(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するに際し、
前記ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する方法であって、
前記ヘタ離れ形質関連遺伝子がエチレン合成遺伝子であるＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）であり、
前記プライマー対が、配列番号３５に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるヘタ離れ性の有無を判別する方法。
【請求項２】
イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するに際し、
前記ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する方法であって、
前記ヘタ離れ形質関連遺伝子がエチレン合成遺伝子であるＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）であり、
前記プライマー対が、配列番号３７に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、
配列番号３９に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、
配列番号４１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、
配列番号４３に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるヘタ離れ性の有無を判別する方法。
【請求項３】
前記増幅したＤＮＡ断片の長さに基づいてヘタ離れ性の有無を判別する請求項１または２に記載のヘタ離れ性の有無を判別する方法。
【請求項４】
前記増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する請求項１または２に記載のヘタ離れ性の有無を判別する方法。
【請求項５】
配列番号３５に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、
配列番号３７に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、
配列番号３９に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、
配列番号４１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、
配列番号４３に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、の少なくとも一つのプライマー対を有する、
イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するヘタ離れ形質判定用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別する方法およびヘタ離れ形質判定用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
イチゴは、生食あるいはジャム用原料として広く栽培されている。イチゴ品種「ベニヒバリ」（品種登録  第4474号（1995年））は、加工用品種「アメリカ」を母、生食用品種「宝交早生」を父として交配・選抜された品種である。
【０００３】
イチゴを収穫する際には、例えばイチゴ果実（以下、単に果実と称する場合がある）に触れずに果梗付きで収穫する方法、および、果実を持って引張り果実のみを収穫する方法が行なわれている。後者の場合、例えば果実の赤道部付近を持って引張ると、果実と萼（がく）との境界付近で、果実および果実の一部が残り付いた萼に分離する。果実の一部が残り付いた萼のことは、一般に「ヘタ」と呼ばれる。
【０００４】
ベニヒバリは、果実を持って引張るだけで果実のみを収穫できる「ヘタ離れ形質」を有する（非特許文献１）。当該ヘタ離れ形質を有することで、例えば片手で容易に収穫することが可能となるため収穫作業の省力化および迅速化を図ることができ、収穫の迅速化によって果実の劣化を抑制でき、さらにヘタが異物として混入することを防止できるといったメリットにつながる。このようにヘタ離れ形質は、加工用イチゴでは有用な形質である。
【０００５】
また、ベニヒバリを用いた交配実験ではヘタ離れ形質の遺伝率は高いことが確認されており、ヘタ離れ形質は遺伝子によって制御されていると推測されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masanori Miyazaki, Hiroshi Sato, Masakazu Oku, and Takako Goto 著、"Characteristics of a New Processing Strawberry Cultivar, 'Benihibari'"、東洋食品工業短大・東洋食品研究所  研究報告書，２１，１−９（１９９６）
