(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖又はその誘導体からナノ粒子を調製する方法であって、該多糖又はその誘導体を、糖環の０．１％〜８０％の酸化度が得られるまで酸化して、アルデヒド基を有する酸化された多糖またはその誘導体を得、次いで、４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪族又は芳香族有機アミン、４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪族または芳香族有機酸のアミド及びヒドラジド、疎水性アミノ酸、ホスファチジルエタノールアミン、を含む群から選択される、疎水性を示す少なくとも１つのナノ粒子形成剤と、少なくとも１つのアミノ、アミド、又はヒドラジド基を含有する少なくとも１つの活性物質とを、水又は水と有機溶媒との混合物中の該酸化された多糖又はその誘導体の溶液に添加し、該溶液を、１〜９のｐＨ、１０〜１００℃の温度で反応させ、該酸化された多糖又はその誘導体と該活性物質とを共有結合させることを特徴とし、ここで、アミノ基対アルデヒド基の総モル比が２０〜０．５である、方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子形成剤が前記活性物質と同時に添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子形成剤が前記活性物質を添加した後に添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子形成剤が、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、エチルフェニルアミン、スフィンゴシン、オレイン酸アミド、パルミチン酸アミド、ステアリン酸ヒドラジド、パルミチン酸ヒドラジド、オレイン酸ヒドラジド、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、セファリン：を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性物質として、アミノ、アミド、もしくはヒドラジド基を含む薬物、又はカルボキシ基がアミドもしくはヒドラジドに修飾されている誘導薬物、遺伝子治療に好適なＲＮＡもしくはＤＮＡ断片、又はこれらの誘導体、プレーン色素及び蛍光色素が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記活性物質が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノアクリジン及びその誘導体、シスプラチン及びその誘導体、メトトレキセート、シタラビン、ゲムシタビン、ダプソン、アシクロビル、アジドチミジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、イマチニブ、スニチニブ、ブレオマイシン、アクチノマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、メルファラン、テモゾロミド、セレコキシブ、ネララビン、クラドリビン、イソニアジド、９−アミノアクリジン及び他のアクリジン色素、ＤＡＰＩ、ローダミン及びその誘導体、ニュートラルレッド、トリパンブルー：を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子形成剤と前記活性物質の両方が、反応液中に、易溶性塩の形態で添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
塩酸塩、硝酸塩、又は硫酸塩が、塩として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
デキストラン、デンプン及びその誘導体、アミロース及びその誘導体、セルロース誘導体、グリコーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸、カラギーンが、多糖又はその誘導体として使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
水／ＤＭＳＯ、水／アセトニトリル、水／エーテル溶媒混合物中で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化が、過ヨウ素酸イオンを含む酸化剤、酸化数４の鉛の塩、酸化数２の銅の化合物、又は好適な触媒の存在下で酸化された水の存在下で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応が終了した後、形成された結合の還元が実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元が、ＮａＢＨ４又はＮａＢＨ３ＣＮにより、水溶液中で実施されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
