(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、プロモーター活性を有する分離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーター活性を有する分離された核酸分子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、目的タンパク質発現カセット。
【請求項３】
請求項１に記載の分離された核酸分子又は請求項２に記載の目的タンパク質発現カセットを含む、組換えベクター。
【請求項４】
前記目的タンパク質をコードする遺伝子が、ＡＴＰＥ遺伝子である、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のベクターが導入された、組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が、コリネバクテリウム属微生物である、請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム又はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記微生物が、エシェリキア属微生物である、請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記エシェリキア属微生物が、大腸菌である、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
（ａ）請求項５に記載の組換え微生物を培地で培養して目的タンパク質を生産する段階、及び
（ｂ）前記微生物又は培地から生産された目的タンパク質を回収する段階を含む、目的タンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項４に記載のベクターが導入された微生物を培養する段階、及び
（ｂ）前記培養した微生物をフルクトースと反応させてプシコース（psicose）を生産
する段階を含む、プシコース生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なプロモーター、それを含むベクター、前記ベクターを含む微生物、及び前記プロモーターを用いて目的タンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飼料、医薬品、食品などの様々な用途とすることが可能なアミノ酸又は有用物質など
の生産菌株として用いられるコリネバクテリウム属微生物において、生産量の増大のための生合成経路上の遺伝子操作及び／又は外部遺伝子導入などの努力が続いてきた（特許文献１）。このようなコリネバクテリウム属微生物で目的遺伝子の過発現を誘導するためには、高効率の遺伝子発現システムが必要である。その中でプロモーターは、遺伝子発現に最も大きく関与する要素であるため、遺伝子発現システムでは、プロモーターの選択が最も重要である。現在までにコリネバクテリウム属微生物で用いることが可能なプロモーターは、大腸菌由来のいくつかのプロモーター（Ｐｌａｃ、Ｐｔｒｃ、Ｐｔａｃ）とコリネバクテリウム属微生物由来のいくつかのプロモーター（Ｐｓｏｄ、Ｐｅｆｔｕ、ＰｇａｐＡ）などが用いられてきた。しかし、これらを用いたコリネバクテリウム属微生物の遺伝子発現システムは、ほとんどの大腸菌遺伝子発現システムに比べて低い発現効率を示した。
【０００３】
そこで、コリネバクテリウム属微生物の遺伝子発現システムで高い発現効率を示すプ
ロモーターの開発の必要性が依然として要求されているのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２０１１−００３５８０５号
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−０６２００９２号
【特許文献４】大韓民国登録特許第１０−１２０３８５６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Manual of Methods for General Bacteriology．American Society for Bacteriology．Washington D.C.、USA、1981
【非特許文献２】“Biochemical Engineering”by James M. Lee、Prentice−Hall International Editions、pp 138−176
【非特許文献３】Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248−254
【非特許文献４】FEMS Microbiology Letters 194, 127−133, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、コリネバクテリウム属微生物菌株で強く遺伝子発現を誘導することができるプロモーターを発掘するために鋭意努力した結果、最終的に新規なプロモーターを開発し、その高い活性を確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、プロモーター活性を有する新規な核酸分子を提供することにある。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、前記プロモーター活性を有する核酸分子及び目的タンパク
質をコードする遺伝子を含む、目的タンパク質発現カセットを提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記プロモーター活性を有する核酸分子を含む、組換えベクターを提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記ベクターが導入された、組換え微生物を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記ベクターが導入された、組換え微生物を用いて目的タンパク質を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、（ａ）前記ベクターが導入された微生物を培養する段階、及び（ｂ）前記培養した微生物をフルクトースと反応させてプシコース（psicose）を生
産する段階を含む、プシコース製造方法を提供することにある。 
【発明の効果】
【００１３】
本発明により確保されたプロモーターは、既存の組換え微生物でタンパク質の大量生産に用いられたプロモーターに比べて、著しく増加された遺伝子発現率を示すため、コレネバクテリウム属又はエシェリキア属微生物を発現宿主として、高収率で機能性素材を生産しようとする食品、製薬、農業産業に有用に用いることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２のベクターマップを示す。
