(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物
【化１】
0006470869.tif 000023
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
【化２】
0006470869.tif 000024
またはその薬学的に許容される塩、及び
【化３】
0006470869.tif 000025
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
【化４】
0006470869.tif 000026
またはその薬学的に許容される塩である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
【化５】
0006470869.tif 000027
である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
癌の治療剤の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項７】
前記癌が、非小細胞肺癌及び肺腺癌を含む肺癌、腺癌、アジア肝細胞癌を含む肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、ならびに急性リンパ球性白血病を含む白血病からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記癌が肺腺癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記癌が乳癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌がアジア肝細胞癌である、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤヌスキナーゼ１（ＪＡＫ１）を阻害する、特定のベンズイミダゾール化合物、またはその薬学的に許容される塩、その化合物を含む薬学的組成物、及び特定のタイプの癌を治療するためのその化合物の使用方法に関する。
【０００２】
ＪＡＫキナーゼは、様々なエフェクタのチロシンリン酸化を制御し、下流シグナル伝達経路の活性化を開始する、チロシンキナーゼファミリーである。ＪＡＫ１は、シグナル伝達兼転写活性化因子３、ＳＴＡＴ３の活性化を媒介する、このファミリーのメンバーである。持続的なＳＴＡＴ３活性化は、腫瘍を形成し、癌細胞の生存及び増殖を促進する。ＳＴＡＴ３活性化における異常も、腫瘍微小環境における腫瘍免疫監視を混乱させることが示されている。したがって、ＪＡＫ１の阻害は、ＳＴＡＴ３活性化をブロックし、腫瘍成長阻害及び腫瘍免疫監視をもたらすことができる。また、活性化ＪＡＫ１変異は、Ｔ系統急性リンパ芽球性白血病及びアジア肝細胞癌の両方において確認され、発癌性であることが証明されている。これらの結果は、ＪＡＫ１が実用的な腫瘍学標的であることを示す。
【０００３】
ＪＡＫ２は、ＳＴＡＴ５経路へのＥＰＯ及びＴＰＯ受容体シグナル伝達を媒介するホモ二量体を形成することが知られ、これは赤血球及び血小板産生を制御する。ＪＡＫ２の阻害は、貧血症及び血小板減少症を引き起こし得る。しかしながら、ＪＡＫ１はこれらの活性を示さず、よって、ＪＡＫ１を選択的に阻害する化合物が、ＪＡＫ２またはＪＡＫ１／２二重阻害剤を選択的に阻害する化合物より良好な血液毒性及び／または免疫原性プロファイルを有し得ることを示す。
【０００４】
ＪＡＫキナーゼ阻害化合物は、文献において知られている。例えば、ＵＳ２０１５／０２０３４５５は、ＪＡＫ阻害剤である特定のベンズイミダゾール化合物について開示している。
【０００５】
癌の治療のための代替ＪＡＫ１阻害剤を提供することが引き続き必要とされている。また、ＪＡＫ２阻害を低減または回避する選択的ＪＡＫ１阻害剤を提供することが引き続き必要とされている。したがって、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＪＡＫ１の特定の阻害剤を提供する。加えて、本発明は、ＪＡＫ２阻害を低減し得る特定の選択的ＪＡＫ１阻害剤を提供する。
【０００６】
本発明は、式Ｉの化合物
【化１】
0006470869.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００７】
好ましくは、本発明は、（２Ｓ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化２】
0006470869.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩、及び
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化３】
0006470869.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物を提供する。
【０００８】
好ましくは、本発明は、（２Ｓ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化４】
0006470869.tif 000005
またはその薬学的に許容される塩である化合物を提供する。より好ましくは、本発明は、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化５】
0006470869.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩である化合物を提供する。
【０００９】
特定の実施形態として、本発明は、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールを提供する。
【００１０】
特定の実施形態として、本発明は、（２Ｓ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールを提供する。
【００１１】
本発明は、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明は、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。本発明は、癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。本発明は、癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールを投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明は、治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、治療に使用するための、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、癌の治療に使用するための、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１４】
本発明は、治療に使用するための、式Ｉの化合物を提供する。本発明はまた、治療に使用するための、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールを提供する。本発明は、癌の治療に使用するための、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１５】
本発明は、癌の治療薬の製造における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明は、癌の治療薬の製造における、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明は、癌の治療薬の製造における、（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールの使用を提供する。
【００１６】
本発明は、結晶形の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールの遊離塩基を提供する。本発明はまた、２θ±０．２で、１１．９°、１５．４°、及び１７．６°からなる群から選択されるピークの１つ以上との組み合わせにおいて１９．５°で発生する、特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる、結晶形の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールの遊離塩基を提供する。
【００１７】
本発明は、結晶形の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールのジメタンスルホン酸塩を提供する。本発明はまた、２θ±０．２で、２１．２°、１８．０°、及び１５．７°からなる群から選択されるピークの１つ以上との組み合わせにおいて２１．７°で発生する、特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる、結晶形の（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オールのジメタンスルホン酸塩を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、癌が、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、及び肺腺癌を含む肺癌、腺癌、アジア肝細胞癌を含む肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、リンパ腫、ならびに急性リンパ球性白血病及びＴ系統急性リンパ芽球性白血病を含む白血病からなる群から選択される、本明細書に記載されている方法及び使用の好ましい実施形態を提供する。好ましい癌は、非小細胞肺癌及び肺腺癌を含む肺癌、腺癌、アジア肝細胞癌を含む肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、ならびに急性リンパ球性白血病を含む白血病である。より好ましい癌は、非小細胞肺癌、肺腺癌、乳癌、及びアジア肝細胞癌である。
【００１９】
上で、及び本発明の説明全体を通して使用されている下記の用語は、特に指示がない限り、下記の意味を有するものと理解されるだろう。
【００２０】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」とは、哺乳類、例えばヒトへの生物活性剤の送達のための技術分野において一般的に許容される媒体である。
【００２１】
「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の、比較的毒性のない無機及び有機塩を指す。
【００２２】
「有効量」とは、研究者、獣医、医師、または他の臨床家により求められている、組織、システム、動物、哺乳類、またはヒトの、生物学的もしくは医学的応答、またはそれに対する所望の治療効果を引き出す、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含有する薬学的組成物の量を意味する。
【００２３】
「治療」、「治療する」、「治療すること」、等の用語は、障害の進行を遅らせること、または回復に向かわせることを含むことを意図している。これらの用語はまた、障害または状態が実際には解消されていなくても、障害または状態の進行がそれ自体は遅れたり、回復に向かったりしていなくても、障害または状態の１つ以上の症状を軽減すること、改善すること、緩和すること、解消すること、または低減することを含む。
【００２４】
本発明の化合物は、例えば、薬学的に許容される塩を形成する多数の無機及び有機酸との反応が可能である。このような薬学的に許容される塩及びこれらを調製するための共通方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ  ６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７を参照されたい。
【００２５】
