(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0006612131.tif 000020
（式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ５は保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２（式中、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはＲ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよい。）で示される基であり、
Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
環Ａは置換されていてもよい芳香環又は置換されていてもよいヘテロ芳香環であり、
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１（Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基を示す。）であり、
ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、
ｍ及びｎは同一又は異なって、０又は１であり、
ｐは１又は２である。）
で表される化合物（蛍光プローブ）、並びに３〜１０個の配位座を有する多座配位子化合物を組み合わせてなり、
前記多座配位子化合物がアミノカルボン酸化合物及びピリジルメチルアミン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含み、
前記一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）と前記多座配位子化合物とが混合されてなる、鉄（II）イオン検出剤。
【請求項２】
前記多座配位子化合物が、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、及び含窒素ヘテロ芳香環からなる群より選ばれる同一又は異なる多座配位子化合物である請求項１に記載の鉄（II）イオン検出剤。
【請求項３】
前記多座配位子化合物が、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス−２−アミノフェニル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＡ）、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）、ｏ−アミノフェノール−Ｎ，Ｎ，Ｏ−三酢酸（ＡＰＴＲＡ）、又はこれらの塩類である請求項１又は２に記載の鉄（II）イオン検出剤。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、環Ａが、式（ａ）：
【化２】
0006612131.tif 000021
（式中、Ｒ８は、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、スルホ基又は活性エステル基であり、ｑは０、１、２又は３であり、ｑが２又は３のとき、Ｒ８は同一又は異なっていてもよい。）
で表される環である請求項１〜３のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にモルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、或いはＲ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ２及びＲ４が結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、或いはＲ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、請求項１〜４のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、請求項１〜５のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）：
【化３】
0006612131.tif 000022
（式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ５は保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２（式中、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはＲ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよい。）で示される基であり、
Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
環Ａは置換されていてもよい芳香環又は置換されていてもよいヘテロ芳香環であり、
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１（Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基を示す。）であり、
ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、
ｍ及びｎは同一又は異なって、０又は１であり、
ｐは１又は２である。）
で表される化合物（蛍光プローブ）を含む容器、及び３〜１０個の配位座を有する多座配位子化合物を含む容器を有してなるキットの形態であり、
前記多座配位子化合物がアミノカルボン酸化合物及びピリジルメチルアミン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、
鉄（II）イオン検出剤。
【請求項８】
鉄（II）イオンの検出方法であって、
（１）鉄（II）イオンを含む検体と、項１〜７のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤とを混合する工程、及び
（２）得られた混合物の蛍光スペクトルを測定する工程
を含むことを特徴とする検出方法。
【請求項９】
鉄（II）イオンの検出感度を増強する方法であって、
（１）鉄（II）イオンを含む検体と、項１〜７のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤とを混合する工程、及び
（２）得られた混合物の蛍光スペクトルを測定する工程
を含むことを特徴とする検出感度の増強方法。
【請求項１０】
鉄（II）イオン検出剤の製造方法であって、一般式（Ｉ）：
【化４】
0006612131.tif 000023
（式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ５は保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２（式中、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはＲ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよい。）で示される基であり、
Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
環Ａは置換されていてもよい芳香環又は置換されていてもよいヘテロ芳香環であり、
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１（Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基を示す。）であり、
ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、
ｍ及びｎは同一又は異なって、０又は１であり、
ｐは１又は２である。）
で表される化合物（蛍光プローブ）と、３〜１０個の配位座を有する多座配位子化合物とを混合することを特徴とし、
前記多座配位子化合物がアミノカルボン酸化合物及びピリジルメチルアミン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、
製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鉄（II）イオン検出剤に関する。具体的には、試験管内及び生細胞内の鉄（II）イオンを選択的かつ高感度で測定することができる鉄（II）イオン検出剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は人体中において最も多く含まれている遷移金属種であり、酸素運搬や呼吸器系における電子伝達などをはじめ、様々な生命現象に関与している。一方、体内における鉄の濃度異常はがん、アルツハイマー病、パーキンソン病などの重篤疾患に関与することが指摘されており、特に、生体内遊離鉄イオンの大半を占める鉄(II)イオンはその高い活性酸素種生成能のために、最近アスベスト発がんやＣ型肝炎においてもその関与が示唆されている。（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１〜５）。そのため、生細胞や生組織中において鉄(II)イオンを選択的に検知できかつ濃度変化を鋭敏に検知できる蛍光プローブが開発できれば、鉄(II)イオンが関与する病態や生命現象の研究、医薬品開発等において非常に重要な手法となる。【０００３】
近年、生体分子、イオン等を標識できる蛍光プローブの開発が積極的に行われており、例えば、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光団を基本骨格として有する蛍光プローブが数多く報告されている（例えば、特許文献３及び４、非特許文献６及び７等）。【０００４】
これまで、鉄イオンを検知する蛍光プローブとしては消光型鉄イオン検出プローブの報告例はあるが（例えば、非特許文献８及び９等）、このプローブでは鉄イオンの検知感度や選択性が低く濃度変化を鋭敏に検知することが困難であった。【０００５】
また、特許文献５には、アルミニウムイオン及び／又は第二鉄イオン測定用の蛍光プローブが報告されているが、対象が鉄（III）イオンであり鉄（II）イオンを対象とするものではないし、金属イオンの選択性も充分ではなかった。【０００６】
上記の課題を解決するべく、特許文献６には、Ｎ−オキシド部分構造を有する鉄（II）イオン検出蛍光プローブ（例えば、RhoNox-1等、図１を参照）が報告されている。この蛍光プローブは、Ｎ−オキシド部分が鉄（II）イオンと反応して脱酸素化反応を受けることで蛍光が増大する特性を利用している。このような鉄（II）イオンに対し発蛍光型の応答を示す蛍光プローブは、従来の消光型の応答を示す蛍光プローブとは一線を画す極めて独創的なものであり、当該蛍光プローブは、鉄（II）イオンの検知感度や選択性に優れているという特徴を有している。【０００７】
さらに、非特許文献１０〜１２には、特許文献６の蛍光プローブ（RhoNox-1等）を改良した蛍光プローブが報告されている。特許文献１０〜１２の蛍光プローブは、具体的には、RhoNox-1のローダミン骨格のカルボキシル基をヒドロキシル基へ変換した化合物（例えば、HMRhoNox-M、HMRhoNox-E等、図１を参照）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2011-79834号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第2009/137612号明細書
【特許文献３】国際公開第01/62755号
【特許文献４】国際公開第99/01447号
【特許文献５】特開2004-101389号公報
【特許文献６】特開2013-193990号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bartzokis, G. et al. In vivo evaluation of brain iron in Alzheimer's disease and normal subjects using MRI. Biol. Psychiatry 35, 480-487 (1994)
【非特許文献２】Cuajungco, M.P. et al. Metal chelation as a potential therapy for Alzheimer's disease. Ann. N. E. Acad. Sci. 920: 292-304 (2000)
【非特許文献３】Dexter, D. T. et al. Increased Nigral Iron Content and Alterations in Other Metal Ions Occurring in Brain in Parkinson's Disease. J. Neurochem. 52, 1830-1836 (1989)
