(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含むヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法：
（ａ）Ｂ型肝炎に罹患したか、Ｂ型肝炎ワクチン追加免疫を受けた健常な供血者から回収されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質画分ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）を溶解させた後、ろ過して分画ＩＩ溶液を取得する段階；
（ｂ）前記取得された分画ＩＩ溶液を透析及び／または濃縮させた後、ｐＨ５．９５〜６．３５で陰イオン交換クロマトグラフィーを行って、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに付着されない分画を取得する段階；
（ｃ）ウイルス不活性化のために、前記取得された分画に溶媒及び洗浄剤を処理した後、溶媒及び／または洗浄剤、及び血栓生成物質を除去するために、ｐＨ５．６〜６．０で陽イオン交換クロマトグラフィーを行う段階；
（ｄ）前記陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液を透析及び／または濃縮させる段階；及び
（ｅ）前記透析及び／または濃縮された溶液をろ過してヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを取得する段階。
【請求項２】
前記（ａ）段階の血漿タンパク質分画ＩＩの溶解は、血漿タンパク質分画体積の２〜１０倍になるように塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して行うことを特徴とする請求項１に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項３】
前記（ａ）段階のろ過は、分画ＩＩ溶液を取得するための段階として、清浄ろ過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とし、ｐＨが４．５〜５．５になるように調節して行われることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項４】
前記（ｂ）段階の透析および／または濃縮は、透析濃縮液の浸透圧が１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で行った後、ｐＨが５．５〜６．５になるように調節することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項５】
前記（ｂ）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、非吸着液を回収することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項６】
前記（ｂ）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ５．９５〜６．３５、流速３０〜１５０ｃｍ／ｈｒの条件で行われ、陰イオン交換クロマトグラフィーに付着しなかった分画を１．０〜２．０ローディングボリューム（Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＬＶ）で回収することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項７】
前記（ｂ）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）系列の陰イオン交換樹脂を利用することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項８】
前記（ｃ）段階の溶媒は、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ：Ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であることを特徴とし、洗浄剤は、ポリソルベート８０（ツイン（Ｔｗｅｅｎ）８０）、トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−４５の中から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項９】
前記（ｃ）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーは、５００〜１，５００ｍＭの塩濃度で行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１０】
前記（ｃ）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）系列の陽イオン交換樹脂を利用することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１１】
前記（ｄ）段階の透析および／または濃縮は、透析濃縮液の浸透圧１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１２】
前記（ｅ）段階のろ過は、ナノろ過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システムを利用して、１．５〜２．５のｂａｒ圧力条件で行うことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１３】
前記（ｅ）段階以降、安定剤を添加する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１４】
前記安定化剤は、糖アルコール、マルトース、ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、アルブミン、リジン、グリシン、ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ８０の中から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１５】
前記安定化剤は、最終濃度が９０〜１１０ｇ／ｌとなるように添加することを特徴とする請求項１３又は１４に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１６】
前記安定化剤を添加した後、ｐＨを３．５〜４．５に調節することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１７】
前記安定化剤を添加する段階以降、細菌ろ過を経て、静脈注射用ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを製造する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項１８】
前記細菌ろ過を経た後、ｐＨを４．０〜４．５に調節することを特徴とする請求項１７に記載のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法に関し、より詳しくはヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質分画ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）を透析濃縮させた後、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂精製技法を介して血栓生成物質および工程中不純物を除去して、ウイルス不活性化時添加される溶媒および洗浄剤を効果的に除去して、極微細ろ過および安定剤を添加して安定性に優れたことを特徴とするヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、種々のウイルスおよび細菌に対する抗体を含有している血漿タンパクであって先天的な抗体欠乏者またはウイルス性や細菌性疾患によって抗体の人為的な補充を要する患者に投与することによって疾患の予防と治療に使用される薬剤である。
【０００３】
このような免疫グロブリンを薬剤で使用するために、コーンおよびオンクレー（Ｃｏｈｎ  ＆  Ｏｎｃｌｅｙ）による冷エタノル分画法（Cohn E. et al., J. Am. Chem. Soc., 68:459, 1946）およびキストラーおよびニッチマンによる変形法（Kistler P, Nitschmann HS, Vox Sang, 7:414. 1952）で皮下および筋肉注射用免疫グロブリンが製造された。
【０００４】
しかし、筋肉注射用免疫グロブリンは、１）投与量が制限されて大量投与が不可能で、２）注射時注射部位に疼痛現象が現れて、３）抗体能力を有する固有の免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ；ＩｇＧ）含有量が少なく、４）注射部位のタンパク分解酵素によるグロブリンの抗体価が減少し、５）最大血中濃度到達時間は２４時間以上が必要とされる問題点がある。
