(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成を検出する方法であって、体液を、
ａ．プロテアソームサブユニットに特異的な抗体である第１の抗体、および
ｂ．補体因子Ｃ３に特異的な抗体である第２の抗体
を含む免疫学的アッセイに供することを含む前記方法。
【請求項２】
前記第１の抗体が、プロテアソームタンパク質ＡＦ１、ＬＭＰ２、２０Ｓアルファ６、２０Ｓアルファ１、２、３、４、およびＲｐｔ５に特異的な抗体からなる群から選択され、前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂまたはｉＣ３ｂに特異的な抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成を検出する方法であって、体液を、
ａ．プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体、および
ｂ．補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体
を含む免疫学的アッセイに供することを含む前記方法。
【請求項５】
前記免疫学的アッセイが、ＥＬＩＳＡ試験として行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成を検出する方法。
【請求項６】
前記第１の抗体が、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体であり、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な前記抗体が、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１に由来するモノクローナル３Ｈ８抗体である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成を検出する方法。
【請求項７】
前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体であり、補体因子Ｃ３ｃに特異的な
前記抗体が、補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成を検出する方法。
【請求項８】
前記体液が、血液、血清、血漿、乳、涙液、涙、精液、精漿、膣液、唾液、痰、汗、腹水、羊水、滑液、胃液、脳脊髄液、髄液、眼の液体、膿、および／または粘液から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記体液が、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびラクダからなる群から選択される哺乳類から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液がトリから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の抗体および第２の抗体を使用して、体液におけるプロテアソーム−補体複合体形成の存在もしくは不存在、および／または濃度を決定するための免疫学的アッセイであって、前記第１の抗体が担体に固定され、前記第２の抗体が標識物質で修飾されており、前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
ａ．プロテアソームサブユニットに特異的な抗体、および
ｂ．補体因子Ｃ３または補体因子Ｃ４に特異的な抗体
から選択される、前記免疫学的アッセイ。
【請求項１２】
前記第１の抗体が、プロテアソームタンパク質ＡＦ１、ＬＭＰ２、２０Ｓアルファ６、２０Ｓアルファ１、２、３、４、およびＲｐｔ５に特異的な抗体からなる群から選択され、前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３に特異的な抗体、または補体因子Ｃ４に特異的な抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１３】
前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂまたはｉＣ３ｂに特異的な抗体である、請求項１２に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１４】
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
ａ．プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体、および
ｂ．補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体
から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１５】
ＥＬＩＳＡ試験キットである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１６】
前記第１の抗体が、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体であり、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な前記抗体が、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１に由来するモノクローナル３Ｈ８抗体である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１７】
前記第２の抗体が、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体であり、補体因子Ｃ３ｃに特異的な前記抗体が、補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の免疫学的アッセイ。
【請求項１８】
血漿中の循環性２６Ｓプロテアソームのレベルを検出／決定／モニタリングするための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイの使用。
【請求項１９】
体液中のインタクトなプロテアソームのレベルを検出／決定／モニタリングするための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイの使用。
【請求項２０】
哺乳類の身体における炎症のレベルを検出／決定／モニタリングするための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイの使用。
【請求項２１】
哺乳類の身体における補体系下方制御を検出するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイの使用。
【請求項２２】
高含有量の抗分泌因子（ＮＡＳＰ）を有する卵黄として提供される、特別加工穀類（ＳＰＣ）および／または天然の抗分泌因子（ＮＡＳＰ）を含む医療食品を摂取する患者のコンプライアンスを検証するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイの使用。
【請求項２３】
医薬における使用のための、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法および／またはアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗分泌因子（ＡＦ）は、炎症を阻害し、体液輸送を制御するタンパク質複合体である。本発明は、ＡＦ複合体が、修飾されたプロテアソーム、ならびに補体Ｃ３および／またはＣ４に存在するという驚くべき知見に関する。さらに、初めて、プロテアソームと補体因子Ｃ３および／またはＣ４との間の、ウイルスにより誘導される複合体が記載される。本明細書では、プロテアソーム−補体Ｃ３および／またはＣ４複合体は、ヒト血液から初めて精製され、ウエスタンブロットおよび質量分析により分析される。プロテアソームサブユニットに特異的な抗体および新規イムノアッセイにおけるそれらの使用が、本明細書において開示される。一実施形態において、ＥＬＩＳＡ試験は、ＡＦを曝露するプロテアソームの補体因子Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、またはＣ４ｃへの結合を開示し、別の一実施形態において、ＥＬＩＳＡ試験は、インタクトなプロテアソームの補体因子Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、またはＣ４ｃへの結合を開示する。本明細書に記載されるアッセイは、ＡＦを測定し、それは、加工穀類（ＳＰＣ）の摂取後に約１０倍増大される。補体因子ＨおよびＩのレベルの差は見られなかった。プロテアソームサブユニットは、部分的に分割され、従前の隠れた抗分泌ペプチド配列を曝露することが示される。また、Ｃ３は、プロテアソーム結合の際にその不活性な形態Ｃ３ｃに部分的に分割され、ＡＦ複合体形成中に抗炎症効果をもたらす。
【０００２】
したがって、第１の抗体および第２の抗体を使用して、体液におけるＡＦ−Ｃ３複合体形成の存在もしくは不存在、および／または濃度を決定するための免疫学的アッセイキットであって、第１の抗体が担体に固定され、第２の抗体が標識物質で修飾されている、免疫学的アッセイキットが開示される。
【０００３】
ＡＦを測定するため、第１の抗体および第２の抗体は、ＡＦ１特異的抗体、およびＣ３ｃのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体から選択される。
【０００４】
プロテアソームと補体因子Ｃ３またはＣ４との間の一般的な複合体形成を測定するために、第１の抗体および第２の抗体は、プロテアソームに対する抗体、および補体因子Ｃ３またはＣ４に対する抗体から選択される。
【０００５】
開示されるアッセイは、哺乳類の身体における補体系下方制御の測定および／またはモニタリングを含む、哺乳類の身体における炎症のレベルのモニタリング、ならびにヒトまたは動物の、高レベルの天然の抗分泌タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／または機能性食品に対するコンプライアンスの検証、ならびに体液における補体系制御に対するウイルスの影響の測定および／またはモニタリングのために使用される。
【背景技術】
【０００６】
補体系
補体系は、病原体に対する防御において主要な役割を果たす。それはまた、死にかけている細胞、免疫複合体またはミスフォールディングされた分子も同定し、適応免疫もガイドする。補体の生理学的関連性は、反復感染、自己免疫疾患および腎疾患のような補体欠損患者を侵す病気により示される。
【０００７】
侵入している病原体は、宿主細胞と比較した表面組成における差に起因して自然発生的に、または抗体もしくはペントラキシン結合を介してのいずれかで補体を活性化する。これは、タンパク質分解性補体カスケードの迅速な開始、血管透過性に影響する炎症促進性アナフィラトキシン（Ｃ５ａ、Ｃ３ａ）および白血球細胞を誘因する炎症促進性アナフィラトキシン（Ｃ５ａ）の放出、Ｃ３ｂでの標的のオプソニン作用、ならびに膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の最終的な形成を導く。
【０００８】
補体は、自己組織を補体により媒介される損傷から保護するために、溶解性および膜結合制御因子の両方により、堅固に制御されなければならない。これらの阻害剤の多くが、染色体１ｑ３２に位置し、それらは、補体活性化（ＲＣＡ）の制御因子とまとめて呼ばれる。ＲＣＡタンパク質は、Ｃ３およびＣ５転換酵素の崩壊を促進することにより、ならびに／またはＣ３ｂおよびＣ４ｂの分解においてセリンプロテイナーゼ因子Ｉ（ＦＩ）の補因子として作用することにより、補体系を阻害する。ＦＩは、活性化されたＣ３ｂおよびＣ４ｂタンパク質を切断することにより、補体の経路の全てを阻害する。しかしながら、これは、補因子の存在下でのみ生じる。
【０００９】
補体系は、異なる補体因子が、順に反応して、細菌の細胞壁を最終的に溶解する、細菌感染への炎症性応答と最も関連する。鍵となる因子Ｃ３およびＣ３ｂが、Ｃ３ｃへの加水分解により不活性化されることはあまり知られておらず、それは、タンパク質分解性因子Ｉ（ＦＩ）により活性化されることが知られている。この下方制御は、炎症後に補体系を回復させるのに必要であり、そうでなければ、それは、無期限に刺激されるだろう。
【００１０】
プロテアソーム
プロテアソームは、全ての細胞に存在し、そこで、プロテアソームは、タンパク質の分解および制御に必須である。その触媒性２０Ｓサブユニットは、７個の構造タンパク質および７個のタンパク質分解性タンパク質からなり、一方、２種の制御性１９Ｓサブユニットは、１９個の異なるタンパク質からなる。全てのプロテアソームタンパク質とは言わないまでも、大抵のプロテアソームタンパク質は、ＨＵＰＯプロジェクト遺伝子カード（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ＧｅｎｅＣａｒｄｓ．ｏｒｇ）に記載されている通り、組織において見出されたものと同様の濃度で血漿において同定された。例えば、ヒト血清において検出された２０Ｓプロテアソームは、「循環性プロテアソーム」（ｃ−プロテアソーム）と一般に命名される。血漿循環性プロテアソームのレベルは、ある種のがんの形態および自己免疫疾患において上昇することが示されている。
【００１１】
本発明者らは、以前に、ＡＦ１（抗分泌因子１）と名付けられたタンパク質を血液から単離し、そのコード遺伝子を配列決定した。後に、ＡＦ１は、１９Ｓプロテアソームサブユニットの構成成分であり、それ自体は、ＰＳＭＤ４、ＲＰＮ１０またはＳ５ａと名付けられたことが示された。細菌のエンテロトキシンおよび加工穀類が、抗分泌因子（ＡＦ）の変化した形態を誘導することができ、それが、腸において炎症および体液分泌を阻害したことがさらに示された。ＡＦのこの修飾した形態は、多糖類アガロースに結合することが見出された。α−メチルグルコシドでの溶出後、その濃度はＥＬＩＳＡにより決定できる。
【００１２】
驚くべきことに、本発明では、プロテアソームが、加工穀類（ＳＰＣ）の摂取後、補体因子Ｃ３と反応することが初めて示された。この反応は、従前の隠れた抗分泌エピトープの曝露をもたらし、それが、ＡＦ−１およびＣ３に対する抗体を使用したダブルサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてアッセイされる。さらに、本発明では、プロテアソーム／補体複合体形成が、Ｃ３のその不活性形態Ｃ３ｃへの分割をもたらすことが初めて示された。
【００１３】
抗分泌因子（ＡＦ）
抗分泌因子（ＡＦ）は、下痢性疾患および腸炎症に対する保護をもたらすと元々記載された、４１ｋＤａのタンパク質である（概説について、非特許文献１を参照）。抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質が配列決定され、そのｃＤＮＡがクローニングされた。抗分泌活性は、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質配列のアミノ酸３５位と５０位との間に位置し、共通配列の４、６、７、８、または１６のような少なくとも４〜１６個のアミノ酸を含むペプチドにより主に発揮されると思われる。免疫化学および免疫組織化学的調査は、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質が、身体中の大抵の組織および器官に存在し、また合成されることを明らかにした。止痢配列を含む、合成ペプチドは、以前に特徴付けられている（特許文献１；特許文献２）。抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質およびペプチドは、例えば、コレラ毒素での負荷後に腸および中枢神経系における脈絡叢において病理学的な体液輸送および／または炎症反応を正常化させることが既に開示されている（特許文献１）。それ故に、ＡＦの内在性合成または加えられたＡＦの取り込みのいずれかを誘導する能力を有する食品ならびに飼料は、例えば、特許文献１において、浮腫、下痢、脱水、および炎症の処置に有用であることが示唆された。特許文献３は、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質の形成を誘導する食品の生産のため酵素活性を有する生成物の使用を開示する。特許文献４は、（ＮＡＳＰ）のような天然の抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質が豊富にある食品製品をさらに開示する。
【００１４】
抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質およびその断片はまた、細胞の減少および／または増加と関連する状態の処置において神経組織の修復、ならびに幹細胞および前駆細胞、ならびにその誘導された細胞の増殖、アポトーシス、分化、および／または遊走を改善すること（特許文献２）、ならびに眼内高血圧の処置および／または予防において（特許文献５）、コンパートメント症候群の処置および／または予防の場合（特許文献６）も同等に有効であることが示された。
【００１５】
その上、本発明者らは、ＡＦが膜における脂質ラフト、受容体、および／またはカベオラの構造、分布、および多機能をモニタリングし、および／または有益に影響を及ぼすことができ、したがって、細胞膜における脂質ラフトおよび／またはカベオラの構造の組織崩壊および機能障害の処置および／または予防のため利用できることを最近示した（特許文献７）。
【００１６】
