(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及び腸内細菌科（Enterobacteriacae）の少なくとも６種の菌属で構成されるヒト腸内細菌叢を含む検体を、嫌気的環境で液体培養する方法であって、酪酸（butyric acid）が添加され、酪酸の濃度範囲が４０〜１００ｍＭで調製された培地を用いて、３０時間以内で培養することを特徴とする腸内細菌叢シミュレーション培養方法。
【請求項２】
バクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及び腸内細菌科（Enterobacteriacae）の少なくとも６種の菌属で構成されるヒト腸内細菌叢を含む検体を、嫌気的環境で液体培養する方法であって、酪酸（butyric acid）が添加され、酪酸の濃度範囲が４０〜１００ｍＭで調製された培地を用いて、ヒト消化管内における固形食物の滞在時間培養することを特徴とする腸内細菌叢シミュレーション培養方法。
【請求項３】
前記培地は、６．０〜７．０の範囲にｐＨが調製されたことを特徴とする請求項１又は２の腸内細菌叢シミュレーション培養方法。
【請求項４】
前記嫌気的環境は、窒素と二酸化炭素の混合ガスである嫌気的ガスを、前記培地中に曝気させることを特徴とする請求項１又は２の腸内細菌叢シミュレーション培養方法。
【請求項５】
前記嫌気的ガスの曝気は、流量０．１〜１．０ｄｌ／ｍｉｎで常時行うことを特徴とする請求項４の腸内細菌叢シミュレーション培養方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかの腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて培養された培養液を凍結乾燥させ粉末化した培養菌叢。
【請求項７】
前記凍結乾燥は、前記培養液を還元剤で洗浄することを特徴とする請求項６に記載の培養菌叢。
【請求項８】
前記還元剤が、アスコルビン酸若しくはシステインであることを特徴とする請求項７に記載の培養菌叢。
【請求項９】
バクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及び腸内細菌科（Enterobacteriacae）の少なくとも６種の菌属で構成されるヒト腸内細菌叢を含む検体を、嫌気的環境で液体培養する装置であって、
培養容器を格納して細菌の液体培養を行う培養手段と、
前記培養手段における温度及びｐＨを調製する培養環境調製手段と、
前記培養手段に嫌気的環境を付与する嫌気的環境付与手段と、
を備え、
前記培養容器内の培地は、酪酸（butyric acid）が添加され、酪酸の濃度範囲が４０〜１００ｍＭで調製されたことを特徴とする腸内細菌叢シミュレーション培養装置。
【請求項１０】
前記嫌気的環境付与手段は、窒素と二酸化炭素の混合ガスである嫌気的ガスを、前記培地中に曝気し得ることを特徴とする請求項９の腸内細菌叢シミュレーション培養装置。
【請求項１１】
請求項１〜５の何れかの腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて、機能性成分を評価する方法であって、
前記機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製し、
前記機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製し、
同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較し、
腸内細菌叢の細胞群の構成バランスの相違から、前記機能性成分の機能性もしくは安全性を評価することを特徴とする腸内細菌叢シミュレーション培養を用いた機能性成分評価方法。
【請求項１２】
請求項６〜８の何れかの培養菌叢を用いて、機能性成分を評価する方法であって、
前記培養菌叢に前記機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製し、
前記培養菌叢に前記機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製し、
同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較し、
腸内細菌叢の細胞群の構成バランスの相違から、前記機能性成分の機能性もしくは安全性を評価することを特徴とする腸内細菌叢シミュレーション培養を用いた機能性成分評価方法。
【請求項１３】
請求項９又は１０の腸内細菌叢シミュレーション培養装置を少なくとも２つ用いて、機能性成分を評価するシステムであって、
前記機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製する第１の腸内細菌叢シミュレーション培養装置と、
前記機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製する第２の腸内細菌叢シミュレーション培養装置と、
同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較分析する分析装置、
から成り、
