(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞を製造する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞に分化させることと、
ｂ．ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養することによって、膵臓前腸前駆細胞を、膵臓内分泌細胞に分化させることと、を含む方法。
【請求項２】
膵臓内分泌細胞を製造する方法であって、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養することによって、前腸内胚葉細胞を、膵臓内分泌細胞に分化させること、を含む方法。
【請求項３】
前記膵臓内分泌細胞が、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記膵臓内分泌細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを共発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを共発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記膵臓内分泌細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
平面培養液中、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞を、膵臓前腸前駆細胞に分化させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
さらに、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した培地での処理によって、前記膵臓前腸前駆細胞を、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前腸内胚葉細胞を、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養することを含む、前腸内胚葉細胞を膵臓前腸前駆細胞に分化させる方法。
【請求項１１】
膵臓前腸前駆細胞を、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養することを含む、膵臓前腸前駆細胞を膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に分化させる方法。
【請求項１２】
膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞を、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した少なくとも１つの培地で空気−液体界面にて培養することを含む、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる方法。
【請求項１３】
さらに、多孔性基質上で細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多孔性基質はコーティングされていない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した培地で、膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞を処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＳＡＮＴ−１又はＬＤＮ−１９３１８９の１つ又はそれ以上が補足される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、膵臓ホルモンの発現を増加させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、ＰＴＦ１ａ、ＳＯＸ９、ＣＤＸ２、ＺＩＣ１及びＳＯＸ２の発現を減少させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、インスリン、クロモグラニン−Ａ又はクロモグラニン−Ａと、インスリンとの両方を共発現する、ＮＸＫ６．１陽性細胞の数を増加させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記多能性幹細胞が、非胚性起源のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
前記膵臓内分泌細胞が、β細胞に特徴的なマーカーを発現している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１又は２に記載の方法により膵臓内分泌細胞を製造する工程を含み、前記膵臓内分泌細胞を非ヒト哺乳動物に移植することを含む、膵臓内分泌細胞のインビボ成熟化の方法。
【請求項２３】
前記膵臓内分泌細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを共発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記膵臓内分泌細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
空気−液体界面にて、膵臓内分泌細胞を産出するためのインビトロ細胞培養系であって、
ａ．培養容器と、
ｂ．前記容器の容量の一部のみを満たすのに十分な容量の前記容器内の分化培地と、
ｃ．前記培地に隣接している前記容器の一部を満たす前記容器内の空気と、
ｄ．前記培地と前記空気との間の界面に位置する多孔性基質と、
ｅ．多能性幹細胞から由来する細胞であって、前記培地が前記細胞の表面の一部のみに接触するように前記基質の表面上に配置された細胞と、を含み、
前記分化培地は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、トリヨードチロニンとを補足した増殖培地を含む、インビトロ細胞培養系。
【請求項２６】
前記多能性幹細胞から由来する細胞が、前腸内胚葉細胞である、請求項２５に記載の細胞培養系。
【請求項２７】
前記多能性幹細胞から由来する細胞が、膵臓前腸前駆細胞である、請求項２５に記載の細胞培養系。
【請求項２８】
前記多能性幹細胞から由来する細胞が、膵臓内胚葉細胞である、請求項２５に記載の細胞培養系。
【請求項２９】
前記多能性幹細胞から由来する細胞が、膵臓内分泌前駆細胞である、請求項２５に記載の細胞培養系。
【請求項３０】
前記増殖培地が、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びこれらの混合物から選択される増殖因子と、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、をさらに補足したものである、請求項２６に記載の細胞培養系。
【請求項３１】
前記増殖培地が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎからなる群から選択されるＢＭＰ阻害剤をさらに補足したものである、請求項２７に記載の細胞培養系。
【請求項３２】
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１又はＢＬＡＲ培地である、請求項３０又は３１に記載の細胞培養系。
【請求項３３】
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、請求項３２に記載の細胞培養系。
【請求項３４】
前記増殖培地が、ＦＧＦ７と、ＴＰＢと、ＬＤＮ−１９３１８９とをさらに補足したＢＬＡＲ培地である、請求項３０に記載の細胞培養系。
【請求項３５】
前記増殖培地が、ＬＤＮ−１９３１８９をさらに補足したＢＬＡＲ培地である、請求項３１に記載の細胞培養系。
【請求項３６】
前記増殖培地が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤ＩＩとを補足したＢＬＡＲ培地である、請求項２８に記載の細胞培養系。
【請求項３７】
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１及びＢＬＡＲ培地から選択される、請求項２９に記載の細胞培養系。
【請求項３８】
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、請求項３７に記載の細胞培養系。
【請求項３９】
前記増殖培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足されている、請求項２５に記載の細胞培養系。
【請求項４０】
前記培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足されている、請求項２８に記載の細胞培養系。
【請求項４１】
前記培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足されている、請求項２７に記載の細胞培養系。
【請求項４２】
前記培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足されている、請求項２６に記載の細胞培養系。
【請求項４３】
前記培地にさらに、レチノイン酸と、アスコルビン酸と、ＳＡＮＴ−１とが補足されている、請求項４０に記載の細胞培養系。
【請求項４４】
前記培地にさらに、レチノイン酸と、ヘパリンと、ＳＡＮＴ−１と、硫酸亜鉛とが補足されている、請求項４１に記載の細胞培養系。
【請求項４５】
前記培地にさらに、ＬＤＮ−１９３１８９と、レチノイン酸と、アスコルビン酸と、ＳＡＮＴ−１とが補足されている、請求項４２に記載の細胞培養系。
【請求項４６】
前記培地にさらに、ＬＤＮ−１９３１８９と、ＳＡＮＴ−１と、ヘパリンとが補足されている、請求項２９に記載の細胞培養系。
【請求項４７】
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とインスリンとを発現する、請求項４６に記載の細胞培養系。
【請求項４８】
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを発現する、請求項２９に記載の細胞培養系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全てが参照により組み込まれている、米国特許仮出願第６１／７４７，６６２号明細書（２０１２年１２月３１日出願）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より詳細には、本発明は、空気−液体界面にて細胞を培養することによって、ヒト多能性幹細胞から、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌細胞前駆体細胞、及び単一ホルモン膵臓内分泌細胞を産出するための方法、細胞培養系及び培地を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病のための細胞置換療法における進展と、移植可能なランゲルハンス島の欠損により、生着に適切な、インスリン産出細胞、又はベータ（β）細胞の供給源の開発に対して興味が集中してきた。１つのアプローチは、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞からの、機能的β細胞の産出である。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。
【０００５】
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる、前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＣＤＸ１、２及び４が、内胚葉の後部領域を同定する一方で、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は、前部領域を同定する。
【０００６】
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、ＦＧＦｓ、ＷＩＮＴＳ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸（ＲＡ）及びＢＭＰリガンド及びそれらのアンタゴニストのような、分泌因子の多血症によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子Ｈｈｅｘ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉による分泌レチノイン酸が、前腸−後腸界面を制御する（２００２  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，１２：１２１５〜１２２０）。
【０００７】
特異的転写因子の発現レベルは、組織の同一性を指定するために使用してよい。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。腸管中の領域化された膵臓ドメインが、ＰＤＸ１の非常に高い発現と、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦＩＡ及びＮＫＸ２．２が、膵臓組織において高く発現し、ＣＤＸ２の発現は、腸組織で高い。
【０００８】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。前腸はまた、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓及び胆管系に対して上昇を与える。
【０００９】
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。従って、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟膵臓は、膵臓内胚葉細胞の分化から発生している外分泌及び内分泌組織両方を含む。
【００１０】
Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．は、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下、ヒト胚性幹細胞由来胚体内胚葉の濃縮培養の産出を記述している（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号明細書）。マウスの腎臓カプセルの元でこれらの細胞を移植することは、内皮性組織の特徴を有するより成熟した細胞への分化となることが報告された（米国特許第７，７０４，７３８号明細書）ヒト胚性幹細胞由来胚体内胚葉細胞はさらに、ＦＧＦ１０とレチノイン酸の補足後、ＰＤＸ１陽性細胞に分化可能である（米国特許明細書第２００５／０２６６５５４号）。免疫欠損マウスの脂肪パッド中の、これらの膵臓前駆脂肪の続く移植が、３〜４ヶ月の成熟化期間に続く、機能的膵臓内分泌細胞の形成となった（米国特許第７，９９３，９２０号明細書及び同第７，５３４，６０８号明細書）。
【００１１】
Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のための系を報告している（米国特許第７，０３３，８３１号明細書）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号明細書）。次に細胞をＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００１２】
低分子阻害剤もまた、膵臓内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の低分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１１、１３８：８６１〜８７１、Ｄｉｂｅｔｅｓ  ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、膵臓内分泌細胞の数を有意に増強するために使用されてきた。加えて、低分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を製造するために使用されている（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００９，５：２５８〜２６５）。
【００１３】
（またＨＩＸＢ９及びＭＮＸ１として知られる）ＨＢ９は、およそ胚性日８にて開始する膵臓発生において、早期に発現したＢＨＬＨ転写活性化因子タンパク質である。ＨＢ９はまた、ノトコード及び脊髄にて発現する。ＨＢ９の発現は、一過性であり、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現細胞にて発現している膵臓上皮にて、約１０．５日でピークとなる。約１２．５日にて、ＨＢ９発現は減少し、後期ステージで、β細胞にのみ制限されるようになる。ＨＢ９の無変異に対するマウスホモ接合体において、膵臓の背葉が、発生を失敗する（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：６７〜７０、１９９９；Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：７１〜７５：１９９９）。ＨＢ９−／−β細胞は、低レベルのグルコーストランスポーター、ＧＬＵＴ２及びＮＫＸ６．１を発現する。さらに、ＨＢ９０−／−膵臓は、インスリン陽性細胞の数において、有意な減少を示すが、一方で、他の膵臓ホルモンの発現に有意に影響を与えない。従って、ＨＢ９の時間制御が、正常β細胞発生及び機能に必須である。β細胞中でＨＢ９発現を制御している因子について、よくわかっていないけれども、ゼブラフィッシュにおける最近の研究は、レチノイン酸が、ＨＢ９の発現を正に制御することを示唆している（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３８、４５９６〜４６０８、２０１１）。
【００１４】
甲状腺ホルモン、チロキシン（「Ｔ４」）とトリヨードチロニン（「Ｔ３］）は、甲状腺によって産出されるチロシンに基づくホルモンであり、主として代謝の制御に応答性である。血中の甲状腺ホルモンの主要な形態は、Ｔ４であり、Ｔ３より長い半減期を有する。血中に放出されたＴ３に対するＴ４の比は、およそ２０対１である。Ｔ４は、脱ヨウ素酵素によって、細胞内で、より活性なＴ３（Ｔ４に比べて、３〜４倍強力である）に変換される。
【００１５】
Ｔ３は、甲状腺ホルモン受容体、ＴＲα１及びＴＲβ１（ＴＲ）に結合する。ＴＲは、核ホルモン受容体であり、レチノイドＸ受容体にヘテロ二量体化する。二量体が、リガンドが存在しない状態で、甲状腺応答要素（ＴＲＥｓ）に結合し、転写抑制剤として働く。Ｔ３のＴＲへの結合が、ＴＲＥ依存遺伝子の抑圧を減少させ、種々の標的遺伝子の発現を誘導する。多数の研究が、β細胞増殖の増加、アポトーシスの減少及びインスリン分泌の改善におけるＴ３の役割を示した一方で、細胞分化におけるその役割は未定義である。
【００１６】
トランスフォーミング増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）は、増殖制御、分化、遊走、細胞生存、線維形成及び発生運命の特性化を含む、多くの生物学的工程に関与する、多面発現性サイトカインの広いファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリ−メンバーは、ＩＩ型及びＩ型受容体を含む、受容体複合体を通してシグナル伝達する。（アクチビン及び増殖分化因子（「ＧＤＦｓ」）のような）ＴＧＦ−βリガンドは、ＩＩ型受容体を、Ｉ型受容体と一緒に有する。ＩＩ型受容体は、複合体中のＩ型受容体をリン酸化及び活性化する。５つの哺乳類ＩＩ型受容体、ＴβＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ、ＢＭＰＲ−ＩＩ及びＡＭＨＲ−ＩＩと、７つのＩ型受容体（ＡＬＫｓ  １〜７）がある。アクチビンと関連リガンドは、ＡｃｔＲ−ＩＩ又はＡｃｔＡＲ−ＩＩＢ、及びＡＬＫ４及びＡＬＫ５の組合せを介してシグナル伝達し、ＢＭＰは、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ又はＢＭＰＲ−ＩＩとのＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６の組合せを通してシグナル伝達する。ＡＭＨは、ＡＬＫ６とのＡＭＨＲ−ＩＩの複合体を通してシグナル伝達し、結節は、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ及びＡＬＫ７の複合体を通してシグナル伝達することが示された。（Ｃｅｌｌ．２００３，１１３（６）：６８５〜７００）。適切な受容体へのＴＧＦ−Ｂリガンドの結合に続いて、次のシグナルが、主に、Ｓｍａｄｓの複合体の活性化を通して、核に形質導入される。活性化に際して、Ｉ型受容体が、Ｓｍａｄｓの受容体制御ファミリーのメンバーをリン酸化する。これは、それらを活性化し、それらが、共通の媒体ＳｍａｄであるＳｍａｄ４との複合体を形成することを可能にする。Ｓｍａｄｓ  １、５及び８は、ＡＬＫｓ  １、２、３及び６に対する基質であり、一方で、Ｓｍａｄｓ  ２及び３は、ＡＬＫｓ  ４、５及び７に対する基質である（ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１３，２０１５〜２１２４）。活性化Ｓｍａｄ複合体は、核内に集積し、一方でこれらは、標的遺伝子の転写、とりわけ、他の特定のＤＮＡ−結合転写因子にて、直接関与される。ＴＧＦ−βに対する受容体を選択的に阻害する化合物が、治療適用のため、及び種々の幹細胞集団からの再プログラミング及び分化の文脈において、細胞運命を調節するために、開発されてきた。とりわけ、ＡＬＫ５阻害剤が、内分泌運命への胚性幹細胞の直接分化のために、先に使用されてきた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１１，６０（１）：２３９〜４７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
一般に、始原細胞を、機能性β細胞への分化させる工程が、種々のステージを通してすすみ、多くのストライドが、ヒト多能性幹細胞のような始原細胞から膵臓細胞を産出するために、プロトコールを改善することにおいて作製された。研究におけるこれらの進展にも関わらず、始原細胞を分化させる工程における各段階は、固有のチャレンジを提示する。従って、機能性内分泌細胞、とりわけ機能性β細胞となるプロトコールに対する必要性がまだ存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｂ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｃ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｄ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｅ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｆ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｇ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図１Ｈ】以下の時間点、１日目（図１Ａ）、５日目（図１Ｂ）、６日目（図１Ｃ）、７日目（図１Ｄ）、９日目（図１Ｅ）、１３日目（図１Ｆ）、１６日目（図１Ｇ）及び２１日目（図１Ｈ）での、実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面で培養した細胞の位相コントラストイメージを示している。
【図２Ａ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｂ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｃ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｄ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｅ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｆ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｇ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｈ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｉ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｊ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図２Ｋ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて１週間分化させ、以下のＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋは、同一の視野からとった。
【図３Ａ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｂ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｃ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｄ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｅ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｆ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｇ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図３Ｈ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて２週間分化させ、以下のインスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図２Ｈ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈは、同一の視野からとった。
【図４Ａ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて３週間分化させ、以下のインスリン（図４Ａ）、グルカゴン（図４Ｂ）、インスリン（図４Ｃ）及びソマトスタチン（図４Ｄ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ及びＣ〜Ｄは、同一の視野からとった。
【図４Ｂ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて３週間分化させ、以下のインスリン（図４Ａ）、グルカゴン（図４Ｂ）、インスリン（図４Ｃ）及びソマトスタチン（図４Ｄ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ及びＣ〜Ｄは、同一の視野からとった。
【図４Ｃ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて３週間分化させ、以下のインスリン（図４Ａ）、グルカゴン（図４Ｂ）、インスリン（図４Ｃ）及びソマトスタチン（図４Ｄ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ及びＣ〜Ｄは、同一の視野からとった。
【図４Ｄ】実施例１にて記述した方法を用いて、空気−液体界面にて３週間分化させ、以下のインスリン（図４Ａ）、グルカゴン（図４Ｂ）、インスリン（図４Ｃ）及びソマトスタチン（図４Ｄ）に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。パネルＡ〜Ｂ及びＣ〜Ｄは、同一の視野からとった。
【図５Ａ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｂ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｃ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｄ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｅ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｆ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｇ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｈ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｉ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｊ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｋ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｌ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｍ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｎ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｏ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｐ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｑ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図５Ｒ】実施例１にて概要を説明したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、ＰＡＸ４（図５Ｃ）、ＰＡＸ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、ＰＴＦＩＡ（図５Ｏ）、ＺＩＣ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）。細胞を、ステージ５の後、空気−液体界面にて培養した。
