(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中における治療薬耐性微生物の存在の検出方法であって、
ａ）少なくとも１つの治療薬をともなう第１のチューブと、前記治療薬をともなわない第２のチューブとに、前記生体サンプルを接種し、該生体サンプルをインキュベートする工程と；
ｂ）前記第１のチューブと前記第２のチューブに、蛍光マーカーを添加する工程と；
ｃ）前記第１のチューブと前記第２のチューブの各々に対して、１又は複数の蛍光パラメータを得るために蛍光分析を実行する工程と；
を備え、
前記生体サンプルは、微生物を単一種集団に単離するための処理を経ずに該微生物を含むサンプルであり、
前記治療薬に対して耐性表現型の微生物を含む該生体サンプルが、前記第１のチューブと前記第２のチューブの間の１又は複数の蛍光パラメータを比較することによって鑑別されることを特徴とする方法。
【請求項２】
生体サンプル中における治療薬耐性微生物の存在の検出方法であって、
ａ）少なくとも１つの治療薬をともなう第１のチューブと、前記治療薬をともなわない第２のチューブとに、前記生体サンプルを接種し、該生体サンプルをインキュベートする工程と；
ｂ）前記第１のチューブと前記第２のチューブに、蛍光マーカーを添加する工程と；
ｃ）前記第１のチューブと前記第２のチューブの各々に対して、１又は複数のフローサイトメトリックパラメータを得るためにフローサイトメトリック分析を実行する工程と；
を備え、
前記生体サンプルは、微生物を単一種集団に単離するための処理を経ずに該微生物を含むサンプルであり、
前記治療薬に対して耐性表現型の微生物を含む該生体サンプルが、前記第１のチューブと前記第２のチューブの間の１又は複数のフローサイトメトリックパラメータを比較することによって鑑別されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、
前記１又は複数のフローサイトメトリックパラメータは、前方散乱、及び／又は、側方散乱、及び／又は、蛍光パラメータを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法であって、
前記蛍光散乱シグナルのパラメータは、強度、スペクトルプロファイル、及び／又は、細胞数を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ａ）工程の該チューブには、少なくとも１つの溶解剤及び／又は緩衝液が更に接種されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
ｉ）前記生体サンプル中に存在する微生物の種類を同定し、前記種類がグラム陽性のバクテリア、グラム陰性のバクテリア、又は真菌である場合、それに応じて治療薬を選択する工程；及び／又は
ｉｉ）前記生体サンプルを濃縮し、残渣が存在するときはその有機堆積物を除去する工程；
の準備工程の１又は複数の工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法であって、
前記ｉｉ）工程は、遠心分離、又は、濾過によりなされることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ａ）工程において、前記生体サンプルが適切な培地に接種されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記蛍光マーカーを用いた前記ｂ）工程の反応時間は５分〜６０分の間であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ｃ）工程の前記生体サンプルは、基質特異性拡張型βラクタマーゼの存在を検出した場合、酵素阻害剤がさらに添加されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法であって、
前記酵素阻害剤は、クラブラン酸又はタゾバクタムであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られた、前記治療薬に対して微生物耐性表現型の生体サンプルを、カルバペネムを含有する試験溶液に接種してインキュベートし、
インキュベート後の試験溶液を、カルバペネム感受性のコントロール菌株による感受性テストにかけ、
前記生体サンプルの中からカルバペネマーゼ産生サンプルを検出する、
工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記微生物は、バクテリア、真菌、又は原生生物であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法であって、
前記バクテリアは、グラム陽性、グラム陰性、グラム染色に対し不安定又は不可能であるモリクテス綱、又は、アルコール−酸耐性バクテリアであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３記載の方法であって、
