(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内にカーゴを形質導入するための送達分子であって、
（Ａ）カーゴと、
（Ｂ）（ｉ）前記細胞の表面上のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ−ＧＡＧ）に結合できるヘパリン結合ドメインもしくはその機能的変異体、または、
（ｉｉ）ＧＡＧ結合抗体もしくはその機能的結合フラグメント、を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合エレメントと、
（Ｃ）タンパク質形質導入ドメインと
を含み、前記タンパク質形質導入ドメインはヘパリン結合ドメインではない、送達分子。
【請求項２】
細胞内にカーゴを形質導入するための送達分子であって、
（Ａ）カーゴに結合するためのカーゴ結合分子であって、任意選択で前記カーゴが前記カーゴ結合分子に結合しているカーゴ結合分子と、
（Ｂ）（ｉ）前記細胞の表面上のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ−ＧＡＧ）に結合できるヘパリン結合ドメインもしくはその機能的変異体、または、
（ｉｉ）ＧＡＧ結合抗体もしくはその機能的結合フラグメント、を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合エレメントと、
（Ｃ）タンパク質形質導入ドメインと
を含み、前記タンパク質形質導入ドメインはヘパリン結合ドメインではない、送達分子。
【請求項３】
前記ＧＡＧ結合エレメントがＨＢ−ＥＧＦのＰ２１、またはその短縮変異体、伸長変異体、もしくは機能的変異体を含む、請求項１または２に記載の送達分子。
【請求項４】
前記ＧＡＧ結合エレメントが線維芽細胞増殖因子のヘパリン結合ドメイン、またはその機能的変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の送達分子。
【請求項５】
前記ＧＡＧ結合エレメントが、ＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ２Ａ、ＦＧＦ２Ｂ、ＦＧＦ４Ａ、ＦＧＦ１Ｃ、ＦＧＦ２Ｃ、ＦＧＦ４Ｃ、ＦＧＦ７Ｂ、もしくはＦＧＦ７ＣなどのＦＧＦ、ＡＴＩＩＩなどのアンチトロンビン、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、Ｓｈｈ  ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ、あるいはその変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の送達分子。
【請求項６】
前記ＧＡＧ結合エレメントがＦＧＦ２Ｂ、ＦＧＦ７Ｂ、またはＰＤＧＦのいずれかを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の送達分子。
【請求項７】
前記ＧＡＧ結合抗体、またはその変異体もしくはフラグメントが単一ドメイン抗体、またはそのフラグメントを含む、請求項１または２に記載の送達分子。
【請求項８】
前記タンパク質形質導入ドメインが親水性または両親媒性である、請求項１〜７のいずれかに記載の送達分子。
【請求項９】
前記タンパク質形質導入ドメインが過半数の親水性アミノ酸残基を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１０】
前記タンパク質形質導入ドメインが過半数のアルギニンアミノ酸残基および／またはリジンアミノ酸残基を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１１】
前記タンパク質形質導入ドメインが、
ペネトラチンまたはアンテナペディア  ＰＴＤ  ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３７）；
ＴＡＴ  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３８）；
ＳｙｎＢ１  ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号３９）；
ＳｙｎＢ３  ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号４０）；
ＰＴＤ−４  ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ（配列番号４１）；
ＰＴＤ−５  ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４２）；
ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５−４９）ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号４３）；
ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号４４）；
ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号４５）；
Ｄ−Ｔａｔ  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４６）；
Ｒ９−Ｔａｔ  ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ（配列番号４７）；
トランスポータン  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４８）キメラ；
ＭＡＰ  ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ（配列番号４９）；
ＳＢＰ  ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０）；
ＦＢＰ  ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５１）；
ＭＰＧ  ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５２）；
ＭＰＧ（ＮＬＳ）ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５３）；
Ｐｅｐ−１  ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５４）；および
Ｐｅｐ−２  ａｃ−ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５５）；または
ＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリアルギニン、ＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリリジン、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ．（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、およびＲ８を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１２】
前記タンパク質形質導入ドメインが約８個のアルギニン残基を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１３】
前記カーゴがペプチド、タンパク質、核酸、およびナノ粒子を含む群のいずれかから選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１４】
前記カーゴが治療用分子；薬物；プロドラッグ；酵素もしくは転写因子などの機能性タンパク質もしくはペプチド；微生物タンパク質もしくはペプチド；および毒素；またはそれをコードする核酸を含む群のいずれかから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１５】
前記カーゴが約２０アミノ酸〜約３０，０００アミノ酸の長さである、請求項１〜１４のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１６】
前記カーゴ結合分子がペプチド、タンパク質、ストレプトアビジン、核酸結合分子、抗体もしくはそのフラグメント、抗体模倣物、化学的リンカー分子、アフィニティータグ、またはアフィニティータグ化分子のいずれかを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の送達分子。
【請求項１７】
形質導入のための送達分子を作製する方法であって、
（ｉ）細胞の表面上のＧＡＧに結合できる、ＧＡＧ結合エレメントを有するカーゴと、タンパク質形質導入ドメインとを融合する段階；または
（ｉｉ）カーゴをコードする核酸と、ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸とを組み合わせ、前記核酸から前記送達分子を発現させる段階；または
（ｉｉｉ）前記細胞の表面上のＧＡＧを結合できる、ＧＡＧ結合エレメントを有するカーゴと、タンパク質形質導入ドメインとをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する段階
を含み、
前記ＧＡＧ結合エレメントは、
（ｉ）前記細胞の表面上のＧＡＧに結合できるヘパリン結合ドメインもしくはそ
の機能的変異体、または、
（ｉｉ）ＧＡＧ結合抗体もしくはその機能的結合フラグメント、を含み、
前記タンパク質形質導入ドメインはヘパリン結合ドメインではない、方法。
【請求項１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内にカーゴを形質導入する方法であって、
請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子を準備することと、
前記細胞を前記送達分子と接触さることと
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって形質導入された細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子を含む、細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子をコードする核酸。
【請求項２２】
形質導入のためのタンパク質の発現のためのベクターであって、
ＧＡＧ結合エレメントをコードする配列と、
タンパク質形質導入ドメインをコードする配列と
を含み、
前記ＧＡＧ結合エレメントは、
（ｉ）細胞の表面上のＧＡＧに結合できるヘパリン結合ドメインもしくはその機
能的変異体、または、
（ｉｉ）ＧＡＧ結合抗体もしくはその機能的結合フラグメント、を含み、
前記タンパク質形質導入ドメインはヘパリン結合ドメインではない、ベクター。
【請求項２３】
カーゴまたはカーゴ結合分子をコードする配列をさらに含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項２１に記載の核酸または請求項２２もしくは２３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２５】
形質導入のための送達分子の作製のための工程であって、
請求項２４に記載の細胞から前記送達分子を発現させることと、
前記送達分子を実質的にまたは部分的に単離することと
を含む、工程。
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入によりカーゴを細胞内にシャペロニングするためのＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインの使用であって、
前記ＧＡＧ結合エレメントは、
（ｉ）前記細胞の表面上のＧＡＧに結合できるヘパリン結合ドメインもしくはそ
の機能的変異体、または、
（ｉｉ）ＧＡＧ結合抗体もしくはその機能的結合フラグメント、を含み、
前記タンパク質形質導入ドメインはヘパリン結合ドメインではない、使用。
【請求項２７】
疾患の治療または予防において使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子、または請求項１９、２０、または２４のいずれかに記載の細胞。
【請求項２８】
細胞培養物中の細胞機能を変更する方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２９】
請求項１〜１６のいずれかに記載の第一の送達分子を心臓幹細胞などの幹細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入し、かつ請求項１〜１６のいずれかに記載の第二の送達分子を前記幹細胞内に形質導入することによって心臓分化を誘導する方法であって、前記第一の送達分子がＧＡＴＡ４を含みかつ前記第二の送達分子がＴＢＸ５を含む、方法。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで請求項１〜１６のいずれかに記載の１つまたは複数の送達分子を非多能性細胞内に形質導入することによって多能性幹細胞を誘導する方法。
【請求項３１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子を含むか、請求項１９、２０または２４のいずれかに記載の細胞と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子を細胞内に送達することを含み、前記カーゴがナノ粒子を含む、細胞撮像の方法。
【請求項３３】
遺伝子治療において使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の送達分子であって、前記カーゴが核酸を含む、送達分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
形質導入
本発明は、生細胞内へのカーゴ分子の形質導入、例えばタンパク質形質導入など、特に形質導入の方法、形質導入のためのカーゴを作製または修飾する方法、形質導入のための送達分子および形質導入または形質導入細胞を用いる治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムおよび定義されたトランスクリプトームのための完全なツールを用いて、研究は現在、臨床応用のための治療標的の賢明な選択を可能にするために、プロテオームを機能的に注釈付けることに主眼が置かれている｛Ｚｏｇｒａｆｏｓ，２０１３，＃８６｝。タンパク質相互作用およびそれが機能を修正する仕組みは標的の選択をさらに複雑にし、正常モデルおよび疾患モデルでタンパク質の機能性を明らかにし検証する必要がある｛Ｎａｔｒａｊａｎ，２０１３，＃８９｝。ＤＮＡベースの方法およびＲＮＡベースの方法、例えばＤＮＡ遺伝子導入および遺伝子のアップレギュレーションまたはノックダウンを仲介する小分子干渉／アンチセンスオリゴヌクレオチドなどは極めて貴重なツールである｛Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，２００９，＃８７｝。しかし、これらの方法は、遺伝子改変を理由に臨床的に適切でないことがあり、または転写産物レベルとタンパク質レベルとの間に相関がみられないためにタンパク質活性に正確に対応していないことがある｛Ｐｅｎｇ，２０１１，＃８８｝。ＤＮＡ構築物でもＲＮＡ分子でもなくタンパク質を直接送達することには様々な利点があり、中でも最も注目すべき点は、細胞内の機構によって活性物質を生成するシステムに依存するのではなく、活性物質が直接投与されることである｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝。
【０００３】
細胞内でタンパク質機能を変化させることは、実際にはこれまで、レンチウイルスベクターなどのベクター構築物にしたＤＮＡにより細胞を遺伝的に形質転換させることに限られている。このことは、細胞が、所望の外部遺伝子ならびに細胞の改変および外来遺伝子構築物の発現に必要なベクターＤＮＡも含む外来性遺伝物質を保有することを意味する。この異種ＤＮＡは、例えばヒト細胞療法などで、遺伝子継承に関する問題を引き起こす可能性がある。一例を挙げれば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いた特定の再プログラミング関連遺伝子の遺伝子形質導入によって作製できる。しかし、この技術を治療に用いるうえでの障害のひとつは、腫瘍原性であるかもしれない挿入変異原性の損傷が生じることである。遺伝子送達に完全に取って代わる戦略のひとつとして、タンパク質形質導入が考えられる。
【０００４】
タンパク質形質導入療法となる可能性があるものとしてほかには、例えば筋障害の治療のための、ヒト成体幹細胞（ｈＡＳＣ）の筋原性分化が挙げられる。
【０００５】
本発明の目的は、ＤＮＡ構築物の使用を回避し、代わりにＤＮＡ構築物を必要とせず細胞にタンパク質を直接形質導入することを可能にすることである。
【０００６】
ＤＮＡ構築物を使用せずに細胞にタンパク質を形質導入することは知られており、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子などの大分子カーゴの多種多様な細胞内への形質導入を促進すると知られる有効な送達分子の数は増加の一途をたどっている｛Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，２００５，＃３６｝。カチオン性ペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）仲介による細胞内形質導入は、治療用高分子の送達に大きな可能性を秘めた細胞内移行法である。培養およびｉｎ  ｖｉｖｏの前臨床モデルで細胞中に多種多様な生物活性カーゴを送達するのにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ＴＡＴタンパク質の塩基性ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２０）およびより長い変異体）をはじめとするＰＴＤ｛Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，２００５，＃３６｝、例えばポリ−アルギニン（例えば、８Ｒ；ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９））またはリジンなどが用いられている｛Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，２００５，＃３６；Ｇｏｕｎ，２００６，＃３８；Ｍｅａｄｅ，２００７，＃３７｝。ＰＴＤによるペプチド、核酸および大分子カーゴの効率的な送達が多数のグループによって示されており、ＰＴＤ仲介性送達を用いる臨床試験が現在進行中である。ＰＴＤ取込みに関する機構的研究が多数実施されているが、正確な機序は未だ十分に明らかにされていない｛Ｆｉｓｃｈｅｒ，２００５，＃４１；Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９；Ｎａｋａｓｅ，２００８，＃４０；Ｈｅｉｔｚ，２００９，＃４２；Ｇｕｍｐ，２０１０，＃２｝。
【０００７】
ＰＴＤ融合カーゴは細胞膜を通って移動し、その細胞外濃度が送達高率に影響を及ぼすことが理解されている。最近の研究では、ＰＴＤ仲介性タンパク質送達が脂質ラフト依存性マクロピノサイトーシスなどのエンドサイトーシス経路によって仲介されることが示されている｛Ｇｕｍｐ，２０１０，＃２｝。マクロピノサイトーシスによって内部移行した後、タンパク質カーゴはマクロピノサイトーム内に含まれた状態にあり細胞質ゾル内で遊離しておらず、正確な局在および活性が限定されている。マクロピノサイトーシス小胞は他の種類のエンドソームに比べて漏出性が高いと考えられており、酸性化のため膜の完全性が次第に失われていく。このことは、ＰＴＤタグ化タンパク質の漏出がいずれも、このような特性による可能性が高いことを意味する｛Ｎｏｒｂｕｒｙ，１９９５，＃２１；Ｍｅｉｅｒ，２００２，＃２０｝。重要なことに、マクロピノサイトーシス小胞は、リソソームに融合してその内容物を分解することはない｛Ｃｏｎｎｅｒ，２００３，＃２２｝。しかし、送達には、移動を促進するため、細胞外に極めて過剰なタンパク質を必要とする。さらに、有効量がエンドソーム保持を脱して生物学的機能を発揮するには、相当な量を送達する必要がある。これらの小胞からのカーゴの放出を刺激するため、エンドソーム経路に対する、超音波処理、エンドソーム破壊ペプチドによる共処理またはクロロキンなどの化学物質による処理を含む様々な技術が開発されている｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝。エンドソーム破壊物質の共送達は、このようなペプチドがカーゴとともに直接送達され得ることから、魅力的なものである｛Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝が、この過程の効率では、未だ大部分のタンパク質が閉じ込められ細胞質ゾルに出られない状態にある｛Ｓｋｅｈｅｌ，２００１，＃３４；Ｈａｎ，２００１，＃３５｝。このため、例えば細胞に対して生理学的または代謝的発現効果を発揮するのに十分な量のタンパク質を細胞に直接形質導入できることは、これまでに現実的な選択肢にはなっていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の１つの目的は、細胞に生理作用または代謝作用をもたらすためのカーゴを形質導入する改善された方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第一の態様によれば、細胞内にカーゴを形質導入するための送達分子であって、
カーゴと；
細胞の表面のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合可能なＧＡＧ結合エレメントと；
タンパク質形質導入ドメインと
を含む、送達分子が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、細胞内にカーゴを形質導入するための送達分子であって、
カーゴに結合するためのカーゴ結合分子であって、任意選択で、カーゴがカーゴ結合分子に結合しているカーゴ結合分子と；
細胞の表面のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合可能なＧＡＧ結合エレメントと；
タンパク質形質導入ドメインと
を含む、送達分子が提供される。
【００１１】
本発明の送達分子を提供することにより、幹細胞などの細胞内へのカーゴの形質導入の効率が増大し得る点が有利である。いくつかの例では、任意の既存の既知のシステムに比して、送達量が１００倍超改善されることが示された。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントＰ２１（増殖因子由来）などのＧＡＧ結合エレメントは、８ｍｅｒアルギニンペプチドなどのタンパク質形質導入ドメイン、およびカーゴとの組み合わせで、哺乳動物細胞などの細胞内への極めて大量のカーゴの取り込みを大幅に促進する。細胞が（マクロピノサイトーシスによって）送達分子を取り込むだけでなく、送達分子が細胞マトリックスを横断し核まで送達されることが示された。この方法はＤＮＡベースのタンパク質送達より効果的であり、活性が所望される部位（核を含む）にカーゴが送達される。細胞特異的応答もまた達成可能である。
【００１２】
この技術は、これまでトランスジェニック実験に限定されていたことに変革をもたらすだけでなく、もはやｉＰＳＣをＤＮＡ構築物で改変する必要のない、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）の治療的使用の土台となる。
【００１３】
カーゴ結合分子を提供することにより、多岐にわたるカーゴに結合して細胞膜を横断させる機能をもつ分子がもたらされる点で有利である。
【００１４】
本明細書の本発明の分子送達システムは、ＧＥＴ（ＧＡＧ結合増強形質導入（ＧＡＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）またはヘパラン硫酸増強形質導入ドメイン（ＨＥＴＤ）仲介性送達と呼ばれ得る。これらの用語は互換的に使用され得る。
【００１５】
ＧＡＧ結合エレメントは、細胞表面のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ−ＧＡＧ）に結合できるＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントであり得る。
【００１６】
ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ−ＧＡＧ）は、２つのまたは３つのＨＳ鎖が密に接近して細胞表面または細胞外マトリックスタンパク質に結合しているプロテオグリカンである。ＨＳが様々なタンパク質リガンドに結合し、発生過程、血管新生、血液凝固および腫瘍転移を含む多種多様な生物活性を調節するのは、この形態である。ヘパラン硫酸は、炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのメンバーであり、構造的にヘパリンと極めて近い関係にある。両者は多様に硫酸化された反復する二糖単位からなる。ヘパラン硫酸内に最もよくみられる二糖単位は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合したグルクロン酸（ＧｌｃＡ）からなり、通常、二糖単位全体の約５０％を占める。
【００１７】
ＧＡＧ結合エレメントは、ＧＡＧに対する特異的親和性を有し得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ−ＧＡＧに対する特異的親和性を有し得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）またはその変異体を含み得る。ヘパリン結合ドメイン変異体は、短縮されたヘパリン結合ドメインまたは伸長されたヘパリン結合ドメインを含み得る。ＧＡＧ結合エレメントは、ＧＡＧに特異的または優先的に結合する任意のタンパク質、ペプチドまたは分子を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ−ＧＡＧに特異的または優先的に結合する任意のタンパク質、ペプチドまたは分子を含み得る。
【００１８】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインの少なくとも一部分を含み得る。ヘパリン結合ドメインは、ＨＢ−ＥＧＦのＰ２１を含み得る。ヘパリン結合ドメインは、Ｐ２１の短縮変異体、伸長変異体、または機能的変異体を含み得る。
【００１９】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、線維芽細胞増殖因子のヘパリン結合ドメイン、またはその機能的部分もしくは変異体を含み得る。
【００２０】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＦＧＦ、ＡＴＩＩＩなどのアンチトロンビン、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、Ｓｈｈ  ＥＧＦおよびＰＤＧＦ；またはその変異体を含む群のいずれかから選択され得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、またはＰＤＧＦのいずれかを含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、任意のＦＧＦタンパク質の１つまたは複数のヘパラン結合硫酸ドメイン（例えば、ドメインＡ、ＢまたはＣ）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントはＦＧＦ４を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＦＧＦ１  ＨＢＤ  Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ（ＦＧＦ１の第一ＨＢＤドメイン））、ＦＧＦ２  ＨＢＤ  Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ）、ＦＧＦ４  ＨＢＤ  Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ）、ＦＧＦ１  ＨＢＤ  Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ２  ＨＢＤ  Ｂ（ヘパラン硫酸結合ドメインＢ）、ＦＧＦ２  ＨＢＤ  Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ４  ＨＢＤ  Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ７  ＨＢＤ  Ｂ（ヘパラン硫酸結合ドメインＢ）、ＦＧＦ７  ＨＢＤ  Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＡＴＩＩＩなどのアンチトロンビン、ＶＥＧＦ、もしくはＰＤＧＦ、またはその変異体を含み得る。
【００２１】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、肝細胞増殖因子、インターロイキン、モルフォゲン、ＨＳ−ＧＡＧ結合酵素、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓ、エンドスタチン、口蹄疫ウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質、アネキシンＶ、リポタンパク質リパーゼ；またはそのＨＳ−ＧＡＧ結合フラグメントを含む群のいずれかから選択され得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ−ＧＡＧを特異的に結合できる任意のタンパク質、ペプチドまたは分子を含み得る。
【００２２】
「変異体」は、機能的変異体を含むと当業者には理解され、ここでは、既知の配列、報告されている配列、開示されている配列または特許請求されている配列とは一部配列の差が存在し得るが、その変異体は依然としてＨＳ−ＧＡＧに結合し得る。保存的アミノ酸置換もまた「変異体」の意味に包含される。
【００２３】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、アミノ酸配列ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ（Ｐ２１、配列番号１）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００２４】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、アミノ酸配列ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴ（ＰＤＧＦ、配列番号３）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号３と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００２５】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、アミノ酸配列ＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱ（（ＦＧＦ７、ＨＢＤＢ）配列番号５）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号５と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号５と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００２６】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、アミノ酸配列ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲ（ＦＧＦ２ＨＢＤＢ、配列番号７）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号７と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号７と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００２７】
配列同一性は、標準的なＢＬＡＳＴアライメントパラメータ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／によって提供される）により決定され得る。
【００２８】
ＧＡＧ結合エレメントは、ＧＡＧ結合抗体、またはその変異体もしくはフラグメントを含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ−ＧＡＧ結合抗体、またはその変異体もしくはフラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、抗体可変ドメイン、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＦＡｂ、Ｄａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、重鎖−軽鎖二量体、または短鎖構造であり得る。抗体変異体は、ＣＤＲを含むタンパク質足場、抗体模倣物、またはＤＡＲＰｉｎを含み得る。
【００２９】
ＧＡＧ結合ドメインまたはＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ナノボディ（重鎖抗体に由来し、軽鎖がなく、ラクダ科に天然に存在する単一ドメイン抗原結合フラグメント）を含み得る。
【００３０】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含むＶＨＨフラグメントであって、
ＣＤＲ１が、ＧＦＴＶＳＳＮＥ（配列番号２１）またはＧＦＡＦＳＳＹＡ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；
ＣＤＲ２が、ＩＳＧＧＳＴ（配列番号２３）またはＩＧＴＧＧＤＴ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；かつ
ＣＤＲ３が、ＧＲＲＬＫＤ（配列番号２５）またはＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得る、
ＶＨＨフラグメントを含み得る。
【００３１】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含むＶＨＨフラグメントであって、
ＣＤＲ１が、ＧＦＴＶＳＳＮＥ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；
ＣＤＲ２が、ＩＳＧＧＳＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；かつ
ＣＤＲ３が、ＧＲＲＬＫＤ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得る、
ＶＨＨフラグメントを含み得る。
【００３２】
あるいは、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＧＭＲＰＲＬ（配列番号２７）、ＨＡＰＬＲＮＴＲＴＮＴ（配列番号２８）、ＧＳＲＳＳＲ（配列番号２９）、ＧＲＴＶＧＲＮ（配列番号３０）、ＧＫＶＫＬＰＮ（配列番号３１）、ＳＧＲＫＧＲＭＲ（配列番号３２）、ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ（配列番号２６）、またはＲＲＹＡＬＤＹ（配列番号３３）を含み得る。
【００３３】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含むＶＨＨフラグメントであって、
ＣＤＲ１が、ＧＦＡＦＳＳＹＡ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；
ＣＤＲ２が、ＩＧＴＧＧＤＴ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得；かつ
ＣＤＲ３が、ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むか、これよりなるものであり得る、
ＶＨＨフラグメントを含む。
【００３４】
あるいは、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＬＫＱＱＧＩＳ（配列番号３４）、ＡＭＴＱＫＫＰＲＫＬＳＬ（配列番号３５）、ＨＡＰＬＲＮＴＲＴＮＴ（配列番号２８）、ＧＭＲＰＲＬ（配列番号２７）、ＲＲＹＡＬＤＹ（配列番号３３）、またはＳＧＲＫＹＦＲＡＲＤＭＮ（配列番号３６）を含み得る。
【００３５】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、抗ＨＳ  ｓｃＦｖ抗体ＡＯ４Ｂ０８、ＡＯ４Ｂ０５、ＡＯ４Ｆ１２、ＲＢ４ＣＢ９、ＲＢ４ＣＤ１２、ＲＢ４ＥＡ１２、またはＲＢ４ＥＧ１２（参照により本明細書に組み込まれるＪｅｎｎｉｓｋｅｎｓら（２０００．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０（１１）：４０９９−４１１１）およびＳｍｉｔｓら（２００６．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４１６，ｐｐ．６１−８７）に記載されている）；またはそのフラグメントを含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントはＡＯ４Ｂ０８を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＡＯ４Ｂ０８、ＡＯ４Ｂ０５、ＡＯ４Ｆ１２、ＲＢ４ＣＢ９、ＲＢ４ＣＤ１２、ＲＢ４ＥＡ１２、またはＲＢ４ＥＧ１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＡＯ４Ｂ０８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。