【０００５】
筋肉注射の問題点を解決するために、静脈注射による免疫グロブリンの投与が試みられたが、免疫グロブリン製剤を静脈に投与する場合、抗補体活性（Ａｎｔｉｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がある凝集体（Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）に起因する副作用（Ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎ）が深刻で呼吸困難現象から循環系ショックまでの様々な即時の副作用が現れた。前記の症状は主に免疫グロブリンが欠乏した患者から見られ、特に深刻な過敏性症状の副作用はＩｇＡに対する抗体が現れた患者で観察された。
【０００６】
すなわち、静脈注射用製剤を開発するためには、血液凝固因子（フィブリノーゲン、アルブミン、ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＫＡ）およびトランスフェリン等）またはＩｇＡおよびＩｇＥなどのＢ型肝炎免疫グロブリンと類似の免疫グロブリン等の不純物を除去して純度と安全性を高める必要がある。
【０００７】
従って、前記問題によって静脈注射が不可能になることによって、静脈注射用製剤の開発が求められ、製造工程の間にこのような凝集体を除去して、および／または、凝集体形成を防止できる方法が開発された。ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）等タンパク分解酵素やベータプロピオラクトン（β−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ）等の化学物質で処理して構造を変化させて凝集体の生成を阻止するか破壊して抗補体活性を低下させることによって静脈注射が可能になった。
【０００８】
第１世代静脈注射用免疫グロブリン（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＩＶＩＧ）は、免疫グロブリン凝集体を除去するために出発物質（コーン分画ＩＩ）にペプシンを処理した。前記工程にはカラムクロマトグラフィー段階が含まれず、製造された製品は適当な期間の間安定に維持されるように凍結乾燥させて、使用直前に溶解させて使用した。しかし、一部メーカーのＩＶＩＧ製品でウイルス性肝炎Ｃ等のウイルスの感染を誘発させることが明らかになり、そこで製造工程に一つ以上の公示のウイルス非活性化および／または除去段階が追加的に含まれた。以後、低い抗補体活性とより高い安定性を有する第２世代ＩＶＩＧが８０年代中頃に開示され、前記ＩＶＩＧは、いくつかの段階のクロマトグラフィー段階を経て精製された。
【０００９】
このような製剤は、静脈注射することにより、筋肉注射用免疫グロブリンの短所であった投与量の制限、注射部位の疼痛現象、タンパク分解酵素によるグロブリンの抗体価減少などが解決され最大血中濃度到達時間も数時間以内に短縮された。
【００１０】
しかし、前記静脈注射用免疫グロブリンは、構造を変化させて抗体能力を有する固有のＩｇＧは殆どなく補体結合能力が低下するかなく、血中濃度半減期も４−１２日程度と短くて疾病の予防と治療に満足するほどの効果を上げられずにいる。また、凍結乾燥された粉末形態で製造された前記第１および２世代ＩＶＩＧは追加的に溶解させる作業が必要で、溶解速度が遅いため、液状ＩＶＩＧ製品が開発されて、より安定で純粋なＩＶＩＧ製品を得ることができるように向上した工程が求められた。
【００１１】
そこでドイツ特許第２，６０４，７５９号および米国特許第４，１２４，５７６号等に紹介された方法（第３世代ＩＶＩＧ）は、前記静脈注射用ガンマグロブリンとは違ってポリエチレングリコール等非イオン性界面活性剤を使用して抗体能力を有する固有のＩｇＧを得る方法が開発されることによって補体結合能力があって血中濃度半減期が長くなって疾病の予防と治療に良い効果を上けるようになっているが、ポリエチレングリコール処理で製造されたこれらの製剤も抗補体活性がある凝集体を完全に除去するのが難しく（抗補体価が０．０２単位／ｍｇ程度を示す）副作用の発生の余地が残っている問題点がある。
【００１２】
また、韓国公開特許第１９８３−０００７０８３号も、ヒト血漿から分離したコーン（ｃｏｈｎ）分画ＩＩまたは分画ＩＩ＋ＩＩＩからポリエチレングリコール処理を介して静脈注射用免疫グロブリンを製造したが、工程が複雑で収率が低い問題点がある。
【００１３】
一方、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーに属するＤＮＡゲノムを有するウイルスであって、急性および慢性肝炎を誘発する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、互いに遺伝子塩基配列が約８％以上異なる８個の遺伝子型に分類するかＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の二ヶ所の抗原決定部位（ｄ／ｙ、ｗ／ｒ）を中心に４種の血清型（ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ、ａｙｒ等）に区分する。世界人口中約３．５億人がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）慢性感染者であり、特に韓国および中国は慢性感染者が約５〜８％に至り、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染はこの地域の肝疾患および肝臓癌の主原因である。現在は、ワクチンの開発によりある程度予防が可能となっているが、依然としてＢ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎患者が相当存在しているのが現状である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の慢性感染は、肝炎、肝硬変だけでなく肝臓癌を誘発して慢性感染者が非感染者に比べて肝臓癌発生頻度が約３００倍高く現れるが、ＷＨＯの調査によると約８０％の肝臓癌は慢性Ｂ型肝炎が原因であると知られている。
【００１４】
現在知られているＢ型肝炎治療剤は、ヌクレオシド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ）のラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）とアデポビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）等があり、これらはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）重合酵素（ＨＢＶ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を阻害することによってＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡ複製を阻害する。しかし、３年投薬時約７５％の患者から耐性ウイルスが発生して、治療効果が低下する問題点があって、ウイルス複製阻害剤を単独で使用してＢ型肝炎を治療するのは不可能であり、これに対する代案としてインターフェロン製剤との併用治療を試みるが、深刻な副作用により現在は使用していない。
【００１５】
類似の治療目的で免疫グロブリンの一種で、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する抗体を力価が高い血液から分離および精製したヒトＢ型肝炎免疫グロブリン（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＨＢＩＧ）製剤を考慮するが、前記のＨＢＩＧ製剤の抗体は血漿から分離精製して製造するため、原料血漿確保、ウイルス感染の恐れ、低い活性、高費用等の問題点がある。
【００１６】
本発明者等は、前記のような従来の問題を解決するために努力した結果、血漿から分離した分画ＩＩを透析／濃縮させた後、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製して、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび溶出時塩濃度を調節することによって、血漿内存在する血栓生成物質が効率的に除去されて、製品の安定性が向上することを確認して本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、純度が高くかつ安定性に優れたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、
