(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、ｔｍｐＢ（Ｔｒａｎｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）遺伝子が破壊されており、且つ当該遺伝子が破壊されていない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体。
【請求項２】
前記破壊が、前記菌株におけるアスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の全部の塩基配列の欠失である、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
ｔｍｐＢ遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
前記菌株がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体の培養物、又は培養物からの抽出物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体の製造方法であって、アスペルギルス属に属する菌株におけるｔｍｐＢ遺伝子を破壊する工程を含む、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の培養物、又は培養物からの抽出物の製造方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項８】
前記原料が大豆及び小麦を含む、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記培養物、培養物からの抽出物が麹又は諸味である、請求項７又は８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス・オリゼの２番染色体と相同な染色体のテロメア末端近傍に大規模な欠失領域を保持するアスペルギルス属糸状菌変異体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品醸造、酵素生産、及びバイオマス利用等のために工業的に広く用いられている。
【０００３】
日本の伝統食品である醤油の製造では、麹菌を原料である大豆と小麦に生育させて麹を作製し、麹に食塩水を加えて諸味とする。麹や諸味中では麹菌の破精込みによる物理的な作用と、麹菌が分泌する様々な加水分解酵素による酵素的な作用によって、原料の大豆や小麦のタンパク質、糖質、脂質が分解されて呈味成分であるアミノ酸、糖、及びグリセロール等を遊離する。この過程での原料分解が向上すると、原料利用率や圧搾性が上がり、生産性を向上させることができる。
【０００４】
上記のように、原料利用率や圧搾性が向上する麹菌の育種は、産業上極めて重要であり、これを目的とした育種が現在までに精力的に行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、発酵諸味の粘度が低下し、圧搾性が向上する麹菌を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、アスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端を大規模に欠失させることにより、加水分解酵素活性が増大し、延いては発酵諸味の粘度が低下し且つ圧搾性が向上するアスペルギルス属糸状菌の変異体を取得できることを発見し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
[態様１]
アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、当該菌株におけるアスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の少なくとも一部の塩基配列が欠失しており、且つ当該塩基配列を欠失していない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体。
［態様２］
前記テロメア末端から２５０ｋｂまでの領域において、以下のｉ）〜ｖ）の領域：
ｉ）前記テロメア末端から５０ｋｂまでの領域；
ｉｉ）前記テロメア末端から５０〜１００ｋｂまでの領域；
ｉｉｉ）前記テロメア末端から１００〜１５０ｋｂまでの領域；
ｉｖ）前記テロメア末端から１５０〜２００ｋｂまでの領域；
ｖ）前記テロメア末端から２００〜２５０ｋｂまでの領域、
のいずれか１つ以上の領域の塩基配列が欠失している、態様１に記載の変異体。
［態様３］
前記ｉｉ）及び／又はｖ）の領域の塩基配列が欠失している、態様２に記載の変異体。
［態様４］
前記テロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の全部の塩基配列が欠失している、態様２又は３に記載の変異体。
［態様５］
ｔｍｐＢ（Ｔｒａｎｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）遺伝子の機能が低下又は欠損している、態様１に記載の変異体。
［態様６］
ｔｍｐＢ遺伝子の一部又は全部が欠失している、態様５に記載の変異体。
［態様７］
前記菌株がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に属する、態様１〜６のいずれかに記載の変異体。
［態様８］
態様１〜７のいずれかに記載の変異体の培養物、又は培養物からの抽出物。
［態様９］
態様１〜７のいずれかに記載の変異体の製造方法であって、アスペルギルス属に属する菌株における２番染色体右腕のテロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の少なくとも一部の塩基配列を欠失させる工程を含む、方法。
［態様１０］
態様８に記載の培養物、又は培養物からの抽出物の製造方法であって、態様１〜７のいずれかに記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、方法。
［態様１１］
前記原料が大豆及び小麦を含む、態様１０に記載の製造方法。
［態様１２］
前記培養物、又は培養物からの抽出物が麹又は諸味である、態様１０又は１１に記載の製造方法。