【００３６】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ３Ａ８、ＬＫＩＶ６９、ＥＷ３Ｄ１０、ＥＷ４Ｇ２、ＮＳ４Ｆ５、ＲＢ４ＥＡ１２、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３（参照により本明細書に組み込まれるＷｉｊｎｈｏｖｅｎら（２００８．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２５：１７７−１８５）およびＳｍｉｔｓら（２００６．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４１６，ｐｐ．６１−８７）に記載されている）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ３Ａ８、ＬＫＩＶ６９、ＥＷ３Ｄ１０、ＥＷ４Ｇ２、ＮＳ４Ｆ５、ＲＢ４ＥＡ１２、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。
【００３７】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、配列番号１５または１７（ＡＯ４Ｂ０８）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは配列番号１１または１３（ＨＳ４Ｃ３）を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、抗体、または抗体フラグメント、重鎖および／または軽鎖を含み得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントは、抗体、または抗体フラグメント、ＨＣＤＲ１鎖とＨＣＤＲ２鎖とＨＣＤＲ３鎖とを含む重鎖および／またはＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３とを含む軽鎖を含み得る。
【００３８】
タンパク質形質導入ドメインは、親水性または両親媒性であり得る。タンパク質形質導入ドメインは、過半数の親水性アミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、過半数のアルギニンアミノ酸残基および／またはリジンアミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、反復アミノ酸配列モチーフを有する周期的配列を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、ペネトラチン、ＨＩＶ由来ＴＡＴなどのＴＡＴ、ＭＡＰ、またはトランスポータン、ｐＶｅｃ、またはｐｅｐ−１を含み得る。
【００３９】
「過半数の」残基に言及する場合、５０％超の残基を含むと当業者には理解され得る。過半数は、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の残基であり得る。
【００４０】
タンパク質形質導入ドメインは：
ペネトラチンまたはアンテナペディア  ＰＴＤ  ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３７）；
ＴＡＴ  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３８）；
ＳｙｎＢ１  ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号３９）；
ＳｙｎＢ３  ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号４０）；
ＰＴＤ−４  ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ（配列番号４１）；
ＰＴＤ−５  ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４２）；
ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５〜４９）ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号４３）；
ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７〜２５）ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号４４）；
ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４〜１６）ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号４５）；
Ｄ−Ｔａｔ  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４６）；
Ｒ９−Ｔａｔ  ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ（配列番号４７）；
トランスポータン  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４８）キメラ；
ＭＡＰ  ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ（配列番号４９）；
ＳＢＰ  ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０）；
ＦＢＰ  ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５１）；
ＭＰＧ  ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５２）；
ＭＰＧ（？ＮＬＳ）ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５３）；
Ｐｅｐ−１  ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５４）；および
Ｐｅｐ−２  ａｃ−ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ（配列番号５５）
を含む群のいずれかから選択され得る。
【００４１】
タンパク質形質導入ドメインは、ＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリアルギニン、ＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリリジン、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ．（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、またはＲ８を含み得る。
【００４２】
タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはポリリジンを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、アルギニンおよびリジン反復配列を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、アルギニン残基、例えば連続するアルギニン残基などを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、アルギニン残基から実質的になるものであり得る。タンパク質形質導入ドメインは、アルギニン反復、例えば４〜２０個のアルギニン残基などを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、８個のアルギニン残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約６〜約１２個のアルギニン残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約７〜約９個のアルギニン残基を含み得る。
【００４３】
タンパク質形質導入ドメインは、約４〜約１２個のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約６〜約１２個のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約７〜約９個のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、少なくとも約４個のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、少なくとも約６個のアミノ酸残基を含み得る。
【００４４】
タンパク質形質導入ドメインは、リジン残基、例えば連続するリジン残基などを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、リジン残基から実質的になるものであり得る。タンパク質形質導入ドメインは、リジン反復、例えば４〜２０個のリジン残基などを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、８個のリジン残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約４〜約１２個のリジン残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約６〜約１２個のリジン残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約７〜約９個のリジン残基を含み得る。
【００４５】
タンパク質形質導入ドメインは、ＱおよびＲ残基、例えば連続するＱＲ反復残基などを含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、ＱおよびＲ残基から実質的になるものであり得る。タンパク質形質導入ドメインは、ＱＲ反復、例えば４〜２０個のＱＲ反復残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、８個のＱＲ反復残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約６〜約１２個のＱＲ反復残基を含み得る。タンパク質形質導入ドメインは、約７〜約９個のＱＲ反復を含み得る。
【００４６】
カーゴは分子カーゴであり得る。カーゴはタンパク質を含み得る。カーゴはペプチドを含み得る。カーゴは非小分子を含み得る。カーゴは、金属ナノ粒子またはポリマーナノ粒子などのナノ粒子を含み得る。ナノ粒子は、金属ロッドなどのロッドであり得る。ナノ粒子は多孔質であり得る。カーゴはナノ構造を含み得る。カーゴは超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）を含み得る。カーゴは、核酸ベクターなどの核酸を含み得る。カーゴはオリゴヌクレオチドを含み得る。カーゴは、ｓｉＲＮＡ、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはその構築物のいずれかを含み得る。
【００４７】
カーゴは、生理的または代謝的に重要なタンパク質を含み得る。カーゴは細胞内タンパク質を含み得る。カーゴは、シグナル経路に関与するタンパク質であるシグナルタンパク質を含み得る。カーゴは、細胞の発現または代謝の調節に関与するタンパク質を含み得る。カーゴは、細胞分裂に関与するタンパク質を含み得る。カーゴは、幹細胞分化などの細胞分化に関与するタンパク質を含み得る。カーゴは、多能性幹細胞の誘導に必要なタンパク質を含み得る。カーゴは、心臓細胞分化に関与するタンパク質を含み得る。カーゴは、タンパク質マーカーなどのマーカーを含み得る。カーゴは、細菌タンパク質または細菌由来タンパク質を含み得る。カーゴは、哺乳動物タンパク質または哺乳動物由来タンパク質を含み得る。カーゴは、任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。カーゴは、研究用、診断用または治療用の分子を含み得る。カーゴは、シグナル産生のメンバーである転写調節因子を含み得る。カーゴは、酵素またはその基質、プロテアーゼ、酵素活性調節因子、攪乱因子（ｐｅｒｔｕｒｂｉｍｅｒ）およびペプチドアプタマー、抗体、タンパク質間相互作用調節因子、増殖因子、または分化因子を含み得る。
【００４８】
カーゴはプレタンパク質であり得る。例えば、細胞内への侵入時または侵入後に切断されるよう構成された除去ドメインを送達分子内に提供し得る。カーゴは、細胞内で翻訳後修飾されるよう構成されたタンパク質であり得る。カーゴは、細胞内に入ると機能するよう構成されたものであり得る。例えば、カーゴは、細胞内に形質導入されるまでは機能しないものであり得る。
【００４９】
カーゴは任意の細胞内分子を含み得る。カーゴは、細胞内機能（作用機序）、細胞内受容体、細胞内リガンド、または細胞内基質を有する任意のタンパク質または分子を含み得る。カーゴは、天然／通常の状態で細胞中に内部移行するタンパク質または分子を含み得る。カーゴは、細胞表面への送達または提示を目的とするタンパク質、例えば細胞表面受容体などを含み得る。カーゴは、治療用分子；薬物；プロドラッグ；酵素もしくは転写因子などの機能性タンパク質もしくはペプチド；微生物タンパク質もしくはペプチド；および毒素；またはそれをコードする核酸を含む群のいずれかから選択され得る。
【００５０】
カーゴは、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＯ、ＭＹＯＤ、Ｃｒｅ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＢＡＦ６０ｃおよびＮＫＸ２．５を含む群のいずれかから選択され得る。カーゴはＲＦＰを含み得る。カーゴはＣｒｅを含み得る。カーゴは、心臓遺伝子調節ネットワークのメンバーを含み得る。カーゴはＧＡＴＡ４を含み得る。カーゴはＴＢＸ５を含み得る。カーゴはＮＫＸ２．５を含み得る。カーゴはＢＡＦ６０ｃを含み得る。カーゴは、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｇｌｉｓ１もしくはｃ−Ｍｙｃ；またはその組合せを含み得る。
【００５１】
カーゴは、毒素、ホルモン転写因子、例えばｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄなど、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウイルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、転写因子、例えばＨＩＦ１ａおよびＲＵＮＴなど、ウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリー、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、ジストロフィンｃＤＮＡ配列、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＲＰＥ６５  Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘＢ１；またはそのフラグメント、および／またはその組合せを含む群のいずれかから選択され得る。
【００５２】
カーゴは、非共有結合複合体、例えばタンパク質−タンパク質複合体、タンパク質−ｍＲＮＡ複合体、タンパク質−非コードＲＮＡ複合体、タンパク質−脂質複合体およびタンパク質−小分子複合体などを含み得る。このような複合体の例は、ＲＩＳＣおよびスプライセオソームである。
【００５３】
カーゴは、分子量が少なくとも１ＫＤａであり得る。カーゴは、分子量が少なくとも５ＫＤａであり得る。カーゴは、分子量が少なくとも１０ＫＤａであり得る。カーゴは、分子量が少なくとも２０ＫＤａであり得る。カーゴは、分子量が４００ＫＤａ以下であり得る。カーゴは、分子量が３００ＫＤａ以下であり得る。カーゴは、分子量が約０．５ＫＤａ〜約４００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約１ＫＤａ〜約４００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約０．５ＫＤａ〜約２００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約１ＫＤａ〜約２００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約２ＫＤａ〜約３００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約２０ＫＤａ〜約３００ｋＤａであり得る。カーゴは、分子量が約２０ＫＤａ〜約１００ｋＤａであり得る。
【００５４】
カーゴがアミノ酸を含む場合、カーゴは、長さが約２０〜約３０，０００アミノ酸であり得る。カーゴは、長さが約２０〜約１０，０００アミノ酸であり得る。カーゴは、長さが約２０〜約５，０００アミノ酸であり得る。カーゴは、長さが約２０〜約１０００アミノ酸であり得る。カーゴは、長さが少なくとも約２０アミノ酸であり得る。カーゴは、長さが少なくとも約１００アミノ酸であり得る。
【００５５】
カーゴは、カーゴ結合分子へのイオン結合または共有結合などの結合が可能であり得る。カーゴは、タンパク質形質導入ドメインおよび／またはＧＡＧ結合エレメントへのイオン結合または共有結合などの結合が可能であり得る。
【００５６】
カーゴは、カーゴ結合分子へ結合するためのエレメントを含み得る。カーゴは、ビオチン、または代わりにストレプトアビジンを含み得る。カーゴはビオチン化され得る。カーゴは、カーゴ結合分子上の相補的なアフィニティータグへ結合可能なアフィニティータグを含み得る。
【００５７】
一実施形態では、カーゴはカーゴ結合分子に結合している。カーゴを送達分子の製造時、製造後、使用前、または使用中にカーゴ結合分子へ結合させ得る。
【００５８】
カーゴ結合分子は、カーゴ分子用の担体であり得る。単一のカーゴ結合分子が多数のカーゴ分子を結合し運搬し得る。カーゴ結合分子は、細胞中への内部移行の前にカーゴを保護し得る。カーゴ結合分子は、ビオチン化したカーゴ上のビオチンに結合可能であり得る。カーゴ結合分子は、核酸ベースのカーゴに結合可能であり得る。カーゴ結合分子は、ペプチドベースのカーゴに結合可能であり得る。カーゴ結合分子は、抗体カーゴまたはそのフラグメントもしくはミミックに結合可能であり得る。カーゴ結合分子は、金属ナノ粒子またはポリマーナノ粒子などのナノ粒子カーゴに結合可能であり得る。カーゴ結合分子は、細胞内では機能的に不活性であり得るが、カーゴを運搬するか結合できる。カーゴ結合分子は化学的リンカー分子を含み得る。カーゴ結合分子はアフィニティータグを含み得る。カーゴ結合分子は、ペプチドまたはタンパク質を含み得る。カーゴ結合分子はｍＳＡ２（単量体ストレプトアビジン２）を含み得る。カーゴ結合分子は、核酸と相互作用するペプチド、例えばＬＫ１５などを含み得る。カーゴ結合分子は、ＩｇＧ結合タンパク質などの抗体結合分子を含み得る。ＩｇＧ結合タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ結合タンパク質であるＳｐＡＢを含み得る。当業者は、カーゴおよびカーゴ結合分子には、両者の間に十分な結合または親和性がある限り、任意の適切な分子対または分子群を使用し得ることを理解するであろう。
【００５９】
カーゴとカーゴ結合分子との間の結合または相互作用は、例えば細胞内環境で、可逆性または分解性であり得る。
【００６０】
ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインは、直接的化学結合によりまたはリンカー分子を介して、カーゴおよび／またはカーゴ結合分子に結合され得る。ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインは、直接的化学結合によりまたはリンカー分子を介して、カーゴに結合され得る。ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインは、直接的化学結合によりまたはリンカー分子を介して、カーゴ結合分子に結合され得る。ＧＡＧ結合エレメント、タンパク質形質導入ドメインおよびカーゴは、単一の融合分子であり得る（例えば、それは単一のペプチド分子としてコードされ転写され得る）。ＧＡＧ結合エレメント、タンパク質形質導入ドメインおよびカーゴ結合分子は、単一の融合分子であり得る（例えば、それは単一のペプチド分子としてコードされ転写され得る）。タンパク質形質導入ドメインおよびＧＡＧ結合エレメントは、カーゴ結合分子および／またはカーゴに隣接し得る。
【００６１】
送達分子は、長さが約１０〜約３０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約２０〜約３０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約３０〜約３０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約４０〜約３０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約１０〜約１０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約２０〜約１０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約４０〜約１０，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約１０〜約３，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約２０〜約３，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約４０〜約３，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約１０〜約１０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約２０〜約１０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約４０〜約１０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約４０〜約５００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約１０〜約５００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約２０〜約５００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが約１００〜約３，０００アミノ酸であり得る。送達分子は、長さが少なくとも約１００アミノ酸であり得る。
【００６２】
送達分子は単一の融合分子であり得る。カーゴ、ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメント、およびタンパク質形質導入ドメインは一緒に融合され得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインはカーゴに隣接し得る。カーゴ、ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメント、およびタンパク質形質導入ドメインは、１つまたは複数のリンカー分子によって一緒に連結され得る。
【００６３】
送達分子は、分子量が少なくとも１ＫＤａであり得る。送達分子は、分子量が少なくとも５ＫＤａであり得る。送達分子は、分子量が少なくとも１０ＫＤａであり得る。送達分子は、分子量が少なくとも２０ＫＤａであり得る。送達分子は、分子量が４００ＫＤａ以下であり得る。送達分子は、分子量が３００ＫＤａ以下であり得る。送達分子は、分子量が約０．５ＫＤａ〜約４００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約１ＫＤａ〜約４００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約０．５ＫＤａ〜約２００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約１ＫＤａ〜約２００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約２ＫＤａ〜約３００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約２０ＫＤａ〜約３００ｋＤａであり得る。送達分子は、分子量が約２０ＫＤａ〜約１００ｋＤａであり得る。
【００６４】
細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。細胞は癌性細胞であり得る。細胞は幹細胞であり得る。細胞は変異細胞であり得る。細胞は、細胞集団を含み得る。細胞集団は、細胞型が混合した集団であり得る。細胞は間葉系幹細胞であり得る。細胞は胚性幹細胞であり得る。細胞は多能性幹細胞であり得る。細胞は、機能回復が必要な細胞であり得る。細胞は心臓幹細胞であり得る。細胞は、ＮＩＨ３ｔ３、ＣＧＲ８、およびＨＵＥＳ７を含む群のいずれかから選択され得る。
【００６５】
送達分子は、送達分子の位置を特定および／または追跡するためのマーカーを含み得る。マーカーは、蛍光マーカー、または放射性同位元素を含み得る。マーカーはｍＲＦＰ１（単量体赤色蛍光タンパク質）を含み得る。マーカーは、ｐＨ感受性ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅなどのｍＮｅｃｔａｒｉｎｅを含み得る。ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅはｐＫａ’が６．９であるため、哺乳動物細胞中の生理的ｐＨ変化を測定するのに適している。マーカーは、ａｖＧＦＰの赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）相同体を含み得る。マーカーは、四量体イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）ＲＦＰに由来するｍＦｒｕｉｔシリーズのＲＦＰから選択される蛍光タンパク質を含み得る。マーカーは、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、イエローＦＰ  Ｃｉｔｒｉｎｅ．ｍＡｐｐｌｅおよびＴａｇＲＦＰ−Ｔのいずれかを含み得る。マーカーはｐＨ感受性であり得る。マーカーは、送達分子が細胞内または組織内に送達されたことを確認するのに使用され得る。マーカーは細胞型特異的であってよく、例えば、マーカーは、特異的細胞型においてのみ活性化され得るか蛍光を発し得る。
【００６６】
送達分子は、精製、単離、検出および／または位置決定に役立つタグを含み得る。タグはアフィニティータグであり得る。タグはペプチドであり得る。タグはＦＬＡＧ−タグ／ＦＬＡＧオクタペプチドであり得る。
【００６７】
送達分子は、配列番号１０を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００６８】
本発明の別の態様によれば、形質導入のための送達分子を作製する方法であって：
（ｉ）細胞の表面のＧＡＧに結合可能なＧＡＧ結合エレメントを有するカーゴと；タンパク質形質導入ドメインとを融合する段階；または
（ｉｉ）カーゴをコードする核酸と、ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸とを組み合わせ、その核酸から送達分子を発現させる段階；または
（ｉｉｉ）細胞の表面のＧＡＧに結合可能なＧＡＧ結合エレメントを有するカーゴ；およびタンパク質形質導入ドメインをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する段階
を含む、方法が提供される。
【００６９】
ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの合成は、ペプチドの液相合成または固相合成を含み得る。ＧＡＧ結合エレメントは、ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントであり得る。
【００７０】
本発明の別の態様によれば、細胞内にカーゴを形質導入する方法であって：
本発明による送達分子を準備すること；および
細胞を送達分子と接触させること
を含む、方法が提供される。
【００７１】
形質導入は、少なくとも約１秒間であり得る。形質導入は、少なくとも約１分間であり得る。形質導入は、少なくとも約２分間であり得る。形質導入は、少なくとも約１０分間であり得る。形質導入は、少なくとも約３０分間であり得る。形質導入は、少なくとも約１時間であり得る。形質導入は１２時間以下、例えば８時間以下などであり得る。形質導入は、約６時間以下であり得る。形質導入は、約１時間〜６時間であり得る。形質導入は約１時間未満であり得る。形質導入は約３０分未満であり得る。形質導入は約１０分未満であり得る。形質導入は約１分未満であり得る。
【００７２】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法によって、または本発明の送達分子によって形質導入、または誘導された細胞が提供される。
【００７３】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子を含むかコードする細胞が提供される。
【００７４】
細胞は人工多能性幹細胞であり得る。
【００７５】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子をコードする核酸が提供される。
【００７６】
核酸はＤＮＡであり得る。核酸はベクターであり得る。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、形質導入のためのタンパク質を発現させるベクターであって、
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントなどのＧＡＧ結合エレメントをコードする配列；および
タンパク質形質導入ドメインをコードする配列
を含む、ベクターが提供される。
【００７８】
ベクターは、分子をコードする核酸配列を含み得る。ベクターは、細菌の複製エレメント、例えばＯｒｉＰなどを含み得る。ベクターは、多重の制限／クローニング部位を含み得る。ベクターは強力なプロモーターを含み得る。ベクターは、抗生物質耐性マーカーなどのマーカーを含み得る。
【００７９】
本発明の別の態様によれば、本発明による核酸、または本発明によるベクターを含む、細胞が提供される。
【００８０】
本発明の別の態様によれば、形質導入のための送達分子を作製する工程であって：
本発明による細胞から送達分子を発現させること；および
送達分子を実質的にまたは部分的に単離または精製すること
を含む、工程が提供される。
【００８１】
送達分子の単離または精製は、細胞（１つまたは複数）からまたは細胞上清からであり得る。送達分子の単離または精製は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）からであり得る。当業者は、任意の標準的な精製方法により細胞から送達分子を単離または精製し得る。
【００８２】
送達分子は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞などの細胞内で産生され得る。送達分子は哺乳動物細胞内で産生され得る。細胞は、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、またはＨＥＫ２９３Ｔであり得る。
【００８３】
本発明の別の態様によれば、カーゴの細胞内への形質導入を増強するためにカーゴを改変する方法であって、カーゴに結合したＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインを準備することを含む方法が提供される。
【００８４】
ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメント、タンパク質形質導入ドメインおよびカーゴは、タンパク質発現により単一の融合分子として準備され得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメント、タンパク質形質導入ドメインおよびカーゴは、それらを化学的に結合させることにより準備され得る。化学結合は共有結合であり得る。ＨＳ−ＧＡＧ結合エレメント、タンパク質形質導入ドメインおよびカーゴは、例えばＳＮＡＰ−タグ、Ｈａｌｏタグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、またはＣＬＩＰ−タグ技術（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、それらを融合することにより準備され得る。
【００８５】
本発明の別の態様によれば、形質導入によりカーゴを細胞内にシャペロニングするためのＨＳ−ＧＡＧ結合エレメントおよびタンパク質形質導入ドメインの使用が提供される。
【００８６】
本発明の別の態様によれば、疾患の治療または予防の方法であって、本発明による送達分子を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００８７】
本発明の別の態様によれば、疾患の治療または予防の方法であって、本発明による細胞を投与することを含む方法が提供される。
【００８８】
本発明の別の態様によれば、疾患の治療または予防に使用するための本発明による送達分子が提供される。
【００８９】
疾患は、１つまたは複数の細胞におけるタンパク質欠乏を特徴とする任意の疾患であり得る。疾患は、心障害などの心病態を含み得る。疾患は、分化した幹細胞の投与により治療可能または予防可能な疾患を含み得る。疾患は、人工多能性幹細胞の投与により治療可能または予防可能な疾患を含み得る。疾患は、タンパク質形質導入により治療可能または予防可能な疾患を含み得る。治療は、心臓組織の再生、または心臓組織の機能回復を含み得る。疾患は、癌または筋ジストロフィーを含み得る。
【００９０】
送達分子は、（ａ）平滑筋細胞の増殖および／または移動の阻害；（ｂ）平滑筋弛緩の促進；（ｃ）心筋の収縮速度の増大；（ｄ）心筋弛緩速度の増大；（ｅ）創傷治癒の促進；（ｆ）瘢痕形成の軽減；（ｇ）接着斑の破壊；（ｈ）アクチン重合の調節；あるいは（ｉ）内膜過形成、狭窄症、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、平滑筋細胞腫瘍、平滑筋攣縮、狭心症、プリンツメタル狭心症（冠動脈攣縮）、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧、肺高血圧、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病もしくはレイノー現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸間膜虚血、裂肛、アカラシア、陰萎、女性性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、片頭痛、平滑筋攣縮に関連する虚血性筋損傷、移植血管症などの血管症、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症、筋ジストロフィー、チャネル病および拡張機能障害のうちの１つあるいは複数の治療、予防または抑制に使用され得る。
【００９１】
本発明の別の態様によれば、対象または細胞培養物中の細胞機能を変更する方法であって、本発明による送達分子を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００９２】
細胞培養物はｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。
【００９３】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子を幹細胞内に形質導入することにより細胞の分化を誘導する方法が提供される。
【００９４】
幹細胞は心臓幹細胞を含み得る。送達分子はＧＡＴＡ４またはＴＢＸ５を含み得る。
【００９５】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子を非多能性細胞内に形質導入することにより多能性幹細胞を誘導する方法が提供される。送達分子は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｇｌｉｓ１もしくはｃ−Ｍｙｃ；またはその組合せを含み得る。
【００９６】
本発明の別の態様によれば、本発明による第一の送達分子を心臓幹細胞内に形質導入し、その心臓幹細胞内に本発明による第二の送達分子を形質導入することにより心臓分化を誘導する方法であって、第一の送達分子がＧＡＴＡ４を含み第二の送達分子がＴＢＸ５を含む、方法が提供される。
【００９７】
幹細胞の心臓分化を誘導する方法は、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＮＫＸ２．５、およびＢＡＦ６０ｃを含む群のいずれかから選択されるカーゴを含む１つまたは複数の融合タンパク質の形質導入をさらに含み得る。幹細胞の心臓分化を誘導する方法は、心臓遺伝子調節ネットワークのタンパク質を含む１つまたは複数の融合タンパク質の形質導入をさらに含み得る。心臓幹細胞内への形質導入は、同時または逐次的であり得る。
【００９８】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物が提供される。
【００９９】
送達分子は、微細飲小胞からの送達分子の放出を促進するための小胞放出剤の存在下で形質導入されるか、これと共投与され得る。小胞放出剤はクロロキンを含み得る。クロロキン濃度は、約１μＭ〜約１００μＭであり得る。
【０１００】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子を細胞内に送達することを含み、カーゴがナノ粒子を含む、細胞撮像の方法が提供される。
【０１０１】
ナノ粒子は、金属またはポリマーを含み得る。ナノ粒子はロッドであり得る。
【０１０２】
本発明の別の態様によれば、本発明による送達分子を細胞内に送達することを含み、カーゴが核酸を含む、遺伝子治療の方法が提供される。
【０１０３】
形質導入は、リアルタイムでモニターされるか、モニター可能であるのが有利である。
【０１０４】
送達分子は、特異的細胞型を標的とする（すなわち、これにカーゴを送達する）よう構成されてよい。対応するＧＡＧ型を細胞表面に有する特異的細胞集団を標的とするよう、しかるべきＧＡＧ結合エレメントが選択され得る。
【０１０５】
当業者は、本発明のある実施形態または態様の任意選択の特徴は、必要に応じて、本発明の他の実施形態または態様に適用可能であり得ることを理解するであろう。
【０１０６】
