(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する方法であって、
アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する工程、
得られた混合物を加熱する工程、
前記混合物の光学的変化を検出する工程、および
前記光学的変化の検出結果に基づき、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したか否かを判定する工程、
を含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質とを含むともに、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸残基を含み、かつ前記第１標識物質と前記第２標識物質との間の位置に前記アミノ酸残基を含んでいる、
温度判定方法。
【請求項２】
前記試料が、全血、血清または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度判定用ペプチドが、配列番号：１６〜３２のいずれかに示されたアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記光学的変化が、前記温度判定用ペプチドに起因する光学的シグナルの波長の変化である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記光学的シグナルの波長の変化が、蛍光の発生である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１標識物質が、蛍光物質であり、前記第２標識物質が、前記蛍光物質から生じる蛍光を消光するクエンチャーである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第１標識物質が、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸または７−メトキシクマリン−４−酢酸であり、前記第２標識物質が４−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］安息香酸または２，４−ジニトロフェノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記判定工程において、前記検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値以上である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定し、
前記判定工程において、前記検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値未満である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇していないと判定する、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記所定温度が１２０〜２５０℃である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標的ペプチドとアルブミンとを含む試料と、温度判定用ペプチドとを混合する工程、
得られた混合物を加熱する工程、
前記混合物の加熱前後の光学的変化を検出する工程、および
前記光学的変化の検出結果に基づき、前記混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程を含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第１標識物質および第２標識物質を含むともに、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸残基を含み、かつ前記第１標識物質と前記第２標識物質との間の位置に前記アミノ酸残基を含んでいる、
前記判定工程において、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定された場合、前記混合物の上清を回収する工程および上清中の標的ペプチドを検出する工程を実行する、
標的ペプチドの検出方法。
【請求項１１】
前記判定工程において、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定されなかった場合、前記回収工程および前記標的ペプチド検出工程を実行しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光学的変化が、前記温度判定用ペプチドに起因する光学的シグナルの波長の変化である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光学的シグナルの波長の変化が、蛍光の発生である、請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記光学的変化検出工程において、前記混合物の上清の蛍光が検出され、
前記上清の蛍光が、前記温度判定用ペプチドに含まれる標識物質に基づく蛍光であり、
前記判定工程において、前記上清の蛍光の強度が所定の閾値以上である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定し、
前記判定工程において、前記上清の蛍光の強度が所定の閾値未満である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇していないと判定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合工程において、前記試料と前記温度判定用ペプチドとに加え、蛍光物質を含む相分配判定用ペプチドをさらに混合し、
前記相分配判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ未満であり、
前記判定工程において、前記混合物中に前記相分配判定用ペプチドの蛍光物質に基づく蛍光を生じる析出物が検出され、前記析出物から生じる蛍光の強度が所定の閾値以上である場合は、前記アルブミンが自己会合体を形成し、前記標的ペプチドが前記上清に存在すると判定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
溶液が所定温度まで上昇したか否かを判定するための試薬であって、
前記試薬は、温度判定用ペプチドを含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質とを含む、
温度判定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度判定方法、標的ペプチドの検出方法および温度判定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルブミンを含む試料に含まれる疾患マーカーなどの標的ペプチドは、アルブミンと複合体を形成していることがある。そこで、アルブミンからペプチドを遊離させる方法として、例えば、特許文献１に記載の方法などが提案されている。
【０００３】
特許文献１に記載の方法では、ペプチドとアルブミンとの複合体を含む試料を所定温度で加熱してアルブミンを自己会合させることによって、アルブミンからペプチドを遊離させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２７７４０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、加熱処理中の試料の温度が所定温度に達しているかどうかを、簡便に判定することができる、温度判定方法および温度判定試薬ならびにこれらを用いた標的ペプチドの検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１つの側面は、試料の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する方法であって、アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する工程、得られた混合物を加熱する工程、混合物の加熱前後の光学的変化を検出する工程、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程、を含む。温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ以上であり、温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質とを含む、温度判定方法を含む。
【０００７】
また、本発明の他の側面は、標的ペプチドとアルブミンとを含む試料と、温度判定用ペプチドとを混合する工程、混合物を加熱する工程、混合物の加熱前後の光学的変化を検出する工程、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程を含み、温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合のＫｄが、５００μＭ以上であり、温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質を含み、判定工程において、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定された場合、混合物の上清を回収する工程および上清中の標的ペプチドを検出する工程を実行する、標的ペプチドの検出方法を含む。
【０００８】
さらに、本発明の別の側面は、溶液が所定温度まで上昇したか否かを判定するための試薬であって、試薬は、温度判定用ペプチドを含み、温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合のＫｄが、５００μＭ以上であり、温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質とを含む、温度判定試薬を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、加熱処理中の試料の温度が所定温度に達しているかどうかを、簡便に判定することができる、温度判定方法および温度判定試薬ならびにこれらを用いた標的ペプチドの検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】参考例１において、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を示すグラフである。
【図２】参考例１において、ヒトγグロブリン含有試料について、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を示すグラフである。
【図３】参考例１において、ヒト血清アルブミンを含む試料について、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を示すグラフである。
【図４】参考例１において、血清、ヒトγグロブリンおよびヒト血清アルブミンについて、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を示すグラフである。
