(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
上記ポリペプチドは、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能な配列番号２を有している、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）の配列の断片を含んでおり、
上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドであって、
上記ポリペプチドは、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能な配列番号２を有している、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）の配列の断片を含んでおり、
上記ポリペプチドは、
配列番号２、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列、ならびに
当該アミノ酸配列のカルボキシル末端またはアミノ末端の少なくとも一方に結合されている少なくとも１つの核局在化配列
からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３】
上記核局在化配列が、ＫＲＫＲおよび／またはＫＫＥＫＫＫＳＫのアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号７、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のアミノ酸配列からなる群から選択される１つの配列からなることを特徴とする、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしていることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項５に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項６に記載の発現ベクターを少なくとも含んでいることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項８】
薬学的に許容可能な補助剤および／またはビヒクルのうち少なくとも１つをさらに含んでいることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの、酸化ストレスおよび／または細胞内ＤＮＡに対する損傷の増大によって引き起こされる疾患および／または障害の処置および／または予防のための薬学的組成物または薬剤の調製のための、使用。
【請求項１０】
上記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のアミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
酸化ストレスおよび／または細胞内ＤＮＡに対する損傷の増大によって引き起こされる疾患および／または障害の処置および／または予防のための薬学的組成物または薬剤の調製に用いられる、請求項５に記載のポリヌクレオチドの、使用。
【請求項１２】
酸化ストレスおよび／または細胞内ＤＮＡに対する損傷の増大によって引き起こされる疾患および／または障害の処置および／または予防のための薬学的組成物または薬剤の調製に用いられる、請求項６に記載の発現ベクターの、使用。
【請求項１３】
上記疾患または障害が、先天性異角化症、神経変性疾患、猫鳴き症候群、血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン染色体不安定症、ブルーム症候群、ウェルナー症候群、ファンコニー貧血、潰瘍性大腸炎、血管老化、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、がん、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、早老症、光過敏症、突然変異または外因性作用物質によって引き起こされる遺伝的不安定性、ハッチンソン−ギルフォード症候群、色素性乾皮症、ロトムンド−トムソン症候群、肺線維症、リウマチ様関節炎、および慢性炎症をともっている疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１４】
上記神経変性疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳性運動失調症および骨髄変性からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項５に記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクターの、組織工学および細胞培養における細胞の生存度を向上させるための、インビトロにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
ＧＳＥ２４．２に由来するペプチドは、酸化ストレスおよび／またはＤＮＡに対する損傷によって引き起こされるか、および／または当該酸化ストレスおよび／または損傷に関連している疾患および／または症状（例えば、炎症または細胞の老化）を処置するための、生物工学分野および薬学分野における用途を有する。
【０００２】
〔背景技術〕
ＧＳＥ２４．２は、テロメラーゼ複合体の一部であるタンパク質ジスケリンに対応しているペプチドである。ＧＳＥ２４．２は、病理的な状態および生理学的な状態においてテロメラーゼを再活性化可能であり；テロメラーゼ異常をともなっている疾患において、ＧＳＥ２４．２活性は、患者由来の細胞の生存度を向上させる。
【０００３】
国際特許出願：ＷＯ２００７／０９０９１１  Ａ１「SEQUENCE OF NUCLEOTIDES AND PEPTIDES GSE24.2 OF DYSKERIN, WHICH CAN INDUCE TELOMERASE ACTIVITY, METHOD FOR OBTAINING SAME, THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF」は、薬剤または薬学的組成物のいずれかにおいて、テロメラーゼ活性を再活性化するための、ＧＳＥ２４．２の使用を示している。この国際特許出願は、本来の機能的な構成単位として、５５アミノ酸の配列を特定している。本発明は、本来の配列に由来するサイズのより小さい新規ペプチド、ならびにその使用および用途（例えば、いずれも炎症性および細胞老化の過程に関与する、酸化ストレスおよびＤＮＡに対する損傷）を説明している。
【０００４】
さらに、本発明は、ＧＳＥ２４．２に由来するこれらのペプチドのバリアントを提供し、ここで、当該バリアントは、当該ペプチドが生物学的活性を発揮するはずの核への、より高率かつ良好な進入を可能にする核局在化配列を含んでいる。当該核局在化配列は、当該それらの効率を向上させ、５５アミノ酸の本来の配列を封入する必要性を低下させる。
【０００５】
〔発明の概要〕
（発明の簡単な説明）
本発明は、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減させるか、または減少させる化合物を提供し、この化合物は、ジスケリンのペプチドＧＳＥ２４．２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の断片に基づいており、当該断片は、正常細胞の酸化還元バランスに戻すことおよび／または細胞ＤＮＡに対する損傷を校正可能である。したがって、本発明は、細胞内の酸化ストレスおよび／またはＤＮＡの構造に対する損傷の増大をともなう疾患（例えば、動脈硬化、パーキンソン病、筋痛性脳症、アルツハイマー病、血管拡張性運動失調症、先天性異常角化および老化）の処置のための新たな治療手段を提供するという課題に対処する。
【０００６】
本特許は、完全配列およびすでに公知の断片より高い生物学的な活性を有している、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）の内部配列を説明しており；さらに、それらの活性を向上させるために、細胞によるそれらの内部移行を向上させること、および細胞核におけるそれらの存在を促進することによって、上記ペプチドの活性をさらに向上させる核輸送配列が、追加されている。
【０００７】
ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１の配列を有している）および由来ペプチドは、これまで説明されていない生物学的な活性（例えば、細胞によるフリーラジカル含有量の低下）を有しており、したがって、酸化ストレス、および認識機構における変異によって引き起こされるＤＮＡに対する構造的な損傷を低減させる活性を有しており；これはすべて、上述の影響を引き起こす種々の作用因子に曝された細胞の生存度を向上させる。この活性は、いくつかの病状（例えば、血管拡張性運動失調症および先天性異常角化）において、調べられているが；これはまた、神経変性疾患、筋肉退化（デュシェンヌ型ジストロフィー）、プロジェロイド症候群、光過敏症、または変異もしくは外来性の作用因子によって引き起こされる遺伝的不安定性におけるその適用に可能性をもたらしており；すべての用途は、このペプチドについてこれまで説明されていない。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明の基礎は、本発明者らが、ヒトの種々の疾患に存在しているか、または作用因子（例えば、放射線または遺伝毒性物質）に対する曝露から生じる、フリーラジカルのレベルおよびＤＮＡに対する損傷を低減させるための、ＧＳＥに２４．２由来するペプチドの能力を調べていることにある。したがって、ＧＳＥに２４．２由来する本発明のペプチドおよびＧＳＥ２４．２自体は、ＤＮＡに対する損傷の蓄積もしくはフリーラジカルの増加を原因とするか、またはＤＮＡに対する損傷の蓄積もしくはフリーラジカルの増加をともなう、これらのすべて疾患（例えば、促進老化の疾患（例えば、ウェルナー症候群、ハッチンソン−ギルフォード症候群）；認識機構およびプロセッシング機構における変異によって引き起こされるＤＮＡに対する損傷がある疾患（例えば、血管拡張性運動失調症、色素性乾皮症、ロトムンド−トムソン症候群、ナイミーヘン染色体不安定症候群）；神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病など）；筋肉退化をともなう疾患（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管疾患または肺疾患（例えば、肺線維症、動脈硬化）；それらの病態に主要な炎症性の成分をともなっている疾患（例えば、リウマチ様関節炎））に適用され得る。また、これらのペプチドの用途は、組織工学および細胞培養に関する用途、ならびに他の生物工学的な用途を包含している。また、これらのペプチドは、化粧品産業（例えば、皮膚における老化によって引き起こされる損傷の処置など）における用途を有し得る。
【０００９】
本発明者らは、細胞に進入する能力および本来のペプチドより高い生物学的な活性を有している、ＧＳＥ２４．２（配列番号１）に由来する小さいサイズのペプチドを生成しており、ＧＳＥ２４．２の完全配列を発現している細菌の細菌溶解物においてそれらを同定している。これらの溶解物は、これらの配列の同定に先立って、ＨＰＬＣによって分析された。ＧＳＥ２４．２の他に５つのペプチドが、溶解物において同定され、これらの配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に一致していた。
【００１０】
表１は、配列および本発明に記載されているペプチドとの対応の一覧を示す。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
細菌溶解物において同定されたペプチドの生物学的な活性は、ＤＮＡの損傷修復試験において詳細に調べられた。これらのうち、ＴＲＵＢＬドメインに含まれているペプチドＧＳＥ４（配列番号２）は、完全なドメイン（配列番号４、ＧＳＥ２）の活性およびＧＳＥ２４．２の活性を大きく向上させ；この活性は、カルボキシル末端位置（Ｎ末端位置ではない）における核局在化のための配列の挿入によって、よりいっそう向上された。本発明において同定された、小さなサイズのペプチドであれば、細胞内にこれらを導入するために細胞捕捉システム（例えばリポソーム）を使用する必要がなく；これは、リポソームが必要とされる完全なペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）またはＴＲＵＢＬドメイン（ＧＳＥ２、配列番号４）に使用されることに比べて、重要な改良である。したがって、これらの新規ペプチドは、現状より再現性のある安定な、治療目的のシステムをもたらす。さらに、これらのペプチドは、これらのペプチドを入手する過程を簡略化する化学合成によって入手され得る。これらのペプチドは、ＧＳＥ２４．２の機能と類似の機能を果たし、したがって、同等の用途において、これらを用いることができる。
【００１３】
本発明は、（１）配列番号１の配列のＧＳＥ２４．２ペプチドに含まれている、（２）配列番号１の、１１アミノ酸の断片からなる、（３）配列番号２を少なくとも含んでいる、活性を有している最小単位または最小のポリペプチドを規定している。このペプチドは、フリーラジカル生成、および／または細胞におけるＤＮＡの構造に対する損傷を低減させるＧＳＥ２４．２活性を担っている最小単位を構成している。
【００１４】
したがって、本発明の第一の側面は、配列番号１を有しているペプチドＧＳＥ２４．２配列の断片を含んでいるポリペプチドに言及しており、当該断片は、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能であり、当該断片は、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）または配列番号４を有しているその断片からなる場合を除いて、配列番号２を少なくとも含んでいる。
【００１５】
好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６によって形成されている群のうちの少なくとも１つから選択される、ペプチドＧＳＥ２４．２の断片を少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有している。
【００１６】
ここまでに規定されているポリペプチドのうち少なくとも１つが、導入されているとき、またはその発現が、細胞の内部、好ましくは真核細胞（例えばヒト細胞）の内部に誘導されているとき、この細胞の、フリーラジカルの生成および／またはＤＮＡに対する損傷の減少を生じさせることができる。このため、公知の方法（例えば、化合物ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ、ヒドロエチジン）など）のいずれかによって生細胞におけるフリーラジカルのレベルを定量化することによって、細胞におけるフリーラジカルの生成は、上記ポリペプチドが導入されていないか、またはその発現が誘導されていない細胞と同種の細胞について、生理学的レベルに至るまで、このポリペプチドの配列に依存して、減少し得る。同様に、細胞内ＤＮＡに対する損傷が、既存の方法（例えば、Ｓｅｒ１３９位におけるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γ−Η２ΑΧ）に対する抗体を用いた、細胞のハイブリダイゼーションシグナルの試験など）によって定量化されるとき、ＤＮＡに対するこの損傷は、上記ポリペプチドが導入されているか、または当該ポリペプチドの発現が誘導されている細胞と同種の細胞について、上記ポリペプチドの配列に依存して５０％まで低下すると認められ得る。
【００１７】
本発明のこの側面に規定されている上記ポリペプチド作用が、細胞核において生じ得ることを考慮すると、核におけるこれらの発現または局在を促進するため、および／または上記ポリペプチドの活性を向上させるために、このポリペプチドは、活性を有しているＧＳＥ２４．２ペプチドの断片に加えて、この断片のカルボキシル末端およびアミノ末端の少なくとも一方、好ましくはカルボキシル末端に連結されている核局在化配列（ＮＬＳ）を少なくとも含み得る。
【００１８】
本発明の範囲において、上記核局在化配列は、結合させられるペプチドの、細胞核への局在化を導くことが可能なアミノ酸の集団であるとみなされ；細胞核に結合されるための、当該ペプチドの局在化を導くことができるアミノ酸基である、と考えられる；この配列は、核への輸送のための配列、または核小体への輸送のための配列であり得る。好ましくは、核局在化配列は、ＧＳＥ２４．２の配列が由来している遺伝子ＤＫＣ１に見られる核局在化配列（例えば、核輸送配列ＫＲＫＲ（ＮＬＳ１）または核小体輸送配列ＫＫＥＫＫＫＳＫ（ＮＬＳ２））であり、より好ましくは核輸送配列ＫＲＫＲ（ＮＬＳ１）である。
【００１９】
したがって、本発明のこの側面のポリペプチドの好ましい実施形態において、当該ポリペプチドがＧＳＥ２４．２の活性な断片に連結されている核局在化配列を含んでいるとき、このポリペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。より好ましい実施形態において、このポリペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。さらなるより好ましい実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００２０】
本書の全体を通して、本発明の第一の側面に規定されている上記ポリペプチドのうちのいずれも、「本発明のポリペプチド」または「本発明のペプチド」と、等しく呼ばれ得る。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成に技術において公知の通常の手法：発現ベクターへの挿入または化学合成によって入手され得る。ペプチドの化学合成手順は、液体もしくは液相における合成、および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の両方を包含している。好ましくは、固相ペプチド合成が、Ｆｍｏｃおよびｔ−Ｂｏｃといった、最新技術において知られている方法のいずれかを用いて、利用される。
