(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合部位を含むがプロテオグリカン結合に寄与するＡＰＲＩＬのアミノ末端部分を欠失した、短縮型増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を含む第一ドメイン；および
（ｉｉ）ＣＤ３特異的抗体またはその抗原結合部分を含み、かつ、Ｔ細胞表面においてＣＤ３に結合すること、および、Ｔ細胞受容体による抗原特異的認識によって引き起こされるものと同じパスウェイを引き起こすことによってＴ細胞を活性化することができる第二ドメイン
を含む二重特異性分子。
【請求項２】
前記第二ドメインは、
以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲ１：（配列番号３）ＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ
ＣＤＲ２：（配列番号４）ＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ
ＣＤＲ３：（配列番号５）ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ、と
以下の軽鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：（配列番号６）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ
ＣＤＲ２：（配列番号７）ＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳ
ＣＤＲ３：（配列番号８）ＱＱＷＳＳＮＰＦＴ、と
を含む、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項３】
前記第二ドメインは、配列番号９に示されるｓｃＦｖ配列、または、配列番号９に示されるｓｃＦｖに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＣＤ３に結合するそのバリアントを含む、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項４】
配列番号２に示される配列、またはＢＣＭＡと結合し、配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項５】
前記第一ドメインおよび第二ドメインは、スペーサーによって連結される、請求項１から４のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項６】
前記スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８の柄を含む、請求項５に記載の二重特異性分子。
【請求項７】
配列番号１０、１１、もしくは１２に示される配列、または、配列番号１０、１１、もしくは１２に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＢＣＭＡに結合、およびｉｉ）Ｔ細胞を活性化する能力を保持するそれらのバリアントを含む、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項８】
三量体としてＢＣＭＡに結合する、請求項１から７のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号１９、２０、もしくは２１に示される配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の核酸を含み、かつ請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子を産生する宿主細胞。
【請求項１３】
前記二重特異性分子が産生されるような条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子を産生する方法。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子を、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、または添加物と一緒に含む薬学的組成物。
【請求項１５】
形質細胞障害を処置するための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子を含む、組成物。
【請求項１６】
前記形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、および無症候性骨髄腫より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記形質細胞障害は多発性骨髄腫である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
形質細胞障害を処置するための医薬の製造における、請求項１から８のいずれかに記載の二重特異性分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、かつＴ細胞を活性化させる、二重特異性分子に関係する。この分子は、多発性骨髄腫などの形質細胞疾患の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性腫瘍である。異常な形質細胞の集団が骨髄に凝集し、そこでそれらは正常な血球細胞の産生を妨げる。骨髄腫は、米国において２番目に一般的な血液悪性腫瘍であり（非ホジキンリンパ腫の次）、血液悪性腫瘍の１３％を、全てのがんの１％を占める。この疾患は、死の前に病的骨折、感染への感受性、腎臓そして骨髄の機能不全を引き起こすことから、苦痛と医療出費の点で負担となる。
【０００３】
多くのリンパ腫と異なり、骨髄腫は現在不治である。リンパ腫に用いられる標準的な化学療法薬は、大部分が骨髄腫には効果的でない。加えて、形質細胞ではＣＤ２０の発現が消失しているため、この疾患に対してリツキシマブを使用することはできない。ボルテゾミブやレナリドミドなどの新しい薬剤は部分的に効果的だが、長期にわたる寛解を導くことはできない。
【０００４】
そのため、上昇した効果と、改善した長期間の効果を有する、骨髄腫の処置のための代替の薬剤への必要性が存在する。
【０００５】
二重特異性抗体
２つの抗体様結合ドメインを有するという根本的な着想に基づく、広範に種々の分子が開発されてきた。
【０００６】
二重特異性Ｔ細胞誘導分子は、初めは抗がん剤としての用途のために開発された、二重特異性抗体タイプの分子のクラスである。これらは、宿主の免疫システム、より具体的にはＴ細胞の細胞障害性活性を、がん細胞などの標的細胞に対して指向させる。これらの分子中で、一方の結合ドメインがＣＤ３受容体を介してＴ細胞と結合し、他方は腫瘍細胞などの標的細胞に（腫瘍特異的分子を介して）結合する。二重特異的抗体は標的細胞とＴ細胞の両方に結合するため、標的細胞をＴ細胞の近くに引き寄せ、それによってＴ細胞が、例えばがん細胞に対する細胞障害性効果のような効果を発揮できる。Ｔ細胞：二重特異的抗体：がん細胞の複合体の形成は、Ｔ細胞中のシグナリングを誘導し、例えば細胞障害性メディエーターの放出を導く。理想的には、薬剤は標的細胞の存在下で望ましいシグナリングのみを誘導し、特異的な殺傷を導く。
【０００７】
二重特異性Ｔ細胞誘導分子は多数の異なる形式で開発されているが、最も一般的なものの１つは、異なる抗体の２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる融合物である。これらは時にＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）として知られる。
【０００８】
ＷＯ２０１２／０６６０５８およびＷＯ２０１３／０７２４１５はいずれも、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合するｓｃＦｖを含むＢｉＴＥについて記載する。
【０００９】
