(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スペインタイプカルチャーコレクションに寄託番号ＣＥＣＴ  ７５０４で寄託されたラクトバチルス・ペントーサスの菌株を含む組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含む、カンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物を含む、膣カンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物を含む、カンジダ・グラブラータに起因する膣カンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含む、高炎症反応を伴う膣カンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物を含む、トリアゾール抗真菌薬又はナイスタチンと併用でのカンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物を含む、口腔又は腸カンジダ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を含む、細菌性膣炎の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物を含む、医薬。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物を含む、医薬製品。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を含む、食品又は食用製品。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物を含む、補助食品。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物を含む、個人用衛生製品。
【請求項１４】
スペインタイプカルチャーコレクションに寄託番号ＣＥＣＴ  ７５０４で寄託されたラクトバチルス・ペントーサスの株。
【請求項１５】
スペインタイプカルチャーコレクションに寄託番号ＣＥＣＴ  ７５０４で寄託されたラクトバチルス・ペントーサスの株の突然変異体を得るための方法であって、寄託された菌株を出発物質として使用すること、及び突然変異誘発を適用することを含み、得られた突然変異体が、寄託された親株の抗真菌活性及び／又は抗菌活性及び／又は膣管にコロニーを形成する能力を保持するか又は強化する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、微生物学及び食品技術の分野に、特に、ヒトの健康のためになるプロバイオティクスとして使用されるラクトバチルス・ペントーサスの新規菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス
プロバイオティクス微生物の概念は、発酵を引き起こすことができる細菌（ラクトバチルス属）の消費が、結腸の微生物叢にプラスの効果を有し、人間の健康に悪影響を与える他の微生物の活動や細菌性毒素の存在を低下させることを示唆した、ノーベル賞イリヤ・メチニコフの仮説から生まれた。
【０００３】
「プロバイオティクスは、その投与後、本来の基本的な栄養を超える利益をその消費者にもたらす生きた微生物である」。今日では、幾つかの胃腸の健康障害を治療するためのプロバイオティクスの有用性についての多くの言及、及び免疫系を活性化しアレルギーを防ぐためのプロバイオティクスの有用性を示唆する多くの研究がある。
【０００４】
プロバイオティクス細菌は、毒性の欠如、生存能力、付着力及び有益な効果に関連する幾つかの要件を満たす必要がある。各菌株の特性は固有であり、同一種の他の菌株に対して推定することはできない(Araya, M., et al. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food - Joint FAO/WHO Working Group. FAO/WHO. Editor 2002. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization: Ontario, Canada)。したがって、すべてのプロバイオティクス要件においてより優れた能力を有する菌株を見つけることが重要である。
【０００５】
プロバイオティクスの概念は腸管微生物フローラと関連付けられていたが、早くも１９８８年に実施された研究が、この概念が女性の膣フローラにも拡大されうることを示していた。幾つかの科学団体が数年にわたりこのアイディアを発展させ、ついに膣健康の乱れを治療するのに有用なラクトバチルス属のうちの幾つかの菌株の同定を成功させて(Anukam, K.C., et al. Clinical study comparing probiotic LactobacillusGR-1 and RC-14 with metronidazole vaginal gel to treat symptomatic bacterial vaginosis. Microbes and Infection. 2006, Vol. 8, Nos. 12-13, pages 2772-2776; Larsson, P.G., et al. Human lactobacillias supplementation of clindamycin to patients with bacterial vaginosis reduce the recurrence rate; a 6-month, double-blind, randomized, placebo-controlled study. BMC Women’s Health. 2008, Vol. 8, No. 1, page 3)、膣の健康のためのプロバイオティクスの概念を証明した。
【０００６】
健康的な膣フローラ
膣分泌物やかゆみの現れは、産婦人科受診の最も一般的な理由である。これは、アレルギー反応、刺激性剤（布繊維、石鹸、スプレー等）との接触が原因でありうるか、又は多くの場合、感染が原因でありうる。
【０００７】
健康的な膣フローラは、膣の自然な酸性のｐＨ（３．９から４．３）を維持するラクトバチルス属から主に構成され、他の微生物による膣コロニー形成を防止している。例えば全身性抗生物質治療によってこの天然のフローラが弱められると、病原性種による感染ははるかに起こりやすくなる。健康的な膣フローラの最もよくある乱れは、外陰膣カンジダ症と細菌性膣炎である。
【０００８】
外陰膣カンジダ症
カンジダ属は、何ら病気の症状なしで膣フローラ内に少数見出されうる、非常に一般的な酵母である。膣フローラの均衡が乱され、カンジダ属の個体数が、防御的なラクトバチルス属の量と比較して増えると、症状が現れる。カンジダ属感染症の典型的な症状は、膣のかゆみ及び熱感、並びに性交疼痛症及び膣痙を含む。外陰膣カンジダ症の症例の約７５％はカンジダ・アルビカンスが原因であり、更に１５％がカンジダ・グラブラータに起因する(Richter, S.S., et al.Antifungal Susceptibilities of Candida Species Causing Vulvovaginitis and Epidemiology of Recurrent Cases. J. Clin. Microbiol. 2005, Vol. 43, No. 5, pages 2155-2162)。女性の７５％が一生涯に少なくとも一度の発症を経験すると推定される。更に、症例の２５％が、年に４回以上再発している。
【０００９】
感染は、多くの場合、異なる治療目的で処方される抗生物質療法による治療後に発生する。感染はまた、エストロゲン含有経口避妊薬を服用している女性、妊婦、及び糖尿病の女性においても一般的である。カンジダ属感染症は、トリアゾール薬（例えば、フルコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール（ｍｙｃｏｎａｚｏｌｅ）、イトラコナゾール）又はナイスタチン等の抗真菌薬で治療される。しかしながら、カンジダ・グラブラータの株がこのような治療に対する高い耐性を示す傾向にあるのと同時に、臨床で単離されたカンジダ・アルビカンスの株の最大２０％が、最も一般的な治療の一つであるフルコナゾールへの耐性を示すことは注目に値し、外陰膣カンジダ症の管理のための新規な治療的ツールを発見することの重要性を強調している。
【００１０】
膣液は、その酸性ｐＨに加えて、例えばリゾチーム、デフェンシン及びラクトフェリンのような幾つかの抗微生物タンパク質を含有する。外陰膣カンジダ症の間、これらの物質の濃度は、女性の約２５％において正常レベルを超えて増加する(Valore, E.V., et al. Reversible Deficiency of Antimicrobial Polypeptides in Bacterial Vaginosis. Infect. Immun. 2006, Vol. 74, No.10, pages 5693-5702)。これらの物質の効果は抗真菌性よりも静菌性又は殺菌性であるため、この反応では、カンジダ属等の酵母を防ぐには通常は不十分である。しかし、健康的な膣フローラはラクトバチルス属の細菌で主に構成されているため、抗微生物タンパク質のこの異常な増加は健康的な膣フローラの回復を更に遅らせることに関与しうる。また、これは、プロバイオティクスとして使用されるのに適したラクトバチルス属を探索する場合、これらの抗微生物因子への耐性を考慮する必要性を強調している。
【００１１】
細菌性膣炎
細菌性膣炎は、膣フローラに通常は存在しないか、又は非常に少量で見出される細菌種の異常増殖に起因する。最も一般的な種は、ガードネレラ・バギナリス及びアトポビウム・バギナーレ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｌｅ）だが、正確な病因物質はこれまで見出されていない。およそ５人に１人の女性が、６ヶ月から１２ヶ月間隔で細菌性膣炎を発症する。細菌性膣炎は、普通でない膣分泌物や魚臭の原因となりうるが、殆どの場合は無症状である。細菌性膣炎の典型的な特徴は、ラクトバチルス属の消失に起因する４．５を超えるｐＨへの上昇であり、これが他の細菌種の増殖を更に促進する。
【００１２】
細菌性膣炎は、メトロニダゾール及びクリンダマイシン等の抗生物質で治療される。しかし、細菌性膣炎は、最初の１ヶ月間で最大３５％、最初の１年間で最大７０％の高い再発率を示す。また、抗生物質、特にクリンダマイシンがラクトバチルス属にも影響を与えるために、膣疾患の抗生物質治療は二次感染として外陰膣カンジダ症をもたらしうることが観察された。
【００１３】