【非特許文献２】Toru Takahashi, Daizo Mori, Masakazu Oku, and Takako Goto 著、"Heritability of Capping Trait in Strawberry"、 東洋食品工業短大・東洋食品研究所  研究報告書，２４，９−１７（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
イチゴは８倍体の染色体を持ち、遺伝様式が複雑である。さらに、ヘタ離れ形質は複数の遺伝子が関与する量的形質である。以上の理由から、従来の交配を主軸とした遺伝学的なアプローチではヘタ離れに関与する遺伝子（ヘタ離れ形質関連遺伝子）の特定が困難である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヘタ離れ形質関連遺伝子を利用してヘタ離れ性の有無を判別する方法、および、ヘタ離れ形質判定用プライマー対を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［５］に示す発明を提供する。
［１］  イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するに際し、前記ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する方法であって、前記ヘタ離れ形質関連遺伝子がエチレン合成遺伝子であるＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）であり、前記プライマー対が、配列番号３５に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるヘタ離れ性の有無を判別する方法。
［２］  イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するに際し、前記ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する方法であって、前記ヘタ離れ形質関連遺伝子がエチレン合成遺伝子であるＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）であり、前記プライマー対が、配列番号３７に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、配列番号３９に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、配列番号４１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、或いは、配列番号４３に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるヘタ離れ性の有無を判別する方法。
［３］  前記増幅したＤＮＡ断片の長さに基づいてヘタ離れ性の有無を判別する請求項［１］または［２］に記載のヘタ離れ性の有無を判別する方法。
［４］  前記増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する［１］または［２］に記載のヘタ離れ性の有無を判別する方法。
［５］  配列番号３５に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、配列番号３７に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、配列番号３９に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、配列番号４１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、或いは、配列番号４３に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせによるプライマー対、の少なくとも一つのプライマー対を有する、イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するヘタ離れ形質判定用プライマーセット。
【００１０】
本発明では、イチゴにおけるヘタ離れ形質関連遺伝子としてエチレン関連遺伝子に着目し、特にエチレン合成遺伝子であるエチレン合成酵素（ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素）が「ヘタ離れ形質」に大きく関与していることを見出した。即ち、本発明では、当該ヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する。
【００１１】
ヘタ離れ形質判定配列は、ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であり、ＤＮＡマーカー配列となり得る多型性などの特徴的なＤＮＡ配列を有するものとすることができる。
【００１２】
このようなヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対として、配列番号３５，３６の組み合わせ、或いは、配列番号３７，３８の組み合わせ、或いは、配列番号３９，４０の組み合わせ、或いは、配列番号４１，４２の組み合わせ、或いは、配列番号４３，４４の組み合わせ、を使用するとよい。