［態様１３］
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、態様１〜７のいずれかに記載の変異体又は態様８に記載の培養物、又は培養物からの抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
［態様１４］
前記有機性材料がタンパク質、多糖又は脂質を含む、態様１３に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アスペルギルス・オリゼの２番染色体と相同な染色体のテロメア末端を大規模に欠失させることにより、アスペルギルス属糸状菌の加水分解酵素活性を顕著に向上させることができる。このような加水分解酵素活性の向上は、原料の加水分解工程が必要とされる醸造・発酵産業における生産性や効率性の増大に資する。例えば、かかる大規模欠失の結果得られる変異体を諸味等の原料の分解工程に用いると、諸味からの自然だれによる液汁回収量が増加し、また、粕重量も減少するため有効である。特に、醸造においては、諸味粘度が高いと圧搾性が低下し歩留まりが低下するが、本変異体を用いることにより、諸味粘度を低下させ、圧搾性が向上した醸造法を提供することができる。しかしながら、本発明の変異体又はその培養物、又は培養物からの抽出物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができるため、その用途は食品分野に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株での染色体２５０ｋｂ欠失株の作製方法
【図２】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株での染色体２５０ｋｂ欠失株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図３】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株での染色体２５０ｋｂ欠失株の麹短期間分解試験における諸味粘度と残渣量
【図４】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株での染色体２５０ｋｂ欠失株の醤油醸造における残渣量と圧搾後の粕重量
【図５】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株での染色体２５０ｋｂ欠失株の麹短期間分解試験における諸味粘度
【図６】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株での染色体２５０ｋｂ欠失株の醤油醸造における圧搾後の粕重量
【図７】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿I株の作製方法
【図８】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿I株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図９】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿II株の作製方法
【図１０】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿II株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図１１】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿III株の作製方法
【図１２】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿III株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図１３】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿IV株の作製方法
【図１４】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ５０ｋ＿IV株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図１５】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ１００ｋ株の作製方法
【図１６】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株Δ１００ｋ株のサザンハイブリダイゼーションによる相同組換えの確認
【図１７】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株における部分欠失株での麹短期間分解試験による諸味粘度
【図１８】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株におけるｔｍｐＢ欠失株の作製方法
【図１９】アスペルギルス・ソーヤ  ΔｔｍｐＢ株のサザンハイブリダイゼーション及びＰＣＲによる相同組換えの確認
【図２０】アスペルギルス・ソーヤ  ΔｔｍｐＢ株での麹短期間分解試験による諸味粘度
【図２１】アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０での２番染色体２５０ｋｂ欠失株の作製方法
【図２２】アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０での２番染色体２５０ｋｂ欠失株のサザンハイブリダイゼーション及びＰＣＲによる相同組換えの確認
【図２３】アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０での２番染色体２５０ｋｂ欠失株の麹短期間分解試験による残渣量
【図２４】アスペルギルス・ソーヤ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３と各種欠失領域及びｔｍｐＢ遺伝子の模式図
【図２５】アスペルギルス・ソーヤ  ｔｍｐＢ遺伝子と糸状菌におけるオーソログの系統樹
