(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法において、
磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップであって、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置されて前記指定空間から磁気特性を検出するものであり、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有するものである、準備ステップと、
各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップであって、前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものであり、前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含むものである、遂行ステップと、及び
検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップと、
を備え、
前記磁性粒子は、それぞれに対応する磁気応答センサの磁化を恒久的に変化し、これにより、前記対応の磁気応答センサの磁化が、磁性粒子を除去した後にも維持され、前記方法は、前記磁気応答センサの読出しを行った後に前記磁気応答センサの少なくとも幾つかの磁化を変化させるステップを含み、
前記磁気応答センサの読出しは、前記磁性粒子を除去した後に行う、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記磁気応答センサは磁気抵抗センサである、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドに付着する磁性粒子の数とは異なる数でそのタイプに付着する磁性粒子を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記磁性粒子のうち１つ又はそれ以上は、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付き、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するときに釈放される、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記指定空間各々は、前記検出装置の基板表面に固定化される単一テンプレート鎖を含む、方法。
【請求項８】
シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）のシステムにおいて、
磁気応答センサのアレイを有している検出装置であって、前記磁気応答センサ各々は、少なくとも２つの強磁性層と、前記２つの強磁性層を分離する非磁性層とを有し、前記磁気応答センサ各々は、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を形成するものであり、前記磁気応答センサは、チャンバ内で対応する指定空間に隣接して位置決めされ、また前記対応する指定空間から磁性粒子を検出するよう構成され、前記検出装置は中間空間によって分離される複数のナノウェルを含み、前記指定空間は前記ナノウェル又は前記中間空間内に親水層を含む、検出装置と、
前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路であって、前記磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている、読出回路と、及び
ＳＢＳプロトコールを遂行するため前記チャンバに試薬を流すよう構成された流体制御系であって、前記試薬は、複数のタイプのヌクレオチドを含むものであり、前記読出回路は、各取り込みイベント後に信号を伝送するよう構成されている、流体制御系と、
を備える、システム。
【請求項９】
請求項８記載のシステムにおいて、前記流体制御系は、
(a) ヌクレオチドを前記指定空間に流して、前記ヌクレオチドを相補鎖に付加する、及び
(b)前記ヌクレオチドに付着するものであり、対応の検出可能な磁気特性を帯びている磁性粒子を前記指定空間に流す
よう構成されており、前記読出回路は、前記(b) の後に前記磁気応答センサの電気抵抗を検出するよう構成されている、システム。
【請求項１０】
請求項８記載のシステムにおいて、前記流体制御系は、
(a) 少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは互いに異なる塩基を有する、該ヌクレオチドを前記指定空間に送給して、前記ヌクレオチドを相補鎖に付加する、及び
(b) 磁性粒子であって、前記第１のヌクレオチドに付着し、また前記第２のヌクレオチドに付着するものである、該磁性粒子を前記指定空間に送給する、及び
(c) 磁性粒子であって、前記第３のヌクレオチドに付着するものである、該磁性粒子を前記指定空間に送給する
よう構成されており、前記読出回路は、前記(b) 及び(c) の後に前記磁気応答センサの電気抵抗を検出するよう構成されている、システム。
【請求項１１】
請求項８記載のシステムにおいて、それぞれの指定空間は疎水性層によって囲まれる親水性層上に存在する、システム。
【請求項１２】
シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法において、
磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップであって、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置されて前記指定エリアから磁気特性を検出するものであり、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖を捕獲するよう構成されているものである、準備ステップと、
それぞれに対応するテンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップであって、前記ヌクレオチドは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものであり、前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付着するとき、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含むものであり、前記ヌクレオチドは複数タイプのヌクレオチドを含み、前記複数タイプの少なくとも１つに対して、所定の複数期間にわたって電気抵抗の大きさが変化する、遂行ステップと、及び
検出した、所定の複数期間にわたって電気抵抗の大きさが変化することを含む電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップと、
を備える、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに関して前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出された変化に基づくものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化の大きさを決定するステップを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法において、前記複数タイプのヌクレオチドはそれぞれ、そのタイプのヌクレオチドに付着する異なる数の磁性粒子を有するものである、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である、方法。
【請求項１８】
請求項１２記載の方法において、前記複数タイプのヌクレオチドはそれぞれ、そのタイプのヌクレオチドに付着する異なるタイプの磁性粒子を有するものである、方法。
【請求項１９】
請求項１２記載の方法において、前記複数のＳＢＳイベント各々は、複数タイプのヌクレオチドを同時に送給するステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１２記載の方法において、前記指定エリア各々は、前記ポリメラーゼによって捕獲される単一テンプレート鎖を有する、方法。
【請求項２１】
請求項１２記載の方法において、前記磁気応答センサは磁気抵抗センサである、方法。
【請求項２２】
請求項１２記載の方法において、前記磁性粒子のうち１つ又はそれ以上は、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付き、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するときに釈放される、方法。
【請求項２３】
請求項１２記載の方法において、前記磁性粒子は、それぞれに対応する磁気応答センサの磁化を恒久的に変化し、これにより、前記対応の磁気応答センサの磁化が、磁性粒子を除去した後にも維持され、前記方法は、前記磁気応答センサの読出しを行った後に前記磁気応答センサの少なくとも幾つかの磁化を変化させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記磁気応答センサの読出しは、前記磁性粒子を除去した後に行う、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本件出願は、遺伝情報（genetic characteristic）を決定するため磁気応答センサを用いるシステム及び方法と題し、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする２０１５年８月１４日出願の米国仮出願第６２／２０５，３３６号の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、遺伝情報を決定するため磁気応答センサを用いるシステム及び方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）に基づく現行の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）システムは複雑であり、高額であり、また大型である。したがって、新しい検出アプローチがＳＢＳ機器に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を提供し、この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものである。前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０００５】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、複数の試薬を前記指定空間に供給するステップを備える。前記試薬は、ヌクレオチド及びポリメラーゼを含み、該ヌクレオチド及びポリメラーゼのうち少なくとも一方は、それらに付着する磁性粒子を有する。本発明方法は、さらに、複数のＳＢＳイベント中に磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを備え、各ＳＢＳイベントは、１つのヌクレオチドを相補鎖に取り込むことによって相補鎖を成長させるステップを含む。該電気抵抗変化は、磁性粒子が前記複数のＳＢＳイベント中に対応する指定空間内に位置決めされるとき生ずる。本発明のこの方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０００６】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップ、(ｂ)前記ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップ、(ｃ)前記磁性粒子の磁気特性によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップ、及び(ｄ)前記磁性粒子を前記指定空間から除去するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０００７】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを有する。該ヌクレオチドは、少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含む。前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｂ)前記第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップと、及び (ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｄ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去するステップ、(ｅ)第３ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップ、及び(ｆ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０００８】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含む。該第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、第１及び第２のヌクレオチドに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｂ)磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出する検出ステップであって、第１ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子は、第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子によって生ずる電気抵抗変化とは異なる電気抵抗変化を生ずる、該検出ステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０００９】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含む。該第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する第１及び第２の単分子磁石（ＳＭＭ）を有する。前記第１及び第２のＳＭＭそれぞれは、互いに異なる光周波数の応答する互いに異なる磁性状態を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｂ)第１光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップ、及び(ｃ)前記第１ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｄ)第２光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップ、(ｅ)第３光周波数を印加することによって第２ＳＭＭの磁性状態を変更するステップ、及び(ｆ)前記第２ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１０】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含む。該第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する単分子磁石（ＳＭＭ）を有する。該第１及び第２のヌクレオチドは、それらに付着する異なる数のＳＭＭを有する。該ＳＭＭは、異なる光周波数に応答する磁性状態を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｂ)第１光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップ、及び(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップ、及び(ｄ)第２光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１１】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、ポリメラーゼを使用して各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを付加することによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。前記ポリメラーゼは、ポリメラーゼに付着する対応の磁性粒子を有し、各ＳＢＳイベントは、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。検出した変化は、ポリメラーゼがヌクレオチドを付加するとき前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１２】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)第１ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含む。ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｂ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。電気抵抗変化は、ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｃ)第２ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含む。ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳサイクルは、さらに、(ｄ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。電気抵抗変化は、対応のポリメラーゼが前記第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１３】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を提供する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにする。前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチド並びにポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含む。前記第１及び第２のヌクレオチドは互いに異なる塩基を有する。前記ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳイベントは、さらに、(ｂ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。電気抵抗変化は、前記ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチド又は第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。前記第１及び第２のヌクレオチドは、互いに異なる取込率を有する。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１４】
実施形態において、ＳＢＳシステムを提供し、この本発明システムは、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を備える。前記磁気応答センサ各々は、少なくとも２つの強磁性層と、前記２つの強磁性層を分離する非磁性層とを有する。前記磁気応答センサ各々は、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を形成する。前記磁気応答センサは、チャンバ内で対応する指定空間に隣接して位置決めされ、また前記対応する指定空間から磁性粒子を検出するよう構成されている。本発明システムは、さらに、前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備える。前記読出回路は、前記磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている。前記検出装置は、さらに、ＳＢＳプロトコールを遂行するため前記チャンバに試薬を流すよう構成された流体制御系を備える。前記試薬は複数のタイプのヌクレオチドを含むものであり、前記読出回路は各取り込みイベント後に信号を伝送するよう構成されている。
【００１５】
実施形態において、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を提供する。前記磁気応答センサ各々は、少なくとも２つの強磁性層と、前記２つの強磁性層を分離する非磁性層とを有する。前記磁気応答センサ各々は、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を形成する。前記磁気応答センサは、チャンバ内で対応する指定空間に隣接して位置決めされ、また前記対応する指定空間から磁性粒子を検出するよう構成されている。検出装置は、前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備えることができる。
【００１６】
実施形態において、本発明によるＳＢＳシステムは、アームと、前記アームに取り付けた磁気応答センサとを有している読取りヘッドを備える。磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を有する。磁気応答センサは、磁性粒子を検出するよう構成されている。本発明システムは、さらに、基板表面を有するサンプル基板を備える。基板表面は、指定空間内で基板表面に沿って配置された複数の核酸テンプレート鎖を有するよう構成され、前記読取りヘッド及びサンプル基板のうち少なくとも一方が、他方に対して相対移動し、磁気応答センサを指定空間の近傍に動作可能関係となるよう位置決めする構成とされる。本発明システムは、さらに、前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備える。前記読出回路は、１つの指定空間に位置決めされるとき、前記磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている。
【００１７】
実施形態において、ＳＢＳ方法を提供し、この本発明方法は、アームと、前記アームに取り付けた磁気応答センサとを有している読取りヘッドを準備するステップを備える。前記磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を有する。前記磁気応答センサは、磁性粒子を検出するよう構成されている。本発明方法は、指定空間内で基板表面に沿って配置された複数の核酸テンプレート鎖を有するサンプル基板を準備するステップを有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子で標識付けする。各ＳＢＳサイクルに関して、本発明方法は、指定空間に隣接して基板表面に沿って前記磁気応答センサを位置決めするステップと、及び前記磁気応答センサにおける電気抵抗を検出するステップを備える。本発明方法は、さらに、電気抵抗の変化に基づいて相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１８】
実施形態において、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法において、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出する。前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有する。前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖を捕獲するよう構成されている。本発明方法は、さらに、対応するテンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。前記ヌクレオチドは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものである。前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付着するとき、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００１９】
実施形態において、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法において、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出する。前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有する。前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。本発明方法は、さらに、前記テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを含む。各ＳＢＳイベントは、さらに、(ｂ)磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップを含む。前記磁性粒子は前記ヌクレオチドによって捕獲される。前記磁性粒子は対応する外部磁場を提供する。各ＳＢＳイベントは、さらに、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップ、及び(ｄ)前記磁性粒子を前記指定エリアから除去するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００２０】
本発明の実施形態において、ＳＢＳの方法を提供し、この本発明方法において、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出する。前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有する。前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。本発明方法は、さらに、テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを有する。該ヌクレオチドは、少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含む。前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有する。各ＳＢＳイベントは、さらに、(ｂ)前記第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、さらに、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップ、(ｄ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去するステップ、(ｅ)第３ヌクレオチドにおける磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップ、及び(ｆ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００２１】
実施形態において、ＳＢＳの方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備え、前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものであり、前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。本発明方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００２２】
実施形態において、磁気応答センサは磁気抵抗センサを有する。
【００２３】
実施形態において、前記磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＧＭＲセンサの導電層に導通する電流の変化によって生ずるものである。
【００２４】
実施形態において、前記磁気応答センサは、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＴＭＲセンサの絶縁層におけるトンネル通過電子の流れの変化によって生ずるものである。
【００２５】
実施形態において、各磁気応答センサは、第１及び第２の強磁性層と、前記第１及び第２の強磁性層を分離する非磁性層とを有する。
【００２６】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【００２７】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【００２８】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記電気抵抗変化が磁気応答センサで生じたか否かを決定するステップを含む。
【００２９】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化の大きさを決定するステップを含む。
【００３０】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドに付着する磁性粒子の数とは異なる数でそのタイプに付着する磁性粒子を有するものである。
【００３１】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【００３２】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドではなくそのタイプに付着する異なるタイプの磁性粒子を有するものである。
【００３３】
実施形態において、前記磁性粒子は異なる磁場強度を有する。
【００３４】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【００３５】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【００３６】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するステップは、複数のＳＢＳサイクルそれぞれが、複数タイプのヌクレオチドを送給する送給ステップであって、各タイプのヌクレオチドが別個の時点で送給される、該送給ステップを含んで前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するものである。
【００３７】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するステップは、複数のＳＢＳサイクルそれぞれが複数タイプのヌクレオチドを同時に送給するステップを含んで前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するものである。
【００３８】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するステップは、複数のＳＢＳサイクルそれぞれが、対応のヌクレオチドを相補鎖に付加した後に磁性粒子を対応のヌクレオチドに送給するステップを含んで前記複数のＳＢＳサイクルを遂行するものである。
【００３９】
実施形態において、前記磁性粒子は可逆性連鎖（リンケージ）を有する。
【００４０】
実施形態において、前記可逆性連鎖は、ビオチン、デスチオビオチン、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、アルデヒド、ヒドラジド、相補オリゴヌクレオチド、又は核酸類似体を有する。
【００４１】
実施形態において、前記磁性粒子は不可逆性連鎖を有する。
【００４２】
実施形態において、前記磁性粒子は光開裂可能連鎖を有する。
【００４３】
実施形態において、前記磁性粒子は光可逆性連鎖を有する。
【００４４】
実施形態において、前記磁性粒子は光活性化性連鎖を有する。
【００４５】
実施形態において、前記磁性粒子は開裂可能連鎖を有する。
【００４６】
実施形態において、前記磁性粒子は、対応のヌクレオチドに一時的に結合するよう構成されているものである。
【００４７】
実施形態において、前記磁性粒子のうち１つ又はそれ以上は、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付き、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、釈放される。
【００４８】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される一群のテンプレート鎖を含む。
【００４９】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される単一のテンプレート鎖を含む。
【００５０】
実施形態において、前記ヌクレオチドはビオチン標識を有する。
【００５１】
実施形態において、前記磁性粒子は、ストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子であり、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子がビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子（ＢＳＭＮ）錯体を形成する。
【００５２】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定空間を有するチャンバを画定するフローセルを備え、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子を前記フローセルのチャンバに流すことにより、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子を前記指定空間に送給する。
【００５３】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定空間を有するチャンバを画定し、前記検出装置は、前記チャンバに沿って位置決めした電極を有し、前記ヌクレオチド送給ステップ及び前記磁性粒子送給ステップは、前記電極を用いての液滴動作を実行するステップを含む。
【００５４】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントは、単一ポット反応により行う。
【００５５】
実施形態において、前記磁性粒子は、それぞれに対応する磁気応答センサの磁化を恒久的に変化し、これにより、前記対応の磁気応答センサの磁化が、磁性粒子を除去した後にも維持され、前記方法は、前記磁気応答センサの読出しを行った後に前記磁気応答センサの少なくとも幾つかの磁化を変化させるステップを含む。
【００５６】
実施形態において、前記磁気応答センサの読出しは、前記磁性粒子を除去した後に行う。
【００５７】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。本発明方法は、さらに、複数の試薬を前記指定空間に供給するステップを備え、前記試薬は、ヌクレオチド及びポリメラーゼを含み、該ヌクレオチド及びポリメラーゼのうち少なくとも一方は、それらに付着する磁性粒子を有する。本発明方法は、さらに、複数のＳＢＳイベント中に磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを備え、各ＳＢＳイベントは、１つのヌクレオチドを相補鎖に取り込むことによって相補鎖を成長させるステップを含み、該電気抵抗変化は、磁性粒子が前記複数のＳＢＳイベント中に対応する指定空間内に位置決めされるとき生ずる。この方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００５８】
実施形態において、磁気応答センサは磁気抵抗センサを有する。
【００５９】
実施形態において、磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＧＭＲセンサの導電層に導通する電流の変化によって生ずるものである。
【００６０】
実施形態において、磁気応答センサは、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＴＭＲセンサの絶縁層におけるトンネル通過電子の流れの変化によって生ずるものである。
【００６１】
実施形態において、各磁気応答センサは、第１及び第２の強磁性層と、前記第１及び第２の強磁性層を分離する非磁性層とを有する。
