(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株からラクトンを生成する方法であって、以下のステップ：
アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，  ３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）の前培養を行うステップと、
前記前培養から得た接種物から、少なくとも３日間にわたり２０〜４０℃の温度での発酵により培養を行って、
炭素供給源と、
窒素供給源と、
無機塩溶液と、
２〜１００ｍＭの濃度のカルシウム供給源と
を含む滅菌水性生成培地で代謝物を生成するステップと、
前記発酵期間の後に、前記生成した代謝物を、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンを含むラクトン混合物に変換するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記得た（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンを、脱水により（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンに変換するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒での抽出後の蒸留により、または超臨界ＣＯ２での抽出により、または水蒸気蒸留により、前記得た（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記前培養のステップを、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７を含むクライオチューブを用いて、麦芽抽出培地またはＹＮＢ（「酵母用ニトロゲンベース」）培地から選択される固体培地および／または液体培地で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ある体積の前記アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７の前培養物を、培養培地の初期光学密度（ＯＤ）が０．５〜２となるように前記生成培地に接種することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記接種物の体積が、前記培養培地の体積の３〜１０％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵培養ステップを、２５〜３５℃の温度で行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵培養ステップを、３〜２０日間、攪拌しながら行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生成培地中のカルシウム濃度が５０ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カルシウム供給源が、酸性条件下で可溶化され、無機塩溶液に即座に添加される少なくとも１つの微量元素を含む少なくとも９８％の純度の沈殿炭酸カルシウムＣａＣＯ３、または微量元素溶液の存在下の塩化カルシウムＣａＣｌ２から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微量元素が、単独または併用で、マンガン、銅、コバルト、鉄、亜鉛、ストロンチウム、鉛、水銀、塩素、ホウ素、モリブデン、および硫黄から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記炭素供給源が、単独または併用で、グルコース、マンノース、スクロース、キシロース、マルトース、フルクトース、およびグリセロールから選択され、
前記窒素供給源が、単独または併用で、硝酸アンモニウムＮＨ４ＮＯ３、硝酸ナトリウムＮａＮＯ３、硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、ペプトン、または天然のアミノ酸から選択され、
前記溶液中の無機塩が、単独または併用で、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、塩化物、硫酸イオンから選択される
ことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成培地がビタミン供給源をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株から、ラクトン、より詳しくは、（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンと一般に知られている（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ラクトンは、ヒドロキシ酸の環化（またはラクトン化）から得られる酸素複素環である。主なラクトンは、４〜１２個の炭素原子の環を含む。その多様性は、これら分子のキラリティー、側基の性質、および側鎖または環の不飽和の有無により起こる（Ｄｕｆｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｄｅｓ  ｌａｃｔｏｎｅｓ  ｄａｎｓ  ｌｅｓ  ａｒｏｍｅｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｉｒｅｓ  ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ｐｒｏｐｒｉｅｔｅｓ  ｓｅｎｓｏｒｉｅｌｌｅｓ  ｅｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ，  １９９４）。
【０００３】
ラクトンは、様々な食品および飲料に含まれている芳香族の化合物である。
【０００４】
特に、マッソイアラクトンには関心が集まっている。これは、様々な割合のエナンチオマー混合物の形態で見出されている。誤解を避けるために、特段他の記載がない限り、本願で使用される用語マッソイアラクトンには、両方の形態が包有されると意図される。
【０００５】
以下の化学構造
【化１】
0006524114.tif 000002
を有する、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンまたはココラクトンとしても知られている（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンに、特に関心が集まっている。
【０００６】
マッソイアラクトンは、特にインドネシアで見出されているクリプトカリヤ  マソイア  ツリー（Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｉａ  ｍａｓｓｏｉａ  ｔｒｅｅ）由来の樹皮油から得られたアルキルラクトンである（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｏｉｌ  ｏｆ  Ｍａｓｏｏｉ，  １９３７；  ｏｒ  Ｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｒｋ，  ｈｅａｒｔｗｏｏｄ  ａｎｄ  ｆｒｕｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｙａ  ｍａｓｓｏｙ  （Ｏｋｅｎ）  Ｋｏｓｔｅｒｍ．  （Ｌａｕｒａｃｅａｅ）  ｆｒｏｍ  Ｐａｐｕａ  Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａ，  ２００７）。
【０００７】
たとえば、マッソイアラクトンは、クリプトカリヤ  マソイア  ツリー（Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｉａ  ｍａｓｓｏｉａ  ｔｒｅｅ）由来の樹皮抽出物としてＣｈａｒａｂｏｔから市販されている。
