）に基づく蛍光を用いて、細胞タンパク質のフコシル化についてスクリーニングされる。ＦＵＴ８遺伝子の破壊についてクローン陽性であれば、ＦＵＴ８遺伝子に関する突然変異体対立遺伝子の酵素アッセイ法及び反応速度論分析によって更に試験される。最終的に、ＦＵＴ８座位におけるゲノム配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介して生じたあらゆる突然変異について分析される。この突然変異は、欠損又は挿入を含み、これによりＦＵＴ８コドン配列のフレームシフト突然変異が導入され、配列は破壊され、酵素は機能を失う。
【０１５８】
本開示の方法から得られるフコースノックアウト抗Ｈｅｒ２抗体発現細胞系は、治療及び任意のその他の使用を目的としてアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を発現させるための細胞系として用いられる。該方法は、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を開発するのに用いられてきた。
【０１５９】
より高い力価で抗Ｈｅｒ２抗体を産生する任意のＣＨＯ細胞系が、開始細胞系として選択される。前記細胞系は、ＦＵＴ８遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体がトランスフェクトされ、またレンズマメアグルチニンアッセイ法に基づく蛍光を介してアフコシル化について選択される。レンズマメアグルチニンアッセイ法に基づく蛍光について陽性のクローン細胞系が開発され、そしてアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の発現で用いられる。
【０１６０】
本開示は、完全にアフコシル化された抗Ｈｅｒ２抗体産物の特徴付け及びその生物学的重要性について記載する。本開示は、イノベータートラスツズマブ分子と比較して、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体では、ＦｃγＲＩＩＩ受容体との相互作用が有意に改善されることについて記載する。対応する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにより、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の有効性改善が明確に立証された。この改善は、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳がん細胞系において、トラスツズマブと比較して、９倍を超える細胞毒性に相当した。このアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、患者の乳がん治療においてより有効であるので、そのような結果は有意な改善である。
【０１６１】
したがって、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体は、下記事項に関連して、乳がん患者のための治療選択肢の改善に対するより有効な分子を代表する。
１．乳がん患者の早期段階における治療選択肢−アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、低レベルの腫瘍抗原、この場合Ｈｅｒ２抗原を発現する腫瘍を有するがん患者で使用可能である。
２．低用量の薬物を用いた治療選択肢−アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、乳がん患者を有効に治療するために、低用量で使用可能である。
３．この薬物による有害な副作用がより少ない治療選択肢−アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物では、乳がん患者を有効に治療するのに必要とされる用量はより少なく、したがって生成する有害な副作用もより少ない。
４．この薬物による免疫原性効果がより小さい治療選択肢−アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、グリカン鎖にフコースを一切有しない点を除き、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、イノベータートラスツズマブ産物と構造的に厳密に類似する。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、より低用量で使用可能であり、したがって産物が引き起こす免疫原性は低い。
５．治療コストが低い治療選択肢−アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物による治療が必要とする用量は、トラスツズマブと比較してはるかに少ない。したがって、この産物は、患者一人当たりの治療コスト削減を実現する。
【０１６２】
本開示は、下記の実施例を参照しながら更に記載されるが、実施例は本質的に説明目的に限定され、いかなる場合でも、本開示の範囲に制限を加えるものと解釈されるべきではない。
【０１６３】
試薬の調製
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ完全増殖培地−５００ｍｌ
１．５０ｍｌ  ＦＢＳ（終濃度１０％）を５００ｍｌフィルターユニットの上部チャンバーに添加する。
２．１０ｍｌの２００ｍＭグルタミン（終濃度４ｍＭ）を添加する。
３．５ｍｌの１００Ｘ  Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液（終濃度１Ｘ）を添加する。
４．容積をａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地で５００ｍｌにする。
５．完全培地を、０．２２μｍフィルターに通し濾過する。
６．上部チャンバーを解体し、リザーバー又は培地ビンを閉める。
７．培地は調製の３０日以内に使用できる。
８．培地は２℃〜８℃に保存し、連続的な感光を避ける。
９．ＬＣＡ選択培地を調製する場合、１０ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌストックＬＣＡ試薬を５００ｍｌの調製したＤＭＥＭ培地と混合し、ＤＭＥＭ培地中終濃度２００μｇ／ｍｌのＬＣＡにする。
【０１６４】
試薬の調製
１．パワーＣＨＯ−２ＣＤ完全増殖培地−５００ｍｌを採取する。
２．１０ｍｌの２００ｍＭグルタミン（終濃度４ｍＭ）を、５００ｍｌフィルターユニットの上部チャンバーに添加する。
３．５ｍｌの１００×Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液（終濃度１×）を添加する。
４．容積をパワーＣＨＯ−２ＣＤ培地で５００ｍｌにする。
５．完全培地を０．２２μｍフィルターを通し濾過する。
６．上部チャンバーを解体し、リザーバー又は培地ビンを閉める。
７．培地は調製の３０日以内に使用できる。
８．培地は２℃〜８℃に保存し、連続的な感光を避ける。
【０１６５】
材料＆道具
１．バイオセイフティーキャビネット
２．Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機
３．ウォーターバス
４．倒立位相差顕微鏡
５．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧＵＡＶＡ  ８ＨＴ  ｅａｓｙＣｙｔｅベンチトップフローサイトメーター
６．Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ＸＲ生死細胞オートアナライザー
７．血球計算盤
８．冷蔵庫
９．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機
１０．マイクロピペット
１１．マイクロチップ
１２．９６ウェル組織培養プレート
１３．１２ウェル組織培養プレート
１４．６ウェル組織培養プレート
１５．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌピペット（１０ｍｌ、２５ｍｌ、及び５０ｍｌ）
１６．１０００ｍｌ濾過ユニット−孔径０．２２μｍ
１７．７０％エタノール
１８．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ
１９．ＤＰＢＳ
２０．ウシ胎仔血清
２１．Ｐｅｎｓｔｒｅｐ
２２．グルタミン
２３．０．０５％トリプシンＥＤＴＡ
２４．０．４％トリパンブルー
２５．マイクロチューブ（１．５ｍｌ及び２ｍｌ）
２６．ファルコンチューブ（１５ｍｌ及び５０ｍｌ）
２７．ウシ血清アルブミン画分Ｖ
２８．フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）
２９．フルオレセインストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）
【表１】
0006587696.tif 000002
【表２】
0006587696.tif 000003
【実施例】
【０１６６】
（例１）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物の設計
本実施例の目的は、ＦＵＴ８対立遺伝子の特異的な不活性化のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を設計することである。
【０１６７】
１．１−ＣＲＩＳＰＲ構築物
ＣＲＩＳＰＲは、化膿性連鎖球菌において見出された微生物の適応免疫系由来のＣａｓ９として公知のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのクラスに基づく。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってゲノム上の特異的部位へと導かれる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、編集する必要がある特異的遺伝子上の３ｂｐのプロトスペーサー活性化モチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧ又はＮＡＧが続く２０ｂｐの標的配列に結合する（Ｊｉｎｅｋ、２０１２年；Ｍａｌｉ、２０１３年）。したがって、この全複合体の結合は二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。
【０１６８】
改変する必要があるゲノム座位における標的ゲノム編集の重要なステップは、これらのＤＳＢの導入である。いったん、ＤＳＢが導入されると、それらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は組換えＤＮＡ修復（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
【０１６９】
ＮＨＥＪは、挿入／欠失突然変異（インデル）の効果的な導入が公知であり、続いて、標的コード配列の翻訳の読み枠又はプロモーター若しくはエンハンサーにおけるトランス作用因子の結合部位の破壊を引き起こす。一方、ＨＤＲ媒介型修復は、標的座位に特定の点突然変異又は配列を挿入し得る。したがって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するベクター及び特異的遺伝子座位を標的とするｇＲＮＡを細胞型にコトランスフェクションすると、標的遺伝子の発現を効果的にノックダウンすることができる。これらの特異的部位における突然変異の予期される頻度は、１％超〜５０％の範囲である（Ｓａｎｄｅｒ  ２０１４年）。
【０１７０】
突然変異体の選択は、薬剤耐性マーカー選択を使用せず、配列決定を使用する単純なスクリーニングによって実施する。遺伝子破壊の特異性を増加するため、本開示は、単一遺伝子座位のための２つのガイドＲＮＡによって誘導され、２つの一本鎖切断又はニックを導入する突然変異体Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）を使用する。これはまた、その他のランダムな部位での非特異的な結合の機会も減らす。Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ及び２つのｇＲＮＡをコードするベクターを使用し、効果的な遺伝子ノックアウトを引き起こす。
【０１７１】
Ｆｕｔ８ゲノム座位は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術によって配列特異的欠失の標的とされ、脱フコシル化哺乳動物発現システムを生成する。
【０１７２】
本開示の図１Ａは、Ｆｕｔ８コード配列及びタンパク質配列を示す。ＦＵＴ８ゲノム配列はデータベース配列、配列ＩＤ  ＮＷ＿００３６１３８６０から分析する。ＦＵＴ８ゲノム配列は５７０１７１〜７３１８０４塩基にわたり、図中、Ｅ１〜Ｅ１１として示す１１個のエクソンを含有する。各エクソンの塩基対位置も示す。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３の一部は上流配列における非翻訳領域を構成し、Ｅ１１の一部も非翻訳領域の一部である。翻訳領域はＣＤＳ１〜ＣＤＳ９として記載される。各ＣＤＳの長さは、ＣＤＳ番号の下に示す。アミノ酸配列をコードするＣＤＳ１〜ＣＤＳ９は、３８個のアミノ酸〜１０５個のアミノ酸と様々である。
【０１７３】
チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）又はチャイニーズハムスターフコシルトランスフェラーゼ８（Ｆｕｔ８）ｍＲＮＡ（３１２６ｂｐ）は、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３５０１３７５．１に由来し、本開示の配列番号１によっても表す。
ＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧｃｔａｇｔａａｔｔｔｔａｇａｇａｃｃｇａｇｇｔｔｃａａｇｃａａｔａａｃａｃｃｔａｔｃｔｃｔｇｃａａｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｃｔｔｔｃｔｔｃａａｔｇｔｃｔｔａｃａｔｃｃｔａａｇｇａａａｇｇａａｇＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＴＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＴＣＣＧａａｔａｃｃａｇａａｇｇｃｃｃｔａｔｔｇａｔｃａｇｇｇｇａｃａｇｃｔａｃａｇｇａａｇａｇｔｃｃｇｔｇｔｔｔｔａｇａａｇａａｃａｇｃｔｔｇｔｔａａｇｇｃｃａａａｇａａｃａｇａｔｔｇａａａａｔｔａｃａａｇａａａｃａａｇｃｔａｇｇａａｔｇＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＡＧｇｔｃｔａｔｃａｔｇａｃａｇａｔｃｔａｔａｃｔａｃｃｔｃａｇｔｃａａａｃａｇａｔｇｇａｇｃａｇｇｔｇａｇｔｇｇｃｇｇｇａａａａａｇａａｇｃｃａａａｇａｔｃｔｇａｃａｇａｇｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｇｇａｇａａｔａａｃａｔａｔｃｔｇｃａｇＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧｇｔｇａａｇｔｇａａｇｇａｃａａａａａｔｇｔｔｃａａｇｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｃｃｃｃａｔｔｇｔａｇａｃａｇｃｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｇｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｔｔａｃｃｃｔｔｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇａａｇａｃｃｔｔｇｃａｇａｔｃｇａｃｔｃｃｔｇａｇａｇｔｃｃａｔｇｇｔｇａｔｃｃｔｇｃａｇｔｇｔｇｇｔｇｇｇｔａｔｃｃｃａｇｔｔｔｇｔｃａａａｔａｃｔｔｇａｔｃｃｇｔｃｃａｃａａｃｃｔｔｇｇｃｔｇｇａａａｇｇｇａａａｔａｇａａｇａａａｃｃａｃｃａａｇａａｇｃｔｔｇｇｃｔｔｃａａａｃａｔｃｃａｇｔｔａｔｔｇｇＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＴＡＣＡＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＧＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡｇｔａｃｔｃｃａａｔｔａｔｇａａｔｔｔａｔｔａｇｔｇａｔａａｃｔｃｔａｔｔｔｃｔｔｇｇｔｃａｇｃｔｇｇａｃｔａｃａｃａａｃｃｇａｔａｃａｃａｇａａａａｔｔｃａｃｔｔｃｇｇｇｇｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｇａｔａｔａｃａｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｇａｃｔｔｃｃｔｔｇｔｇｔｇｔａｃｔｔｔｔｔｃａｔｃｃｃａｇＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＴＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＴＡＣＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＡＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＡＴＧＧＴＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＣＣＴＴＴＡＧＴＣＡＴＧＣＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＡＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧ
選択的エクソンは大文字及び小文字で表す。
【０１７４】
Ｆｕｔ８タンパク質構造は、酵素の機能ドメインを理解するために広く研究されている。ＦＵＴ８酵素の三次元結晶構造は１５個の鎖及び１６個のヘリックスを明らかにした。
【０１７５】
ＦＵＴ８遺伝子のアミノ酸配列を図２に示す。
【０１７６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ結合領域は、部位認識の特異性が高く、同時にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が意図したＤＮＡ一本鎖切断を実行するように設計される。
【０１７７】
