(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒を含む水性反応混合物において、メラミンからアンメリンおよび／またはアンメリドを製造するプロセスであって、
メラミンが、固体間反応によってアンメリンへと転化され、
前記生体触媒が、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ１，３，５−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する、少なくとも１種類の酵素を含む、プロセス。
【請求項２】
前記酵素が、メラミンデアミナーゼ、ｓ−トリアジンヒドロラーゼ、ヒドロキシアトラジンヒドロラーゼ、グアニンデアミナーゼおよびシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記酵素が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９によって表されるアミノ酸配列、またはその相同体を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも１．０質量％のローディングで存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも１０質量％のローディングで存在する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
メラミンが、前記水性反応混合物の総質量に対して、少なくとも２０質量％のローディングで存在する、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
メラミンが、５〜１０で選択されるｐＨにて、アンメリンおよび／またはアンメリドへと転化される、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
メラミンが、６．５〜７．５で選択されるｐＨにて、アンメリンおよび／またはアンメリドへと転化される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
メラミンが、６．５未満で選択されるｐＨにて、アンメリンおよび／またはアンメリドへと転化される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
メラミンが、７．５を超えて選択されるｐＨにて、アンメリンおよび／またはアンメリドへと転化される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記水性反応混合物が有機溶媒を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アンメリンおよび／またはアンメリドを製造するプロセスに関する。本発明はさらに、本発明によるプロセスによって得ることができる生成物に関し、その生成物はアンメリンおよび／またはアンメリドを含む。
【０００２】
アンメリン（４，６−ジアミノ−２−ヒドロキシ−１，３，５−トリアジン）およびアンメリド（６−アミノ−２，４−ジヒドロキシ−１，３，５−トリアジン）は、例えば米国特許第４３４１６９４号明細書、特開５５０９４９５３号公報、特開５９０２９６７６号公報に記載の難燃性組成物において使用される、工業的関心の対象である１，３，５−トリアジン化合物である。しかしながら、それらは工業的大規模では現在、市販されていない。
【０００３】
アンメリンおよびアンメリドの製造について、いくつかの化学的経路が研究され、記述されている（Ｅ．Ｍ．Ｓｍｏｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｒａｐｏｐｏｒｔ．２００８．Ａｍｍｅｌｉｄｅ，Ａｍｍｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｓ−Ｔｒｉａｚｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １３．Ｃｈａｐｔｅｒ  ５．ｐ．２６９−３０８）。かかる合成経路はかなり労力を要し、面倒である。さらにこれには、比較的高価な出発原料（例えば、ジシアンジアミドおよびビウレット）、厳しい反応条件（２００℃を超える温度）、ハロゲン含有化合物、有毒な溶媒（例えば、フェノール、クレゾールまたはキシレノール）、および沈殿させるためのアルコール（例えば、メタノール）の添加、および溶媒からのアンメリンおよび／またはアンメリドの回収が必要である。さらに、これらの経路では、様々な量の副生成物、例えば、シアヌル酸と併せて、未制御の比率で、かつ限られた収率でアンメリンおよびアンメリドが形成される場合が多く、洗浄によるその副生成物の除去は、溶解性が非常に低いために難しく、かつ費用がかかる。したがって、メラミン（２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン；ｓｙｍ−トリアミノ−トリアジンとも呼ばれる）などの安価出発原料から、アンメリンおよび／またはアンメリドへの代替の経路、好ましくはより対費用効果が高いプロセスが必要とされている。
【０００４】
本発明の目的は、上記の欠点のうちの１つまたは複数を克服し、その結果特に収率が高くなり、副生成物の量が少なくなり、それによって工業的に魅力的なプロセスが提供される、アンメリンおよび／またはアンメリドを製造するプロセスを提供することである。
【０００５】
本発明の目的は、アンメリン：アンメリド比を微調整することができる、アンメリンおよび／またはアンメリドの新規な製造プロセスを提供することでもある。
【０００６】
更なる本発明の目的は、制御された比でアンメリンおよび／またはアンメリドを含む生成物を提供することである。
【０００７】
これらの目的は、アンメリンおよび／またはアンメリドを製造するプロセスを含む、本発明によるプロセスであって、生体触媒を含む水性反応混合物中での固体間反応によって、メラミンがアンメリンへと、任意選択的にアンメリドへと転化され、その生体触媒が、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ１，３，５−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する、少なくとも１種類の酵素を含む、プロセスを用いて達成されている。
【０００８】
本発明によるプロセスにおいて、メラミンは、「固体間」反応によって、アンメリンへと、任意にアンメリドへと転化される。これは、前記反応において、ごく小さな割合の基質および／または生成物は常に溶解状態であるが、基質および／または生成物の残りの部分が固相にあることを意味する。出発固体メラミン基質は段々に溶解し、アンメリンおよび／またはアンメリドへ転化されるにしたがって溶液を通過し、次いで沈殿する。
