(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドまたはタンパク質薬物とポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢで構成する融合タンパク質を含み、この融合タンパク質とポリペプチドＡ、ポリペプチドＢまたは別の前記融合タンパク質がβ―プリーツシート構造を形成し、前記ポリペプチドＡはｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドＢはＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチドであることを特徴とする薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項２】
前記融合タンパク質で、ポリペプチドまたはタンパク質薬物がポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の下記部位、即ちポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域、２つのポリペプチドＡのそれぞれのＮ末端、Ｃ末端および４つのｌｏｏｐ領域に位置することを特徴とする請求項１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項３】
前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項４】
前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片であることを特徴とする請求項１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項５】
ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（８Ｇ）、ＳＳＴまたはＰＹＹとポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢで構成する融合タンパク質を含み、この融合タンパク質とポリペプチドＡ、ポリペプチドＢまたは別のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（８Ｇ）、ＳＳＴまたはＰＹＹとポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢで構成する融合タンパク質がβ―プリーツシート構造を形成し、前記ポリペプチドＡはｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドＢは、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項６】
前記融合タンパク質複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の第２５〜１６１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体および２つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体が結合して構成された、β―プリーツシート構造を有する複合体であることを特徴とする請求項５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項７】
前記融合タンパク質複合体は、２つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８中の第２５〜２６０位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体および１つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体が結合して構成された、β―プリーツシート構造を有する複合体であることを特徴とする請求項５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項８】
前記融合タンパク質複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８中の第２５〜１３２位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体および２つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体が結合して構成された、β―プリーツシート構造を有する複合体であることを特徴とする請求項５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項９】
前記融合タンパク質複合体は、２つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０中の第２５〜２３７位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体および１つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体が結合して構成された、β―プリーツシート構造を有する複合体であることを特徴とする請求項５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記融合タンパク質複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２中の第２５〜１５３位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体および２つのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体が結合して構成された、β―プリーツシート構造を有する複合体であることを特徴とする請求項５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質複合体。
【請求項１１】
薬用作用を有する融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、直接的または間接的に順次に接続した第一ポリペプチドＡと、ポリペプチドＢと、第二ポリペプチドＡとを含み、任意の前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の部位に挿入、または接続した１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質薬物を含み、前記２つのポリペプチドＡとポリペプチドＢがフレキシブルｌｉｎｋｅｒを介してβ―プリーツシート構造を形成し、前記第一ポリペプチドＡおよび第二ポリペプチドＡは、ｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドＢは、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチドであることを特徴とする薬用作用を有する融合タンパク質。
【請求項１２】
ポリペプチドまたはタンパク質薬物が任意の前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の下記部位、即ちポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域、２つのポリペプチドＡのそれぞれのＮ末端、Ｃ末端および４つのｌｏｏｐ領域に位置することを特徴とする請求項１１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第一ポリペプチドＡおよび／または第二ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であることを特徴とする請求項１１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第一ポリペプチドＡおよび／または第二ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片であることを特徴とする請求項１１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は、直接的または間接的に順次に接続した第一ポリペプチドＡと、ポリペプチドＢと、第二ポリペプチドＡとを含み、任意の前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の部位に挿入、または接続した１つまたは複数のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（８Ｇ）、ＳＳＴまたはＰＹＹのポリペプチドまたはタンパク質薬物を含み、前記２つのポリペプチドＡとポリペプチドＢがフレキシブルｌｉｎｋｅｒを介してβ―プリーツシート構造を形成し、前記第一ポリペプチドＡおよび第二ポリペプチドＡは、ｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドＢは、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチドであることを特徴とする薬用作用を有する請求項１１に記載の薬用作用を有する融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０中の第２５〜６０１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であることを特徴とする請求項１５に記載の薬用作用を有する融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学の分野に関し、Ｔｉｔｉｎ-Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  β−プリーツシート構造に基づくポリペプチド複合体がポリペプチドまたはタンパク質薬物担体として、ポリペプチドまたはタンパク質類薬物担体の半減期を延長させる使用および方法、このようなポリペプチド複合体によるポリペプチドまたはタンパク質類薬物への設計と改良により、薬用作用を有する融合タンパク質複合体を得られることに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在では、ほとんどのペプチド類およびその類似体薬物はホルモンやホルモンの作用があるペプチド誘導体であり、生物活性や特異性が高く、可溶性が強く、低毒性などのメリットがあり、既に薬物の研究開発のホットな領域となっている。ペプチドやタンパク質薬物は強力な生物学的活性を有するが、体内で薬理学作用を発揮するには、次の制限がある。即ち、１）経口利用度が低く、投与方法は通常注射を選択する、２）親水性が強く、生理バリアを通過しにくい、３）構造の柔軟性が高く、受容体や標的を結合するとき、特異的選択を欠けるため、副作用が出やすくなってしまう。また、以上の制限以外に、体内半減期が短いということが最も主要な制限となっている。あるペプチドやタンパク質類薬物の体内半減期がわずか数分間しかないので、標的組織に届く薬物濃度が低すぎて、十分な効果を発揮できなく、臨床使用は厳しく制限されている。
【０００３】
半減期が短い原因として、２つが挙げられる。１つは血漿、肝臓および腎臓の中に、ペプチド酵素（Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）とプロティナーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）が大量に存在しているため、ペプチドやタンパク質が酵素の作用で迅速に分解されること、もう１つは血漿中の分子量がより小さいペプチドやタンパク質類薬物（５０ｋＤａより低い）が、腎臓の濾過作用で急速に排出されること。
【０００４】
ペプチドやタンパク質類薬物の半減期を延長させることは、薬物の薬物動態と薬力学の特徴を改善するだけでなく、しかも投与量と投与回数を減らすこともでき、これもペプチドやタンパク質類薬物の臨床使用上、大きな問題となっている。
【０００５】
現在では、一連のペプチドやタンパク質類薬物の半減期を延長させる方法が既に開発されており、例えば、ペプチドやタンパク質類薬物が酵素に対する安定性を向上させることにより、酵素の分解を減らすこと、あるいはペプチドやタンパク質類薬物のハイドロメカニクス体積（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ）とＦｃＲｎ介在の再生作用を増加することにより、腎臓の濾過排出を減らすことである。また、小さなポリペプチドやタンパク質類薬物を大分子の物質と遺伝子融合あるいは化学カップリングでつなぐと、その分子量を増大させ、腎臓濾過の臨界値（４０〜５０ｋＤａ）を超えさせることにより、腎臓の濾過排出を減らすだけでなく、しかも大分子量物質の空間の立体効果に依存して、タンパク質酵素などによるポリペプチドやタンパク質薬物への分解を減らすことにより、ポリペプチドやタンパク質類薬物の半減期を大幅に延長させ、臨床使用の底力を増加した。
【０００６】
現在では、ＰＥＧ、ＡｌｂｕｍｉｎやＩｇＧ−Ｆｃなどが使用に比較的成熟した大分子量担体である。最も普遍的な方法は、化学架橋で異なる分子量のＰＥＧをポリペプチドやタンパク質類薬物の特異部位とつなぎ、ポリペプチドやタンパク質薬物の半減期を著しく延長することができる。ＰＥＧ修飾はタンパク質やポリペプチド薬物の水溶性を増やし、安定性を高め、免疫原性を低下させ、プロティナーゼの分解を減らし、血液中の滯留時間を延長させ、薬物の作用時間を延長させる。しかし、ＰＥＧ修飾でも、例えば、生産コストが高く、あるＰＥＧ修飾の薬物の活性が低下し、また近年、ＰＥＧ修飾のタンパク質およびその分解物が腎臓に累積しやすく、腎臓の正常な濾過作用を干渉することを発見し、人や動物がＰＥＧに対して一定の抗体を生じ、一定の免疫原性を有することを表明するといういくつかの問題がある。
【０００７】
そのため、免疫原性のより低いあるいは免疫原性のない、体内により安定したペプチドやタンパク質類薬物の担体を開発する必要があり、ポリペプチドやタンパク質類薬物を原の活性に維持させるとともに、その半減期を延長させることにより、臨床への使用がよりよくなる。
【０００８】
筋原繊維は筋節（ｓａｒｃｏｍｅｒｅ）で構成されており、Ｚ板（Ｚ−ｄｉｓｋ）は筋節の境界線である。Ｚ板でたくさんの蛋白質が固定されており、細胞の骨格成分を構成しており、細胞の構造や筋肉の伸縮を維持する重要な役割を果たす。Ｚ板で、ｔｉｔｉｎ分子が筋節の整合性を維持する重要な役割を果たす。Ｔｉｔｉｎ分子は自然界で知られている最大のタンパク質であり、その分子量が約４ＭＤａであり、長さが約１μｍであり、そのＮ末端がＺ板に固定されており、そのＣ末端が筋節長さの半分を乗り越えてＭ線に到達する。電子顕微鏡画像や遺伝子配列分析によると、ｔｉｔｉｎ分子は３００以上の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ、Ｉｇを略称）とフィブロネクチンＩＩＩ（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ、ＦＮ−ＩＩＩを略称）様ドメイン、およびその他のドメイン（例えばＰＥＶＫドメイン）などで構成されている。
【０００９】
Ｚ板で、ｔｉｔｉｎのＮ末端が多くのタンパク質の分子と相互作用することができ、これらの相互作用は構造上で筋原繊維の機能を支持することができる。これらのタンパク質の分子の中でＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎという特別な分子があり、２つのｔｉｔｉｎ分子のＮ末端を非共有結合でつなぐことができる。
【００１０】
結晶構造解析によると、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  Ｎ末端（ＴｅＮ）の偽対称構造（ｐｓｅｕｄｏｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が水素結合などの非共有結合を介してｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を逆平行で接続し、独特のβ―プリーツシート構造を構成し、このような構造類型は以前の研究にはタンパク質−ＤＮＡ複合体のみで発見される（Ｚｏｕ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１２  Ｊａｎ．２００６，４３９：２２９−２３３）。このような架橋は新規なリガンドとレセプターとの相互作用の方式を代表している。伝統的なリガンドとレセプターとの相互作用はリガンド分子がレセプター分子の結合ドメインに挿入されているが、ＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎとＺ１Ｚ２との相互作用はリガンド分子ＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎのＮ末端がβ―プリーツシートの架橋作用で２つのｔｉｔｉｎ分子のＮ末端（Ｚ１Ｚ２）を結合することになる。このような相互作用はｔｉｔｉｎのＮ末端の安定に非常に重要な役割を果たす。
