(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含む混合物を、粉砕処理により、メディアン径が１００ｎｍ以下の粒子状の組成物にする工程を含み、前記プテリジン誘導体が葉酸であることを特徴とする、α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記α−グルコシルルチンがα−モノグルコシルルチンである、請求項１に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記混合物がさらにイソケルシトリンを含有する、請求項２に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記粉砕処理が湿式粉砕処理である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記湿式粉砕処理がビーズミルを用いたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記粉砕処理が湿式粉砕処理であり、前記粒子状の組成物にする工程の後に、前記粒子状の組成物を含有するスラリーを乾燥粉末処理する工程をさらに含む、請求項４または５に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
前記乾燥粉末処理が凍結乾燥法を用いたものである、請求項６に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含有する、メディアン径が１００ｎｍ以下である粒子状の組成物であり、前記プテリジン誘導体が葉酸であることを特徴とする、α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【請求項９】
前記α−グルコシルルチンがα−モノグルコシルルチンである、請求項８に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【請求項１０】
前記組成物がさらにイソケルシトリンを含有する、請求項８または９に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子を含有する、食品、化粧品、医薬品または飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸に代表されるプテリジン誘導体を含有するナノ粒子の製造方法、および典型的にはその製造方法によって得られる、プテリジン誘導体を含有するナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
葉酸は、核酸およびアミノ酸の合成および代謝において、１つの炭素原子を含む断片の受け渡しを担っている必須の要素であり、先天性神経管閉塞障害のリスクの低下、心血管疾のリスクの減少、精神疾患との関係などにおける役割について注目されている。また、葉酸は、特定保健用食品のうち、疾病リスク低減に資する旨の表示が許可されており、通常の食品からの摂取量を踏まえ、特定保健用食品では１日あたりの摂取目安量が４００〜１，０００μｇと設定されている。このように、葉酸は医薬品またはそれに準ずる用途において魅力的な効果を有するが、水に溶けにくく（１０μｇ／ｍＬ以下）、また光、酸素、温度等によって分解しやすいという欠点を持つ。そのため、葉酸の水に対する溶解性を改善し、物理化学的な安定性を向上させるための手法が求められている。
【０００３】
特許文献１（特開２０１２−２２９１９４号公報）には、酵素処理ルチンと、スチルベン誘導体（レスベラトロール等）、クルクミノイド（クルクミン等）、プテリジン誘導体（葉酸等）およびプリン誘導体（グアニン等）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物とを含む溶解性組成物が記載されている。実施例では、そのような溶解性組成物を調製することで、酵素処理ルチンを水中で併存させることにより、葉酸等の上記所定の化合物の水に対する溶解度が向上するとともに、経時での沈殿の発生を抑制し、光照射に対する分解も抑制するといった溶解安定性も向上することが例証されている。また、特許文献１の実施例には、まず葉酸を５％ＮａＯＨ水溶液に溶解させて１％の葉酸溶液を調製し、該葉酸溶液に１％の酵素処理ルチンの水溶液を加えて攪拌した後、所定のｐＨのクエン酸緩衝液を加えることで得られた葉酸水溶液は、５時間静置しても沈殿が生じず、透明な溶液であることが開示されている。さらに葉酸の水溶液における光安定性も向上することが開示されている。いずれの実施例においても、葉酸に対して重量比で２倍以上の酵素処理ルチンが使用されている。また、実施例には、ＮａＯＨ水溶液を用いたのは、高ｐＨにすることにより、葉酸の溶解性を向上させるためであることが記載されている。
【０００４】
このように、特許文献１に開示の技術では、溶解安定性や光安定性の向上した葉酸の水溶液を得るためには、酵素処理ルチンの水溶液と混合する前に、高ｐＨの工程を経る必要がある。この場合、高ｐＨの工程を経るために、葉酸そのものが不安定になる環境に晒されるという問題や、高ｐＨの溶液に溶解しにくい化合物には適用できないという問題がある。また、溶解性の改善の効果にはまだ改良の余地もある。
【０００５】
特許文献２（特開２０１５−０３０６９０号公報）には、酵素処理ルチンと、プテリジン誘導体（特に葉酸）を含有する、生体吸収性が向上した組成物が記載されている。特許文献２には、葉酸の水への溶解度についての記載はなく、また混合を粉砕処理によって行うことについての記載もないが、実施例では、酵素処理ルチン（αＧルチンＰＳ）９ｍｇと葉酸１ｍｇとデキストリン９０ｍｇとを常温かつ常圧で十分に混合して組成物を得たことが開示されている。
【０００６】