ＢＣＭＡは、成熟リンパ球、すなわち記憶Ｂ細胞、形質芽細胞、および骨髄形質細胞において優先的に発現している膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは多発性骨髄腫細胞でもまた発現している。
【００１０】
ＢＣＭＡは多発性骨髄腫の処置のために見込みがある標的抗原であるが、古典的なターゲティングの手法は、骨髄腫細胞上での低密度なＢＣＭＡの発現により制限される。結果的に、古典的な治療抗体は、骨髄腫細胞表面で効果的なＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を引き起こすのに十分な密度を達成しそうにない。同様に、ｍＡｂと毒または化学療法薬とのコンジュゲートは、標的とされた取り込みと非特異的な取り込みとの間の小さな相異のため、有用な治療の窓口をもたらしそうにない。
【００１１】
そのため、低いＢＣＭＡ密度を、効果的な治療活動へと識別することができる、代替の薬剤の必要性がある。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と結合し、かつ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む第一ドメイン；および
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化能を有する第二ドメイン
を含む二重特異性分子。
（項目２）
前記第二ドメインは、Ｔ細胞表面においてＣＤ３に結合することによってＴ細胞を活性化する、項目１に記載の二重特異性分子。
（項目３）
前記第二ドメインは、ＣＤ３特異的抗体またはその一部を含む、項目２に記載の二重特異性分子。
（項目４）
前記第二ドメインは、配列番号９に示されるｓｃＦｖ配列由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、項目３に記載の二重特異性分子。
（項目５）
前記第二ドメインは、配列番号９に示されるｓｃＦｖ配列、または少なくとも８０％の配列相同性を有し、かつＣＤ３に結合するそのバリアントを含む、項目３に記載の二重特異性分子。
（項目６）
前記第一ドメインは、ＢＣＭＡ結合部位を含むが、プロテオグリカン結合に寄与するＡＰＲＩＬのアミノ末端の一部を欠失した短縮型ＡＰＲＩＬを含む、前述のいずれかの項目に記載の二重特異性分子。
（項目７）
配列番号２に示される配列、またはＢＣＭＡと結合し、少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、項目２に記載の二重特異性分子。
（項目８）
前記第一および第二結合ドメインは、スペーサーによって連結される、前述のいずれかの項目に記載の二重特異性分子。
（項目９）
前記スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８の柄を含む、項目８に記載の二重特異性分子。
（項目１０）
配列番号１０、１１、もしくは１２に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＢＣＭＡに結合、およびｉｉ）Ｔ細胞を活性化する能力を保持するそれらのバリアントを含む、前述のいずれかの項目に記載の二重特異性分子。
（項目１１）
三量体としてＢＣＭＡに結合する、前述のいずれかの項目に記載の二重特異性分子。
（項目１２）
前述のいずれかの項目に記載の二重特異性分子をコードする核酸配列。
（項目１３）
配列番号１９、２０、もしくは２１に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む、項目１２に記載の核酸配列。
（項目１４）
項目１２または１３に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１５）
項目１２または１３に記載の核酸配列を含み、かつ項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子を産生する宿主細胞。
（項目１６）
前記二重特異性分子が産生されるような条件下で、項目１５に記載の宿主細胞を培養
する工程を含む、項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子を産生する方法。
（項目１７）
項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子を、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、または添加物と一緒に含む薬学的組成物。
（項目１８）
項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子を被験体に投与する工程を含む、形質細胞障害を処置するための方法。
（項目１９）
前記形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、および無症候性骨髄腫より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記形質細胞障害は多発性骨髄腫である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
形質細胞障害の処置における使用のための、項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子。
（項目２２）
形質細胞障害を処置するための医薬の製造における、項目１から１１のいずれかに記載の二重特異性分子の使用。
（項目２３）
第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含む二重特異性分子であって、前記第一および第二結合ドメインは、スペーサーによって連結され、前記スペーサーは、ＣＤ８の柄であるか、またはそれを含む、二重特異性分子。
（項目２４）
前記第一結合ドメインは標的分子に結合し、かつ前記第二結合ドメインはＴ細胞活性化能を有する、項目２３に記載の二重特異性分子。
（項目２５）
前記スペーサーは、配列番号１６に示される配列もしくはそのバリアントを含む、またはそれからなる、項目２３または２４に記載の二重特異性分子。
（項目２６）
前記スペーサーが前記二重特異性分子のホモ二量体化を引き起こす、項目２３から２５のいずれかに記載の二重特異性分子。
（項目２７）
項目２３から２６のいずれかに記載の二重特異性分子のホモ二量体型。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０７２４１５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の態様の概要
Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）は、ほとんど全ての多発性骨髄腫（ＭＭ）で発現する表面タンパク質である。ＢＣＭＡは形質細胞でない限り発現していないため、この抗原を標的とすることは、骨髄腫の効果的な処置となり得る。しかしながらＢＣＭＡの低レベルな発現は、この抗原を標的とするときの検討事項である。
【００１４】
本発明者らは、二重特異性Ｔ細胞活性化（ＢＴＡ）分子に、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に基づく結合ドメインを使用する場合、ＢＣＭＡ結合抗体よりもむしろその分子は骨髄腫細胞の存在下でＴ細胞の活性化を引き起こす能力を有することを、驚いたことに発見している。
【００１５】
理論に拘束されることを望むわけではないが、本発明者らは、これは本発明の二重特異性分子が、３回対称でＢＣＭＡに結合するためであると予想している：すなわち、ＢＣＭＡと本発明のＢＴＡとの相互作用は、それぞれの結合パートナーの三量体化を必要とする（図２Ｂを参照）。これは、タンパク質レベルでのＴ細胞活性化ドメインの集合を誘導する。
【００１６】
古典的なＢｉＴＥの方法を用いると、Ｔ細胞活性化は、十分な数のＣＤ３／ＴＣＲ複合体がＢｉＴＥによって結合されたときのみに生じる。これは今度は標的細胞上の抗原密度に依存する。Ｔ細胞活性化カスケードを引き起こすための閾値を超えるために、十分な結合が生じなければならない。結合が不十分な場合は、例えば、標的細胞上の標的抗原の発現レベルが少なすぎるために、この閾値は満たされず、そしてＴ細胞活性化は生じない。