本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を使用して薬学的組成物として製剤化され、様々な経路により投与される。好ましくは、このような組成物は、経口投与のためのものである。このような薬学的組成物及びそれらを調製するプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２００５）を参照されたい。
【００２６】
実際に投与される本発明の化合物の量は、治療する状態、選択される投与経路、実際に投与される本発明の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況下で医師により決定される。一日当たりの投与量は、一日当たり約５０〜１０００ｍｇ、好ましくは一日当たり８０〜６００ｍｇ、最も好ましくは一日当たり３００ｍｇの範囲内に含まれる。いくつかの例において、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルで十分過ぎる場合があるが、他の場合では依然としてより大きな用量が用いられ得る。投与量レベルは当業者が決定できる。
【００２７】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、当該技術分野において知られている様々な手順、ならびに下の調製例及び実施例において記載されているものにより調製してもよい。記載されている経路の各々についての特定の合成ステップを異なる方法で組み合わせ、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を調製してもよい。
【００２８】
試薬及び出発物質は、一般的に、当業者にとって容易に入手可能である。有機及び複素環化学の標準的な技術、当業者に知られている技術、ならびにいずれかの新規手順を含む下記の実施例において記載されている手順により、他の物質を作製してもよい。下記の調製例及び実施例は、本発明をさらに例示する。反対の記述がない限り、本明細書において例示されている化合物は、ＩＵＰＡＣＮＡＭＥ  ＡＣＤＬＡＢＳを使用して名前及び番号が付けられている。
【００２９】
個々の異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーのような方法による化合物の合成において、いずれかの便利な点で、当業者により分離または分割されていてもよい（例えば、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１）を参照されたい）。
【００３０】
当業者であれば、本発明の化合物が少なくとも１つのキラル中心を含有することを理解するだろう。本発明は、全ての個々のエナンチオマーまたはジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む該化合物のエナンチオマー及びジアステレオマーの混合物を考慮する。本発明の化合物は、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在することが好ましい。単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬で開始するか、立体選択的または立体特異的合成技術により調製してもよい。あるいは、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、標準的なキラルクロマトグラフィーまたは結晶化技術により、混合物から単離してもよい。
【００３１】
本発明の化合物は、当該技術分野において周知であり理解されている合成方法に従って、調製することができる。これらの反応のステップについての適切な反応条件は、当該技術分野において周知であり、溶媒及び共試薬の適切な置換は、当該技術分野の範囲内である。同様に、合成中間体を、必要または所望に応じて、様々な周知技術により単離及び／または精製してもよいこと、ならびにしばしば、様々な中間体を、直接その後の合成ステップにおいて、ほとんどまたは全く精製せずに使用することが可能であることが、当業者により理解されるだろう。さらに、当業者であれば、いくつかの状況において、部分が導入される順番は重要ではないことを理解するだろう。本発明の化合物を製造するのに必要なステップの特定の順番は、当該技術分野に精通した化学者によってよく理解されているように、合成される特定の化合物、出発化合物、及び置換部分の相対的な不利益に依存する。全ての置換分は、特に指示がない限り、以前に定義されているとおりであり、全ての試薬は、当該技術分野において周知であり理解されている。
【００３２】
本明細書において使用されている下記の用語は、指定された意味を有する。「ＡＴＰ」とは、アデノシン５’−三リン酸を指し、「ＢＳＡ」とは、ウシ血清アルブミンを指し、「ＤＭＳＯ」とは、ジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸を指し、「ＥＧＴＡ」とは、エチレングリコール四酢酸を指し、「ＦＢＳ」とは、ウシ胎児血清を指し、「ＧＦＰ」とは、緑色蛍光タンパク質を指し、「ＨＥＰＥＳ」とは、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸を指し、「ＨＷＢ」とは、ヒト全血を指し、「ＩＣ５０」とは、所定の応答（配位子結合または酵素応答）を５０％低減する化合物の濃度を指し、「相対ＩＣ５０」とは、化合物の最大応答の半分をもたらす相対濃度を指し、「ＩＶＴＩ」とは、インビボ標的阻害を指し、「ＪＡＫ」とは、ヤヌスキナーゼを指し、「ＭＳ」とは、質量分光分析を指し、「ＮＭＲ」とは、核磁気共鳴を指し、「ＮＳＣＬＣ」とは、非小細胞肺癌を指し、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＲＮアーゼ」とは、リボヌクレアーゼを指し、「ＲＴ」とは、室温を指し、「ＳＣＬＣ」とは、小細胞肺癌を指し、「ＳＴＡＴ」とは、シグナル伝達兼転写活性化因子を指し、「ＴＥＤ」とは、閾値有効量を指し、「ＴＲ−ＦＲＥＴ」とは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動を指す。
調製例１
（２Ｒ）−２−（トリフルオロメチル）オキシラン
【化６】
0006470869.tif 000007
【００３３】
酢酸（０．８９ｍＬ、０．０５２当量）を、トルエン（１６．６５ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−１，２−シクロヘキサンジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔ−ブチルサリシリデン）コバルト（ＩＩ）（０．９０ｇ、０．００５０当量）の溶液に添加する。室温で３０分間撹拌する。溶媒を減圧除去する。トルエン（２０ｍＬ）を添加し、減圧濃縮する。０℃まで冷却し、２−（トリフルオロメチル）オキシラン（３７．００ｇ、３３０ｍｍｏｌ、８０．０％ｅｅ、（２Ｒ）が主エナンチオマー）を添加する。５分間撹拌し、水（０．８０ｍＬ、０．１５当量）を滴下する。ゆっくり室温まで温め、一晩撹拌する。室温で減圧蒸留し、表題化合物を冷却されたフラスコにおいて淡黄色の油（２８．１０ｇ、７６％、９９．８％ｅｅ）として回収する。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．９２−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．９８−３．０１（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．４６（Ｍ，１Ｈ）。
【００３４】
表題化合物（０．１３ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）とメタノール（１．３ｍＬ）とを組み合わせる。０℃まで冷却し、トリエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．１０当量）及びチオフェノール（０．１２ｍＬ、１．０５当量）を添加する。３０分間撹拌する。一アリコートのＧＣＭＳは、１，１，１−トリフルオロ−３−フェニルスルファニル−プロパン−２−オールの（表題化合物の開環からの）形成を示し、ｍ／ｚ＝２２２。キラルＬＣ−ＭＳは９９．８％ｅｅを示し、（２Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−３−フェニルスルファニル−プロパン−２−オールが主エナンチオマーである。
調製例２
１−ブロモ−３，５−ジフルオロ−２−ニトロベンゼン
【化７】
0006470869.tif 000008
【００３５】
硝酸（発煙、２０ｍＬ）を、０℃の硫酸（５０ｍＬ）中の１−ブロモ−３，５−ジフルオロベンゼン（３５．００ｍＬ、３０４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下する。ゆっくり室温まで温め、一晩撹拌する。反応混合物を、氷と水との混合物（６００ｍＬ）中に注ぐ。ゆっくり室温まで温める。酢酸エチル（２００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）を添加する。全ての固体が溶解するまで撹拌する。層を分離する。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮し、表題化合物を黄色の油（５７．３７ｇ、７９％）としてもたらす。ＧＣＭＳ  ｍ／ｚ＝２３７，２３９（Ｂｒ）。
調製例３
３−ブロモ−５−フルオロ−Ｎ−メチル−２−ニトロアニリン
【化８】
0006470869.tif 000009
【００３６】
テトラヒドロフラン（９２ｍＬ、２．００当量）中の２Ｍモノメチルアミンを、１，４−ジオキサン（９２ｍＬ）中の１−ブロモ−３，５−ジフルオロ−２−ニトロベンゼン（２１．９０ｇ、９２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。室温で４５分間撹拌する。水を添加し、酢酸エチルで抽出する。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、２０〜４０％のヘキサン中の塩化メチレンの勾配で溶出し、表題化合物を橙色の固体（１６．９５ｇ、７４％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）２４９／２５１（Ｍ＋Ｈ）。
調製例４
｛シス−４−［３−ブロモ−５−（メチルアミノ）−４−ニトロフェノキシ］シクロヘキシル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９】
0006470869.tif 000010
【００３７】
ジクロロメタン（９７５ｍＬ）及び５Ｍ水性水酸化ナトリウム（２４１ｍＬ）中で、３−ブロモ−５−フルオロ−Ｎ−メチル−２−ニトロアニリン（７５．０４ｇ、３０１ｍｍｏｌ）、（シス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８９．５２ｇ、１．３８当量）、及び重硫酸テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム（１５．５８ｇ、０．１５当量）を組み合わせる。急速に３７℃で窒素下５日間撹拌する。室温まで冷却する。ジクロロメタン（２００ｍＬ）及び水（４００ｍＬ）で希釈する。層を分離する。水層をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。複合有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、０〜４０％のヘキサン中の酢酸エチルの勾配で溶出し、表題化合物を橙色の固体（６８．５７ｇ、５１％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４４２／４４４（Ｍ−Ｈ）。
調製例５
｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１０】
0006470869.tif 000011
【００３８】