得られたナノ粒子が、酸化された多糖又はその誘導体のアルデヒド基とペプチドアミノ基との反応によって、抗体、ペプチド、又はタンパク質で修飾されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記得られたナノ粒子の溶液が凍結乾燥されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
凍結乾燥が凍結防止物質を添加して実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記凍結防止物質が未修飾多糖であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖鎖の特異的酸化と、薬剤を含む、疎水性化合物の付加とによる、多糖及びその誘導体からのナノ粒子の調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多糖群に由来する化合物と、治療活性を示し、かつアミノ基を含む化学物質との共役体が知られている。例えば、特許文献１は、デンプンのヒドロキシエチル化誘導体と、様々な薬剤との共役体を開示している。特許文献２は、抗生物質がペプチド結合を介して多糖の還元末端に付加されている抗生物質／デンプン共役体を開示している。付加は、アルカリ水溶液中での、その還元末端におけるＩ２によるデンプン誘導体の酸化と、それに続く、有機溶液中での酸化誘導体と抗生物質との共役により得られる。更に、特許文献３から、活性成分として、カルボキシ基がアミノ酸又は２〜８個のアミノ酸から構成されるペプチドを介して抗癌活性を有する活性物質に結合している多糖を含む医薬組成物は、転移を阻害し、悪性癌の再発を予防することで知られている。特許文献４は、修飾多糖の末端アルデヒド基と該アルデヒド基と反応できるタンパク質の官能基との共役反応から生じる共有結合を含む修飾多糖とタンパク質との結合相互作用を伴う、タンパク質と、デンプンから誘導される修飾多糖との共役に関する。本発明は、共役により調製される共役化合物を含む医薬製剤、及びヒト又は動物の予防的又は治療的処置のための該化合物の使用も提供する。
【０００３】
特許文献５から、酸化ヒアルロン酸誘導体の調製方法及びそのような誘導体の修飾方法が知られている。その出願の方法に従って、ヒアルロン酸を特異的酸化剤ＴＥＭＰＯで酸化すると、アルデヒド基を有する酸誘導体が得られる。その後、この誘導体は、アミン、ジアミン、アミノ酸、ペプチド、及び他のアミノ含有化合物との結合に使用される。そのような結合は、水又は水と有機溶媒との混合物中での、ＮａＢＨ３ＣＮによる還元アミノ化により実施される。
【０００４】
上記の発明は、多糖と様々な種類の治療物質との共役体（抱合体）を提供するが、これらの解決法はいずれも、多糖ナノ粒子を得ることを目的としていた。一方、ナノ粒子は、いくつかの新規の望ましい特性のために、薬剤の潜在的担体として、現在精力的に研究されている［非特許文献１］。好適な表面特性を有する、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径のナノ粒子は、長時間、血液中を循環し、腎臓、肝臓、又は脾臓濾過による除去を回避することができる（長期循環粒子、ステルス粒子）。そのようなナノ粒子の表面は、免疫系の応答も、小さい血漿タンパク質とオプソニンの凝集も誘導しないはずである。その場合、ポリエチレングリコール、多糖、ポリビニルアルコールなどの高親水性ポリマーによって作り出されるような、ハイドロゲル特性の表面が特に望ましい。多糖は、多くの場合、天然起源であり、生体分解性であり、かつ体内で生じる物質と類似しているため、特に望ましい。そのような長期循環ナノ粒子は、腫瘍又は炎症の部位に蓄積する傾向がある（受動的ターゲティング）［非特許文献２］。その作用は、循環系を覆う内皮細胞の細胞膜が適切なタンパク質でしっかりと密閉されており、かつそれらの間の隙間が数ナノメートル幅であるという事実によるものである。腫瘍又は炎症部位では、これらの隙間がはるかにより広く、数百ナノメートルに達する。このため、ナノ粒子が隙間に蓄積し、循環から腫瘍を含む周囲の罹患組織に「漏れ出る」。罹患部位でのナノ粒子のそのような受動的蓄積は、これらの部位における薬物濃度を増大させ、治療の効力を増強させ、副作用を低下させる。このナノ粒子の更なる特徴は、腫瘍細胞を含む特定の細胞型に対する活性のある親和性を示すように、それを、好適なタンパク質、代謝産物、又は抗体で表面修飾することができることである。これにより、薬剤を、主に罹患細胞に送達することが可能となる。