(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上選択される５〜１２０個の連続したポリペプチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物。
【請求項２】
前記配列番号１で表されるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列は、ＶＨＳＶ構造タンパク質である非ビリオン性タンパク質（ＮＶ）領域であることを特徴とする請求項１に記載の高病原性ＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物。
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上選択される１５〜３６０個の連続したポリヌクレオチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物。
【請求項４】
ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）に感染された検体からＶＨＳＶ  ＤＮＡ塩基配列をシーケンシングする段階と、
前記シーケンシング段階から得られたＤＮＡ塩基配列情報をアミノ酸配列情報に変換する段階と、
前記アミノ酸配列情報のうち、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上検出する段階と、
を含むＶＨＳＶ感染診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項５】
前記検体は、クロソイ、ヒラメ、鯛、マハタ、ボラ、スズキ、コノシロ、カレイ、フグ、サバ、クジメ、マグロ、ニベ、ブリ、アジ、コイ、アユ、ウナギ、ナマズ、ドジョウ、及びフナからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のＶＨＳＶ感染診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項６】
前記シーケンシング段階から得られたＤＮＡ塩基配列情報は、ＶＨＳＶ構造タンパク質である非ビリオン性タンパク質（ＮＶ）領域であることを特徴とする請求項４に記載のＶＨＳＶ感染診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キット。
【請求項８】
配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キット。
【請求項９】
前記製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー及びプローブからなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のＶＨＳＶ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高病原性ウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；ＶＨＳＶ）検出用バイオマーカー組成物及びＶＨＳＶ感染を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）は、ヒラメを含めた多くの養殖魚類の深刻な損失を起こすウイルス病原体であって、ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）の原因となる。
【０００３】
ＶＨＳは、ニジマスの重要ウイルス性疾病として最初に報告されたが、最近、多様な魚類、マス、ニジマス、ギンザケ、カワマス、ブラウンマス、スチールヘッドマス（ｓｔｅｅｌｈｅａｄ  ｔｒｏｕｔ）などのサケ科魚類だけではなく、タラ、ニシンのような自然水系の魚類及びヒラメのような海産養殖魚類でも広く発生し、主にヨーロッパ、北米、アジア地域で広く発生する。
【０００４】
大韓民国の場合、２００１年にヒラメで最初に報告された以後、慶尚北道及び済州島地域で持続的に確認されており、水温が１４℃以下に低くなる晩秋から春季にかけて小さな稚魚だけではなく、大きな魚体にも斃死を起こす。感染されたヒラメを肉眼で見れば、体色黒化、全身の出血、腹水貯留による腹部膨満と脱腸、エラの退色、無眼側体表に赤い斑点状の出血が観察される。
【０００５】
ＶＨＳＶは、陰性一本鎖ＲＮＡウイルスとして１９６３年に世界動物保健機構（ＯＩＥ）の魚病シンポジウムに初めて報告され、弾丸状であり、長さは１８０ｎｍ、直径が６０ｎｍであるウイルスであり、サイズは１１ｋｂであり、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｎ）、ポリメラーゼ関連のリン酸タンパク質（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｐ）、基質タンパク質（ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｍ）、表面糖タンパク質（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｇ）、独特な非ビリオン性タンパク質（ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｏｎ−ｖｉｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＶ）、及びウイルスポリメラーゼ（ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｌ）の６種のタンパク質で構成されているラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）科に属し、前記ＶＨＳＶを生成する６個のタンパク質のうちからＮＶタンパク質が、ＶＨＳＶの病原性と関連があるということが報告された。
【０００６】
このようなＶＨＳＶは、非常に迅速に遺伝子変異が発生して、新たな変種ＶＨＳウイルスが持続的に発生する。
【０００７】
