(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列（１）〜（３）；
（１）SerCysLeuTrpGlyAspValSerGluLeuAspPheLeuCysSer、
（２）SerCysLeuTyrProSerTrpSerAspTyrAlaPheCysSer、及び
（３）上記（１）のアミノ酸配列において１個のアミノ酸残基がアラニン置換されたアミノ酸配列であって、その置換部位が１ＳＡ、２ＣＡ、５ＧＡ、６ＤＡ、７ＶＡ、８ＳＡ、９ＥＡ、１１ＤＡ及び１５ＳＡであるアラニン置換アミノ酸配列
からなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する、レアアースイオンのミネラリゼーション剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、環状ペプチドである、請求項１に記載のミネラリゼーション剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、SerCysLeuTrpGlyAspValSerGluLeuAspPheLeuCysSerで表されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のミネラリゼーション剤。
【請求項４】
前記ペプチドは、SerCysLeuTyrProSerTrpSerAspTyrAlaPheCysSerで表されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のミネラリゼーション剤。
【請求項５】
前記レアアースは、ランタン（La）、セリウム（Ce）、ネオジム（Nd）、サマリウム（Sm）、ガドリニウム（Gd）、テルビウム（Tb）、ジスプロシウム（Dy）、ホルミウム（Ho）及びエルビウム（Er）からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１〜４のいずれかに記載のミネラリゼーション剤。
【請求項６】
前記レアアースはジスプロシウムであり、ジスプロシウムイオンに結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のミネラリゼーション剤。
【請求項７】
前記ペプチドは標識物質を備える、請求項１〜６のいずれかに記載のミネラリゼーション剤。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列（１）〜（３）；
（１）SerCysLeuTrpGlyAspValSerGluLeuAspPheLeuCysSer、
（２）SerCysLeuTyrProSerTrpSerAspTyrAlaPheCysSer、及び
（３）上記（１）のアミノ酸配列において１個のアミノ酸残基がアラニン置換されたアミノ酸配列であって、その置換部位が１ＳＡ、２ＣＡ、５ＧＡ、６ＤＡ、７ＶＡ、８ＳＡ、９ＥＡ、１１ＤＡ及び１５ＳＡであるアラニン置換アミノ酸配列
からなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のミネラリゼーション剤とレアアースイオンの無機化合物と、を備える、複合体。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のミネラリゼーション剤と、レアアースイオンとを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
を備える、複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載のミネラリゼーション剤と、レアアースイオンとを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
前記複合体を回収する工程と、
を備える、レアアース又はその無機化合物の回収方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のミネラリゼーション剤と、レアアースイオンとを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
前記複合体を検出する工程と、
を備える、レアアース又はその無機化合物の検出方法。
【請求項１３】
レアアース又はレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対して結合能を有するペプチドのスクリーニング方法であって、
１又は２以上のレアアース材料と、
以下のアミノ酸配列（１）及び（２）；
（１）SerCysLeuTrpGlyAspValSerGluLeuAspPheLeuCysSer
（２）SerCysLeuTyrProSerTrpSerAspTyrAlaPheCysSer
から選択されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基を置換した置換アミノ酸配列を有する１又は２以上の被験ペプチドと、を接触させて、前記１又は２以上の被験ペプチドの前記１又は２以上のレアアース材料に対する結合能を評価する工程、
を備える、方法。
【請求項１４】
レアアース含有無機化合物の製造方法であって、
液性媒体中、請求項１〜７のいずれかに記載のレアアースイオンのミネラリゼーション剤の存在下で、前記レアアース含有無機化合物の原料となるレアアースイオンと前記ミネラリゼーション剤レアアース含有無機化合物の他の原料とを接触させて前記レアアース含有無機化合物を生成させる工程、を備える、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、レアアース材料ペプチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、レアアースを中心とした無機元素の活用が必須となってきている。一方、レアアースの安定供給やレアアースによる環境への影響も懸念されている。そのため、レアアース類を自然界から効率的に収集する技術の開発や、廃棄された製品や排水中に含まれる希薄なレアアースを低エネルギーで選択的かつ効率良く回収してリサイクルする技術の確立が望まれている。
【０００３】
レアアース回収手法として、Ｎ，Ｎ−ジオクチルジグリコールアミド酸（ＤＯＤＧＡＡ）等を活用した溶媒抽出や還元微生物を利用して回収する方法が報告されている。また、酸化セリウムに結合するペプチドも報告されている（特許文献１）。さらに、酸化亜鉛などの金属酸化物に結合するペプチドも報告されている（特許文献２）。また、金、銀、白金などに対して結合するペプチドが報告されている（特許文献１、非特許文献１、２）。こうした金属結合ペプチドは、常温下で還元作用により金属ナノ粒子を形成できる活性（ミネラリゼーション活性）を有していることがわかっている。
【０００４】
例えば、ジスプロシウムは、ランタノイド系に属するレアアースであり、ハイブリッド車両の永久磁石や光磁気ディスクに使用されている酸化ジスプロシウムの構成金属である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１９３１５５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５０９４５２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Chemistry, Vol. 29, p.393-399, 2011
【非特許文献２】Advanced Materials, Vol, 19, p.2492-2498, 2007
【発明の概要】
【０００７】
上記した溶媒抽出法や還元微生物を利用した回収方法は、コスト面の採算を取ることが困難である。また、レアアースを認識するペプチドや酸化ジスプロシウムなどのレアアース金属の酸化物に結合するペプチドも報告されていない。
【０００８】
本明細書の開示は、レアアース金属やレアアース金属を含有するレアアース含有無機化合物などのレアアース材料に結合するペプチド及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ファージディスプレイ法を利用したランダムペプチドライブラリを用いて、酸化ジスプロシウムに結合するペプチドを探索したところ、酸化ジスプロシウムとの結合に有用なペプチドの特徴に関する知見を得た。また、当該ペプチドは、酸化ジスプロシウム以外のレアアースの無機化合物やイオンの形態のジスプロシウムにも結合することを確認した。本明細書の開示は、かかる知見に基づいて以下の手段を提供する。
【００１０】
（１）  レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドを含む、レアアース材料結合剤。
（２）  前記ペプチドは、１又は２以上の酸性アミノ酸残基を含む、（１）に記載の結合剤。
（３）  前記ペプチドは、２以上の酸性アミノ酸残基を含む、（２）に記載の結合剤。
（４）  前記アミノ酸残基は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される、（２）又は（３）に記載の結合剤。
（５）  前記ペプチドは、アミノ酸残基数が１０個以下２０個以下のペプチドである、（１）〜（４）のいずれかに記載の結合剤。
（６）  前記ペプチドは、環状ペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の結合剤。
（７）  前記ペプチドは、以下の（１）及び（２）のいずれかからなるアミノ酸配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載の結合剤。
（１）-X1-X2- X3-A1- X4-X5-A2-X6-A3-X7-X8−（配列番号１）
（ただし、A1は酸性アミノ酸、チロシン、アラニン、メチオニン又はグリシンであり、A2は、酸性アミノ酸又はロイシンであり、A3は、酸性アミノ酸、グリシン、プロリン、グルタミン又はアラニンであり、X1は、ロイシン、イソロイシン、バリン又はスレオニンであり、X2は、トリプトファン、システィン、アスパラギン酸、グリシン、又はバリンでありX3は、グリシン、イソロイシン、システィン、セリン、アルギニンであり、X4は、バリン、セリン、アルギニン、メチオニン、フェニルアラニン又はロイシンであり、X5はセリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、システィン、アスパラギン又はリジンであり、X6は、ロイシン、リジン、バリンセリン又はグリシンであり、X7は、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、バリン、トリプトファン又はヒスチジンであり、X8は、ロイシン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン、フェニルアラニン、グルタミン酸であり、少なくとも1つの酸性アミノ酸を有する。）
（２）-X11-X12-X13-X14-X15- X16-A4-X17-X18-X19-（配列番号２）
