(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している患者の処置を選択するためにＨｅｒ２ペプチドのレベルを測定する方法であって、
（ａ）質量分析を用いた選択反応モニタリングにより、前記患者から得られた腫瘍サンプルから調製されたタンパク質消化物において特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドのレベルを定量し、前記サンプル中のＨｅｒ２ペプチドのレベルを計算すること、
（ｂ）前記Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルを参照レベルと比較すること、および
（ｃ）Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルよりも高い場合に、有効量の抗Ｈｅｒ２治療薬を含んでなる治療計画を選択し、Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルよりも低い場合に、有効量の抗Ｈｅｒ２治療薬を含まない治療計画を選択するという基準と比較すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記参照レベルが、約１８２５ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇ、または＋／−２５ａｍｏｌ／μｇの被分析生体サンプルタンパク質であり、前記癌が、婦人科癌、食道癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ型質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析、ＭＡＬＤＩ型質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極型質量分析および／または飛行時間型質量分析を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特定されたＨｅｒ２ペプチドが、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍サンプルが、細胞、細胞の集合体、または固形組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍サンプルがホルマリン固定固形組織である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組織がパラフィン包埋組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの定量が、添加した既知量の内部標準ペプチドと比較することにより、前記サンプル中のＨｅｒ２ペプチドの量を決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび前記内部標準ペプチドは両方とも配列番号１に示されるＨｅｒ２フラグメントペプチドの同じアミノ酸配列に相当する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈおよびそれらの組合せからなる群から選択される１以上の重い安定同位体を含む同位体標識ペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
どの薬剤が処置に使用されるかに関する処置決定が、その生体サンプル中の特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドと他のペプチド／タンパク質との組合せの特定のレベルに基づくように、特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの検出および定量を、他のタンパク質由来の他のペプチドの検出および定量と多重的に組み合わせることができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特定されたペプチドの前記レベルが前記参照レベルよりも高ければ、前記抗Ｈｅｒ２治療薬がトラスツズマブを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記特定されたペプチドの前記レベルが前記参照レベルよりも低ければ、治療処置は前記抗Ｈｅｒ２治療薬トラスツズマブを含まない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本出願は、それぞれ「Quantifying Her2 Protein for Optimal Cancer Therapy」と題された２０１５年５月２９日出願の米国仮出願第６２／１６８，７０９号および２０１６年３月１８日出願の米国仮出願第６２／３１０，６３９の利益を主張する。本出願はまた、ＥＦＳウェブから電子的に提出された配列表も含み、この配列表は紙複写およびコンピューターで読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の両方として機能し、２０１６年５月３１日に作成された４４４バイトの大きさの「001152_8047_US02_SEQ_LISTING」の名称のファイルからなり、これもまた引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。
【０００２】
緒論
