(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１又は式２：【化１】
0006511191.tif 000009
【化２】
0006511191.tif 000010
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記膵炎が慢性膵炎又は急性膵炎である、請求項１に記載の膵炎の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項３】
血清アミラーゼ及びリパーゼの活性を特徴的に減少させる、請求項１又は２に記載の膵炎の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項４】
ＩＬ−１β又はＭＣＰ−１の発現を特徴的に阻害する、請求項１〜３のいずれかに記載の膵炎の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項５】
下記の式１：【化３】
0006511191.tif 000011
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患の予防又は治療用医薬組成物であって、前記膵炎媒介疾患が、肺損傷、敗血症、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患である、組成物。
【請求項６】
下記の式１又は式２：【化４】
0006511191.tif 000012
【化５】
0006511191.tif 000013
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎の予防又は改善用健康機能食品。
【請求項７】
下記の式１：【化６】
0006511191.tif 000014
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患の予防又は改善用健康機能食品であって、前記膵炎媒介疾患が、肺損傷、敗血症、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患である、食品。
【請求項８】
下記の式２：【化７】
0006511191.tif 000015
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患の予防又は治療用医薬組成物であって、前記膵炎媒介疾患が、肺損傷、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患である、組成物。
【請求項９】
下記の式２：【化８】
0006511191.tif 000016
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患の予防又は改善用健康機能食品であって、前記膵炎媒介疾患が、肺損傷、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患である、食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、若しくは異性体を有効成分として含む、膵炎を予防及び治療する医薬組成物、又は同様に含む、膵炎を予防及び改善する健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、長さ１３ｃｍ及び重量約１００ｇの長く平らな臓器である。膵臓は、後腹膜中、胃の下、臍上部の深くに位置する。膵臓の重要な役割は、食物の消化及び吸収に必要な消化酵素を分泌するための外分泌機能、並びに糖を調節するインスリンのようなｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を調節するためのホルモン分泌に関与する内分泌機能の２つである。
【０００３】
膵炎は、膵臓における炎症によって発症される疾患であり、急性膵炎及び慢性膵炎に分けられる。膵液は、アミラーゼ（炭水化物を加水分解する）、トリプシン（タンパク質を加水分解する）及びリパーゼ（脂肪を加水分解する）のような消化酵素を含む。膵液がアルコール乱用及び胆石等によってスムーズに流れないことで、上記酵素によって膵臓の自己消化が誘導されると膵炎を発症する。一般に、膵臓の周りの間質性浮腫及び膵周囲脂肪壊死が付随する軽症型膵炎、並びに広範囲の膵周囲及び膵内の脂肪壊死、膵実質壊死及び出血が付随する重症型膵炎の２種類の膵炎がある（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
膵炎は、アルコール乱用及び胆石によって引き起こされる胆道疾患のみならず、代謝障害、薬物及び腹部損傷等を含む、様々な他の理由によっても発症される。膵炎は、膵腺房細胞の損傷、広範囲な間質性浮腫、出血、及び傷害部位への好中性顆粒球の遊走を引き起こす炎症性疾患である。膵炎患者のおよそ２０％は、膵臓壊死及び傷害等の多臓器不全及び全身の合併症を含む、およそ３０％の高い死亡率を伴う重篤な臨床経過をたどる。膵炎の正確な病態生理学の機構は明らかにされていないが、膵臓中のプロテアーゼ前駆物質の早期活性化によって引き起こされる自己消化プロセスであると考えられる。すなわち、消化酵素が膵腺房細胞において異常に早く活性化されると、膵腺房自体が消化され、その結果、炎症が生じて膵臓組織の分離及び壊死を引き起こす。最近、膵腺房細胞の傷害後に膵臓へ浸潤する活性化マクロファージが、組織損傷に対する応答として、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の分泌を誘導することが報告され、炎症細胞の循環、膵臓の浮腫及び実際の膵臓破壊にマクロファージが重要な役割を果たすことが示唆された。
【０００５】
急性膵炎の進行を、局所炎症反応、１つの臓器又は多臓器の不全を引き起こす全身炎症反応、及び膵臓への腸内細菌の移入による炎症の３期に分けることができる。初期の膵炎の病態生理学的機構はまだ明らかにされていない。しかしながら、マクロファージが膵腺房細胞の損傷後に膵臓へ移動し、組織損傷に応答してサイトカイン（ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α））の分泌を誘導することが最近わかった。上記サイトカインは、炎症細胞の循環、膵臓の浮腫及び実際の膵臓破壊に重要な役割を果たす。急性膵炎患者の血清では、サイトカインの増加が観察される。この増加は、膵臓壊死、全身炎症反応、多臓器不全等の合併症を伴う症例において著しく高い。
【０００６】
膵炎の重症度を緩和し、様々な臓器における合併症の発症を阻害するためいくつかの実験的な治療方法が提案された。しかしながら、これらの実験的な治療方法を患者に適用しても、効果はそれほど大きくないことから、これまで膵炎の予防及び治療に関して認可された薬物はない。
【０００７】
一方で、ナフトキノン系化合物は、いくつかの医薬組成物の有効成分として知られている。それらのうち、β−ラパコン（β-lapachone）は南アメリカに生育するラパチョツリー（laphacho tree）（タベブイア・アベラネダエ）（Tabebuia avellanedae）から得られ、ズンニオン（dunnione）及びアルファ−ズンニオンは南アメリカに生育するストレプトカーパス・ズンニイ（Streptocarpus dunnii）の葉から得られる。かかる天然の三環式ナフトキノン誘導体は抗癌剤として、また南アメリカで最も代表的な風土病のうちの１つであるシャガス病（Chagas disease）の治療に対して長く使用されており、その作用が優れていることは証明されている。抗癌剤としての上記の化合物の薬理学的活性は西側世界に知られて以来、人々の注意を引き、その後、特許文献１に記載されるように、これらの三環式ナフトキノン誘導体は多くの研究グループによって様々な種類の抗癌剤として開発されている。それにもかかわらず、これらのナフトキノン系化合物が膵炎を治療するのに有効であるという報告はない。
【０００８】
したがって、本発明者らは、膵炎の予防及び治療において有効な材料を見つけ出すことを試みてきた。本発明者らは、研究の過程で、ナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンが、膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素（アミラーゼ及びリパーゼ）の活性亢進を減少させ、サイトカイン（ＩＬ−１β（インターロイキン−１β）及びＭＣＰ−１）の発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害する可能性があることを確認し、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体が膵炎を予防及び治療する組成物として有効に使用され得ることを証明することによって本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，９６９，２６３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bank PA., Am. J. gastroenterol., 89, pp151-152, 1994.
