(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列が配列番号１に示される環状ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターであって、
ＰＢＡＤプロモーターと、抑制タンパク遺伝子ａｒａＣと、ＲＰ４伝達開始部位と、クロロマイセチン耐性遺伝子と、Ｒ６Ｋ複製開始部位と、マルチクローニング部位領域と、致死遺伝子ｖｍｉ４８０と、を含み、
前記マルチクローニング部位領域は、少なくとも２つのＡｈｄＩ酵素切断部位を含み、
前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０のヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１位−第６１７位の塩基配列に示され、
前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０は、ＰＢＡＤプロモーターの下流に位置し、ＰＢＡＤプロモーターに制御されることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクター。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が配列番号２に示される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターであって、
請求項１に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターについて、ＡｈｄＩによってマルチクローニング部位領域における２つのＡｈｄＩ酵素切断部位で酵素切断された線形ベクターであることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターのビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用。
【請求項４】
目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を請求項２に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターに連結して、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含む自殺ベクターを取得し、前記目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含む自殺ベクターが形質転換を介してドナー菌に入ってから、そのドナー菌をビブリオに混合して、接合作用により前記目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含む自殺ベクターを伝達させてビブリオに入れて、クロロマイセチン選択を介して、前記目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含む自殺ベクターがビブリオのゲノム標的部位に統合された目的遺伝子挿入突然変異型菌株を取得し、それから、当該目的遺伝子挿入突然変異型菌株を、アラビノースでのｖｍｉ４８０遺伝子の誘導で生成された毒素Ｖｍｉ４８０の逆方向での選択圧において、選別により、目的遺伝子を欠損したクローンを取得し、これにより、目的遺伝子のノックアウトを実施して目的遺伝子を欠損した菌株を取得することを特徴とする、請求項３に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物遺伝子操作分野に属し、具体的に、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビブリオは、海洋環境において最もよく見られる従属栄養細菌である。人間の病気を引き起こすビブリオは、少なくとも１２種類ある。その中、コレラビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、腸炎ビブリオは、人間の健康に対して最も深刻な被害をもたらす。また、多くの種類のビブリオは、水産経済動物の病原体でもあり、それによるビブリオ病は、水産養殖に大量の経済損失を招いてしまう。科学者は、コレラビブリオおよび腸炎ビブリオの幾つかの肝心な病原性遺伝子をずっと前から発見していたが、腸内細菌科の病原性菌よりも、ビブリオの病原性機構に対する認知が依然として相当遅れている。円熟且つ便利な遺伝子操作技術が不足していることは、ビブリオ分子の病原性機構に対する研究の主な障害となる。
【０００３】
細菌ｒｅｃＢＣＤの相同組み換え系（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づく遺伝子ノックアウト技術は、現在複数種の細菌において実施可能な技術である。このような技術において、まず、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片がクロスオーバーＰＣＲ増幅により取得され、ＰＣＲ産物と自殺ベクターとが同じ酵素を用いて酵素切断・精製を行った後で再連結され、大腸菌を形質転換して、外因性断片（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）をもつ自殺プラスミド（ベクター）を取得し、当該自殺プラスミドをさらにドナー菌接合を介して受容体標的細菌に導入する。当該プラスミドは、自身の制限により標的細菌において複製できない。正方向での選択圧（通常、プラスミドでの耐性遺伝子）において、相同組み換えによりゲノムが自殺プラスミドを統合した標的細菌のみが生き残れて挿入突然変異を形成する。逆方向での選択圧において、挿入突然変異細胞に２回目の相同組み換えが発生し、統合態の自殺プラスミドが染色体から離脱して、理論的に１つの野生型細胞および１つの遺伝子欠損突然変異細胞を形成することで、標的遺伝子のノックアウトを実現する。これから分かるように、自殺ベクターは、細菌ｒｅｃＢＣＤの相同組み換え系に基づく遺伝子ノックアウト技術のコア要素である。
【０００４】
現在、細菌ｒｅｃＢＣＤの相同組み換え系に基づく遺伝子ノックアウト技術がビブリオに利用されることは、まだ非常に珍しく、偶然に成功する事例の報告のみが多少出て来ている。大腸菌等の細菌の相同組み換えの利用に成功できる遺伝子ノックアウト技術は、ビブリオ遺伝子ノックアウトに明らかな欠陥が存在する。当該欠陥は、下記の（１）〜（５）を含む。（１）汎用性に欠けており、ある１つのビブリオにおける遺伝子欠如のみに限定される。（２）ｓａｃＢが自殺ベクターの致死遺伝子として広く用いられるが、ｓａｃＢによる致死効果がビブリオにおいて非常に弱いため、逆方向での選択プレートにおける正しい欠損突然変異クローンが出現する割合も非常に低くなり、欠損突然変異についての選別工数が大量に現れてしまう。（３）目的断片クロスオーバーＰＣＲ産物および自殺プラスミドに対してダブル酵素切断（ダブル酵素消化）を行う必要があり、時間および手間がかかる。（４）自殺プラスミド自身が大きくてｍｏｂＩの可動性の遺伝子を持つため、プラスミド接合伝達の効率が低くなるとともに、非特異性統合を引き起こす可能性もある。（５）受容体菌がドナー菌および自殺ベクターとは異なる耐性マークを有さなければならないため、常用の技術の利用が制限される。したがって、従来の自殺ベクターは、ビブリオ遺伝子ノックアウトに用いられる場合に、明らかな限界性を表すため、新たな汎用型自殺ベクターを開発して上記欠陥を解消することで細菌ｒｅｃＢＣＤの相同組み換え系に基づく遺伝子ノックアウト技術のビブリオでの幅広い利用を実現させる要望に迫られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来技術の不足を解消し、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２は、環状ベクターであり、ＰＢＡＤプロモーター、抑制タンパク遺伝子ａｒａＣ、ＲＰ４伝達開始部位（ｏｒｉＴＲＰ４）、クロロマイセチン耐性遺伝子（ｃａｔ）、Ｒ６Ｋ複製開始部位（ｏｒｉＶＲ６Ｋγ）、マルチクローニング部位領域（ＭＣＳ）および致死遺伝子ｖｍｉ４８０を含む。前記マルチクローニング部位領域（ＭＣＳ）は、少なくとも２つのＡｈｄＩ酵素切断部位を含む。前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０のヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１位−第６１７位の塩基配列に示される。前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０は、ＰＢＡＤプロモーターの下流に位置し、ＰＢＡＤプロモーターに制御される。