【００１１】
研究で、このｔｉｔｉｎ-Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  β―プリーツシート構造を含む複合体をＺ１Ｚ２／Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ複合体と呼ぶ。Ｓｔｅｅｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＳＭＤ）シミュレーションによると、このＺ１Ｚ２  ／Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ複合体が耐える機械力は単独のＺ１Ｚ２分子（Ｌｅｅ  ＥＨ，  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍａｒ．２００６，１４（３）：４９７−５０９）をはるかに超えている。単分子機械力の試験によると、Ｚ１Ｚ２／Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ複合体が７００  ｐＮ（Ｂｅｒｔｚ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１１  Ａｕｇ．２００９，１０６（３２）：１３３０７−１３３３１０）の張力に耐え、現在の知られているタンパク質分子や複合体に耐えられる張力を超えているため、Ｚ１Ｚ２／Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ複合体は非常に安定した構造である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｚ１Ｚ２／Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ複合体という独特の構造について、すでに一定の研究が進展しているが、このような構造が各方面での使用はまだ報道されていなく、このような構造を持つ複合体が薬物担体としての適用性に関する研究は今までも触れていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はＴｉｔｉｎ-Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  β―プリーツシート構造に基づくポリペプチド複合体のポリペプチドまたはタンパク質薬物担体としての使用であって、前記ポリペプチド複合体は、（ｉ）ｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチド、その同質物（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、類似体または誘導体であるポリペプチドＡと、（ｉｉ）Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体であるポリペプチドＢと、を含み、前記ポリペプチドＢは前記２つのポリペプチドＡを結合してβ―プリーツシート構造を構成する。
【００１４】
さらに、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を含む断片、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体であり、前記ポリペプチドＢは前記２つのポリペプチドＡを結合してβ―プリーツシート構造を構成する。
【００１５】
ある形態では、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有し、好ましくは、少なくとも７０％相同性を有し、より好ましくは、少なくとも８０％相同性を有し、また好ましくは、少なくとも９０％相同性を有し、さらに好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片であり、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同性を有し、好ましくは、少なくとも７０％相同性を有し、より好ましくは、少なくとも８０％相同性を有し、また好ましくは、少なくとも９０％相同性を有し、さらに好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同性を有する配列を含むポリペプチド断片である。
【００１６】
ある形態では、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列に０〜３６個の任意の数値、好ましくは、０〜２０個の任意の数値、より好ましくは０〜１０個の任意の数値、最も好ましくは、０、１、２、３、４、５、６個のアミノ酸殘基を連続的または間欠的に欠失、置換または挿入したポリペプチドの１つを含み、前記ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列に０〜３６個の任意の数値、好ましくは、０〜２０個の任意の数値、より好ましくは０〜１０個の任意の数値、最も好ましくは、０、１、２、３、４、５、６、７、８個のアミノ酸殘基を連続的または間欠的に欠失、置換または挿入したポリペプチドの１つを含む。
【００１７】
さらに、前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢはＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６、ＭＢＰ、Ｆｌａｇ、Ｈａｌｏ、ＣＢＤ、Ｓｔｒｅｐの１つまたは複数から選ばれるタンパク質精製識別配列を含み、または接続してもよい。
【００１８】
さらに、前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢは、前記ポリペプチド複合体のβ−プリーツシート構造を破壊しないように、外因のアミノ酸配列をポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢのアミノ酸配列に挿入するための一段または多段のタンパク質スペーサまたはリンカー配列（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、または接続してもよい。
【００１９】
さらに、前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢは、酵素切断部位、調節配列、および／またはその他非序列の共有結合方式を含んでよい。
【００２０】
好ましくは、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を有するものであり、ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するもの、またはそのＣｙｓをＳｅｒに突然変異する変異体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列）を有するものである。
【００２１】
また好ましくは、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の２７〜２２１位に示すアミノ酸配列を有するものであり、ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の２７〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するもの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の２７〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するものである。
【００２２】
より好ましくは、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の２５〜２２１位に示すアミノ酸配列を有するものであり、ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中の２５〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するもの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の２５〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するものである。
【００２３】
最も好ましくは、前記ポリペプチド複合体で、前記ポリペプチドＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有するものであり、ポリペプチドＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有するもの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有するものである。
【００２４】
さらに、前記ポリペプチド複合体は、前記ポリペプチドＡをコードする核酸配列Ａと、前記ポリペプチドＢをコードする核酸配列Ｂと、を含み、前記核酸配列Ａは下記の一種の核酸配列またはその変異体から選ばれるものであり、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の３１〜２２１位に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体をコードする核酸配列、（ｂ）核酸配列：（ａ）と相補的な核酸配列、（ｃ）核酸配列：（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも７０％相同性を有する核酸配列、前記核酸配列Ｂは下記の一種の核酸配列またはその変異体から選ばれるものであり、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３０〜１１６位またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の３０〜１１６位に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、その保守的変異体、生物活性断片または誘導体をコードする核酸配列、（ｅ）核酸配列：（ｄ）と相補的な核酸配列、（ｆ）核酸配列：（ｄ）または（ｅ）に対して少なくとも７０％相同性を有する核酸配列、前記核酸配列ＢがコードするポリペプチドＢは前記核酸配列Ａがコードする２つのポリペプチドＡを結合してβ―プリーツシート構造を構成する。
【００２５】
前記ポリペプチドＡをコードする核酸配列Ａおよび前記ポリペプチドＢをコードする核酸配列Ｂは、それぞれ、構築対象の発現担体の生体のコドンバイアスにより設計される核酸配列であり、例えば、原核生物大腸菌バイアスのコドンにより設計された、前記ポリペプチドＡおよびポリペプチドＢをそれぞれコードする核酸配列である。
【００２６】
前記ポリペプチドＡをコードする核酸配列Ａは、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５中の９１〜６６３位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、また好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５中の７９〜６６３位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５中の７３〜６６３位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、最も好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、前記ポリペプチドＢをコードする核酸配列Ｂは、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の８８〜３４８位またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３中の８８〜３４８位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、また好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の７９〜３４８位またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３中の７９〜３４８位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的配列または相補的配列の保守的変異体を有するものであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の７３〜３４８位またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３中の７３〜３４８位のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的序列または相補的序列の保守的変異体を有するものであり、最も好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列、その保守的変異体、相補的配列または相補的配列の保守的変異体を有するものである。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲で使用する次の用語は、別に説明がない限り、下記の一般的な意味を持ち、且つ下記の意味は当業者の知識範囲内にあることが認められる。
【００２８】
「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドやポリヌクレオチドおよびその断片または部分を指し、ゲノムや合成のＤＮＡやＲＮＡを指し、一本鎖または二本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。
【００２９】
「ポリペプチド」はオリゴペプチド、ペプチド、狭義のペプチド（２０個アミノ酸殘基以上のペプチド）やタンパク質配列およびその断片または部分を含み、グリコシル化または非グリコシル化させた、アミノ酸配列の中で1つまたは複数のアミノ酸殘基が修飾されてもよいアミノ酸配列を有するペプチド鎖を指す。そのアミノ酸配列が天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列に関するとき、このような「ポリペプチド」や「タンパク質」はアミノ酸配列をその天然に存在するタンパク質分子に関連する完備なまたは全く同じ天然アミノ酸やその配列に制限することを意味しない。
【００３０】
「同質」は完全同質と一部同質を含み、ポリペプチド、タンパク質やアミノ酸配列を述べるとき、同じあるいは類似の構造や機能を持ち、または類似のアミノ酸配列を持つことを指す。核酸配列を述べるとき、相似性または相補的核酸配列を有することを指す。「同質」は本発明では相対的に広範な意味を含めて、例えば、一定割合の相同性を有する配列（アミノ酸配列や核酸配列）を含み、または配列の変異体を含む。
【００３１】
「類似体」とは、本発明のｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）のポリペプチドＡとＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ−プリーツシート領域のポリペプチドＢの構造、生物学の機能や活性を基本的に保持するポリペプチドを指し、両者の間のβ−プリーツシート構造を基本的に形成すればよい。本発明のポリペプチド「類似体」は、（Ｉ）配列で連続的または間隔的に１つまたは複数のアミノ酸殘基を挿入、欠失、置換し、且つ前記１つまたは複数のアミノ酸殘基の挿入、欠失、置換は同一の配列で同時にまたは非同時に存在するもの、（ＩＩ）配列で１つまたは複数のアミノ酸殘基の基が他の基に置換えられ、または欠失されるもの、（ＩＩＩ）配列で１つまたは複数のアミノ酸殘基が修飾されるものを含む。
【００３２】
「誘導体」は、ポリペプチド、タンパク質やアミノ酸配列を述べるとき、原ポリペプチド、タンパク質やアミノ酸配列から誘導された関連ポリペプチド、タンパク質やアミノ酸配列を指し、本発明のポリペプチド複合体がβ−プリーツシート構造を基本的に形成するとき、下記のような誘導体を含んでよい。例えば、本発明でのポリペプチドＡまたはポリペプチドＢは以下のような誘導体を含み、（ＩＶ）成熟ポリペプチドと別の種類の化合物の融合のもの、あるいは（Ｖ）アミノ酸配列の中に付加のアミノ酸配列（ｌｉｎｋｅｒ、タンパク質精製識別配列、酵素切断部位等）を融合または挿入するもの。核酸配列を述べるとき、原始配列から派生した関連配列を指し、（ＶＩ）配列や遺伝子の中に１つまたは複数の塩基（好ましくは対立遺伝子の置換）を連続的または間隔敵に挿入、欠失、置換し、かつ前記１つまたは複数のアミノ酸殘基の挿入、欠失、置換は同一の配列や遺伝子の中で同時にまたは非同時に存在するもの、（ＶＩＩ）配列や遺伝子の中の１つまたは複数の塩基が修飾されるもの、（ＶＩＩＩ）配列や遺伝子に附加のアミノ酸配列をコードする遺伝子を融合、または挿入するもの。