【非特許文献２】Bradley EL., Arch. Surg., 128, pp586-590, 1993.
【非特許文献３】Kim, C. H., Korean Journal of Gastroenterology, 46, pp321-332, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎を予防及び治療する医薬組成物を提供することは、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を実現するために、本発明は、下記の式１又は式２：
【化１】
0006511191.tif 000002
【化２】
0006511191.tif 000003
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎を予防及び治療する医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、式１又は式２によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患を予防及び治療する医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、式１又は式２によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎を予防及び改善する健康機能食品を更に提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、式１又は式２によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患を予防及び改善する健康機能食品を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を含む、膵炎を予防及び治療する組成物に関する。特に、ナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンは、膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素（アミラーゼ及びリパーゼ）の活性亢進を減少させ、サイトカイン（ＩＬ−１β（インターロイキン−１β）及びＭＣＰ−１）の発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫、及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害することができる。したがって、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を、膵炎を予防及び治療する組成物として有効に使用することができる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態の応用は、添付の図面を参照することによって最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】体重に対する膵重量の比の測定結果を示す図である。＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、及び、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較、又はセルレイン処理群とズンニオン処理群との比較。
【図２】血清中のアミラーゼ及びリパーゼの活性の測定結果を示す図である。＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、及び、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較、又はセルレイン処理群とズンニオン処理群との比較。
【図３】血清中のＩＬ−１β（インターロイキン−１β）の濃度、及び膵臓におけるＩＬ−１βの発現の測定結果を示す図である。＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、及び、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較、又はセルレイン処理群とズンニオン処理群との比較。
【図４】膵臓におけるＭＣＰ−１の発現の測定結果を示す図である。＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、及び、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較、又はセルレイン処理群とズンニオン処理群との比較。
【図５】Ｃ５７／ＢＬ６マウスの膵臓組織の形態学的変化を示す写真、及び組織学スコアとして変化を提示するグラフのセットである。Ｃｏｎｔ：正常群、ＣＡＥ：セルレイン処理群、β−Ｌａｐ：β−ラパコン処理群、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  １０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ２０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ４０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、ズンニオン：ズンニオン処理群、ＣＡＥ＋ズンニオン  １０：セルレイン及びズンニオン処理群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋ズンニオン  ２０：セルレイン及びズンニオン処理群（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋ズンニオン  ４０：セルレイン及びズンニオン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、並びに、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較、又はセルレイン処理群とズンニオン処理群との比較。
【図６】ＮＱＯ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける膵臓組織の形態学的変化を示す写真、及び組織学スコアとして変化を提示するグラフのセットである。Ｃｏｎｔ：正常群、ＣＡＥ：セルレイン処理群、β−Ｌａｐ  ４０：β−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ４０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、並びに、ＮＳ：有意差なし（Non-significant）、セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較。
【図７】ＮＱＯ１ノックアウトマウスの体重に対する膵重量の比、血清中のアミラーゼ及びリパーゼの活性、並びに血清中のＩＬ−１βの濃度を示す図である。＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、及び、ＮＳ：有意差なし、セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較。