【０００７】
好ましくは、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２のヌクレオチド配列は、配列番号１に示すように、３８７１ｂｐの塩基を含む。
【０００８】
本発明は、さらに、遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔを提供する。それは、線形ベクターであり、上記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２についてＡｈｄＩを用いてマルチクローニング部位領域における２つのＡｈｄＩ酵素切断部位に対して酵素切断を行った線形ベクターが、遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔである。
【０００９】
好ましくは、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔのヌクレオチド配列は、配列番号２に示すように、３８４８ｂｐの塩基を含む。
【００１０】
前記ＰＢＡＤプロモーター系（ＰＢＡＤプロモーターおよび抑制タンパク遺伝子ａｒａＣを含む）は、厳密に表現型を制御可能なプロモーター系に属する。ブドウ糖は、下流の致死遺伝子ｖｍｉ４８０の発現を完全に閉鎖することができる。アラビノースの誘導のもとで、ｖｍｉ４８０発現が活性化される。アラビノースの誘導濃度の相違により、ｖｍｉ４８０の発現量も調整可能である。ｏｒｉＴＲＰ４がＡＴに富んだ配列であり、ドナー菌で提供された伝達メカニズムの作用のもとで、自殺プラスミドは、その部位から一本鎖伝達を形成する。クロロマイセチン耐性遺伝子は、１回目の統合プラスミド選別の耐性マークを提供する。ｏｒｉＶＲ６Ｋγは、プラスミドが自己複製を行う開始部位である。ＰＢＡＤプロモーター系の制御の下で、ｖｍｉ４８０の発現を活性化してもよいし、発現を抑制してもよい。逆方向での選別を行う際、アラビノースの誘導で、ｖｍｉ４８０は、Ｖｍｉ４８０の発現を活性化させ、猛烈な毒性を有する。２回目の相同組み換えの発生によりプラスミドを欠損した細胞のみが生き残れる。２回目の組み換えの結果、元の細胞が分裂して１つの野生型細胞と１つの遺伝子欠損型細胞を生成する。よって、遺伝子ノックアウトが実現される。マルチクローニング部位領域（ＭＣＳ）は、プラスミドに対して酵素切断を行って、同様に酵素切断されたＰＣＲ産物に連結可能な自殺ベクターを簡便に生成できる。ＭＣＳは、２つのＡｈｄＩ酵素切断部位を含む。ＡｈｄＩ酵素切断を行った後、線形の自殺型Ｔベクターを生成できる。このような場合、ＰＣＲ産物に対して酵素切断を行う必要がなく、精製（ｐｕｒｉｆｙ）後当該ベクターに連結される。
【００１１】
本発明は、遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの遺伝子ノックアウトでの利用をさらに提供する。
【００１２】
好ましくは、前記利用は、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔのビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用である。
【００１３】
さらに好ましくは、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに連結して、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含むｐＬＰ１２Ｔを取得してｐＬＰ１２Ｔ−Ｘと命名し、ｐＬＰ１２Ｔ−Ｘが形質転換を介してドナー菌に入ってから、そのドナー菌を受容体菌に混合して、接合作用によりｐＬＰ１２Ｔ−Ｘを伝達させて受容体菌に入れて、クロロマイセチン選択を介して、ｐＬＰ１２Ｔ−Ｘが受容体菌のゲノム標的部位に統合された細胞のみが生き残れる。ｐＬＰ１２Ｔ−Ｘが受容体菌のゲノム標的部位に統合した目的遺伝子挿入突然変異型菌株を取得し、それから、当該目的遺伝子挿入突然変異型菌株は、アラビノースでのｖｍｉ４８０遺伝子の誘導で生成された毒素Ｖｍｉ４８０の逆方向での選択圧によって、２回目の相同組み換えの発生により自殺ベクター部分を欠如した細胞のみが生き残れる。２回目の組み換えの後、元の目的遺伝子挿入突然変異型菌株は、１つの遺伝子欠損細胞および１つの正常の野生型細胞を生成することができる。よって、逆方向での選択プレートで成長したクローンは、主に目的遺伝子欠損クローンおよび正常の野生型細胞クローンである。選別、例えば、ＰＣＲ検出により、目的遺伝子を欠損したクローンを取得できる。これにより、目的遺伝子をノックアウトする目的を最終的に達成し、目的遺伝子を欠損した菌株を取得する。
【００１４】
前記受容体菌は、ビブリオである。
【００１５】
前記ドナー菌は、欠損型大腸菌β２１６３である。欠損型大腸菌β２１６３がドナー菌として用いられる際、受容体菌が抗生物質耐性を有するか否かを考慮する必要がないため、接合による遺伝子ノックアウト方法の利用が大きく簡便になる。
【発明の効果】
【００１６】
既存の自殺ベクターおよび使用方法よりも、本発明は、下記の有利な作用効果を有する。
（１）本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターは、常用のｓａｃＢ遺伝子の代わりに、斬新な逆方向での選択遺伝子ｖｍｉ４８０を用いる。ｖｍｉ４８０は、致死作用が強く、致死対象が広く、致死効果の発揮がＮａＣｌに影響されないメリットがある。それは、本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターが好塩ビブリオ遺伝子のノックアウトに広く利用されることの基礎となるものである。
（２）本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターのマルチクローニング部位は、２つのＡｈｄＩ部位を導入している。酵素切断後、Ｔベクターを形成してもよい。ベクターが１度形成された後、繰り返し使用される。ＰＣＲ産物についての酵素切断を必要としないとともに、酵素切断部位を考慮する必要もないため、時間が大きく節約される。
（３）本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターは一般的な自殺プラスミドにおける大量の冗長部分を要さないため、自殺ベクターが小さくなり、接合伝達の頻度および正しい統合の確率の向上に寄与する。
（４）ＰＢＡＤプロモーターおよび致死遺伝子の効率性に基づいて、逆方向での選択プレートにおける欠損突然変異クローンの比率が大きく向上し、クローンを選別する工数が大分減少する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２の物理的地図であり、ＡｈｄＩ酵素切断が採用された後、自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔを形成することができる。
【図２】ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの構築のフローチャートである。