一実施形態では、Ｃａｓ９ｎ（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＤ１０Ａ突然変異体）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に使用される。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。２つのＣＲＩＳＰＲ認識部位（５’認識部位と３’認識部位は５塩基対距離で間隔を取り、近接した２つの一本鎖切断を可能にする）。生じる切断によりＤＮＡ切断修復のＮＨＥＪプロセスが可能になり、この領域に突然変異を導入する。
【０１７８】
ＣＲＩＳＰＲ構築物は、ｇＲＮＡ配列の効果的な発現のためのＵ６プロモーターエレメントと縦列にｇＲＮＡ足場を両側に配置する、２つの特有の２０塩基対のＣＲＩＳＰＲ認識配列を有する。特有の設計は、１つの単一のベクターが、ゲノムＤＮＡ上の２つの別々のｇＲＮＡ足場及び２つの特有のＣＲＩＳＰＲ認識配列を発現することを可能にする。
【０１７９】
野生型Ｃａｓ９遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２で示す。
【０１８０】
Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列は、配列番号３で示す。
【０１８１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ設計は、一本鎖切断を組み入れることにより、標的ベータ２鎖及び３Ｈ２ヘリックス領域に特有に配置される。この設計は、近接した２つの一本鎖切断に対応し、それにより、これらの標的化ゲノム位置においてのみ起こるＮＨＥＪ修復メカニズムとして、標的認識のより高い特異性を与える。非特異的一本鎖切断は、生成された場合、正確であり、ほとんど任意の突然変異を生成しない相同組換えによって通常修復される。
【０１８２】
本開示の主な標的は、Ｎ末端触媒ドメイン、ベータ２鎖、及び３Ｈ２ヘリックスに突然変異を生成することである。この位置でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる挿入及び欠失は、ＦＵＴ８酵素を非機能的にする。更に、フレームシフト突然変異も中途翻訳終止コドンを引き起こし、そうなると、この領域の下流にあるロスマンフォールドが発現しない。Ａｒｇ３６５、Ａｒｇ３６６、Ａｓｐ−３６８、Ｌｙｓ−３６９、Ｇｌｕ−３７３、Ｔｙｒ−３８２、Ａｓｐ−４０９、Ａｓｐ−４１０、Ａｓｐ−４５３、及びＳｅｒ−４６９など、ロスマンフォールドのアミノ酸残基は、ＦＵＴ８の機能性に非常に重要である。トランケートされた酵素は非機能的であり、フコースノックアウト細胞系をもたらす。
【０１８３】
本開示の図２は、ＣＨＯ−Ｓ  Ｆｕｔ８アミノ酸配列を示す。ＦＵＴ８遺伝子の全アミノ酸配列を示す。各ＣＤＳからのアミノ酸配列は、大きな矢印で示す。小さな矢印は、ＣＲＩＳＰＲ構築物によってＦｕｔ８遺伝子において標的とされるエクソン７（ＣＤＳ５）に存在する重要なアミノ酸を示す。
【０１８４】
Ｆｕｔ８遺伝子の受入番号ＮＷ＿００３６１３８６０を有するＣＨＯ全細胞ゲノムのショットガン配列決定データは全部で１６１６３４ｂｐに対応する。Ｆｕｔ８遺伝子のコード領域又はｍＲＮＡのＰｕｂｍｅｄ受入番号はＸＭ＿００３５０１７３５．１である。図１Ａに示すように、ｍＲＮＡ配列は、α−１，６フコシルトランスフェラーゼである、ＦＵＴ８遺伝子産物の発現のための全コード配列を包含する。
【０１８５】
Ｓｐｉｄｅｙアライメントツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/spideyweb.cgi）を使用して、ｍＲＮＡ配列をゲノムＤＮＡ配列とアラインすることによってゲノムＤＮＡにおけるエクソンを同定する。表３に示すように、境界を有する全部で１１個のエクソンが同定される。
【表３】
0006587696.tif 000004
【０１８６】
触媒ドメインの非常に重要なアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発研究により、ＦＵＴ８酵素の機能性が確かめられた。
【０１８７】
ゲノムＤＮＡとｍＲＮＡ配列の間に１００％同一性が観察された。１１個のエクソン全て及びエクソン７を標的とするｇＲＮＡの位置を示すＦｕｔ８８遺伝子の構造は、本開示の図１Ａに示す。突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９ｎ）を有する構築物を設計し、標的部位に一本鎖切断（ニック）を生成する。２つの別々のｇＲＮＡが近接した形でエクソン７中において設計され、最終的なＤＮＡ修復のための２つのニックを生成する。
【０１８８】
本開示において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の標的部位は、Ｆｕｔ８遺伝子の最初のいくつかのエクソンに局在する。これは、トランケートされた又は部分的に機能を有する酵素によって引き起こされ得る部分的なフコシル化を回避するために行われる。
【０１８９】
Ｆｕｔ８のエクソン−７（ＣＤＳ−５）ヌクレオチド配列は、本開示の配列番号４によって表す。
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０１９０】
ＣＨＯ細胞のＦｕｔ８のエクソン−７（ＣＤＳ−５）のアミノ酸配列は、本開示の配列番号５によって表される。タンパク質／ペプチド配列における標的アミノ酸位置は下線を引く。
【数１】
0006587696.tif 000005
【０１９１】
１．２−ＣＲＳＰＲを使用して標的とされる、Ｆｕｔ８遺伝子中の対象とする配列
Ｆｕｔ８遺伝子のエクソン７において、以下に示す配列はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体への結合に使用される。
【０１９２】
Ｆｕｔ８遺伝子上のＣＲＩＳＰＲ認識配列１は、配列番号６により表す。
ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧ
【０１９３】
ｇＲＮＡ１は、配列番号−７によって表す。
ＡＡＵＵＧＧＣＧＣＵＡＵＧＣＵＡＣＵＧＧＡＧＧ
【０１９４】
Ｆｕｔ８遺伝子上のＣＲＩＳＰＲ認識配列２は、配列番号−８によって表す。
ＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴ
【０１９５】
ｇＲＮＡ２は、配列番号−９によって表す。
ＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＡＵＣＵＵＧＧＡＡＵ
【０１９６】
本方法の実施形態で使用されるＦｕｔ８遺伝子における標的配列は、本開示の図３Ｂに示す。切断の部位は矢印で示す。２つのｇＲＮＡ間の距離は５塩基である。ｇＲＮＡ認識配列は、図３Ｂにおいて下線を引く。対応する合成断片をｐＤ１４０１ベクターに組み入れ（図３Ａ）、ｐＤ１４０１ｇＲＮＡ５１４〜５５３と名付け、その特徴は本開示に続いて記載する。
【０１９７】
本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＦｕｔ８ゲノム配列、エクソン７の標的化においてＣａｓ９ｎ（ニッカーゼ突然変異体）を使用する。Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの逆鎖において一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成する。上鎖及び下鎖のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列は下線を引く。対応する一本鎖切断部位は黒い矢印で示す。３つのヌクレオチドＰＡＭ配列は太字で示す。
【０１９８】
この設計のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベクター構築物は、ｐＤ１４０１ｇＲＮＡ（５１４〜５５３）と呼ばれる。
【０１９９】
５’及び３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列は小文字のイタリック体で示し、この認識配列に相補的な２つの別々の部位はＦＵＴ８ゲノム配列で認識される。太字で表した配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が結合するｇＲＮＡ足場配列を示す。
【０２００】
配列番号１０−ｇＲＮＡ＋Ｆｕｔ８エクソン７の足場
【数２】
0006587696.tif 000006
【０２０１】
ＤＮＡ２．０又はＤＮＡ結合ドメイン１からの合成ＤＮＡにおける５’ＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号１１
ＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＴＣＧＣ
【０２０２】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）−配列番号１２
ＡＵＵＣＣＡＡＧＡＵＧＡＧＵＧＵＵＣＧＣ
【０２０３】
ＤＮＡ２．０からの合成ＤＮＡ又はＤＮＡ結合領域２における３’ＣＲＩＳＰＲ認識配列−配列番号１３
ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧ
【０２０４】
標的特異的ｃｒＲＮＡ配列（５’から３’方向）−配列番号１４
ＡＡＵＵＧＧＣＧＣＵＡＵＧＣＵＡＣＵＧＧ
【０２０５】
ＤＮＡ２．０からのｇＲＮＡ足場−配列番号１５
【数３】
0006587696.tif 000007
【０２０６】
構築マップを図３Ａに示し、重要な配列領域をマークする。
【０２０７】
１．３−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体合成
２つの成分が細胞又は生物に導入及び／又は発現して、ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集を実行しなければならない：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；及び「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）。
【０２０８】
ｇＲＮＡの５’端における長さヌクレオチド２０個分の認識配列は、標準的なＲＮＡ−ＤＮＡ相補性塩基対合則を使用して、Ｃａｓ９を特異的標的ＤＮＡ部位に導く。これらの標的部位は、限界構造５−ＮＧＧにマッチするＰＡＭ配列のすぐ５’側にあるべきである。
【０２０９】
Ｃａｓ９ｎとして公知の突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｄ１０Ａ）をＦｕｔ８エクソン７座位の標的化に使用し、構築物は二本鎖ＤＮＡ切断の代わりに一本鎖切断を生成する。この設計は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物の特異性を改善することを目的とする。
【０２１０】
一本鎖切断の場合、２つのＤＮＡ標的部位は近接した形で標的とされ、一本鎖切断又はニックは逆ＤＮＡ鎖で生じる。それにより、ＤＮＡ修復機構（ＮＨＥＪ）を導入し、ＤＮＡ損傷を修復する。ＤＮＡ修復を開始する特定の間隔で２つのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｎ複合体を導入することは、標的部位への特異性を改善する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｎ複合体が１つだけ無関係な部位に非特異的に結合する場合、突然変異の頻度が非常に低い相同組換えに基づく修復によって通常修復されるニックを引き起こす。したがって、このアプローチは、Ｆｕｔ８遺伝子を標的とする特異性を上げる。
【０２１１】
ＦＵＴ８遺伝子の特有の領域は、酵素の触媒機能を廃止するように酵素の構造情報に基づき、又は高次構造を破壊することにより標的とされる。
【０２１２】
ベクターの重要な特徴は：
ａ）Ｃａｓ９−化膿性連鎖球菌のＣＲＩＳＰＲシステムの成分として最初に発見され、哺乳動物細胞での利用に適用されてきたヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、高い効率で哺乳動物細胞の内因性ゲノム座位に正確な二本鎖切断を効果的に導入することができる。
ｂ）Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤ１０Ａ突然変異体（Ｃａｓ９ｎ）は一本鎖にニックを入れ、標的ゲノム座位の逆鎖に相補的な一対のオフセットガイドＲＮＡと組み合わせる。これは、野生型Ｃａｓ９に見られる非特異的な活性を減らすのに役立つ。
ｃ）キメラｇＲＮＡ足場−キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）足場は、２０個のヌクレオチドの標的特異的な相補性領域、４２個のヌクレオチドのＣａｓ９結合ＲＮＡ構造、及びゲノム改変のための標的部位へＣａｓ９ヌクレアーゼを導く、化膿性連鎖球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の４０個のヌクレオチドの転写ターミネーターからなる。この場合、２つのｇＲＮＡ足場があり、それぞれ各ｇＲＮＡ用である。
ｄ）カナマイシン−ｒ−それによりミスコードを引き起こすリボソーム転位を阻害する有効な抗細菌剤である。カナマイシン耐性をコードする遺伝子はネオマイシンリン酸転移酵素ＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ／Ｎｅｏ）である。カナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドでトランスフォームした大腸菌は、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地で増殖することができる。
ｅ）Ｐ＿ＣＭＶ−ＣＭＶプロモーターは、構成的な哺乳動物プロモーターであり、様々な細胞システムで強い発現を媒介する。
ｆ）Ｐ＿ｈＵ６．１−ＲＮＡ発現のためのヒトＡタイプ３コアプロモーター。
【０２１３】
１．４−ＣＲＩＳＰＲ構築物を得る全プロセスは以下のステップからなる：
１．ＣＲＩＳＰＲ標的の設計。
２．ベクター骨格を有するベクター構築物、すなわちｇＲＮＡインサートを有するｐＤ１４０１ベクター。
３．ＣＲＩＳＰＲ構築物ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）による、大腸菌コンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ）のトランスフォーメーション、及びカナマイシンを補足したＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）−アガーへのプレーティング。
４．カナマイシンを含むＬＢブロス中へのトランスフォームした細胞（ＣＲＩＳＰＲ構築物を含む）の接種。
５．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞からのプラスミドＤＮＡ  ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ５１４〜５５３）の単離。
６．ＣＨＯ−Ｓ細胞のトランスフェクション；ＬＣＡアッセイによるスクリーニング及び選択。
７．ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用する選択したクローンのゲノムＤＮＡ単離。
８．分光光度法による定量。
９．ＰＣＲ条件の最適化。
１０．ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ試料のクロスチェック。
１１．アガロースゲルでの電気泳動。
１２．Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅及びＴａｑポリメラーゼを使用するテーリング。
１３．ＱＩＡＧＥＮキットを使用するＰＣＲ産物のゲル溶出。
１４．ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターを使用するＴＡクローニング。
１５．ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５アルファ細胞のライゲートした試料ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ）によるトランスフォーメーション。
１６．アンピシリンブロスを含むＬＢへのトランスフォームした細胞（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の接種。
１７．ＱＩＡＧＥＮプラスミドＤＮＡ単離キットを使用するＤＨ５アルファ及びＤＨ１０Ｂ細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の単離。
１８．制限酵素消化によるインサートの存在のクロスチェック。
１９．配列決定プライマー；及び
２０．配列決定によるＩＮＤＥＬの確認。
【０２１４】
（例２）
高力価の抗Ｈｅｒ２抗体を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞系
モノクロナール抗体産物は、任意の技術を使用して、任意のチャイニーズハムスター卵巣細胞系において産生可能である。そのような技術の例として、ＧＰＥｘ（商標）、ＵＣＯＥ（商標）、ＳＵＲＥ（商標）技術、Ｌｉｇｈｔ  Ｐａｔｈ（商標）技術、及びその他の多くの技術が挙げられるが、これらに限定されない。この特定の例では、抗Ｈｅｒ２抗体遺伝子が、ＧＰＥｘ技術を利用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｓ）細胞系内で発現される。ＧＰＥｘ（登録商標）は、標的細胞を１００％トランスフェクトする非常に効率的なレトロウイルスベクターに基づく。ＧＰＥｘ（登録商標）の長所として、
・ベクターのコピー毎に単一の組み込み部位を有すること
・選択マーカーを必要としないこと
が挙げられる。
【０２１５】
抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖及び軽鎖タンパク質配列は、オープンアクセスパブリックソースから得られる。対応する重鎖及び軽鎖遺伝子配列は、独自開発のコドン強化システムを使用してコドン最適化されている。抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子に対するコドン最適化配列は、商業的ベンダーにより合成され、ｐＵＣ５７ベクターにクローン化される。重鎖及び軽鎖配列は、配列番号１６及び１７により表される。
【０２１６】
抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖アミノ酸配列−配列番号１６
