(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁液中で細胞を培養するためのバイオリアクターシステムであって、このシステムは、
可変容積容器であって、
流動性細胞培地を収容するための細胞培養チャンバーを形成するフレキシブル外壁と、
前記バイオリアクターシステムのアジテーターユニットのサポートに対する取り外し可能な取り付けのための第１のエッジと、
円筒形ローラーおよび前記アジテーターユニットのサポートの一方に対する取り外し可能な取り付けのための、前記第１のエッジと平行でかつそれから離間された第２のエッジと、
前記第１のエッジに隣接して形成された前記容器の最小容積領域と、
細胞および細胞培地を付加しかつ除去するための前記最小容積領域における第１の流体ポートと、
前記最小容積領域における第２の流体ポートであって、ガスを除去するために前記アジテーターユニットに対して接続可能な第２の流体ポートと、
前記最小容積領域における第３の流体ポートと、
前記第３の流体ポートが、前記細胞培養チャンバー内で細胞を保持しながら前記流動性細胞培地のサンプリングを可能とすることを保証するために、前記第３の流体ポートと関連付けられた少なくとも一つのフィルターと、を備え、
前記アジテーターユニットは、
前記細胞培養チャンバーとの流体連通のための、前記細胞培養チャンバー内に新鮮な栄養培地を入れるよう構成された少なくとも一つの入口であって、この少なくとも一つの入口は前記第３の流体ポートに接続されると共にそれと流体連通状態である、少なくとも一つの入口と、
前記細胞培養チャンバーとの流体連通のための、前記細胞培養チャンバーからの廃培地の排出を可能とするよう構成された少なくとも一つの出口であって、この少なくとも一つの出口は前記細胞培養チャンバー内で前記培地の制御された補充を実施するために前記第１の流体ポートに接続されると共にそれと流体連通状態である、少なくとも一つの出口と
を有する、可変容積容器と、
部分的に平坦化されたセクションを形成するために前記可変容積容器の前記外壁を締め付けるための手段であって、前記平坦化されたセクションを減少させることによって前記細胞培養チャンバーの容積を増大させるよう動作可能であり、前記可変容積容器の前記外壁を締め付けるための前記手段は、回転のためにかつ前記可変容積容器の前記外壁の表面に接触するために配置された移動可能な円筒形ローラーを含み、締め付けるための前記手段はさらに、前記円筒形ローラーと対向して前記可変容積容器の前記外壁面の一部を支持するための実質的に平坦な支持面を形成するプレート部材を含む、前記可変容積容器の前記外壁を締め付けるための手段と、
前記細胞培養チャンバーを穏やかに撹拌するための攪拌手段と、
播種、前記撹拌および締め付け手段の間欠動作、収穫、培養された細胞マテリアルの収集を周期的に実施するための前記アジテーターユニットと関連付けられた制御手段と
を備える、バイオリアクターシステム。
【請求項２】
前記可変容積容器の前記外壁を締め付けるための前記手段は、回転のためにかつ前記可変容積容器の前記外壁の表面に接触するよう配置された移動可能な円筒形ローラーを含み、前記締め付けのための手段は、前記円筒形ローラーと対向して前記可変容積容器の前記外壁面の一部を支持するための実質的に平坦な支持面を形成するプレート部材をさらに含み、前記円筒形ローラーは第２のエッジに隣接するフレキシブルバッグの一部を受け取りかつ保持するよう構成される、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３】
複数のマイクロキャリアは、前記細胞培養チャンバー内の前記培地中に浮遊させられる、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４】
前記アジテーターユニットと前記細胞培養チャンバーとの間の流体連通は遮断可能である、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項５】
前記円筒形ローラーは、この円筒形ローラーと前記支持部材との間で延在する前記可変容積容器の一部に圧力を加えるために、前記プレート部材に向かって付勢されるよう構成される、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項６】
前記プレート部材に向う前記円筒形ローラーの付勢は弾性スプリング手段によってなされる、請求項５に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項７】
前記弾性スプリング手段はテンションを調整可能である、請求項６に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項８】
前記弾性スプリング手段は、その周囲に前記円筒形ローラーが回転のために配置される軸受シャフトの両端部に作用する圧縮スプリングを含む、請求項６または請求項７に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項９】
前記円筒形ローラーは、前記第２のエッジに隣接する前記フレキシブルバッグの一部を締め付けるよう構成される、請求項２に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１０】
前記プレート部材の実質的に平坦な支持面は、前記円筒形ローラーによって加えられる圧力を均等に分散させかつ前記フレキシブルバッグ上に増大した接触面を得るために、前記円筒形ローラーに面する表面上において弾性変形可能なエラストマー層で覆われる、請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１１】
前記可変容積容器はフレキシブルバッグであり、前記フレキシブルバッグの第１のエッジは、前記プレート部材の前記支持面に対して平行に前記フレキシブルバッグの前記第１のエッジを保持するための前記プレート部材に対して垂直な距離をおいて配置されたサポートに対して取り付けられる、請求項１０に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１２】
前記第１のエッジと反対の前記フレキシブルバッグの前記第２のエッジは、前記プレート部材に対して保持される、請求項１１に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１３】
第１の端部と反対の前記フレキシブルバッグの前記第２のエッジは、前記円筒形ローラーによって規定される外周周面に対して保持される、請求項１１に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１４】
前記円筒形ローラーは、前記第２のエッジを受け入れるために、その外周周面に軸方向スロットを有する、請求項１３に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１５】
前記スロットは、前記可変容積容器の前記第２のエッジに沿ったポケット内でカプセル化されたロッドを受け入れるためのアンダーカットされた長尺なチャンバーを形成する、請求項１４に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１６】
前記細胞培養チャンバーの容積は、前記円筒形ローラーの表面から前記フレキシブルバッグを徐々に巻き戻すことによって増大させられる、請求項１３ないし請求項１５のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１７】