（ただし、A4は、酸性アミノ酸であり、X11は、ロイシン、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、システイン又はチロシンであり、X12は、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、フェニルアラニン又はバリンであり、X13は、プロリン、セリン、グリシン、ロイシン、アラニン、トレオニン、バリン又はフェニルアラニンであり、X14は、セリン、グルタミン酸、アルギニン又はイソロイシンであり、X15は、トリプトファン、アラニン、グリシン、システィン、メチオニン又はチロシンであり、X16は、セリン、グリシン、トレオニン、アラニン、アルギニン又はシステインであり、X17はチロシン、システィン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、セリン、グリシニン、リジン又はヒスチジンであり、X18は、アラニン、グリシン、トレオニン、プロリン、システィン又はセリンであり、X19は、フェニルアラニン、アルギニン、バリン、ロイシン、システィン、アラニン又はセリンである。）
（８）Leu-Trp-Gly-Asp/Glu-Val-Ser/Asn-Asp/Glu-Leu/Val-Asp/Glu-Phe/Leu-Leuで表されるアミノ酸配列を有する、（７）に記載の結合剤。
（９）  Leu-Tyr-Pro/Ala-Ser/Arg-Trp-Ser/Gly/Thr/Arg-Asp/Glu-Tyr/Asp-Ala/Gly-Phe/Leuで表されるアミノ酸配列を有する、（７）に記載の結合剤。
（１０）  前記レアアースは、ランタン（La）、セリウム（Ce）、ネオジム（Nd）、サマリウム（Sm）、ガドリニウム（Gd）、テルビウム（Tb）、ジスプロシウム（Dy）、ホルミニウム（Ho）及びエルビウム（Er）からなる群から選択される１種又は２種以上である、（１）〜（９）のいずれかに記載の結合剤。
（１１）  前記レアアースはジスプロシウムであり、ジスプロシウムイオン及びジスプロシウム酸化物に結合する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の結合剤。
（１２）  前記ペプチドは標識物質を備える、（１）〜（１１）のいずれかに記載の結合剤。
（１３）  以下の（１）又は（２）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
（１）-X1-X2- X3-A1- X4-X5-A2-X6-A3-X7-X8−（配列番号１）
（ただし、A1は酸性アミノ酸、チロシン、アラニン、メチオニン又はグリシンであり、A2は、酸性アミノ酸又はロイシンであり、A3は、酸性アミノ酸、グリシン、プロリン、グルタミン又はアラニンであり、X1は、ロイシン、イソロイシン、バリン又はスレオニンであり、X2は、トリプトファン、システィン、アスパラギン酸、グリシン、又はバリンでありX3は、グリシン、イソロイシン、システィン、セリン、アルギニンであり、X4は、バリン、セリン、アルギニン、メチオニン、フェニルアラニン又はロイシンであり、X5はセリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、システィン、アスパラギン又はリジンであり、X6は、ロイシン、リジン、バリンセリン又はグリシンであり、X7は、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、バリン、トリプトファン又はヒスチジンであり、X8は、ロイシン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン、フェニルアラニン、グルタミン酸であり、少なくとも1つの酸性アミノ酸を有する。）
（２）-X11-X12-X13-X14-X15- X16-A4-X17-X18-X19-（配列番号２）
（ただし、A4は、酸性アミノ酸であり、X11は、ロイシン、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、システイン又はチロシンであり、X12は、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、フェニルアラニン又はバリンであり、X13は、プロリン、セリン、グリシン、ロイシン、アラニン、トレオニン、バリン又はフェニルアラニンであり、X14は、セリン、グルタミン酸、アルギニン又はイソロイシンであり、X15は、トリプトファン、アラニン、グリシン、システィン、メチオニン又はチロシンであり、X16は、セリン、グリシン、トレオニン、アラニン、アルギニン又はシステインであり、X17はチロシン、システィン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、セリン、グリシニン、リジン又はヒスチジンであり、X18は、アラニン、グリシン、トレオニン、プロリン、システィン又はセリンであり、X19は、フェニルアラニン、アルギニン、バリン、ロイシン、システィン、アラニン又はセリンである。）
（１４）  Leu-Trp-Gly-Asp/Glu-Val-Ser/Asn-Asp/Glu-Leu/Val-Asp/Glu-Phe/Leu-Leuで表されるアミノ酸配列を有する、（１３）に記載のペプチド。
（１５）  Leu-Tyr-Pro/Ala-Ser/Arg-Trp-Ser/Gly/Thr/Arg-Asp/Glu-Tyr/Asp-Ala/Gly-Phe/Leuで表されるアミノ酸配列を有する、（１３）に記載のペプチド。
（１６）  レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドと、前記レアアース材料と、の複合体。
（１７）  レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドと、前記レアアース材料とを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
を備える、複合体の製造方法。
（１８）  レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドと、前記レアアース材料とを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
前記複合体を回収する工程と、
を備える、レアアース又はその無機化合物の回収方法。
（１９）  レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドと、前記レアアース材料とを接触させてこれらの複合体を形成する工程、
前記複合体を検出する工程と、
を備える、レアアース又はその無機化合物の検出方法。
（２０）  レアアース又はレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対して結合能を有するペプチドのスクリーニング方法であって、
１又は２以上のレアアース材料と１又は２以上の被験ペプチドとを接触させて、前記１又は２以上の被験ペプチドの前記１又は２以上のレアアース材料に対する結合能を評価する工程、
を備える、方法。
（２１）  レアアース含有無機化合物の製造方法であって、
液性媒体中、レアアース及びレアアースの無機化合物を含むレアアース材料に対する結合能を有するペプチドの存在下で、前記レアアース含有無機化合物の原料となるレアアースイオンと前記レアアース含有無機化合物の他の原料とを接触させて前記レアアース含有無機化合物を生成させる工程、を備える、製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ファージディスプレイ法によるバイオパンニングの概要を示す図である。
【図２】バイオパンニングのラウンド数と酸化ジスプロシウム結合ファージ力価測定結果を示す図である。
【図３】酸化ジスプロシウムに対する単クローンファージの結合能評価結果を示す図である。
【図４】酸化ジスプロシウムに対するLOB2ペプチドの結合能評価結果を示す図である。
【図５】LOB2ペプチドの結合特異性の評価結果を示す図である。
【図６】LOB1ペプチドの結合特異性の評価結果を示す図である。
【図７】LOB2ペプチドのアラニン置換変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】LOB2ペプチドのアラニン置換変異体の酸化ジスプロシウムとの結合評価結果を示す図である。
【図９】LOB2ペプチドの部分変異ライブラリから酸化ジスプロシウムに対する結合能を指標としてスクリーニングされたペプチドのアミノ酸配列解析結果を示す図である。
【図１０】LOB1ペプチドの部分変異ライブラリから酸化ジスプロシウムに対する結合能を指標としてスクリーニングされたペプチドのアミノ酸配列解析結果を示す図である。
【図１１】LOB2ペプチドとジスプロシウムイオンとの接触後に得られる生成粒子のＴＥＭ観察結果を示す図である。
【図１２】LOB2ペプチドとジスプロシウムイオンとの接触後に得られる生成粒子のＥＤＸ解析結果を示す図である。
【図１３Ａ】LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性におけるインキュベーションｐＨの影響を示す図である。
【図１３Ｂ】LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性におけるインキュベーションｐＨの影響を示す図である。
【図１４Ａ】LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性におけるインキュベーション温度の影響を示す図である。
【図１４Ｂ】LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性におけるインキュベーション温度の影響を示す図である。
【図１５】LOB2ペプチドによるミネラリゼーションによって得られた酸化ジスプロシウムのＴＥＭ観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、レアアース又はその無機化合物に対して結合能を有するペプチド及びその利用に関する。
【００１３】
本明細書の開示のペプチドは、レアアース又はその金属酸化物であるレアアース材料に結合して、複合体を形成することができる。このため、本結合剤によれば、ペプチドを介して、レアアース材料を保持し、検出し、回収することができる。
【００１４】
本明細書において、「レアアース材料」とは、レアアース及びその無機化合物を含んでいる。
【００１５】
本明細書において「レアアース」とは、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）の２元素と、ランタノイドのランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジウム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロビウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミニウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、レアアースとは、金属単体のほか、各レアアースに関し可能性ある酸化数の価数のイオンの状態も含まれる。