しかし、大韓民国で獲得した低病原性ＶＨＳＶと高病原性ＶＨＳＶとの全体遺伝子配列情報を分析した結果、ＶＨＳＶの病原性と関連があると報告されたＮＶ遺伝子配列では、差が発見されず、高病原性を有した新種ＶＨＳＶの早期検出方法についての研究は、国内外のヒラメと多様な養殖魚類との保護に必須である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高病原性ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）を検出するためのバイオマーカー組成物を提供して、高病原性を有した新種ＶＨＳＶを早期検出し、ＶＨＳＶ感染の有無を診断する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上選択される５〜１２０個の連続したポリペプチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上選択される５〜３６０個の連続したポリヌクレオチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）に感染された検体からＶＨＳＶ  ＤＮＡ塩基配列をシーケンシングする段階と、前記シーケンシング段階から得られたＤＮＡ塩基配列情報をアミノ酸配列情報に変換する段階と、前記アミノ酸配列情報のうち、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上検出する段階と、を含むＶＨＳＶ感染診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キットを提供する。
【００１３】
また、本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の高病原性と関連したＮＶタンパク質で６個のアミノ酸変異を確認し、前記６個のアミノ酸変異体のうち、特に、５６番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換された時、高い高病原性が誘導されることを確認した。したがって、前記６個のアミノ酸変異をバイオマーカーとして使用して、新たなＶＨＳＶを検出し、魚類のＶＨＳＶ感染の有無を早期に診断することができるウイルス性出血性敗血症診断用バイオマーカーとして活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の完全解毒のために、ＰＣＲ遂行後、増幅されたＤＮＡ断片を確認した結果である。
【図２】ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶ変異体遺伝子を細胞内で効率的にタンパク質で発現させるために、クローニングに使われたｐｃＤＮＡ３ベクター模式図である。
【図３】ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶタンパク質領域の増幅されたＤＮＡ塩基配列をアミノ酸配列に変換し、ＮＶタンパク質アミノ酸配列の変異された部分を確認した結果である。
【図４】野生型ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶ遺伝子がクローニングされたベクターをヒラメ細胞に形質導入し、細胞内で野生型ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質発現によるＡＴＰ生成レベルを確認した結果である。
【図５】６個のウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶアミノ酸変異体タンパク質の病原性を確認するために、それぞれのアミノ酸変異体を発現するベクターを製作して、ヒラメ細胞に形質導入し、発現を誘導した後、ＡＴＰ生成率を確認した結果である。
【図６】ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＮＶ変異体タンパク質のｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘを確認した結果であって、図６のＡは、８番目のアミノ酸であるセリンがアスパラギンに置換された変異体のＡＴＰ生成変化を確認した結果であり、図６のＢは、５６番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換された変異体のＡＴＰ生成変化を確認した結果であり、図６のＣは、８１番目のアミノ酸であるトレオニンがアラニンに置換された変異体のＡＴＰ生成変化を確認した結果であり、図６のＤは、８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換された変異体のＡＴＰ生成変化を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上選択される５〜１２０個の連続したポリペプチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物を提供することができる。
【００１７】
前記配列番号１で表されるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列は、ＶＨＳＶ構造タンパク質である非ビリオン性タンパク質（ＮＶ）領域であり得る。
【００１８】
本発明の一実施例によれば、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の高病原性と関連したＮＶタンパク質で、図３のように、６個のアミノ酸変異を確認し、前記６個のアミノ酸変異体のうち、特に、５６番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換された時、高い高病原性が誘導されることを確認した。したがって、本発明の６個のアミノ酸変異をバイオマーカーとして使用して、新たなＶＨＳＶを検出し、魚類のＶＨＳＶ感染の有無を早期に診断することができるウイルス性出血性敗血症診断用バイオマーカーとして活用することができる。
【００１９】
本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上選択される５〜３６０個の連続したポリヌクレオチドを有効成分として含有するＶＨＳＶ検出用バイオマーカー組成物を提供することができる。
【００２０】
