(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器を収容するための内部空間を包囲する周壁と、
前記周壁に包囲された内部空間の上方を閉塞する透明な天板と、
前記天板に設けられ前記内部空間を保温するためのヒータと、
前記周壁に包囲された内部空間の下方を閉塞し内部空間に収容した細胞培養容器に向けて照射されるレーザ光を透過させることができる透明な底板と
を具備する培養容器収容装置。
【請求項２】
前記ヒータが透明導電膜を用いたものである請求項１記載の培養容器収容装置。
【請求項３】
前記内部空間に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口を具備する請求項１または２記載の培養容器収容装置。
【請求項４】
前記底板が波長２５３．７ｎｍ近傍の紫外線を殆どまたは全く透過させないものである請求項１、２または３記載の培養容器収容装置。
【請求項５】
前記天板が間隙を空けて上下に配置された複数枚の透明板による二重構造をなし、下方の透明板に前記ヒータが設けられている請求項１、２、３または４記載の培養容器収容装置。
【請求項６】
前記周壁が、前記内部空間を包囲する内周壁と、内周壁の外側にあって内周壁を包囲する外周壁とによる二重構造をなしている請求項１、２、３、４または５記載の培養容器収容装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する培養容器を収容した状態で当該培養容器に向けてレーザ光を照射する処理を行うための培養容器収容装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近時、体性幹細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ））、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ））を用いた再生医療技術及び創薬の研究開発が勃興している。この種の研究開発においては、必要となる目的細胞や組織を効率よく量産できることが極めて重要となる。【０００３】
細胞培養の過程では、培地で増殖した細胞コロニーの一部をクランプとして取り出し、そのクランプを新しい培地に移して再び培養する継代培養を行うことが通例である（例えば、下記特許文献１を参照）。【０００４】
現状、増殖した細胞から複数のクランプを切り出す作業は、人の手によってなされている。だが、これには手間を要する上、作業を行う者のスキルその他の個人差の影響を受けるために、クランプの大きさが不揃いとなって、継代後の細胞の生育状態にばらつきを生ずる原因ともなる。【０００５】
また、患者の傷ついた組織や臓器を補う再生医療の目的で用いる細胞集合体に不良のまたは不要な細胞が混交していると、本来の効用を発揮できないおそれがあるだけでなく、腫瘍化その他の患者の健康に悪影響を及ぼすことにもなりかねない。しかしながら、不要細胞が混入している培養容器を丸ごと廃棄することは、目的細胞または組織の収率（歩留まり）の低下につながり、再生医療のコストを高騰させる。目的細胞または組織の収率を改善するためには、培養容器内に存在する不要細胞を死滅させまたは除去して、残りの細胞を無駄にせず利用することが望ましい。【０００６】
そこで、集光性に優れたレーザ光を利用して、増殖した細胞を複数のクランプに精確に切り分けたり、不要細胞のみを選択的に死滅させたりすることが試みられている（例えば、下記特許文献２を参照）。【０００７】
一方、細胞の培養それ自体は、ＣＯ2インキュベータ（例えば、下記特許文献３を参照）を使用して行うことが多い。ＣＯ2インキュベータは、その庫内に温度３７℃、湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の雰囲気を作り出し、その雰囲気中に細胞培養容器を保管しておくものである。培養中の細胞は、有機酸等を生産して培地のｐＨを低下させる。そこで、細胞培養容器内の培地に予め炭酸水素ナトリウムを添加しておき、培養中に発生する水素イオンを重炭酸イオンと反応させて炭酸を生じさせ、その炭酸からの二酸化炭素の生成をＣＯ2インキュベータ内雰囲気中の二酸化炭素濃度と平衡させることにより、培地のｐＨを７．４前後に維持するようにしている。【０００８】
炭酸水素ナトリウムを添加した培地を包有する細胞培養容器を、二酸化炭素濃度の低い空気中に置いておくと、培地のｐＨが７．４よりも高い値で平衡に達する。それ故、細胞培養容器を二酸化炭素濃度の低い雰囲気に曝すことは、できる限り避けることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１４−５０９１９２号公報
【特許文献２】特願２０１６−５２２８３９号明細書
【特許文献３】特開２０１０−１５４７９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞培養容器の周囲の雰囲気を所望の状態に維持しながら細胞培養容器に向けてレーザ光を照射する処理を実行できるようにすることを所期の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した課題を解決するべく、本発明では、細胞培養容器を収容するための内部空間を包囲する周壁と、前記周壁に包囲された内部空間の上方を閉塞する透明な天板と、前記天板に設けられ前記内部空間を保温するためのヒータと、前記周壁に包囲された内部空間の下方を閉塞し内部空間に収容した細胞培養容器に向けて照射されるレーザ光を透過させることができる透明な底板とを具備する培養容器収容装置を構成した。【００１２】