【００６２】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【００６３】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【００６４】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドに付着する磁性粒子の数とは異なる数でそのタイプに付着する磁性粒子を有するものである。
【００６５】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【００６６】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドではなくそのタイプに付着する異なるタイプの磁性粒子を有するものである。
【００６７】
実施形態において、前記磁性粒子は異なる磁場強度を有する。
【００６８】
実施形態において、磁気特性は、磁場、磁気方位、又は磁気モーメントのうち少なくとも１つを含む。
【００６９】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【００７０】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【００７１】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される一群のテンプレート鎖を含む。
【００７２】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される単一のテンプレート鎖を含む。
【００７３】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される単一のポリメラーゼ分子を含む。
【００７４】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定空間を有するチャンバを画定するフローセルを備えており、前記試薬を前記フローセルのチャンバに同時に流すことにより、前記試薬を前記指定空間に送給する。
【００７５】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定空間を有するチャンバを画定し、前記検出装置は、前記チャンバに沿って位置決めした電極を有し、前記試薬の送給は、前記電極を用いての液滴動作を実行するものである。
【００７６】
実施形態において、前記ヌクレオチドそれぞれは、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付く１つ又はそれ以上の磁性粒子を有し、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、釈放される。
【００７７】
実施形態において、前記磁性粒子は前記ポリメラーゼに付着し、前記検出される変化は、前記ポリメラーゼがヌクレオチドを付加するとき前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずるものである。
【００７８】
実施形態において、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプの取込率とは異なる対応の取込率を有する。
【００７９】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を開示する。この本発明方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ｂ)前記ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ｃ)前記磁性粒子の磁気特性によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)前記磁性粒子を前記指定空間から除去するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【００８０】
実施形態において、ステップ(ａ)〜(ｄ)は、複数タイプのヌクレオチドに対して繰り返し、各タイプのヌクレオチドは前記指定空間に別個に送給される。
【００８１】
実施形態において、前記ヌクレオチドの送給は、複数タイプのヌクレオチド送給を同時に送給し、また前記磁性粒子の送給は、複数タイプの磁性粒子を同時に送給し、前記磁性粒子の各タイプは、他タイプの磁性粒子の磁場強度とは異なる対応の磁場強度を有する。
【００８２】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される一群のテンプレート鎖を含む。
【００８３】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される単一のテンプレート鎖を含む。
【００８４】
実施形態において、前記ヌクレオチドはビオチン標識を有する。
【００８５】
実施形態において、前記磁性粒子は、ストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子であり、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子がビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子（ＢＳＭＮ）錯体を形成し、この方法は、さらに、ＢＳＭＮ錯体を除去するステップを備える。
【００８６】
実施形態において、前記磁性粒子は、官能化した磁性ナノ粒子である。
【００８７】
実施形態において、前記磁性粒子は、ストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子である。
【００８８】
実施形態において、前記指定空間は、フローセルのチャンバ内に配置し、また前記ヌクレオチド送給ステップ及び前記磁性粒子送給ステップは、前記チャンバに前記ヌクレオチドを流すステップ及び前記磁性粒子を流すステップを含む。
【００８９】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定空間を有するチャンバを画定し、前記検出装置は、前記チャンバに沿って位置決めした電極を有し、前記ヌクレオチド送給ステップ及び前記磁性粒子送給ステップは、前記電極を用いての液滴動作を実行するステップを含む。
【００９０】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、さらに、ステップ(ｄ)の後に電気抵抗のバックグラウンド（背景）レベルを検出するステップを含む。
【００９１】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、ステップ(ｃ)の後に前記保護基を除去するステップを備える。
【００９２】
実施形態において、磁気応答センサは磁気抵抗センサを有する。
【００９３】
実施形態において、磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＧＭＲセンサの導電層に導通する電流の変化によって生ずるものである。
【００９４】
実施形態において、磁気応答センサは、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＴＭＲセンサの絶縁層におけるトンネル通過電子の流れの変化によって生ずるものである。
【００９５】
実施形態において、各磁気応答センサは、第１及び第２の強磁性層と、前記第１及び第２の強磁性層を分離する非磁性層とを有する。
【００９６】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【００９７】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【００９８】
実施形態において、磁気特性は、磁場、磁気方位、又は磁気モーメントのうち少なくとも１つを含む。
【００９９】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【０１００】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【０１０１】
実施形態において、前記磁性粒子は、それぞれに対応する磁気応答センサの磁化を恒久的に変化し、これにより、前記対応の磁気応答センサの磁化が、磁性粒子を除去した後にも維持され、前記ＳＢＳサイクルは、前記磁気応答センサの読出しを行った後に前記磁気応答センサの少なくとも幾つかの磁化を変化させるステップを含む。
【０１０２】
実施形態において、前記磁気応答センサの読出しは、前記磁性粒子を除去した後に行う。
【０１０３】
本発明の実施形態においては、ＳＢＳの方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを有し、該ヌクレオチドは、少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有する。各ＳＢＳサイクルは、 (ｂ)前記第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップを有する。各ＳＢＳサイクルは、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｅ)第３ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｆ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。本発明方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１０４】
実施形態において、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されるが、ステップ(ｆ)では検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第１ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出され、かつステップ(ｆ)で検出された場合、ステップ(ａ)で前記第２ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されなかったが、ステップ(ｆ)では検出された場合、ステップ(ａ)で前記第３ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【０１０５】
実施形態において、ステップ(ａ)は、第４ヌクレオチドを送給するステップを含み、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されず、かつステップ(ｆ)で検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第４ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【０１０６】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、さらに、(ｇ)前記磁性粒子を前記第２及び第３のヌクレオチドから除去するステップを含む。
【０１０７】
実施形態において、ステップ(ｄ)及び(ｅ)を同時に行う。
【０１０８】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１０９】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０１１０】
実施形態において、磁気特性は、磁場、磁気方位、又は磁気モーメントのうち少なくとも１つを含む。
【０１１１】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【０１１２】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【０１１３】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、ステップ(ｃ)の後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１１４】
実施形態において、前記磁性粒子は、それぞれに対応する磁気応答センサの磁化を恒久的に変化し、これにより、前記対応の磁気応答センサの磁化が、ステップ(ｆ)の後に磁性粒子を除去した後にも維持され、前記ＳＢＳサイクルは、前記磁気応答センサの読出しを行った後に前記磁気応答センサの少なくとも幾つかの磁化を変化させるステップを含む。
【０１１５】
実施形態において、前記磁気応答センサの読出しは、前記磁性粒子を除去した後に行う。
【０１１６】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳサイクルは、(ｂ)磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出する検出ステップであって、第１ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子は、第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子によって生ずる電気抵抗変化とは異なる電気抵抗変化を生ずる、該検出ステップを含む。この方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１１７】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１１８】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０１１９】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、第１の大きさにほぼ等しいか否か又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０１２０】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０１２１】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０１２２】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳサイクルを通して前記磁気応答センサで検出された変化を比較するステップを含む。
【０１２３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳサイクルに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化を比較するステップを含む。
【０１２４】
実施形態において、前記第１及び第２のヌクレオチドは、互いに異なる数の磁性粒子を捕獲し、前記磁性粒子の異なる数は電気抵抗変化の異なる大きさを生ずるよう構成されている。
【０１２５】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【０１２６】
実施形態において、前記第１ヌクレオチドは第１タイプの磁性粒子を捕獲し、第２ヌクレオチドは第２タイプの磁性粒子を捕獲し、前記第１及び第２のタイプの磁性粒子は、電気抵抗変化の異なる大きさを生ずるよう構成されている。
【０１２７】
実施形態において、前記第１及び第２のタイプの磁性粒子は互いに異なる常磁性物質を有する。
【０１２８】
実施形態において、ステップ(ａ)で前記第１及び第２のヌクレオチドを送給するステップは、前記第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるステップと、及び前記磁性粒子を前記指定空間に送給し、これにより前記磁性粒子が前記第１及び第２のヌクレオチドに付着するようにするステップと、を含む。
【０１２９】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベント後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１３０】
実施形態において、前記第１及び第２のヌクレオチドそれぞれは、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付く１つ又はそれ以上の磁性粒子を有し、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチド又は第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するときに釈放されるものである。
【０１３１】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する第１及び第２の単分子磁石（ＳＭＭ）を有し、前記第１及び第２のＳＭＭそれぞれは、互いに異なる光周波数に応答する互いに異なる磁性状態を有する。各ＳＢＳサイクルは、(ｂ)第１光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｃ)前記第１ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)第２光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｅ)第３光周波数を印加することによって第２ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｆ)前記第２ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１３２】
実施形態において、各ＳＢＳサイクルは、さらに、第４光周波数を印加することによって第２ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。
【０１３３】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０１３４】
実施形態において、前記ＳＢＳサイクルのうち少なくとも幾つかに対して、ステップ(ｂ)〜(ｄ)又はステップ(ｅ)〜(ｆ)のうち少なくとも一方を複数回繰り返す。
【０１３５】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１３６】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに関して前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出された変化に基づくものである。
【０１３７】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が第１の大きさにほぼ等しいか、又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０１３８】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０１３９】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０１４０】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳサイクルを通して前記磁気応答センサで検出された変化を比較するステップを含む。
【０１４１】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳサイクルに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化を比較するステップを含む。
【０１４２】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベント後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１４３】
実施形態において、前記第１及び第２のヌクレオチドそれぞれは、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付く１つ又はそれ以上の磁性粒子を有し、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチド又は第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するときに釈放されるものである。
【０１４４】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する単分子磁石（ＳＭＭ）を有し、該第１及び第２のヌクレオチドは、それらに付着する異なる数のＳＭＭを有し、該ＳＭＭは、異なる光周波数に応答する磁性状態を有する。各ＳＢＳサイクルは、(ｂ)第１光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)第２光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。この方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１４５】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０１４６】
実施形態において、前記ＳＢＳサイクルのうち少なくとも幾つかに対して、ステップ(ｂ)〜(ｄ)を複数回繰り返す。
【０１４７】
実施形態において、少なくとも第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれのヌクレオチドに付着するＳＭＭを有する第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、該第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれに付着するＳＭＭの数が異なるものである。
【０１４８】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０１４９】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１５０】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれに関して前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出された変化に基づくものである。
【０１５１】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化の大きさが第１の大きさにほぼ等しいか、又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０１５２】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化の大きさが、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０１５３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化の大きさが、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０１５４】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳサイクルを通して前記磁気応答センサで検出された変化の大きさを比較するステップを含む。
【０１５５】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳサイクルに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化の大きさを比較するステップを含む。
【０１５６】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳサイクルの終了時に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１５７】
実施形態において、前記第１及び第２のヌクレオチドそれぞれは、前記ヌクレオチドのγリン酸塩に結び付く１つ又はそれ以上の磁性粒子を有し、該磁性粒子は、ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチド又は第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するときに釈放されるものである。
【０１５８】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、ポリメラーゼを使用して各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを付加することによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備え、前記ポリメラーゼは、ポリメラーゼに付着する対応の磁性粒子を有し、各ＳＢＳイベントは、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含み、検出した変化は、ポリメラーゼがヌクレオチドを付加するとき前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１５９】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）であり、この方法は、さらに、１つ又はそれ以上の光周波数を用いてＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。
【０１６０】
実施形態において、複数のＳＢＳイベントを遂行するステップは、(ａ)第１タイプのヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記第１タイプのヌクレオチドに関連する電気抵抗変化を検出するステップと、(ｂ)第２タイプのヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記第２タイプのヌクレオチドに関連する電気抵抗変化を検出するステップとを含む。
【０１６１】
実施形態において、複数のＳＢＳイベントを遂行するステップは、複数タイプのヌクレオチドを同時に前記指定空間に送給して電気抵抗変化を検出するステップを含み、各タイプのヌクレオチドは、他タイプのヌクレオチドの取込率とは異なる対応の取込率を有し、前記相補鎖の配列は、検出された変化の持続時間に基づくものである。
【０１６２】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記検出された変化の持続時間が多数の値のうち１つにほぼ等しいか否かを決定するステップを含み、前記値の個数はヌクレオチドのタイプの個数に等しいものである。
【０１６３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記検出された変化の持続時間が多数のあり得る範囲値内にあるか否かを決定するステップを含み、前記あり得る範囲値の個数はヌクレオチドのタイプの個数に等しいものである。
【０１６４】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数ＳＢＳイベントを通して、各磁気応答センサで検出された変化の持続時間を比較するステップを含む。
【０１６５】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳイベントに対して、前記複数の磁気応答センサに関連して検出された変化の持続時間を比較するステップを含む。
【０１６６】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１６７】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０１６８】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントを遂行するステップは、複数の試薬を前記指定空間に同時に供給するステップを含み、前記試薬はヌクレオチド及びポリメラーゼを含み、前記ＳＢＳイベントは単一ポット反応で遂行する。
【０１６９】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、(ａ)第１ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含み、前記ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、(ｂ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含み、前記電気抵抗変化は、ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、(ｃ)第２ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含み、前記ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含み、前記電気抵抗変化は、対応のポリメラーゼが前記第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１７０】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）であり、この方法は、さらに、１つ又はそれ以上の光周波数を用いてＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。
【０１７１】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、さらに、(ｅ)第３ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給する送給ステップであり、前記ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する、該送給ステップと、及び(ｆ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップとを含み、前記電気抵抗変化は、前記ポリメラーゼが前記第３ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生ずる。
【０１７２】
実施形態において、前記複数のＳＢＳサイクルそれぞれは、さらに、第４ヌクレオチド及びポリメラーゼを前記指定空間に送給する送給ステップを含む。
【０１７３】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１７４】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０１７５】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各サイクルの終了時に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１７６】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチド並びにポリメラーゼを前記指定空間に送給するステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは互いに異なる塩基を有し、前記ポリメラーゼは、該ポリメラーゼに付着する磁性粒子を有する。前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、(ｂ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含み、該電気抵抗変化は、前記ポリメラーゼが前記第１ヌクレオチド又は第２ヌクレオチドを前記相補鎖に付加するとき、前記指定空間に前記磁性粒子が存在することによって生じ、前記第１及び第２のヌクレオチドは、互いに異なる取込率を有する。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１７７】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【０１７８】
実施形態において、少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを送給するステップは、それぞれが互いに異なる塩基及び互いに異なる取込率を有する第１、第２、及び第３のヌクレオチドを送給するステップを含む。
【０１７９】
実施形態において、少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを送給するステップは、それぞれが互いに異なる塩基及び互いに異なる取込率を有する第１、第２、第３、及び第４のヌクレオチドを送給するステップを含む。
【０１８０】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０１８１】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０１８２】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各サイクルの終了時に前記保護基を除去するステップを備える。
【０１８３】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントを遂行するステップは、複数の試薬を前記指定空間に同時に供給するステップを含み、前記試薬は第１及び第２のヌクレオチド並びにポリメラーゼを含み、前記ＳＢＳイベントは単一ポット反応で遂行する。
【０１８４】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）システムを開示する。このシステムは、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を備え、前記磁気応答センサ各々は、少なくとも２つの強磁性層と、前記２つの強磁性層を分離する非磁性層とを有し、前記磁気応答センサ各々は、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を形成し、前記磁気応答センサは、チャンバ内で対応する指定空間に隣接して位置決めされ、また前記対応する指定空間から磁性粒子を検出するよう構成されている。このシステムは、前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備え、前記読出回路は、前記磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている。このシステムは、さらに、ＳＢＳプロトコールを遂行するため前記チャンバに試薬を流すよう構成された流体制御系を備え、前記試薬は複数のタイプのヌクレオチドを含むものであり、前記読出回路は各取り込みイベント後に信号を伝送するよう構成されている。
【０１８５】
実施形態において、前記磁気応答センサは、第１状態と第２状態との間で変化するよう構成されたＧＭＲセンサを有し、前記２つの強磁性層は、前記第１状態で反強磁性的に結合され、これにより前記非磁性層が第１電気抵抗を有し、また外部磁場が第２状態で前記反強磁性的な結合を阻害し、これにより前記非磁性層が第２電気抵抗を有するようにする。
【０１８６】
実施形態において、前記磁気応答センサは、第１状態と第２状態との間で変化するよう構成されたＴＭＲセンサを有し、前記２つの強磁性層は前記第１状態で互いに逆向きの磁化方向を有し、これにより前記非磁性層が第１電気抵抗を有し、また前記２つの強磁性層は前記第２状態で同じ向きの磁化方向を有し、これにより前記非磁性層が第２電気抵抗を有するようにする。
【０１８７】
実施形態において、前記流体制御系は、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に流して、前記ヌクレオチドを相補鎖に付加する、及び(ｂ)前記ヌクレオチドに付着するものであり、対応の検出可能な磁気特性を帯びている磁性粒子を前記指定空間に流す、及び(ｄ)前記磁性粒子を前記指定空間から除去するよう構成されており、前記読出回路は、前記(ｂ)の後に前記磁気応答センサの電気抵抗を検出するよう構成されている。
【０１８８】
実施形態において、前記流体制御系は、(ａ)少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは互いに異なる塩基を有する、該ヌクレオチドを前記指定空間に送給して、前記ヌクレオチドを相補鎖に付加する、(ｂ)磁性粒子であって、前記第１ヌクレオチドに付着し、また前記第２ヌクレオチドによって付着するものである、該磁性粒子を前記指定空間に送給する、(ｃ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去する、(ｄ)磁性粒子であって、前記第３ヌクレオチドに付着するものである、該磁性粒子を前記指定空間に送給するよう構成されており、前記読出回路は、前記(ｂ)及び(ｄ)の後に前記磁気応答センサの電気抵抗を検出するよう構成されている。
