(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを含む、光受容機能を内網膜の細胞に与える方法で用いるための治療組成物であって、
前記ヒト光受容タンパク質がヒトロドプシンまたはフォトプシンであり、
前記核酸が内網膜の細胞へ発現を指示するプロモータの制御下にあり、
前記内網膜の細胞が、ON型双極細胞またはOFF型双極細胞である、治療組成物。
【請求項２】
注入可能液体である、請求項１に記載の、方法で用いるための治療組成物。
【請求項３】
前記方法が、注入、好ましくは眼内注入、好ましくは網膜下または硝子体内への注入により、核酸配列を導入することを含む、請求項１または２に記載の、方法で用いるための治療組成物。
【請求項４】
使用説明書、投与計画、１つまたは複数の微細針、１つまたは複数のシリンジ、および溶媒をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療組成物を含む、光受容機能を内網膜の細胞に与える方法で用いるためのキット。
【請求項５】
前記プロモータが、ON型双極細胞またはOFF型双極細胞において特異的な発現である、請求項１に記載の、方法で用いるための治療組成物。
【請求項６】
前記プロモータが、L7、thy-1、レコベリン、カルビンディン、GAD-67、Grm6、及びGrm6エンハンサ−SV40融合タンパク質からなる群から選択される；好ましくは前記プロモータが、ON型双極細胞を選択的に標的とするための細胞特定的プロモータGrm6-SV40である、請求項１または５に記載の、方法で用いるための治療組成物。
【請求項７】
前記方法が、網膜の光受容機能を強化するまたは回復すること、対象の視力を回復すること、および／もしくは網膜変性疾患または症状を治療することを含む、請求項１〜３、５〜６の何れか一項に記載の治療組成物、または請求項４に記載のキット。
【請求項８】
前記網膜変性症状は、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；別の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、浮腫、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気からなる群から選択される、請求項７に記載の治療組成物またはキット。
【請求項９】
前記方法が、例えば、トロピカミドおよび／またはフェニレフリンなどの適切な散瞳薬の適用により、処置する眼の瞳孔を拡張するステップを含む、請求項７または８に記載の治療組成物またはキット。
【請求項１０】
前記方法が、処置した対象の視力を、視力の改善に関してモニタリングするステップを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の治療組成物またはキット。
【請求項１１】
前記ヒトフォトプシンが、長波長感受性（OPN1LW）オプシン、中波長感受性（OPN1MW）オプシン、および短波長感受性（OPN1SW）オプシンからなる群から選択される、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１２】
前記核酸が、
ｉ）ロドプシン（RHO）遺伝子（GenBank: BC111451.3, Accession NM_000539, Version NM_000539.3 Gl:169808383）、または、そのフラグメントもしくは誘導体
ｉｉ）錐体ホモサピエンスオプシン1、長波長感受性OPN1LW（NCBI Reference Sequence: Accession: NM_020061, Version NM_020061.5）遺伝子、または、そのフラグメントもしくは誘導体
ｉｉｉ）錐体ホモサピエンスオプシン1、中波長感受性OPN1MW、（NCBI Reference Sequence: Accession: NM_000513, Version NM_000513.2）、または、そのフラグメントもしくは誘導体、もしくは
ｉｖ）錐体ホモサピエンスオプシン1、短波長感受性（OPN1SW）NM_001708, version NM_001708.2、または、そのフラグメントもしくは誘導体
を含む、請求項１１に記載の治療組成物。
【請求項１３】
前記ヒト光受容タンパク質をコードする前記核酸は、ベクターとして提供され、前記ベクターは好ましくはウイルスベクター、好ましくはAAVベクター、好ましくはAAV血清型2ベクターまたは例えばAAV 4YFまたはAAV 7m8の変性AAVベクター、である、請求項１２に記載の治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、網膜変性の処置で用いる、細胞に光受容機能を与えるための改良された方法に関する。本発明はまた、特にこのような方法で用いる組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の眼の網膜は、カメラのフィルムと同様の機能を果たし、眼のレンズおよび角膜を通過した光により生成される視像を受け取る。受け取った視像は化学的および電気的な信号に変換され、視神経を通じて脳に送られる。
【０００３】
網膜は複雑な構造体であり、異なる細胞種の別個の１０層を含む。これらの層のうち、脳が読み取り、画像として解釈可能な化学的および／または電気的な信号へ、入射光の変換を担うのが、光受容層である。光受容層は、桿体細胞および錐体細胞として知られる、２種類の感光性細胞を含む。これらの細胞種は両方とも、入射光への応答と電気的信号の生成を担うが、網膜内での位置と応答する光の種類が異なる。具体的には、桿体細胞は概ね薄暗い所で機能し、大部分は周辺網膜に存在する。錐体細胞は明るい光に対しより応答し（つまり、日中視力）、色覚を担い、中心網膜に最も高い密度で存在する。網膜はまた、数が３分の１少ない光受容細胞種−感光性神経節細胞−を含み、これは背景光の測定を担うが、画像処理は担わない。
【０００４】
網膜の光受容層の桿体細胞および錐体細胞は光に応答し、そして、細胞が光にさらされると化学的に変化する感光性色素（光色素という）がそこにあるおかげで、それを電気的信号に変換することができる。これらの光色素は、Ｇタンパク質共役受容体である。光色素は、レチナールとして知られる発色団補因子に結合するタンパク質部分を含む。光にさらされると、シス−レチナールからトランス−レチナールへ、レチナール補因子の異性化が起き、これは次に、光退色として知られる、オプシンタンパク質における構造変化を引き起こす。これが信号伝達カスケードでの第１ステップであり、これは視神経に沿って伝達される信号をもたらす。したがって、感光性を保持するため、オプシンは、シス−レチナールを連続して供給する必要がある。桿体光受容細胞も錐体光受容細胞も、シス−レチナール自体を生成することはできない。網膜における主なシス−レチナール源は、ＰＲＥ（網膜色素上皮、retinal pigment epithelium）であり、これは退色したオプシンからオールトランス−レチナールを取得し、シス−レチナールを生成する。無傷網膜では、桿体細胞および錐体細胞はＰＲＥに隣接し、この再生発色団にアクセスできるようにする。
【０００５】
ヒトには、オプシンファミリーとして知られる、密接に関係する光色素がいくつか存在する。これには、異なる波長に対し感光性がある３つの錐体オプシン（色覚の原点）と、桿体細胞にあるロドプシンと、神経節細胞光受容体にあるメラノプシンが含まれる。錐体オプシンには、黄緑色用のＬＷＳオプシン、緑色用のＭＷＳオプシン、および青紫色用のＳＷＳが含まれる。これらのオプシンは高い配列同一性を示す。
【０００６】
網膜ジストロフィーなどの疾患は、外網膜にある光受容体（つまり、桿体および錐体）の破壊により失明を引き起こす。これらの疾患は、光受容体への直接的な損傷、または、光受容体が、網膜色素上皮および／または脈絡膜の病変の結果として非直接的に破壊されたことの結果である。変性が進んだ段階では、重い視覚障害が一般的である。これらの疾患は、現在では治療不能である。網膜ジストロフィーは、桿体−錐体ジストロフィー（網膜色素変性症とも呼ばれる）、錐体−桿体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーに分類することが可能である。桿体−錐体ジストロフィーでは、桿体光受容体が変性して周辺視力および夜間視力の低下を招き、その後しばしば、中心視力および色覚の低下につながる錐体の破壊が続く。逆に、錐体−桿体ジストロフィーでは、初めに詳細視力および色覚の低下につながる錐体光受容体の減少があり、その後、周辺視力の低下および夜盲症を招く桿体変性が続く。両形態とも、広範囲にわたる、または、完全な視野の喪失を伴う失明を招き得る。黄斑ジストロフィーと呼ばれる別種のレチナールジストロフィーは、中心視力の低下を招くが、周辺視力は保持される。
【０００７】
しかしながら、外網膜光受容体の減少にもかかわらず、双極細胞および網膜神経節細胞を含む内網膜ニューロンは存在し続け、視覚情報を脳に送る能力を保持する。そのため、これらのニューロンは、それらを直接的に視覚光受容体に変換し、変性で失われた感光性を再生成することを目指す新しい光遺伝治療に、有望な適所を提供する。いくつかの治療ストラテジーが、これらの内網膜ニューロンを置き換え、または、復活させ、そして視力を回復させるという試みにおいて、有望な結果を示している。光受容細胞またはその前駆細胞株の移植が前臨床研究での主なアプローチであり、光受容体を完全に消失した後の変性後期にある盲目マウスの視力を回復することが示されている。内網膜ニューロンを回復する試みでは、埋め込み型電子的プロテーゼが、外部カメラを通じて網膜神経節細胞（RGC、retinal ganglion cell）の発火を誘発し、少なくとも一部の患者に粗い空間識別を与えた（Zrenner E, et al. 2011 , Proc Biol Sci 278(1711): 1489-1497; Humayun MS, et al. 2012, Ophthalmology 119, 779-788）。別のストラテジーは、ニューロン活動の光スイッチとして微生物オプシンを用い、これは変性網膜で光誘発活動を引き出すために用いられている。この範囲では、rd1マウスにおける、channelrhodopsin-2遺伝子（ChR2）を担持するAAV-2ベクターの硝子体内注入が、RGCにおける光活性化脱分極、つまり「ON」応答と、皮質における視覚誘発電位を招くことが示されている。Biらが筆頭研究者であるこの研究（Bi A, et al 2006, Neuron. 2006;6;50(1):23-33.）は、網膜の機能は光遺伝学を用いて回復させることが可能であるという最初の原理の証明を提供した。（Lagali PS, et al 2008, Nat Neurosci. 2008 Jun; 11 (6):667- 75; Cronin T, et al 2014, EMBO Mol Med. 2014 Aug 4;6(9):1 175-90; Mace E et al 2014, Mol Ther. 2015 Jan;23(1):7-16）さらに、錐体光受容体（Busskamp V, et al 2010, Science. 2010 Jul 23;329(5990):413-7.）を人工光センサに変換することに成功しており、これは盲目マウスの視覚機能の部分的な救出につながる。加えて、最近開発された合成光スイッチが、盲目マウスの視力を取り戻すことにおいて有望な結果を示している。「一成分」アゾベンゼン系光スイッチは、小分子であるAAQまたはDENAQを用い（Polosukhina A, et al 2012, Neuron. 2012 Jul 26;75(2):271-82; Tochitsky I, et al 2014, Neuron. 2014 Feb 19;81 (4):800-13.）、これは、ニューロンの天然イオンチャネルを直接的に感光性にする。「二成分」光スイッチであるLiGluR/MAG（Caporale N, et al 2011 , Mol Ther. 2011 Jul; 19(7): 1212-9; Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Dec 23; 1 11 (51):E5574-83）は、初めに、合成的に作られた光依存性イオンチャネル型グルタミン酸受容体（LiGluR）を網膜で遺伝的に発現させ、その後、活性化のために光スイッチ分子（MAG）の添加を必要とする。両系とも、盲目なマウスおよびイヌ（Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Dec 23;1 1 1 (51):E5574-83）の網膜に光感受性を与え、げっ歯動物の基礎的な視覚機能を回復させることが示されている。
【０００８】
しかしながら、これらの疾患の処置において、改善はなお必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、網膜変性の処置に関連する問題を克服するか、または、改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明の第１態様では、細胞に光受容機能を与える方法を提供する。該方法は、眼の硝子体腔に、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを導入するステップを含む。
【００１１】
本発明の第２態様では、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含む組成物を提供する。好適には、該組成物は治療用である。
【００１２】
本発明の第３態様では、細胞に光受容機能を与える方法で用いるための、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを提供する。
【００１３】
本発明の第４態様では、細胞に光受容機能を与える方法を提供する。該方法は、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含んだ核酸ベクターを、眼に導入するステップを含む。この態様では、好適には、該ベクターは細胞外基質分解酵素の投与なしに導入する（例えば、それは酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。該方法はさらに、内網膜細胞でベクターを発現させるステップを含み、ここにおいて、ヒト光受容タンパク質の発現は、内網膜細胞を光受容性にする。
【００１４】
本発明の第５態様では、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。
【００１５】
本発明の実施形態を、添付図面を参照しながら本明細書においてさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】眼内注入およびAAVを介した遺伝子送達を示す図である。
【図２】ロドプシン処置後の、瞳孔対光反射の回復を示す図である。
【図３】３Ａは、in vivoの電気生理学記録から得たデータを示す図である。３Ｂは、in vivoの電気生理学記録から得たデータを示す図である。３Ｃは、in vivoの電気生理学記録から得たデータを示す図である。３Ｄは、in vivoの電気生理学記録から得たデータを示す図である。３Ｅは、in vivoの電気生理学記録から得たデータを示す図である。３Ｆは、片方の眼を桿体オプシン、つまりCAG-hRho（B）で処置し、もう一方の眼をGFP、つまりCAG-GFP（C）で処置したRd1マウス（n＝5）から得た、代表的なin vivoの、dLGN光応答のヒートマップであり、多様な回復応答：持続的、過渡的、ON、およびOFFが描かれている。応答は、２秒の光刺激提示（15.4 log photons/cm2/s）のうち最初の１秒間の持続応答の振幅に応じて順序付けた。３Ｇは、ON持続的の場合の、フルフィールドフラッシュ（15.4 log photons/cm2/s）の多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）である。対応するトライアルビンカウントはPSTHの上に示す。３Ｈは、ON過渡的の場合の、フルフィールドフラッシュ（15.4 log photons/cm2/s）の多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）である。対応するトライアルビンカウントはPSTHの上に示す。３Ｉは、OFFの場合の、フルフィールドフラッシュ（15.4 log photons/cm2/s）の多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）である。対応するトライアルビンカウントはPSTHの上に示す。３Ｊは、ON−OFFの場合の、フルフィールドフラッシュ（15.4 log photons/cm2/s）の多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）である。対応するトライアルビンカウントはPSTHの上に示す。
【図４Ａ】in vitro MEA記録から得たデータを示す図である。
【図４Ｂ】in vitro MEA記録から得たデータを示す図である。
【図４Ｃ】in vitro MEA記録から得たデータを示す図である。
【図５】観察された応答が、光刺激後のrd1マウス網膜に通常見られる天然の光応答からはっきり区別できることを示す図である。
【図６】Ａ）rd1マウスの桿体オプシンで処置した眼により引き起こされるdLGN応答は、ある範囲の光強度にわたって、明順応状態で応答することを示す図である。異なる光強度（ND2＝13.4, ND1＝14.4、およびND0＝15.4 log photons/cm2/s）でフルフィールドフラッシュを提示されたRd1-CAG-hRhoマウスから得た、５つの代表的なdLGNユニットの感受性応答プロファイル（PSTHおよびTBC）を示す図である。  Ｂ）マウスの桿体オプシンで処置した眼により引き起こされるdLGN応答は、ある範囲の光強度の範囲にわたって、明順応状態で応答することを示す図である。明順応状態（Michelsonコントラスト96％、ND0=15.4 log photons/cm2/s）で記録した、Rd1-CAG-hRhoマウスから得た、４つの代表的なdLGNユニットのコントラスト感受性応答プロファイル（PSTHおよびTBC）を示す図である。
【図７Ａ】ON型双極細胞に対する桿体オプシンの標的発現は、盲目rd1網膜の視覚応答を回復させることを示す図である。プロモータGrm6の下、ヒト桿体オプシンの標的発現を引き起こすAAV2ベクターのDNA構造を示す図である。
【図７Ｂ】細胞外基質を分解するグリコシド酵素と併用して、Ａのウイルスベクターを硝子体内へ送達した後の、マウスの網膜断面の例示的蛍光顕微鏡画像を示す図である。網膜は、a-hRho抗体（赤）で処置し、核はDAPI（青）で着色した。メモリバー＝50μｍ、GCL＝神経節細胞層、IPL＝内網状層、INL＝内顆粒層
【図７Ｃ】INL細胞の神経細胞体における桿体オプシンの膜状局在を描写する、高倍率蛍光画像を示す図である。網膜は、a-hRho抗体（赤）で処置し、核はDAPI（青）で着色した。メモリバー＝50μｍ、GCL＝神経節細胞層、IPL＝内網状層、INL＝内顆粒層。
【図８】Ａ）ON応答の場合の、ND0＝15.4 log photons/cm2/sで、５秒のフルフィールドフラッシュの多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）を示す図である。  Ｂ）OFF応答の場合の、ND0＝15.4 log photons/cm2/sで、５秒のフルフィールドフラッシュの多重提示に対する平均応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）を示す図である。
【図９】より低い光レベル（ND2 -13.4 log photons/cm2/s）で、２秒のフルフィールドフラッシュの多重提示に対する平均的応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）を示す図である。
