(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅用プライマーであって、３’末端から５’方向に、特定の遺伝子配列の増幅のためのヌクレオチド配列Ｘａと、イノシンリンカーであるヌクレオチド配列Ｙａと、前記ヌクレオチド配列Ｘａに対応するヌクレオチド配列Ｘ’ａが連結され、
前記ヌクレオチド配列Ｘａは複数の部位を含み、前記複数の部位は少なくともＸａ１、Ｘａ２、Ｘａ３を含み、
前記ヌクレオチド配列Ｘ’ａは複数の部位を含み、前記複数の部位は少なくともＸ’ａ１、Ｘ’ａ２、Ｘ’ａ３を含み、
前記Ｘａ３の５’末端に前記Ｙａを含み、前記Ｙａの５’末端に前記Ｘ’ａ３が連結され、前記Ｘ’ａ３の末端に前記Ｘ’ａ２が連結され、
前記Ｘ’ａ３は前記Ｘａ３に相補的なヌクレオチド配列であり、
前記Ｘ’ａ２は前記Ｘａ２にミス−マッチングされたミス−マッチングヌクレオチド配列であり、
前記Ｘ’ａ２を構成する前記ミス−マッチングヌクレオチド配列の個数は３〜１２個であり、
前記Ｘ’ａ２の５’末端は前記Ｘａ１に相補的なヌクレオチド配列である前記Ｘ’ａ１を含み、
そのうち、前記相補的とは、逆方向での相補的であることを特徴とし、前記Ｘａ２と前記Ｘ’ａ２はバブル構造を形成し、前記Ｘａ３と前記Ｘ’ａ３の間の前記Ｙａもバブル構造を形成し、前記プライマーのＹａのイノシンリンカーにおけるイノシン塩基が１個〜９個である、下記構造式１の遺伝子増幅用プライマー。
［構造式１］
0006612883.tif 000003
【請求項２】
前記バブル構造の個数が２個〜４個である、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
前記プライマーは、配列番号４〜１０、配列番号１２〜１５、配列番号１８〜１９、及び配列番号２２〜２９に記載のプライマーで構成された群から選択された一つ以上のプライマーであることを特徴とする、請求項１または２に記載のプライマー。
【請求項４】
前記プライマーは、遺伝子増幅のためのフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）、リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）位にそれぞれ使用されるか、または共に使用されることを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項５】
ＲＮＡから特定の遺伝子配列を増幅する過程で、前記請求項１乃至請求項４のいずれか一項のプライマーを利用して逆転写反応のための逆転写重合酵素でｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型として前記請求項１乃至請求項４のいずれか一項のプライマーを使用して特定の遺伝子を増幅する方法。
【請求項６】
前記方法は、前記請求項１乃至請求項４のいずれか一項のプライマーを使用してＲＮＡ鋳型を逆転写反応を遂行した後、特定の遺伝子増幅反応をワンステップで遂行することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項４のいずれか一項のプライマーを有効成分として含むＤＮＡ及びＲＮＡに対する遺伝子増幅のための重合酵素連鎖反応法、リアルタイム重合酵素連鎖反応法または等温増幅法に使用される遺伝子増幅用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性を有するＴａｑ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ重合酵素、ＰＦＵ重合酵素及び５’→３’エキソヌクレアーゼ（−）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（−）活性を有するＫｌｅｎｏｗ重合酵素で構成された群から選択された一つ以上の重合酵素をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１乃至請求項４のいずれか一項のプライマーを有効成分として含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性及び感受性検体のＤＮＡ及びＲＮＡに対する特定の遺伝子を増幅するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーの５’位に直接あるいはｌｉｎｋｅｒを連結した相補的な塩基配列ないしは相補的な塩基配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含む核酸増幅反応（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」という。）用プライマー及びそのプライマーの用途に関し、さらに詳細には、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマーの５’末端に相補的な塩基配列ないしはｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含む相補的な塩基配列を直接またはｌｉｎｋｅｒとしてＩｎｏｓｉｎｅを使用してＰＣＲ用プライマー及び前記プライマーを含むＰＣＲ組成物に核酸鋳型を混合した後、前記混合物に対してＰＣＲを遂行するステップを含むＰＣＲ方法と、相補的なプライマー（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｐｒｉｍｅｒ、ＣＰ）及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断検査または核酸診断検査に必須なＰＣＲ構成要素には、ＤＮＡ重合酵素、プライマー対、ｄＮＴＰ、Ｍｇ＋＋及びその他のｂｕｆｆｅｒが必要となる。このような反応が広く用いられるためには、高度に特異的であり、正確性を有する関心のある目標遺伝子の増幅が要求される。
【０００３】
Ｒｏｂｕｓｔ  ＰＣＲ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅのためには、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ  ＤＮＡ分子検出（Ｗａｂｕｙｅｌｅ，Ｍ．Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌ．，２００１，２：１３−２１）あるいは血液媒介感染（Ｅｌｎｉｆｒｏ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２０００，１３：５５９−５７０）等のような高度に敏感な分析的なＰＣＲが要求される。
【０００４】
一般に、ＰＣＲの進行のためには、検出しようとするｔａｒｇｅｔ遺伝子に関する情報を確保し、プライマー＆プローブｄｅｓｉｇｎをするようになる。このとき、ｄｅｓｉｇｎされるプライマーｓｅｑｕｅｎｃｅ及び長さは、ａｎｎｅａｌｉｎｇ温度でｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ／ＲＮＡにのみよく交雑するように考案されるにもかかわらず、しばしばｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎが発生する。その原因としては、ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ−ｍｉｘ準備や初期変性温度へのｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ｒａｍｐｉｎｇ時の低い温度条件に起因するものと考えられている（Ｃｈｏｕ，Ｑ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：１７１７−１７２３）。このような条件でのプライマーは、ｔａｒｇｅｔより多くの濃度で存在しており、部分的に相補的な部位やプライマー同士で非特異的な反応をするようになる。これらの非特異プライマーｃｏｍｐｌｅｘは、所望のｔａｒｇｅｔ部位反応に競争的に反応をして敏感度を阻害させるようになり、高いｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを示す原因と作用する。特に、プライマーｄｉｍｅｒの場合、ＰＣＲ中にプライマーａｒｔｉｆａｃｔｓでｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅを作ることもある。
