(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（４）を含む無細胞軟骨グラフトの調製方法であって、
ステップ（１）において、動物の軟骨をダイシングして、複数の軟骨基質を作製し、
ステップ（２）において、水酸化ナトリウム溶液でステップ（１）の軟骨基質を室温で約３−２４時間処理し、
ステップ（３）において、消毒剤でステップ（２）のアルカリ処理された軟骨基質を消毒し、前記消毒剤は、アルコール、酸化剤、放射線、フェノール化合物、及び第四級アンモニウム化合物からなる群より選択され、
ステップ（４）において、ステップ（３）の消毒された軟骨基質を超臨界流体（ＳＣＦ）処理して、前記無細胞軟骨グラフトを作製し、前記ＳＣＦ処理は、約１５０−３５０ｂａｒの圧力、３０−５０℃の温度で約１００分間行われ、
前記ＳＣＦは、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）であり、
前記製造方法では、前記無細胞軟骨グラフトを調製する際に、高張性塩溶液、酵素消化、又は脱水を必要としない、無細胞軟骨グラフトの調製方法。
【請求項２】
前記軟骨は、ブタから得られた鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨、又は膝軟骨である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各軟骨グラフトは、円盤状、ストリップ状、円錐状、又は粒子状である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルコールは、エタノール又はイソプロパノールであり、
前記酸化剤は、過酸化水素であり、
前記フェノール化合物は、パラベン、安息香酸、又はサリチル酸であり、
前記第四級アンモニウム化合物は、塩化ベンザルコニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化アンモニウムである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記温度は約３７℃であり、前記圧力は約３５０ｂａｒである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記無細胞軟骨グラフトの各々は、天然軟骨よりも少なくとも２倍の応力に耐えることができる請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2015年8月11日に出願された米国仮特許出願第62/203904号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、無細胞軟骨グラフトの調製方法の分野に関し、特に、無細胞軟骨グラフトを調製するための改良された方法に関する。該無細胞軟骨グラフトは、細胞増殖のための生物学的足場としての使用に適している。従って、該無細胞軟骨グラフトは、骨軟骨疾患の治療のための異種グラフトとして有用である。
【背景技術】
【０００３】
軟骨組織への損傷は、急性または反復性の損傷または老化の結果として、活動量の多い人及び高齢者において非常に一般的である。治療方法には、休息、損傷した軟骨領域をクリアするための関節鏡視下小手術、及び他の外科的処置（例えば、微小破壊手術、穿孔、及び摩耗法）が含まれる。これらの治療方法はすべて、特に損傷前と同じレベルの活動を維持していた場合に、一時的な症状の緩和のみを提供する。例えば、慢性膝関節軟骨損傷は、関節軟骨の損傷をさらに悪化させ、最終的に、膝関節全置換に至る可能性がある。骨軟骨疾患又は損傷には別の問題が存在しており、現在の医療処置および方法は、治療ニーズを完全に満たすことができない。上記のような老化、損傷及び/又は障碍に起因する軟骨損傷に加えて、軟骨組織の修復または増強を必要とする整形又は美容手術（例えば、鼻拡張、顔の左右非対称の矯正手術、まぶた周辺の矯正手術、顔の整形手術など）においても軟骨グラフトの需要が高まっている。 
【０００４】
ヒドロゲル又は天然若しくは合成ポリマーを足場とすることによって生成された既存の人工軟骨は、コラーゲンが主成分であるため、天然軟骨と同じ機械的性質を有しない。このような欠点を克服するために、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を使用して、ヒドロゲルまたはポリマー足場の機械的強度を改善している。しかしながら、ほとんどの架橋剤は、ヒトに対して毒性であるため、その使用は限られている。
【０００５】
従って、上記損傷の治療又は矯正手術のための改良された軟骨グラフトを提供することは有利である。 本発明の改良された軟骨グラフトは、自然軟骨の機械的強度および立体配座を有し、さらなる合併症(例えば、免疫原性の問題)を引き起こすことなく、軟骨を損傷前の状態に回復できるだけではなく、比較的低いコストで容易に製造できる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、上述の問題を克服するために、改良された軟骨グラフト、特に、改良された機械的強度及び天然軟骨の天然立体配座を有する軟骨グラフトを開示する。