また、細菌性膣炎を有する女性には、未熟児又は低体重（２．５ｋｇ未満）の新生児がいる傾向にあることが示されている。時として感染が卵管に広がることもありうる。感染症のこのタイプは、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）と呼ばれ、子宮外妊娠のリスクが増大し、不妊症や卵管損傷の原因となりうる。細菌性膣炎はまた、尿路感染症や性感染症のリスクを増大させる。
【００１４】
外陰膣カンジダ症及び細菌性膣炎の管理のためのプロバイオティクス
現在、外陰膣カンジダ症の管理を補助するために幾つかのプロバイオティクス菌株、例えば、ラクトバチルス・ラムノサスＧＲ１、ラクトバチルス・ファーメンタムＲＣ１４、ラクトバチルス・プランタルムＰ１７６３０及びラクトバチルス・アシドフィルスＮＡＳ等が市販されている。しかし、これらの何れも、４つの感染症例のうち約１例で発生する抗微生物因子の濃度上昇に耐える能力については試験されていない。その上、有効性の主張が無作為化プラセボ対照臨床試験によりサポートされている、外陰膣カンジダ症の管理のためのプロバイオティクスソリューション（ラクトバチルス・ラムノサスＧＲ１株及びラクトバチルス・ロイテリＲＣ１４株により構成されるＢＩＯＮ  Ｆｌｏｒｅ  Ｉｎｔｉｍｅ（登録商標）はたった一つしかない(Martinez, R.C.R., et al. Improved treatment of vulvovaginal candidiasis with fluconazole plus probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14. Letters in Applied Microbiology. 2009, Vol. 48, No. 3, pages 269-274)。
【００１５】
一方、健康上の主張がランダム化プラセボ対照臨床試験によりサポートされている、細菌性膣炎の管理のためのプロバイオティクス製品が２つある：ＢＩＯＮ  Ｆｌｏｒｅ  Ｉｎｔｉｍｅ（登録商標）−ラクトバチルス・ラムノサスＧＲ１及びラクトバチルス・ファーメンタムＲＣ１４−及びＥｃｏＶａｇ（登録商標）−ラクトバチルス・ガセリＤＳＭ  １４８６９及びラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ  １４８７０(Anukam, K.C., et al. 2006, supra; Larsson, P.G., et al. 2008, supra)。
【００１６】
健康な成人個体から得てテトラサイクリンの存在下で培養した便培養物から単離されたラクトバチルス・ペントーサス株ＮＣＩＭＢ  ４１１１４を記述している欧州特許第１４３６３８０号のように、当該技術分野では、膣プロバイオティクスとなりうる他の菌株が記述されている。該文書は、カンジダ属種の増殖を抑える該株の能力の結果、該菌株がテトラサイクリン及び関連する抗生物質に耐性があること、また該株が体の如何なる部位においても、特に過敏性腸症候群において、カンジダ属の望ましくない増殖に対抗するのに有用でありうることを記述している。この文書は、カンジダ・グラブラータに対する該菌株の阻害活性については言及しておらず、また、該菌株の、膣上皮に付着して膣環境で生存する能力又は膣環境内に存在する抗微生物物質（例えば、リゾチーム）に抵抗する能力の実証もしていない。
【００１７】
Okkers, D.J. et al. 1999は、出生前の患者の膣の後円蓋の分泌物から単離した株ラクトバチルス・ペントーサスＴＶ３５ｂが、カンジダ・アルビカンス及び幾つかの細菌種に阻害性であるバクテリオシン様ペプチド（ペントシン（ｐｅｎｔｏｃｉｎ）  ＴＶ３５ｂ）を生成したと記述している。該文書は、カンジダ・グラブラータに対する該菌株の阻害活性については言及していない(Okkers, D. J. et al. Characterization of pentocin TV35b, a bacteriocin-like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans, Journal of Applied Microbiology. 1999, Vol. 87, No. 5, pages 726-734)。
【００１８】
一方、当該技術分野では、カンジダ・アルビカンスに対する阻害活性を示さない膣株が記述されている。例えば、Dimitonova et al. 2007では、健康なブルガリア人女性の膣スワブから単離された２０株のラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の阻害活性が評価された。この２０株のうち、カンジダ・アルビカンスの増殖を阻害したものは一つもなかった(Dimitonova, S.P. et al. Antimicrobial activity and protective properties of vaginal lactobacilli from healthy Bulgarian women. Anaerobe. 2007, Vol. 13, No. 5-6, pages 178-184)。
【００１９】
また、当該技術分野では、カンジダ・アルビカンスに対する阻害活性の存在は、菌株がカンジダ・グラブラータに対してもアンタゴニストであることを意味するものではないことが教示されている。例えば、Pascual L.M. et al. 2008では、非妊娠、健康、閉経前の女性の膣から単離したラクトバチルス属の菌株をラクトバチルス・ラムノサスＬ６０であると同定した。ラクトバチルス・ラムノサスＬ６０は、泌尿生殖器病原体に対して幅広い抗菌活性を、また、こうした病原体に起因する感染症のために一般的に処方される抗生物質に対して耐性を示した。本菌株は、カンジダ・アルビカンス１０株に対してはアンタゴニストであったが、試験したカンジダ・グラブラータ３株に対してはアンタゴニストではなかった（Pascual, L.M. et al. Lactobacillus rhamnosus L60, a potential probiotic isolated from the human vagina. Journal of General and Applied Microbiology. 2008, Vol. 54, No. 3, pages 141-148)。
【００２０】
したがって、膣プロバイオティクス候補としての使用のための、記述されるラクトバチルス属が膣から単離される事実は、ラクトバチルス属がカンジダ属の種に対する阻害活性を示すことを意味しない。更に、ラクトバチルス属の菌株がカンジダ・アルビカンスに対するアンタゴニストであるという事実は、他のカンジダ属の種、例えばカンジダ・グラブラータに対しても活性を有することを意味しない。したがって、カンジダ属種のアンタゴニストであることは、ラクトバチルス属の固有の特徴ではない。
【００２１】
国際公開第２０１２／１０１５００号は、膣感染症の治療のための膣への適用に使用するための固体状の発泡性組成物を記述している。該発泡性組成物は、ガレヌス成分（ｇａｌｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）のうち、膣環境内の病原性剤の存在を削減及び／又は排除するためのプロバイオティクス菌株を含む。該菌株は、プロバイオティクスとして使用される最も一般的な種の長いリストから、ラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属から選択される。該文書はこれらの菌株の特性を評価するための試験を含んでいない。該発明は、製造中のプロバイオティクスの生残性を高めるため、また管理を改善するために設計されたガレヌス組成物に焦点を当てている。該文書中で言及されている菌株は市販されており、言及されている病原体は膣症状では一般的なものである。
【００２２】
日本国特許第２００８０１３５０２号公報は、膣炎のようなカンジダ属感染症の治療又は予防のための、ラクトバチルス・ペントーサス等の乳酸菌を用いたアブラナ科植物（例えば、ブロッコリー）の発酵工程により得られる生成物の使用を記述している。試験は、カンジダ・アルビカンス寄託株を用いて実施される。該文書は、カンジダ・グラブラータに対する発酵物の阻害活性については言及していない。
【００２３】
一方、上に説明したように、膣液中の抗菌物質は、外陰膣カンジダ症を経験している女性の約２５％において正常レベルを超えて増加している。こうした抗菌物質は、ラクトバチルス属に対して有意な阻害効果を有する。少数のラクトバチルス属が、膣プロバイオティクスとして現在使用されているが、それらのうちで、抗微生物因子が膣液中で増加している条件の中で生き残るための能力について試験されているものはない。更に、既存の膣プロバイオティクスの何れも、カンジダ・グラブラータに対する特異的な活性について試験されていない。カンジダ・グラブラータは、カンジダ属感染症のかなりの割合を占め、現行の抗真菌薬治療への高い耐性を示し、故に、より重大な治療的課題を提示する。
【発明の概要】
【００２４】
本発明人らは、健康なヒトから単離した種々のラクトバチルス属菌株についての広範囲な研究の結果として、膣感染症の管理のためのプロバイオティクスとして適切なラクトバチルス・ペントーサスの新規菌株を提供する。菌株  Ｉ１００１は、不衛生な条件下で生活する健康な若い女性の膣フローラから単離された。ラクトバチルス・ペントーサスのこの株は、寄託人ＡＢ−Ｂｉｏｔｉｃｓ，Ｓ．Ａ．（所在地：Ｅｄｉｆｉｃｉ  Ｅｕｒｅｋａ，ｏｆｆｉｃｅ  Ｐ１Ｍ１．１，Ｃａｍｐｕｓ  ＵＡＢ，０８１９３−Ｂｅｌｌａｔｅｒｒａ（Ｓｐａｉｎ））により２００９年３月６日にスペインタイプカルチャーコレクション（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ  Ｅｓｐａｎｏｌａ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｉｖｏｓ  Ｔｉｐｏ，ＣＥＣＴ，Ｅｄｉｆｉｃｉｏ  ３  ＣＵＥ，Ｐａｒｃ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  ｄｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ  Ａｇｕｓｔｉｎ  Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ，９，４６９８０−Ｐａｔｅｒｎａ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ）に寄託された。ラクトバチルス・ペントーサスのこの株は、国際寄託当局（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｐｏｓｉｔ）がその生存を確認した後、寄託番号ＣＥＣＴ  ７５０４を与えられた。
【００２５】
