(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、下記式（１）で表されるフコステロールを単独で含有する、メラニンの生成の抑制又はチロシナーゼの活性の抑制による皮膚美白用化粧料組成物。
【化１】
0006474418.tif 000015
【請求項２】
有効成分として、下記式（１）で表されるフコステロールを単独で含有する、メラニンの生成の抑制又はチロシナーゼの活性の抑制による皮膚美白用食品組成物。
【化２】
0006474418.tif 000016
【請求項３】
有効成分として、下記式（１）で表されるフコステロールを単独で含有する、メラニンの生成の抑制又はチロシナーゼの活性の抑制による皮膚美白用薬学的組成物。
【化３】
0006474418.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国海洋水産部の支援下において、課題番号Ｄ１０９０６１１２Ｈ３２００００１７０により行われたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国海洋研究院、研究事業名は「海外海洋生物資源開発・活用基盤構築」、研究課題名は「インドネシア海洋バイオ資源の確保及び基礎生理活性分析」、主管機関は延世大学校産学協力団、研究期間は２００９年１１月１日〜２０１２年６月３０日である。
【０００２】
本特許出願は、２０１４年１月２３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−０００８４１５号及び第１０−２０１４−０００８４３０号の優先権利益を主張しており、前記特許出願の開示内容はその全体内容が援用によって本明細書に含まれる。
【０００３】
本発明は、フコステロール（fucosterol）の新規の用途に関し、より詳しくは、フコステロールを含有することを特徴とする皮膚美白又は保湿用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
ヒトの皮膚の色は、メラニン（melanin）色素を作るメラノサイト（melanocyte）の活動性、血管の分布、皮膚の厚さ及びカロテノイド（carotenoid）、ヘモグロビン（hemoglobin）等人体内外の色素含有有無のような様々な要因によって決定される。メラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレスなどと関連した生理的要因及び紫外線などの環境的要因が影響を及ぼす（非特許文献１）。
【０００５】
メラニンの生成機構に重要な影響を及ぼすのはチロシナーゼ（tyrosinase）という酵素であり、これは、メラノサイト内のメラノソーム（melanosome）でチロシン（tyrosine）の酸化過程に関与する。紫外線露出などにより、前記チロシナーゼが活性化され、チロシンに作用して、ドーパ（ＤＯＰＡ；３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）及びドーパキノン（DOPAquinone）を生成させる酸化過程によって、メラニン重合体が合成される（被特許文献２）
【０００６】
メラニンは、皮膚の外角である表皮層に存在し、紫外線などから真皮以下の皮膚機関を保護すると同時に、皮膚生体内に生じたフリー・ラジカルなどを捉える役割を果たし、皮膚内タンパク質と遺伝子を保護する重要な機能を有している。しかし、メラニンが過剰生産されれば、シミ、ソバカスなどを形成するだけでなく、皮膚老化を促進し、皮膚癌誘発にも重要な作用をすることが知られている（比特許文献３）。
【０００７】
シミ、ソバカス、色素沈着などの皮膚色素異常沈着症状と紫外線露出などにより発生された過度なメラニン色素沈着を治療又は低減させるために、従来からアスコルビン酸、コウジ酸（kojic acid）、アルブチン（arbutin）、ヒドロキノン（hydroquinone）、グルタチオン（glutathione）又はこれらの誘導体、チロシナーゼ阻害活性を有した物質を化粧料や医薬品に配合して使っている。しかし、これらは不充分な美白効果、皮膚に対する安全性問題、化粧料に配合時、剤形及び安定性問題などによりその使用が制限されている（非特許文献４）。従って、前記有効成分の問題点を解決するために安全性と安定性が立証された天然物由来の有効成分に関する要求が提起されている。
【０００８】
皮膚の角質層（Stratum corneum）は、皮膚において最外角層に存在し、外部環境に直接接しており、外部の物理的化学的ストレスから人体を保護するのに重要な障壁機能（barrier function）を担っている。このような障壁機能は、表皮の恒常性（homeostasis）によって保持される。表皮恒常性は、基底層の角質形成細胞（keratinocytes）の成長分裂と細胞移動による分化過程を通して最終分化（terminal differentiation）を経て、角質層と呼ばれる皮膚障壁を形成することによって、持続的な皮膚障壁機能を保持するものである（非特許文献５）。
【０００９】
角質形成細胞の分化に伴い、保湿に影響を及ぼす２種類の要因を生成する。第一に、角質形成細胞が分化する間、その細胞膜は角質細胞膜（cornified envelope）という構造物に代替される。角質細胞膜は、ロリクリン（loricrin）、インボルクリン（involucrin）、フィラグリン（filaggrin）をはじめとする多様な構造タンパク質がトランスグルタミナーゼ（transglutaminases）という酵素によって架橋を形成した膜構造物であり、外部環境に対する皮膚保護機能の提供と共に、角質細胞内の水分蒸発を抑制する（非特許文献６）。角質細胞膜構造タンパク質とトランスグルタミナーゼは、角質形成細胞の分化により発現が開示されるので、分化因子（differentiation marker）として用いられる（非特許文献６）。従って、角質細胞膜と分化因子は保湿の指標として使用される。
【００１０】
また、角質細胞の分化過程中に角質形成細胞は、天然保湿因子（ＮＭＦ；Natural Moisturizing Factor）を生成しながら皮膚障壁（skin barrier）としての機能を保有させる。天然保湿因子の生成に重要な源泉になるタンパク質としてはフィラグリンである。フィラグリンは、カスパーゼ１４により親水性アミノ酸に分解され、天然保湿因子を形成する。天然保湿因子は、保水能力（water holding capacity）と大気中の吸湿力（moisture absorption）を提供することによって、皮膚内保湿力を保持する機能をする（非特許文献７）。従って、皮膚に適切な水準の天然保湿因子を保持することは、皮膚障壁機能を通した皮膚健康に大変重要な要素である。
【００１１】
フコステロールは、主に海藻類に多く含まれている物質であり、韓国、中国、日本などアジア地域の海岸に棲息する海藻類から多く発見されている。今まで、フコステロールの活性は、抗癌（非特許文献８）、抗糖尿（非特許文献９）、（抗酸化（非特許文献１０）、血中脂質成分改善（非特許文献１１）、コレステロール代謝改善（非特許文献１２）、抗菌（非特許文献１３）、抗かび（非特許文献１４）、及び抗老化（非特許文献１５）等が報告されている。しかし、フコステロールの皮膚美白活性及び保湿活性については今日まで報告されていない実状である。
【００１２】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示始内容はその全体として本明細書に参照のために援用され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Annu. Rev. Genet. 37:67-90, 2003
【非特許文献２】J. Environ. Sci. Health. 23(2):105-161, 2005
【非特許文献３】FASEB J. 21(4):976-994, 2007
【非特許文献４】Dermatol. Ther. 20(5):308-313, 2007