特許文献３（特表２０１３−５４０７３７号公報）には、その背景技術の記載において、難溶性薬物の溶解性を高めてその吸着（吸収）及び生物学的利用能を増加させるための一般的な方法として、薬物粒子サイズを縮小すること、すなわちナノ粒子化することが知られているが、高い表面エネルギーを有するナノ粒子は容易に凝集してしまうという問題点を有することが記載されている。そして、その問題を解消するための医薬または化粧品組成物として、ナノ多孔性葉酸（葉酸およびシリカ前駆体を含有する溶液を調製し、熱処理をしてシリカ前駆体を加水分解および凝集させることにより得られる、規則性メソポーラス材料：特許文献４（特表２０１１−５１４３０２号公報）参照）の粒子のナノ多孔性チャンネル内部に、難水溶性の医薬有効成分を組み込んだ組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−２２９１９４号公報
【特許文献２】特開２０１５−０３０６９０号公報
【特許文献３】特表２０１３−５４０７３７号公報
【特許文献４】特表２０１１−５１４３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、粒子径が小さくかつ経時的な凝集を抑制した、葉酸等のプテリジン誘導体のナノ粒子の製造方法、および典型的にはその製造方法によって得られる、プテリジン誘導体のナノ粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、葉酸等のプテリジン誘導体とα−グルコシルルチンとを特定の比率で含む混合物を粉砕処理することにより、粒子径がナノメートルオーダーの微粒子を調製することができること、それによって当該プテリジン誘導体の水中での凝集が抑制され、水に対する溶解性が著しく改善されること、さらには光に対する安定性も改善されることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一側面において、下記の［１］〜［９］に係るα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法が提供され、別の側面において下記の［１０］〜［１８］に係るα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子が提供され、さらなる側面において下記の［１９］に係る食品、化粧品、医薬品または飼料が提供される。
【００１１】
［１］
プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含む混合物を、粉砕処理により、メディアン径が１０００ｎｍ以下の粒子状の組成物にする工程を含むことを特徴とする、α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１２】
［２］
前記プテリジン誘導体が葉酸である、項１に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１３】
［３］
前記α−グルコシルルチンがα−モノグルコシルルチンである、項１または２に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１４】
［４］
前記混合物がさらにイソケルシトリンを含有する、項３に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１５】
［５］
前記粒子状の組成物のメディアン径が１００ｎｍ以下である、項１〜４のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１６】
［６］
前記粉砕処理が湿式粉砕処理である、項１〜５のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１７】
［７］
前記湿式粉砕処理がビーズミルを用いたものである、項１〜６のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１８】
［８］
前記粉砕処理が湿式粉砕処理であり、前記粒子状の組成物にする工程の後に、前記粒子状の組成物を含有するスラリーを乾燥粉末処理する工程をさらに含む、項６または７に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００１９】
［９］
前記乾燥粉末処理が凍結乾燥法を用いたものである、項８に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法。
【００２０】
［１０］
プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含有する混合物を粉砕処理することにより得られる、メディアン径が１０００ｎｍ以下である粒子状の組成物であることを特徴とする、α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２１】
［１１］
前記プテリジン誘導体が葉酸である、項１０に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２２】
［１２］
前記α−グルコシルルチンがα−モノグルコシルルチンである、項１０または１１に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２３】
［１３］
前記混合物がさらにイソケルシトリンを含有する、項１０〜１２のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２４】
［１４］
前記粒子状物質のメディアン径が１００ｎｍ以下である、項１０〜１３のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２５】
［１５］
前記粉砕処理が湿式粉砕処理である、項１０〜１４のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２６】