それを中心として前記円筒形ローラーが回転のために配置される前記軸受シャフトはそれ自体、前記フレキシブルバッグによって形成される前記細胞培養チャンバーの容積を増大させるための前記フレキシブルバッグの前記第１のエッジに対して平行でかつそれから離れる制御された動作のために配置される、請求項８ないし請求項１６のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１８】
前記フレキシブルバッグは、１０ｍＬから上に向って容積が増大させられるよう構成される、請求項１ないし請求項１７のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１９】
前記フレキシブルバッグは、５０ｍＬから上に向って容積が増大させられるよう構成される、請求項１８に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２０】
播種段階において、前記細胞培養チャンバーは容積に関して１０〜４００ｍＬ間で維持されるよう構成される、請求項１８または請求項１９に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２１】
播種段階において、前記細胞培養チャンバーは容積に関して５０〜２００ｍＬ間で維持されるよう構成される、請求項２０に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２２】
細胞培養段階において、前記細胞培養チャンバーは容積に関して１００ｍＬよりも上に維持されるよう構成される、請求項１８ないし請求項２１のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２３】
細胞培養段階において、前記細胞培養チャンバーは容積に関して４５０ｍＬよりも上に維持されるよう構成される、請求項２２に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２４】
前記軸受シャフトは、少なくとも一つのネジ山付きスピンドルによって前記第１のエッジに対して移動させられる、請求項８ないし請求項２３のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２５】
前記プレート部材は、実質的に水平な軸線の周りで回転可能な、その支持面によって配置される、請求項１ないし請求項２４のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２６】
前記円筒形ローラーは、前記プレート部材の上面に配置される、請求項１ないし請求項２５のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２７】
前記細胞培養チャンバーを穏やかに攪拌するための前記手段は、前記プレート部材の制御された揺動のための手段を含む、請求項１ないし請求項２６のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２８】
前記プレート部材の揺動は、水平面に対する、少なくとも１〜９０度プラスおよび少なくとも１〜９０度マイナスの角度位置間で実施されるよう構成される、請求項２７に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２９】
前記プレート部材の揺動は、水平面に対する、６０および少なくとも９０度プラスならびに６０および少なくとも９０度マイナスの角度位置間にあるよう構成される、請求項２７または請求項２８に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３０】
各揺動サイクルは、前記プレート部材が水平位置にある状態で始まりかつ終了する、請求項２７ないし請求項２９のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３１】
揺動速度は、前記細胞培養チャンバーの容積に依存して、可変様式で制御されるよう構成される、請求項２７ないし請求項３０のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３２】
５０ないし２００ｍＬの細胞培養チャンバー容積のための揺動速度は、毎秒１〜５００回転度に設定されるよう構成される、請求項２７ないし請求項３１のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３３】
前記プレート部材の制御された揺動は、前記フレキシブルバッグの前記第１および第２のエッジに略垂直に延びる水平回動軸線を中心とするよう構成される、請求項２７ないし請求項３２のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３４】
播種の間、揺動速度は１〜５００度／ｓの間で維持されるよう構成される、請求項２７ないし請求項３３のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３５】
播種の間、揺動運動の加速度および／または減速度は、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で維持されるよう構成される、請求項２７ないし請求項３４のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３６】
培養細胞中、揺動速度は１〜５００度／ｓの間まで増大させられるよう構成される、請求項２７ないし請求項３５のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３７】
培養細胞中、揺動運動の加速度および／または減速度は、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で維持されるよう構成される、請求項３６に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３８】
細胞収穫中、揺動運動の加速度および／または減速度は、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で達成されるよう構成される、請求項２７ないし請求項３７のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項３９】
前記フレキシブルバッグの前記第１のエッジにおいて気泡を収集するための収集手段をさらに備える、請求項１ないし請求項３８のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４０】
気泡を収集するための前記手段は、前記第１のエッジに隣接する前記細胞培養チャンバー内に形成される比較的小さなヘッドスペースを含む、請求項３９に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４１】
前記フレキシブルバッグの前記第１のエッジを保持するための前記サポートが配置される距離は、気泡の必要な除去を達成するために前記細胞培養チャンバーの容積に基づいて選択される前記プレート部材上の垂直距離を置いて、前記プレート部材に対して垂直である、請求項３９または請求項４０に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４２】
前記細胞は足場依存性細胞である、請求項１ないし請求項４１のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４３】
前記細胞は動物およびヒトの細胞の一方である、請求項１ないし請求項４２のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４４】
