(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（i）〜（iii）からなる群より選択される、ポリペプチド：
（i）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ii）（i）に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチド、
（iii）（i）に記載のアミノ酸配列において、１から20個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含み、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドに融合パートナーを連結してなる、融合タンパク質。
【請求項３】
融合パートナーが、標識タンパク質、酵素、抗体、金属イオン結合ペプチド、バイオミネラリゼーションペプチド、及び凝集タンパク質からなる群より選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
珪藻類の被殻表面に発現する、請求項２又は３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
次の（i）〜（iv）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（i）配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列を含み、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）（i）に記載の塩基配列において、１から20個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに
（iv）（i）に記載の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載のベクターで珪藻類を形質転換させる工程を含む、形質転換珪藻類を製造する方法。
【請求項９】
珪藻類が、Fistulifera属に属する藻類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Fistulifera属に属する藻類がFistulifera soralisに属する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Fistulifera soralis属に属する藻類が、JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載のベクターで形質転換された、珪藻類。
【請求項１３】
Fistulifera属に属する、請求項１２に記載の珪藻類。
【請求項１４】
Fistulifera soralisに属する、請求項１３に記載の珪藻類。
【請求項１５】
JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、請求項１４に記載の珪藻類。
【請求項１６】
珪藻類の被殻表面に発現している請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の性質に基いて、該珪藻類を凝集させる工程を含む、珪藻類の凝集方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって凝集させた珪藻類を回収する工程を含む、珪藻類の回収方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法。
【請求項１９】
珪藻類が産生する物質が油脂である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、珪藻類の被殻表面に発現する新規タンパク質、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、他の植物に比べてバイオ燃料の生産効率が高いことから、燃料生産に用いることが期待されている。微細藻類からの燃料生産プロセスは、藻類の培養、回収、脱水、油脂抽出、燃料への変換に大きく分けられる。その中でも回収工程が、全工程において最もエネルギー消費が大きい工程であることが試算されている（非特許文献１、２、及び３）。
【０００３】
現在採用されている回収方法として、遠心分離、フィルターろ過、及び凝集沈殿（凝集浮上を含む）等がある（非特許文献４）。
【０００４】
ほとんどの微細藻類は遠心分離によって回収することができ、その方法は当業者には公知である（非特許文献５）。遠心分離は最も回収率の高い方法である反面、回収に高いエネルギーを必要とすることが問題とされている。
【０００５】
フィルターろ過には主に2種類の方法がある。培養液中にフィルター付きホースを挿入し、ホースの先から吸引することで培養液の濃度を高めるバキューム方式と、圧力を加えて培養液をフィルターに流すことで水分のみが分離され、藻体をフィルターに接着させるプレッシャー方式である（非特許文献５及び６）。フィルター濾過法では、目詰まりによるフィルターの交換、培養液を移動させるためのポンプの使用等により運用コストが高くなることが問題とされている。
【０００６】
より低エネルギーで藻体と培地の分離を行える方法として、凝集沈殿法が挙げられる。凝集沈殿法の例として、塩基性の凝集剤を培地に加えることで、藻体表面の負電荷を中和させ、互いに結合して凝集を起こさせる化学的凝集誘導法がある（非特許文献７及び８）。この方法は、淡水性培地を用いた例では高い効率を示すが、塩濃度が高く、多価電解質の豊富な海洋環境中では、藻体の凝集が困難な場合があるという問題点が指摘されている。
【０００７】
その他の化学的凝集誘導法として、水混和溶媒セットを添加する方法（特許文献１）、ポリ塩化アルミニウムとポリジメチルジアリルアンモニウムクロライドの混合物を添加する方法（特許文献２）、カチオン性高分子凝集剤を添加する方法（特許文献３）、ポリグルタミン酸を主体とする生分解性凝集剤を添加する方法（特許文献４）等が挙げられる。いずれの化学凝集法も、凝集剤自体を製造するエネルギー投資やコストは避けられず、環境に負荷を与える要因となる。
【０００８】
一方、バクテリアの添加等、生物学的因子により凝集誘導を起こす研究も報告されている（非特許文献９、１０、及び１１、並びに特許文献５）。例として海洋性の藻類であるNannochloropsis oceanica IMET1の培養液にバクテリアであるBacillus megaterium strain PPB7の培養液を藻体：バクテリア比が5:1となるよう添加することで、藻体が急速に凝集し、培地と藻体を容易に分離できることが知られている（非特許文献１２）。この凝集法では、多量のバクテリアを使用することから、藻体とバクテリアの二種類の生物を大量に培養する必要があるため、二重の培養コストが費やされるという欠点がある。また、バクテリアの培養には二酸化炭素以外の炭素源が必要である。したがって、バクテリアを用いるこの方法は、海洋微細藻類の凝集方法としては有望な方法だが、Carbon Capture and Storage (CCS) の観点において、CO2排出削減効果に貢献できないことから、理想的な方法ではないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表2013-523159号公報
【特許文献２】特開平6-182356号公報
【特許文献３】特開2011-212624号公報
【特許文献４】特開2012-101150号公報
【特許文献５】特開2012-217972号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Davis R, Aden A, Pienkos PT, Applied Energy, (2011), 88(10):3524-3531.