これより、単なる例として添付図面を参照しながら、本発明の実施形態をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１−１】多能性細胞における低効率のタンパク質送達。（ａ）タンパク質送達効率を明らかにするために作製したタンパク質の模式図。ｍＲは、うまく形質導入しない対照タンパク質としての単独のｍＲＦＰであり、バックグラウンドの形質導入を表す。ｍＲ−８Ｒは、Ｃ末端に形質導入を促進する８個のアルギニン残基（８Ｒ）を融合したｍＲＦＰである。（ｂ）ｍＲ−８Ｒは、ＮＩＨ３ｔ３細胞内へ効率よく形質導入する。標準培地条件で１２時間、ｍＲまたはｍＲ−８Ｒ（１００μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）ｍＲ−８Ｒは、ヒト胚性幹細胞およびマウス胚性幹細胞（それぞれＨＵＥＳ７およびＣＧＲ−８）、ヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ２）ならびにマウス心筋細胞系ＨＬ１内への形質導入の効率が低い。細胞型特異的培地条件で１２時間、ｍＲ−８Ｒ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した多数の細胞系の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｄ）様々な用量のｍＲ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した多数の細胞系のフローサイトメトリー解析。（ｅ）用量１００μｇ／ｍｌで２４時間処理した場合のフローサイトメトリー解析。グラフは相対蛍光単位（Ｒ．Ｆ．Ｕ．）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１−２】多能性細胞における低効率のタンパク質送達。（ａ）タンパク質送達効率を明らかにするために作製したタンパク質の模式図。ｍＲは、うまく形質導入しない対照タンパク質としての単独のｍＲＦＰであり、バックグラウンドの形質導入を表す。ｍＲ−８Ｒは、Ｃ末端に形質導入を促進する８個のアルギニン残基（８Ｒ）を融合したｍＲＦＰである。（ｂ）ｍＲ−８Ｒは、ＮＩＨ３ｔ３細胞内へ効率よく形質導入する。標準培地条件で１２時間、ｍＲまたはｍＲ−８Ｒ（１００μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）ｍＲ−８Ｒは、ヒト胚性幹細胞およびマウス胚性幹細胞（それぞれＨＵＥＳ７およびＣＧＲ−８）、ヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ２）ならびにマウス心筋細胞系ＨＬ１内への形質導入の効率が低い。細胞型特異的培地条件で１２時間、ｍＲ−８Ｒ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した多数の細胞系の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｄ）様々な用量のｍＲ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した多数の細胞系のフローサイトメトリー解析。（ｅ）用量１００μｇ／ｍｌで２４時間処理した場合のフローサイトメトリー解析。グラフは相対蛍光単位（Ｒ．Ｆ．Ｕ．）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２−１】Ｐ２１はＰＴＤ仲介性形質導入を改善する。（ａ）ドメインをスクリーニング後に作製した、細胞へのタンパク質送達効率を改善するタンパク質の模式図。ｍＲおよびｍＲ−８Ｒは図１に記載されているものである。Ｐ２１−ｍＲは、Ｎ末端にヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）のＰ２１ドメインを融合したｍＲＦＰである。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、Ｎ末端にＰ２１を融合しＣ末端に８Ｒを融合したｍＲＦＰである。（ｂ）Ｐ２１にｍＲ−８Ｒを融合すると、ＮＩＨ３ｔ３細胞内への形質導入が大幅に改善される。標準培地条件で１２時間、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、ヒト胚性幹細胞およびマウス胚性幹細胞（それぞれＨＵＥＳ７およびＣＧＲ−８）ならびにヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ２）およびマウス心筋細胞系ＨＬ１内へ効率よく形質導入する。タンパク質ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理した、ｍＲ−８Ｒが非効率的に形質導入された細胞系のフローサイトメトリー解析。（ｄ）Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、最初に細胞膜と強く相互作用し、次第に核周囲に局在するよう形質導入する。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理するか、１時間処理し洗浄してさらに５時間インキュベート（無血清培地中）するか６時間処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光像（上段）および共焦点レーザー走査顕微鏡像（下段）。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、無血清培地中で所望の時間の間、形質導入した。スケールバーは５０μｍ（上段）および１０μｍ（下段）を表す。（ｅ）Ｐ２１および８Ｒによって仲介される形質導入の増強は、トリプシンによるタンパク質分解の影響を受ける。トリプシンでの１０分間の前消化あるいは非タンパク質分解性細胞解離溶液（ＣＤＳ）での処理の有無で、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理してさらに５時間インキュベート（無血清培地中）したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、トリプシンで処理し無血清培地中で１時間形質導入した。（ｆ）Ｔｒｉｔｏｎｘ１００処理により、Ｐ２１含有タンパク質の細胞表面相互作用が阻害される。ＰＢＳまたはＴｒｉｔｏｎｘ１００（Ｔｘ１００）を０．１％（ｖ／ｖ）含有するＰＢＳで１０分間、前処理してから、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、さらに５時間インキュベート（無血清培地中）したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、ＰＢＳまたはＴｘ１００を含むＰＢＳで処理し、無血清培地中で１時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２−２】Ｐ２１はＰＴＤ仲介性形質導入を改善する。（ａ）ドメインをスクリーニング後に作製した、細胞へのタンパク質送達効率を改善するタンパク質の模式図。ｍＲおよびｍＲ−８Ｒは図１に記載されているものである。Ｐ２１−ｍＲは、Ｎ末端にヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）のＰ２１ドメインを融合したｍＲＦＰである。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、Ｎ末端にＰ２１を融合しＣ末端に８Ｒを融合したｍＲＦＰである。（ｂ）Ｐ２１にｍＲ−８Ｒを融合すると、ＮＩＨ３ｔ３細胞内への形質導入が大幅に改善される。標準培地条件で１２時間、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、ヒト胚性幹細胞およびマウス胚性幹細胞（それぞれＨＵＥＳ７およびＣＧＲ−８）ならびにヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ２）およびマウス心筋細胞系ＨＬ１内へ効率よく形質導入する。タンパク質ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理した、ｍＲ−８Ｒが非効率的に形質導入された細胞系のフローサイトメトリー解析。（ｄ）Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、最初に細胞膜と強く相互作用し、次第に核周囲に局在するよう形質導入する。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理するか、１時間処理し洗浄してさらに５時間インキュベート（無血清培地中）するか６時間処理したＮＩＨ３ｔ３細胞の蛍光像（上段）および共焦点レーザー走査顕微鏡像（下段）。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、無血清培地中で所望の時間の間、形質導入した。スケールバーは５０μｍ（上段）および１０μｍ（下段）を表す。（ｅ）Ｐ２１および８Ｒによって仲介される形質導入の増強は、トリプシンによるタンパク質分解の影響を受ける。トリプシンでの１０分間の前消化あるいは非タンパク質分解性細胞解離溶液（ＣＤＳ）での処理の有無で、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理してさらに５時間インキュベート（無血清培地中）したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、トリプシンで処理し無血清培地中で１時間形質導入した。（ｆ）Ｔｒｉｔｏｎｘ１００処理により、Ｐ２１含有タンパク質の細胞表面相互作用が阻害される。ＰＢＳまたはＴｒｉｔｏｎｘ１００（Ｔｘ１００）を０．１％（ｖ／ｖ）含有するＰＢＳで１０分間、前処理してから、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、さらに５時間インキュベート（無血清培地中）したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、ＰＢＳまたはＴｘ１００を含むＰＢＳで処理し、無血清培地中で１時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３−１】Ｐ２１はヘパリンおよび細胞表面ＨＳ−ＧＡＧに直接結合する。（ａ）形質導入時に培地中の可溶性ヘパリンは、Ｐ２１含有タンパク質の細胞膜相互作用および形質導入を阻害する。０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する無血清培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｂ）無血清培地中で６時間、様々なＧＡＧ（５０μｇ／ｍｌ）を加えて、あるいは加えずにＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。ＣＳはコンドロイチン硫酸である。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、ＧＡＧを加えて、あるいは加えずに無血清培地中で６時間形質導入した。（ｃ〜ｄ）（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３細胞および（ｄ）ＣＧＲ−８細胞において、高用量のヘパリンのみが８Ｒ活性を阻害するのに対し、Ｐ２１活性はヘパリンによって用量依存性に阻害される。（ｅ）および（ｆ）効率的なＰ２１仲介性タンパク質送達には細胞表面ヘパラン硫酸が必要である。ヘパラン硫酸／ヘパリン含有ＦＣＳはＰ２１仲介性形質導入を阻害するが、同時に、ヘパラン硫酸が欠損した細胞の細胞表面ＧＡＧに取って代わり、Ｐ２１−形質導入を仲介し得る。０％または２０％ＦＣＳを含有する培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞およびＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣの蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３−２】Ｐ２１はヘパリンおよび細胞表面ＨＳ−ＧＡＧに直接結合する。（ａ）形質導入時に培地中の可溶性ヘパリンは、Ｐ２１含有タンパク質の細胞膜相互作用および形質導入を阻害する。０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する無血清培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｂ）無血清培地中で６時間、様々なＧＡＧ（５０μｇ／ｍｌ）を加えて、あるいは加えずにＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。ＣＳはコンドロイチン硫酸である。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、ＧＡＧを加えて、あるいは加えずに無血清培地中で６時間形質導入した。（ｃ〜ｄ）（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３細胞および（ｄ）ＣＧＲ−８細胞において、高用量のヘパリンのみが８Ｒ活性を阻害するのに対し、Ｐ２１活性はヘパリンによって用量依存性に阻害される。（ｅ）および（ｆ）効率的なＰ２１仲介性タンパク質送達には細胞表面ヘパラン硫酸が必要である。ヘパラン硫酸／ヘパリン含有ＦＣＳはＰ２１仲介性形質導入を阻害するが、同時に、ヘパラン硫酸が欠損した細胞の細胞表面ＧＡＧに取って代わり、Ｐ２１−形質導入を仲介し得る。０％または２０％ＦＣＳを含有する培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞およびＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣの蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３−３】Ｐ２１はヘパリンおよび細胞表面ＨＳ−ＧＡＧに直接結合する。（ａ）形質導入時に培地中の可溶性ヘパリンは、Ｐ２１含有タンパク質の細胞膜相互作用および形質導入を阻害する。０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する無血清培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。（ｂ）無血清培地中で６時間、様々なＧＡＧ（５０μｇ／ｍｌ）を加えて、あるいは加えずにＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。ＣＳはコンドロイチン硫酸である。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、ＧＡＧを加えて、あるいは加えずに無血清培地中で６時間形質導入した。（ｃ〜ｄ）（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３細胞および（ｄ）ＣＧＲ−８細胞において、高用量のヘパリンのみが８Ｒ活性を阻害するのに対し、Ｐ２１活性はヘパリンによって用量依存性に阻害される。（ｅ）および（ｆ）効率的なＰ２１仲介性タンパク質送達には細胞表面ヘパラン硫酸が必要である。ヘパラン硫酸／ヘパリン含有ＦＣＳはＰ２１仲介性形質導入を阻害するが、同時に、ヘパラン硫酸が欠損した細胞の細胞表面ＧＡＧに取って代わり、Ｐ２１−形質導入を仲介し得る。０％または２０％ＦＣＳを含有する培地中で６時間、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＧＲ−８細胞およびＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣの蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４−１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介による核へのＣｒｅリコンビナーゼ送達。（ａ）細胞内のＣｒｅ活性の目印とするために作製した構築物の模式図。ｌｏｘＰ部位が隣接する転写ＳＴＯＰ領域のＣｒｅの仲介性切断は、ｅＧＦＰの構成的発現を誘導する。Ｐｒはプロモーター；βＧａｌはβ−ガラクトシダーゼ；Ｎｅｏはネオマイシンホスホトランスフェラーゼを表す。トランスフェクションおよびＮＩＨ３ｔ３細胞の選択により、ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞系を作製した。（ｂ）未処理ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞またはＳＩＮ  Ｃｒｅレンチウイルスで形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞におけるｅＧＦＰ発現。左側はｅＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡像を示し、右側はｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。スケールバーは５０μｍを表す。（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞におけるＣｒｅ活性の形質導入を試験するスキーム。細胞をＣｒｅタンパク質で１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養した後、解析した。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒは効率的に形質導入され、ＤＮＡを組み換える。（ｄ）様々な用量でＣｒｅを形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰの蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｅ）様々な用量（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌ）にてｍＲ−Ｃｒｅ、ｍＲ−Ｃｒｅ−８ＲおよびＰ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒで１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞のフローサイトメトリー解析。グラフは％組換え（すなわち、総細胞集団からのｅＧＦＰ＋ｖｅ％）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４−２】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介による核へのＣｒｅリコンビナーゼ送達。（ａ）細胞内のＣｒｅ活性の目印とするために作製した構築物の模式図。ｌｏｘＰ部位が隣接する転写ＳＴＯＰ領域のＣｒｅの仲介性切断は、ｅＧＦＰの構成的発現を誘導する。Ｐｒはプロモーター；βＧａｌはβ−ガラクトシダーゼ；Ｎｅｏはネオマイシンホスホトランスフェラーゼを表す。トランスフェクションおよびＮＩＨ３ｔ３細胞の選択により、ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞系を作製した。（ｂ）未処理ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞またはＳＩＮ  Ｃｒｅレンチウイルスで形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞におけるｅＧＦＰ発現。左側はｅＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡像を示し、右側はｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。スケールバーは５０μｍを表す。（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞におけるＣｒｅ活性の形質導入を試験するスキーム。細胞をＣｒｅタンパク質で１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養した後、解析した。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒは効率的に形質導入され、ＤＮＡを組み換える。（ｄ）様々な用量でＣｒｅを形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰの蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｅ）様々な用量（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌ）にてｍＲ−Ｃｒｅ、ｍＲ−Ｃｒｅ−８ＲおよびＰ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒで１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞のフローサイトメトリー解析。グラフは％組換え（すなわち、総細胞集団からのｅＧＦＰ＋ｖｅ％）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４−３】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介による核へのＣｒｅリコンビナーゼ送達。（ａ）細胞内のＣｒｅ活性の目印とするために作製した構築物の模式図。ｌｏｘＰ部位が隣接する転写ＳＴＯＰ領域のＣｒｅの仲介性切断は、ｅＧＦＰの構成的発現を誘導する。Ｐｒはプロモーター；βＧａｌはβ−ガラクトシダーゼ；Ｎｅｏはネオマイシンホスホトランスフェラーゼを表す。トランスフェクションおよびＮＩＨ３ｔ３細胞の選択により、ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞系を作製した。（ｂ）未処理ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞またはＳＩＮ  Ｃｒｅレンチウイルスで形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＰ−ｅＧＦＰ細胞におけるｅＧＦＰ発現。左側はｅＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡像を示し、右側はｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。スケールバーは５０μｍを表す。（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞におけるＣｒｅ活性の形質導入を試験するスキーム。細胞をＣｒｅタンパク質で１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養した後、解析した。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒは効率的に形質導入され、ＤＮＡを組み換える。（ｄ）様々な用量でＣｒｅを形質導入したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰの蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｅ）様々な用量（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌ）にてｍＲ−Ｃｒｅ、ｍＲ−Ｃｒｅ−８ＲおよびＰ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒで１時間形質導入し、洗浄し、２日間培養したＮＩＨ３ｔ３  ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞のフローサイトメトリー解析。グラフは％組換え（すなわち、総細胞集団からのｅＧＦＰ＋ｖｅ％）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図５−１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＮＥＯの送達はマウス胚線維芽細胞での抗生物質耐性を促進する。（ａ）マウス胚線維芽（ＭＥＦ）細胞における形質導入ＮＥＯ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）の抗生物質耐性活性を試験するスキーム。ＭＥＦ細胞（３００，０００個）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよびＰ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ中で、毎日新鮮な培地を供給しながら３日間培養した。次いで、培地にＧ−４１８を加え、さらに３日間、毎日新鮮な培地を供給しながら培養した。（ｂ−ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒは、抗生物質耐性を付与することにより、ＭＥＦ細胞およびＮＩＨ３ｔ３細胞をＧ−４１８選択からレスキューする。（ｂ〜ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒにより、Ｇ−４１８選択下でＭＥＦの生存培養物が維持される。（ｂ）ＳＩＮ  ＮＥＯを添加する（ＮＥＯを過剰発現させるため）か、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒで形質導入し、Ｇ−４１８（０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌまたは３００μｇ／ｍｌ）で選択したときのＭＥＦ細胞数。（ｃ）Ｇ−４１８の用量が１５０μｇ／ｍｌのときのＭＥＦ細胞数。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒは、Ｇ−４１８選択されるＭＥＦ細胞およびＮＩＨ３ｔ３細胞の生存を促進する。（ｄ）トリパンブルー染色を用いた生存ＭＥＦ細胞の割合の定量化。（ｅ）１５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８で選択されたＮＩＨ３ｔ３細胞の生存能をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を用いて評価した蛍光顕微鏡観察。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図５−２】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＮＥＯの送達はマウス胚線維芽細胞での抗生物質耐性を促進する。（ａ）マウス胚線維芽（ＭＥＦ）細胞における形質導入ＮＥＯ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）の抗生物質耐性活性を試験するスキーム。ＭＥＦ細胞（３００，０００個）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよびＰ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ中で、毎日新鮮な培地を供給しながら３日間培養した。次いで、培地にＧ−４１８を加え、さらに３日間、毎日新鮮な培地を供給しながら培養した。（ｂ−ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒは、抗生物質耐性を付与することにより、ＭＥＦ細胞およびＮＩＨ３ｔ３細胞をＧ−４１８選択からレスキューする。（ｂ〜ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒにより、Ｇ−４１８選択下でＭＥＦの生存培養物が維持される。（ｂ）ＳＩＮ  ＮＥＯを添加する（ＮＥＯを過剰発現させるため）か、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒで形質導入し、Ｇ−４１８（０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌまたは３００μｇ／ｍｌ）で選択したときのＭＥＦ細胞数。（ｃ）Ｇ−４１８の用量が１５０μｇ／ｍｌのときのＭＥＦ細胞数。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒは、Ｇ−４１８選択されるＭＥＦ細胞およびＮＩＨ３ｔ３細胞の生存を促進する。（ｄ）トリパンブルー染色を用いた生存ＭＥＦ細胞の割合の定量化。（ｅ）１５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８で選択されたＮＩＨ３ｔ３細胞の生存能をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を用いて評価した蛍光顕微鏡観察。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６−１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＮＡＮＯＧの送達はマウス胚性幹細胞の自己再生を促進する。（ａ）ＣＧＲ−８細胞における形質導入ＮＡＮＯＧの活性を試験するスキーム。細胞をＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒタンパク質（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）で３日間連続で形質導入（１代継代、１：３に分割）し、１：３で継代し、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを含むがＬＩＦを含まない増殖培地（−ＬＩＦ）に播種した。細胞にＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを含有する−ＬＩＦ培地を毎日供給し、３日毎に２代にわたり１：３で継代した（計３代の−ＬＩＦ）。（ｂ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒは、ＬＩＦを欠くｍＥＳＣの自己再生を用量依存性にレスキューする。Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒタンパク質およびＬＩＦ退薬で処理したＣＧＲ−８細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色。ＬＩＦで培養した、またはＬＩＦを添加しないがＳＩＮ  ＮＡＮＯＧを添加して（ＮＡＮＯＧを過剰発現させるため）培養した、またはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入したＣＧＲ−８細胞中で、ＡＰ活性およびコロニーの形態が保持される。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒにより、ＬＩＦを欠くｍＥＳＣの増殖が用量依存性に維持される。ＬＩＦを添加せずに培養したＣＧＲ−８細胞と継代時にＬＩＦを添加したＣＧＲ−８細胞の細胞数の割合の比較（％−ＬＩＦ／＋ＬＩＦ）。ＬＩＦ欠損ＣＧＲ−８培養物では、ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧを添加（ＮＡＮＯＧを発現させるため）したまたはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入した場合に増殖が促進される。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ）ＬＩＦ欠損培養物におけるＮＡＮＯＧ依存性レスキューにより、より胚盤葉上層に似た遺伝子発現プロファイルが得られる。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いたＬＩＦ欠損ＣＧＲ−８培養物の相対遺伝子発現の解析。ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧ（ＮＡＮＯＧを過剰発現さるためのもの）を添加した培養物またはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入した培養物でＦｇｆ５発現が増大し、Ｒｅｘ１発現が減少し、Ｏｃｔ４発現が保持される。エラーバーは標準誤差を表す。
【図６−２】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＮＡＮＯＧの送達はマウス胚性幹細胞の自己再生を促進する。（ａ）ＣＧＲ−８細胞における形質導入ＮＡＮＯＧの活性を試験するスキーム。細胞をＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒタンパク質（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）で３日間連続で形質導入（１代継代、１：３に分割）し、１：３で継代し、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを含むがＬＩＦを含まない増殖培地（−ＬＩＦ）に播種した。細胞にＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを含有する−ＬＩＦ培地を毎日供給し、３日毎に２代にわたり１：３で継代した（計３代の−ＬＩＦ）。（ｂ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒは、ＬＩＦを欠くｍＥＳＣの自己再生を用量依存性にレスキューする。Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒタンパク質およびＬＩＦ退薬で処理したＣＧＲ−８細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色。ＬＩＦで培養した、またはＬＩＦを添加しないがＳＩＮ  ＮＡＮＯＧを添加して（ＮＡＮＯＧを過剰発現させるため）培養した、またはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入したＣＧＲ−８細胞中で、ＡＰ活性およびコロニーの形態が保持される。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒにより、ＬＩＦを欠くｍＥＳＣの増殖が用量依存性に維持される。ＬＩＦを添加せずに培養したＣＧＲ−８細胞と継代時にＬＩＦを添加したＣＧＲ−８細胞の細胞数の割合の比較（％−ＬＩＦ／＋ＬＩＦ）。ＬＩＦ欠損ＣＧＲ−８培養物では、ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧを添加（ＮＡＮＯＧを発現させるため）したまたはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入した場合に増殖が促進される。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ）ＬＩＦ欠損培養物におけるＮＡＮＯＧ依存性レスキューにより、より胚盤葉上層に似た遺伝子発現プロファイルが得られる。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いたＬＩＦ欠損ＣＧＲ−８培養物の相対遺伝子発現の解析。ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧ（ＮＡＮＯＧを過剰発現さるためのもの）を添加した培養物またはＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入した培養物でＦｇｆ５発現が増大し、Ｒｅｘ１発現が減少し、Ｏｃｔ４発現が保持される。エラーバーは標準誤差を表す。
【図７−１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＭＹＯＤの送達はヒト胚性幹細胞の筋原性分化を促進する。（ａ）ＨＵＥＳ７細胞における形質導入ＭＹＯＤの分化活性を試験するスキーム。ＨＵＥＳ７細胞をゼラチン化プラスチック上に播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞に１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）とを含有するＤＭＥＭを７日間、毎日供給した。次いで、培地を、２％（ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ）とヒト組換えインスリンとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒとを含有するＤＭＥＭに交換し、３日間、毎日供給した。（ｂ〜ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒは多核化筋管へのＨＵＥＳ７細胞の筋原性分化を促進する。（ｂ）ＳＩＮ  ＭＹＯＤを添加（ＭＹＯＤを過剰発現させるため）したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した、筋原性レジメンの下で培養したＨＵＥＳ７細胞の光学顕微鏡観察。ＳＩＮ−ＭＹＯＤまたは高用量のＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒにより伸長し融合した筋管および単一の筋細胞が生じた。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）ヒト胚性幹細胞のＭＹＯＤ依存性筋原性分化。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いたＨＵＥＳ７培養物の相対遺伝子発現の解析。ＳＩＮ  ＭＹＯＤ（ＭＹＯＤを過剰発現させるためのもの）を添加したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した培養物は、内因性ＭＹＯＤ発現および骨格筋特異的ＡＣＴＡ１発現を増大させた。エラーバーは標準誤差を表す。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞は多核化している。（ｄ）ＰＩ染色を用いた１細胞当たりの核数の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（５０μｇ／ｍｌ）で分化させ、核色素ＤＡＰＩで染色したＨＵＥＳ７細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞はミオゲニン陽性である。免疫蛍光標識を用いたミオゲニン陽性細胞の割合の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。
