(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料のＣＨＣＨＤ２中の突然変異を検出することを特徴とする常染色体優性遺伝性パーキンソン病に関する遺伝子検出方法であって、
ＣＨＣＨＤ２中の突然変異が、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）、ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（p.Arg 145 Gln）又はｃ．３００＋５Ｇ＞Ａである遺伝子検出方法。
【請求項２】
ＣＨＣＨＤ２中の突然変異検出用試薬を含有する常染色体優性遺伝性パーキンソン病診断薬であって、
ＣＨＣＨＤ２中の突然変異が、ＣＨＣＨＤ２中のｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr61 Ile）ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（p.Arg 145 Gln）又はｃ．３００＋５Ｇ＞Ａである診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、常染色体優性遺伝性パーキンソン病の診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ［ＭＩＭ  １６８６００］）は、アルツハイマー病に次いで多い神経変性疾患であり、黒質のドーパミン作動性ニューロンの死に起因する。ＰＤ症状は、主に、安静時振戦、筋固縮、動作緩慢、及び姿勢反射障害を包含する運動障害にある。ＰＤ症例の多くは孤発性であって遺伝性ではなく、実際、ＰＤ患者の１１％のみが１又は複数のＰＤと診断される第一度近親者を持つとされる（非特許文献１）。それでも、希少な家族性症例における原因遺伝子の同定は、ＰＤ病因に対して新たな光明を投じる可能性がある。単一遺伝子変異型の神経変性疾患の多くは常染色体優性であるが、これまで常染色体優性型の家族性ＰＤに関しては、わずか６つの遺伝子が報告されているにすぎない（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Mov. Disord. 2010; 25: 2587-2594
【非特許文献２】Mov. Disord. 2013; 28: 14-23
【非特許文献３】Am. J. Hum. Genet. 2008; 82:822-833
【非特許文献４】Hum. Mol. Genet. 2014; 23: 1794-1801
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、遺伝性ＰＤの検出方法を提供することは、ＰＤの発症前診断手段を提供するだけでなく、ＰＤの発症原因究明の新たな材料となり得る。
従って、本発明の課題は、新たな遺伝性パーキンソン病の診断手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは、ＰＤを有する大規模な日本人家系８名の罹患個体及び５名の非罹患個体について次世代シーケンシング技術を用いて遺伝学的研究を行った結果、ＣＨＣＨＤ２中の突然変異と常染色体優性遺伝性ＰＤとの間に相関性があり、当該ＣＨＣＨＤ２中の突然変異が遺伝性ＰＤの原因遺伝子であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕常染色体優性遺伝性パーキンソン病を診断する目的で、生体試料のＣＨＣＨＤ２中の突然変異を検出する方法。
〔２〕ＣＨＣＨＤ２中の突然変異が、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）、ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（p.Arg 145 Gln）又はｃ．３００＋５Ｇ＞Ａである〔１〕記載の検出方法。
〔３〕ＣＨＣＨＤ２中の突然変異検出用試薬を含有する常染色体優性遺伝性パーキンソン病診断薬。
〔４〕ＣＨＣＨＤ２中の突然変異が、ＣＨＣＨＤ２中のｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（p.Arg 145 Gln）又はｃ．３００＋５Ｇ＞Ａである〔３〕記載の診断薬。
【発明の効果】
【０００８】
遺伝子を含有する生体試料のＣＨＣＨＤ２中の突然変異、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、ｃ．４３４Ｇ＞Ａ又はｃ．３００＋５Ｇ＞Ａを検出すれば、常染色体優性遺伝性（ＡＤ）ＰＤが診断できる。ＣＨＣＨＤ２はミトコンドリアに局在することから、本発明により、新たなパーキンソン病治療薬開発の可能性が生じた。また、ＡＤＰＤの発症前診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＣＨＣＨＤ２突然変異を有する家系図を示す。塗りつぶされた記号、罹患個体；塗りつぶしていない記号、非罹患個体；塗りつぶしていない記号内の数字、罹患していない子の数；Ｍ、異型接合性ＣＨＣＨＤ２突然変異；及びＷ、野生型。家系Ｃにおいて４分の１が塗りつぶされた記号は、本態性振戦 (ＥＴ) に罹患した個体を示す。家系Ａにおけるアスタリスクは、次世代シーケンシングにより解析された被験者を指す。