【０００５】
ＰＣＲの特異度を高める広く用いられる方法は、種々のものがあるが、その一つの方法は、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ技術を適用することである。この技術は、温度を高めてプライマー／ｔａｒｇｅｔ交雑反応を特異度が維持されるようにしてｐｒｅ−ＰＣＲ  ｍｉｘｔｕｒｅの準備時にＤＮＡ重合酵素がｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを妨害する方法である（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ｖ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ａ．Ｖ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００８，３６：ｅ１３１．）．他の方法としては、反応構成物を物理的に区分してＰＣＲ反応が起こらないようにする方法が用いられ（Ｑｕｉｎ  ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：１７１７−１７２３）、ａｃｃｅｓｓａｒｙタンパク質を使用する方法（Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．２００６０５７６１７）、ＤＮＡ重合酵素に対する抗体を使用する方法、Ｍｇ＋＋−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘを作って低い温度での非特異反応を防ぐ方法（Ｂｉｏｎｅｅｒ）等も用いられている。
【０００６】
反応構成物質を調節して特異度を高める方法の他にプライマーを変形させて特異度を高めようとする様々な方法が報告されている。その中には、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを入れて使用する方法、プライマーの２次構造を利用する方法、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙを増加させる方法及び２種のプライマーを付けて使用するＤｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏ方法（ＳＥＥＧＥＮＥ）がある。また、３’−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ方法として、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅが除去するまでプライマーｅｘｔｅｎｓｉｏｎをｂｌｏｃｋする方法、ＵＶ照射により除去されるｂｌｏｃｋｉｎｇ方法及びｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ方法が報告されている。
【０００７】
これらの方法は、非特異反応を減少させる効果はあるが、さらなる酵素を使用する問題、別途の活性化条件追加、ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ変形、構造的に複雑なプライマーｄｅｓｉｇｎによる該当ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅの変種に対するｃｏｖｅｒａｇｅの困難さ、敏感度の減少等の短所を持っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報第１０−２００４−０００５４２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の問題点を解決し、前記の必要性により案出されたものであって、本発明の目的は、ＰＣＲ反応で増幅産物の増加による敏感度の増加及び非特異的に発生する反応を減少させるプライマーを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＰＣＲ反応で増幅産物の増加による敏感度の増加及び非特異的に発生する反応を減少させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、特定の遺伝子配列の増幅のための該当配列に対するプライマーの５’末端に直接あるいはイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を連結したミス−マッチング（ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｉｎｇ）ヌクレオチドを含んでバブル構造をなす相補的な二本鎖のヌクレオチドが含まれた下記構造式１の遺伝子増幅用プライマーを提供する：
［構造式１］
0006612883.tif 000002
【００１２】
本発明において、前記プライマーは、特定の遺伝子配列の増幅のための該当配列の相補的なヌクレオチド配列Ｘａと、Ｘａに相補的であり、ミス−マッチングヌクレオチド配列Ｘ’ａが含まれ、ＸａとＸ’ａがユニバーサル塩基または非−区別性塩基（ｎｏｎ−ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｂａｓｅ）のヌクレオチド配列Ｙａで連結されたプライマーであることが好ましい。
【００１３】
本発明の一具現例において、前記プライマーは、ミス−マッチングヌクレオチドのバブル構造が少なくとも一つ以上の二本鎖配列で連結されたプライマーが好ましく、前記プライマーは、ミス−マッチングヌクレオチドのバブル構造が１個〜４個の二本鎖配列で連結されたプライマーがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００１４】
本発明の他の具現例において、前記プライマーのＸ’ａとＸａの二本鎖に少なくとも一つ以上のバブルが含まれる構造を有するプライマーが好ましく、前記プライマーのＸ’ａとＸａの二本鎖に１個〜３個のバブルが含まれる構造を有するプライマーがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００１５】
本発明のまた他の具現例において、前記プライマーは、相補的な塩基配列（Ｘ’ａ）内のミス−マッチングヌクレオチドの数が少なくとも一つ以上の塩基配列を含むプライマーが好ましく、前記プライマーは、相補的な塩基配列（Ｘ’ａ）内のミス−マッチングヌクレオチドの数が３個〜１２個の塩基配列を含むプライマーがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
本発明のまた他の具現例において、前記プライマーのＹａにも少なくとも０個以上のユニバーサル塩基または非−区別性塩基を含むバブル構造を有するプライマーが好ましく、前記プライマーのＹａにも０個〜９個のユニバーサル塩基または非−区別性塩基を含むバブル構造を有するプライマーがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の一具現例において、前記プライマーは、配列番号３〜１５、配列番号１８〜１９、及び配列番号２２〜２９に記載のプライマーで構成された群から選択された一つ以上のプライマーであることが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本発明のまた他の具現例において、前記プライマーは、遺伝子増幅のためのフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）、リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）位にそれぞれ使用されるか、または共に使用されることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、ＲＮＡから特定の遺伝子配列を増幅する過程で、前記本発明のプライマーを利用して逆転写反応のための逆転写重合酵素でｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型として前記本発明のプライマーを使用して特定の遺伝子を増幅する方法を提供する。
