(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア膜透過性の評価方法であって、
インビトロで被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、
前記カルシウムイオン指示薬を指標として、ミトコンドリア膜を透過したカルシウムイオン量を測定するステップと、
測定されたカルシウムイオン量と第１の基準値を比較するステップと、を含み、
前記測定されたカルシウムイオン量が前記第１の基準値を上回る場合、前記被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される、評価方法。
【請求項２】
インビトロで前記反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、
前記活性酸素指示薬を指標として、活性酸素量を測定するステップと、
測定された活性酸素量と第２の基準値とを比較するステップと、を更に含み、
前記測定されたカルシウムイオン量が前記第１の基準値を上回り、かつ前記測定された活性酸素量が前記第２の基準値を上回る場合、前記被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記活性酸素がスーパーオキシド（Ｏ２−）である、請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記カルシウムイオン指示薬及び前記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬である、請求項２又は３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ前記活性酸素指示薬が化学発光指示薬である、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
前記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項７】
ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、
前記反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、前記第１の被験細胞に被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、前記第２の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させるステップと、
前記カルシウムイオン指示薬を指標として、前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞それぞれについて、ミトコンドリア膜を透過したカルシウムイオン量を測定するステップと、
前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含み、
前記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回る場合、前記被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される、スクリーニング方法。
【請求項８】
インビトロで前記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、
前記活性酸素指示薬を指標として、前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、
前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含み、
前記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回り、かつ前記第１の被験細胞について測定された活性酸素量が前記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を下回る場合、前記被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記活性酸素がスーパーオキシド（Ｏ２−）である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記カルシウムイオン指示薬及び前記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬である、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ前記活性酸素指示薬が化学発光指示薬である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示す、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法であって、
インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、
前記反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、前記第１の被験細胞に被験物質を接触させ、前記第２の被験細胞に被験物質を接触させないステップと、
前記カルシウムイオン指示薬を指標として、前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞それぞれについて、ミトコンドリア膜を透過したカルシウムイオン量を測定するステップと、
前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含み、
前記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回る場合、前記被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される、スクリーニング方法。
【請求項１４】
インビトロで前記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、
前記活性酸素指示薬を指標として、前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、
前記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含み、
前記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が前記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回り、かつ前記第１の被験細胞について測定された活性酸素量が前記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を上回る場合、前記被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記活性酸素がスーパーオキシド（Ｏ２−）である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記カルシウムイオン指示薬及び前記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬である、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ前記活性酸素指示薬が化学発光指示薬である、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示す、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア膜透過性の評価方法、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞死等を原因とする脳神経細胞の脱落は、認知能力及び運動感覚機能の低下をもたらす。これが進行すると、最終的には社会生活が困難になる。老化、パーキンソン病、アルツハイマー病等の症例の増加は、高齢化の進む我が国の最大の課題である。現在、神経細胞死を防ぎ、疾患の発症を防止又は遅延する薬剤による神経細胞保護療法の開発が求められその一部が試験的に実施されている。
【０００３】
これまでに神経変性疾患の細胞・動物モデルで、神経細胞保護作用の機序が明らかとなっている（非特許文献１及び２）。酸化ストレス、神経栄養因子の欠乏、又は神経毒等により、ミトコンドリアが有する細胞死機構が活性化され、アポトーシスの形で細胞死に至る。ミトコンドリア膜にチャンネルが形成され開口すると、アポトーシスを誘導するタンパク質が細胞質に流出することで、細胞死が惹起される。神経細胞保護薬はこの細胞死の各段階を阻止し、最終的に神経細胞を保護するものである。
【０００４】
細胞死の過程では、アポトーシスシグナルがミトコンドリアで誘導され、細胞質でカスパーゼを活性化し、核ＤＮＡの分裂濃縮と細胞の縮小を惹起して典型的なアポトーシス像を示し細胞死に至る。この過程の各段階を測定する方法としては、ミトコンドリア膜のメガチャンネル（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ：ＰＴＰ）形成による変化の測定、ミトコンドリア機能の変化の測定に基づくミトコンドリア膜透過性の変化の測定、流出したアポトーシス誘導分子の測定、カスパーゼ活性化の測定、アポトーシスの定量に基づく細胞死の測定等が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｗら，（２００１年），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７８巻，ｐｐ．７２７−７３５．
【非特許文献２】Ｎａｏｉ  Ｍら，（２０１３年），Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ，１２０巻，ｐｐ．１５３９−１５５１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、細胞死の各段階を測定する方法は知られているものの、細胞死の最初の段階を測定し、評価することは困難であった。例えば、ミトコンドリア膜透過性の変化の測定においては、蛍光法により膜電位の変化を検出することが行われているが、膜電位の変化は二次的な変化である。また、ミトコンドリア機能の変化の測定では、ミトコンドリアの精製が必要なことに加え、細胞全体の機能を反映した評価が困難である。