Ｐａｒｒ反応器において、テトラヒドロフラン（９２３ｍＬ）中で、｛シス−４−［３−ブロモ−５−（メチルアミノ）−４−ニトロフェノキシ］シクロヘキシル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７６．９２ｇ、１７３ｍｍｏｌ）と炭素上の白金５％（硫化、３．８５ｇ）とを組み合わせる。室温で４１４ｋＰａの水素下３日間撹拌する。珪藻土を通して濾過する。テトラヒドロフランで洗浄する。オルトギ酸トリメチル（１６５ｍＬ、８．７０当量）を複合テトラヒドロフラン濾過物に添加する。２２時間６３℃で撹拌する。反応混合物の大部分を減圧濃縮する。水（４００ｍＬ）及び酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈する。水性炭酸ナトリウムで塩基性化し、ｐＨを９に調整する。層を分離する。水層を酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出する。複合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４００ｍＬ）で希釈し、３０分間超音波処理する。濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させ、表題化合物を淡褐色の固体（５２．０２ｇ、７１％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４２４／４２６（Ｍ＋Ｈ）。
調製例６
シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキサンアミン
【化１１】
0006470869.tif 000012
【００３９】
トリフルオロ酢酸（６６６ｍＬ）を、添加漏斗を介して、０℃のジクロロメタン（１１１０ｍＬ）中の｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２２ｇ、４９７ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。ゆっくり室温まで温め、一晩撹拌する。反応混合物を減圧濃縮する。水（２５０ｍＬ）を添加し、５０％水性水酸化ナトリウムで塩基性化し、ｐＨを１０に調整する。水（２５０ｍＬ）を添加する。ジクロロメタン（１５００ｍＬ、次に５００ｍＬ、次に２５０ｍＬ）中の２０％のメタノールで抽出する。複合有機層を２Ｍ水性水酸化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、表題化合物を褐色の固体（１５５ｇ、９１％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３２４／３２６（Ｍ＋Ｈ）。
調製例７
（２Ｒ）−３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１２】
0006470869.tif 000013
【００４０】
（２Ｒ）−２−（トリフルオロメチル）オキシラン（７３．２９ｇ、１．５０当量）を、メタノール（１０５３ｍＬ）中のシス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキサンアミン（１５０．４ｇ、４３６ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。室温で一晩撹拌する。反応混合物を減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、０〜１０％のジクロロメタン中のエタノールの勾配で溶出し、表題化合物を灰白色の固体（９８．１０ｇ、５２％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４３６／４３８（Ｍ＋Ｈ）。
調製例８
３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１３】
0006470869.tif 000014
【００４１】
２−（トリフルオロメチル）オキシラン（２．１３ｍＬ、１．０２当量、８０．０％ｅｅ、（２Ｒ）が主エナンチオマー）を、イソプロパノール（１３０ｍＬ）中のシス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキサンアミン（７．９０ｇ、２４．３７ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。７０℃で一晩加熱する。反応混合物を減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、１００％の酢酸エチルから、酢酸エチル中の２．５％、５％、７．５％、１０％のメタノールまでの段階的な勾配で溶出し、表題化合物（７．８６ｇ、７４％）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４３６／４３８（Ｍ＋Ｈ）。
調製例９
（５Ｓ）−３−｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝−５−（トリフルオロメチル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン
【化１４】
0006470869.tif 000015
【００４２】
ジクロロメタン（３８．３ｍＬ）中で、３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール（３．３４ｇ、７．６６ｍｍｏｌ、８０．０％ｅｅ、（２Ｒ）が主エナンチオマー）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（２．４８ｇ、２．００当量）、及び４−ジメチルアミノピリジン（０．０９４ｇ、０．１０当量）を組み合わせる。室温で窒素下一晩撹拌する。反応混合物を減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、０〜５％のジクロロメタン中のメタノールの勾配で溶出し、３−｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝−５−（トリフルオロメチル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン（３．２８ｇ、８０．０％ｅｅ、（５Ｒ）が主エナンチオマー）をもたらす。
【００４３】
上記を下記のキラルクロマトグラフィー条件で分離し、表題化合物（０．３２ｇ、９％）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４６２／４６４（Ｍ＋Ｈ）：エナンチオマー１、＞９９％ｅｅ、７５％／２５％  ＣＯ２／ＭｅＯＨ、５ｍＬ／分、４．６×１５０ｍｍ、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ。
調製例１０
（２Ｓ）−３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１５】
0006470869.tif 000016
【００４４】
テトラヒドロフラン（７ｍＬ）中で（５Ｓ）−３−｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝−５−（トリフルオロメチル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン（０．３２ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とトリメチルシラノール酸カリウム（０．３６ｇ、４．００当量）とを組み合わせる。室温で窒素下６日間撹拌する。水で希釈する。濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させ、表題化合物を白色の固体（０．２２ｇ、７３％）としてもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４３６／４３８（Ｍ＋Ｈ）。
実施例１
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１６】
0006470869.tif 000017
【００４５】
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（５ｍＬ）中で、（２Ｒ）−３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール（０．２０ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、１，５−ジメチルピラゾール−３−アミン（０．０５６ｇ、１．１当量）、炭酸カリウム（０．１５８ｇ、２．５当量）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−３，６−ジメトキシ−１，１’−ビフェニル（０．０４６ｇ、０．２０当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．０４２ｇ、０．１０当量）、及び酢酸（０．０１ｍＬ）を組み合わせる。クリンプキャップで封止する。マイクロ波反応器において１２０℃で４５分間加熱する。反応混合物を減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、１００％の酢酸エチルから、酢酸エチル中の１％、２．５％、５％のメタノールまでの段階的な勾配で溶出し、表題化合物（０．０７１ｇ、３３％）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝４６７（Ｍ＋Ｈ）。
代替実施例１
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１７】
0006470869.tif 000018
【００４６】
２−メチルブタン−２−オール（４００ｍＬ）中で、（２Ｒ）−３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール（５０ｇ、１１５ｍｍｏｌ）、１，５−ジメチルピラゾール−３−アミン（１８．２５ｇ、１．４３当量）、及び炭酸カリウム（５０ｇ、３．１６当量）を組み合わせる。撹拌し、発泡窒素配管で１５分間脱気する。２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’ビフェニル（２．２０ｇ、０．０３４当量）及びトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１．６０ｇ、０．０１５当量）を添加する。撹拌し、発泡窒素配管で５分間脱気する。酢酸（３ｍＬ）を添加する。還流で窒素下２０時間加熱する。２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル（１．１０ｇ、０．０１７当量）及びトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．８０ｇ、０．００７５当量）を添加する。還流で窒素下３時間加熱する。反応混合物を減圧濃縮する。水（５００ｍＬ）で希釈する。３５％水性塩酸で酸性化し、ｐＨを１に調整する。酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加し、５分間撹拌する。撹拌混合物を活性炭（５ｇ）で処理し、珪藻土を通して濾過する。層を分離し、有機層を廃棄する。水層を３０重量／重量％の水性水酸化アンモニウムで塩基性化し、ｐＨを１０に調整する。濾過し、固体を得る。順相クロマトグラフィーにより精製し、ジクロロメタン中の１０％の２Ｍアンモニア／メタノールで溶出し、表題化合物（５２ｇ、９５％）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝４６７（Ｍ＋Ｈ）。
第２の代替実施例１
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、結晶形Ｉ
【００４７】
Ａ：代替実施例１（１．６０ｇ）の順相クロマトグラフィー生成物の一部分を９：１のアセトン：水（４５ｍＬ）に溶解する。室温で１５分間撹拌し、ＳｉｌｉａＢｏｎｄ（登録商標）ＤＭＴ（０．４２ｇ）を添加する。５時間後、室温で濾過する。濾過物を濃縮して全てのアセトンを除去した後、水（１０ｍＬ）で希釈する。濾過し、減圧下で乾燥させ、結晶物質（１．３７ｇ）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝４６７（Ｍ＋Ｈ）。
【００４８】