前記分析装置で前記機能性成分の機能性もしくは安全性を評価する機能性成分評価システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個々の腸内細菌叢を、その菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できる腸内細菌叢シミュレーション培養方法および装置、該培養方法により培養し凍結乾燥させた培養菌叢、並びに、機能性成分評価方法および評価システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸管内では多種・多様な細菌が絶えず増殖を続けており、これらは腸内細菌叢（フローラ）と呼ばれる。腸内細菌叢は、約１０兆個の微生物が常在し、その種類は一人あたり数百種になり、その構成は食習慣や年齢などによって個々人により異なっている。また、腸内細菌叢は、ヒトに対して様々な生理作用を有しており、有用な作用としては、病原菌の定着阻害、免疫系の活性化、ビタミンの産生などであり、有害な作用として、腐敗産物や発がん物質の産生、各種腸疾患へ関与であることが既に報告されている。
腸内細菌叢を構成している腸内細菌は、互いに共生しているだけでなく、宿主であるヒトと共生関係にあり、ヒトが摂取した食品等に含まれる栄養分を主な栄養源として発酵することで増殖し、同時にさまざまな代謝物を産生する。腸内細菌叢はヒトの健康と密接な関係があり、近年、腸内細菌叢の代謝産物の研究が行われている。【０００３】
一般に、食品等の機能性成分の機能性・安全性の評価は、ラットやマウス等の実験動物への当該成分の経口投与試験、またはヒトボランティアを使った介入試験にて行われている。しかしながら、実験動物を用いた経口投与試験で得られた結果は、ヒト以外の動物の腸内では腸内腐敗物の濃度がヒト糞尿と比較して著しく低いなど、ヒトの腸内環境をシミュレーションしておらず、そのままヒトについても得られる結果と翻訳することが困難である。また一方、ヒトボランティアを使った介入試験では、ヒトを対象とした試験なので対象成分毎に医学部・病院等倫理委員で審議する必要があるため、試験を行うのは容易ではなく、手続面の困難性・煩雑性が問題として挙げられる。【０００４】
上記の問題を解決するための一つの方法として、腸内環境を再現した腸管模倣培養装置により培養した腸内フローラの研究が近年、欧州を中心にして行われており、日本においても、実際の腸内細菌叢に類似した微生物多様性を維持する腸管模倣培養装置が提案されている（特許文献１を参照）。特許文献１では、腸管模倣培養装置に腸管表皮を模倣した構造物を組み込むことにより、微生物の多様性を増すことができることが開示されている。そして、特許文献１では、腸管模倣培養装置を用いることにより、装置内の培養した細菌叢の菌属レベルの種類の多様性が、実際の腸管内に滞在する腸内細菌叢の菌属レベルの種類と類似することを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０３４５８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した特許文献１の腸管模倣培養装置の場合、培養した細菌叢の多様性が、実際の腸管内の腸内細菌叢の菌属レベルの種類と類似できるものであるが、腸内細菌叢のバランスを保ったまま培養できるというものではない。つまり、腸内細菌叢のバランスを保ったままの培養には、菌属レベルの種類が同じだけでは足りず、個々の菌属レベルの存在割合も重要である。
すなわち、従来の腸内細菌叢を構成する細菌群の嫌気培養では、培地の成分や培養条件が腸内環境を十分に模していないので、培養を続けてゆくうちに、腸内細菌叢の細胞群の構成バランス（組成）が大幅に崩れてしまうといった問題がある。【０００７】
かかる状況に鑑みて、本発明は、腸内細菌叢の構成バランスをほぼ維持したまま培養可能な培養方法および装置、並びに、該培養方法により培養させ凍結乾燥させた培養菌叢を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ヒト糞便培養について鋭意検討した結果、腸内細菌叢の構成する細菌群の組成を維持する培養条件を見出し、個々人の腸内細菌叢の細菌構成を反映した糞便培養液を得られることの知見を得た。【０００９】
すなわち、本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養方法は、個々の腸内細菌叢を、低級脂肪酸（炭素数２以上７以下）からなる有機酸が添加された培地を用いて、嫌気的環境で培養することを特徴とする。
これにより、腸内細菌叢の細胞群の構成バランス（組成）をほぼ維持したまま培養することができる。ヒトの腸内細菌叢は非常に複雑であり再現が困難であったが、本発明によって、培地に低級脂肪酸（炭素数２以上７以下）を添加するという簡便な方法で、腸内細菌叢の細胞群の構成バランス（組成）をほぼ維持したまま培養を行い、再現を可能にした。【００１０】
ここで、低級脂肪酸（炭素数２以上７以下）は、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、カプロン酸などが挙げられる。これらの低級脂肪酸の濃度範囲は１〜１００ｍＭに調製する。好ましくは３０〜１００ｍＭであり、より好ましくは５０〜８０ｍＭであり、さらに好ましくは６０ｍＭで用いられる。これらの低級脂肪酸は短鎖脂肪酸が該当し、常温常圧では液体である有機化合物である。
また、低級脂肪酸には、酪酸（butyric acid）を少なくとも含むものが好ましく、酪酸だけを培地に添加することがより好ましい。酪酸の濃度範囲は１〜１００ｍＭに調製する。好ましくは４０〜１００ｍＭであり、より好ましくは５０〜８０ｍＭであり、さらに好ましくは６０ｍＭで用いられる。
