(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(1)〜(16)のいずれかのプライマーセット。
(1)  配列表の配列番号1における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(2)  配列表の配列番号3における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(3)  配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(4)  配列表の配列番号9における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(5)  配列表の配列番号11における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(6)  配列表の配列番号13における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(7)  配列表の配列番号15における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(8)  配列表の配列番号17における塩基番号10〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(9)  配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(10) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(11) 配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(12) 配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
とからなるプライマーセット
(13) 配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(14) 配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(15) 配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(16) 配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
【請求項２】
請求項１の(1)に記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１の(2)に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１の(3)に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１の(4)に記載のプライマーセット。
【請求項６】
請求項１の(5)に記載のプライマーセット。
【請求項７】
請求項１の(6)に記載のプライマーセット。
【請求項８】
請求項１の(7)に記載のプライマーセット。
【請求項９】
請求項１の(8)に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
請求項１の(9)に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
請求項１の(10)に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
請求項１の(11)に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
請求項１の(12)に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
請求項１の(13)に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
請求項１の(14)に記載のプライマーセット。
【請求項１６】
請求項１の(15)に記載のプライマーセット。
【請求項１７】
請求項１の(16)に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
香辛料として使用される植物種（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）を他の植物種、生物種と区別して、様々な原料の混在する食品などの試料においても、含まれている香辛料を特異的かつ高感度に検出できるPCRプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
香辛料とは、食品の調理のために用いる芳香性と刺激性を持った植物群である。
香辛料と呼ばれる植物種は、クワ科、セリ科、ショウガ科、シソ科、ミカン科、コショウ科、アブラナ科、ナス科、キク科、ユリ科など広範囲にわたり、その種子、花、葉、樹皮等いろいろな部分が利用される。香辛料として生産流通量が多いのは、ワサビ、マスタード、ニンニク、トウガラシ、コショウ、ショウガ、ターメリック等である。単独、または、混合物として様々な食品に使用されている。
【０００３】
香辛料のうち、マスタード、ショウガ、ターメリックには、食物アレルギーを引き起こすこと、コショウ、トウガラシ等には、過敏症を示すケースがあることが知られている。
これらの症状を有する消費者は、これらの香辛料を避けなければならないが、国内の加工食品においては、複数の香辛料が使用されていても原材料に占める重量の割合が２％以下の場合は、「香辛料」、「香辛料抽出物」とまとめて記載できることとなっており、どの香辛料がその食品に使用されているかは、生産者しか把握できない。また、加工食品生産者においても、これらの香辛料の意図せぬコンタミネーションや配合の違いが、製品の品質を低下させる危険性があり、香辛料として使用される植物種を個別に検出できる試験法を確立する必要がある。
【０００４】
香辛料の植物種を検出する方法としては、その植物種由来の特定のタンパク質を検出するELISA法やその植物種由来の特定のDNA配列を検出するPCR法が利用される。一般に、タンパク質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、タンパク質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、タンパク質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。
【０００５】
実際、香辛料に使用される植物種の検出法として、PCR法による方法が報告されている（非特許文献1）。これらに記載されるPCRプライマーは、オールスパイス、カルダモン、クローブ等、18種の香辛料を検出できるが、国内で使用されるニンニク、ターメリック、サンショウ、柑橘類は検査対象とされていない。
【０００６】
上記文献において、コショウ、トウガラシ、ショウガ、マスタードは検出対象とされているが、いずれもPCR反応の前にMultiple displacement amplification（MDA）法による全ゲノム増幅を行う検査方法であるため、時間や手間がかかる。また、この方法で使用されているPCRプライマーの交差反応性、すなわち検出特異性の検証では、各種香辛料を試料として用いているが、その他の食用植物に対する記載は無く、特に検証が必要な近縁植物に対しての検証が示されていない。さらに、食品のように複数の動植物を含む試料中の対象香辛料DNAを特異的に検出できるという記載もなされていない。それ故に、複数の動植物を含む食品中の対象香辛料DNAを特異的に検出する方法としては、十分に検証された方法ではない。
【０００７】
上述したように、香辛料として使用される植物種（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）の明確な検出法は、報告されておらず、これらの特定植物が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ferix Focke, Ilka Haase, and Markus Fischer DNA-Based Identification of Spices: DNA Isolation, Whole Genome Amplification, and Polymerase Chain Reacton; Journal of agiricultual and food chemistry, 59: 513-520, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
香辛料として使用される植物種（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）を他の植物種、生物種と区別して、様々な原料の混在する食品などの試料においても、含まれている香辛料を特異的かつ高感度に検出できる手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を達成するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする香辛料（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）、及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタードを高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法などの核酸分析を行うことで、コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタードをそれぞれ簡便に検出し得ることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の香辛料検出用PCRプライマーセットに関与する。