【図５】実施例１において、ペプチド濃度と蛍光強度の差との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図６】実施例２において、ＨＳＡに対する各ペプチドのＫｄを調べた結果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は実施例２において、未処理および水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの図面代用写真、（Ｂ）は未処理および水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの図面代用写真である。
【図８】実施例２において、図６に示される各ペプチドについて、リンカーペプチドに適したペプチドおよびリンカーペプチドに不適なペプチドに分類した結果を示すグラフである。
【図９】実施例３において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの図面代用写真である。
【図１０】（Ａ）は比較例１において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの銀染色像の図面代用写真、（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像の図面代用写真である。
【図１１】（Ａ）は実施例４において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの銀染色像の図面代用写真、（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像の図面代用写真である。
【図１２】実施例５において、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、励起波長：３３５ｎｍで蛍光波長：３６０〜６００ｎｍにおける蛍光スペクトルを測定した結果を示すスペクトル図である。
【図１３】実施例５において、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、励起波長：３３５ｎｍで蛍光波長：４９０ｎｍにおける蛍光強度と、水熱処理における加熱温度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】実施例５において、未処理のＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの水熱処理後の産物それぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像の図面代用写真である。
【図１５】実施例６において、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示すグラフである。
【図１６】実施例７において、ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示すグラフである。
【図１７】（Ａ）実施例８において、未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）はＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示すグラフである。
【図１８】（Ａ）は実施例９において、可視光下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は紫外線照射下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）はＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示す図面代用写真である。
【図１９】（Ａ）は実施例１０において、可視光下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）はＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示すグラフである。
【図２０】（Ａ）は実施例１０において、紫外線照射下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）はＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．温度判定方法
本実施形態に係る温度判定方法は、試料の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する方法であって、アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する工程（以下、「混合工程」ともいう）、得られた混合物を加熱する工程（以下、「加熱工程」ともいう）、混合物の光学的変化を検出する工程（以下、「光学的変化検出工程」ともいう）、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程（以下、「判定工程」ともいう）、を含む。温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数（Ｋｄ）が、５００μＭ以上であり、温度判定用ペプチドは、第１標識物質と第２標識物質とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本実施形態では、アルブミンを含む試料が用いられる。試料としては、例えば、生体試料が挙げられる。生体試料としては、例えば、全血、リンパ液などの体液、尿などの排泄物、これらを前処理した試料が挙げられるが、特に限定されない。これらを前処理した試料としては、血漿、血清などが挙げられる。
【００１３】
所定温度は、アルブミンを自己会合させ、かつ温度判定用ペプチドの開裂に基づく光学的変化を生じさせる温度である。この温度は、好ましくは１２０℃以上、より好ましくは１４０℃以上である。所定温度の上限は、温度判定用ペプチドの開裂に基づく光学的変化を検出できる温度であればよい。通常、所定温度の上限は、好ましくは２６０℃である。本実施形態に係る温度判定方法を標的ペプチドの検出に用いる場合には、所定温度での加熱によって検出不能なほどに標的ペプチドが分解されないようにしなければならない。加熱処理条件は、加熱処理後の標的ペプチド、または標的ペプチドの存在を示す標的ペプチドの断片を特異的に検出できるような条件とする。この温度は標的ペプチドの種類によって設定される。
【００１４】
温度判定用ペプチドは、アルブミンに対する解離定数が５００μＭ以上のペプチドである。そのため、温度判定用ペプチドは、試料中ではアルブミンとは結合または会合しにくい。温度判定用ペプチドは、後述のリンカーペプチドと第１標識物質と第２標識物質とを含む。リンカーペプチドは、第１標識物質と第２標識物質を有する。
【００１５】
本明細書において、「解離定数（Ｋｄ）」は、常圧で２５℃、ｐＨ７．５および電気伝導率（以下、「伝導率」ともいう）１０ｍＳ／ｃｍの条件での解離定数をいう。アルブミンに対する温度判定用ペプチドの解離定数の値が大きいほど、アルブミンに対する温度判定用ペプチドの親和性が低いことを意味する。
【００１６】
本明細書において、「リンカーペプチド」は、２〜１３０アミノ酸残基からなるペプチドをいう。リンカーペプチドは、合成ペプチドであっても、天然由来ペプチドであってもよい。リンカーペプチドの等電点は、特に限定されない。リンカーペプチドとしては、例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（１−３９）〔ＡＣＴＨ（１−３９）〕（配列番号：１６）、ＡＣＴＨ（１−４１）（配列番号：１７）、（Ｇｌｕ）１０（配列番号：１８）、ダイノルフィンＡ（配列番号：１９）、（Ｇｌｙ）１０（配列番号：２０）、（Ａｒｇ）１０（配列番号：２１）、Ｃｐ６（配列番号：２２）、Ｃ４ａ（配列番号：２３）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、配列番号：２４）、ブラジキニン（配列番号：２５）、ＨＳＡ２３７−２４９断片（配列番号：２６）、Ｃ３ｆ（配列番号：２７）、ＩＴＩＨ４（配列番号：２８）、ＨＳＡ３９７−４１３断片（配列番号：２９）、ＨＳＡ５９９−６０９断片（配列番号：３０）、Ｃ−ペプチド（配列番号：３１）、コリスチン（配列番号：３２）などが挙げられるが、特に制限されない。なお、コリスチンは、コリスチンＡ単独、コリスチンＢ単独、およびコリスチンＡとコリスチンＢとの混合物のいずれであってもよい。
【００１７】
リンカーペプチドにおいて、第１標識物質および第２標識物質の付加部位は、特に限定されない。後述のリンカーペプチドの開裂によって、第１標識物質と第２標識物質とが離隔する位置であればよい。この開裂によってより確実に第１標識物質と第２標識物質とが離隔するよう、リンカーペプチドのＮ末端に第１標識物質が結合し、Ｃ末端に第２標識物質が結合していることが好ましい。
【００１８】
第１標識物質および第２標識物質は、温度判定用ペプチドの開裂により、検出可能な光学的変化を生じるものが好ましい。光学的変化は、検出が容易であることから、温度判定用ペプチドに起因する光学的シグナルの波長の変化であることが好ましい。光学的シグナルの波長の変化としては、例えば、光の波長の変化、蛍光の発生などが挙げられるが、特に限定されない。ここで、「蛍光の発生」とは、加熱処理後は所定の閾値以上の強度の蛍光が生じることである。加熱処理前に蛍光が生じていない場合または蛍光強度が閾値未満である場合に「蛍光の発生」を光学的変化として検出することができる。本実施形態においては、第１標識物質および第２標識物質は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する標識物質、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用する標識物質などのなかから、適宜選択され得る。
【００１９】
ＦＲＥＴは、近接した２個の蛍光物質の間でエネルギーが電子の共鳴により直接移動する現象である。ＦＲＥＴでは、ドナーで吸収された励起光のエネルギーがアクセプターである蛍光物質に移動する。これにより、アクセプターから蛍光が放射される。ＢＲＥＴは、生物発光物質が光を発するために使うエネルギーが発光物質の近傍に配置された蛍光物質などに移動し、蛍光などが生じる現象である。
【００２０】
第１標識物質としては、例えば、エネルギーのドナーとなる蛍光物質、エネルギーのドナーとなる生物発光物質などが挙げられるが、特に限定されない。また、第２標識物質としては、例えば、第１標識物質に用いられる蛍光物質に起因する蛍光のクエンチャー（ドナーとなる蛍光物質からエネルギーを受け取るアクセプターとなる蛍光物質）、第１標識物質に用いられる生物発光物質からエネルギーを受け取るアクセプターとなる蛍光物質などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２１】
