(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ抽出液を抗原として雌ダチョウに免疫し、前記雌ダチョウが産卵した卵の卵黄から得た卵黄抗体であって、
ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミンおよびタールに結合する卵黄抗体。
【請求項２】
請求項１の抗体を有するタバコフィルター。
【請求項３】
請求項１の抗体を有するマスク。
【請求項４】
請求項１の抗体を用いた検査キット。
【請求項５】
請求項１の抗体を用いた飲み薬。
【請求項６】
請求項１の抗体を用いた注射薬。
【請求項７】
請求項１の抗体を用いたガム。
【請求項８】
請求項１の抗体を用いた歯磨剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
タバコ抽出液に含まれるニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミン、タールを含むタバコ抽出液に含まれる低分子化合物に結合する抗体とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバコおよびタバコの煙には多くの化学物質が含まれており、発ガン性物質とされるものもあるとされている。これらの化学物質は、分子量が小さい。そのため、喫煙によって血中に移行すると、脳の血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ）を通過し、神経細胞にさまざまな生理活性作用を与える。これがさまざまな中毒に発展する。
【０００３】
このようなタバコ中の化学物質を検知し、無力化しようとする提案はすでにされている。特許文献１には、アフラトキシン、ベンゾピレンと特異的に結合するモノクロナール抗体で、これらのトキシンを無力化することが開示されている。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５１６７２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タバコに含まれる化学物質は、分子量が小さいために血液脳関門を通過する。しかし、これらの化学物質により大きな分子量の物が結合すれば、血液脳関門を通過できず、化学物質の影響を抑制することが可能になる。
【０００６】
ここで、タバコの化学物質に結合するものとして抗体は非常に効果的であると考えられる。しかし、特許文献１に開示されているようなモノクロナール抗体では、タバコに含まれる多くの化学物質を対象とすることは難しい。また、モノクロナール抗体を大量に作製するには大規模な設備が必要となる。 
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたもので、タバコに含まれる複数の化学物質に結合するタバコ抗体を提供する。
【０００８】
より具体的に本発明に係るタバコ抗体は、タバコ抽出液を抗原として雌ダチョウに免疫し、前記雌ダチョウが産卵した卵の卵黄から得た卵黄抗体であって、ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミンおよびタールに結合することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るタバコ抗体の製造方法は、タバコ抽出液を抗原としてダチョウを含む雌性鳥類に免疫し、産卵された卵の卵黄から抗体（ＩｇＹ）を得る。したがって、均質で大量の抗体を得ることができる。また、得られた抗体はポリクロナール抗体であって、タバコ抽出液中の複数の化学物質に結合することができる。
【００１０】
したがって、タバコ中の化学物質を検知し、取り去ることができる。また後述するように本発明に係るタバコ抗体が結合した化学物質は、血液脳関門の通過を抑制されるので、タバコの脳への影響を抑制することが可能となる。 
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】免疫前ダチョウ抗体と抗タバコダチョウ抗体が結合したニコチンの血液脳関門の通過量を測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下本発明に係る抗体について説明する。なお、以下の説明は本発明の一実施形態を示すものであり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下の実施形態および実施例は改変されてもよい。
【００１３】
本発明はタバコの抽出液を抗原として用いる。この抽出液中には、多くの化学物質が含まれている。したがって、この抗原から得られる抗体は、複数の化学物質に対して結合することができると考えられる。ここでは、ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミン、タールについて効果が確認された。
【００１４】
ニコチンは、タバコの依存性を高めるものとして知られている。これはタバコの煙中にも残存し、副流による受動喫煙によっても体内に取り込まれる。また、タールは、ＰＭ２．５と呼ばれるエアロゾル中にも含まれる。ＰＭ２．５は、空気中に浮遊する粒子（エアロゾル）の中で大きさが２．５μｍ以下のものを指す。
【００１５】
ベンゾピレンは５つのベンゼン環が結合した多環芳香族炭化水素で、発癌性があると言われている。メチルエチルニトロソアミンも発癌性があると言われている。
【００１６】
雌性鳥類に対して免疫する工程では、公知の方法を利用することができる。免疫の際は、抗原とともに各種アジュバンドを利用することができる。また、免疫も初回免疫の後、追加免疫してもよい。
【００１７】
利用できる鳥類としては、ウズラ、ニワトリ、ダチョウ等が利用できる。特に、体の大きなダチョウが好適に利用できる。タバコの抽出液は、基本的に毒性を有するので、体型の小さな鳥類は、免疫した際に死亡する場合もあるからである。
【００１８】
免疫後の鳥類から得られた卵から抗体（ＩｇＹ）を回収する工程では、公知の方法で抗体を回収することができる。回収された抗体は、タバコの抽出液中の化学物質に結合する。この結合によってタバコ中の化学物質を検知し、捕獲することができる。また、タバコ抗体が結合した化学物質は血液脳関門の通過が抑制される。したがって、これらの化学物質の脳への生理活性を抑制することができる。
【００１９】
