(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの六量体を含んで成る、組換え又は合成脱アミド化グリアジンを含んで成るセリアック病を検出するための抗原であって、各ペプチドが配列番号１の配列を有する、前記抗原。
【請求項２】
前記六量体が各ペプチドを分離するスペーサーを含んで成る、請求項１に記載の抗原。
【請求項３】
前記スペーサーが配列番号２の配列を有する、請求項２に記載の抗原。
【請求項４】
前記六量体が配列番号３の配列を有するか、又は配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の抗原。
【請求項５】
前記組換え又は合成脱アミド化グリアジンは、タグに共有結合により連結されて、グリアジン融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の抗原。
【請求項６】
前記タグがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＨｉｓタグから成る群から選択される、請求項５に記載の抗原。
【請求項７】
前記Ｈｉｓタグが、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から成る群から選択される配列を有する、請求項６に記載の抗原。
【請求項８】
前記組換え脱アミド化グリアジンが、配列番号７及び配列番号８から成る群から選択される配列を有する、請求項７に記載の抗原。
【請求項９】
前記タグがＧＳＴである、請求項６に記載の抗原。
【請求項１０】
前記抗原が更に組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）を含んでなり、ｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体を形成する、請求項５に記載の抗原。
【請求項１１】
架橋剤によって、前記ｔＴＧと前記グリアジン融合タンパク質が共有結合により連結されている、請求項１０に記載の抗原。
【請求項１２】
前記架橋剤がヘテロ二官能性架橋剤及びホモ二官能性架橋剤から成る群から選択されるメンバーである、請求項１１に記載の抗原。
【請求項１３】
前記架橋剤がホモ二官能性架橋剤である、請求項１２に記載の抗原。
【請求項１４】
前記架橋剤が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ジチオビス（スクシンイミジル）プロピオネート（ＤＳＰ）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ又はＥＤＡＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、ヒドロキシルアミン及びスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）、並びにスルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）から成る群から選択されるメンバーである、請求項１３に記載の抗原。
【請求項１５】
前記架橋剤がビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）である、請求項１４に記載の抗原。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗原をコードする、単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号９の配列を含む、請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１６に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１に記載の抗原；
検出試薬；並びに
任意に、バッファー、塩、安定剤及び取扱説明書から成る群から選択される少なくとも１つのメンバー、
を含んで成る、セリアック病を検出するためのキット。
【請求項２１】
対象のセリアック病の検査方法であって：
（ａ）前記対象からの体液のサンプルを、請求項１に記載の抗原と接触させ、そして
（ｂ）前記抗原に特異的に結合するようになった任意の抗体を検出し、これにより、前記対象におけるセリアック病の存在を示すこと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出ステップが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び免疫蛍光アッセイから成る群から選択されるアッセイを使用しておこなわれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原に特異的な抗体がＩｇＧ及びＩｇＡから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月５日に出願された米国特許仮出願第６１／５６７，０６０号の優先権の利益を主張するものであり、その全部を参照により本明細書中に援用する。
「配列表」、表、又はＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出したコンピュータプログラム一覧表付録の参照
【０００２】
２０１２年１１月２８日に作成した、１２，２８８バイト、ＩＢＭ−ＰＣマシンフォーマット、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステムのファイル９３９−１ＰＣ．ＴＸＴに記載した配列表を、その全体をあらゆる目的のために参照により本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００３】
セリアック病(Celiac disease)（ＣＤ）とは、強い遺伝的要素を持った重篤な胃腸疾患である。ＣＤは小麦、大麦、ライ麦及びオート麦からのタンパク質の永久的な不耐容性を特徴とする。ＣＤの生理病理学は完全に理解されていないが、患者の食事に含まれる毒性タンパク質の存在が、完全又は部分的な腸粘膜の損傷を引き起こし（Brandtzaeg, P. 1997. Mechanisms of gastrointestinal reactions to food. Environmental Toxicology and Pharmacology 4;9-24）、こうして重篤な吸収不良症候群につながり、下痢、嘔吐、腹痛、食欲不振、発育遅延、栄養失調及び貧血を引き起こすことは明らかである。非診断及び未治療の患者において、ＣＤは腸癌になる一層高いリスクと関連づけられている（Holmes GKT, 1989. Malignancy in coeliac disease-effect of a gluten-free diet, Gut 30;333-338）。ＣＤは主に３歳未満の子供が罹患するが、大人でも一般的に見られ、時には臨床的に非定型性又は無症候性である（Ferguson A他、1992. Definitions and diagnostic criteria of latent and potential coeliac disease. Ed by Aurricchio S, Visakorpi J K, in Epidemiology of CD. Dyn Nutr Res, Basel, Karger 2; 119-127）。ＣＤは、例えば、インスリン依存性真性糖尿病、ダウン症候群、選択的ＩｇＡ欠損症及び疱疹状皮膚炎等の他の遺伝疾患又は自己免疫疾患を有する患者においてより頻繁に見られる（Sirgus N et al. 1993. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents in Sweden. Acta Pediatr 66;491-494; Zubillaga P et al. 1993. Down syndrome and coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 16: 168-171; Boyce N 1997）。
【０００４】
ＣＤの臨床症状は他の胃腸疾患のものと混同する場合がある。これらの場合、ＣＤと誤診され、患者は特別な治療、即ち、食事に含まれるグルテンの完全除去を受けないままでいる。一方、非セリアック病患者がセリアック病と誤診された場合、一生に渡って不必要な無グルテン食を与え続けられる。よって、正確なＣＤの診断が必要不可欠である。現在、ＣＤ診断の基準は、臨床症状の発現、数ヶ月の無グルテン食後、グルテンを試した後での繰り返し３回に渡る腸生検である。
【０００５】
腸生検は侵襲的方法であり、正確な血清検査が開発されたことから、上記診断基準は修正されている（Walker-Smith他、1990. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of Working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child 65:909-911）。現在、臨床症状の発現時に血清検査を行うことができ、それが陽性であった場合、確認腸生検が指示される。無グルテン食による治療に対する反応後に血清検査を行うこともできる。治療の臨床反応と血清検査の結果に矛盾が生じた場合、第２の腸生検が指示される。例えば、細胞性抗原に対する抗体又はグリアジン等の食物抗原に対する抗体の検出等のいくつかの血清検査が、セリアック病のために開発されている。抗筋内膜抗体、抗レチクリン抗体、抗グリアジン抗体、及び抗組織トランスグルタミナーゼ抗体の検出のための診断キットがある。
【０００６】
ＣＤの血清学的診断のために、抗グリアジン抗体（ＡＧＡ）が幅広く用いられている（Stern M他、1996. Validation and standardization of serological screening tests for coeliac disease in 1996. 第３版EMRC/ESPGAN Workshop, Dec 5-8, 1996, Molsheim, France, pp:9-24; Catassi C他、1999. Quantitative antigliadin antibody measurement in clinical practice: an Italian multicenter study. Ital J Gastroenterol Hapatol 31; 366-370）。ＡＧＡは、ＩＦＡ（間接免疫蛍光抗体測定法）より簡単で、より客観的な方法であるＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）によって主に検出され、多数のサンプルの分析に用いることができる。しかし、ＡＧＡは筋内膜抗体（ＥＭＡ）よりＣＤに対する特異性が低く、ＩｇＡ又はＩｇＧイソタイプに対する抗体の検出には２つの独立した測定法が必要である。近年、これらの問題をいくつか解決する、ＡＧＡの検出のための視覚免疫測定法が報告されている（Garrote J A, Sorell L, Alfonso P他、1999. A simple visual immunoassay for the screening of coeliac disease. Eur. J Clin Invest 29; 697-699; Spanish Office for Patents and Marks No.9801067）。
