(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病を診断するための方法であり、ヒトの血液中に含まれるアミノ酸チロシンとフェニルアラニンの濃度を測定し、前記アミノ酸とパーキンソン病疾患の重度との関連から、パーキンソン病を診断するための方法。
【請求項２】
パーキンソン病を早期診断するための方法であり、ヒトの血液中に含まれるアミノ酸チロシンとフェニルアラニンの濃度を測定し、該フェニルアラニンに対するチロシンの濃度比を測定することにより診断マーカとすることを特徴とする請求項１記載のパーキンソン病を診断するための方法。
【請求項３】
パーキンソン病を早期診断するための方法であり、前記フェニルアラニンに対するチロシンの濃度比が２．２以上であることがパーキンソン病であることを示すと診断することを特徴とする請求項２記載のパーキンソン病を診断するための方法。
【請求項４】
パーキンソン病を診断するための方法であって、血液中のアミノ酸の測定により得られるチロシン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシンの少なくとも６個のアミノ酸を含む各種アミノ酸の濃度を示すカウント数とパーキンソン病の重度を示す指標のカウント数との関係式，  Ｙ＝ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２＋ａ３ｘ３＋−−−−−−−−−−＋ａｎｘｎ，  でＹはパーキンソン病の重度を示す指標のカウント数であるＵＰＤＲＳであり、ａは係数、ｘはアミノ酸が示す濃度のカウント数を示し、前記関係式がパーキンソン病を診断するためにも用いられることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病を早期診断するため、血液を用いて、クロマトグラフ装置を用いることにより、パーキンソン病の早期診断のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現状のパーキンソン病の診断は、脳ＭＲＩでもＭＩＢＧ心筋シンチでも不可能で、特異的診断マーカは未だ開発されていない。左右差のあるパーキンソン症状といった臨床徴候と、抗パーキンソン病薬に対する反応性による診断によるのみである。
上記に定義するパーキンソン病とは、黒質緻密層ドパミン神経細胞の変性を主病変とし、緩徐進行性に運動４徴候（安静時振戦、固縮、運動緩慢および無動、姿勢反射障害）を発現する特発性、進行性の疾患であり、通常孤発性で、家族発症例は約5％程度である。日本における有病率は人口１０万人に対して１１０人程度、欧米白人の有病率はわが国の約１．５〜２．５倍と高いと言われている。
また、発症年齢は５０歳代後半から６０歳代にかけての年齢が最も多く、２０歳代から８０歳代まで幅広く見られ、早期診断の実現が期待されている。      
【０００３】
従来、皮膚ガスの微量成分を定量するためには、皮膚ガスを採取して、濃縮して次いでガスクロマトグラフにより測定することが実施されている。これまでに皮膚ガスについては、採集については、指からの採取（特許文献１）、腕からの採取（特許文献２）、が実施されており、これらのサンプリングを用いて得た皮膚ガス成分の測定は、皮膚ガス濃度が薄いために、試料皮膚ガスを低温装置に導入し濃縮したのち、ガスクロマトグラフにより皮膚ガス成分を測定している。（非特許文献１）。この方法により、皮膚ガス中のアセトンが糖尿病疾患においてコントロールの２倍の値をとることが分かり、非侵襲である皮膚ガス採集から疾病を見出すことが示された。（非特許文献１）。皮膚ガスを用いてパーキンソン病の疾病マーカが本出願者らにより提案された（特許文献４）。
しかしながらこれまで血液からのパーキンソン病に関する測定は実施されていない。
【０００４】
これまでに汗の採集法については、本出願による指からの採集方法〈非特許文献３〉が提案され、汗中のナトリウム/カリウム比が多汗症の治療の指標として有効であることが示された。（非特許文献２）。また汗中の塩素イオン濃度が慢性膵炎の指標として用いられることが示された。（非特許文献３）。汗中のアミノ酸比を用いたパーキンソン病の疾病マーカが本出願者らにより提案された。(特許文献４)。しかしながらこれまで血液からのパーキンソン病に関する測定は実施されていない。
【０００５】