腫瘍細胞がグルコース需要の顕著な増大を示し（ワールブルグ効果）、これが今度は、腫瘍細胞に対する多糖ナノ粒子の親和性増大の獲得を可能にするという事実のため、ナノ粒子の表面を多糖から調製することが望ましい。薬物を含むそのような多糖ナノ粒子であれば、癌細胞により効率的に浸透して、それらを死滅させるであろうし、また、蛍光マーカーで標識した場合、これらの粒子は、効率的な診断ツールとなる。ナノ粒子の別の重要な用途は、遺伝子治療である。ＲＮＡ又はＤＮＡ断片を含有するナノ粒子は、細胞に浸透し、細胞内で起こる遺伝子読取りプロセスに影響を及ぼすことができる。遺伝病を治癒する期待が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際出願ＷＯ２０１２／００４００７号
【特許文献２】国際出願ＷＯ０３／０００７３８号
【特許文献３】国際出願ＷＯ０３／１５８２６号
【特許文献４】国際出願ＷＯ０３／０７４０８７号
【特許文献５】国際出願ＷＯ２０１１／０６９４７５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｒｅ  ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｈａｐａｒｔｏ  Ａ．，Ｓｉｎｇｈ  Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２０１１
【非特許文献２】Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｋｗａｎｇｊａｅ  Ｃｈｏ，Ｘｕ  Ｗａｎｇ，Ｓｈｕｍｉｎｇ  Ｎｉｅ，Ｚｈｕｏ  Ｃｈｅｎ，Ｄｏｎｇ  Ｍ．Ｓｈｉｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８  １４；１３１０
【非特許文献３】Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  Ｃ，Ｒ．Ｇｒｅｆ，Ｐ．Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ５８，２００４
【非特許文献４】Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｕｍｅｌａｓ  Ａ．，Ｓｅｒｒｅｒｏ  Ａ．，Ｄｕｒａｎｄ，Ｅ．，Ｄｅｌｌａｃｈｅｒｉｅ  Ｅ．，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｍ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ，５９，２００７
【非特許文献５】Ｚｈａｏ，Ｈｕｉｒｕ，Ｈｅｉｎｄｅｌ，Ｎｅｄ  Ｄ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｍｅｔｈｏｄ，  ＰＨａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８．３（１９９１）：４００−４０２
【非特許文献６】Ｊｅａｎｅｓ，Ａｌｌｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｈａｍ，Ｃ．Ａ．Ｐｅｒｉｏｄａｔｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｘｔｒａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ７２．６，（１９５０）：２６５５−２６５７
【非特許文献７】Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｔｒｏｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｌｉｇａｎｄｓ．．．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，４，４６９−４７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ナノ粒子の調製方法は多数あるが、残念なことに、それらの大半は非常に複雑であり、かつ激しい条件（超音波、高温）、侵襲的な化学的化合物、有毒な有機溶媒、又は表面活性化合物の適用を必要とする［非特許文献１］。治療的使用のためのナノ粒子は、無毒で、かつ最も好ましくは、生体分解性であるべきである。多糖は、その生体適合性及び生体分解性のために、そのようなナノ粒子の調製のための非常に優れた材料になる［非特許文献３］。しかしながら、疎水性基を付加することにより、多糖からナノ粒子を調製する既知の方法は複雑であり、表面活性材料又は侵襲性化学物質の使用を必要とする［非特許文献４］。そのように調製されたナノ粒子は、化合物の毒性の結果として、長時間にわたって更に精製されなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、侵襲的環境に感受性のある治療化合物の共有結合を可能にする穏やかな条件での多糖ナノ粒子の調製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験１の結果を示すナノ粒子の直径の分布である。