前記ヒータは、例えば、透明導電膜を用いて作製する。【００１３】
より好ましくは、前記内部空間に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口を具備したものとする。【００１４】
その上で、前記底板が波長２５３．７ｎｍ近傍の紫外線を殆どまたは全く透過させないものであるならば、培養容器収容装置の上方に配置した殺菌灯から照射される紫外線が底板を透過して底板の下方に所在するレーザ光照射装置や顕微鏡等の機構または部材に悪影響を及ぼすことを抑制できる。【００１５】
前記天板が間隙を空けて上下に配置された複数枚の透明板による二重構造をなし、下方の透明板に前記ヒータが設けられていれば、ヒータが加温する内部空間の保温性が高まる。【００１６】
前記周壁が、前記内部空間を包囲する内周壁と、内周壁の外側にあって内周壁を包囲する外周壁とによる二重構造をなしていれば、内部空間の保温性が一層高まる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細胞培養容器の周囲の雰囲気を所望の状態に維持しながら細胞培養容器に向けてレーザ光を照射する処理を実行できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第一実施形態の培養容器収容装置を示す斜視図。
【図２】同実施形態の培養容器収容装置の分解斜視図。
【図３】同実施形態の培養容器収容装置の分解斜視図。
【図４】同実施形態の培養容器収容装置の断面図。
【図５】同実施形態におけるレーザ光を照射する処理を説明する側断面図。
【図６】本発明の第二実施形態の培養容器収容装置を示す斜視図。
【図７】同実施形態の培養容器収容装置の分解斜視図。
【図８】同実施形態の培養容器収容装置の分解斜視図。
【図９】同実施形態の培養容器収容装置の断面図。
【図１０】同実施形態の培養容器収容装置の断面図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜第一実施形態＞本発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。図１ないし図４に示す第一実施形態の培養容器収容装置１は、細胞の培養、観察またはレーザ光を用いた処理を実行するための場（大型の機器の内部であることがある）を上下に区画するテーブル２に設置される。テーブル２の上方の空間は、細胞培養容器９内で培養される細胞や培地９３に悪影響を与えないような清浄な雰囲気に維持される。翻って、テーブル２の下方の空間には、細胞培養容器９に対してレーザ光を照射する照射装置や、細胞培養容器９を観察する顕微鏡等が配置される。テーブル２には、これを上下に貫通する窓２１が予め開設されている。本実施形態の培養容器収容装置１は、この窓２１を閉塞してテーブル２の上方と下方とを隔絶するように、テーブル２に対して組み付けられる。
【００２０】
本実施形態の培養容器収容装置１は、細胞培養容器９を収容する内部空間１０を囲繞する周壁３１２、３２２を形成する枠構造体３と、その周壁３１２、３２２に囲繞された内部空間１０の上方を閉塞する天板４と、天板４に設けられ内部空間１０を保温するためのヒータ５と、内部空間１０の下方を閉塞するとともに内部空間１０に収容した細胞培養容器９に向けて照射されるレーザ光を透過させることが可能な底板６と、内部空間１０に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口７とを具備する。
【００２１】
枠構造体３は、上下に二分割された上枠３１と下枠３２とを要素とする半割構造の金属製の部材である。上枠３１は、頂壁３１１の周縁部から下方に向けて周壁３１２が垂下した、下方に開放した扁平な箱体状の概形をなす。頂壁３１１には、これを上下に貫通する開口３１３が開設されている。天板４は、頂壁３１１の下面側に固定されて、この開口３１３を封鎖する。
【００２２】
天板４は、透明なガラス板、アクリル板等である。天板４の下面には、酸化インジウムスズや酸化亜鉛等を素材とする透明導電膜を蒸着してヒータ５を構成している。この透明導電膜５に通電すれば、ジュール熱が発生し、天板４下に所在する内部空間１０を加温することができる。ヒータ５は、天板４の略全面に設けてもよいし、天板４の一部分に限定して設けてもよい。また、透明導電膜を天板４の上面に蒸着し、天板４の上面にヒータを設けるようにしてもよい。
【００２３】
下枠３２は、底壁３２１の周縁部から上方に向けて周壁３２２が直立した、上方に開放した扁平な箱体状の概形をなす。底壁３２１には、これを上下に貫通する開口３２３が開設されている。底板６は、底壁３２１の下面側に配置されて、この開口３２３を封鎖する。具体的には、テーブル２の窓２１を塞ぐようにして底板６をテーブル２に載置し、その上から下枠３２を載置することで、底板６の周縁部をテーブル２の窓２１の縁部の上面と下枠３２の開口３２３の縁部の下面とで挟持している。テーブル２の窓２１の縁部と底板６の周縁部との間には、シール材となるＯリング２２を配置する。
【００２４】
底板６は、透明なガラス板、アクリル板等である。この底板６は、ＵＶ−Ｃ領域、即ち波長２００ｎｍないし２８０ｎｍの紫外線を殆どまたは全く透過させないものであることが好ましい。そのために、底板６を、例えば光学ガラスＢＫ７（ホウ素シリカガラス、５１７６４２  ｇｌａｓｓ）を用いて作製する。アクリルガラスも、ＵＶ−Ｃ領域の紫外線を透過させない効能を有している。底板６に、紫外線の透過を防止するコーティングを施してよいことは言うまでもない。底板６により紫外線を遮蔽するのは、テーブル２及び培養容器収容装置１の上方の空間に配設した殺菌灯から照射される紫外線が窓２１を介してテーブル２の下方の空間に到達し、その紫外線がレーザ光照射装置や顕微鏡の部材（塗装やプラスチック、リニアサーボモータの磁石をモールドするゴム等）を劣化させることを抑止する意図である。一方で、底板６は、レーザ照射装置のノズル０から出射するレーザが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有する。