パーキンソン病の診断として、特表２００４−５１７６３４号公報（特許文献３）が提案されているが、この提案は神経変性疾患である脊髄小脳性運動失調１（ＳＣＡ−１）のショウジョウバエモデルに関する。特に、ＳＣＡ−１治療のための、正常ヒトアタキシン−１又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体ヒトアタキシン−１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエに関するものであり、さらに、ＳＣＡ−１を発症することへの素因の診断に関するものである。さらに、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするために遺伝子組換えショウジョウバエを使用する方法に関し、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療及び診断用途のため、ならびに治療薬をスクリーニングするための、アタキシン−１の過剰発現によって生じるＳＣＡ−１表現型の変更遺伝子の同定に関するもので、さらに、正常アタキシン−１の過剰発現を検出することを含む、ＳＣＡ−１への素因の診断に関するものである。このことにより診断は可能となるがこの測定法は測定手順も煩雑で本発明の目的である一般的な適用は困難である。
【０００６】
パーキンソン病の臨床的な有効なマーカとして本出願者らにより皮膚ガスおよび汗からの疾病マーカが提案されているが、まだ実用に供されてなく、また臨床現場では血液の採取が日常的に実施されているので、血液中の化学物質によるパーキンソン病の疾病マーカが用いられるのが望ましいが、現状では有効な疾病マーカが現在見出されていないために、多くのパーキンソン病患者が５０％の進行状態で初めて治療が開始される状態にあるので、血液中の化学物質を用いたパーキンソン病のマーカが開発されることは重要な課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許公開  ２００６−２３４８４３号公報
【特許文献２】特許公開  ２００６−２３４８４４号公報
【特許文献３】特表２００４−５１７６３４号公報
【特許文献４】特許出願  ２０１３−２０６７６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Norio Yamane, Takao Tsuda, Kazutoshi Nose, Akiko Yamamoto, Hiroshi Ishiguro, Takaharu Kondo, Clinica Chimica Acta 365, 325-329 (2006).
【非特許文献２】Yuichiro Ohshima, Hirokazu Shimizu, Takeshi Yanagishita, Daisuke Watanabe, Yasuhiko Tamada, Junichi Sugenoya, Takao Tsuda, Yoshinari Matsumoto, Arch Dermatol Res 300, 595-600(2002).
【非特許文献３】Naruse S, Ishiguro H, Suzuki Y, Fujiki K, Mizuno N, Takemura T, Yamamoto A, Yoshikawa T, Jin C, Suzuki R, Kitagawa M, Tsuda T, Kondo T,Hayakawa T, Pancreas, 2004 Apr.28(3):e80-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
パーキンソン病診断、治療ツールとしての血液中のアミノ酸に着目し、該アミノ酸の測定によりパーキンソン病の早期診断を可能としたものである。パーキンソン病診断には、血液中のアミノ酸のチロシン（Ｔｈ）とフェニルアラニン（Ｐｈ）、プロリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシンを測定することによりパーキンソン病に特異的な関係を検討することであり、また血中各種アミノ酸の濃度を統計処理により疾患の重度との関連を見出すことから、これにより疾患の診断や進行度の使用に供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は血液中に、パーキンソン病と関連の有る化合物を複数みいだし、これらの化合物単独あるいはそれらの相対比あるいは複数の因子として取扱い、パーキンソン病疾患の新疾病マーカとして使用できることを見出した。このマーカを用いてパーキンソン病の早期発見のための測定方法を発明し、パーキンソン病の診断の手段を提供するものである。
【００１１】
