(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通タンパク質：
OD-(L)-TD-ED
(式中、
ODは、イソロイシンジッパー及びT4フィブリチンの三量体化ドメインからなる群より選択されるオリゴマー化ドメインであり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは、CD154に由来するか又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来する膜貫通ドメインであり、
EDはCD154の細胞外ドメインである)
を5'から3'へコードするが、CD154の細胞内領域をコードする配列もCD40の細胞内領域をコードする配列も含まないヌクレオチド。
【請求項２】
CD154の細胞外ドメインをコードするヌクレオチドであるEDが、
i)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846、
ii)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846であるが、当該分子の切断を回避するように配列番号１の残基397〜420の１又は２以上の核酸が欠失するか又は別の核酸と置換したもの、
iii)配列番号12、すなわち配列番号３の残基127〜846、
iv)配列番号13、すなわち配列番号４の残基127〜844、
v)配列番号14、すなわち配列番号５の残基127〜844、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項３】
細胞内CD154領域をコードするヌクレオチドが配列番号16のヌクレオチド配列である、請求項１又は２に記載のヌクレオチド。
【請求項４】
膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの部分であるTDが、CD154、ヒトOX40リガンド又はヒトCD70をコードするヌクレオチドのいずれかに由来し、
i)配列番号17、すなわち配列番号１の残基127〜198、
ii)配列番号20、すなわちヒトOX40リガンドの膜貫通ドメイン、又は
iii)配列番号22、すなわちヒトCD70の膜貫通ドメイン
と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドであるTDが、配列番号17、配列番号20又は配列番号22と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有する、請求項４に記載のヌクレオチド。
【請求項６】
膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドであるTDが配列番号17を有する、請求項５に記載のヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチドであるODが、配列番号23、すなわち配列番号１の残基10〜108を有するイソロイシンジッパーである、請求項６に記載のヌクレオチド。
【請求項８】
コザック配列を更に含んでなる請求項１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項９】
コザック配列が配列番号１の残基１〜９に相当する、請求項８に記載のヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも90％の配列同一性を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも95％又は98％又は100％の配列同一性を有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、免疫モジュレーターをコードするヌクレオチドとの組合せ。
【請求項１３】
免疫モジュレーターをコードするヌクレオチドが4-1BBリガンド遺伝子であるか又は抗IL6R単鎖可変フラグメント(scFv)の遺伝子である、請求項１２に記載の組合せ。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、シグナル伝達経路モジュレーター又はシグナル伝達経路ブロッカーとの組合せ。
【請求項１５】
配列番号６又は配列番号８と少なくとも95％、98％又は100％の配列同一性を有する請求項１３に記載の組合せ。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【請求項１７】
次の構造：
OD-(L)-TD-ED
(式中、
ODは、イソロイシンジッパー及びT4フィブリチンの三量体化ドメインからなる群より選択されるオリゴマー化ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
EDはCD154の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列である)
を含んでなるが、該アミノ酸配列はCD154の細胞内領域もCD40の細胞内領域も含まない、タンパク質。
【請求項１８】
CD154の細胞外ドメインが
i)配列番号24、
ii)配列番号24であるが、当該分子の切断を回避するように配列番号１の残基397〜420のヌクレオチドに相当するアミノ酸配列MQKGDQNPの１又は２以上のアミノ酸が欠失するか又は別のアミノ酸と置換したもの、
iii)配列番号12のヌクレオチド、すなわち配列番号３の残基127〜846に相当するアミノ酸残基、
iv)配列番号13のヌクレオチド、すなわち配列番号４の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
v)配列番号14のヌクレオチド、すなわち配列番号５の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択される、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
細胞内CD154領域が配列番号15のアミノ酸配列に相当する、請求項１７又は１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
EDが配列番号24に対して少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
膜貫通ドメインであるTDがCD154の膜貫通ドメインに由来するか又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列が配列番号18に対して少なくとも90％、95％、98％又は100％の配列同一性を有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
配列番号18の残基14及び/又は16が欠失するか又は別のアミノ酸と置換した請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号２と少なくとも90％、95％、98％又は100％の配列同一性を有する請求項１７〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドを含んでなるビヒクル。
【請求項２６】
プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、細胞、人工細胞及び人工ビヒクルから選択される請求項２５に記載のビヒクル。
【請求項２７】
ウイルスの形態である請求項２５又は２６に記載のビヒクル。
【請求項２８】
ウイルスがアデノウイルス血清型5/35ウイルスである請求項２７に記載のビヒクル。
【請求項２９】
アデノウイルス5/35型ウイルスが、E1A遺伝子の上流の少なくとも１つのE2Fプロモーター領域/結合部位、E1A Δ24欠失、E3 Δ6.7K及び/又はΔgp19K欠失、L5遺伝子領域の後に挿入された導入遺伝子カセットであってpCMV及び導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを有し、E1A遺伝子の上流にSp1部位を有していても有していなくてもよい、請求項２８に記載のビヒクル。
【請求項３０】
配列番号１に規定されるTMZ-CD154ヌクレオチドを含んでなる請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項３１】
4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R単鎖可変フラグメント(scFv)の遺伝子を更に含んでなる請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のビヒクル。
【請求項３２】
請求項２５〜３１のいずれか１項に記載のビヒクルの２又は３以上の組合せ。
【請求項３３】
第１のビヒクルが請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のものであり、第２のビヒクルが免疫モジュレーター、例えば4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R単鎖可変フラグメント(scFv)の遺伝子を含んでなる、２つのビヒクルの組合せ。
【請求項３４】
配列番号１に規定される膜結合型CD40リガンドのヒト導入遺伝子と完全長4-1BBLとを有する導入遺伝子カセットであって、CMVプロモーターにより駆動される導入遺伝子カセットを含む改変アデノウイルス血清型5/35。
【請求項３５】
i)E1A遺伝子の上流にE2Fプロモーター部位を有し、
ii)E1A遺伝子の上流にSp-1部位を含み、
iii)E1A Δ24欠失、
iii)E3 Δ6.7K/gp19K、及び
iv)pCMV及び導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットがL5遺伝子領域の後に挿入されている
請求項３４に記載のアデノウイルス血清型5/35ウイルス。
【請求項３６】
医薬に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヌクレオチド若しくはヌクレオチドの組合せ、又は請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のビヒクル若しくはビヒクルの組合せ、又は請求項３４若しくは３５に記載の改変アデノウイルス。
【請求項３７】
免疫関連疾患、ガン、感染性疾患、リンパ球増殖性疾患、炎症、慢性炎症、自己免疫疾患及びアレルギーから選択される疾患の治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヌクレオチド若しくはヌクレオチドの組合せ、又は請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のビヒクル若しくはビヒクルの組合せ、又は請求項３４若しくは３５に記載の改変アデノウイルス。
【請求項３８】
医薬に使用するための、抗ガン剤、免疫モジュレーター、抗ウイルス剤、化学療法剤、サイトカイン、サイトカインレセプター、インターロイキン、増殖因子、増殖因子レセプター又は抗体から選択される医薬物質との組合せでの請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヌクレオチド若しくはヌクレオチドの組合せ、又は請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のビヒクル若しくはビヒクルの組合せ、又は請求項３４若しくは３５に記載の改変アデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規化合物TMZ-CD154及び該新規分子TMZ-CD154を使用する疾患治療法に関する。具体的には、TMZ-CD154は、免疫関連疾患(例えばガン及び感染性疾患)の患者における免疫応答を改変するために使用する。本発明はまた、活性化した細胞を治療目的又は診断目的に用いる前に、細胞をインビトロでTMZ-CD154を用いて活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近数十年間、遺伝子導入技術は、例えばガンの治療で広範に研究されている。2012年に、グリベラ(Glybera)は臨床使用が認可された最初の遺伝子療法薬となった。グリベラは、アデノ関連ウイルス血清型１(AAV1)ウイルスベクターに組み込まれたヒトリポタンパク質リパーゼ(LPL)遺伝子のインタクトなコピーの送達によってリポタンパク質リパーゼ欠損を補うものである。
遺伝子療法の目的は、機能的/治療用遺伝子を標的細胞(例えば腫瘍細胞)に導入することである。
WO 2012/038607は、細胞においてCD40Lを産生し、対象者の腫瘍特異的免疫応答及びアポトーシスを増大させる方法を記載する。CD40L(CD40リガンド、CD154又はgp39とも指称)は、腫瘍壊死因子ファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。
【０００３】
WO 02/36769はCD40L-CD40キメラを記載する。本発明のヌクレオチド配列とは対照的に、このキメラは、別のタンパク質の細胞内シグナル伝達領域を含む一方、本発明は細胞内シグナル伝達能を欠く。
Blaserら(Clin．Immunology 2005，117，231-237)及びHsuら(Journal of Biological Chemistry，1997，272，911-915)は天然に存在するCD40Lを記載し、Blaserらは、或る変異が機能不全タンパク質に至ることを証明している。Hsuらは、天然のCD40Lが切断されて細胞外ドメインを遊離し得ることを記載するが、遊離したCD40Lは三量体として安定ではない。
WO 94/10308及びWO 2007/120368は、形質膜に保持されず細胞から遊離するか、又は患者での全身的使用のための組換え産生分子として使用する可溶性多量体CD40L分子に言及している。これら可溶性分子と本発明のTMZ-CD154との比較により、TMZ-CD154は、おそらくは形質膜に保持されることから、より強い活性化シグナルを与えることが示される。
【０００４】
CD154は、CD40レセプターへの結合に際して三量体化し得る膜貫通分子である。結合は、CD154ポジティブ細胞及びCD40ポジティブ細胞の相互刺激を導く。CD154はまた、切断されて分泌され得るが、そのときには可溶性CD154(sCD154)単量体として作用する。膜結合型CD154又はsCD154は、樹状細胞(DC)を活性化して効率的な抗原提示細胞とし、エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞)を伴ういわゆるTh1型免疫応答を活性化する。Th1型免疫応答は腫瘍免疫において重要な役割を演じ、よって能動的な腫瘍免疫療法の要である。CD154は、十分には検証されていない手段により、CD40ポジティブ腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができる。しかし、それがTRAF3-JNK経路依存性のカスパーゼ-９活性化に起因すると主張する報告もある一方、カスパーゼ-８活性化を誘導し得る死リガンドのオートクリン又はパラクリン産生と関係付けている研究もある(Loskog及びEliopoulos，Semin Immunol 2009)。CD40は尾部に死ドメインを有しておらず、多くの説明の余地が残る。アポトーシスの誘導は、CD154が膜結合型である(これは、結合に際するこのレセプター/リガンド系の三量体化に起因し得る)場合に、より強力であることが示されている。CD154は、ガン患者が参加する臨床試験で可溶性分子として用いられているが、全身曝露は、CD154が例えばアデノウイルス血清型５遺伝子導入により腫瘍転移に局所送達される場合には認知されない肝酵素の増大を生じ得る(Vonderheide JCO，2001；Malmstromら CCR 2010)。完全長CD154も腫瘍溶解ウイルスで用いられており(Fernandesら CCR 2009；Gomesら CCR 2009；Teradaら GT 2006；Diaconuら CR 2012)、患者での安全性が試験されている(Pesonenら CR 2012)。遺伝子操作によりＴ細胞で発現するCD154分子は、リンパ球増殖性疾患をもたらすことがある(Brownら Nat Med 1998)。よって、完全長CD154遺伝子を導入するベクターは、細胞に感染する能力を有し、予想外の不都合な毒性を引き起こし得る様式で反応し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、アポトーシス及び腫瘍抑制に関する有益な性質は維持するが、望ましくない不都合な毒性は有しないCD154誘導体を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な説明
本発明者は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、膜結合型の三量体化CD154誘導体を開発した。この誘導体は、対応する単量体CD154より強力な免疫モジュレーターであり、内部CD154シグナル伝達を生じず、全身性のCD154媒介毒性を生じない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ａ)TMZ-CD154分子を示す概略図である。Ｂ)近接する標的細胞上のCD40レセプターと相互作用しているか又はしていない細胞形質膜(PM)上の三量体化TMZ-CD154分子を示す概略図である。
【図２】293細胞に、TMZ-CD154を含むプラスミド又は空の模擬プラスミドをトランスフェクトした。Ａ)２日間の培養後、細胞を溶解させ、タンパク質懸濁物をゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより分析してTMZ-CD154を検出した。サンプルを２群に分けた。ゲル電気泳動の前に、一方の群は還元性サンプル緩衝液中で煮沸し(R)、他方の群は煮沸せず、非還元性サンプル緩衝液と混合した。Ｂ)２日間の培養後、一部の細胞をフローサイトメトリにより分析して、TMZ-CD154発現を証明した。Ｃ)TMZ-CD154若しくは野生型CD154を発現するAd5/35ウイルス又は導入遺伝子なしの(模擬)Ad5/35ウイルスで形質導入したPanc01、BxPc3、MiaPaca2及びPaCa3細胞の上清を、ELISAを用いて上清への可溶性CD154の放出について分析した。Ｄ)アデノウイルス血清型5/35を用いてＴ細胞にTMZ-CD154分子を形質導入した。コントロールは形質導入せず、空(模擬)ウイルスでも形質導入しなかった。細胞はIL2と共に又はIL2なしで48時間培養した。
【図３】樹状細胞(Ａ)及びMiaPaCa2(Ｂ)細胞に、100MOIのAd5/35-TMZ-CD154ウイルス(赤線)若しくは模擬ウイルス(緑線)で形質導入したか又は形質導入しないままとした(灰色線)。DCには、他の２つの形態のAd5/35-TMZ-CD154ウイルス(4-1BBL(橙色線)又はscFv aIL6R(青線)との組合せ)で形質導入した。24時間後、細胞をTMZ-CD154発現についてフローサイトメトリにより分析した。非形質導入又は模擬形質導入の細胞はTMZ-CD154を発現しなかった一方、Ad5/35-TMZ-CD154形質導入細胞は強力な発現を示し、その発現は腫瘍細胞でDCより高かった。
【図４】膵臓ガン腫瘍細胞株に、条件付き複製コンピテント(腫瘍溶解性)のAd5/35-TMZ-CD154ウイルス(CRC)、模擬腫瘍溶解性ウイルス(CRC)若しくは複製欠損模擬ウイルス(RD)で形質導入したか又は形質導入しないままとした。形質導入細胞を96ウェルプレートに播種し、MTS生存能アッセイを用いて生存に関して分析して、腫瘍溶解によるＡ)Panc01、Ｂ)MiaPaCa2又はＣ)BxPC3の細胞死レベルを測定した。Ｄ)同じアッセイをリンパ腫細胞株(Karpas 422)に対して行った。
【図５】TMZ-CD154、可溶性三量体化(st)CD154(CD40L)、多量体可溶性CD154(CD40L)若しくは模擬のプラスミドをトランスフェクトしたか又はトランスフェクトしないままとした293細胞と、未成熟樹状細胞を共培養した。２日間の共培養後、細胞をCD83発現についてフローサイトメトリーにより分析した(Ａ)。上清を採集し、IL-12発現についてELISAを用いて分析した(Ｂ)。
【図６−１】未成熟樹状細胞に、Ad5/35-TMZ-CD154ウイルス若しくは模擬ウイルスで形質導入するか又は形質導入しないままとした(DCのみ)。２日間の培養後、細胞をフローサイトメトリによりHLA-DR、CD86、CD70及びCD83発現について分析した(Ａ)。
【図６−２】上清を採集して、IL-12発現についてELISAを用いて分析した(Ｂ)。
【図７】CMV+ドナーのCD14-単核細胞を、Ad5/35-TMZ-CD154ウイルスを形質導入してCMV pp65ペプチドでパルスした樹状細胞と共に11日間培養した。11日目に、細胞を、CD3+CD8+四量体+CMV特異的Ｔ細胞の存在についてフローサイトメトリにより分析した。培養前にはＴ細胞の僅か0.5％がCMV特異的であったが、培養後には60％を超えるＴ細胞がCMV特異的であった。
【図８】ウマの単核細胞に、ヒトCD154遺伝子を含むか又は含まないアデノウイルスベクターで形質導入し、該細胞を培養した。１週間後、リンパ球集団は模擬形質導入細胞(Ａ、左)と比べて拡大した(Ａ、右)。上清を採集し、抗ウマMCP-1 ELISAを用いて分析した。模擬ウイルスはMCP-1を活性化するが、CD154ウイルスは発現向上をもたらす。
【図９】Panc01細胞株を機能的免疫系を欠くNu/Nuマウスの皮下で増殖させた。腫瘍に、TMZ-CD154を発現する１×10e9 VPの腫瘍溶解性アデノウイルス又はPBSを注射した。ウイルス注射から経時的に％腫瘍成長を示す。
【図１０】293細胞に、TMZ-CD154を4-1BBL(Ａ、Ｂ)又はaIL6R scFv(Ｃ、Ｄ)との組合せで含むプラスミドをトランスフェクトし、該細胞をCD154(Ａ、Ｃ)又は4-1BBL(Ｂ)の発現についてフローサイトメトリにより分析した。aIL6R scFvをmykタグと共に発現する細胞の上清を、ELISAにより分析してaIL6Rの発現を測定した(Ｄ)。
