(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重バーコード化核酸分子を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドは分子内逆方向反復およびループを含み、そして前記逆方向反復は前記第１のバーコードを含む、ステップ；
（ｂ）前記第１のバーコードが連結した核酸分子から前記ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを前記第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、前記プライマーは、前記第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分、および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）アニールされた前記プライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、前記二重バーコード化核酸分子は、前記第２のバーコード、前記第１のバーコード、および前記核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードにアニールする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードの一部にアニールする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコード内でアニールしない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）が、ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を前記核酸分子の各末端に連結することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、核酸ライブラリー、またはそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステムループオリゴヌクレオチドの５’末端がホスフェートを欠く、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステムループオリゴヌクレオチドがステムループオリゴヌクレオチドの集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステムループオリゴヌクレオチドのループ、または前記ステムループオリゴヌクレオチドのループに隣接した前記ステムの領域が、複製不可能な塩基または領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステムループオリゴヌクレオチドのループ、または前記ステムループオリゴヌクレオチドのループに隣接したステムの領域が、切断可能な複製停止点を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ニックトランスレーション重合の後かつステップ（ｃ）の前に、前記ニックが前記第１のバーコード化核酸分子から除去され、前記切断可能な複製停止点が切断される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループが切断可能な塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断可能な塩基がデオキシウリジンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断可能な塩基が、ステップ（ｂ）の前に切断されて、脱塩基部位を生じる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結することが、前記ステムループオリゴヌクレオチドの３’末端を前記核酸分子の５’末端にライゲーションすることとさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーがプライマーの集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
伸長することが、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記二重バーコード化核酸分子の少なくとも部分の増幅をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のバーコードが、ランダムなバーコードまたは部分的にランダムなバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のバーコードが、既知の配列または部分的に既知の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１２年１１月５日に出願された米国仮出願第６１／７２２，３５７号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
２ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、２０１３年１１月５日に作成された、「ＲＵＢＣＰ００３１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたファイルに含有される配列表は、電子提出により添付して提出されており、参考として本明細書に援用される。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、一般的に、分子生物学および核酸シーケンシングの分野に関する。より具体的には、それは、核酸をバーコード化する（ｂａｒｃｏｄｉｎｇ）方法に関係する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
バーコードは、核酸分子を同定するために用いることができ、例えば、シーケンシングは、関心対象となる核酸分子に連結されたある特定のバーコードを明らかにすることができる。ある場合では、配列特異的事象は核酸分子を同定するために用いることができ、バーコードの少なくとも一部が配列特異的事象において認識され、例えば、バーコードの少なくとも一部が、ライゲーションまたは伸長反応に関与することができる。したがって、バーコードは、それに連結されているｇＤＮＡ分子の同定、選択、または増幅を可能にすることができる。
【０００５】
関心対象となる核酸分子にバーコードを連結するための一つの方法には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＳｙｓｔｅｍについてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって記載されているような、Ｉｏｎ  ｇＤＮＡ断片ライブラリーの調製が挙げられる。この方法において、ｇＤＮＡの断片がアダプターにライゲーションされ、ゲノムＤＮＡの各断片の少なくとも１つの末端が、バーコードを含むアダプターにライゲーションされる。ライゲーションされたアダプターとｇＤＮＡ断片は、ニック修復され、サイズ選択され、アダプターに指向されたプライマーでのＰＣＲを用いて増幅されて、増幅されたライブラリーを生じ得る。例えば、１６個の異なるバーコードを含むライゲーションアダプターは、１６個の異なるｇＤＮＡ試料を調製するために用いることができ、各試料が固有のバーコードを有し、それゆえに、各試料を、同じＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲによって別々に増幅し、その後、プールする（一緒に混合する）ことができるか、または各試料を最初にプールし、その後、同じＰＣＲプライマーを用いて同時に増幅することができる。結果として、各ｇＤＮＡ試料は、それの付着した固有バーコードにより同定することができる。しがしながら、必要とされる異なるライゲーションアダプターの数は、バーコードの数に等しい。例えば、混合物としてシーケンシングされ得る２５６個の試料ライブラリーの作製は、２５６個の異なるライゲーションアダプターを必要とするだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