【００１７】
また、本明細書において、レアアースの無機化合物は、各レアアースに関し可能性ある酸化数での酸化物、水酸化物、無機酸塩及び有機酸塩を含んでいる。
【００１８】
（レアアース材料結合ペプチド）
本明細書に開示されるレアアース材料結合ペプチド（以下、単に本ペプチドともいう。）とレアアース材料との結合は、共有結合以外の相互作用により、ペプチドとレアアース材料とが複合体として取得できる程度の結合状態を意味する。典型的には、液性媒体中において、本ペプチドと、レアアースイオンやレアアース無機化合物とが結合している状態が挙げられる。概して、こうした相互作用は、静電的結合、イオン結合、水素結合等が挙げられるが、本明細書における「結合」は、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本ペプチドは、レアアース又はその陽イオンに結合するものであってもよいし、レアアースの無機化合物に結合するものであってもよい。本ペプチドは、１種のレアアース又はその陽イオンに結合する及び／又は当該特定のレアアースの酸化物などの無機化合物にも結合するものであってもよい。また、本ペプチドは、２種以上のレアアース又はその陽イオンに結合する及び／又は当該２種以上の特定のレアアースの無機化合物にも結合するものであってもよい。本ペプチドは、３種以上、好ましくは４種以上、より好ましくは５種以上のレアアース又はその陽イオンに結合する及び／又は当該特定のレアアースの無機化合物に結合するものであってもよい。
【００２０】
本ペプチドは、レアアース材料に対する結合能を有している。本発明者らによれば、ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基のカルボキシル基がレアアース材料の結合に寄与しているものと考えられる。
【００２１】
本明細書において、ペプチドとは、通常、数個以上の天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を酸アミド結合で連結したポリマーである。ペプチドは、概して、アミノ酸残基数が１００個以下程度である。本ペプチドが備えるレアアース結合配列は、例えば、アミノ酸残基数が５個以上であることが好ましく、より好ましくは７個以上であり、さらに好ましくは８個以上である。また、上限も特に限定しないが、レアアース材料結合能を考慮すると、２５個以下であってもよいし、２０個以下であってもよいし、１５個以下であってもよい。
【００２２】
本ペプチドは、Ｌ体のアミノ酸残基のポリマーであることが好ましいが、Ｄ体ポリマーであることを排除するものではない。
【００２３】
ペプチドは概して直鎖状であるが、本ペプチドは直鎖状であってもよいが、分子内ジスルフィド結合等によって環状化されていてもよい。この場合、レアアース材料との結合に寄与すると考えられるアミノ酸配列（以下、単にレアアース結合配列という。例えば、酸性アミノ酸残基を含むその上流及び下流の適数個のアミノ酸残基を含むアミノ酸など）以外で連結して環状化されていることが好ましい。典型的には、レアアース結合配列の両側にシステイン残基を備えるように構成したペプチドをヨウ素や過酸化水素などの酸化剤の存在下において本ペプチドを環状化することができる。
【００２４】
本ペプチドが結合するレアアース又はその無機化合物におけるレアアースは、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミニウム（Ｈｏ）及びエルビウム（Ｅｒ）からなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。より好ましくは、ランタン、セリア、ネオジム、サマリウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミニウム、エルビニウムであり、より好ましくは、ランタン、セリウム、ネオジム、サマリウム、ガドリニウム、テルビニウム、ジスプロシウムである。
【００２５】
本ペプチドは、１種又は２種以上のレアアース及び／又はその無機化合物に結合することができる。本ペプチドのレアアース及びその無機化合物に対する結合能は、アミノ酸配列に応じて変化する。すなわち、セリウムに対して高い選択性で結合するレアアース結合配列もあれば、ランタンに対して高い選択性で結合するレアアース結合配列もある。また、無機化合物特異的に結合するレアアース結合配列も存在すると考えられる。したがって、用いるレアアース結合配列の結合能に応じて、本ペプチドを適用するレアアースを選択すればよい。レアアース結合配列のレアアース結合能は、酸性アミノ酸残基を備えていることにより確保することができるものと推測されるが、酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列によって結合強度や結合するレアアース又はその無機化合物の種類がある程度異なってくるものと考えられる。
【００２６】
本ペプチドが備えるレアアース結合配列として、１又は２以上の酸性アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。２又は３以上の酸性アミノ酸残基を含んでいることがより好ましい。酸性アミノ酸残基としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸等が挙げられる。好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸である。２以上の酸性アミノ酸残基は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２７】
本ペプチドは、２以上の酸性アミノ酸残基を有している場合、最も近接する酸性アミノ酸残基は、直接隣り合っていてもよいし、１又は２以上のアミノ酸残基を介して隣接していてもよい。当該介在されるアミノ酸残基（介在アミノ酸残基）の種類は特に限定されないが、中性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基などで介在されていることが好ましい。介在アミノ酸残基は、より好ましくは中性アミノ酸残基を含んでいる。
【００２８】
なお、ここで中性アミノ酸残基とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、ノルバリンが挙げられる。また、塩基性アミノ酸残基としては、リジン、ノルロイシン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンが挙げられる。また、酸アミドアミノ酸残基としては、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。塩基性アミノ酸残基としては、リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸が挙げられる。環状アミノ酸残基としては、プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリンが挙げられる。ＯＨ含有アミノ酸残基としては、セリン、スレオニン、ホモセリンが挙げられる。芳香族アミノ酸残基としては、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンが挙げられる。
【００２９】
本ペプチドは、例えば、以下の（１）及び（２）のいずれかからなるレアアース結合配列を有することができる。
（１）-X1-X2- X3-A1- X4-X5-A2-X6-A3-X7-X8−（配列番号１）
（ただし、A1は酸性アミノ酸、チロシン、アラニン、メチオニン又はグリシンであり、A2は、酸性アミノ酸又はロイシンであり、A3は、酸性アミノ酸、グリシン、プロリン、グルタミン又はアラニンであり、X1は、ロイシン、イソロイシン、バリン又はスレオニンであり、X2は、トリプトファン、システィン、アスパラギン酸、グリシン、又はバリンでありX3は、グリシン、イソロイシン、システィン、セリン、アルギニンであり、X4は、バリン、セリン、アルギニン、メチオニン、フェニルアラニン又はロイシンであり、X5はセリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、システィン、アスパラギン又はリジンであり、X6は、ロイシン、リジン、バリンセリン又はグリシンであり、X7は、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、バリン、トリプトファン又はヒスチジンであり、X8は、ロイシン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン、フェニルアラニン、グルタミン酸であり、少なくとも1つの酸性アミノ酸を有する。）
（２）-X11-X12-X13-X14-X15- X16-A4-X17-X18-X19-（配列番号２）
（ただし、A4は、酸性アミノ酸であり、X11は、ロイシン、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、システイン又はチロシンであり、X12は、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、フェニルアラニン又はバリンであり、X13は、プロリン、セリン、グリシン、ロイシン、アラニン、トレオニン、バリン又はフェニルアラニンであり、X14は、セリン、グルタミン酸、アルギニン又はイソロイシンであり、X15は、トリプトファン、アラニン、グリシン、システィン、メチオニン又はチロシンであり、X16は、セリン、グリシン、トレオニン、アラニン、アルギニン又はシステインであり、X17はチロシン、システィン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、セリン、グリシニン、リジン又はヒスチジンであり、X18は、アラニン、グリシン、トレオニン、プロリン、システィン又はセリンであり、X19は、フェニルアラニン、アルギニン、バリン、ロイシン、システィン、アラニン又はセリンである。）
【００３０】
（１）のレアアース結合配列は、ランタン、セリア、ネオジム、サマリウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、ホルミニウム、エルビニウム又はその酸化物に対する結合能が高く、なかでも、セリウム、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム及びエルビニウム又はその酸化物に対して結合能が高く、セリウム及びネオジム又はその酸化物に対して一層結合能が高い。
【００３１】
（２）のレアアース結合配列は、ランタン、セリア、ネオジム、サマリウム、ガドリニウム、テルビニウム、ジスプロシウム、ホルミニウム、エルビニウム又はその酸化物に対する結合能が高く、なかでも、ランタン、セリウム、ホルミニウム又はその酸化物に対して結合能が高く、ランタン及びセリウム又はその酸化物に対して一層結合能が高い。