【図１１】DCを、TMZ-CD154を4-1BBLとの組合せで含むAd5/35ウイルスで形質導入したか、形質導入しないままとしたか又は空の模擬ウイルスで形質導入した。２日間の共培養後、細胞をTMZ-CD154及び4-1BBLの発現についてフローサイトメトリにより分析した。
【図１２】ヒト未成熟樹状細胞を、TMZ-CD154を単独で又は4-1BBL若しくはaIL6R scFvとの組合せで含むAd5/35ウイルスで形質導入したか、形質導入しないままとしたか又は空の模擬ウイルスで形質導入した。２日間の共培養後、細胞をCD83発現についてフローサイトメトリにより分析した。
【図１３】ヒト未成熟樹状細胞を、TMZ-CD154を単独で又は4-1BBL若しくはaIL6R scFvとの組合せで含むAd5/35ウイルスで形質導入したか、形質導入しないままとしたか又は空の模擬ウイルスで形質導入した。２日間の共培養後、細胞をCD70発現についてフローサイトメトリにより分析した。
【図１４】ヒト未成熟樹状細胞を、TMZ-CD154を単独で又は4-1BBL若しくはaIL6R scFvとの組合せで含むAd5/35ウイルスを形質導入したか又は形質導入しないままとした。２日間の共培養後、上清をルミネックス(luminex)により分析してIFNg(Ａ)、IL12(Ｂ)、TNFa(Ｃ)及びIL21(Ｄ)のレベルを群間比較した。
【図１５】CMVポジティブ供血者の単核細胞から、CD14-細胞を、CMV pp65ペプチドでパルスした形質導入樹状細胞と共に拡大することにより、CMV特異的Ｔ細胞を拡大させた。樹状細胞を、模擬ウイルス、或いはTMZ-CD154を単独で又は4-1BBL若しくはaIL6Rとの組合せで含むAd5/35ウイルスで形質導入した。11日目に、細胞を採集し、四量体ポジティブ(CMV特異的)Ｔ細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリを用いて分析し、拡大前の値と比較した(Ａ)。異なる群での拡大細胞の総数を(Ｂ)に示す。TMZ-CD154及び4-1BBLの両方を含むAd5/35ウイルス(LOAd703)もまた、培養でNK細胞を拡大させることができた(Ｃ)。
【図１６−１】膵臓細胞株PaCa3を単独で又は100μMゲムシタビン(Ｇ)と共に培養した。PaCa3細胞を、TMZ-CD154を単独で又は4-1BBリガンド若しくはaIL6R scFvとの組合せで発現するAd5/35ウイルスで形質導入した。最後に、形質導入細胞を100μMゲムシタビンと共に培養した。細胞を96ウェルプレートに播種し、MTS生存能アッセイを用いて生存について分析して、腫瘍溶解、ゲムシタビン又は腫瘍溶解とゲムシタビンとの組合せによる細胞死レベルを測定した。＊はｐ＜0.05の差を示す。Ｂ)Panc02マウス膵臓腫瘍細胞をC57BL6マウスで増殖させ、TMZ-CD154＋4-1BBLを有する腫瘍溶解性アデノウイルスで週２回で６回の処置±ゲムシタビン(25mg/kg)で週１回で３回の処置を施した。腫瘍成長を示す。＊はｐ＜0.05の差を示す。
【図１６−２】Ｃ)Panc01ヒト膵臓細胞を上記(Ａ)のように形質導入し、パクリタキセル(２μM)と共に又はパクリタキセルなしで培養した。＊はｐ＜0.05の差を示す。
【図１７】増殖中のMB49膀胱ガン腫瘍細胞を有するC57BL/6マウスを、マウスCD154遺伝子を有するアデノウイルスベクターの１回の腫瘍内注入で処置した。24時間後、免疫組織化学用(CD11b+GR-1+細胞を共焦点顕微鏡観察により検出)(Ａ)及びフローサイトメトリ用(単一細胞懸濁物への機械的分離後にCD3+CD107a+腫瘍浸潤Ｔ細胞を検出)(Ｂ)に生検を採取した。
【図１８】ヒト内皮細胞(HUVEC)を、TMZ-CD154を単独で又は4-1BBL若しくはaIL6Rと共に含むAd5/35ウイルス、又は導入遺伝子を含まないウイルス(模擬)で形質導入したか、或いは形質導入しないままとした。48時間の培養後、細胞をフローサイトメトリにより、リンパ球の付着及び炎症組織への内皮細胞を介する血管外漏出に重要であるＥ-セレクチン及びICAM-Iの発現について分析した。
【図１９】腫瘍溶解は腫瘍細胞に限定される。腫瘍細胞(Panc01を図示)及び健常コントロール外分泌膵臓細胞を、LOAd703、導入遺伝子を欠くLOAd(-)ウイルス及びE1/E3欠失により複製能を欠くAd5/35模擬ウイルスで形質導入したか又は形質導入しないままとした。細胞を96-ウェルプレートにおいて２つ組で培養し、MTSアッセイを用いて生存能について分析した。生存能が低ければ吸光度も低い。
【図２０】血液ループモデルにおける毒性試験。５人の健常ドナーの血液をLOAd703に対する反応性について試験した。血液を、補体に影響しないヘパリン処理ループ中で４時間循環させた(２ml/ループ)。アッセイ前及び高用量(１×10e8 VP)又は低用量(１×10e7 VP)のLOAd703の添加４時間後に血漿サンプルを採取した。ネガティブコントロールとしてPBSをループに添加し、抗CD28抗体をポジティブコントロールとして用いた。AdCD40Lは、臨床使用されている、LOAd703に類似のウイルスであり、これを高用量(１×10e8 VP)で試験した。
【図２１】C57BL6マウスの皮下で増殖中のB16腫瘍をAdCD40Lで処置した後、B16腫瘍を認識するpmel Ｔ細胞を注入した。次いで、腫瘍をフローサイトメトリによりＴ細胞の存在について分析した。Ａ)pmel Ｔ細胞は腫瘍に浸潤することができたが、腫瘍をAdCD40L(combo)で予め処置しれた場合には、pmel Ｔ細胞の浸潤は劇的に増大した。Ｂ)AdCD40Lで処置した腫瘍では、天然Ｔ細胞及びpmel Ｔ細胞は共に、AdCD40Lで予め処置しなかった腫瘍と比較して増大しており、それらは活性化マーカーCD107aを発現した。
【図２２】Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL(LOAd703)を１×10e11 VPの用量レベル１及び５×10e11 VPの用量レベル２で用いる単回投薬療法の治療スケジュール。青及び白のボックスは１週間を表す。
【図２３】Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL(LOAd703)を５×10e11 VPの用量レベルで用いる反復投薬療法の治療スケジュール。青及び白のボックスは１週間を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
TMZ-CD154の説明
本発明は、CD154の細胞外及び膜貫通ドメインをオリゴマー化ドメインに融合した遺伝子操作形態のCD154に関する(図１)。この遺伝子操作CD154は、機能的細胞外ドメインを有する膜結合形態を保持するが、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。代わりに、オリゴマー化ドメインが、翻訳された遺伝子操作CD154をオリゴマー化し、このタンパク質複合体が膜結合したままとなる。
【０００９】
例として、本発明者らは、三量体化膜結合型イソロイシンジッパー(trimerized membrane-bound isoleucine zipper)含有CD154分子(「TMZ-CD154」と呼ぶ)を作製した。TMZ-CD154は、細胞内ドメインを欠くCD154のオリゴマー化(好ましくは三量体化)分子を形成し、細胞膜に局在する。細胞で発現させた場合、TMZ-CD154は細胞表面で強力に検出され、野生型CD154に匹敵する最小限度でしか分泌されない。TMZ-CD154発現細胞は、CD83の一様な発現及びIL12の高産生で示されるように、樹状細胞(DC)を活性化する。IL12産生は野生型CD154と同程度に高く、DCを可溶性多量体CD154分子で刺激する場合より高い。このことから、TMZ-CD154を膜に保持する膜貫通領域の有益性が示される。更に、CD154発現細胞におけるCD40結合によるCD154シグナル伝達は、不十分にしか規定されていないが、CD154発現Ｔ細胞では増殖状態を誘導し得る。よって、TMZ-CD154は、TMZ-CD154発現細胞内で(例えば遺伝子操作Ｔ細胞の制御不能な増殖、又は遺伝子操作細胞のタイプに依存する他の不知の事象を引き起こし得る)下流のシグナル伝達経路を活性化することなく、CD40ポジティブ細胞をCD154で刺激するという有益な性質を有する。このことは、特に、内部CD154シグナル伝達が影響を及ぼし得る細胞(例えばＴ細胞)に該分子を送達する場合に重要である。
【００１０】
本明細書に記載するように、本発明はTMZ-CD154に限定されず、必須の構成要素を有する他のヌクレオチド/タンパク質もまた本発明の範囲内である。TMZ-CD154は、説明のためだけに、下記のような本発明の種々の観点の一例として用いる：
i)ヌクレオチド又はタンパク質形態のTMZ-CD154、
ii)医薬に使用するためのTMZ-CD154、
iii)遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞又は天然若しくは人工のビヒクルに挿入されたTMZ-CD154、
iv)医薬に使用するための、遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞又は天然若しくは人工のビヒクルに挿入されたTMZ-CD154、
v)ヒト医学及び/又は獣医学におけるガン、感染性疾患、リンパ球増殖性疾患、炎症、慢性炎症、自己免疫又はアレルギーを含むがこれらに限定されない疾患の治療に使用するためのTMZ-CD154又は遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞、若しくは天然若しくは人工のビヒクルに挿入されたTMZ-CD154、
vi)TMZ-CD154を含んでなる医薬組成物、
vii)遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞又は天然若しくは人工のビヒクルに挿入されたTMZ-CD154を含んでなる医薬組成物、
viii)細胞におけるTMZ-CD154の製造方法。
【００１１】
発明の説明
本明細書に記載する知見に基いて、特にTMZ-CD154に関する結果を考慮して、本発明は、次の構造：
OD-(L)TD-ED  (5'→3')
(式中、
ODはオリゴマー化ドメインであり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは膜貫通ドメインであり、
EDはCD154の細胞外ドメインである)
を含んでなるが、配列番号16の等価ヌクレオチド配列に相当する細胞内CD154領域を含まないヌクレオチド配列に関する。
【００１２】
膜貫通ドメインは、CD154に由来してもよいし、任意のII型膜貫通タンパク質に由来してもよい。
細胞外ドメインは、
i)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846、
ii)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846であるが、当該分子の切断を回避するように配列番号１の残基397〜420の１又は２以上の核酸が欠失するか又は別の核酸と置換したもの、
iii)配列番号12、すなわち配列番号３の残基127〜846、
iv)配列番号13、すなわち配列番号４の残基127〜844、
v)配列番号14、すなわち配列番号５の残基127〜844、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択してもよい。
【００１３】
本発明のヌクレオチド配列は、5'末端から3'末端までに構造OD-TD-EDで示される３つの必須要素を含み、同時に、細胞内シグナル伝達を欠く。CD40Lの細胞外ドメインは、シグナル伝達を増強するため、当該ドメインを細胞表面に保持する膜貫通領域に融合し、最大のシグナル伝達のため、三量体化ドメインに融合する。ODとTDとの間にリンカーを挿入してもよい。
TMZ-CD154の意義は、CD40Lを三量体化し、CD40+細胞との相互作用の際にTMZ-CD154保有細胞で細胞内シグナル伝達を生じることなく、CD40Lを形質膜に保持することである。その目的は、シグナルの伝送であり、相互のシグナル伝達の達成ではない。
天然に存在するCD40Lは、三量体化構造をインビボでは強固な様式で維持せず、そのことがシグナル伝達を弱める。
【００１４】
本発明に従うヌクレオチド配列は、例えば−そして、本明細書の実施例に記載されるように−ヌクレオチド配列(例えば、TMZ-CD154遺伝子)((例えば、CD40Lの)細胞内領域を除去することが重要である)を有するウイルスの腫瘍内注射により、インビボ遺伝子療法で用いることができる。インビボ注射により、腫瘍浸潤Ｔ細胞(活性化の間の短時間にCD40Lを天然に発現することができる細胞)を含む全ての感染細胞において該ヌクレオチド配列の発現がもたらされる。Ｔ細胞における野生型CD40Lの過剰発現は、マウスにおいて未制御のＴ細胞増殖、よってリンパ球増殖性疾患に至る。細胞内領域の除去は安全性の観点から重要である。TMZ-CD154は、ヒトＴ細胞における未制御のＴ細胞増殖も、CD40L処置マウスで見出されている有害反応も誘導しない。
【００１５】
具体的には、本発明は、次の構造：
OD-(L)-TD-ED
(式中、ODはオリゴマー化ドメインであり、(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、TDは膜貫通ドメインであり、EDは細胞外ドメインである)
を有するCD40L又はCD154の誘導体に関する。よって、CD40L(CD154)と比較して、本発明のヌクレオチド配列は細胞内ドメインを有さないが、膜貫通及び細胞外ドメインに先行するオリゴマー化ドメインを有する。よって、CD40L(CD154)の細胞内ドメインは存在しない。
【００１６】
下記の表に、本明細書で言及する配列の概要を示す。
配列表
【表１】
0006524208.tif 000002
【００１７】
一般に、ヌクレオチド配列は、細胞内領域を欠くCD154であり、上記から明らかなように、このCD154はヒト、ウマ、イヌ、ネコなどを含む哺乳動物に由来してもよい。ヒトCD154が好ましい。CD154の１又は２以上の残基が欠失していてもよいし、置換していてもよい。下記の表に、(タンパク質として示す)ヒトCD154を例に、別の残基と置換してもよい残基を示す。任意の組合せの置換/欠失パターンが本発明の範囲内である。よって、下記表に示す(細胞内領域を欠く)CD154の１又は２以上のアミノ酸を、言及する具体的変更に従って置換/欠失してよい。
CD154(タンパク質)の幾つかのアミノ酸はまた、当該分子の切断を予防するために置換してもよい。そのような配列の例は配列番号26であり、変更点は次のとおりである(完全長ヒトCD150に基いて)：Q114P、K115R、D117E、Q118E、N119D及びP120S。配列番号26のタンパク質に対応するが、細胞内領域を欠くヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
【００１８】
ヒトCD154アミノ酸配列の天然バリエーション
参照：UniProtKB/Swiss-Prot/P29965(CD40L_HUMAN)。
【表２】
0006524208.tif 000003
【００１９】
上記のとおり、膜貫通ドメインは、任意の膜貫通タンパク質であってもよく、特には、CD154、ヒトOX40リガンド又はヒトCD70に由来する膜貫通タンパク質であってもよい。
よって、膜貫通ドメインは、
i)配列番号17、すなわち配列番号１の残基127〜198、
ii)配列番号20、すなわちヒトOX40の膜貫通ドメイン、若しくは
iii)配列番号22、すなわちヒトCD70の膜貫通ドメイン
と少なくとも90％の配列同一性を有していてもよいし、又は、
配列番号17、配列番号20又は配列番号22と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％若しくは100％の配列同一性を有していてもよい。
例として、膜貫通ドメインは、配列番号17、すなわち配列番号１の残基127〜198を有する(TMZ-CD154)。
【００２０】
オリゴマー化ドメインは、代表的には、イソロイシンジッパー又はT4フィブリチンの三量体化ドメインである。例として、オリゴマー化ドメインは配列番号23、すなわち配列番号１の残基10〜108を有するイソロイシンジッパーである。
ヌクレオチド配列は、コザック配列、例えば配列番号１の残基１〜９に相当するコザック配列を更に含んでなってもよい。
コザック配列は、翻訳プロセスの開始を亢進するための真核生物のmRNAに存在する短いヌクレオチド配列である。遺伝子療法設定で用いるときにTMZ-CD154の翻訳を亢進するため、コザック配列をTMZ-CD154遺伝子配列に先行させる。コザック配列は、TMZ-CD154が単独で、又は免疫モジュレーター若しくは他の分子の遺伝子を追加的に含む転写物中で最初の遺伝子として発現するときに存在する。よって、本発明に関しては、本発明に従うヌクレオチドはコザック配列を有してもよいし、有さなくてもよい。両形態が本発明の範囲内である。
【００２１】
例として、本発明に従うヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性を有していてもよい。特には、本発明に従うヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも98％の配列同一性を有していてもよいし、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチドと同一であってもよい。
本発明に従うヌクレオチド配列はまた、免疫モジュレーターと組み合わせてもよい。適切な免疫モジュレーターの例は、4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R scFv遺伝子である。
同様に、シグナル伝達経路モジュレーター(例えば抗IL6R scFv)と組み合わせてもよく；又は、本発明に従うヌクレオチド配列はシグナル伝達経路ブロッカーと組み合わせてもよい。よって、本発明に従うヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号８(それぞれ、TMZ-CD154/4-1BBL遺伝子及びTMZ-CD154/抗lL6R scFv遺伝子)と少なくとも95％、98％又は100％の配列同一性を有していてもよい。
本発明に従うヌクレオチド配列の使用は本明細書に詳細に記載されている。ヌクレオチド配列の全体が、医薬に及び/又は診断ツールとして使用されてもよい。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載するヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に関する。
本発明に従うヌクレオチド配列の定義と同様、本発明のタンパク質は、次の構造：
OD-(L)-TD-ED,
(式中、
ODはオリゴマー化ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
EDはCD154の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列である)
を含んでなるが、配列番号15のアミノ酸配列に対応する細胞内CD154領域に相当するアミノ酸配列を含まないタンパク質として規定することができる。
【００２３】
CD154の細胞外ドメインは、
i)配列番号24、
ii)配列番号24であるが、当該分子の切断を回避するように、配列番号１の残基397〜420のヌクレオチドに相当するアミノ酸配列MQKGDQNPの１又は２以上のアミノ酸が欠失するか又は別のアミノ酸と置換したもの、
iii)配列番号12のヌクレオチド残基、すなわち配列番号３の残基127〜846に相当するアミノ酸残基、
iv)配列番号13のヌクレオチド残基、すなわち配列番号４の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
v)配列番号14のヌクレオチド残基、すなわち配列番号５の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択してもよい。
【００２４】
膜貫通ドメインは、CD154又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来してもよい。膜貫通ドメインは、配列番号18、配列番号19又は配列番号21(好ましくは配列番号18)と少なくとも90％、95％、98％又は100％の配列同一性を有していてもよい。
本発明に従うタンパク質は細胞内領域(例えば、CD154又はCD40の細胞内領域)を欠く。
ヌクレオチドの観点で記載した詳細及び具体的記載は、タンパク質の観点にも当てはまるが、タンパク質の観点に関しては、当該分子の該当部分は、本明細書に記載するヌクレオチドに対応するアミノ酸配列であるか又は本明細書に記載するヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列である。
例として、本発明に従うタンパク質は、配列番号24に対して少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性を有するEDを含んでなってもよい。更に、ED中の可能な変更の概要を上記の表に示す。上記のとおり、上記の変更のいずれも及び上記変更のいずれの組合せも本発明の範囲内にあるものと意図される。
より具体的には、オリゴマー化ドメインは、イソロイシンジッパードメイン又はT4フィブリチンの三量体化ドメインであってもよい。
【００２５】
上記のとおり、膜貫通ドメインは、CD154の膜貫通ドメイン又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来してもよい。具体的には、膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19(OX40リガンドに由来するTD)又は配列番号21(CD70に由来するTD)に対して少なくとも90％、95％、98％又は100％の配列同一性を有する。例として、本発明に従うタンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号18であってもよいし、配列番号18の１又は２以上の残基が欠失するか又は別のアミノ酸と置換していてもよいタンパク質であってもよい。そのような残基の例はaa14及び/又はaa16であり、例えばM14R及び/又はG15R(完全長CD154中のM36R及びG38Rに対応)である。
