(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性単糸の撚糸の編物からなる中空管状構造の外管及び内管からなり、外管の管腔に、該外管の管腔径よりも小さい外径を有する前記内管が少なくとも一つ配設されている血管再生用の移植材料。
【請求項２】
前記外管の管腔に、該外管の管腔内面と、前記内管の外面とにより構成される空間を備える、請求項１記載の移植材料。
【請求項３】
前記外管及び／又は前記内管に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び／又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群から選択される１以上の因子が結合されている請求項１又は２に記載の移植材料。
【請求項４】
前記外管に前記群から選択される１以上の因子が結合され、前記内管に前記群から選択される他の１以上の因子が結合されている請求項３に記載の移植材料。
【請求項５】
前記内管の管腔及び／又は前記空間に、血管系細胞及び／又は血管系細胞に分化する細胞が充填されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の移植材料。
【請求項６】
前記外管及び前記内管は、前記編物を構成する撚糸の間に形成された間隙を有し、前記間隙が管腔の外部と内部との連絡を可能とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の移植材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管再生用の移植材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の合併症や癌、リウマチ等による血管障害を治療するため、管状構造を有する移植材料を用いた血管再生（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が試みられている。移植材料を障害部位に埋設すると、生体に内在する細胞あるいは移植材料とともに移植した細胞が、移植材料を足場として組織を再生し、新生血管を形成する。【０００３】
移植材料は、生体吸収性材料によって形成され、生体内で分解・吸収されるものであるが、移植後組織が再生するまでの間は、分解されることなく移植部位にとどまり、再生してくる組織のために足場とスペースを提供する。移植材料を管状構造とすることで、このような再生組織のための足場とスペースを管腔内に確保できる。【０００４】
管状構造を有する移植材料として、特許文献１には、「生体吸収性高分子のマルチフィラメントよりなる第１の糸と、生体吸収性高分子のモノフィラメントからなる第２の糸とを、交互に、又は、適当な比率で組み合わせ配置して組み紐状または筒編み状の組織で筒体に構成されていることを特徴とする生体組織再生用管状医療材料。」が開示されている（請求項１参照）。この管状医療材料は、筒体内部を空洞とでき、生体組織の再生のための液体の流れを阻害せず、かつ管腔内部の液体が漏れることも防止できるとされている（当該文献段落０００８参照）。特許文献１には、移植材料を、多重管構造とすることは記載されていない。【０００５】
また、非特許文献１には、「繊維性の人工高分子素材としてポリ乳酸やポリグリコール酸など多くの素材の開発が進んでおり、用途に応じて選択することもできる。組織溶解性型素材の基本糸（直径１０μｍ）を複数本編み込むことにより中空のチューブを製作し、種々の接着分子を結合させた。編み機の設定により多彩なサイズの形状の足場を構築できる。」との記載がある（当該文献第４６頁左欄下から６〜２行目）。さらに、「本方法は、脳脊髄という限られたスペースでの神経回路再建に有効な方法であることが明らかになった。」（当該文献第４７頁左欄１５〜１７行目）との記載はあるが、血管に使用できることは記載されていない。【０００６】
さらに、特許文献２には、血管再生用の足場材料に関し、同心円状の複数の層からなる中空の円筒体であって、脂肪族ポリエステル繊維からなる円筒体である足場材料が開示されている。この足場材料は、脂肪族ポリエステルを含有するドープを静電紡糸法で紡糸し、得られた繊維を巻き付けた、複数の層からなる円筒体であり、血管と類似した構造と同程度の機械的強度を有するとされている（当該文献２頁１５〜２２行目参照）。この足場材料において、複数の層は、実際の血管組織の内膜、中膜、外膜を模擬するものであり（同７頁１〜１２行目参照）、各層は密着しているものと認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２４０２００号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０５４７９９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】機能材料２０１２年５月号Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
管状構造を有する移植材料を生体内に埋設した場合、移植材料が変形して管腔が閉塞してしまう場合がある。特に糖尿病の大血管障害の治療において大腿等の筋肉内に移植材料を埋設するような場合には変形（キンキング）が生じやすい。移植材料の変形により管腔が閉塞すると、再生組織のためのスペースを確保することができなくなり、管腔内における細胞の移動や、酸素及び血液、細胞外液の流れが阻害され、血管再生が生じ難くなるおそれがある。【００１０】
上述の特許文献１に記載される管状医療材料では、太いモノフィラメントからなる第２の糸によって筒体の耐キンキング性を向上させている（当該文献段落０００８参照）。また、特許文献２に記載される足場材料は、複数層からなる積層構造により円筒体の機械的強度を高めていると認められる。【００１１】
本発明は、移植部位において再生組織のための十分なスペースを確保して血管の再生を促進することが可能な移植材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題解決のため、本発明は、生分解性単糸の撚糸が中空管状構造に編み込まれてなる外管及び内管からなり、外管の管腔に、該外管の管腔径よりも小さい外径を有する前記内管が少なくとも一つ配設されている血管再生用の移植材料を提供する。この血管再生用移植材料は、内管が外管の芯材として機能するため、耐キンキング性に優れ、管腔の閉塞が生じ難い。【００１３】
また、本発明に係る血管再生用移植材料は、前記外管の管腔に、該外管の管腔内面と、前記内管の外面とにより構成される空間を備える。該空間は、組織再生のためのスペースとなるとともに、外力を受けて外管が変形した場合には、外管の変形を緩衝し内管の変形を防止して、内管の管腔を維持するためにも機能する。【００１４】
さらに、本発明に係る血管再生用移植材料は、前記外管及び前記内管に、編み込まれた前記撚糸の間に形成され、管腔の外部と内部とを連絡する間隙を備えている。この血管再生用移植材料は、細胞や酸素、血液及び細胞外液が、該再生用移植材料の側壁の間隙を通って外管及び内管の管腔内外へ移動することが可能とされている。【００１５】