【図６Ａ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｂ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｃ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｄ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｅ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｆ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｇ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｈ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｉ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｊ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｋ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図６Ｌ】実施例２にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。
【図７Ａ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｂ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｃ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｄ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｅ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｆ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｇ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｈ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｉ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｊ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｋ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図７Ｌ】実施例３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【図８Ａ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｂ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｃ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｄ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｅ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｆ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｇ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図８Ｈ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【図９Ａ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図９Ｂ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図９Ｃ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図９Ｄ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図９Ｅ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図９Ｆ】実施例４にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、グルカゴン（図９Ｅ）及びインスリン（図９Ｆ）。
【図１０Ａ】実施例４に従った空気−液体界面にて培養し、１マイクロモルＳＤ２０８阻害剤（図１０Ａ）又は１マイクロモルＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（図１０Ｂ）のいずれかで処理し、クロモグラニン−Ａ（膵内分泌マーカー）及びＮＫＸ６．１（膵臓前駆体マーカー及びβ細胞特異的マーカー）に対して染色した、ステージ６細胞の免疫染色の結果を描写している。
【図１０Ｂ】実施例４に従った空気−液体界面にて培養し、１マイクロモルＳＤ２０８阻害剤（図１０Ａ）又は１マイクロモルＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（図１０Ｂ）のいずれかで処理し、クロモグラニン−Ａ（膵内分泌マーカー）及びＮＫＸ６．１（膵臓前駆体マーカー及びβ細胞特異的マーカー）に対して染色した、ステージ６細胞の免疫染色の結果を描写している。
【図１１Ａ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｂ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｃ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｄ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｅ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｆ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｇ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１１Ｈ】実施例６にて記述したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。データは、未分化Ｈ１株に対する倍増加として示す。
【図１２Ａ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｂ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｃ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｄ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｅ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｆ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｇ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１２Ｈ】実施例７にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。
【図１３Ａ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｂ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｃ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｄ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｅ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｆ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｇ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１３Ｈ】実施例８にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。
【図１４Ａ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｂ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｃ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｄ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｅ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｆ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｇ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１４Ｈ】実施例９にて概要を説明したように分化し、ＡＬＩにて培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＫＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。
【図１５Ａ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｂ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｃ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｄ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｅ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｆ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｇ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｈ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｉ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１５Ｊ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１５Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１５Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１５Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１５Ｅ）、ＰＡＸ６（図１５Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１５Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１５Ｈ）、ＮｅｕｒｏＤ（図１５Ｉ）及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１５Ｊ）に対して染色した、ステージ５、３日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ａ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｂ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｃ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｄ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｅ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｆ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｇ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｈ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１６Ｉ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１６Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１６Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１６Ｄ）、ＫＩ−６７（Ｘ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｙ軸）（図１６Ｅ）、ＰＡＸ６（図１６Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１６Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１６Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１６Ｉ）に対して染色した、ステージ６、５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ａ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｂ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｃ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｄ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｅ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｆ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｇ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｈ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１７Ｉ】実施例１０に従って分化し、アイソタイプ対照（図１７Ａ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｂ）、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ２．２（Ｙ軸）（図１７Ｃ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したグルカゴン（Ｙ軸）（図１７Ｄ）、インスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１７Ｅ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１７Ｆ）、ＩＳＬ−１（図１７Ｇ）、ＦＯＸＡ２（図１７Ｈ）及びＮｅｕｒｏＤ（図１７Ｉ）に対して染色した、ステージ６、１５日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図１８Ａ】実施例１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１８Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ｃ）に対して染色した、ステージ４、４日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図１８Ｂ】実施例１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１８Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ｃ）に対して染色した、ステージ４、４日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図１８Ｃ】実施例１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１８Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１８Ｃ）に対して染色した、ステージ４、４日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図１９Ａ】実施例１１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１９Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ｃ）に対して染色した、ステージ６、６日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図１９Ｂ】実施例１１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１９Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ｃ）に対して染色した、ステージ６、６日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図１９Ｃ】実施例１１に従って分化し、クロモグラニン−Ａ（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ａ）、ＫＩ−６７（Ｙ軸）と共染色したＰＤＸ１（Ｘ軸）（図１９Ｂ）、及びインスリン（Ｘ軸）と共染色したＮＫＸ６．１（Ｙ軸）（図１９Ｃ）に対して染色した、ステージ６、６日目細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）プロファイルを示す。
【図２０】実施例１１に記述したように、種々の細胞集団を移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣ−ペプチド産出のインビボ速度論を示す。
【図２１Ａ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２１Ｂ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２１Ｃ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２１Ｄ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２１Ｅ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２１Ｆ】実施例１２に概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。アミリン（図２１Ａ）、インスリン（図２１Ｂ）、ＭＡＦＡ（図２１Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図２１Ｄ）、ＰＴＦ１ａ（図２１Ｅ）及びＳＯＸ９（図２１Ｆ）。
【図２２Ａ】実施例１３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＭＡＦＡ（図２２Ａ）、インスリン（図２２Ｂ）、アミリン（図２２Ｃ）及びＮＫＸ６．１（図２２Ｄ）。
【図２２Ｂ】実施例１３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＭＡＦＡ（図２２Ａ）、インスリン（図２２Ｂ）、アミリン（図２２Ｃ）及びＮＫＸ６．１（図２２Ｄ）。
【図２２Ｃ】実施例１３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＭＡＦＡ（図２２Ａ）、インスリン（図２２Ｂ）、アミリン（図２２Ｃ）及びＮＫＸ６．１（図２２Ｄ）。
【図２２Ｄ】実施例１３にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＭＡＦＡ（図２２Ａ）、インスリン（図２２Ｂ）、アミリン（図２２Ｃ）及びＮＫＸ６．１（図２２Ｄ）。
【図２３Ａ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【図２３Ｂ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【図２３Ｃ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【図２３Ｄ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【図２３Ｅ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【図２３Ｆ】実施例５にて概要を説明したように分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からの結果を描写する。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の以下の詳細な記述は、付随する図面と共に読むことでより理解されるであろう。図は、本発明の特定の実施形態を例示する目的で提供される。しかしながら、本発明は、示した精密な配置、例及び道具に制限はされない。開示を明確にするために、そして制限の方法ではなく、本発明の詳細な記述は、本発明の特定の特徴、実施形態又は適用を記述、又は例示する副項目に分けられる。
【００２０】
本発明は、多能性幹細胞のような、内胚葉前駆細胞を、少なくとも部分的に、空の培養容器、又は部分的に培地でみたした培養容器中に存在する、空気−液体界面にて、この始原細胞を培養することによって、膵臓内分泌細胞の特徴を示している細胞に分化させることを指向する。本明細書で、簡便のために「空気」と呼ぶけれども、本発明は、周辺環境に見られる、気体及び組成物の混合物に制限されない。本発明は特に、例えば、特定の成分が濃縮された混合物を含む、周辺環境とは異なる組成を有する気体混合物、又は特定の成分が欠損するか、除去されたものを企図し、含む。
【００２１】
さらに、本発明は、膵臓内分泌細胞の特徴を示している細胞に、多能性幹細胞を分化させるための細胞培養系、ならびにそのような分化を開始し、促進する分化培地を提供する。有利に、これらの細胞培養系及び分化培地は、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の先には未到の収率を提供するために、空気−液体界面上の分化と共に利用されてよい。
【００２２】
培養することは、多能性幹細胞から、膵臓内分泌細胞への分化経路に寄与する全てのステージに対して、空気−液体界面で発生してよく、又は分化の早期ステージの間、培地中に沈んだ平面培養上で培養し、次いで分化の後期ステージの間、空気−液体界面にて培養することが含まれる。好ましくは、本発明の工程には、早期ステージを通して、培地中に沈んだ支持表面上で多能性幹細胞を培養し、次いで分化の後期ステージで、空気−液体界面にて培養する組合せが含まれる。そのような実施形態において、細胞をまず、沈んだ培養のために固体表面上に播き、次いで固体支持体を取り除き、空気−液体界面にて培養するために、多孔性支持体上に再び播いて良い。あるいは、細胞をまず、多孔性支持体上に播き、次いでこれを分化の早期ステージの間、培地中に沈め、続いて、分化の後期ステージの間、空気−液体界面にて位置付けて良い。分化の後期ステージの間、空気−液体界面にて培養することは、全工程の間、沈めたステージ中で細胞を培養することと比較して、内分泌マーカーの発現を有意に増強し、これは、より大きな割合の細胞が、膵臓内分泌細胞に分化したことを示唆している。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、部分的に培地でみたした培養容器の空気−液体界面にて、内胚葉前駆細胞を、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である膵臓内胚葉前駆細胞に分化させることを指向する。本発明は、部分的に、空気−液体界面で培養することが、内胚葉マーカーの発現を有意に増強することに基づく。さらに、膵臓内分泌前駆細胞は、結果として、圧倒的に単一のホルモンインスリン陽性細胞の発生となる、空気−液体界面で簡単に発生させることができることが発見された。空気−液体界面での単一細胞の播種は、インスリン産出の一貫性を改善することが発見された。
【００２４】
定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を製造することができる。幹細胞はまた、インビトロでの、多重胚芽層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から種々の細胞系統の機能細胞へ分化させるそれらの能力によって特徴付けられる。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。
【００２５】
幹細胞は、それらの発生上の潜在能力によって分類される。多能性幹細胞は、全ての胚性細胞型を形成することが可能である。
【００２６】
分化は、未特定化（「未確定」）又はほとんど特定されていない細胞が、例えば神経細胞又は筋肉細胞のような、特定化した細胞の特徴を獲得する工程である。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特定化した（「確定した」）状態を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。「脱分化」とは、細胞が細胞の系統内においてより特殊化（又は確定）していない位置へと戻る過程のことを指す。本明細書で使用したように、細胞の系統は、細胞の遺伝性を定義し、すなわち、どの細胞がくるのか、及び何の細胞が形成されるのか、を定義する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００２７】
本明細書で使用するところの「マーカー」は、対象の細胞中で差異的に発現する核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比較して、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【００２８】
本明細書で使用するように、細胞は、特定のマーカーが、細胞内で十分検出される時に、特定のマーカー「に対して陽性」であるか、「陽性」である。同様に、細胞は、特定のマーカーが、細胞内で十分検出されない時に、特定のマーカー「に対して陰性」であるか、「陰性」である。特に、ＦＡＣＳによる陽性は、通常２％より多く、一方でＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％未満である。ＰＣＲによる陽性は通常、３４サイクル（Ｃｔｓ）未満であり、一方で、ＰＣＲによる陰性は、通常３４．５サイクルより大きい。
【００２９】
静的インビトロ細胞培養中の多能性幹細胞の、機能性膵臓内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化工程はしばしば、多数の連続ステージを通して処理することとして見られる。特に、分化工程は、６ステージを通して処理することとして一般に見られる。本段階的処理において、「ステージ１」は、分化工程における第一段階を意味し、多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ１細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ２」は、第二段階、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ２細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ３」は、第三段階、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ３細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ４」は、第四段階、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ４細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ５」は、第五段階、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内胚葉細胞及び／又は膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下、合わせて「膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞」又あるいは、「ステージ５細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ６」は、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ６細胞」）への分化を意味する。
【００３０】
しかしながら、特定の集団中の全ての細胞が、同一の速度で、これらのステージを通して進むわけではないことが留意されるべきである。結果として、とりわけ後期分化ステージにて、集団に存在する主要な細胞よりも、少なく、又は多く、分化経路を下って進んだ細胞の存在を検出することは、インビトロ細胞培養系において、一般的ではない。例えば、ステージ５での細胞培養の間、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーの発現が見られることは一般的ではない。本発明を例示する目的のために、以上で同定したステージに関連した種々の細胞型の特徴を本明細書で記述する。
【００３１】