特には、本発明に従うタンパク質は、配列番号２と少なくとも90％、95％又は98％の配列同一性を有していてもよく、例えば配列番号２と100％の配列同一性を有していてもよい。
本発明に従うタンパク質の使用は本明細書に詳細に記載されている。タンパク質の全体を医薬において及び/又は診断ツールとして用いてもよい。
TMZ-CD154は、ヌクレオチド及びタンパク質の両方の形態で特に興味深い。
【００２６】
構造及び配列の参照たるTMZ-CD154に関する詳細
TMZ-CD154遺伝子は、オリゴマー化ドメインに融合したCD154細胞外及び膜貫通ドメインを含むが、CD154細胞内領域を欠く。より具体的には、TMZ-CD154遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の１つと少なくとも90％の配列同一性を有する。特に、TMZ-CD154遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の１つと少なくとも95％の配列同一性を有する。とりわけ、TMZ-CD154遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のうちの１つである。
配列番号２は配列番号１のアミノ酸配列に相当する。配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列の１つに対応するタンパク質配列と少なくとも90％の配列同一性を有するTMZ-CD154タンパク質も本発明に含まれる。特に、TMZ-CD154タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列の１つに対応するタンパク質配列と少なくとも95％の配列同一性を有する。とりわけ、TMZ-CD154タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列に相当する。とりわけ、TMZ-CD154タンパク質は、配列番号２と少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性を有する。とりわけ、TMZ-CD154タンパク質は配列番号２の配列を有する。
【００２７】
TMZ-CD154ドメインはヒト起源のものであってもよいが、イヌ、ネコ及びウマを含む(ただしこれらに限定されない)他の種に起源を有することもできる。導入遺伝子は、自家、同種又は異種形態を用いることができる。例えば、ヒトTMZ-CD154は、ヒト、ネコ、イヌ及び/又はウマにおける疾患を治療するために用いることができる。
オリゴマー化ドメインは、イソロイシンジッパードメインであってもよいが、膜局在を妨げることなくTMZ-CD154分子をオリゴマー化する他のドメインであってもよい。多くのタンパク質がオリゴマー化(具体的には三量体化)し、使用可能な配列を含む。例えば、T4フィブリチン又は天然に三量体化する他の分子の三量体化ドメインを用いてもよい。
膜貫通ドメインは、CD154分子に由来することもでき、１又は２以上の膜貫通領域(又は膜へのCD154の保持を強化するために指定された領域)を有する他の分子に由来することもできる。膜貫通領域は、単一又は複数の膜貫通αヘリックス、βバレル、グラミシジンＡのβ-ヘリックスであることができるが、他の構造であることもできる。
【００２８】
ビヒクル
本発明はまた、本明細書に記載するヌクレオチド配列を含んでなるビヒクルに関する。ビヒクルは、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、細胞、人工細胞及び人工ビヒクルを含む任意の適切なビヒクルであってもよい。
TMZ-CD154を下記のものにおいて用いる場合、ビヒクルは、TMZ-CD154自体及び本発明に従う他のヌクレオチド(及びタンパク質；該当する場合)を含む。
TMZ-CD154導入用ビヒクルは、プラスミド、複製欠損ウイルスベクター、複製コンピテントウイルス、トランスポゾン、細胞、人工細胞又は人工ビヒクルであることができるが、これらに限定されない。
本明細書に記載するTMZ-CD154は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ヌクレオチドオリゴ又はタンパク質として、本明細書に記載するビヒクルに送達してもよい。
【００２９】
プラスミド
本発明に従うヌクレオチド配列、とりわけTMZ-CD154の導入用ビヒクルは、プラスミド、ミニサークルプラスミド誘導体又は自己複製性プラスミド若しくはミニサークルであることができる。
プラスミドベクターは、ORI部位、制限酵素部位、プロモーター及び本発明に従うヌクレオチド配列、とりわけTMZ-CD154配列を、開始及び停止コドンと共に有する環状DNA配列からなる基本的なプラスミドであってもよいが、これに限定されない。
プラスミドはまた、本発明に従うヌクレオチド配列、とりわけTMZ-CD154配列を含むが、原核生物ベクターの部分が限定されているか又は該部分を含まない所謂ミニサークルプラスミド誘導体であってもよい。
本発明に従うヌクレオチド、とりわけTMZ-CD154配列を含むプラスミドは、S/MAR-エレメント又は細胞中での当該プラスミド若しくはミニサークルの自己複製を可能にする他の部分を含むいわゆる自己複製性プラスミド又はミニサークルであってもよい。
【００３０】
ウイルスベクター
ベクターは、本発明に従うヌクレオチド配列、例えばTMZ-CD154を含む複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスであってもよい。
複製欠損ウイルスベクターとは、ウイルス複製に関与する遺伝子の欠失に起因して、それ自体では複製することができないウイルスを意味する。例えば、アデノウイルス科のウイルスから初期遺伝子１(E1)を欠失させて、複製欠損ウイルスベクターを作製することが可能である。複製欠損ウイルスの増殖を支持するためには、プロデューサー細胞株(例えば、293、293T、911、C6(Crucell)プロデューサー細胞株)において、E1遺伝子(これに限定されない)の挿入により、欠失遺伝子/関連タンパク質を提供する必要がある。欠失遺伝子/関連タンパク質また、ウイルス産生細胞株に別途に提供することもできる。例えば、レトロウイルス科に起源を有する複製欠損ベクターのプラスミドを、欠失遺伝子を含む遺伝子/タンパク質とともに、プロデューサー細胞にトランスフェクトすることもできる。
【００３１】
複製コンピテントウイルスとは、当該ウイルスが感染する任意の細胞又は特定起源の細胞中でそれ自体で複製することができるウイルスを意味する。複製コンピテントウイルスは、或る特定の細胞中又は或る特定の状況下でのみ活性であるプロモーターにより複製が駆動される条件付きの複製可能ウイルスであることができる。そのような細胞は腫瘍細胞又は器官特異的細胞であることができ、そのような状況は、増殖に起因するプロモーター(例えば、テロメラーゼプロモーター(TERT))活性のアップレギュレート又は網膜芽細胞腫Rb経路の途絶であることができる。
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、導入遺伝子(例えばTMZ-CD154)のためのより大きなスペースを提供するか又はそうでなければ治療効果若しくは導入遺伝子の発現を損なう遺伝子セグメントを除去するように、ウイルスゲノム中に他の欠失を有していてもよい。例えば、初期遺伝子３(E3)は、上記の理由で、アデノウイルス科のウイルスから部分的に又は完全に欠失させることができる。
【００３２】
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、複製又は導入遺伝子発現を駆動するプロモーター、及び、プロモーター若しくは導入遺伝子を抑制作用から遮蔽し、導入遺伝子翻訳を亢進させ、又は腫瘍溶解ウイルスの腫瘍溶解機能の特異性を増大若しくは増強するインシュレーター若しくは類似物が付加されていてもよい。例えば、ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)及び/又はヒト伸長因子-1a(EF-1a)プロモーターに由来するプロモーター(ただし、これらに限定されない)を含むことができる。
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、アデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、アネロウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アレナウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科、ボルナウイルス科、アルテリウイルス科、ヘペウイルス科のメンバーであってもよいが、これらに限定されない。
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、DNAウイルス、例えばアデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、アネロウイルス科のメンバーであってもよいが、これらに限定されない。
【００３３】
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、RNAウイルス、例えば、レトロウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アレナウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科、ボルナウイルス科、アルテリウイルス科、ヘペウイルス科のメンバーであってもよいが、これらに限定されない。
上記の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ポックスウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科のメンバーであってもよい。
本明細書の実施例で例示するように、本明細書に記載する複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、アデノウイルス科のメンバーである。
【００３４】
本明細書に記載する複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、キメラウイルスであってもよい。キメラウイルスとは、ａ)本明細書に記載する１つのウイルス科の２又は３以上の異なるウイルス部分、ｂ)異なるウイルスの２又は３以上の異なるウイルス部分、又はｃ)「ａ」及び「ｂ」の組合せ  から構成される上記のようなウイルスを意味し、或いは、ｄ)ウイルスベクターは、他の種の遺伝子を有していてもよい。例えば、CMVに由来するプロモーターを別のウイルス科のウイルスベクターに挿入することもでき、或いは、ウイルスベクターはヒトの遺伝子又はプロモーターを有することもできる。
本明細書に記載の複製欠損ウイルスベクター又は複製コンピテントウイルスは、上記のキメラウイルス、特に、ファイバーシャフト及びノブがアデノウイルス血清型35に由来するアデノウイルス血清型５骨格からなるキメラウイルスであってもよい。
よって、本発明に従うビヒクルは、アデノウイルス血清型5/35ウイルスであるウイルスであってもよい。アデノウイルス5/35型ウイルスは、E1A遺伝子の上流に、E2Fプロモーター領域/結合部位を有していてもよく、E1A遺伝子の上流のSp-1部位、E1A Δ24欠失、E3 Δ6.7K/gp19Kを含んでいてもよく、pCMV及び導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットはL5遺伝子領域の後に挿入される。
【００３５】
トランスポゾン
遺伝子ビヒクルはまたトランスポゾンであってもよい。トランスポゾンとは、転移可能エレメント(TE、トランスポゾン又はレトロトランスポゾン)から誘導されたベクターを意味する。例えば(限定されないが)、Sleeping Beautyトランスポゾン系又はPiggyBacトランスポゾン系である。
【００３６】
細胞、人工細胞又は人工ビヒクル
本明細書に記載のヌクレオチド配列(TMZ-CD154を含む)は、細胞、人工細胞又は人工ビヒクルに挿入し又はディスプレイさせることができる。これら細胞/ビヒクルは、ヌクレオチド配列又はその翻訳タンパク質(例えば、TMZ-CD154)の疾患(例えば腫瘍)部位への単純な送達ビヒクルとして使用することができる。細胞がヌクレオチド配列/翻訳タンパク質(例えば、TMZ-CD154)により直接影響を受ける場合には、細胞ビヒクルは、ヌクレオチド配列/翻訳タンパク質(例えば、TMZ-CD154)の送達に用いても、ヌクレオチド配列/翻訳タンパク質(例えば、TMZ-CD154)に起因して細胞が示す新規な特性による細胞療法に用いてもよい。
TMZ-CD154遺伝子操作細胞は、腫瘍細胞(例えば、腫瘍細胞ワクチン)、免疫系細胞(例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、単球及びマクロファージ)及び他の細胞タイプ(例えば、線維芽細胞、間葉間質細胞、内皮細胞、上皮細胞)であってもよいがこれらに限られない。
TMZ-CD154遺伝子操作細胞は、患者に関して自家又は同種である腫瘍細胞であってもよい。このような操作細胞は、ガン患者において細胞ワクチンとして用いてもよい。
【００３７】
TMZ-CD154遺伝子操作細胞は、患者の治療に用いられる(本明細書に記載する)免疫系に起源を有する自家又は同種の細胞である。例えば、細胞は、リンパ系起源のもの、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、又は天然に存在する抗原を認識するＴ細胞を選択し拡大することにより作製する抗原標的Ｔ細胞、又は遺伝子操作したＴ細胞(例えば、キメラ抗原レセプター、抗原標的Ｔ細胞レセプター又はこれらの等価物を発現するＴ細胞)であることができる。
「抗原」とは、Ｔ細胞がＴ細胞レセプター、キメラ抗原レセプター又はこれらの等価物を介して認識する標的、例えば(限定されないが)、ガンを治療するための腫瘍特異的若しくは腫瘍関連抗原、又は感染性疾患を治療するための細菌性抗原、又は細菌性抗原も提示するガン細胞を意味する。例えば、エプスタイン-バーウイルス(EBV)はＢ細胞起源のガンで発現し得るので、EBV抗原をガン細胞標的として用いることができる。同様に、パピローマウイルス及びCMVもガンと関連付けられている。
【００３８】
ヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)で遺伝子操作する細胞はまた、骨髄系起源のもの、例えば(これらに限定されない)、単球、樹状細胞及びマクロファージであることができる。これら細胞は、選択した天然に存在する細胞、始原細胞からエキソビボで作製した細胞及び/又は特性が亢進するか若しくは新規特性を達成するように遺伝子操作した細胞であってもよい。例えば、細胞は、サイトカイン若しくは他の刺激物質(例えば、他の細胞、抗原、タンパク質、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、RNA、DNAなど)と共に培養するか又は新規特性を達成するように遺伝子ビヒクルで遺伝子操作することができる。
ヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)遺伝子操作細胞はまた、腫瘍細胞及び免疫細胞以外の自家又は同種の細胞、例えば(これらに限られない)、幹細胞、線維芽細胞、間葉間質細胞、内皮細胞及び上皮細胞であってもよい。細胞は、天然に存在する細胞であってもよいし、始原細胞の培養により作製してもよい。細胞は、エキソビボで培養されており、及び/又はサイトカイン若しくは他の刺激物質(例えば、他の細胞、抗原、タンパク質、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、RNA、DNAなど)で刺激されており、又は新規特性を達成するように遺伝子ビヒクルで遺伝子操作されていてもよい。
【００３９】
本発明に従うヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)は、人工細胞がディスプレイし又は送達することができる。人工細胞とは、或る特定の細胞機能の幾つかの重要な生物学的特徴を有することができる実体を意味する。人工細胞は、１)疾患部位(例えば、腫瘍)に輸送されて放出される本明細書に記載のTMZ-CD154を含み、２)疾患部位で又はインビトロでCD40ポジティブ細胞を活性化するように、本発明のヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)を膜に保有する、脂質膜、形質膜又は人工膜に囲まれたベシクルであることができる。
本発明に従うヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)はまた、天然又は人工のビヒクルがディスプレイし又は送達することができる。天然又は人工のビヒクルとは、例えばTMZ-CD154の迅速又は緩慢な放出用に、例えばTMZ-CD154がその表面又は内部コアに搭載されたリポソーム、ビーズ、ナノ粒子又はベシクルからなる種々の組成物を意味する。ベシクルは、例えば、ヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)発現細胞の精製エキソソームであることができる。
【００４０】
本発明に従うヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)を含んでなる遺伝子ビヒクルの使用
本発明に従うヌクレオチド配列(例えば本明細書に記載のTMZ-CD154)で遺伝子操作した遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞、天然又は人工のビヒクルは、後に細胞療法として用いる細胞の又は後に細胞療法に用いる細胞用の刺激物質として用いる細胞のインビトロ刺激に用いてもよい。例えば、腫瘍又はウイルスペプチドでパルスしたTMZ-CD154遺伝子操作樹状細胞を、ガン又は感染性疾患の細胞療法として用いてもよい。
本明細書に記載のヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)で遺伝子操作した遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞、人工ビヒクルは、その後に細胞療法に用いる細胞のインビトロ刺激に用いてもよい。例えば、TMZ-CD154遺伝子操作樹状細胞は、ガン又は感染性疾患のＴ細胞療法の前に、腫瘍又はウイルスを標的するＴ細胞のインビトロ刺激及び拡大に用いてもよい。
【００４１】
更に、本明細書に記載のヌクレオチド配列(例えばTMZ-CD154)で遺伝子操作した遺伝子ビヒクル、細胞、人工細胞、人工ビヒクルは、患者又は健常個体のインビトロ分析に用いる細胞のインビトロ刺激に用いる。例えば、TMZ-CD154遺伝子操作樹状細胞は、血液又は生検中の腫瘍又はウイルス特異的Ｔ細胞集団の存在及び機能を評価するために、当該細胞のインビトロ拡大に用いてもよい。
TMZ-CD154及び本明細書に記載の他の配列は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ヌクレオチドオリゴ又はタンパク質の形態の治療剤として用いることができる。下記において、この使用を、TMZ-CD154を一例として用いて説明するが、本発明に従う他のヌクレオチド及びタンパク質もまた、説明する使用に用いることができる。
【００４２】
医薬に用いるためのTMZ-CD154
TMZ-CD154は医薬で用いることができる。特に、TMZ-CD154はガンの治療に用いることができる。
本明細書に記載のTMZ-CD154は、ガン、例えば上皮細胞(ガン腫)、結合組織(肉腫)、生殖細胞(精上皮腫及び未分化胚細胞腫)、前駆又は胚細胞(芽腫)又は造血細胞(リンパ腫及び白血病)に起源を有するガンの治療に用いることができる。
【００４３】
本明細書に記載のTMZ-CD154はまた、下記のものを治療するために用いてもよい：
i)非造血器ガン、例えば上皮細胞(ガン腫)、結合組織(肉腫)、生殖細胞(精上皮腫及び未分化胚細胞腫)、前駆又は胚細胞(芽腫)に起源を有するガン
ii)上皮細胞に起源を有するガン(ガン腫)、例えば、腺ガン腫、扁平上皮細胞ガン腫、腺扁平上皮ガン腫、未分化ガン腫、大細胞ガン腫又は小細胞ガン腫、
iii)膵臓の細胞に由来するガン腫、例えば(限定されない)、腺管ガン腫、
iv)卵巣に由来するガン腫、例えば、卵巣ガン腫、
v)膀胱に由来するガン腫、
vi)肺に由来するガン腫、
vii)肝臓に由来するガン腫、
viii)腎臓に由来するガン腫、例えば、腎細胞ガン腫、
ix)結腸に由来するガン腫、
x)乳房に由来するガン腫、
xi)皮膚に由来するガン腫、
xii)場所に関わらず、神経内分泌腫瘍、
xiii)前立腺に由来するガン
xiv)脳に由来するガン、例えば、神経膠芽腫、
xv)間葉起源の細胞に起源を有するガン、例えば、骨、軟骨、脂肪、筋肉及び血管又は造血組織に由来するもの(肉腫)、
xvi)骨(例えば、骨肉種)又は軟骨(例えば、軟骨肉腫)に由来する肉腫、
xvii)脂肪(例えば、脂肪肉腫)又は平滑筋(例えば、平滑筋肉腫)に由来する肉腫、
xviii)胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、結合組織形成性小細胞腫瘍、結合組織形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨腫、骨外性骨肉種、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、リンパ肉腫、未分化多形性肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、神経線維肉腫、横紋筋肉腫及び滑膜肉腫を含む軟組織肉腫、
xix)ユーイング肉腫、
xx)造血器ガン、例えば、造血細胞に起源を有するもの(リンパ腫及び白血病)、
xxi)造血器ガン、例えば、リンパ系統の造血細胞に起源を有するもの、例えば(限定されない)、ホジキン若しくは非ホジキンリンパ腫はＴ細胞リンパ腫、
xxii)造血器ガン、例えば、リンパ系統の造血細胞に起源を有するもの、例えば(限定されない)、非ホジキンリンパ腫、