【００１３】
これらプライマー対を使用してＰＣＲによって核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片の長さに基づいてヘタ離れ性の有無を判別することができる。また、ヘタ離れ性の有無は、例えばハイブリダイゼーションを行うことにより、増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因に基づいて判別してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】イチゴのヘタ離れの様子を示す概略図である。
【図２】ヘタ離れ性の異なる品種のエチレン生合成酵素遺伝子の発現量の比較で使用したプライマー配列（配列番号１〜８）を示す図である。
【図３】各遺伝子の相対発現量を示した図である。
【図４】イチゴ果実の果梗部のエチレン量を測定した結果を示した図である。
【図５】エチレン生合成阻害剤（ＡＶＧ）を塗布した結果を示した図である。
【図６】網羅的塩基配列解析の結果を示した図である。
【図７】各遺伝子のヘタ離れ形質の寄与率調査で使用したプライマー配列（配列番号９〜３４）を示す図である。
【図８】ＡＣＳ遺伝子４グループ（Ａ：ａ〜ｄ）のそれぞれの発現量をグラフ化した図である。
【図９】ＡＣＯ遺伝子９グループ（Ｂ：ａ〜ｉ）のそれぞれの発現量をグラフ化した図である。
【図１０】品種間の配列差（多型）を検出する際に使用したプライマー配列（配列番号３５〜４４）を示す図である。
【図１１】ＡＣＳ遺伝子（１１２８１９５）の上流域の配列を示した図である。
【図１２】ＡＣＯ遺伝子（９９４４０６）の上流域の配列を示した図である。
【図１３】ＡＣＯ遺伝子（１０７７６８２）の上流域の配列を示した図である。
【図１４】配列番号３５，配列番号３６のプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片を確認した写真図である。
【図１５】配列番号３７，配列番号３８のプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片を確認した写真図である。
【図１６】配列番号３９，配列番号４０のプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片を確認した写真図である。
【図１７】配列番号４１，配列番号４２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片を確認した写真図である。
【図１８】配列番号４３，配列番号４４のプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片を確認した写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明は、イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別する方法である。
【００１７】
（ヘタ離れ性）
図１に示したように、イチゴ果実Ｘを収穫する際に、例えばヘタ離れ性を有するイチゴ品種である「ベニヒバリ」であれば、果実ａの赤道部付近を持って果梗付け根と反対方向に果実を引張ると、果実ａと萼（がく）ｂとの境界付近ｃで、果実ａおよび果実ａの一部が残り付いた萼ｂである「ヘタ」ｄに分離する。このように、ヘタ離れ性を有するイチゴ品種であれば、収穫の際には片手で果実をつまむと容易にヘタｄが分離して果実ａのみを収穫できる。
【００１８】
果実とヘタとの分離は、果実全体が軟化したために果実と萼との境界付近で破断が起こったのではなく、果実はある程度の硬さを有して成熟した状態で、果実と萼との境界付近において分離が起こっている。
【００１９】
（ヘタ離れ形質関連遺伝子）
本発明では、果実を持って引張るだけで容易に果実のみを収穫できる「ヘタ離れ形質」を有するヘタ離れ形質関連遺伝子として、エチレン関連遺伝子に着目している。
エチレンは、植物においては果実の成熟を促進する効果があり、成熟ホルモンの一つであると考えられている。クライマクテリック型の果実では、一般に成熟直後にエチレン生成量のピークを示す。エチレンが合成されるとセルラーゼに関与して細胞壁組織の破壊が誘導され、また、合成されたエチレンは、エチレン受容体、エチレン情報伝達因子などが関与して、果実の成熟が引き起こされると考えられる。
【００２０】
エチレンは、植物においては、メチオニン→Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）→１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）→エチレンという経路を通して合成される。この過程では、ＳＡＭからＡＣＣへの合成にＡＣＣ合成酵素が、ＡＣＣからエチレンの合成にＡＣＣ酸化酵素が関与する。
【００２１】
即ち、エチレン関連遺伝子としては、例えばエチレン合成遺伝子であるエチレン合成酵素（ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＳＡＭ合成酵素）などが挙げられる。
【００２２】
