(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェロイドが撮像された原画像から、前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領域を特定する工程と、
円形分離度フィルタ演算により、前記対象領域内で分離度の値が最大となる円形領域を検出する工程と、
前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する工程と
を備え、
前記円形領域の分離度の値を前記円形領域内の画素の平均画素値で正規化した値を、前記指標値とする画像処理方法。
【請求項２】
前記対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と前記対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において前記円形分離度フィルタ演算を行う請求項１に記載の画像処理方法。
【請求項３】
スフェロイドが撮像された原画像から、前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領域を特定する工程と、
円形分離度フィルタ演算により、前記対象領域内で分離度の値が最大となる円形領域を検出する工程と、
前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する工程と
を備え、
前記対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と前記対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において前記円形分離度フィルタ演算を行う画像処理方法。
【請求項４】
前記円形分離度フィルタ演算では、前記対象領域内における中心の位置および直径の少なくとも一方が複数段階に変更設定され、設定ごとに前記分離度が求められる請求項１ないし３のいずれかに記載の画像処理方法。
【請求項５】
前記対象領域を特定するためのユーザからの設定入力を受け付け、該設定入力に応じて前記対象領域が特定される請求項１ないし４のいずれかに記載の画像処理方法。
【請求項６】
画像処理により前記原画像から前記スフェロイドに対応するオブジェクトを検出する工程を備え、その検出結果に基づき前記対象領域が特定される請求項１ないし４のいずれかに記載の画像処理方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の画像処理方法の各工程を、コンピュータに実行させる制御プログラム。
【請求項８】
スフェロイドが撮像された原画像を取得する画像取得手段と、
前記原画像のうち前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領域内で、円形分離度フィルタ演算を実行し、分離度の値が最大となる円形領域を検出する検出手段と、
前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する出力手段と
を備え、
前記出力手段は、前記円形領域の分離度の値を前記円形領域内の画素の平均画素値で正規化した値を、前記指標値とする画像処理装置。
【請求項９】
スフェロイドが撮像された原画像を取得する画像取得手段と、
前記原画像のうち前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領域内で、円形分離度フィルタ演算を実行し、分離度の値が最大となる円形領域を検出する検出手段と、
前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する出力手段と
を備え、
前記検出手段は、前記対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と前記対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において前記円形分離度フィルタ演算を行う画像処理装置。
【請求項１０】
前記原画像から前記対象領域を特定するための設定入力をユーザから受け付ける受付手段を備える請求項８または９に記載の画像処理装置。
【請求項１１】
前記画像取得手段は、試料を撮像して前記原画像を取得する撮像部を有する請求項８ないし１０のいずれかに記載の画像処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、スフェロイドを撮像した原画像に基づく画像処理により、画像に含まれるスフェロイドの評価を行う技術に関するものである。
関連出願の相互参照
以下に示す日本出願の明細書、図面および特許請求の範囲における開示内容は、参照によりその全内容が本書に組み入れられる：
特願２０１５−０７１６５５（２０１５年３月３１日出願）。
【背景技術】
【０００２】