【非特許文献２】Richardson JW, Johnson MD, Outlaw JL, Algal Research, (2012), 1(1):93-100.
【非特許文献３】Uduman N, Qi Y, Danquah MK, Forde GM, Hoadley A, Journal of Renewable and Sustainable Energy, (2010), 2(1):012701.
【非特許文献４】Molina Grima E, Belarbi E-H, Acien Fernandez F, Robles Medina A, Chisti Y, Biotechnology advances, (2003), 20(7):491-515.
【非特許文献５】Belter PA, Cussler EL, Hu WS. New York: Wiley; 1988.
【非特許文献６】Chen CY, Yeh KL, Aisyah R, Lee DJ, Chang JS, Bioresour Technol, (2011),102(1):71-81.
【非特許文献７】Schlesinger A, Eisenstadt D, Bar-Gil A, Carmely H, Einbinder S, Gressel J, Biotechnol Adv, (2012), 30(5):1023-30.
【非特許文献８】Bilanovic D, Shelef G, Sukenik A, Biomass, (1988), 17(1):65-76.
【非特許文献９】Gardes A, Iversen MH, Grossart HP, Passow U, Ullrich MS, ISME J, (2011), 5(3):436-45.
【非特許文献１０】Lee SJ, Park M-H, Kim H-S, Kim H-C, Yoon J-H, Kwon G-S, Yoon B-D, Biotechnology Letters, (2011), 23(15):1229-1234.
【非特許文献１１】Wang H, Laughinghouse HDt, Anderson MA, Chen F, Willliams E, Place AR, Zmora O, Zohar Y, Zheng T, Hill RT, Appl Environ Microbiol, (2012),78(5):1445-53.
【非特許文献１２】Powell RJ, Hill RT, Applied and environmental microbiology, (2013), 79(19):6093-6101.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、珪藻類の被殻表面にペプチドを発現させることができれば、このペプチドの性質に基いて珪藻類を凝集させることができると考えた。本発明者らは、これを達成するために、Fistulifera solaris JPCC DA0580株のような油脂高蓄積性を示す珪藻類の被殻表面に局在するタンパク質の同定を試みた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、珪藻類の被殻表面に発現する新規タンパク質を見出した。また、この新規タンパク質と他のペプチドを融合させたポリペプチドを被殻表面に発現させることができること、及び融合ポリペプチドに対する抗体を用いて珪藻類を凝集させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
【００１４】
１．次の（i）〜（iii）からなる群より選択される、ポリペプチド：
（i）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ii）（i）に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、（iii）（i）に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．上記１に記載のポリペプチドに融合パートナーを連結してなる、融合タンパク質。
３．融合パートナーが、標識タンパク質、酵素、抗体、金属イオン結合ペプチド、バイオミネラリゼーションペプチド、及び凝集タンパク質からなる群より選択される、上記２に記載の融合タンパク質。
４．珪藻類の被殻表面に発現する、上記２又は３に記載の融合タンパク質。
５．上記１に記載のポリペプチド又は上記２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
６．次の（i）〜（iv）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ii）（i）に記載の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに（iv）（i）に記載の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
７．上記５又は６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
８．上記５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は上記７に記載のベクターで珪藻類を形質転換させる工程を含む、形質転換珪藻類を製造する方法。
９．珪藻類が、Fistulifera属に属する藻類である、上記８に記載の方法。
１０．Fistulifera属に属する藻類がFistulifera soralisに属する、上記９に記載の方法。
１１．Fistulifera soralis属に属する藻類が、JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、上記１０に記載の方法。
１２．上記５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は上記７に記載のベクターで形質転換された、珪藻類。
１３．Fistulifera属に属する、上記１２に記載の珪藻類。
１４．Fistulifera soralisに属する、上記１３に記載の珪藻類。
１５．JPCC DA0580株（受託番号 FERM BP-11201）である、上記１４に記載の珪藻類。