【０００８】
また、この化合物は、甘しょ糖蜜;（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｃａｎｅ  Ｍｏｌａｓｓｅｓ，  １９６８）、乾燥タバコ、およびモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ  ｆｒａｇｒａｎｓ）のエッセンシャルオイルの成分としても見出すことができる。
【０００９】
マッソイアラクトンは、主に、ココナッツの甘く、クリーミー、ミルキー、および蝋様の芳香を有すると表されるその匂い、ならびにクリーム状でわずかにフルーティなココナッツフレーバーとして表される味で知られている。この作用のため、たとえば食品などの幅広い分野で、マッソイアラクトンはその固有の特徴により幅広く使用されている。
【００１０】
また、マッソイアラクトンは、抗真菌剤としての用途（米国特許第６０６０５０７号）、または昆虫を誘引して胞子の分散を促進する役割（Ｎａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｏｌａｔｉｌｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ，  １９９４）が知られている。
【００１１】
マッソイアラクトンは、一般的に、クリプトカリヤ  マソイア（Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｉａ  ｍａｓｓｏｉａ）からの抽出または合成により製造される。
【００１２】
しかしながら、現在の植物をベースとした生成方法はしばしば、多くの木を伐採することとなり、大規模な供給に適してはいない。さらに、このような方法は、皮をはぐ工程で木が高頻度で枯れるという点で環境上の制約を受け、天然産物に基づく製造コストは非常に高くなる
【００１３】
よって、マッソイアラクトンは、その代わりに、ラセミ型（たとえばＧａｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ６−ａｌｋｙｌ−（ａｎｄ  ６，６−ｄｉａｌｋｙｌ−）５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｐｙｒｏｎｅｓ，  １９８６；  ｏｒ  ＪＰ  ６３−５７５８３，  ＪＰ  ６３−２１５６７６，  ＪＰ  ６３−２２２１６４）またはエナンチオマー型（たとえばＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ６Ｒ−（−）ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ，  １９９３；  Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  ｅｎａｎｔｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  （６Ｒ）−（−）−ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ  ａｎｄ  （４Ｒ，６Ｒ）−（＋）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｐｅｎｔｙｌｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ，  １９９２；  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  （＋）−（４Ｒ，６Ｒ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｐｅｎｔｙｌｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  （−）−（６Ｒ）−ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ，  １９９１；  Ｐｉｒｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｌａｃｔｏｎｅｓ，  １９８０；特許文書ＪＰ０２０５９５６４；  Ｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｃｈｉｒａｌ  ｄｅｌｔａ  ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ａｌｐｈａ，ｂｅｔａ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｄｅｌｔａ−ｌａｃｔｏｎｅ，  １９９１；  Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ６−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔａｔｅｄ  ５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２（２Ｈ）−ｐｙｒａｎｏｎｅｓ，  １９８１；  ａｎｄ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （  ）−ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ，  １９９６；またはＪＰＨ０２５９５６４）の両方で化学合成することができる。
【００１４】
しかしながら、マッソイアラクトンの匂いは、（Ｒ）−（−）−型マッソイアラクトンと（Ｓ）−（＋）−型マッソイアラクトンとの間で異なることに留意することが重要である。実際に、（Ｓ）−（＋）−型マッソイアラクトンは、バター状の匂いを有するが、（Ｒ）−（−）−型マッソイアラクトンは、特徴的なココナッツの芳香を有する（Ｎｏｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒａｇｒａｎｔ  Ｌａｃｔｏｎｅｓ，  ２０００）。結果として、必要要件を満たすために、光学純度の高い（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの製造に適した方法を使用することが非常に重要である。
【００１５】
しかしながら、特に出発物質の選択および高い光学純度の（Ｒ）−（−）−型マッソイアラクトンを得るための各ステップに関連する制約により、このような合成方法を開発および使用することは、相対的に費用がかかる。
【００１６】
さらに、化学合成により得ることは、消費者の需要をますます満たさなくなる。
【００１７】
代わりの解決策：一般的なラクトン、より詳しくは、生物工学的な工程による（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの生成が必要とされている。たとえば、脂肪酸をラクトンに生体内変化または生体内転換する微生物細胞および酵素を使用することが可能である。この主題に関する様々な試験および特許文書が公表されている。
【００１８】
特許文書ＪＰ３７７９７５１は公知であり、微生物の培養物、より詳しくは海洋微生物のエクソフィアラ・ピシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）Ｎ１−１０１０２（日本の発酵研究所（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（工業技術院）でＰ−１４２３２の下で登録）の培養物から（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを製造する単純な方法を開示している。このような方法は、反応培地中での（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの生成、および分離ステップによる（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの回収に適している。使用される培養培地は、Ｌ−アスパラギンなどの窒素の供給源、グルコースなどの炭素の供給源、および塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウムなどの無機質を含むが、カルシウムを含まず、ｐＨ６〜７、２２〜２７℃で５〜１０日間培養した後、培地を、メタノールなどの溶媒の存在下で硫酸などの酸により酸性化し、加熱すると反応培地中に（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンが得られる。
