(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起種を含むサンプルを走査することによる光学顕微鏡法であって、当該方法は、個々の所定の走査セグメントに対して、
第１の主波長λ1を有する第１光線と、第２の主波長λ2を有する第２光線とを、前記サンプルの部分的にオーバーラップしたエリアのそれぞれの上に方向付けるステップであって、前記第１光線が、単一光子あるいは多重光子の励起モードにおいて、励起種のメンバーを励起状態に励起させるために提供され、前記第２光線が、前記励起状態にある励起されたメンバーの数を減らすために提供される方向付けステップと、
サンプルから来る光信号を検出するステップであって、前記光信号が、前記第１光線によって励起されたメンバーによって放射された主成分と、前記第２光線によって不所望に励起された前記励起種の他のメンバーによって放射されたスプリアス成分とを備え、前記光信号が、Topen及びTcloseの持続時間のそれぞれを有して期間T =Topen+Tcloseを規定する連続する第１時間ゲート及び第２時間ゲートの間に検出され、前記第１時間ゲートが、主成分及びスプリアス成分の両方が存在する時間間隔の間に前記光信号を検出するために設けられ、前記第２時間ゲートが、主成分がゼロになりやすい又はゼロであるがスプリアス成分が存在したままである時間間隔の間に前記光信号を検出するために設けられている検出ステップとを備え、
前記方法は、 
前記スプリアス成分を推定するために、前記第２時間ゲートの間に検出された前記光信号を処理するステップと、
前記第１時間ゲートの間に検出された前記光信号から前記推定したスプリアス成分の推定値を差し引くステップとをさらに備え、
前記第１光線が、前記第１時間ゲートTopenの間に作動して前記第２時間ゲートTcloseの間に遮断され、前記時間ゲート及び前記期間Tが、Topen≫τ、Tclose≫τ及びT≫τである（ここで、τが前記励起状態の平均寿命である）ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記期間Tが(T/τ)≧102である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
所定の走査セグメントのそれぞれに対して、前記光信号が前記期間Tの倍数に等しい滞留時間Tpの間に検出され、前記光信号が前記第１時間ゲート及び前記第２時間ゲートの複数のサイクルの間に検出される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１時間ゲート及び前記第２時間ゲートの持続時間Topen、Tcloseが、Topen≧Tclose。である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
1≦(Topen/Tclose)≦10である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、画像方法に関し、より具体的には、アッベの回折限界よりも下の詳細を解像できる高速超解像度顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現時点までに開発された方法の中で、誘導放出抑制(STED)顕微鏡法は、回折限界よりも下の空間分解能で、蛍光プローブで印をつけられた、サンプル構造の画像を可能にする。
【０００３】
STED顕微鏡法では、励起ビームは、励起ビームによってすでに励起された蛍光性マーカーを誘導放出によって脱励起させることができる第２脱励起ビーム(STEDビームと呼ばれる)上に空間的にオーバーラップしている。STEDビームが少なくとも１つのゼロ強度ポイントを有する(拡散された構成が、中心にゼロ強度ポイントを有するドーナツ・セクションを持ったSTEDビームを使用する)ので、ゼロ強度ポイントに接近する蛍光性マーカーだけが、それらが基底状態に戻るとき、実際に蛍光を放射する(すなわち、自発的に放射する)ことができる。
【０００４】
脱励起ビームの強度が増加する場合、誘導放出によって蛍光性の種を脱励起させる可能性が増加して、蛍光性の種が放射する体積が減少し、回折限界よりも下の寸法に達する。２つの共同整列しているビームが移動して、自発的に放射された蛍光光が記録されるとき、蛍光性の種で印の付けられた興味のある構造が回折限界を超える空間分解能で検出される。