本発明者らは、同一の抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質、ならびにそのペプチドおよび断片が、膜貫通型タンパク質、例えば、ＮＫＣＣ１の生物学的活性化にＦＡＫおよびＣＡＰを介して介入すること、ならびに、したがって、それが、病理学的細胞および／または乱された細胞におけるイオンチャネルの病理学的活性を直接制御し、前記細胞における細胞内圧および膜貫通型タンパク質機能を有効に正常化し、故に、例えば、がん療法において使用される薬物の改善された取り込みを可能にすることをさらに証明できた（特許文献８）。
【００１７】
本出願は、従前に文書化されていない、補体系とプロテアソームとの間の相互作用、およびこの相互作用の結果として、ＡＦの抗分泌配列が曝露され、血中におそらく放出されるという事実に初めて光明を投じた。これらの異なる化合物間の天然の相互作用経路におけるこの新たに見出された見識により、本発明者らは、体液においてプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を検出するための新規かつ非常に有効な免疫学的アッセイを初めて開発することができた。新しいアッセイは、哺乳類の身体における補体系制御を含む、哺乳類の身体における炎症のレベルをモニタリングするため、ならびにヒトおよび／もしくは動物の、高レベルの天然の抗分泌因子タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／または機能性食品に対するコンプライアンスを検証するための、迅速かつ効率的なツールを初めてもたらす。
【００１８】
単純ヘルペスウイルス１型
単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）は、西欧諸国におけるウイルス性脳炎の最も一般的な原因であり、最大２０％のケースに関与する。年間１００万人当たり２〜４人の居住者に影響を及ぼし、ＨＳＥは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の１次または反復感染のいずれかにより引き起こされる。ＨＳＥをもたらす脳の感染は、三叉神経、嗅索を介した、または両方の経路を介したウイルスの侵入後に生じることが示唆されている。ＨＳＥの初期段階において、嗅球（ＯＢ）ならびに嗅索におけるＨＳＶ−１抗原の存在量が、中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症および壊死の最終位置と関連することが報告されている。加えて、脳内、および２つの脳半球間でのウイルス拡散は、あまり大規模には調べられていないが、ＨＳＥの臨床症状の位置および発症に最も決定的でありそうである。
【００１９】
げっ歯類モデルにおいて、マウスおよびラットにおける嗅索を介したＨＳＥのウイルス拡散は、鼻腔からＣＮＳに拡大することが観察された。嗅覚受容体ニューロンは、嗅覚上皮を通過し、篩板を貫通し、ＯＢに入ってＣＮＳに達する。ＯＢにおいて、嗅覚受容体ニューロンは、糸球体において僧帽細胞（２次ニューロン）につながり、それは、次に、嗅覚系および辺縁系に突き出る。扁桃体、海馬およびＯＢを含む、辺縁系は、脳の最古の部分の進化したものであり、ＨＳＥは、辺縁系全体の灰白質に選択的損傷を引き起こすので、ＨＳＥの臨床症状は、ＨＳＶ−１についての辺縁皮質への特有の親和性に起因することが示唆されている。故に、ＨＳＶ−１は、進化した保存された経路を使用してＯＢから脳に通じるその通路を見出し得る。
【００２０】
本出願は、さらに、補体Ｃ３およびＣ４は、それぞれ、ＨＳＶ−１ウイルス感染後、プロテアソームとの複合体を形成することを初めて示す。この反応は、インタクトなプロテアソームに対する抗体、およびＣ３またはＣ４に対する抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡで推定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】ＷＯ９７／０８２０２
【特許文献２】ＷＯ０５／０３０２４６
【特許文献３】ＷＯ９８／２１９７８
【特許文献４】ＷＯ００／０３８５３５
【特許文献５】ＷＯ０７／１２６３６４
【特許文献６】ＷＯ０７／１２６３６３
【特許文献７】ＷＯ０７／１２６３６５
【特許文献８】ＷＯ２０１０／０９３３２４
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ，２００１、２１０巻：３９〜７５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、体液における異なるプロテアソーム−Ｃ３および／またはＣ４複合体形成を検出するための免疫学的アッセイおよび免疫学的アッセイキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本明細書において、例えば、これらに限定されないが、進行中のウイルス感染症後および／もしくは中に、哺乳類の身体における炎症の状態、および前記哺乳類の身体における補体系（下方）制御をモニタリング、検証、および／または検出するため、ならびにヒトおよび／または動物の、高レベルの、卵黄（Ｓａｌｏｖｕｍ（著作権））のような天然の抗分泌タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／または機能性食品、栄養補助食品、飼料もしくは栄養補助飼料に対するコンプライアンスを検証するための、迅速かつ効率的なツールとなる、新規免疫学的アッセイおよび／または免疫学的アッセイキットが開示される。
【００２５】
本免疫学的アッセイ、ならびに本免疫学的アッセイキットは、ＡＦ１のような、ＡＦを曝露するプロテアソームを検出するため、もしくはインタクトなプロテアソームを検出するためのいずれかの、プロテアソームタンパク質に特異的な抗体、ならびにＣ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から選択される、第１の抗体ならびに第２の抗体を少なくとも使用する。第１および第２の抗体は、同一の抗原に特異的ではない、すなわち、第１の抗体が、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体から選択されるとき、次に、第２の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から選択されなければならず、または逆も同様である。２種より多くの選択された異なる抗体が存在するなら、選択されたものの少なくとも２種が、同一の抗原に特異的でない抗体から選択される必要がある、すなわち、１種の抗体が、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体から選択されるとき、次に、少なくとも１種の他の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から選択されなければならない。
【００２６】
抗体は、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質、またはＣ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な市販の抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体、および／またはプロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体（例えば、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））から選択される。第１の抗体と第２の抗体とのかかる組合せは、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３および／またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成の迅速な測定、ならびに体液におけるＡＦを曝露するプロテアソームの迅速な測定を可能にする。例えば、第１の抗体は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１または任意の他のプロテアソームエピトープに特異的な抗体からなる群から好ましくは選択され、第２の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から好ましくは選択される。
【００２７】
特に、体液におけるＡＦの測定時間は、１〜３０、５〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１０〜６０分までのような、数十分まで、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、もしくは１８０分以下まで短縮され、一方、体液におけるＡＦの測定は、ほぼ１日を通常必要とした。その上、本免疫学的アッセイおよび／または本免疫学的アッセイキットは、当業者が、従前に必要とされたものより、ずっと少ないアリコートの液体試料においてＡＦのレベルを測定することを可能にする。
【００２８】
プロテアソームと補体Ｃ３またはＣ４との間の一般的な反応を、一方で、プロテアソームエピトープに対して向けられた抗体、および他方で、補体因子３または４上のエピトープに対して向けられた抗体で測定することがさらに可能である。
【００２９】
結果として、３つの特定の実施形態において、本発明は、体液における、１）ＡＦ１−Ｃ３相互作用、２）インタクトなプロテアソーム−Ｃ３複合体形成、および／または３）インタクトなプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を検出するためのキットであって、１）ＡＦのような、ＡＦを曝露するプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、および補体因子Ｃ３、またはＣ３の誘導体に特異的な抗体、２）インタクトなプロテアソームのプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、および補体因子Ｃ３、またはＣ３の誘導体に特異的な抗体、ならびに３）インタクトなプロテアソームのプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、および補体因子Ｃ４、またはＣ４の誘導体に特異的な抗体を含むキットに関する。
【００３０】
一実施形態において、キットは、第１の抗体および第２の抗体を使用して、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成、またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成の存在もしくは不存在、および／または濃度を決定するための免疫学的アッセイキットであって、第１の抗体が担体に固定され、第２の抗体が標識物質で修飾されており、第１の抗体および第２の抗体が、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、および補体因子Ｃ３、もしくはＣ３の誘導体、または補体因子Ｃ４、もしくはＣ４の誘導体に特異的な抗体から選択される、免疫学的アッセイキットである。
【００３１】
補体因子Ｃ３またはＣ４の誘導体は、本文脈において、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、およびＣ４ｃからなる群から選択される。
【００３２】
本発明による免疫学的アッセイキットは、ＥＬＩＳＡ試験キットであってよい。
【００３３】
本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイキットは、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体を含み、これは、モノクローナル抗体３Ｈ８であり、本明細書においてｍＡｂ  ３Ｈ８（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））と称される。本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイキットは、補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体を含む。
【００３４】
本発明の一実施形態は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体（例えば、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３）、これは、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている）、および補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体を含む、本発明による免疫学的アッセイキットに関する。
【００３５】
さらに本明細書において、第１の抗体および第２の抗体を使用して、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成の存在もしくは不存在、および／または濃度を決定するための免疫学的アッセイであって、第１の抗体が担体に固定され、第２の抗体が標識物質で修飾されており、第１の抗体および第２の抗体が、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体（例えば、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））、およびＣ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から選択される、免疫学的アッセイが記載される。かかる免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳＡ試験であってよい。第１の抗体は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体（例えば、ＬＭＰ２に特異的な抗体、２０Ｓアルファ６に特異的な抗体、２０Ｓアルファ１、２、３もしくは４に特異的な抗体、およびＲｐｔ５に特異的な抗体）からなる群から好ましくは選択され、第２の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択される。
【００３６】
本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイは、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体を含む。現在好ましい実施形態において、選択される抗体は、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３）である。
【００３７】
本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイは、補体因子Ｃ３に特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３に特異的な抗体を含む。
【００３８】
本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイは、補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体を含む。
【００３９】
本発明の一実施形態において、本発明による免疫学的アッセイは、補体因子Ｃ４に特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ４に特異的な抗体を含む。
【００４０】
体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を検出する方法であって、体液を、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、およびＣ３ｃのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体を含む免疫学的アッセイに供することを含む方法がさらに開示される。抗体は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体、ＬＭＰ２に特異的な抗体、２０Ｓアルファ６に特異的な抗体、２０Ｓアルファ１、２、３または４に特異的な抗体、およびＲｐｔ５に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択され、他方の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような、補体因子Ｃ３に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択される。
【００４１】
体液におけるプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を検出する方法であって、体液を、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体、およびＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体を含む免疫学的アッセイに供することを含む方法がさらに開示される。抗体は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体、ＬＭＰ２に特異的な抗体、２０Ｓアルファ６に特異的な抗体、２０Ｓアルファ１、２、３または４に特異的な抗体、およびＲｐｔ５に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択され、他方の抗体は、Ｃ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、またはＣ４ｃのような、補体因子Ｃ４に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択される。
