(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットであって，
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【請求項２】
請求項１に記載の検出キットであって，
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の検出キットであって，
配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドであるプローブを，更に有する
検出キット。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【請求項４】
請求項３に記載の検出キットであって，
前記プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有する検出キット。
５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の発現検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の発現検出方法であって，前記対象動物は，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である，方法。
【請求項７】
請求項５に記載の発現検出方法であって，前記対象動物は，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である，方法。
【請求項８】
請求項５に記載の発現検出方法であって，移植されたヒト細胞の前記対象動物における発現分布を検出する，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，検出キット，及び検出方法に関する。より詳しく説明すると，本発明は，ヒト以外の実験動物において移植等したヒト細胞がどのように分布しているかを検出するための生体分布の検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開ＷＯ２０１３−０６９６６１号パンフレットには，ｉＰＳ細胞を用いた細胞シートが開示されている。このようにｉＰＳ細胞など幹細胞を移植する試みがなされている。この場合，移植片の安全性を評価する必要が生ずる。このため，人体実験に先立って，動物実験が行われる。その場合，移植した細胞が，実験動物の生体内においてどのように分布したか評価することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３−０６９６６１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の技術では，ｉＰＳ細胞などヒト由来の移植片に由来して発現した細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるかを判別することが困難であった。特に，マカク属に細胞を移植した場合，移植片に由来して発現した細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるか判別することが困難であった。
【０００５】
そこで，本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植や発現等させた場合に，ヒト細胞の発現を検出するための検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【０００７】
フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【０００９】
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
【００１０】
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の発現検出方法に関する。
【００１１】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。
【００１２】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。
【００１３】
この発現検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における発現分布を検出する方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植や発現等させた場合に，ヒト細胞の発現を検出するための検出キットを提供できる。
また，本発明は，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図２】図２は，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図４】図４は，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【図８】図８は，比較例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。この検出キットは，ヒト細胞が発現したか否か，すなわちヒト細胞の分布を検出することに好ましく用いることができる。また，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の検出キットは，マカク属に属するヒト以外の動物において，ヒト細胞を移植等した際に，ヒト細胞が発現したか否かを適切に評価できる。本発明の検出キットは，プライマーを含むため，例えば，ＰＣＲなど公知の核酸増幅法を用いて発現を分析できる。ＰＣＲ自体やＰＣＲを行うための装置は，公知であるから，公知のＰＣＲ法などの核酸増幅法において，本発明の検出キットを用いることができる。
【００１７】
各プライマーセットを用いた増幅反応の結果を確認するには，公知の様々な検出方法を利用することができる。増幅反応を確認する方法の例は，アガロースゲル電気泳動法，ポリアクリルアミド電気泳動法，フラグメント解析法及び蛍光物質による検出方法である。
【００１８】
核酸増幅方法の例は，ＰＣＲの他，ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻，第９１頁（１９９１）），ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報，及び特開平２−２９３４号公報），ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻，第１６９１頁（１９９２）），ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報），ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第３１巻，第３２７０頁（１９９３））である。
【００１９】
ＰＣＲ法は，試料核酸，４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸，一対のオリゴヌクレオチド，及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で，変性，アニーリング，伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより，上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。変性工程で試料の核酸を変性し，続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと，それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ，続く伸長工程で，各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ，二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより，１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って，このサイクルをｎ回繰り返せば，理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので，電気泳動等の方法により容易に検出できる。
