(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物であって、該プロモーターが、配列番号１、配列番号３または配列番号５の少なくとも５００ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含み、該プロモーターが、治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、該プロモーターが、ハンチントン病の発症時または病態進行中に、該治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする該ＤＮＡセグメントの発現を、活性化および／または促進する、組成物。
【請求項２】
プロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物であって、該プロモーターが、配列番号１、配列番号３または配列番号５の少なくとも５００ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸からなり、該プロモーターが、治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、該プロモーターが、ハンチントン病の発症時または病態進行中に、該治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする該ＤＮＡセグメントの発現を、活性化および／または促進する、組成物。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号１、配列番号３または配列番号５の少なくとも５００ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載のプロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物。
【請求項４】
プロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物であって、該プロモーターが、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する１５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含み、該プロモーターが、治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、該プロモーターが、ハンチントン病の発症時または病態進行中に、該治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする該ＤＮＡセグメントの発現を、活性化および／または促進する、組成物。
【請求項５】
プロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物であって、該プロモーターが、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する１３００から１４００ヌクレオチド長の間の核酸を含み、該プロモーターが、治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、該プロモーターが、ハンチントン病の発症時または病態進行中に、該治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする該ＤＮＡセグメントの発現を、活性化および／または促進する、組成物。
【請求項６】
プロモーターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物であって、該プロモーターが、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する１０００から１２００ヌクレオチド長の間の核酸を含み、該プロモーターが、治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、該プロモーターが、ハンチントン病の発症時または病態進行中に、該治療用タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする該ＤＮＡセグメントの発現を、活性化および／または促進する、組成物。
【請求項７】
タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする予め選択されたＤＮＡセグメントに作動可能に連結され、形質転換細胞において機能性がある、請求項１から６のいずれか１項に記載のプロモーターを含む発現カセットを含む、ハンチントン病を処置するための組成物。
【請求項８】
前記予め選択されたＤＮＡセグメントが、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記予め選択されたＤＮＡセグメントが治療用組成物をコードする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
治療用組成物がＲＮＡｉ分子である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクターを含む、ハンチントン病を処置するための組成物。
【請求項１２】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９由来のキャプシドタンパク質を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９由来の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが異種遺伝子をさらに含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の発現カセットまたは請求項１１もしくは１２に記載のベクターを含む形質転換細胞を含む、ハンチントン病を処置するための組成物。
【請求項１７】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物を細胞に導入し、ここで、前記プロモーターが、組み換えＤＮＡとしてＤＮＡセグメントに作動可能に連結されており、形質転換細胞を生じさせる工程、および（ｉｉ）形質転換細胞株を同定するかまたは選択する工程を含む、形質転換細胞を生成させるための方法。
【請求項１９】