【０００７】
１９９７年にDietrichらが８５kDaタンパク質である組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）を抗筋内膜抗体により検出される主な自己抗原として同定した（Dietrich W他. 1997. Identification of tissue transglutaminase as the auto antigen of celiac disease. Nat Med. 3:797-801）。モルモット肝抽出物のｔＴＧ又は異なる組織からクローニングされた組換えヒトｔＴＧを基礎として、ＥＬＩＳＡ又は放射性リガンド（ＲＬＡ）形式での抗ｔＴＧ抗体の検出が最近報告された（Sulkanen S他、1998. Tissue transglutaminase autoantibody enzyme-linked immunosorbent assay in detecting celiac disease. Gastroenterology 115:1322-1328; Siessler J et al. 1999. Antibodies to human recombinant tissue transglutaminase measured by radioligand assay: Evidence for high diagnostic sensitivity for celiac disease. Horm Metab Res 31; 375-379）。
【０００８】
セリアック病の検出のための先行技術方法では、測定法において特異的グリアジンエピトープ又はグリアジンタンパク質の一部分が用いられ、偽陰性及び偽陽性の両方を引き起こす。セリアック病のためのより正確な測定法を提供する、エピトープのより包括的なセットを含む新規な抗原を提供する測定法が必要とされている。驚くべきことに、本発明は本ニーズ及び他のニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００９】
一実施形態において、本発明は、セリアック病を検出するための抗原を提供する。前記抗原は、それぞれ配列番号１を有するペプチドの六量体を有する組換え脱アミド化グリアジンを含むが、ここで前記組換え脱アミド化グリアジンは、タグに共有結合により連結されて、グリアジン融合タンパク質を形成し、ここで前記グリアジン融合タンパク質は、固相支持体上に固定され、且つ、ここで前記組換え脱アミド化グリアジンは、抗脱アミド化グリアジン抗体に結合することができる。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、固体支持体にグリアジン融合タンパク質を接触させることを含む調製方法によって調製されたセリアック病を検出するための抗原を提供し、ここで前記グリアジン融合タンパク質は、それぞれ配列番号１を有するペプチドの六量体を有する組換え脱アミド化グリアジンを含み、且つ、ここで前記グリアジン融合タンパク質が固相支持体上に固定されるように、前記組換え脱アミド化グリアジンがタグに共有結合により連結される。これにより、セリアック病を検出するための抗原が調製される。
【００１１】
ある他の実施形態において、本発明は、対象のセリアック病を診断する方法を提供する。前記方法は、対象からの体液のサンプルを、配列番号３の六量体を含んで成る組換え脱アミド化グリアジンを含む本発明の抗原と接触させることを含む。前記方法はまた、前記抗原に特異的に結合するようになったいずれかの抗体を検出し、これにより、対象のセリアック病の存在を示すことも含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗原を含んで成るキットを提供し、ここで前記組換え脱アミド化グリアジンは、配列番号３の六量体、検出試薬、並びに任意にバッファー、塩、安定剤、及び取扱説明書のうち少なくとも１つを含んで成る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｄ２六量体 (hexamer)の精製を示す。
【図２】ＤＧＰ六量体のコーティング力価測定：キャリブレーターカットオフシグナル相対蛍光強度（ＲＦＩ）を示す。
【図３】１４位にグルタミン酸残基に代えてリジンを有するＤＧＰ六量体のコーティング力価測定：キャリブレーターカットオフシグナルＲＦＩを示す。
【図４】ｒＤＧＰ六量体が、ｒＤＧＰ三量体 (trimer)と比較して改善された感度を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる時、用語「接触させる」とは、反応できるように少なくとも２つの異なる種を接触させる過程をいう。結果として生じた反応生成物は、加えた試薬間の反応から直接に又は反応混合物中で生成できる１以上の加えた試薬の中間体から生成されたものである。
【００１５】
本明細書で用いられる時、用語「体液」とは哺乳類の流体を意味し、これだけに限定されるものではないが例として房水、胆汁、血液及び血漿、母乳、間質液、リンパ、粘液、胸膜液、膿、唾液、血清、汗、涙、尿、脳脊髄液、滑液又は細胞内液が挙げられる。他の体液も本発明において有用であることが、当業者に理解される。
【００１６】
本明細書で用いられる時、用語「架橋剤」とは、２つの別個の成分を結合することができる二官能性又は多機能性の化学的又は生物学的成分を意味する。本発明において有用な架橋剤の例を後述する。
【００１７】
本明細書で用いられる時、「抗体」には、特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子への言及が含まれ、それらとしてはポリクローナル及びモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１８】
本明細書で用いられる時、用語「対象」とは霊長類（例えば、ヒト）、乳牛、羊、ヤギ、馬、犬、猫、ウサギ、ラット、マウス等を含む哺乳類等の動物を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる時、用語「固定」とは、共有結合形成、イオン結合形成、水素結合、双極子間相互作用又はファンデルワールス相互作用を介したｔＴＧ、グリアジン融合タンパク質又はｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体と固相支持物質との会合を意味する。固定は一時的又は永久的なものとすることができる。
【００２０】
本明細書で用いられる時、用語「抗原」とは、抗体産生による等の免疫応答を刺激することのできる分子を意味する。本発明の抗原には、固相支持体固定グリアジン融合タンパク質及び固相支持体固定ｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体が含まれる。本発明のグリアジン融合タンパク質には、組換え脱アミド化グリアジン及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質等のタグの両方を含むことができる。
【００２１】
本明細書で用いられる時、用語「バッファー」とは、ｐＨの変化に耐え、所望の度合いでｐＨを維持する任意の無機又は有機酸又は塩基を意味する。本発明に有用な緩衝剤として、これだけに限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム及びそれらの混合物が挙げられる。他の緩衝剤も本発明において有用であることが、当業者に理解される。
【００２２】
本明細書で用いられる時、用語「組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）」とは、リジン残基のアミノ基及びグルタミン残基のカルボキサミド基間のタンパク質を架橋するトランスグルタミナーゼファミリーの酵素を意味する。これにより分子間又は分子内結合が生成される。セリアック病を検出するためにｔＴＧを用いることができる。
【００２３】
本明細書で用いられる時、用語「グリアジン融合タンパク質」とは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＨｉｓタグ等のタグに結合されたグリアジンタンパク質を意味する。グリアジンタンパク質には、数ある中で組換えグリアジンタンパク質又は合成グリアジンタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、グリアジンタンパク質は脱アミド化されている。通常、タグは、精製、可溶化、クロマトグラフィーのための親和性タグ、エピトープタグ、蛍光タグ及びその他に用いることができる他のタンパク質又は化合物である。本発明において有用なタグとして、これだけに限定されるものではないが、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ ＩＩ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｔ７タグ、エラスチン様ペプチド、キチン結合ドメイン及びキシラナーゼ１０Aが挙げられる。他のタンパク質も本発明の融合タンパク質において有用であることは、当業者に理解されよう。
【００２４】
本明細書で用いられる時、用語「ｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体」とは、ｔＴＧとグリアジン融合タンパク質が一緒に結合された時に形成される複合体を意味する。様々な反応の下、様々な方法でｔＴＧとグリアジン融合タンパク質が結合できる。ｔＴＧはタグ及びグリアジン融合タンパク質の組換え脱アミド化グリアジンの両方又はいずれか一方に結合することができる。
【００２５】