本明細書で使用するところの「胚体内胚葉細胞」は、原腸形成の間に外胚葉から形成している細胞の特徴を有し、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞を意味する。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、ＦＯＸＡ２（また肝細胞核因子３β（「ＨＮＦ３β」）とも呼ばれる）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９及びＭＩＸＬ１の少なくとも１つを発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７が含まれる。従って、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７のそれらの発現によって特徴付けられて良い。さらに、時間の長さに依存して、細胞が、ステージ１に留まることが許容され、ＨＮＦ−４αの増加が観察されうる。
【００３２】
本明細書で使用するところの「腸管細胞」は、肺、肝臓、膵臓、胃及び腸のような全ての内胚葉性器官を形成可能な、胚体内胚葉から由来する細胞を意味する。腸管細胞は、胚体内胚葉細胞によって発現したものよりも、実質的に増加したＨＮＦ４αの発現によって特徴付けられて良い。例えば、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現における１０〜１４倍増加が、ステージ２の間に観察されて良い。
【００３３】
本明細書で使用するところの「前腸内胚葉細胞」は、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢及び十二指腸の一部を形成する内胚葉細胞を意味する。前腸内胚葉細胞は、以下のＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２及びＨＮＦ４αの少なくとも１つを発現する。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞を比較して、ＰＤＸ１の発現の増加を特徴としうる。例えば、ステージ３培養にて５０パーセントより多くの細胞が、ＰＤＸ１を典型的に発現している。
【００３４】
本明細書で使用するところの「膵臓前腸前駆細胞」は、以下のマーカー、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、ＰＲＯＸ１及びＨＮＦ４αの少なくとも１つを発現する細胞を意味する。膵臓前腸前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＳＯＸ９の発現に対して陽性であることによって特徴づけられて良い。
【００３５】
本明細書で使用するところの「膵臓内胚葉細胞」は、以下のマーカー、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３、ガストリン、ＨＢ９又はＰＲＯＸ１の少なくとも１つを発現する細胞を意味する。膵臓内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠如によって特徴付けられて良い。
【００３６】
本明細書で使用するところの「膵臓内分泌前駆細胞」は、膵臓ホルモン発現細胞になることが可能な膵臓内胚葉細胞を意味する。膵臓内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６又はＡＲＸの少なくとも１つを発現する。膵臓内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮｅｕｒｏＤ１の発現によって特徴付けられてよい。
【００３７】
本明細書で使用するところの「膵臓内分泌細胞」は、以下のホルモン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能な細胞を意味する。これらのホルモンに加えて、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーとしては、１つ又はそれ以上の、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ６が挙げられる。β細胞に特徴的なマーカーを発現している膵臓内分泌細胞は、インスリンと、以下の転写因子、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ及びＰＡＸ６の少なくとも１つの発現によって特徴付けることができる。
【００３８】
「ｄ１」、「１ｄ」及び「１日目」、「ｄ２」、「２ｄ」及び「２日目」は、互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコール中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。
【００３９】
「グルコース」は、デキストロース、天然に一般に見られる糖を意味するために本明細書で使用される。
【００４０】
「ＮｅｕｒｏＤ１」は、膵臓内分泌前駆細胞において発現するタンパク質と、それをコードしている遺伝子を同定するために使用される。
【００４１】
「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡから、商標ＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）の下で入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤、（塩酸（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；ＤＭ−３１８９）を意味する。
【００４２】
多能性幹細胞の特徴付け、供給源、増殖及び培養
Ａ．多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、１つ又はそれ以上の、設計されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７）を発現してよい。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１発現の欠損となる。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって記述されたように、基質として、商標ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄの下売られている、アルカリホスファターゼ基質で現像することによって、検出可能である。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００４３】
増殖した多能性幹細胞の他の望ましい表現型は、全ての３つの胚層、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞へ分化する能力がある。幹細胞の多能性は例えば、種々の組合せ免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスに細胞を注射することと、４％パラホルムアルデヒドを用いて形成する奇形腫を固定することと、次いでこれらの３つの胚層からの細胞型の証拠に対して組織学的に試験することと、によって確認されてよい。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００４４】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞が正倍数体であることを意味する、「星状核型」を有する細胞を得ることが望ましく、そこでは全てのヒトクロモソームが存在し、著しく変化しない。
【００４５】
Ｂ．多能性幹細胞の供給源
使用してよい多能性幹細胞の例示型には、（胚盤胞のような）プレ胚性組織、胚性組織、又は妊娠の間、典型的に、しかし必須ではなく、妊娠およそ１０〜１２週前の任意の時間に取った胎児組織を含む、多能性細胞の確立された株が含まれる。非限定例としては、ヒト胚性肝細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のような、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性胚芽細胞の確立された株である。フィーダー細胞のない状態ですでに培養した多能性幹細胞集団から取った細胞もまた好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＺＦＰ４２（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１，１２：１６５〜１８５；またＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６を参照のこと）のような、多数の多能性関連転写因子の集中発現を用いて、成体体細胞から由来した、人工多能性細胞（ＩＰＳ）、又は再プログラム多能性細胞もまた使用してよい。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ）のような変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：１〜１２（２００７）にて開示された細胞のような、成人ヒト体細胞から由来した細胞もまた使用してよい。特定の実施形態において、本発明中での使用に好適な多能性幹細胞を、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６〜１９，２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５〜７０，２００７）、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：２３０〜２４０）、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１０１〜１０６，２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  １３１：８６１〜８７２，２００７）及び米国特許第２０１１／０１０４８０５号  明細書に記述された方法に従って誘導して良い。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胚性起源のものであってよい。これらの参照、特許、特許出願の全てが、とりわけ、多能性細胞の単離、培養、膨張及び分化に関連するので、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。
【００４６】
Ｃ．多能性幹細胞の膨張及び培養
多能性幹細胞は、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で一般的に培養される。あるいは、多能性幹細胞は、フィーダー細胞を本質的に含まないが、それでもなお実質的な分化を起こすことなしに、多能性幹細胞の増殖を支持する培養系において培養されてよい。分化なしにフィーダーを含まない培養中の多能性幹細胞の増殖はしばしば、他の細胞型ですでに培養することによって条件付けた培地を用いて支持される。あるいは、分化なしのフィーダーを含まない培養中の多能性幹細胞の増殖は、化学的に定義された培地を用いて支持され得る。
【００４７】
多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コート容器を用いることによって、簡単に増殖しうる。あるいは、商標ｍＴＥＳＲ（登録商標）１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）の下で売られている培地のような、定義された培地との組合せで、化学的に定義された表面を、細胞の常用膨張のために使用してよい。多能性細胞を、酵素消化、機械的分離、又はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような種々のカルシウムキレーターを用いて、培養プレートから簡単に取り除いて良い。あるいは、多能性細胞を、任意のマトリックスタンパク質又はフィーダー層のない状態で、懸濁液中で膨張させて良い。
【００４８】
多能性幹細胞を膨張させ、培養する多くの異なる方法を、請求された発明にて使用してよい。例えば、本発明の方法は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．及び米国特許第２００２／００７２１１７号明細書の方法を用いてよい。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８））は、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層を用いた、ヒト胚盤胞からの多能性幹細胞の培養を開示している。Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：５４６〜５５６，２００３）は、ヒト多能性幹細胞培養を支持するそれらの能力に対して、１１つの異なるヒト成人、胎児及び新生児フィーダー細胞層のパネルを評価し、成人皮膚線維芽細胞フィーダー上で培養したヒト胚性幹細胞株が、ヒト胚性幹細胞形態を保持し、多能性を維持することが留意される。米国特許第２００２／００７２１１７号明細書は、フィーダーを含まない培養中、霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地を製造する細胞株を開示している。使用される細胞株は、胚組織から得た又は胚性幹細胞から分化した間葉系細胞株、及び線維芽細胞様細胞株である。米国特許第２００２／０７２１１７号明細書はまた、第一フィーダー細胞層としての細胞株の利用を開示する。
【００４９】
多能性幹細胞を膨張させる及び培養する他の好適な方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｙａｍｏｏ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．に開示されている。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞から由来したフィーダー細胞層上の、ヒト多能性幹細胞の長期増殖のための方法を開示している。Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５  ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自発的分化から由来するフィーダー細胞系を開示する。Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒト胎盤から得たフィーダー細胞の供給源を開示している。Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮から由来するフィーダー細胞層を開示する。
【００５０】
多能性幹細胞を拡張し、培養する他の好適な方法は、例えば、Ｉｎｚｕｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，６４２，０４８号明細書、国際特許第２００５／０１４７９９号パンフレット、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．及び米国特許第２００７／００１００１１号明細書に開示されている。Ｉｎｚｕｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒト多能性幹細胞包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、フィーダーを含まない培養液中の霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地と、そのような培地の製造のために有用な細胞株を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、胚性組織より得たか、胚性幹細胞から分化した、間葉及び線維芽細胞様細胞株、並びにそのような細胞株を誘導する、培地を処理する、及びそのような培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を報告している。国際特許第２００５／０１４７９９号パンフレットは、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際特許第２００５／０１４７９９号パンフレットは、本開示物を介して製造された培養培地が、齧は類細胞、とりわけ、ＭＭＨ（Ｍｅｔ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）と呼ばれる、分化し、不死化したトランスジェニック肝細胞の、細胞分泌活性によって条件づけられることを報告している。Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼリバーストランスクリプターゼを過剰発現するように、遺伝的に改変した、ヒト胚性幹細胞誘導体から得た、条件培地を開示している。米国特許第２００７／００１００１１号明細書は、多能性幹細胞の維持のための、化学的に定義された培養培地を開示している。
【００５１】
代替的な培養系は、胚性幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子で補足された無血清培地を使用する。そのような培養系の例としては、Ｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．及び米国特許明細書痔２００５／０１４８０７０号明細書が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９、２００５）は、胚性幹細胞が、胚性幹細胞自己再生を引き起こすことが可能な、異なる増殖因子を加えた未条件付け血清置換（ＳＲ）培地中で維持される、フィーダーを含まない、血清を含まない培養系を開示する。Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを加えた培地を用いて、線維芽細胞又は条件培地のない状態での、ヒト胚性幹細胞の長期培養のための方法を開示する。米国特許第２００５／０１４８０７０号明細書は、血清なし、線維芽細胞フィーダー細胞なしで、定義培地中でヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示し、本方法には、幹細胞を、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代用物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代用物を含む培養培地中で培養することを含み、培養培地が哺乳動物胎児血清を実質的に含まず、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌの、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化可能な線維芽細胞増殖因子を含む、増殖培地中で培養することを含み、増殖因子は、ただの線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給され、培地は、フィーダー細胞又は条件培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００５２】
多能性幹細胞を増殖させ、膨張させる他の好適な方法は、米国特許第２００５／０２３３４４６号明細書、同第６，８００，４８０号明細書、同第２００５／０２４４９６２号明細書、及び国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットに開示されている。米国特許第２００５／０２３３４４６号明細書は、未分化霊長類原発幹細胞を含む、幹細胞を培養することにおいて有用な定義培地を開示している。溶液中、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。該培養液中、特定の培地は、基礎培地及び原発幹細胞の実質的に未分化の増殖を支持するのに必要な量の各ｂＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸を含む。米国特許第６，８００，４８０号明細書は、霊長類由来原発幹細胞を、実質的に未分化の状態で増殖させるための細胞培養培地が、霊長類由来原発幹細胞の増殖を支持するために効果的である、低浸透圧、低内毒素基礎培地を含んで提供されることを報告している。特許第６，８００，４８０号明細書は、基礎培地が、霊長類由来原発幹細胞の増殖を支持するのに効果的な栄養血清と、フィーダー細胞からなる群より選択される基質、及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリックス成分と組み合わされることを報告している。本培地はさらに、非必須アミノ酸、抗酸化剤、及びヌクレオチドからなる群より選択された第一増殖因子及びピルビン酸塩を含むと留意される。米国特許第２００５／０２４４９６２号明細書は、当該発明の一つの態様が、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供することと、培養液中の幹細胞が、実質的に哺乳動物胎児血清を実質的に含まず（おそらくまた、任意の動物血清を実質的に含まず）、ただ線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される、線維芽細胞増殖因子の存在下であることと、を報告している。
【００５３】
国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットは、基礎培地、ｂＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸を、実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するのに十分な量で含む、実質的にフィーダーを含まず、血清を含まない定義された、等張培養培地を開示している。さらに、国際特許第２００５／０８６８４５号パンフレットは、未分化幹細胞の維持のための方法を開示しており、前記方法は、望む結果を達成するために十分な時間、未分化状態で細胞を維持するのに十分な量で、幹細胞を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）を含む。
【００５４】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。１つの実施形態において、好適な培養基質は、基底膜から由来するもののような、又は、接着分子受容体−リガンド結合の部分を形成しうる、細胞外マトリックス成分である。好適な培養基質は、商標ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の下で販売される、再構成基底膜である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、室温でゲル化し、再構成基底膜を形成する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性調製物である。
【００５５】
当技術分野で公知の他の細胞外マトリックス成分と、成分混合物が、代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００５６】
多能性幹細胞を、好適な分布で、培地の存在下、基質上に播いてよく、細胞生存、伝播及び望む特徴の保持を促進する。全てのこれらの特徴は、播種分布への注意深い注意から利益を得、当業者によって容易に決定されうる。好適な培養培地は、以下の成分、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１９６５−０９２）のもと販売されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１０８２９−０１８）の下販売されている、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基礎培地、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１５０３９−０２７）の下販売されている、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１１４０−０５０）の下販売されている非必須アミノ酸溶液、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（Ｐａｒｔ番号７５２２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１３２５６−０２９）の下販売されているヒト組換え体塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）から作製されて良い。
【００５７】
多能性幹細胞の分化
多能性細胞は、β細胞に向かって分化するにつれ、それぞれが、特定のマーカーが存在する、又は存在しないことによって特徴づけられて良い、種々のステージを通して分化する。これらのステージへの細胞の分化は、圧力、培養培地に加えた特定の因子の欠如を含む、特定の培養条件によって達成される。一般に、本分化は、多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞への分化を含んでよい。これらの胚体内胚葉細胞は次いで、腸管細胞にさらに分化し、続いて前腸内胚葉細胞に分化して良い。前腸内胚葉細胞は、膵臓前腸前駆細胞に分化してよく、これは続いて、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞又は両方に分化可能である。これらの細胞は次いで、（β細胞のような）膵臓ホルモン産出細胞に分化してよい。本発明は、細胞を、培地で部分的にみたした培養容器内に存在する空気−液体界面で細胞を培養すること、とりわけ、空気−液体界面で、ステージ４〜ステージ６細胞を培養することによって、膵臓内分泌細胞への、多能性幹細胞の段階的な分化を提供する。
【００５８】
多能性幹細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞の特徴は当業者に公知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、以下の、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１の１つ又はそれ以上の発現が挙げられる。
【００５９】
例示多能性幹細胞としては、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌｒｔｉｓ，Ｓｅｗｄｅｎ）が挙げられる。また、以下の多能性細胞に特徴的なマーカー、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の少なくとも１つを発現する細胞が好適である。
【００６０】
また、胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現する細胞が、本発明における使用のために好適である。本発明の１つの実施形態において、胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆細胞である。他の実施形態において、胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーを発現している細胞は、中胚葉細胞である。他の実施形態において、胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００６１】
また、少なくとも１つの膵臓内分泌系統の特徴的なマーカーを発現している細胞が、本発明における利用のために好適である。本発明の１つの実施形態において、膵臓内分泌系統の特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い、膵臓内分泌細胞である。特定の実施形態において、ＦＡＣＳにて測定するように、３０パーセント以上の細胞が、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現し、３０パーセント未満の細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現する。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の発現よりも少なくとも２倍高い細胞がとりわけ有用である。
【００６２】
少なくとも１つの膵臓内分泌系統の特徴的なマーカーを発現している細胞がまた、本発明における利用のために好適である。本発明の１つの実施形態において、膵臓内分泌系統の特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞である。１つの実施形態において、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン又は膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能である。好ましい実施形態において、膵臓内分泌細胞は、インスリン産出β細胞である。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に到達するために、多能性幹細胞又は誘導可能多能性幹細胞、好ましくは多能性幹細胞類で開始するプロトコールを使用する。本プロトコールは以下を含む。
ステージ１：細胞培養株から得た、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞を、適切な因子で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。
ステージ２：ステージ１からの細胞を、適切な因子で処理して、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ３：ステージ２からの細胞を、適切な因子で処理して、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ４：ステージ３からの細胞を、適切な因子で処理して、膵臓前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。細胞を任意に、ステージ４にて、空気−液体界面で培養する。
ステージ５：ステージ４からの細胞を、適切な因子で処理し、空気−液体界面で培養して、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ６：ステージ５からの細胞を、適切な因子で処理し、空気−液体界面で培養して、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、ステージ６細胞まで多能性幹細胞（例えばステージ１前細胞）を分化させることを包含する一方で、本発明はまた、ステージ６に向かう他の中間ステージで細胞を分化することを包含する。特に、本発明は、ステージ４〜ステージ６細胞の分化を包含する。さらに、工程が分離ステージで記述されるけれども、分化工程を通した細胞の処理並びに工程は、連続性又は持続性であってよい。