本発明に係る血管再生用移植材料は、前記外管及び／又は前記内管に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び／又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群から選択される１以上の因子が結合されたものとできる。この場合、前記外管に前記群から選択される１以上の因子が結合され、前記内管に前記群から選択される他の１以上の因子が結合されたものであってもよい。
また、本発明に係る血管再生用移植材料は、前記内管の管腔及び／又は前記空間に、血管系細胞及び／又は血管系細胞に分化する細胞が充填されていてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、移植部位において耐キンキングに優れ、再生組織のための十分なスペースを確保して血管の再生を促進することが可能な移植材料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第一実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する模式図である。（Ａ）は側面図、（Ｂ）は断面図を示す。
【図２】本発明の第二実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する模式図である。（Ａ）は側面図、（Ｂ）は断面図を示す。
【図３】本発明の第三実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する模式図である。（Ａ）は側面図、（Ｂ）は断面図を示す。
【図４】本発明に係る血管再生用移植材料の敷設のために使用可能なガイドワイヤを説明する模式図である。
【図５−１】遺伝子導入用ベクターを結合した中空管状構造体により培養細胞に遺伝子導入を行った結果を示す写真である。
【図５−２】図５−１に示す写真の模式図である。
【図６−１】血管再生用移植材料を筋肉内へ移植した結果（移植後３日）を示す写真である。
【図６−２】図６−１に示す写真の模式図である。
【図７】下肢虚血モデルマウス（ヌードマウス）にＶＥＧＦコート血管再生用移植材料を移植した結果（移植後３週間）を示す写真である。（Ａ）は一重管構造を有する中空管状構造体の移植部、（Ｂ）は二重管構造を有する血管再生用移植材料の移植部を示す。
【図８】下肢虚血モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にＶＥＧＦコート血管再生用移植材料を移植した結果（移植後３週間）を示す写真である。（Ａ）は一重管構造を有する中空管状構造体の移植部、（Ｂ）は二重管構造を有する血管再生用移植材料の移植部を示す。
【図９】下肢虚血モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の血管再生用移植材料の移植部におけるＣＤ３１染色像を示す写真である。
【図１０】下肢虚血モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の血管再生用移植材料の移植部におけるトマトレクチンの結合を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。また、以下に説明する実施形態の動物種は、ヒトがその一例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
１．第一実施形態に係る血管再生用移植材料
図１は、本発明の第一実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する図である。血管再生用移植材料Ａは、外管１と内管２とからなる。外管１と内管２は、それぞれ生分解性単糸３の撚糸４が中空管状構造に編み込まれてなる。
【００２０】
［生分解性単糸の撚糸］
生分解性単糸３は、生体内で酵素の作用により加水分解され得る天然又は合成の高分子（生分解性高分子）から形成されている。生分解性高分子は、体内で溶解、吸収されるため、異物反応の危険性を最小限に抑えることができ、安全性に優れる。
【００２１】
生分解性高分子は、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどを挙げることができる。生分解性高分子は、特に、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸／乳酸共重合体が好ましい。
【００２２】
生分解性単糸３の直径は、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜選択できる。単糸直径は、例えば、２００μｍ以下であってもよく、１００μｍ以下であってもよく、さらに１０μｍ以下であってもよい。単糸直径は、好ましくは１〜１００μｍ、より好ましくは５〜５０μｍ、さらに好ましくは１０〜２０μｍ程度とされる。
【００２３】
生分解性単糸３の断面形状は、特に限定されず、円形又は多角形などであってよい。生分解性単糸３は、突起や微細凹凸を有していてもよい。
【００２４】
撚糸４は、生分解性単糸３を複数本撚り合わせたものである。撚糸４には、材料、直径及び断面形状等が異なる複数種の生分解性単糸３を組み合わせて用いてもよい。撚糸４として束ねられる生分解性単糸３の本数は、特に限定されないが、２〜１０００本、好ましくは４〜５００本程度、特に好ましくは４〜１００本程度とされる。外管１と内管２のそれぞれに用いられる生分解性単糸３及び撚糸４は、同一の符号を付しているが、材料、直径、断面形状等及び本数が異なっていてもよいものとする。
【００２５】
また、生分解性単糸３は、それ自体が中空構造（管状構造）を有する中空糸であってもよい。さらに、生分解性単糸３には、形状記憶素材を用いてもよい。
【００２６】
外管１及び内管２は、撚糸４を中空管状構造に編み込んで形成されている。具体的には、金属線、樹脂線及び繊維などの芯の周りに撚糸４を編み込んでいき、最後に芯を抜去することによって、中空管状構造を有する外管１及び内管２を得ることができる。なお、芯の材料は、上記の金属、樹脂及び繊維に限定されない。
【００２７】
また、得られた外管１及び内管２には、撚糸４の編目構造に由来して、撚糸４の間に間隙５が形成される。間隙５は、外管１（あるいは内管２）の管腔の外部と内部を連絡し、管腔内外への細胞や酸素、血液及び細胞外液の移動経路となる。
【００２８】
生分解性単糸３の材料、直径、断面形状及び本数や、撚糸４の編み組織及び編み込み時に糸に加える力などを調整することによって、外管１及び内管２の剛性や間隙５の形状及び大きさを変化させることが可能である。
【００２９】
間隙５は、細胞や酸素、血液及び細胞外液が通過可能な大きさとされ、例えば、５μｍ〜２０００μｍ程度とされる。間隙５の大きさは、１０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましく、１００μｍ〜５００μｍ程度がより好ましい。なお、外管１の間隙５と内管２の間隙５は、同一の符号を付したが、形状及び大きさが異なっていてもよいものとする。