【０１８９】
実施形態において、前記流体制御系は、少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるよう構成され、該第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、第１及び第２のヌクレオチドに付着する磁性粒子を有するものであり、前記読出回路は、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するよう構成され、前記第１ヌクレオチドの前記磁性粒子は、前記第２ヌクレオチドの前記磁性粒子が引き起こす電気抵抗変化とは異なる電気抵抗変化を生ずる。
【０１９０】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）のシステムを開示する。このシステムは、アームと、前記アームに取り付けた磁気応答センサとを有している読取りヘッドを備え、磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を有し、磁気応答センサは、磁性粒子を検出するよう構成されている。このシステムは、基板表面を有するサンプル基板を備え、前記基板表面は、指定空間内で基板表面に沿って配置された複数の核酸テンプレート鎖を有するよう構成され、前記読取りヘッド及びサンプル基板のうち少なくとも一方が他方に対して相対移動し、磁気応答センサを指定空間の近傍に動作可能関係となるよう位置決めする構成とされる。このシステムは、前記磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備え、前記読出回路は、１つの指定空間に位置決めされるとき、前記磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている。
【０１９１】
実施形態において、前記サンプル基板は軸線周りに回転可能である。
【０１９２】
実施形態において、前記サンプル基板はディスク形状である。
【０１９３】
実施形態において、読取りヘッドは、アームに取り付けた複数の磁気応答センサを有し、前記読出回路は、動作関係の少なくとも幾つかのために前記磁気応答センサの少なくとも複数からの信号を伝送するよう構成されている。
【０１９４】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、アームと、前記アームに取り付けた磁気応答センサとを有している読取りヘッドを準備するステップを備え、前記磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を有し、前記磁気応答センサは、磁性粒子を検出するよう構成されている。この方法は、指定空間内で基板表面に沿って配置された複数の核酸テンプレート鎖を有するサンプル基板を準備するステップを有する。この方法は、各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備え、前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子で標識付けし、各ＳＢＳサイクルに関して、この方法は、指定空間に隣接して基板表面に沿って前記磁気応答センサを位置決めするステップと、及び前記磁気応答センサにおける電気抵抗を検出するステップを備える。この方法は、電気抵抗の変化に基づいて相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１９５】
実施形態において、前記サンプル基板は軸線周りに回転可能であり、前記磁気応答センサを位置決めするステップは、前記サンプル基板を軸線周りに回転させるステップを含む。
【０１９６】
実施形態において、前記サンプル基板はディスク形状である。
【０１９７】
実施形態において、読取りヘッドは、アームに取り付けた複数の磁気応答センサを有する。
【０１９８】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法において、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出し、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖を捕獲するよう構成されている。この方法は、対応するテンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備え、前記ヌクレオチドは、それぞれに対応する磁気特性を有する対応の磁性粒子に付着するものであり、前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付着するとき、前記磁性粒子それぞれの磁気特性によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０１９９】
実施形態において、前記磁気応答センサは、磁気抵抗センサを有する。
【０２００】
実施形態において、前記磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＧＭＲセンサの導電層に導通する電流の変化によって生ずるものである。
【０２０１】
実施形態において、前記磁気応答センサは、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサを有し、前記電気抵抗変化は、ＴＭＲセンサの絶縁層におけるトンネル通過電子の流れの変化によって生ずるものである。
【０２０２】
実施形態において、各磁気応答センサは、第１及び第２の強磁性層と、前記第１及び第２の強磁性層を分離する非磁性層とを有する。
【０２０３】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０２０４】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０２０５】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記電気抵抗変化が磁気応答センサで生じたか否かを決定するステップを含む。
【０２０６】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化の大きさを決定するステップを含む。
【０２０７】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドに付着する磁性粒子の数とは異なる数でそのタイプに付着する磁性粒子を有するものである。
【０２０８】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【０２０９】
実施形態において、前記ヌクレオチドは、複数タイプのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの各タイプは、他のタイプのヌクレオチドではなくそのタイプに付着する異なるタイプの磁性粒子を有するものである。
【０２１０】
実施形態において、前記磁性粒子は異なる磁場強度を有する。
【０２１１】
実施形態において、前記磁気特性は、磁場、磁気方位、又は磁気モーメントのうち少なくとも１つを含む。
【０２１２】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【０２１３】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【０２１４】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、複数タイプのヌクレオチドを送給するステップを含み、各タイプのヌクレオチドが別個の時点で送給される。
【０２１５】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、複数タイプのヌクレオチドを同時に送給するステップを含む。
【０２１６】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、対応のヌクレオチドを相補鎖に付加した後に磁性粒子を対応のヌクレオチドに送給するステップを含む。
【０２１７】
実施形態において、前記磁性粒子は可逆性連鎖（リンケージ）を有する。
【０２１８】
実施形態において、各指定エリアは、ポリメラーゼによって捕獲される単一テンプレート鎖を有する。
【０２１９】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定エリアを有するチャンバを画定するフローセルを備え、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子を前記フローセルのチャンバに流すことにより、前記ヌクレオチド及び前記磁性粒子を前記指定エリアに送給する。
【０２２０】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定エリアを有するチャンバを画定し、前記検出装置は、前記チャンバに沿って位置決めした電極を有し、前記ヌクレオチド送給ステップ及び前記磁性粒子送給ステップは、前記電極を用いての液滴動作を実行するステップを含む。
【０２２１】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ)の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出し、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。この方法は、前記テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｂ)磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップを含み、前記磁性粒子は前記ヌクレオチドによって捕獲され、前記磁性粒子は対応する外部磁場を提供する。各ＳＢＳイベントは、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｄ)前記磁性粒子を前記指定エリアから除去するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２２２】
実施形態において、ステップ(ａ)〜(ｄ)は、複数タイプのヌクレオチドに対して繰り返し、各タイプのヌクレオチドは前記指定エリアに別個に送給される。
【０２２３】
実施形態において、前記ヌクレオチドの送給は、複数タイプのヌクレオチド送給を同時に送給し、また前記磁性粒子の送給は、複数タイプの磁性粒子を同時に送給し、前記磁性粒子の各タイプは、他タイプの磁性粒子の磁場特性とは異なる対応の磁場特性を有する。
【０２２４】
実施形態において、前記指定空間それぞれは、前記検出装置の基板表面に固定化される単一のテンプレート鎖を含む。
【０２２５】
実施形態において、前記指定エリアは、フローセルのチャンバ内に配置し、前記ヌクレオチドを送給するステップ及び前記磁性粒子を送給するステップは、それぞれ前記チャンバに、前記ヌクレオチドを送給するステップ及び前記磁性粒子を送給するステップを含む。
【０２２６】
実施形態において、前記検出装置は、前記指定エリアを有するチャンバを画定し、前記検出装置は、前記チャンバに沿って位置決めした電極を有し、前記ヌクレオチド送給ステップ及び前記磁性粒子送給ステップは、前記電極を用いての液滴動作を実行するステップを含む。
【０２２７】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、さらに、ステップ(ｄ)の後に電気抵抗のバックグラウンド（背景）レベルを検出するステップを含む。
【０２２８】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベントの後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０２２９】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出し、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。この方法は、テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記ヌクレオチドが前記相補鎖に付加されるのを可能にするステップを有し、該ヌクレオチドは、少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有する。各ＳＢＳイベントは、(ｂ)前記第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｄ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｅ)第３ヌクレオチドにおける磁性粒子を前記指定エリアに送給するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｆ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２３０】
実施形態において、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されるが、ステップ(ｆ)では検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第１ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出され、かつステップ(ｆ)で検出された場合、ステップ(ａ)で前記第２ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されなかったが、ステップ(ｆ)では検出された場合、ステップ(ａ)で前記第３ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【０２３１】
実施形態において、ステップ(ａ)は、第４ヌクレオチドを送給するステップを含み、電気抵抗変化がステップ(ｃ)で検出されず、かつステップ(ｆ)で検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第４ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【０２３２】
実施形態において、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれは、さらに、(ｇ)前記磁性粒子を前記第２及び第３のヌクレオチドから除去するステップを含む。
【０２３３】
実施形態において、ステップ(ｄ)及び(ｅ)を同時に行う。
【０２３４】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０２３５】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０２３６】
実施形態において、磁気特性は、磁場、磁気方位、又は磁気モーメントのうち少なくとも１つを含む。
【０２３７】
実施形態において、前記磁性粒子は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質を含む。
【０２３８】
実施形態において、前記磁気応答センサで検出される電気抵抗変化は、磁性粒子の物質における電子の固有スピンによって生ずる。
【０２３９】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベントの後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０２４０】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出し、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは、対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。この方法は、テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記相補鎖を伸長させ、前記第１及び第２のヌクレオチドは、互いに異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドに付着する磁性粒子を有する。各ＳＢＳイベントは、(ｂ)磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出する検出ステップであって、前記第１ヌクレオチドの磁性粒子は、前記第２ヌクレオチドの磁性粒子によって生ずる電気抵抗変化とは異なる電気抵抗変化を生ずる、該検出ステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２４１】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０２４２】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して、前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出した変化に基づくものである。
【０２４３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、第１の大きさにほぼ等しいか否か又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０２４４】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０２４５】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０２４６】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳイベントを通して前記磁気応答センサで検出された変化を比較するステップを含む。
【０２４７】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳイベントに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化を比較するステップを含む。
【０２４８】
実施形態において、前記第１及び第２のヌクレオチドは、互いに異なる数の磁性粒子を捕獲し、前記磁性粒子の異なる数は電気抵抗変化の異なる大きさを生ずるよう構成されている。
【０２４９】
実施形態において、前記磁性粒子は単分子磁石（ＳＭＭ）である。
【０２５０】
実施形態において、前記第１ヌクレオチドは第１タイプの磁性粒子を捕獲し、第２ヌクレオチドは第２タイプの磁性粒子を捕獲し、前記第１及び第２のタイプの磁性粒子は、電気抵抗変化の異なる大きさを生ずるよう構成されている。
【０２５１】
実施形態において、前記第１及び第２のタイプの磁性粒子は互いに異なる常磁性物質を有する。
【０２５２】
実施形態において、ステップ(ａ)で前記第１及び第２のヌクレオチドを送給するステップは、前記第１及び第２のヌクレオチドを前記指定エリアに送給して前記相補鎖を伸長させるステップと、及び前記磁性粒子を前記指定エリアに送給し、これにより前記磁性粒子が前記第１及び第２のヌクレオチドに付着するようにするステップと、を含む。
【０２５３】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベント後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０２５４】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。この方法は、前記テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する第１及び第２の単分子磁石（ＳＭＭ）を有し、前記第１及び第２のＳＭＭそれぞれは、互いに異なる光周波数に応答する互いに異なる磁性状態を有する。各ＳＢＳイベントは、(ｂ)第１光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｃ)前記第１ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｄ)第２光周波数を印加することによって第１ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｅ)第３光周波数を印加することによって第２ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｆ)前記第２ＳＭＭの磁性状態によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２５５】
実施形態において、各ＳＢＳイベントは、さらに、第４光周波数を印加することによって第２ＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。
【０２５６】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０２５７】
実施形態において、前記ＳＢＳイベントのうち少なくとも幾つかに対して、ステップ(ｂ)〜(ｄ)又はステップ(ｅ)〜(ｆ)のうち少なくとも一方を複数回繰り返す。
【０２５８】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０２５９】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに関して前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出された変化に基づくものである。
【０２６０】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が第１の大きさにほぼ等しいか、又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０２６１】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化が、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０２６２】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化が、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０２６３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳイベントを通して前記磁気応答センサで検出された変化を比較するステップを含む。
【０２６４】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳイベントに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化を比較するステップを含む。
【０２６５】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各ＳＢＳイベント後に前記保護基を除去するステップを備える。
【０２６６】
実施形態において、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法においては、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定エリアの近傍に配置して前記指定エリアから磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、前記指定エリアに固定化されるポリメラーゼを有し、前記ポリメラーゼは対応するテンプレート鎖に付着するよう構成されている。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳイベントは、(ａ)少なくとも第１及び第２のヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖を伸長させるようにするステップを含み、前記第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、該第１及び第２のヌクレオチドにそれぞれ付着する単分子磁石（ＳＭＭ）を有し、該第１及び第２のヌクレオチドは、それらに付着する異なる数のＳＭＭを有し、該ＳＭＭは、異なる光周波数に応答する磁性状態を有する。各ＳＢＳイベントは、(ｂ)第１光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｃ)前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳイベントは、(ｄ)第２光周波数を印加することによってＳＭＭの磁性状態を変更するステップを含む。この方法は、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２６７】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０２６８】
実施形態において、前記ＳＢＳイベントのうち少なくとも幾つかに対して、ステップ(ｂ)〜(ｄ)を複数回繰り返す。
【０２６９】
実施形態において、少なくとも第１及び第２のヌクレオチドは、それぞれのヌクレオチドに付着するＳＭＭを有する第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、該第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれに付着するＳＭＭの数が異なるものである。
【０２７０】
実施形態において、前記ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物を有する。
【０２７１】
実施形態において、前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップは、前記検出した変化に基づく信号が指定パターンを形成するか否かを決定するよう前記検出した電気抵抗変化を解析するステップを含む。
【０２７２】
実施形態において、前記遺伝情報を決定するステップは、前記相補鎖の配列を決定するステップを含み、前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに関して前記磁気応答センサで生ずる電気抵抗の検出された変化に基づくものである。
【０２７３】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化の大きさが第１の大きさにほぼ等しいか、又は第２の大きさにほぼ等しいか否かを決定するステップを含む。
【０２７４】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサでの検出された変化の大きさが、閾値を超えるか否かを決定するステップを含む。
【０２７５】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、前記磁気応答センサで検出された変化の大きさが、値の指定範囲内にあるか否かを決定するステップを含む。
【０２７６】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、複数のＳＢＳイベントを通して前記磁気応答センサで検出された変化の大きさを比較するステップを含む。
【０２７７】
実施形態において、前記相補鎖の配列を決定するステップは、各ＳＢＳイベントに対して、複数の前記磁気応答センサに関連して検出された変化の大きさを比較するステップを含む。
【０２７８】
実施形態において、前記ヌクレオチドは保護基を含み、この方法は、さらに、各イベントの終了時に前記保護基を除去するステップを備える。
【０２７９】
実施形態においては、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の方法を開示する。この方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備え、前記磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出するようにし、前記検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿って相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行する遂行ステップを備える。各ＳＢＳサイクルは、(ａ)ヌクレオチドを前記指定空間に送給して前記相補鎖に付加することを可能にするステップを含み、前記ヌクレオチドは、少なくとも第１、第２及び第３のヌクレオチドを含み、前記第１、第２及び第３のヌクレオチドは、それぞれ異なる塩基を有し、前記第１及び第２のヌクレオチドは磁性粒子を含み、前記第３のヌクレオチドは磁性粒子を含まないものとする。各ＳＢＳサイクルは、(ｂ)前記第１及び第２のヌクレオチドの磁性粒子によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｃ)前記磁性粒子を前記第１ヌクレオチドから除去するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｄ)第３ヌクレオチドによって捕獲される磁性粒子を前記指定空間に送給するステップを含む。各ＳＢＳサイクルは、(ｅ)第２及び第３の磁性粒子によって生ずる前記磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含む。この方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の遺伝情報を決定するステップを備える。
【０２８０】
実施形態において、電気抵抗変化がステップ(ｂ)で検出されるが、ステップ(ｅでは検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第１ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｂ)で検出され、かつステップ(ｅ)で検出された場合、ステップ(ａ)で前記第２ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長し、電気抵抗変化がステップ(ｂ)で検出されなかったが、ステップ(ｅ)では検出された場合、ステップ(ａ)で前記第３ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【０２８１】
実施形態において、ステップ(ａ)は、第４ヌクレオチドを送給するステップを含み、電気抵抗変化がステップ(ｂ)で検出されず、かつステップ(ｅ)で検出されなかった場合、ステップ(ａ)で前記第４ヌクレオチドが前記相補鎖を伸長したものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２８２】
【図１】図１Ａは、例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援する磁気センサアレイを備えるシステムの頂面図を示す。図１Ｂは、図１Ａのシステムの断面図を示す。
【図２】図２Ａは、ＧＭＲデバイスの実施例を示す。図２Ｂは、ＴＭＲデバイスの実施例を示す。
【図３】単独の磁性ナノ粒子を用いるＧＭＲバイオチップの感受性をプロットしたグラフの例を示す。
【図４】図１Ａ及び図１Ｂに示す検出装置の一部であり、磁気センサアレイのより詳細を示す断面図である。
【図５】図１Ａ、１Ｂ及び４に示す検出装置の一部であって、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームの例を示し、取り込まれてビオチニル化したヌクレオチドを使用して、ストレプトアビジン被覆ナノ粒子を捕捉し、また検出可能な信号を発生する、該検出装置の一部を示す。
【図６】図６Ａは、図５のビオチニル化したヌクレオチドの部分構造式を示す。図６Ｂは、ヌクレオチドのγリン酸塩に結合した磁性粒子を有するヌクレオチドの部分構造式を示す。
【図７】例えば、図１Ａ、１Ｂ及び４に示すフローセルを用いる磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基決定方法の例におけるフローチャートを示す。
【図８】例えば、図１Ａ、１Ｂ及び４に示すフローセルを用いる「２標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基識別方法の例におけるフローチャートを示す。
【図９】図８の方法におけるステップを模式的に示す概略図である。
【図１０】例えば、図１Ａ、１Ｂ及び４に示すフローセルを用いる「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基識別方法の例におけるフローチャートを示す。
【図１１】ＳＭＭ標識付けしたヌクレオチドを用いる「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基識別方法の例におけるフローチャートを示す。
【図１２】塩基識別用に異なる磁性の大きさを有する、ＳＭＭ標識付けしたヌクレオチドを用いる「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基識別方法の例におけるフローチャートを示す。
【図１３】ＳＭＭタグ付けしたＤＮＡポリメラーゼ及び異なる取込み率を有するヌクレオチドを用いる磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでの塩基識別方法の例におけるフローチャートを示す。
【図１４】図１４Ａは、フローセル又は液滴アクチュエータにおける半疎水性領域の例と組み合わせた磁気センサアレイの平面図を示す。図１４Ｂは、図１４Ａの磁気センサアレイの断面図を示す。
【図１５】図１５Ａは、フローセル又は液滴アクチュエータにおける半疎水性領域の他の例と組み合わせた磁気センサアレイの平面図を示す。図１５Ｂは、図１５Ａの磁気センサアレイの断面図を示す。
【図１６】図１６Ａは、例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援する磁気センサアレイを備える液滴アクチュエータの一部の平面図を示す。図１６Ｂは、図１６Ａの液滴アクチュエータの断面図を示す。
【図１７】例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援するために１個の可動磁気センサを設ける回転ディスクをベースにした機器の平面図を示す。
【図１８】図１８Ａは、ポリメラーゼを指定領域に固定化する実施形態と組み合わせた磁気センサアレイの平面図を示す。図１８Ｂは、図１８Ａの磁気センサアレイの平面図及び断面図のそれぞれを示す断面図である。
【図１９】本発明の実施形態による磁気応答センサを示す。
【発明を実施するための形態】
【０２８３】
本明細書に記載の方法は、多様な生物学的解析又は化学的分析の技術に関連して使用することができ、これには核酸シークエンシング（配列決定）技術が含まれる。本発明による実施形態は、核酸ストランド（鎖）が成長するときに生ずる電気抵抗変化に基づいてサンプル（標本）の遺伝情報を決定するのに使用することができる。とくに、適用可能な技術は、生物学的又は化学的なサンプルを指定位置に配置し、解析中にそれらサンプルの相対的位置がしないよう配置する技術である。例えば、核酸は、アレイが繰り返し走査される指定プロトコール中に基板表面に沿う固定の場所に付着することができる。例えば、１つのヌクレオチド塩基タイプを他のタイプから区別するのに使用される異なる標識に一致して痕跡（インプレッション）が異なるチャンネルで得られる実施形態がとくに適用可能である。幾つかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは自動化プロセスとすることができる。好適な実施形態には、シークエンシング・バイ・シンセシス（「ＳＢＳ」）技術がある。
【０２８４】
上述したように、本発明の実施形態はサンプルの遺伝情報を決定するのに使用することができる。遺伝情報は、磁気応答センサで生ずる電気抵抗変化を解析することによって決定することができる。例えば、ヌクレオチド又はポリメラーゼに関連する磁性粒子は、ヌクレオチドが核酸に付着するとき磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を生ずることができる。電気抵抗に基づく磁気応答センサからの信号は、解析されて、遺伝情報を決定するのに使用することができるデータを提供する。本明細書で用いる用語「遺伝情報」は、核酸の配列（シーケンス）に基づいて正確な配列が決定されるか否かの、核酸配列又は任意な特性を含む。例えば、実施形態は、核酸の相補鎖を成長させ、この成長において、相補鎖に付加される各ヌクレオチドを１つ又はそれ以上の磁性粒子に関連させる。幾つかの実施形態において、ヌクレオチドは各取込み（incorporation）イベントにおいて同定する（例えば、リアルタイムで）ことができる。他の実施形態において、ヌクレオチドは、複数取込みイベント後又は二次解析でのシークエンシング（配列決定）の操作（ラン）が終了した後にのみ同定することができる。