【図２】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ＡＴＰＥ（ＦＩＳ−４−ＡＴＰＥ）を用いて、フルクトース基質と反応させた後のＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。
【図３】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７− Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥ（ＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ）を用いて、フルクトース基質と反応させた後のＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。
【図４】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７− Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥ−２（ＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２）を用いて、フルクトース基質と反応させた後のＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は一つの様態としてプロモーター活性を有する核酸分子を提供する。具体的には、前記プロモーター活性を有する核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子であってもよい。本発明で前記配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーター活性を有する核酸分子は、「ｓｐｌ１プロモーター」又は「Ｐｓｐｌ１」と混用されてもよい。
【００１６】
また、プロモーター活性を有する核酸分子は、プロモーターと命名されてもよく、本明細書では前述された用語が全て用いられる。
【００１７】
本発明のプロモーターは、目的とする微生物で前記プロモーター活性を有する核酸分子と作動可能に連結された目的遺伝子の発現をもたらすことができ、配列番号１のヌクレオチド配列を有してもよいが、これに限定されない。
【００１８】
また、本発明のプロモーター配列は、従来知られている突然変異誘発法、例えば方向性進化法及び部位特異的突然変異法などにより当業者が容易に変形してもよい。したがって、前記プロモーターは前記配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、具体的には、
８０％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上、またさらに具体的には、９８％以上、最も具体的には、９９％以上の相同性を示すヌクレオチド配列も制限なく含まれてもよい。また、このような相同性を有するヌクレオチド配列であって、プロモーター活性を有するヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、又は付加されたヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００１９】
本発明における用語「相同性」は、二つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分（moiety）との間の同一性のパーセントをいう。一つの部分（moiety）から、もう一つの部分（moiety）までの配列間相同性は、周知の当該技術により決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば、スコア（score）
、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を直接
整列して決定することができる（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドの混成化後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより分解して分解された断片の大きさを決定することにより、決定することができる。
【００２０】
本発明における用語「プロモーター」とは、ポリメラーゼの結合部位を含み、プロモーター下位遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、暗号化領域の上位（upstream）非解読された核酸配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域をいう。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置することができる。
【００２１】
本発明のプロモーター核酸分子は、標準的な分子生物学技術を用いて分離又は製造することができる。例えば、自動化されたＤＮＡ合成器を用いる標準合成技術を用いて製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明のプロモーター活性を有する核酸分子がプロモーターとして機能しうる細胞の種類は、特に制限されないが、具体的には、コリネバクテリウム属微生物又はエシェリキア属微生物を挙げることができ、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、大腸菌などを挙げることができ、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム又は大腸菌であるが、これらに限定されず、コリネバクテリウム属微生物又はエシェリキア属微生物であれば、制限なく含まれることができる。
【００２３】
本発明は、もう一つの様態として、前記プロモーター活性を有する核酸分子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、目的タンパク質発現カセットを提供する。
【００２４】
前記核酸分子は、前記で説明したとおりである。
【００２５】
本発明における用語「発現カセット」とは、プロモーターと目的タンパク質とをコードする遺伝子が含まれていて、プロモーターの下流に作動可能に連結されている目的のタンパク質を生産するために発現させることができる単位カセットを意味する。このような発現カセットの内部又は外部には、前記目的タンパク質の効率的な生産に有用な様々な因子が含まれうる。
【００２６】
前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができる。
【００２７】