患者からの腫瘍組織をアッセイし、それらの患者が抗Ｈｅｒ２治療薬による処置に応答する可能性が高いかどうかを識別するための方法が提供される。腫瘍組織におけるＨｅｒ２発現のレベルは、全長Ｈｅｒ２タンパク質（Ｎｅｕ癌原遺伝子、ｃ−ＥｒｂＢ−２、チロシンキナーゼ型細胞表面受容体ＨＥＲ２、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、およびＣＤ３４０とも呼ばれる）の部分配列に由来する特定されたペプチドを提供することにより決定され、このレベルが参照レベルと比較される。Ｈｅｒ２発現のレベルが参照レベルより高ければ、その患者は、少なくとも１つの抗Ｈｅｒ２治療薬を含む計画で処置され、そのレベルが参照レベルよりも低ければ、その患者は、抗Ｈｅｒ２薬剤を含まない計画で処置される。
【０００３】
特定されたペプチドは、質量分析に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれ、本明細書ではＳＲＭ／ＭＲＭアッセイと呼称する）を用いて検出される。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、癌患者組織、例えば、ホルマリン固定癌組織から取得された細胞において直接、特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの存在を検出し、その量を定量的に測定するために使用される。ペプチドの量は腫瘍サンプルにおける無傷のＨｅｒ２タンパク質の量の定量化を可能とする。特定の最適化された治療薬および治療戦略は、個々の癌患者の疾患を処置するために、どのくらいのＨｅｒ２タンパク質が患者の癌細胞中に存在するかに基づいて使用することができる。
【発明の概要】
【０００４】
癌に罹患している患者を処置するための方法が提供される。本方法の工程には以下のものが含まれる：
（ａ）質量分析を用いた選択反応モニタリングにより、前記患者から得られた腫瘍サンプルから調製されたタンパク質消化物において特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドのレベルを定量し、前記サンプル中のＨｅｒ２ペプチドのレベルを計算すること、
（ｂ）前記Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルを参照レベルと比較すること、および
（ｃ）Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルよりも高い場合に、有効量の抗Ｈｅｒ２治療薬を含んでなる治療計画で患者を処置すること、または
（ｄ）Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルよりも低い場合に、有効量の抗Ｈｅｒ２治療薬を含まない治療計画で患者を処置すること。
【０００５】
前記参照レベルは、約１８２５ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５ａｍｏｌ／μｇの被分析生体サンプルタンパク質であり得、前記癌は、例えば、婦人科癌、食道癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌または肺癌であり得る。有利には、癌は胃癌である。
【０００６】
前記生体サンプルのタンパク質消化物は、リキッドティッシュプロトコールにより調製され得る。前記タンパク質消化物は、例えばトリプシン消化物などのプロテアーゼ消化物を含んでなり得る。
【０００７】
前記質量分析の方法は、タンデム型質量分析、イオントラップ型質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析、ＭＡＬＤＩ型質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極型質量分析および／または飛行時間型質量分析を含み得る。使用される質量分析のモードは、例えば、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る。これらの方法では、特定されたＨｅｒ２ペプチドは、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有し得る。
【０００８】
前記腫瘍サンプルは、細胞、細胞の集合体、または固形組織であり得、パラフィン包埋組織を含む、ホルマリン固定固形組織であり得る。特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドは、有利には、添加した既知量の内部標準ペプチドと比較することにより定量することができ、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび内部標準ペプチドは両方とも配列番号１に示されるＨｅｒ２フラグメントペプチドの同じアミノ酸配列に相当する。有利には、前記内部標準ペプチドは、例えば１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択される１以上の重い安定同位体で標識された同位元素標識ペプチドである。
【０００９】
特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの測定は、どの薬剤が処置に使用されるかに関する処置決定が、その生体サンプル中の特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドと他のペプチド／タンパク質との組合せの特定のレベルに基づくように、他のタンパク質由来の他のペプチドの検出および定量と多重的に組み合わせることができる。