【００３０】
［多重管構造］
本発明に係る血管再生用移植材料は、外管１の管腔に、内管２が少なくとも一つ配設された多重管構造を有している。本実施形態の血管再生用移植材料Ａでは、外管１の管腔に、一つの内管２が配された二重管構造とされている。
【００３１】
内管２は、外管１の管腔径ｄ1よりも小さい外径Ｄ2を有する。内管２の外径Ｄ2は、例えば、外管１の管腔径ｄ1の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％あるいは１０％程度とされる。
【００３２】
二重管構造は以下の手順により作製できる。まず、芯の周りに撚糸４を編み込んで外管１を作製する。次に、外管１の作製に用いた芯よりも径の小さな芯の周りに撚糸４を編み込んで内管２を作製する。そして、芯を抜き取った後の外管１の管腔に、内管２を芯とともに挿入する。最後に、内管２の芯を抜き取ることで、二重管構造を有する血管再生用移植材料Ａを得る。使用する芯の径は、外管１の管腔径ｄ1及び内管２の管腔径ｄ2に応じて適宜設定すればよい。
【００３３】
外管１の外径Ｄ1は、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜選択することができる。外径Ｄ1は、最大１００００μｍまで可能である。外管１の管腔径ｄ1は、脊髄や皮下組織のように運動性を欠く臓器へ移植する場合には、１００μｍ程度であっても、移植後に管腔が閉塞することはない。一方、筋肉のように収縮運動の盛んな臓器へ移植する場合には、管腔径ｄ1が１００μｍ程度では管腔が閉塞するおそれがあるので、管腔径ｄ1は５００μｍ程度とすることが望ましい。ヒトへの適応を考えれば、管腔径ｄ1を比較的大きくすることが、循環動態改善効果ならびに管腔閉塞防止のために有用である。
【００３４】
外管１及び内管２の径の一例として以下の数値が挙げられる。
外管１：外径Ｄ1６００μｍ、管腔径ｄ1５００μｍ
内管２：外径Ｄ2３００μｍ、管腔径ｄ2２００μｍ
【００３５】
また、血管再生用移植材料Ａの長さは、２ｍｍ〜１００ｃｍ程度とされ、好ましくは１ｃｍ〜３０ｃｍ程度とされる。
【００３６】
血管再生用移植材料Ａは、外管１の管腔に、外管１の管腔内面と、内管２の外面とにより構成される空間１１を備えている。この空間１１は、生体に内在する細胞あるいは移植材料とともに移植した細胞による組織再生のためのスペースとなる。空間１１の広さは、組織再生のためのスペースが確保されれば足り、特に限定されず、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜設計される。
【００３７】
血管再生用移植材料Ａは、二重管構造（あるいは多重管構造）を有し、内管２が外管１の芯材としても機能するため、耐キンキング性に優れ、筋肉のように収縮運動の盛んな臓器へ移植した場合にも外管１及び内管２の管腔が閉塞し難い。また、仮に外力を受けて外管１が変形した場合にも、空間１１が外管１の変形を緩衝し内管２の変形を防止するため、内管２の管腔（図１（Ｂ）符号２２参照）を維持できる。従って、血管再生用移植材料Ａでは、移植部位において再生組織のための十分なスペースを確保し、該スペースにおける細胞の移動や、酸素、血液及び細胞外液の流れを促進して、血管の再生を効果的に誘導できる。より具体的には、組織中から外管１及び内管２の管腔に入った遊走細胞や、管腔に充填されていた移植細胞が、空間１１及び内管２の管腔２２に沿って宿主の細胞に邪魔されることなく成長できるため、新生血管の伸長が促進される。
【００３８】
さらに、血管再生用移植材料Ａは、外管１及び内管２が間隙５を有していることにより、外管１及び内管２の管腔内外への細胞や酸素、血液及び細胞外液の移動が可能とされている。従って、血管再生用移植材料Ａでは、組織中の遊走細胞や組織液が間隙５を通過して管腔内に入ったり、管腔に充填しておいた移植細胞が間隙５を通過して組織中に出て行ったりすることが可能である。血管再生用移植材料Ａの管腔から組織中に出た移植細胞は、移植部位及びその周囲に移動して血管の再構築に寄与する。
【００３９】
［接着分子］
血管再生用移植材料Ａには、細胞接着分子が結合されていてもよい。細胞接着分子とは、細胞の接着を促進する分子をいい、例えば、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリジン及びポリオルニチンなどが挙げられる。
【００４０】
血管再生用移植材料Ａには、２種以上の細胞接着分子を組み合わせて結合してもよい。また、血管再生用移植材料Ａの部位毎に異なる種の細胞接着分子を結合させてもよい。例えば、外管１と内管２とで異なる種の細胞接着分子を結合させたり、血管再生用移植材料Ａの端部と中心部とで異なる種の細胞接着分子を結合させたりすることで、挿入する組織に存在する細胞及び血管再生用移植材料Ａとともに移植する細胞に応じて所望の細胞接着特性を備えた血管再生用移植材料Ａを作製することが可能である。
【００４１】
血管再生用移植材料Ａへの細胞接着分子の結合は、化学結合によるものであっても、物理的結合（例えば吸着）によるものであってもよい。例えば、血管再生用移植材料Ａをラミニン水溶液（１〜1000μg/ml）中に室温にて２〜１６時間浸漬させ、次に血管再生用移植材料Ａを蒸留水で洗浄後、乾燥することにより、ラミニンが結合した血管再生用移植材料Ａが得られる。
【００４２】
［成長因子］
血管再生用移植材料Ａには、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸が結合されていてもよい。へパリンとヘパラン硫酸は、アデノ随伴ウイルスなどの遺伝子導入用ベクターとして用いられているウイルスと結合親和性を有する。このため、血管再生用移植材料Ａにヘパリン等を結合させておくことで、血管再生用移植材料Ａにヘパリン等を介してウイルスベクターを結合させることができる。ウイルスベクターには、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等も用いることができる。
【００４３】
ウイルスベクターとしては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ・ｂＦＧＦ）及び幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの新生血管の成長・成熟を促進する作用を有する因子を発現するウイルスベクターが挙げられる。
【００４４】
また、へパリンとヘパラン硫酸は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ・ｂＦＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ケモカイン、ミッドカイン等の多くの栄養因子との結合親和性も有する。このため、血管再生用移植材料Ａにヘパリン等を結合させておくことで、血管再生用移植材料Ａにヘパリン結合性を有する栄養因子を結合させることもできる。さらに、これらの因子のタンパク質を血管再生用移植材料Ａにヘパリンを介さず直接結合させることもできる。
【００４５】