【非特許文献５】Korean J. Food. Sci. Technol. 43:458-463, 2011
【非特許文献６】Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6(4):328-340, 2005
【非特許文献７】J. Cell Sci. 122:1285-1294, 2009
【非特許文献８】Pharmacogn. Mag. 8(29):60-64, 2012
【非特許文献９】Arch. Pharm. Res. 27(11):1120-1122, 2004
【非特許文献１０】Bioorg. Med. Chem. 17(5):1963-1973, 2009
【非特許文献１１】Biochem. Biophys. Res. Commun. 369(2):363-368, 2008
【非特許文献１２】New Phytol. 183(2):291-300, 2009
【非特許文献１３】J.Pharm. Biomed. Anal. 51(2):450-4555, 2010
【非特許文献１４】Nat. Prod.Res. 24(15):1481-1487, 2010
【非特許文献１５】Photochem. Photobiol. 89(4):911-918, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明者らは、天然物由来の美白活性又は保湿機能のある物質を探索していたところ、海藻類に含まれているフコステロールに、優れた美白活性及び保湿機能があることを明らかにすることによって、本発明を完成した。
【００１５】
従って、本発明の目的は、下記の式（１）で表されるフコステロールを含有することを特徴とする美白用化粧料組成物を提供することにある。
【化１】
0006474418.tif 000002
【００１６】
本発明の他の目的は、前記式（１）のフコステロールを含有することを特徴とする美白用食品組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記式（１）のフコステロールを含有することを特徴とする美白用薬学的組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記式（１）のフコステロールを含有することを特徴とする保湿用化粧料組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記式（１）のフコステロールを含有することを特徴とする保湿用食品組成物を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、前記式（１）のフコステロールを含有することを特徴とする保湿用薬学的組成物を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明及び請求範囲によってより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、美白効能に優れた皮膚美白用組成物に関するものであり、さらに詳しくは、有効成分として、下記式（１）で表されるフコステロールを含有することを特徴とする皮膚美白用化粧料、食品及び薬学的組成物に関するものである。
【化２】
0006474418.tif 000003
【００２３】
本発明の他の一態様によれば、本発明は、保湿機能に優れた皮膚保湿用組成物に関するものであり、さらに詳しくは、有効成分として、下記式（１）で表されるフコステロールを含有することを特徴とする皮膚保湿用化粧料、食品及び薬学的組成物に関するものである。
【化３】
0006474418.tif 000004
【００２４】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明の皮膚美白又は皮膚保湿用化粧料、食品及び薬学的組成物において、前記式（１）で表されるフコステロールは、海藻類など天然原料から抽出され、分離するか、化学的合成方法によって合成することができる。
【００２５】
本発明の組成物で、前記フコステロールは、シルベチア・シリクオサ（Silvetia siliquosa）、マコンブ（Saccharina japonica）、ガゴメコンブ（Kjellmaniella crassifolia）、ワカメ（Undaria pinnatifida）、モズク（Cladosiphon okamuranus）、マツモ（Ceratophyllum demersum）、カジメ（Ecklonia cava）、ヒジキ（Hizikia fusiformis）、アラメ（Eisenia bicyclis）、ヘラヤハズ（Dictyopteris prolifera）、イシゲ（Ishige okamurae）、カヤモノリ（Scytosiphon lomentaria）、フクロノリ（Colpomenia sinuosa）、ホンダワラ（Sargassum fulvellum）、ヤナギモク（Sargassum coreanum）、アカモク（Sargassum horneri）、ウミトラノオ（Sargassum thunbergii）、ウガノモク（Cystoseira hakodatensis）などの海藻類から抽出し、分離したものであってもよい。
【００２６】
また、前記フコステロールは、チャイブ（Alliums choenoprasum）、マホガニー（Swietenia macrophylla）、セイヨウハシバミ（Corylus avellana）、インドセンダン（Azadirachta indica）、金木犀（Osmanthus fragrans var．aurantiacus）、楮実子（Fructus broussonetiae）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、アワ（Setaria italica）などの植物から抽出し、分離したものであってもよい。
【００２７】
本発明のフコステロールは、シルベチア・シリクオサから抽出されていてもよい（＜実施例１＞参照）。
【００２８】
本発明のフコステロールの分離及び精製は、シリカゲル（silicagel）や活性アルミナ（alumina）などの各種合成樹脂を充填したカラムクロマトグラフィー及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を単独、又は並行して用いてもよいが、抽出及び分離精製方法が必ずしも前記方法に限定されるものではない。
【００２９】
本発明の一実施例では、フコステロールの細胞毒性を調べるために、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞にフコステロールを処理した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析を通して細胞安全性を測定した。その結果、本発明のフコステロールは０〜２０μＭの濃度でＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対する毒性を示さなかった（＜実施例２＞参照）。
【００３０】
本発明の他の一実施例では、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）でメラニン生成を促進した後、本発明のフコステロールを投与し、メラニン生成の抑制有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールは、メラニンの生成を効果的に抑制することを確認した（＜実施例３、４＞参照）。
【００３１】
本発明の他の一実施例では、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、α−ＭＳＨでチロシナーゼ活性を増加させた後、本発明のフコステロールを投与し、チロシナーゼ活性の抑制有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールはチロシナーゼの活性を効果的に抑制することを確認した（＜実施例５＞参照）。
【００３２】