【図１Ｂ】同定されたＣＨＣＨＤ２突然変異の配列電気泳動図を示す。
【図１Ｃ】（Ｃ）ゲノムＣＨＣＨＤ２の遺伝子座及びＣＨＣＨＤ２構造の略図を示す。同定されたＣＨＣＨＤ２突然変異のゲノム位置が上部パネルに示される。突然変異のアミノ酸位置及び様々な種との配列アラインメントが下部パネルに示される。ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号は以下の通りである：ヒト（H. sapiens）, NP_057223.1；チンパンジー（P. troglodytes），XP_003318501.1；ハツカネズミ（M. musculus），NP_077128.2；ドブネズミ（R. norvegicus），NP_001015019.1；ニワトリ（G. gallus），NP_001006218.1；ゼブラフィッシュ（D. rerio），NP_957061.1；キイロショウジョウバエ（D. melanogaster），NP_573196.1；及び線虫（C. elegans），NP_497826.1。
【図２Ａ】ＣＨＣＨＤ２  ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａのスプライシングアッセイを示す。ｐｃＤＮＡ−ＣＨＣＨＤ２−ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてエクソン２スキッピングを誘導するが、野生型（ＷＴ）、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、又はｃ．４３４Ｇ＞Ａはこれを誘導しない。エクソン２含有バンド及びエクソン２除外バンド（＊）の間の中間の移動度を有する弱いバンドに留意されたい。
【図２Ｂ】ＣＨＣＨＤ２  ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａのスプライシングアッセイを示す。ｐＳＰＬ３−ＣＨＣＨＤ２−エクソン２−ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａは、エクソン２を含まない転写産物、及び上流の隠れた５’スプライス部位（矢印）の活性化を介して部分的なエクソン２を包含する転写産物を生じる。
【図２Ｃ】ＣＨＣＨＤ２エクソン２ＷＴ及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異体５’スプライス部位のＵ１  ｓｎＲＮＰへの結合を示す。この結合は、ＨｅＬａ核抽出物（３μｇ、６μｇ及び１２μｇ）又は精製したＵ１  ｓｎＲＮＰ（０．２８μｇ、０．５５μｇ、及び１．１μｇ）を増量させて測定した。５’スプライス部位プローブのＵ１  ｓｎＲＮＰへの結合は、ＨｅＬａ核抽出物によって顕著に損なわれたが、精製したＵ１  ｓｎＲＮＰではわずかに損なわれたにすぎなかった。
【図３】ＣＨＣＨＤ２はミトコンドリアに局在することを示す。（Ａ）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の細胞成分分画。チューブリン、細胞質（Ｃ）マーカー；アセチルヒストンＨ３、核（Ｎ）マーカー；及びＮＤＵＦＡ９、ミトコンドリア（Ｍ）マーカー。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞におけるＣＨＣＨＤ２−３ｘＦＬＡＧのミトコンドリア局在を示す免疫細胞化学。過剰発現された野生型（ＷＴ）、p.Thr 61 Ile、及びp.Arg 145 GlnのＣＨＣＨＤ２はＴｏｍ２０と共局在したのに対し、ΔＭＴＳとは共局在しなかった。（Ｃ）ＣＨＣＨＤ２−３ｘＦＬＡＧ発現ＨｅＬａ細胞におけるミトコンドリアの免疫電子顕微鏡法。（Ｄ）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来のミトコンドリアに富む画分をトリプシンと共にインキュベートした。ウェスタンブロット解析のため、外膜（ＯＭ）（Ｔｏｍ２０）、内膜（ＩＭ）（ＯＰＡ１）、及びマトリクス（Ｈｓｐ６０）に対して適切なマーカーを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明においては、遺伝子を含む生体試料のＣＨＣＨＤ２中の突然変異を検出することにより、ＡＤＰＤが診断できる。
【００１１】
生体試料としては、遺伝子を含む試料であればよく、例えば、だ液、血液、皮膚、毛髪等が挙げられる。
【００１２】
ＣＨＣＨＤ２（コイルド−コイル−ヘリックス−コイルド−コイル−ヘリックスドメイン２）は、ミトコンドリアに局在するので、細胞中のミトコンドリア画分を使用するのが好ましい。
【００１３】
ＣＨＣＨＤ２中の突然変異としては、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）、ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（p.Arg 145 Gln）及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａから選ばれる変異が挙げられる。ＣＨＣＨＤ２のゲノムＤＮＡの配列を配列番号１に示す。配列番号１中のＣＤＳは(82)..(131)、(2020)..(2269)、(3484)..(3628)、(4634)..(4644)である。
