(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
におい質の評価方法であって、
所定のにおい質を構成するにおい質成分群に応答する１又は２以上のヒト嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して、１又は２以上の被験物質のにおい質の評価を行う評価工程、を備え、
前記におい質がフルーティノートであり、
前記１又は２以上の嗅覚受容体が、ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される少なくともＯＲ２ＡＫ２を含む１種又は２種以上であり、
前記におい質成分群を構成するにおい質成分は、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールからなる群から選択される１種又は２種以上である、方法。
【請求項２】
ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択され、少なくともＯＲ２ＡＫ２を含む１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質を検出する方法。
【請求項３】
ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される少なくともＯＲＫ２を含む１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される少なくともＯＲ２ＡＫ２を含む１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質を識別する方法。
【請求項５】
ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択されるか少なくともＯＲ２ＡＫ２を含む１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールからなる群から選択される１種又は２種以上であるフルーティノートの質及び／又は強度を評価し、当該評価に基づいてフルーティノートを調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、嗅覚受容体（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、単に、ＯＲともいう。）を用いたにおい評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活環境におけるにおい分子の利用やにおい分子のマスクなどが種々検討されている。こうしたにおい分子の利用やマスクのためには、におい分子に対するヒトなどの動物の応答性、すなわち、嗅覚感度を定量的に評価する必要がある。
【０００３】
におい分子の動物における嗅覚感度の評価方法の１つとして、当該におい分子に対して応答性のある嗅覚受容体を用いた評価方法がある（特許文献１〜６、非特許文献１）。この評価方法は、細胞膜に所望の嗅覚受容体を備え、かつ、ｃＡＭＰ応答性エレメント（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＣＲＥ）−ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたＤＮＡを核内に保持する形質転換ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来、アデノウイルス５型による形質転換株）を用いたレポーターアッセイである。
【０００４】
すなわち、この評価用細胞の嗅覚受容体と各種のにおい分子とを接触させこれらを結合させることで、細胞内において、Ｇタンパク質、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が順次活性化されて、ｃＡＭＰが上昇する。これに伴いプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がリン酸化されて下流のシグナル伝達系を活性化する。その一方でＰＫＡが核内に移行して、転写因子ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化し、ＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して、その結果ルシフェラーゼが活性化されて発光する。このＣＲＥを介した応答（以下、単にＣＲＥ応答ともいう。）に基づく発光強度を測定してにおい分子の嗅覚感度を評価する。
【０００５】
一方、様々な花の香気（フローラル）やフルーツの香気（フルーティ）というような香調（ノート）を含むにおいの性質、すなわち、におい質は、一般にヒトの嗅覚によって評価されるほか、半導体等を用いたガスセンサによっても評価されている（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１０５６６０号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５０９５８号公報
【特許文献３】特開２０１２−５０７８１号公報
【特許文献４】特開２０１２−５０４１１号公報
【特許文献５】特開２０１４−２３５０９８号公報
【特許文献６】特表２００８−５３８２７８号公報
【特許文献７】特開平５−２２３７２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Harumi S et al., Science Signaling. 2009 Mar;2(60):ra9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、様々なにおい分子に対する嗅覚受容体応答が調べられている。しかしながら、様々なにおい質と嗅覚受容体応答との関連性については知られていない。このため、個々のにおい分子に対する嗅覚受容体応答を利用して、におい質を推定することは困難であった。