【図８】膵炎を治療するためのβ−ラパコンの投与によって引き起こされた膵臓組織の形態学的変化を示す写真、及び組織学スコアとして変化を提示するグラフのセットである。Ｃｏｎｔ：正常群、ＣＡＥ：セルレイン処理群、β−Ｌａｐ  ４０：β−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  １０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ２０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ４０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）、＃ｐ＜０．０５：正常対照群とセルレイン処理群との比較、並びに、＊ｐ＜０．０５：セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との比較。
【図９】Ｃ５７／ＢＬ６マウス及びＮＱＯ１ノックアウトマウスにおいてβ−ラパコンによって誘導された肺組織の形態学的変化を示す写真である。Ｃｏｎｔ：正常群、ＣＡＥ：セルレイン処理群、β−Ｌａｐ：β−ラパコン処理群、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  １０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ２０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（２０ｍｇ／ｋｇ）、並びに、ＣＡＥ＋β−Ｌａｐ  ４０：セルレイン及びβ−ラパコン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）。
【図１０】Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてズンニオンによって誘導された肺組織の形態学的変化を示す写真である。Ｃｏｎｔ：正常群、ＣＡＥ：セルレイン処理群、ズンニオン：ズンニオン処理群、ＣＡＥ＋ズンニオン  １０：セルレイン及びズンニオン処理群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＥ＋ズンニオン  ２０：セルレイン及びズンニオン処理群（２０ｍｇ／ｋｇ）、並びに、ＣＡＥ＋ズンニオン  ４０：セルレイン及びズンニオン処理群（４０ｍｇ／ｋｇ）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、１時間の間隔でセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を６回腹腔内投与することにより、マウスにおいて膵炎を誘導した。膵炎動物モデルを作製するためのセルレイン投与の前日にマウスにβ−ラパコン（β−Ｌａｐ）及びズンニオンをマウスに経口投与した。膵臓の重量を測定し、体重による膵重量の比率を計算した。その結果、セルレイン処理群の膵重量／体重比は、対照群のものと比較して有意に増加されたのに対し、β−ラパコン及びズンニオン処理群の膵重量／体重比は用量依存的に有意に減少された（図１を参照されたい）。
【００２１】
本発明者らは、膵臓細胞で合成され、分泌される消化酵素であるアミラーゼ及びリパーゼの活性を調査した。その結果、血清中のアミラーゼ及びリパーゼの活性レベルはいずれも正常対照群よりセルレイン処理群においてより高かったのに対し、該活性はβ−ラパコン処理群及びズンニオン処理群において用量依存的に有意に減少された（図２を参照されたい）。膵炎と関連するサイトカインであるＩＬ−１β及びＭＣＰ−１の発現も調査した。その結果、ＩＬ−１β及びＭＣＰ−１の発現、並びに血清中のＩＬ−１βの濃度は、セルレイン処理群においていずれも非常に高かったのに対し、β−ラパコン処理群及びズンニオン処理群では用量依存的に発現が減少された（図３及び図４を参照されたい）。膵臓組織の形態学的変化も調査した。その結果、浮腫、炎症及び壊死が、セルレイン処理群の膵臓組織で観察された。しかしながら、これらの現象は、β−ラパコン処理群及びズンニオン処理群では用量依存的に阻害された（図５を参照されたい）。
【００２２】
β−ラパコンの保護効果がＮＱＯ１酵素の経路に起因するかどうかを確認するため、ＮＱＯ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける膵臓組織の形態学的変化、膵臓の重量、血清中のアミラーゼ及びリパーゼの活性、並びに血清中のＩＬ−１βの濃度を調査した。その結果、セルレイン処理群とβ−ラパコン処理群との間に有意差はなかった（図６及び図７を参照されたい）。セルレインの最終投与から６時間後にβ−ラパコンを静脈内注射して、セルレイン誘導性膵炎に対するβ−ラパコンの治療効果を確認した。その結果、浮腫、炎症及び細胞壊死がセルレイン処理群の膵臓組織で観察された。しかしながら、これらの現象はβ−ラパコン処理群では阻害された（図８を参照されたい）。
【００２３】
また、本発明者らは、膵炎によって引き起こされる肺損傷に対するナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンの保護効果を調査した。その結果、セルレインによって引き起こされる肺損傷は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてβ−ラパコンとの同時処理によって用量依存的に抑制された。しかしながら、ＮＱＯ１ノックアウトマウスでは、β−ラパコンとの同時処理であっても、肺を損傷から保護することはできなかった（図９を参照されたい）。一方、セルレインによって引き起こされる肺損傷は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてズンニオンとの同時処理によって有意に阻害された（図１０を参照されたい）。上記の結果に基づいて、ＮＱＯ−１を介する様々な炎症反応を調節することにより、セルレインによって誘導される膵炎及び膵炎に関連する肺損傷が抑制され得ることを確認した。
【００２４】
したがって、本発明者らは、ナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンが膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素の活性亢進を減少させ、サイトカインの発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害し得ることを確認した。したがって、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、膵炎を予防及び治療する組成物の有効成分として有効に使用することができる。
【００２５】
本発明のナフトキノン系化合物を、薬学的に許容可能な塩の形態として使用することができ、ここで、該塩は、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成される酸付加塩であることが好ましい。本明細書において、酸付加塩を、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸及び亜リン酸等の無機酸；脂肪族モノ／ジカルボキシレート、フェニル置換アルカノエート、ヒドロキシアルカノエート、アルカンジオエート（alkandioate）、芳香族酸、及び脂肪族／芳香族スルホン酸等の毒性のない有機酸；又は酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、酒石酸及びフマル酸等の有機酸から得ることができる。薬学的に毒性のない塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオラート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキサン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、及びマンデル酸塩により例示される。