本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養方法および機能性成分評価方法によれば、腸内細菌叢の構成バランスの評価だけでなく、系内の代謝産物を機器分析（質量分析法、Ｘ線スペクトル法、Ｘ線回折法、ラマン分光法、核磁気共鳴スペクトル法などを利用した分析）して、代謝の変動を評価することも可能である。代謝産物の変動を、例えば、ガスクロマトグラフ／四重極型質量分析計（ＧＣ／ＱＭＳ；Gas Chromatograph ／ Quadrupole Mass Spectrometer）等の質量分析機器を使って計測する場合、解析を困難にしない程度の少ない濃度、例えば、１〜１０ｍＭの低級脂肪酸が望ましい。【００１１】
また、培地は、ｐＨが６．０〜７．０の範囲に、塩酸若しくは水酸化ナトリウムにより調製されることが好ましい。実際の大腸内のｐＨに適合させる。培地は、より好ましくはｐＨが６．２〜６．８であり、さらに好ましくはｐＨが６．４〜６．６に調製される。【００１２】
具体的には、低級脂肪酸は酪酸（butyric acid）であり、酪酸の濃度範囲が４０〜１００ｍＭで調製されたことが好ましい。また、培地はＧＡＭ（Gifu anaerobic medium）培地が好適に使用でき（ＧＡＭ培地の具体的な組成は後述する）、ｐＨは６．０〜７．０の範囲、より好ましくは６．２〜６．８の範囲、さらに好ましくは６．５に調製される。なお、ＧＡＭ培地として寒天培地が好適に用いることができる。【００１３】
また、嫌気的環境は、培地に対して嫌気的ガスを曝気させることにより作り出す。嫌気的ガスは、例えば、窒素、或は、窒素および二酸化炭素である。嫌気的ガスの曝気は、流量０．１〜１．０ｄｌ／ｍｉｎで常時行うか、或は、間欠的に行う。また、嫌気的ガスは、窒素と二酸化炭素の混合ガスであることが好ましい。なお、常時、嫌気的ガスを曝気するのが好ましい。【００１４】
本発明の培養菌叢は、上述の本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて培養された培養液を凍結乾燥させて粉末化したものである。凍結乾燥は、培養液を還元剤で洗浄することが好ましく、還元剤としては、アスコルビン酸やシステインが好適に用いることができる。システインは、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン塩酸塩含有ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を用いることができる。【００１５】
凍結乾燥プロセスは、例えば、３０時間培養液を１０〜２０ｍｌサンプリングし、遠心回収後に還元剤として１％アスコルビン酸若しくは０．１％Ｌ−システイン塩酸塩含有ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で洗浄し、同溶液３〜６ｍｌに再懸濁したものを０．３ｍｌずつ凍結乾燥アンプルに分注して凍結乾燥させる。
本発明の培養菌叢によれば、腸内細菌叢の細胞群の構成バランス（組成）を再現できており、以後の培養試験の再現性を高めると共に、試験を行い易くできる。【００１６】
ヒト糞便を初発の菌叢として使用することにより、個々人の腸内細菌叢を再現できるため、毎回、ヒトから糞便を採取する必要がなくなり、倫理規定に対応するための手続きは初回に１度行っておくことで、その後の手続きは簡略することができ、手続面の困難性・煩雑性が軽減される。すなわち、従来の大腸内細菌叢を対象とした実験では、試験毎にヒトから新鮮糞便を採取する必要があったが、本発明では、当該個人の糞便培養液を凍結乾燥したアンプルを複数作成し、試験毎にそのアンプルを使用して新鮮糞便と同様の実験が可能となることから、多数のヒトの大腸内細菌叢を対象とした試験を非常に簡便に行える。【００１７】
次に、本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養装置について説明する。
本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養装置は、下記１）〜３）を備え、培養容器内の培地は、低級脂肪酸（炭素数２以上７以下）からなる有機酸が添加されていることを特徴とする。
１）培養容器を格納して細菌の培養を行う培養手段
２）培養手段における温度及びｐＨを調製する培養環境調製手段
３）培養手段に嫌気的環境を付与する嫌気的環境付与手段【００１８】
ここで、低級脂肪酸は酪酸（butyric acid）であることが好ましく、さらに、上記２）の嫌気的環境付与手段は、培地に対して、嫌気的ガスを曝気し得ることが好ましい。具体的には、嫌気的ガスの曝気は、流量０．１〜１．０ｄｌ／ｍｉｎで常時行う。また、嫌気的ガスは、窒素と二酸化炭素の混合ガスであることが好ましい。【００１９】
次に、本発明の機能性成分評価方法について説明する。
本発明の機能性成分評価方法は、上述の腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて腸内細菌叢を培養し、機能性成分を評価する方法であり、下記ａ１）〜ａ４）の処理を行う。
ａ１）機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製する。
ａ２）機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製する。
ａ３）同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較する。
ａ４）腸内細菌叢の細胞群の構成バランスの相違から、機能性成分の機能性もしくは安全性を評価する。【００２０】