【００１９】
同様に、この文書で開示された、得られた収量は、１．４ｍｇ／１００ｍｌ、すなわち、１４ｍｇ／ｌにすぎない。
【００２０】
Ｐｒｉｃｅらの刊行物（（アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＮＲＲＬ  ５０３８０，  ２０１３により産生された新規の細胞外リアモシン（ｌｉａｍｏｃｉｎ）（マンニトール油））の構造上の特徴）もまた公知であり、これは、５％（重量／体積）のスクロースを含む培地中のアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＮＲＲＬ  ５０３８０の培養物から抽出したリアモシンからマッソイアラクトンを得る方法を開示している。リアモシンは、メチルエチルケトンを使用して抽出され、最高収量は６日目に得られ、収量は０．５〜０．６ｇのマンニトール油（リアモシン）／ｌである。次に、塩酸の存在下で、無水メタノールでメタノリシスを行い、遠心分離して、重い白色の沈殿物を除去し、マッソイアラクトンを含むメタノール可溶性画分を回収した後に、マッソイアラクトンが得られる。
【００２１】
さらに、Ｋｕｒｏｓａｗａらの刊行物（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  １９９４による、アラビトールおよびマンニトールのポリオール脂質の３，５−ジヒドロキシデカノイルおよび５−ヒドロキシ−２−デセノイルのエステルの細胞外集積）が公知である。この刊行物により、多くのアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株が、炭酸カルシウムＣａＣＯ３を含む培地で大量のポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）を産生することが開示されている。この刊行物は、培養培地においてＣａＣＯ３の非存在下で、これらの株が、ポリ（リンゴ酸）の代わりに重油などの細胞外脂質を産生することを明らかにしている。この刊行物は、より詳しくは、脱イオン水中に１２％のグルコース、０．１５％のＮａＮＯ３、０．１０％のＫＮＯ３、０．００５％のＫＨ２ＰＯ４、０．０２％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｐｐｍのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および０．０２％の酵母抽出物を含むが、炭酸カルシウムＣａＣＯ３を含まない培地で、２５℃、７日間のアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  Ａ−２１Ｍの培養から、（＋）−３−ヒドロキシデカン−５−オリドおよびＲ−（−）−マッソイアラクトンを得ることを説明している。脂質を含む３５ｇの重油を、メチルエチルケトンで抽出する。約１０ｇの脂質を、水酸化ナトリウムＮａＯＨを添加することによりけん化し、次に硫酸Ｈ２ＳＯ４を添加することによって加水分解することにより、約４ｇの脂肪酸を回収する。最終的に、化合物（＋）−３−ヒドロキシデカン−５−オリドおよびＲ−（−）−マッソイアラクトンを、エーテルを用いた抽出により回収する。
【００２２】
しかしながら、この方法で得たＲ−（−）−マッソイアラクトンの収量は、この方法により単離した脂質を含む重油３５ｇと比較して低いと推測され得る。この文書に記載される結果に基づくと、Ｒ−（−）−マッソイアラクトンの収量は１．３ｇ／ｌである。
【００２３】
上記の観点から、本発明が取り組む１つの問題は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株から、ラクトン、より詳しくはこのような用途に適したＲ−（−）−マッソイアラクトンを生成する代替的な方法であって、実行が簡単であり、費用がかからず、十分な再現性を有し、持続可能かつ天然の資源に由来し、生産性が高い（対象となるラクトンの量および生成率の増加）、代替方法を開発することである。
【００２４】
よって、本発明は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株からラクトンを生成する方法であって、以下のステップ：
アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，  ３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）、またはその関連株の前培養を行うステップと、
前培養から得た接種物から、少なくとも３日間にわたり２０〜４０℃の温度での発酵により培養物を生成して、
炭素供給源と、
窒素供給源と、
無機塩溶液と、
２〜１００ｍＭの濃度のカルシウム供給源と
を含む滅菌水性生成培地で代謝物を生成するステップと、
発酵期間の後に、生成した代謝物を、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンを含むラクトン混合物に変換するステップと
を含むことを特徴とする、方法に関する。
【００２５】
本発明および本発明からもたらされる利点は、添付の図面を参照して、以下の説明および非限定な実施形態を読むことにより、より明確に理解されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本出願人によりＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに登録され、またはシークエンシングされたβチューブリン遺伝子の部分配列に基づくアウレオバシジウム属の系統樹（ＣｌｕｓｔａｌＷ（商標）およびｉＴｏｌ（商標）で構築）を表す。
【図２】２５℃で培養した異なるアウレオバシジウム株を用いた、本発明に係る方法の実施例による、ラクトン生成のモニタリングを表すヒストグラムである。
【図３】３０℃で培養した異なるアウレオバシジウム株を用いた、本発明に係る方法の同一の実施例による、ラクトン生成のモニタリングを表すヒストグラムである。
【図４】アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７に関する、本発明に係る方法の実施例による、ラクトン生成に及ぼす培養ステップの温度の効果を表すグラフである。
【図５】アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７に関する、本発明に係る方法の実施例による、ラクトン生成に及ぼす炭素供給源の効果を表すグラフである。
【図６】アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７に関する、本発明に係る方法のいずれかの実施例による、ラクトン生成、生産性、およびグルコース消費のモニタリングを表すグラフである。
【図７】アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７に関する、本発明に係る方法の実施例による、ラクトン生成および生産性に及ぼす培養ステップの最中の培地へのグルコースの逐次的な添加の効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
この説明では、特段他の記載がない限り、ある区間が与えられる場合、上記区間の上限および下限を含むことが理解される。