［１６］
前記湿式粉砕処理がビーズミルを用いたものである、項１５に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２７】
［１７］
前記粉砕処理が湿式粉砕処理であり、前記粒子状の組成物が、それを含有するスラリーの乾燥粉末である、項１５または１６に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２８】
［１８］
前記乾燥粉末処理が凍結乾燥法を用いたものである、項１７に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子。
【００２９】
［１９］
項１０〜１８のいずれか一項に記載のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子を含有する、食品、化粧品、医薬品または飼料。
【００３０】
なお、上記所定量のプテリジン誘導体およびα−グルコシルルチンを含む混合物を「粉砕処理することにより得られる」本発明に係る粒子状の組成物は、粉砕処理の過程において微粒子化されたプテリジン誘導体とα−グルコシルルチンとの間に相互作用が働いていると考えられ、その強度や形態は、単純に原末を混合したときとは相違している可能性があるが、現時点でその詳細は特定されていない。また、本発明に係る粒子状の組成物は、メディアン径が１０００ｎｍ以下であるという点で、メディアン径が通常１０００ｎｍよりも大きい、粉砕処理が施されていない葉酸の粉末（葉酸原末）からなる混合物とは異なる特性を有するが、そのようなメディアン径以外にも、たとえば“粉末Ｘ線回折により確認される葉酸に由来する回折ピークが葉酸原末よりも低い、ないしほとんど確認できない”（図５参照）といった特徴や、“粒度分布（体積分布）の形状が葉酸原末よりも正規分布に近い”（図２参照）といった特徴を有している。したがって、本発明に係る粒子状の組成物は、必要に応じて「粉砕処理することにより得られる」という文言を削除したり、当該文言に代えて“粉末Ｘ線回折により確認される葉酸に由来する回折ピークが葉酸原末よりも低い、ないしほとんど確認できない”および／または“粒度分布（体積分布）の形状が葉酸原末よりも正規分布に近い”などの文言を用いて規定したりすることも可能である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子は、プテリジン誘導体単独のナノ粒子よりも粒子径が小さくでき、かつ粒子の経時的な凝集も抑制することができる。さらに、プテリジン誘導体の溶解性も改善することができ、たとえばメディアン径が１００ｎｍ以下であるα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子を水中に分散させた状態は、実質的にプテリジン誘導体が水中に溶解しているのと同じような状態といえる。
【００３２】
また、本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子は粉砕処理、例えばビーズミルを用いた湿式粉砕処理により製造することができるが、α−グルコシルルチンが粉砕補助作用を発揮し、長時間（例えば３００分間）処理を継続しても粒子の凝集が起きず、平均粒子径を極めて小さな範囲（例えば１００ｎｍ以下）に収めることができる。さらに、湿式粉砕処理の際には比較的長時間に亘って（例えば１８０分間）光に曝されることがあるが、α−グルコシルルチンの作用によりプテリジン誘導体の光安定性も向上し、粉砕処理終了時点でも粉砕処理開始時点とほぼ同量のプテリジン誘導体の含有量を維持することができる。本発明においては、葉酸に対するα−グルコシルルチンの添加量が比較的少量でも、例えば葉酸：α−グルコシルルチンの重量比が１：０．９であっても、分散（溶解）安定性や光安定性についての作用効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、実験例１で測定した各試験物のメディアン径（Ｄ50）の測定結果を表すグラフである。測定値は３サンプルの平均値であり、バーが付いているものはその標準誤差を表す。
【図２】図２は、実験例１で測定した葉酸原末および試料５（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１０のビーズミル処理物）の粒子径分布を表すグラフである。
【図３】図３は、実験例３で測定した各試験物中の葉酸の溶解度を表すグラフである。対照２〜５はいずれも、葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１０の混合物を用いて調製されたものである。ビーズミル処理物である試料４および５のカッコ内の数値は、葉酸：αＧルチンＰＳの比率を表す。
【図４】図４は、実験例４で行った各試験物中の葉酸の光安定性試験の結果を表すグラフである。試料１〜４はいずれもビーズミル処理物であり、試料２，４，５のカッコ内の数値は葉酸：αＧルチンＰＳの比率を表す。
【図５】図５は、実験例５で測定した粉体Ｘ線回折の結果を表すチャートである。試料１〜４はいずれもビーズミル処理物であり、試料２，４および５ならびに「物理混合」のカッコ内の数値は葉酸：αＧルチンＰＳの比率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
−α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子−
本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子（本明細書において「本発明のナノ粒子」と略称することもある。）は、プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含有する混合物を粉砕処理することにより得られる、メディアン径が１０００ｎｍ以下である粒子状の組成物である。