xxiii)造血器ガン、例えば、リンパ系統の造血細胞に起源を有するもの、例えば(限定されない)、Ｂ細胞白血病(例えば、慢性骨髄性白血病及び前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病)
xxiv)造血器ガン、例えば、骨髄系統の造血細胞に起源を有するもの、例えば(限定されない)、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病、
xxv)未知の原発位置を有するガン、
xxvi)局所原発性ガン、
xxvii)局所的に進行したガン、
xxviii)単一の転移ガン、
xxix)広く散在するガン疾患、
xxx)感染性疾患,
xxxi)ウイルス感染、例えば(限定されない)、サイトメガロウイルス(CMV)感染、エプスタイン-バーウイルス(EBV)感染又はアデノウイルス感染、
xxxii)ウイルス感染、例えば(限定されない)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染、
xxxiii)ウイルス感染、例えば(限定されない)、インフルエンザウイルス又はRSウイルス、
xxxiv)リンパ増殖性疾患、例えば(限定されない)、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、
xxxv)免疫機能不全、例えば、高IgM症候群、
xxxvi)進行中の免疫反応がTh1型免疫に傾斜する必要がある免疫機能不全、
xxxvii)ヒト医学における本明細書に記載の疾患、
xxxviii)ヒト成人患者における本明細書に記載の疾患、
xxxix)ヒト小児患者における本明細書に記載の疾患、
xxxx)獣医学における本明細書に記載の疾患、
xxxxi)イヌにおける本明細書に記載の疾患、
xxxxii)ネコにおける本明細書に記載の疾患、
xxxxiii)ウマにおける本明細書に記載の疾患。
【００４４】
免疫モジュレーターとの組合せでのTMZ-CD154の使用
本明細書に記載のTMZ-CD154は、１又は２以上の他の活性分子と組み合わせることができる。この分子は、同一の又は異なるベクター系と共に又はベクター系なしで用いることができる。
適切な活性分子を以下に記載する。
活性分子は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ヌクレオチド又はタンパク質の形態の他の免疫調整遺伝子であってもよい。他の活性物質は、１又は２以上の野生型免疫モジュレーター、例えば、腫瘍壊死因子(TNF)/腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)スーパーファミリーに属する野生型免疫モジュレーターであってもよい。
本明細書に記載のTMZ-CD154はまた、野生型4-1BBリガンド及び/又は野生型サイトカイン若しくはサイトカインレセプターと組み合わせて用いてもよい。
追加的に又は択一的に、本明細書に記載のTMZ-CD154は、１又は２以上のインターロイキンと組み合わせてもよい。インターロイキンは、インターロイキン-２、７、15及び/又は21であってもよい。よって、本明細書に記載のTMZ-CD154と組み合わせる活性剤は、インターロイキン-２、インターロイキン-７、インターロイキン-15又はインターロイキン-21であってもよい。
【００４５】
本明細書に記載のTMZ-CD154はまた、１若しくは２以上の野生型増殖因子又は１若しくは２以上の増殖因子レセプターと組み合わせてもよい。このようなレセプターは、野生型トランスフォーミング増殖因子-β(TGFb)レセプター、TGFbレセプターデコイ又は優性ネガティブTGFbレセプターであってもよい。
本明細書に記載のTMZ-CD154はまた、野生型形式から改変した上記の分子と組み合わせてもよい。例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸は、変更されていてもよいが、同一の又は改善された免疫刺激機能を依然として示す。或いは、分子は変更されており、及び/又はキメラタンパク質が創製されるように他のドメインと融合していてもよい。例えば、膜結合型三量体化4-1BBリガンドが創製されるように、4-1BBリガンドの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをTMZドメインと融合してもよい。
本明細書に記載のTMZ-CD154は、膜結合型三量体化4-1BBリガンドが創製されるように、TMZドメインと融合していてもよい4-1BBリガンドの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインと組み合わせてもよい。
【００４６】
本明細書に記載のTMZ-CD154はまた、シグナル伝達経路をブロックし、変更し又は活性化するようにデコイ分子と組み合わせてもよい。デコイ分子は、抗体、抗体由来の単鎖フラグメント、レセプター、リガンド又はこれらの部分であってもよい。
上記のデコイ分子は、インターロイキン-６(IL6)レセプター/IL6結合をブロックするか又は変更するデコイ分子であることができる。
よって、デコイ分子は、IL6レセプターを標的するscFv又はIL6分子を標的するscFvであってもよい。
択一的に又は追加的に、上記のデコイ分子は、STAT3経路、グレムリン-１、IL10/IL10レセプター結合又はアルギナーゼ-Ｉをブロックするデコイ分子であることができる。
【００４７】
本明細書に記載のTMZ-CD154は、同一の上記ビヒクル系(遺伝子、細胞又は人工ビヒクル)において、上記モジュレータのいずれかと組み合わせてもよい。例えば、TMZ-CD154ヌクレオチド配列は、１つの遺伝子ベクターにおいて、4-1BBリガンドのヌクレオチド配列とトランスであることができる。
TMZ-CD154と別のモジュレータとの組合せを、１つのベクター系にトランスで配置し、両遺伝子の発現を可能とするIRES配列又は類似物で分離してもよい。或いは、TMZ-CD154と別のモジュレータとの組合せを、１つのベクター系にトランスで配置し、該２つのモジュレータの単一遺伝子転写物であって、翻訳後に２つの実体に分離する単一転写物を可能とする2Aペプチドの配列又は類似物で分離してもよい。
【００４８】
医薬に用いるための、TMZ-CD154と１又は２以上の免疫モジュレーターとの組合せ
本発明に従うヌクレオチド又はタンパク質(とりわけ、本明細書に記載のTMZ-CD154)は、異なる上記ビヒクル系(遺伝子、細胞又は人工ビヒクル)において、本明細書に記載のモジュレータのいずれかと組み合わせてもよいが、疾患の治療には併せて用いる。例えば、TMZ-CD154及び4-1BBリガンドをそれぞれ有する２つのビヒクルを、ガン又は感染性疾患(これらに限定されない)の治療の間に、同時に又は異なる時点で用いることができる。
ビヒクルはTMZ-CD154を備えたアデノウイルスベクターであってもよく、他方のビヒクルが4-1BBリガンドを備えたアデノウイルスベクターであってもよい。
また、ビヒクルの１つはTMZ-CD154を備えたアデノウイルスベクターであることができ、他のビヒクルが抗IL6レセプターscFvを備えたアデノウイルスベクターであってもよい。
或いは、ビヒクルの１つはTMZ-CD154を備えたアデノウイルスベクターであってもよく、他のビヒクルが4-1BBリガンドを備えた別のベクター系であってもよいし、又は、ビヒクルの１つはTMZ-CD154を備えたアデノウイルスベクターであってもよく、他のビヒクルが抗IL6レセプターscFvを備えた別のベクター系であってもよい。
ビヒクルはまた、TMZ-CD154をタンパク質4-1BBリガンドと組み合わせて備えたアデノウイルスベクターであってもよいし、又は、ビヒクルは、TMZ-CD154を、IL6レセプターをブロックする抗体若しくはscFvと組み合わせて備えたアデノウイルスベクターであってもよいし、又は、ビヒクルは、TMZ-CD154を、IL6をブロックする抗体若しくはscFvと組み合わせて備えたアデノウイルスベクターであってもよい。
【００４９】
認可された治療との組合せで用いるためのTMZ-CD154
本発明に従うヌクレオチド及びタンパク質(例えば、本明細書に記載のTMZ-CD154)はまた、認可された疾患治療法(例えば、異なる薬剤、放射線療法又は手術)と組み合わせることができる。
よって、本発明に従うヌクレオチド及びタンパク質(例えば、本明細書に記載のTMZ-CD154)は、例えば、下記のものと組み合わせてもよい：
i)認可された免疫調整療法、
ii)認可された抗体ベースの治療法、例えば(限定されない)、トラスツズマブ(抗Her2)、リツキシマブ(抗CD20)、トシリズマブ(抗IL6R)、イピリムマブ(抗CTLA-4)、ニボルマブ(抗PD1)及びペムブロリズマブ(抗PD1)、
iii)認可された免疫由来細胞療法、例えば(限定されない)、Ｔ細胞療法(天然の腫瘍標的リンパ球(例えば、拡大された腫瘍浸潤リンパ球)、又は遺伝子操作されたＴ細胞(例えば、CAR若しくはTcR遺伝子操作Ｔ細胞))、NK細胞療法又は樹状細胞ワクチン、
iv)認可されたＴ細胞療法(天然の腫瘍標的Ｔ細胞(例えば、拡大された腫瘍浸潤リンパ球、又は遺伝子操作されたＴ細胞(例えば、CAR若しくはTcR遺伝子操作Ｔ細胞))、
v)認可されたNK細胞療法、
vi)認可された樹状細胞ワクチン、
vii)認可されたワクチン、例えば(限定されない)、腫瘍細胞ワクチン、腫瘍若しくはウイルス抗原ペプチド又は他のウイルス若しくは細菌抗原、
viii)認可された腫瘍細胞ワクチン、
ix)認可された腫瘍又はウイルス抗原ペプチド、
x)認可されたウイルス又は細菌抗原、例えば(限定されない)、pp65 CMVペプチド若しくは完全長タンパク質、カルメット‐ゲラン杆菌(BCG)又は非メチル化CpGヌクレオチド、
xi)認可された免疫モジュレーター、これにはイミキモド、インターフェロン(例えば、IFNγ、IFNα)、インターロイキン/サイトカイン(例えばIL2)及び増殖因子(例えばGM-CSF)が含まれるが、これらに限定されない、
xii)認可されたガン治療法、これには、アルキル化剤、抗代謝剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤及び細胞傷害性抗生物質が含まれる、
xiii)認可されたガン化学療法、例えば(限定されない)、アルキル化剤、これには、メクロレタミン、ベンダムスチン、シクロホスファミド、メルファラン、クロランブシル、イホスファミド、N-ニトロソ-N-メチルウレア、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロマイド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジコン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン及びヘキサメチルメラミンが含まれる、
xiv)シクロホスファミド、
xv)ベンダムスチン、
xvi)テモゾロマイド、
xvii)シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチン、
xviii)認可されたガン化学療法、例えば(限定されない)、抗代謝剤、例えば、葉酸代謝拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシドアナログ及びチオプリン、
xix)葉酸代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート又はペメトレキセド、
xx)フルオロピリミジン、例えば、フルオロウラシル又はカペシタビン、
xxi)デオキシヌクレオシドアナログ、例えば、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン又はペントスタチン、
xxii)ゲムシタビン、
xxiii)チオプリン、例えば、チオグアニン又はメルカプトプリン、
xxiv)認可されたガン化学療法、例えば(限定されない)、抗微小管剤、例えば、ビンカアルカロイド、タキサン、又は微小管形成をブロックするか若しくは微小管を安定化する他の薬剤、
xxv)ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン又はビンフルニン、
xxvi)パクリタキセル又はドセタキセル、
xxv)エトポシド、テニポシド、又は微小管形成をブロックするか若しくは微小管を安定化する他の物質、
xxvi)認可されたガン化学療法、例えば(限定されない)、トポイソメラーゼ阻害剤、
xxvii)イリノテカン、トポテカン又はカンプトセシン、
xxviii)認可されたガン化学療法、例えば(限定されない)、細胞傷害性抗生物質
xxix)ドキソルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン、
xxx)認可されたガン療法、これには、放射線療法、例えば、外照射療法、近接照射療法及び放射性同位体療法が含まれる、
xxxi)外照射療法、例えば、従来型外照射療法、定位的照射療法、仮想シミュレーション、三次元等角照射療法/強度変調照射療法、粒子線療法及びオージェ療法、
xxxii)近接照射療法、
xxxiii)放射性同位体療法、
xxxiv)認可されたガン療法、これには血管形成阻害剤が含まれる、
xxxv)ベバシズマブ又はアフリベルセプト、
xxxvi)認可されたガン療法、これには経路阻害剤が含まれる、
xxxvii)EGFR、RET、変異BRAF、チロシンキナーゼ、mTOR、ヘッジホッグ、Smo、PI3K、MEK、AKT、RAF、Rac1、PARP、PIM、cMET、STAT3、JAK2、p38MAPK、NOTCH、BCL-2、IAP、p53、GSK2、Chk1、CDK4/6、PDGFR、IGF-1R、DKK1、CF-1R又はTWEAK:Fn14の阻害剤、
xxxviii)変異BRAFの阻害剤、これには、V600E、例えば、ベムラフェニブが含まれる、
xxxix)チロシンキナーゼの阻害剤、例えば(限定されない)、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ及びスニチニブ、
xxxx)STAT3の阻害剤、
xxxxi)Rac-1の阻害剤、
xxxxii)BCL-2の阻害剤、
xxxxiii)アポトーシス阻害剤の阻害剤、例えば(限定されない)、ABT-737又はナビトクラクス(navitoclax)、
xxxxv)認可された抗ウイルス療法
xxxxvi)認可された抗ウイルス療法、これには、アバカビル、アシクロビル(aciclovir)、アシクロビル(acyclovir)、アデホビル、アタザナビル、ボセプレビレルテット(boceprevirertet)、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エンテカビル、ホスカネット、ガンシクロビル、ラミブジン、オセルタミビル、バラシクロビル、バルガンシクロビルが含まれる(これらに限定されない)、
xxxxvii)アシクロビル(aciclovir)、アシクロビル(acyclovir)、ホスカネット、ガンシクロビル又はバルガンシクロビル、
xxxxviii)ホスカネット、ガンシクロビル及びバルガンシクロビル。
【００５０】
投与経路
原則、期待した効果が得られるという前提で、任意の投与経路を用いることができる。一般には、非経口投与が想定される
よって、本発明に従うヌクレオチド配列は、非経口投与経路により、例えば静脈内注射、経皮注射、患っている器官若しくは組織への直接注射又は腫瘍内注射により投与されてもよい。腫瘍内注射の場合、投与は、腫瘍への画像誘導注射により行なってもよい。
【００５１】
医薬組成物
本発明はまた、免疫関連疾患、例えばガン及び感染性疾患の治療に用いる医薬組成物に関する。このような疾患の例を本明細書に示す。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のTMZ-CD154を本明細書に記載の遺伝子ビヒクルに含んでなる。
組成物は、経口、非経口又は粘膜投与用に設計されていてもよい。よって、投与は、経口、舌下、若しくは口腔粘膜への塗布であってもよく、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、髄腔内、腫瘍内などであってもよいし、又は、皮膚、若しくは眼、頬、鼻、膣及び直腸粘膜を含む粘膜表面に塗布してもよい。しかし、非経口投与経路、とりわけ、疾患領域への直接注射、例えば腫瘍又は転移への直接注射が最も効率的であると考えられる。
【００５２】
組成物は固体、半固体又は液体の形態であってもよい。
適切な固体組成物としては、粉体、顆粒、ペレット、カプセル、タブレット(コーティングされたタブレット)、サシェ、移植物、薬剤送達デバイス、フィルムなどが挙げられる。
適切な半固体組成物としては、ゲル、ペースト、クリーム、軟膏、膣坐剤、坐剤などが挙げられる。
適切な液体又は流体組成物としては、溶液、分散体、乳剤、懸濁物、ローション、スプレー、エアロゾルが挙げられる。
注射に適切な医薬組成物としては、滅菌の水性溶液又は分散体が挙げられる。注射に適切な医薬組成物はまた、例えば腫瘍に局所注射すると固化する液体の形態であってもよい。注射に適切な医薬組成物はまた、移植物、挿入物又は送達デバイスの形態であってもよい。
【００５３】
非経口使用のためには、組成物は、例えば、遺伝子ビヒクル中のTMZ-CD154を溶媒又は分散媒体(例えば水、エタノール、プロピレングリコール、イソプロパノール、グリセロール、例えばゴマ油、ピーナッツ油のような植物油など)中に含む液体形態であってもよい。例えば緩衝化剤、pH調節剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤などのような添加物が添加されてもよい。更に、組成物は、注射する組成物に関して医薬的に許容され得る賦形剤を含んでいてもよい。これらは、具体的には、等張性の滅菌生理食塩水溶液(リン酸塩、塩化ナトリウム)であってもよいし、或いは、場合に応じて滅菌水若しくは生理学的食塩水又は別の溶媒若しくは分散媒体の添加により即時使用可能な組成物に再構成される乾燥(特には凍結乾燥)組成物であってもよい。
有利には、このような添加物は溶媒に溶解していてもよい。安定性を増大させるために、組成物は、バイアルに充填して水を減圧除去した後に、凍結することができる。その後、凍結乾燥粉体をバイアルに密封する。使用前に液体に再構成するための注射用水のバイアルを添付して供給してもよい。
組成物はまた、施術前に解凍する凍結組成物として提供してもよい。組成物は、例えば、ウイルスベクターを含む組成物であることができる。このような組成物は、そのまま使用してもよいし、又は、例えば緩衝物質、pH調節剤、緊張度調節剤などを含む水性媒体のような添加物を加えてもよい。
【００５４】
好都合には、組成物は単位剤型で提供してもよく、薬学分野で周知の方法の何れかにより製造してもよい。このような方法は、活性分子(ビヒクルが有するTMZ-CD154)と１又は２以上の副成分を構成するキャリアとを組み合わせる工程を含む。一般には、組成物は、活性成分と液体キャリア若しくは微粉化固体キャリア又はその両方とを均質に組み合わせ、その後必要があれば製品に成形することにより製造する。
上記のとおり、遺伝子ビヒクルに含まれる本発明に従うヌクレオチド配列又はタンパク質(例えばTMZ-CD154)は、医薬組成物の形態で経口投与してもよい。治療する疾患及び患者並びに投与経路に応じて、組成物を種々の用量で投与してもよい。
例えば、本発明の化合物は、即時、遅延又は制御放出適用のために、香味料又は着色剤を含んでいてもよいタブレット、カプセル、小卵(ovule)、エリキシル、溶液又は懸濁物の形態で、経口、頬又は舌下に投与することができる。
このようなタブレットは、賦形剤(例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシン)、崩壊剤(例えば、スターチ(好ましくは、コーン、ポテト又はタピオカスターチ)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び或る特定のシリケート複合体)、及び造粒結合剤(例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン及びアカシア)を含んでいてもよい。更に、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベーヘン酸グリセリン及びタルク)を含んでいてもよい。
【００５５】
また、類似のタイプの固体組成物を、ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いてもよい。この点についての好ましい賦形剤としては、ラクトース、スターチ、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁物及び/又はエリキシルのためには、本発明の化合物は、種々の甘味剤又は香味料、着色物質又は色素、乳化剤及び/又は懸濁剤、及び希釈剤(例えば、水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン)並びにそれらの組合せと組み合わせてもよい。
タブレットは、任意に１又は２以上の副成分と共に、圧縮又はモールド成形により製造してもよい。圧縮錠は、適切な機器において、任意に結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性又は分散剤と混合した自由流動形態(例えば、粉体又は顆粒)の活性物質を圧縮することにより製造してもよい。モールド成形錠は、適切な機器において、不活性液体希釈剤で湿らせた粉状化合物の混合物をモールド成形することにより製造してもよい。タブレットは、任意に、コーティングされていてもよいし、又は分割線を設けられていてもよい。タブレットは、内部の活性成分の緩徐な又は制御された放出を提供するように、例えば、所望の放出プロフィールをもたらす種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて製剤化してもよい。
【００５６】
経口投与に適切な本発明に従う使用のための組成物は、各々が所定量の活性成分を含む個別単位(例えばカプセル、カシェ剤又はタブレット)として；粉体又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁物として；又は、油中水型液体乳剤又は水中油型液体乳剤として提供してもよい。活性成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供してもよい。