本発明は、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）に感染された検体からＶＨＳＶ  ＤＮＡ塩基配列をシーケンシングする段階と、前記シーケンシング段階から得られたＤＮＡ塩基配列情報をアミノ酸配列情報に変換する段階と、前記アミノ酸配列情報のうち、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上検出する段階と、を含むＶＨＳＶ感染診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００２１】
前記検体は、クロソイ、ヒラメ、鯛、マハタ、ボラ、スズキ、コノシロ、カレイ、フグ、サバ、クジメ、マグロ、ニベ、ブリ、アジ、コイ、アユ、ウナギ、ナマズ、ドジョウ、及びフナからなる群から選択され、望ましくは、ヒラメであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
前記シーケンシング段階での配列分析は、当業者に公知の方法をいずれも利用でき、具体的には、これに制限されるものではないか、自動塩基配列分析器を使用するか、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＰＣＲ−ＲＥＬＰ法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリッド化法とを組み合わせたＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリッド化法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＲＣＡ法（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ）法、プライマー伸張法、サザンブロットハイブリッド化法、及びドットハイブリッド化法などの公知の方法のうち、選択された何れか１つ以上を使用することができる。
【００２３】
前記シーケンシング段階から得られたＤＮＡ塩基配列情報は、ＶＨＳＶ構造タンパク質である非ビリオン性タンパク質（ＮＶ）領域であり得る。
【００２４】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のアミノ酸配列内で、５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換されたアミノ酸；８番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸；８１番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸；８８番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたアミノ酸；１１７番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されたアミノ酸、及び１１９番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されたアミノ酸からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キットを提供することができる。
【００２５】
また、本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の遺伝子内で、前記配列の２３番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；１６７番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された遺伝子；２４１番目の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された遺伝子；２６２番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子；３５０番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子、及び３５５番目の塩基がアデノシン（Ａ）に置換された遺伝子からなる群から１つまたは２つ以上を検出する製剤を含むＶＨＳＶ検出用キットを提供し、前記製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー及びプローブからなる群から選択されうる。
【００２６】
本発明のＶＨＳＶ検出用キットには、塩基置換が起こった遺伝子またはこれらのタンパク質を選択的に認知することができるプライマーまたは抗体だけではなく、免疫学的分析に使われる当分野で一般的に使われるツール及び試薬などが含まれる。
【００２７】
このようなツールや試薬としては、適した担体、検出可能な信号を生成することができる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるか、これらに制限されるものではない。標識物質が酵素である場合には、酵素の活性を測定することができる基質及び反応停止剤を含みうる。適した担体としては、これに限定されるものではないが、可溶性担体、例えば、当分野に公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロース、及びこれらの組合わせであり得る。
【００２８】
本発明の検出用キットは、望ましくは、ＲＴ−ＰＣＲキット、ＤＮＡキットまたはタンパク質チップキットであり得る。
【００２９】
前記ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対を含み、その他のテストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ、及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含みうる。
【００３０】
前記ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が付着されている基板、及び蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などを含み、前記基板は、対照群遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含みうる。
【００３１】