【０００７】
そこで、本発明は、細胞死の最初の段階を評価することができる、ミトコンドリア膜透過性の評価方法の提供を目的とする。本発明はまた、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤の提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本明細書の実施例で詳述するように、神経細胞のアポトーシス誘導の過程において、ミトコンドリア膜の透過性亢進により細胞質内でのＣａ２＋量及び反応液中（細胞外）のスーパーオキシド（Ｏ２−）量の増加が見られること、並びに当該Ｃａ２＋量及びＯ２−量の増加がアポトーシス誘導の初発のシグナルであることを見出した。本発明は、これらの新規知見に基づいている。
【０００９】
すなわち、本発明は、ミトコンドリア膜透過性の評価方法であって、インビトロで被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、上記カルシウムイオン指示薬を指標として、カルシウムイオン量を測定するステップと、測定されたカルシウムイオン量と第１の基準値を比較するステップと、を含み、上記測定されたカルシウムイオン量が上記第１の基準値を上回る場合、上記被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される、評価方法に関する。
【００１０】
上記評価方法によれば、カルシウムイオン量に基づいた評価を行うことから、複雑な前処理を要することなく、ミトコンドリア膜透過性の変化を迅速に評価することができる。したがって、上記評価方法は、細胞死の最初の段階を評価することができる。従来、細胞死におけるＣａ２＋の関与は、細胞内外でのＣａ２＋の増減、及びホメオスタシスの撹乱として検討されてきた。これに対し、本発明では、ミトコンドリアにおけるＣａ２＋の動態として細胞死シグナルを測定するのである。
【００１１】
上記評価方法は、インビトロで上記反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、上記活性酸素指示薬を指標として、活性酸素量を測定するステップと、測定された活性酸素量と第２の基準値とを比較するステップと、を更に含むことが好ましい。この場合、上記測定されたカルシウムイオン量が上記第１の基準値を上回り、かつ上記測定された活性酸素量が上記第２の基準値を上回る場合、上記被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される。
【００１２】
カルシウムイオン量に加え、活性酸素量に基づいた評価を併せて行うことにより、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の変化をより精度よく評価することができる。
【００１３】
上記活性酸素は、スーパーオキシド（Ｏ２−）であってもよい。これにより、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の変化をより一層精度よく評価することができる。
【００１４】
上記評価方法は、上記カルシウムイオン指示薬及び上記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬であることが好ましく、上記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ上記活性酸素指示薬が化学発光指示薬であることがより好ましい。これにより、カルシウムイオン量及び活性酸素量の検出を簡便に行うことができ、また検出感度を向上させることができる。
【００１５】
上記評価方法では、カルシウムイオン量、又は活性酸素量に基づいた評価を行うことから、ミトコンドリア膜の透過性亢進によるアポトーシス誘導の初発のシグナルを検出することができる。したがって、上記評価方法は、上記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示すものであってもよい。すなわち、上記測定されたカルシウムイオン量が上記第１の基準値を上回る場合、及び／又は上記測定された活性酸素量が上記第２の基準値を上回る場合、上記被験細胞はアポトーシスが誘導されたと評価される。
【００１６】
本発明はまた、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法であって、インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、上記反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、上記第１の被験細胞に被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、上記第２の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させるステップと、上記カルシウムイオン指示薬を指標として、上記第１の被験細胞、及び前記第２の被験細胞それぞれについて、カルシウムイオン量を測定するステップと、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含み、上記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回る場合、上記被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される、スクリーニング方法にも関する。
【００１７】
上記スクリーニング方法では、カルシウムイオン量に基づいた評価を行うことから、ミトコンドリア膜透過性を評価することができる。したがって、ミトコンドリア膜透過性亢進剤単独で投与した場合と比べて、ミトコンドリア膜透過性亢進剤と被験物質の双方を投与した場合にカルシウムイオン量が低下していれば、当該被験物質をミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価することができる。また上記スクリーニング方法は、カルシウムイオン量に基づいた評価を行うため、複雑な前処理を要せず、またミトコンドリア膜透過性の変化を迅速に検出できることから、短時間での評価が可能である。
【００１８】
上記スクリーニング方法は、インビトロで上記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、上記活性酸素指示薬を指標として、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含むことが好ましい。この場合、上記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回り、かつ上記第１の被験細胞について測定された活性酸素量が上記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を下回る場合、上記被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される。
【００１９】
カルシウムイオン量に加え、活性酸素量に基づいた評価を併せて行うことにより、より精度よく評価することができる。
【００２０】
上記活性酸素は、スーパーオキシド（Ｏ２−）であってもよい。
【００２１】
上記スクリーニング方法は、上記カルシウムイオン指示薬及び上記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬であることが好ましく、上記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ上記活性酸素指示薬が化学発光指示薬であることがより好ましい。これにより、カルシウムイオン量及び活性酸素量の検出を簡便に行うことができ、また検出感度を向上させることができる。
【００２２】
上記スクリーニング方法では、カルシウムイオン量、又は活性酸素量に基づいた評価を行うことから、ミトコンドリア膜の透過性亢進によるアポトーシス誘導の初発のシグナルを検出することができる。したがって、上記スクリーニング方法は、上記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示すものであってもよい。すなわち、上記スクリーニング方法は、上記被験物質が、アポトーシスの誘導を抑制する物質であると評価するものであってもよい。
【００２３】
本発明は更に、セサミン又はセサミノールを有効成分として含有する、ミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤にも関する。
【００２４】
本発明者らは、セサミン及びセサミノールがミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であることを見出した。上記亢進抑制剤は、この新規知見に基づく。
【００２５】
上記亢進抑制剤は、神経細胞のアポトーシス誘導の過程におけるミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制することができるため、アポトーシス抑制剤としても好適に用いることができる。
【００２６】
本発明はまた、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法であって、インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、上記反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、上記第１の被験細胞に被験物質を接触させ、上記第２の被験細胞に被験物質を接触させないステップと、上記カルシウムイオン指示薬を指標として、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞それぞれについて、カルシウムイオン量を測定するステップと、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含み、上記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回る場合、上記被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される、スクリーニング方法にも関する。