前記細胞は動物およびヒトの幹細胞の一方であり、かつ、第３のポートからの、培地中に浮遊させられた複数のマイクロキャリアおよびそれに対して付着した幹細胞の通過を阻止するよう構成された第１のフィルターをさらに備える、請求項１ないし請求項４２のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４５】
前記足場依存性の動物細胞は、哺乳動物幹細胞である、請求項４３または請求項４４に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４６】
前記足場依存性の動物細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項４５に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４７】
播種のための幹細胞は最初に粗生体組織検査から得られる、請求項４５または請求項４６に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４８】
前記第３のポートは、前記第１の流体ポートに隣接して配置された、第１および第２の出口を備える、請求項１ないし請求項４７のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項４９】
前記アジテーターユニットに関連付けられた潅流デバイスは、マイクロキャリア懸濁液容器から前記細胞培養チャンバー内へと流体中に浮遊させられたマイクロキャリアを圧送するよう動作可能である、請求項１ないし請求項４８のいずれか１項に記載のバイオリアクターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジテーター装置と、少なくとも一つの使い切り細胞培養容器とを含むバイオリアクターシステムに関する。これによる使い切り細胞培養容器は好ましくは使い捨て細胞培養バッグの形態であり、一方、灌流デバイスと関連付けることもできるアジテーター装置は繰り返し使用するために設計される。
【背景技術】
【０００２】
一般に、そうしたバイオリアクターシステムは特許文献１に開示されている。当該文献に記載された装置においては、動物細胞が二重バッグ容器内で浮遊させられるが、外側バッグは流動性培地およびある量の空気を含み、一方、内側バッグは流動性培地中で浮遊した細胞を含む。内側および外側バッグは、内側バッグへの流動性培地および空気の移動を可能とする半透膜によって分離されている。外側および内側バッグ間の栄養素の交換を促進するために、二重バッグ容器はアジテーターによって運動させられる。
【０００３】
バイオリアクターで細胞を培養するために、細胞は、一定の最適な温度、ｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）濃度を伴う流動性培地といった特定の環境を必要とする。この環境の一部は、細胞自体による成分の排泄によって形成される。バイオリアクターの容積が細胞の量と比較して過度に大きい場合、これらのコンパウンドは、細胞が成長しないという結果を伴って、有効濃度以下に希釈される。培養される細胞は、細菌細胞、真菌、酵母細胞、植物細胞、藻類、昆虫細胞、哺乳動物細胞など、いかなる種類の細胞であってもよい。本発明および／またはその実施形態の好ましい実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、より好ましくは前駆細胞、より好ましくは幹細胞であるが、細胞はまた、胚細胞、皮膚細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肝細胞、赤血球細胞、白血球細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、肺細胞、眼細胞、卵巣細胞、全能細胞、多能性細胞、癌細胞から選択することができる。細胞は一次細胞であってもよいが、細胞株からのものであってもよい。細胞は懸濁液中で成長させることができるが、付着性依存性であって例えば足場またはマイクロキャリア上での成長を必要としてもよい。
【０００４】
流動性培地の溶存酸素（ＤＯ）およびｐＨを制御するために、液相および気相（ＣＯ２およびＯ２）の両方を持つバイオリアクター容器内で、哺乳動物細胞、特にヒトの細胞、特にヒトの幹細胞といった、剪断過敏細胞を培養する試みがなされてきた。気相の存在は培地中に気泡を導入する。この気泡は剪断力を導入するが、これは剪断応力過敏細胞にとって有害である。さらに重大な欠点は、既知のバイオリアクター容器は固定された容積を持つことであり、これは、容器容積の拡張が、低減された剪断応力での細胞培養を促進させることを可能としない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，０５７，４２９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、改良されたバイオリアクターシステムおよびその中で使用するための使い切り細胞培養容器を提案することである。より一般的な意味では、本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも一つを克服または改善することである。本発明の目的はまた、組み立ておよび操作が面倒ではなく、しかもコスト効率よく製造できる代替構造を提供することである。代替的に、本発明の目的は、少なくとも有用な代替策を公衆に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的のために、本発明は、バイオリアクターシステムおよび使い切り細胞培養容器を提供することによって、この問題に対する解決策を見出すが、これは、バイオリアクター内の小さな液量から始まって、分泌生成物の濃度が最適な細胞増殖のために必要とされる臨界レベルより上に留まるように細胞の培養中に容積を拡張することを可能とする。
【０００８】
特に本発明は、バイオリアクターシステム内で、足場依存性動物またはヒト細胞、特にヒトの幹細胞を培養するための可変容積バイオリアクター容器を提供する。この可変容積容器は、流動性細胞培地を含有するための細胞培養チャンバーを形成するフレキシブル外壁と、バイオリアクターシステムのアジテーターユニットのサポートに対する取り外し可能な取り付けのための第１のエッジと、円筒形ローラーおよびアジテーターユニットのサポートの一方に対する取り外し可能な取り付けのための、第１のエッジと平行でかつそれから離間された第２のエッジと、第１のエッジに隣接して形成された容器の最小容積領域と、最小容積領域における第１の流体ポートであって、細胞、マイクロキャリアおよび細胞培地を付加しかつ除去するためにシステムのアジテーターユニットに対して接続可能な第１の流体ポートと、最小容積領域における第２の流体ポートであって、ガスを除去するためにアジテーターユニットに対して接続可能な第２の流体ポートと、最小容積領域における第３の流体ポートであって、アジテーターユニットに対して接続可能な第３の流体ポートと、第３の流体ポートが細胞培養チャンバー内でマイクロキャリアおよび付着細胞を保持しながら流動性細胞培地のサンプリングを可能とすることを保証するために第３の流体ポートと関連付けられた少なくとも一つのフィルターとを備える。そうした可変容積バイオリアクター容器は、容器容積の拡張が、低減された剪断応力にて細胞培養を促進することを可能とする。それはさらにまたバイオリアクター容器からの過度に大きなヘッドスペースおよび気相の除去を可能とする。本発明のさらなる態様によれば、可変容積バイオリアクター容器はさらに少なくとも一つのセンサーを備える。この少なくとも一つのセンサーは、有利なことに、ｐＨ、溶存酸素およびバイオマスに関連する少なくとも一つのパラメータの少なくとも一つを測定するよう構成される。また有利なことに、上記少なくとも一つのセンサーは最小容積領域に配置される。