【図３】ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターを用いる４種の異なるビブリオの総計６つの遺伝子ノックアウト検出結果を示す。Ｍ：分子量Ｍａｒｋｅｒ；１−３：それぞれビブリオ−アルギノリチカスＥ０６０１のｖａｈ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；４−６：それぞれコレラビブリオＨＮ３７５のｄｅｇＳ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；７−９：それぞれコレラビブリオＨＮ３７５のｖａｓＣ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；１０−１２：それぞれ腸炎ビブリオＥ０６８０のｐｉｌＯ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；１３−１５：それぞれ腸炎ビブリオＥ０６１３５のａｓｃＳ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；１６−１８：それぞれビブリオ・バルニフィカスＡＴＣＣ  ２７５６２のｉｍｐＢ遺伝子野生株、挿入突然変異株、欠損突然変異株の検出結果に対応；Ｎ：水をテンプレートとする陰性照合検出結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下では、具体的な実施例に合わせて、本発明をさらに記述する。本発明のメリットおよび特徴は、その記述により一層明瞭になる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明の範囲について如何なる制限も構成しない。当業者であれば分かるように、本発明の要旨および範囲を逸脱しない限り、本発明の解決手段の詳細および形態を補正や置換してもよいが、これらの補正および置換は、いずれも本発明の保護範囲内に収まる。
【００１９】
以下の実施例１は、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの構築であり、実施例２−７は、自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの代表的なビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用である。ビブリオ−アルギノリチカスは、海洋および川の口の環境に広く分布し、分離ビブリオで最もよく見られる種類であるとともに、複数種の水産養殖動物の条件病原性菌である。それによるビブリオ病の爆発は、巨大な経済損失を引き起こす。コレラビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、腸炎ビブリオは、人間の健康に対して最も深刻な被害をもたらすビブリオの種類である。また、これらの４種のビブリオは、互いに大きな遺伝差異を有する。したがって、これらの４種のビブリオを典型的な代表として選択し、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔのビブリオ遺伝子ノックアウトでの汎用性を検証する。
【００２０】
本実施例におけるあらゆるＰＣＲ増幅プライマーは、表１に示される。
【００２１】
表１  本発明で用いられるプライマー
【表１−１】
0006473510.tif 000002
【表１−２】
0006473510.tif 000003
【表１−３】
0006473510.tif 000004
＊アンダーライン部分は、酵素切断部位である。
【００２２】
実施例１  ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの構築（流れは、図２に示される）
【００２３】
（１）プラスミドｐＳＷ２３Ｔ（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｂｕｒｒｕｓによって提供、文献Ｄｅｍａｒｒｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５６：２４５−２５５を参照）をテンプレートとして、プライマーｐＳＷ２３Ｔ−Ｆ／ｐＳＷ２３Ｔ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行う。ポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ社の高性能のＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（特別な説明がなければ、本発明で用いられるポリメラーゼは、何れもその酵素である）である。ＰＣＲ増幅条件は、酵素の説明書を参照した。ＰＣＲ産物が取得され、当該ＰＣＲ産物は、ｏｒｉＶＲ６Ｋγ、ｏｒｉＴＲＰ４、ｃａｔ、ＭＣＳ部位の断片を含む。
【００２４】
（２）ｐＳＷ２５Ｔ−ｃｃｄＢ（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｂｕｒｒｕｓによって提供、ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｍａｚｅｌ／ＰＳＷ２５Ｔ−ｃｃｄＢ．ｄｏｃｘを参照）をテンプレートとして、プライマーｐＳＷ２５Ｔ−Ｆ／ｐＳＷ２５Ｔ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ産物が取得され、当該ＰＣＲ産物は、ＰＴＡＣプロモーター、ｃｃｄＢおよび１つのＡｈｄＩ酵素切断部位断片を含む。
【００２５】
（３）上記ステップ（１）と（２）の２種のＰＣＲ産物のそれぞれに対してＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩダブル酵素切断を行い、酵素切断産物をさらにＰＣＲ産物精製試薬箱（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製する。
【００２６】
（４）２つの精製産物をＴ４  ＤＮＡ連結酵素（ＴａＫａＲａ）で連結し、連結産物（プラスミドｐＬＰ１０）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布する。プライマーｐＬＰ１０Ｌ−ＴＦ１／ｐＬＰ１０Ｌ−ＴＲ１およびｐＬＰ１０Ｌ−ＴＦ２／ｐＬＰ１０Ｌ−ＴＲ２により、プレートでのクローンをＰＣＲ選別する。正しい陽性クローンＰＣＲ産物の長さは、それぞれ１０６５ｂｐ、５３７ｂｐである。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、正しいクローンを共同して特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１０を含む。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１０を抽出する。プラスミドｐＬＰ１０のマルチクローニング部位ＡｈｄＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ−ＡｈｄＩ−ＮｈｅＩは、それぞれプライマーｐＳＷ２３Ｔ−ＦおよびｐＳＷ２５Ｔ−Ｆの５’端に酵素切断部位を導入することで形成される。
【００２７】
（５）プラスミドｐＬＰ１０をテンプレートとして、プライマーｐＬＰ１０−Ｆ／ｐＬＰ１０−Ｒを用いて逆方向ＰＣＲ増幅を行って断片ｐＬＰ１０−１を取得することで、ｐＬＰ１０における完全なｃｃｄＢ遺伝子を除去する。大腸菌ＬＰ７９（構築方法は、発明者の文章、Ｃａｒｒａｒｏ  Ｎ，Ｍａｔｔｅａｕ  Ｄ，Ｌｕｏ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，１０（１０）：ｅ１００４７１４を参照）ゲノムをテンプレートとして、ｖｍｉ４８０−Ｆ／ｖｍｉ４８０−Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行って完全なｖｍｉ４８０遺伝子断片を取得する。そのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１位−第６１７位の塩基配列に示される。大腸菌ＬＰ７９は、事前に接合伝達により擬態ビブリオＶＭ５７３からの遺伝子島ＭＧＩＶｍｉ１を取得しておく。当該遺伝子島は、ｖｍｉ４８０致死遺伝子を含有する。
【００２８】
（６）ＰＣＲ断片ｐＬＰ１０−１とｖｍｉ４８０遺伝子断片は、それぞれＮｄｅＩ／ＸｈｏＩダブル酵素切断を行って精製した後、Ｔ４  ＤＮＡ連結酵素（リガーゼ）により連結され、連結産物（プラスミドｐＬＰ１１）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｐＬＰ１１Ｌ−ＴＦ／ｐＬＰ１１Ｌ−ＴＲプライマーにより、プレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行う。正しいクローン陽性ＰＣＲ産物の長さは、５１５ｂｐである。ＰＣＲ断片に対してさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１１を含有する。正しいクローンを拡大培養して、プラスミドｐＬＰ１１を抽出する。