【０００７】
従って、本開示の第1の態様は、美容手術 (例えば、鼻形成術、顔の矯正手術など ) 又は骨軟骨疾患の治療に適用される無細胞軟骨グラフトの調製方法を提供する。該方法は、以下のステップ(1)〜(4)を含む。
ステップ(1)において、動物の軟骨をダイシングして軟骨基質を作製する。
ステップ(2)において、ステップ(1)の軟骨基質をアルカリ処理する。
ステップ(3)において、ステップ(2)のアルカリ処理された軟骨基質を消毒処理する。
ステップ(4)において、ステップ(3)の消毒された軟骨基質を脱細胞化処理して無細胞軟骨グラフトを作製する。
【０００８】
本開示の実施形態によれば、ステップ(1)において、軟骨は、哺乳動物に由来し、鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨、又は膝軟骨であり得る。
【０００９】
本開示の実施形態によれば、ステップ(2)において、アルカリ処理は、水酸化ナトリウム溶液で軟骨基質を室温で約3-24時間処理することを含む。
【００１０】
本開示の実施形態によれば、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質を消毒剤で処理する。該消毒剤は、アルコール、酸化剤、放射線、フェノール化合物、及び第四級アンモニウム化合物からなる群より選択され得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質をアルコールで処理する。該アルコールは、エタノール又はイソプロパノールであり得る。
【００１２】
さらなる実施形態において、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質を酸化剤で処理する。該酸化剤は過酸化水素であり得る。
【００１３】
さらに別の実施形態において、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質を放射線で処理する。該放射線は、ガンマ線であり得る。
【００１４】
他の実施形態において、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質をフェノール化合物で処理する。該フェノール化合物は、パラベン、安息香酸又はサリチル酸であり得る。
【００１５】
さらに別の実施形態において、ステップ(3)において、アルカリ処理された軟骨基質を第四級アンモニウム化合物で処理する。該第四級アンモニウム化合物は、塩化ベンザルコニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、又は塩化アンモニウムであり得る。
【００１６】
本開示の実施形態によれば、ステップ(4)において、脱細胞化処理は、超臨界流体(SCF)で消毒された軟骨基質を約150-350barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理することを含む。
【００１７】
SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素 (scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、SCFはscCO2である。別の例では、SCFはscN2Oである。
【００１８】
好ましい一実施形態によれば、上記脱細胞化処理は、温度が約37℃、圧力が約350barの条件下で100分間行われる。
【００１９】
このように作製された軟骨グラフトは、主にコラーゲンで構成され、それらの天然の構造及び立体配座が保持されることにより、被験体に適用(例えば、移植)された後、細胞が増殖可能な三次元生体足場として働くことができる。さらに、このように作製された軟骨グラフトは、無細胞であり、細胞物質が存在していないため、実質的に非免疫原性であり、その宿主に対する免疫原性応答を誘導することはない。さらに、このように作製された軟骨グラフトは、機械的特性が天然軟骨よりも優れているため、天然軟骨及び/又は既存の人工軟骨よりも良好な異種グラフトである。
【００２０】
従って、本開示の第2の態様は、本発明の方法によって調製された軟骨グラフトを提供する。本開示の軟骨グラフトは、異種グラフトとして矯正手術、又は老化、損傷若しくは疾患に起因する軟骨欠損の治療に有用である。矯正手術の例は、鼻拡張、顔の左右非対称の矯正手術、まぶた周辺の矯正手術、顔の整形手術などを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本開示の第3の態様は、骨軟骨疾患の治療方法を提供する。該方法は、本発明の無細胞軟骨グラフトを被験体の治療部位(例えば、病変部位)に適用することを含む。
【００２２】