寄託人ＡＢ−Ｂｉｏｔｉｃｓ，Ｓ．Ａ．は、出願人ＧＹＮＥＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ  Ｓ．Ｌ．に対し、代表者のレファレンス番号（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ’ｓ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｍｂｅｒ）Ｐ２７２３ＥＰ００を有する欧州特許出願において、又はそれに由来するか若しくはそれに基づく優先権を主張する任意の後続の特許出願において前述の寄託された生物学的材料に言及する権限を与え、また欧州特許条約（ＥＰＣ）規則３３に従って、前述の特許出願の日から寄託材料が一般に利用可能になることに無条件且つ取消不能の同意を与えた。
【００２６】
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、以下の際立った特性により、１００の単離ラクトバチルス属菌株より選択された：
●膣液中に見出される抗微生物因子、特にリゾチームに対する高い生残性。上述のように、抗微生物因子は、多くの場合、カンジダ症を有する患者のサブセット（症例の約２５％）において増加し、多くのプロバイオティクスに非常に有害ということもあり得る。実施例の節に示すように、膣由来のラクトバチルス属の一部しか、健康な患者においては見られないが外陰膣カンジダ症の患者においては見られうるリゾチームの濃度上昇に対して生存可能ではなかった（ラクトバチルス属菌１０株が試験されている、下記の実施例３を参照）。このことは、これらのタンパク質への耐性は、ラクトバチルス属の固有の特徴ではないことを意味する。更に、天然抗微生物因子の濃度が膣液中で上昇している条件下で生存する能力を有する膣プロバイオティクスを記述している先行技術はないと思われる。故に、既知のプロバイオティクスは、患者のこのサブセットには有効ではないであろう。驚くべきことに、菌株ＣＡＳＴ  ７５０４は、これらの条件に対して顕著な耐性を示し、故に患者のこのサブセットに特に必要である。特に、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、最高１６ｍｇ／ｌのリゾチーム濃度に対して高い耐性を示した（図２参照）。リゾチームは、有機酸以外には膣液中で最高濃度で見られる抗微生物因子であり、その活性は、ラクトバチルス属等のグラム陽性生物に対して最も向けられているものである。一方、市販の菌株のラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０（ＩＳＡＤＩＮ）は、一部の外陰膣カンジダ症患者で見られるような４ｍｇ／ｌを超える濃度のリゾチームに曝された場合に、生存能力の著しい低下（９０％）を示した。
●カンジダ・アルビカンスとカンジダ・グラブラータ両方の増殖を阻害し、故に外陰膣カンジダ症等のカンジダ属感染症の管理を補助する広範囲の抗菌スぺクトル活性を示す能力。背景技術及び実施例の節に示す通り、膣由来の幾つかのラクトバチルス属は、１又は２のカンジダ属単離菌に対して有意な拮抗活性を示すが、ごく一部だけしか、カンジダ・アルビカンス種とカンジダ・グラブラータ種双方の幾つかの単離菌のパネルに対して有意な活性を示さない（実施例４参照）。故に、上述の通り、カンジダ属単離菌を阻害する能力は、ラクトバチルス属の固有の特徴ではない。驚くべきことに、株ＣＥＣＴ  ７５０４は、市販のプロバイオティクス菌株ラクトバチルス・プランタルムＰ１７６３０と比較した場合、試験したカンジダ・アルビカンス３株に対してより高い活性を示し、また、カンジダ・グラブラータ１株に対しても高い活性を、異なるカンジダ・グラブラータ株に対してはいくらかの活性を示したが、その一方、ラクトバチルス・プランタルムＰ１７６３０と他の野生型菌株は双方ともカンジダ・グラブラータの前者の株に対して低い活性しか示さず、後者の株に対しては全く活性を示さなかった（表３）。
●カンジダ属感染症の管理の為に通常使用される高濃度抗真菌剤に耐えて生存し、故に、本発明の菌株が前記抗真菌剤と共投与されることを可能にする能力。
●他の単離株及び市販の対照と比較して、膣液を酸性化し、故に細菌性膣炎の管理を補助するための高い可能性を示す、改善された能力。膣液を酸性化する能力は、多くの場合、典型的な実験室培地又はミルクを酸性化する能力から推定される。しかし、膣液の組成物（低濃度の栄養素）は、栄養豊富な実験室培地又はミルクの組成物とはかなり異なる。代わりに、本発明の菌株は、膣液の実際の組成をシミュレートする培地中で試験されている。
●膣上皮細胞に強力に付着する能力。
●工業用培地での良好な増殖。
●膣のかぶれの動物モデルで試験した場合の良好な忍容性。
●ヒトのボランティアで試験した場合の良好な忍容性及びコロニー形成能力。
【００２７】
まとめると、上記の特徴を有するラクトバチルス属菌株、特にラクトバチルス・ペントーサス株を記述している先行技術は存在しないと思われる。当該技術分野では、前記特徴のうちの一つに特に当てはまる他のラクトバチルス属株が記述されているが、注目に値するのは、ラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４の菌株は、これらの特性のすべてを同時に満たしていることである。膣感染症の管理のための上記の主要な特徴を更に満たすために、本発明の菌株はまた、毒性の欠如、生存能力、付着力及び有益な効果に関連する優れたプロバイオティクスの特徴を提供する。下記の実施例はプロバイオティクスの一つ一つの特徴を決定するためのプロトコールを（例として）提供し、また、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４が優れたプロバイオティクスの特徴を有することを証明している。
【００２８】
したがって、第一の態様において本発明は、有効量のラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４を含む組成物を提供する。本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の利益を提供するのには十分に高いが、医学的判断の範囲内で深刻な副作用を回避するには十分に低い薬剤の量を意味する。
【００２９】
様々な種類の乳酸菌種は、明らかな安全使用の長い歴史を有する。欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）は、明らかな安全使用の証明された長い歴史を有する分類学上の単位に「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｆｅｔｙ（ＱＰＳ））」のステータスを付与するシステムを開発した。菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、ＱＰＳステータスを有する細菌種に属する(Andreoletti, O., et al. The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. Question no: EFSA-Q-2008-006; The EFSA Journal. 2008, Vol. 923, pages 1-48)。
【００３０】
細菌中での抗微生物剤への耐性の発生と広がりは、ヒト及び動物の健康に脅威を与え、大きな金銭的及び社会的コストを意味する。抗微生物剤への耐性が細菌種に固有である場合、それは一般的に「固有耐性」と称される（「自然耐性」）とも呼ばれる）。追加された遺伝子により媒介される獲得耐性は側方伝播に対して高い可能性を有すると考えられるが、固有耐性は、水平伝播に対する最小の可能性を示すと推定される。本発明の発明人らは、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）のガイドライン(Bories, G. et al. Update on the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. The EFSA Journal. 2008, Vol. 732, pages 1-15)に従って、本発明の組成物を形成する菌株が、ヒト及び／又は獣医学的に重要な抗生物質（アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン及びクロラムフェニコール）への有意な耐性を示さないことを発見し、故に病原性種への抗生物質耐性の潜在的な移転のリスクを除外した。
【００３１】
別の態様では、本発明は、医薬製品、医薬、食品、食用製品、補助食品、医療食品又は個人用衛生製品としての使用のための、本発明の菌株の有効量を含む組成物を提供する。
【００３２】
上述のように、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、カンジダ属種に対して有意な活性を示す。したがって、第三の態様において、本発明は、カンジダ症の予防及び／又は治療における使用のための、上に記載の組成物を提供する。或いは、本態様は、カンジダ症の予防及び／又は治療用の医薬製品、医薬、食品、食用製品、補助食品、医療食品又は個人用衛生製品の製造のための、本発明の第一の態様に記載の組成物の用途として製剤化されうる。或いは、これは、ヒトにおけるカンジダ症の予防及び／又は治療のための方法としても製剤化され得、該方法は、本発明の第一の態様に記載の組成物の有効量を、それを必要としている前記ヒトに投与することを含む。
【００３３】
本発明の組成物は、カンジダ症にかかりやすい個体の予防的治療、また、カンジダ属の微生物に感染した個体の治療管理に特に有用である。特に、本発明の組成物は、鵞口瘡（口腔カンジダ症）又はカンジダおむつかぶれを予防又は治療するために乳幼児、子供及びＡＩＤＳ患者に投与されうる。更に、ＡＩＤＳ患者は、カンジダ属感染症にかかる可能性が低くなるので、本明細書に開示の組成物から利益を得るであろうし、もしかかった場合でも、経口摂取すればカンジダ属のトランスロケーションが少なくなるであろう。本発明の組成物はまた、妊婦中の胎児を危険にさらす感染症、早産及び尿路感染症を予防するためにも有用である。
【００３４】
膣液中で、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の抗カンジダ属活性が、上皮細胞への付着能力及び抗微生物因子に対する抵抗力とともに見出されるため、特定の実施態様において、本発明の組成物は、膣カンジダ症の予防及び／又は治療に特に有用である。更に特定の実施態様において、カンジダ症はカンジダ・グラブラータに起因する。上述のように、本発明の菌株は、高炎症反応を伴う膣カンジダ症の予防及び／又は治療に特に有用である。
【００３５】
本明細書の「高炎症反応」という用語は外陰膣カンジダ症の間に観察される、膣液中に含まれる抗微生物タンパク質（例えば、リゾチーム、デフェンシン及びラクトフェリン）の濃度の増加として理解される(Valore, E.V., et al.supra)。リゾチームは、膣液中で相対的に高い濃度の抗菌物質の一つである。リゾチームの濃度は、健康な女性及び細菌性膣炎にかかっている女性においては、１から４ｍｇ／ｌの間で変化するが、外陰膣カンジダ症を患っている女性においては、１６ｍｇ／ｌ又はそれ以上に達しうる。故に、本明細書の「高炎症反応」は、リゾチームのレベルに基づいて定義されうる。「高炎症反応」があると考えられる根拠となるリゾチームのレベルを設定することは、当該技術分野ではそれについての記述がないために、困難である。本明細書において、「高炎症反応」は、リゾチーム濃度が４ｍｇ／ｌ以上の場合に存在すると考えられる。