【００１７】
本発明の二重特異性分子では、標的細胞上のＢＣＭＡ分子の発現が、本発明の３つの二重特異性分子が集合をすることを引き起こし、Ｔ細胞活性化のための３つのＣＤ３結合ドメインを提供する。本発明の二重特異性分子が二量体として存在する実施形態では（例えばＣＤ８の柄（Ｓｔａｌｋ）を含む実施例、図２（ａ）（３）を参照）、ＢＴＡは、それぞれの結合したＢＣＭＡにつき２つのＣＤ３／ＴＣＲ複合体をリクルートすることができ、これによりよりこのシグナルの増幅を更に高めている。この化学量は、Ｔ細胞の活性化を導くためのＣＤ３結合の閾値レベルを提供するのに十分である。
【００１８】
そのため、第一の態様において、本発明は、：
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、かつ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む第一ドメイン；および
（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化することのできる第二ドメイン
を含む二重特異性分子を提供する。
【００１９】
第二ドメインは、Ｔ細胞表面のＣＤ３に結合することによってＴ細胞を活性化させ得る。この点で、第二ドメインはＣＤ３またはＴＣＲ特異的な抗体またはその一部を含み得る。
【００２０】
第二ドメインは、配列番号９に示されるｓｃＦｖ由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【００２１】
第二ドメインは、配列番号９に示されるものなどのｓｃＦｖ配列を含み得る。第二ドメインは、少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつＣＤ３と結合する、そのような配列のバリアントを含み得る。
【００２２】
第一ドメインは、ＢＣＭＡ結合部位を含むが、プロテオグリカン結合に寄与するＡＰＲＩＬのアミノ末端部分を欠失した、短縮型ＡＰＲＩＬを含み得る。そのような分子は配列番号２に示される配列を含み得る。代替的にその分子は、ＢＣＭＡと結合する、少なくとも８０％の配列同一性を有する、その配列のバリアントを含み得る。
【００２３】
第一および第二結合ドメインは、ＩｇＧ１ヒンジ、セリン−グリシンリンカー、またはＣＤ８の柄を含むスペーサーなどのスペーサーによって連結され得る。
【００２４】
スペーサーは、例えばスペーサー中の、これが、同じスペーサーを含む別の分子とジスルフィド結合を形成できる１つまたは複数のシステイン残基の存在のため、ＢＴＡのホモ二量体形成を引き起こし得る。
【００２５】
二重特異性分子は、配列番号１０、１１、もしくは１２に示される配列、または、少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＢＣＭＡに結合する、およびｉｉ）Ｔ細胞を活性化する能力を保持するそのバリアントを含み得る。
【００２６】
二重特異性分子は、形質細胞表面のＢＣＭＡのようなＢＣＭＡに三量体として結合し得る。
【００２７】
第二の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子をコードする核酸配列を提供する。
【００２８】
核酸配列は、配列番号１９、２０、もしくは２１に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００２９】
第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様に記載の核酸配列を含むベクターを提供する。
【００３０】
第四の態様において、本発明は、本発明の第二の態様に記載の核酸配列を含み、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子を産生する宿主細胞を提供する。
【００３１】
第五の態様において、本発明は、二重特異性分子が産生されるような条件下で、本発明の第四の態様に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子を産生する方法を提供する。
【００３２】
第六の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子を、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、または添加物と共に含む薬学的組成物を提供する。
【００３３】
第七の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子を被献体へ投与する工程を含む、形質細胞障害を治療する方法を提供する。
【００３４】
形質細胞障害は、例えば形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症または無症候性骨髄腫であり得る。
【００３５】
形質細胞障害は、多発性骨髄腫であり得る。
【００３６】
第八の態様において、本発明は、形質細胞障害の治療における使用のための、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子を提供する。
【００３７】
第九の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に記載の二重特異性分子の、形質細胞障害を治療するための医薬品の製造における使用を提供する。
【００３８】
第十の態様において、本発明は、第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含む二重特異性分子を提供し、ここでこの第一および第二結合ドメインは、ＣＤ８の柄であるかまたはそれを含むスペーサーによって連結されている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬのリガンド特異性と機能割り当て  ＢＡＦＦはＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、およびＴＡＣＩと相互作用し、一方でＡＰＲＩＬはＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびプロテオグリカンと相互作用する。ＢＡＦＦ−Ｒ活性化は、末梢Ｂ細胞の生存に影響を及ぼし、一方でＢＣＭＡは形質細胞の生存に影響を及ぼし得る。ＡＰＲＩＬのプロテオグリカンとの相互作用は、ＡＰＲＩＬの酸性硫酸化グリコサミノグリカン側鎖アミノ末端に関係する。
【図２Ａ】Ａ：デザインされ構築された異なる形式  （１）ＩｇＧ１ヒンジによって短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（２）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（３）ＣＤ８の柄を介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（４）ＩｇＧ１ヒンジを介してＯＫＴ３と連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；（５）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；（６）ＣＤ８スペーサーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ。コンストラクト（３）および（６）は、ＣＤ８スペーサー中のジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成する。Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥに結合した状態での細胞間接触面の分子集合の概念図。