【００２２】
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つ（例えば、これまでに規定されているポリペプチドのいずれか）をコードしている配列を含んでいるポリヌクレオチドに言及している。このポリヌクレオチド（本書において、本発明のポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、真核細胞、好ましくはヒト細胞における、フリーラジカルの生成および／またはＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能なポリペプチドの発現を可能であり、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチドを指し得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、配列番号１を有しているペプチドＧＳＥ２４．２の配列の、少なくとも１つの活性な断片をコードしている配列を含んでおり、ここで、この断片は、このポリヌクレオチドがペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）または配列番号４を有しているその断片をコードしている場合を除いて、少なくとも配列番号２を含んでいる。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６によって形成されている群のうち少なくとも１つから選択される、ペプチドＧＳＥ２４．２の断片をコードしている配列を含んでいる。
【００２４】
本発明のポリペプチドについて示されている場合と同様に、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの作用が、細胞核において生じ得ることを考慮すると、本発明のポリヌクレオチド配列はまた、ペプチドＧＳＥ２４．２の断片の配列の３´末端または５´末端のうち少なくとも一方、より好ましくは、３´末端に結合されている少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでいる。
【００２５】
好ましくは、本発明のポリペプチドのために選択される核局在化配列は、核または核小体中に方向付けられている核局在化配列であり、より好ましくは、ＧＳＥ２４．２の配列が由来している遺伝子ＤＫＣ１にある。遺伝子ＤＫＣ１の核輸送配列の好ましい例は、ペプチド配列ＫＲＫＲ（ＮＬＳ１）をコードしている核輸送配列、またはペプチド配列ＫＫＥＫＫＫＳＫ（ＮＬＳ２）をコードしている核輸送配列であり、好ましくはペプチド配列ＫＲＫＲ（ＮＬＳ１）をコードしている核輸送配列である。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドが、ＧＳＥ２４．２の活性な断片をコードしている配列に連結されている核局在化配列を含んでいるとき、このポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている配列からなる。より好ましい実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている配列からなる。さらなるより好ましい実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている配列からなる。
【００２７】
以上に説明されているポリヌクレオチドのいずれかとしての、本発明のポリヌクレオチドは、最新技術において広く知られている手法（Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual" 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3）の使用を通して、当業者によって入手され得る。これらのポリヌクレオチドの配列は、細胞内部の好適な条件における発現の制御を可能にする遺伝子発現ベクターに組み込まれ得る。
【００２８】
したがって、本発明の他の側面は、（１）本発明のポリヌクレオチド、または（２）真核細胞、好ましくはヒト細胞におけるフリーラジカルの生成および／またはＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能なポリペプチドの発現を可能にする、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含んでいるベクター（以下、本発明のベクター）に言及している。
【００２９】
一般的に、本発明によれば、上記発現ベクターは、作動可能に連結されている、転写を導くプロモータ（例えば、ｐＴ７、ｐｌａｃ、ｐｔｒｃ、ｐｔａｃ、ｐＢＡＤ、ｒｅｔなど）、ならびにこの転写および必要に応じて所望の産物の翻訳を制御しかつ調節する、必要もしくは適切な他の配列（例えば、転写開始シグナル、転写終結シグナル（ｔｌｔ２など）、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、転写制御因子（エンハンサ）をコードしている配列、転写サイレンサ（サイレンサ）、リプレッサーなど）を、本発明に説明されているポリヌクレオチドに加えて、さらに含んでいる。適切な発現ベクターの例は、特定の場合のそれぞれの条件および必要性にしたがって、単一または複数の所望の遺伝子を用いて導入されているか、または形質転換されている細胞を選択するために用いられる標識を付加的に含んでいる、発現プラスミド、ウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、コスミド、人工染色体などから選択され得る。ベクターの選択は、宿主細胞、および実施されるそれの利用の種類に依存する。したがって、本発明の特定の実施形態によれば、このベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。このベクターは、微生物および真核細胞の形質転換のために、広く知られている種々の方法が使用され得るように、種々の手引書（Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual" 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3）に説明されている当業者に知られている従来の方法：化学的な形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどによって入手され得る。
【００３０】
本発明において規定されている本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子発現ベクターは、酸化ストレスおよび／または細胞内ＤＮＡに対する損傷の増加によって（好ましくは、フリーラジカルレベルおよび／またはそれらのＤＮＡの構造に対する損傷の増加によって影響される、細胞（好ましくはヒト細胞）におけるその生物学的作用を介して）引き起こされる疾患にかかっているヒトのための、処置方法および／または予防方法における薬剤として使用され得；また、それは、細胞培養系またはインビトロにおける生物工学的なツールとして、細胞の生存度を向上させるために使用され得る。しかし、本発明はまた、ペプチドＧＳＥ２４．２の完全配列（配列番号１）および／または配列番号４の１８アミノ酸の断片（ＧＳＥ２）が、この目的のために使用され得るとみなされる。本発明において説明されている治療方法と同様に、生物工学的なツールおよび薬学的なツールは、そのようなツールが過剰な努力なしに構築され得るように、当該当業者によって十分に知られているとみなされる。
【００３１】
したがって、本発明の他の側面は、ポリペプチド、またはこのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用に言及しており、ここで、このポリペプチドは、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減させ得る、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）の断片である配列番号２（ＧＳＥ４）を、酸化ストレスおよび／または細胞内ＤＮＡに対する損傷の変化（好ましくは増大）によって引き起こされる少なくとも１つの疾患の処置のための、薬剤調製物または薬学的組成物に、少なくとも含んでいる。例示を目的として、本発明の範囲を限定することなく、この疾患は、以下の群：先天性異角化症、神経変性疾患、猫鳴き症候群、血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン染色体不安定症、ブルーム症候群、ウェルナー症候群、ファンコニー貧血、潰瘍性大腸炎、血管老化、動脈硬化、好ましくはアテローム性動脈硬化、がん、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、早老症、光過敏症、突然変異または外来性の作用因子によって引き起こされる遺伝的不安定性、ハッチンソン−ギルフォード症候群、色素性乾皮症、ロトムンド−トムソン症候群、肺線維症、ならびに慢性的な炎症をともなっている疾患（リウマチ様関節炎など）に属し得る。