前記微生物は、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、エンテロバクテリアシー科、大腸菌、クレブシエラ肺炎桿菌、プロテウス属、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、セパシア菌、ネイセリア属、ヘモフィルス属、マイコバクテリウム属、ノカルジア属、レジオネラ属、カンジダ属、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ニューモシスチス肺炎菌、アスペルギルス属、又は、ジアルジア属であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記治療薬は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アズトレオナム、マクロライド、キノロン、アミノグリコシド、グリコペプチド、リポペプチド、テトラサイクリン、コリスチン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、ニトロフラントイン、スルホンアミド、リファンピン、トリメトプリム、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、又は、チゲサイクリンの抗バクテリア薬、５−フルオロシトシン、あるいは、エキノキャンディンであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記蛍光マーカーは、核酸染色剤、代謝染色剤、又は、膜電位染色剤であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法であって、
前記蛍光マーカーは、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナトリジン色素、又は、ローダミン色素であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬耐性微生物の検出キット及び治療薬耐性微生物の検出方法、並びに、基礎的な体制メカニズムの分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微生物の検出と、何より微生物の感受性評価を行うための現状の実験手順の短縮及び改良という大きなニーズがある。理想的な診断技術は、感受性プロファイルに基づく適切な治療の策定を可能にするために、感受性プロファイルをタイムリーに提供することである。
【０００３】
いわゆる、敗血性ショックにつながる最も深刻な感染症の場合には、スピードは最も重要である。適切な抗菌治療が遅れると、死亡リスクは実質的に、時間単位で増加する。
【０００４】
現在の至適基準の診断方法は、ゆっくりとした、労働集約的な培養に基づき、表現型の特定及び抗微生物薬感受性試験を行い、サンプル収集後、４８〜７２時間を必要とする。広域抗生物質を用いた経験的治療をしばしば開始しなければならず、抗微生物薬耐性の上昇をもたらす。
【０００５】
従来の試験を用いると、尿のような生物由来物質が固体培地で培養される必要があり、その後、同定と感受性評価が行える。血液は通常、ブロース培地（血液培地）に植菌され、自動的に分析され；ポジティブになると、血液は少なくとも２４時間経過後、固体培地に置かれ、そして、感受性評価のためにコロニーを形成させる。一方、コロニーは薬剤の集団の存在下で成長することができるので、感受性プロファイルの決定のために、さらに２４時間必要である。
【０００６】
臨床的耐性は、菌株の抗菌薬感受性の欠如と、局部感染での低濃度の活性抗菌薬に関連し得る。生化学的プロトコルでは、ほんの数種類の薬剤、例えば、バンコマイシン、ゲンタマイシン、アミカシンが利用でき、それらは不活性である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、−単一種の生物体を含む検査培養−で作られた、又は、フローサイトメトリーを使って、培養されていない生物学的サンプルから直接の純粋微生物培養物からなる、抗菌薬感受性試験に関する。いくつかの好ましい実施形態は、（少なくとも２４時間経過し、微生物が増殖した）生物由来物質から得られた純粋培地を使用することを要求せず、そして、（フローサイトメトリーのような蛍光分析によって、尿、培養血液、水等の培養されていない）生体サンプルにより直接、抗菌薬感受性試験を実行する。
【０００８】
開示した主題は、生体サンプル中における治療薬耐性微生物の検出方法であって、
ａ）少なくとも１つの治療薬を有する第１のチューブと、前記少なくとも１つの治療薬を有さない第２のチューブに前記サンプルを植菌し、前記サンプルを培養する工程と；
ｂ）前記第１のチューブと前記第２のチューブに、蛍光マーカーを添加する工程と；
ｃ）前記第１のチューブと前記第２のチューブの各々に対して、１又は複数の蛍光パラメータを得るために蛍光分析を実行する工程と；
を備え、
前記治療薬に対して微生物耐性表現型の生体サンプルが、前記第１のチューブと前記第２のチューブの間の１又は複数の蛍光パラメータ又は成長パラメータを比較することによって得られることを特徴とする方法に関する。
【０００９】
開示した主題はまた、生体サンプル中における治療薬耐性微生物（バクテリア、真菌、又は原生生物）の検出方法に関する。言い換えれば、生体サンプル、すなわち、尿、培養血液、水、純粋培地から得られた微生物の懸濁液の（培養されていない）サンプルから直接、治療薬耐性微生物を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの治療薬を有する第１のチューブと、前記少なくとも１つの治療薬を有さない第２のチューブに培養されていない前記サンプルを植菌し；好ましくは、少なくとも１つの溶解剤、及び／又は、緩衝剤、及び／又は、適切な培地をさらに含み、あるいは、血清分離チューブにサンプルを置き；前記サンプルを培養する工程と；
ｂ）前記第１のチューブと前記第２のチューブに、蛍光マーカーを添加する工程と；
ｃ）前記第１のチューブと前記第２のチューブの各々に対して、１又は複数のフローサイトメトリックパラメータを得るためにフローサイトメトリック分析を実行する工程と；を備え、