Ｂ：代替実施例１（４７．０ｇ）の順相クロマトグラフィー生成物をイソプロパノール（１．１５Ｌ）に懸濁させる。混合物を還流まで加熱し、溶液を得る。ガラス状炭素（６ｇ）を添加する。還流で１時間後、珪藻土を通して濾過する。イソプロパノール（５０ｍＬ）で洗浄し、濾過物にＡ項からの結晶物質を上で提供されたそのままで（０．２０ｇ、少しずつ）播種する。撹拌し、２時間かけて室温まで冷却させる。濾過し、減圧下で乾燥させ、結晶物質（３７．８ｇ）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝４６７（Ｍ＋Ｈ）。
実施例２
（２Ｓ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール
【化１８】
0006470869.tif 000019
【００４９】
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２．５ｍＬ）中で、（２Ｓ）−３−（｛シス−４−［（４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）オキシ］シクロヘキシル｝アミノ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール（０．０７７ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、１，５−ジメチルピラゾール−３−アミン（０．０３０ｇ、１．４５当量）、炭酸カリウム（０．０６０ｇ、２．４６当量）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−３，６−ジメトキシ−１，１’−ビフェニル（０．０２２ｇ、０．２５当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．００８０ｇ、０．０５０当量）、及び酢酸（０．０１ｍＬ）を組み合わせる。クリンプキャップで封止する。９５℃で一晩加熱する。酢酸エチルで希釈し、珪藻土を通して濾過する。濾過物を減圧濃縮する。順相クロマトグラフィーにより精製し、５〜１００％のＢ勾配（Ａ：ジクロロメタン、Ｂ：ジクロロメタン中の１５％の０．７５Ｍアンモニア化メタノール）で溶出する。逆相クロマトグラフィーによりさらに精製し、５〜１００％のＢ勾配（Ａ：１０％のメタノールを有する１０ｎＭ水性重炭酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル）で溶出する。純粋な画分をエタノールから、次に再度ジクロロメタンから濃縮し、表題化合物（０．０５４ｇ、６５％）をもたらす。ＭＳ（ＥＳ）  ｍ／ｚ＝４６７（Ｍ＋Ｈ）。
実施例３
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール、ジメタンスルホン酸
【化１９】
0006470869.tif 000020
【００５０】
（２Ｒ）−３−｛［シス−４−（｛４−［（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル｝オキシ）シクロヘキシル］アミノ｝−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−オール（１．００ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）とアセトン（３５ｍＬ）とを組み合わせる。５１℃で加熱し、アセトン（５ｍＬ）中のメタンスルホン酸（０．３０ｍＬ、２．１０当量）の溶液を滴下する。５１℃で１時間撹拌した後、室温まで冷却する。得られた固体を濾過し、７０℃の真空オーブンにおいて一晩乾燥させ、表題化合物（１．２５ｇ、８８％）をもたらす。
【００５１】
Ｘ線粉末回折
３５ｋＶ及び５０ｍＡで稼働する、ＣｕＫａ源λ＝１．５４０６０Å）及びＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ４  ＥｎｄｅａｖｏｒＸ線粉末回折装置上で、結晶固体のＸＲＤパターンを得る。２θにおいて０．００９°のステップサイズ及び０．５秒／ステップの走査速度、ならびに０．６ｍｍの発散スリット、５．２８の固定散乱防止スリット、及び９．５ｍｍの検出器スリットを用いて、２θにおいて４〜４０°で試料を走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダー上に充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形回折パターンを周囲温度及び相対湿度で収集する。任意の所定の結晶形について、回折ピークの相対強度が、結晶形態及び晶癖のような要因からの結果として生じる好ましい配向に起因して変化し得ることは、結晶学技術分野において周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変更されるが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ♯２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ♯１８，ｐａｇｅｓ  １８４３−１８４４，１９９５を参照されたい。さらに、任意の所定の結晶形について、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることも、結晶学技術分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度における変動、試料の変位、または内部標準の存在もしくは不在に起因してシフトし得る。本発明の場合、２θにおける±０．２°のピーク位置可変性は、示された結晶形の明白な同定の妨げになることなく、これらの潜在的な変動を考慮するだろう。結晶形の確認は、特徴的なピーク（°２θを単位とする）、通常はより突出したピークの任意の独特な組み合わせに基づいてなされ得る。周囲温度及び相対湿度で収集された結晶形回折パターンを、８．８５３°及び２６．７７４°２θのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整する。
【００５２】
第２の代替実施例１の化合物の調製された試料を、ＣｕＫａ線を使用してＸＲＤパターンにより、下の表１に記載されている回折ピーク（２θ値）を有するもの、特に、０．２°の回折角度の許容誤差で、１１．９°、１５．４°、及び１７．６°からなる群から選択されるピークの１つ以上との組み合わせにおいて１９．５°でピークを有するものとして特徴付ける。
【表１】
0006470869.tif 000021
【００５３】
実施例３の化合物の調製された試料を、ＣｕＫａ線を使用してＸＲＤパターンにより、下の表２に記載されている回折ピーク（２θ値）を有するもの、特に、０．２°の回折角度の許容誤差で、２１．２°、１８．０°、及び１５．７°からなる群から選択されるピークの１つ以上との組み合わせにおいて２１．７°でピークを有するものとして特徴付ける。
【表２】
0006470869.tif 000022
【００５４】
ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３インビトロ酵素アッセイ
ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３キナーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を決定するのに、ＪＡＫ  ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用される。長寿命のテルビウム標識抗体をドナー種として、及びＧＦＰ−ＳＴＡＴ１をアクセプター種として使用する、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ形式がある。ＴＲ−ＦＲＥＴ比を使用し、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１のリン酸化の増加がＴＲ−ＦＲＥＴ比の増加をもたらすＪＡＫキナーゼ活性をモニタリングする。浅い黒色３８４ウェルＰｒｏｘｉＰｌａｔｅにおいて、１２．５μｌ反応体積を用いてキナーゼ反応を実施する。試薬を添加し、５０ｍｌのＨＥＰＥＳ  ｐＨ、１．７６ｍＭのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＡＴＰ（ＪＡＫ１及びＪＡＫ３酵素アッセイについて２０．０μＭまたはＪＡＫ２酵素アッセイについて５μＭ）、１０．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、０．０５ｍＭのＧＦＰ−ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１酵素アッセイについて１４ｎＭのＪＡＫ１酵素、ＪＡＫ２酵素アッセイについて１．０ｎＭのＪＡＫ２酵素、またはＪＡＫ３酵素アッセイについて２．５ｎＭのＪＡＫ３酵素、ならびに４％ＤＭＳＯ及び試験化合物の連続希釈物（２０，０００〜１ｎＭまで１：３で希釈）の最終反応条件を得る。ＡＴＰ／ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１添加後、アッセイプレートを１分間１０００回転毎分（ＲＰＭ）で遠心分離する。プレートを室温で６０分間インキュベートさせた後、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｎＭのテルビウム抗リン酸化シグナル伝達兼転写活性因子［リン酸化チロシン７０１アミノ酸］抗体（Ｔｂ抗ｐＳＴＡＴ１［ｐＴｙｒ７０１］、０．６７ｍＭの［１｝トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸塩（Ｔｒｉｚｍａ（登録商標））ｐＨ７．５、０．０２％ＮａＮ３、及び０．０１％ノニルフェニルポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０）を含有する１２．５μｌの停止バッファを添加する。室温で９０分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて３４０ｎｍ波長励起フィルタならびに５２０ｎｍ及び４９５ｎｍ波長の発光フィルタで読み取る。（Ｔｂ抗ｐＳＴＡＴ１［ｐＴｙｒ７０１］の４９５ｎｍでの発光に対して５２０ｎｍで測定されるＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の発光波長から比を導き出す。プレート上の対照（トファシチニブにより２．０ｍＭで阻害された酵素に対する活性酵素）に対する反応データから計算される阻害パーセントデータを用い、各化合物のＩＣ５０値を導き出す。ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を使用し、阻害パーセント及び１０点化合物濃度データを、４パラメータロジスティック方程式に当てはめる。
【００５５】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、４．０±０．８ｎＭ（ｎ＝６）のＪＡＫ１のＩＣ５０、５５７±３３７ｎＭ（ｎ＝６）のＪＡＫ２のＩＣ５０、及び１９１０±７８６ｎＭ（ｎ＝６）のＪＡＫ３のＩＣ５０を示す。その結果は、実施例１の化合物がインビトロでＪＡＫ１酵素を阻害することを示す。これらの結果は、実施例１の化合物が、ＪＡＫ１酵素のより有効な阻害剤であり、インビトロでＪＡＫ２及びＪＡＫ３に対して選択的であることも示す。
【００５６】
ＢａＦ３変異体ＪＡＫ−１（Ｓ７２９Ｃ）クローン１２増殖アッセイ
このアッセイの目的は、ＢａＦ３変異体ＪＡＫ−１（Ｓ７２９Ｃ）クローン１２増殖アッセイを使用して、ＪＡＫ−１特異的阻害剤の阻害活性を決定することである。
【００５７】
ｍｔＪＡＫ１（Ｓ７２９Ｃ）発現細胞株は、Ｂａ／Ｆ３細胞（マウスｐｒｏ−Ｂ細胞）に、ヒトｍｔＪＡＫ１（Ｓ７２９Ｃ）−ｐＱＣＸＩＮベクターＤＮＡを発現するレトロウイルスを導入することにより作製される。連続希釈により最高レベルのｍｔＪＡＫ１（Ｓ７２９Ｃ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞を選択するため、単一細胞クローニングが実施される。ＢａＦ３変異体ＪＡＫ−１（Ｓ７２９Ｃ）懸濁細胞は、１０％Ｈｉ−ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  カタログ♯１００８２−０４７）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  カタログ♯９６２０）、１．０ｍｇ／ｍＬのＧ４１８硫酸塩（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｒｅｆ♯３０−２３４−ＣＩ）を含有する（Ｇｉｂｃｏ  ＲＰＭＩ  １６４０  カタログ♯Ａ１０４９１−０１）において培養及び維持され、以降Ｒ１０＋と称される。