１６．珪藻類の被殻表面に発現している上記１に記載のポリペプチド又は上記２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質の性質に基いて、該珪藻類を凝集させる工程を含む、珪藻類の凝集方法。
１７．上記１６に記載の方法によって凝集させた珪藻類を回収する工程を含む、珪藻類の回収方法。
１８．上記１７に記載の方法によって回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法。
１９．珪藻類が産生する物質が油脂である、上記１８に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明者により見出された被殻表面発現タンパク質と融合させることにより、任意のペプチドを被殻表面に発現させることができる。また、発現させた融合タンパク質の性質に基いて、珪藻類を凝集させ、珪藻類の回収に要するエネルギーコストを抑え、珪藻類を効率的に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明で用いた発現ベクターのベクターマップを示す。
【図２】図２は、野生株及びFrustulin 1-GFP融合タンパク質発現株の、明視野下及び蛍光下での観察結果を示す。赤はクロロフィルの蛍光、緑はGFPの蛍光を示す。
【図３】図３は、Frustulin 1-GFP融合タンパク質発現株の、共焦点顕微鏡による三次元再構築画像を示す。
【図４】図４は、Frustulin 1-GFP融合タンパク質発現株の、共焦点顕微鏡による三次元再構築画像から推測される、融合タンパク質の発現部位を示す模式図である。図中、401は上殻を示し、402は下殻を示し、403は上殻と下殻の重なっている部分を示し、404はフィスチュラ（fistula）（いぼ状突起に小孔が開いた構造体）を示す。
【図５】図５は、Frustulin 1-GFP融合タンパク発現株とSilaffin様タンパク質-GFP融合タンパク質発現株の、緑色蛍光分布の比較結果を示す。
【図６】図６は、野生株（WT）、GFPタンパク質発現株（PC）、及びFrustulin 1-GFP融合タンパク質発現株（S）の、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図７】図７は、野生株とFrustulin 1-GFP融合タンパク質発現株に対し酵素標識抗GFP抗体を反応させ、発光試薬を加えた後の蛍光強度の測定結果を示す。図中、701は被殻および細胞外マトリックスを示し、702は酵素標識抗GFP抗体を示し、703はFrustulin 1-GFP融合タンパク質を示す。
【図８】図８は、Frustulin 1-GFP融合タンパク質発現株に対し、抗GFP抗体を加えた際の細胞の凝集状態を示す（Aは抗体を加えていない細胞、Bは抗体を加えた細胞を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜ポリペプチド＞
一態様において、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２はそれぞれ、本発明者らによって新規に見出された、Fistulifera solarisの被殻表面発現タンパク質候補であるFrustulin 1、2、3、4、5、及び6のアミノ酸配列である。ここで、Frustulinとは、珪藻類の被殻に発現するタンパク質であり、3つの特徴（二つのシグナル配列、Acidic cysteine-rich領域、及びProline-rich領域）を有することが知られている。
【００１８】
本明細書で、「珪藻」又は「珪藻類」とは、珪藻綱（Bacillariophyceae）に属する微細藻類を意味する。珪藻類として、円心目（Centrales）に属する藻類及び羽状目（Pennales）に属する藻類が挙げられる。円心目（Centrales）に属する藻類として、シクロテラ属（Cyclotella）、ミニディスクス属（Minidiscus）、タラシオシラ属（Thalassiosira）及びキートケロス属（Chaetoceros）に属する藻類等が挙げられ、羽状目（Pennales）に属する藻類として、ディメレグラムマ属（Dimeregramma）、シリンドロテカ属（Cylindrotheca）、ナビキュラ属（Navicula）、及びフィストゥリフェラ属（Fistulifera）に属する藻類等が挙げられる。本発明の珪藻はいずれの珪藻であってもよい。
【００１９】
本明細書で、「被殻（frustule）」とは、主としてケイ酸で構成される、珪藻類の細胞壁を意味する。被殻は、図４で示す様に二つの部分、すなわち上殻（epitheca）（401）と下殻（hypotheca）（402）からなることが知られている。
【００２０】
Frustulin 1、2、3、4、5、及び6の塩基配列（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、及び１１）は、それぞれアクセッション番号AB854058、AB854059、AB854057、AB854056、AB854061、及びAB854060として、公共のデータベースであるDDBJに登録されている。Frustulin 1〜6の塩基配列、アミノ酸配列、及びアクセッション番号の対応表を以下に示す。
【表１】
0006454491.tif 000002
【００２１】
本発明のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに限定されず、珪藻類の被殻表面に発現する限り、そのオルソログ及び変異体等であって良い。したがって、本発明で用いるポリペプチドは、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と、70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上、例えば98%以上又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。本明細書で使用する同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。また、本発明で用いるポリペプチドは、珪藻類の被殻表面に発現する限り、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。ここで、「１若しくは複数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
【００２２】