ＶＥＧＦ等の新生血管の成長・成熟を促進する作用を有する因子を導入、発現するための手段には、上記のウイルスベクターに限られず、プラスミド等の公知の遺伝子ベクターも採用できる。また、血管形成に関与する因子を発現させるための手段として、ＤＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖を含む）やＲＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを含む）を用いることもできる。例えばセンス鎖を用いれば、血管形成に関与する因子の発現を誘導できる。また、アンチセンス鎖を用いる場合やＲＮＡｉによる場合には、血管形成に関与する因子の発現抑制に機能している転写因子の発現を抑制することによって、血管形成に関与する因子の発現を誘導することが考えられる。また、上記のポリリジンのようにアミノ基を有する化合物は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸とイオン結合するため、血管再生用移植材料Ａに細胞接着分子としてポリリジンを結合させれば、ポリリジンを介して血管形成に関与する遺伝子の発現を制御するための核酸を血管再生用移植材料Ａに結合させることも可能である。本発明において、血管再生用移植材料に結合する成長因子の態様及び結合形態は、成長因子がその機能を発揮できるものであればよく、上記の通り、核酸の態様あるいはタンパク質の態様であってよく、これらの結合はヘパリン及び／又はヘパラン硫酸を介する形態あるいは介さない形態であってよく、さらに因子が核酸である場合には核酸そのものの態様あるいは遺伝子ベクターに搭載された態様であってよいものとする。
【００４６】
外管１と内管２のそれぞれに上記因子の一以上を結合させてよく、外管１と内管２に異なる因子を結合してもよい。外管１と内管２のそれぞれに結合される因子の組み合わせは、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜設定できる。
【００４７】
一例として、血管内皮細胞を誘導、増殖させるＶＥＧＦを内管２に結合させ、他の血管形成関連因子（ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＰＤＧＦなど）を外管１に結合させることで、生体内の血管に近い環境を再現できる。あるいは、外管１にＶＥＧＦを結合させ、内管２に他の血管形成関連因子（ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＰＤＧＦなど）を結合させることも考えられる。血管再生用移植材料Ａによって生体内の血管に近い環境を移植部位に構築することで、ＶＥＧＦ等を組織中に単に注入するだけの従来方法に比して、血管の再生を効果的に促進できる。
【００４８】
［細胞］
空間１１及び内管２の管腔２２には、血管系細胞及び／又は血管系細胞に分化する細胞が充填されていてもよい。ここで、「血管系細胞」には、少なくも血管内皮細胞及び血管周皮細胞（ペリサイト）が含まれる。また、「血管系細胞に分化する細胞」には、血管内皮細胞及びペリサイトの前駆細胞、誘導性多能性幹細胞（iPS細胞）及び胚性幹細胞（ES細胞）等の幹細胞、間葉系幹細胞等が含まれる。
【００４９】
さらに、空間１１及び内管２の管腔２２に、血管系細胞とともに心筋細胞を充填すれば、心筋梗塞や心筋症の治療への適用も可能である。さらに、内管２の管腔２２に移植細胞を充填し、空間１１にＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ・ｂＦＧＦ及びＨＧＦなどの新生血管の成長・成熟を促進する作用を有する因子を結合してもよい。これによって、移植した血管内皮細胞等による血管構造の構築を促進できる。
【００５０】
細胞に替えて、あるいは細胞と共に、空間１１及び内管２の管腔２２に、各種の栄養因子や薬物を導入してもよい。空間１１及び内管２の管腔２２にゲル化した栄養因子や薬物を充填すれば、長期にわたってこれらの物質が移植部位において放出されるようにできる。
【００５１】
［磁性体］
血管再生用移植材料Ａは、磁性体が接続されていてもよい。血管再生用移植材料Ａに磁性体を接続することで、磁気発生装置を用いて、血管再生用移植材料Ａを組織中の目的の部位に誘導して留置できる。
【００５２】
磁性体の材料としては、例えば、鉄、ニッケル、コバルトならびにこれらの合金（鉄クロムコバルト合金、アルミニッケルコバルト合金等）、フェライト、希土類磁石及び磁性ステンレスなどの任意の金属材料を用いることができる。希土類磁石としては、サマリウムコバルト（SmCo）磁石、ネオジウム（NdFeB）磁石などが挙げられる。磁性体には、これらの金属材料を、生体適合性を有する材料であって、従来注射針などのコートに用いられている材料で被覆したものを用いてもよい。生体適合性材料としては、例えば、パラキシリレン系ポリマーであるパリレン（登録商標）、シリコン、ポリプロピレン及びテトラフルオロエチレンなどが挙げられる。金属材料として鉄クロムコバルト合金（FeCrCo）を使用する場合、市販FeCrCo線を熱により引き延ばしたナノワイヤを使用できる。
【００５３】
磁性体は、血管再生用移植材料Ａの一端に連結されていてもよく、血管再生用移植材料Ａの管腔に少なくとも一部を挿入した状態で固定されていてもよい。
【００５４】
磁性体を血管再生用移植材料Ａの一端に連結するためには、磁性体の一端と血管再生用移植材料Ａの一端とを糊剤や熱融着により結合させる。磁性体と血管再生用移植材料Ａを１ケ所結合することで、外部磁場により磁性体と血管再生用移植材料Ａを同時に制御できる。糊剤として例えば０.５％濃度でポリ乳酸（PLLA）とクロロホルムを混合した糊剤を使用できる。熱融着の場合、２００℃程度のハンダコテを血管再生用移植材料Ａにあてて融着してもよい。磁性体の一端と血管再生用移植材料Ａの一端とを機械的に結合させる方法も考えられる。
【００５５】
磁性体を血管再生用移植材料Ａの管腔に少なくとも一部を挿入した状態で固定するためには、血管再生用移植材料Ａの管腔に磁性体を挿し込み、２００℃程度で数秒加熱し、糸を溶融させ磁性体と接着する。また、薬剤で接着してもよい。
【００５６】
磁気発生装置による磁性体の誘導と組織内への挿入を容易にするため、磁性体は細い針状あるいは棒状に形成されることが好ましい。針状あるいは棒状とした磁性体（以下「針状磁性体」という）は、極細磁石であることが好ましい。磁性体を極細とすることで、血管再生用移植材料Ａの挿入あるいは留置に伴う、組織の出血や損傷を最小限に抑えることができる。
【００５７】
針状磁性体の直径は、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜選択することができ、例えば、２００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下とされる。針状磁性体の直径は、血管再生用移植材料Ａの外径より小さいことが望ましい。針状磁性体の長さも、挿入すべき組織の特性および損傷の程度に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