前記目的タンパク質の発現カセットは、具体的には、プロモーター配列の下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されたものであってもよい。
【００２８】
本発明における用語「目的タンパク質」は、微生物から発現させようとするタンパク質をいう。具体的には、組換え微生物から発現させようとするタンパク質であれば、制限なく含むことができ、その例として、ＡＴＰＥ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
前記ＡＴＰＥ遺伝子はプシコース（psicose）エピマー化酵素であって、フルクトース
をプシコースに転換させる活性を有するプシコース−３−エピマー化酵素を意味する。前記ＡＴＰＥ遺伝子の配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースを介して、当業者が容易に入手することができる。また、これらに限定されるものではないが、前記酵素は、その例として特許文献２の配列番号１のアミノ酸配列を有するか又はその機能性断片であってもよい。前記「機能性断片」とはアミノ酸配列に一部のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などによる変異を含み、フルクトースフルクトースをプシコースに転換させる活性を有する断片であれば、特に制限されない。
【００３０】
前記ＡＴＰＥ遺伝子は、本発明のプロモーター活性を有する核酸分子に作動可能に連結される目的遺伝子の一つとして単に例示的なものである。組換え微生物から発現することができるタンパク質であれば、制限なく目的タンパク質として用いることができる。
【００３１】
本発明における用語「作動可能に連結」とは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列が目的タンパク質をコードする遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３２】
作動可能な連結は、当業界の公知された遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これに限定されない。
【００３３】
本発明は、もう一つの様態として、前記プロモーター活性を有する核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００３４】
前記核酸分子については、前記で説明したとおりである。
【００３５】
前記組換えベクターは、目的タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでもよい。すなわち、前記目的タンパク質発現カセットを含んでもよい。前記遺伝子は、ベクター内で前記プロモーター活性を有する核酸分子に作動可能に連結された形態であってもよい。
【００３６】
本発明の用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的遺伝子を発現させることができるように遺伝物質を保有する人工的なＤＮＡ分子であり、具体的には、適切な調節配列に作動可能に連結された遺伝子のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができるが、これに制限されない。本発明の目的上、前記プロモーターは、本発明のｓｐｌ１プロモーターであってもよい。
【００３７】
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及
びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＢＬ３、λＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。本発明で用いることができるベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターとすることができる。その例として、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＥＳ２０８、ｐＸＭＪ１９ベクターなどを用いることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に内在プロモーターを本発明のプロモーター活性を有する核酸分子と交換することができる。前記核酸分子の染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されることができるため、前記染色体への挿入の可否を確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含むことができる。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子の挿入の可否を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性又は表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーを使いることができる。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別
マーカーを発現する細胞のみが生存するか、又は他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【００３９】
したがって、本発明の前記配列番号１のヌクレオチド配列を有する、プロモーター活性を有する核酸分子に目的遺伝子が作動可能に連結されないベクターであっても、宿主細胞、その例としてコリネバクテリウム属微生物内の内在プロモーターと相同組換えによって交換されうる。これにより宿主細胞、例えば、コリネバクテリウム属微生物の内在的遺伝子を過発現させることができる。
【００４０】
前記組換えベクターにおいて、これに限定されるものではないが、前記の目的タンパク質をコードする遺伝子は、ＡＴＰＥ遺伝子であってもよい。この場合、組換えベクターは、前記配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーター活性を有する核酸分子にＡＴＰＥ遺伝子が作動可能に連結されたものであってもよく、例えば、本発明の一実施例で用いられる「ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ」又は「ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２」であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明は、もう一つの様態として、前記ベクターが導入された組換え微生物を提供する。
【００４２】
前記ベクターについては、前記で説明したとおりである。
【００４３】
