(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩と、式［II］で表されるポリメトキシフラボンとを含有するプロスタグランジンＥ２産生抑制剤。
【化１】
0006468018.tif 000007
（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）
【化２】
0006468018.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子またはメトキシ基を表す。）
【請求項２】
請求項１に記載のプロスタグランジンＥ２産生抑制剤を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２の産生を抑制することができるＰＧＥ２産生抑制剤、およびこのＰＧＥ２産生抑制剤を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、生体内の細胞や組織が傷害を受けた際に免疫応答が働き、それによって出現した症状であるので、生体にとっては防御的な反応である。しかしながら、過剰な炎症反応が起こると生体の自己組織の損傷をもたらし、熱感、発赤、疼痛、腫脹や痛みを増悪させることが知られている。このような症状は、傷害した細胞やマスト細胞（肥満細胞）から放出されたケミカルメディエーターやサイトカインによって引き起こされる。
生体内で局所ホルモンとして働く生理活性脂質であるプロスタグランジン（ＰＧ）は、ケミカルメディエーターの一つとして知られている。中でも最も代表的なＰＧはＰＧＥ２であるので、炎症を抑えるためにＰＧＥ２の産生を抑制することが期待されている。
【０００３】
従来、植物由来成分を利用したＰＧＥ２産生抑制剤の一つとして、フラボノイドの一種であるポリメトキシフラボンが知られている（特許文献１）。しかしながら、ポリメトキシフラボンは、ＰＧＥ２産生抑制効果が十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１９２５８８号公報
【特許文献２】特開２００２−３６３０８１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２０２５８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の課題に鑑み、十分なＰＧＥ２産生抑制効果を有するＰＧＥ２産生抑制剤の提供を目的とする。また本発明は、かかるＰＧＥ２産生抑制剤を含有する皮膚外用剤の提供をも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが研究を重ねたところ、ポリメトキシフラボンに対して、特定の環状ホスファチジン酸またはその塩を併用することによって、十分なＰＧＥ２産生抑制効果を有するＰＧＥ２産生抑制剤が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩と、式［II］で表されるポリメトキシフラボンとを含有するプロスタグランジンＥ２産生抑制剤である。
【化１】
0006468018.tif 000002
（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）
【化２】
0006468018.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子またはメトキシ基を表す。）
【０００８】
また、本発明の皮膚外用剤は、本発明のＰＧＥ２産生抑制剤を含有する皮膚外用剤である。
【０００９】
なお、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩は、ヒアルロン酸産生能増強剤（特許文献２）やアトピー性皮膚炎治療剤（特許文献３）等の用途が知られているが、ＰＧＥ２産生抑制効果に及ぼす影響に関しては未だ知られていない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、ポリメトキシフラボン単独の場合に比して、ＰＧＥ２産生抑制効果が顕著に高い。したがって、本発明のＰＧＥ２産生抑制剤を含有する本発明の皮膚外用剤は、抗炎症、むくみ抑制、にきび抑制に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１２】
＜ＰＧＥ２産生抑制剤＞
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、下記（ａ）および（ｂ）成分を含有する。まず、（ａ）成分について説明する。
【００１３】
〔（ａ）１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩〕
本発明で用いられる（ａ）成分は、式［Ｉ］で示される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩である。以下、「１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩」を「置換環状ホスファチジン酸（塩）」とも表記する。