【００３５】
ここで、プテリジン誘導体の代表例である葉酸の分子量は約４４１であり、α−グルコシルルチンの典型例であるα−モノグルコシルルチンの分子量は約７７３であるので、「プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上」という規定は、上記代表例および典型例を用いた換算に基づいて、「プテリジン誘導体１モルに対して０．５モル以上」（４４１×０．９／７７３＝０．５１）と言い換えることができる。
【００３６】
プテリジン誘導体１重量部に対するα−グルコシルルチンの含有量の上限値は特に定められるものではなく、本発明の作用効果を奏する範囲で適宜調節することができる。例えば、本発明のナノ粒子は、プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを９重量部、またはそれ未満の量で含有する混合物を粉砕処理することにより得られるものであってもよい。
【００３７】
＜プテリジン誘導体＞
プテリジン誘導体は、下記式（Ａ１）で表される化合物である。
【００３８】
【化１】
0006612081.tif 000002
式（Ａ１）中の各記号の詳細は、以下のとおりである。
【００３９】
Ｒ1は、−ＯＨ、＝Ｏまたは−ＮＨ2である。Ｒ2、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立に水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。Ｒ3、Ｒ6およびＲ7は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルデヒド基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、シアノ基またはニトロ基である。ａ〜ｄは、それぞれ独立に０または１である。ｅは、０〜１０の整数である。
【００４０】
（１）〜（５）の結合は、以下の場合を除き、単結合である。
（１）の結合は、Ｒ1が＝Ｏ以外の基であり、かつ、ａが０の場合、二重結合である。
（２）の結合は、（１）の結合が単結合であり、かつ、ａが０の場合、二重結合である。
（３）の結合は、（２）の結合が単結合であり、かつ、ｂが０の場合、二重結合である。
（４）の結合は、ｃが０の場合、二重結合である。
（５）の結合は、ｄが０の場合、二重結合である。
【００４１】
Ｒ3、Ｒ6およびＲ7において、アルキル基としては、例えば、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状の炭化水素基が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基およびペンチル基が挙げられ；アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基およびエトキシ基が挙げられ；アルコキシアルキル基としては、例えば、ジエトキシメチル基が挙げられ；アルキルエステル基としては、例えば、メチルエステル基およびエチルエステル基が挙げられ；アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基およびジメチルアミノ基が挙げられる。
【００４２】
Ｒ2、Ｒ4およびＲ5における炭素数１〜５のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基およびブチル基が挙げられる。
Ｒ3は水素原子、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基またはアミノ基であることが好ましく、アミノ基であることがより好ましく、Ｒ6は水素原子またはアルデヒド基であることが好ましく、Ｒ7は水素原子、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アミノ基またはアルキルアミノ基であることが好ましく、水素原子またはアルキル基であることがより好ましく、ｅは１または２であることが好ましい。
【００４３】
プテリジン誘導体の具体例としては、プテロイルモノグルタミン酸（葉酸）、プテロイルジ−γ−グルタミン酸、プテロイルトリグルタミン酸、プテロイルヘプタグルタミン酸、ホルミルテトラヒドロ葉酸、キサントプテリン、１０−ホルミルプテロイン酸、フォリン酸、メトトレキサートが挙げられる。これらの中でも、酵素処理ルチンを用いてナノ粒子化したときの、水に対する溶解性の改善効果に優れる観点から、また食品等の用途に対する有用性の観点から、葉酸（下記式参照）が好ましい。
【００４４】
【化２】
0006612081.tif 000003
＜α−グルコシルルチンおよびイソケルシトリン＞
【００４５】
【化３】
0006612081.tif 000004
α−グルコシルルチンは、「酵素処理ルチン」（「糖転移ルチン」と呼ばれることもある。）として知られている製品に主成分として含まれている化合物であって、式（III）で表される構造を有する化合物、すなわちルチンが有するルチノース残基中のグルコース残基に、α１→４結合により１または複数（２〜２０程度）のグルコースが結合した化合物である。本明細書において、α−グルコシルルチンのうち、グルコースが１つだけ結合したものを「α−モノグルコシルルチン」と称し、グルコースが２つ以上結合したものを「α−ポリグルコシルルチン」と称する。つまり、式（III）において、α−グルコシルルチンは一般的にｎが１〜２０の化合物であり、α−モノグルコシルルチンはｎが１の化合物であり、α−ポリグルコシルルチンは一般的にｎが２〜２０の化合物である。α−モノグルコシルルチンであっても、本発明の作用効果およびα−グルコシルルチンについての一般的な作用効果は問題なく発揮され、α−モノグルコシルルチンの分子量はα−ポリグルコシルルチンの分子量よりも小さいため、単位質量あたりの分子数はα−モノグルコシルルチンの方が多くなり、作用効果の上で有利であると考えられる。したがって、α−グルコシルルチンの一部または全部は、α−モノグルコシルルチンであることが好ましい。