【００１４】
ＣＨＣＨＤ２中の突然変異の検出手段としては、ＰＣＲ法、サンガー法、タックマン法、次世代シーケンシング等が挙げられる。また、ＣＨＣＨＤ２中の突然変異には、Thr 61 Ile、Arg 145 Glnが含まれるので、突然変異の発現産物であるポリペプチドの検出によっても行うことができる。当該変異ポリペプチドの検出方法としては、免疫学的測定法、アミノ酸シークエンス法、質量分析法等が挙げられる。
【００１５】
前記突然変異の検出には、前記変異箇所を含むプライマー、プローブが用いられる。そのようなプライマー又はプローブとしては、前記変異箇所を含む１０〜１００の塩基からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
前記突然変異ポリペプチドの検出には、前記変異箇所を特異的に認識する抗体が用いられる。
【００１６】
前記突然変異のより好ましい検出手段としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、アレル特異的ＰＣＲ法等のＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法等の各種遺伝子増幅法を用いて得られた増幅産物中で前記突然変異の存在を検出することにより行う方法が挙げられる。このような増幅産物中の検出は、直接塩基配列を決定する方法（シーケンス法）に加えて、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等で行うこともできる。また、ハイブリダイゼーション反応を利用した、例えば、タックマン法（Taqman PCR）、侵入法（Invader method）、ＲＣＡ法、及びマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）法等のスニップタイピングで使用される各種方法を用いて、前記突然変異を含むヌクレオチドの存在を検出することもできる。
【００１７】
このような検出方法に使用する本発明の診断薬は、前記突然変異を測定するための具体的な方法・手段に応じて、適当な構成をとることができる。該試薬は、例えば、前記突然変異を含む遺伝子増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブを含むことができる。これらのプライマー又はプローブは、適当な長さ、例えば、１０〜１００個の連続した塩基配列が好ましい。
【００１８】
前記変異ペプチドの存在は、例えば、前記抗体を用いたＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ等の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法等に代表される質量分析によって検出することができる。
【００１９】
これらの診断薬に含まれる、各種のプライマー、プローブ、又は抗体は、当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。更に、診断薬には、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）、プロトコール（使用説明書）等が含まれる。
【００２０】
ＣＤＨＣＤ２中の突然変異を検出すれば、ＡＤＰＤが早期に診断できる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２２】
実施例１
Ａ．方法
（１）被験者及び突然変異スクリーニング
本研究は、順天堂大学医学部の倫理委員会によって承認された。患者及び対照被験者を含む本研究における全ての参加者は日本人であり、順天堂大学ＤＮＡバンクから選択された。全員にインフォームドコンセントを行った。患者は全て、神経内科専門医によって英国PD Society Brain Bank臨床診断基準に従いＰＤと診断された。全ての対照被験者は、神経内科専門医によって神経疾患ではないことが確認された。我々は、少なくとも連続する二世代の内に罹患した家族を有するＡＤＰＤ患者を選択した。
【００２３】
家系Ａの８名の罹患個体及び５名の非罹患個体からＤＮＡ試料を採取し（図１Ａ）、既知のＰＤ原因遺伝子突然変異を伴わないことを確認した。家系Ａの全ての被験者についてGenome-Wide SNP Array 6.0（Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いて遺伝子型を同定し、SNPHitLink及びMerlinソフトウェアを用いてマルチポイントパラメトリック連鎖解析を行った。我々は、エキソームシーケンシングによって捕捉が困難な領域を補完するため、最長の遺伝距離を有するエキソームシーケンシング用に３名の患者（Ａ−ＩＩＩ−１、６及び１７）、及び全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）用に１名の患者（Ａ−ＩＩ−１８）を選択した（図１Ａ）。HiSeq2000（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）上で１００塩基対（ｂｐ）のペアードエンドシーケンシングによりＷＧＳを行った。