【００２７】
上記スクリーニング方法では、カルシウムイオン量に基づいた評価を行うことから、ミトコンドリア膜透過性を評価することができる。したがって、被験物質を接触させない場合と比べて、被験物質を接触させた場合にカルシウムイオン量が上昇していれば、当該被験物質をミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価することができる。また上記スクリーニング方法は、カルシウムイオン量に基づいた評価を行うため、複雑な前処理を要せず、またミトコンドリア膜透過性の変化を迅速に検出できることから、短時間での評価が可能である。
【００２８】
上記スクリーニング方法は、インビトロで上記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、上記活性酸素指示薬を指標として、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含むことが好ましい。この場合、上記第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が上記第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回り、かつ上記第１の被験細胞について測定された活性酸素量が上記第２の被験細胞について測定された活性酸素量を上回る場合、上記被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される。
【００２９】
カルシウムイオン量に加え、活性酸素量に基づいた評価を併せて行うことにより、より精度よく評価することができる。
【００３０】
上記活性酸素は、スーパーオキシド（Ｏ２−）であってもよい。
【００３１】
上記スクリーニング方法は、上記カルシウムイオン指示薬及び上記活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬であることが好ましく、上記カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ上記活性酸素指示薬が化学発光指示薬であることがより好ましい。これにより、カルシウムイオン量及び活性酸素量の検出を簡便に行うことができ、また検出感度を向上させることができる。
【００３２】
上記スクリーニング方法では、カルシウムイオン量、又は活性酸素量に基づいた評価を行うことから、ミトコンドリア膜の透過性亢進によるアポトーシス誘導の初発のシグナルを検出することができる。したがって、上記スクリーニング方法は、上記被験細胞のミトコンドリア膜透過性の亢進が、アポトーシスの誘導を示すものであってもよい。すなわち、上記スクリーニング方法は、上記被験物質が、アポトーシスを誘導する物質であると評価するものであってもよい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、細胞死の最初の段階を評価することができる、ミトコンドリア膜透過性の評価方法が提供される。本発明の評価方法によれば、従来の方法では困難であった細胞死シグナル活性の最初の段階の評価を、複雑な前処理を施すことなく行うことができる。
【００３４】
また、本発明によれば、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法は、複雑な前処理を要せず、短時間で、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制することができる被験物質の評価が可能である。したがって、例えば、食品等由来の天然化合物、又は合成化合物のアポトーシス誘導抑制活性、神経細胞保護活性等を迅速かつ簡便に測定及び評価することができる。
【００３５】
世界に先駆けて超高齢社会に突入した日本において、健康長寿を妨げる大きな原因となる脳神経変性疾患の予防には高い関心が見込まれる。さらに、「食」による予防医療への期待も高まっている今、食への応用が可能な物質についてアポトーシス誘導抑制活性、神経細胞保護活性を迅速に簡便に測定できる方法は、健康長寿社会実現に大いに貢献できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ミトコンドリア膜透過性亢進剤（ＰＫ１１１９５）の添加による細胞質内のＣａ２＋量、及び反応液中のＯ２−量の変化を示すグラフである。
【図２】ミトコンドリア膜透過性亢進剤（ＰＫ１１１９５）及び神経細胞保護薬（シクロスポリンＡ）の添加による細胞質内のＣａ２＋量、及び反応液中のＯ２−量の変化を示すグラフである。
【図３】ミトコンドリア膜透過性亢進剤（ＰＫ１１１９５）及び神経細胞保護薬（Ｒａｓａｇｉｌｉｎｅ）の添加による細胞質内のＣａ２＋量の変化を示すグラフである。
【図４】食品成分（セサミン及びセサミノール）の添加による細胞質内のＣａ２＋量、及び反応液中のＯ２−量の変化を示すグラフである。
【図５】蛍光及び化学発光の同時測定装置の模式断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００３８】
〔ミトコンドリア膜透過性の評価方法〕
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の評価方法は、インビトロで被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、上記カルシウムイオン指示薬を指標として、カルシウムイオン量を測定するステップと、測定されたカルシウムイオン量と第１の基準値を比較するステップと、を含む。
【００３９】
被験細胞としては、ミトコンドリア膜透過性を評価すべき細胞種を用いればよく、任意の細胞を用いることができる。被験細胞としては、例えば、神経細胞、グリア細胞、心筋細胞、癌細胞、肝細胞、並びにこれらの細胞由来で系統化された培養細胞株等を挙げることができる。
【００４０】
被験細胞を含む反応液は、被験細胞を緩衝液（例えば、ＲＨ緩衝液、ＰＢＳ（−）緩衝液）等に懸濁させることで調製することができる。
【００４１】
カルシウムイオン指示薬としては、カルシウムイオンの存在量と相関する信号を検出できる試薬であればよく、例えば、カルシウムイオンと定量的に反応する蛍光指示薬、発光（例えば、化学発光）指示薬、又は吸光指示薬を用いることができる。カルシウムイオン指示薬は、市販されているものを用いてもよい。そのような指示薬として、例えば、Ｆｌｕｏ−３（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−５Ｆ、ｂｉｓ−ｆｕｒａ−２、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｉｎ−ＡＭ、Ｒｈｏｄ−２、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）が挙げられる。
【００４２】
被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン指示薬を添加する方法としては、例えば、上述したカルシウムイオン指示薬又はその溶液等を反応液に加える方法が挙げられる。反応液に添加されたカルシウムイオン指示薬は、ミトコンドリア膜及び細胞膜を透過した反応液中のカルシウムイオンと反応するか、又はカルシウムイオン指示薬そのものの細胞膜透過性により被験細胞の細胞内に取り込まれ、ミトコンドリア膜を透過した細胞質内のカルシウムイオンと反応することになる。
【００４３】
インビトロで被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップは、ミトコンドリア膜透過性の変化をより迅速に評価できることから、インビトロで被験細胞の細胞内にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップであることが好ましい。
【００４４】
被験細胞の細胞内にカルシウムイオン指示薬を添加する方法としては、例えば、カルシウムイオン指示薬そのものの細胞膜透過性を利用して反応液にカルシウムイオン指示薬を添加することにより細胞内に移動させる方法、カルシウムイオン指示薬と細胞内への物質導入に汎用されている試薬（例えば、リポフェクション試薬）を混合して反応液に添加することにより細胞内に導入する方法、物理的にカルシウムイオン指示薬を細胞内に導入する方法（例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法）を挙げることができる。
【００４５】
反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量の測定は、カルシウムイオン指示薬を指標として、常法により行われる。例えば、カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬の場合、励起光源から出力された励起光を被験細胞を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出することで、カルシウムイオン量を測定することができる。カルシウムイオン指示薬が化学発光指示薬の場合、被験細胞を含む試料容器から放出された化学発光を化学発光検出器で検出することで、カルシウムイオン量を測定することができる。ミトコンドリア膜透過性の変化をより精度よく、またより迅速に評価できることから、細胞質内のカルシウムイオン量を測定することが好ましい。
【００４６】
続いて、測定されたカルシウムイオン量と第１の基準値を比較する。第１の基準値は、評価目的、評価対象となる細胞種、及び基準とするミトコンドリア膜透過性の程度に応じて、随時設定することができる。より具体的には、比較対照となる状態の細胞について測定されたカルシウムイオン量を第１の基準値として設定することができる。例えば、神経細胞におけるアポトーシス誘導の初発シグナルの検出を目的とする場合、アポトーシスの誘導が生じない条件（例えば、酸化ストレス、神経栄養因子の欠乏、又は神経毒等のストレスがない条件）で培養している神経細胞においてカルシウムイオン量を測定し、測定されたカルシウムイオン量を第１の基準値として設定することができる。
