(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を一定温度で増幅する工程、及び
増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて検出する工程、
を含む、インフルエンザウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
第一のプライマーが、配列番号７、９および１０から選択される１以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号３８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１９および２８から選択される１以上に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号４４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項２】
インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列を特異的に増幅可能なプライマー、およびそれを用いたインフルエンザウイルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルス（ゲノムとしてＲＮＡを有するウイルス）であり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。さらにＡ型は、ウイルス表面上のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に基づいて、亜型へと分類される。インフルエンザウイルスのうちＡ型（中でもＨ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型は、季節性インフルエンザとして毎年流行を繰り返している。
【０００３】
インフルエンザに対する治療法としては、抗インフルエンザウイルス薬の投与が効果的である。しかしながら抗インフルエンザウイルス薬の多くはウイルスの増殖を阻害する作用機構のため、発症後早期に投与する必要がある。また類似の症状を示す他のウイルスや病原菌に対しては効果がない。従って、季節性インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出することが、臨床上重要である。
【０００４】
インフルエンザウイルスの検出法としては種々の方法が知られており、中でも臨床的にはイムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低く、インフルエンザウイルス数が少ない感染初期では検出できないことが課題となっている。
【０００５】
イムノクロマト法よりも高感度にインフルエンザウイルスを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅して検出するため、インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。しかしながらインフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出するには、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）、すなわちフォワードプライマー（第一のプライマー）とリバースプライマー（第二のプライマー）との組み合わせを最適化する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献２】特許第４４３８１１０号公報
【特許文献３】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許第３１５２９２７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的かつ迅速、高感度に増幅可能なプライマー、および当該プライマーを用いたインフルエンザウイルスの検出法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的かつ迅速、高感度に増幅可能なプライマーセットを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１７、１８、４１、４８から５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号３５、３６、４７のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセットである。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、
第一のプライマーが、配列番号１１、１３、５１から５３、５６のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号５４、５５、５７のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載のプライマーセットである。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが、配列番号４から１６、３７から４０のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１９から３４、４２から４６のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記第二の態様に記載のプライマーセットである。
【００１３】
また本発明の第四の態様は、
第一のプライマーが、配列番号７、９、１０のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号３８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１９、２８のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号４４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第三の態様に記載のプライマーセットである。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットである。
【００１５】
さらに本発明の第六の態様は、前記第一から第五の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡを検出する方法である。
【００１６】
また本発明の第七の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第六の態様に記載の方法である。
【００１７】
さらに本発明の第八の態様は、
前記第一から第五の態様のいずれかに記載のプライマーセットと、
配列番号１に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、
インフルエンザウイルスＲＮＡ検出試薬である。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明において特定塩基配列とは、インフルエンザウイルスＲＮＡのうち、第二のプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。
【００２０】
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。
【００２１】
本発明は、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６１０番目から６４７番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６５５番目から６９２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４（Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の４２５番目から４５４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９７番目までの塩基配列の相補配列）のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号３５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７６６番目までの塩基配列）、配列番号３６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７９３番目までの塩基配列）、配列番号４７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６６番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いることを特徴としている。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。
【００２２】
本発明のプライマーセットは、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡの種類により、前述したオリゴヌクレオチドの中から適宜選択して用いればよい。例えば、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号１７、４８、５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよく、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号１８、４９、５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよく、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、
第一のプライマーとして、配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
第二のプライマーとして、配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いればよい。さらに複数の種類のインフルエンザウイルスＲＮＡを同時に検出したい場合は、前述した各種インフルエンザウイルスＲＮＡに適したプライマーセット（第一および第二のプライマー）を混合させればよい。例えば、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出したい場合は、
第一のプライマーとして、
配列番号１７もしくは４８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号１８もしくは４９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物、または
配列番号５０に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４１に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物を、
第二のプライマーセットとして、
配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとの混合物を、
それぞれ用いればよい。
【００２３】
配列番号１７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１０番目から６４７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６２５番目から６４７番目までの塩基配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６２１番目から６４０番目までの塩基配列）、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１７番目から６３６番目までの塩基配列）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１６番目から６３５番目までの塩基配列）および配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１０番目から６３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２４】
配列番号１８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６５５番目から６９２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６５６番目から６８０番目までの塩基配列）および配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６６２番目から６８１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２５】
配列番号４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４５４番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４３４番目から４５４番目までの塩基配列）、配列番号３８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４３２番目から４５２番目までの塩基配列）、配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４５０番目までの塩基配列）および配列番号４０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４２５番目から４４７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２６】
配列番号４８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９８番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１および配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の５６９番目から５９６番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２７】
配列番号４９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４３番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１３および配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２８】