【００２５】
上枠３１及び下枠３２は、ねじ８によりテーブル２に共締めして螺着する。ねじ８を使用して上枠３１と下枠３２とを結合することで、培養容器収容装置１の内部空間１０が外部から隔絶される。内部空間１０に対して細胞培養容器９を出し入れするためには、ねじ８をテーブル２、下枠３２及び上枠３１から脱離させ、上枠３１を下枠３２から取り外して内部空間１０を開放すればよい。テーブル２から下枠３２を脱離させれば、底板６を取り外しまたは交換することができる。
【００２６】
培養容器収容装置１及びその内部空間１０は、濃度７０％のエチルアルコール水溶液を使用して清拭することができる。
【００２７】
細胞培養容器９は、培地９３及び細胞を内に収めるディッシュ（または、シャーレ）であったり、培地及び細胞を収めるウェル（凹部）を複数備えたウェルプレートであったりする。図示例の細胞培養容器９は、ディッシュである。そして、複数個のディッシュ９をトレイ９４に支持させ、そのトレイ９４の周縁部を下枠３２の開口３２３の縁部に上方から係合させることで、複数個のディッシュ９及びトレイ９４を下枠３２に支持させている。この状態で、ディッシュ９の底面と底板６の上面との間には、若干（１ｍｍないし２ｍｍ程度）の隙間を生じる。
【００２８】
細胞培養容器９に対して下方からレーザ光を照射する照射装置のノズル０や、細胞培養容器９を観察する顕微鏡の対物レンズ０は、テーブル２の下方にあって、テーブル２の窓２１及び底板６の開口を介して細胞培養容器９に臨む。ノズル０から出射するレーザ光は、底板６を透過して細胞培養容器９に到達する。細胞培養容器９を顕微鏡により観察する際には、培養容器収容装置１の上方に照明灯を配置し、その照明灯から放射される照明光を天板４を透過させて内部空間１０に導入、細胞培養容器９を照明することができる。
【００２９】
細胞培養容器９に対して使用するレーザの波長は一意に限定されず、例えば４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、８０８ｎｍ等の可視光レーザや赤外線レーザを採用することができる。尤も、後述する細胞培養容器９の被照射層がそのレーザのエネルギを吸収できるような波長を選択する必要がある。また、波長が３８０ｎｍ以下の紫外線レーザは、ＤＮＡやタンパク質に吸収される可能性があり細胞への影響が懸念される。故に、レーザの波長は３８０ｎｍよりも長いことが好ましい。本実施形態では、レーザ光源として、波長が４０５ｎｍ近傍にある最大出力５Ｗの連続波ダイオードレーザを想定している。
【００３０】
レーザ照射装置のノズル０は、細胞培養容器９の被照射層に照射するべきレーザ光を集光するためのレンズや、レーザ光の出射のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるためのシャッタまたはミラー等を内蔵する。このノズル０は、細胞培養容器９の下方に位置し、上方に向かってレーザを出射させる。ノズル０から出射するレーザビームの光軸は、細胞培養容器９の被照射層に対して略直交する。レーザ光源からノズル０に向けてレーザを伝搬させる光学系は、光ファイバ、ミラー、レンズ等の任意の光学要素を用いて構成できる。
【００３１】
レーザ照射装置のノズル０や、顕微鏡の対物レンズ０は、リニアモータ台車等により、Ｘ軸方向（左右方向）及びＹ軸方向（前後方向）に沿って高速かつ精密に移動させ得る。つまり、細胞培養容器９の被照射層と光軸とが交わる角度を略一定に保ちながら、細胞培養容器９の被照射層に対するレーザの照射位置や、顕微鏡の対物レンズ０を介した観察位置を変位させることができる。
【００３２】
以降、細胞培養容器９に関して補足する。図５に示すように、本実施形態における細胞培養容器９は、ノズル０から出射するレーザ光を透過させ得る容器本体９１に、レーザ光の照射を受けて熱及び／または酸を発生させる光応答性材料を含む層である被照射層９２を設けたものである。
【００３３】
容器本体９１は、ノズル０から出射するレーザが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有する、プラスチックやガラス等の材料により構成する。プラスチックの例としては、ポリスチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー（ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニルピリジン系ポリマー（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系ポリマー（ポリジメチルシロキサン等）、ポリオレフィン系ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等）、ポリエステルポリマー（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等）、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。既製の培養容器を、そのまま容器本体９１として用いてもよい。容器本体９１の形状は、既製の培養容器と同様、ディッシュ（シャーレ）形、マルチディッシュ形、フラスコ形等とすることができる。
