(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配し、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させることを複数回繰り返し、三次元細胞集合体を製造することを特徴とする三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項２】
温度変化が、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることにより行われる請求項１に記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項３】
ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、細胞の遊離状態における体積平均粒径より小さい請求項１から２のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項４】
ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養する請求項１から３のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項５】
ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、５０μｍ以下である請求項１から４のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項６】
細胞が、接着性細胞である請求項１から５のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項７】
ポリマー粒子が、組成物中に均一に分散する請求項１から６のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項８】
細胞と、ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配される請求項１から７のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項９】
細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される請求項１から７のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項１０】
少なくともポリマー粒子を含む組成物が、インクジェット法、ディスペンサー法、及びピペット法から選択される少なくとも一種により基体上に配される請求項１から９のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項１１】
細胞を培養した後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる請求項４から１０のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項１２】
細胞を培養し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、前記ポリマー粒子を除去する請求項１１に記載の三次元細胞集合体の製造方法。
【請求項１３】
細胞の遊離状態における体積平均粒径よりもゾル状態の組成物中における体積平均粒径が小さいポリマー粒子を含み、温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化する組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体。
【請求項１４】
平均厚みが、０．０１ｍｍ以上２０ｍｍ以下である請求項１３に記載の三次元細胞集合体。
【請求項１５】
前記ポリマー粒子のゲル状態の組成物中における体積平均粒径が、５０μｍ以下である請求項１３から１４のいずれかに記載の三次元細胞集合体。
【請求項１６】
温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化するポリマー粒子を含む組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体形成用溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元細胞集合体、並びにその製造方法及び形成用溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養技術の分野では、基体上に細胞を配し、生体外で作製した細胞シートを用いて損傷した生体組織の再生を誘導する方法が開発されている。
【０００３】
前記細胞シートは、水に対する上限臨界溶解温度が０℃以上８０℃以下の範囲にあるポリマー又はオリゴマー、或いは水に対する下限臨界溶解温度が０℃以上８０℃以下の範囲にあるポリマー又はオリゴマーを基体の表面に被覆し、前記基体上で、細胞を培養し、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下の温度にすることで、ゾル状態とゲル状態との間の相変化により前記細胞を前記基体から剥離することができる。
【０００４】
しかし、前記細胞シートは、細胞が、その厚みが０．０１μｍ未満の単層であるため厚みが薄く強度が弱いため、生体組織を再現できるような三次元集合体からなる細胞シートを作製するには、前記単層の細胞シートを１層ずつ重ね合わせるという煩雑な作業が必要である。また、前記単層の細胞シートを１層ずつ重ね合わせるだけでは、心筋細胞や血管内皮細胞といった多種細胞の精密かつ複雑な立体配置ができないという問題がある。
【０００５】
そこで、三次元細胞集合体を作製することができる、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体上で細胞を培養し、前記親水性ポリマーゲルを体積変化させることで三次元構造を付与された三次元細胞集合体の作製方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、ビーズ表面に０℃以上８０℃以下の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを用いた温度応答性細胞培養用ビーズが提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記特許文献１は、多種細胞の精密かつ複雑な立体配置ができないため、生体組織を再現できる三次元細胞集合体を得ることは困難であるという問題がある。
また、前記特許文献２は、温度応答性細胞培養用ビーズの平均粒径が細胞の平均粒径より大きいため、精密立体配置した状態で細胞に三次元構造を付与することは困難であるという問題がある。
さらに、細胞を取り扱う上で、細胞への毒性が低いことが望まれているが、従来技術においては細胞への毒性の点から十分な検討がなされているものはない。
【０００７】
したがって、本発明は、細胞への毒性が低く、細胞の精密かつ複雑な三次元立体配置を実現できる三次元細胞集合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としての本発明の三次元細胞集合体の製造方法は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配し、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させることを複数回繰り返し、三次元細胞集合体を製造する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細胞への毒性が低く、細胞の精密かつ複雑な三次元立体配置を実現できる三次元細胞集合体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた模式図である。
【図２】図２は、インクジェット吐出装置の一例を示す概略図である。
【図３】図３は、インクジェット吐出装置の他の一例を示す概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、下限臨界溶解温度が３２℃であるポリマー粒子分散液Ａの２５℃における状態を示す写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、下限臨界溶解温度が３２℃であるポリマー粒子分散液Ａの３７℃における状態を示す写真である。
【図５】図５は、ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と温度との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ａの粒度分布を示すグラフである。
【図７】図７は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ｂの粒度分布を示すグラフである。
【図８】図８は、液温３７℃におけるポリマー粒子Ｂの粒度分布を示すグラフである。
【図９】図９は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ｃの粒度分布を示すグラフである。
【図１０】図１０は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ｄの粒度分布を示すグラフである。
【図１１】図１１は、液温３７℃におけるポリマー粒子Ｄの粒度分布を示すグラフである。
【図１２】図１２は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ｅの粒度分布を示すグラフである。
【図１３】図１３は、液温３７℃におけるポリマー粒子Ｅの粒度分布を示すグラフである。
【図１４】図１４は、液温２５℃におけるポリマー粒子Ｆの粒度分布を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、基体上に配した細胞上にゾル状態のポリマー粒子を含む組成物を配する模式図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、基体上に配した細胞上に配されたゾル状態のポリマー粒子を含む組成物をゲル化させて層を形成後、前記層上に細胞を配する模式図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、細胞、ポリマー粒子、細胞をこの順に積層させた細胞積層体から、ゲル状態のポリマー粒子を含む組成物をゾル化し除去することで、三次元細胞集合体を得る模式図である。
【図１６】図１６は、三次元細胞集合体を蛍光共焦点顕微鏡で観察した写真である。