本発明のヘタ離れ性の有無を判別する方法は、ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型として核酸増幅し、増幅したＤＮＡ断片に基づいてヘタ離れ性の有無を判別する。
【００２３】
ヘタ離れ形質判定配列は、ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であれば特に限定されるものではなく、例えば、ＤＮＡマーカー配列となり得る、即ち、ヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置する多型性などの特徴的なＤＮＡ配列を有するものであればよい。具体的にはヘタ離れ形質関連遺伝子の上流域に存在するプロモーター配列や、上流域あるいは下流域に存在するエンハンサー配列、或いは、スペーサー配列等とすることができる。
【００２４】
本発明では、ヘタ離れ形質判定配列を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドであるプライマー対を使用して、対象となるイチゴ植物体より抽出した核酸を鋳型としてＰＣＲ法を適用し、特定のサイズのＰＣＲ増幅産物（増幅したＤＮＡ断片）が得られたことを指標としてヘタ離れ性の有無を判別する。ＰＣＲ法については、公知の手法を使用すればよい。本明細書における「イチゴ植物体」は、イチゴの果実・葉・花弁・根・茎等の少なくとも何れかの組織を含む試料のことをいう。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」は、数塩基〜数十塩基からなる核酸断片をいい、天然の核酸分子、遺伝子組換えによって得られた核酸分子、化学合成によって得られた核酸分子などが該当する。「プライマー」は、例えばＰＣＲなどの核酸増幅法などにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下で、１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、重合酵素であるポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得る数塩基〜数十塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
プライマー対の設計は、例えばプライマー設計ソフトであるOligo（Molecular Biology Insights社）を用いて設計すればよい。ＰＣＲ条件は、設計されたプライマーの塩基配列に応じて、適宜設定するとよい。
【００２７】
ヘタ離れ性の有無の判別は、例えば増幅したＤＮＡ断片の長さに基づいて行ってもよいし、増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因に基づいて行ってもよい。
【００２８】
増幅したＤＮＡ断片の長さは、増幅産物について電気泳動などを行って臭化エチジウムなどによって染色し、増幅したＤＮＡ断片をバンドとして検出することによって求めることができる。従って、増幅したＤＮＡ断片の長さが、ヘタ離れ形質判定配列の長さに一致するか否かを判断することにより、対象となるイチゴ植物体のヘタ離れ性の有無を判別することができる。
【００２９】
また、増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因として、増幅したＤＮＡ断片（ヘタ離れ形質判定配列）の全てあるいはその一部のフラグメントをハイブリダイゼーション用プローブとして用い、対象となるイチゴ植物体より抽出したゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションを行なうことが挙げられる。当該ハイブリダイゼーションは、例えばサザンハイブリダイゼーションを行なえばよい。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、増幅したＤＮＡ断片の全てあるいはその一部のフラグメントと、対象となるイチゴ植物体より抽出したゲノムＤＮＡとがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る条件で行なうとよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。
【００３１】
さらに、増幅したＤＮＡ断片に対して特異的に作用する要因として、当該増幅したＤＮＡ断片に結合する転写因子やタンパク質等を利用してヘタ離れ性の有無を判別してもよい。
【００３２】
〔別実施の形態〕
本発明のヘタ離れ性の有無を判別する方法は、ヘタ離れ性に関与するヘタ離れ形質関連遺伝子の近傍に位置するＤＮＡ配列であるヘタ離れ形質判定配列に対して特異的に作用する要因に基づいてヘタ離れ性の有無を判別するようにしてもよい。
【００３３】
ヘタ離れ形質判定配列に対して特異的に作用する要因として、ヘタ離れ形質判定配列の全てあるいはその一部のフラグメントをハイブリダイゼーション用プローブとして用い、対象となるイチゴ植物体より抽出したゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションを行なうことが挙げられる。当該ハイブリダイゼーションは、例えばサザンハイブリダイゼーションを行なえばよい。
