(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、PSA-NCAM、CD24、リカバリン、Sox2、およびPax6を有し、
約10ng/mlから約20ng/mlのEGF、及び、約10ng/mlから約20ng/mlのbFGFで、３％酸素条件で少なくとも６時間培養された、ヒト胎児網膜前駆細胞の、実質的に均一な精製された集団。
【請求項２】
網膜前駆細胞が、(i) 同定可能な陽性マーカーとしてネスチン及びKi-67を含み、及び/または、(ii) 陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD133を欠いている、請求項1に記載の精製された細胞集団。
【請求項３】
網膜前駆細胞が、陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38を欠いている、請求項1または2に記載の精製された細胞集団。
【請求項４】
少なくとも約50％の網膜前駆細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の精製された細胞集団。
【請求項５】
少なくとも約80％の網膜前駆細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の精製された細胞集団。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団および担体を含む、組成物。
【請求項７】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
ヒト胎児眼の神経網膜由来の細胞の混合集団においてヒト胎児網膜前駆細胞を同定する方法であって、陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、リカバリン、Sox2、およびPax6およびPSA-NCAMを有し、かつ、ネスチン及びKi-67を有していてもよい、細胞について該混合細胞集団をスクリーニングする段階を含み、かつ、該ヒト胎児網膜前駆細胞が、約10ng/mlから約20ng/mlのEGF、及び、約10ng/mlから約20ng/mlのbFGFで、３％酸素条件で少なくとも６時間培養されたものである、前記方法。
【請求項９】
単離または精製されたヒト網膜前駆細胞を提供するために、混合集団からヒト網膜前駆細胞を単離または精製する段階をさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD133の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
混合細胞集団が、少なくとも1種のヒト組織源から取得される、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組織源がヒト胎児網膜組織である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
スクリーニングする段階が、フローサイトメトリーを用いる細胞選別を含む、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
スクリーニングする段階が、蛍光活性化細胞選別と陽性細胞表面マーカーを認識して結合する抗体とを用いる細胞選別を含む、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法により調製されるかまたは取得可能な、精製または単離された細胞。
【請求項１７】
請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法により調製される、ヒト胎児網膜前駆細胞の実質的に精製された集団。
【請求項１８】
請求項16に記載の精製もしくは単離された細胞または請求項17に記載の集団と担体とを含む、組成物。
【請求項１９】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
精製されたヒト胎児網膜前駆細胞集団を調製する方法であって、
同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、リカバリン、Sox2、Pax6およびPSA-NCAMを用いて、かつ、CD24を用いてもよく、かつ、ネスチン及びKI-67を用いてもよく、陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD133を欠いていてもよい、
ヒト網膜前駆細胞を含有するヒト胎児眼由来の単離された細胞試料から取得されたヒト網膜前駆細胞を選別する段階、ならびに
該分離されたヒト網膜前駆細胞を回収して、精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する段階
を含み、ここで該単離された細胞試料が、約10ng/mlから約20ng/mlのEGF、及び、約10ng/mlから約20ng/mlのbFGFで、３％酸素条件で少なくとも６時間培養されたものである、前記方法。
【請求項２１】
細胞を選別する段階の前に、単離された細胞試料から不純物および混入物を除去する段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
患者において光受容細胞を置換または修復するための医薬の製造における、請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項6、7、18、もしくは19に記載の組成物の使用であって、該患者が、有効量の該集団または該組成物の該患者への投与を含む、光受容細胞の置換または修復の処置を必要とする、前記使用。
【請求項２３】
患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和するための医薬の製造における、請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項6、7、18、もしくは19に記載の組成物の使用であって、該患者が、有効量の該集団または該組成物の該患者への投与を含む、網膜色素変性症の症候の処置または緩和の処置を必要とする、前記使用。
【請求項２４】
患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和するための医薬の製造における、請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項6、7、18、もしくは19に記載の組成物の1つもしくは複数の細胞集団の使用であって、該患者が、有効量の該細胞集団の該患者への投与を含む、加齢性黄斑変性症の症候の処置または緩和の処置を必要とする、前記使用。
【請求項２５】
1つまたは複数の請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項6、7、18、もしくは19に記載の組成物と、使用説明書とを含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載の使用において使用するためのキット。
【請求項２６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項6、7、18、もしくは19に記載の組成物の単離のための説明書と、使用説明書と、任意で、適当な組織源から細胞または細胞の集団を単離または精製するための試薬とを含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載の使用において使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