【図１７】図１７は、実施例１で作製した三次元細胞集合体１を実体顕微鏡を用いて観察した断面観察像である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、実施例１で作製した三次元細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した際の写真である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、比較例１で作製した細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した際の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者が鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、温度によりゾル状態とゲル状態との間を相変化するポリマー粒子を含む組成物を用いることにより、細胞への毒性が低く、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることで前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させ、細胞を所望の場所に固定させた状態で培養する。前記状態で培養させることで、細胞間が接着し、三次元細胞集合体を製造することができる。また、前記培養後に、ポリマーの下限温度溶解温度以下に降温させることで、前記ポリマー粒子を含む組成物がゲル状態からゾル状態に相変化されることで、前記ポリマー粒子の分散性が向上し、接着した細胞の隙間から除去することができるという知見である。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１２】
（三次元細胞集合体の製造方法）
本発明の三次元細胞集合体の製造方法は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配する工程（以下、「細胞及びポリマー粒子付与工程」と称することがある）と、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させる（以下、「ゲル化」と称することがある）工程（以下、「ゲル化工程」と称することがある）と、必要に応じて選択したその他の工程を含む。なお、前記細胞及びポリマー粒子付与工程、及び前記ゲル化工程は、複数回繰り返される。
本発明の前記三次元細胞集合体の製造方法により得られた三次元細胞集合体は、本発明の三次元細胞集合体であり、前記細胞及びポリマー粒子付与工程において前記基体上に少なくとも前記ポリマー粒子を含む組成物を配するのに用いる溶液が、本発明の三次元細胞集合体形成用溶液である。
【００１３】
＜細胞及びポリマー粒子付与工程＞
前記細胞付与工程は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配する工程である。
【００１４】
＜＜基体＞＞
前記基体としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記形状としては、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；平膜状などが挙げられる。
前記構造としては、例えば、多孔質構造などが挙げられる。
前記基体の材質としては、例えば、有機材料、無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記有機材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレートなどのアクリル系材料、セルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記無機材料としては、例えば、ガラス、セラミックなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１５】
＜＜細胞＞＞
前記細胞は、前記基体上に配されることができれば、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。
前記真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が三次元細胞集合体を形成する点から、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する細胞がより好ましい。
【００１６】
前記接着性細胞としては、例えば、分化した細胞、分化前の細胞などが挙げられる。
前記分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。
前記分化前の細胞としては、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；分化が終了した細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
前記原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
前記細胞の遊離状態での体積平均粒径（Ｄ５０）としては、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。前記体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。前記体積平均粒径としては、例えば、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。前記細胞は、遊離状態であると、略球状の形状をとるため、体積平均粒径（Ｄ５０）を測定することができる。
【００１９】
なお、前記細胞の体積平均粒径（Ｄ５０）としては、下記の測定方法で測定することができる。
−体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法−
インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）において、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と称することがある）で細胞を培養後、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で１００ｍｍディッシュ内の１０％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と称することがある）、及び前記培地を除去する。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製、以下、「ＰＢＳ（−）」と称することがある）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄する。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ，  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離する。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させる。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５ｍｉｎ、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去する。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させる。その細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行って細胞を染色する。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。なお、細胞数、細胞生存率も同様の測定方法により求めることができる。
【００２０】
前記細胞、及び前記ポリマー粒子を含む組成物を前記基体上に配させる前に、前記基体及び前記ポリマー粒子の表面に、細胞接着を促す有機物を公知の方法に従い塗布することが好ましい。前記有機物を塗布することにより、前記細胞の接着を促すことができる。
前記有機物としては、特に制限はなく、細胞同士、又は細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与する物質であり、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン等の生物由来のペプチド；前記細胞由来のペプチドと同様の構造を有するタンパク質；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）等のペプチドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
前記細胞の基体上に配する前の溶液中での細胞数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。前記細胞数が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができ、細胞の精密配置に好適である。
前記細胞数の測定装置としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
【００２２】
前記細胞を基体上に配した後の細胞生存率は、細胞を基体上に配する前の溶媒中の生存率に対して、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が特に好ましい。前記細胞生存率が、９０％以上であると、細胞を基体上に配することによる負荷を少なく、三次元細胞集合体を形成させることができる。
前記細胞生存率の測定装置としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
【００２３】
＜＜ポリマー粒子＞＞
前記ポリマー粒子としては、ポリマー粒子を含む組成物が、温度変化により相変化するものである限り、その大きさ、形状、構造、材質等について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
ここで、前記ポリマー粒子を含む組成物の相変化について下記に説明する。
前記ポリマー粒子の物性としては、体積平均粒径が１００μｍ以下のポリマー粒子を含む組成物を、温度変化により一の成分がコロイドなどの粒子の状態で組成物中に分散して流動性があるゾル状態と、せん断粘度が５００ｍＰａ・ｓ以上であり、流動性がないゲル状態との間を、ゾル状態からゲル状態又はゲル状態からゾル状態へと相変化させることができる。
前記ポリマー粒子を含む組成物の状態を、前記ゾル状態から前記ゲル状態に相変化させることで細胞を固定させることができる。また、前記ポリマー粒子を含む組成物の状態を、ゲル状態からゾル状態に相変化させることで三次元細胞集合体から前記ポリマー粒子を除去することが容易となる。
【００２５】
前記ゾル状態と前記ゲル状態との間の相変化の変化点としては、例えば、前記ゾル状態から前記ゲル状態に相変化させた場合に、前記ポリマー粒子が収縮又は前記ポリマー粒子間で凝集体ネットワークを形成することでせん断粘度が急激に上昇し、前記ポリマー粒子の流動性が消失する点；前記ゲル状態から前記ゾル状態に相変化させた場合に、前記ポリマー粒子が膨潤し、分散することでせん断粘度が急激に降下し、前記ポリマー粒子が流動性を得る点などが挙げられる。