【図２】実験２の結果を示すナノ粒子の直径の分布である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
アルデヒド基を生成させ、本発明のアルデヒド基と反応するアミノ基又はＲ−ＮＨ２結合を有するその他の基を有する化合物を付加するその特異的部分酸化により、多糖及びその誘導体からナノ粒子を調製する方法は、この多糖又はその誘導体を、糖環の０．１％〜８０％の酸化度が得られるまで、既知の方法により酸化して、アルデヒド基を生じさせ、次いで、アルデヒド基の結合後、疎水性を示すＲ−ＮＨ２結合を有する有機化学的化合物である少なくとも１つのナノ粒子形成剤と、少なくとも１つのＲ−ＮＨ２又はＮ−Ｈ結合を含む少なくとも１つの活性物質とを、水又は水と有機溶媒との混合物中の酸化された多糖の溶液に添加し、反応を、この溶液の１〜９のｐＨで、１０〜１００℃、最も好ましくは２０〜６０℃の温度で実施することを特徴とし、ここで、アミン基対アルデヒド基の総モル比は、２０〜０．５である。ナノ粒子形成剤は、４〜２０個の炭素原子を含む脂肪族又は芳香族有機アミン、４〜２０個の炭素原子を含む脂肪族及び芳香族有機酸のアミド及びヒドラジド、疎水性アミノ酸、ホスファチジルエタノールアミン：を含む群から選択される。活性物質は、アミノ、アミド、又はヒドラジド基を含有する。
【００１１】
ナノ粒子形成剤は、活性物質と同時に又は活性物質を添加した後に添加することができる。反応がナノ粒子の折り畳み後にゆっくりと起こり、活性物質の不十分な添加と、生成物の精製におけるその損失とをもたらす可能性があるので、活性物質を最初に添加することが好ましい。場合によっては、活性物質は、折り畳み剤によって生成された疎水性領域に沈殿したナノ結晶形態のナノ粒子中に蓄積され得、次いで共有結合ではなく物理的に結合され、より多く添加されることがある。これは、活性物質が、中性ｐＨ付近で水難溶性であり、７未満のｐＨでよく溶ける場合である。
【００１２】
形成剤と活性物質は両方とも、水易溶性の塩、例えば、塩酸塩の形態で導入されることが好ましい。アミンがより易溶性の塩（例えば、塩酸塩）として導入される場合、ｐＨは、反応の過程で低下し、その後、溶液は、水性塩基溶液でゆっくりと中和される。最適ｐＨは、利用されるアミンのアルカリ度によって決まる。通常、水素イオン濃度の上昇により、アルデヒド基が活性化されるだけでなく、遊離の非プロトン化アミンの濃度も降下する；一次反応の最適ｐＨは、４〜６の間にあり、ｐＨの更なる上昇は、アミンカチオン濃度を低下させることにより、このプロセスを終了させる。
【００１３】
ナノ粒子の調製方法は、水／ＤＭＳＯ、水／アセトニトリル、水／エーテルなどの有機又は混合溶媒中で実施することもできる。得られたナノ粒子の加水分解に対する抵抗性を増大させるために、形成された結合のＮａＢＨ４又はＮａＢＨ３ＣＮによる還元は、水溶液中、かつ穏やかな条件下でも利用される。
【００１４】
好ましくは、ナノ粒子形成剤として、以下のものが利用される：ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、エチルフェニルアミン、スフィンゴシン、オレイン酸アミド、パルミチン酸アミド、ステアリン酸ヒドラジド、パルミチン酸ヒドラジド、オレイン酸ヒドラジド、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、又はセファリン（ホスファチジルエタノールアミン）。これらの形成剤を、アミン塩、例えば、塩酸塩、硝酸塩、又は硫酸塩の水溶液として添加することが好ましいが、それは、これらのアミン塩が、通常、水によりよく溶けるからである。
【００１５】
好ましくは、アミノ、アミド、又はヒドラジド基を含む活性物質として、そのような基を含有する薬物、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノアクリジン及びその誘導体（アムサクリンなど）、シスプラチン及びその誘導体、メトトレキセート、シタラビン、ゲムシタビン、ダプソン、アシクロビル、アジドチミジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、イマチニブ、スニチニブ、ブレオマイシン、アクチノマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、メルファラン、テモゾロミド、セレコキシブ、ネララビン、クラドリビン、カルボキシ基がアミド又はヒドラジドに変換されたイソニアジド又は誘導薬剤；遺伝子治療に好適なＲＮＡもしくはＤＮＡ断片、又はその誘導体；プレーン色素及び蛍光色素、例えば、９−アミノアクリジン及び他のアクリジン色素、ＤＡＰＩ、ローダミン及びその誘導体、ニュートラルレッド、トリパンブルーが使用される。活性物質を、アミン塩、例えば、塩酸塩、硝酸塩、又は硫酸塩の水溶液として、反応媒体に添加することが好ましく、これらのアミンの塩は、通常、水によく溶ける。そのような活性物質が酸性環境では水に溶けるが、中性環境ではあまり溶けない場合、該物質は、ナノ粒子内で、物理的相互作用によってのみ結合し得る。ｐＨが上昇すると、それは、ナノ粒子の疎水性部分において、ナノ結晶として沈殿することになる。