【図７−２】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＭＹＯＤの送達はヒト胚性幹細胞の筋原性分化を促進する。（ａ）ＨＵＥＳ７細胞における形質導入ＭＹＯＤの分化活性を試験するスキーム。ＨＵＥＳ７細胞をゼラチン化プラスチック上に播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞に１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）とを含有するＤＭＥＭを７日間、毎日供給した。次いで、培地を、２％（ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ）とヒト組換えインスリンとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒとを含有するＤＭＥＭに交換し、３日間、毎日供給した。（ｂ〜ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒは多核化筋管へのＨＵＥＳ７細胞の筋原性分化を促進する。（ｂ）ＳＩＮ  ＭＹＯＤを添加（ＭＹＯＤを過剰発現させるため）したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した、筋原性レジメンの下で培養したＨＵＥＳ７細胞の光学顕微鏡観察。ＳＩＮ−ＭＹＯＤまたは高用量のＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒにより伸長し融合した筋管および単一の筋細胞が生じた。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）ヒト胚性幹細胞のＭＹＯＤ依存性筋原性分化。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いたＨＵＥＳ７培養物の相対遺伝子発現の解析。ＳＩＮ  ＭＹＯＤ（ＭＹＯＤを過剰発現させるためのもの）を添加したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した培養物は、内因性ＭＹＯＤ発現および骨格筋特異的ＡＣＴＡ１発現を増大させた。エラーバーは標準誤差を表す。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞は多核化している。（ｄ）ＰＩ染色を用いた１細胞当たりの核数の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（５０μｇ／ｍｌ）で分化させ、核色素ＤＡＰＩで染色したＨＵＥＳ７細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞はミオゲニン陽性である。免疫蛍光標識を用いたミオゲニン陽性細胞の割合の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。
【図７−３】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＭＹＯＤの送達はヒト胚性幹細胞の筋原性分化を促進する。（ａ）ＨＵＥＳ７細胞における形質導入ＭＹＯＤの分化活性を試験するスキーム。ＨＵＥＳ７細胞をゼラチン化プラスチック上に播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞に１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）とを含有するＤＭＥＭを７日間、毎日供給した。次いで、培地を、２％（ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ）とヒト組換えインスリンとＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒとを含有するＤＭＥＭに交換し、３日間、毎日供給した。（ｂ〜ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒは多核化筋管へのＨＵＥＳ７細胞の筋原性分化を促進する。（ｂ）ＳＩＮ  ＭＹＯＤを添加（ＭＹＯＤを過剰発現させるため）したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した、筋原性レジメンの下で培養したＨＵＥＳ７細胞の光学顕微鏡観察。ＳＩＮ−ＭＹＯＤまたは高用量のＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒにより伸長し融合した筋管および単一の筋細胞が生じた。スケールバーは１００μｍを表す。（ｃ）ヒト胚性幹細胞のＭＹＯＤ依存性筋原性分化。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いたＨＵＥＳ７培養物の相対遺伝子発現の解析。ＳＩＮ  ＭＹＯＤ（ＭＹＯＤを過剰発現させるためのもの）を添加したまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した培養物は、内因性ＭＹＯＤ発現および骨格筋特異的ＡＣＴＡ１発現を増大させた。エラーバーは標準誤差を表す。（ｄ〜ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞は多核化している。（ｄ）ＰＩ染色を用いた１細胞当たりの核数の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｅ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（５０μｇ／ｍｌ）で分化させ、核色素ＤＡＰＩで染色したＨＵＥＳ７細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは５０μｍを表す。（ｆ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒで分化させた細胞はミオゲニン陽性である。免疫蛍光標識を用いたミオゲニン陽性細胞の割合の定量化。エラーバーは標準偏差を表す。
【図８】ＰＴＤ−タンパク質は多能性細胞に結合するが、形質導入が不十分である。細胞とのインキュベーション後に残っている残留蛍光タンパク質を求めるための培地の蛍光定量。ｍＲ−８Ｒを無血清培地で２０μｇ／ｍｌに希釈し、１ｍｌ／ウェルを６ウェルプレートで１時間（ａ）または１２時間（ｂ）、コンフルエントなＮＩＨ３ｔ３細胞、ＭＥＦ細胞、ＣＧＲ−８細胞、ＨＵＥＳ７細胞またはＩＰＳ２細胞とインキュベートした。インキュベーション前の蛍光を単位の１００％とし、無血清培地のバックグラウンドを減じた。エラーバーは標準偏差を表す。
【図９】Ｐ２１はヘパリンに直接結合する。ヘパリン−セファロースビーズとのインキュベーション後に残っている蛍光タンパク質を求めるための蛍光定量。組換えタンパク質を無血清培地で希釈し（２０μｇ／ｍｌ）、１ｍｌ／チューブをヘパリン−セファロース５０μｌと３７℃で１時間、回転させながらインキュベートした。インキュベーション前の蛍光を単位の１００％とし、無血清培地のバックグラウンドを減じた。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１０】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるドメイン位置タンパク質変異体の送達。（ａ）ドメインの位置が細胞へのタンパク質送達に及ぼす効果を試験するために作製したタンパク質の模式図。（ｂ）ｍＲへのＰ２１および８Ｒの融合はいずれの方向でも、形質導入を有意に改善する。タンパク質変異体（２０μｇ／ｍｌ）と１２時間インキュベートしたＮＩＨ３ｔ３細胞およびＨＵＥＳ７細胞のフローサイトメトリー解析。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介によるＰＴＤタンパク質変異体の送達。（ａ）細胞にタンパク質を送達するための他のＰＴＤに対するＰ２１の増強効果を試験するために作製したタンパク質の模式図。８ＲはＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９）であり、ＴＡＴはＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２０）であり、８ＫはＫＫＫＫＫＫＫＫであり、８ＲＱはＲＱＲＱＲＱＲＱである。（ｂ）ｍＲへのＰ２１および任意のＰＴＤの融合は、形質導入を有意に改善する。タンパク質変異体（２０μｇ／ｍｌ）を１２時間インキュベートしたＮＩＨ３ｔ３細胞およびＨＵＥＳ７細胞のフローサイトメトリー解析。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１２】ＰＴＤ仲介性送達は遊離ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸によって阻害される。無血清培地に様々なＧＡＧ（５０μｇ／ｍｌ）を加えて、あるいはＧＡＧを加えずにｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間処理したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析。ＣＳはコンドロイチン硫酸である。細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、無血清培地中でＧＡＧを加えて、あるいはＧＡＧを加えずに６時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１３−１】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ−タンパク質送達はＧＡＧ含有ＦＣＳ、ヘパリナーゼ処理および競合する可溶性ヘパリンによって阻害される。（ａ〜ｂ）ヘパリナーゼで前処理した形質導入細胞のフローサイトメトリー。（ａ）ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で、様々な量のヘパリナーゼＩＩＩ（０Ｕ／ｍｌ、０．０１Ｕ／ｍｌ、０．１Ｕ／ｍｌまたは１Ｕ／ｍｌ）と１時間プレインキュベートし、ヘパリナーゼＩＩＩを含有してｍＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（無血清培地中２０μｇ／ｍｌ）で１２時間形質導入した。（ｂ）ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で、様々な量のヘパリナーゼＩＩＩと１時間プレインキュベートし、ヘパリナーゼＩＩＩと様々な量のＦＣＳ（０％（ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ））とを含有してＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間形質導入した。（ｃ）様々な濃度のＦＣＳまたはＰ２１結合物質を枯渇させたＦＣＳ中で形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー。ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、様々な量のＦＣＳ（０（ｖ／ｖ）、０．１（ｖ／ｖ）、０．５（ｖ／ｖ）、１（ｖ／ｖ）、２（ｖ／ｖ）、５（ｖ／ｖ）、１０（ｖ／ｖ）または２０（ｖ／ｖ））を含有してＰ２１−ｍＲ  ８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入した。（ｄ）可溶性ヘパリンを加えて１０％ＦＣＳまたは１０％のＰ２１結合物質枯渇ＦＣＳ中で形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー。ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、いずれかの種類のＦＣＳと様々な量の可溶性ヘパリン（０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）とを含有してＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１３−２】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ−タンパク質送達はＧＡＧ含有ＦＣＳ、ヘパリナーゼ処理および競合する可溶性ヘパリンによって阻害される。（ａ〜ｂ）ヘパリナーゼで前処理した形質導入細胞のフローサイトメトリー。（ａ）ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で、様々な量のヘパリナーゼＩＩＩ（０Ｕ／ｍｌ、０．０１Ｕ／ｍｌ、０．１Ｕ／ｍｌまたは１Ｕ／ｍｌ）と１時間プレインキュベートし、ヘパリナーゼＩＩＩを含有してｍＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（無血清培地中２０μｇ／ｍｌ）で１２時間形質導入した。（ｂ）ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で、様々な量のヘパリナーゼＩＩＩと１時間プレインキュベートし、ヘパリナーゼＩＩＩと様々な量のＦＣＳ（０％（ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ））とを含有してＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間形質導入した。（ｃ）様々な濃度のＦＣＳまたはＰ２１結合物質を枯渇させたＦＣＳ中で形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー。ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、様々な量のＦＣＳ（０（ｖ／ｖ）、０．１（ｖ／ｖ）、０．５（ｖ／ｖ）、１（ｖ／ｖ）、２（ｖ／ｖ）、５（ｖ／ｖ）、１０（ｖ／ｖ）または２０（ｖ／ｖ））を含有してＰ２１−ｍＲ  ８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入した。（ｄ）可溶性ヘパリンを加えて１０％ＦＣＳまたは１０％のＰ２１結合物質枯渇ＦＣＳ中で形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー。ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、いずれかの種類のＦＣＳと様々な量の可溶性ヘパリン（０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）とを含有してＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１４】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性送達はＨＳ−ＧＡＧ合成阻害剤である塩素酸ナトリウムによって阻害される。無血清培地中で、塩素酸ナトリウム（ＳＣ、２０ｍＭ）を加えるか、これを加えずにＰ２１−ｍＲ  ８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で６時間処理したＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー。細胞を無血清培地中で、ＳＣを加えるか、これを加えずに１時間プレインキュベートし、無血清培地中で、ＳＣを加えるか、これを加えずに６時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１５】ＧＥＴ／ＨＥＴＤはトランスジェニックシステムよりも高いカーゴ送達の細胞内レベルを達成し得る。（ａ）ＮＩＨ３ｔ３  ｍＲ（ＳＩＮ  ｍＲで形質導入したトランスジェニックＮＩＨ３ｔ３細胞）から作製した可溶性抽出物と、様々な用量のｍＲ−８ＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（無血清培地中０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞から作製した可溶性抽出物とを比較した蛍光定量。（ｂ）ＮＩＨ３ｔ３  ｍＲ（ＳＩＮ  ｍＲで形質導入したトランスジェニックＮＩＨ３ｔ３細胞）と、様々な用量のｍＲ−８ＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（無血清培地中０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）で６時間形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞から得られたものとを比較したフローサイトメトリー。蛍光は未処理ＮＩＨ３ｔ３細胞に対して正規化されている。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１６】ＧＥＴ／ＨＥＴＤタグ化タンパク質は効率的な形質導入により培地から迅速に枯渇する。（ａ〜ｂ）細胞とのインキュベーション後に残っている残留蛍光タンパク質を求めるための培地の蛍光定量。組換えタンパク質を無血清培地で２０μｇ／ｍｌに希釈し、１ｍｌ／ウェルを６ウェルプレートでコンフルエントなＮＩＨ３ｔ３と１２時間インキュベートした。インキュベーション前の蛍光を単位の１００％とし、無血清培地のバックグラウンドを減じた。（ａ）ＨＵＥＳ７の仲介により１２時間で培地から枯渇した組換えタンパク質。（ｂ）ＮＩＨ３ｔ３仲介により１２時間で培地から枯渇した組換えタンパク質。（ｃ）ＮＩＨ３ｔ３細胞を組換えタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）と様々な時間の間インキュベートすることによりＴ１／２枯渇を計算した。棒グラフは、記載されるシステムにおいて組換えタンパク質を開始濃度の半分まで枯渇させるのに必要な時間（時間）を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７−１】ＨＥＲＤ仲介性Ｃｒｅリコンビナーゼ核活性は、小胞脱出によって促進されるがマクロピノサイトーシスまたはコレステロール枯渇の阻害剤によって抑制される。ＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞を（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中でプレインキュベートし、（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中で１時間、Ｃｒｅタンパク質（ｍＲ−Ｃｒｅ：１００μｇ／ｍｌまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ：１０μｇ／ｍｌ）で形質導入し、洗浄し完全増殖培地中で１２時間培養し（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）、完全増殖培地中でさらに３６時間培養した後、解析した。（ａ）メチル−β−シクロデキストリン（コレステロールを枯渇させるために使用される）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（メチル−β−シクロデキストリンの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭおよび５ｍＭであった）。（ｂ）ナイスタチン（コレステロールを分離する薬物）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（ナイスタチンの用量は０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌであった）。（ｃ）アミロリド（マクロピノサイトーシスに必要なＮａ＋／Ｈ＋交換の特異的阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（アミロリドの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭであった）。（ｄ）サイトカラシンＤ（Ｆ−アクチン伸長阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（サイトカラシンＤの用量は０μＭ、１μＭ、５μＭまたは１０μＭであった）。（ｅ）クロロキンはエンドソーム小胞からのＣｒｅの放出を促進し、組換えを増大させる（クロロキンの用量は０μＭ、１０μＭおよび１００μＭであった）。（ｆ）小胞脱出を増大させて組換えを誘導するにはｐｇ／ｍｌの量が必要である。形質導入Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒの用量を１０倍希釈で変化させ（０〜１００μｇ／ｍｌ）、クロロキンの存在下で１時間インキュベートした。データはいずれも、組換え最大値の％で表されている。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７−２】ＨＥＲＤ仲介性Ｃｒｅリコンビナーゼ核活性は、小胞脱出によって促進されるがマクロピノサイトーシスまたはコレステロール枯渇の阻害剤によって抑制される。ＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞を（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中でプレインキュベートし、（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中で１時間、Ｃｒｅタンパク質（ｍＲ−Ｃｒｅ：１００μｇ／ｍｌまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ：１０μｇ／ｍｌ）で形質導入し、洗浄し完全増殖培地中で１２時間培養し（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）、完全増殖培地中でさらに３６時間培養した後、解析した。（ａ）メチル−β−シクロデキストリン（コレステロールを枯渇させるために使用される）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（メチル−β−シクロデキストリンの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭおよび５ｍＭであった）。（ｂ）ナイスタチン（コレステロールを分離する薬物）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（ナイスタチンの用量は０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌであった）。（ｃ）アミロリド（マクロピノサイトーシスに必要なＮａ＋／Ｈ＋交換の特異的阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（アミロリドの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭであった）。（ｄ）サイトカラシンＤ（Ｆ−アクチン伸長阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（サイトカラシンＤの用量は０μＭ、１μＭ、５μＭまたは１０μＭであった）。（ｅ）クロロキンはエンドソーム小胞からのＣｒｅの放出を促進し、組換えを増大させる（クロロキンの用量は０μＭ、１０μＭおよび１００μＭであった）。（ｆ）小胞脱出を増大させて組換えを誘導するにはｐｇ／ｍｌの量が必要である。形質導入Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒの用量を１０倍希釈で変化させ（０〜１００μｇ／ｍｌ）、クロロキンの存在下で１時間インキュベートした。データはいずれも、組換え最大値の％で表されている。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７−３】ＨＥＲＤ仲介性Ｃｒｅリコンビナーゼ核活性は、小胞脱出によって促進されるがマクロピノサイトーシスまたはコレステロール枯渇の阻害剤によって抑制される。ＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞を（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中でプレインキュベートし、（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）無血清培地中で１時間、Ｃｒｅタンパク質（ｍＲ−Ｃｒｅ：１００μｇ／ｍｌまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ：１０μｇ／ｍｌ）で形質導入し、洗浄し完全増殖培地中で１２時間培養し（薬物を加えて、あるいは薬物を加えずに）、完全増殖培地中でさらに３６時間培養した後、解析した。（ａ）メチル−β−シクロデキストリン（コレステロールを枯渇させるために使用される）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（メチル−β−シクロデキストリンの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭおよび５ｍＭであった）。（ｂ）ナイスタチン（コレステロールを分離する薬物）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（ナイスタチンの用量は０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌであった）。（ｃ）アミロリド（マクロピノサイトーシスに必要なＮａ＋／Ｈ＋交換の特異的阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する（アミロリドの用量は０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭであった）。（ｄ）サイトカラシンＤ（Ｆ−アクチン伸長阻害剤）はＣｒｅ形質導入および組換えを阻害する。（サイトカラシンＤの用量は０μＭ、１μＭ、５μＭまたは１０μＭであった）。（ｅ）クロロキンはエンドソーム小胞からのＣｒｅの放出を促進し、組換えを増大させる（クロロキンの用量は０μＭ、１０μＭおよび１００μＭであった）。（ｆ）小胞脱出を増大させて組換えを誘導するにはｐｇ／ｍｌの量が必要である。形質導入Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒの用量を１０倍希釈で変化させ（０〜１００μｇ／ｍｌ）、クロロキンの存在下で１時間インキュベートした。データはいずれも、組換え最大値の％で表されている。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１８】ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入は細胞内のマクロピノサイトーシス全般を増大させる。７０ｋＤａ  ＦＩＴＣ−デキストラン中でインキュベートし、組換えタンパク質で形質導入した細胞のフローサイトメトリー。ＮＩＨ３ｔ３細胞を無血清培地中で１時間プレインキュベートし、７０ｋＤａ  ＦＩＴＣ−デキストラン（中性）を含有してｍＲ、Ｐ２１−ｍＲ、ｍＲ−８ＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（無血清培地中２０μｇ／ｍｌ）で１時間形質導入した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１９−１】非タンパク質カーゴのＧＥＴ。（ａ）単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ２）を用いたビオチン化カーゴのＧＥＴ。（ｉ）ビオチン化カーゴに結合し形質導入するよう設計されたｍＳＡ２タンパク質の模式図。Ｐ２１−８Ｒを非相互作用対照として使用し、ｍＳＡ２を非形質導入対照として使用し、Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒを被験タンパク質として使用した。（ｉｉ）活性を試験するために用いた、ビオチン化一次（１°）抗体（ヤギ抗ウサギ；ＧｔαＲｂ）をＦＩＴＣコンジュゲート二次（２°）抗体（ウサギ抗マウス；Ｒｂ  αＭｕ）に結合させた抗体（Ａｂ）複合体の模式図。（ｉｉｉ）Ａｂ複合体のＧＥＴ送達が蛍光顕微鏡により可視化された（スケールバーは５０μｍを表す）。Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒ（１０μｇ／ｍｌ、下段の画像）の共インキュベーションにより、Ａｂ複合体が効率的に細胞に送達された。（ｉｖ）直接インキュベートによりまたはｍＳＡ２単独と共インキュベートした場合、１°／２°Ａｂ複合体（１μｇ／ｍｌ）はＮＩＨ３ｔ３細胞内に十分に取り込まれないことを示すフローサイトメトリー。（ｂ）ＬＫ１５ペプチドを用いた核酸のＧＥＴ。（ｉ）核酸に結合し形質導入するよう設計されたＬＫ１５タンパク質の模式図。（ｉｉ）ＧＥＴ−ＬＫ１５を用いたヒト間葉系幹細胞（ｉＨＭＳＣ）のトランスフェクション。最初に、プラスミド（ｐ）ＤＮＡ（ＳＩＮ  ＧＦＰ、トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）、改変合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社；トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）および小分子阻害（ｓｉ）ＲＮＡｓ（送達を検出するためにＦＡＭフルオロフォアで標識される）に対するＬＫ１５ペプチドの結合能を評価した。比を最適化した後、ｉＨＭＳＣをＰ２１−ＬＫ１５−８ＲおよびｐＤＮＡ（１０μｇ）、ｍｏｄＲＮＡ（１０μｇ）またはｓｉＲＮＡ（１μｇ）でトランスフェクトし、蛍光顕微鏡によりトランスフェクションを可視化した（スケールバーは１００μｍを表す）。（ｉｉｉ）フローサイトメトリー（％トランスフェクション効率またはｓｉＲＮＡについては相対蛍光）による、市販の標準品であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬＩＰＯ）２０００と比較したｉＨＭＳＣのＧＥＴ−ＬＫ１５トランスフェクションの定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｃ）磁性ナノ粒子のＧＥＴ。（ｉ）合成Ｐ２１−８Ｒペプチドおよび被験磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の模式図。２５０ｎｍのＮａｎｏｍａｇ−Ｄデキストランシェル／酸化鉄コアＭＮＰを試験し、Ｐ２１−８Ｒペプチドを表面ＣＯＯＨ基にコンジュゲートした。（ｉｉ）無血清培地（ＳＦＭ；左パネル）ではＭＮＰが最も効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞内に取り込まれる。標準培地条件（１０％ＦＣＳ）またはＳＦＭ中、ＭＮＰ（５０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、プルシアンブルー鉄で染色したＮＩＨ３ｔ３細胞の光学顕微鏡像。１０％ＦＣＳ条件およびＳＦＭ条件の両方で、Ｐ２１−８ＲをＭＮＰにコンジュゲートすることにより細胞内取込みが有意に増大する（円形の画像はウェル全体の画像であり、スケールバーは１００μｍを表す）。
【図１９−２】非タンパク質カーゴのＧＥＴ。（ａ）単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ２）を用いたビオチン化カーゴのＧＥＴ。（ｉ）ビオチン化カーゴに結合し形質導入するよう設計されたｍＳＡ２タンパク質の模式図。Ｐ２１−８Ｒを非相互作用対照として使用し、ｍＳＡ２を非形質導入対照として使用し、Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒを被験タンパク質として使用した。（ｉｉ）活性を試験するために用いた、ビオチン化一次（１°）抗体（ヤギ抗ウサギ；ＧｔαＲｂ）をＦＩＴＣコンジュゲート二次（２°）抗体（ウサギ抗マウス；Ｒｂ  αＭｕ）に結合させた抗体（Ａｂ）複合体の模式図。（ｉｉｉ）Ａｂ複合体のＧＥＴ送達が蛍光顕微鏡により可視化された（スケールバーは５０μｍを表す）。Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒ（１０μｇ／ｍｌ、下段の画像）の共インキュベーションにより、Ａｂ複合体が効率的に細胞に送達された。（ｉｖ）直接インキュベートによりまたはｍＳＡ２単独と共インキュベートした場合、１°／２°Ａｂ複合体（１μｇ／ｍｌ）はＮＩＨ３ｔ３細胞内に十分に取り込まれないことを示すフローサイトメトリー。（ｂ）ＬＫ１５ペプチドを用いた核酸のＧＥＴ。（ｉ）核酸に結合し形質導入するよう設計されたＬＫ１５タンパク質の模式図。（ｉｉ）ＧＥＴ−ＬＫ１５を用いたヒト間葉系幹細胞（ｉＨＭＳＣ）のトランスフェクション。最初に、プラスミド（ｐ）ＤＮＡ（ＳＩＮ  ＧＦＰ、トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）、改変合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社；トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）および小分子阻害（ｓｉ）ＲＮＡｓ（送達を検出するためにＦＡＭフルオロフォアで標識される）に対するＬＫ１５ペプチドの結合能を評価した。比を最適化した後、ｉＨＭＳＣをＰ２１−ＬＫ１５−８ＲおよびｐＤＮＡ（１０μｇ）、ｍｏｄＲＮＡ（１０μｇ）またはｓｉＲＮＡ（１μｇ）でトランスフェクトし、蛍光顕微鏡によりトランスフェクションを可視化した（スケールバーは１００μｍを表す）。（ｉｉｉ）フローサイトメトリー（％トランスフェクション効率またはｓｉＲＮＡについては相対蛍光）による、市販の標準品であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬＩＰＯ）２０００と比較したｉＨＭＳＣのＧＥＴ−ＬＫ１５トランスフェクションの定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｃ）磁性ナノ粒子のＧＥＴ。（ｉ）合成Ｐ２１−８Ｒペプチドおよび被験磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の模式図。２５０ｎｍのＮａｎｏｍａｇ−Ｄデキストランシェル／酸化鉄コアＭＮＰを試験し、Ｐ２１−８Ｒペプチドを表面ＣＯＯＨ基にコンジュゲートした。（ｉｉ）無血清培地（ＳＦＭ；左パネル）ではＭＮＰが最も効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞内に取り込まれる。標準培地条件（１０％ＦＣＳ）またはＳＦＭ中、ＭＮＰ（５０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、プルシアンブルー鉄で染色したＮＩＨ３ｔ３細胞の光学顕微鏡像。１０％ＦＣＳ条件およびＳＦＭ条件の両方で、Ｐ２１−８ＲをＭＮＰにコンジュゲートすることにより細胞内取込みが有意に増大する（円形の画像はウェル全体の画像であり、スケールバーは１００μｍを表す）。
【図１９−３】非タンパク質カーゴのＧＥＴ。（ａ）単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ２）を用いたビオチン化カーゴのＧＥＴ。（ｉ）ビオチン化カーゴに結合し形質導入するよう設計されたｍＳＡ２タンパク質の模式図。Ｐ２１−８Ｒを非相互作用対照として使用し、ｍＳＡ２を非形質導入対照として使用し、Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒを被験タンパク質として使用した。（ｉｉ）活性を試験するために用いた、ビオチン化一次（１°）抗体（ヤギ抗ウサギ；ＧｔαＲｂ）をＦＩＴＣコンジュゲート二次（２°）抗体（ウサギ抗マウス；Ｒｂ  αＭｕ）に結合させた抗体（Ａｂ）複合体の模式図。（ｉｉｉ）Ａｂ複合体のＧＥＴ送達が蛍光顕微鏡により可視化された（スケールバーは５０μｍを表す）。Ｐ２１−ｍＳＡ２−８Ｒ（１０μｇ／ｍｌ、下段の画像）の共インキュベーションにより、Ａｂ複合体が効率的に細胞に送達された。（ｉｖ）直接インキュベートによりまたはｍＳＡ２単独と共インキュベートした場合、１°／２°Ａｂ複合体（１μｇ／ｍｌ）はＮＩＨ３ｔ３細胞内に十分に取り込まれないことを示すフローサイトメトリー。（ｂ）ＬＫ１５ペプチドを用いた核酸のＧＥＴ。（ｉ）核酸に結合し形質導入するよう設計されたＬＫ１５タンパク質の模式図。（ｉｉ）ＧＥＴ−ＬＫ１５を用いたヒト間葉系幹細胞（ｉＨＭＳＣ）のトランスフェクション。最初に、プラスミド（ｐ）ＤＮＡ（ＳＩＮ  ＧＦＰ、トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）、改変合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社；トランスフェクション時にＧＦＰを発現させるため）および小分子阻害（ｓｉ）ＲＮＡｓ（送達を検出するためにＦＡＭフルオロフォアで標識される）に対するＬＫ１５ペプチドの結合能を評価した。比を最適化した後、ｉＨＭＳＣをＰ２１−ＬＫ１５−８ＲおよびｐＤＮＡ（１０μｇ）、ｍｏｄＲＮＡ（１０μｇ）またはｓｉＲＮＡ（１μｇ）でトランスフェクトし、蛍光顕微鏡によりトランスフェクションを可視化した（スケールバーは１００μｍを表す）。（ｉｉｉ）フローサイトメトリー（％トランスフェクション効率またはｓｉＲＮＡについては相対蛍光）による、市販の標準品であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬＩＰＯ）２０００と比較したｉＨＭＳＣのＧＥＴ−ＬＫ１５トランスフェクションの定量化。エラーバーは標準偏差を表す。（ｃ）磁性ナノ粒子のＧＥＴ。（ｉ）合成Ｐ２１−８Ｒペプチドおよび被験磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の模式図。２５０ｎｍのＮａｎｏｍａｇ−Ｄデキストランシェル／酸化鉄コアＭＮＰを試験し、Ｐ２１−８Ｒペプチドを表面ＣＯＯＨ基にコンジュゲートした。（ｉｉ）無血清培地（ＳＦＭ；左パネル）ではＭＮＰが最も効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞内に取り込まれる。標準培地条件（１０％ＦＣＳ）またはＳＦＭ中、ＭＮＰ（５０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、プルシアンブルー鉄で染色したＮＩＨ３ｔ３細胞の光学顕微鏡像。１０％ＦＣＳ条件およびＳＦＭ条件の両方で、Ｐ２１−８ＲをＭＮＰにコンジュゲートすることにより細胞内取込みが有意に増大する（円形の画像はウェル全体の画像であり、スケールバーは１００μｍを表す）。