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
【０２１７】
抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖アミノ酸配列−配列番号１７
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ．
【０２１８】
ＤＮＡ配列をコードする（ＣＤＳ）遺伝子はいずれも、クローニングを促進するために、隣接するＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉクローニング部位と共に合成される。ｐＵＣ５７の重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドは、２つのＣＤＳに単離するために、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉ制限酵素により消化される。抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ断片は、ＧＰＥｘ（登録商標）プラスミドｐＣＳ−ｎｅｗＭＣＳ−ＷＰＲＥにクローン化され、レトロウイルスベクターに基づく発現のために、同じ２つの酵素により消化される。完全長抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖ＣＤＳをコードする新規プラスミドは、ｐＣＳ−ＨｉｇｈｗａｙＬＣ−ＷＰＲＥと呼ばれ、また両構築物のＣＤＳの妥当性は、ＤＮＡ配列決定により確認される。
【０２１９】
これらの２つのレトロウイルス発現ベクターが、抗Ｈｅｒ２抗体発現プロデューサー細胞系を開発するのに使用される。製造用細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｓ）親細胞系に、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードする抗Ｈｅｒ２抗体配列を含有するレトロウイルスベクターを形質導入するラウンドを複数回実施することにより作成する。全部で６回の形質導入を実施する。プールされた集団を９６ウェル細胞培養プレートに播種して、単一細胞に由来するクローン細胞系を確立する。クローン細胞系を、ＥＬＩＳＡによりタンパク質力価についてスクリーニングする。トップから３０個のクローンを増殖させ、増殖及び生産性についてＴ１７５フラスコ中で三通り試験し、凍結保存する。トップのクローンを、振盪フラスコ中、フェッドバッチ分析により生産性について試験する。
【０２２０】
親ＣＨＯ−Ｓ細胞系のＦＵＴ８遺伝子、特にＦｕｔ８遺伝子のエクソン７を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物を使用して、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を生成するのに、抗Ｈｅｒ２抗体プロデューサー細胞系を使用する。本実施例では、高生産性のクローン細胞系の１つが、アフコシル化抗Ｈｅｒ２を得るのに用いられる。
【０２２１】
（例３）
ＣＲＩＳＰＲ構築物による細胞のトランスフェクション
本実施例は、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系のトランスフェクションの手順を含む。これまでの節に記載されている、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物を、ＣＨＯ  Ｓ細胞系にトランスフェクトする。また、本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｓ細胞系を開発するために、単一細胞の安定な細胞系を選択及び確認する方法、並びにフローサイトメトリーに基づく機能アッセイにより陽性クローンを選択する方法について記載する。
【０２２２】
３．１−ＣＲＩＳＰＲ構築物によるＣＨＯ細胞系のトランスフェクション
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ構築物による抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ−Ｓ細胞系のトランスフェクションの手順を含む。０．５μｇ〜５μｇの範囲のＤＮＡ濃度を、様々なインキュベーション時間、例えば４時間、２４時間、及び４８時間について試験する。リポソーム及び修飾リポソーム媒介型トランスフェクション試薬は、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＰｌｕｓＴＭ試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｘ２、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ２０２０、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ２９３、ＭＩＲＵＳ  ＴｒａｎｓＩＴ  ＣＨＯトランスフェクションキットについて試験する。複数のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比（μｇ：μｌ）も試験する。最適なトランスフェクション効率は、１：５のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比、２４時間のインキュベーション、及びＰｌｕｓＴＭ試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸを使用して達成される。最適化実験は、ＲＦＰ発現プラスミドＤＮＡで実施した。
【０２２３】
図４は、本開示に記載の方法を使用してＣＨＯ−Ｓ細胞系のトランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、緑色蛍光タンパク質発現プラスミド構築物を使用して決定する。トランスフェクション後に観察された赤色蛍光細胞の数を全生存細胞数と比較し、確立されたプロトコールのトランスフェクション効率を決定する。パネルＡは明視野像を表し、パネルＢは赤色チャネル蛍光の同じ顕微鏡視野を表す。図４は、赤色蛍光タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞は、高レベルのトランスフェクション効率を示したことを提示する。本開示の方法は、したがって、浮遊細胞のトランスフェクションに適する。
【０２２４】
トランスフェクション効率は以下の式によって計算する：
トランスフェクション効率＝（ＲＦＰ発現細胞の数／全細胞数）＊１００
【０２２５】
最適化した一過性トランスフェクション効率は、抗Ｈｅｒ２抗体発現ＣＨＯ−Ｓ細胞系において約５０〜７０％である。
【０２２６】
トランスフェクションプロトコール：
ＣＨＯ−Ｓ細胞は、９０％より高い生存率、６ウェル組織培養プレート中２×１０６個の細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間接着させる。Ｐｌｕｓ（商標）試薬と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸを使用して、ｐＤ１４０１（ｇＲＮＡ  ５１４〜５５３）ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ構築物をトランスフェクトする。１０μｇの構築物を１：５のＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比で使用する。細胞を、トランスフェクション後２０〜２４時間インキュベートする。トランスフェクションの前に、ＤＮＡの量及び質を紫外分光光度法によって概算する。Ａ２６０／２８０値ＤＮＡは、質及びタンパク質の夾雑を表す。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の比を使用して、ＤＮＡの純度を評価する。Ａ２６０／２８０＞１．８は通常「純粋」又は質の良いＤＮＡとして許容される。３〜４μｌのＤＮＡ試料をマイクロキュベット上に置き、ＤＮＡ濃度をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｄ３０を使用して、好適な対照に対して概算する。
【表４】
0006587696.tif 000008
【表５】
0006587696.tif 000009
【０２２７】
ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ溶液を希釈し、優しく混合し、２０〜２５℃で５〜１０分間インキュベートする。ＤＮＡ及びトランスフェクション試薬の希釈物（３ｍｌ）を混合し、複合体形成のため、室温で２０〜３０分間インキュベートする。培地をウェルから吸引する。３ｍｌのＤＮＡ及びトランスフェクション試薬複合体をプレートした細胞に滴下添加する。
【０２２８】
細胞は、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートする。細胞は、１４００ｒｐｍで４分間遠心分離し、消費した培地を除去する。ペレットを、完全培地５〜１０ｍｌ／１２５ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコに再懸濁し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートする。細胞数は２〜３日毎に数え、生存率をモニターする。新鮮な培地への交換を、２〜３日毎に実施する。細胞が生存率９５％に到達したら、ＲＣＢ（リサーチセルバンク）を調製する。
【０２２９】
３．２−単一細胞のクローニング
段階希釈及びプレーティング：
細胞は、クローニングする１日前に、０．２５×１０６個の細胞／ｍｌの密度に分裂させる。細胞数をＶｉｃｅｌｌ  ＸＲ自動細胞カウンターにより数え、プレーティング当日に生存率が９０％を超えるように保証する。細胞懸濁液を段階的に希釈して、細胞密度を１細胞／ウェルとする。各ステップにおいて、１：１０の比で希釈を行う。未処理９６ウェル丸底プレート中の、１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ、及び１×Ｃｌｏｎａ  Ｃｅｌｌ  ＣＨＯ  ＡＣＦ（動物成分を含まない）が補充されたパワーＣＨＯ  ２ＣＤ培地内に、細胞を１００μｌ／ウェルでプレーティングする。プレートを倒立位相差顕微鏡下でスキャンして単一細胞を同定する。単一細胞を含有するウェルを目視で確認し、更にモニターするためにマークする。細胞２個及び細胞６個を含有するウェルもマークし、増幅用として保存する。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、相対湿度７５％で、１０〜１５日間インキュベートする。
【０２３０】
３．３−２４ウェルプレート中でのクローン及びミニプールの増幅：
１０〜１５日後、９６ウェルプレートの１ウェルから２４ウェルプレートの１ウェルへと、培養容積１ｍｌ中でクローンを増幅する。増幅で用いられる培地は、１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、及び１×ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むパワーＣＨＯ２  ＣＤである。２４ウェルプレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、７５％相対湿度で２〜３日間インキュベートする。
【０２３１】
３．４−６ウェルプレート中でのクローン及びミニプールの増幅：
次いで、クローン及びミニプールを、２４ウェルプレートの１ウェルから６ウェルプレートの１ウェルへと、培養容積３ｍｌ中で増幅する。６ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、７５％相対湿度で４〜５日間インキュベートする。増幅で用いられる培地は、４ｍＭグルタミン及び１×ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むパワーＣＨＯ２  ＣＤである。このステップ以降、ＦＢＳフリー培地を増幅用として使用する。
【０２３２】
３．５−フローサイトメトリーによるスクリーニング
それぞれのクローンのＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合プロファイルを決定し、２つの細胞６個のミニプール（ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  ６Ａ、ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  ６Ｂ）、及び２つの単一細胞クローン（ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ａ、ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ｂ）を、更なる試験用として選択する。ＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合アッセイの詳細は、以下の節に記載されている。
【０２３３】
３．６−１２５ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコ中でのクローン及びミニプールの増幅
クローン及びミニプールを、平底１２５ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコ中で、培養容積１０ｍｌに更に増幅する。フラスコを５％ＣＯ２インキュベーターシェイカー中、３７℃、１２０ｒｐｍ、７５％相対湿度で４〜５日間インキュベートする。その後、クローンを、１２５ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコ中で、培養容積３０ｍｌまで増幅し、５％ＣＯ２インキュベーターシェイカー中、３７℃、１２０ｒｐｍ、７５％相対湿度で、４〜５日間インキュベートする。パワーＣＨＯ２  ＣＤ培地は、４ｍＭグルタミン及び１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ溶液と共に増幅するのに使用する。最終的に、細胞数、生存率、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合プロファイルを決定する。細胞上清を１４００ｒｐｍで４分間遠心分離して回収し、プロテインＡ精製用及び更なる特徴付け用として使用する。リサーチセルバンクを調製し、確立されたプロトコールに従い凍結保存する。
【０２３４】
（例４）
ＬＣＡ−ＦＩＴＣ（レンズマメアグルチン−フルオレセインイソチオシアネート）結合アッセイ
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）はＬＣＡにコンジュゲートする蛍光色素である。したがって、対照のＣＨＯ  Ｓ細胞の細胞膜上のフコシル化タンパク質の存在は、フルオレセインコンジュゲートＬＣＡによって認識される。これらの細胞は、特定のフローサイトメーターチャネルでより明るい蛍光を発する。観察される蛍光は、蛍光単位として表す。フコース経路が破壊された細胞、ノックアウト系は、フコシル化細胞タンパク質を産生することができず、したがって細胞膜タンパク質はフコシル化されていない。これらの細胞をフルオレセイン−ＬＣＡコンジュゲートで試験すると、バックグラウンドと同等の蛍光をもたらす。したがって、フコースノックアウト細胞は、対照のＣＨＯ  Ｓ細胞系と比較してより低いレベルの蛍光を発する。
【０２３５】
フルオレセインレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）ストック５ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して４分間１４００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中で再懸濁する。ＣＨＯ  Ｓ対照細胞は、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液のみ（未染色対照）及び２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有する０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液（染色対照）中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、最終アッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、試料は３０分間氷上、暗所でインキュベートする。次いで、データ取得のために、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ベンチトップフローサイトメーターにより各試料を分析する。データ分析は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアを使用して行う。
【０２３６】
フルオレセイン−ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）陰性染色も実施する。フルオレセインストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ）ストック１ｍｇ／ｍｌを希釈し、アッセイ緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの終濃度を得る。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｉｎｉｓｐｉｎ遠心分離機を使用して４分間１４００ｒｐｍでスピンする。培地を吸引し、ペレットを、２μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液中で再懸濁する。ＣＨＯ  Ｓ対照細胞は、アッセイ緩衝液のみ（未染色対照）、２μｇ／ｍｌ  ＬＣＡ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液（染色対照）、及び２μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−ＦＩＴＣを含有するアッセイ緩衝液中で再懸濁する。全ての試料を希釈し、０．２５〜１ｍｌのアッセイ緩衝液中０．１〜０．２×１０６個の細胞／ｍｌを得る。次いで、データ取得のために、各試料をＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ベンチトップフローサイトメーターにより分析する。データ分析は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアを使用して行う。蛍光データは下記の表６に示す。