【００３２】
本発明のこの側面の好ましい実施形態において、上記疾患は、先天性異角化症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、血管拡張性運動失調症または骨髄変性などが挙げられる）、猫鳴き症候群、血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン染色体不安定症、ブルーム症候群、ウェルナー症候群、ファンコニー貧血、潰瘍性大腸炎、血管老化、動脈硬化、好ましくは動脈硬化およびがんによって構成されている群から少なくとも選択される。
【００３３】
本発明のある側面によれば、上記薬剤または薬学的組成物は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、またはそれをコードしている発現ベクターを含んでおり、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６によって構成されている群のうち少なくとも１つから選択される配列を含んでいる。しかし、さらなるより好ましい実施形態は、上記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６によって構成されている群のうち少なくとも１つから好ましくは選択される、２５アミノ酸以下の配列からなるポリペプチドである。
【００３４】
本発明の他の側面において、上記薬剤または薬学的組成物は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、またはそれをコードしている発現ベクターを含んでおり、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化配列を付加的に含んでおり、当該核局在化配列は、（１）カルボキシル末端に好ましく結合されており、（２）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４によって構成されている群のうち少なくとも１つから好ましく選択される。よりいっそう好ましくは、上記ポリペプチド配列は、配列番号７および配列番号８によって構成されている群から選択される。
【００３５】
本発明の他の対象は、好ましくは細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷に関連するか、または当該損傷によって引き起こされる酸化ストレスに起因する細胞内部にあるフリーラジカル含有量の変化によって引き起こされる疾患、障害または病態の処置のための、薬学的組成物または薬剤（以下において、フリーラジカルの生成および／または細胞なＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能なポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターの少なくとも１つを治療上の有効量において含んでおり、必要に応じて酸化還元バランスを調節可能および維持可能な、ＤＮＡに対する損傷を校正可能な、補助剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルとともに含んでいる、本発明の上記薬学的組成物）である。本発明の範囲において、この薬学的組成物または薬剤は、「本発明の薬学的組成物または薬剤」と等しく呼ばれ得る。
【００３６】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容可能な補助剤および／またはビヒクルは、当業者によって知られている補助剤およびビヒクルであり、薬剤組成物の調製に広く使用されている。一例として、これらは、分子の吸収および内部移行を補助するナノ粒子またはリポソームであり得る。
【００３７】
本書に使用されている意味において、治療上の有効量という表現は、本発明のポリペプチド、または分子もしくは化合物の量を指し、当該量は、（１）他の要素（年齢、患者の状態、変性または場外の重篤度、ならびに投与の経路および頻度）のなかでも化合物の特性によって一般的に決定される、（２）フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能な、（３）所望される作用をもたらすために計算されている量である。
【００３８】
特定の実施形態において、この治療組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤における固体懸濁物または水性懸濁物の形態において調製されている。本発明によって提供される治療組成物は、適切な任意の投与経路によって投与され得、したがって、当該組成物は、選択される投与経路によって好適な、薬学的に許容可能な任意の形態によって製剤化される。特定の実施形態において、本発明によって提供される上記治療組成物の投与は、非経口経路、経口経路、腹膜内経路、皮下経路による。薬剤の投与の、種々の薬学的形態、およびそれらを入手するために必要な賦形剤の概説は、例えば、Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S.A. Ediciones, Madridに見出され得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、上記薬剤組成物または薬剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４によって構成されている群のうち少なくとも１つから選択される本発明のポリペプチド；またはこのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクターを含んでいる。より好ましくは、含んでいるか、またはコードしているポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３および配列番号１４からなる群のうち少なくとも１つから選択され；配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群のうち少なくとも１つからより好ましく選択される。
【００４０】
好ましい他の実施形態において、上記薬学的組成物または薬剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６によって構成されている群のうち少なくとも１つから選択されるペプチドＧＳＥ２４．２の活性な断片を含んでいる本発明のポリペプチド；またはこのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクターを含んでいる。
【００４１】
好ましい他の実施形態において、上記薬学的組成物または薬剤は、核局在化配列に結合されているペプチドＧＥＥ２４．２の活性な断片を含んでおり、好ましくはカルボキシル末端に結合されており、配列番号７および配列番号８によって構成されている群のうち少なくとも１つから選択されるポリペプチド；またはこのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクターを含んでいる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、単独または他の薬学的な化合物ともなって、処置方法に使用され得る。
【００４３】
したがって、本発明の他の側面は、本発明の薬学的組成物の使用（以下において、酸化ストレスに起因するか、および／またはＤＮＡの構造に対する損傷によって引き起こされる疾患、障害または病態にかかっている個体（好ましくはヒト）における処置または予防の方法における、本発明の薬学的組成物の使用）である。好ましくは、処置される上記疾患または病態は、上述の組成物の使用において規定されている疾患または病態の１つである。
【００４４】
本発明の他の側面は、フリーラジカルの生成および／または細胞内ＤＮＡの構造に対する損傷を低減可能な、ペプチドＧＳＥ２４．２（配列番号１）の断片（配列番号２）を含んでいるポリペプチド、またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクターの、細胞の生存度を向上させるための、組織工学または細胞培における使用に言及している。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４によって構成されている群から選択される少なくとも１つからなる。
【００４５】
この記載および特許請求の範囲の全体を通じて、単語「含んでいる」およびその変化形は、他の技術的特徴点、付加物、構成要素または工程を排除していない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点および特性は、この説明から部分的に、かつ本発明の実施から部分的に、明らかになる。以下の実施例および図面は、例証の目的のみのために与えられており、本発明を限定するとはみなされるべきではない。
【００４６】
（図面の簡単な説明）