【実施例】
【００３４】
〔実施例１〕
イチゴ果実のヘタ離れとエチレンとの関連性について調査するため、ヘタ離れ性の異なる品種のエチレン生合成酵素遺伝子の発現量を比較した。イチゴの品種は、ベニヒバリ、桃薫、宝交早生（ヘタ離れ性無し）を使用した。それぞれのイチゴ品種について、以下の手法により果実から全ＲＮＡを抽出した。
【００３５】
（ＲＮＡ抽出）
−８０℃で保存している果梗部を液体窒素中で粉末状になるまで乳鉢および乳棒を使用して破砕した。粉砕試料１ｇに対して６５℃に加温したExtraction Buffer（１００ｍＭ Tris-HCl （ｐＨ８．２）, １．４Ｍ NaCl, ２０ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）， ２％ ＣＴＡＢ）を１０ｍＬ添加し、ボルテックスを使用して激しく撹拌した。試料懸濁液を６５℃で１時間静置後、室温まで冷却し、等量のＣＩＡ（Chloroform：Isoamylalchol=２４：１）を添加し、転倒混和により均一なエマルジョンにした。室温にて１５分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、上清を回収した。再度等量のＣＩＡを添加し転倒混和した。室温にて１５分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、上精を回収後、1/3倍量の１２Ｍ  ＫＣｌを添加し、４℃で一晩静置した。４℃にて１５分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、上清を除去し５ｍＬの二重蒸留水と５ｍＬのフェノールを添加し、４℃にて１０分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、水相を回収した。回収した水相と等量のフェノール/クロロホルムを添加し、４℃にて１０分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、水相を回収した。回収した水相と等量のクロロホルムを添加し、４℃にて１０分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、水相を回収した。回収した水相の１／３０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと１／１０倍量の１００％エタノールを添加し、よく撹拌した後、氷上で３０分間静置した。４℃にて２５分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、上清を回収した後１／３０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと３倍量の１００％エタノールを添加し、−７０℃で３時間以上静置した。４℃にて２０分間の遠心分離（１２，０００×ｇ）を行い、上清を除去した後７０％エタノールで洗浄し任意量のBioPak（メルクミリポア）によりＲＮＡ分解酵素を除去した超純水に溶解させた。抽出した全ＲＮＡは２６０ｎｍの吸光度で濃度を測定し、電気泳動法で精製度を調べた。
【００３６】
抽出した全ＲＮＡを鋳型とし、１st strand cDNA synthesis Kit（タカラバイオ株式会社）を用いた逆転写反応によってｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲシステム（Thermal Cycler Dice TP800、タカラバイオ株式会社）でｃＤＮＡを増幅し発現量を測定した。目的遺伝子断片の増幅、蛍光標識にはSYBR Remix Ex Taq (タカラバイオ株式会社)を用いた。アクチン遺伝子の発現量を内部標準とし、各遺伝子の発現量を補正した。
【００３７】
リアルタイムＰＣＲで使用したプライマー配列を図２に示した。
配列番号１，２はＳＡＭ合成酵素遺伝子を増幅するプライマーであり、配列番号３，４はＡＣＣ合成酵素遺伝子（ＡＣＳ）を増幅するプライマーであり、配列番号５，６はＡＣＣ酸化酵素遺伝子（ＡＣＯ）を増幅するプライマーであり、配列番号７，８はアクチン遺伝子を増幅するプライマーである。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲの条件は、製造業者の指示に従って行なった。また、アクチン遺伝子の発現量を各ＲＮＡ試料間の内部標準（アクチン遺伝子の発現量を１とする）として用いた。結果を図３に示した。
【００３９】
この結果、ベニヒバリ果実では、特にＡＣＣ合成酵素遺伝子（ＡＣＳ），ＡＣＣ酸化酵素遺伝子（ＡＣＯ）の発現量が高いと認められた。即ち、ＡＣＳにおいては、ベニヒバリ果実は宝交早生果実の約１２倍であり、ＡＣＯにおいては、ベニヒバリ果実は宝交早生果実の約５倍であった。また、桃薫果実においても、ＡＣＳにおいては宝交早生果実の約１０．５倍であり、ＡＣＯにおいては宝交早生果実の約２．５倍であった。
【００４０】
〔実施例２〕
イチゴ果実の果梗部のエチレン量を測定した。イチゴの品種は、ベニヒバリ、マーシャル、桃薫、宝交早生を使用した。
【００４１】
エチレン量の測定は以下のようにして行った。