【０００９】
また、におい質はヒトの嗅覚やセンサで評価等することも可能ではあるが、ヒトの嗅覚では個体差や熟練が必要であるほか、大量のスクリーニングが困難であるし、センサによれば、スクリーニングは容易であっても、識別や評価に問題がある場合もあり、探索することができなかった。
【００１０】
本明細書は、物質が有するにおい質を、嗅覚受容体を用いて評価する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが、におい質と嗅覚受容体応答との関係を調べたところ、ある種のにおい質に対して特定の嗅覚受容体が応答しうることがわかった。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１２】
（１）におい質の評価方法であって、
所定のにおい質を構成するにおい質成分群に応答する１又は２以上のヒト嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して、１又は２以上の被験物質のにおい質の評価を行う評価工程、を備える、方法。
（２）前記におい質がフルーティノートであり、前記１又は２以上の嗅覚受容体がＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上である、（１）に記載の方法。
（３）前記におい質成分群を構成するにおい質成分は、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールからなる群から選択される１種又は２種以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質を検出する方法。
（５）ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質をスクリーニングする方法。
（６）ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質を識別する方法。
（７）ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト嗅覚受容体を用いて、フルーティノートを調節する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】２−オクタノンに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図２】３−オクタノンに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図３】２−ノナノンに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図４】酢酸ヘキシルに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図５】酪酸ペンチルに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図６】１−ヘプタノールに対する全ヒト嗅覚受容体のＣＲＥ応答を示す図である。
【図７】各におい物質（２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル、１−ヘプタノール、２−ヘキサノン、酢酸フェニル）の各濃度（１０、５０、１００、５００、１０００μＭ）に対する、ＯＲ２ＡＫ２のＣＲＥ応答を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書の開示は、嗅覚受容体（以下、単に受容体という。）を用いたにおい質の評価方法に関する。本開示の評価方法（以下、本評価方法ともいう。）は、所定のにおい質を構成するにおい質成分群に応答する１又は２以上の受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して、１又は２以上の被験物質のにおい質の評価を行う評価工程を備えることができる。また、本開示によれば、上記受容体を用いることで、所定のにおい質を有する物質を簡易に検出することができ、また、高い確度でスクリーニングすることもできる。これより、所定のにおい質を有する物質を簡易に識別することができ、さらにはにおい質を調節することができる。
【００１５】
本開示において「におい質」とは、においの性質を意味することができる。「におい質」は、例えば、ヒトがにおいを嗅ぐことにより連想される、体感的、感覚的又は物質的な表現で表される性質ということができる。
【００１６】
本開示において、受容体は、嗅細胞（嗅覚受容神経）にあるＧタンパク質結合受容体の１種であればよく、由来動物種を特に限定しないが、好ましくはヒトのほか、ヒトの嗅覚受容体と相同遺伝子を備えるマウス等のほ乳動物であり、より好ましくはヒトである。概して、１つのにおい分子は、１又は２以上の受容体に結合し刺激し、１つの受容体は、１又は２以上のにおい分子と結合するようになっている。
【００１７】
（受容体を用いたにおい質の評価方法）
本評価方法は、所定のにおい質を構成するにおい質成分群に応答する１又は２以上のヒト受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して、１又は２以上の被験物質のにおい質の評価を行う評価工程を備えている。
【００１８】
本評価方法によれば、かかる受容体を用いることにより、ヒトの嗅覚に基づくのと同様にして、被験物質が所定のにおい質を呈するものであるかどうかを検出し、当該所定のにおい質に類似しているかどうか（類似性）、あるいは当該所定のにおい質と区別できるかどうか（識別性）、さらには、当該所定のにおい質としての強度などの情報を取得できる。したがって、被験物質が有しているにおい質を、ヒトの嗅覚による官能試験によらないで定性的又は定量的に簡易に推定することができる。ひいては、所望のにおい質を呈する物質や組成物の設計やにおい質の制御が可能となる。さらには、同等のにおい質を呈する被験物質やその組合せを効率的にスクリーニングできるようになる。