【図２Ｂ】Ａ：デザインされ構築された異なる形式  （１）ＩｇＧ１ヒンジによって短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（２）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（３）ＣＤ８の柄を介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；（４）ＩｇＧ１ヒンジを介してＯＫＴ３と連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；（５）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；（６）ＣＤ８スペーサーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ。コンストラクト（３）および（６）は、ＣＤ８スペーサー中のジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成する。Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥに結合した状態での細胞間接触面の分子集合の概念図。
【図３】異なるＡＰＲＩＬｉＴＥコンストラクトをトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の上清のウェスタンブロット。ブロッティングは、抗ＡＰＲＩＬを用いて行った。
【図４ａ】ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３、および６の、野生型ＳｕｐＴ１細胞、およびＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞への結合。染色は抗ＡＰＲＩＬビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣによるものである。Ａｐｒｉｌｉｔｅは、野生型ＳｕｐＴ１細胞への結合は示さないが、ＢＣＭＡ発現細胞には結合し、かつより少ない程度でＴＡＣＩ発現細胞に結合する。
【図４ｂ】野生型ＪｕｒｋａｔへのＡＰＲＩＬｉＴＥの結合、しかしＴ細胞受容体のないＪｕｒｋａｔへは除いて。これは、ＡＰＲＩＬｉＴＥがＴ細胞受容体に結合することを実証する。
【図５】ブランクの培地または３つのＡＰＲＩＬｉＴＥ存在下で、Ｔ細胞と何も導入していないか、または改変したＳｕｐＴ１細胞との１：１共培養。
【図６】ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３、および６の存在下で、共培養３日間後に、ＢＣＭＡ発現ＳｕｐＴ１細胞の完全な消失が観察された。
【図７】初代骨髄腫でのＢＣＭＡ発現の例。ラット抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｖｉｃｋｙ１によって染色した骨髄腫サンプルの４例を示す。最初のパネルは、形質細胞白血病（骨髄腫の異常であり、進行した、かつ侵襲性の形態）患者での明瞭なＢＣＭＡの染色を示す。他の３つの症例は医学的かつ形態的に典型的な骨髄腫である。これらは典型的に見られる中間的または曇った染色を示す。アイソタイプ対照（灰色）での染色を重ね合わせている。
【図８ａ】ＡＰＲＩＬｉＴＥのアミノ酸配列Ａ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１；Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０３；Ｃ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０６
【図８ｂ】ＡＰＲＩＬｉＴＥのアミノ酸配列Ａ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１；Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０３；Ｃ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０６
【図８ｃ】ＡＰＲＩＬｉＴＥのアミノ酸配列Ａ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１；Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０３；Ｃ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０６
【図９】アイソタイプ対照の上に重ねたＢＣＭＡでの骨髄腫サンプルの染色。これらの骨髄腫細胞はＢＣＭＡを発現するが、ただし低いレベルである。
【図１０】１日目での共培養および対照の低倍率鏡検。ＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下で、骨髄腫細胞と培養したときに、Ｔ細胞の透明な凝集／活性化を見ることができる。
【図１１】骨髄腫細胞単独、末梢血Ｔ細胞との共培養の両方共に、ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃３および＃６の非存在下または存在下でのインターフェロンガンマの放出。
【図１２】培養液中での骨髄腫細胞の共培養６日目での生存率。試験した両方のＡＰＲＩＬｉＴＥは、ＰＢＭＣの存在下で初代骨髄腫細胞の効果的な殺傷をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）
本発明の第一の態様の二重特異性分子は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する第一ドメインを含む。
【００４１】
ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７としても公知）は、専らＢ系列造血細胞または樹状細胞において発現する、形質細胞特異的表面抗原である。これはＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。ＢＣＭＡはナイーブＢ細胞では発現されないが、形質細胞芽へのＢ細胞分化の間にはアップレギュレートされ、記憶Ｂ細胞、形質細胞芽、および骨髄形質細胞では明瞭に発現される。ＢＣＭＡは、初代骨髄腫細胞の大部分においても発現される。
【００４２】
ＢＣＭＡは、図１で模式的に示される相互接続したリガンドと受容体とのネットワーク内で機能する。２つの他のＴＮＦ受容体は、活性化Ｔ細胞および全てのＢ細胞で見出されるＢＣＭＡ−ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ならびにＢリンパ球で優先的に発現するＢＡＦＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）と、リガンドＡＰＲＩＬおよびＢＣＭＡを共有する。多発性骨髄腫細胞は、いくつかの症例においてはＴＡＣＩを、そしてほとんどの症例においてはＢＣＭＡを発現するが、ＢＡＦＦ−Ｒは全く発現しない。
【００４３】
ＡＰＲＩＬ
本発明の二重特異性分子の第一ドメインは、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む。ＡＰＲＩＬはＴＮＦＳＦ１３としても公知される。
【００４４】
ＡＰＲＩＬの野生型配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ／Ｏ７５８８８で入手でき、以下に示される（配列番号１）。これはシグナルペプチドを有さないという点で古典的な分泌タンパク質ではない。これはフーリン切断部位”ＫＱＫＫＱＫ”（配列番号１において下線を引かれている）を有する。アミノ末端はプロテオグリカン結合に関係する。
【００４５】
第一結合ドメインは、ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡ結合部位を含み得る。第一結合ドメインは、ＢＣＭＡ結合部位を含むＡＰＲＩＬの断片を含み得る。
【００４６】