【００２９】
（７）プラスミドｐＬＰ１１をテンプレートとして、プライマーｐＬＰ１１−Ｆ／ｐＬＰ１１−Ｒを用いて逆方向ＰＣＲ増幅を行って断片ｐＬＰ１１−１を取得することで、ｐＬＰ１１の完全なＰＴＡＣプロモーター系を除去する。ｐＢＡＤ３０プラスミド（普如汀生物、ＮＴＣＣ  １８０９）をテンプレートとして、プライマーｐＢＡＤ３０−ＰＦ／ｐＢＡＤ３０−ＰＲを用いて増幅し、ｐＢＡＤ３０プラスミドにおけるＰＢＡＤプロモーター部分を取得して、増幅断片ｐＢＡＤ３０−１と命名する。増幅断片ｐＢＡＤ３０−１の両端は、ｐＬＰ１１−１の両端と同じ配列をそれぞれ含有する。シームレスクローン試薬箱（Ｖａｚｙｍｅ）を用いてｐＬＰ１１−１およびｐＢＡＤ３０−１に対して体外組み換えを行い、組み換え産物（プラスミドｐＬＰ１２）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｐＬＰ１２Ｌ−ＴＦ／ｐＬＰ１２Ｌ−ＴＲプライマーにより、プレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行う。正しい陽性クローンＰＣＲ産物の長さは、１１０４ｂｐである。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、組み換え産物−プラスミドｐＬＰ１２を含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２、即ち、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２を抽出する。そのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。具体的な構造は、図１に示される。
【００３０】
（８）ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、プライマーＳＴＶＵ−Ｆ／ＳＴＶＵ−Ｒで増幅する。増幅産物についてＰＣＲ産物精製試薬箱の精製を介した後にＡｈｄＩ酵素切断を行い、酵素切断の後にＤＮＡ濃縮試薬箱を用いて精製（中鼎）を行って、線形化されたビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔ（そのヌクレオチド配列は、配列番号２に示される）を取得する。ｐＬＰ１２Ｔ二本鎖の３’端のそれぞれに、突起する塩基Ｔが１つあるため、通常のＤＮＡポリメラーゼ増幅によって生成されたＰＣＲ産物と直接連結可能である。両者とも酵素切断を行う必要がない。
【００３１】
実施例２  ｐＬＰ１２Ｔを用いたビブリオ−アルギノリチカス溶血素遺伝子（ｖａｈ）のノックアウト
【００３２】
（１）クロスオーバーＰＣＲ方式による増幅を介してビブリオ−アルギノリチカスＥ０６０１のｖａｈ遺伝子フレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれｖａｈ−ＭＦ１／ｖａｈ−ＭＲ１、ｖａｈ−ＭＦ２／ｖａｈ−ＭＲ２であり、テンプレートは、ビブリオ−アルギノリチカスＥ０６０１ゲノムＤＮＡである。第１サイクルでは、ＰＣＲ産物ｖａｈ１、ｖａｈ２がそれぞれ産出される。ｖａｈ１、ｖａｈ２は、ＰＣＲ産物精製試薬箱（Ａｘｙｇｅｎ）での精製を介した後、等体積混合して第２サイクルのＰＣＲのテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲは、プライマーｖａｈ−ＭＦ１／ｖａｈ−ＭＲ２を使用し、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲ増幅条件は当該酵素の説明書を参照することにより、第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００３３】
（２）第２サイクルのＰＣＲ産物は、精製された後、Ｔ４  ＤＮＡ連結酵素を用いて、上記ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結される。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈ）で、直接大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｖａｈ−ＭＦ１／ｖａｈ−ＭＲ２プライマーにより、プレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行う。正しいクローンは、長さ６６０ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈを含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈを抽出する。
【００３４】
（３）ｐＬＰ１２−ｖａｈで、大腸菌β２１６３細胞（従来技術における菌株、構築方法はＤｅｍａｒｒｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｒｏａｄ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ  Ｒ３８８  ｐｌａｓｍｉｄ（ＩｎｃＷ）ａｎｄ  ＲＰ４  ｐｌａｓｍｉｄ（ＩｎｃＰ  ａｌｐｈａ）ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｇｎａｔｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５６：２４５−２５５を参照）を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件は、電圧１８００Ｖ、感電時間５ｍｓである。感電後、細胞を３７℃で１ｈｒ回復培養して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。一晩培養（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）して、任意のクローンを選択し、精製および保存することで、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｖａｈ）を取得する。
【００３５】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｖａｈ）および受容体菌ビブリオ−アルギノリチカスＥ０６０１を一晩培養する。１００μＬのドナー菌を取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、４００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して丁寧に上清液を捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で６ｈｒ転置培養する。
【００３６】
（５）１ｍｌの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（０．３％Ｄ−ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生して染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈが統合された挿入突然変異ビブリオ−アルギノリチカス細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてｖａｈ−ＭＦ１／ｖａｈ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは１２１８ｂｐおよび６６０ｂｐの２つのストリップ（図３でのレーン２）を発生する。このようにして、ｖａｈ挿入突然変異株を取得する。
【００３７】