ここで、機能性成分とは、腸内細菌叢の細菌構成に影響を与える可能性を評価するものを言い、イヌリン、カルニチン、キチン・キトサン、カプサイシン、カテキン、レシチン、アリシン、クロロフィルなど食品に含まれる生理活性成分、食品に添加される化合物だけでなく、医薬やそれに準じるもの、また、経口・経鼻・経胃・経腸投与される、またはそのような投与が可能な物質を含む。それぞれ単品としても、複数混合しても、また食品に含まれた形であっても良い。【００２１】
また、本発明の他の観点の機能性成分評価方法は、本発明の培養菌叢、すなわち、上述の腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて培養された培養液を凍結乾燥させ粉末化した培養菌叢を用いて、機能性成分を評価する方法であり、下記ｂ１）〜ｂ４）の処理を行う。
ｂ１）凍結乾燥させ粉末化した培養菌叢に、機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製する。
ｂ２）凍結乾燥させ粉末化した培養菌叢に、機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製する。
ｂ３）同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較する。
ｂ４）腸内細菌叢の細胞群の構成バランスの相違から、機能性成分の機能性もしくは安全性を評価する。【００２２】
次に、本発明の機能性成分評価システムについて説明する。
本発明の機能性成分評価システムは、上述の腸内細菌叢シミュレーション培養装置を少なくとも２つ用いて、機能性成分を評価するシステムであって、下記１）〜３）の構成からなり、分析装置で機能性成分の機能性もしくは安全性を評価する。
１）機能性成分を添加して腸内細菌叢を培養する第１の培養液を作製する第１の腸内細菌叢シミュレーション培養装置
２）機能性成分を添加しないで腸内細菌叢を培養する第２の培養液を作製する第２の腸内細菌叢シミュレーション培養装置
３）同時間培養した第１の培養液と第２の培養液の腸内細菌叢の細胞群の構成バランスを比較分析する分析装置【００２３】
第１の腸内細菌叢シミュレーション培養装置と、第２の腸内細菌叢シミュレーション培養装置は、機能性成分の添加の有無以外は、同時間、同じ条件で培養する。複数の機能性成分を同時に評価する場合には、上記２）の第２の腸内細菌叢シミュレーション培養装置を２つ以上使用する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養方法および装置によれば、腸内細菌叢の構成バランス（組成）をほぼ維持したまま培養できるといった効果がある。
また、本発明の腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて培養された培養液を凍結乾燥させて粉末化した培養菌叢により、倫理的な問題を気にすることなしに、食品等の機能性成分や医薬等の腸内における動態、腸内細菌叢への影響を随時調べることができ、機能性成分の機能性・安全性の評価や腸内細菌叢における代謝変換について、動物実験を使用せずに正しく評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１の腸内細菌叢の培養方法のフロー図
【図２】ヒト糞便液を利用した培養試験結果のグラフ
【図３】凍結乾燥させて粉末化した培養菌叢を使用した培養試験結果のグラフ
【図４】実施例２の培養試験結果のグラフ（１）
【図５】実施例２の培養試験結果のグラフ（２）
【図６】実施例２の培養試験結果のグラフ（３）
【図７】実施例２の培養試験結果のグラフ（４）
【図８】実施例２の培養試験結果のグラフ（５）
【図９】実施例２の培養試験結果のグラフ（６）
【図１０】実施例２の培養試験結果のグラフ（７）
【図１１】実施例２の培養試験結果のグラフ（８）
【図１２】実施例３の培養試験結果のグラフ（３０代男性）
【図１３】実施例３の培養試験結果のグラフ（４０代男性）
【図１４】実施例３の培養試験結果のグラフ（５０代男性）
【図１５】実施例３の培養試験結果のグラフ（２０代女性）
【図１６】実施例３の培養試験結果のグラフ（３０代女性）
【図１７】実施例３の培養試験結果のグラフ（４０代女性）
【図１８】実施例３の培養試験結果のグラフ（５０代女性）
【図１９】実施例４の培養試験結果のグラフ（３０代男性）
【図２０】実施例４の培養試験結果のグラフ（２０代女性）
【図２１】実施例５のイヌリンの機能性成分評価フロー図
【図２２】実施例５の機能性成分評価システムの概略構成図
【図２３】実施例５のイヌリン添加／非添加の培養試験結果のグラフ
【図２４】実施例５の機能性評価のための培養試験結果のグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
【実施例１】
【００２７】
図１は、腸内細菌叢の培養方法のフロー図を示している。
培養方法としては、まずＧＡＭ培地をオートクレーブ後に急冷して（ステップＳ０１）、ＧＡＭ培地に溶存している酸素量を減少させる。次に、培地に嫌気的ガスで曝気する（ステップＳ０２）。嫌気的ガスには窒素のみを用いる。ＤＯ（溶存酸素量）が、０．０（所定値）になるまで窒素のみの曝気を継続する（ステップＳ０３）。溶存酸素量が０．０になると、糞便をリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）溶液で懸濁して投入する（ステップＳ０４）。使用したＧＡＭ培地の組成を下記表１に示す。【００２８】
【表１】
0006482135.tif 000002
【００２９】
そして、嫌気的ガス（窒素のみ）で培養を行う（ステップＳ０５）。所定時間後（培養開始後、０，３，６，９，１８，２４，３０時間後）、培養液を分取し（ステップＳ０６）、培養液の細菌叢の構成バランス（組成）を解析する（ステップＳ０７）。