【００４２】
本発明による体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成および／またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を検出する方法は、ＥＬＩＳＡ試験として行ってよい。
【００４３】
本発明の一実施形態において、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を検出する前記方法は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体（例えば、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））の使用を含む。
【００４４】
本発明の一実施形態において、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を検出する前記方法は、補体因子Ｃ３に特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３に特異的な抗体の使用を含む。
【００４５】
本発明の一実施形態において、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を検出する前記方法は、補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ３ｃに特異的な抗体の使用を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態において、体液におけるプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を検出する方法は、補体因子Ｃ４に特異的なポリクローナル抗体である、補体因子Ｃ４に特異的な抗体の使用を含む。
【００４７】
本明細書において開示される、キット、アッセイ、および／または方法は、血液、血漿、尿、乳、唾液、卵黄、涙液、精液、膣液、痰、滑液、胃液、脳脊髄液、眼の液体、膿、および粘液からなる群から選択される非常に様々な体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成および／またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を測定、決定、モニタリング、および／または検出するために利用することができる。
【００４８】
本発明は、哺乳類の身体における炎症のレベルを検出、測定、決定、および／またはモニターするため、ならびに哺乳類の身体における、下方制御のような補体系制御を検出、測定、決定、および／またはモニタリングするための、本明細書に記載されるキット、アッセイ、および／または方法の使用をさらに含む。
【００４９】
その上、本発明は、一実施形態において、卵黄のような、高レベルの天然の抗分泌タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／もしくは機能性食品の有効性、ならびに／またはヒトおよび／もしくは動物の、卵黄のような、高レベルの天然の抗分泌タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／もしくは機能性食品に対するコンプライアンスを検証するための、本発明によるキット、アッセイ、および／または方法の使用を含む。
【００５０】
本明細書において以下で、本発明の実施形態が詳細に記載される。以下で個々に開示される実施形態は、本発明の免疫学的アッセイおよび免疫学的アッセイキット、ならびに方法および意図される使用の例であることに留意されたい。本発明は、これらの例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】２種の異なる方法によるヒト血漿における抗分泌因子（ＡＦ）の検出の図である。被検人４〜６は、特別加工穀類（ＳＰＣ）を消費し、人１〜３は対照であった。図１ａにおいて、血漿は、タンパク質サブユニットＡＦ１に対するモノクローナル抗体（ＰＳＭＤ４）での免疫検出の前に、アガロースゲル上で精製された。図１ｂにおいて、血漿は、表１に記載されるプロテアソーム−補体Ｃ３複合体を検出する、ダブルＥＬＩＳＡにおいて直接展開された。捕獲抗体は、抗ＡＦ１（明るいカラム）または抗ＬＭＰ２（黒色カラム）のいずれかであり；検出抗体は抗Ｃ３ｃであった。Ｙ軸値は、逆力価として示す。
【図２】Ｃ３ｃに対する抗体を使用した健常な人由来の血漿のウエスタンブロットの図である。人１および２は対照であり；人３および４は、特別加工穀類（ＳＰＣ）を消費した。被検人において、Ｃ３のより大きなおよびより小さなペプチドへの部分的変換が観察された。ウェル５は、３７℃において４時間アガロースゲルとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後の人１由来の血漿を示し、α−のｃ−ペプチドへの総変換を明らかにする。α−、β−、およびｃ−ペプチドの分子量は、それぞれ、１１５、７５、および４３ｋＤａである。
【図３】プロテアソーム−結合補体３タンパク質のウエスタンブロットの図である。血漿をアガロースゲルとインキュベーションして、凝集したプロテアソームおよびＣ３タンパク質を得た。プロテアソームは、マトリックス−結合抗プロテアソーム抗体により続いて精製された。図は、プロテアソームで同時に精製されたＣ３のαおよびβサブユニットを示す（列２；列１における参照）。
【図４】表１  サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて決定される、ＡＦ１／Ｃ３凝集体に対するアガロースによる刺激の効果を示す図である。人１〜３は対照であり；人４〜６は加工穀類を消費した。アガロースゲルとのインキュベーションは、全ての試料においてＣ３へのプロテアソーム結合を実質的に刺激した。逆力価として与えられたデータ。
【図５】表２  血漿における補体因子Ｉ（ＣＦＩ）およびＨ（ＣＦＨ）の濃度を示す図である。人１〜３は対照であり；人４〜６は加工穀類を消費した。対照群と比較して、試験群における因子Ｉまたは因子Ｈ濃度の有意な差は存在しない。逆力価として与えられたデータ。
【図６Ａ】４日間ＨＳＶ１（ＨＳＶ、Ｎ＝６）または対照としてＰＢＳ（ＣＴＲ、Ｎ＝５）を鼻腔内に負荷されたＳＤラットの図である。捕獲抗体としてプロテアソームサブユニット（２０Ｓα４、２０Ｓα６、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＰＴ５）に対するモノクローナル抗体、および検出抗体として補体Ｃ３に対するポリクローナル抗体を用いたダブルＥＬＩＳＡ。血漿および髄液において、２０Ｓα６サブユニットとＣ３との複合体は、有意により高く（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）、ＬＭＰ２または２０Ｓα４と補体Ｃ３は、血漿において有意により高かった。
【図６Ｂ】４日間ＨＳＶ１（ＨＳＶ、Ｎ＝６）または対照としてＰＢＳ（ＣＴＲ、Ｎ＝５）を鼻腔内に負荷されたＳＤラットの図である。捕獲抗体としてプロテアソームサブユニット（２０Ｓα４、２０Ｓα６、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＰＴ５）に対するモノクローナル抗体、および検出抗体として補体Ｃ３に対するポリクローナル抗体を用いたダブルＥＬＩＳＡ。血漿および髄液において、２０Ｓα６サブユニットとＣ３との複合体は、有意により高く（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）、ＬＭＰ２または２０Ｓα４と補体Ｃ３は、血漿において有意により高かった。
【図６Ｃ】４日間ＨＳＶ１（ＨＳＶ、Ｎ＝６）または対照としてＰＢＳ（ＣＴＲ、Ｎ＝５）を鼻腔内に負荷されたＳＤラットの図である。捕獲抗体としてプロテアソームサブユニット（２０Ｓα４、２０Ｓα６、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＰＴ５）に対するモノクローナル抗体、および検出抗体として補体Ｃ３に対するポリクローナル抗体を用いたダブルＥＬＩＳＡ。血漿および髄液において、２０Ｓα６サブユニットとＣ３との複合体は、有意により高く（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）、ＬＭＰ２または２０Ｓα４と補体Ｃ３は、血漿において有意により高かった。
【図７】４日間ＨＳＶ１（ＨＳＶ）または対照としてＰＢＳ（ＣＴＲ）を鼻腔内に負荷されたＳＤラットの図である。捕獲抗体としてプロテアソームサブユニット（２０Ｓα６）に対するモノクローナル抗体、および検出抗体として補体Ｃ４に対するポリクローナル抗体を用いたダブルＥＬＩＳＡ。血漿および髄液において、２０Ｓα６サブユニットとＣ４との複合体は、有意により高かった（ｐ＜０．０５）。
【図８】アガロース精製した血漿の２Ｄ分析の図である。試料は、ＳＰＣ摂取の前（Ａ）および４週間後（Ｂ）に３人の個人１〜３から採取された。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ乾燥ストリップｐＨ３〜１０が、等電点電気泳動のため、１０％トリス−グリシンゲルが、２次元のため使用された。左に、分子量標準が適用され、４０ｋＤａのバンドが示される。タンパク質含有量は、銀染色により視覚化された。続く分析のため選択されたスポットが、矢印で示される。
【図９】表３  ＡＦのＳＰＣ誘導後のアガロース精製された血漿の２Ｄ分離後の銀染色したゲルにおいて選んだスポットについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定の要約を示す図である。混入タンパク質は、結果から除去された。＊＝プロピオンアミドでの配列修飾が、文字ｃとして挿入される。
【図１０】ＡＦのＳＰＣ導入後の分離されたアガロース精製された血漿での２Ｄゲルにおけるウエスタンブロットの図である。１次元電気泳動等電点電気泳動が、７ｃｍのストリップゲル、ｐＨ３〜１０にて実行され、一方、１０％トリス−グリシンゲルが、２次元のため使用された。ＰＶＤＦ膜は、抗Ｃ３ｃとインキュベーションされた。左に、４０および８０ｋＤａのバンドを示す、分子量標準が適用される。
【図１１】抗Ｃ３ｃを使用したＥＬＩＳＡにより試験された、アガロース精製された血漿（ｎ＝４）におけるＣ３ｃのレベルの図である。ＳＰＣ摂取の前および６週間後由来の試料が分析され、正味の吸光度レベルが決定された。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊ＳＰＣ食の前と後に採取された試料間の有意差（ｐ＝０．００３９）。
【図１２】ＡＦ活性および補体因子のＥＬＩＳＡ決定の図である。ＳＰＣの摂取前、中、および１週間後の、３人の個人由来のアガロース精製された血漿における、（Ａ）モノクローナル抗体ＡＦ  ３Ｈ８（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））、およびＣ３ｃ、Ｃ４ｃ、または因子Ｈに対して反応する抗体（Ｂ、Ｃ、Ｄ）で決定された、ＡＦ活性および補体因子のレベル。データは、平均±ＳＥＭとして表される。試料間の有意差は、＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１により視覚化される。
【図１３】ヒト血漿における抗Ｃ３ｃ検出を使用したウエスタンブロット分析の図である。レーン１：ＳＰＣ摂取前の直接の血漿。レーン２：ＳＰＣ摂取後の直接の血漿。レーン３：ＳＰＣ摂取前のアガロース精製された血漿。レーン４：ＳＰＣ摂取後のアガロース精製された血漿。中心において、分子量標準が適用され、４３および７５ｋＤａのバンドが印づけられる。
【図１４Ａ】ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１についての寄託の図である。
【図１４Ｂ】ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１についての寄託の図である。
【図１４Ｃ】ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１についての生存率検証の図である。
【図１４Ｄ】ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１についての生存率検証の図である。
【図１５】ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１についての寄託者の宣誓の図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義および略語
略語
ＩＦＰ：間質液圧；
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水；
ＡＦ：抗分泌因子、全長ＡＦタンパク質（配列番号１において示される）
ＡＦ−６：ヘキサペプチドＣＨＳＫＴＲ（配列番号２において示される）；
ＡＦ−１６：アミノ酸ＶＣＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬで構成されるペプチド（配列番号３において示される）；
ＡＦ−８：セプタペプチドＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号４において示される）；
オクタペプチドＩＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号５において示される）；
ペンタペプチドＨＳＫＴＲ（配列番号６において示される）；
ＳＰＣ：特別加工穀類；
ＲＴＴ：ＡＦ（ＡＳＰ）の含有量の測定についてＳＥ９００００２８−２（公開番号第４６６３３１号）において公開されている、ラット小腸における標準化分泌応答を測定する方法；
ＡＦ：抗分泌因子；
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ；
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水；
ＡＰ：アルカリホスファターゼ；
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；
ｍＡｂ：モノクローナル抗体；
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：ナノフロー液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析；
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＨＳＶ１：単純ヘルペスウイルス１型
【００５３】
定義
タンパク質は、ペプチド結合により一緒に結合されるアミノ酸残基により構築される生物学的高分子である。アミノ酸の直線状ポリマーとしてのタンパク質は、ポリペプチドとも呼ばれる。典型的には、タンパク質は、５０〜８００個のアミノ酸残基を有し、故に、約６，０００〜約数十万ダルトンまたはそれ以上の範囲内の分子量を有する。小さいタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと呼ばれる。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本文脈において互換的に用いられる。ペプチドは、２〜５０個のアミノ酸残基（ａａ）のような、非常に少数のアミノ酸残基を有する。
【００５４】
用語「抗分泌性」は、本文脈において、分泌および／または体液輸送を阻害すること、または低減することを指す。本文脈において、用語「抗分泌因子タンパク質」、「抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質」、「ＡＦ−タンパク質」、ＡＦ、またはその相同体、誘導体、もしくは断片は、ＷＯ９７／０８２０２において定義される、用語「抗分泌因子」または「抗分泌因子タンパク質」と互換的に用いられ、抗分泌活性ならびに／または均等な機能活性および／もしくは類似の活性を有する抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質もしくはペプチド、またはその相同体、誘導体および／もしくは断片、またはペプチドの機能が変化していないその修飾物を指す。故に、本文脈における「抗分泌因子」、「抗分泌因子タンパク質」、「抗分泌ペプチド」、「抗分泌断片」、または「抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質」はまた、その誘導体、相同体、または断片を指し得ることは理解されるべきである。これらの用語は、本発明の文脈において互換的に全て使用される。さらに、本文脈において、用語「抗分泌因子」は、「ＡＦ」と省略される。本文脈における抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質はまた、ＷＯ９７／０８２０２およびＷＯ００／３８５３５において従前に定義された、抗分泌特性を有するタンパク質も指す。抗分泌因子はまた、例えば、ＷＯ０５／０３０２４６においても開示されている。
【００５５】
ＳＰＣ（著作権）は、特別加工穀類（ＳＰＣ）を含む医療食品である。
【００５６】
「医療食品」は、本文脈において、食品、補助飼料もしくは食品、または特別な食事療法上の使用のための食品を指し、これは、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質で調製されるか、あるいは内在性ＡＦの合成および／もしくは活性化を誘導する能力を有する。前記食品は、液体もしくは粉末のような、流体もしくは固体形態の任意の適当な食品、または任意の他の適当な食糧である。かかる事項の例は、ＷＯ００３８５３５またはＷＯ９１／０９５３６において見られる。