（６）ｖａｈ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で３時間培養された後、勾配希釈され、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレート上で、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｈを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞は、２回目の組み換えをした後、１つのｖａｈ遺伝子欠損の細胞と野生型ｖａｈ遺伝子を含む１つの細胞とを生成する。
【００３８】
（７）ｖａｈ−ＭＦ１／ｖａｈ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいｖａｈ遺伝子欠損クローンは、６６０ｂｐのストリップ（図３でのレーン３）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、１２１８ｂｐのストリップ（図３でのレーン１）を生成する。正しいｖａｈ遺伝子欠損クローンについてＰＣＲ産物シークエンシング検証を経て、ｖａｈ遺伝子欠損株を取得することにより、ビブリオ−アルギノリチカスｖａｈの遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された１６個のクローンのうちの１２個が正しいｖａｈ遺伝子欠損クローンである。
【００３９】
実施例３  ｐＬＰ１２Ｔを用いたコレラビブリオペリプラズムセリンペプチダーゼ（ｄｅｇＳ）のノックアウト
【００４０】
（１）クロスオーバーＰＣＲ増幅によりコレラビブリオＨＮ３７５のｄｅｇＳ遺伝子フレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれｄｅｇｓ−ＭＦ１／ｄｅｇｓ−ＭＲ１、ｄｅｇｓ−ＭＦ２／ｄｅｇｓ−ＭＲ２であり、テンプレートはコレラビブリオＨＮ３７５ゲノムＤＮＡである。２つのＰＣＲ産物は、等体積混合された後に精製され、第２サイクルのＰＣＲのテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲは、プライマーとしてｄｅｇｓ−ＭＦ１／ｄｅｇｓ−ＭＲ２を使用し、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００４１】
（２）上記第２サイクルのＰＣＲ産物を、自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結させる。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳ）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｄｅｇｓ−ＭＦ１／ｄｅｇｓ−ＭＲ２プライマーによりプレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行うと、正しいクローンは、長さ９２６ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳを含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳを抽出する。
【００４２】
（３）ｐＬＰ１２−ｄｅｇＳで、大腸菌β２１６３細胞を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件および感電後の細胞培養条件は、実施例２と同様である。任意のクローンを選択、精製および保存することで、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｄｅｇＳ）を取得する。
【００４３】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｄｅｇＳ）および受容体菌コレラビブリオＨＮ３７５を一晩培養する。１００μＬのドナー菌を取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで３ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、５００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を丁寧に捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で７ｈｒ転置培養する。
【００４４】
（５）１ｍｌの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（１０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生して染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳが統合された挿入突然変異コレラビブリオ細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてｄｅｇＳ−ＭＦ１／ｄｅｇＳ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは１４９６ｂｐと９２６ｂｐの２つのストリップ（図３でのレーン５）を生成する。このようにして、ｄｅｇＳ挿入突然変異株を取得する。
【００４５】
（６）ｄｅｇＳ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で３時間培養された後、勾配希釈され、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞に２回目の組み換えが発生した後、ｄｅｇＳ遺伝子を欠損した１つの細胞と野生型ｄｅｇＳ遺伝子を含む１つの細胞が生成される。
【００４６】
（７）ｄｅｇＳ−ＭＦ１／ｄｅｇＳ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいｄｅｇＳ遺伝子欠損クローンは、９２６ｂｐのストリップ（図３でのレーン６）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、１４９６ｂｐのストリップ（図３でのレーン４）を生成する。正しいｄｅｇＳ遺伝子欠損クローンについてさらにＰＣＲ産物シークエンシング検証を経ると、ｄｅｇＳ遺伝子欠損株が取得され、コレラビブリオｄｅｇＳ遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された１６個のクローンのうちの８個が正しいｄｅｇＳ遺伝子欠損クローンである。
【００４７】
実施例４  ｐＬＰ１２Ｔを用いたコレラビブリオＶＩ型分泌システム遺伝子（ｖａｓＣ）のノックアウト
【００４８】
（１）クロスオーバーＰＣＲ増幅によりコレラビブリオＨＮ３７５のｖａｓＣ遺伝子フレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれｖａｓＣ−ＭＦ１／ｖａｓＣ−ＭＲ１、ｖａｓＣ−ＭＦ２／ｖａｓＣ−ＭＲ２であり、テンプレートは、コレラビブリオＨＮ３７５ゲノムＤＮＡである。２つのＰＣＲ産物は、精製された後、等体積混合して第２サイクルのＰＣＲのテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲプライマーｖａｓＣ−ＭＦ１／ｖａｓＣ−ＭＲ２では、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００４９】
（２）第２サイクルのＰＣＲ産物は、精製された後、実施例１で作製された遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結される。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣ）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｖａｓＣ−ＭＦ１／ｖａｓＣ−ＭＲ２プライマーによりプレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行うと、正しいクローンは、長さ９２５ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片について、さらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣ）を含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣを抽出する。