【００３４】
ポリスチレン系樹脂を用いて作製した容器本体９１の光透過率は非常に高く、光波長約３８０ｎｍ以上では８５％以上となる。但し、光波長約３８０ｎｍ以下では、光波長が短くなるほど光透過率が低下、即ち容器本体９１による光の吸収が増大してゆく。これは、ポリスチレン材料に含まれる不純物に起因するものと思われる。
【００３５】
被照射層９２は、ノズル０から出射するレーザが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）を含んだポリマー（高分子）により構成することが好ましい。このような材料は、容器本体９１へのコーティングが容易であり、必要な細胞の接着性を確保でき、かつ細胞への移行も起こりにくいものとなるからである。レーザ光を吸収する色素構造の例としては、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素、インジゴ、カロチノイド（カロテン等）、フラボノイド（アントシアニン等）、キノイド（アントラキノン等）等といった有機化合物の誘導体を挙げることができる。並びに、ポリマーを構成する骨格の例としては、アクリル系ポリマー、ポリスチレン系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ポリ酢酸ビニルやポリ塩化ビニル、ポリオレフィン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。
【００３６】
被照射層９２の材料となる色素構造含有ポリマーの一具体例として、ポリ［メチルメタクリラート−ｃｏ−（ジスパースイエロー  ７  メタクリラート）］（化１、（Ｃ5Ｈ8Ｏ2）m（Ｃ23Ｈ20Ｎ4Ｏ2）n）を示す。但し、このアゾポリマーにおけるアゾベンゼンの構造については、無置換のアゾベンゼンの他、ニトロ基やアミノ基、メチル基等で修飾した様々なバリエーションが考えられる。
【００３７】
【化１】
0006473552.tif 000002
【００３８】
上述の色素構造含有ポリマーを含む原料液、または当該色素構造含有ポリマーを溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体９１の上向面即ちウェル９０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光の照射を受けて熱を生じさせる被照射層９２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを７μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体９１の上向面即ちウェル９０の底に塗布すると、平均の厚みが７０ｎｍの被照射層９２をウェル９０の底に敷設することができる。なお、レーザ光を吸収する色素を容器本体９１の構成材料に含有させることで、または色素構造含有ポリマーを材料として容器本体９１を作製することにより、レーザ光の照射を受けて熱を生じさせる被照射層９２を形成しても構わない。
【００３９】
色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを容器本体９１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層９２の光吸収率は、光波長が約３６０ｎｍのときに約６０％でピークとなり、光波長が約３６０ｎｍから長くなるほど低下してゆく。この被照射層９２の光吸収率は、光波長が約４２５ｎｍ以上の領域では２０％を切る。だが、光波長が長くなってもある程度以上の光吸収性が存在しており、４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍまたは５３２ｎｍの波長のレーザ光を当該被照射層９２に十分に吸収させることが可能である。
【００４０】
被照射層９２の材料として、上述の色素構造含有ポリマーとともに、またはこれに代えて、レーザ光の照射を受けて酸性物質を発生させる光酸発生剤を用いることも考えられる。上掲の特許文献１にも開示されている通り、光酸発生剤は、ノズル０から出射するレーザが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）と、分解後に酸性物質となる酸前駆体とを備えた構造を有するものとすることが好ましい。スルホン酸誘導体、カルボン酸エステル類、オニウム塩類、ニトロベンズアルデヒド構造を有する光酸発生基等は、このような光酸発生剤に該当する。
【００４１】
特に、光酸発生剤となるスルホン酸誘導体の例として、チオキサントン系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，３，６−トリオキソ−３，６−ジヒドロ−１Ｈ−１１−チア−アザシクロペンタ［ａ］アントラセン−２−イルエステル等）及びナフタレンイミド系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，８−ナフタルイミド等）を挙げることができる。これら以外に、ジスルホン類、ジスルホニルジアゾメタン類、ジスルホニルメタン類、スルホニルベンゾイルメタン類、イミドスルホネート類、ベンゾインスルホネート類等のスルホン酸誘導体も採用することが可能である。
【００４２】