５００ｍＬビーカーに蒸留水３５０ｍＬを注水し、その中に足を短く切断したガラス漏斗（漏斗径６０ｍｍ、足外径６ｍｍ、足内径５ｍｍ：株式会社  相互理化学硝子製作所）にセプタムを嵌め込んで沈め、その下に切り出した果梗部（萼片と果柄は除去、直径１０〜１５ｍｍ×高さ５ｍｍ）を置いた。設置後、１分間の減圧処理により試料内部のガスを捕集した。その後、１ｍＬの横穴針付きガスタイトシリンジ（株式会社  伊藤製作所、針型はＸＸ−ＭＳＥ）で任意量のヘッドスペースガスを採集し、ガスクロマトグラフィー装置ＧＣ−９Ａ（株式会社  島津製作所）により、エチレン量を測定した。
ＧＣ−９Ａによる測定では、活性アルミナを充填したパックドカラム（内径３．２ｍｍ、長さ１．６ｍ：ジーエルサイエンス株式会社）、キャリアガスはヘリウム（毎分５０ｍＬ）を用いた。注入口温度は１３０℃、オーブン温度は８０℃とし、検出器には水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用いた。試料ガス注入量は０．１〜０．５ｍＬとした。エチレン濃度は標準ガスのピーク面積値より算出した。有意差検定および相関率の算出にはＥｘｃｅｌ（株式会社マイクロソフト）を用いた。結果を図４に示した。
【００４２】
この結果、ヘタ離れ性の高いベニヒバリ果実のエチレン量が最も多く、ヘタ離れ性の無い宝交早生が最も少ない結果となり、ヘタ離れ性（率）の高さに比例していると認められた（ヘタ離れ率とエチレン量の相関係数ｒ＝０．８６８）。
【００４３】
〔実施例３〕
エチレン代謝剤処理によるヘタ離れ形質への影響を調べた。
エチレン代謝剤として、エチレン発生剤（エテホン：２−クロロエチルホスホン酸（石原バイオサイエンス株式会社））およびエチレン生合成阻害剤であるＡＶＧ（アミノエトキシビニルグリシン塩酸塩：シグマ・アルドリッチ株式会社）を使用した。これらエチレン代謝剤を以下のように使用してヘタ離れ形質への影響を調べた。
【００４４】
エテホンの０．１％水溶液をベニヒバリ果実（２１個）の果梗部に塗布した。塗布処理した株は２４〜４８時間、密封容器内に静置した後、ヘタ離れを調査した。対照区のベニヒバリ果実（１５個）には水を塗布した。その結果、エテホン処理したベニヒバリ果実は５２％（１１/２１）のヘタ離れ率を示したが、対照区のベニヒバリ果実のヘタ離れ率は０％（０/１５）であった。
【００４５】
また、ＡＶＧを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬株式会社）溶液に溶解して１および１０ｍＭ溶液を作成した。各濃度のＡＶＧ溶液をベニヒバリ着色開始果実の果梗部に塗布した。塗布した果実は通常栽培条件下で生育させ、収穫期（処理後３−５日）を迎えた果実のヘタ離れを調査した。対照区のベニヒバリ着色開始果実には０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を塗布した。結果を図５に示した。この結果、ＡＶＧの濃度が高いほどヘタ離れ率が減少するものと認められた。
【００４６】
以上より、イチゴヘタ離れは、エチレン発生剤（エテホン）処理により誘導され、エチレン代謝阻害剤（ＡＶＧ）により抑制されることが判明した。
【００４７】
〔実施例４〕
上述した実施例より、イチゴヘタ離れにおいて、エチレンは促進的に作用することが示唆され、エチレン生合成酵素遺伝子はヘタ離れ形質関連遺伝子であることが推測された。
【００４８】
本実施例では、２種類のエチレン生合成酵素遺伝子（ＡＣＣ合成酵素遺伝子（ＡＣＳ），ＡＣＣ酸化酵素遺伝子（ＡＣＯ））を対象に、イチゴゲノム上の存在数および各遺伝子の近傍配列情報を次世代シーケンスによって解析した。
【００４９】
＜イチゴゲノム上に存在するＡＣＳ遺伝子数およびＡＣＯ遺伝子数の調査＞
以下の手法によりベニヒバリおよび宝交早生のゲノムＤＮＡを抽出した。
展開した本葉を採取後、液体窒素を用いて凍結し、乳鉢および乳棒を使用して破砕したものをゲノムＤＮＡの抽出試料とし、DNeasy Plant Maxi Kit（株式会社キアゲン）を用いて抽出した。抽出した試料（最大１ｍＬ）を濃縮するため、試料と等倍量の１００％イソプロパノールを添加し、氷中で２０分以上静置した。４℃、１２，０００×ｇで２０分遠心し、沈殿したＤＮＡを回収した。７０％エタノールで洗浄し、任意量のＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸バッファー：ｐＨ８．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ：ｐＨ８．０）に溶解させた。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍ，２８０ｎｍの吸光度を測定し、２６０ｎｍの吸光度から濃度を、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの比から精製度を求めた。
【００５０】
