(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体を細胞培養担体として用い、肝細胞を５日間以上培養する方法であり、前記繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ２あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有していることを特徴とする、肝細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における薬剤の代謝のほとんどは肝臓で行なわれることから、創薬の非臨床試験では、生体から分離した正常肝細胞を用いて代謝試験を実施することが推奨されている。また、一般化学物質、食品中化学物質、新規素材などにおいても、有害性・安全性評価のために正常肝細胞を用いた評価が実施されている。
【０００３】
このような正常肝細胞は新鮮状態で入手することが困難であるため、凍結保存されたものが多く用いられているが、凍結肝細胞は解凍後の寿命が短く、最も一般的なプロトコルとして推奨されている、Ｉ型コラーゲンコートプレートによる単層培養法では、培養２〜３日程度で、肝代謝試験に重要な酵素活性が失われてしまう、という問題があった。
【０００４】
そのため、このような問題を解決するための方法として、細胞外基質のゲルで肝細胞を挟み込むサンドイッチ培養法（特許文献１）や、肝細胞の生存や機能維持を補助する異種細胞と共培養する方法（特許文献２）が提案されている。
【０００５】
しかしながら、前者のサンドイッチ培養法は、厳格な水素イオン指数や温度の管理や、肝細胞播種後に、再度、ゲルを重層する必要があるなど、作業工程が多く、培養するのが煩雑で、また、ハイスループット分析装置への適用が困難であった。また、ゲルでサンドイッチしているが故に、薬剤が肝細胞に到達しにくい、或いは肝細胞成分を抽出するのに手間がかかるなど、様々な問題点を有していた。
【０００６】
一方、後者の共培養する方法は、予め異種細胞を培養するのに手間がかかる、異種細胞と共培養しているが故に、肝細胞の応答だけを解析するのが難しい、という問題を有していた。
【０００７】
なお、本願出願人らは、「平均繊維径３μｍ以下の無機系繊維からなる無機系繊維集合体の内部を含む全体が無機系接着剤で接着され、繊維表面に細胞機能性因子が付与され、空隙率が９０％以上の高機能繊維構造体を培養担体として用いる」ことを提案した（特許文献３）。しかしながら、この高機能繊維構造体が肝細胞の培養担体として有用であることは認識していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−１７４１１号公報
【特許文献２】特開２００８−１１９０１０号公報
【特許文献３】特開２０１２−１６３２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上述のような問題点を解決するためになされたものであり、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、また、肝細胞を評価、解析しやすい、肝細胞の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１にかかる発明は、「単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体を細胞培養担体として用い、肝細胞を５日間以上培養する方法であり、前記繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ２あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有していることを特徴とする、肝細胞の培養方法。」である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の請求項１にかかる発明は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上であり、しかも繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ２あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有している繊維集合体を細胞培養担体として用いて肝細胞を培養すると、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を５日間以上という長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるため、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できることを見出したものである。このように酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できる機構は明らかではないが、本発明者らは、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広くなるため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。つまり、このような肝細胞と細胞接着因子とが立体的及び／又は多点的に、広く接触した構造は、生体内の組織構造に類似しており、生体内で肝細胞を取り巻く微小環境を再現しているため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。
【００１２】
また、繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ２あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有している、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体を、単に細胞培養担体として使用すれば良く、厳格な水素イオン指数や温度の管理やゲルを重層する必要がなく、また、異種細胞を培養する必要もないため、簡易な培養方法であり、ハイスループット分析装置への適用も容易である。
【００１３】
更に、ゲルでサンドイッチする訳でもないため、薬剤が肝細胞へ浸透しやすく、肝細胞成分を抽出するためにゲルを消化分解するという処理も不要であり、更には、共培養している訳ではないため、肝細胞の応答だけを解析できるなど、肝細胞を評価、解析しやすい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の繊維集合体を製造することのできる静電紡糸装置の一態様を模式的に示す説明図
【図２】（ａ）沿面放電素子の構造を模式的に示す平面図、（ｂ）沿面放電素子の構造を模式的に示す側面図
【図３】培養日数とアルブミン分泌量の関係を示すグラフ（実施例１〜２及び比較例１〜４）
【図４】培養日数とアルブミン分泌量の関係を示すグラフ（実施例１、３、比較例２、５）
【図５】誘導後の培養５日目に相当する肝細胞のラットＣＹＰ３Ａ活性を示すグラフ
【図６】誘導後の培養７日目に相当する肝細胞のラットＣＹＰ３Ａ活性を示すグラフ
【図７】誘導後の培養５日目に相当する生肝細胞の相対的細胞密度を示すグラフ