【００１９】
したがって、本評価方法は、１又は２以上の被験物質のにおい質の検出方法のほか、におい質の識別方法、におい質の推定方法、におい質の調節方法、所定のにおい質を呈する物質のスクリーニング方法等としても実施できる。
【００２０】
（嗅覚受容体）
本評価方法は、所定のにおい質を構成するにおい質成分からなるにおい質成分群に応答する受容体を用いることができる。におい質成分群は、所定のにおい質構成する（又は当該におい質に分類される）２以上のにおい質成分を含むことが好ましい。かかる受容体は、特定のにおい質成分に応答するというよりもむしろ、当該におい質成分からヒトにおいてある程度まとまりのあるにおいとして知覚されるにおい質に対して応答している受容体といえるからである。こうした受容体を用いることで、被験物質が所定のにおい質を呈するものであるかどうか等を簡易に検出できる。
【００２１】
受容体は、好ましくは、より好ましくは３以上のにおい質成分、さらに好ましくは４以上のにおい質成分、なお好ましくは５以上のにおい質成分からなるにおい質成分群に応答する受容体を用いる。こうした受容体を用いることで、より効率的に所定のにおい質について評価できるし、所定のにおい質に対してより高い精度で評価できる。
【００２２】
こうした受容体は、例えば、ヒトの嗅覚による官能試験において、任意のにおい質、例えば、フルーティノートなどの香気を呈するものと認識できる複数の成分に対して反応性を呈する受容体をスクリーニングすることなどにより取得することができる。なお、ここでいう反応性は、ヒト受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用することができる。
【００２３】
本評価方法では、目的に応じて、１又は２以上のにおい質を構成するにおい質成分群に反応する１又は２以上の受容体を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
こうした受容体としては、例えば、ヒト嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３が挙げられる。これらの受容体は、フルーティノートを呈するにおい質成分群に応答することができる。
【００２５】
ここで、フルーティノートとは、フルーツ様の甘い香りで表されるにおい質である。フルーティノートには、柑橘系（シトラス）に由来するにおい質を含んでいてもよい。フルーティノートは、香料、化粧品及び食料品等に用いられることが多く、好ましい香りや風味に寄与している。フルーティノートを呈するにおい成分としては、特に限定するものではないが、例えば、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノール等を挙げることができる。におい質成分としては、これらのうち１種又は２種以上を組み合わせることができる。
【００２６】
例えば、ＯＲ２ＡＫ２は、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールに対して特異的に応答を示すことができる。なかでも、ケトンである２−オクタノン、３−オクタノン及び２−ノナノンに高い応答性を示すことができる。ＯＲ２ＫＡ２は、１つの受容体で、６種類のフルーティノートを呈するにおい質成分に応答できるため、フルーティノートの評価に好ましく用いることができる。
【００２７】
また、例えば、ＯＲ１Ａ１及びＯＲ１Ｄ２はそれぞれケトンである２−オクタノン、３−オクタノン及び２−ノナノンに対して特異的に応答を示すことができる。なかでも、ＯＲ１Ａ１は、３−オクタノンに対して高い応答性を示すことができ、ＯＲ１Ｄ２は、２−オクタノン及び２−ノナノンに対して高い応答性を示すことができる。これらの受容体も、ＯＲ２ＡＫ２と組み合わせて用いることができる。
【００２８】
また、例えば、ＯＲ５Ｐ３はエステルである酢酸ヘキシル及び酪酸ペンチル、並びにアルコールである１−ヘプタノールに対して応答を示すことができる。これらの受容体も、ＯＲ２ＡＫ２やＯＲ１Ａ１及びＯＲ１Ｄ２と組み合わせて用いることができる。
【００２９】
ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３は、いずれもヒト嗅細胞で発現している受容体であり、代表的なポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を含む塩基配列は公知のデータベースから容易に取得できる。例えば、ＯＲ２ＡＫ２は、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）にＮＭ＿００１００４４９１として登録されており、塩基配列は配列番号１で表され、アミノ酸配列は配列番号２で表される。また、ＯＲ１Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿０１４５６５として登録されており、塩基配列は配列番号３で表され、アミノ酸配列は配列番号４で表される。また、ＯＲ１Ｄ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００２５４８として登録されており、塩基配列は配列番号５で表され、アミノ酸配列は配列番号６で表される。また、ＯＲ５Ｐ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿１５３４４５として登録されており、塩基配列は配列番号７で表され、アミノ酸配列は配列番号８で表される。なお、これらの受容体及び当該受容体をコードする遺伝子は、上記に示した配列のほか、公知の方法で適宜改変を加えたものであってもよい。
【００３０】