骨軟骨疾患は、先天性欠損、骨折、半月板損傷または欠陥、骨/脊柱の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症と脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯骨損失、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎固定、脊椎円板の再構築または除去、骨ページェット病、半月板損傷、関節リウマチ、変形性関節症、及び外傷性または外科的な軟骨損傷であり得る。
【００２３】
以下、本開示の1つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２４】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示的なものであり、請求項に記載の本発明のさらなる説明を提供することが意図されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成し、本発明の様々な態様の様々な例示的なシステム、方法、及び他の例示的な実施形態を示す。本説明は、添付の図面に照らして以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。
【００２６】
【図１】図1は、本開示の一実施形態に係る、H&E染色した本発明の軟骨グラフトを(A)SCF処理前に、並びに、(B)150bar、(C)200bar及び(D)350barでSCF処理した後に、20,000xの倍率で撮影した写真である。
【図２】図2は、本開示の一実施形態に係る、本発明の軟骨グラフトの(A)SCF処理前、及び(B)SCF処理後のH&E及びDPAI染色の写真である。
【図３】図3は、本開示の一実施形態に係る、本発明の軟骨グラフトの(A)SCF処理前、及び(B)SCF処理後のアルシアンブルー染色の写真である;
【図４】図4は、本開示の一実施形態に係る、本発明のSCF処理された軟骨グラフトを(A)500k、(B)1000k及び(C)2,000kの倍率で撮影した走査型電子顕微鏡(SEM)写真である。
【図５】図5は、本開示の一実施形態に係る、実施例1.1のSCF処理された軟骨グラフト及び天然軟骨の圧縮強度（それぞれ(A)応力負荷及び(B)ヤング率で示す）を描く棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。
【００２８】
文脈で別途明記示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００２９】
本明細書で使用する「無細胞」という用語は、生物学的に活性な細胞および/またはその破片のような細胞物質を含まないインプラントを指す。従って、「無細胞軟骨グラフト」という用語は、実質的にいかなる細胞物質も含まない動物（例えば、哺乳類）の軟骨に由来する軟骨グラフトを指す。一例では、軟骨は、ブタの鼻軟骨から採取される。別の例では、軟骨は、ブタの膝軟骨から採取される。さらなる例において、軟骨は、ブタの肋軟骨に由来する。
【００３０】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００３１】
本開示は、その最も広い意味で、美容若しくは整形手術に適用される無細胞軟骨グラフトの調製、又は本発明の方法で作製された無細胞軟骨グラフトを軟骨病変部位に移植することによる骨軟骨疾患の治療（破損、損傷、創傷若しくは老化骨軟の修復若しくは回復、及び/又は骨軟骨欠損の修復を含む）に関する。
【００３２】
従って、本開示の目的は、無細胞軟骨グラフトの調製方法に関する。該方法によれば、コラーゲンの機械的強度、及び天然構造と立体配座が保持されるため、組織再建又は骨軟骨疾患の治療のために本発明の無細胞軟骨グラフトが宿主に移植された後に、宿主組織細胞の増殖に最適なマイクロ環境を提供することができる。さらに、本発明の方法によって作製された軟骨グラフトは、細胞物質が存在していないため、実質的に非免疫原性であり、移植後に免疫原性応答を誘導することはない。
【００３３】
従って、本発明の方法は、少なくとも以下のステップを含む。
ステップ(1)において、動物の軟骨をダイシングして複数の軟骨基質を作製する。
ステップ(2)において、ステップ(1)の軟骨基質をアルカリ処理する。
ステップ(3)において、ステップ(2)のアルカリ処理された軟骨基質を消毒処理する。
ステップ(4)において、ステップ(3)の消毒された軟骨基質を脱細胞化処理して無細胞軟骨グラフトを作製する。
【００３４】
所望の無細胞軟骨グラフトを作製するために、軟骨源として非ヒト動物、好ましくは、家畜からインタクトな軟骨（例えば、鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨または膝軟骨）を採取する。 軟骨源として適切な家畜の例は、ブタ、ウシ、乳牛、ブルズ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウサギ、アヒル、ガチョウ、及びニワトリを含むが、これらに限定されない。軟骨グラフトの供給源としての軟骨は、新たに殺された動物から採取し、直ちに滅菌等張液または他の保存溶液中に置くことが好ましい。次いで、採取した軟骨を適切な大きさおよび形状に切断して、円盤状、ストリップ状、粒子状、又は円錐状の軟骨基質を作製する。いくつかの例では、各軟骨基質は、円盤状を有し、直径が約8-12mm、好ましくは、約11mmである。他の例では、各軟骨基質は、長さが約6cm、幅が10mm、厚さが2-5 mmのストリップ状を有する。一般に、各軟骨グラフトのサイズおよび形状は、治療部位のサイズおよび形状に適合する限り、特に限定されない。