本明細書で用いられる時、用語「組換え脱アミド化グリアジン」とは、遺伝子操作を介して作製された脱アミド化グリアジンタンパク質を意味する。脱アミドタンパク質は、グルタミンからグルタミン酸への変換等、遊離アミド基のいくつか又は全てがカルボン酸へ加水分解されたものである。いくつかの実施形態において、本発明において有用な組換え脱アミド化グリアジンは、配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するペプチドを含んで成るか、又は配列番号３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する六量体を含んで成る。
【００２６】
本明細書で用いられる時、用語「架橋」とは、２つの異なる化学成分の間の１以上の結合の形成を意味する。本発明において、化学的成分は、タンパク質、酵素、抗体等の生物学的種又は固相支持体物質であることができる。架橋された各化学成分を連結する化学官能性を「架橋剤」と呼ぶ。通常、架橋剤は、１つの化学成分上で１つの反応性官能基と、他の化学成分上で１つの反応性官能基と反応し、それによって２つの化学成分を互いに結合する二官能性化合物である。架橋剤は、ホモ二官能性架橋剤又はヘテロ二官能性架橋剤とすることができる。ホモ二官能性架橋剤は、各化学成分と反応するホモ二官能性架橋剤の官能基が同じである。ヘテロ二官能性架橋剤は、各化学成分と反応するヘテロ二官能性架橋剤の官能基が異なる。本発明の好ましいホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤について、以下に詳細に説明する。
【００２７】
本明細書で用いられる時、２以上の核酸又はポリペプチド配列との関係において、用語「同一」又は％「同一性」とは、比較ウィンドウ又は次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて又は手動アラインメント及び外観検査によって測定された指定領域上で最大一致となるよう比較及び整列された場合の、同じ又は同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の％を有する２以上の配列又は部分配列を意味する（即ち６０％同一性、好ましくは特定の領域において６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性）。このような配列は「実質的に同一」であるという。この定義は試験配列の相補鎖についても用いられる。
【００２８】
２つの核酸又はポリペプチドとの関係において、語句「実質的に同一」とは、参照配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列又は部分配列を意味する。あるいは、％同一性を４０％から１００％のうちの任意の整数とすることができる。更に好ましい実施形態において、ここで記載されるプログラムを用いて参照配列と比較して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。以下に記載するように標準パラメーターを用いたＢＬＡＳＴが好ましい。
【００２９】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が試験配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験及び参照配列がコンピューターに入力され、必要である場合に部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができ、又は他のパラメーターを指定することができる。そして、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターを基にして、参照配列と比較した試験配列のパーセント配列同一性を計算する。核酸及びタンパク質の配列比較のために、以下に説明するＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム及びデフォルトパラメーターが用いられる。
【００３０】
％配列同一性及び配列同一性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例として、Altschul他, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 （1977）及びAltschul他, J. MoI. Biol. 215:403-410 （1990）にそれぞれ記載されたＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。本発明の核酸及びタンパク質の％配列同一性を決定するために、ここで記載されたパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０が用いられる。全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアが公的に入手可能である。このアルゴリズムは最初に、データベース中の同じ長さのワードと整列した場合にいくつかの正の値の閾値スコア（positive-valued threshold score）と一致するか又は満たす、問い合わせ配列中の長さがＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（HSPs; high scoring sequence pairs）を同定する。Ｔは近傍ワードスコア閾値を意味する（Altschul他、前掲）。これら最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一対の一致残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対する罰則スコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下した場合；負のスコアを有する残基アライメントが１つ以上累積したことにより累積スコアが０以下になった場合；又はいずれかの配列の最後に達した場合には、各方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸにより、アライメントの感度および速度が決定づけられる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、既定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３及び期待値（Ｅ）１０を既定値として用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 （1989）を参照）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を既定値として用いる。
【００３１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787 （1993）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性に関する１つの測定値が、最小総和確率（Ｐ（Ｎ））であって、これは２つのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じたものである確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小総和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、更に好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考えられる。
【００３２】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるとの指標は、以下に記載するように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。このため、ポリペプチドは通常、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるとの他の指標は、緊縮条件の下で２つの分子又はそれらの相補鎖が互いにハイブリッド形成することである。２つの核酸配列が実質的に同一であるとの更に他の指標は、配列を増幅するのに同じプライマーを用いることができることである。
【００３３】
本明細書で用いられる時、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は同意語として用いられ、５’から３’末端まで読みとったデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本又は二本鎖ポリマーを意味する。例えば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又は０-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照）；並びにペプチド核酸骨格及び連結を含む代替の骨格を有し得る核酸類似体を時には用いてもよいが、本発明の核酸は一般的にリン酸ジエステル結合を含む。他の核酸類似体には、正骨格；非イオン性骨格及び非リボース骨格が含まれる。このため、核酸又はポリヌクレオチドはポリメラーゼによる正しい読み取りを可能とする修飾されたヌクレオチドも含んでよい。「ポリヌクレオチド配列」又は「核酸配列」には、核酸のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が個々の一本鎖として又は二重鎖の中に含まれる。当業者に理解されるように、一本鎖の説明によって相補鎖の配列もが定義され、このためここで記載される配列は対応する配列も提供する。他に示されない限り、特定の核酸配列は黙示的にその変異体（例えば、縮重コドン置換）、相補配列及び明確に示された配列を包含する。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ又はハイブリッドでもよく、ここで核酸はデオキシリボ及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等の塩基の組み合わせを含んでいてもよい。
【００３４】
本明細書で用いられる時、語句「〜をコードする核酸配列」とは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等の構造的ＲＮＡの配列情報又は特異タンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列の配列情報、並びにトランス作用調節剤の結合部位の配列情報を含む核酸を意味する。この語句は天然配列又は特定の宿主細胞におけるコドン選択と一致するように導入された配列の縮重コドン（即ち、単一のアミノ酸をコードする異なるコドン）を特に包含する。