二重バーコード化核酸分子を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドは分子内逆方向反復およびループを含み、そして前記逆方向反復は前記第１のバーコードを含む、ステップ；
（ｂ）前記第１のバーコードが連結した核酸分子から前記ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを前記第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、前記プライマーは、前記第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分、および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）アニールされた前記プライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、前記二重バーコード化核酸分子は、前記第２のバーコード、前記第１のバーコード、および前記核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ、
を包含する、方法。
（項目２）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードにアニールする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードの一部にアニールする、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコード内でアニールしない、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）が、ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を前記核酸分子の各末端に連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含まない、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、核酸ライブラリー、またはそれらの断片である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ステムループオリゴヌクレオチドがステムループオリゴヌクレオチドの集団である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループが切断可能な塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記切断可能な塩基がデオキシウリジンである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記切断可能な塩基が、ステップ（ｂ）の前に切断されて、脱塩基部位を生じる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結することが、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの３’末端を前記核酸分子の５’末端にライゲーションすることとさらに定義される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記プライマーがプライマーの集団である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
伸長することが、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記二重バーコード化核酸分子の少なくとも部分の増幅をさらに含む、項目１に記載の方法。
本発明の実施形態は、シーケンシングのための二重バーコード化核酸分子を作製する方法を提供する。核酸分子の同じ末端上に第１および第２のバーコードを有することは、シーケンシング読み取りが第２のバーコードから始まり、第１のバーコードを経て、その後、核酸分子へ続くことを可能にし得る。したがって、第２のバーコード、第１のバーコード、および核酸分子の配列の同定は、二重シーケンシングバーコードを用いる伝統的な方法における場合のような、核酸分子の遠位末端から戻って単一バーコードの配列を読み取るために核酸分子の各末端からのシーケンシング読み取りを提供しなければならないこととは対照的に、単一の読み取りで得られ得る。
【０００７】
したがって、本発明の一実施形態は、以下を含む、二重バーコード化核酸分子を作製する方法に関する：ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、そのステムループオリゴヌクレオチドが分子内逆方向反復およびループを含み、その逆方向反復が第１のバーコードを含む、ステップ；第１のバーコードが連結した核酸分子からステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；プライマーを第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、そのプライマーが、第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびにアニールされたプライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、その二重バーコード化核酸分子が第２のバーコード、第１のバーコード、および核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ。いくつかの態様において、プライマーの第１部分は、第１のバーコードに、または第１のバーコードの一部へアニールする。他の態様において、プライマーの第１部分は、第１のバーコード内でアニールしない。伸長ステップは、ポリメラーゼを用いることにより、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応即ちＰＣＲによって、実施されてもよい。核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、核酸ライブラリー、またはそれらの断片であってもよい。
【０００８】
本発明の一実施形態において、二本鎖核酸分子を提供するステップ；および逆方向反復およびループを含むステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を二本鎖核酸分子に付着させて、オリゴヌクレオチド付着核酸分子を生じるステップを含む、核酸分子を調製する方法がある。二本鎖核酸分子は、いくつかの態様において、二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。特定の実施形態において、付着させることは、オリゴヌクレオチド付着核酸分子においてニック、ギャップ、または５’フラップ構造などの非共有結合性接合部を生じる条件下で、オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸分子に付着させることとしてさらに定義される。本発明の特別な態様において、付着させることは、ライゲーションすることとしてさらに定義される。ライゲーションすることは、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの３’末端を標的核酸分子の５’末端にライゲーションすることとして定義されてもよい。その方法は、オリゴヌクレオチド付着核酸分子からオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換するステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド付着核酸分子の少なくとも部分が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＮＡ転写、または鎖置換などにより、増幅される。本発明の方法は、オリゴヌクレオチド付着核酸分子を増幅するステップであって、ステムループアダプターの分子内逆方向反復の少なくとも部分が増幅されたオリゴヌクレオチド付着核酸分子から排除される、ステップをさらに含んでもよい。