【表６】
0006587696.tif 000010
【０２３７】
単一細胞クローン及びミニプール集団のＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合プロファイル：
図５Ａ及び５Ｂは、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現し、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞に観察された蛍光シフトを示す。蛍光シフトは、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞におけるＦＵＴ８遺伝子ノックアウト表現型の成功を示す。試料ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ａ及びＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ｂは、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトした、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞に由来する代表的な単一細胞クローン細胞系を示す。試料ＣＲ２ＴＭＣＨＯ  ６Ａ及びＣＲ２ＴＭＣＨＯ  ６Ｂは、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトした、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞に由来する細胞集団から得られた代表的なミニプールを示す。
【０２３８】
複数回継代したときのトランスフェクトしたプールのＬＣＡ−ＦＩＴＣ結合プロファイル：
抗Ｈｅｒ２抗体を発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物でトランスフェクトし、フコースノックアウト表現型について分析する。トランスフェクトした細胞系のプールを、フコースノックアウト表現型の安定性を理解するために、複数回継代した場合について分析する。
【０２３９】
データよりトランスフェクトしたプールは、複数世代にわたり、フコースノックアウト表現型を維持することが示唆される（図６）。８２％よりも多くのＣＨＯ  Ｓ細胞が、フコースノックアウト表現型を維持したことが観察される。これは、予期せぬ観察所見である。８２％を超えるフコースノックアウト表現型が維持されるという観察所見は、複数世代にわたり一貫している。
【０２４０】
結果は、本開示で設計及び使用した独自のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、多数の細胞（８２％を超える細胞）をフコースノックアウト細胞にトランスフォームする能力を有することを示している。該方法及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、新規のアフコシル化抗体産物を作成するために、任意の抗体過剰発現細胞系において使用可能であるので、構築物の独自性、及び特有の方法は有用である。これは、アフコシル化モノクロナール抗体を作成するための、より単純で、非常に迅速且つ高度に強固な新規のアプローチである。この驚くべき成果は、この方法及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる、任意の標的抗原に対する新規アフコシル化抗体産物の開発を可能にする。
【０２４１】
比較として、アフコシル化モノクロナール抗体を開発する場合、当該プラットフォームにおいてモノクロナール抗体遺伝子を発現させる前に、特別なフコースノックアウトプラットフォームを作成し、そして完全に特徴付けする必要がある。そのようなフコースノックアウトプラットフォームを開発するプロセスは非常に複雑であり、時間がかかり、成功率は極めて低い。
【０２４２】
このプロセスを単純化すれば、任意のモノクロナール抗体を発現する任意のＣＨＯ  Ｓ細胞系から、アフコシル化モノクロナール抗体を、非常に短期間で開発することが可能となる。したがって、ここに記載する方法、並びに本開示で設計及び開発するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは有効であると考えられる。
【０２４３】
（例５）
ＦＵＴ８ノックアウトクローンの増殖曲線決定：
０．５Ｘ１０６個の細胞／ｍｌを１２５ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコ内に播種する。生存細胞の計測は、１、２、３、及び４日目に、Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ＸＲ生死細胞オートアナライザーを使用して実施する。それぞれの増殖曲線を作成し、図７に示す。データより、親ＣＨＯ  Ｓ細胞系、及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するフコースノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞系の増殖曲線は同等であることが示唆された。親ＣＨＯ  Ｓ細胞系についてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介されるトランスフォーメーションを行っても、増殖曲線及び生存率プロファイルに影響を及ぼさない。このデータから、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの設計は、細胞増殖、及びここに記載するトランスフェクトした細胞系内でのモノクロナール抗体産生に影響を及ぼすその他の細胞生物学パラメーターに対して有害効果を有さないことが示唆される。
【０２４４】
（例６）
ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムをトランスフェクトした、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系のゲノム配列決定分析
機能アッセイ、主にＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって選択した、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞系をゲノム配列分析で使用する。チャイニーズハムスターのＦＵＴ８ゲノム座位は文献（ＮＷ＿００３６１３８６０）に十分に報告されており、各細胞系クローンにおいて遺伝子改変の型を理解するために野生型配列として使用される。本実施例の目的は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトし、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系から得られるゲノムＤＮＡ配列決定結果を分析することである。本明細書で報告する全ての細胞系は、クローン細胞系であり、ＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイから選択される。
【０２４５】
簡潔に言えば、選択したクローン細胞系は、ゲノムＤＮＡ単離に適した増殖条件下で増殖し、精製したゲノムＤＮＡは、ＦＵＴ８標的座位の両側のプライマーを使用するＰＣＲ増幅に使用し、次いでＰＣＲ増幅産物を精製し、大腸菌コンピテントセルを使用して好適なベクターにクローン化し、生じるアンピシリン耐性大腸菌コロニーを選択及び培養し、各細菌クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、およそ５〜１０個の個々の細菌コロニーを自動配列決定によってクローン細胞系ごとに試験し、ＦＵＴ８標的ゲノム座位において改変の型を理解する。
【０２４６】
以下の試薬及び溶液を使用し、選択したクローンのゲノム配列決定を実行する。
【０２４７】
全ゲノム配列決定プロトコールは以下の４つのプロセスに分けられる。
Ａ．選択したクローンからのゲノムＤＮＡ単離
Ｂ．各細胞系の特定のゲノム座位を増幅するＰＣＲ戦略
Ｃ．配列決定ベクターへのＰＣＲ産物のクローニング
Ｄ．配列データ分析及びＩＮＤＥＬの同定
【０２４８】
選択したクローンからのゲノムＤＮＡ単離
クローンＣＨＯ  Ｓ細胞系は、振盪フラスコで４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むパワーＣＨＯ２  ＣＤ培地中、制御した条件のインキュベーター内で、５％ＣＯ２及び７５％相対湿度の存在下、１２０ｒｐｍ、３７℃で増殖する。細胞の増殖は、毎日観察し、生存率をモニターする。生存率が９０％を上回ったときに細胞を回収する。単離の日、細胞集団を遠心分離することにより培養培地を除去する。次いで細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳと混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。使用した培地を除去し、細胞ペレットを１０ｍｌ  ＤＰＢＳ中に再懸濁する。細胞は、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離を使用して再び洗浄する。ＤＰＢＳを吸引により完全に除去する。最後の細胞ペレットをゲノムＤＮＡ単離に使用する。
【０２４９】
ゲノムＤＮＡは、ＣＨＯ  Ｓ親細胞、及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトし、ＬＣＡフローサイトメトリーアッセイよって選択したＣＨＯ  Ｓ細胞系から、単離する。製造業者のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを単離するために市販のＱＩＡＧＥＮ  ｇＤＮＡ抽出キットを使用する。
【０２５０】
ＰＣＲ戦略設計
チャイニーズハムスターのゲノムＤＮＡ配列を、一般に利用可能なデータベース配列ＮＷ＿００３６１３８６０から分析する。ＦＵＴ８エクソン７ＤＮＡ配列及び部分的なイントロン配列を、ＦＵＴ８標的座位を増幅するＰＣＲ戦略を設計するために使用する。
【０２５１】
プライマーは、プライマー長、ＰＣＲ産物長、ＧＣ含量、融解温度、並びに候補ホモ二重鎖及びヘテロ二重鎖形成に基づいて設計する。以下に示すように、プライマーは、ＦＵＴ８標的座位の両側に設計する。増幅したＰＣＲ産物は、ＣＲＩＳＰＲ媒介型ＳＳＢ及び続くＤＮＡ修復による突然変異分析を意図する。以下のヌクレオチド配列は太字のプライマー配列による対象の領域を表す。
【０２５２】
ＰＣＲプライマー設計に使用するＦｕｔ８エクソン７及び関連イントロン配列：配列番号２０
【数４】
0006587696.tif 000011
【０２５３】
イントロンは、塩基２１〜塩基１０６及び塩基３４５〜塩基３７１に小文字で表す。エクソン７は塩基１０７〜塩基３４４に大文字で表す。左及び右のプライマー結合部位は下線を引く。
【０２５４】
ＰＣＲによってＩＮＤＥＬを同定するためのプライマー設計
ゲノムＰＣＲは、表７に記載の以下のプライマーを使用するＱＩＡＧＥＮ  ｇＤＮＡ抽出キットを使用して実施する。
【表７】
0006587696.tif 000012
【０２５５】
以下の節は、対照細胞系及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を発現するＣＨＯ  Ｓクローン細胞系由来のＣＨＯ  ＳゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物の生成、大腸菌コンピテントセルへのＰＣＲ産物のクローニング、並びにクローン化ＰＣＲ産物の配列決定に関する実験の詳細を提供する。
【０２５６】
ＰＣＲ条件の最適化−
実験を設計し、ＰＣＲ条件を標準化する。試験したパラメーターは、ゲノムＤＮＡ濃度（１００ｎｇ〜１０００ｎｇ）、プライマー濃度（２ｎｍｏｌｅ〜２０ｎｍｏｌｅ）、ＰＣＲアニーリング温度（５５．８℃〜６２．９℃）、及び時間（２０秒〜５０秒）、ＰＣＲ産物の伸長時間（３０秒〜６０秒）を含み、ＰＣＲサイクル数を３０サイクルに設定する。到達した最適化条件は以下の節に記載する。
【０２５７】
ＰＣＲ反応は、プルーフリーディングポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用して実行し、ＰＣＲ媒介型突然変異の制限を確実にする。ＰＣＲ増幅サイクルに続き、Ｔａｑポリメラーゼ酵素をテーリングの混合物に添加する。テーリングステップは重要である。ＰＣＲ産物に追加された余分な塩基が、次の節に記載する配列決定ベクターへの直接クローニングを可能にするからである。ＴＡクローニングベクターへのクローニングのために、ＰＣＲ産物にｄＡＴＰオーバーハングを付加するため、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ増幅産物を、７２℃で２０分間Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする。
【０２５８】
ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ試料のクロスチェック−
ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、産物長は分子量標準を使用して確認する。はっきりとした増幅プロファイルを有するＰＣＲ試料を、次の処理ステップに使用する。
【０２５９】
ＱＩＡＧＥＮキットを使用するＰＣＲ産物のゲル溶出−
増幅したＰＣＲ産物を、新しく調製した１％アガロースゲルにロードし、１００Ｖで１時間電気泳動して、増幅したＰＣＲ産物を、未使用のプライマー及び増幅プロセス中に生成された任意のその他の二量体から分離する。増幅した産物をゲルから切り取り、市販のＱｉａｇｅｎゲル溶出キットを使用して溶出する。ＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
【０２６０】
配列決定ベクターへのＰＣＲ産物のクローニング−
アガロースゲルで精製したＰＣＲ増幅産物は、次いでＤＮＡライゲーションプロセスによって市販のｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターにクローニングするために使用する。ＤＮＡライゲーションの条件は、以前に標準化されている。
【０２６１】
ＤＨ５アルファ大腸菌コンピテントセルの、ライゲートした試料ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ）によるトランスフォーメーション−
ライゲートしたＤＮＡにより、市販の大腸菌ＤＨ５アルファ  コンピテントセルをトランスフォームする。製造業者によって記載されるトランスフォーメーションプロトコールに従って、高レベルのトランスフォーメーション効率を達成する。トランスフォーメーション後、大腸菌細胞は、トランスフォームしたコロニーの増殖のため、アンピシリン抗生物質の存在下で増殖する。
【０２６２】
トランスフォームした細胞（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））のアンピシリンを含むＬＢ培地への接種−
各別々のコロニーを、５ｍｌ培養容積のＬＢ＋アンピシリンブロス中に接種し、プラスミドＤＮＡ単離のため一晩増殖する。
【０２６３】
ＤＨ５アルファのトランスフォームした細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の単離−
４．５ｍｌの一晩増殖した培養物を、製造業者のプロトコールに従って、市販のＱＩＡＧＥＮプラスミドＤＮＡ単離キットを使用するプラスミドＤＮＡ単離のために使用する。プラスミドＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
【０２６４】
インサートの存在に関してプラスミドのクロスチェック−
各プラスミド調製物は、好適な制限酵素消化後、続いてアガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在を試験する。インサートのサイズは、好適な分子量標準と比較する。
【０２６５】
ＰＣＲ反応
まず、二本鎖ＤＮＡ鋳型を９４℃の高温で変性する。次いで、表７に記載の配列特異的プライマーを標的配列の両側の部位にアニールする（６０．４℃）。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）によりアニールしたプライマーを伸長し（７２℃）、それにより最初のＤＮＡ配列の量を倍にする。次いでこの新しく合成された産物は、増幅の続くサイクルの更なる鋳型になる。これらの３ステップを３０サイクル反復し、標的ＤＮＡ濃度の１０９倍の増加をもたらす。ＴＡクローニングベクターへのクローニングのために、ＰＣＲ産物にｄＡＴＰオーバーハングを付加するため、ＰＣＲ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ増幅産物を７２℃で２０分間Ｔａｑポリメラーゼとインキュベートする。
【表８】
0006587696.tif 000013
【表９】
0006587696.tif 000014
【０２６６】
ＰＣＲ産物は更に、テーリングのためのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって修飾する。最終ＰＣＲ産物は、次いで、増幅断片の溶出のためにアガロースゲルで電気泳動する。増幅断片を、次いでＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キットを使用してゲル溶出する。
【０２６７】
ライゲーション
ＰＣＲ増幅及びゲル溶出産物は市販のｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターにライゲートする。ライゲーションプロトコールを以下に記載する。
【表１０】
0006587696.tif 000015
【０２６８】
上記のライゲーション混合物を４℃で一晩インキュベートし、ライゲートした混合物の５０％はヒートショック法によってＤＨ５アルファ大腸菌コンピテントセルをトランスフォームする。
【０２６９】
ヒートショック法によって、ライゲートした試料による細菌細胞のトランスフォーメーション