前記治療薬に対して微生物耐性表現型の生体サンプルが、前記第１のチューブと前記第２のチューブの間の１又は複数のフローサイトメトリックパラメータを比較することによって得られることを特徴とする方法に関する。
【００１０】
他の実施形態において、１又は複数のフローサイトメトリックパラメータは、前方散乱、及び／又は、側方散乱、及び／又は、蛍光パラメータを含む。蛍光散乱シグナルのパラメータは、強度、スペクトルプロファイル、及び／又は、細胞数を含む。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、開示した方法は、
ｉ）前記生体サンプル中に存在する微生物の種類を同定し、その結果、前記種類がグラム陽性又はグラム陰性である場合、治療薬を選択する工程と；
ｉｉ）前記生体サンプルを濃縮し、有機堆積物、例えば、血液サンプル、尿、又は、他の生物由来物質からの残渣が存在するときは前記有機堆積物を、好ましくは、遠心分離、濾過、又は、血清分離チューブ及び遠心分離機を使用して、除去する工程と；
を含む準備工程の１又は複数の工程をさらに備える。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、前記サンプルのインキュベーション時間は３０分〜２時間の間、好ましくは３０分〜６０分の間である。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、前記サンプルのインキュベーション温度は３０〜４０℃の間、好ましくは２５〜３５℃の間である。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、蛍光マーカーを用いる前記ｂ）工程の反応時間は５分〜６０分の間であってもよい。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、微生物の耐性メカニズムを分析するために、前記ｃ）工程における前記生体サンプルは、例えば、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬｓ）の存在を検出する場合、酵素阻害剤をさらに備えてもよい。好ましい酵素阻害剤は、クラブラン酸、タゾバクタム、又はこれらの混合物等であってもよい。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様において、本方法は、例えば、カルバペネマーゼ（カルバペネムを分解する酵素）の存在に起因して、微生物の抵抗メカニズム、（ホッジ試験（Hodge test）は、さらに２４時間かけるのが望ましく、解釈するのが煩わしく難しい）重要な耐性メカニズムを検出するために、
ｉ）前記サンプルにカルバペネムを植菌し、前記サンプルを培養する工程と；
ｉｉ）前記生体サンプルの微生物を、好ましくは濾過によって除去する工程と；
ｉｉｉ）例えば、一連の濃度のカルバペネムと大腸菌ATCC strain 25922等の微生物をフローサイトメトリーによって培養し、公知の作用を有する菌株、すなわち、公知の線量効果曲線を有するコントロール菌株を添加する工程と；
ｉｖ）２種類のサンプルに蛍光マーカーを添加する工程と；
ｖ）前記第１のチューブと前記第２のチューブの各々に対して１又は複数のフローサイトメトリックパラメータを得るためにフローサイトメトリック分析を実行する工程と；
ｖｉ）生成された前記プロファイルとコントロール菌株とを比較する工程と：をさらに備える。
【００１７】
カルバペネマーゼの存在下において、試験された菌株はカルバペネムを分解し、活性薬剤が少なくなり；基準株でのカルバペネムの効果が小さくなる。一定濃度のカルバペネムの効果が予測より低い場合、微生物はカルバペネマーゼ産生株である。
【００１８】
本発明のより好ましい実施形態において、本方法は、例えば、カルバペネマーゼの存在に起因して、微生物の耐性メカニズムを検出するために、
・フローサイトメトリック線量効果曲線を得て、一連の濃度のカルバペネムと大腸菌ATCC strain 25922等の微生物をフローサイトメトリーによって培養する工程と；
・カルバペネムに抵抗菌株を接触させ、一定濃度のカルバペネムで培養した後、菌株を有するテストチューブ（試験管）から濾過によって微生物を除去する工程と；
・ろ液が基準株（ATCC）を用いて培養され、その効果がフローサイトメトリーによって分析され；その効果が線量効果曲線について予測した結果と比較される工程と；
をさらに備える。
【００１９】
他の好ましい実施形態において、生体液中の薬剤の治療量はさらに同じ方法に基づいて評価され得る。
【００２０】
生体サンプル中における治療薬に対する抵抗菌の検出方法の最も好ましい実施形態において、前記微生物は、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属；大腸菌等のエンテロバクテリアシー科、クレブシエラ肺炎桿菌、プロテウス属；緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、又はセパシア菌等の非発酵菌；ネイセリア属、ヘモフィルス属；マイコバクテリウム属、ノカルジア属；レジオネラ属、嫌気性菌；カンジダ属等の真菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ニューモシスチス肺炎菌、アスペルギルス属のようなカビ；又は、ジアルジア属等の寄生体、又は他の類似の微生物である。
【００２１】