【非特許文献４】Toyokuni, S. Elucidation of Asbestos-induced Carcinogenesis and Its Application to Prevention, Diagnosis and Treatment in Relation to Iron. Japan. J. of Lung Cancer 49(4), 362-367 (2009)
【非特許文献５】Nishina S, Korenaga M, Hidaka I, Shinozaki A, Sakai A, Gondo T, Tabuchi M, Kishi F, Hino K. Hepatitis C virus protein and iron overload induce hepatic steatosis through the unfolded protein response in mice. Liver Int. 30(5) 683-92 (2010)
【非特許文献６】Kikuchi, K., Komatsu, K. & Nagano, T. Zinc sensing for cellular application. Current opinion in chemical biology 8, 182-91 (2004)
【非特許文献７】Que, E.L., Domaille, D.W. & Chang, C.J. Metals in neurobiology: probing their chemistry and biology with molecular imaging. Chemical reviews 108, 1517-49 (2008)
【非特許文献８】Fakih, S. et al. Targeting the lysosome: fluorescent iron(III) chelators to selectively monitor endosomal/lysosomal labile iron pools. Journal of medicinal chemistry 51, 4539-52 (2008)
【非特許文献９】Rauen, U. et al. Assessment of Chelatable Mitochondrial Iron by Using Mitochondrion-Selective Fluorescent Iron Indicators with Different Iron-Binding Affinities. ChemBioChem 8, 341-352 (2007)
【非特許文献１０】日本ケミカルバイオロジー学会第８回年会（２０１３年）学会要旨集１５９頁
【非特許文献１１】第７回バイオ関連化学シンポジウム（２０１３年）学会要旨集、101頁
【非特許文献１２】日本化学会第９３春季年会（２０１３年）学会要旨集、発表番号２Ｅ３−４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の特許文献６には、鉄（II）イオンの検知感度や選択性に優れた蛍光プローブが報告されている。しかし、鉄（II）イオンに対する応答速度が必ずしも充分ではなく、臨床検査薬、検出キット、自動測定装置等への展開を考えた場合、より迅速な蛍光応答性能をもつ鉄（II）イオン検出剤が望まれていた。【００１１】
本発明は、特許文献６に記載された蛍光プローブと比べて、鉄（II）イオンを高感度かつ迅速に蛍光検出できる鉄（II）イオン検出剤及びそれを用いた検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、特許文献６に記載された鉄（II）イオン選択的蛍光プローブに、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のアミノ酢酸系キレート化合物を共存させることで、鉄（II）イオン蛍光プローブの蛍光応答の応答速度及び蛍光応答のコントラストが大きく増大することを見出した。つまり、特許文献６に記載された蛍光プローブの鉄（II）イオンに対する蛍光応答をさらに高感度化できることを見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は、下記の鉄（II）イオン検出剤を提供する。【００１４】
項１．一般式（Ｉ）：【００１５】
【化１】
0006612131.tif 000002
【００１６】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ５は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２（式中、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはＲ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよい。）で示される基であり、
Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
環Ａは置換されていてもよい芳香環又は置換されていてもよいヘテロ芳香環であり、
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１（Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基を示す。）であり、
ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、
ｍ及びｎは同一又は異なって、０又は１であり、
ｐは１又は２である。）
で表される化合物（蛍光プローブ）、並びに３個以上の配位座（coordinating positions）を有する化合物を組み合わせてなる鉄（II）イオン検出剤。【００１７】
項２．前記３個以上の配位座を有する化合物が、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基及び含窒素ヘテロ芳香環からなる群より選ばれる同一又は異なる３個以上の配位座を有する化合物である項１に記載の鉄（II）イオン検出剤。【００１８】
項３．前記３個以上の配位座を有する化合物が、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス−２−アミノフェニル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ホスホノブタン三カルボン酸（ＰＢＴＣ）、トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＡ）、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）、ｏ−アミノフェノール−Ｎ，Ｎ，Ｏ−三酢酸（ＡＰＴＲＡ）、ポルフィリン若しくはその誘導体、フタロシアニン若しくはその誘導体、１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＣＹＣＬＥＮ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ＣＹＣＬＡＭ）、又はこれらの塩類である項１又は２に記載の鉄（II）イオン検出剤。【００１９】
項４．一般式（Ｉ）において、環Ａが、式（ａ）：【００２０】
【化２】
0006612131.tif 000003
【００２１】
（式中、Ｒ８は、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、スルホ基又は活性エステル基であり、ｑは０、１、２又は３であり、ｑが２又は３のとき、Ｒ８は同一又は異なっていてもよい。）
で表される環である項１〜３のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。【００２２】
項５．一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にモルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、或いはＲ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ２及びＲ４が結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、或いはＲ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、項１〜４のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。【００２３】
項６．一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、項１〜５のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。【００２４】
項７．一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）と３個以上の配位座を有する化合物とが混合されてなる、項１〜６のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。【００２５】
項８．一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）を含む容器、及び３個以上の配位座を有する化合物を含む容器を有してなるキットの形態である、項１〜６のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤。【００２６】
項９．鉄（II）イオンの検出方法であって、
（１）鉄（II）イオンを含む検体と、項１〜８のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤とを混合する工程、及び
（２）得られた混合物の蛍光スペクトルを測定する工程
を含むことを特徴とする検出方法。【００２７】
項１０．鉄（II）イオンの検出感度を増強する方法であって、
（１）鉄（II）イオンを含む検体と、項１〜８のいずれかに記載の鉄（II）イオン検出剤とを混合する工程、及び
（２）得られた混合物の蛍光スペクトルを測定する工程
を含むことを特徴とする検出感度の増強方法。【００２８】
項１１．鉄（II）イオン検出剤の製造方法であって、一般式（Ｉ）：【００２９】
【化３】
0006612131.tif 000004
【００３０】
（式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよく、
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
Ｒ５は水素原子、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２（式中、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、低級アルキル基、カルボキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基であり、或いはＲ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成していてもよい。）で示される基であり、
Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子又は低級アルキル基であり、
Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、
環Ａは置換されていてもよい芳香環又は置換されていてもよいヘテロ芳香環であり、
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１（Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基を示す。）であり、
ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、
ｍ及びｎは同一又は異なって、０又は１であり、
ｐは１又は２である。）
で表される化合物（蛍光プローブ）と、３個以上の配位座を有する化合物とを混合することを特徴とする製造方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の鉄（II）イオン検出剤は、一般式（I）で表される化合物（蛍光プローブ）と３個以上の配位座を有する化合物を含んでおり、蛍光プローブのみと比べて、鉄(II)イオンを高感度かつ迅速に蛍光検出できる。【００３２】