【００３３】
「保守」とは、かかるアミノ酸配列や核酸配列が原始配列と高い相似性または同一性を持ち、その原始配列の基本的な構造、生物学的活性や機能を維持することができ、一般的に、似たアミノ酸殘基の置換や対立遺伝子（縮退コドン）の置換などにより得ることができ、例えば、リジンとアルギニン、ロイシンとイソロイシンの間の置換などである。
【００３４】
「変異体」とは、１つまたは複数のアミノ酸やヌクレオチドが変更したものを有するアミノ酸配列や核酸配列を指し、前記変更はアミノ酸配列や核酸配列の中のアミノ酸やヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含んでよい。変異体は保守的変更を有してよく、その置換のアミノ酸と原アミノ酸は似たような構造や化学的性質を有し、例えば、ロイシンとイソロイシンの間の置換であり、非保守的変更を有してもよい。本発明では、非保守的変更の変異体も天然アミノ酸配列からなるポリペプチド複合体が有する性質および達成できる効果を達成し、さらに越えることができ、例えば、研究によると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列中のシステインを全てセリンに置換すると、ポリペプチドＢ鎖の中のβ−プリーツシート領域の余分なジスルフィド結合を除去ことができ、本発明のポリペプチド複合体のβ−プリーツシート構造をより安定にする。
【００３５】
「類似性」、「類似」、「相同性」または「同一性」はポリペプチドやタンパク質構造、アミノ酸配列や核酸配列を述べるとき、それに含まれる配列の間が並んで対比するとき、相応位置のアミノ酸殘基やヌクレオチドの相同の程度を指し、百分数で表示することができる。
【００３６】
本発明は上記のポリペプチド複合体の薬物担体としての使用の方法であって、１つまたは複数のポリペプチドやタンパク質類薬物のコード配列を前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢのコード配列の１つまたは複数の適切な部位に挿入、または接続し、融合遺伝子を得て、融合遺伝子を発現システムにこのポリペプチドやタンパク質薬物を含むポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの融合タンパク質を発現させ、そして融合タンパク質をその配位化合物に接触させ、薬用作用を有する融合タンパク質複合体を構成し、前記配位化合物とは、前記融合タンパク質とβ―プリーツシート構造を形成できるポリペプチドＡもしくはポリペプチドＢ、または別のポリペプチドやタンパク質薬物に接続したポリペプチドＡもしくはポリペプチドＢの融合タンパク質を指す。
【００３７】
前記部位は、ポリペプチド複合体でポリペプチドやタンパク質薬物と結合できる領域であり、本発明で、好ましい部位は下記の１６個を含み（図１）、ポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域（ＬＴ１、ＬＴ２）、２つのポリペプチドＡのＮ末端（ＮＺＡ、ＮＺＢ）、Ｃ末端（ＣＺＡ、ＣＺＢ）および８つのｌｏｏｐ領域（ＬＺＡ１、ＬＺＡ２、ＬＺＡ３、ＬＺＡ４、ＬＺＢ１、ＬＺＢ２、ＬＺＢ３、ＬＺＢ４）である。
【００３８】
ポリペプチドやタンパク質薬物は上記の１０個のｌｏｏｐ領域の任意の位置で前記ポリペプチド複合体と結合することができる。
【００３９】
さらに、具体的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡとポリペプチドＢでは、上記の１０個のｌｏｏｐ領域の位置はそれぞれ以下の通りである。
【００４０】
ポリペプチドＢ内部の２つのｌｏｏｐ領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２やＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の第４２〜４３位と第７２〜７３位のアミノ酸配列、
ポリペプチドＡ内部の４つのｌｏｏｐ領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の第５７〜６２位、第１１１〜１１３位、第１４２〜１４７位、第１７０〜１７５位のアミノ酸配列。
【００４１】
前記融合遺伝子は、タンパク質精製識別配列、酵素切断部位、各種フレキシブルや剛直なｌｉｎｋｅｒのコード配列、調節配列などを含む。前記融合遺伝子は、ＰＣＲ、酵素切断、酵素結合、遺伝子組み換え、遺伝子全合成等の方式で得ることができる。前記発現システムは大腸菌発現システム（ｐＥＴシリーズプラスミッドを発現担体として選択することができる）、酵母発現システム（例えばピキア酵母）、昆虫発現システム（例えば家蚕の多角体ウイルス）、哺乳動物発現システムや植物発現システムなどを採用することができ、好ましくは、ｐＥＴシリーズプラスミッドを発現担体とする大腸菌発現システムを採用する。
【００４２】
さらに、前記方法は、融合遺伝子取得後のシークエンシングステップと、融合タンパク質の精製ステップと、を含む。
【００４３】
また、本発明は上記のポリペプチド複合体の薬物担体としての使用の方法であって、いくつかのカップリング試薬を用いてポリペプチドやタンパク質薬物をポリペプチド複合体の１つまたは複数の部位と接続する。例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドやジイソシアネート化合物などの常用カップリング剤を用いて、ポリペプチドやタンパク質類薬物をポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢのＮ末端あるいはＣ末端と接続してから、接続後のポリペプチドをその配位化合物に接触させ、薬用作用を有する融合タンパク質複合体を得、または、遺伝子突然変異の方式でポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの内部に−ＳＨを導入してから、マレイミドなどカップリング剤を用いて、ポリペプチドやタンパク質薬物につなぎ、そして接続後のポリペプチドをその配位化合物に接触させ、薬用作用を有する融合タンパク質複合体を得る。
【００４４】
また、本発明は薬物半減期を延長させる方法であって、ポリペプチド複合体を担体として、前記ポリペプチド複合体は、（ｉ）ｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇ構造ドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体であるポリペプチドＡと、（ｉｉ）Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体であるポリペプチドＢと、を含み、前記ポリペプチドＢは前記２つのポリペプチドＡを結合してβ―プリーツシート構造を構成する。
【００４５】
さらに、前記方法は、１つまたは複数のポリペプチドやタンパク質類薬物のコード配列を前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢのコード配列の１つまたは複数の適切な部位に挿入、または接続し、融合遺伝子を得て、融合遺伝子を発現システムにこのポリペプチドやタンパク質薬物を含むポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの融合タンパク質を発現させ、そして融合タンパク質をその配位化合物に接触させ、薬用作用を有する融合タンパク質複合体を構成し、前記配位化合物とは、前記融合タンパク質とβ―プリーツシート構造を形成できるポリペプチドＡもしくはポリペプチドＢ、または別のポリペプチドやタンパク質薬物に接続したポリペプチドＡもしくはポリペプチドＢの融合タンパク質を指す。
【００４６】
前記部位は、前記ポリペプチド複合体でポリペプチドやタンパク質薬物と結合できる領域であり、本発明で、好ましい部位は下記の１６個を含み（図１）、ポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域（ＬＴ１、ＬＴ２）、２つのポリペプチドＡのＮ末端（ＮＺＡ、ＮＺＢ）、Ｃ末端（ＣＺＡ、ＣＺＢ）および８つのｌｏｏｐ領域（ＬＺＡ１、ＬＺＡ２、ＬＺＡ３、ＬＺＡ４、ＬＺＢ１、ＬＺＢ２、ＬＺＢ３、ＬＺＢ４）である。
【００４７】
さらに、具体的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡとポリペプチドＢでは、上記の１０個のｌｏｏｐ領域の位置はそれぞれ以下の通りである。
【００４８】
ポリペプチドＢ内部の２つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２やＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の第４２〜４３位と第７２〜７３位のアミノ酸配列、
ポリペプチドＡ内部の４つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の第５７〜６２位、第１１１〜１１３位、第１４２〜１４７位、第１７０〜１７５位のアミノ酸配列。
【００４９】
前記融合遺伝子は、タンパク質精製識別配列、酵素切断部位、各種フレキシブルや剛直なｌｉｎｋｅｒのコード配列、調節配列などを含む。前記融合遺伝子は、ＰＣＲ、酵素切断、酵素結合、遺伝子組み換え、遺伝子全合成等の方式で得ることができる。前記発現システムは大腸菌発現システム（ｐＥＴシリーズプラスミッドを発現担体として選択することができる）、酵母発現システム（例えばピキア酵母）、昆虫発現システム（例えば家蚕の多角体ウイルス）、哺乳動物発現システムや植物発現システムなどを採用することができる。
【００５０】
さらに、前記方法は、融合遺伝子取得後のシークエンシングステップと、融合タンパク質の精製ステップと、を含む。
【００５１】
また、本発明は薬用作用を有する融合タンパク質複合体であって、前記融合タンパク質複合体は、ポリペプチドやタンパク質薬物とポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢで構成する融合タンパク質を含み、この融合タンパク質はポリペプチドＡ、ポリペプチドＢまたは別の前記融合タンパク質とβ−プリーツシート構造を形成する。
【００５２】
前記ポリペプチドＡはｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体であり、前記ポリペプチドＢは、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体である。
【００５３】
さらに、前記融合タンパク質で、ポリペプチドやタンパク質薬物がポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の下記部位、即ちポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域（ＬＴ１、ＬＴ２）、２つのポリペプチドＡのＮ末端（ＮＺＡ、ＮＺＢ）、Ｃ末端（ＣＺＡ、ＣＺＢ）および８つのｌｏｏｐ領域（ＬＺＡ１、ＬＺＡ２、ＬＺＡ３、ＬＺＡ４、ＬＺＢ１、ＬＺＢ２、ＬＺＢ３、ＬＺＢ４）に位置する。
【００５４】
さらに、具体的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡとポリペプチドＢでは、上記の１０個のｌｏｏｐ領域の位置はそれぞれ以下の通りである。
【００５５】
ポリペプチドＢ内部の２つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２やＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の第４２〜４３位と第７２〜７３位のアミノ酸配列、
ポリペプチドＡ内部の４つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の第５７〜６２位、第１１１〜１１３位、第１４２〜１４７位、第１７０〜１７５位のアミノ酸配列。
【００５６】
さらに、前記融合タンパク質で、ポリペプチドやタンパク質薬物が１つまたは複数であってよい。
【００５７】
さらに、前記融合タンパク質のコード配列は、タンパク質精製識別配列、酵素切断部位、各種フレキシブルや剛直なｌｉｎｋｅｒのコード配列、調節配列などを含む。
【００５８】
本発明は薬用作用を有する融合タンパク質複合体であって、前記融合タンパク質は、直接的または間接的に順次に接続した第一ポリペプチドＡと、ポリペプチドＢと、第二ポリペプチドＡとを含み、また、任意の前記ポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の部位に挿入、または接続した１つまたは複数のポリペプチドやタンパク質薬物を含み、前記２つのポリペプチドＡとポリペプチドＢがフレキシブルｌｉｎｋｅｒを介してβ―プリーツシート構造を形成する。
【００５９】
前記第一ポリペプチドAおよび/または第二ポリペプチドAは、ｔｉｔｉｎ分子のＮ末端の２つのＩｇ構造ドメイン（Ｚ１Ｚ２）を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体であり、前記ポリペプチドＢは、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ―プリーツシート領域を含むポリペプチド、その同質物、類似体または誘導体である。
【００６０】
さらに、前記融合タンパク質で、ポリペプチドやタンパク質薬物がポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの１つまたは複数の下記部位、即ちポリペプチドＢのＮ末端（ＮＴ）、Ｃ末端（ＣＴ）および内部の２つのｌｏｏｐ領域（ＬＴ１、ＬＴ２）、２つのポリペプチドＡのＮ末端（ＮＺＡ、ＮＺＢ）、Ｃ末端（ＣＺＡ、ＣＺＢ）および８つのｌｏｏｐ領域（ＬＺＡ１、ＬＺＡ２、ＬＺＡ３、ＬＺＡ４、ＬＺＢ１、ＬＺＢ２、ＬＺＢ３、ＬＺＢ４）に位置する。
【００６１】
さらに、具体的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡとポリペプチドＢでは、上記の１０個のｌｏｏｐ領域の位置はそれぞれ以下の通りである。
【００６２】
ポリペプチドＢ内部の２つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２やＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４中の第４２〜４３位と第７２〜７３位のアミノ酸配列、
ポリペプチドＡ内部の４つのｌｏｏｐ領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の第５７〜６２位、第１１１〜１１３位、第１４２〜１４７位、第１７０〜１７５位のアミノ酸配列。
【００６３】
さらに、前記融合タンパク質で、ポリペプチドやタンパク質薬物が１つまたは複数であってよい。
【００６４】
さらに、前記融合タンパク質のコード配列は、タンパク質精製識別配列、酵素切断部位、各種フレキシブルや剛直なｌｉｎｋｅｒのコード配列、調節配列などを含む。
【００６５】
本発明のポリペプチド複合体が担体できる薬物は、ポリペプチド複合体の薬物担体としての使用、方法、薬物半減期を延長させる方法、および薬用作用を有する融合タンパク質複合体のいくつかのテーマに係るポリペプチドやタンパク質薬物を含み、下記の受容体と相互作用できるポリペプチドやタンパク質薬物であってよく、これらの受容体の活性化剤（ａｇｏｎｉｓｔ）または拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）を含み、（ａ）例えば、Ｎアセチルコリン受容体、興奮性アミノ酸受容体などのようなイオンチャネル含有受容体、（ｂ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、（ｃ）例えば、インスリン受容体、上皮成長因子受容体、成長ホルモン受容体、インターフェロン受容体などのような酵素活性受容体、（ｄ）例えば、副腎皮質ホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体などのような核内ホルモン受容体である。
【００６６】