【００２０】
本発明の一具現例において、前記方法は、前記本発明のプライマーを使用してＲＮＡ鋳型に対して逆転写反応を遂行した後、特定の遺伝子増幅反応をワンステップで遂行することが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含むＤＮＡ及びＲＮＡに対する遺伝子増幅のための重合酵素連鎖反応法、リアルタイム重合酵素連鎖反応法または等温増幅法に使用される遺伝子増幅用組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一具現例において、前記組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性を有するＴａｑ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ重合酵素、ＰＦＵ重合酵素及び５’→３’エキソヌクレアーゼ（−）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（−）活性を有するＫｌｅｎｏｗ重合酵素で構成された群から選択された一つ以上の重合酵素をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００２３】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性及び感受性検体のＤＮＡ及びＲＮＡに対する特定の遺伝子を増幅するキットを提供する。
【００２４】
本発明に係るプライマーは、前記それぞれプライマー及びプライマーセットの塩基配列に対して一つ以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列も含むことができる。
【００２５】
本発明に係るプライマー及びプライマーセットは、基本性質を変化させないさらなる特徴を含むことができる。即ち、塩基配列が当該分野に公知になった多くの手段を利用して変形され得る。このような変形の例としては、メチル化、キャップ化、ヌクレオチドの一つ以上の同族体への置換及びホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダートまたはカルバメート等の荷電されていない連結体やホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート等の荷電された連結体へのヌクレオチドの変形が可能である。また、核酸は、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン等のタンパク質、アクリジンまたはプソラレン等の挿入剤、金属、放射性金属、鉄酸化性金属等のキレート化剤及びアルキル化剤等の一つ以上の付加的な共有結合された残基を有することができる。
【００２６】
また、本発明に係るプライマー及びプライマーセットの塩基配列は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供できる標識を利用して変形させることができる。前記プライマー及びプライマーセットは、分光学、光化学、生化学、免疫化学または化学的手段を利用して検出され得る標識を含むことができる。有用な標識は、３２Ｐ、蛍光染料、電子密集試薬、酵素（一般的に、ＥＬＩＳＡＳに利用されるもの）、ビオチンまたはハプテン及び抗血清または単一クローン性抗体が利用可能なタンパク質を含む。
【００２７】
本発明に係るプライマー及びプライマーセットは、適切な配列のクローニング及び制限酵素分解及びナラン（Ｎａｒａｎｇ）等のホスホトリエステル方法（１９７９，Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）、ボウケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）等のジエチルホスホラミダイト方法（１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２）、及び米国特許第４４５８０６６号の固形物支持方法のような直接的な化学的合成法を含む任意のその他の広く公知になった方法を用いて化学的に合成することができる。
【００２８】
以下、本発明を説明する。
本発明のＰＣＲ用プライマーは、５’位に直接あるいはｌｉｎｋｅｒを連結した相補的な塩基配列ないしは相補的な塩基配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含ませることで、ＰＣＲ反応で増幅産物の増加による敏感度の増加及び非特異的に発生する反応を減少させることに目的がある。
【００２９】
本発明は、プライマーの５’位に直接あるいはｌｉｎｋｅｒを連結した相補的な塩基配列ないしは相補的な塩基配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含むＰＣＲプライマーに関し、さらに詳細には、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマーの５’末端に相補的な塩基配列ないしはｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含む相補的な塩基配列を直接またはｌｉｎｋｅｒとしてＩｎｏｓｉｎｅ塩基を使用してＰＣＲプライマー及び前記プライマーを含むＰＣＲ組成物に核酸鋳型を混合した後、前記混合物に対してＰＣＲを遂行するステップを含むＰＣＲ方法に関する。本発明のＰＣＲプライマーは、塩基配列と相補的な、あるいは相補的な塩基配列内に一部のｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含ませることで、増幅反応で発生する非特異反応を低めることができるという長所がある。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明は、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマーの５’部位に相補的な塩基配列ないしはｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含む相補的な塩基配列部位を直接あるいはｌｉｎｋｅｒで連結させたＰＣＲプライマーを提供する。
【００３２】