第一結合ドメインは、分子のアミノ末端を欠失した、短縮型ＡＰＲＩＬを含み得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合を保持するが、プロテオグリカン結合は失い得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、フーリン切断部位、またはその直後で切断され得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号２で示される野生型ＡＰＲＩＬ分子からアミノ末端１１６アミノ酸を欠失し得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号２で示される配列（太字で示される配列番号１の一部に対応する）、またはそのバリアントを含み得る。これは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合に必要とされる分子の一部に対応する。
【化１】
0006557657.tif 000002
【化２】
0006557657.tif 000003
【００４７】
本発明の二重特異性分子は、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ同等または改良されたＢＣＭＡ結合能を有する、配列番号２に示される短縮型ＡＰＲＩＬのバリアントを含み得る。そのバリアント配列は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００４８】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．において自由に入手できるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。
【００４９】
Ｔ細胞活性化
本発明の分子の第二ドメインは、Ｔ細胞活性化能を有する。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面上でＭＨＣ分子によって提示されたときに、抗原性ペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を細胞表面に有する。そのような抗原認識は、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴ  ＡＭ）のリン酸化をもたらし、これが更なるキナーゼのリクルートを引き起こし、Ｃａ２＋の放出を含むＴ細胞活性化をもたらす。
【００５０】
第二ドメインは、ＴＣＲによる抗原特異的認識によって引き起こされるものと同じパスウェイを引き起こすことによって、Ｔ細胞活性化を引き起こし得る。
【００５１】
表面抗原分類３（ＣＤ３）
本発明の二重特異性分子の第二ドメインは、ＣＤ３に結合し得る。
【００５２】
ＣＤ３は４つの別個の鎖：ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖によって構成されるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合して、活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は共にＴＣＲ複合体を含む。
【００５３】
例えば固定された抗ＣＤ３抗体による、Ｔ細胞上のＣＤ３の集合は、Ｔ細胞受容体の結合に類似したＴ細胞の活性化を導くが、そのクローンの典型的な特異性には非依存的である。
【００５４】
Ｔ細胞活性の調節における中心的な役割のため、ＴＣＲ／ＣＤ３結合能を有する分子を開発する試みがある。この仕事の多くは、ヒトＣＤ３抗原に特異的な抗体の生成にフォーカスしている。
【００５５】
第二ドメインは、ＯＫＴ３、ＷＴ３２、抗ｌｅｕ−４、ＵＣＨＴ−１、ＳＰＶ−３ＴＡ、ＴＲ６６、ＳＰＶ−Ｔ３Ｂ、またはアフィニティー調整されたそれらのバリアントなどの、ＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその一部を含み得る。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「抗体」は、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、かつドメイン抗体（ｄＡｂ）の抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み、古典的な抗体分子の抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りは、抗原結合部位に適した足場を提供し、そして抗原と結合するためにそれを適切な手段でそれを提示する、任意の配列であり得る。抗体は、免疫グロブリン全体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、ナノボディ、または一本鎖可変ドメイン（３つのＣＤＲを有するＶＨまたはＶＬ鎖であり得る）などのその一部であり得る。抗体は二機能性抗体であり得る。抗体は非ヒト、キメラ、ヒト化、または完全にヒト型であり得る。
【００５７】
代替的に、第二ドメインは、免疫グロブリン由来でない、または免疫グロブリンに基づかないＣＤ３結合分子を含み得る。多数の「抗体模倣」デザインされたリピートタンパク質（ＤＲＰ）が開発され、非抗体ポリペプチドの結合能が利用されている。そのような分子としては、アンキリンまたはロイシン−リッチリピートタンパク質、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）、アンチカリン、アビマー、およびヴァーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）が挙げられる。
【００５８】
本発明の二重特異性抗体の第二ドメインは、ＦＤＡによって認可された最初のモノクローナル抗体である、モノクローナル抗体ＯＫＴ３の全長または一部を含み得る。ＯＫＴ３は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８００１から入手可能である。抗体配列は、米国特許第７，３８１，８０３において公開されている。
【００５９】
第二ドメインは、ＯＫＴ３由来の１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。第二結合ドメインは、ＯＫＴ３重鎖由来のＣＤＲ３、および／またはＯＫＴ３軽鎖由来のＣＤＲ３を含み得る。第二結合ドメインは、以下に示すように、ＯＫＴ３由来の６つ全てのＣＤＲを含み得る。
【００６０】
重鎖
ＣＤＲ１：（配列番号３）ＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ
ＣＤＲ２：（配列番号４）ＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ
ＣＤＲ３：（配列番号５）ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ
【００６１】
軽鎖
ＣＤＲ１：（配列番号６）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ
ＣＤＲ２：（配列番号７）ＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳ
ＣＤＲ３：（配列番号８）ＱＱＷＳＳＮＰＦＴ
【００６２】
第二結合ドメインは、ＯＫＴ３由来のＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含み得る。第二結合ドメインは、配列番号９として以下に示されるｓｃＦｖ配列、またはＣＤ３結合能を残し、少なくとも８０％の配列同一性を有する、そのバリアントを含み得る。
【化３】
0006557657.tif 000004
【００６３】
配列番号９由来のバリアント配列は、配列番号９で示す配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の配列同一性を有し得、かつ同等または改良されたＣＤ３結合能、および／またはＴＣＲ活性化能を有し得る。
【００６４】
二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢＩＴＥＳ）
ＢｉＴＥＳは、標的抗原をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に接近させる、治療薬の新しいクラスである。本来のデザインは、一方のｓｃＦｖ標的抗原とＴ細胞を活性化させる他方とが、リンカーによって一緒に連結された２つのｓｃＦｖであった。
