(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
碁石茶（登録商標）抽出物を含有するニトロ化タンパク質分解剤。
【請求項２】
碁石茶（登録商標）抽出物を含有するニトロ化チロシン分解剤。
【請求項３】
碁石茶（登録商標）抽出物を含有する黄ぐすみ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトロ化タンパク質分解に関し、更に詳しくは碁石茶（登録商標）抽出物を含有するニトロ化タンパク質分解剤、ニトロ化チロシン分解剤、黄くすみ改善剤に関する。以下、ニトロ化タンパク質を単にニトロ化タンパクと称する場合があるが、同義である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のニトロ化とは、生体内で発生した活性窒素種によって生じるタンパク質翻訳後修飾のひとつであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸のチロシン、トリプトファンの残基中のベンゼン環にニトロ基が付与されたものである。ニトロ化反応はアミノ酸中のベンゼン環が、活性窒素種により形成されるニトロニウムイオン（NO２＋）や二酸化窒素ラジカルなどと求電子置換反応をおこすことで生じる（非特許文献１）。生体内に存在する多くのタンパク質中のトリプトファンの含有率はチロシンのそれよりもはるかに小さく、タンパク質のニトロ化反応は主にチロシン残基に生じると考えられている（非特許文献２）。
タンパク質のニトロ化が起きると、酵素やチロシンキナーゼ型受容体の機能低下を引き起こすことで、細胞機能に影響を及ぼすことが知られる（非特許文献３）。また、タンパク質中のニトロチロシンは加齢に伴う数々の疾患（動脈硬化や脳虚血疾患など）で蓄積することが知られており、これらの疾患に関与することが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
皮膚では加齢に伴い、シワ、たるみ、シミ、くすみ等の変化が生じる。
くすみにはさまざまな種類があり、透明感の減少によるくすみ（皮膚表面の凹凸による影によるもの、角層肥厚による光透過性の低下によるもの、皮膚表面での乱反射によるつやの低下によるものなど）、皮膚の赤みの低下によるくすみ（血行不良による）、皮膚の色ムラによるくすみ（メラニンの不均一性）、加齢に伴う皮膚の黄みの増加によるくすみなどがある（非特許文献５）。
中でも加齢に伴う皮膚色の黄み（ｂ*）の増加は、黄ぐすみとして知られ、老化に伴う特徴的な皮膚の色調変化である。従来、黄ぐすみの主な原因は、真皮中に存在するエラスチンやコラーゲン等のタンパク質の糖化物（特許文献１）やタンパク質のカルボニル化物（特許文献２）であると考えられていた。
【０００４】
ニトロ化タンパク生成に伴う各種疾患を改善するため、ペルオキシナイトライトを消去する効果成分の提案や（特許文献３）や、チオール基をもつ物質によるペルオキシナイトライト補足する効果成分の提案（特許文献４）がなされてきた。しかしながら、これらはすべて専らニトロ化タンパクの生成を抑制するのみであり、出来てしまったニトロ化タンパクに対しては何らの改善もされていない。その為、ニトロ化タンパク生成に伴う各種疾患の根本的な解決に至っていない。
【０００５】
一方、碁石茶は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉を収穫後、蒸して自然発酵を停止させ、その後、むしろの中で寝かす間に好気性カビ、桶に浸ける間に嫌気性バクテリアによって発酵を行う、二段発酵茶である。碁石茶中に含まれる成分としては、アスコルビン酸やカテキン化合物が他の茶類と比較して少なく、特有の活性成分を含む可能性が指摘されており、高脂血症及び動脈硬化抑制効果（非特許文献６）、動血圧上昇抑制効果（特許文献５）が知られているが、ニトロ化タンパクの分解効果については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chem Res Toxicol. 2009 May ; 22(5):894−898
【非特許文献２】Front Chem. 2016 Jan 7;3:70.
【非特許文献３】Ｄｉａｂｅｔｅｓ. ２００８ Ａｐｒ;５７(４):８８９−９８
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２０００ Ｎｏｖ ３;２９０(５４９３):９８５−９.