【００６５】
ステージ１：多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって、又は本明細書で提案した任意の方法によって、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させてよい。多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための有用な方法は、多能性幹細胞、及び胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化に関するとして、その全てが参照により組み込まれている、米国特許第２００７／０２５４３５９号明細書、米国特許第２００９／０１７０１９８号明細書、米国特許第２００９／０１７０１９８号明細書、米国特許第２０１１／００９１９７１号明細書、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９００号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９０８号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９１５号明細書に開示されている。
【００６６】
本発明の１つの実施形態において、多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを補足した培地で処理し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生をもたらす。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５ｎｇ／ｋｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地と接触させることを含んでよい。処理はまた、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３Ａと接触させることを含んでよい。多能性細胞を、およそ２〜５日間、好ましくは約３日間培養して、それらの胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を促進して良い。１つの実施形態において、細胞を、アクチビンＡとＷＮＴ３の存在下で１日培養し、続いてアクチビンＡ（ＷＮＴ３Ａが存在せず）の存在下、残りの時間培養する。
【００６７】
本発明の他の実施形態において、多能性幹細胞を、増殖分化因子８（「ＧＦＤ８」）と（その全てが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書にて開示された環状アニリン−ピリジノトリアジン化合物のような）グルカゴンシンターゼキナーゼ−３  β（「ＧＳＫ３β」）阻害剤を補足した培地で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を促進する。好ましいＧＳＫ３β阻害剤は、本明細書で（「ＭＣＸ化合物」）と呼ぶ、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５）、２（２７）、３，５，８（２６）、９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンである。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５ｎｇ／ｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ８を補足した培地と接触させることを含んでよい。処理はまた、細胞を約０．１〜５μＭ、あるいは約０．５〜約２．５μＭ、好ましくは約１μＭのＭＣＸ化合物と接触させることを含んでもよい。多能性幹細胞を、およそ２〜５日間、好ましくは２〜３日間培養し、それらの胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を促進してよい。
【００６８】
１つの実施形態において、細胞を、ＧＤＦ８とＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と低濃度のＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物のない状態で１日培養する。特に、細胞を、ＧＤＦ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いてＧＤＦ８と約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物のない状態で、１日培養する。他の実施形態において、細胞を、ＧＤＦ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と、約０．１μＭ  ＭＣＸ化合物の存在下、１日培養する。
【００６９】
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生は、特定のプロトコールに従う前、及び後に、マーカーの存在に関して試験することによって決定して良い。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。従って、多能性細胞の分化は、細胞が、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現し始めた時に検出可能である。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、インサイチューハイブリッド形成（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．２００１補遺））、及び（切断材料の免疫染色化学解析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中でアクセス可能なマーカーに対して、フローサイトメトリ解析（ＦＡＣＳ）（例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）のような）免疫アッセイが挙げられる。
【００７０】
さらに、分化の効率は、対象の分化した細胞によって発現したタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬剤へ、処理した細胞集団を曝露することによって決定されてよい。
【００７１】
分化細胞をまた、さらに精製しても良い。例えば、多能性幹細胞を、本発明の方法で処理した後、分化した細胞を、処理した細胞集団を、精製している分化細胞によって特徴的に発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬剤に曝露することによって精製してよい。
【００７２】
ステージ２：胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へさらに分化して良い。１つの実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成には、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）７又はＦＧＦ１０を含む培地で培養して、これらの細胞を分化させることが含まれる。例えば、培養培地には、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約７５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７が含まれてよい。細胞を、約２〜３日、好ましくは約２日間、これらの条件下で培養して良い。
【００７３】
他の実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化には、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）と培養することが含まれる。培養培地は、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭアスコルビン酸、あるいは約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、あるいは約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を含んでよい。培養培地はまた、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７を含んでもよい。例えば、培養培地は、約０．２５ｍＭのアスコルビン酸と約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７を含んでよい。１つの実施形態において、ステージ１細胞を、ＦＧＦ７とアスコルビン酸とで、２日間処理する。
【００７４】
ステージ３：腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞をさらに、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化して良い。１つの実施形態において、ステージ２細胞をさらに、これらの細胞を、（「ＭＲＴ１０」（Ｎ−［［［３−ベンゾイルアミノ）フェニル］アミノ］チオキソメチル］−３，４，５−トリメトキシベンズアミド））又はシクロパミンのような）Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（「ＳＭＯ」）受容体阻害剤、又は（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  １（「ＳＡＮＴ−１」）（（Ｅ）−４−ベンジル−Ｎ−（（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレンピペラジン−１−アミン）のような）Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（「ＳＨＨ」）シグナル伝達経路アンタゴニスト、又はＨｅｄｇｅｈｏｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １（「ＨＰＩ−１」）（２−メトキシエチル１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−（３−ヒドロキシフェニル）−７−（２−メトキシフェニル）−２−メチル−５−オキソ−３−キノリンカルボキシレート））、レチノイン酸、及びＮｏｇｇｉｎを補足した培養培地中で培養することによって、ステージ３細胞に分化させる。あるいは、ステージ２細胞を、これらの細胞を、ＳＭＯ受容体阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びＮｏｇｇｉｎを補足した培養培地中で培養することによって、ステージ３細胞に分化させてよい。細胞を、およそ２〜４日間、好ましくは２日間培養して良い。１つの実施形態において、培地には、約０．１μＭ〜約０．３μＭのＳＡＮＴ−１、約０．５μＭ〜約３μＭのレチノイン酸及び約７５ｎｇ／ｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎを補足する。他の実施形態において、培地には、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２μＭのレチノイン酸及び約１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎを補足する。
【００７５】
他の実施形態において、ステージ２細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、レチノイン酸、（ＭＲＴ１０又はＣｙｃｌｏｐａｍｉｎｅのような）ＳＭＯ受容体阻害剤又は（ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」））ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のようなタンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）アクチベータ、ホルボール−１２，１３−ジブチレート（「ＰＤＢｕ」）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（「ＰＭＡ］）、又はインドラクタムＶ（「ＩＬＶ」））、（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎのような）骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）阻害剤、及びアスコルビン酸を補足した培地で処理することによって、ステージ２細胞をさらにステージ３細胞に分化させる。他の実施形態において、培地に、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、レチノイン酸、ＳＭＯ受容体阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達アンタゴニスト、（ＴＰＢのような）ＰＫＣアクチベータ、（ＬＤＮ−１９３１８９のような）ＢＭＰ阻害剤及びアスコルビン酸を補足して良い。細胞を、これらの増殖因子、低分子アゴニスト、及びアンタゴニストの存在下、約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、培養して良い。
【００７６】
さらなる実施形態において、培地には、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、約０．５μＭ〜約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１、約１００〜約３００ｎＭのＴＰＢ、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．１５ｍＭ〜約０．３５ｍＭのアスコルビン酸を補足する。他の実施形態において、培地には、約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、約１μＭのレチノイン酸、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２００ｎＭのＴＰＢ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補足する。
【００７７】
空気−液体界面で培養することによる、ステージ４のステージ６細胞への発生
本発明は、多能性細胞の膵臓内分泌細胞への経路における全てのステージに対して、空気−液体界面にて培養することを企図するけれども、本発明は好ましくは、沈んだ培養液中、ステージ１〜ステージ３細胞の形成と、空気−液体界面で細胞を培養することによるステージ４〜ステージ６細胞を提供する。従って、特定の実施形態において、本発明は、空気−液体界面で、ステージ４〜６の間に培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的方法を提供する。特定の実施形態において、細胞を、ステージ４〜６の全体の間、空気−液体界面で培養して良い。他の実施形態において、後期ステージ４〜ステージ６のみ、又はステージ５及び６のみ、又はステージ４と５のみ、又はステージ４と６のみが、空気−液体界面で培養することを含む。
【００７８】
細胞を空気−液体界面（空気−液体界面）で培養する時に、細胞が、頂部側で空気と、底部側で細胞培養培地と接触するように、細胞を多孔性基質上で培養して良い。例えば、十分な容量の培地を、培地が、基質上に残っている細胞の底表面に接触するが、それらを封入又は沈めはしないように、多孔性基質（例えばフィルタ挿入物）を含む培養容器の底に加えて良い。好適な多孔性基質は、細胞の増殖及び分化に負の影響を与えないであろう任意の材料から形成可能である。例示多孔性基質は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル又はポリカルボネートのような、ポリマーから作製される。好適な多孔性基質は、コーティングされているか、又はコーティングされていなくて良い。１つの実施形態において、多孔性基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）にてコーティングされて良い。本発明の１つの実施形態において、多孔性基質は、多孔性フィルタ挿入物であり、これは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）にてコーティングされて良い。好ましくは、しかしながら、多孔性基質は、コーティングされていないフィルタ挿入物である。基質の多孔性は、細胞生存を維持し、細胞の分化を促進するのに十分であるべきである。好適な基質には、約０．３〜約３．０μｍ、約０．３〜約２．０μｍ、約０．３〜約１．０μｍ、約０．３〜約０．８μｍ、約０．３〜約０．６μｍ、約０．３〜約０．５μｍ、約０．５〜約３．０μｍ、約０．６〜約３．０μｍ、約０．８〜約３．０μｍ、約１．０〜約３．０μｍ、約２．０μｍ〜約３．０μｍ、好ましくは約０．４μｍの孔サイズと、約５０〜約１２０百万孔／ｃｍ2、約６０〜約１１０百万孔／ｃｍ2、約７０〜約１００百万孔／ｃｍ2、好ましくは約８０〜約１００百万孔／ｃｍ2、約９０〜約１００百万孔／ｃｍ2、より好ましくは約１００百万孔／ｃｍ2の孔密度を有するフィルタ挿入物が含まれる。
【００７９】
培地は有利に、毎日又は２日に一回交換又はリフレッシュしてよい。多孔性基質の頂部上で増殖した細胞は、一般に単一細胞ではなく、それらは、シートの形状であるか、細胞の凝集クラスタとして存在する。空気−液体界面で培養した細胞は、培地中で沈んだ細胞と比較して、より高い酸素張力を経験して良い。
【００８０】
本発明は従って、空気−液体界面での、ステージ４〜ステージ６細胞、好ましくはステージ５及びステージ６細胞の発生を包含する。ステージ４細胞を、全体に平面培養液中で、全体に空気−液体界面で培養してよく、又は細胞を、ステージ４の早期部分の間、沈んだ平面培養液中で培養し、次いで、ステージ４の後期部分の間、空気−液体界面にて培養してよい。これらの細胞を、多能性幹細胞を分化させることによって、又は他の手段から誘導した、ステージ３、４又は５細胞をさらに分化させることによって製造してよい。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することによって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵臓内分泌細胞／β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、を含む、多能性幹細胞から、膵臓内分泌細胞、好ましくはβ細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法を提供する。
【００８２】
他の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することによって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、を含む、多能性幹細胞から、膵臓内分泌細胞、好ましくはβ細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法を提供する。
【００８３】
方法には、トリヨードチロニン（ＴＡ３）、チロキシン（Ｔ４）、Ｔ３又はＴ４の類似体、又はこれらの混合物（合わせて本明細書以下「Ｔ３／Ｔ４」と呼ぶ）、又はアクチビン受容体様キナーゼ（「ＡＬＫ」）５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理が含まれてよい。好適な甲状腺ホルモン類似体としては、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号４５５４から入手可能なＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）、ＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨードチオプロパン酸）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ２００３，１００：１００６７〜１００７２にて議論されたＫＢ−１４１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５にて議論されたＭＢ０７３４４、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１０，５ｅ８７２２及びＪ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００９，５０：９３８〜９４４にて議論されたＴ０６８１、及びＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１０  ｅ８７２２及びＥｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４にて議論されたＧＣ−２４が挙げられ、これらの文献はその全てが本明細書にて参照により組み込まれている。有用なＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、ＡＬＫ５ｉ（Ａｘｘｏｒａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＤ２０８（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＩＴＤ−１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１０９７６１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、Ａ８３−０１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１５７２９９（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）が挙げられる。本方法には、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することによって、前腸内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、平面培養液中で培養することと、が含まれてよい。本方法にはまた、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又は両方を補足した培地で処理することによっ���、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、が含まれてよい。
【００８４】
１つの実施形態において、本方法には、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地での処理が含まれる。他の実施形態において、本方法には、ステージ３細胞を、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することが含まれる。本方法にはまた、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することが含まれてよい。
【００８５】
本発明の１つの実施形態は、空気−液体界面にて培養することによって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を形成する方法である。β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、インスリンと、少なくとも１つの以下の転写因子、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、１ＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４及びＰＡＸ６を発現する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、細胞の形成となる。従って、本発明は、そのような発現を誘導するのに十分な条件下、空気−液体界面にて、膵臓内胚葉細胞を培養することによって、ヒト細胞中、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９の発現を誘導する方法を提供する。本発明はまた、空気−液体界面にて、膵臓内胚葉細胞を培養することによって、ヒト細胞中の、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＮＧＮ３の発現を誘導するための方法も提供する。本方法には、Ｔ３、ＡＬＫ５阻害剤又は両方を補足した培地での処理が含まれてよい。従って、１つの実施形態において、培地にＴ３を補足してよく、一方で他の実施形態において、培地に、ＡＬＫ５阻害剤を補足して良い。他の実施形態において、培地に、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤両方を補足して良い。ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性の細胞であってよい。他の実施形態において、ステージ６細胞は、単一ホルモン陽性細胞である。例えば、ステージ６細胞は、（ａ）ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａを共発現する、又は（ｂ）ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、細胞であってよい。
【００８６】
空気−液体界面で細胞を培養することに、多孔性フィルタ挿入物のような、多孔性基質上で細胞を播くことが含まれる。特定の実施形態において、基質孔サイズは、約０．４〜約３ミクロン、又は本発明で言及した任意の孔サイズの範囲であってよい。播くことは、又は単層培養液からの単一細胞、又は細胞のクラスタとして細胞を、懸濁液内に放出することと、続いて空気−液体界面にて位置する多孔性基質上へ、細胞懸濁液を分液することと、によって達成されて良い。細胞は、約１０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約９０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約８０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約７０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約６０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約５０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約４０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約３０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約２０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約１０，０００細胞／μｌ、約１０００細胞／μｌ〜約５０００細胞／μｌ、約５０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約１０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約２０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約３０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約４０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約５０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約６０，０００細胞／μｌ〜約１００，０００細胞／μｌ、約２０，０００細胞／μｌ〜約８０，０００細胞／μｌ、約３０，０００細胞／μｌ〜約７０，０００細胞／μｌ、約４０，０００細胞／μｌ〜約６０，０００細胞／μｌ、好ましくは約５０，０００細胞／μｌを含む懸濁液から、多孔性基質上に播いて良い。細胞を、個々の細胞又は細胞のクランプを含む細胞懸濁液の液滴として播いて良い。得られる細胞析出は、約５×１０6〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約６×１０6〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約７×１０6〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約８×１０6〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約９×１０6〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約１×１０7〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約２×１０7〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約３×１０7〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約４×１０7〜約５×１０7細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約４×１０7細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約３×１０7細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約１×１０7細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約９×１０6細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約８×１０6細胞／ｃｍ2、約５×１０6〜約７×１０6細胞／ｃｍ2、約７×１０6〜約４×１０7細胞／ｃｍ2、約８×１０6〜約３×１０7細胞／ｃｍ2、約９×１０6〜約２×１０7細胞／ｃｍ2、好ましくは×１０7細胞／ｃｍ2のオーダー上を含んでよい。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明は、多孔性基質上、空気−液体界面にて、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉前駆細胞の集団を、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性膵臓内分泌細胞に、培養し分化することによって、ＨＢ９タンパク質の発現を増強する方法に関する。あるいは、ＨＢ９タンパク質発現を、空気−液体界面にて、主にＰＤＸ１陽性細胞を含む前腸内胚葉細胞の集団を培養し、分化させることによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、膵臓内分泌細胞の集団を、少なくとも、部分的に、空気−液体界面にて、多能性細胞の段階的分化によって得る。