生体サンプル中における治療薬に対する抵抗菌の検出方法の他の好ましい実施形態において、治療薬は、ペニシリン、セファロスポリン、他のβラクタム（カルバペネム、アズトレオナム）、マクロライド、キノロン、アミノグリコシド、グリコペプチド、リポペプチド、テトラサイクリン、及び他の薬剤（例えば、コリスチン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、ニトロフラントイン、スルホンアミド、リファンピン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、又は、チゲサイクリン）；ポリエン、５−フルオロシトシン、アゾール、エキノキャンディン等の抗菌薬、又は、他の類似の治療薬であってもよい。
【００２２】
生体サンプル中における治療薬に対する抵抗菌の検出方法の他の好ましい実施形態において、蛍光マーカーは、核酸染色剤、代謝染色剤、膜電位染色剤、細胞小器官用のプローブ、細胞形態及び細胞流動の蛍光トレーサ、細胞生存性、細胞増殖及び細胞機能用のプローブ、又は、活性酸素種用プローブであってもよい。最も好ましくは、蛍光マーカーは、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナトリジン色素、又は、ローダミン色素である。
【００２３】
別の実施形態において、カビへの抗真菌感受性がさらに実行され、アムホテリシンＢ、ボリコナゾール、及びフルコナゾール等の抗真菌剤の有無とは無関係に、Bactec社のMycosis IC/Fバイアル又はMGITチューブでカビ胞子を培養し；ボジティブ（蛍光発光）になる時刻がBactec社の装置によって記録される。抗真菌感受性を有する感受性菌株バイアルは、抗真菌感受性を有さないコントロールバイアルと比較してポジティブになるのに、少なくとも２倍の時間がかかる。
【００２４】
さらに、本発明の主題は、上述した方法を備える、治療薬に対する抵抗菌を検出するキットである。
【００２５】
本発明のもう一つの実施形態において、キットはさらに、治療薬、及び／又は、蛍光マーカーをさらに備える。
【００２６】
また、本発明の他の実施形態において、キットはさらに、緩衝剤、溶解剤、及び／又は、培地、及び／又は、酵素阻害剤、及び／又は、コントロール菌株を備えてもよい。
【００２７】
さらに、本発明の主題は、上述の方法を実行するための蛍光デバイスである。蛍光バイアスは、フローサイトメーター又はBACTEC社のMGIT（マイコバクテリア成長インジケータチューブ：Mycobacteria Growth Indicator Tube）である。
【００２８】
開示した主題は、コロニー又は生体サンプルから主要な抗菌薬に対する、微生物、すなわち、感染病原体の感受性を評価することを可能にする。そして、真菌類はカビ毎に異なるプロトコルを有する。開示した主題はさらに、様々な生体サンプルにおける、抵抗メカニズムの検出及び薬剤の微生物学的アッセイの定量化ですら可能にする。
【００２９】
日常的な臨床検査室で使用される感受性プロファイルのための検査室内方法は、最短でも４８時間の時間を要求する。この遅れは、公知の方法が微生物の成長に基づくという事実に起因する。予想以上に、蛍光分析、すなわち、短期間の薬剤への暴露の後、細胞の生理状態の評価に基づくフローサイトメトリーによって、抗菌感受性評価を遅らせる。形態的障害（morphological lesion）又は生理活性の測定は古典的手法では困難である。
【００３０】
数多くの研究が微生物学の分野で、特に分子生物学的技術を用いる微生物の特定に関して、行われた。しかしながら、このような技術はゲノムが公知である生物だけに適用できるので、このような技術には限界がある。他の欠点は、非常に費用がかかる点に関する。さらに、分子生物学は非常にごくまれに、特定の遺伝子の存在が特定の薬剤耐性を付与することがごくまれに知られているように分子生物学では、微生物の感受性に関する情報を提供することがごくまれにある。このような直接的な関係は、結核菌の耐性及びスタフィロコッカス・アウレウスでのメチシリンへの耐性に対して、リファンピシンのような特殊な場合で確立している。
【００３１】
生成物から直接試験も行える特性は、以下の通りである。
・これらの生成物が、フローサイトメトリースクリーニングに対して（好ましくは１０５を超える）十分な細胞密度を有するという事実。
−培養血液が、事前培養に供し、後でポジティブになった際、微生物が感受性試験を実行するのに必要とされる細胞密度となる；
−尿サンプル、すなわち感染基準は、１ｍＬにつき１０５個を超える細胞密度に相当する。
・両生成物において、微生物は、対数期で発見されることが認められる。この点は、幾つかのタイプの抗菌薬の感受性評価がその作用様式のために対数期にある微生物を有する必要があるので、要求される。
【００３２】
フローサイトメトリーの革新的利用は、継時的に微生物の細胞集団のマルチパラメータ評価を実行できることあり、微生物の増殖能力の研究と関連付けることである。従来方法によって薬剤の急激な致死活性を立証するために、我々は細胞が増殖できないことを証明しなければならない。フローサイトメトリーによって、我々は、特定の薬剤を用い、数分の培養時間経過後、死滅を意味する、細胞膜の重大な損傷を証明することができる。さらに、作用メカニズム、及びより重要な抵抗メカニズムは、フローサイトメトリーによって調べられる。さらに、このような新規なアプローチは、薬剤組合せの研究を、以前のようなインビトロ（in vitro）での相乗効果の結果を用いることなく重症患者にしばしば利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】フローサイトメトリー前に、陽性の（ポジティブな）培養血液又は尿サンプルから直接、迅速な抗菌感受性評価の方法を説明する図。