具体的には、当該蛍光プローブは、鉄(II)イオンと選択的に反応してＮ−オキシドが還元されアミノ基に変換されて強い蛍光を発する。特許文献６（特開2013-193990号公報）によれば、当該蛍光プローブは、２，２’−ビピリジル等のキレート剤で安定化された不活性な鉄(II)イオンとは反応しないと認識されていた（特許文献６の段落［００２４］、［００９８］、図７等）。しかし、今回予想に反して、蛍光プローブに３個以上の配位座を有する化合物を添加することにより、鉄(II)イオンを更に高感度かつ迅速に蛍光検出できることが分かった。例えば、当該蛍光プローブだけを用いて１時間かかっていた測定時間を、５分から１０分程度に大幅に短縮することができる（例えば、試験例１、図２の（e）及び（f）を参照）。【００３３】
本発明の鉄（II）イオン検出方法は、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）やエチレンジアミン四酢酸等（ＥＤＴＡ）等の安価かつ入手容易な３個以上の配位座を有する化合物を当該蛍光プローブと混合して使用するだけでよく、極めて簡便な操作で実施することができる。そのため汎用性も高い。【００３４】
本発明の鉄（II）イオン検出剤は、試験管内及び細胞内における鉄(II)イオンの増減を蛍光顕微鏡等で選択的かつ定量的に、しかも迅速且つ高感度に検出できるため、鉄の関与が疑われる疾患の病態解明研究において極めて有用である。また、医療現場、医薬品開発等の迅速な試験が必要となる場面においても極めて有用である。【００３５】
また、材料としての鉄の腐食開始期では鉄（II）イオンが鍵となっていることから、船舶等における鉄の腐食機構の解明研究にも用いることができる。そのため、本発明の鉄（II）イオン検出剤は、医学のみならず材料科学分野にも貢献し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】上段：RhoNox-1とヒドロキシメチルローダミン（HMRhoNox-M、HMRhoNox-E）及びヒドロキシメチルロドール（HMFluNox-M、HMFluNox-E）を蛍光団としたN-オキシド型鉄(II)イオン蛍光プローブ分子の構造を示す。下段：今回用いた多座配位子化合物の構造と名称を示す。
【図２】(a)〜（d)は、RhoNox-1に対して硫酸鉄(II)を各種多座配位子化合物の存在下で加えた時の蛍光スペクトル変化を示す。(a) 多座配位子化合物無し、(b) NTA、(c) EDTA、(d) TPA。点線は多座配位子化合物無しの場合の１時間後の蛍光強度を示す。(e) 各スペクトル変化の575 nmにおける蛍光強度の時間変化を示す。灰色丸：多座配位子化合物無し、黒四角：NTA、黒三角：EDTA、黒丸：TPA。(f) 上記(e)の0秒から900秒までの部分を拡大したもの。測定条件：2 μM RhoNox-1、20 μM FeSO4、200 μM多座配位子化合物、50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)中で測定した。励起波長：540 nm。
【図３】(a)及び（b)は、HMRhoNox-Mに対して硫酸鉄(II)をNTAの存在下で加えた時の蛍光スペクトル変化を示す。(a)NTA無し、(b) NTA。 (c) 各スペクトル変化の575 nmにおける蛍光強度の時間変化を示す。灰色丸：NTA無し、黒丸：NTA。(d) (c)の0秒から900秒までの部分を拡大したもの。測定条件：2 μM HMRhoNox-M、20 μM FeSO4、200 μMNTA、50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)中で測定した。励起波長：550 nm。(e)及び（f)は、HMFluNox-Mに対して硫酸鉄(II)をNTAの存在下で加えた時の蛍光スペクトル変化を示す。(e)NTA無し、(f) NTA。 (g) 各スペクトル変化の535 nmにおける蛍光強度の時間変化を示す。灰色丸：NTA無し、黒丸：NTA。(h) (g)の0秒から900秒までの部分を拡大したもの。測定条件：2 μM HMFluNox-M、20 μM FeSO4、200 μMNTA、50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)中で測定した。励起波長：520 nm。
【図４】(a)は、FluNox-1の構造を示す。(b)〜（e)は、FluNox-1に対して各種金属化合物を各種多座配位子化合物の存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。 (b) IDA、(c) NTA、(d) EDTA、(e) TPA。励起波長：490 nm、測定波長：510〜570 nm。
【図５】(a)は、FluNox-2の構造を示す。(b)〜（e)は、FluNox-2に対して各種金属化合物を各種多座配位子化合物の存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。(b) IDA、(c) NTA、(d) EDTA、(e) TPA。励起波長：490 nm、測定波長：510〜570 nm。
【図６】(a)は、RhoNox-1の構造を示す。(b)〜（e)は、RhoNox-1に対して各種金属化合物を各種多座配位子化合物の存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。(b) IDA、(c) NTA、(d) EDTA、(e) TPA。励起波長：525 nm、測定波長：580〜640 nm。
【図７】(a)は、RhoNox-2の構造を示す。(b)〜（e)は、RhoNox-2に対して各種金属化合物を各種多座配位子化合物の存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。(b) IDA、(c) NTA、(d) EDTA、(e) TPA。励起波長：525 nm、測定波長：580〜640 nm。
【図８】(a)は、RhoNox-3の構造を示す。(b)〜（e)は、RhoNox-3に対して各種金属化合物を各種多座配位子化合物の存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。(b) IDA、(c) NTA、(d) EDTA、(e) TPA。励起波長：525 nm、測定波長：580〜640 nm。
【図９】(a)は、Si-RhoNox-1の構造を示す。(b)は、Si-RhoNox-1に対して各種金属化合物をTPAの存在下で加えてから30分後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合（図中、「no metal」）の蛍光強度を「１」とした、相対値である。励起波長：625 nm、測定波長：660〜720 nm。
【図１０】(a)〜（f)は、蛍光プローブに対して硫酸鉄(II)を各種多座配位子化合物の存在下で加えてからの、蛍光強度の時間変化を分光蛍光光度計で測定した結果を示す。縦軸は、蛍光プローブのみを加えた場合の蛍光強度を「１」とした、相対値である。 (a) FluNox-1、(b) FluNox-2、(c) RhoNox-1、(d) RhoNox-2、(e) RhoNox-3、(f) Si-RhoNox-1。灰色丸：多座配位子化合物無し、黒三角：IDA、黒四角：NTA、黒丸：EDTA、黒逆三角：TPA。励起波長：500 nm (FluNox-1及びFluNox-2)、530 nm (RhoNox-1、RhoNox-2、及びRhoNox-3)、630 nm (SiRhoNox-1)。測定波長：530 nm (FluNox-1及びFluNox-2)、570 nm (RhoNox-1、RhoNox-2、及びRhoNox-3)、665 nm (SiRhoNox-1)。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明の鉄（II）イオン検出剤
本発明の鉄（II）イオン検出剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）、及び３個以上の配位座を有する化合物（以下、「多座配位子化合物」と表記する場合がある）を組み合わせてなる。
【００３８】
（１）一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）
一般式（Ｉ）で表される化合物はＮ−オキシド部位を有し、この部位が鉄（II）イオンと選択的に反応してアミノ基に変換される。得られたアミノ基含有化合物は強い蛍光を発することから、一般式（Ｉ）で表される化合物は、鉄(II)イオンを高選択的かつ高感度で検出できる蛍光特性を有しているため、鉄(II)イオン選択的な蛍光プローブとして有用である。
【００３９】
なお、本発明において、検出対象である鉄(II)イオンは、遊離の鉄(II)イオンのみならず、鉄(II)イオンと配位子様化合物（クエン酸、アミノ酸、プロトポルフィリンIX等）と配位した化合物も包含される。
【００４０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ６及びＲ７で示される「低級アルキル基」としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基のＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、より好ましくは、メチル基又はエチル基である。
【００４１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５１及びＲ５２で示される「カルボキシ低級アルキル基」としては、上記「低級アルキル基」の１個以上の水素原子がカルボキシル基で置換された基であり、例えば、１〜３個（特に、１個）のカルボキシル基を有する直鎖又は分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、具体的には、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、３−カルボキシプロピル基、４−カルボキシブチル基等が挙げられる。好ましくは２−カルボキシエチル基である。
【００４２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５１及びＲ５２で示される「アリール基」としては、例えば、単環又は二環のアリール基が挙げられ、具体的には、フェニル基、トルイル基、キシリル基、ナフチル基等が挙げられる。好ましくはフェニル基である。
【００４３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５１及びＲ５２で示される「アリール基低級アルキル基」としては、上記「低級アルキル基」の１個以上の水素原子がアリール基で置換された基であり、例えば、ベンジル基、フェネチル基等のフェニルＣ１〜６アルキル基が挙げられる。好ましくはベンジル基である。
【００４４】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７で示される「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００４５】
Ｒ５で示される「低級アルコキシ基」としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基が挙げられ、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシル基オキシ、イソヘキシルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基等が挙げられる。
【００４６】
Ｒ５で示される「保護されていてもよい水酸基」における保護基としては、例えば、メトキシメチル基（ＭＯＭ）、２−テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、アセチル基（Ａｃ）等が挙げられる。
【００４７】
Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環を形成するとは、好ましくは、式：
【００４８】
【化４】
0006612131.tif 000005
【００４９】
（式中、Ｒ１又はＲ２は前記に同じ。）
で示される基が、式：
【００５０】
【化５】
0006612131.tif 000006
【００５１】
（式中、ＸはＯ、ＣＨ２、又はＮＲ１２（Ｒ１２は水素又はアルキルカルボニル基を示す。）である。）
で示される基であることを意味する。
【００５２】
Ｒ１２で示される「アルキルカルボニル基」としては、例えば、Ｃ２〜Ｃ６アルキルカルボニル基が挙げられ、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。好ましくは、アセチル基、プロピオニル基等のＣ２〜Ｃ３アルキルカルボニル基であり、より好ましくは、アセチル基である。
【００５３】
Ｒ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基（-CH2CH2CH2-；以下同じ）を形成する、及び／又は、Ｒ２及びＲ４が互いに結合してトリメチレン基を形成するとは、式：
【００５４】
【化６】
0006612131.tif 000007