【００２６】
本発明において酸付加塩を、当業者に知られている従来の方法によって作製することができる。例えば、本発明のナフトキノン系化合物をメタノール、エタノール、アセトン、塩化メチレン、又はアセトニトリル等の有機溶媒中に溶解し、そこに有機酸又は無機酸を添加して沈殿を誘導する。その後、沈殿物を濾過し、乾燥して塩を得る。或いは、同量のナフトキノン系化合物と酸又はアルコールとを水中で加熱した後、混合物を蒸発させ、乾燥させるか、又は沈殿した塩を吸引濾過して塩を得た。
【００２７】
薬学的に許容可能な金属塩を、塩基を使用して作製することができる。アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩は以下の工程によって得られる：過剰なアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物の溶液中に化合物を溶解し、不溶性化合物塩を濾過し、残留する溶液を蒸発させ、それを乾燥させる。この時、金属塩は、ナトリウム、カリウム又はカルシウムの塩の薬学的に好適な形態で作製されることが好ましい。また、対応する銀塩は、適切な銀塩（例えば、硝酸銀）と、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩との反応によって作製される。
【００２８】
本発明は、本発明のナフトキノン系化合物だけでなく、その薬学的に許容可能な塩、及びそれから生成され得る溶媒和物、水和物又は光学異性体も含む。
【００２９】
本発明において付加塩を、当業者に知られている従来の方法によって作製することができる。例えば、本発明のナフトキノン系化合物をアセトン、メタノール、エタノール、又はアセトニトリル等の水混和性有機溶媒に溶解し、そこに過剰な有機酸又は無機酸の酸水溶液を添加して沈澱又は結晶化を誘導する。その後、溶媒又は過剰な酸を上記混合物から蒸発させた後、該混合物を乾燥させて付加塩を得るか、又は沈殿した塩を吸引濾過して付加塩を得る。
【００３０】
ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を有効成分として含む本発明の医薬組成物を、経口的に又は非経口的に投与することができ、医薬製剤の一般的な形態で使用され得るが、必ずしもそれらに限定されない。
【００３１】
経口投与用の製剤は、錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、溶液、懸濁液、乳剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤、及びトローチ等によって例示される。これらの製剤は、有効成分に加えて、希釈剤（例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、及び／又はグリシン）、及び滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウムの塩、及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。錠剤は、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、澱粉糊、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン等の結合剤を含んでもよく、また必要に応じて、デンプン、アガロース、アルギン酸若しくはそのナトリウム塩等の崩壊剤、又は共沸混合物及び／又は吸収剤、着色剤、香料及び甘味料を更にそこに含んでもよい。
【００３２】
ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を有効成分として含む本発明の医薬組成物を非経口的に投与することができ、非経口投与として、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、及び胸腔内注射が挙げられる。非経口投与用の製剤として組成物を作製するため、本発明のナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、安定剤又は緩衝剤と混合して、溶液又は懸濁液を作製した後、アンプル又はバイアルとして製剤化する。本明細書では組成物を殺菌することができ、防腐剤、安定剤、水和剤又は乳化剤、浸透圧の調整のための塩及び／又はバッファー、並びに他の治療的に有用な物質を更に含んでもよく、該組成物を従来の混合、造粒、又はコーティングの方法によって製剤化することができる。
【００３３】
本発明の組成物の有効投薬量は、患者の年齢、体重、及び性別、投与経路、健康状態、疾患の重症度等に応じて調整され得る。例えば、有効投薬量は体重６０ｋｇの成人患者に対して０．００１ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日であって、これを一日に１回〜数回投与することができ、又は上記投薬量を医師又は薬剤師の判断によって一定間隔で１日当たり数回に分けて投与することができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、医薬の形態に応じて変更可能な０．０１重量％〜１００重量％の濃度でナフトキノン系化合物を含む。
【００３５】
本発明はまた、式１又は式２によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患を予防及び治療する医薬組成物を提供する。
【００３６】
本明細書において膵炎媒介疾患は、肺損傷、敗血症、腎不全、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患であるのが好ましい。
【００３７】
本発明のナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンが、膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素の活性亢進を減少させ、サイトカインの発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害することを確認した。したがって、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、膵炎を予防及び治療する組成物の有効成分として有効に使用することができる。
【００３８】
本発明は、式１又は式２：
【化３】
0006511191.tif 000004
【化４】
0006511191.tif 000005
によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎を予防及び改善する健康機能食品を更に提供する。
【００３９】
上記膵炎は、慢性膵炎又は急性膵炎が好ましい。
【００４０】
上記健康機能食品は、食品学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含むことが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。
【００４１】
本発明のナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンが、膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素の活性亢進を減少させ、サイトカインの発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害することを確認した。したがって、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、膵炎を予防及び改善する健康機能食品の有効成分として有効に使用することができる。