【００３２】
これらのレアアース結合配列において、酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。
【００３３】
（１）のレアアース結合配列のX1は好ましくはロイシン、イソロイシン又はバリンであり、X2は、好ましくはトリプトファン又はシステインであり、Ｘ３は好ましくはグリシンであり、A1は好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、X4は好ましくはバリンであり、A2は好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、X5は好ましくはセリン、アルギニン、アスパラギン又はリジンであり、X6は好ましくロイシン又はバリンであり、X7は好ましくはフェニルアラニン又はロイシンであり、X8は好ましくはロイシン、バリン又はトレオニンである。
【００３４】
（２）のレアアース結合配列のX11は好ましくはロイシン、イソロイシン、バリン又はトレオニンであり、X12は好ましくはチロシン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はグルタミン酸であり、X13は好ましくはプロリン、アラニン、セリン又はグリシンであり、X14は好ましくはセリン、アルギニン又はイソロイシンであり、X15は好ましくはトリプトファンであり、X16は好ましくはセリン、グリシン又はトレオニンであり、X17は好ましくはチロシン、アスパラギン酸又はセリンであり、X18はアラニン、スレオニン又はグリシンであり、X19は好ましくはフェニルアラニン又はロイシンである。
【００３５】
（１）のレアアース結合配列は、好ましくは
Leu/Val-Trp/Cys-Gly/Arg-Asp/Glu-Val-Ser/Asn/Lys/Arg-Asp/Glu-Leu/Val-Asp/Glu-Phe/Leu/Val-Leu/Val/Thrで表され、より好ましくは、
Cys-Leu/Val-Trp/Cys-Gly/Arg-Asp/Glu-Val-Ser/Asn/Lys/Arg-Asp/Glu-Leu/Val-Asp/Glu-Phe/Leu/Val-Leu/Val/Thr-Cysで表され、さらに好ましくは、
Ser-Cys-Leu/Val-Trp/Cys-Gly/Arg-Asp/Glu-Val-Ser/Asn/Lys/Arg-Asp/Glu-Leu/Val-Asp/Glu-Phe/Leu/Val-Leu/Val/Thr-Cys-Serで表される。
【００３６】
このレアアース結合配列は、セリウム、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム及びその酸化物に高い結合能を有し、さらに、セリウム、ネオジム及びその酸化物に高い結合能を有している。また、このレアアース結合配列は、ジスプロシウム（イオン）に対する結合性も有している。
【００３７】
（２）のレアアース結合配列は、好ましくは
Leu-Tyr-Pro/Ala-Ser/Arg-Trp-Ser/Gly/Thr/Arg-Asp/Glu-Tyr/Asp-Ala/Gly/Ser/Thr-Phe/Leuで表され、より好ましくは、
Cys-Leu-Tyr-Pro/Ala-Ser/Arg-Trp-Ser/Gly/Thr/Arg-Asp/Glu-Tyr/Asp-Ala/Gly/Ser/Thr-Phe/Leu-Cysで表され、さらに好ましくは、
Ser-Cys-Leu-Tyr-Pro/Ala-Ser/Arg-Trp-Ser/Gly/Thr/Arg-Asp/Glu-Tyr/Asp-Ala/Gly/Ser/Thr-Phe/Leu-Cys-Serで表される。このレアアース結合配列は、ランタン、セリウム、ホルミニウム及びその酸化物に高い結合能を有し、さらに、ランタン、セリウム及びその酸化物に高い結合能を有している。
【００３８】
レアアース結合配列のＮ末端やＣ末端に１又は複数個のアミノ酸がさらに付加されていてもよい。例えば、１個又は２個のアミノ酸が付加されていてもよいし、１個以上３個以下のアミノ酸が付加されていてもよいし、１個以上５個以下のアミノ酸が付加されていてもよいし、１個以上７個以下のアミノ酸が付加されていてもよいし、１個以上１９個以下のアミノ酸が付加されていてもよいし、１個以上１０個以下のアミノ酸が付加されていてもよい。
【００３９】
レアアース結合配列の末端に付加するアミノ酸としては、例えば、セリン、システイン、アスパラギン等が挙げられる。また、両末端にシスティンを導入することで、本ペプチドを環状化することが可能となる。
【００４０】
（１）のレアアース結合配列を含むペプチドとしては、例えば、以下のレアアース結合配列を含むペプチドが挙げられる。以下に示すペプチド中、レアアース結合配列は、好ましくはＮ末端及びＣ末端の各１つのアミノ酸残基を除く配列であり、より好ましくは、両末端の各２つのアミノ酸残基、すなわち、SC−及び-CSを除く配列である。
【００４１】
SerCys-LeuTrpGlyAspValSerGluLeuAspPheLeu-CysSer（配列番号３）
SerCys-LeuTrpIleGluSerLeuAspLeuAspGlyLeu-CysSer（配列番号４）
SerCys-LeuCysCysGluValSerAspLeuGlyLeuVal-CysSer（配列番号５）
SerCys-ValCysIleGluArgArgGluLeuAspLeuLeu-CysSer（配列番号６）
SerCys-IleAspSerTyrValGlyGluLeuGluThrLeu-CysSer（配列番号７）
SerCys-LeuTrpArgAlaValCysAspLeuGlyIleGlu-CysSer（配列番号８）
SerCys-LeuGlyGlyAspMetSerAspLysProValSer-CysSer（配列番号９）
SerCys-ThrCysGlyMetValAsnAspValAspLeuThr-CysSer（配列番号１０）
SerCys-IleValGlyGluValArgLeuSerAspLeuVal-CysSer（配列番号１１）
SerCys-ThrCysGlyMetValAsnAspValAspLeuThr-CysSer（配列番号１２）
SerCys-ValTrpArgGlyPheLysAspGlyGlnTrpPhe-CysSer（配列番号１３）
SerCys-ValCysArgGlyLeuArgAspLeuAlaHisAsn-CysSer（配列番号１４）
【００４２】
（２）のレアアース結合配列を含むペプチドとしては、例えば、以下のレアアース結合配列を含むペプチドが挙げられる。以下に示すアミノ酸配列中、レアアース結合配列は、好ましくはＮ末端の３アミノ酸残基及びＣ末端の２アミノ酸残基を除く配列であり、より好ましくは両末端のSC−及−CSを除く配列である。
【００４３】
SerCys-LeuTyrProSerTrpSerAspTyrAlaPhe-CysSer（配列番号１５）
SerCys-ThrAspProSerTrpGlyGluTyrGlyPhe-CysSer（配列番号１６）
SerCys-GluTyrSerSerAlaSerGluTyrAlaArg-CysSer（配列番号１７）
SerCys-IleTyrGlyGluTrpArgAspTyrAlaPhe-CysSer（配列番号１８）
SerCys-ValTyrLeuSerGlySerGluCysThrPhe-CysSer（配列番号１９）
SerCys-LeuAsnAlaArgTrpSerAspSerProVal-CysSer（配列番号２０）
SerCys-LeuAsnThrIleTrpAlaAspTyrGlyLeu-CysSer（配列番号２１）
SerCys-LysAspValSerTrpGlyAspIleAlaCys-CysSer（配列番号２２）
SerCys-PheGluPheSerTrpSerGluAspCysAla-CysSer（配列番号２３）
SerCys-GluArgGlySerTrpCysGluAspAlaCys-CysSer（配列番号２４）
SerCys-ValTyrThrGlyTrpArgGluAspAlaSer-CysSer（配列番号２５）
SerCys-CysPheAlaSerCysThrAspSerAlaLeu-CysSer（配列番号２６）
SerCys-ThrArgSerArgCysGlyAspGlyAlaPhe-CysSer（配列番号２７）
SerCys-TyrValAlaIleMetSerGluLysSerPhe-CysSer（配列番号２８）
SerCys-IleGluAlaArgTyrThrAspHisAlaLeu-CysSer（配列番号２９）
【００４４】
本ペプチドは、公知の化学合成法のほか、遺伝子工学的な方法等、当業者において周知の方法により取得することができる。
【００４５】
本ペプチドは、標識物質を備えていてもよい。標識物質を備えていることにより、レアアースと結合した本ペプチドを識別できるようになり、回収等に都合がよい。標識としては特に限定しないで公知の各種標識物質を用いることができる。標識物質は、目視にて識別可能なものであってもよいし、所定の波長の光によって発光等するものであってもよい。また、それ自体、着色しているもののほか、他の化合物との反応等により発色可能なものであってもよい。また、標識物質はビーズ等の担体に保持されていてもよい。こうした標識物質としては、たとえば、着色ビーズ、金コロイド、蛍光化合物、酵素タンパク質が挙げられる。また、標識物質には、抗体−抗体反応を利用したもの、ビオチン−アビジン結合を利用したものなどの標識結合物質を包含する。標識結合物質は、標識物質を結合する物質であり、こうした標識結合物質も標識物質として機能できる。
【００４６】
標識物質は、公知の方法で結合される。典型的には、本ペプチドに対して適数個のリンカーペプチドを介して本ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付与される。
【００４７】
レアアース材料に対する結合性の異なる（結合選択性など）２以上の本ペプチドを用いる場合には、ペプチド毎に異なる標識物質を備えることができる。
【００４８】
本ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて回収可能なように、タグを備えていてもよい。タグは、抗原（エピトープ）等であってもよいし、公知のHisタグのほか、ビオチン等を用いることができる。こうしたタグは適当なリンカーを介して結合されていてもよい。
【００４９】
なお、本ペプチドに対する抗体を用いることで、本ペプチドに何ら標識することなく、本ペプチドを識別できる。
【００５０】
以上のことから、本ペプチドをレアアース材料に対して結合能を有するレアアース結合剤としても使用できる。
【００５１】
（ミネラリゼーション活性）
本ペプチドは、レアアース材料結合能を有するほか、レアアースイオンからレアアース含有無機化合物を生成するミネラリゼーション活性を有する。ミネラリゼーション活性については後段で詳述する。
【００５２】