受容体は、本開示において必要な受容体機能を失わない限り、どのような形態で使用されてもよい。例えば、受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に受容体を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物のほか、当該受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される受容体に含まれる。受容体は、受容体毎に細胞に発現させるようにすることが好ましい。こうした各種形態の受容体は当業者であれば公知技術に基づいて適宜準備することができる。
【００３１】
（被験物質）
被験物質は、１種類の被験物質を個々に本評価方法に適用してもよいし、２以上の被験物質を組み合わせた混合物、複合体、又は組成物として本評価方法に適用してもよい。被験物質は、気体のほか、液体や固体であってもよく、その形態を問わない。また、被験物質は、任意の場所から採取されたガス、例えば、煙、排気、異臭ガスや香気ガス、任意の材料から抽出された又は任意の材料中に含まれるガスであってもよい。
【００３２】
（におい質の評価）
１又は２以上の被験物質を、受容体を介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して評価する形態は、特に限定されない。活性化したＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して下流の遺伝子の発現を促進することを利用して、当該下流の遺伝子として、レポーター遺伝子を導入し、当該レポーター遺伝子の発現レベルを測定してもよい。レポーター遺伝子としては、公知の蛍光タンパク質をコードする遺伝子など、当業者であれば適宜選択できる。またレポーター遺伝子の発現レベルは、用いるレポーター遺伝子の種類に応じて適宜決定される。
【００３３】
受容体を介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路は、既出の通り当業者において周知である。受容体と各種のにおい分子とを接触させこれらを結合させることで、細胞内において、Ｇタンパク質、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が順次活性化されて、ｃＡＭＰが上昇する。これに伴いプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がリン酸化されて下流のシグナル伝達系を活性化する。その一方でＰＫＡが核内に移行して、転写因子ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化するものである。
【００３４】
受容体として、好ましくは、嗅細胞等の天然に受容体を発現する細胞、又は受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００３５】
受容体を発現させる細胞には、受容体輸送タンパク質１Ｓ（ＲＴＰ１ｓ）をコードする遺伝子を共に導入することが好ましい。ＲＴＰ１ｓは、受容体の細胞膜発現を補助する機能を有している。上記組換え細胞の作製に使用できるＲＴＰ１ｓとしては、例えば、ヒトＲＴＰ１ｓが挙げられる。なお、ＲＴＰ１ｓ遺伝子の代わりにＲＴＰ１ｓ変異体遺伝子を用いてもよい。
【００３６】
なお、被験物質の評価は、例えば、被験物質添加群と対照群（例えば、被験物質非添加群若しくは対照物質添加群）との間でｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を比較することによって行われ得る。対照群と比較して、被験物質添加群におけるｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化が増大の有無やその程度により、当該被験物質についての、所定のにおい質の呈示性、当該におい質との類似性や強度を評価できる。
【００３７】
本評価方法によれば、被験物質に対する所定のにおい質を構成するにおい質成分群に応答するヒト受容体の反応性を取得することで、被験物質が有するにおい質に関する、定性的及び定量的な情報を取得できる。こうした情報を利用して、被験物質のにおい質の検出、識別のほか、所定のにおい質を呈する物質のスクリーニング、におい質の設計や制御が可能となる。
【００３８】
（フルーティノートを呈する物質の検出方法等）
本開示は、フルーティノートを呈する物質を検出する方法を提供する。本方法は、ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト受容体を用いて、フルーティノートを呈する物質を検出することができる。これらの受容体は、におい質としてのフルーティノートを検知することができる。このため、これらの受容体に対して被験物質を供給することで、フルーティノートを呈する物質をヒトの官能試験によらないで効率的に検知したり、識別したり、スクリーニングすることができる。
【００３９】
フルーティノートを呈する物質としては、特に限定されないが、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールから選択される１種又は２種以上を検出することができる。また、これらと同等にあるいは類似する代替物質もヒトの嗅覚によって知覚される物質も同様に検出される。本検出方法においては、本評価方法に用いたような評価形態を採用することができる。
【００４０】
以上のことから、本検出方法は、フルーティノートを呈する物質、例えば、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールから選択される１種又は２種以上と同等あるいは類似する代替物質の識別方法やこうした物質のスクリーニングする方法としても利用できる。
【００４１】
（フルーティノートの調節方法）