【００１６】
好ましくは、多糖として、水又は他の溶媒に溶ける、最大１０００ｋＤａの分子量の多糖、最も好ましくは、デキストラン、デンプン及びその誘導体（ヒドロキシエチルデンプン）、アミロース及びその誘導体、セルロース誘導体（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、グリコーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸、カラギーンが使用される。
【００１７】
好ましくは、酸化は、多糖中の酸化された糖環の０．５％〜８０％の酸化度まで実施される。
【００１８】
好ましくは、酸化は、過ヨウ素酸イオン（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム又は過ヨウ素酸カリウム）、酸化数４の鉛の塩、酸化数２の銅の化合物、又は例えば、酸化バナジウムなどの好適な触媒の存在下で酸化された水を含む、酸化剤を加えて実施される。
【００１９】
更に、得られたナノ粒子は、酸化された多糖のアルデヒド基とペプチドのアミン基との反応によっても、抗体もしくはペプチド、又はタンパク質で修飾することができる。
【００２０】
このように得られたナノ粒子の水懸濁液は、透析、沈殿、遠心分離により精製されるか、又は直接利用される。得られたナノ粒子溶液は、凍結乾燥させることができる。凍結乾燥のために、保護剤（抗凍結剤）の役割を果たす物質、例えば、非修飾多糖−例えば、デキストランを添加することができる。得られたナノ粒子は、水又は生理食塩水に懸濁させた後、凍結乾燥させて乾燥粉末にする場合、自己組織化能を示し、数分以内にナノ粒子を形成する。
【００２１】
本発明に従って、多糖は、所定量の酸化剤を添加することにより、水溶液中で予備酸化される。特異的酸化の過程では、多糖鎖ではなく、単糖、例えば、グルコース環が切断され、酸化環がアルデヒド基を形成する。過ヨウ素酸塩による単糖又は多糖の酸化方法により例示されるように、これは、有機化学で利用される典型的な特異的酸化反応の１つである。［非特許文献６］。この酸化方法では、隣接する炭素上に−ＯＨ基を有する炭素−炭素結合が切断され、形成される両末端にアルデヒド基が形成される。単糖（グルコース）環の切断により多糖鎖に沿ったアルデヒド基の形成をもたらし、多糖鎖を切断することなく進行する他の部分酸化方法も利用することができる。酸化度−アルデヒド基の数は、公知の方法で；例えば、アルデヒドと塩酸ヒドロキシルアミンとを反応させ、遊離塩酸を滴定することにより、決定することができる［非特許文献５］。アルデヒド基とアミノ基とを反応させることにより、調製された多糖分子に対して、形成している化合物を付加し、これにより、ナノ粒子が自然に形成される。
【００２２】
本発明に従って、酸化された多糖は、アミンの性質を有する少なくとも２種類の物質により同時に修飾される：ナノ粒子形成剤は、もともと疎水性であり、残りの物質は、治療剤又は着色剤であるが、１つのナノ粒子中で、数種の様々な活性物質を同時に使用することが可能である。これにより、数種の薬剤の組み合わされた活性の相乗効果を得ることが可能になる。数種の薬剤の同時使用は、腫瘍による薬物耐性の発生の可能性を顕著に低下させ、細胞周期の段階にかかわらず、細胞の積極的な破壊を可能にする。本発明の方法では、疎水性−親水性相互作用のために、活性物質及び疎水性折り畳み剤を内側に含有し、その外層が、親水性成分、主に、多糖を含む、多糖ナノ粒子が形成される。多糖と、形成剤、薬物、並びに抗体、ヌクレオチド塩基、又は代謝産物、例えば、葉酸などの特異的細胞型に対する親和性を増強するアルデヒド基反応性成分とを同時に修飾することも可能である。ナノ粒子の形成時に、疎水性の作用物質が内側に入り、親水性の作用物質がナノ粒子の外側に位置する。
【００２３】
本発明の反応は、水性環境中、穏やかな温度条件下で、有機溶媒又は界面活性剤がなくても進行する。得られたナノ粒子は、それ自体、無毒であり（毒性薬なしで調製された場合）、特に、腫瘍の治療及び診断において、薬剤の担体及び色又は蛍光指示薬として使用することができる。このナノ粒子は、１種以上の形成剤又は数種の薬物を様々な組合せで含有することができ、それらは、薬剤としてのその効力を高めるアジュバント（ジインドリルメタン）を含有することもできる。