【００１１】
項１.  下記の(1)〜(18)のいずれかのPCRプライマーセット。
(1)  配列表の配列番号1における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(2)  配列表の配列番号3における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(3)  配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(4)  配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(5)  配列表の配列番号9における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(6)  配列表の配列番号11における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(7)  配列表の配列番号13における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(8)  配列表の配列番号15における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(9)  配列表の配列番号17における塩基番号10〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(10)  配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(11) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(12) 配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(13) 配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(14) 配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
とからなるプライマーセット
(15) 配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(16) 配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(17) 配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(18) 配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
【００１２】
項２.      請求項１の(1)に記載のプライマーセット。
【００１３】
項３.      請求項１の(2)に記載のプライマーセット。
【００１４】
項４.      請求項１の(3)に記載のプライマーセット。
【００１５】
項５.      請求項１の(4)に記載のプライマーセット。
【００１６】
項６.      請求項１の(5)に記載のプライマーセット。
【００１７】
項７.      請求項１の(6)に記載のプライマーセット。
【００１８】
項８.      請求項１の(7)に記載のプライマーセット。
【００１９】
項９.      請求項１の(8)に記載のプライマーセット。
【００２０】
項１０.    請求項１の(9)に記載のプライマーセット。
【００２１】
項１１.    請求項１の(10)に記載のプライマーセット。
【００２２】
項１２.    請求項１の(11)に記載のプライマーセット。
【００２３】
項１３.    請求項１の(12)に記載のプライマーセット。
【００２４】
項１４.    請求項１の(13)に記載のプライマーセット。
【００２５】
項１５.    請求項１の(14)に記載のプライマーセット。
【００２６】
項１６.    請求項１の(15)に記載のプライマーセット。
【００２７】
項１７.    請求項１の(16)に記載のプライマーセット。
【００２８】
項１８.    請求項１の(17)に記載のプライマーセット。
【００２９】
項１９.    請求項１の(18)に記載のプライマーセット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析によって、香辛料として使用される植物種（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）由来DNAを、高精度及び高感度での検出を可能とし、被験食品原料や被験食品中に、上記香辛料が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明におけるプライマーセットを用いた場合のDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ａ）配列番号1及び配列番号2を用いたPCRにおけるコショウDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｂ）配列番号3及び配列番号4を用いたPCRにおけるトウガラシDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｃ）配列番号5及び配列番号6を用いたPCRにおけるニンニクDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｄ）配列番号7及び配列番号8を用いたPCRにおけるショウガDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｅ）配列番号9及び配列番号10を用いたPCRにおけるターメリックDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｆ）配列番号11及び配列番号12を用いたPCRにおけるサンショウDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｇ）配列番号13及び配列番号14を用いたPCRにおけるオレンジDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｈ）配列番号15及び配列番号16を用いたPCRにおけるイエローマスタードDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｉ）配列番号17及び配列番号18を用いたPCRにおけるブラウンマスタードDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
香辛料検出用PCRプライマーセット
本発明者等は、上記の目的に従い、以下の9種の香辛料検出用PCRプライマーセットを開発した。本発明の香辛料検出用PCRプライマーセットには、コショウに特徴的な塩基配列を有するもの、トウガラシに特徴的な塩基配列を有するもの、ニンニクに特徴的な塩基配列を有するもの、ショウガに特徴的な塩基配列を有するもの、ターメリックに特徴的な塩基配列を有するもの、サンショウに特徴的な塩基配列を有するもの、柑橘類に特徴的な塩基配列を有するもの、マスタード（イエローマスタード）に特徴的な塩基配列を有するもの、マスタード（ブラウンマスタード）に特徴的な塩基配列を有するものがある。
【００３３】
それぞれのプライマーセットは以下のようにして設計した。標的とする塩基配列は、感度向上の観点から、1細胞あたりのコピー数が多いものが望ましく、クロロプラストのrbcL(large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)遺伝子配列、matk（maturase-encoding gene）遺伝子配列、rRNA遺伝子の内部転写スペーサー領域1（ITS1）塩基配列、及び内部転写スペーサー領域2（ITS2）塩基配列を候補として選定した。各種植物のそれらの配列を既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得、あるいは、一部の植物については独自に解析することによって取得し、それらの膨大な塩基配列の多重並列配列図を作成した。その中でも、ITS領域は進化速度が速く、より近縁の種の識別が可能となるため、各種香辛料特異的プライマーの標的配列として好適であった。
【００３４】
コショウ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をコショウ科コショウ属（Piper spp.）に設定し、コショウと、その他植物のITS領域の塩基配列を比較した。コショウに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００３５】
また、トウガラシ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をナス科トウガラシ属トウガラシ（Capsicum annuum）に設定し、トウガラシと、その近縁種である同科ナス属のナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、及びトマト（Solanum lycopersicum）のITS領域の塩基配列を比較した。トウガラシに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００３６】
また、ニンニク検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をユリ科ネギ属ニンニク（Allium sativum）に設定し、ニンニクと、その近縁種である同属のネギ（Allium fistulosum）、及びタマネギ（Allium cepa）のITS領域の塩基配列を比較した。ニンニクに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００３７】