【００４２】
上に言及される膵炎の予防及び改善に使用されるように、本発明のナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、食品学又は薬学の分野の当業者に知られる様々な方法によって作製することができる。上記ナフトキノン系化合物を、そのまま調製してもよく、又は食品学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤とそれらを混合することによって、経口摂取が可能な任意の食物形態へ加工してもよい。上記ナフトキノン系化合物は、飲料、丸剤、顆粒剤、錠剤、又はカプセル剤の形態に調製し得ることが好ましい。
【００４３】
本発明の健康機能食品は、食品製品の製造過程に一般に添加され得る任意の食品学的に許容可能な成分を更に含んでもよい。例えば、本発明のナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体が、飲料として調製される場合、クエン酸、液体フルクトース、糖、グルコース、酢酸、リンゴ酸及び果汁からなる群から選択される１以上の成分をそれに添加してもよい。
【００４４】
健康機能食品に添加される本発明の有効成分の量は、膵炎を予防及び改善する標的被験体の年齢、性別、体重、健康状態又は疾患状態に応じて調整可能であり、望ましい投薬量は（成人に対して）１日当たり０．０１ｇ〜１０．０ｇである。この投薬量は、本発明の健康機能食品が膵炎に対して予防及び改善の効果をもたらすのに有効である。
【００４５】
本発明による健康機能食品の調製において、該健康機能食品は、健康機能食品の形態に応じて変更可能な０．０１重量％〜１００重量％の濃度でナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を含んでもよい。
【００４６】
さらに、本発明は、式１又は式２によって表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物、又は異性体を有効成分として含む、膵炎媒介疾患を予防及び改善する健康機能食品を提供する。
【００４７】
本明細書において膵炎媒介疾患は、肺損傷、敗血症、腎不全、胸水、多臓器不全、及び多臓器損傷からなる群から選択される１以上の疾患であることが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。
【００４８】
本発明のナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンは、膵炎によって増加される膵重量／体重比を減少させ、消化酵素の活性亢進を減少させ、サイトカインの発現を減少させ、膵臓組織の炎症、浮腫及び細胞壊死を軽減又は阻害し、膵炎によって引き起こされる肺損傷を阻害することを確認した。したがって、ナフトキノン系化合物、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、溶媒和物又は異性体を、膵炎媒介疾患を予防及び改善する健康機能食品の有効成分として有効に使用することができる。
【００４９】
以下の実施例に示すように、本発明の実際に現在好ましい実施形態を説明する。
【００５０】
しかし、当業者であれば、本開示を考慮した上で本発明の趣旨及び範囲内の変更及び改善をなし得ることが理解されるだろう。
【実施例】
【００５１】
実施例１：β−ラパコンの合成
β−ラパコンはラパチョツリーから比較的小量で得られるが、β−ラパコン合成の原料であるラパコールはラパチョツリーから比較的大量に得られる。したがって、ラパコンを使用することによりβ−ラパコンを合成する方法がずっと以前に開発された。該方法によれば、ラパコールと硫酸とを混合し、室温で該混合物を勢いよく撹拌することによって、比較的良好な収率でβ−ラパコンを得ることができる。
【００５２】
本実施例では、ラパコールを合成するため、ＤＭＳＯ（１２０ｍｌ）に２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（１７．４ｇ、０．１０Ｍ）を溶解し、それにＬｉＨ（０．８８ｇ、０．１１Ｍ）を徐々に添加した。この時、水素を生成する可能性があり、注意深く見なければならなかった。反応溶液の撹拌中に、水素の発生が観察されなくなったら混合物を更に３０分間撹拌し、それにプレニル臭化物（１−ブロモ−３−メチル−２−ブテン、１５．９ｇ、０．１０Ｍ）、及びＬｉＩ（３．３５ｇ、０．０２５Ｍ）を徐々に添加した。その後、反応溶液を４５℃に加熱した後、１２時間、勢いよく撹拌した。反応溶液を１０℃以下まで冷却し、それに氷（７６ｇ）を添加した後、段階的に水（２５０ｍｌ）を添加した。濃塩酸（２５ｍｌ）を徐々に添加することによって、反応溶液を酸性（ｐＨ１）に維持した。ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）を反応混合物に添加した後、勢いよく撹拌した。その結果、ＥｔＯＡｃに溶解しなかった白色固体が生成された。得られた白色固体を濾過し、ＥｔＯＡｃ層を分離した。水層を再びＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を使用して抽出し、それを先に抽出した有機層と混合した。有機層を５％ＮａＨＣＯ３（１５０ｍｌ）で洗浄した後、濃縮した。濃縮物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）に溶解した後、２ＮのＮａＯＨ（７０ｍｌ）を使用して、勢いよく撹拌しながら分離した。ＣＨ２Ｃｌ２層を、２ＮのＮａＯＨ水溶液（７０ｍｌを２回）の使用により２度分離した。分離した溶液を合わせ、濃ＨＣｌを使用して混合溶液のｐＨをｐＨ２に調整した。その後、固体がそこに生成され、それを濾過によって分離した。その結果、ラパコールを得た。得られたラパコールを、７５％ＥｔＯＨを使用して再結晶化させた。該混合物を硫酸（８０ｍｌ）と共に、室温で１０分間勢いよく撹拌し、そこに氷（２００ｇ）を投入し、反応を止めた。
【００５３】
上記のプロセスを下記式で表すことができる。
【化５】
0006511191.tif 000006
【００５４】
次に、ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍｌ）をそれに添加した後、該混合物を勢いよく撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２層を分離し、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）で再度抽出した後、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄した。抽出した水層を先に抽出した有機層と混合した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、濃縮し、その結果、不純β−ラパコンを得た。得られた不純β−ラパコンを、イソプロパノールを使用して再結晶化した。その結果、純粋なβ−ラパコン（８．３７ｇ）を得た。