式［Ｉ］中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基であり、好ましくは炭素数１２〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状の脂肪酸由来のアシル基である。
脂肪酸としては、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸等の飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸、およびこれら脂肪酸の混合物が挙げられる。脂肪酸の混合物としては、ヤシ油脂肪酸、パーム核油脂肪酸、牛脂脂肪酸、硬化牛脂脂肪酸、大豆リン脂質由来脂肪酸、卵黄リン脂質由来脂肪酸が挙げられる。中でも好ましくは、大豆リン脂質由来脂肪酸、卵黄リン脂質由来脂肪酸であり、さらに好ましくは、大豆リン脂質由来脂肪酸である。
【００１４】
本発明で用いられる１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸塩は、下記式［III］で示されるものである。
【００１５】
【化３】
0006468018.tif 000004
（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表し、Ｍ＋はカチオンを表す。）
【００１６】
式［III］中のＲは式［Ｉ］中のＲと同義である。
式［III］中のＭとしては、例えば、アルカリ金属原子、アンモニウム、有機アンモニウムなどが挙げられる。アルカリ金属原子としては、例えば、ナトリウム、カリウムが挙げられる。有機アンモニウムとしては、例えば、トリエタノールアンモニウム、ブチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムが挙げられる。これらの中でも、入手のし易さや溶解性等の観点から、ナトリウム、カリウムが好ましい。
【００１７】
置換環状ホスファチジン酸（塩）の製造方法としては、例えば、リゾホスファチジルコリンをホスホリパーゼＤで酵素処理する方法、化学合成にて調製する方法（特開平６−２２８１６９号公報等を参照）等が挙げられる。
【００１８】
また、本発明で用いられる置換環状ホスファチジン酸（塩）の純度や形態は特に限定されない。例えば、純品のもの、賦形剤を含有するもの、液体のもの、粉体のものを用いることが可能である。具体的には、賦形剤としてシクロデキストリンを用いて凍結乾燥により得られた、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を含有する粉体が挙げられる。この凍結乾燥方法によれば、賦形剤によりさらさらとした取り扱いやすい脂質とすることが可能である。
１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸は１種または２種以上を用いることができ、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸塩も１種または２種以上を用いることができ、さらに１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸とその塩を併せて用いることもできる。
【００１９】
なお、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸は、商業的には、日油株式会社製「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＥＴ」、「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＰＷ」として入手することができる。「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＥＴ」および「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＰＷ」は、いずれも大豆リン脂質由来脂肪酸のアシル基である１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を含有する。大豆リン脂質由来脂肪酸の脂肪酸組成は、パルミチン酸２０．４質量％、ステアリン酸３．２質量％、オレイン酸１１．３質量％、リノール酸５７．６質量％、リノレン酸６．１質量％、その他１．４質量％である。
【００２０】
〔（ｂ）ポリメトキシフラボン〕
本発明で用いられる（ｂ）成分は式［II］で表されるポリメトキシフラボンである。
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、式［II］で表されるポリメトキシフラボンから選ばれる少なくとも１種のポリメトキシフラボンを含有する。