本明細書において、「相補的塩基」は、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマーの塩基配列に相補的な配列を有する塩基をいい、該当塩基の方向は、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマーの５’末端方向に位置する。相補的塩基に含まれている「ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列」は、ＦｏｒｗａｒｄあるいはＲｅｖｅｒｓｅプライマー塩基配列とｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄされる塩基配列を称し、ＤＮＡ塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウリジンのいずれであっても構わない。相補的なプライマーにｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基の数がなくなると、プライマーの焼きなまし現象に対するＴｍ値が高くなり、鋳型ＤＮＡの塩基配列にアニーリングがよくできず、増幅反応が遂行されない。また、相補的なプライマーにｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基の数が１３個を超えると、プライマーのＴｍ値が顕著に低くなり、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基数が多くなって、ＰＣＲ遂行の間、非特異反応がもたらされ得る。従って、本発明のプライマー（ＣＰ）は、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基の数によってバブルが発生し、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基の数が多くなるほど、ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｍが低くなる役割をする。これによって、バブル部位である相補的な配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基部位では１個〜３個のバブルが形成される。
【００３３】
プライマーと相補的プライマーの連結は、直接連結されることもあるが、ｌｉｎｋｅｒを使用することもあり、この時に使用される塩基は、Ｉｎｏｓｉｎｅを使用し、Ｉｎｏｓｉｎｅ塩基の数は、特に限定されるものではないが、１〜９個の範囲であることが好ましい。また、本発明は、ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰｓ、反応用緩衝溶液及び前記ＰＣＲプライマーを含むＰＣＲ増幅用組成物を提供する。
【００３４】
前記反応用緩衝溶液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２等の成分を含む通常のＰＣＲ緩衝溶液を適宜変形して使用することができる。前記ｄＮＴＰｓは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを意味し、使用できるＤＮＡ重合酵素もまた特定の酵素やＨｏｔ  ｓｔａｒｔ効果に限定されるものではない。本発明の好ましい実施例においては、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（５’→３’ｅｘｏ＋）、Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（５’→３’ｅｘｏ＋）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素（５’→３’ｅｘｏ−）、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素（３’→５’ｅｘｏ＋）を使用してＰＣＲを遂行した。また、前記ＰＣＲ増幅用プライマーは、０．２〜１ｕＭの範囲の濃度で使用することができ、適切なプライマー濃度は、当業者が容易に決定できる。
【００３５】
本発明は、増幅しようとするプライマーの５’末端部位に直接あるいはｌｉｎｋｅｒで連結させた相補的な塩基配列ないしは相補的な塩基配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含むＰＣＲプライマーを利用して前記プライマーを含むＰＣＲ組成物に核酸鋳型を混合した後、前記混合物に対してＰＣＲを遂行するステップを含むＰＣＲ増幅方法に関する。
【００３６】
前記ＰＣＲは、変性、アニーリング及び延長ステップを繰り返すことにより遂行され、このようなＰＣＲ原理は、当事者にとって明確である。前記変性、アニーリング及び伸び温度は、それぞれ８５〜９５℃で１〜６０秒、４０〜７０℃で１〜６０秒及び５０〜７５℃で１〜６０秒間遂行することが好ましく、温度範囲及び時間は、反応条件によって適切に調節できる。例えば、本発明の好ましい実施例によると、プライマー内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基が２−３個置換される場合は、メルティング温度（以下、「Ｔｍ」という。）が約５〜１０℃低くなり、４〜６個置換される場合は、メルティング温度（以下、「Ｔｍ」という。）が約１０〜２０℃低くなり、７〜１２個置換される場合は、メルティング温度（以下、「Ｔｍ」という。）が約２０〜３０℃低くなる。このようなＴｍの温度変化は、使用するＤＮＡ重合酵素の種類、プライマーの長さ、プライマー内の塩基の種類、反応条件等によって多少変化し得る。前記のようなＴｍ変化程度に基づいて、相補的塩基配列内にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基部位を含むプライマーをデザインするとき、温度同等性を付与するプライマー作製条件を確立できるようになり、適切な数字のｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基を導入することで、ＰＣＲの特異性を増加させることができるようになる。
【００３７】
下記実施例の結果を利用することで、プライマー位置に対するプライマーデザイン時に温度同等性を付与するプライマー作製条件を確立することができ、相補的な塩基配列にｌｉｎｋｅｒとｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基を適切な位置に導入することで発生し得るＴｍ値の顕著な差を最小化した塩基配列を作製できるようになり、これによるＰＣＲ反応の特異性を増加させることができるようになる。また、使用するＤＮＡ重合酵素のｅｘｏｎｕｌｅａｓｅ（５’→３、３’→５’）機能の有無に関係なくＰＣＲの特異度及び敏感度を維持することができる。
【発明の効果】
【００３８】
前記において検討したように、プライマーの５’位に直接あるいはＩｎｏｓｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒを連結した相補的な塩基配列ないしはＭｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ塩基配列を含ませることで、ＤＮＡ、ＲＮＡを鋳型とする核酸増幅反応で増幅産物を増加させ、敏感度の改善に効果的であり、発生する非特異反応を減少させることができる。このような効果は、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの種類に関係なく全て作用されている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明のプライマー（ＣＰ）を利用して二本鎖ＤＮＡを増幅する方法を順次に示す。
【図２】本発明のプライマー（ＣＰ）を利用して一本鎖ＲＮＡを増幅する方法を順次に示す。
【図３】核酸増幅のために必要な二つのプライマーのうち一つを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した方法で本発明のプライマー（ＣＰ）のターゲット部位５’−末端に位置したバブル部位１に含まれるジオキシイノシンの数による結果を示す。
【図４】本発明のプライマー（ＣＰ）の相補的な部位に位置したバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドの数（０、３、７、１２）による結果である。また、核酸増幅のために必要な二つのプライマーのうち一つを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した方法による結果１を示す。