本明細書によれば、また、本ペプチドないしレアアース結合配列と他のペプチドとを備える融合ペプチドないし融合タンパク質(以下、単に融合タンパク質という。)も提供される。融合タンパク質においては、本ペプチドないしレアアース結合配列は、レアアース結合能の少なくとも実質的に維持されるように融合化されている。レアアース結合能が実質的に維持されるとは、当初のレアアース結合能の特異性が維持されるとともにその結合強度が好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上である。融合タンパク質において当初のレアアース結合能が維持されているか否かは、後述する実施例等に基づき確認することができる。
【００５３】
融合タンパク質における他のペプチドは、所望の特性や機能を備えることができる。抗体、酵素、膜タンパク質、などの各種公知のタンパク質を、必要に応じて選択できる。当業者であれば、こうした融合タンパク質は、周知の遺伝子工学的手法ないしは化学的手法により取得することができる。
【００５４】
本明細書において、融合タンパク質は、本ペプチドと同等の特性や機能を有することができ、同様の用途に適用することができる。
【００５５】
また、本明細書によれば、本ペプチド又は本融合タンパク質をコードするヌクレオチドなどのＤＮＡや、本ペプチドや融合タンパク質を発現するための、これらをコードするＤＮＡ及びを含むベクターも提供される。既に説明したレアアース結合配列等に基づくＤＮＡの取得や発現用ベクターの構築は、当該分野において周知の手法によって当業者であれば容易に実施できる。発現用ベクターは、本ペプチドや融合タンパク質を発現させるための宿主細胞の種類に応じてその要素が選択される。
【００５６】
（ペプチド固定化固相担体）
本ペプチドは固相担体に保持されていてもよい。例えば、各種ビーズ等の粒状体や、各種材料からなるシート状体に保持されていてもよい。こうした固相担体は、公知であり、当業者であれば適宜選択して利用できる。こうした固相担体の表面へのペプチドの固定化形態や手法は公知である。当業者であれば、適宜固定化手法を選択し、所望の形態（シート状の固相担体への固定化パターンなど）を選択し、ペプチド固相担体を得ることができる。粒子状固相担体は、典型的にはディッピング等により固相担体表面全体に本ペプチドを保持させた形態を採ることができる。また、シート状固相担体は、ディッピング、コーティングあるいはスポッティング等により、膜状にあるいは任意のパターンで本ペプチドを保持させた形態を採ることができる。
【００５７】
レアアース材料に対する結合性の異なる（結合選択性など）２以上の本ペプチドを固相担体に固定化する場合、各ペプチドを、異なる識別性を有する粒子状の固相担体にそれぞれ固定化してもよいし、各ペプチドを、異なる位置情報に基づいたスポットとして、シート状の固相担体に固定化してもよい。
【００５８】
また、本ペプチドは、生物担体を伴っていてもよい。具体的には、本ペプチドは、細胞等の生物担体の表層に提示された状態又は表層を構成する状態であってもよい。生物担体は、各種微生物、植物細胞、動物細胞のほか、ウイルスやファージ等が挙げられる。本ペプチドは、例えば、酵母や大腸菌等の微生物の表層に提示されてもよいし、ファージやウイルスに外殻タンパク質として構成したものであってもよい。
【００５９】
以上説明したように、本ペプチドは、そのレアアース材料結合能に基づいて、レアアース材料の結合剤としてのほか、レアアース材料の検出剤（プローブ）、レアアース材料回収剤（分離剤）等として利用できる。例えば、ペプチド固相担体は、これらの用途にいずれも有用である。また、本ペプチド固定化固相担体は、レアアース材料、回収、検出のためのデバイス（アレイ）として有用である。
【００６０】
また、本ペプチドは、そのミネラリゼーション活性に基づいて、レアアースイオンからレアアースの無機化合物を製造するための製造用剤として利用できる。ペプチド固相担体も製造用剤として利用できる。
【００６１】
また、以上説明したことから、本ペプチド及び標識物質等を備える本ペプチド、本ペプチドが保持されたペプチド固定化固相担体（生物担体含む）は、いずれも、それ自体、有用である。
【００６２】
（本ペプチドとレアアース材料との結合）
本ペプチドとレアアース材料とを結合させるには、本ペプチドの存在下でレアアース材料と接触させればよい。本ペプチドとレアアース材料との結合のための条件は、本ペプチドのレアアース材料結合能が発揮される限り特に限定されない。結合条件は、レアアース材料と本ペプチドとを、ｐＨ、温度、塩濃度において条件を異ならせて、結合状態を確認することで取得できる。例えば、本発明者らによれば、ｐＨ５以上８以下、温度４℃以上８０℃以下の範囲で、本ペプチドとレアアース材料との結合を確認できている。
【００６３】
本ペプチドとレアアース材料との結合は、液性媒体中において本ペプチドとレアアース含有材料とを混合等するなどして接触させればよい。液体媒体としては、本ペプチドのレアアース材料結合能を発揮できる限り、いかなる液体媒体であってもよい。液性媒体は、水性媒体であっても有機溶媒であってもよく、これらの混合媒体であってもよい。典型的には、中性付近のバッファ等やそれらを含む混液等用いることができる。例えば、ｐＨは、特に限定されないが、５以上８以下程度とすることができ、塩濃度も特に限定されないが、１０ｍＭ以上１Ｍ以下とすることができる。温度も、特に限定されないで、温度制御なくて容易に結合を実現できるが、典型的には、４℃以上８０℃以下、より好ましくは１０℃以上４０℃以下とすることができ、さらに好ましくは１５℃以上３０℃以下とすることができる。本ペプチドとレアアース材料とのためには、適宜撹拌して接触効率を高めることができる。また、接触のための時間は、特に限定しないが、１０分程度から数時間程度とすることができ、好ましくは３０分以上８時間以下とすることができ、上限時間はより好ましくは６時間以下、さらに好ましくは４時間以下程度とすることができる。また、より好ましくは１時間以上３時間以下程度とすることができる。
【００６４】
本ペプチドのレアアース材料結合能を発揮させるための液体媒体中の本ペプチド濃度及びレアアース材料濃度も特に限定されないが、例えば、本ペプチドが２０ｎＭ以上の濃度であることが好ましく、レアアース材料濃度が１００μＭ以上であることが好ましい。
【００６５】
（本ペプチドによるミネラリゼーション）
本ペプチドによれば、本ペプチドとレアアース含有無機化合物の原料（ミネラリゼーション原料）からレアアース含有無機化合物を生成することができる。レアアース含有無機化合物は、生成時点においては結晶質であってもよいし、非晶質であってもよい。非晶質の場合には、必要に応じて焼成工程を実施することで結晶質化することができる。
【００６６】
ミネラリゼーションを実現するには、本ペプチドとレアアースの無機化合物の原料（ミネラリゼーション原料）とを液性媒体中でインキュベートすればよい。ミネラリゼーション原料としては、１つはレアアースイオンである。レアアースイオンは、例えば、硝酸塩や塩酸塩などミネラリゼーションに使用する媒体に溶解する状態で用いることができる。その他のミネラリゼーション原料としては、レアアースの無機化合物である酸化物、水酸化物及び無機酸の構成原料である。酸化物や水酸化物においては、水性媒体の液性により水性媒体等において存在し得るし、無機酸にあっては、水性媒体等中に陰イオンとして存在させればよい。
【００６７】
インキュベート条件は、本ペプチドのミネラリゼーション活性を発揮させることができる限り特に限定されない。典型的には、既に説明した本ペプチドのレアアース材料結合能を発揮させる状態を採用することができる。なお、ｐＨ、温度及び／又はインキュベート時間により無機化合物の生成状況や析出状況が異なるため、ｐＨ調節、温度調節及び／又はインキュベート時間を適宜延長したり短縮したりするなど設定することが好ましい。例えば、本発明者らによれば、ｐＨ５以上８以下、温度４℃以上８０℃以下の範囲で、本ペプチドによるミネラリゼーション活性を確認できている。
【００６８】
本ペプチドによるミネラリゼーションにおいては、本ペプチドとミネラリゼーション原料を、静置してもよいしミネラリゼーションを阻害しない程度に撹拌してもよい。ミネラリゼーションによるレアアース含有無機化合物は、インキュベーション中の液性媒体において不溶物（沈殿物）として取得することができる。遠心分離等により固相を回収し、界面活性剤等を利用して本ペプチド等を分離することで、本ペプチドと分離したレアアース含有無機化合物を得ることができる。さらに、必要に応じ、乾燥及び／又は焼成によりレアアース無機化合物を得ることができる。
【００６９】
本ペプチドのミネラリゼーション活性を発揮させるための液体媒体中の本ペプチド濃度及びミネラリゼーション原料濃度も特に限定されないが、例えば、本ペプチドが５μＭ以上の濃度であることが好ましく、ミネラリゼーション原料のレアアースイオン濃度が１００μＭ以上であることが好ましい。また、無機化合物のレアアース以外である他のミネラリゼーション原料についても、レアアースイオン濃度と同様である。
【００７０】
本ペプチドのミネラリゼーションのためのインキュベーションは、簡易な低コスト条件で実現できる点において有利である。
【００７１】
ミネラリゼーションによって得られるレアアース含有無機化合物の乾燥及び非晶質のレアアース含有無機化合物の結晶化のための焼成については、後述する。
【００７２】
（複合体及びその製造方法）
本明細書に開示される複合体は、本ペプチドとレアアース材料（レアアース及び／又はその酸化物などの無機化合物）との複合体（以下、本複合体ともいう。）である。本複合体は、本ペプチドと、レアアース及び／又はその無機化合物と、を備えている。両者の複合化形態は、特に限定されない。ペプチドは、既述の標識物質、タグ、固相担体、生物担体を伴っていてもよい。レアアースは、イオン及び／又は金属無機化合物の形態であってもよい。
【００７３】
また、複合体において、１種の本ペプチドに対して２種以上のレアアースが結合している場合もあるし、２種以上の本ペプチドに対して１種のレアアースが結合している場合もある。
【００７４】
複合体の製造方法は、本ペプチドとレアアース材料とを接触させてこれらの複合体を形成する工程、を備えることができる。複合体形成工程は、既に記載したように、本ペプチドの変性が抑制された条件下で、レアアース材料と接触させればよい。
【００７５】
複合体の製造方法としては、後述するレアアース含有無機化合物の製造方法を実施してもよい。
【００７６】
複合体の製造は、後述するように、レアアース材料の回収、検出及びレアアース結合配列の同定（本ペプチドのスクリーニング）に有用である。
【００７７】
（レアアース材料の回収方法）
本明細書に開示されるレアアース材料の回収方法は、上記した複合体形成工程と、複合体を回収する工程と、を備えることができる。複合体の回収にあたっては、レアアース材料の特性に応じて分離するほか、本ペプチドを介して複合体を回収することができる。例えば、レアアース含む可能性のある資源材料（石炭灰、石油灰等の各種リサイクル材料、鉱山資源材料、海洋資源材料）と本ペプチドとを接触させて得られた複合体を、本ペプチド自体あるいは本ペプチドに付与した標識物質や、本ペプチドが結合したレアアース材料の特性に応じた回収方法で回収工程を実施できる。本ペプチド自体を介して回収するには、本ペプチドを特異的に識別する抗体等を用いることができる。また、本ペプチドが備えるタグの形態に応じても適切な回収工程を実施することができる。さらに、複合体を構成するレアアース材料の特性に応じて分離することができる。複合体は、本ペプチドとレアアース材料とを、回収指標として有するため、より効率的な回収が可能となっている。