（ａ）Ｂ型肝炎に罹患したか、Ｂ型肝炎ワクチン追加免疫を受けた健常な供血者から回収されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質画分ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）を溶解させた後、ろ過して分画ＩＩ溶液を取得する段階；
（ｂ）前記取得された分画ＩＩ溶液を透析及び／または濃縮させた後、陰イオン交換クロマトグラフィーを行って、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに付着されない分画を取得する段階；
（ｃ）ウイルス不活性化のために、前記取得された分画に溶媒及び洗浄剤を処理した後、溶媒及び／または洗浄剤、及び血栓生成物質を除去するために、陽イオン交換クロマトグラフィーを行う段階；
（ｄ）前記陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液を透析及び／または濃縮させる段階；及び
（ｅ）前記透析及び／または濃縮された溶液をろ過してヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを取得する段階；
を含むヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法を提供する。
【００１９】
前記（ｅ）段階以降、安定剤を添加した後、力価を調整して、細菌ろ過する段階をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る静脈注射用ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンの製造過程を示した模式図である。
【図２】本発明のイオン交換クロマトグラフィーの順序および条件を最適化するために行ったイオン交換クロマトグラフィー溶出液の分析結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２２】
本発明の「ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン」とは、Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎを意味し、Ｂ型肝炎に罹患したり、血漿分画製剤を製造する目的でＢ型肝炎ワクチン追加免疫を受けた健常な供血者から回収された抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン−Ｇ含有血漿から製造されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリンであり、好ましくはヘパビッグであってもよいが、これに限定されない。
【００２３】
本発明の「ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質」とは、ヒト血漿またはヒト胎盤由来血漿からＦａｃｔｏｒ  ＩＸおよび抗トロンビンといった種々の血漿タンパク質が除去された無−低温沈殿物（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ−ｆｒｅｅ）血漿、種々のコーン（Ｃｏｈｎ）分画およびアンモニウムサルフェートまたはＰＥＧ（Polson et al., Biochem Biophys Acta, 82:463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang, 23:107. 1972）による沈殿法を介して得られる分画を含む。好ましくは血漿タンパク質分画はコーン分画ＩＩや、コーン分画Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩまたはコーン分画ＩＩ＋ＩＩＩも同様に使用され得る。
【００２４】
本発明では、ヒト血漿から得られた分画ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）を使用して、通常のコーン血漿分画法に従って製造された。分画ＩＩに含まれた様々なリポプロテイン類、フィブリノーゲン、α−グロブリンと、β−グロブリン及び様々な凝固因子を除去するための後続精製工程を行った。
【００２５】
本発明で、ヒト血漿は、好ましくは血漿分画製剤製造用原料で使用する目的で健常者にＢ型肝炎ワクチンに追加免疫を実施して血漿内抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン−Ｇの数値を向上させた後、成分採血（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）を介して血漿の部分だけを取って凍結したもので、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する核酸増幅検査（ＮＡＴ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）および血清学的検査を含むバイオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ）を経て、−２０℃以下で保管されていた血漿を１〜６℃のジャケット式反応器（ｊａｃｋｅｔｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ）で１２〜７２時間反応させて溶かした。
【００２６】
前記条件で血漿が溶けながらフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）および凝固因子（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれた凍結沈降血漿（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）が生成されるが、遠心分離を介して凍結沈降血漿を除去させて、凍結沈降血漿が除去された冷凍欠乏性血漿（ｃｒｙｏｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）を回収した。その後沈殿とろ過過程を繰り返して最終的に分画ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）を取得した。
【００２７】
ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンが含まれた血漿を分離するためのろ過過程は、フィルター補助剤を添加して混合させた後、フィルタープレスを使用して上澄み液と沈殿物を分離し、前記フィルター補助剤は、Ｃｅｌｉｔｅ（ＳＴＤ）、Ｈａｒｂｏｌｉｔｅ（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｅｒｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）等を使用した。
【００２８】
本発明において、前記（ａ）段階の血漿タンパク質分画ＩＩの溶解は、血漿タンパク質分画体積の２〜１０倍になるように塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して行うことを特徴とする。
【００２９】
血漿タンパク質分画は、実質的に非−変成温度およびｐＨで水および／または緩衝液に懸濁液化（溶解）されることが好ましい。「実質的に非変性」とは、前記言及された条件が免疫グロブリン分子の機能性活性の実質的に非可逆的な損失、例えば、抗原結合活性および／または生物学的Ｆｃ−作用の損失を引き起こさないことを意味する。
【００３０】
有利には、血漿タンパク質分画はプラズマタンパク質分画体積の２〜１０、好ましくは３〜５倍の体積で一つ以上の非変性緩衝剤で酸性化された水に溶解させて、ヒトＢ型肝炎免疫グロブリン−含有懸濁液のｐＨはヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの最適な溶解度を保障することができるように、ｐＨ６．０以下、好ましくは４．０〜６．０、さらに好ましくは４．５〜５．５、最も好ましくは４．８〜５．２になるように維持する。酸性緩衝液として当業界に公示されたものならいずれも使用できるが、好ましくはリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸、塩酸、水（蒸溜水）等を使用することができ、本発明では塩化ナトリウム溶液を使用した。
【００３１】
ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン懸濁液は、タンパク質変成を防止して、プロテアーゼ活性を最小化することができるように低い温度で維持させて、ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン懸濁液と水または添加される緩衝液は、好ましくは−１２〜１０℃、より好ましくは−１２〜０℃、最も好ましくは−１２〜８℃の範囲を維持するようにする。
【００３２】