【図１０】明順応状態−Michelsonコントラスト９６％で５秒のフルフィールドフラッシュの多重提示に対する平均的応答を示す、代表的な刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）を示す図である。
【図１１】Ａは、桿体オプシンの異所性発現が、処置盲目rd1マウスの視覚行動を回復することを示す図である。ある範囲の光強度で白色光を１０秒当てる間の、最大縮瞳に関する放射照度−応答曲線を示す図である。桿体オプシン処置rd1眼（非標的CAG発現、赤）は、GFP注入rd1眼（緑）と比較し、視覚感度の著しい改善を示す。標的発現（Grm6、青）があると、瞳孔対光反射は大きく低下したままだった。PBS／酵素混合物を注入した野生型マウスのデータを、比較のために示す（黒）。データは、照光を始める直前に、瞳孔サイズについて正規化する。値は平均±SEMであり、nは試験した動物の数を示す。１１Ｂは、WTマウス、Rd1-GFPマウス、Rd1-CAG-hRhoマウス、Rd1-grm6-hRhoマウスについて、ND4（11.8 log photons/cm2/s）およびNDO（15.8 log photons/cm2/s）で、暗所（基線）において測定した瞳孔野の代表的な赤外線画像を示す図である。１１Ｃは、ND4（11.8 log photons/cm2/s）での、全４グループの母集団の平均最大縮瞳を示す図である。試験した動物の数：WT n＝6；Rd1-GFP n＝16；Rd1-CAG-hRho n＝10；Rd1-grm6-hRho n＝6。エラーバーはSEMである。１１Ｄは、NDO（15.8 log photons/cm2/s）での、全４グループの母集団の平均最大縮瞳を示す図である。試験した動物の数：WT n＝6；Rd1-GFP n＝16；Rd1-CAG-hRho n＝10；Rd1-grm6-hRho n＝6。エラーバーはSEMである。
【図１２】4グループのマウス：WT n＝5；Rd1-GFP n＝6；Rd1-CAG-hRho n＝6；Rd1-grm6-hRho n＝5について、暗（暗く影になった）から明（白色領域）へ移したときのオープンボックス活動プロットを示す図である。プロットの値は、直前の３０秒ビンで移動した距離の母平均±SEMである。右のヒストグラムは、暗（照明直前の３０秒；黒いバー）から明（照明直後の３０秒）への移行期間での、母集団全体の平均移動距離を示す図である。エラーバーはSEMである。* p<0.05、** p<0.005、対応のあるStudentのt検定。
【図１３】Ａ）Rd1-grm6-hRho（n＝5）について、グレースクリーン光から4Hzフリッカ光に移したときの、オープンボックス活動プロットを示す図である。データは、直前の３０秒ビンで移動した距離の母平均±SEMである。Ｂ）Rd1-GFPマウス（n＝6）；Rd1-CAG-hRhoマウス（n＝6）；Rd1-grm6-hRhoマウス（n＝5）についての、4Hzフリッカ応答を示す図である。各マウス群について対応のあるヒストグラムを示し、これは、（ＦでRd1-grm6-hRhoについて示すような）全活動プロットのうち、グレー光（4Hzフリッカ直前の３０秒）から4Hzフリッカ光（4Hzフリッカ直後の３０秒）までの移行期間のみを示す。データは移動距離の母集団平均±SEMである。** p<0.005、対応のあるStudentのt検定。
【図１４】Rd1-grm6-hRhoマウス（n＝5）についてのコントラスト感受性応答を示す図であり、これは、異なるMichelsonコントラストにおける4Hzフリッカ前後での移動距離を示す。各コントラストパフォーマンスについて、活動プロットのうち移行期間のみを示し、これは、フリッカの提示前の３０秒（白バー）および提示後の３０秒（格子柄バー）での移動距離を示す。
【図１５】Rd1-grm6-hRhoマウス（n＝5）についてのフリッカ周波数応答を示す図であり、これは、異なる周波数でのフルフィールドフリッカ光の提示前後の移動距離を示す。各フリッカ応答について、活動プロットのうち移行期間のみを、フリッカの提示前３０秒間の距離（グレーバー）と、提示後３０秒間の距離（模様付きバー）を比較して示す。データは移動距離の母集団平均±SEMである。* p<0.05、** p<0.005、対応のあるStudentのt検定。
【図１６】Ａ）標的桿体オプシン発現は、写実的な動画シーンへの応答を回復することを示す図である：３０秒の写実的な動画の多重提示にさらされたRd1-CAG-hRhoマウス（平面視で開放アリーナで動くマウス）の代表的な応答dLGNユニットについてのラスタープロットである。  Ｂ）標的桿体オプシン発現は、写実的な動画シーンへの応答を回復することを示す図である：３０秒の写実的動画の多重提示にさらされたRd1-Grm6-hRhoマウス（平面視で開放アリーナで動くマウス）の代表的な応答dLGNユニットについてのラスタープロットである。  Ｃ）標的桿体オプシン発現は、写実的な動画シーンへの応答を回復することを示す図である：Rd1-grm6-hRho（n＝5）について、グレースクリーン光（グレーで影をつけた）から迫ってくるフクロウの動画（緑色で影をつけた）に移したときのオープンボックス活動プロットである。データは、直前の３０秒ビンでの移動距離の母集団平均±SEMである。
【図１７】Rd1-GFPマウス（n＝6）；Rd1-CAG-hRhoマウス（n＝6）；Rd1-grm6-hRhoマウス（n＝5）についての、写実的動画応答を示す図である。対応のあるヒストグラムを各マウス群について示し、これは、全活動のうち、グレー光（動画提示直前の３０秒；白バー）からフクロウの動画（動画直後の３０秒：黒バー）までの移行期間のみを示す。データは移動距離の母集団平均±SEMである。** p<0.005、対応のあるStudentのt検定。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、変性した、または部分的に変性した網膜において感光性を回復するための、細胞に光受容機能を与えるヒト光受容タンパク質の使用に関する。このような天然光受容機能は、光受容体の変性と共に失われる。本発明は、内網膜におけるヒト光受容タンパク質の発現は、内網膜ニューロン細胞に光受容機能を与えることが可能であるという驚くべき発見に基づく。内網膜におけるヒト光受容タンパク質の導入遺伝子発現は、微生物オプシンおよび電子式アレイそれぞれを用いるのとは対照的に、起こり得る免疫原生副作用を最小限にするという利点を有する。加えて、外側光受容体であるこのGPCRは、細胞の機構をハイジャックする潜在力を持ち、完全自己完結型光受容メカニズムを提供し、活性化のための光スイッチを外から定期的に供給する必要がある合成光スイッチとは異なり、ひとりでに、そして、さらなる介入なしに、光検出をサポートすることができる。さらに、桿体オプシンは活性化に可視光を必要とするが、それは、タンパク質レベルで信号を増幅することはできない現在のチャネル型または合成の光スイッチ系とは対照的に、生来のGPCR増幅カスケードを介して、低光強度の下でも機能する潜在力を持つ。
【００１８】
遺伝子治療の方法としての硝子体内注入は、網膜へのアクセスにおいて技術的な困難が少なく、投与中、特に網膜が分解により薄くなっていた場合に合併症のリスクが少ないという点で、特別な利点を有する。
【００１９】
本発明は、部分的に、遺伝子治療における細胞外基質分解酵素の共投与は、網膜細胞のトランスダクションの増加を招き、視力の回復を高めるという点で結果を改善するという発見に基づく。本発明は、標的細胞にある外来遺伝物質の接触を妨げる障壁を減らすことでトランスダクションの増加を可能にすることにより、以前の硝子体内遺伝子治療法を超える改善を示す。
【００２０】
遺伝子治療と細胞外基質分解酵素の併用は、該遺伝子治療にロドプシンをコードする核酸配列を眼の硝子体に導入することが含まれている場合は特に、驚くべき結果をもたらした。ロドプシンは、視覚情報伝達後に生成されるオールトランスレチナールが網膜色素上皮（PRE）に運ばれ、オールシスレチナールに変換され、その後、さらなる視覚応答のために桿体細胞に戻されることを必要とする。このリサイクルは、桿体細胞とRPEの間の密接な接触に依存していると考えられている。内網膜細胞は、桿体と錐体が変性する網膜ジストロフィーがある場合でさえ、同様にPREと物理的に関連することはないだろう。本発明者らは、遺伝子治療により内網膜にロドプシンを提供すると、機能性内網膜細胞とRPEの間の接触がないにもかかわらず、視覚応答を生成するということに予期せず気付いた。さらに、内網膜細胞は、ロドプシンと連係して機能し、神経節細胞を介して脳に送られ得る電気的信号を生成するために必要な、細胞内機構を持たないと考えられる。
【００２１】
本結果はさらに驚くべきである。これは、視覚は内網膜細胞を光により脱分極する（「ON」にする）ことを必要とすると想定されていたのに対し、ロドプシンは、光に応答して細胞を過分極化すること（脳における、細胞を「オフ」にするのと同等）により機能するからである。
【００２２】
本発明は、感光性タンパク質をコードする核酸配列と共に細胞外基質分解酵素を投与し、網膜に感光性機能を回復することを提供する。網膜および硝子体は、種々の細胞外基質分子を含み、これには、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン（DSPG）などの（異なるクラスのグリコサミノグリカン（GAG）鎖を持つ）プロテオグリカン；ヒアルロン酸、内境界ラミナにあるIV型コラーゲンなどのコラーゲン；ラミニン；ニドジェン１、ニドジェン２、ならびに、当業者には既知の種々の他のタンパク質および糖タンパク質が含まれる。
【００２３】
本発明は、細胞外基質タンパク質、または、硝子体および／もしくは内境界膜および／もしくは網膜細胞外基質に存在する（グリコサミノグリカンなどの）炭水化物を分解可能な酵素を利用することができると想定される。特に、本発明で用いる酵素は、網膜に提供される細胞外基質タンパク質もしくは炭水化物、または、硝子体および網膜細胞の間の経路に提供され、そのため核酸配列のトランスダクションに影響を与え得る細胞外基質タンパク質もしくは炭水化物を、分解することが可能なものとすることができる。グリコサミノグリカン（GAG）を分解する酵素が好適である。
【００２４】
細胞外基質分解タンパク質は、コラゲナーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼII、ヘパリナーゼIII、コンドロイチンABCリアーゼ、コンドロイチンACリアーゼ、メタロプロテアーゼ、ADAMTS、プラスミン（セリンプロテアーゼプラスミンまたはその切断型マイクロプラスミン（Ocriplasmin））、好中球エラスターゼおよびカテプシンG、ノイラミニダーゼ、N-グリカナーゼ、O-グリカナーゼ、ならびにプロナーゼからなる群から選択することができる。特に好適な酵素は、Streptomyces hyalurolyticus（EC 4.2.2.1；Genbank accession CP003990内に含まれる）由来のヒアルロン酸リアーゼ；ウシ精巣（EC 3.2.1.35）由来のヒアルロニダーゼ；プロテウス・ブルガリス（EC 4.2.2.4）由来のコンドロイチンABCリアーゼ、およびフラボバクテリウムヘパリナム由来のヘパリナーゼIII（EC 4.2.2.8；Genbank accession L12534、好ましくはバージョンL12534.1）からなる群から選択することができる。本発明で用いる酵素は、Sigma Aldritchなどの商業的供給源から入手できる。
【００２５】
「分解する」または「分解酵素」とは、タンパク質または炭水化物を分解することが可能な酵素を意味する。タンパク質は、例えばペプチド結合の加水分解により、ペプチド配列またはアミノ酸に分解することが可能である。炭水化物は、オリゴ糖または単糖の単位まで分解することができる。タンパク質および／または炭水化物は、完全に、または、部分的に分解され、これは、その一部がより小さいフラグメントに分解される一方、タンパク質および／または炭水化物の残余は、その天然形態のままある場合があることを意味する。好適には、分解された細胞外基質タンパク質または炭水化物は、細胞に構造的および／または生化学的なサポートを提供するという一部の機能を失い、その結果、硝子体に導入された核酸配列が網膜細胞により良くアクセスすることが可能になる。特に、分解された細胞外基質タンパク質は、硝子体内および網膜全体で核酸配列（例えば、ウイルスベクターなどの遺伝子送達ベクター）の動きを妨げる機能を一部、または全て失う。細胞外基質の機能低下は、眼または視力に著しい悪影響を及ぼさないように、十分に最小化する。
【００２６】
本明細書では、細胞外基質分解酵素への言及は、その活性フラグメントを含む。活性フラグメントは、天然酵素の一部またはその短いバージョンとすることができ、これは、細胞外基質分解酵素として機能する能力は保持する、つまり、本明細書で定義するように、細胞外基質タンパク質または炭水化物を分解する機能を保持する。活性フラグメントは、天然酵素の配列のうち、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を含み得る。
【００２７】
本明細書では、酵素への言及は１つまたは複数の酵素を含む。したがって、本発明は、単一酵素または２つ以上の酵素の組み合わせの、共投与を提供する。好適には、２つ以上の酵素を提供する場合、それらはそれぞれ、上記で定義した群から選択する。２つ以上の酵素を投与する場合、それらは個別に、連続して提供するか、または、２つ以上を一緒に提供することができる。好適には２つの酵素は一緒に投与する。２つ以上の別個の酵素投与量を提供する場合、これらのうち任意の１つまたは複数を、核酸配列と共に提供することができる。
【００２８】
本発明で用いる酵素は、適切な供給源から採取することができる。該供給源は、哺乳類または非哺乳類とすることができる。それは、動物、植物、細菌、または始原細菌の供給源から採取することができる。哺乳類の場合、それはヒト酵素であることが好適である。それは、このような供給源より単離または精製することができる。それは、組換えタンパク質として生成することができる、あるいはそれは、合成的に生成することもできる。
【００２９】
本発明で用いる酵素の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で既知である。
【００３０】
本明細書では、酵素には、天然酵素のフラグメントおよび誘導体が含まれる。好適には、フラグメントまたは誘導体は、天然酵素の長さの50%、60%、70%、80%、90%、または少なくとも95%の長さにわたり、天然酵素との間で、少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%、少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、または少なくとも99%の配列同一性を共有する。
【００３１】
配列同一性は、所定の比較ウィンドウの上でアライメントを行った２つの配列（これは、参照ヌクレオチド配列またはタンパク質の長さの、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%とすることができる）を比較し、同一の残基が生じている場所の数を求めることにより決定する。典型的には、これはパーセンテージで表される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は、当業者に周知の方法であり、ALIGN（Version 2.0）、GAP, BESTFIT, BLAST（Altschul et al J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）、FASTA and TFASTA（Wisconsin Genetic Software Package Version 8、カリフォルニア州サンディエゴ、Genetics Computer Group, Accelrys Inc.より入手可能）、およびCLUSTAL（Higgins et al, Gene 73: 237-244 (1998)）などの数学的アルゴリズムを実装した、デフォルトパラメータを用いるコンピュータを使用する。
【００３２】
本発明で用いる酵素は、乾燥形態で供給することができ、これには脱水または凍結乾燥された形態のいずれかが含まれる。典型的には、酵素は凍結乾燥形態で提供されるだろう。あるいは、酵素は、例えば所定の濃度および体積で水に予め溶解させた水溶液として、提供することができる。本発明の製品またはキットは、溶解する指示書を任意でつけた、乾燥形態の酵素の提供に適していると考えられるが、投与のためには水性形態が好適である。したがって、本発明の方法は、乾燥した酵素を用いて酵素溶液を生成する方法を含むことができる。好適にはこれは、酵素を水性または非水性の溶媒に溶解する、または、該溶媒で戻すことにより達成される。適切な溶媒は、毒性がなく、ヒトまたは動物での使用に適切なものである。好適には、適切な溶媒は無菌である。適切な溶媒の一例は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。乾燥タンパク質を溶解する方法は、当技術分野で既知である。
【００３３】
本発明は、網膜に光感受性機能を戻すため、感光性タンパク質をコードする核酸配列を網膜に投与することを提供する。感光性タンパク質は、化学的または物理的な変化を経ることにより、光に対し応答するものである。光受容性とは、感光性である、または、感光性タンパク質を含む細胞を意味する。光受容性または光受容体、および感光性という用語は、同じ意味で用いることができる。
【００３４】
本発明で用いる核酸配列は、任意の感光性タンパク質をコードすることができる。好適には、本発明の核酸配列は、哺乳類または非哺乳類の感光性タンパク質をコードする。その供給源は、哺乳類、非哺乳類、植物、細菌、または始原細菌とすることができる。哺乳類の場合、それはヒトタンパク質をコードするのが好適である。本発明で用いる核酸配列は、ロドプシン、メラノプシン、錐体オプシン（特にLWSオプシン、MWオプシン、およびSWSオプシン）、ニューロプシン（Opn5）、エンセファロプシン（OPN3）、副松果体オプシン、VAオプシン、パラピノプシン、パリエトプシン、ピノプシン、TMTオプシン、クラゲオプシン、C-オプシン、クリプトクロム、ならびに、任意の脊椎動物の網膜オプシンおよび／または動物において網膜外の感光性を通常サポートするオプシンからなる群から選択することができる。
【００３５】
本明細書で用いる核酸配列は、該核酸配列が、処置対象の網膜に生来備わっている感光性タンパク質をコードするように、処置対象に応じて選択することができる。したがって、例えば、対象がヒトである場合、核酸配列は好適には、ヒト感光性タンパク質、例えばロドプシンをコードするだろう。しかしながら、ある実施形態では、処置対象に生来備わっていないが、対象において免疫応答を好適には起こさない、感光性タンパク質をコードする核酸配列を提供することができると考えられる。
【００３６】
多くの感光性タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列が当技術分野では既知である。例えば、好適な感光性タンパク質の核酸配列を以下に提供する。
メラノプシン：ホモサピエンスオプシン4（OPN4）, mRNA（cDNAクローンMGC：142118 IMAGE:8322610）, GenBank: BC113558, Version BC113558.1；
ロドプシン：ホモサピエンスロドプシン（RHO）, GenBank BC111451.3, Accession NM_000539, Version NM_000539.3 Gl: 169808383；
錐体ホモサピエンスオプシン1 : ホモサピエンスオプシン1, 長波長感受性, OPN1LW - NCBI Reference Sequence: Accession: NM_020061 , Version NM_020061.5;
ホモサピエンスオプシン1, 中波長感受性OPN1MW - NM_000513, version NM_000513.2;
ホモサピエンスオプシン1 短波長感受性 (OPN1SW) NM_001708, version NM_001708.2.