【００３６】
カンジダ属感染症は、膣道（ｖａｇｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）の外側の他の上皮、例えば腸上皮又は口腔上皮でも発生しうる。したがって、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の抗カンジダ属活性及び上皮への付着能力は、腸内又は口腔内のカンジダ属感染症の治療及び／又は予防に有用でありうる。故に、別の態様において本発明は、口腔カンジダ症及び／又は腸カンジダ症の予防及び／又は治療における使用のための、上に記載の組成物を提供する。或いは、本態様は、口腔及び／又は腸カンジダ症の予防及び／又は治療用の医薬製品、医薬、食品、食用製品、補助食品、医療食品又は個人用衛生製品の製造のための、本発明の第一の態様に記載の組成物の用途として製剤化されうる。或いは、これは、ヒトにおける口腔及び／又は腸カンジダ症の予防及び／又は治療のための方法としても製剤化され得、該方法は、本発明の第一の態様に記載の組成物の有効量を、それを必要としている前記ヒトに投与することを含む。
【００３７】
最後に、上述のように、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、膣内環境を酸性化する高い能力を示す。したがって、別の態様において本発明は、細菌性膣炎の予防及び／又は治療における使用のための、本発明の第一の態様に記載の組成物を提供する。或いは、本態様は、細菌性膣炎の予防及び／又は治療用の医薬製品、医薬、食品、食用製品、補助食品、医療食品又は個人用衛生製品の製造のための、本発明の第一の態様に記載の組成物の用途として製剤化されうる。或いは、これは、ヒトにおける細菌性膣炎の予防及び／又は治療のための方法としても製剤化され得、該方法は、本発明の第一の態様に記載の組成物の有効量を、それを必要としている前記ヒトに投与することを含む。
【００３８】
本発明の組成物は、本発明の組成物を形成する菌株の生存能力に悪い影響を与えない任意の適切な形態で調製されうる。本発明の組成物の特定の目的を考慮した製剤化のための最も適切な方法及び賦形剤の選択は製薬技術分野の当業者の範囲内である。本発明の組成物は、経口的、経膣的又は経直腸的に、或いは同時に異なる投与形態を使用して（例えば、経口的及び経膣的に）投与される。
【００３９】
この意味では、本発明の組成物は、固体又は液体の形態であり、とりわけ、散剤、錠剤又はロゼンジ、吸引錠剤（ｓｕｃｋｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、フィルム製剤、液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エアゾール剤、顆粒剤、丸薬、懸濁剤、エマルジョン剤、カプセル剤、腸溶性（ｅｎｔｅｒｏｃｏａｔｅｄ）錠剤及び腸溶性カプセル剤、シロップ剤、液剤（ｌｉｑｕｉｄ）、エリキシル剤、キャンディー、チューイングガム、坐剤、マイクロ浣腸、膣錠、膣ゼラチンカプセル剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、タンポン、ナプキン、パッド、溶融ストリップ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｓｔｒｉｐ）、コンドーム、ペッサリー、スプレー、チンキ剤又は流エキスの形態であってもよい。
【００４０】
本発明の組成物は、食品又は食用製品の場合、本発明の菌株が唯一の活性剤であるか、或いは一又は複数の他の活性剤と混合されているか、及び／又は薬学的に許容される賦形剤若しくは適切な添加剤若しくは成分と混合されている形態で製剤化されうる。本発明の特定の実施態様では、本発明の組成物は、一又は複数の更なる活性剤を付加的に含有する。付加的活性剤又は薬剤は、好ましくは、本発明の組成物を形成する菌株に対して拮抗的ではない他のプロバイオティクス細菌である。カンジダ属感染症を管理するために一般的に使用される高濃度抗真菌剤中で生残することができる本発明の菌株の能力の結果、特定の実施形態において本発明の組成物は、カンジダ症の治療又は予防においてトリアゾール抗真菌薬又はナイスタチン（ｎｉｓｔａｔｉｎ）と併用で投与されうる。それらの併用可能性は下記の実施例で実証されている。製剤によって菌株は、精製された細菌として、細菌培養物として、細菌培養物の一部として、後処理済みの細菌培養物として、単独で又は適切な担体若しくは成分とともに添加されてもよい。また、プロバイオティクスが添加されてもよい。
【００４１】
用語「医薬製品」は、本明細書において広い意味に解され、活性成分（この場合、好ましくは組成物の形態である本発明の菌株）を薬学的に許容される賦形剤と共に含む任意の組成物を含む。用語「医薬製品」は、医薬に限定されない。本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される」は、妥当な利益／リスク比に見合い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症のない、正当な医学的判断の範囲内で対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関連する。各担体、賦形剤等も、製剤の他の成分と相溶性であるという意味において「許容される」ものでなければならない。適切な担体、賦形剤等は、標準的な薬学の教科書に見出すことができる。
【００４２】
医薬製品は、製品承認経路によって、また国によっても、異なる形態又は名称を採用することができる。例えば、医薬は、特定の医薬製品である。医療食品は、別の特定の医薬製品である。用語「医療食品」又は「特別な医療目的のための食品」は、普通の食事だけでは満たされ得ない特有の栄養ニーズを有する疾患の食事管理のために特別に作られた食品を指すために、一部の国で使用されている。これらの用語は、米国における食品医薬品局（ＦＤＡ）の１９８８年オーファンドラッグ法改正、及び欧州における欧州委員会指令１９９９／２１／ＥＣ等の規則の中で定義されている。医療食品は、より広範なカテゴリーの補助食品や、健康上の主張を掲げる伝統食品とは性質が異なる。故に、特定の実施態様では、本発明の組成物は医療食品である。
【００４３】
多くの場合、例えば本明細書に開示されるようなプロバイオティクス細菌の組成物は、補助食品とみなされる。ダイエタリー・サプリメント又はサプリメントとしても知られている補助食品は、別の特定の医薬製品とみなされる。補助食品は、食事を補って、通常の食事では摂取できないか、又は十分な量を消費できない栄養素或いは有益な成分を提供することを意図した調製物である。補助食品は、たいていは食品とみなされるが、時には薬、自然健康製品又は機能性食品製品と定義される。本発明の意味では、補助食品は機能性食品製品も含む。補助食品は通常、「店頭」で、すなわち処方箋なしで販売されている。補助食品は、丸薬又はカプセル剤の形態を採っている場合、医薬に使用されるものと同じ賦形剤を含む。しかし、補助食品は、幾つかの栄養素で強化されている食品（例：バー又はヨーグルト）の形態も採りうる。
【００４４】
それ故、特定の実施形態では、本発明の組成物は補助食品である。
【００４５】
本発明の組成物が補助食品であれば、それ自体として投与されてもよく、水、ヨーグルト又はフルーツジュース等の適切な飲用液体と混合されてもよく、又は固形若しくは液状食品と混合されてもよい。このような文脈では、補助食品は、錠剤又はロゼンジ、丸薬、カプセル剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、サシェ剤、キャンディー、バー、シロップ剤の形態であり得、それに対応する投与形態、通常は単位用量の形態でありうる。本発明の組成物を含む補助食品は、好ましくは、ダイエタリー・サプリメントを調製する一般的な方法で製造される錠剤、ロゼンジ、カプセル剤又は散剤の形態で投与される。
【００４６】
本発明の菌株はまた、乳製品（ヨーグルト、チーズ、発酵乳、粉乳、ミルクベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵穀物ベースの製品、ミルクベースの粉末）、パン、バー、スプレッド、ビスケット及びシリアル、飲料又はドレッシング等の様々な食品又は食用製品に含まれうる。用語「食用製品」は、本明細書において、動物によって摂取されうる、すなわち感覚器官的に許容される、如何なる体裁の如何なるタイプの製品をも含む最も広い意味で使用される。用語「食品」は、身体に栄養サポートも与える食用製品として理解される。食品の例は他に、肉製品（例：ソーセージ又はミートスプレッド）、チョコレートスプレッド、フィリング及びフロスティング、チョコレート、菓子、焼き菓子（ケーキ、ペストリー）、ソース及びスープ、フルーツジュース及びコーヒー用クリームである。特に興味深い食品は、補助食品及び調整粉乳である。食品は、好ましくは、オートミール粥、乳酸発酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質及びグリコシル化タンパク質等の担体物質を含む。特定の実施態様では、本発明の菌株はカプセル化又はコーティングされている。
【００４７】
それ故、特定の実施態様において、本発明の組成物は食品又は食用製品である。
【００４８】
前述の形態の幾つかは、一部の国で医療用具、例えば、膣用カプセル、タンポン又は他のタイプのアプリケーターとみなされる。したがって、特定の実施態様では、本発明の組成物は医療用具である。
【００４９】
別の特定の実施態様では、本発明の組成物は個人用衛生製品であり、スーパーや薬局の「店頭で」販売されうる。個人用衛生製品の例は、タンポン、生理用ナプキン、生理用パッド、おむつ、石鹸、シャンプー、ジェル、軟膏、クリーム、スプレー及びローションである。
【００５０】
本発明の組成物は、特に、アプリケーター装置を用いて膣内に適用される溶解性粘膜付着性膣錠の形態である。錠剤７００ｍｇは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、無水ラクトース及びクエン酸、並びに１００ｍｇ（１−２ｘ１０９ｃｆｕ）の菌株ＣＥＣＴ  ７５０４を特に含む（実施例８参照）。
【００５１】
したがって、本発明の組成物は、組成物の形態と関係なく、すなわち、医薬製品、医薬、食品、食用製品、補助食品、医療食品又は個人用衛生製品であろうとなかろうと、カンジダ症及び細菌性膣炎の管理に有用であることを理解されたい。
【００５２】