【００１０】
上記の方法で、特定されたペプチドのレベルが参照レベルよりも高ければ、抗Ｈｅｒ２治療薬がトラスツズマブを含み得、一方、特定されたペプチドのレベルが参照レベルよりも低ければ、治療処置はトラスツズマブを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、トラスツズマブおよび化学療法で処置した患者と化学療法単独で処置した患者の無増悪生存率の比較を示す。このデータは、Ｈｅｒ２＞１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者とＨｅｒ２＜１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者を比べたものである。
【図２】図２は、トラスツズマブおよび化学療法で処置した患者と化学療法単独で処置した患者の全生存率の比較を示す。このデータは、Ｈｅｒ２＞１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者とＨｅｒ２＜１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者を比べたものである。
【発明の具体的説明】
【００１２】
癌患者がＨｅｒ２タンパク質を特異的に標的とする癌治療薬に有利な様式で臨床応答するかどうかを決定するための定量方法が提供される。具体的には、腫瘍サンプルまたは患者由来のサンプルにおいてＨｅｒ２タンパク質を測定するための診断方法が提供され、得られる定量的データはその患者のその後の処置決定を導くために使用される。サンプルは有利にはホルマリン固定される。特定のＨｅｒ２ペプチドフラグメントを測定するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイおよびこのペプチドに関する特定の特徴を用い、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に由来する細胞におけるＨｅｒ２の量が決定される。このペプチドフラグメントは全長Ｈｅｒ２タンパク質の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に由来し、配列ＥＬＶＳＥＦＳＲを有する。驚くことに、このペプチドは腫瘍組織のＦＦＰＥサンプルから調製された消化物において信頼性をもって検出および定量できることが見出された。米国特許出願第１３，９９３，０４５号参照、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。
【００１３】
より具体的には、このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌患者組織などの患者の組織サンプルから取得された細胞から調製された複雑なタンパク質溶解液サンプルにおいて、このペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載され、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、好都合には、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックヴィル、Ｍｄ．）から入手可能なリキッドティッシュ試薬およびプロトコールを用いて実施され得る。
【００１４】
癌患者からの最も広くかつ有利に入手可能な組織および癌組織の形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に取り出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界的にみても、癌組織サンプルを保存する断然最も一般的な方法であり、標準的な病理学実践において受け入れられている慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中ホルムアルデヒドの飽和溶液（約４０容量％または３７質量％）からなり、酸化および重合度を限定するために少量の安定剤、通常はメタノールを含む。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体を長時間（８時間〜４８時間）、一般に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれるホルムアルデヒド水溶液に浸漬し、次いで、その固定組織全体を室温で長期保存するためにパラフィンワックスに包理するというものである。よって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析法が、癌患者組織の分析のための、最も許容され、頻用される方法となる。
【００１５】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの結果は、組織が採取および保存された患者の特定の癌内のＨｅｒ２タンパク質の正確かつ精密な定量的レベルと相関させるために使用することができる。これにより、その癌に関する診断情報が提供されるだけでなく、医師またはその他の医療専門家がその患者に適当な療法を導く客観的基準も提供する。この場合、本アッセイを用いると、癌組織におけるＨｅｒ２タンパク質発現の具体的なレベルに関する情報が提供され、その癌組織が得られた患者が、Ｈｅｒ２タンパク質の機能を特異的に阻害し、かつ／またはその存在を低減するように設計された抗癌治療薬による療法に有利な様式で応答するかどうかを示す。