請求項１１から１６のいずれか１項に記載のベクターを含む、哺乳動物においてハンチントン病を処置するための組成物であって、該組成物が該哺乳動物に投与されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９４，８１８号の優先権を主張し、当該出願はその全体が本明細書において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患のための遺伝子治療に対する現在のアプローチは、送達された治療用遺伝子の発現を作動させ、遮断する能力に欠ける。さらに、現在のアプローチは、送達後の治療用遺伝子の発現を与える能力に欠ける。制御可能なプロモーターが現在必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する、５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含む（またはそれからなる）単離プロモーター配列を提供する。ある実施形態において、本プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。
【０００４】
ある実施形態において、本発明は、タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする予め選択されたＤＮＡセグメントに作動可能に連結される、形質転換細胞において機能性がある上述のプロモーターを含む発現カセットを提供する。ある実施形態において、予め選択されたＤＮＡセグメントは、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含む。ある実施形態において、予め選択されたＤＮＡセグメントは、治療用組成物をコードする。ある実施形態において、本治療用組成物はＲＮＡｉ分子である。
【０００５】
ある実施形態において、本発明は、上述の発現カセットを含むベクターを提供する。ある実施形態において、本ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【０００６】
ある実施形態において、本発明は、上述の発現カセットまたは上述のベクターを含む形質転換細胞を提供する。ある実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。ある実施形態において、真核細胞は動物細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞など）である。
【０００７】
ある実施形態において、本発明は、（ｉ）形質転換細胞を生じさせるために、ＤＮＡセグメントに作動可能に連結される上述のプロモーターを含む組み換えＤＮＡを細胞に導入する工程、および（ｉｉ）形質転換細胞株を同定するかまたは選択する工程を含む、形質転換細胞を生成させるための方法を提供する。ある実施形態において、組み換えＤＮＡは、形質転換細胞に表現型特性を付与するために発現される。ある実施形態において、本形質転換細胞は、対照個体由来の細胞と比較して、ハンチントン病患者由来の細胞に導入された際にレポーター遺伝子の顕著な発現上昇を呈する。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、上述の方法により作製される形質転換細胞を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、上述の単離プロモーターを含む形質転換細胞を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、上述の発現カセットを含む形質転換細胞を提供する。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）上述のベクターまたは（ｂ）上述の形質転換細胞を投与することを含む、哺乳動物において神経変性疾患を処置する方法を提供する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含む単離プロモーター配列。
（項目２）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸からなる単離プロモーター配列。
（項目３）
前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有する、項目１または２に記載の単離プロモーター配列。
（項目４）
配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する１５００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目５）
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する６００から８００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目６）
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する１３００から１４００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目７）
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する１３００から１５００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目８）
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する１０００から１２００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目９）
配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有する５００から７００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目１０）
配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する９００から１７００ヌクレオチド長の間の核酸を含む、単離プロモーター配列。
（項目１１）
タンパク質またはＲＮＡ転写産物をコードする予め選択されたＤＮＡセグメントに作動可能に連結され、形質転換細胞において機能性がある、項目１から１０のいずれか１項に記載のプロモーターを含む発現カセット。
（項目１２）
前記予め選択されたＤＮＡセグメントが、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含む、項目１１に記載の発現カセット。