腸内細菌叢シミュレーション培養方法は、図１の処理フローを基本とし、ＧＡＭ培地に各種有機酸（低級脂肪酸）の添加を行い、ｐＨ調整機能付きのジャーファーメンター（連続培養器）に投入し、連続嫌気培養を実施した。【００３０】
培地は、ＧＡＭブイヨン（ニッスイ製薬株式会社）を用いて調製したＧＡＭ培地１Ｌに有機酸６０ｍＭ（低級脂肪酸）を添加し培養培地とした。そして、培養培地１Ｌを市販のｐＨ調整機能付きのジャーファーメンター（ＥＹＬＡ、Ｍ−１０００Ａ）に投入し、そこに常時、窒素ガスを流量０．２ｄｌ／ｍｉｎで曝気し嫌気的環境を設定した。温度は３７℃、ｐＨは６．５にそれぞれ保持して培養を行った。【００３１】
糞便液の調製と播種に関しては、ヒトの糞便を予め重量を測定しておいた採便管で採取し、糞便重量０．１ｇあたり１ｍｌの窒素ガスの曝気済み滅菌生理食塩水に懸濁し、ヒト糞便液とした。ヒト糞便液１ｍｌを調製した上記の培地に播種し培養を開始した。
培養開始後経時的（０，３，６，９，１８，２４，３０時間後）にジャーファーメンターより内容物をサンプリングした。サンプリングは使用したジャーファーメンターの取扱説明書に従い、流路内に残存する前回分の持越しを防ぐために２度サンプリングを行い、２度目のサンプルを解析に使用した。
なお、培養開始後経時的条件を上記のように３０時間を上限とするのは、ヒト消化管内における食物（固形物）の滞在時間を考慮したものであり、特に大腸内細菌叢の培養を考慮した場合、２５時間前後の２４時間後における評価が最も適当である。【００３２】
大腸内細菌叢の菌のＤＮＡ抽出および菌数解析について説明する。ＤＮＡ抽出における抽出液は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）飽和フェノール５００μｌ、溶菌Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＥＤＴＡ）２５０μｌ、１０％ ＳＤＳ ５０μｌ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇを用いた。試料（サンプル）は、抽出液を２００μｌ添加したものをＦａｓｔＰｒｅｐ２４ (ＭＰ)を用い、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。そして、遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質変性後イソプロパノール沈殿によりDNAを析出させた。DNAを析出させて、１００μｌのＴＥに溶解したものを鋳型ＤＮＡとして使用した。鋳型ＤＮＡを用いてｑＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により試料（サンプル）の細菌叢の解析を行った。【００３３】
図２は、ヒト糞便液を利用した培養試験結果のグラフを示している。
モニタリングする菌は、真正細菌全体（All Eubacteria）、ヒト大腸内で細菌叢を構成していることが知られているバクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及び腸内細菌科（Enterobacteriacae）とした。これらは、糞便に由来するものである。これらの大腸内細菌の検出方法、単離方法、系統分類などは公知である。【００３４】
次に、腸内細菌叢シミュレーション培養方法の結果を説明する。
図２のグラフにおいて、（Ａ）糞便（細胞数／ｇ）、（Ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）、（Ｃ）「糞便２４時間培養＋ｐＨコントロール（６．５）＋酪酸（細胞数／ｍｌ）」（ｐＨを６．５に調製し培地に酪酸を６０ｍＭ 添加して糞便２４時間培養したもの）の３通りの結果をそれぞれ棒グラフで示している。腸内細菌叢シミュレーション培養方法の結果は、（Ｃ）「糞便２４時間培養＋ｐＨコントロール（６．５）＋酪酸（細胞数／ｍｌ）」が表している。
なお、図２のグラフの横軸は評価する菌群であり、縦軸は菌数を対数軸で示している。【００３５】
図２から、（Ｃ）「糞便２４時間培養＋ｐＨコントロール（６．５）＋酪酸（細胞数／ｍｌ）」の方は、（Ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）と比べて、解析した７つの菌群の細胞数が、（Ａ）糞便（細胞数／ｇ）に近似していることがわかる。特に、エンテロコッカス属（Enterococcus）と腸内細菌科（Enterobacteriacae）は、（Ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）で過剰に増殖しているのに対し、（Ｃ）「糞便２４時間培養＋ｐＨコントロール（６．５）＋酪酸（細胞数／ｍｌ）」では（Ａ）糞便（細胞数／ｇ）に近似していることが理解できる。【００３６】
次に、腸内細菌叢シミュレーション培養方法を用いて培養された培養液を凍結乾燥させて粉末化したものを使用し、さらに培養試験を行った結果について、図３を参照して説明する。
凍結乾燥は、３０時間培養液を１０ｍｌサンプリングし、遠心回収後に還元剤として１％アスコルビン酸で洗浄し、同溶液３ｍｌに再懸濁したものを０．３ｍｌずつ凍結乾燥アンプルに分注して凍結乾燥させた。
図３のグラフにおいて、（ａ）糞便１ｇ中菌数（細胞数／ｇ）、（ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）、（ｃ）凍結乾燥菌体２４時間培養（細胞数／ｍｌ）の３通りの結果をそれぞれ棒グラフで示している。【００３７】