医療や生物科学の実験においては、多数の細胞が球状に集まった細胞集塊（スフェロイド）を培養し観察することが行われる。細胞活性の高いスフェロイドほど球に近い形状となる。このことから、スフェロイドを撮像した画像においてスフェロイドが如何に円形に近い形状をしているかを評価することが行われている。【０００３】
画像に含まれる細胞等のオブジェクトの丸さを評価する技術としては、例えば特許文献１ないし３に記載の各技術がある。これらの技術においては、画像内に含まれるオブジェクトの丸さが、オブジェクトの面積と周長との比から求められる真円度により評価されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４７４０３号
【特許文献２】特許第４５２１５７２号公報
【特許文献３】特開２００６−０７９１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
オブジェクトが単細胞である場合、上記従来技術の評価方法は一定の成果を上げることができる。一方、オブジェクトがスフェロイドである場合には必ずしも良好な結果が得られない。その理由は以下の通りである。スフェロイドは多数の細胞からなっており、その外周には個々の細胞の輪郭に起因する凹凸が現れる。そのため、同程度のサイズの円に比べて周長が長く見積もられる傾向がある。結果として、求められた真円度は必ずしもスフェロイドの丸さを指標しない。【０００６】
このように、スフェロイドの評価を行うためにはその丸さを定量的に表す指標が必要となる。しかしながら、そのような指標値を求める技術はこれまで確立されるに至っていない。【０００７】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、スフェロイドを撮像した画像から、スフェロイドの丸さを定量的に表す指標値を求めることのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明にかかる画像処理方法は、上記目的を達成するため、スフェロイドが撮像された原画像から、前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領域を特定する工程と、円形分離度フィルタ演算により、前記対象領域内で分離度の値が最大となる円形領域を検出する工程と、前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する工程とを備えている。その第１の態様では、前記円形領域の分離度の値を前記円形領域内の画素の平均画素値で正規化した値を、前記指標値とする。また第２の態様では、前記対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と前記対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において前記円形分離度フィルタ演算を行う。
【０００９】
また、この発明にかかる画像処理装置は、上記目的を達成するため、スフェロイドが撮像された原画像を取得する画像取得手段と、前記原画像のうち前記スフェロイドに対応するオブジェクトを含む対象領内で、円形分離度フィルタ演算を実行し、分離度の値が最大となる円形領域を検出する検出手段と、前記円形分離度フィルタ演算により算出される前記円形領域の分離度に比例する値を、当該円形領域により特定される前記スフェロイドの丸みを示す指標値として出力する出力手段とを備えている。その第１の態様では、前記出力手段は、前記円形領域の分離度の値を前記円形領域内の画素の平均画素値で正規化した値を、前記指標値とする。また第２の態様では、前記検出手段は、前記対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と前記対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において前記円形分離度フィルタ演算を行う。
【００１０】
また、この発明の他の態様は、上記した画像処理方法の各工程を、コンピュータに実行させる制御プログラムである。【００１１】
上記のように構成された発明では、原画像のうちの対象領域内に描ける円のうち分離度が最大となるものが、円形分離度フィルタ演算により特定される。この円は対象領域内に存在するスフェロイドの輪郭に対応している蓋然性が高いと考えられる。このことから、この円で特定される円形領域は、スフェロイドの領域を近似的に示していると言える。そして、画像中でスフェロイドが円形に近ければ分離度の値が大きく、円形からの乖離が大きければ分離度の値が小さくなる。したがって、分離度の値自体が、画像中でスフェロイドがどの程度円形に近い形状をしているかを定量的に示す情報となる。【００１２】
そこで、本発明では、スフェロイドと推定される円形領域について求められた分離度の値に比例する値が、当該スフェロイドの丸さを指標する指標値として出力される。こうして得られる指標値は、スフェロイドの丸さを定量的かつ客観的に示すものとなっている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、スフェロイドを撮像した画像を用いて円形分離度フィルタ演算を行うことによって、スフェロイドの丸さを定量的に表す指標値を求めることができる。【００１４】
