(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、カルボキシル末端側から１〜８１個のアミノ酸が欠失しており、且つ９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（３）前記ポリペプチド（１）又はポリペプチド（２）のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチド、
であって、９１番〜９７番のアミノ酸が置換されていないポリペプチドと比較して切断が抑制され、そしてチロシンキナーゼの基質となるポリペプチド。
【請求項２】
前記９１番〜９７番のアミノ酸の置換が、９４番のアミノ酸の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記９１番〜９７番のアミノ酸の置換が、９４番のアスパラギン酸からアラニンへの置換である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
フェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ドナーとして蛍光タンパク質若しくは生物発光タンパク質が、又は前記ドナーの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の一方に結合し、そして前記アクセプターとして蛍光タンパク質が、又は前記アクセプターの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の他方に結合している、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ドナー及びアクセプターの蛍光タンパク質がＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｉＣｙ、ｍＫＯ、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
核外搬出シグナルを更に含む、請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４、６、８、又は１９で表されるアミノ酸配列からなる請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４で表されるアミノ酸配列における５４５番〜５４７番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号６で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号８で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列における４６８番〜４７０番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されている請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、
を含む、チロシンキナーゼ活性の測定方法。
【請求項１１】
前記チロシンキナーゼ活性が、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、又は上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
チロシンキナーゼ阻害剤、請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、
を含む、前記細胞のチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。
【請求項１４】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試験化合物の存在下で、請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、若しくは上皮増殖因子受容体とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を測定する工程、
を含む、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチド、及びＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、若しくは上皮増殖因子受容体の接触が、細胞内で行われる請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチド及びそれを用いたチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性確認方法に関する。本発明によれば、プロテアーゼにより切断されないため、解析した細胞のほとんどをＦＲＥＴの評価に用いることができ、従って効率のよいチロシンキナーゼ活性の測定が可能である。
【背景技術】
【０００２】
白血病は、これを放置すると重大な合併症により死に至る血液腫瘍性疾患である。白血病の一種である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び一部の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）においては、９・２２番染色体の相互転座により生じる特徴的なフィラデルフィア（Ｐｈ１）染色体転座によりｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が形成され、この遺伝子から恒常的なチロシンキナーゼ活性をもつ細胞質タンパク質（ＢＣＲ−ＡＢＬ）が発現されること、そしてこのＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性によって種々のタンパク質がリン酸化されることが発症に関連していること、等が知られている。【０００３】
白血病の治療法としては、一般に、抗癌剤等の投与による薬学的治療又は造血幹細胞移植等の移植治療のいずれか、あるいはその両方が選択される。特に、ＣＭＬの薬学的治療は、２−フェニルアミノピリミジン系化合物であるチロシンキナーゼ阻害剤の投与を中心に行われており、現在では、登録商標名「イマチニブ」（ｉｍａｔｉｎｉｂ、ＳＴＩ−５７１又は登録商標名グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）とも呼ばれる）の投与が標準的な薬学的治療法となりつつある。【０００４】
イマチニブは、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメインにおけるＡＴＰ結合部位を標的とする、選択性の高い分子標的薬物の一種である。一般に、分子標的薬物の使用は、その特異性から高い安全性と効果が期待される、理想の治療法の一つである。しかし同時に、分子標的薬物の使用は、突然変異を有する標的分子を持つ患者に対してはその期待される薬効が発揮され難いという問題を伴うことが多く、イマチニブを代表とするＢＣＲ−ＡＢＬを標的分子とした２−フェニルアミノピリミジン系化合物であるチロシンキナーゼ阻害剤もその例外ではない。【０００５】
従って、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメインの変異により、イマチニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）などの効果が得られない患者を発見するために、薬剤耐性を検査することは重要である。従来、白血病患者のイマチニブ耐性の検査は、主に、患者のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の塩基配列を決定してＢＣＲ−ＡＢＬの変異の種類を確認する方法（例えば非特許文献１）又はＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質であるＣｒｋＬのリン酸化をイムノブロッティングで検出する方法（例えば非特許文献２）によって、行われていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２７８９４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈａｈら、Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ、２００２年、第２巻、第２号、第１１７−１２５頁
【非特許文献２】ｔｅｎ  Ｈｏｅｖｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９４年、第５４巻、第１０号、第２５６３−２５６７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＣＭＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の測定について、鋭意研究した結果、２種の蛍光マーカーで修飾したＣｒｋＬを、フェルスター共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴと称することがある）用ポリペプチドとして、ＢＣＲ−ＡＢＬに作用させることによって、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出できることを見いだした（特許文献１）。すなわち、このポリペプチドを用いてチロシンキナーゼ活性を測定することによって、チロシンキナーゼ阻害剤に対する薬剤耐性を検査することが可能となった。
しかしながら、本発明者らは前記フェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチドを用いて、細胞内のチロシンキナーゼ活性の測定を行った場合に、ドナーとアクセプターの蛍光強度が異なり、正しいＦＲＥＴの評価ができない細胞があることを見出した。そのため、チロシンキナーゼ活性の測定を行う場合、多数の細胞を解析し、そしてＦＲＥＴの評価ができる細胞を選択する必要があり、解析の効率が悪かった。
従って、本発明の目的は、ＦＲＥＴの評価ができない細胞を減少させ、効率のよいチロシンキナーゼ活性の測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、効率のよいチロシンキナーゼ活性の測定方法を構築することについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＦＲＥＴ用ポリペプチドのＣｒｋＬのアミノ末端側、及びカルボキシル末端側に切断される箇所があることを見出した。そのため、一部の細胞においては、ＦＲＥＴ用ポリペプチドが２つ又は３つの断片に切断され、ＦＲＥＴの評価ができないことがわかった。本発明者は、プロテアーゼなどに切断されるアミノ酸配列の領域のアミノ酸を置換することにより、プロテアーゼなどによる切断を抑制できることを見出した。すなわち、解析した細胞の多くをＦＲＥＴの評価に用いることができるようになった。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、カルボキシル末端側から１〜８１個のアミノ酸が欠失しており、且つ９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（３）前記ポリペプチド（１）又はポリペプチド（２）のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチド、であって、９１番〜９７番及び２０１番〜２２２番のアミノ酸が置換されていないポリペプチドと比較して切断が抑制されるポリペプチド、