また、本発明で用いるポリペプチドは、珪藻類の被殻表面に発現する限り、上記ポリペプチドの断片であってもよい。かかる断片は、上記のアミノ酸配列に基いて任意のペプチド断片を作製し、そのペプチド断片の発現部位を確認することにより、当業者であれば容易に作製することができる。
【００２３】
＜融合タンパク質＞
一態様において、本発明は、上記ポリペプチドに融合パートナーを連結してなる、融合タンパク質に関する。該融合タンパク質は、好ましくは、珪藻類の被殻表面に発現する。
【００２４】
本明細書で使用する「融合パートナー」は、上記ポリペプチドと異なるポリペプチドであれば、いかなるものであってもよく、珪藻類に元来存在する内因性のポリペプチドであるか否かを問わない。融合パートナーは、上記ポリペプチドに対して1個連結させてもよいし、1個以上、例えば2〜10個、特に2〜5個、例えば2個、3個、4個、又は5個連結させても良い。融合パートナーは上記ポリペプチドのN末端及びC末端のいずれに連結してもよいし、場合によりリンカー（例えば1〜50アミノ酸）を介して連結してもよい。当業者であれば、必要に応じて適宜リンカーを選択することができる。
【００２５】
融合パートナーとして、限定するものではないが、標識タンパク質、酵素、抗体、金属イオン結合ペプチド、バイオミネラリゼーションペプチド、及び凝集タンパク質等が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する「標識タンパク質」は、上記ポリペプチドを標識する役割を果たせるタンパク質であれば、特に限定しない。そのようなタンパク質として、例えば蛍光タンパク質及び発光タンパク質等が挙げられる。具体的な蛍光タンパク質として、例えば、GFP、CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、及びAPC等が挙げられ、具体的な発光タンパク質として、例えば、イクオリン等が挙げられる。
【００２７】
酵素又は抗体の種類は特に限定しない。酵素又は抗体を被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を固定化担体として利用し、イムノアッセイ、バイオアッセイ、バイオセンサ等に用いることができる。
【００２８】
本明細書で使用する「金属イオン結合ペプチド」は、金属イオンを結合できるペプチドであれば特に限定するものではなく、例えばポリヒスチジンタグペプチド等のキレート作用を有するペプチド等が挙げられる。金属イオン結合ペプチドを被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を海洋等の環境からの資源回収や環境浄化（バイオレメディエーション）に用いることができる。
【００２９】
本明細書で使用する「バイオミネラリゼーションペプチド」は、鉱物を作り出すペプチドを意味し、例えば、金粒子合成ペプチド（例えば、J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, pp. 13660-13661に記載のAHHAHHAAD（配列番号17））、銀粒子合成ペプチド（例えば、Nat. Mater., 2002, 1, pp.169-172に記載のNPSSLFRYLPSD（配列番号18））、パラジウム粒子合成ペプチド（例えば、Chem. Mater, 2007, 19, pp.2056-2064に記載のGHHHHHH（配列番号19））等が挙げられる。バイオミネラリゼーションペプチドによって生成される鉱物としては金、銀、パラジウムのナノ粒子等が挙げられる。バイオミネラリゼーションペプチドを被殻表面に発現させた場合は、珪藻類を触媒の担体として用いることができる。
【００３０】
本明細書で使用する「凝集タンパク質」は、その性質に基いて凝集を誘起することができるタンパク質であれば特に限定しない。そのようなタンパク質として、例えば自己凝集タンパク質、抗体定常領域に対する抗体定常領域認識タンパク質、抗体定常領域認識タンパク質に対する抗体定常領域、ビオチンキャリアタンパク質に対するアビジン若しくはストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプトアビジンに対するビオチンキャリアタンパク質、並びに抗原タンパク質に対する抗体、及び抗体に対する抗原タンパク質等が挙げられる。以下で具体的に説明する。
【００３１】
自己凝集タンパク質には、エラスチン様タンパク質等が挙げられる。エラスチン様タンパク質は、（VPGVG）nで表されるタンパク質であり、温度上昇によりコンフォメーションチェンジが起こると、疎水性相互作用により自己凝集する。したがって、このタンパク質を凝集タンパク質として利用する場合は、培養温度を調節することで、細胞凝集を誘起することができる。
【００３２】
抗体定常領域認識タンパク質には、Protein A、Protein G、及びProtein L等が挙げられる。抗体定常領域又は抗体定常領域認識タンパク質を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、抗体定常領域を発現する株と、抗体定常領域認識タンパク質を発現する株を別個に作成し、混合することで細胞凝集を誘起することができる。
【００３３】
ビオチンキャリアタンパク質とは、生体内に元来存在し、小分子であるビオチンを固定化できるタンパク質である。ビオチンキャリアタンパク質、又はアビジン若しくはストレプトアビジン（若しくはその単量体）を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、ビオチンキャリアタンパク質を発現する株と、アビジン又はストレプトアビジンを発現する株を別個に作成し、混合することで細胞凝集を誘起することができる。
【００３４】
抗原タンパク質又は抗体を凝集タンパク質として利用する場合は、例えば、抗原タンパク質を発現する株に対して抗体を添加することで、細胞凝集を誘起することができる。
【００３５】
＜ポリヌクレオチド＞
一態様において、本発明は上記「ポリペプチド」の章に記載のポリペプチド又は上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００３６】