【００５０】
（３）ｐＬＰ１２−ｖａｓＣで、大腸菌β２１６３細胞を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件および感電後の細胞培養条件は、実施例２と同様である。任意のクローンを選択、精製および保存すると、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｖａｓＣ）が取得される。
【００５１】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｖａｓＣ）および受容体菌コレラビブリオＨＮ３７５を一晩培養する。１００μＬのドナー菌を取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、６００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理し、上清液を丁寧に捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で８ｈｒ転置培養する。
【００５２】
（５）１ｍｌの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（０．３％Ｄ−ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生して染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣが統合された挿入突然変異コレラビブリオ細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてｖａｓＣ−ＭＦ１／ｖａｓＣ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは、１６３０ｂｐと９２５ｂｐとの２つのストリップ（図３でのレーン８）を生成する。このようにして、ｖａｓＣ挿入突然変異株を取得する。
【００５３】
（６）ｖａｓＣ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で３時間培養された後、勾配希釈され、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｖａｓＣを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞は、２回目の組み換えにより、ｖａｓＣ遺伝子を欠損した１つの細胞と野生型ｖａｓＣ遺伝子を含む１つの細胞を生成する。
【００５４】
（７）ｖａｓＣ−ＭＦ１／ｖａｓＣ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいｖａｓＣ遺伝子欠損クローンは、９２５ｂｐのストリップ（図３でのレーン９）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、１６３０ｂｐストリップ（図３でのレーン７）を生成する。正しいｖａｓＣ遺伝子欠損クローンについてさらにＰＣＲ産物シークエンシング検証を経ると、ｖａｓＣ遺伝子欠損株が取得されて、コレラビブリオｖａｓＣ遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された１６個のクローンのうちの７個が正しいｖａｓＣ遺伝子欠損クローンである。
【００５５】
実施例５  ｐＬＰ１２Ｔを用いた腸炎ビブリオＩＶ型鞭毛合成遺伝子（ｐｉｌＯ）のノックアウト
【００５６】
（１）クロスオーバーＰＣＲ増幅により腸炎ビブリオＥ０６８０のｐｉｌＯ遺伝子フレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれｐｉｌＯ−ＭＦ１／ｐｉｌＯ−ＭＲ１、ｐｉｌＯ−ＭＦ２／ｐｉｌＯ−ＭＲ２であり、テンプレートは、腸炎ビブリオＥ０６８０ゲノムＤＮＡである。２つのＰＣＲ産物は、精製された後、等体積混合して第２サイクルのＰＣＲテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲプライマーｐｉｌＯ−ＭＦ１／ｐｉｌＯ−ＭＲ２では、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる。第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００５７】
（２）第２サイクルのＰＣＲ産物は、精製された後、ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結される。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯ）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｐｉｌＯ−ＭＦ１／ｐｉｌＯ−ＭＲ２プライマーによりプレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行うと、正しいクローンは、大きさが８１５ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行って、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯを含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯを抽出する。
【００５８】
（３）ｐＬＰ１２−ｐｉｌＯで、大腸菌β２１６３細胞を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件および感電後の細胞培養条件は、実施例２と同様である。任意のクローンを選択、精製および保存すると、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｐｉｌＯ）が取得される。
【００５９】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｐｉｌＯ）および受容体菌腸炎ビブリオＥ０６８０を一晩培養する。１００μＬのドナー菌を取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、４００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して、上清液を丁寧に捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で８ｈｒ転置培養する。
【００６０】
（５）１ｍｌの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（０．３％Ｄ−ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生して染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯが統合された挿入突然変異腸炎ビブリオ細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてｐｉｌＯ−ＭＦ１／ｐｉｌＯ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは、１２１４ｂｐと８１５ｂｐとの２つのストリップ（図３でのレーン１１）を生成する。このようにして、ｐｉｌＯ挿入突然変異株を取得する。
【００６１】
（６）ｐｉｌＯ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で３時間培養された後、勾配希釈され、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｐｉｌＯを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞に２回目の組み換えが発生すると、ｐｉｌＯ遺伝子を欠損した１つの細胞と野生型ｐｉｌＯ遺伝子を含む１つの細胞とが生成される。