【００８８】
他の実施形態において、本発明は、空気−液体界面にて、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞の集団を培養し、分化させることによって、単一ホルモン陽性細胞（例えばＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する細胞、又はＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａを産出する細胞）の数を増強する方法を提供する。他の実施形態において、空気−液体界面で培養した膵臓内胚葉細胞をさらに、以下の：ＡＬＫ５阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤、Ｅｐｈｒｉｎリガンド、ＥｐｈＢ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＥＧＦｒ阻害剤、レチノイン酸、ビタミンＣ、Ｔ３／Ｔ４グルコース、細胞周期調節剤、ＷＮＴ調節剤、ＳＨＨ阻害剤又はこれらの組合せから選択される化合物での処理によって、膵臓内分泌細胞に分化させる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、空気−液体界面で培養した膵臓内分泌細胞をさらに、膵臓内分泌前駆細胞へ、及び膵臓ホルモン発現細胞へ分化させる。他の実施形態において、本発明は、インスリンを発現するが、ＮＫＸ６．１は発現しない、本発明の方法によって調製した細胞を包含する。いくつかの実施形態において、空気−液体界面にて発生した膵臓内分泌集団を、機能的膵臓内分泌細胞へのさらなるインビボ成熟化のために、糖尿病動物に移植する。
【００９０】
ステージ４：前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
１つの実施形態において、本発明の方法には、以下の（ａ）ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹＡ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群より選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤、（ｄ）ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｅ）ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｆ）ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータ、（ｇ）ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子、（ｈ）レチノイン酸、（ｉ）アスコルビン酸、（ｊ）ヘパリン及び（ｋ）硫酸亜鉛の１つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ３細胞を処理することが含まれる。例えば、ＭＣＤＢ１３１又はＢＬＡＲのような増殖培地には、（ＭＲＴ１０又はＣｙｃｌｏｐａｍｉｎｅのような）ＳＭＯ阻害剤、又は（ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎのような）ＢＭＰ受容体阻害剤、アスコルビン酸及び（ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ又はＩＬＶのような）ＰＫＣアクチベータを補足して、有用な分化培地を提供して良い。そのような培地中、ステージ３細胞を、約２〜４日間、好ましくは３日間、培養することは通常、ステージ３細胞をステージ４細胞に分化するのに十分である。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストを補足して良い。好ましい実施形態において、ステージ３細胞を、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭレチノイン酸、約２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約０．２５ｍＭアスコルビン酸及び約１００ｎＭ  ＴＰＢを補足した培地で、３日間処理して良い。他の実施形態において、培地にさらに、約５ｎＭ〜約２５ｎＭ、あるいは約１０ｎＭのＴ３のような、Ｔ３を補足して良い。
【００９１】
ステージ４において、細胞を、平面培養液上、又は空気−液体界面にて、培養して良い。とりわけ、本発明は、（ａ）培養容器と、（ｂ）前記容器の容量の一部分のみみたすのに十分な、前記容器内の多量の増殖培地と、（ｃ）前記培地を隣接している前記容器の一部をみたす前記容器内の空気と、（ｄ）前記培地と前記空気間の界面に位置する多孔性基質と、（ｅ）前記培地が、前記細胞の表面の一部のみに接触するように、前記基質の表面上に析出した多能性幹細胞から由来する細胞とを含む、空気−液体界面にて、多孔性幹細胞から由来した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養系を提供する。あるいは、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、平面培養液中で、以上に記述したように補足した培地での処理によって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化可能である。
【００９２】
さらなる実施形態において、ステージ４の最後での細胞を、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）、ＧＳＫ２６９９６２（Ｎ−［３−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３？−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ］フェニル］−４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド）、Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン、２ＨＣｌ）及びＳＲ３６７７（Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキシアミドジヒドロクロライド）のような、Ｒｈｏ関連キナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤で処理して良い。特定の実施形態において、約１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を使用してよい。
【００９３】
特定の実施形態において、ステージ４の後期においてのみ、空気−液体界面にて細胞を培養する。１つの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤で処理した後期ステージ４細胞のみを、空気−液体界面にて培養する。特定の実施形態において、細胞を、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解、コラーゲン分解酵素を含む溶液のような、細胞剥離溶液で処理して良い。
【００９４】
他の実施形態において、ステージ３細胞を、ＡＬＫ５阻害剤、Ｎｏｇｇｉｎ及び（ＴＰＢのような）ＰＫＣアクチベータを補足した増殖培地を含む分化培地で処理して良い。特定の実施形態において、培地に、約０．１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤、約１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、及び約５００ｎＭ  ＴＰＢを補足して良い。細胞培養は、単層フォーマットであってよい。処理は、合計約３日間存続してよい。特定の実施形態において、細胞を、２日間処理し、次いで最後の日に、細胞を、ジスパーゼのようなタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素又は両方で処理し、約１００ミクロン未満の直径を有する細胞クラスタに破壊し、続いて、ＡＬＫ５阻害剤及びＬＤＮ−１９３１８９の存在下、培養して良い。特定の実施形態において、約１００ミクロン未満の直径を有する細胞クラスタを、約２００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤及び約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９を補足した培地中で培養して良い。
【００９５】
ステージ５：膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
１つの実施形態において、本発明の方法には、以下の（ａ）ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群より選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤、（ｄ）ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｅ）ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｆ）ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータ、（ｇ）ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子、（ｈ）レチノイン酸、（ｉ）アスコルビン酸、（ｊ）ヘパリン及び（ｋ）硫酸亜鉛の１つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ４細胞を処理することと、空気−液体界面にて、約２〜４日間、好ましくは約３日間、培養して、細胞をステージ５細胞に分化することと、が含まれる。他の実施形態において、増殖培地に、（ＭＲＴ１０又はシクロパミンのような）ＳＭＯ阻害剤、又は（ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、Ｔ３、アスコルビン酸、（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎのような）ＢＭＰ阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤を補足する。他の実施形態において、本発明の方法には、ステージ４細胞を、ＳＭＯ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、Ｔ３、アスコルビン酸、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することと、細胞を、空気−液体界面にて、約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、ステージ５細胞に細胞を分化させることと、が含まれる。１つの実施形態において、ステージ４細胞を、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭレチノイン酸、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０ｎＭのＴ３及び約１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で細胞を処理することによって、ステージ５細胞に分化させる。特定の実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＤ２０８（（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イルーアミン）である。１つの実施形態において、培地に約１０００ｎＭのＳＤ２０８を補足する。
【００９６】
また他の実施形態において、本発明の方法には、ステージ４細胞を、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤、またはＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することと、細胞を、空気−液体界面にて、約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、ステージ５細胞に細胞を分化させることと、が含まれる。他の実施形態において、培地に、レチノイン酸、ＢＭＰ受容体阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤と共に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。
【００９７】
培地にはさらに、ＺｎＳＯ4を補足して良い。例えば、約１０μＭ  ＺｎＳＯ4を加えて良い。従って、１つの実施形態において、ステージ４細胞を、ヘパリン、ＺｎＳＯ4、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、ＬＤＮ−１９３１８９及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足した培地で処理することによって、ステージ４細胞を、ステージ５細胞に分化させて良い。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。１つの実施形態において、細胞を、約１０μｇ／ｍｌのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭレチノイン酸、約５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０ｎＭのＴ３及び約１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することによって、ステージ４細胞を、ステージ５細胞に分化する。好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００９８】
１つの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。他の実施形態において、約１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。他の実施形態において、ステージ４細胞を、約１０μｇ／ｍｌのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭレチノイン酸、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９及び約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足した培地で処理する。
【００９９】
また他の実施形態において、本発明の方法には、ステージ４細胞を、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することと、細胞を、空気−液体界面で、約２日間培養して、細胞をステージ５細胞に分化させることと、が含まれる。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤とＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと両方を補足して良い。１つの実施形態において、細胞を、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭレチノイン酸、約５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、及び約１０００ｎＭの（ＳＤ２０８又はＡＬＫ５阻害剤ＩＩのような）ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することによって、ステージ４細胞を、ステージ５細胞に分化させる。特定の実施形態において、培地は、ＭＣＤＢ−１３１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）であってよい。
【０１００】
空気−液体界面にて培養するために播いた細胞の量は様々であって良い。例えば、空気−液体界面にて細胞を培養するために、約２×１０5細胞／μｌ〜約６×１０5細胞／μｌ、３×１０5細胞／μｌ〜約６×１０5細胞／μｌ、４×１０5細胞／μｌ〜約６×１０5細胞／μｌ、５×１０5細胞／μｌ〜約６×１０5細胞／μｌ、２×１０5細胞／μｌ〜約５×１０5細胞／μｌ、２×１０5細胞／μｌ〜約４×１０5細胞／μｌ、又は３×１０5細胞／μｌを含む細胞懸濁液の液滴を、空気−液体界面にて位置するフィルタのような、多孔性基質上へ播いて良い。いくつかの実施形態において、約０．５×１０5細胞／μｌ〜約０．７５×１０5細胞／μｌ、約０．６×１０5細胞／μｌ〜約０．７５×１０5細胞／μｌ、又は約０．５×１０5細胞／μｌ〜約０．６×１０5細胞／μｌを含む細胞懸濁液の液滴を、空気−液体界面にて培養すべき、多孔性支持体上に播く。
【０１０１】
他の実施形態において、本発明の方法には、ステージ４細胞を、ＢＭＰ受容体阻害剤（例えばＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎ）及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で、約１日処理して、ステージ４細胞をステージ５細胞に分化することが含まれる。例えば、培地に、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９と、約２００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤を補足して良い。好ましくは、本実施形態には又、細胞をジスパーゼで前処理することが含まれる。細胞は、クラスタの形状であってよい。特定の実施形態において、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解及びコラーゲン分解酵素を含む溶液のような、細胞剥離溶液で細胞を処理してよい。１つの実施形態において、本発明の実施形態に従って培養したステージ４細胞を使用して、ステージ５細胞に分化させ、一方で他の実施形態において、他のプロトコールに従って培養したステージ４細胞を使用してよい。
【０１０２】
以上の方法に従って、本発明はさらに、（ａ）培養容器と、（ｂ）前記容器の容量の一部分のみみたすのに十分な、前記容器内の多量の増殖培地と、（ｃ）前記培地を隣接している前記容器の一部をみたす前記容器内の空気と、（ｄ）前記培地と前記空気間の界面に位置する多孔性基質と、（ｅ）前記培地が、前記細胞の表面の一部のみに接触するように、前記基質の表面上に析出した多能性幹細胞から由来する膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞と、を含む、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための細胞培養系を提供する。
【０１０３】
特定の実施形態において、空気−液体界面にてステージ５における細胞を培養することは、膵臓ホルモンの発現を増強してよい。従って、本発明はまた、細胞を空気−液体界面にて培養することによって、膵臓ホルモンの発現を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステージ５における細胞を、本明細書で、そして以下表ＶＩＩＩ〜ＸＩＩＩで記述するように処理して良い。特定の実施形態において、本方法はまた、ＰＴＦ１ａ、ＳＯＸ９、ＣＤＸ２（腸マーカー）、ＺＩＣ１（外胚葉マーカー）及びＳＯＸ２（前側内胚葉マーカー）の発現を減少させてよい。
【０１０４】
１つの実施形態において、本方法には、Ｔ３／Ｔ４、又はＡＬＫ５阻害剤又はＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、が含まれる。
【０１０５】
ステージ６：膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
本発明の１つの実施形態において、方法には、以下の（ａ）ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹＡ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群より選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体阻害剤、（ｄ）ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｅ）ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｆ）ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータ、（ｇ）ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子、（ｈ）レチノイン酸、（ｉ）アスコルビン酸、（ｊ）ヘパリン及び（ｋ）硫酸亜鉛の１つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ５細胞を処理することと、空気−液体界面にて、約２〜４日間、好ましくは約３日間、培養して、ステージ５細胞をステージ６細胞に分化することと、が含まれる。１つの実施形態において、増殖培地に、（ＭＲＴ１０又はＣｙｃｌｏｐａｍｉｎｅのような）ＳＭＯ阻害剤、又は（ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、アスコルビン酸、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補足する。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤とＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。ステージ５細胞を、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ  ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５００ｍＭのＡＬＫ５阻害剤、及び約０．１ｎＭのＴ３を補足した培地での、約３日間の処理によって、ステージ６細胞に分化させてよい。あるいは、ステージ５細胞を、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭレチノイン酸、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤及び１０ｎＭ  Ｔ３を補足した培地での、約３日間の処理によって、ステージ６に分化させてよい。細胞を、望むのならば、そのような培地中で、さらに２日間、又はそれ以上培養して良い。
【０１０６】
あるいは、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地での処理と、空気−液体界面での、約６〜１４日間、あるいは約６日間、あるいは約７日間、あるいは約８日間、あるいは約９日間、あるいは約１０日間、あるいは約１１日間、あるいは約１２日間、あるいは約１３日間及びあるいは約１４日間培養することにより、ステージ５細胞をステージ６細胞に分化させて良い。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。例えば、細胞を、約１０μｇ／ｍｌのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３及び約５００〜約１０，０００ｎＭ、約１０００〜約１０，０００ｎＭ、約５０００〜約１０，０００ｎＭ、約６００〜約５０００ｎＭ、約７００〜約５０００ｎＭ、約８００〜約５０００ｎＭ、約９００〜約５０００ｎＭ、約１０００〜約５０００ｎＭ、約６００〜約１０００ｎＭ、約７００〜約１０００ｎＭ、約８００〜約１０００ｎＭ、約６００〜約１２００ｎＭ、約７００〜約１２００ｎＭ、約８００〜約１２００ｎＭ、約９００〜約１２００ｎＭ、あるいは約５００ｎＭ、あるいは約１０００ｍＭ、及びあるいは約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養してよい。
【０１０７】
好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１０８】
１つの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。他の実施形態において、約１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを使用する。従って、１つの実施形態において、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補足した培地での処理と、空気−液体界面で、約６日間培養することによって、ステージ５細胞をステージ６細胞に分化させて良い。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。特定の実施形態において、空気−液体界面で培養する前に、タンパク質分解及びコラーゲン分解酵素を含む溶液のような、細胞剥離溶液で細胞を処理して良い。
【０１０９】
他の実施形態において、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足した培地での処理と、約５日〜約１５日、約６日〜約１４日、約７日〜約１３日、約８日〜約１２日、約９日〜約１１日、約５日〜約１０日、約１０日〜約１５日、あるいは約５日、あるいは約６日、あるいは約７日、あるいは約８日、あるいは約９日、あるいは約１０日、あるいは約１１日、あるいは約１２日、あるいは約１３日、あるいは約１４日、あるいは約１５日の間、空気−液体界面で培養することによって、ステージ５細胞をステージ６細胞に分化させて良い。１つの実施形態において、細胞を、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上の間、空気−液体界面で培養する。１つの実施形態において、細胞を、１５日以下、１４日以下、１３日以下、１２日以下、１１日以下、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、６日以下、５日以下の間、空気−液体界面で培養する。１つの実施形態において、細胞を約１０日間、空気−液体界面で培養する。他の実施形態において、細胞を約１１日間、空気−液体界面で培養する。他の実施形態において、細胞を約１２日間、空気−液体界面で培養する。また他の実施形態において、細胞を約１５日間、空気−液体界面で培養する。これらの実施形態において、培地に、約１０μｇ／ｍｌのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３及び約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足して良い。特定の実施形態において、培地にさらに硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4）を補足して良い。例えば、培地に、さらに約１０μＭ  ＺｎＳＯ4を補足して良い。他の実施形態において、培地に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。
【０１１０】
以上の方法に従って、本発明はさらに、（ａ）培養容器、（ｂ）前記容器の容量の一部分のみみたすのに十分な、前記容器内の多量の増殖培地、（ｃ）前記培地を隣接している前記容器の一部をみたす前記容器内の空気、（ｄ）前記培地と前記空気間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｄ）前記培地が、前記細胞の表面の一部のみに接触するように、前記基質の表面上に析出した多能性幹細胞から由来する膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、を含む、膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための細胞培養系を提供する。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明の実施形態に従って培養したステージ５細胞を使用し、ステージ６細胞に分化させ、一方で他の実施形態において、他のプロトコールに従って培養したステージ５細胞を使用してよい。
【０１１２】
他の実施形態において、本発明の方法は、単一ホルモン陽性である、ステージ６細胞の発生をもたらす。従って、１つの実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａを共発現するステージ６細胞をもたらす。他の実施形態において、本方法は、ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、ステージ６細胞をもたらす。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態において、本方法は、ステージ４〜６にて、ＢＬＡＲカスタム培地（表ＩＩを参照のこと）を使用する。培地は好ましくは、毎日、又は２日に一度交換して良い。本発明の特定の実施形態において、方法には、ステージ４〜ステージ６細胞を、本明細書表ＶＩＩＩ〜ＸＩＩＩで記した量にて、特定の成分で処理することが含まれる。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明は、ステージ４〜６、好ましくはステージ５と６にて、空気−液体界面にて培養することを含む、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａを共発現しているステージ６細胞を製造する方法に関する。また他の実施形態において、本発明は、ステージ４〜６、好ましくはステージ５と６にて、空気−液体界面にて培養することによって、ＮＫＸ６．１を発現している単一ホルモンインスリン陽性細胞を製造する方法に関する。