本発明の他の一実施例では、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、α−ＭＳＨでチロシナーゼのタンパク質発現を増加させた後、本発明のフコステロールを投与し、チロシナーゼのタンパク質発現の抑制有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールはチロシナーゼのタンパク質発現を効果的に抑制することを確認した（＜実施例６＞参照）。
【００３３】
本発明の他の一実施例では、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、α−ＭＳＨでＴＲＰ−１とＴＲＰ−２のタンパク質発現を増加させた後、本発明のフコステロールを投与し、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のタンパク質発現の抑制有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールはＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のタンパク質発現を効果的に抑制することを確認した（＜実施例７＞参照）。
【００３４】
本発明の他の一実施例では、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、α−ＭＳＨでＭＩＴＦのタンパク質発現を増加させた後、本発明のフコステロールを投与し、ＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現の抑制有無を測定した。その結果本発明のフコステロールはＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現を効果的に抑制することを確認した（＜実施例８＞参照）。
【００３５】
従って、前記フコステロールは、美白活性に優れていることから化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物の有効な成分として用いることができる。
【００３６】
本発明のフコステロールは、角質細胞膜の形成を促進し、角質細胞分化を促進し、天然保湿因子を形成することによって、優れた皮膚保湿効能を提供する。
【００３７】
本発明の一実施例では、角質形成細胞に、本発明のフコステロールを処理した後、角質細胞膜形成の有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールは角質細胞膜形成を効果的に促進することを確認した（＜実施例９＞参照）。
【００３８】
本発明の他の一実施例では、角質形成細胞において、本発明のフコステロールを処理し、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼを含む分化因子の発現の増加有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールはロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのような皮膚保湿関連分化因子の発現を効果的に増加させることを確認した（＜実施例１０＞、＜実施例１１＞参照）。
【００３９】
本発明の他の一実施例では、角質形成細胞において、本発明のフコステロールを処理し、フィラグリンとカスパーゼ１４の発現の増加有無を測定した。その結果、本発明のフコステロールはフィラグリンとカスパーゼ１４発現を効果的に増加させることを確認した（＜実施例１２＞、＜実施例１３＞参照）。
【００４０】
従って、前記フコステロールは、保湿機能に優れていることから化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物の有効な成分として用いることができる。
【００４１】
フコステロールは、本発明の皮膚美白用化粧料組成物及び皮膚保湿用化粧料組成物の有効成分として含まれてもよいが、その量は、美白作用又は保湿機能を達成するのに有効な量に特に限定されるものではなく、全組成物の総重量に対して、０．００１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは、０．０１〜５重量％で含まれる。含量が０．００１重量％未満のとき、目的とする美白又は保湿效果を期待することができなく、１０重量％を超えると安全性又は剤形上の製造に困難がある。
【００４２】
本発明のフコステロールを有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物及び皮膚保湿用化粧料組成物は、その剤形において特に限定されない。例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジンポム、クレンジングウォーター、パック、ジェル、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンスなどの化粧料に剤形化される。
【００４３】
また、本発明の皮膚美白用化粧料組成物は、美白効果を上昇させるために、前記したフコステロール以外に他の従来の美白成分、例えば、アルブチン、アスコルビン酸誘導体などの美白成分をさらに含有していてもよく、これら従来の美白成分の種類及び含量は当業者に周知されている。
【００４４】
本発明の皮膚保湿用化粧料組成物は、保湿機能を上昇させるために、前記したフコステロール以外に他の従来の保湿成分をさらに含有していてもよく、これら従来の保湿成分の種類及び含量は当業者に周知されている。
【００４５】
また、本発明に係るフコステロールは、美白又は保湿を目的に食品組成物の形態で提供される。本発明の食品組成物は、一般食品（conventional foods）、栄養補助剤（nutritional supplements）、健康機能食品（health function foods）、食品添加剤（food additives）及び飼料などのあらゆる形態を含んでもよく、ヒト又は家畜をはじめとする動物を取食対象とする。前記類型の食品組成物は、当業界に公示された通常の方法により多様な形態に製造することができる。
【００４６】
例えば、一般食品として、これらに限定されないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例：果物の缶詰め、瓶詰、ジャム、ママレイドなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例：ハム、ソーセージコーンビーフなど）、パン類及び麺類（例：うどん、ソバ、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：韓国式味噌、醤油、ソースなど）等に前記フコステロールを添加して製造することができる。また、栄養補助剤としては、これらに限定されないが、カプセル、タブレット、丸などに前記フコステロールを添加して、製造することができる。また、健康機能食品としては、これらに限定されないが、例えば、前記フコステロール自体を茶、ジュース及びドリンクの形態に製造して飲用することができるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。また、前記フコステロールを食品添加剤の形態として用いるためには、粉末又は濃縮液形態に製造することができる。また、前記フコステロールと美白又は保湿效果があると知らされた公示の有効成分と共に混合して、組成物の形態に製造することができる。
【００４７】
フコステロールは、皮膚美白用食品組成物及び皮膚保湿用食品組成物の有効成分として含まれていてもよい。その量は、美白作用又は保湿機能を達成するのに有効な量に特に限定されないが、全組成物の総重量に対して、０．０１〜１００重量％が好ましい。本発明の食品組成物は、フコステロールと共に美白又は保湿效果があると知られた他の有効成分と共に混合して、製造することができる。
【００４８】