【００２６】
前記ポリマー粒子の形状としては、ポリマー粒子が細胞に過剰に吸着することを抑え、細胞への毒性を低くすることができる点から、例えば、真球状、半真球状等の球状；不定形状などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
温度により相変化するポリマー粒子を含む組成物は、臨界溶解温度を有する。
前記臨界溶解温度を有するポリマー粒子としては、例えば、上限臨界溶解温度を有するポリマー粒子、下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子などが挙げられる。これらの中でも、細胞に負荷がかからない点から、その温度より高い温度では水溶液に溶解せず、水溶液と接触しても溶解せず二層に分かれるが、その温度以下では水溶液に溶解する下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子が好ましい。
【００２８】
図１は、ポリマー粒子を含む組成物のゾル状態からゲル状態に相変化させた模式図である。図１に示すように、例えば、基体１に付与される組成物Ｄ中に含まれるポリマー粒子２は、ポリマー粒子２の下限臨界溶解温度以下の温度においてはゾル状態にあり、粘度も低く凝集せず、溶液中に流動的に存在している。基体１上に配されたポリマー粒子２を含む組成物に対し、基体１をポリマー粒子２の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温すると、ゾル状態のポリマー粒子２を含む組成物がゲル化し、流動性がなくなり、ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物となり、擬集体ネットワークが形成され、前記ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物を含有する層が形成される。前記層上に、さらに前記ゾル状態のポリマー粒子２を含む組成物が配され、上記同様にゲル化させてゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物に相変化させた層が積層される。これを複数回繰り返すことで、ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物を含有する層が複数層積層された三次元積層体を形成させることができる。なお、前記組成物Ｄ中に、前記細胞を含有させることで、上記同様に三次元積層体を形成させることで、三次元細胞集合体を形成させることができる。
【００２９】
前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度としては、細胞の至適培養温度が３７℃である点から、０℃以上５０℃以下が好ましく、３７℃で細胞を培養する場合は、０℃以上３５℃以下がより好ましい。前記下限臨界溶解温度が、０℃以上であると、細胞が過度に冷却されることがなく細胞に負荷がかからず、５０℃以下であると、細胞が過度に熱せられることがなく、細胞に負荷がかからない。
前記下限臨界溶解温度は、前記ポリマー粒子の曇点を、ＪＩＳ  Ｋ  ７１０５法に準拠した全光線透過率測定方法に従い測定することで算出することができる。
【００３０】
前記ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径（Ｄ５０）としては、細胞の遊離状態における体積平均粒径より小さいことが好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。前記体積平均粒径が、細胞の遊離状態における体積平均粒径よりも小さいと、細胞への毒性が低くすることができ、また、粘度を下げることができ、液滴サイズを小さくすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができ、また、前記培養後、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させ、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた時に、三次元細胞集合体から、前記ゾル状態の組成物に含まれるポリマー粒子を除去することが容易になる。
前記ポリマー粒子のゲル状態の組成物中における体積平均粒径（Ｄ５０）としては、５０μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上５μｍ以下がより好ましい。前記体積平均粒径が、５０μｍ以下であると、細胞への毒性が低くすることができ、また、前記細胞と前記ポリマー粒子とからなる積層体を作製し、細胞を培養した場合に、細胞間の距離を近くすることができ、細胞間の接着を阻害することがない。
【００３１】
前記ポリマー粒子のゾル状態の組成物中におけるキュムラント粒径としては、細胞の遊離状態におけるキュムラント粒径より小さいことが好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。前記キュムラント粒径が、細胞の遊離状態におけるキュムラント粒径よりも小さいと、細胞への毒性が低くすることができ、また、粘度を下げることができ、液滴サイズを小さくすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができ、また、前記培養後、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させ、前記ポリマー粒子をゲル状態からゾル状態に相変化させた時に、三次元細胞集合体から、前記ゾル状態の組成物中のポリマー粒子を除去することが容易になる。
前記ポリマー粒子のゲル状態の組成物中におけるキュムラント粒径としては、５０μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上５μｍ以下がより好ましい。前記キュムラント粒径が、５０μｍ以下であると、細胞への毒性が低くすることができ、また、前記細胞と前記ポリマー粒子とからなる積層体を作製し、細胞を培養した場合に、細胞間の距離を近くすることができ、細胞間の接着を阻害することがない。
【００３２】
前記体積平均粒径（Ｄ５０）、及びキュムラント粒径としては、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のサンプル液の調製例により得られたサンプル液を用いて、以下の測定条件により測定することができる。
−サンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、合成した粉末状ポリマー粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｃｃ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約一日攪拌することでサンプル液を調製することができる。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｃＰ、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
【００３３】
前記ゾル状態のポリマー粒子を含む組成物のせん断粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．１Ｐａ・ｓ以下が好ましく、０．０１Ｐａ・ｓ以下がより好ましい。前記せん断粘度が、０．０１Ｐａ・ｓ以下であると、細胞を含む組成物の粘度を低くすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができる。
前記ゲル状態のポリマー粒子を含む組成物のせん断粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．２Ｐａ・ｓ以上が好ましく、１Ｐａ・ｓ以上がより好ましく、１０Ｐａ・ｓ以上が特に好ましい。前記せん断粘度が、０．２Ｐａ・ｓ以上であると、細胞を含む組成物の粘度を高くすることができるので、細胞固定化が可能となる。
【００３４】
前記せん断粘度としては、下記の測定方法により求めることができる。
−せん断粘度の測定方法−
ポリマー粒子を濃度１０質量％で純水に分散させ、１２１℃、２０分の高圧蒸気滅菌（商品名：ＭＬＳ−３０３０、パナソニック株式会社製）を行う。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）、１％抗生物質（商品名：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製）にて、滅菌した前記ポリマー粒子を１質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させる。前記分散を確認後、レオメーター（商品名：ＭＣＲ３０１、ＡｎｔｏｎＰａａｒ社製）にて液粘度の測定を行う。レオメーターでの測定は、２５℃でせん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、３７℃に昇温しながら、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めることができる。
【００３５】
前記ポリマー粒子は、組成物中に均一に分散されていることが好ましい。前記ポリマー粒子が、均一に分散されることで、インクジェット法に好適に用いることができる。
【００３６】
前記ポリマー粒子を含む組成物は、前記相変化をするため、一般に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子の下限臨界溶解温度前後の温度において体積変化を伴う。前記体積変化としては、例えば、ポリマー粒子が液体（分散媒）を吸収して体積を増加する現象である膨潤などが挙げられる。この体積変化の程度は、膨潤度で表すことができ、前記膨潤度としては、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下でのポリマー粒子の体積が、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度でのポリマー粒子の体積に対して、３０以下が好ましく、８以下がより好ましい。前記膨潤度が、３０以下であると、ゾル化によるポリマー粒子の除去がし易くなる。
【００３７】
なお、下限臨界溶解温度よりも高い温度Ａから下限臨界溶解温度以下の温度Ｂに温度を下げた場合、前記膨潤度は以下の式で表すことができる。
膨潤度＝（温度Ｂにおけるゾル状態のポリマー粒子の質量／温度Ａにおけるゲル状態のポリマー粒子の質量）
ここで、温度Ａ＞温度Ｂである。
【００３８】
前記体積変化の際、前記ポリマー粒子を含む組成物は、異方的に変形するものであれば、等方的に変化するものもある。これらの中でも、剥離時に細胞が破損しやすくなることを防止する点から、前記体積変化の際に前記ポリマー粒子を含む組成物が特定方向のみに変形するものが好ましい。
【００３９】