【０２８５】
さらに他の実施形態において、配列を知得するようヌクレオチドを個別に同定することなく、遺伝情報を決定することができる。例えば、１つ又はそれ以上の取込みイベント後の信号によって得られるデータを解析して、１つの配列を１つ又はそれ以上の他の配列から区別することができる。一つの特別な例として、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）を含む２つ（又はそれ以上）の核酸から導き出されるデータを比較することができる。核酸の配列を知ることなく、本発明実施形態は、磁気応答センサから受け取る信号のパターンを解析することができる。例えば、各ヌクレオチドは、異なる磁気特性を持つ磁性粒子を有することができる。第１パターンを形成する信号は第１の遺伝子型を有することができ、また第２パターンを形成する信号は第２の遺伝子型を有することができる。したがって、第１パターンをもたらす核酸は或る遺伝情報を有すると称することができるとともに、第２パターンをもたらす核酸は異なる遺伝情報を有すると称することができる。このような決定は、やはり核酸の配列を知ることなく行うことができる。
【０２８６】
語句「遺伝情報を決定する（determining a genetic characteristic）」は、必ずしも、サンプルが持っているのがどの遺伝情報かを特異性（specificity）で同定することを含むものではない。例えば、疑いのあるＳＮＰに基づく或る遺伝子型を精査する間に、本発明実施形態は、１つ又はそれ以上のサンプルが或るパターンを有し、他のサンプルがそのパターンを有していないことのみを同定することができる。いずれのケースでも、サンプルの遺伝情報は決定されている。これと同様に、語句「遺伝情報を決定する」ステップは、サンプルが疑わしい病原体を持っていないこと、又は遺伝的変異がＳＮＰ又は短縦列反復（ＳＴＲ）を持っていないことを決定するステップを含む。
【０２８７】
他の例としては、或る疾患を疑われる個人からのサンプルは検査を受けることができる。その疾患は、例えば、遺伝的障害、がん、又は病原体（例えば、エボラ）によって生ずるものであり得る。検査は、核酸が成長するときの電気抵抗変化を検出するステップを含むことができる。やはり、核酸の正確な配列を知ることなく、本発明実施形態は、１つ又はそれ以上のパターンを同定するよう信号を解析することによって、その個人が疾患を有しているか否かを決定することができる。
【０２８８】
「シークエンシング・バイ・シンセシス（「ＳＢＳ」）技術」は、概して新生核酸の鎖（ストランド）におけるテンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復付加による酵素的伸長を含む。ＳＢＳの慣習的方法においては、各送給におけるポリメラーゼの存在の下で単一ヌクレオチド単量体（モノマー）を標的ヌクレオチドに供給することができる。しかし、本明細書に記載の本発明方法においては、１つより多いタイプのヌクレオチド単量体を送給におけるポリメラーゼの存在の下で標的核酸に供給することができる。
【０２８９】
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体、又は何らターミネーター部分がないヌクレオチド単量体を利用することができる。ターミネーターがないヌクレオチド単量体を利用する方法としては、例えば、以下により詳細に説明するピロシークエンシング及びγリン酸塩で標識付けしたヌクレオチドを用いるシークエンシングがある。ターミネーターがないヌクレオチド単量体を利用する方法においては、各サイクルで付加されるヌクレオチドの数は、概して変動し、またこれはテンプレート（鋳型）配列及びヌクレオチド送給モードに依存する。ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体を利用するＳＢＳ技術に関しては、ジデオキシヌクレオシドを利用する慣習的なサンガーシークエンシングの場合と同様にターミネーターはシークエンシング条件の下で効果的に不可逆的なものとするか、又はターミネーターはソレクサ（Solexa）社（現在はイラミーナ社(Illumina（登録商標）, Inc.)）が開発したシークエンシング方法と同様に可逆的なものとすることができる。
【０２９０】
ＳＢＳ技術は、標識部分を有する、又は標識部分がないヌクレオチド単量体を利用することができる。したがって、取込みイベントは、標識の蛍光発光のような標識の特性、分子量又は分子電荷のようなヌクレオチド単量体特性、ピロリン酸塩釈放のようなヌクレオチド取込みにおける副生成物等に基づいて検出することができる。２つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドがシークエンシング試薬に存在する実施形態においては、異なるヌクレオチドは互いに区別可能なものとすることができる、又は代案として、用いている検出技術の下では２つ又はそれ以上の異なる標識は区別不能なものとすることができる。例えば、シークエンシング試薬内に存在する異なるヌクレオチドは、異なる標識を有することができ、またソレクサ社（現在はイラミーナ社）が開発したシークエンシング方法によって例示されているように、適切な光学系を用いて区別することができる。
【０２９１】
ピロシークエンシングは、特定ヌクレオチドが新生鎖に取り込まれるとき、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.” Analytical Biochemistry 242(1), 84-9； Ronaghi, M. (2001) “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.” Genome Res. 11(1), 3-11；Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) “A sequencing method based on real-time pyrophosphate.” Science 281(5375), 363；米国特許第6,210,891号、米国特許第6,258,568号及び米国特許第6,274,320号参照。これら文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする）。ピロシークエンシングにおいて、釈放されたＰＰｉは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への即時変換でＡＴＰスルフリル化によって検出することができる。シークエンシング（配列決定）すべき核酸は、アレイにおける形体（features）に付着することができ、このアレイは、アレイの形体におけるヌクレオチド取込みに起因して発生する化学発光シグナルを捕捉するよう画像化することができる。画像は、アレイを特定のヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）で処理した後に取得することができる。各ヌクレオチドタイプの付加後に取得した画像は、アレイにおけるどの形体を検出するかによって異なる。画像におけるこれらの相違は、アレイにおける形体の異なる配列（シーケンス）内容を反映する。しかし、各形体の相対的場所は、画像内で不変のままである。画像は、本明細書に記載の方法を用いて保存、処理、及び解析することができる。例えば、各異なるヌクレオチドタイプでアレイを処理した後に取得される画像は、可逆的ターミネーターをベースとするシークエンシング方法のための異なる検出チャンネルから取得された画像に対して、本明細書で例示したのと同一のやり方で取り扱うことができる。
【０２９２】
ＳＢＳの他の例示的なタイプにおいて、サイクル・シークエンシングは、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、国際公開第０４／０１８４９７号及び米国特許第７，０５７，０２６号に記載のような開裂可能な又は光退色可能な色素標識を含む可逆ターミネーター・ヌクレオチドの段階的付加によって完遂される。この手法は、ソレクサ社（現在はイラミーナ社）によって商業化されており、また国際公開第９１／０６６７８号及び国際公開第０７／１２３，７４４号にも記載されており、これら文献は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるものとする。ターミネーション（終止）が可逆的である蛍光標識付けターミネーターの利用可能性、及び開裂した蛍光標識は、効率的な環状可逆ターミネーション（ＣＲＴ：cyclic reversible termination）配列決定（シークエンシング）を容易にする。ポリメラーゼも、効率的に取込みを行い、またこれらの修飾されたヌクレオチドから伸長するよう同時改変操作することができる。
【０２９３】
可逆ターミネーターをベースとするシークエンシングの実施形態において、好適にも、標識はＳＢＳ反応条件の下で伸長をほとんど阻害しない。しかし、検出標識は、例えば、開裂（cleavage）又は分解（degradation）によって除去することができる。画像は、アレイ配列された標識の核酸形体への取込みに続いて撮像することができる。特別な実施形態において、各サイクルは、４つの異なるヌクレオチドタイプを同時に送給するステップを含み、各ヌクレオチドタイプはスペクトル的にはっきりと区別がつく標識を有する。こうして、４つの画像は、それぞれ４つの異なる標識に各個に選択的な検出チャンネルを用いて取得することができる。代案として、異なるヌクレオチドタイプを逐次的に付加することができ、アレイの画像は、各付加ステップ相互間で取得することができる。このような実施形態において、各画像は、特定タイプのヌクレオチドを取り込んだ核酸形体を示す。異なる形体は、各形体の異なる配列内容に起因して異なる画像内で存在又は不存在である。しかし、形体の相対的位置は、画像内で不変のままである。このような可逆ターミネーターＳＢＳ方法から取得した画像を本明細書で記載のように保存、処理及び解析することができる。画像撮像ステップに続いて、標識を除去することができ、可逆ターミネーター部分を除去して、後続サイクルのヌクレオチド付加及び検出を行うことができるようにする。特定サイクルにおける標識を検出した後かつ後続サイクル前における標識除去は、サイクル相互間でのバックグラウンド（背景）信号及びクロストークを減少する利点をもたらすことができる。有用な標識及び除去方法の例を以下に記載する。
【０２９４】
特別な実施形態において、ヌクレオチド単量体の幾つか又はすべては、可逆ターミネーターを含むことができる。このような実施形態において、可逆ターミネーター／開裂可能蛍光体は、３′エステル連鎖を介してリボース部分に結合した蛍光体を含むことができる（Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005) 参照。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする）。他のアプローチは、蛍光標識の開裂からターミネーターの化学的構造を分離しておくものである（Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005) 参照。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする）。Ruparel氏らは、伸長をブロックするため小さい３′アリル基を使用するが、パラジウム触媒での短い処理によっては脱ブロック化できる可逆ターミネーターの展開について記載した。蛍光色素分子（フルオロフォア）は、光開裂可能なリンカーを介して塩基に付着し、このリンカーは、長い波長のＵＶ光に３０秒間露光させることにより開裂できた。例えば、ジスルフィド還元又は光開裂を使用してリンカーを開裂することができる。可逆ターミネーターに対する他のアプローチは、ｄＮＴＰにおける大きな色素の配置後に続いて起きる自然ターミネーションを使用することである。ｄＮＴＰにおける帯電した大きな色素の存在は、立体的及び／又は静電気的な障害による効果的なターミネーターとして作用することができる。１つの取込みイベントの存在は、色素が除去されない限りそれ以上の取込みを阻止する。色素の開裂は、蛍光体を除去し、またターミネーションを効果的に逆転する。修飾したヌクレオチドの例は、米国特許第７，４２７，６７３号及び米国特許第７，０５７，０２６号に記載されており、これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０２９５】
本明細書に記載の方法及びシステムに利用できる他の例示的ＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第７，５４１，４４４号、米国特許第７，５６６，５３７号、米国特許第７，０５７，０２６号、米国特許第８，４６０，９１０号、米国特許第８，６２３，６２８号、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許第７，９８５，５６５号、国際公開第０６／０６４，１９９号、国際公開第０７／０１０，２５１号、米国特許公開第２０１２／０２７０３０５号、国際公開第２０１３／０２６０３７２号に記載されており、これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０２９６】
幾つかの実施形態は、４つより少ない異なる標識を用いて４つの異なるヌクレオチドの検出を利用することができる。例えば、ＳＢＳは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２に組み入れられた資料に記載の方法及びシステムを利用して実施することができる。第１の例として、１対のヌクレオチドタイプは同一波長で検出できるが、対における一方の要素を他方の要素と比較した強度差に基づいて、又は対における一方の要素の見掛け信号を出現又は消滅させる変化であって、対における他方の要素で検出される見掛け信号に比較しての該変化に基づいて区別することができる。第２の例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうち３つを特定条件の下で検出することができるとともに、第４のヌクレオチドタイプは、それらの条件下で検出可能である標識がない、又はそれらの条件下で最小限しか検出（例えば、バックグラウンド蛍光発光等に起因する最小検出）されないものとする。最初の３つのヌクレオチドタイプを核酸に取り込むことは、それぞれに対応する信号の存在に基づいて決定することができ、また第４ヌクレオチドタイプの取込みは、任意な信号の不存在又は最小検出に基づいて決定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチドタイプは２つの異なるチャンネルで検出される標識を含むことができるが、他のヌクレオチドタイプは一方のチャンネルでしか検出されない。上述した３つの例示的形態は相互に排他的とは見なされず、様々な組合せで使用することができる。３つすべての例を組み合わせる例示的実施形態は、第１チャンネルで検出される第１ヌクレオチドタイプ（例えば、第１励起波長で励起されるとき、第１チャンネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２チャンネルで検出される第２ヌクレオチドタイプ（例えば、第２励起波長で励起されるとき、第２チャンネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１チャンネル及び第２チャンネルの双方で検出される第３ヌクレオチドタイプ（例えば、第１及び／又は第２の励起波長で励起されるとき、第１及び第２双方のチャンネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）、及び標識がなく、どちらのチャンネルでも検出されない、又は最小でしか検出されない第４ヌクレオチドタイプ（例えば、標識を持たないｄＧＴＰ）を使用する、蛍光発光ベースのＳＢＳ方法である。
【０２９７】
さらに、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２に組み入れられた資料に記載のように、シークエンシングデータは単一チャンネルを使用して取得することができる。このようないわゆる１色素シークエンシングでのアプローチにおいて、第１ヌクレオチドタイプは標識付けされるが、この標識は第１画像生成後に除去され、また第２ヌクレオチドタイプは第１画像生成後にのみ標識付けされる。第３ヌクレオチドタイプは第１及び第２の双方の画像において、その標識を保持しており、第４ヌクレオチドタイプは双方の画像において標識付けされないままである。
【０２９８】
幾つかの実施形態はライゲーション（連結）反応技術によるシークエンシングを利用することができる。このような技術は、ＤＮＡリガーゼ（合成酵素）を利用して、オリゴヌクレオチドを取り込み、またこのようなオリゴヌクレオチドの取込みを同定する。オリゴヌクレオチドは、一般的に配列（シーケンス）におけるオリゴヌクレオチドが交雑する特定ヌクレオチドの同定に相関付けされる異なる標識を有する。他のＳＢＳ方法と同様に、画像は、アレイの核酸形体を標識付けしたシークエンシング試薬で処理した後に取得することができる。各画像は、特定タイプの標識を取り込んだ核酸形体を示す。異なる形体は、各形体の異なる配列内容に起因して異なる画像に存在するか又は存在しないが、形体の相対的位置は画像において不変のままである。ライゲーション反応ベースのシークエンシング方法から取得された画像は、本明細書に記載のように保存、処理及び解析することができる。本明細書に記載の方法及びシステムで利用できる例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第６，９６９，４８８号、米国特許第６，１７２，２１８号、米国特許第６，３０６，５９７号に記載されており、これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０２９９】
幾つかの実施形態は、ナノ細孔シークエンシング（Deamer, D. W. & Akeson, M. “Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing.” Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)； Deamer, D. and D. Branton, “Characterization of nucleic acids by nanopore analysis”. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin；及びJ. A. Golovchenko, “DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope” Nat. Mater. 2:611-615 (2003) 参照。これら文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする）。このような実施形態において、標的核酸はナノ細孔を通過するが、幾つかのナノ細孔の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド取込みをリアルタイムでモニタリングするステップを含む方法を利用することができる。ナノ細孔は、合成細孔、又はα溶血素のような生体膜タンパク質とすることができる。１つの例示的実施形態において、標的核酸がナノ細孔を通過するとき、各塩基は、細孔の電気伝導度における変動を測定することによって同定することができる。（米国特許第７，００１，７９２号；Soni, G. V. & Meller, “A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores.” Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)；Healy, K. “Nanopore-based single-molecule DNA analysis.” Nanomed. 2, 459-481 (2007)；及びCockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. “A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution.” J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008) 参照。これら文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする）。ナノ細孔シークエンシングから取得したデータは、本明細書に記載のように保存、処理及び解析することができる。とくに、データは、本明細書に記載のような光学的画像及び他の画像の例示的処理に従って画像として処理することができる。
【０３００】
幾つかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活量をリアルタイムでモニタリングするステップを含む方法を利用することができる。ヌクレオチドの取込みは、例えば、（参照により本明細書に組み入れられるものとする）米国特許第７，３２９，４９２号及び同第７，２１１，４１４号に記載のように、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγリン酸塩で標識付けしたヌクレオチドとの間における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用により検出することができる、又はヌクレオチドの取込みは、例えば、（参照により本明細書に組み入れられるものとする）米国特許第７，３１５，０１９号に記載のようなゼロモード導波管で、また蛍光ヌクレオチド類似体及び例えば、（参照により本明細書に組み入れられるものとする）米国特許第７，４０５，２８１号及び同第８，３４３，７４６号に記載のような改変操作ポリメラーゼを用いて検出することができる。照明は、表面テザー係留したポリメラーゼの周りにゼプト（１０−２１）リットルスケールの容積に限定し、これにより蛍光標識付けしたヌクレオチドの取込みを低バックグラウンドで観測できるようにする（Levene, M. J. et al. “Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.” Science 299, 682-686 (2003)；Lundquist, P. M. et al. “Parallel confocal detection of single molecules in real time.” Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)；及びKorlach, J. et al. “Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008) 参照。これら文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする）。このような方法から取得される画像は、本明細書に記載のように保存、処理及び解析することができる。
【０３０１】
特別な実施形態において、ポリメラーゼは、磁気応答センサの近傍の表面に沿う指定エリアに固定化又はテザー係留される。このような実施形態は、相補鎖が成長するとき磁気応答センサによって検出される異なる磁性粒子が、磁気応答センサから比較的等しい距離をとることができる。
【０３０２】
本明細書に記載の実施形態は、さらに、γリン酸塩で標識付けしたヌクレオチドを含むことができ、この場合、γリン酸塩に結合される標識は、磁気応答センサの電気抵抗を変化させる磁性粒子を有することができる。
【０３０３】
幾つかのＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドを伸長生成物内に取り込む際に釈放される陽子を検出する。例えば、釈放された陽子の検出に基づくシークエンシングは、アイアン・トレント社（コネチカット州ギルフォードのライフ・テクノロジーズ（登録商標）社の子会社）から市販されている電気的検出器及び関連の技術、並びに米国特許第８，２６２，９００号、米国特許第７，９４８，０１５号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号、又は米国特許第８，３４９，１６７号に記載のようなシークエンシング方法及びシステムを使用することができ、これら文献それぞれは、参照により本明細書に組み入れられるものとする。動的排除を用いて標的核酸の増幅をするための本明細書に記載の方法は、陽子検出に使用される基板に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法は、陽子検出に使用される単位複製配列（アンプリコン）のクローン集団（クラスター）生成に使用することができる。
【０３０４】
上述のＳＢＳ方法は、複数フォーマットで有利に実施することができ、複数の異なる標的核酸を同時に取扱い操作される。特別な実施形態において、異なる標的核酸は共通の反応容器内で又は特定基板の表面上で処理することができる。このことによれば、多重方式でシークエンシング試薬の送給、反応しなかった試薬の除去、及び取込みイベントの検出を都合よく行うことができる。表面結合標的核酸を用いる実施形態において、標的核酸はアレイフォーマットになり得る。アレイフォーマットにおいて、標的核酸は、一般的に空間的に区別可能な様態で表面に結合することができる。標的核酸は、直接共有結合、ビード若しくは他の粒子への付着、又は表面に付着するポリメラーゼ若しくは他の分子への結合によって結合することができる。アレイはそれぞれの部位で標的核酸の単一複製（形体とも称する）を含むことができ、又は同一配列を有する複数の複製が各部位又は形体で存在することができる。複数の複製は、以下に詳細に説明するように、ブリッジ増幅、又はエマルションポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法によって産生することができる。
【０３０５】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０形体／ｃｍ２、約１００形体／ｃｍ２、約５００形体／ｃｍ２、約１，０００形体／ｃｍ２、約５，０００形体／ｃｍ２、約１０，０００形体／ｃｍ２、約５０，０００形体／ｃｍ２、約１００，０００形体／ｃｍ２、約１，０００，０００形体／ｃｍ２、約５，０００，０００形体／ｃｍ２、又はそれ以上の様々な密度のうち任意な密度の形体を有するアレイを使用することができる。
【０３０６】
本明細書に記載の方法の利点は、複数標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並列的に行う点である。したがって、本発明によれば、上述したような従来既知の技術を用いて、核酸を調合しまた検出することができる統合システムを提供する。本発明による統合システムは、増幅試薬及び／又はシークエンシング試薬を１つ又はそれ以上の固定化したＤＮＡ断片に送給することができる流体コンポーネントを有することができ、このシステムは、ポンプ、バルブ、リザーバ、流体ライン、等々を備える。フローセルは、標的核酸を検出する統合システム内で構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許第８，２４１，５７３号及び米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号に記載されており、これら特許文献各々は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。フローセルの例として、統合システムにおける１つ又はそれ以上の流体コンポーネントは、増幅方法及び検出方法のために使用することができる。核酸シークエンシングの実施形態を例にとると、統合システムにおける１つ又はそれ以上の流体コンポーネントは、本明細書に記載の増幅方法及び上述したようなシークエンシング方法におけるシークエンシング試薬の送給に使用することができる。代案として、統合システムは、増幅方法を実施するための、及び検出方法を実施するための別個の流体系を有することができる。増幅核酸を生成することができ、また核酸の配列を決定することができる統合シークエンシングシステムの例としては、限定しないが、ＭｉＳｅｑ(商標)プラットフォーム（カリフォルニア州サンディエゴのイラミーナ社）及び米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号に記載のデバイスがあり、この文献は、参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
【０３０７】
本明細書に使用される以下の用語は指示される意味を有する。「液滴」は液滴アクチュエータにおける液体量を意味する。代表的には、液滴は填隙剤（フィラー）流体によって少なくとも部分的に区切られる。例えば、液滴は、填隙剤流体によって完全に包囲されるか、又は填隙剤流体と及び液滴アクチュエータの１つ又はそれ以上の表面とによって区切られることができる。他の例として、液滴は、填隙剤流体、液滴アクチュエータの１つ又はそれ以上の表面、及び／又は大気によって区切られることができる。さらに他の例として、液滴は、填隙剤流体及び大気によって区切られることができる。液滴は、例えば、水性若しくは非水性であることができ、又は水性成分及び非水成分を含む混合物若しくはエマルションであり得る。液滴は、広範囲にわたる様々な形状をとることができ、限定しないが、概してディスク形状、スラグ形状、截頭球体形状、楕円体形状、球体形状、圧縮球体形状、半球体形状、卵形形状、円筒形形状、このような形状の組合せ、及び液滴操作中、例えば合体若しくは分割中、又は液滴アクチュエータの１つ若しくはそれ以上の表面にこのような形状が接触する結果として形成される種々の形状をとることができる。本発明のアプローチを使用する液滴操作を受けることができる液滴流体の例としては、２００７年１０月２５日公開に公開された国際公開第２００７／１２０２４１号：Eckhardt et al., International Patent Pub. No. WO/2007/120241, entitled, “Droplet-Based Biochemistry,”を参照されたく、この文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０３０８】
様々な実施形態において、液滴としては、生物学的試料（サンプル）、例えば、全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄、羊水、精液、膣排出物、漿液、滑液、心嚢液、腹水、胸膜液、浸出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞試料、単一細胞又は多細胞を含む液体、細胞小器官を含む液体、流動化組織、流動化有機体、多細胞有機体を含む液体、生物学的ぬぐい液、及び生物学的洗浄液があり得る。さらに、液滴としては、水、脱イオン水、生理食塩水溶液、酸性溶液、塩基性溶液、清浄液、及び／又は緩衝液のような試薬があり得る。液滴は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはその類似体のような核酸；デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、若しくはターミネーター部分を有するそれらの類似体のようなヌクレオチドであって、ターミネーター部分を有するそれらの類似体としては、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、２０１３年９月１２日公開された “Improved Methods of Nucleic Acid Sequencing”と題するゴームレイ氏ら（Gormley et al.）の国際公開第２０１３／１３１９６２号、２００６年６月６日発行された“Labelled Nucleotides”と題するバーンズ氏ら（Barnes et al.）の米国特許第７，０５７，０２６号、２００８年４月１０日公開された“Compositions and Methods for Nucleotide Sequencing”と題するコズロフ氏ら（Kozklov et al.）の国際公開第２００８／０４２０６７号、２０１３年４月１５日公開された“Targeted Enrichment and Amplification of Nucleic Acids on a Support”と題するリガッティ氏ら（Rigatti et al.）の国際公開第２０１３／１１７５９５号、２００８年２月１２日発行された“Methods for Real-Time Single Molecule Sequence Fetermination”と題するハーディン氏ら（Hardin et al.）の米国特許第７，３２９，４９２号、２００７年５月１日発行された“Enzymatic Nucleic Acid Synthesis: Compositions and Methods for Altering Monomer Incorporation Fidelity”と題するハーディン氏ら（Hardin et al.）の米国特許第７，２１１，４１４号、２００８年１月１日発行された“Arrays of Optical Confinements and Uses Thereof”と題するターナー氏ら（Turner et al.）の米国特許第７，３１５，０１９号、２００８年７月２９日発行された“Fluorescent Nucleotide Analogs and Uses Therefor”と題するエクスユー氏ら（Xu et al.）の米国特許第７，４０５，２８１号、及び２００８年５月８日公開された“Polymerase Enzymes and Reagents for Enhanced Nucleic Acid Sequencing”と題するランケット氏ら（Ranket et al.）の米国特許公開第２００８／０１０８０８２号に記載されているものがある（これら文献は全体が参照によって本明細書に組み入れられるものとする）、該ヌクレオチド；ポリメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼ、若しくはトランスポーゼースのような酵素；抗体、エピトープ、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、レクチン、若しくは炭水化物のような結合パートナー；又は他の生化学的活性分子を含むことができる。液滴内容物の他の例としては、試薬を含むことができ、試薬としては、例えば、核酸増幅プロトコール、親和性に基づく検定評価プロトコール、酵素検定評価プロトコール、配列決定（シークエンシング）プロトコール、及び／又は生体液分析プロトコールのような生化学的プロトコール用の試薬がある。液滴は、１つ以上の基質ビードを含むことができる。
【０３０９】