【図２】本発明の２つの異なる実施形態の図。供されたポジティブな培養血液又は尿サンプルを用いて、治療薬に対する微生物の感受性を検出する方法と、典型的な感受性及び抵抗性を有する菌株を用いて得られた結果を示す。
【図３】２時間の培養時間経過後、ＦＤＡで染色した、オキサシリン（ＭＲＳＡ）に対する感受性（ＭＳＳＡ）及び抵抗性を有するスタフィロコッカス・アウレウスの典型的な実施例のフローサイトメトリーヒストグラム。
【図４】１時間の培養時間経過後、ＦＤＡで染色した、バンコマイシンに対する感受性及び抵抗性を有するエンテロコッカス・フェカリスの典型的な実施例のフローサイトメトリーヒストグラム。
【図５】１時間の培養時間経過後、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）で染色した、キノロン、すなわちシプロフロキサシンに対する感受性及び抵抗性を有する大腸菌の典型的な実施例のフローサイトメトリーヒストグラム。
【図６】クラブラン酸（ＣＬＡ）の有無に関わらずＣＴＸを含むＣＴＸ培養物に耐性があり、ＤｉＢＡＣ４（３）で染色された場合の、１時間の培養後、ＤｉＢＡＣ４（３）で染色したセフォタキシム（ＣＴＸ）に対する感受性及び抵抗性を有する大腸菌の典型的な実施例のフローサイトメトリーヒストグラム。ＣＬＡで培養されると、ＥＳＢＬポジティブ菌株は、感受性菌株として振る舞う。
【図７】アニデュラファンギン、フルコナゾール、又はその両方の混合物を用いて、１時間の培養時間経過後、ＤｉＢＡＣ４（３）で染色した、カンジダ・アルビカンス菌株の典型的な実施例のフローサイトメトリーヒストグラム。ａは（抗真菌薬を用いない）コントロール細胞を、Ｃ（Ｃ１：アニデュラファンギン，Ｃ２：フルコナゾール，Ｃ３：アニデュラファンギン及びフルコナゾール）は薬剤を用いた培養後の細胞数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
添付図面は、発明を説明するために好ましい実施形態を与えるが、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００３５】
従来の感受性判定方法は、固体培地における純粋培地に基づく。微生物の懸濁液は、微生物に応じて、自動化方法（VITEK 1 or VITEK 2 System−BioMerieux社；BD Phoenix System−Becton-Dickinson Biosciences社；MicroScan WalkAway System −Dade Behring社）において適切な感受性カード／パネル（例えば、グラム陽性の桿菌；グラム陽性の球菌；真菌等）に調製される。
【００３６】
他の手動試験は、ブロース大量希釈試験及びブロース微量希釈試験（broth macrodilution and microdilution tests）、Ｅ−テスト（E-test）（AB BIODISK社）、ディスク拡散試験（Disc diffusion test）、及び、ドライフォームパネル（TREK Diagnostics社）等を利用できる。
【００３７】
上記試験の全ては、様々な抗菌剤の存在下での、微生物の増殖能力の研究に基づく。
【００３８】
初めに、最大の欠点は、上記試験が、成長するために少なくとも２４時間必要である固体培地におけるコロニーから実行されるということである。利用可能な半自動化方法であるけれども、上記試験は結果を得るのに時間がかかる（最低１８〜２４時間）成長検出法に基づき、非常に経験豊富な人材を必要とし、費用がかかる。
【００３９】
［生体分子方法（BioMolecular method）（全ての日常検査では実行されない）］
生体分子方法は、微生物同定と最も関連した微生物学的診断臨床検査の革命であり、ごくまれに感受性評価（マルチプレックスＰＣＲ、マイクロアレイ等）に役立つ。
【００４０】
実際、抵抗メカニズムにはいくつもの遺伝子が含まれ、後工程に多くの時間をもたらすことになる。通常、遺伝子型と表現型の間に相関性の欠如がある。非常に感受性があり、特異性があるものの、生存能力に関する情報が得られず、高価である。
【００４１】
［１．微生物懸濁液の調整］
［１．１  培養血液又は尿サンプル］
ポジティブな培養血液又は尿サンプルから：
・後に続く解析に導くために、（最大１０分の）グラム染色又は質量分析（Maldi-TOF）を実行する。このような前工程は、微生物、すなわち、
−バクテリア：球菌又は桿菌；グラム陽性又はグラム陰性で、検査される抗生物質の選択に繋がる；
−真菌
について、不可欠な情報を発明者等に提供し、
・（血液学的な細胞と大きな壊死組織片を取り除くために）濾過し、溶血溶液（ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨＣＯ３、及びＥＤＴＡの水溶液）を含むバイアルに、培養血液又は尿を移し、
・分離リンパ液チューブ（バキュテナーゲルチューブ）に移しかえ、遠心分離機にかける。血液細胞は、ゲルの底部に、微生物がゲルの上部にとどまり、
・無菌の微生物懸濁液、濾過された培地を作成する。
【００４２】
［１．２  純粋培地由来］
無菌で濾過されたブロース培地（例えば、ミューラー・ヒントン培地）のコロニーから微生物懸濁液を作成し、対数増殖期まで培養する。
１．バクテリアが、無菌で濾過された（０．２２μｍ）ミューラー・ヒントンブロース（Difco（登録商標））において、初期の対数増殖期（好ましくは、６００ｎｍの波長で急吸光度０．２）に到達するまで、３７℃で、１分間につき１５０ストロークで、バクテリア懸濁液を培養する。