【００３５】
本明細書で用いられる時、用語「特異的な結合」とは、セリアック病の存在を示す抗体による本発明の抗原の捕捉又は取り込みを意味する。これにより、指示された免疫学的アッセイ条件の下で、抗体（例えば、抗脱アミド化グリアジン抗体）は、バックグラウンドレベルを少なくとも２倍上回って、より典型的には、バックグラウンドレベルを少なくとも５、１０、２０、３０、４０、又は５０倍上回って本発明の抗原に結合する。さまざまな免疫学的アッセイ形式が、抗体が本発明の抗原に特異的に結合するか否かを決定するのに使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、抗体がタンパク質と特異的に免疫反応するか否かを決定するのに日常的に使用される（例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイ形式及び条件の説明について、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual （1998）を参照）。
【００３６】
ＩＩ．抗原
本発明はセリアック病を検出するための抗原及び方法を提供する。抗原には固相支持体物質上に固定されたグリアジン融合タンパク質が含まれる。グリアジン融合タンパク質には組換え脱アミド化グリアジン及びタグの両方が含まれる。任意に抗原は組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）を含むことができる。存在する場合、ｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体を形成するために、固相支持体に固定される前に、例えばアミノ基転移を通してグリアジン融合タンパク質とｔＴＧとを共有結合することができる。固相支持体にｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質を固定した後に、好適な架橋剤を用いてグリアジン融合タンパク質とｔＴＧとを架橋することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明はセリアック病を検出するための抗原を提供する。本発明の抗原には、後述する固相支持体に結合したグリアジン融合タンパク質が含まれる。
【００３８】
他の実施形態において、本発明は、セリアック病を検出するための抗原を提供する。前記抗原は、それぞれ配列番号１の配列を有するペプチドの六量体を有する組換え脱アミド化グリアジンを含むが、ここで前記組換え脱アミド化グリアジンは、タグに共有結合により連結されて、グリアジンが融合タンパク質を形成し、ここで前記グリアジン融合タンパク質は、固相支持体上に固定され、且つ、ここで前記組換え脱アミド化グリアジンは、抗脱アミド化グリアジン抗体に結合することができる。
【００３９】
Ａ．グリアジン融合タンパク質
本発明において有用なグリアジン融合タンパク質は、タグ付与タンパク質として発現される組換え脱アミド化グリアジンを含む。多くの組換えグリアジンタンパク質が本発明の調製方法において有用であることが、当業者に認識される。いくつかの実施形態において、組換えグリアジンタンパク質はＤ２（Aleanzi et al, Clin Chem 2001, 47 （11）, 2023）、ペプチド配列：QPEQPQQSFPEQERPF（配列番号１）を含むことができる。組換えグリアジンタンパク質は、以下の式：
Ｘ1ＰＸ2Ｘ3ＰＸ4Ｘ5ＳＦＰＸ6Ｘ7Ｘ8ＲＰＦ（配列番号１２）
｛式中、各Ｘはグルタミン（Ｑ）又はグルタミン酸（Ｅ）のいずれかであって、少なくとも１つのＸはグルタミンであり、少なくとも１つのＸはグルタミン酸である｝で表されるＤ２の変異体をも含むことができる。本発明の組換えグリアジンタンパク質は、Ｄ２又はその変異体の六量体とすることもできる。いくつかの実施形態において、本発明の組換えグリアジンタンパク質は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２）等のいずれかの好適なスペーサーで分離されているＤ２又はその変異体の六量体とすることもできる。本発明において他のスペーサーも有用であることが当業者に理解される。
【００４０】
あらゆる好適なスペーサーが本発明において有用であり、そして、リンカーと代替可能である。典型的なペプチドスペーサ配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、及びＴｈｒ残基を含んでいる。有効スペーサーとしては、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１４）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５）｛式中、ｎは少なくとも１つの整数である｝を含んで成るグリシン−セリン重合体；グリシン−アラニン重合体；アラニン−セリン重合体；他のフレキシブルリンカーが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記六量体は、配列番号１の配列を有する各ペプチドを分離するスペーサーを含んでいる。他の実施形態において、前記各スペーサーは、配列番号２の配列を有することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、組換え脱アミド化グリアジンは、Ｄ２六量体（配列番号３）である。他のいくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１又は配列番号３の配列のポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を提供する。本発明の組換え脱アミド化グリアジンタンパク質は抗脱アミド化グリアジン抗体に結合し、このためセリアック病等のグルテンに関連する障害を患っている対象を診断することができる。本発明において他の組換え脱アミド化グリアジンタンパク質も有用であることが、当業者に理解される。
【００４３】
グリアジン融合タンパク質にはタグも含まれる。当該技術分野において知られているあらゆるタグが、本発明のグリアジン融合タンパク質において有用である。本発明の抗原に好適なタグとして、これらだけに限定されるものではないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ ＩＩ、ＨＡタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、エラスチン様ペプチド、キチン結合ドメイン、チオレドキシン、キシラナーゼ１０Ａ、マルトース結合タンパク質及びＮｕｓＡが挙げられる。いくつかの実施形態において、タグは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＨｉｓタグである。本発明において他のタグが有用であることが、当業者に理解される。タグは、典型的には、共有結合を介して組換えグリアジンタンパク質に結合されている。
【００４４】
本発明で有用なＨｉｓタグは、あらゆる好適なＨｉｓタグであり得る。本発明で好適なＨｉｓタグとしては、これらだけに限定されるものではないが、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６の配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｈｉｓタグは、配列番号５又は配列番号６の配列であり得る。他の実施形態において、組換え脱アミド化グリアジンは、配列番号７又は配列番号８の配列であり得る。
【００４５】
他の実施形態において、タグはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質である。ＧＳＴタンパク質（配列番号１０）は、組換えグリアジンタンパク質の精製を可能にすることや、組換えグリアジンタンパク質にて表されるエピトープの提示等、様々な機能を果たす。
【００４６】
グリアジン融合タンパク質がＧＳＴを含み、組換え脱アミド化グリアジンがＤ２六量体である場合、グリアジン融合タンパク質は配列番号１１の配列で表される。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１１の配列のポリペプチドをコードするいずれか任意のヌクレオチド配列を提供する。本発明のグリアジン融合タンパク質は、記載した方法等の組換え方法を含む様々な方法で作製することができる。
【００４７】
グリアジン融合タンパク質の固相支持体上への固定は、当該技術分野で知られているいずれの方法でも達成できる。グリアジン融合タンパク質の固相支持体への固定は、共有又はイオン結合形成、水素結合、ファンデルワールス力及び抗体−抗原相互作用を通じて行うことができる。他の固定方法が本発明に有用であることが、当業者に理解される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、抗原は組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）も含む。ｔＴＧが存在する場合、ｔＴＧとグリアジン融合タンパク質はｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体を形成する。共有結合の形成、イオン結合、水素結合又はファンデルワールス相互作用等の様々な方法で、ｔＴＧとグリアジン融合タンパク質を結合することができる。ｔＴＧとグリアジン融合タンパク質が共有結合で結合された場合、アミド基転移等のさまざまな反応で共有結合を形成することができる。Ｃａ2+の存在中等、様々な条件下でアミド基転移が起こりうる。ｔＴＧは、タグ及びグリアジン融合タンパク質の組換え脱アミド化グリアジンのいずれか一方又は両方に結合することができる。グリアジン融合タンパク質の固定と同じ条件下で同時に、ｔＴＧが固相支持体に固定される。組織トランスグルタミナーゼは当業者に知られており、以前に発表されている。ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ ００４６０４及びＮＰ ９４５１８９（２００８年４月１３日）を参照。
【００４９】