ＧＰＣＲは人体内の最大の膜受容体タンパク質の家族であり、現代薬物では約５０％のペポリプチドやタンパク質がＧＰＣＲを作用標的とする。これらのポリペプチドやタンパク質薬物は特に本発明のポリペプチド複合体を担体とすることに適合し、非限定的な例が以下のいくつのＧＰＣＲの１つまたは複数に対することができ：一、例えば、Ｓａｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（ＳＳＴ）／  Ｇｒｏｗｔｈ（ＧＨ）受容体群、Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ）／  Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨ）／ステロイドホルモン受容体群、ＣＸＣＲ４などのような腫瘍関連ＧＰＣＲ、二、例えば、ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ受容体やＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ受容体、Ｆｏｒｍｙｌポリペプチド受容体などのような免疫システムＧＰＣＲ、三、例えば、ＧＬＰ−１受容体、Ｇｌｕｃａｇｏｎ受容体、ＮＰＹＹ２受容体、Ｃａｎａｂｉｎｏｉｄ受容体ＣＢ１とＣＢ２、Ｇｈｒｅｌｉｎ受容体ＧＨＳ−Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ受容体ＭＣ４およびＧＰＲ３５、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ１０１などのようないくつかのオーファン受容体のような内分泌システムＧＰＣＲのポリペプチドやタンパク質薬物である。
【００６７】
さらに、前記ポリペプチド複合体が担体できる薬物は、改良後のポリペプチドやタンパク質薬物を含み、例えば、薬物活性を維持する条件下で、ポリペプチドやタンパク質薬物のアミノ酸配列またはその核酸配列に対して、１つまたは複数のアミノ酸殘基や塩基を連続的または間隔的に挿入、欠失、置換、修飾を行い、しかも前記１つまたは複数のアミノ酸殘基や塩基の挿入、欠失、置換、修飾は同一の配列または遺伝子の中で同時にまたは非同時に存在することができる。前記改良は本発明の融合タンパク質複合体の製造過程のいずれかのステップで行うことができ、例えば、ポリペプチドやタンパク質薬物とポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの融合タンパク質を製造する前に、ポリペプチドやタンパク質薬物の配列を突然変異させてから、遺伝子融合を行って融合タンパク質をコードする融合遺伝子を得、またはポリペプチドやタンパク質薬物とポリペプチドＡおよび／またはポリペプチドＢの融合タンパク質をコードする融合遺伝子を得てから、融合遺伝子の中のポリペプチドやタンパク質薬物のコード配列部分を突然変異させるなど。
【００６８】
本発明の明細書および特許請求の範囲では、本発明のポリペプチド複合体が薬物担体としての使用以外のテーマに関するとき、例えば、ポリペプチド複合体の薬物担体としての使用の方法、薬物半減期を延長させる方法、薬用作用を有する融合タンパク質複合体、薬用作用を有する融合タンパク質など、かかるポリペプチドＡとポリペプチドＢは、いずれも本発明のポリペプチド複合体が薬物担体としての使用のテーマで検討したポリペプチドＡとポリペプチドＢと同等の意味および範囲を有するので、ここで贅言しない。
【発明の効果】
【００６９】
本発明のポリペプチド複合体はプロティナーゼ加水分解を抵抗することができ、安定性がよく、その分子量の大きさが５０ｋＤａぐらいまたはもっと高くなり、腎臓がそれを迅速に濾過することができず、その起源は人体の筋肉タンパク質であり、４つの免疫グロブリンのサブユニットから構成し、免疫原性が比較的に低く、かつポリペプチド複合体が多くの部位を含んで、これらの部位にペプチドや小分子タンパク質を接入、または挿入すると、複合体の構造および安定性に影響を与えなく、本発明のポリペプチド複合体がポリペプチドやタンパク質薬物の担体とするとともに、ポリペプチドやタンパク質薬物を迅速に設計、改良することができ、新型の薬用作用を有する融合タンパク質複合体を構築し、原来の薬物の活性を維持するとともに、ポリペプチドやタンパク質薬物の半減期を効果的に延長させるため、臨床によりよく使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のポリペプチド複合体結晶構造および薬物接入または挿入の部位の模式図である。Ｚ１ＡとＺ２Ａはそれぞれポリペプチド複合体の１本のポリペプチド鎖上の２つのＩｇドメインを示し、Ｚ１ＢとＺ２Ｂはそれぞれポリペプチド複合体のもう１本のポリペプチド鎖上の２つのＩｇドメインを示す。
【図２】実施例１にＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ（Ａ）とＺ１Ｚ２／ＴｅＮ（Ｂ）が精製した後のＳＤＳとＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥである。
【図３】実施例１に異なる濃度のＧＬＰ−１とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅがＲＩＮｍ５Ｆ細胞を刺激して生成したＣａｍｐである。
【図４】実施例１の活性測定結果図である。（Ａ）２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ、Ｚ１Ｚ２／ＴｅＮとＧＬＰ−１の一回腹腔注射による血糖のコントロール作用を示し、（Ｂ）Ａ試験の曲線下面積（ＡＵＣ）を示し、（Ｃ）２５ｎｍｏｌのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１の一回腹腔注射後、ラット血漿中のインスリン含有量の変化を示し、（Ｄ）２５ｎｍｏｌのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅの一回腹腔注射２４ｈ後、ＯＧＴＴを行うことを示し、（Ｅ）Ｄ試験のＡＵＣを示し、（Ｆ）異なる濃度のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅによる血糖のコントロール作用を示し、（Ｇ）Ｆ試験のＡＵＣを示す。（異なる処理群とＰＢＳ群を比較して、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。）
【図５】実施例１のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１をラットに腹腔注射（Ａ）と静脈注射（Ｂ）した後、ラット血漿中の活性ＧＬＰ−１含有量の経時変化曲線である。
【図６】実施例１による糖尿病マウスの空腹時血糖の長期的なコントロールの影響曲線である。
【図７】実施例２の活性測定結果図である。（Ａ）異なる濃度（１、５、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧがＯＧＴＴ試験を行う結果図を示し、（Ｂ）異なる濃度（１、５、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇがインスリン分泌を刺激する試験結果図を示す。（＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。）
【図８】実施例２に生体内安定性測定試験でＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇをラットに静脈注射した後、血漿中のＧＬＰ−１含有量の変化曲線図である。
【図９】実施例３にＧＬＺ／ＴｅＮ複合体が精製した後のＳＤＳとＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥである。
【図１０】実施例３の活性測定結果図である。（Ａ）１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇの腹腔注射による血糖のコントロール作用を示し、（Ｂ）Ａ試験の曲線下面積（ＡＵＣ）を示し、（Ｃ）１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇの一回腹腔注射後、ラット血漿中のインスリン含有量の変化を示す。（異なる処理群とＰＢＳ群を比較して、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。）
【図１１】実施例３に静脈注射（ｉ．ｖ）と皮下注射（ｓ．ｃ）後のラット血漿中のＧＬＺ／ＴｅＮ複合体の濃度の変化である。
【図１２】実施例３にＧＬＺ／ＴｅＮの一回腹腔注射によるＣ５７ＢＬ／６マウスの摂食量と血糖レベルの影響である。（Ａ）２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇの一回腹腔注射によるマウスの摂食量の抑制を示し、（Ｂ）マウス血糖レベルのコントロール作用を示し、（Ｃ）Ｂ試験のＡＵＣを示す。（異なる処理群とＰＢＳ群を比較して、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、ＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群を比較して、＃＃はｐ＜０．０１を示す。）
【図１３】実施例３にＧＬＺ／ＴｅＮによるＨＦＤおよびＳＴＺ誘導糖尿病モデルマウスの血糖影響曲線である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス体重変化を示し、（Ｂ）ＯＧＴＴ試験結果図を示し、（Ｃ）ＧＬＺ／ＴｅＮによる２型糖尿病モデルマウスの血糖コントロールを示す。（異なる処理群と対照群を比較して、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。）
【図１４】実施例４にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるＧＬＲｅｃｏｍタンパク質精製である。１−誘導前、２−誘導後全細胞、３−誘導後上清液、４と５−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ精製、６−ＴＥＶ酵素切断後の二次Ｎｉ２＋−ＮＴＡ精製、７−Ｑカラム精製である。
【図１５】実施例４の活性測定結果図である。（Ａ）血糖のコントロール作用を示し、（Ｂ）Ａ試験のＡＵＣを示し、（Ｃ）インスリンレベル変化を示す。（異なる処理群とＰＢＳ群を比較して、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。）
【図１６】実施例４に静脈注射後のラット血漿中のＧＬＲｅｃｏｍ濃度の変化である。
【図１７】実施例５にＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ精製後のＳＤＳとＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥである。
【図１８】実施例５に活性測定試験でラット体内の成長ホルモンの含有量の変化曲線図である。
【図１９】実施例５に半減期測定試験でＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅをラットに静脈注射した後、血漿中のＳＳＴ含有量の変化曲線図である。
【図２０】実施例６にＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体によるラットの成長ホルモンの含有量の変化曲線図である。
【図２１】実施例６に静脈注射後のラット血漿中のＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体濃度の変化である。
【図２２】実施例７にＺ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体によるマウスの摂食量の影響である。（Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹとＰＢＳ群を比較して、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。）
【図２３】実施例７に静脈注射後のラット血漿中のＺ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体濃度の変化である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
以下、具体的な実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。下記の実施例で、具体的な条件が記載されていない試験方法について、通常の条件、当業者が知識の範囲内で推知できる条件、あるいはメーカーが提案している条件により行う。下記の実施例の試薬や機器用具は、通常、商用で市販できる製品であり、または他の公開ルートから入手できる製品である。
【実施例】
【００７２】
実施例１  ＧＬＰ−１がポリペプチド複合体でのポリペプチドＢのＮ末端を接続する
ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １）はブドウ糖依存したインスリン促進分泌ペプチドであり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドとＧＬＰ−１（７−３７）の２種類の活性形式がある。ＧＬＰ−１は体内でＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）に属するＧＬＰ−１受容体と結合でき、膵島β細胞のインスリン分泌を促進でき、グルカゴンの分泌を抑制でき、血糖をコントロールでき、２型糖尿病を効果的に治療するポリペプチドホルモンであるが、体内でジペプチジルペプチダーゼＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ、ＤＰＰ−ＩＶ）の分解を受け、その半減期が２ｍｉｎ程度だけで、臨床使用に高剤量の頻繁注射が必要となり、薬物として臨床使用は厳しく制限されている。
【００７３】
試験：
１．担体構築
コードＺ１Ｚ２を有する遺伝子配列（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５中の７３〜６６３位、以下Ｚ配列と略称）と、コードＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  のＮ末端（ＴｅＮ）を有する遺伝子配列（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の７３〜３４８位、以下Ｔ配列と略称）を、ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ酵素切断部位を介して改良後のｐＥＴ２４ｄの担体に（ｐＥＴ２４ｄに６ｘＨｉｓタグとＴＥＶプロテアーゼ酵素切断部位を導入）クローンして、Ｔ配列でのＣｙｓをＳｅｒ（Ｚｏｕ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４  Ｊａｎ  ２００３，２７８（４）：２６３６−２６４４）に突然変異し、ｐＥＴ−Ｚ１Ｚ２（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の通り）とｐＥＴ−ＴｅＮ（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の通り）プラスミッドを得た。
【００７４】
ＰＣＲの方法でＧＬＰ−１（７−３７）をＴ配列のＮ末端に接続し、中間でｌｉｎｋｅｒ（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）により接続する。プライマーＴｅＮ−Ｆ、ＴｅＮ−Ｒを用いてｐＥＴ−ＴｅＮプラスミッドの全長を増幅し、
ＴｅＮ−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ここで、第１〜４８位はｌｉｎｋｅｒコドンであり、
ＴｅＮ−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０。
【００７５】
ＧＬＰ−１全長遺伝子は重複伸長法を用いて増幅し、プライマーはそれぞれＧＬＰ−１−Ｆ、ＧＬＰ−１−Ｒであり、
ＧＬＰ−１−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ここで、５’末端は燐酸化されており、
ＧＬＰ−１−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ここで、５’末端は燐酸化されている。
【００７６】
まず、ＴｅＮ−ＦとＴｅＮ−Ｒを用いて全長かつ（ＧＧＧＧＳ）３付きのｐＥＴ−ＴｅＮを増幅し、そしてＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いてｐＥＴ−ＴｅＮと５’燐酸付きのＧＬＰ−１遺伝子を接続、転化し、モノクローナルを選択してプラスミッドを抽出した後、シークエンシングした。シークエンシング正しいプラスミッドをｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＴｅと名づけて、原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分は以下の（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で、第２５と２６の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第２５〜５５位はＧＬＰ−１アミノ酸配列であり、第５６〜７０位はｌｉｎｋｅｒである。