【０００５】
誘導放出によって蛍光性の種を脱励起させる可能性が、STEDビームの強度だけに依存するだけでなく、STEDビームの波長での蛍光プローブの誘導放出プロセスの断面にも依存することに注目することは重要である。誘導放出断面が増加するので、蛍光性の種を脱励起させる可能性も増加する。したがって、誘導放出断面の増加は、与えられた空間分解能を達成するのに必要なSTEDビームの強度の低減に直ちに明示され、それにより、サンプルに対する潜在的な光損傷影響を低減する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vicidomini G等、「放出最大に近い波長を持ったSTED」オプト・エクスプレス、2012年、20巻(5号)、5225-5236頁。
【非特許文献２】Ronzitti E等、(2013年)「変調された励起光を使用するSTED顕微鏡での周波数依存性の検出」、オプト・エクスプレス、21巻(1号)、210-219頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
STED顕微鏡法では、STEDビームの波長は、通常、蛍光性の種の放出ピークの赤色側端の近くにある。好適には、蛍光性の種の放出ピークへSTEDビームの波長を近く移すことは、誘導放出断面を増加させる。しかしながら、放出と励起スペクトルとの間の無視できないオーバーラップのために、このシフトは、直接的にSTEDビームで、基底状態に留まっている蛍光性の種を、励起させる可能性も増加させ、その結果、望ましくないバックグラウンド蛍光を引き起こす。励起ビームによって走査された蛍光性の体積が減少するが、その結果として空間分解能を潜在的に改善して、STEDビームによって生成された蛍光性のバックグラウンドが合計の有効な蛍光性の体積を増加させて、それにより、著しく画像コントラストを損なう。
【０００８】
幸いにも、この望まれない蛍光バックグラウンドは、画像の空間周波数内容を歪めない。そして、特に、それは、画像の有効解像度を変更しない。実際、原画像は、STEDビームによって生成された背景画像を加えて励起ビームによって生成された超解像度標準画像(回折限界よりも下)から成る。したがって、十分な信号対ノイズ比と背景画像の信頼できる分離した記録とを仮定すると、超解像度背景画像は、単に原画像から記録された背景画像を差し引くことにより取り出す（retrieve）ことができる。
【０００９】
所定のSTED波長に対して、望まれないバックグラウンド信号(STEDビームによって生成された)を差し引く可能性が、回折限界よりも下の画像に使用できる可能な蛍光性の種の選択を増加させることは注目されるべきである。上述のように、STEDビームのある波長を仮定して、それは、STEDビームの波長の無視できる励起と、そしてしたがって、STED画像に対して従来からうまく使用できる無視できるバックグラウンドとを持った蛍光性の種だけである。したがって、このバックグラウンドを除去する方法の提供は、スペクトルの制約を蛍光性の種に対して緩和することを可能にして、この方法を多色画像(異なるスペクトルの特性を持った複数の種であって、その各々がサンプル内の異なる構造をマークする)に対して非常に重要にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記を考慮して、この発明は、特に、励起種（excitable species）を含むサンプルの走査による光学顕微鏡法に関し、当該方法は、個々の所定の走査セグメントに対して、
第１の主波長λ1を有する第１光線と、第２の主波長λ2を有する第２光線とを、前記サンプルの部分的にオーバーラップしたエリアのそれぞれに方向付けるステップであって、前記第１光線が、単一光子あるいは多重光子の励起モードにおいて、励起種のメンバー（member）を励起状態に励起させるために提供され、前記第２光線が、前記励起状態にある励起されたメンバーの数を減らすために提供される方向付けステップと、