細菌細胞をトランスフォームする目的は、プラスミドＤＮＡをクローン化し増やすことである。コンピテント大腸菌セル（ＤＨ５アルファ）の２０μＬ分取物を−８０℃の冷凍庫から取り出し、５分間氷上で溶かす。ライゲートした試料（ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ＋ＣＲＩＳＰＲ（ＰＣＲ））の５０％をコンピテントセルに添加し、優しく混合し、２０分間氷上でインキュベートする。混合物を含有するチューブを５０秒間４２℃でウォーターバス／ドライバスに置く。チューブを２分間氷上に戻す。０．９５０ｍｌの３７℃に温めたＬＢブロス（アンピシリン抗生物質なし）を、シェイカー中２２０ｒｐｍで１時間、３７℃でインキュベートする。生じた培養物の１００μＬを温めたＬＢ＋アンピシリン培養プレート上に広げる。プレートは３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートする。
【０２７０】
ＱＩＡＰｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐを使用する細菌細胞からのプラスミドＤＮＡ単離
本手順の目的は、以下の実験に使用する特異的ＤＮＡプラスミドを含有する細菌を増殖／培養することである。５ｍｌのＬＢ＋アンピシリンブロスを、オートクレーブ処理したチューブに添加し、単離した細菌コロニーを培養プレートからＬＢブロス＋アンピシリン培養チューブに接種する。チューブは、２２０ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートする（細菌の増殖に応じて、およそ１６〜１８時間）。４．５ｍｌの一晩培養した培養物を１３ｒｐｍで１分間遠心分離する。プラスミドＤＮＡは、市販のＱＩＡＧＥＮプラスミド単離キットを使用して単離する。プラスミドＤＮＡは、高純度の分子生物学等級の水で溶出し、更なる使用まで、−２０℃の冷凍庫に保管する。
【０２７１】
ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ酵素による制限消化を使用する陽性クローンの選択
したがって、単離したプラスミドＤＮＡはインサート、この場合はＰＣＲ増幅断片の存在を試験する。ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターは、クローン化ＰＣＲ産物の両側に複数の制限酵素部位を含有する。制限部位ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを以下の表に記載するように制限消化のために選択する。反応は、プラスミドＤＮＡの完全な消化のために３７℃で２時間実行する。制限消化に続いて、混合物を１％アガロースゲルで１時間電気泳動する。ＰＣＲ産物インサートは、存在する場合、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格から分離され、確認された細菌クローンをＤＮＡ配列決定のために使用する。
【表１１】
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【０２７２】
本開示は、ｐＴＺ５７Ｒ／ＴベクターにおけるＰＣＲ増幅産物の代表的な制限酵素消化を示し、異なるＣＨＯ  Ｓ細胞系由来のインサートの存在を確認する。別々の細菌クローンからのプラスミドＤＮＡ調製物は、ベクターにクローン化したＰＣＲ断片の両側のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって消化し、混合物は１％アガロースゲルで電気泳動する。生じたＤＮＡ断片のサイズはＤＮＡ分子量標準から推定する。異なるＣＨＯ  Ｓ細胞系内でＦＵＴ８座位の状態を把握するための自動化配列決定のために、細菌クローンを使用する。
【０２７３】
（例７）
配列データ分析及びＩＮＤＥＬの同定
配列決定−確認したプラスミドは、次いでｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター骨格に存在する特異的な配列決定プライマーによって配列決定する。配列データは、適切なプロトコールに従って自動ＤＮＡ配列決定機器で生成する。配列決定は、フォワード及びリバース配列決定プライマー両方で実行し、正確な配列情報を確かめる。
【０２７４】
ＤＮＡ配列分析−全てのプラスミドからのＤＮＡ配列決定データを分析する。ＣＨＯ  Ｓ親細胞系及び様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介型ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ  Ｓクローン細胞系由来のプラスミドＤＮＡからのＤＮＡ配列を比較し、ＤＮＡ配列の違いを同定する。各ＣＨＯ  Ｓ細胞系クローンから、ＰＣＲ産物を生成し、大腸菌へクローニングする。複数の大腸菌クローンは配列決定し、標的ゲノム座位において、ヌクレオチド配列の改変を確認する。
【０２７５】
ＣＨＯ  Ｓ親細胞系−ＦＵＴ８遺伝子のエクソン−７の配列（配列番号２０）は大文字である。イントロン配列は小文字であり、下線を引く。
ａａｇａａａｔａａｇｃｔｇａａｔｃａｇｃｔｃｔｇａｃｔｔａｔｔｇｔｇｔｇａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｇｔｇａｃｃａａａａｔｇａｇａａｇｔｔａａｃｔｃｃｔｔａｔａｔｃｔｔｔａｔｃｔｔａｔｔｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｇａａｇＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧｇｔａａｇｇａｇｃａｔｇｔｇｃａｃｃａｔｇａａａｇａｔｃｔｃｔｇｇｔｔａｇｇｔｃａｇａｔｔａｇｃａｃ
【０２７６】
ＣＨＯ  Ｓ  ＦＵＴ８ノックアウトクローン細胞系の配列を以下に示す。エクソン７の配列は細胞系において突然変異されることが観察される。
【０２７７】
クローンＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ａ対立遺伝子バージョン：配列番号２１
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０２７８】
クローンＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ａ対立遺伝子バージョン：配列番号２２
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０２７９】
クローンＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ｂ対立遺伝子バージョン：配列番号２３
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧ
【０２８０】
クローンＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ｂ対立遺伝子バージョン：配列番号２４
ＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＡＡＴＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＴＧＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣ
【０２８１】
フォワード及びリバース配列決定プライマー両方によって配列決定した５〜１５個の別々の細菌クローンの分析から配列データを収集する。配列決定データは、ＣＨＯ  Ｓ親細胞系と比較した複数のクローンにおける様々な長さの欠失を示唆する。塩基の欠失が、クローンＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ａ及びＣＲ２ＴＭＣＨＯ  １Ｂ対立遺伝子バージョンにおいて観察される。全ての欠失はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的部位に位置する。
【０２８２】
データは、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトした、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系内のＦＵＴ８ゲノム座位に存在する様々なＩＮＤＥＬを示唆する。多くの場合、標的塩基に改変があることが観察される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によるゲノム改変のそのような多様性は、近接した内因性ＤＮＡ一本鎖切断及び非相同末端結合による修復によって可能である。これらの細胞系の全ては、機能スクリーニングアッセイ、主にＬＣＡ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって選択する。結果は、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系を単離及び同定する高効率の機能アッセイも意味する。
【０２８３】
Ｃａｓ９ｎエンドヌクレアーゼを含むこの一対のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、ＣＨＯ  Ｓ細胞系内の標的ＦＵＴ８座位において非常に配列特異的な遺伝子変化をもたらすので、本開示に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の設計は非常に効率的であることも明らかである。
【０２８４】
配列データの合成分析を使用して、ＦＵＴ８ゲノム標的座位が欠失及び／又は挿入によって改変されている（ＩＮＤＥＬ）候補ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ  Ｓ細胞系を同定する。次いで、顕著な差異を明確にするために、ＤＮＡ配列をアラインする。図８Ａ及び８Ｂは、ＣＨＯ  Ｓ対照細胞系、及びＦＵＴ８ノックアウトされたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体発現ＣＨＯ  Ｓ細胞系のヌクレオチド配列のアライメントを示す。ＤＮＡ配列情報を使用し、ＦＵＴ８遺伝子（エクソン７）のアミノ酸配列を割り当てる。次いで、アミノ酸配列をアラインし、特定の位置での欠失、フレームシフト突然変異、終止コドンの挿入、並びにアミノ酸置換を同定する。図８Ａ及び８Ｂは、ＣＨＯ  Ｓ親細胞系と比較した場合、ＣＨＯ  Ｓ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系において観察されるヌクレオチド改変の程度を示す。データは、ＣＨＯ  Ｓ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞系中のＦＵＴ８ゲノムＤＮＡ構造を表したものを提示する。
【０２８５】
ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをトランスフェクトした、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系のアミノ酸配列分析
ＣＨＯ  Ｓ親細胞系、及び抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現し、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞系のＦＵＴ８座位におけるゲノムＤＮＡ配列を更に分析し、ＦＵＴ８タンパク質の状態に対してＤＮＡ配列ＩＮＤＥＬの影響を理解する。標的ＦＵＴ８座位のＤＮＡ配列は、脊椎動物のコドンバイアスを使用してアミノ酸配列へと翻訳される。エクソン７領域のアミノ酸配列を厳密に研究し、結果は以下の表１２に要約する。ＣＨＯ  Ｓ親細胞系と比較すると、ＦＵＴ８ノックアウト細胞系では、フレームシフト突然変異及び終止コドンの導入を含む改変が判明した。
【０２８６】
多くの例では、ＦＵＴ８タンパク質のＣ末端領域を変更し、それを非機能的な酵素にするフレームシフト突然変異が観察される。更に、終止コドンは、フレームシフト突然変異の影響で導入され、それによりＦＵＴ８タンパク質がトランケートされ、これらのクローンにおいて非機能的である。
【表１２】
0006587696.tif 000017
【０２８７】
更に、ＦＵＴ８タンパク質配列における標的アミノ酸の選択が非常に有効であることが観察される。１対のみのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体による野生型ＦＵＴ８タンパク質の位置に保存されたアミノ酸の標的化は、複数のノックアウト細胞系において標的座位に突然変異を生成する（図９）。
【０２８８】
アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現し、そして上記ゲノム配列決定プロトコールを介して確認された全てのフコースノックアウトクローンＣＨＯ  Ｓ細胞系を、リサーチセルバンク及びワーキングセルバンクとして、液体窒素保存法で保存する。リサーチセルバンク及びワーキングセルバンクの複数のバイアルを、将来使用するために液体窒素保存法で保存する。
【０２８９】
（例８）
アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を発現する単一細胞クローン細胞系からの上流プロセスの開発：
アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するフコースノックアウトクローンＣＨＯ  Ｓ細胞系を含有するワーキングセルバンクのバイアルを、２リットルバイオリアクター培養プロトコールを開始するのに使用する。細胞を解凍し、シードトレイン培養を、１５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコ内で開始する。２Ｌバイオリアクターの接種用として１１日間にわたり、２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコまで培養物を更に増やす。接種ステップ毎に、１ミリリットル当たり約０．３〜約０．５×１０６個の生存細胞の開始細胞密度を使用する。
【０２９０】
製造用バイオリアクターは、フェッドバッチモードで稼働させる。バイオリアクターは、作業容積が約１．３Ｌ〜約２Ｌの撹拌タンク型の反応装置である。使用する培地は、市販の化学的に定義された培地である。通気は、スパージングにより実施する。プロセスパラメーター、例えばｐＨ、温度、溶存酸素、及び撹拌速度等は、自動的に制御される。いくつかの培地成分は、別の無菌溶液としてバイオリアクターに供給する。この溶液は、グルコース、アミノ酸、ビタミン、及び微量元素を含む。多くの工程内制御パラメーター、例えば細胞密度、生存率、ｐＨ、溶存酸素、及び代謝物レベル、例えばグルコース、グルタミン、乳酸、アンモニア、グルタミン酸塩、ＩｇＧ、及びＬＤＨ等を継続的にモニターしながら発酵を数日行った後、１０日目に生存率が約８０％のバッチを回収する。未変化の細胞及び細胞デブリを、遠心分離により培養ブロスから除去する。工程内パラメーターのプロファイルを以下に示す。
【０２９１】
図１０Ａに示すように、細胞数は、０日目から５日目まで一定増加を開始したが、得られる最大カウントは、約６×１０６個の細胞／ｍｌであり、次に産生段階に入ると徐々に減少を開始した。回収の日、細胞数は、４．５×１０６個の細胞／ｍｌである。生存率プロファイルを図１０Ｂに示した。細胞が健康且つ活動的なまま存続するように、発酵培養物の生存率を、８０％を上回り維持することが不可欠である。フィード供給により、生存率を、増殖段階全体を通じて９０％を上回り維持し、１０日目に、生存率が８０％の培養物を回収する。哺乳動物細胞は、浸透圧が３００〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の条件で通常培養する。浸透圧が高いほど、組換えタンパク質の比生産性を増加させることができる；但し、これは多くの場合、細胞増殖に対する影響を伴う。したがって、図１１Ａに示すように、浸透圧は、発酵バッチ全体を通じて５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満に維持する。図１１Ｂに示すように、基本培地及びフィードの組成物は、抗体力価に対して実質的な効果を有した。１０日間の培養物の増殖において、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の最高濃度１．８ｇ／Ｌを実現する。
【０２９２】
培養した哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ  Ｓ細胞系培養物等は、その化学量論的ニーズを超えてグルコース及びグルタミン等の栄養分を頻繁に消費すること、並びに組換えＣＨＯ  Ｓ細胞系内で老廃物の乳酸及びアンモニアを分泌することは周知である。炭水化物が、培地内の主要なエネルギー源である。哺乳動物細胞培養中で最も一般的に使用される炭水化物は、グルコースである。グルコースは、細胞にエネルギーを提供し、タンパク質を合成するための主要な炭素源として作用する。タンパク質を生成するために、細胞が必要とする構成ブロックを形成するアミノ酸は、重要な構成成分を形成する。培地内のアミノ酸の濃度は、培養が実現し得る最大細胞密度に多大な影響を及ぼす。Ｌ−グルタミン等の必須アミノ酸は、ヌクレオチドの窒素源として、また代謝の二次供給源としても作用する。発酵実施期間中のグルコース及びグルタミン消費プロファイルは、図１２Ａ及び図１２Ｂにそれぞれ示した。グルコースプロファイルは、発酵装置稼働期間中に約２ｇ／Ｌに維持する。グルタミンレベルも、フェッドバッチ期間中に１ｍｍｏｌ／Ｌ未満に維持する。
【０２９３】
高濃度のアンモニウムイオンは、増殖を阻害し、生産性を損なうおそれがあるので、アンモニウムイオンは、細胞培養物に対して乳酸よりも強い影響を有する。細胞におけるアンモニウムイオン毒性の正確な機構は、この効果はｐＨ依存性であることが示されているものの明確ではない。発酵実施の際、アンモニウム濃度は、図１３Ａに示すように約８ｍｍｏｌ／Ｌとして得られる。乳酸も、細胞増殖を阻害する培地ｐＨの有意な低下を引き起こすおそれがある。乳酸濃度は５日目まで上昇したが、バッチが回収される１０日目には約０．７５ｇ／Ｌまで徐々に低下した（図１３Ｂ）。
【０２９４】
本開示は、２リットルフェッドバッチバイオリアクターにおいてアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の過剰発現に必要とされる最適な増殖条件について記載する。結果より、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのトランスフェクションを介して開発されたこれらの特有の細胞系は、２リットルフェッドバッチバイオリアクター製造期間中にモニターされる主要な生化学パラメーターを維持することが明らかであった。特有のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、本方法は、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系から新規のアフコシル化モノクロナール抗体産物の開発に成功したことが、この観察所見より再確認される。