ベニヒバリおよび宝交早生のゲノムＤＮＡを使用して配列情報を取得した。試料のゲノムＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ定量試薬Ｑｕｂｉｔ（インビトロジェン株式会社）により品質検査を行った後、超音波処理により試料ＤＮＡを断片化し、TruSeq DNA Sample Prep Kit（イルミナ株式会社）を用いてシーケンス用サンプルを調製した。次世代シーケンサーIllumina Hiseq（イルミナ株式会社）を使用し、シーケンス解析を行った。解析条件は、断片化したＤＮＡの両端側１００塩基分の配列（リード）を解読し、片側１億個のリードデータ、両端合わせて計２億個分のリードデータを集積した。
【００５１】
取得した「ベニヒバリ」の配列データを用いてゲノム配列の構築（アセンブル）を行った。アセンブルプログラムvelvet（http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/）を用いて、相同性が高いリードデータを統合し、コンティグと呼ばれるある程度の長さを持った配列群を形成した。コンティグ形成後、Gapcloserプログラム（http://soap.genomics.org.cn/）により、コンティグ内またはコンティグ間に存在するギャップ（塩基配列が不明な箇所）を除去した。また、イチゴは八倍体のゲノム構造を持ち多数の類似配列の存在が予想されたため、クラスタリングプログラムＣＤ−ＨＩＴ（http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/）を用いて、類似配列を統合した。配列長が２ｋｂｐ以上のコンティグを対象に、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のBlastxプログラムを用いて、ゲノム上に存在する遺伝子の推定を行った。
【００５２】
上述した次世代シーケンサーを用いた網羅的塩基配列解析から、ゲノム上にＡＣＳ遺伝子は７個、ＡＣＯ遺伝子は１３個と存在していることが明らかとなった。また、配列の相同性からＡＣＳ遺伝子は４つのサブグループ（Ａ：ａ〜ｄ）、ＡＣＯ遺伝子は９つのサブグループ（Ｂ：ａ〜ｉ）に大別することができた（図６）。
【００５３】
＜各遺伝子のヘタ離れ形質の寄与率調査＞
上述したＡＣＳ遺伝子４グループ（Ａ：ａ〜ｄ）、ＡＣＯ遺伝子９グループ（Ｂ：ａ〜ｉ）において、図７に示したプライマー配列（配列番号９〜３４）を用いて遺伝子発現量を解析・比較した。ＲＮＡ抽出ならびリアルタイムＰＣＲについては、実施例１（ヘタ離れ性の異なる品種のエチレン生合成酵素遺伝子の発現量を比較）に準じて行った。配列番号９〜３４のプライマーは、実施例４で得た配列情報に基づき、各グループ特異的な配列を用いた。リアルタイムＰＣＲの条件は、製造業者の指示に従って行なった。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲを行って得られた結果に基づいた各遺伝子の相対発現量の結果を図８，９に示した。当該相対発現量は、内部標準遺伝子であるアクチン遺伝子の発現量を１としたときの相対的な発現量とした。
【００５５】
図８において、ＡＣＳ遺伝子４グループ（Ａ：ａ〜ｄ）のそれぞれの発現量（％）をグラフ化した。サブグループａ〜ｄにおいて、それぞれのヘタ離れ形質の寄与率はａ：０％、ｂ：１４．８％、ｃ：７５．６％、ｄ：９．６％であった。これより、ＡＣＳ遺伝子４グループのうち、サブグループｂ，ｃの２グループに属する遺伝子の寄与率が高いことが明らかになった。
【００５６】
また、図９において、ＡＣＯ遺伝子９グループ（Ｂ：ａ〜ｉ）のそれぞれの発現量をグラフ化した。サブグループａ〜ｉにおいて、それぞれのヘタ離れ形質の寄与率はａ：０．１％、ｂ：６．６％、ｃ：２．０％、ｄ：１９．１％、ｅ：５６．８％、ｆ：２．２％、ｇ：１２．８％、ｈ：０．１％、ｉ：０．３％であった。これより、ＡＣＯ遺伝子９グループのうち、サブグループｂ，ｄ，ｅ，ｇの４グループに属する遺伝子の寄与率が高いことが明らかになった。
【００５７】
〔実施例５〕
実施例４で明らかとなったヘタ離れ形質への寄与度が高い遺伝子の近傍配列から、品種間の配列差（多型）を検出した。
【００５８】
イチゴの品種は、ベニヒバリ、マーシャル、章姫（ヘタ離れ性無し）、とちおとめ（ヘタ離れ性無し）、宝交早生（ヘタ離れ性無し）を使用した。各品種の葉から実施例４の手法に準じてゲノムＤＮＡを抽出し、多型を含む領域をＰＣＲにより増幅した（尚、試料破砕液をPhire Taq Polymerase（Thermo Scientific）などのＰＣＲ阻害物質耐性が強い酵素を用いることで試料破砕液から直接ＰＣＲ増幅が可能であることを確認しており、その場合は、ＤＮＡ抽出工程は省略可能である）。
【００５９】
使用したプライマー（配列番号３５〜４４）を図１０に示した。これらプライマーは、配列番号４５〜５０に示したＡＣＳ遺伝子（１１２８１９５）或いはＡＣＯ遺伝子（９９４４０６或いは１０７７６８２）の上流配列２ｋｂ以内に存在する多型を含む領域を増幅できるプライマーである（図１１〜１３）。配列番号３５〜４４のプライマーは、実施例４で得た配列情報に基づき、Oligo（Molecular Biology Insights社）を用いて設計した。これらプライマーを使用したＰＣＲによって得られた増幅産物の長さや構造から、ヘタ離れ品種に特異的なパターンを示すプライマーを選抜した。ＰＣＲにはTaKaRa Ex Taq Hot start version（タカラバイオ株式会社）を用いた。
【００６０】