【０００９】
有利なことに、細胞培養チャンバーは２５〜１５０ｍＬ（ミリリットル）の最小容積領域を、そして事実上制限されない最大容積を有する。２０Ｌの、そして７００Ｌの細胞培養チャンバーさえ、全く、非現実的ではない。そうした最小容積から始まるサイズ範囲は、収量の最適化に良好な結果をもたらすことが見出されれた。少なくとも一つのフィルターは、有利なことには、浮遊細胞の通過ならびに少なくとも一つの出口からの複数のマイクロキャリアおよび幹細胞の通過を阻止することを可能とするよう構成される。これによって、少なくとも一つのフィルターは、好ましくは、マイクロキャリアの少なくとも大部分を閉じ込めるように適合されたメッシュサイズを有する。通常使用されるサイズのマイクロキャリアの場合、これは、例えば、６０μｍ（マイクロメーター）を超えないメッシュサイズであってもよい。少なくとも一つのフィルターにとって、少なくとも７ｃｍ２、好ましくは少なくとも３６ｃｍ２の面積を有することもまた有利である。
【００１０】
本発明に係る可変容積バイオリアクター容器においてはまた、有利なことに、第１、第２および第３の流体ポートの少なくとも一つは、システムのアジテーターユニットと関連付けられた潅流デバイスに接続するためのチューブを含む。流体ポートに対してチューブ状延長部を持たせることで、それをシステムのアジテーターユニットに接続しあるいは切り離す際に、バイオリアクター容器の操作性が向上する。
【００１１】
有利なことに、フレキシブル外壁は実質的にガス不透過性材料のシートから形成される。容器壁がガスに対して実質的に不透過性であることを保証することによって、ガス制御における不正確さが防止される。
【００１２】
可変容積容器は有利なことにはフレキシブルバッグの形態であり、さらに有利なことにはまた、使い切りとして設計される。そうした可変容積容器は使用後に廃棄され、そして、培養物間の交差汚染のリスクを排除するために新しい無菌のものと交換される。そうした可変容積容器は有利なことには使い切りプラスチックバッグであり、これは材料コストが禁止的なものとなることなく、経済的に大量に製造することができる。フレキシブル外壁がフレキシブルプラスチックフォイルを含むこともまた有利である。フレキシブル外壁は、有利なことには、ＥＶＥ、ＰＥおよびＰＶＣの一つからなるポリマー材料からなる。
【００１３】
可変容積バイオリアクター容器の第２のエッジはまた、有利なことには、ロッドを受け入れるためのポケットを備える。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明はまた、マイクロキャリア懸濁液中で足場依存性動物細胞を培養するためのバイオリアクターシステムに関する。本発明に係る、あるいは少なくとも本開示に係る当該システムは、先に規定したような流動性細胞培地を含有するための細胞培養チャンバーを形成するフレキシブル外壁を有する可変容積バイオリアクター容器と、細胞培養チャンバー内で培地の制御された補充を実施するための、第３の流体ポートと流体連通状態の少なくとも一つの入口および第１の流体ポートと流体連通状態の少なくとも一つの出口を備えたアジテーターユニットとを含む。それに対するアジテーターユニットは、細胞培養チャンバーとの流体連通のための少なくとも一つの入口であって、細胞培養チャンバー内に新鮮な栄養培地を入れるよう構成された少なくとも一つの入口と、細胞培養チャンバーとの流体連通のための少なくとも一つの出口であって、細胞培養チャンバー内でマイクロキャリアを保持するフィルターを用いて細胞培養チャンバーからの廃培地の排出を可能とするよう構成された少なくとも一つの出口とを有する。やはり容積拡張ユニットとして有効であるアジテーターユニットはさらに、部分的に平坦化されたセクションを形成するために可変容積容器の外壁を締め付けるための手段であって、平坦化されたセクションを減少させることによって細胞培養チャンバーの容積を増大させるよう動作可能な手段を備える。撹拌手段はまた、播種、撹拌および締め付け、収穫、培養された細胞マテリアルの収集を周期的に実施するための制御手段と組み合わされて、細胞培養チャンバーを穏やかに攪拌するためのアジテーターおよび拡張ユニットと関連付けられる。そうしたバイオリアクターシステムは、上記可変容積バイオリアクター容器の最適な使用を可能とする。有利なことには、複数の好ましくは同一のマイクロキャリアが細胞培養チャンバー内に収容された培地中に浮遊させられる。また、有利なことには、アジテーターおよび拡張ユニットと細胞培養チャンバーとの間の流体連通は、容易な交換およびバイオリアクター容器の一度きりの使用を可能にするために切断可能である。
【００１５】
可変容積容器の外壁を締め付けるための手段は、回転のためにかつ可変容積容器の外壁の表面に接触するよう配置された移動可能な円筒形ローラーを含む。これに関して、締め付けのための手段はまた、好ましくは、円筒形ローラーと対向して可変容積容器の外壁面の一部を支持するための実質的に平坦な支持面を形成するプレート部材をさらに含む。円筒形ローラーがこの円筒形ローラーと支持部材との間で延在する可変容積容器の一部に圧力を加えるためにプレート部材に向かって付勢されるよう構成されるならばさらに有利である。好ましくは、プレート部材に向う円筒形ローラーの付勢は弾性スプリングによってなされ、そして弾性スプリング手段はテンションを調整可能である。特に有利な構成において、弾性スプリング手段は、その周囲に円筒形ローラーが回転のために配置される軸受シャフトの両端部に作用する圧縮スプリングを含む。円筒形ローラーを含むバイオリアクターシステムでは、このローラーはまた、第２のエッジに隣接するフレキシブルバッグの一部を受け取りかつクランプするよう構成されてもよい。
【００１６】
本発明に係るバイオリアクターシステムはまた、円筒形ローラーによって加えられる圧力を均等に分散させかつフレキシブルバッグ上に増大した接触面を得るために、円筒形ローラーに面する表面上において、弾性的に圧縮可能なあるいは変形可能な材料、例えばシリコーンあるいはその他のエラストマー層で覆われたプレート部材の実質的に平坦な支持面を有していてもよい。そうした実施形態において、可変容積容器は、好ましくは、フレキシブルバッグの形態であり、そしてフレキシブルバッグの第１のエッジは、プレート部材の支持面に対して平行にフレキシブルバッグの第１のエッジを保持するためのプレート部材に対して垂直な距離をおいて配置されたサポートに対して取り付けられる。この場合、  第１のエッジと反対のフレキシブルバッグの第２のエッジは、プレート部材に対して保持されるか、あるいは円筒形ローラーによって規定される外周周面に対して保持される。
【００１７】
フレキシブルバッグの、第１のエッジと反対の第２のエッジが円筒形ローラーの外周周面に対して保持される場合、円筒形ローラーが第２のエッジを受け入れるために、その外周周面に軸方向スロットを有することが有利である。当該スロットは、有利なことには、可変容積容器の第２のエッジに沿ったポケット内でカプセル化されたロッドを受け入れるためのアンダーカットされた長尺なチャンバーを形成する。
【００１８】
さらに、フレキシブルバッグの第２のエッジが円筒形ローラーの外周周面に対して保持される場合、円筒形ローラーは、有利なことには、その間で第２のエッジをクランプするように二つの半体に軸方向に切断されてもよい。
【００１９】
締め付けるための手段が、それに対してフレキシブルバッグの第２のエッジが任意選択で保持される移動可能な円筒形ローラーを含む場合、細胞培養チャンバーの容積が、円筒形ローラー表面からフレキシブルバッグを徐々に巻き戻すことによって増大させられるならばさらに有利である。このために、それを中心として円筒形ローラーが回転のために配置される軸受シャフトは、それ自体、有利なことには、フレキシブルバッグによって形成される細胞培養チャンバーの容積を増大させるためのフレキシブルバッグの第１のエッジに対して平行でかつそれから離れる制御された動作のために配置される。