エネルギーのドナーとなる蛍光物質としては、例えば、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸、７−メトキシクマリン−４−酢酸、フルオロセイン５（６）シソチオシアナート、６−カルボキシフルオロセイン、テトラクロロフルオレセイン、ローダミングリーン（商標）、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、Ｃｙ５（商標）、Ｃｙａｎｉｎ５（商標）、ＡＴＴＯ  ６５５（商標）  、ＳＴＥＬＬＡＴＭ−４８８（商標）、ＳＴＥＬＬＡＴＭ−６００（商標）、蛍光性ナノ粒子などが挙げられるが、特に限定されない。エネルギーのドナーとなる蛍光物質は、蛍光の検出の容易性の点から、好ましくは５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸および７−メトキシクマリン−４−酢酸である。エネルギーのドナーとなる生物発光物質としては、例えば、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質などが挙げられるが、特に限定されない。クエンチャーとしては、例えば、４−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］安息香酸、２，４−ジニトロフェノール、テトラメチルローダミン、ＢＨＱ−１（商標）、ＢＨＱ−２（商標）、７−ニトロベンゾフラザン、Ｃｙ５Ｑ（商標）などが挙げられるが、特に限定されない。クエンチャーは、蛍光の検出の容易性の点から、好ましくは４−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］安息香酸および２，４−ジニトロフェノールである。生物発光物質からエネルギーを受け取るアクセプターとなる蛍光物質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質などが挙げられるが、特に限定されない。第１標識物質と第２標識物質との組み合わせは、適宜決定することができる。
【００２２】
リンカーペプチド上の第１標識物質と第２標識物質との間の距離は、十分に近接した距離である。共鳴エネルギー移動を利用する場合は、このエネルギー移動が生じる距離であればよい。加熱処理によって第１標識物質と第２標識物質とが離隔した際にこのエネルギー移動が生じなくなり、光学的変化が生じる。リンカーペプチド上の第１標識物質と第２標識物質との間の距離は、例えば、第１標識物質および第２標識物質がＦＲＥＴを利用した蛍光物質とクエンチャーとの組み合わせである場合、蛍光物質に起因する蛍光をクエンチャーが消光できる距離であればよい。この場合、第１標識物質と第２標識物質との間の距離の上限は、好ましくは１１１１残基、より好ましくは４０残基である。この距離であれば、クエンチャーが蛍光を消光することができる。
【００２３】
温度判定用ペプチドの開裂は、ペプチド結合の開裂によると考えられる。アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基は、加熱処理によってＮ末端側またはＣ末端側で開裂し易いと考えられる。したがって、温度判定用ペプチドは、好ましくは上記の残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、より好ましくはアスパラギン酸残基を含む。
【００２４】
温度判定用ペプチドは、例えば、緩衝液などの助剤に溶解させて用いることができる。
【００２５】
本実施形態に係る温度判定方法では、まず、混合工程において、アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する。混合工程において、試料に対する温度判定用ペプチドの量は、試料に含まれるタンパク質、ペプチドなどの量、試料の種類などに応じて、適宜決定することができる。
【００２６】
つぎに、加熱工程において、混合工程で得られた混合物を加熱する。加熱温度は、所定温度と同様である。また、加熱時間は、混合物の所定温度への加熱を行なうのに十分な時間であればよい。通常、加熱時間は、例えば、５分間以上である。
【００２７】
混合物の加熱方法としては、例えば、マイクロ波の照射による加熱、外部からの熱伝導加熱などが挙げられるが、特に限定されない。また、混合物の加熱に用いられる装置としては、例えば、水熱反応器、マイクロ波照射装置などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２８】
アルブミンは、所定温度での加熱により分子同士が会合し、不溶性の析出物となるが、温度判定用ペプチドは、試料中ではアルブミンとは結合しにくい。そのため、温度判定用ペプチドは、加熱の際に不溶性のアルブミンの析出物に捕捉されない。したがって、加熱工程において、混合物の温度が所定温度に達した場合、温度判定用ペプチドは、アルブミンの不溶性の析出物中には含まれず、液体成分（上清）中に存在する。温度判定用ペプチドは、混合物の温度が所定温度に達した場合、ペプチド結合が切断され、開裂すると考えられる。したがって、第１標識物質と第２標識物質との間の距離が、加熱工程を行なう前よりも離隔しており、光学的変化が起こりやすくなっていると考えられる。
【００２９】
つぎに、光学的変化検出工程において、混合物の光学的変化を検出する。光学的変化の検出に際しては、加熱前の光学的状態を検出してもよいし、検出しなくてもよい。加熱前の光学的状態は、試薬自体の光学的状態であるため、予めわかっている。加熱後の光学的状態を検出し、加熱前の光学的状態と比較することによって、光学的変化を検出することができる。
【００３０】
混合物が所定温度に加熱された場合、温度判定用ペプチドは、開裂すると考えられる。そのため、第１標識物質と第２標識物質との間の距離は、加熱工程を行なう前よりも長くなり、光学的変化が生じると考えられる。第１標識物質および第２標識物質が、例えば、ＦＲＥＴに用いられる蛍光物質とクエンチャーとの組み合わせである場合、温度判定用ペプチドの開裂（ペプチド結合の切断）により、第１標識物質の蛍光物質と第２標識物質のクエンチャーとの間の距離が、ＦＲＥＴが生じなくなる程度に離隔する。これにより、クエンチャーが蛍光物質からの蛍光を消光することができなくなり、蛍光が生じる。
【００３１】
光学的変化の検出手段としては、例えば、分光光度計、蛍光光度計、電気泳動装置とイメージングアナライザーと組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。かかる検出手段は、検出対象の光学的変化の種類などに応じて、適宜選択することができる。
【００３２】
その後、判定工程において、光学的変化検出工程で得られた光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する。
【００３３】
判定工程では、例えば、検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値以上である場合、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定することができる。一方、検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値未満である場合、混合物の温度が所定温度まで上昇していないと判定することができる。なお、本明細書において、「所定の閾値」とは、加熱前の光学的シグナルの強度と、加熱による温度判定用ペプチドの開裂に起因する光学的シグナルの強度とを、最も精度よく分類し得る値をいう。
【００３４】
光学的変化検出工程において、混合物の上清中の温度判定用ペプチドに含まれる標識物質に基づく蛍光を検出した場合、判定工程において、上清の蛍光の強度に基づいて判定を行なうことができる。上清の蛍光の強度が所定の閾値以上である場合、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定することができる。一方、上清の蛍光の強度が所定の閾値未満である場合、混合物の温度が所定温度まで上昇していないと判定することができる。
【００３５】
試料が入った容器を密封して加熱する必要がある場合、測定対象物に温度計を接触させて温度計測を行なうことが難しい。この場合、試料の温度は、サーモグラフィなどの非接触温度計を用いずに、外部から測定することが困難である。本実施形態の温度判定用ペプチドを用いると、測定対象物に接触させて測定する温度計や非接触温度計を用いずに、容器内の試料の温度を簡便に確認することができる。したがって、本実施形態に係る温度判定方法によれば、試料が入った容器を密封して加熱する際の試料の温度の確認などに好適である。
【００３６】
２．標的ペプチドの検出方法
本実施形態に係る標的ペプチドの検出方法（以下、単に「検出方法」ともいう）は、標的ペプチドとアルブミンとを含む試料と、温度判定用ペプチドとを混合する工程（混合工程）、混合物を加熱する工程（加熱工程）、混合物の光学的変化を検出する工程（光学的変化検出工程）、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定の温度まで上昇したか否かを判定する工程（判定工程）を含む。温度判定用ペプチドは上述の通りである。判定工程において、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定された場合、混合物の上清を回収する工程（以下、「回収工程」ともいう）および上清中の標的ペプチドを検出する工程（以下、「標的ペプチド検出工程」ともいう）を実行する。本実施形態に係る検出方法における混合工程、加熱工程、光学的変化検出工程および判定工程は、前述の温度判定方法における混合工程、加熱工程、光学的変化検出工程および判定工程と同様である。
【００３７】
本実施形態に係る検出方法の標的ペプチドは、温度判定用ペプチドのリンカーペプチドと異なることが好ましい。
【００３８】
標的ペプチドとしては、例えば、生体試料に含まれるバイオマーカーなどのペプチドなどが挙げられるが、特に限定されない。バイオマーカーとしては、例えば、ＡＣＴＨ、ＢＮＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ブラジキニン、α−エンドルフィン、Ｃ３ｆ、ＩＴＩＨ４、Ｃ−ペプチド、β−アミロイド、エンドセリン、アドレノメデュリン、バソプレッシン、オキシトシン、インタクトＩ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｉｎｔａｃｔ  ＰＩＮＰ）、プロコラーゲンＩＩＩペプチド（Ｐ−ＩＩＩ−Ｐ）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３９】
判定工程において、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定された場合、回収工程および標的ペプチド検出工程を実行する。一方、判定工程において、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定されなかった場合、回収工程および標的ペプチド検出工程を実行しない。
【００４０】
回収工程において、混合物の上清の回収は、例えば、遠心分離、限外ろ過、デカンテーションなどによって行なうことができる。
【００４１】
標的ペプチド検出工程において、標的ペプチドの検出は、標的ペプチドに対する抗体を用いる方法、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など；液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）；反射干渉分光センサを用いる方法；反射強度測定法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００４２】
