(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又は抗体断片と治療剤とのコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが、リンカーを介して前記治療剤に接続された抗体又は抗体断片結合部分を含有し、前記リンカーが1つ以上のポリエチレングリコール部分をさらに含み、前記抗体又は抗体断片結合部分が、一般式:
【化１】
0006612860.tif 000088
(式中、Prは、前記抗体又は抗体断片を表し、各Nuは、前記抗体又は抗体断片のシステイン、リシン又はヒスチジン残基中に存在する硫黄又はアミン基を表すか、又はNuは、前記抗体又は抗体断片Prに付加されているポリヒスチジンタグに存在するヒスチジン残基に存在するイミダゾール基を表す)
を有し、前記リンカーが、
ａ）式(Ib)の基に直接隣接する、場合により置換されたフェニル基、及びまた前記フェニル基に隣接する-NHC(O)-又は-C(O)NH-基を含む部分であって、式:
【化２】
0006612860.tif 000089
(式中、Fは上記式Ibを有する);
を有する、部分;及び
ｂ）式:
【化３】
0006612860.tif 000090
(式中、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す)
の基;
を含み、前記ポリエチレングリコール部分が、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子又はC1〜4アルキル基を表す)の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖であるか又はこれを含み、前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が2個〜50個のエチレングリコール単位を含有し、前記治療剤が細胞毒性剤である、コンジュゲート。
【請求項２】
前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が、12個〜50個のエチレングリコール単位を含有する、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が、12、20、24、36、40又は48の反復単位を有する直鎖又は分枝鎖ポリエチレングリコールである、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が24の反復単位を有する直鎖又は分枝鎖ポリエチレングリコールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ペンダントポリエチレングリコール鎖を2つ以上含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記AAが1〜5個のアミノ酸を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記AAが、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、及びPhe-Lysから選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記AAが、Val-Citである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記治療剤がオーリスタチン又はメイタンシノイドである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
抗体又は抗体断片と反応することができ、治療剤を含む、コンジュゲート試薬であって、前記試薬が、式:
【化４】
0006612860.tif 000091
(式中、Wはケト基を表し、A及びBの各々は、独立して、CH2基を表し、各Lは、独立して、脱離基を表す)
の官能グルーピングを含み、
前記コンジュゲート試薬が、前記治療剤と式(II)又は(II’)の基との間にリンカーを含み、前記リンカーが、
ａ）式(II)又は(II’)の基に直接隣接する、場合により置換されたフェニル基、及びまた前記フェニル基に隣接する-NHC(O)-又は-C(O)NH-基を含む部分であって、式:
【化５】
0006612860.tif 000092
(式中、Fは上記式II又はII’を有する);
を有する、部分;及び
ｂ）式:
【化６】
0006612860.tif 000093
(式中、AAはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す)
の基;
を含み、前記ポリエチレングリコール部分が、式-CH2CH2OR(式中、Rは水素原子又はC1〜4アルキル基を表す)の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖であるか又はこれを含み、前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が2個〜50個のエチレングリコール単位を含有し、前記治療剤が細胞毒性剤である、コンジュゲート試薬。
【請求項１１】
各Lが、-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3、ハロゲン、又は-Oφ(式中、Pは、水素原子又はアルキル、アリール、若しくはアルキル-アリール基を表すか、或いは-(CH2CH2O)n-(式中、nは、2以上の数である)部分を含む基であり、R2及びR3の各々は、独立して、水素原子、C1〜4アルキル基、又はP基を表し、φは、少なくとも1個の電子吸引性置換基を含有する置換アリール基を表す)を表す、請求項10に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１２】
各Lが、式-SP又は-SO2Pの基を表し、Pが、トシル基又は-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表す、請求項10に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１３】
2つ以上の前記ペンダントポリエチレングリコール鎖を含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１４】
前記ペンダントポリエチレングリコール鎖が、12、20、24、36、40又は48の反復単位を有する直鎖又は分枝鎖ポリエチレングリコールである、請求項10〜13のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１５】
前記AAが1〜5個のアミノ酸を含む、請求項10〜14のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１６】
前記AAが、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、及びPhe-Lysから選択される、請求項10〜15のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１７】
前記AAが、Val-Citである、請求項10〜16のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１８】
前記治療剤がオーリスタチン又はメイタンシノイドである、請求項10〜17のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
【請求項１９】
請求項10〜18のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬を、抗体又は抗体断片と反応させる工程を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコンジュゲートの調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、新規なコンジュゲート及び新規なコンジュゲート試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの研究調査が、広範囲の適用のためのペプチド及びタンパク質への、多種多様なペイロード、例えば治療剤、診断剤、及び標識化剤のコンジュゲーションに充てられている。タンパク質又はペプチドは、それ自体が治療的特性を有してもよい及び/又は結合性タンパク質であってもよい。
【０００３】
ペプチド及びタンパク質は治療剤としての潜在的使用を有し、コンジュゲーションはそれらの特性を改善する1つのやり方である。例えば、水溶性の合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、治療活性ペプチド又はタンパク質をコンジュゲートするために広く使用されている。これらの治療コンジュゲートは、好ましくは循環時間を延長すること及びクリアランス速度を減少すること、全身性毒性を減少させること、並びにいくつかの場合において臨床的効力の増加を提示することによって、薬物動態を変えることが示されてきた。タンパク質にポリエチレングリコール、PEGを共有結合でコンジュゲートする方法は、共通して「PEG化」として知られている。PEG鎖は、ペイロード、例えば治療剤、診断剤、又は標識化剤を担持することができる。
【０００４】
結合性タンパク質、特に抗体又は抗体断片は、頻繁にコンジュゲートされる。標的細胞及び分子の表面上の特異的マーカーのための結合性タンパク質の特異性は、それら自体で治療剤若しくは診断剤として又は治療剤、診断剤、若しくは標識化剤を含み得るペイロードのための担体としてのいずれかで、それらの広範な使用をもたらしている。標識及びレポーター基、例えばフルオロフォア、放射性同位体及び酵素にコンジュゲートされているこのようなタンパク質は、標識化及び画像化（イメージング）適用における使用を見出し、一方、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を生成するための細胞毒性剤及び化学療法薬等の薬物へのコンジュゲーションは、特定の組織又は構造、例えば特定の細胞型又は増殖因子へのこのような薬剤の標的化送達を可能にして、正常の健常組織に対する影響を最小化し、化学療法処置に関係する副作用を著しく低減する。このようなコンジュゲートは、いくつかの疾患域において、特にがんにおいて広範な潜在的治療適用を有する。結合性タンパク質を含有するコンジュゲートは、頻繁にPEGを含有する。
【０００５】
タンパク質及びペプチドをコンジュゲートする多くの方法が文献に報告されている。おそらく、最も共通して使用される方法は、マレイミドに基づくコンジュゲート試薬の使用を伴う。このような試薬は、多くの公報、例えばWO2004/060965に記載されている。より均質の生成物をもたらす代替の手法は、Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50及びdel Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59によって記載されており、これらは、抗体を含めたタンパク質におけるジスルフィド結合を横断して架橋するために使用することができる試薬の使用を記載している。WO2005/007197は、タンパク質におけるジスルフィド結合から誘導される両方の硫黄原子とコンジュゲートする能力を有する新規なコンジュゲート試薬を使用することで新規なチオエーテルコンジュゲートを与える、タンパク質へのポリマーのコンジュゲーションのための方法を記載しており、一方、WO2009/047500は、タンパク質に付加されているポリヒスチジンタグに結合するために同じコンジュゲート試薬の使用を記載している。WO2010/000393は、タンパク質におけるジスルフィド結合を横断して単一の炭素架橋を形成できる試薬を記載している。タンパク質のコンジュゲーションに関する他の文献としては、WO2014/064423、WO2013/190292、WO2013/190272及びEP2260873が挙げられる。
【０００６】
WO2014/064424は、薬物がメイタンシンであり、抗体がジスルフィド結合を横断して架橋することによって結合されている特定のADCを記載している。WO2014/064423は、薬物がオーリスタチンであり、抗体がジスルフィド結合を横断して架橋することによって結合されている特定のADCを記載している。これらの文献の実施例において例示されているリンカーは、PEG部分を含有し、PEG鎖の一方の端部がリンカーのさらなる部分を介して薬物に付加されており、一方、PEG鎖の他方の端部がリンカーのさらなる部分を介して抗体に付加されている。これは、ADCに関して共通の構造パターンである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2004/060965
【特許文献２】WO2005/007197
【特許文献３】WO2009/047500
【特許文献４】WO2010/000393
【特許文献５】WO2014/064423
【特許文献６】WO2013/190292
【特許文献７】WO2013/190272
【特許文献８】EP2260873
【特許文献９】WO2014/064424
【特許文献１０】GB1418984
【特許文献１１】US4,179,337
【特許文献１２】WO2015057699
【特許文献１３】US7090843
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36〜50
【非特許文献２】del Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51〜59
【非特許文献３】Dreborgら  Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990)6 315〜365
【非特許文献４】Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008; 68:9280〜9290
【非特許文献５】Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、R. Ian Freshney、第3版、Alan R. Liss、N.Y. 1994出版又は第5版、Wiley-Liss、N.Y. 2005出版
【非特許文献６】Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252
【非特許文献７】Lyonら、(2015)Nature Biotechnology、33(7) 733〜736ページ
【非特許文献８】Lyonら、(2012)、Methods in Enzymology、502巻、123〜137ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
近年、コンジュゲートにおいてペイロードをタンパク質又はペプチドに連結するリンカーの重要性が明らかになってきた。しばしば、下されるべき重要な採択は、開裂可能なリンカー、即ちコンジュゲートの投与において、分解して遊離ペイロードを放出するリンカーを有することが所望されるか、又は開裂不可能なリンカーを有することが所望されるかである。別の重要な採択は、リンカーにPEGを含ませるか又は含ませないかである。これらの考慮を前提として、原則的に、任意のリンカーが使用され得る。しかしながら実際には、リンカーの構造における変化により、コンジュゲート試薬又は結果として得られるコンジュゲートのいずれかの特性に差異がもたらされることがある。
【００１０】
頻繁に見出される1つの問題は、コンジュゲートが所望されるよりも貯蔵安定でないことがあるということである。これは、開裂可能なリンカーが使用される場合に特に当てはまり、この場合、コンジュゲートは投与前に長い保存期間を有するべきであるが次いで適用にて急速に開裂するべきであることが所望されるが、それはいずれのリンカーにも当てはまり得る。コンジュゲートの貯蔵安定性を増加させる必要がある。加えて、in vivoにおける安定性の改善が望ましく、これは生物学的活性の増加をもたらし得るからである。本発明者らは、特定のクラスのコンジュゲートについて、特定の構造のPEG含有リンカーの使用が貯蔵安定性の増加を与えることを見出した。更に、非常に驚くべきことに、該コンジュゲートは、増加された生物学的活性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、治療剤、診断剤、又は標識化剤とのタンパク質又はペプチドのコンジュゲートを提供し、前記コンジュゲートは、タンパク質又はペプチド結合部分及びポリエチレングリコール部分を含有し;前記タンパク質又はペプチド結合部分は、一般式:
【００１２】
【化１】
0006612860.tif 000002
【００１３】
(式中、Prは、前記タンパク質又はペプチドを表し、各Nuは、タンパク質又はペプチドに存在する又は付加されている求核試薬を表し、A及びBの各々は、独立して、C1〜4アルキレン又はアルケニレン鎖を表し、W'は、電子求引性基又は電子求引性基の還元によって得られる基を表す)
を有し;前記ポリエチレングリコール部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖である又はそれを含む。
【００１４】
本発明は、タンパク質又はペプチドと反応できるとともに治療剤、診断剤、又は標識化剤及びポリエチレングリコール部分を含むコンジュゲート試薬も提供し;前記コンジュゲート試薬は、式:
【００１５】
【化２】
0006612860.tif 000003
【００１６】
(式中、Wは電子求引性基を表し、A及びBは、上記で定められた意味を有し、mは0から4であり、各Lは独立して脱離基を表す)
の基を含み;前記ポリエチレングリコール部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖である又はそれを含む。
【００１７】
本発明は、タンパク質又はペプチドを本発明によるコンジュゲート試薬と反応させる工程を含む、本発明によるコンジュゲートの調製のための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例6の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例6の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例7の結果を示すグラフである。
【図４】図４ａ〜４ｃは、実施例14の結果を示すグラフである。
【図５】図５ａ及び５ｂは、実施例15の結果を示すグラフである。
【図６】図６ａ〜６ｄは、実施例16の結果を示すグラフである。
【図７】図７ａ〜７ｃは、実施例17の結果を示すグラフである。
【図８】図８ａ及び８ｂは、実施例18の結果を示すグラフである。