【００２０】
本発明に係るバイオリアクターシステムは、有利なことには、１０ｍＬの容積から、はるかに大きな容積まで増大させられるよう構成されたフレキシブルバッグとして形成された可変容器と共に使用できる。特に、フレキシブルバッグは、１０ｍＬから始まって容積が増大させられるよう構成される。
【００２１】
播種段階において、細胞培養チャンバーは容積に関して１０〜４００ｍＬの間で維持されるよう構成される。特に、播種段階において、細胞培養チャンバーは容積に関して５０〜１００ｍＬの間に維持されるよう構成される。
【００２２】
細胞培養段階において、細胞培養チャンバーは、有利なことには、容積に関して１００ｍＬよりも上に維持されるよう構成される。特に、細胞培養段階において、細胞培養チャンバーは容積に関して４５０ｍＬよりも上に維持されるよう構成される。
【００２３】
円筒形ローラーが、軸受シャフトの両端部に作用する圧縮スプリングによって付勢される構成において、軸受シャフトは、有利なことには、少なくとも一つのネジ山付きスピンドルによって第１のエッジに対して移動させられる。
【００２４】
アジテーター／拡張ユニットのプレート部材はまた、有利なことには、プレート部材の上面に配置された円筒形ローラーと共に、実質的に水平な軸線の周りで回転可能な、その支持面を備えて配置される。細胞培養チャンバーを穏やかに攪拌するための手段は、この場合、有利なことには、プレート部材の制御された揺動のための手段を含む。これに関して、プレート部材の揺動は、有利なことには、水平面に対する、少なくとも１〜９０度プラスおよび少なくとも１〜９０度マイナスの角度位置間で実施されるよう構成される。特に、プレート部材の揺動は、水平面に対して、６０〜９０度プラスおよび６０〜９０度マイナスの角度位置間にあるよう構成される。さらに、各揺動サイクルは、プレート部材が水平位置にある状態で始まりかつ終了するならば有利である。また、揺動速度は、有利なことには、細胞培養プロセスの段階に依存するなど可変様式で任意に制御されるよう構成されてもよい。これに関して、５０ないし２００ｍＬの細胞培養チャンバー容積のための揺動速度は、有利なことには、毎秒１〜５００回転度に設定されるよう構成されてもよい。プレート部材の制御された揺動は、好ましくは、フレキシブルバッグの第１および第２のエッジに略垂直に延びる水平回動軸線を中心とするよう構成される。播種の間、揺動速度は、有利なことには、１〜５００度／ｓの間で維持されるよう構成される。播種の間、揺動運動の加速度および／または減速度は、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で維持されるようさらに最適に構成される。
【００２５】
また、培養細胞中、揺動運動の加速度および／または減速度は、好ましくは、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で維持されるよう構成される。
【００２６】
また、細胞収穫中、揺動運動の加速度および／または減速度は、好ましくは、１〜１０００度／ｓ２の範囲内で達成されるよう構成される。細胞培養プロセス全体の間、これらの境界域内に維持することは細胞の損傷を防止するのに役立つ。
【００２７】
本発明に係るバイオリアクターシステムは、さらに有利になことに、フレキシブルバッグの第１のエッジにおいて気泡を収集するための収集手段をさらに備えてもよい。気泡を収集するためのそうした手段は、第１のエッジに隣接する細胞培養チャンバー内に形成される比較的小さなヘッドスペースを含んでいてもよい。このために、フレキシブルバッグの第１のエッジを保持するためのサポートは、有利なことには、気泡の必要な除去を達成するために細胞培養チャンバーの容積に基づいて選択されるプレート部材上の垂直距離を置いて、プレート部材に対して垂直に配置されてもよい。
【００２８】
本発明に係るバイオリアクターシステムは、さらに有利なことには、浮遊細胞の通過を可能とし、かつ、第３の出口からの複数のマイクロキャリアおよび幹細胞の通過を阻止するよう構成された第１のフィルターを備えてもよい。本発明に係るバイオリアクターシステムにおいて培養される足場依存性の動物細胞は、有利なことには、哺乳動物幹細胞である。特に、足場依存性の動物細胞は間葉幹細胞（ＭＳＣ）である。そうした播種のための幹細胞は最初に粗生体組織検査から得られたものである。
【００２９】
本発明に係るバイオリアクターシステムの第３のポートは、有利なことには、第１の流体ポートに隣接して配置された、第１および第２の出口を備える。
【００３０】
本発明のバイオリアクターシステムのアジテーターおよび拡張ユニットは、有利なことには、マイクロキャリア懸濁液容器から細胞培養チャンバー内へとマイクロキャリアを圧送するように動作可能であるさらなる機器と関連付けられる。
【００３１】
播種段階の間、細胞培養チャンバー内へのマイクロキャリアの導入と関連した、細胞培養チャンバーへの粗骨髄吸引液の追加はオプションであってもよい。
【００３２】
バイオリアクターシステムは、有利なことには、細胞培養チャンバー内から除去された廃培地が８〜１００μｍのメッシュサイズを有する少なくとも一つのフィルターを通過させられるよう構成されてもよい。
【００３３】
本発明のさらに有利な態様は以下の詳細な説明ならびに図面から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】細胞培養バッグの平坦化を利用するバイオリアクターシステムの第１実施形態の概略側面図である。
【図２】細胞培養バッグの巻回を利用するバイオリアクターシステムの第２実施形態の概略側面図である。
【図３】透明な細胞培養バッグの平面図である。
【図４】図３の細胞培養バッグを構成するための主要な要素の概略分解図である。
【図５】バイオリアクターシステムの第２実施形態での使用のための円筒形ローラーの斜視図であり、代替的に第１実施形態にも適している。
【図６】バイオリアクターシステムの第２実施形態での使用のためのアジテーターおよび拡張装置の斜視図である。
【図７】図６のアジテーターおよび拡張装置の詳細図である。
【図８】その駆動機構を示すために部品を取り外した状態での、図６のアジテーターおよび拡張装置の別な図である。
【図９】第２実施形態に係るバイオリアクターシステムの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１には本発明に係るバイオリアクターシステム１Ａの第１実施形態が概略的に示されている。使い切り使い捨てバッグ３の形態の可変容積容器は剛体支持部材上に支持されている。支持部材５は、この例ではシリコーンエラストマー層７といった、弾性的に圧縮可能な材料で覆われた平坦な上側支持面を有する。バッグ３は、支持部材５の第１の端部において隆起部分１１に対して取り外し可能に取り付けられた第１のエッジ９を有する。バッグ３の第２のエッジ１３は、第１の端部と反対側の支持部材５の第２の端部に対して取り外し可能に取り付けられる。円筒形ローラー１５は、バッグ３の可変容積を減少させるためにローラー１５とシリコーン層７との間でバッグ３を平坦化するためにバッグ３の第２のエッジ１３に配置される。ローラー１５はアクスルシャフト１７に回転可能に設けられるが、このアクスルシャフトは、圧縮スプリング１９によって支持部材５に向ってスプリング付勢される。可変容積バッグ３の容積を変更する（すなわち細胞成長の増殖中に容積を増大させる）ために、シリンダー１５は、支持部材５の支持面と平行に、そのアクスルシャフト１７によって移動させられる。