本実施形態に係る検出方法では、混合工程において、試料と温度判定用ペプチドとに加え、蛍光物質を含む相分配判定用ペプチドをさらに混合してもよい。ここで、「相分配」とは、不溶性の析出層と溶液層とを分配することをいう。アルブミンを含む試料を加熱処理すると、アルブミンが自己会合体を構成し、不溶性の析出物が生じる。この不溶性の析出物には、アルブミンと結合するタンパク質やペプチドなども含まれる。アルブミンと結合しない成分は溶液層に存在することとなる。上述した温度判定用ペプチドはアルブミンと結合しないため溶液層に存在し、相分配判定用ペプチドは後述のようにアルブミンと結合するため、不溶性の析出層に存在する。
【００４３】
相分配判定用ペプチドは、アルブミンとの結合のＫｄが５００μＭ未満であるペプチドである。したがって、相分配判定用ペプチドは、試料中ではアルブミンとは結合しやすい。そのため、加熱工程において、混合物の温度が所定温度に達した場合、相分配判定用ペプチドは、アルブミンの不溶性の析出物中に含まれる。この場合、相分配判定用ペプチドを用いた場合、加熱処理によって生じるアルブミンの不溶性の析出物と、上清画分との相分離の成否を簡便に判定することができる。蛍光物質としては、温度判定用ペプチドに用いられる蛍光物質と同様の物質が例示される。なお、相分配判定用ペプチドの蛍光物質は、相分配判定用ペプチド中の蛍光物質に起因する蛍光を容易に検出する観点から、温度判定用ペプチドの標識物質と異なる物質である。
【００４４】
相分配判定用ペプチドを用いた場合、光学的変化検出工程では、温度判定用ペプチドに起因する光学的変化に加え、アルブミンの不溶性の析出物に含まれる相分配判定用ペプチド中の蛍光物質に起因する蛍光を検出する。
【００４５】
相分配判定用ペプチドを用いた場合、混合物中に相分配判定用ペプチドの蛍光標識に基づく蛍光を生じる析出物が検出される。析出物から生じる蛍光の強度が所定の閾値以上である場合、相分配が適切に行われていると判定することができる。
【００４６】
３．温度判定試薬
本実施形態に係る温度判定試薬は、上述した温度判定用ペプチドを含む。この試薬は、温度判定用ペプチドのみからなる試薬であってもよく、水などの溶媒に温度判定用ペプチドを溶解させた試薬であってもよい。また、温度判定用試薬は、ペプチドなどを安定に保持するための助剤をさらに含有していてもよい。助剤としては、緩衝液、防腐剤などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００４７】
本実施形態の試薬は、さらに相分配判定用ペプチドを含んでいてもよい。この場合、温度判定用ペプチドと相分配判定用ペプチドとを異なる容器に収容した試薬キットの形態であることが好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下において、アミノ酸残基の表記を、表１に示されるように、３文字で表記する場合がある。
【００４９】
【表１】
0006473366.tif 000002
【００５０】
（参考例１）
０．１Ｍ塩化カルシウム含有０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて健常者の血清１５０μＬを１０倍希釈し、血清含有試料を得た。得られた血清含有試料１．５ｍＬを水熱処理用ガラス容器に入れた。つぎに、希釈液が入った水熱処理用ガラス容器をマイクロ波合成反応装置〔マイルストーンゼネラル社製、商品名：ＭｕｌｔｉＳＹＮＴＨ〕にセットし、１６０℃の水熱処理を行なった。その後、水熱処理後の試料から上清を回収した。なお、１６０℃の水熱処理の温度条件を、常温（２０℃）から１００℃までの昇温を３０秒間、１００℃から１６０℃までの昇温を１分間の条件に設定した。
【００５１】
得られた上清を、限外濾過膜〔メルクミリポア社製、商品名：ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５  １０ｋＤａ〕を用いて限外濾過した。得られた濾過液を、固相抽出カラム〔ジーエルサイエンス社製、商品名：ＲＰ−１〕を用いて脱塩した。さらに、脱塩後の溶液を遠心エバポレータに供して乾固させた。得られた乾固物を、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水混合溶媒〔５０体積％アセトニトリルと０．１体積％ＴＦＡとを含有する精製水〕１００μＬに溶解させた。得られた溶液５μＬを０．１体積％ＴＦＡ／精製水混合溶媒で５０倍希釈した。得られた希釈液５μＬを液体クロマトグラフ装置〔ミクロム・バイオリソーシーズ・インク（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）製、商品名：ＡＤＶＡＮＣＥ  ＵＰＬＣ  ＳＹＳＴＥＭ〕および質量分析装置〔サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック・インク．（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）製、商品名：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ〕に供し、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって水熱処理によって生成されるペプチドを解析した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の測定条件および測定結果の解析条件は、下記条件に設定した。
【００５２】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
分離カラム：（財）化学物質評価研究機構製、商品名：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ（０．１×１５０ｍｍ）
溶出溶媒Ａ：２体積％アセトニトリル／０．１体積％ギ酸混合溶媒
溶出溶媒Ｂ：９０体積％アセトニトリル／０．１体積％ギ酸混合溶媒
流速：５００ｎＬ／ｍｉｎ
濃度勾配：表２に記載の濃度勾配
【００５３】
【表２】
0006473366.tif 000003
【００５４】
＜質量分析条件＞
イオン化方式：Ｎａｎｏｆｌｏｗ−ＬＣ  ＥＳＩ
イオン化モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ
キャピラリー電圧：１．８ｋＶ
コリジョンエネルギー：３５ｅＶ
【００５５】
＜測定結果の解析条件＞
解析ソフトウェア：マトリクス・サイエンス・インク（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）提供、Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ｉｎ−ｈｏｕｓｅでのデータベース検索）
データベース：ＮＣＢＩＩｎｒ
生物種：ａｌｌ  ｅｎｔｒｉｅｓ（全ての生物種）
消化酵素：なし
修飾：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）
【００５６】
その結果、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、２９２種のペプチドが同定された。水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を図１に示した。
【００５７】
ヒトγグロブリン〔和光純薬（株）製〕および塩化カルシウムをそれぞれの濃度が２０ｍｇ／ｍＬおよび０．１Ｍになるように、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、ヒトγグロブリン含有試料を得た。ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう）〔シグマ・アルドリッチ社製〕および塩化カルシウムをそれぞれの濃度が４０ｍｇ／ｍＬおよび０．１Ｍになるように、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、ＨＳＡ含有試料を得た。
【００５８】
つぎに、前記において、血清含有試料の代わりに、ヒトγグロブリン含有試料またはＨＳＡ含有試料を用いたことを除き、前記と同様に、水熱処理およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行なった。つぎに、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端における各アミノ酸残基の出現頻度を求めた。ヒトγグロブリン含有試料について、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を図２、ヒト血清アルブミンを含む試料について、水熱処理後の試料に含まれるペプチドの末端におけるアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を図３、血清、ヒトγグロブリンおよびヒト血清アルブミンそれぞれを水熱処理することによって生成されたペプチドの末端に出現するアミノ酸残基の出現頻度を調べた結果を図４に示した。
【００５９】
図１〜４に示された結果から、血清に含まれるタンパク質およびペプチドには、水熱処理によって開裂しやすい位置が存在していることがわかった。開裂しやすい位置は、好ましくはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基それぞれの位置、より好ましくはアスパラギン酸残基の位置であった。
【００６０】
（実施例１）
ＨＳＡ（シグマ・アルドリッチ社製）をその濃度が１μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、Ａ液を得た。また、ＨＳＡの３９７〜４１３位のアミノ酸からなるＨＳＡ３９７−４１３断片（配列番号：２９）、テトラメチルローダミン（以下、「ＴＭＲ」ともいう）標識ＨＳＡ３９７−４１３断片およびＨＳＡをそれぞれの濃度が８３３μＭ、７μＭおよび１μＭになるように、リン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、Ｂ液を得た。つぎに、Ａ液とＢ液とを種々の混合比で混合することにより、ＨＳＡ濃度が一定で、かつＨＳＡ３９７−４１２断片濃度が異なる種々の混合液を調製した。得られた各混合液を、分光蛍光光度計〔（株）日立ハイテクノロジー製、商品名：Ｆ−７０００〕に供し、励起波長：５４０ｎｍで蛍光波長：５８０ｎｍにおける蛍光強度（以下、「蛍光強度Ａ」という）を測定した。
【００６１】
また、ＨＳＡ３９７−４１２断片およびＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１２断片をそれぞれの濃度が８３３μＭおよび７μＭになるように、リン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、Ｃ液を得た。リン酸緩衝生理食塩水とＣ液とを種々の混合比で混合することにより、ＨＳＡ３９７−４１２断片濃度が異なる種々の混合液を調製した。得られた各混合液を、分光蛍光光度計〔（株）日立ハイテクノロジー製、商品名：Ｆ−７０００〕に供し、励起波長：５４０ｎｍで蛍光波長：５８０ｎｍにおける蛍光強度（以下、「蛍光強度Ｂ」という）を測定した。
【００６２】
混合液におけるＨＳＡ３９７−４１２断片濃度とＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１２断片濃度との和（以下、ペプチド濃度ともいう）を算出した。また、式（Ｉ）：
【００６３】
蛍光強度の差＝蛍光強度Ａ−蛍光強度Ｂ                                  （Ｉ）
【００６４】