本発明の菌株は、適切な培地中、適切な条件下で細菌を培養することにより製造されうる。菌株は、純粋培養物を形成するために単独で培養されてもよく、或いは、他の微生物とともに、又は異なる種類の細菌を別々に培養してから所望の割合でそれらを組み合わせることにより混合培養物として培養されてもよい。培養後、細胞懸濁液は回収され、それ自体として使用されるか、更に医薬製品又は食用製品の調製に使用されるべく所望の方法で、例えば濃縮又は凍結乾燥することにより、処理される。場合によってプロバイオティクス調製物は貯蔵寿命を改善するために、固定化又はカプセル化プロセスに供される。細菌の固定化又はカプセル化のための幾つかの技術が当該技術分野で知られている。
【００５３】
出発物質として寄託された菌株を用いて、従来の突然変異誘発又は再単離技術によって、本発明の組成物を形成する菌株の、本明細書に記載されている関連する特徴及び利点を保持するか又は強化する更なる変異体又はその誘導体を、当業者が日常的に得ることができることは明らかである。本発明の第一の態様の一実施態様では、突然変異体は、組換えＤＮＡ技術を用いることにより得られる。本発明の第一の態様の別の実施態様では、突然変異体はランダム突然変異誘発により得られる。本発明の第一の態様の第三の実施態様では、変異体は、天然に存在する変異体である。したがって、本発明の別の態様は、寄託された株を出発物質として使用することと、突然変異誘発を適用することとを含む、したがって、本発明の別の態様は、スペインタイプカルチャーコレクションに寄託番号ＣＥＣＴ  ７５０４で寄託されたラクトバチルス・ペントーサスの株の突然変異体を得るための方法に関し、寄託された菌株を出発物質として使用すること、及び突然変異誘発を適用することとを含み、得られた突然変異体が、寄託された親株の抗真菌活性及び／又は抗菌活性及び／又は膣管にコロニーを形成する能力を保持するか又は強化する。
【００５４】
組成物中の菌株のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の有効量は、当業者によって決定され、最終製剤次第である。例えば、経口投与される場合、本発明の菌株は、現行の法律に従って、１０７から１０１２ｃｆｕ、好ましくは１０９から１０１１ｃｆｕの有効日用量を与える量で組成物中に存在し、また、経膣的又は経直腸的に投与される場合、１０３から１０１２ｃｆｕ、好ましくは１０５から１０１０ｃｆｕの有効日用量を与える量である。用語「コロニー形成単位」（「ｃｆｕ」）は、寒天プレート上の微生物計測数により明白であるとおり、細菌細胞の数として規定される。補助食品は、通常、１０７から１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量でプロバイオティクス菌株を含有する。特定の実施態様では、本発明の組成物は、１０９−１０１１ｃｆｕ／ｇを含む補助食品である。
【００５５】
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の一般的な使用は、生細胞の形態でである。しかし、それは、死滅培養物又は細胞溶解物等の非生細胞（細菌を殺傷又は溶解するための数ある手段の中で、例えば、変化させたｐＨへの曝露、超音波処理、放射線、温度又は圧力により得られる）、又は菌株ＣＥＣＴ  ７５０４によって生成される有益な因子を含有する組成物にも拡張されうる。
【００５６】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分又は工程を排除することを意図しない。本発明の追加的な目的、利点及び特徴は、本明細書の調査により当業者に明らかとなり、本発明の実施により理解され得る。更に、本発明は、本明細書中に記載される特定且つ好ましい実施態様のすべての可能な組合せを包含する。以下の実施例及び図面は例示目的で提示されており、本発明を限定することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】（左から右）ラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４（Ｉ１００１）、ラクトバチルス・プランタルムＰ１７６３０及びＤＮＡ分子マーカー（Ｍ）のＳｍａ−Ｉ及びＳｆｉ−Ｉ制限ゲノムＤＮＡのパルスフィールド電気泳動パターン。
【図２】リゾチーム（０、４及び１６ｍｇ／ｌの最終濃度）を補充した膣液類似物中のラクトバチルス属菌株の増殖を示す。「Ｌｙｓ」は「リゾチーム」を意味する。Ｉ１００１は、株ＣＥＣＴ  ７５０４であり、Ｐ１７６３０は、コントロール菌株ラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０である。
【図３】工業用培地をシミュレートした培地における、よく知られているプロバイオティクスラクトバチルス・ラムノサスＧＧの増殖と比較した、菌株ラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４（Ｉ１００１）の増殖を示す；「ｔ」は「時間」を表し、ｃｆｕ／ｍｌは生細胞の数である。
【図４】製品の最後の投与後に、試験に参加した女性ボランティアの膣液中に見出されたラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラム種のＤＮＡの量を示す。データは、平均及びＳＥＭ値を示す。時間は、最後の投与からの時間（ｈ）で示されており、膣液１ｍｌ当たりのＤＮＡコピーは、対数スケールである。白丸は、５日間連続製品を与えられたボランティアのデータを表し、黒丸は３日間連続製品を与えられたボランティアのデータを表す。
【実施例】
【００５８】
本明細書で使用される場合、Ｉ１００１は、ラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ７５０４を表す。
【００５９】
実施例１．微生物の単離
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４を、不衛生な条件下で生活する１４歳から２１歳の健康な若い女性の膣スワブから単離した。試料を、ＰＢＳバッファーｐＨ７．４に溶解し、アリコートに分けて、異なる条件下でのインキュベーションのための異なる培地上にプレーティングした。インキュベーション時間は、菌株の増殖速度に依存し、通常、２４時間から３日まで実施する。個々の菌株の単離は同じ選択培地を用いて進められ、次いでグラム染色及び顕微鏡検査試験が初期特徴付けのために実施された。
【００６０】
菌株を、１００μｇ／ｌ ノボビオシン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌ ナイスタチン、５μｇ／ｍｌ シクロヘキサミド（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｌ アンピシリン及び１０μｇ／ｍｌ バンコマイシンを補充したＭＲＳ培地中で最初は増殖させ、けん気条件下３０℃、ｐＨ６．４でインキュベートした。グラム染色は、明確なグラム陽性染色、及び芽胞非形成菌形態を示した。
【００６１】
実施例２．菌株の分類学的特徴付け
細菌を回収し、洗浄し、プレ溶解バッファー（４８０ｍｌ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０；１２０ｍｌ リゾチーム １０ｍｇ／ｍｌ）に６０分間３７oＣで再懸濁させた。Ｗｉｚａｒｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＤＮＡを抽出した。２分間１４０００ｇで前処理された細菌を遠心分離して上清を除去した後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のプロトコールに従った。簡単に説明すると、細菌を、Ｎｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁させ、５分間８０℃でインキュベートし、次いで室温に冷却した。細胞溶解物を６０分間３７℃でＲＮａｓｅ溶液中でインキュベートし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して高速でボルテックスすることによりタンパク質を沈殿させた。試料を冷却し、３分間１５０００ｇで遠心分離した。ＤＮＡを含有する上清を、清浄な１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、反転によりイソプロパノール６００ｍｌと混合させた。２分間１５０００ｇで遠心分離し、慎重に上清を捨てることによりＤＮＡを収集した。穏やかにチューブを数回反転させることにより、７０％エタノール６００ｍｌでＤＮＡ試料を洗浄した。エタノールを、２分間１５０００ｇで遠心分離した後、吸引により除去した。最後に、ＤＮＡペレットを、１時間６５℃でのインキュベーションによりＲｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １００ｍｌに再懸濁させた。２〜８℃で試料を保存した。
【００６２】
２．１．属及び種の同定
１６Ｓ  ｒＲＮＡを、ユニバーサルプライマーＥｕｂ２７ｆ及びＥｕｂ１４９２ｒを用いてＰＣＲにより増幅し、１６Ｓ遺伝子（１４００超のヌクレオチド）のほぼ完全な配列の断片を生成する（表１）。次いで、Ｑｉａｑｕｉｃｋキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを洗浄した。
0006587614.tif 000002
【００６３】
四つの連続した配列決定反応は、ＢｉｇＤｙｅキットｖ．３．１及び表１に示したプライマーを用いてＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３１３０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で各試料について実施された。データ収集及びクロマトグラムは、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ．５．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて構築され、Ｃｈｒｏｍａｓ（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）及びＢｉｏＥｄｉｔ（Ｉｂｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた視覚的分析により確認された。配列番号７は、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の１６Ｓ遺伝子の配列である。
【００６４】