【００４７】
測定されたカルシウムイオン量が第１の基準値を上回る場合、第１の基準値を設定するために用いられた比較対照となる状態の細胞と比べて、被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される。
【００４８】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の評価方法は、カルシウムイオン量に基づく評価と共に、活性酸素量に基づいた評価を行ってもよい。すなわち、本実施形態のミトコンドリア膜透過性の評価方法は、インビトロで被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、活性酸素指示薬を指標として、活性酸素量を測定するステップと、測定された活性酸素量と第２の基準値とを比較するステップとを更に含んでいてもよい。これにより、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の変化をより精度よく評価することができる。
【００４９】
活性酸素指示薬としては、活性酸素の存在量と相関する信号を検出できる試薬であればよく、例えば、活性酸素と定量的に反応する蛍光指示薬、発光（例えば、化学発光）指示薬、又は吸光指示薬を用いることができる。活性酸素指示薬は、市販されているものを用いてもよい。そのような指示薬として、例えば、２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ）、２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＭＣＬＡ）、２−メチル‐６−ｐ−メトキシフェニルエチニルイミダゾピラジノン（ＭＰＥＣ）、インドシアニン型イミダゾピラノジン化合物（ＮＩＲ−ＣＬＡ）、２−［２，４，５，７−テトラフルオロ−６−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシフェニルスルホニルオキシ）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸（ＢＥＳ−Ｓｏ）ジヒドロエチジウム等のスーパーオキシドと反応する指示薬、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）、ジヒドロカルセイン、ジヒドロローダミン１２３、ルミノール等の過酸化水素と反応する指示薬、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＣ、プロキシルフルオレスカミン、ＴＥＰＯ−９−ＡＣ等のヒドロキシラジカルと反応する指示薬、トランス−１−（２’−メトキシビニル）ピレン等の一重項酸素と反応する指示薬が挙げられる。
【００５０】
被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加する方法としては、例えば、上述した活性酸素指示薬又はその溶液等を反応液に加える方法が挙げられる。反応液に添加された活性酸素指示薬は、反応液中の活性酸素と反応するか、又は活性酸素指示薬そのものの細胞膜透過性により被験細胞の細胞内に取り込まれ、細胞質内の活性酸素と反応することになる。
【００５１】
インビトロで被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップは、ミトコンドリア膜透過性の変化をより迅速に評価できることから、インビトロで被験細胞の細胞内に活性酸素指示薬を添加するステップであってもよい。
【００５２】
被験細胞の細胞内に活性酸素指示薬を添加する方法としては、カルシウムイオン指示薬を添加する方法と同様の方法を例示できる。活性酸素指示薬を添加する場合、活性酸素指示薬とカルシウムイオン指示薬との添加順序は任意であり、同時に添加してもよい。
【００５３】
反応液中又は細胞質内の活性酸素量の測定は、活性酸素指示薬を指標として、常法により行われる。活性酸素量の測定方法の具体例としては、カルシウムイオン量の測定方法の具体例と同様の方法を例示できる。ミトコンドリア膜透過性の変化をより精度よく評価できることから、反応液中の活性酸素量を測定することが好ましい。
【００５４】
カルシウムイオン量及び活性酸素量の測定においては、検出感度を向上させるという観点から、カルシウムイオン指示薬及び活性酸素指示薬の少なくとも一方が蛍光指示薬であることが好ましく、カルシウムイオン指示薬が蛍光指示薬であり、かつ活性酸素指示薬が化学発光指示薬であることがより好ましい。
【００５５】
カルシウムイオン量及び活性酸素量は、略同時に測定してもよい。これにより、同一の条件下におけるカルシウムイオン量及び活性酸素量を測定することができ、ミトコンドリア膜透過性をより正確に評価することができる。
【００５６】
カルシウムイオン量及び活性酸素量は、例えば、蛍光検出装置、化学発光検出装置、吸光度測定装置を用いて測定することができる。また、カルシウムイオン量及び活性酸素量を蛍光と化学発光により略同時に測定する場合、例えば、特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−１３１２３４号公報等に記載の蛍光及び化学発光を同時に測定する装置を用いて測定することもできる。
【００５７】
続いて、測定された活性酸素量と第２の基準値を比較する。第２の基準値は、評価目的、評価対象となる細胞種、及び基準とするミトコンドリア膜透過性の程度に応じて、随時設定することができる。より具体的には、比較対照となる状態の細胞について測定された活性酸素量を第２の基準値として設定することができる。例えば、神経細胞におけるアポトーシス誘導の初発シグナルの検出を目的とする場合、アポトーシスの誘導が生じない条件（例えば、酸化ストレス、神経栄養因子の欠乏、又は神経毒等のストレスがない条件）で培養している神経細胞において活性酸素量を測定し、測定された活性酸素量を第２の基準値として設定することができる。第２の基準値は、第１の基準値と同じ条件で設定するのが好ましい。
【００５８】
活性酸素としては、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素が挙げられる。アポトーシス誘導の初発シグナルの検出を目的とする場合には、より精度よい評価が可能になることから、活性酸素としてスーパーオキシドを採用することが好ましい。
【００５９】
測定された活性酸素量が第２の基準値を上回る場合、第２の基準値を設定するために用いられた比較対照となる状態の細胞と比べて、被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価される。ここで、評価の精度をより向上させる観点から、測定されたカルシウムイオン量が第１の基準値を上回り、かつ測定された活性酸素量が第２の基準値を上回る場合に、被験細胞のミトコンドリア膜透過性が亢進したと評価されることが好ましい。
【００６０】
上述したミトコンドリア膜透過性の評価方法によれば、ミトコンドリア膜透過性の亢進によるアポトーシス誘導の初発シグナル（例えば、細胞質におけるＣａ２＋又はＯ２−量の増加）を検出することができるため、本実施形態の評価方法は、被験細胞におけるアポトーシス誘導の評価方法又は検出方法としても有用である。
【００６１】
〔ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法〕
本発明は、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法にも応用することができる。
【００６２】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法は、インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、第１の被験細胞に被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、第２の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させるステップと、カルシウムイオン指示薬を指標として、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞それぞれについて、カルシウムイオン量を測定するステップと、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含む。比較の結果、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される。
【００６３】
被験物質に特に制限はなく、任意の物質を用いることができる。被験物質としては、例えば、天然由来の化合物、人工合成された化合物、ペプチド、タンパク質、脂質、核酸（リボ核酸、デオキシリボ核酸等）が挙げられる。被験物質として、食品由来の物質を用いてもよい。
【００６４】
ミトコンドリア膜透過性亢進剤としては、ミトコンドリア膜の透過性を亢進させる性質を有する物質を制限なく用いることができる。ミトコンドリア膜の透過性を亢進させる性質は、ミトコンドリア膜のＰＴＰ形成（開口）を促進する性質であることが好ましい。ミトコンドリア膜透過性亢進剤の具体例としては、例えば、ＰＫ１１１９５（１−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチルプロピル）−３−イソキノリンカルボキサミド）が挙げられる。ＰＫ１１１９５は、ミトコンドリア膜のＰＴＰを開口させ、アポトーシスシグナルを活性化して細胞死を惹起することが知られている（非特許文献２）。
【００６５】
被験細胞は、任意の細胞を用いてよい。特に神経細胞保護活性を有する物質のスクリーニングを目的とする場合は、神経細胞又は神経細胞由来で系統化された培養細胞株を用いるのが好ましく、ドパミン細胞系の培養細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いるのがより好ましい。