にしたがって蛍光強度の差を求めた。各混合液におけるペプチド濃度および各混合液を用いたときの蛍光強度の差のデータ点を、ｘ軸がペプチド濃度であり、ｙ軸が蛍光強度の差である２次元座標上にプロットした。ペプチド濃度と蛍光強度の差との関係を調べた結果を図５に示した。さらに、プロットされたデータ点群の近似曲線と、データ解析・グラグ作成ソフトウェア〔ヒューリンクス（Ｈｕｌｉｎｋｓ）製、商品名：ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ〕と、式（ＩＩ）：
【００６５】
Ｙ＝Ａ×Ｃｎ／Ｃｎ＋Ｋｄｎ                                          （ＩＩ）
【００６６】
（式中、Ｙは蛍光強度、Ａは蛍光強度の補正のための係数、Ｃはペプチド濃度、Ｋｄは解離定数、ｎはヒル係数を示す）
で表わされるヒルの式とを用い、ＨＳＡに対するＨＳＡ３９７−４１２断片のＫｄを求めた。
【００６７】
その結果、ＨＳＡに対するＨＳＡ３９７−４１２断片のＫｄは、１０００μＭ以上であることがわかった。したがって、ＨＳＡ３９７−４１２断片は、ＨＳＡに対する親和性が低いことがわかった。この結果から、ＨＳＡ３９７−４１２断片は、ＨＳＡに結合しにくいことが示唆された。
【００６８】
（実施例２）
（１）水熱処理
表３に示される各ペプチドをＴＭＲで標識した。
【００６９】
【表３】
0006473366.tif 000004
【００７０】
つぎに、実施例１において、ＨＳＡ３９７−４１２断片の代わりに、各ＴＭＲ標識ペプチドを用いたことを除き、実施例１と同様に、ＨＳＡに対する表３に示される各ペプチドのＫｄを求めた。実施例２において、ＨＳＡに対する各ペプチドのＫｄを図６に示した。
【００７１】
図６に示されたペプチドのなかから、ＨＳＡに対するＫｄが２００μＭであるＡＣＴＨ（１−２４）とＨＳＡに対するＫｄが５２０μＭであるＡＣＴＨ（１−３９）を選択した。ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）と、ＨＳＡとをそれぞれの濃度が５μＭおよび４７０μＭになるように０．１Ｍトリス−塩酸溶液に混合し、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料を得た。また、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）と、ＨＳＡとをそれぞれの濃度が８μＭおよび６００μＭになるように０．１Ｍトリス−塩酸溶液に混合し、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料を得た。
【００７２】
参考例１において、血清含有試料、ヒトγグロブリン含有試料またはＨＳＡ含有試料の代わりに、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料またはＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料を用いたことを除き、参考例１と同様に水熱処理を行なった。その後、水熱処理後の試料から上清を回収した。
【００７３】
（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用被験試料の調製
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用添加緩衝液〔タカラバイオ（株）製、商品名：１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ〕１０μＬと６０体積％グリセロール水溶液２０μＬとを混合し、試料用緩衝液を得た。得られた試料用緩衝液３μＬにＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料１．５μＬを添加し、被験試料を得た。また、前記において、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料の代わりに、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料または各試料の水熱処理後の上清を用いたことを除き、前記と同様に、被験試料を得た。
【００７４】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動装置〔インビトロジェン社製、商品名：垂直型ミニ電気泳動システム〕と、泳動ゲル〔インビトロジェン社製、商品名：ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、１．０ｍｍ、１０ウェル〕と、ランニングバッファー〔インビトロジェン社製、商品名：ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー（２０×）を２０倍希釈した希釈液〕とを用い、電圧：２００Ｖ下で、前記実施例２（２）で得られた各被験試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。得られた泳動ゲルを蛍光イメージャー〔バイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製、商品名：Ｐｈａｒｏｓ  ＦＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ〕に供し、ＴＡＭＲＡ用波長（励起波長：５３２ｎｍ）のＨｉｇｈ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙモードで泳動ゲルの蛍光像を取得した。
【００７５】
実施例２において、未処理および水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図７（Ａ）、未処理および水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図７（Ｂ）に示した。図７（Ａ）中、レーンＭは分子量マーカーの泳動パターン、レーン２はＨＳＡ存在下で未処理のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料の泳動パターン、レーン２はＨＳＡ存在下で水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料の上清画分の泳動パターンを示した。また、図７（Ｂ）中、レーン１はＨＳＡ存在下で未処理のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料、レーン２はＨＳＡ存在下で水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料の上清画分、レーン３はＨＳＡ非存在下での未処理のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）を示した。
【００７６】
図７（Ａ）に示された結果から、ＨＳＡ存在下で未処理のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料の泳動パターン（レーン１）には、ＡＣＴＨ（１−２４）由来のバンドが確認された。これに対し、ＨＳＡ存在下で水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）の上清の泳動パターン（レーン２）には、ＡＣＴＨ（１−２４）由来のバンドが確認されなかった。この結果から、ＡＣＴＨ（１−２４）は、水熱処理後において、不溶性画分のアルブミンの析出物と結合していることが予想された。
【００７７】
一方、ＨＳＡ存在下で水熱処理後のＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料の上清の泳動パターン（レーン２）には、ＡＣＴＨ（１−３９）由来のバンドが確認された。この結果から、ＡＣＴＨ（１−３９）は、ＡＣＴＨ（１−３９）を含む試料を加熱することによって加熱温度が所定温度に達した場合、不溶性画分に含まれるアルブミンの析出物に結合せず、上清画分中に存在していることがわかった。
【００７８】
これらの結果から、ＡＣＴＨ（１−３９）は、アルブミン存在下に加熱した際に加熱温度が所定温度に達した場合、上清画分中において、容易に検出することができることが示唆された。したがって、ＡＣＴＨ（１−３９）は、アルブミンを含む試料の温度が所定温度であるかどうかを判定するための温度判定用ペプチドのリンカー部分に適していることが示唆された。また、これらの結果から、アルブミンに対するＫｄが５００μＭ以上であるペプチドは、アルブミンを含む試料の温度が所定温度であるかどうかを判定するための温度判定用ペプチドのリンカーペプチドに適することが示唆された。図６に示される各ペプチドについて、リンカーペプチドに適したペプチドおよびリンカーペプチドに不適なペプチドに分類した結果を図８に示した。
【００７９】
図８に示された結果から、ＡＣＴＨ（１−３９）、ＡＣＴＨ（１−４１）、（Ｇｌｕ）１０、ダイノルシンＡ、（Ｇｌｙ）１０、（Ａｒｇ）１０、Ｃｐ６、Ｃ４ａ、ＢＮＰ、ブラジキニン、ＨＳＡ２３７−２４９断片、Ｃ３ｆ、ＩＴＩＨ４、ＨＳＡ３９７−４１３断片、ＨＳＡ５９９−６０９断片、Ｃ−ペプチドおよびコリスチンが、リンカーに適することがわかった。
【００８０】
（実施例３）
（１）水熱処理
ＴＭＲ標識ＨＳＡ２３７−２４９断片、ＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片またはＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片をその濃度が５μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、試料Ａ（ＴＭＲ標識ＨＳＡ２３７−２４９断片含有）、試料Ｂ（ＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片含有）または試料Ｃ（ＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片含有）を得た。
【００８１】
試料Ａ  ０．７ｍＬをスクリュー管瓶に入れた。つぎに、蓋をせずに試料Ａをスクリュー管瓶ごと鉄製伝熱容器内に入れた。鉄製伝熱容器を２００℃に保たれた恒温槽内で４０分間加熱した後、恒温槽内の温度が室温に下がるまで、鉄製伝熱容器をインキュベーションすることにより、水熱処理を行なった。得られた溶液を水熱処理後試料Ａとした。また、前記において、試料Ａの代わりに、試料Ｂまたは試料Ｃを用いたことを除き、前記と同様に、水熱処理を行なった。
【００８２】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用被験試料の調製
実施例２（２）において、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料または各試料の水熱処理後の上清の代わりに、試料Ａ〜Ｃまたは水熱処理後の各試料を用いたことを除き、実施例２（２）と同様に被験試料を得た。
【００８３】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例２（２）において、実施例２（２）で得られた各被験試料の代わりに、実施例３（２）で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例２（２）と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動ゲルの蛍光像を取得した。
【００８４】