【０００９】
本発明による固体間反応は、水相中に固体基質および／または生成物および生体触媒を含む「水性反応混合物」において行われる。前記水相は、主な溶媒が水である、液相である。
【００１０】
本明細書で定義される「生体触媒」は、本発明によるプロセスにおいて反応段階を触媒する、生体源に由来する生体物質または部位である。生体触媒は原則的に、あらゆる生物、例えば微生物、またはそれに由来する生体分子であり得る。生体触媒は特に、１種または複数種の酵素を含み得る。
【００１１】
「アミドヒドロラーゼスーパーファミリー」は、触媒ドメインにおいて折り畳まれたトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＩＭ）様バレルを含有する「金属依存性ヒドロラーゼ」酵素の構造ベースのクラスターである。このスーパーファミリーのメンバーは、有機化合物のＣ−Ｎ結合だけでなく、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−ＳおよびＯ−Ｐ結合の切断も触媒する（Ｌ．Ａｉｍｉｎ，Ｌ．Ｔｉｎｇｆｅｎｇ，Ｆ．Ｒｏｎｇ．２００７．Ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００７）。
【００１２】
「１，３，５−トリアジン化合物に対するアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素」は、トリアジン環の炭素原子とアミノ置換基のＮ原子のＣ−Ｎ結合の加水分解によって、１つまたは複数のアミノ置換基をヒドロキシ置換基へと転化する能力と共に、アミノ置換１，３，５−トリアジン化合物に対する加水分解活性を有する酵素であるが、一方ではアンモニアを発生する（反応スキーム［１］）。
【化１】
0006519088.tif 000002
【００１３】
「１，３，５−トリアジン化合物に対するアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素」は、以下で「酵素」とも呼ばれる。
【００１４】
先行技術の方法と比較すると、本発明によるプロセスは、穏やかな条件を必要とする。そのプロセスは、生体触媒を活性な状態のままにするために、水相の存在下にて適度な温度で行われる。このプロセスはさらに、有毒な溶媒、ハロゲン含有化合物またはアルコールを使用しない、環境に優しいプロセスである。アンメリンおよび／またはアンメリドは、水性反応混合物中で直接沈殿し、それらの（その）回収には、水を使用する数回の洗浄段階のみ必要である。プロセスの他の利点は、収率の低下を生じる、副生成物、例えばシアヌル酸の形成がなく、目的の生成物が製造されることである。本発明による方法によって、先行技術に記述される化学経路よりも高い収率が可能となることが考えられる。アンメリンおよび／またはアンメリドへのメラミンの最大転化率（約９９％までの）が達成される。化学経路に関する本発明によるプロセスのその他の利点は、アンメリン：アンメリド比を微調整する能力である。
【００１５】
アンメリンおよび／またはアンメリドへのメラミンの転化は、未反応基質および生体触媒が存在するにも関わらず、有意な反応が起こらない場合に、その「最大転化率」に達すると言われる。
【００１６】
一部の研究では、ヒトおよび動物におけるメラミン毒性への土壌細菌の寄与を調べ、細菌のメラミン代謝経路が同定され、メラミンは、逐次的な脱アミノ化によってアンメリンおよびアンメリドに加水分解されることが示された。これら２つの脱アミノ化段階に関与する遺伝子および酵素が同定されており、一部の場合には、酵素が精製され、特徴付けられている。後者は、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属することが判明している（反応スキーム［２］；Ｊ．Ｌ．Ｓｅｆｆｅｒｎｉｃｋ，Ａ．Ｇ．Ｄｏｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｊ．Ａ．Ｂｕｍｐｕｓ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐ．Ｗａｃｋｅｔｔ．２０１０．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｍｍｅｌｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｖｉａ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９２（４），１１０６−１１１２；Ａ．Ｇ．Ｄｏｄｇｅ，Ｌ．Ｐ．Ｗａｃｋｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．Ｓａｄｏｗｓｋｙ．２０１２．Ｐｌａｓｍｉｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｍｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  Ｍｅｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７８（５），１３９７−１４０３）。これらの研究は、本発明の技術分野には関係せず、つまり、生体触媒を含む水性反応混合物中での固体間反応により、メラミンからアンメリンおよび／またはアンメリドを製造するプロセスには関係せず、細菌のメラミン代謝経路において同定される酵素は、本発明によるプロセスで適切に使用することができるという指標はなかった。
【００１７】
メラミンの加水分解経路からの最初の２段階を反応スキーム［２］に示す。各段階を触媒する微生物酵素をコードする遺伝子を示す。ｔｒｉＡ、ｔｒｚＡ、ａｔｚＢ遺伝子は、メラミンデアミナーゼ、ｓ−トリアジンヒドロラーゼおよびヒドロキシアトラジンヒドロラーゼをそれぞれコードしている。ＧＤＡは、グアニンデアミナーゼの省略形である。この酵素のすべてが、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーである。
【化２】
0006519088.tif 000003
【００１８】
本発明に従って、生体触媒を含む水性反応混合物中での「固体間」反応によって、メラミンは、アンメリンへと、任意にアンメリドへと転化される。反応パラメーター（例えば、生体触媒、水相、混合、ｐＨ、温度または基質ローディング）は、反応を最適化するため、かつ目的の生成物を得るために、変動し得る。
【００１９】
本発明による生体触媒はあらゆる形態で使用され得る。生体触媒は例えば、（部分）精製酵素、凍結乾燥酵素粉末、固定化酵素、全細胞（例えば、透過処理された、凍結乾燥された）、固定化全細胞、細胞溶解物または無細胞抽出物の形で使用され得る。