なお、（ｃ）凍結乾燥菌体２４時間培養（細胞数／ｍｌ）は、（ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）で得られた培養液を凍結乾燥させて粉末化したものを使用して培養試験を行った結果である。（ｂ）および（ｃ）の培養における培地組成及びｐＨは、図２の（Ｃ）の条件と同一である。凍結乾燥粉末の作製は、２４時間経過後の培養菌体に、還元剤としてアスコルビン酸を１％添加しつつ行い、凍結乾燥アンプルに封入した凍結乾燥粉末を１ｍｌの生理食塩水（０．８％  ＮａＣｌ）に懸濁し全量を培養器に投入して培養した。図３のグラフは、図２のグラフと同様に、横軸は評価する菌群であり、縦軸は菌数を対数軸で示している。【００３８】
図３から、（ｃ）凍結乾燥菌体２４時間培養（細胞数／ｍｌ）の菌数は、（ｂ）糞便２４時間培養（細胞数／ｍｌ）の菌数とほぼ同じであることがわかる。また、ラクトバチルス属（Lactobacillus）に関しては、（ａ）糞便１ｇ中菌数（細胞数／ｇ）により近似した菌数になっていることがわかる。
すなわち、図３から、糞便中の大腸内細菌叢の構成バランス（組成）をある程度まで再現できることがわかる。
【実施例２】
【００３９】
次に、実施例２では、実施例１の培養方法のフロー（図１）において、６０ｍＭ 酢酸と３０ｍＭ プロピオン酸と３０ｍＭ 酪酸を全て培地に添加した場合、１００ｍＭ プロピオン酸を培地に添加してｐＨを６．５に調製した場合、３０ｍＭ 酢酸を培地に添加してｐＨを６．５に調製した場合、酪酸を４０ｍＭ，６０ｍＭ，１００ｍＭそれぞれの量だけ培地に添加してｐＨを６．５に調製した場合、凍結乾燥粉末を２４時間培養させた場合について、腸内細菌叢の構成バランス（組成）を比較した結果を下記に示す。
なお、表中、図中の菌数はｌｏｇ１０表示である。【００４０】
先ず、２０代男性の糞便について、図１に示すフローで２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表２および図４に示す。【００４１】
【表２】
0006482135.tif 000003
【００４２】
次に、図１に示すフローの培養において、６０ｍＭ 酢酸と３０ｍＭ プロピオン酸と３０ｍＭ 酪酸を全て培地に添加し、ｐＨを調製しない場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表３および図５に示す。
図表から大腸内細菌叢の菌属レベルの構成は、培養器内ではバクテロイデス属（Bacteroides）が若干減っているものの、その他の菌類は、ほぼ維持したまま培養できていることがわかる。【００４３】
【表３】
0006482135.tif 000004
【００４４】
また、図１に示すフローの培養において、１００ｍＭ プロピオン酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨ調製した場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表４および図６に示す。
図表から大腸内細菌叢の菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できることがわかる。【００４５】
【表４】
0006482135.tif 000005
【００４６】
また、図１に示すフローの培養において、３０ｍＭ 酢酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨ調製した場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表５および図７に示す。
図表から、大腸内細菌叢の菌属レベルの構成に類似しているが、エンテロコッカス（Enterococcus）属の細菌が突出して増加していることがわかる。【００４７】
【表５】
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【００４８】
また、図１に示すフローの培養において、４０ｍＭ 酪酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨを６．５に調製した場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表６および図８に示す。
図表から、酪酸を培地に添加したものは、大腸内細菌叢の菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できることがわかる。【００４９】
【表６】
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【００５０】
また、図１に示すフローの培養において、６０ｍＭ 酪酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨを６．５に調製した場合について、糞便およびそれに対して９時間，１８時間，２４時間，３０時間培養した後の培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表７に示す。また、糞便およびそれに対して２４時間後の培養液の細菌構成バランス（組成）を図９に示す。
図表から、酪酸を培地に添加したものは、大腸内細菌叢の菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できることがわかる。【００５１】
【表７】
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【００５２】