この発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、添付図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。ただし、図面は専ら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】画像処理装置の一実施形態としての撮像装置の概略構成を示す図である。
【図２Ａ】スフェロイドの外観を模式的に示す第１の図である。
【図２Ｂ】スフェロイドの外観を模式的に示す第２の図である。
【図２Ｃ】スフェロイドの外観を模式的に示す第３の図である。
【図３】この撮像装置の動作を示すフローチャートである。
【図４Ａ】ウェルを撮像して得られた原画像の例を示す。
【図４Ｂ】原画像から切り出された対象領域の画像の第１の例を示す。
【図４Ｃ】原画像から切り出された対象領域の画像の第２の例を示す。
【図４Ｄ】原画像から切り出された対象領域の画像の第３の例を示す。
【図５】円形分離度フィルタ演算の処理内容を示すフローチャートである。
【図６Ａ】スフェロイドの形状と対応する円形領域との関係を示す第１の図である。
【図６Ｂ】スフェロイドの形状と対応する円形領域との関係を示す第２の図である。
【図６Ｃ】スフェロイドの形状と対応する円形領域との関係を示す第３の図である。
【図７】表示画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１は本発明にかかる画像処理装置の一実施形態としての撮像装置の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中で培養されるスフェロイド（細胞集塊）を撮像する装置である。以下、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。
【００１７】
ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものであり、平板状のプレートの上面にウェルＷが複数設けられている。ウェルＷの断面は略円形の筒状に形成され、底面は透明で平坦である。１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意である。例えば１２ないし３８４穴のものが一般的に使用されている。また、複数ウェルを有するウェルプレートに限らず、例えばディッシュと呼ばれる平型の容器で培養されたスフェロイドの撮像にも、この撮像装置１を使用することが可能である。
【００１８】
ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地Ｍとしての液体が所定量注入され、この液体中で所定の培養条件で培養されたスフェロイドが、この撮像装置１の撮像対象となる。培地Ｍは適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。後述するように、この撮像装置１は培地Ｍ内で、例えばウェルＷの内底面で培養されたスフェロイドを撮像対象とすることができる。
【００１９】
撮像装置１は、ホルダ１１と、照明部１２と、撮像部１３と、制御部１４とを備えている。ホルダ１１は、試料を液体とともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰの、下面周縁部に当接してウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持する。照明部１２はホルダ１１の上方に配置される。撮像部１３はホルダ１１の下方に配置される。制御部１４は、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する。
【００２０】
照明部１２は、ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰに向けて適宜の拡散光（例えば白色光）を出射する。より具体的には、例えば光源としての白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源と拡散板とを組み合わせたものを、照明部１２として用いることができる。照明部１２により、ウェルプレートＷＰに設けられたウェルＷ内のスフェロイドが上方から照明される。
【００２１】
ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３には、ウェルプレートＷＰの直下位置に撮像光学系１３１が配置されており、撮像光学系１３１の光軸ＡＸは鉛直方向（Ｚ方向）に向けられている。
【００２２】
撮像部１３により、ウェルＷ内のスフェロイドが撮像される。具体的には、照明部１２から出射されウェルＷの上方から液体に入射した光が撮像対象物を照明する。ウェルＷ底面から下方へ透過した光が、撮像光学系１３１を介して撮像素子１３２の受光面に入射する。撮像光学系１３１により撮像素子１３２の受光面に結像する撮像対象物の像が、撮像素子１３２により撮像される。撮像素子１３２としては例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができ、二次元イメージセンサおよび一次元イメージセンサのいずれであってもよい。