【００５５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：８．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，８Ｈｚ）、７．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，８Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１，８Ｈｚ）、７．５０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１，８Ｈｚ）、２．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、１．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）１．４７（６Ｈ，ｓ）。
【００５６】
実施例２：ズンニオンの合成
実施例１でラパコールの生成の間に分離されたＥｔＯＡｃに溶けなかった固体は、Ｏ−アルキル化２−プレニルオキシ−１，４−マフトキノンであり、Ｃアルキル化ラパコールとは異なる物質であった。得られたＯ−アルキル化２−プレニルオキシ−１，４−マフトキノンを精製するため再度ＥｔＯＡｃを使用して再結晶化した。精製した固体（３．６５ｇ、０．０１５Ｍ）をトルエンに溶解した後、５時間に亘って還流して、クライゼン転位を誘導した。トルエンを減圧蒸留によって濃縮し、それ以上精製工程を行わずにそれを硫酸（１５ｍｌ）と混合した後、室温で１０分間勢いよく撹拌した。そこに氷（１００ｇ）を添加して反応を止めた。そこに反応物としてＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を添加した後、該混合物を勢いよく撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２層を分離し、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）で再度抽出した後、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄した。抽出した水層を先に抽出した有機層と混合した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、濃縮し、続けてシリカゲルクロマトグラフィーを行った。その結果、純粋なズンニオン（２．３２ｇ）が得られた。
【００５７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：８．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．５６（１Ｈ，ｍ）、４．６７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ）、１．４７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）、１．４５（３Ｈ，ｓ）１．２７（３Ｈ，ｓ）。
【００５８】
実施例３：α−ズンニオンの合成
実施例２で精製された２−プレニルオキシ−１，４−マフトキノン（４．８ｇ、０．０２０Ｍ）をキシレンに溶解した後、１５時間に亘って還流した。クライゼン転位を、実施例１のものより長時間、より高温で誘導した。このプロセスでは、２つのメチル基のうちの１つが移動したラパコール誘導体とのクライゼン転位及び環化反応が遂行され、α−ズンニオンを得た。その後、キシレンを減圧蒸留によって濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィーを行った。その結果、純粋なα−ズンニオン（１．６５ｇ）を得た。
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．６４（２Ｈ，ｍ）、７．５７（１Ｈ，ｍ）、３．２１（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ）、１．５３（３Ｈ，ｓ）、１．５１（３Ｈ，ｓ）１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【００６０】
実験例１：膵炎動物モデルの作製
本発明では、体重２２±２ｇのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。全てのマウスを、一定温度（２２℃〜２６℃）及び湿度（５５％〜６０％）の無菌動物実験室で育てた。マウスを通常の固形飼料（Samtaco Korea）及び水を給餌しながら１週間に亘って順応させた。全ての実験は、円光大学によって設定された実験動物の取り扱い及び使用に対する指針に従って行われた。膵炎を誘導する多くの方法のなかでも、優れた再現性及び経済的実現可能性により、セルレイン媒介膵炎モデルは最も一般的な動物モデルであることから、この動物モデルは、多くの研究グループによって、特に該疾患の発症機構に関して比較的よく研究されている。正常群以外の全ての実験動物について、実験の１６時間前から飼料の供給を停止し、その時からセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を１時間の間隔で６回、腹腔内投与して膵炎を誘導した。セルレイン投与の前日、セルレイン媒介膵炎に対するβ−ラパコン及びズンニオンの予防効果を調査するため、β−ラパコン（β−Ｌａｐ）及びズンニオンを経口投与した。１時間の間隔で６回のセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって膵炎を誘導した後、最終セルレイン投与の６時間後、β−ラパコンを静脈内注射し、続いてセルレイン媒介膵炎に対するβ−ラパコンの治療効果を調査した。
【００６１】
実験例２：β−ラパコン及びズンニオンによる膵重量の減少
膵炎が発症すると、膵臓の重量は浮腫のため増加することが知られている。したがって、実験を終了した全ての動物から採血した後、体重に対する膵重量の比を測定した。
【００６２】
特に、膵炎を誘導するためにセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）が投与された、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルを、種々の濃度（０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ）のβ−ラパコン及びズンニオンで処理した。採血の後、膵臓を切り取り、体重に対する膵臓の重量を、グラディ法（Grady method）の膵重量（湿膵重量）／体重（湿体重）の式によって測定した。
【００６３】
その結果、図１に示されるように、膵重量／体重比は、セルレイン処理群では有意に増加した。一方、β−ラパコン又はズンニオンの処理群では、膵重量／体重比は、用量依存的に有意に減少された（図１）。
【００６４】
実験例３：消化酵素活性に対するβ−ラパコン及びズンニオンの阻害効果
膵臓はタンパク質を最も活発に合成する臓器であり、そのため１日当たり６ｍｇ〜２０ｍｇの消化性タンパク質を合成し、分泌する。これらの消化酵素は、強力なタンパク質分解活性を有することから、膵臓の自己消化を防止するため様々な安全システムが膵腺房細胞ではたらいている。膵炎は、通常は不活性前駆物質として膵臓細胞において合成され分泌される消化酵素が、異常に早く活性化される場合に誘導される膵臓の自己消化によって生じる。したがって、本発明者らは、血清中のアミラーゼ及びリパーゼの活性を調査した。
【００６５】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルを、実験例２に記載されるのと同じ方法によって、β−ラパコン又はズンニオンで処理した後、セルレインを投与した。血清を得た後、アミラーゼ及びリパーゼの活性を調査するため、アミラーゼ活性分析キット（ＤＡＭＹ−１００、米国BioAssay Systems）及びリパーゼ活性分析キット（ＤＬＰＳ−１００、米国BioAssay Systems）を使用して、ＯＤ５９５及びＯＤ４１２を測定した。