本明細書に使用する「液滴アクチュエータ」は、液滴を取扱い操作することができるデバイスを意味する。液滴アクチュエータの例としては、２００５年６月２８日発行された“Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques”と題するパムラ氏ら（Pmula et al.）の米国特許第６，９１１，１３２号、２００６年８月３１日公開された“Apparatus and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board”と題するパムラ氏ら（Pmula et al.）の米国特許公開第２００６／０１９４３３１号、２００７年１０月２５日公開された“Droplet-Based Biochemistry”と題するポラック氏ら（Pollack et al.）の国際公開第２００７／１２０２４１号、２００４年８月１０日発行された“Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same”と題するシェンデロフ氏ら（Shenderov et al.）の米国特許第６，７７３，５６６号、２００３年５月２０日発行された“Actuators for Fluidics Without Moving Parts”と題するシェンデロフ氏ら（Shenderov et al.）の米国特許第６，５６５，７２７号、２００３年１１月６日公開された“Electrowetting-driven Micropumping”と題するキム氏ら（Kim et al.）の米国特許出願公開第２００３／０２０５６３２号、２００６年７月２７日公開された“Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle”と題するキム氏ら（Kim et al.）の米国特許出願公開第２００６／０１６４４９０号、２００７年２月１日公開された“Small Object Moving on Printed Circuit Board”と題するキム氏ら（Kim et al.）の米国特許出願公開第２００7／００２３２９２号、２００９年１１月１９日公開された“Method for Using Magnetic Particles in Droplet Fluidics”と題するシャー氏ら（Shah et al.）の米国特許出願公開第２００９／０２８３４０７号、２０１０年４月２２日公開された“Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip”と題するキム氏ら（Kim et al.）の米国特許出願公開第２０１０／００９６２６６号、２００９年６月１６日発行された“Droplet Transportation Devices and Methods Having a Liquid Surface”と題するヴェレフ氏ら（Velev et al.）の米国特許第７，５４７，３８０号、２００７年１月１６日発行された“Method, Apparatus and Article for Fluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like”と題するスターリン氏ら（Sterling et al.）の米国特許第７，１６３，６１２号、２０１０年１月５日発行された“Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing”と題するベッカー氏ら（Becker et al.）の米国特許第７，６４１，７７９号、２００５年１２月２０日発行された“Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing”と題するベッカー氏ら（Becker et al.）の米国特許第６，９７７，０３３号、２００８年２月１２日発行された“System for Manipulation of a Body of Fluid”と題するデクレ氏ら（Decre et al.）の米国特許第７，３２８，９７９号、２００６年２月２３日公開された“Chemical Analysis Apparatus”と題する山川氏ら（Yamakawa et al.）の米国特許公開第２００６／００３９８２３号、２０１１年３月３日公開された“Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes”と題するウー氏ら（Wu et al.）の国際公開第２０１１／００４８９５１号、２００９年７月３０日公開された“Electrode Addressing Method”と題するフーイリレット氏ら（Fouillet et al.）の米国特許公開第２００９／０���９２０４４号、２００６年５月３０日発行された“Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces”と題するフーイリレット氏ら（Fouillet et al.）の米国特許第７，０５２，２４４号、２００８年５月２９日公開された“Droplet Microreactor”と題するマーチャンド氏ら（Marchand et al.）の米国特許公開第２００８／０１２４２５２号、２００９年１２月３１日公開された“Liquid Transfer Device”と題する足立氏ら（Adachi et al.）の米国特許公開第２００９／０３２１２６２号、２００５年８月１８日公開された“Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or Several Solid Substrates”と題するルークス氏ら（Roux et al.）の米国特許公開第２００５／０１７９７４６号、及びDhindsa et al., “Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality”, Lab Chip, 10:832-836 (2010)を参照されたい。これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。若干の液滴アクチュエータは、液滴操作ギャップを基板間に配置した１つ以上の基板と、及び１つ以上の基板に関連した（例えば、層状に積層、付着及び／又は埋設した）電極であって、１回以上の液滴操作を行うよう配列した、該電極とを有する。例えば、若干の液滴アクチュエータは、ベース（又は底部）基板、基板に関連した電極、基板及び／又は電極上の１つ以上の誘電体層、並びに随意的に、液滴操作表面を形成する基板、誘電体層及び／又は電極上の１つ以上の疎水性層を有する。頂部基板も設けることができ、この頂部基板は液滴操作表面からギャップを介して分離させ、このギャップは液滴操作ギャップを称することができる。頂部及び／又は底部基板における種々の電極構成は、上述した本明細書に組み入れられる特許文献に詳述されている。液滴操作中、液滴は接地又は基準電極と連続接触又は頻繁な間断接触を維持することができる。接地又は基準電極は、ギャップに対向する頂部基板若しくはギャップに対向する底部基板に関連させる、又はギャップ内に配置することができる。電極を双方の基板に設ける場合、電極を液滴アクチュエータ機器に接続して電極を制御又はモニタリングするための電気接点は、一方又は双方の基板に関連させることができる。幾つかの事例において、一方の基板における電極は、他方の基板に電気的に接続し、一方の基板のみが液滴アクチュエータに接触するようにする。一実施形態において、導電性材料（例えば、ニュージャージー州ハッケンサックのマスターボンド社から入手可能なMASTER BOND(商標)ポリマーシステムＥＰ７９のようなエポキシ）が一方の基板における電極と他方の基板における電気経路との間に電気的接続を生じ、例えば、頂部基板における接地電極が底部基板における電気経路に対してこのような導電性材料によって接続される。複数の基板を使用する場合、基板間にスペーサを設けて、基板間ギャップの高さを決定し、またアクチュエータ上分注リザーバを画定する。スペーサ高さは、例えば、少なくとも約５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ又はそれ以上とすることができる。代替的又は付加的にスペーサ高さは、多くとも約６００μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ又はそれ以下とすることができる。スペーサは、例えば、頂部又は底部��基板から突出する突起層、及び／又は頂部基板と底部基板との間に挿入した材料から形成することができる。１個以上の開口を１つ以上の基板に設け、液滴操作ギャップに対して液滴を送給又は排除できる液体経路を形成することができる。ベース（又は底部）及び頂部の基板は、幾つかの事例において、１個の一体コンポーネントとして形成することができる。１個以上の基準電極をベース（又は底部）及び／若しくは頂部の基板上並びに／又はギャップ内に設けることができる。基準電極構成の例は、上述した本明細書に組み入れられる特許文献に記載されている。種々の実施形態において、液滴アクチュエータによる液滴の取扱い操作は、電極媒介、例えば、電気湿潤媒介又は誘電泳動媒介又はクーロン力媒介で行うことができる。本発明の液滴アクチュエータで使用し得る液滴操作を制御する他の技術の例としては、流体力学的流体圧力を誘発するデバイス、例えば、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧薄膜ポンプ、振動薄膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、圧電／超音波ポンプ及び音響放射力）；電気的又は磁気的な原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、磁性流体プラグ、電気流体力学的ポンプ、磁力を用いる吸引又は反発及び磁気流体力学的ポンプ）；熱力学的原理（例えば、気体バブル発生器／相転移誘発体積膨張）；他の種類の表面湿潤原理（例えば、電気湿潤、及び光電湿潤、並びに化学的、熱的、構造的及び放射能誘発表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば、毛細管作用）；静電気（例えば、電気浸透流）；遠心フロー（コンパクトディスク上に配置して回転させられる基板）；磁力（例えば、周期振動するイオンが流れを発生させる）；磁気流体力学的力；及び真空又は差圧に基づいて動作するデバイスがある。若干の実施形態において、上述した技術の２つ以上の組合せを用いて本発明の液滴アクチュエータにおける液滴操作を行うことができる。同様に、上述した技術のうち１つ又はそれ以上を使用して液体を液滴操作ギャップ内に送給する、例えば、他のデバイスにおけるリザーバ又は液滴アクチュエータの外部リザーバ（例えば、液滴アクチュエータ基板に関連させたリザーバ及びリザーバから液滴操作ギャップ内に至る流路）から送給することができる。若干の液滴アクチュエータにおける液滴操作表面は、疎水性材料から形成する、又は疎水性を持たせるようコーティング又は処理することができる。例えば、幾つかの実施例において、液滴操作表面の幾らかの部分又はすべてに対して低表面エネルギー材料又は化学物質で誘導体化し、この誘導体化は、例えば、溶液内又は重合可能なモノマー内におけるポリフッ素化合物又は過フッ素化合物のような化合物を用いた析出又はその場の合成によって行うことができる。例としては、テフロン（登録商標）ＡＦ（デラウェア州ウィルミントンのデュポン（登録商標）社から入手可能である）、サイトップ（cytop）材料群のうちの材料、疎水性及び超疎水性コーティングであるＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（登録商標）群（メリーランド州ベルツビルのサイトニクッス(Cytonix)社から入手可能である）におけるコーティング、シランコーティング、フルオロシランコーティング、疎水性ホスホン酸誘導体（例えば、アクロン(Aculon)社���よって市販されている）、及びＮＯＶＥＣ（登録商標）電子コーティング（ミネソタ州セントポールの３Ｍ（登録商標）社から入手可能である）、プラズマ助長化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化モノマー、及びＰＥＣＶＤ用のオルガノシロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）がある。幾つかの事例において、液滴操作表面に、約１０ｎｍ〜約１，０００ｎｍの範囲にわたる厚さを有する疎水性コーティングを設けることができる。さらに幾つかの実施形態において、液滴アクチュエータの頂部基板は導電性有機ポリマーを有し、次にこの導電性有機ポリマーに疎水性コーティングをコーティングする、又は液滴操作表面を疎水性にする処理を施す。例えば、プラスチック基板上に堆積する導電性有機ポリマーは、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)ポリ(スチレンスルホン酸塩)（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）とすることができる。導電性有機ポリマー及び代替的導電層の他の例は、２０１１年１月６日に公開された「Droplet Actuator Devices and Methods」と題するポラック（Pollack）氏らの国際公開第２０１１／００２９５７号に記載されており、この特許文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。液滴アクチュエータの一方又は双方の基板は、印刷回路板（ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆ガラス、及び／又は半導体材料を基板として用いて作製することができる。基板がＩＴＯ被覆ガラスであるとき、ＩＴＯコーティングは、少なくとも約２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、又はそれ以上の厚さにすることができる。代替的又は付加的に、この厚さは、多くとも、約２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、又はそれ以下とすることができる。
幾つかの事例において、頂部及び／又は底部の基板はＰＣＢ基板を有し、この基板をポリイミド誘電体のような誘電体でコーティングし、さらにこのような誘電体に対して液滴操作表面を疎水性にするコーティング又は他の処理を施すことができる。基板がＰＣＢを有するとき、以下の材料が適当な材料の例であり、すなわち、ＭＩＴＳＵＩ（商標名）ＢＮ−３００（カリフォルニア州サンホセの三井ケミカル・アメリカ社から入手可能である）；ＡＲＬＯＮ（商標）１１Ｎ（カリフォルニア州サンタアンナのアーロン(Arlon)社から入手可能である）；ＮＥＬＣＯ（登録商標）Ｎ４０００−６及びＮ５０００−３０／３２（ニューヨーク州メルヴィルのパーク・エレクトロケミカル社から入手可能である）；ＩＳＯＬＡ（商標）ＦＲ４０６（アリゾナ州チャンドラーのイソラ・グループ社から入手可能である）、とくに、ＩＳ６２０；フッ素ポリマー群（低背景蛍光発光を有するために蛍光発光検出に適する）；ポリイミド群；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶ポリマー；シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）；シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）；アラミド；ＴＨＥＲＭＯＵＮＴ（登録商標）不織アラミド補強材（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）；ＮＯＭＥＸ（登録商標）ブランドのファイバ（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）；及び紙が適当である。種々の材料も基板の誘電体コンポーネントとして使用するのに適する。例としては、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）Ｃ（とくに、ガラス上の）、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）Ｎ及びＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）ＨＴ（〜３００℃の高温用）のような蒸着誘電体（テキサス州カティのパリレーン・コーティング・サービス社から入手可能である）；ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティング；サイトップ；液体写真品質画像はんだマスクのようなはんだマスク（例えば、ＰＣＢ上の）であって、例えば、ＴＡＩＹＯ（商標）ＰＳＲ４０００シリーズ、ＴＡＩＹＯ（商標）ＰＳＲ及びＡＵＳシリーズ（ネバダ州カーソンシティーのタイヨー・アメリカ社から入手可能である）（熱制御を含む用途向けの良好な熱特性を有する）、及びＰＲＯＢＩＭＥＲ（登録商標）８１６５（カリフォルニア州ロスアンゼルスのハンツマン・アドバンスド・マテリアル・アメリカ社から入手可能である）のようなはんだマスク；ＶＡＣＲＥＬ（登録商標）乾式フィルムはんだマスク製品群（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）におけるような乾式フィルムはんだマスク；ポリイミドフィルム（例えば、デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能なＫＡＰＴＯＮ（登録商標）ポリイミドフィルム）、ポリエチレン、及びフッ素ポリマー（例えば、ＦＥＰ）のようなフィルム誘電体；ポロテトラフルオロエチレン；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）；シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）；及び任意な他の先に列挙したＰＣＢ基板材料；ブラックマトリクス樹脂；ポリプロピレン；並びにデュポン（商標名）Ｐｙｒａｌｕｘ（登録商標）ＨＸＣ及びデュポン（商標名）Ｋａｐｔｏｎ��登録商標）ＭＢＣ（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）のようなブラック可撓性回路材料がある。液滴移送電圧及び周波数は、特定の検定評価プロトコールに使用する試薬とともに使用するよう選択することができる。策定パラメータは変動し、例えば、アクチュエータ上リザーバの数及び配置、独立電極接続部の数、異なるリザーバのサイズ（容積）、磁石／ビード洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間ピッチ、及びギャップ高さ（頂部基板と底部基板との間における）は、特定試薬、プロトコール、液滴体積量等での使用によって変動し得る。幾つかの事例において、本発明の基板は、例えば、溶液内又は重合可能なモノマー内におけるポリフッ素化合物又は過フッ素化合物のような化合物を用いた析出又はその場の合成によって誘導体化することができる。例としては、浸漬又は噴霧コーティング用のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティング及びＦＬＯＲＯＰＥＬ（登録商標）コーティング、プラズマ助長化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化モノマー、及びＰＥＣＶＤ用のオルガノシロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）がある。さらに、幾つかの事例において、液滴操作表面の幾らかの部分又はすべてを、ＰＣＢ基板からの背景蛍光発光のような背景ノイズを減少する物質でコーティングすることができる。例えば、ノイズ減少コーティングには、日本の東レ（登録商標）株式会社から入手可能なブラックマトリクス樹脂のようなブラックマトリクス樹脂がある。液滴アクチュエータの電極は、代表的にはそれ自体システムの一部をなすコントローラ又はプロセッサによって制御し、このコントローラ又はプロセッサは、処理機能並びにデータ及びソフトウェアの保存、並びに入力及び出力能力を有することができる。試薬は、液滴操作ギャップ内又は液滴操作ギャップに流体接続したリザーバ内における液滴アクチュエータに供給することができる。試薬は、液滴のような液状形態とし、又は液滴操作ギャップ内又は液滴操作ギャップに流体接続したリザーバ内で、再構成可能な形態で供給することができる。再構成可能な試薬は、一般的には再構成のために液体と組み合わせることができる。本明細書に記載する方法及び装置での使用に適する再構成可能な試薬の例は、２０１０年６月１日発行の「Disintegratable Films for Diagnostic Devices」と題するメスレル（Meathrel）氏らの米国特許第７，７２７，４６６号に記載されており、この文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０３１０】
「液滴操作（droplet operation）」は、液滴アクチュエータにおける液滴の任意な取扱い操作を意味する。液滴操作としては、例えば、液滴を液滴アクチュエータ内に装填する；液滴源から１滴又はそれ以上の液滴を分注する；一滴の液滴を２滴又はそれ以上の液滴に分裂、分離又は分割する；液滴を１つの場所から任意な方向に他の場所に移送する；２滴又はそれ以上の液滴を単独液滴に合体又は結合する；液滴を希釈する；液滴を混合する；液滴を撹拌する；液滴を変形させる；液滴を所定位置に保持する；液滴を培養する；液滴を加熱する；液滴を蒸発させる；液滴を冷却する；液滴を廃棄する；液滴を液滴アクチュエータから送出する；本明細書に記載した他の液滴操作をする；及び／又は上述の行為の組合せをすることがあり得る。用語「合体する（merge）」、「合体させる（merging）」、「組み合わせる（combine）」、「組み合わさる（combining）」等は、２滴以上の液滴から１滴の液滴を生ずることを記述するのに使用する。このような用語は、２滴以上の液滴につき使用するとき、２滴以上の液滴が１滴の液滴に組み合わさるのに十分な液滴操作の任意な組合せで使用できる。例えば、「液滴Ａを液滴Ｂに合体させる」は、液滴Ａを静止している液滴Ｂに接触するよう移送する、液滴Ｂを静止している液滴Ｂに接触するよう移送する、又は液滴Ａ及びＢを互いに接触するよう移送することによって達成することができる。用語「分裂する（splitting）」、「分離（separating）」、「分割（dividing）」は、結果として生じた液滴の特定の分量を含意することは意図しない（結果として生じた液滴の量は同一又は異なるものであり得る）、又は結果として生じた液滴の個数を含意することは意図しない（結果として生じた液滴の数は２，３，４，５又はそれ以上であり得る）。用語「混合（mixing）」は、液滴内で１つ以上の成分がより均一に分布する結果となる液滴操作に言及する。「装填（loading）」液滴操作の例としては、微小透析装填、圧力支援装填、ロボット装填、受動的装填、及びピペット装填がある。液滴操作は電極媒介で行うことがあり得る。幾つかの事例において、液滴操作は、さらに、表面上における親水性及び／若しくは疎水性の試薬の使用、並びに／又は物理的障害物によって容易になる。液滴操作の例としては、「液滴アクチュエータ」の定義につき上述した特許文献を参照されたい。インピーダンス若しくは容量に関する感知若しくは撮像技術を使用して、液滴操作の成果を決定若しくは確認する、又は収容キャビティ若しくはウェル内の液体の量若しくはレベルを決定若しくは確認することが時々あり得る。このような技術の例は、２０１０年８月５日公開された「Capacitance Detection in a Droplet Actuator」と題するステュルメル（Sturmer）氏らの国際公開第２０１０／０１９４４０８号に記載されており、この文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。概して、感知又は撮像技術を使用して、特定電極における、又はウェル若しくは収容キャビティ内での液滴の有無を確認することができる。例えば、液滴分注操作に続いての行き先電極における分注された液滴の存在は、液滴分注操作が有効であったことを確認する。同様に、検定評価プロトコールの適切ステップにおける検出スポットに液滴が存在することは、一連の先行液滴操作が検出用液滴生成に成功していたことを確認し得る。液滴移送時間は極めて迅速にすることができる。例えば、様々な実施形態において、１つの電極から次の電極への液滴移送は約１秒よりも、又は約０.１秒よりも、又は約０.０１秒よりも、又は約０.００１秒よりも速くすることができる。一実施形態において、電極はＡＣモードで動作するが、撮像用にＤＣモードに切り換える。液滴操作を行うためには、液滴の占有面積が電気湿潤面積に類似するようにすることが有用であり、換言すれば、１個、２個及び３個の電極を使用する場合には、それぞれ１×、２×、３×の液滴占有面積となるよう制御操作するのが有用である。液滴占有面積が所定時刻での液滴操作を行うのに利用可能な電極の数より大きい場合、液滴サイズと電極の数との間の差は一般的に１より大きくないようにすべきであり、換言すれば、２×液滴は１個の電極を使用して制御するのが有用であり、また３×液滴は２個の電極を使用して制御するのが有用である。液滴がビードを含むとき、液滴サイズは、液滴を制御する、例えば、液滴を移送する電極の数に等しくするのが有用である。
【０３１１】
「填隙剤液体」は、液滴アクチュエータの液滴操作基板に関連する液体を意味し、この液体は、液滴相と十分には混和せず、液滴相が電極媒介液滴操作を受けるようにする。例えば、液滴アクチュエータの液滴操作ギャップは、代表的には填隙剤液体で充満する。填隙剤液体は非極性液体とすることができる。填隙剤液体は、例えば、シリコーンオイル若しくはヘキサデカンによる填隙剤液体のような低粘性オイルとする又はそれを含むものとすることができる。填隙剤液体は、フッ素化又は過フッ素化したオイルのようなハロゲン化オイルとする又はそれを含むものとすることができる。填隙剤液体は、液滴アクチュエータのギャップ全体を填隙する、又は液滴アクチュエータの１つ以上の表面を被覆することができる。填隙剤液体は導電性又は非導電性とすることができる。填隙剤液体は、液滴操作を改善及び／又は液滴から試薬若しくは標的物質の損失を減少、微小液滴形成を促進、液滴相互間の交差汚染を減少、液滴アクチュエータ表面の汚染を減少、液滴アクチュエータ材料の劣化を減少、等々をするよう選択することができる。例えば、填隙剤液体は、液滴アクチュエータ材料に対する適合性を有するよう選択することができる。例として、フッ素化填隙剤液体は、フッ素化表面コーティングに採用するのが有用であり得る。フッ素化填隙剤液体は、ウンベリフェロン物質、例えば、6-ヘキサデカノイルアミド-4-メチルウンベリフェロン物質（例えば、クラッベ、ニーマン、ピック、又は他の検定評価に使用する）のような脂溶性の化合物の損失を減少するのに有用であり、他のウンベリフェロン物質は、２０１１年５月１９日公開の「Enzymatic Assays Using Umbelliferone Substrates with Cyclodextrins in Droplets of Oil」と題したウィンガー（Winger）氏らの米国特許出願公開第２０１１／０１１８１３２号に記載されており、この文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。適当なフッ素化オイルの例としては、ガルデン（登録商標）製品群、例えば、ガルデンＨＴ170（ｂｐ＝170℃、粘度＝１.８ｃＳｔ、密度＝１.７７）、ガルデンＨＴ200（ｂｐ＝200℃、粘度＝２.４ｃＳｔ、密度＝１.７９）、ガルデンＨＴ230（ｂｐ＝230℃、粘度＝４.４ｃＳｔ、密度＝１.８２）（すべてソルヴェイ・ソレキス（Solvay Solexis）社から入手可能である）；ノベック（登録商標）製品群、例えば、ノベック7500（ｂｐ＝128℃、粘度＝０.８ｃＳｔ、密度＝１.６１）、フルオリナート（登録商標）FC-40（ｂｐ＝155℃、粘度＝１.８ｃＳｔ、密度＝１.８５）、フルオリナートFC-43（ｂｐ＝174℃、粘度＝２.５ｃＳｔ、密度＝１.８６）（すべて３Ｍ社から入手可能である）がある。概して、過フッ素化填隙剤液体の選択は、動粘性率（＜７ｃＳｔであるが、必ずしも必要とされない）、及び沸点（＞150℃であるが、ＤＮＡ／ＲＮＡに基づく用途（ＰＣＲ、等々）での使用には必ずしも必要とされない）に基づいて行われる。填隙剤液体には、例えば、界面活性剤又は他の添加物をドーピングすることができる。例えば、添加剤は、液滴操作を改善及び／又は液滴から試薬若しくは標的物質の損失を減少、微小液滴形成を促進、液滴相互間の交差汚染を減少、液滴アクチュエータ表面の汚染を減少、液滴アクチュエータ材料の劣化を減少、等々をするよう選��することができる。界面活性剤ドーピングを含む填隙剤液体の組成は、特定検定評価プロトコールに使用される試薬の性能、及び液滴アクチュエータ材料との有効な相互作用又は非相互作用が得られるように選択することができる。本明細書に記載の方法及び装置での使用に適した填隙剤液体及び填隙剤液体調製の例は、２０１０年６月３日に公開された「Droplet Actuator, Modified Fluids and Methods」と題したスリニバサン（Srinivasan）氏らの国際公開第２０１０／０２７８９４号；２００９年２月１２日に公開された「Use of Additives for Enhancing Droplet Operations」と題したスリニバサン（Srinivasan）氏らの国際公開第２００９／０２１１７３号；２００９年１月１５日に公開された「Droplet Actuator, Devices and Methods Employing Magnetic Beads」と題したシスタ（Sista）氏らの国際公開第２００８／０９８２３６号；及び２００８年１１月２０日に公開された「Electrowetting Devices,」と題したモンロー（Monroe）氏らの国際公開第２００８／０２８３４１４号に記載されており、これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとし、また本明細書で引用した他の特許及び特許出願にも記載されている。フッ素化オイルは、幾つかの事例において、例えば、ゾニール（登録商標）FSO-100（シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社）のようなフッ素化界面活性剤、及び／又は他のフッ素化界面活性剤をドーピングできる。填隙剤液体は、代表的には液体である。幾つかの実施形態において、液体の代わりに填隙剤ガスを使用することができる。
【０３１２】
「リザーバ」は、液体を保持、保存、又は供給するよう構成されたエンクロージャ又は部分的エンクロージャを意味する。本発明の液滴アクチュエータシステムは、オン・カートリッジ型リザーバ及び／又はオフ・カートリッジ型リザーバを含むことができる。オン・カートリッジ型リザーバは、(1) 液滴操作ギャップ内又は液滴操作表面上のリザーバであるオン・アクチュエータ型リザーバ、(2) 液滴アクチュエータカートリッジ上のリザーバであるが、液滴操作ギャップの外側でありかつ液滴操作表面には接触しないオフ・アクチュエータ型リザーバ、(3) オン・アクチュエータ領域及びオフ・アクチュエータ領域を有するハイブリッド型リザーバとすることができる。オフ・アクチュエータ型リザーバの例は頂部基板におけるリザーバである。オフ・アクチュエータ型リザーバは、一般的には、オフ・アクチュエータ型リザーバから液滴操作ギャップ内に、オン・アクチュエータ型リザーバ内へのように流体を流入させるよう構成した開口又は流路に流体連通させる。オフ・カートリッジ型リザーバは、全く液滴アクチュエータカートリッジの一部分ではないリザーバであり、液体を液滴アクチュエータカートリッジの何らかの部分に液体を流すものである。例えば、オフ・カートリッジ型リザーバは、操作中に液滴アクチュエータカートリッジを接続するシステム又はドッキングステーションの一部とすることができる。同様に、オフ・カートリッジ型リザーバは、試薬保存容器、又はオン・カートリッジ型リザーバ内又は液滴操作ギャップ内に流体を強制的に流入させるのに使用するシリンジとすることができる。オフ・カートリッジ型リザーバを用いるシステムは、一般的には、オフ・カートリッジ型リザーバからオン・カートリッジ型リザーバ内又は液滴操作ギャップ内に流体を移送することができる流体通路手段を有する。
【０３１３】
用語「頂部（top）」、「底部（bottom）」、「上方（over）」、「下方（under）」、及び「上（on）」は、本明細書全体を通して、フローセル及び／又は液滴アクチュエータのコンポーネントの相対位置、例えば、フローセル及び／又は液滴アクチュエータの頂部基板及び底部基板の相対位置について説明するのに使用される。当然のことながら、フローセル及び／又は液滴アクチュエータは空間における向きとは無関係に機能する。
【０３１４】
任意な形態の液体（例えば、移動又は静止状態であっても液滴又は連続体である）が電極、アレイ、マトリクス又は表面「上（on）」、「に（at）」、「上方（over）」に存在すると記載するとき、このような液体は、電極／アレイ／マトリクス／表面に直接接触するか、又は液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間に介在する１つ以上の層又は薄膜に接触するか、のいずれかとすることができる。一実施例において、填隙剤液体は、このような液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間おける薄膜（フィルム）と見なすことができる。
【０３１５】
液滴が液滴アクチュエータ「上」に存在する又は液滴を液滴アクチュエータ「上に装填する（loaded on）」と記述するとき、液滴が液滴アクチュエータ上又は液滴アクチュエータ内に配置され、この配置は、液滴アクチュエータ使用での１つ以上の液滴操作を液滴に対して行うのが容易となるように行う、又は液滴の特性又は液滴からの信号を感知するのが容易になるように行う、及び／又は液滴が液滴アクチュエータで液滴操作を受けて、液滴が液滴アクチュエータ上に配置されるものと理解されたい。
【０３１６】
本明細書に記載の実施形態は、磁気的感知スキームを用いて生物学的解析又は化学的分析を行うための方法、システム、デバイス、及び装置を含むことができる。例えば、実施形態は、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）プロトコール中に塩基の検出及び識別のために磁気感知による検出を用いることができる。様々な実施形態は、統合化ＣＭＯＳフローセル及び／又は液滴アクチュエータにおける磁気バイオセンシング技術に基づくＳＢＳのための方法を提供する。幾つかの実施形態において、フローセルは、テンプレート鎖が固定化される表面によって画定される１つ又はそれ以上のチャンネルを有することができる。異なる溶液を所定スケジュールに従ってチャンネルに導き、ＳＢＳシークエンシング用の試薬を送給する。他の実施形態において、試薬は液滴アクチュエータで制御される液滴によって送給することができる。
【０３１７】
幾つかの実施形態において、ＳＢＳシークエンシングは、単一ポット反応（ワン・ポット合成とも称される）により実施することができる。例えば、プライマーは、ポリメラーゼ、可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体、及び脱ブロック化剤に同時に供給することができる。核酸、ポリメラーゼ、可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体、及び脱ブロック化剤は、反応内に同時に存在することができる。ポリメラーゼは単一の可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体をマプライマーに触媒付加することができ、ブロックされた３′末端を有する伸長したプライマーを生成することができる。脱ブロック化剤は、伸長したプライマーの３′末端を脱ブロック化することができ、これによりその後にヌクレオチド類似体を伸長したプライマーに付加することができる。さらに他の実施形態において、ヌクレオチドは３′ブロックを持たないものとすることができ、脱ブロック化剤を添加しない。ポリメラーゼが順次にヌクレオチドを取り込むとき、抵抗変化をリアルタイムにモニタリングすることができる。このような実施形態は、単一分子の解析にとくに適用可能であり得る。試薬はともに同時に供給されることから、プライマーは順次に伸長して、単一ポット反応で数個のヌクレオチド類似体を取り込むよう順次に伸長する。単一ポット反応の少なくとも１つの利点は、試薬を反応に対して添加する必要がなく、反応から除去する必要もなく、これにより反復的流体移送で生ずる試薬消費の無駄を減らし、また時間のかかる流体移送ステップを少なくすることによって反応の応答時間を増大する点である。単一ポット反応でのＳＢＳシークエンシングは米国特許出願公開第２０１３／００８５０７３号に記載されており、この文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０３１８】
単一ポット反応中、磁気応答センサは相補鎖を効果的にモニタリングし、またヌクレオチドが相補鎖に付加されるときを検出する。このような実施形態において、ヌクレオチド又はポリメラーゼのいずれかが、それらに付着した磁性粒子を有することができる。例えば、ヌクレオチドの各タイプ（型）は、そのヌクレオチドをヌクレオチドの他のタイプから区別可能にする一意的な（固有）磁気特性を付与する磁性粒子を有することができる。他の実施形態において、ポリメラーゼは、そのポリメラーゼに付着した磁性粒子を有することができる。本明細書に記載のように、異なるタイプのヌクレオチドは、異なる取込率を有することができ、これにより実施形態は付加されるヌクレオチドのタイプを同定することができる。
【０３１９】
本明細書に記載のように、幾つかの実施形態におけるテンプレート鎖は、例えば、フローセルの表面に固定化することができる。しかし、他の実施形態においては、ポリメラーゼをフローセルの表面に固定化することができる。ポリメラーゼは、小反応チャンバ又はウェル内で固定化することができる。例えば、ポリメラーゼは、小容積（例えば、ゼプト（１０−２１）リットルスケール）内に配置することができ、これにより、信号が存在する時点に基づいて、自由に拡散する磁性粒子をポリメラーゼに安定的に関連する磁性粒子から容易に区別できる。各容積は、１つ又はそれ以上の磁気応答センサに割り当てることができる。
【０３２０】
ポリメラーゼは、既知のリンカーを用いて表面に固定化することができる。このようなリンカーの例としては、ＮＨＳエステル、イソシアネート、アミンに対して共役するイソチオシアネートリンカー、システインに対して共役するマレイミド、アジドでアルキンに接合するクリック化学、Halotag（登録商標）、Spycatcher-Spytag（登録商標）、及び他の類似のタンパク質−タンパク質生体共役反応方法のような融合タグの使用がある。使用可能である例示的な連鎖（リンケージ）に関する更なる情報については、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献を参照されたい：Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd Ed., Elsevier, 2008; Zakeri et al., "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin," PNAS 109(12): E691-E697 (2012)； 及び Liu et al., "Specific Enzyme Immobilization Approaches and Their Application with Nanomaterials," Topics in Catalysis 55(16-18): 1146-1156 (2012)。