本発明のフコステロールは、それ自体又は塩若しくは薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができる。前記用語「薬学的に許容可能」とは生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的にアレルギー反応又はこれと類似な反応を引き起こさないことを意味し、前記塩には、薬学的に許容可能な遊離酸（free acid）によって形成された酸付加塩が好ましい。前記遊離酸には、有機酸と無機酸を使うことができる。前記有機酸は、これらに制限されないが、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、メタスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられる。また、前記無機酸はこれらに制限されないが、塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸が挙げられる。
【００４９】
一方、前記本発明の薬学的組成物は、前記フコステロールを単独で含有するか、又は一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を更に含有していてもよい。薬学的に許容される担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体を更に含んでいてもよい。経口投与用担体はラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。また、非経口投与用担体は、水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含んでいてもよく、安定化剤及び保存剤をさらに含んでいてもよい。適した安定化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸などの抗酸化剤がある。適した保存剤には、塩化ベンザルコニウム、メチル−又はプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、次の文献に記載されているものを参考にすることができる（Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995）。
【００５０】
本発明の薬学組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にいかなる方法でも投与することができる。例えば、経口又は非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法には、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与であってもよい。
【００５１】
本発明の薬学組成物は、前述するような投与経路により経口投与用又は非経口投与用製剤に剤形化することができる。経口投与用製剤の場合に、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などに、当業界に公示された方法を用いて剤形化することができる。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合した後、粉砕し、適した補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することによって錠剤又は糖衣錠剤を得ることができる。適した賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトル及びマルチトールなどを含む糖類とトウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン及びポテトデンプンなどを含むデンプン類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル−セルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどとの充填剤が含まれていてもよい。また、場合に応じて、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどを崩壊剤として添加していてもよい。
【００５２】
また、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを更に含んでいてもよい。非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟こう剤、油剤、保湿剤、ゲル剤、エアゾール及び鼻腔吸入剤の形態に当業界に公示された方法で製剤化することができる。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公示された処方書である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour）に記載されている。
【００５３】
本発明の薬学的組成物の総有効量は、単一投与量で患者に投与してもよく、多重投与量で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与することができる。本発明の薬学組成物は、疾患の程度により有効成分の含量を別にすることができる。非経口投与時は、前記フコステロールに対して、一日に体重１ｋｇ当り、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜３０ｍｇの量で投与するように、そして、経口投与時は、前記フコステロールに対して、一日に体重１ｋｇ当り、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜５０ｍｇの量で投与するように、１回〜数回に分けて投与することができる。しかし、前記フコステロールの容量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重篤度、ダイエット及び排せつ率など多様な要因を考慮して、患者に対する有効投与量が決定されるものであるので、このような点を考慮するとき、当分野の通常の知識を有した者であれば、前記フコステロールを美白のための特定の用途に係る適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【発明の効果】
【００５４】
前述のように、本発明のフコステロールは、メラニン生成及びチロシナーゼ活性を抑制することによって卓越した美白効果があるので、美白用化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物の有効な成分として用いることができる。
【００５５】
また、本発明のフコステロールは、角質細胞膜を形成し、角質形成細胞の分化を促進して、天然保湿因子を生成することによって、卓越した保湿機能があるので、保湿用化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物の有効な成分として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理による細胞毒性を測定した結果である。
【図２】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるメラニン生成阻害効果を定量的に測定した結果である。
【図３】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるメラニン生成阻害効果を顕微鏡で観測した結果である。
【図４】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるチロシナーゼ活性阻害効果を測定した結果である。
【図５】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるチロシナーゼのタンパク質発現量低減を測定した結果である。