また、カルボン酸エステルの例として、１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドメチルスルホネートや１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドトシルスルホネート等を挙げることができ、オニウム塩の例として、テトラフルオロボレート（ＢＦ4-）、ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ6-）、ヘキサフルオロアンチモネート（ＳｂＦ6-）等のアニオンを有するスルホニウム塩またはヨードニウム塩を挙げることができる。
【００４３】
上述の光酸発生剤をプラスチック（特に、ＰＭＭＡのようなアクリル系ポリマーやポリスチレン系ポリマー等）に含ませた原料液、または当該光酸発生剤を溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体９１の上向面即ちウェル９０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光の照射を受けて熱とともに酸を生じさせる被照射層９２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを２００μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体９１のウェル９０の底に塗布すると、平均の厚みが２μｍの被照射層９２をウェル９０の底に敷設することができる。なお、光酸発生剤を容器本体９１の構成材料に含有させることにより、レーザ光の照射を受けて熱及び酸を生じさせる被照射層９２を形成しても構わない。
【００４４】
色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを容器本体９１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層９２の光吸収率は、光波長が約３７５ｎｍから約４６０ｎｍの範囲に亘って分布する。この範囲外の波長の光を当該被照射層９２が吸収することはできない。従って、４０５ｎｍまたは４５０ｎｍの波長のレーザ光であれば、当該被照射層９２に吸収させることが可能である。尤も、当該被照射層９２の光吸収率は、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを用いて構成した被照射層９２の光吸収率よりは小さくなり、光波長が約４００ｎｍから約７００ｎｍの可視光領域で２０％（さらに言えば、１０％）を切る。
【００４５】
被照射層９２は、レーザ光の照射を受けて蛍光を発しない材料を用いて構成することが好ましい。また、被照射層９２の厚みは、１０μｍ以下とすることが好ましく、さらに薄ければより好ましい。
【００４６】
なお、細胞培養容器９の被照射層９２の表面に、細胞の接着性を高めるための材料、例えばラミニンやマトリゲル等のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）をコーティングしてもよい。
【００４７】
細胞を培養する際には、細胞培養容器９の容器本体９１に成形されているウェル９０内に培地特に、液体培地）９３を充填する。その培地９３は、ウェル９０の底に敷設されている被照射層９２の直上に所在することとなる。そして、培養される細胞は、当該被照射層９２の表面に接着しつつ増殖して細胞集合体を形成する。
【００４８】
細胞培養容器９のウェル９０内に存在している細胞のうちの所望の細胞を致死させるレーザ照射処理では、レーザ照射装置のノズル０から出射するレーザ光を、培養容器収容装置１の内部空間１０に収容した細胞培養容器９の被照射層９２における、致死させるべき細胞の直下の箇所に照射する。本実施形態では、ノズル０を細胞培養容器９の下方に配置し、ノズル０から打ち上げたレーザ光を容器本体９１を透過させた上、被照射層９２に裏面側から照射する。ノズル０に内蔵されているレンズは、ノズル０から出射するレーザ光の焦点を細胞培養容器９の被照射層９２に合わせる。被照射層９２におけるレーザ光の照射を受けた箇所は、レーザ光のエネルギを吸収して熱及び／または酸を生じ、その熱によって当該箇所の直上に存在する細胞を死に至らしめる。
【００４９】
特に、被照射層９２の構成材料に光酸発生剤を用いているならば、被照射層９２におけるレーザ光の照射を受けた箇所で酸性物質が発生し、その酸性物質が当該箇所の直上に存在する細胞の死または被照射層９２からの剥離を促す。光酸発生剤がスルホン酸誘導体である場合、発生する酸性物質はスルホン酸類である。
【００５０】
レーザ光の波長は、例えば４０５ｎｍとする。培養容器収容装置１の底板６が光学ガラスＢＫ７である場合、この波長のレーザの透過率は９２％となる。レーザの出力の大きさは、０．４Ｗから５Ｗの間とする。無論、出力が５Ｗを超えていても構わない。レーザのビーム径は、例えば５０μｍ以下とする。無論、ビーム径をより小さく、例えば２０μｍないし２５μｍ程度に絞ってもよいし、ビーム径を５０μｍ以上に拡大してもよい。連続波レーザまたは連続波に近いパルスレーザを出射するノズル０を細胞培養容器９に対して移動させる走査の速さは、５０ｍｍ／秒から２０００ｍｍ／秒の間とする。
【００５１】
レーザ照射処理中の細胞培養容器９は、ＣＯ2インキュベータと同等の雰囲気とした培養容器収容装置１内に配置される。培養容器収容装置１の内部空間１０には、ガス供給口７を介して、二酸化炭素濃度５％のガスが供給される。
【００５２】
本実施形態では、細胞培養容器９を収容するための内部空間１０を包囲する周壁３１２、３２２と、前記周壁３１２、３２２に包囲された内部空間１０の上方を閉塞する透明な天板４と、前記天板４に設けられ前記内部空間１０を保温するための透明導電膜を用いたヒータ５と、前記周壁３１２、３２２に包囲された内部空間１０の下方を閉塞し内部空間１０に収容した細胞培養容器９に向けて照射されるレーザ光を透過させることができる透明な底板６と、前記内部空間１０に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口７とを具備する培養容器収容装置１を構成した。