【図９】図９ａ及び９ｂは、実施例19の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例23の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例25の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のコンジュゲートは、式:
【００２０】
【化３】
0006612860.tif 000004
【００２１】
(式中、Dは治療剤、診断剤、又は標識化剤を表し、F'は式Iの基を表し、PEGは、式-CH2CH2ORの末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す)
によって模式的に表すことができる。
【００２２】
本発明の試薬は、式:
【００２３】
【化４】
0006612860.tif 000005
【００２４】
(式中、Dは治療剤、診断剤、又は標識化剤を表し、Fは式II又はII'の基を表し、PEGは、式-CH2CH2ORの末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す)
によって模式的に表すことができる。官能グルーピングFは、下記で説明されている通り、タンパク質又はペプチドに存在する2種の求核試薬と反応できる。
【００２５】
ポリエチレングリコール部分
本発明のコンジュゲート及び試薬のポリエチレングリコール(PEG)部分は、式-CH2CH2OR(式中、Rは、水素原子、アルキル基、例えばC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す)の末端基を有するペンダントPEG鎖である又はこれを含む。好ましくは、Rはメチル基又は水素原子である。
【００２６】
PEG部分は、上記で定義されている通りの単一のペンダントPEG鎖を含み得るか、又はそれは、2つ以上の、例えば2つ若しくは3つのペンダントPEG鎖を含み得る。
【００２７】
PEG部分の全体的サイズは、当然、意図される適用に依存する。一部の適用のため、高分子量PEGが使用され得、例えば数平均分子量は、最大およそ75,000g/モルまで、例えば最大50,000、40,000又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルからおよそ75,000の範囲であってよい。しかしながら、より小さいPEG部分が一部の適用にとって好ましいことがある。
【００２８】
好ましい一実施形態において、PEG部分におけるPEGの全ては、1つ又は複数のペンダントPEG鎖に存在する。別の実施形態において、PEGは、分子の骨格に存在してもよく、これは下記でより詳細に論じられている。
【００２９】
PEG部分と同様に、ペンダントPEG鎖又は鎖のサイズは、意図される適用に依存する。一部の適用のため、高分子量ペンダントPEG鎖が使用され得、例えば数平均分子量は、最大およそ75,000g/モルまで、例えば最大50,000、40,000又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルからおよそ75,000の範囲であってよい。しかしながら、多くの適用のため、より小さいペンダントPEG鎖が使用され得る。例えば前記PEG鎖は、最大3,000g/モルまでの分子量を有することができる。しかしながら、例えば、わずか2反復単位、例えば2から50の反復単位を有する別個のPEG鎖からなる非常に小さいオリゴマーは、一部の適用に有用であり、本発明の好ましい一実施形態においてペンダントPEG鎖として存在する。ペンダントPEG鎖は直鎖状又は分枝状であってよい。PEG鎖、例えば12、20、24、36、40又は48の反復単位を有する直鎖又は分枝鎖が例えば使用され得る。
【００３０】
ペイロード
本発明のコンジュゲート及び試薬は、治療剤、診断剤、又は標識化剤であるペイロードを担持する。治療剤、診断剤、若しくは標識化剤の単一の分子が存在し得るか、又は2つ以上の分子が存在し得る。1つ又は複数の薬物分子、例えば細胞毒性剤又は毒素の包含が好ましい。オーリスタチン及びメイタンシノイドは、典型的な細胞毒性薬である。薬物コンジュゲート、特に抗体薬物コンジュゲートは、薬物の複数のコピーを含有するべきであることが、しばしば好ましい。標識化剤(これには、造影剤が含まれると理解されるべきである)としては、例えば、放射性核種、蛍光薬剤(例えば、5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(2-アミノエチル)等のアミン誘導体化蛍光プローブ)スルホンアミド-ダンシルエチレンジアミン、Oregon Green(登録商標)488カダベリン(カタログ番号O-10465、Molecular Probes社)、ダンシルカダベリン、N-(2-アミノエチル)-4-アミノ-3,6-ジスルホ-1,8-ナフタルイミド、二カリウム塩(ルシファーイエローエチレンジアミン)、又はローダミンBエチレンジアミン(カタログ番号L 2424、Molecular Probes社)、又はチオール誘導体化蛍光プローブ、例えばBODIPY(登録商標)FL L-シスチン(カタログ番号B-20340、Molecular Probes社)が挙げられ得る。ビオチンも使用することができる。
【００３１】
本発明者らの同時係属出願GB1418984は、リンカーを介してメイタンシン含有ペイロードに付加されているタンパク質、ペプチド及び/又はポリマーを含むコンジュゲート、このようなコンジュゲートを形成するのに有用なコンジュゲート試薬、並びにペイロードとしての使用のためのメイタンシン含有化合物を提供している。メイタンシン含有ペイロード及び化合物は、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなる。これらのメイタンシンは本発明におけるペイロードとして使用することができ、該試薬及びコンジュゲートは本発明の一態様を形成する。本発明者らの同時係属出願は以下を開示している:
【００３２】
「本発明は、第1の態様において、少なくとも2つのメイタンシン部分(D)が架橋基(Bd)を介して互いに連結されているメイタンシン含有化合物を提供する。架橋基(Bd)は生理学的条件下で非分解性である。有利には、架橋基(Bd)は少なくとも3個の鎖炭素原子を有し、場合により、3個の鎖炭素原子に加えてポリ(エチレングリコール)スペーサーを含有する。有利には、2個のヘテロ原子は架橋基において互いに隣接していない。有利には、架橋基は、-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分(式中、bは1、2又は3であり、R1は水素及びC1〜C6アルキルから選択され、Xは任意の基である)を含まない。2つのメイタンシン部分が存在する第1の態様のメイタンシン含有化合物は、以下の式(I):
D-Bd-D      (I)
によって表すことができる。
【００３３】
第2の態様において、本発明は、ペプチド若しくはタンパク質と反応できる官能基及び/又はポリマーと反応できる官能基を含有するコンジュゲート試薬であって、ペイロードが1個又は複数のリンカーを介して官能基に付加されており、コンジュゲーション試薬が、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを含むことを特徴とし、但し、コンジュゲート試薬が、ペプチド又はタンパク質と反応できる官能基を含む場合、ペプチド又はタンパク質と反応できる官能基にペイロードを付加させているリンカーが分解性であることを条件とする、コンジュゲート試薬を提供する。コンジュゲート試薬が、ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基を含有し、該官能基が、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含む場合、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードは、有利には、分解性リンカーを介してペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基に付加されている。コンジュゲート試薬は、場合により、ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基を含有し、官能基は、有利には、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含み、コンジュゲーション試薬が、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分、特に2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを含むこと、及びペイロードが、リンカー、特に分解性リンカーを介してペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応できる官能基に付加されていることを特徴とする。該リンカーは、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチドに架橋基を連結するのに適当である。好ましくは、メイタンシン含有ペイロード(D2Bd)の架橋基(Bd)は、生理学的条件下で切断される分解性基を含む分解性リンカー(Lkd)に接続されている。該分解性基は、例えば、加水分解条件、特に酸性条件に感受性であり得;還元条件下での分解に感受性であり得;又は酵素分解に感受性であり得る。
【００３４】
2つのメイタンシン部分が存在する第2の態様のメイタンシン含有コンジュゲート試薬は、以下の式(II):
D2Bd-Lk-F      (II)
(式中、D2Bdは、非分解性架橋基を介して互いに連結されている2つのメイタンシン部分からなるメイタンシン含有ペイロードを表し、Lkはリンカー、特に分解性リンカー(Lkd)であり、Fは、ペプチド若しくはタンパク質と反応できる官能基及び/又はポリマーと反応できる官能基を表す)によって表すことができる。
【００３５】
本発明は、ペプチド、タンパク質及び/又はポリマーのコンジュゲーションのための方法であって、前記ペプチド、タンパク質及び/又はポリマーを、本発明の第2の態様のコンジュゲート試薬と反応させる工程を含む方法を更に提供する。コンジュゲート試薬がペプチド又はポリマーと反応する場合、前記コンジュゲート試薬は、有利には、前記ペプチド又はタンパク質に存在する少なくとも1種の求核試薬と反応でき、前記試薬は、有利には、前記求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含有する。
【００３６】
本発明は、第3の態様において、リンカーを介してメイタンシン含有ペイロードに付加されているタンパク質、ペプチド及び/又はポリマーを含むコンジュゲートであって、メイタンシン含有ペイロードが、非分解性架橋基を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分からなることを特徴とする、コンジュゲートも提供する。コンジュゲートがタンパク質又はペプチドを含む場合、タンパク質又はペプチドにペイロードを付加させるリンカーは、有利には、分解性である。本発明の第3の態様のコンジュゲートは、例えば、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチド(Ab)に、リンカー(Lk)、特に分解性リンカー(Lkd)を介して連結されているメイタンシン含有薬物部分(D2Bd)を含むことができ、ここで、メイタンシン含有薬物部分(D2Bd)は、非分解性架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)を含む。2つのメイタンシン部分(D)が存在する本発明の第3の態様のメイタンシン含有コンジュゲートは、以下の式(III):
D2Bd-Lk-Ab      (III)
によって表すことができる。
【００３７】
リンカー(Lk)は、有利には、架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)を含むメイタンシン含有薬物部分(D2Bd)を、パートナー又は標的に結合できるタンパク質又はペプチド(Ab)から分離させる、生理学的条件下で開裂する分解性基を含む分解性リンカー(Lkd)である。該分解性基は、例えば、加水分解条件、特に酸性条件に感受性であり得;還元条件下での分解に感受性であり得;又は酵素分解に感受性であり得る。非分解性架橋基(Bd)は、分解性リンカーにおける分解性基が開裂する条件と同じ条件下での開裂に感受性である基を含有しない。
【００３８】
本発明の第1の態様のメイタンシン含有化合物は、例えば、少なくとも3個の鎖炭素原子、特に少なくとも7個の鎖炭素原子、及び鎖炭素原子に加えて任意選択のポリ(エチレングリコール)単位を有する架橋基(Bd)を介して互いに連結されている少なくとも2つのメイタンシン部分(D)、特に2つのメイタンシン部分を含む又はこれらからなることができ、但し、2個のヘテロ原子が架橋基において互いに隣接しないことを条件とし、及び架橋基は-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分(式中、bは1、2又は3であり、R1は水素及びC1〜C6アルキルから選択され、Xは任意の基である)を含まないことを条件とする。場合により、架橋基は、0個から8個のカルボニル基、特に2個から8個のカルボニル基を組み込んでいる。架橋基は、場合により、0個から4個の不飽和炭素-炭素二重結合;及び/又は0個から4個のC3〜C10アリール又はヘテロアリール基を鎖中に組み込んでいる。場合により、該鎖には、N、O及びSから選択される0個から11個、特に2個から11個の鎖ヘテロ原子が散在しており、但し、2個のヘテロ原子が互いに隣接しないことを条件とする。有利には、架橋基における鎖炭素原子は、アミン、カルボキシ、アルキン、アジド、ヒドロキシル又はチオールから選択されるペンダント型接続基で置換されている。有利には、架橋基は、鎖中に少なくとも1つのアミド連結を含む。」
【００３９】
好ましくは、ペイロードは、治療剤、特に上に記述されているものの1つである。
【００４０】
タンパク質
このセクション及び他所において便宜のために、「タンパク質」は、文脈が別段に必要としている場合を除いて「タンパク質及びペプチド」を含むと理解されるべきである。
【００４１】
本発明のコンジュゲートに存在することができる適当なタンパク質としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、転写タンパク質又は多量体タンパク質が挙げられる。
【００４２】
酵素としては、炭水化物特異的酵素及びタンパク分解酵素等、例えば、US4,179,337により開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。対象の特定の酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ及びグルタミナーゼが挙げられる。
【００４３】
血液タンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、因子VII、因子VIII又は因子IX、フォンビルブランド因子、インスリン、ACTH、グルカゲン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、例えばIFN-α又はIFN-β、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体断片、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００４４】
対象の他のタンパク質は、ポリ(アルキレンオキシド)等のポリマーとコンジュゲートされる場合に低減されたアレルゲン性を有するような、Dreborgら  Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst.(1990) 6 315〜365によって開示されているアレルゲンタンパク質であり、その結果として、耐性誘導物質としての使用に適当である。開示されているアレルゲンに中に、ブタクサ抗原E、ミツバチ毒液及びダニアレルゲン等がある。
【００４５】
糖ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子並びにグリコシル化されたインターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子は、免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びそれらの断片がそうであるように、対象となる。
【００４６】
特に興味深いのは、診断及び治療目的のために臨床医学において使用される受容体及びリガンド結合性タンパク質並びに抗体及び抗体断片である。抗体-薬物コンジュゲートは、特に薬物が細胞毒性薬、例えばオーリスタチン又はメイタンシノイドである場合、本発明の特に好ましい実施形態である。
【００４７】
タンパク質は、所望であれば誘導体化又は官能化することができる。特に、コンジュゲーションより前に、タンパク質、例えば未変性タンパク質は、様々な遮断基と反応させておくことで、そこの感受性基を保護することができるか;又はそれは、1つ又は複数のポリマー又は他の分子と前にコンジュゲートしておくことができる。それは、コンジュゲーション反応中にコンジュゲート試薬によって標的化することができるポリヒスチジンタグを含有することができる。
【００４８】
タンパク質又はペプチド、及びコンジュゲート試薬の結合
本発明のコンジュゲート試薬は、WO2005/007197及びWO2010/000393に開示されている一般の型である。官能グルーピングII及びII'は、互いに化学的同等物である。II基を含有する試薬がタンパク質と反応する場合、第1の脱離基Lは失われて、第1の求核試薬と反応するII'基を含有するコンジュゲート試薬をin situで形成する。次いで第2の脱離基Lが失われ、第2の求核試薬との反応が発生する。したがって、官能グルーピングIIを出発材料として含有する試薬を使用することの代替として、官能グルーピングII'を含有する試薬が出発材料として使用され得る。
【００４９】