また、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。また、本発明のポリヌクレオチドは、上記塩基配列を含むポリヌクレオチドに限定されず、珪藻類の被殻表面に発現するポリペプチドをコードする限り、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基配列と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上、例えば98%以上又は99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
【００３７】
同様に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基酸配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１１からなる群より選択される塩基酸配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。
【００３８】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。
【００３９】
＜発現ベクター＞
一態様において、本発明は、発現ベクターに関する。本発明のベクターは、好ましくは、上記「ポリペプチド」の章に記載のポリペプチド又は融合タンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含む。ここで、「発現可能な状態で含む」とは、ベクターが宿主細胞に導入された際に、ベクターに含まれるDNAによりコードされるポリペプチドが、宿主細胞において発現されることを意味する。
【００４０】
本発明に使用されるベクターとしては、例えばプラスミドベクター等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えばpSP-NPT/H4及びpSP-ShBle/H4等が挙げられる。
【００４１】
ベクターは、発現されるDNAの他に、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、及びターミネーター等の調節性配列、並びに必要に応じて選択マーカー等を含んでよい。プロモーターは恒常的なものであってもよいし、誘導性のものであってもよい。調節性の配列を使用すれば、上記ポリペプチド又は融合タンパク質の発現時期を調整することができる。例えば、誘導性のプロモーターの下流に凝集タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを珪藻類に形質転換すれば、プロモーターを活性化することで、任意の時期に珪藻類の凝集を促進することができる。
【００４２】
＜形質転換珪藻の製造方法＞
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターで珪藻類を形質転換させる工程を含む、形質転換珪藻類を製造する方法に関する。また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターで形質転換された珪藻類に関する。
【００４３】
本発明において、遺伝子を導入する生物は、前述した珪藻類であれば特に限定しないが、好ましくはFistulifera属に属する珪藻類である。Fistulifera属に属する珪藻類等として、特にWO 2010/116611に開示されているFistulifera sp. JPCC DA0580株（Navicula sp. JPCC DA0580株から改名、本明細書ではFistulifera solaris JPCC DA0580株とも称する）を例示することができる。なお、Fistulifera solaris JPCC DA0580株は、WO 2010/116611に記載されているように、FERM BP-11201（FERM P-21788より移管）として独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター (IPOD, NITE) (〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8) に国際寄託されている。
【００４４】
ポリヌクレオチドの導入方法としては、珪藻類へポリヌクレオチドを導入できる方法であればいずれも用いる事ができ、例えばパーティクルガン法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、及びエレクトロポレーション法等を挙げることができる。これらの方法は植物分野において遺伝子導入方法として周知の技術である。例えば、Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T,  Marine Biotechnology, (2013), 15(1): 48-55に記載の方法を利用することができる。
【００４５】
＜珪藻類による物質の産生方法＞
一態様において、本発明は珪藻類、特に本明細書に記載の形質転換珪藻類の被殻表面に発現しているポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて、形質転換珪藻類を凝集させる工程を含む、珪藻類の凝集方法に関する。
【００４６】
本明細書で使用する「ポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて」珪藻類を凝集させるとは、該ポリペプチドの性質を利用して珪藻類を凝集させることを意味し、その手段は特に限定しない。利用し得る性質は、限定するものではないが、ペプチド又は融合タンパク質の恒常的な自己凝集性、又は温度及びpH等の培養条件の変更若しくは凝集因子の添加によって誘導される誘導的凝集性が挙げられる。自己凝集性を利用する場合は、適切な調節因子、例えば誘導性のプロモーターを選択することによって、また、誘導的凝集性を利用する場合は、培養条件の変更又は凝集因子の添加によって、珪藻類の凝集時期を調節することができる。
【００４７】
凝集因子の例として、上記ポリペプチド若しくは上記融合タンパク質を発現させた場合の、該ポリペプチド若しくは融合タンパク質に対する抗体が挙げられる。具体的には、例えば、FrustulinとGFPの融合タンパク質を発現させた場合の、抗Frustulin抗体又は抗GFP抗体である。また、本明細書に記載の凝集タンパク質を用いて、珪藻類を凝集させることもできる。