【００５３】
本実施形態によれば、二酸化炭素濃度の高い雰囲気を維持しながら、細胞培養容器９に向けてレーザ光を照射する処理を実行したり、細胞培養容器９を観察したりすることができ、細胞培養容器９で培養している細胞に不要なダメージを与えずに済む。
【００５４】
加えて、本実施形態では、図５に示しているように、培養容器収容装置１の内部空間１０に配置した細胞培養容器９に対して下方からレーザ光を照射するようにしている。培養容器収容装置１及びテーブル２の直下に配置した加工ノズル０から出射するレーザ光は、底板６を透過して細胞培養容器９の被照射層９２に照射される。その上で、レーザ光が通過する底板６にはヒータを設けず、細胞培養容器９よりも上方にあってレーザ光が通過しない天板４に透明導電膜ヒータ５を敷設している。このような構造により、レーザ光の照射処理中であっても培養容器収容装置１の内部空間をヒータ５を用いて適切に保温できる上、透明導電膜ヒータ５にレーザ光が吸収されて細胞培養容器９２に照射されるレーザ光のエネルギが徒に低減することがなく、レーザ光によって透明導電膜ヒータ５が損傷することも回避できる。もしも底板６にヒータを設けていると、底板６と被照射層９２との距離が近いことから、そのヒータが大きな損傷を受けるおそれがある。
【００５５】
また、培養容器収容装置１の底板６が、波長２５３．７ｎｍ近傍の紫外線を殆どまたは全く透過させないものであることから、培養容器収容装置１の上方に配設された殺菌灯から放射される滅菌用の紫外線が培養容器収容装置１の下方に配設されたレーザ照射装置や顕微鏡の部材を劣化させることを回避できる。
【００５６】
＜第二実施形態＞続いて述べる第二実施形態の培養容器収容装置１は、天板４１、４２及び周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２をそれぞれ二重構造化して内部空間１０の保温性をより一層高めたものである。以降、第一実施形態との相違点を中心に説明する。第一実施形態と共通する事項については、その説明を割愛する。
【００５７】
図６ないし図１０に示す本実施形態の培養容器収容装置１もやはり、細胞の培養、観察またはレーザ光を用いた処理を実行するための場を上下に区画するテーブル２に設置される。テーブル２には、これを上下に貫通する窓２１が予め開設されている。培養容器収容装置１は、この窓２１を閉塞してテーブル２の上方と下方とを隔絶するように、テーブル２に対して組み付けられる。
【００５８】
本実施形態の培養容器収容装置１は、細胞培養容器９を収容する内部空間１０を囲繞する周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２を形成する枠構造体３と、その周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２に囲繞された内部空間１０の上方を閉塞する天板４１、４２と、天板４２に設けられ内部空間１０を保温するためのヒータ５と、内部空間１０の下方を閉塞するとともに内部空間１０に収容した細胞培養容器９に向けて照射されるレーザ光を透過させることが可能な底板６と、内部空間１０に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口７とを具備する。
【００５９】
枠構造体３は、上枠３３と下枠３４とを備えている。本実施形態にあって、上枠３３は、外枠３３１、内枠３３２及び最内枠３３３を要素とする二重構造（多重構造）をなし、さらに外枠３３１の下縁よりも下方に突き出すカバー枠３３４が付随するものである。
【００６０】
外枠３３１は、頂壁３３１１の周縁部から下方に向けて周壁３３１２が垂下した、下方に開放した扁平な箱体状の概形をなす。この外枠３３１の周壁３３１２は、第一実施形態における上枠３１の周壁３１２よりも肉薄となっている。外枠３３１の頂壁３３１１には、これを上下に貫通する開口３３１３が開設されている。天板４１、４２は、頂壁３３１１の下面側に固定されて、この開口３３１３を封鎖する。
【００６１】
内枠３３２は、外枠３３１の周壁３３１２の内周に略等しい外周を有した四方枠状の部材であり、外枠３３１の内側に収まる。内枠３３２の周壁３３２１の内周面の上縁近傍の部位からは、内側方に向かって略水平に支持片３３２２が突き出している。支持片３３２２の上面には、上方から天板となる透明板４１を載置する。透明板４１は、その周縁部が支持片３３２２に対して固定される。
【００６２】
最内枠３３３は、内枠３３２の周壁３３２１の内周に略等しい外周を有した四方枠状の部材であり、内枠３３２の内側に収まる。最内枠３３３の周壁３３３１の上面には、上方から天板となる透明板４２を載置する。透明板４２は、その周縁部が周壁３３３１に対して固定される。なお、透明板４２と最内枠３３３とが一体成形されていることがある。
【００６３】
天板となる透明板４１、４２はそれぞれ、透明なガラス板、アクリル板等である。透明板４１、４２が、可視光や、殺菌灯として使用される波長２００ｎｍないし２８０ｎｍの紫外線を透過させるものであることは言うまでもない。しかして、内部空間１０に面する下方の透明板４２の上面及び／または下面に透明導電膜を蒸着して、ヒータ５を構成している。この透明導電膜５に通電すれば、ジュール熱が発生し、透明板４２下に所在する内部空間１０を加温することができる。ヒータ５は、透明板４２の略全面に設けてもよいし、透明板４２の一部分に限定して設けてもよい。
【００６４】