外傷、年齢、または疾患のいずれかの結果としてのヒト網膜の変性は、永久的な視力喪失を結果として生じ得、世界中の何百万人もの人々がこれに冒されている可能性がある。変性状態は、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、および糖尿病性網膜症を含む。これらの状態は、網膜の、光を感知する光受容細胞の進行性の死を特徴とし、西欧諸国における不治の盲目の主要な原因である。ヒト網膜の内因性再生能力は極度に限定されたものであるため、光受容細胞の喪失を患う人々にとっての唯一の有望な処置選択肢は、細胞の置換である。
【０００２】
いくつかの細胞型が、網膜変性障害のための細胞治療ツールとして示唆されている。そのような細胞型は、ヒト網膜前駆細胞（hRPC）、網膜色素上皮細胞、グリア前駆体、神経幹細胞、骨髄および臍帯血由来の細胞を含む。多分化能幹細胞（様々に、前駆細胞、未熟細胞、先駆細胞、未分化細胞、または増殖細胞とも呼ばれる）が、移植および分化についての活発な焦点となっている。
【０００３】
ヒト網膜前駆細胞は、変性または罹患した網膜宿主中への移植のためなどの臨床応用における使用について、大きな潜在能力を有する。そのような細胞は、典型的に、混入を排除するために毛様体辺縁帯および視神経を除去することにより、出生前および出生後の組織中の胎児網膜から単離される。例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,514,259号（特許文献1）を参照されたい。これらの細胞は、インビトロで拡大することができ、かつ、網膜中へ遊走し、新たな機能する光受容体を形成して網膜を再生することができる。
【０００４】
移植のためなどの臨床応用における製剤（drug product）としての生細胞の使用には、宿主集団の拡大の間およびヒトレシピエントにおける細胞の注射の前に、細胞集団の包括的な特徴決定が必要とされる。そのような特徴決定は、典型的に、細胞の表面上に発現される特異的マーカーの同定により達成される。特異的マーカー、すなわち特定の細胞株に特有のマーカーの同定はまた、宿主集団の濃縮または枯渇のためにも有用である。
【０００５】
様々な細胞型に特有の特異的マーカーを同定するための種々の試みが、これまでなされてきている。このように特徴決定に成功し、同定されている細胞集団は、造血幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、およびグリア前駆細胞を含む。
【０００６】
Carter et al., BMC Ophthalmology, 9:1, 2009（非特許文献1）は、成人網膜細胞を精製するためのマーカーCD133の使用を記載している。網膜細胞懸濁液は、成人の死後組織に由来し、自動磁気細胞選別で濃縮された。約95％の細胞精製が実証された。
【０００７】
米国特許第6,468,794号（特許文献2）は、細胞表面マーカーに結合するモノクローナル抗体を用いた、神経幹細胞および前駆細胞集団の濃縮を記載している。米国特許第7,015,037号（特許文献3）は、マーカーCD44、CD45、HLAクラスIおよびHLAクラスIIについて表面が陰性である、単離された多分化能幹細胞を記載している。また、米国特許第6,908,763号（特許文献4）、米国特許第7,749,754号（特許文献5）、および米国特許第7,781,179号（特許文献6）も参照されたく、これらのそれぞれの開示のすべては、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００８】
Yuan et al., Plos One, 6(3), e17540, March 2011（非特許文献2）は、多能性幹細胞に由来する神経幹細胞、グリア、およびニューロンの高純度の集団を生成する、改善された分化および濃縮の手順を記載している。細胞表面の特性またはマーカーが細胞について同定され、蛍光活性化細胞選別による、不均一に分化している細胞集団からの細胞の単離を可能にする。特に、参照文献は、神経幹細胞の集団が、蛍光活性化細胞選別（FACS）ならびに以下のマーカー：CD184＋、CD271−、CD44−、およびCD24＋を使用することにより単離に成功していることを述べている。本刊行物の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００９】
細胞特異的マーカーを用いて様々な型の幹細胞を特徴決定する種々の試みにもかかわらず、ヒト網膜前駆細胞に特異的な表面マーカーは同定されていない。そのようなマーカーの同定の成功は、細胞集団の濃縮、培養物からのグリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞などのより望ましくない細胞の排除、ならびに、関心対象のマーカーを高発現する網膜前駆細胞の最終的な選択を可能にすることにより、この技術を進歩させるであろう。高度に精製された細胞集団は、次に、2011年6月14日に出願された米国特許出願第13/160,002号（特許文献7）に記載されているものなどの技術を用いて培養することができ、網膜の変性疾患の処置のためにヒトの移植において使用され得る細胞の由来をたどることを目的とする細胞バンクへと製造することができる。細胞表面マーカーは、患者に送達される細胞製品の特徴決定を可能にし、細胞製品の品質を定義するための政府規制官庁による基準値を部分的に満たすマーカーを表すことができる。
【００１０】
前述の、ならびに臨床的な評価および使用のためのヒト網膜前駆細胞の重要性を考慮して、移植および疾患処置のためにヒト網膜前駆細胞の特徴決定、同定、および精製を改善する必要性が存在することが、容易に認識される。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の説明から明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第7,514,259号
【特許文献２】米国特許第6,468,794号
【特許文献３】米国特許第7,015,037号
【特許文献４】米国特許第6,908,763号
【特許文献５】米国特許第7,749,754号
【特許文献６】米国特許第7,781,179号
【特許文献７】米国特許出願第13/160,002号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Carter et al., BMC Ophthalmology, 9:1, 2009
【非特許文献２】Yuan et al., Plos One, 6(3), e17540, March 2011
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、精製されたヒト網膜前駆細胞および／またはヒト網膜前駆細胞の実質的に均一な集団、ならびに、該細胞および／または実質的に均一な細胞集団を取得するための方法に向けられる。本発明のヒト網膜前駆細胞は、細胞表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMの各々の存在を独自に特徴とする。さらなる局面において、細胞は、リカバリン、Sox2、およびPax6の発現を特徴とする。細胞および／または集団を含有する組成物が、本明細書においてさらに開示される。
【００１４】
1つの局面において、本発明のヒト網膜前駆細胞は、表面マーカーであるCD15、CD133、A2B5、およびCD38を欠いていることをさらに特徴とする（当技術分野においてCD15−、CD133−、A2B5−、およびCD38−とも同定される）。CD15およびCD133は、神経幹細胞表面マーカーである。A2B5およびCD38は、グリア前駆細胞表面マーカーである。さらなる局面において、本発明の精製された細胞集団は、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、最も好ましくは少なくとも約80％の、表示された細胞表面マーカーで特異的に同定されたヒト網膜前駆細胞を含む。細胞および／または集団を含有する組成物が、本明細書においてさらに開示される。