【００５７】
抗分泌因子という用語によりまた意図されるＳａｌｏｖｕｍ（著作権）は、例えば、ＳＥ９０００２８−２およびＷＯ００／３８５３５において開示され、以下でさらに記載される、高含有量の抗分泌因子（ＮＡＳＰ）を有する卵黄として提供される天然抗分泌因子（ＮＡＳＰ）である。
【００５８】
コンプライアンスは、アドヒアランスまたは維持と区別される、患者が規定のレジメンに従う恒常性および正確さの程度を記載するために本文脈において利用される。それは、彼または彼女自身の健康管理における患者の積極的な参加；医療アドバイスを求めること、約束を守ること、ライフスタイルに関する提案に従うこと、ならびに医療レジメンに従うことを包含する。
【００５９】
発明の詳細な説明
臨床研究は、炎症および／または分泌障害を含む慢性疾患を有する患者が、低い血漿ＡＦ活性を有することを示した（Ｌａｎｇｅら、２００３年；Ｌａｕｒｅｎｉｕｓら、２００３年）。したがって、慢性病において、疾患プロセスは、ＡＦ活性における内在性の増大に十分な刺激でないように見える。依然、これらの患者は、ＡＦ活性における食事により誘導される上昇の恩恵を受け得る。
【００６０】
ポリクローナル抗体を使用した、本発明者らによる従前の研究は、組織において、多数のＡＦの構造上の変異体が存在することを示し（Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅら、２００６年）、ＡＦ活性の制御が、構造上の変化に関与し、それが、ＡＦタンパク質の活性な配列を曝露するか、または隠すことが示唆された。血漿に存在するＡＦの大部分が、抗分泌の不活性な状態にあり、ＡＦの分画の活性化が、細菌の毒素での腸の負荷に対する、または特定の食品化合物に対する応答として生じる。本開示は、活性化ステップが、プロテアソーム中のＡＦ１タンパク質の抗分泌部位の曝露を含むことを証明する。
【００６１】
本発明者らは、ＡＦ１のアガロースへの結合の増大が、その抗分泌および抗炎症活性に結び付けられることを以前に示した。驚くべきことに、ＳＰＣの消費は、ＡＦ１のアガロースへの結合ばかりでなく、補体因子Ｃ３への結合も導くことが本明細書において開示される。ＡＦ１とＣ３との間の関連は、最小量のみの血漿を必要とする高感度ＥＬＩＳＡ試験により示される。以前に使用された試験は、アガロースカラム上での一次精製が行われなければならないので、１０倍より多い血漿を必要とし、より長時間を費やす。結果は、制御性１９Ｓサブユニットばかりでなく、触媒性２０Ｓサブユニットも、Ｃ３と関連することをさらに示す。
【００６２】
モノクローナルＡＦ１抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））が、インタクトなプロテアソームと反応しないことが、本明細書において初めて開示され、タンパク質構造の開放が、ＳＰＣの摂取後、Ｃ３の結合において生じることを示している。したがって、通常、ＡＦ１が、１９Ｓプロテアソームサブユニットと２０Ｓプロテアソームサブユニットとの間で隠されることを示しているが、Ｃ３ｃとの反応は、ＡＦ複合体の抗分泌活性に関与するペプチド配列を広げるように見える。
【００６３】
プロテアソームへの結合は、Ｃ３のその不活性な形態、Ｃ３ｃへの変換を導く。Ｃ３のＣ３ｃへの分割が、タンパク質分解性補体因子Ｉを、補因子としての因子Ｈと常に関与させることは、以前示された。循環性プロテアソームは補因子としても作用するか、またはむしろタンパク質分解性分割において直接含まれるかどうかは、見られるままである。Ｃ３のα−鎖全体をＣ３ｃに変換するアガロースの能力は、優れている。血漿は異なる表面活性材料に曝露されたので、本開示に先立ち、Ｃ３ｃへの部分的な変換のみが記載されている。
【００６４】
その上、ウイルス感染は、プロテアソームと補体因子Ｃ３および／またはＣ４との間の複合体形成を誘導することが、初めて示される。細胞内プロテアソームは、例えば、ＮＦκＢの活性化中、炎症の開始中に重要な役割を果たす。リポ多糖によるインフラマソーム初回刺激は、プロテアソーム機能に依存する。本発明を化学的仮説に限定することを望むことなく、恐らく、血中のプロテアソームは、補体作用を増強することにより、炎症の引き金を引く。他方、ＳＰＣは、プロテアソームとＣ３補体因子の下方制御を引き起こす、プロテアソームならびに補体の分割を引き起こすことにより、これに対抗する。この仮説は、プロテアソーム阻害性食品成分を用いた最近の実験により強化され、それは、患者において抗炎症性に作用する。さらに、ある種の食品成分は、血中のＣ３レベルを低減する能力を有し、これは、プロテアソーム−Ｃ３凝集に起因する。
【００６５】
体液におけるインタクトなプロテアソームの従前の研究は存在しない。しかしながら、ＧｅｎｅＣａｒｄｓによると、ＡＦ１のような分離したプロテアソームタンパク質は、組織中と同一の濃度、例えば、１ｐｐｍにおいて血漿で生じると想定される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＰＳＭＤ４）。この濃度は、現在提示される推定値、ならびに循環性２０Ｓプロテアソームサブユニットの報告されたレベルより高い。矛盾は、血中のプロテアソームが、組織中のものと異なり、それは、開示されるアッセイにおける標準として使用されることを示唆する。興味深いことに、循環性２０Ｓプロテアソームの濃度は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、およびシェーグレン病のような、自己免疫疾患と相関する。これらの２０Ｓサブユニットが、１９Ｓ制御性サブユニットとも関連するかどうかは、未解決の問題である。
【００６６】
結論として、初めて、プロテアソームと補体因子３との複合体、およびプロテアソームと補体因子Ｃ４との複合体の存在が、それぞれ、開示される。この形成は、単純ヘルペスウイルス１型により本明細書において誘導されるが、もちろん他の炎症剤により誘導することができる。この反応は、プロテアソーム−補体複合体の分解を導くＳＰＣの消費により対抗され、ここで、成分の両方が、部分的に分割され：隠れた抗分泌ペプチド配列を曝露するプロテアソーム、およびＣ３ｃに変換されているＣ３を導く。
【００６７】
この見識は、抗原−抗体反応を利用した、試料に含有されるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を測定するための新しい免疫学的アッセイの開発を導き、ここで、第１の抗体および第２の抗体の上述の組合せは、体液におけるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成および／またはプロテアソーム−Ｃ４複合体形成の迅速な測定を可能にするような組合せである。特に、体液における１）プロテアソーム−Ｃ３形成、２）プロテアソームＣ４形成、および３）ＡＦを曝露するプロテアソーム、ならびに血漿中の循環性２６Ｓプロテアソームを決定することのできる、いくつかの新しいＥＬＩＳＡ方法が記載される。
【００６８】
免疫学的アッセイ
本発明の一実施形態において、本発明の免疫学的アッセイは、抗原−抗体反応を利用した、試料に含有されるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成を測定するための免疫学的アッセイであり、ここで、第１の抗体と第２の抗体の上述の組合せは、プロテアソーム−Ｃ３複合体形成の迅速な測定を可能にするような組合せである。
【００６９】
本発明の別の一実施形態において、本発明の免疫学的アッセイは、抗原−抗体反応を利用した、試料に含有されるプロテアソーム−Ｃ４複合体形成を測定するための免疫学的アッセイであり、ここで、第１の抗体と第２の抗体の上述の組合せは、プロテアソーム−Ｃ４複合体形成の迅速な測定を可能にするような組合せである。
【００７０】
本発明のなお別の一実施形態において、本発明の免疫学的アッセイは、抗原−抗体反応を利用した、試料に含有されるＡＦ１曝露プロテアソーム−Ｃ３複合体形成を測定するための免疫学的アッセイであり、ここで、第１の抗体と第２の抗体の上述の組合せは、ＡＦ１曝露プロテアソーム−Ｃ３複合体形成の迅速な測定を可能にするような組合せである。
【００７１】
すなわち、本発明の免疫学的アッセイは、測定されるべき物質である、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質への第１の抗体結合と、補体因子Ｃ３もしくはＣ４、またはＣ３もしくはＣ４の誘導体への第２の抗体結合との組合せとして可能な組合せのいずれか１つを使用した、プロテアソーム−補体複合体形成を測定するための免疫学的アッセイである。上記によると、本発明の免疫学的アッセイは、試料に含有されるプロテアソーム−補体複合体形成の迅速な測定を可能にする。
【００７２】
免疫学的アッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、酵素抗体技術、蛍光抗体アッセイ、イムノクロマトグラフィー、免疫比濁法、ラテックス比濁法、およびラテックス凝集アッセイを含む。
【００７３】
さらに、本発明の免疫学的アッセイにおける測定は、手動で、または分析装置のような装置を使用して行われる。
【００７４】
さらに、本発明の免疫学的アッセイは、公知の方法により操作される。例えば、担体に固定された第１の抗体、試料、および標識物質で修飾された第２の抗体は、同時に、または連続して反応される。「担体に固定された第１の抗体と、標識物質で修飾された第２の抗体」の複合体は、上記反応により形成され、試料に含有されるプロテアソーム−補体複合体形成の量（濃度）は、複合体に含有される、標識物質で修飾された第２の抗体の量に基づき、測定される。
【００７５】
例えば、酵素結合免疫吸着アッセイは、第１の抗体が固定されたマイクロプレート、検体の希釈溶液、ＨＲＰのような酵素で修飾された第２の抗体、洗浄バッファー、および基質溶液を使用して行われる。さらに、測定は、第２の抗体を修飾する酵素が、酵素に最適な条件下でその基質と反応させること、および光学的な方法により酵素反応の生成物の量を測定することなどにより行われる。
【００７６】
また、蛍光イムノアッセイは、第１の抗体が固定された光導波路、検体の希釈溶液、蛍光物質で修飾される第２の抗体、および洗浄バッファーを使用して行われる。また、測定は、第２の抗体を修飾する蛍光物質を励起光で照射すること、および蛍光物質により放出された蛍光の強度を測定することにより行われる。
【００７７】
さらに、ラジオイムノアッセイが行われるとき、放射性物質により放出された放射線の量が測定される。また、発光イムノアッセイが行われるとき、発光反応系から放出された光の量が測定される。
【００７８】
さらに、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集アッセイなどが行われるとき、透過光および散乱光は、エンドポイント法またはレート法により測定される。また、イムノクロマトグラフィーなどが、視覚的に行われるとき、試験ラインに出現する標識物質の色が、視覚的に測定される。分析装置のような機器は、視覚的測定の代わりに用いられることは注意されるべきである。
【００７９】
本発明の免疫学的アッセイまたは方法において使用されるべき試料は、哺乳類の血液、血清、血漿、乳、涙液、涙、精液、精漿、膣液、唾液、痰、汗、腹水、羊水、滑液、胃液、脳脊髄液、髄液、眼の液体、膿、および／または粘液を含む体液のような、プロテアソーム−補体複合体を含有する可能性のある生物学的試料の全てを含む。
【００８０】
本発明の免疫学的アッセイまたは方法において使用されるべき試料は、任意の哺乳類から回収される。一実施形態において、哺乳類は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類、イヌ、ネコ、またはラクダからなる群から選択される。
【００８１】
本発明の特定の一実施形態において、本発明の免疫学的アッセイまたは方法において使用されるべき試料は、雌鶏のような、トリから回収される。当業者は、この特定の実施形態において、トリ抗原に対する抗体が選択される必要があることが分かる。したがって、選択される抗体は、測定されるべき物質である、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなトリプロテアソームタンパク質に結合する第１の抗体、およびトリ補体因子Ｃ３もしくはその誘導体、または補体因子Ｃ４もしくはその誘導体に結合する第２の抗体である。本発明の免疫学的アッセイまたは方法のこの特定の実施形態において使用されるべき試料は、特に、血液、血清、血漿、およびこれに限定されないが、雌鶏のようなトリの卵黄を含む体液のようなプロテアソーム−補体複合体を含有する可能性がある生物学的試料の全てを含む。
【００８２】
免疫学的アッセイキット
本発明の免疫学的アッセイキットは、抗原−抗体反応を利用した、試料に含有されるプロテアソーム−Ｃ３複合体形成、プロテアソーム−Ｃ４複合体形成、およびＡＦ１曝露プロテアソーム−Ｃ３ｃ複合体形成を測定するために免疫学的アッセイキットであり、ここで、第１の抗体と第２の抗体との上述の組合せは、プロテアソーム−補体複合体形成の迅速な測定を可能にするような組合せである。
【００８３】
本発明による免疫学的アッセイキットは、本発明の上述の免疫学的アッセイのために使用することができる。したがって、上述の免疫学的アッセイに類似の測定原理などは、本発明の免疫学的アッセイキットに適用する。
【００８４】
免疫学的アッセイキットにおける他の試薬成分
本発明の免疫学的アッセイキットにおいて、種々の水性溶媒が、溶媒として用いられる。水性溶媒の例は、精製水、生理食塩水、またはトリスバッファー、リン酸バッファー、もしくはリン酸緩衝生理食塩水のような種々のバッファーを含む。特定の制限は、これらのバッファーのｐＨに課せられず、適当なｐＨが適当に選択されるが、ｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内で一般に選択される。
【００８５】
さらに、本発明の免疫学的アッセイキットは、担体に固定された上述の第１の抗体および標識物質で修飾された第２の抗体に加えて、１種またはそれ以上の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、もしくはその塩のようなタンパク質、種々の塩、種々の糖、脱脂粉乳、正常なウサギ血清のような種々の動物の血清、アジ化ナトリウムおよび抗生物質のような種々の保存剤、活性化因子、反応促進剤、ポリエチレングリコールのような感度増強剤、非特異的反応阻害剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤、もしくは陰イオン界面活性剤のような種々の界面活性剤などを適当に含む。特定の制限は、アッセイ試薬中のこれらの物質の濃度に課せられないが、濃度は、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）であってよく、特に、０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）であってよい。
【００８６】
免疫学的アッセイキットの組成
上述の第１ならびに第２の抗体が、測定されるべき物質である、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に結合している第１の抗体、およびＣ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に結合している第２の抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体の少なくとも１つを含む限り、特定の制限は、本発明の免疫学的アッセイキットに課せられない。典型的には、少なくとも第１および第２の抗体は、別々の容器において提供される。
【００８７】
さらに、販売用の本発明の免疫学的アッセイキットは、上述の２種の抗体を含有する試薬に加えて、組合せでおよび別々の他の試薬を含んでよい。
【００８８】
上述の他の試薬の例は、バッファー、試料の希釈溶液、試薬の希釈溶液、標識物質を含有する試薬、発色のようなシグナルを生じる物質を含有する試薬、発色のようなシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、較正のための物質を含有する試薬、精度制御のために使用される物質を含有する試薬を含む。
【００８９】
次に、本発明の上述の他の試薬および免疫学的アッセイ試薬は、種々の組合せで適当に使用され、販売され、例えば、他の試薬が、第１の試薬として提供され、本発明の免疫学的アッセイ試薬が、第２の試薬として提供されるか、または本発明の免疫学的アッセイ試薬が、第１の試薬として提供され、上述の他の試薬が、第２の試薬として提供される。
【００９０】
また、特定の制限は、本発明の免疫学的アッセイキットの構成に課せられない一方、単純な方法で迅速な測定を行うために、本発明の免疫学的アッセイキットは、一体化された診断キットとして提供され、ここに、本発明の免疫学的アッセイキットの成分が組込まれる。特定の制限は、上述の一体化された診断キットに課せられないが、その例は、ＥＬＩＳＡキット、蛍光イムノアッセイキット、およびイムノクロマトグラフィーキットを含む。
【００９１】
例えば、ＥＬＩＳＡキットの配置は、第１の抗体が固定されたマイクロプレート、検体の希釈溶液、ＨＲＰのような酵素で修飾された第２の抗体、洗浄バッファー、基質溶液などを含む。
【００９２】
さらに、蛍光イムノアッセイキットが提供されるとき、キットは、第１の抗体が固定された光導波路、検体の希釈溶液、蛍光物質で修飾された第２の抗体、洗浄バッファーなどを含む。
【００９３】
さらに、イムノクロマトグラフィーキットが提供されるとき、次の実施形態が例として提供される。その１つの端（下流側）に固定された上述の第１の抗体を有する膜は、反応カセットにおいて保存される。それと同時に、現像液が膜の他の端（上流側）にセットされ、それに加えられる上述の標識物質の基質を有するパッドが、現象液がセットされる下流側近くに配置され、上述の標識物質で標識された第２の抗体を有するパッドが、膜の中間部分に配置される。