カバー枠３３４は、後述する下枠３４の外枠３４１の周壁３４１２の内周に略等しい外周を有した四方枠状の部材である。このカバー枠３３４は、下枠３４の外枠３４１の内側に収まる。カバー枠３３４は、特に、ヒータ５により加温するべき内部空間１０の容積を縮小する役割を担う。
【００６５】
外枠３３１、透明板４１を支持する内枠３３２、透明板４２を支持する最内枠３３３、及びカバー枠３３４は、一体化されて枠構造体３の上枠３３を構成する。このとき、図９及び図１０に示しているように、外枠３３１の周壁３３１２の内周面に内枠３３２の周壁３３２１の外周面が当接または近接し、内枠３３２の周壁３３２１の内周面に最内枠３３３の周壁３３３１の外周面が当接または近接する。
【００６６】
また、外枠３３１の頂壁３３１１の下面に内枠３３２の周壁３３２１の上面が当接または近接し、内枠３３２の支持片３３２２の下面に最内枠３３３に支持された天板４２の外周部の上面が当接または近接する。そして、複数枚の透明板４１、４２が、支持片３３２２の厚み分またはそれよりも大きい間隙４３を空けて上下に対向配置された状態となる。
【００６７】
さらに、上枠３３の内枠３３２及び最内枠３３３の周壁３３２１、３３３１の下面に、カバー枠３３４の周壁３３４１の上面が当接または近接する。
【００６８】
なお、内枠３３２及び最内枠３３３を外枠３３１から分離可能としてもよいし、最内枠３３３を内枠３３２から分離可能としてもよい。カバー３３４枠を、内枠３３２及び最内枠３３３から分離可能としてもよい。
【００６９】
下枠３４は、カバー枠３３４が上方から挿入される外枠３４１を主体とする。外枠３４１は、底壁３４１１の周縁部から上方に向けて周壁３４１２が直立した、上方に開放した扁平な箱体状の概形をなす。この外枠３４１の周壁３４１２は、第一実施形態における下枠３２の周壁３２２よりも肉薄となっている。外枠３４１の底壁３４１１には、これを上下に貫通する開口３４１３が開設されている。底板６は、底壁３４１１の下面側に配置されて、この開口３４１３を封鎖する。具体的には、テーブル２の窓２１を塞ぐようにして底板６をテーブル２に載置し、その上から下枠３４の外枠３４１を載置することで、底板６の周縁部をテーブル２の窓２１の縁部の上面と外枠３４１の開口３４１３の縁部の下面とで挟持している。テーブル２の窓２１の縁部と底板６の周縁部との間には、シール材となるＯリング２２を配置する。
【００７０】
底板６は、透明なガラス板、アクリル板等である。この底板６は、波長２００ｎｍないし２８０ｎｍの紫外線を殆どまたは全く透過させない一方、レーザ照射装置のノズル０から出射するレーザが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有することが好ましい。
【００７１】
細胞培養容器（例えば、ディッシュ）９を支持するトレイ９４は、外枠３４１に載置する。具体的には、トレイ９４の周縁部を、外枠３４１の開口３４１３の縁部に上方から係合させる。しかる後、カバー枠３３４を上方から外枠３４１内に挿入して、上枠３３と下枠３４とを結合する。これにより、図９及び図１０に示しているように、トレイ９４が支持する細胞培養容器９は、カバー枠３３４の内側に収まる。また、外枠３４１の周壁３４１２の内周面にカバー枠３３４の周壁３３４１の外周面が当接または近接し、これら外枠３４１及びカバー枠３３４が二重構造をなす。カバー枠３３４の周壁３４１２の下面は、トレイ９４の周縁部の上面からやや浮いている。トレイ９４が支持する細胞培養容器９の底面と、底板６の上面との間には、若干（１ｍｍないし２ｍｍ程度）の隙間を生じる。
【００７２】
第一実施形態では、上枠３１及び下枠３２を、ねじ８によりテーブル２に共締めして螺着していた。これに対し、本実施形態では、下枠３４の外枠３４１をねじによりテーブル２に螺着し、またはその他の固定手段を用いてテーブル２に固定するが、上枠３３と下枠３４とを共締めはしない。その代わりに、下枠３４の外枠３４１の周壁３４１２の上面に上方に突出するピン３４１４を設け、上枠３３の外枠３３１の周壁３３１２の下面に上方に凹んだ係合穴（図示せず）を形成しており、下枠３４に上枠３３を被せるときに前者のピン３４１４が後者の係合穴に挿入されて上枠３３を下枠３４に対して位置決めするようにしている。
【００７３】
上枠３３と下枠３４とを結合することで、培養容器収容装置１の内部空間１０が外部から隔絶される。このとき、図９及び図１０に示しているように、下枠３４の外枠３４１の周壁３４１２の上面に、上枠３３の外枠３３１の周壁３３１２の下面が当接または近接する。内部空間１０に対して細胞培養容器９を出し入れするためには、上枠３３を下枠３４から取り外して内部空間１０を開放すればよい。内部空間１０に対してトレー９４を出し入れするためには、さらに、下枠３４のカバー枠３３４を外枠３４１から取り外せばよい。テーブル２から下枠３４を脱離させれば、底板６を取り外しまたは交換することができる。
【００７４】
レーザ照射処理中の細胞培養容器９は、ＣＯ2インキュベータと同等の雰囲気とした培養容器収容装置１内に配置される。培養容器収容装置１の内部空間１０には、ガス供給口７を介して、二酸化炭素濃度５％のガスが供給される。そのガスは、噴射ノズル７１から内部空間１０に噴出する。図７及び図１０に示すように、噴射ノズル７１は、内部空間１０の前方及び後方のそれぞれ、かつ左右に離間した複数箇所に設置してある。
【００７５】
内部空間１０の前方に設置した噴射ノズル７１は、後上方に向けて、特に透明板４２の下面のヒータ５を指向してガスを吹き出す。並びに、内部空間１０の後方に設置した噴射ノズル７１は、前上方に向けて、透明板４２の下面のヒータ５を指向してガスを吹き出す。図１０に示しているように、下枠３４のカバー枠３３４が噴射ノズル７１を塞いでしまうような場合には、カバー枠３３４に、噴射ノズル７１と内部空間１０とを連通する連通孔３３４２を穿っておけばよい。連通孔３３４２もまた、透明板４２の下面のヒータ５を指向している。