【図２０】細胞内および細胞外の膜係留ＨＡＬＯタンパク質のリガンド自己標識化。（ａ）ＨＡＬＯ（細胞内）およびＬＡＭＰ２ｂ−ＨＡＬＯ（細胞外膜係留）トランスジェニックＳＩＮレンチウイルス構築物の模式図。ＬＡＭＰ２ｂ−ＨＡＬＯでは、発現したタンパク質が、切断されるシグナルペプチド（ＳＩＧ）によって細胞膜に局在化し、細胞膜の細胞外側に提示される。（ｂ）細胞内ＨＡＬＯタンパク質のトランスジェニックであるＮＩＨ３ｔ３細胞（ＮＩＨ３ｔ３−ＨＡＬＯ）は、細胞透過性リガンド（ＨＡＬＯＴＡＧＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）によってのみ効率的に標識される。膜係留細胞外ＨＡＬＯタンパク質のトランスジェニックであるＮＩＨ３ｔ３細胞（ＮＩＨ３ｔ３−ＬＡＭＰ２ｂ）は、細胞透過性リガンドおよび細胞不透過性リガンド（ＨＡＬＯＴＡＧＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８）の両方によって効率的に標識される。データは、リガンド（１μＭ）と１５分間インキュベートし、次いで培地で３回洗浄し１５分間インキュベートして未結合リガンドを除去したＮＩＨ３ｔ３細胞系のフローサイトメトリーを示す。エラーバーは標準偏差を表す。これはＨＡＬＯタンパク質の細胞内局在対細胞内局在を評価するアッセイとなる。
【図２１−１】ＧＥＴ−ＨＡＬＯタンパク質のリガンド標識化は迅速な細胞結合および形質導入を示す。（ａ）作製した（図１でｍＲＦＰについて記載されている通りに）ＨＡＬＯタンパク質の模式図。（ｂ）Ｐ２１−ＨＡＬＯ−８ＲおよびＰ２１−ＨＡＬＯは、１時間のインキュベーションで効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞を結合するが、有意な内部移行は認められない。（ｃ）さらなるインキュベーション（１時間−５時間）により、結合Ｐ２１−ＨＡＬＯ−８Ｒが効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞内に形質導入される。結合Ｐ２１−ＨＡＬＯは、さらなるインキュベーションにより効率的に細胞内に侵入することはなく、細胞膜に結合したままである。データは、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した後、リガンドで直接標識化する（１時間）か、さらに５時間インキュベートした（１時間−５時間）ＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２１−２】ＧＥＴ−ＨＡＬＯタンパク質のリガンド標識化は迅速な細胞結合および形質導入を示す。（ａ）作製した（図１でｍＲＦＰについて記載されている通りに）ＨＡＬＯタンパク質の模式図。（ｂ）Ｐ２１−ＨＡＬＯ−８ＲおよびＰ２１−ＨＡＬＯは、１時間のインキュベーションで効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞を結合するが、有意な内部移行は認められない。（ｃ）さらなるインキュベーション（１時間−５時間）により、結合Ｐ２１−ＨＡＬＯ−８Ｒが効率的にＮＩＨ３ｔ３細胞内に形質導入される。結合Ｐ２１−ＨＡＬＯは、さらなるインキュベーションにより効率的に細胞内に侵入することはなく、細胞膜に結合したままである。データは、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した後、リガンドで直接標識化する（１時間）か、さらに５時間インキュベートした（１時間−５時間）ＮＩＨ３ｔ３細胞のフローサイトメトリー解析を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２２−１】ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ（ｍＮｅｃｔ）タンパク質のｐＨ感受性は迅速な細胞結合および形質導入を示す。（ａ）作製した（図１でｍＲＦＰについて記載されている通りに）ＨＡＬＯタンパク質の模式図。（ｂ〜ｃ）ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質またはＧＥＴ−ｍＲタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に１時間形質導入した（膜結合活性を示すため）後、タンパク質を加えずに１時間、次いでさらに５時間（１時間−５時間）（形質導入活性を示すため）または６時間（持続送達を示すため）インキュベートした。フローサイトメトリーを用いてｍＮｅｃｔタンパク質およびｍＲ  ＧＥＴ−タンパク質の強度を比較した。ｍＮｅｃｔタンパク質の形質導入による蛍光シグナルは（ｍＲ型とは異なり）、エンドソーム酸性化およびタンパク質アンフォールディングに新しい内部移行の後、迅速に消失する。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ〜ｆ）サイトメトリーの前にｐＨ７．５またはｐＨ５．５のＤＭＥＭで洗浄する以外は同じレジメンでＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に形質導入した。膜局在ｍＮｅｃｔタンパク質の蛍光は、ｐＨ５．５では消失するがｐＨ７．５では保持され、このことは、１時間のインキュベーションではＰ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒが膜と結合したまま細胞外にあり、ｐＨによるアンフォールディングから保護されないことを示唆している。１時間−５時間のインキュベーションは、Ｐ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒの局在が移行してｐＨによるアンフォールディングから保護され、タンパク質の内部移行および細胞膜による保護を示していることを実証する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２２−２】ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ（ｍＮｅｃｔ）タンパク質のｐＨ感受性は迅速な細胞結合および形質導入を示す。（ａ）作製した（図１でｍＲＦＰについて記載されている通りに）ＨＡＬＯタンパク質の模式図。（ｂ〜ｃ）ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質またはＧＥＴ−ｍＲタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に１時間形質導入した（膜結合活性を示すため）後、タンパク質を加えずに１時間、次いでさらに５時間（１時間−５時間）（形質導入活性を示すため）または６時間（持続送達を示すため）インキュベートした。フローサイトメトリーを用いてｍＮｅｃｔタンパク質およびｍＲ  ＧＥＴ−タンパク質の強度を比較した。ｍＮｅｃｔタンパク質の形質導入による蛍光シグナルは（ｍＲ型とは異なり）、エンドソーム酸性化およびタンパク質アンフォールディングに新しい内部移行の後、迅速に消失する。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ〜ｆ）サイトメトリーの前にｐＨ７．５またはｐＨ５．５のＤＭＥＭで洗浄する以外は同じレジメンでＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に形質導入した。膜局在ｍＮｅｃｔタンパク質の蛍光は、ｐＨ５．５では消失するがｐＨ７．５では保持され、このことは、１時間のインキュベーションではＰ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒが膜と結合したまま細胞外にあり、ｐＨによるアンフォールディングから保護されないことを示唆している。１時間−５時間のインキュベーションは、Ｐ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒの局在が移行してｐＨによるアンフォールディングから保護され、タンパク質の内部移行および細胞膜による保護を示していることを実証する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２２−３】ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ（ｍＮｅｃｔ）タンパク質のｐＨ感受性は迅速な細胞結合および形質導入を示す。（ａ）作製した（図１でｍＲＦＰについて記載されている通りに）ＨＡＬＯタンパク質の模式図。（ｂ〜ｃ）ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質またはＧＥＴ−ｍＲタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に１時間形質導入した（膜結合活性を示すため）後、タンパク質を加えずに１時間、次いでさらに５時間（１時間−５時間）（形質導入活性を示すため）または６時間（持続送達を示すため）インキュベートした。フローサイトメトリーを用いてｍＮｅｃｔタンパク質およびｍＲ  ＧＥＴ−タンパク質の強度を比較した。ｍＮｅｃｔタンパク質の形質導入による蛍光シグナルは（ｍＲ型とは異なり）、エンドソーム酸性化およびタンパク質アンフォールディングに新しい内部移行の後、迅速に消失する。エラーバーは標準偏差を表す。（ｄ〜ｆ）サイトメトリーの前にｐＨ７．５またはｐＨ５．５のＤＭＥＭで洗浄する以外は同じレジメンでＧＥＴ−ｍＮｅｃｔタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をＮＩＨ３ｔ３細胞内に形質導入した。膜局在ｍＮｅｃｔタンパク質の蛍光は、ｐＨ５．５では消失するがｐＨ７．５では保持され、このことは、１時間のインキュベーションではＰ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒが膜と結合したまま細胞外にあり、ｐＨによるアンフォールディングから保護されないことを示唆している。１時間−５時間のインキュベーションは、Ｐ２１−ｍＮｅｃｔ−８Ｒの局在が移行してｐＨによるアンフォールディングから保護され、タンパク質の内部移行および細胞膜による保護を示していることを実証する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２３】再形質導入を成功させるにはＧＥＴタンパク質が細胞内に送達されなければならない。（ａ）ＮＩＨ３ｔ３細胞におけるＧＥＴタンパク質の再形質導入の効果を試験するスキーム。細胞を新鮮な培地中で１時間プレインキュベートし、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）で１時間形質導入した。次いで、細胞の蛍光を解析するか、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）でさらに１時間形質導入した。この再形質導入は、直後（０時間）であるか、再形質導入との間で１〜６時間インキュベーションを伴い、その後フローサイトメトリーにより蛍光を解析した。直後の再形質導入は阻害されるのに対し、形質導入と形質導入との間での１時間超のインキュベーションは、最も効率的なＧＥＴ−タンパク質の再形質導入を可能にする。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図２４】ＮＥＯのＣＰＰ単独形質導入と比較したＧＥＴ。（ａ）ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（ＣＰＰ単独タンパク質）およびＰ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（ＧＥＴタンパク質）の模式図。（ｂ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８ＲはＧ−４１８選択下でＭＥＦ培養物の生存を維持するのに対し、ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒはレスキュー活性に乏しい。Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ活性は、ＳＩＮ  ＮＥＯを遺伝的に補充した（ＮＥＯを過剰発現させるため）細胞と同程度である。データは、用量１５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８に対するＭＥＦ細胞数を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２５】ＮＡＮＯＧのＣＰＰ単独形質導入と比較したＧＥＴ。（ａ）ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒ（ＣＰＰ単独タンパク質）およびＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒ（ＧＥＴタンパク質）の模式図。（ｂ）Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８ＲはＬＩＦを欠く状態でｍＥＳＣの増殖を用量依存性に維持するのに対し、ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒは自己再生活性に乏しい。データは、継代時にＬＩＦを添加せず培養したＣＧＲ−８細胞数対ＬＩＦを添加して培養したＣＧＲ−８細胞数の割合（％−ＬＩＦ／＋ＬＩＦ）を示す。ＬＩＦ欠損ＣＧＲ−８培養物では、増殖は、ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧを補充する（ＮＡＮＯＧを過剰発現させるため）か、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒで形質導入した場合に促進されるが、ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒによる形質導入の場合は不十分である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２６】ＭＹＯＤのＣＰＰ単独形質導入と比較したＧＥＴ。（ａ）ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（ＣＰＰ単独タンパク質）およびＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（ＧＥＴタンパク質）の模式図。（ｂ）Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒは、ミオゲニン陽性多核化筋管へのＨＵＥＳ７細胞の筋原性分化を促進するのに対し、ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒは筋原性活性に乏しい。Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ活性は、ＳＩＮ  ＭＹＯＤを遺伝的に補充した（ＭＹＯＤを過剰発現させるため）細胞と同程度である。データは、免疫標識を用いたミオゲニン陽性細胞の割合の定量化を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２７】組織から抽出したアポトーシス促進タンパク質のＧＥＴ−ｍＳＡ２による送達。（ａ）ウシ心臓シトクローム−Ｃ（Ｃｙｔ−Ｃ）およびビオチン化Ｃｙｔ−Ｃ（ＢＩＯ−Ｃｙｔ−Ｃ）およびＣｙｔ−ＣとｍＳＡ２との複合体の模式図。（ｂ）ＮＩＨ３ｔ３のアポトーシスを誘導するためのクロロキン（１００μＭ）の存在下でのＣｙｔ−Ｃ（非相互作用対照）またはＢＩＯ−Ｃｙｔ−Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）とＧＥＴ−ｍＳＡ２タンパク質との共インキュベーション。１２時間のインキュベーション後に実施したトリパンブルー排除法による評価では、（クロロキンと）完全に相互作用し形質導入する複合体のみが細胞生存能の喪失を仲介した。エラーバーは標準偏差を表す。（ｃ）クロロキンの存在下にてＰ２１−ｍＳＡ２−８Ｒで形質導入されたＢＩＯ−Ｃｙｔ−Ｃは、光学顕微鏡観察に示される細胞生存能を完全に喪失した。（スケールバーは５０μｍを表す）。
【図２８】ＳｐＡ  Ｂドメインを用いる抗体のＧＥＴ。（ａ）ＩｇＧ抗体に結合し形質導入するよう設計されたＳｐＡＢタンパク質およびＰ２１−ＳｐＡＢ−８Ｒタンパク質の模式図。ＦＩＴＣコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｒｂ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）の送達を試験した。（ｂ）直接インキュベートによりまたはＳｐＡＢと共インキュベートした場合、ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）はＮＩＨ３ｔ３細胞内に十分に取り込まれなかった（左パネル）。Ｐ２１−ＳｐＡＢ−８Ｒとの共インキュベーションにより（１０μｇ／ｍｌ、右パネル）、蛍光顕微鏡により可視化されるように、ＩｇＧは効率的に細胞に送達された（スケールバーは５０μｍを表す）。（ｃ）送達した細胞のフローサイトメトリーにより、２桁を超えるＩｇＧ送達の増大が確認された。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２９】カーゴへのＰ２１およびＣＰＰの付加は送達を２桁超改善する。ラットの大動脈平滑筋細胞（ｒＳＭＣ）および新生仔心筋細胞（ｒＣＭｓ）を含む細胞系（図１に記載されている）を、カーゴタンパク質のｍＲＦＰ融合変異体（ｍＲ、ｍＲ−Ｃｒｅ、ｍＲ−ＮＥＯ、ｍＲ−ＮＡＮＯＧまたはｍＲ−ＭＹＯＤ）またはＮ末端にＰ２１配列を融合しＣ末端に８Ｒ（ＣＰＰ）配列を融合したカーゴ（ＧＥＴタンパク質；Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ、Ｐ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒ、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８ＲまたはＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ）で形質導入した。形質導入は、細胞系の標準培地中で、２０μｇ／ｍｌのタンパク質で２４時間実施した。データは、フローサイトメトリーにより評価した、カーゴにＧＥＴ配列（Ｐ２１および８Ｒ）を付加して実施した形質導入の増加倍数を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３０】高レベルのＧＥＴ−形質導入または恒常的なＧＥＴ−形質導入は細胞生存能に影響を及ぼさない。（ａ）０〜２００μｇ／ｍｌのＰ２１−ｍＲ−８Ｒタンパク質で１２時間形質導入したＮＩＨ３ｔ３の、形質導入直後（０時間；左）または形質導入から２４時間後（２４時間；右）のいずれかでのトリパンブルー排除法による細胞生存能の評価。（ｂ）０〜２００μｇ／ｍｌのＰ２１−ｍＲ−８Ｒタンパク質で２４時間形質導入したＮＩＨ３ｔ３の、継代および細胞数カウントによる形質導入後の細胞増殖の評価。（ｃ）０〜２００μｇ／ｍｌのＰ２１−ｍＲ−８Ｒタンパク質で形質導入したＮＩＨ３ｔ３の、継代および細胞数カウントによる恒常的形質導入時の細胞増殖の評価（継代毎にタンパク質を補給）。細胞を毎日継代し、１２ウェル当たり１００，０００個の細胞で再播種した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３１】ＧＥＴは多数の臨床的に重要な細胞型において生体適合性である。細胞系を２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌのＰ２１−ｍＲ−８Ｒで２４時間にわたって形質導入し、トリパンブルーにより細胞生存率を評価した（細胞系は、ラットの大動脈平滑筋細胞（ｒＳＭＣ）および新生仔心筋細胞（ｒＣＭｓ）を含む図１に記載されているものであった）。試験したいずれの濃度でも、全細胞型で高い生存率が維持された。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３２】Ａ：デキストランコートナノ粒子の模式図、Ｂ：Ｐ２１ｍＲで標識したＮａｎｏｍａｇ‐Ｄナノ粒子５０μｇおよび別個に加えた粒子とタンパク質のプルシアンブルー染色、Ｃ：赤色蛍光タンパク質で標識したＮａｎｏｍａｇ‐Ｄ粒子の蛍光、Ｄ：標識する前および後の溶液の蛍光。
【図３３】Ａ：３ｔ３細胞と２４時間インキュベートしたＮａｎｏｍａｇ粒子のプルシアンブルー染色、Ｂ：２４時間インキュベーション後の１細胞当たりの鉄の量に関する鉄アッセイの結果。
【図３４】Ａ：３ｔ３細胞と様々な時間の間インキュベートしたｎａｎｏｍａｇ‐Ｄ粒子のプルシアンブルー染色、Ｂ：鉄アッセイによる定量化の結果。
【図３５】Ａ：鉄アッセイにより分析した、ナノ粒子５０μｇ、１μＭのＰ２１８Ｒおよび様々な量のヘパリンとインキュベートした３ｔ３細胞、Ｂ：デキストランとインキュベートした３ｔ３細胞、Ｃ：様々な量の血清とインキュベートした３ｔ３細胞。Ｄ：Ｆｉｔｃ‐ＢＳＡとのインキュベート後の３ｔ３細胞の蛍光。
【図３６】Ｐ２１  ｍＲＦＰ  ８Ｒペプチドにより細胞へのｍＲＦＰのＧＥＴ仲介性送達が増大する。ＦｍＲＦＰペプチド、Ｐ２１  ｍＲＦＰペプチド、ｍＲＦＰ  ８ＲペプチドおよびＰ２１  ｍＲＦＰ  ８Ｒペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像。顕微鏡像には、対照として、いずれのペプチドでも処理していない細胞も含まれている。スケールバーは１００μｍを表す。
【図３７】ｍＲＦＰコンジュゲートペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＧＲ−８細胞およびＨＵＥＳ７細胞を示すグラフである。フローサイトメトリー解析を用いて細胞の蛍光（相対蛍光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）（ＲＦＵ））を定量化した。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図３８】改変ＣＰＰ（ＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインｍＲＦＰ  ８Ｒ）により細胞内へのｍＲＦＰの形質導入が未改変ＣＰＰ（ｍＲＦＰ  ８Ｒ）よりも増大することを示すグラフである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＧＲ−８細胞およびＨＵＥＳ７細胞をｍＲＦＰコンジュゲートペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理した。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図３９】ＧＥＴを促進することが示された改変ペプチドによる細胞へのｍＲＦＰの効率的な送達。Ｐ２１  ｍＲＦＰ  ８Ｒペプチド、ＦＧＦ２Ｂ  ｍＲＦＰ  ８Ｒペプチド、ＦＧＦ７Ｂ  ｍＲＦＰ  ８ＲペプチドおよびＰＤＧＦ  ｍＲＦＰ  ８Ｒペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で１２時間処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＧＲ８細胞およびＨＵＥＳ−７細胞の蛍光顕微鏡像。スケールバーは１００μｍを表す。
【図４０】ＹＯ−ＰＲＯ−１アッセイを用いるＰ２１  ＬＫ１５  ８ＲとｐＳＩＮ  ＧＦＰとの（＋／−）負荷比の最適化。グラフは、Ｐ２１  ＬＫ１５  ８ＲがｐＳＩＮ  ＧＦＰを結合したときの蛍光の％の減少を示す。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図４１】ｐＳＩＮ  ＧＦＰで６時間トランスフェクトした後のＮＩＨ３Ｔ３細胞のＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットの例。トランスフェクション後、４８時間の時点で細胞を固定した。フローサイトメトリー解析を用いてＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した。
【図４２】Ｐ２１  ＬＫ１５  ８ＲペプチドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞内へのｐＳＩＮ  ＧＦＰトランスフェクションの最適化。細胞をＰ２１  ＬＫ１５  ８ＲとｐＳＩＮ  ＧＦＰがそれぞれ２：１である最適な（＋／−）負荷比で処理した。（Ａ）１０％血清トランスフェクション培地、（Ｂ）無血清トランスフェクション培地中で、様々なトランスフェクション時間（３時間、６時間および２４ｈ）で最適化を実施した。トランスフェクション後、４８時間の時点で細胞を固定した。フローサイトメトリー解析を用いてＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図４３】無血清条件での、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によるＮＩＨ３Ｔ３細胞内へのｐＳＩＮ  ＧＦＰのトランスフェクションの最適化を示すグラフである。フローサイトメトリー解析を用いてＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
緒言
ヒト多能性幹細胞（ＨＰＳＣ）は着床前胚の内部細胞塊に由来するＨＥＳＣを含み、ＨｉＰＳＣは体細胞のエピジェネティックな再プログラム化により作製される｛Ｒｏｂｉｎｔｏｎ，２０１２，＃３０｝。これらの細胞の挙動および分化を効率的かつ再現的に制御する能力は、再生医療および個別化医療で現在重ねられている努力の基盤である。これまでに、転写因子が促進するトランスジェニック法が、心臓分化を促進し収縮性心筋細胞を生じさせるようＨＰＳＣの遺伝子調節ネットワークを直接プログラムすると記載されている｛Ｄｉｘｏｎ，＃１１｝。細胞の挙動、例えばゲノム再プログラミング｛Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７，＃８２｝、自己再生｛Ｃｈａｍｂｅｒｓ，２００３，＃７０｝、分化｛Ｄｉｘｏｎ，＃１１｝、アポトーシス｛Ｍｏｈａｎ，２０１３，＃８３｝、増殖｛Ｚｈａｏ，２０１３，＃８５｝または移動｛Ｄｅｂｏｕｘ，２０１３，＃８４｝などを制御するための、導入遺伝子が促進する方法が多数記載されている。これらのすべては外来遺伝子を発現させるためのＤＮＡの組み込みを含み、通常ウイルスベクターまたは一過性ＤＮＡトランスフェクションを用い、それは効率が低くかつゲノム改変を引き起こし得る。このため、ＲＮＡトランスフェクション｛Ｗａｒｒｅｎ，２０１０，＃４｝またはＰＴＤ仲介性タンパク質送達｛Ｚｈｏｕ，２００９，＃７２｝などの方法が、化学量論組成が制御されかつゲノム組込みの可能性が全くない魅力的な代替法である｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝。多能性幹細胞内への生物活性タンパク質の確実な送達を可能にし、現在用いられている技術に代わり、再生医療適用へのＨＰＳＣの導入を改善するために使用できるＰＴＤ技術の開発が、１つの目的であった。
【０１０９】
結果
ＨＳ−ＧＡＧ相互作用を介してＰＴＤ機能を増強するＨＢＤであるＰ２１の単離
主眼を、カーゴタンパク質のエンドソーム脱出ではなく、カーゴタンパク質の最初のＰＴＤ相互作用および脂質二重層形質導入の改善に置いた。まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現および精製が容易な自己レポートカーゴとして単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）を用いた（図１ａ）。検討により、ＴＡＴおよび８Ｒ  ＰＴＤはｍＥＳＣ、ＨＥＳＣおよびＨｉＰＳＣの細胞膜と相互作用する（図８ａ）がカーゴの形質導入率は極めて低い（対照の約１〜３倍）（図１および８ｂ）ことが明らかになった。これは、効率的な送達（対照の約５〜５０倍、ｐ＜０．０１）を示した、広範囲に試験した細胞系（ＮＩＨ３ｔ３、Ｃ２Ｃ１２およびマウス胚線維芽細胞など）との比較である（図１）。これまでの報告で、ＰＴＤタグ化タンパク質が様々な確実度で多能性幹細胞内へ機能的に送達されることが示されている｛Ｄｏ  Ｋｗｏｎ，２００５，＃７４；Ｌｉａｎｇ，２０１３，＃７３｝。これらの研究が成功を収めたのは、必要とされる有効なタンパク質の量がごくわずかであったこと、開始集団ではなく分化誘導体にタンパク質を送達したこと、または低レベルの機能性を誘発するのに大量のタンパク質を使用したことに起因するものと仮定された。
【０１１０】
これらの標的細胞型へのカーゴタンパク質の結合および最終的な形質導入の改善を目的とした。インテグリン、ＣＤマーカーおよびＧＡＧを含むｍＥＳＣ、ＨＥＳＣまたはＨｉＰＳＣの膜上に存在すると知られている分子と相互作用することが報告されている短いペプチドを、いくつかスクリーニングした。ペプチドをｍＲＦＰ１にＮ末端で融合し、発現させ、アフィニティー精製し、３つの細胞型とインキュベートした。１２種類の変異体をスクリーニングしたところ、細胞およびそれらの膜へのｍＲＦＰ１蛍光（ｍＲ）の局在を明らかに増大させたＰ２１（ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ（配列番号１））と称する１つの変異体が得られた（図２）。興味深いことに、このペプチドはまた、エンドソーム局在を示す点状の細胞内蛍光によって明白に示される形質導入活性を示した（図２ｂ、２ｃ）。Ｐ２１は、サイトカインのＥＧＦファミリーに属するＨＢ−ＥＧＦに由来した。ＨＢ−ＥＧＦはヘパリンに対して強い親和性を示し、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αと同じ受容体に結合する｛Ｓａｋｕｍａ，１９９７，＃７６｝。細胞表面ＨＳ−ＧＡＧとのＨＢ−ＥＧＦの相互作用は、ＥＧＦＲへのその最適な結合およびＨＢ−ＥＧＦの血管平滑筋細胞に対するその成長／移動活性を促進するのに不可欠である｛Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，１９９３，＃９０｝。合成ペプチドおよびヘパリンを用いる分析と組み合わせた、組換えＨＢ−ＥＧＦの変異誘発およびプロテアーゼ消化は、可溶性ＨＢ−ＥＧＦのアミノ末端領域中のＰ２１配列がヘパリンへのその結合に重要であり、そのため典型的なＨＢＤと考えられることを明らかにした｛Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９４，＃７７｝。さらに、Ｐ２１は細胞表面ＨＳ−ＧＡＧとも相互作用するが、ＨＢ−ＥＧＦ中の他の配列によって仲介されるＥＧＦＲとは相互作用しない。そこで、マウスおよびヒト両方の多能性幹細胞への蛍光レポーターの結合を増強する短い２１残基ペプチド、Ｐ２１を単離した。
【０１１１】
Ｐ２１がヘパリンに直接結合することを確認するため、ヘパリン−セファロースビーズを用いた結合アッセイを開発した（図９）。Ｐ２１タグ化ｍＲは未タグ化ｍＲと異なり、ヘパリン−セファロースによって効率的に分離された（９６．２±５．３％；ｐ＜０．０１）。この分離は、遊離ヘパリンと共インキュベートすることにより用量依存性に逆転させることができた。ＨＢＤが単離されたのは興味深いことであり、ＨＳ−ＧＡＧは長い間、ＰＴＤ仲介性形質導入の過程で重要であると考えられてきた。しかし、形質導入におけるＨＳ−ＧＡＧの正確な役割は現時点で１つの論点となっており、最新の仮説は、ＨＳ−ＧＡＧは、ＰＴＤへの直接結合およびそれらを膜上に集中させることにより形質導入において重要であるにすぎず；これは脂質二重層の転移を増強するが、その発生には必要でないというものである｛Ｇｕｍｐ，２０１０，＃２｝。
【０１１２】
あらゆる哺乳動物細胞上には負荷電硫酸化プロテオグリカンおよび糖タンパク質が存在する。しかし、それらは異なって修飾されており、特異的変異体が広範囲に存在するか、非常に特異的な細胞型上に存在する｛Ｌｉｎｄａｈｌ，１９９８，＃５６｝。ＧＰＩアンカープロテオグリカンおよび糖タンパク質は脂質ラフト中に存在し、このことは、ＰＴＤが特定のプロテオグリカンに対して高い結合力を有するか、おそらくＰＴＤがコレステロール膜の構成要素に直接結合しこれがマクロピノサイトーシスを誘発することを示唆している。Ｐ２１−ペプチドが特定のＨＳ−ＧＡＧ形態に対して特異的結合力を有し、ＰＴＤでの同じモチーフを認識し得るとも考えられる。
【０１１３】
細胞膜のＰ２１仲介性結合を試験して、１分子内で両方の部分を組み合わせることによってｍＲのＰＴＤ仲介性形質導入を増強し得るかどうかを決定した（図２ａ）。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒをクローニングし、発現させ、精製し、その活性をＰ２１単独（Ｐ２１−ｍＲと称する）または８Ｒ単独（ｍＲ−８Ｒ）のタンパク質と比較した（図２ａ）。データから、Ｐ２１部分と８Ｒ部分の両方を含むと、同じタンパク質内で相乗的に働き全被験細胞系の蛍光を有意に増強することが示された（図２ｂ）。重要なことに、マウスおよびヒトの多能性幹細胞（ＣＧＲ−８、ＨＵＥＳ７およびＩＰＳ２）ならびに心筋細胞（ＨＬ１）は、Ｐ２１タグの含有により初めて効率的に形質導入され、両方のタグが協働して他の細胞系の場合でみられるものと同様の高レベルの形質導入をもたらした（図２ｃ）。これらのモチーフをまたｍＲＦＰのＮ末端およびＣ末端に直列して配置する（Ｐ２１または８Ｒが先；Ｐ２１−８Ｒ−ｍＲ、８Ｒ−Ｐ２１−ｍＲまたはｍＲ−Ｐ２１−８Ｒ、ｍＲ−８Ｒ−Ｐ２１）か、それらの末端を切り替える（すなわち、８Ｒ−ｍＲ−Ｐ２１）と、いずれの変異体もＰ２１−ｍＲ−８Ｒでみられるような同様の相乗作用および細胞形質導入挙動を示した（図１０）。さらに、８Ｒを十分に特徴付けられた代替のＰＴＤ（ＴＡＴ、８Ｋおよび８ＲＱ；｛Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，２００５，＃３６｝）に入れ替えたところ、それらもＰ２１と協働することが示された（図１１）。
【０１１４】
細胞をタンパク質と様々なタイミングでインキュベートし、培養後の期間を設けることにより、細胞表面で発生した蛍光シグナルと内部移行した蛍光シグナルとを効率的に区別できた（図２ｄ）。１時間と称する短いインキュベーション時間（１時間）で、細胞は蛍光の膜局在を示した。１時間−５時間と称する、この短時間のインキュベーションとこれに続く培養期間（１時間および培養後５時間）では、形質導入を示すほぼ細胞内のみの蛍光が観察された。６時間と称するさらに長いインキュベーション時間（６時間）を用いたところ、細胞は、エンドソーム仲介性形質導入を示す核周囲の点状の強い蛍光を示した。この相乗的送達機序は、ＧＡＧ結合増強形質導入（ＧＡＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）（ＧＥＴ）またはヘパラン硫酸増強形質導入ドメイン（ＨＥＴＤ）仲介性送達と呼ばれる。
【０１１５】
ＧＥＴはトリプシン感受性および界面活性剤可溶性の細胞膜分子の存在を必要とする
ＧＥＴ相互作用および細胞による取込みの機序を評価するため、既にＰＴＤの評価に用いた一連の実験を実施した。最初の細胞結合およびＨＥＴＤによる形質導入の両方にどの細胞膜成分が必要であるかを評価するため、形質導入前に細胞膜を酵素的に枯渇させることによって同様の形質導入が得られるかどうかを明らかにした。細胞をタンパク質分解酵素であるトリプシンで前処理し、１時間−５時間レジメンプロトコルを用いて被検細胞の形質導入を試験した。細胞表面タンパク質の酵素的な除去は、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入を強力に阻害した（約８．４倍；ｐ＜０．０５）（図２ｅ）。これに対し、イオン性細胞解離溶液（ＣＤＳ）を用いる培養プラスチックからの細胞の非酵素的な放出は、ＨＥＴＤ仲介性取込みを変化させなかった。
【０１１６】
次に、界面活性剤可溶性の細胞膜分子の枯渇もまた形質導入に同様の効果を及ぼすかどうかを試験した。細胞を０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で前処理し、１時間−５時間プロトコルを用いると、生存率は低下せずにＧＥＴの低下（約２．２倍；ｐ＜０．０５）が観察された（図２ｆ）。したがって、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ−形質導入において、細胞膜上のタンパク質部分および界面活性剤可溶性部分の両方が、Ｐ２１とＰＴＤの相乗作用を介するタンパク質形質導入の効果に影響を及ぼすことが示された。
【０１１７】
ＧＥＴは細胞膜ＨＳ−ＧＡＧの存在を必要とする
Ｐ２１はＨＢＤであり、ＰＴＤはそのカチオン性の性質により負に帯電したＨＳ−ＧＡＧに結合する。ＨＳ−ＧＡＧの酵素的枯渇または遊離ＧＡＧとの競合のいずれかによってＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入の機序を確認することをさらなる目的とした（図３）。ヘパリンはＨＥＴＤタンパク質の細胞表面結合を妨害し、形質導入を強力に阻害した（９９．８±２．１％；ｐ＜０．００１）（図３ａ、３ｂ）。コンドロイチン硫酸（ＣＳ）Ａ、ＢまたはＣのいずれも、両活性にほとんど効果を示さなかった（図３ｂ）。ＣＳ−ＢおよびＣＳ−Ｃは、ＰＴＤ−タンパク質結合に影響を及ぼすことが既に示されている｛Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝。ヘパリン、ＣＳ−ＢおよびＣＳ−Ｃは、ＰＴＤ単独のタンパク質の形質導入の阻害に有意な活性を示す（それぞれ８．１倍、２．４倍および４．１倍；ｐ＜０．０５）が、ヘパリンのみがＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介による形質導入に影響を及ぼすことが確認された（図３ｂおよび図１２）。Ｐ２１タグ化タンパク質は、ＮＩＨ３ｔ３細胞およびＣＧＲ−８細胞において、ヘパリン濃度の増大に伴って用量依存性の形質導入の阻害を示す（それぞれ図３ｃおよび３ｄ）。８Ｒ単独のタンパク質は最高用量の競合ヘパリンでのみ阻害される。したがって、ＨＥＴＤタンパク質（Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒ）との関連において、細胞膜ＨＳ−ＧＡＧに対するＰ２１の結合力が、ＰＴＤ結合に対するＣＳ−ＧＡＧの結合力をはるかに上回っている可能性が考えられる。したがって、ヘパリンおよびＨＳ−ＧＡＧがＰＴＤ活性を増強するためのＰ２１の主要な標的であると結論付けることができる。