【００４６】
酵素処理ルチンは、α−グルコシル糖化合物（サイクロデキストリン、澱粉部分分解物など）の共存下で、ルチンに糖転移酵素（サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase, EC 2.4.1.19）など、ルチンにグルコースを付加する機能を有する酵素）を作用させることにより得られる生成物（本明細書において「第１酵素処理ルチン」と呼ぶ。）である。第１酵素処理ルチンは、結合したグルコースの個数が異なる様々なα−グルコシルルチン、すなわちα−モノグルコシルルチンおよびそれ以外のα−グルコシルルチンからなる集合体と、未反応物であるルチンとを含有する組成物である。必要に応じて、例えば多孔性合成吸着材と適切な溶出液を用いて、第１酵素処理ルチンを精製することにより、糖供与体およびその他の不純物を除去し、さらにルチンの含有量を減らし、α−グルコシルルチンの純度を高めた第１酵素処理ルチン（α−グルコシルルチン精製物）が得られる。
【００４７】
また、第１酵素処理ルチンを、α-１,４-グルコシド結合をグルコース単位で切断するグルコアミラーゼ活性を有する酵素、たとえばグルコアミラーゼ（EC 3.2.1.3）で処理し、複数のグルコースが付加されたα−グルコシルルチンにおいて、ルチン自体の（ルチノース残基中の）グルコース残基に直接付加されたグルコース残基を１つだけ残してそれ以外のグルコース残基を切断することにより、α−モノグルコシルルチンを多く含有する酵素処理ルチン（本明細書において「第２酵素処理ルチン」と呼ぶ。）を得ることができる。この酵素処理によって、ケルセチン骨格に直接結合しているルチノース残基中のグルコース残基が、ケルセチン骨格から切断されることはない。
【００４８】
一方、イソケルシトリン（「イソクエルシトリン」と呼ばれることもある。）は、式（II）で表される構造を有する化合物、すなわちケルセチン骨格の７位の水酸基にβ−Ｄ−グルコースが結合した化合物、言い換えればルチンのルチノース残基中のラムノース残基が切断された化合物である。イソケルシトリンは、ルチンにラムノシダーゼ活性を有する酵素（たとえばヘスペリジナーゼ、ナリンギナーゼ）を作用させることにより産生することができるほか、次に述べるα−グルコシルイソケルシトリンを、α-１,４-グルコシド結合をグルコース単位で切断するグルコアミラーゼ活性を有する酵素、たとえばグルコアミラーゼ（EC 3.2.1.3）で処理し、ケルセチン骨格に直接結合するグルコース残基（もともとルチンにおけるルチノース残基に含まれていたグルコース残基）のみを残してそれ以外のグルコース残基を切断することにより産生することもできる。
【００４９】
また、α−グルコシルイソケルシトリンは、式（IV）で表される構造を有する化合物、すなわちイソケルシトリンが有する（ルチノース残基に含まれていた）グルコース残基に、α１→４結合により１または複数（２〜２０程度）のグルコースが結合した化合物である。α−グルコシルイソケルシトリンは、α−グルコシルルチンにラムノシダーゼ活性を有する酵素（たとえばヘスペリジナーゼ、ナリンギナーゼ）を作用させることにより、またはイソケルシトリンに糖転移酵素（例えばサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase, EC 2.4.1.19））などを作用させることにより産生することができる。
【００５０】
α−グルコシルルチンは、例えば東洋精糖株式会社の製品「αＧルチンＰＳ」、「αＧルチンＰ」、「αＧルチンＨ」などに主成分として含まれている。このうち「αＧルチンＰＳ」は、α−モノグルコシルルチンを８０〜９０重量％、イソケルシトリンを５〜１０重量％含有する組成物である。このような組成物は、（ｉ）上述した第１酵素処理ルチンを調製する、（ｉｉ）第１酵素処理ルチンを、グルコアミラーゼ活性を有する酵素で処理し、α−グルコシルルチンをほとんど全てα−モノグルコシルルチンに変換する、（ｉｉｉ）同時にラムノシダーゼ活性を有する酵素で処理し、未反応のルチンをほとんど全てイソケルシトリンに変換する、という手順により製造することができる。本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子を製造するための、粉砕処理に供される混合物を調製する際には、α−グルコシルルチンとして上記の各製品、例えば「αＧルチンＰＳ」を配合することができる。したがって、粉砕処理に供される混合物は、α−グルコシルルチンに加えて、さらにイソケルシトリンを含有していてもよい。
【００５１】
なお、上述したような組成物ないし製品について、そこに含まれるルチン、α−グルコシルルチン、イソケルシトリンなどの成分はＨＰＬＣのクロマトグラムによって確認することができ、各成分の含有量、または特定の成分の純度は、クロマトグラムのピーク面積から算出することができる。
【００５２】
＜ナノ粒子＞
本発明のナノ粒子のメディアン径（Ｄ50）は１０００ｎｍ以下であり、好ましくは１００ｎｍ以下である。本発明におけるメディアン径（Ｄ50）は、動的光散乱法に従って測定を行う装置、例えば「ナノトラック粒度分析計」（日機装株式会社）を用いて測定された、粒子径分布に基づいて算出される値として定義される。
【００５３】
本発明のナノ粒子は、プテリジン誘導体およびα−グルコシルルチンを所定の割合で含有する混合物を粉砕処理することによって得られるものである。そのような粉砕処理物は、メディアン径が１０００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下であるとともに、“粉末Ｘ線回折により確認される葉酸に由来する回折ピークが葉酸原末よりも低い、ないしほとんど確認できない”（図５参照）といった特徴や、“粒度分布（体積分布）の形状が葉酸原末よりも正規分布に近い”（図２参照）といった特徴を有している。