また、図１に示すフローの培養において、１００ｍＭ 酪酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨを６．５に調製した場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表８および図１０に示す。
図表から、酪酸を培地に添加したものは、大腸内細菌叢の菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できることがわかる。【００５３】
【表８】
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【００５４】
また、図１に示すフローの培養において、６０ｍＭ 酪酸を培地に添加し、塩酸及び水酸化ナトリウムによりｐＨを６．５に調製した場合について、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液、そして培養液を回収し１％アスコルビン酸含有ＰＢＳ溶液を用いて洗浄して再懸濁した物を凍結乾燥させて粉末化した凍結乾燥粉末を使用して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）を下記表９および図１１に示す。
図表から、凍結乾燥粉末を使用して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）は、糞便およびそれに対して２４時間培養した培養液の細菌構成バランス（組成）と近似していることがわかる。これにより、凍結乾燥粉末を用いた場合でも、糞便中の大腸内細菌叢の構成バランス（組成）をある程度まで再現できることがわかる。【００５５】
【表９】
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【実施例３】
【００５６】
実施例２では２０代男性の糞便に対するものであったが、実施例３では、３０代男性、４０代男性、５０代男性、２０代女性、３０代女性、４０代女性および５０代女性の糞便に対する腸内細菌叢の構成バランス（組成）の結果を説明する。実施例３では、実施例１の培養方法のフロー（図１）において、６０ｍＭ 酪酸を培地に添加し、ｐＨを６．５に調製した条件で２４時間培養させた結果を示す。
下表１０および図１２は３０代男性、下表１１および図１３は４０代男性，下表１２および図１４は５０代男性、下表１３および図１５は２０代女性、下表１４および図１６は３０代女性、下表１５および図１７は４０代女性、下表１６および図１８は５０代女性に関する結果である。【００５７】
【表１０】
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【００５８】
【表１１】
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【００５９】
【表１２】
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【００６０】
【表１３】
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【００６１】
【表１４】
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【００６２】
【表１５】
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【００６３】
【表１６】
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【００６４】
上記表１０〜１６および図１２〜１８からわかるように、３０代男性、４０代男性、５０代男性、２０代女性、３０代女性、４０代女性、５０代女性のそれぞれの糞便１ｇ中の細菌叢の菌数と、２４時間培養液１ｍｌ中の細菌叢の菌数がいずれも近似しており、構成バランス（組成）がほぼ維持したまま培養できている。すなわち、性別を問わず、年齢を問わず、個々人の大腸内細菌叢の菌属レベルの構成を培養器内でほぼ維持したまま培養できることがわかる。
【実施例４】
【００６５】
図１９および図２０は、それぞれ３０代男性と２０代女性の培養試験結果のグラフであり、図１９（１）および図２０（１）は、嫌気ガスとして窒素のみを用いて、流量０．１〜１．０ｄｌ／ｍｉｎで、培地に対して嫌気的ガスを常に曝気させた環境下で２４時間培養したものである。一方、図１９（２）および図２０（２）は、嫌気ガスとして窒素と二酸化炭素の混合ガス（窒素：二酸化炭素 ＝ ４：１）を用いて、流量０．１〜１．０ｄｌ／ｍｉｎで、培地に対して嫌気的ガスを常に曝気させた環境下で２４時間培養したものである。
嫌気ガスとして窒素のみを用いた場合と、窒素と二酸化炭素の混合ガスを用いた場合を比較すると、窒素と二酸化炭素の混合ガスを用いた方が、図１９に示すように、３０代男性に関しては、特にClostridium、Enterococcus、Lactobacillus、Bifidobacteriumの菌属レベルで一致性が高く、また、２０代女性に関しては、特にClostridium、Enterococcusの菌属レベルで一致性が高く、腸内細菌叢の細胞群の構成バランス（組成）の維持に優れていることがわかる。
【実施例５】
【００６６】
次に、機能性成分の評価の一例として、イヌリン等の機能性成分の評価に、腸内細菌叢シミュレーション培養方法およびシステムを用いた一例を説明する。