２．ブロース培地をＯ．Ｄ．＝０．０６（フローサイトメーターで読める最適細胞密度である、１ｍｌにつき略１０６細胞数）に希釈し、又は、その代わりに０．５（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ）に調整され、その後、好ましくはブロース培地で１：１００に希釈される。
【００４３】
［２．インビトロ抗微生物処理］
−フローサイトメーターによる感受性試験のために、細胞密度、例えば、１０６細胞数／ｍｌを調べる。
−（抗菌薬を含まない）コントロールバイアルと、（ブレークポイント濃度で）様々な抗菌薬を含む一連のバイアルに微生物懸濁液を移し、培養し；
−（０．５〜２時間）抗菌薬に応じてバイアルを培養し；
−事前に最適化されたプロトコルに従って、（抗菌薬に応じて）適切な蛍光色素を添加する。
【００４４】
［３．フローサイトメトリック分析］
取得設定（Acquisition setting）は、全ての蛍光チャネルの第３常用対数（third logarithmic (log) decade）に電位を調整することによって、微小球サンプルを用いて規定される。ＦＳＣ閾値が使用される。サンプルは、蛍光プローブに応じてＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３蛍光チャネルで分析され、２つのドットプロット（ＳＳＣ対ＦＳＣ、及び、ＳＳＣ対蛍光）を使用する。数値結果は、染色した細胞の蛍光強度、及び／又は、割合を使用して表せられる。装置は、標準フィルター（ＦＬ１：ＢＰ ５３０／３０ｎｍ；ＦＬ２：ＢＰ ５８５／４２ｎｍ；ＦＬ３：ＬＰ６７０ｎｍ）と、１５ｍＷ４８８ｎｍアルゴンレーザとを装備した３つのＰＭＴを有し、cell Quest Pro software（version 4.0.2，BDBiosciences社，シドニー）で操作するフローサイトメーターである（例えば、FACSCalibur  BD Biosciences社，オーストラリア  シドニー）。使用したフローサイトメトリーデータファイルフォーマットはＦＣＳ２．０ａであった。
【００４５】
［実施例］
以下の実施例は、好ましい実施形態を提供するが、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【００４６】
［実施例  ｎｏ．１］
［キノロンに対する大腸菌の感受性評価］
・微生物剤：大腸菌
・試験した薬：キノロン−シプロフロキサシン（２つのブレークポイント濃度：１μｇ／ｍｌ及び４μｇ／ｍｌ）
・使用した蛍光色素：サイバーグリーン（SYBR Green）、２本鎖ＤＮＡ構造に結合する膜浸透性色素
１．以下の通り、
・シプロフロキサシン  １μｇ／ｍｌ；
・シプロフロキサシン  ４μｇ／ｍｌ；
・（シプロフロキサシンを有さない）生育可能なコントロール
を含む一連のバイアルに、１ｍｌにつき１０６細胞数の濃度にバクテリア懸濁液を希釈する。
２．３５℃で、１分間につき１５０ストロークで３０分間培養した後、５分間、１００００ｒｐｍで一連のバイアルを遠心分離機にかける。
３．暗闇の中で３０分間、１：１０００００の最終希釈物となるようにサイバーグリーンを（ＴＥで調整、ｐＨ＝７．５）に添加する。
４．５３０／３０ｎｍ−ＦＬ１でフローサイトメトリック収集を実行し、未処理の細胞と処理された細胞の蛍光強度を比較する。
【００４７】
［結果解釈基準：］
シプロフロキサシンは、ＤＮＡジャイレースを阻害することによって作用し、ＤＮＡ複製をブロックし、蛍光色素のサイバーグリーンへのターゲットである１本鎖ＤＮＡ（less double stranded DNA）に導く。従って、シプロフロキサシンの感受性菌株（ＭＩＣ値＜１μｇ／ｍｌ）が（より低い蛍光強度に相当する）２本鎖ＤＮＡの削減（redution）を示すことが期待される。
【００４８】
処理された細胞と未処理の細胞（生育可能なコントロール）の緑色蛍光の強度（５３０／３０ｎｍ；ＦＬ−１）の比率に基づいて増殖能（ＳＩ：staining index）を計算する。
・シプロフロキサシン１μｇ／ｍｌでＳＩ＜１の場合、感受性バクテリア（Susceptible bacteria）
・シプロフロキサシン４μｇ／ｍｌでＳＩ≧１の場合、耐性バクテリア（Resistant bacteria）
【００４９】
［実施例  ｎｏ．２］
［カルバペネムに対するグラム陰性バクテリアの感受性評価］
・微生物剤：緑膿菌
・試験した薬：カルバペネム−メロペネム（３つのブレークポイント濃度：１，２及び４μｇ／ｍｌ）
・使用した蛍光色素：ビス（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（３））−膜電位測定用の電位感受性親油性アニオン；脱分極させた細胞の蛍光強度が高いほど、分極した細胞はより低い値を示す。
１．以下の通り、
・メロペネム  １μｇ／ｍｌ；
・メロペネム  ４μｇ／ｍｌ；
・生育可能なコントロール（メロペネム未添加）
を含む一連のバイアルに、１ｍｌにつき１０６細胞数の濃度にバクテリア懸濁液を希釈する。
２．３５℃で、１分間につき１５０ストロークで３０分間培養した後、暗闇の中で３０分間、１μｇ／ｍｌの最終希釈物となるようにＤｉＢＡＣ４（３）を添加する。
３．５３０／３０ｎｍ−ＦＬ１でフローサイトメトリック収集を実行し、未処理の細胞と処理された細胞の蛍光強度を比較する。
【００５０】
［結果解釈基準：］
メロペネムは、バクテリア細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することによって作用する殺菌剤である。メロペネム細胞膜の脱分極は、感受性菌株でＤｉＢＡＣ４（３）によって迅速に検出される。脱分極した細胞は蛍光強度が高ければ高いほど、分極した細胞はより低い値を示す。