また、ショウガ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をショウガ科ショウガ属ショウガ（Zingiber officinale）に設定し、ショウガと、その近縁種である同属のミョウガ（Zingiber mioga）、同科ウコン属のウコン（Curcuma longa / Curcuma aromatica）、及びショウズク属のカルダモン（Elettaria cardamomum）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、ショウガ特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、ショウガに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００３８】
また、ターメリックとして食品に使用される植物種には、秋ウコンと呼ばれるショウガ科ウコン属のウコン（Curcuma longa）と、春ウコンと呼ばれるショウガ科ウコン属のキョウオウ（Curcuma aromatica）がある。ウコン、及びキョウオウと、それらの近縁種である同科ショウガ属のショウガ（Zingiber officinale）、ミョウガ（Zingiber mioga）、及びショウズク属のカルダモン（Elettaria cardamomum）のITS領域の塩基配列を比較した。ウコン、及びキョウオウに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００３９】
また、サンショウ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をミカン科サンショウ属（Zanhoxylum sp.）に設定し、サンショウ属サンショウ（Zanthoxylum piperitum）、及びカショウとして用いられるサンショウ属カホクザンショウ（Zanthoxylum bungeanum）等、広く検出できるようにした。サンショウ属と、その近縁種であるユズ（Citrus junos）、及びオレンジ（Citrus sinensis）等、同科ミカン属のITS領域の塩基配列を比較した。サンショウ属に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００４０】
また、柑橘類検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をミカン科ミカン属（Citrus sp.）に設定し、ミカン属と、その近縁種である同科サンショウ属（Zanhoxylum sp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ミカン属に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００４１】
また、マスタードとして使用される植物種には、イエローマスタードと呼ばれる白ガラシ（Brassica alba）と、ブラウンマスタード、オリエンタルマスタードと呼ばれるカラシナ（Brassica juncea）があり、多くのマスタードはこれらを混合して作られている。これらの属するアブラナ科アブラナ属には、その他に多くの食用植物が存在し、それらを検出せずに二種のマスタードのみを特異的に検出するPCRプライマーを設計することは困難であった。よって、白ガラシとカラシナをそれぞれ個別に検出する二種のPCRプライマーセットを設計した。その際、カラシナは、黒ガラシ（Brassica nigra）とブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）の交雑種であるが、ブラッシカ・ラパにはハクサイ（Brassica rapa var. perkinensis）やカブ（Brassica rapa var. glabra）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）等、多くの変種が存在し、これらを検出せずにカラシナのみを特異的に検出するために、黒ガラシ（Brassica nigra）の塩基配列領域からPCRプライマーセットを設計した。ITS領域の塩基配列は多くの近縁種との相同性が高く、各々のマスタード特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、各々のマスタードに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００４２】
なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。
【００４３】
本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能（検出特異性等）を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、配列番号３７と配列番号３８とからなるブラウンマスタード検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、ブラウンマスタードに特有の塩基配列を用いたにも関わらず、ブラウンマスタードDNAだけでなく、カブやコマツナ、ダイコンなどの近縁種DNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能（検出特異性等）を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。
【００４４】
従って、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれる香辛料（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）由来DNAを高感度かつ特異的に、検出することができる。
【００４５】
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
【００４６】
本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
塩基番号          12345678901234567890123456789
配列番号１ （コショウS）GATGCCCATCGAAACAAGACA
配列番号２ （コショウAS）              TTCGTCGCTGCCCGACACG
配列番号３ （トウガラシS）              ATTGCAGAATCTCGTGAACCATTGAC
配列番号４ （トウガラシAS）            CAGTATCCGCCCTGTGATGG
配列番号５ （ニンニクS）GATTTCGATGTTTGCTTTCGTAGCA
配列番号６ （ニンニクAS）              TCGAGTTAACGCACGATGTCTCTAATC
配列番号７ （ショウガS）GGTAAAAGTCGGCAGTCGCG
配列番号８ （ショウガAS）              CGCAGGGTCTCTTGAGGAATTCAG
配列番号９ （ターメリックS）            CATAGAATGATGGATGATTGTGAAC
配列番号１０（ターメリックAS)            ACCAACATGGGCGGGCTG
配列番号１１（サンショウS）              GCAGAACGACCCGTGAACTTGTG
配列番号１２（サンショウAS）            CGTTGCCGAGAGTCGTTATAGATAG
配列番号１３（柑橘類S）  GGGCGCTCCTCCTTCCCG
配列番号１４（柑橘類AS）GTTGCCGAGAGTCGTTTTGGATAC
配列番号１５（イエローマスタードS）          AGTGTCAAGGAACATTCAACTAGGT
配列番号１６（イエローマスタードAS)        GACCGACAATATGACGAGGTTAC
配列番号１７（ブラウンマスタードS）          CCCCGGTTCAAGACTTACTTAG
配列番号１８（ブラウンマスタードAS)        CGACCGACGATATTACGAGGC
また、本発明が提供する３０塩基のＤＮＡからなるプライマーとしては、例えば以下の塩基配列のものを上げることができる。
配列番号１９（コショウS）cgacccgatGATGCCCATCGAAACAAGACA
配列番号２０（コショウAS）              gacgaacgcacTTCGTCGCTGCCCGACACG
配列番号２１（トウガラシS）              ggtcATTGCAGAATCTCGTGAACCATTGAC
配列番号２２（トウガラシAS）            cggacgaggtCAGTATCCGCCCTGTGATGG
配列番号２３（ニンニクS）acggcaGATTTCGATGTTTGCTTTCGTAGCA
配列番号２４（ニンニクAS）              tgtTCGAGTTAACGCACGATGTCTCTAATC
配列番号２５（ショウガS）cgacggtcggGGTAAAAGTCGGCAGTCGCG
配列番号２６（ショウガAS）              ggtcgcCGCAGGGTCTCTTGAGGAATTCAG
配列番号２７（ターメリックS）            caactCATAGAATGATGGATGATTGTGAAC
配列番号２８（ターメリックAS）            gcaagaacccagACCAACATGGGCGGGCTG
配列番号２９（サンショウS）              accccggGCAGAACGACCCGTGAACTTGTG
配列番号３０（サンショウAS）            gggagCGTTGCCGAGAGTCGTTATAGATAG
配列番号３１（柑橘類S）  atcatgccaagcGGGCGCTCCTCCTTCCCG