パーキンソン病を早期診断するために、ヒトの血液のサンプリングを行い、アミノ酸を分離分析し、アミノ酸のチロシンとフェニルアラニンを計測し、あらかじめ求められた診断基準を用いてパーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定することを特徴とするパーキンソン病の早期診断方法である。測定方法は、血液２０マイクロリットルに有機溶媒アセトニトリルおよびメタノールを加え、次いで１００００ｇで遠心分離を行い、上澄み液を２０マイクロリットル取り出し、蛍光誘導化試薬  ＮＢＤ−Ｆ（4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole）を加えて反応させ、次いで液体クロマトグラフィーを行い、血液中のアミノ酸分析を行い、各種アミノ酸の濃度が得られた。測定された各種アミノ酸の内チロシンとフェニルアラニンの相対比を求め、アミノ酸のパーキンソン病疾マーカとした。また各種アミノ酸の濃度とパーキンソン病の重度との統計処理による関連を求め関係式を得て、パーキンソン病の疾患の診断を行った。統計処理の方法は本特許出願者らによる特許文献４の手法に従った。すなわち因子(x)として各種アミノ酸濃度カウントを当て、係数（a）を見出し、疾患の重度（ｙ）のカウント数を求める方法である。
上記測定方法により血液中のアミノ酸を液体クロマトグラフまたは液体クロマトクロマトグラフ/質量分析計を用いて測定を行い、血液中のアミノ酸中のチロシンとフェニルアラニン成分の濃度による比率（Ｔｈ／Ｐｈ）を得た。あらかじめ疾病マーカを定め、それら比率から作成した判定基準を用いてパーキンソン病の早期発見を行った。
また、クロマトグラフ/質量分析計による測定から得られたアミノ酸濃度のカウント数に、あらかじめパーキンソン病疾患から得られた統計処理を加えてパーキンソン病重度の指標のカウント数を算出した。これによりアミノ酸濃度測定からパーキンソン病を診断することの方法を発見した。
【００１２】
パーキンソン病を早期診断するために、血液のサンプリングを行い、採血した血液中のアミノ酸測定を実施し、アミノ酸中のチロシンとフェニルアラニン濃度を計測し、あらかじめ測定された診断基準を用いてパーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定した。
【００１３】
パーキンソン病の疾病マーカを見出すためにパーキンソン病疾患を有する被験者の血中アミノ酸測定例を図１及び図２に示した。図１及び図２に認められるように、液体クロマトグラフィーにより血中アミノ酸の分離が詳しく表示されている。サンプル数１０２人の疾病群（治療していない人と治療中の人）と健常人について測定を実施した。
【００１４】
サンプル数１０２人の疾病群（治療していない人と治療中の人）と健常人の差が明らかにできた。この方法をより明確にするために、チロシンとフェニルアラニンの比を用いると、図２に示すように健常人と疾病群の分け方が、良好な確率で達成できた。上記比率が２以上であることで判別できる。
【００１５】
この図よりパーキンソン病患者群と健常者群の区別が明確にできた。これを被験者に実施したところ、それぞれの妥当な群への区分が出来た。血液中の上記比率が２.２以上であることで判別できる。
【００１６】
チロシンとはタンパク質を構成する芳香族アミノ酸の一つであり、絹糸・カゼインに特に多く含まれる。生体内でフェニルアラニンから生成されるもので生成前のフェニルアラニンに占める生成後のチロシンの比率が指標となることをつきとめたものである。
【００１７】
パーキンソン病を早期診断するためのものであり、血液を採血し、該血液中のアミノ酸を液体クロマトグラフあるいは液体クロマトグラフ/質量分析計により分離分析し、アミノ酸類の濃度を計測し図１を得たのち、各種アミノ酸と疾病の重度との間の関係を求めて統計処理を加え、パーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定する手段とする方法を得た。
【００１８】
血液のクロマトグラフによる測定から得られた各種アミノ酸の濃度データーに、あらかじめパーキンソン病疾患から得られた重度との関連について、統計処理を加えてパーキンソン病重度の指標を算出した。これにより早期発見を行った。パーキンソン病疾病群を分けて、一つの群により統計処理（多変量解析法のうちのPLS 回帰Partial Least Squares Regressionの使用)を実施し、得られた処理方法を用いて、もう一つの群に適用したところ良い相関係数０．９が得られた。この実施例により、パーキンソン病の重度を示す指標（ＵＰＤＲＳ、パーキンソン病統一スケール、カウント数で表示される）が個々の患者さんに得られた。
上記により得られた式は
Y=a1x1+a2x2+a3x3+----------+anxn
でＹはＵＰＤＲＳのカウント数であり、aは係数、ｘは各種アミノ酸の濃度カウント数を用いる。
この得られた式を用いて上記方法を一般の被験者に適用した。すなわち一般の被験者の血液を採集し、クロマトグラフ分析計による血中アミノ酸濃度測定を実施し、次いで前記式を適用して、ＵＰＤＲＳのカウント数を得る。得られたなＵＰＤＲＳのカウント数により病気になっていないかを診断する。
【００１９】