他の実施形態において、ｔＴＧとグリアジン融合タンパク質は架橋剤により共有結合される。イオン結合、水素結合又はファンデルワールス力等を通して他の架橋方法も利用できることが、当業者に理解される。本発明においてあらゆる架橋剤が好適であることが、当業者に認識される。いくつかの実施形態において、架橋剤はヘテロ二官能性架橋剤及びホモ二官能性架橋剤からなる群より選ばれるメンバーである。更に他の実施形態において、架橋剤はホモ二官能性架橋剤である。更に他の実施形態において、架橋剤は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ジチオビス（スクシンイミジル）プロピオネート（ＤＳＰ）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、メチルＮ−スクシンイミジルアジペート（ＭＳＡ）、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ又はＥＤＡＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、ヒドロキシルアミン及びスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）、並びにスルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）からなる群より選ばれるメンバーである。他の実施形態において、架橋剤はビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）である。
【００５０】
更なる実施形態において、組換え脱アミド化グリアジンは配列番号３に対して９５％同一性を有する。比較ウィンドウ又は指定領域上で最大一致となるように比較及び整列された際に、特定の領域に対して６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性等の他のパーセント同一性が可能であることが、当業者に理解される。このような配列を「実質的に同一」であるという。配列番号３の配列に対していくつかの％同一性を有する本発明の組換え脱アミド化グリアジンは、セリアック病を検出するために、サンプル中の抗グリアジン抗体と結合することができる。いくつかの他の実施形態において、脱アミド化グリアジンは、配列番号３の配列を有する。
【００５１】
Ｂ．固相支持体
本発明の使用のための固相支持体物質は、次の性質によって特徴づけられる：（１）スクリーニングに用いられる液層中での不溶性；（２）他の全ての支持体から独立した三次元の移動性；（３）グリアジン融合タンパク質又はｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体の多数のコピーを含むこと；（４）スクリーニング検定条件への適合；及び（５）検定条件への不活性。好ましい支持体は、これらだけに限定されるものではないが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、炭酸塩、カルバミン酸塩、イソシアネート、スルホン、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホキシド等の反応性官能基をグリアジン融合タンパク質とｔＴＧの結合のために有する。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、固相支持体物質は特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ多数の支持体が利用でき、当業者に知られている。固相支持体として、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラス、プラスチック、又は磁性ビーズ等のビーズ、コットン、アルミナゲル、セファロース等の多糖類が挙げられる。他の固相支持体はＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートとすることができる。好適な固相支持体は、所望の最終用途及び様々な合成プロトコールへの適合性を基に選ぶことができる。例えば、ポリアミド合成において、有用な固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Bachem Inc., Peninsula Laboratories等から得られるPAM−樹脂）、ＰＯＬＹＨＹＰＥ（商標）樹脂（Aminotech, Canadaから得られる）、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから得られる）、ポリエチレングリコールに接合されたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Rapp Polymere, Tubingen, Germany）、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch, Californiaから入手可能）又はＰＥＧＡビーズ（Polymer Laboratoriesから得られる）等の樹脂とすることができる。特定の合成のための好ましい固相合成支持体は後述する。いくつかの実施形態において、固相支持体はビーズである。本発明において様々な種類の固相支持体が有用であることが、当業者に認識される。
【００５３】
Ｃ．組換え脱アミド化グリアジン抗原の作製方法
いくつかの実施形態において、本発明は、固体支持体にグリアジン融合タンパク質を接触させることを含む方法によって調製されたセリアック病を検出するための抗原を提供し、ここで前記グリアジン融合タンパク質は、それぞれ配列番号１の配列を有するペプチドの六量体を有する組換え脱アミド化グリアジンを含み、且つ、前記グリアジン融合タンパク質が固相支持体上に固定されるように、前記組換え脱アミド化グリアジンがタグに共有結合により連結される。これにより、セリアック病を検出するための抗原が調製される。
【００５４】
組換え脱アミド化グリアジン抗原を調製する方法は、上述したあらゆる組換え脱アミド化グリアジン抗原を調製できる。
【００５５】
タグは、上述した通りである。いくつかの実施形態において、タグはＧＳＴ又はＨｉｓタグである。他の実施形態において、タグはＧＳＴである。いくつかの実施形態において、グリアジン融合タンパク質は固相支持体上にタグを介して固定される。
【００５６】
固体支持体は、上述したとおりである。いくつかの実施形態において、固体支持体は磁性ビーズ等のビーズである。いくつかの実施形態において、固体支持体には、反応性官能基がある。
【００５７】
ｔＴＧが存在する場合、当該方法には、ｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体を形成して、接触段階の前に、グリアジン融合タンパク質とｔＴＧの間に共有結合を形成することも含むことができる。グリアジン融合タンパク質とｔＴＧの間に共有結合を形成する方法は、接触段階中及び／又はその後に行うこともできる。グリアジン融合タンパク質とｔＴＧの錯体形成は、当該技術分野で知られているいずれの方法によっても生じることができる。いくつかの実施形態において、共有結合を形成するために錯体形成はアミノ基転移によって起きる。
【００５８】
他の実施形態において、当該方法は、固相支持体を架橋剤と接触させて、グリアジン融合タンパク質とｔＴＧを架橋することを更に含む。他のいくつかの実施形態において、架橋剤はＧＳＴタンパク質をｔＴＧに架橋する。上述したもの等あらゆる架橋剤も本発明において有用であることが、当業者に理解される。架橋は、水素結合、共有結合又はイオン結合形成を通じて生じる。
【００５９】
１．一般的な組換え方法
組換え脱アミド化グリアジンポリペプチドを作製するために、本発明は組換え遺伝学の分野におけるルーチン技術を用いることができる。本発明の使用の一般的な方法を開示する基本的な教科書として、Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual （第３版, 2001）; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual （1990）;及びCurrent Protocols in Molecular Biology （Ausubel et al., eds., 1994-1999）が挙げられる。
【００６０】
組換え脱アミド化グリアジン又は例えば、組換え脱アミド化グリアジンと、ＧＳＴタグ又はＨｉｓタグ等のタグとを含む融合タンパク質は当該技術分野においてよく知られている技術を用いて発現することができる。動物細胞、昆虫細胞、細菌、真菌及び酵母等の真核及び原核宿主細胞を用いてもよい。単離核酸を発現させる際の宿主細胞の使用方法は当業者によく知られており、例えば前掲の一般参照文献中に見つけることができる。よって、本発明は、宿主細胞及び本願明細書に記載された核酸配列を含む発現ベクターのためにも提供する。
【００６１】
組換え脱アミド化グリアジンをコードする核酸又は、例えば、組換え脱アミド化グリアジンと、ＧＳＴタグ又はＨｉｓタグ等のタグとを含む、融合タンパク質をコードする核酸は、標準的な組換え又は合成技術を用いて作製することができる。核酸はＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらのハイブリッドでもよい。当業者は、同じポリペプチドをコードする核酸等の機能的に等価な核酸を含む様々なクローンを構築することができる。これら目的を達成するクローニング方法及び核酸の配列を確認する配列決定方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００６２】
いくつかの実施形態において、核酸はインビトロで合成される。デオキシヌクレオチドは、例えばNeedham-VanDevanter他, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 （1984）に記載された自動合成装置を用いて、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22（20）: 1859-1862 （1981）に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、化学合成することができる。他の実施形態において、例えばPCR等の増幅反応によって、所望のタンパク質をコードする核酸を得てもよい。
【００６３】
与えられたポリペプチド配列の改変体又は変異体を作製する他の多くの方法を、当業者は認識するだろう。通常、ポリペプチド配列は、対応する核酸配列を変化させて、ポリペプチドを発現させることにより改変される。
【００６４】