（図１）ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定：ＡＴ３７８４  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、処理後の２４時間に固定し、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）に対する抗体とハイブリダイズさせた。対照Ｃ−１７８７細胞を、陰性対照として用いた。次に、それらを、フルオレセイン標識した抗体とハイブリダイズさせ、核の位置を示すためにＤＡＰＩを用いて染色した。凝集体（ｆｏｃｉ）は、細胞種ごとに２００細胞において、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸに対する染色によって評価し、その結果を、凝集体を示さない細胞、５〜２０の凝集体の細胞、および２０を超える凝集体の細胞に分類した。
【００４７】
（図２）ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定：ＡＴ３７８４  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、処理後の２４時間に固定し、キナーゼｐＣＨＫ２ｔｈｒ６８に対する抗体とハイブリダイズさせた。対照Ｃ−１７８７細胞を、陰性対照として用いた。次に、それらを、フルオレセイン標識した抗体とハイブリダイズさせ、核の位置を示すためにＤＡＰＩを用いて染色した。凝集体を、細胞種ごとに２００細胞において、ｐＣＨＫ２ｔｈｒ６８に対する染色によって評価し、その結果を、凝集体を示さない細胞、５〜２０の凝集体の細胞、および２０を超える凝集体の細胞に分類した。
【００４８】
（図３）ＡＴ細胞におけるＲＯＳレベルの決定：ＡＴ３１８９−Ｐ  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３週間後に、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを検出するＤＨＥ試薬を取り込ませた。ＡＴ７３６Ｃ細胞を、対照として用いた。３つの細胞株の相対蛍光および最大強度を有している細胞の比率は、５１８ｎｍ吸収および６０５ｎｍ発光の波長を用いて、フローサイトメトリーを介して決定した。そのデータは、上記波長において発光している細胞の相対的なパーセンテージとして示されている。
【００４９】
（図４）ＡＴ細胞におけるｐ３８のリン酸化のレベルの決定：ＡＴ７１９−Ｐ  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクターまたはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３週間後に、タンパク質抽出物を得た。また、ＧＳＥ２４．２によって感染させたＡＴ７１９−Ｐ  ＡＴ細胞を、使用し、最大蛍光を有している細胞群を、ソータ（ＡＴ  ＡＴ７１９−Ｐ  ＧＳＥ２４．２ソータ）を用いて選択した。ＡＴ７３６Ｃ細胞を、対照として用いた。タンパク質を、ポリアクリルアミドゲルによって分離させ、ニトロセルロース膜に転写した。膜を、Ｔｈｒ１８０／Ｔｒｙ１８２においてリン酸化されているタンパク質ｐ３８に対するポリクローナル抗体、およびローディング対照としての非リン酸化タンパク質に対するポリクローナル抗体とハイブリダイズさせた。
対照の細胞株について得られた（ＮＩＨイメージプログラムを用いて）、リン酸化タンパク質および上記非リン酸化タンパク質の間における相対値を１とみなし、他は、それを基準にされている。
【００５０】
（図５）ＡＴ細胞におけるブレオマイシンに対する生存度の決定：ＡＴ７１９−Ｐ  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３週間後に、異なる用量のブレオマイシンを用いて処理した。ＡＴ７３６Ｃ細胞を、対照として用いた。細胞、処理の７２時間後に固定し、生存度を、ＭＴＳ試薬を用いて決定した。値は、３つ１組において実施された試験の結果を表しており、処理されていない細胞に対する生存度を示している。
【００５１】
（図６）ＧＳＥ２４．２に由来する化学合成ペプチドを用いたトランスフェクションの２４時間後におけるＦ９細胞およびＦ９Ａ３５３Ｖ細胞のウエスタンブロット。ゲルの各ラインに示されたペプチドを、３０ｍｍプレート上においてトランスフェクションした（１５μｇの各ペプチド）。ポリアクリルアミドゲルにおいてタンパク質抽出物を分離し、かつニトロセルロース膜にそれらを転写した後に、膜を、ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）に対する抗体とハイブリダイズさせ、そのとき、ローディング対照としてα−チューブリンに対する抗体とハイブリダイズさせた。
【００５２】
（図７）図６のウェスタンブロットの定量化。ＮＩＨイメージプログラム用いて、ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）を用いて得られたシグナルを、α−チューブリンのシグナルを用いて補正し、ベータ−ガラクトシダーゼを用いてトランスフェクションしたＦ９細胞を用いて得られたシグナル（対照として）を１とみなした。
【００５３】
（図８）漸増する濃度のＧＳＥ４ペプチドを用いたトランスフェクションの２４時間後における、Ｆ９細胞およびＦ９Ａ３５３Ｖ細胞のウェスタンブロット。ＧＳＥ４合成ペプチドを、ゲルの各ラインに示されている濃度においてトランスフェクションした。膜を、ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）に対する抗体、およびローディング対照としてのα−チューブリンに対する抗体とハイブリダイズさせた。
【００５４】
（図９）図８のウェスタンブロットの定量化。ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）を用いて得られたシグナルを、α−チューブリンのシグナルを用いて補正し、ベータ−ガラクトシダーゼを用いてトランスフェクションしたＦ９細胞を用いて得られたシグナルを１とみなしした。
【００５５】
（図１０）ペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ５のトランスフェクション後における、ＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性の決定。ペプチドＧＳＥ４およびペプチドＧＳＥ５の発現の作用を決定するため、ＶＡ１３細胞を、リポフェクションを介してトランスフェクションし、２４時間後に、テロメラーゼ活性についてＴＲＡＰアッセイを実行した。
【００５６】
（図１１）ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現させた後における、血管拡張性運動失調症の細胞における、酸化ストレスレベルの決定。ＡＴ７１９−Ｐ細胞を、ＧＳＥ２４．２もしくはＧＳＥ４を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３週間後に、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを検出するＤＨＥ試薬を取り込ませた。ＡＴ７３６Ｃ細胞を、対照として用いた。４つの細胞株の相対蛍光および最大強度を有している細胞の比率を、５１８ｎｍの吸収および６０５ｎｍの発光の波長におけるフローサイトメトリーによって決定した。そのデータを、上記波長において発光する細胞の相対的なパーセンテージとして示されている。
【００５７】
（図１２）ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現させた後における、血管拡張性運動失調症の細胞における、炎症性サイトカインの発現のレベル。ＡＴ７１９−Ｐ  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２もしくはＧＳＥ４を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３週間後にＲＮＡを抽出し、対応するｃＤＮＡを得た後に、炎症誘発性サイトカインＩＬ６およびＩＬ８の発現のレベルを決定した。ＡＴ７３６Ｃ細胞を、対照として用いた。遺伝子β−アクチンの発現のレベルを、発現の対照として測定した。その結果を、β−アクチンと比べた各遺伝子の発現の倍数の、相対的な増加として示し、ＡＴ７３６Ｃ細胞の発現レベルを１とみなした。
【００５８】
（図１３）ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現せさた後における、ＡＴ細胞の老化の決定：ＡＴ２０７８  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２もしくはＧＳＥ４を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、３日後または８日後に、老化に関連する酵素β−ガラクトシダーゼ酸（老化関連β−ガラクトシダーゼ）の発現を決定するために、細胞を固定した。対照Ｃ−１７８７細胞を、陰性対照として用いた。視野ごとの全体の細胞から、β−ガラクトシダーゼを発現している細胞のパーセンテージを決定した。細胞種ごとの２００細胞を評価し、その結果を、活性を示さない細胞（β−ｇａｌ−、分裂中）および老化細胞（β−ｇａｌ＋）に分類した。