【００９４】
抗体
本発明の免疫学的アッセイおよび免疫学的アッセイキットにおける第１の抗体は、担体に固定されている。すなわち、第１の抗体は、抗体の１つが、担体に物理吸着、化学結合、もしくはこれらの組合せのような方法を介して吸着するか、または結合することを可能にすることにより、調製される。
【００９５】
物理吸着により固定化される抗体は、公知の方法により調製される。かかる方法の例は、抗体と担体とが混合され、バッファーのような溶液において互いに接触される方法、およびバッファーなどに溶解された抗体が、担体に接触することを可能にさせる方法を含む。
【００９６】
典型的には、第１の抗体および第２の抗体は、ＡＦ１またはインタクトなプロテアソームのようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体（例えば、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））、およびＣ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体から選択される。
【００９７】
第１の抗体は、プロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的な抗体（例えば、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））、ＬＭＰ２に特異的な抗体、２０Ｓアルファ６に特異的な抗体、２０Ｓアルファ１、２、３、または４に特異的な抗体、およびＲｐｔ５に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択され、第２の抗体は、Ｃ３、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂのような補体因子Ｃ３に特異的な抗体、またはＣ４、Ｃ４ｂ、ｉＣ４ｂ、もしくはＣ４ｃのような補体因子Ｃ４に特異的な抗体からなる群から好ましくは選択される。
【００９８】
Ａｎｄｅｒｓ  Ｏｌｄｆｏｒｓ、Ｄｅｐｔ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｐ．Ｏ．Ｂ．４２０、Ｓ−４０５３０  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎが、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｕｌｄｈｅｄｓｇａｔａｎ  １０、４１３４６  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎの名前の下、２０１５年５月１２日に、ブタペスト条約に著すものと同一の用語の受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１生物学的材料の下、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７  Ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに寄託したことを立証する、承認および同意の寄託者の宣誓が、本出願において添付される。寄託者は、Ｌａｎｔｍａｎｎｅｎ  ＡＳ−Ｆａｋｔｏｒ  ＡＢ、ＢＯＸ  ３０１９２、１０４  ２５  Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍが、国際および欧州および米国特許出願番号［代表的な参照番号ＰＳ５４７２８ＰＣ００／ＰＳ５４７２８ＥＰ００／ＰＳ５４７２８ＵＳ００］における上述の寄託された生物学的材料を指すことをここで承認し、上述の特許出願の出願日より、ＥＰＣ施行規則第３３条に従い公的に入手可能となる寄託された材料に対する彼の無条件かつ取消不能な同意を与えた。
【００９９】
さらに、化学的結合により固定された抗体はまた、公知の方法により調製される。かかる方法の例は、抗体および担体が、抗体および担体の両方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、ヒドロキシル基などが反応するように、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、またはマレイミドのような２価の架橋結合試薬と混合され、互いに接触される方法を含む。
【０１００】
さらに、抗体が固定された担体の非特異的反応、自発的な凝集などを阻害するための処置が、必要なら、公知の方法により行われる。かかる方法の例は、抗体が固定された担体の表面または内部表面が、担体の表面または内部表面がこれらの物質でカバーされるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵アルブミン、もしくはその塩、界面活性剤、脱脂粉乳などと接触される方法を含む。本発明の免疫学的アッセイおよび免疫学的アッセイキットにおける第２の抗体は、標識物質で修飾されている。第２の抗体は、抗体の１つが、標識物質に、物理吸着、化学結合、もしくはこれらの組合せのような方法を介して吸着または結合することを可能にすることにより、調製される。物理吸着によりそれに結合した標識物質を有する抗体は、公知の方法により調製される。かかる方法の例は、抗体と標識物質とが混合され、バッファーのような溶液において互いに接触させる方法、およびバッファーなどに溶解された抗体が、標識物質に接触することを可能にさせる方法を含む。
【０１０１】
例えば、標識物質が、金コロイドまたはラテックスであるとき、物理吸着が有効である。金コロイドで標識された抗体は、抗体と金コロイドとをバッファーにおいて混合すること、およびそれらを互いに接触させることにより入手可能である。
【０１０２】
さらに、化学的結合により標識物質で修飾された抗体もまた、公知の方法により調製される。かかる方法の例は、抗体および標識物質が、抗体および標識物質の両方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、ヒドロキシル基などが反応するように、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、またはマレイミドのような２価の架橋結合試薬と混合され、互いに接触される方法を含む。例えば、標識物質が、蛍光物質、酵素、または化学発光物質であるとき、化学結合が有効である。
【０１０３】
さらに、標識物質で修飾された抗体の非特異的反応、自発的な凝集などを阻害するための処置が、必要なら、公知の方法により行われる。かかる方法の例は、それに結合した標識物質を有する抗体が、抗体がこれらの物質でカバーされるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵アルブミン、もしくはその塩、界面活性剤、脱脂粉乳などと接触される方法を含む。
【０１０４】
また、酵素結合免疫吸着アッセイが行われるとき、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどが、標識物質として使用される。
【０１０５】
また、蛍光イムノアッセイが行われるとき、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロルトリアジンイソチオシアネート、シアニン、メロシアニンなどが使用される。または、ラジオイムノアッセイが行われるとき、トリチウム、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１などが使用される。
【０１０６】
また、蛍光イムノアッセイが行われるとき、ルミノール化合物、ルシフェラーゼ化合物、アクリジニウムエステル、ジオキセタン化合物などが使用される。
【０１０７】
また、イムノクロマトグラフィー、免疫比濁法、ラテックス比濁法、およびラテックス凝集アッセイが行われるとき、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホンコポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマー、ビニルクロライド−アクリル酸エステルコポリマー、ビニルアセテート−アクリル酸コポリマー、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸コポリマー、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸コポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー、（メタ）アクリル酸ポリマー、アクリル酸ポリマー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、金属コロイド、セラミック、または磁性材料などの材料で作製された粒子が使用される。
【０１０８】
本発明の免疫学的アッセイにおける担体として、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ナイロン、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミック、または磁性材料、マイクロプレート、試験管、スティック、膜、検体片などで作製されたビーズの形態の固体担体が使用される。具体的には、本発明の担体として、光導波路として配置される導波路が使用される。
【０１０９】
抗分泌因子
抗分泌因子は、身体において天然で生じる、タンパク質のクラスである。ヒト抗分泌因子ＡＦタンパク質は、脳下垂体から単離されるとき、３８２〜２８８個のアミノ酸を含む、４１ｋＤａのタンパク質である。活性部位は、タンパク質のＮ末端に近い領域におけるタンパク質に局在し、特に、配列番号１のアミノ酸１〜１６３、より具体的には、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質配列上のアミノ酸３５〜５０位に局在する。ＡＦの生物学的効果は、前記共通配列の少なくとも６個のアミノ酸、配列番号２（ＡＦ−６）を含む断片および／もしくは相同体、またはポリペプチドおよび／もしくはペプチドの機能が変化していないその修飾物により発揮される。
【０１１０】
本発明者らは、抗分泌因子が、全ての細胞に一般的な構成成分のサブユニット、２６Ｓプロテアソーム、より具体的には、１９Ｓ／ＰＡ７００ｃａｐを構成する、タンパク質Ｓ５ａ、およびＲｐｎ１０と相同であることを示した。本発明において、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質は、同一の機能特性を有する、相同なタンパク質のクラスとして定義される。抗分泌因子はまた、アンギオシジン、トロンボスポンジン−１に結合し、がんの進行と関連することが知られている別のタンパク質アイソフォームとも高度に類似する。
【０１１１】
本明細書に記載される、本免疫学的アッセイ、ならびに本免疫学的アッセイキット、ならびに方法は、少なくとも第１の抗体および第２の抗体を使用し、その１つは、ＡＦ１もしくはインタクトなプロテアソーム、類似の生物学的活性を有する、ＡＦに対する相同体、抗分泌因子（ＡＦ）の誘導体、ペプチド、もしくは断片のようなプロテアソームタンパク質に特異的な抗体から選択される。相同体、誘導体、または断片は、本文脈において、天然に生じる抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質のものに対応する、少なくとも６個のアミノ酸（配列番号２において示される）を含み、それは、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドの必須の機能を変えることなく、抗分泌因子の生物学的活性を最適化するために１つまたはそれ以上のアミノ酸を変化させることにより、さらに修飾される。
【０１１２】
ＷＯ００／０３８５３５は、抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質が豊富にある食品製品を開示し、したがって、それは、本文脈において適当な食品、食糧、および／または栄養補助食品の例である。
【０１１３】
本発明は、第１の抗体および第２の抗体を使用した、身体におけるＡＦ１曝露プロテアソーム−Ｃ３補体形成の存在もしくは不存在、および／または濃度を決定するための免疫学的アッセイ、方法、およびキットを初めて開示し、ここで、第１の抗体または第２の抗体のいずれかが、ＡＦ１、類似の生物学的活性を有する、ＡＦに対する相同体、抗分泌因子（ＡＦ）の誘導体、ペプチド、または断片に特異的な抗体から選択される。
【０１１４】
開示されるアッセイまたは方法は、哺乳類の身体における補体系（下方）制御を含む、哺乳類の身体における炎症のレベルをモニタリングするため、ならびに高レベルの天然の抗分泌因子タンパク質（ＮＡＳＰ）を含む加工穀類（ＳＰＣ）および／または機能性食品のコンプライアンスを検証するためのような、血漿または他の体液中の循環性２６Ｓプロテアソームのレベルを検出するために使用される。
【０１１５】
一実施形態において、開示される免疫学的アッセイまたは方法を利用して、天然に生じる抗分泌因子が豊富な卵黄として好ましくは提供される、非常に高レベルの天然の抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質を含む、Ｓａｌｏｖｕｍ（著作権）（ＮＡＳＰ）、食品、栄養補助飼料および／または食品のコンプライアンスが検証される。それは、例えば、前記食品、栄養補助飼料および／または食品を消費した対象から採取された試料を試験して、前記食品、栄養補助飼料および／または食品の消費後、前記対象におけるプロテアソーム−補体複合体形成が測定されることが予想される。
【０１１６】
別の同等に好ましい一実施形態において、開示される免疫学的アッセイまたは方法を利用して、ＳＰＣ（著作権）のような、加工穀類のコンプライアンスが検証され、それは、食品、ならびに／もしくは抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質の摂取、形成ならびに／もしくは放出を誘導する固有の食事療法上の使用のための食品の摂取後、対象により、配列番号１（ＡＦ）に示される抗分泌因子（ＡＦ）タンパク質、ならびに／もしくは均等な活性を有し、配列番号２（ＡＦ−６）において示されるアミノ酸配列を含む、その相同体および／もしくは断片、ならびに／または薬学的に活性なその塩の内因的生産を刺激する。それは、例えば、前記食品、栄養補助飼料および／または食品を消費した対象から採取された試料を試験して、前記食品、栄養補助飼料および／または食品の消費後、前記対象におけるプロテアソーム−補体複合体形成が測定されることが予想される。
【０１１７】
実験セクション
本研究において、ＡＦ複合体が、プロテアソームと補体Ｃ３の両方からなることが、示される。プロテアソームおよびプロテアソーム−補体Ｃ３複合体は、ヒト血液から精製され、ウエスタンブロットおよび質量分析により分析される。プロテアソームサブユニットに特異的な抗体が産生され、２つの新しいイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が開発される。正常血漿中の０．４１±０．０３μｇ／ｍｌの２６Ｓプロテアソーム濃度を確立する、第１のＥＬＩＳＡ試験、プロテアソームの補体因子Ｃ３への結合を開示する、第２のＥＬＩＳＡ。後者の試験はＡＦを測定し、それは、加工穀類の摂取後、約１０倍増大される。補体因子ＨおよびＩのレベルの差は見られなかった。ＡＦの誘導は、血漿をアガロースゲルとｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションすること、形成されたタンパク質ペプチド配列を単離し、特徴付けることを可能にすることにより、模倣される。Ｃ３は、プロテアソーム結合の際に、その不活性な形態のＣ３ｃに部分的に分割され、それは、ＡＦ複合体形成中の抗炎症効果を説明する。結論として、２６Ｓプロテアソームは、正常血液において生じ、補体Ｃ３と相互作用し、ＡＦ複合体を形成する。
【実施例１】
【０１１８】
材料および方法
一般的な試薬
ＡＦ１に特異的なモノクローナル抗体を作製し、受託番号ＸＹの下、寄託する。プロテアソームＬＭＰ２（２０Ｓβ１ｉ）および２０Ｓα６に特異的なモノクローナルマウスＩｇＧ抗体を、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）から得た。補体因子Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体を、Ｄａｋｏ（ｗｗｗ．ｄａｋｏ．ｃｏｍ）から購入した。セファロース６ＢおよびセファクリルＳ３００を、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から得た。前腫大したＤＥ５２セルロースは、Ｗｈａｔｍａｎ、番号４０５７０５０、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からであった。特別加工穀類（ＳＰＣ）を、ＡＳ−Ｆａｋｔｏｒ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ（ｗｗｗ．ａｓ−ｆａｋｔｏｒ．ｓｅ）から得た。
【０１１９】
ヒト血液試料