【００５５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記に同じ。）
で示される基が、式：
【００５６】
【化７】
0006612131.tif 000008
【００５７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記に同じ。）
で示される基であることを意味する。
【００５８】
Ｒ５が式（Ａ）で示される基の場合、Ｒ５１及びＲ５２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成するとは、好ましくは、式：
【００５９】
【化８】
0006612131.tif 000009
【００６０】
（式中、Ｒ５１又はＲ５２は前記に同じ。）
で示される基が、式：
【００６１】
【化９】
0006612131.tif 000010
【００６２】
（式中、ＹはＯ、ＣＨ２、又はＮＲ１３（Ｒ１３は水素又はアルキルカルボニル基を示す。）である。）
で示される基であることを意味する。
【００６３】
Ｒ１３で示される「アルキルカルボニル基」としては、例えば、Ｃ２〜Ｃ６アルキルカルボニル基が挙げられ、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。好ましくは、アセチル基、プロピオニル基等のＣ２〜Ｃ３アルキルカルボニル基であり、より好ましくは、アセチル基である。
【００６４】
Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成する、及び／又は、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成するとは、式：
【００６５】
【化１０】
0006612131.tif 000011
【００６６】
（式中、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ６、Ｒ７及びｎは前記に同じ。）
で示される基が、式：
【００６７】
【化１１】
0006612131.tif 000012
【００６８】
（式中、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ６及びＲ７は前記に同じ。）
で示される基であることを意味する。
【００６９】
環Ａで示される置換されていてもよい芳香環における、芳香環としては、単環、二環又は三環式の芳香環が挙げられ、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環等が挙げられる。芳香環の置換基としては、例えば、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、スルホ基又は活性エステル基等が挙げられる。これらの置換基は芳香環上に１〜３個有していてもよい。
【００７０】
環Ａで示される置換されていてもよいヘテロ芳香環における、ヘテロ芳香環としては、単環、二環又は三環式の酸素、窒素及び硫黄からなる群より選ばれる１〜３個の原子を含むヘテロ芳香環が挙げられる。例えば、チオフェン環、フラン環、ピロール環、イミダゾール環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、インドール環、キノリン環、イソキノリン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キノキサリン環、キナゾリン環、アクリジン環等が挙げられる。ヘテロ芳香環の置換基としては、例えば、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、スルホ基又は活性エステル基等が挙げられる。これらの置換基はヘテロ芳香環上に１〜３個有していてもよい。
【００７１】
環Ａとして好ましくは、式（ａ）：
【００７２】
【化１２】
0006612131.tif 000013
【００７３】
（式中、Ｒ８は、保護されていてもよい水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、スルホ基又は活性エステル基であり、ｑは０、１、２又は３であり、ｑが２又は３のとき、Ｒ８は同一又は異なっていてもよい。）
で表される環である。
【００７４】
環Ａ上の置換基（Ｒ８を含む）である「保護されていてもよい水酸基」における保護基としては、例えば、メトキシメチル基（ＭＯＭ）、２−テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、アセチル基（Ａｃ）等が挙げられる。
【００７５】
環Ａ上の置換基（Ｒ８を含む）である「低級アルコキシ基」としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１〜Ｃ６（特にＣ１〜Ｃ３）アルコキシ基が挙げられ、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基等が挙げられる。
【００７６】
環Ａ上の置換基（Ｒ８を含む）である「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００７７】
環Ａ上の置換基（Ｒ８を含む）である「低級アルコキシカルボニル基」としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基等の直鎖又は分枝鎖の（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基）カルボニル基が挙げられる。
【００７８】
環Ａ上の置換基（Ｒ８を含む）である活性エステル基としては、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が反応性の高い活性エステルに変換された基であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いた活性エステル基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＳｕ：Ｓｕはコハク酸イミド基）、カルボン酸を混合酸無水物にした基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ：ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基）、ＣＤＩを用いたイミダゾライド基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｉｍ：Ｉｍは１−イミダゾリル基）等が挙げられる。
【００７９】
式（ａ）において、ｑは０、１又は２が好ましく、０又は１がより好ましく、０が特に好ましい。ｑが１のとき、Ｒ８が結合するベンゼン環の結合位置として好ましくは、
【００８０】
【化１３】
0006612131.tif 000014
【００８１】
（式中、Ｒ８、Ｗ及びＺは前記に同じ。）
が挙げられる。  ＷはＣＨ２、ＣＯ又はＳ（Ｏ）ｐであり、好ましくはＣＨ２又はＣＯであり、より好ましくはＣＯである。
【００８２】
ＺはＯ又はＮＲ９（Ｒ９は水素原子又はアルキル基を示す。）であり、好ましくはＯである。
【００８３】
Ｒ９で示されるアルキル基としては、例えば、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
【００８４】
ｍは０又は１であり、好ましくは０である。
【００８５】
ｎは０又は１であり、好ましくは０である。
【００８６】
ｐは１又は２であり、好ましくは２である。
【００８７】
一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましいものとしては、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が互いに結合して隣接する窒素原子と共にモルホリン環、又は置換されていてもよいピペラジン環（好ましくは置換されていてもよいピペラジン環、より好ましくはアルキルカルボニル基で置換されているピペラジン環）を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、或いはＲ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ２及びＲ４が結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、或いはＲ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、化合物が挙げられる。
【００８８】
一般式（Ｉ）で表される化合物のより好ましいものとしては、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、或いはＲ１及びＲ３が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ２及びＲ４が結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、或いはＲ５１及びＲ６が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、Ｒ５２及びＲ７が互いに結合してトリメチレン基を形成していてもよく、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、化合物が挙げられる。
【００８９】
本発明の化合物のよりさらに好ましいものとしては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ５が保護されていてもよい水酸基又は式（Ａ）：−ＮＲ５１Ｒ５２で示される基であり、Ｒ５が式（Ａ）で示される基のとき、Ｒ５１及びＲ５２は同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ６及びＲ７が水素原子であり、Ｒ８が水素原子であり、ｑが０であり、ＷがＣＨ２又はＣＯであり、ＺがＯであり、ｍが０であり、ｎが０である、化合物が挙げられる。
【００９０】
本発明の化合物の特に好ましいものとしては、一般式（ＩＡ）：
【００９１】
【化１４】
0006612131.tif 000015
【００９２】
（式中、Ｗ’はＣＨ２又はＣＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ６、Ｒ７、及びＶは前記に同じ。）
で表される化合物が挙げられる。
【００９３】
ＶはＯ又はＳｉＲ１０Ｒ１１であり、好ましくはＯである。Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって水素原子又は低級アルキル基であり、好ましくは低級アルキル基である。Ｒ１０又はＲ１１で低級アルキル基としては、例えば直鎖又は分枝のＣ１〜Ｃ４のアルキル基であり、好ましくはＣ１〜２のアルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
【００９４】
このうち特に好ましいものとしては、ＶがＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５１及びＲ５２が同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基（さらにメチル基又はエチル基、特にエチル基）であり、Ｒ３、Ｒ２、Ｒ６及びＲ７が水素原子である化合物が挙げられる。
【００９５】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、基Ｒ５が電子供与性の窒素原子や酸素原子等を有する場合（例えば、−ＮＲ５１Ｒ５２、水酸基）、その電子供与により、キサンテン骨格のベンゼン環の共役系が移動して環が開環した化合物となる場合もある。例えば、基Ｒ５が−ＮＲ５１Ｒ５２の場合には、開環して一般式（Ｉａ）：
【００９６】
【化１５】
0006612131.tif 000016
【００９７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｗ、Ｚ、環Ａ、ｍ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物となる。別の例として、基Ｒ５が水酸基の場合には、開環して一般式（Ｉｂ）：
【００９８】
【化１６】
0006612131.tif 000017
【００９９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｗ、Ｚ、環Ａ、ｍ及びｎは前記に同じ。）
で表わされる化合物となる。
一般式（Ｉ）で表される化合物及び／又は一般式（Ｉａ）で表される化合物を媒体（溶媒）に溶解した場合には、通常、一般式（Ｉ）で表される化合物及び一般式（Ｉａ）で表される化合物の平衡状態にあり、その媒体（溶媒）の極性やｐＨ等によりその平衡の偏りが変動し得る。そのため、本明細書では、一般式（Ｉ）で表される化合物及び一般式（Ｉａ）で表される化合物をまとめて、一般式（Ｉ）で表される化合物として表記することとする。