【００５４】
また、本発明のナノ粒子、すなわち粉砕処理により得られる粒子状の組成物の携帯は特に限定されるものではなく、たとえば粉砕処理が（特にビーズミルを用いた）湿式粉砕処理により得られるものであれば、湿式粉砕処理後のスラリー状のままの組成物であってもよいし、そのスラリーを乾燥して粉体化した組成物であってもよい。
【００５５】
−α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法−
本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の製造方法は、プテリジン誘導体１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上含む混合物を、粉砕処理により、メディアン径が１０００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の粒子状の組成物にする工程を含む。
【００５６】
上記の混合物からメディアン径が上記の範囲にある粒子状の組成物が得られる限り、粉砕処理のための手法は特に限定されるものではないが、例えば湿式粉砕処理、特にビーズミルを用いた湿式粉砕処理は、そのような範囲のメディアン径を有する粒子状の組成物を調製しやすいことから、本発明のナノ粒子を製造するための手法として好ましい。
【００５７】
ビーズミルを用いた湿式粉砕処理を行うための装置は特に限定されるものではなく、ナノサイズの粒子を調製できるもの（いわゆるナノ分散機）の中から適宜選択することができるが、例えば「ウルトラアペックスミル」（寿工業株式会社）が好ましい装置の一つとして挙げられる。ウルトラアペックスミルは、ビーズとスラリーの分離に遠心力のみを利用したセントリセパレータ（スクリーンレス）とビーズを撹拌するロータピンから構成された、非常にシンプルな装置である。運転により、ミル内に充填したビーズがロータピンにより撹拌されている中、凝集粒子スラリー（すなわちあらかじめ調製しておいた前記所定の混合物）が分散機下部より投入され、機内で激しく運動しているビーズとの接触により分散されながら分散機上部に到達する。到達した製品スラリー（すなわち本発明による粒子状の組成物）とビーズは、セントリセパレータにより比重差で遠心分離され、ビーズは機内に留まり、製品スラリーのみが中空軸を経由して、機外に排出される。ミル以外の構成要素として原液ポンプ、スラリータンクがあり、一般的な運転方法として、排出された製品スラリーは、スラリータンクに戻り、再度、原液ポンプによりミルに戻される循環運転方式になっている。このような「ウルトラアペックスミル」は、ナノ分散を効率的に行えること、α−グルコシルルチンおよびプテリジン誘導体に対する熱的影響が小さいこと、ビーズの詰まりや噛み込みが起こらず安定した運転が行えること、原料スラリーの前分散をほとんど必要とせず工程の簡略化が図れること、などの特徴を有する。
【００５８】
ビーズミルを用いた湿式粉砕処理のための適切な条件、例えば用いるビーズの粒子径および量、回転速度、原料スラリーの供給速度などは、使用する装置などに応じて、当業者であれば適宜調節することができる。
【００５９】
本発明の製造方法は、所定の粉砕処理、好ましくは湿式粉砕処理、特にビーズミルを用いた湿式粉砕処理の工程を行った後、必要に応じて、製品スラリーを乾燥粉末処理するための工程をさらに含んでいてもよい。この際の乾燥粉末処理は、一般的な乾燥法に従って行うことができるが、例えば凍結乾燥法（フリーズドライ法）は、プテリジン誘導体に熱によるダメージを与えることなく、良好な再分散性を呈する粉体を調製することができることから、本発明のナノ粒子を粉体化するための手法として好ましい。凍結乾燥法およびその他の乾燥法の適切な条件も、使用する装置などに応じて、当業者であれば適宜調節することができる。
【００６０】
−α−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子の用途−
本発明のα−グルコシルルチン含有プテリジン誘導体ナノ粒子水溶性組成物は、それに含まれるプテリジン誘導体、例えば葉酸の用途に応じて、各種の食品、化粧品、医薬品および飼料などに添加して用いることができる。食品、化粧品、医薬品および飼料は、それ自体が水溶液または分散液の形態であってもよいし、それ自体は水溶液または分散液ではないが、プテリジン誘導体が有効成分として生体内に吸収されることを意図して摂取されるまたは体内もしくは体外に適用される、固形状、あるいは水溶液または分散液以外の液状の形態であってもよい。
【００６１】
食品（栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、およびそれ以外のいわゆる健康食品を含む。）としては、例えば、発酵食品、パン類、漬物、乾物、練り製品、粉類、缶詰、冷凍食品、レトルト食品、インスタント食品（即席麺、ドライ・フーズ、粉末飲料等）、乳製品（加工乳、脱脂粉乳等）、魚肉加工品、畜産加工品等の加工食品；菓子類等の嗜好食品；油脂類、甘味料、調味料、香辛料等の調理・調味用材料；サプリメント；特別用途食品（病者用食品、高齢者用食品、育児用食品）；ゲル化剤や膨張剤等の加工材料；保存食；非常食；宇宙食；水、清涼飲料水、アルコール飲料、茶、コーヒー等の飲料などが挙げられる。
【００６２】
化粧品（医薬部外品に該当する薬用化粧品を含む。）としては、例えば、パウダー、乳液、リキッド、クリーム、ローション等の皮膚外用剤（ファンデーション、日焼け止め、スキンローション、口紅、香水等）；歯磨剤、マウスウォッシュ、うがい薬等の口腔用組成物；石鹸、ボディソープ、シャンプー、リンス等の洗浄用組成物；頭髪剤、育毛剤等の頭髪用組成物などが挙げられる。