６人の健常な被検人を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから採用した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇの倫理委員会が、研究プロトコールを承認した（Ｄｎｒ．０３７−１４、Ｅｘｐ．２０１４−０２−１９）。被検人３人が、１ｇ／体重１ｋｇのＳＰＣを、１日１回、１カ月間消費し、一方残る３人は、対照とした。それぞれの人から、静脈血１５〜２０ｍｌをＥＤＴＡバキュテナーチューブ（ｇｂｏ．ｃｏｍ／ｐｒｅａｎａｌｙｔｉｃｓ）に引き出した。遠心分離による分離後、血漿を、等量のクエン酸バッファー（０．１１Ｍグルコース、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム、および０．０７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．１）と混合した。それぞれの試料を、アリコート２ｍｌに続いて分け、使用まで−２０℃にて維持した。試料を、４週間より長く凍結保存しなかった。
【０１２０】
アガロースろ過後のＡＦ１アッセイ
従前に記載された通り、ＡＦ１を、小さなアガロースカラム上で血漿から親和性精製し、イムノアッセイにより、濃度を決定した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．、Ｉ．Ｌｏｎｎｒｏｔｈ、Ｉ．Ｊｏｎｓｏｎ、Ｓ．Ｌａｎｇｅ、およびＥ．Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９、３４２巻（１〜２号）：６４〜７０頁）。簡単に言うと、１：１希釈した血漿試料６ｍｌ（上述）を、３ｍｌのセファロース６Ｂカラムに通し、ＰＢＳで２回洗浄し、１Ｍα−メチル−グリコシドで続いて溶出した。精製した試料を９６ウェルプレートにおいて滴定し、一晩コートし、ＡＦ１に特異的な３Ｈ８モノクローナルマウス抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））または対照としてＰＢＳにより検出し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合した２次抗体で最後に展開した。４５０ｎｍにおける吸光度の読み取り後、結果を逆力価として示した。３Ｈ８抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））は、抗分泌活性に関与するＡＦ配列を認識する（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｖ．、およびＶ．Ｌｉｅｖｉｎ−Ｌｅ  Ｍｏａｌ、Ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＦ−１６  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｓａｔ  ｔｏｘｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｓｓａｇｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２０１４、Ｍａｔｓｏｎ  Ｄｚｅｂｏ，Ｍ．、Ａ．Ｒｅｙｍｅｒ、Ｋ．Ｆａｎｔ、Ｐ．Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｂ．Ｎｏｒｄｅｎ、およびＳ．Ｒｏｃｈａ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＦ−１６  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｔｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４、５３巻（４１号）：６５６６〜７３頁）。
【０１２１】
プロテアソーム／Ｃ３  ＥＬＩＳＡ
血漿におけるプロテアソーム／Ｃ３複合体の検出のため、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。１：２００希釈したプロテアソームタンパク質ＡＦ１に特異的なモノクローナル３Ｈ８抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））、または１：２０００希釈したＬＭＰ２を、９６ウェルタイタープレートに一晩コートした。０．２％ＢＳＡで、３７℃にて４５分間ブロッキング後、血漿試料を、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳに滴定し、１時間振盪した。１：２０００希釈のポリクローナルウサギ抗体を、検出抗体として適用した。３０分間インキュベーション後、抗ウサギ−ＡＰ２次抗体を適用し、さらに３０分後、ＡＰ基質を加えた。光度計において、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０１２２】
循環性プロテアソーム
ＤｅＭａｒｔｉｎｏ（ＤｅＭａｒｔｉｎｏ，Ｇ．Ｎ．、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡ７００、ｔｈｅ  １９Ｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００５、３９８巻：２９５〜３０６頁）により記載される通り、ヒト赤血球から、１９Ｓプロテアソームサブユニットを調製した。簡単に言うと、ヒト血液由来の洗浄した赤血球を、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノールに溶解し、１００００×ｇにて２時間遠心した。溶解物に、１／４容量のＤＥ５２セルロースを加え、室温で３０分間ゆっくり混合した。セルロースをろ去し、ろ液を４０％飽和硫酸アンモニウムにおいて沈殿させた。沈殿物を、バッファーＸ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ−２０％グリセロール、ｐＨ７．６）に溶解後、溶液を、バッファーＸで平衡化したセファクリルＳ−３００カラムにてゲルろ過した。上述のシングルＥＬＩＳＡ（アガロースろ過後のＡＦ１アッセイ）における最大反応性により明らかにした、１９Ｓを含有するタンパク質ピークを、未変性ゲル電気泳動により検証した。
【０１２３】
１カ月間投与した、１００μｇの４回用量により、精製したサブユニットで、ウサギを免疫し、１９Ｓプロテアソームサブユニットに特異的な抗血清を得た。１：１０００希釈した２０Ｓα６に特異的な捕獲抗体（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ｎｕｎｃ  ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐｐｏｌｙｖｉｎｙｌプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にコートし、１：４００希釈したポリクローナル抗１９Ｓを、検出抗体として使用した。２６Ｓプロテアソーム（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を参照として、ウサギ前免疫血清を対照として使用した。血漿における２０Ｓサブユニットの検出のため、市販のキット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。このキットはまた、２０Ｓα６モノクローナルを捕獲抗体として、ポリクローナル２０Ｓを検出抗体としても使用する。
【０１２４】
ウエスタンブロット
従前に記載（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．、Ｉ．Ｌｏｎｎｒｏｔｈ、Ｓ．Ｌａｎｇｅ、Ｉ．Ｊｏｎｓｏｎ、Ｅ．Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ、およびＣ．Ｌｏｎｎｒｏｔｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９５、２７０巻（３５号）：２０６１５〜２０頁）される通り、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットを行った。１：２５０００希釈の補体Ｃ３ｃに特異的なポリクローナルウサギ抗体を、検出抗体として使用した。血漿試料を１：１０希釈した。
【０１２５】
アガロースインキュベーション
プロテアソーム−Ｃ３複合体形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成するため、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのアガロースセファロース６Ｂを使用した。アガロースのコンパクトなゲルに、等量のクエン酸バッファー（０．１１Ｍグルコース、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム、０．０７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．１）を加えた。ゲル懸濁液１容量を試験管に加え、１５００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清を捨て、血漿２容量を加えて、１：３の血漿−ゲル比を得た。血漿−アガロース混合物を、血液ロッカーに３７℃にて４時間置いた。遠心分離により、アガロースをペレット化し、さらなる試験まで−２０℃にて血漿を凍結維持した。
【０１２６】
プロテアソーム−Ｃ３複合体の精製
上述の通り、血漿をアガロースとインキュベーションし、その後、等量の飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を結合バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．４）４容量に溶解して、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのプロテアソーム精製キットＢＭＬ−ＰＷ１０７５Ａを使用することにより、プロテアソーム−Ｃ３複合体の部分的精製を達成した。簡単に言うと、溶解したタンパク質１００μｇを、アガロース結合抗２０Ｓβ５からなるプロテアソーム結合マトリックスと、一晩、５℃にてインキュベーションした。結合したプロテアソーム材料を結合バッファーで３回洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディングバッファー２５μｌをマトリックスに加え、結合したタンパク質を、９５℃で１０分間溶出した。９μｌをウエスタンブロットゲルに適用し、残りの試料を、後述の質量分析（ＭＳ）のためＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。
【０１２７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびタンパク質同定
クーマシー染色したゲル片を切り出し、タンパク質をトリプシンで消化した。簡単に言うと、ゲル片を、５０％ＣＨ３ＣＮ中の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３において３回洗浄し、５０％ＣＨ３ＯＨ中の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３にて１回洗浄した。ゲル片を、真空遠心機にて乾燥させ、１０ｎｇ／μｌのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）と、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３において３７℃で一晩インキュベーションした。７５％ＣＨ３ＣＮ／２％ＴＦＡをまず加えることにより、ペプチドを抽出し、続いて５０％ＣＨ３ＣＮ／０．２％ＴＦＡで抽出した。プールした抽出物を、真空遠心機にて蒸発乾固し、ＭＳ分析に先立ち、０．２％ＨＣＯＯＨ１８μｌに再構成した。７Ｔ  ＩＣＲ  ｍａｇｎｅｔ（ＬＴＱ−ＦＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を装着したハイブリッド線形イオンｔｒａｐ−ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計にて、ナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。タンパク質同定のため、最小判断基準を、ＭＡＳＣＯＴにより与えられる９５％またはそれ以上のレベルの信頼で一致する少なくとも２つのトリプシンペプチドに設定した。
【０１２８】
補体ＩおよびＨの検出
血漿における補体ＩおよびＨ濃度の決定のため、市販のＥＬＩＳＡキットを使用した。ＡｓｓａｙＰｒｏ、ＵＳＡ（ｗｗｗ．ａｓｓａｙｐｒｏ．ｃｏｍ）の補体Ｉキットは、本発明者らが、範囲０．４〜２０μｇ／ｍｌの補体Ｉ濃度を決定することを可能にし；Ｂｌｕｅ  Ｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｂｌｕｅｇｅｎｅ．ｃｃ）の補体Ｈキットは、範囲５〜１００ｎｇ／ｍｌのＨ濃度を決定することを可能にした。
【０１２９】
ウイルス
致死であることが後に判明した致死性脳炎を提示した５８歳の男性患者の脳生検から単離した、ＨＳＶ−１  ２７６２（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、１９９０年）を、ラットの感染のため使用した。ウイルスは、動物モデルにおいて高度に神経毒性であることが示された（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、１９９０年）。脳生検からのウイルスの単離は、ヘルシンキ宣言において表現される原理により行われた、ＨＳＥにおける抗ウイルス処置についてのスウェーデンの多施設研究（Ｓｋｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、１９８４年）について、ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ、Ｌｕｎｄ、Ｕｍｅａ、およびＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＵｐｐｓａｌａの倫理委員会により、１９８１年に承認された。ＨＳＶ−１株２７６２のウイルスストックを数の少ない継代から調製した。
【０１３０】
動物
体重２５０±２０ｇの雄のスプラーグドーリーラット（ＳＤ）ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した（感染したラットｎ＝４９、対照ラットｎ＝１１）。Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓの地域の倫理委員会は、試験プロトコールを承認し、動物実験についてのＥＣ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣガイドラインに従い、全ての実験を行った。実験の開始前に、ラットを１週間一般的に適応させ、それらは、ペレット化飼料および水に自由に常にアクセスした。動物の４分の１の温度および空気の換気を、標準的手法に従いモニタリングし；１２時間の光サイクルを使用し、空気を１時間当たり１７回交換した。
【０１３１】
鼻腔内注射
従前に記載される通り（Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅら、２００８年）、２５μｌ（与えた総用量＝１．１×１０４プラーク形成単位（ｐｆｕ））の容量のＨＳＶ−１での右の鼻孔における鼻腔内滴下後、ラットにおける脳炎感染を達成した。この滴下は、ＲＴ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９６４年）により記載される接種方法から適合した。ラットが深いイソフルレン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）麻酔下にある間に、感染用量を右の鼻孔に常に置いた。感染の４日後に、ラットを屠殺した。倫理的理由のため、全ての動物がそれまで症候性であったので、実験の範囲は６日目のｐ．ｉ．を越えなかった。
【０１３２】
結果
血漿中のプロテアソーム濃度
２種の異なるイムノアッセイを使用して、血漿中のプロテアソーム濃度を決定した。２０Ｓサブユニットに特異的な抗体に基づく市販のキットにより、２０Ｓプロテアソームを標準として使用して、正常血漿中０．６０±０．０７μｇ／ｍｌの濃度を得た。組み合わせたモノクローナル２０Ｓおよび１９Ｓ抗体を使用した、本明細書において開示した試験で、対応する値は、０．４１±０．０３μｇ／ｍｌであった。これらの試験の両方において、モノクローナル抗２０Ｓα６を捕獲抗体として使用した。抗分泌ペプチド配列を認識する、抗ＡＦ１抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））を捕獲のため使用するとき、インタクトな２６Ｓプロテアソームへの結合はなかった。
【０１３３】
加工穀類の摂取後のアガロース分離したＡＦ１濃度の上昇
従前の研究は、ＡＦ１、ならびにＣ３ｃが、特別加工穀類（ＳＰＣ）の消費後、アガロースゲルに結合することを示した。６人のボランティア由来のアガロースろ過した血漿の本研究において、このことを確認した。図１ａは、対照の人１〜３における明らかなＡＦ１値を示さず、一方、人４〜６は、２カ月より長くＳＰＣを食した後、有意に高いＡＦ１力価を有した。
【０１３４】
加工穀類によるＡＦ１−反応性プロテアソーム／補体Ｃ３複合体の誘導
血中のプロテアソームと補体因子Ｃ３との間の反応が存在するかどうかを試験するために、２種の新しいＥＬＩＳＡアッセイを開発し：プロテアソーム成分ＡＦ１に特異的なモノクローナル抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））を、捕獲抗体として利用し、一方、Ｃ３ｃに特異的なポリクローナル抗体を検出抗体として使用した。これは、血漿においてプロテアソームとＣ３との結合を直接測定することを可能にした。図１ｂにおいて見られる通り、被検人４、５、および６由来の３つの試料は、対照の人１、２、および３由来のものより８〜１１倍大きい力価であった。その高感度に起因し、血液１００μｌというわずかな試料が、試験を行うのに十分である。