配列番号３５（フォワード），配列番号３６（リバース）のプライマーは、アニーリング温度５８℃、配列番号３７（フォワード），配列番号３８（リバース）のプライマーは、アニーリング温度５８℃、配列番号３９（フォワード），配列番号４０（リバース）のプライマーは、アニーリング温度５８℃、配列番号４１（フォワード），配列番号４２（リバース）のプライマーは、アニーリング温度５４℃、配列番号４３（フォワード），配列番号４４（リバース）のプライマーは、アニーリング温度５８℃、の条件でそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、熱変性９５℃で３０秒、アニーリングは各プライマーのアニーリング温度で３０秒、伸長反応７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返すものとした。
【００６１】
これらプライマーセットを使用して増幅される領域を、それぞれＭＫ１（1128195）、ＭＫ２（994406_SSR）、ＭＫ３（994406_pro1）、ＭＫ４（994406_pro2）、ＭＫ５（1077682_pro1）とした。
【００６２】
これらプライマーセットを使用して、一般的な電気泳動（ＥＰ：Electrophoresis）或いはＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism：一本鎖ＤＮＡの立体構造により分離する特種な電気泳動法）の少なくとも何れかによってヘタ離れ品種に特異的なＤＮＡ断片、或いは、ヘタ離れ性が無い品種に特異的なＤＮＡ断片を検出した。
【００６３】
一般的な電気泳動は、ＰＣＲ産物液の一部についてアガロースゲル電気泳動を行い，エチジウムブロマイドで染色し，ＰＣＲ産物の増幅様式を確認した。
また、ＳＳＣＰは、ＰＣＲ産物液１０μＬとサンプルバッファー（９５％Formamide，２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，０．０５％Bromophenol blue）１０μＬを混合して９５℃で５分間反応（変性）させ、氷水で急冷した後、電気泳動を行った。泳動ゲルの作成および電気泳動装置は、DCode ユニバーサルミューテーション検出システム（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いた。染色は、CLEAR STAIN Ag（株式会社ニッポンジーン）を用いた。結果を図１４〜１８に示した。
【００６４】
図１４において、ベニヒバリ、マーシャルのみが、配列番号３５（フォワード），配列番号３６（リバース）のプライマーによってＭＫ１（1128195）のＤＮＡ断片（矢印）を増幅できたことが確認された。従って、このＭＫ１のＤＮＡ断片はヘタ離れ品種に特異的なＤＮＡ断片であると認められた。
【００６５】
図１５において、ベニヒバリ、マーシャルのみが、配列番号３７（フォワード），配列番号３８（リバース）のプライマーによってＭＫ２（994406_SSR）のＤＮＡ断片（矢印）を増幅できたことが確認された。従って、このＭＫ２のＤＮＡ断片はヘタ離れ品種に特異的なＤＮＡ断片であると認められた。
【００６６】
図１６において、ベニヒバリのみが、配列番号３９（フォワード），配列番号４０（リバース）のプライマーによってＭＫ３（994406_pro1）のＤＮＡ断片（矢印）を増幅できたことが確認された。従って、このＭＫ３のＤＮＡ断片はヘタ離れ品種に特異的なＤＮＡ断片であると認められた。
【００６７】
図１７において、章姫（ヘタ離れ性無し）、とちおとめ（ヘタ離れ性無し）、宝交早生（ヘタ離れ性無し）が、配列番号４１（フォワード），配列番号４２（リバース）のプライマーによってＭＫ４（994406_pro2）のＤＮＡ断片（矢印）を増幅できたことが確認された。従って、このＭＫ４のＤＮＡ断片はヘタ離れ性が無い品種に特異的なＤＮＡ断片であると認められた。
【００６８】
図１８において、ベニヒバリ、マーシャルのみが、配列番号４３（フォワード），配列番号４４（リバース）のプライマーによってＭＫ５（1077682_pro1）のＤＮＡ断片（矢印）を増幅できたことが確認された。従って、このＭＫ５のＤＮＡ断片はヘタ離れ品種に特異的なＤＮＡ断片であると認められた。
【００６９】
従って、図１０に示したプライマーを使用したＰＣＲによって、ＭＫ１〜ＭＫ５のそれぞれのＤＮＡ断片の増幅の有無を確認することで、ヘタ離れ品種を識別可能となることが判明した。従って、ＭＫ１〜ＭＫ５のそれぞれは、ヘタ離れ性の有無を判別するＤＮＡマーカー配列となり得るものと認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、イチゴ果実と当該イチゴ果実の一部が残り付いた萼であるヘタとの分離性であるヘタ離れ性の有無を判別するために利用できる。
【符号の説明】
【００７１】
Ｘ        イチゴ果実
ａ        果実
ｂ        萼
ｃ        境界付近
ｄ        ヘタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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