脱離基Lは、例えば、-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3、ハロゲン又は-Oφであってよく、式中、Pは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表すか、或いは-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、式中、nは2以上の数であり、R2及びR3の各々は独立して、水素原子、C1〜4アルキル基又はP基を表し、φは、少なくとも1つの電子吸引性置換基、例えば-CN、-NO2、-CO2Ra、-COH、-CH2OH、-CORa、-ORa、-OCORa、-OCO2Ra、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-NHCORa、-NRa、CORa、-NHCO2Ra、-NPCO2Ra、-NO、-NHOH、-NRaOH、-C=N-NHCORa、-C=N-NRaCORa、-N+Ra3、-N+HRa2、-N+H2Ra、ハロゲン、特に塩素又は特にフッ素、-C≡CRa、-C=CRa2及び-C=CHRa(式中、各Raは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表す)を含有する置換アリール(特にフェニル)基を表す。Pが、-(CH2CH2O)n-部分(式中、nは2以上の数である)を含む基を表すコンジュゲート試薬は、本発明者らの同時係属出願GB1418186の対象である。この出願は以下を開示している:
【００５０】
「脱離基には、例えば、-(CH2CH2O)n-R1(式中、R1はキャッピング基である)が含まれ得る。非常に広い範囲のキャッピング基が使用され得る。R1は、例えば、水素原子、アルキル基、特にC1〜4アルキル基、特にメチル基、又は場合により置換されているアリール基、例えば場合により置換されているフェニル基、例えばトリル基であってよい。代替として、キャッピング基には、カルボキシル基又はアミン基等の官能基が含まれ得る。このようなキャッピング基は、例えば、式-CH2CH2CO2H又は-CH2CH2NH2を有することができ、-(CH2CH2O)n-鎖の末端単位を官能化することによって調製することができる。代替として、キャッピング基によって末端化される代わりに、-(CH2CH2O)n-基は、化学的に2種の求核試薬と反応できる2個の脱離基の同等物が存在するように、コンジュゲート試薬内に2つの付着点を有することができる。
【００５１】
該脱離基の-(CH2CH2O)n-部分は、PEG、ポリエチレングリコールに基づく。PEGは直鎖状又は分枝状であってよく、それは任意のやり方で誘導体化又は官能化することができる。nは2以上の数、例えば2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10である。例えば、nは、5から9であってよい。代替として、nは10以上の数であってよい。nについて特定の上限はない。nは、例えば150以下、例えば120以下、例えば100以下であってよい。例えばnは、2から150、例えば7から150、例えば7から120であってよい。脱離基のPEG部分-(CH2CH2O)n-は、例えば、1から5kDaの分子量を有することができ;それは例えば1kDa、2kDa、3kDa、4kDa又は5kDaであってよい。脱離基は、所望であれば、1つ又は複数のスペーサーによって分離される2つ以上の部分-(CH2CH2O)n-を含有することができる。
【００５２】
本発明によるコンジュゲート試薬における脱離基は、適当には、式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3であり、式中Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は、独立して、水素原子、C1〜4アルキル基又はP基を表す。好ましくは、R2及びR3の各々は、C1〜4アルキル基、特にメチル基、又は特に水素原子を表す。代替として、該コンジュゲート試薬は、式-S-P-S-;-O-P-O-;-SO2-P-SO2-;-OSO2-P-OSO2-;及び-N+R2R3-P-N+R2R3-の基を含み得る。この型の特定の基としては、-S-(CH2CH2O)n-S-、-O-(CH2CH2O)n-O-;-SO2-(CH2CH2O)n-SO2-;-OSO2-(CH2CH2O)n-OSO2-;又は-N+R2R3-(CH2CH2O)n-N+R2R3-が挙げられる。それらとしては、以下の型:
【００５３】
【化５】
0006612860.tif 000006
【００５４】
(式中、-(CH2CH2O)n-基は、任意の適当な連結基、例えばアルキル基によって担持される)の基も挙げることができる。これらの二価の基は、2種の求核試薬と反応できる2個の脱離基と化学的に同等である。」
【００５５】
本発明による新規なコンジュゲート試薬に存在する特に好ましい脱離基Lは、-SP又は-SO2P、特にSO2Pである。この基内において、好ましい一実施形態は、Pがフェニル又は特にトシル基を表す場合である。別の好ましい実施形態は、Pが、-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表す場合である。
【００５６】
電子求引性基Wは、例えば、ケト基-CO-、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-であってよい。好ましくは、W'は、以下に記載されている通りの、これらの基の1つ又はこれらの基の1つの還元によって得られる基を表す。好ましくは、Wはケト基を表し、好ましくは、W'は、ケト基又はケト基の還元によって得られる基、特にCH.OH基を表す。
【００５７】
好ましくは、グルーピングF'及びFは、式:
【００５８】
【化６】
0006612860.tif 000007
【００５９】
特に
【００６０】
【化７】
0006612860.tif 000008
【００６１】
を有する。
【００６２】
タンパク質における求核基は、例えば、システイン、リシン又はヒスチジン残基によって提供され、Nuは、例えば、硫黄原子又はアミン基であってよい。本発明の好ましい一実施形態において、各Nuは、タンパク質に存在するシステイン残基に存在する硫黄原子を表す。このような構造は、タンパク質に存在するジスルフィド結合の還元によって得ることができる。別の実施形態において、各Nuは、前記タンパク質に付加されているポリヒスチジンタグに存在するヒスチジン残基に存在するイミダゾール基を表す。
【００６３】
コンジュゲート方法
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、本発明によるコンジュゲートを形成することができ、このような反応は、本発明のさらなる態様を形成する。したがって、官能グルーピングII又はII'を含むコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、グルーピングIを含むコンジュゲートを形成する。コンジュゲーション方法の即時生成物は、電子求引性基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、該コンジュゲーション方法は、適当な条件下で可逆的である。これは、一部の適用、例えばタンパク質の急速な放出が必要とされる場合には望ましいことがあるが、他の適用には、タンパク質の急速な放出は望ましくないことがある。そのため、電子求引性部分Wの還元によってコンジュゲートを安定化することで、タンパク質の放出を防止する部分を与えることが望ましいことがある。したがって、上に記載されている方法は、コンジュゲートにおける電子求引性基Wを還元する追加の任意選択の工程を含むことができる。還元剤として、水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用することができる他の還元剤としては、例えば、塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
【００６４】
したがって、例えば、ケト基を含有するW部分は、CH(OH)基を含有する部分に還元することができ;エーテル基CH.ORaは、ヒドロキシ基とエーテル化剤との反応によって得ることができ;エステル基CH.O.C(O)Raは、ヒドロキシ基とアシル化剤との反応によって得ることができ;アミン基CH.NH2、CH.NHRa若しくはCH.NR2aは、還元的アミノ化によってケトンから調製することができ;又はアミドCH.NHC(O)Ra若しくはCH.N(C(O)Ra)2は、アミンのアシル化によって形成することができる。スルホンは、スルホキシド、スルフィド又はチオールエーテルに還元することができる。
【００６５】
本発明のコンジュゲート試薬を使用するという重要な特色は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化性部分として働く電子求引性官能基とクロスコンジュゲートされることである。脱離基が直接的置き換えよりもむしろクロス官能性試薬において排除される傾向があるとともに、電子求引性基がマイケル反応のための適当な活性化部分である場合、順次的な分子内ビス-アルキル化は、連続したマイケル及びレトロマイケル反応によって発生させることができる。脱離部分は、第1のアルキル化が発生することで官能グルーピングII'を含む試薬を与えた後まで曝露されない潜在的コンジュゲート二重結合を遮蔽する働きをし、ビス-アルキル化は、順次的及び相互作用的なマイケル及びレトロマイケル反応に起因する。クロス官能性アルキル化剤は、二重結合に又は脱離基と電子求引性基との間にコンジュゲートされている多重結合を含有することができる。
【００６６】
タンパク質への結合が、タンパク質におけるジスルフィド結合から誘導される2個の硫黄原子を介する場合、該方法は、ジスルフィド結合を還元することによって行うことができ、これに続いて、還元生成物は本発明による試薬と反応する。好ましくは、ジスルフィド結合は還元され、任意の過剰の還元剤は、例えば緩衝剤交換によって除去された後で、コンジュゲート試薬が導入される。ジスルフィド結合は、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はトリス-カルボキシエチルホスフィンを用いて、従来の方法を使用して還元することができる。
【００６７】
コンジュゲーション反応は、WO2005/007197、WO2009/047500、WO2014/064423及びWO2014/064424に開示されている条件を含めて、公知のコンジュゲーション方法と同様の条件下で行うことができる。該方法は、例えば、全ての反応物が可溶性である溶媒又は溶媒混合物中で行うことができる。例えば、タンパク質は、水性反応媒体中でポリマーコンジュゲート試薬と直接的に反応させることができる。この反応媒体は、求核試薬のpH要件に依存して緩衝液で処理することもできる。反応のための最適なpHは、一般には少なくとも4.5、典型的には約5.0から約8.5の間、好ましくは約6.0から7.5である。最適な反応条件は、当然、用いられる特定の反応物に依存する。
【００６８】
水性反応媒体を使用する場合、3〜40℃の間の反応温度が一般に適当である。有機媒体(例えば、THF、酢酸エチル、アセトン)中で行われる反応は、典型的に、最大室温までの温度で行われる。好ましい一実施形態において、該反応は、例えば有機溶媒の体積により最大20%まで、典型的には有機溶媒の体積により5から20%の有機溶媒の割合を含有することができる水性緩衝液中で実施される。
【００６９】
タンパク質は、化学量論的当量又はわずかに過剰のコンジュゲート試薬を使用して有効にコンジュゲートすることができる。しかしながら、過剰の化学量論のコンジュゲート試薬とのコンジュゲーション反応を行うことも可能であり、これは、一部のタンパク質にとって望ましいことがある。過剰の試薬は、コンジュゲートの後続の精製中に例えばイオン交換クロマトグラフィー又はHPLCによって簡単に除去することができる。
【００７０】
当然、1種より多いコンジュゲート試薬が、十分な適当な付着点を含有するタンパク質にコンジュゲートされることは可能である。例えば、2個の異なるジスルフィド結合を含有するタンパク質において、又は1個のジスルフィド結合を含有するとともにポリヒスチジンタグも担持するタンパク質において、タンパク質の1分子当たり試薬の2個の分子をコンジュゲートすることが可能であり、このようなコンジュゲートは本発明の一部を構成する。
【００７１】
リンカー
治療剤、診断剤、又は標識化剤を、本発明のコンジュゲートにおけるタンパク質若しくはペプチド結合部分に又は本発明のコンジュゲート試薬における官能グルーピングに接続するリンカーは、上に記載されている通りの1つ又は複数のPEG部分を含まなければならない。それは、任意の他の所望の基、特に、この分野に共通して見出される従来の基のいずれかを含有することもできる。
【００７２】
サブセクション(i)。一実施形態において、ペイロードと式F'/Fのグルーピングとの間のリンカー、及び特に、式F'/Fのグルーピングに直接隣接するリンカーのその部分は、アルキレン基(好ましくはC1〜10アルキレン基)、又は場合により置換されているアリール若しくはヘテロアリール基を含んでいてよく、これらのいずれもが、1個又は複数の酸素原子、硫黄原子、-NRa基(式中、Raは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表す)、ケト基、-O-CO-基、-CO-O-基、-O-CO-O、-O-CO-NRa-、-NR-CO-O-、-CO-NRa-及び/又は-NRa.CO-基によって末端又は中断されていてよい。適当なアリール基としては、フェニル及びナフチル基が挙げられ、一方、適当なヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンが挙げられる。特に適当な連結基は、ヘテロアリール又は、特にアリール基、特にフェニル基である。これらは、-NRa.CO-若しくは-CO.NRa-基、例えば-NH.CO-若しくは-CO.NH-基であるか、又はこれを含有する連結基のさらなる部分に隣接していてよい。この明細書の全体にわたって此所及び他所で、Ra基が存在する場合、これは、好ましくはC1〜4アルキル、特にメチル基、又は特に水素原子である。
【００７３】
場合により置換されているアリール、特にフェニル、又はヘテロアリール基上に存在することができる置換基としては、例えば、アルキル(好ましくは、OH又はCO2Hによって場合により置換されているC1〜4アルキル、特にメチル)、-CN、-NO2、-CO2Ra、-COH、-CH2OH、-CORa、-ORa、-OCORa、-OCO2Ra、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-NHCORa、-NRaCORa、-NHCO2Ra、-NRa.CO2Ra、-NO、-NHOH、-NRa.OH、-C=N-NHCORa、-C=N-NRa.CORa、-N+Ra3、-N+H3、-N+HRa2、-N+H2Ra、ハロゲン、例えばフッ素又は塩素、-C≡CRa、-C=CRa2及び-C=CHRaから選択される同じ又は異なる置換基の1つ又は複数が挙げられ、式中、各Raは独立して、水素原子又はアルキル(好ましくはC1〜6アルキル)、アリール(好ましくはフェニル)、又はアルキル-アリール(好ましくはC1〜6アルキル-フェニル)基を表す。電子求引性置換基の存在は特に好ましい。好ましい置換基としては、例えばCN、NO2、-ORa、-OCORa、-SRa、-NHCORa、-NRa.CORa、-NHOH及び-NRa.CORaが挙げられる。
【００７４】
好ましくは、該リンカーは、グルーピングF'/Fに隣接する上記基の1つを含む。特に好ましいのは、グルーピング:
【００７５】
【化８】
0006612860.tif 000009
【００７６】
又は特に:
【００７７】
【化９】
0006612860.tif 000010
【００７８】
を含むコンジュゲート及びコンジュゲート試薬である。
【００７９】
上記式において、好ましくは、F'は上記の式Ia又はIbを有し、好ましくは、Fは上記の式IIa、II'a、IIb又はII'bを有する。
【００８０】
サブセクション(ii)。一実施形態において、リンカーは分解性基を含有することができ、即ちそれは、生理学的条件下で切断される基を含有することができ、それが結合されている又は結合されるタンパク質からペイロードを分離させる。代替として、リンカーは、生理学的条件下で開裂可能でないリンカーであってよい。リンカーが生理学的条件下で切断される場合、それは、好ましくは細胞内条件下で開裂可能である。標的が細胞内にある場合、好ましくは、リンカーは細胞外条件に実質的に非感受性である(即ち、その結果、細胞内標的への十分な用量の治療剤の送達が禁止されない)。
【００８１】
リンカーが分解性基を含有する場合、これは一般に、加水分解条件に感受性であり、例えばそれは、ある特定のpH値(例えば、酸性条件)で分解する基であってよい。加水分解性/酸性条件は、例えばエンドソーム又はリソソームにおいて見出すことができる。酸性条件下で加水分解に感受性の基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニットアミド、オルトエステル及びケタールが挙げられる。加水分解条件に感受性の基の例としては:
【００８２】
【化１０】
0006612860.tif 000011
【００８３】
が挙げられる。
【００８４】
好ましい実施形態において、リンカーは
【００８５】
【化１１】
0006612860.tif 000012
【００８６】
を含む。
【００８７】
例えば、それは:
【００８８】
【化１２】
0006612860.tif 000013
【００８９】
を含み得る。
【００９０】
リンカーは、還元条件下での分解に感受性であってもよい。例えば、それは、チオール等の生物学的還元剤への曝露で開裂可能であるジスルフィド基を含有することができる。ジスルフィド基の例としては:
【００９１】
【化１３】
0006612860.tif 000014
【００９２】
(式中、R、R'、R''及びR'''は、各々独立して、水素又はC1〜4アルキルである)
が挙げられる。好ましい実施形態において、リンカーは
【００９３】
【化１４】
0006612860.tif 000015
【００９４】
を含む。
【００９５】
例えば、それは
【００９６】
【化１５】
0006612860.tif 000016
【００９７】
を含み得る。
【００９８】
リンカーは、酵素分解に感受性である基を含有することもでき、例えばそれは、プロテアーゼ(例えば、リソソーム又はエンドソームのプロテアーゼ)又はペプチダーゼによる開裂に感受性であり得る。例えば、それは、少なくとも1個、例えば少なくとも2個、又は少なくとも3個のアミノ酸残基(例えば、Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、Phe-Lys)を含むペプチジル基を含有することができる。例えば、それは、1個から5個、例えば2個から4個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を含み得る。酵素分解に感受性の基の別の例は:
【００９９】
【化１６】
0006612860.tif 000017
【０１００】
(式中、AAは、Val-Cit等プロテアーゼ特異的アミノ酸配列を表す)
である。
【０１０１】
好ましい実施形態において、リンカーは:
【０１０２】
【化１７】
0006612860.tif 000018
【０１０３】
を含む。
【０１０４】