【００６２】
（７）ｐｉｌＯ−ＭＦ１／ｐｉｌＯ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいｐｉｌＯ遺伝子欠損クローンは、８１５ｂｐのストリップ（図３でのレーン１２）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、１２１４ｂｐのストリップ（図３でのレーン１０）を生成する。正しいｐｉｌＯ遺伝子欠損クローンについてさらにＰＣＲ産物シークエンシング検証を経ると、ｐｉｌＯ遺伝子欠損株が取得され、腸炎ビブリオｐｉｌＯ遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された１６個のクローンのうちの７個が正しいｐｉｌＯ遺伝子欠損クローンである。
【００６３】
実施例６  ｐＬＰ１２Ｔを用いた腸炎ビブリオプレタンパク質伝達酵素遺伝子（ａｓｃＳ）のノックアウト
【００６４】
（１）クロスオーバーＰＣＲにより腸炎ビブリオＥ０６１３５のａｓｃＳ遺伝子を増幅して、ａｓｃＳフレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれａｓｃＳ−ＭＦ１／ａｓｃＳ−ＭＲ１、ａｓｃＳ−ＭＦ２／ａｓｃＳ−ＭＲ２であり、テンプレートは、腸炎ビブリオＥ０６１３５ゲノムＤＮＡである。２つのＰＣＲ産物は、等体積混合されて精製された後、第２サイクルのＰＣＲのテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲプライマーａｓｃＳ−ＭＦ１／ａｓｃＳ−ＭＲ２では、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００６５】
（２）第２サイクルのＰＣＲ産物は、精製された後、上記ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結される。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ａｓｃＳ）で、大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ａｓｃＳ−ＭＦ１／ａｓｃＳ−ＭＲ２プライマーによりプレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行うと、正しいクローンは、７０３ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１２−ａｓｃＳを含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ａｓｃＳを抽出する。
【００６６】
（３）ｐＬＰ１２−ａｓｃＳで、大腸菌β２１６３細胞を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件および感電後の細胞培養条件は、実施例２と同様である。任意のクローンを選択、精製および保存すると、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ａｓｃＳを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ａｓｃＳ）が取得される。
【００６７】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ａｓｃＳ）および受容体菌腸炎ビブリオＥ０６１３５を一晩培養する。１００μＬのドナー菌を取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、４００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで２ｍｉｎ遠心処理して上清液を丁寧に捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で８ｈｒ転置培養する。
【００６８】
（５）１ｍＬの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（０．３％Ｄ−ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生して染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ａｓｃＳが統合された挿入突然変異腸炎ビブリオ細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてａｓｃＳ−ＭＦ１／ａｓｃＳ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは、９５２ｂｐと７０３ｂｐとの２つのストリップ（図３でのレーン１４）を生成する。このようにして、ａｓｃＳ挿入突然変異株を取得する。
【００６９】
（６）ａｓｃＳ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で４時間培養され、勾配希釈されてから、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｄｅｇＳを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞に２回目の組み換えが発生した後、ａｓｃＳ遺伝子を欠損した１つの細胞と野生型ａｓｃＳ遺伝子を含む１つの細胞とが生成される。
【００７０】
（７）ａｓｃＳ−ＭＦ１／ａｓｃＳ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいａｓｃＳ遺伝子欠損クローンは、７０３ｂｐのストリップ（図３でのレーン１５）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、９５２ｂｐのストリップ（図３でのレーン１３）を生成する。正しいａｓｃＳ遺伝子欠損クローンについてさらにＰＣＲ産物シークエンシング検証を行うと、ａｓｃＳ遺伝子欠損株が取得され、腸炎ビブリオａｓｃＳ遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された１６個のクローンのうちの３個が正しいａｓｃＳ遺伝子欠損クローンである。
【００７１】
実施例７  ｐＬＰ１２Ｔを用いたビブリオ・バルニフィカスＶＩ型分泌システム遺伝子（ｉｍｐＢ）のノックアウト
【００７２】
（１）クロスオーバーＰＣＲ増幅によりビブリオ・バルニフィカスＡＴＣＣ  ２７５６２のｉｍｐＢ遺伝子フレーム内欠損結合断片を取得する。第１サイクルのＰＣＲプライマーペアは、それぞれｉｍｐＢ−ＭＦ１／ｉｍｐＢ−ＭＲ１、ｉｍｐＢ−ＭＦ２／ｉｍｐＢ−ＭＲ２であり、テンプレートは、ビブリオ・バルニフィカスＡＴＣＣ  ２７５６２ゲノムＤＮＡである。２つのＰＣＲ産物は、精製された後、等体積混合して第２サイクルのＰＣＲのテンプレートとする。第２サイクルのＰＣＲは、プライマーｉｍｐＢ−ＭＦ１／ｉｍｐＢ−ＭＲ２を使用して、通常のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第２サイクルのＰＣＲ産物を取得する。
【００７３】
（２）第２サイクルのＰＣＲ産物は、精製された後、実施例１で作製されたビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに直接連結される。連結産物（プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢ）で、直接大腸菌ＤＨ５α  λｐｉｒ細胞を形質転換して、ＬＢプレート（２０μｇ／ｍｌクロロマイセチン、０．３％Ｄ−ブドウ糖を含む）に塗布する。ｉｍｐＢ−ＭＦ１／ｉｍｐＢ−ＭＲ２プライマーによりプレートでのクローンに対してＰＣＲ選別を行うと、正しいクローンは、長さ９０９ｂｐの増幅ストリップを生成する。ＰＣＲ断片についてさらにシークエンシング検証を行い、共同して正しいクローンを特定する。当該正しいクローンは、連結産物−プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢを含有する。正しいクローンを拡大培養し、プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢを抽出する。