【００２８】
本発明に係る方法は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の株からラクトンを生成するために使用される。
【００２９】
本発明に係る方法は、培養物の再現性および生成される代謝物の解析を可能にするように開発された。アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）は、子嚢菌タイプの多形型偏在性真菌である。この真菌は、多くの場合は黒酵母型であり、変化した単細胞型（酵母、分芽胞子、厚膜胞子型の細胞）、および出芽により個々の菌糸が単細胞を生成する糸状菌糸型を含む、複雑な生殖サイクルを有する。これらの異なる生理的状態は、培養条件（炭素および窒素の供給源、ｐＨ、酸素、および無機塩濃度など）により様々な比率で共存する。
【００３０】
本出願人は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、より具体的にはアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，  ３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）、またはそれらの関連株の生殖サイクルを制御することを試みた。
【００３１】
本発明に係るアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）細胞株  ＣＢＳ  ７７１．９７に対する関連株との文言は、ＣＢＳ７７１．９７細胞株と同一のクレードに属するアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株を指す。系統発生学的な用語では、クレードは、単系統のグループを形成する、すなわち、共通の祖先を有し、そのすべての子孫を含むグループを形成する一連の生物により定義される。このように、同一のクレードの種は、常に、クレード外の別の種よりも互いに近縁である。同一のクレードのメンバーは、共通の祖先から受け継がれた、グループ全体に固有の少なくとも１つの特徴を有する。異なるクレードにおけるアウレオバシジウム株の分布は、Ｍａｎｉｔｃｈｏｔｐｉｓｉｔ  ら（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，  ｐｕｌｌｕｌａｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｘｙｌａｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ，  ２００９；  Ｈｅａｖｙ  ｏｉｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ，  ２０１１；  ａｎｄ  ポリ（β−Ｌ−ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｌａｄｅｓ  ｏｆ  Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ，  ２０１２）により定義されるものに加えて、そのβチューブリン遺伝子（ＢＴ２）配列の類似性のパーセンテージに基づくものである。そのため、同一のクレードに属するアウレオバシジウム株は、別のクレードに属する株よりもβチューブリン遺伝子配列に関して大きい相互類似性を有する。
【００３２】
本発明の範囲内で、本出願人は、Ｍａｎｉｔｃｈｏｔｐｉｓｉｔらにより定義された基準を適用して関連株を決定し、この分類に基づき、ＣＢＳ７７１．９７は、クレード番号７に属する。
【００３３】
クレード番号７に属するＣＢＳ７７１．９７株に関連する株の非限定的な例には、図１に表されるアウレオバシジウム属の株ＲＳＵ２８、ＣＵ３、ＤＯＵＧ、ＮＲＲＬＹ−６２２０、ＲＳＵ２５、ＢＭ１、ＲＳＵ１６が挙げられ得る。
【００３４】
本発明によると、より均質な培地で作用させることが可能であり、よって十分な再現性にとってより好ましい酵母型を得ることが、特に有益である。発酵の再現性に関して有意な影響を有する糸状菌型は、扱いがかなり困難である。さらに、糸状菌型は、ラクトン前駆体代謝物をごくわずかしか産生しないか、または全く産生しない。
【００３５】
各培養物で同一の生理的な状態で同一量の細胞のバッチ（接種物）から開始することができるように、前培養ステップを導入した。実際に、特に単一のステップで同調的な増殖を得ることは事実上不可能である。前培養ステップは、微生物学において比較的慣習的な実務であるが、各ステップのそれぞれの持続期間、ならびに前培養の培地および温度の選択は、発達させる菌型、好ましくは糸状菌型に関連する酵母型を制御するために、本発明により使用されるアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株に適合させた。
【００３６】
また、本発明に係る方法の第１のステップでは、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株の前培養物を、たとえば、−８０℃で保存したこの株のクライオチューブを使用して生成する。
【００３７】
前培養ステップは、好ましくは、麦芽抽出物、たとえば、Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｆｌｕｋａ（商標）ｎ°７０１６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＭａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（商標）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および好ましくはペプトン、たとえばＢａｃｔｏ（商標）ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）に基づく培地、またはＹＮＢ（「酵母用ニトロゲンベース」）培地、たとえばＤｉｆｃｏ（商標）酵母用ニトロゲンベースから選択される固体培地および／または液体培地で行われる。
【００３８】
好ましくは、前培養ステップは、微生物の発達状態を制御し、再現性を保証するための固体培地における少なくとも１つの第１の前培養ステップと、微生物を液体培地に適合させて、培養のために微生物の型（特に酵母）および細胞の産生を制御することができる、液体培地における少なくとも１つの第２の前培養のステップとを含む。
【００３９】
例として、前培養ステップは、好ましくは以下のステップ：
アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株のクライオチューブを使用して、麦芽抽出物ペプトン寒天チューブに接種し、コロニーが出現するまで２５℃でインキュベートするステップと、
このチューブを使用して、麦芽抽出物ペプトン寒天を含むペトリ皿に画線で接種し、２４時間２５℃でインキュベートするステップと、
ペトリ皿で増殖した後、クローンを液体麦芽抽出物のチューブに接種し、２００ｒｐｍで攪拌しながら２５℃で約１８時間インキュベートするステップと
を含む。
【００４０】
この有益な前培養ステップは、後に、液体生成培地中、および本発明により定義される条件下で、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株の発酵培養ステップのため、バイオリアクター／発酵槽のフラスコに接種するために使用される。
【００４１】
明らかに、培養条件の制御を最適化して、生成される代謝物の量を増加させるために適した、１リットルから１０００リットルのバイオリアクター／発酵槽で培養ステップが実行される限り、求める接種物の量／体積を得るために、前培養ステップを複数回行ってもよい。
【００４２】
次に、前培養から得た接種物を使用して、培養物を、少なくとも３日間２０℃〜４０℃の温度で発酵により生成し、、炭素供給源、窒素供給源、無機塩溶液、およびカルシウム供給源、および任意にビタミン供給源を含む滅菌水性生成培地中で、代謝物、より詳しくはスクロ脂質（ｓｕｃｒｏｌｉｐｉｄ）を生成する。