［２］前記９１番〜９７番のアミノ酸の置換が、９４番のアミノ酸の置換である、［１］に記載のポリペプチド、
［３］前記９１番〜９７番のアミノ酸の置換が、９４番のアスパラギン酸からアラニンへの置換である、［１］又は［２］に記載のポリペプチド、
［４］フェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した、［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
［５］前記ドナーとして蛍光タンパク質若しくは生物発光タンパク質が、又は前記ドナーの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の一方に結合し、そして前記アクセプターとして蛍光タンパク質が、又は前記アクセプターの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の他方に結合している、［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
［６］前記ドナー及びアクセプターの蛍光タンパク質がＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｉＣｙ、ｍＫＯ、及びそれらの変異体からなる群から選択される、［５］に記載のポリペプチド、
［７］核外搬出シグナルを更に含む、［５］又は［６］に記載のポリペプチド、
［８］配列番号４、６、８、又は１９で表されるアミノ酸配列からなる［５］又は［６］に記載のポリペプチド、
［９］配列番号４で表されるアミノ酸配列における５４５番〜５４７番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号６で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号８で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列における４６８番〜４７０番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されている［８］に記載のポリペプチド、
［１０］［４］〜［９］のいずれかに記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、を含む、チロシンキナーゼ活性の測定方法、
［１１］前記チロシンキナーゼ活性が、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、又は上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性である、［１０］に記載の方法、
［１２］前記細胞が腫瘍細胞である、［１０］又は［１１］に記載の方法、
［１３］チロシンキナーゼ阻害剤、［４］〜［９］のいずれかに記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、を含む、前記細胞のチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法、
［１４］前記細胞が腫瘍細胞である、［１３］に記載の方法、
［１５］試験化合物の存在下で、［４］〜［９］のいずれかに記載のポリペプチドと、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、若しくは上皮増殖因子受容体とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を測定する工程、を含む、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法、及び
［１６］前記ポリペプチド、及びＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−Ａｂｌ、若しくは上皮増殖因子受容体の接触が、細胞内で行われる［１５］に記載のスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のフェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチドによれば、プロテアーゼなどによる切断がないため、解析した細胞のほとんどをＦＲＥＴの評価に用いることができる。従って、従来のチロシンキナーゼ活性の測定方法と比較して、効率のよいチロシンキナーゼ活性の測定が可能である。すなわち、少数の細胞でも、チロシンキナーゼ阻害剤に対する薬剤耐性を検査することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】２９３Ｆ細胞にｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１をトランスフェクションした場合の、細胞ごとのＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光強度の比率をプロットしたグラフである。
【図２】Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１の構造を模式的に示した図である。
【図３】Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０から得られるポリペプチドの模式図と、それを用いたウエスタンブロットによるポリペプチドの切断部位の解析結果を示した図である。
【図４】Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１から得られるポリペプチドの模式図と、それを用いたウエスタンブロットによるポリペプチドの切断部位の解析結果を示した図である。
【図５】Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａ及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａから得られるポリペプチドの模式図と、それを用いたウエスタンブロットによるポリペプチドの切断部位の解析結果を示した図である。
【図６】本発明のＰｉｃｋｌｅｓ  ４．３１を、ＣＭＬ患者由来の骨髄単核球にエレクトロポレーションし、Ｉｍａｔｉｎｉｂ又はＮｉｌｏｔｏｎｉｂを作用させた後の細胞のＹＦＰ及びＣＦＰの蛍光強度をプロットしたグラフである。
【図７】２９３Ｆ細胞にｐＰｉｃｋｌｅｓ  ４．３１、又はｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ  ４．３１ＮＥＳをトランスフェクションし、細胞ごとのＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光強度の比率をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［１］フェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチド
本発明のフェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチドは、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、カルボキシル末端側から１〜８１個のアミノ酸が欠失しており、且つ９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（３）前記ポリペプチド（１）又はポリペプチド（２）のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチド、であって、９１番〜９７番及び２０１番〜２２２番のアミノ酸が置換されていないペプチドと比較して切断が抑制されるポリペプチドである。
【００１３】
（フェルスター共鳴エネルギー移動）
本発明のポリペプチドは、フェルスター共鳴エネルギー移動（Forster Resonance Energy Transfer：ＦＲＥＴ）に用いるものである。ＦＲＥＴは、電子励起状態の異なる２種以上の分子間の相互作用であり、一方の分子（ドナー分子）が外部の光源による励起の後、他方の分子（アクセプター分子）にそのエネルギーが転移される現象である。フェルスター共鳴エネルギー移動には、ドナー分子及びアクセプター分子として蛍光分子を用いる蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer）、及びドナー分子及びアクセプター分子としてそれぞれ生物発光分子及び蛍光分子を用いる生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence Resonance Energy Transfer：以下ＢＲＥＴと称することがある）が含まれる。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、そのアミノ末端側及びカルボキシル末端側のいずれか一方に、ＦＲＥＴを誘導することのできるドナー分子が結合しているか又は結合することができ、他方にアクセプター分子が結合しているか又は結合することができる。本発明のポリペプチドは、このドナー分子及びアクセプター分子によって誘導されるＦＲＥＴを利用して、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化を測定することができる。ＢＣＲ−ＡＢＬはチロシンキナーゼであり、細胞内の種々のタンパクのチロシン残基をリン酸化する機能を持っている。本発明のポリペプチドは、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化を受けるタンパク質の１つであるＣｒｋＬの誘導体を含んでいる。このＣｒｋＬの誘導体がＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化されることによって、ＢＣＲ−ＡＢＬのリン酸化活性のレベルを測定することが可能である。
ＣｒｋＬ（又はＣｒｋＬの誘導体）がＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化を受けた場合、ＣｒｋＬ（又はＣｒｋＬの誘導体）の３次元構造が変化すると考えられる。ＣｒｋＬ（又はＣｒｋＬの誘導体）の３次元構造が変化することによって、ドナー分子及びアクセプター分子が、ＦＲＥＴが可能となる距離に近接する。例えば、ドナー分子及びアクセプター分子がともに蛍光分子の場合、このポリペプチドに励起光を照射することによりＦＲＥＴが観察される。
【００１５】
（ＣｒｋＬ）