【００６３】
医薬品としては、例えば、錠剤、散剤（細粒剤、顆粒剤等）、カプセル剤、ドリンク剤、シロップ剤、トローチ剤等の内服薬；外用薬；および注射剤が挙げられる。
飼料としては、例えば、実験用、家畜・養殖用または愛玩・観賞用（ペット）の哺乳類またはその他の動物用の飼料が挙げられる。
【００６４】
このような本発明の食品、化粧品、医薬品および飼料に配合される、本発明のナノ粒子の添加量は、それに含まれるプテリジン誘導体、α−グルコシルルチン、およびその他の成分の効能を考慮して適宜設定すればよい。また、本発明の食品、化粧品、医薬品および飼料は、適切な段階で本発明の水溶性組成物を添加すること以外は、基本的には従来と同じ方法で製造することができ、必要に応じて各種の添加剤を併用することもできる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例等で用いた東洋精糖(株)製の商品「αＧルチンＰＳ」は、α−モノグルコシルルチン９０重量％、イソケルシトリン１０重量％を含有する組成物である。
［実験例１］メディアン径（Ｄ50）の測定
原料１：葉酸５００ｍｇを水５００ｍＬに分散させた分散液（１ｍｇ葉酸／ｍＬ）
原料２：葉酸５００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」５０ｍｇを水５００ｍＬに分散させた分散液（１ｍｇ葉酸／ｍＬ，葉酸：α−グルコシルルチン＝１：０．０９）
原料３：葉酸５００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」２５０ｍｇを水５００ｍＬに分散させた分散液（１ｍｇ葉酸／ｍＬ，葉酸：α−グルコシルルチン＝１：０．４５）
原料４：葉酸５００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」５００ｍｇを水５００ｍＬに分散させた分散液（１ｍｇ葉酸／ｍＬ，葉酸：α−グルコシルルチン＝１：０．９）
原料５：葉酸５００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」５０００ｍｇを水５００ｍＬに分散させた分散液（１ｍｇ葉酸／ｍＬ，葉酸：α−グルコシルルチン＝１：９）
上記原料１〜５を調製した後、それぞれをナノ分散機「ウルトラアペックスミル」（壽工業株式会社、ビーズ：φ０．１ｍｍのジルコニアビーズ、４００ｇ；回転速度：４１．６Ｈｚ；供給速度：１５０ｍＬ／分）に供給し、ビーズミルを用いた湿式粉砕処理を３００分間行った。湿式粉砕処理の開始時、終了時、および途中の所定の時点で試料を３つずつ採取し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計「ＵＰＡ−ＵＴ１５１」（日機装株式会社）を用いて粒子径分布を測定し、メディアン径を算出した。
【００６６】
各原料に対応するビーズミル処理物（試料１〜５）のメディアン径の測定結果を図１に示す。また、３００分処理後の試料１および２の粒子径分布を図２に示す。試料４および５は、処理開始から３００分の時点（終了時点）で、処理工程を通じての最小値である、約８０ｎｍのメディアン径に到達した。一方、試料１，２および３は、途中まではメディアン径が減少していったが、処理開始から２５０分および３００分の時点ではメディアン径が増加に転じ、粉砕処理物の凝集が起きたことが示唆されている。これらの結果から、葉酸１重量部に対してα−グルコシルルチンを０．９重量部以上配合した場合に、α−グルコシルルチンの粉砕補助作用が認められ、１００ｎｍ以下のメディアン径を達成できることが分かる。
【００６７】
［実験例２］分散安定性試験
実験例１で得られた試料１〜５（３００分処理後）を用いてフリーズドライを行い、それぞれの凍結乾燥粉末を得た。フリーズドライは、まず低温水層「ＰＦＲ−１０００」（ＥＹＥＬＡ）で予備凍結（−４０℃）し、その後、凍結乾燥器「ＦＤＵ−８３０」（ＥＹＥＬＡ）にて３０Ｐａ以下に減圧し、２４時間処理をすることにより行った。各凍結乾燥粉末について、葉酸の含有量が５ｍｇに相当する量を水９００ｍＬに添加し、日本薬局方（ＪＰ１６）に対応した溶出試験機「ＮＴＲ−８０００ＡＣ」（富山産業株式会社）を用いて、３７℃でパドル法（５０ｒｐｍ）により撹拌し、再分散させた。
【００６８】
３００分のビーズミル処理直後の試料１〜５と、それぞれに対応する、２４時間室温で放置した後の試料および上記のようにして得られた凍結乾燥粉末の再分散液について、実験例１と同じ装置を用いて粒子径分布を測定し、メディアン径（Ｄ50）を算出した。
【００６９】
結果を表１に示す。試料４および５については、室温放置２４時間後においても凝集は認められなかった。このことから、葉酸１重量部に対して「αＧルチンＰＳ」を１重量部以上、つまりα−グルコシルルチンに換算すると０．９重量部以上含有する混合物を粉砕処理することにより得られるナノ粒子は、凍結乾燥粉末にしても良好な再分散性を呈することが分かる。
【００７０】
【表１】
0006612081.tif 000005
【００７１】
［実験例３］溶解度の測定
実験例２と同様の手順で得られた試料１（葉酸のビーズミル処理物）、試料４（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１のビーズミル処理物）および試料５（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１０のビーズミル処理物）それぞれの凍結乾燥粉末について、葉酸の含有量が５０ｍｇに相当する量を３７℃の水２５ｍＬに添加し（葉酸の仕込み量２ｍｇ／ｍＬ）、１００ストローク／分でインキュベーションを行った。また、下記の対照１〜５についても、上記と同様にしてインキュベーションを行った。