例えば、それは
【０１０５】
【化１８】
0006612860.tif 000019
【０１０６】
を含み得る。
【０１０７】
リンカーは、単一のペイロードD、又は1つより多いD基を担持することができる。複数のD基は、例えばアスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基を組み込むことができる分岐リンカーの使用によって組み込むことができる。これは、式:
【０１０８】
【化１９】
0006612860.tif 000020
【０１０９】
(式中、bは1、2又は3であり、b=1はアスパルテートであり、b=2はグルタメートであり、b=3は好ましい一実施形態を表す)
の分岐要素を導入する。上記式におけるアシル部分の各々は、D基にカップリングさせることができる。上記の分岐基は、以下のように:
【０１１０】
【化２０】
0006612860.tif 000021
【０１１１】
-CO.CH2-基を組み込むことができる。
【０１１２】
所望であれば、アスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基は、例えば:
【０１１３】
【化２１】
0006612860.tif 000022
【０１１４】
等、さらなるアスパルテート及び/若しくはグルタメート並びに/又は同様の残基にカップリングさせることができる。
【０１１５】
明らかになる通り、グルーピングF/F'とペイロードとの間のリンカーのための多くの代替立体配置が可能である。1つの好ましい立体配置は、以下の通りに模式的に表すことができる:
【０１１６】
【化２２】
0006612860.tif 000023
【０１１７】
(式中、Eは、上記のサブセクション(i)に記述されている基の1つを表し、Bは、このサブセクション(ii)において記述されている基の1つを表す)。
【０１１８】
特定の特に好ましい構造は、下記に示されている:
【０１１９】
【化２３】
0006612860.tif 000024
【０１２０】
(式中、F'及びFは、上記で定められた意味を有する)。
【０１２１】
サブセクション(iii)。治療剤、診断剤、又は標識化剤を、本発明のコンジュゲートにおけるタンパク質若しくはペプチド結合部分に又は本発明のコンジュゲート試薬における官能グルーピングに接続するリンカーは、式-CH2CH2ORの末端基を有するペンダントPEG鎖に加えて、追加のPEGを含有することができる。それは例えば、以下のように:
【０１２２】
【化２４】
0006612860.tif 000025
【０１２３】
模式的に示されるリンカーの骨格にPEGを含有することができる。
【０１２４】
これらの式において、p、q及びrは、該コンジュゲート又は試薬のリンカーに存在する様々なPEG鎖に存在するPEG単位の数を表す。明確にするため、PEG単位は直鎖の単位として示されているが、単位のいずれにも分枝鎖が含まれ得ると理解される。
【０１２５】
サブセクション(iv)。治療剤、診断剤、又は標識化剤を、本発明のコンジュゲートにおけるタンパク質若しくはペプチド結合部分に又は本発明のコンジュゲート試薬における官能グルーピングに接続するリンカーは、2つ以上のペンダントPEG鎖を含有することができる。これは、以下のように:
【０１２６】
【化２５】
0006612860.tif 000026
【０１２７】
2つのペンダントPEG鎖について模式的に例示することができ、明らかに2つより多いペンダントPEG鎖は同様に存在することができる。該リンカーは、上記のサブセクション(iii)に記載されている通り、ペンダントPEG鎖に加えて追加のPEGを含有していてもよく又は含有していなくてもよい。
【０１２８】
複数のペンダントPEG鎖が、任意の適当な方法を使用してリンカーに組み込まれてよい。ペンダントPEG鎖は、例えば、上記で論じられているリンカー部分のいずれかに存在する任意の反応性グルーピングとの反応によって導入することができる。上に記載されている通りの式(XIIa-d)の分岐基が使用され得る。例えば、特定の一実施形態において、2つのペンダントPEG部分は、構造(XIIa):
【０１２９】
【化２６】
0006612860.tif 000027
【０１３０】
の使用によって組み込むことができる。
【０１３１】
代替として、分岐は、ポリオール官能性基、例えば:
〜CHs[(CH2)tO]3-s〜
(式中、sは0、1又は2であり、tは1から4である)の使用によって導入することができる。例えば、特定の一実施形態において、3つのペンダントPEG部分は、構造:
〜C[CH2O-(CH2)2-CO-NH-PEG]3
の使用によって組み込むことができる。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は本発明を例示する。
【０１３３】
［実施例１］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬1の合成
【０１３４】
【化２７】
0006612860.tif 000028
【０１３５】
工程1:化合物2の合成。
【０１３６】
【化２８】
0006612860.tif 000029
【０１３７】
4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(1.0g、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の溶液を、無水THF(10mL)中のN-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(306mg)に窒素雰囲気下で添加した。結果として得られた溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド(310μL)を滴下添加した。反応混合物を20分間0℃で撹拌した後に室温に加温した。追加のTHF(10mL)を反応混合物に1時間後に添加した。18時間後、形成された沈殿物を濾過し、冷THF(2×5mL)で洗浄した後に真空中で乾燥させた。固体をMeOH(10mL)とともに1時間の間室温で撹拌し、濾過によって回収し、MeOH(2×5mL)及びEt2O(5mL)で順次に洗浄した。次いで、固体を真空中で乾燥させることで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-安息香酸HOBtエステル化合物2が白色の固体として与えられた(1.1g、88%)。m/z[M+H]+(618、100%)。
【０１３８】
工程2:化合物3の合成。
【０１３９】
【化２９】
0006612860.tif 000030
【０１４０】
無水DMF(20mL)中の(S)-Glu-5-(OtBu)(198mg)の撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、N-メチルモルホリン(NMM)(107μL)を添加した。反応混合物を0℃に冷却した後に、化合物2(603mg)を添加した。結果として得られた懸濁液を0℃で1時間の間撹拌し、この後、反応混合物を室温に加温しておいた。19時間後、結果として得られた溶液を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[OH]化合物3が白色の固体として与えられた(198mg、67%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (1H, d), 7.86 (2H), 7.71 - 7.65 (6H, m), 7.36 (4H, d), 4.68 (1H, ddd), 4.34 (1H, q), 3.62 (2H, ddd), 3.50 (2H, ddd), 2.69 (1H ddd), 2.55 - 2.45 (1H, m), 2.48 (6H, s), 2.34-2.16 (2H, m), 1.46 (9H, s); m/z [2M+H]+ (1371,74%), [2M-tBu]+ (1315, 70%), [M-tBu]+ (630, 100%)。
【０１４１】
工程3:化合物4の合成。
【０１４２】
【化３０】
0006612860.tif 000031
【０１４３】
化合物3(50mg)及び(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(40mg)を、無水DMF(3mL)中に溶解させ、0℃に冷却し、無水DMF(2mL)中のNH2-PEG(24u)-OMe(99mg)及びNMM(10μL)の溶液に添加した。反応混合物を0℃で撹拌し、4時間後、追加量のBOP(10mg)及びNMM(2.5μL)を反応混合物に添加し、更に15分間インキュベートした後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。その結果得られた反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]が無色の油として与えられた(128mg、100%)。m/z[M+H]+(1757、100%)、[M+2H]2+(879、100%)。ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](126.5mg)をギ酸(2.5mL)中に溶解させ、窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。20時間後、反応混合物を真空中で濃縮し、高真空下で18時間の間乾燥させることで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]化合物4が無色の油として与えられた(122mg、推定定量的収量)。m/z[M+Na]+(1723、15%)、[M+H]+(1700、100%)。この材料を任意のさらなる精製をせずに使用した。
【０１４４】
工程4:試薬1の合成。
DMF(1.0mL)中の化合物4(13.0mg)、HATU(4.1mg)、val-cit-PAB-MMAE TFA塩(9.0mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却した。これに、NMM(2.0μL)を添加した。1時間後、追加量のHATU(4.1mg)及びNMM(2μL)を添加し、更に1.5時間後、溶液を-20℃で72時間の間貯蔵した。反応溶液を真空中で濃縮し、アセトニトリル(1.0ml)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-[NH-PEG(24u)-OMe]-[val-cit-PAB-MMAE]試薬1が濃い清澄な無色の油として与えられた(11.4mg、56%)。m/z[M+H]+(2805、20%)、[M+2H]2+(1403、75%)、[M+3H]3+(936、100%)。
【０１４５】
［実施例２］
メイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬5の合成
【０１４６】
【化３１】
0006612860.tif 000032
【０１４７】
工程1:化合物6の合成。
【０１４８】
【化３２】
0006612860.tif 000033
【０１４９】
DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、(ベンゾトリアゾール-a-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートBOP(41mg)、その後、NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(19μL)を添加した。溶液を室温に加温しておき、22時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(1mL)中に溶解させ、ジクロロメタン:メタノール(100:0v/vから80:20v/v)で溶出する順相カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去することで、Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]が無色の油として与えられた(84mg、67%)。ピペリジン(49μL)を、DMF(2mL)中の化合物Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](74mg)の溶液に、アルゴン雰囲気下で添加し、結果として得られた溶液を室温で22時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をヘキサン(3×0.7mL)で摩砕した。有機溶媒を毎回デカンテーションし、結果として得られた残渣を真空中で乾燥させることで、L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]化合物6が白色の固体として与えられた(61mg、97%)。m/z[M+H]+(1097、10%)、[M+2H]2+(1035、100%)。
【０１５０】
工程2:化合物7の合成。
【０１５１】
【化３３】
0006612860.tif 000034
【０１５２】
DMF(550μL)中の化合物6(26.6mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、これにHATU(10.5mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、DMF(550μL)中の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(32mg、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252における4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸と類似したやり方だが、4-メチルベンゼンチオールの代わりにアルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)を使用して調製された)の溶液を添加した。結果として得られた溶液を5分間0℃で撹拌した後に、NMM(2.9μL)及びHATU(10.5mg)を添加した。反応溶液を0℃で2時間の間撹拌させておいた後に、室温に加温し、更に3.5時間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水及びアセトニトリル(v/v;1/1、1.2ml)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]が無色の油として与えられた(30.5mg、55%)。1H NMR (400 MHz, MeOH-δ4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.83 - 4.71 (1H, m), 4.58 (1H, dd, ), 3.92 - 3.83 (6H, m), 3.78 - 3.56 (140H, m), 3.57-3.51 (6H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.41 (2H, t), 2.24 - 2.13 (1H, m), 2.10 - 1.98 (1H, m), 1.45 (9H, s); m/z [M+Na]+ (2243, 50%), [M+H]+ (2221, 40%), [M+Na+2H]3+ (747,100%)。
【０１５３】
ジクロロメタン(2mL)中のビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、これにトリフルオロ酢酸(500μL)を添加し、結果として得られた溶液を1.5時間の間撹拌した。反応混合物を室温に加温しておき、更に1時間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/1、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]化合物7が無色の油として与えられた(20mg、68%)。1H NMR (400 MHz, MeOH-δ4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.81 - 4.72 (1H, m), 4.59 (1H, dd), 3.92 - 3.84 (6H, m), 3.67 - 3.50 (146H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.48 (2H, t), 2.26 - 2.15 (1H, m), 2.15 - 2.03 (1H, m); m/z [M+H]+ (2165, 55%), [M+2H]2+ (1083, 60%), [M+2H+Na]3+ (729, 100%)。
【０１５４】
工程3:試薬5の合成
DMF(600μL)中の化合物7(15.0mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した。HATU(2.9mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(600μL)中のval-ala-PAB-AHX-DM1(9.2mg)及びNMM(0.8μL)の溶液を添加した。5分後、追加量のHATU(2.9mg)及びNMM(0.8μL)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。3時間後、追加量のHATU(0.7mg)を添加し、反応混合物を0℃で撹拌した。更に2時間後、反応物を-20℃で16時間の間貯蔵した。反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-ala-PAB-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]化合物5が濃い清澄な無色の油として与えられた(14.3mg、64%)。1H NMR (600 MHz, MeOH δ4) (選択した特徴的シグナル) 5.69 (1H, dd,), 6.59 (1H, dd), 6.68 (1H, s), 6.69 (1H, d), 7.10 (1H, s), 7.28 (2H, d), 7.57 (2H, d), 8.01 (2H, d), 8.16 (2H, d); m/z [M-AHX-DM1]+ (2422, 40%)。
【０１５５】
［実施例３］
7反復単位のポリマー性脱離基及びメイタンシノイド細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬8の合成
【０１５６】
【化３４】
0006612860.tif 000035
【０１５７】