本発明において、前記（ａ）段階のろ過は、分画ＩＩ溶液を取得するための段階として、清浄ろ過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とし、ｐＨが４．５〜５．５になるように調節して行われることを特徴とする。好ましくはｐＨが４．８〜５．２になるように調節する。
【００３３】
本発明では、分画ＩＩを１０℃以下のジャケット式反応器（ｊａｃｋｅｔｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ）に移して、分画ＩＩ体積４倍の０．６％塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して溶解させた後、溶解した溶液にｐＨが５．０±０．２になるように１Ｍの酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を添加した。次に、溶液を深層ろ過カートリッジを使用して清浄ろ過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して分画ＩＩ溶液（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取得した。
【００３４】
本発明において、前記（ｂ）段階の透析および／または濃縮は、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）；ＵＦ／ＤＦ）システムを利用することを特徴とし、透析濃縮液の浸透圧が１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下まで行った後、ｐＨが５．５〜６．５になるように調節することを特徴とし、好ましくはｐＨが５．９５〜６．３５になるように調節する。
【００３５】
透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）と限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を共に行うことで、溶媒と分子の大きさが異なる二つ以上の溶質が含まれた流体から一部溶質だけ除去する方法であって、高分子物質の精製に効果的であり、通常の透析法に比べて時間と費用が節減される長所がある。
【００３６】
本発明の一実施例では、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＵＦ／ＤＦ）システムを使用して、１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で分画ＩＩ溶液をろ過し、ろ過液に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）を５．０±１．０ｍＭになるように添加してｐＨを６．１５±０．２０に調節して透析および／または濃縮されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンが含まれた水溶液を取得した。
【００３７】
本発明において、前記（ｂ）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ５．５〜７．０、好ましくはｐＨ６．１５±０．２０、流速３０〜１５０ｃｍ／ｈｒの条件で行って、陰イオン交換クロマトグラフィーに付着しなかった分画を１．０〜２．０ローディングボリューム（Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＬＶ）で取得することを特徴とする。
【００３８】
陰イオン交換クロマトグラフィー段階で使用する陰イオン交換樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）系列の陰イオン交換樹脂を使用することができ、この時、第四級アムモニウム（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）基で置き換えられた陰イオン交換樹脂が使用できるが、これに制限されない。好ましくは強塩基性の第四級アムモニウム基を有するグループやまたは弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）グループを有する陰イオン交換樹脂中いずれか一つを選択して使用することができる。
【００３９】
例えば、強塩基性の陰イオン交換グループとしては、Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PWなどを使用することができるが、これに限定されず、当業界に公示された陰イオン交換樹脂を使用することができる。
【００４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーに使用される樹脂の適切な体積は、カラム寸法、すなわち、カラムの径と樹脂の高さによって反映されて、例えば、適用される溶液のヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン溶液量と使用される樹脂の結合性能に応じて異なる。イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、イオン交換樹脂は好ましくは緩衝液で平衡化させて、樹脂がその対イオンと結合することができるようにする。
【００４１】
本発明では、陰イオン交換樹脂としてＤＥＡＥセファロースゲルを使用し、カラム緩衝液としてはリン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等当業界に公示された平衡化バッファー（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）、洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）および溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用することができる。
【００４２】
陰イオン交換クロマトグラフィーでコラムは、１０ｍＭの緩衝溶液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）または酢酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）でｐＨ５．５〜７．０、好ましくはｐＨが６．１５±０．２になるように平衡化させ、移動相の流速は３０〜１５０ｃｍ／ｈｒに調節した。陰イオン交換クロマトグラフィーに付着しなかった分画を１．０〜２．０ローディングボリューム（Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＬＶ）で回収した。
【００４３】
本発明において、前記（ｂ）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、非吸着液を回収することを特徴とする。
【００４４】
本発明において、前記（ｃ）段階は、ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンが含まれた溶液の潜在的脂質外皮ウイルス（ｌｉｐｉｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）等のウイルスを不活性化させて、不活性化以後、不活性化のために使用された物質を除去するための段階として、ウイルス−非活性化剤、好ましくは溶媒および／または洗浄剤、最も好ましくは溶媒−洗浄剤混合物を利用した溶媒および洗浄剤処理（Ｓｏｌｖｅｎｔ  ＆  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が利用できる。
【００４５】
前記（ｃ）段階を介してＨＩＶ１およびＨＩＶ２、肝炎タイプＣおよびｎｏｎ  Ａ−Ｂ−Ｃ、ＨＴＬＶ１および２、ヘルペスウイルス群、ＣＭＶおよびエプスタインバールウイルス等の潜在的脂質外皮ウイルスが不活性化されて、最終製品の安全性を高めることができる。
【００４６】
前記（ｃ）段階で使用できる溶媒および洗浄剤は、ウイルス、特に脂質外皮ウイルスを不活性化させることができる特性を有するものならいずれも制限なしに使用可能である。洗浄剤は、非イオン性およびイオン性洗浄剤からなる群で選択され、実質的に非変成であることが好ましい。特に、除去の容易性の面から、非イオン性洗浄剤が好ましく、溶媒は米国登録特許第４，７６４，３６９号に開示された通りトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ：Ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が最も好ましいが、これに限定されない。
【００４７】
本発明を行うに当たり、特に好ましいウイルス−非活性化剤は、ＴＮＢＰおよびポリソルベート８０（ツイン（Ｔｗｅｅｎ）８０）、トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−４５の中から選択される一つ以上ものの混合物であるが、これに限定されない。
【００４８】