【００２３】
撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ制御部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ制御部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき、撮像部１３をＸ方向およびＹ方向に移動させる。これにより撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。また撮像部１３のＺ方向への移動によりフォーカス調整がなされる。１つのウェルＷ内の撮像対象物が撮像されるとき、メカ制御部１４６は、光軸ＡＸが当該ウェルＷの中心と一致するように、撮像部１３を水平方向に位置決めする。撮像部１３の撮像素子が一次元イメージセンサである場合には、イメージセンサの長手方向と直交する方向に撮像部１３を走査させることにより二次元画像を撮像することができる。このような撮像方法では、撮像対象であるスフェロイドに対し、非接触、非破壊かつ非侵襲で撮像を行うことができる。そのため、撮像によるスフェロイドへのダメージを抑えることができる。
【００２４】
また、メカ制御部１４６は、撮像部１３をＸＹ方向に移動させる際、図において点線矢印で示すように、照明部１２を撮像部１３と一体的にＸＹ方向に移動させる。すなわち、照明部１２は、その光中心が撮像部１３の光軸ＡＸと略一致するように配置されており、撮像部１３がＸＹ方向に移動するとき、連動してＸＹ方向に移動する。これにより、どのウェルＷが撮像される場合でも、当該ウェルＷの中心および照明部１２の光中心が常に撮像部１３の光軸上に位置することとなる。したがって、各ウェルＷに対する照明条件を一定にして、撮像条件を良好に維持することができる。
【００２５】
撮像部１３の撮像素子から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき各種の画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有している。これらは一体のメモリであってもよい。ＣＰＵ１４１は、メモリ１４５に記憶された制御プログラムを実行することにより、後述する各種の演算処理を行う。
【００２６】
その他に、制御部１４には、インターフェース（ＩＦ）部１４２が設けられている。インターフェース部１４２は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行う。また、インターフェース部１４２は通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。なお、制御部１４は、上記したハードウェアを備えた専用装置であってもよい。また、パーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置に、後述する処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものが制御部１４として用いられてもよい。すなわち、この撮像装置１の制御部１４として、汎用のコンピュータ装置を利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置１には、撮像部１３等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。
【００２７】
上記のように構成された撮像装置１は、ウェルＷ内で培養されたスフェロイドを撮像する機能と、撮像された画像に基づきスフェロイドの丸み度を算出する機能とを有する。ここでいう「丸み度」は、撮像された画像においてスフェロイドが如何に円形に近い形状を有しているかを定量的に示す指標値である。
【００２８】
図２Ａないし図２Ｃはスフェロイドの外観を模式的に示す図である。図２Ａに示されるスフェロイドＳｐ１は、バイアビリティ（生存能力、細胞活性）の比較的高い細胞によって構成された例である。図に示すように、バイアビリティの高いスフェロイドＳｐ１では、多数の細胞Ｃによって球形に近い形状が形作られる。そのため、スフェロイドＳｐ１を撮像した二次元画像では、スフェロイドＳｐ１の輪郭が略円形である。
【００２９】
一方、スフェロイドを構成する細胞の一部が衰弱または死滅すると、図２Ｂに示すスフェロイドＳｐ２のように、細胞間の結合力が弱まってその輪郭が不定形となってくる。このように、撮像されたスフェロイドがどの程度円形に近いか、あるいは乖離しているかは、スフェロイドを構成する細胞の活性を評価する上で重要な情報である。そのため、画像におけるスフェロイドがどの程度真円に近いかを定量的に表す指標値が有用である。
【００３０】