【０１１５】
ステージ４の間又は後で、空気−液体界面にて細胞を培養することは、内分泌関連マーカーと共に、膵臓内胚葉マーカーの発現を有意に増強させて良い。従って、本発明は、空気−液体界面にて、ステージ４の間又は後に、細胞を培養することにより膵臓内胚葉及び内分泌関連マーカーの発現を増強する方法を提供する。
【０１１６】
他の実施形態において、本発明はまた、ステージ４及び続く細胞を、ＡＬＫ５阻害剤の存在下、空気−液体界面にて培養することによって、インスリン、クロモグラニン−Ａ又はクロモグラニン−Ａとインスリンを共発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞の収率を増加させる方法も提供する。１つの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。他の好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩ及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤に加えて、細胞を、以下の表ＶＩＩＩ〜ＸＩＩＩ中で記述したように処理して良い。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの存在下、空気−液体界面にて、ステージ５の間に細胞を培養することによって、インスリン、クロモグラニン−Ａ又はクロモグラニン−Ａとインスリンを共発現している、ＮＫＸ６．１陽性細胞を増加させる方法を提供する。１つの実施形態において、方法にはさらに、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩとＴ３の存在下、ステージ５の間に細胞を培養することが含まれる。
【０１１８】
ステージ６細胞のインビボ成熟化
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に従って調製したステージ６細胞をさらに、インビボで成熟化させて良い。１つの実施形態において、これらの細胞は、哺乳動物へのインビボ移植によってさらに成熟化させてよい。例えば、細胞を、マウスの腎臓カプセルのもと、移植して良い。１つの実施形態において、さらにインビボで成熟化するステージ６細胞は、ＮＸＫ６．１とインスリンを共発現する細胞である。他の実施形態において、さらにインビボで成熟化するステージ６細胞は、ＮＸＫ６．１及びクロマグラニンを共発現する細胞である。他の実施形態において、（ａ）ＮＸＫ６．１及びインスリンを共発現する細胞、又は（ｂ）ＮＸＫ６．１とクロマグラニンを共発現する細胞のインビボ成熟化は、早期Ｃ−ペプチド製造をもたらす。特定の実施形態において、およそ３百万のステージ６細胞を移植することからのＣ−ペプチド産出は、およそ３，０００のヒト島を移植することによって製造されるＣ−ペプチドの量と同様である。
【０１１９】
本明細書で記述した方法に従って、空気−液体界面にて培養することはまた、膵臓ホルモン及び内分泌マーカーの分泌における、それらの効果に対して化合物をスクリーニングすることにおける利用のためによく適合する。特に、空気−液体界面にて培養したステージ４〜ステージ６細胞を、３８４〜６ウェルフォーマットを含む、種々の培養フォーマットにて使用して、種々の用量及び時間間隔で、種々の低分子又はバイオロジクスの封入が有する、膵臓内胚葉、膵臓内分泌前駆、膵臓内分泌及び膵臓β細胞マーカーの続く発現における効果を評価可能である。そのような評価は、ＰＣＲによる遺伝子発現、ＦＡＣＳ、免疫染色による、タンパク質発現を測定することによって、または低分子又はバイオロジクスの添加によって影響を受けた細胞による因子の分泌に関して、ＥＬＩＳＡによって、達成されてよい。
【０１２０】
本発明の方法によって得ることが可能な細胞
本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得た細胞、又は細胞の集団を提供する。
【０１２１】
本発明はまた、好ましくは、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａの有意な共発現によって特徴づけられる、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している、細胞又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、好ましくは、ＮＫＸ６．１発現（任意に＞３０％）によって特徴づけられる、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している、インスリン陽性細胞、又はインスリン陽性細胞の集団を提供する。これらは、実施例１０にて例示したように、先には記述されていない細胞集団である。
【０１２２】
処置方法
本発明は、処置方法を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病を患っている、又発達するリスクのある患者を処置方法を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、処置方法での使用のための、本発明の方法によって得ることが可能、もしくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。特に、本発明は、糖尿病を患っている、又は発達するリスクのある患者を処置する方法における利用のために、本発明の方法によって得ることが可能、もしくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。
【０１２４】
糖尿病は１型、又は２型糖尿病であってよい。
【０１２５】
１つの実施形態において、処置法には、患者へ、本発明の方法によって得た、又は得ることができる細胞を移植することが含まれる。
【０１２６】
１つの実施形態において、処置方法には、例えば本明細書で記述するように、多能性幹細胞をインビトロにて、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５又はステージ６細胞に分化させることと、患者に、分化した細胞を移植することと、が含まれる。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明はさらに、多能性幹細胞を分化させる段階の前に、例えば、本明細書で記述したように、多能性幹細胞を培養する段階を含む。
【０１２８】
１つの実施形態において、方法にはさらに、移植の段階の後、インビボで、細胞を分化させる段階が含まれる。
【０１２９】
１つの実施形態において、患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１３０】
１つの実施形態において、細胞を、分散した細胞として移植してよく、又は肝門脈内に浸出してよいクラスタを形成して良い。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０１３１】
インビボにて、移植した細胞のさらなる分化、生存又は活性を増強するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤のような追加因子を、細胞の投与前、同時又は後に投与可能である。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にインサイチューで曝露されてもよい。埋め込まれた細胞は、当該技術分野で既知の内因性の、及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。
【０１３２】
埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。
【０１３３】
１つの実施形態において、処置方法にはさらに、移植の前の、三次元支持体内への細胞の組込が含まれる。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロで更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。
【実施例】
【０１３４】
（実施例１）
空気−液体界面での膵臓内分泌前駆細胞の培養
本実施例は、膵臓内分泌前駆細胞（ステージ５細胞）が、空気−液体界面にて培養する際に、さらに成熟化可能であることを試験し、実証する。空気−液体界面にて膵臓内分泌前駆細胞を培養するために、胚性幹細胞を、以下に議論するプロトコールに基づいて、膵臓内分泌前駆細胞に分化させた。
【０１３５】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｎｄａ）中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）−コーティングされたディッシュ上に、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１：（３日間）：１：３０  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングされた表面上にプレートした未分化Ｈ１細胞の６０〜７０％コンフルエント接着培養液を、０．２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ）、１００ｎｇ／ｍｌアクチビン−Ａ（ＡＡ；Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補足したＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に、１日目のみ曝露した。次の２日間、細胞を、０．５％  ＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＡを含むＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ中で培養した。
ｂ）ステージ２：（３日間）：ステージ１細胞を次いで、２％  ＦＢＳと５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＹ）に、３日間曝露した。
ｃ）ステージ３：（４日間）：ステージ２細胞を次いで、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１％（ｖ／ｖ）の、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標Ｂ２７（登録商標）の下売られている栄養補助物（カタログ番号：１７５０４０４４）を補足した、ＤＭＥＭ−ＨＧ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中、４日間培養した。
ｄ）ステージ４：（３日間）：ステージ３細胞を次いで、単層フォーマットにて、０．１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ；Ａｘｘｏｒａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ、５００ｎＭ  ＴＰＢ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ）及び１％  Ｂ２７で補足したＤＭＥＭ−ＨＧ培地中で３日間培養した。培養の最後の日のために、細胞を５ｍｇ／ｍｌジスパーゼ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ、＃３５４２３５）で５分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞クラスタ（＜１００ミクロン）に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン１２５ｍｌ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、２００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，ＣＡ）及び１％  Ｂ２７を補足したＤＭＥＭ−ＨＧを含む懸濁液中、８０〜１００ｒｐｍにて一晩回転させた。
ｅ）ステージ５：（１日）：ステージ４細胞を次いで、５ｍｇ／ｍｌジスパーゼで５分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞クラスタ（＜１００ミクロン）に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン１２５ｍｌ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に移し、２００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，ＣＡ）及び１％  Ｂ２７を補足したＤＭＥＭ−ＨＧを含む懸濁液中、８０〜１００ｒｐｍにて一晩回転させた。
【０１３６】
ステージ５、１日目クラスタを、６−ウェルプレート（〜１百万細胞を含む１０マイクロリットル分液中）、０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＥＴ膜、＃３５３４９３）上に播き、挿入物の底に１．５ｍｌのＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％  Ｂ２７を加え、挿入物上には培地がない状態にて、空気−液体界面で、３週間培養した。図１Ａ〜Ｈは、空気−液体界面での播種後、種々の時間点でのクラスタの相コントラストイメージを描写している。図２Ａ〜Ｋは、フィルタ上細胞クラスタの播種１週間後の時点での、以下のタンパク質、ＤＡＰＩ（図２Ａ）、インスリン（図２Ｂ）、ＨＢ９（図２Ｃ）、ＤＡＰＩ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）、インスリン（図２Ｆ）、ＤＡＰＩ（図２Ｇ）、インスリン（図２Ｈ）、ソマトスタチン（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）及びインスリン（図２Ｋ）に対する免疫染色結果を示している。一方で、図３Ａ〜Ｈは、フィルタ上の播種２週間後の時点での、以下のタンパク質、インスリン（図３Ａ）、グルカゴン（図３Ｂ）、インスリン（図３Ｃ）、ソマトスタチン（図３Ｄ）、インスリン（図３Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図３Ｆ）、ＨＢ９（図３Ｇ）及びＮＫＸ６．１（図３Ｈ）に対する免疫染色結果を描写している。図２において、パネルＡ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆ、Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｋを同一の視野からとった。図３において、パネルＡ〜Ｂ、Ｃ〜Ｄ、Ｅ〜Ｆ及びＧ〜Ｈをそれぞれ同一の視野からとった。図４Ａ〜Ｄは、フィルタ上の播種３週間後の時点での、以下のタンパク質、インスリン（図４Ａ）、グルカゴン（図４Ｂ）、インスリン（図４Ｃ）及びソマトスタチン（図４Ｄ）に対する免疫染色の結果を描写している。図４において、パネルＡ〜Ｂ及びＣ〜Ｄをそれぞれ同一の視野から取った。
【０１３７】
ステージ４及び続く培養にて、ｍＲＮＡを、関連する膵臓内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ解析のために回収した。トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、製造業者の説明書に従って、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを、カスタムＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上へ前もってロードしたＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘとＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いて増幅した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析し、ΔΔＣｔ法（すなわち、内部標準と相関したｑＰＣＲ結果（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ試料−ΔＣｔ参照））を用いて、未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に対して標準化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。ＦＡＣＳ及び免疫蛍光解析を、先に記述された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１２６，２０１２）ように実施した。
【０１３８】
図５Ａ〜Ｒは、実施例１に概要を示したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを記述している。ＰＤＸ１（図５Ａ）、ＮＫＸ６．１（図５Ｂ）、Ｐａｘ４（図５Ｃ）、Ｐａｘ６（図５Ｄ）、ＮＧＮ３（図５Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図５Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図５Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図５Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図５Ｉ）、ＩＡＰＰ（図５Ｊ）、インスリン（図５Ｋ）、グルカゴン（図５Ｌ）、ソマトスタチン（図５Ｍ）、グレリン（図５Ｎ）、Ｐｔｆ１ａ（図５Ｏ）、Ｚｉｃ１（図５Ｐ）、ＣＤＸ２（図５Ｑ）及びＳＯＸ９（図５Ｒ）空気−液体界面での３週間培養に続き、ＡＢＣＣ８、ＩＡＰＰ（Ａｍｙｌｉｎ）及びＰＣＳＫ１のような、内分泌細胞の成熟に関連したマーカーの発現における、有意な時間依存増加が存在した。ＰＴＦ１ａ及びＳＯＸ９発現における有意な減少と、ＣＤＸ２（腸マーカー）、ＺＩＣ１（内胚葉マーカー）及びＳＯＸ２（前側内胚葉マーカー）の非常に低い発現が存在し、一方で、ＮＫＣ６．１及びＰＤＸ１の発現が、非常に高レベルで維持された。全ての膵臓ホルモンの発現が、空気−液体界面での３週間の培養期間を通して、有意に増強された。
【０１３９】
（実施例２）
種々のフィルタ挿入物を用いた空気−液体界面での、膵臓内分泌前駆細胞の培養
本実施例は、空気−液体界面での、膵臓内胚葉細胞の分化における、フィルタ挿入物の型及び多孔性を試験する。フィルタ挿入物の型及び多孔性の効果を試験するために、胚性幹細胞を、以下で議論したプロトコールを用いて分化させた。
【０１４０】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングされたディッシュ又はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コーティングされたフィルタ挿入物（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＨＴ  ３０Ｒ  ４８）上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。続いて、細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間））：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ  Ｔ３（Ｔ６３９７，Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ  Ｔ３、５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。ＳＤ２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イル−アミン）は、２，４−二置換プテリジン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７，７２：１５２〜１６１に開示され、式Ｉに示した構造を有する、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤である。
【０１４１】
【化１】
0006557146.tif 000002
【０１４２】
ｆ．ステージ６（５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．０２５ｍＭアスコルビン酸、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、０．１ｎＭ  Ｔ３を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
【０１４３】
いくつかの培養液にて、平面ディッシュ上で培養したステージ３〜ステージ６細胞を、１×ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）で、室温にて１〜３分間処理し、続いて、酵素を除去し、細胞スクレーバによって細胞をスクレープした。得られた細胞の懸濁液を、６ウェルプレート中、およそ４．２ｃｍ2の表面積を有する０．４ミクロン多孔細胞培養フィルタ挿入物上に、約２〜６×１０6の密度で播いた。使用した種々のフィルタ挿入物を表Ｉに同定する。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。いくつかの培養液において、フィルタを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）で室温にて１時間コーティングし、細胞を、空気−液体界面にて、コーティングした挿入物の頂上に、又は挿入物の頂上で培地にて播いた。培地を、研究の期間、２日に一回置換した。
【０１４４】
図６は、実施例２にて概要を示したように分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内での、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｂ）、ＰＡＸ４（図６Ｃ）、ＰＡＸ６（図６Ｄ）、ＮＧＮ３（図６Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図６Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図６Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図６Ｉ）、ＩＡＰＰ（図６Ｊ）、インスリン（図６Ｋ）及びグルカゴン（図６Ｌ）。ステージ４細胞を、フィルタ挿入物（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３４１２、ＢＤ  ３５３４９３及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＨＴ  ３０Ｒ  ４８）上で培養することにより、内分泌関連マーカーにそった、膵臓内胚葉マーカーが有意に増強された。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でのフィルタのコーティングが、空気−液体界面でのフィルタ上の培養の利点を有意に減少させた。さらに、低多孔性密度フィルタ挿入物（ＢＤ  ３５３０９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３４５２）上出培養した細胞は、少ない生存及び分化を示した。
【０１４５】
【表１】
0006557146.tif 000003
【０１４６】
（実施例３）
空気−液体界面にて培養した膵臓内胚葉細胞は、平面培養液、又は液体−液体界面でのフィルタ上で維持した培養液と比較して、内分泌マーカーの増強した発現を示した。
本実施例は、空気−液体界面で培養したものと比較して、平面基質上で培養した膵臓内胚葉細胞の分化の傾向における差に関する。さらに、空気−液体界面の効果は更に、挿入物上、しかし挿入物の頂部及び底に加えた培地での分化によって強調された。
【０１４７】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ又はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コーティングしたフィルタ挿入物（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＨＴ  ３０Ｒ  ４８）上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。フィルタ挿入物上で培養した細胞に対して、ステージ１の開始時点で、いくつかの培養液において、培地を、挿入物の底にのみに加え、挿入物の頂部は、空気−液体界面にて維持し、一方他の培養液中、培地をまた、フィルタ挿入物の頂部と、挿入物の底に加えた。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。続いて、細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって製造された、ＢＬＡＲ培地の成分に関して、表ＩＩを参照のこと）ＢＬＡＲカスタム培地で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ  Ｔ３（Ｔ６３９７，Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ  Ｔ３、５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ２０８）を補足した、ＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
ｆ）ステージ６（５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、０．０２５ｍＭアスコルビン酸、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、０．１ｎＭ  Ｔ３を補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
【０１４８】
いくつかの培養液にて、ステージ３の最後に平面ディッシュ上で培養した細胞を、１×  ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）で、室温にて１〜３分間処理し、続いて、酵素を除去し、細胞スクレーバによって細胞をスクレープした。得られた細胞の懸濁液を、６ウェルプレート中、０．４ミクロン多孔細胞培養フィルタ挿入物（ＢＤ  ３５３４９３）上に、（５０〜１００μｌ分液中）約２〜６×１０6の密度で播いた。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、２日に一回置換した。
【０１４９】
図７は、実施例３にて概要を示したように分化したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図７Ａ）、ＮＫＸ６．１（図７Ｂ）、ＰＡＸ４（図７Ｃ）、ＰＡＸ６（図７Ｄ）、ＮＧＮ３（図７Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図７Ｆ）、ＡＢＣＣ８（図．７Ｇ）、クロモグラニン−Ａ（図７Ｈ）、ＰＣＳＫ１（図７Ｉ）、ＩＡＰＰ（図７Ｊ）、インスリン（図７Ｋ）、及びグルカゴン（図７Ｌ）。
【０１５０】
ステージ４〜６にて、空気−液体界面でのフィルタ挿入物上で細胞を培養することにより、膵臓内分泌関連マーカーが有意に増強された。さらに、フィルタ挿入物の頂部及び底上で、培地にて、ステージ１の開始から、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コーティングされたフィルタ挿入物上で培養し、分化した細胞は、平面培養液上又は空気−液体界面にて培養した細胞と比較して、より低いレベルの膵臓内胚葉及び内分泌発現を示した。さらに、空気−液体界面でのフィルタ挿入物上で培養した膵臓内胚葉細胞は、全ての試験した構成と比較して、膵臓内分泌細胞の最も高い発現を示した。
【０１５１】
【表２−１】
0006557146.tif 000004
【０１５２】
【表２−２】
0006557146.tif 000005
【０１５３】
（実施例４）
空気−液体界面で培養し、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩで処理した膵臓内胚葉細胞は、有意により大きな数のクロモグラニン−Ａ及びインスリンを共発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞を示した。
【０１５４】
本実施例を、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが、ＮＫＸ６．１とインスリン又はクロモグラニン−Ａを発現した空気−液体界面での、細胞の有意な集団を発生することにおいて固有であった。ことを示すために実施した。さらに、本観察は、空気−液体界面での培養液に固有であった。単層平面培養液中の沈んだ培養液は、有意な数の、インスリン又はクロモグラニン−Ａを発現しているＮＫＸ６．１細胞を示すことを失敗した。
【０１５５】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ又はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）−コートフィルタ挿入物（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＨＴ  ３０Ｒ  ４８）上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、５０ｎＭ  ＬＤＮ、５００〜１０００ｎＭの種々のＡＬＫ５阻害剤（使用した阻害剤のリストについて表ＩＩＩを参照のこと）を補足した、ＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
ｆ）ステージ６（７日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、５００〜１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤（試験した阻害剤のリストについて表ＩＩＩを参照のこと）を補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