磁場発生装置としては、例えば、国際公開第２００１／０６１４７４号に開示される磁場制御装置を用いることができる。磁場発生装置は、電磁石と、発生する磁場を制御する制御装置とを備え、先端に誘導針を有する。誘導針は、電磁石から発生した磁場の磁束密度を高めるための磁性金属の針である。血管再生用移植材料Ａを挿入する組織の付近に誘導針を密着させるかまたは挿入した後、制御装置を操作して磁場を発生させる。磁場の強度と誘導針の位置を調節することにより、磁性体を誘導して、血管再生用移植材料Ａを組織内の所望の位置に挿入・留置できる。
【００５９】
この際、高感度磁気センサーを利用することにより、磁性体の正確な位置をモニターできる。高感度磁気センサーを利用した手術中のモニター方法として、例えばホール素子、ＭＩ（磁気インピーダンス）センサー、ＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉素子）センサーの利用が考えられる。
【００６０】
２．第二実施形態に係る血管再生用移植材料
図２は、本発明の第二実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する図である。血管再生用移植材料Ｂは、外管１の管腔に、内管が複数配設されている点で、上述の血管再生用移植材料Ａと異なる。すなわち、本実施形態の血管再生用移植材料Ｂでは、外管１の管腔に、３つの内管２ａ、２ｂ、２ｃが配された多重管構造とされている。なお、外管１の管腔に配設される内管の数は２又は４以上であってもよい。
【００６１】
血管再生用移植材料Ｂを構成する撚糸４（及び生分解性単糸３）、外管１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの中空管状構造、間隙５等は、血管再生用移植材料Ａと同じであるので詳細な説明を割愛する。
【００６２】
内管２ａは、外管１の管腔径ｄ1よりも小さい外径Ｄ2aを有する。内管２ａの外径Ｄ2aは、例えば、外管１の管腔径ｄ1の７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％あるいは５％程度とされる。内管２ｂ、２ｃについても同様であるが、内管２ａ、２ｂ、２ｃの外径は同一であっても異なっていてもよい。
【００６３】
多重管構造は以下の手順により作製できる。まず、芯の周りに撚糸４を編み込んで外管１を作製する。次に、外管１の作製に用いた芯よりも径の小さな芯の周りに撚糸４を編み込んで内管２ａ、２ｂ、２ｃを作製する。そして、芯を抜き取った後の外管１の管腔に、内管２ａ、２ｂ、２ｃを芯とともに挿入する。最後に、内管２ａ、２ｂ、２ｃの芯を順に抜き取ることで、多重管構造を有する血管再生用移植材料Ｂを得る。使用する芯の径は、外管１の管腔径ｄ1、内管２ａの管腔径ｄ2a（及び内管２ｂ、２ｃの管腔径）に応じて適宜設定すればよい。同様にして、２又は４以上の内管を配置することもできる。
【００６４】
外管１及び内管２ａ（及び内管２ｂ、２ｃ）の径の一例として以下の数値が挙げられる。
外管１：外径Ｄ1６００μｍ、管腔径ｄ1５００μｍ
内管２ａ：外径Ｄ2a２００μｍ、管腔径ｄ2a１００μｍ
【００６５】
血管再生用移植材料Ｂは、外管１の管腔に、外管１の管腔内面と、内管２ａ、２ｂ、２ｃの外面とにより構成される空間１１を備えている。この空間１１は、生体に内在する細胞あるいは移植材料とともに移植した細胞による組織再生のためのスペースとなる。
【００６６】
血管再生用移植材料Ｂは、多重管構造を有し、内管２ａ、２ｂ、２ｃが外管１の芯材としても機能するため、耐キンキング性に優れ、筋肉のように収縮運動の盛んな臓器へ移植した場合にも外管１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔が閉塞し難い。血管再生用移植材料Ｂは、外管１の管腔に複数の内管を配することで、上述の血管再生用移植材料Ａに比して、より高い耐キンキング性が得られる。
【００６７】
また、仮に外力を受けて外管１が変形した場合にも、空間１１が外管１の変形を緩衝し内管２ａ、２ｂ、２ｃの変形を防止するため、内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔（図２（Ｂ）符号２２ａ、２２ｂ、２２ｃ参照）を維持できる。従って、血管再生用移植材料Ｂでは、移植部位において再生組織のための十分なスペースを確保し、該スペースにおける細胞の移動や、酸素、血液及び細胞外液の流れを促進して、効果的に血管の再生を誘導できる。より具体的には、組織中から外管１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔に入った遊走細胞や、管腔に充填されていた移植細胞が、空間１１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔２２ａ、２２ｂ、２２ｃに沿って宿主の細胞に邪魔されることなく成長できるため、新生血管の伸長を促進できる。
【００６８】
血管再生用移植材料Ｂには、上述した細胞接着分子、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸、成長因子、ウイルスベクター等を結合させてもよく、必要に応じて磁性体を結合させてもよい。この場合、内管２ａ、２ｂ、２ｃには、それぞれ異なる細胞接着分子等を結合させることもできる。
【００６９】
また、空間１１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔２２ａ、２２ｂ、２２ｃには、血管系細胞及び／又は血管系細胞に分化する細胞が充填されていてもよく、ゲル化した栄養因子や薬物が充填されていてもよい。各管腔には、それぞれ細胞及び／又は薬物を任意の組み合わせで充填できる。本実施形態に係る血管再生用移植材料Ｂでは、内管を３つ配しているため、空間１１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの各管腔に充填する細胞や薬物について多様な組み合わせを実現できる。他方、上述の第一実施形態に係る血管再生用移植材料Ａは、空間１１及び内管２の管腔２２を比較的広くとることができるため、多量の細胞や薬物を充填、移植するために適している。
【００７０】
空間１１及び内管２ａ、２ｂ、２ｃの管腔２２ａ、２２ｂ、２２ｃに充填する細胞や薬物の組み合わせは例えば以下のようにできる。２又は４以上の内管が配されている場合にも同様に種々の組み合わせが可能である。
【００７１】
【表１】
0006473695.tif 000002
【００７２】
３．第三実施形態に係る血管再生用移植材料
図３は、本発明の第三実施形態に係る血管再生用移植材料を説明する図である。血管再生用移植材料Ｃは、外管１の管腔に配置された第１の内管２ｄの管腔にさらに第２の内管２ｅが配設されている点で、上述の血管再生用移植材料Ａと異なる。すなわち、本実施形態の血管再生用移植材料Ｃにおいては、第一の内管２ｄは、外管１に対しての内管であると同時に、第２の内管２ｅに対しての外管ともなっている。血管再生用移植材料Ｃは、３つの管状構造体（外管１、第１の内管２ｄ、第２の内管２ｅ）が「入れ子」になった多重管構造とされている。「入れ子」構造は、図に示す３重構造に限られず、４重以上であってもよい。