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．アスペルギルス属に属する菌株の変異体及びその製法
本発明は、アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、当該菌株におけるアスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の少なくとも一部の塩基配列が欠失しており、且つ当該塩基配列を欠失していない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体を提供する。アスペルギルス属に属する菌株としては、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Aspergillus luchuensis）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等の任意の菌株が挙げられるが、そのうちアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する菌株や、これらの菌株のアスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から２５０ｋｂまでに存在する遺伝子群、特にｔｍｐＢ遺伝子又はそのオーソログを有する菌株が好ましい。
【００１１】
さらに具体的な菌株として、アスペルギルス・ソーヤについてはアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）が挙げられる。
【００１２】
本発明の変異体は、アスペルギルス属に属する菌株のアスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端を大規模に欠失させることにより調製することができる。それにより、欠失していない親の菌株と比較して、加水分解酵素活性が増大する。欠失部位はテロメア末端から２５０ｋｂまでの領域の少なくとも一部の塩基配列であればよい。例えば、以下のｉ）〜ｖ）の領域：
ｉ）前記テロメア末端から５０ｋｂまでの領域（Δ５０ｋ＿Iの塩基配列に相当）；
ｉｉ）前記テロメア末端から５０〜１００ｋｂまでの領域（Δ５０ｋ＿IIの塩基配
列に相当）；
ｉｉｉ）前記テロメア末端から１００〜１５０ｋｂまでの領域（Δ５０ｋ＿IIIの塩基配列に相当）；
ｉｖ）前記テロメア末端から１５０〜２００ｋｂまでの領域（Δ１００ｋの領域の５’末端から５０ｋｂまでの塩基配列に相当）；
ｖ）前記テロメア末端から２００〜２５０ｋｂまでの領域（Δ５０ｋ＿IVの塩基配列に相当）、
のいずれか１つ以上の領域の塩基配列が少なくとも一部欠失していることが想定される。少なくとも「一部」の塩基配列の欠失とは、例え一塩基の欠失であっても親株と比較して加水分解酵素活性を増大させるような欠失である。
【００１３】
加水分解酵素活性をより増大させる観点からは、ｉｉ）及び／又はｖ）の領域の塩基配列が欠失していることが好ましい。前記領域の塩基配列全部、すなわち、アスペルギルス・オリゼの２番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から数えて２５０ｋｂの領域全てが欠失していることがより好ましい。
【００１４】
本発明の変異体は、欠失させたい任意の領域の両端をつなぎ合わせたベクターを用いて遺伝子組換えを行うことで任意の領域を欠失させることにより調製できる。
【００１５】
ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。
【００１６】
マーカー遺伝子としては、例えば、ａｄｅＡ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ｓＣ、のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、ピリチアミンやオーレオバシジンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００１７】
対象転写制御因子の強制発現に用いるプロモーターとしては、例えば、アルカリプロテアーゼプロモーター(ａｌｐプロモーター)、トランスレーションエロンゲーションファクタープロモーター（ｔｅｆ１プロモーター）、α―アミラーゼプロモーター等が挙げられる。
【００１８】
本発明の変異体は、宿主を組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、糸状菌類で有れば特に限定はされず、例えば、麹菌アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ等が挙げられる。
【００１９】
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９−１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。
【００２０】
上記の欠失による形質転換に代えて、ｔｍｐＢ（Ｔｒａｎｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）遺伝子又はそのオーソログの機能を低下乃至欠損させることによっても加水分解酵素活性が増大した変異体を得ることができる。本発明者らは、ｔｍｐＢ遺伝子が種々のアスペルギルス属菌にオーソログとして存在していること（図２５）、そして、アスペルギルス・ソーヤのｔｍｐＢが、Soid-Raggi G, et al. Molecular Microbiology (2006) 59(3)に記載されている、アスペルギルス・ニジュランスのｔｍｐＡ遺伝子のパラログに相当することを確認している。ここで、ｔｍｐＡは、ＮＡＤ（Ｐ）、ＦＡＤ、ヘム結合ドメインを有する膜貫通タンパク質であり、ｔｍｐＡの遺伝子を破壊すると分生子形成が抑制され、強制発現させると液体培養での分生子形成が促進されることが知られている。このように、ｔｍｐＡ遺伝子の機能は加水分解酵素活性とは無関係である。
【００２１】
ｔｍｐＢ遺伝子の機能の低下乃至欠損は、同遺伝子を破壊すること、例えば、同遺伝子の一部又は全部を欠失させたり、同遺伝子の途中に薬剤耐性遺伝子等、別の遺伝子を挿入するなどして正常に機能しないように遺伝子を修飾すること等により行うことができる。