【００６５】
ＢｉＴＥは、短い５残基ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）を介して、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを抗標的抗原ｓｃＦｖに融合させることによって、一般的に作製される。１９９５年に、ＣＨＯ細胞で、ＥｐＣＡＭ（上皮１７−１Ａ抗原）およびヒトＣＤ３を標的としたタンデムｓｃＦｖが産生された。この新種の二重特異性抗体の形式は、共シグナリングの非存在下で無刺激のヒトＰＢＭＣを使用して、多様な細胞株に対してナノモル濃度で高度に細胞毒性であることが証明された。後に、マウス抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖとマウス抗ＣＤ３  ｓｃＦｖとの間の融合物が創出された。この分子は、共シグナリング（例えばＣＤ２８を通じた）の必要なしに、効果的な細胞毒性を含む傑出したインビトロ特性を実証した。
【００６６】
マウス抗ヒトＣＤ３×抗ヒトＣＤ１９であるブリナツモマブは、開発された最初のＢｉＴＥであり、かつ臨床試験で最も進行したＢｉＴＥである。その候補はリンパ腫および白血病への処置として研究されている。
【００６７】
抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗ヒトＣＤ３  ＴａＦｖであるＭＴ１１０は、臨床試験で試験された２番目のＢｉＴＥであり、かつ最初は広範な固形腫瘍に指向された。ＭＴ１１０のインビトロ特性評価は、腫瘍細胞株においてＭＴ１０３で得られた結果を再現し、それによってＢｉＴＥ形式の普遍性を実証した。ＭＴ１１０は現在、肺がん、大腸がん、および胃腸がん患者のための臨床試験中である。
【００６８】
本発明の二重特異性分子は、ＢｉＴＥ様の形式に基づくが、標的抗原に結合するｓｃＦｖまたは他の抗体に基づく結合ドメインを有する代わりに、ＢＣＭＡに対するリガンド、つまりＡＰＲＩＬに基づく結合ドメインを有する。
【００６９】
この「ＡＰＲＩＬｉＴＥ」形式は、様々な理由で古典的なｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式と比較して好ましい：（ａ）単一ドメイン−ｓｃＦｖ融合物は、他の形式よりも安定であり、かつ作製が容易でありそうである；（ｂ）細胞表面でのＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬのアセンブリは、それぞれの結合パートナーの三量体化を必要とする。これは、タンパク質レベルでのＴ細胞活性化ドメインの集合を誘導し、タンパク質を高度に特異的に、かつ高度に強力にする。
【００７０】
本発明の分子は、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る：
【化４】
0006557657.tif 000005
【化５】
0006557657.tif 000006
【化６】
0006557657.tif 000007
【００７１】
本発明の分子は、バリアント配列が本発明の最初の態様で定義された分子、すなわち：
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、かつ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む第一ドメイン；および
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化能を有する第二ドメイン
を含む二重特異性分子である限り、配列番号１０、１１、または１２に示される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。
【００７２】
シグナルペプチド
発明の二重特異性分子は、その産生を補助するシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、二重特異性分子が宿主細胞上清より回収できるように、二重特異性分子の宿主細胞からの分泌を引き起こし得る。
【００７３】
シグナルペプチドのコアは、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、移行の間にポリペプチドの適切なトポロジーに強制することを補助する、アミノ酸の短い正に荷電されたストレッチより開始し得る。シグナルペプチドの端部には、典型的にシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ切断されるアミノ酸のストレッチがある。シグナルペプチダーゼは、移行間または完了の後のいずれかに切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的なプロテアーゼによって消化される。
【００７４】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
【００７５】
二重特異性分子は、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド−第一ドメイン−第二ドメイン
【００７６】
シグナルペプチドは、配列番号１３もしくは１４、またはシグナルペプチドが二重特異性分子の分泌をまだ引き起こすよう機能する限り、５、４、３、２、または１つのアミノ酸変異（挿入、置換、または付加）を有するそれらのバリアントを含み得る。
【００７７】
配列番号１３：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号１４：ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ
【００７８】
配列番号１３および１４のシグナルペプチドは、コンパクトであり、かつ高度に効果的である。それらは、末端グリシン後に約９５％の切断を生じさせると予測され、これがシグナルペプチダーゼによる効果的な除去を生じさせる。
【００７９】
スペーサー
本発明の分子は、第一ドメインと第二ドメインとを連結させ、かつこの２つのドメインを空間的に離すためのスペーサー配列を含み得る。
【００８０】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８の柄を含み得る。リンカーは、代替的にＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８の柄と同様の長さおよび／またはドメイン配置特性を有する代替的なリンカー配列を含み得る。
【００８１】
スペーサーは、短いスペーサー（例えば１００未満、８０未満、６０未満、または４５未満のアミノ酸を含むスペーサー）であり得る。スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８の柄、またはそれらの修飾された形態であるか、またはそれらを含み得る。
【００８２】
これらリンカーのアミノ酸配列の例は下記に挙げられる：
【００８３】
配列番号１５（ＩｇＧ１ヒンジ）：ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫＳＧＧＧＧＳ
配列番号１６（ＣＤ８の柄）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
【００８４】
ＣＤ８の柄は、ホモ二量体の形成を誘導し得るような配列を有する（図２を参照）。これが望まれない場合には、１つまたは複数のシステイン残基が、ＣＤ８の柄の配列より置換または除去され得る。本発明の二重特異性分子は、スペーサーを含み得、スペーサーは配列番号１６に示される配列、もしくはそのバリアントを含むかまたはそれからなり、そのバリアントは、第一および第二ドメインのおおよそ同等な配置を引き起こし、ならびに／もしくはバリアント配列は、二重特異性分子のホモ二量体化を引き起こす分子である限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する。
【００８５】
本発明の分子は、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド−第一ドメイン−スペーサー−第二ドメイン
【００８６】