（項目１３）
前記予め選択されたＤＮＡセグメントが治療用組成物をコードする、項目１１に記載の発現カセット。
（項目１４）
治療用組成物がＲＮＡｉ分子である、項目１３に記載の発現カセット。
（項目１５）
項目１１から１４のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
（項目１６）
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目１５に記載のベクター。
（項目１７）
項目１１から１４のいずれか１項に記載の発現カセットまたは項目１５もしくは１６に記載のベクターを含む、形質転換細胞。
（項目１８）
宿主細胞が真核細胞である、項目１７に記載の形質転換細胞。
（項目１９）
前記真核細胞が動物細胞である、項目１８に記載の形質転換細胞。
（項目２０）
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、項目１９に記載の形質転換細胞。
（項目２１）
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目２０に記載の形質転換細胞。
（項目２２）
（ｉ）ＤＮＡセグメントに作動可能に連結される項目１から１０のいずれか１項に記載のプロモーターを含む組み換えＤＮＡを細胞に導入し、形質転換細胞を生じさせる工程、および（ｉｉ）形質転換細胞株を同定するかまたは選択する工程を含む、形質転換細胞を生成させるための方法。
（項目２３）
前記組み換えＤＮＡが発現して前記形質転換細胞に表現型特性を付与する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
対照個体由来の細胞と比較して、ハンチントン病患者由来の細胞に導入された際に、前記形質転換細胞がレポーター遺伝子の顕著な発現上昇を呈する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
項目２２から２４のいずれか１項に記載の方法により作製される、形質転換細胞。
（項目２６）
項目１から１０のいずれか１項に記載の単離プロモーターを含む、形質転換細胞。
（項目２７）
項目１１から１４のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、形質転換細胞。
（項目２８）
（ａ）項目１５もしくは１６に記載のベクターまたは（ｂ）項目２５から２７のいずれか１項に記載の形質転換細胞を投与することを含む、哺乳動物において神経変性疾患を処置する方法。
（項目２９）
項目１から１０のいずれか１項に記載の単離プロモーターの使用であって、該プロモーターが、神経変性障害の発症時または神経変性障害の病態進行中に、遺伝子配列の発現を活性化するか、促進するかまたは抑制する、使用。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５個のプロモーターに対する発現分析から、健常対照個体と比較した場合にハンチントン病死後脳患者材料におけるそれらの内因性転写産物の上方制御が明らかになる。
【００１３】
【図２Ａ】図２Ａから２Ｃ。６週間（図２Ａ）、１１週間（図２Ｂ）および１９週間（（図２Ｃ）でのハンチントン病マウス脳における内因性転写産物の上方制御。
【図２Ｂ】図２Ａから２Ｃ。６週間（図２Ａ）、１１週間（図２Ｂ）および１９週間（（図２Ｃ）でのハンチントン病マウス脳における内因性転写産物の上方制御。
【図２Ｃ】図２Ａから２Ｃ。６週間（図２Ａ）、１１週間（図２Ｂ）および１９週間（（図２Ｃ）でのハンチントン病マウス脳における内因性転写産物の上方制御。
【００１４】
【図３】クローニングされた遺伝子プロモーター配列の活性。
【００１５】
【図４】レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現により実証される、クローニングされた遺伝子プロモーター配列の誘導。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、神経変性障害の発症時または病態進行中に、遺伝子配列の発現を活性化、促進または抑制し得る遺伝子プロモーター配列の使用を提供する。本発明は、遺伝子治療の分野に直接適用可能である。本発明は、神経変性疾患に対する制御された遺伝子治療アプローチの開発におけるツールとして商業的価値を有する可能性がある。本発明は、神経変性疾患の進行の状況または速度に基づいて疾患の経過中に治療用遺伝子の発現を与えるかまたは制御するための手段を提供する。例えば、疾患進行中に、遺伝子プロモーター配列は、治療用遺伝子の発現を活性化し得る。治療が疾患の進行を停止させたら、遺伝子プロモーター配列の活性が減弱し、その結果、治療用遺伝子発現が低下し／制限される。治療用遺伝子発現に対するこの疾患制御性の動的なアプローチは、特有なものであり、遺伝子治療分野で必要とされる。
【００１７】
本発明は遺伝子治療分野に適用可能である。本発明は、脳への送達後の治療用遺伝子の制御および／または投与に対するニーズを満たす。遺伝子発現分析は、神経変性疾患進行の開始時および／または神経変性疾患進行の経過中に、多くの遺伝子プロモーター配列が、遺伝子の発現を「動作」させるか、促進するか、抑制するかまたは「遮断」するために作用することを示した。本発明者らは、神経変性疾患の細胞および動物モデルにおいて神経変性疾患進行中に遺伝子発現を活性化および／または促進する遺伝子プロモーター配列を同定し、クローニングした。これらの遺伝子プロモーター配列はまた、神経変性疾患のモデルにおいて神経変性疾患進行中にレポーター遺伝子の発現も活性化および／または促進し得る。このアプローチは、特有のものであり、治療用遺伝子発現を人工的に制御するために使用される現在の系とは、治療用遺伝子の発現を調整するために神経変性疾患関連の分子的事象にそれが依存する点において異なる。これらの事象および、したがって特異的な遺伝子プロモーター配列の活性は、疾患の発症および／または進行に依存する細胞内および／または細胞外シグナルにより調節／誘導される。
【００１８】
本発明者らは、対照個体またはハンチントン病（すなわち神経変性疾患）遺伝子突然変異を保有する個体から得られた組織培養細胞において、７種類の異なる遺伝子プロモーター配列を同定し、クローニングし、その活性を試験した。この実験から、これらの遺伝子プロモーター配列が、対照個体由来の細胞と比較して、ハンチントン病患者由来の細胞に導入された際に、レポーター遺伝子の顕著な発現上昇を推進し得ることが明らかとなる。さらに、培養細胞において内因性に調節された転写産物またはレポーター遺伝子の発現によって測定した場合、プロテアソーム阻害剤または炎症促進性の刺激などの人為的なストレッサーの導入の結果、遺伝子プロモーター配列からの活性が上昇する。さらに、発明者らは、ハンチントン病（すなわち神経変性疾患）のマウスモデルの脳において、内因性の制御された遺伝子転写産物の定量的ＰＣＲ分析により測定した場合に、これらの遺伝子プロモーター配列の活性の疾患進行依存的な上昇を検出した。