好ましい溶媒／洗浄剤の混合物は、ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン含有溶液中ＴＮＢＰ濃度が０．２〜０．６重量％以内、好ましくは０．２４〜０．３６重量％となるように添加され、ツイン８０の濃度は、０．８〜１．５重量％範囲以内、好ましくは０．８〜１．２重量％の濃度になるように添加する。
【００４９】
ウイルス−非活性化段階は、脂質外皮ウイルスを非活性化させて、実質的にウイルスの危険性がないヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン含有溶液を生成させる条件下で行われる。前記条件で反応温度は、好ましくは４〜３０℃、より好ましくは１９〜２８℃、最も好ましくは２４〜２６℃であり、反応時間は、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは４〜１２時間、最も好ましくは約８時間であり、ウイルスの非活性化を保証するのに十分である。
【００５０】
本発明において、前記（ｃ）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨが５．０〜６．５、好ましくは５．６〜６．０の条件で行うことを特徴とする。
【００５１】
ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを吸着させた後、平衡バッファー（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄する。前記条件で洗浄に利用される平衡バッファーは、カラムボリュームの３倍以上、好ましくは５倍以上の体積を使用して洗浄することができ、洗浄後吸着体積の０．５〜１．５倍以上の溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを溶出する。
【００５２】
陽イオン交換樹脂は、セファデックス（Ｓｅｐｈａｒｄｅｘ）系列の陽イオン交換樹脂、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）系列の陽イオン交換樹脂、ハイパーセル（ＨｙｐｅｒＣｅｌｌ）またはソース（Ｓｏｕｒｃｅ）等を使用することができるが、これに限定されることはなく、他の当業界に公知された陽イオン交換樹脂を使用することができる。本発明では、好ましくはセファデックス（Ｓｅｐｈａｒｄｅｘ）系列の陽イオン交換樹脂を使用することができる。本発明の一実施例では、陽イオン交換樹脂としてＣＭ−セファデックスゲルを使用し、カラム緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等、当業界に公知された平衡バッファー（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）、洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）及び溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。
【００５３】
陽イオン交換樹脂からヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンの溶出は、ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの効率的な溶離を引き起こすのに十分なｐＨおよびイオン強度を有する実質的に非−変成緩衝液で行ってヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン含有溶出液を回収する。「効率的な溶離」とは、陽イオン交換樹脂にローディングされたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン溶液の７５％以上、８０％以上等、例えば、８５％以上等が陽イオン交換樹脂から溶出されることを意味する。
【００５４】
本発明において、前記（ｃ）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換樹脂でヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンを置き換えるのに充分なほど高い溶出緩衝液の塩濃度で行うことができ、５００〜１，５００ｍＭの塩濃度、好ましくは８００〜１，２００ｍＭの塩濃度で行うことができる。
【００５５】
また、本発明において、前記（ｄ）段階の透析および／または濃縮は、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）；ＵＦ／ＤＦ）システムを利用して、透析濃縮液の浸透圧１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下、ｐＨ３．５〜４．５、好ましくはｐＨ３．８±０．２で行われることを特徴とする。
【００５６】
本発明では、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液から低分子イオンを除去するために透析ろ過を行い、ＵＦ／ＤＦシステムの浸透圧が１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下になるようにした。その後、ろ過液に塩酸（ＨＣｌ）を添加してｐＨを３．８±０．２に調節した。
【００５７】
本発明において、前記（ｅ）段階のろ過は、ナノろ過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システムを利用して、１．５〜２．５ｂａｒの圧力条件で行うことを特徴とする。
【００５８】
本発明において、前記（ｅ）段階を終えた後、安定化剤を添加して静脈注射用ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤を製造する段階をさらに含んでもよい。
【００５９】
ナノろ過を行った後、追加で添加することができる１つ以上のタンパク質安定化剤としては、当業界に公知された様々な糖アルコール、糖類（ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、マルトース）、タンパク質（アルブミン等）、アミノ酸（リジン、グリシン等）及び有機作用剤（ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ８０等）が含まれる。
【００６０】
本発明において、前記（ｅ）段階の後、追加添加される安定化剤は、糖アルコール、マルトース、ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、アルブミン、リジン、グリシン、ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ８０の中から選択される１つ以上であることを特徴とし、好ましくはマルトースを使用する。
【００６１】
前記安定化剤は、最終濃度が９０〜１１０ｇ／ｌとなるように添加することを特徴とし、安定化剤を添加した後、ｐＨを３．５〜４．５に調節することを特徴とし、好ましくはｐＨ３．６〜４．０になるように酸、好ましくは硫酸または塩酸を添加することにより成されることができる。
【００６２】
ナノろ過は、重要なウイルス除去段階で、本発明で透析濃縮されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン溶液を２．０±０．５ｂａｒ圧力より大きくならないようポールＤＶＤプレフィルター（Ｐａｌｌ  ＤＶＤ  ｐｒｅ−ｆｉｌｔｅｒ）およびＤＶ２０ウイルスフィルターを介してろ過させてヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン溶液中に含まれたウイルスを除去した。次に、ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンの安定化のために、ナノろ過されたろ過液にマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を最終濃度が９０〜１１０ｇ／ｌになるように添加して混合させて、安定化されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン溶液のｐＨが３．０〜４．６、好ましくは３．６〜４．０になるように塩酸を追加して調節して、０．２μｍフィルターを利用して滅菌させて保管した。
【００６３】
前記滅菌された静脈注射用ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤は、タンパク質濃度（精製されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン）が全体体積の１〜２０重量％になるように希釈させるか濃縮させることを特徴とし、本発明ではタンパク質の濃度が４０〜６０ｇ／ｌ、好ましくは４５〜５５ｇ／ｌ、さらに好ましくは４９．５〜５０．５ｇ／ｌになるようにＷＦＩで希釈するか限外ろ過で濃縮させた後、力価を２００ＩＵ／ｍＬ以上に調整した後、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を最終濃度が９０〜１１０ｇ／ｌになるように添加して完全に混合させた後、安定化されたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤のｐＨを測定してｐＨが４．２±０．２になるように塩酸を追加添加して調節することで静脈注射用ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の最終剤形を製造した。