【０１５６】
いくつかの培養液において、ステージ４の最後の日に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１×  Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）で、室温にて１〜３分間処理し、続いて、酵素を除去し、細胞スクレーバによって細胞をスクレープした。得られた細胞の懸濁液を、６ウェルプレート中、０．４ミクロン多孔細胞培養フィルタ挿入物（ＢＤ  ３５３４９３）上に、（２５〜５０μｌ分液中）約２〜４×１０6の密度で播いた。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、２日に一回置換した。
【０１５７】
図８は、空気−液体界面にて、ステージ４の１日目、ステージ５の３日目、ステージ６の６日目の後、実施例４にて概要を示したように分化し、空気−液体界面で培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図８Ｂ）、ＮＧＮ３（図８Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図８Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図８Ｅ）、グレリン（図８Ｆ）、グルカゴン（図８Ｇ）及びインスリン（図８Ｈ）。
【０１５８】
図９は、ステージ５の３日目、及びステージ６の４日目で、実施例４にて概要を示したように分化し、平面単一層培養液中で培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、以下の遺伝子、ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＮＧＮ３（図９Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図９Ｄ）、ＰＣＳＫ１（図９Ｅ）、グレリン（図９Ｆ）、グルカゴン（図９Ｇ）及びインスリン（図９Ｈ）に対する発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。図８及び９の比較により、ステージ５及びステージ６での平面培養液の、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩでの処理が、ステージ５と比較して、ステージ６でのインスリン発現の下降をもたらしたことを明らかにする。しかしながら、ＡＬＫ５阻害剤での空気−液体界面での培養液の処理は、ステージ５と比較して、ステージ６でのインスリン発現の増強をもたらした。同一のパターンが、単層培養液と比較して、空気−液体界面培養液中のＮＧＮ３及びＮＫＸ６．１発現に適用された。
【０１５９】
図１０は、１マイクロモルＳＤ２０８阻害剤（パネル９Ａ）又は１マイクロモルＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（パネル１０Ｂ）いずれかで処理した培地中、空気−液体界面で培養し、クロモグラニン−Ａ（パン内分泌マーカー）及びＮＫＸ６．１（膵臓前駆マーカー及びβ細胞特異的マーカー）に対して染色した、ステージ６細胞に対する免疫染色結果を示している。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩで処理した培養液は、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａの共発現をもたらした。しかしながら、ＳＤ２０８で処理した培養液は、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａの非常に低い共発現を示した。
【０１６０】
膵臓前腸前駆細胞を、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩとの組み合わせで、空気−溶液界面にて、フィルタ挿入物上で培養することが、インスリン又はクロモグラニン−Ａを共発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞の数を有意に増強した。さらに、伝統的な単層培養液上で培養した同一のプロトコールは、インスリン又はクロモグラニン−Ａを共発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞の有意な数を示すことを失敗した。最後に、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ以外のＡＬＫ５阻害剤での、空気−液体界面で培養した細胞の処理は、インスリン又はクロモグラニン−Ａを共発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞の有意な数を示すことを失敗した。これらの結果は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足した培地での、空気−液体界面で培養することの固有の組合せが、インスリン／クロモグラニン−Ａ及びＮＫＸ６．１の共発現をもたらすことを示唆する。
【０１６１】
【表３】
0006557146.tif 000006
【０１６２】
（実施例５）
空気−液体界面に培養した細胞に対する、ステージ５及び６における種々のＡＬＫ５阻害剤の比較
本実施例は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが、ＮＫＸ６．１及びインスリン又はクロモグラニン−Ａを発現した、空気−液体界面での有意な細胞集団を発生することにおいて固有であったことを示す。試験したさらなるＴＧＦ−β阻害剤を、表ＩＶにリストする。
【０１６３】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、２日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物（ＢＤ  ３５３４９３）上へ、又は１０ｃｍディッシュ中、１０ｃｍフィルタ挿入物（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３４１９）上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、６−ウェルプレート中、各挿入物の底に加え、７．５ｍｌの培地を、各１０ｃｍ挿入物の底に加えた。更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭの種々のＡＬＫ５阻害剤（使用した阻害剤のリストに関して表ＩＶを参照のこと）を補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ．ステージ６（６日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤（試験した阻害剤のリストについて表ＩＶを参照のこと）を補足したＢＬＡＲ培地で、６日間処理した。
【０１６４】
図２３は、ステージ５の４日目、ステージ６の６日目の後、実施例５にて概要を示したように、空気−液体界面にて分化し、培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図２３Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２３Ｂ）、ＮＧＮ３（図２３Ｃ）、ＡＢＣＣ８（図２３Ｄ）、グルカゴン（図２３Ｅ）及びインスリン（図２３Ｆ）。実施例４の結果と同様に、空気−液体界面で、フィルタ挿入物上、膵臓前腸前駆細胞を培養することと、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩでの処理が、インスリン及びグルカゴンの発現を有意に増強した。他のＡＬＫ５阻害剤での、膵臓前腸前駆細胞の処理は、インスリン又はグルカゴンいずれかの有意な発現をもたらさなかった。
【０１６５】
【表４】
0006557146.tif 000007
【０１６６】
（実施例６）
続く内分泌細胞への分化における、空気−液体界面での、播種細胞密度の効果
本実施例は、空気−液体界面での播種密度の範囲と、内分泌マーカーの得られる発現を同定する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下の議論したプロトコールを用いて同定した。
【０１６７】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。続いて、細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。次いでステージ３の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物（ＢＤ  ３５３４９３）上へ、０．１、０．５、１及び５×１０6細胞（１０μｌ分液）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
ｄ）ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｍｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、２日間培養した。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理した。
ｆ）ステージ６（１４日間）ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９及び１０００ｎＭ  Ｔ３を補足したＢＬＡＲ培地で、１４日間処理した。
【０１６８】
ＲＮＡ試料を、ステージ４、５及び６で回収し、リアルタイムＰＣＲによって解析した。図１１は、実施例６にて概要を示したように分化し、空気−液体界面にて培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＡＢＣＣ８（図１１Ａ）、グルカゴン（図１１Ｂ）、アミリン（図１１Ｃ）、インスリン（図１１Ｄ）、ＮＧＮ３（図１１Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｇ）及びＰＤＸ１（図１１Ｈ）。０．１〜１×１０6細胞／１０μｌの範囲での播種密度は、ステージ５及び６にて、膵臓内胚葉及び内分泌マーカーの同様の発現をもたらす。空気−液体界面での最も高い試験した播種密度（５×１０6細胞／１０μｌ）にて、内分泌マーカーの発現の下降が存在した。
【０１６９】
（実施例７）
０．４、１及び３ミクロン孔サイズフィルタ挿入物の比較
本実施例は、空気−液体界面での、続く分化における、フィルタ孔サイズの効果を比較する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下に議論するプロトコールを用いて分化させた。
【０１７０】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸを補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、２日間処理した。次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、０．４、１又は３ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
ｅ）ステージ５（４日間）ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭの種々のＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（１５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、１５日間処理した。
【０１７１】
ＲＮＡ試料をステージ６で回収し、リアルタイムＰＣＲで解析した。図１２は、本実施例にて概要を示したように分化し、空気−液体界面にて培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＡＢＣＣ８（図１２Ａ）、グルカゴン（図１２Ｂ）、アミリン（図１２Ｃ）、インスリン（図１２Ｄ）、ＮＧＮ３（図１２Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１２Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１２Ｇ）及びＰＤＸ１（図１２Ｈ）。０．４〜３ミクロンの範囲のフィルタ挿入物孔サイズは、空気−液体界面での、膵臓内胚葉又は内分泌マーカーの発現に有意に影響を与えなかった。
【０１７２】
（実施例８）
空気−液体界面での膵臓前腸前駆細胞の分化の、フィルタ挿入物上の液体−液体（Ｌ／Ｌ）界面との比較
本実施例は、フィルタ挿入物上の膵臓前腸前駆細胞の分化における、空気−液体界面での培養系の影響を、液体−液体界面での培養系に対して比較する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下で議論するプロトコールを用いて分化させた。
【０１７３】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、２日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コート０．４ミクロン孔細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。Ｌ／Ｌ条件のために、培地をまた、フィルタ挿入物の頂部上に加え、液体−液体界面をもたらした。培地を、研究の間毎日置換した。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭの種々のＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（１０日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、１０日間処理した。
【０１７４】
ＲＮＡ試料をステージ５及び６で回収し、リアルタイムＰＣＲで解析した。図１３は、実施例８にて概要を示したように分化し、空気−液体界面にて培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＡＢＣＣ８（図１３Ａ）、グルカゴン（図１３Ｂ）、アミリン（図１３Ｃ）、インスリン（図１３Ｄ）、ＮＧＮ３（図１３Ｅ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１３Ｇ）及びＰＤＸ１（図１３Ｈ）。最も劇的な差は、空気−液体界面と比較して、Ｌ／Ｌ条件における、グルカゴンの有意なアップレギュレーション（７倍）で見られた。
【０１７５】
（実施例９）
空気−液体界面で培養した膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞は、化合物のライブラリを選別するために使用可能である。
本実施例は、化合物のライブラリを選別するために、空気−液体界面培養液の利用を試験する。そうするために、胚性幹細胞を、以下で議論したプロトコールを用いて分化した。
【０１７６】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、２日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コート細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（１２日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、１２日間処理した。本ステージにて、表Ｖにて列記した化合物を選別して、内胚葉及び内分泌マーカーに影響を与える潜在的な化合物を同定した。
【０１７７】
【表５】
0006557146.tif 000008
【０１７８】
ＲＮＡ試料をステージ６で回収し、リアルタイムＰＣＲで解析した。図１４は、実施例９にて概要を示したように分化し、空気−液体界面にて培養したヒト胚性幹細胞Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＡＢＣＣ８（図１４Ａ）、グルカゴン（図１４Ｂ）、アミリン（図１４Ｃ）、インスリン（図１４Ｄ）、ＩＳＬ−１（図１４Ｅ）、ＭＮＸ１（図１４Ｆ）、ＮＫＸ６．１（図１４Ｇ）及びＳＬＣ３０Ａ８（図１４Ｈ）。本実施例は、スクリーニングツールとしての、空気−液体界面培養した細胞の可能性を示す。
【０１７９】
（実施例１０）
空気−液体界面で培養したステージ５及びステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイル
本実施例は、空気−液体界面でのステージ５及びステージ６培養液の組成を研究する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下に記述するプロトコールを用いて、ステージ５及びステージ６に分化させた。
【０１８０】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コート細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（１５日間）ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、５〜１５日間処理した。
【０１８１】
細胞をステージ５と、ステージ６の種々の時間点で回収し、ＦＡＣＳによって解析した。ＦＡＣＳ染色を、先に記述（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１６，２０１２）されたように、そして表ＶＩにて列記した抗体を使用して、実施した。図１５は、ステージ５回収した細胞のＦＡＣＳプロファイルを描写している。図１６は、空気−液体界面で培養した、ステージ６、５日のＦＡＣＳプロファイルを示す。最後に、図１７は、空気−液体界面で培養した細胞の、ステージ６、１５日のプロファイルを示す。図１５で示されるように、ステージ５において、インスリンとＮＫＸ６．１（〜１％）を共発現しているわずかな細胞と、ＰＤＸ１陽性細胞の有意な部分が、ＰＤＸ１とＫＩ−６７の共発現によって測定されるように、活性細胞周期中に存在した（〜２３％、ＫＩ−６７は、活性細胞周期中である細胞の指標である）。しかしながら、ステージ６、５日（図１６）まで、ＰＤＸ１＋細胞の増殖中、有意な降下が存在し（８％）、一方でクロモグラニン−Ａ（５１％、クロモグラニン−Ａは、パン内分泌マーカーである）又はインスリン（１４％）を共発現しているＮＫＸ６．１＋細胞の数の有意な増加があった。さらに、内分泌前駆マーカー、ＩＳＬ−１、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＫＸ２．２を発現している細胞における有意な増加が存在した。これは、ステージ６の固有の培養液が、増殖している前駆細胞運命から、早期成熟内分泌細胞への、細胞の急速な成熟化を許容したことを示す。さらに、インスリンとＮＸＫ６．１を共発現している細胞の割合の増加（３３％）が、ステージ６を１５日間に延長することによって観察された（図１７）。さらに、細胞周期中であるＰＤＸ１陽性細胞のパーセンテージ（１％）における更なる減少と、ＩＳＬ−１及びＮｅｕｒｏＤのパーセンテージにおける更なる増加が存在した。最後に、ホルモン陽性細胞の大部分が、単一ホルモンインスリン陽性細胞（３４％単一ホルモンインスリン陽性細胞、７％単一ホルモングルカゴン陽性細胞、及び８％ポリホルモン細胞）であった。ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａと、ＮＫＸ６．１を発現している（３０％）単一ホルモンインスリン陽性細胞の有意な共発現が、先に記述されていない細胞集団を強調する。
【０１８２】
【表６】
0006557146.tif 000009
【０１８３】
（実施例１１）
ＳＣＩＤマウスでのＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ＋インスリン＋細胞、ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ−インスリン−及びＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を共発現している膵臓前駆対ヒト膵島のインビボ成熟
本実施例は、分化細胞のインビトロ組成と、インビボ細胞性能における影響を強調する。特に、平面培養液上、実施例１に従って調製した５百万ステージ４、４日目（ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６．１＋）膵臓前腸前駆細胞、空気−液体界面で培養した、５百万ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ陰性細胞、及び空気−液体界面で、実施例１０に従って調製した、３百万ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−陽性細胞を、（Ｄｉｂｅｔｅｓ  ２０１２，６１（８）：２０１６−２９）にて記述されるように、非糖尿病ＳＣＩＤマウスの腎カプセル内に移植した。マウスを、時間の関数として、細胞の成熟状態の測定として、ヒトＣ−ペプチドを循環させることについて追跡した。さらに、別のマウスコホートにおいて、１５００〜４０００の死体ヒト膵島（ＰＲＯＤＯラボ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）等価物を、陽性対象として移植した。
【０１８４】
ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ陰性集団を以下のように調製した。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０；ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤；カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。次いでステージ３細胞を、１×  ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）で１〜３分間、室温にて処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞の懸濁液を、０．４ミクロン多孔性細胞フィルタ挿入物上、〜２×１０6細胞／１０μｌの密度で播いた。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
ｄ．ステージ４（２日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎＭ  Ｔ３（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、空気−液体界面にて２日間培養した。
ｅ．ステージ５（２日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤（ＳＤ２０８）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｆ．ステージ６（６日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で、６日間処理した。
【０１８５】
以下表ＶＩＩは、３つのヒト胚性幹細胞由来集団に対する、種々の膵臓内胚葉及び内分泌マーカーの発現レベルを強調する。特に、表ＶＩＩは、以下の結果を比較する。（１）実施例１に従って発生したステージ４、４日目集団（ステージ４、４日目）、（２）実施例１１に従って発生した内胚葉／内分泌前駆集団（膵臓内胚葉／内分泌）及び（３）実施例１０に従って発生したＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ＋インスリン＋集団（ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ＋インスリン＋）。それぞれに対するＦＡＣＳプロファイル情報を図１７〜１９に描写する。特に、図１７は、ＮＫＸ６．１＋クロモグラニン−Ａ＋集団のＦＡＣＳプロファイルを描写し、図１８は、ステージ４、４日目細胞のＦＡＣＳプロファイルを描写し、図１９は、実施例１１に従って発生した、ステージ６、６日目膵臓内分泌細胞のＦＡＣＳプロフィルを描写する。
【０１８６】
【表７】
0006557146.tif 000010
【０１８７】
実施後、マウスを、循環ヒトｃ−ペプチドの濃度に関して、周期的に試験した。循環ヒトＣ−ペプチドを、伏在静脈を介して血液を回収することによって試験した。血漿を、−２０℃にて保存し、後に、ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）によって、ヒトＣ−ペプチドを用いてアッセイした。結果を、図２０に図面として示す。
【０１８８】
図２０は、種々の用量のヒト膵島と比較して、３つのＥＳ由来集団からのＣ−ペプチド製造の速度論を示す。ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａ、及びＮＫＸ６．１とインスリンの実質的共発現を示している細胞の集団は、Ｃ−ペプチドの有意に早期の製造をもたらした。Ｃ−ペプチド製造のレベルは、１２週の時点で、およそ４０００ヒト膵島を移植することと同様であった。しかしながら、移植１６週後、ヒトＣ−ペプチドのレベルは、４０００ヒト膵島を移植することで見られたＣ−ペプチドの大きさのおよそ２倍であった。
【０１８９】
しかしながら、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現している前駆細胞、又は膵臓前駆細胞とポリホルモン細胞（クロモグラニン−Ａ＋ＮＫＸ６．１−）の混合集団が、４０００ヒト膵島と等価のレベルのＣ−ペプチドを分泌するために、有意により長い時間を要求した。
【０１９０】
（実施例１２）
ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸの補足が、空気−液体界面で培養したステージ６細胞の成熟マーカーをさらに増加させる。
本実施例は、ガンマセクレターゼ阻害剤のような、ＮＯＴＣＨ阻害剤が、ＮＫＸ６．１の発現を保持した一方で、β細胞の成熟マーカーをさらに増強することを強調する。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４２）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コート０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（１４日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、１４日間処理した。
【０１９１】
ステージ６にて、種々の用量（１００ｎＭ〜５０００ｎＭ）のガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ、＃５６５７８９）を試験した。ｍＲＮＡを、ステージ６、４日目及びステージ６、８日目に回収した。図２１は、膵臓前駆マーカーに沿って、鍵となるβ細胞成熟マーカーに対してのＰＣＲデータを描写する。図２１にて示すように、アミリン（パネル２１Ａ）、インスリン（パネル２１Ｂ）及びＭＡＦＡ（パネル２１Ｃ）のような成熟マーカーが有意にアップレギュレートされ、一方でＮＫＸ６．１（パネル２１Ｄ）発現は有意に影響を受けなかった。しかしながら、ＰＴＦ１ａ（パネル２１Ｅ）及びＳＯＸ９（パネル２１Ｆ）のような膵臓前駆マーカーが、有意にダウンレギュレートされた。
【０１９２】
（実施例１３）
ＡＬＫ５阻害剤の存在が、ＭＡＦＡのアップレギュレーションのために必須であり、Ｔ３のさらなる添加が、ＭＡＦＡ発現をさらに増強する。
本実施例は、ＭＡＦＡ発現をアップレギュレートする、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ添加の能力と、ＡＬＫ５阻害剤及びＬＤＮ−１９３１８９との、Ｔ３の添加が、ＭＡＦＡの発現をさらに増強することを強調する。
【０１９３】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４２）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００希釈）、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｌａｍｐｉｒｅ，ＰＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コーティングしたディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養液を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
ａ）ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＦ８を補足したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ）ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補足したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ）ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ  ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足したＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２日間処理した。
ｄ）ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎＭ  ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ  ＴＰＢを補足したＢＬＡＲ培地で、３日間処理し、次いでステージ４の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳでリンスし、１×  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温にて５分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、６−ウェルプレート中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）−コート０．４ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、０．５〜０．７５×１０6細胞（１０μｌ分液中）の密度で播種した。１．５ｍｌの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