【００７７】
２．発現
ｐＥＴ−Ｚ１Ｚ２、ｐＥＴ−ＴｅＮとｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＴｅをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに転化し、シングルコロニーをピックアップして６０mｇ／ｍｌカナマイシン含有のＬＢ培地に入れて、３７℃振とうの一晩培養後、１％の接種量で次の１級に切り替え、３７℃で菌液ＯＤ６００が約０．４〜０．６になるまで培養し続けて、最終濃度が１．０ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧに添加して、３０℃で１２ｈ誘導発現した。発現時間が終了後、４℃、５０００ｇ条件で１０ｍｉｎ遠心して、菌体を収集した。
【００７８】
菌体を収集した後、平衡緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて再懸濁して、高圧細胞破砕機（広州聚能生物科技有限公司）を用いて菌体を破砕した後、１４０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心した。
【００７９】
Ｚ１Ｚ２について、上清液をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（あらかじめ平衡緩衝液で平衡した）に吸収して、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０ＡＫＴＡタンパク質精製器を用いてタンパク質に対して、それぞれ洗浄緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて洗浄し、そして溶離緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶離し、溶離液を収集した。
【００８０】
ＴｅＮとＧＬＴｅについて、上清液を捨てて、８Ｍ尿素含有の平衡緩衝液を用いて再懸濁し、１４０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心した後、上清液を吸収して、８Ｍ尿素含有の平衡緩衝液で平衡化したＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに添加し、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０タンパク質精製器を用いてタンパク質に対して、それぞれ洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて洗浄し、そして溶離緩衝液（８Ｍ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶離し、溶離液を収集した。
【００８１】
３．精製
それぞれ等体積のＴｅＮとＧＬＴｅをＺ１Ｚ２に１滴ずつ滴下し、滴下しながら揺れ、最終尿素の濃度が４Ｍになり、そして、混合溶液を透析液Ｉ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）に４ｈ透析して、透析液ＩＩ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に換えて一晩透析した。最終的に、それぞれＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体を形成した。
【００８２】
Ｚ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体に１／５０の体積比でＴＥＶプロティナーゼおよびＴＥＶプロテアーゼ酵素緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し、室温で２ｈ反応した。
【００８３】
ＴＥＶプロテアーゼ酵素で酵素切断した後のＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体をＮｉ２＋−ＮＴＡカラムを通過し、完全に切断されていないまたはいくつかの雑種タンパク質がＮｉ２＋を再結合した。Ｈｉｓ−ｔａｇのないＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体にフロースルーした。
【００８４】
ＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｑイオン交換カラムを用いてＺ１Ｚ２／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅをさらに精製した。Ｚ１Ｚ２／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅをＱイオン交換カラムとそれぞれ結合して、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０タンパク質精製システムを用いてリニア―溶離を行い、それぞれ純度の高いＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体を得た。
【００８５】
４．内毒素の除去
大腸菌で発現したタンパク質に大量の内毒素が含まれ、内毒素は後期の細胞や動物試験に深刻な影響を与えるため、それを除去しなければならない。Ｑイオン交換カラムで精製したＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体を内毒素除去カラム（ＴｏｘｉｎＥｒａｓｅｒＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｎａｎｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）に添加して内毒素を除去し、内毒素検出キット（ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒＴＭ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で内毒素含有量を検出し、最終的に、Ｚ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体中の内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さくなった。
【００８６】
５．ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＬＰ−１Ｒ）の活性化試験
ラットインスリン腫細胞ＲＩＮｍ５Ｆを１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）含有のＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、３７℃で、５％ＣＯ２培養器に培養した。５０００個ＲＩＮｍ５Ｆ細胞を９６ウェル細胞培養プレートに接種し、一晩培養し、血清を含有しないＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄した後、異なる濃度のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体とＧＬＰ−１（血清を含有しない培地で希釈し、１００μＭのＩＢＭＸを添加）をそれぞれＲＩＮｍ５Ｆ細胞と３７℃で２０ｍｉｎ孵化し、そして、細胞を分解し、細胞内ｃＡＭＰの含有量をｃＡＭＰ−ＧｌｏＴＭ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）説明書により測定した。
【００８７】
６．活性測定
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅによるブドウ糖のコントロール作用を確定するために、経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ、ＯＧＴＴ）を行った。２５０ｇぐらいのラットをランダムにＺ１Ｚ２／ＴｅＮ群、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ群、ＧＬＰ−１群とＰＢＳ群の４群（ｎ＝５）に分け、前の３群にそれぞれ体重別に２５ｎｍｏｌ／ｋｇ腹腔注射し、ＰＢＳ群に等体積のＰＢＳを投与し、血糖計で血糖濃度を測定した。３０ｍｉｎ後、１ｋｇ体重ごとに２ｇブドウ糖を胃内投与し、このとき０ｍｉｎと計時し、その後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎで血糖値を測定した。曲線下面積（Ａｒｅａ  ｏｆ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアで計算した。この過程で、それぞれ０、１０、３０ｍｉｎで尾静脈から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取って、Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でそのインスリン含有量を測定した。
【００８８】
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ濃度と血糖コントロールの関係をさらに確定するために、異なる濃度のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅのＯＧＴＴ試験を行った。２５０ｇぐらいのＳＤラットをランダムに１ｎｍｏｌ／ｋｇ群、５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ群とＰＢＳ群の４群（ｎ＝５）に分け、上述の濃度線量のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＰＢＳを腹腔注射でそれぞれラットの体内に注入して、３０ｍｉｎ後に１ｋｇ体重ごとに２ｇのブドウ糖を胃内投与し、このとき０ｍｉｎと計時し、その後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎにて血糖計で血糖値を測定し、それぞれＡＵＣを計算した。
【００８９】
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅがどれくらいの時間内で血糖コントロールの作用を発揮するかを確定するために、薬物の腹腔注射２４ｈ後にＳＤラットに対してＯＧＴＴを行った。正常に摂食したラットをランダムにＰＢＳ群とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ群の２群（ｎ＝５）に分けた。Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ群は、２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅをラットの体内に腹腔注射し、もう１群は等体積のＰＢＳを注射した。１２ｈ自由に摂食した後、１２ｈ欠食してＯＧＴＴを行った。
【００９０】
７．体内安定性測定
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１はそれぞれ腹腔（４ｎｍｏｌ）と静脈（１ｎｍｏｌ）でＳＤラットの体内に注入し、そしてそれぞれ０、０．５、１、１．５、２、４、６、１０ｈで尾から採血して、ＥＤＴＡ−Ｎａ２で処理したＥｐ管に滴下し、採血後にすぐに（３０ｓ以内）ＤＰＰ−４抑制剤を添加した。サンプルでの活性ＧＬＰ−１濃度をＡｃｔｉｖｅ  ＧＬＰ−１  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【００９１】
８．糖尿病マウスに対する血糖と摂食のコントロール
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を４５ｍｇ／ｋｇ体重別にＫＭマウスに腹腔注射し、５ｄ連続注射してから、正常に１０ｄ給餌した。そして、一晩欠食（１２〜１６ｈ）した後、血糖値を測定し、空腹時血糖値＞１１．１ｍＭを糖尿病のモデルと判断できる。試験は正常群（即ち、非糖尿病モデル群）、糖尿病マウス対照群（ＰＢＳ注射）と糖尿病マウス試験群（Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ注射）の３群に分け、１群が６匹で、３かご分けて飼育した。試験群では、毎日午前９時、体重で２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅを腹腔注射するが、対照群と正常群では、それぞれＰＢＳを腹腔注射した。４ｄごとに一晩欠食（１２〜１６ｈ）し、第４ｄで空腹時血糖値を測定した。
【００９２】
結果と分析：
１．Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ発現精製
図２から分かるように、一連の精製後、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅはＳＤＳ−ＰＡＧＥ図でＺ１Ｚ２（上）とＧＬＴｅ（下）の２本の非常に純粋なストライプを示し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ図でＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体である１本の非常に純粋なストライプを示した。これは、純度の高い、後続試験に用いるＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体を得ることを表明した。
【００９３】
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ複合体が内毒素除去カラムで処理された後、その内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌの範囲内に制御され、後続の細胞や動物試験を行うことができる。
【００９４】
２．活性化ＧＬＰ−１Ｒ試験
ＧＬＰ−１Ｒは細胞表面発現のＧタンパク質共役受容体であり、ＧＬＰ−１は細胞表面発現のＧＬＰ−１Ｒと結合することで、下流の信号経路を活性化にして、ｃＡＭＰを生成することができる。生成したｃＡＭＰの量により、受容体との結合状況を反映することができる。その結果、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１はいずれもＧＬＰ−１Ｒと結合することができ、しかも濃度依存の方式でｃＡＭＰの生成を刺激することができる。Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１のＥＣ５０値はそれぞれ０．３５±０．０５ｎＭと０．２４±０．０３ｎＭ（図３）である。これは、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅがＧＬＰ−１Ｒと結合でき、かつＧＬＰ−１Ｒを強力に活性化でき、ＧＬＰ−１Ｒの興奮剤の一種であることを表明した。
【００９５】
３．活性測定
ＧＬＰ−１は体内で膵島β細胞のインスリン分泌を促進でき、グルカゴンの分泌を抑制でき、血糖をコントロールすることができる。その結果、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅはラット血糖を著しく下げることができる。ブドウ糖を経口摂取したとき、血糖含有量が急激に上がり、ＧＬＰ−１とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅが血糖値を著しく下げることができるが、ＧＬＰ−１は３０ｍｉｎだけで効果を発揮して、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅは全体の１２０  ｍｉｎ以内で血糖を効果的にコントロールすることができる（図４Ａ、Ｂ）。インスリンの生成から見れば、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅとＧＬＰ−１はいずれも血液中のインスリン含有量を著しく増えるため、血糖値を下げる作用を効果的に発揮することができる（図４Ｃ）。
【００９６】
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅによる血糖コントロールの能力は濃度依存性を持ち、濃度の上昇につれて増加し、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅの注射量が１ｎｍｏｌ／ｋｇであるとき、血糖値を著しく下げることができ、注射量が２５ｎｍｏｌ／ｋｇであるとき、その血糖上昇の抑制能力が最大となる（図４Ｆ、Ｇ）。
【００９７】
