(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィッカーハモミセス属酵母を、下記式（１）：
【化１】
0006514867.tif 000010
〔式中、Ｘは炭素数１〜３のアルキル基を示し、ｎは６又は７の整数を示す。〕
で表される不飽和脂肪酸エステルを含有する培地で培養する工程を含む、下記式（２）：
【化２】
0006514867.tif 000011
〔式中、Ｙ１〜Ｙ３は独立して水酸基又はアセチル基を示し、Ｙ４は水素原子又はアセチル基を示し、ｎは前記と同じ数を示す。但し、Ｙ１〜Ｙ４の内、少なくとも３つ以上はアセチル基を示す。〕
で表されるアセチルスフィンゴイドの製造方法。
【請求項２】
ウィッカーハモミセス属酵母が、ウィッカーハモミセス・シフェリイである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
Ｘがメチル基又はエチル基である請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた不飽和を含むアセチルスフィンゴイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質は、Ｌ-セリンとパルミトイル-ＣｏＡなどのアシル-ＣｏＡの縮合反応から始まる生合成により合成される。基本構造であるスフィンゴイド塩基として、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）、６−ヒドロキシスフィンゴシンなどが知られており、これらスフィンゴイド塩基と種々の脂肪酸がアミド結合することで多種類のセラミドが合成される。セラミドＩ、II、Ｖ、IV、VII、VIIIはスフィンゴイドの側鎖にアルケニル基を有する。
【０００３】
スフィンゴ脂質は多くの生理機能を有している。特にセラミド及びスフィンゴイド塩基は皮膚の保湿機能、バリア機能に関与し、皮膚からの水分蒸散を防止し、外界からの様々な刺激から人体を守る役割を担っている。ヒトの皮膚にはスフィンゴイド塩基としてスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、６−ヒドロキシスフィンゴシンが存在するが、動物、植物、昆虫など他の生物からさらに多様な構造のスフィンゴイド塩基を含むスフィンゴ脂質が検出され（非特許文献１）、それらの機能および生理活性解析が進められている。しかし、それらの多くは未だ効率的な生産方法が構築されていない。
【０００４】
スフィンゴ脂質の製造法は多く検討されているが、動物及び植物由来スフィンゴ脂質は分離精製が困難なため、近年、酵母による発酵を用いたスフィンゴ脂質の生産法の開発が進められている。候補酵母株として、ピチア・シフェリイ(Pichia ciferrii；現在はウィッカーハモミセス・シフェリイ（Wickerhamomyces ciferrii））、カンジダ・ユチリス(Candida utilis)及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられているが、テトラアセチルフィトスフィンゴシンを菌体外に分泌するウィッカーハモミセス・シフェリイを利用してテトラアセチルフィトスフィンゴシンを得る方法が有用である（特許文献１）。
【０００５】
斯かるウィッカーハモミセス・シフェリイにおけるテトラアセチルフィトスフィンゴシン合成の律速段階は、生合成経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析より、セリンとパルミトイル−ＣｏＡの縮合反応及びフィトスフィンゴシンのアセチル化反応であることが明らかにされ（非特許文献２）、アセチル化酵素としてＳＬＩ１とＡＴＦ２の二つが見出されている。このうち、ＳＬＩ１は、サッカロマイセス・セルビシエにおいて、これを発現させた場合にトリアセチルフィトスフィンゴシンを産生することから（非特許文献３）、フィトスフィンゴシンの３つの水酸基及び１つのアミノ基のうちの何れか３箇所のアセチル化に関与すると考えられている。
【０００６】
しかしながらこの生産方法では、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシン（非特許文献４）の生産は確認されているが、それ以外の構造のアセチルスフィンゴイドの生産はこれまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平９−５０４４３４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sarah T. P. et. al., J. Lipid Res., 49, 1621, (2008)
【非特許文献２】Barenholz, Y. et. al., Biochem. Biophys. Acta, 306, 341, (1973)
【非特許文献３】Veld, F. et. al., Appl. Microbiol, Biotechnol., 97, 19, 8537 (2013)
【非特許文献４】Borgel, D. et. al., Metab. Eng., 14, 412, (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵母を用いて、側鎖にアルケニル基を有するアセチルスフィンゴイドを製造する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ウィッカーハモミセス（Wickerhamomyces）属酵母を、下記式（１）で表される不飽和脂肪酸エステルを含有する培地で培養した場合に、下記式（２）で表されるアセチルスフィンゴイドを製造できることを見出した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の方法に係るものである。
ウィッカーハモミセス属酵母を、下記式（１）：
【００１２】
【化１】
0006514867.tif 000002
【００１３】
〔式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは６又は７の整数を示す。〕
で表される不飽和脂肪酸エステルを含有する培地で培養する工程を含む、下記式（２）：
【００１４】
【化２】
0006514867.tif 000003
【００１５】
〔式中、Ｙ１〜Ｙ３は独立して水酸基又はアセチル基を示し、Ｙ４は水素原子又はアセチル基を示し、ｎは前記と同じ数を示す。但し、Ｙ１〜Ｙ４の内、少なくとも３つ以上はアセチル基を示す。〕