【０１００】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば次のようにして製造することができる。
【０１０１】
【化１７】
0006612131.tif 000018
【０１０２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｗ、Ｚ、環Ａ、ｍ及びｎは前記に同じ。）
一般式（ＩＩ）で表される化合物は容易に入手できるか、或いは公知の方法に従い又は準じて製造することができる。
【０１０３】
一般式（ＩＩ）で表される化合物のうちＷがＣ＝Ｏである化合物は、市販されているか、或いは、例えば、Bioorg. Med. Chem. 17 (2009) 6952-6958、Org. Lett. 12 (2007) 496-499、Org. Lett. 13 (2010), 6354-6357、Tetrahedron 61 (2005) 3097-3105等の記載に従い又は準じて製造することができる。
【０１０４】
また、一般式（ＩＩ）で表される化合物のうちＷがＣＨ２である化合物は、例えば、Organic Letters 2010, 12, 3219−21、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12960−3等の記載に従い又は準じて製造することができる。
【０１０５】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、一般式（ＩＩ）で表される化合物を酸化反応（窒素原子のＮ−オキサイド化反応）に付すことにより製造することができる。例えば、特許文献６の記載に従い又は準じて製造することができる。
【０１０６】
原料である一般式（ＩＩ）で表される化合物は、基Ｒ１及びＲ２が結合する窒素原子からの電子供与により、キサンテン骨格のベンゼン環の共役系が移動して環が開環した、一般式（ＩＩａ）：
【０１０７】
【化１８】
0006612131.tif 000019
【０１０８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｗ、Ｚ、環Ａ、ｍ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物となる場合もある。この化合物は、通常、強い蛍光を発する。一般式（ＩＩ）で表される化合物及び／又は一般式（ＩＩａ）で表される化合物を媒体（溶媒）に溶解した場合には、通常、一般式（ＩＩ）で表される化合物及び一般式（ＩＩａ）で表される化合物の平衡状態にあり、その媒体（溶媒）の極性やｐＨ等によりその平衡の偏りが変動し得る。そのため、本明細書では、一般式（ＩＩ）で表される化合物及び一般式（ＩＩａ）で表される化合物をまとめて、一般式（ＩＩ）で表される化合物として表記することとする。
（２）３個以上の配位座を有する化合物
３個以上の配位座を有する化合物（多座配位子化合物）としては、例えば、アミノ基、水酸基、エーテル基（−Ｏ−）、カルボキシル基、ホスホン酸基及び含窒素ヘテロ芳香環からなる群より選ばれる同一又は異なる３個以上の配位座を有する化合物が挙げられる。
【０１０９】
ここで、アミノ基とは、ｓｐ３混成軌道を有する窒素原子を含む部分構造を意味する。
【０１１０】
また、含窒素ヘテロ芳香環とは、窒素原子を１〜３個含むヘテロ芳香環（例えば、ピリジン環、イミダゾール環、ピロール環等）の部分構造を意味する。当該含窒素ヘテロ芳香環は置換基（例えば、フェニル、トルイル、キシリル、メシチル等のアリール基；メチル、エチル等のアルキル基等）を１〜３個有していてもよい。
【０１１１】
上記配位座のうち、アミノ基、カルボキシル基、ホスホン酸基及び含窒素ヘテロ芳香環（ピリジン環、ピロール環等）が好ましく、さらにアミノ基、カルボキシル基及びピリジジン環がより好ましく、アミノ基、及びピリジン環がさらに好ましい。化合物中の配位座の数は、通常、３〜１６個、好ましくは４〜１２個、より好ましくは４〜１０個、さらに好ましくは４〜５個である。
【０１１２】
３個以上の配位座を有する化合物が窒素原子を含む場合、その数は５個以内であることが好ましい。
【０１１３】
３個以上の配位座を有する化合物がピリジン環を含む場合、その数は３個以内であることが好ましい。
【０１１４】
この３個以上の配位座を有する化合物は速やかに鉄（II）イオンと錯体を形成し、その錯体が式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）と反応してＮ−オキシドの還元反応（脱酸素化反応）を促進していると考えられる。この反応機構を考慮すると、３個以上の配位座を有する化合物としては、鉄（II）イオンと錯形成した時に、蛍光プローブが反応できる空配位サイトができるものが好適である。
【０１１５】
３個以上の配位座を有する化合物として具体的には、例えば、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス−２−アミノフェニル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ｏ−アミノフェノール−Ｎ，Ｎ，Ｏ−三酢酸（ＡＰＴＲＡ）等のアミノカルボン酸化合物；エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ホスホノブタン三カルボン酸（ＰＢＴＣ）等のホスホン酸化合物；トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＡ）、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）、等のピリジルメチルアミン化合物；１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＣＹＣＬＥＮ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ＣＹＣＬＡＭ）等の環状ポリアミン化合物；ポルフィリン若しくはその誘導体、プロトポルフィリンＩＸ若しくはその誘導体、フタロシアニン若しくはその誘導体、環状ポリピロール誘導体；又はこれらの塩類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはピリジルメチルアミン化合物、アミノカルボン酸化合物等が挙げられ、より好ましくはピリジルメチルアミン化合物が挙げられる。
【０１１６】
３個以上の配位座を有する化合物の塩類としては、例えば、アルカリ金属塩（リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩等）、アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩等が挙げられる。特に、カルボン酸を含む化合物の場合、アルカリ金属塩（ナトリウム塩）が好ましい。
【０１１７】
（３）鉄（II）イオン検出剤
本発明の鉄（II）イオン検出剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）と３個以上の配位座を有する化合物（多座配位子化合物）を組み合わせてなるものである。
【０１１８】
本発明の鉄（II）イオン検出剤は、上記の２成分を含むものであれば特に限定はなく、種々の形態が含まれる。例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）と３個以上の配位座を有する化合物（多座配位子化合物）が混合されてなる形態（例えば、組成物、配合剤等）、或いは、両者が別々の容器に収容されている形態（例えば、キットの形態）が挙げられる。混合形態の場合には、固体（粉末、結晶等）状態、媒体（例えば、水、緩衝液等）に溶解又は分散した状態のいずれの場合も包含する。両者が別々の容器に収容された形態の場合にも、それぞれが固体状態、媒体（例えば、水、緩衝液等）に溶解又は分散した状態のいずれであってもよい。
【０１１９】
２．鉄（II）イオン検出方法
本発明の鉄(II)イオンを測定（又は検出）する方法は、（１）鉄（II）イオンを含む検体と、本発明の鉄（II）イオン検出剤とを混合する工程、及び（２）得られた混合物の蛍光スペクトルを測定する工程を含むことを特徴とする。具体的には、適当な緩衝液中で鉄(II)イオンを含む検体及び本発明の鉄（II）イオン検出剤を混合しインキュベートした後、この混合物に励起光を当てて蛍光を測定することで鉄(II)イオンを測定できる。
【０１２０】
緩衝液としては特に限定はなく、例えば、HEPES緩衝液（pH 7.4）等の公知のものを用いることができる。
【０１２１】
緩衝液中の式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）の濃度は特に限定はなく、通常、０．１μＭ〜１ｍＭ程度、好ましくは１μＭ〜０．１ｍＭ程度、より好ましくは５μＭ〜２０μＭ程度である。また、緩衝液中の３個以上の配位座を有する化合物（多座配位子化合物）の濃度も特に限定はなく、通常、０．１μＭ〜１０ｍＭ程度、好ましくは１μＭ〜１ｍＭ程度、より好ましくは１０μＭ〜５００μＭ程度である。
【０１２２】
緩衝液中において、３個以上の配位座を有する化合物（多座配位子化合物）は、式（Ｉ）で表される化合物（蛍光プローブ）１モルに対して、通常、１〜１０００モル程度、好ましくは１０〜１００モル程度である。
【０１２３】
インキュベーションの温度及び時間は、特に限定されず、例えば、０〜４０℃程度で１０分〜２時間程度である。検体が細胞又は組織である場合には、その培養に適した温度（例えば、ヒト由来の細胞又は組織であれば３７℃）であることが好ましい。
【０１２４】
蛍光の測定は、市販の蛍光計を用いることができる。細胞内の鉄（II）イオンの動態を調べる場合には、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡等の公知の方法を用いて観察することができる。
【０１２５】
本発明の方法を採用することで、特許文献６に記載された蛍光プローブと比べて、鉄（II）イオンを高感度かつ迅速に蛍光検出することができる。
【実施例】
【０１２６】
本発明を、実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１２７】
下記実施例において、化合物の精製にはシリカゲルカラムクロマトグラフィー又はアルミナクロマトグラフィーを使用し、化合物の同定には薄層クロマトグラフィー（TLC）、ESI-MS（JEOL JMS-T100TD）、1H-NMR, 13C-NMR（JEOL ECA-500 spectrometer）を使用した。【０１２８】
実施例１
３’−（ジエチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−アミンオキサイド（以下、「RhoNox-1」と表記する）を、特許文献６に従って合成した。【０１２９】
実施例２
（１）３'−（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−アミンオキシド（以下、「HMRhoNox-M」又は「RhoNox-2」と表記する）を次のようにして合成した。【０１３０】
前駆化合物であるＮ３’，Ｎ３’，Ｎ６’，Ｎ６’−テトラメチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−３'，６'−ジアミンを、Organic Letters 2010, 12, 3219−21、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12960−3等に従い合成した。Ｎ３’，Ｎ３’，Ｎ６’，Ｎ６’−テトラメチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−３'，６'−ジアミン90 mg（0.24 mmol）を酢酸エチル18 mLに溶解し、撹拌しながら0 ℃に冷却した。ここにメタクロロ過安息香酸83 mg（0.48 mmol）をゆっくり加え、室温に戻し、１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝50：1から20：１）にて精製し、HMRhoNox-Mを無色の粉末として得た（64 mg、収率71%）。【０１３１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.91 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 8.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.26 (m, 1H), 7.04 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 6.9Hz, 1H), 6.46 (m, 2H), 5.30 (dd, J = 20.0 Hz, 12.6 Hz, 2H), 3.58 (d, J = 4.0 Hz, 6H), 2.97 (s, 6H).