【００５８】
増殖アッセイは、選択なしの培養培地において実施され、以降（Ｒ１０−）と称される。簡潔に、培養された細胞は、１０ｍＬのＲ１０−においてデカント、遠心分離、及び再構成され、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌを使用して計測される。細胞は、Ｒ１０−において２ｅ４／ｍＬまでさらに希釈され、９６ウェル白色不透明アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  カタログ♯３６１０）において１ウェル当たり１×１０３個（５０μｌｓ）で分注される。対応する９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、試験化合物は、１００％ＤＭＳＯで希釈され、その後Ｒ１０−でさらに希釈され、２倍の試験化合物テンプレートをもたらす。希釈された試験化合物は、対応するセルプレートに添加され、２０μＭ〜０．００１μＭのＣＲＣをもたらす。最小及び最大対照が各プレート上に含まれている。最小対照にはスタウロスポリン（１μＭ最終）が使用され、ＣＲＣと等しいＤＭＳＯレベルを含有するＲ１０−が最大対照として使用される。プレートは、水を充填したＭｉｃｒｏｃｌｉｎｅ蒸発フタ（カタログ♯ＬＬＳ−０３１０）で覆われ、３７℃、５％ＣＯ２中で３日間インキュベートされる。３日のインキュベーション後、プレートは、インキュベータから取り出され、周囲温度まで冷却させる。冷却後、プレートは、１００μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ♯Ｇ７５７１）を添加し、プレートミキサー上で２分混合し、さらに１０分室温でインキュベートすることにより展開する。次にルミネッセンスが、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ２上で、０．１秒のルミネッセンスの予備設定プログラムを使用して読み取られる。ＩＣ５０曲線は、内部ＳＴＡＴＳ  ＴＭＡＧプログラム及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．０３を使用して生成される。
【００５９】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、９５６ｎＭ±２１７ｎＭ（ｎ＝４）のＩＣ５０を示す。その結果は、実施例１の化合物が、Ｂａ／Ｆ３細胞中で発現するｍｔＪＡＫ１（Ｓ７２９Ｃ）に対して活性であることを示す。
【００６０】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅプロトコル  ｐ−ＳＴＡＴ３−（ｐ−Ｔｙｒ７０５）−ＩＬ６−ＴＦ−１−ＪＡＫ１細胞ベースアッセイ
試験化合物のＪＡＫ１細胞有効性を決定するのに、下に記載されているＪＡＫ１細胞ベースアッセイが使用される。
【００６１】
細胞調製：
ＴＦ−１細胞を、３７℃の０．５％２６４００（ＦＢＳ）及び１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ培地において飢餓させる。透明底を有するＢＤ９６ウェル黒色プレートにおいて、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を分注する。プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートする前に、室温で３０〜６０分間維持する。Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンタを使用して細胞数を計測し、１００個／ｍＬの細胞懸濁液を使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔプレート（カタログ♯３５４６４０）において１００μＬ／ウェルで分注した。
【００６２】
試験化合物調製及び処理：
化合物を、ＤＭＳＯでの１：３連続希釈で調製し、培地でさらに希釈する。２０，０００〜１ｎＭの１０点濃度の範囲内の化合物を試験する。希釈された化合物を対応するセルプレートに添加する。プレートを３７℃で２０分間インキュベートする。３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＩＬ６溶液を、対応するセルプレートに添加し、継続して３７℃で３０分間インキュベートする。培地を除去し、５０μＬの１倍溶解バッファを各ウェルに添加する。
【００６３】
ｐＳＴＡＴ３検出：
下記のステップを順次実施する。アクセプター混合物（活性化バッファ／反応バッファ／アクセプタービーズ）を作製する。４μＬの溶解物を９６ウェルプレートから３８４ウェルＰｒｏｘｉＰｌａｔｅに移す。５μＬのアクセプター混合物を３８４ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅプレートに添加し、プレートをアルミシールで封止する。プレートシェーカー上で１〜２分振盪する。プレートを室温で２時間穏やかに振盪しながらインキュベートする。ドナー混合物（希釈バッファ中のドナービーズ）を作製する。２μＬのドナー混合物をアッセイプレートに添加する。プレートをアルミシールで封止する。プレートシェーカー上で１〜２分振盪する。室温で２時間穏やかに振盪しながらインキュベートする。プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎで読み取る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｓｕｒｅｆｉｒｅ  ３８４プロトコルを実施する。
【００６４】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、８７ｎＭ±７５（ｎ＝１０）のＩＣ５０を示す。この結果は、実施例１の化合物が細胞ベースアッセイにおいてＪＡＫ１酵素を阻害することを示す。
【００６５】
ホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＡＣＵＭＥＮプロトコルＨ１９７５−ＪＡＫ１細胞ベースアッセイ
【００６６】
ＳＴＡＴ３経路が自己分泌ＩＬ−６ループにより活性化されるＮＳＣＬＣ細胞において試験化合物の有効性を確認するのに、Ｈ１９７５−ＪＡＫ１細胞アッセイが使用される。
【００６７】
細胞調製：
下記のステップを順次実施する。細胞を顕微鏡下で観察する。培地を細胞から無菌真空駆動ピペットで吸い出す。細胞を約５ｍＬのＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを無菌真空駆動ピペットで吸い出す。５ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを１５０ｃｍ２フラスコに添加する。フラスコを穏やかに振動させ、細胞をトリプシンで覆い、フラスコをフード中に３分間静置またはインキュベータ中に３分間配置して細胞をフラスコから分離させる。フラスコを数分間撹拌し、細胞を確実に分離させる。１０ｍＬの成長培地をフラスコに添加し、懸濁液をフラスコの細胞成長側に穏やかに投与し、ピペットで吸い上げたり押し出したりして細胞を滴定する。回転させ（１３００ｒｐｍ５分）、１０ｍＬの成長培地に再懸濁させる。セルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５２３５０、７０μｍセルストレーナー）を通して濾過する。細胞を無菌５０ｍＬ無菌コニカルチューブにおいて回収する。Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンタを使用して細胞数を計測する（０．５ｍＬ細胞）。
【００６８】
１日目：透明底を有するＢＤ９６ウェル黒色プレートにおいて、１ウェル当たり３００００個の細胞を分注する。Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンタを使用して細胞数を計測し、３０００００個／ｍＬの細胞懸濁液を使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔプレート、カタログ♯３５４６４０において１００μＬ／ウェルで分注した。プレートを、それらをインキュベータに入れる前に、室温で３０〜６０分間維持する。次に一晩３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
【００６９】
試験化合物調製及び処理：
ＦＢＳを含まず、０．６％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を含有する深いウェルプレートを用意し、次に２μＬの化合物（１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液）を添加し、２０μＭのストックプレートを作製する。希釈プレートにおいて、ＦＢＳを含まず、０．６％ＤＭＳＯを含む培地での化合物の１：３連続希釈を実施する。２０μＭ〜１ｎＭの１０点濃度の範囲内の化合物を試験する。培地をアッセイプレートから細胞と共に取り出す。１００μＬの化合物を希釈プレートから、１００μＬの培地に付着した細胞を含有するアッセイプレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔプレート、カタログ♯３５６４４０）に移し、３７９７  ｓｌｏｗ  ｄｉｓｐｅｎｓｅ．ｇｅｍからのＴＥＭＯプログラム、ＳＡＭＰＬＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ  ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹを使用する。次に細胞を４時間３７℃でインキュベートする。
【００７０】
ｐＳＴＡＴ３検出：
１日目、下記のステップを順次実施する。培地を除去する。１００μＬの３．７％パラホルムアルデヒドを添加する。３０分間暗室でインキュベートする。１００μＬのＰＢＳで洗浄する。１００μＬの冷メタノールを添加する。１５分暗室でインキュベートする。１００μＬのＰＢＳで２回洗浄する。１００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）を添加する。３０分間暗室でインキュベートする。５０μＬの１：５００一次抗体ｐＳＴＡＴ３（ブロッキング溶液中、１％ＢＳＡ、マウス抗ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５））を添加する。プレートをアルミ箔で封止し、４℃で穏やかに振盪しながら一晩インキュベートする。
【００７１】
２日目、下記のステップを順次実施する。１００μＬのＰＢＳで２回洗浄する。５０μＬの二次抗体（１：１０００、Ａｂ２°ヤギ抗マウスＩｇＧ）を添加する。１時間、室温、暗室でインキュベートする。１００μＬのＰＢＳで２回洗浄する。ＲＮアーゼ（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬのヨウ化プロピジウム（市販溶液からのＰＢＳ中で１：１０００）を添加する。読み取り前にプレートを透明なフィルムで封止し、室温で２時間インキュベートする。Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（パラメータを陽性及び陰性ウェルに基づき設定）上で読み取る。レーザー（走査１）４８８ｎｍ。
【００７２】
データ処理：
データを、Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｂａｓｅを通して処理し、４パラメータ非線形ロジスティック方程式（４パラメータロジスティック濃度−応答曲線）を使用して分析する。
Ｙ＝ボトム＋[（トップ−ボトム）／１＋（ｘ／ＩＣ５０）スロープ]