【図８】誘導後の培養７日目に相当する生肝細胞の相対的細胞密度を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の肝細胞の培養方法において使用する細胞培養担体は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体であり、その繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有している。このように、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に肝細胞に作用し、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えられるため、単位体積あたりの表面積は０．０５ｍ２／ｃｍ３以上であるのが好ましく、０．１ｍ２／ｃｍ３以上であるのがより好ましく、０．１２ｍ２／ｃｍ３以上であるのが更に好ましい。なお、単位体積あたりの表面積の上限は特に限定するものではないが、繊維の充填密度が高くなり過ぎると、肝細胞が繊維集合体内部に入り込みにくくなり、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込みにくくなり、立体的及び／又は多点的に接触するのが難しくなる結果、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が狭くなる傾向があるため、３０ｍ２／ｃｍ３以下であるのが好ましい。
【００１６】
この「単位体積あたりの表面積（＝Ｓ、単位：ｍ２／ｃｍ３）」は、平均繊維径（＝Ａ、単位：μｍ）、平均目付（＝Ｂ、単位：ｇ／ｍ２）、平均厚さ（＝Ｃ、単位：μｍ）及び繊維の密度（＝Ｄ、単位：ｇ／ｃｍ３）を用い、次の式から算出される値である。
Ｓ＝４Ｂ／（ＡＣＤ）
【００１７】
なお、この単位体積あたりの表面積は、次の考え方を根拠としている。
（１）平均繊維径がＡμｍで、繊維の密度がＤｇ／ｃｍ３である時、繊維の単位質量あたりの表面積は、４／（ＡＤ）（単位：ｍ２／ｇ）と表すことができる。
（２）平均目付Ｂｇ／ｍ２あたりの繊維のトータルの表面積は、４Ｂ／（ＡＤ）（単位：ｍ２）と表すことができる。
（３）１ｍ２（＝目付）あたり、厚さがＣμｍの繊維集合体の空隙も含めた体積は、１０−６Ｃ（単位：ｍ３）と表すことができる。
（４）単位体積あたりの表面積は、４×１０６Ｂ／（ＡＣＤ）（単位：ｍ２／ｍ３）＝４Ｂ／（ＡＣＤ）（単位：ｍ２／ｃｍ３）と表すことができる。
【００１８】
本発明の繊維集合体を構成する繊維の平均繊維径は、前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、表面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に肝細胞に作用できるように、３μｍ以下であるのが好ましく、２μｍ以下であるのがより好ましく、１μｍ以下であるのが更に好ましく、０．８μｍ以下であるのが更に好ましい。なお、平均繊維径の下限は特に限定するものではないが、０．０１μｍ以上であるのが好ましい。本発明における「平均繊維径」は５０点における繊維径の算術平均値をいい、「繊維径」は１０本以上の繊維が写る視野で繊維集合体を撮影した電子顕微鏡写真をもとに測定した繊維の太さをいう。
【００１９】
また、本発明の繊維集合体の平均目付は前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、表面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に作用できるように、０．５ｇ／ｍ２以上であるのが好ましく、２ｇ／ｍ２以上であるのがより好ましく、５ｇ／ｍ２以上であるのが更に好ましい。なお、平均目付の上限は特に限定するものではないが、１００ｇ／ｍ２以下であるのが好ましい。本発明における「平均目付」は、最も面積の広い面の面積及び質量を測定し、この面積と質量から、面積１ｍ２当たりの質量に換算した値を目付とし、１８点における目付の算術平均値をいう。
【００２０】
更に、本発明の繊維集合体の平均厚さは前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、肝細胞が細胞培養担体に立体的及び／又は多点的に接触しているのが好ましいことから、肝細胞の直径２０μｍと同程度以上の平均厚さであるのが望ましいが、必要以上に厚いと培地の流動性又は循環性が悪くなる傾向があるため、２０〜２０００μｍであるのが好ましく、４０〜１０００μｍであるのがより好ましく、１００〜３００μｍであるのが更に好ましい。本発明における「平均厚さ」は、最も面積の広い面のマイクロメーター法［荷重：０．５Ｎ（測定面積：直径１４．３ｍｍ）］で測定した値を厚さとし、５４箇所における算術平均値をいう。
【００２１】
更に、繊維の密度は前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、繊維の密度が細胞培養に使用する代表的な緩衝液である生理食塩水よりも低いと、培養操作時に取り扱いづらいため、１．００３〜１６ｇ／ｃｍ３であるのが好ましく、１．０５〜１０ｇ／ｃｍ３であるのがより好ましく、１．１〜６ｇ／ｃｍ３であるのが更に好ましい。本発明における「繊維の密度」は、繊維の元素分析を行い、９９％以上が同一素材から構成されていることが確認された場合には、素材そのものの比重を密度とし、９９％未満が同一素材で、二種類以上の素材から構成されていることが確認された場合には、ピクノメータ理論に基づき、定容積膨張法［例えば、乾式自動密度計（株式会社島津製作所製、アキュピックII）で測定可能］により測定した値を密度とする。
【００２２】
本発明の繊維集合体は肝細胞を培養しやすいように、肝細胞の大きさの０．１〜２倍の平均孔径を有するのが好ましい。肝細胞の大きさは約２０μｍであるため、繊維集合体の平均孔径は２〜４０μｍであるのが好ましく、４〜２０μｍであるのがより好ましく、６〜１０μｍであるのが更に好ましい。なお、平均孔径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径の値をいい、ポロメータ［Ｐｏｌｏｍｅｔｅｒ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）社製］を用いて、ミーンフローポイント法により測定される値をいう。
【００２３】
本発明の繊維集合体の形態は肝細胞の培養に適用できる形態であれば良く、特に限定するものではないが、例えば、不織布、織物、編物のような二次元的形態、中空円筒形、円筒形などの三次元的形態であることができる。なお、三次元的形態の繊維集合体は、例えば、不織布形態等の二次元的形態の繊維集合体を成形することによって製造できる。
【００２４】
本発明の繊維集合体は繊維集合体の内部及び／又は繊維間に形成される孔に、肝細胞が入り込み、繊維表面のラミニン又はフィブロネクチンが有効に作用しやすいように、空隙率が９０％以上であるのが好ましく、９１％以上であるのがより好ましく、９２％以上であるのが更に好ましく、９３％以上であるのが更に好ましく、９４％以上であるのが更に好ましい。空隙率の上限は特に限定するものではないが、形態安定性に優れるように、９９．９％以下であるのが好ましい。