【図６】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２のタンパク質発現量低減を測定した結果である。
【図７】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現量低減を測定した結果である。
【図８】ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理による角質細胞膜形成効果を測定した結果である。
【図９】ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理による分化因子、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのｍＲＮＡ発現量増加を測定した結果である。
【図１０】ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理による分化因子、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのタンパク質発現量増加を測定した結果である。
【図１１】ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理によるフィラグリンとカスパーゼ１４のｍＲＮＡ発現量増加を測定した結果である。
【図１２】ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理によるフィラグリンとカスパーゼ１４のタンパク質発現量増加を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明に対する理解を助けるために例示目的のために提供されたものであって、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００５８】
以下の全ての試験結果において、活性分析は３回以上繰り返して行っており、その結果は平、均±標準偏差で示した。統計分析はＡＮＯＶＡ分析法（Scheff test）を用いており、＊Ｐ値が０．０５以下の場合や＃＃Ｐ値と＊＊Ｐ値が０．０１以下の場合に統計的に有意であるものと判定した。
【００５９】
［実施例１］フコステロールの抽出及び分離精製
乾燥シルベチア・シリクオサ５００ｇをミキサーで粉砕し、粉砕したシルベチア・シリクオサ試料を４倍体積のｎ−ヘキサンに添加し、４８時間室温で冷浸して抽出した。抽出された試料はワットマン２番ろ紙でろ過し、濾過された抽出液を真空回転濃縮器で濃縮し、溶媒成分を除去した後、約１５．０ｇのシルベチア・シリクオサｎ−ヘキサン抽出物を得た。ｎ−ヘキサン可溶抽出物１５ｇをシリカゲルオープンカラム（70-230mesh, Merck&Co., Whitehouse Station, NJ, USA）に積載し、核酸及び酢酸エチルの混合した溶媒システムを用いて分取した。前記分取順に従って濃度こう配で４０個の下部画分物に分けた後、そのうちの１０番と３０番の間の画分物から下記の式（１）で表される化合物であるフコステロールを分離（２１０ｍｇ）した。
【化４】
0006474418.tif 000005
【００６０】
［実施例２］メラノーマ細胞において、フコステロール処理による安全性効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、２４−ウェルプレートに、２．５×１０４ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積１ｍＬ）で添加した。０．１、１、５、１０、２０μＭのフコステロールをＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞にそれぞれ処理した。４８時間処理後、培地を除去し、０．５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液を０．３ｍＬずつ各ウェルに添加した後、培養器で４時間培養した。４時間後、ＭＴＴ溶液を除去し、生成されたホルマザンにＤＭＳＯ（dimetyl sulfoxide）を添加して溶解した後、５７０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図１に示した。
【００６１】
図１に示されるように、フコステロールをＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に処理した結果、０〜２０μＭ濃度で細胞毒性を示さなかった。
【００６２】
［実施例３］メラノーマ細胞でフコステロール処理によるメラニン生成の抑制効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。７２時間後、６−ウェルプレートで培養された培地を除去し、０．２５％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）溶液を処理して細胞ペレットを回収し、１．５ｍＬのチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除去した。得られたペレットを６０℃で乾燥し、１Ｎ  ＮａＯＨ  １００μＬを添加し、細胞内メラニンを溶解した。この溶液をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈した、ＥＬＩＳＡ判読機（Versa max, Sunnyvale, CA, USA）で、４０５ｎｍで吸光度を測定し、試料処理群のメラニン含量を求めた。このとき、フコステロールを添加しなかった細胞を対照群とし、対照群とフコステロールを処理した細胞のメラニン生成程度を測定した。下記の数式１により対照群対比メラニン含量を計算し、その結果を図２に示した。
【数１】
0006474418.tif 000006
【００６３】
図２に示されるように、フコステロールは非常に優れたメラニン生成阻害効果を示した（＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【００６４】
［実施例４］メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるメラニン生成抑制効果の顕微鏡観測
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、２０μＭ濃度で処理した。７２時間後、６−ウェルプレートで培養された培地を除去し、顕微鏡（Olympus IX71 Model）でＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を撮影し、その結果を図３に示した。
【００６５】
図３に示されるように、フコステロールはα−ＭＳＨに誘導されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞のメラニン生成を大きく阻害した。
【００６６】
［実施例５］メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるチロシナーゼ活性の抑制効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。４８時間後、６−ウェルプレートで培養された培地を除去し、１％トリトンＸ−１００が含まれたＰＢＳを添加して細胞を回収した。回収された細胞は、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清のうち１５０μＬを９６−ウェルプレートに添加し、Ｌ−ドーパ（Ｌ−３,４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−ＤＯＰＡ）５０μＬを添加した。３７℃で３０分間培養した後、生成されたドーパクロムの量をマイクロプレートリーダー（Versa max, Sunnyvale, CA ,USA）を利用して４７５ｎｍで吸光度を測定した。このとき、フコステロールを添加しなかった細胞を対照群とし、対照群とフコステロールを処理した細胞のチロシナーゼ活性程度を測定した。下記の数式２により対照群対比チロシナーゼ活性を計算し、その結果を図４に示した。