【００２０】
本発明によるプロセスにおいて、適切な活性を有する天然生体触媒（野生型）または天然生体触媒の変異体を利用することができることは、当業者には明らかであるだろう。天然生体触媒の特性は、例えば、分子進化または合理的デザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）など、当業者に公知の生物学的技術によって向上され得る。野生型生体触媒の変異体は例えば、当業者に公知の突然変異誘発技術（例えば、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、定方向進化、遺伝子組換え）を用いて、生体触媒として作用することができる生物、または生体触媒部位を生成することができる生物（例えば、酵素）のコード化ＤＮＡを修飾することによって製造することができる。特に、野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む酵素をコードするように、あるいは変異体が２つ以上の親酵素の配列を併せ持つように、あるいはこのように修飾されたＤＮＡを適切な（宿主）細胞において発現させることによって、ＤＮＡが修飾され得る。後者は、例えば国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の方法に基づいて、コドン対最適化などの当業者に公知の方法によって達成され得る。
【００２１】
変異体生体触媒は、例えば以下の側面：基質に対する選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨプロファイル、温度プロファイル、基質プロファイル、阻害の受けやすさ、補助因子の利用および基質−親和性のうちの１つまたは複数に関して向上した特性を有し得る。向上した特性を有する変異体は、例えば、適切な高処理スクリーンングまたは当業者に公知のかかる方法に基づく選択方法を適用することによって同定することができる。
【００２２】
本発明によるプロセスにおいて反応工程を触媒するための１つまたは複数の酵素を含む細胞、特に組換え細胞は、それ自体が当技術分野で公知の分子生物学技術を用いて作製することができる。例えば、１つまたは複数の外来性酵素が組換え細胞において生成される場合、かかる技術を使用して、前記外来性酵素の１つまたは複数をコードする１つまたは複数の外来性遺伝子を含むベクター（例えば、組換えベクター）を提供することができる。１つまたは複数のベクターを使用してもよく、それぞれがかかる外来性遺伝子の１つまたは複数を含む。かかるベクターは、１つまたは複数の調節因子、例えば、酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結され得る、１つまたは複数のプロモーターを含み得る。
【００２３】
本明細書で使用される「外来性」という用語は、生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）が宿主細胞内に導入されることを意味することが意図される。生体分子は例えば、宿主細胞内に導入された後に相同（または異種）タンパク質をコードする相同（または異種）核酸であり得る。「異種」という用語は、宿主細胞以外のドナー源から単離された生体分子を意味するのに対して、「相同」という用語は、宿主細胞から単離された生体分子を意味する。したがって、本発明のコード化核酸の外来性発現では、異種または相同コード化核酸のいずれかまたは両方が利用され得る。
【００２４】
本発明者らが見出したように、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ１，３，５−トリアジン化合物（本発明によるプロセスで使用される）に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素は、メラミンデアミナーゼ（メラミンアミドヒドロラーゼとも呼ばれる）、ｓ−トリアジンヒドロラーゼ（Ｎ−エチルアンメリンクロロヒドロラーゼとも呼ばれる）、ヒドロキシアトラジンヒドロラーゼ（アトラジンクロロヒドロラーゼとも呼ばれる）、グアニンデアミナーゼ（グアニンアミドヒドロラーゼとも呼ばれる）およびシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択される、いずれかの適切な酵素（つまり、１，３，５−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有することを確認することができる場合にはその酵素は適している）であることができる。
【００２５】
一実施形態において、適切なメラミンデアミナーゼは、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、ケトグロニシゲニウム（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ウィリアムシア（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ネステレンコニア（Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、キトコッカス（Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）に由来するメラミンデアミナーゼからなる群から選択され得る。特に、前記メラミンデアミナーゼは、アシドボラックス・シトルリ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｃｉｔｒｕｌｉｉ）（以前はシュードモナス・シトルリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ・ｃｉｔｒｕｌｉｉ）と呼ばれた）、シドボラックス・アベナエ・シトルリ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｉｔｒｕｌｉｉ）（以前は、シュードモナス・シュードアルカリゲネス・シトルリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ・ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｉｉ）と呼ばれた）、ケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）（ゴルドニア・ルブリペルチンクタ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）とも呼ばれ；ロドコッカス‐コラリナス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）と同義語）、クレブシエラ・テラゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ・ｔｅｒｒａｇｅｎａ）またはミクロコッカス属ＭＦ−１株から生じ得る。さらに詳しくは、前記メラミンデアミナーゼは、アシドボラックス・シトルリ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｃｉｔｒｕｌｉｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２２７またはケトグロニシゲニウム・ブルガレ（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）Ｙ２５に由来し得る。