13C NMR ( MHz, CDCl3) δ: 154.5, 151.5, 151.3, 150.9, 144.5, 139.1, 129.9, 129.2, 128.4, 128.2, 128.2, 125.7, 123.8, 120.7, 114.2, 111.7, 109.2, 109.0, 98.5, 83.3, 72.1, 63.2, 63.1, 40.3.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C24H25N2O3+: 389.1860, found 389.1871.【０１３２】
（２）３'−（ジエチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−アミンオキシド（以下、「HMRhoNox-E」と表記する）を次のようにして合成した。【０１３３】
前駆化合物であるＮ３’，Ｎ３’，Ｎ６’，Ｎ６’−テトラエチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−３'，６'−ジアミンはOrganic Letters 2010, 12, 3219−21、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12960−3等に従い合成した。Ｎ３’，Ｎ３’，Ｎ６’，Ｎ６’−テトラエチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−３'，６'−ジアミン267 mg（0.62 mmol）を酢酸エチル20 mLに溶解し、撹拌しながら0 ℃に冷却した。ここにメタクロロ過安息香酸214 mg（1.24 mmol）をゆっくり加え、室温に戻し、１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝20：1から10：１）にて精製し、HMRhoNox-Eを淡紫色の粉末として得た（145 mg、収率53%）。【０１３４】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ : 7.78 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.03 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.42 (m, 4H), 5.29 (dd, J = 16.4 Hz, 12.6 Hz, 2H), 3.70 (m, 4H), 3.35 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.16 (q, J = 6.6 Hz, 12H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ : 151.7, 151.0, 149.0, 148.8, 144.4, 139.2, 129.6, 129.4, 128.3, 128.1, 125.5, 123.8, 120.6, 115.5, 111.1, 110.7, 108.5, 97.5, 83.3, 71.9, 66.9, 44.4, 12.5, 8.3.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C28H33N2O3+: 445.2486, found 445.2501.【０１３５】
（３）３'−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−アミンオキシド（以下、「HMFluNox-M」と表記する）を次のようにして合成した。【０１３６】
前駆化合物である３'−（ジメチルアミノ）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−オールはOrganic Letters 2010, 12, 3219−21、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12960−3等に従い合成した。３'−（ジメチルアミノ）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−オール34 mg（0.098 mmol）を酢酸エチル4 mLに溶解し、撹拌しながら0 ℃に冷却した。ここにメタクロロ過安息香酸34 mg（0.20 mmol）をゆっくり加え、室温に戻し、１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1から8：１）にて精製し、HMFluNox-Mを無色の粉末として得た（21 mg、収率58%）。【０１３７】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 8.47 (s, 1H), 7.28 (s, 2H), 7.18-7.17 (m, 1H), 7.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.93(s, 2H), 6.83(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H) 5.24, (m, 2H), 3.52 (s, 6H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 159.8, 153.7, 151.5, 151.0, 144.4, 139.0, 129.9, 129.4, 128.4, 128.2, 126.1, 124.0, 120.6, 113.7, 113.4, 112.8, 110.5, 103.1, 83.3, 72.1, 63.1, 62.2.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C22H20NO4+ : 362.1387, found 362.1389.【０１３８】
（４）３'−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチル−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−アミンオキシド（以下、「HMFluNox-E」と表記する）を次のようにして合成した。【０１３９】
前駆化合物である３'−（ジエチルアミノ）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−オールはOrganic Letters 2010, 12, 3219−21、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12960−3等に従い合成した。３'−（ジエチルアミノ）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９'−キサンテン］−６'−オール100 mg（0.27 mmol）を酢酸エチル10 mLに溶解し、撹拌しながら0 °Cに冷却した。ここにメタクロロ過安息香酸93 mg（0.54 mmol）をゆっくり加え、室温に戻し、１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝20：1から10：１）にて精製し、HMFluNox-Eを無色の粉末として得た（102 mg、収率97%）。【０１４０】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.72 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.33 (m, 3H), 7.19 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.55 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H), 3.76 (m, 2H), 3.56 (m, 1H), 1.01 (m, 6H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 158.8, 151.1, 150.1, 148.3, 144.6, 138.7, 130.0, 129.8, 128.3, 126.0, 123.2, 120.8, 115.8, 115.2, 112.2, 110.8, 101.7, 83.3, 72.2, 66.4, 29.3, 22.2, 13.0, 7.22.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C24H24NO4+: 390.1700, found 390.1695.【０１４１】
（５）４−（３’−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）モルフォリン ４−オキサイド（以下、「FluNox-1」と表記する）を次のようにして合成した。【０１４２】
前駆化合物である、３’−ヒドロキシ−６’−モルフォリノ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３−オンを、Organic Letters, 2011, 13, 6354−6357等に従い合成した。３’−ヒドロキシ−６’−モルフォリノ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３−オン100 mg（0.23 mmol）をジメチルホルムアミド10 mLに溶解し、0 ℃で10分間撹拌した。ここにメタクロロ過安息香酸47 mg（0.27 mmol）をゆっくり加え、室温に戻し、３時間撹拌し、それから追加のメタクロロ過安息香酸47 mg（0.27 mmol）をゆっくり加えた。３時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝7：1）にて精製し、FluNox-1を得た（37 mg、収率63%）。【０１４３】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ：8.10 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 7.80-7.71 (m, 2H), 7.67 (dd, 1H, J = 9.2, 2.3 Hz), 7.22 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 7.00 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.65-6.58 (m, 2H), 4.47 (t, 2H, J = 11.2 Hz), 4.18-1.12 (m, 2H), 3.94 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 3.23 (m, 2H).