【００６４】
本発明の一実施例で、製造段階別免疫グロブリン溶液の純度（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ／ＩｇＧ）及び製造段階別ろ過液または沈殿物に含まれた不純物（血液凝固因子（フィブリノーゲン、アルブミン、ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＫＡ）およびトランスフェリン等）およびＢ型肝炎免疫グロブリンと類似タンパク質（ＩｇＡおよびＩｇＥ））の濃度を測定した結果、多くの不純物が精製工程を経ると共に除去されたことを確認することができた（表１および表２）。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６６】
実施例１：静脈注射用ヒトＢ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造
１−１：血漿（ｐｌａｓｍａ）の準備
血漿は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する核酸増幅検査（ＮＡＴ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）および血清学的検査を含むバイオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ）が行われ、ＦＤＡの承認を受けた血漿を使用した。
【００６７】
本発明では赤十字由来血漿（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．６００Ａ９００８）を使用して、血漿は使用する前まで−２０℃以下で保管した。血漿が含まれている瓶は、カット機器（ｂｏｔｔｌｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）でオープンして、１〜６℃のジャケット式反応器（ｊａｃｋｅｔｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ）で１２〜７２時間反応させて血漿を溶かした。
【００６８】
前記条件で血漿が溶けながらフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）および凝固因子（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれた凍結沈降血漿（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）が生成されるが、遠心分離（条件説明）を介して凍結沈降血漿を除去させて、凍結沈降血漿が除去された冷凍欠乏性血漿（ｃｒｙｏｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）を回収した。
【００６９】
１−２：沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）Ｉ段階
前記冷凍欠乏性血漿で凝固因子を追加的に除去するために、沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）Ｉ段階を行った。
【００７０】
最終エタノール濃度が−３±１℃で８±０．８％になるように実施例１−１で回収した冷凍欠乏性血漿に９６％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）を添加した後（添加Ｉ）、アセテートバッファー（ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用してｐＨが７．２±０．２なるように調節した。遠心分離（条件）を介して沈殿物を除去して、上澄み液（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｉ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収して、その後全生菌数測定（ｔｏｔａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｏｕｎｔ）を行うために一部をサンプリングして保管した。
【００７１】
１−３：沈殿ＩＩ＋ＩＩＩ段階およびろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
実施例１−２で回収した上澄み液に含まれたヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン（Ｈｅｐａｂｉｇ、ＨＢＩＧ）を沈殿させるために沈殿ＩＩ＋ＩＩＩ段階を行った。
【００７２】
最終エタノール濃度が−５±１．０℃で２０±２％になるように実施例１−２で回収した上澄み液に９６％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）を添加した後（添加ＩＩ＋ＩＩＩ）、アセテートバッファー（ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用してｐＨが６．９±０．１なるように調節した。
【００７３】
その後、血漿ｋｇ当たりフィルター補助剤（Ｃｅｌｉｔｅ（ＳＴＤ）、Ｈａｒｂｏｌｉｔｅ（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｅｒｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ））０．０２８４ｋｇずつ添加して３０±１０分間混合させた。混合物を２〜８℃に維持させたコールドルーム（ｃｏｌｄ  ｒｏｏｍ）中フィルタープレス（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｅｓｓ、ＤＧ８００Ｋ）を使用して上澄み液と沈殿物を分離させた。
【００７４】
上澄み液はろ液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（またはＩＩ＋ＩＩＩ）と命名して、沈殿物は分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩｗ（またはＩＩ＋ＩＩＩｗ）と命名した（ｗ；ｗａｓｈ）。分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩｗ（またはＩＩ＋ＩＩＩｗ）は直ちに使用するか−２０℃以下で保管する。
【００７５】
１−４：沈殿ＩＩＩ段階およびろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
ヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリンが含まれた分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩｗ（またはＩＩ＋ＩＩＩｗ）で追加的二アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）および他の望ましくないタンパク質（ｏｔｈｅｒ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を除去するために沈殿ＩＩＩ段階を行った。
【００７６】
実施例１−３で回収した分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩｗ（またはＩＩ＋ＩＩＩｗ）を冷たい蒸溜水（ｃｏｌｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）に溶かした後、その後全生菌数測定（ｔｏｔａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｏｕｎｔ）をするために一部をサンプリングして保管した。前記蒸溜水に溶かした分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩｗ（またはＩＩ＋ＩＩＩｗ）に最終エタノール濃度が−５±１．０℃で１８±１．８％になるように９６％エタノールを添加して（添加ＩＩＩ）、−６℃で予め準備しておいたアセテートバッファー（ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用してｐＨが５．２±０．１なるように調節した。
【００７７】