【００２６】
他の実施形態において、適切なｓ−トリアジンヒドロラーゼは、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アビトロフィア（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲメラ（Ｇｅｍａｌｌａ）、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトベルティシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、キタサトスポラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）、チャイニア（Ｃｈａｉｎｉａ）およびアクチノスポランギウム（Ａｃｔｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）に由来するｓ−トリアジンヒドロラーゼからなる群から選択され得る。適切なｓ−トリアジンヒドロラーゼは特に、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）（ゴルドニア・ルブリペルチンクタ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）とも呼ばれ；ロドコッカス・コラリナス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）と同義語）、さらに詳しくはロドコッカス・コラリナス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１５４４４Ｒから選択され得る。
【００２７】
更なる実施形態において、適切なヒドロキシアトラジンヒドロラーゼは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、βプロテオバクテリウム（Ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、ボゲセラ（Ｖｏｇｅｓｅｌｌａ）、デレヤ（ｄｅｌｅｙａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ヒドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）またはシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）に由来し得る。特に、適切なヒドロキシアトラジンヒドロラーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＡＤＰまたはアミノバクター・アミノボランス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）に由来し得る。
【００２８】
また更なる実施形態において、適切なグアニンデアミナーゼは、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびレクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）に由来するグアニンデアミナーゼからなる群から選択され得る。特に、前記グアニンデアミナーゼは、ダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来し得る。さらに詳しくは、前記グアニンデアミナーゼは、ダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ  １１０または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＥＴＥＣ  Ｈ１０４０７に由来し得る。
【００２９】
また更なる実施形態において、適切なシマジンクロロヒドロラーゼは、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）に由来するシマジンクロロヒドロラーゼからなる群から選択され得る。特に、前記シマジンクロロヒドロラーゼは、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属Ｂ６０１に由来し得る。
【００３０】
特定の実施形態において、アミドヒドロラーゼスーパーファミリーに属し、かつ１，３，５−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号５（ＡＡＧ４１２０２．１）、配列番号６（ＹＰ＿００３９６３９５４．１）、配列番号７（Ｑ５２７２５．２）、配列番号８（ＮＰ＿７７０５２０．１）および配列番号９（ＣＢＪ０２５７９．１）によって表されるアミノ酸配列またはその相同体を含む。
【００３１】
「相同体」は特に、その参照タンパク質（つまり、配列番号５、６、７、８または９）と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドに対して本明細書において使用される。相同体は一般に、参照タンパク質と類似の機能、好ましくは類似の構造を有するポリペプチドである。あるタイプの相同体は、同じ属の他の種からの遺伝子、または他の属からの遺伝子によってコードされる。「相同体」は、タンパク質の所望の特性を向上するために行われた突然変異誘発によって改変されたタンパク質を含むことも意図される。
【００３２】