ＣｒｋＬは、ＲＡＳ及びＪＵＮのリン酸化酵素の情報伝達経路を活性化すると考えられている。特にＲＡＳ依存型においては、線維芽細胞を形質転換することが示されている。前記ＣｒｋＬは、１つのＳＨ２領域と２つのＳＨ３領域を含んでおり、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化されるチロシンは２つのＳＨ３領域間の介在配列に存在する２０７番目のチロシンである。
【００１６】
（ＣｒｋＬの誘導体）
本発明のポリペプチドは、前記ＣｒｋＬの誘導体を含む。ＣｒｋＬの誘導体は、ＢＣＲ−ＡＢＬによりリン酸化されるものであり、具体的には、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ポリペプチド１と称することがある）、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、カルボキシル末端側から１〜８１個のアミノ酸が欠失しており、且つ９１番〜９７番の少なくとも１つのアミノ酸及び／又は２０１番〜２２２番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ポリペプチド２と称することがある）、又は（３）前記ポリペプチド（１）又はポリペプチド（２）のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチド（以下、ポリペプチド３と称することがある）である。これらのポリペプチドは、９１番〜９７番及び２０１番〜２２２番のアミノ酸が置換されていないポリペプチドと比較して切断が抑制される。
【００１７】
（１）ポリペプチド１
ポリペプチド１は、ＣｒｋＬの全長の３０３アミノ酸からなるポリペプチドにおいて、Ｎ末アミノ酸置換領域（例えば、９１番〜９７番）の少なくとも１つのアミノ酸及び／又はＣ末アミノ酸置換領域（例えば、２０１番〜２２２番）の少なくとも１つのアミノ酸が親のアミノ酸から他のアミノ酸に置換されているポリペプチドである。ＣｒｋＬは細胞内のプロテアーゼなどによって、アミノ末端側の切断領域（以下、Ｎ末切断領域と称することがある）において切断されることがある。更に、ＣｒｋＬは細胞内のプロテアーゼなどによって、カルボキシル末端側の切断領域（以下、Ｃ末切断領域と称することがある）において、切断されることがある。
【００１８】
Ｎ末アミノ酸置換領域の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されることによって、切断を抑制することができる。アミノ酸が置換されることによって、プロテアーゼなどによる切断部位が認識されなくなるためである。Ｎ末アミノ酸置換領域は、ＣｒｋＬの９１番〜９７番のアミノ酸配列「ＨＹＬＤＴＴＴ（配列番号９）」からなる領域であってもよく、ＣｒｋＬの９１番〜９６番のアミノ酸配列「ＨＹＬＤＴＴ（配列番号１０）」からなる領域であってもよく、ＣｒｋＬの９２番〜９７番のアミノ酸配列「ＹＬＤＴＴＴ（配列番号１１）」からなる領域であってもよく、ＣｒｋＬの９２番〜９６番のアミノ酸配列「ＹＬＤＴＴ（配列番号１２）」からなる領域であってもよく、９２番〜９５番のアミノ酸配列「ＹＬＤＴ（配列番号１３）」からなる領域であってもよく、９３番〜９６番のアミノ酸配列「ＬＤＴＴ（配列番号１４）」からなる領域であってもよく、９３番〜９５番のアミノ酸配列「ＬＤＴ」からなる領域であってもよく、９３番〜９４番のアミノ酸配列「ＬＤ」からなる領域であってもよく、９４番〜９５番のアミノ酸配列「ＤＴ」からなる領域であってもよいが、最も好ましくは９４番の「Ｄ」である。
【００１９】
Ｃ末アミノ酸置換領域の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されることによって、切断を抑制することができる。アミノ酸が置換されることによって、プロテアーゼなどによる切断部位が認識されなくなるためである。
【００２０】
本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換は、親のアミノ酸から他のアミノ酸に置換されるものである限りにおいて、限定されるものではない。例えば、９４番のＤ（アスパラギン酸）においては、例えばメチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アルパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）を挙げることができ、アラニン、又はグリシンが好ましく、Ａ（アラニン）が最も好ましい。
また、アミノ酸が置換されていない親のポリペプチドと比較して、プロテアーゼなどによる切断が抑制されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸が置換されていない親のポリペプチドと同程度、又はそれ以上に、プロテアーゼによって切断される置換は、本発明の効果が得られないため、本発明から除くことが好ましい。
【００２１】
（２）ポリペプチド２
ポリペプチド２は、ＣｒｋＬの全長の３０３アミノ酸からなるポリペプチドにおいて、カルボキシル末端側から１〜８１個のいずれかの数の連続するアミノ酸が欠失したものであり、且つＮ末アミノ酸置換領域（例えば、９１番〜９７番）の少なくとも１つのアミノ酸及び／又はＣ末アミノ酸置換領域（例えば、２０１番〜２２２番）の少なくとも１つのアミノ酸が親のアミノ酸から他のアミノ酸に置換されているポリペプチドである。すなわち、ＣｒｋＬの全長の３０３アミノ酸からなるポリペプチドにおいて、Ｎ末側から２２２〜３０２のいずれかの長さのポリペプチドであって、Ｎ末アミノ酸置換領域（例えば、９１番〜９７番）の少なくとも１つのアミノ酸及び／又はＣ末アミノ酸置換領域（例えば、２０１番〜２２２番）の少なくとも１つのアミノ酸が親のアミノ酸から他のアミノ酸に置換されているポリペプチドである。
ＣｒｋＬのＮ末側から２２２〜３０２のいずれかの長さのポリペプチド、すなわちトランケートＣｒｋＬは、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される２０７番目のチロシンを含んでいる。また、Ｎ末端から、少なくとも１〜２２２番のアミノ酸を含むことによって、ＦＲＥＴを誘導することが可能であるが、最も好ましくは１〜２２２番のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。本ポリペプチドを用いた場合のＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の検出感度は、ＣｒｋＬの全長を用いたポリペプチド１と比較して、向上するからである。
【００２２】
ポリペプチド２におけるＮ末アミノ酸置換領域及びＣ末アミノ酸置換領域、並びにアミノ酸の置換は、前記ポリペプチド１と同じである。
【００２３】
（３）ポリペプチド３
ポリペプチド３は、前記ポリペプチド１及びポリペプチド２において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたポリペプチドからなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチドである。すなわち、ポリペプチド３は、欠失、置換、挿入、及び／又は付加が発生している。しかしながら、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される２０７番目のチロシンを含んでおり、且つ欠失、置換、挿入、及び／又は付加によって、ＦＲＥＴの誘導能が阻害されないものである。
【００２４】
本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、更により好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２５】
本明細書において「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。また、化学的に類似していない場合でも、アミノ酸の構造が類似したアミノ酸残基で置き換えてもよい。例えばアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）への置換、アスパラギン（Ｅ）からアラニン（Ａ）への置換、チロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換などを挙げることができる。
【００２６】
本発明のポリペプチド３は、前記のようにフェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性を有する。ポリペプチドの欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変は、改変前のポリペプチドのフェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性を改良する改変（改良改変）でもよく、フェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性を維持する改変（維持改変）でもよい。
欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変が、改良改変であることは、親のポリペプチドのフェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性と比較して、前記活性が向上していることによって確認することができる。また、改良改変に用いられる置換は、保存的置換でもよいが、結晶化促進活性が向上する限りにおいて、保存的置換でなくてもよい。
【００２７】
また、維持改変は親ポリペプチドのフェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性を維持する改変である。維持改変に用いられる置換は、保存的置換が好ましい。欠失、置換、挿入、及び／又は付加による改変が、維持改変であることは、親のポリペプチドのフェルスター共鳴エネルギー移動の誘導活性と比較して、前記活性が同等又は顕著な低下がないことによって確認することができる。
本発明のポリペプチド３は、常法、例えば部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis）により、ポリペプチド１又は２をコードするポリヌクレオチドに変異を導入し、改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを発現させることによって取得することができる。
【００２８】
更に、ポリペプチド３は、ポリペプチド１及びポリペプチド２において、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されているため、Ｎ末アミノ酸置換領域及びＣ末アミノ酸置換領域、並びにアミノ酸の置換は、前記ポリペプチド１又はポリペプチド２と同じである。特に、本発明のポリペプチド３のＮ末アミノ酸置換領域及びＣ末アミノ酸置換領域におけるアミノ酸の置換は、親のアミノ酸（欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸）から他のアミノ酸に置換されるものである限りにおいて、限定されるものではないが、アミノ酸が置換されていない親のポリペプチドと比較して、プロテアーゼなどによる切断が抑制されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸が置換されていない親のポリペプチドと同程度、又はそれ以上に、プロテアーゼなどによって切断される置換は、本発明の効果が得られないため、本発明から除くことが好ましい。