パラピノプシン（Genbank Accession NM_001200073, Version NM_001200073.1 Gl:318056020）；
パリエトプシン（Genbank Accession DQ100320, Version DQ100320.1 Gl:73666459）；
ピノプシン（Genbank Accession AF487546, Version AF487546.1 Gl:20805654)；
VAオプシン（Genbank Accession AF233520, Version AF233520.1 Gl:8272567）;
TMTオプシン（Genbank Accessions AH011520 AF349943 AF349944 AF349945, version AH011520.2 Gl:339511123）；
クラゲオプシン（Genbank Accession AB435549, Version AB435549.1 G1:210049957）；
OPN3（Genbank Accession NM_014322, Version NM_014322.2 Gl:71999130）；
OPN5（Genbank Accession AY377391 , Version AY377391.1 Gl:38482095）；
C-オプシン（Genbank Accession HF566407, version HF566407.1 Gl:543581059）；および、
クリプトクロム（Genbank Accession NM_169852, Version NM_169852.1 Gl:24648151）。
【００３７】
上記の本発明の第４または第５態様において、光受容タンパク質はヒト光受容タンパク質である。ヒト光受容タンパク質は、ヒトロドプシン（Rh1、OPN2、RHOともいう）またはフォトプシンとすることができる。フォトプシンは、長波長感受性（OPN1LW）オプシン、中波長感受性（OPN1MW）オプシン、および短波長感受性（OPN1SW）オプシンからなる群から選択することができる。
【００３８】
長波長感受性（OPN1LW）オプシンは、電磁スペクトルの黄緑色領域で、560nmのλ最大を有する。それは「赤オプシン」、「Lオプシン」、または「LWSオプシン」ともいう。中波長感受性（OPN1MW）は、電磁スペクトルの緑色領域で、530nmのλ最大を有する。それは、「緑オプシン」、「Mオプシン」、または「MWSオプシン」ともいう。短波長感受性（OPN1SW）オプシンは、電磁スペクトルの青色領域で、430nmのλ最大を有する。それは、「青オプシン」、「Sオプシン」、または「SWSオプシン」ともいう。
【００３９】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸配列は、ホモサピエンスロドプシン（RHO）遺伝子（GenBank: BC111451.3, Accession NM_000539, Version NM_000539.3 Gl:169808383）、または、そのフラグメントもしくは誘導体とすることができる。
【００４０】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸配列は、錐体ホモサピエンスオプシン1、長波長感受性OPN1LW（NCBI Reference Sequence: Accession: NM_020061, Version NM_020061.5）、または、そのフラグメントもしくは誘導体とすることができる。
【００４１】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸配列は、錐体ホモサピエンスオプシン1、中波長感受性OPN1MW、（NCBI Reference Sequence: Accession: NM_000513.2; (Science 232 (4747), 193-202 (1986)）、または、そのフラグメントもしくは誘導体とすることができる。
【００４２】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸配列は、錐体ホモサピエンスオプシン1、短波長感受性（OPN1SW）NM_001708, version NM_001708.2、または、そのフラグメントもしくは誘導体とすることができる。
【００４３】
感光性タンパク質をコードする核酸配列への言及には、本明細書に記載の配列の誘導体であるか、または、感光性タンパク質のより短いバージョンもしくはフラグメントをコードする核酸配列であって、該誘導体またはフラグメントは天然感光性タンパク質と実質的に同じ感光性機能を保持する、核酸配列が含まれる。実質的に同じとは、天然タンパク質の感光性機能の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を意味する。フラグメントは、天然タンパク質配列のうち70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を含む。
【００４４】
好適には、核酸配列のフラグメントまたは誘導体は、参照核酸配列長さの50%、60%、70%、80%、90%、または少なくとも95%の長さにわたり、参照核酸配列との間で、少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%、少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、または少なくとも99%の配列同一性を共有する。誘導体は好適には活性で、天然配列に比べ、置換および／または欠失および／または付加を含むことができる。誘導体はまた、他の遺伝子配列の一部を含むことができ、これは感光性タンパク質に望ましい活動または機能を提供する。
【００４５】
配列同一性は、所定の比較ウィンドウの上でアライメントを行った２つの配列（これは、参照ヌクレオチド配列またはタンパク質の長さの、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%とすることができる）を比較し、同一の残基が生じている場所の数を求めることにより決める。典型的には、これはパーセンテージで表される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は、当業者に周知の方法であり、ALIGN（Version 2.0）、GAP, BESTFIT, BLAST（Altschul et al J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）、FASTA and TFASTA（Wisconsin Genetic Software Package Version 8、カリフォルニア州サンディエゴ、Genetics Computer Group, Accelrys Inc.より入手可能）、およびCLUSTAL（Higgins et al, Gene 73: 237-244 (1998)）などの数学的アルゴリズムを実装した、デフォルトパラメータを用いるコンピューターを使用する。
【００４６】
核酸配列は、DNA、RNA、cDNA、またはPNAとすることができる。それは、ゲノム、組換え、または合成とすることができる。核酸配列は単離または精製することができる。それは、一本鎖または二本鎖とすることができる。好適には、核酸配列は、本明細書に記載するように感光性タンパク質をコードするだろう。核酸配列は、例えば、Sambrook et al；Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour laboratory Pressに記載されるような、制限消化、ライゲーション、ゲル電気泳動などの一般的な分子クローンニング技術を例えば用いて、クローニングすることにより、採取することができる。核酸は、例えば、ＰＣＲ技術等を用いて単離することができる。このような技術では、増幅する核酸配列の配列に基づいてプライマーを用いることができる。「単離して」とは、核酸配列を、任意の不純物および他の核酸配列から、ならびに／または、その供給源の核酸配列に関連して天然で存在するタンパク質から、分離することを意味する。そのため、それは、隣接核酸配列、または、染色体物質もしくは染色体配列から分離することができる。好適には、それはまた、細胞性物質、培地、または精製／生成工程で生じる他の化学物質を含まないだろう。核酸配列は合成でよく、例えば、ホスホトリエステル法（Narang et al、Meth Enzymol 68: 109-151 1979）などを用いる直接的な化学合成により生成することができる。核酸配列は、核酸のままか、または、タンパク質もしくは脂質と複合化して提供することができる。
【００４７】
配列を変えて（例えば、C末端を切り捨てる、もしくは標的モチーフを導入することにより）発現効率を改善する、または、（例えば、信号終端プロセスの一環として、ロドプシンキナーゼにより標的される残基を取り除く、または、加えることにより）光応答の特性を変えることができる。
【００４８】
配列情報を与えられれば、当業者は利用可能なクローニング技術を用いて、細胞へのトランスダクションに適した核酸配列またはベクターを生成することが可能である。
【００４９】
好適には、感光性タンパク質をコードする核酸配列は、ベクターとして、好適には発現ベクターとして、提供される。好適には、それは、遺伝子治療ベクターとして、好適には標的網膜細胞におけるトランスダクションと発現に適した遺伝子治療ベクターとして、提供することができる。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性（例えば、プラスミド）とすることができる。ウイルスベクターには、アデノウイルス、突然変異型を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、MMLV、GaLV、サル免疫不全ウイルス（SIV）、HIV、ポックスウイルス、およびSV40に由来するものを含む。ウイルスベクターは、複製欠損、複製可能、または条件付きとすることができると考えられるが、好適には複製欠損である。ウイルスベクターは、典型的には、標的網膜細胞のゲノムに統合せず、染色体外の状態で存続することができる。感光性タンパク質をコードする核酸配列を網膜標的細胞に導入するのに好適なウイルスベクターは、AAVベクター、例えば、自己完結型アデノ随伴ウイルス（scAAV）である。選択的な標的は、特異的AAV血清型（AAV血清型2〜AAV血清型12）、または、AAV 4YFベクターおよびAAV 7m8ベクターなどの血清型のうちいずれかの修正版を用いて達成することができる。ベクターを硝子体内投与により提供する本発明の態様では、ベクターは、１つまたは複数のECMタンパク質に結合しないように修正したものとすることができる。例えば、好適なベクターは、AAV 7m8のように、ヘパラン硫酸を結合させない、または結合させにくいようにした、修正ヘパリン硫酸結合部位を含むことができる（Dalkara Dら Sci Transl Med 2013; 5: 189ra76）。
【００５０】
ウイルスベクターを修正して、任意の非本質的な配列を削除することができる。例えば、AAVにおいて、ウイルスを修正してIX遺伝子、E1 a遺伝子および／またはE1 b遺伝子の全てまたは一部を削除することができる。野生型AAVでは、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスが存在せず、複製の効率は極めて低い。組み換えアデノ随伴ウイルスでは、好適には複製遺伝子およびカプシド遺伝子をトランスに（pRep/Capプラスミドに）提供し、AAVの２つのITRのみを残してビリオンにパッケージングする一方、必要なアデノウイルス遺伝子を、アデノウイルスまたは別のプラスミドにより提供する。同様の修正を、レンチウイルスベクターに施すことができる。
【００５１】
ウイルスベクターは、細胞内に侵入する機能を持つ。しかしながら、プラスミドのような非ウイルスベクターは、助剤と複合化して標的細胞による取り込みを容易にすることができる。このような錠剤には、ポリカチオン剤が含まれる。あるいは、リポソームに基づく送達システムなどの送達システムを、用いることができる。
【００５２】
本発明で用いるベクターは、好適にはin vivoまたはin vitroでの使用に適しており、好適にはヒトでの使用に適している。
【００５３】
ベクターは、好適には、標的網膜細胞の核酸配列の発現を指示する１つまたは複数の調節配列を含む。調節配列は、核酸配列に操作可能に連結したプロモータ、エンハンサ、転写終結信号、ポリアデニル化配列、複製起点、核酸制限酵素部位、および相同組換え部位を含むことができる。ベクターはまた、例えば成長系（例えば細菌性細胞）または標的網膜細胞のベクターの発現を決定する、選択可能マーカーを含むことができる。
【００５４】
「操作可能に連結した」とは、核酸配列が、それが操作可能に連結する配列と機能的に関連し、その結果、互いの発現または機能に影響を与えるように連結することを意味する。例えば、プロモータに操作可能に連結した核酸配列は、プロモータに影響された発現パターンを有するだろう。
【００５５】
プロモータは、それが連結する核酸配列の発現を仲介する。プロモータは、構造性または誘導性とすることができる。プロモータは、内網膜細胞における遍在的発現、またはニューロン特異的発現を指示することができる。後者の場合、プロモータは、例えばON型双極細胞またはOFF型双極細胞に、細胞種特異的発現を指示することができる。例えば、適切なプロモータは、L7、thy-1、レコベリン、カルビンディン、ヒトCMV、GAD-67、ニワトリβ-アクチン、hSyn、Grm6、Grm6エンハンサ-SV40融合タンパク質からなる群から選択することができる。標的は、細胞特異的プロモータ、例えば、ON型双極細胞を選択的に標的するためのGrm6-SV40を用いて達成することができる。Grm6プロモータは、ON型双極細胞特異的代謝型グルタミン酸受容体、mGluR6をコードするGrm6遺伝子の200塩基対エンハンサ配列と、SV40真核生物プロモータの融合である。Grm6遺伝子の好適な供給源は、マウスおよびヒトである。遍在性発現は、汎ニューロン（pan-neuronal）プロモータを用いて達成することができ、該プロモータの例は当技術分野で既知であり、利用可能である。その一例はCAGである。CAGプロモータは、CMV初期エンハンサ（early enhancer）とチキンベータ-アクチンプロモータの融合である。
【００５６】
本発明は、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含む、治療組成物を提供する。組成物は、薬学的に利用可能な賦形剤で提供することができる。
【００５７】
本発明はまた、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。ヒト光受容タンパク質は、ヒトロドプシン（Rh1、OPN2、RHOともいう）またはフォトプシンとすることができる。フォトプシンは、長波長感受性（OPN1LW）オプシン、中波長感受性（OPN1MW）オプシン、および短波長感受性（OPN1SW）オプシンからなる群から選択することができる。ベクターは、対象に投与するため、組成物として提供することができる。
【００５８】
組成物は、液体または固体、例えば、粉、ゲル、またはペーストとすることができる、好適には、組成物は液体であり、好適には注入可能な液体である。適切な賦形剤は、当業者に既知であろう。
【００５９】
ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターの投与に関係する、本発明の第４態様および第５態様において、ベクターは、網膜下または硝子体内への投与により眼に投与することができる。どちらの投与方法でも、ベクターは好適には注入可能な液体として提供される。好適には注入可能な液体は、カプセルまたはシリンジとして提供される。この態様では、好適には、本明細書で記載するような核酸は細胞外基質分解酵素の投与なしに導入される（つまり、それは酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。この態様では、好適には、注入可能な液体は、細胞外基質分解酵素を含まない。
【００６０】
細胞外基質分解酵素の投与を含む本発明の態様では、酵素は核酸とは別に、または、核酸と一緒に、つまり単一の組成物として、提供することができる。個別に提供された場合、酵素および核酸配列は、同一賦形剤または違う賦形剤で提供することができる。このような好適な実施形態では、それは個別に、例えば、個別のマイクロカプセルに保持することができる。したがって、このような実施形態では、本発明は、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列を含む第１注入可能液体と、（２）細胞外基質分解酵素とを含む第２注入可能液体とを含む組成物を提供する。好適には、第１および第２の注入可能液体は、例えば、好適には同一のパッケージ内にある、カプセルまたはシリンジなど、個別の容器で提供する。
【００６１】
好適には、本発明の第１、第２、および第３の態様の組成物は、核酸および酵素を、個別に、連続で、または併用して対象に投与するために提供する。
【００６２】
本発明の組成物は、光受容機能を細胞に提供する方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、網膜の光受容機能を回復する方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、対象の視力を回復させる方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、網膜変性症状、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；他の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気、例えば網膜色素変性症を処置する方法で用いるために提供することができる。
【００６３】