配列同一性は本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性は、配列の全長に関して比較されるが、互いに整列する配列の一部についても比較される。当技術分野において、「同一性」とは、場合により、かかる配列間のマッチによって決定される、ポリペプチド配列または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性を決定する好ましい方法は、テストされる配列間の最も大きなマッチを得るようにデザインされる。本発明の文脈において、２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３−４１０（ＮＣＢＩから公的に入手可能）および他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用したポリペプチド配列比較の好ましいパラメーターは、ギャップ開始（ｇａｐ  ｏｐｅｎ）１０．０，ギャップ継続（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ）０．５，Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを使用した核酸配列の好ましいパラメーターは、ギャップ開始（ｇａｐ  ｏｐｅｎ）１０．０、ギャップ継続（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ）０．５，ＤＮＡ完全マトリックスである（ＤＮＡ同一性マトリックス）。
【００３３】
本発明のプロセスにおける水相は、主な溶媒が水である液相である。水相は、水のみ、水と１種または複数種の緩衝塩（例えば、リン酸カリウム緩衝剤）との混合物、水と有機溶媒（例えば、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ）との混合物、または緩衝剤と有機溶媒（例えば、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ）との混合物であり得る。当業者であれば、生体触媒の効率的な活性のために水相を選択し、かつ最適化することができるだろう。
【００３４】
固体間反応の性質のために、水性反応混合物の効果的な混合が、反応成分の良い輸送および接触を提供し、かつ粒子沈降を防ぐのに重要である。当業者であれば、商業的に利用可能な技術を用いて適切なミキサーデザインおよび混合条件を選択することができるだろう。効率的な混合は例えば、放射式ポンピング攪拌機によって行うことができ、粒子の沈降は、軸方向攪拌機によって反応容器の底に下向きにポンピングして、防ぐことができる。軸方向ポンピングインペラとして、幅が狭い水中翼が現況技術で使用されている。従来から、標準インペラとして傾斜ブレード付きタービンが使用されている。プロペラも、中心からそれた位置で使用することができる。中心にあるインペラを使用する場合、渦を巻く流れの向きをインペラの所望のパターンに変えるために、バッフル（ｂａｆｆｌｉｎｇ）を適用することができる。外部ループを介して水性反応混合物をポンピングすることによる混合を提供することも１つの選択肢である。意外なことに、本発明によるプロセスで使用される酵素は、未溶解固体の混合および存在のために生じる流体力学的剪断力に耐え抜くことが判明した。
【００３５】
原則的に、反応媒体のｐＨは、生体触媒が適用されるｐＨ条件下にて活性である限り、広い範囲内で選択され得る。反応混合物のｐＨは適切には、４〜１１、好ましくは５〜１０である。ＡとＢの間で選択されるｐＨ、Ａ〜Ｂの範囲のｐＨまたはＡ〜ＢのｐＨ範囲は、終点ＡおよびＢを含む。
【００３６】
本発明者らは驚くべきことに、そのｐＨがアンメリン：アンメリド比に対して顕著な影響を有することを見出した。実施例２および表３はこの影響を例示する。適用条件下およびｐＨ範囲７〜１０内では、ｐＨが高いほど、アンメリン：アンメリド比が高くなった。特に、ｐＨが７、８、９、９．５および１０の時、アンメリン：アンメリド比はそれぞれ、３．５（アンメリン７５．２モル％、アンメリド２１．２モル％）、１４．３（アンメリン９０．０モル％、アンメリド６．３モル％）、５６．８（アンメリン９６．５モル％、アンメリド１．７モル％）、１０８．８（アンメリン９７．９モル％、アンメリド０．９モル％）および１６４（アンメリン９８．４モル％、アンメリド０．６モル％）となった。ｐＨ値７未満では逆の傾向が確認され、ｐＨが高くなるほど、アンメリン：アンメリド比は低くなった。特に、ｐＨ５および６でのアンメリン：アンメリド比はそれぞれ、１８．３（アンメリン９１．５モル％、アンメリド５．０モル％）および８．８（アンメリン８６．９モル％、アンメリド９．９モル％）であった。言い換えると、適用された条件下および６．５〜７．５の範囲のｐＨ内では、高いアンメリド含有率の生成物が得られ、ｐＨ６．５未満、好ましくは６未満または７．５を超えるｐＨ、好ましくは８を超えるｐＨにて、高いアンメリン含有率の生成物が形成された。したがって、このｐＨは、アンメリン：アンメリド比を微調整するための重要なパラメーターとして同定されている。
【００３７】
原則的に、使用される反応媒体の温度は、生体触媒が適用される温度条件下にて活性なままである限り、広い範囲内で選択され得る。本発明によるプロセスにおいて、反応温度は通常、０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃である。
【００３８】
本発明によるプロセスにおいて、飽和を超えるローディングにて水性反応混合物にメラミン基質が添加されて、本発明において選択される温度およびｐＨ範囲内で固体が形成される。選択される反応条件でメラミンが固体を形成する、メラミンローディングは、通常の実験によって決定することができる。
【００３９】
本明細書において意味される、「ローディング」という用語は、水性反応混合物の総質量に対して、反応混合物に最初に添加されるメラミンの総質量である。メラミンローディングは、質量パーセンテージ（質量％）と表される。
【００４０】
「飽和」は、メラミンの溶液が更なる量のメラミンをもはや溶解できず、かかる更なる量のメラミンが固体として現れる、最大ローディングのポイントとして本明細書において定義される。
【００４１】
本発明の一実施形態において、メラミンは、水性反応混合物の総質量に対して少なくとも１．０質量％、好ましくは少なくとも１０質量％、さらに好ましくは少なくとも１５質量％、またさらに好ましくは少なくとも２０質量％、さらに好ましくは少なくとも３０質量％のローディングで存在する。
【００４２】
本発明者らは驚くべきことに、その基質のローディングが最終生成物の組成に顕著な影響を及ぼし、メラミンローディングが高いほど、アンメリン：アンメリド比が高くなることを見出した。実施例３および表４はこの影響を例示する。適用される条件下にて、最初のメラミンローディングが約１質量％、９質量％および１７．５質量％であると、アンメリン：アンメリド比はそれぞれ、１０８．８（アンメリン９７．９モル％、アンメリド０．９モル％）、３２９．７（アンメリン９８．９モル％、アンメリド０．３モル％）、４９４（アンメリン９８．８モル％、アンメリド０．２モル％）となった。したがって、メラミンローディングは、アンメリン：アンメリド比を微調整するためのもう１つの重要なパラメーターとして同定される。