スペーサーは、チェーンブレークを導入するための１つまたは複数のリンカーモチーフを含み得る。チェーンブレークは、２つの別個のドメインを分離させるが、異なる角度に配向させる。そのような配列は、配列ＳＤＰ、および配列ＳＧＧＧＳＤＰ（配列番号１７）を含み得る。
【００８７】
リンカーは、ＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）などのセリン−グリシンリンカーを含み得る。
【００８８】
核酸配列
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様の二重特異性分子をコードする核酸配列に関する。
【００８９】
核酸配列は、下記の配列の１つであるか、またはそれを含み得る。
【化７−１】
0006557657.tif 000008
【化７−２】
0006557657.tif 000009
【化８−１】
0006557657.tif 000010
【化８−２】
0006557657.tif 000011
【化９】
0006557657.tif 000012
【００９０】
核酸配列は、配列番号１９、２０、または２１によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝暗号の縮重に起因して、異なる核酸配列を有し得る。核酸配列は、本発明の第一の態様で定義される分子をコードする限り、配列番号１９、２０、または２１に示される配列と、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有し得る。
【００９１】
ベクター
本発明は、本発明に記載の核酸配列を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、本発明の第一の態様に記載の分子を発現し、かつ産生するよう、宿主細胞に核酸配列を導入するために使用され得る。
【００９２】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００９３】
宿主細胞
本発明は、本発明に記載の核酸を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、本発明の第一の態様に記載の分子の産生能を有し得る。
【００９４】
宿主細胞は、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３などの哺乳動物細胞であり得る。
【００９５】
本発明はまた、本発明の第一の態様に記載の分子を産生する方法も提供し、この方法は、分子の産生に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養し、そして次いで宿主細胞または上清より分子を回収する工程を含む。
【００９６】
上記のような、細胞において産生される本発明の二重特異性分子は、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、または封入体中）で産生され、そして次いで宿主細胞より単離され、そして必要に応じてさらに精製されるか；またはそれらは、細胞外（例えば、宿主細胞が培養されている培地中）で産生され、そして次いで培養培地より単離され、そして必要に応じてさらに精製されるかのいずれかであり得る。
【００９７】
薬学的組成物
本発明は、有効成分として、少なくとも１つの本発明の二重特異性分子を、薬学的に許容されるキャリア、希釈液、または添加物、および／または補助剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のさらなる薬学的に有効なポリペプチド、および／または化合物を一緒に含む薬学的組成物にも関係する。そのような製剤は、例えば、経口投与または非経口投与（静脈内、筋肉内、または皮下注射、または静脈注入）に適した形式であり得る。
【００９８】
処置の方法
本発明の分子は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に関連する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のために使用され得る。
【００９９】
形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ（ＰＯＥＭＳ症候群）、およびＨ鎖病と意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症／無症候性骨髄腫を含む。
【０１００】
上記疾患は、多発性骨髄腫であり得る。
【０１０１】
上昇したＢＣＭＡ発現レベルに相関するＢ細胞障害の例は、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。本発明の二重特異性結合薬剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の治療においても使用され得る。
【０１０２】
本発明の方法は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に相関する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のためであり得る。
【０１０３】
疾患の処置のための方法は、本発明の分子の治療的使用に関係する。本明細書中では、疾患に付随する少なくとも１つの症状を小さくする、減少する、もしくは改善する、および／または疾患の進行を遅延する、減少する、もしくは阻止するために、その分子が、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。本発明の分子または薬学的組成物は、形質細胞などのＢＣＭＡ発現細胞のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こすか、または促進し得る。
【０１０４】
ここで本発明がさらに実施例によって記載されるが、これは本発明の実施において当業者を支援することに役立つことを意図しており、本発明の範囲を制限することを何ら意図しない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１  一連の”ＡＰＲＩＬＩＴＥＳ”の構築
図２Ａに示されるように、本発明者らは、ＯＫＴ３由来のｓｃＦｖをＡＰＲＩＬの細胞外領域に結合させる、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体を構築した。これらの分子の構築の間に、いくつかのデザインの検討が行われた：（ａ）ＡＰＲＩＬのプロテオグリカンに結合するＮ末端領域を短縮させ、非特異的な結合を防いだ；（ｂ）コンストラクト４、５、および６ではシグナルペプチドを成熟したＡＰＲＩＬの外部ドメインに結合した；（ｃ）ＯＫＴ３を、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結するリンカーでｓｃＦｖとして再形式化した；（ｄ）ｓｃＦｖとＡＰＲＩＬとの間に種々の異なるスペーサーを試した。
【０１０６】
種々の異なる形式は以下である：
（１）ＩｇＧ１のヒンジによって短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；
（２）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；
（３）ＣＤ８の柄を介して短縮型ＡＰＲＩＬと連結したＯＫＴ３  ｓｃＦｖ；
（４）ＩｇＧ１のヒンジを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；
（５）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ；および
（６）ＣＤ８スペーサーを介してＯＫＴ３  ｓｃＦｖと連結した短縮型ＡＰＲＩＬ。
コンストラクト（３）および（６）は、ＣＤ８スペーサー中のジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成する。コンストラクト（１）、（３）、および（６）のアミノ酸配列は図８に示される。
【０１０７】