DMF(500μL)中の化合物7(12.4mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した。HATU(2.4mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(500μL)中の化合物10Aと類似したやり方で作製されたval-cit-AHX-DM1(6.4mg)及びNMM(0.7μL)の溶液を添加した。5分後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。2時間後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。更に1時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]8が濃い清澄な無色の油として与えられた(9.6mg、53%)。m/z[M-H2O]+(3148、8%)、[M-H2O]2+(1575、40%)、[M-H2O]3+(1050、100%)、1036[M-NHCO-H2O]3+。
【０１５８】
［実施例４］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬9の合成
【０１５９】
【化３５】
0006612860.tif 000036
【０１６０】
試薬9を、実施例3の試薬8と類似したやり方で、化合物7及びval-cit-PAB-MMAE TFA塩から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(24u)-OMe]9を無色の油として単離した。m/z[M+H]+(3270、12%)、[M+2H]2+(1636、50%)、[M+3H]3+(1091、100%)。
【０１６１】
［実施例５］
抗体薬物コンジュゲートの調製
抗体薬物コンジュゲートを、WO2014064423及びWO2014064424に記載されているものと類似した方法によって調製した。簡潔には、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンを使用して40℃で1時間の間、抗体(トラスツズマブ又はブレンツキシマブ)を還元した。次いで、鎖間ジスルフィド結合当たり試薬1.5モル当量(即ち、1、5、8、9)を用いる抗体のコンジュゲーションを、アセトニトリル又はDMFのいずれかに1.6mMの最終濃度まで試薬を溶解させることによって行った。抗体溶液を4.21mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。試薬を抗体に添加し、反応物における最終の抗体濃度を4mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で調整した。各溶液を穏やかに混合し、22℃でインキュベートした。抗体薬物コンジュゲート生成物を、各コンジュゲートのために疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。
【０１６２】
［実施例６］
WO2014064423に記載されている方法を使用して、試薬ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE、12を使用して生成されたブレンツキシマブ薬物コンジュゲート11と、試薬9から調製したブレンツキシマブ薬物コンジュゲート10とのin vitro細胞毒性比較。
【０１６３】
【化３６】
0006612860.tif 000037
【０１６４】
実施例6に記載されている通りの4の薬物対抗体比(DAR)を有する、精製されたブレンツキシマブ薬物コンジュゲート10及び11を、下に記載されている方法を使用して(CD30)-陽性細胞株Karpas 299の細胞増殖に対する阻害効果を測定することによってin vitroで評価した。
【０１６５】
in vitroでの細胞毒性薬又はADCを用いる処置に続く腫瘍細胞生存性の損失は、薬物又はADCの増加する濃度の存在下で細胞株を増殖させること、及びCellTiter Glo(登録商標)発光試薬(Promega社、Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008; 68:9280〜9290)を使用して増殖又は代謝活性の損失を定量化することによって測定することができる。プロトコールは、細胞播種、薬物処理、及びウェルに存在する細胞の数に直接関連するATP合成に基づく未処理細胞を参照する細胞生存性の決定を記載している。
【０１６６】
ヒトT細胞リンパ腫細胞株Karpas 299を、University of CambridgeのDr Abraham Karpasから得た。RPMI培地(Life Technologies(登録商標))、10%のウシ胎児血清、100u/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン中で、細胞を増殖させた。
【０１６７】
Neubauer血球計算器を使用して、CD30陽性Karpas 299をカウントし、5×104/mLの細胞密度に調整した。細胞を不透明壁の96ウェルプレート中に播種し(50μL/ウェル)、24時間の間37℃及び5%のCO2でインキュベートした。
【０１６８】
細胞培養の方法を、供給元からの製品情報シート及びそこに引用されている参考文献、例えばCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、R. Ian Freshney、第3版、Alan R. Liss、N.Y. 1994出版又は第5版、Wiley-Liss、N.Y. 2005出版から導入した。ADC又は遊離薬物(MMAE)の系列希釈を、希釈剤として関連の細胞培養培地を使用して2倍希釈で、カラム2〜11の96ウェルプレートにわたってピペッティングすることによってトリプリケートで作製した。CD30陽性Karpas 299を、Table 1(表1)に示される薬物濃度で処理した。次いで、細胞を該薬物と37℃及び5%のCO2で更に72時間の間インキュベートした。
【０１６９】
【表１】
0006612860.tif 000038
【０１７０】
Cell-Titer Glo(登録商標)発光試薬を使用して、製造業者の指示によって記載されている通りに(Promega社、Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008; 68:9280〜9290)、細胞生存性アッセイを行った。インキュベーション時間、例えば発光試薬を用いる細胞溶解及びインキュベーションを、最適な発光シグナルについてそれぞれ3分及び20分に延長した。プレートリーダー(例えばMD Spectramax M3プレートリーダー)を使用して発光を記録し、引き続いて、4パラメータ非線形回帰モデルを使用してデータを分析した。
【０１７１】
結果は、Karpas 299細胞内の抗体コンジュゲート10、11又は遊離薬物のいずれかでの処理に対する細胞生存性応答を例示する図1及び図2に示されている。図1は、CD30陽性Karpas 299細胞株の細胞生存性に対する、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10(実線)及び遊離薬物、MMAE(点線)の効果を示し、一方図2は、CD30陽性Karpas 299細胞株の細胞生存性に対する、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート11(実線)及び遊離薬物、MMAE(点線)の効果を示している。生存性は、未処理細胞の%として表されている。%生存性(Y軸)は、全てのコンジュゲート並びに遊離薬物についてのIC50値を決定するため、pMでの薬物濃度の対数(x軸)に対してプロットされている。IC50値はTable 2(表2)に示されている。
【０１７２】
【表２】
0006612860.tif 000039
【０１７３】
図1及び図2及びTable 2(表2)に示されている通り、抗体-薬物コンジュゲート10及び11は、CD30陽性Karpas 299において活性である。
【０１７４】
［実施例７］
試薬9から調製したブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10を、WO2014064423に記載されている方法を使用して生成されたブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート11と比較するin vivo異種移植片試験。
各々がDAR=4を有する、2つの精製された抗体薬物コンジュゲート(ADC)、10及び11を、実施例6内に記載されている通りに生成した。HIC精製後の純度は、両方のコンジュゲートについて95%より大きかった。
【０１７５】
次いで、各コンジュゲートを、以下の通りの異種移植片試験において使用した。
【０１７６】
試験1日目に20.2g(範囲=16.5gから23.2g)の平均体重(BW)を有する健康な雌性の重症複合免疫不全(SCID)マウス(C.B-17/Icr-Prkdcscid、Charles River Laboratories社)を使用した。動物をSPF健康状態に、FELASAガイドラインに従って飼育室内にて制御環境条件下で維持した。滅菌及び適切な空間に、床敷き材、食物及び水、環境及び社会的エンリッチメントを提供するように、動物用囲壁を設計した。
【０１７７】
Karpas 299 T未分化大細胞リンパ腫(ALCL)細胞株を用いて、SCIDマウスにおける皮下注射によって、異種移植片を開始した。腫瘍誘導の当日に、各試験マウスは、200μLのRPMI 1640における107のKarpas 299細胞を、右側腹部内に受けた。ノギスを使用して2つの次元で腫瘍を測定し、式:
【０１７８】
【数１】
0006612860.tif 000040
【０１７９】
(式中、腫瘍のmmでの、w=幅及びl=長さ)
を使用して体積を算出した。
【０１８０】
試験の1日目と指定された腫瘍移植の12日から14日後、各々が111から115mm3又は148から162mm3の群平均腫瘍体積を有する5匹又は10匹のマウスからなる群に、動物を分けた。処置は、全ての群において1日目に始まった。1つの処置群には1mg/kgでブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート11を用いて、及び別の処置群には1mg/kgでブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10を用いて、静脈内注射(i.v.)を1日目に与えた。ビヒクル処置された対照群におけるマウスに、PBSを与えた。
【０１８１】
マウスを個々にモニタリングし、各動物を、それの腫瘍が2000mm3のエンドポイント体積に達した時に安楽死させた。処置耐容性を、体重測定、及び処置関連副作用の臨床的徴候に対する頻繁な観察によって判定した。
【０１８２】
腫瘍体積の百分率変化を各マウスについて7日目に算出し、%平均±標準誤差として表した。全てのレジメンは良好に耐容性を示し、効力について評価することができた。ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート11を使用してコンジュゲートされたブレンツキシマブで処置された群における7日後の百分率腫瘍体積変化は212±43%であり、腫瘍体積の増加を示した。対照的に、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10を使用してコンジュゲートされたブレンツキシマブで処置された群における7日目の百分率腫瘍体積変化は、-2±6%で有意により低く(p=0.0043;スチューデントt検定)、腫瘍体積の低減及び抗腫瘍効果の増強を示した。結果は、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10及び11について腫瘍体積の百分率変化を示す図3に示されている。コンジュゲートを1mg/kg i.v.で投薬し、腫瘍体積を注射後7日目に測定した。値は、%平均±標準誤差として表されている。
【０１８３】
［実施例８］
細胞毒性ペイロード1Aを含むジスルフィド架橋試薬11Aの合成。
【０１８４】
【化３７】
0006612860.tif 000041
【０１８５】
細胞毒性ペイロード1Aの合成。
【０１８６】
【化３８】
0006612860.tif 000042
【０１８７】
工程1:化合物2Aの合成。
【０１８８】
【化３９】
0006612860.tif 000043
【０１８９】
ジメチルホルムアミド(DMF)(400μL)中の式:
【０１９０】
【化４０】
0006612860.tif 000044
【０１９１】
のアミノヘキサン酸メイタンシン(AHX-DM1).TFA塩(29.4mg)の撹拌溶液に、DMF(200μL)中の4-(N-Boc-アミノ)-1,6-ヘプタン二酸ビス-ペンタフルオロフェニルエステル(10.2mg)の溶液を添加した。溶液を0℃に冷却した後にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(13.5μL)を添加した。溶液を室温に加温しておき、18.5時間の間撹拌した。反応溶液を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(N-boc-アミノ)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物2A(推定定量的収量、29.7mg)が白色の固体として与えられたm/z[M+2H-2(H2O)-NHCO]2+844(100%)、[M+H]+1767。
【０１９２】
工程2:細胞毒性ペイロード1Aの合成。
化合物2(推定定量的収量、29.7mg)をギ酸(700μL)中に溶解させ、溶液を室温で1.5時間の間を撹拌した。揮発分を真空中で除去し、残渣を、緩衝剤A:緩衝剤B50:50v/v%混合物(1.5mL、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)中に溶解させることによってトリフルオロ酢酸塩に変換した。溶液を室温で5分間撹拌した後に、溶媒を凍結乾燥によって除去した。該方法を反復することで、4-(アミノ)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1細胞毒性ペイロード1Aがオフホワイトの固体として与えられた(18.0mg、2つの工程で60%)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO)]2+794(100%)、[M+H]+1667。
【０１９３】
工程3:化合物8Aの合成。
【０１９４】
【化４１】
0006612860.tif 000045
【０１９５】
特許(EP0624377A2)に記載されている手順に従って化合物8Aを合成することで、前に報告されているものと一致する分光データを有する白色の固体を与えた。
【０１９６】
工程4:化合物9Aの合成。
【０１９７】
【化４２】
0006612860.tif 000046
【０１９８】
DMF(500μL)中の化合物8A(20.0mg)及びDMF(400μL)中のHATU(40.0mg)のストック溶液を調製した。DMF(700μL)中の化合物1A(14.0mg)の撹拌溶液に、化合物8Aストック溶液(126.9μL)及びHATUストック溶液(77.8μL)のアリコートを添加した。反応溶液を0℃に冷却した後にDIPEA(4.11μL)を添加した。溶液を0℃で50分間撹拌した後に、化合物8Aストック溶液(126.9μL)、HATUストック溶液(77.8μL)及びDIPEA(4.11μL)のさらなるアリコートを添加した。溶液を40分間0℃で撹拌した。反応溶液を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(Fmoc-val-cit-アミド)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物9A(推定定量的収量、16.9mg)がオフホワイトの固体として与えられたm/z[M+2H-2(H2O)]2+1055(100%)。
【０１９９】
工程5:化合物10Aの合成。
【０２００】
【化４３】
0006612860.tif 000047
【０２０１】
DMF(500μL)中の化合物9A(推定定量的収量、16.9mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(3.04μL)を添加した。反応溶液を室温で1.5時間の間撹拌した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-(val-cit-アミド)-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1化合物10Aがオフホワイトの固体として与えられた(8.8mg、2つの工程で55%)m/z[M+2H]2+962(100%)。
【０２０２】
工程6:化合物12Aの合成。
【０２０３】
【化４４】
0006612860.tif 000048
【０２０４】
DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(41mg)、その後、NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)及びDIPEA(19μL)を添加した。溶液を室温に加温しておき、22時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(1mL)中に溶解させ、ジクロロメタン:メタノール(100:0v/vから80:20v/v)で溶出する順相カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去することで、Fmoc-Glu-(OtBu)-NH-PEG(24u)-OMe化合物12Aが無色の油として与えられた(84mg、67%)m/z[M+H]+(1097、10%)、[M+2H]2+(1035、100%)。
【０２０５】
工程7:化合物13Aの合成。
【０２０６】
【化４５】
0006612860.tif 000049
【０２０７】
DMF(2mL)中の化合物12A(74mg)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ピペリジン(49μL)を添加し、結果として得られた溶液を室温で撹拌した。22時間後、揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣をヘキサン(3×0.7mL)で摩砕した。有機溶媒を毎回デカンテーションし、結果として得られた残渣を真空中で乾燥させることで、Glu-(OtBu)-NH-PEG(24u)-OMe化合物13Aが固体として与えられた(61mg、97%)m/z[M+H]+(1097、10%)、[M+2H]2+(1035、100%)。
【０２０８】
工程8:化合物4Aの合成。
【０２０９】
【化４６】
0006612860.tif 000050