サンプルから来る光信号を検出するステップであって、前記光信号が、前記第１光線によって励起されたメンバーによって放出された主成分と、前記第２光線によって不所望に励起された前記励起種の他のメンバーによって放出されたスプリアス成分とを備え、前記光信号が、持続時間（duration）Topen及びTcloseのそれぞれを有して期間（period）T =Topen+Tcloseを規定する連続した第１時間ゲート及び第２時間ゲートの間に検出され、前記第１時間ゲートが、主成分及びスプリアス成分の両方が存在する間での時間間隔の間に光信号を検出するために設けられていて、前記第２時間ゲートが、スプリアス成分が存在したままであるが主成分がゼロの傾向にあるかゼロである時間間隔の間に光信号を検出するために設けられている検出ステップとを備え、前記方法は、
前記スプリアス成分の推定（estimate）を抽出（extract）するために、前記第２時間ゲートの間に検出された光信号を処理するステップと、
前記第１時間ゲートの間に検出された光信号からスプリアス成分の前記推定を差し引くステップとをさらに備える。
【００１１】
非特許文献１に記載されたこの種の方法は、前述の時間ゲート(「開」フェーズ及び「閉」フェーズ)を規定するために各パルスレーザーの自然な遮断を使用する。特に、２つの励起パルス間の時間間隔が等しい長さの２つの時間ゲートに分割される。STEDビームは、連続波(CW)モードで、あるいは励起パルスの周波数よりも２倍大きな周波数で作動しなければならない。更に、励起ビームの周波数は、蛍光性の種の励起状態の平均寿命τに基づいて正確に選ばれなければならない。特に、パルス間隔は有効な「開」フェーズ及び「閉」フェーズを提供するのに十分に長くなければならない(所定のフェーズにおいて励起されたほとんどの蛍光プローブは、同じフェーズの間に脱励起しなければならない)。しかし、長いパルス間隔は、蛍光性の種の有用な作動サイクルを低減し、単にノイズを増加させる。したがって、このシナリオに関連して、励起パルスの周波数が蛍光性の種の平均寿命に応じて変化しなければならず、前述の方法を複雑にして柔軟性を無くす。
【００１２】
さらに、蛍光性の種の励起状態の平均寿命τが、ほとんどの場合、数ナノセカンドであるので、前述の既知の方法では、「開」サイクル及び「閉」サイクルは、数十ナノセカンドで完成しなければならない。しかしながら、多くの検出器が数十ナノセカンドのオーダでのデッドタイム(すなわち、或る光子を記録したあと、検出器が別の光子を記録することができない時間)を有する。したがって、光子があらゆる可能性を持って「開」フェーズの間に捕捉されるとき、それに続く「閉」フェーズに検出器に到達する潜在的な光子が記録されない。したがって、差し引かれるバックグラウンドが過小に推定されている。時間相関のある単光子計数法(TCSPC)カードが使用される場合、検出システムのデッドタイムの合計がさらに増加する。更に、問題の方法は、連続波励起ビームに基づいたSTED顕微鏡と適合しない。
【００１３】
非特許文献２に記載されている別の既知の方法は、周波数fで励起ビームを変調するためのパルス発生器と、同じ周波数fに従う蛍光信号を選択的に検出するための(パルス発生器と同期した)ロックイン増幅器とを使用する。励起ビームによって生成された蛍光信号だけが同じ周波数に従うので、STEDビームによって生成された蛍光信号がフィルタリングにより除去される。次に、ロックイン増幅器から得られた信号は、最終画像を形成するためにI/Oカードから集められる。ロックイン増幅器は、変調の「閉」フェーズの間での信号と、変調（modulation）の「開」フェーズの間でのバックグラウンドとの間の差を検出する。走査を制御するパルス発生器及びI/Oカードが独立しているので、走査プロセス及び変調が手動で同期しなければならない。それにより、上述の方法の汎用性が低減する。
【００１４】
更に、ロックイン増幅器は、同じ持続時間（duration）を有する「開」フェーズ及び「閉」フェーズだけが存在して、弱いバックグラウンドの場合に所望の信号の収集を最大限にすることを不可能にすることを仮定する。最後に、ロックイン増幅器は、バックグラウンドからフィルターされた信号だけを供給する。言いかえれば、「開」信号及び「閉」信号は別々にアクセスすることができない。したがって、画像の後処理方法は使用することができない。
【００１５】
この発明の１つの目的は、前述の先行技術の欠点を少なくとも部分的に克服できる光学顕微鏡法を提供することである。
【００１６】
この発明に係る当該目的及び他の目的は、上に規定されたタイプの光学顕微鏡法によって達成される、前記第１光線は、第１時間ゲートTopenでの間に作動して、第２時間ゲートTcloseの間に遮断され、前記時間ゲート及び前記期間Tは、Topen≫τ、Tclose≫τ及びT≫τである。ここで、τが前記励起状態の平均寿命である。