ｅ）ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地中、空気−液体界面で、３日間培養した。
ｆ）ステージ６（８日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭグルコース、１×  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３１４９）、１０μＭ  ＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ，Ｚ０２５１）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ  Ｔ３、１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補足したＢＬＡＲ培地で、８日間処理した。
【０１９４】
ステージ６にて、ＡＬＫ５阻害剤、Ｔ３又はＬＤＮを、種々の組み合わせで取り除き、ＮＫＸ６．１、インスリン及びＭＡＦＡの発現における各因子の影響について試験した。ｍＲＮＡを、ステージ６、５日目及びステージ６、８日目で回収した。図２２は、膵臓前駆マーカーに沿って、鍵となるβ細胞成熟マーカーに対する、ＰＣＲデータを描写している。図２２にて示すように、ステージ６でのＡＬＫ５阻害剤の除去が、ＭＡＦＡの発現における劇的な下降をもたらした。一方、ＡＬＫ５阻害剤、ＬＤＮ−１８３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤）及びＴ３の組合せは、ＭＡＦＡ（図２２）、インスリン（図２２Ｂ）、アミリン（図２２Ｃ）の発現を有意に増強し、ＮＫＸ６．１（図２２Ｄ）の発現を穏やかに改善した。
【０１９５】
（実施例１４）
空気−液体界面でのステージ６細胞の培養のための追加プロトコール
本実施例は、空気−液体界面でステージ６細胞を培養する追加材料及び方法を開示する。
【０１９６】
使用した材料は以下を含む。Ｃｏｒｎｉｎｇからの１０ｃｍフィルタ挿入物（カタログ番号３４１９、０．４ミクロンポリカーボネート膜）、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）又はＢＬＡＲカスタム培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより製造）、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、Ｓｉｇｍａ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ−ＥＮＺＯ（カタログ番号−ＡＬＸ−２７−４４５）、ＬＤＮ−１９３１８９−ＳｔｅｍＧｅｎｔ（＃０４−００７４）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３１４９）及びＢＳＡ−脂肪酸−フリー（Ｐｒｏｌｉａｎｔ／Ｌａｍｐｉｒｅ，７５００８０４）。
【０１９７】
ステージ６基礎培地の調製：１．５グラム／リットルの重炭酸ナトリウムを、ＭＣＤＢ１３１培地＋２％  ＢＳＡ＋１：２００Ｘ  ＩＴＳ−Ｘ＋さらなる１５ｍＭグルコースに加えた。
【０１９８】
ステージ６分化培地の調製：ステージ６基礎培地に、１０マイクロモルＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９及び１マイクロモルＴ３を加えた。
【０１９９】
方法
７．５ｍｌのステージ６分化培地を、１０ｃｍフィルタ挿入物の底に加える。少量（２０〜３０μｌ）で細胞のクラスタを、フィルタ挿入物の頂部に加える。典型的に、およそ５０細胞クラスタを、１０ｃｍの挿入物辺りで配置する。播種にて、各細胞クラスタは、およそ０．５Ｍ細胞を含む。
【０２００】
培地は好ましくは、毎日変更する。細胞を、ワイドマウスピペットチップを用いることでのように、個々に細胞凝集体を除去することによって、フィルタ挿入物から取り除くか、全ての凝集体を、基礎培地でフィルタの頂部をリンスすることによって一辺に除去可能である。細胞凝集体は、挿入物に緩く接続させる。
【０２０１】
以上の実施形態において記述された特定の培地条件に加えて、多能性細胞、又はそれらの子孫を、膵臓内分泌細胞ヘ分化させるための他の好適な培養条件を、表ＶＩＩＩ〜ＸＩＩＩに列記する。これらの表で使用するところの、「ＡＬＫ５  ｉｎｈ．」は、ＡＬＫ５阻害剤であり、「ＲＡ」はレチノイン酸であり、「Ｖｉｔ．Ｃ」はアスコルビン酸であり、「ｉｎｈ．」は阻害剤であり、「ａｃｔ．」はアクチベータであり、ＺｎＳＯ4は硫酸亜鉛であり、「ＭＣＸ」はＭＣＸ化合物であり、「ＡＡ」はアクチビンＡである。特定の実施形態において、１つのステージ（例えばステージ４）での任意の１つの処理を、他のステージ（例えばステージ５）での任意の１つの処理と組み合わせて良い。
【０２０２】
【表８】
0006557146.tif 000011
【０２０３】
【表９】
0006557146.tif 000012
【０２０４】
【表１０】
0006557146.tif 000013
【０２０５】
本明細書の方法において使用するように、表Ｘにて引用された成分の例示範囲を以下に示す。
【０２０６】
【表１１】
0006557146.tif 000014
【０２０７】
以下で示した表ＸＩは、本発明の方法の実施形態での使用に好適な他の例示培養条件を示す。
【０２０８】
【表１２−１】
0006557146.tif 000015
【０２０９】
【表１２−２】
0006557146.tif 000016
【０２１０】
以下で示した表ＸＩＩは、本発明の方法の実施形態における使用に好適な他の例示培養条件を示す。
【０２１１】
【表１３】
0006557146.tif 000017
【０２１２】
以上で詳述したように、本発明は、とりわけ、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、またはＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、空気−液体界面で培養することと、を含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を形成する方法を提供する。１つの実施形態において、ステージ４〜ステージ６細胞のみを、空気−液体界面で培養する。ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性であってよい。従って、本発明はまた、（ａ）多能性幹細胞を培養することと、（ｂ）多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、（ｃ）Ｔ３／Ｔ４、又はＡＬＫ５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４とＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現している細胞に分化し、空気−液体界面で培養することと、を含む、多能性幹細胞から由来する細胞中で、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９発現を誘導する方法を提供する。さらに、得られたステージ６細胞は、単一ホルモン陽性細胞であってよい。１つの実施形態において、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａを共発現する。他の実施形態において、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１とインスリンを共発現する。
【０２１３】
特定の実施形態において、本方法には、ステージ５細胞を、Ｔ３／Ｔ４と、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩのようなＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で処理することが含まれる。これらの実施形態において、培地に有利に、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＳＡＮＴ−１又はＬＤＮ−１３９１８９の１つ又はそれ以上をさらに補足して良い。
【０２１４】
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
本発明は以下を提供する。
［１］
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
ｃ．ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した少なくとも１つの培地での処理によって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む方法。
［２］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、［１］に記載の方法。
［３］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａを共発現する、［１］に記載の方法。
［４］
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａを共発現する、［３］に記載の方法。
［５］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンを共発現する、［１］に記載の方法。
［６］
得られた細胞の少なくとも３０パーセントが、ＮＫＸ６．１とインスリンを共発現する、［５］に記載の方法。
［７］
平面培養液中、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることをさらに含む、［１］に記載の方法。
［８］
さらに、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前記膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む、［７］に記載の方法。
［９］
トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地での処理を含む、［１］に記載の方法。
［１０］
さらに、多孔性基質上で細胞を培養することを含む、［１］に記載の方法。
［１１］
前記多孔性基質はコーティングされていない、［１０］に記載の方法。
［１２］
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［１３］
前記ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、［１２］に記載の方法。
［１４］
さらに、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地で、膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を処理することを含む、［１］に記載の方法。
［１５］
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンであり、前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＳＡＮＴ−１又はＬＤＮ−１９３１８９の１つ又はそれ以上が補足される、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記方法が、膵臓ホルモンの発現を増加させる、［１］に記載の方法。
［１８］
前記方法が、ＰＴＦ１ａ、ＳＯＸ９、ＣＤＸ２、ＺＩＣ１及びＳＯＸ２の発現を減少させる、［１６］に記載の方法。
［１９］
前記方法が、インスリン、クロモグラニン−Ａ又はクロモグラニン−とインスリン両方を共発現する、ＮＸＫ６．１陽性細胞の数を増加させる、［１］に記載の方法。
［２０］
前記多能性幹細胞が、非胚性起源のものである、［１］に記載の方法。
［２１］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、β細胞に特徴的なマーカーを発現している、［１］に記載の方法。
［２２］
［１］に記載の方法によって得た膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を哺乳動物に移植することを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞のインビボ成熟化の方法。
［２３］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを共発現する、［２２］に記載の方法。
［２４］
前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、［２２］に記載の方法。
［２５］
空気−液体界面で培養する一方で、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した少なくとも１つの培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法。
［２６］
膵臓前腸前駆細胞、膵臓内胚葉細胞及び膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞のみを、空気−液体界面にて培養する、［２５］に記載の方法。
［２７］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、［２５］に記載の方法。
［２８］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、単一ホルモン陽性細胞である、［２５］に記載の方法。
［２９］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａとを共発現する、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、［２８］に記載の方法。
［３１］
さらに、多孔性基質上で細胞を培養することを含む、［２５］に記載の方法。
［３２］
前記細胞が、シート内であるか、又は前記多孔性基質の頂部上の凝集体クラスタである、［３１］に記載の方法。
［３３］
ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地で、膵臓内胚葉／膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を処理することを含む、［２５］に記載の方法。
［３４］
前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンであり、前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、［３３］に記載の方法。
［３５］
前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＳＡＮＴ−１又はＬＤＮ−１９３１８９の１つ又はそれ以上を補足する、［３４］に記載の方法。
［３６］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現する、［２５］に記載の方法。
［３７］
［２５］に記載の方法によって得た、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、哺乳動物に移植することを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞のインビボ成熟化の方法。
［３８］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とクロモグラニン−Ａを共発現する、［３７］に記載の方法。
［３９］
前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを共発現する、［３７］に記載の方法。
［４０］
多能性幹細胞から由来する細胞中で、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９発現とを誘導する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．前記多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
ｃ．ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前記膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む方法。
［４１］
前記多能性幹細胞が、非胚性起源のものである、［４０］に記載の方法。
［４２］
さらに、空気−液体界面にて、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤とを補足した培地中で、膵臓内胚葉細胞又は膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することを含む、［４０］に記載の方法。
［４３］
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、［４２］に記載の方法。
［４４］
前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＳＡＮＴ−１又はＬＤＮ−１９３１８９の１つ又はそれ以上が補足される、［４０］に記載の方法。
［４５］
空気−液体界面にて、細胞を分化するためのインビトロ細胞培養系であって、
ａ．培養容器と、
ｂ．前記容器の容量の一部のみをみたすのに十分な容量の前記容器内の分化溶媒と、
ｃ．前記培地を隣接している前記容器の一部をみたす前記容器内の空気と、
ｄ．前記培地と前記空気間の界面に位置する多孔性基質と、
ｅ．前記培地が前記細胞の表面の一部のみに接触するように、前記基質の表面上に析出した多能性幹細胞から由来する細胞と、を含む、インビトロ細胞培養系。
［４６］
前記多能性幹細胞から由来した細胞が、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現する、［４５］に記載の細胞培養系。
［４７］
前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現する、［４５］に記載の細胞培養系。
［４８］
前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現する、［４５］に記載の細胞培養系。
［４９］
前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現する、［４５］に記載の細胞培養系。
［５０］
前記分化培地が、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した増殖培地を含む、［４５］に記載の細胞培養系。
［５１］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１及びＢＬＡＲ培地から選択される、［５０］に記載の細胞培養系。
［５２］
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、［５１］に記載の細胞培養系。
［５３］
前記増殖培地に、トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補足される、［５２］に記載の細胞培養系。
［５４］
前記分化培地が、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びこれらの混合物から選択される増殖因子、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータ、及びＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤を補足した増殖培地を含む、［４６］に記載の細胞培養系。
［５５］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１及びＢＬＡＲ培地から選択される、［５４］に記載の細胞培養系。
［５６］
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、［５５］に記載の細胞培養系。
［５７］
前記増殖培地に、ＦＧＦ７、ＴＰＢ及びＬＤＮ−１９３１８９を補足する、［５６］に記載の細胞培養系。
［５８］
前記分化培地が、ＡＬＫ５阻害剤と、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎからなる群から選択されるＢＭＰ阻害剤と、を補足した増殖培地を含む、［４７］に記載の細胞培養系。
［５９］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１及びＢＬＡＲ培地から選択される、［５８］に記載の細胞培養系。
［６０］
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、［５９］に記載の細胞培養系。
［６１］
前記増殖培地に、ＬＤＮ−１９３１８９とＡＬＫ５阻害剤ＩＩとが補足される、［６０］に記載の細胞培養系。
［６２］
前記分化培地が、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した増殖培地を含む、［４８］に記載の細胞培養系。
［６３］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１及びＢＬＡＲ培地から選択される、［６２］に記載の細胞培養系。
［６４］
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、［６３］に記載の細胞培養系。
［６５］
前記増殖培地に、トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩと、が補足される、［６４］に記載の細胞培養系。
［６６］
前記分化培地が、ＡＬＫ５阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した、増殖培地を含む、［４９］に記載の細胞培養系。
［６７］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１とＢＬＡＲ培地から選択される、［６６］に記載の細胞培養系。
［６８］
前記増殖培地が、ＢＬＡＲ培地である、［６７］に記載の細胞培養系。
［６９］
前記増殖培地に、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補足される、［６８］に記載の細胞培養系。
［７０］
前記増殖培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足される、［５３］に記載の細胞培養系。
［７１］
前記培地に、さらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足される、［６１］に記載の細胞培養系。
［７２］
前記培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足される、［６５］に記載の細胞培養系。
［７３］
前記培地にさらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、の１つ又はそれ以上が補足される、［６９］に記載の細胞培養系。
［７４］
前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、及びＳＡＮＴ−１が補足される、［７０］に記載の細胞培養系。
［７５］
前記培地にさらに、レチノイン酸、ヘパリン、ＳＡＮＴ−１、及び硫酸亜鉛が補足される、［７１］に記載の細胞培養系。
［７６］
前記培地にさらに、ＬＤＮ−１９３１８９、レチノイン酸、アスコルビン酸、及びＳＡＮＴ−１が補足される、［７２］に記載の細胞培養系。
［７７］
前記培地にさらに、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＡＮＴ−１及びヘパリンが補足される、［７３］に記載の細胞培養系。
［７８］
得られた細胞の少なくとも約３０パーセントが、ＮＫＸ６．１及びインスリンを発現する、［７３］に記載の細胞培養系。
［７９］
得られた細胞の少なくとも約３０パーセントが、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａを発現する、［７３］に記載の細胞培養系。
［８０］
ａ．ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤と、
ｂ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、を補足した増殖培地を含む、多能性幹細胞から由来した細胞中、分化を誘導するために有用である培地。
［８１］
さらに、ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択される、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストを含む、［８０］に記載の培地。
［８２］
さらに、レチノイン酸を含む、［８１］に記載の培地。
［８３］
ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＳＡＮＴ−１、ＬＤＮ−１９３１８９及びレチノイン酸を含む、［８２］に記載の培地。
［８４］
さらに、
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
ｂ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモンと、
ｃ．アスコルビン酸と、
ｄ．ヘパリンと、
ｅ．硫酸亜鉛と、から選択される１つ又はそれ以上の補助剤を含む、［８３］に記載の培地。
［８５］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ−１３１とＢＬＡＲ培地とから選択される、［８３］に記載の分化培地。
［８６］
前記増殖培地に、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＳＡＮＴ−１、ＬＤＮ−１９３１８９、ヘパリン、硫酸亜鉛及びレチノイン酸が補足される、［８４］に記載の分化培地。
［８７］
ａ．ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤と、
ｂ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモンと、
ｃ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストと、を補足した増殖培地を含む、多能性幹細胞から由来した細胞中で、分化を誘導するために有用な培地。
［８８］
さらに、レチノイン酸を含む、［８７］に記載の培地。
［８９］
さらに、アスコルビン酸を含む、［８８］に記載の培地。
［９０］
さらに、
ａ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｂ．ヘパリンと、
ｃ．硫酸亜鉛と、から選択される１つ又はそれ以上の補助剤を含む、［８７］に記載の培地。
［９１］
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ−１３１とＢＬＡＲ培地とから選択される、［９０］に記載の分化培地。
［９２］
前記増殖培地に、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＬＤＮ−１９３１８９、硫酸亜鉛、トリヨードチロニン、ＳＡＮＴ−１及びヘパリンが補足される、［９１］に記載の分化培地。
［９３］
少なくとも３０パーセントの前記分化細胞が、ＮＫＸ６．１とインスリンとを発現する、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現する分化多能性幹細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養系。
［９４］
少なくとも３０パーセントの前記分化細胞が、ＮＫＸ６．１とクロマグラニンとを発現する、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現する分化多能性幹細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養系。
［９５］
試験化合物の存在下、［１］に記載の方法に従った細胞を培養することと、膵臓ホルモンの産出における前記試験化合物の効果を測定することと、を含む、膵臓ホルモン産出における効果に対して、化合物を選別する方法。
［９６］
前記膵臓ホルモンがインスリンである、［９５］に記載の選別方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
0006557146.tif 000024
【図１Ｈ】
0006557146.tif 000025
【図２Ａ】
0006557146.tif 000026
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006557146.tif 000029
【図２Ｅ】
0006557146.tif 000030
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
0006557146.tif 000033
【図２Ｉ】
0006557146.tif 000034
【図２Ｊ】
0006557146.tif 000035
【図２Ｋ】
0006557146.tif 000036
【図３Ａ】
0006557146.tif 000037
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
0006557146.tif 000052
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
0006557146.tif 000059
【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
0006557146.tif 000063
【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
0006557146.tif 000065
【図５Ｒ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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