【０２１０】
DMF(70mL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(1.50g、Nature Protocols、2006、1(54)、2241〜2252)の撹拌溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(3.20g)及びトリエチルアミン(2.50mL)を添加した。結果として得られた反応混合物を、不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。19時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(2.4mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-チオ-ヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]-安息香酸化合物4Aが濃い清澄な無色の油として与えられた(1.77g、66%)m/z[M+H+]901。
【０２１１】
工程9:化合物5Aの合成。
【０２１２】
【化４７】
0006612860.tif 000051
【０２１３】
メタノール:水(18mL、9:1v/v)中4A(1.32g)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(著作権)(2.70g)を添加した。2.5時間後、揮発分を真空中で除去し、水をアセトニトリル(2×15mL)と共沸除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×10mL)中に溶解させ、硫酸マグネシウムのカラムに通して濾過し、ジクロロメタン(2×7mL)で洗浄した。溶出液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、濃い清澄な淡黄色の油(1.29g、92%)が与えられた。残渣の一部(700mg)を、水:アセトニトリル(1.50mL、3:1v/v)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸試薬5Aが濃い清澄な無色の油として与えられた(524mg、68%)m/z[M+H+]965。
【０２１４】
工程10:化合物14Aの合成。
【０２１５】
【化４８】
0006612860.tif 000052
【０２１６】
DMF(550μL)中の化合物5A(26.6mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、その時にHATU(10.5mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、DMF(550μL)中の13A(32mg)の溶液を添加し、結果として得られた溶液を5分間0℃で撹拌した後に、NMM(2.9μL)及びHATU(10.5mg)を添加した。反応溶液を0℃で2時間の間撹拌させておいた後に、室温に加温し、更に3.5時間の間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/1、1.2mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-(OtBu)-NH-PEG(24u)-OMe化合物14Aが無色の油として与えられた(30.5mg、55%)m/z[M+Na]+(2243、50%)、[M+H]+(2221、40%)、[M+Na+2H]3+(747、100%)。
【０２１７】
工程11:化合物15Aの合成。
【０２１８】
【化４９】
0006612860.tif 000053
【０２１９】
ジクロロメタン(2mL)中の化合物14A(30mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、この後、トリフルオロ酢酸(500μL)を添加し、結果として得られた溶液を1.5時間の間撹拌した。反応混合物を室温に加温しておき、更に1時間の間撹拌し、この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水及びアセトニトリル(v/v;1/1、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-NH-PEG(24u)-OMe化合物15Aが無色の油として与えられた(20mg、68%)m/z[M+H]+(2165、55%)、[M+2H]2+(1083、60%)、[M+2H+Na]3+(729、100%)。
【０２２０】
工程12:試薬11Aの合成。
【０２２１】
DMF(200μL)中のHATU(10mg)及びDMF(94.2μL)中のNMM(5.83μL)のストック溶液を調製した。化合物15A(5.4mg)を、DMF(153.7μL)中の化合物10A(3.6mg)の溶液中に、撹拌しながら溶解させた。撹拌溶液に、HATUストック溶液(40μL)のアリコートを添加した。溶液を0℃に冷却した後に、NMMストック溶液(10μL)のアリコートを添加した。50分後、HATUストック溶液(6.67μL)及びNMMストック溶液(1.67μL)のさらなるアリコートを添加した。反応溶液を0℃で更に30分間撹拌し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって直接精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬11Aがオフホワイトの固体として与えられた(3.8mg、53%)m/z[M+4H-(H2O)-NHCO]4+1003(100%)、[M+3H-2(H2O)-NHCO]3+1331、[M+2H-2(H2O)]2+2017。
【０２２２】
［実施例９］
細胞毒性ペイロード1Aを含むジスルフィド架橋試薬16Aの合成。
【０２２３】
【化５０】
0006612860.tif 000054
【０２２４】
工程1:化合物17Aの合成。
【０２２５】
【化５１】
0006612860.tif 000055
【０２２６】
DMF(200μL)中のヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、6.6mg)のストック溶液を調製した。DMF(500μL)中の細胞毒性ペイロード1A(10mg)の撹拌溶液に、Fmoc-val-ala-PAB-PNP(3.7mg)、及びHOBtストック溶液(2μL)のアリコートを添加した。反応溶液を0℃に冷却した後に、DIPEA(2.14μL)を添加した。次いで、反応溶液を室温で18時間の間撹拌した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1試薬17Aが与えられた。
【０２２７】
工程2:化合物18Aの合成。
【０２２８】
【化５２】
0006612860.tif 000056
【０２２９】
ビス-メイタンシノイド化合物アミン-val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1 18Aを、化合物10Aについて記載されているものと類似したやり方で、化合物9Aの代わりに化合物17Aを使用して合成した。
【０２３０】
工程3:試薬16Aの合成。
ビス-メイタンシノイド試薬ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-[NH-PEG(24u)-OMe]-[val-ala-PAB-アミド-1,6-ヘプタンジアミドビス-AHX-DM1]16Aを、試薬11Aについて記載されているものと類似したやり方で、化合物10Aの代わりに化合物18Aを使用して合成した。
【０２３１】
［実施例１０］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬13の合成
【０２３２】
【化５３】
0006612860.tif 000057
【０２３３】
工程1:化合物14の合成。
【０２３４】
【化５４】
0006612860.tif 000058
【０２３５】
Boc-L-Glu(134.9mg)及び(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(724mg)を無水DMF(4mL)中に溶解させ、0℃で窒素雰囲気下にて1.25時間の間撹拌した。次いで、この溶液を、DMF(3mL)中のH2N-PEG(12u)-Me(685mg)及びNMM(179.8μL)の溶液に添加した。次いで、溶液をN2下で4時間の間撹拌した。次いで、溶液を0〜4℃、窒素雰囲気下で4.5時間の間撹拌した。さらなるBOP(241mg)及びNMM(60μL)を添加し、反応混合物を24時間の間4℃で放置した。揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから65:35v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去した。該材料を、酢酸エチル:メタノール(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーによって再精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Boc-Glu-[PEG(12u)-Me]2化合物14が無色の油として与えられた(450mg)。m/z[M+H]+(1331、100%)、[M+2H]2+(665、100%)。
【０２３６】
工程2:化合物15の合成。
【０２３７】
【化５５】
0006612860.tif 000059
【０２３８】
化合物14(450mg)をDCM(25mL)中に溶解させ、これに、TFA(2.5mL)を添加した。溶液を室温で5時間の間撹拌した。この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから60: 40v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2TFA化合物15が清澄な無色のガムとして与えられた(320mg)m/z[M+Na]1+(1253.0、10%)[M+H]2+(616.8、100%)。
【０２３９】
工程3:化合物16の合成
【０２４０】
【化５６】
0006612860.tif 000060
【０２４１】
無水DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36.6mg)の撹拌溶液に、HATU(37.30mg)を添加した。反応混合物を0℃で窒素雰囲気下にて1時間の間撹拌し、次いで、DMF(1mL)中の化合物15(103.5mg)及びNMM(19.2μL)の溶液に添加した。追加のDMF(1mL)を添加した。撹拌反応物を放置することで室温に5時間かけて加温した。揮発分を真空中で除去した。結果として得られた淡黄色の油を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから50:50v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物16(173mg)が白色ペーストとして与えられた。m/z[M+1]+(1638、100%)及び[M+Na]+(1660、57%)。
【０２４２】
工程4:化合物17の合成
【０２４３】
【化５７】
0006612860.tif 000061
【０２４４】
無水DMF(3.2mL)中の化合物16(173mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(104.4μL)を添加した。溶液を室温でアルゴン下にて1.5時間の間撹拌した。揮発分を真空中で除去し、残渣をヘキサンで反復して摩砕した。生成物を真空中で乾燥させることで、L-Glu-(OtBu)-L-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物17(152mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(1416.7、85%)、[M+2H]2+(708.5、100%)、[M+Na]1+(1438.7、30%)
【０２４５】
工程5:化合物18の合成
【０２４６】
【化５８】
0006612860.tif 000062
【０２４７】
無水DMF(3mL)中の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(114mg)の撹拌溶液に、HATU(51.4mg)を添加した。反応混合物を0℃で0.5時間の間撹拌し、次いで、DMF(2mL)中のL-Glu(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2(152.0mg)の溶液に添加し、さらなるDMF(1mL)、その後NMM(14.8μL)で洗浄した。反応混合物を0〜15℃で3.5時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから55:45v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物18(160.6mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(2366.7、100%)、[M+2H]2+(1184.0、80%)[M+H2O]3+(795.5、100%)。
【０２４８】
工程6:化合物19の合成
【０２４９】
【化５９】
0006612860.tif 000063
【０２５０】
無水DCM(6mL)中の化合物18(58mg)の撹拌溶液に、TFA(6.0mL)を添加した。反応混合物を室温で2時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去し、水(25mL)中に溶解させ、凍結乾燥することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OH)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2化合物19(160.6mg)が清澄な無色の油として与えられた。m/z[M+H]1+(2306.8、90%)、[M+2H]2+(1153.0、100%)。
【０２５１】
工程7:試薬13の合成
試薬13を、実施例3の試薬8と類似したやり方で、化合物7及びval-cit-PAB-MMAE TFA塩から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(val-cit-PAB-MMAE)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]213を無色の油として単離した(69%)。m/z[M+H]1+(3410.4、90%)、[M+2H]2+(1706.2、60%)、[M+3H]3+(1137.2、85%)、[M+4H]4+(852.8、70%)。
【０２５２】
［実施例１１］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬20の合成
【０２５３】
【化６０】
0006612860.tif 000064
【０２５４】
試薬20を、実施例3の試薬8と類似したやり方で、化合物7及びval-cit-PAB-MMAE TFA塩の代わりに化合物20Bを使用して合成した。
【０２５５】
【化６１】
0006612860.tif 000065
【０２５６】
化合物20Bを、実施例3における化合物7と類似したやり方で、H2N-PEG(24u)の代わりにH2N-PEG(12u)-トリ(m-dPEG(24u)を使用して作製した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(12u)-トリ(m-dPEG(24u))]20を無色の油として単離した。m/z[M+2H]2+(3166、20%)、[M+3H]3+(2111、50%)、[M+4H]4+(1583、100%)。
【０２５７】
［実施例１２］
2種のオーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬21の合成
【０２５８】
【化６２】
0006612860.tif 000066
【０２５９】
工程1:化合物22の合成。
【０２６０】
【化６３】
0006612860.tif 000067
【０２６１】
無水DMF(18mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(2000mg)の撹拌溶液に、HOBt(666mg)及びDIC(768μL)を添加した。反応混合物を0℃で10分間、次いで2.5時間室温で撹拌した。H-L-Glu-(OtBu)-OH(1194mg)及びDIPEA(2464μL)を添加し、反応混合物を18時間の間室温で撹拌した。反応混合物を水(100mL)で希釈し、希釈HClを添加することによってpH2.0に酸性化した。水性層をEtOAc(3×100mL)で抽出し、有機相を合わせ、水(2×50mL)及び飽和ブライン溶液(1×50mL)で洗浄した。EtOAc層をNa2SO4で2時間の間脱水し、次いで、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。生成物を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから80:20v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって単離した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH 22(875mg)が白色の固体として与えられた。m/z[M+H]1+(610.8、85%)、[M+Na]1+(633.1、55%)、[2M+Na]+(1243.2、55%)。
【０２６２】
工程2:化合物23の合成。
【０２６３】
【化６４】
0006612860.tif 000068
【０２６４】
無水DMF(5mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH(510mg)及びNH2-PEG(24u)-OMe(1000mg)の撹拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(43.8μL)及びHATU(47.6mg)を添加した。反応混合物を0℃で10分間、次いで16時間室温で撹拌した。溶液を真空中で2mLに濃縮し、残渣を、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0v/vから83:17v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物23(644mg)が白色のペーストとして与えられた。m/z[M+H]1+(1681.0、40%)、[M+Na]1+(1704.0、30%)及び[M+2H]2+(841.4、55%)。