【００２５】
本発明の「空隙率」は、次の式から算出した値である。
Ｐ＝［１−Ｍｓ／（Ｖ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは空隙率（単位：％）、Ｍｓは繊維集合体の質量（単位：ｇ）、Ｖは繊維集合体の占める見掛上の体積（単位：ｃｍ３）、ＳＧは繊維集合体構成繊維の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
【００２６】
例えば、繊維集合体が不織布のように厚さが均一なシート形態の場合は、次の式から算出することができる。
Ｐ＝［１−Ｍｎ／（ｔ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは空隙率（％）、Ｍｎは繊維集合体の平均目付（ｇ／ｍ２）、ｔは繊維集合体の平均厚さ（μｍ）、ＳＧは繊維集合体構成繊維の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
【００２７】
本発明で使用する繊維集合体が二次元的形態（特に不織布）の場合、形態安定性に優れ、充分な強度を有するように、引張破断強度が０．２ＭＰａ以上であるのが好ましく、０．３ＭＰａ以上であるのがより好ましく、０．４ＭＰａ以上であるのが更に好ましく、０．５ＭＰａ以上であるのが更に好ましく、０．５５ＭＰａ以上であるのが更に好ましい。
【００２８】
この「引張破断強度」は切断荷重を繊維集合体の断面積で除した商である。なお、切断荷重は次の条件で測定した値であり、断面積は測定時の試験片の幅（＝５ｍｍ）と平均厚さの積から得られる値である。
【００２９】
製品名：小型引張試験機
型式：ＴＳＭ−０１−ｃｒｅ サーチ株式会社製
試験サイズ：５ｍｍ幅×４０ｍｍ長
チャック間間隔：２０ｍｍ
引張速度：２０ｍｍ／ｍｉｎ．
初荷重：５０ｍｇ／１ｄ
【００３０】
本発明の繊維集合体の繊維単位質量あたりの水酸基量は特に限定するものではないが、ラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面に付与する際の、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する水溶液との親和性に優れるように、ある程度の量の水酸基が必要である一方で、水酸基量が過剰で親水性が高すぎると、繊維表面を水分子が取り巻き、ラミニン又はフィブロネクチンの繊維表面への吸着が阻害される場合があるため、５〜５００μｍｏｌ／ｇであるのが好ましく、１５〜３００μｍｏｌ／ｇであるのがより好ましく、３０〜１００μｍｏｌ／ｇであるのが更に好ましい。
【００３１】
この繊維単位質量あたりの水酸基量は、繊維集合体の水酸基量を水酸基量測定に用いた繊維集合体の繊維量（単位：ｇ）で除した商である。なお、「水酸基量」は、中和滴定法を用いて定量した値である。つまり、繊維集合体を２０ｖｏｌ％の塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬ中に分散させた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和点まで滴下し、中和に必要な水酸化ナトリウム滴下量から、繊維集合体の水酸基量を決定する（参考文献参照）。
（参考文献）
George W S.,Determination of Specific Sufface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
【００３２】
本発明の繊維集合体を構成する繊維は前記単位体積あたりの表面積を満たす限り、特に限定するものではないが、例えば、ナイロン繊維、ビニロン繊維、ビニリデン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリエステル繊維、アクリル繊維、ポリオレフィン繊維、ポリウレタン繊維、フッ素樹脂繊維などの合成繊維；レーヨン繊維などの再生繊維；アセテート繊維などの半合成繊維；金属酸化物成分を１種類以上含む繊維、炭素繊維などの無機系繊維；綿、麻、羊毛、絹などの天然繊維；を挙げることができ、単独で、又は２種類以上の繊維から構成することができる。これらの中でも、無機系繊維は剛性があり、培地中においても繊維集合体の形態を維持し、繊維集合体の広い表面積を有効に利用できるため好適であり、特に、金属酸化物成分を１種類以上含む繊維表面は生体親和性に優れ、ラミニン又はフィブロネクチンといった生体分子、並びに肝細胞との親和性に優れているため好適である。
【００３３】
なお、好適である金属酸化物成分を１種類以上含む繊維の場合、ゲル状、乾燥ゲル状又は焼結した繊維であることができる。ゲル状繊維は溶媒を含む状態の繊維であり、乾燥ゲル状繊維はゲル状繊維中に含まれる溶媒などが抜けた多孔質の繊維であり、焼結繊維は乾燥ゲル状繊維が焼結した無孔質の繊維である。これらの中でも、焼結繊維は剛性に優れ、細胞培養時に形態安定性に優れているため好適である。このような金属酸化物成分を１種類以上含む繊維は保形性に優れているように、繊維集合体の３０ｍａｓｓ％以上を占めているのが好ましく、５０ｍａｓｓ％以上を占めているのがより好ましく、７０ｍａｓｓ％以上を占めているのが更に好ましく、１００ｍａｓｓ％を占めているのが最も好ましい。
【００３４】
また、好適である金属酸化物成分を１種類以上含む繊維を構成する金属酸化物としては、例えば、リチウム、ベリリウム、ホウ素、炭素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウムなどの金属酸化物を挙げることができ、より具体的には、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができる。なお、一成分の金属酸化物から構成されていても、二成分以上の金属酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２−Ａｌ２Ｏ３の二成分の金属酸化物から構成されていても良い。
【００３５】
更に、本発明の繊維集合体構成繊維は連続繊維であるのが好ましい。培養条件下の肝細胞は生育に最適な環境を形成するために、細胞同士が接触して相互作用することが知られており、繊維が不連続であると、肝細胞が移動し、接触する確率が低下しやすい傾向があるためである。なお、「連続繊維」とは、繊維集合体の５,０００倍の電子顕微鏡写真を撮影した場合に、構成繊維の端部を確認できないことを意味する。
【００３６】
本発明の繊維集合体（特に不織布の場合）は接着剤で接着されているのが好ましい。形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいためである。特に、繊維集合体の内部を含む全体において、繊維同士間に被膜を形成することなく接着剤で接着していると、表面積が広いため、ラミニン又はフィブロネクチンを効率的に作用させることができ、また、肝細胞に必要な栄養素や酸素などを効率的に供給できるため好適である。
【００３７】
この接着剤は有機系接着剤であっても、無機系接着剤であっても、或いは有機系接着剤と無機系接着剤との併用であっても良いが、形態安定性に優れているように、無機系接着剤を含む接着剤で接着されているのが好ましく、無機系接着剤のみによって接着されているのがより好ましい。