実施例３において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図９に示した。図中、レーンＭは分子量マーカーの泳動パターン、レーン１は未処理のＴＭＲ標識ＨＳＡ２３７−２４９断片を含む試料Ａの泳動パターン、レーン２は未処理のＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片を含む試料Ｂの泳動パターン、レーン３は未処理のＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片を含む試料Ｃの泳動パターン、レーン４は水熱処理後のＴＭＲ標識ＨＳＡ２３７−２４９断片を含む試料Ａの泳動パターン、レーン５は水熱処理後のＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片を含む試料Ｂの泳動パターン、レーン６は水熱処理後のＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片を含む試料Ｃの泳動パターンを示した。
【００８５】
図９に示された結果から、未処理のペプチドが用いられたレーン１〜３では、各ペプチドに対応する１本のバンドが確認された。一方、水熱処理後のペプチドが用いられたレーン４〜６では、水熱処理後のＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片が用いられたレーン５のみに、２本のバンドが確認された。ＨＳＡ２３７−２４９断片、ＨＳＡ３９７−４１３断片およびＨＳＡ５９９−６０９断片のうち、ＨＳＡ３９７−４１３断片のみが、アミノ酸配列中にアスパラギン酸残基を有していた。したがって、ＨＳＡ３９７−４１３断片は、水熱処理によってアスパラギン酸残基の位置で開裂することが予想された。また、これらの結果から、マイクロ波の代わりに、伝熱を用いた場合であっても、マイクロ波を用いた場合と同様に、水熱処理を行なうことができるがわかった。
【００８６】
（比較例１）
（１）水熱処理
ＴＭＲ標識ＳＡ２１およびＨＳＡをそれぞれの濃度が８μＭおよび３００μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、ＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料を得た。
【００８７】
実施例３（１）において、試料Ａ〜Ｃの代わりに、ＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料を用いたことを除き、実施例３（１）と同様に、水熱処理を行なった。
【００８８】
その結果、ＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料は、水熱処理後、溶液の下部に赤色（ＴＭＲに起因する色）に染まった不溶性画分と、ほとんど無色透明に近い上清との二相に分離した。この結果から、ほとんどのＴＭＲ標識ＳＡ２１は、不溶性画分に存在することが予想された。
【００８９】
水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清を回収した。
【００９０】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用被験試料の調製
実施例２（２）において、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−２４）含有試料、ＴＭＲ標識ＡＣＴＨ（１−３９）含有試料または各試料の水熱処理後の上清の代わりに、未処理のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料または水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清を用いたことを除き、実施例２（２）と同様に、被験試料を得た。
【００９１】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例２（２）において、実施例２（２）で得られた各被験試料の代わりに、比較例１（２）で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例３（２）と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。得られた泳動ゲルを蛍光イメージャー〔バイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製、商品名：Ｐｈａｒｏｓ  ＦＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ〕に供し、ＴＡＭＲＡ用波長（励起波長：５３２ｎｍ）のＨｉｇｈ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙモードで泳動ゲルの蛍光像を取得した。また、得られた泳動ゲルを銀染色し、銀染色像を取得した。
【００９２】
比較例１において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの銀染色像を図１０（Ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像を図１０（Ｂ）に示した。図中、レーンＭは分子量マーカーの泳動パターン、レーン１は未処理のＴＭＲ標識ＳＡ１含有試料の泳動パターン、レーン２は水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清の泳動パターンを示した。また、図中、「Ａ」は未処理のＳＡ２１由来のバンド、「Ｂ」はＳＡ２１の凝集体を示した。
【００９３】
図１０（Ａ）に示された結果から、未処理のＴＭＲ標識ＳＡ１含有試料の泳動パターン（レーン１）には、ＨＳＡ由来の濃いバンドが確認された。この結果から、未処理のＴＭＲ標識ＳＡ１含有試料は、大量のＨＳＡを含むことが示唆された。また、図１０（Ｂ）に示された結果から、未処理のＴＭＲ標識ＳＡ１含有試料の泳動パターン（レーン１）には、ＴＭＲ標識ＳＡ１由来のバンドが確認された。
【００９４】
一方、図１０（Ａ）に示された結果から、水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清の泳動パターン（レーン２）には、ＨＳＡが断片化されたと推測される断片ペプチド群由来のバンドが確認された。また、図１０（Ｂ）に示された結果から、水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清の泳動パターン（レーン２）には、ＴＭＲ標識ＳＡ２１由来の薄いバンドが確認された。この結果から、水熱処理後のＴＭＲ標識ＳＡ２１含有試料の上清は、ごく少量のＴＭＲ標識ＳＡ２１を含むことが示唆された。
【００９５】
これらの結果から、水熱処理後、ＨＳＡのほとんどは、不溶性画分として沈殿し、ＨＳＡに対するＫｄが低いペプチド、すなわち、ＨＳＡとの親和性が高いペプチドは、不溶性画分に取り込まれることが示唆された。これらの結果は、水熱処理後の上清および不溶性画分の肉眼での観察結果と一致した。したがって、ＨＳＡに対するＫｄが低いペプチドは、温度判定ペプチドのリンカーとして不適であることが示唆された。
【００９６】
（実施例４）
（１）水熱処理
ＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片をその濃度が５μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、試料Ｄを得た。また、ＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片をその濃度が５μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、試料Ｅを得た。ＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片およびＨＳＡをそれぞれの濃度が５μＭおよび６００μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、試料Ｆを得た。また、ＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片およびＨＳＡをそれぞれの濃度が５μＭおよび６００μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、試料Ｇを得た。ＨＳＡをその濃度が６００μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに溶解させ、対照試料を得た。
【００９７】
実施例３（１）において、試料Ａ〜Ｃの代わりに、試料Ｄ〜Ｇまたは対照試料を用いたことを除き、実施例３（１）と同様に、水熱処理を行なった。水熱処理後の各試料の上清を回収した。
【００９８】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用被験試料の調製
実施例２（２）において、実施例２（２）で得られた各被験試料の代わりに、試料Ｄ〜Ｇ、対照試料または水熱処理後の各試料の上清を用いたことを除き、実施例２（２）と同様に、被験試料を得た。
【００９９】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例３（２）において、実施例３（２）で得られた各被験試料の代わりに、実施例４（２）で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例３（２）と同様に、泳動ゲルの銀染色像および蛍光像を取得した。
【０１００】
実施例４において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの銀染色像を図１１（Ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像を図１１（Ｂ）に示した。図中、レーンＭは分子量マーカーの泳動パターン、レーン１は未処理の試料Ｄの泳動パターン、レーン２は未処理の試料Ｅの泳動パターン、レーン３は未処理の試料Ｆの泳動パターン、レーン４は未処理の試料Ｇの泳動パターン、レーン５は未処理の対照試料の泳動パターン、レーン６は水熱処理後の試料Ｆの上清の泳動パターン、レーン７は水熱処理後の試料Ｆの上清の泳動パターン、レーン８は水熱処理後の対照試料の上清の泳動パターンを示した。
【０１０１】
図１１（Ａ）に示された結果から、未処理の試料Ｆ、試料Ｇおよび対照試料の泳動パターン（レーン３〜５）には、ＨＳＡ由来の濃いバンドが確認された。また、水熱処理後の試料Ｆ、試料Ｇおよび対照試料それぞれの上清の泳動パターン（レーン６〜８）には、ＨＳＡが断片化されたと推測される断片ペプチド群由来のバンドが確認された。
【０１０２】
一方、図１１（Ｂ）に示された結果から、未処理の試料Ｆの泳動パターン（レーン３）および水熱処理後の試料Ｆの泳動パターン（レーン６）には、ＴＭＲ標識ＨＳＡ３９７−４１３断片由来のバンドが確認された。また、未処理の試料Ｇの上清の泳動パターン（レーン４）および水熱処理後の試料Ｇの上清の泳動パターン（レーン７）には、ＴＭＲ標識ＨＳＡ５９９−６０９断片由来のバンドが確認された。これに対し、対照試料の泳動パターン（レーン５）には、ペプチド由来のバンドが確認されなかった。
【０１０３】
これらの結果から、ＨＳＡに対するＫdが高いペプチド（ＨＳＡに対するＫｄが５００μＭ以上）、すなわち、ＨＳＡとの親和性が低いペプチドは、水熱処理後、不溶性画分に取り込まれることがわかった。したがって、これらの結果から、ＨＳＡに対するＫdが高いペプチドが、温度判定用ペプチドのリンカーペプチドに適したペプチドであることが示唆された。