【００３５】
次に、ダイシングされた軟骨基質を、それぞれステップ(2)及び(3)に記載されるようにアルカリ処理及び消毒処理する。本発明の方法に適用されるアルカリ剤の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、尿素、硫化ナトリウム、カルシウムチオアセテート等を含むが、これらに限定されない。好ましくは、水酸化ナトリウム溶液で軟骨基質を室温で約3時間処理する。消毒処理は、軟骨基質を消毒剤で処理して軟骨基質を殺菌することで行われる。消毒剤は、例えば、アルコール、酸化剤、フェノール化合物、第四級アンモニウム化合物、抗生物質及び放射線である。本発明の方法に適用される消毒剤の適切な例は、エタノール、イソプロパノール、重炭酸ナトリウム、過酸化水素、酢酸、スルホンアミド、パラベン、安息香酸、サリチル酸、塩化ベンザルコニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化アンモニウム、X-線、ガンマ放射線、及びUV光を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、軟骨基質を過酸化水素溶液で処理する。さらに、各ステップの後、次の処理に供される前に、大量の水で軟骨基質を洗浄して可溶性物質を除去する。
【００３６】
次いで、ステップ(3)のアルカリ処理及び消毒処理された軟骨基質を脱細胞化処理する。脱細胞化処理は、組織足場(例えば、異種グラフト)としてより良く働かせるように、コラーゲンの物理的および生化学的特性を維持しながら、軟骨組織から細胞材料を除去する目的で行われる。従って、ステップ(4)において、ステップ(3)の消毒された軟骨基質を超臨界流体(SCF)により約100-500barの圧力（例えば、100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490及び500bar）、好ましくは、約150-350bar（例えば、150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340及び350bar）の圧力で処理する。さらに、ステップ(4)は、30-50℃（例えば、30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49及び50℃）、好ましくは、35-45℃（例えば、35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44及び45℃）の温度で約20分間〜5日（例えば、20, 30, 40, 50及び60分間; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23及び24時間; 2, 3, 4及び5日）行われる。いくつかの例では、ステップ(3)の消毒された軟骨基質をSCFで約1〜24時間処理する。他の例では、ステップ(3)の消毒された軟骨基質をSCFで約2〜5日処理する。
【００３７】
SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素 (scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、SCFはscCO2である。scCO2は、約350barで37℃のような温和な臨界条件を有するので、体温(即ち、37℃)又はそれに近い温度で生体物質を除去することができる。別の好ましい例では、SCFはscN2Oである。
【００３８】
必要に応じて、SCFは、共溶媒とともにステップ(3)の消毒された軟骨基質に適用される。共溶媒は、C1-4アルコールであり得る。該C1-4アルコールは、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、sec-ブタノール、t-ブタノール及びシクロブタノールを含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい例では、共溶媒は、エタノールであり、1:20〜1:4（例えば、1:20,1:19,1:18,1:17,1:16,1:15,1:14,1:13,1:10,1:9,1:8,1:7,1:6,1:5,1:4）の体積比でSCFと併用される。好ましい一実施形態において、エタノールは、1:19の体積比でSCFと併用される。別の実施形態において、エタノールは、1:10の体積比でSCFと併用される。さらに別の実施形態において、エタノールは、1:4の体積比でSCFと併用される。最も好ましくは、エタノールとSCFは、約1:10の体積比で併用される。