シリンダー１５は、これによって、支持部材５の隆起部分１１に近接した位置から始まって矢印２１の方向に移動する。バッグ３の第１のエッジ９近くのローラー１５の出発位置は、細胞培養を開始するの適切である最小容積領域がその第１のエッジに隣接してバッグ３内に形成されるように選択される。バッグ３内での細胞培養中、ローラー１５は、その出発位置から、支持部材５の反対側端部のバッグの第２のエッジ１３に向かって徐々に移動する。スプリング１９によってローラー１５に加えられる圧力の結果として、可変容積バッグ３は、バッグ３内の流体がローラー１５とバッグ３の第１のエッジ９との間に形成されるコンパートメント２３から逃げることができないように、ローラー１５と支持部材５との間でクランプされる。特に、コンパートメント２３からの流体は、ローラー１５とバッグ３の第２のエッジ１３との間で延びるバッグ３の平坦化されたセクション２５へと移動することはできない。これによって、エラストマー層７は、ローラーよって加えられる圧力を、バッグ３の適切な表面上に均等に分散させるのに有効である。これは、ローラー１５が静止していてもあるいはコンパートメント２３の容積を増大させるために移動していても、流体がローラー１５と支持部材５との間のニップを越えて移動するのを防止するためにバッグ３上の圧力表面が十分であることを保証する。
【００３６】
コンパートメント２３内での細胞増殖を増強するために、支持部材５はアセンブリ全体と共に、ローラー１５のアクスルシャフト１７に対して好ましくは垂直に延在する水平軸線を中心として揺動させることができる。この揺動運動は連続的にまたは間隔を置いて実施することができ、水平位置の一方側における９０度と水平位置の他方側における９０°との間で拡大できる。コンパートメント２３内での細胞培養物の最適な混合を実現するために、揺動動作の異なる角度（９０度よりも大きいか小さい）または異なる向きを有する揺動軸線もまた可能であることを理解されたい。
【００３７】
図２には、本発明に係るバイオリアクターシステム１Ｂの第２実施形態が概略的に示されている。この変形例では、可変容積バッグ３の第２のエッジ１３はローラー１５に対して接線方向に取り外し可能に取り付けられる。これによって、平坦化されたセクション２５はローラー１５の外周のある位置の周りで延在する。図２において、図１に関連して先に説明したものと同一の参照数字が使用されており、第２実施形態のさらなる説明はしたがって過剰であると見なされる。
【００３８】
ここで、第２実施形態について、図３ないし図９を参照して、さらに詳しく説明する。図３および図４は、バイオリアクターシステムの第２実施形態１Ｂと共に使用するのに特に有用であるバッグ３を示しているが、これもまた、変更を伴わずに、第１実施形態１Ａと共に容易に使用することができる。図４の概略分解図に最もよく示されるように、バッグ３は、基本的に、第１のフレキシブルシート２７および第２のフレキシブルシート２９から構成される。これら第２および第１のシート２９，２７は、好ましくは、ＥＶＥ、ＰＥまたはＰＶＣといった透明なフレキシブルプラスチックフォイルからなる。第１のシート２７の内面に取り付けられるのは、溶存酸素（ＤＯ）センサー３１、ｐＨセンサー３３およびバイオマスセンサー３５である。溶存酸素用のセンサー３１およびｐＨ用のセンサー３３は、Ocean Optics（830 Dougllas Avenue, Dunedin，フロリダ州，米国）によって、あるいはPreSens Precision Sensing GmbH（Josef-Engert-Strasse11，93053 Regensburg，独国）によって供給されるもののような使い捨ての蛍光光学センサーパッチであってもよい。バイオマスセンサー３５は、Aber Instruments（5 Science Park, Aberystwyth, 英国）によって、あるいはFOGALE nanotech（125 rue de l’hostellerie-Bat A, 30900 Nimes, 仏国）によって供給されるようなタイプのものであってもよい。センサーパッチ３１，３３は、光学的励起および検出のためにバッグ３の外部との光学的続が必要である。第１のシート２７の透明性が十分であるとき、第１のシートの内面にセンサーパッチを接着することは全く可能である。しかしながら、各ＤＯおよびｐＨセンサーパッチ３１，３３の光学的接続を簡素化するために、参照数字３７，３９によって示される位置において第１のシート２７に開口を設けることが好ましい。バイオマスセンサー３５はバッグ３の外部との電気的接続を使用し、開口４１がまた、バイオマスセンサー３５の電気的接続を可能とするために第１のシート２７に設けられる。
【００３９】
さらに、第２および第１のシート２９，２７間に挟み込まれているのは、細胞、マイクロキャリア、エンボディメントからのサンプルおよび細胞培地を追加および除去するための第１のチューブ状接続部４３、ガスを除去するための第２のチューブ状接続部４５、そして流動性細胞培地をサンプリングしかつ液体を除去するための一対の第３のチューブ状接続部４７Ａ，４７Ｂの形態の多数の流体アクセスポートである。培地のサンプリング中、マイクロキャリアおよび付着細胞がバッグ３の内部で保持されることを保証するために、各第３のチューブ状接続部４７Ａ，４７Ｂはフィルター４９を備える。フィルター４９は６０μｍのメッシュサイズを有し、第２のシート２９に対して取り付けるためのパッチとして、あるいは第１のエッジ９において第２および第１のシート２９，２７を一体化するための周囲継ぎ目によって一体化されたパウチの形態で提供することができる。やはり周囲継ぎ目によって取り囲まれているのは、バッグ３の第２のエッジ１３と関連付けられた保持ロッド５１である。
【００４０】
周囲継ぎ目の説明のために、ここで図３を参照するが、これは透明バッグ３の第２の平面図である。透明バッグ３の第１および第２のシート２７，２９は、バッグ３の内部スペース全体および培養コンパートメントを形成する内側周囲継ぎ目５３、ならびにバッグ３に付加的な強度および剛性を提供するための任意選択的の外側周囲継ぎ目５５によって、その周囲を取り囲むように接合される。さらに、図３から、フィルター４９（ここではパウチの形態）が、バッグ３の第１のエッジ９において内側継ぎ目と一体化されることが分かる。バッグ３の第２のエッジ１３において、保持ロッド５１が内側および外側周囲継ぎ目５３，５５間でカプセル化される。保持ロッド５１は、内側および外側継ぎ目５３，５５を形成する前に第２のエッジ１３に配置されてもよいが、これによって形成されるポケット内に内側および外側継ぎ目５３，５５の形成後にロッド５１を挿入できるように、第１および第２のシート２７，２９の少なくとも一方に少なくとも一つのスリット５７を設けることも可能である。さらに、図３および図４に示すようなバッグ３に関して、対４７Ａ，４７Ｂの代わりに単一の第３のチューブ状接続部のみを有することもまた可能であることに留意されたい。さまざまなセンサー３１，３３，３５と干渉することなくフィルター４９を十分なサイズの面積を伴って設けることができることを保証できる場合に、単一の第３のチューブ状接続部は可能である。本実施形態では、それらが有利なことにセンサー間に配置できるように、一対の第３のチューブ状接続部４７Ａ，４７Ｂ間でフィルター領域を分割することが好まれる。だが、センサーとの干渉を回避できる限り、この構成を要求に従って変更することは当業者の能力の範囲内にある。
【００４１】