【００４８】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって凝集させた珪藻類を回収する工程を含む、珪藻類の回収方法に関する。回収は、本明細書に記載の方法によって凝集させた細胞を含む培養液等から、デカンテーション又はアスピレーション等により単に培養液等を除くことにより行ってもよいし、凝集が不十分な場合には、さらに遠心分離、フィルターろ過、凝集沈殿等の分離操作を行った後に、培養液等を除くことにより行ってもよい。
【００４９】
一態様において、本発明は、回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法に関する。珪藻類が産生する物質の抽出は、当業者にとって公知の方法、例えば、ホモジナイザー等による物理的処理、超音波処理、熱処理、及び有機溶媒による抽出等の化学的処理のいずれかを用いて、又はこれらの一以上を組み合わせて行うことができる。
【００５０】
一態様において、本発明は、（a）珪藻類、特に本明細書に記載の形質転換珪藻類を培養する工程、（b）該珪藻類の被殻表面に発現しているポリペプチド又は融合タンパク質の性質に基いて、該珪藻類を凝集させる工程、（c）凝集させた珪藻類を回収する工程、及び（d）回収した珪藻類から、珪藻類が産生する物質を抽出する工程を含む、珪藻類による物質の産生方法に関する。
【００５１】
珪藻類が産生する物質は、特に限定するものではないが、例えば、スクワレン及びトリグリセリド等の油脂、フコキサンチン及びエイコサペンタエン酸等の生理活性物質が挙げられ、好ましくは油脂である。油脂を生産する場合には、Fistulifera属に属するオイル蓄積能を有する珪藻類、特にオイル高蓄積能を有するFistulifera solaris JPCC DA0580株を用いることが好ましい。
【００５２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１：珪藻類における被殻表面タンパク質の単離＞
（１）珪藻類の培養
Fistulifera solaris JPCC DA0580株はhalf strength of Guillard's f solution (f/2培地)（75 mg NaNO3, 6 mg Na2HPO4・2H2O, 0.5 μg vitamin B12, 0.5 μg biotin, 100 μg thiamine HCl, 10 mg Na2SiO3・9H2O, 4.4 mg Na2EDTA, 3.16 mg FeCl3・6H2O, 12 μg CoSO4・5H2O, 21 μg ZnSO4・7H2O, 0.18 mg MnCl2・4H2O, 70 μg CuSO4・5H2O, and 7 μg Na2MoO4・2H2O）を1 Lの人工海水(富田製薬)に溶解した培地を用いて、500 mLの扁平フラスコを用いて、25 ℃、140 μmol/m2/sの連続光照射下で培養した。
【００５４】
（２）被殻表面タンパク質の検索
Fistulifera solaris JPCC DA0580株のゲノム配列を解析した。次に、Fistulifera solaris JPCC DA0580株のドラフトゲノム配列から、AUGUSTUSプログラムを利用してタンパク質をコードする領域を予測した。予測されたタンパク質群のアミノ酸配列から、他の珪藻で見出されている被殻表面タンパク質であるFrustulinと相同性を持つタンパク質を検索した。すなわち、Query配列としてCylindrotheca fusiformis由来alpha 2 Frustulin (EMBL登録番号：CAA67702.1)、及びalpha 3 Frustulin (EMBL登録番号：CAA67703.1) を利用し、BlastPによる検索を行った。その際、E-value cut off valueを1e-15とした。その結果、他の珪藻で見出されたFrustulinの3つの特徴（二つのシグナル配列、Acidic cysteine-rich領域、及びProline-rich領域）を備えるタンパク質として、6つの候補タンパク質が選択された。それらを、Furstulin 1（cDNA配列：配列番号1、及びアミノ酸配列：配列番号2）、Furstulin 2（cDNA配列：配列番号3、及びアミノ酸配列：配列番号4）、Furstulin 3（cDNA配列：配列番号5、及びアミノ酸配列：配列番号6）、Furstulin 4（cDNA配列：配列番号7、及びアミノ酸配列：配列番号8）、Furstulin 5（cDNA配列：配列番号9、及びアミノ酸配列：配列番号10）、及びFurstulin 6（cDNA配列：配列番号11及びアミノ酸配列：配列番号12）として同定した。
【００５５】
＜実施例２：Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現ベクターの構築＞
500 μg/mL G418を添加したf/2培地中でFistulifera solaris JPCC DA0580株を4日間培養し、3000 g、10分間、24 ℃の条件で遠心回収を行った。回収した細胞ペレットを液体窒素中で乳鉢、乳棒を用いて粉砕し、ConcertTM Plant RNA Reagent (Life technologies)によりTotal RNAの抽出を行った。得られた抽出物をRNeasy Mini Kit (QIAGEN)により精製した。その後、DNase I (TaKaRa)により37 ℃、30分間の条件でサンプル中のDNAの分解を行った。吸光度及びAgilent RNA 6000 Nano Assay kit(Agilent technologies)を用いてキャピラリー電気泳動によりTotal RNAを評価した。得られたTotal RNA 1 μgをテンプレートとし、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)によりcDNA合成を行った。得られたcDNAを鋳型とし、実施例１で同定したFrustulin 1をコードする遺伝子を、特異的プライマーペア (forward primer: 5’-ATG ACA GTC CTT CAG CTT TTA CTC AAG GTC-3’（配列番号１３）及びreverse primer: 5’-GTA TTT GTT CCA GTA CGA TGT GTT GCT GC-3’（配列番号１４）)を用いてPCR増幅した。