【００１５】
本発明の方法は、当業者に公知である方法を用いる、ヒト組織から単離された細胞試料を取得する段階、ならびに、上記で同定されたマーカーの使用により前駆細胞を同定した後に単離または精製する段階を含む。1つの局面において、方法は、細胞試料中に通常存在する種々の不純物および混入物を除去する段階、上記で同定された表面マーカーを有するヒト前駆細胞を分離および精製するように細胞を選別する段階、ならびに臨床的または実験的使用のために精製された細胞を回収する段階を含むか、または、代替的にそれらから本質的になるか、さらにまたは、さらにそれらからなる。その開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に出願された米国特許出願第13/160,002号に記載されているように、細胞をその後、組織培養内に入れて成長させ、治療のために実質的な細胞数を生成させることができる。本発明の実施において使用され得る細胞選別技術は、一般的に公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含み、具体的には、細胞表面マーカーを認識して結合する抗体およびその断片を用いる蛍光活性化細胞選別を含む。
【００１６】
本発明の方法は、骨髄、臍帯血、ヒト胚性幹細胞またはその分化した後代、ヒト人工多能性幹細胞またはその分化した後代などの様々なヒト組織源からの、網膜前駆細胞の選択を可能にするが、好ましい組織源は、ヒト成体または胎児の網膜組織である。
【００１７】
本発明のヒト網膜前駆細胞は、罹患した眼中への移植による網膜疾患の処置のためなどの種々の治療用途を有し、該細胞は、宿主患者またはレシピエントにとって自己由来または同種異系であることができる。本発明の細胞はまた、適切なアッセイフォーマットにおいて細胞を薬学的作用物質と接触させることにより、インビトロでの薬物発見および毒性試験のためにも使用することができる。網膜前駆細胞は光受容細胞へ分化することができるので、患者において光受容組織を置換または修復するために、ならびに、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、および糖尿病性網膜症などの眼の変性疾患の処置のために、有用である。従って、本開示はまた、上記で同定された細胞または細胞の集団を、細胞の光受容細胞への分化を誘導または支持するための適切な条件下で培養する段階により、光受容細胞の精製された培養物を調製するための方法も提供する。次に種々の作用物質を、ある場合は細胞の生存率、特徴、または分化に対する効果を判定するために、細胞と（細胞または集団の分化中に1回または複数回）接触させることができる。
【００１８】
本発明の前述の態様および局面は、単なる例証であり、特許請求される本発明の精神および範囲を制限することを意味するものではない。
[本発明1001]
同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAM、CD24を有するヒト網膜前駆細胞の、実質的に均一な、精製された集団。
[本発明1002]
網膜前駆細胞が、リカバリン、Sox2、およびPax6を、同定可能な陽性マーカーとして含む、本発明1001の精製された細胞集団。
[本発明1003]
網膜前駆細胞が、陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133を欠いている、本発明1001または1002の精製された細胞集団。
[本発明1004]
網膜前駆細胞が、陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38を欠いている、本発明1001〜1003のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1005]
少なくとも約50％の網膜前駆細胞を含む、前記本発明のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1006]
少なくとも約80％の網膜前駆細胞を含む、本発明1001〜1004のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1007]
前記本発明のいずれかの集団および担体を含む、組成物。
[本発明1008]
担体が薬学的に許容される担体である、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
細胞の混合集団においてヒト網膜前駆細胞を同定する方法であって、陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを有する細胞について該混合細胞集団をスクリーニングする段階を含む、前記方法。
[本発明1010]
単離または精製されたヒト網膜前駆細胞を提供するために、混合集団からヒト網膜前駆細胞を単離または精製する段階をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、本発明1009〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
混合細胞集団が、少なくとも1種のヒト組織源から取得される、本発明1009〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
組織源がヒト網膜組織である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
組織源が、ヒト骨髄、または、胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞の多能性細胞、または臍帯血細胞である、本発明1009〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
スクリーニングする段階が、フローサイトメトリーを用いる細胞選別を含む、本発明1009〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
スクリーニングする段階が、蛍光活性化細胞選別と陽性細胞表面マーカーを認識して結合する抗体とを用いる細胞選別を含む、本発明1009〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
本発明1010〜1017のいずれかの方法により調製されるかまたは取得可能な、精製された細胞。
[本発明1019]
本発明1010〜1017のいずれかの方法により調製される、ヒト網膜前駆細胞の実質的に精製された集団。
[本発明1020]
本発明1018の精製もしくは単離された細胞または本発明1019の集団と担体とを含む、組成物。
[本発明1021]
担体が薬学的に許容される担体である、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する方法であって、同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを用いて、ヒト網膜前駆細胞を含有するヒト組織源由来の単離された細胞試料から取得されたヒト網膜前駆細胞を選別する段階、ならびに
該分離されたヒト網膜前駆細胞を回収して、精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する段階
を含む、前記方法。
[本発明1023]
細胞を選別する段階の前に、単離された細胞試料から不純物および混入物を除去する段階をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
そのような処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または修復するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において光受容細胞を置換または修復する段階を含む、前記方法。