本発明の好ましい実施態様においては、以下の式［IV］〜式［VI］で示される３，５，６，７，８，３′，４′−ヘプタメトキシフラボン（ヘプタメトキシフラボン）、５，６，７，８，３′，４′−へキサメトキシフラボン（ノビレチン）、５，６，７，８，４′−ペンタメトキシフラボン（タンゲレチン）からなる群から選択される少なくとも１種のポリメトキシフラボンを含有する。
【００２１】
【化４】
0006468018.tif 000005
【００２２】
式［II］で表されるポリメトキシフラボンは、各種の合成法によって得ることができ、植物から天然物として溶媒抽出することによっても得ることができる。
植物から溶媒抽出にて得る方法としては、例えば、ミカン科ミカン属植物の果皮から抽出する方法が挙げられる。ミカン科ミカン属植物、例えば、ウンシュウミカン、シークワーサー、ポンカン、ハッサク、レモン、タチバナ、ユズ、スダチ、ザボン、タンジェリン、オレンジ、グレープフルーツなどには、ポリメトキシフラボンが含有されている（Journal of Medicinal Plant Research Vol. ４６, １６２−１６６, （１９８２））。これらの中で、好ましい植物はウンシュウミカン、シークワーサー、タチバナ、ユズ、スダチおよびオレンジであり、より好ましい植物はシークワーサー、オレンジおよびタチバナである。
【００２３】
ポリメトキシフラボンの単離精製は、これらのミカン科ミカン属植物の果皮を溶剤で抽出し、抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分離することにより行なうことができる。以下、具体的に説明する。
まず、ミカン属植物の果皮を、溶剤を用いて抽出する。かかる溶剤としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の水溶性アルコール；アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム等の溶剤；もしくはそれらの混合溶剤が挙げられる。好ましい溶剤は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールおよび酢酸エチルからなる群から選択される１種または２種以上の溶剤である。より好ましい溶剤は、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールおよび酢酸エチルからなる群から選択される１種または２種以上の溶剤である。
【００２４】
抽出に使用する溶剤の量は、ミカン属植物の果皮（乾燥物）に対して１〜１０倍質量、好ましくは２〜６倍質量である。抽出時の温度は、通常、室温（１〜３０℃）であり、好ましくは常温（１５〜２５℃）である。抽出期間は、例えば、１〜３０日間、好ましくは５〜２０日間である。
【００２５】
次に、抽出液を濃縮すると目的のポリメトキシフラボンを約１〜１５質量％含有する抽出物が得られる。この抽出物は、さらに乾固させてもよい。この抽出物を２倍質量以上、好ましくは３〜１０倍質量の酢酸エチルに溶解し、水を加えて撹拌・分層し、水層を除去してから酢酸エチルを留去して、乾固物を得ることができる。
なお、本発明においては、単離したヘプタメトキシフラボン、ノビレチン、タンゲレチンのいずれかを単独で用いてもよいし、これらの中から２種以上混合して用いてもよい。また、合成時の混合物のまま、あるいは植物抽出物等の複数の天然物を含む形態で用いてもよい。
【００２６】
得られた乾固物は、通常、適切な溶剤に再溶解されて液体カラムクロマトグラフィーに供され、ノビレチン、ヘプタメトキシフラボン、タンゲレチンが得られる。液体カラムクロマトグラフィーにおいては、例えば、シリカゲルまたはアルミナを充填材とし、溶離液として、ヘキサン／エタノールを容積比７０／３０〜９７／３で混合した混合溶剤が用いられる。
【００２７】
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤において、（ａ）成分の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）と（ｂ）成分のポリメトキシフラボンとの含有割合は、（ａ）：（ｂ）で１：９〜９：１の割合（質量比）が好ましく、より好ましくは１：４〜４：１の割合（質量比）であり、さらに好ましくは１：２〜２：１の割合（質量比）である。
【００２８】
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、医薬品、医薬部外品、食品として利用することができる。本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、ＰＧＥ２産生抑制効果に優れているので、抗炎症、むくみ抑制、にきび抑制に有用であり、皮膚外用剤に配合することが好ましい。
本発明のＰＧＥ２産生抑制剤は、（ａ）成分および（ｂ）成分に加えて、医薬品、医薬部外品、食品の分野で用いられる他の成分、例えば、溶剤や賦形剤などを含有することがある。
【００２９】
＜皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は本発明のＰＧＥ２産生抑制剤を含有する。