配列番号３２（柑橘類AS）ccgatgGTTGCCGAGAGTCGTTTTGGATAC
配列番号３３（イエローマスタードS）          gctccAGTGTCAAGGAACATTCAACTAGGT
配列番号３４（イエローマスタードAS）        aatgccaGACCGACAATATGACGAGGTTAC
配列番号３５（ブラウンマスタードS）          acggcgtgCCCCGGTTCAAGACTTACTTAG
配列番号３６（ブラウンマスタードAS）        gcgcaacacCGACCGACGATATTACGAGGC
【００４７】
本発明の研究段階において、意図した検出特異性を示さなかったプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
配列番号３７（ブラウンマスタードS）      CCCCGGTTCAAGACTTACTTAG    
配列番号３８（ブラウンマスタードAS）     CCGGGTTGGCGAAAGCAGA      
（ Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。）
【００４８】
本発明は、第1のプライマーセットとして、配列表の配列番号1における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、コショウ検出用に好適に使用できる。
【００４９】
本発明は、第2のプライマーセットとして、配列表の配列番号3における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、トウガラシ検出用に好適に使用できる。
【００５０】
本発明は、第3のプライマーセットとして、配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号6における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ニンニク検出用に好適に使用できる。
【００５１】
本発明は、第4のプライマーセットとして、配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号8における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ショウガ検出用に好適に使用できる。
【００５２】
本発明は、第5のプライマーセットとして、配列表の配列番号9における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ターメリック検出用に好適に使用できる。
【００５３】
本発明は、第6のプライマーセットとして、配列表の配列番号11における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号12における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、サンショウ検出用に好適に使用できる。
【００５４】
本発明は、第7のプライマーセットとして、配列表の配列番号13における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号14における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、柑橘類検出用に好適に使用できる。
【００５５】
本発明は、第8のプライマーセットとして、配列表の配列番号15における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号16における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マスタード（イエローマスタード）検出用に好適に使用できる。
【００５６】
本発明は、第9のプライマーセットとして、配列表の配列番号17における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号18における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マスタード（ブラウンマスタード）検出用に好適に使用できる。
【００５７】
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマーとしての塩基配列の適切な長さが15〜30程度であること、また、3´末端側15個の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりしても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。
【００５８】
本発明においては、さらに、第1のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（1´）（最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（2´）（最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはコショウ検出用に好適に使用でき、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（1´）の具体例としては配列番号１９のプライマー、（2´）の具体例としては配列番号２０のプライマーを例示できる。
【００５９】
本発明においては、さらに、第2のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（3´）（最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（4´）（最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはトウガラシ検出用に好適に使用でき、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（3´）の具体例としては配列番号２１のプライマー、（4´）の具体例としては配列番号２２のプライマーを例示できる。
【００６０】
本発明においては、さらに、第3のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（5´）（最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（6´）（最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはニンニク検出用に好適に使用でき、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（5´）の具体例としては配列番号２３のプライマー、（6´）の具体例としては配列番号２４のプライマーを例示できる。
【００６１】
本発明においては、さらに、第4のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（7´）（最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（8´）（最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはショウガ検出用に好適に使用でき、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（7´）の具体例としては配列番号２５のプライマー、（8´）の具体例としては配列番号２６のプライマーを例示できる。
【００６２】
本発明においては、さらに、第5のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（9´）（最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（10´）（最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはウコン検出用に好適に使用でき、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（9´）の具体例としては配列番号２７のプライマー、（10´）の具体例としては配列番号２８のプライマーを例示できる。
【００６３】
本発明においては、さらに、第6のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（11´）（最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（12´）（最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはサンショウ検出用に好適に使用でき、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（11´）の具体例としては配列番号２９のプライマー、（12´）の具体例としては配列番号３０のプライマーを例示できる。
【００６４】
本発明においては、さらに、第7のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（13´）（最も好ましくは配列番号13の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（14´）（最も好ましくは配列番号14の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは柑橘類検出用に好適に使用でき、配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（13´）の具体例としては配列番号３１のプライマー、（14´）の具体例としては配列番号３２のプライマーを例示できる。
【００６５】