【００２２】
２．変異体の用途
本発明は更に、上記変異体を用いて得られる培養物を提供する。本発明の変異体を含む培養物は、タンパク質を多く含む原料、例えば、植物性タンパク質を含む穀物類、野菜類など（例えば、大豆、小麦など）、そして動物性タンパク質を含む肉類、魚類などの加水分解工程で使用することができる。本明細書で使用する場合、「培養物」はアスペルギルス属菌を添加した麹や、更にはアスペルギルス属菌を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。
【００２３】
本発明の培養物は、上記変異体とタンパク質性の原料とを接触させる工程を含む方法により製造することができる変異体を添加するタイミングは特に限定されない。本発明の効果、例えば向上した加水分解酵素活性を損なわない限り、培養物の調製の途中又はその前後の工程でアスペルギルス属菌以外の菌を添加して培養物を処理してもよい。その他の工程については、所望とする用途に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００２４】
本発明の変異体又はその培養物は、向上した加水分解酵素活性により処理されることが必要な種々の分野、特に醸造・発酵産業での使用が想定される。例えば、アスペルギルス属菌を利用して製造される種々の発酵食品、例えば醤油、味噌等の製造に本発明の変異体等を使用した場合、原料利用率や圧搾性の向上、延いては最終製品の生産性の向上に資する。食品分野に限らず、本発明の変異体又はその培養物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができる。本明細書で使用する場合、「有機性材料」とは、天然・非天然の由来を問わず、広く炭素を主要元素として、酸素、水素、窒素原子などで構成される物質であって、糸状菌によって分解可能な物質を意味する。例えば、本発明の変異体又はその培養物によれば、糸状菌によって分解されるタンパク質、多糖、脂質等を含む食物残渣やバイオマスを効率的にその構成単位であるペプチドや単糖にまで分解することができる。
【００２５】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
・麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９系統株におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂ欠失株の作製。
麹菌アスペルギスル・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株については、そのドラフトゲノム解析の結果が２０１１年に公開されており（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１８，  １６５−１７６、２０１１）、本麹菌のスッキャフォールドの塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＥＮＡ／Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＤＦ０９３５５７からＤＦ０９３５８５として登録・公開されている。
【００２７】
麹菌アスペルギスル・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３；７５５０−２５９１７０の塩基配列を欠失させた場合に、植物原料の分解効率を向上させる効果があることを検証した。
【００２８】
使用菌株
麹菌アスペルギルス・ソーヤ  ＫＰ−ｄｅｌ株（ΔｐｙｒＧ，Δｋｕ７０）（アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株誘導体。）。アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株（ΔｐｙｒＧ、Δｋｕ７０）は、次の手順を経て得られた株である。
【００２９】
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を、過塩素酸を含む培地上で培養することにより、ｎｉａＤ遺伝子に自然変異が導入され不活性化された株（アスペルギルス・ソーヤΔｎｉａＤ株）を取得した。このΔｎｉａＤ株のｐｙｒＧ遺伝子座に、変異の導入されていないｎｉａＤ遺伝子を導入することにより、アスペルギルス・ソーヤΔｐｙｒＧ、ｎｉａＤ＋株を作製した。
【００３０】
このΔｐｙｒＧ、ｎｉａＤ＋株のｋｕ７０遺伝子を、ｐｙｒＧ遺伝子により破壊したのち、ｐｙｒＧ遺伝子の除去を行い、Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株であるアスペルギルス・ソーヤＰ６−１−１２株を得た。
【００３１】
次に、このＰ６−１−１２株のｐｙｒＧ遺伝子座に導入されているｎｉａＤ遺伝子を実施することにより除去しΔｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ、ΔｎｉａＤ株であるＮＤ−ｄｅｌ株を取得した。ＮＤ−ｄｅｌ株に存在する変異型ｎｉａＤ遺伝子を、変異が導入されていないｎｉａＤ遺伝子に置き換え、ｎｉａＤ遺伝子が野生型に復帰した状態の株であるアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株）を得た。
【００３２】
使用培地
ＰＤ培地（ポリペプトン  １％、デキストリン  ２％、リン酸水素二カリウム  ０．５％、硝酸ナトリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、カザミノ酸  ０．１％、ｐＨ  ６．０）、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（グルコース  ３．０％、塩化カリウム  ０．０５％、硝酸ナトリウム  ０．２％、リン酸水素二カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、硫酸第二鉄  ０．００１％、ｐＨ  ６．０）、マルツ寒天培地（麦芽エキス  ８％、寒天１．５％、ｐＨ６．０）
栄養要求性株を培養する場合には、ウリジン要求性株では終濃度１０ｍＭのウリジンを培地添加し、変異体の再生には培地に１．２Ｍのソルビトールを添加した。