【００７２】
対照１：葉酸原末。
対照２：葉酸５００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」５０００ｍｇ（重量比１：１０）を、粉末のまま乳鉢で混合した物理混合粉末。
対照３：葉酸１００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」１０００ｍｇ（重量比１：１０）を、ボールミルで粉砕処理して得られた粉砕処理物。上記原料および精製水２ｍＬを遊星型ボールミル「Ｐ−６  クラシックライン」（フリッチュ・ジャパン株式会社；ボール：ジルコニア製，φ＝５ｍｍ，１０個；回転数：５００ｒｐｍ）に供給し、ボールミルを用いた粉砕処理を３０分間行った。
対照４：葉酸２００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」２０００ｍｇ（重量比１：１０）を含有する溶液を、ロータリーエバポレーターで蒸発させて得られた粉末。原料溶液は次の手順（ｉ）〜（iii）により調製した。（ｉ）葉酸２００ｍｇをエタノール７５ｍＬに溶解、懸濁した。（ii）「αＧルチンＰＳ」２０００ｍｇを水１００ｍＬに溶解した。（iii）上記（ｉ）および（ｉｉ）の溶液を混合し、原料溶液とした。この原料溶液を、ロータリーエバポレーター「Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（登録商標）Ｒ−３」（Ｂｕｃｈｉ社）に供給し、エバポレーションを行った。
対照５：葉酸２００ｍｇおよび「αＧルチンＰＳ」２０００ｍｇ（重量比１：１０）を含有する溶液を、スプレードライヤーで噴霧乾燥して得られた粉末。原料溶液は次の手順（ｉ）〜（iii）により調製した。（ｉ）葉酸２００ｍｇをエタノール７５ｍＬに溶解、懸濁した。（ii）「αＧルチンＰＳ」２０００ｍｇをエタノール１７５ｍＬに溶解した。（iii）上記（ｉ）および（ｉｉ）の溶液を混合し、原料溶液とした。この原料溶液を、スプレードライヤー「Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０」（Ｂｕｃｈｉ社；フローレート：３５Ｌ／分、ポンプレート：５．５Ｌ／分；入口温度：１２０℃、出口温度：６５〜７５℃；アスピレーション：１００％，ポンプ：３０％）にて噴霧乾燥した。
【００７３】
インキュベーション開始時と、２４時間のインキュベーション終了時に、試料１，４および５ならびに対照１〜５の各溶液に含まれる葉酸の量をＨＰＬＣを用いて測定した。
結果を図３に示す。試料４および５については、葉酸の溶解性が大幅に改善され、葉酸原末と比較して溶解度は１００倍以上（最大１８３倍）に向上することが分かる。
【００７４】
［実験例４］光安定性試験
［４−１］
前記原料１（葉酸のみ）および前記原料４（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１の混合物）について、実験例１に準じて、ビーズミルを用いた湿式粉砕処理を１８０分間行い、湿式粉砕処理の前後における葉酸の含有量をＨＰＬＣによって測定した。なお、湿式粉砕処理をする際に、光の照射に対する保護は行わなかった。その結果、原料１を用いた場合は湿式粉砕処理後の葉酸の含有量は湿式粉砕処理前の約５０％に減少したのに対し、原料４を用いた場合は湿式粉砕処理後の葉酸の含有量は湿式粉砕処理前の約１００％を保持していた。
【００７５】
［４−２］
実験例２と同様の手順で得られた試料１，２，４および５（３００分処理後）それぞれの凍結乾燥粉末を用いて、凍結乾燥粉末（固体状態）およびその再分散液（溶液状態）の光安定性を試験した。この光安定性試験は、「新原薬及び新製剤の光安定性試験ガイドライン」（ＩＣＨ−Ｑ１Ｂ）に準拠した条件で行った。すなわち、総照射量１２０万Ｌｘ・ｈ、総照射エネルギー２００Ｗ／ｍ2の光を固体状態、溶液状態それぞれの試料に照射し、照射前後における葉酸の含有量をＨＰＣＬによって測定した。結果を図４に示す。固体状態では照射の前後で葉酸の含有量の低下はほとんど認められないが、溶液状態では、試料１および２においてほぼ全ての葉酸が分解した。試料４および５では葉酸はほとんど分解しなかったことから、葉酸１重量部に対して「αＧルチンＰＳ」を１重量部以上、つまりα−グルコシルルチンに換算すると０．９重量部以上を添加することにより、葉酸の光安定性は顕著に改善されることが分かる。
【００７６】
［実験例５］結晶性の確認
葉酸原末および「αＧルチンＰＳ」原末、ならびに実験例２と同様にして調製した試料１（葉酸のビーズミル処理物）、試料２（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：０．１のビーズミル処理物）、試料４（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１のビーズミル処理物）および試料５（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１０のビーズミル処理物）それぞれの凍結乾燥粉末について、粉末Ｘ線回折を行った。粉末Ｘ線回折は、Ｘ線回折装置「Ｍｉｎｉｆｌｅｘ  ６００」（株式会社リガク）を用いて、４°／分、４〜３５°（ステップ：０．０２°）の測定条件で行った。結果を図５に示す。葉酸原末では葉酸に由来する回折ピークが認められたが、ビーズミル処理物では回折強度の低下が認められた。これは、混合粉砕処理を利用したナノ粒子化により、葉酸の結晶の粒子径が減少したことに起因するものと考えられる。なお、物理混合粉末（葉酸：αＧルチンＰＳ＝１：１０）についても、葉酸に由来する回折ピークが認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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