図２１は、イヌリンの機能性成分評価フロー図、図２２は、機能性成分評価システムの概略構成図、図２３は、実施例５のイヌリン添加／非添加の培養試験結果のグラフ、図２４はイヌリン等の機能性成分の培養試験結果のグラフを示している。
なお、イヌリンは、果糖の重合体で多糖類の一種であり、ゴボウやキクイモなどのキク科植物の塊茎や根、タマネギやニンニクといったユリ科植物などに存在しており、食物繊維として様々な機能性を有することが知られている。【００６７】
図２１に示すように、先ず凍結乾燥させ粉末化した培養菌叢（凍結乾燥アンプル）を準備する（ステップＳ１１）。培養菌叢（凍結乾燥アンプル）は、上述の実施例１の培養方法のフロー（図１）において、６０ｍＭ 酢酸を培地に添加してｐＨを６．５に調製して、３０時間培養した培養液を１０〜２０ｍｌサンプリングし、遠心回収後に還元剤として１％アスコルビン酸若しくは０．１％Ｌ−システイン塩酸塩含有ＰＢＳで洗浄し、同溶液３〜６ｍｌに再懸濁したものを０．３ｍｌずつ凍結乾燥アンプルに分注して凍結乾燥させたものである。【００６８】
次に、凍結乾燥アンプルにイヌリン（Ｗａｋｏ製）を添加して培養して、第１の培養液を作製する（ステップＳ１２）。また、別の凍結乾燥アンプルにイヌリンを添加しないで培養して、第２の培養液を作製する（ステップＳ１３）。第１の培養液と第２の培養液は同時に培養してもよい。
そして、２４時間培養した第１の培養液と第２の培養液のフローラの細胞群の構成バランスを比較する（ステップＳ１４）。イヌリンを添加しないで培養した第２の培養液のフローラの細胞群と比べ、イヌリンを添加して培養した第１の培養液のフローラの細胞群で、２４時間で増加した菌とその増加量を確認する（ステップＳ１５）。ステップＳ１５の確認結果に基づいて、イヌリンの機能性を評価する（ステップＳ１６）。【００６９】
機能性成分評価システムは、図２２に示すように、凍結乾燥アンプルにイヌリンを添加してフローラを培養した培養液１を作製する培養装置１と、凍結乾燥アンプルにイヌリンを添加しないでフローラを培養した培養液２を作製する培養装置２と、同時間培養した培養液１と培養液２のフローラの細胞群の構成バランスを比較分析し、イヌリンの機能性を評価する分析装置から構成される。【００７０】
図２３の培養試験結果に示すように、イヌリンを添加した糞便のアンプルを２４時間培養した方が、イヌリンを添加していない糞便のアンプルの培養よりも、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の菌数が約１０倍も増加していることが確認できた。これは、善玉菌であるビフィズス菌が約１０倍増加していることを示している。なお、凍結乾燥アンプルは２０代女性のアンプルを使用した。【００７１】
イヌリン以外の機能性成分についても、機能性成分評価の確認のために、同様にそれぞれの機能性成分を添加した糞便のアンプルを２４時間培養した。それらの培養試験結果を図２４に示す。凍結乾燥アンプルは２０代女性のアンプルを使用した。
図２４において、“Control”はアンプルをそのまま培養した結果であり、“Sucrose”はスクロースを０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“１−kestose”は、ケストースを０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“ＦＯＳ”はフラクトオリゴ糖（Ｗａｋｏ製）を０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“ＧＯＳ”はガラクトオリゴ糖（Ｗａｋｏ製）を０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“Fuji FF”はフジFF（フジ日本精糖製）を０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“Inulin”はイヌリン（Ｗａｋｏ製）を０．５％濃度で添加して培養した結果であり、“Agave inulin”はアガベイヌリンを０．５％濃度で添加して培養した結果である。【００７２】
図２４に示す培養試験結果から、ＦＯＳ以降の多糖について、Clostridium、Bifidobacteriumが、Controlやスクロースよりも増加していることが確認できた。このことは、既知のヒト介入試験による文献（例えば、「Petra A.M.J.Scholtens et al., "Bifidogenic Effects of Solid Weaning Foods With Added Prebiotic Oligosaccharides: A Randomised Controlled Clinical Trial", Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Vol.42, No.5, pp.553-559, 2006」を参照）のデータと一致している。従って、本実施例の機能性成分評価のデータが、生体のデータとも相関性があることを示唆していると言える。
以上から、本発明の機能性成分評価方法および機能性成分評価システムが、機能性成分のスクリーニングに活用できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、生体外においても細菌の構成バランスを維持した腸内細菌叢を用いた、食品、医薬等の機能性成分の機能性、安全性の評価方法、評価システムとして、簡便で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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