当業者は、本発明の所望の核酸又はポリペプチドを、ここで参照される配列及び組換え脱アミド化グリアジン構造及び機能に関する容易に利用できる知識を基にして選ぶことができる。これらタンパク質の物理的特性及び一般的な性質は、当業者に知られている。
【００６５】
組換え脱アミド化グリアジン、又は組換え脱アミド化グリアジンとＧＳＴタグ又はＨｉｓタグ等のタグとを含む融合タンパク質の高レベルな発現を得るために、転写を指令するプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位等のような要素を含む発現ベクターが構築される。好適な細菌プロモーターは当該技術分野においてよく知られており、例えば、上記で引用された発現クローニング法及びプロトコールを提供する参照文献に記載されている。リボヌクレアーゼを発現するための細菌発現系は、例えばＥ．コリ（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）及びサルモネラ（Salmonella）で利用可能である（Palva他, Gene 22:229-235 （1983）; Mosbach他, Nature 302:543-545 （1983）も参照）。このような発現システムのためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系が当該技術分野において知られており、市販もされている。
【００６６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは通常、転写ユニット又は宿主細胞における核酸の発現に必要な追加の要素を全て含有する発現カセットを含む。このため、典型的な発現カセットは、組換え脱アミド化グリアジン又は融合タンパク質（例えば組換え脱アミド化グリアジンＧＳＴ融合タンパク質）をコードする核酸配列に作用可能に結合したプロモーター、並びに転写産物の効率的ポリアデニル化、リボソーム結合部位及び翻訳終結に必要なシグナルを含む。発現系によっては、組換え脱アミド化グリアジン又は融合タンパク質（例えば組換え脱アミド化グリアジンＧＳＴ融合タンパク質）をコードする核酸配列は、形質転換細胞によるコードされたタンパク質の分泌を促進するために、開裂可能なシグナルペプチド配列に結合されてもよい。
【００６７】
上述したように、効率的な終結に備えるために、構造遺伝子の下流に転写終結も含むべきである。プロモーター配列と同じ遺伝子又は異なる遺伝子から終結領域を得てもよい。
【００６８】
遺伝情報を細胞に輸送するために用いられる特定の発現ベクターは、特に重要でない。真核又は原核細胞での発現に用いられる、従来のいずれのベクターを用いてもよい。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ２３Ｄ、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）等のプラスミド及び、ＧＳＴ及びＬａｃＺ等の融合発現系が含まれる。例えば６−ｈｉｓ等の単離の便利な方法を提供するために、エピトープタグを組換えタンパク質に加えることもできる。コード配列を含む発現カセットに加えて、これらのベクターはＴ７プロモーター、転写イニシエーター及びターミネーター、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ部位、ｂｌａコード配列及びｌａｃｌオペレーターを含む。
【００６９】
ＲＮａｓｅ分子又は融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターは、Ｅ．コリ、他の細菌細胞、酵母、及びＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞系及び骨髄腫細胞系等の様々なより高等な真核細胞を含む様々な宿主細胞で発現させてもよい。細胞に加えて、ベクターは、トランスジェニック動物、好ましくは、羊、ヤギ及び畜牛によって発現させてもよい。通常、この発現系では、組換えタンパク質はトランスジェニック動物の乳において発現される。
【００７０】
本発明の発現ベクター又はプラスミドは、Ｅ．コリ（E.coli）のための塩化カルシウム形質転換及びリン酸カルシウム処理、リポソーム融合又は哺乳動物細胞のためのエレクトロポレーション等のよく知られた方法で、選ばれた細胞に運搬することができる。プラスミドによって形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子等のプラスミド上に含まれる遺伝子によって与えられた抗生物質に対する耐性によって選択することができる。 
【００７１】
一度発現すると、硫酸アンモニウム分画、カラムクロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィーを含む）、ゲル電気泳動等の当該技術分野の標準的な手法にしたがって、発現したタンパク質を精製することができる（R. Scopes, Protein Purification, Springer −Verlag, N. Y. （1982）, Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. （1990）; Sambrook ＆ Ausubel, 共に前掲を一般的に参照）。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明は、組換えグリアジンタンパク質Ｄ２六量体配列をコードする配列番号９の配列を含む単離された核酸を提供する。他の実施形態において、単離された核酸は発現ベクター内にある。他のいくつかの実施形態において、発現ベクターは宿主細胞内にある。
【００７３】
２．固相支持体上の固定
本発明のグリアジン融合タンパク質は、当該技術分野において知られている任意の有用な固定方法で、任意の有用な固相支持材に固定することができる。固相支持体へのグリアジン融合タンパク質の固定は、共有又はイオン結合形成、水素結合、ファンデルワールス力、及び抗体−抗原相互作用を介することができる。本発明において他の固定方法が有用であることが、当業者に理解される。
【００７４】
抗体に似た方法での固定を可能にする他の化合物が開発されている。特定のこれらの「抗体模倣体 (antibody mimics)」は、抗体の可変領域のための代替タンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリンタンパク質の骨組を用いる。
【００７５】
例えば、Ladnerら（米国特許第５，２６０，２０３号）は、凝集されているが分子的に離れている抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のものと似た結合特異性を有する単一ポリペプチド鎖結合分子について記載している。単一鎖結合分子は、ペプチドリンカーによってつながれた抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含み、２つのペプチド抗体のものと似た構造に折りたたまれる。単一鎖結合分子は、より小さな大きさ、より高い安定性、より簡単に修飾できるなど、従来の抗体を上回るいくつかの利点を有する。
【００７６】
Kuら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92（14）:6552-6556 （1995））は、シトクロムｂ５６２を基にした抗体の代替を開示する。Kuら（１９９５年）は、ウシ血清アルブミンに対して結合するためにシトクロムｂ５６２のループの２つが無作為化され選択されるライブラリーを構築した。各変異体が抗BSA抗体に似てBSAに選択的に結合することが分かった。
【００７７】
Lipovsekら（米国特許第６，８１８，４１８及び７，１１５，３９６号）は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様タンパク質の骨組及び少なくとも１つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を開示する。アドネクチンとして知られているように、これらのフィブロネクチン系抗体模倣体は、標的とされるいずれかのリガンドに対する高親和性及び特異性等、天然又は改変抗体と同じ特徴の多くを呈する。新規又は向上した結合タンパク質を進化させる任意の方法を抗体模倣体と共に用いてもよい。
【００７８】
これらフィブロネクチン系抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と似ている。このため、これら模倣体は天然のものと似た抗原結合性質及び自然抗体のものに対する親和性を呈する。更に、これらフィブロネクチン系抗体模倣体は、抗体及び抗体断片を上回る特定の利点を呈する。例えば、これら抗体模倣体は、生来の折りたたみ安定性のためにジスルフィド結合に依存せず、このため、抗体が通常破壊される条件下において安定である。更に、これらフィブロネクチン系抗体模倣体の構造がＩｇＧ重鎖のものと似ていることから、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに似た、ループ無作為化及びシャッフリングのためのプロセスをインビトロで用いてもよい。
【００７９】
Besteら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96（5）:1898-1903 （1999））は、リポカリン骨格を基にした抗体模倣体を開示する（ANTICALIN（登録商標））。リポカリンは、タンパク質の末端で４つの超可変ループを有するβ−バレルからなる。Beste （1999）は、ランダム変異導入法にループをさらし、例えばフルオレセインとの結合について選択した。これらの変異体はフルオレセインとの特異的結合を呈し、１つの変異体は抗フルオレスセイン抗体のものと類似した結合を示した。更なる分析によって、全てのランダム化位置は可変的であることが明らかになり、ANTICALIN（登録商標）は抗体の代替として用いるのに好適であることを示す。
【００８０】
ANTICALIN（登録商標）は、通常１６０から１８０残基の小さな単一鎖ペプチドであり、生産のコスト削減、貯蔵における安定性の増大、免疫学的反応の低下等、抗体に対していくつかの利点を提供する。
【００８１】