【００１９】
プロモーター配列
ある実施形態において、本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ）は、遺伝子発現を活性化および／または促進する次のプロモーター配列を提供する：ユビキチン特異的なペプチダーゼ３１（ＵＳＰ３１、配列番号１）、ガンマ−ＦＢＧ（配列番号２）、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＹ（ｍｅｍｂｅｒ  Ｙ）（Ｈ２ＡＦＹ、配列番号３）、核転写因子Ｙ、ガンマ（ＮＹＦＣ、配列番号４）、ＤＮＡ−損傷誘導性転写産物３（ＣＨＯＰ、配列番号５）、非コード３８Ａ  ＲＮＡ（３８Ａ遺伝子座、配列番号６）および非コード１７Ａ  ＲＮＡ（１７Ａ、配列番号７）。
【化１】
0006473438.tif 000002
【化２】
0006473438.tif 000003
【化３】
0006473438.tif 000004
【化４】
0006473438.tif 000005
【００２０】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび適正な転写に必要とされる他の因子に対する認識を提供することによってコード配列の発現を調節する、そのコード配列に対して通常上流（５’）であるヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」としては、発現の調節のために制御エレメントが付加される転写開始部位を特定するために働くＴＡＴＡ−ｂｏｘおよび他の配列から構成される短いＤＮＡ配列である最小プロモーターが挙げられる。「プロモーター」はまた、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を調節することが可能である最小プロモーター＋制御エレメントを含めるヌクレオチド配列も指す。このタイプのプロモーター配列は、近位の上流エレメントおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得、プロモーターの生得的なエレメントまたはプロモーターのレベルまたは組織特異性を促進するために挿入される異種エレメントであり得るＤＮＡ配列である。エンハンサーは、両方向（正常または反転）で作動可能であり、プロモーターから上流または下流のいずれかに移動した際にも機能することが可能である。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの両方は、それらの効果を媒介する配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、それらの全体においてネイティブ遺伝子由来であり得るか、または天然で見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントからも構成され得る。プロモーターはまた、生理学的または発生学的状態に反応して転写開始の有効性を調節するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含有し得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性がある」は、プロモーターが配列番号１または配列番号２を含むＣＣＴプロモーターの活性の少なくとも約０．１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、さらに９０％またはそれを超える、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有することを意味する。プロモーターの活性は、当技術分野で周知の方法によって決定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）を参照。配列番号１または配列番号２と同一ではないが同等の生物学的活性を保持する本発明のプロモーターは、変異プロモーターと呼ばれる。本発明のヌクレオチド配列は、天然の配列ならびに組み換え型の両方を含む。
【００２２】
本発明は、単離されているかまたは実質的に精製されている核酸組成物を包含する。本発明の文脈において、「単離されている」または「精製されている」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、そのネイティブの環境とは離れて存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、したがって、天然の産物ではない。単離されているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製形態で存在し得るか、または非ネイティブ環境、例えばトランスジェニック宿主細胞などに存在し得る。例えば、「単離されている」または「精製されている」核酸分子または生物学的に活性があるその一部は、他の細胞性物質を実質的に含まないか、または組み換え技術により生成される場合は培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。ある実施形態において、「単離されている」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にその核酸に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離されている核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。開示されるヌクレオチド配列の断片および変異体も本発明により包含される。「断片」または「一部」は、ヌクレオチド配列の全長または全長未満を意味する。
【００２３】