【００３３】
Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂ欠失カセットの作製
図１に麹菌アスペルギルス・ソーヤのＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３の２５０ｋｂ欠失ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。表１に示すプライマーＡｓ２５０ＲＦ＿ｐｙｒとＡｓ２５０ＲＲ、ＡｓＡｓ２５０ＬＦとＡｓ２５０ＬＲ＿ｐｙｒ、ＡｓＰｙｒＦとＡｓＰｙｒＲを用いてアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡよりＰＣＲによって相同組換えにおけるアーム領域とマーカー遺伝子をクローニングした。
【００３４】
ＰＣＲには、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。クローニングしたＤＮＡ断片はＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。３つのＤＮＡ断片を用いてＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。
【００３５】
最後に、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を鋳型として、Ａｓ２５０Ｆ＿ｎｅｓｔｅｄとＡｓ２５０Ｒ＿ｎｅｓｔｅｄを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、２５０ｋｂ欠失用のベクターを構築した。
【表１】
0006473001.tif 000002
【００３６】
形質転換
５００ｍＬ三角フラスコ中の１０ｍＭのウリジンを含むＰＤ培地１００ｍＬに形質転換宿主株の分生子懸濁液を接種し、３０℃で１６時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を０．７Ｍの塩化カリウム緩衝液で洗浄し、１．５％  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（シグマ社製）及び０．３％  Ｙａｔａｌａｓｅ（大関社製）を含む０．７Ｍ塩化カリウム緩衝液で３０℃、３時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調整した。得られたプロトプラストは１．２Ｍソルビトール緩衝液で洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。
【００３７】
相同組換えの確認
得られた変異体については、サザンハイブリダイゼーション法にて相同組換えの確認を行った。サザンハイブリダイゼーションに用いたプローブは表１に示すＡｓ２５０ＲＦ＿ｐｙｒとＡｓ２５０Ｒ＿ｎｅｓｔｅｄを用いて、また、通常のｄＮＴＰの代わりにＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用してＰＣＲすることによって作製した。
【００３８】
形質転換株のゲノムＤＮＡを抽出後、ＰｓｔＩ（Ｔａｋａｒａ社製）によって消化した。アガロースゲル電気泳動によって分離した後にＮｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ（Ｒｏｃｈｅ社製）に転写し、メンブレンとプローブを一晩ハイブリダイゼーションさせた後に洗浄、ブロッキングを行い、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ，  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて発光させ、ＬＡＳ３０００（富士フィルム社製）によって検出した。
【００３９】
この結果、目的の変異体が取得されていることが確認できた（図２）。この２５０ｋｂ欠失株をアスペルギルス・ソーヤΔ２５０ｋ株とした。
【実施例２】
【００４０】
・Δ２５０ｋ株を用いた醤油原料短期間分解試験
本菌を用いた醤油原料の短期間分解試験を行い、本菌株が醤油醸造における原料の分解促進に有効であるか検討を行った。
【００４１】
Δ２５０ｋ株による醤油原料短期間分解試験における諸味粘度への影響
脱脂大豆、小麦及び水を１：１：１．３の割合で混合したのち、１５ｇ秤量し、１５０ｍＬ容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、２．７ｘ１０7個のΔ２５０ｋ株又はＮＢＲＣ４２３９  Δｋｕ７０株（ネガティブコントロール）の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた（盛込み）。これを３０℃で培養し盛込みから４６時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は３反復で行った。
【００４２】
出麹サンプルを滅菌した薬匙を用いてよくほぐしたのち、オートクレーブにより滅菌処理を行った２８％食塩水を１５ｍＬ加えよく混ぜて諸味としたものにゴム栓で蓋をした。これを２５℃、１８０ｒｐｍにて振盪しながら９０時間分解を行った。
【００４３】
分解反応終了後、サンプルを２５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ社製  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＢＬＩＩ）により諸味粘度を測定した。また、この分解物の残渣量を測定するため、一定量を目開き約１．０ｍｍのメッシュ（サンプラテックＰＰ２４）に分取し、水で洗浄した後にメッシュ上に残存した固形物の乾燥重量を測定した。
【００４４】
それらの結果を図３に示した。
【００４５】
Δ２５０ｋ株では諸味粘度がコントロールと比較して約２５％低下していた。また、１．０ｍｍ以上の残渣の量もコントロールと比較して約５０％減少していた。このことから、Δ２５０ｋ株を用いた場合、醤油原料の分解が促進され、諸味の粘度や残渣の量を低下させることが可能であると考えられる。
【実施例３】
【００４６】
・Δ２５０ｋ株を用いた醤油小仕込試験