本発明の皮膚外用剤におけるＰＧＥ２産生抑制剤の含有量は、（ａ）成分と（ｂ）成分の合計配合量（乾燥質量）として、皮膚外用剤中、概ね０．０００１〜１質量％が好ましい。
本発明の皮膚外用剤の使用形態は任意であり、例えば、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、パック、オイル、軟膏、スプレー、貼付剤などの形態で利用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００３１】
（ａ）成分は、日油株式会社製「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＥＴ」：大豆リン脂質由来脂肪酸のアシル基である１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を４質量％、エタノールを４０質量％含有する水溶液、または、日油株式会社製「ＣｙＰＡ（登録商標）−ＰＷ」：大豆リン脂質由来脂肪酸のアシル基である１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を１０質量％、シクロデキストリンを５０質量％含有する粉末を使用した。
【００３２】
（ｂ）成分（ポリメトキシフラボン）の単離・精製について説明する。
ミカン科オレンジの乾燥果皮１００ｋｇをブレンダーにて粉砕し、５倍質量の９５％エタノールで５日間浸漬、抽出した。抽出液を濾過後、減圧濃縮してオレンジ果皮抽出物４５０ｇを得た。このオレンジ果皮抽出物を５倍質量の酢酸エチルに溶解し、酢酸エチルと等量の水を加えて撹拌し、静置した。分層後、水層を除去した。この操作を３回繰り返した後、酢酸エチルを留去し、乾固物２８０ｇを得た。
さらに、この乾固物を２倍質量のヘキサン／エタノール混合溶剤（容積比８５／１５）に溶解し、溶解液を得た。シリカゲルを充填したカラム（直径３０ｃｍ、長さ１ｍ）にこの溶解液を全量チャージした。このカラムにカラム容量の２倍容量のヘキサンを流した後、溶離液としてヘキサン／エタノール混合溶剤（容積比９０／１０）を使用し、溶出液を１Ｌずつ分画した。
この各分画液について、展開溶剤としてヘキサン／エタノール混合溶剤（容積比９０／１０）を使用したシリカゲル薄層クロマトグラフィーに供して分析したところ、上記式［IV］〜［VI］で示される３種の化合物の存在を確認した。そして、それぞれの化合物を含有する分画液を合一してから溶媒を留去し、式［IV］で示される化合物１、式［Ｖ］で示される化合物２、式［VI］で示される化合物３を得た。化合物１〜３の各収量は、化合物１（ヘプタメトキシフラボン）が１３ｇ、化合物２（ノビレチン）が９．２ｇ、、化合物３（タンゲレチン）が２．２ｇであった。このようにして、３種のポリメトキシフラボンが単離・精製された。
【００３３】
〔試験例：ＰＧＥ２産生抑制試験〕
ＰＧＥ２産生抑制試験に供する試験溶液は下記方法で調製した。
（１）１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸溶液の調製
ＣｙＰＡ（登録商標）−ＰＷ１０ｍｇに５０質量％エタノール水溶液を０．９９ｍＬ添加した。この液０．１ｍＬに無血清培地（ダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬社製）にペニシリン・ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製）が１００Ｕ／ｍＬ含有するように調製した）を９．９ｍＬ添加した（１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸濃度：１０μｇ／ｍＬ）。
【００３４】
（２）ポリメトキシフラボン溶液の調製
ポリメトキシフラボン（ノビレチン、ヘプタメトキシフラボンまたはタンゲレチン）１０ｍｇに８０質量％１，３−ブチレングリコール水溶液９．９９ｍＬを加えた。この液０．１ｍＬに無血清培地を９．９ｍＬ添加し、調製した（ポリメトキシフラボン濃度：１０μｇ／ｍＬ）。
【００３５】
（３）１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸とポリメトキシフラボン混合液の調製
上記の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸溶液と上記のポリメトキシフラボン溶液をそれぞれ５００μＬずつ採取し、混合して混合液を調製した（１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはポリメトキシフラボン濃度：５μｇ／ｍＬ）。
【００３６】
（ＰＧＥ２産生抑制効果）