【００１６】
抗Ｈｅｒ２治療薬による癌患者の治療は、癌の成長を防ぎ、婦人科癌、食道癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、および胃癌に罹患している癌患者を含む、癌患者の生命を延長するための最も一般的で有効な戦略の１つである。婦人科癌には、例えば、子宮頸癌、卵巣癌、子宮癌、膣癌、および外陰癌を含み得る。
【００１７】
Ｈｅｒ２タンパク質は、上皮細胞で発現されるシグナル受容体タンパク質であり、通常、Ｈｅｒ２受容体は、健康な細胞がそれ自体どのように成長し、分裂し、修復するかを制御する助けをする。しかしながら、いくつかの癌では、癌細胞は、Ｈｅｒ２受容体を多く作り過ぎる（Ｈｅｒ２タンパク質の過剰発現）。これにより細胞は制御を欠いた様式で成長および分裂する。多くの場合、このタンパク質の過剰発現には増幅されたＨｅｒ２遺伝子が伴い、その結果、この遺伝子の複数のコピーが生じる（Ｈｅｒ２遺伝子増幅として知られる）。多くの場合、Ｈｅｒ２遺伝子のこれらの余分なコピーは、Ｈｅｒ２受容体の発現の上昇を招く（Ｈｅｒ２タンパク質の過剰発現）。従って、いくつかの抗Ｈｅｒ２治療薬がＨｅｒ２陽性と見なされる癌を治療するために利用できることから、患者の癌細胞において過剰なＨｅｒ２タンパク質が存在するかどうかを知ることは医師にとって有用である。
【００１８】
現在のところ、癌患者が抗Ｈｅｒ２処置戦略の候補であるかどうかを決定するためには２つの基本的検査がある。両検査とも、患者由来の腫瘍サンプルの薄層切片を使用する。第１の検査は、癌細胞においてＨｅｒ２タンパク質を検出するための抗体を使用し、それらの細胞に過剰なＨｅｒ２タンパク質が存在するかどうかを決定しようとするＩＨＣ（免疫組織化学）検査である。ＩＨＣ検査の結果は、０（陰性）、１＋（これもまた陰性）、２＋（ボーダーライン）、または３＋（Ｈｅｒ２タンパク質過剰発現陽性）であり得る。第２の検査は、癌細胞においてＨｅｒ２遺伝子の過剰なコピーが存在するかどうかを測定しようとするＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）検査である。ＦＩＳＨ検査の結果は、陽性（Ｈｅｒ２遺伝子増幅）または陰性（Ｈｅｒ２  遺伝子増幅無し）であり得る。この検査は、Ｈｅｒ２遺伝子増幅がＨｅｒ２タンパク質の過剰発現を生じることを推論するものの、Ｈｅｒ２タンパク質発現の測定を直接提供するものではない。
【００１９】
一般に、ＩＨＣ  ３＋と判定されるか、またはＦＩＳＨ陽性である癌のみが、Ｈｅｒ２陽性癌を標的とする治療薬に応答し得る。ＩＨＣ  ２＋の判定結果はボーダーラインと考えられ、腫瘍がＩＨＣ  ２＋のスコアになれば、その組織はより厳密なＨｅｒ２  ＦＩＳＨ検査で再検査される。ＩＨＣ検査もＦＩＳＨ検査も、ＨＥＲ２陽性集団においてトラスツズマブ感受性の感受性などの抗ＨＥＲ２治療薬に対する感受性を予測する定量的データを提供するものではない。
【００２０】
Ｈｅｒ２状態のいくつかの検査結果が誤っている可能性があることを示した研究がある。これはおそらく、研究室によって陽性および陰性のＨｅｒ２状態を分類するための規則が異なるためである。それらの検査を行っている病理学者もまた、それらの結果が陽性か陰性かを決定するために異なる判定基準を用いている可能性がある。ほとんどの場合、これはそれらの検査結果がボーダーラインである場合、すなわち、それらの結果が強くＨｅｒ２陽性でもＨｅｒ２陰性でもない場合に起こる。他の場合では、腫瘍のある領域からの組織はＨｅｒ２陽性と判定されるが、その腫瘍の他の領域からの組織はＨｅｒ２陰性と判定される。不正確なＨｅｒ２検査結果は、癌と診断された患者が可能性のある最良のケアを受けない場合があることを意味し得る。癌の全部または一部がＨｅｒ２陽性であるが検査結果がそれをＨＥＲ２陰性と分類する場合、医師は、その患者がそれらの薬剤からおそらく利益を受け得るとしても、抗Ｈｅｒ２治療処置を推奨しないと思われる。癌がＨｅｒ２陰性であるが検査結果がそれをＨＥＲ２陽性と分類する場合には、医師は、その患者が利益を得る見込みがなく薬剤の二次的リスクに曝されるとしても、抗Ｈｅｒ２治療処置を推奨するであろう。
【００２１】
Ｈｅｒ２遺伝子増幅および／またはＨｅｒ２タンパク質過剰発現を有する癌は、病理レポートではＨｅｒ２陽性と呼ばれる。Ｈｅｒ２陽性癌は、Ｈｅｒ２陰性癌に比べて成長が速い傾向があり、拡散および再発する可能性が高い。しかしながら、Ｈｅｒ２タンパク質と特異的に結合してその機能を阻害する治療薬が利用可能であり、患者の腫瘍がＨｅｒ２陽性と判定される場合に指示される。例えば、最も慣用される抗Ｈｅｒ２薬は、それ自体が癌細胞上のＨｅｒ２受容体に結合してそれらが成長シグナルを受け取るのを遮断することにより働くモノクローナル抗体ハーセプチン（化学名：トラスツズマブ）である。これらのシグナルを遮断することにより、ハーセプチンは、癌成長の緩徐化または停止を助けさえし得る。Ｈｅｒ２受容体を遮断することに加え、ハーセプチンはまた、それが結合する癌細胞を破壊するように免疫系を変更することにより癌と闘う助けをすることができる。
【００２２】