【数２】
0006474418.tif 000007
【００６７】
図４に示されるように、フコステロールは非常に優れたチロシナーゼ阻害効果を示した（＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【００６８】
［実施例６］メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるチロシナーゼタンパク質発現の低減効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、細胞をプロテアーゼインヒビターカクテルが含まれたＮＰ４０緩衝溶液で溶解し、細胞から抽出されたタンパク質量をブラッドフォード（Bio-Rad proein assay dye reagent, Bradford）試薬を用いて定量した。定量したタンパク質を５分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に伝達した。チロシナーゼの１次抗体を２．５％ウシ血清アルブミンに１：１０００の割合で希釈し、ニトロセルロース膜に伝達されたタンパク質と２０時間室温で反応した。１次抗体を反応した後、ＴＢＳＴ（tris-buffer  saline  tween20）を用いてニトロセルロース膜を１０分間３回洗浄した。洗浄後、１次抗体を認知する２次抗体（anti-goat horseradish）を２．５％ウシ血清アルブミンに１：５０００になるように希釈し、ニトロセルロース膜と２時間室温で反応させ、ＴＢＳＴを用いて１０分ずつ３回洗浄した。タンパク質バンドはＥＣＬウェスタンブロッティング検出用試薬（Amersham, Tokyo, Japan）を用いて発色し、Ｇ；ＢＯＸＥＦイメージシステム（Syngene, Cambridge, UK）により、発色されたタンパク質バンドを確認した。測定結果、チロシナーゼのタンパク質発現を確認しており、α−チューブリンでタンパク質ロード量が一定であることを示した。
【００６９】
図５に示されるように、フコステロールは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞でメラニン生成酵素であるチロシナーゼのタンパク質発現を低減した。
【００７０】
［実施例７］メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるチロシナーゼ関連ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２のタンパク質発現の低減効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、細胞をプロテアーゼインヒビターカクテルが含まれたＮＰ４０緩衝溶液で溶解し、細胞から抽出されたタンパク質量をブラッドフォード試薬で定量した。定量されたタンパク質を５分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に伝達した。ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の１次抗体を２．５％ウシ血清アルブミンに１：１０００の割合で希釈し、ニトロセルロース膜に伝達されたタンパク質と２０時間室温で反応した。１次抗体を反応した後、ＴＢＳＴを用いてニトロセルロース膜を１０分間３回洗浄した。洗浄後、１次抗体を認知する２次抗体（anti-goat horseradish）を２．５％ウシ血清アルブミンに１：５０００になるように希釈し、ニトロセルロース膜と２時間室温で反応し、ＴＢＳＴを用いて１０分ずつ３回にかけて洗浄した。タンパク質バンドは、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出用試薬（Amersham, Tokyo, Japan）を用いて発色し、Ｇ；ＢＯＸ  ＥＦイメージシステム（Syngene, Cambridge, UK）を利用して発色されたタンパク質バンドを確認した。測定結果、ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の発現を確認しており、α−チューブリンでタンパク質ロード量が一定していることを示した。
【００７１】
図６に示されるように、フコステロールはＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞において、メラニン生成酵素であるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２のタンパク質発現を低減した。
【００７２】
［実施例８］メラノーマ細胞において、フコステロール処理によるＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現の低減効果
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、２００ｎＭ  α−ＭＳＨ入りＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて総ＲＮＡを分離した。分離された総ＲＮＡは、ナノドロップ（nano-drop、ND-1000）を利用して定量した。定量されたＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）とＰＣＲ機械（Applied biosystems, Fostercity, CA, USA）を利用してｃＤＮＡで合成した後、次の特定プライマーでＰＣＲを行った：
ＧＡＰＤＨ
フォーワードプライマー：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’（配列番号１）
リバースプライマー：5’-CCACCCGAGCCACATCGCTC-3’（配列番号２）
ＭＩＴＦ
フォーワードプライマー：5’-AGTCAACCTCTGAAGAGCA-3’（配列番号３）
リバースプライマー：5’-CGTGTTCATACCTGGGCACT-3’（配列番号４）
【００７３】
ＰＣＲ結果、増幅されたｃＤＮＡを１．５％アガロースゲルで電気泳動して分離し、Ｇ；ＢＯＸ  ＥＦイメージシステム（Syngene, Cambridge, UK）を利用してｃＤＮＡバンドを確認し、その結果を図７に示した。
【００７４】
図７に示されるように、フコステロールはＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞におうて、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のタンパク質発現を調節するＭＩＴＦのｍＲＮＡ量を低減した。
【００７５】
［実施例９］ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理による角質細胞膜の形成効果
ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。９６時間培養後、６−ウェルプレートで培養された培地を除去して細胞のペレットを回収し、１．５ｍＬチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除去した。得られたペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と２０ｍＭ濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有したトリス緩衝溶液を加え、煮沸し、３４０ｎｍで吸光度を測定して、角質細胞膜形成効果を評価した。下記数式３により対照群対比角質細胞膜の形成程度を計算し、その結果を図８に示した。
【数３】
0006474418.tif 000008
【００７６】
図８に示されるように、フスコテロールは角質細胞膜の形成効果に優れ、保湿効果に優れていることが分かる（＊：ｐ＜０．０５）。