【０００９】
ライゲーションすることの実施形態は、以下を含むとしてさらに定義されてもよい：二本鎖核酸分子上にライゲーション可能な末端を作製するステップ；ステムループオリゴヌクレオチド上にライゲーション可能な末端を作製するステップ；およびステムループオリゴヌクレオチドのライゲーション可能な末端の１つの鎖を核酸分子の末端の１つの鎖にライゲーションし、それにより、オリゴヌクレオチド付着核酸分子においてニック、ギャップ、または５’フラップ構造などの非共有結合性接合部を作製するステップ。さらなる態様において、方法は、核酸分子上に平滑末端を作製するステップ；ステムループオリゴヌクレオチド上に平滑末端を作製するステップ；およびステムループオリゴヌクレオチドの平滑末端の１つの鎖を核酸分子の平滑末端の１つの鎖にライゲーションし、それにより、オリゴヌクレオチドがライゲーションされた核酸分子においてニックを作製するステップを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、方法は、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの１つの鎖を標的核酸分子の各末端に連結するステップを含んでもよい。いくつかの態様において、標的核酸分子の各末端に連結されたステムループアダプターの逆方向反復は、同一の配列を含んでもよい。この態様において、ステムループアダプターを標的核酸分子の各末端へ連結させることは、末端逆方向反復を含む核酸分子を生じ、それにより、その分子がステムループを形成することを可能にするだろう。他の態様において、標的核酸分子の各末端に連結されたステムループアダプターの逆方向反復は、同一の配列を含まなくてもよい。この態様において、ステムループアダプターを標的核酸分子の各末端へ連結させることは、末端逆方向反復を欠く核酸分子を生じ、したがって、その分子はステムループを形成することはできないだろう。
【００１１】
追加の実施形態において、オリゴヌクレオチド付着核酸分子は、３’ヒドロキシ基を有するニックを含み、オリゴヌクレオチド付着核酸分子の少なくとも部分の３’ヒドロキシ基からの重合がある。
【００１２】
鎖置換またはニックトランスレーション重合は、ループ、またはループに隣接したステムの領域における複製不可能な塩基または領域で終わる重合としてさらに定義されてもよい。
【００１３】
本発明の特定の態様において、方法は、二本鎖ＤＮＡ分子をエンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡ断片を生じるステップであって、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ断片の１つの鎖にライゲーションされるようになり、オリゴヌクレオチドがライゲーションされたＤＮＡ断片の重合が、ループ、またはループに隣接したステムの領域における塩基または配列で停止する鎖置換またはニックトランスレーション重合にオリゴヌクレオチドがライゲーションされたＤＮＡ断片を供することにより、ステムループアダプターの分子内逆方向反復の少なくとも部分を排除する、ステップをさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、ステムループオリゴヌクレオチドは、切断可能な塩基を含むとしてさらに定義される。特に、場合によっては、切断可能な塩基は、オリゴヌクレオチドのループに、またはループに隣接したステムの配列に存在する。切断可能な塩基または配列は、脱塩基部位もしくは配列、ヘキサエチレングリコール、および／または糖−ホスフェートバックボーンもしくは塩基に付着したかさ高い化学的部分を含んでもよい。特定の実施形態において、脱塩基部位または配列は、単一溶液における１つまたは複数の酵素により導入される。さらなる特定の実施形態において、ステムループオリゴヌクレオチドのループは、少なくとも１つのデオキシ−ウリジンを含む。
【００１５】
特定の態様において、ステムループオリゴヌクレオチドの５’末端はホスフェートを欠く。
【００１６】
「バーコード」とも呼ばれる、バーコードは、特別な核酸配列を選択することに基づいて作製することができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）シーケンシングは、６個の塩基を利用して、４８個の異なるバーコードを効果的に作製することができる。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサー（例えば、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーまたはＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）シーケンサー）は、６個の塩基を利用して、１６個のバーコードを作製することができる。いくつかの実施形態において、たとえ２つのエラーがシーケンシング中に生じたとしても、別個のバーコードが正しく同定されることを可能にするルールが、バーコードの作製に適用され得る。バーコード化は、例えば、米国特許第７，９０２，１２２号および米国特許公開第２００９／００９８５５５号に記載されている。例えばＰＣＲを用いた、プライマー伸長によるバーコード取り込みは、米国特許第５，９３５，７９３号またはＵＳ  ２０１０／０２２７３２９に記載された方法を用いて実施されてもよい。いくつかの実施形態において、バーコードは、ライゲーションを用いることにより核酸へ取り込まれ得、その後、続いて、増幅することができ、例えば、米国特許第５，８５８，６５６号、米国特許第６，２６１，７８２号、米国特許公開第２０１１／０３１９２９０号、または米国特許公開第２０１２／００２８８１４号に記載された方法は、本発明と共に用いられてもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のバーコードは、例えば、米国特許公開第２００７／００２０６４０号、米国特許公開第２００９／００６８６４５号、米国特許公開第２０１０／０２７３２１９号、米国特許公開第２０１１／００１５０９６号、または米国特許公開第２０１１／０２５７０３１号に記載されているように、用いられてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態は、例えば、米国特許第７，８０３，５５０号に記載された方法によって、作製されたゲノムライブラリーへ第２のバーコードを取り込むが、本発明の方法は、核酸ライブラリーを作製するための幅広い種類の技術と組み合わせて用いられてもよい。