「核酸」という用語は、糖、リン酸およびプリンもしくはピリミジンのいずれかである塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）からできている、１本鎖または２本鎖形態のいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然のヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸包含する。別段の断りがない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されているそれらの変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明確に指示される配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの第三の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成させることによって達成され得る。「核酸断片」は、ある種の核酸分子の一部である。
【００２４】
「天然の」、「ネイティブ」または「野生型」は、人工的に作製されるものとは区別されるような、天然で見出され得る対象を説明するために使用される。例えば、天然のソースから単離され得、実験室で人の手により意図的に修飾されていない、（ウイルスを含める）生物中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然である。
【００２５】
ベクターおよび発現カセット
ある実施形態において、本発明は、上述のプロモーターを含有するベクターおよび発現カセットを提供する。
ベクター
【００２６】
「ベクター」は、自己伝達性または可動性であり得るかまたはあり得ず、細胞性ゲノムへの組み込みにより原核または真核宿主のいずれかに形質転換可能であり得るかまたは染色体外に存在し得る（例えば複製起点がある自律複製プラスミド）、２本鎖または１本鎖の直鎖状または環状形態の、特に、任意のウイルスベクター、ならびに任意のプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリベクターを含むものと定義される。
【００２７】
細胞において特異的な治療用組成物（例えばタンパク質）を発現させるための特定の発現ベクターの選択および最適化は、１またはそれを超える適切な調節領域（例えば、プロモーター、挿入配列）を有する可能性があるそのタンパク質をコードする核酸配列を得て、そのタンパク質をコードする核酸配列が挿入されるベクターを含むベクターコンストラクトを調製し、インビトロで培養細胞にベクターコンストラクトを遺伝子移入または形質導入し、そのタンパク質が培養細胞中に存在するか否かを決定することによって達成され得る。
【００２８】
細胞遺伝子治療のためのベクターには、ウイルス、例えば複製欠損ウイルスなどが含められる。複製欠損レトロウイルスは、全ビリオンタンパク質の合成を支配可能であるが、感染性粒子を作製することはできない。したがって、これらの遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、培養細胞における核酸配列の高効率形質導入に対する一般的用途および本発明の方法での使用に対する具体的な用途がある。このようなレトロウイルスは、インビボでの細胞への核酸配列の効率の良い形質導入のための用途をさらに有する。レトロウイルスは、核酸物質を細胞に転移させるために広く使用されてきた。複製欠損レトロウイルスを生成させるためのプロトコール（外因性核酸物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドによるパッケージング細胞株の遺伝子移入を行う工程、パッケージング細胞株によって組み換えレトロウイルスの産生を行う工程、ウイルス粒子を組織培養培地から回収する工程、標的細胞にウイルス粒子を感染させる工程を含む）は当技術分野で周知である。
【００２９】
遺伝子治療のためにレトロウイルスを使用することの長所は、ウイルスが標的タンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞ゲノムに挿入し、それによって、その細胞の分裂時に標的タンパク質をコードする核酸配列を細胞の子孫に受け継がせることが可能となることである。ＬＴＲ領域におけるプロモーター配列は、様々な細胞タイプにおいて挿入されるコード配列の発現を促進させ得る。
【００３０】
細胞の形質転換のための発現ベクターとして有用な別のウイルス候補は、アデノウイルス（Ａｄ）であり、これは２本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、例えば筋肉および内皮細胞を含める多岐にわたる細胞タイプにおいて感染性である。アデノウイルスは、３６ｋｂゲノムの２本鎖直鎖状ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスのいくつかの特性ゆえに、アデノウイルスは、インビボ遺伝子送達を促進するなど、治療適用のための導入遺伝子送達ビヒクルとして有用とされている。組み換えアデノウイルスベクターは、肺、脳、膵臓、胆嚢および肝臓を含む様々な臓器の実質細胞への有効なインサイチュ遺伝子移入が可能であることが示されている。これによって、遺伝性の遺伝子疾患、例えば嚢胞性線維症などを処置するための方法におけるこれらのベクターの使用が可能となり、この場合、ベクターが標的臓器に送達され得る。
【００３１】
レトロウイルスのように、アデノウイルスゲノムは、すなわちウイルスそれ自身の産生を調節する遺伝子情報を除去することによって、遺伝子治療用の発現ベクターとしての使用に適応可能となる。アデノウイルスは、染色体外方式で機能するので、組み換えアデノウイルスは、挿入による突然変異誘発の理論的問題がない。
【００３２】
従来から組み換えアデノウイルスを作製するために使用されてきたいくつかのアプローチがある。あるアプローチは、目的の核酸配列を含有する制限エンドヌクレアーゼ断片のアデノウイルスゲノムの一部への直接的ライゲーションを伴う。あるいは、相同組み換えの結果によって、目的核酸配列が欠損アデノウイルスに挿入され得る。所望の組換え体は、補完細胞の菌叢で生成される個々のプラークをスクリーニングすることによって同定される。
【００３３】
適切なベクターの例としては、ＤＮＡウイルス（例えばアデノウイルス）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶまたはマウスモロニーに基づくウイルスベクター、ハーベイ肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＭＰＳＶ由来のウイルスベクターまたはハイブリッドトランスポゾンに基づくベクターが挙げられる。ある実施形態において、ベクターはＡＡＶである。ＡＡＶは、パルボウイルス科ファミリーの小型の非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、これが複製のためにヘルパーウイルスに依存することによって、このファミリーの他のメンバーとは異なる。ＡＡＶのおよそ５ｋｂのゲノムは、＋または−極性のいずれかの１本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折り畳まれ、ウイルスＤＮＡ複製起点となり得る短い末端逆位反復である。物理的に、パルボウイルスビリオンは、エンベロープがなく、その正二十面体キャプシドは直径がおよそ２０ｎｍである。