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤タイプに関する慣用の他の物質を含んでもよいことを理解すべきである。例えば、経口投与に適切なものには香味料が含まれてもよい。
本明細書の実施例に示すように、本発明に従うヌクレオチド配列は、水性媒体が注射用に通常用いる生理学的に受容可能な媒体である水性組成物の形態の組成物において用いてもよい。このような水性媒体は、0.9％塩化ナトリウム、リンゲル溶液又はTris/グリセロール緩衝溶液であってもよい。
【００５７】
TMZ-CD154を、(例えば、本明細書の実施例にみられる)ウイルスを介して送達する場合、本発明に従うヌクレオチドを含むウイルスは、(例えば、塩化セシウムを用いる)超遠心分離により精製することができ、濃縮ウイルスをTris/グリセロール緩衝溶液(20mM Tris、25mM塩化ナトリウム、2.5％ w/vグリセロールを含み、pHをpH8.0に調整済み)に透析する。よって、ヌクレオチドは緩衝剤中で投与し、必要であれば、緩衝剤は、同じTris/グリセロール緩衝溶液又はインビボ投与に適切な溶液(例えば、上記の溶液)で希釈してもよい。
当業者は、本明細書中の開示に基いて及び/又はRemington's Pharmaceutical Sciences(18版) Mack Publishing Company，1990若しくはより新しい版の指針に基いて、本発明に従う使用に適切である組成物を製造することができる。
本発明の医薬組成物はまた、TMZ-CD154を、１若しくは２以上の上記免疫モジュレーターとの組合せ又は１若しくは２以上の上記の他の治療活性物質との組合せで含んでもよい。このような組成物は、全ての活性要素を同一製剤(例えば、全ての活性分子を含む単位投薬形態で)含んでもよいし、又は、各々が１若しくは２以上の活性分子を含有する製剤セットを含むパッケージの形態(例えば、一方がビヒクル中にTMZ-CD154を含有し、他方がその他の活性分子を含有する２つの異なる製剤を含むパッケージの形態；又は、例えば１つがビヒクル中のTMZ-CD154及び免疫モジュレーターを含有し、他方が別の活性分子を含有する２つの異なる製剤を含むパッケージの形態)であってもよい。
【００５８】
TMZ-CD154分子の投薬量は、当該特定の分子、該分子を含むビヒクル、関与する疾患、対象者、疾患の性質及び重篤度、対象者の身体的状態並びに選択した投与経路に従って変わる。
適切な投薬量は、当業者が容易に決定することができる。
組成物は、投与方法及び(例えば、タンパク質又は遺伝子療法として使用される)TMZ-CD154の形態に応じて、0.1重量％、好ましくは５〜95重量％、より好ましくは10〜60重量％の本発明の化合物を含んでもよい。アデノウイルスベクターは、１×10e6〜１×10e14ウイルス粒子/mLの範囲の濃度であってもよい。示唆される治療あたりの用量は、腫瘍内注射又は静脈内注入により投与する場合、好ましくは１×10e9〜１×10e13ウイルス粒子/mLの範囲であってもよい。
本発明の化合物の最適量及び個々の投与間隔は、治療する病的状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位並びに治療する具体的対象者の年齢及び状態により決まること、最終的には医師が使用する適切な投薬量を決定することを当業者は認識する。この投薬量は必要に応じて繰り返してもよい。副作用を発症する場合、通常の臨床実務に従って投薬の量及び頻度を変更するか又は低減することができる。
【００５９】
下記では、医学、とりわけガン免疫療法におけるTMZ-CD40Lの使用を説明する。
ガン免疫療法
腫瘍免疫学及びガン免疫療法
免疫系は、ウイルス感染細胞を認識、殺傷して致死性感染から宿主を護るのと同じ機序により腫瘍細胞を認識して殺傷することができる。ウイルス感染細胞と同様、腫瘍細胞は自己の細胞であり、ウイルス又は腫瘍関連エピトープは、細胞の主要組織適合性複合体Ｉ(MHC-I)上でCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)に対して提示される。ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞は共に、当該細胞をナチュラルキラー(NK)細胞の標的に仕向けるMHC分子のダウンレギュレーションによりCTL認識を妨害している可能性がある。しかし、ウイルスは、初期に、抗ウイルス免疫を活性化するよう抗原提示細胞(例えば、樹状細胞(DC))に警戒態勢を取らせる先天性免疫防御応答を活性化する一方、腫瘍細胞は同程度の刺激を誘導しない。実際、ガン進行の間、腫瘍及びその間質は免疫細胞を阻害する物質を産生する。腫瘍免疫は、DC成熟の阻止並びに免疫抑制細胞の分化及び腫瘍環境への誘引の促進により抑制される。これら抑制細胞は、通常、M2マクロファージ、種々の未成熟骨髄系細胞(纏めて骨髄系由来抑制細胞(MDSC)と呼ぶ)及びＴ調節性細胞(Treg)である。これら細胞は、抑制性サイトカイン及び増殖因子(例えば、IL10、TGFβ、プロスタグランジンE2、アルギナーゼＩ及びミエロイドペルオキシダーゼ)を産生する。腫瘍環境では、活性化CTLは、これら因子により急速に抑制され、不応答性(可逆性無応答の状態)になるか又は死亡する。
【００６０】
ガン免疫療法の本質は、腫瘍寛容(例えば不応答性)を崩し、進行中の２型免疫応答から１型免疫応答へ復帰させることである。１型免疫応答は、Ｔヘルパー１(Th1)リンパ球、CTL、NK細胞及びM1マクロファージの活性化並びにサイトカイン(例えば、IFNγ、IL12、IL21及びTNF)のプールにより特徴付けられる。
メラノーマ及び他の固形悪性腫瘍についてのCTLA4及びPD1/PDL1を標的するチェックポイント阻害抗体の最近の成功並びにＢ細胞悪性腫瘍についてのキメラ抗原レセプター(CAR)Ｔ細胞を標的するチェックポイント阻害抗体の最近の成功によりガン免疫療法の分野が大いに強化された。免疫系の刺激によりガンを治療するという新規な概念は現在詳しく調べられている最中である。この概念の１つは、腫瘍溶解性ウイルスを遺伝子送達ビヒクルとして利用する免疫刺激遺伝子療法である。
【００６１】
免疫刺激遺伝子療法
免疫刺激遺伝子療法は、免疫刺激性タンパク質をコードする遺伝子を腫瘍領域に導入することを目的とする。実験モデルで免疫刺激遺伝子療法を用いた最初の研究は、有望な結果を伴って19世紀後期に発表された。種々のアプローチが臨床試験でも用いられたが、その多くは効力を示さなかった。しかし、これら研究は、免疫抑制細胞が腫瘍に浸潤するという知識及びこれら免疫抑制細胞のレベルを低減させる事前処置又は支持化学療法を用いて免疫応答を補助することの可能性についての知識が増大する前に行われた。更に、免疫療法に対する応答は、伝統的な化学療法又は放射線療法と比較して異なる経過を辿る。炎症に起因する初期の腫瘍腫脹が進行と誤解され、治療の早期中断に至ったのかもしれない。事前処置/支持化学療法とデータ解釈法の認識との組合せにより、他の免疫療法と同様、免疫刺激遺伝子療法の道が開かれる可能性が高い。可溶性で免疫刺激性のサイトカイン、増殖因子及び抗体の全身送達と比べて、遺伝子療法は、独特な部位へ送達し、用いるベクターに応じて免疫刺激性の導入遺伝子を数日間から数週間の間発現させることができる。このことにより、腫瘍において免疫刺激性タンパク質の高濃度が達成され、(全身的な免疫活性化の際に観察され得る)自己細胞に対する寛容の不要な停止に起因する毒性が低減する。
【００６２】
治療用免疫刺激性遺伝子は種々のビヒクルを用いて腫瘍に送達する。複製欠損アデノウイルスは、大きな導入遺伝子カセットを有することが可能であることから広く用いられている。不運なことに、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれないので、導入遺伝子の発現は期間が限られている。組み込まれないことは、宿主細胞の変異誘発のリスクがあり得ないので安全性が増大する。更に、ヒトはアデノウイルス感染に対処する能力を完全に備えている。例えば、ほとんどの個体は、アデノウイルスに起因する上気道感染を経験し、幾つかの血清型に対する抗体及び全てに対して交差反応性であるＴ細胞を機能させている。免疫刺激性遺伝子療法に関して、このウイルスの免疫刺激効果は、腫瘍抗原をロードしたDC上のTLRの活性化により抗腫瘍応答の生成を援助する可能性がある。腫瘍内送達に際して、このウイルスはニードル路内の細胞に感染するにもかかわらず、ウイルス感染を増大させて導入遺伝子の発現を延長させる必要がある。このことは、腫瘍溶解性ウイルスを遺伝子送達ビヒクルとして用いることにより達成してもよい。
【００６３】
腫瘍溶解性ウイルス(OV)療法
或る特定のウイルスが細胞に感染し、増殖し、新たなビリオンの放出の間に溶解により細胞を殺傷する能力は、該ウイルスをガン治療薬として利用できることを意味する。腫瘍溶解を腫瘍細胞に限局するために、腫瘍で優先的に活性なプロモーターを付加することによりウイルス複製遺伝子の発現を制限する。十分な利益のためには、OVは全ての腫瘍細胞に感染すべきであるが、このことは腫瘍が転移している場合には難題であり得る。遠位腫瘍へのウイルスの全身拡散は免疫系により制限され得るので、免疫原性が低いOVを開発する試みがなされつつある。
OVの免疫原性を低減させる代わりに、ウイルスの固有の免疫刺激能力を利用し、OVゲノムに免疫刺激性遺伝子を付加することにより、免疫刺激能力を高めることが別のアプローチである。免疫刺激性導入遺伝子を備えた腫瘍溶解性アデノウイルスは、該免疫刺激性導入遺伝子の腫瘍への送達に成功し、転移性疾患に対して活性な全身性の抗腫瘍免疫応答を誘導する。腫瘍溶解及び免疫刺激の組合せの完全な効力は、マウスモデルでの測定が困難である。なぜならば、腫瘍溶解はマウス細胞に限られ、免疫刺激効果を免疫欠損マウスの異種移植モデルで評価できないからである。完全長ヒトCD40L遺伝子を有する腫瘍溶解性アデノウイルスを末期ガン患者に用いた研究が少なくとも１つ公表されており、実現可能性及び安全性が証明されている。GM-CSFを備えた腫瘍溶解性ウイルスを用いた他の研究が進行中であり、GM-CSFを備えた単純ヘルペスウイルス(タリモジーン ラハーパレプベック)は、メラノーマ患者で第III相臨床試験が完了している。
【００６４】
事前処置又は支持化学療法
事前処置又は支持化学療法は、そうしなければ意図した免疫活性化を障害し得る阻害性腫瘍間質細胞(例えば、Treg及びMDSC)を低減させるために、免疫療法を受ける患者に行われることが多い。更に、化学療法が引き起こすリンパ球又は骨髄系細胞の涸渇は、免疫細胞集団を(すなわち、恒常性複製により)回復させる骨髄サイトカイン産生を誘導し得、抗腫瘍応答の活性化を支持する。診断及び化学療法のタイプに依存して、腫瘍成長も影響を受け得る。免疫抑制細胞を制御しようとして、免疫療法を受けている患者に、メトロノーム様シクロホスファミドが投与されている。このような支持化学療法プロトコルは、所望の抗腫瘍応答を妨害しなければ、大いに価値あるものであり得る。関心を引く支持化学療法の１つは、ゲムシタビンであり得る。
ゲムシタビンは、DNA複製の間にシチジンと置き換わるヌクレオシドアナログであり、増殖停止及びアポトーシスを導く。ゲムシタビンはまた、リボヌクレオチドレダクターゼを標的し、該酵素の機能をブロックする。ゲムシタビンは、現時点で、外科手術に対するアジュバント治療として及び進行腫瘍に対する単一治療として、膵臓ガンに対する標準治療である。進行した転移腫瘍のゲムシタビン治療は待期療法でしかないが、我々自身の研究を含む幾つかの研究は、ゲムシタビン治療を行った患者で免疫抑制分子TGF、Treg及びMDSCのレベルが有意に低下し、DC、単球及び活性化Ｔ細胞の数が増加することを示した。最近、ゲムシタビンが腫瘍へのMDSC動員を低減し、抗腫瘍Ｔ細胞応答の発現を加速して、腫瘍崩壊性Reoウイルスとの組合せ療法を支持することが示された。マウスにおいて、ゲムシタビンはMDSCを低減し、免疫療法の効力を増大させた。
よって、標準治療たるゲムシタビンと免疫療法との組合せは、これら患者にとって有益であり得る。
【００６５】
TMZ-CD40Lを含む試験品LOAd703
LOAd703は新規なガン免疫療法剤である。LOAd703は、細胞への結合が増大することにより感染性が増大するように血清型35のファイバー(シャフト及びノブ)を有する腫瘍溶解性アデノウイルス血清型５(Ad5/35)である。ウイルスの複製及び腫瘍溶解は、E1Ad24及びE1A上流の複数のE2F結合性ドメインに起因して、網膜芽腫(Rb)経路が機能不全である細胞に制限される。正常細胞では、Rbは、転写因子E2Fに結合することにより、細胞サイクルのG1期からＳ期への移行を促進する遺伝子の転写を誘導するE2F本来の能力をブロックする。Rbのリン酸化により、E2Fが開放されて細胞増殖を刺激する。ヒト腫瘍は、Rbタンパク質及び/又はRbの過リン酸化を導く因子を改変させる広範な変異を有する。よって、ガン細胞では、E2Fはウイルスの転写を自由に駆動する。ウイルスは腫瘍細胞に感染して過剰なウイルス複製に起因する腫瘍溶解を介して該細胞を殺傷する一方、健常な非悪性腫瘍細胞は感染し得るが、新たなウイルス粒子を産生しない。したがって、LOAd703は健常細胞を殺傷しない。LOAd703は、CMVプロモーターが駆動する２つの免疫刺激性遺伝子(TMZ-CD40L及び4-1BBL)を備える導入遺伝子カセットを有する。CMVプロモーターは組織限定的でなく、免疫刺激性遺伝子は、LOAd703が感染する全ての細胞で発現することができる。よって、LOAd703は腫瘍及びその間質の両方を標的する。このウイルスは腫瘍内注射により投与するので、導入遺伝子の発現は腫瘍領域に限られる。
【００６６】
遺伝子構築物の概要
LOAd703の複製は、悪性腫瘍細胞に通常見られる異常な(過リン酸化)網膜芽腫タンパク質を有する細胞中にウイルス複製を制限するE1AΔ24を介して制御される。更に、E1Aの前にはE2Fプロモーター領域及びSp-1部位が挿入されている。これら複製制限は、最終的に腫瘍を腫瘍溶解及び死亡に駆り立てるウイルス複製を腫瘍細胞において促進する。LOAd703ウイルスは正常細胞に感染し得るが、複製せず、正常細胞を殺傷することもない。更なる改変としては、E3領域における6.7K及びgp19Kの欠失が挙げられる。6.7Kは細胞においてTRAILレセプター１及び２を阻害する一方、gp19Kは小胞体(ER)にMHCを捕捉する。これら２つは併せてＴ細胞がウイルス感染細胞を認識し殺傷する能力を低減させる。LOAd703の目的は免疫原性を増強することであるので、これら領域をアデノウイルスゲノムから除去した。L5領域に位置する血清型５ファイバーのシャフト及びノブ領域を、ウイルス形質導入を増大させる血清型35ウイルスのシャフト及びノブ領域に変更した。なぜならば、35型のファイバーは、正常及び悪性腫瘍の両方のヒト細胞で豊富に発現するレセプターCD46に結合する一方、Ad5のファイバーはコクサッキー-アデノウイルスレセプターについてポジティブである細胞に制限されるからである。サイトメガロウイルスプロモーター(pCMV)が駆動するTMZ-CD40L及び4-1BBL遺伝子を有する導入遺伝子カセットをL5領域の後に挿入した。よって、細胞感染により、LOAd703ウイルスはTMZ-CD40L及び4-1BBLの発現を誘導する。発現はCMVプロモーターが駆動し、ウイルス複製に依存しない。腫瘍内注射により腫瘍内で感染した細胞はいずれも、導入遺伝子を発現することができる。
【００６７】
TMZ-CD40L導入遺伝子は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く代わりに、細胞外及び膜貫通ドメインがイソロイシンジッパードメインに融合した改変ヒトCD40リガンド(CD40L；CD154)である。このことにより、TMZ-CD40L発現細胞での細胞内シグナル伝達を欠くが、レセプターCD40を発現する他の細胞に依然として結合してシグナルを伝送する膜結合型三量体化CD40L分子が創製される。CD40Lは、通常、病的状態下の多くの細胞タイプで(すなわち、細胞がストレスを受けるか又は活性化したときに)発現する。CD40+細胞のCD40L刺激は、当該CD40+細胞の身分に応じて種々の作用を導く。未成熟DCはCD40を発現し、CD40L刺激により、DCは、主要組織適合性複合体(MHC)分子、同時刺激性分子及びサイトカインを増大レベルで発現する成熟表現型に分化する。成熟DCは、Ｔ細胞(Th1及びCTL)、NK細胞及びM1マクロファージの優れた刺激物質である。CD40+内皮細胞は、Ｔ細胞付着とＴ細胞動員を促進する血管外漏出とに重要な分子の発現を増大させる。しかし、CD40+腫瘍細胞はCD40細胞内シグナル伝達経路が歪んでおり、CD40L刺激により、ほとんどの腫瘍細胞は増殖が阻害されるか又はアポトーシスに進む。更に、腫瘍微小環境中でのCD40L媒介シグナル伝達は、CD40L遺伝子療法(AdCD40L)で処置した膀胱ガン患者において、Tregレベルを間接的に低減することができる。マウスモデルにおいて、骨髄系細胞集団は、抑制CD11b+Gr1int/lowM2細胞からCD11b+Gr1highM1骨髄系細胞に傾斜した。
【００６８】
4-1BBリガンド(4-1BBL；CD137L)導入遺伝子は完全長ヒト4-1BBL遺伝子である。このリガンドは、活性化したＴ細胞及びNK細胞に発現するレセプター4-1BB(CD137)に結合する。Ｔ細胞及びNK細胞の4-1BBL刺激は、アポトーシス阻害剤(例えば、BCL-xL)のアップレギュレーションを介して、該細胞を活性化誘導細胞死(AICD)から保護する。4-1BBL刺激はまた効率的なリンパ球増殖を促進する。4-1BBLは、CTL及びNK細胞の両方の良好なインビトロ刺激物質であるが、腫瘍モデルでのインビボ効力については、4-1BBLと他の免疫エンハンサーとの組合せが重要なようである。CD40L及び4-1BBLでの刺激とToll様レセプター(TLR)のアデノウイルス骨格刺激との組合せは、下記の我々の前臨床実験設定で、DC、Ｔ細胞及びNK細胞を強力に刺激する。
よって、LOAd703は、CD40L及び4-1BBLを発現するため、１)腫瘍溶解又はCD40媒介アポトーシスのいずれかを介する細胞死の誘導、及び２)CD40L、4-1BBL及びアデノウイルス骨格を介する免疫系の活性化という２つの主要なエフェクター機序を有する。主要なエフェクターは、おそらく免疫活性化であるが、腫瘍溶解による細胞死の誘導は、腫瘍抗原特異的免疫刺激をもたらす腫瘍抗原の放出に起因して抗腫瘍応答を更に強化する。
【００６９】
略号
aCTLA4      抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４
Ad          アデノウイルス
AICD        活性化誘導細胞死
CD          分化抗原
CD40L       CD40リガンド、CD154
CMV         サイトメガロウイルス
CTL         細胞傷害性Ｔリンパ球
DC          樹状細胞
GM-CSF      顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子
IFNg        インターフェロンγ
IL          インターロイキン
LOAd        Lokon腫瘍溶解性アデノウイルス
MDSC        骨髄系由来抑制細胞
NK          ナチュラルキラー
PCR         ポリメラーゼ連鎖反応
PDAC        膵管腺ガン腫
PD1         プログラム死レセプター１
PDL1        プログラム死レセプターリガンド１
Rb          網膜芽腫
TCR         Ｔ細胞レセプター
TGFb        トランスフォーミング増殖因子β
Th          Ｔヘルパー
TLR         Toll様レセプター
TMZ-CD40L   三量体化膜結合型CD40L
TNFa        腫瘍壊死因子α
Treg        調節性Ｔ細胞
VP          ウイルス粒子
4-1BBL      4-1BBリガンド、CD137リガンド
【００７０】
定義
Ad5/35：用語「Ad5/35」は、ファイバーのシャフト及びノブがAd血清型35由来である腫瘍溶解性血清型５アデノウイルスベクターを意味する。
抗原：用語「抗原」は、Ｔ細胞がＴ細胞レセプター、キメラ抗原レセプター又はそれらの等価物を介して認識する標的である。
cDNA：用語「cDNA」は、細胞から取得した、スプライシングを受けた成熟mRNA分子から逆転写により製造することができるDNA分子を意味する。cDNAは、対応するゲノムDNAに存在し得るイントロン配列を欠く。最初の一次RNA転写物は、スプライシングを受けた成熟mRNAとして現れる前に、スプライシングを含む一連の工程を通じてプロセシングされるmRNAの前駆体である。
コーディング配列：用語「コーディング配列」は、TMZ-CD154又はそのバリアントのアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は、一般に、開始コドン(例えば、ATG、GTG又はTTG)で始まり、停止コドン(例えば、TAA、TAG又はTGA)で終わるオープンリーディングフレームにより決まる。コーディング配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA又はそれらの組合せであってもよい。
【００７１】
発現：用語「発現」には、TMZ-CD154の産生に関与する任意の工程(転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌が挙げられるがこれらに限定されない)が含まれる。
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターでの形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受ける任意の細胞タイプを意味する。
作動可能に連結した：用語「作動可能に連結した」は、制御配列がポリヌクレオチドのコーディング配列に対して適切な位置に配置されている結果、該制御配列が該コーディング配列の発現を導く形態を意味する。
複製起点：用語「複製起点」は、そこから複製が始まる、ゲノム中の特定配列を意味する。これは、生存している生物(例えば、原核生物及び真核生物)におけるDNAの複製又はウイルス(例えば、二本鎖RNAウイルス)におけるDNA又はRNAの複製を含むことができる。
【００７２】