【非特許文献５】日本化粧品工業連合会，粧工連技術資料， 101-148 (1995)
【非特許文献６】宮村充彦，森山洋憲， 邑田修三，横田淳子，吉岡三郎，宅間大祐， 濱田篤秀，西岡 豊.  コレステロール負荷家兎における後醗酵茶「碁石茶」の高脂血症及び動脈硬化抑制効果. YAKUGAKU ZASSHI l28:1037−1044, 2008.
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１３３３０３号
【特許文献２】特開２０１２−３２２８７号
【特許文献３】特開２００２−３２６９２２号
【特許文献４】特開２００５−１７０８４９号
【特許文献５】特開２０１４−４３４０６号
【発明の概要】
【０００８】
このような状況下、発明者らは、ニトロ化タンパク生成に伴う各種疾患を根本的に解決するには、単にその生成を抑制するのではなく、出来てしまったニトロ化タンパクを分解することこそが、根本的解決につながるとの結論に至った。
【０００９】
合わせて、黄ぐすみの原因に関し研究を行ったところ、黄ぐすみの原因は、従来考えられていた真皮中に存在するタンパク質の糖化物やカルボニル化物だけではなく、角層中に存在するタンパク質を構成するアミノ酸がニトロ化されることによって生じるニトロ化タンパクが大きな原因となっていることを解明し、更には碁石茶抽出物によって当該ニトロ化タンパクを分解することが出来ることを突き止め、発明完成に至った。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、出来てしまったニトロ化タンパクを分解する成分を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、碁石茶抽出物を用いることで上記課題を解決した。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明によれば、出来てしまったニトロ化タンパクを分解することが出来、ニトロ化タンパクに起因する動脈硬化や脳虚血疾患、細胞機能低下、黄ぐすみ等の各種症状を改善することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】タンパク質中のニトロチロシン量と黄ぐすみとの関係
【図２】各被験素材のニトロ化タンパクの分解度比較
【図３】各被験素材の抗酸化効果比較
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施の形態について説明する前に、本発明者らが得た新知見について説明する。
【００１５】
＜黄ぐすみの要因の特定＞
発明者らは、以下の方法により黄ぐすみの原因が、角層中のタンパク質がニトロ化されることにより生成されるニトロ化タンパクであることを突き止めた。
【００１６】
＜実験方法＞
事前に測定内容に同意を得た２０、３０、４０、５０代の女性（各４−５名）を被験者に、頬部の皮膚色を分光測色計（ＣＭ−７００ｄ、コニカミノルタ）にて測定し、頬部角層の採取を行った。角層の採取は、頬部に粘着テープ（スリーエム製）を接着し、角層を採取した。角層が接着したテープを約３ ｍｍ四方に細切し、溶出バッファー（１００ ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ (ｐＨ ８．０)、１４０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ μｇ／ｍＬ アプロチニン、１ ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙＬ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）が入ったチューブに混合した。この混合物を超音波処理することで、テープから角層タンパク質をバッファー中に溶出した。溶出溶液を新しいチューブに移して遠心操作を行い、上清を回収したものを角層抽出物サンプルとした。
角層抽出物サンプル中の３−ニトロチロシン量はＮＷＬＳＳＴＭ Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ）を用いて定量し、角層抽出物サンプルのタンパク質量はBCA法にて定量した。３−ニトロチロシン量をタンパク質量で除したものを、角層タンパク質あたりの３−ニトロチロシン量とした。
【式１】
【００１７】
0006557166.tif 000002
【００１８】
＜結果＞  
頬部の角層タンパク質あたりの３−ニトロチロシン量と皮膚色の黄み（ｂ*値）の関係について、ピアソンの相関関係の検定を行ったところ、これらに正の相関関係にあることが明らかとなり、角層にニトロ化タンパク質が多いほど、頬部の皮膚は黄色化することが強く示された（図１）。
【００１９】
この結果を年齢層別に分析すると、表１に示すとおり、２０〜３０代の層より、４０〜５０代の層の方が、ニトロ化タンパクの量と皮膚色の黄み（ｂ*値）間の相関関係が高いことが分かった。
このことから、ニトロ化タンパクを分解できれば、肌の黄ぐすみを改善できることは勿論のこと、その素材の効果はより高い年齢層における肌の黄みの改善に期待出来ると言える。
【００２０】
【表１】
0006557166.tif 000003
【００２１】
本発明で使用する碁石茶は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉を収穫後、蒸して自然発酵を停止させ、その後、むしろの中で寝かす間に好気性カビ、桶に浸ける間に嫌気性バクテリアによって発酵を行う、二段発酵茶である。高知県で伝統的に製造されているので、市販品を使用することができる他、特開2014-43406号や、特開2009-183272号等に記載の方法で製造して得ることもできる。
【００２２】
碁石茶抽出物の調製は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。就中、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。  
【００２３】
本発明に用いることのできる碁石茶抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものであれば重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。また、１０℃以下の抽出溶媒が凍結しない程度の温度で、１時間以上、特に１〜７日間抽出を行なっても良い。