【００６６】
本実施形態に係るスクリーニング方法では、まず複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン指示薬を添加する。当該添加はインビトロで行われる。カルシウムイオン指示薬、及びそれを添加する方法の具体例としては、上述したとおりである。
【００６７】
次に反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得る。そして、第１の被験細胞に被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、第２の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させる。
【００６８】
被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を被験細胞に接触させる方法としては、例えば、被験細胞を含む反応液に被験物質若しくはミトコンドリア膜透過性亢進剤、又はこれらの溶液を添加することにより行うことができる。第１の被験細胞において、被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させる順序は任意であり、同時に接触させてもよい。ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する作用をより精度よく評価するという観点からは、被験細胞に被験物質を接触させた後、ミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させることが好ましい。
【００６９】
次にカルシウムイオン指示薬を指標として、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞それぞれについて、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量を測定する。測定方法の具体例としては、上述したとおりである。
【００７０】
次に第１の被験細胞、及び第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較する。第２の被験細胞は、ミトコンドリア膜透過性亢進剤の作用により、ミトコンドリア膜の透過性が亢進し、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量が上昇する。これに対し、被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する性質を有する場合、第１の被験細胞はミトコンドリア膜透過性亢進剤の作用が被験物質の作用により打ち消され、第２の被験細胞と比べて、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量の上昇が抑えられるか、又は上昇しないことになる。したがって、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される。
【００７１】
本実施形態に係るスクリーニング方法においては、カルシウムイオン指示薬を添加した複数の被験細胞を含む反応液を３つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、第２の被験細胞を含む反応液、及び第３の被験細胞を含む反応液を得て、第１の被験細胞に被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、第２の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させ、第３の被験細胞に細胞保護薬及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させるステップを含むものであってもよい。また、細胞保護薬が、後述するＢｃｌ−２タンパク質のように細胞に発現させることにより細胞保護薬として機能する細胞保護因子である場合、当該接触させるステップにおける細胞保護因子との接触は、細胞内部で細胞保護因子が発現することを意味する。
【００７２】
第３の被験細胞に接触させる細胞保護薬（細胞保護剤ともいう。）としては、ミトコンドリア膜の透過性の亢進を抑制する性質を有する物質を制限なく用いることができる。細胞保護薬としては、例えば、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ−Ａ）、ラサギリン（Ｎ−２−プロピニル−１−インダンアミン）、Ｂｃｌ−２タンパク質が挙げられる。シクロスポリンＡはＰＴＰ開口を阻害することが知られている。また、Ｂｃｌ−２タンパク質及びラサギリンは、ＰＴＰ形成を阻害することでアポトーシスを阻止し神経細胞を保護することが知られている（非特許文献１）。Ｂｃｌ−２タンパク質は、被験細胞へ遺伝子導入を行いミトコンドリアに発現させたものであってもよい。
【００７３】
第３の被験細胞は、ミトコンドリア膜透過性亢進剤の作用が細胞保護薬の作用で打ち消されるため、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量の上昇が抑えられるか、又は上昇しない。したがって、第１の被験細胞と第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較することに加え、第１の被験細胞と第３の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較することによって、より精度のよい評価を行うことができる。
【００７４】
本実施形態に係るスクリーニング方法は、カルシウムイオン量に基づく評価と共に、活性酸素量に基づいた評価を行ってもよい。すなわち、本実施形態に係るスクリーニング方法は、インビトロで上記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、活性酸素指示薬を指標として、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞、並びに必要に応じて第３の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞、並びに必要に応じて第３の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含んでいてもよい。これにより、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する作用をより精度よく評価することができる。
【００７５】
活性酸素指示薬、及びそれを添加する方法の具体例としては、上述したとおりである。また、カルシウムイオン量及び活性酸素量の測定方法の具体例も上述したとおりである。
【００７６】
第１の被験細胞について測定された活性酸素量が第２の被験細胞について測定された活性酸素量を下回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価される。ここで、評価の精度をより高める観点から、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を下回り、かつ第１の被験細胞について測定された活性酸素量が第２の被験細胞について測定された活性酸素量を下回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価されることが好ましい。
【００７７】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、ミトコンドリア膜透過性の亢進によるアポトーシス誘導の初発シグナル（例えば、細胞質におけるＣａ２＋又はＯ２−量の増加）に基づく評価が可能であるため、本実施形態のスクリーニング方法は、アポトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法としても有用である。
【００７８】
本実施形態のスクリーニング方法により、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質であると評価された被験物質は、ミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤として好適に用いられる。次に、ミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤について説明する。
【００７９】
〔ミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤〕
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、セサミン又はセサミノールを有効成分として含有する。
【００８０】
セサミンは、ゴマに含まれる成分の一つであり、５，５’−（１Ｓ，３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］フラン−１，４−ジイルビス（１，３−ベンゾジオキソール）とも称される化合物である。
【００８１】
セサミノールは、ゴマに含まれる成分の一つであり、（１Ｓ，３ａβ，６ａβ）−１β−（６−ヒドロキシ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−４β−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］フランとも称される化合物である。
【００８２】
セサミン及びセサミノールは、ミトコンドリア膜透過性亢進剤（ＰＫ１１１９５）により誘導されるミトコンドリア膜の透過性の亢進を抑制することができるため、セサミン及びセサミノールを有効成分として含有するミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する用途に好適に用いられる。
【００８３】
セサミン及びセサミノールは、天然由来のものであってもよく、化学合成されたものであってもよい。セサミン及びセサミノールは、例えば、ゴマ油から精製して得ることができる。セサミン及びセサミノールは、市販されているものを用いてもよい。