前記タンパク質チップキットは、マーカーに対する１つ以上の抗体が基板上の定められた位置に配列されて、高密度で固定化されているキットであり得る。タンパク質チップを用いる方法は、試料からタンパク質を分離し、該分離したタンパク質をタンパク質チップと混成化させて、抗原−抗体複合体を形成し、それを読み出してタンパク質の存在または発現レベルを確認することができる。
【００３２】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００３３】
＜実施例１＞ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）全体遺伝子変異確認
ヒラメを含めた多様な養殖魚類の深刻な斃死を起こす高病原性ＶＨＳＶの早期診断のために、２０１２年から２０１４年まで３年間大韓民国の海岸地域で獲得した斃死誘発ＶＨＳＶ１３種のウイルス全体遺伝子変異配列を分析した。
【００３４】
１．ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）分離
ウイルス性出血性敗血症の症状を見せるヒラメの内臓でウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）を獲得するために、下記表１のように、１３匹のヒラメから得られた内臓組織を抗生剤と子牛血清とが含まれたＭＥＭ培地で粉砕し、粉砕物を４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．４５μｍ膜を用いて濾過した。
【００３５】
濾過後、得られた組織粉砕物をＥＰＣヒラメ細胞に１：１００及び１：１０００の希釈倍率で接種して、１６℃で培養し、顕微鏡観察を通じて細胞異常を確認した。
【００３６】
細胞病理現象が鮮明に確認された時、細胞培養液を収集して、−８０℃で保管し、標準プラーク分析方法（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．，＆  Ｖｏｇｔ，Ｍ．（１９５３）．Ｓｏｍｅ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｌａｑｕｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１８，２７３−２７９；Ｌｅｌａｎｄ  Ｄ，Ｇｉｎｏｃｃｈｉｏ  Ｃ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｇｅ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００７；２０：４９−７８）で定量した。
【００３７】
【表１】
0006511544.tif 000002
【００３８】
２．ＶＨＳＶゲノム分離及び遺伝子配列分析
ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質の遺伝子配列（配列番号２）に基づいて、全体ウイルス遺伝子配列分析に必要なＤＮＡ重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を表２のように製作した。
【００３９】
【表２】
0006511544.tif 000003
【００４０】
１μＭの各プライマー、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ、５  Ｕ  ｎＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）及び鋳型ＤＮＡとして、ｐｃＤＮＡ３−ＮＶ  １００ｎｇ添加した後、蒸留水でＰＣＲ混合物の最終ｖｏｌｕｍｅが２０μＬになるようにした。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎさせた後、９５℃で３０秒ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ、５８℃で３０秒ａｎｎｅａｌｉｎｇ、７２℃で３０秒ｅｘｔｅｎｓｉｏｎの反応を１ｃｙｃｌｅにして、２５ｃｙｃｌｅｓを反応させた。
【００４１】
次いで、７２℃で５分間ｐｏｓｔ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎさせた。ＰＣＲ後、増幅産物は、１×ｂｕｆｆｅｒを電気泳動のための緩衝液にして、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）が添加された１％アガロースゲル上で電気泳動した後、ＵＶ検出器でバンドを観察した。
【００４２】
ＰＣＲ増幅産物は、ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて回収した後、各試料を１：１で混合し、鋳型として使用して、ＮＶ  ＯＲＦ  ｐｒｉｍｅｒを用いて前記のような条件でもう一度ＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、同様に電気泳動後、ＵＶ検出器でＤＮＡバンドを観察した。ＰＣＲ増幅産物は、ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて回収し、ＴＯＰｃｌｏｎｅｒＴＭＴＡｃｏｒｅＫｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）を用いてクローニングして、塩基配列分析を行った。
【００４３】
ＰＣＲ反応後、得られたＤＮＡ生成物は、アガロースゲルを用いて確認し、図１のようなＤＮＡ断片を獲得した。
【００４４】
前記ＤＮＡ断片の配列分析を行って、ＶＨＳＶ  ＮＶ  ＤＮＡの変異を確認した。
【００４５】
ＤＮＡ配列情報を獲得した後、ＶＨＳＶ  ＮＶ遺伝子のＯＲＦ配列をｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎして、アミノ酸配列を得た。アミノ酸配列をアラインメント（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）して、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）によって変化された配列を確認した。前記あらゆる過程は、Ｂｉｏｅｄｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍを用いて行った。
【００４６】