【００２４】
以上のような条件で得られる碁石茶抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００２５】
本発明の各剤における碁石抽出物の配合量は、蒸発乾燥分に換算して０．００００１〜２０．０重量％が好ましく、特に０．００１〜１０．０重量％の範囲が最適である。
【００２６】
本発明の各剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他成分を併用することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。また、特記しない限りエタノールは試薬特級（９９．５％）を用いた。
【００２８】
＜被験物質の調製＞ 
乾燥植物原体に１０倍の重量の５０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液を加えて６０℃、４時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で１：２．５：９６．５となるように加えて希釈したものを被験物質とした。なお用いた茶葉は、不発酵茶（緑茶、番茶、ほうじ茶）、茶葉を酸化酵素で半発酵させた半発酵茶（ウーロン茶）、茶葉を酸化酵素で完全発酵させた発酵茶（紅茶）、茶葉を酸化酵素および微生物により発酵させた後発酵茶（プーアール茶、碁石茶）である。
【００２９】
＜ニトロ化タンパク質分解活性試験＞
ニトロ化タンパクの構成アミノ酸である３−ニトロチロシンをＰＢＳに溶解し、０．００５％（w/v）の濃度の溶液を調製した。ＰＢＳまたは３−ニトロチロシン溶液を９６ ｗｅｌｌ-ｐｌａｔｅに２５０ μＬずつ分注し、被験物質および対照物質を各ｗｅｌｌに終濃度が１００ ｐｐｍになるよう添加した。３７℃で７２時間インキュベートしたのち、プレートリーダーにて４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
【式２】
【００３０】
0006557166.tif 000004
【００３１】
図２より、対照物質（コントロール）および不発酵茶抽出物（緑茶、番茶、ほうじ茶）、半発酵茶（ウーロン茶）、発酵茶（紅茶）、後発酵茶（プーアール茶）では、ニトロ化タンパクの構成アミノ酸である３−ニトロチロシンの分解度は０〜７％程度に留まった。
一方、後発酵茶である碁石茶抽出物は、ニトロ化タンパクの構成アミノ酸である３−ニトロチロシン分解率は２０％を超えた。以上のことから、碁石茶抽出物には、ニトロ化タンパクを分解する効果があることが示された。
【００３２】
＜抗酸化効果試験＞
ＤＰＰＨ試験
＜ＤＰＰＨ溶液の調製＞ＤＰＰＨ溶液は、以下に示す各成分を、（Ａ）：（Ｂ）：（Ｃ）＝１：４：３容量の割合 で混合し調製する。 
（Ａ）ＭＥＳ（２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸）５．５２ ｇを水１００ ｍＬに溶か し、１Ｎ−ＮａＯＨでＰＨ６．１に調製する。
（Ｂ）ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニルー２−ピクリルヒドラジル）１５．７ ｍｇをエタノール１００ ｍＬに溶解する。
（Ｃ）精製水 
＜Ｔｒｏｌｏｘ溶液の調製＞ Ｔｒｏｌｏｘ ２５ ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１０ｍＬに溶解し、１０ｍＭ 溶液を作成した。
＜ＤＰＰＨ試験＞１０ μＬの被験物質またはＴｒｏｌｏｘ溶液（０．０７８ ｍＭ、０．１５６ ｍＭ、０．３１３ ｍＭ、０.６２５ ｍＭ、１．２５ ｍＭ）を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中に加え、次いでＤＰＰＨ溶液１９０ μＬを迅速に加え混合する。１０分後、各ｗｅｌｌの吸光度を５４０ ｎｍ で測定する。Ｔｒｏｌｏｘ濃度と５４０ ｎｍの吸光度値の検量線を作成し、被験物質の５４０ ｎｍの吸光度から、被験物質のＴｒｏｌｏｘ当量を算出した。
【００３３】
図３より、各被験物質の抗酸化力（Ｔｒｏｌｏｘ等量）は、緑茶抽出物が最も高く、ついで紅茶抽出物、ほうじ茶抽出物、碁石茶抽出物の順であった。図２では、碁石茶抽出物のみにニトロ化タンパク構成アミノ酸である３−チロシン分解活性が認められたため、抗酸化力とニトロ化タンパク分解力には関係がないことが考えられた。同時に、碁石茶抽出物が他の茶類の抽出物とは全く異なる性質を有することが示唆された。
【００３４】
以下、本発明における各剤の処方例を示す。なお、含有量は質量％である。製法は、常法による。なお、処方は代表例であり、これに限定されない。また、処方例中の碁石茶抽出物の濃度は乾燥残分としての濃度である。
【００３５】
＜処方例１：軟膏＞
碁石茶抽出物（１，３ブチレングリコール５０ｖ／ｖ％溶媒・６０℃・４時間抽出）                                         ０.１
レゾルシン                                            ０.５
パラジメチルアミノ安息香酸オクチル                    ４.０
ブチルメトキシベンゾイルメタン                        ４.０
ステアリルアルコール                                １８.０
モクロウ                                            ２０.０
グリセリンモノステアリン酸エステル                    ０.３
ワセリン                                            ３３.０
香料                                                  適 量
防腐剤・酸化防止剤                                    適 量
精製水                                                残 部
合  計                                            １００.０
【００３６】
＜処方例２：錠剤＞