【００２９】
（フェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する２つの分子）
本発明のポリペプチドは、前記ＣｒｋＬ誘導体のＮ末端側及びＣ末端側に、それぞれフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する分子が１つ以上結合していることが好ましい。これらの分子は、前記のようにドナー分子及びアクセプター分子である。前記ドナー分子とアクセプター分子は互いに異なる分子が用いられる。この場合、ＦＲＥＴは、例えばアクセプターの増感蛍光の出現によって、又はドナー分子からの蛍光消光によって検出される。また、ＦＲＥＴを達成するためには、ドナー分子は、光を吸収するとともにアクセプター分子に対して励起された電子の共鳴を通じて転移させることのできる分子であることが必要である。更に、ＦＲＥＴを生じさせるために、ドナー分子の発光波長はアクセプター分子の励起波長よりも低いことが必要である。ドナー分子としては蛍光化合物、蛍光タンパク質又は生物発光タンパク質を用いることができ、アクセプター分子としては蛍光化合物、又は蛍光タンパク質を用いることができる。すなわち、ドナー分子及びアクセプター分子の組み合わせとしては、蛍光化合物及び蛍光化合物、蛍光化合物及び蛍光タンパク質、蛍光タンパク質及び蛍光化合物、蛍光タンパク質及び蛍光タンパク質、生物発光タンパク質及び蛍光化合物、又は生物発光タンパク質及び蛍光タンパク質の組み合わせを用いることができる。
【００３０】
（蛍光化合物）
蛍光化合物としては、例えばカルボキシフルオレセイン、６−(フルオレセイン)−５，６−カルボキサミドヘキサン酸又はフルオレセインイソチオシアネート等のフルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＣｙ７などのシアニン色素、クマリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコエリトリン、ＸＬ６６５などの修飾アロフィコシアニン、テキサスレッド、プリンストンレッド、フィコビリプロテイン、ユーロピウムクリプテート、ＸＬ６６５、アビジン、ストレプトアビジン、ローダミン、エオシン、エリスロシン、ナフタレン、ピレン、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾール及びスルホインドシアニン、それらの誘導体又はそれらの複合体等を挙げることができる。本発明においては、これらに代表されるドナー分子とアクセプター分子の中からＦＲＥＴを可能とする上記の要件を満たす組合せを選択して使用することができる。
【００３１】
本発明で使用される前記蛍光化合物の適当な組合せの例としては、ローダミンＢスルホニルクロリド及びフルオレセインマレイミド、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ′−（５−スルホ−１−ナフチル）エチル−エンジアミン（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）又はヨードアセトアミドとスシンイミジル６−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエート（ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ）、（ジエチルアミノ）クマリン（ＤＥＡＣ）又はＮ−メチル−アントラニロイルデオキシグアニンヌクレオチド（例えばＭａｎｔｄＧＤＰ又はＭａｎｔｄＧＴＰ）とｓＮＢＤ（スクシンイミジル６−［（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノエート）などを挙げることができる。これらの蛍光化合物による、前記ＣｒｋＬ誘導体への結合（修飾）は、当業者に知られたタンパク質の化学修飾法（例えば、架橋）に従って行うことができる。
【００３２】
《融合ポリペプチド》
本発明のポリペプチドは融合ポリペプチドでもよく、前記ＣｒｋＬ誘導体に蛍光タンパク質などが結合した本発明のポリペプチドを融合ポリペプチドと称することがある。融合ポリペプチドは、前記ドナー又はドナー結合タグとして、蛍光タンパク質生物発光タンパク質、又は蛍光化合物結合ポリペプチドが前記ＣｒｋＬ誘導体のＮ末端又はＣ末端の一方に結合し、前記アクセプター又はアクセプター結合タグとして、蛍光タンパク質、又は蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ＣｒｋＬ誘導体のＮ末端又はＣ末端の他方に結合している。
本明細書において、「ドナー結合タグ」又は「アクセプター結合タグ」とは、蛍光化合物が結合することのできるポリペプチド（アミノ酸配列）を意味する。蛍光化合物のタグへの結合は限定されるものではなく、例えば蛍光化合物が特異的に結合するポリペプチド（アミノ酸配列）をタグとして用い、蛍光化合物をタグに結合させてもよく、ポリペプチド（アミノ酸配列）に結合する抗体（例えばモノクローナル抗体）を蛍光化合物で標識し、蛍光化合物をタグ（ポリペプチド）に結合させてもよい。
【００３３】
（蛍光タンパク質）
本発明の融合タンパク質に用いる蛍光タンパク質としては、種々の生物由来の蛍光タンパク質を利用することができるが、特に発光クラゲの一種であるイクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する蛍光タンパク質、いわゆるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が好ましい。
【００３４】
ＧＦＰは、３９５ｎｍに励起極大を示す励起スペクトルと５０９ｎｍに発光極大を示す発光スペクトルを有し、緑色に発光するタンパク質である（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第２６３巻、第８０２−８０５頁）が、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換させた、ＧＦＰとは異なる励起・発光極大を有する人為的変異体であるＢＦＰ（Ｈｅｉｍら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、第１２５０１−１２５０４頁）、ＣＦＰ（Ｈｅｉｍら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年、第６巻、第１７８−１８２頁）、ＹＦＰ（Ｏｒｍｏら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７３巻、第１３９２−１３９５）などが開発されている。また、それぞれの蛍光強度が高められたさらなる変異体も開発されている。更に、発光クラゲとは異なる種由来の蛍光タンパク質としてＤｓＲｅｄ（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９０巻、第１５８５−１５８８頁）も単離されている。また、蛍光タンパク質として、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉの触手からクローニングされたＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ＭｉＣｙ）（Ｋａｒａｓａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００４年、第３８１巻、第３０７−１２頁）、ＫｕｓａｂｉｒａｉｓｈｉからクローニングされたＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）及びその単量体であるｍＫＯを用いることもでき、ＭｉＣｙ及びｍＫＯの組み合わせで、ＦＲＥＴを誘導することができる。
【００３５】
本発明の融合ポリペプチドにおいては、前記の蛍光タンパク質の中から、前記のＦＲＥＴを可能とする要件を満たす組合せを選択して使用することが好ましい。本発明の融合ポリペプチドにおいて最も好ましい蛍光タンパク質の組合せは、ＣＦＰ（ドナー分子）とＹＦＰ（アクセプター分子）である。本発明のポリペプチドにおいては、Ｎ末端とＣ末端に連結させる蛍光タンパク質は、相互に位置を入れ替えて使用してもよい。
更に、蛍光タンパク質は、アミノ酸配列の順序を変更されたものでもよい。例えば、ＣＦＰの１〜１７２番目までのアミノ酸配列と１７３〜２３８番目までのアミノ酸配列を前後するように入れ替えたｃｐＣＦＰ（circular permutated CFP）、すなわちＣＦＰの１７３番目のアミノ酸が新たにＮ末端となり、１７２番目のアミノ酸が新たにＣ末端となる様にアミノ酸配列が入れ替えたＣＦＰの変異体（以下、ＣＦＰ１７３変異体とする）を用いることができる。前記ＣＦＰ１７３変異体を用いることによって、検出感度が上昇させることができる。
【００３６】
（生物発光タンパク質）
本発明の融合タンパク質に用いる生物発光タンパク質は、生物由来の生物発光タンパク質である限りにおいて限定されるものではないが、例えばホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、ウミシイイタケルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、オキアミルシフェリン、過鞭毛藻ルシフェリン、ラチアルルシフェリン、若しくはミミズルシフェリン、又はこれらのルシフェリンの誘導体を挙げることができる。
【００３７】
（蛍光化合物結合ポリペプチド）
本発明の融合タンパク質に用いる蛍光化合物結合ポリペプチドは、蛍光化合物が結合する限りにおいて限定されるものではない。例えば、１つの態様として、蛍光化合物が特異的に結合するアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、Ｈａｌｏ  Ｔａｇ）を挙げることができる。また、別の態様としてポリペプチドに特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）に蛍光化合物を標識したものを用いることもできる。この場合、蛍光化合物結合ポリペプチドとして、抗体が結合するポリペプチドを用いることができる。
【００３８】