【０１３５】
アガロースゲルによるプロテアソーム／補体Ｃ３複合体のＡＦ１曝露の誘導
血漿プロテアソームおよび因子Ｃ３に対するアガロースの影響を試験するために、血漿をアガロースゲルと４時間、３７℃にてインキュベーションした。アガロースによる、ＡＦ１曝露プロテアソームおよびＣ３の凝集の実質的な増大を、全６人の被検人において観察した（表１）。ウエスタンブロットにより分析したとき、Ｃ３の同時分割は明らかであった（図２、列５）。αバンドをＣバンドに加水分解し、これは、Ｃ３のＣ３ｃへの変換の典型であった。加えて、対照血漿の２つを、ＳＰＣ試験血漿と比較したとき（図２、列１〜４）、ペプチドパターンの差も観察した。ＳＰＣ血漿は、Ｃ３のものを超える分子量のｃ領域とａ領域の両方において余分なバンドを有した。
【０１３６】
ＡＦ１曝露プロテアソーム／Ｃ３複合体の部分的精製
プロテアソーム−Ｃ３複合体の部分的精製を、マトリックス結合プロテアソーム抗体への親和性により達成した。アガロースにより刺激した、および硫酸アンモニウム沈殿した血漿を、マトリックスに結合し、これを洗浄後、ウエスタンブロットにより、Ｃ３ならびにプロテアソームを含有することを示した（図３）。クーマシー染色したゲルバンドを切り出すこと、およびトリプシン消化したバンドをＭＳ／ＭＳにおいて実行することにより、Ｃ３の含有量を確認し；Ｃ３のα−およびβ−バンドは、ウエスタンブロットにおけるものに対応する位置の最初のバンドとして出現した。
【０１３７】
補体ＨおよびＩの血液レベル
補体因子ＩおよびＨにより、Ｃ３ｃの形成を達成した。それ故に、これらの補体因子について、６つの血漿試料においてそれを試験した。表２において示す通り、対照対試験血漿におけるこれらの化合物のレベルの差は存在しなかった。
【０１３８】
ラットにおける単純ヘルペスウイルス２型によるプロテアソーム／補体複合体の誘導
ラットモデルにおいて、プロテアソーム／補体因子複合体形成に対する単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）の影響を試験した。それらが神経学的機能障害の症状、すなわち、反復性、常同運動および運動不安定を示し始めたとき、鼻腔内に負荷した４日後に、ラットを試験した。多数のプロテアソームモノクローナル抗体を、捕獲抗体として、補体因子３および４に対する抗体を検出抗体として試験した。図６において見られる通り、感染後の血液および髄液において、プロテアソーム／Ｃ３複合体の有意な上昇を示した。また、ＨＳＶ１感染後、プロテアソーム／Ｃ４複合体の有意な上昇を示した（図７）。
【０１３９】
しかしながら、ＡＦ１抗体（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））は、ＡＦ１エピトープが、インタクトな２６Ｓプロテアソームにおいてと同様隠れたままである、ＨＳＶ１により誘導される複合体と反応しなかった（示していない）。
【実施例２】
【０１４０】
ＳＰＣ食後の血漿のプロテオームの変化の調査
目的：抗分泌因子（ＡＦ）は病理学的体液分泌および炎症を阻害する。細菌のエンテロトキシンを負荷後、増大したＡＦ活性を有する変化した形態の誘導が続いた。ＡＦのこの形態を、「活性なＡＦ」と命名し、特別加工穀類、ＳＰＣの摂取後、増大もした。不活性な形態から活性な形態への移行に影響する分子現象は、曖昧なままであった。
【０１４１】
この研究の目的は、ＳＰＣ食後の血漿のプロテオームの変化を調査することであった。
【０１４２】
研究方法および手法：
少なくとも４週間のＳＰＣの摂取前および後に、ヒトボランティアから、血漿試料を採取した。アガロース精製後の血漿の変化を、２Ｄ  ＤＩＧＥおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、続いて、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを使用することにより、分析した。ＳＰＣ食の４日、７日後、および終了の１週間後に、血漿において、上方制御したタンパク質についての時間コースをその後研究した。
【０１４３】
結果。ＳＰＣ食の６週後、アガロース精製したヒト血漿において、補体因子Ｃ３ｃのレベルは有意に上方制御された（ｐ＝０．００３９）。Ｃ３ｃレベルの増大は、ＡＦ活性のレベルの上昇と関連した。ＳＰＣ摂取後、アガロース精製した血漿において、制御因子ＨおよびＣ４も上方制御された。ＡＦ誘導は、４日目において、Ｃ３の有意な増大（ｐ＝０．００７７）についてだが、ＡＦ活性（ｐ＝０．３１）についてのＳＰＣ摂取の４日間と比較して、７日後有意にまず至った（ｐ＝０．００１１）。アガロース精製後、血漿において、上方制御されたＣ３ｃのみを検出した。
【０１４４】
結論：補体系の具体的に確認した変化は、刺激に応答した血漿におけるＡＦ活性の増大の背景にある機序に関与するように見える。
【０１４５】
本研究は、ヒトアガロース精製した血漿におけるＡＦ活性の増大の背景にある機序における補体系の関与を示唆する、上方制御された発現タンパク質を、ＳＰＣ刺激に対する応答として同定するための、プロテオミクス分析、２次元蛍光差ゲル電気泳動（２Ｄ  ＤＩＧＥ）、およびナノフロー液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を含む。
【０１４６】
材料および方法
研究の第１部：プロテオミクス分析
血漿−ＡＦの調製
親和性クロマトグラフィーを使用して、血漿からＡＦを精製した（１０）。簡単に言うと、血漿をφ０．９ｃｍのアガロースカラム（セファロース６Ｂ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）に通し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、アガロースに吸着したＡＦを、１Ｍメチル−α−Ｄ−グルコシドで溶出し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１４７】
２Ｄゲル電気泳動
ＳＰＣ摂取前、および４週間後、３人の個人から引き出したアガロース精製した血漿試料を採取した。その後、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、続いて、２次元（２Ｄ）電気泳動で分析した。２Ｄ試料溶液における懸濁前に、２Ｄ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を精製した。製造元の指示に従い、ＩＰＧｐｈｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＩＥＦを行った。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ乾燥ストリップゲル（７ｃｍ  ｐＨ３〜１０）を、２％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）、０．３％ＤＴＴ（ｗ／ｖ）、８Ｍ尿素、０．５％担体両性電解質溶液（ｖ／ｖ）を含有する溶液１２５μｌ、および２Ｄ試料溶液中の試料血漿１００μｌにおいて一晩水和させた。５００Ｖにて３０分間、１０００Ｖにて３０分間、および５０００Ｖにて１．５時間、ＩＥＦを行った。２Ｄ分離に先立ち、平衡バッファー（１．５Ｍ  トリス−ＨＣＬバッファー中の６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１％ＤＴＴ、および０．００１％ブロモフェノールブルー、ｐＨ８．８）２．５ｍｌにおいて１５分間、ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ乾燥ストリップゲルストリップを浸漬した。１０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において２Ｄウェルに、ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ乾燥ストリップゲルストリップを置き、製造元の指示に従い、実施した。ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ゲルを染色するか、またはＰＶＤＦ膜にブロットした。ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、４℃にて１６時間、膜をブロッキングした。次いで、Ｄａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の１次ポリクローナル抗Ｃ３ｃ（１／２５０００希釈）を膜に加え、１．５時間インキュベーションした。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）、続いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、および４−ニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、ブロットを展開した。
【０１４８】
タンパク質消化およびペプチド抽出
銀染色したゲル片を切り出し、製造元のプロトコール（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、脱染色した。銀脱染色後、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら（２０）により記載された、トリプシンでのゲル内タンパク質消化方法を、いくつかのマイナーな改変で適用した。簡単に言うと、ゲル片を、５０％ＣＨ３ＣＮ中の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３において３回洗浄し、５０％ＣＨ３ＯＨ中の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３にて１回洗浄した。真空遠心機において、ゲル片を乾燥させ、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｎｇ／μｌトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）と３７℃において一晩インキュベーションした。７５％ＣＨ３ＣＮ／２％ｚＴＦＡを加えることにより、ペプチドをまず抽出し、続いて、５０％ＣＨ３ＣＮ／０．２％ＴＦＡにおいてさらに抽出した。プールした抽出物を、真空遠心機にて蒸発乾固して、ＭＳ分析に先立ち、０．２％ＨＣＯＯＨ１８μｌに再構成した。
【０１４９】
ナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびタンパク質同定
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に接続した、ＨＴＣ−ＰＡＬ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＡＧ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、３マイクロタイターの試料注射を作製した。プレカラム（４５×０．０７５ｍｍ  ＩＤ）に、ペプチドをトラップさせ、逆相カラム（２００×０．０５０ｍｍ  ＩＤ）にて分離した。３μｍのＲｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ粒子と一緒に、両方のカラムを社内でパックした。約１００ｎｌ／分までの分割により、分析カラムを通じた流れを低減した。ペプチドの分離のため、０．２％ＣＯＯＨ中３７分の勾配１０〜５０％ＣＨ３ＣＮを使用し、さらに５分間８０％Ｂにおいて保持した。７Ｔ  ＩＣＲ  ｍａｇｎｅｔ（ＬＴＱ−ＦＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を装着したハイブリッド線形イオンｔｒａｐ−ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計にて、ナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。ＭＳ／ＭＳモードに自動的にスイッチする、データに依存したモードで、分光計を操作した。ＦＴ−ＩＣＲにおいて、ＭＳ−スペクトルを取得し、一方、ＬＴＱ−ｔｒａｐにおいて、ＭＳ／ＭＳ−スペクトルを取得した。ＦＴ−ＩＣＲのそれぞれのスキャンのため、衝突により誘導される解離により、線形イオントラップにおいて、６つの最大強度の２倍または３倍荷電したイオンを連続して断片化した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した同定のため、ＭＳ生データファイルを使用した。２０１４年７月にダウンロードした（分類後、２０２６５種の配列を含有する）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した、ＭＡＳＣＯＴ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＴＤ．、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で、１回のデータベース検索を行った。検索パラメーターを：Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｈｕｍａｎ、ＭＳ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ５ｐｐｍ、ＭＳ／ＭＳ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ０．５Ｄａに設定し、トリプシンによる１つの失敗した切断が、システインの固定されたプロピオンアミド修飾、および可変修飾としてのメチオニンの酸化を可能にした。
【０１５０】
タンパク質同定のため、最小判断基準を、ＭＡＳＣＯＴにより与えられる９５％またはそれ以上のレベルの信頼で一致する少なくとも２つのトリプシンペプチドに設定した。
【０１５１】
研究の第２部：補体の立体構造
対象および研究設計
３人の健常ボランティアが、研究の第２部に参加した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇのヒト倫理委員会が、実験の手法を承認した（Ｄｎｒ．０３７−１４）。全てのボランティアは、体重１ｋｇおよび１日当たり１ｇの用量のＳＰＣ（ＡＳ−Ｆａｋｔｏｒ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を経口摂取した。３週間の期間、ＳＰＣ摂取を、１２時間毎に２回の給仕に分けた。開始前、４日および７日後に、それぞれのボランティアから、血漿試料を引き出した。ＳＰＣ食の終了の１週間後、最後の試料を引き出した。１０００×ｇにて５分間遠心分離後、血漿試料を、アルセバークエン酸バッファー（１／２）と混合した。セクション「血漿−ＡＦの調製」において上記した通り、その後、ＡＦを精製した。
【０１５２】
免疫原性ＡＦ活性のＥＬＩＳＡ試験
従前に記載される通り、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、血漿中のＡＦの含有量をアッセイした。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、親和性精製した血漿でコートし、１／２希釈し、その後、１／３連続希釈し、次いで、４℃にて一晩インキュベーションした。ＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡで、４５分間、３７℃にてブロッキング後、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄した。（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．２％ＢＳＡ中１／１００希釈した）ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、３Ｈ８（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１の下、ＤＳＭＺに寄託されている、ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ハイブリドーマ細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３））を加え、プレートを２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。洗浄後、ＡＰコンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリンＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）を、１時間ＲＴで加えた。洗浄後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むジエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）中の基質４−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ  ＡＢ）をプレートに加え、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより、結合した酵素を明らかにした。モノクローナル培養培地をバックグラウンドとして使用し、値を引いて、正味の吸光度を得た。
【０１５３】
補体因子のＥＬＩＳＡ検出