一方、発現ベクターpSP-NPT/H4（pSP73 (Promega Corporation, Madison,WI, USA）をもとに、Muto M, Fukuda Y, Nemoto M, Yoshino T, Matsunaga T, Tanaka T,  Marine Biotechnology, (2013), 15(1): 48-55に記載の方法で構築）に新たにJPCC DA0580株由来のglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)  遺伝子プロモーター（500-bp）、緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子配列（720-bp）、及びPhaeodacylum tricornutum由来のfucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A (fcpA)遺伝子ターミネーター配列（227-bp）を導入した。その新たに導入したプロモーター及びGFP遺伝子配列間に設計されたEcoRV配列にFrustulin 1遺伝子を導入し、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現ベクターpSP-Frustulin 1-GFP/GAPDHを構築した（図１）。
【００５６】
＜実施例３：JPCC DA0580株への遺伝子導入方法＞
60 mg/mLの濃度で50 %グリセロール中に懸濁した0.6 μmのタングステン粒子（高純度化学研究所）50 μLに対し、実施例２で得られた発現ベクターpSP-Frustulin 1-GFP/GAPDH（1 μg/μL、5 μL）及び2.5 M CaCl2 50 μL、0.1 Mスペルミジン20 μLを添加し、粒子上にベクターを固定化した。また、対数増殖期初期（細胞濃度：1〜2 × 107 cells/mL）のJPCC DA0580株5 × 107 cellsを1 %寒天f/2培地（直径3.6 cmシャーレ）上に塗布した。シャーレをBiolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD)内にセットし、打ち出し圧力を1550 psiに調整し、パーティクルガンにより発現ベクターを導入した。導入後、寒天培地上の藻体を1 mLのf/2培地で懸濁し、1 %寒天f/2培地（直径9 cm）に塗布し、140 μmol/m2/sの光照射、25 ℃条件下で24時間培養した。1 mLのf/2培地で寒天培地上の細胞を懸濁し、1 × 107 cells (200 μL)を500 μg/mLのG418を含む1 %寒天培地（直径9 cmシャーレ）に播種し、3週間培養を行い、190個の抗生物質耐性コロニーの獲得を行った。
【００５７】
＜実施例４：蛍光顕微鏡観察による融合タンパク質の局在評価＞
実施例３で得られた抗生物質耐性クローンを500 μg/mLのG418が添加されたf/2液体培地中で培養し、生育の見られたクローンを形質転換体とした。得られた形質転換体クローンを、以下の様に、蛍光顕微鏡で観察し、Frustulin 1の局在を確認した。
【００５８】
細胞培養液2 μLをスライドガラスに載せ、カバーガラスを置き、デジタルカメラ (Olympus DP-70) を搭載した蛍光顕微鏡 (Olympus BX51) を用いて観察した。観察条件としてレーザー強度50、ISO感度1600、フィルターユニットには、GFP観察用にはNIBAを、クロロフィル蛍光用にWIGをそれぞれ使用し、露光時間はGFP、クロロフィルそれぞれ5秒及び0.5秒、光源はファイバ光源システムU-HGLGPS (Olympus) を用いた。また、同株において三次元再構築画像を取得するため、473 nm 及び559 nmのレーザーを搭載した共焦点レーザー走査型顕微鏡FV 1000-D IX81 (Olympus) にて観察を行った。細胞のGFP蛍光及びクロロフィル自家蛍光をそれぞれAlexa Fluor 488及びAlexa Fluor 568を用いた撮像条件で、100倍油浸対物レンズを用いて撮影した。三次元蛍光画像を取得するため、Z軸方向0.2 μm間隔で共焦点画像を撮像した。撮影した画像をVolocity (Perkin Elmer Inc.) を用いて三次元画像に再構築した。
【００５９】
その結果、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株において、細胞の外周を覆うように緑色蛍光が観察された（図２）。同条件で野生株を観察したところ、緑色蛍光は観察されなかったことから、組み換え発現させたFrustulin 1-GFP融合タンパク質が、実際に被殻表面に局在していることが示唆された。共焦点顕微鏡による三次元再構築画像（図３）によると、緑色蛍光は被殻表面全体で観察される一方、上殻 (epitheca) （図４、401）と下殻 (hypotheca) （図４、402）が重なっている部位であるplural bandsに特に局在している様子が観察された（図３及び図４）。
【００６０】
続いて、Frustulin 1-GFP融合タンパク質と、Silaffin様タンパク質の発現効率を比較した。ここで、Silaffin様タンパク質は、Fistulifera solaris JPCC DA0580で見出された珪殻タンパク質G7408（Accession ID: AB854049）であり、その一部（47アミノ酸）を除いたもの（cDNA配列：配列番号15、及びアミノ酸配列：配列番号16）を発現させた（詳細は、Nemoto et al. Identification of a frustule-associated protein of the marine pennate diatom Fistulifera sp. strain JPCC DA0580, Marine Genomics, in pressを参照されたい）。なお、発現ベクターの作製及び遺伝子の導入は、実施例2〜3でFrustulin 1-GFP融合遺伝子について記載したのと同様に行った。
【００６１】
Frustulin 1-GFP融合タンパク質を発現させた場合、観察したほぼ全ての形質転換体細胞において、同様の緑色蛍光分布が観察された。Frustulin 1-GFP融合タンパク質の発現効率（形質転換体の99%程度が緑色蛍光を示す）は、他の被殻表面タンパク質であるSilaffin様タンパク質の発現効率（形質転換体の15%程度が緑色蛍光を示す）よりも顕著に高かった（図５）。
【００６２】
＜実施例５：ウェスタンブロッティングによるGFP融合タンパク質の発現評価＞