Hamiltonら（米国特許第５，７７０，３８０号）は、結合部位として用いられる複数の可変ペプチドループに結合した、カリックスアレーン (calixarene)の強固な非ペプチド有機骨格を用いた合成抗体模倣体を開示する。ペプチドループは全て、カリックスアレーンからお互いに対して幾何学的に同じ側面から突出している。この幾何学的な確認によって、全てのループは結合に用いることができ、リガンドに対する結合親和性が増大する。しかし、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーン系抗体模倣体はペプチドのみからならず、よってプロテアーゼ酵素による攻撃に対して強い。骨格が純粋にペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡからならない意味とは、この抗体模倣体が極限環境条件下で比較的安定であり、長い寿命を有するということである。更に、カリックスアレーン系抗体模倣体が比較的小さいことから、免疫原性反応があまり生じない傾向にある。
【００８２】
Muraliら（Cell Mol Biol 49（2）:209-216 （2003））は、抗体をより小さなペプチド模倣薬に縮小する方法について検討し、抗体に対する代替としても有用である「抗体様結合ペプチド模倣薬 (antibody like binding peptidomemetics)」（ＡＢｉＰ）と称した。
【００８３】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体性質はＲＮＡ分子及び非天然オリゴマーを含む化合物にも模倣されている（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体及びベータ−ターン模倣体）。また、グリアジン融合タンパク質を固相支持体に結合させるために、例えば、ストレプトアビジン及びビオチン間の既知の結合相互作用を用いることができる。
【００８４】
グリアジン融合タンパク質を固相支持体に結合させる更なる方法には、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性リンカーの使用が含まれる。ゼロ長架橋試薬 (zero-length linking reagent)は、いずれの外部物質も導入しないで、２つのリガンドの直接結合を誘導する。ジスルフィド結合の形成を触媒する試薬はこのカテゴリーに属する。他の例は、カルボキシ及び第１級アミノ基の縮合を誘導して、アミド結合を形成する、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ１、カルボニルジイミダゾール等の試薬である。ホモ二官能性試薬は２つの同一の官能基を担持し、一方へテロ二官能性試薬は２つの似ていない官能基を含む。ヘテロ二官能性架橋剤の大多数は、第１級アミン反応基及びチオール反応基を含む。ホルミルからチオールへの結合のための新規へテロ二官能性リンカーは、Heindel, N. D. et al, Bioconjugate Chem. 2, 427-430 （1991）で開示された。好ましい実施形態において、共有結合性架橋剤は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、グリコール（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ２）−）、又はエステル（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）ブリッジを形成することができる試薬から選ばれる。
【００８５】
ルミネックス (Luminex)染料で内面的に染色された、常磁性ラテックスビーズの表面上に存在するカルボン酸基は、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメソ−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の作用を通して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換することができる。磁気分離及び洗浄後、グリアジン融合タンパク質及びｔＴＧの混合物を、界面活性剤及びｐＨ７．４で１０ｍＭのＣａＣｌ2を含有する緩衝食塩水に加える。懸濁液を室温にて振盪しながら１時間インキュベートする。洗浄後、非特異的結合を減らすためビーズはブロッキングされ、そして粒子希釈剤に保存される。
【００８６】
III．セリアック病を患っている対象を診断する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、セリアック病を患っている対象を診断する方法を提供する。前記方法には、対象からの体液のサンプルを、配列番号３の配列を有する六量体を含む組換え脱アミド化グリアジンを含む本発明の抗原と接触させることを含む。該方法には、抗原に特異的に結合するようになったあらゆる抗体を検出することをも含み、これにより対象におけるセリアック病の存在が示される。
【００８７】
本発明のサンプルは、任意の体液であり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、房水、胆汁、血液及び血漿、母乳、間質液、リンパ、粘液、胸膜液、唾液、血清、汗、涙、尿、脳脊髄液、滑液又は細胞内液とすることができる。いくつかの実施形態において、サンプルは血液サンプルである。
【００８８】
本発明の対象は任意の哺乳類とすることができる。いくつかの実施形態において、対象は霊長目（例えば、ヒト）、乳牛、羊、ヤギ、馬、犬、猫、ウサギ、ラット、マウス等とすることができる。他の実施形態において、対象はヒトである。
【００８９】
固相支持体に固定されたグリアジン融合タンパク質又はｔＴＧ−グリアジン融合タンパク質複合体に結合した抗体の存在は、当該技術分野において知られているいずれの方法でも検出することができる。いくつかの実施形態において、検出ステップは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又は免疫蛍光測定法等の測定法を用いて行うことができる。他の実施形態において、検出ステップは、酵素法を用いて行うことができる。検出ステップで用いることができる免疫測定法として、例えば、ウエスタンブロット法、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降素反応、ゲル内沈降素反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法等の競争的及び非競争的測定法システムが挙げられる（例えば、Harlow＆Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York （1999）を参照）。
【００９０】
抗原に特異的な抗体は、任意の好適な抗体とすることができる。いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭとすることができる。他の実施形態において、抗体はＩｇＧ又はＩｇＡとすることができる。本発明において他の抗体も有用であることが、当業者に理解される。
【００９１】
ＩＶ．キット
いくつかの実施形態において、本発明は、前記組換え脱アミド化グリアジンが、配列番号３の配列と実質的に同一であるか又は配列番号３の配列を有する六量体を含む、上述された抗原、検出試薬、並びに任意にバッファー、塩、安定剤及び取扱説明書のうちの少なくとも１つを含むキットを提供する。
【００９２】
本発明において有用なバッファー、塩及び安定剤は、当業者に知られているものを含み、Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. （Easton, Pa.） 1990に見ることができる。
【実施例】
【００９３】
実施例１．Ｈｉｓタグを持つＤ２六量体の精製
Ｈｉｓタグを持つＤ２六量体は、非変性条件又は変性条件のいずれかを使用して精製できる。この実施例では、Ｄ２六量体を、８Ｍの尿素を用いた変性条件下で精製した。そのタンパク質が配列番号７の配列を有する、Ｈｉｓタグを持つ「古典的な」Ｄ２六量体を作製した。さらに、そのタンパク質が配列番号８の配列を有する、Ｈｉｓタグを持つ「リジン含有」Ｄ２六量体を作製した。
【００９４】
古典的な組換え六量体の精製
六量体を過剰発現する６リットルのＥ．コリ培養物からの溶解細胞を、約５ｍｌ／ｇの湿重量にて平衡バッファー（１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、８Ｍの尿素、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）中に懸濁した。室温にて３０分間撹拌した後に、細胞残屑を遠心分離によって取り除いた。約２００ｍｌの上清を、平衡バッファーで予洗した２５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂に加え、室温にて６０分間混合した。樹脂に結合した六量体タンパク質を、１００ｍｌの洗浄バッファー（１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、８Ｍの尿素、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ８．０）で４回洗浄する前に、結合していない溶解物と分離した。洗浄バッファーを樹脂から取り除いた後に、結合した六量体タンパク質を、４倍量の２０ｍｌの溶出バッファー（１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、８Ｍの尿素、２００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）で溶出した。溶出したタンパク質画分を、貯留し、濃縮し、そして、１０ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。得られたすべての沈殿物を、１５ｋ×ｇの遠心分離によって取り除いた。２３０ｎｍのＵＶにて観察される、アフィニティー精製したタンパク質は、１０ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いたサイズ排除カラムでさらに精製できる。最初の主なピークを含む画分を、貯留し、濃縮した。
【００９５】
リジン含有Ｄ２六量体組換えタンパク質の精製方法は、古典的な組換え六量体のものと同じであった。
【００９６】
精製した古典的な六量体タンパク質又はリジン含有六量体タンパク質の特徴づけ