従来の技術では、撮像されたオブジェクトの輪郭がどの程度円に近いか、つまりスフェロイドの「丸さ」を表す指標値として「真円度」または「円形度」が一般的に用いられている。これらの方法では、オブジェクトの輪郭に外接する円と内接する円との半径の比、あるいは、オブジェクトの面積とその輪郭の周長との比によって、オブジェクトがどの程度円に近い形状を有しているかが表される。
【００３１】
しかしながら、スフェロイドは多数の細胞の集まりである。そのため、図２Ａに示すように、概略円形に見えるスフェロイドＳｐ１であっても、微視的にはその輪郭に個々の細胞Ｃの表面に起因する凹凸が現れる。したがって、真円度または円形度を用いた指標値では、スフェロイドの「丸さ」を適切に表すことができない場合がある。また、実際のスフェロイドは立体的な形状を有しているため、図２Ｃに示すように、照明光による影がスフェロイドＳｐ１の像に濃淡を生じさせることがある。この場合、スフェロイドの輪郭を適切に抽出することができず、結果として当該スフェロイドについて求められた真円度または円形度が不適切な値を有することがあり得る。
【００３２】
本実施形態においては、上記のような従来技術の問題を改善するために、新たな指標値としてスフェロイドの「丸み度」が導入される。以下、スフェロイドの撮像から丸み度の算出に至るこの撮像装置１の動作について説明する。
【００３３】
図３はこの撮像装置の動作を示すフローチャートである。この動作は、制御部１４のＣＰＵ１４１が予め用意された制御プログラムをユーザの指示に応じて実行し、撮像装置１の各部にプログラムで規定された所定の動作を行わせることにより実現される。スフェロイドを含む試料が培養されたウェルプレートＷＰがユーザまたは搬送ロボットによりホルダ１１にセットされると（ステップＳ１０１）、撮像部１３がウェルＷを撮像する（ステップＳ１０２）。必要に応じ複数回撮像を行うことで、各ウェルＷが撮像され、原画像が取得される。
【００３４】
撮像された原画像から、背景領域とは異なる特徴を有するオブジェクト領域が画像処理によって抽出される（ステップＳ１０３）。画像処理によって画像からオブジェクト領域を抽出する方法は各種のものが公知であり、本実施形態でもそれらのうち適宜の方法を適用することができる。例えば原画像を構成する画素の画素値が所定の範囲にある領域をオブジェクト領域とすることができる。また例えば、エッジ抽出によって抽出されたエッジで囲まれた領域をオブジェクト領域とすることができる。なお、後述するように、ステップＳ１０３は省くことができる場合がある。
【００３５】
次に、撮像された原画像のうち、以下の処理の対象となる対象領域についての設定入力が受け付けられる（ステップＳ１０４）。設定入力は、例えばユーザがインターフェース部１４２に設けられた入力デバイスとしてのキーボード、マウス、タブレット等を操作することにより制御部１４に与えられる。
【００３６】
図４Ａないし図４Ｄは画像の例を模式的に示す図である。より具体的には、図４ＡはウェルＷを撮像して得られた原画像の例を示す。また、図４Ｂないし図４Ｄは原画像から切り出された対象領域の画像の例を示す。図４Ａに示すように、原画像ではウェルＷ内の各所にスフェロイドが分布している。ここでは７つのスフェロイドＳｐ３〜Ｓｐ９が含まれているが、スフェロイドの個数は様々であり、もちろん１つでもよい。
【００３７】
原画像には様々な特徴を有するスフェロイドが含まれ得る。例えば、比較的円形に近い形状を有するスフェロイド（Ｓｐ４〜Ｓｐ８）、よりいびつな形状のスフェロイド（Ｓｐ３，Ｓｐ９）、互いに近接しているスフェロイド（Ｓｐ４〜Ｓｐ６）などが含まれ得る。
【００３８】
ユーザは、このような原画像から丸み度を求めようとするスフェロイドを含む一部領域を対象領域として指定する。そして、原画像のうち対象領域内の部分画像が切り出されて、当該部分画像について円形分離度フィルタ演算が実行される（ステップＳ１０５）。
【００３９】
対象領域は、原画像から当該対象領域を切り出した部分画像に、丸み度を求めようとする１つのスフェロイドが含まれるように選ばれることが好ましい。例えばスフェロイドＳｐ８，Ｓｐ９は、他のスフェロイドとの距離が比較的大きく、孤立している。このような場合、図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、部分画像Ｐが当該スフェロイドの全体およびその周囲の背景領域を含むように対象領域が設定されることが好ましい。一方、スフェロイドＳｐ５では近傍に他のスフェロイドが存在している。このような場合には、図４Ｄに示すように、部分画像Ｐが当該スフェロイドの全体を含み他のスフェロイドができるだけ除外されるように、対象領域が選ばれることが好ましい。
【００４０】
なお、ここではユーザにより対象領域が指定されるものとしているが、これに代えて、あるいはこれに加えて、撮像装置１により自動的に対象領域が設定されるようにしてもよい。すなわち、ステップＳ１０３において原画像からオブジェクト領域が抽出されると、原画像中のオブジェクト領域の位置およびサイズがわかる。そのため、抽出されたオブジェクト領域を含むように対象領域を自動的に設定することが可能である。
【００４１】