前記ベクターは、プロモーター活性を有する核酸分子を含むベクター又は前記プロモーター活性を有する核酸分子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターであってもよい。
【００４４】
前記ベクターは、形質転換により微生物へ導入することができる。
【００４５】
本発明における用語「形質転換」は、本発明に係るプロモーター、又はさらに目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入することを意味する。また、形質転換された目的タンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞内に発現さえすれば、
宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり、染色体外に位置することができる。
【００４６】
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知の適切な標準技術を選択して実行してもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩
化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明で微生物は、本発明のプロモーター活性を有する核酸分子が導入されてプロモーターとして作動することができる微生物であれば、制限なく含まれることができる。具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、その例としてコリネバクテリウム・グルタミカム又はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであってもよいが、これらに限定されない。また、前記微生物は、エシェリキア属微生物であってもよく、その例として大腸菌であってもよいが、これに限定されない。
【００４８】
本発明は、もう一つの様態として、（ａ）前記組換え微生物を培地で培養して目的タンパク質を生産する段階、及び（ｂ）前記微生物又は培地から生産された目的タンパク質を回収する段階を含む、目的タンパク質を製造する方法を提供する。
【００４９】
本発明における用語「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明で組換え微生物を用いて、目的タンパク質を製造する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチ又は反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム属又はエシェリキア属菌株に対する培養培地は公知である（例えば、非特許文献１）。使用できる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のような油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、グルコン酸、酢酸、ピルビン酸のような有機酸が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。これらの物質は、個別に又は混合物として用いることができる。使用できる窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦、及び尿素又は無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。窒素源も、個別に又は混合物として用いることができる。使用できるリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記の原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式又は連続式で添加してもよい。これらの様々な培養方法は、例えば、非特許文献２に開示されている。
【００５１】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物又はリン酸又は硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入し
てもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であってもよいが、条件に応じて変更可能であり、これに限定されない。
【００５２】
本発明の目的タンパク質を製造する方法は、微生物又は培養物から目的タンパク質を回収する段階を含むことができ、微生物又は培養物から目的タンパク質を回収する方法は当業界で知られている方法、例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどを用いてもよいが、これらの例に限定されるものではない。
【００５３】
前記回収段階は精製工程を含むことができ、当業者は、公知のいくつかの精製工程のうち、必要に応じて選択して活用することができる。
【００５４】
本発明は、もう一つの様態として、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーター及びＡＴＰＥ遺伝子を含むベクターが導入された微生物を培養する段階、及び（ｂ）前記培養した微生物をフルクトースと反応させてプシコース（psicose）を生産する
段階を含む、プシコース生産方法を提供する。
【００５５】
前記プロモーター、ＡＴＰＥ遺伝子、ベクター、及び微生物については、前述のとおりである。
【００５６】
前記生産方法は、従来公知のあらゆるプロモーターにＡＴＰＥ遺伝子を作動可能に連結して、微生物で発現させた場合よりプシコース生産性を著しく向上させることができる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明の理解を助けるために実施例などを挙げて詳細に説明する。しかし、本発明に係る実施例は、様々な他の形態に変形することができ、本発明の範囲が下記の実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供される。
【００５８】
本発明では、目的遺伝子の発現を誘導するプロモーターを合成するために、コリネバクテリウム属微生物とエシェリキア属微生物由来の様々なプロモーター配列を分析して、配列番号１のヌクレオチドを有するプロモーターを合成し、これをｓｐｌ１プロモーター（以下「Ｐｓｐｌ１」と称する）と命名した。 Ｐｓｐｌ１の発現誘導活性を測定するため
に、Ｐｓｐｌ１をＧＦＰ又はＡＴＥＰ遺伝子と作動可能に連結して組換えベクターを製造し、これをコリネバクテリウム属細菌に形質転換して形質転換菌株を作製した。
【００５９】
実施例１：プロモーターライブラリ作製