パーキンソン病を早期診断するためのものであり、ヒトの血液を採集するサンプリングを行い、採血した血液を液体クロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計で分離分析し、あらかじめ測定されているＵＰＤＲＳのカウント数を用いて統計処理を実施して相関を得た。この相関をパーキンソン病患者群へ適用したところ、妥当なＵＰＤＲＳのカウント数が得られこれによりパーキンソン病を診断をするための方法が得られた。
【発明の効果】
【００２０】
パーキンソン病の有用な臨床的疾病マーカはこれまで見出されていない。本発明は血液中のアミノ酸の一つであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸であり、絹糸・カゼインに特に多く含まれ、生体内でフェニルアラニンから生成されるチロシンとの比率が指標となることを発明したものである。
本発明によりこれまでパーキンソン病の疾患は５０％進行して医学的に見出される現状であったが、これが改善され早期発見が出来るようになる。すなわち本発明によりパーキンソン病の診断をするための手段とする方法の発見が可能になり、したがって早期に治療の開始ができるので、人々の健康維持に貢献できる。
【００２１】
本発明は人の血液をサンプリングして、次いで分離分析を実施して、疾病マーカの濃度を検知し、これを用いて被検者のパーキンソン病に罹病しているか否かを診断する。非常に医療現場に受け入れやすい方法で、パーキンソン病の早期発見に寄与する。
【００２２】
本発明は被験者の血液をサンプリングして、分離手段に供し、用いた液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフ/質量分析計により血液中の各種アミノ酸の濃度を得、ついであらかじめパーキンソン病疾患のＵＰＤＲＳとの統計処理を実施して得た数式に代入して、新たに被検者のＵＰＤＲＳが求められる。この方法により得られたＵＰＤＲＳはパーキンソン病疾患の進行度を示しており、治療の参考に用いることが出来る。
【００２３】
以上説明したように本発明は、血液を採血して、分離手段を用いて血液中に含まれる各種アミノ酸の濃度を定量し,それらの相対比および各種アミノ酸の統計処理からパーキンソン病疾患と健常者との区分を見出す手段を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】パーキンソン病疾病の被験者の血液中各種アミノ酸の測定例１の図である。
【図２】パーキンソン病疾病でＤＯＰＡを服用していない被験者で血液中各種アミノ酸の測定例２の図である。
【図３】パーキンソン患者（ｎＰＤ：ＤＯＰＡ薬を服用していないパーキンソン病患者、ＰＤ：ＤＯＰＡ薬を服用しているパーキンソン病患者）と健常人（Ｃ）の血液中のチロシンとフェニルアラニンの比率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明を実施する一つの形態として、次の測定手順を用いてパーキンソンマーカの濃度を測定する。
測定手順は、まず人の血液を採血する。次にタンパク質成分を除去し、アミノ酸を誘導化し、次いで液体ケロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計により各種アミノ酸濃度を測定する。詳しくは、被験者の血液２０マイクロリットルに有機溶媒アセトニトリルおよびメタノールを加え、次いで１００００ｇで遠心分離を行い、上澄み液を２０マイクロリットル取り出し、蛍光誘導化試薬ＮＢＤ−Ｆを加えて反応させて、次いで液体クロマトグラフィーを行い、血液中のアミノ酸分析を行ない、各種アミノ酸の濃度が得られた。図１及び図２に示した。
測定された各種アミノ酸の内チロシンとフェニルアラニンの相対比を求め、アミノ酸のパーキンソン病疾病マーカとした。パーキンソン病疾患の被験者１０２人と健常者の典型的なチロシンとフェニルアラニンの相対比を図３に示した。
また各種アミノ酸の濃度とパーキンソン病の重度との統計処理による関連を求め関係式を得て、パーキンソン病の疾患の診断を行った。統計処理の方法は本特許出願者らによる特許文献4の手法に従った。
【００２６】
ここで、パーキンソン病についての実験結果を説明すると、図１乃至図３により説明すると、図１および図２はパーキンソン患者の血中から得られたアミノ酸のクロマトグラムである。患者によりピークの強度がそれぞれ異なっていることが分かる。図３ではＤＯＰＡ薬を服用中の患者とＤＯＰＡ薬を服用していない患者と、健常人の血液中のアミノ酸化合物であるフェニルアラニンを分母としてフェニルアラニンから生成されるチロシンを分子とした比率を縦軸に、横軸には上記対象患者と健常者とを示している。図３からわかるようにチロシン／フェニルアラニンが２．２以上である場合には、パーキンソン病患者はＤＯＰＡ薬服用および非服用ともパーキンソン病と診断できるので、服用条件にかかわらずパーキンソン病患者であることのマーカとなることを示している。