配列番号５０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７７番目から４９７番目までの塩基配列）および配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４７２番目から４９２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２９】
配列番号３５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１９番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７２１番目から７４５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７２７番目から７４８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７３９番目から７５８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７３９番目から７６０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７４０番目から７５９番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７４５番目から７６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３０】
配列番号３６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６４番目から７９０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６６番目から７９０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７７２番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号３４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７７４番目から７９３番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３１】
配列番号４７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４０番目から５６２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４２番目から５６５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４３番目から５６５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４３番目から５６１番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号４６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４５番目から５６６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３２】
本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（Ｔ７プロモーター）である配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３３】
本発明のプライマーセットを用いて増幅したインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識プローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブがあげられる。
【００３４】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの一例として、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル部分または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍色素を標識した核酸プローブがある。前記核酸プローブはインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。
【００３５】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用としては配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６７９番目から７０１番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用としては配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、それぞれあげられる。なお、プライマーセットのときと同様、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出したい場合は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用核酸プローブとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ検出用核酸プローブとを混合させればよい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のプライマーセットは、配列番号１７、１８、４１、４８から５０のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号３５、３６、４７のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる第二のプライマーとから構成される、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであり、インフルエンザウイルスＲＮＡを迅速かつ高感度に増幅／検出することができる。さらに、本発明のプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせを最適化することで、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお、３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号５８（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目までの塩基配列）、配列番号５９（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目までの塩基配列（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号６０（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００４０】
なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。
【００４１】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号１に記載の配列の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号２に記載の配列の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した（図１）。
【００４２】
実施例３  Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと表記）を用いて、下記に示す方法で、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを測定した。なお、配列番号４から８、１１、１２、１９から２７に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ１Ｎ１亜型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６）の塩基配列を基に、
配列番号９、１０、１３、１４、および２８から３４に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ３Ｎ２亜型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９）の塩基配列を基に、
配列番号１５および１６に記載の塩基配列からなるプライマーは、Ｈ１Ｎ１亜型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６）およびＨ３Ｎ２亜型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９）で塩基配列が共通している領域を基に、それぞれ設計した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、ＴＥバッファーを用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４３】
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
９０ｍＭ  トレハロース
各２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）
各０．２μＭ  第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている）
各０．２μＭ  第二のプライマー
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
【００４４】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００４５】
開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１に示す。なお表１中のＮ．Ｔ．は未試験（Ｎｏｔ  Ｔｅｓｔｅｄ）を意味する。
【００４６】
【表１】
0006565193.tif 000002
本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、いずれも１０３コピー／ｔｅｓｔのＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型および／またはＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを１０分以内に検出することができた。中でも組み合わせ［Ａ０１］から［Ａ１１］および［Ａ１５］から［Ａ３３］は前記標準ＲＮＡを６分以内に検出しており、より好ましい組み合わせといえる。また組み合わせ［Ａ０４］、［Ａ０６］、［Ａ０７］、［Ａ２４］、［Ａ３２］および［Ａ３３］は、Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型のＡ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを５分以内に検出しており、さらに好ましい組み合わせといえる。
【００４７】
実施例４  Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表２に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０３コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出を試みた。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、いずれも１０３コピー／ｔｅｓｔのＢ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを１０分以内に検出することができた。
【００４９】
実施例５  Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出（その１）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表３に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０３コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの同時検出を試みた。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
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本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、いずれも１０３コピー／ｔｅｓｔのＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡを１０分以内に検出することができた。
【００５１】
実施例６  Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出（その２）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表４に示す組み合わせを、ＲＮＡ試料としてＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（濃度：１０コピー／５μＬ）を、それぞれ用いた他は、実施例３と同様な方法でＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの同時検出を試みた。結果を表５に示す。なお表５中の検出時間は検出できた試料の平均検出時間を、検出率はＮ＝１０で測定した結果の検出率を、それぞれ示している。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、いずれも１０コピー／ｔｅｓｔのＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡならびにＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡを８０％以上の検出率で検出することができた。また検出できた試料の検出時間は、概ね１０分以内であった。
【図１】
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【配列表】
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