碁石茶抽出物 （エタノール５０ｖ／ｖ％水溶液溶媒・２５℃・３日抽出）                                                 ５．０
卵殻カルシウム                                            １０．０
乳糖                                                      ２０．０
澱粉                                                        ７．０
デキストリン                                                ８．０
硬化油                                                      ５．０
セルロース                                                  残部
合計                                                                                             １００．０
【００３７】
＜処方例３：栄養ドリンク＞
碁石茶抽出物（水・６０℃・４時間抽出）          １.０
タウリン                                          ３．０
ピリドキシン塩酸塩                         ０．０２
チアミン硫化物                                ０．０１
リボフラビン                                   ０．００３
無水カフェイン                                ０．０５
精製白糖                                          ５．０ 
D−ソルビトール液                         ２．０
クエン酸無水物                                ０．２
香料                                                 適量 
精製水                                              残部
合計                                                 １００．０
【００３８】
＜処方例４：化粧水＞  
碁石茶抽出物（エタノール溶媒・５℃・１日抽出）                      ０．０１
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）       １．５
１，３−ブチレングリコール                                      ４．５
グリセリン                                                      ３．０
エタノール                                                      ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液）                            ５．０
エデト酸三ナトリウム                                            ０．１
防腐剤                                                          適量
ｐＨ調整剤                                                      適量
精製水                                                          残部
合計                                                        １００．０
【００３９】
＜処方例５：ファンデーション＞
碁石茶抽出物（エタノール溶媒・２５℃・１日抽出）                                        ０.０５
タルク                                                ５.０
セリサイト                                            ８.０
酸化チタン                                            ５.０
色顔料                                                適 量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル                    ３.０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                        １.５
イソノナン酸イソトリデシル                          １０.０
１，３−ブチレングリコール                            ５.０
酸化防止剤                                            適 量
防腐剤                                                適 量
精製水                                                残 部
合  計                                            １００.０
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、碁石茶抽出物を用いることで、ニトロ化タンパク質を分解することが出来るので、ニトロ化タンパク質の生成に起因する各種症状を改善することが期待出来る。
【図１】
0006557166.tif 000005
【図２】
0006557166.tif 000006
【図３】
0006557166.tif 000007