【００２７】
以上の結果から血液中のアミノ酸の成分から見出したパーキンソン病疾病マーカによる効果を示す。血液中の成分としてフェニルアラニンとチロシンが有効な疾病マーカであることを見出した。チロシン／フェニルアラニンの相対比の値２．２のところで疾病群と健常者群とが明確に分かれている。これは非常に良い新規疾病マーカである。以上説明したように本発明は血液成分のフェニルアラニンとチロシンの比が２．２以上であることを特徴とするパーキンソン病の早期診断のための方法である。
【００２８】
パーキンソン病疾病患者と健常人の血中成分を比較すると、その化学成分の濃度の高さと相対的な比較を実施すると、プロリンについて患者は健常人に比べて濃度が低く、スレオニンについても患者は健常人に比べて濃度が低く、ロイシンについて患者は健常人より濃度が高く、イソロイシンについても患者は健常人より濃度が高いことが分かった。これらの化学物質が存在するか調べることによりパーキンソン病の診断が出来る。すなわちプロリン、スレオニンンの濃度が相対的に低く、ロイシン、イソロイシンの濃度が相対的に高いときはパーキンソン病が疑われると診断できた。
【００２９】
各種血液中にアミノ酸濃度の存在から、これとパーキンソン病統一スケール（UPDRS）との統計解析より、被験者のパーキンソン病の可能性を診断することの方法が出来た。
【００３０】
血液試料の液体クロマトグラフまたはガスクロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計による測定から得られた各種アミノ酸濃度に、あらかじめパーキンソン病疾患の重度から得られた関係について統計処理を加えてパーキンソン病指標のカウント数を算出した。これにより発見を行った。
すなわち、パーキンソン疾病群を分けて、一つの群により統計処理（多変量解析法のうちのPLS 回帰Partial Least Squares Regressionの使用)を行ない、得られた処理方法を用いて、もう一つの群に適用したところ良い相関係数０．９が得られた。得られた関係式により、パーキンソン病の重度を示す指標（ＵＰＤＲＳ、パーキンソン病統一スケール）が個々の被験者について得られた。
上記に統計処理についてさらに詳しく説明する。得られた関係式は、
Y=a1x1+a2x2+a3x3+----------+anxn
でＹはＵＰＤＲＳのカウント数であり、aは係数、ｘは各種アミノ酸を示しそれらの個別濃度を示すカウント数を用いる。ここでカウント数とはその特定のアミノ酸の濃度強度を示す。
上記方法をある被験者に適用した。すなわち血液を採集し、液体クロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計による測定を実施し各種アミノ酸濃度を得て、次いでパーキンソン病疾患から得られた式を適用し、ＵＰＤＲＳのカウント数を求めたところ、5以下の小さな値を示しほぼ健常人と診断された。
【００３１】
以上パーキンソン病疾病マーカとして血液中に存在するフェニルアラニンとチロシンが有効な疾病マーカであることを見出した。チロシン／フェニルアラニンの相対比を用いた診断するための方法を見出した。また各種アミノ酸濃度からパーキンソン病患者の重度の診断が出来ることを見出した。
【００３２】
血液中のアミノ酸濃度からパーキンソン病疾患マーカを見出し、また血中の各種アミノ酸の統計処理によりパーキンソン病疾患の重度に関するカウント数を得るための方法を見出したが、その運用には、好ましくは複数のマーカの併用が期待され、より正確にパーキンソン病の疾病判断をすることである。また、皮膚ガスや、身体からの汗についてのマーカとの併用が好ましい。
【００３３】
あらたなパーキンソン病疾病マーカを用いることにより、早期判断が正確に実施でき治療の早期開始による人々の健康への回復が期待できるようになると想定できる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、医療現場での利用が出来れば、パーキンソン病の疾病の早期発見が可能となり、早期治療の開始により人々の健康の回復が期待できる大きな効果が期待できるので、本発明を実施する検査機関の確立などの医療産業に効果をもたらす。また早期治療用の薬剤の開発が進み医薬産業への貢献が可能となる。さらに脳科学の進歩にも貢献できる。またパーキンソン病の早期診断のための血液中のアミノ酸濃度のカウント数を測定するためにクロマトグラフ装置を使用していることより分析機器産業や医療産業に効果がある。
【図１】
0006565010.tif 000002
【図２】
0006565010.tif 000003
【図３】
0006565010.tif 000004