【００６６】
その結果、図２に示されるように、正常群（１１６８±２１５．０Ｕ／Ｌ）と比較して、アミラーゼ活性はセルレイン処理群（１７００±１０６．４Ｕ／Ｌ）で有意に増加した。また、リパーゼ活性は、正常群よりもセルレイン処理群において約３０％高かった。β−ラパコン又はズンニオンで処理した群では、アミラーゼ活性及びリパーゼ活性は用量依存的に有意に減少された（図２）。
【００６７】
実験例４：炎症メディエーターの発現に対するβ−ラパコン及びズンニオンの阻害効果
＜４−１＞ＩＬ−１βの発現に対するβ−ラパコン及びズンニオンの阻害効果
膵炎は、膵腺房細胞における消化酵素の自己活性化による膵臓細胞の損傷によって引き起こされる。様々な免疫細胞が活性化されて炎症を引き起こすと、膵臓の損害が拡大する。その後、免疫細胞から産生される炎症性サイトカインを含む様々な液性因子は、全身の臓器損傷の誘因に関与する。膵炎において炎症反応を引き起こす免疫細胞の活性化に関与する最も代表的な因子は、ＴＮＦ−α、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、及びインターロイキン−６である。特に、血清ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αは、膵炎の場合、上方制御される。先の報告によれば、それらも、密接に膵炎の重症度と関連づけられる。インターロイキン１ノックアウトマウスを使用する実験は、インターロイキン１受容体アンタゴニストが動物に対して処理された場合、膵炎の発症が阻害されることを証明し、ＩＬ−１βが膵炎を引き起こす主な因子であったことを示した。したがって、ＩＬ−１βの発現のあらゆる変化を調査した。
【００６８】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルを、実験例２に記載されるのと同じ方法によってβ−ラパコン又はズンニオンで処理した後、セルレイン投与を行った。動物モデルから血清を得た後、マウスＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキット（米国BD）を使用して血清ＩＬ−１βのレベルを測定した。最初に、鼻洗浄液又は希釈した血清をマウスＩＬ−１β特異的抗体で被覆した９６ウェルプレートに投入した後、２時間室温で反応させた。プレートを洗浄した後、ビオチン複合体をそれに添加し、続いて１時間室温で反応させた。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジンＨＲＰ希釈標準溶液をそれに添加し、続いて反応させた。再びプレートを洗浄した後、安定化された色素原をそれに添加し、続けて反応させた。その後、ＯＤ４５０を測定した。さらに、膵臓中のＩＬ−１βの発現を、各膵臓組織においてリアルタイムＰＣＲによって確認した。トータルＲＮＡを抽出するため、ＴＲＩｚｏｌ（米国Invitrogen）１ｍＬを２０ｍｇの各膵臓組織に添加し、それを氷上に５分間置いて細胞を溶解させた。２００μＬのクロロホルムをそこに添加し、続いて１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。上清を得て、新しいチューブに移し、それに等量のイソプロパノールを添加した後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ってＲＮＡを分離した。そこに９９％エタノールを添加した後、２０００ｒｐｍで遠心分離を行った。再度洗浄した後、ＲＮＡペレットを空気中で乾燥させ、その後、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）水に溶解した。ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（米国Thermo）を使用して定量した。２μｇのトータルＲＮＡをＤＥＰＣと共に７０℃で５分間加熱し、それを、最終容量を２０μＬに調整したオリゴ（ｄＴ）を含む逆転写酵素プレミックス（米国Invitrogen）に添加した。４２℃で５５分間、及び７０℃で１５分間、反応混合物を反応させてｃＤＮＡを合成した。合成ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した。得られたｃＤＮＡからＩＬ−１β及びＧＡＰＤＨを増幅するため、ＤＥＰＣで５倍希釈した２μＬのｃＤＮＡ、０．５μＬのプライマー、７μＬのＤＥＰＣ水、及び１０μＬのＳＹＢＲグリーンマスターミックス（米国Invitrogen Life Technology）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（米国Applied Biosystems）を使用し、ＰＣＲを行った。反応条件は以下の通りであった：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１０秒及び６０℃で１分間。このサイクルを４０回繰り返した。増幅される遺伝子のプライマー配列を下記表１に示す。
【００６９】
【表１】
0006511191.tif 000007
【００７０】
その結果、図３に示されるように、正常群と比較して、血清ＩＬ−１βレベルはセルレイン処理群において有意に高かった。一方、血清ＩＬ−１βレベルは、β−ラパコン又はズンニオンで処理した群では用量依存的に有意に減少された。正常群と比較して、膵臓におけるＩＬ−１βの発現は、セルレイン処理群において有意に高かったのに対し、β−ラパコン又はズンニオンで処理した群では、膵臓におけるＩＬ−１βの発現は有意に減少された（図３）。
【００７１】
＜４−２＞ＭＣＰ−１の発現に対するβ−ラパコン及びズンニオンの阻害効果
炎症細胞の浸潤には、炎症細胞活性化及び炎症細胞の血管から組織への遊走等の一連のプロセスが必要とされる。ケモカインはサイトカインの１種であり、その化学運動性（chemokinesis）及び走化性（chemotaxis）等の活性によって炎症細胞が組織部位へと移動するのを支援する。特に、膵炎の場合には、ＭＣＰ−１は膵炎及び膵炎合併症である肺損傷の発症に関与することが知られている。したがって、本発明者らはＭＣＰ−１発現パターンを調査した。
【００７２】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルを、実験例２に記載されるのと同じ方法によって、β−ラパコン又はズンニオン及びセルレインで処理した。ＭＣＰ−１の発現パターンを調べるため、実施例＜４−１＞に記載されるのと同じ方法で各膵臓組織を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅される遺伝子のプライマー配列を下記表２に示す。
【００７３】
【表２】
0006511191.tif 000008
【００７４】
その結果、図４に示されるように、正常群と比較して、ＭＣＰ−１の発現はセルレイン処理群において有意に高かった。β−ラパコン又はズンニオンで処理した群の膵臓におけるＭＣＰ−１の発現は、用量依存的に減少された（図４）。
【００７５】
実験例５：β−ラパコン及びズンニオンによって誘導される膵臓組織の形態学的変化
本発明者らは、炎症、浮腫及び細胞壊死が膵炎で見られたと述べる先の報告に基づいて、膵臓組織の形態学的変化を調査した。
【００７６】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルを、実験例２に記載されるのと同じ方法によって、β−ラパコン又はズンニオン及びセルレインで処理した。膵臓組織を分離し、４℃で２４時間に亘って１０％ホルマリン中で固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）溶液で脱塩し、洗浄し、脱水し、パラフィン包埋して、５μｍの切片に切断した。切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した後、光学顕微鏡下で観察を行った。