【００７８】
複合体からのレアアース材料の回収は、例えば、イソプロパノールやメタノール・アセトンの混液（例えば１：１等）、あるいは界面活性剤溶液など、本ペプチドを変性させるか、あるいは本ペプチドとレアアース材料との相互作用を遮断するような溶媒と接触させるなどの処理により、レアアースを本ペプチドと分離して回収することができる。こうした複合体における本ペプチドとレアアース材料との相互作用を解消する処理やその程度は、レアアース材料の種類や本ペプチドとの結合強度に応じて適宜選択できる。
【００７９】
（レアアース材料の検出方法）
本明細書に開示されるレアアース材料の検出方法は、上記した複合体形成工程と、複合体を検出する工程と、を備えることができる。複合体の検出にあたっては、レアアース材料の特性に応じて検出する他、本ペプチドを介して複合体を検出することができる。例えば、レアアース含む可能性のある資源材料（石炭灰、石油灰等のリサイクル材料、鉱山資源材料、海洋資源材料）と本ペプチドとを接触させて得られた複合体を、本ペプチド自体あるいは本ペプチドに付与した標識物質や、本ペプチドが結合したレアアース材料の特性に応じた検出方法で検出工程を実施できる。本ペプチド自体を介して検出するには、本ペプチドを特異的に識別する抗体等を用いることができる。また、本ペプチドが備える標識物質に応じて適切な検出工程を実施することができる。さらに、複合体を構成するレアアース材料の特性に応じて検出することができる。複合体は、本ペプチドとレアアース材料とを、検出指標として有するため、より確実な検出が可能となっている。
【００８０】
（レアアース材料結合能を有するペプチドのスクリーニング方法）
本明細書に開示されるレアアース結合ペプチドのスクリーニング方法は、レアアース材と１又は２以上の被験ペプチドとを接触させて、前記１又は２以上の被験ペプチドの前記レアアース材料に対する結合能を評価する工程を備えることができる。本開示のスクリーニング方法によれば、レアアース材料に対して結合性を有するペプチドをスクリーニングできる。換言すれば、レアアース結合配列をスクリーニングないし同定することができる。
【００８１】
レアアース材料は、既に記載したとおり、レアアース単体、レアアースイオン、レアアースの酸化物などの無機化合物が挙げられる。これらは独立してレアアース材料として被験ペプチドとの結合性を評価できる。レアアースイオンの場合、硝酸塩又は塩酸塩等の溶液とすることができる。また、レアアースの無機化合物やレアアース単体の場合、溶解しないために、分散液等とすることができる。
【００８２】
被験ペプチドとは、特に限定しないで、天然のアミノ酸配列ほか、人工のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。ペプチド長は特に限定しないが、既に説明したように、概してアミノ酸残基数が１００個以下程度とすることができ、典型的には、アミノ酸残基数が５個以上であることが好ましく、より好ましくは７以上であり、さらに好ましくは８個以上である。また、２５個以下であってもよいし、２０個以下であってもよいし、１５個以下であってもよい。また、被験ペプチドは環状ペプチドであってもよい。環状ペプチドは、２以上のシステイン残基によるジスルフィド結合により形成できる。
【００８３】
被験ペプチドは、天然のＬ体のポリマーであってもよいし、非天然のＤ体のポリマーであってもよい。さらに、被験ペプチドは、人工的なアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００８４】
被験ペプチドは、例えば、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、インビトロウイルス法などを用いて多様なペプチドを提示させる方式のほか、化学合成や、無細胞タンパク質合成系等を含む遺伝子工学的な合成により取得し、スクリーニングに供することができる。被験ペプチドは、また、一定のアミノ酸配列を元に公知の手法により作製した変異体ライブラリに属するものであってもよい。さらに、被験ペプチドは、本ペプチドと同様、固相担体や生物担体に保持された形態であってもよい。
【００８５】
被験ペプチドには、本ペプチドについて既に説明したように、レアアース材料との結合性の評価に都合がよいように、標識物質やタグを付与しておくことができる。あるいは、被験ペプチドのアミノ酸配列が既に知得されている場合には、予め被験ペプチドに特異的に結合する抗体を準備しておくこともできる。このような付加物のある本ペプチドの利用は、レアアース材料との結合能をさらに評価する二次スクリーニングに好適である。
【００８６】
被験ペプチドとレアアース材料との接触は、既に説明したように、被験ペプチドの変性が抑制された状態でレアアース材料と接触させればよい。典型的には、溶液系内において、被験ペプチドとレアアース材料とを接触させる。
【００８７】
１又は２以上のレアアース材料と被験ペプチドとの接触形態は特に限定しないが、特に、高精度にレアアース材料との結合能を評価する二次スクリーニングにおいては、例えば、レアアース材料をアレイ状に固相担体に固定するなどした、レアアース材料固定化固相担体を用いることもできる。こうしたレアアース材料固定化固相担体を用いることで、複数のレアアース材料及び複数の被験ペプチドについて、一挙に結合能を評価することができる。レアアース材料固定化固相担体は、例えば、シート（プレート）状の固相担体に形成されたウェル内にレアアース材料が固定化されていてもよい。レアアース材料は、レアアース材料の分散液をガラスやプラスチックなどの表面に対して供給し、例えば、真空下などでの乾燥などにより固着される。
【００８８】
レアアース材料と被験ペプチドとが結合して得られた複合体を、被験ペプチド自体あるいはそれに付与した標識物質を介して識別し回収できる。また、複合体と、複合体を形成しないレアアース材料及び被験ペプチドは、その質量が複合体より小さいため、遠心分離等の質量差を利用した分離法で上清等として除去し、結果として複合体を精製することもできる。この場合、残存した複合体に対して、既述したように、界面活性剤溶液などを付与して、被験ペプチドとレアアース材料との非特異的結合複合体を排除し、再び遠心分離して上清等を除去することで、非特異的にレアアース材料と結合していた被験ペプチドを除去できる。こうした洗浄操作を繰り返すことにより、高い確度でレアアース材料を結合する被験ペプチドをスクリーニングできる。
【００８９】
複合体形成工程に続く１又は２回以上の洗浄工程をセットとして複数回行うことにより、レアアース材料に対する被験ペプチドの濃度が高まり濃縮され、レアアース材料に対して結合能の高い被験ペプチドがスクリーニングされる。セットは、３回以上行うことが好ましく、より好ましくは４回以上であり、さらに好ましくは５回以上であり、一層好ましくは６回以上である。１０回程度までは概して洗浄効果を認めることができる。
【００９０】
複合体又は複合体を形成した被験ペプチドを必要に応じて識別し、回収し、被験ペプチドのアミノ酸配列を確認することにより、用いたレアアース材料に結合性を有するレアアース結合配列を同定又はスクリーニングすることができる。なお、ファージディスプレイ法など被験ペプチドのアミノ酸配列が不知の場合には、被験ペプチドの配列解析を行ってレアアース結合配列を同定する。
【００９１】
こうしたスクリーニング方法は、例えば、特定のレアアース材料に対する一次スクリーニングには、ファージディスプレイ法等を用いて行うことが好ましい。その場合、上記のようなセットの繰り返しが実施例におけるパンニングに該当する。
【００９２】
また、特定のレアアース材料又は複数のレアアース材料に対する、被験ペプチドの結合能を評価するなどの二次スクリーニングには、レアアース材料を固相担体等に固定化した固相担体（アレイ等）を用いて行うことが精度の良好な評価に有用である。
【００９３】
本スクリーニング方法によれば、特定のレアアース材料や２以上のレアアース材料に特異的に結合するレアアース結合配列を同定・スクリーニングできる。
【００９４】
（レアアース含有無機化合物の製造方法）
本明細書によれば、レアアース含有無機化合物の製造方法が提供される。本製造方法は、液性媒体中で、本ペプチドの存在下で、前記レアアース含有無機化合物の原料となるレアアースイオンと前記レアアース含有無機化合物の他の原料とを接触させて前記レアアース含有無機化合物を生成させる工程を備えている。本製造方法に簡易にかつ低コストをレアアース酸化物などのレアアース含有無機化合物を得ることができる。
【００９５】
レアアース含有無機化合物生成工程は、先に説明した本ペプチドのミネラリゼーションのための条件を適用できる。
【００９６】
本製造方法は、さらに、レアアース含有無機化合物の回収工程を備えることができる。レアアース含有無機化合物は不溶物として生成するため、固液分離によりレアアース含有無機化合物を分離及び回収することができる。また、当該固液分離に先立ってあるいは固液分離の際に、さらにまた固液分離後に、レアアース含有無機化合物と本ペプチドとの結合を本ペプチドを変性させることなどにより解除して、複合体の状態でないレアアース含有無機化合物を回収することができる。
【００９７】
本製造方法は、さらに、回収したレアアース含有無機化合物の乾燥工程を備えることができる。乾燥工程は、特に限定しないで、一般的な乾燥工程を適用することができる。
【００９８】
本製造方法は、さらに、回収したレアアース含有無機化合物の焼成工程を備えることができる。焼成工程は、レアアース含有無機化合物が非晶質である場合などにおいて、結晶化を促進するために行うことができる。あるいは焼成工程は、水酸化物などから脱水して酸化物に変換させるために行うことができる。
【００９９】
結晶化のための焼成工程は、公知の非晶質化合物を結晶化するための条件に基づいて行うことができる。例えば、３００℃以上１５００℃以下とすることができる。ミネラリゼーションによるレアアース含有無機化合物が炭酸塩などの無機塩類の場合、当該無機塩の状態を維持して結晶化するための加熱温度を設定することができる。また、脱炭酸等など無機酸を脱離させて酸化物を得る場合には、当該脱離が生じる温度を適宜選択することができる。
【０１００】
本製造方法は、ｎｍレベルのレアアース含有無機化合物の粒子を製造できるというメリットもある。なお、本製造方法は、本ペプチドとレアアース含有無機化合物との複合体の製造方法としても実施できる。
【実施例】
【０１０１】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０２】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリの構築）