図５は、好都合には部分的に金属製のシリンダーの形態である円筒形ローラー１５を単体で示す斜視図である。その剛性を損なうことなく、円筒形ローラー１５の重量を低減するために、それは、プラスチック（例えばナイロン）コア（ただし部分的に中空）およびアルミニウムまたはステンレススチールまたは硬質プラスチック製の外筒を有することができる。ローラー１５の中心において、軸方向孔６１が、図１および図２に大まかに示されるように、アクスルシャフト１７の収容のために設けられている。ローラー１５はさらに、使い切りバッグ３の第２のエッジ１３および保持ロッド５１を収容するために、その外周囲に、方向スロット６３と、関連する長尺なキャビティ６５とを備える。これによって、保持ロッド５１は長尺なキャビティ６５内に収容され、そして第２のエッジ１３が軸方向スロット６３から脱落するのを防止する。
【００４２】
図６の円筒形ローラー１５は、ローラー１５を動作させる拡張システムの説明を明瞭にするために、使い切り細胞培養バッグを伴わずに示されたアジテーターおよび拡張装置の一部として示されている。このアジテーターおよび拡張装置７１は、細胞培養バッグ３と共に、図２に大まかに示すように、バイオリアクターシステム１Ｂを構成する。アジテーターおよび拡張装置７１の支持部材５はトレイ形状であり、かつ、細胞培養バッグの第１のエッジ（図２における９）の取り付けのための一端に隆起部分１１を有する。支持部材５の平坦な上側支持面はエラストマー層７によって形成される。ローラー１５は、そのアクスルシャフト（図６では認識できない）を介して、一対の適切に配置されたキャリッジ７３によって回転可能に支持される。軸受プレート７７とトランスミッションハウジング７９との間に軸支された回転可能なスクリュースピンドル７５は、隆起部分１１と平行でかつそれから離れる円筒形ローラー１５の制御された動作を可能とする。隆起部分１１はトランスミッションハウジング７９を収容するように形成されるが、これはスクリュースピンドル７５を回転させるための駆動機構を収容する。同様に配置されたスクリュースピンドルが、隆起部分に対するローラー１５の平行移動を保証するために、支持部材５の反対側に沿って設けられてもよい。にもかかわらず、当業者は、隆起部分１１から平行に離れるようにローラー１５を並進移動させるための同等に有効な手段を容易に考え出すことができる。トランスミッションハウジング７９上の隆起部分１１はさらに、細胞バッグのバイオリアクターの第１のエッジをクランプするためのクランピングバー８１を備える。さらなるクランピングバー８３は、細胞培養バッグのチューブ状接続部が適所で適切に保持可能であることを保証する。クランピングスクリュー８５は、クランピングバー８１，８３がトランスミッションハウジング７９に対して堅固に締め付け可能であることを保証する。スクリューアジャスター８７は、支持部材５のエラストマー層７に対してローラー１５を押圧する際に圧縮スプリング１９によって加えられる圧力を調節するために、ローラー１５の長手方向両端部における各キャリッジ７３と関連付けられる。
【００４３】
図７は図６のキャリッジ７３の拡大図である。図７から最もよく分かるように、キャリッジ７３はローラーシャフトキャリア８９を有するが、これは、ピボットピン９１によって、それに対して回動可能に搭載される。ピボットピン９１の反対側で、スクリューアジャスター８７は、ヒンジピン９５によってキャリッジ７３に連結されたピラー９３のネジ山付き部分（認識できないが一般的なものである）と係合する。スライドブロック９７が、ピラー９３を中心とするスライド運動のためにシャフトキャリア８９に回動可能に搭載される。スクリューアジャスター８７および圧縮スプリング１９は、シャフトキャリア８９へと、加えられた圧力を伝達するためにスライドブロック９７に対して着座する。
【００４４】
図８は、トランスミッションハウジングの側から、アジテーターおよび拡張装置７１を示しているが、ハウジング７９は、支持部材の隆起部分１１および内部の駆動手段を見えるようにするために除去されている。図８に示すように、スクリュースピンドル７５の長手方向端部は平坦面を有する多角形輪郭を与えられており、この結果、これらの端部は歯車１０１による回転のために係合可能である。同一の直径を有する歯車１０１は歯付き駆動ベルト１０３と駆動可能に結合される。歯付き駆動ベルト１０３は、回動可能に設けられた張力調整アーム１０７の自由端部に対して設けられた張力調整ローラー１０５によって緊張状態で維持される。歯付きベルトドライブは、両方のスクリュースピンドル７５が支持部材５の両端に沿って同時に向かい合うキャリッジ（図６および７の７３）を移動させるために同期的に動作することを保証する。動力式ドライブを、公知の一般的な様式でスクリュースピンドル７５の露出した多角形端部の一つを電気的に駆動することによって導入できる。だが、異なる位置に電気駆動モーターを配置することおよび／または歯車１０１のための異なるマウントを使用することも可能である。そうした変更は当業者の能力の範囲内であると考えられ、さらなる説明は必要とされない。張力調整アーム１０７は、プレテンション方式で取り付けられても、あるいはスプリング付勢されてもよい。ローラー１５のアクスルシャフト１７に対して垂直に延在すると共に支持部材５を揺動させるための水平ピボット軸線１０９の端部はまた図８において認識可能である。
【００４５】
ローラー１５（図６参照）によって加えられる圧力が支持部材５の幅を横切って一定であることを保証するためには、同じトルクでスクリューアジャスター８７のそれぞれを調整すれば十分であることが判明している。ローラーシャフトの端部がローラー１５に同じ力を加えることを保証するために、より複雑な機構、例えば油圧技術を使用できることもまた当業者にとって自明であろう。
【００４６】
図９はバイオリアクターシステム１Ｂを全体的に示しており、細胞培養バッグはアジテーターおよび拡張装置７１の支持部材５に設置されている。チューブ状接続部４３，４５，４７Ａおよび４７Ｂはそれぞれ、概して参照数字１０９で示すさらなるチューブに接続されるが、これはさらに灌流ユニット（図示せず）に接続され、これは、細胞培地をサンプリングするために、培地中で付着細胞を伴うマイクロキャリアを浮遊状態で維持するためにガスを除去しかつ支持部材５を激しく動かすために、そして細胞増殖を促進するために、アジテーターおよび拡張装置７１と関連付けられてもよい。
【００４７】
したがって、懸濁液中で足場依存性の動物またはヒト細胞を培養するためのバイオリアクターシステム（１Ａ；１Ｂ）が開示される。システム（１Ａ；１Ｂ）は、流動性培地および浮遊状態の足場依存性細胞を収容するための細胞培養チャンバーを形成するフレキシブル外壁（２７，２９）を有する可変容積容器（３）を含む。可変容積容器（３）は、バイオリアクターシステムのアジテーター／拡張ユニットのサポート（５）に対する取り外し可能な取り付けのための第１のエッジ（９）と、円筒形ローラー（１５）およびアジテーター／拡張ユニットのサポート（５）の一方に対する取り外し可能な取り付けのための、第１のエッジ（９）と平行でかつそれから離間された第２のエッジ（１３）とを含む。第１のエッジ（９）に隣接して形成された容器（３）の最小容積領域（２３）は、最小容積領域（２３）における第１の流体ポート（４３）であって、細胞、マイクロキャリアおよび細胞培地を付加しかつ除去するためにシステムのアジテーター／拡張ユニットに対して接続可能な第１の流体ポート（４３）と、最小容積領域（２３）における第２の流体ポート（４５）であって、ガスを除去するためにシステムに対して接続可能な第２の流体ポート（４５）と、最小容積領域（２３）における第３の流体ポート（４７Ａ；４７Ｂ）であって、システムに接続可能な第３の流体ポート（４７Ａ；４７Ｂ）とを有する。可変容積容器はまた、第３の流体ポートが細胞培養チャンバー内でマイクロキャリアおよび付着細胞を保持しながら流動性細胞培地のサンプリングを可能とすることを保証するために第３の流体ポート（４７Ａ；４７Ｂ）と関連付けられた少なくとも一つのフィルター（４９）を有する。システム（１Ａ；１Ｂ）のアジテーター／拡張ユニットは、細胞培養チャンバー内に新鮮な栄養培地を入れるために、そして細胞培養チャンバーからの廃培地の排出を可能とするために、細胞培養チャンバー内の培地の制御された補充を行うため、第１、第２および第３の流体ポート（４３，４５，４７Ａ；４７Ｂ）と流体連通状態である。アジテーター／拡張ユニットはさらに、可変容積容器の平坦化されたセクション（２５）を伸ばすために可変容積容器（３）の外壁を締め付けるためのローラー（１５）を有する。