【００１７】
解決に対するこの考えにより、時間間隔で励起される化学種のメンバーが、同じ時間間隔で放射し、さらに、検出装置のデッドタイムと関連した危険性が相当に低減されるということが確実になる。更に、この発明に係る方法は、使用される装置上の制約を除去するか少なくとも低減し、したがって、パルス波あるいは連続波タイプのものが、すべてのSTED顕微鏡構成において適用可能である。
【００１８】
更に、この発明に係る方法は、異なる持続時間を有する「開」時間ゲート及び「閉」時間ゲートの使用を可能にし、これらのフェーズの間に測定されたデータへの別々のアクセスを可能にし、データ処理が遭遇した実験条件による必要条件に適することを可能にする。
【００１９】
この発明は具体的にSTED顕微鏡法の分野で考案されているが、さらに、それは、明らかに、頭字語RESOLFT(可逆的飽和性光学蛍光遷移：REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions)によって共同で引用される、他の超解像度顕微鏡法においても使用される。
【００２０】
この発明に係る方法のさらなる特性及び利点は、限定しない図としてのみで提供される添付図面に関して与えられた、この発明の実施形態の以下の詳細な記載によってより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図のＡ及びＢは、この発明に係る方法の励起ビーム及びSTEDビームの波形のタイミングチャートを示す。
【図２】この発明に係る方法を使用するために設定された（set up）好ましいSTED顕微鏡の概略図である。
【図３】校正サンプル(分解能より相当に下である、40nmの直径の蛍光性のボール)で使用される、提案された方法の例を示す。パネルは、共焦点の方法として知られている従来方式(底パネル)すなわち非アクティブなSTEDビームと、超解像度STED方法(トップのパネル)との間での比較を示す。左から右に、(i) 励起ビームがアクティブである「開」フェーズにおいて記録された信号。(ii) 励起ビームが非活性化（de-activated）であるがSTEDビームがアクティブである「閉」フェーズにおいて記録された信号(励起レーザーが各ピクセルに対してＯＮ・ＯＦＦに切り替えられることに注目すること)。(iii) ２つのフェーズの異なった（differentiated）記録なしで得られている結果をシミュレートするために、２つのフェーズで記録された信号の合計。言いかえれば、トップ・パネルは低コントラストの生のSTED画像を示す。 (iv) 画像のコントラストを回復する（retrieve）ための信号の減算。したがって、トップ・パネルの最後は、提案された方法の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
この発明に係る光学顕微鏡法は、従来の方法において、励起種を、典型的に、励起状態から基底状態に変わるときに蛍光を放射する種を含むサンプルを走査することを提供する。
【００２３】
所定の走査セグメントのそれぞれに対して、方法は、サンプルのそれぞれの部分的にオーバーラップしたエリア上に、第１の主波長λ1を有する第１光線(典型的に励起ビーム)及び第２の主波長λ2を有する第２光線(典型的に脱励起ビーム、具体的にはSTED抑制ビーム)の方向付けを提供する。第１光線は、単一光子励起モードあるいは多重光子励起モードで、励起種のメンバーを励起状態に励起させるために提供され、前記第２光線は、励起状態にある励起されたメンバー（member）の数を減らすために提供される。
【００２４】
以下の記載では、簡易さのために、所定の走査セグメントが走査ピクセルと一致することが仮定されている。しかしながら、この走査セグメントは複数の連続する走査ピクセル、特に全体の走査線を備えてもよい。したがって、この発明は、照明及び検出のサイクルが１つのピクセルよりも長い走査セグメントと関連して、特に走査線と等しい場合にも当てはまる(以下を参照)。
【００２５】
したがって、方法は、サンプルから受け取った光信号の検出を備える。この光信号は、第１光線によって励起されたメンバーから放射された主成分と、第２光線によって不所望に励起された励起しやすい化学種の他のメンバーによって放射されたスプリアス成分(バックグラウンド)とを備える。 