【０１１８】
Ｐ２１活性に細胞膜ＨＳ−ＧＡＧが必要であることをさらに理解するため、細胞をＨＳ−リアーゼ酵素であるヘパリナーゼＩＩＩで処理し、６時間プロトコルを用いて細胞の形質導入を試験した（図１３）。細胞表面ＨＳ−ＧＡＧの酵素的な除去は、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入を強力に阻害した（１Ｕ／ｍｌで９７．２±３．４％；ｐ＜０．００１）。これに対し、シアル酸ＧＡＧ（ＳＡ−ＧＡＧ）を枯渇させるノイラミニダーゼ処理はＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性取込みを変化させなかった。分析の範囲をさらに広げて、血清が形質導入に及ぼす効果を明らかにした（図１３ｂ）。血清はＰＴＤ仲介性送達に負の効果を及ぼすことが明らかにされている｛Ｋａｐｌａｎ，２００５，＃４３｝。血清をアフィニティー精製Ｐ２１ペプチドとセファロース上でインキュベートすることにより、ＨＥＴＤ仲介性組換えに対するその阻害効果を除去することが可能であった（１０％ｖ／ｖ、枯渇により約７．３の増加倍数；ｐ＜０．０１）（図１３ｃ）。このことは、血清がＰ２１−膜結合の競合分子として働くＧＡＧを含んでいる可能性があることを示している。これらは、Ｐ２１結合セファロースを用いる前枯渇により除去できる。この阻害活性は、枯渇させた血清に可溶性ヘパリンを加えることにより再構成可能であったことから、この仮説がさらに強化された（図１３ｄ）。酵素的枯渇に加えて、ＨＳ合成の強力な阻害剤である塩素酸ナトリウムで細胞を処理することによりＨＳ−ＧＡＧの必要性が確認され、塩素酸ナトリウムはまたＨＥＴＤ仲介性タンパク質送達を強力に妨害した（約７．６倍；ｐ＜０．０５）（図１４）。したがって、ＨＳ−ＧＡＧ枯渇はタンパク質形質導入の効果に特異的に影響を及ぼし、したがって内在性ＨＳ−ＧＡＧはＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性タンパク質送達に重要な分子であることが示された。外来性ＨＳ−ＧＡＧがこの過程に対し非常に阻害的であることも示された。
【０１１９】
ＨＳ−ＧＡＧは複雑な糖構造を有し、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の繰り返し二糖の骨格からなり、ヘテロマー複合体のＥＸＴ１／ＥＸＴ２酵素によって重合化される｛Ｌａｗｒｅｎｃｅ，２００８，＃５１｝。ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入でのＨＳ−ＧＡＧの役割をさらに検討するため、内因性に合成される細胞膜ＨＳ−ＧＡＧを欠くＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣを用いた｛Ｌｉｎ，２０００，＃７８｝。従来のｍＥＳＣ培地（２０％ｗ／ｖのＦＣＳを含有する）で培養したところ、野生型ＣＧＲ−８  ｍＥＳＣに比してＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣで有意に低い形質導入が観察された（約６．８分の１；ｐ＜０．０１）（図３ｅ、３ｆ）。このことは、細胞を無血清条件で培養した場合にも明らかであり（約５．６分の１；ｐ＜０．０１）、ＦＣＳ中の遊離ＧＡＧの干渉によると思われる。ＥＸＴ１−／−細胞では形質導入／ＧＥＴが消失しておらず（ｍＲ対照レベルの約９．７倍）、Ｐ２１含有タンパク質の最初の結合もみられた。これは、外来性の可溶性血清ＧＡＧが欠損ＥＸＴ１−／−細胞膜内に取り込まれたことに起因し得ると仮定された。これは、続いてののヘパリナーゼＩＩＩ処理がこれらの細胞での結合および形質導入をさらに阻害するためであると思われる。
【０１２０】
ＧＥＴはレンチウイルスによる遺伝子導入よりも高い細胞内タンパク質レベルを生じる
いくつかの研究は、ＰＴＤ仲介性形質導入が臨床試験で生物学的に活性なカーゴの輸送を可能にするのに十分洗練されていると結論づけている。現在、これらには、癌治療｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝、ｓｉＲＮＡ｛Ｍｅａｄｅ，２００７，＃３７｝およびｉｎ  ｖｉｖｏ撮像技術｛Ｂｕｌｌｏｋ，２００６，＃７９｝の試験が含まれている。ゲノム改変を回避する有益性のみならず、ＰＴＤ仲介性形質導入が遺伝子治療法より優先的であるならば、それは高レベルの分子の送達を達成し、短い時間枠にわたってタンパク質レベルの制御が可能であり、さらには細胞型特異的送達を可能にしなければならない。ＰＴＤ送達またはＧＥＴ／ＨＥＴＤ送達によって細胞で達成されるレベルを、効率的なレンチウイルスによる形質導入｛Ｄｉｃｋ，２０１１，＃１０｝およびｍＲＦＰ１の外来発現（安定なＥＦ１α−プロモーターによって促進される）によって達成されるレベルと比較した（図１５）。これを実施するため、形質導入細胞から可溶性タンパク質を抽出し、蛍光定量法により測定するか（図１５ａ）、フローサイトメトリーを用いた（図１５ｂ）。６時間のインキュベーションを用いたところ、ｍＲ−８Ｒレベルは、最高被検用量（２００μｇ／ｍｌ）ででも、ウイルスによる遺伝子導入によって達成されるレベルよりも数倍低かった（約３分の１；ｐ＜０．０５）。しかし、同じ条件下でのＰ２１−ｍＲ−８Ｒレベルは、トランスジェニック細胞の約１６倍（ｐ＜０．００１）であった。重要なのは、インキュベートしたＰ２１−ｍＲ−８Ｒタンパク質の量のうち、相当な割合が可溶性細胞内タンパク質として回収されたことである（約４６±３．５μｇ／２００μｇ使用；約２３±１．７％回収）。これらの条件下では形質導入細胞は通常光下で赤色／紫色に見え、細胞内での大量のＨＥＴＤタグ化／ＧＥＴタンパク質の効率的な濃縮を示していることに留意することが重要である。
【０１２１】
インキュベーション期間にわたって培地中での蛍光の枯渇を測定することにより、これらのタンパク質が細胞内で濃縮される速度を検討した（図１６）。タンパク質を希釈し（２０μｇ／ｍｌ）、無血清条件で細胞と１２時間インキュベートした。８Ｒタグ化タンパク質は、ＮＩＨ３ｔ３−インキュベーションでは約１２％、ＨＵＥＳ７−インキュベーションでは約３．５％枯渇した。これは、８Ｒ−タンパク質がＨＵＥＳ７細胞内にはうまく形質導入されないが、ＮＩＨ３ｔ３細胞内には中程度のレベルで形質導入されるというフローサイトメトリーのデータを正確に反映している（図２）。Ｐ２１タグ化タンパク質は両細胞型中で有意に枯渇し（ＮＩＨ３ｔ３細胞およびＨＵＥＳ７細胞で、それぞれ約３７％および約２５％；ｐ＜０．０５）、ＨＥＴＤ−タンパク質が最高レベルまで培地から枯渇し、大部分のタンパク質が除去された（ＮＩＨ３ｔ３細胞およびＨＵＥＳ７細胞でそれぞれ約７２％および約６６％；ｐ＜０．０１）。
【０１２２】
蛍光を半分枯渇させるのに必要な時間（Ｔ１／２）を求めたところ、約６２時間を要したｍＲ−８Ｒおよび７日後でも半分の枯渇に至らなかった未タグ化タンパク質に対して、Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは９．４時間程度のみを要した（図１６）。これらのデータは、外来性ＧＥＴ−タンパク質／ＨＥＴＤ−タンパク質が迅速かつ効率的に細胞内に濃縮されたことを示すサイトメトリーのデータを裏付けるものである。したがって、比較的短いインキュベーション時間（６時間）内で相当なタンパク質濃縮が細胞内で達成され得ることが示された。ＧＥＴ送達を用いると、１日未満で大部分の細胞外タンパク質が効率的に内部移行した。このシステムは、タンパク質の化学量論組成を正確に調節できると同時に、確率論的な導入遺伝子発現の変動および遺伝子治法で用いる組み込みベクターのサイレンシングを回避するであろう。
【０１２３】
ＧＥＴはＣｒｅ仲介性ゲノム改変を増強する
ＨＥＴＤはＨＳ−ＧＡＧを介して細胞膜に迅速に結合し、細胞内へと効率的に形質導入することが明らかにされたが、取込みの様式がＰＴＤのようにマクロピノサイトーシスを介するかどうかは未だ確認されていなかった。エンドソームを脱出し送達が成功したと見なされ得るこのタンパク質の割合も評価されていなかった。以前の研究では、Ｃｒｅリコンビナーゼの核内活性の成否をアッセイすることにより、蛍光タグ化タンパク質の直接測定に関する問題（膜、小胞または機能的な細胞質内／核内タンパク質を区別できないなど）は回避されてきた｛Ｇｕｍｐ，２０１０，＃２｝。このシステムを用いて、細胞内取込みの指標として、生きたＮＩＨ３ｔ３マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞）中のｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ（ＬＳＬ）高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子のＣｒｅ仲介性組込みを測定した（図４ａ）。このシステムは、緑色蛍光を活性化させるのに外来性Ｃｒｅタンパク質が細胞内に侵入し、核内に移行し、導入遺伝子のＬＳＬフラグメントを切断する必要であるため、厳格なものである。これは生細胞中で起こり、続くｅＧＦＰの発現に関して無毒性でなければならない。しかし、この過程は、ｅＧＦＰを活性化するために送達するべき機能的Ｃｒｅリコンビナーゼ分子を１分子のみ必要とするため、送達されるカーゴの正確な量を決定できない。この問題を克服するため、Ｃｒｅタンパク質を限界希釈にて短い曝露時間（１時間）で送達し、４８時間後に緑色蛍光を活性化するのに必要な最小用量（図４ｃ）を求めた。
【０１２４】
Ｃｒｅを遺伝子導入的に過剰発現させるためのＳＩＮ  ＣｒｅレンチウイルスでのＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞の形質導入により、全ての細胞でｅＧＦＰ発現のほぼ完全な（９２±６％；ｐ＜０．００１）活性化がみられ、このシステムの有用性が確認された（図４ｂ）。蛍光システムおよび送達される蛍光型のＣｒｅ−リコンビナーゼタンパク質の有益性は、Ｃｒｅ  ｃＤＮＡのＮ末端にクローニングしたｍＲＦＰ１でタンパク質を精製することにより保持された。ＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞のｍＲ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅに融合したｍＲＦＰ）での処理により、最高用量（５００μｇ／ｍｌ）で組換えおよびｅＧＦＰ活性化（２２．１±６．７％；ｐ＜０．０５）が起こったた（図４ｄ）。ｅＧＦＰ活性化は４℃で阻害され、血清により濃度依存的に負の影響を受けた。ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒは、８Ｒ  ＰＴＤがＣｒｅの機能的送達を増強する（約２２倍；ｐ＜０．０１）ことを示した。
【０１２５】
ＧＥＴ−タンパク質／ＨＥＴＤ−タンパク質であるＰ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒは、低用量（１μｇ／ｍｌ）で細胞とわずか１分間インキュベートするだけで組換えを誘発し（４．３±２．５％；ｐ＜０．０５）、結合および内部移行が効率的で迅速な過程であることが確認された。中程度の用量（１０μｇ／ｍｌ）では、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ−形質導入は、ＰＴＤ単独のレベルの約１５倍（ｐ＜０．０１）の機能的送達を達成し、全てのＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞を完全に組換えた（図４ｄ、４ｅ）。重要なことに、この活性はｍＲ−Ｃｒｅよりも約３４０倍（ｐ＜０．００１）優れていた。Ｃｒｅ組換え系を用いて、ヘパリナーゼＩＩＩ、遊離ヘパリンおよび無血清の実験を再び実施した。ヘパリナーゼＩＩＩ前処理が組換えを基底レベルまで低下させ、かつ培地中の血清がヘパリナーゼにより枯渇した細胞膜ＧＡＧの補充に何らかの役割を果たしていることが確認された。以上の結果は、蛍光送達の結論と十分に相関し、Ｐ２１部分とＰＴＤ部分との間の相乗作用がタンパク質カーゴの機能的形質導入を有意に増大させることを示している。
【０１２６】
ＧＥＴタンパク質は脂質ラフトマクロピノサイトーシスによって細胞内に侵入する
ＰＴＤ仲介性内部移行は他のエンドサイトーシス経路ではなくマクロピノサイトーシスを介することが既に示されている｛Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝。次に、Ｃｒｅアッセイシステムを用いて、ＧＥＴ−タンパク質／ＨＥＴＤ−タンパク質の細胞内取込みが特異的エンドサイトーシス経路を介して生じるのかどうかを明らかにした。細胞膜からコレステロールを除去すると、カベオラおよびマクロピノサイトーシスを含むいくつかの脂質ラフト仲介性エンドサイトーシス経路が破壊される｛Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９８，＃２９；Ｎｉｃｈｏｌｓ，２００１，＃３０；Ｌｉｕ，２００２，＃２８｝。メチル−β−シクロデキストリンおよびナイスタチンで処理したＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞を用いて、それぞれコレステロールを枯渇または分離させた後、ＨＥＴＤタグ化タンパク質を形質導入した。脂質ラフトをメチル−β−シクロデキストリンで破壊した場合（図１７ａ）、ナイスタチンで破壊した場合（図１７ｂ）ともに、機能的送達が用量依存的に阻害された。これらのデータは、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入が脂質ラフト仲介性エンドサイトーシスを特異的に必要とすることを示している。
【０１２７】
マクロピノサイトーシスは、マクロピノソームと呼ばれる小胞内に封入されるアクチン膜の隆起を必要とする、迅速な脂質ラフト依存型および受容体依存型のエンドサイトーシスである｛Ｎｉｃｈｏｌｓ，２００１，＃３０；Ｌｉｕ，２００２，＃２８；Ｃｏｎｎｅｒ，２００３，＃２２｝。マクロピノサイトーシスが実際にＨＥＴＤ仲介性形質導入のエンドサイトーシス機序であることを確認するため、細胞をマクロピノサイトーシス阻害化合物で前処理した（図１１ａ、１１ｂ）。アミロリドは、マクロピノサイトーシスに必要とされるＮａ＋／Ｈ＋交換の特異的な阻害剤である｛Ｗｅｓｔ，１９８９，＃３１｝。サイトカラシンＤは、マクロピノソーム結合膜の隆起に必要とされるＦ−アクチン伸長の阻害剤である｛Ｓａｍｐａｔｈ，１９９１，＃３２｝。アミロリドおよびサイトカラシンＤはＨＥＴＤ−タンパク質の細胞結合を妨害しなかったが、細胞内への機能的形質導入を用量依存的に低下させた（それぞれ図１７ｃおよび１７ｄ）。これらのデータから、Ｐ２１は、ＰＴＤがカーゴ分子を内部移行させるのに用いるマクロピノサイトーシス経路を増強することが裏付けられる。
【０１２８】
ＧＥＴ送達はマクロピノサイトーシス全般を促進する
ＧＥＴ結合／ＨＥＴＤ結合がマクロピノサイトーシスの誘導に及ぼす効果を検討した。ＰＴＤ仲介性形質導入は、マクロピノサイトーシスの全体的レベルの増大により他のタンパク質の取り込みを促進することが既に明らかにされている｛Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝。細胞を、蛍光液相マクロピノサイトーシスのメーカーであるＦＩＴＣ標識７０ｋＤａ中性デキストランと、ＧＥＴ／ＨＥＴＤタンパク質であるＰ２１−ｍＲ−８Ｒと組み合わせてインキュベートした（図１８）。他の研究｛Ｏｌｉｖｅｒ，１９８４，＃２４；Ａｒａｋｉ，１９９６，＃２３；Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝では、中性デキストランがアミロリド感受性マクロピノサイトーシスによって取り込まれることが示されている。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、定常状態の対照レベルに比して液相デキストラン取込みの有意な用量依存性の増大を引き起こした。このマクロピノサイトーシスを刺激するＰＴＤタグ化活性とＧＥＴ／ＨＥＴＤタグ化活性とを比較した。Ｐ２１−ｍＲ−８Ｒは、ＦＩＴＣ−デキストラン取込みを同じ濃度のｍＲ−８Ｒによって得られる刺激の約２．５倍（ｐ＜０．０５）に増強し、Ｐ２１を介したＨＳ−ＧＡＧとの関与およびＰＴＤ仲介性形質導入に及ぼすその続いての効果がマクロピノサイトーシスによる取込みを刺激することが示された。
【０１２９】
ＧＥＴにより送達されたタンパク質の相当量がエンドソーム内に捕捉され、これはクロロキンにより効率的に放出され得る
ＰＴＤにより送達された分子の大部分は、さらにインキュベートした後でもマクロピノソーム内に捕捉されたままであり、これらの小胞からの放出が不十分であることを示している。微調整された段階的な量の送達が制御されるならば、それは内部移行したタンパク質の大部分が機能的であると見なし得る場合に有益であると思われる。クロロキンはエンドソームの酸性化を阻害することによってこれを破壊するイオン輸送性ＡＴＰアーゼ阻害剤であり｛Ｓｅｇｌｅｎ，１９７９，＃３３｝、このクロロキンで細胞を処理した（図１７ｅ）。同様の用量がＰＴＤにより送達されるタンパク質の機能的送達を有意に改善すると示されている｛Ｗａｄｉａ，２００４，＃２５｝。細胞毒性量未満のクロロキン（１００μＭ）により、閾値下量（０．１μｇ／ｍｌ）で機能的ＨＥＴＤタグ化／ＧＥＴタンパク質送達の著明な増大（９５．３±４．８倍；ｐ＜０．００１）がみられ、これが経路のポイントであり、依然としてＧＥＴ／ＨＥＴＤを医療に応用するうえで解決するべき主要な問題であることが示された。それでも、ＧＥＴ送達／ＨＥＴＤ送達システムは非常に効率的であるため、クロロキン処理を用いて、１０ｐｇ／ｍｌ超の短時間（１時間）インキュベーションにより有意で測定可能なレベルの組換え（４．８±２．９％；ｐ＜０．０５）が達成された（図１７ｆ）。したがって、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ送達効率とエンドソーム脱出技術とを組み合わせることにより、細胞内のカーゴ機能の量を正確かつ時間的に制御することが可能になると思われる。
【０１３０】
ＧＥＴ仲介性内部移行は細胞膜結合後に効率的である
少量のＧＥＴ−タンパク質を用いたインキュベーションでも、細胞内に機能的量のタンパク質活性が観察された。しかし、ほとんどのＧＥＴタンパク質が実際に効率的に内部移行することを断定的かつ厳密に証明するため、その細胞内または細胞外局在に応答するレポーターを用いて一連の分析を実施した。ＤｈａＡに由来する自己標識タンパク質であるＨＡＬＯ（ＨａｌｏＴａｇ）を用いた２９。ＨＡＬＯは、細胞透過性および細胞不透過性リガンドが利用可能な合成クロロアルカン系リガンドに共有結合を迅速に形成する。未タグ化ＨＡＬＯ（細胞内用）および外部細胞膜上に存在するＬＡＭＰ２ｂ−ＨＡＬＯ（細胞外用）の遺伝子導入過剰発現を用い、細胞透過性リガンド（ＨＡＬＯＴＡＧＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）または不透過性リガンド（ＨＡＬＯＴＡＧＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８）で標識して、ＨＡＬＯの細胞内標識対細胞外標識を確認した（図２０）。ＧＥＴ−ＨＡＬＯタンパク質を構築して組換えにより発現させ（図２１ａ）、それらを細胞に送達し、細胞不透過性リガンドによる標識に対する感受性によって内部移行を試験した。１時間のインキュベートで、ＧＥＴ−タンパク質が主として細胞外に局在し細胞膜に付着したままであることが示された（図２１ｂ）。しかし、さらなるインキュベートで（１時間の曝露とさらに５時間のインキュベーション；１時間−５時間）、ＧＥＴ−タンパク質（Ｐ２１−ＨＡＬＯ−８Ｒ）は効率的に内部移行する（細胞透過性リガンドには感受性、細胞不透過性リガンドには非感受性のままである）（図２１ｃ）。ｐＨ感受性でありｐＨ６未満の環境で蛍光がほぼすべて消失するＲＦＰのｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ（ｍＮｅｃｔ）変異体３０を用いて、上記の実験を再び実施した（図２２）。ＨＡＬＯ形質導入の場合と同じく、ｍＮｅｃｔは１時間後にほとんどが膜に局在したままであり、酸性ｐＨ培地インキュベーション（ｐＨ５．５）に対するその蛍光感受性も維持されていた（図２２ｄ）。送達後さらにインキュベートしたところ（１時間−５時間）、ＧＥＴ−ｍＮｅｃｔの蛍光はもはや細胞外ｐＨに対し感受性ではなかった（図２２ｅ）；しかし興味深いことに、ＧＥＴ−ｍＲと比較して絶対蛍光レベルが有意に低下しており、これは、エンドソーム酸性化の過程でタンパク質が内部ｐＨの変化に曝されたことに起因すると推測される１。これらのデータは、ＧＥＴタンパク質の膜結合が迅速であり、細胞結合後に形質導入が効率的であることを示している。送達過程ではＧＥＴ−タンパク質の膜クリアランスが律速段階なのではないかという仮説を立て、形質導入間の時間を変化させてＧＥＴ−ｍＲの形質導入（１時間）を多数回実施することにより、これを検証した（図２３ａ）。実際、最初の形質導入の直後の再形質導入は、２回目の形質導入の効率を低下させたが、最大効率の再形質導入を得るために新たな形質導入までに必要な時間間隔はわずか１時間であった（図２３ｂ）。
【０１３１】
ＧＥＴ送達はＮＥＯに付与された抗生物質選択の耐性により生存を促進する
ＧＥＴ／ＨＥＴＤシステムは、未タグ化タンパク質よりも数桁大きい相当量の分子を送達できるように思われた。次に、このシステムが長期間にわたるタンパク質活性を送達し得るかどうかを試験するべく、抗生物質選択下で細胞に耐性を与えることを試みるためのシステムを考案した（図５）。これは、臨床応用に必要とされるであろうＧＥＴ−カーゴ／ＨＥＴＤ−カーゴの送達および機能の持続をより反映するアッセイであると考えられる。ＮＥＯベースのアッセイは、一度細胞内に送達してＧＦＰに「成功」を報告させる単一の酵素を必要とするＣｒｅベースのアッセイとは異なり、抗生物質の活性を打ち消すために数日間にわたる持続的送達および相当な量を必要とする。アミノグリコシド系抗生物質であるＧ−４１８硫酸塩（ジェネテシン）は、鎖伸長を阻害することによってポリペプチド合成を遮断する｛Ｅｕｓｔｉｃｅ，１９８４，＃６９｝。
【０１３２】
これを試験するため、細胞を播種し３日連続でＧＥＴ／ＨＥＴＤ  ＮＥＯ−カーゴであるＰ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒで形質導入し、細胞を次いで再播種し、さらに３日間、Ｇ−４１８および進行中のＧＥＴ／ＨＥＴＤ  ＮＥＯ形質導入で同時に選択する選択プロトコルに、ＭＥＦ細胞およびＮＩＨ３ｔ３細胞の両方を供した（図５ａ）。選択後、これらの培養物の残存細胞数を評価し、トリパンブルー排除法を用いて生存数を評価し、カルセインＡＭ／エチジウムホモ二量体−１を用いてそれぞれ生細胞／死細胞を染色した。これらを、Ｇ−４１８耐性を付与する従来のトランスジェニック法の代表的なものとしてＮＥＯ発現レンチウイルスのＳＩＮ  ＮＥＯで形質導入した以外は同じレジメンで処理した細胞と比較した。
【０１３３】
これらのデータから、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒを形質導入し選択された細胞の用量依存的な生存が明らかになった（図５ｂ）。この生存は、高用量のＰ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒをこれより低い用量のＧ−４１８とともに送達した場合にＳＩＮ  ＮＥＯ組込みによる遺伝子導入によって付与されるもの（生存は約３．６倍；ｐ＜０．０５）と同程度であった（生存は約３．３倍；ｐ＜０．０５）（図５ｃ〜５ｅ）。最高用量のＧ−４１８はＳＩＮ  ＮＥＯ遺伝子導入によってのみ打ち消すことができた。以上を考え合わせると、これらの実験は、ＧＥＴ送達／ＨＥＴＤ送達タンパク質により、相当量の分子の持続送達が可能になり、ストリンジェントな抗生物質選択下での哺乳動物細胞の生存を促進できるという原理を証明する。
【０１３４】
ＮＡＮＯＧのＧＥＴ送達は多能性の自己再生を促進する
この技術を臨床応用に採り入れるのであれば、細胞運命を変化させ、同時に細胞代謝を制御するのにそれが役立つことを明らかにすることが重要である。この技術の将来的に重要な応用は、幹細胞の再プログラミング、自己再生および分化の促進においてであろう。ｉＰＳＣ技術が急速に発展したことにより、ゲノムに組み込まないＤＮＡベース｛Ｙｕ，２０１１，＃９１｝、ＲＮＡベース｛Ｗａｒｒｅｎ，２０１０，＃４｝およびタンパク質ベース｛Ｋｉｍ，２００９，＃７１；Ｚｈｏｕ，２００９，＃７２｝の技術が可能になり、最初のレトロウイルスプロトコル｛Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７，＃８２｝に取って代わるようになった。ＰＴＤ送達仲介性再プログラミングについては既に明らかにされているため、本発明者らは、ＨＥＴＤ送達が多能性細胞運命の促進に応用可能であることを示すことに努めた｛Ｋｉｍ，２００９，＃７１；Ｚｈｏｕ，２００９，＃７２｝（図６）。
【０１３５】
この仮説を検証するため、ＣＧＲ−８  ｍＥＳＣを用いて、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を退薬してもＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性送達がそれらの多能性自己再生表現型を維持し得るかどうかを明らかにした。ｍＥＳＣ中の役割Ｎａｎｏｇを最初に単離するために用いられたもの｛Ｃｈａｍｂｅｒｓ，２００３，＃７０｝と類似のアッセイで、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ  ＮＡＮＯＧ−カーゴを送達した｛Ｄｉｘｏｎ，２０１０，＃１６｝。ＣＧＲ−８細胞をゼラチン化プラスチック上に播種し、３日連続でＧＥＴ／ＨＥＴＤ  ＮＡＮＯＧ−カーゴであるＰ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒで形質導入し、継代し、ＬＩＦを欠く条件下で連日形質導入を継続しながらさらに３代継代した（１継代当たり３日間）（図６ａ）。これらの培養物の細胞数を継代毎に評価し、３回目のＬＩＦ欠損継代後に、形態変化、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性ならびにＱＰＣＲによる多能性関連遺伝子および分化関連遺伝子の発現（それぞれＯｃｔ４、Ｒｅｘ１およびＦｇｆ５）を評価した。これらを、本発明者らが既に同じアッセイでＣＧＲ−８細胞の自己再生をレスキューすることを示した｛Ｄｉｘｏｎ，２０１０，＃１６｝、ＮＡＮＯＧ発現レンチウイルスであるＳＩＮ  ＮＡＮＯＧで形質導入した細胞と比較した。
【０１３６】
これらのデータから、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒが比較的低用量（５〜１０μｇ／ｍｌ）でも、相当数のＣＧＲ−８でＡＰ活性をレスキューすることが明らかになった（図６ｂ）。高用量Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒ試料でのＡＰ活性は、ＳＩＮ  ＮＡＮＯＧ遺伝子導入によって得られたものと同程度であった。遺伝子導入および高用量Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒを形質導入したＣＧＲ−８細胞は、ＬＩＦ欠損培養物におけるレベルと同レベルまで増殖し（約８７．６倍；ｐ＜０．００１）（図６ｃ）、またＯｃｔ４発現を同レベル（ただし、ＬＩＦ含有培養物よりも低い）に保持したことにより、多能性の保持が示された（ともにｐ＜０．０５）（図６ｄ）。既に観察された通り、ＤＮＡ法およびタンパク質法によってレスキューされた細胞はいずれもＦｇｆ５発現をアップレギュレートしかつＲｅｘ１発現をダウンレギュレートし、これはＩＣＭから胚盤葉上層への移行期の表現型を示す｛Ｄｉｘｏｎ，２０１０，＃１６｝。これらの実験は、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ送達タンパク質が分化を抑制し多能性表現型を保持できることを示し、このことはのちにｉＰＳＣ技術に応用され得る。
【０１３７】
ＭＹＯＤのＧＥＴ送達は筋形成を促進する
再生医療または疾患モデル作製へのｉＰＳＣ技術の可能性を実現するには、多能性細胞の多系列分化能を利用することが不可欠である｛Ｒｏｂｉｎｔｏｎ，２０１２，＃３０｝。細胞外サイトカイン環境を調節することによってこれらの細胞の分化を様々な系列に方向付けることに進歩がみられるが、このようなプロトコルは依然として比較的非効率的である。Ｐ２１増強による機能的ＰＴＤ仲介性カーゴ送達の効率が高いことを考慮すれば、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ技術を、転写因子の形質導入について既に記載されているものを超えて、多能性細胞を分化細胞運命へと再び方向付けるためにも利用し得ると考えられた｛Ｄｏ  Ｋｗｏｎ，２００５，＃７４；Ｈｉｄｅｍａ，２０１２，＃７５；Ｌｉａｎｇ，２０１３，＃７３｝。
【０１３８】
そのために、有効なＭＹＯＤ筋原性因子｛Ｂｉｃｈｓｅｌ，２０１３，＃９２｝の送達を用いて骨格筋特異化を促進した（図７）。この仮説を検証するため、ＨＵＥＳ７細胞をゼラチン上に播種し従来の培地を除去するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のプロトコルを考案した。次いで、これらの条件下で、細胞に７日連続でＧＥＴ／ＨＥＴＤ  ＭＹＯＤ−カーゴであるＰ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを形質導入した後、低濃度のウマ血清を加えた条件でさらに３日間培養した（図７ａ）。これらの培養物の形態変化を評価し、筋原性マーカーのミオゲニンを免疫染色し、ＤＡＰＩ染色により筋原性関連多核化を評価し、かつＱＰＣＲにより筋原性遺伝子発現（内在性ＭＹＯＤおよびＡＣＴＡ１）を評価した。これらを、ＭＹＯＤ発現レンチウイルスであるＳＩＮ  ＭＹＯＤで形質導入した以外は同じレジメンで処理した細胞と比較した。
【０１３９】
これらのデータから、大型の多核化ミオゲニン陽性筋管の割合が高く（６２．１±８．９％；ｐ＜０．０１）（図７ｂ〜７ｆ）、これによりＭＹＯＤおよびＡＣＴＡ１の発現が増大した（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）（図７ｃ）ことが明らかになった。これは、Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒを高用量で送達した場合にＳＩＮ  ＭＹＯＤ遺伝子導入で観察された分化と同程度であった。以上を考え合わせると、これらの実験は、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ送達タンパク質はＨＵＥＳ７細胞の運命を最終的に分化した体細胞型に方向付けできるという原理を証明する。
【０１４０】
考察
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を、ＨＳ−ＧＡＧ結合（ＨＢＤ）−ペプチドなどの細胞膜結合ペプチドと組み合わせて細胞膜標的化を改善することにより、形質導入が困難な細胞型であっても、機能的に重要なタンパク質を高効率で送達して様々な細胞挙動を方向付けできる技術が開発された。ＧＥＴ／ＨＥＴＤシステムを利用して多能性細胞の生存、自己再生を促進する、または所望の系列への分化を方向付けできることが示された。このシステムは、改変ＲＮＡシステムに関する限り、技術的に複雑ではなく｛Ｗａｒｒｅｎ，２０１０，＃４｝、遺伝子またはタンパク質の外来性機能を送達するためにすでに確立された技術よりも優れたいくつかの重要な利点を提供する。さらに、ＧＥＴ／ＨＥＴＤ促進性タンパク質形質導入技術は、ウイルス遺伝子治療法で必要とされる厳重な生物学的封じ込めを不要にすることにより、このような方法をさらに利用しやすくするはずである。
【０１４１】
さらに根本的には、この技術はタンパク質ベースであるため、あらゆるＤＮＡベースの方法論に固有のゲノム組込みおよび挿入的変異誘発のリスクを完全に解消する｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝。さらに、エンドソーム脱出を改善し得る場合、本発明者らの方法により、タンパク質の化学量論組成を培養物内で厳密に調節可能になる。これにより、組み込みベクターに典型的な発現の確率論的変動および制御不能なウイルスサイレンシングの効果が回避される。ＧＥＴ／ＨＥＴＤ技術はまた、再プログラミング技術に直接応用され得る。多能性誘導の過程｛Ｃｈａｎ，２００９，＃６３；Ｓｍｉｔｈ，２００９，＃６４｝および方向付けられた分化プロトコル｛Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，２０１１，＃８１｝で観察される表現型の変化が段階的であるという特徴を考えると、個々の転写因子が異なる、ステージ特異的な役割を果たしているように思われる。ＧＥＴ／ＨＥＴＤ技術によってもたらされる個々の因子機能に対する一時的な制御の先例のない能力は、これらの変数を試験して細胞運命制御の効率および動態を改善できるはずである。
【０１４２】
タンパク質ベースの形質導入の一過的で非変異原性である特徴は、本明細書で検討されたもの以外の重要な臨床的有用性ももたらす可能性がある。実際、タンパク質形質導入を用いて免疫療法のための癌または病原抗原を発現させること｛Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，２００９，＃６７｝により、タンパク質形質導入の非免疫原性から利益を得られる。
【０１４３】
送達されるタンパク質の大部分はエンドソームの内部に捕捉され得る。ＰＴＤの分野は、小胞からのカーゴの放出を改善することを目標に、ＴＡＴをはじめとするＰＴＤの相互作用およびマクロピノサイトームからの脱出の機構的側面に主眼を置いてきた｛Ｈｅｉｔｚ，２００９，＃４２｝。ＰＴＤおよびその細胞表面への結合力によって達成され得るものを超えてタンパク質を送達することを目標として、この問題に別の角度からアプローチした。
【０１４４】
ＴＡＴ−Ｃｒｅを送達するこれまでの研究は、機能的カーゴの効果的なＰＴＤ仲介性送達の律速段階はマクロピノソーム脱出であることを示唆したが、このデータは、この脱出過程がＰＴＤを用いた疾患治療が成功するかどうかを最終的にコントロールするが｛Ｓｕｇｉｔａ，２００７，＃８０｝、ＰＴＤ形質導入過程そのものは生理的に最も効率的ではないことを示唆している。本明細書に記載されるＧＥＴ／ＨＥＴＤ仲介性形質導入は、現時点のシステムを形質導入が困難な細胞で最大３桁改善する。小胞脱出とＧＥＴ／ＨＥＴＤシステムとを結びつけることは大きな発展であろう。概念の実証として、一般的なエンドソーム破壊物質であるクロロキンを用いることによって、このことが示された。ＧＥＴ／ＨＥＴＤ形質導入時にマクロピノサイトームの完全性を低下させることにより、ｐｇ／ｍｌ濃度を用いるタンパク質の機能的な送達が示された（図１７ｆ）。
【０１４５】
ＰＴＤ仲介性送達に関する現在の理解は、密に林立するＧＡＧによって細胞膜に負の電荷が遍在し、これにＰＴＤが結合するという仮説からなる｛Ｇｕｍｐ，２００７，＃３９｝。電荷の変化がこの結合をもたらすが、これはＰＴＤが細胞に形質導入する、またはマクロピノサイトーシスによる取込みを誘導する能力とは無関係である。ＧＥＴ／ＨＥＴＤにより、タグ化タンパク質がさらに盛んに細胞膜と結合し、かつＰＴＤによって仲介される形質導入の成功を促進するという、さらに強調された形でこの現象が効率的にもたらされた。代替的なＨＢＤはＰ２１と同じように機能し、その単離源によって異なる効果および細胞型活性を示す。８Ｒの置換は、他のＰＴＤ（ＴＡＴ、８Ｋ、８ＲＱ）を用いてもＧＥＴ／ＨＥＴＤを成功させ得ること示した（図１１）。
【０１４６】
ＨＳ−ＧＡＧなどのＧＡＧには多様な生物学的機能があり、増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含む様々なタンパク質との相互作用を介して｛Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，２００６，＃５５；Ｇａｎｄｈｉ，２００８，＃５４｝、血液凝固および炎症性応答などの多数の生理学的および病理学的過程に広く関与する｛Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ，２００２，＃５３；Ｖａｒｋｉ，２００８，＃５２｝ことが知られている。この相互作用は、様々な生物学的過程の調節に重要な役割を果たす、ＧＡＧの二糖の組成およびパターンに依存する。ＨＳ−ＧＡＧの不均一性は、様々な病的状態下での様々な関連遺伝子および多数のＨＳ−ＧＡＧ編集酵素の発現パターンによって決まる｛Ｌｉｎｄａｈｌ，１９９８，＃５６；Ｎａｋａｔｏ，２００２，＃５７；Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，２００２，＃６０；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，２００３，＃５９；Ｇｅｓｓｌｂａｕｅｒ，２００７，＃５８｝。炎症過程ならびにムコ多糖症、変形性関節症および骨髄腫などの疾患は、ＧＡＧの様々な二糖構造と関係があることが報告されている。したがって、ＧＡＧの変化物（すなわち、存在および量）の評価には、疾患を診断および予後予測するうえで大きな可能性が秘められている。
【０１４７】
ＧＡＧ相互作用を促進することにより、ＰＴＤでタグ付けした生物学的に活性な高分子カーゴの効率が大幅に改善されるという発見は、疾患の治療および実験的研究に新たな道を開くものである。
【０１４８】
実験方法
組換えタンパク質の発現および精製