式中、Ｙ＝阻害％、Ｘ＝ｙ阻害％をもたらす濃度、ボトム＝曲線が到達したｙの最小値、トップ＝曲線が到達したｙの最大値、及びスロープ＝ＩＣ５０での曲線の勾配。
阻害％＝[（最大中央値−ｘ／最大中央値−最小中央値）]・１００
【００７３】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、２９７ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を示す。その結果は、実施例１の化合物が、ＳＴＡＴ３経路が自己分泌ＩＬ−６ループにより活性化されるＮＳＣＬＣ細胞において、ＪＡＫ１に対して活性であることを示す。
【００７４】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅプロトコル  ｐ−ＳＴＡＴ５（ｐ−Ｔｙｒ６９４／６９９）−ＥＰＯ−ＪＡＫ２細胞ベースアッセイ
ＪＡＫ２に対するＪＡＫ１についての試験化合物の選択性倍率は、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を活性化するのにＥＰＯが使用され、ｐＳＴＡＴ５が読み出し情報として使用される、細胞アッセイにより決定される。
【００７５】
細胞調製：
ＵＴ−７細胞を、３７℃の０．５％１６００（ＦＢＳ）及び１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む（ＧＭ−ＣＳＦを含まない）ＤＭＥＭ培地において、一晩飢餓させる。透明底を有するＢＤ９６ウェル黒色プレートにおいて（ＦＢＳ及びＧＭ−ＣＳＦを含まない培地中）、１ウェル当たり５００００個の細胞を分注する。プレートを、一晩３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする前に、室温で３０〜６０分間維持する。Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンタを使用して細胞数を計測し、５０００００個／ｍＬの細胞懸濁液を使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔプレート、カタログ♯３５４６４０において１００μＬ／ウェルで分注した。
【００７６】
化合物希釈及び処理：
２０，０００〜１ｎＭの１０点濃度の範囲内の化合物を試験する。化合物を、ＤＭＳＯでの１：３連続希釈で調製し、培地でさらに希釈する。希釈された化合物を対応するセルプレートに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした後、２０μＬのＥＰＯ（２９５ｎｇ／ｍＬ、最終濃度４５ｎｇ／ｍＬ）を対応するセルプレートに添加し、継続して３７℃で３０分間インキュベートする。
【００７７】
細胞溶解：
培地を廃棄し（注意深く）、５０μＬの１倍溶解バッファを各ウェル（溶解物凍結ＯＮ）に添加する。（溶解バッファ：５倍、１倍の最終濃度まで水で希釈）。
【００７８】
ｐ−ＳＴＡＴ５検出：
下記のステップに順次従う。アクセプター混合物（活性化バッファ／反応バッファ／アクセプタービーズ）を作製する。４μＬの溶解物を９６ウェルプレートから３８４ウェルＰｒｏｘｉＰｌａｔｅに移す。５μＬのアクセプター混合物を３８４ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅプレートにＭｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉで添加する。プレートをアルミシールで封止する。プレートシェーカー上で１〜２分振盪する。プレートを室温で２時間穏やかに振盪しながらインキュベートする。ドナー混合物（希釈バッファ中のドナービーズ）を作製する。２μｌのドナー混合物をアッセイプレートにＭｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉで添加する。プレートをアルミシールで封止する。プレートシェーカー上で１〜２分振盪する。室温で２時間穏やかに振盪しながらインキュベートする。プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎで読み取る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｓｕｒｅｆｉｒｅ  ３８４プロトコルを実施する。
【００７９】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、１１．８μＭ±５．４（ｎ＝５）のＩＣ５０を示したその結果は、実施例１の化合物が、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を活性化するのにＥＰＯが使用される細胞アッセイにおいて、ＪＡＫ２に対してＪＡＫ１について選択的であることを示す
【００８０】
ヒト全血アッセイ：リンパ球及び単球におけるｐＳＴＡＴ３（ＪＡＫ１）及びｐＳＴＡＴ５（ＪＡＫ２）の決定。
ヒト全血（ＨＷＢ）アッセイは、試験化合物のＪＡＫ１及びＪＡＫ２選択性を決定するために、開発及び認可された。
【００８１】
試験化合物を、１０点、１００％ＤＭＳＯで、及びＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで段階的に降下させて（１：３）で希釈する。トファシチニブを、各プレートにおける参照化合物として、ならびにデータを正規化するための最大シグナル（刺激されたウェル）及び最小シグナル（刺激されていないウェル）として使用する。４人の異なる健康なドナーからＨＷＢのプールを入手する。血液を、９６ウェルプレートにおいて、Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏ  ９６ｗを使用して分注し、試験化合物と１時間室温でインキュベートする。今回のインキュベーション後、ＨＷＢを、ＩＬ６（２０６−ＩＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）及びＧＭ−ＣＳＦ（ＰＨＣ２０１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の両方で１５分間以上刺激する。Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏ  ９６ｗ（５倍混合）を使用して、バイアビリティ色素（６５−０８６５、ｅＢｉｏｓｉｃｉｅｎｃｅ）（１：１０００）を添加する。
【００８２】
アッセイにおける最終濃度は、下記のとおり、化合物について１００μＭ、トファシチニブについて５０μＭ、０．１μｇ／ｍＬのＩＬ６、０．０３８μｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、及び１％ＤＭＳＯである。Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏ  ９６ｗ（１０倍高速混合）を使用して９００μＬの溶解バッファを添加することにより、溶解／固定バッファ（５５８０４９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＨＷＢを溶解及び固定する。ＨＷＢを浴中３７℃で１０分間インキュベートする。ＨＷＢを５００Ｇ、８分で遠心分離し、上澄みを廃棄する。細胞を透過化するために、Ｔｅｃａｎ  Ｅｘｏ  ９６ｗを使用して冷メタノールを添加する。血液細胞を氷中で３０分間インキュベートする。この後、細胞を、染色バッファ（５５４６５６、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して２回洗浄し、３０００ｒｐｍで２分回転させ、上澄みを廃棄し、下記の抗体、抗ヒトＣＤ４  ＰＥ、１：１００（１２−００４８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３３  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、１：５０（４８−０３３７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ホスホ−ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃ７１Ｅ５）ウサギｍＡｂ、１：１００（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８複合体）（３９３９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、及びホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰ（商標）ウサギｍＡｂ、１：２００（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体）（４３２４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を添加する。抗体を１時間、暗室、室温でインキュベートした後、細胞を２回洗浄し、サイトメーターＭａｃｓｑｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で読み取る。データをＣＤ４＋（リンパ球）及びＣＤ４Ｌｏｗ  ＣＤ３３Ｈｉ（単球）上でゲートし、それぞれｐＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ５を発現する細胞からの蛍光を測定する。データを、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ＿１０を使用して分析し、蛍光の中央値を最大及び最小シグナルに対してその正規化してＩＣ５０を決定する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用し、用量応答曲線を表す。
【００８３】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、ＪＡＫ１について２．４０±０．６４μＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０及びＪＡＫ２について１３．０±３．２μＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０を示す。その結果は、実施例１の化合物が、ヒト全血アッセイにおいて、ＪＡＫ２に対してＪＡＫ１について約５倍の有効性を示すことを例証する。
【００８４】
ｐＳＴＡＴ３マウスＩＶＴＩ（ＪＡＫ１）アッセイ
このアッセイの目的は、Ｈ１９７５異種移植マウスモデルにおいてＳＴＡＴ３のリン酸化（ＳＴＡＴ３活性化）を阻害する試験化合物の能力を測定することである。Ｈ１９７５細胞を、ＡＴＣＣ仕様書に従って、利用可能な最も低い継代数で成長させる。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０において培養及び維持し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートする。細胞を標準的な技術により採取し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ基底膜マトリックス（ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））と混合し、細胞懸濁液が１：１の細胞／マトリックス比を達成し、５ｅ６細胞を含有する０．２ｍＬの細胞／マトリックス懸濁液の接種体積をもたらす。接種手順全体を通して細胞懸濁液を氷上で保持し、細胞培養物採取後１時間以内に移植を開始する。全ての移植を、Ｈａｒｌａｎから入手した雌の胸腺欠損ヌードマウスの右後脇腹に皮下投与する。全てのマウスにＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ♯２９２０Ｘを不断給餌し、ゲルパックにより給水する。移植された腫瘍細胞を、固形腫瘍として成長させ、移植後５〜９日から開始して一週間に２回体重と共に測定する。０．５３６＊Ｌ＊Ｗ＾２の計算を用いて腫瘍体積を決定する。腫瘍体積が約２００〜２５０ｍｍ３に達した後、マルチタスクブロックランダム化ツールを使用して動物をランダム化し、６〜１０匹の動物を含むビヒクル群及び各々６匹の動物を含む複数の治療群に入れる。インサイチュ塩を形成する１．１モル当量のメタンスルホン酸を含む０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０５％消泡剤を含有する１％ＨＥＣビヒクルにおいて、試験化合物を製剤化する。ビヒクル対照群には酸を添加しない。最近の群の平均体重に基づいて用量を計算する。化合物を、用量応答及び時間経過試験の両方について、経口強制栄養法により投与する。用量応答試験とは、腫瘍除去、処理、及び凍結前に２時間投与される単一用量である。時間経過試験とは、用量応答試験から決定されたＴＥＤ７０で投与される単一用量である。