【００８４】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、セサミン又はセサミノールを１種単独で有効成分として含有していてもよく、２種を組み合わせて有効成分として含有していてもよい。
【００８５】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、固体、液体（懸濁液を含む）、ペースト等のいずれの形状であってもよい。また、剤形としては、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれであってもよい。
【００８６】
上述の各種製剤は、有効成分であるセサミン又はセサミノールのみからなるものであってもよく、当該有効成分と薬学的に許容される添加剤との混合物であってもよい。また、上述の製剤は、例えば、セサミン、セサミノール、及び必要に応じて添加剤を混和し、上記剤形に成形することによって調製することができる。添加剤を含む場合、上記有効成分の含有量は、例えば、製剤全量を基準として、０．１〜９０質量％である。
【００８７】
薬学的に許容される添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤を挙げることができる。
【００８８】
賦形剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、例えば、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。
【００８９】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。投与量及び投与方法の一例として、本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤の有効成分濃度と脳内移行効率を考慮すると、１００ｍｇ〜１ｇ（有効成分量基準）を１日１回経口で投与する方法を挙げることができる。
【００９０】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、医薬品、医薬部外品、一般食品、サプリメント、特定保健用食品、機能性食品、栄養補助食品、食品添加物、飼料、飼料添加物等として使用することができる。
【００９１】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤は、細胞のアポトーシス誘導の過程におけるミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制することができるため、例えば、アポトーシス抑制剤、細胞保護剤（例えば、神経細胞保護剤）としても好適に用いることができる。また、アポトーシス抑制作用、神経細胞保護作用を介して、老化防止効果、脳を若く保つ効果等を奏することもできる。
【００９２】
〔ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法〕
本発明は、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法にも応用することができる。
【００９３】
本実施形態のミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法は、インビトロで複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）指示薬を添加するステップと、反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得て、第１の被験細胞に被験物質を接触させ、第２の被験細胞に被験物質を接触させないステップと、カルシウムイオン指示薬を指標として、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞それぞれについて、カルシウムイオン量を測定するステップと、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較するステップと、を含む。比較の結果、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される。
【００９４】
被験物質に特に制限はなく、任意の物質を用いることができる。被験物質としては、例えば、天然由来の化合物、人工合成された化合物、ペプチド、タンパク質、脂質、核酸（リボ核酸、デオキシリボ核酸等）が挙げられる。被験物質として、食品由来の物質を用いてもよい。
【００９５】
被験細胞は、任意の細胞を用いてよい。特に癌治療効果を有する物質のスクリーニングを目的とする場合は、癌細胞又は癌細胞由来で系統化された培養細胞株を用いるのが好ましい。癌細胞は、アポトーシスを避けて増殖し続ける性質があるため、アポトーシスを誘導する物質を抗癌剤又は抗癌補助剤として使用している例もある。
【００９６】
本実施形態に係るスクリーニング方法では、まず複数の被験細胞を含む反応液にカルシウムイオン指示薬を添加する。当該添加はインビトロで行われる。カルシウムイオン指示薬、及びそれを添加する方法の具体例としては、上述したとおりである。
【００９７】
次に反応液を少なくとも２つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、及び第２の被験細胞を含む反応液を得る。そして、第１の被験細胞に被験物質を接触させ、第２の被験細胞には被験物質を接触させない。
【００９８】
被験物質を被験細胞に接触させる方法としては、例えば、被験細胞含む反応液に被験物質又はその溶液を添加することにより行うことができる。
【００９９】
次にカルシウムイオン指示薬を指標として、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞それぞれについて、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量を測定する。測定方法の具体例としては、上述したとおりである。
【０１００】
次に第１の被験細胞、及び第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較する。第２の被験細胞は、被験物質と接触させていないときの反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量を示す対照である。被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する性質を有する場合、第１の被験細胞は被験物質の作用により、対照である第２の被験細胞と比べて、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量が上昇することになる。したがって、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される。
【０１０１】
本実施形態に係るスクリーニング方法においては、第１の被験細胞に被験物質及び細胞保護薬を接触させ、第２の被験細胞に細胞保護薬を接触させてもよい。細胞保護薬については、上述したとおりである。第２の被験細胞は、細胞保護薬の作用により、ミトコンドリア膜の透過性の亢進が抑制されている。これに対し、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する性質を有する場合、第１の被験細胞は、細胞保護薬の作用が被験物質の作用により打ち消され、第２の被験細胞と比べて、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量が上昇することになる。したがって、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される。
【０１０２】
本実施形態に係るスクリーニング方法においては、カルシウムイオン指示薬を添加した複数の被験細胞を含む反応液を３つに分けて、第１の被験細胞を含む反応液、第２の被験細胞を含む反応液、及び第３の被験細胞を含む反応液を得て、第１の被験細胞に被験物質を接触させ、第２の被験細胞には被験物質及びミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させず、第３の被験細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤を接触させるステップを含むものであってもよい。また、第１〜第３の被験細胞のそれぞれに対して、更に細胞保護薬を接触させてもよい。ミトコンドリア膜透過性亢進剤については上述したとおりである。
【０１０３】
第３の被験細胞は、ミトコンドリア膜透過性亢進剤の作用により、反応液中又は細胞質内のカルシウムイオン量が上昇するため、陽性対照として利用できる。したがって、第１の被験細胞と第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較することに加え、第１の被験細胞と第３の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を比較することによって、より精度のよい評価を行うことができる。
【０１０４】
本実施形態に係るスクリーニング方法は、カルシウムイオン量に基づく評価と共に、活性酸素量に基づいた評価を行ってもよい。すなわち、本実施形態に係るスクリーニング方法は、インビトロで上記複数の被験細胞を含む反応液に活性酸素指示薬を添加するステップと、上記活性酸素指示薬を指標として、上記第１の被験細胞、及び上記第２の被験細胞、並びに必要に応じて第３の被験細胞それぞれについて、活性酸素量を測定するステップと、第１の被験細胞、及び第２の被験細胞、並びに必要に応じて第３の被験細胞について測定された活性酸素量を比較するステップと、を更に含んでいてもよい。これにより、細胞死に関連したミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制作用をより精度よく評価することができる。
【０１０５】
活性酸素指示薬、及びそれを添加する方法の具体例としては、上述したとおりである。また、カルシウムイオン量及び活性酸素量の測定方法の具体例も上述したとおりである。
【０１０６】