GFP融合タンパク質の更なる発現評価のため、抗GFP抗体を用いた発現評価を行った。形質転換体において発現していると予想されるFrustulin 1-GFP融合タンパク質は約63 kDaである。また、ポジティブコントロールとしてGFP（約27 kDa）のみを発現する形質転換体、ネガティブコントロールとして野生株の細胞を用いて、同様の実験を行った。それぞれの細胞5 × 107 cellsを遠心回収 (8,500g, 23 ℃, 5分) し、ペレットに1% SDSを200 μL添加後、Heatblock (SIBATA) を用いて99 ℃で10分間加熱した。再び遠心分離を行い、上清のみを回収後、30 μLを3×SDS sample buffer (188 mM Tris-HCl [pH 6.8], 3% SDS, 15% β-mercaptoethanol, 30% glycerol, 0.01% bromophenol blue) 15 μLと混合し5分間煮沸した後、アクリルアミド濃度12.5% (w/v) の分離ゲルを用いたSDS-PAGEに40 μL供した。続いてゲルとPolyvinyliden Difuloride (PVDF) 膜をA液 (0.3 M Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.5) 、B液 (25 mM Tris, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.3) 、C液 (25 mM Tris, 0.04 M 6-amino-n-capronic acid, 20% Methanol, 0.02% SDS, pH 9.1) に浸したろ紙に挟み、Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (BIO-RAD) を用いて1時間40分通電 (1 mA/cm2) させることでブロッティングを行った。ブロッティング後、PVDF膜を1% BSA含有PBS-T中でovernight反応させ、ブロッキングを行った。PBS-Tを加え、10分間の振盪を3回繰り返し洗浄した後、1 μg/mL アルカリホスファターゼ (AP) 標識抗GFP抗体 (Rockland Immunochemicals Inc.) を添加し、室温にて1時間反応させた。反応後のPVDF膜をPBS-Tで3回洗浄した後、BCIP/NBT Blue (Sigma-Aldrich Co. LLC.) を3 mL添加した。バンドが可視化されたところで溶液を捨て、超純水で3回洗浄した後、乾燥させた。その結果、Frustulin 1-GFP融合タンパク質発現株（図６、Lane S）、及びGFP発現株（図６、Lane PC）において、目的の位置にバンドが得られた（図６）。一方、野生株からは特異的なバンドは得られなかった（図６、Lane WT）。以上の事から、蛍光顕微鏡による観察から緑色蛍光が見られた形質転換体において、目的のFrustulin 1-GFP融合タンパク質が発現していることが確認された。
【００６３】
＜実施例６：抗体結合試験によるGFP融合タンパク質の被殻表面提示状態の確認＞
実施例４における顕微鏡観察の結果、融合タンパク質が被殻表面に局在していることが確認された。一方で珪藻の被殻表面は多糖類を主成分とする細胞外マトリックスで被われていることが知られている。そのため、融合タンパク質が被殻表面において細胞外マトリックスに埋没している可能性もある。
【００６４】
被殻表面タンパク質に凝集因子を融合発現し、その凝集因子の相互作用を介して細胞を回収するためには、凝集因子は細胞外マトリックスに埋没せず、露出した状態で提示されていることが望ましい。そこで、GFP融合タンパク質の被殻表面提示状態を確認するため、形質転換体細胞に対する抗体の結合試験を行った。
【００６５】
融合タンパク質発現株、及び野生株それぞれ5.0×106細胞を含む培養液をとり、3,000 g, 20 ℃の条件で5分間遠心回収を行った。ペレットを50 μLのアルカリホスファターゼ標識抗GFP抗体（1 μg/mL）で懸濁し、30分間静置した。次いで50 μLのTris buffered saline with Tween20（TBS-T: 洗浄緩衝液）で3回洗浄した。その後、発光試薬としてLumi-Phosを50 μL添加し、5分後の発光強度をプレートリーダー SH-9000 (Corona electric)を用いて測定した。その結果、融合タンパク質発現株は野生株と比較し、顕著な発光強度を示した（図７）。このことから、被殻表面タンパク質に融合したGFPに対して添加した抗体が結合できること、すなわち、融合タンパク質が外部に露出した状態で提示されていることが確認された。
【００６６】
＜実施例７：抗GFP抗体によるGFP融合タンパク質提示細胞の凝集誘導＞
被殻表面に提示された融合タンパク質を介して細胞凝集を誘導できるかを確認するため、Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株に対し抗GFP抗体を加え、細胞の凝集状態を観察した。Frustulin 1-GFP融合遺伝子発現株を5.0×106細胞含む培養液をとり、3,000 g, 20 ℃の条件で5分間遠心回収を行った。ペレットに対し、抗GFP抗体（1 μg/mL）を50 μL添加し、30分間静置した。その後、デジタルカメラ (Olympus DP-70) を搭載した顕微鏡 (Olympus BX51) を用いて観察した。その結果、細胞が凝集している様子が観察された（図８、Aは抗体を加えていない細胞、Bは抗体を加えた細胞を示す）。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明者により見出された被殻表面発現タンパク質と融合させることにより、任意のペプチドを被殻表面に発現させることができる。また、発現させた融合タンパク質の性質に基いて、珪藻類を凝集させ、効率的に回収することができる。珪藻類は、スクワレン及びトリグリセリド等の油脂、フコキサンチン及びエイコサペンタエン酸等の生理活性物質の有用物質を産生することが知られているため、本発明による珪藻類回収方法を用いることで、珪藻類による有用物質の産生の効率化に寄与できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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