実施例２  ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＲＩＬｉＴＥの発現
２９３Ｔ細胞に、上に挙げたＡＰＲＩＬｉＴＥコンストラクトをコードする発現プラスミドをトランスフェクションした。２９３Ｔ細胞由来の上清をアクリルアミドゲル上で泳動し、タンパク質をメンブレンに転写した。次にメンブレンを、ＡＰＲＩＬを認識する抗体によって染色した。その結果は図３に示される。タンパク質１、３および６が予想される分子量で検出された。タンパク質２、４および５は検出されず、これらの構成は不安定であることが示された。
【０１０８】
実施例３  ＴＣＲとＢＣＭＡへの結合
次に、これらのタンパク質が一端でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、他端でＢＣＭＡの両方と結合できるか否かについて調べた。トランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の上清を使用して、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞およびＴＣＲαβがノックアウトされたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞クローンを染色した。これはＡＰＲＩＬｉＴＥがＴＣＲに結合することを示す(図４ｂ)。ＢＣＭＡを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞、およびＴＡＣＩを発現するよう改変したＳｕｐＴ１細胞を、二次的に抗ＡＰＲＩＬビオチンとそれに続くストレプトアビジンＰＥを用いて、上記の上清と共に染色した。その結果は図４ａに示される。ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３、および６はＢＣＭＡに結合し、そしてＴＡＣＩとはより少ない程度でＴＡＣＩと結合することが見出された。
【０１０９】
実施例４  安定なＡＰＲＩＬＩＴＥはＩＦＮγの放出を誘起する。
正常ドナーＴ細胞を異なるＳｕｐＴ１と１：１で培養した。使用したＳｕｐＴ１は何も導入していないもの、ＢＣＭＡを発現するように改変したもの、またはＴＡＣＩを発現するように改変したもののいずれかであった。その結果を図５に示す。Ｔ細胞は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩで改変したＳｕｐＴ１細胞に曝された時に、いずれかのＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下でのみＩＦＮγを放出することが見出された。ＢＣＭＡへの応答は、ＴＡＣＩへの応答よりも大きかった。
【０１１０】
実施例５  安定なＡＰＲＩＬＩＴＥはＢＣＭＡ＋標的のＴ細胞媒介性殺傷を誘導する。
Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３および６の非存在下または存在下で、野生型ＳｕｐＴ１細胞、ＢＣＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞、およびＴＡＣＩの発現するＳｕｐＴ１細胞と、１：１で培養した。その結果を図６に示す。残っているＴ細胞は、ＡＰＲＩＬｉＴＥを添加していない条件下で存在するＳｕｐＴ１細胞の比率として示される。
【０１１１】
実施例６  初代骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の解析
４つの異なる骨髄腫サンプルを、ラット抗ヒトＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｖｉｃｋｙ１によって染色した。その結果を図７に示す。医学的かつ形態的に典型的な骨髄腫（パネル２から４）において、中間的または曇った染色が観察された。
【０１１２】
実施例７  初代骨髄腫細胞におけるＡＰＲＩＬＩＴＥの効果の解析
既知のＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫を有する２人の患者由来の診断用の骨髄吸引物由来の余った材料を使用した。ＣＤ１３８磁気ビーズによる選択を行って、吸引物から骨髄腫細胞を精製した。これらの細胞を完全培養培地中で４８時間休止させ、ＢＣＭＡについて染色を行って、それらが実際にＢＣＭＡ陽性であるか確認した。骨髄細胞はＢＣＭＡを発現するが、ただし低いレベルではあることが見出された（図９）。
【０１１３】
次に、ＯＫＴ３とＣＤ２８．２を用いて刺激した正常ドナー由来の末梢血単核球から、ＣＤ５６を枯渇させ、ＮＫ細胞を取り除いた。ＡＰＲＩＬＩＴＥ＃０３とＡＰＲＩＬＩＴＥ＃０６のいずれかの非存在下または存在下で、ＣＤ５６を枯渇させたＰＢＭＣとＣＤ１３８で選択した初代骨髄腫細胞を１：１で共培養した。ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１を試験するためには、不十分な材料があった。共培養物を顕微鏡によって観察した。上清中へのインターフェロンガンマの放出を、ＥＬＩＳＡによって計測した。骨髄腫細胞の生存を、アネクシンＶ／ＰＩ染色およびビーズ計数で制御されたフローサイトメトリーによって計測した。
【０１１４】
透明な凝集（Ｔ細胞活性化の指標）が共培養下において観察された（図１０を参照）。ＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下で、ＰＢＭＣを骨髄腫細胞と培養した条件においてインターフェロンガンマの放出が観察されたにも関わらず、ＳｕｐＴ１  ＢＣＭＡ細胞との共培養の時よりも少ない絶対量であった。（図１１）。骨髄腫細胞の殺傷もまた、共培養６日後にＰＢＭＣがＡＰＲＩＬｉＴＥと共に存在するときに観察された（図１２）。
【０１１５】
これらの発見は、Ｔ細胞媒介性の骨髄腫細胞の殺傷を引き起こすのに十分なレベルの初代骨髄腫細胞の存在下で、ＡＰＲＩＬｉＴＥはＴ細胞の活性化を引き起こすということを実証した。
【０１１６】
実施例８  ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＰＲＩＬｉＴＥの試験
ｈｕＳＣＩＤモデルを使用した：ＮＳＧ（ｎｏｄ−ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ）マウスは、典型的なレベルのＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞株を異種移植されている。これらの株は、生物発光イメージングによって疾患を計測するために、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変されている。正常ドナーのＰＢＭＣは、付随するＡＰＲＩＬｉＴＥの腹腔内投与の間に、尾静脈を介して投与される。以下を順番に計測した  （１）ＡＰＲＩＬｉＴＥの血清レベル；（２）ヒトインターフェロンガンマの血清レベル；（３）フローサイトメトリーによる末梢血Ｔ細胞の増加量、生着、および活性化；（４）腫瘍の生物発光計測。次に、以下を計測した：（１）骨髄組織学による腫瘍の負荷；（２）骨髄、脾臓、血液、およびリンパ節のフローサイトメトリーによるＴ細胞の増殖と生着；ならびに（３）残りの組織は任意の毒性について肉眼で、および免疫組織学的に調べた。
【０１１７】
上記の明細書の中で言及されている全ての刊行物は、本明細書中に参照により援用される。記載された方法の種々の改変および変化、ならびに本発明のシステムは、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当事者に明白であろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、記載された手法についての発明を遂行するための、分子生物学、細胞免疫学、または関連する分野の当事者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された態様の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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