【０２９５】
本明細書に記載するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び方法は、任意のモノクロナール抗体を過剰発現する任意のＣＨＯ  Ｓ細胞系から、アフコシル化モノクロナール抗体を開発する能力を有する。
【０２９６】
（例９）
単一細胞クローン細胞系のフェッドバッチ培養からのアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の精製
ＦＵＴ８ゲノム座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、フコース生合成経路を破壊するように、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰発現するＣＨＯ  Ｓ細胞系を遺伝的に改変する。２リットルフェッドバッチバイオリアクター製造から得られた細胞培養材料は、生存率が８０％を超える１０日間の培養後に回収する。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を精製するために培養物を処理するが、その手順を以下に記載する。
【０２９７】
モノクロナール抗体又はバイオ治療用タンパク質の品質特性は、プロセス及び生成物関連の不純物の両方により多大な影響を受ける。今日の下流精製プロセスは、経済的要因により益々動かされやすい。製品を市場に届ける時間を短縮することが使命であるが、それは、プロセス開発は、品質を損なうことなく、迅速且つ安価でなければならないことを意味する。これを念頭に置き、製品開発ワークフローが適正であることが非常に不可欠であり、重要なパラメーターが識別されており、制御されている強固なプロセスを保証する。上流及び下流の両方の初期段階プロセス開発において、プロセス分析技術（ＰＡＴ）の支援を受けるクオリティ・バイ・デザイン（ＱｂＤ）の概念が、近年多くのバイオ医薬品会社で採用されている。
【０２９８】
モノクロナール抗体の下流プロセス開発（一般的に、ラボスケールでの）には、所望の純度、製品品質、スループット、及び収率を提供するいくつかのユニット操作の最適化及び一体化が含まれる。化学的に定義された培地を使用して、フェッドバッチモードでタンパク質を発現させるモノクロナール抗体の製造において、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞が幅広く使用されている。治療用モノクロナール抗体の製造で使用されるその他の細胞系として、ＮＳ０、ＳＰ２／０、及びＰＥＲ．Ｃ６が挙げられる。
【０２９９】
ＣＨＯ細胞は、いくつかのｍＡｂ産物の製造で最も一般的に使用される。近年、発酵プロセスパラメーターの制御及び効率的なフィーディング戦略による生産性向上に対する努力がなされている。ＣＨＯ細胞培養物を回収したら、回収物を清澄化に供して、細胞、細胞デブリ、培地成分、及び不純物を除去する。これは、任意の方法、すなわち遠心分離、深層濾過、又はタンジェント流濾過（精密濾過）により実現する。各清澄化法は、その固有の長所並びに欠点を有する。清澄化の初期段階では、遠心分離ステップが用いられた。遠心分離プロセスの清澄化効率は、多くの要因に依存し、そのような要因として、遠心分離フィード率、Ｇ力、ボウルの幾可学的形状、作動圧力、排出頻度、及び細胞培養物を遠心分離機に移すのに使用される付属機器が挙げられる。細胞培養物特性、例えば培養プロセス期間中、及び回収時の総細胞密度及び培養物の生存率等も、分離性能に影響を及ぼす。次に最良の方法はタンジェント流濾過であり、この場合細胞培養物は、細胞、細胞デブリ、及び不溶性粒子の分離を引き起こす設定圧力限界未満で、微多孔性膜に対して接線方向に流れる。細胞分離では、一連の濃縮及び透析濾過ステップが後続する。圧力は、細胞内タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プロテアーゼ等の放出増加を引き起こす細胞溶解を生じさせるおそれがあるので、圧力制御は非常に重要である。最も一般的に使用される孔径は、０．２２ミクロンであり、０．１１ミクロンも近年使用される。
【０３００】
深層濾過は、最も一般的に使用される清澄化ツールである。運動電位吸着、粒径排除、及び疎水的相互作用等の複数の機構に起因して、この種の清澄化ステップは、細胞、細胞デブリ、プロセス汚染物質、並びに可溶性及び不溶性不純物を分離又は除去するために、広範に使用されている。また、深層濾過は、宿主細胞ＤＮＡの除去にも役立つ。今日では、細胞培養液の沈殿／フロキュレーションに基づく前処理が、清澄化段階に対する負荷軽減のために採用されている。ラボスケールで最初にフィルターの種類、孔径、表面積、及びフラックスの最適化が行われ、次いでパイロットスケールにスケールアップされる。
【０３０１】
清澄化後、清澄化済みの試料を、孔径０．２２μｍのフィルターを使用して濾過に供する。濾過済みの試料をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードし、結合した分子を低ｐＨ緩衝液により溶出する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、最高回収率で９５％を上回る純度を実現する十分に確立された捕捉ステップである。モノクロナール抗体の溶出に最適な酸性ｐＨは、ｍＡｂｓは低ｐＨで凝集する傾向を有するので、実験的に試験すべきである。溶出したタンパク質は、ウイルス不活性化（低ｐＨ）に供し、中和してウイルスを除去する。いくつかのプロテインＡ樹脂が市販されており、いくつかはアルカリ耐性で、高いタンパク質結合能力を有する。市販のプロテインＡ樹脂は、様々な供給業者、すなわちＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ等から入手可能である。
【０３０２】
１つ又は２つのクロマトグラフィーポリッシングステップは、生成物関連の不純物、例えば生成物アイソフォーム、短縮された種、電荷変異体等、及びプロセス関連の不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、エンドトキシン、外来ウイルス、プロテインＡ浸出液等の両方を除去するために一般的に採用される。一般的に、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかが、第２のクロマトグラフィーステップとして採用される。但し、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合式クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、いくつかの場合で用いられる。精製プロセスフローには、２つのウイルス除去ステップ、第１のステップは、Ｐｒｏ  Ａクロマトグラフィー捕捉段階後の低ｐＨ不活性化、及び第２のステップは、最終ポリッシングクロマトグラフィー後のナノフィルトレーション（ウイルスの濾過）ステップが含まれる。近年、Ｐｒｏ  Ａクロマトグラフィーの代わりに、捕捉ステップとして、イオン交換クロマトグラフィー又は混合式クロマトグラフィーのいずれかを使用する努力がなされてきた。陰イオン膜吸収材も、タンパク質が通過画分に溶出し、不純物が膜に結合する陰性結合モードとして、ｍＡｂｓの下流処理で使用される。最後に、最終ポリッシングクロマトグラフィーステップ後の精製された生成物を濃縮し、タンジェント流濾過を使用して最終処方緩衝液内で透析濾過する。
【０３０３】
本開示は、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー及びその他の精製技術を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介されるＦＵＴ８ノックアウト細胞系でトランスフォームしたＣＨＯ  Ｓ細胞から産生されるアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を精製する方法について記載する。
１．２リットルバイオリアクターから得られた細胞培養試料を含有するアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体
２．清澄化（遠心分離及び深層濾過）
３．アフィニティークロマトグラフィー
４．低ｐＨウイルス不活性化
５．ＡＥＸクロマトグラフィー（ＮＢ）
６．ＣＥＸクロマトグラフィー
７．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の分析
【０３０４】
清澄化：
生存率が７９．７％のＫＯ  ＣＨＯ細胞培養回収物、約１４１０ｍｌを遠心分離に供して、細胞及び細胞デブリを除去する。濁度が２２．５ＮＴＵの上清を慎重に収集し、ＺｅｔａＰｌｕｓ  ＢＣ２５深度フィルター（面積２５ｃｍ２）を通過させて、宿主細胞タンパク質及び懸濁状態の固体粒子を除去する。二次的な清澄化試料を、０．２２μｍフィルター（面積４７ｍｍ）を使用して濾過し、無菌ビン内に収集した濾過液を、プロテインＡアフィニティーカラムにロードする。
【０３０５】
アフィニティークロマトグラフィー：
カルボキシペプチダーゼＢ、１２ミリグラムを、清澄化済みの試料、約１４００ミリリットル（２４００ミリグラム）に添加し、３７℃で１時間インキュベートして、Ｃ末端リシン変異体を除去する。インキュベーション後、清澄化済みの試料を、平衡緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２０±０．２０）内で事前平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、約７０ｍｌのＸＫ２６／２０カラムに、流速８．８ｍｌ／分でロードする。約１５５０ｍｌの通過画分を収集する。次の通過ステップは、弱く結合した不純物及び宿主細胞タンパク質を除去するために、平衡緩衝液を経由する。次の通過ステップは、不純物を除去するために、１カラム容積の高塩濃度ｉｓｈ緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２０±０．２０）、その後に３カラム容積の低ｐＨ  Ｉｓｈ緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０±０．２０）を経由する。結合したタンパク質を溶出緩衝液（３０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０±０．２０）により溶出させる。
【０３０６】
ウイルス不活性化：
ウイルス不活性化のために、プロテインＡ溶出物のｐＨを３．０±０．２に調整し、試料を２４℃±２℃で３０分間インキュベートする。試料を、次いで１Ｍトリスを使用してｐＨ６．０±０．２に中和して、更に精製する。
【０３０７】
陰イオン交換クロマトグラフィー：
ウイルス不活性化後、ｐＨ６．０の試料を、精製水を使用して希釈し、電導度を低下させ、ｐＨを６±０．２に再度調整する。希釈した試料（約１０００ミリリットル）を事前平衡化したＸＫ１６／４０Ｑセファロース６ＦＦカラムにロードし、通過画分を収集するが、このクロマトグラフィーステップは陰性結合モードに設定されるので、生成物は通過画分に溶出する。このステップには、単一ステップ（１００％の濃度Ｂ）での溶出緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２０±０．２０）による、結合した不純物、宿主細胞ＤＮＡ、及びトランケートされた種の溶出が後続する。溶出物を単一の画分として収集する。
【０３０８】
陽イオン交換クロマトグラフィー：
ＡＥＸクロマトグラフィーから得た通過画分を、平衡緩衝液（５０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０、約２．２３ミリジーメンス）内で事前平衡化したＸＫ２６／４０Ｃａｐｔｏ  Ｓカラムにロードする。通過画分試料を収集する。次の通過ステップは、痕跡量の不純物を除去するために、約２カラム容積の平衡緩衝液を経由する。溶出は、０％から開始して、単一ステップで２０％の濃度Ｂ（溶出緩衝液：５０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０、約１４．５０ミリジーメンス）に至り（約２．５ｍＳ〜約７．３０ミリジーメンス）、単一ステップで２０〜２２．５％（約７．３０ミリジーメンス〜約７．５０ミリジーメンス）が後続する。グラジエント溶出は、２２．５％から開始して、グラジエント方式で８０％に至る（２０カラム容積のグラジエント長さ）。約６ｍｌサイズの画分を収集する。次いで、１００％の濃度Ｂを通過させ、高塩濃度の溶出緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２０）が後続する。
【０３０９】
データ分析
二次的な清澄化試料は、深層濾過による清澄化後、５比濁計濁度単位（ＮＴＵ）未満の濁度を示す。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロファイル（図１４Ａ）より、高塩濃度ｉｓｈで、いくつかの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が除去されることが明らかであり、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０）を使用して、結合したタンパク質を溶出させると、プロテインＡ溶出において、合理的な収率が観察される。プロテインＡ溶出プロファイルに基づけば、その他のテーリングピークは観察されないが、これは、溶出期間中に生成物の凝集が認められないことを示す。プロテインＡ溶出試料のＡ２８０分析に基づけば、回収物からの回収率は約９５％を超えることが観察される。
【０３１０】
ＡＥＸクロマトグラフィー（図１４Ｂ）は、通過画分モードで作動させるが、このモードでは生成物が樹脂に結合せず、低ｐＨで負荷するとより多くの正味の正電荷が得られる。このクロマトグラフィーステップでは、観察された生成物は、ＡＥＸクロマトグラフィーの通過画分に完全に溶出し、生成物は、期待通りカラムに結合せず、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及びいくつかのトランケートされた種のみが樹脂に結合する。結合した不純物又は汚染物質は、高塩濃度の溶出緩衝液を使用してカラムから溶出させる。
【０３１１】
ＣＥＸクロマトグラフィーステップ（図１４Ｃ）では、タンパク質の溶出は、通過画分には観察されず、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物が樹脂に完全に結合する。１つのピークが洗浄ステップ期間中に、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて低塩濃度で観察され、グラジエント溶出により、幅広い溶出ピークが得られ、溶出の際に２０カラム容積のグラジエント長さを採用した場合、電荷変異体についてより良好な分離が観察される。生成物は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度内で完全に溶出した。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の溶出後、高塩濃度の溶出条件で小さな溶出ピークが観察されるが、それは２００ｍＭ  ＮａＣｌの濃度内で完全に精製されたことを示す。
【０３１２】
（例１０）
アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の特徴付け
ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトを標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムでトランスフォームしたＣＨＯ  Ｓ細胞系から産生されるアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を特徴付けるために、複数の分析方法を使用する。
【０３１３】
以下の方法が、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の特徴付けで使用される。
１．抗体産物の等電点電気泳動
２．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析
３．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の免疫ブロッティング
４．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物によるＨＥＲ２抗原結合ＥＬＩＳＡ
５．細胞表面上のＨｅｒ２抗原認識を示す、細胞に基づくＥＬＩＳＡアッセイ
６．ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムでトランスフォームしたＣＨＯ  Ｓ細胞系から得られた、精製済みのアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のタンパク質濃度
７．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の弱陽イオン交換による電荷変異体分析
８．１００％アフコシル化を立証する、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のＮ−グリカンプロファイリング
９．用量依存様式のＨｅｒ２抗原認識を明らかにする、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物のフローサイトメトリー分析
１０．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合改善を確かめるＳＰＲ結合反応速度
１１．アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の生物学的機能性を確かめるＨｅｒ２過剰発現細胞系の抗増殖アッセイ
１２．腫瘍細胞の細胞毒性の改善を立証する、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物によるＡＤＣＣアッセイ
【０３１４】
１．等電点電気泳動
等電点電気泳動法は、タンパク質の電荷の差異に基づくタンパク質分離で幅広く適用される。等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、タンパク質の等電点（ｐＩ）に基づき、タンパク質を分離するための電気泳動技術である。等電点電気泳動の原理はｐＨグラジエントにあり、試料成分が、その正味電荷がゼロとなるｐＨ値（試料成分のｐＩ）まで、アノード又はカソードに向かって移動する。
【０３１５】
方法プロトコール