【００７３】
血管再生用移植材料Ｃを構成する４（及び生分解性単糸３）、外管１及び第１・第２の内管２ｄ、２ｅの中空管状構造、間隙５等は、血管再生用移植材料Ａと同じであるので詳細な説明を割愛する。
【００７４】
第１の内管２ｄは、外管１の管腔径ｄ1よりも小さい外径Ｄ2dを有する。また、第２の内管２ｅは、第１の内管２ｄの管腔径ｄ2dよりも小さい外径Ｄ2eを有する。第１の内管２ｄの外径Ｄ2dは、例えば、外管１の管腔径ｄ1の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％あるいは１０％程度とされる。同様に、第２の内管２ｅの外径Ｄ2eは、例えば、第１の内管２ｄの管腔径ｄ2dの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％あるいは１０％程度とされる。
【００７５】
多重管構造は以下の手順により作製できる。まず、芯の周りに撚糸４を編み込んで外管１を作製する。次に、外管１の作製に用いた芯よりも径の小さな芯の周りに撚糸４を編み込んで第１の内管２ｄを作製する。さらに、第１の内管２ｄの作製に用いた芯よりも径の小さな芯の周りに撚糸４を編み込んで第２の内管２ｅを作製する。そして、芯を抜き取った後の外管１の管腔に、第１の内管２ｄを芯とともに挿入した後、芯を抜き取る。さらに、芯を抜き取った後の第１の内管２ｄの管腔に、第２の内管２ｅを芯とともに挿入した後、芯を抜き取ることで、多重管構造を有する血管再生用移植材料Ｃを得る。使用する芯の径は、外管１の管腔径ｄ1及び第１・第２の内管２ｄ、２ｅの管腔径ｄ2d、ｄ2eに応じて適宜設定すればよい。同様にして、４重以上の構造を作製することもできる。
【００７６】
外管１及び第１・第２の内管２ｄ、２ｅの径の一例として以下の数値が挙げられる。
外管１：外径Ｄ1７００μｍ、管腔径ｄ1６００μｍ
第１の内管２ｄ：外径Ｄ2d４００μｍ、管腔径ｄ2d３００μｍ
第２の内管２ｅ：外径Ｄ2e２００μｍ、管腔径ｄ2e１００μｍ
【００７７】
血管再生用移植材料Ｃは、外管１の管腔に、外管１の管腔内面と、第１の内管２ｄの外面とにより構成される空間１１を備えている。また、第１の内管２ｄの管腔にも、第１の内管２ｄの管腔内面と、第２の内管２ｅの外面とにより構成される空間２２ｄを備えている。これらの空間１１、２２ｄは、生体に内在する細胞あるいは移植材料とともに移植した細胞による組織再生のためのスペースとなる。
【００７８】
血管再生用移植材料Ｃは、多重管構造を有し、第１・第２の内管２ｄ、２ｅが外管１の芯材としても機能するため、耐キンキング性に優れ、筋肉のように収縮運動の盛んな臓器へ移植した場合にも外管１及び内管２ｄ、２ｅの管腔が閉塞し難い。血管再生用移植材料Ｃは、「入れ子」状の多重構造とされることで、上述の血管再生用移植材料Ａに比してより高い耐キンキング性を発揮する。
【００７９】
また、仮に外力を受けて外管１が変形した場合にも、空間１１が外管１の変形を緩衝し、第１の内管２ｄの変形を防止する。さらに、仮に第１の内管２ｄまでもが変形した場合にも、空間２２ｄが第１の内管２ｄの変形を緩衝し、第２の内管２ｅの変形を防止する。このため、空間２２ｄ及び第２の内管２ｅの管腔（図３（Ｂ）符号２２ｅ参照）が維持される。従って、血管再生用移植材料Ｃでは、移植部位において再生組織のための十分なスペースを確保し、該スペースにおける細胞の移動や、酸素、血液及び細胞外液の流れを促進して、効果的に血管の再生を誘導できる。より具体的には、組織中から外管１及び内管２ｄ、２ｅの管腔に入った遊走細胞や、管腔に充填されていた移植細胞が、空間１１、２２ｄ及び第２の内管２ｅの管腔２２ｅに沿って宿主の細胞に邪魔されることなく成長できるため、新生血管の伸長を促進できる。
【００８０】
血管再生用移植材料Ｃには、上述した細胞接着分子、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸、成長因子、ウイルスベクター等を結合させてもよく、必要に応じて磁性体を結合させてもよい。この場合、外管１及び内管２ｄ、２ｅには、それぞれ異なる細胞接着分子等を結合させることもできる。
【００８１】
また、空間１１、２２ｄ及び第２の内管２ｅの管腔２２ｅには、血管系細胞及び／又は血管系細胞に分化する細胞が充填されていてもよく、ゲル化した栄養因子や薬物が充填されていてもよい。各管腔には、それぞれ細胞及び／又は薬物を任意の組み合わせで充填できる。本実施形態に係る血管再生用移植材料Ｃでは、３つの管状構造体（外管１、第１の内管２ｄ、第２の内管２ｅ）が「入れ子」になって配されているため、空間１１、２２ｄ及び第２の内管２ｅの管腔２２ｅに充填する細胞や薬物について多様な組み合わせを実現できる。
【００８２】
空間１１、２２ｄ及び第２の内管２ｅの管腔２２ｅに充填する細胞や薬物の組み合わせは例えば以下のようにできる。４重以上の構造とする場合にも同様に種々の組み合わせが可能である。
【００８３】
【表２】
0006473695.tif 000003
【００８４】
さらに、本発明に係る血管再生用移植材料は、上述の第二実施形態における多重管構造と、第三実施形態における多重管構造とを組み合わせた構造を有していてもよいものとする。
【００８５】
４．血管再生用移植材料の敷設方法
本発明に係る血管再生用移植材料の敷設様式としては、（１）全体を皮下及び／又は筋肉内に埋設する方式、（２）両端部を体外に露出し、中央部のみを皮下及び／又は筋肉内に埋設する方式、（３）片端部を体外に露出し、残余の部を皮下及び／又は筋肉内に埋設する方式のいずれであってもよい。
【００８６】
［磁気による敷設］
本発明に係る血管再生用移植材料が磁性体を備える場合には、上述の通り、磁気発生装置を用いて組織中の目的の部位へ誘導し、敷設することができる。また、この際、高感度磁気センサーを用いることで、磁性体の位置をモニターして、血管再生用移植材料を目的の位置へ正確に移植できる。
【００８７】
磁性体は、無害な鉄を用いる場合には挿入部位にそのまま留置してもよいし、磁性体を体外に導き出した後に、磁性体を血管再生用移植材料から切り離し、血管再生用移植材料のみを体内に留置してもよい。安全性を考慮すると血管再生用移植材料のみを体内に留置することが好ましい。
【００８８】
比較的長い針状磁性体を血管再生用移植材料の管腔に挿入した構造の場合、血管再生用移植材料の全長に磁力線を挿入することが可能となるため強力な磁場誘導効果が得られる。
【００８９】
［ガイドワイヤによる敷設］
また、本発明に係る血管再生用移植材料は、磁場を使用せずに、用手的に組織に挿入し、敷設することもできる。ガイドワイヤが目的部位へ到達したかは、例えばＸ線カメラ透視により確認できる。
【００９０】
図４に本発明に係る血管再生用移植材料の敷設に使用可能なガイドワイヤを例示する。
【００９１】
（Ａ）に示す筒状のガイドワイヤは、先端の開口から血管再生用移植材料を通して用いるものであり、太い血管再生用移植材料の敷設に適する。先端は、筋肉内に進入できるように鋭利となっている。このガイドワイヤでは、上記（１）〜（３）の敷設様式が可能である。また、二本以上の血管再生用移植材料を同時に敷設することもできる。