本発明は、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを含むキットを提供する。ヒト光受容タンパク質は、上記の通りとすることができる、核酸ベクターは、本明細書に記載のように、組成物として提供することができる。組成物は、注入可能液体とすることができる。この態様では、好適には、キットは細胞外基質分解酵素を含まない。
【００６４】
本発明は、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含むキットとを提供する。本発明のキットでは、細胞外基質分解酵素および核酸配列は、個別に、または、一緒に、提供することができる。それらはそれぞれ、独立して、例えば本明細書に記載するような組成物として提供することができる。したがって、本発明のキットは、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含み、ここにおいて、前記核酸および／または酵素は組成物として提供される。核酸配列および酵素は、単一の組成物で一緒に提供されてもよいし、、個別の組成物として提供されてもよい。別個に提供される場合、酵素および核酸配列は、同一の賦形剤または異なる賦形剤で提供することができる。このような実施形態では、それは個別に、例えば、個別のマイクロカプセルに保持することができる。
【００６５】
好適な実施形態では、キットは、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列を含む第１注入可能液体と、（２）細胞外基質分解酵素を含む第２注入可能液体とを含むことができる。好適には第１および第２の注入可能液体は、例えば、好適には同一のパッケージ内にある、カプセルまたはシリンジなど、個別の容器で提供される。
【００６６】
本発明のキットはさらに、使用説明書、投与計画、１つまたは複数の微細針、１つまたは複数のシリンジ、および溶媒を含むことができる。
【００６７】
本発明のキットは、細胞に光受容機能を提供する方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明のキットは、網膜の光受容機能を回復する方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明のキットは、対象の視力を回復させる方法で用いるために提供することができる。一実施形態では、本発明のキットは、網膜変性症状、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；他の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、および、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気、例えば網膜色素変性症を処置する方法で用いるために提供することができる。
【００６８】
本発明は、細胞に光受容機能を提供する方法であって、眼にヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを導入するステップを含む、方法を提供する。ヒト光受容タンパク質は、上記の通りとすることができる、本発明は、核酸ベクターの、眼の網膜細胞への網膜下投与または硝子体内投与を含む。この態様では、好適には、該方法は細胞外基質分解酵素の投与は含まない。本発明は、細胞に光受容機能を提供することにより網膜変性を処置する方法で用いる、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。この態様では、好適には、細胞外基質分解酵素は用いない（つまり、核酸は酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。
【００６９】
本発明は、眼の硝子体腔に、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを導入するステップを含む、細胞に光受容機能を与える方法を提供する。本発明は、細胞に光受容機能を提供する方法で用いるための、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素を提供する。
【００７０】
本発明はまた、網膜の光受容機能を、特に桿体および／または錐体細胞の変性後に、強化する方法であって、眼の硝子体腔にヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを導入するステップを含む、方法を提供する。ヒト光受容タンパク質は上記の通りとすることができる。該方法は、核酸ベクターの、眼の網膜細胞への網膜下投与または硝子体内投与を含む。この態様では、好適には、該方法は細胞外基質分解酵素の投与は含まない。本発明は、網膜の光受容機能を強化することにより網膜変性を処置する方法で用いる、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。ヒト光受容タンパク質は上記の通りとすることができる。この態様では、好適には、細胞外基質分解酵素は用いない（つまり、核酸は酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。
【００７１】
本発明はまた、網膜の光受容機能を、特に桿体および／または錐体細胞の変性後に、強化する方法であって、本明細書に記載のように、光受容機能を細胞に提供するステップを含む、方法を提供する。本発明は、網膜の光受容機能を、特に桿体および／または錐体細胞の変性後に、強化する方法であって、本明細書に記載のように、光受容機能を細胞に提供するステップを含む、方法で用いるための、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素を提供する。
【００７２】
本発明はまた、対象の視力を回復する方法であって、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを眼に導入するステップを含む、方法を提供する。ヒト光受容タンパク質は、上記の通りとすることができる。該方法は、核酸ベクターの、眼の網膜細胞への網膜下投与または硝子体内投与を含む。この態様では、好適には、該方法は細胞外基質分解酵素の投与を含まない。本発明は、対象の視力を回復するために用いるヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。ヒト光受容タンパク質は、上記の通りとすることができる。この態様では、好適には、細胞外基質分解酵素は用いない。（つまり、核酸は酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。
【００７３】
本発明はまた、対象の視力を回復する方法であって、本明細書に記載のように光受容機能を細胞に与えるステップを含む、方法を提供する。本発明は、対象の視力を回復する方法であって、本明細書に記載のように光受容機能を細胞に与えるステップを含む、方法で用いるための、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素を提供する。
【００７４】
本発明はまた、対象の網膜疾患を処置する方法であって、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを眼に導入するステップを含む、方法を提供する。ヒト光受容タンパク質は上記の通りとすることができる。該方法は、核酸ベクターの、眼の網膜細胞への網膜下投与または硝子体内投与を含む。この態様では、好適には、該方法は細胞外基質分解酵素の投与は含まない。本発明は、対象の網膜疾患を処置する際に用いるヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。ヒト光受容タンパク質は上記の通りとすることができる。この態様では、好適には、細胞外基質分解酵素は用いない（つまり、核酸は酵素の共投与なしで導入する。ここで、共投与には、同一治療下での個別投与、連続投与、または併用投与が含まれる）。疾患は、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；他の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気とすることができる。
【００７５】
本発明はまた、網膜変性疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載のように光受容機能を細胞に提供するステップを含む、したがって、本発明は、本発明で定義するように疾患を処置する方法で用いるための、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素を提供する。疾患は、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；他の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気とすることができる。
【００７６】
光受容体機能を細胞に提供することは、かねて光受容機能を持たなかった、または、光受容機能が全体的または部分的に変性してしまった細胞が、感光性タンパク質をコードする外来核酸配列がそこで発現すると同時に光受容性になることを意味する。このような細胞は、中に非天然核酸を含むことから、本明細書では形質転換細胞ということができる。好適には、形質転換網膜細胞は、天然光受容細胞の光受容機能の一部またはすべてを呈す。好適には、形質転換細胞は、天然網膜光受容細胞と少なくとも同じ、または、実質的に同じ光受容機能を呈す。好適には、形質転換細胞は、疾患または変性のある天然網膜光受容細胞よりも、高い光受容機能を呈す。そのため、形質転換細胞では、好適には、同一の供給源に由来し、同一の条件下で維持され、変性または疾患のある未処置細胞に比べ、光受容体が増加するだろう。形質転換細胞は、その中に外来性核酸が存在することにより、天然細胞と見分けることが可能である。
【００７７】
光受容機能の強化とは、桿体または錐体細胞などの光受容細胞の機能の向上すること、および／または、光受容機能を細胞に提供することにより、網膜の光受容機能を向上することを意味する。したがって、網膜では、本明細書に記載の方法で処置していない網膜に比べ、光信号を受け、該信号を送る機能が向上するだろう。向上はどの程度でもよく、好適には野生型レベルまでである。
【００７８】
対象の視力を回復するとは、対象が、例えば本明細書に記載の視力テストを用い、処置前と比べて視力の改善を示すことを意味する。回復には任意の改善度を含み、視力が、完璧な、またはほぼ完璧な視力へ回復することを含む。
【００７９】
疾患を処置するとは、本明細書に記載の核酸および細胞外分解酵素を投与して、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；他の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気からなる群から選択される疾患の、１つまたは複数の症状を改善または緩和することを意味する。改善または緩和は、周辺視力もしくは中心視力の改善、および／または、日中視力もしくは夜間視力の向上をもたらし得る。
【００８０】
本発明の方法は、眼の硝子体腔に感光性タンパク質をコードする核酸配列を導入するステップを含む。好適には、該方法は、感光性タンパク質をコードする核酸配列を有する細胞を接触させるステップを含む。好適には、細胞は網膜細胞であり、好適には、ON型双極細胞、OFF型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、および／または、無軸索細胞である。
【００８１】
好適には、本発明の方法は、感光性タンパク質をコードする核酸配列を、眼の網膜に、好適には、網膜の光受容細胞に、好適には、ON型双極細胞、OFF型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、および／または、無軸索細胞に、標的させる。したがって、細胞を接触させることには、細胞のトランスフェクションおよび／またはトランスダクションを含む。
【００８２】
酵素を投与する場合、酵素は網膜細胞に内在化される必要はないが、多くは硝子体腔または網膜に残り、ここでそれは細胞外基質タンパク質を分解して、核酸配列の網膜細胞へのアクセスを改善する。
【００８３】
本発明の方法は好適にはin vivoで行われる。
【００８４】
感光性タンパク質をコードする核酸配列および酵素は、個別に、連続して、または一緒に提供することができる。同時に（つまり、一緒に）提供する場合、核酸配列および酵素は、硝子体腔に導入する単一組成物として、または、硝子体腔に同時に提供するが個別の組成物として、提供することができる。個別に提供する場合、核酸配列および酵素は、個別の組成物として提供し、同時にまたは連続してのいずれかで提供することができる。連続して提供する場合、酵素は、核酸配列の前後で、好適には後に、提供することができる。第４および第５の態様では、酵素は本明細書に記載の方法により、共投与されなかった。
【００８５】
２つ以上の酵素を提供する場合、それらは併用単回投与または複数回投与で導入することができる。酵素は、核酸配列と組み合わせて、または、それとは別に、提供することができる。複数の酵素投与量を導入する場合、１つまたは複数の任意の投与量を、併用酵素／核酸配列投与量とすることができる。好適な方法は、（１）併用酵素投与量と、（２）核酸配列との連続投与量の導入を含む。好適な実施形態では、酵素投与量はヘパリナーゼIIIおよびヒアルロン酸リアーゼを含む。
【００８６】
任意の適切な方法を、核酸配列および酵素の網膜下または硝子体腔への導入に用いることができる。好適な方法は注入である。したがって、１回分の核酸配列および／または酵素を注入として提供する。本発明の方法は、ヒト光受容タンパク質をコードする核酸を含む核酸ベクターを網膜下または硝子体腔に注入するステップを含む。好適には、該方法は、例えば視力を回復するため、好適には、網膜変性症状、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；別の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気の処置のために、光受容機能を細胞に提供することである。
【００８７】
方法は、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを、硝子体腔に個別に、同時に、または連続して、注入するステップを含む。好適な実施形態では、本発明の方法は、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含む単回投与量を、眼の硝子体腔に注入するステップを含む。好適には、方法は、（１）ロドプシンをコードする核酸配列と、（２）酵素ヘパリナーゼIIIおよびヒアルロン酸リアーゼとを含む単回投与量を、眼の硝子体腔に注入するステップを含む。好適な実施形態では、本発明は、光受容機能を細胞に提供し、例えば視力を回復するため、好適には、網膜変性症状、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；別の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気の処置のために、（１）感光性タンパク質をコードする核酸配列と、（２）細胞外基質分解酵素とを含む、眼の硝子体腔内へ導入するための注入可能単回投与量を提供する。好適には、本発明は、光受容機能を細胞に提供し、例えば視力を回復するため、好適には、網膜変性疾患、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；別の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気の処置のために、（１）ロドプシンをコードする核酸配列と、（２）酵素ヘパリナーゼIIIおよびヒアルロン酸リアーゼとを含む、眼の硝子体腔内へ導入するための注入可能単回投与量を提供する。
【００８８】
核酸配列および１つまたは複数の酵素を複数回（２回以上）投与で提供する場合、これらは、例えば３０秒〜数時間または１日以上といった適切な時間間隔で分けることができる。
【００８９】
各投与量は、有効量の核酸配列および／または酵素を含む。核酸配列の有効投与量は、1回の治療計画当たり1×109〜1×1014または7.5×1015、好適には、1×1011〜7.5×1013の核酸配列（例えば、ベクターまたはウイルス粒子の数）に及び得る。酵素は、眼１つにつき0.075〜0.125単位以上の投与量で提供することができる。
【００９０】
本発明の方法は、網膜変性症状、例えば、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー；別の形態の網膜変性または黄斑変性、虚血状態、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気について、対象を診断するステップを含むことができる。診断ステップには、視覚テスト、例えば、瞳孔対光反射（PLR）テスト、視力テスト（LogMAR）、生体顕微鏡検査／眼のスリットランプ検査／網膜臨床検査などの臨床診断テスト；色覚テスト、視野テスト、コントラスト／全視野感受性；例えばEGG、VEPを含む電気診断テスト；結像網膜眼底撮影法、OCT、および補償光学適用走査型レーザー検眼鏡（AOSLO）を含むことができる。他の適切なテストは当業者に既知であろう。
【００９１】
本発明の方法は、例えば、トロピカミドおよび／またはフェニレフリン、および／またはシクロペントレートなどの散瞳薬の適用により、処置する眼の瞳孔を拡張するステップを含むことができる。本発明の方法は、例えば手術により、網膜にアクセスするステップを含むことができる。
【００９２】
本発明の方法は、処置した対象の視力を、視力の改善に関してモニタリングするステップを含むことができる、視力の改善は、以下のうち任意の１つまたは複数のすることができる：瞳孔対光反射（PLR）の向上、コントラスト感受性の向上、高周波または低周波のフリッカの解像度の向上、および動画検出の向上。加えて、光誘発性自発運動の増加が、マウスなどの動物で改善される。視力の改善は、1015〜1013 photons/cm2/s角膜照度の光に応答する、または、検出する能力とすることができる。視力の改善には、ON-維持応答、ON-過渡応答、OFF-興奮性応答、OFF-抑制性応答、またはON-OFFの応答を含むことができる。好適には、改善のモニタリングは、対象の主観的視覚経験、または、客観的光応答、例えば、瞳孔対光反射（PLR）テスト、LogMAR視力、臨床検査スリットランプ生体顕微鏡検査法；色覚テスト、視野テスト、コントラスト／全視野感受性；電気診断法−EGG、VEP；結像：網膜眼底撮影法、OCT、補償光学適用走査型レーザー検眼鏡（AOSLO）、または客観的光応答測定、または迷路ナビゲーション課題を定量化する方法を含むことができる。