[本発明1025]
網膜色素変性症の症候の処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、前記方法。
[本発明1026]
加齢性黄斑変性症の症候の処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団の細胞集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、方法。
[本発明1027]
1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、または1021の組成物と、使用説明書とを含む、本発明1024〜1026のいずれかの方法における使用のためのキット。
[本発明1028]
本発明1001〜1005のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、または1021の組成物の単離のための説明書と、使用説明書と、任意で、適当な組織源から細胞または細胞の集団を単離または精製するための試薬とを含む、本発明1024〜1026のいずれかの方法における使用のためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の前述のおよび他の利点および特徴は、添付の図および図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、明白になる。
【図１】ヒト網膜前駆細胞のフローサイトメトリー解析に基づいて、表示された幹細胞性／眼領域マーカーの発現を示す棒グラフである。
【図２】ヒト網膜前駆細胞のフローサイトメトリー解析に基づいて、表示された増殖／細胞周期マーカーの発現を示す棒グラフである。
【図３】ヒト網膜前駆細胞のフローサイトメトリー解析に基づいて、表示された神経／グリアマーカーの発現を示す棒グラフである。
【図４】ヒト網膜前駆細胞の免疫細胞化学解析に基づいて、表示された幹細胞性／眼領域マーカーの発現を示す棒グラフである。
【図５】ヒト網膜前駆細胞の免疫細胞化学解析に基づいて、表示された増殖／細胞周期マーカーの発現を示す棒グラフである。
【図６】ヒト網膜前駆細胞の免疫細胞化学解析に基づいて、表示された神経／グリアマーカーの発現を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
態様の詳細な説明
別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料が次に記載される。本明細書において引用されるすべての技術刊行物および特許刊行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【００２１】
本発明の実施は、別の方法で示されない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えDNA、フローサイトメトリー、ならびに細胞選別の従来の技術を使用し、それらは当技術分野の技能内である。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyのシリーズ；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)のシリーズ；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第4,683,195号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；およびHerzenberg et al., eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。また、Yuan et al., Plos One, 6(3), el7540, March 2011も参照されたい。
【００２２】
範囲を含む、すべての数字表示、例えば、pH、温度、時間、濃度、および分子量は適切に、1.0または0.1の増分で（＋）または（−）に変動する近似値である。常に明確に述べられるわけではないが、すべての数字表示は、「約」という用語が前に付くように理解されるべきである。常に明確に述べられるわけではないが、本明細書において記載される試薬は単に例示的であること、およびその同等物が当技術分野において公知であることもまた、理解されるべきである。
【００２３】
当業者により理解されるように、任意のおよびすべての目的に関して、特に書面による説明を提供する点において、本明細書で開示されるすべての範囲はまた、任意のおよびすべての可能な部分範囲、ならびにその部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一などに分解されることを十分に記載しかつ可能にするように、容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書において議論される各範囲は、下部の三分の一、中央の三分の一、および上部の三分の一などに容易に分解することができる。当業者によりまた理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのような言語のすべては、列挙された数を含み、かつ、上記で議論された部分範囲へと次に分解することができる範囲を指す。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形である「ある」、「1つの」、および「その」は、文脈が明らかに他の方法で示さない限り、複数の言及を含む。例えば、「薬学的に許容される担体」という用語は、その混合物を含む、複数の薬学的に許容される担体を含む。
【００２５】
本明細書において使用される際、「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するように、意図される。組成物および方法を定義するために使用される際の「から本質的になる」とは、意図される用途のための組み合わせにとって本質的に重要である任意の他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、単離法および精製法由来の極微量の混入物、ならびに、リン酸緩衝食塩水、保存料などのような薬学的に許容される担体を排除しないものとする。「からなる」とは、他の構成成分の極微量より多い要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法段階を排除することを意味するものとする。これらの移行性の用語の各々により定義される態様は、本発明の範囲内である。
【００２６】
本発明の「宿主」または「患者」とは、哺乳動物などの動物、またはヒトである。診断または処置に供される非ヒト動物は処置を必要とするものであり、例えば、サル、ラット、マウスなどのネズミ科の動物、イヌなどのイヌ科の動物、ウサギなどのウサギ科の動物、家畜、スポーツの動物、およびペットなどである。
【００２７】
「精製された」または「単離された」という用語は、天然においてその中に細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が通常付随している、細胞性のおよび別の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、例えば染色体上で、その自然または天然の環境において通常関連している3'および5'の隣接したヌクレオチドから分離されている。精製または単離された細胞とは、それが天然では通常関連している組織から分離されている。単離または精製された細胞とは、類似していない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者に明白であるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物から識別するための「単離」を必要としない。