【００７６】
本実施形態では、細胞培養容器９を収容するための内部空間１０を包囲する周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２と、前記周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２に包囲された内部空間１０の上方を閉塞する透明な天板４１、４２と、前記天板４２に設けられ前記内部空間１０を保温するための透明導電膜を用いたヒータ５と、前記周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２に包囲された内部空間１０の下方を閉塞し内部空間１０に収容した細胞培養容器９に向けて照射されるレーザ光を透過させることができる透明な底板６と、前記内部空間１０に対して二酸化炭素を含むガスを供給するためのガス供給口７とを具備する培養容器収容装置１を構成した。
【００７７】
本実施形態によれば、二酸化炭素濃度の高い雰囲気を維持しながら、細胞培養容器９に向けてレーザ光を照射する処理を実行したり、細胞培養容器９を観察したりすることができ、細胞培養容器９で培養している細胞に不要なダメージを与えずに済む。
【００７８】
本実施形態でも、第一実施形態と同様に、培養容器収容装置１の内部空間１０に配置した細胞培養容器９に対して下方からレーザ光を照射する。培養容器収容装置１及びテーブル２の直下に配置した加工ノズル０から出射するレーザ光は、底板６を透過して細胞培養容器９の被照射層９２に照射される。その上で、レーザ光が通過する底板６にはヒータを設けず、細胞培養容器９よりも上方にあってレーザ光が通過しない天板４に透明導電膜ヒータ５を敷設している。このような構造により、レーザ光の照射処理中であっても培養容器収容装置１の内部空間をヒータ５を用いて適切に保温できる上、透明導電膜ヒータ５にレーザ光が吸収されて細胞培養容器９２に照射されるレーザ光のエネルギが徒に低減することがなく、レーザ光によって透明導電膜ヒータ５が損傷することも回避できる。
【００７９】
培養容器収容装置１の底板６が、波長２５３．７ｎｍ近傍の紫外線を殆どまたは全く透過させないものであることから、培養容器収容装置１の上方に配設された殺菌灯から放射される滅菌用の紫外線が培養容器収容装置１の下方に配設されたレーザ照射装置や顕微鏡の部材を劣化させることを回避できる。
【００８０】
本実施形態では、前記天板が、間隙４３を空けて上下に配置された複数枚の透明板４１、４２による二重構造をなし、下方の透明板４２に前記ヒータ５が設けられている。このため、ヒータ５が加温する内部空間１０の保温性が高まる。
【００８１】
さらに、本実施形態では、前記周壁３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２が、前記内部空間１０を包囲する内周壁３３２１、３３３１、３３４１と、内周壁３３２１、３３３１、３３４１の外側にあって内周壁３３２１、３３３１、３３４１を包囲する外周壁３３１２、３４１２とによる二重構造をなしており、内部空間１０の保温性がより一層高まっている。
【００８２】
なお、本発明は以上に詳述した実施形態に限られるものではない。上記各実施形態では、天板４、４２に透明導電膜を用いたヒータ５を設けていたが、透明導電膜以外の材料を用いたヒータ、例えば銅その他の金属を素材とするワイヤをメッシュ状に編んだワイヤメッシュヒータ（特に、人間の肉眼で視認しにくいように微細化されたワイヤを用いたもの）を天板４、４２に設けて、培養容器収容装置１の内部空間１０の保温を図ってもよい。
【００８３】
ガス供給口７が、常に高濃度の二酸化炭素を含むガスを内部空間１０に供給するとは限らない。細胞培養容器９で培養する細胞腫によって、あるいは培地９３の条件によっては、低濃度の二酸化炭素を含むガスや、低濃度の酸素を含むガス、その他の種類のガスをガス供給口７を介して内部空間１０に供給することとなる。即ち、ガスの種類は、細胞培養容器９の周囲に具現するべき望ましい雰囲気に応じたものとなる。
【００８４】
第一実施形態では、上枠３１及び下枠３２をねじ８によりテーブル２に共締めしており、第二実施形態では、下枠３４をねじ等によりテーブル２に固定していた。だが、上枠３１や下枠３２、３４をねじ８等を使用してテーブル２に固定することは必須ではなく、単にテーブル２に載せ置くのみでも構わない。
【００８５】
その他、各部の具体的構成は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【符号の説明】
【００８６】
１…培養容器収容装置
１０…内部空間
３１２、３２２、３３１２、３３２１、３３３１、３３４１、３４１２…周壁
４、４１、４２…天板
４３…間隙
５…ヒータ
６…底板
７…ガス供給口
０…レーザ照射装置のノズル
【図１】
0006473552.tif 000003
【図２】
0006473552.tif 000004
【図３】
0006473552.tif 000005
【図４】
0006473552.tif 000006
【図５】
0006473552.tif 000007
【図６】
0006473552.tif 000008
【図７】
0006473552.tif 000009
【図８】
0006473552.tif 000010
【図９】
0006473552.tif 000011
【図１０】
0006473552.tif 000012