【００４３】
好ましくは、液体生成培地に接種したアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株の前培養物の体積は、生成培地および接種物を含む培養培地の初期光学密度（ＯＤ）０．５〜２、より好ましくは０．５の初期ＯＤに関連する。
【００４４】
接種物の体積は、好ましくは、培養培地の体積の３〜１０％である。
【００４５】
発酵培養ステップは、好ましくは２５℃〜３５℃、より好ましくは２８℃〜３０℃、たとえば３０℃で行われる。
【００４６】
さらに、発酵培養ステップは、好ましくは、３〜２０日間、より好ましくは５〜１８日間、さらにより好ましくは７〜１５日間、たとえば７日間、１０日間、１２日間、１４日間、または１５日間攪拌しながら行われる。
【００４７】
例示的な例では、生成培地を１０％となるように充填した３００ｍｌのバッフルフラスコで発酵を行う場合、ここでの攪拌は、およそ１４０ｒｐｍで一定である。発酵槽では、攪拌は、たとえばおよそ５００ｒｐｍであり得る。
【００４８】
好ましくは、エアレーションは影響を有し、たとえば、バイオリアクター／発酵槽での培養の最中で０．５ｖｖｍの範囲にあってもよい。
【００４９】
しかしながら、選択される攪拌速度およびエアレーションは、各発酵槽の形状に依存する。そのため、発酵槽／バイオリアクターでは、当業者は、フラスコと少なくとも等価の酸素供給を得るために、エアレーションおよび攪拌のパラメータを調節するよう注意する。
【００５０】
本発明に係るアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株の発酵による培養ステップで使用される滅菌水性生成培地は、炭素供給源、窒素供給源、無機塩溶液、カルシウム供給源、および任意にビタミン供給源を含む。
【００５１】
フラスコまたはバイオリアクター／発酵槽に、滅菌水性培地、次に接種物を充填して、培養培地を形成する。
【００５２】
本発明に係る方法の一実施形態では、その後、生成培地をさらに添加することなく発酵を行う。
【００５３】
本発明に係る方法の１つの好ましい実施形態では、生産性を維持かつ最適化するために、培養ステップの最中に生成培地、より具体的には炭素供給源を逐次的に添加する。
【００５４】
本発明に係る培養ステップで使用される水性生成培地は、好ましくは、１５〜１８メガオーム、好ましくは１８メガオームの伝導率を有する超純水で調製される。
【００５５】
また、本発明に係る培養ステップで使用される生成培地は、コンタミネーションのリスクを減らすために滅菌されている。
【００５６】
炭素供給源は、好ましくは、単独または併用で、グルコース、マンノース、スクロース、キシロース、マルトース、フルクトース、およびグリセロールから選択され、好ましくはグルコースである。
【００５７】
炭素供給源は、グルコースに関して、好ましくは３０〜１５０ｇ／ｌ、たとえば、４５、６０、７５、９０、または１２０ｇ／ｌ、より好ましくは６０ｇ／ｌの濃度で使用される。
【００５８】
窒素供給源は、好ましくは、単独、または併用で、硝酸アンモニウムＮＨ４ＮＯ３、硝酸ナトリウムＮａＮＯ３、硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、ペプトン（たとえばＢａｃｔｏ（商標）ペプトン（Ｄｉｆｃｏ））、または天然のアミノ酸から選択され、好ましくは硝酸アンモニウムＮＨ４ＮＯ３である。
【００５９】
窒素供給源は、好ましくは０．１％〜１％（重量／体積）、たとえば０．１％、０．２％、または０．５％、より好ましくは０．１％のＮＨ４ＮＯ３の濃度で使用される。
【００６０】
溶液中の無機塩は、好ましくは、単独または併用で、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、塩化物、硫酸イオンから選択される。
【００６１】
例として、無機塩溶液は、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、およびＨＣｌの混合物である。
【００６２】
また、本発明に係る培養ステップで定義かつ使用される滅菌した水性生成培地はカルシウム供給源、好ましくは生成培地中で２〜１００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭの濃度のカルシウム供給源をも含む。
【００６３】
カルシウム供給源は、好ましくは、酸性条件下で可溶化して即座に無機塩溶液に添加される、少なくとも１つの微量元素を含む少なくとも９８％純粋な沈殿炭酸カルシウムＣａＣＯ３、または微量元素溶液の存在下の塩化カルシウムＣａＣｌ２から選択される。ＣａＣＯ３が、たとえば１００％純粋で使用され、微量元素を含まない限り、少なくとも１つの微量元素と併用して使用される。
【００６４】
カルシウム供給源に関連する微量元素は、好ましくは、単独または併用で、マンガン、銅、コバルト、鉄、亜鉛、ストロンチウム、鉛、水銀、塩素、ホウ素、モリブデンおよびイオウ、たとえば鉄および／またはマンガンから選択される。
【００６５】
生成培地中の単独または併用での微量元素の濃度は、好ましくはおよそ０．１ｍＭ以下である。
【００６６】
対象のアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＣＢＳ  ７７１．９７株またはその関連株の特定の選択に加え、従来技術との１つの主要かつ本質的な差異は、好ましくは、生成培地における少なくとも１つの微量元素、好ましくはマンガンの存在下でＣａＣＯ３またはＣａＣｌ２の形態のカルシウム供給源の使用である。実際に、ＣａＣＯ３の存在がポリリンゴ酸の生成を増大させるが、生成される対象の脂質の量が減少する、引用された従来技術とは異なり、本発明に係る方法で、本出願人は、代謝物、より詳しくはスクロ脂質、結果的にラクトン、より詳しくは、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）および／またはヒドロキシラクトン、すなわち（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの生成における、この化合物の本質的で予想外の役割を実証した。
【００６７】
よって、カルシウムの作用は、本発明に係る方法では予期しないものであり、従来技術における既知のＣａＣＯ３の役割とは反対であった。
【００６８】
本発明に係る一実施形態の１つの好ましい例では、９８％以上の純度を有する沈殿ＣａＣＯ３（Ｒｅｃｔａｐｕｒ（商標）Ｐｒｏｌａｂｏ  Ｎｏ．２２２９６．２９４）の最適な濃度の試験により、低濃度（０．０２％）で収量を上げることがすでに可能であること、およびより高濃度（０．５％）で、その後（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンに変換されるラクトン前駆体を含む対象の油相の沈殿の原因となる可能性がさらに最も高いことを決定することができた。これら前駆体の存在は例証されたものである。また、ラクトンは、特に長期間保存される場合、少量で自然発生的に形成されることが可能である。
【００６９】
好ましくは、生成培地はビタミン供給源をさらに含む。
【００７０】
ビタミン供給源は、好ましくは、酵母抽出物、たとえばＢａｃｔｏ（商標）酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）またはビタミンＢ複合体から選択される。
【００７１】
ある体積のアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＣＢＳ  ７７１．９７またはその関連株の前培養物が接種される、本発明に係る特に好ましい生成培地の非限定的な例として、
炭素供給源は、超純水で調製し、１１５℃で滅菌した６５ｇ／ｌのグルコースであり、