【００２６】
この目的のために、この発明に係る方法は、第２光線(STEDビーム)で蛍光性の種の直接に励起することによって生成された望ましくない(蛍光の)バックグラウンドを信頼性高く推定して続いて差し引くための同期検出システムを利用する。
【００２７】
画像に関連して、同期検出が(下に説明された利点で)ピクセル毎に行なわることに注目することは重要である。図１を参照する。同期検出システムは、励起ビームの周期的な遮断を要求する。言いかえれば、励起ビームは、時間Topen(「開」の時間ゲートあるいはフェーズ)の間にアクティブであり、時間Tclose(「閉」の時間ゲートあるいはフェーズ)の間に遮断される。したがって、f = 1/(Topen+Tclose)及び、T =Topen+Tcloseは、それぞれ、励起ビームの周期的な遮断に使用された矩形波信号の周波数及び期間を表わす。励起ビームの周期的な遮断は、光線を生成するレーザー源、あるいは音響光学変調器(AOM)、高速メカニカル・シャッター、電気・光学モジュレーター(EOM)あるいは音響光学的可変フィルタ(AOTF)のような外部デバイスの変調特性の使用によって達成できる。
【００２８】
サンプルから受信された光信号は、連続した「開」時間ゲート及び「閉」時間ゲートの間に励起ビームのタイミングで同期して検出される。第１の「開」時間ゲートは、光信号の主成分及びスプリアス成分が、両方とも存在する時間間隔の間に光信号を検出するために提供される一方、第２の「閉」時間ゲートは、主成分がゼロになりやすい（tend to）又はゼロでありスプリアス成分が存在したままである時間間隔の間に光信号を検出するために提供される。
【００２９】
ある制約はバックグラウンド蛍光の推定において尊重されなければならない。
(i) 各走査ピクセル上の滞留時間（dwell time）Tpは、期間Tの倍数でなければならない。すなわちTp= aTであり、ここで、a∈[1、2、…、N]である。
(ii) 期間Tは、励起しやすい化学種の励起状態の平均寿命τよりはるかに長くなければならない。その結果、時間間隔(フェーズ)において励起される化学種のメンバーは、同じ時間間隔で放射する。特に、Tは、τよりも少なくとも２桁大きくなければ、言いかえれば(T/τ)≧102であるようになければならない。通常、Tp（実質的にTと同じ桁であるかもしれない）は、τよりも３桁以上大きいので、この特性は容易に得ることができる。
(iii) 「閉」フェーズの持続時間は、「開」フェーズの持続時間と同じであるか短くなければならないが、同じ桁でなければならない。つまり1≦(Topen/Tclose)≦10。「閉」フェーズが(「開」フェーズに対して)短いほど、蛍光性のバックグラウンドの推定は不十分である（poor）。長い「閉」フェーズは、所定時間での所望の信号の収集を最大限にし、それによって獲得を促進する(言いかえれば、ピクセル上の滞留時間を低減する)ために使用されてもよい。
【００３０】
同期検出システムは、２つの異なるカウンタ及び単一の検出器を使用する。両方のカウンタは、信号源と同じ検出器を使用する。検出器は、アナログ(従来の光電子増倍管(PMT))又はディジタル(従来のアバランシェ・フォトダイオード(APD))であってもよい。ディジタルの実施形態では、「ゲート制御された光子計数」として既知のものに基づいて、第１カウンタは、「開」フェーズの間にAPDパルス(光子)をカウントして、したがって、バックグラウンドをプラスした信号を測定する。第２カウンタは、「閉」フェーズの間にAPDパルス(光子)をカウントして、したがってバックグラウンドだけ(あるいは実質的にバックグラウンドだけ)を測定する。「開」フェーズのカウントcopenと「閉」フェーズのカウントccloseとの違い(２つのフェーズ間の時間差の間に可能にするファクタで重み付けされている)は、読み出された（retrieved）信号s = copen−(Topen/Tclose)ccloseである。本願に記述した例において、信号sを取り込む（retrieve）ために、同期検出が、減算を使用し、言いかえれば最も速くて最も自然な手順を使用することは注目されるべきである。しかしながら、値copen及び値ccloseを前提にして（given）、他の多くのロバスト手法(以下を参照)を考案することが可能である。概念の用語において、「ゲート制御された統合」として既知の同様のケースは、或るしきい値識別レベルを超過するPMTパルスだけがカウントされる以外、ゲート制御された（gated）光子計数と同一である。多数のサイクルの場合、すなわち、a>1である場合、移動（move）が次のピクセルになされる前に、データが単に蓄積される。