実施例２で示したとおり、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端２５０ｋｂの欠失は醤油原料の分解を促進することが確認された。そこで、実際に小規模での試醸を実施し、圧搾性が向上するか検討を行った。
【００４７】
Δ２５０ｋ株での醤油小仕込試験における諸味粘度への影響
麹蓋で製麹した麹に２５％食塩水を添加し、よく混合し諸味とした。これに、純粋培養した醤油乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィルス及び醤油酵母ジゴサッカロミセス・ルキシーを添加し、１５℃から３０℃にて９０日間発酵させた。得られた醤油諸味については、目開き約１．０ｍｍのメッシュ（サンプラテックＰＰ２４）で水洗後の残渣重量の測定と、薮田式圧搾機による圧搾後の残存粕重量の測定を行った。
【００４８】
なお、小仕込試験は、３反復で行ったが、圧搾試験には３つの諸味を混合して１連で行った。
【００４９】
それらの結果を図４に示した。
【００５０】
短期間諸味分解試験同様に水洗後の粕の重量は、Δ２５０ｋ株にて約半分に低下していた。また、薮田式圧搾機を用いた圧搾後の粕重量は、約５％低下していた。
以上のことから、Δ２５０ｋ株を用いた場合、醤油醸造においても醤油原料の分解が促進され、残渣量を低下させることが可能であることが確認された。
【実施例４】
【００５１】
・麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１系統株でのＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂ欠失株の諸味粘度及び原料分解効率に与える効果の検証
【００５２】
実施例１から３までに示したデータは、いずれもアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の誘導体にて取得したデータであるが、ＮＢＲＣ４２３９株とは異なる系統である、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株の系統を宿主とした場合でもＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂ欠失の効果があるか検証を行った。
【００５３】
麹菌アスペルギルス・ソーヤＫｕＵ１株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株を親株とする変異株）を宿主とし、Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端側２５０ｋｂを欠失させた株を作製した。アスペルギルス・ソーヤ内では遺伝子配列がほとんど変わらないことから、実施例１で用いた形質転換カセットをそのまま使用した。形質転換においても実施例１に記載した方法と同じ手順にて行った。
【００５４】
上記変異体が醤油原料の分解に有効であるか、短期間分解試験を実施し評価した。短期間分解試験は、分解条件以外は実施例２に記載した方法と同じ手順にて行った。分解条件は、１５ｇの麹に１５ｍＬの２８％食塩水を添加してよく混合した後、２０℃で４２時間分解を行った。分解終了後、諸味粘度を測定した。
その結果を図５に示した。
【００５５】
ＮＢＲＣ４２４１株を用いたΔ２５０ｋ株では、諸味粘度がコントロールと比較して約５０％低下していた。このことから、ＮＢＲＣ４２４１株を用いた場合でもＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端２５０ｋｂを欠失させることで、醤油原料の分解が促進されることが可能であると考えられる。
【００５６】
さらに、醤油小仕込試験においても同様の効果が得られるかを検証した。実施例３と同様の手順にて醤油小仕込試験を実施し、得られた諸味を用いて薮田式圧搾機による圧搾後の粕重量を測定した。
【００５７】
その結果を図６に示した。
【００５８】
ＮＢＲＣ４２４１株を用いたΔ２５０ｋ株では、圧搾後の粕重量がコントロールと比較して約４％低下していた。このことから、小仕込試験においてもＮＢＲＣ４２３９株と同様にＮＢＲＣ４２４１株を用いた場合でもＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端２５０ｋｂを欠失させることで、醤油原料の分解が促進されることが確認された。
【実施例５】
【００５９】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１系統株でのＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂ領域の部分欠失株が諸味粘度に与える効果の検証
実施例１から４までの結果より、アスペルギルス・ソーヤでは種を問わずＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端側２５０ｋｂを欠失させることにより醤油原料の分解効率が促進することが明らかになった。
【００６０】
そこで、この２５０ｋｂの領域の中でも諸味粘度に影響を与える領域を絞り込むために、約５０ｋｂ〜１００ｋｂずつに分割して欠失させた株で諸味粘度に与える影響を検討した。
【００６１】
Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂの部分欠失カセットの作製
部分欠失カセットの概要を図７、図９、図１１、図１３、図１５に示した。それぞれテロメア末端側よりΔ５０ｋ＿I〜Δ５０ｋ＿IV、Δ１００ｋとしてカセットを作製した。
Δ５０ｋ＿I〜Δ５０ｋ＿IV、Δ１００ｋの位置関係を図２４に示す。用いたプライマー
は、表２〜６に示した。
【００６２】
なお、Δ５０ｋ＿IのＲｉｇｈｔ  ＡｒｍはΔ２５０ｋのＲｉｇｈｔ  Ａｒｍ（Ａｓ２
５０ＲＦ＿ｐｙｒとＡｓ２５０ＲＲの増幅産物）と同一のものを、Δ５０ｋ＿IV及びΔ１００ｋのＬｅｆｔ  ＡｒｍはΔ２５０ｋのＬｅｆｔ  Ａｒｍ（Ａｓ２５０ＬＦとＡｓ２５０ＬＲ＿ｐｙｒの増幅産物）と同一のものを使用した。
【００６３】
また、ｐｙｒＧマーカーもΔ２５０ｋと同様のプライマーを用いて増幅させた断片を使用した。それぞれＬｅｆｔ  Ａｒｍ（プライマーＬＦとＬＲ＿ｐｙｒの増幅産物）とＲｉｇｈｔ  Ａｒｍ（プライマーＲＦ＿ｐｙｒとＲＲの増幅産物）をゲル抽出によって精製後、ｐｙｒＧマーカー遺伝子断片と合わせて３つのＤＮＡ断片でＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。