進行したＨｅｒ２陽性癌を有する一部の患者の別の抗Ｈｅｒ２治療選択肢は、タイケルブ（化学名：ラパチニブ）である。タイケルブは、細胞を異常に成長および分裂させる特定のタンパク質に干渉することにより働く。タイケルブは、１）アントラサイクリンおよびタキサンなどの他の形態の化学療法、ならびにハーセプチンへの応答を停止した進行したＨＥＲ２陽性癌を処置するための化学療法の一種であるゼローダ（化学名：カペシタビン）、２）ホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２陽性の進行した病期の癌と診断された閉経後の女性を処置するためのホルモン療法の一種としてのフェマーラ（化学名：レトロゾール）、といった他の非Ｈｅｒ２標的薬と併用することができる。他の抗Ｈｅｒ２治療薬としては、限定されるものではないが、ペルツズマブ（Ｈｅｒ２と他のＨＥＲタンパク質との二量体形成を阻害する抗体）およびネラチニブ（Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害するキナーゼ阻害剤）が挙げられる。
【００２３】
よって、患者が最適な療法を受ける最大の機会を得るように、腫瘍、特に腫瘍においてＨｅｒ２タンパク質の定量的レベルを適正に評価できることには大きな臨床的価値がある。
【００２４】
ペプチドの検出および特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの定量的レベルの決定は、リキッドティッシュ溶解液中に存在する複雑なペプチド混合物内で各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が決定されるＳＲＭ／ＭＲＭ法（例えば、上記のような米国特許第７，４７３，５３２号参照）により質量分析計で実施される。次に、Ｈｅｒ２タンパク質の定量的レベルは、ある生体サンプル中のＨｅｒ２タンパク質に由来する個々の特定されたペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、個々の特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの既知量の「添加された」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較されるＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定される。
【００２５】
１つの実施態様では、内部標準は、１以上の重い同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する同じ正確なＨｅｒ２フラグメントペプチドの合成型である。このような同位体標識内部標準は、質量分析が、天然Ｈｅｒ２フラグメントペプチドクロマトグラフィーシグネチャーピークとは異なり明瞭に区別され、コンパレータピークとして使用できる予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークを生じるように合成される。よって、内部標準が生体サンプルからのタンパク質またはペプチド調製物に既知の量で添加され、質量分析により分析される場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較され、この数的比較が、生体サンプルからの元のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対的モル濃度および／または絶対的重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドに関する絶対的定量的データは、サンプル当たりに分析されるタンパク質の量に応じて示される。
【００２６】
Ｈｅｒ２フラグメントペプチドのためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するためには、単なるペプチド配列を超える付加的情報が質量分析計により利用される。その付加的情報は、質量分析計（例えば、三連四重極型質量分析計）に特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドの適正かつ集中的分析を実施させる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う際の重要な考慮事項は、そのようなアッセイが三連四重極型質量分析計で有効に実施できることである。現在のところ、このタイプの質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質に由来する数百ないし数千から数百万までの個々のペプチドからなり得る極めて複雑なタンパク質溶解液内で単一の単離された標的ペプチドを分析するために最も適した機器であると考えられる。付加的情報は三連四重極型質量分析計に、細胞内に含まれる全タンパク質に由来する数百ないし数千から数百万までの個々のペプチドからなり得る極めて複雑なタンパク質溶解液内で単一の単離された標的ペプチドの分析を可能とする適正な指示を与える。
【００２７】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ型、イオントラップ型、または三連四重極型を含む、いずれのタイプの質量分析計に対しても開発および実施可能であるが、現在のところ、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために最も有利なインストルメントプラットフォームは、大抵の場合、三連四重極型インストルメントプラットフォームであると考えられる。一般に標的ペプチドに関する、特には、特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドに関する付加的情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプのうち１以上を含み得る。この特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドのペプチド配列、およびこの特定されたＨｅｒ２フラグメントペプチドに関して報告されている必要な付加的情報を表１に示す。