抽出されたオブジェクト領域が全てスフェロイドであるとは限らず、また評価の必要のないスフェロイドが含まれる場合もある。ユーザの指示入力により対象領域を設定可能とすることで、無用な演算処理を省き処理時間を短縮することができる。同じ理由で、原画像全体において円形分離度フィルタ演算が行われるのではなく、スフェロイドとその周囲とを含む部分画像Ｐについて演算が行われる。
【００４２】
図５はこの実施形態における円形分離度フィルタ演算の処理内容を示すフローチャートである。最初に、指定された対象領域に対応する部分画像に含まれる画素の画素値の平均値、すなわち平均画素値が算出される（ステップＳ２０１）。そして、元の部分画像の各画素の画素値と平均画素値との差の絶対値を当該画素の画素値とする、差分画像が作成される（ステップＳ２０２）。
【００４３】
なお、差分画像は以降の処理に用いられる仮想的な中間画像である。差分画像における各画素の画素値が求められれば足り、実際に何らかの画像が作成・出力されることを要するものではない。また差分画像ではオブジェクト領域とそれ以外の背景領域とのコントラストが原画像より小さくなる場合もある。しかしながら、円形分離度フィルタ演算を行うという目的においては、平均画素値に対する差分画像を用いることで、背景領域やオブジェクト領域それぞれにおける濃度ムラの影響を低減することが可能となるという利点が生じる。
【００４４】
次に、分離度を算出するためのパラメータとして仮想的な円の中心座標位置および直径が適宜の値に仮設定される（ステップＳ２０３）。ステップＳ１０３で抽出されたオブジェクト領域が対象領域内に存在すれば、その位置およびサイズが予めわかっているので、それらの情報に基づいてパラメータ設定を行うことが可能である。すなわち、中心位置およびサイズがオブジェクト領域と同等である円が設定されればよい。またパラメータの設定値がユーザから与えられるようにしてもよい。
【００４５】
設定された中心座標位置と直径とにより特定される対象領域内の円について、分離度が算出される（ステップＳ２０４）。分離度は、当該円の外側に隣接する環状の外側領域に含まれる画素の画素値と、当該円の内側に隣接する環状の内側領域に含まれる画素の画素値とに基づき、以下の計算式により求められる。これらの環状の領域の幅としては例えば数画素分とすることができる。
【数１】
0006470399.tif 000002
【００４６】
ステップＳ２０３およびＳ２０４はループ処理となっており、円の中心位置と直径との組み合わせを種々に変更しながら分離度の計算が繰り返される。対象領域内に描き得る全ての円について演算を行ってもよい。しかしながら、対象領域内におけるオブジェクト領域の位置およびサイズが既知である場合には、その情報に基づき、円の中心位置および直径の変更範囲を限定することができる。こうすることで、中心座標位置および直径のあらゆる組み合わせについて演算を行う場合よりも処理時間を大幅に短縮することができる。
【００４７】
設定すべき全ての円について分離度が求められるとループ処理は終了する（ステップＳ２０５）。こうして求められた分離度のうちの最大値（以下、「最大分離度」という）が、当該最大値を取る円の中心位置および直径とともにメモリ１４５に記憶される（ステップＳ２０６）。これにより、対象領域内において分離度が最大となる円が特定される。
【００４８】
こうして特定された円は、対象領域内に存在するスフェロイドの輪郭の概略的に示すものと推定することができる。つまり、この円を外周とする円形領域が、対象領域内のスフェロイドの領域である蓋然性が高い。特に、スフェロイドが理想的な円形に近い形状を有している場合、円形領域はスフェロイド領域と略一致するはずである。
【００４９】
図６Ａないし図６Ｃはスフェロイドの形状とそれに対応する円形領域との関係を示す図である。例えば図４Ａに示すスフェロイドＳｐ８のように、スフェロイドＳｐが略円形の形状を有している場合、図６Ａに示すように、求められた円形領域ＣＲと実際のスフェロイドＳｐの領域とは概ね一致する。このため、求められた最大分離度の値は比較的大きい。
【００５０】
一方、例えば図４Ａに示すスフェロイドＳｐ９のように、スフェロイドＳｐの形状がいびつである場合、図６Ｂに示すように、求められた円形領域ＣＲと実際のスフェロイドＳｐの領域との乖離が比較的大きい。スフェロイドＳｐの輪郭との乖離が大きい円について求められた最大分離度の値は比較的小さい。
【００５１】
なお、図６Ｃに示すように、対象領域内に複数のスフェロイドＳｐが含まれる場合、単一の円を用いた円形分離度フィルタ演算では最大分離度の値はさらに小さくなる。そして、その値は対象領域に含まれるスフェロイドのいずれかの属性を適切に指標するものとも言えない。この点から、図４Ｄに示すように、対象領域は単一のスフェロイドを主として含むように設定されることが望ましい。
【００５２】
このように、円形分離度フィルタ演算を行って分離度が最大となる円形領域ＣＲを検出することにより、対象領域内でスフェロイドが存在すると推定される領域を特定することができる。さらに、当該円形領域における分離度の値は、スフェロイドが円形に近いほど大きくなる。したがって、最大分離度が大きくなるほど大きな値を取るような、例えば最大分離度の値に比例する値を、スフェロイドの丸み度を表す指標値として用いることができる。分離度に基づく丸み度の指標値では、スフェロイドの包絡外形が略円形であれば外周の細かい凹凸の影響が現れにくい。