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅを腹腔注射した２４ｈ後、ＯＧＴＴを行い、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅが６０ｍｉｎ内で血糖をコントロールでき、その２４ｈ後にＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅがまだ血液中に存在し、しかもその濃度が作用を発揮することできることを表明した（図４Ｄ、Ｅ）。
【００９８】
４．体内安定性測定
試験データによると、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅは腹腔注射（図５Ａ）や静脈注射（図５Ｂ）を問わず、いずれもＧＬＰ−１半減期を著しく延長することができる。Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅを腹腔注射した２ｈ後、血漿中の濃度が最大に達するが、ＧＬＰ−１は０．５ｈに最大に達し、その後、ＧＬＰ−１が急速に低下し、１ｈに測定下限に達し、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅを腹腔注射した２４ｈ後も２００ｐＭ以上の濃度を測定することができる。これは、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅがＧＬＰ−１の安定性を著しく増加し、その半減期を延長させ、その作用を発揮する時間を増加することを表明した。静脈注射後、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ濃度は徐々に低下するが、ＧＬＰ−１は急速に低下し、０．５ｈに検出下限に達する。ＧＬＰ−１の静脈注射の半減期は１〜２ｍｉｎ（Ｋｉｍ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１２，３３４（３）：６８２−６９２）であるが、本試験にＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅは６７±３．３ｍｉｎであり、ＧＬＰ−１半減期を著しく延長した。
【００９９】
５．Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅによる糖尿病マウスの血糖の長期コントロール
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅは原始ＧＬＰ−１と比べてより長い半減期があるが、その活性は弱まっていないので、ＧＬＰ−１よりは長い時間の血糖コントロール能力を持つ。糖尿病マウスの血糖のコントロール試験（図６）から分かるように、毎日、２５ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅを腹腔注射すると、糖尿病マウスの空腹時血糖レベルを効果的に下げることができる。毎日１回の注射で、空腹時血糖レベルを長期間に低い範囲内にコントロールすることができる。注射が停止した（２８ｄ）後、そのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ群の血糖値がまた上昇する。
【０１００】
実施例２  ＧＬＰ−１（８Ｇ）がポリペプチド複合体でのポリペプチドＢのＮ末端を接続する
ＧＬＰ−１（７−３７）はそのアミノ酸配列の前の２つのアミノ酸がＨＡであるため、血液中にＤＰＰ−４の切断作用を受けやすくて活性を失うため、ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列中の第８位アミノ酸をＧｌｙに突然変異することで、ＤＰＰ−４による酵素切断を効果的に抑えることができ、半減期をより長く延長することができる。
【０１０１】
試験：
１．担体構築
下記のプライマーを用いて実施例１での担体ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＴｅを部位特異的突然変異し、ＧＬＰ−１（７−３７）アミノ酸配列中の第８位アミノ酸ＡｌａをＧｌｙに突然変異した。
【０１０２】
８Ａ−Ｇ−Ｆ：  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
ＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣ（下線は突然変異部位）
８Ａ−Ｇ−Ｒ：  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
ＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣ
シークエンシング成功後、ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＴｅ−Ｇと名付けて、原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列の部分は以下ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で、第２５〜２６位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第２５〜５５位はＧＬＰ−１アミノ酸配列であり、第５６〜７０位はｌｉｎｋｅｒであり、第２６位は突然変異したアミノ酸である。
【０１０３】
２．発現、精製、内毒素の除去
実施例１と同じ方法ステップを用いて行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体を得ることができ、他の複合体、例えばＺ１Ｚ２／ＴｅＮ複合体は直接に実施例１での担体やその発現産物や内毒素除去後の産物から得ることができる。
【０１０４】
３．活性測定
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇが血糖を効果的にコントロールできるかどうか、異なる濃度と血糖コントロールの関係を確定するために、異なる濃度のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧのＯＧＴＴ試験を行った。２５０ｇぐらいのＳＤラットをランダムに１ｎｍｏｌ／ｋｇ群、５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ群とＰＢＳ群の４群（ｎ＝５）に分け、上述の濃度剤量のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧとＰＢＳを腹腔注射でそれぞれラットの体内に注入して、３０ｍｉｎ後に１ｋｇ体重ごとに２ｇのブドウ糖を胃内に投与し、このとき０  ｍｉｎと計時し、その後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎにて血糖計で血糖値を測定した。
【０１０５】
各群のＯＧＴＴ試験中で、１０〜３０ｍｉｎでそれぞれラット尾静脈から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有のＥｐ管に滴下し、血漿を取って、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でインスリン含有量を測定した。
【０１０６】
４．体内安定性測定
１ｎｍｏｌのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇをラット尾からラット体内に静脈注射し、このとき０ｈと計時し、その後、１、２、４、８、２４ｈで採血し、予めＥＤＴＡ−Ｎａ２で処理したＥｐ管に滴下した。サンプルでの活性ＧＬＰ−１濃度をＧＬＰ−１（Ｔｏｔａｌ）Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０１０７】
結果と分析：
１．活性測定
異なる濃度のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体に対してＯＧＴＴ試験を行い、その用量依存性の血糖値を下げることができる（図７Ａ）。たとえ１ｎｍｏｌ／ｋｇの時でも血糖値を下げる作用を発揮することができ、２５ｎｍｏｌ／ｋｇの時で、血糖値を下げる作用が最も顕著になる。これは、ＧＬＰ−１配列中の第８位アミノ酸ＡをＧに突然変異するとき、その活性は影響を受けず、依然として血糖値を下げる作用を発揮することができることを十分に表明した。
【０１０８】
インスリン分泌試験によると、濃度の増加につれて、インスリン分泌量も増加すると表明している（図７Ｂ）。これは、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体は膵島細胞のインスリン分泌を効果的に刺激することにより、血糖値を下げる作用を発揮することができることを表明した。
【０１０９】
２．体内安定性測定
Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体をＳＤラット体内に静脈注射した後、一定時間ごとに尾から採血して、ＧＬＰ−１（Ｔｏｔａｌ）Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で血漿中のＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇを測定した（図８）。その低下速度が遅いことを発見し、計算により、その半減期は約４ｈで、突然変異前（６７ｍｉｎ）の４倍にもなり、原ＧＬＰ−１（１〜２ｍｉｎ）の約２００倍であり、その半減期が大幅に延長され、よりよい臨床使用に基礎を打ち立った。
【０１１０】
実施例３  ＧＬＰ−１（８Ｇ）がポリペプチド複合体でのポリペプチドＡのＮ末端を接続する
試験：
１．担体構築
遺伝子全合成の方式を採用して、ＧＬＰ−１（８Ｇ）のコード配列をコードＺ１Ｚ２を持つ遺伝子配列のＮ末端に接続し、改良後のｐＥＴ２４ｄ担体に構築し、ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＺと名付ける（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分は以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で、第２４〜２５位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第２５〜５５位はＧＬＰ−１（８Ｇ）アミノ酸配列であり、第５６〜６６位はｌｉｎｋｅｒであり、第２６位は突然変異したアミノ酸である）。ＧＬＰ−１（８Ｇ）とＺ１Ｚ２との間のＬｉｎｋｅｒはＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫである。
【０１１１】
２．発現、精製、内毒素の除去
実施例１と同じ方法ステップを用いて行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＧＬＺ／ＴｅＮ複合体を得ることができ、他の複合体、例えばＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体は前の実施例から得ることができる。
【０１１２】
３．活性測定
ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体が血糖値を効果的に下げるかどうか、およびＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体と比べて、その活性はどうでしょうか、ＯＧＴＴ試験を行った。
【０１１３】
２５０ｇぐらいのＳＤラットをランダムにＰＢＳ群、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群とＧＬＺ／ＴｅＮ群の３群（ｎ＝５）に分け、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群とＧＬＺ／ＴｅＮ群について、それぞれ体重に１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧとＧＬＺ／ＴｅＮ複合体を腹腔注射し、ＰＢＳ群について、等体積のＰＢＳを投与し、血糖計で血糖濃度を測定し、このとき−３０ｍｉｎと計時し、３０ｍｉｎ後に１ｋｇ体重ごとに２ｇのブドウ糖を胃内投与し、このとき０  ｍｉｎと計時し、その後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎで血糖値を測定した。曲線下面積（Ａｒｅａ  ｏｆ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアで計算した。
【０１１４】
この過程で、それぞれ１０〜３０ｍｉｎの間で尾静脈から採血して、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取って、Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でそのインスリン含有量を測定した。
【０１１５】
４．体内安定性測定
１ｎｍｏｌのＧＬＺ／ＴｅＮをＳＤラット（２５０ｇぐらい）の尾静脈（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ｉ．ｖ）と皮下（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ｓ．ｃ）でラット体内に注入し、このとき０ｈと計時し、それぞれ０．０５、０．５、２、４、８、１１、２４、４８ｈにラット尾静脈から採血し、予めＥＤＴＡ−Ｎａ２で処理したＥｐ管に滴下し、採血後にすぐに（３０ｓ以内）プロティナーゼ抑制剤Ａｐｒｏｔｉｎｉｎを添加し、サンプルでのＧＬＰ−１（８Ｇ）濃度をＧＬＰ−１（Ｔｏｔａｌ）Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０１１６】
５．１回薬物注射による摂食と血糖の影響
２５ｇぐらいのＣ５７ＢＬ／６マウスをランダムにＰＢＳ群、ＧＬＺ／ＴｅＮ群とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群の３群（ｎ＝５）に分け、各マウスごとに１かごであり、各群のマウスを初日夜の７時から翌日の９時まで欠食し、各群のマウスの空腹体重を秤量し、そしてマウスの鼠餌を早めに計量してパケットし、ＧＬＺ／ＴｅＮ群とＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群について、体重別に２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／  ＧＬＴｅ−Ｇ複合体を腹腔注射し、ＰＢＳ群について、等体積のＰＢＳを投与し、このとき０ｈと計時し、薬物注射後、すぐにあらかじめ計量したマウスの鼠餌を与えて、０、２、５、８、２４、３６、４８ｈに鼠餌および血糖値を測定した。
【０１１７】
６．糖尿病マウス血糖レベルへの影響
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６匹の対照群と１５匹の試験群の２群に分け、対照群に正常飼料（Ｓｔａｎｄａｒｄ）を給餌し、試験群に高糖分高脂飼料（ＨＦＤ）（１％コレステロール、２０％蔗糖、１２％ラード、１０％卵黄粉と２％コール酸ナトリウム）を給餌し、飼料は北京軍事医学科学院から購入し、対照群と試験群に対して異なる飼料を２ヶ月給餌し、この間で１５ｄごとに体重を秤量し、空腹１２ｈ後、対照群（６匹）と試験群をそれぞれ２ｇ／ｋｇのブドウ糖を胃内投与し、ＯＧＴＴを行い、異なる時点で血糖値を測定し、インスリン抵抗効果を測定し、インスリン抵抗効果があったと、また小剤量で連続５ｄにＳＴＺ誘導型糖尿病モデルを注射し、引き続き給餌７ｄ後、血糖値を測定して、空腹時血糖値＞１１．１ｍＭになるとモデル成功と考えられる。試験群からモデル成功の１２匹マウスをランダムにＧＬＺ／ＴｅＮ群とＰＢＳ群の２群に分け、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＺ／ＴｅＮ複合体或いは同量のＰＢＳを毎日１回腹腔注射し、血糖値を測定した。
【０１１８】
結果と分析：
１．発現、精製、内毒素の除去
ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＺとｐＥＴ−ＴｅＮプラスミッドをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化して発現させ、ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体を形成し、かつ系列操作を経て、純度の高いＧＬＺ／ＴｅＮ複合体を得た。
【０１１９】
サンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥとＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析したと、サンプル中のタンパク質がＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで１本の高純度のストライプを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと２本の高純度のストライプを示し、このサンプルがＧＬＺ／ＴｅＮ複合体であることを表明した（図９）。最後に、内毒素を除去した後、最終的に高純度のＧＬＺ／ＴｅＮタンパク質複合体を得、後続の動物試験に使うことができる。