例えば、第２のバーコードは、核酸ライブラリーの断片へ取り込まれてもよく、その核酸ライブラリーが、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＤＮＡ試料プレップキットなどのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングと適合性のアプローチで作製されており、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングライブラリー調製物を作製するための追加のアプローチは、例えば、Ｏｙｏｌａら（２０１２）に記載されている。他の実施形態において、核酸ライブラリーは、ＳＯＬｉＤ（商標）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング方法（例えば、ＳＯＬｉＤ（登録商標）Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＳＯＬｉＤ（登録商標）Ｍａｔｅ−Ｐａｉｒｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＳＯＬｉＤ（登録商標）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ、ＳＯＬｉＤ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ、ＳＯＬｉＤ（登録商標）ＳＡＧＥ（商標）Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔなど）と適合性の方法で作製される。本発明の実施形態と共に用いられ得るライブラリー構築のための様々な方法を含む、次世代シーケンシング方法のための追加の方法は、例えば、Ｐａｒｅｅｋ（２０１１）およびＴｈｕｄｉ（２０１２）に記載されている。
【００１８】
追加の実施形態において、本発明の１つもしくは複数の組成物を含み、および／または本発明の少なくとも１つの方法に適した１つもしくは複数の組成物を含む、適切な容器に収容されたキットがある。
【００１９】
本発明の追加の実施形態は、本発明の方法により調製されたＤＮＡ分子のライブラリーを含む。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において用いられる場合、語「含むこと」と共に用いられる時、語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは１つより多いことを意味し得る。
【００２１】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことを明確に示されない限り、またはその選択肢がお互いに排他的ではない限り、「および／または」を意味するように用いられるが、本開示は、選択肢のみを指すという定義と「および／または」を支持する。本明細書で用いられる場合、「別の」は、少なくとも第２の、またはそれ以上を意味し得る。
【００２２】
本出願を通して、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられることになっている装置、もしくは方法についての固有の誤差の変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００２３】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変化および改変が詳細な説明から当業者に明らかになるだろうことから、例証としてのみ示されていることは理解されるべきである。
【００２４】
以下の図面は、本明細書の部分を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することにより、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、単一セットのバーコードの使用  対  第１および第２のセットのバーコードの使用を比較する概略図である。
【図２】図２は、第１のバーコードを付加するためのステムループアダプターの使用、さらに続いて、第２のバーコードを付加するためのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図３】図３は、タンデム型二重バーコードを含有するが、末端逆方向反復を生じないアダプターを示す図である。
【図４】図４は、逆方向反復を含まないタンデム型二重バーコードを用いたリアルタイムＰＣＲライブラリー増幅の結果である。
【図５】図５は、末端逆方向反復を生じる、タンデム型二重バーコードを含有するアダプターを示す図である。
【図６】図６は、逆方向反復を有するタンデム型二重バーコードを用いたリアルタイムＰＣＲライブラリー増幅の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本技術は、核酸分子のバーコード化に関する。タグ、インデキシング配列、または識別子コードとしても記載されるバーコードには、同定を目的として核酸分子に取り込まれる特異的な配列が挙げられる。例えば、合成核酸分子は、ライゲーションおよび／またはプライマー伸長によりゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）と連結することができる。本技術は、複数のバーコード、特に逐次的なバーコードまたはタンデム型バーコードを有する核酸分子を対象としている。タンデム型バーコードの例は、ライゲーション事象（例えば、合成ステムループアダプターへのライゲーション）によるｇＤＮＡ分子の少なくとも１つの末端に連結された第１のバーコード、続いて、プライマー伸長（例えば、ＰＣＲ）によりｇＤＮＡに連結される第２のバーコードを含み、その第１のバーコードがｇＤＮＡ分子に対して近位にあり（挿入断片により近い）、かつその第２のバーコードがｇＤＮＡに対して遠位にある（挿入断片からより遠い）。追加の配列を付加するためのステムループアダプターライゲーションおよびプライマー伸長またはＰＣＲを用いる方法は、例えば、全体として参考として本明細書に援用される、米国特許第７，８０３，５５０号に記載されている。これらの方法は、第１および／または第２のバーコードを核酸分子に付加するために本発明の実施形態において用いられてもよい。
【００２７】
バーコードは、核酸分子を同定するために用いることができ、例えば、シーケンシングは、関心対象となる核酸分子に連結されたある特定のバーコードを明らかにすることができる。場合によっては、配列特異的事象は、核酸分子を同定するために用いることができ、バーコードの少なくとも一部が、配列特異的事象において認識され、例えば、バーコードの少なくとも一部が、ライゲーションまたは伸長反応に関与することができる。したがって、バーコードは、それに連結しているｇＤＮＡ分子の同定、選択、または増幅を可能にすることができる。
【００２８】
関心対象となる核酸分子にバーコードを連結するための一つの方法には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＳｙｓｔｅｍについてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより記載されているような、Ｉｏｎ  ｇＤＮＡ断片ライブラリーの調製が挙げられる。この方法において、ｇＤＮＡの断片は、アダプターにライゲーションされ、ゲノムＤＮＡの各断片の少なくとも１つの末端が、バーコードを含むアダプターにライゲーションされる。ライゲーションされたアダプターとｇＤＮＡ断片は、ニック修復され、サイズ選択され、アダプターに指向されたプライマーでのＰＣＲを用いて増幅され、増幅したライブラリーを生じることができる。例えば、１６個の異なるバーコードを含むライゲーションアダプターを用いて、それぞれが固有のバーコードをもつ、１６個の異なるｇＤＮＡ試料を調製することができ、それゆえに、各試料を、同じＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲによって別々に増幅し、その後、プールする（一緒に混合する）ことができ、または各試料をまずプールし、その後、同じＰＣＲプライマーを用いて同時に増幅することができる。結果として、各ｇＤＮＡ試料は、それの付着した固有バーコードにより同定することができる。しかしながら、このアプローチに関する一つの問題は、必要とされる異なるライゲーションアダプターの数が、バーコードの数に等しいことである。例えば、混合物としてシーケンシングされ得る２５６個の試料ライブラリーの作製は、２５６個の異なるライゲーションアダプターを必要とするだろう。