【００３９】
本開示の実施形態によれば、ステップ(4)のSCFで処理された軟骨グラフトは、実質的に細胞物質が存在していないため、酵素消化処理（例えば、プロテアーゼおよび/またはグリコシダーゼによる消化）を行うことで、軟骨グラフトの免疫原性拒絶の源として役立ち得る抗原性表面炭水化物部分を除去する必要がない。本開示の実施形態によれば、本発明の方法によって作製された軟骨グラフトは、核酸および非コラーゲンタンパク質が完全に除去されたものである。
【００４０】
さらに、ステップ(4)のSCF処理された軟骨グラフトは、コラーゲン線維で構成され、コラーゲン線維の機械的強度及び完全性が保持されるため、宿主細胞が増殖するための生物学的足場としての使用に適している。本開示の実施形態によれば、本開示の軟骨グラフトは、コラーゲン線維の天然構造及び立体配座が保持され、線維芽細胞の増殖を支持することができる。
【００４１】
なお、本発明の方法は、軟骨グラフトを調製する際に、常用の高張性塩溶液、脱水及び/又は凍結処理を採用しない点において、従来の方法と異なるため、本発明の方法は、より簡単で、使用が容易であるとともに、軟骨グラフトにおけるコラーゲン線維の完全性及び/又は機械的強度を保持することができる。また、本発明の方法は、架橋剤(例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなど)を用いて軟骨グラフトのタンパク質を架橋する必要がない点において従来の方法と異なるため、軟骨グラフトの毒性および免疫原性が低下または減少する。
【００４２】
本開示の任意の実施形態によれば、SCF処理された軟骨グラフトは、任意の公知の方法を用いて滅菌 (例えば、前述の消毒剤による処理) し、使用するまで乾燥滅菌の状態で保存することができる。いくつかの実施形態において、軟骨グラフトを強度が10-60 kGy（例えば、10, 20, 30, 40, 50及び60 kGy）であるガンマ線に曝露して軟骨グラフトを滅菌する。より好ましくは、軟骨グラフトを強度が10-30 kGy（例えば、10, 15, 20, 25及び30 kGy）であるガンマ線に曝露して軟骨グラフトを滅菌する。
【００４３】
このように作製された無細胞軟骨グラフトは、美容若しくは整形手術、又は本発明の方法で作製された無細胞軟骨グラフトを治療部位（軟骨病変部位）に移植することによる骨軟骨疾患の治療（破損、損傷、創傷若しくは老化骨軟の再構築、修復若しくは回復、及び/又は骨軟骨欠損の修復を含む）に適用される。
【００４４】
本開示のさらなる態様は、被験体の骨軟骨疾患を治療するための方法を提供する。該方法は、本発明の軟骨グラフトを被験体の治療部位(例えば、病変部位)に適用するステップを含む。骨軟骨疾患の例は、例えば、先天性欠損、骨折、半月板損傷若しくは欠損、骨/脊柱の変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症と脊柱側弯症、骨粗鬆症、歯周病、歯骨損失、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、脊椎固定、脊椎円板の再構築若しくは除去、骨ページェット病、半月板損傷、関節リウマチ、変形性関節症、又は外傷性若しくは外科的な軟骨損傷を含むが、これらに限定されない。本発明のSCF処理軟骨グラフトが病変部位に移植された後、隣接する軟骨細胞は、活性化され、軟骨グラフトの多孔性構造内に移動し、そこで病変部位の損傷軟骨が最終的に置換されたまで増殖する一方、本発明のSCF処理軟骨グラフトが完全に分解され、被験体に有害な残留物が残らないことが想定される。
【００４５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。これらの実施例は、典型的には使用されるものであるが、その代わりに、当業者に知られている他の手順、方法、又は技術が使用されることができる。
実施例
材料及び方法
細胞培養
【００４６】
NIH-3T3線維芽細胞を高グルコースのDMEM（10％ウシ胎仔血清(FBS)、100単位/ mlのペニシリン、及び100 mg/mlストレプトマイシン含有）で、37℃、加湿雰囲気、5％CO2の条件で培養した。
【００４７】
軟骨細胞の単離 
【００４８】
ブタ関節軟骨から軟骨細胞を単離した。軟骨を培地ですすぎ、その後H型コラゲナーゼを含有する消化培地(DMEM, 10％FBS, 1％P/S, 0.1mg/mLのストレプトマイシン)に移し、37℃で24時間培養した。細胞を遠心分離(300×g;5分間)して収集した。
【００４９】
H&E染色
【００５０】
切片軟骨組織をキシレンに10分間浸漬することにより脱パラフィンし、そして該処理を1回繰り返しました。次いで脱パラフィンした組織を一連のアルコール浴により水和させ、ここで、アルコールの濃度は、それぞれ100％から95％、85％及び75％まで変化させた。水和の過程において、組織試料を各濃度のアルコール溶液中に2分間置いた後、大量の脱イオン水ですすいだ。水和後、組織試料をヘマトキシリンで3-5分間染色し、次いで脱イオン水及び75％エタノールで清浄した。ヘマトキシリン染色した軟骨をさらに1％エオシンYで約30秒間染色し、続いて脱イオン水、95％および100％エタノールで順次洗浄した。