更に、ＦＲＥＴを誘導することのできるドナー及びアクセプターの蛍光タンパク質、蛍光化合物、又は生物発光タンパク質の組み合わせとしては、例えばSirius及びmseCFP、EBFP及びC-S65T、mTFP1及びeYFP、T-Sapphire及びmOrange、mAmetrine及びtdTomato、T-Sapphire及びPSmOrange2、mCellurian及びmCitrine、mTurquoise及びeYFP、eCFP及びtdTomato、eCFP及びmDsRed、eCFP及びYPet、CyPet及びYPet、LSSmOrange及びLSSmKate2、mTurquiose及びcpVenus、CFP及びYFP、CFP及びcpVenus、mseCFP及びPA-GFP、mTFP1及びmCitrine、GFP及びTMR、GFP及びAlexa546、eGFP及びmStrawberry、eGFP及びHalo-TMR、Alexa488及びAlexa594、Alexa488及びTMR、eGFP及びmDsRed、eGFP及びmRFP、sYFP及びmRFP、TagGFP及びTagRFP、TMR及びAtto647、Cy3及びAtto647N、TMR及びCy5、TMR及びIC5、Clover及びmRuby2、Cy3及びCy5、mKO及びmCherry、tagRFP及びmPlum、mOrange2及びmKate2、mOrange及びmCherry、Qdot及びCy3、QDot525及びCy3、RLuc及びEYFP、RLuc8及びEYFP、RLucX及びVenus、又はcpeCFP及びmVenus等を挙げることができる。
【００３９】
（融合ポリペプチド）
本発明の融合ポリペプチドは、前記ＣｒｋＬの誘導体のＣ末端又はＮ末端に、直接又はペプチドリンカーを介して、蛍光タンパク質、発光タンパク質及び蛍光化合物結合ポリペプチドから選択される２つの組み合わせを結合させることにより得ることができる。融合ポリペプチドとしては、前記のＣｒｋＬ誘導体と、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質又は蛍光化合物（蛍光化合物結合ポリペプチド）の２つの組み合わせとを限定することなく用いることができるが、例えば全長のＣｒｋＬ誘導体のＮ末端にＹＦＰが結合し、そしてＣ末端にＣＦＰが結合した本発明のポリペプチド１に属する融合ポリペプチド（配列番号４）を挙げることができる。また、ＣｒｋＬの１〜２２２番の鎖長のＣｒｋＬ誘導体のＮ末端にＹＦＰが結合し、そしてＣ末端にＣＦＰが結合した本発明のポリペプチド２に属する融合ポリペプチド（配列番号６）を挙げることができる。更に、ＣｒｋＬの１〜２２２番の鎖長のＣｒｋＬ誘導体のＮ末端にＹＦＰが結合し、そしてＣ末端にＣＦＰ１７３変異体が結合した本発明のポリペプチド２に属する融合ポリペプチド（配列番号８）を挙げることができる。また、ＣｒｋＬの１〜２２２番の鎖長のＣｒｋＬ誘導体のＮ末端にＹＦＰが結合し、そしてＣ末端にＣＦＰ１７３変異体が結合させ、更にＹＦＰのＮ末端にプロテイン・カイネースA・インヒビター（Protein kinase A inhibitor：ＰＫＩ）の核外搬出シグナル（Nuclear export signal:ＮＥＳ）、すなわち「ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ」（配列番号２２）を有する本発明のポリペプチド２に属する融合ポリペプチド（配列番号１９）を挙げることができる。
【００４０】
（リンカーペプチド）
本発明の融合ポリペプチドにおいて、例えばＣｒｋＬ誘導体及び蛍光タンパク質は、リンカーペプチドによって結合することができる。すなわち、ＣｒｋＬ誘導体のＮ末端（アミノ末端）側、又はＣ末端（カルボキシル末端）側において、リンカーペプチドを介して蛍光タンパク質を結合することができる。リンカーペプチドは、本発明のポリペプチドのＦＲＥＴを極端に阻害しないものが好ましい。リンカーペプチドの鎖長は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましく、１〜３が更に好ましい。具体的なアミノ酸配列としては、「ＧＧＳ」、「ＲＧＲ」、「ＣＧＲ」、「ＧＧＲ」、「ＬＥ」、又は「ＧＧＳＧＧ（配列番号１５）」を挙げることができる。
【００４１】
本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは配列番号４で表されるアミノ酸配列における５４５番〜５４７番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号６で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、配列番号８で表されるアミノ酸配列における４６４番〜４６６番の少なくとも１つのアミノ酸、又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列における４６８番〜４７０番の少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。この置換により、プロテアーゼなどによる切断が抑制される。
更に、本発明の融合ポリペプチドの１つの態様においては、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含むことができる。ＮＥＳを有することによって、ポリペプチドを核外に移行させ、核のプロテアーゼの影響を受けにくくすることができる。従って、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を有する融合ポリペプチドは、プロテアーゼによる切断が抑制される。核外搬出シグナル（ＮＥＳ）のペプチドは、「ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬ」の配列を有するペプチドであり、「Ｌ」は疎水性アミノ酸を意味し、ｘは任意のアミノ酸を意味する。疎水性アミノ酸は、通常ロイシン（Ｌ）が多いが、イソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）でもよい。本発明の融合ポリペプチドに含むことのできる核外搬出シグナル（ＮＥＳ）のペプチドは、前記「ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬ」の構造を有するものであれば、特に限定されるものではない。
【００４２】
前記融合ポリペプチドは、本分野において公知の遺伝子工学の技術を用いて発現及び精製させ、チロシンキナーゼ活性の測定方法に用いることができる。
（融合ポリヌクレオチド）
前記融合ポリペプチドの発現に用いるポリヌクレオチドは、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、融合ポリヌクレオチドと称することがある）である。融合ポリヌクレオチドは、ＣｒｋＬ誘導体をコードするポリヌクレオチド（以下、ＣｒｋＬ誘導体ポリヌクレオチドと称することがある）、及び蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、蛍光タンパク質ポリヌクレオチドと称することがある）、生物発光タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、物発光タンパク質ポリヌクレオチドと称することがある）及び蛍光化合物結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、蛍光化合物結合ポリヌクレオチドと称することがある）から選択される２つが結合したものである。蛍光タンパク質ポリヌクレオチド、生物発光タンパク質ポリヌクレオチド又は蛍光化合物認識ポリペプチドは、ＣｒｋＬ誘導体ポリヌクレオチドの３’末端及び５’末端に結合することができる。その組み合わせは、蛍光タンパク質ポリヌクレオチド及び蛍光タンパク質ポリヌクレオチド、蛍光タンパク質ポリヌクレオチド及び蛍光化合物結合ポリヌクレオチド、蛍光化合物結合ポリヌクレオチド及び蛍光化合物結合ポリヌクレオチド、蛍光タンパク質ポリヌクレオチド及び生物発光タンパク質ポリヌクレオチド、又は蛍光化合物結合ポリヌクレオチド及び生物発光タンパク質ポリヌクレオチドを挙げることができる。
更に、融合ポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド（以下、リンカーヌクレオチドと称することがある）を含んでもよい。
【００４３】
（組換えベクター）
前記融合ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むことによって、融合ポリペプチドとして、発現させることができる。前記発現ベクターに融合ポリヌクレオチドを組み込むことによって、組換えベクター（以下、融合ポリペプチドベクターと称することがある）を得ることができる。
前記組換えベクターに用いることのできるベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００４４】
（形質転換細胞）
前記組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、形質転換細胞を得ることができる。すなわち、形質転換細胞は、前記融合ポリペプチドベクターを含む。
本発明の組換えベクターを含む宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等を用いることができる。
【００４５】
［２］チロシンキナーゼ活性の測定方法
本発明のＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の測定方法は、（１）本発明のポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）及び患者由来の細胞を接触させる工程、及び（２）前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、を含む。本明細書において「蛍光発光」とは、ＢＲＥＴにおいて、励起光を与えることなく、基質からのエネルギー移動による発光を含むものである。
また、通常アクセプターの蛍光発光を測定することによって、ＦＲＥＴを測定することが可能であるが、アクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光の比を測定すること、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの蛍光発光の比を測定することによって、より確実にＦＲＥＴを測定することもできる。
また、本発明のポリペプチドとして、ドナー結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）又はアクセプター結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）を有するポリペプチドを用いる場合、患者由来細胞との接触工程（１）において、これらのタグと結合する蛍光化合物を細胞と接触させることが好ましい。
本発明のチロシンキナーゼ活性の測定方法によって測定することのできるチロシンキナーゼは、ＣｒｋＬ（又はＣｒｋ）を基質とするチロシンキナーゼである限りにおいて、限定されるものではないが、ＢＣＲ−ＡＢＬ、上皮増殖因子受容体（Ｅpidermal growth factor receptor；ＥＧＦＲ）、又はｃ−Ａｂｌを挙げることができる。
本発明のポリペプチドに含まれるＣｒｋＬ誘導体が、例えばＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化されることによって、ＦＲＥＴが誘導される。従って、ＦＲＥＴを測定することによって、ＢＣＲ−ＡＢＬによるリン酸化を測定することができる。