SureSelect Human All Exon Kit（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いてエキソームシーケンシング用の試料調製を行い、試料をGenomeAnalyzer IIx（Illumina）上の７５ｂｐのペアードエンドシーケンシングに供した。Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）version 0.5.9(Bioinformatics. 2009; 25: 1754-1760)を用いて参照ヒトゲノム（ＵＣＳＣ  ｈｇ１９）に対するリードアラインメントを行った。SAMtools version 0.1.1610を用い、各被験者において一塩基変異型（ＳＮＶ）及びインデルを検出した。Applied Biosystems 3130及び3730 Genetic Analyzer（Life Technologies、米国カリフォルニア州カールスバド）を用いてサンガーシーケンシングにより、候補遺伝子の確認のために３４０名のＡＤＰＤ発端者、５１７名の孤発性ＰＤ患者、及び５５９名の対照被験者のゲノム配列を解析した。ExonPrimer（http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html）を用いてサンガーシーケンシング用プライマーを設計した。
【００２４】
（２）細胞培養及び形質移入
形質移入の前に、５日間（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）又は２４時間（ＨｅＬａ細胞）に亘り組織培養プレートに細胞を播種した。Lipofectamine 2000試薬（Life Technologies）を用い、製造業者の推奨に従って培養細胞に形質移入を行った。
【００２５】
（３）スプライシング解析
野生型（ｗｔ）及び突然変異ゲノムＣＨＣＨＤ２  ＤＮＡフラグメント（ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ、及びｃ．４３４Ｇ＞Ａ）を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Life Technologies）にクローニングし、その後ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−Ａ（Life Technologies）中のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩサイトに移行させ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＨＣＨＤ２（ｗｔ、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ、及びｃ．４３４Ｇ＞Ａ）を作製した。隣接するイントロン配列（上流に５２ヌクレオチド（ｎｔｓ）及び下流に１４ｎｔｓ）を有するＣＨＣＨＤ２エクソン２（ｗｔ及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ）をｐＳＰＬ３にサブクローニングしてｐＳＰＬ３−ＣＨＣＨＤ２（ｗｔ及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ）を作製した。ＴＲＩ試薬（Life Technologies）に続いてRQ1 DNase（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）処理を用い、形質移入から２４時間後に総ＲＮＡを抽出した。Superscript II逆転写酵素（Life Technologies）又はReverTra Ace（東洋紡株式会社、日本、大阪）を用いてランダムプライマーによりｃＤＮＡを合成した。形質移入されたｐｃＤＮＡスプライシングミニ遺伝子の突然変異誘発性エクソンスキッピングを検出するための増幅に２つのプライマー対を使用した。製造業者の指示書に従い、ＰＣＲ増幅フラグメントと共にRiboprobe in vitro転写システム（Promega）を用いてＣＨＣＨＤ２エクソン２の５’スプライス部位中に［α−３２Ｐ］−ＵＴＰ標識化ＲＮＡを合成した。Ohe他（Mol Cell Biol. 2010; 30: 2220-2228）の記載のようにＲＮＡ電気泳動移動度シフト解析を行った。精製されたＵ１  ｓｎＲＮＰは、Reinhard Luhrmann博士（Max Planck Institute）から寄贈された。
【００２６】
（４）抗体
本研究で使用した抗体は、抗ＣＨＣＨＤ２抗体（19424-1-AP、Proteintech、米国イリノイ州シカゴ）、抗α−チューブリン抗体（T9026、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）、抗アセチルヒストンＨ３抗体（06-599、Merck Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ）、抗Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ＮＤＵＦＡ９抗体（MS111、MitoSciences、米国オレゴン州ユージーン）、抗Ｔｏｍ２０抗体（sc-11415、Santa Cruz Biotechnology、米国テキサス州ダラス）、抗ＯＰＡ１抗体（612606、BD Biosciences、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗Ｈｓｐ６０抗体（SMC-110、StressMarq Biosciences、カナダ、バンクーバー州ビクトリア）、及び抗ＦＬＡＧ抗体（F1804、Sigma-Aldrich）を含む。