13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ：169.7, 160.1, 155.2, 115.3, 113.0, 109.9, 109.2, 102.4, 82.4, 66.9, 61.6.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C24H20NO6+: 418.1285, found: 418.1304.【０１４４】
（６）４−アセチル−１−（３’−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）−ピペラジン １−オキサイド（以下、「FluNox-2」と表記する）を次のようにして合成した。【０１４５】
前駆化合物である３’−ヒドロキシ−６’−（ピペラジン−１−イル）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３−オンを、Chemical Communications, 2013, 49, 10474−10476等に従い合成した。３’−ヒドロキシ−６’−（ピペラジン−１−イル）−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３−オン78 mg（0.16 mmol）をピリジン2 mLに溶解し、そこへ無水酢酸148μL（1.6 mmol）を0 ℃でゆっくり加えた。室温に戻して１時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝100：0から100：1）にて精製し、３’−（４−アセチルピペラジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル アセテートを淡黄色の粉末として得た（68 mg、収率91%）。【０１４６】
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.02 (dd, J = 7.6 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.81−6.76 (m, 2H), 6.69 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 8.9 Hz, 2.2 Hz, 1H), 3.75−3.72 (m, 2H), 3.60−3.58 (m, 2H), 3.25−3.20 (m, 4H), 2.32 (s, 3H), 2.12 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ：169.2, 168.9, 168.8, 152.7, 152.4, 152.0, 151.8, 151.7, 135.0, 129.7, 129.0, 128.7, 126.4, 124.9, 123.9, 117.2, 116.6, 112.2, 110.1, 109.2, 102.2, 82.5, 48.1, 47.9, 45.6, 40.8, 21.2, 21.0.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C28H24N2O6Na+: 507.1527, found 507.1554.【０１４７】
続いて、得られた３’−（４−アセチルピペラジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル アセテート90 mg（0.19 mmol）をジクロロメタン5 mLに溶解し、そこへメタクロロ過安息香酸48 mg（0.28 mmol）を0 ℃でゆっくり加えた。室温に戻して５時間撹拌後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1）にて精製し、１−（３’−アセトキシ−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）−４−アセチルピペリジン １−オキシドを無色の粉末として得た（26 mg、収率28%）。【０１４８】
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.25 (d, J =  2.0 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.72−7.66 (m, 2H), 7.61 (dd, J = 8.7 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.18 (t, J =  Hz, 1H), 7.14 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 6.96 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 6.85 (s, 2H), 4.67 (d, J = 13.7 Hz, 2H), 4.43 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 3.86−3.73 (m, 4H), 3.21 (t, J = 10.6 Hz, 4H), 2.33 (s, 3H), 2.18 (s, 3H).
HRMS (ESI+): m/z calculated for C28H24N2O7Na+: 523.1476, found 523.1483.【０１４９】
続いて、得られた無色の粉末18 mg（0.036 mmol）をメタノール1.5 mLに溶解し、そこへ炭酸カリウム15 mg（0.11 mmol）の水溶液0.5 mLを加えた。室温で30分間撹拌後、1 M Hclaqを加えて中和した。得られた中和物からジクロロメタンで抽出した（5 mL×5）。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1から7：1）にて精製し、FluNox-2を無色の粉末として得た（14 mg、収率82%）。【０１５０】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 8.11 (dd, J = 5.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.66−7.63 (m, 1H), 7.20 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.12−4.10 (m, 2H), 4.00−3.98 (m, 2H), 3.64−3.59 (m, 1H), 3.27−3.26 (m, 2H), 2.16 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ：170.5, 169.6, 160.2, 155.3, 152.8, 152.1, 151.7, 135.6, 130.2, 129.3, 128.9, 126.2, 124.8, 123.8, 120.8, 115.4, 112.9, 109.9, 109.2, 102.3, 66.6, 41.1, 36.3, 19.7.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C26H23N2O6+: 459.1551, found 459.1553.【０１５１】
（７）４−アセチル−１−（３’−（４−アセチルピペラジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）ピペラジン １−オキサイド（以下、「RhoNox-3」と表記する）を次のようにして合成した。【０１５２】
前駆化合物であるジ−ターシャリー−ブチル ４，４’−（３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］３’，６’−ジイル）ビス（ピペラジン−１−カルボキシラート）をOrg. Lett. 2011, 13, 6354−6357等に従い合成した。ジ−ターシャリー−ブチル ４，４’−（３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］３’，６’−ジイル）ビス（ピペラジン−１−カルボキシラート）188 mg（0.028 mmol）をメタノール3 mLに溶解し、そこへ2 M HCl / メタノール溶液3 mLを0 ℃で滴下した。室温に戻して10時間撹拌後、減圧留去し、残渣（黒紫色の粉末）を得た。この残渣を乾燥ジクロロメタン5 mLに溶解し、そこへトリエチルアミン196 μL（1.41 mmol）及びピリジン68 μL（0.84 mmol）を加えた。0 ℃に冷却し、塩化アセチル60 μL（0.28 mmol）のジクロロメタン溶液（3 mL）を加えた。室温に戻して窒素雰囲気下で３時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液30 mLでクエンチし、ジクロロメタンで抽出した（30 mL×5）。有機層を水50 mL及び塩水50 mLで洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた紫色の粉末をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝20：1から10：1）にて精製し、１，１’−（４，４’−（３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（ピペラジン−４，１−ジイル）ジエタノンを紫色の粉末として得た（142 mg、収率92%）。【０１５３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.65- 7.60 (m, 2H), 7.17 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.69 (m, 2H), 6.67 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 2H), 3.77- 3.76 (m, 4H), 3.66- 3.61 (m, 4H), 3.26- 3.22 (m, 8H), 2.15 (s, 6H).
13C NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 171.8, 171.7, 154.6, 152.1, 135.9, 131.0, 130.1, 129.6, 126.4, 125.8, 113.5, 111.3, 102.7, 46.9, 42.3, 21.2. 
HRMS (ESI+): m/z calculated for C32H32N4NaO5+: 575.2265, found 575.2288.【０１５４】
続いて、得られた１，１’−（４，４’−（３−オキソ−３Ｈスピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（ピペラジン−４，１−ジイル）ジエタノン133 mg（0.24 mmol）を酢酸エチル4 mL及びジクロロメタン2 mLに溶解し、そこへメタクロロ過安息香酸46 mg（0.27 mmol）を0 ℃でゆっくり加えた。室温に戻して１時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝20：1から8：1）にて精製し、RhoNox-3を白色の粉末として得た（60 mg、収率44%）。【０１５５】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 8.12 (dd, J = 5.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.65− 7.62 (m, 1H), 7.20 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.15− 4.12 (m, 2H), 4.02− 3.96 (m, 2H), 3.72− 3.61 (m, 5H), 3.32− 3.25 (m, 6H), 2.18 (s, 3H), 2.13 (s, 1H).
13C NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 170.5, 170.4, 169.7, 155.3, 153.1, 152.8, 152.1, 151.9, 135.5, 130.2, 129.3, 128.4, 126.3, 124.7, 123.8, 120.8, 115.3, 112.6, 109.9, 108.4, 101.8, 82.3, 66.6, 45.7, 41.1, 41.0, 36.3, 19.8, 19.7.