【００２４】
調製された巨大分子の安定性は、通常、十分であり、水性環境中で数週から１２週超にまで及ぶ。凍結乾燥後の乾燥安定性は顕著により高く、適切な保存により１年を超える。アミノ基とアルデヒド基の間に形成される結合の安定性は、アルデヒド−アミン結合を還元することにより、更に増強させることができる。
【００２５】
本発明の方法を作業実施例でより詳細に説明した。
【実施例】
【００２６】
実施例１
分子量７０ｋＤａのデキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、約５％のグルコース環を酸化し、精製した。これを実施するために、デキストラン水溶液を調製し、過ヨウ素酸ナトリウムをそれに添加した。この反応の化学量論は、酸化条件、分子量、及び多くの場合、デキストランの源によって決まり、１モルの酸化グルコース当たり１〜２モルの過ヨウ素酸塩に相当し（２つのアルデヒド基が形成される）、これは、実験的に確認されなければならない。デキストラン酸化のプロセスを、黒いガラス製の容器中、室温で１時間、実施した。その後、この溶液を中和し、蒸留水に対する透析により精製し、その後、真空中で水を揮散させた。アルデヒド基の数を既知のヒドロキシルアミン滴定法により決定した。該デキストランの５％蒸留水溶液を調製した。その後、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基のモル数に基づく１５ｍｏｌ％の塩酸ダウノルビシンを添加した。この溶液を３０℃で２０分間撹拌した。その後、５％塩酸ドデシルアミン水溶液を、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく８５ｍｏｌ％で添加し、温度を３５℃に上昇させ、反応を６０分間継続させた。実行中の反応は、反応環境のｐＨを低下させる。その後、５％ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、ｐＨの上昇を開始させた。３０分でｐＨをｐＨ９に上昇させるように、添加を実施した。ｐＨ＝９に達した後、反応を更に３０分間継続させた。その後、アラニンを、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく１５ｍｏｌ％で添加して、全ての未反応アルデヒド基を結合させた。１５分間撹拌した後、この溶液を５％塩酸でｐＨ＝７に中和し、２４時間の透析により精製した。その後、（酸化デキストランの初期重量に基づく）２０重量％の純粋な非酸化デキストランを抗凍結剤として添加し、溶液を凍結乾燥させた。粉末を水に再懸濁させると、ナノ粒子の懸濁液が得られた。得られたナノ粒子の直径の分布を、図１に示すＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａ  Ｓｉｚｅｒ装置で測定した。４０５ｎｍレーザーを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置で行なわれた測定により、わずかにより小さい平均粒径及びより狭い直径分布が明らかになった。
【００２７】
実施例２
分子量４０ｋＤａのデキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、約２０％のグルコース環を酸化し、精製した。そのようなデキストランの１０％蒸留水溶液を調製した。その後、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基のモル数に基づく２０ｍｏｌ％の塩酸ドキソルビシンを添加した。この溶液を３０℃で２０分間撹拌した。その後、５％塩酸オクチルアミン水溶液を、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく８０ｍｏｌ％で添加し、温度を４０℃に上昇させ、反応を６０分間継続させた。実行中の反応は、ｐＨの低下を引き起こす。その後、５％ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、ｐＨの上昇を開始させた。３０分でｐＨをｐＨ８に上昇させるように、添加を実施した。ｐＨ＝８に達した後、反応を更に３０分間継続させた。その後、アラニンを、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく１０ｍｏｌ％で添加した。１５分間撹拌した後、この溶液を５％塩酸でｐＨ＝７に中和し、ＮａＢＨ３ＣＮをアルデヒド基の初期量に基づく１０ｍｏｌ％過剰で添加した。その後、反応を１２時間実施した。この溶液を中和し、４８時間の徹底的な透析により精製し、その後、デキストランをデキストランの初期重量に基づく５０重量％で添加し、溶液を凍結乾燥させた。水に再懸濁させた後、得られたナノ粒子の直径の分布を、４０５ｎｍレーザーを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置で測定し、図２に示した。