【００２７】
（５）局在性解析
Amo他（Biochem. J. 2007; 404: 345-351）に記載されるようにＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽腫細胞からのミトコンドリアの単離を行った。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来のミトコンドリアに富む画分を、氷上にて３０分間、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、又は含まないトリプシン（０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、及び１００μｇ）を用いて消化した。今井譲博士（順天堂大学）から提供されたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＣＨＣＨＤ２コーディング領域を増幅した。ｃＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１−Ｃ−３ｘＦＬＡＧへとクローニングした。Quikchange Lightning site-directed mutagenesis kit（Stratagene、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて部位特異的変異誘発を行い、ＣＨＣＨＤ２点突然変異（ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ、及びｃ．４３４Ｇ＞Ａ）を作出した。ＰＣＲにより欠失突然変異体（ΔＭＴＳ）を作出した。免疫蛍光顕微鏡法及び免疫電子顕微鏡法にはＨｅＬａ細胞を使用した。共焦点顕微鏡法により外因性ＣＨＣＨＤ２の局在を検出した。Hoechst 33258（Life Technologies）を用いて核を対比染色した。二次抗体として抗マウスイムノゴールド抗体（EM.GMTA10、BBI Solutions、英国カーディフ）を用いて、Ishikawa他(PLoS One 2014; 9: e94645)に記載されるように免疫電子顕微鏡解析を行った。
【００２８】
（６）統計学的解析
SNPHitLinkを用い、ハーディー−ワインベルク平衡Ｐ値＞０．０５、対照における最小コールレート１、最大信頼＞０．０２、最小区間１００ｋｂ、及び最小マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）０．２を有するＳＮＰを選択した。Merlinソフトウェア、及び疾患頻度０．００１を用いてパラメトリックマルチポイント連鎖解析を行った。罹患していない患者の兄弟姉妹及び子供達の表現型を０と表した（表現型なし）。５１７名の孤発性ＰＤ患者と５５９名の非罹患対照被験者との間でアレル頻度の有意性を算出するため多重検定に対するボンフェローニ補正によるカイ二乗検定を使用した。JMP 8（SAS Institute、米国ノースカロライナ州ドライブケーリー）を用いて、本研究で見出された変異型のオッズ比（ＯＲ）及び９５％信頼区間（ＣＩ）を算出した。全ての統計学的解析において、Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とした。
【００２９】
Ｂ．結果
次世代シーケンシングを用いて、我々は、４つの症例において累計２３０万を超える変異型を検出した。同定された変異型を以下の基準に従って選別した：（１）ポジティブ異質性ロッド値（ＨＬＯＤ）＞１を有する領域に位置する；（２）ｄｂＳＮＰ１３２を含まない；（３）エクソン部位又はスプライス部位に位置する；（４）異型接合状態で保有される；（５）非同義であるか、又は異常スプライシングを引き起こすと予想される；（６）サンガーシーケンシングによって確認される；及び（７）５００名を超える非罹患日本人対照（１０００対立遺伝子）には見出されない。１つの変異型のみがこれらの選別基準を満たした（表１）。
【００３０】
【表１】
0006468586.tif 000002
【００３１】
コイルド−コイル−ヘリックス−コイルド−コイル−ヘリックスドメイン２（ＣＨＣＨＤ２；参照配列アクセッション番号ＮＭ＿０１６１３９．２）における異型接合性ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）突然変異は、家系ＡにおいてＰＤと共に同時分離した（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＣＨＣＨＤ２は、染色体７ｐ１１．２上に位置し、予測されたＮ末端ミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）を含む１５１アミノ酸をコードする４つのエクソンを含む（図１Ｃ）。これらの結果に基づき、我々は、ＡＤＰＤに関する新たな遺伝子としてＣＨＣＨＤ２を提案する。ＣＨＣＨＤ２と家系Ａとの関連を確認するため、我々は、ＣＨＣＨＤ２の５’及び３’隣接領域をマッピングした６つのマイクロサテライトを用いて、パラメトリックマルチポイント連鎖解析を行った。Merlinによるパラメトリックマルチポイント連鎖解析より、Ｄ７Ｓ５０６においてＺｍａｘ３．００９を得た。