属の同定は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）のツールを使用して実施された(Wang Q., et al. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 2007, Vol. 73, No. 16, pages 5261-5267)。種の同定は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔで、タイプ株の１６Ｓ配列と得られた配列との比較により実施された(Cole, J.R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): introducing myRDP space and quality controlled public data. Nucl. Acids Res. 2007, Vol. 35(suppl_1), pages D169-172)。最も近い一致は、ラクトバチルス・ペントーサス株ＪＣＭ  １５５８（１００％最大類似性スコア）であり、これはラクトバチルス・ペントーサス種のタイプ株である。更に、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の１６Ｓ配列を、ＢＬＡＳＴを使用してＮＣＢＩ配列データベースと整列させた結果、ラクトバチルス・プランタルムの菌株ＫＬＤＳ１．０６７６と最も近い一致となった。連続的に新たな遺伝子配列が組み込まれることで配列データベースが動的であるという事情があるため、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、ラクトバチルス・ペントーサス又はラクトバチルス・プランタルムとして分類される可能性がある。ラクトバチルス属のプランタルム種、パラプランタルム種及びペントーサス種は近縁関係にあることが知られており、したがって実際のところは交換可能である。
【００６５】
２．２．菌株のジェノタイピング
特徴付けは、ゲノム消化及びパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により実施された。ＣＥＣＴ  ７５０４菌株は、軽微な変更を加えた前述のプロトコール(Rodas, A.M., et al. Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications. Int J Syst Evol Microbiol. 2005, Vol. 55, No. 1, pages 197-207)に供された。菌株を、ＭＲＳ寒天プレート上で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。細胞を回収し、８ｍｌのＰＥＴ（１０ｍＭ トリス、ｐＨ７．６、１Ｍ ＮａＣｌ）中で３回洗浄し、次いで６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを、７００ｍｌの溶解バッファー（６ｍＭ トリス、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＬＳ、０．２％デオキシコール酸；１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、４０Ｕ／ｍｌ ムタノリシン；２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ）に再懸濁させた。１．６％低融点アガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ，ＵＳＡ）の等量を再懸濁した細胞に添加し、４℃で１時間凝固させた。インサートを２ｍｌの溶解バッファーＩＩ（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．２、１％Ｎ−ラウリルサルコシン及び１ｍｇ／ｍｌ プロナーゼ）に移し、５０℃で４８時間インキュベートした。次いでインサートを、ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて室温で洗浄した。トータルＤＮＡ消化は、Ｓｆｉ−Ｉ及びＳｍａ−Ｉ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により別々に実施された。市販のプロバイオティクス菌株  ラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０がコントロールとして使用された。
【００６６】
パルスフィールドゲル電気泳動を、ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩＩ装置（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。インサートを、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＭＥ，ＵＳＡ）にロードした。表２は、各酵素の電気泳動条件を説明している。ＤＮＡ  ＭＷマーカーは、Ｌａｍｂｄａ  ｌａｄｄｅｒ  ＰＦＧ  Ｍａｒｋｅｒ及びＬｏｗ  Ｒａｎｇｅ  ＰＦＧ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。電気泳動後、ゲルは、ＧｅｌＤｏｃシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用い、エチジウムブロマイド及びＵＶで染色された。結果を図１に示す。
0006587614.tif 000003
【００６７】
図１に示すように、パルスフィールドゲル電気泳動Ｓｆｉ−Ｉ及びＳｍａ−Ｉ制限パターンは、本発明のラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４（Ｉ１００１）の株と、近縁なラクトバチルス・プランタラム（Ｐ１７６３０）種に属する市販のコントロール菌株では異なっていた。ＰＦＧＥは、同一種の菌株間の区別ができ、したがって、細菌種内の所与の菌株を一意的に同定するために使用されうる(Rodas, A.M., et al. 2005 supra)。
【００６８】
実施例３．膣液への耐性
膣液は、酸性ｐＨ、リゾチーム、ラクトフェリン及びデフェンシン等の異なるメカニズムによって作用する多種多様な抗微生物因子を含有する。そのため、菌株が酸性環境下で生残可能であることを実証すること(Dho, G., et al. Microbial characteristics of Lactobacillus plantarum P17630 contained in vaginal suppositories. GIMMOC. 2003. Vol. VII, No. 2, pages 102-8)は、本株が、膣環境内で生残可能であろうことの十分な保証ではない。なぜなら、膣環境は酸性ｐＨに加えて他の抗微生物因子も含有するためである。
【００６９】
膣液（合成）
膣液類似物を使用し(Owen, D.H. et al. A vaginal fluid simulant. Contraception. 1999, Vol. 59, No. 2, pages 91-5)、抗菌タンパク質及び抗菌ペプチドをそこに添加した：３．５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１．４ｇ／ｌ ＫＯＨ、０．２２ｇ／ｌ Ｃａ（ＯＨ）２、０．０２ｇ／ｌ ＢＳＡ、２ｇ／ｌ 乳酸、１ｇ／ｌ 酢酸、０．１６ｇ／ｌ グリセロール、０．４ｇ／ｌ 尿素及び５ｇ／ｌ グルコース。乳酸を用い、ｐＨを４．２に更に調整した。
【００７０】
抗菌タンパク質
リゾチームは、膣液中で相対的に高い濃度の抗菌物質の一つである。リゾチームの濃度は、健康な女性及び細菌性膣炎にかかっている女性においては、１から４ｍｇ／ｌの間で変化するが、外陰膣カンジダ症を患っている女性においては、１６ｍｇ／ｌ又はそれ以上に達しうる(Valore, E.V., et al. 2006, supra)。リゾチームは、広いスペクトルの抗菌活性を有するが、ラクトバチルス属等の細菌に対して特に活性である。したがって、外陰膣カンジダ症を有するすべての女性に利益をもたらすことができるプロバイオティクスを得るために、高濃度のリゾチームに対して生残可能な菌株の選択を確実にすることが非常に重要である。
【００７１】
抗菌ペプチド
ラクトバチルス属に対するデフェンシンβ−２及びβ−３の活性は十分に立証されている。しかし、デフェンシンβ−２は、デフェンシンβ−３よりも３０倍低い濃度で見出される(Ghosh, S.K., et al. Quantification of Human beta-defensin-2 and -3 in Body Fluids: Application for Studies of Innate Immunity. Clin Chem. 2007, Vol. 53, No. 4, pages 757-765)。膣液中のデフェンシンβ−３の濃度は、１から５ｍｇ／ｌでありうる。
【００７２】
逆に、ラクトフェリン等の他の抗微生物タンパク質は、ラクトバチルス属に対してほとんど活性を持たない。例えば、ラクトフェリンの抗菌活性は主に細菌の鉄代謝の破壊に基づいており、ラクトバチルス属は増殖のために鉄を必要としない（Archibald, F., Manganese: its acquisition by and function in the lactic acid bacteria. Crit Rev Microbiol. 1986, Vol. 13, No. 1, pages 63-109)。
【００７３】
ラクトバチルス属の菌株をＭＲＳブロス中で一晩で増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、１０７ｃｆｕ／ｍｌでＰＢＳに再懸濁させた。リゾチームを補充した膣液類似物２００μｌ（０、４及び１６ｍｇ／ｌ最終濃度）又は４ｍｇ／ｌ リゾチーム、プラスβ−３デフェンシン（０、２及び４ｍｇ／ｌ最終濃度）に細胞懸濁液２０μｌを植菌した。マイクロタイタープレートを３７℃で３時間インキュベートし、段階希釈してＭＲＳ寒天培地にプレーティングすることにより、各ウェルに残っている生存細胞の数を計数した。すべての実験は三連で実施された。
【００７４】
単離したラクトバチルス属菌１０株のうち、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、リゾチームとβ−３デフェンシン双方に耐性を示した５株に入っていた。菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、１６ｍｇ／ｌまでの濃度のリゾチームへの高い耐性を示した（図２参照）。一方、コントロール菌株ラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０（ＩＳＡＤＩＮ）は、外陰膣カンジダ症患者にかなりの割合で見出すことがきるような、４ｍｇ／ｌを超える濃度のリゾチームに曝された場合、生存能力の著しい低下（９０％）を示した。
【００７５】