【００２９】
この問題に取り組むために、ゲノムＤＮＡの断片は、例えば米国特許第７，８０３，５５０号に記載されているようなステムループアダプターおよび方法を用いて、第１セットのバーコードを有するアダプターにライゲーションすることができる。１６個の異なるバーコードを有するアダプターを作製することができ、例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングシステム（例えば、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサー、またはＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）シーケンサー）と共に用いてもよい。その後、第１セットのバーコードを有するライゲーションされたアダプターとｇＤＮＡ断片は、第２セットのバーコードを有するプライマーを用いるプライマー伸長反応またはＰＣＲに供することができる。生じた核酸分子はそれぞれ、核酸分子の少なくとも１つの末端上に、第２セットのバーコード由来の１つのバーコードに隣接した、第１セットのバーコード由来の１つのバーコードを有する。バーコードの正確な数は、特別な適用に基づいて決定され得る；例えば、いくつかの実施形態において、第２のバーコードは６個の塩基を利用して、例えば、１６個の追加のバーコードを生じ得る。とはいえ、適用および／またはシーケンシング方法に依存して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、もしくは１６個、またはそれより多くの塩基を利用して、第２のバーコードを作製してもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも２個、少なくとも３個、または３〜１６個の塩基を用いて、第２のバーコードを作製することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、第２セットのバーコードは、１６個の異なるプライマーを含むことができる。この様式において、１６個の異なるバーコードを有するライゲーションアダプター（第１セットのバーコード）は、（第２セットのバーコードに指向された）１６個の異なるプライマーで増幅され、１６×１６個の固有の組み合わせのバーコードを生じることができ、それは、２５６個の試料をプールし、２５６倍に多重化することを可能にする。このレベルの多重化を達成するためのたった１６＋１６個のオリゴヌクレオチドの使用は、２５６個の有用なライブラリーを作製することにおいて費用と時間のかなりの節約である。好ましくは、第１のバーコードおよび第２のバーコードは、ｇＤＮＡの同じ側に（すなわち、同じアダプターの部分として）あってもよく、シーケンシングの時間および費用を節約するためにお互いと、かつｇＤＮＡと順次シーケンシングすることができる。
【００３１】
追加として、第１のバーコードは、ｇＤＮＡに直接付着してもよいが、第２のバーコードは、ＰＣＲによる増幅中に付着されてもよい。したがって、第１セットのバーコードは、ａ）ｇＤＮＡ試料の全メンバーに同じバーコードでタグをつけるか、またはｂ）ｇＤＮＡ試料の異なるメンバーを異なるバーコードでタグをつけるかのいずれのためにも用いることができる。例えば、ライゲーションが、単一バーコードを用いて実施される場合には、ｇＤＮＡの全メンバーは一般的に同じバーコードを有するだろう。しかしながら、ライゲーションアダプターがランダムな、または部分的ランダムなバーコードで合成される場合には、ｇＤＮＡ試料における異なる分子は、異なるバーコードを有するだろう。極端には、バーコード領域が１６個のランダムな塩基を含有する場合には、６５，５３６個のバーコードが、ライゲーションされた核酸ライブライリー内に示され得る。バーコードは、インプットｇＤＮＡライブラリーの異なるメンバー間を区別するために用いられてもよい；例えば、これらの方法は、ｇＤＮＡライブラリーにおける分子重複（それらの大部分は異なるバーコードを有するだろう）、およびＰＣＲ増幅中に生じた重複（それらの大部分は同一の第１のバーコードを有するだろう）の独立した計数に用いられてもよい。部分的ランダムな第１のバーコードは、個々の試料についての、および個々の分子についての情報を与えるために用いることができる。
【００３２】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる場合、「増幅」は、ヌクレオチド配列または複数のヌクレオチド配列のコピーの数を増加させるための任意のインビトロ過程を指す。核酸増幅は、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヌクレオチドの取り込みを生じる。本明細書で用いられる場合、一つの増幅反応は、多数のラウンドのＤＮＡ複製からなってもよい。例えば、一つのＰＣＲ反応は、３０〜１００「サイクル」の変性および複製からなり得る。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「ヌクレオチド」は、塩基−糖−ホスフェートの組み合わせを指す専門用語である。ヌクレオチドは、核酸重合体、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡの単量体の単位である。その用語は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、またはｒＵＴＰなどのリボヌクレオチド三リン酸、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。
【００３４】
「ヌクレオシド」は、塩基−糖の組み合わせ、すなわち、ホスフェートを欠くヌクレオチドである。ヌクレオシドとヌクレオチドという用語の使用法において、特定の交換可能性があることは当技術分野において認識されている。例えば、ヌクレオチドのデオキシウリジン三リン酸、ｄＵＴＰは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸である。ＤＮＡへの取り込み後、それは、ＤＮＡ単量体としての役割を果たし、正式には、デオキシウリジレート、すなわち、ｄＵＭＰまたはデオキシウリジン一リン酸である。たとえ結果として生じたＤＮＡにｄＵＴＰ部分がないとしても、ｄＵＴＰをＤＮＡへ取り込むと言ってもよい。同様に、たとえそれが基質分子の一部のみであるにしても、デオキシウリジンをＤＮＡへ取り込むと言ってもよい。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「取り込むこと」とは、核酸重合体の部分になることを意味する。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」は、２つの専門用語の「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」を総称して、および交換可能に指す。オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドは別個の専門用語であるが、それらの間に正確な境界線があるのではなく、それらは本明細書で交換可能に用いられることは留意されたい。用語「アダプター」もまた、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「プライマー」は、増幅中のヌクレオチド単量体の共有結合性付加により伸長される一本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドを指す。しばしば、核酸増幅は、核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づいている。多くのそのようなポリメラーゼは、伸長されて、核酸合成を開始することができるプライマーの存在を必要とする。