【００７７】
その結果、図５に示されるように、正常群では膵腺房細胞が密に並ぶのに対し、セルレイン処理群では、浮腫のため、膵腺房細胞のサイズがより大きく、細胞間の距離が遠かった。また、炎症細胞の浸潤及び壊死が、セルレイン処理群で観察された。しかしながら、セルレイン処理群で示されるこれらの現象は、β−ラパコン又はズンニオン処理によって阻害され、ほぼ正常であった。グラフの結果より、セルレインによって誘導される膵臓組織の浮腫、炎症及び細胞壊死は、いずれもβ−ラパコン又はズンニオン処理によって用量依存的に阻害されたことが確認された（図５）。
【００７８】
実験例６：ＮＱＯ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるβ−ラパコンの膵臓保護活性の経路
＜６−１＞ＮＱＯ１ノックアウトマウスにおける膵臓組織の形態学的変化
β−ラパコンは、ＮＱＯ−１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ−１）の補助基質として知られている。したがって、β−ラパコンの膵臓保護効果がＮＱＯ−１の活性化経路を介したかどうかを確認するため、ＮＱＯ−１ノックアウトマウスにおいて膵臓の形態学的変化を調査した。
【００７９】
特に、ＮＱＯ−１ノックアウトマウスを、実験例２に記載されるのと同じ方法によってβ−ラパコン又はズンニオン及びセルレインで処理した。その後、膵臓組織を実験例５に記載されるのと同じ方法によってヘマトキシリン−エオシンで染色した後、光学顕微鏡下で観察を行った。
【００８０】
その結果、図６に示されるように、セルレインによって誘導される膵腺房細胞の浮腫、炎症細胞の浸潤及び壊死は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスで示されるものと同様に増加したが、β−ラパコンで処理した群では、膵臓組織の浮腫、炎症及び細胞壊死は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスで示されたものとは異なり、減少されなかった（図６）。
【００８１】
＜６−２＞ＮＱＯ−１ノックアウトマウスにおける膵炎に対する保護効果の経路
膵炎に対するβ−ラパコンの保護効果がＮＱＯ−１酵素の活性化経路を介したかどうかを確認するため、本発明者らは、ＮＱＯ−１ノックアウトマウスにおいて、膵臓の重量、血清アミラーゼ及びリパーゼの活性、並びに血清ＩＬ−１βの濃度を調査した。
【００８２】
特に、ＮＱＯ−１ノックアウトマウスを、実験例２に記載されるのと同じ方法によって、β−ラパコン又はズンニオン及びセルレインで処理した。その後、体重に対する膵重量の比を、実験例２に記載されるのと同じ方法によって計算した。血清アミラーゼ及びリパーゼの活性は、実験例３に記載されるのと同じ方法によってキットを使用して測定した。血清ＩＬ−１βの濃度は、実験例＜４−１＞に記載されるのと同じ方法によってＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。
【００８３】
その結果、図７に示されるように、ＮＱＯ１ノックアウトマウスでは、膵重量／体重の比、並びに血清アミラーゼ及びリパーゼの活性は、セルレイン処理群とβ−ラパコン同時処理群との間で有意差はなかった。血清ＩＬ−１βの濃度も、２つの群間でさほど異ならなかった（図７）。
【００８４】
実験例７：膵炎に対するβ−ラパコンの治療効果
セルレインによって誘導された膵炎に対するβ−ラパコンの治療効果を調査した。
【００８５】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意した動物モデルに、膵炎を誘導するため１時間の間隔で６回、腹腔内注射によってセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を投与した。セルレインの最終投与の６時間後、β−ラパコンを静脈内注射した。膵臓を取り出し、実験例５に記載されるのと同じ方法によるヘマトキシリン−エオシン染色によって膵臓組織の形態学的変化を観察した。
【００８６】
その結果、図８に示されるように、浮腫のため、セルレイン処理群の膵腺房細胞はより大きく、細胞の空間は拡大された。炎症細胞の浸潤及び細胞壊死も観察された。一方、これらの現象は、β−ラパコン処理によって有意に阻害された。グラフの結果より、セルレインによって誘導された膵臓組織の浮腫、炎症及び細胞壊死はいずれも、β−ラパコン処理によって軽減されたことが確認された（図８）。
【００８７】
実験例８：膵炎によって誘導される肺損傷に対する保護効果
＜８−１＞肺損傷に対するβ−ラパコンの保護効果
膵炎は様々な臓器で合併症（特に呼吸不全）を誘導し、この場合には死亡率約２０％を伴う重篤な疾患である。したがって、本発明者らは、膵炎誘導性肺損傷がβ−ラパコンによって抑制され得ることを確認した。
【００８８】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意したＣ５７／ＢＬ６マウス及びＮＱＯ−１ノックアウトマウスを、実験例２に記載されるのと同じ方法により、β−ラパコン及びセルレインで処理した。その後、膵臓組織を実験例５に記載されるのと同じ方法によってヘマトキシリン−エオシンで染色した後、光学顕微鏡下で観察を行った。
【００８９】
その結果、図９に示されるように、セルレインによって誘導される肺損傷は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて、β−ラパコン同時処理によって用量依存的に阻害された。一方、セルレインによって誘導される肺損傷は、ＮＱＯ−１ノックアウトマウスでは、β−ラパコン同時処理によって阻害されなかった（図９）。
【００９０】
＜８−２＞肺損傷に対するズンニオンの保護効果
本発明者らは、膵炎誘導性肺損傷がズンニオンによって抑制され得ることを確認した。
【００９１】
特に、実験例１に記載されるのと同じ方法によって用意したＣ５７／ＢＬ６マウスを、実験例２に記載されるのと同じ方法によってズンニオン及びセルレインで処理した。その後、膵臓組織を実験例５に記載されるのと同じ方法によってヘマトキシリン−エオシンで染色した後、光学顕微鏡下で観察を行った。
【００９２】
その結果、図１０に示されるように、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて、ズンニオン同時処理により、セルレインによって誘導される肺損傷が有意に阻害されたことを確認した（図１０）。
【００９３】
上記の結果に基づき、ナフトキノン系化合物であるβ−ラパコン及びズンニオンは、様々な炎症反応を調節することにより、セルレイン媒介膵炎及び膵炎によって誘導される肺損傷に対して、優れた保護効果を有することが確認された。
【００９４】
当業者であれば、上記の明細書に開示された概念及び具体的な実施形態が、本発明と同じ目的で実施される他の実施形態を改変又は設計する基礎として容易に利用し得ることが理解されるだろう。当業者であれば、このような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがないことも理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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