【００４８】
これによって、可変容積容器は、最初の最小容積領域（２３）から出発して細胞培養チャンバーを、そして細胞培養チャンバーを穏やかに撹拌するための手段を形成するその容積が増大する。制御手段が、定期的に播種、攪拌および締め付け手段の間欠動作を実施するための、そして培養された細胞マテリアルの収穫および収集のためのアジテーター／拡張ユニットと関連付けられる。
【００４９】
ここまで説明したように、本発明に係るバイオリアクターシステムは、必須の要素として、使い切り細胞培養バッグおよびアジテーター／拡張装置を含む。使い切り細胞培養またはバイオリアクターバッグは、チューブ、フィルターおよびセンサーを有するフレキシブルプラスチックフォイルからなる。説明した例は、約３６ｃｍ２の総面積を備えた６０μｍの二つのフィルターを備える。バイオリアクターバッグ内のフィルターは、培地の灌流の間、バイオリアクターバッグ内にマイクロキャリアに付着した細胞を維持するために必要とされる。この出口を介して、細胞を含まない使用済みの培地サンプルを取り出すことができる。一つのチューブは、バイオリアクターバッグに細胞、マイクロキャリアおよび新鮮な培地を付加し、バイオリアクターバッグからマイクロキャリアおよび細胞を伴うサンプルを採取するためのものである。もう一つの別なチューブは、バイオリアクターバッグから気泡を除去するためのものである。この使い切りバイオリアクターバッグにおいては三つのセンサー、すなわち
・ｐＨを測定するためのセンサー
・溶存酸素を測定するためのセンサー
・バイオマスを測定するためのセンサー
が存在する。バイオマスセンサーはオプションである。チューブ、フィルターおよびセンサーは、５０〜１５０ｍＬの最小容積がバイオリアクターバッグのフォイルを締め付けることによって形成され、それによって小さなコンパートメントが形成されるように配置される。バイオリアクターバッグの出発容積および灌流チューブは、排泄コンパウンドを臨界レベルよりも上で維持するのに十分なほど小さい。細胞の培養中、容積は、排泄成分の濃度が臨界レベルよりも上に留まるように拡張することができる。拡張は、離散的容積段階で、あるいは５０ｍＬから最大容積まで無段階に実施できる。
【００５０】
アジテーター／拡張装置は、円筒形ローラー、有利なことには、少なくとも金属または硬質プラスチック外周面を備えたシリンダーを含み、これは、フォイルをクランプしかつ小さな容積を形成するために使い切りバイオリアクターバッグのフォイル材料に押し付けられる。バッグは、スライド内にそれを押し込むことによりシリンダーに対して取り付けられる。バイオリアクターバッグのロッドはシリンダーの溝に収まる。圧力は、シリンダーに特定の圧力を加えるためのトルクスクリュードライバーを用いて制御される。バイオリアクターバッグの下方には、（シリコーンエラストマーといった）好ましくは弾性的に圧縮可能なフレキシブルシートが、クランプをより効果的にするために付加される。バイオリアクターバッグの端部に向かってシリンダーを移動させることで、容積は可能な限り最小の容積から可能な限り大きな容積へと増大させられる。この拡張システムは、バイオリアクターバッグ内で培養物を混合するために、水平から最大９０°または−９０°までの揺動運動で動作する。バイオリアクターバッグの設置およびクランプの位置は同じレベルにはない（図１および図２参照）。これは、システムが揺動動作中に垂直に配置される場合、空気出口チューブが配置されるバイオリアクターバッグの一部において気泡を収集することを可能とするために、このように設計される。そして、この設置位置は、バッグの容積のためのスペースを形成するためにそれが効果的に垂直に膨張できるように、バイオリアクターバッグスペースを与えるために必要とされる。このようにして、バイオリアクターバッグの形状はクッションのようなものとなるが、これはバイオリアクターバッグのための最も効果的な容積拡張形状である。
【００５１】
したがって、本発明の動作および構成は先の説明および図面から明らかである。本発明が本明細書に記載された実施形態に限定されないこと、そして特許請求の範囲内にあるとみなされるべき変更が可能であることは当業者には自明である。また動的な反転は本質的に開示されており、そして本発明の範囲内にあるとみなされる。特許請求の範囲において、参照数字は請求項を限定するものとして解釈すべきではない。「備える」および「含む」との用語は、本明細書または特許請求の範囲で使用されるとき、排他的または網羅的な意味ではなく、むしろ包括的な意味で解釈されるべきである。したがって本明細書で使用される「備える」との表現は、請求項に記載されたものに加えて、その他の要素またはステップの存在を排除しない。さらに、「一つ」との語句はただ一つへの限定と解釈すべきではなく、代わりに「少なくとも一つの」を意味するように使用され、複数を排除しない。特異的または明示的に説明されまたは特許請求されていない特徴は、その範囲内で本発明の構成に付加的に含まれ得る。「〜のための手段」といった表現は、「〜のために構成されたコンポーネント」または「〜のために構成された部材」と解釈されるべきであり、そして開示される構造に関する均等物を含むものと解釈すべきである。「臨界」、「好ましい」、「特に好ましい」等の表現の使用は本発明の限定を意図したものではない。当業者の知識範囲内での追加、削除および変更は、概して、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく実施できる。
【符号の説明】
【００５２】
１Ａ，１Ｂ  バイオリアクターシステム
３  可変容積容器（細胞培養バッグ）
５  サポート（支持部材）
７  シリコーンエラストマー層
９  第１のエッジ
１１  隆起部分
１３  第２のエッジ
１５  円筒形ローラー（シリンダー）
１７  アクスルシャフト
１９  圧縮スプリング
２３  初期最小容積領域（コンパートメント）
２５  平坦化されたセクション
２７  第１のフレキシブルシート（外壁）
２９  第２のフレキシブルシート（外壁）
３１  溶存酸素（ＤＯ）センサー
３３  ｐＨセンサー
３５  バイオマスセンサー
４１  開口
４３  第１の流体ポート（第１のチューブ状接続部）
４５  第２の流体ポート（第２のチューブ状接続部）
４７Ａ  第３の流体ポート（第３のチューブ状接続部）
４７Ｂ  第３の流体ポート（第３のチューブ状接続部）
４９  フィルター
５１  保持ロッド
５３，５５  継ぎ目
５７  スリット
６１  軸方向孔
６３  軸方向スロット
６５  キャビティ
７１  拡張装置
７３  キャリッジ
７５  スクリュースピンドル
７７  軸受プレート
７９  トランスミッションハウジング
８１，８３  クランピングバー
８５  クランピングスクリュー
８７  スクリューアジャスター
８９  ローラーシャフトキャリア
９１  ピボットピン
９３  ピラー
９５  ヒンジピン
９７  スライドブロック
１０１  歯車
１０３  駆動ベルト
１０５  張力調整ローラー
１０７  張力調整アーム
１０９  水平ピボット軸線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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