【００３８】
また、本発明の繊維集合体は細胞培養時における形態安定性に優れているように、前述のような接着剤による接着に替えて、又は加えて、繊維同士が部分的に融着した状態にあるのが好ましい。部分的に融着している場合、ドット状又はライン状であることができ、前者のドット状である場合、その形状は、例えば、長方形などの矩形、円形、楕円形、長円形などの丸形、又はこれらの組合せであることができ、後者のライン状である場合、直線、曲線又はこれらの組合せであることができる。特に、繊維集合体の外縁において、繊維同士がライン状又はドット状に融着していると、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいため好適である。
【００３９】
このように外縁において繊維同士が融着している場合、形態安定性に優れているように、外縁部における厚さ方向の内部においても、繊維同士が融着しているのが好ましい。具体的には、外縁部における融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真において、粒状の塊（融着部）の占める面積が、繊維集合体の断面積の５％以上を占めているのが好ましく、より好ましくは１０％以上占めており、更に好ましくは１５％以上占めており、更に好ましくは２０％以上占めている。なお、前記粒状の塊（融着部）の占める面積が５％未満であっても、融着部の数が５ヶ所以上であるように融着していれば、形態安定性に優れている。
【００４０】
この外縁部における厚さ方向断面における、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）繊維集合体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）前記電子顕微鏡写真において、融着部における厚さを一辺（短辺）とし、前記厚さの５倍の長さを一辺（長辺）とする長方形の枠を任意の箇所に設定し、測定領域を確定する。
（３）前記測定領域内における粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｃ）は、次の式から算出する。
Ａｒｃ＝（Ａｔｃ／Ａｍｃ）×１００
ここで、Ａｔｃは測定した融着部の面積の総和、Ａｍｃは測定領域の面積、をそれぞれ意味する。
【００４１】
なお、繊維集合体が接着剤で接着していない場合には、形態安定性に優れるように、繊維集合体の外縁がライン状又はドット状に融着しているとともに、繊維集合体の主面における融着した外縁よりも内側においても、ドット状又はライン状に部分的に融着しているのが好ましい。このように内側においても融着している場合、融着した外縁よりも内側における融着部の総面積が、主面における融着した外縁に囲まれた面積の５％以上を占めるように融着しているのが好ましく、１０％以上を占めるように融着しているのがより好ましい。なお、繊維集合体の主面における融着部は１点以上であるのが好ましく、５点以上であるのがより好ましい。また、主面における融着した外縁に囲まれた領域に２点以上融着している場合、任意の箇所で融着していることができるが、融着部が分散して融着していると、より形態安定性に優れている。
【００４２】
なお、繊維集合体の主面における融着した外縁よりも内側において、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）繊維集合体の主面全体の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積を測定する。
（３）繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域における、粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｓ）は、次の式から算出する。
Ａｒｓ＝（Ａｔｓ／Ａｍｓ）×１００
ここで、Ａｔｓは繊維集合体の主面における融着部の占める面積の総和、Ａｍｓは繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積、をそれぞれ意味する。
【００４３】
本発明における「融着」とは、繊維集合体構成繊維が溶融し、繊維集合体構成繊維の横断面積の２倍以上の大きさを有する粒状の塊の状態で固着し、繊維間に介在していることをいう。このような状態は、繊維集合体の厚さ方向における断面電子顕微鏡写真、及び／又は繊維集合体の主面における電子顕微鏡写真から確認することができる。なお、「繊維集合体構成繊維の横断面積」は粒状の塊に隣接する箇所における繊維の横断面積をいう。また、「繊維集合体構成繊維が溶融して粒状の塊の状態で固着している」ことは、ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分析：Energy dispersive X-ray spectrometry）などの微小領域を分析可能な元素分析により、繊維集合体構成繊維を構成する元素と粒状の塊を構成する元素とが同じであることによって確認できる。
【００４４】
このような本発明の単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体は、例えば、静電紡糸法、特開２００９−２８７１３８号公報に開示されているような、液吐出部から吐出された紡糸液に対してガスを平行に吐出し、紡糸液に１本の直線状に剪断力を作用させて繊維化する方法、メルトブロー法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法などにより製造することができるが、空隙率が９０％以上であるのが好ましいため、特開２００４−２３８７４９号公報に記載の方法により製造するのが好ましく、特には、前記公報に記載の方法により繊維を集積した後に、接着剤で接着するのが好ましい。より具体的には、（１）紡糸溶液を静電紡糸法により繊維を紡糸する工程（紡糸工程）、（２）前記繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、繊維ウエブを形成する工程（集積工程）、及び（３）前記繊維ウエブを結合（特に接着剤で接着）して繊維集合体とする工程（結合工程）、により製造することができる。
【００４５】
特に、本発明の繊維集合体構成繊維として好適である、金属酸化物成分を１種類以上含む繊維を含む繊維集合体は、特開２０１０−１８５１６４号公報に記載の方法により製造することができる。つまり、（１）金属元素の酸化物を含む紡糸用ゾル溶液を用いて、静電紡糸法により無機系繊維を紡糸する工程（紡糸工程）、（２）前記無機系繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、無機系繊維ウエブを形成する工程（集積工程）により、無機系繊維ウエブを繊維集合体として製造することができる。
【００４６】