ＢＣＲ−ＡＢＬは、フィラデルフィア（Ｐｈ１）染色体転座の結果として得られるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子にコードされる、恒常的なチロシンキナーゼ活性をもつ細胞質タンパク質である。生体内の種々のタンパク質を基質として認識してそのチロシン残基をリン酸化する、チロシンキナーゼ活性を有する。ＣｒｋＬは、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質の代表例である。
【００４６】
本発明のポリペプチドと患者由来の細胞との接触は、特に限定されるものではなく、細胞内での接触でもよく、細胞外での接触でもよい。例えば、細胞内での接触の場合、タンパク質が細胞内に取り込まれることにより、細胞内で接触してもよく、細胞内に発現ベクターをトランスフェクションして細胞内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、細胞内で接触してもよい。また、細胞外での接触の場合、本発明のポリペプチドと細胞膜とが接触してもよい。また、細胞を溶解して細胞抽出物と接触させることも、細胞外での接触に含まれる。本発明のＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の測定方法によって、チロシンキナーゼ活性を測定される細胞は、ＣｒｋＬ（又はＣｒｋ）を基質とするチロシンキナーゼを有する限りにおいて、限定されるものではないが、腫瘍細胞が好ましく、特には慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の患者、頭頸部癌患者、大腸癌患者、乳癌患者、腎癌患者、胃癌患者、卵巣癌患者、又は肺癌患者の細胞が好ましい。
【００４７】
［３］チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法
本発明のチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法は、（１）チロシンキナーゼ阻害剤、本発明のポリペプチド、及び患者由来の細胞を接触させる工程、及び（２）前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、を含む。前記接触工程（１）において、チロシンキナーゼ阻害剤を存在させることを除いては、前記のチロシンキナーゼ活性の測定方法と同じように実施することができる。すなわち、チロシンキナーゼ阻害剤によって、抑制された細胞のチロシンキナーゼ活性を測定することによって、チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認することが可能である。
具体的には、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲが含まれると想定される患者から採取された検体とチロシンキナーゼ阻害剤とを共存させると、チロシンキナーゼ阻害剤がＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するものである場合には、ＣｒｋＬ誘導体のチロシン残基のリン酸化が阻害される結果、ＦＲＥＴによる蛍光（発光）強度が減少あるいは観測されなくなる。したがって、このＦＲＥＴを測定することで、患者から採取された検体に含まれると想定されるＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲが前記チロシンキナーゼ阻害剤に抵抗性を示すか否かを確認することができる。
また、前記チロシンキナーゼ活性の測定方法と同様に、本発明のポリペプチドとして、ドナー結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）又はアクセプター結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）を有するポリペプチドを用いる場合、患者由来細胞との接触工程（１）において、これらのタグと結合する蛍光化合物を細胞と接触させることが好ましい。
【００４８】
本発明のチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法において、用いられるチロシンキナーゼ阻害剤は、限定されるものではないが、例えば、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ゲフェチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、又はボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）を、挙げることができる。
【００４９】
［４］チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法
本発明のチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法は、（１）試験化合物の存在下で、本発明のポリペプチド及びＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲを接触させる工程、及び（２）前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を測定する工程、を含む。
前記チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法における、チロシンキナーゼ阻害剤を、試験化合物に置き換えることによって、試験化合物のスクリーニングを行うことができる。すなわち、チロシンキナーゼ活性を阻害すると期待される物質のＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性に対する阻害作用を検出することができる。このチロシンキナーゼ活性に対する阻害作用は定量化することもできる。
また、本発明のポリペプチドとして、ドナー結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）又はアクセプター結合タグ（蛍光化合物結合ポリペプチド）を有するポリペプチドを用いる場合、ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＥＧＦＲとの接触工程（１）において、これらのタグと結合する蛍光化合物を細胞と接触させることが好ましい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００５１】
《参考例１》
本参考例では、ＣｒｋＬの１〜２２２番のポリペプチドのＮ末端にＹＦＰ（単量体型Ｖｅｎｕｓ；ｍ１Ｖｅｎｕｓ）及びＣ末端にＣＦＰ１７３変異体が結合したＦＲＥＴ用ポリペプチドを発現する発現ベクターｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を構築した。【００５２】
ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３（特許文献１に記載）のＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）の２０７番のアラニン（Ａ）をリシン（Ｋ）に置換させ、ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を得た。
具体的には、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ−Ｖｅｎｕｓを鋳型として、２  ｓｔｅｐ  ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを用いて、２０７番のアラニン（Ａ）をリシン（Ｋ）に変異させるプライマーによってＰＣＲを行なった。ＤＮＡ断片の末端には、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩサイトを導入するようにプライマーを設計した。ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３及び得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトに、前記ＤＮＡ断片をライゲーションにより結合させ、ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を得た。【００５３】
《解析例１》
本解析例では、前記ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を用いて、細胞内における従来のフェルスター共鳴エネルギー移動用ポリペプチドの蛍光の測定を行った。
２９３Ｆ細胞に、参考例１で得たｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入した。２４時間後に細胞を低速遠心で回収し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、３５ｍｍガラス底ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に播種した。以下の構成のイメージングワークステーションを用いてＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光画像を取得した。バックグラウンド除去後、それぞれの細胞の有するＣＦＰとＹＦＰ蛍光強度データをマイクロソフトエクセルに書き出し、プロットした。結果を図１に示す。
ワークステーション構成
顕微鏡：オリンパスIX71
CCDカメラ：CoolSNAP HQ（日本ローパー）
フィルターホイル：Mac 5000（Ludl）
フィルター：すべてOmega社
CFP励起，XF1071；CFP吸収，XF3075；YFP励起，XF1068；YFP吸収，XF3079
制御及び解析ソフト：MetaMorph（モレキュラーデバイスジャパン）【００５４】
図１は、２９３Ｆ細胞を蛍光顕微鏡で観察・撮像し、ＣＦＰの蛍光強度を横軸、ＹＦＰの蛍光強度を縦軸にプロットしたものである。Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１はＣＦＰとＹＦＰを１：１で含むため、理論上は、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度は比例関係になり直線上に分布するはずである。しかしながら、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１は、ＣＦＰとＹＦＰの値にばらつきが見られ、ＹＦＰあるいはＣＦＰが著しく過多の細胞も少なくない。この結果は、細胞内において発現したＰｉｃｋｌｅｓ  ２．３１が複数箇所で切断され、細胞ごとにＹＦＰ又はＣＦＰを含む断片の分解が異なるために、それぞれの細胞における蛍光強度がばらついているものと考えられた。【００５５】
《解析例２》
本解析例では、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１の切断部位の解析に用いるため、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．０（特許文献１に記載）のＹＦＰをＦｌａｇペプチドに入れ換えたポリペプチドをコードするベクターＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０を構築し、ウエスタンブロットにより切断部位を解析した。