２種類のオリゴヌクレオチドプライマーT7-Libup（ATG ATT ACC AGG ATC CGA ATT CAG GTG GAG GTT CG、配列番号３０）,T7-Libdownt（ACT ATC GTC GGC CGC AAG CTT TTA GCT、配列番号３１）を用いて、PCR反応を行い、テンプレートDNA（CGA ATT CAG GTG GAG GTT CGT GT(NNK)9-12 TGT AGC TAA AAG CTT GCG GCC GA、配列番号３２）を増幅した。
N＝A２５％、T２５％、G２５％、C２５％（A/T/G/Cの等量混合塩基）
K＝A０％、T５０％、G５０％、C０％の混合塩基
【０１０３】
増幅したDNA断片は、一般的なプロトコールに従ってフェノール処理、ブタノール濃縮を行った後,QIAquick PCR Purificationkit（QIAGEN）を用いて精製した。精製したDNAは、制限酵素Hind III、Eco RI（タカラバイオ）で処理した後、T7 select 10-3 vector arm(Novagen)にライゲーションし、T7ファージゲノムを構築した。
【０１０４】
構築したファージゲノムを、T7select packaging溶液（Novagen）と混合することで、ランダムペプチド遺伝子導入型のT7ゲノムDNAを有するT7ファージを構築した。この際、一部を用いて構築されたファージ集団の数を計測したところ、１．０×１０6〜４．０×１０7の配列多様性を有するファージライブラリが構築されていることを確認した。
【０１０５】
構築したファージ集団は、OD660nm＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E.coli BLT5403株に感染させ増幅後、８％ポリエチレングリコール、０．２２μｍフィルター処理を行うことで濃縮・精製した。精製後にファージ数を計測した結果、各ライブラリは約１．０×１０12pfu／mlのファージを有しており、ペプチドファージ１種あたり１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅していることを確認した。
【実施例２】
【０１０６】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリを用いた酸化ジスプロシウムに対するバイオパンニング）
実施例１にて作製したランダムペプチド提示型T7ファージライブラリにより、酸化ジスプロシウムに結合するペプチドを提示するT7ファージの単離を試みた。一連のスキームを図１に示す。
【０１０７】
酸化ジスプロシウム(Sigma-Aldrich)をメタノール：アセトン混液（１：１）で洗浄し、次いでイソプロパノールにて洗浄後、TBSに分散させた。
【０１０８】
５００μｇの酸化ジスプロシウムを分散させた溶液とT7ファージライブラリを混合し、１時間室温にて反応後、遠心（６０００ｒｐｍ、３分）により粒子を沈殿させ上清を除去することで、非結合ファージを除去した。
【０１０９】
上清除去後、TBSTを加えて酸化ジスプロシウムを分散させ、再度遠心操作して粒子に非特異的に結合したファージの除去を試みた。本操作（洗浄操作）を、３〜１０回繰り返すことで,酸化ジスプロシウムに非特異的に結合するペプチドファージの除去を行った。
【０１１０】
非結合ファージ、非特異的に結合しているファージを洗浄により除去した後、OD660nm ＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E.coli BLT 5403溶液１０ｍｌと混合し、大腸菌が完全に溶菌するまで３７℃で培養を行った。
【０１１１】
大腸菌が完全に溶菌した後、培養溶液に対して１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌを加え遠心（３５００ｒｐｍ、１５分）を行い、大腸菌の細胞壁などの不溶性画分を沈殿させ、上清を回収した。
【０１１２】
回収した上清に対して、１／６量の５０％ポリエチレングリコール６０００溶液を加え、撹拌後３５００ｒｐｍで１５分遠心しT7ファージを沈殿させた。沈殿したT7ファージ集団は、TBS溶液で溶解後、０．２２μｍフィルター処理を行い、使用まで４℃で保存した。
【実施例３】
【０１１３】
（バイオパンニングにより酸化ジスプロシウム結合ファージの濃縮確認）
実施例２の一連の操作について５回繰り返した後、各ラウンド後のファージについて酸化ジスプロシウムに対する結合ファージ数を測定した。
【０１１４】
まず、酸化ジスプロシウムをメタノール・アセトン混液（１：１）で洗浄し、次いでイソプロパノールにて洗浄後TBSに分散させた。
【０１１５】
５００μｇの酸化ジスプロシウムを分散させた溶液と各ラウンド後のファージプールをそれぞれ混合し、１時間室温下にて反応後、遠心分離（６０００ｒｐｍで３分）し、上清を除去した。次いで、ＴＢＳＴにて１０回洗浄操作を行った。
【０１１６】
洗浄後、酸化ジスプロシウム粒子に結合したファージ数をプラークアッセイにより測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、パンニングのラウンドを重ねるにつれ、酸化ジスプロシウム粒子に対する結合ファージ数の上昇が確認された。これらの結果から、ラウンドを重ねることで酸化ジスプロシウムに対する結合能に優れたペプチドを提示するファージをスクリーニングできることがわかった。
【実施例４】
【０１１７】
５ラウンドのパンニングを行った後のファージプールについて、単クローン化を行い、ランダムに選択した３５種のファージについて提示ペプチド配列解析を行った結果、３１種の配列が確認された。以下に特徴的な７種のアミノ酸配列を示す。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
表１に示すように、９−４（LOB1）及び１０−２０（LOB2）の配列は、それぞれ４クローン及び２クローンで重複が確認され、また、その他のアミノ酸配列とは異なり塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ及びＨ）が含まれていなかった。
【実施例５】
【０１２０】
（酸化ジスプロシウムに結合するペプチドを提示する単クローンファージのスクリーニング）
実施例４において同定されたペプチドファージのうち、表１に示す特徴的な配列を有するファージクローンについて、酸化ジスプロシウムに対する結合性の評価を行った。
【０１２１】
洗浄しTBSに分散させた酸化ジスプロシウム５００μｇと各ファージをそれぞれ混合し、１時間室温下にて反応後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３分）し、上清を除去した。次いで、TBSTにて１０回洗浄操作を行った。洗浄後、酸化ジスプロシウム粒子に結合したファージ数をプラークアッセイ法により測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、配列の重複が確認された９−４（LOB1）及び１０−２０（LOB2）について、野生型と比較して１００倍程度のファージ結合数が確認された。
【実施例６】
【０１２２】
（合成ペプチドの調製）
酸化ジスプロシウムへの結合が確認されたLOB1及びLOB2の各ファージが提示するペプチドにつて、Fmoc固相合成法により、合成ペプチドを調製した。なお、合成ペプチドのＮ末端には、ｇ１０配列由来のGGGを介してビオチン化を行った。
【０１２３】
樹脂より切り出し脱保護したペプチドは、ヨウ素等の適当な酸化剤で分子内ジスルフィド結合を形成させた後、逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥した。
【実施例７】
【０１２４】
（合成ペプチドと酸化ジスプロシウムの結合評価）
実施例６にて調製した合成ペプチド（LOB2）とマイクロプレートに固定した酸化ジスプロシウムの結合評価を行った。
【０１２５】
洗浄し、イソプロパノールに分散させた酸化ジスプロシウム５μｇをマイクロプレートに添加し、真空下で一時間乾燥固定した。
【０１２６】
乾燥固定したマイクロプレートを超純水で洗浄後、０．５％BSAを４００μｌ加えて９０分間室温で静置してブロッキングし、TBSTにて３回洗浄した。
【０１２７】
合成ペプチドLOB2（最終濃度８０ｎＭ）とSA-HRP（最終濃度２０ｎＭ）を混合して、１０分間反応させた後、TBSTで５回洗浄した。
【０１２８】
マイクロプレートの洗浄後、各ウェルにTMB溶液を加え、ある程度の発色が確認された後、１ＮＨＣｌを添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーSpectra max plus 384にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。これにより酸化ジスプロシウム粒子に対する合成ペプチドの結合能を評価した。なお、ランタノイドイオン結合ペプチド（Ｌａ−ＢＰ、アミノ酸配列：GGGSFIDTNNDGDWIEGDELLA、配列番号３８）をネガティブコントロールとして使用した。結果を図４に示す。
【０１２９】
図４に示すように、LOB2は、濃度依存的に酸化ジスプロシウムに対して特異的な結合能を示した。
【実施例８】
【０１３０】
（合成ペプチドの結合特異性評価）
実施例７と同様の手法で、LOB1及びLOB2の各合成ペプチドと、マイクロプレートに固定したレアアースの金属酸化物粒子（Ｌａ2Ｏ3、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3、Ｓｍ2Ｏ3、Ｇｄ2Ｏ3、Ｔｂ4Ｏ7、Ｄｙ2Ｏ3、Ｈｏ2Ｏ3、Ｅｒ2Ｏ3、Ｙｂ2Ｏ3、Ｙ2Ｏ3、ＴｉＯ2、ハイドロキシアパタイト、Ａｇ）の総合評価を行った。LOB1及びLOB2についての結果を、図５及び図６に示す。
【０１３１】
図５に示すように、LOB2は、Ｌａ2Ｏ3、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3、Ｓｍ2Ｏ3、Ｇｄ2Ｏ3、Ｄｙ2Ｏ3、Ｈｏ2Ｏ3、Ｅｒ2Ｏ3に対して高い結合能を有していた。なかでも、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3、Ｇｄ2Ｏ3、Ｄｙ2Ｏ3に対して高い結合能を有し、さらには、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3に対して高い結合能を有し、Ｎｄ2Ｏ3に対して最も高い結合能を有していた。なお、Ｌａ−ＢＰは、Ｌａ2Ｏ3にはほとんど結合せず、ＣｅＯ2には若干結合性を示したが、LOB2の結合能とは比較にならない程度であった。
【０１３２】
図６に示すように、LOB1は、Ｌａ2Ｏ3、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3、Ｓｍ2Ｏ3、Ｇｄ2ｏ3、Ｔｂ4Ｏ7、Ｄｙ2Ｏ3、Ｈｏ2Ｏ3、Ｅｒ2Ｏ3に対して高い結合能を有していた。なかでも、ＣｅＯ2、Ｎｄ2Ｏ3、Ｇｄ2Ｏ3、Ｄｙ2Ｏ3に対して高い結合能を有し、さらには、Ｌａ2Ｏ3、ＣｅＯ2、Ｈｏ2Ｏ3に対して高い結合能を有し、Ｌａ2Ｏ3、ＣｅＯ2に対して最も高い結合能を有していた。