【００５３】
図３に戻ってこの装置の動作説明を続ける。ステップＳ１０５において、対象領域内で分離度が最大となる円が特定されると、その最大分離度の値に基づいて当該対象領域内のスフェロイドの丸み度が算出される（ステップＳ１０６）。丸み度としては、最大分離度の値に比例する値を用いることができる。例えば最大分離度の値をそのまま、あるいは所定の比例係数を乗じて正規化した値を、丸み度の値とすることができる。この他、最大分離度の値に対し単調増加となるような適宜の計算式により丸み度を数値化してもよい。
【００５４】
また、上記演算により求められる最大分離度の値は、背景領域の濃度が同程度であればスフェロイド領域の濃度が高いほど大きくなる傾向にある。したがって、濃度が大きく異なるスフェロイド同士の丸み度を比較する際には最大分離度の値をそのまま指標値とすることは適当でない。この問題を回避するために、例えば、最大分離度の値を当該スフェロイド領域内の平均画素値で除することで正規化し濃度差の影響を低減した値を、丸み度としてもよい。
【００５５】
こうして求められたスフェロイドの丸み度については、所定の形式で出力されユーザに提示される。例えば、インターフェース部１４２に設けられたディスプレイ（出力デバイス）に結果を表示することでユーザに報知することができる（ステップＳ１０７）。
【００５６】
図７は表示画像の一例を示す図である。なお、表示の態様はここに示すものに限定されるものではなく任意である。また、丸み度の演算結果の出力は、このように表示装置に表示されることによる以外に、例えば外部の記録媒体や情報処理装置に送信出力される態様であってもよい。
【００５７】
表示画像ＩＭのうち、ボックス領域Ｂ１には、原画像が表示されるとともに、設定された対象領域の範囲が点線により示されている。また、ボックス領域Ｂ２には、対象領域の拡大画像が表示される。また、円形分離度フィルタ演算により特定された、最大分離度に対応する円形領域が点線により示されている。そして、ボックス領域Ｂ３には、円形領域の中心座標位置、直径およびスフェロイドの丸み度の算出結果がテキスト表示されている。こうして１つの対象領域について丸み度が算出されその結果が表示される。
【００５８】
図３に戻って説明を続ける。１つの対象領域について処理が終了すると、さらに別の対象領域を設定し当該領域での丸み度の算出を継続して行うか否かが判断される（ステップＳ１０８）。処理の継続が必要であればステップＳ１０４に戻り、上記処理が繰り返される。
【００５９】
対象領域がユーザにより指定される場合、処理を継続するか否かをユーザに問い合わせることができる。また、対象領域が自動的に設定される場合には、抽出されたオブジェクト領域のうち丸み度が未だ算出されていないものがあればそのオブジェクト領域についての処理が継続される。そして、全てのオブジェクト領域について丸み度の算出処理が済んでいれば処理を終了すればよい。
【００６０】
以上のように、この実施形態の撮像装置１では、撮像により得られた原画像のうちスフェロイドを含むように指定された対象領域について、円形分離度フィルタ演算が行われる。そして、分離度が最大となるときの分離度の値に比例する値が、当該対象領域にあるスフェロイドの丸み度を表す指標値として出力される。こうすることにより、画像に含まれるスフェロイドがどの程度円形に近い形状を有しているかを、定量的かつ客観的に表すことができる。
【００６１】
細胞活性が高い球状のスフェロイドであっても、その表面には個々の細胞に起因する小さな凹凸がある。本実施形態により求められる「丸み度」では、このような凹凸の影響が低減される。また、真円度または円形度により丸みを表す従来の技術では、予めスフェロイドの輪郭を適正に特定できなければ正確な値が得られないという問題があった。これに対し、本実施形態の算出方法では、予め輪郭を特定しなくても丸み度を算出することが可能である。この意味において、図３のステップＳ１０３を省いても丸み度の算出は可能である。特に、対象領域に１つのスフェロイドが含まれていることが明らかな場合には輪郭の特定を省くことができる。
【００６２】
本実施形態において、円形分離度フィルタ演算は、原画像から円形領域を探索することを目的として用いられているのではない。すなわち、スフェロイドに対応するオブジェクトの位置はある程度特定されているという前提の下、このオブジェクトを含む対象領域内で分離度の最大値を得るために、円形分離度フィルタ演算が用いられている。
【００６３】
こうして求められたスフェロイドの丸み度は、当該スフェロイドの包絡外形が円形に近ければ大きな値となり、円形から乖離するほど小さな値となる。スフェロイド形状の円からの乖離は主としてスフェロイドをなす細胞が衰弱することによって生じているから、丸み度の値をスフェロイドの活性評価に役立てることができる。
【００６４】