複製コンピテントウイルスベクター：用語「複製コンピテントウイルスベクター」は、それが感染する任意の細胞又は特定起源の細胞において自身の手段により複製可能なウイルスである。
複製欠損ウイルスベクター：用語「複製欠損ウイルスベクター」は、ウイルス複製に関与する遺伝子が欠失しているため自身の手段では複製不可能なウイルスである。
配列同一性：用語「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を意味する。ヌクレオチドクエリー用アルゴリズム：blastn、megablst、discontiguous megablast。タンパク質クエリー用アルゴリズム：blastp、psi-blast、phi-blast、delta-blast。
ウイルスベクター：用語「ウイルスベクター」は、遺伝物質を細胞に送達するツールを意味する。
用語「含んでなる」は、広義で理解されるべきであり、用語「含有する」、「からなる」を包含し、分子構造との関連では、構造は示されるとおりであってもよく、すなわち如何なる更なるエレメントを有しなくてもよい。
【実施例】
【００７３】
下記では非限定的実施例により本発明を説明する。
実施例
材料及び方法
TMZ-CD154遺伝子配列
本明細書に記載のTMZ-CD154分子の遺伝子配列を実証するために、ヒト、ウマ、イヌ及びネコのTMZ-CD154遺伝子配列を構築した。
配列番号１(DNA)、配列番号２(タンパク質)
ヒト
ヒト三量体化膜結合型CD154
1-9         コザック配列
10-108      イソロイシンジッパー
109-126     リンカー
127-198     膜貫通ドメイン ヒトCD154
199-846     細胞外ドメイン ヒトCD154
【００７４】
CD154のtm及びecドメインのアミノ酸配列を灰色で示す。
【化１−１】
0006524208.tif 000004
【化１−２】
0006524208.tif 000005
【００７５】
配列番号３
ウマTMZ-CD154(太字CD154ドメイン)
【化２】
0006524208.tif 000006
【００７６】
TMZ-CD154ウマアミノ酸配列
【化３】
0006524208.tif 000007
【００７７】
配列番号４
イヌTMZ-CD154(太字CD154ドメイン)
【化４】
0006524208.tif 000008
【００７８】
TMZ-CD154イヌアミノ酸配列
【化５】
0006524208.tif 000009
【００７９】
配列番号５
ネコTMZ-CD154(太字CD154ドメイン)
【化６】
0006524208.tif 000010
【００８０】
TMZ-CD154ネコアミノ酸配列
【化７】
0006524208.tif 000011
【００８１】
プラスミドの構築
遺伝子配列を、AcaClone社のフリーソフトウェアpDraw32を用いて構築した後、5'遺伝子の前にCMVプロモーターを、両端にアデノウイルスベクターへの相同組換え用のアデノウイルスフランキング領域(制限部位5'SspI及び3'ScaIも含む)を有するように合成した。プラスミドのトランスフェクションにより遺伝子発現が達成されるように、3'側のAdフランキング領域の後にポリＡ部位を合成した。GenScript Inc.社で、この遺伝子フラグメントを合成し、pUC57-Kanプラスミドにサブクローニングした。
アデノウイルスベクターの構築
導入遺伝子カセットを有するpUC57プラスミドをSspI及びScaI酵素で消化し、標準的ゲル電気泳動によりバンドを単離し、精製した。遺伝子カセットをアデノウイルス骨格プラスミドに相同組換えにより挿入した。正確な挿入物を有するコロニーを拡大させ、遺伝子配列を制限パターン分析及び配列決定で確証した。遺伝子カセットを有するアデノプラスミドを293細胞にトランスフェクトしてウイルスを作製した。プラークアッセイをA549細胞について行い、単一ウイルスクローンを作製した。ウイルスをA549細胞で更に増幅させ、CsClグラジエント遠心分離で精製した。最終ウイルス粒子は20mM TRIS、25mM NaCl及び2.5％グリセロール中に製剤化した。物理的力価(O.D)及び機能的力価(抗ヘキソン染色)を測定した。
【００８２】
細胞株
細胞株HEK 293、B16及びA549はATCCから購入し、Karpas 422、PancO1、MiaPaCa2、PaCa3及びBxPC3はカロリンスカ研究所から厚意で提供を受けた。MB49細胞株は、シンガポール国立大学病院から提供を受けた。293細胞は、Life Technologies社のDMEMベース培地(10％ FBS、１％ペスト ストレプトマイシン、0.1％ピルビン酸ナトリウム)で培養した。A549は、10％ FBS、１％ PeSt、１％ HEPES及び0.1％ピルビン酸ナトリウムを補充したRoswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培地GlutaMAXTMで生育させた。MiaPaca2及びPanC01は、10％ FBS及び１％ PeStを含むDMEMで生育させた。BxPC3は、１％ FBS及び１％ Pestを補充したRPMI 1640培地GlutaMAXTMで生育させた。細胞増殖培地の成分は全てLife Technologies社のものであった。
バフィーコートの調製
バフィーコートはウプサラ大学病院の血液銀行から購入した。単核細胞はフィコール遠心分離により調製した。簡潔には、バフィーをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で１:１希釈し、10mLのフィコールを含む50mL Falconチューブに２層が混ざらないように穏やかに加えた。チューブを1500rpmにて20分間、間断なく遠心分離した。次いで、ピペッティングにより白血球層を新たなチューブに移し、PBS遠心分離で洗浄した。調製した細胞はそのまま使用したか、又は更なる使用のために、DMSO含有凍結培地中、液体窒素タンク内で凍結させた。
【００８３】
未成熟樹状細胞の調製
CD14+単球は、MACSビーズシステムCD14 MicroBeadsを製造業者(Miltenyi Biothech)のプロトコルに従って用い、バフィーコート調製物の単核細胞から選別した。CD14-細胞(Ｔ細胞を含む)は凍結させた。次いで、CD14+細胞をRPMI培養培地(10％ FBS、１％ペニシリン/ストレプトマイシン)に濃度１×10e6細胞/mLに希釈した。GM-CSF及びIL-4をそれぞれ最終濃度50ng/mL及び25ng/mLまで加えた。GM-CSF及びIL-4を含む新鮮培地を１日おきに１週間加えた。１週間の培養後、単球は未成熟CD14-CD1a+樹状細胞に分化した。
Ｔ細胞の刺激
末梢血単核細胞をOKT-3(抗CD3)抗体(１μg/ml)及びIL2(100U/ml)で刺激した。３日目に、拡大したＴ細胞を、下記のようにアデノウイルスベクターで形質導入し、細胞を新たなIL2と共に又はIL2なしで48時間培養した。
プラスミドを用いるトランスフェクション
293細胞をPBS遠心分離(1500rpm、５分間)により洗浄した。細胞(0.75×10e6/群)を培地に再懸濁し、６ウェルプレートに播種して一晩培養した。翌日、５μgのプラスミドを、100μLのOptiMEM(Life Technologies)中８μLのポリエチレンイミンの懸濁物に混ぜ込み、20分間インキュベートした。次いで、プラスミド懸濁物を293細胞を含むウェルに滴下した。FACS分析、上清採取及び未成熟樹状細胞との共培養のために、種々の時間で細胞を培養した。
【００８４】
アデノウイルスベクターを用いる形質導入
アデノウイルスベクターで形質導入する細胞を無血清培地で洗浄した。10mL円錐チューブあたり１×10e6細胞を加え、1500rpmにて５分間遠心分離した。上清は廃棄した。細胞を、チューブあたり約150μLの残っている培地に再懸濁した。25〜100ffu/細胞の範囲のアデノウイルスをチューブに加えた後、37℃の細胞インキュベーター中５％ CO2で２時間インキュベートした。血清を含む細胞培養培地を加え、細胞を更にインキュベートし、種々のアッセイ(種々の時点でのフローサイトメトリ、ゲル電気泳動/ウェスタンブロット、未成熟樹状細胞との共培養など)に用いた。
フローサイトメトリ
フローサイトメトリにより分析する細胞は、PBSで洗浄し、フローサイトメトリ用チューブ(BD Biosciences)中で遠心分離した。上清を除去し、残る細胞をボルテックスにより再懸濁した。PBS中１％ウシ血清アルブミン(BSA)に希釈した抗体又は四量体を、細胞懸濁物に加えて室温にて５分間又は４℃にて30分間インキュベートした。ヒトCD154、CD83、HLA-DR、CD86、CD70、CD14、CD1a、CD3、CD8、CD107a及び4-1BBリガンド並びにマウスGr-1及びCD11bを検出する抗体は、BioLegend社から購入した。無関係のイソタイプ適合コントロールも同様であった。CMV pp65四量体はNordic BioSite社から購入した。染色細胞をPBS中１％ BSAで洗浄し、PBS中１％パラホルムアルデヒド(PFA)を300μL/チューブの総体積で用いて固定した。BD Biosciences社のFACS Canto IIを用いて細胞を分析した。データ分析はTreestar Inc社のFlowJoソフトウェアを用いて行った。
【００８５】
上清分析
細胞培養物の上清を、非形質導入細胞、形質導入細胞又はトランスフェクト細胞からのヒト可溶性CD154、ヒトIL-12、ウマMCP1、及びヒトIL-6Rに対するscFvの放出について分析した。sCD154は、eBioScience Inc社のsCD40Lプラチナキットを用いるELISAにより分析した。ウマMCP1は、BioLegend社のMCP1キットを用いて分析した。IL-12p70は自家製ELISAにより検出した。簡潔には、96-ウェルプレートを、１μg/mLの精製抗ヒトIL-12(p70)抗体(Biolegend)で４℃にて一晩コーティングした。１％ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma-Aldrich)を含むPBSを加え、37℃で１時間ブロッキングを行った。次いで、コーティングしたウェル中でサンプルを37℃にて２時間インキュベートした後、ビオチン化抗ヒトIL-12/IL-23 p40抗体(Biolegend)を濃度１μg/mLで37℃にて１時間加えた。アビジン接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Dako A/S)を1:4000に希釈し、暗所でプレートに37℃にて１時間加えた。このアッセイの顕色はTMB(Dako)を用いて行い、450nmでの吸光度をEmax精密マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った。ヒトIL-6Rに対するscFvは、scFvに挿入したMykタグを検出する自家製ELISAにより分析した。簡潔には、プレートを組換えヒトIL-6Rでコーティングした後、サンプルとインキュベートした。１％ BSA-PBSでの洗浄後、プレートを抗myk-HRP抗体とインキュベートした。抗myk-HRP抗体は、基質及びペルオキシダーゼ酵素(Dako)を加えて検出した。色シフトを分光光度法により分析した。更に、上清を複数のサイトカインについて、ルミネックスを製造業者のプロトコルに従って用いて分析した。次の被検物質を検出するキットを用いた：IFNg、Il12、TNFa及びIL21。
【００８６】
ゲル電気泳動及びウェスタンブロット
溶解物は、上記のプラスミドをトランスフェクトした細胞から調製した。細胞を氷冷１×PBSで洗浄し、１％ Haltホスファターゼ阻害剤カクテル及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)を補充したM-PER哺乳動物タンパク質抽出試薬を含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞溶解物のタンパク質濃度は、クーマシープラスタンパク質アッセイ試薬キットを製造業者のプロトコルに従って用いて測定した。10μgのサンプルをBioRad社のゲルにロードした。サンプルを、メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液(還元型)又は含まないサンプル緩衝液(非還元型)に混合した。また、還元サンプルはロード前に５分間95℃にて煮沸した。ゲルを50分間110Vで泳動させ、iBlot装置(Life Technologies)のゲルトランスファースタックを用いてメンブレンに転写した。メンブレンを１時間室温(RT)にてブロックした後、1:500希釈CD154抗体(H215)(Santa Cruz Biotechnology Inc)をメンブレンに加えて、一晩４℃にてインキュベートした。二次抗体としてヤギ抗ウサギIgG-HRP(Life Technologies)を希釈率1:2000で用い、RTにて１時間インキュベートした。ECL溶液Clarity Western ECL基質(BioRad)を加えてメンブレンを発色させ、V3 Western WorkflowTM(BioRad)で撮像した。
【００８７】
生存能アッセイ
TMZ-CD154導入遺伝子を含むウイルスの腫瘍溶解能は、Promega社のCellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)を用いて測定した。このアッセイは製造業者のプロトコルに従って使用した。簡潔には、腫瘍細胞をウイルスで形質導入した後、群あたり４つ組で96ウェルプレートに10000細胞/ウェルで播種した。健常ドナーの外分泌細胞を、ウプサラ大学病院の膵島細胞調製物余剰材料から取得し、制限された腫瘍細胞複製のコントロールとして用いた。プレートを培養し、種々の時点、すなわち形質導入の24、48及び72時間後に分析した。20μLのキット試薬を加え、プレートを1.5時間インキュベートした。A490の吸光度を分光光度法により測定した。
Ｔ細胞の活性化及び拡大
CMVポジティブドナーの未成熟DCを、ウイルス形質導入プロトコルに従って異なるウイルスベクターで形質導入したか、形質導入しないままとしたか又はTNFa(40ng/ml)及びポリIC(30μg/mL)で刺激した。翌日、細胞を採集してチューブに移し、PBS遠心分離(1500rpm、５分間)により洗浄した。上清を廃棄し、CMV pp65ペプチド(10μg)及びβ2マイクログロブリン(１μg)を加えた後、細胞を37℃にて４時間インキュベートした。細胞をPBSで２回洗浄した後、培養培地に濃度１×10e5細胞/mLに希釈した。並行して、同じドナーのCD14-単核細胞を解凍し、PBS遠心分離(1500rpm、５分間)で洗浄した。細胞を培養培地に濃度１×10e6細胞/mLに希釈した。調製した未成熟DC及びCD14-単核細胞(Ｔ細胞を含む)をT-25フラスコ中１:10の比で11日間共培養した(５〜10mL/フラスコ)。11日目に、拡大したＴ細胞をＴ細胞マーカー及びCMV pp65四量体に対する反応性についてフローサイトメトリにより分析した。
【００８８】
動物実験
雌性C57BL/6野生型又はNu/NuマウスはTaconic M&B社から取得した。ヒトPanc01腫瘍細胞を免疫欠損Nu/Nuマウスに注射した。検出可能となったら、腫瘍に、TMZ-CD154を有するウイルスを１×10e9 VP/マウスで１回注射した。種々の時点で腫瘍体積を測定した。マウスPanc02腫瘍細胞を野生型マウスに注射した。マウスを、マウスTMZ-CD154＋4-1BBLを有するアデノウイルスで週２回処置した(１×10e9 VP/マウス)。ゲムシタビン(25mg/kg)を週１回投与した。腫瘍サイズをモニターした。同所性モデル：マウスを麻酔し、カテーテルを挿入した(INSYTE.w24G×3/4；BD Biosciences)。膀胱を100μlの0.1μg/mlポリ-Ｌ-リジン(PLL、分子量70000〜150000)(Sigma-Aldrich)でプレインキュベートして腫瘍細胞接着性を亢進させた。次いで、MB49細胞(2.5×10e5/マウス)を膀胱に移植した。マウスに、複製欠損マウスAd5-CD154又はAd5-模擬(１×10e8ffu)での局所膀胱内処置を施した。ベクターの滴下注入前に、膀胱を、形質導入エンハンサーClorpactin WCS-90(0.1％溶液)(United-Guardian)で３回予備洗浄し、PBSで１回洗浄した。膀胱腫瘍内の骨髄系細胞及びＴ細胞の量を測定するために、処置の24時間後、腫瘍を採取し、液体窒素で素早く凍結させ、その後に染色し、CD11b+Gr-1+細胞の存在について免疫組織化学により評価した。腫瘍の一部を単一細胞に機械的に分離し、フローサイトメトリにより分析して浸潤Ｔ細胞の数を測定した。pmelモデル：B16腫瘍細胞をC57BL6マウスの皮下で増殖させた。マウスを４群に分けた。第１の群には、ネガティブコントロールとしてPBSのみを与えた。第２の群はAdCD40Lで処置し、第３の群はpmel Ｔ細胞で処置し、第４の群は、pmel Ｔ細胞療法に対するプライマーとして先ずAdCD40Lで処置した。ウプサラ(スウェーデン)の地域倫理委員会Dnrは、全ての動物実験を認可した：C86/10及びC54/13。
【００８９】
免疫組織化学
OCT(Tissue-Tek Sakura)に包埋した急速凍結組織の６μm切片を氷冷アセトン(Sigma-Aldrich)中で10分間固定し、PBS中で平衡化した。スライドをPBS中10％の正常ヤギ血清(Dako)及び非特異的ラットIgG2b(BD Biosciences、５μg/ml)で２時間ブロックした後、ブロッキング溶液に希釈した一次抗体(２μg/ml、PE接合ラット抗マウスCD11b(クローンM1/70、BD Biosciences)、FITC接合ラット抗マウスGr-1(クローンRB6-8C5、BD Biosciences))と１時間RTにてインキュベートした。核を２μg/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)で対比染色した後、PBSでよく洗浄し、Fluoromount G(Southern Biotech)でマウントした。サンプルあたり１つの腫瘍切片全体をカバーする顕微鏡写真を、Nikon DXM 1200カメラ(Nikon Instruments Europe)を備えたNikon Eclipse E100顕微鏡でPlanApochromat 20×/0.75対物レンズ(Nikon)を用いて撮影した。画像をImageJ(NIH)で分析した。CD11b+Gr-1+細胞の数を測定するため、手作業による閾値設定によって二重ポジティブ領域を規定して、この領域内及び興味対象領域(ROI)内の核を計数した。細胞数は総ROIに関連付けて表した。
血液ループモデル
全血をヘパリン処理チューブ内で循環させた(２ml/チューブ)。ウイルスを注入し、４時間のインキュベーション後、補体及びサイトカイン活性化の分析用にサンプルを採取した。プレサンプルをコントロールとして用いた。コントロールループにはPBS又は活性化抗体抗CD28を注入した。
【００９０】
実施例１
プラスミド遺伝子ビヒクルを用いるTMZ-CD154遺伝子の導入及び発現
プラスミド遺伝子導入系を用いてTMZ-CD154遺伝子を導入し、トランスフェクト細胞でのTMZ-CD154発現を導くことが可能であることを実証するため、プラスミド-TMZ-CD154遺伝子ビヒクルを構築し、TMZ-CD154を細胞に送達する能力を試験した。ヒトTMZ-CD154遺伝子をpUC57-Kan発現プラスミドに「材料及び方法」の記載のように挿入することにより、プラスミド-TMZ-CD154を構築した。次いで、プラスミド(５μg)を293細胞(１×106)にトランスフェクトし、トランスフェクション後２日目にTMZ-CD154発現をトランスフェクト細胞で測定した。最初に、一部の細胞を標準RIPA緩衝液により溶解させ、ゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより分析した(図2A)。TMZ-CD154又は模擬のプラスミドをトランスフェクトした293細胞を各々２群に分けた。一方の群は還元性サンプル緩衝液中で煮沸しなかったが、他方の群は還元性サンプル緩衝液中で煮沸した。この方法では、TMZ-CD154は単量体(還元型)又はオリゴマー(非還元型)として同定することができる。模擬トランスフェクト細胞の両群はCD154についてネガティブであった。TMZ-CD154群では、単量体TMZ-CD154は、予測どおりに還元群及び非還元群の両方で検出することができた。しかし、量は還元群で少なかった。非還元群でのみ、TMZ-CD154のオリゴマーを検出することができた。興味深いことに、野生型CD154は両群で単量体形態で検出することができた。このことから、TMZ-CD154発現は野生型CD154の発現も誘引することが示唆される。第二に、残る細胞をフローサイトメトリにより分析した。プラスミド-TMZ-CD154を用いる293細胞のトランスフェクションはTMZ-CD154の強力な細胞表面発現をもたらした一方、模擬コントロールプラスミドはTMZ-CD154発現をもたらさなかった(図2B)。第三に、TMZ-CD154若しくは野生型CD154を発現するウイルス又は導入遺伝子を有しない(模擬)ウイルスで形質導入したか、又は形質導入しなかった腫瘍細胞の上清をELISAにより分析して、培地へのCD154の放出を測定した。結果は、TMZ-CD154が野生型CD154に匹敵するような高量では細胞上清中に放出されないことを示す(図2C)。CD154は通常、Ｔ細胞の活性化及び増殖を駆動する。TMZ-CD154は細胞内シグナル伝達ドメインを欠く。TMZ-CD154がTMZ-C154発現Ｔ細胞で無制御の自己増殖を引き起こさないことをしめすため、Ad5/35-TMZ-CD154若しくはAd5/35-模擬で形質導入するか又は形質導入しないままとする前に、Ｔ細胞をOKT-3及びIL2で活性化した。細胞をIL2と共に又はIL2なしで48時間培養し、細胞数を測定した。図2Dは、IL2がＴ細胞の拡大を駆動すること及びTMZ-CD154の追加が更なる増殖を誘導しないことを示す。Ｔ細胞は、TMZ-CD154の存在とは無関係に、IL2の添加なしでは増殖しない。
【００９１】
実施例２
ウイルス遺伝子ビヒクルを用いるTMZ-CD154遺伝子の導入及び発現