【図５】本発明のプライマー（ＣＰ）の相補的な部位に位置したバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドの数（０、３、７、１２）による結果である。また、核酸増幅のために必要な二つのプライマーのうち一つを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した方法による結果を示す。
【図６】核酸増幅のために必要な二つのプライマーのうち一つを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した方法で本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位１とバブル部位２を含んで総バブル数がそれぞれ２、３、４個である本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した結果を示す。
【図７】核酸増幅のために必要な二つのプライマーのうち一つを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した方法を示す。
【図８】は、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素を示す。
【図９】Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素を示す。
【図１０】Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素を使用した結果を示す。
【図１１】Ｈｕｍａｎ  ｇＤＮＡでｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ遺伝子を核酸増幅するために必要な二つのプライマーを本発明のプライマー（ＣＰ）としてｆｏｒｗａｒｄプライマーとｒｅｖｅｒｓｅプライマーにそれぞれ利用した反応と、二つのプライマーを全て本発明のプライマー（ＣＰ）として利用した増幅反応に対する結果を示す。
【図１２】Ｒａｔ  ｇＤＮＡでＧＡＰＤ遺伝子を核酸増幅するために必要な二つのプライマーを本発明のプライマー（ＣＰ）を利用して増幅反応した結果を示す。
【図１３】本発明のプライマー（ＣＰ）の相補的な部位に位置したバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドの数によってｃＤＮＡ合成温度によるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図１４】本発明のプライマー（ＣＰ）の相補的な部位に位置したバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドの数によってｃＤＮＡ合成温度によるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図１５】本発明のプライマー（ＣＰ）の相補的な部位に位置したバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドの数によってｃＤＮＡ合成温度によるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、実施例を通して、本発明をさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位１のｌｉｎｋｅｒによる効果分析
ＨＩＶ  ｔａｔ増幅のための鋳型ＤＮＡは、ＨＩＶ−１  ｉｓｏｌａｔｅ  １０ＢＲ＿ＰＥ０６４（ＧＩ：６７２９１８７２０、５２８１−５７００  ｂｐ）をｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡに遺伝子合成を通してＨＩＶ  ｔａｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを作製した。
【００４２】
本発明のプライマー（ＣＰ）は、従来の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：２０，２００８）のＨＩＶ  ｔａｔ遺伝子に対するｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーをターゲット部位で設計し、これに相補的な配列を５’−末端に位置させ、相補的な配列には、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を７〜８個含ませた。ターゲット部位と相補的な配列との間であるバブル部位１にＩｎｏｓｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒを配列番号３〜１０のように設計した。配列番号３は、バブル部位１にｌｉｎｋｅｒが含まれないプライマーであり、配列番号４〜１０は、Ｉｎｏｓｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒを１（Ｉｘ１ａ、Ｉｘ１ｂ、Ｉｘ１ｃ）、３（Ｉｘ３）、５（Ｉｘ５）、７（Ｉｘ７）、９（Ｉｘ９）個を含ませて設計した。
【００４３】
前記作製されたプライマーは、配列番号１をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、配列番号２をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして使用する混合物を対照群として使用し、試験群は、配列番号３〜１０に対する本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、配列番号２をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして使用する混合物を製造した。
【００４４】
前記プライマーを使用する核酸増幅反応に対する混合物は、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＮＥＢ）、１．７５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭ  プライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００４５】
前記反応混合物４５ｕｌと前記鋳型ＤＮＡ６９、６．９、０．６９ｆｇ／ｕｌをそれぞれ５ｕｌずつ添加し、９４℃で１０分の初期変性ステップ（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、５５℃で３０秒のアニーリングステップ（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｔｅｐ）、７２℃で２分の延長ステップ（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を４０サイクル進行し、７２℃で７分間の最終延長ステップ（Ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００４６】
その結果、図３に示されたように、鋳型濃度が３４５ｆｇを反応させた３番ラインで従来のプライマー（Ｃｏｎの３番ライン）に比べて本発明のプライマー（ＣＰ）（Ｉｘ９、Ｉｘ７、Ｉｘ５、Ｉｘ３、Ｉｘ１ａ、Ｉｘ１ｂ、Ｉｘ１ｃ、Ｉｘ０の３番ライン）の増幅産物が増加して現れた。鋳型濃度が３４ｆｇである２番ラインで従来のプライマー（Ｃｏｎの２番ライン）に比べて本発明のプライマー（ＣＰ）（Ｉｘ７、Ｉｘ５、Ｉｘ３、Ｉｘ１ａ、Ｉｘ１ｂ、Ｉｘ１ｃ、Ｉｘ０の２番ライン）の増幅産物が増加して現れた。
【００４７】
前記反応に対する結果において、本発明のプライマー（ＣＰ）の中で、Ｉｘ１、Ｉｘ３、Ｉｘ５、Ｉｘ７は、Ｉｘ０に比べて増幅産物が増加することを確認することができた。これによって、本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位１にＩｎｏｓｉｎｅが含まれることで核酸増幅反応の増幅産物が増加することを確認した。