以上説明したように、この実施形態においては、撮像装置１が本発明の「画像処理装置」として機能している。そして、撮像部１３が本発明の「画像取得手段」として、ＣＰＵ１４１が本発明の「検出手段」として、またインターフェース部１４２が本発明の「出力手段」および「受付手段」として機能している。
【００６５】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態の画像処理装置は、本発明の「画像取得手段」としての撮像部１３を備えるものである。しかしながら、撮像機能を備えない画像処理装置であってもよい。すなわち、上記実施形態の制御部１４内のインターフェース部１４２が外部から画像データを受信することで原画像を取得し、この原画像を用いて丸み度が算出される態様で、本発明が実施されてもよい。この場合、インターフェース部１４２が「画像取得手段」として機能することとなり、撮像機能は必要とされない。
【００６６】
また、上記実施形態では、ＣＰＵ１４１がメモリ１４５に記憶された制御プログラムを実行することで本発明が実施される。前記したように、この実施形態における制御部１４としては汎用のコンピュータ装置を用いることが可能である。したがって、このようなコンピュータ装置に読み込まれることを前提に、上記した処理をコンピュータ装置に実行させる制御プログラムとして、またこれを適宜の記録媒体に記録した態様で、本発明をユーザに提供することも可能である。これにより、例えば既に運用されている撮像装置に新たな機能を付加することも可能となる。また、汎用のコンピュータ装置を本発明の「画像処理装置」として機能させることが可能となる。
【００６７】
以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明における円形分離度フィルタ演算では、対象領域内における中心の位置および直径の少なくとも一方が複数段階に変更設定され、設定ごとに分離度が求められてもよい。こうすることで、対象領域内に設定可能な種々の円から分離度が最大となるものを的確に選出することができる。
【００６８】
また、対象領域内の各画素について、当該画素の画素値と対象領域の平均画素値との差分を求め、該差分を当該画素の画素値とする差分画像において円形分離度フィルタ演算が行われてもよい。こうすることで、対象領域中のオブジェクト領域および背景領域における濃度ムラが分離度の算出結果に及ぼす影響を低減することができる。
【００６９】
また、円形領域の分離度の値を円形領域内の画素の平均画素値で正規化した値が、丸みを示す指標値とされてもよい。スフェロイドごとにその濃度が異なる場合、同等の丸みを有していても分離度の値が異なることになる。当該スフェロイドに対応する円形領域の平均画素値で分離度の値を正規化することで、この問題を解消することができる。
【００７０】
また、原画像から対象領域を特定するための設定入力をユーザから受け付け、該設定入力に応じて対象領域が特定される構成であってもよい。こうすることで、ユーザが評価を希望するオブジェクトを優先的に処理して、演算結果を短時間でユーザに提示することができる。
【００７１】
また、画像処理により原画像からスフェロイドに対応するオブジェクトを検出する工程を備え、その検出結果に基づき対象領域が特定されてもよい。こうすることで、原画像中の各オブジェクトについての演算を、ユーザ入力によらず自動的に行うことが可能となる。
【００７２】
また、この発明にかかる画像処理装置において、画像取得手段は、試料を撮像して原画像を取得する撮像部を有する構成であってもよい。本発明の画像処理装置において、原画像は外部から与えられてもよいが、撮像部を備えることで原画像の撮像からスフェロイドの丸み度の算出までを一貫して行うことが可能となる。
【００７３】
以上、特定の実施例に沿って発明を説明したが、この説明は限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。発明の説明を参照すれば、本発明のその他の実施形態と同様に、開示された実施形態の様々な変形例が、この技術に精通した者に明らかとなるであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、発明の真の範囲を逸脱しない範囲内で、当該変形例または実施形態を含むものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
この発明は、観察、分析等を目的としてスフェロイドを評価する用途に好適であり、例えば医療や生物科学分野の各種実験に用いることができる。
【符号の説明】
【００７５】
１  撮像装置（画像処理装置）
１３  撮像部（画像取得手段）
１４  制御部
１４１  ＣＰＵ（検出手段）
１４２  インターフェース部（出力手段、受付手段）
ＣＲ  円形領域
Ｓｐ、Ｓｐ１〜Ｓｐ９  スフェロイド
Ｗ  ウェル
ＷＰ  ウェルプレート
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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