ｍＲＦＰ１（ｍＲ）のｃＤＮＡをＲ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ教授（カリフォルニア大学、米国）の厚意により入手した｛Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２００２，＃１２｝。８Ｒ、ＴＡＴ、８Ｋ、８ＲＱ、Ｐ２１、Ｃｒｅ、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＯＤおよびＮＥＯのｃＤＮＡをｄｅ  ｎｏｖｏ合成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ社）。ｃＤＮＡをｐＧＥＸ６−Ｐ１発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中にクローニングしてインフレーム融合物を作製し、ＢＬ２１（ＤＥ２１）ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中でタンパク質を発現させた。３７℃、２２０ｒｐｍで振盪させた対数増殖期のＬＢ培養物（ＯＤ６００＝０．４）を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを２５℃で２４時間用いて誘導した。細菌ペレットを溶解させ、１×ＳＴＥ抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび１×プロテアーゼインヒビターカクテル）中で超音波処理した（振幅数７、１分、５回）。Ｒａｐｉｄ  ＧＳＴ封入体可溶化／再生キット（ＡＫＲ−１１０；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて不溶性タンパク質を回収した。グルタチオン−セファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより組換えタンパク質を精製した。１×切断緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ切断（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によりＧＳＴタグを除去し、樹脂から溶離させた。ＢＣＡベースのタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ社）を用い、組換えｍＲタンパク質を標準品として５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質濃度を求めた。完全性および完全長タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。試料間の強度差が１０％未満の全調製物について組換えタンパク質の蛍光（励起：５８４ｎｍ；発光：６０７ｎｍ）を測定した（蛍光／μｇ）。ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００ＰＲＯマルチモードリーダーを用いて標準品および試料を分析した。一部を−８０℃で保管した。
【０１４９】
細胞培養
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ社）培地を含むＤＭＥＭ中で、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児腎細胞、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、ｉＨＭＳＣ不死化ヒト間葉系幹細胞（記載されている通りに作製｛Ｏｋａｍｏｔｏ，２００２，＃８｝）およびＭＥＦマウス胚線維芽細胞（記載されている通りに採取｛Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００７，＃９｝）を維持した。ＣＧＲ−８マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）およびＥＸＴ１−／−ｍＥＳＣ（米国ヒューストン大学のＤ．Ｅ．Ｗｅｌｌｓ博士の厚意による；｛Ｌｉｎ，２０００，＃７８｝）を、ＤＭＥＭ（２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１０００単位／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）、非必須アミノ酸、１００μＭ  β−メカプトエタノール（ｍｅｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中で維持した。ＨＬ１マウス心筋細胞を、記載されている通りに維持した｛Ｃｌａｙｃｏｍｂ，１９９８，＃７｝。ＨＵＥＳ７ヒト胚幹細胞およびＩＰＳ２誘導人工多能性幹細胞を、既に記載されている通りに培養した｛Ｄｉｃｋ，２０１１，＃１０｝。ＨＵＥＳ７細胞に由来するＨＵＥＳ７ｆｉｂヒト線維芽細胞を作製し、既に記載されている通りに培養した｛Ｄｉｃｋ，２０１１，＃１０｝。いずれの細胞も５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。
【０１５０】
フローサイトメトリーおよび顕微鏡観察
フローサイトメトリーでは、細胞をトリプシン処理し（特に明記されない限り）、４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、ＭｏＦｌｏ（商標）ＤＰ（ＤＡＫＯ社）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで４８８ｎｍの緑色レーザーを用いて解析した（５０，０００細胞；前方／側方散乱により生細胞にゲートをかけた）。統計解析には蛍光中央値を用い、非標識／形質導入細胞からのバックグラウンドを減じ、値を実験対照に対する比とした。示されるデータは三つ組み試料の３つの実験である。顕微鏡観察では、培養物をＰＢＳで２回洗浄し、倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００）で撮像した。
【０１５１】
蛍光送達アッセイ
多数の細胞系を試験するため、被験細胞系に関連する表面に２×１０５細胞／ウェル（１２ウェルプレート中）で播種し、細胞を２時間付着させ、細胞型特異的増殖培地中にて組換えタンパク質で形質導入した。形質導入後、フローサイトメトリー用に細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し４％ＰＦＡで固定した。膜局在、細胞内局在またはその両方に関しては、細胞を上記の通りに播種したが、形質導入前に培養物を無血清培地中で１時間プレインキュベートした。膜局在化による細胞相互作用の評価には、無血清培地中で短時間の形質導入を１時間実施した。細胞内局在化による形質導入効率の評価には、短時間の形質導入を１時間実施した後、無血清培地のみで５時間インキュベートした。細胞を無血清培地中で６時間形質導入することにより、細胞結合（膜および細胞内レベル）を評価した。フローサイトメトリーのために細胞をトリプシン処理し、洗浄し４％ＰＦＡで固定し、顕微鏡観察のために細胞をＰＢＳで洗浄した後、生きた状態で撮像した。トリプシンによる細胞表面タンパク質の枯渇のために、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＥＤＴＡベースの細胞解離溶液（ＣＤＳ）（Ｓｉｇｍａ社）で１５分間、３７℃で処理した後、ＰＢＳおよび１×ダイズトリプシンインヒビター（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）で洗浄した。次いで、細胞を３７℃で無血清培地中にて、タンパク質で１時間処理した。界面活性剤による細胞膜の枯渇のために、細胞を３７℃で１０分間、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｔｘ１００）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．５）で処理した後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を３７℃で無血清培地中にて、タンパク質で１時間処理した。ＧＡＧ処理のために、細胞を形質導入前に血清を含まないＤＭＥＭ中にてＧＡＧで前処理し、形質導入培地中に含めた。この培地はヘパリンおよびコンドロイチン硫酸Ａ、ＢおよびＣ（０〜５０μｇ／ｍｌ）を含んだ。
【０１５２】
総送達タンパク質量の分析
５×１０６個のＮＩＨ３ｔ３細胞を（Ｔ２５フラスコに）播種し、無血清ＤＭＥＭ中で１時間プレインキュベートし、無血清ＤＭＥＭ中で６時間、ｍＲ−８ＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（０〜２００μｇ／ｍｌ；体積１ｍｌ）で形質導入した。遺伝子導入システム｛Ｄｉｘｏｎ，２０１１，＃１５；Ｄｉｃｋ，２０１１，＃１０｝によって達成されるレベルの対照として、ＳＩＮ−ｍＲレンチウイルスで形質導入したＮＩＨ３ｔ３細胞を用いた。トリプシン処理により細胞を回収し、フローサイトメトリー用に４％ＰＦＡで固定するか、蛍光定量｛Ｍｅｄｉｎａ，２０００，＃１４｝用に冷ＰＢＳで数回洗浄し、冷ＨＫＭ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５ｍＭ  ＤＴＴに１×完全無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルを加えたもの）中に可溶性タンパク質を抽出した。抽出物を超音波処理し、遠心分離し、ＮａＣｌを加えて最終濃度を１００ｍＭとした後、分析に供した。蛍光定量法を用いて、可溶性抽出物と、標準品である１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＨＫＭ緩衝液で希釈した精製ｍＲＦＰタンパク質とを比較した。フローサイトメトリーを用いて、無傷細胞中の総送達タンパク質量を評価した。
【０１５３】
培地枯渇評価
２×１０６個のＮＩＨ３ｔ３細胞またはＨＵＥＳ７  ＨＥＳＣを播種し（６ウェルプレート中）、無血清ＤＭＥＭ中で１時間プレインキュベートし、無血清ＤＭＥＭ中で１２時間、組換えタンパク質（２０μｇ／ｍｌ；体積１ｍｌ）で形質導入した。培地を回収し、蛍光定量法を用いて、培地中の残存蛍光と細胞インキュベーション前の蛍光とを比較した。プレインキュベーション培地の蛍光を１００％蛍光単位とし、無血清培地のバックグラウンドを減じた。
【０１５４】
ヘパリン結合アッセイ、ヘパリナーゼ処理および血清からのＰ２１結合分子の枯渇
ヘパリン結合活性のために、ＤＭＥＭ中に溶かした組換えタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを、ＰＢＳで洗浄したヘパリン−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社）５０μｌと３７℃で１時間、１００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。インキュベート前の培地とインキュベート後の培地を蛍光定量法により比較した。ヘパリナーゼ処理のために、ＮＩＨ３ｔ３細胞を２×１０５個／ウェルで播種し（１２ウェルプレート中）、無血清培地中で１時間、ヘパリナーゼＩＩＩ（０〜１Ｕ／ｍｌ）またはヘパリン（０〜５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ｍＲまたはＰ２１−ｍＲ−８Ｒ（ヘパリナーゼＩＩＩまたはヘパリンを含有する無血清培地またはＦＣＳ濃度の異なる培地中２０μｇ／ｍｌ）で１２時間形質導入した。アフィニティークロマトグラフィーによりＦＣＳからＰ２１結合物質を枯渇させた。これは、ＦＣＳ  ５０ｍｌを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で発現させたＧＳＴ−Ｐ２１タンパク質を予め吸着させたグルタチオン−セファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）２ｍｌとインキュベートすることにより実施した。
【０１５５】
マクロピノサイトーシス評価
タンパク質形質導入がマクロピノサイトーシス全般に及ぼす効果を測定するため、細胞を１００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−７０ｋＤａ中性デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）および様々な組換えタンパク質（０〜１０μｇ／ｍｌ）と４℃または３７℃で１時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した後、フローサイトメトリーにより解析した。
【０１５６】
Ｃｒｅ組換えアッセイ
Ｃｒｅリコンビナーゼ活性を測定するため、ｐＺ／ＥＧプラスミドトランスフェクションおよびＧ−４１８選択｛Ｎｏｖａｋ，２０００，＃６｝を用いてＮＩＨ３ｔ３：ＬＳＬ−ｅＧＦＰ細胞系を作製した。Ｃｒｅ活性が効率的に組換えおよびｅＧＦＰ活性化を引き起こすことを確認するため、細胞をＳＩＮ−Ｃｒｅレンチウイルスで形質導入し（Ｄｉｘｏｎら，２０１１に記載されている通り）、形質導入から４８時間後、細胞の９５％超がｅＧＦＰ陽性であることを確認した。２×１０５細胞／ウェルを播種し（１２ウェルプレート中）、血清を含まないＤＭＥＭ中にて１時間プレインキュベートし、血清を含まないＤＭＥＭ中にてＣｒｅタンパク質（０〜５００μｇ／ｍｌ）で処理した。Ｃｒｅインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、完全培地中に再播種し、２日間インキュベートした。血清を含まないＤＭＥＭ中にて細胞を記載される時間の間、薬物で前処理し、Ｃｒｅ形質導入培地に含め再播種後に加えた。前処理は、ヘパリン（０〜５０μｇ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢおよびＣ（０〜５０μｇ／ｍｌ）、クロロキン（０〜１００μＭ）、サイトカラシン−Ｄ（０〜１０μＭ）、アミロリド（０〜５ｍＭ）、メチル−β−シクロデキストリン（０〜５ｍＭ）およびナイスタチン（０〜５０μｇ／ｍｌ）を含んだ。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、フローサイトメトリーにより組換え細胞の％を求めた。ｍＲ−Ｃｒｅ−８ＲとＰ２１−ｍＲ−Ｃｒｅ−８Ｒの比較のために、それぞれ１００μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度を用い、データを％組換え最大値で表した（すなわち、開始用量のＣｒｅで得られた組換え最大値に対する％）。
【０１５７】
ＮＥＯ抗生物質耐性アッセイ
ＮＥＯ活性を測定するため、Ｇ−４１８抗生物質選択の存在下でＮＩＨ３ｔ３およびＭＥＦの生存および増殖を評価した。細胞数、生存能および生細胞／死細胞比を測定した。ＮＥＯ活性がＧ−４１８選択下でＮＩＨ３ｔ３細胞およびＭＥＦ細胞の生存および増殖を効率的に引き起こすことを確認するため、細胞をＳＩＮ−ＮＥＯレンチウイルスで形質導入し（Ｄｉｘｏｎら，２００９に記載されている通り）、ＮＥＯ形質導入が厳しいＧ−４１８選択下で細胞死を防ぎ、生存能を維持することが確認された。これをＮＥＯタンパク質形質導入との比較に用いた。３×１０５個のＭＥＦ細胞／ウェルまたは１×１０５個のＮＩＨ３ｔ３細胞／ウェルを播種し（１２ウェルプレート中）、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（０〜１００μｇ／ｍｌ）を含有し１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で３日間培養した。細胞を、ＭＥＦ細胞では３×１０５細胞／ウェルで、またはＮＩＨ３ｔ３細胞では１×１０５細胞／ウェルで再播種した。細胞をさらに３日間、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＥＯ−８Ｒ（０〜１００μｇ／ｍｌ）およびＧ−４１８硫酸塩（０〜３００μｇ／ｍｌ）を含有し１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で、毎日培地を供給して非耐性細胞を殺滅しながら培養した。細胞をカウントし、トリパンブルー排除法を用いて生存能を評価するか、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を用いてアッセイした｛Ｂａｙｏｕｓｓｅｆ，２０１２，＃１３｝。
【０１５８】
ＮＡＮＯＧ自己再生アッセイ
ＮＡＮＯＧ活性を測定するため、ＣＧＲ−８  ｍＥＳＣからのＬＩＦ退薬を用い、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性、細胞数を測定し、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により遺伝子発現変化を評価した。ＬＩＦを加えなくてもＮＡＮＯＧ活性が効率的に自己再生のレスキューをもたらすことを確認するため、細胞をＳＩＮ−ＮＡＮＯＧレンチウイルスで形質導入し（Ｄｉｘｏｎら，２００９に記載されている通り）、ＣＧＲ−８自己再生が効率的にレスキューされることを確認し、これをＮＡＮＯＧタンパク質形質導入との比較に用いた。２×１０５細胞／ウェルを播種し（６ウェルプレート中）、Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ  ８Ｒ（０〜５０μｇ／ｍｌ）を含有しＬＩＦを加えた増殖培地中で、毎日新鮮な培地を供給しながら、１継代／３日でプレインキュベートした。Ｐ２１−ｍＲ−ＮＡＮＯＧ−８Ｒ（０〜５０μｇ／ｍｌ）を含有しＬＩＦを加えない増殖培地（および対照としてＬＩＦを加えた培地）に細胞を２×１０５細胞／ウェルで再播種した（６ウェルプレート中）。細胞にこの培地を毎日供給し、３日毎にカウントし、１０分の１の細胞を再播種して継代し、これを３継代まで繰り返した。ＬＩＦ退薬から３回目の継代後、細胞をＡＰ活性に対して染色する（８６Ｒ−１キット；Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩおよびファストレッドバイオレットＬＢをベースとする；Ｓｉｇｍａ社））か、ＱＰＣＲ分析用に処理した。ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび特異的ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いるＱＰＣＲにより相対発現レベル（ΔΔＣＴ）を求めた。
【０１５９】
ＭＹＯＤ筋形成アッセイ
ＭＹＯＤ活性を測定するため、ＨＵＥＳ７  ＨＥＳＣの分化を用い、細胞形態、細胞多核化、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）による遺伝子発現変化およびミオゲニンタンパク質発現を評価した。ＭＹＯＤ活性が効率的にＨＥＳＣの筋原性分化を引き起こすことを確認するため、細胞をＳＩＮ−ＭＹＯＤレンチウイルスで形質導入し（Ｄｉｘｏｎら，２００９に記載されている通り）、ＭＹＯＤが多核化筋管分化を指令することを確認し、これをＭＹＯＤタンパク質形質導入との比較に用いた。０．１％ゼラチンでコートしたプレートに１×１０６細胞／ウェルを播種し（６ウェルプレート中）、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で１週間培養し、トリプシンを用いて１代継代した。細胞を０．１％ゼラチンでコートしたプレートに１×１０６細胞／ウェルで播種し、Ｐ２１−ｍＲ−ＭＹＯＤ−８Ｒ（０−５０μｇ／ｍｌ）を含有し１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で培養した。細胞にこの培地を７日間、毎日供給した。次いで、２％ウマ血清（ＨＳ）を加えたＤＭＥＭに培地を切り替え、さらに７日間、培養物を維持した。次いで、細胞をＱＰＣＲ用に処理するか、４％ＰＦＡで固定して免疫染色した｛Ｂａｙｏｕｓｓｅｆ，２０１２，＃１３｝。既に記載されている通りにＤＡＰＩを用いて核を標識した（Ｄｉｘｏｎら，２００９）。１条件当たり最低２００個の核をカウントして、ミオゲニン陽性の核数／全核数の割合を定量化した。ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび特異的ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いるＱＰＣＲにより相対発現レベル（ΔΔＣＴ）を求めた。
【０１６０】
抗体、核酸およびナノ粒子の送達
ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体およびＦＩＴＣ−ウサギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＳＩＮ−ＧＦＰ（Ｄｉｘｏｎら，２０１４）、ＧＦＰ用の改変ヌクレオチドＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）およびＧＡＰＤＨに対するＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社）、ならびにｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（２５０ｎｍ）（ＭｉｒｃｏＭｏｄ社）をＧＥＴ−タンパク質またはＧＥＴ−ペプチドと複合体を形成させ、細胞に加えた。抗体については、増殖培地中で２０分間、複合体を形成させた後に細胞に加えた。核酸については、複合体形成に２：１のペプチド：核酸装填比を用いた。ＧＥＴトランスフェクションまたはＬＩＰＯ２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）トランスフェクションには、１２ウェルプレート中で、１００，０００個のｈＭＳＣのトランスフェクション当たり１０μｇまたは１μｇの核酸を用いた。正確な製造業者の指示に従ってＬＩＰＯ２０００をＧＥＴ−ペプチドに置き換えた。ＭＮＰについては、製造業者の指示に従って、ＭＮＰ  ２ｍｇを用いるＥＤＡＣ／ＮＨＳ反応中で最終濃度２５μＭのペプチドを用いた。２．５％ｗ／ｖＨＣｌ中のフェロシアン化カリウム（２．５％ｗ／ｖ）を用いてプルシアンブルー染色を実施した。
【０１６１】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いて統計学的比較を実施した。テューキー・クレーマー分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較を実施した。ｐ＜０．０５であれば結果を有意とみなした。
【０１６２】
配列の例
ＨＳ−ＧＡＧ結合配列の例
Ｐ２１アミノ酸配列
（配列番号１）
ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ
Ｐ２１ヌクレオチド配列（メチオン（ｍｅｔｈｉｏｎｅ）／ＡＴＧを有する）：
（配列番号２）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇ
ＰＤＧＦ（１９４〜２１１）アミノ酸配列：
（配列番号３）
ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴ
ＰＤＧＦ（１９４〜２１１）ヌクレオチド配列：
（配列番号４）
ｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇａａａｇｃｇｇｃａａａａａａｃｇｃａａａｃｇｃａａａｃｇｃｃｔｇａａａｃｃｇａｃｃ
ＦＧＦ７Ｂ  アミノ酸配列：
（配列番号５）．
ＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱ
ＦＧＦ７Ｂヌクレオチド配列：
（配列番号６）
Ａｃｃｔａｔｇｃｇａｇｃｇｃｇａａａｔｇｇａｃｃｃａｔａａｃｇｇｃｇｇｃｇａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａｃｃａｇ
ＦＧＦ２ＨＢＤＢ（２４７−２６２）アミノ酸配列：
（配列番号７）．
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲ
ＦＧＦ２  ＨＢＤ  Ｂ（２４７−２６２）ヌクレオチド配列：
（配列番号８）
ａｃｃｔａｔｃｇｃａｇｃｃｇｃａａａｔａｔａｃｃａｇｃｔｇｇｔａｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａａｃｇｃ
８Ｒタンパク質形質導入ドメイン配列をコードするヌクレオチド：
（配列番号９）
ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ
送達分子ヌクレオチド配列の例（Ｐ２１−カーゴ−８Ｒ）：
（配列番号１０）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇＮｃｇａａｇａｃｇｃａｇｇａｇａｃｇｔｃｇａａｇｇ
【０１６３】
Ｎ＝様々な長さのカーゴ核酸配列（すなわち、ヌクレオチド残基の数が異なり得る）、または別の分子的実体。
【０１６４】
ＳｃＦｖ抗体の各ナノボディ変異体について２つの型；ＳｃＦｖ  ｖＨＨドメイン（フレームドメイン１−ＣＤＲ１−フレームドメイン２−ＣＤＲ２−フレームドメイン３−ＣＤＲ３−ＩｇＡヒンジドメイン／フレームドメイン４）と同じ配列を有する型ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを一般的なｖＨＨドメイン配列内に移植した型を作製した。両型の活性に差はなく、移植型は、一般的な抗体にＣＤＲドメインを単に移植するだけでも機能することを示すために作製した。
【０１６５】
以下に記載するのは、ＨＳ４Ｃ３  ＳｃＦｖ  ｖＨＨ、ならびにＡＯ４ＢＯ８  ＳｃＦｖ  ｖＨＨおよび移植ｖＨＨの配列である：
ＨＳ４Ｃ３  ＳｃＦｖ  ｖＨＨ
（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＲＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＲＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＲＡＥＧＴＡＡＹＹＣＧＲＲＬＫＤＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１  ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２  ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３  ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３  ＳｃＦｖ  ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１２）
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａａｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃａｇｃａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｃｇｃａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃａｇｃａａａａａｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇａａｇｇｃａｃｃｇｃｇｇｃｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＨＳ４Ｃ３移植ｖＨＨ
（配列番号１３）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＧＲＲＬＫＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１  ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２  ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３  ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３移植ｖＨＨヌクレオチド
（配列番号１４）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８  ＳｃＦｖ  ｖＨＨ
（配列番号１５）
ＥＤＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＰＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＨＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＭＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＨＭＮＳＬＩＡＥＤＭＡＶＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１  ＧＦＡＦＳＳＹＡ（配列番号２２）
ＣＤＲ２  ＩＧＴＧＧＤＴ（配列番号２４）
ＣＤＲ３  ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ（配列番号２６）
ＡＯ４Ｂ０８  ＳｃＦｖ  ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１６）
ｇａａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａａａｇｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｔａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｔｔｇｃｇｇａａｇａｔａｔｇｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８移植ｖＨＨ
（配列番号１７）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１  ＧＦＡＦＳＳＹＡ（配列番号２２）
ＣＤＲ２  ＩＧＴＧＧＤＴ（配列番号２４）
ＣＤＲ３  ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ（配列番号２６）
ＡＯ４Ｂ０８移植ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１８）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
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【０１６７】
細胞透過性ペプチドを用いた酸化鉄ナノ粒子取込み効率の改善
背景
超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮＳ）は、酸化鉄コアと表面コーティングとからなる小型で強い磁気を帯びた粒子である。ＳＰＩＯＮＳはＭＲＩ造影剤中の使用が臨床的に承認されており１、現在、標的化薬物送達２、温熱療法および細胞標識３での使用が研究されている。ＳＰＩＯＮＳはＭＲＩ造影剤中の使用が承認されており、市販されている製品としては、Ｌｕｍｉｒｅｎ、ＲｅｓｉｖｉｓｔおよびＦｅｒｉｄｅｘ１が挙げられる。
【０１６８】
ＳＰＩＯＮＳの適用は細胞中に内部移行する十分な濃度を必要とし、必要とされるナノ粒子の標的化が行われないと、非効率的な結果をもたらし得る。細胞内部移行の効率は、２、３例を挙げれば、大きさ、コーティングおよび追加的なリガンドによって左右され得る４。文献では、内部移行剤を結合させずに細胞当たり１５〜３０ｐｇの範囲の鉄が達成されつつあることが明らかにされている５、６。ナノ粒子コーティング上の官能基を利用して、内部移行剤としてモノクローナル抗体、細胞透過性ペプチドおよび小分子を結合させることにより、細胞内部移行の増大を標的にできる７。
【０１６９】
現在研究されている細胞透過性ペプチドは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）である。ＲＧＤはαｖβ３インターグリン（ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ）を標的とするよう設計された８。インターグリン（ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ）は主として癌細胞上でみられ、このため、標的化ペプチドとしても使用できる。研究から、ＲＧＤペプチドがナノ粒子取込みを５０％増大させることがわかっている９。
【０１７０】
以下の研究は本明細書の本発明の細胞透過性ペプチド、特にＰ２１８Ｒに主眼を置く。このペプチドには２つのドメインがあり、Ｐ２１は細胞膜上のヘパラン硫酸（ＨＳ）に結合し、８Ｒは形質導入を促進する。本研究の目的は、Ｐ２１８Ｒの効率を明らかにし、その機序を検討することである。
【０１７１】
材料および方法
ナノ粒子標識
０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中の３１ｍＭ  ＥＤＡＣおよび０．１Ｍ  ＮＨＳを、Ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（２５０ｎｍ）粒子にそれぞれ１：５の比で加え、１時間混合した。次いで、粒子を０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄し、同緩衝液に溶かした０．２μｇ／μｌの必要な標識剤を加えて標識溶液とナノ粒子の比を１：１とし、標識溶液の一部を標識効率の試験用に取り置いた。次いで、溶液を室温で３時間継続的に混合する。粒子が標識されてから、粒子に２５ｍＭグリシン溶液を加え、次いでさらに３０分間インキュベートする。標識溶液の一部を先のアリコートとの比較用に取り置き、粒子をＢＳＡの０．１％ＰＢＳ溶液で洗浄する。最後に、粒子をＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで希釈して１ｍｇ／ｍｌ溶液とする。取り置いた標識溶液および標識ナノ粒子の一部の両方を、蛍光について評価した。
【０１７２】
細胞培養
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび（ＰＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｅｃｏ社）中にて、ＮＩＨ３ｔ３線維芽細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。次いで、細胞をコンフルエントまで培養した。
【０１７３】
細胞標識
コンフルエント細胞を１２ウェルプレートに２００，０００細胞／ウェルで分割し、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞にＮａｎｏｍａｇ−Ｄ酸化鉄ナノ粒子（２５０ｎｍ）５０μｇならびに０μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、２μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭの細胞透過性ペプチドのいずれかを１０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭ培地または無血清ＤＭＥＭ培地のいずれかとともに加え、２４時間放置して鉄ナノ粒子を内部移行させた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄して余分なナノ粒子を除去し、次いで、定性的プルシアンブルー染色、定量的比色鉄アッセイまたは蛍光活性化フローサイトメトリー用に回収した。
【０１７４】
プルシアンブルー染色
細胞を標識し、次いで４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ中で１５〜２０分間、４℃で固定した。２．５％ＨＣＬ中のフェロシアン化カリウムの２．５％溶液を細胞に加え、室温で１時間インキュベートした。ナノ粒子が存在する場合、鉄の濃度に比例して青い染色が見られた。
【０１７５】
定量的比色鉄アッセイ
細胞を標識し、トリプシン処理し、ペレット化した後、培地をすべて除去した。細胞に３７％ＨＣＬを４０μｌ加え、溶解するまで７０℃で加熱し、次いでＮａＯＨ  ５０μｌで中和した。高濃度の鉄を含有するこれらの試料を１：１０に希釈し、次いでＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ機能試薬４０μｌを加えた後、Ｑｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ鉄アッセイの指示書に従った。
【０１７６】
フローサイトメトリー
細胞を、Ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ粒子５０μｇ、１μＭのＰ２１８Ｒならびに０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌのＦｉｔＣ−ＢＳＡのいずれかで標識した。次いで、細胞を固定し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｔｒａフローサイトメータに通して緑色蛍光を評価した。次いで、観察結果をＷｅｓａｌソフトウェアにより統計学的に解析した。
【０１７７】
結果
ナノ粒子および細胞の標識
図３２に示されるように、Ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ（２５０ｎｍ）粒子はｍＲ、Ｐ２１ｍＲ、８ＲｍＲおよびＰ２１ｍＲ８Ｒで良好に標識された。グラフは、標識後の溶液中で蛍光が減少し、粒子上の蛍光が増大したことを明確に示しており、タンパク質がカルボン酸基と反応してＮａｎｏｍａｇ粒子の表面に結合したという仮説が導かれる。グラフは、タンパク質がすべて粒子表面と反応したわけではないことを示すが、タンパク質を過剰に加えたことを考慮に入れると、このことが問題であるとは思われなかった。グラフのまた別の特徴は、８Ｒと比較してＰ２１ドメインは、Ｐ２１について標識後の蛍光の際立った減少およびナノ粒子が示す強力なシグナルがみられることから、粒子への結合親和性がより高いことである。粒子の結合能を上回るタンパク質を加えたことを考慮すると、このような減少は予想外であった。Ｐ２１ドメインの役割は細胞膜上のＨＳに結合することであり、ＨＳとデキストランの構造がほぼ同じ構造であることを考慮すると、タンパク質が粒子のデキストラン表面に結合することも結論づけられた。
【０１７８】
Ｐ２１がデキストラン表面に結合するという仮説をさらに検証するため、Ｐ２１ｍＲ８Ｒで予め標識した両粒子を細胞に加え、粒子とＰ２１８Ｒを別個に細胞に加えた。プルシアンブルー染色の結果を図３２に示す。非標識粒子対照では青色の染色は見られず、したがって、限られた数の粒子が細胞と結合したはずであるという結論が導かれた。しかし、両可変物とも、タンパク質を予め結合させない場合でも染料が反応して青色を発した。粒子取込みが起こるためには、タンパク質がどこかの地点で粒子と結合したはずである。最も可能性が高い仮説は、Ｐ２１がデキストラン表面に結合するというものである。
【０１７９】
ナノ粒子取込みの定量的評価
タンパク質濃度の最適化
図３３に示されるように、プルシアンブルー染色から、Ｐ２１８ＲがＰ２１または８Ｒ単独と比較して粒子取込みに最も効果的なペプチドであることがわかる。鉄アッセイの結果から、細胞を１μＭのＰ２１８Ｒおよび５０μｇのＮａｎｏｍａｇ−Ｄ粒子と２４時間インキュベートすると、１００％の粒子が細胞と６３ｐｇ／細胞で結合することが明らかになった。したがって、粒子が１００％取り込まれるためには１μＭのＰ２１８Ｒのみが必要であるという結論が導かれた。