（１）Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０の構築
ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０（特許文献１に記載）を鋳型として、ＣｒｋＬの１〜２２２番のアミノ酸配列を含み、増幅後のＤＮＡ断片が、５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行って増幅ＤＮＡ断片を得た。得られた増幅ＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで開環させたｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＣＦＰＣベクター（５‘側にＦｌａｇを有し、３’側にＣＦＰを有するベクター）に組み換えて、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０（ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＣｒｋＬ−ＣＦＰＣ）を得た。【００５６】
（２）ウエスタンブロットによる解析
前記Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１及びＢＣＲ−ＡＢＬを、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に、細胞を回収し、１×ＳＤＳサンプルバッファー（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．６、１２％（ｖ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ＳＤＳ、０．００４％ブロモフェノールブルー、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）を用いて可溶化した。超音波処理後の組織懸濁液を１００００ｒｐｍで５分遠心後、上清をサンプルとして使用した。９５℃で５分インキュベートした。１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、サンプルを電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＡＢＬ抗体、抗リン酸化ＣｒｋＬ（ｐＣｅｋＬ）抗体（＃３１８１  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＣｒｋＬ抗体（＃３１８２  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）、又は抗ＧＦＰ抗体（松田道行博士より分与）を反応させた。二次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＰｌｕｓ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）を用い、シグナルを検出した。結果を図３に示す。
図３に示すように、抗リン酸化ＣｒｋＬ（ｐＣｒｋＬ）抗体は、ＣｒｋＬの２０７番目のリン酸化されたチロシンを認識し、抗ＣｒｋＬ抗体は、ＣｒｋＬのＳＨ２領域を認識する。また、Ｆｌａｇ抗体は、Ｆｌａｇの検出に用い、抗ＧＦＰ抗体はＣＦＰの検出に用いた。抗ＡＢＬ抗体はＢＣＲ−ＡＢＬの検出に用いたが、図３に示すようにＢＣＲ−ＡＢＬをトランスフェクションした細胞では、ＢＣＲ−ＡＢＬが検出された。
写真中の（Ａ）で示した切断断片の分子量から、ＳＨ２領域とＳＨ３領域の結合部分付近の切断部位の存在が推定された。また、写真中の（Ｂ）で示した切断断片の分子量から、ＳＨ３領域とＣＦＰの結合部分付近の切断部位の存在が推定された。【００５７】
《解析例３》
本解析例では、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１の切断部位、特に前記解析例１における（Ｂ）の切断部位の解析に用いるため、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０（ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＣｒｋＬ−ＣＦＰＣ）のＣＦＰをＣＦＰ１７４変異体（ｃｐＣＦＰ）に入れ換えたポリペプチドをコードするベクターＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を構築し、ウエスタンブロットにより切断部位を解析した。
（１）Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１の構築
ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ＣＦＰ１７４変異体（ｃｐＣＦＰ）を含むＤＮＡ断片を切り出した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩで開環させた、前記Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０（ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＣｒｋＬ−ＣＦＰＣ）ベクターに組み換えて、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０を得た。
（２）ウエスタンブロットによる解析
Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を用い、解析例２（２）の操作を繰り返してウエスタンブロットを行った。抗体は、抗ＣｒｋＬ抗体のみを用いた。結果を図４に示す。
本解析例の目的は、（Ｂ）示した切断部位が、ＣＦＰのアミノ酸配列に存在するか、又はＣｒｋＬのアミノ酸配列に存在するかを確認することである。Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１に含まれるｃｐＣＦＰは、ＣＦＰの１７３番目のアミノ酸からはじまり、１番目のメチオニンは矢頭の位置にあるので、もし切断部位がＣＦＰ内部であれば、切断された断片の分子量が変わるはずである。Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．０、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１のいずれを用いた場合も、同じサイズのバンドが検出されたため、切断部はＣＦＰのアミノ酸配列には存在しないことがわかった。【００５８】
《解析例４》
本解析例では、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１の切断部位（Ｂ）の切断を抑制するために、９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換した。切断の抑制の確認のために、前記解析例１で構築したＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１に、変異を導入したＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａを作成した。更に、ＣｒｋＬの１〜２２２番目のポリペプチドを、ＣｒｋＬの全長のポリペプチドに置き換えたＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを作成し、ウエスタンブロットにより解析した。
（１）Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａ及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａの構築
前記９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）への置換は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Agilent Technologies）を用いて行った。Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を鋳型として、以下の２つのプライマーを用い、添付のプロトコールに従って、置換を導入した。
hCrkL_D94A_F：AGATCCACTACCTGGCCACCACCACCCTCAT（配列番号１６）
hCrkL_D94A_R：ATGAGGGTGGTGGTGGCCAGGTAGTGGATCT（配列番号１７）
得られたベクターをＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａと称する。【００５９】
Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａは、以下の通り構築した。
ｐＣＲ２．１−ＣｒｋＬベクターを鋳型として、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Agilent Technologies）を用いて、９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換されたＣｒｋＬの全長を含むベクターを得た。具体的には、前記hCrkL_D94A_Fプライマー及びhCrkL_D94A_Rプライマーを用いて、添付のプロトコールに従って、ｐＣＲ２．１−ＣｒｋＬベクターに置換を導入した。得られたベクターをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡ断片を得た。また、Ｆｌａｇ−Ｐｉｃｋｌｅｓ＿２．３−（ＣＦＰＣ）をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し開環させた。得られたベクターに、前記ＤＮＡ断片をライゲーションにより結合させ、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを得た。【００６０】
（２）ウエスタンブロットによる解析
Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａ、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを用い、解析例２（２）の操作を繰り返してウエスタンブロットを行った。コントロールとして、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を用いた。抗体は、抗ＣｒｋＬ抗体及び抗ＧＦＰ抗体を用いた。結果を図５に示す。【００６１】