【００５９】
（図１４）ペプチドＧＳＥ４およびＳＧＳＥ４をトランスフェクションした後における、ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定：ＡＴ２０７８  ＡＴ細胞を、ＧＳＥ２４．２もしくはＧＳＥ４を発現するレンチウイルスベクター、またはＧＦＰの空ベクターによって感染させ、２４時間後に処理のために固定し、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）に対する抗体とハイブリダイズさせた。対照Ｃ−１７８７細胞を、陰性対照として用いた。次に、それらを、フルオレセイン標識した抗体とハイブリダイズさせ、核の位置を示すためにＤＡＰＩを用いて染色した。凝集体を、細胞種ごとに２００細胞におけるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸの染色によって評価し、その結果を、凝集体を示さない細胞、５〜２０の凝集体の細胞、２０を超える凝集体の細胞に分類した。
【００６０】
（図１５）ジスケリンの配列の、配列ＮＬＳ１および配列ＮＬＳ２。核局在化配列（ＮＬＳ１）および核小体局在化配列（ＮＬＳ２）は、遺伝子ＤＫＣ１に含まれていた。
【００６１】
（図１６）ＧＳＥ２４．２の配列における５´位または３´位に核局在化シグナルＮＬＳ１またはＮＬＳ２を配置するために使用されたコンストラクトの模式図。発現ベクターｐＣＤＮＡ３ｍｙｃにおいてｍｙｃに対するタグを含んでいる、ＧＳＥ２４．２の５´位または３´位にＮＬＳ１およびＮＬＳ２配列を配置している、４つのコンストラクトを得た。
【００６２】
（図１７）Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ１−３  ＧＳＥ２４．２、ＮＬＳ１−５  ＧＳＥ２４．２、ＮＬＳ２−３  ＧＳＥ２４．２ならびにＮＬＳ２−５  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現。プラスミドをトランスフェクトした（リポフェクタミンを用いて）２４時間後に、ペプチドの細胞内発現および細胞内局在を、コンストラクト（図１６を参照）にあるｃ−ｍｙｃタグに対する抗体を用いた免疫蛍光法、検出した。
【００６３】
（図１８）Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ１−３  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現。プラスミドをトランスフェクトした（リポフェクタミンを用いて）２４時間後に、ペプチドの細胞内発現および細胞内局在を、コンストラクトにあるｃ−ｍｙｃタグに対する抗体を用いた免疫蛍光法、検出した。
【００６４】
（図１９）Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ２−３  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現。プラスミドをトランスフェクトした（リポフェクタミンを用いて）２４時間後に、ペプチドの細胞内発現および細胞内局在を、コンストラクトにあるｃ−ｍｙｃタグに対する抗体を用いた免疫蛍光法、検出した。
【００６５】
（図２０）ｃ−ｍｙｃプロモータによる、コンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびコンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３の活性。コンストラクトＧＳＥ２４．２、ＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３用の発現ベクターを、ｃ−ｍｙｃのプロモータのレポータ遺伝子、ｐＸＰ１とともに、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を。市販のキットを用いて測定した。値は、相対活性として表されており、空の発現ベクターｐＣＤＮＡ３ｍｙｃによるシフェラーゼの値を１とみなした。
【００６６】
（図２１）Ｈｅｌａ細胞におけるペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４ＮＬＳ１のトランスフェクション。フルオレセインで標識され、化学合成によって得られた、ペプチドＧＳＥ４、およびペプチドＧＳＥ４ＮＬＳ１（配列番号７）を、プロテオジュース試薬を用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション後の９時間、２４時間および４８時間に、共焦点蛍光顕微鏡において観察した。
【００６７】
（図２２）Ｈｅｌａ細胞におけるペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４ＮＬＳ１の内部移行。フルオレセインを用いて標識し、化学合成によって得られたペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４ＮＬＳ１（配列番号７）を、Ｈｅｌａ細胞の培養培地に加え、トランスフェクション後の９時間、２４時間および４８時間に、共焦点蛍光顕微鏡において観察した。
【００６８】
（実施例）
実施例１．血管拡張性運動失調症の患者の細胞内のＤＮＡに対する損傷を戻すＧＳＥ２４．２の能力。
【００６９】
当該検定を実行するため、遺伝子ＡＴＭ中に突然変異を有している、血管拡張性運動失調症の患者からの細胞系統（ＡＴ、コリエルレポジトリーより）であって、ＡＴ３４８７と称される細胞系統を用いた。細胞系統Ｃ−１７８７は、対照細胞系統として用いた。上記細胞に、バイシストロニックなレンチウイルスベクターｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＧＳＥ２４．２を感染させた。感染の４８時間後、上記細胞をホルムアルデヒドで固定し、その後、トライトンＸ−１００でこれらを処理することによって、浸透させた。ＤＮＡに対する損傷は、ヒストンＨ２ＡＸ  Ｓｅｒ１３９に対する抗体で、上記細胞をハイブリダイゼーションし、続いて、フルオレセインに結合されている抗体でハイブリダイゼーションした後の、シグナルを検討することで、推定した。ヒストンＨ２ＡＸに対する染色を有している凝集体の数（核あたりの数）は、総数２００個の細胞において、共焦点顕微鏡を用いて決定され、そのデータは、特定数の凝集体を有している細胞の割合を表した。
【００７０】
図１は、ＧＳＥ２４．２の発現は、ＡＴ細胞の２０％において、ＤＮＡに対する全体的な損傷を完全に校正し、ＡＴ細胞の２５％において、ＤＮＡに対する損傷のレベルを下げることを示している。従って、４０％のＤＮＡに対する全体的な損傷の校正が見られた。
【００７１】
次に、Ｔｈｒ６８においてリン酸化された、タンパク質ｐＣＨＫ２を認識する抗体のハイブリダイゼーションによって、ＤＮＡに対する損傷を決定している以外は、同様の実験を行い、この場合、当該実験のデータは、ＧＳＥ２４．２を発現した後に、２５％より少ないＡＴ細胞が、基礎損傷を示し、ＤＮＡに対する高いレベルの損傷は、１３％減ったことを示した（図２）。従って、ＧＳＥ２４．２の発現は、２８％の細胞において、ＤＮＡに対する損傷を校正することができ、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸを用いて取得されたデータを支持している。
【００７２】
実施例２．血管拡張性運動失調症の患者の細胞内におけるフリーラジカルのレベルを下げる、ＧＳＥ２４．２の能力。
【００７３】
ＡＴ細胞の特徴の１つは、フリーラジカル含有量の増加である。これは、細胞が、生体外の培養等の環境的ストレスに曝された際に、正常細胞内において、レドックスバランスを維持することができるという、タンパク質ＡＴＭの機能の破綻によるものである。ＧＳＥ２４．２の発現が、フリーラジカルレベルの制御において、効果を有するかどうかを確かめるため、生細胞において、フリーラジカルレベルを定量化することができる、化合物であるジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）を用いた。この実験のため、対照リンパ芽球ＡＴ７６３Ｃおよび、ＡＴリンパ芽球ＡＴ３１８９−Ｐの系統を用いた。後者は、ＧＳＥ２４．２を発現するレンチウイルスベクターｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＧＳＥ２４．２、またはＧＦＰのみを発現する空ベクター（ＧＦＰ）を感染させた。感染の３週間後、上記細胞を３０分間、ＤＨＥ試薬でロードし、異なるフリーラジカル含有量を有している細胞の比率を、フローサイトメトリーによって決定した。その結果は、ＡＴ７６３Ｃ細胞内のフリーラジカルのレベルは、空ベクター（ＧＦＰ）を発現しているＡＴ３１８９−Ｐ細胞内よりも少ないことを示した（図３）。逆に、ＲＯＳレベルは、ＡＴ３１８９−Ｐ  ＧＳＥ２４．２細胞内において、ＡＴ７６３Ｃ対照細胞内で検出された値と同等の値にまで下がった。
【００７４】
実施例３．血管拡張性運動失調症の患者の細胞内のリン酸化ｐ３８キナーゼレベルを低下させる、ＧＳＥ２４．２の能力。
【００７５】