【０３２１】
１つの例示的実施形態において、システイン残基の還元チオール（-SH）基（いわゆるスルフヒドリル基）は、チオール反応基を有するテザーと反応することができる。このような基の例としては、マレイミド及びヨードアセトアミドがある。ヨードアセトアミド、マレイミド、ベンジルハロゲン化物、及びブロモメチルケトンを含めて、主なチオール反応性試薬は、チオールのＳアルキル化により反応して、安定したチオエーテル生成物を生じ、7-ニトロベンズ-2,1,3-オキサジアゾリル（ＮＢＤ）ハロゲン化物のようなアリール化試薬は、求核試薬で芳香族ハロゲン化物の同様な置換によってチオール又はアミンと反応することができ、またチオレート陰イオンは天然のチオールよりも良好な求核試薬であることから、システインは、ｐＫａよりも反応性が高い。さらに、スルフヒドリル反応性化学基としては、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ-チオール（2-ニトロ-5-チオ安息香酸）、及びジスルフィド還元剤があり、このような基は、アルキル化（例えば、チオエーテル結合の形成を介する）又はジスルフィド交換（例えば、ジスルフィド結合の形成）によりスルフヒドリル基と共役することができる。スルフヒドリル交換反応も好適に使用することができる。
【０３２２】
代案として、アミン（-ＮＨ２）を標的化することができる。例えば、リジン残基の一級アミン及びポリペプチドＮ末端は比較的反応性が高く、アミン残基は、安定したアミド結合を形成するＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）により、又はアミド結合を形成するよう一級アミンと反応できるイミドエステル架橋剤により標的化することができる。他のアミン反応性化合物が多く存在する。例えば、一級アミンとの化学結合を形成することができる合成化学基としては、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、炭酸塩、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、及びフルオロフェニルエステルがあり、このような化学基は、例えば、アシル化又はアルキル化を介してアミンと共役することができる。さらに他の実施形態において、修飾したアミノ酸残基を使用して、クリック化学で使用されるアジド又はアルキンに類似した新規な官能性を導入することができる。例えば、上述のようなチオール反応性又はアミン反応性は、さらにクリック化学で使用されるアジド又はアルキンの付加を可能にするリンカーとともに使用することができる。
【０３２３】
幾つかの実施形態において、シークエンシングは、２つの部分を結合する、又は２つの部分を分離（例えば、開裂）する指定反応を生ぜしめることによって実施することができる。多くのケースにおいて、指定反応は化学的又は酵素的に引き起こすことができる。しかし、幾つかの実施形態において、指定反応は反応物質が受ける温度又は電気的特性を変化することによって引き起こすことができる。
【０３２４】
幾つかの実施形態において、磁性粒子は、ほぼ一定又は均一の磁気特性又は磁性状態を有する。例えば、磁気特性は一定又は均一な磁場を提供することができる。しかし、他の実施形態において、磁気特性又は磁性状態は誘導可能又は調整可能なものとすることができる。例えば、磁気特性は、指定周波数の電磁エネルギーを印加することにより１つの状態から他の状態に変更することができる。
【０３２５】
様々な実施形態は、さらに、システム及び／又は検出装置を有する。本明細書で使用するように、「検出装置」は、磁気応答センサのアレイと、及び磁気応答センサの近傍に流体を流すことができるチャンバとを有する。様々な実施形態において、検出装置は、固体デバイスを有する。流体流は、例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献、すなわち、米国特許出願公開第２０１５／００７９５９６号、米国特許第８，９５１，７８１号、及び国際公開第２０１５／０８９０９２号に記載のように、液体の連続流とすることができる。代案として、流体流は、以下により詳細に説明する電気湿潤（エレクトロウェッティング）操作のような液滴操作で導くこともできる。
【０３２６】
実施形態は、磁気抵抗及び／又はスピントロニクスに基づく磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを有する。例えば、フローセル又は液滴アクチュエータは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）デバイス及び／又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）デバイスに基づく高密度の磁気センサアレイを有することができる。ＧＭＲデバイス及びＴＭＲデバイスは、それぞれＧＭＲセンサ又はＴＭＲセンサとも称することができる。特別な実施形態において、磁気センサアレイは、ＤＮＡの増幅したクローン集団（クラスター）又は磁性粒子で標識付けしたＤＮＡの一本鎖（単一ストランド）を検出するのに使用することができる。磁性粒子は、例えば、磁気ナノ粒子及び／又は単分子磁石（ＳＭＭ）とすることができる。
【０３２７】
本明細書に記載のように、磁気応答センサのアレイは、指定構成を有する複数のセンサを有する。アレイは、グリッド若しくはマトリクス構成（例えば、１０行及び１０列）で互いに並置したセンサを有する、又はアレイはより分散した不均一な構成を有することができる。幾つかの実施形態において、アレイの磁気応答センサは、介在する素子なしに互いに直ぐ隣接させて位置決めすることができる。しかし、他の実施形態において、アレイの磁気応答センサは、互いに離間させることができる。随意的に、他の素子（例えば、電極）を隣接する磁気応答センサ間に位置決めすることができる。
【０３２８】
幾つかの実施形態において、生物学的又は化学的なサンプルを、信号検出前にアレイの１つ又はそれ以上の磁気応答センサに隣接するよう選択的に位置決めすることができる。例えば、各磁気応答センサは、それぞれに対応するエリア又は容積部（概して指定空間と称する）に割り当てることができ、磁気応答センサは指定空間から外部磁場を検出するよう構成する。特別な実施形態として、テンプレート鎖は指定空間に配置された表面又はマトリクスに固定化することができる。他の実施例として、生物学的又は化学的なサンプルを、１つ又はそれ以上の磁気応答センサ上に位置決めされた窪み（例えばウェル）内に位置決めすることができる。
【０３２９】
代案として、生物学的又は化学的なサンプルは、検出前に磁気センサに沿う未知の位置をとることができる。このような実施形態において、磁性粒子を検出した後にのみ、磁性粒子が磁気応答センサの指定空間内に存在しているか否かを決定することができる。このような実施形態において、１つ又はそれ以上の磁気応答センサは、生物学的又は化学的なサンプルを検出することができない。他の実施形態において、複数の磁気応答センサを単一サンプルの近傍に配置し、複数のセンサそれぞれが同一磁性粒子を検出できるようにする、又はその同一サンプルに結合した異なる磁性粒子を検出できるようにする。
【０３３０】
本明細書に記載のように、「のアレイ」又は「複数の［素子］」等の語句は、詳細な説明及び特許請求の範囲で使用されるとき、必ずしもコンポーネントが有しうる各素子及びすべての素子を含むものではない。コンポーネントはその複数の素子に類似する他の素子を有することができる。語句「［語られたフィーチャー（特徴／形体）を有する］複数の磁気応答センサ」は、必ずしも検出装置の磁気応答センサ各々及び全てが語られたフィーチャーを有することを意味しない。他の磁気応答センサは語られたフィーチャーを含まない場合がある。したがって、他に明示する（例えば、［語られたフィーチャーを有する］磁気応答センサ各々及びすべてと明示する）のではない限り、実施形態は語られたフィーチャーを持たない類似の素子を有することができる。
【０３３１】
磁気応答センサそれぞれは、電気抵抗変化を検出するのに使用することができる。例えば、磁気応答センサそれぞれは、その磁気応答センサに関連する電気抵抗を有することができる。磁気応答センサは、例えば、磁気応答センサ近傍に位置決めされた物質の磁気特性によって生ずる電気抵抗変化を検出することができる。本明細書に記載のように、「磁気特性」は、磁場、磁気方位、磁気モーメントを含むことができる。磁気特性は、常磁性、反磁性、強磁性、又は反強磁性を示す物質によって生ずる。磁気特性は、さらに、少なくとも部分的に物質内の電子のスピンによって生ずる。幾つかの実施形態において、磁気特性は不変のものとすることができる。しかし、他の実施形態において、磁気特性は変更又は誘導されるものとすることができる。
【０３３２】
例えば、ＧＭＲセンサは、指定磁気特性を持つ物質の存在下にあるとき変化し得る電気抵抗がある導電層を有することができる。例えば、磁性粒子は、抵抗変化を引き起こす対応の磁場又は磁気モーメントを有することができる。ＧＭＲセンサは、外部磁場が存在しないとき第１電気抵抗を有し、また外部磁場が存在するとき第２電気抵抗を有することができる。同様に、ＴＭＲセンサはトンネル電流を示す絶縁層を有することができる。トンネル電流の流れはＴＭＲセンサの電気抵抗によって阻害される。ＴＭＲセンサは、磁性物質が存在しないとき第１電気抵抗を有し、また磁性物質が存在するとき第２電気抵抗を有することができる。本明細書の実施形態は、磁性物質が存在するか否かを決定するため、電気抵抗の相違を決定することができる。幾つかのケースにおいて、磁性物質は異なる磁気特性を有する。このようにして、実施形態は、異なる磁場及び／又は異なる磁気モーメントを区別することができる。
【０３３３】
各磁気応答センサのための、検出装置の回路、例えば、読出回路に設けた回路は磁気応答センサにおける電気抵抗に相関する信号を伝送することができる。例えば、回路は、磁気応答センサの１つ又はそれ以上の層、例えば、強磁性層のうちの１つ及び／又は非磁性層に電気的に接続することができる。外部磁場が存在するときと、存在しないときとでの信号を比較し、電気抵抗変化を検出することができる。電気抵抗変化は、信号が伝送されたときに磁性粒子が存在していたか否かを決定することができる。例えば、電気抵抗のいかなる大きな変化も磁性粒子が存在することを示すことができる。さらに、幾つかの実施形態において、変化の大きさを解析して、存在する磁性粒子のタイプ、又は存在する磁性粒子の数を決定することができる。換言すれば、実施形態は、(a) 指定空間に何らかの磁場が存在したか否かを決定する、又は(b) 指定空間に存在した磁場の強度を同定するよう構成する。このデータにより、実施形態は、生物学的又は化学的なサンプルに関する有用な情報を決定することができる。有用な情報は、例えば、ヌクレオチド又は核酸の配列（シーケンス）を同定することができる。
【０３３４】
上述したように、実施形態は、磁気特性が存在するとき、及び磁気特性が存在しないときに電気抵抗を表している信号を受け取ることができる。このデータを解析して電気抵抗変化を決定することができる。実施形態は、磁気特性が第１状態又は属性を有するとき、及び磁気特性が異なる第２状態又は属性を有するときの信号を受け取ることができる。同様に、このデータを解析して電気抵抗変化を決定することができる。例えば、磁性物質は、変更又は誘導される磁気特性を有することができる。１つの例として、ＳＭＭ粒子は、光周波数ＯＮ／ＯＦＦの異なるセットに対する感受性を有することができる。ＳＭＭ粒子の磁性状態は、ＯＮ光周波数又はＯＦＦ光周波数を供給することにより変更することができる。このように、実施形態は、ＯＮ光周波数が印加された後に受け取った信号を、ＯＦＦ光周波数が印加された後に受け取った信号を比較することができる。
【０３３５】
以下に説明する実施形態は、磁場単独で生ずる電気抵抗変化を決定するステップを有する。しかし、このような変化は、他の磁気特性（例えば、磁気方位及び／又はモーメント）によっても生じ得ることを理解されたい。
【０３３６】
特別な実施形態において、デバイス及び方法は、ＤＮＡの増幅されたクローン集団（クラスター）又はＤＮＡの一本鎖をシークエンシング（配列決定）するのに使用することができる。
【０３３７】
特別な実施形態において、ハプテンで標識付けしたヌクレオチド及び官能化された磁性ナノ粒子を使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームでのヌクレオチド取込みイベントを検出及び区別する。
【０３３８】
特別な実施形態において、ＳＭＭで標識付けしたヌクレオチドを使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基を検出及び区別する。
【０３３９】
特別な実施形態において、標識付けしないヌクレオチド及び官能化されたＤＮＡポリメラーゼを使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基を検出及び区別する。１つの例において、ＤＮＡポリメラーゼは、単分子磁石のような磁性粒子により官能化（タグ付け）される。
【０３４０】
［1.1   ＤＮＡシークエンシング用の磁気抵抗センサ］
本明細書に記載の実施形態は、磁気感知スキームを用いて生物学的又は化学的な解析用の方法、システム、デバイス及び装置を含むことができる。例えば、実施形態は、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援するためのようなＤＮＡシークエンシングのために磁気バイオセンシングを用いるデバイス及び方法を含むことができる。すなわち、１つ又はそれ以上の実施形態は、磁気抵抗及び／又はスピントロニクスに基づいて磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを有するフローセル及び／又は液滴アクチュエータを準備する。磁気抵抗は、外部磁場を印加されるとき電気抵抗の値を変化させる物質の特性である。或る物質（及び多層デバイス）は、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）、コロッサル磁気抵抗（ＣＭＲ）、トンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）、及び異常磁気抵抗（ＥＭＲ）を示す。概して、抵抗は、磁化（印加磁場によって制御される）又は磁場のいずれかに直接依存し得る。スピンエレクトロニクス又はフラクストロニックとしても知られているスピントロニクスは、固体デバイスにおける、基礎的電子電荷に加えて電子の固有スピン及びそれに関連する磁気モーメントの双方を有効活用する新興の技術である。スピントロニクスにおいて、スピンは、磁場によってだけではなく、電場によっても取扱い操作される。
【０３４１】
１つ又はそれ以上の実施形態は、例えば、ＧＭＲベース及び／又はＴＭＲベースのセンサのアレイを使用することができる。普通のＳＢＳデバイスの検出機構は大型で高価な光学系を必要とするが、ＧＭＲベース及び／又はＴＭＲベースのセンサは、メモリアレイを形成する既知の半導体製造プロセスを活用して、磁気センサアレイを安価に作製するのに使用することができる。さらに、これら既知の半導体製造プロセスを用いて、高密度磁気センサアレイを、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで、例えば、フローセル及び／又は液滴アクチュエータにおいて実装することができる。
【０３４２】
そのようにする場合、実施形態は安価で携帯可能な非光学的シークエンシングデバイスを提供し、このデバイスにおいては、(1) 最も複雑な生物サンプルであっても検出可能な磁気バックグラウンド信号がない、(2) 生物サンプルが磁気変換メカニズムに干渉しない、及び(3) 塩分、ｐＨ、蛍光発光からの組合せバックグラウンドが磁気バイオセンシングに対して問題とならない。さらに、１つ又はそれ以上の実施形態は診断法（血液、細胞溶解物、唾液、尿等）によく役立てることができる。シークエンシングに関しては、これらの特質自体は、単分子検出（幾つかの実施形態においては、クラスター（集団）も依然として精度にとって有利である）及びサンプル調製用途にも役立つ。
【０３４３】
図１Ａ及び１Ｂは、それぞれシステム１００の実施例における頂面図及び断面図を示す。図示の実施形態において、システム１００は、検出装置（又は検出器）１０２、検出装置１０２と流体連通する流体制御系１０４（図１Ａ参照）、読出回路１０６（図１Ａ参照）、及び解析回路１０５（図１Ａ参照）を備える。検出装置１０２は、例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援する磁気センサアレイ１１０を有する。例えば、検出装置１０２は、印刷回路板（ＰＣＢ）１１２及びＰＣＢ１１２に備え付けた磁気センサアレイ１１０を含む底部基板１０８を有する。検出装置１０２は、さらに、磁気センサアレイ１１０に対して相対的に設けた頂部基板（又はフローセル）１１４を有する。磁気センサアレイ１１０は、底部基板１０８の基板表面１０９（図１Ｂ参照）に沿って位置決めする。チャンバ又はリザーバ１１８は、基板表面１０９と頂部基板１１４との間に画定される。磁気センサアレイ１１０は、チャンバ１１８内で指定空間の近傍に位置決めされる複数のセンサを有することができる。例えば、センサはチャンバ１１８を画定する露出表面を有することができる。代案として、１つ又はそれ以上の層（例えば、不動態化層）をチャンバ１１８と磁気センサアレイ１１０との間に位置決めすることができる。例えば、基板表面１０９を不動態化層によって画定することができる。図示の実施形態において、頂部基板１１４及び底部基板１０８をスペーサ１１６によって互いに隔てる。他の実施形態において、頂部基板１１４は、頂部基板１１４を底部基板１０８に備え付けるときチャンバ１１８となる窪みをなす形状にすることができる。
【０３４４】
頂部基板１１４は、例えば、ガラス基板又はプラスチック基板とすることができる。１つの実施例において、頂部基板１１４は約４００μｍの厚さとする。１つの実施例において、スペーサ１１６は約１００μｍの高さの粘着性スペーサとすることができる。他の実施例において、スペーサ１１６は、頂部基板又は底部基板のいずれかに一体であり、また約１００μｍの高さのライザーとする。シークエンシングチャンバ１１８は、頂部基板１１４における入口１２０及び出口１２２によって供給されるフローチャンネルである。すなわち、液体は、入口１２０及び出口１２２を用いてシークエンシングチャンバ１１８に対して流入／流出することができる。
【０３４５】
１つの実施例において、磁気センサアレイ１１０は、１０×１０のアレイであり、磁気応答センサのピッチは、例えば、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲にわたるものとすることができる。他の実施例において、磁気センサアレイ１１０は、高密度ＣＭＯＳベースの磁気センサアレイであり、例えば、磁気応答センサのピッチが約２００ｎｍ（現行６４Mbitデバイスにおける）である８,０００×８,０００アレイ、又は磁気応答センサのピッチが約１００ｎｍ（現行１０Ｇｂｉｔデバイスにおける）である１００,０００×１００,０００アレイである。１つの実施例において、磁気センサアレイ１１０は１００ｎｍ×４００ｎｍのデバイスである。
【０３４６】
磁気センサアレイ１１０を形成する磁気応答センサは、例えば、ＧＭＲベースのデバイス若しくはセンサ、又はＴＭＲベースのデバイス若しくはセンサとすることができる。ＧＭＲベースのデバイス又はＴＭＲベースのデバイスを使用して、例えば、ＤＮＡの増幅したクローン集団（クラスター）、又は例えば磁性ナノ粒子及び／又はＳＭＭで標識付けしたＤＮＡの一本鎖を検出することができる。このシステム１００は診断用途のような他の用途に使用でき、この場合、プローブ又は磁性粒子を有する他の部分が、指定した生物学的若しくは化学的な標的に対して選択的に付着する。
【０３４７】
図１Ａに示すように、読出回路１０６は検出装置１０２とは別個のものである。しかし、他の実施形態において、読出回路１０６は、検出装置１０２と完全に一体化することができる。例えば、検出装置１０２はＣＭＯＳのような固体デバイスであり、少なくとも読出回路１０６の少なくとも一部を形成する回路を有することができる。幾つかの実施形態において、底部基板１０８はＣＭＯＳデバイスを含むことができる。
【０３４８】
読出回路１０６は、アレイ１１０を形成する磁気応答センサに通信可能に接続する。読出回路１０６は、磁気応答センサの電気抵抗に基づく（又は電気抵抗を示す若しくは表す）信号を解析回路１０５に伝送するよう構成する。読出回路１０６は導電通路を有する。幾つかの実施形態において、読出回路１０６は、信号を解析回路１０５に伝送する前に信号を修正するよう構成した回路を有する。例えば、読出回路１０６は、信号を増幅する、信号をデジタル化する、信号をルックアップテーブルに基づいて変換する等々を行うことができる。代案として、読出回路１０６は、信号を解析回路１０５に伝送する前に信号を修正しない。
【０３４９】
幾つかの実施形態において、読出回路１０６は、磁気応答センサにおける電気抵抗を決定し、またこのデータを解析回路１０５に伝送する。他の実施形態において、読出回路１０６は生データを解析回路１０５に伝送し、解析回路１０５が各磁気応答センサにおける電気抵抗を決定する。電気抵抗は、オームの法則又は少なくとも部分的にオームの法則に基づく他の公式／アルゴリズムを使用して計算することができる。電気抵抗は、例えば、情報（例えば、検出した電流又は電圧）をルックアップテーブルに供給し、このルックアップテーブルが電気抵抗を表す信号又は値に情報を変換することによって計算することができる。
【０３５０】
解析回路１０５は、読出回路１０６から信号を受け取り（直接的又は間接的に）、また有用な情報を得るよう１つ又はそれ以上の所定アルゴリズム／公式に従って信号を解析するよう構成する。随意的に、解析回路１０５は検出装置１０２に組み込むことができる。例えば、解析回路１０５は底部基板１０８に固定することができる。
【０３５１】
読出回路１０６及び／又は解析回路１０５は、各磁気応答センサで検出された電気抵抗変化を決定することができる。本明細書で使用する語句「検出された電気抵抗変化」（等々）は、単純な数学的計算に限定することを意図するものではない。幾つかのケースにおいて、必要な情報だけとは、電気抵抗（又は電気抵抗を示す他の特性、例えば、電流又は電圧）が所定条件を満たしているか否かである。例えば、電気抵抗が指定値を下回る場合、この読出しは、陽性の読み（すなわち、磁性粒子が指定空間内に存在した）として指定することができる。電気抵抗が指定値を上回る場合、この読出しは、陰性の読み（すなわち、磁性粒子が指定空間内に存在していなかった）として指定することができる。上述の実施例において、電気抵抗が指定値と異なる相違量は重要でない。質問は、電気抵抗が指定値を上回るか又は下回るかである。
【０３５２】
しかし、他の実施形態において、電気抵抗が指定値と異なる相違量が有用である場合がある。例えば、電気抵抗変化の量は、磁場の強度を示すことができる。この磁場強度は、指定空間内における磁性粒子の数及び／又は磁性粒子のタイプに対応することができる。
【０３５３】
従って、検出された電気抵抗変化を決定するステップは、(a) 何らかの変化が存在する場合を決定するステップ、及び／又は(b) 変化量を決定するステップを含むことができる。さらに、検出された電気抵抗変化を決定するステップは、他の電気的特性を表している値（例えば、電流、電圧）を使用するステップを含むことができる。
【０３５４】
１つの実施例として、検出した変化は、開裂操作後のような第１期間で得られる第１検出値（例えば、ベースライン電気抵抗、ベースライン電流、又はベースライン電圧）、及び取込みイベント後のような後続の第２期間で得られる第２検出値との間の差を見つけることによって決定することができる。
【０３５５】
他の実施例として、検出した変化は、１つの検出値を受け取った後にのみ決定することができる。例えば、指定閾値又はベースライン値を各磁気応答センサに割り当てることができる。読出しは、この指定値を検出値と比較することにより陽性又は陰性として同定することができる。
【０３５６】
他の実施形態において、検出値をルックアップテーブルに適用し、出力を得ることができる。この出力は磁場の強度を示し、この磁場強度は指定空間内における磁性粒子の数及び／又は磁性粒子のタイプに対応する。
【０３５７】
他の実施形態において、検出値は複数の異なる値と比較することができる。これら異なる値それぞれは、磁性粒子のタイプに対応し得る。例えば、検出値が第１の大きさにほぼ等しい場合、第１タイプの磁性粒子が指定空間内に存在し得る。検出値が第２の大きさにほぼ等しい場合、第２タイプの磁性粒子が指定空間内に存在し得る。同様に、検出値は複数の異なる値範囲と比較することができる。検出値が第１範囲内である場合、第１タイプの磁性粒子が指定空間内に存在し得る。検出値が第２範囲内である場合、第２タイプの磁性粒子が指定空間内に存在し得る。
【０３５８】
検出値は１つの瞬間で得られる単一値を表すことができる。しかし、幾つかのケースにおいて、検出値は、１つの所定位置期間にわたって又は複数の所定位置期間にわたって取得することができる。例えば、検出値は、その期間中に検出された最大値又は最小値とすることができる、又はその期間中に検出された平均値とすることができる。さらに他の実施形態において、電気抵抗変化が存在する持続時間も有用な情報を提供することができる。
【０３５９】
解析回路１０５は、生物学的又は化学的サンプルに関する有用な情報を提供するため検出された変化を解析するよう構成される。例えば、解析回路１０５は、核酸の配列（シーケンス）を決定するよう各ＳＢＳイベントに対して付加されたヌクレオチドを同定又は判定することができる。ＳＢＳイベントは、ヌクレオチドを相補的配列に付加させる１つ又はそれ以上のステップと、付加を検出する１つ又はそれ以上のステップとを含むことができる。ＳＢＳイベントは、単一のヌクレオチドを複数のクラスター（何百、何千の集団）に付加するステップを含むことができ、又は単一のヌクレオチドを単一の相補鎖に付加するステップを含むことができる。ヌクレオチドを同定するための様々な方法を本明細書に記載する。この方法は、電気抵抗変化を検出する上述のプロセスを含むことができる。例えば、幾つかの実施形態において、単一の検出変化だけでヌクレオチドの同定に十分である。他の実施形態において、２つ又はそれ以上の検出変化をヌクレオチド同定のために比較することができる。
【０３６０】
幾つかの実施形態において、ヌクレオチドは、各ＳＢＳイベントに対して複数の磁気応答センサに関連する検出した変化を比較することによって、ヌクレオチドを判定する、及び／又は配列を決定することができる。例えば、第１磁気応答センサが第１電気抵抗を示し、また第２磁気応答センサが第２電気抵抗を示す場合、第１及び第２のセンサによって検出された磁性粒子は互いに異なっていることを決定することができる。第３磁気応答センサが第４磁気応答センサによる電気抵抗にほぼ等しい電気抵抗を示す場合、第３及び第４のセンサによって検出された磁性粒子が同一であることを決定することができる。
【０３６１】
幾つかの実施形態において、各磁気応答センサに関連して検出された異なる変化を比較することによって、ヌクレオチドを判定する、及び／又は配列を決定することができる。例えば、ＳＢＳプロトコール後に、或る磁気応答センサは、その磁気応答センサに関連して１００の異なる読み（測定値）を有することができる。各読みは、相補鎖に取り込まれている４つの塩基のうち１つに対応することができる。同一タイプ（又は同数）の磁性粒子が同一の電気抵抗変化を生ずるという仮定に基づいて、ヌクレオチドは各読みに対して判定することができる。
【０３６２】
読出回路１０６及び／又は解析回路１０５は、１つ又はそれ以上の機能を実施するよう動作するハードウェア及び／又はソフトウェアを含むことができる。例えば、読出回路１０６及び／又は解析回路１０５は、コンピュータプロセッサ、コントローラ、又は他の論理ベースのデバイスを含むことができ、コンピュータメモリのような有形かつ持続性コンピュータ可読媒体に保存した命令に基づいて動作を実施する。代案として、読出回路１０６及び／又は解析回路１０５は、デバイスの配線論理に基づいて動作を実施する配線デバイスを有することができる。
【０３６３】
読出回路１０６及び／又は解析回路１０５は、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の動作を実施する、ハードウェア及び関連の命令（例えば、有形かつ持続的コンピュータ可読記憶媒体、例えば、コンピュータハードドライブ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、等々）を含む又は代表することができる。ハードウェアは、マイクロプロセッサ、プロセッサ、コントローラ等々のような１つ又はそれ以上の論理ベースのデバイスを有する及び／又はそれに接続した電子回路を含むことができる。これらデバイスは、上述の命令から本明細書に記載の動作を実施するよう適切にプログラム又は命令される市販のデバイスとすることができる。付加的又は代替的に、これらデバイスのうち１つ又はそれ以上のデバイスは、これら動作を実施するよう論理回路に配線接続することができる。
【０３６４】
本明細書で使用されるとき、タスク又は動作（オペレーション）を実施する「よう構成された／されている（configured to）」という構造、限定又は素子は、そのタスク又は動作に対応する様態となるよう特別な構造で形成、構成又は適応される。分かり易くするまた疑念を回避する目的で、タスク又は動作を実施するよう単に変更し得る対象物は、本明細書で使用されるタスク又は動作を実施する「よう構成された」ものではない。その代わり、本明細書で使用される「よう構成された」は、構造的適応又は特徴を示し、またそのタスク又は動作を実施する「よう構成された」ものであると記載された任意な構造、限定又は素子の構造的要件を示す。例えば、タスク又は動作を実施する「よう構成された」読出回路及び／又は解析回路は、そのタスク若しくは動作を実施するよう特別に構成されている（例えば、該回路に保存され、又はそのタスク若しくは動作を実施するよう調整若しくは意図されて該回路とともに使用される１つ又はそれ以上のプログラム若しくは命令を有する、又はそのタスク若しくは動作を実施するよう調整若しくは意図された処理回路の構成を有する）ものと理解される。分かり易くするまた疑念を回避する目的で、汎用コンピュータ（適切にプログラムされる場合には、そのタスク若しくは動作を実施する「よう構成された／されている」ものとなり得る）は、タスク若しくは動作を実施するよう特別にプログラムされる又は構造的に変更されるものでない限り、若しくはそうされるまでは、そのタスク若しくは動作を実施する「よう構成された／されている」ものではない。さらに、読出回路１０６及び／又は解析回路１０５が実施する動作（例えば、本明細書で詳述したプロセス若しくは方法、又はその態様に対応する動作）は妥当な期間内に人間では実施できないほど十分に複雑なものであることを付記する。
【０３６５】
システム及び／又は検出装置は、さらに、指定スケジュールに従って所定プロトコールを遂行するためのチャンバに試薬を流すよう構成された流体制御系を有することができる。流体制御系は、チューブ、フローセル又は他の流体デバイスによって形成されるチャンネルのネットワークを有する。流れ（フロー）は、所望試薬を送給するよう選択的に作動する１つ又はそれ以上のバルブ及びポンプによって制御することができる。プロトコールは、複数タイプのヌクレオチド、酵素（例えば、ポリメラーゼ）、又は他の反応成分を含む試薬を指定空間に供給してテンプレート鎖を伸長させるＳＢＳプロトコールとすることができる。流体制御系は、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献：米国特許出願公開第２０１５／００７９５９６号及び同第２０１５／００４５２３４号、米国特許第８，９５１，７８１号及び同第８，１７３，０８０号、並びに国際公開第２０１４／１４３０１０号及び同第２０１５／０８９０９２号に記載のシステムと同様の又は同様に動作するものとすることができる。各取込みイベントの後又は最中に、読出回路は信号を解析回路に伝送することができる。
【０３６６】
幾つかの実施形態において、流体制御系は試薬の連続流を供給する。しかし、他の実施形態において、検出装置１０２は液滴アクチュエータを有することができる。例えば、頂部基板１１４及び底部基板１０８のうち少なくとも一方は、液滴動作を実行するための電極を有することができる。電極は、磁気センサアレイ１１０内で交互配置する又は分散させることができる。代案として、磁気センサアレイ１１０は、他の実施形態において、電極に対向させてチャンバ１１８で両者間に位置決めすることができる。
【０３６７】
図２Ａ及び２Ｂは、それぞれＧＭＲデバイス２００及びＴＭＲデバイス２０５を示す。ＧＭＲデバイス２００及びＴＭＲデバイス２０５の双方とも、非磁性層によって分離した１対の強磁性層を有する。
【０３６８】
図２Ａにつき説明すると、ＧＭＲデバイス２００は、第１強磁性層２１０、非磁性層２１２、及び第２強磁性層２１４を有する。非磁性層２１２は強磁性層２１０と強磁性層２１４との間に挟み込む。強磁性層２１０及び強磁性層２１４は強磁性合金である。非磁性層２１２は、極薄非磁性の導電層（例えば、銅層）である。
【０３６９】
図２Ａは２つの状態にあるＧＭＲデバイス２００を示し、強磁性層２１４における磁化方向は、強磁性層２１４上のピン止め層（図示せず）を使用して固定又は「ピン止め」されている。先ず、強磁性層２１０及び強磁性層２１４における磁気モーメントは反強磁性結合に起因して逆向きに対面する。この状態では、電流（Ｉ）に対する抵抗が高い。銅の非磁性層２１２は、平素は優れた導体であるが、２，３個の原子分の厚さだけであるとき、電子散乱が銅の抵抗を大幅に増大させる。この抵抗は、導電層（すなわち、非磁性層２１２）を包囲する電子スピンの相対的向きに基づいて変化する。
【０３７０】
次に、ＧＭＲデバイス２００の状態は、反強磁性結合に打ち勝って強磁性層２１０及び強磁性層２１４の磁気モーメントを整列させる外部磁場（Ｈ）を印加することによって翻ることができる。外部磁場（Ｈ）に対する被曝はデバイスの抵抗を変化（すなわち、減少）させ、その構体を使用して外部の場を感知することができる。実用的なデバイスは、しばしば感度を改善するため磁性層及び非磁性層を交互配置した多層にして形成される。ＧＭＲデバイス２００が磁場を受けるときの抵抗変化は、一般的に、他タイプの磁気センサにおける２、３％の最大感度に比べて大きい１０％〜約２０％となり得る。
【０３７１】
次に、図２Ｂにつき説明するが、ＴＭＲデバイス２０５は、強磁性層２１０、非磁性層２１２、及び強磁性層２１４を有する。ＧＭＲデバイス２００における非磁性層２１２は導電性であるが、ＴＭＲデバイス２０５では非磁性層２１２は薄い絶縁層である。
【０３７２】
２つの強磁性層（すなわち、強磁性層２１０及び強磁性層２１４）が薄い絶縁層（例えば、非磁性層２１２）によって隔てられているとき、フィルムに直交する方向における多層の電気抵抗は、強磁性層の磁化の向きに基づいて変化し、この変化は２つの強磁性層間におけるスピン依存電子トンネル現象によるものである。
【０３７３】
図２Ｂは２つの状態にあるＴＭＲデバイス２０５を示し、強磁性層２１４における磁化の方向が、強磁性層２１４上のピン止め層（図示せず）を使用して固定又は「ピン止め」されている。先ず、２つの強磁性層における磁化方向が互いに逆向きであるとき、強磁性層の磁化に対して逆向きのスピン方向を有する電子はトンネル通過できない。このとき、トンネル電子電流は、磁化方向が同一方向である場合と比べるとより少ない（すなわち、より高い抵抗となる）。次に、２つの強磁性層の磁化方向が同一であるとき、絶縁層を貫通する２つの強磁性層間における電子トンネル通過の可能性はより大きくなり、この結果、より大きいトンネル電流を生ずる（すなわち、より低い抵抗となる）。
【０３７４】
図２ＡのＧＭＲデバイス２００及び図２ＢのＴＭＲデバイス２０５におけるデバイスジオメトリは平行異方性に基づき、これは自由層及びピン止め層の磁化が基板表面に対して平行であることを意味する。しかし、磁気センサアレイ１１０は、任意な既知のＧＭＲ／ＴＭＲデバイスのジオメトリに基づくことができる。他の実施形態において、磁気センサアレイ１１０は、平行異方性の代わりに、自由層及びピン止め層の磁化が基板表面に対して直交することを意味する直交異方性を利用するＧＭＲ／ＴＭＲデバイスのジオメトリに基づくことができる。
【０３７５】
ＤＮＡの増幅したクローン集団、又は例えば、磁性ナノ粒子及び／又はＳＭＭで標識付けしたＤＮＡの一本鎖を検出するため、フローセル１００におけるＧＭＲベース及び／又はＴＭＲベースの磁気センサアレイ１１０を使用することに関して、図３は、単一磁性ナノ粒子を用いるＧＭＲバイオチップの感受性をプロットしたグラフ３００の例を示す。プロットグラフ３００につき説明すると、予増幅信号の測定した均一場依存性は、最小検出可能な場変化が０.１Ｏｅよりも良好であることを実証している。単一ナノ粒子がセンサ面積にわたり０.１２Ｏｅの均一場を生成し（シミュレーションによって）、このことは、ＧＭＲバイオチップが単一ナノ粒子（分子）検出を実施できることを示している。１つ又はそれ以上のＤＮＡ分子テンプレート（鋳型）を有するクラスター（集団）を使用することは読出し信号の強度を増強することが予想される。