【００９３】
対象を、6時間、8時間、10時間、12時間、もしくは24時間毎に、または、2日、3日、4日、5日毎に、モニタリングすることができる。これは、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月または1年以上後に繰り返すことができる。
【００９４】
「in vivo」と言う用語は、天然環境（例えば、動物または細胞において）、および、その天然環境（例えば、対象の体内）で起きるプロセスまたは応答を意味する。
【００９５】
本発明は、感光性タンパク質をコードする核酸配列を網膜細胞に標的させ、網膜の光受容細胞の変性を補償することに基づく。核酸配列が標的にする細胞は、生きた網膜細胞で、外来性核酸配列を発現することが可能な網膜細胞である。本明細書では、網膜細胞は網膜の細胞である。これは、神経または神経細胞であり、そして、活性化して電気信号を伝達することが可能である。好適には、標的網膜細胞は、電気信号を生成し、そして、信号の視神経への伝達につながる信号伝達カスケードを開始することが可能であろう。好適には、標的網膜細胞は、内網膜の細胞である。標的細胞は桿体または錐体細胞とすることができ、および／または、非光受容細胞（つまり、天然形態では光に応答しない網膜細胞）とすることができる。標的網膜細胞は、桿体細胞、錐体細胞、ON型双極細胞、OFF型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、ミューラー細胞、および／または無軸索細胞からなる群から選択した、１つまたは複数の細胞種を含むことができる。
【００９６】
したがって、標的網膜細胞を、網膜のON型双極細胞、OFF型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、および／または無軸索細胞に的を絞る場合、感光性タンパク質をコードする核酸の発現は、異所性発現ということができる。したがって、本発明は、その範囲内に、非光受容細胞で、感光性タンパク質をコードする核酸配列を異所性発現させる方法を含む。該異所性発現は、そこで異種感光性タンパク質が発現することにより、光受容機能を細胞に提供する効果がある。これは、変性が観察される網膜の光受容能力を向上するのに役立つ。細胞外基質分解酵素と核酸配列の共投与は、核酸配列の標的網膜細胞へのトランスダクションを改善するのに役立つ。
【００９７】
細胞は、原核生物または真核生物とすることができる。それは、大腸菌などの細菌細胞とするか、哺乳類、または、例えば、昆虫細胞、酵母細胞、細胞株、もしくは、例えば本発明のベクターや組成物を生成するのに用いる無細胞発現システムといった非哺乳類細胞とすることができる。標的網膜細胞は、ON型双極細胞、OFF型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、および／または無軸索細胞とすることができる。
【００９８】
水平細胞は、信号処理および光受容細胞へのフィードバックに関与する内網膜細胞であり；双極細胞は内網膜細胞であって、桿体／錐体細胞と、無軸索および／または神経節細胞の間を連絡し；無軸索細胞は、内網膜に見られ、光受容経路と神経節細胞の間を連絡し；神経節細胞は、光受容細胞からの信号を視神経に渡す、最内網膜細胞である。
【００９９】
本明細書における細胞への言及は、細胞の子孫を含む。好適には、本発明に従う細胞の修正は、形質転換された宿主細胞の継代でも起きる。子孫細胞は当初標的にされた細胞と同一であることはできないが、好適には、該子孫細胞も非天然感光性タンパク質の発現を示すだろう。
【０１００】
本発明は、眼の光受容細胞の変性、典型的には、視力の部分的または完全な喪失をもたらすのに十分な変性により特徴付けられる、任意の障害の処置に用いることができる。本発明により処置または改善することができる疾患の例には、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、錐体−桿体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、および黄斑ジストロフィーを含む網膜ジストロフィー（網膜色素変性症）；他の形態の網膜変性または黄斑変性（例えば、加齢に伴う黄斑変性）、虚血状態、（黄斑または網膜）浮腫、ブドウ膜炎、ならびに、光受容機能の低下により引き起こされる任意の他の病気が含まれる。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、任意の哺乳類または非哺乳類を意味する。哺乳類はヒト、ならびに、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、キリン、ヤク、シカ、ラクダ、ラマ、アンテロープ、野ウサギ、およびウサギなどの脊椎動物を含むが、これに限らない。
【０１０２】
本明細書において、「１つ（「a」または「an」）」への言及は、その範囲内に単数形および複数形の両方、つまり１つまたは複数を含む。
【０１０３】
特に明記されない限り、各態様の特徴および実施形態は、本発明の他の態様に準用する。
【０１０４】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む（comprise）」および「含有する（contain）」という用語ならびにそれらの活用形は、「含むが、これに限らない」ということを意味し、他の部分、添加剤、要素、整数又はステップを含まないことを意図するものではない（すなわち、排除しない）。本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、単数形の表現は、文脈上別意に解すべき場合を除き、複数を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、本明細書は、文脈上別意に解すべき場合を除き、単数と同様に複数も考慮するものと理解すべきである。
【０１０５】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分、または基は、矛盾しない限り、本明細書内に記載の任意の他の態様、実施形態又は実施例にも適用可能であると理解すべきである。本明細書（添付のいかなる特許請求の範囲、要約書、および図面も含む）に開示されたすべての特徴、ならびに／または、そのように開示された任意の方法もしくはプロセスのすべての工程は、少なくとも一部のそのような特徴および／またはステップが互いに排他的である組合せを除き、任意の組合せで組み合わせ得る。本発明は、前述のいかなる実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（添付のいかなる特許請求の範囲、要約書、および図面も含む）に開示された特徴の、いかなる新規な１つもしくはいかなる新規な組合せ、または、そのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の、いかなる新規な１つもしくはいかなる新規な組合せにも及ぶ。
【実施例】
【０１０６】
本研究では、硝子体内AAV遺伝子治療を用いて、残った内網膜ニューロンにおいてヒト桿体オプシンを発現させることにより、盲目なrd1網膜に光応答性を戻すことの実現可能性を調べた。非標的（ニューロン非選択的）送達および標的（ON BP細胞に対し選択的）送達の両方を研究した。さらに、in vivoでの応答回復の特徴、ならびに、フルフィールドフリッカ、コントラスト検出、および写実的光景を含むより複雑な画像処理を解像する、処置済み盲目マウスの能力を調べた。
【０１０７】
非標的異所性桿体オプシンおよび標的異所性桿体オプシンは両方とも、ON経路およびOFF経路を含む多様な視覚コードを介して、上手く視力を回復することが分かった。回復した応答は網膜を超えてCNS視覚経路に送られ、明順応条件下と同様に、通常の錐体（および桿体）視力の光強度範囲下でも機能する。応答は、屋内の室内照明と同等の照明下で、処置マウスにおいて光誘発性運動行動を導くのに十分なほど強力である。さらに、結果は、ON型双極細胞を特異的に標的したマウスは、フルフィールドフリッカ、コントラスト検出、および、空間パターンおよび物体運動の変化を特徴とする写実的な動画の場面を含む、より複雑な視覚機能を解像できる。
【０１０８】
１．眼内注入およびAAVを介した遺伝子送達（図１）
本研究では成体C3H/HeJ（rd1）マウスを用いた。具体的には、rd1マウスの機能喪失型突然変異（null mutation）pde65bは、p90により光受容体の完全な消失を引き起こす（Crater-Dawsonら1978、Farber dbら1994）。（変異はロドプシン自体には影響を与えないことに留意することが重要である。）。桿体オプシンは、in vivoで外部光受容体を発現可能かどうかに答えるため、遺伝子発現カセットを成体rd1マウスの硝子体内に注入した（図１Ａ）。このアプローチの応用可能性を念頭に置き、臨床的に安全なAAV2/2ベクターとヒト化桿体オプシンを用いた。より広範にわたる網膜トランスダクションを達成し、ベクターの代替網膜下送達と関連する潜在的合併症を最小化するため、硝子体内注入を用いた。網膜下アプローチは、通常、注入部位に局在するトランスダクションを引き起こす。トランスダクションを強化し、ベクターを網膜のより深くに浸透させるため、グリコシド酵素の最適組み合わせを共に注入した。あったとしても、天然光受容体以外でどの細胞種が桿体オプシンを発現するかは知られていない。強力な汎ニューロンプロモータ、CAGを用いて、非標的発現をまず研究した。
【０１０９】
注入して４〜６カ月後に網膜を採取し、網膜の低温切片を、ヒト桿体オプシンに対する抗体で免疫標識した。発現を、蛍光顕微鏡法を用いて確かめた。桿体オプシンは、強力に標識された神経細胞体により確認されるように、光受容体の外側でよく発現していた（図１Ｂ）。発現は、プラズマ膜に局在化し、RGC層（図１Ｃ）およびINLの両方で観察された。非選択的プロモータで、水平細胞および無軸索細胞を含む、INLのいくつかの異なる細胞種が形質導入されたようだった。ただし、概して、INL中の形質導入された細胞体は、双極細胞の特徴を有していた（図１Ｄ）。比較すると、我々の対照PBS注入群では、蛍光は見られなかった。加えて、桿体オプシンに対する抗体で処置した非注入野生型網膜は、光受容体外部分で明確な蛍光を示した。これは、該抗体が、オフターゲット標識を持たない桿体オプシンに特異的であることを示す。
【０１１０】
〔結果〕
〔瞳孔測定〕
図２．ロドプシン処置後の瞳孔対光反射の回復。減光フィルタND4（最も暗い）〜ND0（最も明るい）に白色光を１０秒当てた際の、最大縮瞳に関する放射照度−応答曲線。ロドプシン処置眼（Rd RHO）が、GFP注入眼（Rd GFP）に比べ、視覚感度の著しい改善を示す。PBS／酵素混合物を注入した野生型C57マウスのデータを比較のために示す（WT PBS）。データは、照光を始める直前に、瞳孔サイズについて正規化する。値は平均±SEMであり、nは試験した動物の数を示す。
【０１１１】
〔in vivo 電気生理学〕
図３．in vivo電気生理学記録からの記録。強度を高めながら対側ロドプシン処置眼に当てた、405nm光の2秒刺激に対するLGN細胞の平均発火率を示す、記録チャネル（sig）の数についての、イベント前後ヒストグラムの代表サンプル（図３Ａ−ND2、図３Ｂ−ND1、図３Ｃ−ND1；ND2＝最も暗い、ND0＝最も明るい）。多くのチャネル（例えば、ND0およびND1におけるsig 50、sig52）が、光のスイッチ入れた後、「ONピーク」を有する強力な「早発性」光応答を示し、光のスイッチを切った際は「OFFピーク」を示した。観察された応答は、対側の眼の刺激後にrd1マウスLGNに通常ある天然光応答とははっきり区別される（図３）。これらの天然応答は、ロドプシンまたはGFPで処置した眼の両方で観察され、典型的な、（メラノプシン網膜神経節細胞（図３Ｄ）による）「遅発性」の持続応答、および、（残存錐体光受容体（図３Ｅ）による）非常に高速な過渡応答を示す。「回復」応答（図３Ａ〜Ｃ）は、そのため、ロドプシンの異所性発現が原因の誘発光受容特性を持つ網膜細胞（網膜神経節または双極細胞）に由来する。
【０１１２】
〔MEA in vitro記録〕
図４．in vitro MEA記録によるデータ。強度を高めながら単離網膜に適用した、405nm光の2秒刺激に対する網膜神経節細胞の平均発火率を示す、記録チャネル（sig）の数についての、イベント前後ヒストグラムの代表サンプル（図４Ａ−ND2、図４Ｂ−ND1、図４Ｃ−ND1；ND2＝最も暗い、ND0＝最も明るい）。多くのチャネルが、強力な「早発性」光応答を示し、一部のチャネル（例えば、ND0およびND1におけるsig35、sig36）は、光のスイッチ入れた後「ONピーク」を示し、光のスイッチを切った際に「OFFピーク」を示した。観察された応答は、光刺激後にrd1マウス網膜に通常ある天然光応答とははっきり区別される（図５）。これらの天然応答は、ロドプシンまたはGFPで処置した眼の両方で観察され、典型的な、（メラノプシン網膜神経節細胞（図５、sig37）による）「遅発性」の持続応答を示す。そのため、新規の応答（図４Ａ〜Ｃ）は、ロドプシンの異所性発現に由来する光受容特性を持つ網膜細胞から生じる。
【０１１３】
〔網膜神経節細胞における光誘発活動の回復−in vitroにおける桿体オプシン応答の機能評価〕（図３）
次に、異所性発現した桿体オプシンが、盲目網膜において機能的な光応答を引き起こし得るかを確かめることが望まれた。網膜外植片をマルチ電極アレイに乗せ、光誘発性活動をテストした。rd1マウス（生後４〜６か月）に由来する桿体オプシン注入（CAG-hRho）網膜は、15.4 log photons/cm2/sで広域スペクトル白色光の２秒フルフィールドフラッシュで刺激した後、強力な初期発火率を有する光応答細胞を示した。しかしながら、提示を数回繰り返した後は、光誘発性活動のスパイク頻度は漸減した。これは、退色効果を示す。これは、9-cisの内因性供給がすぐ欠乏するin vitro 調製物では、驚くことではなかった。しかしながら、9-cisを該調製物に加えると、高度に再現性のある応答を有する強力なニューロン活動を誘発した。加えて、ON持続応答、ON過渡応答、およびOFF応答など、様々な応答プロファイルが光応答細胞（n=6網膜）の母集団全体で確認された。対照的に、GFP注入（CAG-GFP）月齢対応対照網膜は、光受容体の欠乏に合致し、同様の光刺激を提示した後も光誘発性活動を示さなかった（n=2網膜）。（より低い光刺激（14.4 log photons/cm2/s図１Ｈおよび13.4 log photons/cm2/s）で、桿体オプシン処置網膜において光応答を引き起こすことも可能で、これは、天然錐体視の活性化に必要な光強度より少なくとも5〜6log単位高い光強度を用いる他の光遺伝ストラテジー（Gaub, Lagaliなど）と比較し、光感受性において著しい改善を示した。
【０１１４】
異所性桿体オプシンが仲介する応答をLGNに送る−in vivoでの回復応答の特性評価
発色団（9-cisレチナール）の定期的な外来性供給のない桿体オプシン退色が、in vitro実験では問題であることから、発色団のリサイクリングを可能にし、退色を防ぐのに十分なレチナールが無傷網膜にあるか否かを確認するため、ニューロン活動をテストした。加えて、網膜を変性およびリモデリングするという文脈の中で、回復応答はより高度な視覚中枢を活性化するのに十分なほど強力であるか否かを調べた。外側膝状体背側核、dLGNからのニューロン応答を、両脳半球から同時に記録した。ここで、片方の目は事前に桿体オプシンで処置し、もう一方はGFPを注入し、インターナルコントロールとして機能させた。dLGNは、脳の主な網膜受容部であり、信号を視覚野に中継するニューロンを含む。dLGNからの応答、つまり、RGCに対する第１シナプス結合を研究し、応答を回復する特性についての最良のアイディアを得た。15.4 log photons/cm2/sで410nm光の２秒フルフィールドフラッシュ後、インターナルコントロールと比べ、dLGN全体で光応答数の著しい増加がみられた（インターコントロール：4、dLGN：157）。平均発火率が、基線と比較し、刺激開始または刺激終了の後、95％CIを横切らなければならないという、Neuroexplorer（Nex Technologies）における刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）を用いた客観的基準に従って、光応答細胞を特定した。2秒の刺激に対するPSTH時間間隔は-2秒〜5秒であり、ビンサイズは250msだった。偽陽性を招く明確な不自然な結果は除外した。各群に由来する全光応答細胞を含め、2秒刺激提示のうち最初の1秒間の持続応答の振幅に応じて応答を順序付けするため、「ヒートマップ」を生成した。緑色（+1）は高発火率を示し、桃色／紫色（-1）は低発火率を示す。図３Ｆは、WT網膜で通常見られるような、持続応答、過渡応答、ON応答、およびOFF応答など、様々な種類の回復応答を明確に示す。対照的に、対照群で見られた光応答細胞（n=4）は全て、天然ipRGCから生じるような、遅発性ON持続性だった。退色は、多くの反復トライアルで強固な発火を示したin vivo光応答では、問題とは考えられなかった。
【０１１５】