第１の被験細胞について測定された活性酸素量が第２の被験細胞について測定された活性酸素量を上回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価される。ここで、評価の精度をより高める観点から、第１の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量が第２の被験細胞について測定されたカルシウムイオン量を上回り、かつ第１の被験細胞について測定された活性酸素量が第２の被験細胞について測定された活性酸素量を上回る場合、被験物質がミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価されることが好ましい。
【０１０７】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、ミトコンドリア膜透過性の亢進によるアポトーシス誘導の初発シグナル（例えば、細胞質におけるＣａ２＋又はＯ２−量の増加）に基づく評価が可能であるため、本実施形態のスクリーニング方法は、アポトーシスを誘導する物質のスクリーニング方法としても有用である。
【０１０８】
本実施形態のスクリーニング方法により、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質であると評価された被験物質は、ミトコンドリア膜透過性亢進剤として好適に用いられる。当該ミトコンドリア膜透過性亢進剤は、細胞のアポトーシス誘導の初発シグナルであるミトコンドリア膜透過性の亢進を促すことができるため、例えば、アポトーシス誘導剤としても好適に用いることができる。また、アポトーシス誘導作用を介して、癌細胞死を誘導できることから、抗癌剤又は従来の抗癌剤に抵抗性を示す癌細胞における治療補助剤としても好適に用いることができる。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１１０】
〔１．実験方法〕
（１）細胞培養
ヒト神経芽細胞腫由来ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％血清（ＦＢＳ）、１００ｍｇ／ｍＬペニシリン及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地で維持した。フラスコ（１２５ｃｍ２フラスコ）に播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、８０〜９０％コンフルエント（約３日間）になった段階で、継代培養を行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に遺伝子導入し、Ｂｃｌ−２を過剰発現させた細胞（Ｂｃｌ−２過剰発現細胞）も同様にして維持した。
【０１１１】
（２）カルシウムイオン指示薬の添加
上記のように維持していた細胞を機械的に収集し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分間）した。遠心沈渣として得られた細胞をＲＨ緩衝液（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ，５．６ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）に懸濁し、再度遠心分離した。遠心沈渣として得られた細胞を５ｍＬ  ＤＭＥＭ培地に懸濁させ、細胞内蛍光指示薬であるＦｌｕｏ−３  ＡＭ（１ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ，ＤＯＪＩＮＤＯ社）を添加した。添加量は、１ｍＭ  Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ  １５μｌ／５ｍＬ細胞懸濁液とした。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分培養し、Ｆｌｕｏ−３  ＡＭを細胞内に取り込ませた。
【０１１２】
（３）細胞懸濁液の調整
Ｆｌｕｏ−３  ＡＭで処理した細胞を遠心分離し、ＲＨ緩衝液で洗浄し再度遠心分離した。遠心沈渣として得られた細胞を２ｍＬ  ＲＨ緩衝液に再懸濁した。この細胞懸濁液２０μＬに等量の０．４％  Ｔｒｙｐａｎ−Ｂｌｕｅ溶液を混合し、血球計算盤で細胞数を測定した。測定された細胞数に基づいて、細胞懸濁液の濃度が６×１０５細胞／ｍＬとなるようにＲＨ緩衝液を加えて調整した。
【０１１３】
（４）活性酸素指示薬の添加、及び細胞保護薬による処理
下記（５）におけるカルシウムイオン量及び活性酸素量の測定時の細胞反応液の総容量が１５００μＬとなるように、上述の細胞懸濁液とＲＨ緩衝液を混合した。これに、スーパーオキシドの化学発光指示薬であるＭＣＬＡ（２５μＭ、ＲＨ緩衝液に溶解，東京化成）６０μＬ（終濃度が１μＭ）又はＣＬＡ（２５μＭ、ＲＨ緩衝液に溶解，東京化成）６０μＬ（終濃度が１μＭ）を添加した。細胞保護薬（１００μＭ  シクロスポリンＡ、又は１０μＭ  ラサギリン）を添加する場合は、ＭＣＬＡと一緒に細胞懸濁液に１５μＬ添加した。添加後、３７℃で７分間置き、温度を平衡化した。
【０１１４】
（５）ミトコンドリア膜透過性亢進剤による処理、並びにカルシウムイオン量及び活性酸素量の測定
上記のとおり温度を平衡化した細胞懸濁液を蛍光セル（キュベット）に入れ、図５に示す蛍光及び化学発光の同時測定装置にセットし、測定時間を設定した（０．５秒／ポイント×１５００ポイント）。ミトコンドリア膜透過性亢進剤（５００〜１００μＭＰＫ１１１９５）を添加する場合は、この段階で１５μＬ添加した。測定に用いた反応液の組成例を表１に示す。なお、溶媒はエタノールである。
【表１】
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【０１１５】
カルシウムイオン量及び活性酸素量は、図５に示す蛍光及び化学発光の同時測定装置により蛍光及び化学発光を検出することにより測定した。図５に示す測定装置１００は、ＬＥＤ光源１（５００ｎｍ）から放出された励起光が、バンドパスフィルター２、開口部３及びレンズ４を介してブロックヒーター５にセットされたキュベット６に照射される。キュベット６内には上記反応液が入っている。反応液から放出された蛍光及び化学発光は、レンズ７、バンド阻止フィルター８及びシャッター９を介して検出器１０に導かれる。検出器１０で蛍光及び化学発光量を定量する。測定装置１００は、上述の構成が暗箱５０内に備えられている。
【０１１６】
〔２．ＰＫ１１１９５による細胞質内のＣａ２＋及び反応液中のＯ２−量の増加（１）〕
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＢｃｌ−２過剰発現細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤としてＰＫ１１１９５を添加し、上述の実験方法に従って、細胞質内のＣａ２＋及び反応液中のＯ２−量を測定した。結果を図１に示す。
【０１１７】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５を添加した場合（図１（Ａ）中、「ＩＩ」と表示。ＰＫ１１１９５（ＣＬ）又はＰＫ１１１９５（ＦＬ）で示される曲線。）、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量共に増加が見られた。一方、ＰＫ１１１９５を添加していない対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ではこのような増加はなかった（図１（Ａ）中、「Ｉ」と表示。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＬ）又はＣｏｎｔｒｏｌ（ＦＬ）で示される曲線。）。なお、図１〜４中「ＣＬ」は化学発光を意味し、「ＦＬ」は蛍光を意味する。
【０１１８】
一方、Ｂｃｌ−２過剰発現細胞は、ＰＫ１１１９５を添加した場合（図１（Ｂ）中、「ＩＩ」と表示。ＰＫ１１１９５（ＣＬ）又はＰＫ１１１９５（ＦＬ）で示される曲線。）も、添加していない場合（図１（Ｂ）中、「Ｉ」と表示。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＬ）又はＣｏｎｔｒｏｌ（ＦＬ）で示される曲線。）も細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量の増加はなかった。
【０１１９】
図１（Ｃ）は、図１（Ａ）及び（Ｂ）における３７３〜３７７．５秒のＣａ２＋のシグナルの積算値を示すグラフである。図１（Ｄ）は、図１（Ａ）及び（Ｂ）における３７３〜３７７．５秒のＯ２−のシグナルの積算値を示すグラフである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ｗｉｌｄ）では、ＰＫ１１１９５の添加により、有意に細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量共に増加した。一方、Ｂｃｌ−２過剰発現細胞（Ｂｃｌ−２）では、ＰＫ１１１９５を添加しても細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量に有意差はなかった。
【０１２０】
Ｂｃｌ−２はミトコンドリア外膜で発現しＰＴＰの開口による膜透過性の増加を阻止することが知られている。また、Ｂｃｌ−２をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に過剰発現させると、膜透過性の増加、及びその下流のアポトーシスシグナルの活性化を阻害し、細胞死が阻止されるという報告がある（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００２年，８２（４），ｐｐ．９１３−９２３）。したがって、これらの結果は、ＰＫ１１１９５の添加による細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量の増加がＰＴＰの開口を介していることを証明している。
【０１２１】
〔３．ＰＫ１１１９５による細胞質内のＣａ２＋及び反応液中のＯ２−量の増加（２）〕