本発明においては、さらに、第8のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（15´）（最も好ましくは配列番号15の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（16´）（最も好ましくは配列番号16の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマスタード（白からし）検出用に好適に使用でき、配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（15´）の具体例としては配列番号３３のプライマー、（16´）の具体例としては配列番号３４のプライマーを例示できる。
【００６６】
本発明においては、さらに、第9のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（17´）（最も好ましくは配列番号17の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（18´）（最も好ましくは配列番号18の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマスタード（黒からし）検出用に好適に使用でき、配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（17´）の具体例としては配列番号３５のプライマー、（18´）の具体例としては配列番号３６のプライマーを例示できる。
【００６７】
本発明の香辛料検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に香辛料（コショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタード）が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
【００６８】
即ち、上記本発明の香辛料検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の香辛料を特異的に検出することが可能となる。このとき、コショウを検出する場合には、コショウ検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にトウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、柑橘類、マスタードを検出する場合には、それぞれトウガラシ検出用PCRプライマーセット、ニンニク検出用PCRプライマーセット、ショウガ検出用PCRプライマーセット、ターメリック検出用PCRプライマーセット、サンショウ検出用PCRプライマーセット、柑橘類検出用PCRプライマーセット、マスタード検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。
【００６９】
検出法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法やPCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。
【００７０】
PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の香辛料検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。蛍光量によりPCR増幅が見られた場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。
【００７１】
具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約100 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にコショウが存在していたことを示唆する。
【００７２】
具体的には、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約154 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にトウガラシが存在していたことを示唆する。
【００７３】
具体的には、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約71 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にニンニクが存在していたことを示唆する。
【００７４】
具体的には、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約105 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にショウガが存在していたことを示唆する。
【００７５】
具体的には、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約67 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にターメリックが存在していたことを示唆する。
【００７６】
具体的には、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約238 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にサンショウが存在していたことを示唆する。
【００７７】
具体的には、配列番号13記載のプライマーと配列番号14記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約193 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に柑橘類が存在していたことを示唆する。
【００７８】
具体的には、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約399 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマスタード（イエローマスタード）が存在していたことを示唆する。
【００７９】
具体的には、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約576 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマスタード（ブラウンマスタード）が存在していたことを示唆する。
【００８０】
PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。なお、PCR増幅産物をプローブで検出するその他の方法としては、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の香辛料検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。
【００８１】
本発明の香辛料検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、食品原料や加工食品等が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。
【００８２】
また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法（消費者庁次長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成26年3月26日、消食表第36号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA（ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA）を、通常、試料から抽出することができる。
【００８３】
実施例
以下に、本発明について実施例を用いて、さらに、詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
【００８４】
実施例1
各種植物由来DNAに対する香辛料検出用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の香辛料検出用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種植物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
【００８５】
コショウ、トウガラシ、トマト、ニンニク、ネギ、サンショウ、オレンジ、ユズ、キャベツ、ラッカセイ、ダイズ、ショウガ、ミョウガ、ターメリック、カルダモン、カホクザンショウ、イエローマスタード、ブラウンマスタード、ハクサイ、カブ、チンゲンサイ、ミズナ、コマツナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ダイコンは、商店から購入した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部（種子、果皮部、葉部、塊茎部）を70%エタノールで洗浄し、さらに、TE緩衝液で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からGenomic-tip 20/G（Qiagen GmbH, Germany）、DNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。
【００８６】
ソバ及びコムギの精製DNAは、商店から購入したそば粉及び小麦粉からGenomic-tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。