単一単位レベルで見られる（ただし、テストした全網膜で見られる）回復応答の多様性を捉えるため、個別応答を、その刺激前後時間ヒストグラム（PSTH）および対応するトライアルビンカウント（TBC）を通じて系統的に研究した。一部の細胞が光ONで活性化し（ON応答）、一部が光ONで抑制され（OFF抑制性応答）、一部が光OFFで活性化し（OFF興奮性）、一部は光ONおよび光OFFの両方で活性化する（ON-OFF細胞）場合、細胞の母集団全体を平均することは難しいだろう。持続応答（10秒および2秒の光ステップ、図３Ｇ）およびより過渡な応答（2秒光ステップ、図３Ｈ）の両方が、WT網膜由来のもの（挿入）と比較し、処置眼において誘発された。加えて、ON応答に対し、多くのOFF応答（図３Ｉ）およびいくらかのON-OFF応答（図３Ｊ）を発見した。光応答細胞の母集団全体では、ON細胞の99／157（63.1％）、OFF細胞の46／157（29.3％）、およびON-OFF細胞の12／157（7.6％）（図３Ｅ）を発見した。これらは、ON持続細胞（51／157；32.5％）、ON過渡細胞（48／157；30.6％）、OFF興奮性細胞（29／157；18.5％）、OFF抑制性細胞（17／157；10.8％）、およびON-OFF細胞（12／157；7.6％）に大まかに分類される。平均発火率は、回復応答全体で20〜100Hz間にわたった。応答は、短い潜伏時間（50〜100ms−2D、細胞1；2E 細胞1）でもより長い潜伏時間（500msで開始−2D、細胞3）でもみられた。最も持続した応答での発火率は、即座に基線に戻った（光刺激をオフにしてから数百ミリ秒、2D細胞3）が、一部の細胞では発火はより持続した（光オフ後数秒、2D細胞2）（他の研究、lagali, flannery, wt応答と同様）。
【０１１６】
〔回復LGN応答の感受性およびコントラスト特徴〕
ChR（1015〜1017photons/cm2/s）および光合成スイッチ（1015〜1018 photons/cm2/s）に基づく現在の光遺伝ストラテジーは、活性化に高い光強度を必要とし、これらの光強度に長期間さらすことは、網膜に有害となり得る。我々の実験では、回復ニューロンを、自然の日光の照度の同等（1013〜1015 photons/cm2/s）の、光強度ダイナミックレンジ下で操作した（図６）。重要なことに、強力で反復可能な、持続応答および過渡応答、ON応答、ならびにOFF応答がこれらの光強度全体で見られ、これは、系が如何に高感度であるかを示す。一部の光応答はまた、より低い光強度（1012および1011）でもみられたが、これらは再現しにくいと同時に容易ではなかった（データ表示なし）。未処置網膜を刺激した場合、1015 photons/cm2/sより低いレベルでは説得力のある光応答は記録されなかった。
【０１１７】
これまで、新しい光遺伝ツールでの研究は全て、暗闇からのフルフィールド光ステップを用いて、暗順応状態下での回復応答を特徴付けるものだった。これは強いニューロン応答を誘発する可能性を高めたが、これらの状態は実生活シナリオでめったにない。系を、より自然な状態、つまり明順応状態でテストした。強力で、高振幅の、反復可能な応答が、明順応状態下で、Michelsonコントラスト96％で記録された（図６Ｂ）。対照rd1網膜の明順応刺激に応えるコントラスト検出細胞はなかった。
（より低いコントラスト（66％および33％）も測定可能な応答を誘発したが、これらは反復トライアル全体では高い再現可能性はなかった（補足参照／または表示なし）。）
【０１１８】
〔細胞特異的プロモータを用いた桿体オプシンの制限異所性発現〕
桿体オプシンの非限定的異所性発現のある生成視覚コードの多様性は期待が持てるものだった。しかしながら、桿体オプシン発現が「ON経路」のみに限定されるものである場合、このコードに変化があるか否かを調べることを決めた。そのため、桿体オプシンを、細胞特異的Grm6プロモータを用いてON型双極細胞に発現させた（図７Ａ〜Ｃ）。
【０１１９】
図８〜１０は、桿体オプシンをONBP細胞に標的させて処置したマウスについて、種々の光条件下でdLGN光応答が回復したことを示す。感受性は、通常の光条件に至るまで実証された。引用した放射照度の数字は角膜測定に関する。網膜照射は、約１桁小さいだろう。
【０１２０】
in vivoでのこれらのマウスからのLGN記録も、15.4 log photons/cm2/sで410nmの光のフルフィールドフラッシュでの刺激後、インターナルコントロール（n=6）と比較し、光応答数の著しい増加（n=100）を示す。再度、ある範囲の応答プロフィールを観察した−桿体オプシン処置群では、持続的、過渡的、ON、およびOFF（興奮性および抑制性）だった。非標的応答と比較し、標的ON-BP細胞からの光応答は、ON型およびOFF型の間でより均一に分布した。光応答細胞の母集団全体で、ON応答の48／84（57.1％）と、OFF応答の36／84（42.9％）を観察した。これらは、大まかに、ON持続細胞（34／84；40.5％）、ON過渡細胞（14／84；16.6％）、OFF興奮性細胞（6／84；7.1％）、およびOFF抑制性細胞（30／84；35.7％）に細分される。より詳しい回復光応答の特性評価は、応答速度の速い、ON過渡応答、ON持続応答、およびOFF過渡応答（数百ミリ秒内に開始）、ならびに、応答速度がより遅いOFF抑制性応答（数秒内に開始）を示した。これらの遅延強力OFF抑制性応答は、標的桿体オプシン発現の特異的な特徴だった（4G細胞2および細胞3）。
【０１２１】
ON型双極生成応答の感受性およびコントラスト検出が我々の非標的群と類似しているか否かを次に調べた。非選択的／非標的群と比較可能なON型双極生成応答の感受性プロファイルを発見し、13.4 log photons/cm2/sでの光応答（図４Ｈ）を記録した。同様に、明順応状態で、Michelsonコントラストレベル（96％、図４Ｉ）に応答する細胞も発見した。
（より低いコントラストレベル（６６％および３３％）で、非標的網膜で観察されたものと同様の、より低い振幅とより再現性の低い応答を記録した（データ表示なし）。）
【０１２２】
〔光誘発性行動応答〕
次に、非標的異所性桿体オプシントランスダクションおよび標的異所性桿体オプシントランスダクションの両方により引き起こされる、脳に送られる視覚情報が、盲目rd1マウスの失われた視覚機能を回復し得るか否かを調べた。最初に、光に対する単純な行動応答、瞳孔対光反射（PLR）をテストした。この反射は通常、メラノプシン発現ipRGCにより仲介され（Lucas R, et al、Science. 2003 Jan 10;299(5604):245-7.）、光受容体の変性後はrd1マウスにおいて高閾値で維持される（Lucas RJ, et al、Nat Neurosci. 2001 Jun;4(6):621-6., Lin B, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Oct 14; 105(41): 16009-14.）。ある範囲の光強度で白色光を１０秒当てる間の、最大縮瞳に関する放射照度−応答曲線を記録した（図１１Ａ）。GFPを注入した対照マウスでは、PLRの低下がみられ、先の発見を裏付けた。非限定的桿体オプシン発現は、野生型の行動と同等のPLRを回復した（図１１Ａ〜Ｄ）。しかしながら、標的発現では、PLRは大きく低下したままだった（図１１Ａ〜Ｃ）。
【０１２３】
その後、回復した光遺伝視覚コードは、行動レベルで、より複雑な視覚的識別をサポートし得るか否かを問うた。古典的なオープンフィールド明／暗ボックス（open-field light/dark box）テスト（Bourin M, Hascoet M (2003), Eur J Pharmacol 463(1-3): 55-65.）に動機づけられ、種々の人工照明および自然光に応答した運動行動を測定した。マウスを、オープンフィールド修正明／暗ボックスに置き、分離壁にある開口を介して２つのアリーナ間を自由に移動できるようにした。各アリーナの外側にある平面型ディスプレイコンピュータモニターを用いて、種々の視覚刺激を表示した。刺激の光強度は、屋内照明レベルと同等だった（ブラックスクリーンで0.00132 W/m2、ホワイトスクリーンで、0.116 W/m2）。単純な明暗識別を最初にテストした。新しい環境への初期馴化後（３分）、マウスを暗（ブラックスクリーン照射輝度＝0.004072 Wsr-1m-2、放射照度＝0.00132 W/m2）で５分間、続いて白色光で（ホワイトスクリーン照射輝度＝0.06526 Wsr-1m-2、放射照度＝0.116 W/m2）５分間、ボックスを探検することを許可した。運動アッセイを最初に野生型マウスで測定したが、ここで活動プロットは、暗から明へ移動した最初の３０秒で、運動の著しい増加を示す（図１２、暗での平均距離＝24.46±7.00cm；明での平均距離＝147.5±5.09cm；p=0.0066）。盲目rd1マウスは、この暗から明への移動時に、活動の著しい変化を見せなかった（暗での平均距離＝91.75±7.70cm；明での平均距離＝100.2±8.145cm、p=0.5541）。しかしながら、処置した群、rd1-hRho-CAGおよびrd1-hRho-grm6の活動プロットは、光を点けた際に自発運動量の突然の減少を示す。この光誘発性「フリーズ」行動は、暗から明に移動した最初の３０秒間で著しかった（rd1-hRho-CAGは、暗での平均距離＝98.40±16.12cm；明での平均距離＝69.73±13.32cm；p=0.0070；rd1-hRho-grm6は、暗での平均距離＝112.9±21.47cm；明での平均距離＝68.37±16.81cm；p=0.0224）。
【０１２４】
処置マウスが明と暗を識別できるのを確かめた後、より動的な視覚刺激に応答した行動をテストした。明順応状態での自発行動（グレースクリーン光、照射輝度＝0.03342 Wsr-1m-2、放射照度＝0.0663 W/m2に５分間さらす）を、4Hzでのフルフィールドフリッカと比較した（図１３Ａ）。Rd1-hRho-grm6群は、このフリッカ周波数を分解することができたが（グレーでの平均距離＝151.3±34.95cm；フリッカでの平均距離＝83.7±13.76cm；p=0.0466）、一方、rd1-hRho-CAGおよび未処置盲目マウスは、行動に変化を示さなかった（図１３Ａ）。その後、より低い周波数、2Hzでrd1-hRho-CAGをテストし、それが応答するのを発見した（おそらくこの系の限界）（データ表示なし）。
【０１２５】
標的rd1-hRho-grm6マウスが、フルフィールドフリッカで最も応答したことから、この群を、マウスはより微妙な光の変化を識別し、コントラストを検出することが可能であるか否かを調べるため、さらにテストした。実際に、マウスは、異なるMichelsonコントラストで応答することが示された（図１４；68.6％コントラストで、グレーでの平均距離＝179.3±17.34cm、フリッカでの平均距離＝127.2±16.29cm；p=0.0238、および、100％コントラストで、グレーでの平均距離＝151.3±34.95cm；フリッカでの平均距離＝83.7±13.76cm；p=0.0466）。
【０１２６】
rd1-hRho-grm6マウスでは、より高いフリッカ周波数、10Hzおよび20Hzも見られた。20Hzでは応答は見られなかったが、10Hzでは説得力のある応答が見られた（図１５；10Hzで、グレーでの平均距離＝93.64±26.39cm；フリッカでの平均距離＝162.6±18.57cm；p=0.039）。
【０１２７】
〔写実的光景に対する応答〕
種々の人工刺激を用いた回復応答の特徴を記載してきたが、異所性桿体オプシンが、空間特性を有するより写実的光景の下、脳レベルで視覚応答を引き起こし得るかを判断することに着手した。この目的のため、写実的動画をRd1-CAG-hRho麻酔マウスおよびRd1- grm6-hRho麻酔マウスに投映し（オープンアリーナを動き回るマウス）、LGNからのin vivo応答を記録した。３０秒の動画を３０分の期間にわたり繰り返し提示し、多くの提示に対する再現性発火パターンを有する細胞の特定を可能にした。非標的網膜および標的網膜の両方を刺激した後、動画シーンの特定の特徴により発火率が調節される単一ニューロンが観察された（図１６Ａ〜Ｃ）；対照の眼には「動画応答性」ニューロンはなかった。
【０１２８】
その後、マウスが写実的光景を見ることが可能か否かを調べた。オープンフィールド行動運動アッセイにおいて、迫ってくるフクロウを特集した写実的動画をテストボックスのマウスに提示した。実際に、rd1-hRho-grm6マウスは迫りくるフクロウに応答することが分かり（図６Ｃ）、均一光から動画光景への３０秒の移動中に、運動行動の著しい変化を示した（図１４；グレーでの平均距離＝67.68±22.05；写実的動画での平均距離＝110.2±19.44；p=0.0079）。興味深いことに、それらはフリーズ行動を示さず、実際には、おそらく捕食者から逃れようとして、自発運動量を増加させた。盲目Rd1マウスまたはRd1-hRho-CAGマウスでは動画へ応答した行動に変化は見られなかった。
【０１２９】
〔物質および方法〕
〔動物〕
これらのマウスは、ヒトの網膜色素変性書の一部の形態と類似した、重度で急速な形態の網膜変性のモデルである（McLaughlinら、1993）。全ての動物実験を、実験動物の管理と使用に関する英国内務省の規定、UK Animals (Scientific Procedures) Act、およびマンチェスター大学のAnimal Welfare Bodyに従って実施した。動物は１２時間の明：暗サイクル下に置き、随時、食物と水を与えた。
【０１３０】
〔AAV経由の遺伝子送達〕
眼内注入を、イソフルランを用いた全身麻酔下で、生後６週間のマウスに行った。注入前に、瞳孔をトロピカミドおよびフェニレフリンで拡張させた。特注の極細針（ESSLAB から供給された、Hamilton RN針34ゲージ）を、5μLのHamiltonガラスシリンジに取り付け、レンズおよび血管を注意深くさけながら、毛様体扁平部を通って硝子体腔内に45度で通した。手術用顕微鏡の下、カバーガラスで覆われた眼に通した針の先端を直接可視化しながら注入を実行した。強力な遍在的汎ニューロンプロモータ（CAG）またはON型双極細胞特異的（Grm6）プロモータの制御下で、桿体オプシンまたはGFPを発現するベクター、rAAV血清型2（rAAV2/2または、単にAAV2）を、Vector Biolabs（アメリカ合衆国、フィラデルフィア）から取得した。CAGプロモータは、CMV初期エンハンサ（early enhancer）とチキンベータ-アクチンプロモータの融合である。Grm6プロモータは、ON型双極細胞特異的代謝型グルタミン酸受容体、mGluR6をコードするマウスGrm6遺伝子の200塩基対エンハンサ配列と、SV40真核生物プロモータとの融合である。何れの場合も対照遺伝子は、末端逆位配列（ITR）ドメインが側面に位置し、ポリアデニル化シグナル配列（polyA）およびウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element、WPRE）により安定化させた。
【０１３１】
各マウスの一方の眼に、桿体オプシン発現構造体（非標的発現用AAV2- ITR-CAG-hRho-polyA-WPRE-ITR、または、標的発現用AAV2-ITR-grm6-hRho- polyA-WPRE-ITRのいずれか）を注入し、もう一方にはGFP発現構造体（非標的発現用AAV2-ITR-CAG-GFP-polyA-WPRE-ITR、または、標的発現用AAV2-ITR-grm6-GFP-polyA-WPRE-ITRのいずれか）を注入した。各眼は、Sigma-Aldrich（英国、ドーセット）から取得した、ヘパリナーゼIII（E.C. 4.2.2.8）とヒアルロン酸リアーゼ（E.C. 4.2.2.1）を0.125単位含む0.5μLのグリコシド酵素と一緒に、1×1013のゲノムカウントを含む、3μLのウイルス構造体を受け入れた。酵素溶液は、酵素を無菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解することにより、注入当日に新しく作製した。ベクターおよび酵素を、眼内注入の直前にシリンジ内で混合し、単一組み合わせ注入で与えた。
【０１３２】
〔組織処理、免疫組織化学、および生体撮像〕
組織処理では、抽出したアイカップ（ベクター注入後、＞6週間）を4％のパラホルムアルデヒド(PFA)に24時間4℃で固定した。組織をその後、PBSで洗浄し、さらに30％スクロースを溶解したPBSに一晩度で固定した。固定した眼を最適切削温度培地（Raymond A Lamb Ltd.、英国、イーストボーン）で低温保護し、さらなる処理まで-80℃で凍結した。低温保護した網膜切片を、低温保持装置（Leica, Microsystems）上で、各切片が、網膜の鼻側（nasal）から側頭側（temporal）まで、完全な横断面を含むように、アイカップを8〜10μmの厚さで、背側から腹側へ水平に切断した。全網膜を代表する断面を含む10〜12個の切片を各スライドで集めた、スライドは-80℃で保存した。
【０１３３】
免疫組織化学では、スライドをフリーザーから移して室温で１時間空気乾燥させる。切片を、0.2%トライトン（Triton）を有するPBSに、室温で20分間スライドを浸すことにより透過処理した。続いてこの切片を、10％ロバ血清（D9663；Sigma、英国）を含む0.2％トライトンX-100含有PBSで、室温で1時間、バックグラウンドブロッキングした。一次抗体（ウサギ抗ヒトロドプシン、Abcam、Ab112576）を、室温で3時間、1：200に希釈して、ブロッキングバッファ（0.2％トライトンX-100および2.5％ロバ血清を有するPBS）に適用した。Tween0.05％PBSで4回10分間洗浄した後、切片を、0.2％トライトンX-100および2.5％ロバ血清を有するPBSで1：200に希釈した二次抗体（Alexa Fluor（登録商標）546ロバ抗ウサギ(H+L)抗体、Life technologies、lot: 1504518）で、室温で2時間培養した。スライドをその後、0.05％Tween-PBSで4回10分間洗浄し、続いてdH20で1回最終洗浄した。過剰な液体を取り除いた後、スライドに、DAPI含有蛍光染色用マウンティングメディウム（fluorescent mounting media）（Vectashield, Vector Laboratories Ltd.、英国、ピーターバラ）を取り付け、細胞核を染色した。
【０１３４】
生体撮像では、切片を、x4、x10、x20のPlan Fln対物レンズを用いたOlympus BX51正立顕微鏡の下で分析し、MetaVue Software（Molecular Devices Ltd、ウォーキンガム、英国）Coolsnap ESカメラ（Photometries、アリゾナ州ツーソン）を用いて取り込んだ。画像を特定バンド通過フィルタセットの下で撮り、色合成画像を、Image Ｊを用いる更なる処理のために使用した。