【００２８】
実施例３
分子量約１００ｋＤａ及び酸化数５％のカルボキシメチルセルロースの４％水溶液を調製し、ｐＨをｐＨ５に調整した。その後、９−アミノアクリジンを、その塩酸塩水溶液として、使用されたセルロース誘導体のアルデヒド基の初期量に基づく５０ｍｏｌ％で添加した。その後、水性オクチルアミンをアルデヒド基の初期のモル数に基づく５５ｍｏｌ％で添加した。反応を４０℃で１時間実施した。その後、１５分でｐＨをｐＨ９に上昇させることにより、この溶液を中和し、３０分間放置し、透析した。１５０ｎｍの平均直径の蛍光ナノ粒子が得られた。
【００２９】
実施例４
分子量７０ｋＤａのデキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、約１５％のグルコース環を酸化し、精製した。そのようなデキストランの１０％蒸留水溶液を調製した。その後、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基のモル数に基づく２５ｍｏｌ％の塩酸ドキソルビシンを添加した。この溶液を３５℃で２０分間撹拌した。その後、葉酸をアルデヒド基の初期の量に基づく５ｍｏｌ％で添加して、腫瘍細胞に対するナノ粒子の親和性を増強させた。１５分後、５％塩酸イソロイシン水溶液を、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく８０ｍｏｌ％で添加し、温度を４０℃に上昇させ、反応を６０分間実施した。その後、５％ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、ｐＨの上昇を開始させた。３０分でｐＨをｐＨ９．５に上昇させるように、添加を実施した。反応を更に３０分間継続させた。その後、この溶液を中和し、２４時間の透析により精製した。得られたナノ粒子の平均直径は、１４０ｎｍであった。
【００３０】
実施例５
カルボキシメチルセルロースナトリウム塩を、水溶液中、テトラ−スルホ鉄−フタロシアニン触媒の存在下、過酸化水素で酸化した［非特許文献７］。このプロセスを４０℃で１２時間実施し、その後、生成物を、濾過、次いで、透析により精製した。得られたアルデヒドカルボキシメチルセルロース誘導体中のアルデヒド基の量を、既知のヒドロキシルアミン滴定法により決定した。得られた誘導体の５％蒸留水溶液を調製した。その後、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基のモル数に基づく１０ｍｏｌ％の塩酸ドキソルビシンを添加した。この溶液を３０℃で２０分間撹拌した。その後、５％塩酸ドデシルアミン水溶液を、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく９０ｍｏｌ％で添加し、温度を３５℃に上昇させ、反応を６０分間継続させた。その後、５％ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、ｐＨの上昇を開始させた。３０分でｐＨをｐＨ９に上昇させるように、添加を実施した。ｐＨ＝９に達した後、反応を更に３０分間継続させた。その後、アラニンを、使用量の酸化デキストラン中のアルデヒド基の初期のモル数に基づく３０ｍｏｌ％で添加して、全ての未反応アルデヒド基を結合させた。１５分間撹拌した後、この溶液を５％塩酸でｐＨ＝７に中和し、２４時間の透析により精製した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａ  Ｓｉｚｅｒ装置で測定したときの、得られたナノ粒子の平均直径は、１１０ｎｍであった。
【００３１】
実施例６
１％ヒアルロン酸ナトリウム塩水溶液を調製し、実施例１と同様に、５％の酸化度にまで過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。ｐＨをｐＨ５に調整し、塩酸ダウノルビシン及び塩酸シタラビンを、酸化ヒアルロン酸の全アルデヒド基の１０ｍｏｌ％を含む各々の薬物に対して添加し、反応を３０℃で１５分間実施した。その後、塩酸デシルアミン水溶液を、アルデヒド基の初期のモル数に基づく８５ｍｏｌ％で添加した。反応を４０℃で１時間実施した。その後、２０分以内にｐＨをｐＨ９に上昇させ、この溶液を中和し、透析した。作用機序の異なる２種の薬物を含む多糖ナノ粒子の水懸濁液が得られた。
【図１】
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【図２】
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