アフィニティー精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析した（図１）。上述したようにサイズ排除カラムでさらに精製したＤ２六量体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１）。意外なことに、両方の六量体（古典的な及びリジン含有）共に、六量体タンパク質の三量体のサイズに相当する４５ｋｄ近辺に主要なバンドを呈した。六量体のこの凝集は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用される変性条件の下でも分離されないほど強い。さらに、両方の六量体タンパク質が、サイズ排除クロマトグラムにおいて約４５ｋｄの位置に移動した。特定の理論に縛られるものではないが、凝集して六量体の三量体を形成する六量体の驚くべき傾向は、Ｄ２六量体の改善された免疫反応性に寄与している可能性がある。
【００９７】
実施例２．組換え脱アミド化グリアジン抗原の調製
この実施例は、「古典的な」Ｈｉｓタグ付与した組換え脱アミド化グリアジンタンパク質（配列番号７）の調製に使用したプロトコールを提供する。
【００９８】
磁性ビーズ上への組換え脱アミド化グリアジンペプチド（ＤＧＰ）抗原の固定
１０ｍｇのカルボキシル修飾磁性ビーズを、マイクロチューブに入れる。１０００μＬの７０％のエタノール（ＥｔＯＨ）中、５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフィリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ６．１を、そのチューブに加える。該チューブを、ボルテックスにかけ、そして、ビーズを磁気的に分離する。上清を、ピペットで取り出し、捨てる。この洗浄工程をもう１回繰り返す。
【００９９】
５００μＬの、７０％のＥｔＯＨ中、５０ｍＭのＭＥＳ中の１２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐＨ６．１を、ビーズの入ったチューブに加え、そして、混合する。５００μＬの、７０％のＥｔＯＨ中、５０ｍＭのＭＥＳ中のＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナート（ＣＭＣ）、ｐＨ６．１を、ビーズの入った同じチューブに加え、そして、混合する。該チューブを、継続的に混合しながら、室温にて３０分間インキュベートする。
【０１００】
ビーズを、上清と分離し、そして、１０００μＬの、１０％のＥｔＯＨ中、５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．１を加える。そのビーズを混合し、磁気的に分離し、そして、上清をピペットで取り出し、捨てる。この洗浄工程をもう１回繰り返す。
【０１０１】
洗浄したビーズを、２５０μＬの５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．１を加えることによって懸濁させ、そして、混合する。ビーズに加える（始めの方に詳述したように調製した）組換えＤＧＰ抗原を、５μｇ／ｍｇのコーティング濃度を得るようにビーズカップリングバッファー（界面活性剤含有緩衝食塩水）中に混合する。この混合物を、連続して混合しながら、室温にて６０分間インキュベートする。
【０１０２】
１０００μＬのポストコーティング洗浄バッファー（界面活性剤、塩化カルシウム及び保存料を含んで成る緩衝食塩水）をチューブに加え、混合する。ビーズを磁気的に分離し、そして、上清をピペットで取り出し、捨てる。この洗浄工程をもう３回繰り返す。
【０１０３】
ビーズブロッキング
１０００μＬのブロッキングバッファー（界面活性剤、塩化カルシウム、保存料及びブロッカーを含んで成る緩衝食塩水）をチューブに加えた。そのチューブを、混合しながら２〜８℃にてインキュベートする。インキュベーション終了時点で、ビーズを磁気的に分離し、そして、上清をピペットで取り出し、捨てた。
【０１０４】
１０００μＬの粒子希釈剤（界面活性剤、塩化カルシウム、保存料及びブロッカーを含んで成る緩衝食塩水）をチューブに加えることによって、ビーズを粒子希釈剤で洗浄する。チューブを混合し、ビーズを磁気的に分離し、そして、上清をピペットで取り出し、捨てた。この洗浄工程をもう３回繰り返す。
【０１０５】
１０００年μＬの粒子希釈剤（１００μＬ／ｍｇ粒子）をチューブに加え、このバッファー中で２〜８℃にて保存する。
【０１０６】
実施例３．組換えＤＧＰ抗原を使用したセリアック病の検出
この実施例は、抗原としてＨｉｓタグ付与した古典的な組換え脱アミド化グリアジンタンパク質（配列番号７）を使用したセリアック病の検出のために使用した方法を提供する。
【０１０７】
セリアックＩｇＡ及びＩｇＧイムノアッセイプロトコールの概要：
機器（Bio-Rad Laboratoriesが製造した）ＢｉｏＰｌｅｘ２２００は、サンプルチューブから５μＬのサンプルを吸引し、４５μＬの洗浄バッファー（界面活性剤と保存料を含んで成るリン酸緩衝生理食塩水）によって追い出される該サンプルを反応器（ＲＶ）に分注する。
【０１０８】
１００μＬのサンプル希釈剤（界面活性剤、保存料及びブロッカーを含んで成る緩衝食塩水）をＲＶに加え、続いて、１５０μＬの洗浄バッファーをＲＶに加える。
【０１０９】
ＲＶを３７℃にて１３０秒間インキュベートする。
【０１１０】
１００μＬの粒子試薬（粒子希釈剤中の組換え脱アミド化グリアジンコーティングビーズの溶液）をＲＶに加える。最終サンプル希釈率は１／８０である。
【０１１１】
時々混合しながら、混合物を３７℃にて１１８０秒間インキュベートする。
【０１１２】
ビーズを、各洗浄後の磁力的分離を伴って、６００μＬ、次いで３００μＬ、次いで６００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄する。
【０１１３】
５０μＬの結合試薬（結合希釈剤（界面活性剤、保存料及びブロッカーを含んで成る緩衝食塩水）中の抗ヒトＩｇＡ／ＩｇＧ−フィコエリトリンの混合物）をＲＶに加える。
【０１１４】
時々混合しながら、混合物を３７℃にて６００秒間インキュベートする。
【０１１５】
ビーズを、各洗浄後の磁力的分離を伴って、６００μＬ、次いで３００μＬ、次いで６００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄する。
【０１１６】
５０μＬの洗浄バッファーをＲＶに加えて、ビーズを再懸濁する。
【０１１７】
Luminex Detectorモジュール（ＬＤＭ）にビーズ懸濁液を吸引し、それぞれの特定されたビーズ領域内の粒子のメジアン蛍光を計測する。図２は、ＤＧＰの古典的な六量体のコーティング力価測定を示す。
【０１１８】
セリアック病試験における感度
表１は、異なった濃度のＤＧＰ六量体における正常サンプルとセリアック病陽性サンプルについて検出されたシグナルの量（相対蛍光強度、ＲＦＩ）を示す。
【表１】
0006470347.tif 000002
【０１１９】
セリアック病サンプルの分析
以下の一致試験は６２個のセリアック病サンプルから成る。表２はＤＧＰ六量体と述語メソッド（predicate method）との比較の結果を示す。
【表２】
0006470347.tif 000003
【０１２０】
相対蛍光強度（ＲＦＩ）を、ＤＧＰ六量体（表３）を使用して正常サンプルとセリアック病患者サンプルについて計測した。患者の免疫反応性を、陽性の反応性が＞１．０である抗体指数（ＡＩ）によって評価した。
【表３】
0006470347.tif 000004
【０１２１】
実施例４．追加リジンを有する組換えＤＧＰ抗原を使用したセリアック病の検出
この実施例では、「リジン含有」Ｄ２六量体タンパク質（Ｎ末端領域付近の１４位にてグルタミン酸残基と置換したリジンを有する、Ｈｉｓタグ付与した組換え脱アミド化グリアジンペプチド）（配列番号８）を、セリアック病に対する感度について試験した。
【０１２２】
磁性ビーズ上へのこの抗原の固定を、実施例２に記載したのと同じ様式でおこなった。図３はリジン含有ＤＧＰ六量体のコーティング力価測定を示す。
【０１２３】
イムノアッセイにおけるこの抗原を使用したセリアック病の検出を、実施例３で「古典的な」六量体タンパク質に関して記載したのと同じ様式でおこなった。
【０１２４】
セリアック病試験における感度
表４は、異なった濃度のＤＧＰ六量体における正常サンプルとセリアック病陽性サンプルについてのＲＦＩを示す。
【表４】
0006470347.tif 000005
【０１２５】
セリアック病サンプルの分析
表５は、ＤＧＰ六量体によって計測される正常サンプルとセリアック病患者サンプルに関する相対蛍光強度（ＲＦＩ）を示す。患者の免疫反応性を、陽性の反応性が＞１．０である抗体指数（ＡＩ）によって評価した。
【表５】
0006470347.tif 000006
【０１２６】
実施例５．ＤＧＰ三量体対ＤＧＰ六量体の比較研究
６２個のセリアック病サンプルから成る以下の一致試験は、ＤＧＰ六量体対以前に記載したグリアジン抗原であるＤ２三量体組換え融合タンパク質（参照により本明細書中に援用されるＵＳ２００９／０３１１７２７ですでに記載した）の予測値を比較した。ＤＧＰ六量体は、ＤＧＰ三量体に対して改善された陽性の一致及び合計の一致を示した（表６）。これらの結果は、ＤＧＰ三量体と比較して、ＤＧＰ六量体の改善された感度を実証する。
【表６】
0006470347.tif 000007
【０１２７】
ＤＧＰ六量体はまた、（多くの偽陽性の結果をもたらした）ＤＧＰ三量体と比較して、驚いたことに改善された特異性も示した。この問題は、ＤＧＰ六量体を使用することによって解決した。
以下の表７は、４０７個の正常サンプルのスクリーニングからのデータを示す。ＤＧＰ三量体は２５％の偽陽性を生じたが、それに対して、ＤＧＰ六量体は０．５％の偽陽性しか生じなかった。偽陽性検出の特異性は≦１％である。
【表７】
0006470347.tif 000008
【０１２８】
図の４ａ及び４ｂは、ＤＧＰ三量体と比較して、ＤＧＰ六量体の改善された性能を示す。これらの試験では、ＤＧＰ六量体のビーズコーティング濃度は、ＤＧＰ三量体のものの５分の一であったが、カットオフＲＦＩシグナルは同じであった。組換えＤＧＰ六量体は、ＩｇＡアッセイ（図４ａ）及びＩｇＧアッセイ（図４ｂ）の両方で、組換えＤＧＰ三量体と比較して改善された感度を有した。
【０１２９】
明確に理解する目的のために、説明及び実施例を用いて上述した本発明を幾分詳しく説明したが、本請求項の範囲内において特定の変化及び修正が行われてもよいことが当業者に理解される。更に、各参照文献があたかも各々参照により援用されたのと同じように、本願明細書で提供された各参照文献はその全体を参照により援用されたものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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