ＳＰＣ摂取後、補体系に対する効果を研究するために、親和性精製したヒト血漿試料における７つの補体因子のレベルを、セクション「免疫原性ＡＦ活性のＥＬＩＳＡ試験」において記載したものと同一の手法でＥＬＩＳＡにより決定した。検出抗体として、本発明者らは、Ｄａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のウサギ抗Ｃ３ｃ（１／２０００希釈した）および抗Ｃ４ｃ（１／１０００希釈した）を使用していた。マウス抗Ｃ２および抗Ｃ５（１／２００希釈した）、ヤギ抗Ｃ１ｑおよび抗Ｃ６（１／２００希釈した）、ならびにウサギ抗因子Ｈ（１／２００希釈した）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。次いで、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはロバ抗ヤギのＡＰコンジュゲート２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）を適用した（１／１００００希釈した）。前免疫血清をバックグラウンドとして使用し、値を引いて、正味の吸光度を得た。
【０１５４】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット
ＳＰＣ摂取の前および後に引き出した血漿試料において、Ｃ３ｃの含有量を決定し、Ｃ３ｃをまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、ニトロセルロース膜への免疫ブロットにより、血漿のアガロース精製前および後に分析した。続くインキュベーションは、セクション「２Ｄゲル電気泳動」において上述したウエスタンブロットアッセイについてと同一であった。
【０１５５】
統計的分析
平均の平均±標準偏差（ＳＥＭ）として、データを表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉａｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＳＰＣ摂取の前および後に試料を比較した。一元ＡＮＯＶＡおよびｔ−検定を使用することにより、統計的有意を決定した。ｐ値≦０．０５を有意であるとみなした。
【０１５６】
結果
ＡＦの誘導後のアガロース精製した血漿におけるタンパク質の２Ｄ分析
３〜１０のｐＨ範囲において、これらの血漿試料においてＡＦ活性の増大をもたらしたＳＰＣの摂取の前および４週間後に３人の個人から採取した精製した血漿試料にて、２Ｄ分離を行った。試料の２つの群の間でのタンパク質発現レベルを比較することにより、銀染色したゲル上の別個のスポットが、ＡＦの誘導後、等電点４．８および約４３ｋＤａの分子量の領域で明らかであった（図８）。
【０１５７】
ＭＳ分析
ゲルから選択した血漿タンパク質スポットの同定を、２Ｄ  ＤＩＧＥ、続いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより行い、結果を、表３において要約した（図９）。ケラチンおよびトリプシンのような、明らかな混入したタンパク質の除去後、２つのタンパク質が、独自性のリストに残っていた。それらは、補体Ｃ３前駆体（スコア１５８１．２０）およびヒートショックプロテインＨＳＰ９０−ベータ（スコア１０３．１８）を含んだ。ＨＳＰは、２つの割り当てたペプチドのみを有するウシ供給源のものであるので、ヒト補体Ｃ３前駆体は、１４種の固有のペプチドとの、アガロース精製した血漿において最も関連する同一性であり、＞９５％信頼を示している。ペプチドは、１６６３全長タンパク質のアミノ酸１３３１から出発してアミノ酸１５９９までの、Ｃ３前駆体配列のＣ末端部分における全ての一致するアミノ酸であった。選択したタンパク質スポットは、約４３ｋＤａおよびｐＩ４．８の領域にあり、分析したタンパク質は、最も好ましくは、Ｃ３のＣ３ｃα鎖断片２への分割産物である。
【０１５８】
ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡによるプロテオミクス同一性Ｃ３ｃの検証
銀染色した２Ｄゲルから同定したスポットを確認するために、Ｃ３ｃ抗体を使用したウエスタンブロットにより、Ｃ３ｃの発現を分析した。図１０において示す通り、抗体は、ＳＰＣ食後に引き出した、アガロース精製した血漿に反応し、これは、予測Ｃ３ｃα鎖がＣ３から切断されたことを示している、等電点４．８および分子量４３ｋＤａのドットを含む。抗体は、スメアー染色で、等電点６．８のＣ３の７５ｋＤａのβバンドも一緒に検出し、これは、タンパク質の化学修飾を示している。ヒトのアガロース精製した血漿試料におけるＣ３ｃの上方制御も、ＥＬＩＳＡ決定により確認した。図１１において示す通り、ＳＰＣ摂取の６週間後に、ＡＦにより誘導した試料において、Ｃ３ｃの有意な増大を検出した（ｐ＝０．００３９）。
【０１５９】
ＳＰＣの摂取後の血漿におけるＡＦ活性
研究の第２部において、本発明者らは、ＳＰＣ食後の結果を継続して分析した。ＳＰＣ刺激の効果を評価するために、ＡＦ  ｍＡｂ  ３Ｈ８（ＡＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、細胞培養物２３４１由来の３Ｈ８（＝３Ｈ８Ｂ３）＝ＤＳＭ  ＡＣＣ３２７１）で、アガロース精製した血漿におけるＡＦ活性のレベルを決定した。図１２Ａにおいて示す通り、対照血漿と比較し、ＳＰＣ摂取後の吸光度は、アッセイにおいて首尾よく増大した。活性なＡＦの血漿レベルにおける有意な増大を、ＳＰＣの７日後に誘導した（ｐ＝０．００１１）。ＡＦ活性は、食事の終了の１週間後でさえ、継続して有意に増大した（ｐ＝０．００２３）。
【０１６０】
Ｃ３ｃのおよび他の補体因子についてのＥＬＩＳＡ決定
さらなる補体因子を調査するために、Ｃ３ｃに加え、アガロース精製血漿にてＥＬＩＳＡを行った。Ｃ３ｃと一緒に、７つの補体因子を試験して、ＳＰＣの摂取後の補体系への影響を決定した。３つの因子、Ｃ３ｃ、Ｃ４ｃおよび因子Ｈは、ＡＦ誘導後、アガロース精製血漿においてレベルの増大を示した（図１２Ｂ、Ｃ、Ｄ）。ＡＦ誘導が、ＳＰＣ食の７日後有意に達した（図１２Ａ）一方、補体因子の血漿レベルの有意な増大を、４日後に既に誘導した（ＡＦについてのｐ＝０．３１と比較して、Ｃ３ｃについてｐ＝０．００７７、Ｃ４ｃについてｐ＝０．０１１、および因子Ｈについてｐ＝０．００４２）。Ｃ３ｃの平均値はまた、ＳＰＣ終了の１週間後、継続して有意に増大した（ｐ＝０．０４７５）。
【０１６１】
試料のいずれかにおけるＣ１ｑ、Ｃ２、Ｃ５、またはＣ６を試験するＥＬＩＳＡにおいて、差は見られなかった。
【０１６２】
直接の血漿およびアガロース精製血漿におけるウエスタンブロット分析
アガロース精製前および後に、補体因子Ｃ３ｃに対する抗体を使用したウエスタンブロットにより、研究由来の血漿試料を試験した。試料はまた、ＳＰＣ摂取の前および後に採取した血漿も含み、これは、ＡＦ活性の増大の決定を伴った。図１３、レーン１および２において示す通り、分離した直接の血漿試料に対する抗Ｃ３ｃ反応において、目に見える差は存在しなかった。いくつかのタンパク質バンドを検出した抗体は、公知のＡＦ誘導にも関わらず、同一の方法で、補体Ｃ３前駆体に起源をもつ。対照的に、ＳＰＣ食後採取した試料においてのみ、Ｃ３ｃに対する抗体が、アガロース精製血漿にて反応し、これは、Ｃ３の２つの鎖Ｃ３ｃαおよびβバンドを検出している（図１３、レーン４）。
【０１６３】
考察
内在性ＡＦの活性化が、エンテロトキシンの腸内曝露に対する天然の応答として生じるか、またはある種の食品の成分、すなわち、ＳＰＣの摂取により模倣される。ＡＦの活性化ステップの背後にある分子現象の研究において、それは、プロテオミクスアプローチ；２Ｄ  ＤＩＧＥ、続いて、上方制御したタンパク質発現のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる同定を使用した、ＳＰＣ摂取後の調査したアガロース精製血漿であった。ＳＰＣ食の摂取前および後の、アガロース精製血漿タンパク質の分析は、補体因子Ｃ３ｃα鎖断片２として同定したＡＦにより誘導した試料におけるスポットを明らかにした。ＳＰＣ後、増大したＣ３ｃの所定の結果を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにおける特異的抗体反応を示すことにより、血漿試料において確認した。本発明者らは、誘導したＡＦレベルが、ＳＰＣの投与量ならびに摂取の期間と関連することを従前に示した。本研究において、７つの補体系タンパク質に対するＳＰＣの影響を調査した。アガロースの補体タンパク質Ｃ３ｃ、因子ＨおよびＣ４ｃへの結合の有意な増大は、ＳＰＣ摂取の４日後に既にみられた。ＡＦの活性化の傾向を、４日後に決定したが、レベルの有意な増大を、ＳＰＣ食の７日後に検出した。従前の研究は、ＡＦが、食事の２週間後に増大したことを示した。差は、ＳＰＣ摂取の開始の数日後に採取した試料を欠く、異なる研究設計によるものであった。
【０１６４】
結果は、ＳＰＣの摂取が、補体系の因子Ｃ３およびＣ４を不活性化することを示す。この系におけるいくつかの因子は、自然および適応免疫の重大な成分であり、ＡＦ活性化中の注目すべき抗炎症反応を結果的に説明する。補体系はまた、代替機能に含まれることも提案され、これは、それが、その炎症性の役割と異なる、多様な生物学的プロセスにおける重要な役割を有することを示している。例えば、正常妊娠は、血漿補体成分の増大と関連する。
【０１６５】
Ｃ３は、Ｃ３ｃ、Ｃ３の生理学的下方制御産物への最終形態の脱活性化における連続するタンパク質分解により、活性化断片への巨大な構造上の変化を経験することにより、その活性化を通じて補体系において中心的な役割を果たす（２３）。
【０１６６】
Ｃ３のＣ３ｃへの分割は、タンパク質分解性補体因子Ｉを補因子として因子Ｈと関与させることは、従前に示された。因子Ｈの早期増大は、この研究において、補体系の下方制御として見られることを示した。この反応は、宿主細胞を損傷から最終的に保護し、これは、無制限の補体活性化から生じる。同時に、Ｃ４は、因子ＩおよびＨによりＣ４ｃに下方制御される。
【０１６７】
この研究において、アガロースにて最初に親和性精製し、α−メチルグルコシドで溶出した血漿を分析するとき、ＡＦと一緒の補体Ｃ３ｃを同定した。本発明者らは、ＳＰＣ摂取後、直接の血漿におけるウエスタンブロットにより、Ｃ３ｃ増大を検出することができなかった。
【０１６８】
結論
この研究は、ＡＦの活性化の背後にある機序を記載する、新しい基礎を提供する。ＳＰＣ食後の２Ｄ分離した血漿は、活性化ＡＦの増大に先行する、補体Ｃ３ｃの早期上方制御を示した。結論として、補体系における特定の立体構造の変化が、それ故に、ＡＦ活性化中の第１のステップである。
【０１６９】
参考文献
1.  WO 97/08202
2.  WO 05/030246
3.  WO 97/08202
4.  WO 97/08202
5.  WO 98/21978
6.  WO 00/038535
7.  WO 05/030246
8.  WO 07/126364
9.  WO 07/126363
10.  WO 07/126365
11.  WO 2010/093324
12.  Lange et al., 2003; Food-induced antisecretory factor activity is correlated with small bowel length in patients with intestinal resections. APMIS. 2003 Oct; 111(10):985-8.
13.  Laurenius et al., 2003; Antisecretory factor counteracts secretory diarrhoea of endocrine origin. Clin Nutr. 2003 Dec; 22(6):549-52.
14.  Jennische et al., 2006; Immunohistochemical staining patterns using epitope-specific antibodies indicate conformation variants of antisecretory factor/S5a in the CNS. APMIS. 2006 Jul-Aug; 114(7-8):529-38.
15.  Tomko, R.J., Jr. and M. Hochstrasser, Molecular architecture and assembly of the eukaryotic proteasome. Annu Rev Biochem, 2013. 82: p. 415-45.
16.  Sixt, S.U. and B. Dahlmann, Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin - incidence and relevance. Biochim Biophys Acta, 2008. 1782(12): p. 817-23.
17.  Johansson, E., I. Lonnroth, S. Lange, I. Jonson, E. Jennische, and C. Lonnroth, Molecular cloning and expression of a pituitary gland protein modulating intestinal fluid secretion. J Biol Chem, 1995. 270(35): p. 20615-20.
18.  Bjorck, S., I. Bosaeus, E. Ek, E. Jennische, I. Lonnroth, E. Johansson, and
S. Lange, Food induced stimulation of the antisecretory factor can improve symptoms in human inflammatory bowel disease: a study of a concept. Gut, 2000. 46(6): p. 824-9.
19.  Lange, S. and I. Lonnroth, The antisecretory factor: synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol, 2001. 210: p. 39-75.
20.  Johansson, E., I. Lonnroth, I. Jonson, S. Lange, and E. Jennische, Development of monoclonal antibodies for detection of Antisecretory Factor activity in human plasma. J Immunol Methods, 2009. 342(1-2): p. 64-70.
21.  Johansson, E., M. Al-Olama, H.A. Hansson, S. Lange, and E. Jennische, Diet-induced antisecretory factor prevents intracranial hypertension in a dosage-dependent manner. Br J Nutr, 2013. 109(12): p. 2247-52.
22.  Nilsson, S.C., R.B. Sim, S.M. Lea, V. Fremeaux-Bacchi, and A.M. Blom, Complement factor I in health and disease. Mol Immunol, 2011. 48(14): p. 1611-20.
23.  Nicolas, V. and V. Lievin-Le Moal, Antisecretory peptide AF-16 inhibits the
Sat toxin-stimulated transcellular and paracellular passages of fluid in cultured human enterocyte-like cells. Infect Immun, 2014.
24.  Matson Dzebo, M., A. Reymer, K. Fant, P. Lincoln, B. Norden, and S. Rocha, Enhanced cellular uptake of antisecretory peptide AF-16 through proteoglycan binding. Biochemistry, 2014. 53(41): p. 6566-73.
25.  DeMartino, G.N., Purification of PA700, the 19S regulatory complex of the 2
6S proteasome. Methods Enzymol, 2005. 398: p. 295-306.
【図１】
0006454360.tif 000002
【図２】
0006454360.tif 000003
【図３】
0006454360.tif 000004
【図４】
0006454360.tif 000005
【図５】
0006454360.tif 000006
【図６Ａ】
0006454360.tif 000007
【図６Ｂ】
0006454360.tif 000008
【図６Ｃ】
0006454360.tif 000009
【図７】
0006454360.tif 000010
【図８】
0006454360.tif 000011
【図９】
0006454360.tif 000012
【図１０】
0006454360.tif 000013
【図１１】
0006454360.tif 000014
【図１２】
0006454360.tif 000015
【図１３】
0006454360.tif 000016
【図１４Ａ】
0006454360.tif 000017
【図１４Ｂ】
0006454360.tif 000018
【図１４Ｃ】
0006454360.tif 000019
【図１４Ｄ】
0006454360.tif 000020
【図１５】
0006454360.tif 000021
【配列表】
0006454360000001.app