【００３４】
現在まで、多くの血清学的に区別されるＡＡＶが同定されており、ヒトまたは霊長類から単離されてきた。例えば、ＡＡＶ２のゲノムは、４６８０ヌクレオチド長であり、２個のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含有する。左のＯＲＦは、非構造的Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８をコードし、これらは、１本鎖子孫ゲノムの生成に加えて、複製および転写の制御に関与する。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を保持することも示されている。Ｒｅｐタンパク質は、核局在シグナルならびにいくつかの潜在的なリン酸化部位を保持する。これらのキナーゼ部位のうち１つの突然変異の結果、複製活性が失われた。
【００３５】
ゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製起点となるＴ−型のヘアピン構造に折り畳まれる可能性を有する短い末端逆位反復（ＩＴＲ）である。ＩＴＲ領域内で、ＩＴＲの機能の中心となる２個のエレメント、ＧＡＧＣ反復モチーフおよび末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が記載されている。反復モチーフは、ＩＴＲが直鎖状またはヘアピン立体構造のいずれかである場合、Ｒｅｐに結合することが示されている。この結合は、部位および鎖特異的な方式で起こるｔｒｓにおける切断のためにＲｅｐ６８／７８を配置することに役立つ。ＡＡＶベクターは、広い宿主範囲を保持するなど、遺伝子移入に対する魅力的なベクターとなるいくつかの特性を有し、インビトロおよびインビボで分裂および非分裂細胞の両方を形質導入可能であり、形質導入された遺伝子の高レベル発現を維持することが可能である。
【００３６】
ある実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを指し、天然の野生型ウイルスそれ自身またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別に要求される場合を除き、全てのサブタイプ、血清型および偽型ならびに天然型および組み換え型の両方に及ぶ。本明細書中で使用される場合、「血清型」という用語は、定められた抗血清とのキャプシドタンパク質反応性により同定され、定められた抗血清とのキャプシドタンパク質反応性に基づき他のＡＡＶから区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ１からＡＡＶ８の、８種類の既知の血清型がある。例えば、血清型ＡＡＶ９は、ＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質を含有するＡＡＶおよび同じＡＡＶ９血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを指すために使用される。ある実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９である。
【００３７】
「ｒＡＡＶ」という略語は、組み換えアデノ随伴ウイルスを指し、また、組み換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。ある実施形態において、ＡＡＶ発現ベクターは、転写開始領域を含む調節エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を、転写方向で作動可能に連結されるコンポーネントとして少なくとも提供するために公知の技術を用いて構築される。調節エレメントは、哺乳動物細胞において機能性であるように選択される。作動可能に連結されるコンポーネントを含有する得られるコンストラクトは、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列と隣接する（５’および３’）。
【００３８】
「アデノ随伴ウイルス末端逆位反復」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端で見られる当技術分野で認められている領域を意味する。
【００３９】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むが限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれか由来であり得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されるヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、これらが意図されるように機能する、すなわち宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にする限り、必ずしも同一であるかまたは同じＡＡＶ血清型または分離株由来である必要はない。
【００４０】
治療用組成物をコードする核酸は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）に記載されるものなど、標準的なライゲーション技術を用いて、ＡＡＶベクターへと操作され得る。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ  ＮａＣｌならびに０℃での４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１から０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」ライゲーションの場合）または１４℃での１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３から０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーションの場合）のいずれかにおいて、達成され得る。分子間「粘着末端」ライゲーションは通常、３０から１００μｇ／ｍＬ総ＤＮＡ濃度（５から１００ｎＭ総最終濃度）で行われる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがそこに記載され、これらは、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。