ＡＴ患者の細胞の特徴の１つは、ＡＴＭタンパク質の機能の破綻による、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのより高い活性化である。このｐ３８の活性化の増大は、ＡＴ細胞内の細胞死の進行、および、従って、ニューロン細胞の数の減少を引き起こす。従って、ＡＴ患者からの細胞系統において、ＧＳＥ２４．２の発現が、ｐ３８の活性化を低下させることができるか、を確認した。
ＡＴ７１９細胞に、ＧＳＥ２４．２、ｐを発現するレンチウイルスベクターＣＭＶ−ＧＦＰ−ＧＳＥ２４．２、またはＧＦＰのみを発現する空ベクター（ＧＦＰ）を感染させ、感染から３週間後に、タンパク質抽出物を、両方の細胞系統から取得した。正常なリンパ芽球細胞系統ＡＴ７３６は、陰性対照として用いた。上記抽出物をポリアクリルアミドゲル上に溶解し、タンパク質をニトロセルロースフィルターへとトランスファーし、続いて、抗体とハイブリダイゼーションさせた。リン酸化ｐ３８タンパク質を検出する抗体を使用し、その後、ローディング対照として、非リン酸化ｐ３８タンパク質に対する抗体で、再度ハイブリダイゼーションした。両方のハイブリダイゼーションにおいて取得したシグナルは、ＮＩＨ−イメージプログラムを用いて定量化し、対照細胞系統として取得された、リン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質との間の相対値を、１とみなした。図４は、当該値は、ＧＦＰウイルスを感染させたＡＴ７１９細胞の場合において増加したが、ＧＳＥ２４．２ウイルスを感染させた際には、対照細胞と同様のレベルにまで著しく低下した、ことを示している。これらのデータは、ＡＴＭの活性化の破綻および関連した酸化ストレスの結果の１つとしてのｐ３８の活性化が、ＧＳＥ２４．２の発現後に戻ったことを示している。
【００７６】
実施例４．血管拡張性運動失調症の患者からの細胞内における、放射線様作用薬での処理後の生存能を増大させる、ＧＳＥ２４．２の能力。
【００７７】
遺伝子ＡＴＭにおける突然変異は、電離放射線、またはブレオマイシンのような放射線様作用薬を用いた処理に対して、ＡＴ患者の細胞を敏感にする。ＡＴ患者の細胞内におけるＧＳＥ２４．２によって誘導された保護的効果が、放射線様作用薬に対して拡大適用できるかを確かめるため、ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＧＳＥ２４．２を発現しているか、ＧＦＰのみを発現する空ベクター（ＧＦＰ）を発現しているＡＴ７１９患者細胞を、７２時間、漸増する複数の濃度のブレオマイシンで処理した。この時間の後、細胞の生存能を、ＭＴＳ試薬を用いて評価した。ＡＴ７３６Ｃ細胞は、対照として用いた。結果は、ＧＳＥ２４．２の発現は、対照細胞と同様のレベルにまで、ＡＴ７１９細胞の生存能を増大させることができたが、一方で、ＡＴ７１９細胞またはＡＴ７１９ＧＦＰ細胞は、対照よりも敏感であった、ことを示した（図５）。これらの結果は、ＧＳＥ２４．２の発現は、放射線様作用薬によって誘導される細胞死から保護することができることを示している。
【００７８】
実施例５．記載のペプチドの活性の検定。ＤＮＡに対する損傷の修復。
【００７９】
細菌ベクターｐＧＡＴＥＶＧＳＥ２４−２を発現している細菌である、ロゼッタガミツー(RosettaGami2)から細菌溶解物を取得した。上記検定を行うため、上記細菌をプロテアーゼインヒビターを含有する生理食塩水溶媒中で超音波照射し、上記細菌プラスミドによって発現させた融合タンパク質を、グルタチオンセファロースカラムにおいて、精製した。上記溶解物は、サイズおよび電荷によって分離するカラムを用いて、他の細胞内タンパク質から該当のペプチドを分離するため、ＨＰＬＣにかけた。生じた分画は、エドマン法由来でかつ商業的利用における方法を用いている、シークエンサーを用いて、シークエンスした。ＧＳＥ２４．２を発現している細菌の細菌溶解物中に検出された、種々のペプチドは、化学合成によって取得され、先天性異角化症の患者において最も高頻度な突然変異（Ａ３５３Ｖ）を有している、Ｆ９Ａ３５３Ｖ細胞を用いて、ＤＮＡに対する損傷を修復する活性を検定した。上記検定を行うため、プロテオジュース試薬を用いて、種々のペプチドをＦ９Ａ３５３Ｖ細胞にリポフェクトし、Ｆ９対照細胞（損傷なしの細胞）を、損傷の対照として用いた。関係のないペプチドを陰性対照として用い、完全なＧＳＥ２４．２を陽性対照として用いた。ウェスタンブロット（図６）を定量化すると、ＧＳＥ４は、ヒストンＨ２ＡＸ  Ｓｅｒ１３９のリン酸化の量によって測定された、ＤＮＡに対する損傷を修復することができる、Ａ３５３Ｖ細胞中に現れた最も小さなサイズのペプチドであることがわかった（図７）。
【００８０】
ペプチドＧＳＥ４の作用条件の最適化を行うため、異なる量のペプチドＧＳＥ４をＦ９Ａ３５３Ｖ細胞へとトランスフェクションし、図６中で実施したような、特定の抗体を用いて、ＤＮＡに対する損傷の量を決定した（図８）。ウェスタンブロットを定量化すると（図９）、ＤＮＡに対する損傷の最大の阻害は、８μｇのペプチドＧＳＥ４をトランスフェクションすることで得られた。
【００８１】
実施例６．ペプチドＧＳＥ４を用いた処置後の、テロメラーゼ活性の増大の測定。
【００８２】
ペプチドＧＳＥ４の活性を定量化する他の方法は、ＶＡ１３細胞において、テロメラーゼ活性を増大する性能を評価することであった。この評価を行うため、これらの細胞に、８μｇの２種のペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ５をトランスフェクションした。４８時間後に、ＴＲＡＰ法によってテロメラーゼ活性を検定するために、上記細胞を処理した。
【００８３】
図１０（ＡおよびＢ）は、ペプチドＧＳＥ５は、ＧＳＥ４と同様に、ＤＮＡに対する損傷の修復能を有しているものの、後者は、テロメラーゼ活性を再活性する点において、より高い活性を有している。従って、ペプチドＧＳＥ４の活性は、テロメラーゼ活性を再活性化するために、より効果的である。
【００８４】
実施例７．ペプチドＧＳＥ４を用いた処置後の、酸化ストレス、炎症および老化の減少の測定。
【００８５】
ＧＳＥ４と称されたペプチドは、テロメラーゼ活性を修復するための性能を有しているペプチドよりも小さいため、血管拡張性運動失調症の細胞において、炎症性サイトカインの発現ならびに酸化ストレスを弱めること、および老化を修復すること、といったペプチドＧＳＥ２４．２と同じ活性を有しているか、検討した。図１１は、ペプチドＧＳＥ４は、ＡＴ７１９−Ｐ細胞内において、ＧＳＥ２４．２と同様に、フリーラジカルレベルを５０％程度低下することができたことを示している。加えて、これらの細胞内では、ＩＬ６およびＩＬ８の発現レベルを、それぞれ８０％および９０％程度低下でき（図１２）、これらの値は、ペプチドＧＳＥ２４．２の場合と同じ程度内であった。最後に、血管拡張性運動失調症において、インターロイキンＩＬ６およびＩＬ８の発現の増加が、老化に関連した、分泌性表現型に関連があるとの想定の下、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−ベータ−ギャル）を評価することによって、老化を低減するための、ペプチドＧＳＥ２４．２およびペプチドＧＳＥ４の両方の性能を評価した（図１３）。得られたデータは、何れのペプチドの発現も、時間の経過に従って、ベータ−ガラクトシダーゼ活性に関して陽性な細胞の割合を減少させたことを示した。これらの実験の結果は、ペプチドＧＳＥ４の配列は、ＤＮＡに対する損傷を低減すること、およびテロメラーゼ活性を増大することに加えて、酸化ストレス、炎症性インターロイキンレベルおよび老化を低減することに対して必要な領域を保存していることを示している。
【００８６】
実施例８．ペプチドＧＳＥ４、および、同様の配列を有している、ジスケリンのＴＲＵＢＩＩドメイン中に局在するＳＧＳＥ４と称されたペプチドを用いた、ＤＮＡに対する損傷の測定。
【００８７】
ＧＳＥ４と称されたペプチドは、ＤＮＡに対する損傷を阻害する性能を有しているペプチドの中で最も小さなサイズであるため、我々は、ペプチドＧＳＥ２４．２の配列内に存在する、同様の配列を有している他のペプチドが同じ活性を有しているか、または、当該活性は、ＧＳＥ４に特異的であるか、を調べた。ペプチドＳＧＳＥ４（配列番号１５）は、配列（プセイドウリジン合成酵素のコンセンサス配列を構成している、アミノ酸ＬＤＰＫ／ＬＤＫＰ）およびサイズにおいて、ＧＳＥ４と類似であり、ジスケリンのＴＲＵＢＩＩドメイン中に見られる。血管拡張性運動失調症の患者の細胞系統ＡＴ２０７８を、上記測定のために用いた。細胞系統Ｃ‐１７８７を対照細胞系統として用いた。上記細胞に、バイシストロニックなレンチウイルスベクターｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＧＳＥ２４．２、ＳＧＳＥ４またはＧＦＰを感染させた。感染の４８時間後、上記細胞をホルムアルデヒドで固定し、その後、トライトンＸ−１００でこれらを処理することによって、浸透させた。ＤＮＡに対する損傷は、ヒストンＨ２ＡＸ  Ｓｅｒ１３９に対する抗体で、上記細胞をハイブリダイゼーションし、続いて、フルオレセインに結合されている抗体でハイブリダイゼーションした後の、シグナルを検討することで、推定した。ヒストンＨ２ＡＸに対する染色を有している、凝集体の数（核あたりの数）は、総数２００個の細胞において、共焦点顕微鏡を用いて決定され、そのデータは、特定数の凝集体を有している細胞の割合を表した。