【００３１】
理論上、この発明は、励起源及びSTED源のタイプにかかわらず、あらゆる既存のSTED顕微鏡に適用することができる。パルスレーザーの場合、励起ビームの遮断の周波数が、「開」フェーズ及び「閉」フェーズが実際に作り出されるように選ばれなければならない。したがって、それは励起ビームのパルス間隔を許容して（with allowance of）選ばれなければならない。特に、それは励起ビームのパルス周波数よりもかなり低いように選ばれなければならない。
【００３２】
ピクセル毎のシステムが蛍光性の化学種のフォトブリーチング又はサンプルのドリフティングのような信号変動の多くの望まれないソースを最小化するので、ピクセル毎のシステムはバックグラウンドに対する実値の推定に対して有用である。同様に、励起ビームの遮断用の周波数fの選択は、「開」フェーズ及び「閉」フェーズ間の信号変動ソースの最小化のための重要なパラメーターである。上述のように、この周波数の選択は、蛍光性の化学種の平均寿命(上限)及びピクセル上の滞留時間(下限)によって制限されている。しかしながら、概して、高周波(しかし期間Tがτよりも大きいような周波数)は、独立して測定されたバックグラウンド(「閉」フェーズ)と、「開」信号でのバックグラウンド寄与(カウントノイズは別にして)との間の差を回避する。高周波が使用されるとき、「開」フェーズ及び「閉」フェーズは、実質的に同時に測定される。したがって、励起ビームの高頻度（high-frequency）の遮断は、レーザー出力、ブリーチング、ドリフティング及び他のファクタでの不安定さにより、多くの望まれない信号をキャンセルする。
【００３３】
通常通り、同期検出システムの効率は、基本的に信号対ノイズ比(SNR)によって制限されている。この発明に係る方法は、(「開」フェーズの間に集められた)蛍光性の光子の総数から、(「閉」フェーズの間に集められた)バックグラウンドを表わす蛍光性の光子の数(Nback)を差し引くことにより、信号を表わす蛍光性の光子の数(Ndes)を見つける。したがって、Ndes>√(Ndes+2Nback)であるか、あるいは、等価に、差し引かれた信号のSNR =Ndes/√(Ndes+2Nback)が>1である場合、所望の蛍光性の信号が取り込まれる。励起ビームの高頻度の遮断によって他のすべてのノイズ源が除外される(この点で、同期検出があらゆるロックイン検出システムと等価である)という仮定に基づいて、この関係が光子のカウントノイズだけを考慮することは注目されるべきである。しかしながら、フェーズが等しくない場合、すなわちTopen/Tclose>1である場合、Nbackの推定の正確さが低下し、したがって実際のSNRが、さらに悪化させるかもしれない。したがって、(所望の蛍光信号Ndesに対して)弱い蛍光性のバックグラウンドNbackがある場合のみ、異なる持続時間のフェーズを使用することは重要である。
【００３４】
様々なデバイス及び方策が、上に提案された方法を実現するために使用されてもよい。最も即時で多目的な実施が、たった１つの入力/出力(I/O)カードを使用する。それは、方法によって要求されるインターフェース機能のすべてを供給する。図２は、この発明に係る方法を使用するためにセットアップされたSTED顕微鏡の可能な例示の実施形態を示す。
【００３５】
第１光源1(特にレーザー源)は、可視域で主波長λ1(例えば532nm)を有する第１光線FBを供給する。第１光源1は、連続波タイプあるいはパルスタイプのものであってもよい。第１光線FBは、分析用サンプル(図示せず)に含まれた励起しやすい化学種のメンバーを励起するために提供された励起ビームである。
【００３６】
音響光学変調器AOMは、遮断周波数（interruption frequency）fを持った第１光線FBを変調するために、第１光源1の後に設けられる。別法として、この変調器は、例えば、電気・光学モジュレーター(EOM)あるいは音響光学的可変フィルタ(AOTF)と置き換えることができる。代替の実施形態(図示されない)では、光源が、それ自身で、変調された励起ビームを生成できる。したがって、別個の（separate）変調器は省略することができる。図示した例において、変調器AOMは、そのオペレーション用のコンピュータ制御されたI/Oカードによって生成された矩形波変調信号を使用する。