【０１０４】
（実施例５）
（１）未処理の試料の調製
ＨＳＡ３９７−４１３断片の両末端（Ｎ末端およびＣ末端）が標識されたＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳをその濃度が２０μＭになるように、１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）６ｍＬに溶解させ、試料Ｈを得た。ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳは、未開裂の状態では、ＤＡＢＣＹＬによってＥＤＡＮＳの蛍光が消光されるが、開裂することによってＥＤＡＮＳに起因して蛍光強度が上昇するように設計された。
【０１０５】
（２）水熱処理
実施例５（１）で得られた試料Ｈ  １．５ｍＬを水熱処理用ガラス容器に入れた。つぎに、試料Ｈが入った水熱処理用ガラス容器をマイクロ波合成反応装置〔マイルストーンゼネラル社製、商品名：ＭｕｌｔｉＳＹＮＴＨ〕にセットし、表４に示される条件にしたがって８０℃、１２０℃または１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１０６】
【表４】
0006473366.tif 000005
【０１０７】
（３）蛍光スペクトルの測定
実施例５（１）で得られた未処理の試料Ｈおよび実施例５（２）で得られた水熱処理後の試料Ｈそれぞれを、分光蛍光光度計〔（株）日立ハイテクノロジー製、商品名：Ｆ−７０００〕に供し、励起波長：３３５ｎｍで蛍光波長：３６０〜６００ｎｍにおける蛍光スペクトルを測定した。
【０１０８】
実施例５において、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、励起波長：３３５ｎｍで蛍光波長：３６０〜６００ｎｍにおける蛍光スペクトルを測定した結果を図１２に示した。図中、（Ａ）は未処理の試料Ｈの蛍光スペクトル、（Ｂ）は８０℃での水熱処理後の試料Ｈの蛍光スペクトル、（Ｃ）は１６０℃での水熱処理後の試料Ｈの蛍光スペクトル、（Ｄ）は１６０℃での水熱処理後の試料Ｈの蛍光スペクトルを示した。また、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、励起波長：３３５ｎｍで蛍光波長：４９０ｎｍにおける蛍光強度と、水熱処理における加熱温度との関係を調べた結果を図１３に示した。
【０１０９】
図１２および図１３に示された結果から、１２０℃以上での水熱処理を行なった場合、蛍光強度が増大することがわかった。したがって、これらの結果から、１２０℃以上での水熱処理を行なった場合、ＨＳＡ３９７−４１３断片が開裂していることが示唆された。
【０１１０】
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用被験試料の調製
実施例３（１）において、試料Ａ〜Ｃまたは水熱処理後の各試料の代わりに、実施例５（１）で得られた未処理の試料Ｈまたは実施例５（２）で得られた水熱処理後の試料Ｈを用いたことを除き、実施例３（１）と同様に、被験試料を得た。
【０１１１】
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例２（２）において、実施例２（２）で得られた各被験試料の代わりに、実施例５（４）で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例２（２）と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動後のゲルに対し、トランスイルミネーター（ＵＶＰ社製  型式ＮＭ−１５  ９５−０２１９−０３）によってＵＶ照射して、オレンジフィルターをセットしたカメラ（Ｎｉｃｏｎ社製  ＣＯＯＬＰＩＸ  ４５００）にて撮影することで励起光を排除した状態の蛍光像のみの泳動パターンを可視化した。ＥＤＡＮＳ由来の蛍光を発するバンドの位置に基づき、水熱処理によるＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂状態を確認した。実施例５において、未処理のＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの水熱処理後の産物それぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後の泳動ゲルの蛍光像を図１４に示した。図中、レーン１は未処理のＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの泳動パターン、レーン２はＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの水熱処理後の産物の泳動パターンを示した。
【０１１２】
図１４に示された結果から、レーン１において、未処理のＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳ由来のバンド（矢印Ａ）のみが確認された。これに対し、レーン２において、未処理のＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳ由来のバンドは確認されず、より小さい分子量を有するペプチドに対応するバンドが確認された。これらの結果から、水熱処理により、ＨＳＡ３９７−４１３断片が開裂していることが示唆された。
【０１１３】
（実施例６）
（１）未処理の試料の調製
実施例５（１）において、１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）の代わりに、５０μＭ  ｐＨ１１ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液を用いたことを除き、実施例５（１）と同様に、試料Ｉを得た。
【０１１４】
（２）水熱処理
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた試料Ｈの代わりに、実施例６（１）で得られた試料Ｉを用いたことを除き、実施例５（２）と同様に、１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１１５】
（３）蛍光強度の測定
実施例６（１）で得られた未処理の試料Ｉが入った容器および実施例６（２）で得られた水熱処理後の試料Ｉが入った容器のそれぞれをトランスイルミネーター（ＵＶＰ社製  型式ＮＭ−１５  ９５−０２１９−０３）によってＵＶ照射しながら、オレンジフィルターをセットしたカメラ（Ｎｉｃｏｎ社製  ＣＯＯＬＰＩＸ  ４５００）にて撮影することで励起光を排除した状態の蛍光像を撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名：Ｉｍａｇｅ  Ｊ〕とを用い、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１１６】
実施例６において、未処理の試料および水熱処理後の試料それぞれについて、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図１５に示した。図１５に示されるグラフでは、当該グラフ内の写真中の矢印Ａで示される位置での蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１１７】
図１５に示された結果から、アルカリ性条件下（ｐＨ１１）で１６０℃の水熱処理を行なった場合にも、未処理の場合と比べ、蛍光強度が増加していることがわかった。これらの結果から、水熱処理によるＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光強度の増加は、加熱温度が所定温度に達したかどうかを判定する指標であることが示唆された。したがって、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳは、温度判定用ペプチドとして用いることができることが示唆された。
【０１１８】
（実施例７）
（１）未処理の試料の調製
ＨＳＡ３９７−４１３断片の両末端（Ｎ末端およびＣ末端）が標識されたＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰをその濃度が２０μＭになるように、リン酸緩衝生理食塩水６ｍＬに溶解させ、試料Ｊを得た。ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰは、未開裂の状態では、ＭＣＡによってＤＮＰの蛍光が消光されるが、開裂することによってＤＮＰに起因して蛍光強度が上昇するように設計された。
【０１１９】
（２）水熱処理
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた試料Ｈの代わりに、実施例７（１）で得られた試料Ｊを用いたことを除き、実施例５（２）と同様に、１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１２０】
（３）蛍光強度の測定
実施例６（３）において、未処理の試料Ｉが入った容器および水熱処理後の試料Ｉが入った容器の代わりに、実施例７（１）で得られた未処理の試料Ｊが入った容器および実施例７（２）で得られた水熱処理後の試料Ｊが入った容器を用いたことを除き、実施例６（３）と同様に、ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１２１】
実施例７において、ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図１６に示した。図１６に示されるグラフでは、当該グラフ内の写真中の矢印Ａで示される位置での蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１２２】
図１６に示された結果から、ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰについて、中性条件下（ｐＨ７．５）で１６０℃の水熱処理を行なった場合にも、未処理の場合と比べ、蛍光強度が増加していることがわかった。これらの結果から、水熱処理によるＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰの開裂に起因する蛍光強度の増加は、加熱温度が所定温度に達したかどうかを判定する指標であることが示唆された。したがって、ＭＣＡ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＤＮＰは、温度判定用ペプチドとして用いることができることが示唆された。
【０１２３】
（実施例８）
（１）未処理の試料の調製
ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳおよびＨＳＡをそれぞれの濃度が２０μＭおよび３００μＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水１．５ｍＬに溶解させ、試料Ｋを得た。
【０１２４】
（２）水熱処理
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた試料Ｈの代わりに、実施例８（１）で得られた試料Ｋを用いたことを除き、実施例５（２）と同様に、１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１２５】