【００８８】
図１４は、ＧＳＥ４の発現が、ＡＴ細胞の３８％において、ＤＮＡに対する全体的な損傷を校正し、そして、ＤＮＡに対する損傷の全体的な校正は、ＡＴ細胞の６０％である、ことを示している。ペプチドＳＧＳＥ４は、同じ条件において、ＤＮＡに対する損傷を校正することができなかった。従って、ＧＳＥ４の配列だけが、ＡＴ細胞においてＤＮＡに対する損傷を修復することができ、他の類似の配列は、ＡＴ細胞においてＤＮＡに対する損傷を修復することができない。
【００８９】
実施例９．核局在化シグナルがある場合とない場合とにおける、ペプチドＧＳＥ２４．２の、細胞に入る能力の検定。
【００９０】
ペプチドＧＳＥ２４．２に関して、考慮すべき重要な側面は、それが発現したのちの、細胞内局在化である。従って、ＧＳＥ２４．２の５´位置および３´位置において、２種の核局在化シグナルＮＬＳ１およびＮＬＳ２を挿入している、種々のコンストラクトが得られた。ＮＬＳ１は、遺伝子ＤＫＣ１の配列中に存在している、タンパク質を核へと運ぶシグナルであり、配列ＮＬＳ２は、核への輸送を仲介する。図１５は、両方の核局在化配列の配列を示している。
【００９１】
配列ＧＳＥ２４．２とマージされた、遺伝子ｃ−ｍｙｃのタグを５´位置に含んでいる、真核細胞内の発現プラスミドであるｐＣＤＮＡ３ｍｙｃを使用した。ＧＳＥ２４．２の配列中、５´位置および３´位置の両方に、配列ＮＬＳ１およびＮＬＳ２を挿入している、図１６中に示された、種々のコンストラクトが得られた。ＧＳＥ２４．２のＮＬＳ１−３、ＧＳＥ２４．２のＮＬＳ１−５、ＧＳＥ２４．２のＮＬＳ２−３およびＧＳＥ２４．２のＮＬＳ２−５と称されたコンストラクトを、Ｈｅｌａ細胞中にトランスフェクションした。これらのコンストラクトは、コンストラクトの発現を位置特定するため、抗体９Ｅ１０によって認識される、ｃ−ｍｙｃのタグ配列を有している。
【００９２】
図１７は、ＧＳＥ２４．２の３´位置に局在化シグナルＮＬＳ１またはＮＬＳ２を有しているコンストラクトは、ＧＳＥ２４．２の核内での発現を優先的に促進した、コンストラクトであった、ことを示している。図１８および図１９は、コンストラクトＮＬＳ１−３およびコンストラクトＮＬＳ２−３の細胞内局在化の詳細を示している。
【００９３】
実施例１０．ｃ−ｍｙｃの発現を活性化するための、コンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびコンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３の活性。
【００９４】
シグナルＮＬＳ１−３およびシグナルＮＬＳ２−３を含んでいるコンストラクトの生物学的な活性を評価する目的で、ｃ−ｍｙｃのプロモーターのレポーター遺伝子と共に、２９３Ｔ細胞に、上記コンストラクトをトランスフェクションし、コンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびコンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３の両方によって活性化された、ルシフェラーゼ活性を、ＧＳＥ２４．２との関連において評価した。図２０は、ベクターＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびベクターＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３は、ＧＳＥ２４．２よりも効果的に、ｃ−ｍｙｃのプロモーターの発現を活性化したことを示している。これらのデータは、両方のコンストラクトが有する、細胞核内で発現されるより高い能力と一致している。上記２つのコンストラクトの他に、最も効果的なのは、３´位置においてＮＬＳ１シグナルを有しているコンストラクトである。
【００９５】
実施例１１．細胞に入るためのＧＳＥ４の能力。
【００９６】
ＧＳＥ２４．２の活性に寄与する、配列ＮＬＳ１の能力を考慮し、ペプチドＧＳＥ４が最大のテロメラーゼの活性化を得るためのペプチドであったことから、この配列ＮＬＳ１を、ペプチドＧＳＥ４の３´位置へ配置した合成ペプチドを構築した。蛍光顕微鏡下での視覚化を容易にするために、化学合成によって取得されたこのペプチドをフルオレセインで標識した。２つの実験を並列に行い、一方では、上記ペプチドを、プロテオジュースを用いてトランスフェクションし、他方では、上記ペプチドを培地中に直接添加した。その結果は、ＧＳＥ４、およびＧＳＥ４ＮＬＳ１（配列番号７）が、プロテオジュース試薬を用いたこと（図２１）、または培地に単に加えたこと（図２２）によって、細胞に入ったことを示している。観察された重要な違いは、ペプチドを直接培地へと加えた際、プロテオジュースを使用したときよりも、多くの数の細胞へとそのペプチドが入った、ということであった。上記試薬は、少ない数の細胞に対してではあるが、内在化に対してより優れた効果をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定を示す図である。
【図２】ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定を示す図である。
【図３】ＡＴ細胞におけるＲＯＳレベルの決定を示す図である。
【図４】ＡＴ細胞におけるｐ３８のリン酸化のレベルの決定を示す図である。
【図５】ＡＴ細胞におけるブレオマイシンに対する生存度の決定を示す図である。
【図６】ＧＳＥ２４．２に由来する化学合成ペプチドを用いたトランスフェクションの２４時間後におけるＦ９細胞およびＦ９Ａ３５３Ｖ細胞のウエスタンブロットを示す図である。
【図７】図６のウェスタンブロットの定量化を示す図である。
【図８】漸増する濃度のＧＳＥ４ペプチドを用いたトランスフェクションの２４時間後における、Ｆ９細胞およびＦ９Ａ３５３Ｖ細胞のウェスタンブロットを示す図である。
【図９】図８のウェスタンブロットの定量化を示す図である。
【図１０】ペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ５のトランスフェクション後における、ＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性の決定を示す図である。
【図１１】ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現した後における、血管拡張性運動失調症の細胞における、酸化ストレスレベルの決定を示す図である。
【図１２】ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現させた後における、血管拡張性運動失調症の細胞における、炎症性サイトカインの発現のレベルを示す図である。
【図１３】ペプチドＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ４を発現せさた後における、ＡＴ細胞の老化の決定を示す図である。
【図１４】ペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４をトランスフェクションした後における、ＡＴ細胞におけるＤＮＡに対する損傷の決定を示す図である。
【図１５】ジスケリンの配列の、配列ＮＬＳ１および配列ＮＬＳ２を示す図である。
【図１６】ＧＳＥ２４．２の配列における５´位または３´位に核局在化シグナルＮＬＳ１またはＮＬＳ２を配置するために使用されたコンストラクトの模式図を示す。
【図１７】Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ１−３  ＧＳＥ２４．２、ＮＬＳ１−５  ＧＳＥ２４．２、ＮＬＳ２−３  ＧＳＥ２４．２ならびにＮＬＳ２−５  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現
【図１８】Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ１−３  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現を示す図である。
【図１９】Ｈｅｌａ細胞における、コンストラクトＮＬＳ２−３  ＧＳＥ２４．２およびＧＳＥ２４．２の発現を示す図である。
【図２０】ｃ−ｍｙｃプロモータによる、コンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ１−３およびコンストラクトＧＳＥ２４．２ＮＬＳ２−３の活性を示す図である。
【図２１】Ｈｅｌａ細胞におけるペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４ＮＬＳ１のトランスフェクションを示す図である。
【図２２】Ｈｅｌａ細胞におけるペプチドＧＳＥ４およびＧＳＥ４ＮＬＳ１の内部移行を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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