【００５１】
アルシアンブルー染色
【００５２】
軟骨組織切片を「H＆E染色」に記載された手順に従って脱パラフィンし、水和させた。次に、試料をアルシアンブルーで30分間染色し、続いて流水で2分間洗浄し、脱イオン水ですすいだ。アルシアンブルー染色された軟骨試料を核高速赤色溶液中で5分間対比染色し、次いで流水で1分間洗浄した。軟骨試料を95％エタノール及び100％エタノールを通過させることによって脱水し（2回、毎回2分）、次いで樹脂封止材で封止した。
【００５３】
軟骨グラフトでの3T3細胞の再細胞化
【００５４】
3T3細胞を80％コンフルエントまで増殖させ、次いで酵素処理（0.25％トリプシン/1mM EDTA）により回収し、500xgで5分間遠心分離した。回収した細胞を最終濃度2x106細胞/mLとなるように培地に再懸濁した。本発明のSCF処理軟骨グラフトを培地で予め濡らし、一晩インキュベートした後、低付着24ウェルプレート（Corning）に入れた。細胞懸濁液の半分(200uL)を各SCF処理軟骨グラフトの片側に注意深く置き、細胞を表面に確実に付着させるようにインキュベーター内で2時間培養した。上記と同じ方法に従って、残りの細胞懸濁液をSCF処理軟骨グラフトの他側（即ち、細胞と接触していない側）に置いた。次いで、細胞接種した軟骨グラフトを2mLの培地で7日間培養した後、以下の分析のために10％ホルマリンで固定した。
【００５５】
軟骨グラフトの初代軟骨細胞の再細胞化
【００５６】
軟骨グラフトを24ウェルプレート（200mg /ウェル）に入れ、その後、新たに単離した軟骨細胞を軟骨グラフトに接種した。培地における最終細胞数は1.2x107であった。培地を週に3回交換した。培養2週間後、軟骨グラフトを回収し、後続の分析のために10％ホルマリンで固定した。
【００５７】
圧縮強度の測定
【００５８】
すべての軟骨試料をPBS溶液中で少なくとも16時間再水和させ、試料の形状に応じて、各試料の高さ及び/又は直径を測定した。軟骨試料がストリップ状である場合に、その高さを測定した。一方、軟骨試料が円盤状である場合に、試験前の直径を記録した。圧縮強度の測定は、Lloyd機器（LRX Instrument、England）で行った。各試験は2Nの予荷重で開始し、装填速度を0.18mm /分に設定し、試料の高さおよび/または直径が65％低下したときに試験を中止した。
【００５９】
実施例1:軟骨グラフトの調製及び特性分析
【００６０】
1.1  脱細胞化軟骨グラフトの調製
【００６１】
ブタの関節を滅菌し、軟骨を外科的に除去した。軟骨を水で洗浄した後、目的の用途に応じて様々なサイズおよび形状の基質にダイシングした。
【００６２】
まず、室温で軟骨基質を水酸化ナトリウム溶液（1N）に3時間浸漬し、次に4℃で過酸化水素溶液（5％）に48時間浸漬した。各溶液処理後、軟骨基質を大量の水で洗浄して残留処理溶液を除去した。
【００６３】
次いで、軟骨基質をscCO2により350bar、37℃で100分間処理して残留細胞物質を除去し、脱細胞化軟骨グラフトを生成した。その後、ガンマ線（30kGy）で照射し、使用するまで乾燥滅菌の状態で保存した。
【００６４】
1.2  実施例1.1の軟骨グラフトの特性分析
【００６５】
形態学的分析の結果は、SCF処理前に、小腔（軟骨に軟骨細胞を含む小さな空間）に残留細胞物質が観察されたことを示した(図1;パネルA)。しかし、異なるレベルの圧力でSCF処理した後、小腔で観察された残留細胞物質が完全に消失した(図1;パネルB,C,D)。それによって、SCF処理が軟骨から軟骨物質を除去する有効な手段であることが確認された。この結果は、H&E染色、DAPI及びアルシアンブルー染色によって確認された。これらの染色において、細胞核（図2）も酸性多糖類（例えば、軟骨中のグリコサミノグリカン）（図3）も陽性染色されなかった。 図1から3の結果により、SCF処理軟骨グラフトに残留細胞物質（例えば、核および炭水化物部分）が存在しないことが確認された。
【００６６】
さらに、SCF処理軟骨グラフトの多孔性が比較的インタクトであった(図4)ため、3T3細胞及び初代軟骨細胞の再細胞化を支持することができる。初代軟骨細胞は、実施例1.1の軟骨グラフトの多孔質構造中に移動し、小腔に埋め込まれていることが観察された(データは示さず)。
【００６７】
実施例1.1のSCF処理軟骨グラフトの機械的性質は、天然軟骨よりも優れていた。圧縮試験において、実施例1.1のSCF処理軟骨グラフトは、天然軟骨より少なくとも2倍の応力に耐えることができた（図5）。
【００６８】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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