【００８５】
腫瘍組織処理：
腫瘍を採取及び切断し、約１５０〜２５０ｍｍ３サイズの断片をもたらし、１ｍＬの氷冷ＭＳＤトリス溶解バッファ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  カタログ♯Ｒ６０ＴＸ−２）及び１倍ＨＡＬＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製品♯１８６１２８１）を含有する１２×７５ｍｍ管中に直ちに落とす。試料を、−６０℃凍結器に一晩移す前に、使い捨て硬組織Ｏｍｎｉ  Ｔｉｐホモジナイザープローブ（Ｏｍｎｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ♯３＿７５０Ｈ）を使用して約１５秒間均質化し、濡れた氷上にさらに１５〜２５分間静置させる。試料を凍結器から取り出し、室温で静置させて解凍を開始する。試料が解凍し始めると、濡れた氷に移して解凍を継続する。解凍が完了した後、試料を旋回し、１．８ｍＬ微量遠心管に移す。溶解物を１４，０００Ｘｇで３０〜６０分間４℃で遠心分離する。溶解物（２００μＬ）を９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ  カタログ♯３８７９）に移す。下で示されているＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（カタログ♯２３２２５）を使用してタンパク質濃度を決定する。簡潔に、標準曲線は、１倍ＨＡＬＴを含有するＲＩＰＡ溶解バッファで希釈されたＢＳＡ標準物を使用して生成され、２，０００μｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬの動作範囲をもたらす。全ての溶解物は、１倍ＨＡＬＴを含有するＲＩＰＡ溶解バッファに１：１０で希釈される。ピペットで２５μＬの標準物及び試料を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ♯３５３０７２）中に入れ、２００μＬの作動試薬を各ウェルに添加し、プレートをプレートシェーカー上で３０秒間しっかり混合する。プレートを覆い、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを室温まで冷却し、５６２ｎｍ付近での吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ上で測定する。各試料のタンパク質濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．３ソフトウェアプログラムを使用して決定される。腫瘍試料を定量化した後、溶解物を９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて−８０℃で凍結し、後日アッセイを実施する。
【００８６】
ｐＳＴＡＴ３測定：
ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）アッセイを下記のとおり実施する。ＭＳＤ  ｐＳＴＡＴ３アッセイキットは、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手される（カタログ♯Ｋ１５０ＤＩＤ−２）。１００倍ＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤は、使用及び実施しやすさに基づき、キットのホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤で置換してもよい。１００倍ＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を１倍最終濃度まで添加することにより、ＭＳＤトリス溶解バッファを調製し、ＭＳＤ完全溶解バッファと称する。腫瘍試料を−８０℃凍結器から取り出し、室温で静置させて解凍を開始する。試料解凍中、ｐＳＴＡＴ３  Ｔｙｒ７０５捕捉プレート（カタログ♯Ｋ１５０ＤＩＤ−２）を、１５０μＬのブロッキング溶液で最低１時間、室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）ブロックする。プレートを振盪前に接着プレートシールで封止する。ブロッキング溶液は、ブロッカーＡ（カタログ♯Ｒ９３ＢＡ−４）６００ｍｇｓ：２０ｍＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファ（カタログ♯Ｒ６１ＴＸ−２）の比を含有する。試料が解凍し始めると、濡れた氷に移して解凍を継続する。解凍が完了した後、マルチチャネルピペットを使用して数回吸い上げたり押し出したりすることにより、注意深く混合する。氷冷ＭＳＤ完全溶解バッファ中の試料を、０．４μｇ／μＬ×１００μＬのタンパク質濃度に正規化する。全ての正規化された腫瘍試料を、それらがｐＳＴＡＴ３捕捉プレートに添加されるまで、９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて氷上で維持する。ｐＳＴＡＴ３捕捉プレートがブロックされた後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４プレートウォッシャーを使用して、２５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、プレートを軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去する。１ウェル当たり総体積２５μＬ（１０μｇ）の正規化された腫瘍溶解物を添加し、さらに２〜３時間室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）インキュベートする。このインキュベーション中、６０μＬのスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を２．９４ｍＬの抗体希釈バッファに添加することにより、キットで提供されるスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を抗体希釈バッファ（２ｍＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファと組み合わされた１ｍＬのブロッキング溶液）で希釈する。この抗体溶液を、必要になるまで、濡れた氷上で保持する。腫瘍溶解物インキュベーション後、プレートを２５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、プレートを軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去し、２５μＬ／ウェルのスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を添加する。プレートをさらに１時間室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）インキュベートする。このインキュベーション中、界面活性剤を含む４倍ＭＳＤ読み取りバッファＴ（カタログ♯Ｒ９２ＴＣ−３）を脱イオン水で１倍まで希釈し、室温で保持する。検出抗体インキュベーションが完了した後、プレートを��５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、プレートを軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去し、総体積１５０μＬ／ウェルの界面活性剤を含む１倍ＭＳＤ読み取りバッファＴを添加する。プレートをＭｅｓｏ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０上で読み取る。データを下で示されているように分析する。
【００８７】
ｐＳＴＡＴ３阻害パーセント計算：
Ｍｅｓｏ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０からの生のプレートデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌバージョン２０１０ワークシートにそのままコピーアンドペーストする。データを適切な形式（用量応答または時間経過）に組織化し、ｐＳＴＡＴ３阻害パーセント計算（下の式を参照）のためにＪＭＰバージョン１１にそのままコピーアンドペーストする。
[１−（治療試料シグナル／ビヒクル対照の平均シグナル）]＊１００
ダネット検定を使用してビヒクル対照平均と比較した治療群平均で一元配置分散分析を決定する。
【００８８】
ＴＥＤ計算：
ＴＥＤ５０及びＴＥＣ５０値は、用量応答試験から決定される。それぞれ、ＴＥＤ５０とは、２時間で５０％のｐＳＴＡＴ３阻害を達成するのに必要な用量であり、ＴＥＣ５０とは、２時間で５０％のｐＳＴＡＴ３阻害を達成するのに必要な血漿濃度である。
【００８９】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、３５ｍｇ／ｋｇのＴＥＤ５０及び１１．１μＭ（ｎ＝１）のＴＥＣ５０を示す。これらの結果は、実施例１の化合物がインビボで、経口投与後２時間で、（ｐＳＴＡＴ３を読み出し情報として使用して）ＪＡＫ１−ＳＴＡＴ３シグナル伝達を効果的に阻害することを示す。これらの結果は、実施例１の化合物が、ＴＥＣ５０とのＰＫ／ＰＤ相関活性も例証することを示す。
【００９０】
ｐＳＴＡＴ３ラットＩＶＴＩ（ＪＡＫ１）アッセイ
このアッセイの目的は、Ｈ１９７５異種移植ラットモデルにおいてｐＳＴＡＴ３発現を阻害する試験化合物の能力を測定することである。Ｈ１９７５細胞を、ＡＴＣＣ仕様書に従って、利用可能な最も低い継代数で成長させる。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０において培養及び維持し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートする。細胞を標準的な技術により採取し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ基底膜マトリックス（ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））と混合し、１：１の細胞／マトリックス比を達成し、２ｅ６細胞を含有する０．２ｍＬの細胞／マトリックス懸濁液の接種体積をもたらす。接種手順全体を通して細胞懸濁液を氷上で保持し、細胞培養物採取後１時間以内に移植を開始する。全ての移植を、Ｔａｃｏｎｉｃから入手した雌のＮＩＨヌードラットの右後脇腹に皮下投与する。全てのラットにＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔｓ  ♯２９２０Ｘを不断給餌し、ボトルにより給水する。移植された腫瘍細胞を固形腫瘍として成長させ、一週間に２回体重と共に測定する。移植後５〜９日から体重及び腫瘍体積の測定を開始する。０．５３６＊Ｌ＊Ｗ＾２の計算を用いて腫瘍体積を決定する。腫瘍体積が約３５０〜４００ｍｍ３に達した後、マルチタスクブロックランダム化ツールを使用して動物をランダム化し、６匹の動物を含むビヒクル群及び各々６匹の動物を含む複数の治療群に入れる。インサイチュ塩を形成する１．１モル当量のメタンスルホン酸を含む０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０５％消泡剤を含有する１％ＨＥＣビヒクルにおいて、化合物を製剤化する（化合物１ｍｇ当たり１．１ｍＬの１Ｎメタンスルホン酸）。ビヒクル対照群には酸を添加しない。最近の群の平均体重に基づいて用量を計算する。全ての化合物を、用量応答及び時間経過試験の両方について、経口強制栄養法により投与する。用量応答試験とは、腫瘍除去、処理、及び凍結前に２時間投与される単一用量である。時間経過試験とは、用量応答試験から決定されたＴＥＤ７０で投与される単一用量である。腫瘍除去、処理、及び凍結の実施は、下に概説されている複数の時間点で発生する。