【００３７】
RESOLFT法のために通常使用されるタイプの光学系は、分析用サンプルの所定エリアに励起ビームFBを方向付けするように構成されて、このエリアの走査を行ない、サンプルの表面に沿った合焦エリアをシフトするためにさらに設けられている。この光学系は、従来のように、複数のミラー、複数のダイクロイックミラーDM、ガルバノメトリックミラーGM、走査レンズSL、チューブレンズTL、１／４波長板QWP及び対物レンズOLを備えることができる。
【００３８】
第２光源2(特にレーザー源)は、例えば642nmで、第２光線SB(特に脱励起ビーム)を供給する。第２光源2は、連続波タイプあるいはパルスタイプであってもよい。脱励起ビームSBは、前記励起状態にある励起されたメンバーの数を減らすために提供される。代替の実施形態(図示されない)では、異なる波長を生成できる同じ光源によって生成される励起ビーム及び脱励起ビームのために配置する（arrange）ことは可能である。 
【００３９】
図示した例において、ミラー、半波長板HWP、位相マスクPM、位相遅延プレートPP及び上述されている光学系は、すべて、光源2の後に位置決めされる。
【００４０】
この光学系は、分析用のサンプルの所定エリアに脱励起ビームSBを追加的に合焦させるように構成されている。それは、励起ビームFBの合焦エリアと部分的にオーバーラップして、サンプルの表面に沿って後者と一緒に移動することができる。
【００４１】
典型的には、脱励起ビームSBは、サンプル上にドーナツ形のスポットを生成する。このスポットは、励起ビームによって生成されたセンタースポットの周辺部分とオーバーラップする。そのとき、サンプルは、励起ビーム及び脱励起ビームの効果（effect）のオーバーラップによって決定された光信号OSを放射する。典型的には、これは蛍光信号である。前に言及したように、放射された光信号は、サンプルに含まれた励起しやすい化学種と励起ビームFBとの相互作用によって生成された主成分と、脱励起ビームSBによって引き起こされた励起しやすい化学種の望まれない励起によって生成された、強いか弱い強度のスプリアス成分とを備える。
【００４２】
前述の光学系によって、蛍光信号OSは、バンドパスフィルタBPF、色消しダブレットAD及びマルチモード・ファイバーMFを介して、この光信号を受け取って対応する電気的な検出信号を提供するように構成されたアバランシェ・フォトダイオードAPDに伝えられる。アバランシェ・フォトダイオードAPDは、例えば光電子増倍管と置き換えられてもよい。
【００４３】
フォトダイオードによって供給された電気的信号は、I/Oカードを介してコンピューターによって最終的に受け取られる。
【００４４】
上述の構成において、I/Oカードは、周期的に励起ビームを遮断して、２つのカウンタの開閉(「開」フェーズ及び「閉」フェーズのそれぞれの間に)を同期させる矩形波信号を供給する。２つのカウンタは、I/Oカードによって提供される。したがって、外部デバイスを必要としない。各走査ピクセルの端に、I/Oカードは、「開」フェーズ及び「閉」フェーズのそれぞれにおいて集められた光子に比例する２つの値を提供する。追加的に、走査プロセスが、通常、同じI/Oカードによって制御されるので、走査プロセスが時間ゲートの検出システム(カウンタ)と同期することが、直ちに提供される。滞留時間Tpが用途とサンプルによって通常変わるので、これは好都合である。従って、励起ビームの遮断の周波数f及び検出ゲートの同期は、対応して変化しなければならない。このカードが、走査プロセス、励起ビームの遮断及び同期された検出のためのマスターとして働くので、これらのオペレーションのすべてがI/Oカードによって自動的に実行される。
【００４５】
走査プロセスが新しいピクセルに移るたびに、２つの時間ゲートを通してカウントされた信号、すなわち「開」信号及び「閉」信号は、取り出された（retrieved）信号sを生成するために差し引かれる。そして、修復された画像は、リアルタイムで構成される。
【００４６】