窒素供給源および無機塩溶液は、超純水で調製し、１２０℃で滅菌されており、１ｇ／ＬのＮＨ４ＮＯ３、０．１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＫＣｌ、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、およびさらにビタミン供給源としての０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）の混合物を含み、ならびに
０．５％（重量／体積）のＣａＣＯ３（Ｒｅｃｔａｐｕｒ（商標）Ｐｒｏｌａｂｏ  Ｎｏ．  ２２２９６．２９４）は、塩酸で酸性化した約５のｐＨの超純水で可溶化され、次にオートクレーブによる滅菌後に無機塩溶液に添加される。
【００７２】
さらなる例では、カルシウム供給源が、微量元素を含む溶液中のＣａＣｌ２である場合、カルシウム供給源は、超純水で調製され、０．２μｍの滅菌性フィルターを介してろ過することにより滅菌されている。
【００７３】
よって、液体培地におけるこの培養ステップは、バイオマス（細胞）および代謝物の生成を可能にする。
【００７４】
培養ステップの間に生成される代謝物は、本質的にスクロ脂質である。本出願人は、特に、ジヒドロキシデカン酸モノマーに基づくスクロ脂質の生成、より具体的には、２１種の代謝物、特にハリメシン、ハリメシン−アラビトール、ハリメシン−マンニトールおよびエキソフィリン−マンニトールの生成を同定した。
【００７５】
本発明に係る方法では、発酵期間の後、生成される代謝物を、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンを含むラクトン混合物に変換する。より詳しくは、酸性または塩基性培地中へ加水分解することにより、または生成されるスクロ脂質をモノマーに酵素的に加水分解することより、およびガスクロマトグラフィーによるアッセイに適している（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンを含むラクトン混合物を得るために代謝物を環化することにより、生成される代謝物をラクトン混合物に変換する。
【００７６】
１つのみのアリコートが抽出される限り、生成されるスクロ脂質の量と共に増加する培地の不均質による結果の再現性に関する問題を回避するために、標的のラクトンを得るために培養培地全体を処置することが得策である。
【００７７】
あるいは、細胞培地全体を、好ましくは遠心沈降させて、上清を除去し、細胞および生成されるスクロ脂質を含む回収されたペレットを処理して標的のラクトンを得てもよい。実際に、変換物は、スクロ脂質の生成物から分離されており、よってこれらのステップは、好ましくは２つの異なる場所で行うことができる。さらに、処理される体積は少なく、よって、面倒な機器を必要とすることが少ない。
【００７８】
培養培地全体、または好ましくは遠心沈降後のペレット上で、発酵期間の後に生成された代謝物質を変換する第１の様式では、たとえば、４Ｎの水酸化ナトリウムＮａＯＨを添加することによるスクロ脂質のけん化を行って、次に、たとえば５０％の硫酸Ｈ２ＳＯ４を添加し、たとえば９０℃で４時間加熱することにより酸性化する。（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）およびヒドロキシラクトン、すなわち（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの混合物が得られ、混合物の比率は、酸の濃度、温度、および加熱時間により変動する。（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン／ヒドロキシラクトンの比率は、酸の濃度、加熱の温度および／または時間が増加すると増加する。さらに、ヒドロキシラクトンは、一般的に、処置の後に存在したままであり、好ましくは、対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンへと脱水させることができる。
【００７９】
発酵期間の後、生成される代謝物を変換する第２の好ましい様式では、培養培地を、たとえば５０％の硫酸Ｈ２ＳＯ４（最終規定度  １．２Ｎ）、クエン酸、または酒石酸を添加することにより直接酸性化し、たとえば１２時間〜２４時間、９０℃〜１１０℃に加熱する。スクロ脂質の加水分解（モノマー形成）を同時に行い、次に形成されたモノマーのラクトン化および脱水を行って、対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）を得る。３つの反応は同時に行われる。ヒドロキシラクトンは、反応条件（温度、酸の規定度、時間）が十分ではない場合に存在し得る。（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン／ヒドロキシラクトンの比率は、酸の濃度、加熱の温度および／または時間が増加すると増加する。ヒドロキシラクトンが処理後も存在したままである場合、好ましくは、対象の（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンに脱水してもよい。さらにより好ましくは、この変換様式は、ペレットに適用される。
【００８０】
生成される代謝物を変換する第３の様式では、発酵期間の後、培養培地および遠心沈降後に得たペレットを、溶媒を用いて抽出する。例として、媒体が酸性化されない限り酢酸エチルが使用され、これは、スクロ脂質が酢酸エチルでは安定ではあるが、ラクトンは安定ではないためである。次に溶媒を蒸発させて、抽出したスクロ脂質を使用して、けん化、酸性化、および加熱を、第１の実施形態に従って行うか、または酸性化および加熱を第２の実施形態に従って直接行う。同様に、約２５０℃で熱変換を行うことも可能である。
【００８１】
さらなる変換様式も想定され得る。たとえば、生成した代謝物を含むペレットを、超臨界ＣＯ２で抽出して、対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）を直接得てもよい。
【００８２】
そのため、選択される変換条件により、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの混合物が得られる限り、本発明に係る方法は、得られたヒドロキシラクトンを、たとえば、有機溶媒に可溶化した後に酸の存在下で同物質を脱水することにより、対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンに変換するステップをさらに含む。
【００８３】
最終的に、たとえばメチルｔ−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、および炭酸ジメチルなどの有機溶媒を用いた抽出、次に蒸留を行うことにより、または超臨界ＣＯ２での抽出により、または水蒸気蒸留により、得られた対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離する
【００８４】
よって、このような使用に適している、対象の（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）を回収する。
【００８５】
よって、本発明に係る方法は、クリプトカリヤ  マソイア  ツリーの樹皮油から得られる（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンに忠実な特徴的なココナッツミルクおよび果肉の芳香を有する（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを得るのに適している。よって、本発明に係る方法を使用して生成される（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは、食品、飲料、またはその他の香味料または香料などとしての使用に適している。さらに（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは、本発明に係る方法による生物学的な工程により、市場の需要に応じるために適した大量で、環境上の制約を満たす方法に従い低コストで生成される。