ウイルス遺伝子ビヒクル導入系を用いてTMZ-CD154遺伝子を導入し、細胞での発現を導くことが可能であることを実証するため、アデノウイルスベースの遺伝子ビヒクル(Ad5/35-TMZ-CD154)を構築した。Ad5/35-TMZ-CD154を293細胞の形質導入に用いた。その後、これら細胞の表面では強力なTMZ-CD154遺伝子発現を検出することができた一方、模擬コントロールウイルスはTMZ-CD154発現を誘導することができなかった(図3A)。
【００９２】
実施例３
腫瘍細胞に対するTMZ-CD154遺伝子の導入及び発現
TMZ-CD40Lを発現するように腫瘍細胞を遺伝子操作することが可能であることを実証するため、Ad5/35-TMZ-CD154ベクターを用いて膵臓ガンに由来する腫瘍細胞系(Panc01)にTMZ-CD154を導入した。形質導入細胞株はAd5/35-TMZ-CD154での形質導入によりTMZ-CD154を発現したが、模擬コントロールベクターでの形質導入では発現しなかった(図3B)。以前に示されたように、CD154発現腫瘍細胞は、実験モデルで腫瘍細胞ワクチンとして効率的に用いることができ(Loskog Aら JU 2001)、インビトロでDC活性化及びＴ細胞拡大の刺激に用いることができる(Loskog Aら CGT 2002；Loskogら JI 2004；Loskogら CII 2006)。
【００９３】
実施例４
腫瘍溶解性Ad5/35-TMZ-CD154ベクターの細胞殺傷効力の評価
腫瘍溶解性Ad5/35-TMZ-CD154ベクターにより腫瘍細胞を溶解させることが可能であることを実証するため、腫瘍細胞(Ａ)Panc01、Ｂ)MiaPaCa2、Ｃ)BxPC3、Ｄ)Karpas-422)をAd5/35-TMZ-CD154(MOI 100ffu/細胞)で形質導入した。３日目に、「材料及び方法」に記載した細胞生存能アッセイで細胞の生存能を分析した。結果は、腫瘍溶解性Ad5/35-TMZ-CD154ベクターが、複製欠損ウイルスを用いた場合より又は非形質導入細胞と比較して腫瘍細胞を良好に殺傷することを明確に証明した(図４)。複製コンピテントAd5/35-TMZ-CD154群は、Panc01細胞株に対して、対応する複製コンピテントAd5/35-模擬ベクターに匹敵する細胞毒性の増強を示した。他の２つの細胞株に対しても、TMZ-CD154群は細胞毒性の増大を示したが、その差に有意差はなかった。このウイルスはリンパ腫細胞株Karpas-422に大しても同等に効果的であった。
【００９４】
実施例５
樹状細胞に対するTMZ-CD154遺伝子の導入及び発現
TMZ-CD154により抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を活性化することが可能であることを実証するため、ヒト細胞で活性化研究を行った。単球は、CD14 MACSビーズを用い「材料及び方法」の記載のようにバフィーコートから調製した末梢血単核細胞から選別した。次いで、単球をIL-4及びGM-CSFと共に７日間培養して未成熟樹状細胞に分化させた。次いで、未成熟樹状細胞を、プラスミド-TMZ-CD154又は模擬コントロールをトランスフェクトした293細胞と共に培養した。２日後、細胞及び上清を採集し、樹状細胞の活性化状態についてフローサイトメトリ(CD83活性化マーカー)及びELISA(IL-12活性化マーカー)により分析した。結果は、TMZ-CD154刺激に付された樹状細胞が、CD83の発現を増大させ且つIL-12を高レベルで産生する活性化表現型に成熟したことを示す(図5A、B)。TMZ-CD154刺激樹状細胞が可溶性三量体CD154(stCD40L)又は多量体可溶性CD154(多量体sCD40L)より有意に高い量のIL-12を発現することから、膜結合型CD154(TMZ-CD154を含む)が樹状細胞の活性化をより高度に誘導することも結果から示される。
【００９５】
実施例６
Ad5/35-TMZ-CD154での樹状細胞の形質導入
Ａ．抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)をAd5/35-TMZ-CD154ベクターで形質導入することが可能であることを実証するため、未成熟樹状細胞をこのベクター又は模擬コントロールで形質導入した。結果は、Ad5/35-TMZ-CD154で形質導入した樹状細胞が、CD83を発現し且つIL-12を産生する活性化樹状細胞に成熟したことを証明する(図6A、B)。Ad5/35-TMZ-CD154活性化DCはHLA-DR、CD86及びCD70の発現も増大していた(図6A)。
Ｂ．TMZ-CD154により活性化した抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)が抗原特異的Ｔ細胞応答(例えば、抗ウイルスCMV特異的Ｔ細胞)を誘導可能であることを実証するため、Ad5/35-TMZ-CD154又は模擬コントロールで形質導入した樹状細胞を、「材料及び方法」に記載のように、pp65 CMVペプチドと培養し、自家Ｔ細胞と共培養した。11日間の拡大後に、pp65特異的Ｔ細胞のレベルを四量体染色及びフローサイトメトリにより測定した。結果は、TMZ-CD154活性化樹状細胞がpp65特異的Ｔ細胞を活性化し、拡大させることができたことを示す(図７)。
【００９６】
実施例７
ヒトCD154発現アデノウイルスがイヌ由来免疫細胞の活性化を誘導可能であることは以前に示されている(von Eulerら JIT 2008)。ウマのPBMCもCD154発現アデノウイルスにより活性化を示す。なぜならば、PBMCのウイルス形質導入後にリンパ球集団が拡大するからである(「材料及び方法」を参照)(図8A)。更に、MCP-1は形質導入PBMCの上清中で増加する(図8B)。
【００９７】
実施例８
インビボ腫瘍成長抑制
Ad5/35-TMZ-CD154が腫瘍成長をインビボで抑制可能であることを実証するため、ヒト異種移植Panc01腫瘍を有するマウスをAd5/35-TMZ-CD154又はPBSで１回処置した。７日目に、腫瘍体積を測定した。結果は、Ad5/35-TMZ-CD154がその腫瘍溶解能に起因してインビボで腫瘍進行を阻害可能であることを証明する(図９)。ヒトTMZ-CD154はマウスCD40と交差反応しないため、このウイルスの免疫学的効果はマウスモデルで評価することができない。更に、このウイルスはマウス腫瘍では複製せず、よって免疫欠損マウスでヒト異種移植モデルを用いなければならない。
【００９８】
実施例９
ベクター系でのTMZ-CD154と他の免疫モジュレーターとの組合せ
TMZ-CD154と他の免疫モジュレーターとの組合せが可能であることを実証するため、プラスミド及びアデノウイルスベクター系で、TMZ-CD154遺伝子構築物を4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R scFv遺伝子と共に遺伝子操作した。
配列番号６(DNA)、配列番号７(タンパク質)
TMZ-CD154/4-1BBL遺伝子
1-6：コザック配列
7-768：4-1BBL
769-831：T2Aペプチド
832-1668：TMZ-CD154
【００９９】
【化８−１】
0006524208.tif 000012
【化８−２】
0006524208.tif 000013
【０１００】
配列番号８(DNA)、配列番号９(タンパク質)
TMZ-CD154/aIL6R scFv遺伝子
1-6：コザック配列
7-59：SigPep
60-798：aIL6R scFv
799-861：T2Aペプチド
862-1698：TMZ-CD154
【０１０１】
【化９−１】
0006524208.tif 000014
【化９−２】
0006524208.tif 000015
【０１０２】
実施例10
細胞でのTMZ-CD154/4-1BBL/aIL6R scFv遺伝子の発現
Ａ．プラスミド-TMZ-CD154/4-1BBL及びプラスミド-aIL6R scFvを用いてTMZ-CD154/4-1BBL/aIL6R scFv遺伝子を導入し、その発現を細胞で誘導可能であることを実証するために、プラスミド-TMZ-CD154/4-1BBL及びプラスミド-aIL6R scFvを293細胞のトランスフェクションに用いた。結果は、これらプラスミドでのトランスフェクションにより全ての導入遺伝子を発現可能であることを証明する(図10)。「材料及び方法」を参照。
Ｂ．TMZ-CD154を、2Aペプチドで分離した別の遺伝子とトランスで発現可能であることを実証するため、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBLを用いて樹状細胞を形質導入した。結果は、これらウイルスベクターでの形質導入により両導入遺伝子とも発現可能であることを証明する(図11)。「材料及び方法」を参照。
【０１０３】
実施例11
TMZ-CD154と4-1BBリガンド又はaIL6R scFvとの組合せによる樹状細胞の活性化
TMZ-CD154と4-1BBリガンドとの組合せが抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を活性化することが可能であることを実証するため、未成熟樹状細胞を、Ad5/35-TMZ-CD154、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL、Ad5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFvベクター若しくは模擬ベクターで形質導入したか又は形質導入しないままとした。結果は、CD83発現により示されるように、形質導入樹状細胞が、導入遺伝子の発現により成熟し活性化されたことを証明する(図12)。更に、TMZ-CD154含有ウイルスが、樹状細胞を空の模擬ウイルスで刺激した場合より高いCD70発現を生じるときでさえ、これら組合せウイルスは、TMZ-CD154単独と比較して、樹状細胞上のCD70のアップレギュレーションをもたらした(図13)。更に、形質導入樹状細胞は、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL群で、より高レベルのIFNg及びIL12を発現した(図14)。「材料及び方法」を参照。
【０１０４】
実施例12
抗原特異的Ｔ細胞の活性化
TMZ-CD154/4-1BBLの組合せ又はTMZ-CD154/aIL6Rの組合せにより刺激した樹状細胞が抗原特異的Ｔ細胞を活性化することが可能であることを実証するため、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBLベクター又はAd5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFvベクターで形質導入し且つpp65 CMVペプチドでパルスした樹状細胞を、自家Ｔ細胞と共培養した。11日間の拡大後、活性化したpp65特異的Ｔ細胞の数を測定した。結果は、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL又はAd5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFvで刺激した樹状細胞が、ドナーの単核細胞での抗原特異的Ｔ細胞の数と比較して、抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、拡大させることが可能であることを示す(図15A)。TMZ-CD154と4-1BBリガンド又はaIL6R scFvとの両方を含むウイルスで形質導入した樹状細胞は、TMZ-CD154を単独で含むウイルスで形質導入した樹状細胞より、拡大後の細胞数が多かった(図15B)。TMZ-CD154及び4-1BBリガンドの両方を有するウイルスは、培養物中のNK細胞も拡大させた(図15C)。「材料及び方法」を参照。
【０１０５】
実施例13
他の療法との組合せでのTMZ-CD154
TMZ-CD154と他の療法との組合せが可能であることを実証するため、腫瘍細胞をAd5/35-TMZ-CD154、Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL又はA5/35-TMZ-CD154/aIL6Rの単独及びゲムシタビン(100μM)との組合せで処置した。結果は、ガン細胞殺傷能力を喪失することなくAd5/35-TMZ-CD154と他の療法との組合せが可能であること及び他の療法との組合せが腫瘍細胞死を増加させることを証明する(図16A)。Panc02マウス膵臓腫瘍細胞をC57BL6マウスで増殖させ、TMZ-CD154＋4-1BBLを有する腫瘍溶解性アデノウイルスで週２回で６回の処置±ゲムシタビン(25mg/kg)で週１回で３回の処置を施した。腫瘍成長を経時的に評価した。Ｃ)Panc01ヒト膵臓細胞を上記(Ａ)のように形質導入し、パクリタキセル(２μM)と共に又はパクリタキセルなしで培養した。＊はｐ＜0.05の差を示す。「材料及び方法」を参照。
【０１０６】
実施例14
ヒトTMZ-CD154はマウスCD40を活性化することができない。したがって、骨髄系由来サプレッサー細胞の存在を低減させる(このことにより腫瘍環境中へのＴ細胞の浸潤及び腫瘍環境中での生存が可能になる)ことによるＴ細胞療法への腫瘍の事前感作にインビボでのAd-CD154媒介免疫活性化を用いることが可能であることを証明するために、マウスCD154をAd5ベクターに挿入した。結果は、Ad-CD154処置腫瘍が骨髄系由来サプレッサー細胞の数を減少させ(図17A)、腫瘍浸潤Ｔ細胞を誘引し活性化する能力を増大させたことを示す(図17B)。「材料及び方法」を参照。事実、TMZ-CD154は単独で又は4-1BBLと共に、内皮細胞表面でＥ-セレクチン及びICAM-Iをアップレギュレートすることができる。Ｅ-セレクチン及びICAM-Iは付着性及び血管外漏出の増大によるリンパ球の動員に重要である(図18)。
【０１０７】
実施例15 − LOAd703に関する前臨床データの概要
腫瘍溶解能
LOAd703が腫瘍細胞の腫瘍溶解を誘導する能力を膵臓ガン細胞株のパネルで評価した。LOAd703で形質導入した全ての細胞株がTMZ-CD40L及び41BBL導入遺伝子を発現し、用量依存性の細胞死が経時的に観察された。細胞は、フローサイトメトリによるアネキシンＶの検出により示されるように、主にアポトーシスで死亡した。しかし、健常ドナーの免疫細胞(例えば、DC、Ｔ細胞又はNK細胞)は、導入遺伝子発現を検出しても(DC、Ｔ細胞)、LOAd703媒介腫瘍溶解では死亡しなかった。更に、LOAd703は正常外分泌膵臓細胞で複製せず、このことから、このOVの調節された複製が示される(図19)。LOAd703の複製は膵臓ガン細胞に限らず、他の腫瘍も同様に標的することができる。なぜならば、ほとんどの腫瘍はRb経路が調節不全となっているからである。よって、LOAd703は、Ｂ細胞リンパ腫又は肺腺ガン腫に由来する他の腫瘍細胞株の腫瘍溶解も効率的に誘導し得る。更に、LOAd703媒介腫瘍溶解による腫瘍細胞死は、膵臓ガン患者に通常用いる化学療法剤(例えば、ゲムシタビン又はパクリタキセル)で増強し得る(図16)。
LOAd703を、皮下ヒト膵臓ガン腫瘍が確立した異種移植マウスで、単回又は複数回(６回まで)の腫瘍周囲注射として用いた。異種移植モデルは免疫欠損マウスを利用しているので、LOAd703は、腫瘍溶解のみに依拠して腫瘍縮退を誘導し得る。侵攻性モデル(より大きな腫瘍)で、ゲムシタビンはLOAd703の効力を有意に増大させ得る。これらデータは、LOAd703を膵臓ガン患者の標準治療法たるゲムシタビンとの組合せで用いるべきことの根拠を示すものである(図16)。
【０１０８】
免疫刺激効果
ヒト単球由来樹状細胞のLOAd703形質導入は、細胞表面マーカー(例えば、CD83及びCD70)発現のアップレギュレーションにより示されるように、該細胞の成熟を誘導した(図12及び13)。成熟DCは、Th1促進性サイトカインIL12、TNFα、IL21及びIFNγも発現し放出した(図14)。活性化DCは、その後、特異的Ｔ細胞応答を誘導し、Ｔ細胞及びNK細胞の両方の拡大を誘導し得る(図15)。よって、LOAd703は腫瘍細胞に対するTh1媒介免疫を強力に誘導し得る。全血におけるLOAd703に対する即時応答を、(循環している全血にインビトロでウイルスを添加する)健常ドナー血液ループモデルで検証した。結果は、LOAd703血清型5/35ウイルスが即時の補体活性化もサイトカイン放出も誘導せず、既に患者に用いているアデノウイルス血清型５(CD40Lをコードする)に匹敵したことを証明する(図20)。
不運なことに、マウス細胞はウイルス取込みレセプターであるCD46を欠くため、動物モデルでLOAd703を免疫刺激効果について調べることができない。インビトロ形質導入を高いウイルス/細胞比で実行できるとしても、インビボでの効率的な形質導入に必要な高いウイルス/細胞用量を達成することは困難である。にもかかわらず、マウスTMZ-CD40L及び41BBLを発現するマウス版LOAd703(mLOAd703)を、膵臓ガンのマウスモデルに用いた。２つの導入遺伝子であるマウスTMZ-CD40L及び4-1BBLを発現するように、マウス腫瘍細胞をインビトロで形質導入した。次に、形質導入腫瘍細胞をマウスに注射し、マウスを腫瘍成長についてモニターした。CD40L+4-1BBL+腫瘍細胞は抗腫瘍免疫を活性化し、腫瘍を形成しなかった。CD40L及び4-1BBLを欠くコントロール腫瘍は14日以内に腫瘍を形成した。
【０１０９】
内皮細胞は、CD40を発現するので、CD40Lシグナル伝達に反応し得る。ヒト内皮細胞(HUVEC)を用いるモデルで、HUVEC細胞がLOAd703形質導入によりＴ細胞の付着、ローリング及び血管外漏出のレセプターをアップレギュレートすることが証明された(図18)。よって、LOAd703は、Ｔ細胞の腫瘍実質への浸潤を増強することにより、(腫瘍特異的Ｔ細胞活性の一般的な問題である)腫瘍浸潤性リンパ球の間質への局在を防止し得る。マウス細胞は上記のようにCD46を欠くため、LOAd703はインビボでマウス細胞を形質導入しない。アデノウイルス血清型５はマウス細胞をより良好に形質導入する。したがって、マウスCD40Lを有するAd5ウイルスを用いて、HUVEC細胞が形質導入によりＴ細胞の付着、ローリング及び血管外漏出に重要なレセプターを発現すること及び腫瘍へのインビボ遺伝子導入が実際に活性化Ｔ細胞の大量浸潤を誘導することを証明し、LOAd703もまた、Ｔ細胞療法の前に腫瘍をプライムするために効率的に用いることが可能であることを示した(図21)。
【０１１０】
インビボ毒性データの概要
ヒト免疫刺激性遺伝子を備えたアデノウイルスベースの腫瘍溶解性ウイルスの完全な効力及び毒性可能性は、動物モデルを用いて評価することが困難である。第一に、アデノウイルスはマウス細胞で十分に複製しない。よって、腫瘍溶解は、免疫欠損マウスにヒト腫瘍細胞を用いる異種移植モデルで測定する必要がある。オフターゲット毒性(例えば、健常細胞の形質導入及び溶解のおそれに至るウイルスの拡散)は、マウスで測定することができない。にもかかわらず、インビトロデータは、LOAd703が正常細胞(外分泌膵臓細胞を含む)で複製しないことを示した。ヒトCD40Lはマウス細胞では反応性でないため、導入遺伝子発現による毒性もの検証も妨げられる。更に、マウス腫瘍細胞はCD46を発現しないので、ウイルス形質導入は(細胞あたりのウイルス粒子を増加させてCD46の必要性を回避可能な)インビトロ設定に限られる。したがって、マウスTMZ-CD40L及び4-1BBLを発現するインビトロ形質導入マウス膵臓ガン細胞をマウスの皮下に注射して、導入遺伝子発現の毒性の可能性を調べた。繰返し注射(３回)による有害反応は見られなかった。
腫瘍を有するゴールデンハムスターにもLOAd703を繰返し注射した(４回)。アデノウイルスはゴールデンハムスターで幾らかの腫瘍溶解活性を示すが、ヒト導入遺伝子は最適に機能せず、十分に規定された抗腫瘍免疫反応をハムスターで測定するツールはほとんど存在しない。そうではあるが、処置したハムスターで有害反応は見られなかった。
【０１１１】
実施例16 − TMZ-CD154＋4-1BBL(LOAd703)の着想の証明
TMZ-CD154＋4-1BBLが有効であるとの着想を証明するための臨床試験プロトコルを開発した。Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL腫瘍溶解性ウイルスをGMP条件下で作製し、１〜３の転移を有すると診断され、第一標準治療のゲムシタビン治療を開始している膵臓ガン患者を治療するための治験医薬品として用いる。この試験では、ウイルス(500μl)を画像誘導腫瘍内注射により送達する一方、疾患がより拡散している他の試験では、全身送達を考え得る。この第I/IIa相試験では、安全性プロフィールに応じて最大17〜26人の患者を評価する。簡潔には、第１の患者コホートには、標準治療のゲムシタビン治療を補完してAd5/35-TMZ-CD154/4-1BBL(１×10e11 VP)を単回投与する。次のコホートには、高用量５×10e11 VPのAd5/35-TMZ-CD154/4-1BBLを投与する(図22)。単回投薬与が安全であれば、次のコホートには、標準治療の補完としてAd5/35-TMZ-CD154/4-1BBL(５×10e11 VP/処置)を反復投与する(６回)(図23)。患者を、安全性、腫瘍抑制に対する効力、ウイルス薬物動態及び抗ウイルス抗体の生成についてモニターし、免疫活性化についても同様にモニターする(免疫細胞の表現型決定並びにタンパク質マーカー(例えば、サイトカイン)についての血清又は血漿及び生検の測定を含む)。第I/IIa相試験が成功すれば、第IIb相無作為化試験を行い、ゲムシタビン単独を、ゲムシタビンとAd5/35-TMZ-CD154/4-1BBLとの組合せと比較する。
【０１１２】
下記に、試験の詳細を更に説明する。
治験品：LOAd703
活性物質：CMVプロモーターが駆動する導入遺伝子カセット並びに膜結合型CD40リガンド(TMZ-CD40L)及び完全長4-1BBLのヒト導入遺伝子を含む改変アデノウイルス血清型5/35
製造業者：Baylor College of Medicine，Houston，TX。
用量：注射あたり500μl懸濁物中１〜５×1011ウイルス粒子(VP)。500μl懸濁物でのより高濃度のウイルス粒子は、ウイルス粒子の凝集を引き起こし得るので、推奨しない。
剤型：懸濁状態のLOAd703アデノウイルス粒子、650μl/バイアル、１×1012VP/ml(低用量；２×1011 VP/ml)。
投与
LOAd703は、500μlのLOAd703ウイルス懸濁物で、画像誘導腫瘍内注射により送達する。試験者の指示により、腫瘍の位置に応じて、種々の画像化技法を用いることができる。