【００４８】
実施例２：本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ個数による効果分析
ＨＩＶ  ｔａｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを鋳型として使用し、本発明のプライマー（ＣＰ）は、バブル部位１にＩｎｏｓｉｎｅを一つ含ませた後、バブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を０、３、８、１２個含ませて配列番号１１、１２、４、１３を作製した。
【００４９】
前記作製されたプライマーは、配列番号１をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、配列番号２をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして使用する混合物を対照群として使用し、試験群は、配列番号１１、１２、４、１３に対する本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、配列番号２をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして使用する混合物を製造した。
前記プライマーを使用する核酸増幅反応に対する混合物は、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００５０】
前記反応混合物４５ｕｌと前記鋳型ＤＮＡ６９、６．９、０．６９ｆｇ／ｕｌをそれぞれ５ｕｌずつ添加し、９４℃で１０分の初期変性ステップ（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、５５℃で３０秒のアニーリングステップ（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｔｅｐ）、７２℃で２分の延長ステップ（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を４０サイクル進行し、７２℃で７分間の最終延長ステップ（Ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００５１】
図４のＭ０は、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が含まれていない配列番号１１をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用した結果であり、増幅産物が生成されなかった。Ｍ３は、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が３個含まれた配列番号１２であり、従来のプライマー（配列番号１）は、鋳型ＤＮＡを３４５ｆｇを反応させた３番ラインでＣｏｎの３番ラインよりＭ３の３番ラインの増幅産物が増加した。しかし、３４．５ｆｇを反応させた２番ラインでは、Ｍ３の２番ラインで増幅産物が確認されなかった。
【００５２】
図５のＭ８は、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が８個含まれた配列番号４であり、Ｍ１２は、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が１２個含まれた配列番号１３であり、従来のプライマー（配列番号１）より鋳型ＤＮＡを３．４５ｆｇを反応させた１番ラインで増幅産物を確認し、特に、Ｍ８で増幅産物が最も多く増加したことを確認した。
【００５３】
前記の結果により、本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ数によって増幅産物の増加及び敏感度の上昇に対する影響を確認した。
【００５４】
実施例３：本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル個数による効果分析
本発明のプライマー（ＣＰ）は、バブル部位１にＩｎｏｓｉｎｅを含み、バブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が含まれる。バブル部位１は、１個のバブルを生成し、バブル部位２は、１〜３個のバブルを生成する。
【００５５】
配列番号１３は、バブル部位１に１個、バブル部位２に１個と、計２個のバブルを生成し、配列番号１４は、バブル部位１に１個、バブル部位２に２個のバブルを生成する。配列１５は、バブル部位１に１個、バブル部位２に３個のバブルを生成する。
【００５６】
前記本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、配列番号２をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして利用して、核酸増幅反応に対する混合物は、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００５７】
前記反応混合物４５ｕｌと前記鋳型ＤＮＡ６９、６．９、０．６９ｆｇ／ｕｌをそれぞれ５ｕｌずつ添加し、９４℃で１０分の初期変性ステップ（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、４５℃で３０秒のアニーリングステップ（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｔｅｐ）、７２℃で２分の延長ステップ（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を４０サイクル進行し、７２℃で７分間の最終延長ステップ（Ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００５８】
図６のＡラインは、バブルの個数が２個であり、Ｂラインのバブルの個数は３個、Ｃラインのバブルの個数は４個の本発明のプライマー（ＣＰ）を利用した結果により、バブルの個数２〜４個は、２番ラインの鋳型ＤＮＡで３４．５ｆｇまで増幅反応が確認され、３４５ｆｇを使用した３番ラインでは、Ｃｏｎの３番ラインより増幅産物が増加したことを確認した。
【００５９】
実施例４：ＤＮＡ重合酵素の種類別の本発明のプライマー（ＣＰ）の増幅反応分析
核酸増幅反応に使用されるＤＮＡ重合酵素による本発明のプライマー（ＣＰ）の増幅反応を確認するために、配列番号４の本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして利用し、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを配列番号２を利用して、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素による増幅反応を分析した。
【００６０】
図７の核酸増幅反応は、前記Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素の核酸増幅反応に対する混合物は、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００６１】
図８の核酸増幅反応は、前記ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素の核酸増幅反応に対する混合物は、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００６２】
図９の核酸増幅反応は、前記Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素の核酸増幅反応に対する混合物は、２．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００６３】