【００５１】
抗菌薬と（未処理の）コントロール細胞での以下の処理が行われた脱分極した細胞の緑色蛍光の強度（５３０／３０ｎｍ；ＦＬ−１）の比率に基づいて増殖能（ＳＩ：staining index）を計算する。
・メロペネム１μｇ／ｍｌでＳＩ＜１の場合、感受性バクテリア（Susceptible bacteria）
・メロペネム４μｇ／ｍｌでＳＩ≧１の場合、耐性バクテリア（Resistant bacteria）
【００５２】
［実施例  ｎｏ．３］
［オキサシリンに対するスタフィロコッカス・アウレウスの感受性評価］
・微生物剤：スタフィロコッカス・アウレウス
・試験した薬：オキサシリン（２つの濃度：２４μｇ／ｍｌ及び４μｇ／ｍｌ）
・使用した蛍光色素：ＦＤＡ（フルオレセイン二酢酸）、細胞生存率の蛍光指示薬；エステラーゼによってＦＤＡが加水分解し、生育可能な細胞はフルオレセインを形成する。
１．以下の通り、
・オキサシリン  ２μｇ／ｍｌ；
・オキサシリン  ４μｇ／ｍｌ；
・生育可能なコントロール（オキサシリン未添加）
を含む一連のバイアルに、１ｍｌにつき１０６細胞数の濃度にバクテリア懸濁液を希釈する。
２．３５℃で、１２０分間培養した後、ＦＤＡ１μｇ／ｍｌを添加し、同じ条件で６０分間培養する。
３．５３０／３０ｎｍ−ＦＬ１でフローサイトメトリック収集を実行し、未処理の細胞と処理された細胞の蛍光強度を比較する。
【００５３】
［結果解釈基準：］
オキサシリンは、バクテリア細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することによって作用する殺菌剤である。従って、オキサシリンに対する感受性菌株（ＭＩＣ値≦２μｇ／ｍｌ）は、より低い蛍光フルオレセインの強度に対応するように、代謝活性（metabolic activity）の低下を示す。
【００５４】
処理された細胞と未処理の細胞（生育可能なコントロール）の緑色蛍光の強度（５３０／３０ｎｍ；ＦＬ−１）の比率に基づいて増殖能（ＳＩ：staining index）を計算する。
・オキサシリン２μｇ／ｍｌでＳＩ＜１の場合、感受性バクテリア（Susceptible bacteria）
・オキサシリン４μｇ／ｍｌでＳＩ≧１の場合、耐性バクテリア（Resistant bacteria）
【００５５】
［実施例  ｎｏ．４］
［バンコマイシンに対するグラム陽性バクテリアの感受性評価］
・微生物剤：エンテロコッカス・フェカリス
・試験した薬：グリコペプチド−バンコマイシン（２つのブレークポイント濃度：４μｇ／ｍｌ及び１６μｇ／ｍｌ）
・使用した蛍光色素：ＦＤＡ（フルオレセイン二酢酸）、細胞生存率の蛍光指示薬；エステラーゼによる加水分解で生育可能な細胞、ＦＤＡはフルオレセインを形成し、蛍光発光を増加する。
１．以下の通り、
・バンコマイシン  ４μｇ／ｍｌ；
・バンコマイシン  １６μｇ／ｍｌ；
・生育可能なコントロール（バンコマイシン未添加）
を含む一連のバイアルに、１ｍｌにつき１０６細胞数の濃度にバクテリア懸濁液を希釈する。
２．３５℃で、１分間につき１５０ストロークで、６０分間培養した後、ＦＤＡ１μｇ／ｍｌを添加し、同じ条件で３０分間培養する。
３．５３０／３０ｎｍ−ＦＬ１でフローサイトメトリック収集を実行し、未処理の細胞と処理された細胞の蛍光強度を比較する。
【００５６】
［結果解釈基準：］
バンコマイシンは、バクテリア細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することによって作用する殺菌剤である。従って、バンコマイシンに対する感受性菌株（ＭＩＣ値≦２μｇ／ｍｌ）は、より低い蛍光フルオレセインの強度に対応するように、代謝活性の低下を示す。
【００５７】
処理された細胞と未処理の細胞（生育可能なコントロール）の緑色蛍光の強度（５３０／３０ｎｍ；ＦＬ−１）の比率に基づいて増殖能（ＳＩ：staining index）を計算する。
・バンコマイシン４μｇ／ｍｌでＳＩ＜１の場合、感受性バクテリア（Susceptible bacteria）
・バンコマイシン１６μｇ／ｍｌでＳＩ≧１の場合、耐性バクテリア（Resistant bacteria）
【００５８】
［実施例  ｎｏ．５−抵抗メカニズムの研究］
［基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬｓ）による耐性］
・微生物剤：肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）
・試験した薬：セフォタキシム（ＣＴＸ）、及び、セフタジジム（ＣＡＺ）（２つのブレークポイント濃度：ＣＴＸに対して、１μｇ／ｍｌ及び４μｇ／ｍｌ、ＣＡＺに対して、４μｇ／ｍｌ及び１６μｇ／ｍｌ）
・試験した薬阻害剤：クラブラン酸（ＣＬＡ）−４μｇ／ｍｌ
・使用した蛍光色素：ビス（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（３））−膜電位測定用の電位感受性親油性アニオン
１．以下の通り、
・ＣＴＸ  １μｇ／ｍｌ；
・ＣＴＸ  ４μｇ／ｍｌ；
・ＣＴＸ  １μｇ／ｍｌ＋ＣＬＡ  ４μｇ／ｍｌ；
・ＣＴＸ  ４μｇ／ｍｌ＋ＣＬＡ  ４μｇ／ｍｌ；
・ＣＡＺ  ４μｇ／ｍｌ；
・ＣＡＺ  １６μｇ／ｍｌ；
・ＣＡＺ  ４μｇ／ｍｌ＋ＣＬＡ  ４μｇ／ｍｌ；
・ＣＡＺ  １６μｇ／ｍｌ＋ＣＬＡ  ４μｇ／ｍｌ；
・生育可能なコントロール（セファロスポリン未添加）