前記ポリマー粒子の光透過率としては、７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましい。前記光透過率が、７０％以上であると、細胞培養期間における細胞の状態を確認しやすくなる。なお、架橋剤濃度を高くすると、光透過率は低くなる。前記光透過率としては、ＪＩＳ  Ｋ  ７１０５法に準拠した全光線透過率測定方法に従い測定することができる。
【００４０】
前記ポリマー粒子としては、例えば、単一モノマーから形成されたホモポリマー、複数モノマーから形成されたランダムコポリマー、ブロックコポリマー、マクロモノマー、これらを重合したブラシ状ポリマー、分岐したグラフトポリマー、多分岐したハイパーブランチポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
前記ポリマー粒子の構造としては、例えば、ポリマー単体の構造、複数の前記ポリマー単体が凝集した複合体構造などが挙げられる。
前記複数の前記ポリマー単体が凝集した複合体構造としては、例えば、前記ポリマー粒子と、前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーとの併用などが挙げられる。この場合、温度変化による相変化される点から、前記ポリマー粒子の表面は、温度変化による体積変化されるポリマー粒子で形成されていることが好ましい。
【００４２】
前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーの重量平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１，０００以上５０，０００以下が好ましく、２，０００以上５０，０００以下がより好ましく、５，０００以上５０，０００以下が特に好ましい。前記重量平均分子量が、１，０００以上であると、親水性を向上させることができ、５０，０００以下であると、ポリマー粒子自体が嵩高くなることを防止し、温度変化による相変化させることが容易になる。
前記重量平均分子量は、例えば、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）を用いてテトラヒドロフラン可溶分を測定することにより求めることができる。
【００４３】
前記ポリマー粒子としては、例えば、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリジエチルアクリルアミド等のアルキルアクリルアミド重合体；ポリビニルメチルエーテル、オキシエチレンを側鎖に持つポリビニルエーテル；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４４】
前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；ポリアクリル酸塩；ポリアクリルアミド；エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；メチルデンプン、エチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；アルギン酸プロピレングリコール等のアルギン酸誘導体；ゼラチン、カゼイン、アルブミン、コラーゲン等の動物系ポリマーの誘導体；グアーガム、ローカストビーンガム、クインスシードガム、カラギーナン等の植物系ポリマーの誘導体；キサンタンガム、デキストラン、ヒアルロン酸、プルラン、カードランなどの微生物系ポリマーの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４５】
複数の前記ポリマー粒子が凝集した複合体としては、前記ポリマー粒子が架橋剤により架橋されていることが好ましい。
前記架橋剤としては、例えば、二官能性架橋剤、三官能性架橋剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記二官能性架橋剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビス（メタ）アクリルアミド等の二官能性アクリルアミド；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート；ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミドが好ましく、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドがより好ましい。
前記三官能性架橋剤としては、例えば、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記架橋剤の種類と濃度を変えることにより、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度、透明性、及び膨潤性を調製することができる。
前記架橋剤濃度を高くすることで、下限臨界溶解温度を低くすることができる。
【００４６】
前記ポリマー粒子としては、細胞に対して毒性が少ないことが好ましい。
【００４７】
前記ゾル状のポリマー粒子を含む組成物をゲル状に相変化させる装置としては、公知の昇温装置を用いることができる。前記昇温装置としては、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。
【００４８】
前記ポリマー粒子の含有量としては、基体上に配する前の組成物全量に対して、０．１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上３質量％以下がより好ましい。前記含有量が、０．１質量％以上であると、好適にゲル化ができ、１０質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
なお、培養後、三次元細胞集合体からポリマー粒子を除去した際の前記ポリマー粒子の残存量としては、三次元細胞集合体全量に対して、３質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。前記含有量が、１質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
【００４９】
＜＜配し方法＞＞
前記細胞及びポリマー粒子付与工程において、前記細胞及び前記ポリマー粒子を含む組成物の配し方法としては、例えば、細胞と、ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる方法（細胞及びポリマー粒子同時付与工程）；前記細胞が基体上に配された後（以下、「細胞付与工程」と称することがある）に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される（以下、「ポリマー粒子付与工程」と称することがある）方法などが挙げられる。
前記細胞及びポリマー粒子同時付与工程においては、例えば、前記細胞を含有する分散液と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを作製し、同時に基体上に配する方法；前記細胞と、前記ポリマー粒子とを混合した混合分散液を事前に調製し、前記混合分散液を基体上に配する方法などが挙げられる。
前記混合分散液を基体上に配する方法において、前記ポリマー粒子が、前記細胞の前記混合分散液中での凝集を防止し、細胞の分散性を向上させることができる。
【００５０】
前記細胞を含有する分散液、前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液のせん断粘度としては、ポリマー粒子が含有される場合に前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下の温度において、０．１Ｐａ・ｓ以下が好ましく、０．０１Ｐａ・ｓ以下がより好ましい。前記せん断粘度が、０．１Ｐａ・ｓ以下であると、インクジェット法に好適に用いることができる。
前記細胞を含有する分散液、前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液のせん断粘度としては、ポリマー粒子が含有される場合に前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度において、１Ｐａ・ｓ以上が好ましく、１０Ｐａ・ｓ以上がより好ましい。前記せん断粘度が、１０Ｐａ・ｓ以上であると、細胞の固定化が可能になる。前記せん断粘度は、レオメーター（商品名：ＭＣＲ３０１、ＡｎｔｏｎＰａａｒ社製）を用いて、せん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、４０℃に昇温し、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めることができる。
【００５１】
前記細胞を含有する分散液中の細胞の数、及び細胞とポリマー粒子とを混合した混合溶液中の細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下が好ましい。前記細胞数が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができ、細胞の精密配置に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００５２】
前記細胞及び前記ポリマー粒子を含む組成物の配し方法としては、例えば、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、一細胞レベルで精密かつ複雑な細胞配置できる点から、インクジェット法が好ましい。
【００５３】
前記インクジョット法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。なお、前記インクジェット法を実施するには公知のインクジェット吐出装置を、細胞及びポリマー粒子飛翔手段として好適に使用することができる。
【００５４】
＜＜インクジェット吐出装置＞＞
前記インクジェット吐出装置としては、基体上に、細胞及びポリマー粒子を含む組成物を配させることができれば、特に制限はなく、細胞及びポリマー粒子飛翔手段と、細胞及びポリマー収容部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有してなる。
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段としては、例えば、細胞及びポリマー粒子を含む組成物を、基体上に配させる手段であり、細胞とポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる手段；前記細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される手段などが挙げられる。
【００５５】
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、インクジェット法により細胞及びポリマー粒子を含む組成物を前記基体上に飛翔可能なノズルを有する。なお、前記ノズルとしては、公知のインクジェットプリンターにおけるノズル（吐出ヘッド）を好適に使用することができ、また、前記インクジェットプリンターを前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段として好適に使用することができる。なお、前記インクジェットプリンターとしては、例えば、株式会社リコー製のＳＧ７１００、などが好適に挙げられる。前記インクジェットプリンターは、ヘッド部から一度に滴下できる細胞及びポリマー粒子量が多く、塗布面積が広いため、塗布の高速化を図ることができる点で好ましい。