【０１３３】
以上の結果から、合成ペプチドLOB1及びLOB2は、ランタノイド系のレアアースの複数の酸化物に対して結合能を有する一方、それぞれ、それらの酸化物に対しては異なる結合特異性を示すことがわかった。
【実施例９】
【０１３４】
（LOB2ペプチドのアラニン置換試験）
LOB2ペプチドのアミノ酸配列の各位置において、アラニンに置換されたペプチド配列を提示するＴ７ファージを、実施例１に示すＴ７−Ｌｉｂｕｐ、Ｔ７−Ｌｉｂｄｏｗｎと表２に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施例１と同様の手法で作製した。作製したファージの提示するペプチド配列を図７に示す。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
作製したLOB2−ａｌａ置換体ファージについて、実施例７と同様の方法でＤｙ2Ｏ3に対する結合を評価した。結果を図８に示す。
【０１３７】
図８に示すように、第３位、４位、１０位、１２〜１４位において、アラニン置換の影響が大きく結合量が低下した。また、第２位、６位及び９位のアラニン置換の影響も大きかった。以上のことから、第３位、４位、１０位、１２〜１４位においては、それぞれ、ロイシン、トリプトファン、ロイシン、フェニルアラニン、ロイシン及びシステインであることが好ましいことがわかった。また、第２位、６位、９位については、それぞれ、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸であることが好ましいことがわかった。
【実施例１０】
【０１３８】
（部分変異ライブラリの構築）
LOB1及びLOB2にならい、１４残基又は１５残基のペプチドライブラリの各位置において、１，２残基目はSer、Cysで、１３、１４残基目又は１４、１５残基目は、Cys、Serで固定して、それ以外の位置は、酸化ジスプロシウム結合ペプチド由来のアミノ酸が３０％前後の確率で出現するようなライブラリを作製した。
【０１３９】
２種類のテンプレートDNA（LOB1-2nd、LOB2-2nd）を用いて実施例１と同様の手法で部分変異ライブラリを作製した。
LOB1-2nd：CGA ATT CAG GTG GAG GTT CGT GTN JFJ OOE ONO FNE JNF ONO FNN JFO FNJ JNN JFT GTA GCT AAA AGC TTG CGG CCG A（配列番号５４）
LOB2-2nd：CGA ATT CAG GTG GAG GTT CGT GTN JFJ OOE ONO FNE JNF ONO FNN JFO FNJ JNN JFT GTA GCT AAA AGC TTG CGG CCG A（配列番号５５）
【０１４０】
２種類のテンプレートDNAにおけるＦ、Ｊ、Ｏ、Ｘ、Ｎ、Ｂ、Ｅ及びＰは、それぞれ以下の塩基配列の偏りになるようにランダムに合成されたＤＮＡ配列を示す。
【０１４１】
Ｆ＝A７０％、T１０％、G１０％、C１０％の混合塩基
Ｊ＝A１０％、T７０％、G１０％、C１０％の混合塩基
Ｏ＝A１０％、T１０％、G７０％、C１０％の混合塩基
Ｘ＝A１０％、T１０％、G１０％、C７０％の混合塩基
Ｎ＝A、T、G、Cの等量混合塩基
Ｂ＝T、G、Cの等量混合塩基
Ｅ＝A２０％、T２０％、G４０％、C２０％の混合塩基
Ｐ＝A２０％、T２０％、G２０％、C４０％の混合塩基
【０１４２】
構築されたファージ集団の数を計測したところ、LOB1部分変異ライブラリで３．０×１０7、LOB2部分変異ライブラリで８．０×１０7の多様性を有するファージライブラリが構築されていることを確認した。
【実施例１１】
【０１４３】
（部分変異ライブラリを用いたバイオパンニングと単離ファージの提示ペプチド配列解析）
実施例２と同様にして、実施例１０にて作製した部分変異ライブラリを用いたて酸化ジスプロシウムに対するバイオパンニングを５回行った。その後、得られたファージプールを単クローン化し、実施例４と同様に、得られたファージが提示するペプチドのアミノ酸配列を解析した。LOB2ライブラリ及びLOB1ライブラリにおいてクローン化されたファージのペプチドのアミノ酸配列を図９及び図１０に、それぞれ示す。
【０１４４】
図９に示すように、LOB2ペプチドの部分変異ライブラリでは、LOB2に本来存在していた酸性アミノ酸残基が保存される傾向があった。なかでも、９残基目の酸性アミノ酸残基（グルタミン酸）は、グルタミン酸又はアスパラギン酸として１１クローン中１０クローンで維持されていた。次いで、１１残基目の酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸）は、アスパラギン酸又はグルタミン酸として、１１クローン中６クローンで維持されていた。６残基目の酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸）も、アスパラギン酸又はグルタミン酸として１１クローン中５クローンで維持されていた。他の位置についても、LOB2ペプチドが備えているアミノ酸残基の特性（中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸、環状アミノ酸、含硫アミノ酸、酸アミドアミノ酸）の特性を維持する傾向があった。
【０１４５】
図１０に示すように、LOB1ペプチドの部分変異ライブラリでは、LOB1に本来存在していた酸性アミノ酸残基が保存される傾向があった。すなわち、９残基目の酸性アミノ酸残基（グルタミン酸）は、グルタミン酸又はアスパラギン酸として全クローン（１４クローン）で維持されていた。他の位置についても、LOB1ペプチドが備えているアミノ酸残基の特性（中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸、環状アミノ酸、含硫アミノ酸、酸アミドアミノ酸）の特性を維持する傾向があった。
【０１４６】
（LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性評価）
LOB2ペプチドとジスプロシウムイオンとの結合について評価した。HEPESバッファ（HEPES １ｍＭ、ｐＨ６．２）に硝酸ジスプロシウム（ジスプロシウムはイオンとして存在）とDMSOに溶解したペプチドをそれぞれ１ｍＭ、１０μＭ（ＤＭＳＯ５％）になるように希釈し、エッペンドルフチュ中に室温下で静置した。
【０１４７】
５時間経過後、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清を除去後、１００μｌの超純水を加えてよく撹拌洗浄した。こした遠心と撹拌洗浄を２回繰り返した後、２０μｌの超純水で沈殿をよく分散させ、ＴＥＭ、ＥＤＸ（日立ハイテクノロジーズ）による解析結果を図１１及び図１２に示す。
【０１４８】
図１１に示すように、ＴＥＭによれば、LOB2ペプチドとジスプロシウムイオンと接触によりなんらかの粒子が生成していることが確認できた。図１２に示すように、また、その生成粒子は、ＥＤＸによりジスプロシウムを含んでいることがわかった。
【０１４９】
以上のことから、LOB2ペプチドは、酸化ジスプロシウムと結合するほか、ジスプロシウムイオンから、ジスプロシウムの無機化合物を析出させる能力を有していることがわかった。
【実施例１２】
【０１５０】
（LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性におけるインキュベーションｐＨの影響）
ＨＥＰＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ １ｍＭ、ｐＨ７．５）にLOB2ペプチドを１０μＭ（ＤＭＳＯ ３％）になるように希釈し、０．１ＮＨＣｌ又は０．１ＭＮａＯＨを用いてｐＨを３．９〜８．０に調整後、硝酸ジスプロシウムイオンを加えて室温下で揺らしながらインキュベートした。
【０１５１】
５時間インキュベート後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去後、１００μｌの超純水を加えて良く撹拌洗浄した。こうした遠心と撹拌洗浄を２回繰り返した後、２０μｌの超純水で沈殿を分散させ、カーボンテープ上に１０μｌ滴下し、クリンベンチ内で完全に乾燥するまで放置し、ＳＥＭ／ＥＤＸ解析した。結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。
【０１５２】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、広い範囲のｐＨでミネラリゼーション活性を呈し、ジスプロシウムの無機化合物を取得できることがわかった。本実施例においては、ｐＨ５．０以上ｐＨ８．０以下の範囲で良好なミネラリゼーションを確認できた。
【実施例１３】
【０１５３】
（LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性における反応温度の影響）
ＨＥＰＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ １ｍＭ、ｐＨ７．５）にLOB2ペプチドを１０μＭ（ＤＭＳＯ ３％）になるように希釈し、硝酸ジスプロシウムイオンを加えて４℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃及び８０℃の温度下で静置してインキュベートした。
【０１５４】
５時間インキュベート後、実施例１２と同様に、遠心及び撹拌洗浄して、最終的に沈殿を取得し、ＳＥＭ／ＥＤＸで解析した。結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
【０１５５】
図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、広い温度範囲でミネラリゼーション活性を呈し、酸化ジスプロシウムを取得できることがわかった。本実施例においては、４℃以上８０℃以下の範囲で良好なミネラリゼーションを確認できた。
【実施例１４】
【０１５６】
（LOB2ペプチドのミネラリゼーション活性により生成する粒子の粒径）
ＨＥＰＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ １ｍＭ、ｐＨ７．５）にLOB2ペプチドを１０μＭ（ＤＭＳＯ ３％）になるように希釈し、硝酸ジスプロシウムイオンを加えて室温下で揺らしながら５時間インキュベートした。
【０１５７】
５時間経過後、実施例１２と同様に、遠心及び撹拌洗浄して、最終的に沈殿を取得し、ＴＥＭで解析した。結果を図１５に示す。
【０１５８】
図１５に示すように、得られたジスプロシウムの無機化合物粒子は、概して５ｎｍ以下であり、ナノメータレベルの粒子が得られていることを確認できた。
【配列表フリーテキスト】
【０１５９】
配列番号１〜２９、３３〜３８：合成ペプチド
配列番号３０〜３２、３９〜５５：合成ヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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