図１０の核酸増幅反応は、前記Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素の核酸増幅反応に対する混合物は、１ｘバッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．８）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．７５Ｕ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、１０ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００６４】
前記反応混合物４５ｕｌと前記鋳型ＤＮＡ６９、６．９、０．６９ｆｇ／ｕｌをそれぞれ５ｕｌずつ添加し、９４℃で１０分の初期変性ステップ（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、４５℃で３０秒のアニーリングステップ（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｔｅｐ）、７２℃で２分の延長ステップ（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を４０サイクル進行し、７２℃で７分間の最終延長ステップ（Ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００６５】
前記Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素による結果は図７であり、鋳型ＤＮＡ３．４５ｆｇを使用したＣｏｎの１番ラインは、増幅産物が確認されなかったが、本発明のプライマー（ＣＰ）の１番ラインでは、増幅産物を確認した。
【００６６】
前記Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素による結果は図８であり、鋳型ＤＮＡ３４．５ｆｇを使用したＣｏｎの２番ラインに比べて本発明のプライマー（ＣＰ）の２番ラインで増幅産物が増加したことを確認した。
【００６７】
前記Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素による結果は図９であり、鋳型ＤＮＡ３４．５ｆｇを使用したＣｏｎの２番ラインは、増幅産物が確認されなかったが、本発明のプライマー（ＣＰ）の２番ラインでは、増幅産物を確認することができた。鋳型ＤＮＡ３．４５ｆｇを使用したＣｏｎの１番ラインの場合は、１００ｂｐ以上の増幅産物が多数検出されたが、本発明のプライマー（ＣＰ）の１番ラインは、１００ｂｐ以上の増幅産物を確認することができなかった。
【００６８】
前記Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素による結果は図１０であり、鋳型ＤＮＡ３４５ｆｇを使用したＣｏｎの３番ラインと、本発明のプライマー（ＣＰ）の３番ラインの増幅産物が類似したバンド厚さを示すが、Ｃｏｎの１、２、３番ラインは、全て引かれ現象が示されており、本発明のプライマー（ＣＰ）の１、２、３番ラインの場合は、引かれ現象がないことを確認することができた。
【００６９】
実施例５：本発明のプライマー（ＣＰ）Ｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーそれぞれまたは一対を適用した場合による増幅反応分析
図１１は、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅するために、従来の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：２０，２００８）のプライマーであるＣｏｎラインは配列番号１６をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして、配列番号１７をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして核酸増幅反応を遂行した。
【００７０】
本発明のプライマー（ＣＰ）は、バブル部位１にＩｎｏｓｉｎｅを１個含ませ、バブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を４個含ませて、配列番号１６と配列番号１７に対する配列番号１８と配列番号１９である本発明のプライマー（ＣＰ）を作製した。
【００７１】
前記本発明のプライマー（ＣＰ）を利用して、図１１のＡ＿Ｆラインは、配列番号１８である本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、従来の配列番号１７番プライマーで核酸増幅反応を遂行し、Ａ＿Ｒラインは、配列番号１６である従来のプライマーを使用し、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、配列番号１９である本発明のプライマー（ＣＰ）を使用した。Ａ＿Ｆ＆Ｒラインは、ｆｏｒｗａｒｄとｒｅｖｅｒｓｅプライマーを配列番号１８と配列番号１９である本発明のプライマー（ＣＰ）を使用した。
【００７２】
前記プライマーセットに対する核酸増幅反応の混合物は、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００７３】
前記反応混合物とＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３０４１）１００、１０、１ｎｇずつ添加し、総５０ｕｌの反応物を９４℃で２分の初期変性ステップ、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ、６０℃で３０秒のアニーリングステップ、７２℃で４５秒の延長ステップを４０サイクル繰り返し、７２℃で７分間の最終延長ステップを経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００７４】
前記核酸増幅反応による結果は、本発明のプライマー（ＣＰ）を使用したＡ＿Ｆ、Ａ＿Ｒ、Ａ＿Ｆ＆Ｒラインは、単一バンドの増幅産物が現れ、従来のプライマーを使用したＣｏｎラインは、３個以上のバンドに対する増幅産物が確認された。Ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ遺伝子に対する増幅産物は、６５３ｂｐに該当する単一増幅産物であり、図１１の本発明のプライマー（ＣＰ）による結果は、従来のプライマーより特異度が高いということを確認することができ、本発明のプライマー（ＣＰ）をｆｏｒｗａｒｄとｒｅｖｅｒｓｅプライマーのうち一つだけ適用させても、特異度が高くなることを確認した。増幅産物の増加効果は、本発明のプライマー（ＣＰ）を二つのプライマーのうち一つだけ適用させても増幅産物が増加し、一対を利用しても増幅産物の増加を確認した。
【００７５】
図１２は、Ｒａｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのＧＡＰＤ遺伝子を増幅するために、従来のプライマー（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：２０，２００８）である配列番号２０をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして、配列番号２１をｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして利用し、本発明のプライマー（ＣＰ）は、バブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が６個である配列番号２２と、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が１０個である配列番号２４をｆｏｒｗａｒｄプライマーとして使用し、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が８である配列番号２３と、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が１０個である配列番号２５を使用した。