【００４３】
固体間反応が許容可能な転化レベルまで進行した後、従来の方法によって（例えば、濾過によって、遠心分離によって、またはデカンター遠心機にかけることによって）、水性反応混合物から固体生成物を単離することができる。その後、単離された生成物は、残留メラミン基質を除去するために水で洗浄され得る。アンメリン：アンメリド比は、これらの洗浄段階によって影響を受けない。
【００４４】
本発明によるプロセスによって得られる固体生成物は、高いアンメリンおよび／またはアンメリド含有率および低レベルの残留メラミンを有する。適切には、この生成物は、アンメリンおよび／またはアンメリドを少なくとも９５質量％、メラミンを最大で５質量％含む。好ましくは、この生成物は、アンメリンおよび／またはアンメリドを少なくとも９８質量％、メラミンを最大で２質量％含む。さらに好ましくは、生成物は、アンメリンおよび／またはアンメリドを少なくとも９９質量％、メラミンを最大で１質量％含む。
【００４５】
原則的に、固体生成物のアンメリン：アンメリド比は、広い範囲内で微調整することができる。一般に、アンメリンは、アンメリドより多い。適切には、固体生成物は、１〜１０００の範囲、さらに適切には２〜５００の範囲のアンメリン：アンメリド比を有する。
【００４６】
本発明はさらに、本明細書に記述される本発明のプロセスに従って、様々な実施形態および／または好ましい特徴の可能性のあるすべての組み合わせに関する。
【００４７】
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるが、これらによって制限されることはない。
【００４８】
［実施例］
［材料および一般的な方法］
［１．メラミン基質；標準物質アンメリン、アンメリドおよびシアヌル酸］
９９．９％を超える化学的純度を有するメラミン（ＯＣｌ−窒素からの）が実施例に適用された。
化学的純度９７．５％を有するアンメリン（Ｈｉｃｏｌからの）がＨＰＬＣ分析における標準物質として使用された。
化学的純度９９．７％を有するアンメリドがＨＰＬＣ分析における標準物質として使用された。
９９％を超える化学的純度を有するシアヌル酸がＨＰＬＣ分析における標準物質として使用された。
【００４９】
［２．生体触媒の製造］
［２．ａ．組換え酵素のクローニングおよび発現］
１，３，５−トリアジン化合物に対してアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする異なる生物からの５つの遺伝子が、本発明を例証するために選択された：つまり、配列番号５（ＡＡＧ４１２０２．１）、配列番号６（ＹＰ＿００３９６３９５４．１）、配列番号７（Ｑ５２７２５．２）、配列番号８（ＮＰ＿７７０５２０．１）および配列番号９（ＣＢＪ０２５７９．１）をそれぞれコードする、配列番号１０（ｇｉ＿１１８９０７４５）、配列番号１１（ｇｉ＿３１０８１５９９０）、配列番号１２（ｇｉ＿４０３３７０３）、配列番号１３（ｇｉ＿２７３７８９９１）および配列番号１４（ｇｉ＿３０９７０３２４４）（表１）。
【００５０】
【表１】
0006519088.tif 000004
【００５１】
５つの標的遺伝子のうち４つ、つまり配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現させるためにコドン対最適化され、その結果それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４（配列表）が生じる。コドン対最適化は、国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の手順に従って行われた。
【００５２】
より大規模な発現実験のために、Ｚ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１細胞を化学的にコンピテントセルにし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株から上述のように単離されたｐＢＡＤ組換えベクターで形質転換した。形質転換体は、ネオマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天平板上で選択された。これらのプレートから、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地における前培養物５０ｍｌを接種し、１８０ｒｐｍおよび２８℃にてオービタルシェーカー上でインキュベートした。一晩インキュベートした後、前培養物を使用して、１Ｌ  ＬＢ発現培養物（２Ｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ内）に０．０５の開始ＯＤ６２０まで接種した。これらの発現培養物をオービタルシェーカー上で１８０ｒｐｍおよび２８℃にてインキュベートした。培養物のうちの３分の１において、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースを添加することによって８時間後に、メラミンデアミナーゼ遺伝子の発現が誘発され、インキュベーションを一晩続けた。続いて、これらの培養物を１０，０００ｇで１０分間遠心分離することによって、収集した。培養物のうちの他の３分の２も一晩インキュベートし、約２４時間後に上述のように誘発された。４時間後および８時間後にそれぞれ、これらの培養物も遠心分離によって収集された。
【００５３】
［２．ｂ．１０Ｌ規模での生体触媒の発酵］
炭素源としてグルコースを使用して、１０Ｌ規模で流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵において、ｐＢＡＤ組換えベクターを発現する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１の発酵を行った。
【００５４】
［２．ｃ．小規模（１〜１０ｍｌ）での無細胞抽出物の製造］
氷冷１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して、細胞ペレットをその湿重量の２倍の体積に再懸濁した。Ｓｏｎｉｃｓ（Ｍｅｙｒｉｎ／Ｓａｔｉｇｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ＶＣＸ１３０音波発生器（出力１００％，１０秒オン／１０秒オフ，１０分間）を使用して、細胞浮遊液を音波処理し、氷／アセトン浴で冷却し、続いてエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｒ遠心機（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１３，０００×ｇおよび４℃にて３０分間遠心することによって、無細胞抽出物（ＣＦＥ）が得られた。上清（＝ＣＦＥ）を新しいチューブに移し、すぐに使用するために氷上に保存するか、または−２０℃で保存した。