混合物をフィルタープレス（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｅｓｓ、ＤＧ８００Ｋ）を使用して上澄み液と沈殿物を分離させた。上澄み液はろ過液（ｆｉｌｔｒａｔｅ）Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）と命名して、沈殿物は、分画Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）と命名した。分画Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）は廃棄して、ろ過液Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）はその後全生菌数測定（ｔｏｔａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｏｕｎｔ）をするために一部をサンプリングして保管した。
【００７８】
１−５：沈殿ＩＩ段階およびろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
実施例１−４のろ過液Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）でヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを沈殿させるために沈殿ＩＩ段階を行った。
【００７９】
最終エタノール濃度が−１０±２．０℃で２５±２．５％になるようにろ過液Ｉ＋ＩＩＩ（またはＩＩＩ）に９６％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）を添加して、１Ｍ炭酸水素ナトリウム（中炭酸ナトリウム；ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を使用してｐＨが７．４±０．２なるように調節した。
【００８０】
混合物をフィルタープレス（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｅｓｓ、ＤＧ８００Ｋ）を使用して上澄み液と沈殿物を分離させた。沈殿物を分画ＩＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）と命名し、その後バクテリアエンドトキシン、タンパク質含有量および構成を測定するために一部をサンプリングして保管した。
【００８１】
１−６：分画ＩＩ溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）および清浄ろ過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
血漿から分離したヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの含有量を高めて血栓生成物質を除去するための分離精製過程を行った。
【００８２】
先ず、実施例１−５で分離したヒトＢ型肝炎免疫グロブリンが含まれた分画ＩＩを溶解させて透析過程に適する条件を有するように調節した。分画ＩＩは１０℃以下のジャケット式反応器（ｊａｃｋｅｔｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ）に移して、分画ＩＩボリューム４倍の０．６％塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を添加して溶解させて、タンパク質含有量および構成を測定するために一部サンプリングして保管した。
【００８３】
次に、１Ｍの酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を使用して溶解した溶液のｐＨが５．０±０．２なるように調節した後、溶液を深層ろ過カートリッジ（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ；ＢｅｃｏｄｉｓｋＢＰ０１）を使用して清浄ろ過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して分画ＩＩ溶液（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取得した。
【００８４】
１−７：透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
実施例１−６で取得したヒトＢ型肝炎免疫グロブリンが含まれた分画ＩＩ溶液でエタノールと低分子イオンを除去して、陰イオン交換クロマトグラフィー過程に適する条件を有するようにｐＨを調節した。
【００８５】
ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンが含まれた分画ＩＩ溶液は、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２（５０Ｋ））システムを使用して１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で透析ろ過を行って、取得されたろ過液はその後タンパク質含有量、構成および生菌を測定するために一部をサンプリングして保管した。
【００８６】
前記ろ過液に０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を１０．０±１．０ｍＭになるように添加してｐＨを６．１５±０．２に調節して透析および／または濃縮されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液を取得した。
【００８７】
１−８：陰イオン交換クロマトグラフィー（ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
実施例１−７で取得した透析および／または濃縮されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液中に含まれたポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）および他の血漿タンパク質を除去するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００８８】
陰イオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセファロスゲル（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｇｅｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１７−０７０９）をカラムに充填した後、平衡化バッファー（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用してｐＨが６．１５±０．２になるように平衡化させた。その後、実施例１−７で取得した透析および／または濃縮されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液を流速５０±１０ｃｍ／ｈｒになるようにカラムにローディングして、陰イオン交換クロマトグラフィーに付着しなかった分画を１．５ローディングボリューム（Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＬＶ）で回収した。
【００８９】
１−９：ウイルス不活性化のための溶媒および洗浄剤処理（ｓｏｌｖｅｎｔ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンが含まれた溶液の潜在的脂質外皮ウイルス（ｌｉｐｉｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）を不活性化させるために溶媒および洗剤を処理する段階を行った。
【００９０】
先ず、実施例１−８で回収した陰イオン交換クロマトグラフィーに付着しなかった分画に塩酸（ＨＣｌ）または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加してｐＨが５．０±０．２なるように調節して、トリ（ｎ−ブチル）−ホスフェート（Ｔｒｉ（ｎ−ｂｕｔｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＴＮＢＰ）およびポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０；Ｔｗｅｅｎ８０）を各々０．３±０．０６％および１±０．２％の濃度になるように添加した後、２０〜３０分間２００±５０ＲＰＭで撹はんした。溶液中のＴＮＢＰおよびＴｗｅｅｎ８０が均一に混合されたか確認するため、一部をサンプリングして確認して、その後２５±１．０℃で８時間２００±５０ＲＰＭで持続的に撹はんした。撹はんが完了した後、ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンが含まれた溶液はハードパイプラインを介してウイルス安全領域（ｖｉｒａｌ  ｓｅｃｕｒｅ  ａｒｅａ；ＶＳＡ）である別のタンクに移した。
【００９１】
１−１０：陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