【００３８】
本明細書に用いられる場合、用語「ヘアピン」および「ステムループオリゴヌクレオチド」は、二本鎖ステムを形成する分子内逆方向反復である５’  末端領域および３’末端領域、ならびに一本鎖ループを形成する非自己相補的中央領域で構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される構造を指す。
【００３９】
ＩＩ．本発明の態様
本発明の実施形態は、以下の通り、１つまたは複数の利益または利点を提供し得る。核酸分子の同じ末端上に第１および第２のバーコードを有することは、シーケンシング読み取りが第２のバーコードから始まり、第１のバーコードを経て、その後、核酸分子へ続くことを可能にし得る。したがって、第２のバーコード、第１のバーコード、および核酸分子の配列の同定は、二重シーケンシングバーコードを用いる伝統的な方法における場合のような、核酸分子の遠位末端から戻って単一バーコードの配列を読み取るために核酸分子の各末端からのシーケンシング読み取りを提供しなければならないこととは対照的に、単一の読み取りで得られ得る。
【００４０】
ある特定の実施形態における別の利点は、第１および第２のバーコードが好ましくは、２つの別々のステップにおいて付加され得ることである。この付加の順序は、コードされる試料識別情報の可能な組み合わせを有意に増加させ得る。加えて、個々の試料の個々のＰＣＲプライマーでの増幅は、いくつかの次世代シーケンシングプラットフォームにおいて現在、実施されているような、プールされた試料のユニバーサルＰＣＲプライマーでの増幅とは対照的に、プライミングおよび増幅のアーティファクトによるバーコード間の相互汚染の確率を低下させ得る（図１）。特に、第１のバーコードの、核酸分子の少なくとも１つの末端へのライゲーションは、短いアダプター、例えば、短いステムループアダプターを用いて実施されてもよい。例えば、短いアダプターは、約１４個〜約２３個のヌクレオチドを含むステムを有し、一方、長いアダプターは約２４個〜約４０個のヌクレオチドのステムを有する。
【００４１】
定性的観察および定量的実験により、ライゲーション部位に対して近位に共通の配列を含有するように設計された単一のアダプターまたは２つの異なるアダプターのライゲーションが、制御されたサイズの標的挿入断片を含む分子を優先的に増幅し、挿入断片を有しない、またはほとんど情報価値がない、もしくは全く情報価値がない短い挿入断片を含む分子を有するアダプター二量体に対して識別する能力へ有益な効果を生じ得ることが示される。この現象は、抑制または抑制ＰＣＲと呼ばれる。抑制は、末端逆方向反復に隣接されたある特定のサイズより小さい分子が、増幅に用いられるプライマーが反復全体または反復の一部分に対応する場合の非効率的な増幅のせいで、選択的に排除されることを指す（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら、１９９６；Ｌｕｋｙａｎｏｖら、１９９９；Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５；Ｓｈａｇｉｎら、１９９９）。これの理由は、断片の相補的末端の生産的なＰＣＲプライマーアニーリングと非生産的な自己アニーリングとの間の平衡にある。隣接する末端逆方向反復の固定サイズにおいて、挿入断片が短ければ短いほど、抑制効果は強く、逆もまた同様である。同じように、固定された挿入断片サイズにおいて、末端逆方向反復が長ければ長いほど、抑制効果は強い（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら、１９９６；Ｌｕｋｙａｎｏｖら、１９９９；Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５；Ｓｈａｇｉｎら、１９９９）。
【００４２】
末端逆方向反復を核酸分子の両方の末端にライゲーションおよび／またはプライマー伸長により付着させることにより、米国特許第７，８０３，５５０号により記載されているように、望ましくないアダプター二量体または短い挿入断片副産物に対して、所望の最小サイズの標的挿入断片のプライマーアニーリングおよび伸長の効率に関して正確な制御を達成し得る。第１のバーコードをアダプターライゲーションにより付着させることにおける効率は、試料における核酸分子の偏りを防ぎ、かつ表現を保存するために利用され得る。逆に、第２のバーコードをプライマー伸長によって連結することは、第２のバーコードを含む長いプライマーを効率的に用い得る。
【００４３】
本発明のこの実施形態において、標的核酸は、３’陥凹末端、３’突出末端、または平滑末端を有するステムループオリゴヌクレオチド；３’プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなど）；Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ；ＡＴＰ；およびｄＮＴＰを含む例示的な混合物とインキュベートされる。以下の４つの例示的な酵素反応が同時に起こっている：ＤＮＡ末端およびオリゴヌクレオチド二本鎖ステム領域の「ポリッシング」；ＤＮＡの３’末端とオリゴヌクレオチド二本鎖ステム領域の５’末端との間にニックを残す、オリゴヌクレオチド３’末端のＤＮＡの５’リン酸へのライゲーション；ステムループオリゴヌクレオチドの末端へ広がる３’ＤＮＡ末端のポリメラーゼ伸長；およびオリゴヌクレオチドステム領域内での鎖置換反応。この過程は、結果として、第１のバーコード配列を含む末端に逆方向反復アダプターを有するＤＮＡ断片のライブラリーを生じる。
【００４４】
ＩＩＩ．本発明の方法
以下の概略は、本技術の方法および組成物に関するさらなる詳細を提供する。提供される全ての特別な例は、非限定的例であると理解される。
【００４５】
Ａ．関心対象となる核酸分子の調製
関心対象となる核酸分子は、単一の核酸分子または複数の核酸分子であり得る。また、関心対象となる核酸分子は、生物学的起源または合成起源のものであり得る。核酸分子の例には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、増幅されたＤＮＡ、既存核酸ライブラリーなどが挙げられる。
【００４６】
関心対象となる核酸分子は、修復処理および断片化処理などの様々な処理に供してもよい。断片化処理には、機械的、音波の、化学的、酵素的処理、時間をわたっての分解などが挙げられる。修復処理には、伸長および／またはライゲーションによるニック修復、平滑末端を生じるためのポリッシング、脱アミノ、誘導体化、脱塩基、または架橋ヌクレオチドなどの損傷した塩基の除去が挙げられる。関心対象となる核酸分子をまた、化学修飾（例えば、亜硫酸水素塩変換、メチル化／脱メチル化）、伸長、増幅（例えば、ＰＣＲ、等温性など）などに供してもよい。
【００４７】
Ｂ．第１のバーコードの連結
第１のバーコードまたは第１セットのバーコードは、関心対象となる核酸分子の少なくとも１つの末端に連結されてもよい。いくつかの態様において、第１のバーコードは、ステムループアダプター内に提供されてもよく、または第１セットのバーコードが、ステムループアダプターの集団として提供されてもよい。ステムループアダプターは、米国特許第７，８０３，５５０号に記載されているように、ステムループアダプターを含んでもよい。いくつかの態様において、ステムループアダプターは、ステムループアダプターのステム部分内にバーコードを含んでもよい。いくつかの態様において、ステムループアダプターのループ部分は、切断可能な複製停止点を含んでもよい。