【００５５】
［２．ｄ．大規模（１０〜２５０ｍｌ規模）での無細胞抽出物の製造］
湿潤細胞（凍結された）７６．３ｇに、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝７）を添加した。細胞を懸濁し、氷上に置いた。続いて、リゾチーム１１２５ｍｇ、ベンゾナーゼ５０μｌを添加し、混合し、−２０℃で一晩置いた。翌朝、懸濁液を３７℃の部屋で振盪機上に２．２５時間置いた。その後、懸濁液を氷上で冷却し、続いて５０ｍｌのチューブ８本に分け（それぞれ約２８ｍｌ）、Ｓｏｎｉｃｓ（Ｍｅｙｒｉｎ／Ｓａｔｉｇｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌ）およびＶｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ＶＣＸ１３０音波発生器（出力１００％，１０秒オン／１０秒オフ，１０分間）を使用して、各懸濁液を２分間音波処理し、氷／アセトン浴で冷却した。続いて、懸濁液を４℃の部屋で氷上で４時間保存した。次に、懸濁液を１５．０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた上清を回収し、−２０℃で保存した。
【００５６】
［３．タンパク質の決定］
ＢｒａｄｆｏｒｄによりＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９７６）に記述される修飾タンパク質−色素結合法を用いて、ＣＦＥにおけるタンパク質の濃度を決定した。各試料のうち適切な希釈度の５０μを試薬９５０μｌ（エタノール４６ｍｌおよび８５％オルト−リン酸１００ｍｌに溶解されたブリリアントブルー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｇ２５０  １００ｍｇ、ミリＱ水で１，０００ｍｌまで満たした）と共に室温で少なくとも５分間インキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ３５ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で波長５９５ｎｍでの各試料の吸収を測定した。既知の濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．０１２５ｍｇ／ｍｌ〜０．２０ｍｇ／ｍｌの範囲）を含有する溶液で決定された較正線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。
【００５７】
［４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０  ＣＦＥおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ＣＦＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え発現を分析し、過剰発現された対照タンパク質とＣＦＥを比較した。
【００５８】
［５．転化反応および生成物の単離］
［５．ａ．転化反応−概要］
転化反応は、プロペラ撹拌機を含有する８０ｍｌのガラス反応器内、またはタービン攪拌機およびｐＨスタット装置（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製ｔｙｐｅ７１８  Ｓｔａｔ  Ｔｉｔｒｉｎｏ）を含有する１６００ｍｌガラス反応器内で行われた。約５００ｒｐｍの攪拌機速度が適用された。
【００５９】
一般に、転化は以下のとおり行われた：特定量のメラミンを３７℃の緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）に添加して、所望のローディングを達成した。１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（７以下のｐＨを得るために）または１Ｍ  ＮａＯＨ（８以上のｐＨを得るために）を使用して、ｐＨを所望の値に調整した。続いて、生体触媒を添加して、転化を開始した。パラグラフ６に記載のＨＰＬＣ分析のために、転化経路で試料を採取した。
【００６０】
［５．ｂ．生成物の単離］
真空（約７５０ミリバール）を用いて、Ｐ３ガラスフィルター上に反応混合物を注ぐことによって、特定の反応時間の後に、生成物の単離を行った。濾過ケークを水で３回洗浄した。得られた生成物を一晩乾燥させた。
【００６１】
［６．ＨＰＬＣ分析］
［６．ａ．ＨＰＬＣ分析のための試料作製］
水性反応混合物の試料または単離された生成物の試料を最初に、１，３，５−トリアジン化合物総濃度約０．５質量％までギ酸で希釈し、続いて、ＨＰＬＣ分析にかける前に、水で５０倍希釈した。
【００６２】
［６．ｂ．ＨＰＬＣ分析法］
２つの２５０ｍｍ  Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８カラムが使用される。重要な分離がアセトニトリル０％にて行われる。勾配後に少なくとも８分間、カラムが平衡化される。
使用されたＨＰＬＣの具体的な分析条件は：
カラム：Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃ１８  ２×（２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ×５□ｍ）
溶離剤Ａ：ＨＣｌＯ４  ｐＨ＝２．０（７０％ＨＣｌＯ４１．６３ｇ／水）
溶離剤Ｂ：アセトニトリル
流量：１．２ｍｌ／分
注入容積：５μｌ
カラム温度：１５℃
検出波長：１９５ｎｍ
【００６３】
【表２】
0006519088.tif 000005
【００６４】
［実施例１：水性反応混合物中での固体間反応による、メラミンからのアンメリンおよび／またはアンメリドの製造。］
攪拌機およびｐＨスタット装置を含む約５５ｍｌの充填容積を有する８０ｍｌ反応器において転化反応を行った。
【００６５】
試験反応のために、メラミン５５５ｍｇを３７℃の緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）４７ｇに添加した。１Ｍ  ＮａＯＨ１．６５ｇでｐＨを９．５に調整した。続いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ｐＢＡＤ＿Ｍｅｌｄｅａｍ＿Ａｃｉの無細胞抽出物０．２５ｍｌを添加して反応を開始し、それによって無細胞抽出物の最終濃度０．５体積％が得られた。メラミンローディングは１．１質量％であった。１Ｍ  ＮａＯＨで滴定することによって、ｐＨを９．５で一定に維持した。