を含む一連のバイアルに、１ｍｌにつき１０６細胞数の濃度にバクテリア懸濁液を希釈する。
２．３５℃で、１分間につき１５０ストロークで、３０分間培養した後、暗闇の中で３０分間、１μｇ／ｍｌの最終希釈物にＤｉＢＡＣ４（３）を添加する。
３．適切なプロトコルでフローサイトメトリック収集を実行し、５３０／３０ｎｍ−ＦＬ１で読み込む。
【００５９】
［結果解釈基準：］
ＥＳＢＬｓは、セファロスポリン（ＣＴＸ及びＣＡＺ）を加水分解させる能力に基づいて検出されるが、クラブラン酸（ＣＬＡ）によって阻害される。すなわち、ＥＳＢＬｓがＣＬＡと関連するセファロスポリンへの暴露によって感受性を獲得するとき、ＥＳＢＬｓの生成を介してセファロスポリン耐性バクテリアを検出することが考えられる。
【００６０】
ＣＬＡの存在の有無と無関係に、最も高い濃度の両セファロスポリン（４μｇ／ｍｌのセフォタキシム（ＣＴＸ）及び１６μｇ／ｍｌのセフタジジム（ＣＡＺ））で以下の処理が行われ、脱分極した細胞の緑色蛍光の強度（５３０／３０ｎｍ；ＦＬ−１）の比率に基づいて増殖能を計算する。このように特殊な場合、ＣＬＡ指数と呼ぶ。
・（少なくとも１つのセファロスポリンに対して）ＣＬＡ指数＞１．５の場合、ＥＳＢＬ製造バクテリア（ESBL producer bacteria）
・ＣＬＡ指数≦１．５の場合、ＥＳＢＬ産生陰性バクテリア（ESBL negative producer bacteria）
【００６１】
［実施例  ｎｏ．６］
［酵母菌に対する陽性培養血液由来の薬剤の組合せの感受性評価］
濾過及び溶血剤の使用、又は分離チューブ及び遠心分離器の使用。
・グラム−酵母菌又はカンジダ・アルビカンスのMaldiTof分析を実行する。
・試験した薬剤：分離され、関連性のある、アニデュラファンギン及びフルコナゾールの単独及び混合（anidulafungin and fluconazole isolated and in association）
・使用した蛍光色素：ＦＵＮ−１、酵母菌の生存率を研究するために使用される蛍光マーカー（注：生存能を有さない細胞は、生存能を有する（未処理の）細胞よりより高い蛍光強度を示す）
・単独及び混合と抗真菌薬とを３７℃で６０分間培養した後、暗闇の中で３０分間、０．５μｇ／ｍｌの最終希釈物となるようにＦＵＮ−１を添加する。
【００６２】
５７５ｎｍ−ＦＬ２でフローサイトメトリック収集を実行し；蛍光指数（index of fluorescence）は、抗真菌薬と関連する処理された細胞の蛍光と、抗真菌薬にてそれぞれ単独で処理された細胞の蛍光との割合の合計として計算される。関連性は、相乗的（synergic）、不関（indifferent）、又は拮抗（antagonistic）として分類される。
【００６３】
［結果解釈基準：］
インビトロでの薬剤相互作用の評価は、増殖能（ＳＩ）に従って分析された。ＳＩは、
薬剤の組合せ（０．５×ＭＩＣの各薬剤）で処理された細胞によって表された平均蛍光強度の合計を、薬剤のみの蛍光で除すことで算出した。従って、
ＳＩ＝（ＭＩＦ ＡＮＤ＋ＦＬＵ／ＭＩＦ ＡＮＤ）＋（ＭＩＦ ＡＮＤ＋ＦＬＵ／ＭＩＦ ＦＬＵ）（処理された細胞と生育可能な細胞の平均蛍光強度の間のＭＩＦ−割当）。関連性は、ＳＩ＜１に対して「拮抗（antagonism）」、ＳＩ＝１〜４に対して「不関（indifferent）」、ＳＩ＞４に対して「相乗的（synergy）」として規定された。
【００６４】
［実施例  ｎｏ．７］
［アスペルギルス・フミガーツスの抗真菌薬感受性］
・アスペルギルス・フミガーツスの高密度懸濁液の調製；
・一連のBactec社のMycosis IC/Fバイアル、又は自動化したBactec社の装置（Becton Dickinson）のＭＧＩＴチューブでの、１０７胞子／ｍｌの培養；
・各々は抗真菌薬（コントロール）を有さない１つのバイアル又はチューブを、アムホテリシンＢを有する１つのバイアル又はチューブを、ポサコナゾールを有する１つのバイアル又はチューブを、そして、ボリコナゾールを有する１つのバイアル又はチューブを含み；
・バイアル又はチューブは、それぞれのBactec社の装置において培養し、陽性になるまでの時間を記録した。
【００６５】
［結果解釈基準：］
抗真菌薬と培養された感受性菌株は、コントロールと比較して、陽性になるまでの時間が２倍以上かかる。ＭＧＩＴチューブは、Bactec社のバイアルより迅速に結果を出す（例．コントロールサンプルは、Bactec社のバイアルで７±１時間かかるのに対して、ＭＧＩＴチューブで１１±１時間かかる）。
【００６６】
［実施例  ｎｏ．８］
［生体液由来の微生物抗菌性数量化］
・定量化したい抗菌剤と培養する場合、公知のフローサイトメトリック線量効果曲線を有するコントロール菌株を使用；
・コントール菌株と微生物サンプルを培養；
・抗菌効果を評価する適切な蛍光マーカーで上述の２サンプルをラベルする；
・フローサイトメーター蛍光・点在シグナルの取得し、前記微生物のプロファイルを生成する。
【００６７】
［結果解釈基準：］
コントロールサンプル曲線と、生成されたフローサイトメトリックプロファイルを比較し、サンプルでの現濃度を推定する。
【００６８】
もちろん、本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、当業者であれば本発明の基本的思想から逸脱することなく、多くの改変を行うことができる。
【図１】
0006587643.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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