本開示は、フルーティノートの調節方法を提供する。本方法は、ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ｄ２及びＯＲ５Ｐ３からなる群から選択される１種又は２種以上のヒト受容体を用いて、フルーティノートを調節することができる。これらの受容体は、におい質としてのフルーティノートを検知し、識別することができる。したがって、これらの受容体に対して１又は２以上の被験物質を供給することで、ヒトの官能試験によらないで効率的にフルーティノートの質（類似性）や強度を調節することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４３】
（フルーティノートを呈する物質に対する全ヒト嗅覚受容体の応答評価）
ヒト嗅覚受容体の各遺伝子（全３９６種）はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各ヒト嗅覚受容体遺伝子を、SgfIとPmeIサイトを利用して、Ｎ末端にFlag-Rhoタグが付加されるようにpF5K CMV-neo Flexi Vector（Promega社）に常法に従って組み込み、嗅覚受容体発現ベクターを構築した。
【００４４】
表１に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で３０分放置した後、３８４ウェル（ポリ−Ｌ−リジンコート・ホワイトプレート）の各ウェルに添加した。ｐＧＬ４．２９（ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）ベクター（Promega）は、ＣＲＥ応答の測定用である。すなわち、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイのために導入した。また、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Promega）は、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたものであり、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準のために導入した。
【００４５】
【表１】
0006504659.tif 000002
【００４６】
次いで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地にて培養したＨＥＫ２９３細胞を、３．０×１０５／ｃｍ２の割合で各ウェルに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養し、嗅覚受容体発現細胞を調製した。
【００４７】
２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で調製したにおい物質（各１ｍＭ）を添加し、４時間ＣＯ２インキュベーター内に放置した。におい物質としては、フルーティノートを呈する、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールとした。
【００４８】
ルシフェラーゼ活性はDual-Glo Luciferase assay system（Promega社）の添付のプロトコルに準じて測定した。におい物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値をコントロール群の発光値で割った値をFold induction of luciferaseとして、応答強度の指標とした。コントロール群は、非におい処理群であり、各におい物質の代わりにＤＭＳＯを添加した。結果を図１〜６に示す。
【００４９】
図１〜６に示すように、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールに共通して、ＯＲ２ＡＫ２が応答を示した。さらに、２−オクタノン、３−オクタノン及び２−ノナノンにＯＲ１Ａ１及びＯＲ１Ｄ２が応答を示した。また、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールにＯＲ５Ｐ３が応答を示した。ＯＲ２ＡＫ２及びＯＲ１Ｄ２に対する上記におい物質の応答は、これまで報告されていない新規のものである。
【実施例２】
【００５０】
（ＯＲ２ＡＫ２の濃度依存性応答）
実施例１と同様の手順でＯＲ２ＡＫ２をＲＴＰ１ｓとともに発現させ、各におい物質（２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノール）の各濃度（１０、５０、１００、５００、１０００μＭ）に対する応答を調べた。また、対照物質として、フルーティノートを呈さないが、化学構造上類似している２−ヘキサノン及び酢酸フェニルに対する応答についても調べた。なお、コントロールとして、嗅覚受容体遺伝子を導入していない細胞（ｍｏｃｋ細胞）を用いて、各におい物質の１００μＭ及び１０００μＭに対する応答を調べた。結果を図７に示す。
【００５１】
図７に示すように、ＯＲ２ＡＫ２に対して、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ノナノン、酢酸ヘキシル、酪酸ペンチル及び１−ヘプタノールは濃度依存的な応答を示したが、２−ヘキサノン及び酢酸フェニルは濃度依存的な応答を示さなかった。以上の結果から、ＯＲ２ＡＫ２は、フルーティノートを呈するにおい物質に対して特異的に応答することがわかった。
【図１】
0006504659.tif 000003
【図２】
0006504659.tif 000004
【図３】
0006504659.tif 000005
【図４】
0006504659.tif 000006
【図５】
0006504659.tif 000007
【図６】
0006504659.tif 000008
【図７】
0006504659.tif 000009
【配列表】
0006504659000001.app