【００３２】
ＣＨＣＨＤ２がＡＤＰＤの真の原因遺伝子かどうかを特定するため、我々は、サンガーシーケンシングにより３４０名のＡＤＰＤ発端者をスクリーニングし、さらに３名のＣＨＣＨＤ２変異型を有する患者を検出した（家系Ｂ〜Ｄ、図１Ａ及び図１Ｂ）。３つの変異型のいずれも、５００名を超える非罹患日本人対照には見出されなかった（表２）。さらに、本研究で検出された３つの変異型のいずれも1000 Genomes、Exome variant server、the Human Genetic Variation Database、又はdbSNP138において見出されなかった（表２）。p.Thr61 Ile変異型が家系Ａ及びＣの患者において同定されたが、ハプロタイプ解析により独立した創始者が推定された。我々は、４つの独立したＡＤＰＤの家系において、全部で２つのミスセンス突然変異（ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、p.Thr61 Ile、及びｃ．４３４Ｇ＞Ａ、p.Arg145 Gln）及び１つのスプライス部位突然変異（ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ）を同定し、これはＣＨＣＨＤ２がＡＤＰＤの新規な原因遺伝子である可能性を示唆している。
【００３３】
【表２】
0006468586.tif 000003
【００３４】
Thr 61及びArg 145は脊椎動物間の保存残基（図１Ｃ）であり、この部位が機能的に重要であることが示唆されている。p.Thr61 Ile及びp.Arg145 Glnの置換は、Polyphen2（Nat. Methods 2010; 7: 575-576）、MutationTaster(Nat. Protoc. 2009; 4: 1073-1081)、及びSIFT(Nucleic Acid Res 2009; 37: e67)により損傷／疾患を引き起こすと予測されている。さらに、我々は、Human Splicing Finder（HSF; version 2.4.1）(Nucleic Acid Res 2007; 35: 5995-6003)を用いてｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異を解析し、それがＣＨＣＨＤ２スプライシングに影響を及ぼすかどうかを予測した。５’スプライス部位におけるｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異は、ＨＳＦスコアを８８．２から７６．０に減少し、ＭａｘＥｎｔスコアを６．７１から１．６２に減少した。ＳＤスコア(Hum. Mol. Genet 2008; 17: 4022-4035)も同様にｃ．３００＋５Ｇ＞Ａが異常スプライシングを引き起こし、スプライシング突然変異のようであると予測した。
【００３５】
この突然変異のいずれかが培養細胞におけるスプライシングに影響を及ぼすかどうかを特定するため、我々は、ｗｔ及び突然変異全長（４９２１ｂｐ）ゲノムＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクターにクローニングした。図２Ａに示されるように、エクソン２スプライシングは、ｐｃＤＮＡ−ＣＨＣＨＤ２  ｗｔ、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、又はｃ．４３４Ｇ＞Ａによって影響を受けなかったが、ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異はエクソン２スキッピングを引き起こした。いずれのクローンもエクソン３スプライシングに影響を与えなかった。ＣＨＣＨＤ２エクソン２及び隣接イントロンを改変されたエクソントラッピングベクターｐＳＰＬ３(J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1992; 55: 181-184)の２つの専用の構成エクソン（proprietary constitutive exons）の間に挿入することにより、ＨｅＬａ細胞においてｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異を更に解析した。図２Ｂは、この異型接合に関して、ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異がＣＨＣＨＤ２エクソン２除外を引き起こすことを示す。エクソン２が除外されたｍＲＮＡは、最後のエクソン接合部の２４ｎｔｓ上流に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を生じ、そのためにナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）に抵抗性のはずである。エクソンを含むバンド及びエクソンを含まない（exon-skipped）バンドの間の中間の移動度を有するバンドをシーケンシングし、ＣＨＣＨＤ２エクソン２のｃ．１６１における上流の隠れた（cryptic）５’スプライス部位の活性化に起因することが示された。最後のエクソン接合部の９８ｎｔｓ上流に作製されたＰＴＣによって、このｍＲＮＡがＮＭＤに供されると予測した。ＲＮＡ電気泳動移動度シフト解析を用いて、ｗｔ及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ突然変異５’スプライス部位へのＵ１  ｓｎＲＮＰ結合を試験した。ｗｔの５’スプライス部位ＲＮＡと比べ、ｃ．３００＋５Ｇ＞ＡについてＨｅＬａ核抽出物におけるＵ１  ｓｎＲＮＰ結合の減少が観察された（図２Ｃ、レーン４及び１１）。