なお、（２）の集積工程の後に、熱処理する工程を実施して、無機系繊維同士を接着すると、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいため好適である。特に、２００℃以上、好ましくは３００℃以上で熱処理を実施し、無機系繊維同士の交点で接着すると、形態安定性に優れているため好適である。なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、熱処理温度によって水酸基量を調節することもでき、例えば、熱処理温度を３００℃とすることによって、水酸基量を約３００μｍｏｌ／ｇとすることができ、熱処理温度を５００℃とすることによって、水酸基量を約１００μｍｏｌ／ｇとすることができる。
【００４７】
また、（２）の集積工程の後（熱処理する場合には熱処理後）に、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいように、（３）前記無機系繊維ウエブを結合して繊維集合体とする工程（結合工程）を含んでいるのが好ましい。この結合工程としては、例えば、接着剤による接着、部分的な融着などを挙げることができる。
【００４８】
この接着剤によって接着する場合、金属元素の酸化物を含むゾル溶液（特には、金属アルコキシド加水分解縮合物が好ましい）を接着剤として使用すると、繊維集合体の形態安定性に優れ、無機系繊維が離脱しにくいため好適である。特に、無機系繊維を構成する金属酸化物と同じ金属元素の酸化物を含むゾル溶液を接着剤として使用すると、接着力に優れ、更に繊維集合体の形態安定性に優れ、無機系繊維が離脱しにくいため好適である。この接着剤による接着は無機系繊維ウエブ表面のみなど、一部の無機系繊維のみを接着しても良いが、形態安定性及び繊維脱落性に優れているように、無機系繊維ウエブの内部を含む全体を接着するのが好ましい。このように無機系繊維ウエブの内部を含む全体を接着するには、例えば、無機系繊維ウエブを金属元素の酸化物を含むゾル溶液に浸漬することによって実施できる。なお、無機系繊維ウエブの全体を接着剤で接着する際に無機系繊維ウエブの嵩が潰れないように、接着剤付与後の余剰の接着剤は、通気により除去するのが好ましい。通気により除去することによって、無機系繊維間に被膜を形成することもない。更に、室温で自然乾燥するか、熱処理により接着剤の溶媒を除去して、接着することができる。
【００４９】
更に、（３）結合工程の後に、無機系繊維を無機化及び／又は金属元素の酸化物を含むゾル溶液（接着剤）を無機化し、無機系繊維の強度及び剛性、無機系繊維同士の接着強度、及び繊維集合体の形態安定性を向上させるために、焼成処理を行なうのが好ましい。なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、焼成温度によって水酸基量を調節することもでき、例えば、焼成温度を３００℃とすることによって、水酸基量を約３００μｍｏｌ／ｇとすることができ、焼成温度を５００℃とすることによって、水酸基量を約１００μｍｏｌ／ｇとすることができる。
【００５０】
前述の結合工程（３）を、接着剤で接着するのに替えて、又は加えて、部分的に融着し、形態安定性及び繊維脱落防止性を付与することができる。なお、接着剤での接着と部分的融着の両方を実施する場合には、どの順序で行っても構わない。また、部分的に融着する方法としては、例えば、集光した光やレーザーを照射する方法、ガスバーナーを使用する方法、放電を使用する方法、電子ビームを使用する方法、などを挙げることができ、特にレーザーによる方法は、所望箇所のみを融着させることができ、また、非接触状態で融着させることができることから、小さい歪で融着させることができ、嵩高性を損なわないため好適である。
【００５１】
本発明の肝細胞の培養方法においては、上述のような繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用することによって、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるため、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できることを見出したものである。その機構は明らかではないが、本発明者らは、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広くなるため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。つまり、このような肝細胞と細胞接着因子とが立体的及び／又は多点的に、広く接触した構造は、生体内の組織構造に類似しており、生体内で肝細胞を取り巻く微小環境を再現しているため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。
【００５２】
本発明において、繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体の調製方法は特に限定するものではないが、例えば、繊維集合体を培養容器等の底面に配置した後、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液を供給し、該溶液中に繊維集合体を浸漬して自然吸着する方法、繊維集合体を培養容器等の底面に配置した後、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液を繊維集合体に塗布又はスプレーして自然吸着する方法などを挙げることができる。
【００５３】
前記ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液における、ラミニン又はフィブロネクチンの含有量は特に限定するものではないが、繊維表面の単位面積に対して含有量が少ないと、肝細胞との接触が少なくなり、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養しにくくなる傾向があるため、繊維表面積１ｃｍ２あたり、０．０５μｇ以上含有しているのが好ましく、０．１５μｇ以上含有しているのがより好ましく、０．２５μｇ以上含有しているのが更に好ましい。また、含有量の上限に関しては特に限定するものではないが、繊維表面の単位面積に対して必要以上の含有量があっても、ラミニン又はフィブロネクチンを含有していることの効果が上限に達しており、それ以上の効果は得られない傾向があるため、繊維表面積１ｃｍ２あたり、３０μｇ以下含有しているのが好ましい。
【００５４】
なお、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液は、ラミニンとフィブロネクチンの両方を含有していても構わず、更に、その他の生理活性物質（例えば、ラミニン、フィブロネクチン以外の細胞外基質、細胞増殖因子など）を含有していても構わない。このように、ラミニンとフィブロネクチンの両方を含有している場合、その合計含有量が０．０５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのが好ましく、１．５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのがより好ましく、０．２５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのが更に好ましい。
【００５５】