注目すべきは、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４と菌株ラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０の双方が、単独であれ、リゾチーム４ｍｇ／ｌとの組み合わせであれ、２ｍｇ／ｌと４ｍｇ／ｌの濃度のβ−３デフェンシンに対して耐性であったことであり、双方の菌株が健康的な膣の環境の中で生き残るようになっていることを示す。
【００７６】
実施例４．抗菌特性
４．１．カンジダ・アルビカンス及びカンジダ・グラブラータに対する活性
カンジダ・アルビカンス及びカンジダ・グラブラータに対する活性を、寒天重層法を用いて試験した。簡単に言えば、ラクトバチルス属菌株をＭＲＳ寒天（Ｓｃｈａｒｌａｂ）中で一晩増殖させ、２交差直線として無菌の細菌ループでプレーティングした。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートし、その後ＹＭブロス中のカンジダ属の一晩培養液２０μｌを植菌した溶解ＹＭ培地（Ｓｃｈａｒｌａｂ）６ｍｌで重層した。プレートを冷却させ、１４時間再度インキュベートし、阻害ゾーンを３つの異なる点で測定した。ラクトバチルス属菌株は、最初は、カンジダ・アルビカンス（ＣＥＣＴ  １３９２）のある一つの株に対して試験された。有意な活性を示す株は、その後、カンジダ属の更に４つの株：カンジダ・アルビカンスＣＥＣＴ  １４７２及びＣＥＣＴ  １００２並びにカンジダ・グラブラータＣＥＣＴ  １４４８及びＣＥＣＴ  １９００に対して試験された。すべての実験は三連で実施された。
【００７７】
膣試料から単離されたラクトバチルス属の４６株のうち、３５株が、カンジダ・アルビカンスＣＥＣＴ  １３９２に対して有意な活性を示した。しかし、わずか８株のラクトバチルス属しか、カンジダ・アルビカンスの３つのすべての菌株に対して有意な活性を示さなかった。また、わずか３株のラクトバチルス属しか、カンジダ・アルビカンス株とカンジダ・グラブラータ株の双方に対して有意な活性を示さなかった。結果の実例を表３に示す。
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【００７８】
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、市販のプロバイオティクス菌株ラクトバチルス・プランタルムＰ１７６３０と比較した場合、カンジダ・アルビカンスの３つの菌株に対して高い活性を示した。試験したほとんどの野生型ラクトバチルス属は、最大で２株に対して活性を示した。また、ラクトバチルス・プランタラムＰ１７６３０と他の野生型菌株の双方が第一の菌株に対して低い活性を示し、第二の菌株に対しては全く活性を示さなかったのに対し、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、カンジダ・グラブラータの１株に対して高い活性を示し、第二の菌株に対してもある程度の活性を示した（表３）。
【００７９】
４．２．膣環境の酸性化
健康的な膣フローラの基本的な機能の一つは、主に乳酸及び酢酸の生成を通じて膣液を酸性化し、望ましくない細菌種の異常増殖、すなわち細菌性膣炎を予防することであることが広く認められている。したがって、乳酸の高レベル生成は、細菌性膣炎の管理のためのプロバイオティクス菌株の望ましい特性である。
【００８０】
膣液を酸性化する能力は、多くの場合、典型的な実験室培地又はミルクを酸性化するプロバイオティクス菌株の能力から推定される。しかし、膣液の組成物（低濃度の栄養素）は、栄養豊富な、典型的な実験室培地又はミルクの組成物とはかなり異なる。したがって、菌株が、生残し、増殖し、異なる組成物を有する培地を酸性化するその能力故に生残し、増殖し、膣液を酸性化する優れた能力を有すると仮定することは、少なくとも危険である。
【００８１】
膣液を酸性化する可能性を検出するために、リゾチーム４ｍｇ／ｌ（細菌性膣炎中で観察される最高濃度(Valore, E.V., et al. 2006, supra)：ＮａＣｌ ３．５ｇ／ｌ、ＫＯＨ １．４ｇ／ｌ、Ｃａ（ＯＨ）２０．２２ｇ／ｌ、ＢＳＡ ０．０２ｇ／ｌ、乳酸 ２ｇ／ｌ、酢酸 １ｇ／ｌ、グリセロール ０．１６ｇ／ｌ及び尿素 ０．４ｇ／ｌを補充して改良された膣液類似物が使用された(Owen, D.H. et al. 1999, supra)。ｐＨは、１ＮのＮａＯＨを用いて５．５に調整し、グルコースは、発酵によって生じるｐＨの低下を検出することができる２０ｇ／ｌで添加した。
【００８２】
ラクトバチルス属菌株をＭＲＳブロス中で一晩増殖させ、５０μＬを改良膣液類似物３ｍｌに植菌した。３７℃で一晩インキュベーションした後にｐＨを測定した。すべての実験は三連で実施された。
【００８３】
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、試験したラクトバチルス属菌株の中で最も高い膣液を酸性化する能力を示し、それはコントロール菌株Ｐ１７６３０が示した能力よりも有意に高かった（表４）。菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の酸性化能力はまた、カンジダ属に対して最も高い活性を有する単離株の中でも最高であった。
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【００８４】
実施例５．膣上皮の細胞への付着力
トリチウムチミジンで標識されるラクトバチルス属菌株を、膣上皮へのラクトバチルス属の付着性を評価するために以前使用された子宮頸膣部（ｖａｇｉｎａｌ  ｃｅｒｖｉｘ）上皮から得られた細胞株であるＨｅＬａ細胞のコンフルエントな培養物と共にインキュベートした(Atassi, F., et al. Lactobacillusstrains isolated from the vaginal microbiota of healthy women inhibit Prevotella bivia and Gardnerella vaginalis in coculture and cell culture. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2006, Vol. 48, No. 3, pages 424-432; Mastromarino, P., et al. Characterization and selection of vaginal Lactobacillusstrains for the preparation of vaginal tablets. Journal of Applied Microbiology.2002, Vol. 93, No. 5, pages 884-893)。この方法は、上皮細胞の部分的な試料を採取して付着したラクトバチルス属の視覚計数を顕微鏡により実施する代わりに、すべての付着したラクトバチルス属細胞を計数することを可能にし、結果としてより信頼性の高い計数が得られる。
【００８５】
本出願人らの経験で、酸性培地（膣液等）でのプレインキュベーションは、主に膜中のＨＳＰタンパク質の発現に因り、細菌の付着性を変えうることがわかっている。また、本試験が実施されているのは、他のプロバイオティクスについて報告されているような溶液中の個々の上皮細胞上ではなく、上皮の実際の条件をシミュレートするために上皮細胞のコンフルエントな単層上であることに留意することが重要である(Culici, M., et al. Adhesion of Lactobacillus plantarum P17630 to vaginal epithelial cells and its influence on Candida albicans adhesion. GIMMOC. 2004, Vol. 8, No. 1, pages 34-41)。
【００８６】
ＨｅＬａ細胞を、２４ウェルプレートで９５〜１００％コンフルエンスまで増殖させた。ラクトバチルス属菌株を、トリチウムチミジン（１０μＣｉ）を有するＭＲＳ培地１０ｍｌ中で一晩培養した。その後、細菌細胞を遠心分離により回収し、乳酸を使用して５に調整したｐＨを有する膣液内類似物に３７℃で１５分間５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁させた。０．５ｍｌのアリコートをＰＢＳに希釈し、２ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌと２．５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を得た。これらの懸濁液は細菌対ＨｅＬａ細胞の比率がそれぞれ２００：１及び２５：１とほぼ同等である。
【００８７】
半分ｍｌの細菌懸濁液を、ＨｅＬａ細胞のコンフルエントな培養物を含有するウェルに添加し、３７℃で４５分間コインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで二回洗浄し、緩く付着した細菌を取り除いた。最後に、ウェルを廃棄し、内容物をトリチウムチミジンの量を定量化するためにシンチレーションバイアルに入れた。また、２４ウェルプレートに植菌した細菌懸濁液のアリコートをシンチレーションバイアルに入れ、各菌株について放射能と細菌細胞との比を計算した。すべての実験は二連で実施された。
【００８８】
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４は、以下の表（表５）に示すように、コントロール株Ｐ１７６３０よりも高い膣上皮細胞への付着性を示した：
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【００８９】
実施例６．工業用培地中での増殖
各試験菌株の一晩培養物の０．５％の種菌を、工業用培地の代わりとして使用される、３７℃に予熱した一般的な食用培地（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｄｉｂｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）１００ｍｌに植菌した(Saarela, M., et al. Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology. 2004, Vol. 96, No. 6, pages 1205-1214)。この培地は、Ｋリン酸バッファー０．０１Ｍ（ｐＨ６．３）中、２０ｇ／ｌのグルコース、３０ｇ／ｌの大豆ペプトン、７ｇ／ｌの酵母抽出物、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ４ｘ７  Ｈ２Ｏにより構成されている。菌株を、３７℃でインキュベートし、プレート計数により生存細胞の数を定量するために、１００μＬのアリコートを異なる時点（０、３、６及び２３時間）で抽出した。よく知られているプロバイオティクスである菌株ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（Ｖａｌｉｏ  Ｌｔｄ）をコントロールとして使用した。