【００２８】
【表１】
0006524266.tif 000002
【００２９】
Ｈｅｒ２定量化に適当な参照レベルを決定するために、癌、例えば胃癌に罹患している患者のコホートから腫瘍サンプルを得る。腫瘍サンプルは、標準的な方法を用いてホルマリン固定され、サンプル中のＨｅｒ２のレベルを上記のような方法を用いて測定する。組織サンプルはまた、当技術分野で周知の方法を用いたＩＨＣおよびＦＩＳＨにより調べてもよい。このコホートの患者をパクリタキセルなどの標準的な化学療法と組み合わせてトラスツズマブなどの抗Ｈｅｒ２治療薬で処置し、それらの患者の応答を、当技術分野で周知の方法を用い、例えば、処置後の期間における患者の全生存率を記録することによって測定する。好適な参照レベルは、当技術分野で周知の統計学的方法を用い、例えば、ログランク検定のｐ値を決定することによって決定することができる。
【００３０】
ひと度、参照レベルが決定されれば、処置計画に抗Ｈｅｒ２治療薬を含むことから利益を得る見込みがある、Ｈｅｒ２発現レベルが十分に高い患者を、抗Ｈｅｒ２薬の使用に治療的利益がある見込みのない、Ｈｅｒ２発現レベルが十分に低い患者とともに識別するためにそれを使用することができる。当業者ならば、抗Ｈｅｒ２薬が付加的薬剤または薬剤の組合せを使用する計画の一部として使用されることを認識するであろう。非標的標準化学療法により癌を処置するための処置計画は当技術分野で公知であり、使用される薬物としては、フルオロウラシル、サイラムザ（ラムシルマブ）、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、ハーセプチン（トラスツズマブ）、およびマイトマイシンＣを含み得る。胃癌で使用される薬物組合せには、ＦＵ−ＬＶ（フルオロウラシルとロイコボリン）、ＴＰＦ（ドセタキセル、シスプラチンおよびフルオロウラシル）ならびにＸＥＬＩＲＩ（カペシタビンと塩酸イリノテカン）が含まれる。これらの薬物の１以上を個々に、また、組み合わせて使用することができ、どの単剤も他よりも良好な応答を歴史的に示さずに著しく同等の転帰を持つ。よって、この薬剤群全体は、特定の癌タンパク質に標的化されず、従って、標準化学療法と見なされ、処置および転帰に関して著しく相互交換可能である。しかしながら、胃癌患者、一般には癌患者の、これらの標準化学療法薬の１以上での処置は、患者を標準化学療法で処置しない場合に比べて無増悪生存率（ＰＦＳ）および全生存率（ＯＳ）に著しい改善を示すことが歴史的に示されている。
【００３１】
患者サンプルにおいてＳＲＭにより決定されたＨｅｒ２のレベルは、他の単位も使用可能であるが一般にａｍｏｌ／μｇで表される。当業者ならば、例えば＋／−２５０、１５０、１００、５０または２５ａｍｏｌ／μｇなどの中央値前後の範囲として表すことができることを認識するであろう。以下に詳細に記載される特定の例では、好適な参照レベルは１８２５ａｍｏｌ／μｇであることが判明したが、当業者ならば、臨床結果および経験に基づき、これによりも高いまたは低いレベルが選択され得ることを認識するであろう。婦人科癌、食道癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、および胃癌などの多くの癌について、約２０００ａｍｏｌ／μｇ以上（場合所望により、２０００＋／−２５０、１５０、１００、５０または２５ａｍｏｌ／μｇ）のレベルが、トラスツズマブ含有処置計画に対する応答を予測することが判明した。
【実施例】
【００３２】
ＨＥＲ２陽性胃癌集団におけるトラスツズマブ感受性に関するＨＥＲ２タンパク質発現レベルの予測値の設定を実証する試験データ
患者
ソウル公立大学病院からの合計２４９名の患者を、組織学的に確認された再発性または転移性の胃癌を有すると特定した。ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検を処置前に採取し、Ｈｅｒ２を免疫組織化学（ＩＨＣ）および／またはＦＩＳＨにより分析した。ＩＨＣおよび／またはＦＩＳＨいずれかによってＨｅｒ２＋であると決定された合計１５３名の患者を本試験に用いた。トラスツズマブと標準化学療法の組合せで処置した合計９５名の患者（コホート１）を分析し、生存分析に使用し、一方、標準化学療法単独で処置した５８名の患者の対照集団（コホート２）を分析し、生存分析に使用した。
【００３３】
方法
本試験において全１５３名の患者からのＦＦＰＥ腫瘍組織を顕微解剖して腫瘍細胞を採取し、下流の質量分析のために上記のようにリキッドティッシュ試薬を用いて可溶化した。Ｈｅｒ２タンパク質レベルを、全患者での選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）による質量分析を用いて定量した。Ｈｅｒ２タンパク質レベルの関数としての、これらの患者集団の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）を、カプラン・マイヤー法により評価した。ＨＥＲ２の効果を比較して評価するためにＨＥＲ２タンパク質レベルと処置群（トラスツズマブと化学療法または化学療法単独）との間の相互作用項を含んだコックス回帰モデルを当てはめた。トラスツズマブ感受性を推定するためのＨＥＲ２  ＳＲＭの最適なカットオフを、ログランク検定の最低ｐ値によって決定した。