【００２８】
本明細書において使用される際、「幹細胞」とは、培養中に不定期間分裂することができ、かつ分化した細胞を生じることができる、細胞を定義する。現在のところ、幹細胞は便宜上、体性（成体）または胚性に分類される。体性幹細胞とは、分化した組織中に見出される未分化細胞であり、これは、（クローン的に）自分自身を複製することができ、かつ（一定の限界の下で）分化して、その起源である組織の特殊化した細胞型すべてをもたらすことができる。胚性幹細胞は、多種多様の特殊化した細胞型になる潜在能力（多能性）を有する、胚由来の原始（未分化）細胞である。近年、線維芽細胞などの完全に分化した成体細胞を含む体細胞を、以下の因子：Oct-3/4、SOX2、c-Myc、Nanog、およびKlf4のいくつかまたは全ての導入によって、多能性様の胚性幹細胞とすることができる。これらの細胞は人工多能性幹細胞（IPSC）と呼ばれる。胚性幹細胞または人工多能性幹細胞とは、数か月間から数年間、分化せずに増殖することを可能にするインビトロ条件下で培養されている細胞である。多能性幹細胞は、Oct-4、アルカリホスファターゼ、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、SSEA1、SSEA3、およびSSEA4を含むがこれらに限定されない適切なマーカーの使用により、他の型の細胞から識別することができる。
【００２９】
「幹細胞」という用語はまた、「脱分化した」幹細胞を含み、その例は、直接幹細胞に変換された、すなわちリプログラミングされた体性細胞である。クローンとは、起源となる細胞と遺伝学的に同一である細胞の系統であり、この場合は幹細胞である。
【００３０】
「増殖させる」という用語は、細胞の表現型もしくは細胞の集団を成長させることまたは変更することを意味する。「成長させること」または「拡大すること」という用語は、支持培地、栄養素、成長因子、支持細胞、または望ましい数の細胞または細胞型を取得するために必要な任意の化学的もしくは生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を指す。1つの態様において、細胞を成長させる段階は、組織の再生を結果として生じる。また別の態様において、組織は心筋細胞から構成される。
【００３１】
「培養すること」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のインビトロ増殖を指す。培養において成長した細胞の子孫は、親細胞と完全に（すなわち、形態学的に、遺伝学的に、または表現型的に）同一でなくてもよいことが理解される。「拡大された」とは、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【００３２】
「クローン的な増殖」または「クローン的な拡大」とは、単一細胞が2つの同一の娘細胞および／または同一細胞の集団へと連続的に分裂することによる、細胞の集団の成長を指す。
【００３３】
本明細書において使用される際、細胞の「系統」とは、細胞の遺伝、すなわち、その先代および後代を定義する。細胞の系統により、細胞は、代々の発生および分化の体系内に位置づけられる。
【００３４】
「分化」とは、特殊化していない細胞が、それにより心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特性を獲得する過程を説明するものである。「定方向分化」とは、分化を特定の細胞型または表現型に誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化」とは、細胞の系統内でそれほど専門化していない位置に逆戻りする細胞を定義するものである。本明細書において使用される際、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系統内でより専門化した（「分化した」）位置を呈する細胞を定義する。
【００３５】
本明細書において使用される際、「抗体」とは、抗体全体およびその任意の抗原結合断片または一本鎖を含む。従って、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのようなものの例は、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（CDR）またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（FR）領域、もしくはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部を含むがこれらに限定されず、そのいずれも、本発明の抗体中に組み入れられ得る。
【００３６】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、任意の適当な生物学的供給源、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、およびイヌ科動物から単離することができる。
【００３７】
「抗体」という用語はさらに、モノクローナル抗体、その消化断片、特定部分、誘導体、および変異体を包含することが意図され、これは、抗体模倣物を含むか、または、抗体またはその特定断片もしくは部分の構造および／または機能を模倣する抗体の一部を含み、これは、一本鎖抗体およびその断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例は、VL、VH、CL、およびCHドメインからなる1価の断片であるFab断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2個のFab断片を含む2価の断片であるF(ab')2断片；VHおよびCHドメインからなるFd断片；抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、VHドメインからなるdAb断片（Ward et al. (1989) Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（CDR）を含む。さらに、Fv断片の2個のドメインであるVLおよびVHは、別々の遺伝子によりコードされるが、組み換え法を用いて、VLおよびVH領域が対になって1価の分子を形成する一本のタンパク質鎖（一本鎖Fv（scFv）として公知である）として作られることを可能にする合成リンカーにより、それらを連結することができる。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883。一本鎖抗体もまた、「抗体の断片」という用語内に包含されることが意図される。上記の抗体断片のいずれも、当業者に公知である従来の技術を用いて取得され、断片は、完全抗体と同じ様式で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
【００３８】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性を有する表面グループから通常なり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を通常有する。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下で失われるが後者では失われないという点で、識別される。
【００３９】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を提示する。
【００４０】