ＰＫ１１１９５の添加による細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量の増加がＰＴＰの開口を介していることを更に証明するため、シクロスポリンＡ（細胞保護薬）の添加による影響を解析した。シクロスポリンＡは、ミトコンドリア内膜に存在しＰＴＰを構成するアデニンヌクレオチド転移酵素（ＡＮＴ）を阻害し、ＰＴＰが形成されることを阻害することが知られている。
【０１２２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤としてＰＫ１１１９５を、細胞保護薬としてシクロスポリンＡを添加し、上述の実験方法に従って、細胞質内のＣａ２＋及び反応液中のＯ２−量を測定した。結果を図２に示す。
【０１２３】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５のみを添加した場合（図２（Ａ）中、「ＩＩ」と表示。ＰＫ１１１９５（ＣＬ）又はＰＫ１１１９５（ＦＬ）で示される曲線。）、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量共に増加が見られた。ＰＫ１１１９５もシクロスポリンＡも添加していない対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ではこのような増加はなかった（図２（Ａ）中、「ＩＶ」と表示。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＬ）又はＣｏｎｔｒｏｌ（ＦＬ）で示される曲線。）。また、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５とシクロスポリンＡの両方を添加した場合（図２（Ａ）中「ＩＩＩ」と表示。ＰＫ＋ＣｙｓＡ（ＣＬ）又はＰＫ＋ＣｙｓＡ（ＦＬ）で示される曲線。）、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量共に増加が見られたものの、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５のみを添加した場合と比べて、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量は減少した。また、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にシクロスポリンＡのみを添加した場合、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量に有意な増加は見られなかった（図２（Ａ）中、「Ｉ」と表示。ＣｙｓＡ（ＣＬ）又はＣｙｓＡ（ＦＬ）で示される曲線。）。
【０１２４】
図２（Ｂ）は、図２（Ａ）における３７３〜３７７．５秒のＣａ２＋のシグナルの積算値を示すグラフである。図２（Ｃ）は、図２（Ａ）における３７３〜３７７．５秒のＯ２−のシグナルの積算値を示すグラフである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５とシクロスポリンＡの両方を添加した場合、ＰＫ１１１９５のみを添加した場合と比べて、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量は有意に減少した。
【０１２５】
この結果は、図１の結果とともに、今回観察された細胞質内のＣａ２＋量の増加がミトコンドリアＣａ２＋プールに存在し、ＰＴＰの開口で細胞質に流出したＣａ２＋に由来することを示している。また反応液中の活性酸素種（Ｏ２−）の生成が、ミトコンドリア膜透過性の亢進によることが明らかとなった。
【０１２６】
〔４．ラサギリンによる細胞質内のＣａ２＋量の制御〕
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にミトコンドリア膜透過性亢進剤としてＰＫ１１１９５を、細胞保護薬としてラサギリンを添加し、上述の実験方法に従って、細胞質内のＣａ２＋量を測定した。結果を図３に示す。
【０１２７】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に５００μＭ、２５０μＭ又は１００μＭ  ＰＫ１１１９５のみを添加した場合（図３（Ａ）中、それぞれ「ＩＩ」、「ＩＩＩ」及び「ＩＶ」と表示。）、細胞質内のＣａ２＋量に増加が見られた。ＰＫ１１１９５もラサギリンも添加していない対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図３（Ａ）中、「Ｉ」と表示）、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に１０μＭラサギリンのみを添加した場合（図３（Ｂ）中、「Ｉ」と表示。）ではこのような増加はなかった。また、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に５００μＭ  ＰＫ１１１９５と１０μＭラサギリンの両方を添加した場合（図３（Ｂ）中、「ＩＩＩ」と表示）、及び２５０μＭ  ＰＫ１１１９５と１０μＭラサギリンの両方を添加した場合（図３（Ｂ）中、「Ｖ」と表示）は、細胞質内のＣａ２＋量に増加が見られたものの、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５のみを添加した場合と比べて（図３（Ｂ）中、「ＩＩ」（５００μＭ）又は「ＩＶ」（２５０μＭ）と表示。）、細胞質内のＣａ２＋量は減少した。なお、図３（Ｂ）中、「Ｉ」と表示した曲線は、１０μＭラサギリンのみを添加した場合のものである。
【０１２８】
図３（Ｃ）は、図３（Ａ）及び（Ｂ）における３７３〜３７７．５秒のＣａ２＋のシグナルの積算値を示すグラフである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５とラサギリンの両方を添加した場合、ＰＫ１１１９５のみを添加した場合と比べて、細胞質内のＣａ２＋量は有意に減少した。また、この減少はＰＫ１１１９５及びラサギリンの濃度に依存していた。
【０１２９】
ラサギリンは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、又はその他の培養細胞を用いた細胞実験、さらに動物実験でもＰＫ１１１９５等のＰＴＰ形成を促進する物質、神経毒、酸化ストレス、虚血、神経栄養因子の除去等による神経細胞死から神経細胞を保護しているという報告がある（非特許文献１、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１２年，１２（２０），ｐｐ．２１７７−２１８８、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．，１３（６），ｐｐ．６７１−６８４）。
【０１３０】
〔５．ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング〕
食品成分であるセサミン（ＳＭ）及びセサミノール（ＳＭＬ）を被験物質として、ミトコンドリア膜透過性の亢進抑制活性を評価した。
【０１３１】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１００μＭセサミン（長良サイエンス株式会社製）、又はセサミノール（長良サイエンス株式会社製）に接触させる前処理を行った。次いで、ミトコンドリア膜透過性亢進剤としてＰＫ１１１９５を添加し、上述の実験方法に従って、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量を測定した。結果を図４に示す。
【０１３２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５のみを添加した場合（図４（Ａ）中、「Ｉ」と表示。図４（Ｂ）中、「Ｉ」と表示。ＰＫ１１１９５（ＣＬ）又はＰＫ１１１９５（ＦＬ）で示される曲線。）、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量共に増加が見られた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５とセサミノールの両方を添加した場合（図４（Ａ）中「ＩＩ」と表示。ＰＫ１１１９５＋ＳＭＬ（ＣＬ）又はＰＫ１１１９５＋ＳＭＬ（ＦＬ）で示される曲線。）、及びＰＫ１１１９５とセサミンの両方を添加した場合（図４（Ｂ）中「ＩＩ」と表示。ＰＫ＋ＳＭ（ＣＬ）又はＰＫ＋ＳＭ（ＦＬ）で示される曲線。）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＫ１１１９５のみを添加した場合と比べて、細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量は減少した。なお、図４（Ａ）中、ＳＭＬ（ＣＬ）又はＳＭＬ（ＦＬ）（「ＩＩＩ」と表示。）と表示した曲線は、セサミノールのみを添加した場合のものである。同様に、図４（Ｂ）中、ＳＭ（ＣＬ）又はＳＭ（ＦＬ）（「ＩＩＩ」と表示。）と表示した曲線は、セサミンのみを添加した場合のものである。
【０１３３】
図４（Ｃ）は、図４（Ａ）及び（Ｂ）における３７３〜３７７．５秒のＣａ２＋のシグナルの積算値を示すグラフである。図４（Ｄ）は、図４（Ａ）及び（Ｂ）における３７３〜３７７．５秒のＯ２−のシグナルの積算値を示すグラフである。セサミン又はセサミノールを添加することによる細胞質内のＣａ２＋量及び反応液中のＯ２−量の減少は統計上有意であった。
【０１３４】
この結果は、セサミン及びセサミノールには、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する作用があることを示している。
【符号の説明】
【０１３５】
１…ＬＥＤ光源、２…バンドパスフィルター、３…開口部、４…レンズ、５…ブロックヒーター、６…キュベット、７…レンズ、８…バンド阻止フィルター、９…シャッター、１０…検出器、５０…暗箱、１００…測定装置。
【図１】
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【図２】
0006468781.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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