【００９０】
菌株ラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４（Ｉ１００１）は、１０６ｃｆｕ／ｍｌ１の種菌から開始して一晩培養した後に１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に達し、工業用メディアをシミュレートする培地中で、よく知られているプロバイオティクス  ラクトバチルス・ラムノサスＧＧの増殖に匹敵する増殖を示した。
【００９１】
実施例７．反復投与後のウサギにおける膣耐性
ＩＳＯ  １０９９３−１０：２００２ガイドラインに従い、膣粘膜における忍容性を、二つの異なる濃度（５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｇで２０ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌ）での菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の投与後にコントロール群（ビヒクルのみ）と比較して決定した。９〜１１週齢、体重２．１〜２．５ｋｇのメスのニュージーランド白ウサギを、各６羽ずつ３群にランダム化し、１７〜２０℃で５０〜７０％の相対湿度で個々のケージ内で飼養し、標準的なＴｅｋｌａｄ  ２０３０Ｃウサギ飼料と水道水を不断給餌した。各ウサギは、膣に局所経路で７日間連続一日一回１ｍｌ／日の用量で投与された。蒸留水中１％カルボキシメチルセルロースナトリウムをビヒクルとして使用した。製剤のｐＨは、ビヒクルのみで７．６、２０ｍｇ／ｍｌ用量で５．８、及び１００ｍｇ／ｍｌ用量で５．６であった。
【００９２】
死亡率を一日二回、臨床徴候を一日一回確認した。体重は、馴養中に二回、一回目と四回目の投与の直前、及び屠殺前に確認した。すべての動物は、６０ｍｇ／ｋｇ体重の用量及び１ｍｌ／ｋｇの量でのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射による耳静脈への最後の投与の２４時間後に屠殺され、剖検された。各動物の生殖器は、膣の表面に特に重点を置いて調べられた。
【００９３】
脂肪と脂肪に隣接する組織とを分離した後、各動物の卵巣、膣及び子宮を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。膣の遠位、中位及び近位ゾーンの切片を、包埋し、４マイクロメートルの厚さに切り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、微視的に調べ、以下の評価尺度（表６）に従って、観察された変化をグレーディングした：
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【００９４】
テスト項目の忍容性及び刺激性特性の評価は、得られた平均スコアに基づいて行われる。試験群のすべての動物についての微視的評価グレードが加えられ、その合計を観察数で割り、試験群の平均、刺激の平均値（ＭＶＩ）を得る。最大スコアは１６である。これを、コントロール群について繰り返す。コントロール群の平均は、刺激指数を得るために試験群の平均から減算され、以下の尺度（表７）に従って分類される：
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【００９５】
臨床徴候
死亡と全身毒性の臨床徴候のいずれも試験期間中には観察されず、すべての動物は、予定された剖検まで生き残った。体重の顕著な差又は体重増は、群２（２０ｍｇ／ｍｌ用量）においては観察されなかった。体重減は、群３（１００ｍｇ／ｍｌ用量）の２羽のメスにおいて記録された。しかし、差は、コントロール群に対して統計的に有意（ダネット検定）ではなかった。
【００９６】
巨視的及び微視的所見
コントロール群と比較した膣粘膜の赤みがかった変色の発生率の増加が、２０ｍｇ／ｍｌ及び１００ｍｇ／ｍｌ（５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｇ）の濃度での菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の局所投与の７日後に観察された。発生率の増加並びに／或いは免疫応答に因る重症度の血管のうっ血及び白血球浸潤のみならず、膣粘膜下層の炎症が認められた。しかし、応答は用量依存的であり、変化は、２０ｍｇ／ｋｇで最小の重症度であり、１００ｍｇ／ｋｇでわずかであった。全体として、群２で得られた平均刺激値（ＭＩＶ）は０．８３で、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で全く刺激応答がないことを示した。群３で得られた平均刺激値（ＭＩＶ）は２．３３で、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で最小の刺激を示した。ウサギにおける生殖管粘膜のミクロフローラは、基本的にブドウ球菌属、ミクロコッカス属及びシュードモナス属を含有し、非常に少ないことが考慮されるべきである(Jacques, M., et al. The normal microflora of the female rabbit’s genital tract. Can J Vet Res. 1986, Vol. 50, pages 272-4)。そのため、ヒトの膣フローラとは異なり、ラクトバチルス属は殆ど存在せず、したがって異物に対する免疫応答はラクトバチルス・ペントーサスＣＥＣＴ  ７５０４の投与後に観察された。
【００９７】
実施例８．反復投与後の女性ボランティアにおける膣コロニー形成及び忍容性
菌株ＣＥＣＴ  ７５０４の膣上皮へのコロニー形成能力を（主要評価項目として）決定するため、及び製品の忍容性を（副次評価項目として）評価するために、１８〜４０歳の１０人の健康な女性ボランティアにおいて非盲検臨床試験が実施された。プロバイオティクスへの曝露期間が膣上皮にコロニー形成する能力に影響したかどうかを評価するために、３日間及び５日間の投与が試験された。包含基準は、定期的な月経があり、製品投与日の間及び試料採取の前夜に性的行為を控える意志があることであった。免疫抑制、授乳中又は妊娠中の女性の他、試験の開始１５日前から膣内製品を使用しているか、膣感染症を有するか、又は抗生物質を服用している女性は除外された。プロトコールは、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）の倫理委員会によって評価及び承認され、ヘルシンキ宣言及びＧｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドラインに従って実施された。
【００９８】
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、無水ラクトース及びクエン酸で作られ、菌株ＣＥＣＴ  ７５０４を１００ｍｇ（１−２ｘ１０９ｃｆｕ）含有している７００ｍｇの溶解性粘膜付着性膣錠を、６０Ｎの圧縮力で調製した。ボランティア（２１〜３６歳、中央値２９歳）をランダム化し、連続３日間（女性５名）又は連続５日間（女性５名）錠剤を与えた。錠剤は、アプリケーター装置を使用し、就寝前にボランティアによって膣内に適用された。滅菌綿棒を使用して、最初の投与の直前及び最後の投与後１、３及び８日目の膣液の試料が収集された。試料は、分析されるまで４℃で保管された。忍容性を評価するために、ボランティアは膣錠の投与の初日から３週間毎日膣の症状を記録した。
【００９９】
ＥａｓｙＭａｇ自動システム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を用いて試料からＤＮＡを抽出し、ラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラム種に特異的な定量的ＰＣＲを用いてＣＥＣＴ  ７５０４菌株の存在について試料を試験した。増幅は、１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間領域内の１４４塩基対の領域を標的とした。プローブは、５’末端にＦＡＭを標識し、３’末端にＮＦＱ−ＭＧＢを標識した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。増幅は、製造者の指示に従い、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施された。ウォームアップは、５０℃で２分、９５℃で１０分から構成された。変性が９５℃で１５秒間、次にアニーリング及び伸長が６０℃で６０秒間の４５サイクルが実施された。プライマー及びプローブの配列は、下記（表８）に示されている。
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【０１００】
プロバイオティクスは、良好な忍容性を示すことが見出された。軽度の膣分泌物が何人かのボランティアによって報告されたが、この結果はプラセボ製品を与えられたボランティアにおいても観察されるため、他の研究では、プロバイオティクス菌株にではなく、製品の膣への導入に起因することが示されている(Stapleton A.E, et al. Randomized, Placebo-Controlled Phase 2 Trial of a Lactobacillus crispatus Probiotic Given Intravaginally for Prevention of Recurrent Urinary Tract Infection. Clinical Infectious Diseases. 2011, Vol. 52, Vol. 10, pages1212-17)。ラクトバチルス・ペントーサス株又はラクトバチルス・プランタラム株の検出可能なＤＮＡは、ボランティアにおけるベースラインでは全く見出されなかった。しかし、膣液１ｍｌ当たり平均で１０６のＤＮＡコピーが、プロバイオティクスの最後の投与後の午前中に見出された（図４）。二日後、プロバイオティクスは群に関係なく依然検出可能であった。連続５日間錠剤を与えられた群の患者５人のうち２人において、最後の投与後８日目でもプロバイオティクスは依然検出可能であったが、３日間製品を与えられた患者においてはそうではなかった。
【０１０１】
参考文献
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欧州特許第１４３６３８０号
【図１】
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【図２】
0006587614.tif 000011
【図３】
0006587614.tif 000012
【図４】
0006587614.tif 000013
【配列表】
0006587614000001.app