【００４８】
いくつかの態様において、バーコードを含むステムループアダプターは、標的核酸分子の１つの末端、または標的核酸分子の両方の末端に連結されてもよい。いくつかの態様において、標的核酸分子の各末端に連結されたステムループアダプターの分子内逆方向反復は、同一配列を含んでもよい。この態様において、ステムループアダプターの標的核酸分子の各末端への連結は、末端逆方向反復を含む核酸分子を生じ、それにより、その分子がステムループを形成することを可能にする。他の態様において、標的核酸分子の各末端に連結されたステムループアダプターの分子内逆方向反復は、同一の配列を含まなくてもよい。この態様において、ステムループアダプターの標的核酸分子の各末端への連結は、末端逆方向反復を欠く核酸分子を生じ、それゆえに、その分子は、ステムループを形成することができないだろう。
【００４９】
いくつかの態様において、バーコードを含むステムループアダプターは、核酸分子の５’末端へのライゲーションを通して、例えば、平滑末端ライゲーションにより、核酸分子に連結されてもよい。ステムループアダプターを標的核酸分子の一方または両方の末端へライゲーションすることは、結果として、ニック形成を生じ得る。前記１つまたは複数のニックは、ライゲーションされたステムループアダプターと核酸分子から除去されてもよい。
【００５０】
いくつかの態様において、伸長反応は、ステムループアダプターを通して核酸分子の３’末端を伸長してもよく、ループ部分は、切断可能な複製停止点で切断される。
【００５１】
Ｃ．第２のバーコードの連結
第２のバーコードまたは第２セットのバーコードは、核酸分子に連結されている第１のバーコードまたは第１セットのバーコードに連結されてもよい。この様式において、第１のバーコードは、核酸分子と第２のバーコードの中間物であり得る。いくつかの態様において、第２のバーコードは、プライマー内に提供されてもよく、または第２セットのバーコードが、プライマーの集団として提供されてもよい。いくつかの態様において、プライマー伸長またはＰＣＲは、第２のバーコードを取り込むために用いられてもよい。いくつかの態様において、プライマーは、３’部分および５’部分を含み得、その３’部分は第１のバーコードの部分にアニールすることができ、かつその５’部分は第２のバーコードを含む。
【００５２】
その方法に関する追加の情報は、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００３）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に見出され得る。当業者によって認識されているように、関心対象となる核酸の調製、第２のバーコードを取り込むためのプライマー伸長、またはＰＣＲを最適化するために様々なパラメーターが操作され得る。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために挙げられる。以下に続く実施例に開示された技術が、本発明の実施においてよく機能するための、本発明者によって発見された技術を表し、したがって、それの実施のための好ましいモードを構成するとみなされ得ることは、当業者によって理解されているはずである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑みれば、開示されている特定の実施形態において多くの変化がなされ得、かつそれでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様の、または類似した結果を得ることができることは、理解すべきである。
【００５４】
実施例１  ＤＮＡシーケンシングのための二重直列型バーコード化アダプター配列
図１は、単一セットのバーコードの使用（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）  対  本技術の実施形態における第１および第２セットのバーコードの使用を比較する概略図を提供する。プライマーは、第１のバーコードの外側の配列に結合することが示されている；しかしながら、いくつかの実施形態において、プライマーは、第１のバーコードに、またはさらにｇＤＮＡ配列に結合してもよい。本発明の態様において、ライゲーションは、ｇＤＮＡの両方の末端に付加される固有のアダプター分子（例えば、ステムループ）、または異なる配列を有する２つ（またはそれより多く）の別個のアダプター分子に対してであり得る。アダプター二量体からのバックグランドを低下させることを目的として、異なるアダプター分子が用いられる場合には、それらは好ましくは、アダプター二量体を含む、非常に短い分子のＰＣＲ増幅を抑制するだろう共通の配列を有してもよい。
【００５５】
図２は、第１のバーコードを有するアダプターを付加するために、米国特許第７，８０３，５５０号に記載されているようなステムループアダプターおよび方法を利用する、本発明の特定の実施形態を示す。その方法の後に、第２のバーコードを付加するためのＰＣＲ増幅がさらに続く。
【００５６】
本発明者らは、タンデム型二重バーコードを含有するが、末端逆方向反復を生じるための配列を欠く、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔアダプターを試験しようと試みた。ステムループアダプターおよびＰＣＲプライマーを、図３および表１に示されているように設計した。留意すべきこととして、本方法は、他の次世代シーケンシングプラットフォームと共に用いるのに適合させることができ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームとの使用に限定されない。
【００５７】
【表１】
0006454281.tif 000002
【００５８】
鋳型調製。１０マイクロリットルの各ＤＮＡ試料（０．１ｎｇ／μＬ  Ｃｏｖａｒｉｓ剪断化（ｓｈｅａｒｔｅｄ）ヒトｇＤＮＡ）をＰＣＲチューブまたはウェルに加えた。非鋳型対照（ＮＴＣ）として、１０μＬのヌクレアーゼフリーの水をＤＮＡ試料の代わりに用いた。２μＬ／試料  鋳型調製緩衝液（ｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ）を追加した、（以下を含む６．５×ＡＴＰフリーのリガーゼ緩衝液：３２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．６＠２５℃、６５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．２５ｍＭ  ＤＴＴ））および１μＬ／試料  鋳型調製酵素（Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｉｘ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｙ９１４−ＬＣ−Ｌ）のプレミックスを、別々のチューブ内に調製し、ピペットで混合した。その後、３μＬのプレミックスを、ＰＣＲチューブまたはウェル内の１０μＬ  ＤＮＡ試料に加え、４〜５回、８μＬに設定されたピペットで混合した。反応構成要素の最終濃度は以下の通りであった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．６＠２５℃、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、３８５μＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅｓ。ＰＣＲプレートを遠心分離し、以下の条件を用いてサーマルサイクラーにおいてインキュベートした：２２℃で２５分間の１サイクル；５５℃で２０分間の１サイクル；２２℃で保持。
【００５９】