本発明の肝細胞の培養方法は、上述のようなラミニン又はフィブロネクチンを有する繊維表面に有する繊維集合体を細胞培養担体として使用する方法であり、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合せた細胞培養担体を用いて肝細胞を培養すると、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できるという、予測できない優れた効果を見出したものである。つまり、凍結肝細胞は凍結、解凍等の低温保存する過程において、損傷を受けやすく、培養するのが非常に難しい細胞であるが、このような凍結肝細胞であっても、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できるということは、驚くべき優れた効果である。
【００５６】
このように、本発明の肝細胞の培養方法は、前述のような繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用すること以外は、従来と全く同様にして、肝細胞を培養する方法である。つまり、前述の細胞培養担体を用い、肝細胞を播種し、培養する方法である。例えば、前述の細胞培養担体を培養容器等に入れ、培地に懸濁した肝細胞を静かに播種し、適宜、培地交換を行うことによって培養できる。
【００５７】
本発明においては、接着性を有する肝細胞を使用するのが好ましい。凍結肝細胞においては、肝臓からの細胞単離処理時のダメージにより、接着性が失活する場合があるが、このような接着性が失活した肝細胞は本発明の細胞培養担体を使用しても、培養するのが困難な傾向があるためである。なお、本発明の培養方法によれば、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるという優れた効果を奏するが、新鮮肝細胞であっても、使用することができる。また、肝細胞の由来する動物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットといったげっ歯類、更には、イヌ、ウサギ、ブタなど、創薬の非臨床試験や化学物質などの安全性評価に用いられる哺乳動物の肝細胞を使用することができる。
【００５８】
なお、本発明において肝細胞の播種密度は特に限定するものではないが、細胞培養担体の播種面の見掛面積に対して、過剰な肝細胞を播種すると、肝細胞と繊維が十分に接触できず、ラミニン又はフィブロネクチンが十分に作用できない場合があるため、播種密度は細胞培養担体播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり、３．０×１０５viable cells以下あるのが好ましく、２．０×１０５viable cells以下であるのがより好ましく、１．５×１０５viable cells以下であるのが更に好ましい。一方で、肝細胞の播種密度が少なすぎると、肝細胞同士の相互作用が低下し、成育に必要な微小環境の構築に不具合が生じやすい傾向があるため、播種密度は細胞培養担体播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり、０．１×１０５viable cells以上であるのが好ましく、０．２×１０５viable cells以上であるのがより好ましく、０．５×１０５viable cells以上であるのが更に好ましい。
【００５９】
また、培地は各細胞メーカー又は試薬メーカーから肝細胞培養用として販売されている培地を使用することができる。
【００６０】
以上、説明した通り、本発明の肝細胞の培養方法は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体として単に使用すれば良く、厳格な水素イオン指数の管理、温度の管理、ゲルの重層、或いは異種細胞の培養といった煩雑な操作の必要性がなく、簡易な培養方法であり、ハイスループット分析装置への適用も容易である。更に、ゲルでサンドイッチする訳でもなく、肝細胞が露出した状態で培養することができるため、薬剤が肝細胞へ浸透しやすく、肝細胞成分を抽出するためにゲルを消化分解する手間も不必要で、更には、共培養する必要がなく、肝細胞のみで培養できるため、肝細胞の応答だけを解析できるなど、評価、解析しやすい培養方法である。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明の肝細胞の培養方法について具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、繊維単位重量あたりの水酸基量は繊維集合体の水酸基量を水酸基量測定に用いた繊維集合体質量（単位：ｇ）で除した商であり、水酸基量は中和滴定法を用いて定量した値である。つまり、繊維集合体を２０ｖｏｌ％の塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬ中に分散させた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和点まで滴下し、中和に必要な水酸化ナトリウム滴下量から、繊維集合体の水酸基量を決定した（参考文献参照）。
（参考文献）
George W S.,Determination of Specific Surface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
【００６２】
（繊維集合体の作製）
金属化合物としてのテトラエトキシシラン、溶媒としてのエタノール、加水分解のための水、及び触媒として１規定の塩酸を、１：５：２：０．００３のモル比で混合し、温度７８℃で１０時間の還流操作を行い、次いで、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去して濃縮した後、温度６０℃に加熱して、粘度が２ポイズのゾル溶液を形成した。
【００６３】
得られたゾル溶液を用いて、静電紡糸法によりゲル状シリカ連続繊維を紡糸する（紡糸工程）とともに、前記ゲル状シリカ連続繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、ゲル状シリカ連続繊維ウエブを形成（集積工程）した。つまり、特開２００５−２６４３７４号公報の実施例８と同じ紡糸条件でゲル状シリカ連続繊維ウエブを形成した。より具体的には、図１の対向電極５として、図２の対向電極（沿面放電素子２５）を紡糸容器室内に収納した紡糸装置を使用し、次の条件で紡糸した。
【００６４】
（１）紡糸ノズル：内径０．４ｍｍの金属製注射針（先端カット）
（２）紡糸ノズルと対向電極との距離：２００ｍｍ
（３）対向電極及びイオン発生電極（両電極を兼ねる）：ステンレス板（誘起電極）上に厚さ１ｍｍのアルミナ膜（誘電体基板）を溶射し、その上に直径３０μｍのタングステンワイヤ（放電電極）を１０ｍｍの等間隔で張った沿面放電素子（タングステンワイヤ面を紡糸ノズルと対向させると共に接地し、ステンレス板とタングステンワイヤ間に交流高電圧電源により５０Ｈｚの交流高電圧を印加）
（４）第１高電圧電源：−１６ｋＶ
（５）第２高電圧電源：±５ｋＶ（交流沿面のピーク電圧：５ｋＶ、５０Ｈｚ）
（６）気流：水平方向（紙面上、左から右方向）２５ｃｍ／ｓｅｃ、鉛直方向（紙面上、捕集部材４の上から下方向）１５ｃｍ／ｓｅｃ
（７）紡糸容器内の雰囲気：温度２５℃、湿度４０％ＲＨ以下
【００６５】