【００８７】
トウモロコシの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社（BioChain Institute, Inc., USA）から購入したものを使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。
【００８８】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、及び18に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。
【００８９】
上述したように準備した各種植物DNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNA濃度を10 ng/μLに調製した。調製した1 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Takara Bio Inc., Japan）を用いて調製した。この試薬は、TaKaRa Ex Taq HS（ホットスタートタイプ）、dNTP Mixture、Mg2+およびSYBR Green Iを溶液中に含んでいる。反応液は、SYBR Premix Ex Taqをベースとし、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler（Roche Diagnostics GmbH, Germany）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
【００９０】
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度でT℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、t秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。なお、Tは、コショウ、トウガラシ、及びニンニク検出用PCRプライマーの場合には56、ターメリック検出用PCRプライマーの場合には62、ショウガ、サンショウ、柑橘類、及びマスタード検出用PCRプライマーの場合には64とした。また、tは、マスタード検出用PCRプライマーの場合には30、その他の場合には20とした。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2〜5%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして100bp DNA ldder、又は20bp DNA ladder（Sigma）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表1〜4に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。
【００９１】
コショウ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、コショウDNAを使用した場合のみ100bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【００９２】
また、トウガラシ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、トウガラシDNAを使用した場合のみ154bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるトマトDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【００９３】
また、ニンニク検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ニンニクDNAを使用した場合のみ71bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるネギDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【００９４】
また、ショウガ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ショウガDNAを使用した場合のみ105bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表2）。近縁種であるミョウガDNA、ターメリックDNA、カルダモンDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。
【００９５】
また、検出用ターメリックPCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ターメリックDNAを使用した場合のみ67bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表2）。近縁種であるショウガDNA、ミョウガDNA、カルダモンDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。
【００９６】
また、サンショウ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、サンショウDNA、及びカホクザンショウDNAを使用した場合のみ238bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表3）。近縁種であるユズDNA、オレンジDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表3）。
【００９７】
また、柑橘類検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ユズDNA、オレンジDNAを使用した場合のみ193bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表3）。近縁種であるサンショウDNA、カホクザンショウDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表3）。
【００９８】
また、マスタード（イエローマスタード）検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、イエローマスタードDNAを使用した場合のみ399bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表4）。近縁種であるブラウンマスタードDNA、ハクサイDNA、カブDNA、チンゲンサイDNA、ミズナDNA、コマツナDNA、キャベツDNA、ブロッコリーDNA、カリフラワーDNA、ダイコンDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表4）。
【００９９】
また、マスタード（ブラウンマスタード）検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラウンマスタードDNAを使用した場合のみ576bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表4）。近縁種であるイエローマスタードDNA、ハクサイDNA、カブDNA、チンゲンサイDNA、ミズナDNA、コマツナDNA、キャベツDNA、ブロッコリーDNA、カリフラワーDNA、ダイコンDNAや、他の植物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表4）。
【０１００】
【表１】
0006612656.tif 000002
【０１０１】
【表２】
0006612656.tif 000003
【０１０２】
【表３】
0006612656.tif 000004
【０１０３】
【表４】
0006612656.tif 000005
【０１０４】
実施例2
香辛料検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した香辛料検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。
実施例1で調製したコショウ、トウガラシ、ニンニク、ショウガ、ターメリック、サンショウ、オレンジ、イエローマスタード、ブラウンマスタードの各DNAを滅菌水で希釈し、1 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl のDNA溶液の希釈系列を作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１０５】
図1に示すように、コショウ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 pg DNA/分析であり、トウガラシ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 pg DNA/分析であり、ニンニク検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、ショウガ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ターメリック検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、サンショウ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、柑橘類検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、イエローマスタード検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ブラウンマスタード検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であった。