【０１２０】
２．活性測定
ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体がＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇより強い活性を持つかどうかか、ＯＧＴＴで直接に対比することができる。ＯＧＴＴ試験結果によると、腹腔注射濃度が１０ｎｍｏｌ／ｋｇであるとき、ＧＬＺ／ＴｅＮの活性がＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇより著しく高くなる。ＳＤラットにブドウ糖を胃内投与するとき、ＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群が明らかに血糖値を下げ、ＧＬＺ／ＴｅＮがＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇより高い活性を持ち、血糖を下げる能力が高く、３０ｍｉｎ時にその最高血糖値がそれぞれ８．３と５．７ｍＭである（図１０Ａ）。ＡＵＣデータからわかるように、ＧＬＺ／ＴｅＮとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体はいずれもＡＵＣを非常に顕著に下げることができ（図１０Ｂ）、ＧＬＺ／ＴｅＮがＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇより強い抑制力を持つ。
【０１２１】
ＯＧＴＴを行う過程中で、尾静脈から採血して、血漿中のインスリン含有量の変化をインシュリンＥＬＩＳＡキットで測定した。結果により、ＧＬＺ／ＴｅＮおよびＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇを腹腔注射した後、いずれもインスリン分泌を顕著に刺激することができる（図１０Ｃ）。
【０１２２】
３．体内安定性測定
ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体が皮下（ｓ．ｃ）や静脈（ｉ．ｖ）でＳＤラットに注射された後、ＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡキットで血漿中のＧＬＰ−１含有量を測定した。その含有量の低下が遅いことを発見し、計算により、皮下注射の半減期は１９．８±３．２ｈであり、静脈注射の半減期は１８．７±２．３ｈである（図１１）。その静脈注射の半減期はＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体（４ｈ）の４倍でもあり、さらに向上した。これは、ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体に２つのＧＬＰ−１分子があり、その分子量をさらに増えて、腎臓の濾過作用を緩め、しかもそれとＧＬＰ−１Ｒの結合の親和性がより大きくなり、その半減期が長くなるためである。
【０１２３】
４．摂食と血糖への影響
１回で体重別に薬物を腹腔注射した後、結果によると、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧおよびＧＬＺ／ＴｅＮ複合体はいずれも８ｈ内でマウスの摂食量を著しく抑えることができ、２４ｈ後、抑制作用が消失するが、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群がＧＬＺ／ＴｅＮ群と比べ、明らかな差異がない（図１２Ａ）。
【０１２４】
血糖レベル測定によると、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧおよびＧＬＺ／ＴｅＮ複合体はいずれもマウス血糖値を著しく下げることができるが、時間の延長、複合体の分解につれて、濃度は次第に低下し、マウスの血糖値が次第に高まって、４８ｈに対照レベルまで回復した。Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群が２〜８ｈ内で血糖値レベルを著しく下げることができ、２４ｈに血糖値を下げることができるが、対照と比べ、明らかな差異がない。ＧＬＺ／ＴｅＮ組が３６ｈ内で血糖値レベルを著しく下げるが、４８ｈに対照レベルまで回復し、ＧＬＺ／ＴｅＮ群はＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群より２〜５ｈ内で血糖レベルがより低くなる（図１２Ｂ）。ＡＵＣデータによると、ＧＬＺ／ＴｅＮがＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体より、より強いマウス血糖値を下げる能力を持つことを直感的に表明した（図１２Ｃ）。
【０１２５】
５．糖尿病マウス血糖レベルへの影響
ＨＦＤ飼料で２ヶ月連続給餌すると、体重から分かるように（図１３Ａ）、マウスの体重は２ヶ月内で正常飼料給餌の対照群より明らかに増えた。
【０１２６】
試験群はインスリン抵抗効果があるかどうかを確定するために、対照群と試験群に対してＯＧＴＴ（図１３Ｂ）を行った結果、試験群（ＨＦＤ）は明らかなインスリン抵抗効果があり、１５〜３０ｍｉｎ時にＨＦＤマウスが正常給餌のマウスの血糖値より明らかに高くなり、それは、ＨＦＤ飼料給餌により、インスリン抵抗効果があり、血糖値を下げる作用は明らかに弱まるためである。
【０１２７】
インスリン抵抗効果が現れた後、２型糖尿病モデルを成功に誘導し、ＧＬＺ／ＴｅＮ複合体が２型糖尿病モデルマウスの非空腹時血糖値を正常マウスの非空腹時血糖値まで顕著に下げることができ、約６〜９ｍＭである（図１３Ｃ）。
【０１２８】
実施例４  ポリペプチド複合物ＧＬＰ−１（８Ｇ）の担体をワンステップ組換えする
試験：
１．担体構築
まず、遺伝子全合成の方式でＧＬＰ−１（８Ｇ）のコード配列を（Ｇ４Ｓ）３ｌｉｎｋｅｒのコード配列によりＺ１Ｚ２を持つコード配列のＮ末端に接続し、改良後のｐＥＴ２４ｄ担体に構築して、ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＺ−ｓｙｎと名付ける。そして、プライマーを設計することにより、それぞれｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＺ−ｓｙｎ、ｐＥＴ−ＴｅＮ、ｐＥＴ−Ｚ１Ｚ２をテンプレートとして新しい発現担体を構築し、そのＮ末端がＧＬＰ−１（８Ｇ）付きのＺ１Ｚ２、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ分子のＮ末端のβ−プリーツシート領域およびＺ１Ｚ２分子の間をｌｉｎｋｅｒで接続し、１つの大きい融合タンパク質をワンステップ発現して形成することができる。
【０１２９】
ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＺ−Ｓｙｎを担体として、Ｒｅｃ−Ｔｉ−Ｆ１／Ｒｅｃ−Ｔｉ−Ｒ１をプライマーとして、ＰＣＲを行い、ｐＥＴ−２４ｄ−Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎを担体として、Ｒｅｃ−Ｔｅ−Ｆ／Ｒｅｃ−Ｔｅ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲを行い、ｐＥＴ−２４ｄ−Ｚ１Ｚをプライマーとして、Ｒｅｃ−Ｔｉ−Ｆ２／  Ｒｅｃ−Ｔｉ−Ｒ２をプライマーとして、ＰＣＲを行い、そしてそれぞれのゲルを回収した後、５０μｌ反応体系（５＊Ｔｒａｎｓｔａｒｔ  Ｆａｓｔｐｆｕ  Ｂｕｆｆｅｒ，１０  μｌ；２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ，５  μｌ；Ｔｒａｎｓｔａｒｔ  Ｆａｓｔｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１μｌ；ｄｄＨ２０，２７μｌ  ）に５０ｎｇ（各１μｌ）上記ゲル回収産物を添加し、プライマーＲｅｃ−Ｔｉ−Ｆ１／Ｒｅｃ−Ｔｉ−Ｒ２（濃度１０μＭ、各２μｌ）を添加して、ＰＣＲを行い、ゲル回収後に酵素切断と酵素結合により、改良後のｐＥＴ２４ｄ担体に接入し、転化、シークエンシングした後、シークエンシング正しいプラスミッドをｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＲｅｃｏｍ（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分は以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で、第２５〜２６位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第２５〜５５位はＧＬＰ−１（８Ｇ）アミノ酸配列であり、第５６〜７０位、２６７〜２９１位、３８２〜４０６位はそれぞれｌｉｎｋｅｒであり、第２６位は突然変異したアミノ酸である。）と名付ける。各プライマーのヌクレオチド配列は下記の表１の通りである。
【０１３０】
【表１】
0006612360.tif 000002
【０１３１】
また、遺伝子全合成の方式で、上記のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を有する配列を直接に得、改良後のｐＥＴ２４ｄ担体に構築し、上記のｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＲｅｃｏｍと名付けるプラスミッドを得、担体構築ステップを簡略化することができる。
【０１３２】
２．発現、精製、内毒素の除去
ｐＥＴ−２４ｄ−ＧＬＲｅｃｏｍプラスミッドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に転化し、１ｍＭ  ＩＴＧの誘導下で、１６℃振とうに２４ｈ発現し、ＧＬＲｅｃｏｍタンパク質が上清液に発現させ、後でＴＥＶ酵素切断、二次Ｎｉカラム、Ｑカラム精製などの過程を経て、純度の高いＧＬＲｅｃｏｍタンパク質を得、そして、実施例１と同じ方法ステップを用いて内毒素の除去を行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＧＬＲｅｃｏｍタンパク質を得た。
【０１３３】
３．活性測定
ＧＬＲｅｃｏｍが血糖値を効果的に下げるかどうか、およびＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇと比べて、その活性はどうでしょうか、ＯＧＴＴ試験を行った。
【０１３４】
２５ｇぐらいのＣ５７ＢＬ／６匹マウスをランダムにＰＢＳ群、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群とＧＬＲｅｃｏｍ群の３群（ｎ＝５）に分け、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ群とＧＬＲｅｃｏｍ群について、それぞれ体重別に１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−ＧとＧＬＲｅｃｏｍを腹腔注射し、ＰＢＳ群について、等体積のＰＢＳを投与し、血糖計で血糖濃度を測定し、このとき−３０ｍｉｎと計時し、３０ｍｉｎ後に１ｋｇ体重ごとに２ｇのブドウ糖を胃内投与し、このとき０ｍｉｎと計時し、その後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎで血糖値を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアでＡＵＣを計算した。
【０１３５】
この過程で、それぞれ１０−３０ｍｉｎの間で尾静脈から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取って、Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でそのインスリン含有量を測定した。
【０１３６】
４．体内安定性測定
２．８ｎｍｏｌ  ＧＬＲｅｃｏｍをＳＤラット（２５０ｇぐらい）の尾静脈（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ｉ．ｖ）でラット体内に注入し、このとき０ｈと計時し、それぞれ０．０５、０．５、２、５、１０、２４、４８ｈにラット尾静脈から採血し、予めＥＤＴＡ−Ｎａ２で処理した遠心管に滴下し、採血後、すぐに（３０ｓ以内）プロティナーゼ抑制剤Ａｐｒｏｔｉｎｉｎを添加し、サンプルでのＧＬＰ−１（８Ｇ）濃度をＧＬＰ−１（Ｔｏｔａｌ）Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０１３７】
結果と分析：
１．発現、精製、内毒素の除去
ＧＬＲｅｃｏｍタンパク質で、ＧＬＰ−１（８Ｇ）付きの一番目のＺ１Ｚ２分子とＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎβ−プリーツシート領域の間にＳＧＳＧＳＡＰＧＴＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳをｌｉｎｋｅｒとして設計し、Ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎβ−プリーツシート領域と二番目のＺ１Ｚ２分子の間にＧＡＳＧＰＡＧＳＰＴＧＳＧＰＧＳＡＧＳＧＰＧＳＡＧをｌｉｎｋｅｒとして設計し、組換えタンパク質を形成し、発現、精製ステップの減少に有利するため、精製に必要な時間やコストを減らすことができる。ＧＬＲｅｃｏｍタンパク質は一連の精製過程を経た後、分子量が６０．０  ｋＤａのタンパク質を得（図１４）、上清液に発現させ、操作は簡単で、しかも純度の高いタンパク質を得やすい。
【０１３８】
２．活性測定
ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体にいずれも１つのＧＬＰ−１分子が含まれ、そのＧＬＰ−１分子中のＮ末端のＡｌａがＧｌｙに置換される。ＯＧＴＴ結果によると、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体はいずれも血糖値を著しく下げる作用がある。マウスに２ｇ／ｋｇブドウ糖を投与した後、ＰＢＳ群のマウスの血糖値が急速に上昇するが、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体群はＰＢＳ群より顕著に低下する。１２０ｍｉｎになると、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体群も血糖値レベルを著しく下げることができる（図１５Ａ）。ＡＵＣデータによると、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体群がマウスの血糖レベルを顕著に下げ、マウスの経口ブドウ糖耐性を増加させることを直感的に表明し（図１５Ｂ）、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体が血糖値レベルを下げる点で差異がない原因は、その構造中に１つだけのＧＬＰ−１分子がある可能である。
【０１３９】
インスリン分泌試験によると、薬物注射後、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体がマウスのインスリン分泌レベルを著しく増強することができるが、ＧＬＲｅｃｏｍとＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体がインスリン分泌を刺激する点で明らかな差異がない（図１５Ｃ）。
【０１４０】
３．体内安定性測定
ＧＬＲｅｃｏｍタンパク質が血液中に長い半減期を有し、濃度の低下が遅くて（図１６）、その半減期を計算すると、１３．４±０．８ｈであり、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇ複合体（４ｈ）の３倍以上でもある。これは、ＧＬＲｅｃｏｍが大きな分子量（６０．０ｋＤａ）を有するが、Ｚ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇの分子量が５６．７ｋＤａであり、または、ＧＬＲｅｃｏｍタンパク質中の分子間のｌｉｎｋｅｒがフレキシブルの非常に高いＬｏｏｐを形成するためであり、コンパクトなＺ１Ｚ２／ＧＬＴｅ−Ｇに対して、これらのｌｉｎｋｅｒはＧＬＲｅｃｏｍの体積を増え、プロティナーゼの分解をより阻止し、腎臓による濾過作用をより緩め、その半減期を延長することができる。
【０１４１】
実施例５  ＳＳＴがポリペプチド複合体でのポリペプチドＢのｌｏｏｐ領域を接続する
ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，ＳＳＴ）は環状ポリペプチドであり、中枢神経系、末梢神経系や胃腸の中で広く分布され、成長ホルモンの分泌と放出を著しく抑制することができ、膵臓ホルモン、胃泌素などの分泌を抑制することもできる。ＳＳＴがインスリンやグルカゴンの分泌をコントロールすることができる。ＳＳＴはＳＳＴ１４とＳＳＴ２８の２つの活性形式がある。ＳＳＴはＧＰＣＲｓに属するＳＳＴ受容体と結合して、下流の通路を活性化する。主に末端肥大症、肝硬変門脈高圧による食道静脈出血、急性膵炎およびその合併症、並びに膵液瘻、胆汁瘻および腸瘻などを治療する。しかし、その体内の半減期は２−３ｍｉｎ（Ａｆａｒｇａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２００１，１４２（１）：４７７−４８６）だけで、その臨床使用は厳しく制限されている。
【０１４２】
試験：
１．担体構築
遺伝子全合成の方式で、それぞれＳＳＴ遺伝子をＴｅＮ突然変異体Ｌｏｏｐ（ＬＴ１）中の遺伝子配列に挿入する担体ｐＥＴ−２４ｄ−ＳＳＴｅ（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で、第２５〜２６位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第４３〜５４位はＧＬＰ−１アミノ酸配列であり、第５７〜５８位はｌｉｎｋｅｒである。）を得た。
【０１４３】
２．発現、精製、内毒素の除去
実施例１と同じ方法ステップを用いて行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体を得ることができる。
【０１４４】
３．活性測定
２５０ｇぐらいのＳＤラットを１２〜１６ｈ欠食した後、ランダムに３群分け、２群は試験群であり、体重別に２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＳＳＴとＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体を腹腔注射し、もう１群は等体積のＰＢＳを注射した。０、３０、６０、１２０ｍｉｎ時にそれぞれ尾から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取った。上清液での成長ホルモンの濃度をＧｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）キットで測定した。
【０１４５】
４．体内安定性測定
Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ  ０．２８ｍｇを尾静脈からラットの体内に注入し、それぞれ０、０．５、１、２、４、８、２４ｈで尾静脈から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取った。上清液でのＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ中のＳＳＴをＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  （ＳＳＴ）  ＥＩＡ  ｋｉｔ  （Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で測定した。
【０１４６】
結果と分析：
１．発現、精製、内毒素の除去
図１７から分かるように、一連の精製後、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅはＳＤＳ−ＰＡＧＥ図で２本の非常に純粋なストライプを示すが、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ図でＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体である１本の非常に純粋なストライプを表しました。これは、純度の高い、後続試験に用いるＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体を得ることを表明した。
【０１４７】
Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体の内毒素は内毒素除去樹脂で処理された後、含有量を２ＥＵ／ｍｌの範囲内で制御し、後続の試験に使うことができる。
【０１４８】
２．活性測定
ＳＳＴが体内で成長ホルモンの分泌を抑えることができるので、ラット体内の成長ホルモンの含有量を測定することにより、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体の活性を検証することができる。Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体がラット体内に注入された後、ラット成長ホルモンのレベルを著しく抑制した。ＳＳＴおよびＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅがラット体内に注入された後、初期ではいずれも体内成長ホルモンの分泌を明らかに抑制するが、ＳＳＴの半減期（２〜３ｍｉｎ）が短いため、ＳＳＴの分解につれて、その抑制効果を次第に弱め、最後に２ｈで対照レベルまで回復し、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅが１２０ｍｉｎ内で成長ホルモンのレベルを明らかに抑制し、より長い半減期を有することを説明した（図１８）。それは原ＳＳＴと類似する生物学的活性を持ち、かつ成長ホルモンへの抑制作用をより長い期間で発揮することができることを表明した。
【０１４９】
３．体内安定性測定
Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体の静脈注射後、血漿中のＳＳＴ含有量が図１９に示すように、その計算の半減期は６．６２±０．４３ｈであり、原ＳＳＴ（２〜３  ｍｉｎ）より約２００倍に延長した。これは、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体はＳＳＴとその受容体の結合に影響しない場合で、その半減期を大幅に延長して、より長く薬効を発揮させることができることを表明した。
【０１５０】
実施例６  ＳＳＴがポリペプチド複合体でのポリペプチドＡのｌｏｏｐ領域を接続する
試験：
１．担体構築
遺伝子全合成の方式で、それぞれＳＳＴ遺伝子をＺ１Ｚ２分子のＬｏｏｐ中の遺伝子配列に挿入する担体ｐＥＴ−２４ｄ−ＺＳＳＴ（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の配列部分は以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０で、第２４〜２５位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第１７１〜１８４位はＳＳＴアミノ酸配列であり、第１８５〜１８６位はｌｉｎｋｅｒである。）を得た。
【０１５１】
２．発現、精製、内毒素の除去
実施例１と同じ方法ステップを用いて行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体を得ることができる。
【０１５２】
３．活性測定
２５０ｇぐらいのＳＤラットを１２〜１６ｈ欠食した後、ランダムに４群分け、３群は試験群であり、体重別に２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＳＳＴ、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ、ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体を腹腔注射し、もう１群は等体積のＰＢＳを注射した。０、３０、６０、１２０ｍｉｎ時にそれぞれ尾から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取った。上清液での成長ホルモンの濃度をＧｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）キットで測定した。
【０１５３】
４．体内安定性測定
ＺＳＳＴ／ＴｅＮ  ０．２ｍｇを尾静脈からラットの体内に注入し、それぞれ０、０．５、１、２、４、８、２４、４８ｈで尾静脈から採血し、ＥＤＴＡ−Ｎａ２含有の遠心管に添加し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、上清液を取った。上清液でのＺＳＳＴ／ＴｅＮ中のＳＳＴをＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  （ＳＳＴ）  ＥＩＡ  ｋｉｔ  （Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で測定した。
【０１５４】
結果と分析：
１．発現、精製、内毒素の除去
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図で２本の非常に純粋なストライプを示すが、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ図で１本の非常に純粋なストライプを示し、純度の高いＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体を得ることを表明した。ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体の内毒素は内毒素除去樹脂で処理された後、含有量を２ＥＵ／ｍｌの範囲内で制御し、後続の試験に使うことができる。
【０１５５】
２．活性測定
ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体がＳＤラット体内に腹腔注入された後、ラット成長ホルモン（ＧＨ）のレベルを著しく抑制した。ＳＳＴおよびＺ１Ｚ２／ＳＳＴｅはラット体内に注入された後、短い時間内で成長ホルモンの分泌を抑制するが、ＳＳＴの半減期（２〜３ｍｉｎ）が短くて、抑制作用が弱いため、２ｈ後に対照レベルまで回復し、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅは４ｈ内で成長ホルモンのレベルを明らに抑制することができ、８ｈ後に対照レベルまで回復し、より長い半減期を有する。そして、ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体が１２ｈに成長ホルモンの分泌を著しく抑制することができ、より長い半減期を有することを表明した（図２０）。ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体が２つのＳＳＴ分子を有するので、より長い半減期を有するとともに、より強い成長ホルモンの分泌の抑制作用を有する。
【０１５６】
３．体内安定性測定
ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体がＳＤラットに静脈注射された後、血漿中のＳＳＴ含有量がＥＬＩＳＡキットで測定し（図２１）、その計算の半減期は１４．３±１．７ｈであり、原ＳＳＴ（２〜３ｍｉｎ）より数百倍も延長し、Ｚ１Ｚ２／ＳＳＴｅ複合体よりも大幅に延長した。これは、ＺＳＳＴ／ＴｅＮ複合体はＳＳＴとその受容体の結合に影響しない場合で、その半減期を顕著に延長することを表明した。
【０１５７】
実施例７  ＰＹＹがポリペプチド複合体でのポリペプチドＢのＣ末端を接続する
ＰＹＹ（ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎ）は腸のＬ−細胞の摂食後で分泌した３６個のアミノ酸のポリペプチドである。研究によると、その体内でＰＹＹ１−３６とＤＰＰ−４酵素切断後のＰＹＹ３−３６の２つの形式がある。ＰＹＹ３−３６は視床下部と外週神経系のＹ２受容体に作用することにより、食欲の抑制、胃排出の緩め、体重の軽減の作用を発揮させる。動物と人体の試験をしたところ、ＰＹＹ３−３６の外週注射が摂食量を明らかに減少することができる。よって、ＰＹＹ３−３６が肥満治療の有効な薬物と認められる。しかし、ＰＹＹは体内で、プロティナーゼの分解と腎臓の濾過作用で、半減期が短くて、８ｍｉｎだけあるため、その臨床使用に制限した。
【０１５８】
本発明の複合体を利用してＰＹＹ３−３６を改良すると、より長い半減期を有し、臨床の肥満治療に使用できるタンパク質薬物を創造することが期待されている。ＰＹＹ３−３６を遺伝子融合によりＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎ  β−プリーツシート領域のＣ末端と融合発現（ＴｅＰＹ）を行い、かつ、Ｚ１Ｚ２と結合し、複合体（Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹ）を形成し、その活性を測定した。
【０１５９】
試験：
１．担体構築
遺伝子全合成の方式で、ＰＹＹ３−３６コード配列をＴｅｌｅｔｈｏｎｉｎβ−プリーツシート領域のコード配列のＣ末端の遺伝子配列に接続する担体ｐＥＴ−２４ｄ−ＴｅＰＹ（原ｐＥＴ２４ｄ担体以外の部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の通りであり、そのコードのアミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２で、第２４〜２５位の間はＴＥＶ酵素の酵素切断部位であり、第３〜８位は６ｘＨｉｓタグであり、第１２０〜１５３位はＰＹＹアミノ酸配列であり、第１１７〜１１９位はｌｉｎｋｅｒである。）を得た。
【０１６０】
２．発現、精製、内毒素の除去
実施例１と同じ方法ステップを用いて行い、純度の高いかつ内毒素含有量が２ＥＵ／ｍｌより小さいＺ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体を得ることができる。
【０１６１】
３．活性測定
Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体が体内で摂食を抑制する作用を発揮できるかどうかを確定するために、オスＫＭマウスを用いて摂食試験を行った。３０ｇぐらいのＫＭマウスをランダムにＰＢＳ群とＺ１Ｚ２／ＴｅＰＹ群の２群に分け、そして夜６時から翌朝９時まで１５h欠食させ、各マウスの空腹体重；各々マウス空腹体重別にＺ１Ｚ２／ＴｅＰＹ群に２００ｎｍｏｌ／ｋｇ薬物を腹腔注射し、ＰＢＳ群に等体積のＰＢＳを投与し、このとき０ｈにして、すぐ事前に重量が秤量した食べ物を投与し、しばらくの時間ごとに食べ物を秤量し、各時間帯のマウスの摂食量/体重をもってマウスの摂食量と表す。
【０１６２】
４．体内安定性測定
９．０ｎｍｏｌ  Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体をＳＤラット（２５０ｇぐらい）の尾静脈（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ｉ．ｖ）からラット体内に注入し、このとき０ｈと計時し、それぞれ０．０５、１、２、４、７、１０、２４ｈにラット尾静脈から採血し、予めＥＤＴＡ−Ｎａ２で処理した遠心管に滴下し、採血後、すぐに（３０ｓ以内）プロティナーゼ抑制剤Ａｐｒｏｔｉｎｉｎを添加し、サンプルでのＰＹＹ濃度をＰＹＹ３−３６  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｐｈｏｅｎｉｘ）で測定した。
【０１６３】
結果と分析：
１．発現、精製、内毒素の除去
ｐＥＴ−２４ｄ−ＴｅＰＹがそれぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化され、ＩＰＴＧで誘導発現を行った。そして、それぞれＮｉ２＋−ＮＴＡ親和クロマトグラフィーカラム精製、ＴＥＶプロティナーゼ切断、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ親和クロマトグラフィーカラム二次精製、Ｑイオン交換カラム精製や内毒素除去などのステップを経て、最終的に純度の高いタンパク質複合体Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹを得、後続の動物試験に使うことができる。
【０１６４】
２．活性測定
Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹ  ２００ｎｍｏｌ／ｋｇをマウスの体内に腹腔注射した後、８ｈ内で摂食量（ｐ＜０．０５）を顕著に低下させることができるが、８ｈ後にその抑制作用が消えることを発見した（図２２）。
【０１６５】
３．体内安定性測定
測定によると、Ｚ１Ｚ２／ＴｅＰＹ複合体が体内で濃度の低下が遅くて、その半減期を計算すると、静脈注射では６．４±０．８ｈであり、天然ＰＹＹ（８ｍｉｎ）より大きく延長した（図２３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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