次に、前記ゲル状シリカ連続繊維ウエブを、温度８００℃で３時間の熱処理をすることにより乾燥し、乾燥シリカ連続繊維同士の交点で接着した乾燥シリカ連続繊維ウエブを作製した。
【００６６】
続いて、金属化合物としてテトラエトキシシラン、溶媒としてエタノール、加水分解のための水、及び触媒として硝酸を、１：７．２：７：０．００３９のモル比で混合し、温度２５℃、攪拌条件３００ｒｐｍで１５時間反応させた後、酸化ケイ素の固形分濃度が０．２５％となるようにエタノールで希釈してシリカゾル溶液を調製し、接着剤とした。
【００６７】
次いで、前記乾燥シリカ連続繊維ウエブを前記シリカゾル溶液（接着剤）に浸漬した後、吸引により余剰のシリカゾル溶液を除去した後、温度５００℃で３時間焼成して、内部を含む全体における焼結シリカ連続繊維同士を、被膜を形成することなくシリカで接着した、焼結シリカ連続繊維のみからなる、不織布形態を有するシート状の焼結シリカ連続繊維集合体（平均目付：７．４２ｇ／ｍ２、平均厚さ：０．１４２ｍｍ、空隙率：９５％、平均孔径：７μｍ、水酸基量：５０μｍｏｌ／ｇ、焼結シリカ連続繊維の平均繊維径：０．７３μｍ、焼結シリカの密度：２．２ｇ／ｃｍ３、引張破断強度：０．５６８ＭＰａ、単位体積あたりの表面積：０．１３ｍ２／ｃｍ３）を作製した。
【００６８】
（実施例１〜２、比較例１）
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径６．２５ｍｍの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
【００６９】
次いで、４７９．５２μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［＝実施例１、マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］、４７９．５２μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液［＝実施例２、ヒト血漿由来（ＢＤ,３５４００８）］、又は４７９．５２μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液［＝比較例１、ラット尾由来（ＢＤ,３５４２３６）］のコート液を、それぞれ１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、各焼結シリカ連続繊維表面にラミニン、フィブロネクチン又はコラーゲンを有する細胞培養担体をそれぞれ調製した。なお、細胞低接着性９６ウェルプレートにはタンパク質は吸着しないものと見なした場合、いずれの細胞培養担体も繊維表面積１ｃｍ２あたりの含有量は４．２μｇであった。
【００７０】
その後、各コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、細胞培養担体をそれぞれ２回ずつ洗浄した。
【００７１】
そして、細胞培養担体上で、１４日間、肝細胞を培養した。なお、培養条件は次の通りとした。
【００７２】
ＳＤラット凍結肝細胞（Ｌｏｎｚａ,ＡＣ−６００９）を解凍後、２％牛胎児血清を含む肝細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ，ＣＣ−３１９８）に分散し、遠心洗浄（５０ｘｇ，９０ｓｅｃ，４℃）を一回行った。次いで、同培地を用いて肝細胞を再懸濁させ、トリパンブルー法によって肝細胞の生存率を算出した。
【００７３】
その後、細胞培養担体の播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり播種密度１．０×１０５viable cells、１ウェルあたりの培地量１００μＬで、それぞれのウェルに生肝細胞を播種し、温度３７℃、ＣＯ２分圧５％の加湿インキュベータ内で培養を開始した。そして、播種４時間後に、牛胎児血清を含まない肝細胞培養培地に交換を行い、その後、同培地を用いて１日１回の頻度で培地交換を行った。
【００７４】
（比較例２〜４）
細胞接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、３３．３μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［＝比較例２、マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］、３３．３μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液［＝比較例３、ヒト血漿由来（ＢＤ,３５４００８）］、又は３３．３μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液［＝比較例４、ラット尾由来（ＢＤ,３５４２３６）］のコート液を、それぞれ１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、各ウェル底面をラミニン、フィブロネクチン又はコラーゲンでコートした。なお、いずれも底面積１ｃｍ２あたりの含有量は５μｇであった。
【００７５】
その後、各コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各ウェルをそれぞれ２回ずつ洗浄した。
【００７６】
そして、実施例１〜２と同じ操作で、１４日間、肝細胞を培養した。
【００７７】
（実施例３）
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径６．２５ｍｍの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
【００７８】
次いで、３３．３μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］のコート液を、１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、焼結シリカ連続繊維表面にラミニンを有する細胞培養担体を調製した。なお、細胞低接着性９６ウェルプレートにはタンパク質は吸着しないものと見なした場合、細胞培養担体の繊維表面積１ｃｍ２あたりの含有量は０．２９μｇであった。
【００７９】
その後、コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各細胞培養担体をそれぞれ２回ずつ洗浄した。
【００８０】
そして、実施例１〜２と同じ操作で、細胞培養担体上で、１４日間、肝細胞を培養した。
【００８１】
（比較例５）
細胞接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、４７９．５２μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］のコート液を、１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、ウェル底面をラミニンでコートした。なお、底面積１ｃｍ２あたりの含有量は７２．７μｇであった。
【００８２】
その後、コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各ウェルをそれぞれ２回ずつ洗浄した。
【００８３】