【０１０６】
実施例3
香辛料検出用PCRプライマーセットを用いたPCRによる香辛料含有食品中の香辛料由来DNAの検出
各種香辛料を原料として含有する市販食品等に対する本発明の香辛料検出用PCRプライマーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
【０１０７】
各種香辛料を原料として含有することが明記されている市販スパイスミックス（表5）を準備し、1〜10 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。その混合破砕物の1 gから各々のDNAをGenomic-tip 20/G kitを用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。これらの調製DNA液の1 μLを、実施例1で使用した香辛料検出用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2〜5%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして100bp DNA ldder、又は20bp DNA ladder（Sigma）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表5に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社）を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBank nucleotide sequence database（BLAST search）もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。
【０１０８】
その結果、コショウ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、コショウ含有食品である、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAにおいてのみ、100bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、コショウのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、コショウ非含有食品試料からコショウ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、コショウ含有食品試料からコショウ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１０９】
また、トウガラシ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、トウガラシ含有食品である、スパイスミックスB、C、及びD由来DNAにおいてのみ、154 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスB、C、及びD由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、トウガラシのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、トウガラシ非含有食品試料からトウガラシ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、トウガラシ含有食品からトウガラシ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１０】
また、ニンニク検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ニンニク含有食品である、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAにおいてのみ、71bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ニンニクのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ニンニク非含有食品試料からニンニク由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ニンニク含有食品試料からニンニク由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１１】
また、ショウガ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ショウガ含有食品である、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAにおいてのみ、105bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスA、C、及びD由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ショウガのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ショウガ非含有食品試料からショウガ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ショウガ含有食品試料からショウガ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１２】
また、ターメリック検出用PCRプライマー（配列番号9、及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ターメリック含有食品である、スパイスミックスD、及びE由来DNAにおいてのみ、67bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスD、及びE由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ターメリックのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ターメリック非含有食品試料からターメリック由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ターメリック含有食品試料からターメリック由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１３】
また、サンショウ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、サンショウ含有食品である、スパイスミックスB、及びC由来DNAにおいてのみ、238bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスB、及びC由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、サンショウのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、サンショウ非含有食品試料からサンショウ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、サンショウ含有食品試料からサンショウ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１４】
また、柑橘類検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、柑橘類含有食品である、スパイスミックスB由来DNAにおいてのみ、193bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスB由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、柑橘類のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、柑橘類非含有食品試料から柑橘類由来DNAやその他のDNAを検出しないが、柑橘類含有食品試料から柑橘類由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１５】
また、マスタード検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット及び配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、マスタード含有食品である、スパイスミックスD、及びE由来DNAにおいてのみ、399bp前後、または476bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表5）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、スパイスミックスD、及びE由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、マスタード（イエローマスタード、またはブラウンマスタード）のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、マスタード非含有食品試料からマスタード由来DNAやその他のDNAを検出しないが、マスタード含有食品試料からマスタード由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１１６】
【表５】
0006612656.tif 000006
【図１】
0006612656.tif 000007
【配列表】
0006612656000001.app