溶媒／洗剤処理されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液でＴＮＢＰ、Ｔｗｅｅｎ８０および凝固因子等が異なる血栓生成物質を除去するために、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００９２】
陽イオン交換樹脂は、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカラムに充填した後、平衡化バッファー（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用してｐＨが５．８±０．２になるように平衡化させた。その後、実施例１−９の溶媒／洗剤処理されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液を３±１時間吸着した。その後、吸着体積の２〜３倍の洗浄バッファーを使用して７回洗浄した。洗浄した後、溶出バッファー（溶出バッファーの組成：１．０Ｍ  ＮａＣｌ）を使用してヒトＢ型肝炎免疫グロブリンを溶出させて回収した。
【００９３】
１−１１：透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液から低分子イオンを除去するために、透析ろ過を行った。
【００９４】
実施例１−１０で取得した溶出液は、限外ろ過／透析ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システムを使用して１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で透析ろ過を行って、ＵＦ／ＤＦシステムは重合体含有量を維持するために、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液を計算された透析濃縮液に添加して１００ｍＭ塩化ナトリウム以下の濃度を維持させながら連続的に進行した。
【００９５】
取得されたろ過液は、その後タンパク質含有量、構成および生菌を測定するために一部をサンプリングして保管して、残ったろ過液に塩酸（ＨＣｌ）を添加してｐＨを４．２±０．２に調節した。
【００９６】
１−１２：ナノろ過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）の追加
ナノろ過は重要なウイルス除去段階で、実施例１−１１で透析濃縮されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液をプレフィルター（Ｆｌｏｒｏｄｙｎｅ  ＩＩ  ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ、ＡＢ１ＤＪＬ７ＰＨ４）等でろ過して、２．０±０．５ｂａｒ圧力条件下でウイルスフィルター（ＤＶ２０、ＡＢ３ＤＶ２０７ＰＨ４）を介してろ過させて、ヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液中に含まれたウイルスを除去した。
【００９７】
ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの安定化のために、ナノろ過されたろ過液にマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を最終濃度が１０±１重量％になるように添加して完全に混ぜた。安定化されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン溶液のｐＨを測定してｐＨが３．８±０．２になるように塩酸を追加して調節した。
【００９８】
次に、ろ過液を０．２μｍフィルターを利用して滅菌させて、ステンレススチール貯蔵タンクに移して保管した。
【００９９】
１−１３：静脈注射用ヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの最終剤形製造および無菌充填
静脈注射用ヒトＢ型肝炎免疫グロブリン製剤のタンパク質濃度が５０±１ｇ／ｌになるようにＷＦＩで希釈するか限外ろ過で濃縮させた後、アルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を最終濃度が１０±１重量％になるように添加して完全に混合させた後、力価を２００ＩＵ／ｍＬ以上に調整した。その後、安定化されたヒトＢ型肝炎免疫グロブリン製剤のｐＨを測定してｐＨが４．２±０．２になるように塩酸を追加して調節した。
【０１００】
ヒトＢ型肝炎免疫グロブリン製剤は、ｐＨ調整後滅菌させて、充填のために充填室に移して製品を製造した後２〜８℃に保管した。
【０１０１】
実施例２：製造段階別ろ過液または沈殿物に含まれた不純物の濃度測定
血栓凝固剤の除去程度を確認するために、前記実施例１の製造段階別ろ過液または沈殿物に含まれたフィブリノーゲン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡおよびＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｓｓａｙｐｒｏ、Ｋｏｒｅａ）で測定して、ＰＫＡ（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）活性は実施例１の製造段階別ろ過液または沈殿物に含まれたＰＫＡの活性をカリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）基質溶液（Ｓ−２３０２．Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して２８０ｎｍで分当たり吸光度を測定して計算した。
【０１０２】
【表１】
0006514412.tif 000002
【０１０３】
【表２】
0006514412.tif 000003
【０１０４】
前記表１および表２で分離精製効率と関連して、ＰＫＡはプレカリクレインが第１２因子等の物質によって活性化してカリクレインに転換するに当たり、残っているプレカリクレインの活性測定を介して第１２因子などの不純物が除去されたか否かを確認できる因子であり、単位はＩＵ／ｍｌである。ＬＲＶはｌｏｇ単位の該当不純物の除去値をいい、算術的には−ｌｏｇ（（収集液×１ｍｌ当たり不純物の含有量（ｍｇ））／（ローディング液×１ｍｌ当たり不純物の含有量（ｍｇ）））を意味する。
【０１０５】
本発明の精製工程の産物の不純物（フィブリノーゲン、アルブミン、トランスフェリン、ＰＫＡ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）含有量を測定した結果、表１および表２に開示された通り、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー工程から不純物の濃度が減少し始め、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー工程の溶出液では非常に低い濃度で不純物が検出されて、特にフィブリノーゲン、アルブミン、トランスフェリン、ＰＫＡ、ＩｇＡおよびＩｇＥの場合、該当工程を経ると共に大部分除去されることを確認することができた。
【０１０６】
実施例３：クロマトグラフィー条件最適化
イオン交換クロマトグラフィーの順序および条件を最適化するために、実施例１のクロマトグラフィー段階の順序と条件を下記の図２のような方法で調節して、溶出液に含まれたフィブリノーゲン、アルブミン、トランスフェリンおよびＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｓｓａｙｐｒｏ、Ｋｏｒｅａ）で測定して、ＰＫＡ（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）活性は、図２の溶出液に含まれたＰＫＡの活性をカリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）基質溶液（Ｓ−２３０２．Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して２８０ｎｍで分当たり吸光度を測定して計算した。
【０１０７】
その結果、図２に開示された通り実施例１のようにｐＨ６．１５の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後、陽イオン交換クロマトグラフィーを行う方法が最も効率が高く、不純物が少なく出ることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明に係るヒト血漿由来Ｂ型肝炎免疫グロブリン製剤の製造方法を利用すると、不純物および血栓生成物質の除去効率を高めて、重合体含有量を維持することができるため、安定的で向上した品質のヒトＢ型肝炎免疫グロブリンの生産が可能である。
【０１０９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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