ライブラリー合成。１μＬ／試料  ライブラリー合成緩衝液（１５ｍＭ  ＡＴＰおよび１５μＭ  各ステムループアダプターオリゴを追加した、以下を含む２×ＡＴＰフリーのリガーゼ緩衝液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．６＠２５℃、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＤＴＴ）および１μＬ／試料  ライブラリー合成酵素ミックス（１μＬあたり、１．２Ｕ  ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ＃Ｇ５０１０Ｌ）および８Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ＃Ｌ６０３−ＨＣ−Ｌ）を含む）の新鮮なライブラリー合成プレミックスを、別個のチューブ内で調製し、ピペットにより混合した。その後、２μＬのライブラリー合成プレミックスを各試料に加え、１０μＬに設定されたピペットで４〜５回、混合した。反応構成要素の最終濃度は以下の通りであった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．６＠２５℃、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、３３４μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１．２Ｕ  ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、８Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１μＭ  各アダプターオリゴ。プレートを遠心分離し、以下の条件を用いてサーマルサイクラーにおいてインキュベートした：２２℃で４０分間の１サイクル；４℃で保持。
【００６０】
ＴｈｒｕＰＬＥＸ−ＦＤライブラリー増幅。４．２５μＬ／試料  ヌクレアーゼフリーの水、３．７５μＬ／試料  ＥｖａＧｒｅｅｎ：ＦＣ（９：１）、５０．５μＬ／試料  ライブラリー増幅緩衝液（０．３７５μＭの各ＰＣＲオリゴを追加した、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ８．５＠２５℃、１２０ｍＭ  ＴＭＡＣ、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０６％ｗ／ｖ  ゼラチンを含む）および１．５μＬ／試料  ライブラリー増幅酵素（１Ｕ／ｕｌにおけるＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ２１０２））のライブラリー増幅プレミックスを、使用直前に別個のチューブ内で調製した。その後、６０μＬのライブラリー増幅プレミックスを、各ライブラリーに加え、６０μＬに設定されたピペットで３〜４回、混合した。反応構成要素の最終濃度は以下の通りであった：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ８．５＠２５℃、８０ｍＭ  ＴＭＡＣ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０４％ｗ／ｖ  ゼラチン、１×ＥｖａＧｒｅｅｎ、１×ＦＣＤ、１．５Ｕ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５μＭ  各ＰＣＲオリゴ。プレートを遠心分離し、その後、以下の通り、リアルタイムサーマルサイクラーにおいてインキュベートした：７２℃で３分間の１サイクル；８５℃で２分間の１サイクル；９８℃で２分間の１サイクル；９８℃で２０秒間、６７℃で２０秒間、７２℃で４０秒間の４サイクル；ならびに９８℃で２０秒間および７２℃で５０秒間の４〜２１サイクル。
【００６１】
結論。アダプター二量体の有意な増大が生じた（図４）。これは、構築物における抑制の欠如による可能性がある；それゆえに、本発明者らは、末端逆方向反復を生じる配列を含有し、かつ近位直列型バーコードを含むバージョンを試験した。
【００６２】
実施例２  末端逆方向反復を含有する、ＤＮＡシーケンシングのための二重直列型のバーコード化するアダプター配列
本発明者らは、（ライゲーションの部位に対して近位の）第２のバーコードによって表示される末端逆方向反復を有するタンデム型二重バーコードを含有するＩｏｎアダプターを試験しようと試みた。ステムループアダプターおよびＰＣＲプライマーを、図５および表２に示されているように設計した。
【００６３】
【表２】
0006454281.tif 000003
【００６４】
ＩｏｎユニバーサルアダプターＰ１／ＡのＴＭを、０．２５μＭ  オリゴ、１００ｍＭ  Ｎａ＋、２．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋、および０．３ｍＭ  ｄＮＴＰにおいてＯｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＩＤＴ）を用いて計算し、６１℃であった。
【００６５】
実験条件は、表２に示されたオリゴヌクレオチド配列が用いられ、かつ単一のユニバーサルステムループアダプター（ライブラリー合成反応において２μＭ）が、末端逆方向反復をＤＮＡ断片の両方の末端に付着させるために用いられたことを除いて、実施例１に記載されている通りであった。末端逆方向反復を生じるための配列を含有するステムループアダプターは、実施例１に記載された、逆方向反復を生じるためのそのような配列を含有しない設計（図４）に対して、信号雑音比の有意な改善を示した（図６）。
【００６６】
本明細書に開示され、および主張された方法の全ては、本開示を鑑みれば、過度の実験なしになされ、かつ実行することができる。この発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載された方法に、および方法のステップにおいて、または一連のステップにおいて、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、バリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連しているある特定の作用物質が、本明細書に記載された作用物質に代わって用いられてもよいが、同時に、同じまたは類似した結果が達成されるだろうことは、明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似した置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されているような本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあるとみなされる。
【００６７】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されたものを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する範囲において、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【００６８】
【化１】
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【図１】
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【図２】
0006454281.tif 000006
【図３】
0006454281.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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