【０３７６】
図４は、図１Ａ及び１Ｂに示す検出装置１０２の一部の断面図であり、磁気センサアレイ１１０の磁気応答センサのより詳細を示す。やはり、検出装置１１０はＰＣＢ１１２に備え付けた磁気センサアレイ１１０を有する。図４は、磁気センサアレイ１１０が複数の磁気応答センサ１３０有することを示す。幾つかの実施形態において、磁気応答センサ１３０は行列状態に配列することができる。しかし、他の実施形態は所望用途に基づいて選択することができる。各磁気応答センサ１３０は、例えば、ＧＭＲベースのデバイス（例えば、図２ＡのＧＭＲデバイス２００）又はＴＭＲベースデバイス（例えば、図２ＢのＴＭＲデバイス２０５）とすることができる。各磁気応答センサ１３０は、第１強磁性層２１０と第２強磁性層２１４との間に挟み込んだ非磁性層２１２を有することができる。この実施例において、各磁気応答センサ１３０の第１強磁性層２１０はチャンバ１１８の方向に指向させる。さらに、第２強磁性層２１４の磁化方向は、第２強磁性層２１４に隣接するピン止め層２１６を使用して固定又は「ピン止め」されている。図４は第１及び第２の強磁性層２１０、２１４並びに非磁性層２１２のみを示すが、他の実施形態は互いに積層した２つより多い強磁性層及び１つより多い非磁性層を有することができる。
【０３７７】
図示のように、各磁気応答センサ１３０は、チャンバ１１８における指定空間又は関連空間１３１内に位置する又はその空間内で発生する外部磁場を検出するよう構成されている。本明細書で使用される用語「指定空間」は、磁性粒子が対応の磁気応答センサによって検出される近接空間を意味する。指定空間のサイズ及び形状は、複数の要因、例えば、磁性粒子のサイズ及び強度、磁気応答センサの形態（例えば、層のサイズ、形状及び数）、又は磁気応答センサの感度に基づくことができる。このように、指定空間は用途に基づいて変化し得る。磁気応答センサは該センサの指定空間に隣接する空間からの外部磁場を検出できると考えられるが、この外部磁場は比較的弱く、またいかなる信号もノイズとして認識されることがあり得る。
【０３７８】
図示の実施形態において、各指定空間は、磁気センサアレイに沿って連続的に延在するチャンバ１１８の小さい部分又は容積部でしかなく、隣接の指定空間は壁のような他の物質によって物理的に分離されてはいない。他の実施形態において、指定空間は互いに物理的に分離することができる。例えば、各指定空間は壁内に、又は１つ又はそれ以上の壁によって画定される窪み内に存在することができる。壁は指定空間を分離することができる。液滴アクチュエータを有する実施形態に対しては、指定空間は、試薬が指定空間に送給されるとき、液滴によって占有され得る。このような実施形態において、指定空間は、填隙剤流体によって互いに分離され得る。しかし、単独の液滴が一度に複数の指定空間を占有することも考えられる。
【０３７９】
さらに、図４は、磁気応答センサ１３０とチャンバ１１８との間に位置決めされる層１４０を有する検出装置１０２を示す。図４は、さらに、検出装置１０２が頂部基板１１４に沿って位置決めされた導電層１５０を有することを示す。頂部基板１１４における導電層１５０は、例えば、金層又はインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）層とすることができる。１つの実施例において、導電層１５０は、磁気センサアレイ１１０におけるすべての磁気応答センサ１３０に共通のＶｄｄ基準面として使用することができる。
【０３８０】
層１４０は、チャンバ１１８内で表面ベースの相互関係を遂行するのに適した、親水性材料、疎水性材料、又は親水性材料及び疎水性材料の組合せのうち任意な材料で形成することができる。層１４０は、例えば、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍの厚さとすることができる。１つの実施例において、層４０は、ポリアクリルアミドゲル被覆、例えば、ノルボルネン（又はノルボルニレン又はノルカンフェン）及びPAZAMとしても知られているポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド)の混合物のコーティングとする。PAZAMのより詳細については、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献で見ることができる（George et al., U.S. Patent App. No. 13/784,368, entitled “Polymer Coatings,” filed on March 4, 2013）。
【０３８１】
図４において、複数のオリゴヌクレオチド・プライマー１４２をチャンバ１１８内の層１４０に固定化し、磁気センサアレイ１１０の磁気応答センサ１３０に対する位置付けをする。１つの実施例において、オリゴヌクレオチド・プライマー１４２は捕獲プライマーであり、この捕獲プライマーにおいて一本鎖ＤＮＡ断片が交雑及び増幅されて、ＳＢＳのためのクローンＤＮＡテンプレート（鋳型）集団（クラスター）を形成する。
【０３８２】
本明細書に記載のように、幾つかの実施形態において、ＳＢＳ反応中に供給される信号は、例えば、磁性粒子で直接的又は間接的に標識付けされ、以下により詳細に説明される磁気応答センサを用いて検出されるヌクレオチドの取込みを介して供給することができる。磁性粒子は、例えば、磁性ナノ粒子又はＳＭＭとすることができる。
【０３８３】
［1.2   磁性ナノ粒子ベースのＳＢＳ］
一実施形態において、官能化された磁性ナノ粒子及びハプテンで標識付けされたヌクレオチドを使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームにおけるヌクレオチド取込みイベントの検出を行う。１つの実施例において、ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）をビオチニル化し、また磁性ナノ粒子をストレプトアビジンでコーティング（被覆）する。例えば、単一タイプの磁性ナノ粒子を使用し、また四つ（４回）の流体／検出サイクルを使用して、ＳＢＳサイクルにおけるヌクレオチドの逐次付加を行う。
【０３８４】
図５〜１２は、本明細書に記載のシステム及び検出装置によって実施することができる種々の方法を示す。例えば、１つの方法は、磁気応答センサのアレイを有している検出装置を準備する準備ステップを備える。磁気応答センサ各々は、それぞれに対応する指定空間の近傍に配置して前記指定空間から磁気特性を検出することができる。検出装置は、さらに、それぞれに対応する指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有する。この方法は、さらに、各テンプレート鎖に沿ってヌクレオチドを取り込むことによって相補的な相補鎖を成長させる複数のＳＢＳイベントを遂行する遂行ステップを備える。前記ヌクレオチドのうち少なくとも幾つかは、それぞれに対応する磁場を生ずる対応の磁性粒子に付着する。前記複数のＳＢＳイベント各々は、前記磁性粒子それぞれの磁場によって生ずる磁気応答センサにおける電気抵抗の変化を検出するステップを含む。この方法は、さらに、検出した電気抵抗変化に基づいて前記相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを備える。前記相補鎖の配列は、前記複数のＳＢＳイベントそれぞれに対して磁気応答センサで生ずる検出された電気抵抗変化に基づく。
【０３８５】
図５は、図１Ａ、１Ｂ及び４に示すフローセル１００の一部を示し、また磁気バイオセンシングＳＢＳスキーム５００の例を描写している。磁気バイオセンシングＳＢＳスキーム５００において、取り込まれてビオチニル化したヌクレオチドを使用して、ストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子を捕獲し、また検出可能な信号を発生する。この実施例において、クラスター増幅プロセスで形成されたＤＮＡテンプレート鎖５１０（すなわち、ＤＮＡテンプレート鎖５１０ａ及び５１０ｂ）は層１４０に固定化される。ＤＮＡテンプレート鎖５１０ａは第１クローン集団における１つのテンプレート鎖であり、ＤＮＡテンプレート鎖５１０ｂは第２クローン集団における１つのテンプレート鎖である。ＤＮＡテンプレート鎖５１０ａ及び５１０ｂに対して、それぞれ配列決定（シークエンシング）プライマー５１５ａ及び５１５ｂが交雑される。塩基付加反応において、ビオチニル化したヌクレオチド５２０が取り込まれて配列決定プライマー５１５を伸長させる。ビオチニル化ヌクレオチド５２０を図６につきより詳細に説明する。ビオチニル化ヌクレオチド５２０は、ＤＮＡテンプレート５１０ｂでのみ成長する（すなわち、ｄＡＴＰはＤＮＡテンプレート５１０ａに対して塩基付加するのに相補的ではない）相補鎖に取り込まれる。複数のストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子５２５を含む溶液（図示せず）をフローセル１００のチャンバ１１８に流入させる。磁性ナノ粒子５２５は、例えば、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有する超常磁性ナノ粒子とすることができる。磁性ナノ粒子５２５は、ビオチン・ストレプトアビジン結合錯体の形成により取り込まれたビオチニル化ヌクレオチド５２０に結合する。結合されなかった磁性ナノ粒子５２５は洗浄により除去する。取り込まれたヌクレオチド５２０に結合した磁性粒子５２５は、磁気センサ１３０ｂの抵抗を変化させ、これに対応する電気信号を発生し、またこの信号が測定される。この一方で、磁気センサ１３０ａにおいてＤＮＡテンプレート鎖５１０ａ／配列決定プライマー５１５ａに結合される磁性ナノ粒子５２５が存在せず、磁気センサ１３０ａが発生する信号は磁気センサ１３０ｂが発生する信号とは異なる。
【０３８６】
図６Ａは、図５におけるビオチニル化ヌクレオチド５２０の部分的構造式を示す。ビオチニル化ヌクレオチド５２０は、ビオチン標識６１０を有する。ビオチン標識６１０は、開裂可能リンカー６２０を介してヌクレオチド５２０の塩基６１５に結合する。ヌクレオチド５２０の３′ヒドロキシ（ＯＨ）基は保護基６２５によって保護される。取込みイベントにおける成長する相補的ＤＮＡ鎖へのヌクレオチド５２０の取込み及び検出（磁気バイオセンシング）後、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体は、開裂可能リンカー６２０の開裂によりヌクレオチド５２０から除去することができる。ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体の除去後、検出信号はバックグラウンドレベルに復帰する。保護基６２５は、次の相補的ビオチニル化ヌクレオチドの後続取込みのために脱ブロック化反応によって除去することができる。
【０３８７】
図６Ｂは、幾つかの実施形態で使用できる磁気的標識付けをしたヌクレオチド６５０の部分的構造式を示す。ヌクレオチド６５０は、塩基６５５と、リンカー６７０を介してγリン酸塩６６５に付着する磁性粒子６６０とを含む。様々なリンカー及び様々な磁性粒子を使用することができる。
【０３８８】
図７は、例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び４に示すフローセル１００を用いて磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基決定する方法７００の実施例におけるフローチャートを示す。方法７００は、塩基決定のために、ビオチニル化ヌクレオチドの順次の付加（１回につき１つのヌクレオチド）及び１つのタイプのストレプトアビジン被覆（ＳＡ）磁性ナノ粒子を使用する。１つの実施例において、方法７００は、図５の磁気バイオセンシングＳＢＳスキーム５００及び図６のビオチニル化ヌクレオチド５２０を使用する。図７につき説明すると、方法７００は、限定しないが、以下のステップを含む。
【０３８９】
ステップ７１０において、方法７００は、第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０をＳＢＳサイクルにおける第１塩基付加反応で成長する相補的ＤＮＡ鎖内に取り込む。第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０は、テンプレート鎖を有する指定空間に送給することができる。例えば、第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド５２０ａ）を含む溶液を、フローセル１００の配列決定（シークエンシング）チャンバ１１８内及び指定空間に流入させ、第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０が成長する相補鎖を伸長できるようにする。他の例としては、第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０を含んでいる溶液の液滴を、本明細書に記載の液滴操作を使用して各指定空間に送給することができる。液滴は、所定期間にわたり指定空間を占有し、第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０が成長する相補鎖を伸長させることができる。１つの実施例において、第１ヌクレオチドはビオチニル化したｄＡＴＰとする。
【０３９０】
ステップ７１５において、ＳＡ磁性ナノ粒子をフローセルに導入する。ＳＡ磁性ナノ粒子は、テンプレート鎖を有する指定空間に送給し、第１信号を検出することができる。例えば、ＳＡ磁性ナノ粒子５２５を含む溶液をフローセル１００のチャンバ１１８内に流入させることができる。ＳＡ磁性ナノ粒子５２５は第１ビオチニル化ヌクレオチド５２０によって捕獲することができる。例えば、磁性ナノ粒子５２５は、ビオチン／ストレプトアビジン結合錯体を介してその部位（クラスター）で捕獲することができる。他の実施例としては、溶液の液滴は、本明細書に記載の液滴操作を用いて各指定空間に送給することができる。液滴は、所定期間にわたり指定空間を占有し、ＳＡ磁性ナノ粒子を標識付けしたヌクレオチドに付着させることができる。磁性粒子が標識付けしたヌクレオチドに付着した後、第１信号を検出することができる。この信号は磁気応答センサにおける電気抵抗変化とすることができる。この電気抵抗変化は、指定空間内に位置付けられた磁性粒子によって生じ得る。
【０３９１】
ステップ７２０において、磁性粒子は標識付けしたヌクレオチドから除去することができる。例えば、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体は、開裂可能リンカー６２０により取り込まれたヌクレオチド５２０から除去することができる。ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体の除去後、信号はバックグラウンドレベルに復帰する。ヌクレオチド５２０の保護基６２５は、次の相補的ヌクレオチドの後続取込みのために脱ブロック化反応によって除去する。
【０３９２】
ＳＢＳシークエンシングは、後続の塩基付加反応によって継続する。特別な実施形態においては、第２、第３、及び第４の塩基付加反応を遂行することができる。例えば、第２ビオチニル化ヌクレオチド５２０（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド５２０ｂ）を含む溶液をフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流入させる。１つの実施例において、第２ヌクレオチドはビオチニル化したｄＧＴＰとする。
【０３９３】
ステップ７２５において、ＳＡ磁性ナノ粒子をフローセルに導入し、第２信号を検出する。例えば、磁性ナノ粒子５２５は、ビオチン／ストレプトアビジン結合錯体を介してＧの取込み部位（クラスター）で捕獲され、また第２信号を関連の磁気センサ１３０で検出する。
【０３９４】
ステップ７３０において、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体は、開裂可能リンカー６２０の開裂によって取り込まれたヌクレオチド５２０から除去される。ヌクレオチド５２０の保護基６２５は、次の相補的ヌクレオチドの後続取込みのために脱ブロック化反応によって除去する。ＳＢＳサイクルは、第３塩基付加反応によって継続する。例えば、第３ビオチニル化ヌクレオチド５２０（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド５２０ｃ）を含む溶液をフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流入させる。１つの実施例において、第３ヌクレオチドはビオチニル化したｄＣＴＰとする。
【０３９５】
ステップ７３５において、ＳＡ磁性ナノ粒子をフローセルに導入し、第３信号を検出する。例えば、磁性ナノ粒子５２５は、ビオチン／ストレプトアビジン結合錯体を介してＣ取込みのすべての部位（クラスター）で捕獲され、また第３信号を関連の磁気センサ１３０で検出する。
【０３９６】
ステップ７４０において、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体は、開裂可能リンカー６２０の開裂によって取り込まれたヌクレオチド５２０から除去される。ヌクレオチド５２０の保護基６２５は、次の相補的ヌクレオチドの後続取込みのために脱ブロック化反応によって除去する。ＳＢＳサイクルは、第４塩基付加反応によって継続する。例えば、第４ビオチニル化ヌクレオチド５２０（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド５２０ｄ）を含む溶液をフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流入させる。１つの実施例において、第４ヌクレオチドはビオチニル化したｄＴＴＰとする。
【０３９７】
ステップ７４５において、ＳＡ磁性ナノ粒子をフローセルに導入し、第４信号を検出する。例えば、磁性ナノ粒子５２５は、ビオチン／ストレプトアビジン結合錯体を介してＴ取込みのすべての部位（クラスター）で捕獲され、また第４信号を関連の磁気センサ１３０で検出する。
【０３９８】
判定ステップ７５０において、他の４塩基付加ＳＢＳサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望ましい場合、方法７００はステップ７５５に進む。他のＳＢＳサイクルを望まない場合、方法７００は終了する。
【０３９９】
ステップ７５５において、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体は、開裂可能リンカー６２０の開裂によって取り込まれたヌクレオチド５２０から除去される。ヌクレオチド５２０の保護基６２５は、次の相補的ヌクレオチドの後続取込みのために脱ブロック化反応によって除去する。方法７００はステップ７１０に復帰する。
【０４００】
他の実施例において、「２標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームは、ハプテンで標識付けしたヌクレオチドと、２つの異なるタイプの官能化磁性ナノ粒子を使用する。この実施例において、２つの流体／検出サイクルをＳＢＳサイクルにおける塩基識別に使用する。
【０４０１】
図８は、例えば、図１Ａ、１Ｂ及び４に示すフローセルを用いて、「２標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基識別する方法８００の実施例のフローチャートを示す。図９は、図８に示す方法８００のステップを図式的に示す概略図である。１つの実施例において、方法８００は、開裂可能ジスルフィド（ＳＳ）結合を有するビオチニル化Ａヌクレオチド（Ａ-LN3-SS-ビオチン）、ビオチニル化Ｃヌクレオチド（Ｃ-LN3-ビオチン）、Ａ及びＣの取込みを検出するためストレプトアビジン（ＳＡ）被覆した磁性ナノ粒子、ジゴキシゲニン（DIG）で標識付けしたＴヌクレオチド（Ｔ-LN3-DIG）、並びにＴの取込みを検出するためDIGに対して特異的な抗体（又は抗体断片）で被覆した磁性ナノ粒子を使用する。Ｇヌクレオチドは検出のために標識付けしない。図８につき説明すると、方法８００は、限定しないが以下のステップを含む。
【０４０２】
ステップ８１０において、ヌクレオチドはＳＢＳサイクルにおいて成長する相補鎖内に取り込まれる。ヌクレオチドは、Ａ-LN3-SS-ビオチン、Ｃ-LN3-ビオチン、Ｔ-LN3-Dig、又は標識付けしていないＧとすることができる。このステップは図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０３】
ステップ８１５において、第１信号はＡ又はＣのヌクレオチドの取込みを検出する。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、第１信号はＡ又はＣヌクレオチド取込みに対して検出される。ストレプトアビジン（ＳＡ）被覆した磁性ナノ粒子の溶液をフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流し、ビオチン／ストレプトアビジン磁性ナノ粒子錯体がＡ又はＣの取込みがある部位（クラスター）で形成される。このステップも図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０４】
ステップ８２０において、抗ＤＩＧで被覆した磁性ナノ粒子（抗-DIG NP）及びジスルフィド（ＳＳ）開裂剤（クリーバー）を含む溶液をローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流入させる。取り込まれたＴ-LN3-DIGヌクレオチドと抗-DIG NPとの間での錯体形成は、Ｔ取込みがあった部位（クラスター）を選択的に同定する。ＳＳクリーバーは、取り込まれたＡ-LN3-SS-ビオチンのヌクレオチドにおけるジスルフィド結合を開裂し、またＡヌクレオチドからビオチン／ストレプトアビジン錯体を効果的に除去し、これによりそれら部位から発生する信号を排除する。このステップも図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０５】
ステップ８２５において、第２信号はＴヌクレオチドの取込みに関して検出される。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、第２信号はＴヌクレオチドの取込みに関して検出される。Ｃヌクレオチド取込みからの信号も検出される。このステップも図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０６】
ステップ８３０において、塩基判定は生物情報科学的ソフトウェアの使用により行う。この実施例において、Ａ及びＣの取込みは第１信号検出で検出される。Ｔ及びＣの取込みは第２信号検出で検出される。ＳＳクリーバーがステップ８２０でフローセルに流されるため、取り込まれたＡヌクレオチドからの信号は第２信号検出には存在しない。Ｇの取込みは、第１及び第２検出での信号不在に基づいて決定される。このステップも図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０７】
判定ステップ８３５においては、ＳＢＳの他のサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望まれる場合、方法８００はステップ８４０に進む。他のＳＢＳサイクルが望まれない場合、方法８００は終了する。
【０４０８】
ステップ８４０において、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施する。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドから結合した磁性ナノ粒子を除去して、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。方法８００はステップ８１０に復帰する。このステップも図９の概略図で図式的に示されている。
【０４０９】
他の実施例において、磁性粒子は、ヌクレオチドが相補鎖に付加されるとき、すでに１つ又はそれ以上のヌクレオチドに付着することができる。例えば、相補鎖に付加されるよう配列決定チャンバを経て流れるヌクレオチドは、Ａ-LN3-SS-磁性粒子、Ｃ-LN3-ビオチン、Ｔ-LN3-磁性粒子、及標識付けされないＧとすることができる。このような実施形態において、ヌクレオチドが相補鎖に付加された後に磁性粒子をヌクレオチドＡ及びＴに付着させることは必ずしも必要ではない。その代わり、取り込まれたＡ及びＴのヌクレオチドからの第１信号を検出することができる。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、取り込まれたＡ又はＴのヌクレオチドのための第１信号を検出する。
【０４１０】
これに引き続き、ジスルフィド（ＳＳ）クリーバーをフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流すことができる。ＳＳクリーバーは、取り込まれたＡ-LN3-SS-磁性粒子におけるジスルフィド結合を開裂させ、これによりこれら部位から発生し得る信号を排除する。Ｃ-LN3-ビオチンに付着する磁性粒子を含む溶液も配列決定チャンバ１１８に流すことができる。
【０４１１】
この後、Ｔヌクレオチド及びＣヌクレオチドの取込みに関する第２信号を検出することができる。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、取り込まれたＴヌクレオチド及び取り込まれたＣヌクレオチドに関する第２信号を検出する。
【０４１２】
第１及び第２の信号を検出した後、塩基判定を生物情報科学的ソフトウェアの使用により行うことができる。この実施例において、Ａ及びＴの取込みは第１信号検出で検出される。Ｔ及びＣの取込みは第２信号検出で検出される。ＳＳクリーバーがフローセルに流されるため、取り込まれたＡヌクレオチドからの信号は第２信号検出には存在しない。Ｇの取込みは、第１及び第２検出での信号不在に基づいて決定される。
【０４１３】
上述したように、それ以上のサイクルが不要である場合、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施することができる。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドから結合した磁性ナノ粒子を除去して、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。
【０４１４】
さらに他の実施形態において、「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームは、塩基識別のために修飾ヌクレオチド及び異なる磁気の大きさを使用する。１つの実施例において、異なる磁気の大きさは、ヌクレオチド取込み部位における１つ又はそれ以上の磁性ナノ粒子の捕獲によって得られる。例えば、ｄＡＴＰは、１個の磁性ナノ粒子を捕獲するよう修飾される。ｄＴＴＰは、２個の磁性ナノ粒子を捕獲するよう修飾される。ｄＣＴＰは、３個の磁性ナノ粒子を捕獲するよう修飾される。ｄＧＴＰは、４個の磁性ナノ粒子を捕獲するよう修飾される。したがって、検出される信号の大きさは、取り込まれた塩基の関数である。
【０４１５】
１つの実施例において、チオール（-SH）基を有する修飾ヌクレオチドを使用して、１個のみの反応基（例えば、マレイミド修飾ＳＭＭ）を有する単分子磁石（ＳＭＭ）を捕獲する。ヌクレオチドは、1個、２個、３個又は４個のチオール基を有することができ、またそれぞれ1個、２個、３個又は４個のマレイミド修飾ＳＭＭを捕獲することができる。アルデヒド（ＣＨＯ）−アミノオキシ（又はヒドラジン）は、修飾したヌクレオチド及びＳＭＭを用いる「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームに使用し得る他の化学構造（ケミストリー）ペアの例である。
【０４１６】
他の実施例において、４つまでの直交化学構造をヌクレオチド修飾に使用し、単一ヌクレオチドは、１〜４個の磁気応答性ビードから補充を行うことができる。「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームの例を図１０につき説明する。
【０４１７】
他の実施形態において、異なる常磁性体（物質）を有するナノ粒子を磁気バイオセンシングＳＢＳスキームに使用することができる。例えば、常磁性体は、各タイプのナノ粒子が印加される外部磁場の周波数に対して異なる応答を示すよう選択する。幾つかの常磁性粒子は、調整可能な共鳴周波数を有することができ、また最適でない周波数では、常磁性にならない、又は印加外部磁場にうまく追従しない。各タイプのナノ粒子は印加外部磁場に対して異なる応答をする理由から、各タイプのナノ粒子を塩基識別に使用することができる。異なる常磁性体を有するナノ粒子を、例えば、「１標識」、「２標識」、又は「４標識」の磁気バイオセンシングＳＢＳスキームに使用することができる。
【０４１８】
他の実施形態において、各標識用のナノ粒子の直径／体積は互いに異なるものとすることができる。例えば、１０ｎｍ直径対５０ｎｍ直径では、結果として約１００倍の体積差となり、また約２５倍の表面積差を生ずる（信号は体積及び表面積によって影響を受ける）。
【０４１９】
図１０は、例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び４に示すフローセル１００を用いて、「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基識別する方法１０００の実施例におけるフローチャートを示す。この実施例において、ｄＡＴＰは、１個の磁性ナノ粒子（又はＳＭＭ）を捕獲するよう修飾される。ｄＴＴＰは、２個の磁性ナノ粒子（又はＳＭＭ）を捕獲するよう修飾される。ｄＣＴＰは、３個の磁性ナノ粒子（又はＳＭＭ）を捕獲するよう修飾される。ｄＧＴＰは、４個の磁性ナノ粒子（又はＳＭＭ）を捕獲するよう修飾される。方法１０００は、限定しないが以下のステップを含む。
【０４２０】
ステップ１０１０において、ヌクレオチドはＳＢＳサイクルで成長する相補鎖内に取り込まれる。ヌクレオチドはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧとすることができる。
【０４２１】
ステップ１０１５において、信号は取り込まれたヌクレオチドのために検出される。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、信号は取り込まれたヌクレオチドに対して検出される。官能化された磁性粒子の溶液をフローセル１００の配列決定チャンバ１１８に流し、またＡ、Ｔ、Ｃ又はＧの取込みがあるすべての部位（クラスター）でヌクレオチド／ナノ粒子錯体を形成する。
【０４２２】
ステップ１０２０において、塩基判定は生物情報科学的ソフトウェアを使用して磁気の大きさに基づいて行う。この実施例において、Ａの取込みは第１大きさの信号で検出され、Ｔの取込みは第２の大きさの信号で検出され、Ｃの取込みは第３の大きさの信号で検出され、またＧの取込みは第４の大きさの信号で検出される。
【０４２３】
判定ステップ１０２５においては、ＳＢＳの他のサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望まれる場合、方法１０００はステップ１０３０に進む。他のＳＢＳサイクルが望まれない場合、方法１０００は終了する。
【０４２４】
ステップ１０３０において、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施する。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドから結合した磁性ナノ粒子を除去して、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。方法１０００はステップ１０１０に復帰する。
【０４２５】
図１０の代替的実施形態において、ＳＢＳ方法は単一ポット反応を用いて実施することができる。この実施例において、相補鎖は、表面に対して、又は表面に固定化され得るポリメラーゼに対して固定化することができる。単一ポット反応に対して、可逆的にブロック化され、磁性粒子が付着しているヌクレオチドに同時に脱ブロック化剤を供給する。相補鎖が表面に固定化される実施形態では、ポリメラーゼにヌクレオチド及び脱ブロック化剤を供給することができる。
【０４２６】
ステップ１０１０において、ヌクレオチドは成長する相補鎖内に取り込まれ得る。ステップ１０１５において、信号は取り込まれたヌクレオチドのために検出される。とくに、ヌクレオチドがポリメラーゼによって相補鎖に付加されるときに、磁気応答センサは、磁性粒子の存在により生ずる電気抵抗変化を検出することができる。磁性粒子は、一定の外部磁場をもたらすことができる、又は代案として、外部刺激を印加することによって誘導することができる。
【０４２７】
ステップ１０２０において、塩基判定は検出された電気抵抗変化に基づいて行うことができる。例えば、Ａの取込みは第１大きさの信号で検出され、Ｔの取込みは第２の大きさの信号で検出され、Ｃの取込みは第３の大きさの信号で検出、Ｇの取込みは第４の大きさの信号で検出される。
【０４２８】
ステップ１０３０において、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施する。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドから結合した磁性ナノ粒子を除去して、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。
【０４２９】
単一ポットの実施形態において、反応物質は、３′ブロック化剤又は脱ブロック化剤を含まない。各磁気応答センサの電気抵抗は、取込みイベントをリアルタイムで同定するようモニタリングすることができる。このような実施形態は、とくに、単分子プロトコールに適用可能であり得る。
【０４３０】
上述の実施形態は単一ポット反応を説明しているため、ステップ１０１０、１０１５、及び１０３０は、異なるテンプレート鎖用に異なる時点で行うことができる。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上のステップを制御することができる。例えば、ステップ１０３０は、システムが供給する外部刺激によって実施することができる。さらに、ステップ１０３０はリアルタイムで行うことができる。代案として、ステップ１０３０は、複数回の取込みイベント後、又はＳＢＳシークエンシングが完了した後に行うことができる。単分子プロトコールのような他の代替的実施形態において、ステップ１０３０は行わない。
【０４３１】
［1.3   単分子磁石ＳＢＳ］
他の実施形態において、単分子磁石（ＳＭＭ）で標識付けされたヌクレオチドを使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームにおける塩基識別を行う。ＳＭＭは、超常磁性挙動を示す金属有機化合物の分類であり、例えば、外部磁場の存在下においてのみ磁性を示す。幾つかのＳＭＭの磁気特性又は磁性状態は外部刺激を印加することにより変化し得る。１つの実施例において、ＳＭＭの磁性状態は光を用いて切り替えることができる。１つの光周波数を使用してＳＭＭオン（ＯＮ）状態に切り替え、また他の光周波数を使用してＳＭＭオフ（ＯＦＦ）状態に切り替えることができる。磁性状態は切り替えることができるため、信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は反復サンプリングにより向上させることができる。１つ又はそれ以上のＳＭＭは、ＳＭＭのサイズがヌクレオチドの化学的構造に適合するよう選択することができる。１つの実施例において、ＳＭＭは約１.２ｎｍのサイズとすることができる。
【０４３２】