抗ＣｒｋＬ抗体でのウエスタンブロットの写真から、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａ、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを導入した細胞では、「（Ａ切断無し）」の矢印で示したＣｒｋＬのＮ末側の切断が阻害されたバンドが検出された。また、抗ＧＦＰ抗体でのウエスタンブロットの写真では、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を導入した細胞では、「（Ａ）」の矢印で示したＣｒｋＬのＮ末側が切断されたバンドが、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１−Ｄ９４Ａ、及びＦｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを導入した細胞では、消失しており（サイズが大きくなり）切断が阻害されたことが分かった。限定されるものではないが、ＣｒｋＬは９１番のヒスチジン（Ｈ）及び９７番のスレオニン（Ｔ）の間で切断されているものと推定される。
更に、抗ＧＦＰ抗体でのウエスタンブロットの写真では、Ｆｌａｇ−ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿１．０−Ｄ９４Ａを導入した細胞において、（Ｂ）及び（Ｂ‘）で示す２つのバンドが出現した。これはＣ末側の（Ｂ）の切断部位が２箇所あり、１箇所はＳＨ３領域内に、もう１箇所はリンカー部分に存在すると推定された。【００６２】
《実施例１》
本実施例では、Ｐｉｃｋｌｅｓ＿２．３１において、９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）への置換を行った。
前記９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）への置換は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Agilent Technologies）を用いて行った。ｐＰｉｃｋｌｅｓ＿２．３１を鋳型として、以下の２つのプライマーを用い、添付のプロトコールに従って、置換を導入した。
hCrkL_D94A_F：AGATCCACTACCTGGCCACCACCACCCTCAT（配列番号１６）
hCrkL_D94A_R：ATGAGGGTGGTGGTGGCCAGGTAGTGGATCT（配列番号１７）
得られたベクターをｐＰｉｃｋｌｅｓ＿４．３１と称する。【００６３】
《実施例２》
本実施例では、ＣＭＬ患者由来の骨髄単核球におけるＰｉｃｋｌｅｓ  ４．３１のＮ末側での切断の抑制を検討した。
実施例１で得られたｐＰｉｃｋｌｅｓ＿４．３１及びコントロールとしてｐＰｉｃｋｌｅｓ  ２．３１を、ＣＭＬ患者由来の保存骨髄単核球に電気穿孔法で導入した。２４時間後に、Ｉｍａｔｉｎｉｂを２μＭ、又はＮｉｌｏｔｏｎｉｂを４μＭを添加し、更に２４時間培養した。フローサイトメーター（三井造船社製、Ｆｌｉｃｙｍｅ  ３００）を用いて各細胞の蛍光強度を取得し、データをＦｌｏｗＪｏにインポートした後ＦＬ１とＦＬ２の蛍光強度に基づき２次元プロットした。結果を図６に示す。
Ｉｍａｔｉｎｉｂ添加、及びＮｉｌｏｔｏｎｉｂ添加のいずれにおいても、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１では、ＹＦＰ過剰細胞（左上点線枠内）が存在した。一方、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ４．３１では、ＹＦＰ過剰細胞が有意に減少した。
すなわち、９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）への置換により、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１において見られたＮ末側の切断が抑制された。【００６４】
更に、実際の解析細胞数、評価対象細胞数、ＣＦＰ切断細胞数、及びＹＦＰ切断細胞数を計数した。結果を表１に示す。
【表１】
0006473080.tif 000002
【００６５】
ＣＭＬ薬効検査では、総解析細胞数（データをとりこんだ全ての細胞）のうち、図２に示したＣＦＰ過剰細胞とＹＦＰ過剰細胞を評価対象から除外し、残った細胞で薬効評価を行なっている。評価対象細胞数は患者により様々である。表１に示した患者においては特にＣＦＰ切断細胞及びＹＦＰ切断細胞が多く、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１では１００個以上の評価対象細胞を確保するために１０００個近い細胞の観察及び解析が必要であった。Ｐｉｃｋｌｅｓ  ４．３１によりＹＦＰ切断細胞数は０となった。評価対象細胞％は、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ２．３１の１５％から３５％に向上した。今回の患者では３００個程度の解析で、評価対象細胞数を得ることができるものと推定できた。【００６６】
《実施例３》
本実施例では、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ４．３１に、プロテイン・カイネースＡ・インヒビター（Protein kinase A inhibitor：ＰＫＩ）の核外搬出シグナル（Nuclear export signal:ＮＥＳ）を導入した。
具体的には、Ｖｅｎｕｓの遺伝子を含むｐＦＸ−Ｖｅｎｕｓ−ＦＡＴベクターを鋳型として、Ｖｅｎｕｓの全長のアミノ酸配列を含み、増幅後のＤＮＡ断片が、５’末端にそれぞれ制限酵素ＸｂａＩの認識配列とＰＫＩのＮＥＳ配列に相当する１０７〜１４１番のアミノ酸および制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの認識配列を、及び３’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計及び合成された以下のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行って増幅ＤＮＡ断片を得た。
【化１】
0006473080.tif 000003
reverse primer（CFP-STOP-PspOMI-BglII-rv）：CCAGATCTGGGCCCTCAGGCGGCGGTCACGAAC（配列番号２１）
得られた増幅ＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩとＢｇｌＩＩで開環させたｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ３．３１ベクターに組み換えて、ｐＦＸ−ＮＥＳ−Ｖｅｎｕｓベクターを得た。なお、前記ｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ３．３１ベクターは、ｐＰｉｃｋｌｅｓ２．３１ベクターのＣｒｋＬ内のＥｃｏＲＩ切断部位を、アミノ酸を変異させずに、点突然変異により欠失させ、更にプロモーターをＣＭＶプロモーターに変更したベクターである。
前記実施例１で得たｐＰｉｃｋｌｅｓ４．３１から制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで抜き出したＰｉｃｋｌｅｓ４．３１を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで開環させたｐＦＸ−ＮＥＳ−Ｖｅｎｕｓベクターに組み換えて、ｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ４．３１ＮＥＳベクターを得た。【００６７】
《実施例４》
本実施例では、実施例１で得られたｐＰｉｃｋｌｅｓ４．３１ベクター、及び実施例３で得たｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ４．３１ＮＥＳベクターを用い、解析例１に従って、評価可能な細胞数を解析した。
ＣＭＬ患者由来の骨髄単核球に、ｐＰｉｃｋｌｅｓ４．３１ベクター又はｐＦＸ−Ｐｉｃｋｌｅｓ４．３１ＮＥＳベクターを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入した。２４時間後に細胞を低速遠心で回収し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、３５ｍｍガラス底ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に播種した。以下の構成のイメージングワークステーションを用いてＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光画像を取得した。バックグラウンド除去後、それぞれの細胞の有するＣＦＰとＹＦＰ蛍光強度データをマイクロソフトエクセルに書き出し、プロットした。結果を図７に示す。
ワークステーション構成
顕微鏡：オリンパスIX71
CCDカメラ：CoolSNAP HQ（日本ローパー）
フィルターホイル：Mac 5000（Ludl）
フィルター：すべてOmega社
CFP励起，XF1071；CFP吸収，XF3075；YFP励起，XF1068；YFP吸収，XF3079
制御及び解析ソフト：MetaMorph（モレキュラーデバイスジャパン）【００６８】
図７に示すように、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ４．３１はＣＦＰとＹＦＰとの蛍光強度が比例関係にある細胞が多く、評価対象細胞数％が１３．７％であった。一方、Ｐｉｃｋｌｅｓ４．３１ＮＥＳは、更に解析可能な細胞が増加し、評価対象細胞数％は３５．６％であった。Ｐｉｃｋｌｅｓ４．３１ＮＥＳは、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含むため、核のプロテアーゼの影響を受けにくくなり、解析可能な細胞が増加したものと考えられる。なお、実施例２で、ＣＭＬ患者由来の骨髄単核球におけるｐＰｉｃｋｌｅｓ＿４．３１を用いた評価対象細胞％が３５％であるのに対し、本実施例ではｐＰｉｃｋｌｅｓ４．３１を用いた評価対象細胞％が１３．７％であった。これはＣＭＬ患者ごとに、骨髄単核球中のプロテアーゼ活性等が大きく異なり、ばらつきがあるためである。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のポリペプチドは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に用いることができる。具体的にはＣＭＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を測定することが可能である。従って、ＣＭＬ患者の治療に用いるチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＭＬ患者の細胞、及び本発明のポリペプチドを共存させることによって、チロシンキナーゼ阻害剤による薬剤耐性を測定することもできる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
0006473080.tif 000004
【図２】
0006473080.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006473080.tif 000010
【配列表】
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