【００５６】
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、本発明の前記細胞及びポリマー粒子を含む組成物に、刺激を印加し、前記細胞及びポリマー粒子を含む組成物を飛翔させて画像を形成する手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、続噴射型、オンデマンド型などが挙げられる。前記オンデマンド型としては、ピエゾ方式、サーマル方式、静電方式などが挙げられる。これらの中でも、ピエゾ方式が特に好ましい。
【００５７】
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、具体的には、液室部、流体抵抗部、振動板、及びノズル部材などを有することが好ましく、前記液室部、流体抵抗部、振動板、及びノズル部材の少なくとも一部は、シリコーン及びニッケルの少なくともいずれかを含む材料から形成されることが好ましい。
また、前記ノズルのノズル径としては、特に制限はなく、細胞がノズル部に詰まることを避けるため、細胞の大きさに対して、２倍以上が好ましい。動物細胞、特にヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ以上３０μｍ以下であるため、ノズル径としては使用する細胞に合わせて１０μｍ以上２００μｍ以下が好ましい。一方、液滴が大きくなりすぎると微小液滴を形成するという本来の目的を達成することが困難となる点から、６０μｍ以下がより好ましい。これらの中でも、１０μｍ以上だと細胞を含有する分散体を好適に吐出することができため、インクジェット法に好適に用いることができる点から、１０μｍ以上６０μｍ以下が特に好ましい。
【００５８】
本発明においては、前記細胞及びポリマー粒子を精度良くしかも高効率に付与可能な前記インクジェットプリンターを用いた場合においても、前記ノズル乃至そのヘッドにおいて目詰り等が発生せず、腐食等を生じさせることもなく、寸法精度の良い三次元細胞集合体が容易にかつ短時間で効率よく得られる点で有利である。
【００５９】
前記細胞及びポリマー粒子収容部は、前記細胞及び前記ポリマー粒子が収容された部材であり、その大きさ、形状、材質などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、貯留槽、袋、カートリッジ、タンクなどが挙げられる。
前記細胞と前記ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる手段を用いる場合は、細胞とポリマー粒子とを混合した混合分散液を前記部材に収容することが好ましい。
前記細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される手段を用いる場合は、前記細胞を含有する分散液と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを収容する部材は、別々であることが好ましい。
【００６０】
ここで、図２にインクジェット吐出装置の一例を示す。このインクジェット吐出装置は、インクジェットヘッド４０を有する。
【００６１】
前記インクジェット吐出装置は、インクジェットヘッド４０を用いて、基体１０上に、細胞とポリマー粒子とを混合した混合分散液２０を配させる。この際、温度調節装置５０を用いて、前記基体１０を前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させる。なお、前記昇温は、基体１０上に前記混合分散液を配させる前に、基体１０を温めて、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に保温しておくことが好ましい。これにより、前記基体１０に配された前記混合分散液中のポリマー粒子を含む組成物がゾル状態からゲル状態に相変化され、細胞を固定させ、細胞集合体６０が形成される。前記細胞集合体６０上に、上記と同様に、前記混合分散液を配させ、前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化され、細胞集合体６０を形成させることを複数回繰り返すことで、三次元細胞集合体を得ることができる。
【００６２】
図３に、インクジェット吐出装置の他の一例を示す。図３のインクジェット吐出装置は、原理的には図２と同じであるが、細胞及びポリマー粒子飛翔手段が異なる。即ち、インクジェットヘッド１４０を用いて、細胞１２０が基体１００上に配された後に、細胞１２０上にポリマー粒子を含む組成物１３０が配される。図２と同じように、温度調節装置１５０により前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に温められたポリマー粒子を含む組成物がゾル状態からゲル状態に相変化されることで、細胞集合体１６０が形成される。前記細胞集合体１６０上に、上記と同様の操作により細胞１２０を配させ、前記細胞１２０上に、ポリマー粒子を含む組成物１３０を配させ、前記ポリマー粒子を含む組成物がゾル状からゲル状に相変化され、細胞集合体１６０が形成されることを複数回繰り返すことで、三次元細胞集合体が得られる。
【００６３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、前記細胞と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを基体上に配させた後に、ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養させる工程（以下、「培養工程」と称することがある）、前記細胞を培養した後に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる（以下、「ゾル化」と称することがある）工程（以下、「ゾル化工程」と称することがある）、前記細胞を培養し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子を除去する工程（以下、「除去工程」と称することがある）を有することが好ましい。
【００６４】
＜＜培養工程＞＞
前記培養工程は、ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養させる工程である。前記培養させることで、細胞が増殖、及び伸展し、細胞間で接着することで、三次元細胞集合体を形成させることができる。
【００６５】
前記培養としては、特に制限はなく、培養温度、培養装置、培養時間、培地、培地中の二酸化炭素濃度、培地の供給方法、培地の供給量、ｐＨなどの条件を目的に応じて適宜選択することができる。
【００６６】
前記培養温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、培養温度は２５℃以上４５℃以下が好ましく、３３℃以上４０℃以下がより好ましく、３６℃以上３８℃以下が特に好ましい。前記培養温度が、２５℃以上４５℃以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
【００６７】
前記培養装置としては、細胞を至適培養温度に保温し培養することができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。
【００６８】
前記培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１２時間以上６０時間以下が好ましく、１５時間以上５０時間以下が好ましい。前記培養時間が、１２時間以上６０時間以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
また、細胞が増殖、及び伸展し、細胞間で接着することで、三次元細胞集合体を形成しているかを確認するには、組織体をヘマトキシリン・エオジン法（ＨＥ）染色し、例えば、ＮＨＤＦの手技による組織体断面観察像により断面を観察することで、組織体中の空隙割合や細胞の進展度合いで確認することができる。
【００６９】
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成で分類される培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）等の形状により分類される培地などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
【００７０】
前記動物細胞の培養に用いられる培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄ−ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７１】
前記培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２％以上５％以下が好ましく、３％以上４％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、２％以上５％以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
【００７２】
前記培地の供給方法としては、特に制限はなく、例えば、目的に応じて適宜選択することができ、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７３】
前記培地の供給量としては、１ｍＬの培地に対して細胞数が、５×１０５個以上５×１０８個以下となるように供給することが好ましく、５×１０５個以上５×１０７個以下となるように供給することが好ましい。１ｍＬの培地に対して前記細胞数が、５×１０５個以上５×１０８個以下であると、細胞の増殖、及び伸展に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００７４】
前記ｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、４以上７以下が好ましく、５以上６以下がより好ましい。
【００７５】
なお、培養工程において、使用する試薬は、滅菌処理されたものを用いることが好ましく、培養操作、及び培養装置は、無菌処理されたものを用いることが好ましい。
【００７６】
＜＜ゾル化工程＞＞
前記ゾル化工程は、前記細胞を培養した後に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる工程である。前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させることで、前記三次元細胞集合体を取り出すことができる。
【００７７】