コリネバクテリウム属菌株で外来タンパク質を高発現量に発現させることができる強力な合成プロモーターをスクリーニングするために、ライブラリを構築した。詳しくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenase）及び大腸菌Ｋ１２（Escherichia
coli K12）のゲノムＤＮＡを用いてＤＮＡシャッフリング技術を介して、より強力に発
現するか、他の発現プロファイルを示すプロモーターライブラリを確保した。
【００６０】
より詳しくは、まず、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenase）及び
大腸菌Ｋ１２（Escherichia coli K12）のゲノムＤＮＡをＤＮａｓｅＩを処理して、複数の断片に切った後、プライマーなしでＰＣＲ反応を行った。これにより類似なヌクレオチド配列を有しているそれぞれの断片が互いのプライマーとして作用して、ライブラリが作製されることができる。その次に、前記ライブラリをｐＵＣ１９ベクターに平滑末端接合（blunt-end ligation）方式で導入した。次にＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ切断部位を含む配列番
号２及び配列番号３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、様々に合成されたプロモーターライブラリを作製した。
【００６１】
ライブラリの空ベクターは、コリネバクテリウム属及びエシェリキア属菌株で発現可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（特許文献３、ＫＦＣＣ−１０６７３／ＫＦＣＣ−１０６７４）を用いた。まず、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子断片は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ｐＧＦＰｕｖベクター（クロンテック社、米国））を鋳型にして、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ切断部位を含む正方向プライマー（配列番号４）及び逆方向プライマー（配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、製造した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）を含むＰＣＲ産物（配列番号６）を収得した。前記ＰＣＲ産物と空ベクターｐＥＣＣＧ１１７とを制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとでそれぞれ処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて作動可能に連結することにより、最終的には、ＧＦＰと連結されている遺伝子組換えベクターであるｐＥＣＣＧ１１７−ｇｆｐプラスミドを製造した。
【００６２】
前記確保されたプロモーターライブラリと緑色蛍光タンパク質がクローニングされたベクターとを制限酵素ＫｐｎＩとＰｓｔＩとで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて接合させてプロモーターライブラリプラスミドを作製した。
【００６３】
前記製造されたプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換して合成プロモーターライブラリを作製した。
【００６４】
作製されたコリネバクテリウム・グルタミカム合成プロモーターライブラリを培養、菌体収得、前処理過程を経て緑色蛍光タンパク質の発現によって蛍光を示す細胞を介してスクリーニングした。複数回のスクリーニングの後、最終的に選ばれた強い合成プロモーターＰｓｐｌ１を確保し、配列番号１と同じヌクレオチド配列を有していた。
【００６５】
実施例２：スクリーニングを介して最終確保されたプロモーター及び他のプロモーターとの活性比較を通じたコリネバクテリウム・グルタミカムでの発現誘導活性の確認
実施例１で最終的に確保されたＰｓｐｌ１プロモーターを含有するプラスミドｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ｇｆｐ、陽性対照群として、従来公知のプロモーターＰｃｊ４（特許文献３）を有するプラスミドｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐ、及び陰性対照群としてｐＥＣＣＧ１１７プラスミドを用いて、リポータータンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現によるプロモーター活性を比較分析した。
【００６６】
具体的には、Ｐｓｐｌ１活性を確認するために、前記で得られた形質転換菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐ、及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ｇｆｐを下記のような方法で培養し、ＧＦＰ活性を測定した。
【００６７】
培地（グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１５０μｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、カルシウムパントテン酸３ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ（蒸留水１Ｌあたり）、ｐＨ７．２）２５ｍｌが入れられた２５０ｍｌコーナーバブルフラスコに形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を１／２０の割合でそれぞれ接種し、３０℃で培養し中期（ＯＤ６００ = １０．０）まで振とう培養（２００ｒ
ｐｍ）した。培養液から遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１５分）により菌体を回収し、０
．１％トリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０ほどになるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズ（glass bead）を添加した後、ビーズビーター（bead beater）を用いて、６分間菌体
を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）を介して上清液を回収し、ブレッドフォード方法（非特許文献３）によるタンパク質濃度を定量した。同量の菌体抽出物についてＬａｕｒｅ Ｇｏｒｙなどの方法（非特許文献４）を用いて、４８８ｎｍで励起