【００９２】
（Ｂ）に示すガイドワイヤは、先端部の溝に血管再生用移植材料を引っ掛けて用いる。先端は、筋肉内に進入できるように鋭利となっている。このガイドワイヤでは、先端を目的部位まで挿入後引き抜くだけで敷設でき、上記（２）（３）の敷設様式が可能である。また、二本以上の血管再生用移植材料を同時に敷設することもできる。
【００９３】
（Ｃ）に示すガイドワイヤは、先端の孔に血管再生用移植材料を通して用いるものである。先端は、筋肉内に進入できるように鋭利となっている。このガイドワイヤでは、上記（１）（２）の敷設様式が可能である。
【００９４】
また、図に示さないが、血管再生用移植材料の一端を閉鎖端とし、開口端である他の一端から血管再生用移植材料の管腔に挿入したガイドワイヤを用いて、血管再生用移植材料を組織中の目的の部位へ誘導してもよい。目的の部位へ挿入した後、開口端からガイドワイヤを引き抜く、あるいは、閉鎖端を切断して開口させ該開口からガイドワイヤを抜き取る。
【００９５】
ガイドワイヤの長さは、通常、血管再生用移植材料の体内敷設長よりも長くされる。ガイドワイヤの長さは、臓器の種類や敷設部位などに応じて適宜設定されるものであり、特に限定されない。ガイドワイヤの材質は、特に限定されず、非磁性金属あるいはテフロン（登録商標）、ポリプロピレン、ポリエチレンなどの有機素材を使用できる。
【００９６】
［縫い込みによる敷設］
さらに、本発明に係る血管再生用移植材料を用手法的に組織に敷設する方法として、通常の手術糸のように、血管再生用移植材料を組織に縫い込む方法も採用できる。この方法は、細い血管再生用移植材料の敷設に適する。
【００９７】
以上のようにして、血管再生用移植材料を敷設することにより、例えば虚血部位では、血管再生用移植材料に沿って血管が再生する。これにより、侵襲と危険が伴う血管再建術を行うことなく、心筋梗塞や、動脈硬化による下肢虚血（主に糖尿病）を治療できる可能性がある。また、血管内皮細胞あるいはその前駆細胞を血管再生用移植材料に付着させて、好ましくは血管再生用移植材料の管腔に充填して移植すれば、細胞を単に注入するだけの従来法ではほとんど不可能であった長い血管を目的臓器内に再生させることも可能となる。
【００９８】
本発明の血管再生用移植材料は、動物に移植して血管を再生させることができる。動物種は、特に限定されないが、好ましくはヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット等であり、更に好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ等であり、最も好ましくは、ヒトである。また、血管再生用移植材料は、上記のとおり作製することもできるが、購入することもできる。
【実施例】
【００９９】
＜参考例１：中空管状構造体の作製＞
芯（直径１００，  ５００μｍのポリグリコール酸繊維（ＰＧＡ））の周りにポリグリコール酸繊維（直径１０μｍの単糸を４〜８本撚り合わせて使用）を編み込んで中空管状構造体（外管あるいは内管に相当）を作製した。【０１００】
ヘパリンを１０μｇ／ｍｌで０．１Ｎ−リン酸バッファ（ｐＨ７．２）に溶解し、中空管状構造体を浸漬した（室温、１６時間）。次に、中空管状構造体をリン酸バッファで洗浄し、乾燥させてヘパリン結合中空管状構造体とした。【０１０１】
ヘパリン結合中空管状構造体をＶＥＧＦ溶液に浸漬することによって、中空管状構造体にヘパリンを介してＶＥＧＦを結合させた。【０１０２】
＜参考例２：遺伝子導入用ベクターを結合した中空管状構造体による遺伝子導入＞
参考例１で得た中空管状構造体を、ＧＦＰ遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の溶液（ウイルス濃度１×１０１２  ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍｌのリン酸バッファ）に浸漬し、３７℃で１時間反応させた後、リン酸バッファで洗浄した。２９３細胞を培養皿一面に培養し、その上にＡＡＶを搭載した中空管状構造体を載せ、３週間培養した。【０１０３】
図５−１に示されるように、中空管状構造体に触れた細胞のみが緑色蛍光を発していた。このことは、ＡＡＶが中空管状構造体からほとんど離脱しないこと、及びＡＡＶが活性を持った状態で中空管状構造体に結合していることを示している。なお、図５−２は、図５−１に示した写真において、中空管状構造体と、これに接触しかつＧＦＰを発現する細胞と、が位置している領域を模式的に示した図である。【０１０４】
＜実施例１：血管再生用移植材料の筋肉内への移植＞
参考例１で得た一重管構造を有する中空管状構造体（以下、本実施例及び実施例２、３において単に「中空管状構造体」という）のうち管腔径５００μｍのもの及び管腔径１００μｍのものを、ラット下肢の皮下結合組織に縫い込んで移植した。３日後に、中空管状構造体を縫い込んだ部位を採取し、定法に従って組織切片を作製し、光学顕微鏡により観察した。結果を図６−１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。【０１０５】
また、参考例１で得た中空管状構造体のうち管腔径１００μｍのものをラット下肢の筋肉内に縫い込んで移植した。さらに、参考例１で得た中空管状構造体のうち管腔径５００μｍのもの及び管腔径１００μｍのものをそれぞれ外管及び内管とし、芯を抜き取った外管の管腔に内管を芯とともに挿入し、内管の芯を抜き取ることで、二重管構造を有する中空管状構造体（すなわち、血管再生用移植材料）を得た。得られた血管再生用移植材料を、ラット下肢の筋肉内に縫い込んで移植した。３日後に、中空管状構造体あるいは血管再生用移植材料を縫い込んだ部位を採取し、定法に従って組織切片を作製し、光学顕微鏡により観察した。結果を図６−１（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。【０１０６】
皮下結合組織に移植した場合には、管腔径５００μｍ及び管腔径１００μｍのいずれの中空管状構造体でも、移植３日後にも、管腔が維持されていた（図６−１（Ａ）及び（Ｂ）、中空管状構造体及び管腔を模式的に示した図６−２（Ａ）及び（Ｂ）を参照）。しかし、筋肉内に移植した場合には、管腔径１００μｍの管状構造体では、移植３日後には管腔が閉塞し、管状構造が崩壊していた（図６−１及び図６−２の（Ｃ）参照）。一方、二重管構造を有する血管再生用移植材料では、筋肉内への移植後３日においても、内管の管腔スペースを維持でき、外管の管腔内面と内管の外面とにより構成された空間も維持できていることが明らかとなった（図６−１及び図６−２の（Ｄ）参照）。【０１０７】
＜実施例２：ＶＥＧＦコート血管再生用移植材料の下肢虚血モデルマウス（ヌードマウス）への移植＞
参考例１により管腔径１００μｍの中空管状構造体を得た。二重管構造を有する血管再生用移植材料は、参考例１により得た芯を抜き取った外管（管腔径５００μｍ）の管腔に芯を抜き取った内管（管腔径１００μｍ）を挿入することにより得た。【０１０８】