【００４１】
ある実施形態において、アデノ随伴ウイルスは、全長ゲノム、すなわちネイティブゲノムとほぼ同じサイズであり、大きすぎず、小さすぎないものを封入する。ある実施形態において、ＡＡＶは自己相補的ＡＡＶベクターではない。
【００４２】
ウイルスベクターは、異種遺伝子の転写を調節するためのプロモーターをさらに含める。プロモーターは、治療用組成物の転写を調節するための誘導性プロモーターであり得る。発現系は、哺乳動物レシピエントへの投与に適切である。
【００４３】
ある実施形態において、ウイルス粒子が投与される。ウイルス粒子は熱に安定であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨの変化、温度に耐性があり、ＣｓＣｌ勾配上で濃縮され得る。ＡＡＶはいかなる病原性事象も付随せず、ＡＡＶベクターでの形質導入は、細胞増殖または分化においていかなる持続する負の効果を誘導することも見付かっていない。ＩＴＲは、ベクター系を作製するためのウイルス遺伝子の完全なガットレス化（ｇｕｔｔｉｎｇ）を可能にするパッケージングに必要とされる唯一のシスエレメントであることが示されている。
【００４４】
ある実施形態において、本発明は、標的配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現カセットを含有するベクターを提供する。「発現カセット」は、本明細書中で使用される場合、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を支配可能である核酸配列を意味し、これには、終結シグナルに作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターが含められる。コード領域は通常、目的の機能的ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ分子をコードする。目的のヌクレオチド配列を含める発現カセットはキメラであり得る。
【００４５】
本発明のある実施形態は、単離されているＲＮＡｉ分子など、標的分子をコードするベクターを提供する。本明細書中で使用される場合、「によりコードされる」という用語は、特許用語における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、広義で使用される。ＲＮＡｉ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび例えばＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を調整し得るかまたは調整可能である他の低分子ＲＮＡが挙げられる。このような低分子ＲＮＡとしては、ｓｈＲＮＡおよびｍｉｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるがこれに限定されない。
【００４６】
「作動可能に連結される」は、配列のうち１つの機能が別のものにより影響されるような１つの核酸断片における核酸配列の会合を指す。例えば、制御ＤＮＡ配列は、制御ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が位置づけられる（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターの転写調節下にある）場合、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、「作動可能に連結される」かまたは「会合させられる」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続することを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の慣習に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。さらに、酵素をコードする核酸の複数コピーが発現ベクター中で一緒に連結され得る。このような複数の核酸をリンカーにより分離し得る。
【００４７】
「発現」は、細胞における内因性遺伝子または導入遺伝子の転写および／または翻訳を指す。例えば、アンチセンスコンストラクトの場合、発現は、アンチセンスＤＮＡの転写のみを指し得る。さらに、発現は、センス（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまたタンパク質の産生も指し得る。
【００４８】
「発現カセット」は、本明細書中で使用される場合、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を支配可能なＤＮＡ配列であって、終結シグナルに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含むＤＮＡ配列を意味する。これはまた、一般に、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列も含む。コード領域は通常、目的のタンパク質をコードするが、センスまたはアンチセンス方向の、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡもコードし得る。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得、つまり、そのコンポーネントのうち少なくとも１つが、その他のコンポーネントのうち少なくとも１つに対して異種である。発現カセットはまた、天然であるが異種発現に有用な組み換え型で得られているものでもあり得る。このような発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に連結される転写開始領域を含む。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下に置かれる目的の遺伝子の挿入のための複数の制限部位とともに提供され得る。発現カセットは、選択可能マーカー遺伝子をさらに含有し得る。
【００４９】
本開示はまた、本明細書中に記載のベクターを含有する哺乳動物細胞も提供する。細胞はヒトであり得、脳、脾臓、腎臓、肺、心臓または肝臓由来であり得る。細胞タイプは、幹細胞または子孫細胞集団であり得る。