それぞれに対応の磁気特性又は磁性状態が外部刺激を印加することによって変化するＳＭＭについては、以下の文献に記載されている：Feng et al., “Tristability in a Light-Actuated Single-Molecule Magnet,”  J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (42), pp 15880-15884; Mathoniere et al., “Photoinduced Single-Molecule Magnet Properties in a Four-Coordinate Iron(II) Spin Crossover Complex,” J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (51), pp 19083-19086; Christou et al. “Single-molecule magnets,” Mrs Bulletin 25.11 (2000): 66-71; “Single-molecule magnets and related phenomena,” Volume 122 of Structure and bonding Single-molecule magnets and related phenomena, editors Richard Winpenny and Guillem Aromi, Springer (2006); Sato, “Switchable molecular magnets,” Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2012 Jun 11; 88(6): 213-225; Sato (2003) “Optically switchable molecular solids: Photoinduced spin-crossover, photochromism, and photoinduced magnetization.” Acc. Chem. Res. 36, 692-700; Sato et al. (2007) “Control of magnetic properties through external stimuli.” Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2152-2187。これら文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０４３３】
１つの実施例において、ＳＭＭで標識付けしたヌクレオチドは、ほぼ図６のヌクレオチド５２０と同一構造を有する。この実施例で、ビオチン標識６１０を１つ又はそれ以上のＳＭＭに置換する。
【０４３４】
１つの実施例において、ＳＭＭを「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームに使用する。この実施例において、各ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）を、ＯＮ／ＯＦＦ光周波数の異なるセットに感受性があるＳＭＭで標識付けする。例えば、Ａは第１セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第１ＳＭＭで標識付けし、Ｇは第２セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第２ＳＭＭで標識付けし、Ｃは第３セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第３ＳＭＭで標識付けし、またＴは第４セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第４ＳＭＭで標識付けする。
【０４３５】
図１１は、ＳＭＭ標識付けヌクレオチドを用いて、「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基識別する方法１１００の実施例におけるフローチャートを示す。この実施例において、Ａは第１セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第１ＳＭＭで標識付けし、Ｇは第２セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第２ＳＭＭで標識付けし、Ｃは第３セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第３ＳＭＭで標識付けし、またＴは第４セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数に感受性がある第４ＳＭＭで標識付けする。
【０４３６】
ステップ１１１０において、ＳＭＭ標識付けヌクレオチドはＳＢＳサイクルで成長する相補鎖内に取り込まれる。ヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、又はＴとすることができる。
【０４３７】
ステップ１１１５において、第１セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数を用いて第１ヌクレオチド、例えばＡの取込みを検出する。例えば、「ＯＮ」周波数は、取り込まれたＡヌクレオチドのＳＭＭ標識をオン（ＯＮ）状態に切り替えるのに使用し、信号を検出する。「ＯＦＦ」光周波数は、ＳＭＭ標識をオフ（ＯＦＦ）状態に切り替え、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。
【０４３８】
ステップ１１２０において、第２セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数を用いて第２ヌクレオチド、例えばＧの取込みを検出する。例えば、「ＯＮ」周波数は、取り込まれたＧヌクレオチドのＳＭＭ標識をオン（ＯＮ）状態に切り替えるのに使用され、信号を検出する。「ＯＦＦ」光周波数は、ＳＭＭ標識をオフ（ＯＦＦ）状態に切り替えるのに使用され、信号をバックグラウンドレベルに復帰させる。
【０４３９】
ステップ１１２５において、第３セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数を用いて第３ヌクレオチド、例えばＣの取込みを検出する。例えば、「ＯＮ」周波数は、取り込まれたＣヌクレオチドのＳＭＭ標識をオン（ＯＮ）状態に切り替えるのに使用され、信号を検出する。「ＯＦＦ」光周波数は、ＳＭＭ標識をオフ（ＯＦＦ）状態に切り替えるのに使用され、信号をバックグラウンドレベルに復帰させる。
【０４４０】
ステップ１１３０において、第４セットのＯＮ／ＯＦＦ光周波数を用いて第４ヌクレオチド、例えばＴの取込みを検出する。例えば、「ＯＮ」周波数は、取り込まれたＴヌクレオチドのＳＭＭ標識をオン（ＯＮ）状態に切り替えるのに使用され、信号を検出する。「ＯＦＦ」光周波数は、ＳＭＭ標識をオフ（ＯＦＦ）状態に切り替えるのに使用され、信号をバックグラウンドレベルに復帰させる。
【０４４１】
判定ステップ１１３５においては、ＳＢＳの他のサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望まれる場合、方法１１００はステップ１１４０に進む。他のＳＢＳサイクルが望まれない場合、方法１１００は終了する。
【０４４２】
ステップ１１４０において、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施する。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドからＳＭＭ標識を除去するのに使用する。方法１１００はステップ１１１０に復帰する。
【０４４３】
他の実施例において、ＳＭＭ標識付けヌクレオチドは、塩基識別するため異なる磁気の大きさを用いる「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームに使用することができる。１つの実施例において、ｄＡＴＰは１個のＳＭＭで標識付けされ、ｄＧＴＰは２個のＳＭＭで標識付けされ、ｄＣＴＰは３個のＳＭＭで標識付けされ、またｄＴＴＰは４個のＳＭＭで標識付けされる。検出される信号の大きさは、取り込まれた塩基の関数である。
【０４４４】
図１２は、塩基識別用に異なる磁気の大きさを有するＳＭＭ標識付けヌクレオチドを用いて「４標識」磁気バイオセンシングＳＢＳスキームで塩基識別する方法１２００の実施例におけるフローチャートを示す。この実施例において、単一タイプのＳＭＭを使用するが、各ヌクレオチドは異なる数のＳＭＭで標識付けされる。例えば、ｄＡＴＰは１個のＳＭＭで標識付けされ、ｄＧＴＰは２個のＳＭＭで標識付けされ、ｄＣＴＰは３個のＳＭＭで標識付けされ、またｄＴＴＰは４個のＳＭＭで標識付けされる。方法１２００は、例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び４に示すフローセル１００を使用する。方法１２００は、限定しないが以下のステップを含む
【０４４５】
ステップ１２１０において、ＳＭＭ標識付けヌクレオチドは、ＳＢＳサイクルで成長する相補鎖内に取り込まれる。ヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、又はＴとすることができる。
【０４４６】
ステップ１２１５において、例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、信号は取り込まれたヌクレオチドに対して検出される。第１光周波数は、ＳＭＭ標識をＯＮ状態に切り替えるのに使用し、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴの取込みがあるすべての部位（クラスター）で信号を検出する。第２光周波数は、ＳＭＭ標識をＯＦＦ状態に切り替え、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。
【０４４７】
ステップ１２２０において、塩基判定は、生物情報科学的ソフトウェアを使用して磁気の大きさに基づいて行う。この実施例において、Ａの取込みは第１大きさの信号で検出され、Ｇの取込みは第２の大きさの信号で検出され、Ｃの取込みは第３の大きさの信号で検出され、またＴの取込みは第４の大きさの信号で検出される。
【０４４８】
判定ステップ１２２５においては、ＳＢＳの他のサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望まれる場合、方法１２００はステップ１２３０に進む。他のＳＢＳサイクルが望まれない場合、方法１２００は終了する。
【０４４９】
ステップ１２３０において、脱ブロック化反応及び開裂反応を実施する。脱ブロック化反応は、次のＳＢＳサイクルにおける次のヌクレオチド付加のために取り込まれたヌクレオチドにおける保護基を除去するのに使用される。開裂反応は、取り込まれたヌクレオチドからＳＭＭ標識を除去して、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。方法１２００はステップ１２１０に復帰する。
【０４５０】
［1.4   磁気バイオセンシングＳＢＳにおける官能化したＤＮＡポリメラーゼ］
さらに他の実施形態において、標識付けしないヌクレオチド及び官能化したＤＮＡポリメラーゼを使用して、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームにおける塩基識別を行う。１つの実施例において、ＤＮＡポリメラーゼは単分子磁石でタグ付けし、またヌクレオチドはＳＢＳ中に異なる取込率を有するよう改変操作する。例えば、Ａは第１取込率を有するよう修飾され、Ｇは第２取込率を有するよう修飾され、Ｃは第３取込率を有するよう修飾され、またＴは第４取込率を有するよう修飾される。取込率はヌクレオチド毎に異なることから、ＤＮＡポリメラーゼが取込み部位（クラスター）に関連する時間は、取り込まれた塩基の関数である。ヌクレオチド取込率の例を以下の表１に示す。
【０４５１】
【表１】
0006612421.tif 000002
【０４５２】
１つの実施例において、改変操作したヌクレオチドにおける３′ヒドロキシル（ＯＨ）基は保護基により保護されない。他の実施例において、改変操作したヌクレオチドの３′ヒドロキシル（ＯＨ）基は保護基により保護される。
【０４５３】
図１３につき説明するような１つ又はそれ以上の実施形態において、ＳＢＳプロトコールは磁性粒子をポリメラーゼに付着させるステップを有することができる。磁性粒子は、例えば、磁性ナノ粒子又はＳＭＭとすることができる。より具体的には、１つ又はそれ以上の実施形態において、ＳＢＳ方法は、磁気応答センサのアレイを有する検出装置を準備するステップを備えることができる。検出装置は本明細書に記載したのと同様のものとすることができる。各磁気応答センサは、それぞれに対応の指定空間に近接して配置し、その指定空間から外部磁場を検出するようにする。検出装置は、さらに、対応の指定空間内に配置した複数の核酸テンプレート鎖を有することができる。テンプレート鎖は表面に固定化することができる。代案として、テンプレート鎖は、ウェル又はゲルマトリクスのような指定容積部内に閉じ込めることができる。
【０４５４】
本発明方法は、さらに、ポリメラーゼを用いて各テンプレート鎖にヌクレオチドを付加することによって相補鎖を成長させる複数のＳＢＳサイクルを遂行するステップを備えることができる。ポリメラーゼは、ポリメラーゼに付着するそれぞれ対応する磁性粒子を有することができ、これら磁性粒子がそれぞれに対応の磁場を生ずる。ポリメラーゼがヌクレオチドをテンプレート鎖に付加するとき、ポリメラーゼは指定空間内に位置付けすることができる。このようにして、センサは、ポリメラーゼに付着した磁性粒子からの磁場を検出することができる。
【０４５５】
各ＳＢＳサイクルは、磁気応答センサにおける電気抵抗変化を検出するステップを含むことができる。より具体的には、検出される変化は、ポリメラーゼがヌクレオチドを付加するとき指定空間に磁性粒子が存在することによって生ずることができる。本発明方法は、さらに、本明細書に記載の相補鎖の配列（シーケンス）を決定するステップを含むことができる。
【０４５６】
図１３は、ＳＭＭタグ付けＤＮＡポリメラーゼ及び異なる取込率を有するヌクレオチドを用いて、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームにおける塩基識別する方法１３００の実施例のフローチャートを示す。この実施例において、ヌクレオチドは脱ブロック化され、表１に示す取込率を有する。
【０４５７】
ステップ１３１０において、ヌクレオチドは、ＳＢＳサイクルにおいて成長する相補鎖に取り込まれる。ヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、又はＴとすることができる。１つの実施例において、同一の取込み時間を有する４つのヌクレオチドは個別に流す。このとき、ポリメラーゼ取込み（おそらく約３０ｍｓ〜約１００ｍｓの時間）に関してモニタリングする。他の実施例において、極めて異なる取込み時間を有する４つのヌクレオチドをすべて同時に流す。
【０４５８】
ステップ１３１５においては、ポリメラーゼＳＭＭタグからの信号を検出する。例えば、フローセル１００の磁気センサ１３０を用いて、ＳＭＭタグ付けＤＮＡポリメラーゼからの信号を各ヌクレオチド取込み部位で検出する。第１光周波数は、ポリメラーゼのＳＭＭタグをＯＮ状態に切り替えるのに使用し、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴの取込みがあるすべての部位（クラスター）で信号を検出する。第２光周波数は、ポリメラーゼのＳＭＭタグをＯＦＦ状態に切り替え、信号をバックグラウンドレベルに復帰させるのに使用する。
【０４５９】
ステップ１３２０において、塩基判定は、生物情報科学的ソフトウェアを使用して磁気の大きさに基づいて行う。この実施例において、Ａの取込みは第１持続時間（例えば、約１０ｍｓ）の信号で検出され、Ｇの取込みは第２持続時間（例えば、約１００ｍｓ）の信号で検出され、Ｃの取込みは第３持続時間（例えば、約５００ｍｓ）の信号で検出され、またＴの取込みは第４持続時間（例えば、１０００ｍｓ）の信号で検出される。
【０４６０】
判定ステップ１３２５においては、ＳＢＳの他のサイクルが望ましいか否かを決定する。他のＳＢＳサイクルが望まれる場合、方法はステップ１３１０に進む。他のＳＢＳサイクルが望まれない場合、方法１３００は終了する。
【０４６１】
しかし、本願発明の実施形態は、図１Ａ〜１３に示す実施形態には限定されるものではない。磁気センサ（例えば、ＧＭＲベース及び／又はＴＭＲベースのセンサ）は、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援する他の構造、メカニズム、及び／又はシステムとの組合せで使用することができ、それらの例を図１４Ａ〜１８につき以下に詳細に説明する。
【０４６２】
図１４Ａ及び１４Ｂは、それぞれフローセル又は液滴アクチュエータ１４００における半疎水性領域の例との組合せにおける磁気センサアレイ１１０の平面図及び断面図を示す。フローセル又は液滴アクチュエータ１４００は、図１Ａ、１Ｂ及び４のフローセル１００につき説明したような、頂部基板１１４に対するＰＣＢ１１２の頂部における磁気センサアレイ１１０と、導電層１５０とを有する。
【０４６３】
フローセル又は液滴アクチュエータ１４００は、さらに、半疎水性領域１４１０を有する。この実施例において、半疎水性領域１４１０は、基板１４１８を有する。基板１４１８は、例えば、ガラス基板又はＣＭＯＳ基板とすることができる。１つの実施例において、基板１４１８は二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）基板とする。半疎水性領域１４１０は、さらに、基板１４１８にパターン化した複数のナノウェル１４１２を有する。ナノウェル１４１２の内面を親水性層１４１４で被覆し、これにより親水性ナノウェル１４１２を形成する。ナノウェル１４１２の外側である基板１４１８の表面を疎水性層１４１６で被覆する。さらに、オリゴヌクレオチド・プライマー１４２を各ナノウェル１４１２内に設ける。
【０４６４】
ナノウェル１４１２の内面における親水性層１４１４は、液滴アクチュエータにおける導電性表面ベースの化学的構造に適合する任意な親水性材料とすることができる。１つの実施例において、親水性層１４１４は、ポリアクリルアミドゲル被覆、例えば、ノルボルネン（又はノルボルニレン又はノルカンフェン）及びPAZAMとしても知られているポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド)の混合物のコーティングとする。他の実施例において、親水性層１４１４は、PAZAM-PANとしても知られているポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリロニトリル)を含むことができる。幾つかの実施形態において、PAZAM及び／又はPAZAM-PANは、熱応答性を有するよう修飾することができ、これにより熱応答性ポリアクリルアミドゲルを形成する。PAZAMのより詳細については、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献で見ることができる（George et al., U.S. Patent App. No. 13/784,368, entitled “Polymer Coatings,” filed on March 4, 2013）。
【０４６５】
疎水性層１４１６はナノウェル１４１２間の空間を埋める。疎水性層１４１６は、液滴アクチュエータにおける導電性表面ベースの化学的構造に適合する任意な疎水性材料とすることができる。１つの実施例においては、疎水性層１４１６は、正式には（トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル）トリクロロシランとして知られているフルオロ-オクチル-トリクロロ-シラン（ＦＯＴＳ）とする。他の実施例において、疎水性層１４１６は、旭硝子社（日本国東京）、別名ＡＧＣから入手可能なALX2010光誘電体のようなフッ素化フォトレジスト（すなわち、疎水性フッ素重合体）とする。
【０４６６】
フローセル又は液滴アクチュエータ１４００において、ナノウェル１４１２は磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１３０の行列にほぼ対応する位置をとる行列にして配列する。各ナノウェル１４１２は所定の深さ及び直径を有する。一実施例において、ナノウェル１４１２は、約３５０ｎｍの深さ及び約４００ｎｍの直径を有する。他の実施例において、ナノウェル１４１２は、約３５０ｎｍの深さ及び約５００ｎｍの直径を有する。
【０４６７】
図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれフローセル又は液滴アクチュエータ１４００における半疎水性領域１４１０の他例との組合せにおける磁気センサアレイ１１０の平面図及び断面図を示す。この実施例において、親水性層１４１４及び疎水性層１４１６の極性を逆転する。すなわち、親水性層１４１４が疎水性層１４１６の平面に対してウェル内に存在するのではなく、親水性１４１４は疎水性層１４１６の平面に対して台座部上に存在する。例えば、図１４Ａ及び１４Ｂに示した半疎水性領域１４１０におけるナノウェル１４１２は台座部１４２０と置き換わっている。台座１４２０上に親水性層１４１４及びオリゴヌクレオチド・プライマー１４２があり、したがって、親水性台座部１４２０を形成する。
【０４６８】
フローセル又は液滴アクチュエータ１４００において、親水性台座部１４２０は磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１３０の行列にほぼ対応する位置をとる行列にして配列する。
【０４６９】
図１６Ａ及び１６Ｂは、例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援するための磁気センサアレイ１１０を有する液滴アクチュエータ１６００の一部における平面図及び断面図を示す。液滴アクチュエータ１６００は、液滴操作ギャップ１６１４によって隔てられた底部基板１６１０及び頂部基板１６１２を有する。液滴操作ギャップ１６１４は填隙剤流体１６１６を収容する。この填隙剤流体は、例えば、シリコーンオイル若しくはヘキサデカンによる填隙剤液体のような低粘性オイルとする。底部基板１６１０は電極構成１６０５を有し、この電極構成１６０５は、例えば、種々のリザーバ電極１６２０に供給を行う液滴操作電極１６１８（例えば、電気浸潤電極）のラインを有する。液滴操作は、液滴操作表面における液滴操作電極１６１８上で行われる。
【０４７０】
液滴操作電極１６１８とほぼ同一サイズの磁気センサアレイ１１０を、図示のように、液滴操作電極１６１８による１つ又はそれ以上のラインにして設けることができる。この実施例において、頂部基板１６１２の液滴操作電極１６１８に近い部分は接地基準面又は接地基準電極（図示せず）を有するとともに、頂部基板１６１２の磁気センサアレイ１１０に近い部分はＶｄｄ基準面又はＶｄｄ電極（図示せず）を有することができる。液滴１６３０（例えば、サンプル又は試薬の液滴）は、液滴操作電極１６１８に沿って液滴操作を介して磁気センサアレイ１１０に輸送することができ、この磁気センサアレイ１１０において、図５〜１３につき説明したように所定の磁気バイオセンシング操作を生ずることができる。
【０４７１】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の磁気応答センサは、生物学的又は化学的サンプルが配置されるサンプル基板に対して移動可能とすることができる。例えば、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）システムは、アーム及びこのアームに取り付けた磁気応答センサを有する読取りヘッドを備えることができる。磁気応答センサは、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ又はトンネル磁気抵抗（ＴＭＲ）センサのうち少なくとも一方を有することができる。
【０４７２】
このシステムは、さらに、基板表面を有するサンプル基板を備えることができる。この基板表面は、指定空間内で基板表面に沿って配置された複数の核酸テンプレート鎖を有するよう構成される。読取りヘッド及びサンプル基板のうち少なくとも一方が他方に対して相対移動し、磁気応答センサを指定空間の近傍に動作可能関係となるよう位置決めする構成とされる。より具体的には、磁性粒子が発生する外部磁場を検出できるよう磁気応答センサを位置決めする。このシステムは、さらに、磁気応答センサに通信可能に接続した読出回路を備える。読出回路は、１つの指定空間に位置決めされるとき、磁気応答センサの電気抵抗に対応する信号を伝送するよう構成されている。この読出回路は読出回路１０６（図１参照）と同様のものとすることができる。
【０４７３】
図１７は、このようなシステムの平面図を示す。より具体的には、図１７は、例えば、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援するために、１つの可動磁気センサを設ける回転ディスクベースの機器１７００を示す。回転ディスクベースの機器１７００は、例えば、プラスチックコンパクトディスク（ＣＤ）基板をすることができるディスク基板（サンプル基板）１７１０を有する。同心状トラック（又は溝）１７１２のセットをディスク基板１７１０に設ける。回転ディスクベースの機器１７００は、さらに、可動アーム１７１６における磁気読取りヘッド１７１４を備える。すなわち、可動アーム１７１６の一方の端部に回動ポイントが存在し、また磁気読取りヘッド１７１４が可動アーム１７１６の反対側の端部に存在する。磁気読取りヘッド１７１４は、ＧＭＲベース及び／又はＴＭＲベースのセンサのような１つの磁気センサ、例えば、図１Ａ〜４につき説明した１つの磁気センサ１３０を有する。しかし、磁気読取りヘッドは１つより多い数の磁気応答センサを有することができる。
【０４７４】
回転ディスクベースの機器１７００において、ディスク基板１７１０は、標準のＣＤ技術を用いて回転可能とする。同心状トラックは、例えば、複数のオリゴヌクレオチド・プライマー１４２（図示せず）を入植させることができる。オリゴヌクレオチド・プライマー１４２は捕獲プライマーであり、一本鎖ＤＮＡ断片が交雑し、またＳＢＳのためのクローンＤＮＡテンプレート集団（クラスター）を形成するよう増幅することができる。
【０４７５】
１つの実施例において、約１００集団／トラックの同心状トラックが約１０個存在し、約１０００集団／ディスクである。ディスク基板１７１０をスピンさせることにより、試薬は遠心力により同心状トラック上に分注しまた分配することができる。次に、磁気読取りヘッド１７１４の１つの磁気センサを用いて、例えば約１０ＲＰＭで磁気バイオセンシング操作を行うことができる。磁気読取りヘッド１７１４と、ＳＢＳヌクレオチド取込み反応中に取り込まれた又は捕獲された磁性粒子との間の距離は、良好な検出に適合する短い距離でなければならない。回転ディスクベースの機器１７００の態様は、マイクロ流体ポンプ送給のオーバーヘッド、高速流体工学を節約する安価な基板（例えば、ＣＤ基板）を有するものとし、またセンサは、ＳＢＳを実施するのに適合するよう機能化されるため再使用することができる。
【０４７６】
機器１７００は回転ディスクを利用するが、他のタイプの運動を使用することも考えられる。例えば、サンプル基板はスライドを有することができる。スライド及び／又は読取りヘッドを可動にし、磁気応答センサを指定空間に対して位置決めできるようにする。例えば、スライド及び／又は読取りヘッドはモータに動作可能に連結することができる。
【０４７７】
ＳＢＳ用途の従来型光学的検出システムと比べると、磁気バイオセンシングＳＢＳスキームを支援する磁気センサアレイを用いる本明細書に記載のＳＢＳデバイス及び方法は、限定しないが、以下の若干の利点を提供する。すなわち、
(1) 小型サイズ--磁気センサアレイは光学機械的デバイスよりも相当小さい領域しか占有しない。例えば、１ギガビット磁気センサアレイのデバイスは約１３ｃｍ×３ｃｍ×０.１ｃｍの領域を占有するが、光学機械的デバイスは５.０８ｃｍ×５.０８ｃｍ×５.０８ｃｍの領域を占有する、
(2) 簡素かつ低コスト--磁気バイオセンシングシステムはコントローラのみを必要とするが、光検出システムは並進ステージ、光学的コンポーネント、及びコントローラを必要とする、
(3) 耐久性--磁気バイオセンシングシステムは精巧な可動部分を持たないが、光検出システムは精巧な可動部分を有する、及び
(4) 速度--磁気バイオセンシングスキームは直接ＣＭＯＳ撮像よりも約６.５倍速く、またＸＴｅｎ光機械系よりも１００倍速い
という利点をもたらす。例えば、磁気バイオセンシングは、３.２ギガバイト／秒のデータ量；Ｉ／Ｏあたり１.６×１０９転送／秒、すなわち、１.６×１０９クラスター／秒を支援することができる。
【０４７８】
図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれフローセル又は液滴アクチュエータ１８００における磁気センサアレイの平面図及び断面図を示す。フローセル又は液滴アクチュエータ１８００は、図１Ａ、１Ｂ及び４のフローセル１００につき説明したような、頂部基板１１４に対するＰＣＢ１１２の頂部における磁気センサアレイ１１０と、導電層１５０とを有する。
【０４７９】
フローセル又は液滴アクチュエータ１８００は、さらに、半疎水性領域１８１０を有する。この実施例において、半疎水性領域１８１０は、基板１８１８を有する。基板１８１８は、例えば、ガラス基板又はＣＭＯＳ基板とすることができる。１つの実施例において、基板１８１８は二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）基板とする。半疎水性領域１８１０は、さらに、基板１８１８にパターン化した複数のウェル１８１２（例えば、ナノウェル）を有する。ナノウェル１８１２の内面を親水性層１８１４で被覆し、これにより親水性ナノウェル１８１２を形成する。ナノウェル１８１２の外側である基板１８１８の表面を疎水性層１８１６で被覆する。さらに、オリゴヌクレオチド・プライマー１４２を各ナノウェル１８１２内に設ける。
【０４８０】
ナノウェル１８１２の内面における親水性層１８１４は、液滴アクチュエータにおける導電性表面ベースの化学的構造に適合する任意な親水性材料とすることができる。１つの実施例において、親水性層１８１４は、ポリアクリルアミドゲル被覆、例えば、ノルボルネン（又はノルボルニレン又はノルカンフェン）及びPAZAMとしても知られているポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド)の混合物のコーティングとする。他の実施例において、親水性層１８１４は、PAZAM-PANとしても知られているポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリロニトリル)を含むことができる。幾つかの実施形態において、PAZAM及び／又はPAZAM-PANは、熱応答性を有するよう修飾することができ、これにより熱応答性ポリアクリルアミドゲルを形成する。PAZAMのより詳細については、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の文献で見ることができる（George et al., U.S. Patent App. No. 13/784,368, entitled “Polymer Coatings,” filed on March 4, 2013）。
【０４８１】
疎水性層１８１６はナノウェル１８１２間の空間を埋める。疎水性層１８１６は、液滴アクチュエータにおける導電性表面ベースの化学的構造に適合する任意な疎水性材料とすることができる。１つの実施例においては、疎水性層１８１６は、正式には（トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル）トリクロロシランとして知られているフルオロ-オクチル-トリクロロ-シラン（ＦＯＴＳ）とする。他の実施例において、疎水性層１８１６は、旭硝子社（日本国東京）、別名ＡＧＣから入手可能なALX2010光誘電体のようなフッ素化フォトレジスト（すなわち、疎水性フッ素重合体）とする。
【０４８２】
フローセル又は液滴アクチュエータ１８００において、ナノウェル１８１２は磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１３０の行列にほぼ対応する位置をとる行列にして配列する。図１８Ｂに示すように、各ナノウェルは、ナノウェル１８１２内の指定エリア１８２２に固定化される単一ポリメラーゼ１８２０を有することができる。ポリメラーゼ１８２０は、本明細書で記載したようなリンカーを用いて指定エリア１８２２に固定化することができる。各ポリメラーゼ１８２０は、テンプレート鎖を捕獲し、このテンプレート鎖には付着したプライマーを有するよう構成される。図１８Ｂにおいては、ＳＢＳプロトコールが部分的に完了している。
【０４８３】
ポリメラーゼ１８２０が表面に固定化された状態で、実施形態は、ヌクレオチドが磁性粒子で標識付けされる上述した様々なプロトコールを遂行することができる。例えば、図７〜１２につき説明したプロセスは、表面に固定化されたポリメラーゼで実施することができる。本明細書で記載したように、磁気応答センサ１３０は、ヌクレオチドに付着した磁性粒子が相補鎖に付加されるとき、電気抵抗変化を受けることができる。各サイクルに対して、実施形態は、１度に１つのヌクレオチドを送給することができ、この場合、４つの個別サブサイクルを実施しなければならない。代案として、実施形態は、同時に２つ又はそれ以上のヌクレオチドを同時に送給することができる。他の実施形態において、ＳＢＳプロトコールは、単一ポット反応で実施することができる。
【０４８４】
上述したのはポリメラーゼがウェル内の表面に固定化される例につき説明したが、ポリメラーゼが平面状表面に沿って選択的に位置付けられることも考えられる。
【０４８５】
次に図１９につき説明すると、ＴＭＲデバイス１９０５をＳＢＳプロトコールにおける異なる３つの段階１９５１、１９５２、及び１９５３で示す。ＴＭＲデバイス１９０５は、フローセル又は液滴アクチュエータが組み込むセンサアレイの一部となり得る磁気応答センサを構成することができる。ＴＭＲデバイス１９０５は、第１強磁性層１９１０、非磁性層１９１２、及び第２強磁性層１９１４を有する。非磁性層１９１２は、Ａｌ２Ｏ３のような薄い絶縁層を含む。上述したように、フィルムに対して直交する方向の複数層の電気抵抗は、２つの強磁性層１９１０、１９１４間におけるスピン依存電子トンネル通過に起因する強磁性層１９１０、１９１４の磁化方向に基づいて変化する。図示のように、ＴＭＲデバイス１９０５は、Ｒｕの分離層１９１６、磁束補償層１９１８、及び反強磁性層１９２０を有する。ＴＭＲデバイス１９０５は、書込みライン（導電性配線）１９２２と読出しライン１９２４との間で電気的に接続及び位置決めする。
【０４８６】
上述したように、２つの強磁性層１９１０、１９１４の磁化方向は互いに逆向きになるとき（第３段階１９５３参照）、強磁性層の磁化方向に対して逆向きのスピンを有する電子はトンネル通過することができない。したがって、トンネル効果電子電流は同一磁化方向である場合と比べるとより少なくなる（すなわち、抵抗がより高くなる）。２つの強磁性層１９１０、１９１４の磁化方向が同一である場合（第１及び第２の段階１９５１、１９５２参照）、絶縁層を通過する２つの強磁性層間の電子トンネル作用の可能性はより大きくなり、この結果、より大きなトンネル電流（すなわち、より低い抵抗）となる。
【０４８７】
実施形態は、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の方法を実施することができる。例えば、第１段階１９５１の前にテンプレート鎖１９２８を基板表面１９２６の指定エリアに固定化し、またプライマーをテンプレート鎖に付着させることができる。第１段階１９５１の最中にヌクレオチド１９３０を相補鎖に取り込むことができ、またこれに続いて取り込まれたヌクレオチド１９３０に付着する磁性粒子１９３２を供給することができる。代案として、ヌクレオチド１９３０を相補鎖に付加するとき、ヌクレオチド１９３０が、該ヌクレオチドに付着した磁性粒子１９３２を有することができる。
【０４８８】
磁性粒子１９３２は、第１強磁性層１９１０の状態を切り替えることができる磁気特性を有することができ、これにより第２段階１９５２に示すように磁性粒子１９３２を除去した後には第１強磁性層１９１０がその磁化状態を維持できる。より具体的には、磁化状態が書込みライン１９２２によって変化させられるまでは、過渡的ではなく不変である。この動作は、不揮発性メモリの動作に類似のものであり得る。このような実施形態において、ＴＭＲデバイス１９０５は、読出しライン１９２４経由で指定時及び指定期間にわたり読み出すことができる。このような実施形態において、ＴＭＲデバイス１９０５は、磁性状態を維持する保存層をもたないＴＭＲデバイスよりも高い信号対ノイズ比を得ることができる。ＴＭＲデバイス１９０５を読み出すとき、書込みライン１９２２に電流を流して、第１強磁性層１９１０の磁化状態を変化させることができる。この後に、ＳＢＳプロトコールは他のＳＢＳサイクルを繰り返すことができる。
【０４８９】
実施形態の上述した詳細な説明は、本明細書の特定実施形態を示す添付図面についてのものである。異なる構成及び動作を有する他の実施形態も本発明の範囲から逸脱するものではない。様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更することができる。さらに、上述の説明は、単に説明目的であって、限定目的ではない。
【０４９０】
特許請求の範囲の請求項は本願発明の若干の実施形態を復唱する。特許請求の範囲の用語は本明細書の詳細な説明にも組み入れられている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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