【０１３５】
〔多電極アッセイ記録〕
多電極アッセイ記録を、桿体オプシン処置rd1マウス（n=6）およびGFP注入rd1対照（n=2）で実行した。摘出した眼を、カルボキシ化（carboxygenated）（95% CO2/5%CO2）aCSF（人工脳脊髄液、mM濃度: 118 NaCl、25 NaHCO3、1 NaH2PO4、3 KCI、1 MgCl2、2 CaCl2、10 C6H12O6、0.5 L-Glutamine）を満たしたペトリ皿に置いた。網膜をその後、解剖顕微鏡の下、赤色散乱光で注意深く単離し、神経節細胞を下にして60チャネルまたは256チャネルの多電極アレイ（Multi Channel Systems、ドイツ、ロイトリンゲン）にのせた。網膜外植片を加重透析膜で所定の位置に固定し、カルボキシ化したaCSFを蠕動ポンプ（SCI400、Watson Marlow、英国）を用いて１分間に2.2mLずつ連続してかん流させ、aCSFという流入物用のインラインヒーターを調節するユニバーサル・シリアル・バス温度コントローラを用いて32℃に保った。特注のライトエンジン源（Lumencor、アメリカ合衆国）により、光刺激（白色光）を提示した。最も明るい強度で、LEDは15 log photons/cm2/sだった。LabVIEW（Version 8.6、National Instruments、アメリカ合衆国、テキサス州)に書かれたプログラムにより制御されるNational Instrumentsカード（USB-6229）を用いて、LEDの出力を変え、ニュートラルデンシティフィルタ（neutral-density filter）（Cairn Research Ltd）を含むフィルタホイールを調節することにより、刺激持続期間および強度を制御した。2秒光パルスで、20秒の刺激間隔で、20〜30回反復して、ND0（15 log photons/cm2/s）〜ND4に刺激を与えた。自発活動と誘発活動の両方が獲得される間、データを25kHz周波数でサンプリングし、Offline Sorter（Plexon）を用いてオフライン分類用に記録した。全チャネルに共通する明確に不自然な結果を除外した後、主成分分析を用いて、主成分スペース内の別個のスパイククラスタとして特定される、スパイク間の間隔分布において明確な不応期を有する単一ユニットを識別した。スパイク分類された単一ユニットデータをその後さらにNeuroexplorer（Nex Technologies）およびMATLAB R2010a（The Mathworks Inc.）を用いて分析した。
【０１３６】
〔瞳孔測定〕
瞳孔対光反射（PLR）を、注入後６〜８週間の、野生型マウス（6）、rd1-CAG-GFPマウス（n=16）rd1-CAG-hRhoマウス（n=10）、およびrd1-grm6-hRho（n=6）において測定し、実行した。マウスは記録前の１時間の間、暗順応だった。光刺激をクォーツハロゲンランプにより提供し、光ファイバー束に沿って積分反射球に送った。これは、マウスの角膜に均一光を提供した。共感性PLRを、麻酔をせず、軽く首をつかまれたマウスにおいて、赤外線状態下で、10Xマクロレンズと赤外線フィルタを取り付けた赤外感受性CCDカメラを用いて記録した。間のシャッターで刺激のタイミングを制御した。単一トライアルは２０秒続いた：５秒光OFF、１０秒光ON、５秒光OFF。光の強度はニュートラルデンシティ（ND）フィルタにより制御し、マウスを、連続して強度が上昇する白色光にさらし、各トライアルは少なくとも５分間離した。NDにおける光子放出値は、log photons/cm2/sでND0の15.85からND5での10.85に及んだ。瞳孔反射を、Virtual DubおよびImageJソフトウェアを用いることにより、ビデオ画像から定量化し、データは光開始直前の瞳孔野について正規化した。
【０１３７】
〔In vivo 電気生理学〕
in vivo電気生理学を、野生型マウス(n=2)、rd1-CAG-hRhoマウス(n=7)、およびrd1-grm6-hRho (n=5)で実行した。注入およびPLR測定の６週間後、マウスをウレタンで麻酔した（腹腔内注入1.7g/kg；30％w/v；Sigma Aldrich、英国、プール）。動物を、定位固定フレーム（stereotaxic frame）（SR-15M；Narishige International Ltd.、英国、ロンドン）に拘束し、中核体温を恒温性ヒートマット（Harvard Apparatus、英国、エデンブリッジ）により３７℃に保った。瞳孔をアトロピンで拡張し、角膜の水分を保つために鉱油（Sigma Aldrich）を適用した。小規模の開頭および硬膜切開（〜1mm2）を、マウスアトラスに従って、定位固定座標（stereotaxic coordinate）を用いて、各外側膝状体（LGN）の上で直接的に行った（Paxinos and Franklin, 2001；穴中心＝前項：-2.46 mm；正中線：-2.8）。３２チャネル電極（Neuronexus Technologies Inc.、アメリカ合衆国、ミシガン州）を、各LGNの穴の中心（内側シャンク：正中線に対し-2.5mm；脳表面に対し１８度の角度で-2.6mm）に、両LGNから刺激記録をとるために導入した。マウスは記録の前の３０分間放置して暗順応させ、電極挿入後にニューロン活動を安定化させた。視覚刺激をUV LED（Thorlab λ最大：405nm）により提供し、潜在的な光漏れを最小限にするように各眼にきっちりと配置した、目的のために作ったアイコーン（eye cone）に、光ファイバーを介して届けた。LabVIEW（Version 8.6、National Instruments、アメリカ合衆国、テキサス州)に書かれたプログラムにより制御されるNational Instrumentsカード（USB-6229）を用いて、LEDの出力を変え、ニュートラルデンシティフィルタ（neutral-density filter）（Cairn Research Ltd）を含むフィルタホイールを調節することにより、刺激持続期間および強度を制御した。最も明るい強度（ND0）で、LEDは、桿体オプシン用に47W/m2または15.4 log photons/cm2/sの有効束だった。データを、20xゲインAC-結合ヘッドステージ（20x gain AC-coupled headstage）（Plexon、テキサス州）による信号増幅のついた、Recorder64 system（Plexon、アメリカ合衆国、テキサス州）を用いて獲得し、続けて、3500xの総ゲインを与える前置増幅調節を行った。データをハイパス（300Hz）にかけ、タイムスタンプを付けた神経系波形を全チャネルから同時に40kHzの率でデジタル化した。マルチユニットデータはその後、オフライン分類と、上記のMEAデータについての分析用に保存した。最も明るい強度で、LEDは〜15 Log photons/cm2/sだった。刺激を、２部からなる光プロトコルに従って届けた。Part 1は、暗闇からのフラッシュを含んだ：２秒光ON、２０秒光OFF、各眼の間で１０秒のオフセットあり。このパラダイムを、最も暗い（ND3 = 12.4 log photons/cm2/s）〜最も明るい（ND0 = 15.4 log photons/cm2/s）各NDフィルタにおいて３０回繰り返した。より長い刺激長も、より持続する応答のために用いた：１０秒 ON、３０秒OFF、各眼の間で１５秒のオフセットあり。該パラダイムをND3〜ND0において１０〜２０回繰り返した。
【０１３８】
光プロトコルのPart 2には、明順応状態の記録を含み、ここにおいて、５秒光ステップを、Michelsonコントラスト96％で不変背景照明に適用した。２０秒の刺激間間隔と、２つの眼の間に１０秒のオフセットを設けた。このパラダイムを１０回繰り返した。
（光プロトコルのPart 2には、増加する光コントラストを不変背景照明に適用した、明順応状態の記録を含んだ。Michelsonコントラスト、33％、66％、および96％を５秒ステップで適用し、２０秒の刺激間間隔と、２つの眼の間に１０秒のオフセットを設けた。このパラダイムサイクルを１０回繰り返した。）
【０１３９】
写実的な動画に対する応答も記録した。これについては、別個の記録の組（rd1-CAG-hRho mice；n=2およびrd1-grm6-hRho；n=3）を、桿体オプシン処置眼の対側のdLGNから獲得した。異なる実験セットアップを用い、これは、用いる波長と動画の強度を最大化するため、デジタルミラーデバイスプロジェクタ（DLP（登録商標） LightCommanderTM；Logic PD Inc.）を含んだ。プロジェクタ固有のライトエンジンを、別々に制御される４つのLED（λ最大は405nm、455nm、525nm、および630nm；Phlatlight PT-120 Series（Luminus Devices））を含むマルチスペクトルLED光源と置き換えた。LEDからの光を一連のダイクロイックミラー（Thorlabs）によりまとめ、プロジェクタに当てた。動画を、PsychoPy Version 1.70.00ソフトウェアを実行するPythonを用いて提示した。それは、行動アリーナを動き回るマウスを特集しし、これは、異なるサイズの物体が、ある範囲の方向、スピード、およびコントラスト（最大Michelsonコントラスト = 96 %）で移動し、迫りくることを含んだ（規定する（subtending）視角は0.5°〜36°に及んだ）。動画は色の違いはなく、時間を通じて放射照度の変化を最小にした（放射照度の標準偏差＝5.94％）。野生型マウスにおける事前検証では、焦点をぼかしたバージョンの提示に対しては検出不可能な応答が示され、これは、大抵の活動は、空間パターンおよび物体の動きの変化により誘発されることを示した。
【０１４０】
データを、20xゲインAC-結合ヘッドステージ（20x gain AC-coupled headstage）（Plexon、テキサス州）による信号増幅のついた、Recorder64 system（Plexon、アメリカ合衆国、テキサス州）を用いて獲得し、続けて、3500xの総ゲインを与える前置増幅調節を行った。データをハイパス（300Hz）にかけ、タイムスタンプを付けた神経系波形を全チャネルから同時に40kHzの率でデジタル化し、オフライン分析用に保存した。
【０１４１】
記録部位の場所を確認するため、記録電極を脳に挿入する前に、蛍光染料（Cell Tracker CM-Dil；Invitrogen）に浸した。in vivo記録の後、マウスの脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに一晩、後固定し（post-fixed）、それから３０％スクロース中に２４時間低温保存した。その後、100μmの冠状切片（coronal section）を、滑走式ミクロトームを用いて切り出し、ガラススライドの上に乗せ、Vectashield（Vector Laboratories, Inc.）を用いてカバーガラスで覆った。
【０１４２】
〔マルチ電極アレイ（MEA）記録〕
in vivo電気生理学記録の直後、マウスを安楽死させ、眼球摘出をした。眼を、カルボキシ化（95% CO2/5%CO2）aCSF（人工脳脊髄液、mM濃度: 118 NaCl、25 NaHCO3、1 NaH2PO4、3 KCI、1 MgCl2、2 CaCl2、10 C6H12O6、0.5 L-Glutamine）で満たしたペトリ皿に置いた。網膜をその後、解剖顕微鏡の下、赤色散乱光で注意深く単離し、神経節細胞を下にして60チャネルの多電極アレイ（Multi Channel Systems、ドイツ、ロイトリンゲン）にのせた。網膜外植片を加重透析膜で所定の位置に固定し、カルボキシ化したaCSFを蠕動ポンプ（SCI400、Watson Marlow、英国）を用いて１分間に2.2mLずつ連続してかん流させ、aCSFという流入物用のインラインヒーターを調節するユニバーサル・シリアル・バス温度コントローラを用いて32℃に保った。光刺激を、特注のライトエンジン（Lumencor、アメリカ合衆国）により提供し、UV光を提示した（λ最大：405nm）。最も明るい強度で、LEDは15 log photons/cm2/sだった。LabVIEW（Version 8.6、National Instruments、アメリカ合衆国、テキサス州)に書かれたプログラムにより制御されるNational Instrumentsカード（USB-6229）を用いて、LEDの出力を変え、ニュートラルデンシティフィルタ（neutral-density filter）（Cairn Research Ltd）を含むフィルタホイールを調節することにより、刺激持続期間および強度を制御した。上記のin vivo電気生理学データに関する光プロトコルに従って、刺激を届けた。自発活動と誘発活動の両方が獲得される間、データを25kHz周波数でサンプリングし、オフライン分析用に記録した。
【０１４３】
〔行動〕
現在、一般的に用いられる視覚識別課題は、ストレスの多い、広範囲の訓練環境を必要とするか、または、目標指向型行動というよりむしろ反射運動に基づく。これらの欠点に対処するため、自発行動に基づいて視力を評価する、オープンフィールドに基づく方法を開発した。明／暗ボックス（寸法：長さ＝40cm、幅＝40cm、および高さ＝30cm、蓋なし）の修正を用いて、マウスが分離壁にある開口を介して２つの等しいアリーナ間を自由に移動できるようにした。ボックスはパースペックスガラスで作り、その壁は各アリーナの２つの長辺を除いて白く塗り、該長辺は透明のままとした。２つの同一の赤外線ランプを各アリーナの上部中心に置き、暗い状況下での視覚化を可能にした。
【０１４４】
２つの１７インチ平面型ディスプレイコンピュータモニターから、各アリーナの透明壁に向けて、DualHead2Goデジタル版外部マルチディスプレイアダプタ（Matrox Graphics Inc.）を用いて、視覚刺激を表示した。これは、別々のモニターに、同時に、制御刺激およびテスト刺激を示すことを可能にした。フルフィールド均一光（黒、グレー、白）、フルフィールドフリッカ、および写実的動画を含む、種々の視覚刺激を表示した。これらの刺激は、２つの異なる刺激を２つの異なるウィンドウに同時に形成することを可能にする一方、双方を個別に操作する機能は保持する特注プログラムを用いて、生成した。プログラムは、白（255）、黒（0）、およびグレー（128）の成分を変更し、所望の明るさおよびコントラストレベルを達成することを可能にした。
【０１４５】
行動実験を野生型マウス（5）、rd1-CAG-GFPマウス（n=6）、rd1-CAG-hRhoマウス（n=6）、およびrd1-grm6-hRho（n=5）で行った。実験期間の前に、毎日同じ時間に、マウスに触れ、次のようなやり方で５日間新しい環境に慣れさせた：動物をホームケージにあるテスト部屋に連れていき、実験ボックスの中に置き、30分間、同腹子と共に自由に行動させた
【０１４６】
馴化期間に続き、数週間にわたって完全に暗い部屋の中で、毎日同じ時間に行動実験を行った。各マウス群を、１日につき１つのテスト状態のみを経験させた。各テスト日に、マウスをそのホームケージのテスト部屋に持っていき、３０分間テスト部屋の状態に順応させ、その後、各マウスを個別にテストした。マウスをオープンフィールドボックスに（無作為に、東または西の半分に）置き、２つのアリーナ間を自由に移動できるようにした。全テストトライアルを、赤外線フィルタ（λ＝665nm）のついたカムコーダを通して、赤外線状態下で記録した。各テストトライアル後、ボックスを70％エタノールで完全に掃除し、次のマウスを該ボックスに置く前に空気乾燥させた。
【０１４７】
記録トライアルは、馴化の３分後に始めた。各トライアルランは、５分の制御刺激から成り、それに続いてテスト刺激を、その時点でマウスを収容しているアリーナに面したスクリーンに提示した。暗順応実験では、制御刺激は５分間の暗（スクリーンを暗にする；照射輝度＝0.004072 Wsr-1m-2、放射照度＝0.00132 W/m2）から成り、続いて明で５分（白スクリーン；照射輝度＝0.06526 Wsr-1m-2、放射照度＝0.116 W/m2）、その後１分間暗に戻した。明順応実験では、制御刺激は５分間の均一なグレーのスクリーン光（グレースクリーン；照射輝度＝0.03342 Wsr-1m-2、放射照度＝0.0663 W/m2）から成り、続いてフルフィールドフリッカで５分（フリッカスクリーン；照射輝度＝0.03342 Wsr-1m-2、放射照度＝0.0663 W/m2）、続いて均一光で１分とした。コントラスト感受性実験では、スクリーン出力を調節して２アリーナ間でテストコントラストを異ならせた（Michelsonコントラスト：100%、68.6%、37.3%、13.7%、および0%コントラスト）。写実的動画実験では、制御刺激は５分間の均一なグレー光から成り、続いて動画提示１分、その後１分間制御状態に戻した。（カラー）動画は迫ってくるフクロウを特集した。
【０１４８】
記録トライアルは、映像追跡ソフトウェア装置（video tracking software device）（EthoVision （登録商標） XT 10.1 Noldus、Tracksys Ltd.、英国）を用いて、オフライン分析用に保存した。我々は、ボックス全体での各マウスの移動距離を分析し、３０秒ビンに結果を出力した。視覚刺激を見るマウスの能力を、制御からテスト刺激までの１分間の移行期間の間の自発行動の変化として、評価した（つまり、我々は、テスト刺激直前の制御状態下での３０秒間の移動距離と、テスト刺激直後の３０秒間移動距離を分析した）。１分間の移行期間の間のテスト刺激提示前後における、同一マウス群内での比較のために、ツーウェイ対応のあるｔ検定（two-way paired t test）を用いた。
【０１４９】
まとめると、ヒトロドプシンを、重い網膜変性ならびに桿体光受容体および錐体光受容体の消失により盲目になったマウスの内網膜細胞へ導入することは、瞳孔応答の回復と、脳（外側膝状体核）および網膜における視覚応答の回復により証明されるように、視力の回復をもたらした。
【０１５０】
〔議論〕