【００２０】
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
【００２１】
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１８〜２１塩基（１９〜２１塩基又は２０〜２１塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１９〜２２塩基（２０〜２２塩基又は２１〜２２塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマーは，ヒト由来のあるＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものと考えられる。「特異的にハイブリダイズする」とは，通常のハイブリダイゼーション条件下，好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば，サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ，  第２版，１９８９に記載の条件）において，他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
【００２４】
この検出キットは，上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーに加え，ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むものであってもよい。
【００２５】
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブは，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に標識が付加されてもよい。配列番号３で示される塩基配列中の連続する１２〜１５塩基（１３〜１５塩基又は１４〜１５塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【００２６】
標識の例は，蛍光化学物質による蛍光標識，発光団，酵素，蛍光蛋白質，発光蛋白質，磁性体，導電性物質，ビオチン，ハプテン，抗原及び抗体である。蛍光化学物質の例は，ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド，Ｃｙ３，及びＣｙ５である。発光団の例は，ルテニウムである。酵素の例は，アルカリフォスファターゼ及びペルオキシダーゼである。プローブのみならず，上記したフォワードプライマー及びリバースプライマーにも適宜標識が付されていてもよい。
【００２７】
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
５’末端及び３’末端のＦＡＭ及びＴＡＭＲＡは蛍光標識である。
【００２８】
本発明の検出キットを用いた検出方法は，標識の種類に応じて選択されればよい。例えば，プライマーとプローブが異なる蛍光化学物質で標識されている場合は，蛍光検出器，又はフローサイトメーターを用いることにより目的とする増幅核酸を検出することができる。さらに，ＦＲＥＴを利用することで，目的とする増幅核酸を検出してもよい。例えば，一方がビオチン，他方が蛍光化学物質や発光団により標識されている場合は，例えば，ビオチン標識を利用してハイブリッドの捕捉を行い，捕捉されたハイブリッドの標識を測定する方法などが考えられる。またビオチンと抗原等の両方が捕捉可能な物質の場合は，例えばアビジンを固定した通液フィルターでハイブリッドを捕捉し，次に酵素標識抗体を反応させ，当該酵素による発色もしくは発光基質を添加することによる発光を利用して検出することができる。
【００２９】
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の発現検出方法に関する。ヒト細胞の発現を検出するためには，上記において説明した各種の方法を適宜用いればよい。
【００３０】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。ヒトの幹細胞の例は，ヒトのｉＰＳ細胞であり，ヒトのｉＰＳ細胞シートであってもよい。対象動物は，形質転換されたヒト以外の動物であってもよい。さらに，対象動物は，ヒト細胞が投与されたヒト以外の動物であってもよい。
【００３１】
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。マカク属に分類される動物の例は，カニクイザルである。
【００３２】
この発現検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における発現分布を検出する方法である。この場合，対象動物の各部位から細胞を取り出して，本発明の検出キットを用いて，各部位においてヒト細胞が発現しているかを分析（例えば定量分析）すればよい。具体的に説明すると，移植片が移植された部位のみならず，その周辺や各種の器官から細胞を採取し，ヒト細胞が発現等しているか否か分析すればよい。
【００３３】
以下実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，上記した説明や，実施例に限定されるものではなく，当業者に公知な方法や条件を適宜採用することができる。
【実施例１】
【００３４】
カニクイザルまたはラットのゲノムＤＮＡ由来の増幅は起こらず，ヒトのゲノムＤＮＡを特異的に増幅できることを確認するため，ヒト，カニクイザル及びラットそれぞれのゲノムＤＮＡを５〜５００００コピー（１６．５ｐｇ〜１６５ｎｇ，ゲノムＤＮＡ  １コピー  ＝  ３．３ｐｇ換算）含む希釈系列を作製し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行った。
この際，フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号１及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
また，プローブとして，５’−ＦＡＭ−（配列番号３）−ＴＡＭＲＡ−３’で示されるものを用いた。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
【００３５】
ｑＰＣＲは，公知の装置を用いて行った。ｑＰＣＲ条件は，５０℃２分／９５℃１０分／（９５℃１５秒及び６０℃１分）を１サイクルとし，４０サイクル行うことを基本とした。
【００３６】
ラット及びカニクイザルのゲノムＤＮＡに市販のヒトゲノムＤＮＡを規定量（５〜５００００コピー）添加した希釈系列を作成し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行うことで，ヒトゲノムＤＮＡを特異的に検出できるか否かを評価した。バックグラウンド試料として，代表的な臓器である肝臓を使用した。具体的には，ラットやカニクイザルのゲノムＤＮＡをそれらの肝臓から抽出し，ｑＰＣＲ定量のバックグラウンド試料として用いた。
検量線を作成する際には，バックグラウンド試料を含まないヒトゲノムＤＮＡを使用し，ＰＣＲ増幅に対する影響の有無を確認した。その結果を図１〜図６に示す。