前記降温の温度としては、特に制限はなく、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下であればよく、０℃以上５０℃以下が好ましく、０℃以上３２℃以下がより好ましい。前記降温には、公知の装置を用いることができる。前記装置としては、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させることができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。
【００７８】
＜＜除去工程＞＞
前記除去工程は、前記細胞を培養し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子を除去する工程である。前記ゾル状態の組成物中のポリマー粒子を三次元細胞集合体から除去することで、三次元細胞集合体のみを得ることができる。なお、前記三次元細胞集合体においては、すべてのポリマー粒子が除去されておらず、全部又は一部に前記ポリマー粒子が残存していても問題なく使用することができる。
【００７９】
前記除去としては、細胞間の接着を壊さない穏和な条件であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、洗浄液で洗浄することなどが挙げられる。
前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と称することがある）、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。前記除去方法を下記に詳細に示す。
【００８０】
−除去方法−
作製された得られた三次元細胞集合体から細胞を単離するために培養した組織体の培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後に、コラゲナーゼ溶液（商品名：ＮＢ  ４Ｇ／０．２６  ＰＺ  Ｕ／ｍｌ、コスモバイオ株式会社製）を添加し、インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）に２時間放置し、細胞間、およびＥＣＭ（細胞外マトリックス）／細胞間との結合から細胞を単離させる。次に、前記溶液をφ２０μｍのメッシュフィルター（商品名：ＣｅｌｌＴｒｉｃｓ  Ｆｉｌｌｔｅｒ、株式会社池田理化製）にて分離し、ろ過した溶液を遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、株式会社コクサン製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５ｍｉｎ、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去する。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むダルベッコ変法イーグル培地を１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させる。上記の遠心分離、上清除去を３回繰り替えし、前記ポリマー粒子を除去することできる。
【００８１】
（三次元細胞集合体）
本発明の三次元細胞集合体は、細胞の遊離状態における体積平均粒径よりもゾル状態の組成物中における体積平均粒径が小さいポリマー粒子を含み、温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化する組成物を含有し、更に必要に応じてその他の部材を有してなる。
本発明の三次元細胞集合体は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法により好適に製造することができる。
前記前記ポリマー粒子は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法と同様のものを用いることができる。
【００８２】
前記三次元細胞集合体の大きさ、形状、構造等としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８３】
前記三次元細胞集合体の平均厚みとしては、特に制限はなく、０．０１ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、０．０５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がより好ましく、０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下が特に好ましい。前記厚みが、０．０５ｍｍ以上２０ｍｍ以下であると、人体の損傷部位への移植用、及び薬剤スクリーニング材料用に好適に使用することができる。前記厚みとしては、組織体をＨＥ染色し、断面観察を用いるか、非破壊手段の場合、光干渉断層計（ＯＣＴ：Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、光干渉断層撮影、商品名：ＧａｎｙｍｅｄｅＩＩ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社製）を用いて測定することができる。
【００８４】
前記三次元細胞集合体の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィルム状、シート状等の平面状；柱状；球状；血管の形状；複雑な臓器の形状などが挙げられる。
前記複雑な臓器としては、例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、小腸、大腸などが挙げられる。
【００８５】
前記ポリマー粒子の含有量としては、基体上に配する前の組成物全量に対して、０．１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上３質量％以下がより好ましい。前記含有量が、０．１質量％以上であると、好適にゲル化ができ、１０質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
なお、培養後、三次元細胞集合体からポリマー粒子を除去した際の前記ポリマー粒子の残存量としては、三次元細胞集合体全量に対して、３質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。前記含有量が、１質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
【００８６】
なお、三次元細胞集合体中のポリマー粒子を単離するには、以下の工程を行う。つまり、培養した組織体の培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後に、コラゲナーゼ溶液（商品名：ＮＢ  ４Ｇ／０．２６  ＰＺ  Ｕ／ｍｌ、コスモバイオ株式会社製）を添加し、インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）に２時間放置し、細胞間、およびＥＣＭ（細胞外マトリックス）／細胞間との結合から細胞を単離させる。次に、前記溶液をφ２０μｍのメッシュフィルターにて分離し、ろ過した溶液を遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、ピペットでポリマー粒子を含んだ上清を回収した。回収後、遠沈管にＰＢＳを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞と残存ポリマー粒子を分散させた。上記の遠心分離、上清回収を３回繰り替えし、上清を集めることで三次元積層体を構成していたポリマー粒子の分散液を得ることができる。前記ポリマー粒子を含んだ分散液を濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、ポリマー粒子の残存量、粒度分布を測定することができる。
【００８７】
−用途−
本発明の三次元細胞集合体は、人体の損傷部位への移植、組織再生を誘導する組織再生用移植材料、組織形態形成過程のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検討用材料、薬剤スクリーニング材料などに好適に用いることができる。
【００８８】
（三次元細胞集合体形成用溶液）
本発明の三次元細胞集合体形成用溶液は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法において用いる、前記ポリマー粒子を含む組成物、又は前記細胞及び前記ポリマー粒子を混合した混合分散液を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００８９】
前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱イオン水；超純水；生理食塩水；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；前記培地；５％デキストロース水溶液；電解質；懸濁剤；無痛化剤；アルブミン、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標、ペンタファームジャパン社）の安定剤（アルブミンやＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標、ペンタファームジャパン）等）；保存剤；防腐剤、天然多糖類をはじめとした生態適合を有した天然、又は構造を模倣した高分子材料などが挙げられる。前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００９０】
以下に、本発明の実施例及び比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例及び比較例において示す「部」及び「％」は、特に明示しない限り、「質量部」及び「質量％」を示す。なお、以下に示す実施例及び比較例において、各成分の含有量は、純分換算値を示す。
【００９１】
＜ポリマー粒子の作製例＞
＜＜ポリマー粒子Ａの作製例１＞＞
１００ｍＬの２口フラスコ（柴田科学株式会社製）に、モノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミド（下限臨界溶解温度：３２℃、東京化成工業株式会社製）２．５ｇ、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（東京化成工業株式会社製）２５ｍｇ、界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（関東化学株式会社製）１２．５ｍｇを、溶媒である水４５ｇ添加した。
水全量に対して、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが５質量％（０．４７ｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド全量に対してＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが１質量％（０．７３ｍｏｌ％）、水全量に対してドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが表１に示す値になるように調製し、２ｍｍ回転子により、撹拌して完全に溶解させ水溶液を得た。