得られたタバコ抗体は、タバコのフィルタ、飲み薬、注射薬、ガムや歯磨剤に混入させることができる。また、タバコの葉自体に混入させておいてもよい。タバコ抗体は、いわゆるフィルタ付き巻きたばこのフィルタに含ませておくことで、喫煙時に体内に流れる煙中の化学物質を捕獲することができる。
【００２０】
また、飲み薬や注射薬にすることで、体内に取り込まれたタバコの化学物質が脳内の神経細胞に作用することを抑制することができる。また、ガムや歯磨剤に混入させることで、喫煙後に口腔内に残留した化学物質に結合し、これらの物質が脳内の神経細胞に作用することを抑制する。
【００２１】
さらに、タバコの葉自体に混入させると、フィルタ無し（いわゆる両切りタバコ）を喫煙する場合であっても、化学物質の体内への取り込みを抑制することができる。
【実施例】
【００２２】
＜抗原＞
市販のフィルタ無しタバコの１本から、タバコの葉のみを取り出し、１ｍｌのＰＢＳで十分にホモジネートし、４０，０００ＲＰＭで３０分遠心分離後、上澄みを回収した。得られた液をタバコ抽出液とした。
【００２３】
＜抗体の製造方法＞
成熟したメス鳥（ダチョウ、ニワトリ、ウズラ）を用いた。タバコ抽出液（原液）０．２ｍＬをそれぞれフロイントの完全アジュバント０．２ｍＬと混和し、ダチョウ、ニワトリ、ウズラに初回免疫した。各抗原を個別に５羽のダチョウ、５羽のニワトリ、５羽のウズラに接種した。したがって、ダチョウもニワトリもウズラも同量の抗原を接種したことになる。初回免疫後、２週目と４週目に０．２ｍＬの各抗原とフロイントの不完全アジュバントの混和液を、各鳥に追加免疫した。ダチョウは全羽生存したが、鶏は途中で４羽死亡、ウズラも４羽死亡した。 
【００２４】
初回免疫後８週目に得られた各鳥からの卵の卵黄より卵黄抗体（ＩｇＹ）を精製した。得られた卵黄抗体の反応性をＥＬＩＳＡにより検証した。具体的には、まず、得られた卵の卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌した。
【００２５】
次に１ＭのＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収した。そして、最終濃度が４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置した。
【００２６】
１２時間の静置後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収した。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析した。以上の方法で、各卵から純度９０％の抗体（ＩｇＹ）が回収できた。 
【００２７】
＜ＥＬＩＳＡ法＞
各卵黄から得られたタバコ抗体のタバコの化学物質に対する反応性はＥＬＩＳＡにより検証した。具体的には、まず９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴にニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミン、タールをそれぞれ別々に５μｇを固層化した（室温で４時間）。
【００２８】
その後、ダチョウ抗体（各５羽のダチョウ）、ニワトリ抗体（生存した１羽のニワトリ）、ウズラ抗体（生存した１羽のウズラ）の段階希釈液（原液は２ｍｇ／ｍＬ）を各穴に滴下し、室温で１時間反応させた。洗浄後、各抗体に対するＨＲＰ標識２次抗体を室温で１時間反応させた。十分な洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（Ｓ−Ｂｉｏ  ＳＵＭＩＬＯＮ）を用いてプレートリーダーにて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。免疫前の各鳥種の卵黄抗体の２倍以上の吸光度値を示す最大希釈倍率をＥＬＩＳＡ値として示した。結果を表１に示す。 
【００２９】
【表１】
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【００３０】
ダチョウ、ニワトリ、ウズラにおいて、ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミンに対する卵黄抗体が作製されることが判明した。特に、各鳥種類には同量の抗原を免疫したのにもかかわらず、巨大なダチョウが最も反応性が高い抗体が産生されていた。これは、ダチョウを使うことで、少量の抗原でも高感度の抗体が産生できることを示している。 
【００３１】
次に、タバコ抽出液を免疫して作製したダチョウ抗体（抗タバコダチョウ抗体）を用いて、ニコチンの脳内拡散防止の効果について確認した。
【００３２】
血液脳関門のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしては、ファーマコセル社製ＢＢＢキット（以下単に「ＢＢＢキット」と呼ぶ。）を用いた。
【００３３】
まず、ＢＢＢキットのｗｅｌｌ上層部にニコチン（最終濃度３００μｇ／ｍＬ）と免疫前ダチョウ抗体（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を３７℃１時間反応させたものを添加した。２日後にｗｅｌｌの下部チャンバー（下層）に透過したニコチン量を液クロマトグラフィーにて測定した。免疫前ダチョウ抗体とは、タバコ抽出液を免疫する前のダチョウが産卵した卵の卵黄から上記に示した方法で得た抗体（ＩｇＹ）である。
【００３４】
一方で、ニコチン３００μｇ／ｍＬに抗タバコダチョウ抗体（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を１時間３７℃反応させたものも別ｗｅｌｌに添加し、同様に下層に透過したニコチン量を測定した。結果を図１に示す。図１は、横軸に免疫前ダチョウ抗体と抗タバコダチョウ抗体を示す。また縦軸は、ＢＢＢキットによるニコチン透過量（μｇ／ｍＬ）を示す。図１を参照して、抗タバコダチョウ抗体はニコチンの脳血管関門の通過を抑制することが判明した。このことは、ニコチンの脳内拡散を防止することが可能であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明に係る抗タバコダチョウ抗体は、検査キットを始め、タバコのフィルタ、飲み薬、注射薬、ガムや歯磨きとともに利用することができる。
【図１】
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