【００７７】
［実施例１０］ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理によるロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのｍＲＮＡ発現の増加効果
ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加する。２４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で総ＲＮＡを収穫し、逆転写した後、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）分析を次のように行った。まず、ｃＤＮＡ合成のために前記ＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）で逆転写した。ＲＴ−ＰＣＲは次の特定プライマーで行っており、その結果を図９に示した：
ＧＡＰＤＨ
フォーワードプライマー：5’-TGACCTTGGCCAGGGGTGCT-3’（配列番号５）
リバースプライマー：5’-CCACCCGAGCCACATCGCTC-3’（配列番号６）
ロリクリン
フォーワードプライマー：5’-GGGTACCACGGAGGCGAAGGA-3’（配列番号７）
リバースプライマー：5’-ACTGAGGCACTGGGGTTGGGA-3’（配列番号８）
インボルクリン
フォーワードプライマー：5’-GGGGCAGCTGAAGCACCTGG-3’（配列番号９）
リバースプライマー：5’-GAGACGGGCCACCTAGCGGA-3’（配列番号１０）
トランスグルタミナーゼ
フォーワードプライマー：5’-CTTCCGTCTGCGCACCCCAG-3’（配列番号１１）
リバースプライマー：5’-AGGCACAAACGACTGGCGCA-3’（配列番号１２）
【００７８】
図９に示されたように、フコステロール処理によりＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのｍＲＮＡ発現が増加したことを確認することができた。従って、フコステロールは角質形成細胞で分化を促進することによって保湿効果に優れていることが分かる（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【００７９】
［実施例１１］ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理によるロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのタンパク質発現の増加効果
ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後。ＨａＣａＴヒト角質細胞をプロテアーゼインヒビターカクテルが含まれたＮＰ４０緩衝溶液で溶解した。ＨａＣａＴヒト角質細胞で抽出したタンパク質量は、ブラッドフォード（Bradford）法を利用して定量した。前記試料を５分間煮沸し、同量のタンパク質（２０ｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離した。電気泳動後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に伝達し、ウエスタンブロットを行った。１次抗体に反応した後、ＴＢＳＴ（Tris-buffer Saline Tween20）を用いて１０分間３回洗浄した。このとき、本発明で用いられた１次抗体の種類と希釈率は１：１０００であった。２次抗体反応は、前記１次抗体反応を行った膜に２次抗体を添加し、室温で２時間反応した。このとき、２次抗体の希釈率は１：５０００とした。タンパク質バンドは、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出用試薬（Amersham, Tokyo, Japan）を用いて発色した。ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのタンパク質発現を確認し、α−チューブリンでタンパク質ロード量が一定であることを示した。
【００８０】
図１０に示されるように、フコステロール処理によりＨａＣａＴヒト角質細胞において、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼのタンパク質発現が増加したことを確認することができた。従って、フコステロールはヒト角質形成細胞で分化を促進することによって保湿機能に優れていることが分かる。
【００８１】
［実施例１２］ＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フコステロール処理によるフィラグリンとカスパーゼ１４のｍＲＮＡ発現の増加効果
ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて総ＲＮＡを収穫し、逆転写した後、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）分析を次のように行った。まず、ｃＤＮＡ合成のために前記ＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）で逆転写した。ＲＴ−ＰＣＲは次の特定プライマーで行っており、その結果を図１１に示した：
ＧＡＰＤＨ
フォーワードプライマー：5’-TGACCTTGGCCAGGGGTGCT-3’（配列番号５）
リバースプライマー：5’-CCACCCGAGCCACATCGCTC-3’（配列番号６）
フィラグリン
フォーワードプライマー：5’-AGTGCACTCAGGGGGCTCACA-3’（配列番号１３）
リバースプライマー：5’-CCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3’（配列番号１４）
カスパーゼ１４
フォーワードプライマー：5’-CGGGACTCACAACCAAAGGA-3’（配列番号１５）
リバースプライマー：5’-GGGTCCCTTTGTTCTCCTCG-3’（配列番号１６）
【００８２】
図１１に示されるように、フコステロール処理によりＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フィラグリン、カスパーゼ１４のｍＲＮＡ発現が増加したことを確認することができた。従って、フコステロールは角質形成細胞でフィラグリンとカスパーゼ１４発現量増加を通して天然保湿因子を生成することによって保湿効果に優れていることが分かる（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【００８３】
［実施例１３］ＨａＣａＴヒト角質形成細胞におうて、フコステロール処理によるフィラグリンとカスパーゼ１４のタンパク質発現の増加効果
ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した後、６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ（最終体積３ｍＬ）で添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭ培地に溶解したフコステロールを、それぞれ５、１０、２０μＭ濃度で処理した。２４時間後、ＨａＣａＴヒト角質細胞をプロテアーゼインヒビターカクテルが含まれたＮＰ４０緩衝溶液で溶解させた。ＨａＣａＴヒト角質細胞で抽出したタンパク質量はブラッドフォード（Bradford）法を利用して定量した。前記試料を５分間煮沸し、同量のタンパク質（２０ｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分離した。電気泳動後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に伝達し、ウエスタンブロットを行った。１次抗体に反応した後、ＴＢＳＴ（Tris-buffer Saline Tween20）を用いて１０分間３回洗浄した。このとき、本発明で用いられた１次抗体の種類と希釈率は１：１０００であった。２次抗体反応は、前記１次抗体反応を行った膜に２次抗体を添加し、室温で２時間反応した。このとき、２次抗体の希釈率は１：５０００とした。タンパク質バンドは、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出用試薬（Amersham, Tokyo, Japan）を用いて発色した。フィラグリン、カスパーゼ１４のタンパク質発現を確認したし、α−チューブリンでタンパク質ロード量が一定していることを示した。