【００３４】
結果
トラスツズマブ＋標準化学療法の組合せで処置したコホート１の９５名の患者の組織学的特徴を表２に示す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
各個の患者腫瘍のＨｅｒ２レベルを決定したところ、得られたカプラン・マイヤー曲線は、Ｈｅｒ２レベルが、ログランク検定の最低ｐ値により決定した１８２５ａｍｏｌ／μｇのカットオフよりも高かった（＞１８２５ａｍｏｌ／μｇ）患者において、トラスツズマブ＋化学療法での処置に顕著な利益を示す。図１に示されるように、＞１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者と＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者の間の比較はＰＦＳに有意差を示し、コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇはＰＦＳ＝１０．６か月であるのに対し、コホート１＜１８２５ａｍｏｌ／μｇはＰＦＳ＝７か月である。統計分析はｐ値＝０．０２００を示し、これを統計的に有意な所見とする。
【００３７】
図１はまた、コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇは、標準化学療法単独を受けたコホート２と比較した場合、トラスツズマブ＋化学療法での処置からはるかに大きい有意な利益を実現することも示す。コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者はＰＦＳ＝１０．６か月を示し、コホート２の患者はＰＦＳ＝６か月を示す。統計分析はｐ値＝０．００２０を示し、これを統計的に有意性の高い所見とする。
【００３８】
図１はまた、＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者（トラスツズマブ＋化学療法）とコホート２の患者（化学療法単独）の間の比較も示す。この比較は極めて類似したＰＦＳを示し、＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート２の患者はＰＦＳ＝７か月を示し、コホート１の患者はＰＦＳ＝６か月を示した。ログランク検定による統計分析はこの比較に関してｐ値＝０．５００を示し、Ｈｅｒ２値が＜１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者の場合、Ｈｅｒ２＋患者を抗Ｈｅｒ２薬トラスツズマブで処置しても標準化学療法単独を超える有意な利益は無いことを示す。
【００３９】
コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇからの患者においてトラスツズマブ処置に対する利益を示す同様の結果は、同じ統計的方法下の全生存期間（ＯＳ）にも見て取れる。カプラン・マイヤー曲線は、Ｈｅｒ２レベルが、ログランク検定の最低ｐ値で決定された１８２５ａｍｏｌ／μｇのカットオフよりも高い（＞１８２５ａｍｏｌ／ｕｇ）患者において、トラスツズマブ＋化学療法での処置に対してＯＳに顕著な利益を示す。図２に示されるように、＞１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者と＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者の間の比較はＰＦＳに有意差を示し、コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇはＯＳ＝３５か月であるのに対し、コホート１＜１８２５ａｍｏｌ／μｇはＰＦＳ＝１７．５か月である。統計分析はｐ値＝０．０１１０を示し、これを統計的に有意な所見とする。
【００４０】
図２はさらに、コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇは、標準化学療法単独を受けたコホート２と比較した場合に、トラスツズマブ＋化学療法での処置からはるかに大きい有意な利益を実現したことを示す。コホート１＞１８２５ａｍｏｌ／μｇの患者はＯＳ＝３５か月を示し、コホート２の患者はＯＳ＝１１．９か月を示した。統計分析はｐ値＝０．０００６を示し、これを統計的に有意性の高い所見とする。
【００４１】
図２はまた、＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者（トラスツズマブ＋化学療法）とコホート２の患者（化学療法単独）の間の比較を示す。この比較は同等のＯＳを示し、＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのコホート１の患者はＯＳ＝１７．５か月を示し、コホート２の患者はＰＦＳ＝１１．９か月を示した。ログランク検定のよる統計分析はこの比較に関してｐ値＝０．３３１を示し、＜１８２５ａｍｏｌ／μｇのＨｅｒ２値を示すＨｅｒ２＋患者を抗Ｈｅｒ２薬トラスツズマブ＋化学療法で処置しても化学療法単独を超える有意な利益は無いことを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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