【００８６】
本発明に係る、ラクトン、特には（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）を生成する方法の利点は、本明細書中以下の実施例の結果により証明され、図２〜７に示す。
【００８７】
実施例１
本発明に係る生成方法の例示的な例として、本出願人は、試験した様々な入手可能な株によるラクトンに関する生産性を決定するために、十分な再現性を得るために本発明により開発された生成の操作条件により、異なるクレードのアウレオバシジウムの様々な株を比較試験でスクリーニングした。
【００８８】
よって、本出願人は、以下の表１に列挙されるように、複数のアウレオバシジウム株を購入した。
【表１】
0006524114.tif 000003
【００８９】
この試験において具体化される本発明に係る方法の例となる操作条件は、以下により詳しく記載されており、スクリーニングした全ての株で同一である。
【００９０】
前培養物を、スクリーニングした細胞株の各クライオチューブから以下のステップにより生成した：
ステップ１：麦芽抽出物ペプトン寒天チューブ（固体ＭＥ培地：ＭＥＡ  Ｆｌｕｋａ（商標））に接種し、２５℃でインキュベートしてコロニーが現れるまで増殖させた。
ステップ２：このチューブを使用して、固体ＭＥ培地（ＭＥＡ  Ｆｌｕｋａ（商標））を含むペトリ皿に画線で接種し、ペトリ皿に２５℃で２４時間接種した。
ステップ３：ペトリ皿で増殖した後、クローンを５ｍｌの液体麦芽抽出物チューブ（液体ＭＥ培地）に接種し、２００ｒｐｍで攪拌しながら２５℃で１８時間インキュベートした。
【００９１】
翌日、同一の株を含むすべてのチューブを合わせて、光学密度（ＯＤ）の読み取りを行った。
【００９２】
次に、この方法で生成される前培養物を、次の発酵培養ステップのためにフラスコに接種するために使用する。この試験では、接種物の大きさを、培養物の初期ＯＤ値：０．５を得るために固定する。
【００９３】
スクリーニングした各株の増殖に基づき、フラスコあたり接種した前培養物の体積は、以下の表２に示されるようにわずかに変動する。
【表２】
0006524114.tif 000004
【００９４】
このように、各株で生成された前培養物を使用して、各株について決定された体積（表２参照）の前培養物を、
超純水で調製し、１１５℃で別々に滅菌した６０ｇ／ｌのグルコースからなる炭素供給源と、
超純水で調製し、１２０℃で滅菌した窒素供給源および無機塩供給源であって、
ＮＨ４ＮＯ３：１ｇ／Ｌ；
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｇ／Ｌ；
ＫＣｌ：０．５ｇ／Ｌ；
ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ：０．２ｇ／Ｌ；
を含む、窒素供給源および無機塩供給源と、
ビタミン供給源としての０．５ｇ／ｌの酵素抽出物（Ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ））と、
ｐＨおよそ５で、塩酸で酸性化した超純水に可溶化され、即座に塩溶液に添加した５ｇ／ｌの沈殿炭酸カルシウムＣａＣＯ３（Ｒｅｃｔａｐｕｒ（商標）Ｐｒｏｌａｂｏ  Ｎｏ．  ２２２９６．２９４）と
を含む生成培地３０ｍｌを含む３００ｍｌのバッフルフラスコに接種する。
【００９５】
次に、様々なスクリーニングした株の培養ステップを、２５℃および３０℃の２つの発酵温度で行う。
【００９６】
よって、フラスコを、攪拌（１４０ｒｐｍ）しながら２５℃および３０℃で並行してインキュベートする。
【００９７】
試験した各株に関して、生成される総ラクトン、すなわち（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの混合物の収量を決定するために、培養の３日目、５日目、および７日目にフラスコを停止する。
【００９８】
次に、各フラスコの発酵培地を、４ＮのＮａＯＨを添加することにより一晩けん化し、次に、５０％のＨ２ＳＯ４で酸性化し、最終的に１時間９０℃に加熱する。
【００９９】
生成されるラクトン混合物を、メチルｔ−ブチルエーテルを用いて抽出することにより回収する。
【０１００】
有機相を、生成されるラクトンの定量的解析のためガスクロマトグラフィーに注入する。
【０１０１】
この試験の範囲内の異なるアウレオバシジウム株のスクリーニングで得た結果のすべてを、以下の表３に記録する。
【表３】
0006524114.tif 000005
【０１０２】
上記の表３に列挙した比較試験の結果を、図２および３により、より具体的に示す。
【０１０３】
図２は、２５℃の発酵により試験したアウレオバシジウムの各株による、３日間、５日間、および７日間の培養後に生成されるラクトン、すなわち（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの混合物の収量のモニタリングをヒストグラムの形態で表す。
【０１０４】
また、図３は、３０℃の発酵により試験したアウレオバシジウムの各株による、３日間、５日間、および７日間の培養後に生成されるラクトン、すなわち（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オンおよび／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの混合物の収量をヒストグラムの形態で表す。
【０１０５】
このことから、本発明に係る方法を使用して試験した各株によるラクトンの生成を評価する。
【０１０６】
よって、本発明に係る方法の培養ステップの最中の発酵温度を上げる作用を、生成されるラクトンの収量の観点からすべての株で試験した。
【０１０７】
この目的のために、試験したすべての株のうち、特に図２および３に例示されるように、株ＣＢＳ７７１．９７が、２５℃または３０℃かどうかにかかわらず、Ｄ３から（Ｄ５およびＤ７でも同様）、最も多くのラクトン生成を有することが判明することに留意されたい。
【０１０８】
２５℃の発酵では、生成されるラクトンの収量は、株ＣＢＳ７７１．９７では他の株と比較して、Ｄ３およびＤ５で少なくとも３倍多く、Ｄ７では少なくとも２倍多い。
【０１０９】
同様に、収量の差異は、３０℃の発酵ではさらに顕著であり、生成されるラクトンの収量は、株ＣＢＳ７７１．９７に関して、他の株と比較してＤ３では少なくとも１０倍多く、Ｄ５では少なくとも５倍多く、Ｄ７では少なくとも７倍多い。
【０１１０】
また、一部の株が、生成の観点から温度に非感受性であることも観察される。これは、たとえば、試験した２つの発酵温度のいずれでもスクロ脂質、よってラクトンを生成しない株ＣＢＳ１１７．４６６、または、最小量のラクトンを生成し、２５℃および３０℃で同様である、株ＣＢＳ１２３．３３に当てはまる。
【０１１１】
さらに、一部の株では発酵温度を上昇させると、ラクトン収量に負の作用を有するように思われる。これは、発酵温度を２５℃から３０℃に増加させると生成に対して顕著な効果を及ぼす株ＣＢＳ１４７．９７で明確に観察される。実際に、この株は、収量がＤ７で最大２．８ｇ／ｌである２５℃と比較して３０℃ではもはやラクトンを生成しない。たとえば株ＣＢＳ５８４．７５などのさらなる株もまた温度の上昇に感受性があり：Ｄ７で２５℃と比較して３０℃で６倍少ないラクトンを生成する。さらに、この負の作用は、Ｄ３から顕著である。また、株ＣＢＳ５８５．７５は、温度の上昇が、総ラクトンの収量に関して負の作用を有する株の群に属する。
【０１１２】
しかしながら、驚くべきことであり、有益なことに、温度の上昇の正の作用は、株ＣＢＳ７７１．９７に限って観察され、２５℃と比較して３０℃での発酵でさらに多くのラクトンを生成し、スクリーニングしたすべての株と異なり、Ｄ７で２２．６％有意に増加する。
【０１１３】
よって、ＣＢＳ７７１．９７またはその関連株（クレード番号７）の特異性が、本発明に係る方法により観察される。
【０１１４】
実施例２