【００９２】
次に、室温（２５℃）、流量１００ｍＬ／分間で１５秒間、前記水溶液をアルゴンガスでパージした。前記アルゴンパージ後、７０℃で、水２．５ｇに重合開始剤として２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（和光純薬工業株式会社製）１０ｍｇ溶かし、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド全量に対して２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩が０．４質量％（０．１７ｍｏｌ％）になるように調製した溶液を添加し、１時間重合させた。前記重合により得られたＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー粒子を含む重合液約４８ｇを１００ｃｃビーカーに入れ、メタノール２８ｇで凝集させ、自然ろ過して凝集物を分離させた。次に、分離した凝集物を水３０ｇ、及びメタノール１８ｇの混合溶液で洗浄後、８０℃恒温槽で５時間乾燥させ水分を十分に除去しポリマー粒子の塊を得た。
【００９３】
次に、前記ポリマー粒子の塊を１５０ｍＬねじ口管びん（商品名：ＳＶ−１５０、日電理化硝子株式会社製）入れ、アセトン２５ｇを添加し、４０ｍｍ回転子で均一に分散させた後、ヘキサン５０ｃｃを添加し再沈殿させた。再沈殿させた沈殿物をガラス棒で潰し小粒にさせた。次に、デカンテーションでヘキサンを除去し、同様にして、５０ｃｃヘキサンを添加し、再沈殿させた。この操作を３回繰り返した。次に５０℃で３時間ホットプレートでプレ乾燥させた後、５０℃で減圧乾燥させ、粉末状のポリマー粒子Ａを調製した。収量は、２．２５ｇで、収率は約９０％であり、２５℃における体積平均粒径（Ｄ５０）は２．４１μｍ、２５℃におけるキュムラント粒径は２．２４でり、５質量％分散液でのせん断粘度は、２５℃では０．０１ｍＰａ・ｓ、３７℃では２，７４０ｍＰａ・ｓであった。前記ポリマー粒子の体積平均粒径（Ｄ５０）及びキュムラント粒径は以下の測定方法により測定した。また、ポリマー粒子のせん断粘度は以下の測定条件により測定した。
【００９４】
−ポリマー粒子の体積平均粒径（Ｄ５０）及びキュムラント粒径の測定方法−
前記体積平均粒径（Ｄ５０）及び前記キュムラント粒径としては、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のようにサンプル液を調製し、得られたサンプル液を以下の測定条件により測定することができる。
−サンプル液の調製−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、０．５質量％になるように合成した粉末状のポリマー粒子Ａを膨潤、分散させる。測定用の液量は５ｃｃ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約一日攪拌することでサンプル液を調製した。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｃＰ、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
【００９５】
−せん断粘度の測定方法−
０．４質量％の塩化カルシウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液にて、滅菌した前記ポリマー粒子Ａを５質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させた。前記分散を確認後、レオメーター（ＡｎｔｏｎＰａａｒ製／ＭＣＲ３０１）にてせん断粘度の測定を行った。レオメーターでの測定は、２５℃でせん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、３７℃に昇温しながら、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めた。
【００９６】
＜＜ポリマー粒子Ｂ〜Ｆの作製例２〜６＞＞
架橋剤の含有量、及び界面活性剤の含有量を表１に記載の含有量に変更した以外は、ポリマー粒子Ａの作製例１と同様にして、ポリマー粒子Ｂ〜Ｆを作製した。表１に、架橋剤の含有量、界面活性剤の含有量、並びに液温２５℃における体積平均粒径、液温２５℃におけるキュムラント粒径、液温３７℃における体積平均粒径、液温３７℃におけるキュムラント粒径、並びに２５℃及び３７℃におけるせん断粘度を示す。また、図６〜１４に、各温度における前記ポリマー粒子の粒度分布を示す。なお、ポリマー粒子Ｂ〜Ｆの体積平均粒径（Ｄ５０）キュムラント粒径、及びせん断粘度は、ポリマー粒子Ａと同様にして測定した。
【００９７】
【表１】
0006519168.tif 000002
なお、表１中、ポリマー粒子Ａ、Ｃ、及びＦにおいては、液温３７℃における体積平均粒径、及びキュムラント粒径は測定していない。
【００９８】
＜ポリマー粒子分散液Ａ〜Ｆの作製例１＞
前記ポリマー粒子Ａ〜Ｆを純水にて１０質量％で分散させ、１２１℃、２０分の高圧蒸気滅菌（商品名：ＭＬＳ−３０３０、パナソニック株式会社製）した。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ：和光純薬工業株式会社製）にて、滅菌したポリマー粒子を０．４質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させ、ポリマー粒子分散液Ａ〜Ｆを得た。
【００９９】
＜ポリマー粒子Ａを含有するポリマー粒子分散液Ａの温度変化による相変化に伴う相状態の確認＞
前記ポリマー粒子分散液Ａを、前記ポリマー粒子Ａの下限臨界溶解温度（３２℃）より高い温度である３７℃、及び前記ポリマー粒子Ａの下限臨界溶解温度以下である２５℃に静置し、ポリマー粒子分散液Ａの相状態を目視で確認した。図４Ａは、下限臨界溶解温度が３２℃である前記ポリマー粒子分散液Ａの２５℃における状態を示す写真である。図４Ｂは、下限臨界溶解温度が３２℃である前記ポリマー粒子分散液Ａの３７℃における状態を示す写真である。
【０１００】
図４Ａに示すように、下限臨界溶解温度が３２℃以下である２５℃においては、前記ポリマー粒子分散液Ａはゾル状態で存在することが確認できる。一方、図４Ｂに示すように、下限臨界溶解温度が３２℃よりも高い温度である３７℃においては、前記ポリマー粒子分散液Ａは、ゲル状態で存在することが確認できる。
【０１０１】
＜ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と温度との関係の確認＞
前記ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と、温度との関係を下記のように測定し確認した。
下限臨界溶解温度が３２℃であるポリマー粒子Ｂ（体積平均粒径：２．４１μｍ）１質量％を、２０℃において、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に分散させ、せん断粘度を２０℃で１００秒間測定後、３７℃に昇温しながら、さらに１００秒間測定した。図５は、ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と、温度との関係を示すグラフである。図５に示すように、下限臨界溶解温度以下である２０℃から下限臨界溶解温度を超える３７℃に昇温した場合のポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度は、９０秒で約２，８６０倍に上昇し、前記ゾル状態と前記ゲル状態との間の相変化に係る温度応答速度が早いことが確認できる。
【０１０２】
（実施例１）
＜細胞の調製例＞
−細胞の調製例１−
冷凍保存された緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を室温まで解凍し、１０ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と称することがある）へ溶解させ、無血清培地と混合して、１０μＭの溶液を５ｍＬ／ディッシュの緑色蛍光染料含有無血清培地を調製した。次に、３５ｍｍディッシュにて培養しておいたヒト皮膚線維芽細胞（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製、以下、「ＮＨＤＦ」と称することがある）をアスピレータで回収し、前記緑色蛍光染料含有無血清培地に２ｍＬ添加し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で３０分間培養した。なお、緑色蛍光染料含有無血清培地に添加する前のＮＨＤＦの遊離状態における体積平均粒径は１５μｍであった。なお、ＮＨＤＦの遊離状態における体積平均粒径は、下記の測定条件に従って測定した。次に、ディッシュの培地をアスピレータで回収し、血清入りの培地を２ｍＬ添加し、アスピレータで回収し細胞を洗浄することで、過剰な緑色蛍光染料、及びＤＭＳＯを洗い流した。さらに、血清入りの培地を３ｍＬ添加し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で３０分間以上培養し、細胞を観察できるように緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを得た。
【０１０３】
−細胞の遊離状態における体積平均粒径（Ｄ５０）の測定条件−
インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）において、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と称することがある）でＮＨＤＦ（商品名：ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ社製）を培養後、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で１００ｍｍディッシュ内の１０％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と称することがある）、及び前記培地を除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製、以下、「ＰＢＳ（−）」と称することがある）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ，  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去した。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、及び１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させた。その細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞の体積平均粒径（Ｄ５０）を測定した。
【０１０４】