そして、実施例１〜２と同じ操作で、１４日間、肝細胞を培養した。
【００８４】
（アルブミン分泌量の測定）
培地交換時の培養上清を全量回収（各ウェル１００μＬ）し、凍結保存を行った。全培養日程終了後、これらを解凍し、培養上清中に分泌されたラット由来アルブミン量を、ＥＬＩＳＡ法 （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）によって測定した。検出には、一次抗体として抗ラットアルブミンウサギ抗血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，５５７１１）、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットアルブミンヒツジＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，５５７７６）を使用した。なお、測定値の取得には、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）を使用し、付属のソフトウェアで解析した。この結果を示すグラフを図３（実施例１〜２及び比較例１〜４）及び図４（実施例１、３、比較例２、５）に示した。なお、グラフは４ウェルの平均値と標準偏差を示している。
【００８５】
（肝代謝酵素の誘導実験）
実施例１と比較例２の肝細胞の培養において、３日又は５日間培養した後に、肝細胞の培養培地を除去し、肝細胞培養培地（図５〜８中、「定常状態」と表記）、０．１ｖｏｌ％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む肝細胞培養培地（図５〜８中、「溶媒のみ」と表記）、又は５０ｍＭデキサメサゾン（Ｄｅｘ）を溶解したＤＭＳＯを０．１ｖｏｌ％混和した肝細胞培養培地（Ｄｅｘ終濃度：５０μＭ、図５〜８中、「誘導薬剤あり」と表記）を、各ウェルに１００μＬ添加した。
【００８６】
次の日、同様の培地交換を行い、計４８時間の酵素誘導を行って、誘導後の培養５日又は７日目に相当する肝細胞のラットＣＹＰ３Ａ活性を測定した。なお、ラットＣＹＰ３Ａ活性の測定は、ＣＹＰ３Ａ４活性測定キット（プロメガ，Ｖ９００１）を使用し、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）によって実施した。この結果を示すグラフを図５（誘導後の培養５日目）及び図６（誘導後の培養７日目）に示した。なお、グラフは３ウェルの平均値と標準偏差で示した。
【００８７】
更に、ラットＣＹＰ３Ａ活性測定後に、ウェルの生肝細胞の相対的細胞密度の測定を行なった。なお、生肝細胞の相対的細胞密度の測定は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所，３４１−０７７６１）を使用し、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）によって行なった。この結果を示すグラフを図７（誘導後の培養５日目）及び図８（誘導後の培養７日目）に示した。なお、グラフは３ウェルの平均値と標準偏差で示した。
【００８８】
実施例１〜２の肝細胞の培養方法と比較例１〜４の肝細胞の培養方法により培養した肝細胞のアルブミン分泌量を示す図３から、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用すると、１０〜１４日間程度、高い活性を維持できる肝細胞を培養できることが分かった。
【００８９】
また、創薬の非臨床試験および化学物質などの安全性評価で重要な酵素の誘導活性についても、図５、６から理解できるように、同様の傾向が見られ、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用した場合は、このような繊維集合体を使用しなかった場合では活性がほぼ消失してしまう培養７日目においても、高い薬剤応答性を有していることが示された。
【００９０】
更に、肝代謝酵素の誘導実験後の生肝細胞の相対的細胞密度の計測からは、図７、８から理解できるように、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用した場合と使用しなかった場合では、生残細胞数には殆ど差がなかったことが分かった。
【００９１】
これらの結果から、本発明は、ラミニン又はフィブロネクチンを付与することによって肝細胞の接着性を向上させるという単純なものではなく、個々の肝細胞の機能が高められており、肝細胞の生体内の微小環境が正しく再現されていることを示唆する結果であった。このことは、接着性向上のための因子として最も一般的なＩ型コラーゲンの付与では効果がみられなかったこと（比較例１）からも支持され、細胞外基質ならどれでも同様の効果が得られるわけではないことから、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合わせた細胞培養担体が有する、肝細胞に対する接着性向上以外の作用によって、個々の肝細胞の機能が高められるという、予測できない、優れた効果を奏することがわかった。
【００９２】
また、実施例１〜２の肝細胞の培養方法と比較例１〜４の肝細胞の培養方法とでは、単位表面積あたりのラミニン又はフィブロネクチンの含有量をほぼ同量に揃えていることから、ラミニン又はフィブロネクチンの絶対含有量で１４．４倍もの差がある。そのため、この絶対含有量の差によって、培養した肝細胞の活性に差が生じたのではないか、とも考えられたが、図４に示すように、実施例３の肝細胞の培養方法と、比較例５の肝細胞の培養方法により培養した肝細胞のアルブミン分泌量の比較から、絶対含有量の影響よりも、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合わせた細胞培養担体を使用することによって、高い活性を維持できる肝細胞を培養できることが分かった。
【００９３】
つまり、比較例５におけるラミニンの絶対量は実施例３における１４．４倍であるにも関わらず、活性を維持できなかったのに対して、実施例３においては、１０日間程度、高い活性を維持できる肝細胞を培養できたことから、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンを組合わせた細胞培養担体を使用することが有用であることが明確となった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の肝細胞の培養方法によれば、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できる。また、肝細胞を評価、解析しやすい、肝細胞の培養方法である。
【符号の説明】
【００９５】
１  静電紡糸装置
２  紡糸ノズル
３  繊維回収容器
４  捕集部材
５  対向電極
５ａ  イオン
６  ゾル溶液供給機
７  第１高電圧電源
８  第２高電圧電源
９  吸引機
２５  沿面放電素子
２６  誘電体基板
２７  放電電極
２８  誘起電極
２９  交流電源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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