ラクトン収量に関する本発明に係る方法での発酵温度を上昇させる効果に関する追加的な試験を、上記の比較試験と同一の操作条件に基づき、対象の株、すなわち、より具体的にはアウレオバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＣＢＳ  ７７１．９７に関して、より詳しく行った。
【０１１５】
この追加的な試験で得られた生成されるラクトンの収量を、以下の表４に列挙して、図４に示し、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株ＣＢＳ  ７７１．９７に関する本発明に係る方法の例により、ラクトン生成に及ぼす培養ステップの温度の効果を表す。
【表４】
0006524114.tif 000006
【０１１６】
得られた結果に基づき、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株ＣＢＳ  ７７１．９７を使用して生成されるラクトンの収量に関して、２５℃および３５℃と比較して、３０℃に発酵温度を上昇させる正の効果がＤ３から観察され、特にＤ７では、それぞれ３２．４％および１８３・７％の有意な増加を伴う。
【０１１７】
さらに、この追加的な試験で得た収量は、類似の培養条件下で、２５℃および３０℃で得た生成されたラクトンの収量が、この追加的な試験で得た結果と、この株ＣＢＳ７７１．９７に関して実施例１の比較試験で得た結果との間で、２５℃では、単に８．３％（Ｄ３）および１％（Ｄ７）変化し、３０℃ではＤ３で同一であり、Ｄ７ではわずか６．９％変化するという点において本発明による方法の再現性が十分であることを証明する。
【０１１８】
よって、本出願人により使用され、特に水性生成培地中のカルシウムの存在下での操作条件は、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７による、スクロ脂質、したがってラクトン、特に（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの生成を促進する。よって、当業者により一般的に行われる操作からなる本発明に係る方法で使用される操作条件は、実行することが非常に容易である。
【０１１９】
さらに、本発明に係る方法は、十分な再現性を有し、かつ、ラクトン、特に（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの生産性の向上（形成されたラクトンの量および生成比率の向上）させる。この目的のため、この株ＣＢＳ７７１．９７またはその関連株では、生成される代謝物は、好ましくは、ピークに達した後に迅速に分解されず、（Ｒ）−５，６−ジヒドロ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−２−オン（または（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン）および／または（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−ペンチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンに変換され得ることが注目される。
【０１２０】
また、本出願人は、図５に示されるように、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７を使用して本発明に係る方法の一例に従うラクトンの生成に及ぼす、炭素供給源の効果も証明した（実施例３）。
【０１２１】
実施例３
ラクトン生成に及ぼす炭素供給源の効果を、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７を使用して、２５℃で培養することにより実施例１の操作条件に基づき試験した。これを、図５により詳しく示す。
【０１２２】
図５では、試験した炭素供給源のうち、アラビノースおよびガラクトース（４５ｇ／ｌ）は、本発明に係る方法により有意なラクトン生成に適していないことが観察される。また、得られた収量も、６０または７５ｇ／ｌのアラビノースまたはガラクロースの濃度で同様であるかまたはより低いことに留意することが重要である。
【０１２３】
他方で、６０または７５ｇ／ｌの濃度のグリセロール、フルクトース、マルトース、キシロース、スクロース、グルコース、およびマンノースから選択される本発明に係る方法の生成培地の炭素供給源は、２５℃での発酵による６日間の培養の後、グリセロールでは、少なくとも２ｇ／ｌの生成ラクトンの有意な収量がもたらされ、同様に、マンノースではＤ６で最大１１ｇ／ｌの収量がもたらされた。
【０１２４】
得られた結果に基づき、好ましくは使用される炭素供給源は、費用あたり生成される代謝物（生成されるラクトン）の割合が最良である６０ｇ／ｌのグルコースである。
【０１２５】
実施例４：
また、本出願人は、図６に示されるように、２０日間の培養にわたる２５℃での培養により、アウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７を使用した実施例１の操作条件に基づくラクトンの生成、生産性、およびグルコースの消費をモニタリングした。
【０１２６】
７日間の培養後、ラクトン生成は、およそ９ｇ／ｌでピークに達した。測定誤差を考慮すると、プラトーは、７日間〜１０日間の間に存在すると考えることができる。
【０１２７】
生産性を考慮すれば、５日目でピークに達し、その後低下する。
【０１２８】
培養培地からのグルコースの消失は、生産性の低下と同時であると考えられる。
【０１２９】
実施例５
この目的のために、本発明に係る方法の１つの好ましい実施形態では、培養ステップの最中の、生成培地、より具体的には炭素供給源、特にはグルコースの逐次的な添加を、第４の前培養ステップを導入することにより、実施例１の操作条件に基づきアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）株  ＣＢＳ  ７７１．９７を使用して試験した。ステップ３における前培養は、３つのフラスコに接種するために使用されるが、これを２つの１Ｌ発酵槽での前培養として使用する。次に培養ステップを、０．５ｖｖｍのエアレーションおよび５００ｒｐｍの攪拌を伴いながら、１５日間の培養期間にわたり、発酵槽中２８℃で行う。
【０１３０】
第１の発酵槽では、炭素供給源、より具体的にはグルコースは、生成培地（６０ｇ／ｌ）から得られる。第２の発酵槽では、生成培地中に最初に含まれる６０ｇに加えて、５００ｇ／ｌの滅菌水溶液の形態のグルコース３０ｇを、それぞれ、Ｄ３およびＤ７に培養ステップの最中に添加した。
【０１３１】
ラクトンの生成およびグルコース消費のモニタリングを、図７により詳しく示す。
【０１３２】
よって、グルコースを逐次的に添加すると、経時的に生成されるラクトンの量の増加が観察され、これは、培養ステップの最中にグルコースを添加しなかった場合よりも量が多く、生成が迅速である。同様にＤ７では、生成されるラクトン量の３８％の増加が観察され、Ｄ１２では増加は５７％である。
【０１３３】
よって、培養ステップの最中の、生成培地、より具体的には炭素供給源、特には、たとえばグルコースの逐次的な添加は、より長期間、すなわちこの実施例では５日超のより長い期間にわたり高い生産性を維持するのに適切である。
【０１３４】
明らかに、本発明は、上記に提示される実施形態および実施例に限定されるものではなく、当業者は、定例的な操作により、明白に描写されていないさらなる実施形態を作製することができ、それらも本発明の広い範囲に含まれる。
【図１】
0006524114.tif 000007
【図２】
0006524114.tif 000008
【図３】
0006524114.tif 000009
【図４】
0006524114.tif 000010
【図５】
0006524114.tif 000011
【図６】
0006524114.tif 000012
【図７】
0006524114.tif 000013