【００６４】
最後に、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を鋳型として、それぞれのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Δ５０ｋ＿I〜Δ５０ｋ＿IV用とΔ１００ｋ用のベ
クターを構築した。
【００６５】
【表２】
0006473001.tif 000003
【００６６】
【表３】
0006473001.tif 000004
【００６７】
【表４】
0006473001.tif 000005
【００６８】
【表５】
0006473001.tif 000006
【００６９】
【表６】
0006473001.tif 000007
【００７０】
形質転換及び相同組換えの確認
実施例１に記載した方法と同様に形質転換を実施した。得られた変異体はサザンハイブリダイゼーションにて相同組換えの確認を行った。
【００７１】
サザンハイブリダイゼーションに用いたプローブの領域及び用いた制限酵素、及び予想される断片長は図７、図９、図１１、図１３、図１５に示した。
【００７２】
Δ５０ｋ＿Iで用いたプローブは、配列番号１と配列番号２のプライマーを用いて増幅
した断片を、Δ５０ｋ＿II及びΔ５０ｋ＿IIIで用いたプローブは配列番号５と配列番号６のプライマーによって増幅されるＰｙｒＧマーカー全長の断片を、Δ５０ｋ＿IV及びΔ１００ｋで用いたプローブは実施例１で用いたものと同様に配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて増幅される断片を用いた。
【００７３】
それらのサザンハイブリダイゼーションの結果を図８、図１０、図１２、図１４、図１６に示した。いずれの変異体も予想通りのシグナルが検出され、目的の株が取得されていることが確認された。
【００７４】
部分欠失株による諸味短期間分解物の粘度測定
上記変異体が醤油原料の分解に有効であるか、短期間分解試験を実施し評価した。短期間分解試験は、分解条件以外は実施例４に記載した方法と同じ手順にて行った。分解終了後、諸味粘度を測定した。
【００７５】
その結果を図１７に示した。
【００７６】
２５０ｋｂ領域中の部分欠失株ではΔ５０ｋ＿II及びΔ５０ｋ＿IV、Δ１００ｋにおいて短期間分解諸味での粘度が低下した。
【００７７】
Δ５０ｋ＿IVの欠失領域は、Δ１００ｋに含まれており、両菌株の諸味粘度はほぼ同等に低下していることから、Δ５０ｋ＿IVの領域に諸味粘度の低下において重要な領域が含まれていることが考えられた。
【００７８】
また、各部分欠失だけでは２５０ｋｂ全体を欠失させた株の諸味粘度には及ばなかった。このことから、Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端側２５０ｋｂの欠失における諸味粘度の低下には、Δ５０ｋ＿IIとΔ５０ｋ＿IVの欠失領域に含まれる諸味粘度低下を阻害する因子の欠失が大きく関与していることが示唆された。
【実施例６】
【００７９】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１系統株でのｔｍｐＢ遺伝子欠失が諸味粘度に与える効果の検証
さらにΔ５０ｋ＿II領域中に含まれる領域を段階的に絞り込んだ結果、Ｔｒａｎｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎであるｔｍｐＢ遺伝子（配列番号４７、４８）の効果が期待されたため、ｔｍｐＢ遺伝子の破壊株を作製し、その効果を検証した。
【００８０】
ｔｍｐＢ遺伝子欠失カセットの作製
ｔｍｐＢ遺伝子欠失カセットの概要を図１８に示した。用いたプライマーは、表７に示した。
【００８１】
これまで同様にＬｅｆｔ ＡｒｍとＲｉｇｈｔ Ａｒｍ及びＰｙｒＧマーカーをＰＣＲで増幅後、Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲにて各断片を連結させ、最後にＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行って目的のｔｍｐＢ欠失用ベクターを構築した。
【００８２】
【表７】
0006473001.tif 000008
【００８３】
形質転換及び相同組換えの確認
実施例１に記載した方法と同様に形質転換を実施した。得られた変異体は、サザンハイブリダイゼーションにて相同組換えの確認を行った。サザンハイブリダイゼーションにはＰｙｒＧマーカー領域のプローブを用い、ＢｇｌＩＩにてゲノム断片を消化した。予想される断片は、目的の組換え産物による７．４ｋｂの断片と、内在の不活化したｐｙｒＧ遺伝子による３．０ｋｂの二本検出される。サザンハイブリダイゼーションの結果、ΔｔｍｐＢ＿１とΔｔｍｐＢ＿２共に予想されるバンドが検出されたが、ΔｔｍｐＢ＿１では４．５ｋｂ付近にもシグナルが検出されたため、以降の実験にはΔｔｍｐＢ＿２を使用した（図１９）。
【００８４】
ΔｔｍｐＢ株による諸味短期間分解物の粘度測定
上記変異体が醤油原料の分解に有効であるか評価するため、短期間分解試験を実施した。短期間分解試験は、分解条件以外は実施例４に記載した方法と同じ手順にて行った。分解終了後、諸味粘度を測定した。その結果を図２０に示した。
【００８５】
ｔｍｐＢ遺伝子を破壊すると諸味粘度が約３０％低下した。このことから、ｔｍｐＢ遺伝子の欠失が醤油原料の分解効率の向上に寄与していることが示唆された。
【００８６】
しかしながら、２５０ｋｂを欠失させた株では約６０％諸味粘度が低下していることから、２５０ｋｂ領域中にはｔｍｐＢ遺伝子以外にも原料分解に寄与する因子が含まれていることが考えられた。
【実施例７】
【００８７】
・麹菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０系統株でのＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂと相同領域欠失株が諸味粘度及び原料分解効率に与える効果の検証