HRMS (ESI+): m/z calculated for C32H33N4O6+: 569.2395, found 569.2390.【０１５６】
（８）３−（ジエチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−５，５−ジメチル−３’−オキソ−３’Ｈ，５Ｈスピロ［ジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０，１’−イソベンゾフラン］−７−アミン オキサイド（以下、「Si-RhoNox-1」と表記する）を次のようにして合成した。【０１５７】
前駆化合物である３，７−ビス（ジエチルアミノ）−５，５−ジメチル−３’Ｈ，５Ｈスピロ［ジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０，１’−イソベンゾフラン］−３’−オン（Si-Rhodamine）をChemical Communications 2014, 50, 14374−14377等に従い合成した。Si-Rhodamine 300 mg（0.6 mmol）を、炭酸水素ナトリウム 104 mg（1.2 mmol）の酢酸エチル溶液15 mLに溶解し、そこへメタクロロ過安息香酸182 mg（0.74 mmol）を0 ℃でゆっくり加えた。室温まで温めてから３０分間撹拌した。セライトパッドで濾過することにより不溶物を除去し、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝15：1）にて精製し、Si-RhoNox-1を橙色の粉末として得た（172 mg、収率55%）。【０１５８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.31 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.72 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 7.61 (t, 1H, J = 7.5 Hz), 7.41 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.51 (dd, 1H, J = 9.2, 2.9 Hz), 3.66 − 3.62 (m, 4H), 3.37 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.16 − 1.12 (m, 12H), 0.68 (d, 6H, J = 14.0 Hz) ; 
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: −2.12, 8.01, 8.03, 12.13. 18.11, 43.92, 66.43, 66.51, 76.89, 90.45, 112.06, 115.59, 121.67, 124.48, 125.77, 126.53, 126.64, 127.34, 128.14, 128.92, 133.53, 136.47, 138.43, 145.18, 146.49, 152.51, 169.76; 
HRMS (ESI+): m/z calculated for C30H37N2O3Si+: 501.2568, found 501.2571.【０１５９】
試験例１（RhoNox-1及び多座配位子化合物）
本実験ではRhoNox-1を蛍光プローブとして用いた。ここではすべて1 mMのRhoNox-1のジメチルスルホキシド溶液を調製し、これを希望の最終濃度となるよう緩衝溶液に加えて使用した。【０１６０】
50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)に最終濃度が2 μMとなるようRhoNox-1を添加し、さらに最終濃度が200 μMとなるよう各種多座配位子化合物（NTA、EDTA及びTPA）を添加した。ここに最終濃度20 μMとなるよう 硫酸鉄(II)を添加し、室温で撹拌しながら5分おきに蛍光測定を実施した。励起波長：540 nm。【０１６１】
図２の(a)から(d)に示すように、鉄(II)イオンのみの添加の場合は1時間で約30倍の蛍光強度の増大であったのに対して、鉄(II)イオン＋NTAでは100倍、鉄(II)イオン＋TPAでは200倍、鉄(II)イオン＋EDTAでは80倍の蛍光増大を示すことが分かった。また、図２の(e)及び(f)から、575 nmにおける蛍光強度の時間変化において特に、初期に顕著な差が見られ、添加して5分程度で一気に多座配位子化合物無しの1時間後の蛍光強度とほぼ同等の蛍光を示すことが分かった。以上のことから、これら多座配位子化合物の添加により鉄(II)イオンを高感度で検出できることが確認された。【０１６２】
試験例２（HMRhoNox-M及びNTA）
本実験ではHMRhoNox-Mを蛍光プローブとして用いた。ここではすべて1 mMのHMRhoNox-Mのジメチルスルホキシド溶液を調製し、これを希望の最終濃度となるよう緩衝溶液に加えて使用した。【０１６３】
50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)に最終濃度が2 μMとなるようHMRhoNox-Mを添加し、さらに最終濃度が200 μMとなるよう多座配位子化合物NTAを添加した。ここに最終濃度20 μMとなるよう 硫酸鉄(II)を添加し、室温で撹拌しながら5分おきに蛍光測定を実施した。励起波長：520 nm。【０１６４】
図３の(a)から(d)に示すように、ヒドロキシメチル型のHMRhoNox-MについてNTA存在下で蛍光測定したところ、鉄(II)イオンを高感度で検出できることが確認された。【０１６５】
試験例３（HMFluNox-M及びNTA）
本実験ではHMFluNox-Mを蛍光プローブとして用いた。ここではすべて1 mMのHMFluNox-Mのジメチルスルホキシド溶液を調製し、これを希望の最終濃度となるよう緩衝溶液に加えて使用した。【０１６６】
50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)に最終濃度が2 μMとなるようHMFluNox-Mを添加し、さらに最終濃度が200 μMとなるよう多座配位子化合物NTAを添加した。ここに最終濃度20 μMとなるよう 硫酸鉄(II)を添加し、室温で撹拌しながら5分おきに蛍光測定を実施した。【０１６７】
図３の(e)から(h)に示すように、ヒドロキシメチル型のHMFluNox-MについてNTA存在下で蛍光測定したところ、鉄(II)イオンを高感度で検出できることが確認された。【０１６８】
以上の実験事実から、一般式（Ｉ）で表される蛍光プローブに各種多座配位子化合物を共存させることで、鉄(II)イオンへの応答性について、応答速度及び蛍光強度増強比ともに大幅に向上することが分かった。よって、本発明の鉄(II)イオン検出剤は、各種検体に含まれる鉄(II)イオンを高選択的、高感度かつ迅速に検出することができる。【０１６９】
試験例４（鉄(II)イオンの選択的検出）
本実験では、蛍光プローブとしてFluNox-1、FluNox-2、RhoNox-1、RhoNox-2、RhoNox-3、又はSi-RhoNox-1を、多座配位子化合物としてIDA、NTA、EDTA、又はTPAを、金属化合物としてMnSO4、CoSO4、NiSO4、FeSO4、FeCl3、CuSO4、ZnSO4、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、又は[Cu(MeCN)4PF6]を用いた。まず、以下のストック溶液を調製した。【０１７０】
＜金属化合物ストック溶液＞
[Cu(MeCN)4PF6]以外の遷移金属化合物：1 mM水溶液
アルカリ金属又はアルカリ土類金属化合物：100 mM水溶液
[Cu(MeCN)4PF6]：1 mMアセトニトリル溶液【０１７１】
＜蛍光プローブストック溶液＞
1 mMジメチルホルムアミド溶液【０１７２】
＜多座配位子化合物ストック溶液＞
IDA（ナトリウム塩）：100 mM水溶液
NTA（ナトリウム塩）：100 mM水溶液
EDTA（ナトリウム塩）：100 mM水溶液
TPA：100 mMジメチルスルホキシド溶液。【０１７３】
これらのストック溶液を希望の最終濃度となるよう緩衝溶液に加えて使用した。具体的には次の通りである。50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4)に、最終濃度が2 μMとなるように蛍光プローブを添加し、さらに最終濃度が200 μMとなるように多座配位子化合物を添加した。得られた溶液100 μLを96ウェルプレートのそれぞれのウェルに入れた。ここに、最終濃度20 μMとなるように遷移金属化合物を添加し、或いは最終濃度2 mMとなるようにアルカリ金属又はアルカリ土類金属化合物を添加した。室温で撹拌しながら30分間インキュベートした後、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（GloMax、プロメガ社製）で測定した。測定には各蛍光プローブの波長に対応したフィルターセットを用い、蛍光強度を測定した。具体的にはFluNox-1およびFluNox-2は励起波長に490 nmを用い、510 nmから 570 nmの蛍光強度を測定した。RhoNox-1、RhoNox-2およびRhoNox-3は励起波長に525 nmを用い、580 nmから 640 nmの蛍光強度を測定した。Si-RhoNox-1は励起波長に625 nmを用い、660 nmから 720 nmの蛍光強度を測定した。測定結果を図４〜９に示す。【０１７４】
試験例５
本実験では、蛍光プローブとしてFluNox-1、FluNox-2、RhoNox-1、RhoNox-2、RhoNox-3、又はSi-RhoNox-1を、多座配位子化合物としてIDA、NTA、EDTA、又はTPAを、金属化合物としてFeSO4を用いた。ストック溶液は試験例４と同様に調製した。【０１７５】
ストック溶液を希望の最終濃度となるよう緩衝溶液に加えて使用した。具体的には次の通りである。50 mM HEPES緩衝溶液(pH 7.4) 3 mLに、最終濃度が2 μMとなるように蛍光プローブを添加し、さらに最終濃度が200 μMとなるように多座配位子化合物を添加した。ここに、最終濃度20 μMとなるようにFeSO4を添加した。添加から、0秒経過、10秒経過、以降は300秒経過毎に、60分経過まで、蛍光スペクトラムを分光蛍光光度計（FP-6600、JASCO社製）で測定した。励起波長は、500 nm (FluNox-1及びFluNox-2)、530 nm (RhoNox-1、RhoNox-2、及びRhoNox-3)、630 nm (SiRhoNox-1)とした。530 nm (FluNox-1及びFluNox-2)、570 nm (RhoNox-1、RhoNox-2、及びRhoNox-3)、665 nm (SiRhoNox-1)の発光強度を測定した。測定結果を図１０に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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