不死化ヒト角化細胞（ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ）を２４ウェルプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌになるように播種した。播種培地は、ダルベッコ変法イーグル培地に牛胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）が１０％、ペニシリン・ストレプトマイシンが１００Ｕ／ｍＬ含有するように調製した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、無血清培地に置換し、２４時間培養した。培養終了後、リン酸緩衝生理食塩水（DULBECCO'S PHOSPHATE BUFFERED SALINE，ＳＩＧＭＡ社製）に置換し、ＵＶＢ（紫外線Ｂ波）を２０ｍＪ／ｃｍ２（０．２ｍＷ×１００秒）照射した。照射後、各ウェルに試験溶液を５００μＬずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、培養上清を回収し、ＰＧＥ２ＥｘｐｒｅｓｓＥＩＡＫｉｔ（Ｃａｙｍａｎ社製，９６ウェル）で上清中のＰＧＥ２量を測定した。すなわち、ＥＬＩＳＡ法でＨａＣａＴ  ｃｅｌｌが産生するＰＧＥ２量を測定した。
その結果を表１に示す。なお、表中に記載している数値は、各試料の有効分濃度を表す。また、ＵＶＢの欄中の「−」はＵＶＢ非照射を、「＋」はＵＶＢ照射を表す。
【００３７】
ポリメトキシフラボンと１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸とを組み合わせた実施例１〜３では、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸単独の場合（比較例１）、およびＰＧＥ２産生抑制効果を有することが知られているポリメトキシフラボン単独の場合（比較例２〜４）に比べ、ＰＧＥ２産生抑制効果が飛躍的に向上することが確認された。
【００３８】
【表１】
0006468018.tif 000006
【００３９】
以下に本発明の皮膚外用剤の配合処方例を示す。
【００４０】
〔配合処方例１：化粧水〕
（配合成分：質量％）
３，５，６，７，８，３′，４′−ヘプタメトキシフラボン：０．０１
１−アシル−２,３−環状ホスファチジン酸1)：０．０１
ポリオキシプロピレン（１０モル）メチルグルコシドエーテル2)：２．０
ポリオキシエチレン（２０モル）メチルグルコシドエーテル3)：５．０
１,３−ブチレングリコール：５．０
メチルパラベン：０．２
イオン交換水：残部
【００４１】
〔配合処方例２：乳液〕
（配合成分：質量％）
５，６，７，８，３′，４′−ヘキサメトキシフラボン：０．０５
１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸1)：０．０３
ポリオキシブチレンポリオキシエチレンポリオキシプロピレンメチルグルコシド4)：１．０
ポリオキシエチレン（２０モル）メチルグルコシドエーテル3)フ：５．０
１,３−ブチレングリコール：３．０
ホホバ油：３．０
トリ−２−エチルへキサン酸グリセリル：２．０
シクロペンタシロキサン：１．０
ベヘニルアルコール：３．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタン：１．０
モノステアリン酸グリセリル：２．０
カルボキシビニルポリマー：０．２  
Ｌ−アルギニン：０．１５
メチルパラベン：０．２
イオン交換水：残部
【００４２】
〔配合処方例３：クリーム〕
（配合成分：質量％）
５，６，７，８，４′−ペンタメトキシフラボン：０．５０
１−アシル−２,３−環状ホスファチジン酸1)：０．５０
ポリオキシブチレンポリオキシエチレンポリオキシプロピレンメチルグルコシド4)：１．０
ポリオキシエチレン（２０モル）メチルグルコシドエーテル3)：５．０
１,３−ブチレングリコール：３．０
ホホバ油：５．０
トリ−２−エチルへキサン酸グリセリル：５．０
ジメチルポリシロキサン（１００ＣＳ）：３．０
シクロペンタシロキサン：３．０
ベヘニルアルコール：３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール（７０モル）：１．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタン：１．０
モノステアリン酸グリセリル：２．０
メチルパラベン：０．２
イオン交換水：残部
【００４３】
１）ＣｙＰＡ（登録商標）−ＰＷ（大豆リン脂質由来脂肪酸のアシル基である１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を１０質量％、シクロデキストリンを５０質量％含有する粉末、日油株式会社製）。但し、上記の「１−アシル−２,３−環状ホスファチジン酸」の濃度は、１−アシル−２,３−環状ホスファチジン酸自体の濃度を表す。
２）マクビオブライドＭＧ−１０Ｐ、日油株式会社製
３）マクビオブライドＭＧ−２０Ｅ、日油株式会社製
４）ウィルブライドＭＧ−２０７０、日油株式会社製
【００４４】
上記のいずれの配合処方例においても、プロスタグランジンＥ２産生抑制効果が示された。