【００３６】
ＣＨＣＨＤ２が孤発性ＰＤに対する感受性遺伝子であり得るかどうかを調査するため、我々は、５１７名の孤発性ＰＤ患者及び５５９名の非罹患対照被験者においてスプライス接合部を含む全てのＣＨＣＨＤ２エクソンをシーケンシングした。３つのＳＮＶ（ｒｓ１００４３、ｒｓ１４２４４４８９６、及びｒｓ８４０６）が、それぞれオッズ比  ０．４５（９５％ＣＩ、０．２７〜０．７５、ｐ＝３．９×１０-3）、オッズ比  ４．３７（９５％ＣＩ、１．５４〜１２．４０、ｐ＝７．５×１０-3）、及びオッズ比  ０．５８（９５％ＣＩ、０．３７〜０．８９、ｐ＝３．６×１０-2）の統計学的に異なる頻度を有することを確認した（表２）。我々の対照被験者におけるいくつかの変異型の頻度は、公的なデータベースと比較した場合にわずかに異なっていた（表２）。ＣＨＣＨＤ２変異型と孤発性ＰＤのリスクとの関連を確認するため、我々は、以前報告された日本人孤発性ＰＤに対する全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）(Nat Genet. 2009; 41: 1303-1307)を検査した。１つのＳＮＰ（ｒｓ８１６４１１）がＣＨＣＨＤ２のイントロン上に見出されたが、患者と対照被験者との間でその頻度に有意差はなかった（オッズ比、１．１７、９５％ＣＩ、０．９６〜１．１９、ｐ＝０．２２、コクラン−アーミテージの傾向検定）。
【００３７】
ＣＨＣＨＤ２は、予測されたＮ末端ＭＴＳを有することから、我々は、ＣＨＣＨＤ２がミトコンドリア中に位置するかどうかを特定した。細胞成分画分のウェスタンブロット解析により、内因性ＣＨＣＨＤ２がミトコンドリア中に存在することが明らかとなった（図３Ａ）。さらに、共焦点顕微鏡研究により、外因性に発現されたＣＨＣＨＤ２はミトコンドリアに局在するのに対し、ＭＴＳ欠失ＣＨＣＨＤ２はそうではないことが示された（図３Ｂ）。免疫電子顕微鏡法及びトリプシン消化アッセイは、ＣＨＣＨＤ２が主に膜間腔（ＩＭＳ）に局在することを示した（図３Ｃ及びＤ）。ｗｔとミスセンス突然変異体との間で局在の差異は観察されなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＣＨＣＨＤ２が、そのＮ末端ＭＴＳによって媒介されてミトコンドリアＩＭＳに局在化されることを示唆している。
【００３８】
ＣＨＣＨＤ２突然変異を有する患者の臨床的特徴を表３に要約する。発症時の平均年齢は５６．２±８．１歳（４０〜６７歳の範囲）であった。家系Ｃの２人（図１Ａ中Ｃ−ＩＩＩ−３及びＣ−ＩＶ−２）が主に、上肢の振戦様本態性振戦（ＥＴ）のみを示したが、他の患者は、英国Barin BankのＰＤ診断基準と明確に一致するレボドパ症状に対する反応と共に、動作緩慢、筋固縮、及び歩行障害を含む典型的なパーキンソン病様の特徴を呈した。さらに、我々は、異型接合性ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（p.Thr 61 Ile）突然変異を有する３名の無症候性保因者（図１Ａ中Ａ−ＩＩＩ−１８、Ａ−ＩＶ−５及びＡ−ＩＶ−８）を検出した。サンプリング時の彼らの年齢は、それぞれ５５歳、５６歳、及び３５歳であった。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
次世代シーケンシングによりＡＤＰＤの大規模な家系からミスセンス突然変異（ＣＨＣＨＤ２、ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、p.Thr 61 Ile）を同定した。ＣＨＣＨＤ２突然変異スクリーニングにより、３４１名のＡＤＰＤの独立家系のうち４名において３つのＣＨＣＨＤ２突然変異（ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ、p.Thr 61 Ile；ｃ．４３４Ｇ＞Ａ、p.Arg 145 Gln；及びｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ）を検出した。
ＣＨＣＨＤ２は、ミトコンドリア呼吸において重要な役割を果たし、ミトコンドリア内膜腔に局在し、シトクロムｃオキシダーゼ活性に関与する。よって、ＣＨＣＨＤ２遺伝子はミトコンドリア呼吸と強く結びついたパーキンソン病の第１原因遺伝子である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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