「網膜前駆細胞」、または「神経網膜由来の網膜幹細胞」、または「網膜幹細胞」は、それらの用語が本明細書において使用される際、同義であり、神経網膜組織に由来し得る単離された生存可能な幹細胞を意味する。これらの細胞の起源が、それらを網膜色素上皮、毛様体、または虹彩の色素含有細胞などの非神経網膜細胞から識別できる1つの要素である。本発明の細胞は、成長因子の非存在下で増殖できないことによりさらに識別される。当該細胞は、通常の増殖培養中には有意な量の光受容体マーカーを発現しないが、成長因子の非存在下で、および特に特定のマトリクス材料（PCL特許出願）上にプレーティングされた場合には、迅速に分化して、光受容体マーカーに対して陽性の細胞となる。
【００４１】
本発明の細胞はまたさらに、本明細書で更に説明される細胞表面マーカーの独自のセットを特徴とする。本発明の細胞は、出生前および出生後の供給源のどちらにも由来することができ、かつ多分化能であり、これは、それらが自己複製できかつ光受容体へ網膜特異的に分化できることを意味する。そのような細胞はまた、米国特許第7,514,259号においてより記載され、この開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００４２】
本発明の網膜前駆細胞と関連して本明細書において使用される際、「多分化能」という用語は、網膜前駆細胞が増殖でき、かつ成熟網膜細胞型、特に光受容細胞を形成できる能力を意味する。
【００４３】
「実質的に均一な」細胞集団とは、細胞の約50％より多く、または代わりに約60％より多く、または代わりに70％より多く、または代わりに75％より多く、または代わりに80％より多く、または代わりに85％より多く、または代わりに90％より多く、または代わりに95％より多くが、同じかまたは類似した表現型である、細胞の集団を説明するものである。表現型は、本明細書でより詳細に説明される細胞表面マーカーにより決定される。
【００４４】
本明細書において使用される際、「処置すること」、「処置」などの用語は、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために、本明細書において使用される。効果は、障害またはその徴候もしくは症候を完全にまたは部分的に防ぐ観点で予防的であることができ、かつ／または、障害および／もしくは障害に起因し得る有害効果についての部分的または完全な治癒の観点で治療的であることができる。「処置」の例は、障害の素因を有し得るがまだそれを有するとは診断されていない対象において障害が起こるのを防ぐこと；障害を阻害すること、すなわちその発症を停止すること；および／または、障害、例えば黄斑変性症の症候を軽減もしくは改善することを含むが、これらに限定されない。当業者により理解されるように、「処置」は、病理と関連する症候の全身の改善、および／または胸痛などの症候の発症の遅延を含むことができる。「処置」の臨床的および前臨床的な証拠は、病理、個体、および処置によって変動すると考えられる。
【００４５】
「組成物」とは、活性作用物質、細胞または細胞の集団と、不活性であるか（例えば、検出可能な作用物質もしくは標識）または活性である、別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【００４６】
「薬学的組成物」とは、活性作用物質と、不活性であるか活性である、例えば生体適合性足場またはマトリクス[マトリクスの例を提示すること]などの、担体との組み合わせを含むことが意図され、該担体は、該組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断用途または治療用途に適したようにさせる。
【００４７】
生物学的に適合性の担体または媒体という用語と互換的に使用されてもよい、「薬学的に許容される担体」（または媒体）という用語は、治療的に投与される細胞および他の作用物質と適合性であるだけでなく、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症が無く、妥当な有益性／危険性の比と釣り合った、ヒトおよび動物の組織と接触する使用にも適した、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。本発明における使用に適した薬学的に許容される担体は、液体、半固体（例えばゲル）、および固体の材料（例えば、細胞足場およびマトリクス、管、シート、ならびに当技術分野において公知であり、本明細書においてより詳細に記載されるような他の材料）を含む。これらの半固体および固体の材料は、体内での分解に抵抗するように設計されてもよく（非生分解性）、または体内で分解するように設計されてもよい（生分解性、生侵食性）。生分解性材料は、さらに、生体再吸収性または生体吸収性であってもよく、すなわち、体液中に溶解および吸収されてもよい（水溶性インプラントが一例である）か、または、他の材料への変換もしくは天然の経路を通した崩壊および排除のいずれかにより、分解されて最終的に体から排除されてもよい。
【００４８】
「有効量」とは、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用、または投薬において投与することができる。
【００４９】
本明細書において使用される際、インビボおよびエクスビボの目的での「投与すること」という用語は、方法の望ましい目的を達成するために有効な、組成物、細胞、または集団の有効量を対象に提供することを意味する。本明細書において記載されるものなどの組成物を投与する方法は、当業者に周知であり、非経口投与、局所投与、経口投与、または局部投与、および、静脈内、皮下、または筋肉内を含むが、これらに限定されない。投与は、処置の過程を通して連続的にまたは間欠的に行うことができる。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される細胞、治療に使用される組成物、治療の目的、および処置される対象と共に変動する。単回または複数回の投与を、処置する医師により選択される用量レベルおよびパターンで実施することができる。例えば、組成物は、事前に、または代わりに、処置が意図される疾患または状態を既に患っている対象に投与することができる。
【００５０】
網膜前駆細胞表面マーカー
本発明は、細胞表面マーカーであるSSEA4＋、CD73＋、PTK7＋、およびPSA-NCAM＋の各々の存在を特徴とする網膜前駆細胞の、精製または単離された細胞および／または実質的に均一な集団に関する。
【００５１】
これらは陽性表面マーカーであり、これは、各マーカーが細胞の表面上に存在し、かつその存在が、表面マーカーに結合する抗体または他の関連のあるリガンドにより検出され得ることを意味する。本発明の網膜細胞はまた、陰性細胞マーカーによっても特徴決定され、これは、マーカーの存在が、マーカーに対する抗体により検出され得ない（または、マーカーの不在が観察される）ことを意味する。以下は、本発明の網膜前駆細胞についての陰性細胞マーカーである：CD15−（神経幹細胞）、CD133−（神経幹細胞）、A2B5−（グリア前駆細胞）、およびCD38−（グリア前駆細胞）。
【００５２】
本発明の細胞集団は、典型的に、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、最も好ましくは少なくとも約80％のヒト網膜前駆細胞を有する。網膜前駆細胞のためのヒト供給源は、種々の器官由来の組織、または、出生前網膜組織、胎児組織、成体器官および骨髄、ならびに網膜ニューロスフェアなどの組織を含む。ヒト網膜組織は、これらの細胞の好ましい供給源である。細胞は、生きている生存可能な宿主または死体由来であることができる。
【００５３】