で表されるアセチルスフィンゴイドの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、所望の不飽和脂肪酸エステルを培地に添加する簡易な方法で、側鎖にアルケニル基を有するアセチルスフィンゴイドを製造することができる。当該アセチルスフィンゴイドは、側鎖にアルケニル基を有するスフィンゴイドを含むセラミドの合成原料として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において用いられるウィッカーハモミセス（Wickerhamomyces）属酵母としては、セリンと不飽和脂肪酸エステルからスフィンゴイドを生産し、当該スフィンゴイドをアセチル化する能力を有するものであればよく、自然界から分離された野性株であっても、該野生株から誘導された変異株であってもよい。ウィッカーハモミセス属酵母としては、例えば、ウィッカーハモミセス・シフェリイ（旧名：ピチア・シフェリイ（Pichia ciferrii））が好ましい。また、ウィッカーハモミセス・シフェリイとしては、具体的にはウィッカーハモミセス・シフェリイ  ＡＴＣＣ１４０９１株、ＡＴＣＣ３２２９２株、ウィッカーハモミセス・シフェリイ  ＮＢＲＣ０７９３株、ＮＢＲＣ０９０５株等が使用できる。
斯かるウィッカーハモミセス属酵母の使用量は、反応時間や菌体当たりの活性を考慮して適宜決定されるが、１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上であり、且つ１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ以下、好ましくは１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ以下である。ＣＦＵ／ｍＬとは、Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔの略であり、１ｍＬ中に存在する菌体の数を示す。
【００１８】
培地に含有させる式（１）で表される不飽和脂肪酸エステルにおいて、Ｘで示される炭素数１〜４のアルキル基としては、直鎖又は分岐の何れでもよい。例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基である。
【００１９】
本発明において、不飽和脂肪酸エステルは、式（１）で示されるように、二重結合における立体異性はトランス（Ｅ）であるものが用いられる。後記実施例に示すようにトランス体を用いることにより、対応するアセチルスフィンゴイドの製造が可能となる。
好適な不飽和脂肪酸エステルとして、ｎが６であるトランス−９−ヘキサデセン酸メチル、ｎが７であるトランス−１０−へプタデセン酸メチルが挙げられる。
【００２０】
斯かる不飽和脂肪酸エステルは、反応効率の点から、反応系中の濃度が、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは２０ｍＭ以上であり、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは  １００ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下となるように使用される。また、好ましくは１〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭ、更に好ましくは２０〜５０ｍＭとなるように使用される。
【００２１】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができ、合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。市販の培養培地を使用してもよい。
【００２２】
培地に使用される炭素源及び窒素源は培養する微生物株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【００２３】
また、培養培地としては、例えば、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、２％  Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％  Ｇｌｕｃｏｓｅを含むＹＰＤ培地、０．３％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．３％  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％  Ｇｌｕｃｏｓｅを含むＹＭ培地、０．３〜０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．３〜０．５％  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５〜０．７％  Ｐｅｐｔｏｎｅ、１〜１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むＹＭｇl培地等が挙げられる。
【００２４】
また、斯かる培地には、適宜、Ｌ−セリン、塩化カルシウム等を添加することができる。これにより、アセチルスフィンゴイドの生成効率を向上させることができる。
【００２５】
培養温度は、例えば２０℃以上、好ましくは２５℃以上であり、３５℃以下、好ましくは３３℃以下が挙げられ、また２０〜３５℃、好ましくは２５〜３３℃が挙げられる。
培養時間は、例えば２４時間以上、好ましくは４８時間以上、好ましくは７２時間以上であり、１２０時間以下、好ましくは９６時間以下が挙げられる。また、２４〜１２０時間、好ましくは４８〜９６時間が挙げられる。
【００２６】
斯かる培養により、培養液中に式（２）で表されるアセチルスフィンゴイドが蓄積する。ここで、得られるアセチルスフィンゴイドは、式（２）中のＹ１〜Ｙ４の内、いずれか３つがアセチル基であるトリアセチル化物と、Ｙ１〜Ｙ４が全てアセチル基であるテトラアセチル化物の混合物である。
【００２７】
培養終了後の培養液からアセチルスフィンゴイドを回収する方法は、特に限定されず、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から必要に応じて菌体を除去した後に、有機溶剤により溶剤抽出してアセチルスフィンゴイドを採取することができる。
【００２８】
前記溶剤抽出に用いる有機溶剤としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール、メタノール、酢酸エチル等を挙げることができる。このうち、アセチルスフィンゴイドの抽出効率向上、生産コスト低減の観点から、クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、及びヘキサンからなる群から選ばれる１種又は２種以上が好ましく、より好ましくはクロロホルム−メタノール混合溶液である。