【００６６】
生体触媒を添加しないことを除いては、上述の手順と同じ手順を用いて、化学的ブランク反応を並行して行った。メラミンを転化することができない酵素（この場合には、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＢＭ３由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素）をコードする遺伝子挿入を有するｐＢＡＤ組換えベクターを内部に持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１から無細胞抽出物が得られることを除いては、上述の手順と同じ手順を用いて、生物学的ブランク反応を並行して行った。
【００６７】
１８時間の反応時間後、ＨＰＬＣ分析のために、３つの反応混合物から試料を採取した。結果を表２に示す。
【００６８】
【表３】
0006519088.tif 000006
【００６９】
表２の結果から、アンメリンおよびアンメリドへのメラミンの転化率は、生体触媒（つまり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ｐＢＡＤ＿Ｍｅｌｄｅａｍ＿Ａｃｉの無細胞抽出物）の活性によるものである。反応混合物に最初に添加されるメラミンは、１８時間以内にほぼ完全にアンメリンおよびアンメリドに転化される。シアヌル酸は形成されなかった。メラミンの有意な転化は、化学的ブランク反応混合物では起こらず、メラミンが適用条件下での反応中に化学的に安定であることが示された。さらに、メラミンの有意な転化は、生物学的ブランク反応混合物では起こらなかった。
【００７０】
［実施例２：アンメリン：アンメリド比に対するｐＨの影響。］
攪拌機およびｐＨスタット装置を含む約５５ｍｌの充填容積を有する８０ｍｌ反応器において転化反応を行った。３７℃の緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）４７ｇにメラミン５５５ｍｇを添加した。１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（７以下のｐＨを得るために）または１Ｍ  ＮａＯＨ（８以上のｐＨを得るために）を使用して、ｐＨを所望の値に調整した。続いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ｐＢＡＤ＿Ｍｅｌｄｅａｍ＿Ａｃｉの無細胞抽出物０．２５ｍｌを添加して反応を開始し、それによって、０．５体積％の無細胞抽出物の最終濃度が得られた。メラミンローディングは１．１質量％であった。１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４または１Ｍ  ＮａＯＨで滴定することによって、ｐＨを一定に維持した。ＨＰＬＣ分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表３に示す。
【００７１】
【表４】
0006519088.tif 000007
【００７２】
表３の結果から、反応混合物において得られたアンメリン：アンメリド比は、ｐＨによって微調整することができることが分かる。７〜１０のｐＨ範囲内では、ｐＨが高いほど、アンメリン：アンメリド比が高くなる。７未満のｐＨでは逆の傾向が確認され、ｐＨが高いほど、アンメリン：アンメリド比が低くなる。シアヌル酸が全く検出されなかったことは注目に値する。
【００７３】
［実施例３：アンメリン：アンメリド比に対するメラミンローディングの影響。］
攪拌機およびｐＨスタット装置を含む約５５ｍｌの充填容積を有する８０ｍｌ反応器において転化反応を行った。３７℃の緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）４７ｇにメラミンを１．１質量％、９質量％または１７．５質量％のローディングまで添加した。１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、ｐＨを９．５に調整した。続いて、反応を開始するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ｐＢＡＤ＿Ｍｅｌｄｅａｍ＿Ａｃｉの無細胞抽出物をそれぞれ、濃度０．５体積％、５体積％または１０体積％まで添加した。１Ｍ  ＮａＯＨで滴定することによって、転化中、ｐＨを一定に維持した。ＨＰＬＣ分析のために、時間の経過にしたがって試料を採取した。最大転化率にて、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。結果を表４に示す。
【００７４】
【表５】
0006519088.tif 000008
【００７５】
表４の結果から、選択された反応条件にて、アンメリン：アンメリド比は、メラミンローディングを調節することによって微調整することができることが分かり；選択された反応条件にて、メラミンローディングが高いほど、アンメリン：アンメリド比が高くなる。シアヌル酸が全く検出されなかったことは注目に値する。
【００７６】
［実施例４：１Ｌ規模での水性混合物中における固体間反応による、アンメリンおよび／またはアンメリドの製造。］
緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）１０５０ｍｌにメラミン１２５．２ｇを添加することによって、１．６Ｌ撹拌ガラス反応器内で反応混合物を調製した。メラミン固体基質を３７℃で２０分間撹拌し、その後、５Ｍ  ＮａＯＨ０．０５ｇを添加することによって、ｐＨをｐＨ９．５に調整した。反応を開始するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３１１ｐＢＡＤ＿Ｍｅｌｄｅａｍ＿Ａｃｉの無細胞抽出物６２．５ｍｌを添加し（５体積％）、その後、５Ｍ  ＮａＯＨをさらに０．１ｇ添加することによって、ｐＨをｐＨ９．５に調整した。メラミンローディングは１０．１質量％であった。転化中、ｐＨスタット装置を適用して、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の溶液を滴定することによって、ｐＨ９．５で一定に維持した。ＨＰＬＣ分析のために、試料を採取した。５時間後、反応を止め、固体生成物を単離し、「材料および一般的な方法」に記載のように分析した。アンメリン９８．６質量％、アンメリド０．４質量％、メラミン１質量％を含有する生成物が合計１２５ｇ得られ、転化率９９％に相当した。シアヌル酸は形成されなかった。
【配列表】
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