簡潔に言うと、ヒト網膜前駆細胞は、倫理的にかつGTPに準拠した組織バンク、例えばABR Inc of Alameda, Californiaから取得された、16週の在胎齢のヒト神経網膜の異なる供与物から単離される。単離および分離された細胞を、補給物（20 ng/ml rhEGF、10 ng/ml bFGF）を含むUltraculture（商標）培地中の、フィブロネクチンでコーティングされた表面上で、例えばP8およびP13の異なる継代まで拡大し、その後、原薬（DS）ロットのストックを提供するように凍結する。これらの原薬ロットは、臨床応用のためにGMPに製造することができる。細胞調製のために、DSロットを融解し、細胞20,000個／平方センチメートルの密度でプレーティングした。2日後、標準的な手段に従って細胞を採集して調製し、製剤（DP）を生成した。ヒト網膜前駆細胞の調製されたバッチ各々について、細胞密度（1mLあたりの実際の細胞の数）および細胞生存率（安定性）を記録する。
【００５４】
特徴決定のために、ヒト網膜前駆細胞を、1mLあたり細胞5000万個の密度で、HBSS-NACなどの非毒性賦形剤中の網膜細胞の新鮮な懸濁液として調製する。細胞を、移植のための標準的な手段に従って拡大し、調製する。概して、その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に提出された米国特許出願第13/160,002号に記載されている方法を参照されたい。
【００５５】
細胞は、実施例において以下に記載されるように、フローサイトメトリー解析および免疫細胞化学解析を用いて特徴決定することができる。
【００５６】
治療用途
本発明はまた、上記のヒト網膜前駆細胞を、罹患または変性したヒト網膜の網膜下腔に移植する段階を含む、この処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または防御するための方法も提供する。1つの局面において、当該細胞は、処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和することができる。別の局面において、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、2012年1月23日に出願された米国特許出願第13/356,073号に記載されたものなどの適切な生体適合性足場に、当該細胞を播種することができ、この処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和するためにこの細胞-足場の組み合わせ製品を移植することができる。これらの処置のすべてについて、網膜前駆細胞は、患者にとって同種異系である。さらなる局面において、本発明の細胞は、他の処置との組み合わせで投与することができる。
【００５７】
スクリーニングアッセイ
本発明は、網膜前駆細胞の分化を調節する種々の作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。これはまた、網膜前駆細胞から培養中に生成される成熟光受容体を支持および／またはレスキューする治療用作用物質を発見するためにも使用することができる。本発明の目的に関して、「作用物質」とは、生物学的または化学的化合物、例えば、単純もしくは複雑な有機もしくは無機の分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）、またはリボザイムを含むが、これらに限定されないことが意図される。数多くのいろいろな化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびに種々のコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、「作用物質」という用語に含まれる。加えて、植物または動物の抽出物などのような種々の天然供給源が、スクリーニングのための化合物を提供することができる。常に明確に述べられるわけではないが、作用物質は、単独で、または本発明のスクリーニングにより同定された作用物質と同じかまたは異なる生物学的活性を有する別の作用物質との組み合わせで使用されることが、理解されるべきである。
【００５８】
インビトロでスクリーニング法を実施するために、単離された細胞の集団を、上記のように取得することができる。作用物質が、上記の低分子などの、DNAまたはRNA以外の組成物である場合、作用物質を細胞に直接添加するか、または添加用の培養培地に添加することができる。当業者に明白であるように、経験的に決定することができる「有効」量を添加しなければならない。作用物質がポリヌクレオチドである場合、遺伝子銃またはエレクトロポレーションの使用により直接添加することができる。  
【００５９】
あるいは、遺伝子送達媒体または上記のような他の方法を用いて細胞に挿入することができる。薬物または他の作用物質の意図される活性を確認するために、陽性および陰性の対照をアッセイすることができる。
【００６０】
キット
本開示はまた、1つまたは複数の本発明の集団、細胞、または組成物、および使用説明書を含有する、本明細書において記載される方法における使用のためのキットも提供する。任意で、キットは、方法における使用のための試薬を含むことができる。
【００６１】
代替的な局面において、本開示は、細胞または集団の単離または精製のための説明書、および使用説明書、および任意で、本明細書において記載される適当な組織源から細胞または細胞の集団を単離または精製するための試薬を含む、本明細書において記載される方法における使用のためのキットを提供する。
【００６２】
本発明は、それにより本発明の範囲を限定するようには意図されない以下の実施例において、さらに説明されかつ例証され得る。
【実施例】
【００６３】
網膜形態
本発明の主題である神経網膜の形態は、その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に出願された同一出願人による同時係属中の米国特許出願第13/160,002号においてさらに記載されている。
【００６４】
細胞単離
hRPC（ヒト網膜前駆細胞）を、小さな改変を伴い、以下の参照文献において記載されているように、胎児網膜から単離した：Klassen, H.J. et al., Multipotent Retinal Progenitors Express Developmental Markers, Differentiate into Retinal Neurons, and Preserve Light-Mediated Behavior, Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 2004,45(11), 4167-4173ページ；Klassen, H. et al., Isolation of Retinal Progenitor Cells from Post-Mortem Human Tissue and Comparison with Autologous Brain Progenitors, J. Neuroscience Research, 2004, 77(3), 334-343ページ；Klassen, H. et al., Progenitor Cells from the Porcine Neural Retina Express Photoreceptor Markers after Transplantation to the Subretinal Space of Allorecipients; Stem Cells, 2007, 25(5); 1222-1230ページ。
【００６５】
簡潔に言うと、ヒト胎児の眼（14〜18週の在胎齢）由来の全神経網膜を解剖し、4サイクル（全体で1.5時間の発酵）にわたり0.1％コラゲナーゼI（Sigma）で解離させ、改変Ultraculture培地（10 ng/ml rhEGF、20 ng/ml rhbFGF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ナイスタチン、およびL-グルタミン）中にプレーティングするかまたは凍結した。単一細胞および凝集塊の量および生存率を、トリパンブルーおよび血球計算板を用いて概算した。
【００６６】
フローサイトメトリー解析
ヒト網膜前駆細胞を、以下の一般的なプロトコルに従って加工処理する：