【００３７】
図１Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図１Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図２は，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図３Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図３Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図４は，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図５Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図５Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
図６Ａは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図６Ｂは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
【００３８】
増幅曲線において，縦軸（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）は，反応生産物量を示す。数値は蛍光量の対数で記載されたものである。理論上，（テンプレートの初期濃度×２のｎ乗）で増幅する。増幅曲線において，横軸（Ｃｙｃｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ）は，ＰＣＲ反応のサイクル数を示す。増幅曲線において，補助線（Ｔｒａｓｈｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ（図中の横線））は，指数関数的に増幅されている領域に引かれたベースラインである。補助線は，ユーザーが任意の場所に変更できるものである。増幅曲線において，Ｃｔ値は，補助線と増幅曲線との交点のサイクル数を示す。Ｃｔ値は，検量線作成や，サンプルの濃度推定に使用する数値である。
検量線において，縦軸（Ｃｔ値）はサイクル数を示す。Ｃｔ値は，増幅曲線のＣｔ値が使用される。検量線において，横軸（Ｌｏｇ  Ｃ０）は，検量（濃度）を対数表記したものである。既知濃度サンプルを検量線試料とすることで，未知のサンプル濃度を推定できる。
【００３９】
検量線試料より，５００００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１６．３±０．０６であり，５０００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１９．３±０．０７であり，５００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２２．７±０．０６であり，５０コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２６．４±０．１４であり，５コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝３０．１±０．１１であった。バックグラウンド試料中の各コピー数に応じたサイクル数は，カニクイザルでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０２，１９．３±０．１３，２２．８±０．１０，及び３０．１±０．１１であった。ラットでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０４，１９．４±０．０８，２２．８±０．１６，及び３０．２±０．１７であった。この結果，バックグラウンド試料存在下でもＰＣＲ増幅に影響なく，ヒトゲノムＤＮＡを定量できることが明らかとなった。
【００４０】
［比較例１］
フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これは，ヒトではマルチに存在し，マカク属には１００％一致する配列が存在しない領域であるＱ８ＩＸ６２＿１７−８３を選択的に増幅するプライマーセットである。この領域は，ヒト特異的な配列であり，ＤＵＦ１２２０配列とよばれるものである。また，プローブとして，５’末端及び３’末端がそれぞれＶＩＣ，及びＴＡＭＲＡで蛍光修飾された配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ｑＰＣＲの条件は，実施例１と同様とした。その結果を図７〜図９に示す。
【００４１】
配列番号４：５’−ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣ−３’
配列番号５：５’−ＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡ−３’
配列番号６：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＣＣ−３’
【００４２】
図７Ａは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図７Ｂは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図８は，比較例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ａは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ｂは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
【００４３】
図７から，ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で指数関数的増幅を示すことが確認された。
図８から，ラットＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で増幅がみられないことが分かった。
図９から，カニクイザルＤＮＡを鋳型として用いた場合には，５００００コピー（１６５ｎｇ）の濃度において，２８サイクル目（Ｃｔ＝２７．７±０．０５）から，増幅が検出された。ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合には，Ｃｔ＝１７．７±０．０４であり，これと比べると２×１０２の差が生じているものの，ヒトＤＮＡと同様に指数関数的な増幅が確認でき，定量分析を行うことができることがわかる。比較例では，ヒト及びカニクイザルといった霊長類特異性を確認することができたものの，ヒト特異的ではなく，マカク属を対象動物とした移植片等の分布評価には，適していないことがわかった。
【００４４】
本発明の検出キットを用いることで，ヒトＤＮＡのみを測定することができた。バックグラウンドに動物ＤＮＡが存在してもその特異性は変化することなく安定して測定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は，製薬産業，医療機器産業，及び医療診断産業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プローブ
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プローブ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
0006468555.tif 000014
【図９Ａ】
0006468555.tif 000015
【図９Ｂ】
0006468555.tif 000016
【配列表】
0006468555000001.app