【００５０】
治療用組成物をコードする核酸
本発明は、治療用組成物を投与する方法を提供する。ある実施形態において、治療用組成物は導入遺伝子であり、これは、ベクターが主に由来するレトロウイルスにとって外来性であり、それが投与される生物において有用な生物学的活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子（例えば治療用遺伝子）である。本明細書中で使用される場合、「治療用遺伝子」という用語は、治療効果を提供するために、例えば、疾患を処置するために、細胞において発現が所望される遺伝子を指す。
【００５１】
使用方法
本開示は、上述の単離プロモーターを含有するベクターを投与することによって、遺伝性疾患、例えばハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディー病、アルツハイマー病、ポリグルタミンリピート疾患など、または局限性曝露（ｆｏｃａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を処置する方法を提供する。
【００５２】
本開示のある種の態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクターおよび遺伝子改変細胞（インビボで修飾）およびそれらの使用に関する。特に本開示は、治療剤の治療的有効用量の全身送達の両方が可能である遺伝子またはタンパク質治療のための方法に関する。
【００５３】
ここで本発明を次の非限定実施例により例示する。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
この実験に対して、５種類の異なるポリメラーゼ２プロモーターの活性を分析するために、６名の異なるハンチントン病患者または５名の対照健常個体から得たヒト死後脳組織を使用した。ＲＮＡを抽出し、これらのプロモーターにより産生される内因性ＲＮＡ転写産物の量を測定するために定量的ＰＣＲに供した。発明者らは、ハンチントン病患者の脳において、健常個体と比較した場合、全ての５種類のプロモーターに対して顕著な上方制御を見出した。図１。
【００５５】
６および１１週齢（発症前）および１９週齢（発症後）で野生型およびＨＤマウスを屠殺した。トータルＲＮＡを線条体試料から単離し、リアルタイムＱ−ＰＣＲを用いることによって、マウスＮｆｙｃ、Ｈ２ａｆｙ、Ｕｓｐ３１およびＣｈｏｐ遺伝子の発現を決定した。６および１１週齢では上方制御された遺伝子はなかったが、一方で、１９週齢では、ＮｆｙｃおよびＨ２ａｆｙの発現が顕著に上方制御された。試験したマウス数は１群あたり４匹である。図２Ａ−２Ｃ。
【００５６】
ホタルルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子の上流に各遺伝子プロモーター配列をクローニングした。基本条件でのそれらの転写活性を確認するために、ヒト培養細胞においてこれらのコンストラクトを一過性に発現させた。図３。
【００５７】
添付書類４で示されるプロモーターコンストラクトを対照またはハンチントン病由来培養繊維芽細胞に一過性に遺伝子移入した。発明者らは、ハンチントン病繊維芽細胞において、対照繊維芽細胞と比較した場合、クローニングされた遺伝子プロモーター配列の活性上昇を認めた。図４。
【００５８】
全ての刊行物、特許および特許出願書類が参照により本明細書中に組み込まれる。本発明のある一定の好ましい実施形態と関連させて先述の明細書において本発明を記載し、多くの詳細を説明のために記してきたが、当業者にとって当然のことながら、本発明は、さらなる実施形態が容易に生じ、本明細書中に記載のある一定の詳細が、本発明の基本的な原理から逸脱することなく著しく変更され得る。
【００５９】
「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および本発明を記載する文脈における類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈により明白に否定されない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されたい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の指摘がない限り、制約がない用語（すなわち、「挙げられるが、限定されない。」を意味する。）として解釈されたい。本明細書中での値の範囲の引用は、単に、本明細書中で別段の指示がない限り、その範囲内に入るそれぞれの個別の値を個々に指す省略した方法となるものとし、それぞれの個別の値は、それが個々に本明細書中に引用されていたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈により明白に否定されない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される、ありとあらゆる例または例示的な語（例えば「など」）の使用は、本発明を単により良好に説明するものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲における限定を提示しない。本明細書中の言語はすべて、本発明の実施に必須である何らかの請求されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００６０】
本発明の実施形態は、本発明を実施するための発明者にとって公知の最良の形態を含め、本明細書中に記載される。これらの実施形態の変形物は、先述の記載を読めば、当業者にとって明らかになるであろう。発明者らは、当業者が、適切にこのような変形物を使用することを予想し、発明者らは、本発明に対して、具体的に本明細書中に記載されるものとは別のように実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法令により許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲で引用される主題の全ての改変物および同等物を含める。さらに、全てのその可能な変形物における上述のエレメントのあらゆる組み合わせが、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈により明白に否定されない限り、本発明により包含される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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