【００７６】
前記プライマーセットに対する核酸増幅反応の混合物は、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００７７】
前記反応混合物とＲａｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６３６４０４）１０００、１００、１０、１ｐｇずつ添加し、総２５ｕｌの反応物を９４℃で５分の初期変性ステップ、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ、５５℃で３０秒のアニーリングステップ、７２℃で３０秒の延長ステップを３５サイクル繰り返し、７２℃で７分間の最終延長ステップを経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００７８】
図１２の１番ラインは、Ｒａｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを１ｐｇ使用した核酸増幅反応の増幅産物であり、Ｃｏｎの１番ラインに比べて本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位２をｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を６個と８個を適用した配列番号２２と配列番号２３に対するＭ６＆Ｍ８の１番ラインと、本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位２をｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を１０個と１０個を適用した配列番号２４と配列番号２５に対するＭ１０＆Ｍ１０の１番ラインが増幅産物が増加したことを確認した。
【００７９】
前記１１と１２の結果により、核酸増幅反応に対するプライマー対のうち一つだけまたは二つを本発明のプライマー（ＣＰ）に適用した結果で特異度及び増幅産物の増加を確認することができた。本発明のプライマー（ＣＰ）のｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列個数が異なる２対の本発明のプライマー（ＣＰ）の組み合わせでも増幅産物の増加を確認した。
【００８０】
実施例６：本発明のプライマー（ＣＰ）を利用したＲＴ−ＰＣＲの増幅有効性検証
Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７５０５００）でｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅するために、従来のプライマー（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：２０，２００８）と本発明のプライマー（ＣＰ）を利用してＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ＲＴ−ＰＣＲの最初ステップであるＲＮＡをｃＤＮＡで合成するために、従来のプライマーセットのｒｅｖｅｒｓｅプライマーに該当する配列番号１７を利用し、本発明のプライマー（ＣＰ）は、バブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列を４個含ませた配列番号１９とｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列６個である配列番号２７、そして、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が８個である配列番号２９をそれぞれ利用して、ｃＤＮＡに合成に利用した。
【００８１】
ｃＤＮＡ合成のために、１Ｘｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、７５ｍＭ  ＫＣｌ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｕＭプライマー、２００Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ４０、４、０．４ｎｇを含む混合物を製造した。
【００８２】
前記混合物のｃＤＮＡ合成反応のために、４５、５５、６５℃でそれぞれ６０分間反応した後、９４℃で５分間Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅを不活性化した。
【００８３】
前記ｃＤＮＡ反応液を鋳型として配列番号１７で合成された反応液は配列番号１６と配列番号１７で、配列番号１９で合成された反応液は配列番号１８と配列番号１９で、配列番号２７で合成された反応液は配列番号２６と配列番号２７で、配列番号２９で合成された反応液は配列番号２８と配列番号２９をプライマーセットとして核酸増幅反応を遂行した。
【００８４】
前記プライマーセットに対する核酸増幅反応の混合物は、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、０．５ｕＭプライマーセットを含む反応混合物を製造した。
【００８５】
前記反応混合物とＨｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対する各プライマー別のｃＤＮＡ反応液（２、０．２、０．０２ｎｇ）を５ｕｌずつ添加し、総５０ｕｌの反応物を９４℃で２分の初期変性ステップ、そして、９４℃で３０秒の変性ステップ、６０℃で３０秒のアニーリングステップ、７２℃で４５秒の延長ステップを４０サイクル繰り返し、７２℃で７分間の最終延長ステップを経て核酸増幅反応を遂行し、増幅産物５ｕｌをＧｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅが含まれた２％アガロースゲルに電気泳動分析を遂行した。
【００８６】
図１３は、前記ｃＤＮＡ合成反応を６５℃で遂行した結果であり、従来のプライマーであるＣｏｎラインに比べて本発明のプライマー（ＣＰ）のバブル部位２にｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列がそれぞれ４、６、８個含まれたＡ、Ｂ、Ｃラインの増幅産物が増加されたことを確認した。図１４は、前記ｃＤＮＡ合成反応を５５℃で遂行した結果であり、従来のプライマーに比べて本発明のプライマー（ＣＰ）で増幅産物が増加し、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が８個であるＣの１番ラインがＣｏｎとＡ、Ｂの１番ラインに比べて増幅産物が増加したことを確認した。図１５は、前記ｃＤＮＡ合成反応を４５℃で遂行した結果であり、従来のプライマーに比べて本発明のプライマー（ＣＰ）で増幅産物が増加し、ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ配列が６、８個であるＣの１番ラインがＣｏｎとＡの１番ラインに比べて増幅産物が増加したことを確認した。
【００８７】
前記結果により、本発明のプライマー（ＣＰ）を利用してｃＤＮＡ合成時、温度範囲によって従来のプライマーセットに比べて反応性が増加することを確認した。従って、本発明のプライマー（ＣＰ）を使用して一本鎖のＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲ反応で特定の遺伝子の増幅反応に対する有用性を確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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