【００７４】
（３）ｐＬＰ１２−ｉｍｐＢで、大腸菌β２１６３細胞を電気的に形質転換する。電気的な形質転換の条件および感電後の細胞培養条件は、実施例２と同様である。一晩培養を経て、任意のクローンを選択、精製および保存すると、自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢを含むドナー菌−大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｉｍｐＢ）が取得される。
【００７５】
（４）大腸菌β２１６３（ｐＬＰ１２−ｉｍｐＢ）および受容体菌ビブリオ・バルニフィカスＡＴＣＣ  ２７５６２を一晩培養する。ドナー菌を１００μＬ取って１００μＬの受容体菌に混合して、８０００ｇで３ｍｉｎ遠心処理して上清液を捨て、６００μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再び８０００ｇで３ｍｉｎ遠心処理して、上清液を丁寧に捨てる。１０μＬの新鮮なＬＢ培地を加えて再懸濁し、再懸濁液を全部吸入してＬＢ寒天プレート上に滴下する。スーパークリーンベンチで空気乾燥させた後、３７℃で７ｈｒ転置培養する。
【００７６】
（５）１ｍＬの新鮮なＬＢ培地を上記培養物に十分に吹き付け懸濁し、１００μＬを取ってＬＢ寒天プレート（０．３％Ｄ−ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌクロロマイセチンを含む）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、１回目の相同組み換えが発生した後で染色体に自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢが統合された挿入突然変異ビブリオ・バルニフィカス細胞のみが成長できる。クローンをランダムに選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲプライマーとしてｉｍｐＢ−ＭＦ１／ｉｍｐＢ−ＭＲ２を用いると、正しいクローンは、１２９０ｂｐと９０９ｂｐとの２つのストリップ（図３でのレーン１７）を生成する。このようにして、ｉｍｐＢ挿入突然変異株を取得する。
【００７７】
（６）ｉｍｐＢ挿入突然変異株は、ＬＢ（０．３％Ｄ−ブドウ糖）で３時間培養され、勾配希釈されてから、それぞれを１００μＬ取ってＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）に塗布して、３７℃で一晩培養する。このプレートでは、２回目の相同組み換えが発生して染色体に統合態の自殺プラスミドｐＬＰ１２−ｉｍｐＢを欠損した細胞のみが生き残れる。細菌細胞に２回目の組み換えが発生した後、ｉｍｐＢ遺伝子を欠損した１つの細胞と野生型ｉｍｐＢ遺伝子を含む１つの細胞とが生成される。
【００７８】
（７）ｉｍｐＢ−ＭＦ１／ｉｍｐＢ−ＭＲ２プライマーによりＬＢ寒天プレート（０．２％Ｌ−アラビノース）でのクローンに対してＰＣＲ検出を行うと、正しいｉｍｐＢ遺伝子欠損クローンは、９０９ｂｐのストリップ（図３でのレーン１８）を生成し、２回目の組み換えにより形成された野生型クローンは、１２９０ｂｐのストリップ（図３でのレーン１６）を生成する。正しいｉｍｐＢ遺伝子欠損クローンについてＰＣＲ産物シークエンシング検証を経ると、ｉｍｐＢ遺伝子欠損株が取得され、腸炎ビブリオｉｍｐＢ遺伝子ノックアウトを完成させる。本実施例では、逆方向での選択プレート（１０−１希釈）でランダムに選択された２０個のクローンのうちの６個が正しいｉｍｐＢ遺伝子欠損クローンである。
【００７９】
上記実施例２−７における逆方向での選択プレートの何れにもＮａＣｌが存在するが、欠損突然変異株が変わらずに高い出現比率を有するため、致死遺伝子が役割を果たすとともに、ＮａＣｌの存在に影響されないことを表明した。
【００８０】
（付記）
（付記１）
環状ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２において、
ＰＢＡＤプロモーターと、抑制タンパク遺伝子ａｒａＣと、ＲＰ４伝達開始部位と、クロロマイセチン耐性遺伝子と、Ｒ６Ｋ複製開始部位と、マルチクローニング部位領域と、致死遺伝子ｖｍｉ４８０と、を含み、
前記マルチクローニング部位領域は、少なくとも２つのＡｈｄＩ酵素切断部位を含み、
前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０のヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１位−第６１７位の塩基配列に示され、
前記致死遺伝子ｖｍｉ４８０は、ＰＢＡＤプロモーターの下流に位置し、ＰＢＡＤプロモーターに制御されることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２。
【００８１】
（付記２）
前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されることを特徴とする、付記１に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２。
【００８２】
（付記３）
線形ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔにおいて、
付記１に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２について、ＡｈｄＩを用いてマルチクローニング部位領域における２つのＡｈｄＩ酵素切断部位に対して酵素切断を行った線形ベクターが、当該遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔであることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔ。
【００８３】
（付記４）
前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔのヌクレオチド配列は、配列番号２に示されることを特徴とする、付記３に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔ。
【００８４】
（付記５）
付記３に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔの遺伝子ノックアウトでの利用。
【００８５】
（付記６）
前記利用は、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔのビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用であることを特徴とする、付記５に記載の利用。
【００８６】
（付記７）
目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターｐＬＰ１２Ｔに連結して、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含むｐＬＰ１２Ｔを取得してｐＬＰ１２Ｔ−Ｘと命名し、ｐＬＰ１２Ｔ−Ｘが形質転換を介してドナー菌に入ってから、そのドナー菌を受容体菌に混合して、接合作用によりｐＬＰ１２Ｔ−Ｘを伝達させて受容体菌に入れて、クロロマイセチン選択を介して、ｐＬＰ１２Ｔ−Ｘが受容体菌のゲノム標的部位に統合された目的遺伝子挿入突然変異型菌株を取得し、それから、当該目的遺伝子挿入突然変異型菌株を、アラビノースでのｖｍｉ４８０遺伝子の誘導で生成された毒素Ｖｍｉ４８０の逆方向での選択圧において、選別により、目的遺伝子を欠損したクローンを取得し、これにより、目的遺伝子のノックアウトを実施して目的遺伝子を欠損した菌株を取得することを特徴とする、付記５に記載の利用。
【００８７】
（付記８）
前記受容体菌は、ビブリオであることを特徴とする、付記７に記載の利用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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