【００８４】
図１２に示されるように、フコステロール処理によりＨａＣａＴヒト角質形成細胞において、フィラグリン、カスパーゼ１４のタンパク質発現が増加したことを確認することができた。従って、フコステロールは角質形成細胞でフィラグリンとカスパーゼ１４発現量増加を通して天然保湿因子を生成することによって保湿効果に優れていることが分かる。
【００８５】
本発明に係るフコステロールを有効成分として含有する皮膚美白用化粧料の剤形例を説明するが、本発明はこれを限定するためのものでない、具体的に説明するためのものである。前記皮膚美白効果に優れたフコステロールを持って、下記のような組成成分及び組成比により剤形例１〜６の皮膚美白用化粧料組成物を通常の方法に随って製造した。
【００８６】
＜剤形例１-化粧品＞
＜１−１＞栄養化粧水（乳液）
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表１の栄養化粧水剤形の条件で通常の方法により栄養化粧水を製造した。
【００８７】
【表１】
0006474418.tif 000009
【００８８】
＜１−２＞柔軟化粧水（スキンローション）
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表２の柔軟化粧水剤形の条件で通常の方法により柔軟化粧水を製造した。
【００８９】
【表２】
0006474418.tif 000010
【００９０】
＜１−３＞栄養クリーム
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表３の栄養クリーム剤形割の条件で通常の方法により栄養クリームを製造した。
【００９１】
【表３】
0006474418.tif 000011
【００９２】
＜１−４＞マッサージクリーム
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表４のマッサージクリーム剤形の条件で通常の方法によりマッサージクリームを製造した。
【００９３】
【表４】
0006474418.tif 000012
【００９４】
＜１−５＞パック
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表５のパック剤形の条件で通常の方法によりパックを製造した。
【００９５】
【表５】
0006474418.tif 000013
【００９６】
＜１−６＞ジェル
前記＜実施例１＞のフコステロールを下記の表６のジェル剤形の条件で通常の方法によりジェルを製造した。
【００９７】
【表６】
0006474418.tif 000014
【００９８】
＜剤形例２−食品＞
＜２−１＞健康食品の製造
前記＜実施例１＞のフコステロール  １０００ｍｇ、ビタミンＡアセテート７０μｇ、ビタミンＥ  １．０ｍｇ、ビタミンＢ  １０．１３ｍｇ、ビタミンＢ２  ０．１５ｍｇ、ビタミンＢ６  ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１  ２０．２μｇ、ビタミンＣ  １０ｍｇ、ビオチン１０μｇ、ニコチン酸アミド１．７ｍｇ、葉酸５０μｇ、パントテン酸カルシウム０．５ｍｇ、硫酸第１鉄を１．７５ｍｇ、酸化亜鉛０．８２ｍｇ、炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ、第１リン酸カリウム１５ｍｇ、第２リン酸カルシウム５５ｍｇ、クエン酸カリウム９０ｍｇ、炭酸カルシウム１００ｍｇ、塩化マグネシウム２４．８ｍｇを混合して製造することができ、その配合比を任意に変えて実施してもよく、通常の健康食品製造方法により前記成分を混合した後、顆粒を製造して、通常の方法により健康食品組成物製造に用いることができる。
【００９９】
＜２−２＞健康飲料の製造
前記＜実施例１＞のフコステロール１０００ｍｇ、クエン酸１０００ｍｇ、オリゴ糖１００ｇ、梅の実濃縮液２ｇ、タウリン１ｇに精製水を加え、全体９００ｍＬ。通常の健康飲料製造方法により前記の成分を混合した後、約１時間８５で撹拌加熱した後、得られた溶液をろ過し、滅菌された２Ｌ容器に取得し、密封滅菌した後、冷蔵保管し、健康飲料組成物製造に用いることができる。
【０１００】
＜２−３＞チューインガム
ガムベース２０重量％、砂糖７６．９重量％、香料１重量％及び水２重量％と前記＜実施例１＞のフコステロール０．１重量％を配合して、通常の方法でチューインガムを製造した。
【０１０１】
＜２−４＞キャンディ
砂糖６０重量％、水飴３９．８重量％及び香料０．１重量％と前記＜実施例１＞のフコステロール０．１重量％を配合して、通常の方法でキャンディを製造した。
【０１０２】
＜２−５＞ビスケット
薄力１級  ２５．５９重量％、中力１級  ２２．２２重量％、精糖４．８０重量％、食塩０．７３重量％、ブドウ糖０．７８重量％、パームショートニング１１．７８重量％、アンモニウム１．５４重量％、重曹０．１７重量％、重亜硫酸ナトリウム０．１６重量％、米粉１．４５重量％、ビタミンＢ  ０．０００１重量％、ミルク香料０．０４重量％、水２０．６９９８重量％、全脂粉乳１．１６重量％、代用粉乳０．２９重量％、第１リン酸カルシウム０．０３重量％、散布塩０．２９重量％及び噴霧乳７．２７重量％と前記＜実施例１＞のフコステロール重量％を配合して通常の方法でビスケットを製造した。
【０１０３】
＜剤形例３−医薬品＞
＜３−１＞散剤
前記＜実施例１＞のフコステロール５０ｍｇ、結晶セルロース２ｇを混合した後、通常の散剤製造方法に従って機密包に充填して散剤を製造した。
【０１０４】
＜３−２＞錠剤
前記＜実施例１＞のフコステロール５０ｍｇ、結晶セルロース４００ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇを混合した後、通常の錠剤製造方法に従って打錠して、錠剤を製造した。
【０１０５】
＜３−３＞カプセル剤
前記＜実施例１＞のフコステロール３０ｍｇ、乳清タンパク質１００ｍｇ、結晶セルロース４００ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム６ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【０１０６】
＜３−４＞注射剤
通常の注射剤製造方法により、活性成分を注射用蒸溜水に溶解し、ｐＨを約７．５で調節した後、前記＜実施例１＞のフコステロール１００ｍｇ、注射用蒸溜水、ｐＨ調節剤を混合して、２ｍＬ容量のアンプルに充填し、滅菌して、注射剤を製造した。
【０１０７】
（産業上の利用可能性）
前記式（１）のフコステロールは、メラニン生成及びチロシナーゼ活性を抑制することによって卓越した美白効果があり、美白用化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物を製造することができるので、産業上利用度が高い。
【０１０８】
また、前記式（１）のフコステロールは、角質細胞膜形成、角質形成細胞分化促進及び天然保湿因子を生成することによって、卓越した保湿機能があり、保湿用化粧料組成物、食品組成物又は薬学的組成物を製造することできるので、産業上利用度が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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