【０２６５】
工程3:化合物24の合成。
【０２６６】
【化６５】
0006612860.tif 000069
【０２６７】
無水DMF(900μL)中のFmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe(193mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(34μL)を添加し、反応混合物を1時間室温で撹拌した。溶液を真空中で濃縮乾固し、残渣をEt2O(2×2.5mL)で摩砕した。生成物を真空中で乾燥させることで、H-L-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物24(166mg)がオフホワイトの固体として与えられた。
【０２６８】
工程4:化合物25の合成。
【０２６９】
【化６６】
0006612860.tif 000070
【０２７０】
試薬25を、実施例8の試薬18と類似したやり方で、化合物24及び4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe25を無色の油として単離した。m/z[M+H]1+(2407.2、25%)、[M+Na]1+(2429.4、70%)。
【０２７１】
工程5:化合物26の合成。
【０２７２】
【化６７】
0006612860.tif 000071
【０２７３】
試薬26を、実施例8の試薬19と類似したやり方で、化合物25から合成した。ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-Glu-(OH)-Glu-(OH)-PEG(24u)-OMe26を無色の油として単離した。m/z[M+H]1+(2294.2、20%)、[M+Na]1+(2317.4、10%)及び[M+2Na]2+(1217.4、100%)。
【０２７４】
工程6:試薬21の合成。
無水DMF(1.5mL)中の化合物26(28.1mg)、val-cit-PAB-MMAE TFA塩(30.6mg)及びHATU(13.9mg)の撹拌溶液に、N-メチルモルホリン(6.7μL)を添加し、反応混合物を0℃で5時間の間撹拌した。溶液を水(1mL)で希釈し、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%TFA及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.1%TFA(100:0v/vから60:40v/v)で溶出する逆相C18-フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-ビス-[Glu-(val-cit-PAB-MMAE)]-PEG(24u)-OMe化合物21(36.1mg)が白色の固体として与えられた。m/z[M+2H]2+(2252.7、20%)、[M+3H]3+(1501.6.7、40%)及び[M+4H]4+(1126.6、100%)。
【０２７５】
［実施例１３］
in vitro細胞生存性アッセイによる抗体薬物コンジュゲート(ADC)の分析
実施例5において調製された抗体コンジュゲート及び遊離ペイロードのin vitro効力を、標的過剰発現がん細胞株の細胞増殖に対する阻害効果を測定することによって決定した。
【０２７６】
in vitroにおけるADC又は遊離ペイロードでの処理に続く腫瘍細胞生存性の損失は、化合物の増加する濃度の存在下で細胞株を増殖させること、及びCell-Titer Glo(登録商標)発光試薬(Promega社)を使用して増殖又は代謝活性の損失を定量化することによって測定することができる。プロトコールは、細胞播種、薬物処理、及びウェルに存在する細胞の数に直接相関するATP合成に基づく未処理細胞を参照する細胞生存性の決定を記載している。
【０２７７】
細胞株の特徴並びにアッセイについての播種密度は、下記のTable 3(表3)に記載されている。
【０２７８】
付着性JIMT-1細胞をTrypLEで剥離し、完全培地中に再懸濁した。ディスポーザブルNeubauerカウントチャンバーを使用して細胞をカウントし、下記のTable 3(表3)に詳述されている通りに細胞密度を調整した。組織培養処理された不透明壁の96ウェル白色プレート中に細胞を播種し(100μL/ウェルで付着性細胞、及び50μL/ウェルでKarpas-299)、24時間の間37℃及び5%のCO2でインキュベートした。
【０２７９】
【表３】
0006612860.tif 000072
【０２８０】
8点系列希釈の化合物を関連の培養培地中で調製した。滴定範囲を各化合物/細胞株組合せについて調整した。付着性細胞の場合において、該細胞を含有するプレートからの培地を除去し、1x系列希釈化合物の100μL/ウェルによって置き換えた。
【０２８１】
Cell-Titer Glo(登録商標)発光試薬(Promega社)を使用して、製造業者によって記載されている通りに、細胞生存性アッセイを行った。
【０２８２】
Molecular Devices SpectramaxM3プレートリーダーを使用して発光を記録し、引き続いて、GraphPad Prism 4パラメータ非線形回帰モデルを使用してデータを分析した。
【０２８３】
生存性を未処理細胞の%として表し、以下の式:
【０２８４】
【数２】
0006612860.tif 000073
【０２８５】
を使用して算出した。
【０２８６】
%生存性を薬物濃度の対数に対してプロットすることで、全てのコンジュゲートについてIC50値を外挿した。
【０２８７】
［実施例１４］
ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10を、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート46(比較)、トラスツズマブ-薬物コンジュゲート32(陰性対照)、及びAdcetris(登録商標)(比較)と比較するKarpas-299マウス異種移植片試験。
この実施例において、トラスツズマブ-薬物コンジュゲート32を陰性対照として使用した。トラスツズマブは、存在しない又は非常に低いレベルで存在する標的HER-2をKarpas-299細胞上に結合する。したがって、トラスツズマブ-薬物コンジュゲート32は、これらの細胞で特異的に標的化されず、非特異的細胞毒性効果のみを有するはずである。逆に、ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10は、Karpas-299細胞上で発現される細胞表面マーカーCD30を認識して、ADCを特異的にこれらの細胞に標的化し、特異的細胞毒性効果を生じる。
【０２８８】
ブレンツキシマブ薬物コンジュゲート10及び46を、それぞれコンジュゲーション試薬9及び45から、実施例5に記載されている方法によって調製した。トラスツズマブ薬物コンジュゲート32を、コンジュゲーション試薬1から、実施例5に記載されている方法によって調製した。
【０２８９】
19.7gの平均体重を有する健康な雌性CB17 SCIDマウス(CB17/lcr-Prkdcscid/Crl)を、細胞接種のために使用した。腫瘍細胞注射より24から72時間前に、マウスにγ照射した(1.44Gy、60Co)。動物をSPF健康状態に、FELASAガイドラインに従って飼育室内にて制御環境条件下で維持した。
【０２９０】
200μLのRPMI 1640における107のKarpas-299細胞(T未分化大細胞リンパ腫、ALCL)の皮下注射によって右側腹部内に、腫瘍を誘導した。腫瘍を週2回ノギスで測定し、式:
【０２９１】
【数３】
0006612860.tif 000074
【０２９２】
を使用して、体積を概算した。
【０２９３】
腫瘍移植の14日後、Vivo manager(登録商標)ソフトウェアを使用して、動物を5匹のマウス(152.9mm3平均腫瘍体積)の群にランダム化し、処置を開始した(0日目)。尾静脈を介して、全ての試験物質を注射した(i.v.、ボーラス)。4つの0.4mg/kg用量のADCを4日毎に与え(Q4Dx4)、ビヒクル群にPBSを使用した(Q4Dx4)。
【０２９４】
マウスの生存性及び挙動を毎日記録した。体重を週2回測定した。人道的エンドポイント(humane endpoint)に到達した時(例えば、2,000mm3の腫瘍体積)又は投薬後最大6週後に、動物を安楽死させた。
【０２９５】
平均腫瘍体積±標準誤差は、各処置群について図4aから図4cに表されている。全ての化合物は良好に耐容性を示した。結果は、コンジュゲート10が、腫瘍体積の初期低減に加えて、コンジュゲート46又はAdcetris(登録商標)よりも腫瘍増殖の大きな及び延長された阻害を呈したが、陰性対照32がビヒクル(薬物なし)対照と比べて識別可能な効果を有していなかったことを示している。
【０２９６】
［実施例１５］
トラスツズマブ-薬物コンジュゲート27をKadcyla(登録商標)(比較)と比較するJIMT-1マウス異種移植片試験。
トラスツズマブ-薬物コンジュゲート27を試薬9から、実施例5に記載されている方法によって調製した。
【０２９７】
到着時に生後6週であった健康な雌性NMRIヌードマウス(RjOrl:NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu)を、細胞接種のために使用した。動物をSPF健康状態に、FELASAガイドラインに従って飼育室内にて制御環境条件下で維持した。
【０２９８】
PBS中の200μLの細胞懸濁液における5×106のJIMT-1細胞(乳癌)の皮下注射によって右側腹部内に、腫瘍を誘導した。マトリゲル(200μLの細胞懸濁液当たり40μLのマトリゲル)を腫瘍細胞の接種直前に添加した。腫瘍をノギスで週2回測定し、式:
【０２９９】
【数４】
0006612860.tif 000075
【０３００】
を使用して、体積を概算した。
【０３０１】
腫瘍体積がおよそ150mm3の平均腫瘍体積に到達した時に、動物を10匹のマウス(128mm3の平均腫瘍体積)の群にランダム化し、処置を開始した(0日目)。尾静脈(i.v.、ボーラス)を介して、全ての試験物質を注射した。ADCの単回5mg/kg用量を10mL/kgで与え、ビヒクル群にはPBSを使用した。
【０３０２】
マウスの生存性及び挙動を毎日記録した。体重を週2回測定した。人道的エンドポイントに到達した時(例えば、>10%体重の算出腫瘍質量、群分布での体重と比較した>20%の動物体重損失、腫瘍の潰瘍化、移動性の欠如、疼痛の一般徴候)、又は所定の試験終了日に、動物を安楽死させた。
【０３０３】
平均腫瘍体積±標準誤差は、各群について図5a及び図5bに表されている。両化合物は良好に耐容性を示した。結果は、コンジュゲート27が腫瘍体積の完全な低減を示して、ビヒクル対照と比べてほとんど効果を有さなかった市販品、Kadcyla(登録商標)よりも大きな活性を示したことを示している。
【０３０４】
［実施例１６］
ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10、28及び29をAdcetris(登録商標)(比較)と比較するKarpas-299マウス異種移植片試験。
コンジュゲート28及び29を、実施例12からのコンジュゲーション試薬21及び実施例10からのコンジュゲーション試薬13からそれぞれ調製した。コンジュゲーションを実施例5に記載されている通りに行った。
【０３０５】
18.9gの平均体重を有する健康な雌性CB17-SCIDマウス(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J、Charles River Laboratories社)を、細胞接種のために使用した(0日目)。腫瘍細胞注射より24から72時間前に、マウスにγ照射した(1.44Gy、60Co)。動物をSPF健康状態に、FELASAガイドラインに従って飼育室内にて制御環境条件下で維持した。
【０３０６】
200μLのRPMI 1640における107のKarpas-299細胞(T未分化大細胞リンパ腫、ALCL)の皮下注射によって右側腹部内に、腫瘍を誘導した。腫瘍をノギスで週2回測定し、式:
【０３０７】
【数５】
0006612860.tif 000076
【０３０８】
を使用して、体積を概算した。
【０３０９】
腫瘍移植の15日後(15日目)、Vivo manager(登録商標)ソフトウェアを使用して、動物を8匹のマウス(169mm3の平均腫瘍体積)の群にランダム化し、処置を開始した。ビヒクル群からの動物は、PBSの単回静脈内(i.v.)注射を受けた。処置群にADCの単回i.v.注射を用いて1mg/kgで投薬した。
【０３１０】
隔週の体重測定、及び処置関連の副作用の臨床的徴候についての毎日の観察によって、処置耐容性を判定した。人道的エンドポイントに到達した時(例えば、1,600mm3の腫瘍体積)又は投薬後最大6週後に、マウスを安楽死させた。
【０３１１】
平均腫瘍体積±標準誤差は、各群について図6a、図6b、図6c及び図6dに表されている。全ての化合物は良好に耐容性を示した。結果は、全てのコンジュゲートがAdcetris(登録商標)よりも大きな活性を呈し、コンジュゲート10及び29が試験の持続期間の間、腫瘍体積の完全な低減を示したことを示している。
【０３１２】
［実施例１７］
ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート10及び30をAdcetris(登録商標)(比較)と比較するKarpas-299マウス異種移植片試験。
コンジュゲート30を実施例11からのコンジュゲーション試薬20から調製した。コンジュゲーションを実施例5に記載されている通りに行った。
【０３１３】
このin vivo試験を、実施例16に記載されているものと同様の方式で行った。
【０３１４】
腫瘍誘導時(0日目)の動物の平均体重は19.9gであった。
【０３１５】
ランダム化及び処置を、平均腫瘍体積が205mm3に到達していた15日目に発生させた。ビヒクル群からの動物は、PBSの単回静脈内(i.v.)注射を受けた。処置群にADCの単回i.v.注射を用いて1mg/kgで投薬した。
【０３１６】
平均腫瘍体積±標準誤差は、各群について図7a、図7b及び図7cに表されている。全ての化合物は良好な耐容性を示した。結果は、両コンジュゲート10及び30がAdcetris(登録商標)よりも大きな腫瘍低減活性を呈し、10が試験の持続期間の間、完全な腫瘍低減を呈したことを示している。
【０３１７】
［実施例１８］
トラスツズマブ-薬物コンジュゲート31をKadcyla(登録商標)(比較)と比較するJIMT-1マウス異種移植片試験。
実施例2からのコンジュゲーション試薬5を使用して、コンジュゲート31を調製した。コンジュゲーションを実施例5に記載されている通りに行った。
【０３１８】
該試験を実施例15に記載されているのと同様の方式で行った。
【０３１９】
腫瘍体積がおよそ150mm3の平均腫瘍体積に到達した時に、動物を10匹のマウス(150mm3平均腫瘍体積)の群にランダム化し、処置を開始した(0日目)。尾静脈(i.v.、ボーラス)を介して、全ての試験物質を注射した。ADCの10mg/kg又は30mg/kgのいずれかの単回用量を10mL/kgで与え、ビヒクル群にはPBSを使用した。
【０３２０】
平均腫瘍体積±標準誤差は、各群について図8a及び図8bに表されている。全ての化合物は良好に耐容性を示した。結果は、コンジュゲート31が腫瘍体積を低減して、両方の用量でKadcyla(登録商標)よりも大きな活性を呈したことを示している。
【０３２１】
［実施例１９］
ペンダントPEG基、連続したPEG基(即ち、非ペンダントPEG基)及びAdcetris(登録商標)を有するADCの薬物動態学的分析。
ブレンツキシマブコンジュゲート10を、この試験において、ペンダントPEG基を有するADCとして使用した。
【０３２２】
ブレンツキシマブコンジュゲート11を、非ペンダントPEG基を有するコンパレータとして使用した。
【０３２３】
ラットにおけるin vivo薬物動態。200gの平均体重を有するスプラーグドーリーラット(1群当たり3匹のラット)を、10、11又はAdcetris(登録商標)のいずれかで、尾静脈(IV、ボーラス)を介して7mg/kgの単回用量で処置した。100μLの血液の連続サンプリングを、投薬前に、引き続いて投薬後30分、24時間、48時間、7日、14日及び35日にそれぞれ行った。血漿を新鮮な血液試料から調製し、分析まで-80℃で凍結した。
【０３２４】
総(抗CD30抗体)ELISA。ELISA技術を使用して、血漿試料からの総ブレンツキシマブ抗体含有量を定量化した。簡潔には、Maxisorp(商標)96ウェルプレート(Nunc/Fisher社)を組換えヒトCD30(Sino Biological社、希釈剤中2.5μg/mL)でコーティングし、4℃で終夜インキュベートした。血漿試料を希釈することで、不明なADCがS字形の標準検量線の直線範囲内に確実に入るようにした。次いで、100μLの希釈血漿試料をCD30コーティングプレート上に移し、3時間の間インキュベートした。インキュベーション後、プレート洗浄器を使用して0.05%Tween-20(PBST)を含有するPBSを用いて3回(200μL/ウェル)、プレートを洗浄した。HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG(Promega社)をプレートに添加し、試料を1時間の間室温で振盪機上にて350rpmでインキュベートした。次いで、プレート洗浄器を使用してPBSTを用いて3回及び洗浄緩衝液を用いて1回、プレートを洗浄した。100μLの予備加温されたTMBを添加し、7分間インキュベートした。該アッセイを100μLの0.5M H2SO4で停止させ、プレートリーダーを使用してUV  λ=430nmで読み取った。データをプロットし、GraphPad Prism 5及びMicrosoft Excelで評価した。
【０３２５】
平均DAR決定のためのCD30親和性捕捉。ストレプトアビジンをコーティングされた磁気ビーズ(Dynabeads-Streptavidin T1、Life Technologies社)を使用して、親和性捕捉を行った。CD30(組換えヒトCD30、Sino Biological社)をビオチン化し、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介してビーズに固定化し、最終的に、脱脂乳ペプチドを使用して遮断した。PBS中の血漿試料500μLをCD30コーティングビーズに添加し、終夜4℃でインキュベートし、最終的に、PBSを使用して洗浄した。酸性溶出緩衝剤を使用して5分間4℃で、捕捉された抗体を溶出した。引き続いて、酢酸ナトリウム緩衝剤、pH8を使用して、溶出物をpH7に中和した。溶出された試料をHICローディング緩衝剤と更に混合し、UV検出(HIC-UV)を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析した。