−細胞の調製例２−
前記細胞の調製例１における緑色蛍光染料に代えて赤色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた以外は、前記細胞の調製例１と同様にして、細胞を観察できるように赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを得た。
【０１０５】
−細胞分散液の作製例１−
前記細胞の調製例２で得た赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを３５ｍｍディッシュにおいて、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で３５ｍｍディッシュ内の１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−）、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ，  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去した。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１００μＬ添加し、次に、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ、細胞分散液１を得た。前記細胞分散液１における細胞の遊離状態における体積平均粒径の測定条件に従い測定した細胞の遊離状態における体積平均粒径は、１３μｍであり、細胞数は、５×１０５個であり、細胞生存率は９１％であった。
前記細胞数、及び細胞生存数は、細胞の遊離状態における体積平均粒径の測定条件と同様にして、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定した。
【０１０６】
＜三次元細胞集合体の作製＞
図１５Ａに示すように、前記細胞の調製例１で得た緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０の３５ｍｍディッシュ３００から、培地をアスピレータで除去し、ピペットを用いて前記ポリマー粒子分散液Ｂ３５０を緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０上に１ｍＬ添加した。さらに、３５ｍｍディッシュを共焦点蛍光顕微鏡（ライカ社製）に設置した前記ポリマー粒子Ｂの限界臨界溶解温度（３２℃）より高い温度に設定したインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で５分間放置し、細胞上に配したポリマー粒子分散液Ｂをゲル化させることにより層を形成させた。次に、ピペットを用いて前記細胞分散液１を前記層の上に静かに０．１ｍＬ（細胞数：５×１０６個）播種し、図１５Ｂに示すような緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０、ポリマー粒子分散液Ｂ３５０、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３２０をこの順に積層した積層体１を得た。
【０１０７】
次に、ディッシュの温度を３７℃から前記ポリマー粒子Ｂの下限臨界溶解温度（３２℃）以下である２５℃まで降温させ、１０分間放置し、前記ポリマー粒子分散液Ｂをゾル化させ、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを沈降させることで、図１５Ｃに示すような緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０、及び赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３２０が積層された三次元細胞集合体１を得た。前記三次元細胞積層体１を蛍光顕微鏡にて観察した結果が図１６である。図１６に示すように、緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ（図では灰色）上に、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ（図では黒色）が観察できており、細胞の伸展が確認でき、細胞間の接着、及び自己組織化が起きていることが確認できた。
【０１０８】
前記三次元細胞集合体の平均厚みは、三次元細胞集合体１をヘマトキシリン・エオジン法（ＨＥ）染色し、断面を確認し、実体顕微鏡を用いて測定した。その結果、前記三次元細胞集合体１の平均厚みは、０．０１ｍｍ以上０．０３ｍｍ以下であった。実体顕微鏡を用いて測定した三次元細胞集合体１の断面観察像の結果を図１７に示す。組織体中の空隙割合や細胞の進展度合いから、細胞が増殖、進展していることが分かる。
【０１０９】
（実施例２〜６）
ポリマー粒子分散液Ｂをポリマー粒子分散液Ａ、及びＣ〜Ｆに変更した以外は、実施例１と同様にして、三次元細胞集合体２〜６を得た。三次元細胞集合体２〜６を蛍光顕微鏡にて観察した結果、三次元細胞集合体１と同様に、細胞の伸展が確認でき、細胞間の接着、及び自己組織化が起きていることが確認できた。前記三次元細胞集合体２〜６の平均厚みは０．０１ｍｍ以上であった。
【０１１０】
（比較例１）
ポリマー粒子分散液Ｂを使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、細胞集合体１を得た。細胞集合体１を共焦点蛍光顕微鏡にて観察した結果、細胞が三次元積層体を形成しておらず、前記細胞集合体１の厚さが０．０１ｍｍ未満と薄い細胞シート状態であった。
【０１１１】
（ポリマー粒子の細胞毒性の評価）
前記実施例１で作製した三次元細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した。結果を図１８Ａに示す。また、前記比較例１で作製した細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した。結果を図１８Ｂに示す。
【０１１２】
図１８Ａ及び図１８Ｂの結果から、図１８Ｂの比較例１の培養後のＮＨＤＦと比較して、図１８Ａの実施例１の培養後の三次元細胞集合体１は、細胞の増殖及び伸展が確認でき、ポリマー粒子は細胞への毒性がないことが分かる。なお、図には示していないが、前記ポリマー粒子分散液Ｂに代えて前記ポリマー粒子分散液Ａ、及びＣ〜Ｆを用いた場合も、細胞の増殖及び伸展が確認でき、細胞への毒性がないことが確認できた。
【０１１３】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配し、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させることを複数回繰り返し、三次元細胞集合体を製造することを特徴とする三次元細胞集合体の製造方法。
＜２＞  温度変化が、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることにより行われる前記＜１＞に記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜３＞  ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、細胞の遊離状態における体積平均粒径より小さい前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜４＞  ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜５＞  ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、５０μｍ以下である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜６＞  細胞が、接着性細胞である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜７＞  ポリマー粒子が、組成物中に均一に分散する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜８＞  細胞と、ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配される前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜９＞  細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１０＞  少なくともポリマー粒子を含む組成物が、インクジェット法、ディスペンサー法、及びピペット法から選択される少なくとも一種により基体上に配される前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１１＞  細胞を培養した後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる前記＜４＞から＜１０＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１２＞  細胞を培養し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、前記ポリマー粒子を除去する前記＜１１＞に記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１３＞  細胞の遊離状態における体積平均粒径よりもゾル状態における体積平均粒径が小さいポリマー粒子を含み、温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化する組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体である。
＜１４＞  平均厚みが、０．０１ｍｍ以上２０ｍｍ以下である前記＜１３＞に記載の三次元細胞集合体である。
＜１５＞  前記ポリマー粒子のゲル状態における体積平均粒径が、５０μｍ以下である前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体である。
＜１６＞  温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化するポリマー粒子を含む組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体形成用溶液。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１４】
【特許文献１】特開２０１３−１１６０４５号公報
【特許文献２】特開２０１３−５９３１２号公報
【符号の説明】
【０１１５】
１、１０、１００：基体
２、１３０：ゾル状態のポリマー粒子を含む組成物
３：ゲル状態のポリマー粒子を含む組成物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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