光を照射し、５１１ｎｍ発出光をＬＳ−５０Ｂ分光光度計（Perkin-Elmer）機器を用いて測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現程度を測定した（表１）。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
表１に示すように、Ｐｓｐｌ１が実際にコリネバクテリウム・グルタミカムでプロモーター活性を有し、既存の当社で作製したＰｃｊ４に比べてＧＦＰ遺伝子を強力に発現させることができる優れたプロモーターであることを確認できた。
【００７０】
実施例３．Ｐｓｐｌ１プロモーター配列を含むＡＴＰＥ発現用ベクター作製
コリネバクテリウムの発現改良プロモーター（以下Ｐｓｐｌ１）の機能性を評価するために、１つの例示としてＡＴＰＥ（アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ３３９７０由来のプシコースエピマー化酵素）の発現が増大されたコリネバクテリウム菌株のベクターを作製した。
【００７１】
ｐＥＴ２４−ＡＴＰＥ（特許文献２の配列番号１のヌクレオチド配列と同一）又はｐＥＴ２４−ＡＴＰＥ−２（特許文献４のヌクレオチド配列と同一：熱安定性が向上された変異体、Ｉ３３Ｌ−Ｓ２１３Ｃ）ベクターを鋳型にして、配列番号７及び８のヌクレオチド配列を有するプライマーでＰＣＲを行い（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を３０回）、ＡＴＰＥ遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）を増幅した。実施例１で作製されたコリネバクテリウム菌株用ベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ＧＦＰとを制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで処理した後、ＡＴＰＥ遺伝子ＯＲＦ断片及びＡＴＰＥ−２（ＡＴＰＥ安定性改良変異株）をＢＤ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔを用いて作動可能に連結することにより、最終的にコレネバクテリウム菌株用ベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥベクター（以下「ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ」）とｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥ−２ベクター（以下、「ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２」）（図１）を作製した。
【００７２】
実施例４．コリネバクテリウム・グルタミカム菌株内でのプシコース生産酵素発現及び活性の確認
前記作製されたｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥベクターとｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２ベクターとを電気穿孔法を用いて、ＡＴＣＣ１３０３２菌株に導入してＦＩＳ−２−ＡＴＰＥとＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２菌株を作製した。このうちＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２菌株は韓国種菌協会（ＫＣＣＭ）に３月２７日付けで寄託し寄託番号ＫＣＣＭ１１６７８Ｐを与えられた。前記菌株を実施例１の培地（グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１５０μｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、カルシウムパントテン酸３ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ（蒸留水１Ｌあたり）、ｐＨ７．２）を用いて、三角フラス
コで培養した後ＡＴＰＥの活性を測定した。
【００７３】
３０℃培養器（incubator）でＬＢ固体培地中に一晩培養したそれぞれの菌株を２５ｍ
ｌ培地に接種した後、これを３０℃、２００ｒｐｍの培養器で２４時間培養しており、培養後、遠心分離を介して上清液を除去し、冷たいＰＢＳを用いて得られた菌体を洗浄し、確保されたペレットをＥＰＰＳ溶液（ｐＨ８．０）に２０％（ｗ／ｖ）で溶解させた後、１ｍｇ／ｍｌのＰＯＥＳＡを添加して室温で１時間反応させた後、遠心分離した。遠心分離して得られたペレットをＥＰＰＳ溶液（ｐＨ８．０）に２０％（ｗ／ｖ）で溶解させ、基質であるフルクトース溶液３００ｇ／Ｌを添加して、５０℃で３時間反応させた後、熱処理により反応を停止させた。以後、遠心分離を介して上清液を収得しＨＰＬＣ分析によりプシコース生成量を測定した（図２〜図４）。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
前記表２に示されたように、前記作製した野生型の生産菌株由来のＡＴＰＥ遺伝子が発現されたコリネバクテリウム菌株の中、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥ（ＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ）及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｓｐｌ１−ＡＴＰＥ−２（ＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２）は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ＡＴＰＥ（ＦＩＳ−４−ＡＴＰＥ）より生産性が著しく向上されたことを確認した。
【００７６】
総合すると、本発明のＰｓｐｌ１プロモーターは、従来公知のプロモーターに比べて組換え微生物で目的遺伝子の発現を著しく増加させることができるので、機能性素材を高収率で生産しようとする様々な産業分野に有用に用いることができる。
【００７７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想又は必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるであろう。これに関連して、既述の実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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