1．固定：（細胞周期解析およびPCNA以外の）すべての抗原について、冷たい新鮮な緩衝4％パラホルムアルデヒド、pH 7.4を30分間、4℃で使用する。細胞周期解析およびPCNAについては、100％エタノールを30分間、4℃で使用する。
2．洗浄：PBSを添加し、1500 rpmで5分間回転させる。
3．透過処理およびブロッキング：沈殿をブロッキング緩衝液（PBS中5％ BSAにおいて調製した0.1％ Triton-X、10％ヤギ血清溶液）に再懸濁し、30分間、室温でインキュベーションする。
4．洗浄
5．沈殿をX（添加される抗体の数）の染色緩衝液（PBS中5％ BSAにおいて調製した10％ヤギ血清溶液）100fllに再懸濁する。100111ずつ5mlチューブに等分する。
6．下記の表1に従って一次抗体を添加する。すべての抗体溶液を、染色緩衝液中で調製した。45分間、室温でインキュベーションする。
7．洗浄
8．表1に従って100fllの二次抗体（染色緩衝液中）を添加する。30分間、室温でインキュベーションする。
9．洗浄
10．500fllのPBSに再懸濁する。
11．4時間以内に（例えば、BD LSR IIを用いて）ゲート内の少なくとも10,000イベントを解析する。
【００６７】
ヨウ化プロピジウム染色（細胞周期解析のため）
1．細胞沈殿を、20flg/mLのPIおよび100flg/mLのDNアーゼ非含有RNアーゼAを含有する1mL PBSに懸濁する。
2．洗浄
3．500f..tlのPBSに再懸濁して解析する。
【００６８】
DAPI染色（生存率解析のため）
1．固定前に、細胞をPBS中の200ng/ml DAPIに再懸濁する。
2．5分間、室温でインキュベーションする。
3．洗浄
4．4％の冷たいPFA中で30分間、固定する。
5．洗浄
6．500f..llのPBSに再懸濁して解析する。
【００６９】
【表１】
0006468843.tif 000002
【００７０】
統計的方法
陽性細胞の比を、抗体についてのアイソタイプ対照に基づいて決定する。実験を3回繰り返し、各マーカーについて陽性細胞の平均パーセンテージを標準偏差と共に計算する。また、高発現／低発現細胞の比を、適用可能な場合は計算する。
【００７１】
結果
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析の結果（3ラン、各々10,000イベント）を、以下の表2に示す。表中の数字は、適切なアイソタイプ対照との比較に基づく、製剤内の陽性（発現）細胞の比を示す。アイソタイプの発現の98％のレベルを、閾値レベルとして選択した。
【００７２】
【表２】
0006468843.tif 000003
【００７３】
図1、図2、および図3は、上記の結果の平均および標準偏差（M＋／−SEM）を例証する棒グラフである。製剤中の細胞は、調査された幹細胞性マーカーの大部分を発現することが見出された。しかしながら、親集団の半分しかPax6、Crx、およびNr1について陽性ではなく、このことは、この集団が実際にはいくつかの亜集団からなることを示唆している。マーカーは、継代9から14への増加にわたって、かつ2件の別々の胎児の供与物にわたって安定である。
【００７４】
免疫細胞化学解析
ヒト網膜前駆細胞を、以下の一般的なプロトコルに従って加工処理する：
1．プレーティング：細胞を、新しくフィブロネクチンでコーティングされた16ウェルNuncスライド上に4k細胞／sq.em.の密度で、ヒト網膜前駆細胞培地（200fll／ウェル）においてプレーティングする。
2．インキュベーション：37℃、5％ CO2、3％ O2、100％湿度で6時間。
3．洗浄：培地を吸引し、PBSを添加する。
4．固定：冷たい緩衝4％ PFAで10分間、室温。
5．洗浄
6．透過処理およびブロッキング：ブロッキング緩衝液（PBS中5％ BSAにおいて調製した0.1％ Triton-X、10％ヤギ血清溶液）中で1時間、室温でインキュベーションする。
7．洗浄
8．表3に従って一次抗体を添加する（50fll／ウェル）。すべての抗体溶液を、染色緩衝液（PBS中5％ BSAにおいて調製した10％ヤギ血清溶液）中で調製する。一晩4℃で、加湿チャンバーにおいてインキュベーションする。
9．洗浄2回、各々5分。
10．表3に従って50fllの二次抗体（染色緩衝液中）を添加する。1時間、室温でインキュベーションする。
11．洗浄3回、各々5分。
12．DAPIを含むマウント培地中でマウントする。
13．一晩乾燥する。
14．画像化して解析する。
【００７５】
【表３】
0006468843.tif 000004
【００７６】
結果
免疫細胞化学
免疫細胞化学解析の結果（5ラン、各々＞100イベント）を、図4、図5、および図6に示す。顕微鏡／カメラについての蛍光および露光の設定を、適切なアイソタイプ対照を用いて調整した。図4、図5、および図6は、上記の結果の平均および標準偏差（M＋／−SEM）を例証する棒グラフである。免疫細胞化学解析由来の結果は、フローサイトメトリーを用いて確立されたプロファイルを支持しかつ助長する。
【００７７】
本発明のヒト網膜前駆細胞を、網膜および眼の発生、ならびに（有益か不利益かに関わらず）そのような発生に影響を及ぼす要素を研究するために使用してもよい。これらのhRPCはまた、眼の機能不全を患う網膜中への移植により、臨床試験のために使用することもできる。それらを、ジストロフィのおよび変性した眼の組織、特に機能不全の網膜を再生するためまたはレスキューするために有利に使用してもよい。網膜機能不全は、疾患、機械的もしくは化学的損傷、または、レシピエントの網膜に影響を及ぼす変性過程もしくは病理学的過程によるものであるかに関わらず、正常な網膜機能の任意の欠如または喪失を包含する。hRPCは、当技術分野において公知である技術に従って、網膜部位、網膜下腔、硝子体腔、または視神経に注入してもよく、またはさもなければ配置してもよい。
【００７８】
有利には、本発明のhRPCを、光受容細胞機能の欠如または減少を補償するために使用してもよい。本発明の網膜幹細胞集団および方法により処置することができる網膜機能不全の例は、以下を含むが、これらに限定されない：光受容体の変性（例えば、網膜色素変性症、錐体ジストロフィ、錐体桿体ジストロフィおよび／または桿体錐体ジストロフィ、ならびに黄斑変性症において起こるようなもの）；網膜剥離および網膜外傷；レーザーおよび太陽光により引き起こされる光損傷；黄斑円孔；黄斑浮腫；夜盲および色盲；糖尿病または血管閉塞により引き起こされるような虚血性網膜症；未熟／早産による網膜症；例えば、CMV網膜炎およびトキソプラズマ症などの感染状態；ブドウ膜炎などの炎症状態；網膜芽腫および眼メラノーマなどの腫瘍；ならびに、緑内障、外傷性視神経症、剥離、ならびに、放射線視神経症および網膜症を含む眼の神経症において影響を受けている内部網膜ニューロンの置換のため。
【００７９】
本明細書において記載される処置は、単独型の治療として、または他の治療的処置との組み合わせで使用することができる。そのような処置は、神経網膜由来の幹細胞の光受容細胞または他の網膜細胞型（例えば、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、無軸索細胞、ミュラー細胞）への分化を刺激する物質の投与を含むことができる。
【００８０】
前述から、本発明の特定の態様が例証の目的で本明細書において記載されているが、添付の特許請求の範囲において示される本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされてもよいことが、認識される。本明細書において参照とされるすべての刊行物、特許、および特許出願は、全体として参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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