実施例１から５までに示したデータは、いずれもアスペルギルス・ソーヤにて取得したデータであるが、アスペルギルス・オリゼのゲノム解読株である、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の系統を宿主とした場合でもＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３テロメア末端２５０ｋｂと相同な領域を欠失させることで同様の効果が得られるか検証を行った。
【００８８】
はじめに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端領域とアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムでの相同性解析を行った。
【００８９】
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端領域４５０ｋｂをクエリに用いて、ＢＬＡＳＴプログラムを利用して検索を行った。
【００９０】
その結果、アスペルギルス・オリゼでは何箇所か欠失があり、４５０ｋｂで見ると１００ｋｂほど短くなっているものの、全体的には約２番染色体右腕のＳＣ００３の末端側と相同性を有していることが確認できた。
【００９１】
そこで、ＳＣ００３の末端側アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９におけるＳｃａｆｆｏｌｄ０００６３のテロメア末端領域２５０ｋｂと相同性を示すＳＣ００３の領域を欠失させるためのカセットを作製した。
【００９２】
カセットの概要は、図２１に示した。
【００９３】
表７に示すプライマーＡｏ２５０ＲＦ＿ｐｙｒとＡｏ２５０ＲＲ、Ａｏ２５０ＬＦとＡｏ２５０ＬＲ＿ｐｙｒ、ＡｏＰｙｒＦとＡｏＰｙｒＲを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡよりＰＣＲによって相同組換えにおけるアーム領域とマーカー遺伝子をクローニングした。
【００９４】
ＰＣＲには、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。クローニングしたＤＮＡ断片は、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。３つのＤＮＡ断片を用いてＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。
【００９５】
最後にＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を鋳型としてＡｏ２５０Ｆ＿ｎｅｓｔｅｄとＡｏ２５０Ｒ＿ｎｅｓｔｅｄを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のＳＣ００３テロメア末端２５０ｋ欠失用のベクターを構築した。
【００９６】
【表８】
0006473001.tif 000009
【００９７】
相同組換えによる２５０ｋｂ欠失株の作製
構築したベクターを用いて、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を親株とする形質転換効率を向上させた栄養要求宿主であるＲＫｕＮ１６ｐｒｔ１（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）株に対して形質転換を行った。なお、コントロール株の作製には、欠失したｐｙｒＧ遺伝子を復帰させる相同組換えを行った。
【００９８】
得られた変異体での相同組換えの確認をサザンハイブリダシゼーションにより行った結果、図２２に示すとおり、目的の部位にベクターが組み込まれていることが確認された。しかしながら、親株と同じバンドも検出されたため、得られた変異体はヘテロカリオンであることが示唆された。そのため、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地にて経代培養を繰り返して核の純化を行った。純化の確認をＡｏＬＦ＿ｔ及びＡｏＬＲ＿ｔのプライマーを用いて、ＰＣＲにて行った。
【００９９】
その結果、図２２に示すとおり、親株由来のＰＣＲ産物が変異体では消失したことから、ホモカリオンの２５０ｋｂ欠失株の取得が確認された。
【０１００】
２５０ｋｂ欠失株による麹短期間分解
上記欠失株を用いて小スケールで醤油麹を作製し、短期間分解を実施した。３０℃で４２時間分解を行った後、分解物の残渣量を測定した。
【０１０１】
その結果、図２３に示す通り、アスペルギルス・オリゼにおいてもアスペルギルス・ソーヤと同様に分解物の残渣量がコントロール株と比較して約半分に低下していることが確認された。
【図１】
0006473001.tif 000010
【図２】
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【図３】
0006473001.tif 000012
【図４】
0006473001.tif 000013
【図５】
0006473001.tif 000014
【図６】
0006473001.tif 000015
【図７】
0006473001.tif 000016
【図８】
0006473001.tif 000017
【図９】
0006473001.tif 000018
【図１０】
0006473001.tif 000019
【図１１】
0006473001.tif 000020
【図１２】
0006473001.tif 000021
【図１３】
0006473001.tif 000022
【図１４】
0006473001.tif 000023
【図１５】
0006473001.tif 000024
【図１６】
0006473001.tif 000025
【図１７】
0006473001.tif 000026
【図１８】
0006473001.tif 000027
【図１９】
0006473001.tif 000028
【図２０】
0006473001.tif 000029
【図２１】
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【図２２】
0006473001.tif 000031
【図２３】
0006473001.tif 000032
【図２４】
0006473001.tif 000033
【図２５】
0006473001.tif 000034
【配列表】
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