【０１８０】
ナノ粒子と細胞の結合にかかる時間の評価
図３４に示されるように、いずれの結果も、最適なナノ粒子と細胞の結合は２４時間においてであることを示していた。２４時間の時点で１００％の粒子が細胞と結合する；この結果は図３３に示される結果とも一致する。グラフはまた、ペプチドを加えると粒子取込みが著しく増大することを明白に示しており、このデータによると、取込みの割合は、ペプチドを加えた２４時間後にペプチドを加えない場合の７％から９６％に増大する。
【０１８１】
無血清培地の効果
図３５の結果から、血清の割合が２０％まで増加すると、取込みが３０％低下することがわかる。１μＭ  Ｐ２１８Ｒを加えた場合、この低下は１６％にとどまっている。無血清条件では栄養分の減少によりエンドサイトーシスが誘導されることから、血清量の増加に伴うこの取込みの低下は、エンドサイトーシスの減少に起因するものと考えられた。ペプチドを加えたときにエンドサイトーシス減少が抑えられれば、ペプチドがエンドサイトーシスを増大させると考えることができる。ペプチドを加えた場合、細胞によって取り込まれるＦｉｔｃ−ＢＳＡの量が増加するとエンドサイトーシスが増大したのに対し、ナノ粒子は取込みに影響しなかったことが明らかになり、これらの結果を図３５に示す。ＦｉｔＣ−ＢＳＡの取込みの増大は、粒子取込みの増大を引き起こすエンドサイトーシスの増大と関係している可能性があるる。無血清のみでエンドサイトーシスが増大することから、細胞を様々な無血清条件に置いても、それほど際立った差はみられない。
【０１８２】
Ｐ２１結合の競合因子
Ｐ２１が細胞膜上のＨＳに結合することが示され、したがって、ヘパリンを培地に加えれば、ヘパリンが結合を、したがってナノ粒子取込みを競合的に阻害すると仮定できる。結果を図３５に示す。グラフからヘパリンが結合の阻害剤であることがわかり、その阻害の程度から、Ｐ２１が細胞膜上のＨＳよりもヘパリンに対して高い親和性を有することがわかり、したがって、Ｐ２１の結合がナノ粒子の取込み機序に不可欠であることがわかる。Ｐ２１はナノ粒子表面のデキストランにも結合すると考えられ、そこで、デキストランの濃度を漸増させて培地に加えた。その結果を図３５に示す。デキストラン濃度の増大に伴い、ナノ粒子取込みが１８％低下している。デキストランは粒子結合の競合阻害剤として作用し、阻害における低下が少ないことから、Ｐ２１が細胞膜に対するより高い親和性を有している。
【０１８３】
考察
以上の結果は、少量のＰ２１８Ｒの添加により酸化鉄ナノ粒子が１００％取り込まれることを示している。細胞の顕微鏡観察およびトリプシン処理の結果は、粒子が内部移行することを示している。間葉系幹細胞を用いる実験も実施し、９０％の粒子が結合することが明らかになった。取込みの背後にある機序は、ペプチドの２つのドメインの共生作用に依存している。仮説ではあるが、Ｐ２１は細胞膜上のＨＳとナノ粒子コーティング中のデキストランの両方に結合でき、ペプチドは多数の結合点を有し、それによりナノ粒子と細胞の両方がいずれも同じＰ２１に結合できると考えられる。したがって、粒子に予め結合したタンパク質は膜にも結合でき、粒子を細胞に近接した状態で維持する。次いで、８Ｒはエンドサイトーシスによるナノ粒子の形質導入を促進できる。あるいは、別の機序として、ペプチドがナノ粒子に予め結合しており、次いで細胞膜に近接すると、ＨＳがより高い結合効率を有し、それによりＰ２１が細胞に結合すると考えられる。次いで、これにより粒子が内部移行し得る。Ｐ２１８Ｒペプチドを用いる利点は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境とより関連の高い血清培地中でのその効率および、システムがナノ粒子表面コーティング上の官能基を使用する必要がない点にある。遊離官能基は、標的分子または薬物が粒子に共有結合できることを意味する。
【０１８４】
結論
ペプチドＰ２１８Ｒは細胞をナノ粒子と１００％結合させることがわかった。これはデキストラン結合機序によることが見出され、多数の用途、例えば、抗体を結合させることによる特異的組織に対するナノ粒子の標的化、または薬物送達に利用可能である。
【０１８５】
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【０１８６】
ＧＥＴ（グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強形質導入）を介した治療用分子の効率的な細胞型特異的送達のための改変ＣＰＰ
緒言
本研究の第一の目的は、Ｐ２１をＨＳ−ＧＡＧ結合ドメイン由来増殖因子に置き換えた場合、Ｐ２１  ８Ｒを用いた細胞内へのｍＲＦＰの送達においてＧＥＴ仲介による相乗作用的増大が観察され得るかどうかを検討することであった。本研究の第二の目的は、特異的細胞表面ＨＳエピトープを標的にすることにより、不均一な細胞集団における細胞型特異的送達を示すことであった。Ｍｅｒｒｙらは、中胚葉分化の過程にある細胞の亜集団の標的化にＨＳエピトープ結合抗体が有用であることを明らかにしている［１３］。この抗体の可変領域を８Ｒにコンジュゲートして細胞型特異的送達の例を示した。本研究の第三の目的は、治療用生体分子のＧＥＴ仲介性送達を示すことであった。Ｐ２１  ＬＫ１５  ８Ｒペプチドを用いてレポーター遺伝子（ｐＳＩＮ  ＧＦＰ）のトランスフェクションを最適化し、「ゴールドスタンダード」である市販の脂質ベースの遺伝子導入試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と比較した。
【０１８７】
ＧＥＴを介した細胞型特異的送達
実験手順
ペプチドの調製
ペプチドであるｍＲＦＰ、ｍＲＦＰ  ８Ｒ、Ｐ２１  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ１Ａ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ１Ａ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ２Ａ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ２Ａ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ４Ａ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ４Ａ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ７Ａ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ７Ａ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ１Ｂ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ１Ｂ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ２Ｂ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ２Ｂ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ４Ｂ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ４Ｂ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ７Ｂ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ７Ｂ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ１Ｃ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ１Ｃ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ２Ｃ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ２Ｃ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ４Ｃ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ４Ｃ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＦＧＦ７Ｃ  ｍＲＦＰ、ＦＧＦ７Ｃ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＡＴＩＩＩ  ｍＲＦＰ、ＡＴＩＩＩ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＰＤＧＦ  ｍＲＦＰ、ＰＤＧＦ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＶＥＧＦ  ｍＲＦＰ、ＶＥＧＦ  ｍＲＦＰ  ８Ｒ、ＨＳ４Ｃ３  ｍＲＦＰおよびＨＳ４Ｃ３  ｍＲＦＰ  ８Ｒを、既に記載されている通りにｃＤＮＡとしてｐＧＥＸ６−ＰＩベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ２１）ｐＬｙｓＳ  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で発現させ、精製した［１２］。完全性および完全長ペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００ＰＲＯマルチモードリーダーを用いて組換えペプチドの蛍光を確認し、試料間の蛍光強度測定値の差は１０％未満であった。
【０１８８】
ペプチドアッセイ
ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を定量化した［１４］。組換えｍＲＦＰタンパク質を標準品として用いて、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した［１２］。ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００ＰＲＯマルチモードリーダーを用いて試料を分析した。
【０１８９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＧＲ−８細胞およびＨＵＥＳ７細胞の細胞培養
ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＧＲ−８細胞およびＨＵＥＳ７細胞を既に記載されている通りに増殖させ、維持した［１２］。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）を含み２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトミオシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｏｃｉｎ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＣＧＲ−８マウス胚性幹細胞は、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含み１０００単位／ｍｌ白血病阻害因子（ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＬＩＦ）、１００μＭ  β−メカプトエタノール（ｍｅｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトミオシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｏｃｉｎ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。ＨＵＥＳ７ヒト胚性幹細胞はゼラチンコート組織培養フラスコで培養した。細胞は２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含み１０００単位／ｍｌ  ＬＩＦ、１００μＭ  β−メカプトエタノール（ｍｅｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトミオシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｏｃｉｎ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。いずれの細胞も、加湿５％ＣＯ２条件下、３７℃でインキュベートした。
【０１９０】
細胞へのペプチド送達
細胞を１２ウェルプレート中に２×１０５細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、該当する増殖培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ）（ＧＭ）１ｍＬ中、３７℃で２時間インキュベートした。ペプチドをＧＭ  ５００μｌ中で２０μｇ／ｍｌに希釈した。各ウェルの細胞を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で洗浄し、ペプチド溶液５００μｌに入れ替えた。細胞を５％ＣＯ２加湿雰囲気中、ペプチドと３７℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、３．７％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＰＦＡ）で固定してフローサイトメトリー用に調製した。各実験は二つ組みで実施し、３回反復した（ｎ＝３）。
【０１９１】
Ｂｒｙ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞の維持および分化、ＥＢの作製
Ｂｒｙ−ＧＦＰマウス胚性幹細胞を既に記載されている通りに維持し、分化させた［１３］。Ｂｒｙ−ＧＦＰ細胞をＤＭＥＭ−ＥＳ（１５％ＦＣＳを含み１．５×１０５Ｍモノチオグリセロール（ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＭＴＧ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ）中、フィーダー上で維持した。
【０１９２】
Ｂｒｙ−ＧＦＰ細胞をＥＢとして分化させた。分化させる前に、細胞を１代目はＤＭＥＭ−ＥＳを入れたゼラチンコートフラスコで、２代目はイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）−ＥＳ（１５％ＦＣＳを含み１．５×１０４Ｍモノチオグリセロール（ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＭＴＧ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＩＭＤＭ）を入れたフラスコで、計２代継代した。細胞を次いで、１５％ＦＣＳを含み４×１０４Ｍ  ＭＴＧ、３００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＩＭＤＭを入れたＰｅｔｒｉグレード皿でＥＢとして２．８日間分化させた。解離の３時間前に、ＥＢを５０μｇ／ｍｌのＨＳ４Ｃ３  ｍＲＦＰまたはＨＳ４Ｃ３  ｍＲＦＰ  ８Ｒで処理した。分化後、１０分間のインキュベーションおよび細胞解離緩衝液中での攪拌により、ＥＢを単一細胞に分離し、ＰＦＡで固定した。
【０１９３】
フローサイトメトリー解析
ＭｏＦｌｏ（商標）ＤＰ（ＤＡＫＯ社）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで４８８ｎｍの緑色レーザーおよび／または６３３ｎｍの赤色レーザーを用いて細胞を解析した（４０，０００細胞；前方／側方散乱により生細胞にゲートをかけた）。統計解析には蛍光中央値を用いた。
【０１９４】
結果および考察
ＧＥＴを含めるためのＣＰＰ改変
本研究では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびアンチトロンビン−ＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）のＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインを８Ｒと結合させた。これらの増殖因子は、胚発生および血管新生に重要な生物学的役割を果たしている。それらはまた、Ｐ２１と同様に、細胞表面ＨＳ−ＧＡＧと相互作用することも明らかにされている。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＣＧＲ８マウス胚性幹細胞およびＨＵＥＳ−７ヒト胚性幹細胞をこれらの改変ＣＰＰで処理して、いずれかのペプチドがＧＥＴ仲介によるｍＲＦＰ送達の増大を示すかどうか検討した（図３７）。いずれかの改変ペプチドが、様々な細胞型のいずれかで他の細胞型よりも多量に発現するＨＳエピトープを優先的に標的とするかどうかを明らかにすることもまた重要であった。
【０１９５】
細胞内へのＧＥＴ仲介性増強形質導入を示す一群の４つの改変ＣＰＰを特定した。Ｐ２１  ８Ｒ、ＦＧＦ２Ｂ  ８Ｒ、ＦＧＦ７Ｂ  ８ＲおよびＰＤＧＦ  ８Ｒは、細胞内へのｍＲＦＰの形質導入において８Ｒ単独を用いた場合の３０〜１００倍の増大を示した（図３８および３９）。Ｐ２１  ８Ｒ、ＦＧＦ７Ｂ  ８ＲおよびＰＤＧＦ  ８Ｒは、ＨＵＥＳ−７胚性幹細胞内への優先的な形質導入を示した。このことは、形質導入が困難であると考えられる細胞型中へのＣＰＰの優先的な形質導入を示している。ＦＧＦ２Ｂ  ８Ｒは、ＣＧＲ８胚性幹細胞およびＨＵＥＳ７胚性幹細胞内への多能性特異的形質導入を示した。改変ＣＰＰの３つの細胞型への送達プロファイルが多様であることは、異なる増殖因子のＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインは、異なる細胞表面ＨＳエピトープを標的とし結合することを示唆する。特異的細胞型によってより豊富に発現されるるＨＳエピトープの標的化は、それらの用途により適したＣＰＰの選択に利用できる。
【０１９６】
プラスミドＤＮＡのＧＥＴ仲介性送達
実験手順
ペプチドの調製
固相ｔ−Ｂｏｃ化学反応を用いてＰ２１−ＬＫ１５−８Ｒペプチドを合成した（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（ビーストン、ノッティンガムシャー州、英国））。
【０１９７】
細胞培養
２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトミオシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｏｃｉｎ）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）培地を含むＤＭＥＭ中でＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を維持した。細胞を加湿５％ＣＯ２条件下、３７℃でインキュベートした。
【０１９８】
プラスミドＤＮＡの調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でＤＮＡ（ｐＳＩＮ  ＧＦＰ）を増幅した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ＤＮＡを抽出し精製した。ＤＮＡを１００％エタノール中で沈殿させ、ｄＨ２Ｏ中で脱水した。ナノドロップを用いてプラスミドの純度を確認した。
【０１９９】
ペプチド−ＤＮＡ複合体形成アッセイ
ＤＮＡ  １０μｇを４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−緩衝生理食塩水（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＮａＣｌ）溶液、ｐＨ７．４）６０μｌで希釈した。１ｍＭ  ＹＯ−ＰＲＯ−１ストック溶液をジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（ＤＭＳＯ）で０．１ｍＭに希釈した。希釈したＹＯ−ＰＲＯ−１溶液２．７μｌをＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水で６０μｌとし、希釈したＤＮＡに滴加した。ＤＮＡ／ＹＯ−ＰＲＯ−１溶液を混合し、ホイルに包み、室温で５時間インキュベートした。５時間後、ＤＮＡ／ＹＯ−ＰＲＯ−１溶液をＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水で１ｍｌとし、１処理条件当たり１００μｌ分をピペットでエッピンドルフ（ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ）チューブに入れた。所望の（＋／−）負荷比に対応する量のペプチドを各エッピンドルフ（ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ）に加えた（付表１）。ペプチド／ＤＮＡ／ＹＯ−ＰＲＯ−１溶液を混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００ＰＲＯマルチモードリーダーを用いて蛍光測定値を解析した。同様に、希釈したＹＯ−ＰＲＯ−１溶液２．７μｌをＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水１２０μｌで希釈し、上記の手順に従うことにより、ＤＮＡを含まない対照を作製した。
【０２００】
トランスフェクション実験の設計および最適化
１２ウェルプレートに１ウェル当たり８０，０００個の細胞を播種し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で１０％ＧＭ  １ｍＬ中、３７℃で一晩インキュベートした。各ウェルのトランスフェクトされる細胞に対し、ＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１００μｌで希釈し、混合した。希釈したＤＮＡにペプチドを最適な（＋／−）負荷比で直接加えた。次いで、溶液を混合し、室温で２５分間インキュベートした。細胞を吸い取り、ＰＢＳで洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）４００μｌに入れ替えた。各ウェルの細胞をペプチド／ＤＮＡ複合体１００μｌで処理し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。各ウェルに用いた様々な処理条件を付表２に示す。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＧＭ  １ｍｌに入れ替えた。４８時間後、各ウェルの細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、３．７％ＰＦＡで固定した。実験を３回繰り返した。
【０２０１】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクションの最適化を、製造業者の手引書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に記載されている通りに実施した。細胞を１２ウェルプレートにウェル当たり８０，０００個の細胞で播種し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内でＧＭ  １ｍＬ中、３７℃で一晩インキュベートした。各ウェルのトランスフェクトされる細胞に対し、ＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１００μｌで希釈し、混合した。希釈したＤＮＡにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  １．５μｌを直接加えた。次いで、混合物を混合し、室温で２５分間インキュベートした。細胞を吸い取り、ＰＢＳで洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）４００μｌに入れ替えた。各ウェルの細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＤＮＡ複合体１００μｌで処理し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。６時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、３．７％ＰＦＡで固定した。この操作を様々な体積のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（３μｌ〜４．５μｌ）で繰り返し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とＤＮＡの最適な比を見出した。実験を３回繰り返した。
【０２０２】
フローサイトメトリー解析
ＭｏＦｌｏ（商標）ＤＰ（ＤＡＫＯ社）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで６３３ｎｍの赤色レーザーを用いて細胞を解析した（４０，０００細胞；前方／側方散乱により生細胞にゲートをかけた）。蛍光中央値を統計解析に用いた。
【０２０３】
結果および考察
ペプチドとＤＮＡの結合
ＹＯ−ＰＲＯ−１アッセイは、ＤＮＡ結合ペプチドのＤＮＡ濃縮能を検討するのに用いることができる。ＹＯ−ＰＲＯ−１は、ＤＮＡを結合して蛍光ＤＮＡ／色素複合体を形成するシアニン色素である。様々な（＋／−）負荷比のペプチドを蛍光ＤＮＡ／色素複合体に加えることができる。ペプチドがＤＮＡを結合することにより色素との競合に勝つと、蛍光強度の減少が観察される。本研究では、ＬＫ１５をＰ２１  ８Ｒ形質導入タンパク質に融合して、改変細胞透過性ペプチドのＤＮＡ結合能を改善した。ＴＡＴへのＬＫ１５ペプチドの融合は、ＨＴ２９培養細胞およびＨＴ１０８０培養細胞内へのｐＤＮＡのトランスフェクションを大幅に改善することが明らかにされている［１９］。Ｔａｔ−ＬＫ１５の形質導入効率の増大がＴａｔに勝るのは、ペプチドとＤＮＡの濃縮能が改善され、ＤＮＡが細胞膜を横断して形質導入されやすくなるためであると考えられる［２０］。
【０２０４】
（＋／−）負荷比のグラフを％蛍光に対してプロットして、最適なＰ２１  ＬＫ１５  ８ＲとｐＳＩＮ  ＧＦＰの比を検討した（図４０）。結果から、最適なＰ２１  ＬＫ１５  ８ＲとｐＳＩＮ  ＧＦＰの（＋／−）負荷比がそれぞれ２：１であることがわかった。この比をトランスフェクション実験に用いた。
【０２０５】
Ｐ２１  ＬＫ１５  ８Ｒを介したｐＤＮＡレポーター遺伝子のトランスフェクション
細胞膜のリン脂質二重層は核酸に対し透過できないバリアとして働くため、ｐＤＮＡを改変ＣＰＰにコンジュゲートして細胞内へのその輸送を促進する［２］。本研究では、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞内へのレポーター遺伝子ｐＳＩＮ  ＧＦＰのＧＥＴ仲介性トランスフェクションを、トランスフェクション時間（３時間、６時間または２４時間）、トランスフェクション培地（血清を含む、または含まない）およびＤＮＡの量（１μｇ、４μｇまたは１０μｇ）の点で最適化した。Ｐ２１  ＬＫ１５  ８ＲではＰ２１が細胞表面ＨＳ−ＧＡＧを標的とし結合し、ＬＫ１５複合体がｐＳＩＮ  ＧＦＰと複合体を形成し、８Ｒが細胞膜を横断してｐＳＩＮ  ＧＦＰを形質導入するが、このペプチドを用いてレポーター遺伝子ｐＳＩＮ  ＧＦＰを細胞内にトランスフェクトした。Ｐ２１  ＬＫ１５  ８Ｒを用いたｐＳＩＮ  ＧＦＰのトランスフェクション効率と、商業的に用いられる脂質ベースの遺伝子導入試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のトランスフェクション効率とを比較した。トランスフェクションから４８時間後に細胞を固定して、捕捉されるＧＦＰを一過性発現させる時間を設け、フローサイトメトリーによりトランスフェクション効率を定量化した（図４１）。
【０２０６】
効果的なｉｎ  ｖｉｖｏ応用のためには、遺伝子担体システムは血清耐性でなければならないが、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を含むほとんどの遺伝子担体は、血清含有培地中でトランスフェクション効率の急激な低下を示す［２１］。これは、血清分子が遺伝子担体を競合的に結合し、したがってＤＮＡを結合するのに利用可能な遊離の遺伝子担体を減少させるためと考えられる［２２］。血清を含有するトランスフェクション培地中および無血清トランスフェクション培地中でのＰ２１  ＬＫ１５  ８Ｒのトランスフェクション効率を特徴付けた。最適なトランスフェクション条件は、血清条件で細胞をＤＮＡ  １０μｇで２４時間トランスフェクトした場合であり、トランスフェクション効率は１７．９±４．８％に達した（図４２）。これは、無血清条件でのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００で観察された最適化トランスフェクション効率（５４．７±１０．３％、付表３）の３分の１であるが、Ｐ２１  ＬＫ１５  ８Ｒトランスフェクションの血清耐性は、治療用生体分子のどのような臨床／ｉｎ  ｖｉｖｏ送達にも有利である。さらに、エンドソーム脱出戦略がＣＰＰ仲介性トランスフェクションの効率を大幅に増大させることは十分に示されている。
【０２０７】
結論
細胞表面ＨＳ−ＧＡＧ結合ドメイン由来の増殖因子を含むよう改変されたＣＰＰの一群は、細胞内への形質導入において未改変ＣＰＰに比して３０〜１００倍の増大を示した。仮説ではあるが、これらのペプチドのＧＥＴ仲介性送達は、ｉ）ＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインを介して細胞膜との相互作用を増大させ、ｉｉ）８Ｒを介して細胞膜を横断してタンパク質を形質導入するという、ペプチドの二重機能によるものであると考えられる。改変ＣＰＰは、様々な細胞型中にｍＲＦＰを優先的に送達するというプロファイルを示し、これは、異なる細胞型でより豊富に発現される特異的ＨＳエピトープを標的とするＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインによるものである。今後の研究では、特異的抗体に由来するＨＳエピトープ結合ドメインを含むようＣＰＰを改変する。抗体のＨＳエピトープ結合ライブラリーは、ＧＥＴを介した治療用分子の細胞型特異的送達に利用できる。
【０２０８】
これらのペプチドが治療用分子の送達に有用であることを示すため、Ｐ２１  ＬＫ１５  ８Ｒを用いて細胞内にレポーター遺伝子ｐＳＩＮ  ＧＦＰを送達した。結果は、エンドソーム脱出戦略なしで、血清条件で最大１７．９±４．８％のＧＥＴ仲介トランスフェクションの効率を示した。ＨＳ−ＧＡＧ結合ドメインを含めるＣＰＰの改変は、治療用生体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達にウイルスおよび脂質ベースの送達媒体を使用することに代わる方法として極めて有望である。
【０２０９】
（参考文献）
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［８］Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｙ，Ｃｈｉｂａ  Ｔ，Ｋａｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，Ｍｏｒｉｏ  Ｔ，Ｔａｋａｄａ  Ｓ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｏ  ＩＬ２ＲＧ  ｌｏｃｕｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１４；４．
［９］Ｐａｒｅｌｋａｒ  ＳＳ，Ｌｅｔｔｅｒｉ  Ｒ，Ｃｈａｎ−Ｓｅｎｇ  Ｄ，Ｚｏｌｏｃｈｅｖｓｋａ  Ｏ，Ｅｌｌｉｓ  Ｊ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４；１５：１３２８−３６．
［１０］Ｙａｎｇ  ＨＹ，Ｖｏｎｋ  ＬＡ，Ｌｉｃｈｔ  Ｒ，ｖａｎ  Ｂｏｘｔｅｌ  ＡＭＧ，Ｂｅｋｋｅｒｓ  ＪＥＪ，Ｋｒａｇｔｅｎ  ＡＨＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１４；５３：３５−４４．
［１１］Ｍａ  Ｙ，Ｇｏｎｇ  Ｃ，Ｍａ  ＹＬ，Ｆａｎ  ＦＫ，Ｌｕｏ  ＭＪ，Ｙａｎｇ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃａｒｇｏｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄ−ａｎｄ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２；１６２：２８６−９４．
［１２］Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄｉｘｏｎ  ＧＭ，Ｎｉｎａ  Ｌａｎｅ，Ｃｈｒｉｓ  Ｄｅｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｅｖｉｎ  Ｍ．Ｓｈａｋｅｓｈｅｆｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＧＡＧ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ２０１４．
［１３］Ｂａｌｄｗｉｎ  ＲＪ，ｔｅｎ  Ｄａｍ  ＧＢ，ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ  ＴＨ，Ｌａｃａｕｄ  Ｇ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＪＴ，Ｋｏｕｓｋｏｆｆ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８；２６：３１０８−１８．
［１４］Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ．ＲＡＰＩＤ  ＡＮＤ  ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＧＲＡＭ  ＱＵＡＮＴＩＴＩＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＤＹＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７６；７２：２４８−５４．
［１５］Ｓｃｈａｍｈａｒｔ  ＤＨＪ，Ｋｕｒｔｈ  ＫＨ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  Ｆｒｏｍ  ｒｅｖｉｅｗ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９７；２５：Ｓ８９−Ｓ９６．
［１６］Ｄｅｌｅｈｅｄｄｅ  Ｍ，Ｄｅｕｄｏｎ  Ｅ，Ｂｏｉｌｌｙ  Ｂ，Ｈｏｎｄｅｒｍａｒｃｋ  Ｈ．Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  １９９７；４５：３０５−１１．
［１７］Ｓｈａｏ  Ｃ，Ｓｈｉ  ＸＦ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＪ，Ｚａｉａ  Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３；８５：１０９８４−９１．
［１８］Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＫＥ，Ｂａｓｈｏｒ  ＣＪ，Ｌｉｍ  ＷＡ，Ｋｅａｔｉｎｇ  ＡＥ．ＳＹＮＺＩＰ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｂｏｘ：  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ａｃｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２；１：１１８−２９．
［１９］Ｓａｌｅｈ  ＡＦ，Ａｏｊｕｌａ  Ｈ，Ａｒｔｈａｎａｒｉ  Ｙ，Ｏｆｆｅｒｍａｎ  Ｓ，Ａｌｋｏｔａｊｉ  Ｍ，Ｐｌｕｅｎ  Ａ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ＬＫ１５  ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０；１４３：２３３−４２．
［２０］Ｄｕｆｏｕｒｃｑ  Ｊ，Ｎｅｒｉ  Ｗ，Ｈｅｎｒｙ−Ｔｏｕｌｍｅ  Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９８；４２１：７−１１．
［２１］Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｈｕ  ＨＭ，Ｌｉｕ  ＴＢ，Ｙａｎｇ  ＹＹ，Ｐｅｎｇ  ＹＦ，Ｃａｉ  ＱＱ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉ−ａｒｍｅｄ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）−ｇｒａｆｔ−ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｎｉｍｅ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１４；４６５：４４４−５４．
［２２］Ｗｕ  ＨＭ，Ｐａｎ  ＳＲ，Ｃｈｅｎ  ＭＷ，Ｗｕ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｃ，Ｗｅｎ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｒｕｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；３２：１６１９−３４．
【０２１０】
【表１】
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【０２１１】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２２−１】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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