（３）蛍光強度の測定
実施例６（３）において、未処理の試料Ｉが入った容器および水熱処理後の試料Ｉが入った容器の代わりに、実施例８（１）で得られた未処理の試料Ｋが入った容器および実施例８（２）で得られた水熱処理後の試料Ｋが入った容器を用いたことを除き、実施例６（３）と同様に、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳおよびＨＳＡの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１２６】
実施例８において、未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を図１７（Ａ）、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図１７（Ｂ）に示した。図１７（Ｂ）に示されるグラフでは、図１７（Ａ）に示される写真中の矢印Ａで示される位置での蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１２７】
図１７に示された結果から、ＨＳＡ存在下に水熱処理を行なった場合、ＨＳＡ存在下で未処理の場合と比べ、蛍光強度が増加していることがわかった。したがって、これらの結果から、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳは、ＨＳＡなどの夾雑タンパク質の存在下においても、温度判定用ペプチドとして用いることができることが示唆された。
【０１２８】
（実施例９）
（１）未処理の試料の調製
ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳが濃度６０μＭ、全血〔プロメドクス（ＰＲＯＭＥＤＤＸ）社製、商品名：ＥＤＴＡ  Ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏａｄ（女性２０歳）〕が５倍希釈濃度、グリシンが濃度１Ｍとなるよう３ｍＬに調製し、試料Ｌを得た。
【０１２９】
（２）水熱処理
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた試料Ｈの代わりに、実施例９（１）で得られた試料Ｌを用いたことを除き、実施例５（２）と同様に、１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１３０】
（３）未処理の試料および水熱処理後の試料の評価
未処理の試料Ｌおよび水熱処理後の試料Ｌを１５０００×ｇで３分間の遠心分離に供した。得られた上清が入った容器を可視光下に撮影した。また、得られた上清が入った容器を、トランスイルミネーター（ＵＶＰ社製  型式ＮＭ−１５  ９５−０２１９−０３）によってＵＶ照射しながらオレンジフィルターを介してカメラ（ニコン社製  ＣＯＯＬＰＩＸ  ４５００）によって撮影した。ＵＶ照射下に撮影した画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名：Ｉｍａｇｅ  Ｊ〕とを用い、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３１】
実施例９において、可視光下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を図１８（Ａ）、紫外線照射下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を図１８（Ｂ）、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図１８（Ｃ）に示した。図１８（Ｃ）に示されるグラフでは、当該グラフ内の写真中の矢印Ａで示される位置での蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３２】
図１８に示された結果から、全血存在下に水熱処理を行なった場合、全血存在下で未処理の場合と比べ、蛍光強度が増加していることがわかった。したがって、これらの結果から、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳは、多数の夾雑タンパク質を含む全血などの生体試料の存在下においても、温度判定用ペプチドとして用いることができることが示唆された。
【０１３３】
（実施例１０）
（１）未処理の試料の調製
ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳおよびＴＭＲ−ＳＡ２１をそれぞれの濃度が２００μＭおよび２０μＭとなるように０．１倍リン酸緩衝生理食塩水に溶解させた。得られた溶液７５０μＬと、健常な女性（２２歳）から得た血清〔プロメドクス（ＰＲＯＭＥＤＤＸ）社製、商品名：Ｎｏｒｍａｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｏｏｌ〕３００μＬとを混合した。得られた血清含有溶液１０５０μＬに２Ｍグリシン溶液３７５μＬとリン酸緩衝生理食塩水７５μＬとを添加し、試料Ｍを得た。
【０１３４】
（２）水熱処理
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた試料Ｈの代わりに、実施例９（１）で得られた試料Ｍを用いたことを除き、実施例５（２）と同様に、１６０℃の水熱処理を行なった。
【０１３５】
（３）未処理の試料および水熱処理後の試料の評価
未処理の試料Ｍが入った容器および水熱処理後の試料Ｍが入った容器それぞれを可視光下に撮影した。その結果、容器の壁面に不溶性画分が付着していることが確認された。また、不溶性画分は、ＴＭＲ由来の赤色を呈していることが確認された。また、得られた画像から、画像処理ソフト〔アドビ（Ａｄｏｂｅ）社製、商品名：Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ〕を用いてレッドチャンネルのみのデータ画像を取得した。得られたレッドチャンネルのみのデータ画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名：Ｉｍａｇｅ  Ｊ〕とを用い、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３６】
実施例１０において、可視光下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を図１９（Ａ）、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図１９（Ｂ）に示した。図１９（Ｂ）中、（ａ）は水熱処理後の試料、破線（ｂ）は未処理の試料を示した。図１９（Ｂ）に示されるグラフでは、図１９（Ａ）に示される写真中の枠囲みの部分の蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３７】
つぎに、上清のみをエッペンチューブに移した。上清が入ったエッペンドルフチューブを、トランスイルミネーター（ＵＶＰ社製  型式ＮＭ−１５  ９５−０２１９−０３）によるＵＶ照射下にて、オレンジフィルターをセットしたカメラ（Ｎｉｃｏｎ社製  ＣＯＯＬＰＩＸ  ４５００）によって撮影し、ＵＶ励起像を得た。ＵＶ照射下に撮影した画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名：Ｉｍａｇｅ  Ｊ〕とを用い、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３８】
実施例１０において、紫外線照射下に未処理の試料が入った容器および水熱処理後の試料が入った容器を観察した結果を図２０（Ａ）、ＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した結果を図２０（Ｂ）に示した。図２０（Ｂ）に示されるグラフでは、図２０（Ａ）に示される写真中の矢印Ａで示される位置での蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
【０１３９】
図１９に示された結果から、ガラス管表面に付着する不溶性画分は、ＴＭＲ由来の赤色を呈していることが確認された。また、図２０に示された結果から、水熱処理を行なった場合、未処理の場合と比べ、ＥＤＡＮＳ由来の蛍光が増強されていることが確認された。これらの結果から、水熱処理により、血清中のＨＳＡとＴＭＲ−ＳＡ２１とが結合してＴＭＲ−ＳＡ２１が不溶性画分に移動したことおよび上清中でＤＡＢＣＹＬ−ＨＳＡ３９７−４１３断片−ＥＤＡＮＳが開裂したことが示唆された。なお、ＳＡ２１は、ＨＳＡに対するＫｄが５００μＭ未満であり、ＨＳＡに対する親和性が高いペプチドであった。したがって、これらの結果から、ＨＳＡに対する親和性が高いペプチドは、ＨＳＡが不溶性画分として析出したかどうかを判定するための相分配判定用ペプチドとして用いることができることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１４０】
配列番号：１は、β−アミロイド（１−４０）断片の配列である。
配列番号：２は、β−アミロイド（１−４２）断片の配列である。
配列番号：３は、ＲＳＡ２１の配列である。
配列番号：４は、グルカゴン（１−２９）の配列である。
配列番号：５は、ＡＣＴＨ（７−１１）の配列である。
配列番号：６は、（Ｌｙｓ）１０の配列である。
配列番号：７は、キニノゲンの配列である。
配列番号：８は、Ｃ３ｆ（１６アミノ酸残基）の配列である。
配列番号：９は、ＳＡ２１の配列である。
配列番号：１０は、ＡＣＴＨ（２−１６）の配列である。
配列番号：１１は、（Ｈｉｓ）３の配列である。
配列番号：１２は、フィブリノゲンαの配列である。
配列番号：１３は、ｌｑｐの配列である。
配列番号：１４は、ＡＣＴＨ（１−２４）の配列である。
配列番号：１５は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の配列である。
配列番号：１６は、ＡＣＴＨ（１−３９）の配列である。
配列番号：１７は、ＡＣＴＨ（１−４１）の配列である。
配列番号：１８は、（Ｇｌｕ）１０の配列である。
配列番号：１９は、ダイノルフィンＡの配列である。
配列番号：２０は、（Ｇｌｙ）１０の配列である。
配列番号：２１は、（Ａｒｇ）１０の配列である。
配列番号：２２は、Ｃｐ６の配列である。
配列番号：２３は、Ｃ４ａの配列である。
配列番号：２４は、ＢＮＰの配列である。
配列番号：２５は、ブラジキニンの配列である。
配列番号：２６は、ＨＳＡ２３７−２４９断片の配列である。
配列番号：２７は、Ｃ３ｆ（８アミノ酸残基）の配列である。
配列番号：２８は、ＩＴＩＨ４の配列である。
配列番号：２９は、ＨＳＡ３９７−４１３断片の配列である。
配列番号：３０は、ＨＳＡ５９９−６０９断片の配列である。
配列番号：３１は、Ｃ−ペプチドの配列である。
配列番号：３２は、コリスチンの配列である。４位のＸａａは、６−メチル−１−オキソオクチル−Ｄｂｕまたは６−メチル−１−オキソヘプチル−Ｄｂｕである。３位、４位、５位、８位および９位のＸａａは、Ｄｂｕである。４位のＸａａと１０位のＴｈｒは結合して環を形成する。６位のＬｅｕはＤ−ロイシンである。１０位のＴｈｒは末端ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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