【０３２６】
平均DAR決定のための疎水性相互作用クロマトグラフィー。平均薬物対抗体比(DAR)を決定するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、親和性捕捉ADCを分析した。該方法は、280nmでの検出を用いるTOSOH TSKゲルButyl-NPR HIC分離カラムを使用する、30分での100%緩衝剤A(50mMのリン酸ナトリウムpH7.0、1.5Mの硫酸アンモニウム)から100%緩衝剤B(50mMのリン酸ナトリウムpH7.0、20%のイソプロパノール)への直線勾配から成っていた。
【０３２７】
図9a及び図9bは、850時間の期間にわたってのラットにおける、ADC 10、11及びAdcetris(登録商標)についての総抗体(μg/mL)及び平均DAR値を示している。結果は、コンジュゲート10が、コンジュゲートからの薬物損失の最も低い速度及びこの期間にわたる循環からのクリアランスの最も低い速度を有することを示している。コンジュゲート11及びAdcetris(登録商標)(比較)は、薬物解離のかなり速い速度を示し、より迅速に排出される。
【０３２８】
［実施例２０］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬33(比較)の合成。
マレイミド官能グルーピングを含有するコンジュゲーション試薬33を、WO2015057699内に記載されている通りに合成した。
【０３２９】
【化６８】
0006612860.tif 000077
【０３３０】
［実施例２１］
細胞毒性ペイロード36を含むコンジュゲーション試薬35の合成。
【０３３１】
【化６９】
0006612860.tif 000078
【０３３２】
工程1:化合物38の合成。
【０３３３】
【化７０】
0006612860.tif 000079
【０３３４】
無水DMF(6mL)中のBoc-L-Glu(OH)-OH(51.6mg)の撹拌溶液に、BOP(277mg)を添加した。溶液を0℃で20分間撹拌した後に、MeO-PEG(24)-NH2(500mg)、その後NMM(68.9μL)を添加した。4時間後、追加量のBOP(92mg)及びNMM(23.0μL)を添加した。更に2.5時間後、反応混合物を-20℃で18時間の間貯蔵した後に、真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、白色の固体が与えられた(373mg)。ギ酸(6mL)を固体に添加し、結果として得られた混合物を不活性雰囲気下で60分間撹拌した後に、真空中で濃縮した。残渣を95%水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(約6mL)中に溶解させ、終夜凍結乾燥することで、TFA・H2N-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物108がオフホワイトの固体として与えられた(330mg)。m/z[M+2H]2+(1144、5%)、[M+3H]3+(763、35%)、[M+4H]+(573、100%)。
【０３３５】
工程2:化合物39の合成。
【０３３６】
【化７１】
0006612860.tif 000080
【０３３７】
無水DMF(18mL)中のFmoc-Glu(OtBu)-OH(2.00g)の撹拌溶液に、0℃で、HOBt(666mg)及びDIC(768μL)を添加した。反応混合物をRTに加温しておき、2時間後、Glu(OtBu)-OH(1.19g)及びDIPEA(2.46mL)を添加した。20時間の間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相カラムC18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-OH、化合物39が白色の固体として与えられた(1.03g)。m/z[2M+H]+(1221、15%)、[M+H]+(611、60%)、[M-tBu+H]+(554、65%)、[M-2tBu+H]+(499、100%)。
【０３３８】
工程3:化合物40の合成。
【０３３９】
【化７２】
0006612860.tif 000081
【０３４０】
無水DMF(10mL)中の化合物38(330mg)の撹拌溶液に、化合物39(100mg)を添加した。次いで、0℃で、HATU(156mg)及びNMM(45.3μL)を添加し、結果として得られた溶液を5分間撹拌した後に、NMM(2.9μL)及びHATU(10.5mg)を更に添加した。反応溶液を更に20分間撹拌させておいた後に、室温に加温し、その上、撹拌を更に4時間の間続けた。この時間の後、追加量のHATU(51.1mg)及びNMM(15.1μL)を添加した。更に1.5時間後、混合物を-20℃で18時間の間貯蔵した後に、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物40が、白色の固体として与えられた(193mg)。m/z[M+3H]3+(961、20%)、[M-tBu+4H]4+(707、100%)、[M-2tBu+4H]4+(693、85%)、[M+5H]5+(577、75%)。
【０３４１】
工程4:化合物41の合成。
【０３４２】
【化７３】
0006612860.tif 000082
【０３４３】
無水DMF(1.5mL)中の41(193mg)の撹拌溶液に、ピペリジン(19.8μL)を添加した。90分後、さらなる量のピペリジン(13.2μL)を添加し、反応物を更に90分間撹拌した後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。溶媒を高真空下で除去し、結果として得られた残渣をヘキサン中で摩砕した。残渣を高真空下で30分間更に乾燥させた後に、緩衝剤A:緩衝剤B(2mL、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸)の50:50混合物中に溶解させ、終夜凍結乾燥することで、TFA・H2N-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe、化合物41が淡青色の固体として与えられた(186mg)。m/z[M+3H]3+(887、20%)、[M+4H]4+(666、100%)、[M+5H]5+(533、30%)。
【０３４４】
工程5:化合物42の合成。
【０３４５】
【化７４】
0006612860.tif 000083
【０３４６】
無水DMF(1.5mL)中の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(71.0mg)の撹拌溶液に、HATU(27.9mg)を添加した。混合物を0℃に冷却し、不活性雰囲気下で30分間撹拌した。無水DMF(2.5mL)中の41(186mg)の溶液、その後HATU(22.9mg)及びNMM(14.7μL)を添加し、混合物をRTに加温しておいた。
【０３４７】
3時間後、追加量の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(18.1mg)、HATU(50.8mg)及びNMM(15.1μL)を添加した。更に1.5時間後、さらなる量の4-[2,2-ビス[アルファ-メトキシ-オメガ-スルホニルヘプタ(エチレングリコール)]アセチル]安息香酸(9.04mg)、HATU(50.8mg)及びNMM(15.1μL)を添加した。反応混合物を更に8時間の間撹拌し、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって2回精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、42が淡黄色の油として与えられた(推定定量)。m/z[M+4H]4+(902、60%)、[M-tBu+4H]4+(888、60%)、[M-2tBu+4H]4+(874、45%)、[M-tBu+5H]5+(711、100%)。
【０３４８】
工程6:化合物43の合成。
【０３４９】
【化７５】
0006612860.tif 000084
【０３５０】
ギ酸(2mL)を42に不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を60分間撹拌した後に、真空中で濃縮した。該材料を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０３５１】
有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、43が無色の油として与えられた(28.1mg)。m/z[M+3H]3+(1165、5%)、[M+4H]4+(874、65%)、[M+5H]5+(699、100%)。
【０３５２】
工程7:試薬35の合成。
無水DMF(270μL)中の43(15.0mg)の撹拌溶液に、HATU(4.08mg)を添加した。混合物を0℃に冷却し、不活性雰囲気下で20分間撹拌した。無水DMF(300μL)中のval-Cit-PAB-MMAE(12.2mg)の溶液、その後HATU(2.45mg)及びNMM(1.89μL)を添加し、混合物をRTに加温しておいた。4時間20分後、追加量のHATU(3.3mg)及びNMM(0.94μL)を添加した。反応混合物を更に2時間の間撹拌した後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。RTに加温すると、HATU(3.26mg)及びNMM(0.94μL)を撹拌溶液に添加した。4.5時間後、追加量のHATU(1.63mg)及びNMM(0.472μL)を添加し、反応物を更に2.5時間の間撹拌させておいた後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。該材料を、緩衝剤A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、35が白色の固体として与えられた(13.8mg)。m/z[M+4H]4+(1426、5%)、[M+5H]5+(1141、70%)、[M+6H]6+(951、100%)、[M+7H]7+(815、20%)。
【０３５３】
［実施例２２］
抗体-薬物コンジュゲート(ADC)34(比較)及び44を与えるための、ブレンツキシマブへの試薬33(比較)及び35のコンジュゲーション。
WO2015057699、US7090843、Lyonら、(2015)Nature Biotechnology、33(7) 733〜736ページ及びLyonら、(2012)、Methods in Enzymology、502巻、123〜137ページ内に記載されている方法を使用して、コンジュゲーション試薬33をブレンツキシマブにコンジュゲートし、ADC 34を生じさせた。簡潔には、20mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、pH6.5(150mMのNaCl、20mMのEDTA)中のブレンツキシマブを、TCEP(6当量)を用いて40℃で1時間の間還元した。次いで、遊離チオール当たり2.0モル当量の試薬33を用いる還元抗体のコンジュゲーションを行った。試薬33をmAbに添加することで、4mg/mLの最終抗体濃度が与えられた。溶液を穏やかに混合し、22℃で2時間の間インキュベートした。2時間後、追加の試薬33(0.2モル当量)を添加し、混合物を更に1時間の間22℃でインキュベートした。過剰の試薬33をN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)でクエンチし、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(2MのNaCl)で平衡化された1mLのToyoPearl Phenyl-650S HICカラムを使用して粗反応物を精製した。50mMのリン酸ナトリウム、pH7(20%のイソプロパノール)の勾配を用いるカラムから、ADCを溶出した。ADCを含有する画分をプールし、濃縮することで(Vivaspin20、10kDaのPES膜)、平均DAR 8の生成物が与えられた。濃縮試料をDPBS、pH7.1〜7.5中に緩衝剤交換し、滅菌濾過した。
【０３５４】
ADC 34は、反応生成物の不均一性(DAR変異体の数)により精製及び特徴付けするのが困難であり、分取HICによる個々のDAR種の不十分な分離度がもたらされた。結果は、最終の反応生成物が、DAR 8超及びDAR 8未満の両方のDAR種の有意な分量を含有していたことを示した。DAR 8種よりも高い及び低いこれらから完全にDAR 8種を精製することは、最終生成物におけるDAR 8の著しくより低い収率を生じる。
【０３５５】
実施例5に記載されているコンジュゲーション手順を使用してコンジュゲーション試薬35をブレンツキシマブにコンジュゲートし、ADC 44を生じさせた。
【０３５６】
［実施例２３］
ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート34及び44を比較するKarpas-299マウス異種移植片試験。
このin vivo試験を実施例16に記載されているものと同様の方式で行った。腫瘍誘導時(0日目)での動物の平均体重は18.8gであった。処置群当たりの動物の数は5匹であった。ランダム化及び処置は、平均腫瘍体積が167mm3に到達していた17日目に発生した。ビヒクル群からの動物は、PBSの単回静脈内(i.v.)注射を受けた。処置群にADCの単回i.v.注射を用いて0.5mg/kgで投薬した。全ての化合物は良好に耐容性を示した。
【０３５７】
図10は、28日目での両ADC 34及び44について腫瘍体積の%変化を示している。100%を投薬初日(17日目)での腫瘍体積と定義した。
【０３５８】
［実施例２４］
熱応力試験によるペンダントPEGコンジュゲート34(比較)及び44の比較。
ADC試料34及び44を各々、DPBS pH7.1〜7.5を用いる希釈によって0.5mg/mLで調製した。
【０３５９】
2つのADC試料を65℃で30分間インキュベートし、その後、氷浴中にて5分間のインキュベーションが続いた後にサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。TOSOH Bioscience TSKゲルSuper SW 3000カラムを使用して、SECを行った。2Mのリン酸カリウム緩衝液、pH6.8(0.2Mの塩化カリウム及び15%のイソプロパノール)を用いる均一溶媒溶出中に、280nmでのUV吸光度をモニタリングした。
【０３６０】
下記のTable 4a及び4b(表4)は、SECに続く、Abs 280nmによる各ピークの曲線下面積によって測定される通りの、熱応力試験の前後のADC 34及び44の立体配座を示している。
【０３６１】
Table 4a及び4b(表4)における結果は、ADC 44が、熱応力試験後、ADC 34よりもかなり大きい範囲で、非凝集状態のままであることを示している。加えて、結果は、34がコンジュゲート44よりも大きい範囲で、より軽い分子量成分に解離することも示している。
【０３６２】
【表４】
0006612860.tif 000085
【０３６３】
［実施例２５］
ヒト血清内における、インキュベーションに続く、ペンダントPEGコンジュゲート34及び44についての平均DARの比較。
ADC 34及び44をヒト血清中0.1mg/mL、88%(v/v)血清含有量に希釈した。各溶液を直ちに、4×0.5mLの低結合エッペンドルフチューブ中にサブアリコートした。「0」時点に対応するエッペンドルフチューブの2つを直ちに-80℃の冷凍庫に移し、一方で試料の残りを37℃で6日間インキュベートした。6日後、親和性捕捉(CD30コーティング磁気ビーズ)による精製のために、適切な試料を冷凍庫及びインキュベーターから除去し、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用する分析が続いた。CD30親和性捕捉及び平均DAR決定のためのHICを、実施例19に記載されている通りに行った。
【０３６４】
図11は、6日後37℃でヒト血清において、コンジュゲート34が、それの細胞毒性ペイロードの多くを損失しており、一方、コンジュゲート44が依然として、試料の平均DAR値の低減によって示されている通り、ほとんど変化していないことを示している。これは、本発明のコンジュゲートがin vivoでの安定性を改善していることを示している。
【０３６５】
［実施例２６］
オーリスタチン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬45(比較)の合成。
【０３６６】
【化７６】
0006612860.tif 000086
【０３６７】
下記の構造:
【０３６８】
【化７７】
0006612860.tif 000087
【０３６９】
を有するval-cit-PAB-MMAE塩のTFA塩(25.0mg)に、DMF(1.5mL)中の試薬5A(15.6mg)の溶液を添加し、不活性窒素雰囲気下にて室温で5分間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、HATU(6.1mg)及びNMM(1.8μL)のアリコートを20分毎に添加し、合計5回添加した。1.5時間後、反応混合物を室温に加温した。2時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水及びアセトニトリル(v/v;1/1、0.6mL)中に溶解させ、緩衝剤A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝剤B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0v/vから0:100v/v)で溶出する逆相C18-カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-val-cit-PAB-MMAE試薬45が白色の粉末として与えられた(22.4mg、68%)m/z[M+2H2+]1035。
【図１】
0006612860.tif 000094
【図２】
0006612860.tif 000095
【図３】
0006612860.tif 000096
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006612860.tif 000100
【図８】
0006612860.tif 000101
【図９】
0006612860.tif 000102
【図１０】
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【図１１】
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