電荷変異体を識別する試験で使用される試料は、トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅから得られる）、及びＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｓ細胞系から開発したアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体である。全ての試料を希釈し、希釈剤として超純粋のミリＱ水を使用して１ｍｇ／ｍｌの濃度に保ち、そしてタンパク質試料２０μｇをＩＥＦ試料アプリケーターにロードする。標準的なＩＥＦ条件を使用する。１Ｍ水酸化ナトリウム及び１Ｍオルトリン酸をカソード緩衝液及びアノード緩衝液としてそれぞれ使用する。この試験で使用するゲル混合物は５％である。泳動後、ゲルを２％トリクロル酢酸で３０分間固定する。クマシーブリリアントブルー溶液を、溶液の染色に使用する。
【０３１６】
２．ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析
１０％（ｖ／ｖ）分離ゲルを使用して、還元及び非還元条件下で、抗体試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。トリスグリシンＳＤＳ  ＰＡＧＥは、供給業者のプロトコール（Ｂｉｏｒａｄ）により実施する。アクリルアミド及びビス−アクリルアミドストック溶液（２９：１）、スタッキング緩衝液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）、分離緩衝液（２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８）、１０％ＳＤＳ、ＡＰＳ、並びに触媒としてＴＥＭＥＤからポリアクリルアミドゲルを調製する。スタッキングゲルは、４％濃度で使用する。
【０３１７】
抗体試料５μｇを、５×試料緩衝液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール（還元条件の場合）、５０％グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）と混合する。混合物を、次いで５分間加熱し、ゲル上にロードする。抗体試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、電圧１５０ボルトで６０分間実施する。分子量が１０〜２５０ｋＤａの範囲のタンパク質マーカー標準（Ｂｉｏｒａｄ）を使用する。タンパク質の染色を、０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーを用いて実施する。染色したゲルを、次いでメタノール：酢酸溶液（４０％：１０％）の混合物で洗浄し、次いでキャノンデジタルカメラにより写真撮影してタンパク質バンドを視覚化する。
【０３１８】
３．免疫ブロッティング
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに溶解した抗体試料をＰＶＤＦ膜に転写する。０．０５％ツイーン／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで３０分間ブロッキングした後、膜を、ＰＢＳＴを用いて１回、１０分間ｉｓｈし、１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて、室温で３０分間更にインキュベートし、ＤＡＢ基質を使用して検出する。
【０３１９】
４．ＨＥＲ２結合ＥＬＩＳＡによるアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の定量
ヒト化抗ヒト上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ２）モノクロナール抗体である、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ１トラスツズマブは、腫瘍細胞上でＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳がん患者の治療で用いられる。抗ＨＥＲ２モノクロナール抗体の定量は、異なる方法、例えばＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して実施可能である。ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）内で産生されるヒトＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２タンパク質（ヒトＨｅｒ２、Ｈｉｓ  Ｔａｇ）Ｔｈｒ２３−Ｔｈｒ６５２（受託番号ＡＡＡ７５４９３）を用いて、９６ウェルプレートをコーティングする。受容体はヒトＨｅｒ２である；Ｈｉｓ  Ｔａｇは、Ｃ端でポリ−ヒスチジンタグと融合しており、７０．２ｋＤａのＭＷを計算上有する。予測されるＮ端はＴｈｒ２３である。ＤＴＴ還元型タンパク質は、グリコシル化により、１１０〜１１５ｋＤａとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ内を移動する。
【０３２０】
方法プロトコール
濃度１μｇ／ｍｌ（１００ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６で希釈）のＨＥＲ２タンパク質（Ａｃｒｏ  ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、１００μｌを９６ウェルプレートにコーティングする（細胞培養デルタ表面処理プレート）。プレートを２〜４℃、一晩インキュベートを継続し、その後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０）２×２００μｌで洗浄する。非特異的結合を、ブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液＋０．１％ＢＳＡ）で２時間（２００μｌ）ブロックし、洗浄緩衝液で２回洗浄する。標準／試料、１００μｌを添加し、インキュベーションを１．５時間継続する。試料及び標準を２倍ずつ連続希釈して、１．９５３〜２５０ｎｇ／ｍｌの範囲にする。二次抗体をプレートに添加し、インキュベーションを１時間継続する。ＴＭＢを基質として使用する。プレートを、６２０ｎｍをバックグラウンドとして４５０ｎｍで読み取る。全ての測定を２回行う。測定した試料／標準の濃度を、４パラメーター非線形回帰曲線近似プログラムを使用して決定して、結合曲線を生成する（Ｇｅｎ５）。
【０３２１】
５．細胞に基づく結合ＥＬＩＳＡ
細胞に基づくＥＬＩＳＡは、特異的受容体発現細胞を用いて特異的標的分子の結合能力を見積もる方法の１つである。ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４細胞系（ＡＴＣＣから得られる）は、細胞表面上でＨＥＲ２受容体を過剰発現する。抗Ｈｅｒ２抗体の結合能力を評価するのに、該細胞系を使用する。細胞に基づくＥＬＩＳＡアッセイでは、下記のプロトコールに従う、
１．細胞をマイクロタイタープレートに播種する；
２．ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、一晩インキュベーション；
３．細胞を１０％ホルマリンで固定する；
４．表面をｉｓｈ及びブロックする；
５．標的抗Ｈｅｒ２抗体を添加する；
６．Ｉｓｈし、酵素コンジュゲート抗体を添加する；
７．基質を添加し、読み取りを行う。
【０３２２】
方法プロトコール
２つの細胞系、すなわちＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４細胞をこの試験で使用する。ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４細胞を継代し、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭ培地内でそれぞれ３７℃及び５％ＣＯ２で維持する。細胞を、１ウェル当たり５０００個の細胞（１００μＬ）の密度で、９６ウェルプレートデルタ処理表面にプレーティングし、接着させたまま、３７℃及び５％ＣＯ２で、一晩放置する。翌日、２×２００μＬの冷却ＰＢＳで細胞を洗浄して、非接着粒子を除去する。次に、細胞を１０％ホルマリン、１００μＬで固定し、室温で１０分間インキュベートする。固定溶液を除去し、２×２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液［ＰＢＳ＋ツイーン２０（０．０５％）＋０．１％ＢＳＡ］、２００μＬで、プレートを１時間ブロックする。２×２００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０）でプレートを洗浄して、過剰のブロッキング溶液を除去する。試料／標準、１００μＬを各ウェルに添加し、プレートシェイカー内で３０分間インキュベートする。２×２００μＬのｉｓｈ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０）でプレートをｉｓｈして非特異的相互作用を除去する。二次抗体（抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ１）、１００μＬを添加し、１時間インキュベートする。ＴＭＢ基質１００μＬを添加し、６２０ｎｍをバックグラウンドとして、４５０ｎｍで発色した色を読み取る。全ての試料／標準について２回行う。測定した試料／標準の濃度を、４パラメーター非線形回帰曲線近似プログラムを使用して決定し、結合曲線を生成する（Ｇｅｎ５）。表１３は、両細胞系（ＢＴ４７４及びＳＫＢＲ３）で使用する試料／標準の濃度を示す。
【表１３】
0006587696.tif 000018
【０３２３】
６．タンパク質濃度測定
タンパク質濃度は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ−ｉ  ＨＰＬＣ上で、ＭＡｂＰａｃプロテインＡカラム（１２μｍ；４×３５ｍｍ）を使用して、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより決定する。移動相は、流速が２．５ｍＬ／分のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ酸緩衝液である。モノクロナール抗体を３％氷酢酸グラジエントで溶出させる。カラム温度は、２５℃であり、検出は２８０ｎｍで行う。ラボソリューションソフトウェアを使用してクロマトグラムを統合し、公知の標準の濃度に対して、ピーク下面積をプロットした標準曲線を使用して濃度を見積もる。
【０３２４】
７．イオン交換クロマトグラフィー
電荷変異体を、４．０×２５０ｍｍのＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ陽イオン交換（ＩＥＣ）カラムＷＣＸ−１０上で分離する。移動相Ａは、１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．８であり、移動相Ｂは、２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．８であり、流速は１．０ｍＬ／分、稼働時間は２１分間である。カラム温度は３０℃であり、検出は２８０ｎｍで行う。ラボソリューションソフトウェアを使用してクロマトグラムを統合し、ピーク面積の相対割合を得る。
【０３２５】
８．酵素的Ｎ−グリカン放出及びＧＬＹＣＯＷＯＲＫＳ  ＲＡＰＩＦＬＵＯＲ−ＭＳ  Ｎ−グリカンキットによるラベリング
Ｎ−グリカンをプロファイリングするための試料調製は、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ  ＲａｐｉＦｌｕｏｒ−ＭＳ  Ｎ−グリカンキット（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を使用して実施する。キットは４ステップを有する。
ステップ１：高速脱グリコシル化、
ステップ２：グリコシルアミンの高速ラベリング、
ステップ３：ラベリングしたグリコシルアミンのＨＩＬＩＣ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ、
ステップ４：ＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ  ＵＰＬＣ分析用の、ラベリングしたグリカンの調製。
【０３２６】
９．ＵＰＬＣ−蛍光ＨＩＬＩＣによるＮ−グリカンのプロファイリング
２−ＡＢ誘導型Ｎ−グリカンは、Ｅｍｐｏｗｅｒ３クロマトグラフィーワークステーションソフトウェアの制御下に置かれた、クオターナリーソルベントマネージャー、試料マネージャー、及び蛍光検出器からなるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ  Ｈ−クラス装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）上で、蛍光検出機能を有する超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により分離する。１ｍＬ／分、２６分で８０〜６０％アセトニトリルのリニアグラジエントを使用するＴｈｅｒｍｏ  Ａｃｃｕｃｏｒｅ−１５０−アミド−ＨＩＬＩＣカラム、１００×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．、２．６μｍ粒子を使用して、ＨＩＬＩＣ分離を実施する。溶媒Ａは、アンモニア溶液を用いてｐＨ４．４に調整した５０ｍＭギ酸アンモニウムであり、溶媒Ｂは、アセトニトリルである。試料の注入容積は、１０μＬである。注入前に試料を５℃に維持し、カラム温度は６０℃である。蛍光検出励起／発光波長は、それぞれｅｘ＝２６５ｎｍ及びｅｍ＝４２５ｎｍである。
【０３２７】
１０．フローサイトメトリー分析
ｍＡｂ試料のＨＥＲ２抗原への特異的結合を、間接的フローサイトメトリー法を使用して調査する。細胞表面上で高レベルのＨＥＲ２受容体を発現するＢＴ−４７４細胞系を、ＡＴＣＣから得る。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２増殖培地内で、ＢＴ−４７４細胞を培養する。
【０３２８】
実験の場合、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで細胞をトリプシン処理する。１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ペレットを、ＤＰＢＳ緩衝液中２％ＢＳＡに懸濁し、所望の濃度、０．１百万個の細胞／ｍｌとする。次いで様々な濃度、すなわち０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．００１２５ｍｇ／ｍｌのビオチン標識Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ  Ｈｅｒｃｌｏｎ及び抗Ｈｅｒ２抗体で細胞を処理する。抗体試料のビオチン化を、ＥＺ  ＳｕｌｆｏＬｉｎｋビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施する。
【０３２９】
抗体試料と細胞の容積を１：１の比で維持し、室温で１時間インキュベートする。０．１ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐ−ＦＩＴＣ、２０μｌを反応混合物に添加し、氷浴上で３０分間インキュベートする。処理した全ての試料を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析する。
【０３３０】
１１．ＳＰＲ結合反応速度
異なる電荷変異体に関する結合反応速度試験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施する。ＨＥＲ２結合反応速度及びＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６ａ）結合反応速度について、変異体及び主要な種を分析する。ＨＥＲ２及びＣＤ１６ａリガンドを、製造業者のプロトコールに記載されている標準アミンカップリング手順を使用してＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定する。
【０３３１】
１２．ＨＥＲ２結合反応速度
ＨＥＲ２は、ｎｅｕ及びｃ−ｅｒｂＢ２としても公知であり、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体のメンバー、又はＨＥＲ１（ＥＧＦＲ／ｃ−ｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ３（ｃ−ｅｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ｃ−ｅｒｂＢ４）も含まれるチロシンキナーゼ受容体のＨＥＲファミリーである。ＨＥＲ２の過剰発現は、乳がん及び卵巣がんで頻繁に観察され、不良な予後と関連する。
【０３３２】
ＨＥＲ２外部ドメイン受容体（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中で２μｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリングプロトコールは、ＧＥアミンカップリング手順の記載に従う。リガンドの固定化は、フローセル２（ＦＣ２）を備える５００ＲＵのためであり、フローセル１（ＦＣ１）は、リガンドを一切含まないバックグラウンドとして機能する。全ての抗ＨＥＲ２  Ｍａｂを、ランニング緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製ＨＢＳ  Ｐ＋１×緩衝液）で、２倍希釈により、１００ｎＭ〜６．２５ｎＭの異なる濃度に希釈する。これらの個々の濃度を、会合速度では、５分間、２回注入し、次いで解離速度では、ランニング緩衝液のみを１５分間通過させ、表面の再生は、グリシン緩衝液ｐＨ１．５を３０秒間、グリシン緩衝液ｐＨ２．０を９０秒間注入して行い、ランニング緩衝液安定化時間は１分間とする。
【０３３３】
治療用抗体は、一般的にＩｇＧクラスの分子であり、腫瘍細胞抗原と結合する抗原結合断片（Ｆａｂ）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、又はマクロファージ等のエフェクター細胞上のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と結合する結晶性の断片（Ｆｃ）を含む。Ｆｃγ受容体は、抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーの周知の分子である。ＡＤＣＣにおいてＩｇＧ  Ｆｃ媒介型のエフェクター機能が寄付することから、治療用抗体の開発及び製造のために、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用強化を図る努力の動機付けとなってきた。