抽出時の培養物と有機溶剤の重量比（培養物／有機溶剤）は、アセチルスフィンゴイドの抽出効率向上、生産コスト低減の観点から、１／１〜１／２０が好ましく、より好ましくは１／１〜１／１０、より好ましくは１／１〜１／５である。
【００２９】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ウィッカーハモミセス属酵母を、下記式（１）：
【００３０】
【化３】
0006514867.tif 000004
【００３１】
〔式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは６又は７の整数を示す。〕
で表される不飽和脂肪酸エステルを含有する培地で培養する工程を含む、下記式（２）：
【００３２】
【化４】
0006514867.tif 000005
【００３３】
〔式中、Ｙ１〜Ｙ３は独立して水酸基又はアセチル基を示し、Ｙ４は水素原子又はアセチル基を示し、ｎは前記と同じ数を示す。但し、Ｙ１〜Ｙ４の内、少なくとも３つ以上はアセチル基を示す。〕
で表されるアセチルスフィンゴイドの製造方法。
＜２＞ウィッカーハモミセス属酵母が、ウィッカーハモミセス・シフェリイである＜１＞の製造方法。
＜３＞不飽和脂肪酸エステルが、トランス−９−ヘキサデセン酸メチル又はトランス−１０−へプタデセン酸メチルである＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞反応系中の不飽和脂肪酸エステルの濃度が、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは２０ｍＭ以上であり、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下であるか、又は、好ましくは１〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭ、更に好ましくは２０〜５０ｍＭである、＜１＞〜＜３＞の何れかの方法。
【実施例】
【００３４】
実施例１〜２  アセチルスフィンゴイドの生産
（１）ウィッカーハモミセス・シフェリイＡＴＣＣ１４０９１株をＹＰＤ寒天培地に塗布して培養し、生育したコロニーを５ｍＬのＹＰＤ培地（２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％  Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌した後、２５℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。
得られた培養液を５ｍＬのＹＭｇl培地（１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５％ Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．４％  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．４％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、５０ｍＭ 塩化カルシウム二水和物及び２５ｍＭ Ｌ−セリン）を含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、表２に示す不飽和脂肪酸エステル（トランス−９−ヘキサデセン酸メチル、トランス−１０−へプタデセン酸メチル）を所定濃度となるように添加し、２５℃、２５０ｒｐｍにて３日間培養した。
反応終了後、１ｍＬの培養液に４ｍＬのクロロホルム：メタノール＝２：１混合溶液を添加し、ボルテックスにてよく混和した後、約15分静置してから３０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、下層（クロロホルム層）から生成物を回収した。回収したクロロホルム層は窒素にて乾固させ、メタノールに再懸濁して適宜希釈し、フィルター濾過してからＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて次の条件で分析した。
【００３５】
ＬＣ条件：Ｃａｐｃｅｌｌ  ｃｏｒｅ  Ｃ１８  ２．７  ｕｍφ２．１×５０ｍｍ（資生堂）、Ｏｖｅｎ  Ｔｅｍｐ．  ４０℃、Ｓｏｌ．Ａ：  ０．１％  ＨＣＯ２Ｈ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ、Ｓｏｌ．Ｂ：  ＭＥＣＮ、（Ａ６０％、Ｂ４０％）  ０．５ｍｉｎ→［（Ａ６０％、Ｂ４０％）→（Ａ０％、Ｂ１００％）５．５ｍｉｎ］→Ｂ１００％  ２ｍｉｎ、［（Ａ０％、Ｂ１００％）→（Ａ６０％、Ｂ４０％）０．０１ｍｉｎ］→（Ａ６０％、Ｂ４０％）２ｍｉｎ、Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、Ｉｎｊｅｃｔ  ５μｌ、ＭＳ／ＭＳ装置：ＡＰＩ３２００ＱＴｒａｐ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）
得られた分析値はトリアセチル化物についてはトリアセチルフィトスフィンゴシン、テトラアセチル化物についてはテトラアセチルフィトスフィンゴシンの検量線を用いて濃度を算出し、定量値とした。
【００３６】
【表１】
0006514867.tif 000006
【００３７】
（２）結果
表２に示すとおり、トランス−９−ヘキサデセン酸メチル（実施例１）及びトランス−１０−へプタデセン酸メチル（実施例２）を添加した場合には、対応するアセチルスフィンゴイドが生成された。
【００３８】
【表２】
0006514867.tif 000007
【００３９】
比較例１〜３
上記実施例において、添加する不飽和脂肪酸エステルを、表３に示すシス−９−ヘキサデセン酸メチル又はシス−１０−へプタデセン酸メチル、表４に示すトランス−９−オクタデセン酸メチルに換え、同様に培養して生成物を回収し、定量した。結果を表３及び４に併せて示す。
【００４０】
【表３】
0006514867.tif 000008
【００４１】
【表４】
0006514867.tif 000009
【００４２】
表３及び４に示すとおり、シス−９−ヘキサデセン酸メチル（比較例１）及びシス−１０−へプタデセン酸メチル（比較例２）添加した場合には、対応するアセチルスフィンゴイドは殆ど生産されなかった。また、側鎖の炭素数が多いトランス−９−オクタデセン酸メチル（比較例３）を添加した場合でも対応するアセチルスフィンゴイドは生産されなかった。