本研究では、ヒト桿体オプシンの発現が、ON経路、OFF経路、過渡経路、および持続経路を含む種々の視覚コードを介して、盲目網膜に光感受性を与えることを実証した。強力な視覚応答が、内因性錐体／PR視力と同等の光強度下で、in vitroおよびin vivoで観察され、コントラスト検出などの複雑な網膜回路機能を動かすことができた。処置盲目マウスは、天然の屋内環境に特有の照明下で、光誘導性自発運動の回復を示し、明順応状態では低周波数フリッカを解像することができた。加えて、標的桿体オプシン処置を施したマウスはより低いコントラストを検出し、より高い周波数のフルフィールドフリッカを解像でき、写実的な動画シーンを検出できた。
【０１５１】
微生物桿体チャネル、ポンプ、および化学的光スイッチを残存網膜ニューロンに導入することは、光感受性を回復することが可能である。ここで、遺伝子治療を用いて、ヒト桿体オプシンを盲目マウスに送達することが可能である。しかしながら、光遺伝治療の主な課題の一つは、臨床的に関連する送達方法により、網膜において、安定して効果的なレベルのオプシン発現を達成することである。現在のウイルス性送達方法は、侵襲的な網膜下注入を必要とし、ここにおいてトランスダクションは網膜の注入部位のごく一部に限られる。より全体的なトランスダクションは、硝子体内への注入、つまり、眼科の通常業務で一般的に用いられるより安全な技法により達成可能だろう。しかしながら、網膜細胞の細胞外基質により生じる物理的な障壁が、このルートからのウイルストランスダクションを制限する。網膜組織に、より深く浸透する能力を持ついくつかの新しい突然変異型AAVベクターが登場したが、今は、潜在的に高い免疫原性とオフターゲット効果を持つ、非常に高いウイルス力価（1014）を必要とする。本アプローチでは、治験で安全性がすでに証明されているAAV2ベクターの硝子体内送達を用いた。加えて、硝子体から網膜に到達するウイルス粒子に対する物理的障壁を破壊する、酵素標的細胞外基質タンパク質の組み合わせが特定されている。これらの酵素を共注入することは、ウイルスに感染した神経細胞の数および空間拡散を大きく増加させる。
【０１５２】
哺乳類の無傷網膜桿体オプシンは、通常、特定桿体光受容体に見られる。それは、信号伝達カスケード中間体を介して機能する、Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）のファミリーに属する。光活性化において、桿体オプシンは視覚信号トランスダクションのために、トランスデューシン（Gt；Gi/oサブファミリーのメンバー）にin vivoで結合し（Palczewski, K. G. Annu. Rev. Biochem. (2006) 75, 743-767）、K+電流の増加、膜過分極、および神経伝達物質放出の抑制を引き起こす。光受容体とその二次ニューロンである双極細胞の間の符号反転シナプスは、この抑制性応答を陽性の電気信号に変換し、これは、神経節細胞を通して視覚のために脳に送られる。
【０１５３】
オプシンチャネル（ChR）およびポンプ（HaloR）は、盲目網膜で機能的に発現し、それぞれ脱分極と過分極を引き起こしている。加えて、脊椎動物桿体オプシンは、細胞培養物および網膜外のin vivo（小脳プルキンエ細胞）で発現し、光によって活性化された際、ニューロンの興奮しやすい性質を抑制することが示された（Li X, et al Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Dec 6; 102(49):17816-21 ; Gutierrez DV, et al J Biol Chem. 201 1 Jul 22;286(29):25848-58.）。しかしながら、GPCR様桿体オプシンが、二次ニューロンおよび三次ニューロン（RGC）で直接的に発現した際に天然光受容体の外側で機能し、その抑制作用を働かせて視覚信号を生成できることが今は知られている。通常の光受容入力から切り離された盲目網膜では、残存出力神経細胞の基礎活性が全体的に増加し、桿体オプシンが機能してこの「過反応」を抑制し、視覚識別をサポートするために雑音比に対する信号を改善すると推論された。
【０１５４】
ここで、異所性桿体オプシンは内網膜細胞で発現し、天然光受容体の外側で機能可能であることが分かる。実際に、予想されたように、桿体オプシン標的処置（全光応答の35.7％）と桿体オプシン非標的処置（10.8％）の両方で、in vivoでの抑制性OFF応答（光ON刺激での発火率が減少する）が観察された。これらはWT応答では通常見られず、我々も、このような応答はin vitro調製物では観察しなかった。しかしながら、驚くべきことに、多くの正の「ON応答」が、in vitroとin vivoの両方で見られた。実際に、in vivo OFF 抑制性信号と同様に、ON持続応答、ON過渡応答、およびOFF興奮性（光OFFで発火率が上昇する）応答を含む種々の応答が、非標的処置および標的処置の両方で見られた。加えて、少数のin vivo On-OFF応答が非標的処置で観察された。これは、桿体オプシンが、脱分極光依存方法および過分極光依存方法の両方で、細胞行動を調節し得ることを示唆する。これは、ON型双極細胞における桿体オプシン発現が、シナプス後三次ニューロンを動かし、OFF型双極細胞の活性化を引き起こす無軸索抑制性ループ（全細胞）を刺激するのに十分に強く、そのため、抑制性または興奮性のON応答を２倍にすることを示唆する。
【０１５５】
無傷の系では、視覚情報は２つの平行な経路、ON経路およびOFF経路を通して処理される。ON経路では、細胞は光増加に応答する一方、OFF経路では細胞は光減少に応答する。我々の、盲目網膜におけるON経路およびOFF経路の回復は、ChRおよびLiGluRをON-BP細胞にあらかじめ特異的に標的させた他の研究を支持するものである。しかしながら、遍在的プロモータ（Lin B,et al Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Oct 14; 105(41): 16009-14）または特異的標的RGCのみを用いる先の研究は、電気生理学的により均一的な信号（例えば、異所性メラノプシンでの持続ON）を報告し、ON経路およびOFF経路両方の同時回復は報告していない（RGCのChRはON経路のみ動かす一方、RGCのHaloRはOFF経路のみを動かす）。RGCのみの発現は、細胞に対する通常の興奮性入力および抑制性入力を直接的に活性化するのに十分なほど強くはなかった場合がある。加えて、この場合では、非標的処置でも、INL細胞（有望BP細胞）での桿体オプシン発現は、全ループの二次活性化と、抑制性信号および興奮性信号の両方に対する応答の分析を説明することが可能であることが分かった。
【０１５６】
桿体オプシンを光遺伝ツールとして用い視力を回復することの主な利点の一つは、天然光スイッチとして内因性発色団（レチナールまたはシス−レチナールデヒド）を用いる機能とともに完全自己解決型光受容性を提供するという、その簡潔性にある。しかしながら、視覚応答については、桿体オプシンは定期的なレチナールのリサイクルを必要とし、これは通常光により退色する。このリサイクルは、桿体とPREの間の密接な接触に依存していると考えられる、実際に、先の研究（Li X, et al Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Dec 6; 102(49): 17816-21; Gutierrez DV, et al J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):25848-58）と一致して、in vitroで桿体オプシンは光刺激直後に退色し、それは、光依存応答を維持するため、発色団（9-cisレチナール）を定期的に外から供給することを必要とする。しかしながら、in vivoでは、著しく問題となるような退色は見られなかった。重要なことに、多くの光応答が、多数のトライアルにわたって強力で、反復可能だった。そのため、変性網膜は適切なレチナールの内因性供給を提供し、それを通常担う光受容体が欠乏している場合は、内網膜細胞の桿体オプシンがPREまたはミューラー細胞による発色団リサイクルにアクセスし、視覚応答を生成する可能性がある。
【０１５７】
桿体オプシン治療の別の重要な面は、活性化に著しく高い光強度を必要とする、微生物オプシンおよび合成光センサに基づく現在のストラテジーと違い、生理的光状態下で作用するというその機能である。ONおよびOFF、過渡および維持の細胞種は、内因性錐体感受性の範囲にある、テスト光強度のダイナミックレンジ（1013〜1015 photons/cm2/s）下で、in vivoで機能することが分かった。以前報告された研究は、活性化のためにずっと高い光強度を用いた：LiGluR > 1.7x1017 photons/cm2/s（Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Dec 23; 1 11 (51):E5574-83）、ChR > 3x1015〜1017 photons/cm2/s（Lagali PS, et al 2008, Nat Neurosci. 2008 Jun;1 1 (6):667-75;）RGCのHaloR >5.1x1018 photons/cm2/s（Zhang Y,et al J Neurosci. 2009 Jul 22;29(29):9186-96）、および錐体内切片のHaloR >1016 photons/cm2/s（Busskamp V,et al 2010, Science. 2010 Jul 23;329(5990):413-7.）。感受性は細胞内機構の要素であり、我々のデータは、桿体オプシンが、低光強度下でGPCR光増幅カスケードを通して機能可能であることを示唆する。これは、タンパク質レベルで信号を増幅できない微生物イオンチャネル（ChR2）、ポンプ（HaloR）、または光スイッチ（LiGluR）とは対照的である。
【０１５８】
in vivoでの回復応答の動力学の更なる特性評価は、非標的アプローチおよび標的アプローチの両方について、光応答の開始、オフセット、および持続期間が細胞種間で異なることを示した。先の研究（Caporale N, et al 201 1 , Mol Ther. 2011 Jul; 19(7): 1212-9; Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Dec 23;1 1 1 (51):E5574-83）と一致して、一部は速く、一部はより遅い、様々な待ち時間の応答を見つけた。桿体オプシン光スイッチは本来速く、より遅い光応答は細胞内信号伝達カスケードの動力学の効果であり、桿体オプシンを発現する天然細胞種に依存する可能性がある。加えて、より遅い応答開始は、一部の細胞における非飽和光入力、および、桿体オプシン発現のレベルがより低いことによる可能性がある。（一部の速い桿体オプシン応答は、ON BP細胞における天然mgluR6受容体カスケードの高速動力学による場合がある。）
【０１５９】
眼は、暗所視（夜）から明所視（昼）まで、幅広いレンジの光強度を感知できる。この感受性は、視力を誘発するのに必要な最小限の閾値強度により測定することが可能である。視力の持つ重要な面の一つは、明るい光にさらされた後の暗がりでその感受性を即座に回復すること（暗順応）か、または、より重要なのは、即座に背景照明に適応し、この背景中の物体を識別できること（明順応）である。これまでのほとんどの光遺伝研究は、暗がりからの光ステップを含む単純な視覚刺激を研究していた。これはむしろ不自然なシナリオであり、実世界の物体にはコントラストがあり、これは一定で周辺輝度の影響を受けない。そのため、異所性桿体オプシンが明順応状態下で作用し、放射照度の変化に対する回復視覚コードを保存するか否かが問題だった。実際に、強力な背景照明に対し増加するテスト光刺激を提示した後は、強力なdLGN応答が見られた。（観察された、ON経路およびOFF経路への強力な分離は、この光適応を容易にし、コントラスト感受性を高めることができる。）
【０１６０】
非標的発現および標的発現の両方を調べた。まず、強力な汎ニューロンプロモータ、CAGを使用する非選択的非標的アプローチを用いて、遺伝子を残存内網膜に送達した。あったとしてもどのニューロンが桿体オプシンを発現するのか、そして、それは他よりもある特定の種のニューロンにおいて発現するのか、または、ON経路もしくはOFF経路のいずれかを優先するのか、または、両方を平等に対象とするのかは、分からなかった。ON経路およびOFF経路の間の発現の不均衡が、一部の信号が互いを相殺したとしても、脳に送られる視覚情報の全体的な増加を意味することが期待された。このアプローチの利点はまた、最も長く残存する（Mazzoni F,) J Neurosci 28(52): 14282-14292）網膜神経節細胞も標的されることを意味し、このアプローチは、双極細胞が不全になる遅発性変性で用いることが可能である（cronin）。次に、「ON」経路のみに発現を限定することが、電気生理学的に、および行動的に、の両方で、視覚信号の改善を導くか否かをテストした。桿体オプシンを、最小細胞特異的プロモータGrm6を用いて、特異的に網膜ON型双極細胞に標的させた（Masu M et al., Cell 1995）。
【０１６１】
非標的桿体オプシン処置および標的桿体オプシン処置の間で、著しい電気生理学的類似性が観察された。回復されたコードは同様に複雑で、多岐にわたった。応答動力学、感受性、およびコントラスト応答は、２つの治療で同様だった。興味深いことに、標的処置はより多くのOFF応答（主にOFF抑制性）を引き起こした。
【０１６２】
しかしながら、行動的には重要な違いがあった。まず。単純な視覚機能、PLRの回復において違いが観察された。非選択的発現桿体オプシンが、PLRを仲介するRGC経路に対する原動力をWTレベル近くまで回復させた。これは、RGCのメラノプシンおよび第１生成LiGluRと一致し、これはPLRのほぼ完全な（Lin B, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Oct 14;105(41): 16009-14）または部分的な（Caporale N, et al 2011 , Mol Ther. 2011 Jul; 19(7): 1212-9）、PLRの回復を引き起こす。興味深いことに、発現がON-BP細胞に限定された場合、この経路は大きく損なったままだった。桿体オプシンの非標的発現は、直接的に（Gs/Gqカスケードと結合する）ipRGCを活性化し、刺激を引き起こした一方、ON-PB細胞における選択的発現は、経路の直接的な活性化とこの非視覚的反射の回復を回避した可能性がある。
【０１６３】
画像形成経路はどうなっているか？我々が生成したこの視覚コードは、生理的光レベルの下、画像形成視覚を改善するのに用いることが可能だろうか？より末端のニューロンを特異的に標的する利点の一つは、内網膜処理を保存し、回復した応答をより多くのコヒーレント信号に微調整し、そしてより良質な視覚を達成することだろう。これまでの光遺伝研究は、暗−明識別を含む単純な視覚課題を扱ってきており、系が背景照明に対して、または、写実的光景に応答して、変化をたどるか否かについては報告がされていない。回復したin vivo応答は、屋内照明と同等の照明下において、両処置で単純な暗−明識別をサポート可能であることが分かった。加えて、非標的桿体オプシン処置および標的桿体オプシン処置で処置されたマウスは、均一の背景照明に対し、2Hzのフルフィールドフリッカを解像可能だった。加えて、標的処置を受けたマウスは、均一の背景照明に対し、4Hzおよび10Hzを含む、より高い周波数のフリッカを解像することが分かった。さらに、ONBP細胞において桿体オプシンの特異的発現があるマウスは、背景照明に対しより低いコントラストレベル（Michelsonコントラスト66.7％）で、4Hzフリッカを検出可能だった。
【０１６４】
ヒトは自然の視覚光景を処理するのに長けている。定期的に視覚光景が変化するにもかかわらず、我々の脳は複雑な光のパターンを網膜上で形質転換し、数百ミリ秒内に関連する情報を抽出することができる。応用の可能性を念頭に、マウスが、屋内照明に典型的なレベルの光強度で固有の時空調節をたどるために用いることが可能な視覚コードを生成する多くのレベルの視覚処理を保存するのに十分強力な信号を、異所性桿体オプシンは引き出し得るか否かを問うた。電子生理学的に、両処置において、自然的な動画シーンで起きる時空での、光レベルの変化をたどることが可能な個別ニューロンの特定を開始した。これは、（柔軟性のある）視覚システムは、実際の自然光景を処理するために、ON信号およびOFF信号、ならびにコントラストについての単純な情報を運ぶ、時間的および空間的にプールされた回復応答を活用できることを示唆する。加えて、標的桿体オプシン処置後マウスは、自然的な動画シーンに応答して運動行動を増やすことを発見した。これは、知覚視覚の質が非標的処置に比べ標的処置で改善することを示唆し、これはおそらく、より複雑な時空間識別に必要な、双極細胞からRGCへのより多くのコヒーレント信号収束による。
【０１６５】
要約すると、結果は、残存内網膜ニューロンにあるヒト桿体オプシンは、光受容体の消失による網膜変性における視力の回復および末期の失明を好転させる有望なストラテジーであることを示す。ヒトタンパク質として、それは、倫理および安全性への懸念という点で、現在の微生物をベースにする治療を上回る利点を提供する。それは、細胞内カスケードを介して信号を増幅する自己完結型光受容ストラテジーを提供し、現在の光遺伝ストラテジーと比較し、より改善した感受性を与えることが可能である。内網膜ニューロンで異所的に発現した場合、それは、ON応答およびOFF応答の両方に基づき、背景照明を上回る光強度および自然的な動画シーンにおける光強度の、変化をたどることが可能な様々な視覚コードを生成する。行動的には、処置盲目マウスは、暗と明を識別することができ、屋内照明に典型的な照明の下において、明順応状態で、2Hzフルフィールドフリッカを解像することが可能である。加えて、発現をONBP細胞に限定すると、in vivoでの視覚の改善を引き起こし、処置マウスは、より高周波のフリッカを解像し、より低いコントラストを検出し、そして、自然光景を解像することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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