【０３３４】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６ａ  Ｖ１５８）バリン変異体が本試験で用いられ、ＣＤ１６ａ受容体の外部ドメインは、Ａｃｒｏ  ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国から調達される。全てのアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を、ランニング緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製ＨＢＳ  ＥＰ＋１×緩衝液）で、０．８３３μＭ〜０．０５μＭの異なる濃度に連続希釈する（２倍希釈）。分析物の反応速度を、ラングミュア結合キネティクスを使用して決定する（１：１結合モデル）。
【０３３５】
１３．抗増殖アッセイ
ＢＴ４７４細胞系を本試験で使用し、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地を使用して細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で増殖及び維持する。１ウェル当たり２０００個の細胞を本試験で使用する。試料／標準の希釈を、ＤＭＥＭアッセイ培地（２％ＦＢＳを含有）内で実施する。試料／標準、１００μＬを、細胞１００μＬと共に９６ウェルプレートに添加し、インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２で６日間継続する。６日後、アラマーブルー３０μＬを添加し、インキュベーションを６時間継続する。次いで、プレートを５３０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの励起波長で読み取る。４点非線形回帰曲線を、ＰＬＡソフトウェアから得る。下記の表１４は、ＢＴ４７４抗増殖アッセイで使用する試料／標準の濃度を示す。
【表１４】
0006587696.tif 000019
【０３３６】
エフェクター細胞の単離
末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコールグラジエント遠心分離により、ヘパリン添加血から単離する。細胞をＤＰＢＳ（１×）内で、次いで完全培地内で再度ｉｓｈし、次いで最適なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を得るのに必要とされる細胞濃度に調整する。
【０３３７】
１４．ＡＤＣＣアッセイ
ＢＴ−４７４標的細胞（１ウェル当たり１０，０００個の細胞）を、アフコシル化モノクロナール抗体試料とＲＰＭＩ  １６４０アッセイ培地内で混合し、９６ウェルプレートに分配する。３０分間のインキュベーション後、エフェクター細胞を１：２０（ＢＴ４７４細胞のエフェクター細胞に対する）の比で、細胞及び薬物反応混合物に添加する。アッセイプレートを、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で７時間インキュベートする。細胞より放出された死亡細胞プロテアーゼレベル（細胞死の指標）を、Ｃｙｔｏｔｏｘｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定する。インキュベーション後、均一に混合するために、プレートを３０分間シェイカー上で維持する。最大細胞毒性レベルを決定するために、溶解緩衝液２０μｌを対照ウェルに添加する。Ｃｙｔｏｔｏｘｇｌｏ試薬２０μｌを各試料及び対照ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートする。発光を、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定する。細胞毒性割合の値を以下の通り計算する：［（試験試料−低対照）／（最大対照−低対照）］×１００。低対照は、自発細胞死を表し、最大対照は、完全細胞死を表す。
【０３３８】
結果及び考察
アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の見通しについて、一連の分析実験により試験及び特徴付けを行う。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体とトラスツズマブとの比較により、生物活性を比較する。
【０３３９】
ＩＥＦ
ＩＥＦを実施して、存在する電荷変異体（酸性及び塩基性の種）を識別する。４つのバンドが、イノベーターにおいて明らかに目視可能である。主要なバンド（図１５）が、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の両方に観察される。
【０３４０】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
非還元条件下では、未変化の抗体を示す、分子量（ＭＷ）１５０ｋＤａに対応する単一の主要なバンドが観察される（図１６）。還元条件下で、２つのバンドが、２５ｋＤａ及び５０ｋＤａにおいて明らかであるが、それぞれ、抗体の軽鎖及び重鎖と関連する。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物について観察されたバンドパターンは、トラスツズマブのバンドパターンと類似する。
【０３４１】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティング分析は、抗体試料を特異的に検出するために実施する。トラスツズマブは、タンパク質パターンを評価及び比較するのに使用する。非還元型抗体試料は、二次抗体でプローブしたとき、単一の異なるバンドを示す。但し、還元型の試料の場合、重鎖（約５０ｋＤａ）の単一バンドのみが検出され、モノクロナール抗体の軽鎖は検出されない。これは、使用される二次抗体は、抗体のＦｃ領域に対してのみ特異的であり、軽鎖領域に対しては特異的でないことによる。図１７において、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、ウェスタンブロット実験においてまったく同一のバンディングパターンを示す。
【０３４２】
抗ＨＥＲ２結合ＥＬＩＳＡ
連続希釈して得られた異なる濃度（６０ｎｇ／ｍＬ〜０．４８ｎｇ／ｍＬ）のトラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体を、結合効率についてＨＥＲ２コーティングＥＬＩＳＡプレートにおいて分析する。観察された結果（図１８）より、トラスツズマブと比較して、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体は、固定化したＨＥＲ２ドメインに対して類似した相互作用を有することが示される。
【０３４３】
細胞に基づくＥＬＩＳＡ
細胞に基づくＥＬＩＳＡ（図１９Ａ及び１９Ｂ）より、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体とトラスツズマブは同等の活性を有することが明らかである。この方法は、乳がん細胞上で発現するＨＥＲ２抗原と、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体及びトラスツズマブとの間の結合活性を決定する。理想的には、表面上でのＨＥＲ２抗原の発現量は、ＳＫＢＲ３細胞と比較したとき、ＢＴ４７４細胞では、それよりも高い。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体分子は、両細胞系において同等の結合能力を示す。ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４細胞に対するアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体の結合能力は、それぞれ８９．１％及び８０．３％である。細胞に基づくＥＬＩＳＡに関する結合能力基準は、平行線定量法計算ソフトウェア（ＰＬＡソフトウェア）において７５〜１２５％に設定する。
【０３４４】
タンパク質濃度測定
プロトタイププロテインＡカラムを、回収後の細胞培養物（ＨＣＣ）から医薬品段階まで、モノクロナール抗体力価を測定するのに使用する。クロマトグラム（図２０）では、各試料５０μＬをプロトタイププロテインＡカラムに注入する。本方法の初期部分において溶出した最初のピークは、未結合物質に該当する。モノクロナール抗体は、低ｐＨの３％氷酢酸を通過させることにより放出される。モノクロナール抗体力価を、これまでに作成した校正曲線を使用して決定する。各試料の代表的なクロマトグラムを図２０に示し、各試料の力価を以下の表にまとめる（表１５）。
【表１５】
0006587696.tif 000020
【０３４５】
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換プロファイルのピークは、一般的に３つの異なる成分に対応する。初期及び後期の溶出ピークは、酸性及び塩基性変異体とそれぞれ呼ばれる。最も大きなピークは、主要ピークと呼ぶ。図２１に示すように、Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０カラムは、モノクロナール抗体の酸性及び塩基性変異体分析において、優れたピーク効率及び高分解能を提供するが、酸性、塩基性及び主要のピークを、２１分間の稼働時間内で分解し、それぞれの割合を下記の表１６にまとめる。
【表１６】
0006587696.tif 000021
【０３４６】
ＨＩＬＩＣ  Ｎ−グリカンのプロファイリング
治療用モノクロナール抗体に関する重要な品質特性の１つは、グリコシル化プロファイルである。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物におけるグリカンの分布をチェックするために、ＨＩＬＩＣ  Ｎ−グリカンプロファイリング法により分析する。主要なグリカン、例えばＧ０、Ｇ１、Ｇ１’、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ’、及びＧ２Ｆ等を、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物について、下記の表１７に列挙する。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体試料におけるアフコシル化グリカンの全体的な割合は、それぞれ８．９５％及び１００％である。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体におけるグリカンプロファイルを、図２２に示す。
【表１７】
0006587696.tif 000022
【０３４７】
フローサイトメトリー
本方法は、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって、乳がん細胞系のＢＴ−４７４上で発現するＨｅｒ２受容体のリガンド結合親和力を測定する手段を提供する。ビオチン化された抗体試料による受容体結合レベルを、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いてプロービングすること、及びフローサイトメーターを使用して蛍光レベルを測定することにより評価する。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、「非染色細胞のみ」の対照と比較して右側に寄ったピークシフトを示し、乳がん細胞上のＨｅｒ２受容体に対するこの試料の特異性を示す。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体のオーバーレイデータ（図２３）は同等であり、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物は、トラスツズマブと類似した結合親和力を有することを示唆する。またこれらの結果は、生成したアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の適切なフォールディング、正確な会合、及び生物活性も示す。
【０３４８】
ＳＰＲデータ
ＳＰＲデータ（図２４Ａ）より、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物に対するＨＥＲ２の結合は、トラスツズマブに匹敵することが明らかである。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体に関するＫＤ値は、４．２１Ｅ−０９（４．２ｎＭ）であり、トラスツズマブの場合、３．６９Ｅ−０９（３．６ｎＭ）であることが判っている。会合及び解離（ｋａ及びｋｄ）値から、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体は、ＨＥＲ２リガンドに対して非常に強いアフィニティーを有することが示される。しかし、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６ａリガンド）の場合、ＳＰＲセンサーグラムは、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物との結合において顕著な差異を示す。データより、トラスツズマブは、一般的にＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６ａリガンド）に対して非常に弱い結合を有し、ＨＥＲ２リガンドとは強い結合を有することが示唆される。一方、本開示に記載するアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体に対して有意に高レベルの結合を示す。反応速度データ（図２４Ｂ）は、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体（ＫＤ  ４．００Ｅ−０８Ｍ）の結合親和力は、トラスツズマブ（ＫＤ  １．０８Ｅ−０７Ｍ）よりも約３倍高いことを示唆する。
【０３４９】
抗増殖アッセイ
抗増殖アッセイ（図２５）では、乳がん細胞系の細胞増殖を阻害する薬物の能力について調べた。アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体は、トラスツズマブと比較して同等の細胞増殖抑制能力（がん細胞が増殖するのを阻止する薬物の能力）を示し、また相対的効力値は、トラスツズマブに対して８５．２％を示す。抗増殖アッセイに関する効力の規格は、平行線定量法計算ソフトウェア（ＰＬＡソフトウェア）において、７０〜１３０％に設定する。
【０３５０】
ＰＢＭＣ試料による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
図２６は、抗Ｈｅｒ２抗体を過剰産生するＣＨＯ  Ｓ細胞系から開発され、ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでトランスフォームされたアフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物の生物学的能力を示す。異なる薬物濃度における細胞傷害レベルをアッセイするのに、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物及びトラスツズマブを使用する。データ分析には、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する。結果は、アフコシル化抗Ｈｅｒ２抗体産物を用いると、ＡＤＣＣが８倍を超えて改善されることを示唆する。このデータは、モノクロナール抗体のアフコシル化は、モノクロナール抗体の生物学的機能において直接的な影響を有することを立証する。
【０３５１】
多数の腫瘍抗原性の標的が、モノクロナール抗体が媒介する治療の可能性について現在試験中である。従来型のモノクロナール抗体治療薬は、フコース生合成経路を介して内因性のフコシル化活性を有するＣＨＯ  Ｓ細胞発現系において開発されている。
【０３５２】
したがって、本開示に記載する方法及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、新規製品開発アプローチをもたらし、そのようなアプローチでは、フコシル化に起因して不良な生物学的効率を有する任意のモノクロナール抗体産物が、モノクロナール抗体のアフコシル化バージョンを開発することにより有意に改善される。ここに記載する新規アプローチは、既存の高発現真核生物タンパク質発現プラットフォームから、アフコシル化モノクロナール抗体を開発するための新規製品開発ルートを切り開く。
【図１Ａ】
0006587696.tif 000023
【図１Ｂ】
0006587696.tif 000024
【図２】
0006587696.tif 000025
【図３Ａ】
0006587696.tif 000026
【図３Ｂ】
0006587696.tif 000027
【図４】
0006587696.tif 000028
【図５Ａ】
0006587696.tif 000029
【図５Ｂ】
0006587696.tif 000030
【図６】
0006587696.tif 000031
【図７】
0006587696.tif 000032
【図８Ａ】
0006587696.tif 000033
【図８Ｂ】
0006587696.tif 000034
【図９】
0006587696.tif 000035
【図１０】
0006587696.tif 000036
【図１１】
0006587696.tif 000037
【図１２】
0006587696.tif 000038
【図１３】
0006587696.tif 000039
【図１４】
0006587696.tif 000040
【図１５】
0006587696.tif 000041
【図１６】
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【図１７】
0006587696.tif 000043
【図１８】
0006587696.tif 000044
【図１９】
0006587696.tif 000045
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
0006587696.tif 000049
【図２４】
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【図２５】
0006587696.tif 000051
【図２６】
0006587696.tif 000052
【配列表】
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