【００９１】
腫瘍組織処理
腫瘍を採取及び切断し、約２００〜２５０ｍｍ３サイズの断片をもたらし、１ｍＬの氷冷ＭＳＤトリス溶解バッファ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  カタログ♯Ｒ６０ＴＸ−２）及び１倍ＨＡＬＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製品♯１８６１２８１）を含有する１２×７５ｍｍ管中に直ちに落とす。試料を、−６０℃凍結器に一晩移す前に、使い捨て硬組織Ｏｍｎｉ  Ｔｉｐホモジナイザープローブ（Ｏｍｎｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ♯３＿７５０Ｈ）を使用して約１５秒間均質化し、濡れた氷上にさらに１５〜２５分間静置させる。試料を凍結器から取り出し、室温で静置させて解凍を開始する。試料が解凍し始めると、濡れた氷に移して解凍を継続する。解凍が完了した後、試料を旋回し、１．８ｍＬ微量遠心管に移す。溶解物を１４，０００Ｘｇで３０〜６０分間４℃で遠心分離する。溶解物（２００μＬ）を、９６ウェル試料テンプレート設計に対応する９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ  カタログ♯３８７９）に移す。下で示されているＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（カタログ♯２３２２５）を使用してタンパク質濃度を決定する。簡潔に、標準曲線は、１倍ＨＡＬＴを含有するＲＩＰＡ溶解バッファで希釈されたＢＳＡ標準物を使用して生成され、２，０００μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍＬの動作範囲をもたらす。全ての溶解物は、１倍ＨＡＬＴを含有するＲＩＰＡ溶解バッファに１：１０で希釈される。ピペットで２５μＬの標準物及び試料を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ♯３５３０７２）中に入れ、２００μＬの作動試薬を各ウェルに添加し、プレートをプレートシェーカー上で３０秒間しっかり混合する。プレートを覆い、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを室温まで冷却し、５６２ｎｍ付近での吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ上で測定する。各試料のタンパク質濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．３ソフトウェアプログラムを使用して決定される。腫瘍試料を定量化した後、９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて−８０℃で凍結し、後日アッセイを実施する。
【００９２】
ｐＳＴＡＴ３測定
ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）は下記のとおり実施される。ＭＳＤ  ｐＳＴＡＴ３アッセイキットは、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手される（カタログ♯Ｋ１５０ＤＩＤ−２）。１００倍ＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤は、使用及び実施しやすさに基づき、キットのホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤で置換してもよい。キットからの全ての他の試薬を活用する。１００倍ＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を１倍最終濃度まで添加することにより、ＭＳＤトリス溶解バッファを調製する（ＭＳＤ完全溶解バッファと称する）。腫瘍試料を−８０℃凍結器から取り出し、室温で静置させて解凍を開始する。試料解凍中、ｐＳＴＡＴ３  Ｔｙｒ７０５捕捉プレート（カタログ♯Ｋ１５０ＤＩＤ−２）を、１５０μＬのブロッキング溶液で最低１時間、室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）ブロックする。プレートを振盪前に接着プレートシールで封止する。ブロッキング溶液は、ブロッカーＡ（カタログ♯Ｒ９３ＢＡ−４）６００ｍｇｓ：２０ｍＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファ（カタログ♯Ｒ６１ＴＸ−２）の比を含有するべきである。試料が解凍し始めると、濡れた氷に移して解凍を継続する。解凍が完了した後、マルチチャネルピペットを使用して数回吸い上げたり押し出したりすることにより、注意深く混合する。氷冷ＭＳＤ完全溶解バッファ中の試料を、０．４μｇ／μＬ×１００μＬのタンパク質濃度に正規化する。全ての正規化された腫瘍試料を、それらがｐＳＴＡＴ３捕捉プレートに添加されるまで、９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて氷上で維持する。ｐＳＴＡＴ３捕捉プレートがブロックされた後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４プレートウォッシャーを使用して、２５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去する。１ウェル当たり総体積２５μＬ（１０μｇ）の正規化された腫瘍溶解物を添加し、さらに２〜３時間室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）インキュベートする。このインキュベーション中、６０μＬのスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を２．９４ｍＬの抗体希釈バッファに添加することにより、キットで提供されるスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を抗体希釈バッファ（２ｍＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファと組み合わされた１ｍＬのブロッキング溶液）で希釈する。この抗体溶液を、必要になるまで、濡れた氷上で保持する。腫瘍溶解物インキュベーション後、プレートを２５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去し、２５μＬ／ウェルのスルホ−ＴＡＧ抗ホスホ−ＳＴＡＴ３検出抗体を添加する。プレートをさらに１時間室温で、プレートシェーカー上で激しく振盪しながら（３００〜１０００ｒｐｍ）インキュベートする。このインキュベーション中、界面活性剤を含む４倍ＭＳＤ読み取りバッファＴ（カタログ♯Ｒ９２ＴＣ−３）を脱イオン水で１倍まで希釈し、室温で保持する。検出抗体インキュベーショ��が完了した後、プレートを２５０〜３００μＬの１倍ＭＳＤトリス洗浄バッファで４回洗浄する。最終洗浄後、軽くたたき、全ての残留洗浄バッファを除去し、総体積１５０μｌ／ウェルの界面活性剤を含む１倍ＭＳＤ読み取りバッファＴを添加する。プレートをＭｅｓｏ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０上で読み取る。データを下で示されているように分析する。
【００９３】
ｐＳＴＡＴ３阻害パーセント計算：
Ｍｅｓｏ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０からの生のプレートデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌバージョン２０１０ワークシートにそのままコピーアンドペーストする。データを適切な形式（用量応答または時間経過）に組織化する。ｐＳＴＡＴ３阻害パーセント計算（下の式を参照）のためにＪＭＰバージョン１１にそのままコピーアンドペーストする。
[１−（治療試料シグナル／ビヒクル対照の平均シグナル）]＊１００
ダネット検定を使用してビヒクル対照平均と比較した治療群平均で一元配置分散分析を決定する。
【００９４】
ＴＥＤ計算：
ＴＥＤ５０及びＴＥＣ５０値は、用量応答試験から決定される。それぞれ、ＴＥＤ５０とは、２時間で５０％のｐＳＴＡＴ３阻害を達成するのに必要な用量であり、ＴＥＣ５０とは、２時間で５０％のｐＳＴＡＴ３阻害を達成するのに必要な血漿濃度である。
【００９５】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、９ｍｇ／ｋｇのＴＥＤ５０及び３．９μＭ（ｎ＝１）のＴＥＣ５０を示す。これらの結果は、実施例１の化合物が、ラットＨ１９７５ＩＶＴＩモデルにおいて標的結合を例証することを示す。
【００９６】
ＨＣＣ８２７異種移植腫瘍モデルにおける有効性試験
このアッセイの目的は、ＨＣＣ８２７異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する化合物の能力を測定することである。ＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ−２８６８、ロット♯５９３９２８９１）を、ＡＴＣＣ仕様書に従って、利用可能な最も低い継代数で成長させる。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０において培養及び維持し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートする。ＴｒｙＰＬＥを使用してフラスコから細胞を採取し、ＤＰＢＳ中で２回すすぎ、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ基底膜マトリックス（ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））と混合し、細胞懸濁液が１：１の細胞／マトリックス比を達成し、５ｅ６細胞を含有する０．２ｍｌの細胞／マトリックス懸濁液の接種体積をもたらす。接種手順全体を通して細胞懸濁液を氷上で維持し、細胞培養物採取後１時間以内に移植を開始する。移植を、Ｈａｒｌａｎから入手した雌のＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（１８〜２０ｇ）の右後脇腹に皮下投与する。マウスにＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒｕｄｅｄ  ２９２０Ｘを不断給餌し、ラック給水システムにより給水する。移植された腫瘍細胞を固形腫瘍として成長させ、移植後７日目から開始して一週間に２回体重と共に測定する。０．５３６＊Ｌ＊Ｗ＾２の計算を用いて腫瘍体積を決定する。腫瘍体積が約１５０〜２００ｍｍ３に達した後、動物をランダム化し、各々５〜８匹の動物を含む群に入れる。インサイチュ塩を形成する１．１モル当量のメタンスルホン酸を含む０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０５％消泡剤を含有する１％ＨＥＣビヒクルにおいて、化合物を製剤化する（化合物（分子量を挿入）ｍｇ当たり１．１ｍＬの１Ｎメタンスルホン酸）。試験化合物を室温で保存する。化合物を一週間に１回製剤化し、室温で保存する。ビヒクル対照群には酸を添加しない。最近の群の平均体重に基づいて用量を計算する。化合物を経口強制栄養法により、投与量に応じてＢＩＤ（１日２回）またはＱＤ（１日１回）のいずれかで、２８日間投与する。
【００９７】
本発明の範囲内の化合物は、このアッセイにおいて、実質的に上に記載されているように試験される。実施例１の化合物は、３０ｍｇ／ｋｇＢＩＤで３１％の腫瘍成長阻害、６０ｍｇ／ｋｇＢＩＤで２２％の腫瘍退縮、及び１２０ｍｇ／ｋｇＱＤで２２％の腫瘍退縮を示す。これらの結果は、実施例１の化合物が、ＨＣＣ８２７異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を例証することを示す。