経皮注射で接近容易な腫瘍には、LOAd703は、好ましくは、腫瘍転移への腹部超音波誘導経皮注射により投与することができる。内視鏡超音波誘導注射で、より良好に接近できる腫瘍もある。試験者の指示により、他の画像化技法、例えばコンピュータトモグラフィー(CT)誘導注射も用いることができる。
【０１１３】
第I/IIa相試験での用量の根拠
初期用量は、治療あたり500μl懸濁物中１×1011 VPのLOAd703の単回注射である。この根拠は、500μl懸濁物中2.5×1011 VPの用量で繰返し(４〜８回)安全に注射されている先行品AdCD40Lの腫瘍内注射での経験による。LOAd703はAdCD40Lとは異なり腫瘍溶解性ウイルスであるため、より低い初期用量を選択した。この用量が２人の被験患者で安全であれば、次の用量レベルは、500μl懸濁物中５×10e11 VPの単回用量である。この用量を追加の２人の患者に投与する。次の３人の患者には、１週間おきにLOAd703をその選択用量で６回腫瘍内注射する。安全であれば、第IIa相試験で10人の患者に複数回用いて、より大きなコホートでの安全性を確認する。
免疫系は刺激への反復曝露により反応性が亢進するので、単回投薬患者では効力も毒性も持続すると予測されない。したがって、単回投薬での用量増大の間は、２＋２デザインを選択し、複数回投薬には標準的な３人の患者を用いて、第IIa相に入る前に安全性を確証する。
用量制限毒性(DLT)が決まれば、用量を調整することができる。
【０１１４】
患者集団
膵管腺ガン腫(PDAC)は最も侵攻的なガンの１つであり、全ての主要なガンのうち死亡率が最も高い。膵臓ガンは、希少適用症であるとしても、米国で４番目に死亡率が高いガンである。当初、症状はほとんど見られず、したがって患者は腫瘍が既に転移してから診断されることが多い。膵臓ガンは高度の薬剤耐性プロフィールを有し、生存に対して有意に有益である薬剤はほとんどない。標準治療は現時点ではゲムシタビンであるが、他の薬剤、例えばパクリタキセルとの組合せ療法が転移膵臓ガンについて最近認可された。診断患者の10〜20％は、ガンが局在しているが、その僅か20％が外科手術及びアジュバント化学療法を受けるにすぎない。膵臓ガンの１年生存率は約20％であり、５年後には僅か６％しか生存しない。しかし、外科手術に適した患者亜群に限れば、５年生存率は20％である。
本試験には、局所的に進行した疾患(単一病変)を有する患者及び進行しているが病原の数が少ない(２〜３)患者を参加させる。
【０１１５】
研究の目的及び終点
PDACと診断された患者は治療選択肢が限られており、腫瘍が依然として膵臓に局在しているか又は僅か数箇所にしか転移していない場合であっても、予後はよくない。局所免疫刺激性遺伝子療法は、病変が単一又は少数である患者には価値があり得るが、高リスクプロフィールを有する。このような患者は、腫瘍を標的するのみならず、免疫抑制細胞のレベルも低減させる標準療法(ゲムシタビン)を受ける。LOAd703は１つの病変に投与する。アデノウイルス粒子自体は、炎症応答を導く病原体関連分子パターン(PAMP)(例えば、TLR2及びTLR9)と相互作用する。腫瘍溶解は、抗原提示細胞(例えば、DC)による抗原取込みを補助し、新たなビリオンの近傍細胞への感染を可能にして免疫刺激性導入遺伝子の発現を延長する。TMZ-CD40Lは、腫瘍抗原を取り込むDCを活性化して新たなCTL、NK細胞及びM1マクロファージ応答を刺激し、内皮細胞を活性化して腫瘍実質へのリンパ球進入を増加させることができる一方、4-1BBLは、既存の腫瘍浸潤性Ｔ細胞及びNK細胞を再刺激して腫瘍細胞の撲滅を補助すると共に、新規刺激免疫細胞の腫瘍進入時の生存を延長する可能性がある。生じた免疫は、その後、遠位の腫瘍細胞にも作用して腫瘍成長速度を低減させるか、又は新たな転移病変形成を予防さえする可能性がある。
【０１１６】
目的
第Ｉ相試験
第Ｉ相試験の目的は、標準治療の間に、２用量レベルのLOAd703の画像誘導腫瘍内注射の実現可能性及び安全性を用量あたり２人の患者で決定し、選択用量での６回の反復注射の実現可能性及び安全性を３人の患者で決定することである。
第IIa相試験
第IIa相試験の目的は、標準治療と組み合わせた反復LOAd703療法の安全性及び効果を決定することである。
【０１１７】
終点
第Ｉ相
第Ｉ相の部の終点は毒性を評価することである。
１．身体検査、血液学的分析及び臨床化学的分析を用いる標準的な基準による毒性
２．定量的リアルタイムPCRを用いる、血液中及び生検(複数回投薬のみ)中のLOAd703ウイルスのコピー
３．ELISAを用いる血中の抗アデノウイルス抗体
４．ELISA及び/又はマルチプレックスベースの方法(例えば、ProSeek)による血中及び腫瘍溶解物中(複数回投薬のみ)の免疫学的タンパク質プロフィール
５．フローサイトメトリ及びELISPOTによる血中の免疫学的細胞プロフィール
６．腫瘍位置に応じた適切な画像化及び腫瘍マーカーCA 19-9のモニタリングによる腫瘍に対する効果
【０１１８】
第IIa相
第IIa相の部の終点は腫瘍に対する効果及び安全性である。
１．身体検査、血液学的分析及び臨床化学的分析を用いる標準的な基準による毒性
２．定量的リアルタイムPCRを用いる、生検中及び血中のLOAd703ウイルスのコピー
３．ELISAを用いる血中の抗アデノウイルス抗体
４．ELISA及び/又はマルチプレックスベースの方法(例えば、ProSeek)による血中及び腫瘍溶解物中の免疫学的タンパク質プロフィール
５．フローサイトメトリ及びELISPOTによる血液中の免疫学的細胞プロフィール
６．腫瘍位置に依存する適切な画像化及び腫瘍マーカーCA 19-9のモニタリングによる腫瘍に対する効果
【０１１９】
試験設計
試験設計の概要
本試験は、単回及び複数回投薬により用量を増大させる第Ｉ相と、第Ｉ相で選択した用量レベルを複数回投薬により検証する第IIa相とからなる。第IIa相に入る前にDLTによる用量調整も追加のコホートも必要としない限り、第Ｉ相には７人の患者を参加させる。よって、第Ｉ相では、最大７〜16人の患者を処置し得る。第IIa相の部には最大10人の患者を参加させる。ゲーハンの方法論を適用することにより、LOAd703が、実際には30％の効果(OR)を与えるという事実にもかかわらず、第IIa相の10人の患者の後に少なくとも１人の患者で効果(OR)を不正確に欠くリスクは、５％未満である。本試験には、合計で、最大17〜26人の患者の処置が意図される。
【０１２０】
第Ｉ相
患者は、この研究に関する説明を受け、インフォームドコンセントに署名することにより、健康状態のサンプリング及び放射線検査等についての適格性を決定するスクリーニング相に参加する。患者は、初回の３週間の標準治療ゲムシタビン(1000mg/m2)を開始し、続いて１週間休止する。休止の間、最初の２人の患者は、１×1011 VPのLOAd703の画像誘導腫瘍内注射を１回受け、次の２人の患者は５×1011 VPのLOAd703を１回投薬される(図22)。後者の２人の患者の治療は、最初の２人の患者が用量制限毒性(DLT)を示さずに最終経過観察をパスしたときに開始することもできる。患者は、ウイルス治療後一晩、観察のために入院する。その後、患者は、２回目の３週間のゲムシタビン及び１週間の休止を続ける。図22に示すように、血液サンプルを採取して、毒性、ウイルス薬物動態(例えば、血液への拡散)及び免疫反応を評価する。スクリーニング研究の間及び最終経過観察の時点で、患者は放射線検査を受け、その後に試験を終える。
【０１２１】
単回投薬レジメンが安全であれば、次の３人の患者は、標準治療のゲムシタビン療法と並行して１週間おきに複数回(６回)の腫瘍内注射を受ける(図23)。最初の４人の単回投薬患者で、用量増加の間にLOAd703注射後の即時反応が生じなければ、複数回投薬を受ける患者は、一晩入院する必要がないが、試験者の指示により、ウイルス注射後少なくとも４時間観察し、その後に、病院を退出することができる。
最初のLOAd703注射の前及び最後のLOAd703注射の１週間後に生検を採取する。図23に示すように、種々の時点で血液サンプルを採取し、毒性、ウイルス薬物動態(例えば、血液への拡散)及び免疫反応を評価する。１ヶ月おきに撮像して腫瘍サイズを測定する。６ヶ月の時点で、患者は最終の経過観察分析を受け、その後、試験を終える。この試験への参加後、患者は、臨床ルーティンに従い、病院で標準治療レジメンを続ける。
３人全ての患者が最終のウイルス投薬から少なくとも２週間経過した時点での判断で、３人の患者を安全用量の複数回のウイルス注射により処置できた場合、第IIa相の部を開始することができる。
用量増加又は複数回投薬の間にDLTが生じたら、用量を調整しなければならない。
【０１２２】
第IIa相試験
患者は、この研究に関する説明を受け、インフォームドコンセントに署名することにより、健康状態のサンプリング及び撮像等についての適格性を決定するスクリーニング相に参加する。患者は初回の３週間の標準治療ゲムシタビン(1000mg/m2)を開始し、続いて１週間休止する。休止の間、患者は、選択用量のLOAd703の画像誘導腫瘍内注射によるLOAd703治療を開始する。LOAd703注射は１週間おきに、標準治療のゲムシタビン治療と並行して行う。６回のウイルス投薬を行う。
最初のLOAd703注射の前及び最後のLOAd703注射の１週間後に生検を採取する。図23に示すように、種々の時点で血液サンプルを採取し、毒性、ウイルス薬物動態(例えば、血液への拡散)及び免疫反応を評価する。１ヶ月おきに放射線検査を行い腫瘍サイズを測定する。６ヶ月の時点で、患者は最終の経過観察分析を受け、その後、試験を終える。この試験への参加後、患者は、臨床ルーティンに従い、病院で標準治療レジメンを続ける。第IIa相では合計10人の患者を処置する。
【０１２３】
試験期間
患者はこの試験に２ヶ月間(単回投薬)〜６ヶ月間(複数回投薬)参加する。合計17〜26人の患者を参加させる。２年以内にこの試験を評価して完了する。
試験の終了
試験の終了は、臨床試験に参加した最後の患者が最後に来院した日と規定する。
【０１２４】
具体的実施形態
項目１．
次の構造：
OD-(L)-TD-ED
(式中、
ODはオリゴマー化ドメインであり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは、CD154に由来するか又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来する膜貫通ドメインであり、
EDは、
i)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846、
ii)配列番号11、すなわち配列番号１の残基199〜846であるが、当該分子の切断を回避するように配列番号１の残基397〜420の１又は２以上の核酸が欠失しているか又は別の核酸と交換されているもの、
iii)配列番号12、すなわち配列番号３の残基127〜846、
iv)配列番号13、すなわち配列番号４の残基127〜844、
v)配列番号14、すなわち配列番号５の残基127〜844、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択されるCD154の細胞外ドメインである)
を含んでなるが、配列番号16の等価ヌクレオチド配列に相当する細胞内CD154領域を含まないヌクレオチド配列。
【０１２５】
項目２．
膜貫通ドメインがCD154、ヒトOX40リガンド又はヒトCD70に由来する、項目１に記載のヌクレオチド配列。
項目３．
膜貫通ドメインが
i)配列番号17、すなわち配列番号１の残基127〜198、
ii)配列番号20、すなわちヒトOX40リガンドの膜貫通ドメイン、又は
iii)配列番号22、すなわちヒトCD70の膜貫通ドメイン
と少なくとも90％の配列同一性を有する、項目２に記載のヌクレオチド配列。
項目４．
膜貫通ドメインが配列番号17、配列番号20又は配列番号22と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有する、項目３に記載のヌクレオチド配列。
項目５．
膜貫通ドメインが配列番号17を有する、項目４に記載のヌクレオチド配列。
項目６．
オリゴマー化ドメインがイソロイシンジッパー又はT4フィブリチンの三量体化ドメインである、項目１〜５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【０１２６】
項目７．
オリゴマー化ドメインが配列番号23、すなわち配列番号１の残基10〜108を有するイソロイシンジッパーである、項目６に記載のヌクレオチド配列。
項目８．
コザック配列を更に含んでなる項目１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目９．
コザック配列が配列番号１の残基１〜９に相当する、項目８に記載のヌクレオチド配列。
項目10．
配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも90％の配列同一性を有する項目１〜９のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目11．
配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも95％又は98％の配列同一性を有する項目１〜10のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【０１２７】
項目12．
配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と100％の配列同一性を有する項目１〜11のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目13．
免疫モジュレーターと組み合わされた項目１〜12のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目14．
免疫モジュレーターが4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R scFv遺伝子である、項目１〜13のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目15．
シグナル伝達経路モジュレーターと組み合わされた項目１〜14のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目16．
シグナル伝達経路モジュレーターが抗IL6R scFvである、項目１〜15のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【０１２８】
項目17．
シグナル伝達経路ブロッカーと組み合わされた項目１〜14のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目18．
配列番号６又は配列番号８と少なくとも95％、98％又は100％の配列同一性を有する項目14に記載のヌクレオチド配列。
項目19．
医薬に使用するための項目１〜18のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目20．
診断ツールとしての使用のための項目１〜18のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
項目21．
項目１〜20のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質。
【０１２９】
項目22．
次の構造：
OD-(L)-TD-ED,
(式中、
ODはオリゴマー化ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
(L)は存在していても存在していなくてもよいリンカーであり、
TDは膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列であり、
EDは
i)配列番号11のヌクレオチド、すなわち配列番号１の残基199〜846に相当するアミノ酸残基、
ii)配列番号11のヌクレオチド、すなわち配列番号１の残基199〜846に相当するアミノ酸残基であるが、当該分子の切断を回避するように配列番号１の397〜420のヌクレオチドに相当する１又は２以上のアミノ酸残基が欠失しているか又は別のアミノ酸と交換されているもの、
iii)配列番号12のヌクレオチド、すなわち配列番号３の残基127〜846に相当するアミノ酸残基、
iv)配列番号13のヌクレオチド、すなわち配列番号４の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
v)配列番号14のヌクレオチド、すなわち配列番号５の残基127〜844に相当するアミノ酸残基、
vi)i)〜v)のいずれかに規定される配列と少なくとも95％、98％又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
vi)哺乳動物由来の対応する細胞外CD154ドメイン
から選択されるCD154の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列である)
を含んでなるが、配列番号15のアミノ酸配列に対応する細胞内CD154領域に相当するアミノ酸配列を含まないタンパク質。
【０１３０】
項目23．
EDが配列番号24に対して少なくとも90％又は少なくとも95％の配列同一性を有する、項目22に記載のタンパク質。
項目24．
オリゴマー化ドメインがイソロイシンジッパードメイン又はT4フィブリチンの三量体化ドメインである、項目21〜23のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目25．
膜貫通ドメインがCD154の膜貫通ドメインに由来するか又は任意のII型膜貫通タンパク質に由来する、項目21〜24のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目26．
膜貫通ドメインに相当するアミノ酸配列が配列番号18に対して少なくとも90％、95％、98％又は100％の配列同一性を有する、項目22〜25のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目27．
配列番号18の１又は２以上の残基が欠失しているか又は別のアミノ酸と置換されていてもよい、項目22〜26のいずれか１項に記載のタンパク質。
【０１３１】
項目28．
前記残基がaa14及び/又はaa16である、項目27に記載のタンパク質。
項目29．
配列番号２と少なくとも90％、95％又は98％の配列同一性を有する項目21〜28のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目30．
配列番号２と100％の配列同一性を有する項目21〜29のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目31．
医薬に使用するための項目21〜30のいずれか１項に記載のタンパク質。
項目32．
本明細書に記載の疾患の治療に使用するための項目21〜31のいずれか１項に記載のタンパク質。
【０１３２】
項目33．
医薬に使用するための、抗ガン剤、免疫モジュレーター及び本明細書に規定する他の医薬物質から選択される医薬物質と組み合わされた項目21〜32のいずれか１つに記載のタンパク質。
項目34．
項目１〜20に記載のヌクレオチド配列を含んでなるビヒクル。
項目35．
プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、細胞、人工細胞及び人工ビヒクルから選択される項目34に記載のビヒクル。
項目36．
ウイルスの形態である項目34又は35に記載のビヒクル。
項目37．
ウイルスがアデノウイルス血清型5/35ウイルスである、項目36に記載のビヒクル。
【０１３３】
項目38．
アデノウイルス5/35ウイルスが、E1A遺伝子の上流にE2Fプロモーター領域/結合部位を有しており、E1A遺伝子の上流のSp1部位、E1A Δ24欠失、E3 Δ6.7K/gp19Kを有していてもよく、pCMV及び導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットがL5遺伝子領域の後に挿入されている、項目37に記載のビヒクル。
項目39．
配列番号１に規定されるTMZ-CD154ヌクレオチドを含んでなる項目34〜38のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目40．
4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R scFv遺伝子を更に含んでなる項目34〜39のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目41．
項目34〜40のいずれか１つに記載のビヒクルの２又は３以上の組合せ。
項目42．
第１のビヒクルが項目34〜41のいずれか１つに記載のものであり、第２のビヒクルが免疫モジュレーター、例えば4-1BBリガンド遺伝子又は抗IL6R scFv遺伝子を含んでなる、２つのビヒクルの組合せ。
【０１３４】
項目43．
医薬に使用するための項目34〜42のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目44．
本明細書に記載の疾患の治療に使用するための項目34〜43のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目45．
ガンの治療に使用するための項目34〜43のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目46．
固形腫瘍の治療に使用するための項目34〜43のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目47．
膵臓ガンの治療に使用するための項目34〜43のいずれか１つに記載のビヒクル。
項目48．
医薬に使用するための、抗ガン剤、免疫モジュレーター及び本明細書に記載の他の医薬物質から選択される医薬物質と組み合わせた項目34〜44のいずれか１つに記載のビヒクル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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