ヘパリン（シグマ）を１０ｍｇ／ｍｌで注射用蒸留水に溶解し、中空管状構造体及び血管再生用移植材料を浸漬した（室温、１６時間）。次に、中空管状構造体及び血管再生用移植材料を注射用蒸留水で洗浄し、ヘパリン結合中空管状構造体及びヘパリン結合血管再生用移植材料とした。【０１０９】
組換えマウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を５μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、ヘパリン結合中空管状構造体及びヘパリン結合血管再生用移植材料を浸漬した（室温、２時間）。次に、中空管状構造体及び血管再生用移植材料をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＶＥＧＦが結合した中空管状構造体及び血管再生用移植材料を得た。【０１１０】
下肢虚血モデル動物への血管再生用移植材料の移植は以下のように行った。ヌードマウス（ＣＡｎＮ．ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、チャールズリバー）の雌に、ソムノペンチル（登録商標）（共立製薬）を腹腔内投与することで全身麻酔を行った。右側下肢の皮膚を切開し、腹壁直下にて大腿動静脈を縫合糸にて結紮し、縫合部位から伏在動静脈にかけて血管を剥離した。続いて、大腿二頭筋に、ＶＥＧＦが結合した中空管状構造体又は血管再生用移植材料を縫合針で縫い込むことにより移植した。皮膚を縫合し、移植部位を閉じた。【０１１１】
移植３週間後に、アバーチン（２，２，２‐トリブロモエタノール、シグマ）麻酔下にて放血させることにより安楽死させた。移植用足場材を縫い込んだ部位を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンにて固定した。定法に従って組織のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン（武藤化学）、エオシン（武藤化学）による染色を行った。光学顕微鏡（キーエンスＢＩＯＲＥＶＯ  Ｘ７１０）により観察した。【０１１２】
結果を図７に示す。（Ａ）は中空管状構造体の移植部、（Ｂ）は血管再生用移植材料の移植部を示す。下肢筋肉に移植した３週間後、一重管構造を有する中空管状構造体は管腔が閉塞し、管状構造が崩壊していた。一方、二重管構造を有する血管再生用移植材料を移植した場合では、内管の管腔スペースを維持でき、外管の管腔内面と内管の外面により構成された空間も維持できていることが明らかとなった。【０１１３】
＜実施例３：ＶＥＧＦコート血管再生用移植材料の下肢虚血モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）への移植＞
次に、別のマウス系統において血管再生用移植材料の内部の管腔スペースの確保を確認するとともに、血管再生用移植材料の内部の血管再生を実証するための実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー）の雌を用いて、実施例２と同様にして、下肢虚血モデルを作製し、ＶＥＧＦを結合した中空管状構造体又は血管再生用移植材料を移植した。【０１１４】
移植３週間後に、ビオチン結合トマトレクチン（ベクターラボラトリーズ）１ｍｇ／ｍｌ、１００μｌを尾静脈注射し、注射７分後にアバーチン麻酔薬の腹腔内投与を行い、注射１０分後に開胸してリン酸緩衝生理食塩水２０ｍｌを灌流、さらに２％パラホルムアルデヒド溶液２０ｍｌを灌流した。【０１１５】
中空管状構造体又は血管再生用移植材料を縫い込んだ部位を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンにて固定した。定法に従って組織のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン、エオシン染色を行った。血管内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１の抗体を用いた免疫組織染色を以下のように行った。０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ１０．０）中での加熱処理により抗原の賦活化を行い、１０％ロバ血清（ジャクソンイムノリサーチ）によるブロッキング後、ウサギ抗ＣＤ３１抗体（アブカム）、ｅｎｂｉｓｉｏｎキット＋／ＨＲＰ・抗ウサギ（ダコ）およびＤＡＢ＋（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）基質キットを用いて染色を行った。また、静脈注射したビオチン結合トマトレクチンを検出するため、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中での加熱処理により抗原の賦活化を行い、５％スキムミルク（ＢＤバイオサイエンス）によるブロッキング後、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（サーモサイエンティフィック）およびＤＡＢ＋基質キット（ダコ）を用いて染色を行った。光学顕微鏡（キーエンスＢＩＯＲＥＶＯ  Ｘ７１０）により観察した。【０１１６】
結果を図８に示す。（Ａ）は中空管状構造体の移植部、（Ｂ）は血管再生用移植材料の移植部を示す。下肢筋肉に移植した３週間後、一重管構造を有する中空管状構造体は管腔が一部閉塞していた。一方、二重管構造を有する血管再生用移植材料を移植した場合では、内管の管腔スペースを維持でき、外管の管腔内面と内管の外面により構成された空間も維持できていることが明らかとなった。実施例１の移植後３日の結果に加え、実施例２と実施例３の移植後３週間の結果からも、二重管構造を有する血管再生用移植材料の有用性が明らかとなった。【０１１７】
ＣＤ３１の染色を行うことにより、二重管構造を有する血管再生用移植材料の内部の血管再生を確認した。結果を図９に示す。内管の管腔スペース、および外管の管腔内面と内管の外面により構成された空間のいずれにおいても、ＣＤ３１陽性の血管が形成されていることが明らかとなった。【０１１８】
静脈注射したビオチン結合トマトレクチンを検出することにより、二重管構造を有する血管再生用移植材料の内部の、血流を伴う機能的な血管再生を評価した。結果を図１０に示す。内管の管腔スペース、および外管の管腔内面と内管の外面により構成された空間のいずれにおいても、静脈注射したトマトレクチン陽性となる機能的な血管が形成されていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明に係る血管再生用移植材料は、糖尿病の合併症や癌、リウマチ等による血管障害の治療を目的とした、血管の再生医療に有用である。
【符号の説明】
【０１２０】
１：外管、２，２ａ，２ｂ，２ｃ：内管、２ｄ：第１の内管、２ｅ：第２の内管、３：生分解性単糸、４：撚糸、５：間隙、１１，２２ｄ：空間
【図１】
0006473695.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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