その結果、１３匹のヒラメから分離された１３個のＶＨＳＶ配列のうち、４個の位置（３９Ｃ／Ｔ、２５３Ｃ／Ｔ、２９１Ｇ／Ａ、３３６Ｇ／Ａ）で変異が共通して発生したが、前記４個のＤＮＡ変異は、アミノ酸を変化させない変異として確認された。
【００４７】
一方、前記４個の共通変異位置の以外に、表３のような６個の重複されないＤＮＡ変異位置を確認し、前記ＤＮＡ変異位置は、図３のように、ＮＶタンパク質のアミノ酸変異（Ｎｏ．８、５６、８１、８８、１１７及び１１９）を誘導することを確認することができた。
【００４８】
【表３】
0006511544.tif 000004
【００４９】
＜実施例２＞アミノ酸変異体ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の病原性確認
１．野生型ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）ＮＶタンパク質変異体のヒラメ細胞内の効果確認
まず、ヒラメ細胞で細胞エネルギーであるＡＴＰの生成程度を分析して、ＶＨＳＶの高病原性を確認した。
【００５０】
細胞内で効率的に野生型ＶＨＳＶ  ＮＶを発現させるために、野生型ＶＨＳＶ  ＮＶ遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングして、組換えベクターを製作した。
【００５１】
前記製作された組換えベクターをヒラメの胚芽細胞であるＨＩＮＡＥ細胞（国立水産科学院）に形質導入して、ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質を発現させた。形質導入２４時間後、細胞エネルギーであるＡＴＰ生成をＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ロシュ社、スイス）を用いて製造社の説明書通りに測定して、ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質発現による細胞エネルギー生成変化を確認した。
【００５２】
その結果、図４のように、野生型ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質発現は、ヒラメ細胞で約２０％のＡＴＰ細胞エネルギー生成を減少させると確認された。
【００５３】
２．アミノ酸変異体ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）ＮＶタンパク質の病原性確認
６個のアミノ酸変異体ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質の病原性を確認するために、前記表３に開示された６個のアミノ酸変異部位の塩基配列をｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングして、組換えベクターを製作した。
【００５４】
前記製作されたベクターを実施例２−１と同じ方法でヒラメ細胞に形質導入し、細胞内で各６個のアミノ酸変異体（Ｎｏ．８、Ｓ→Ｎ；Ｎｏ．５６、Ｓ→Ｌ；Ｎｏ．８１、Ｔ→Ａ；Ｎｏ．８８、Ｖ→Ｉ；Ｎｏ．１１７、Ｇ→Ｄ及びＮｏ．１１９、Ｅ→Ｋ）の発現を誘導した後、ＡＴＰ生成率を分析した。
【００５５】
その結果、図５のように、野生型ＶＨＳＶ  ＮＶタンパク質と比較して、最高４５％のＡＴＰ生成減少を示し、６個の変異体のうちからＮｏ．５６（セリン→ロイシン）アミノ酸変異体が最も大きな減少を示した。
【００５６】
また、タンパク質の機能は、タンパク質の構造と密接な関連性を有するので、タンパク質構造結晶に最も重要な要素の１つである親水性／疏水性を示すｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ（Ｋｙｔｅ  Ｊ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ（Ｍａｙ  １９８３）．“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−３２．）を各変異アミノ酸に代入して確認した。
【００５７】
その結果、図６のように、あらゆる変異体のｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘで変化が確認され、特に、図６のＢのＮｏ．５６（セリン→ロイシン）変異でｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘが−０．８（セリン）から＋３．８（ロイシン）に最も大きく変わると表われた。これは、以前実験結果であるＡＴＰ生成率の分析と一致し、それを通じてＮｏ．５６アミノ酸変異によってＮＶタンパク質の３次構造が急激な変化が誘導されたことが確認された。
【００５８】
前記結果からタンパク質の機能は、タンパク質構造と密接な関連性を有するので、Ｎｏ．５６アミノ酸変異によるＮＶタンパク質構造変形は、ＶＨＳＶ高病原性に影響を与えるということが確認されることによって、前記Ｎｏ．５６（セリン→ロイシン）アミノ酸変異をヒラメのＶＨＳＶ−関連高病原性／斃死誘導の早期診断のための効果的な病原性マーカーとして使われる。
【００５９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施態様であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物とによって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、高病原性ウイルス性出血性敗血症ウイルス検出用バイオマーカー及び診断方法関連の分野に適用可能である。
【図１】
0006511544.tif 000005
【図２】
0006511544.tif 000006
【図３】
0006511544.tif 000007
【図４】
0006511544.tif 000008
【図５】
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【図６Ａ】
0006511544.tif 000010
【図６Ｂ】
0006511544.tif 000011
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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