同時に、２つのフェーズを表わす２つの画像全体を得ることも可能である。ピクセル毎の減算が画像デコンボリューション・アルゴリズムのようなもっと高度なアルゴリズムと置き換えられるならば、この可能性が非常に有用であろう。減算方法は速く即時であるが、それは基本的にSNRの低減によって制限されて、空間相関（spatial correlation）を可能にしない。「開」フェーズ及び「閉」フェーズのそれぞれを表わす２つの画像の生成によって、近隣のピクセル間の相関を可能にする画像デコンボリューションによってそれらを合体することは可能であり、それにより、SNRを改善する。 
【００４７】
発明者らは、図２に示されるアーキテクチャーを提供するように既存のCW-STEDセットアップに同期検出方法を適用することにより、この発明を実施することができるプロトタイプを開発している。
【００４８】
CW-STEDセットアップでは、励起ビームは、532nmで放射された連続波が光学的にポンピングされた半導体レーザー(OPSL)を放射することにより供給されたが、STEDビームが642nmで放射されたCWファイバーレーザー(カナダのMPBコミュニケイションズ)によって供給された。STEDビームのパスに配置された螺旋状位相（vortex phase）板(米国のRPC Photonics)は、サンプル上でドーナツ形の光分布を形成するのに必要な位相遅延を生成した。励起ビーム及びSTEDビームは、ダイクロイックミラー(ドイツのAHF Analysentechnik)によって組み合わせられ、２つのガルバノメトリック走査ミラー(CTI-Cambridge)によって偏向され、商用走査顕微鏡(ライカTCS SP5、ライカマイクロシステムズ)で使用されるのと同じセットの走査レンズ及びチューブレンズによって対物レンズ(HCX PL APO 100x/1.40-0.70  Oil、ライカマイクロシステムズ)の方に方向付けされた。蛍光は、ダイクロイックミラー(AHF Analysentechnik)及びバンドパス蛍光フィルタ(AHF Analysentechnik)によってデスキャンされる（de-scanned）とともに、反射した励起ビーム及びSTEDビームから分離された。フィルターされた蛍光は、エアリ（Airy）ユニットの直径に対応する小開口径の（stenopaeic）穴として働くマルチモード・ファイバー(ドイツのThorlabs)に合焦された。ファイバーの出力は、単一光子のアバランシェダイオード(SPAD)に接続された。走査及び集めた信号のデータ処理は、FPGAカード(PCI-7833R、米国のナショナルインスツルメンツ)及びインスペクター・ソフトウェア(ドイツのアベリオールインスツルメンツ（Abberior Instruments）)によって制御された。上述の顕微鏡をこの発明を実施可能にする顕微鏡に変換するために、音響光学変調器(フランスのエーエー・オプトエレクトロニック（AA Optoelectronic）)は、励起ビームのパスへ導入され、この変調器は、FPGAカードによって生成された矩形波によって励起ビームを周期的に遮断する。FPGAカードは、「開」フェーズ及び「閉」フェーズの光子をそれぞれカウントする、２つのゲートの同期された開閉を制御した。
【００４９】
図３は、従来のCW-STEDアーキテクチャーに関して、この発明に係る方法を使用することにより得られた改良されたものの例を提供するいくつかの画像を示す。特に、STEDビームに使用された波長での高い励起を特徴とする、40nmの赤い蛍光性ボールが使用された。
【００５０】
上述のように、この発明は、照明及び検出のサイクルが１つのピクセルより長い走査セグメントに関連していて、特に走査線と等しい場合にも当てはまる。この場合、励起ビームの遮断のサイクルは、ピクセル・レベルで起こるのではなく画像ラインレベルで起こるであろう。すなわち、画像のラインが、アクティブなビームの両方で得られる。そして、同じラインが、STEDビームのみを使用して得られる。このポイントでは、ラインの２つの通過（passage）の信号は処理される(特に、差し引かれる)。そして、当該方法は次のラインに移動する。明らかに、各ラインの処理は、同じピクセル上のビームの複数の遮断の場合(a>1)と同じように複数回繰り返される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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