(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）および工程（２）を含む、リグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類の糖化方法、
工程（１）：粉砕済バイオマス原料およびセルロース加水分解酵素の少なくとも一方に、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を予め添加して、混合液を得る工程、
工程（２）：工程（１）で得られた混合液とセルロース加水分解酵素または粉砕済バイオマス原料を混合することにより、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を反応させ、バイオマス原料中のホロセルロース類を酵素糖化する工程。
【請求項２】
下記工程（１）〜工程（３）を含む、リグニン類が共存するバイオマス原料中からエタノールの製造方法、
工程（１）：粉砕済バイオマス原料およびセルロース加水分解酵素の少なくとも一方に、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を予め添加して、混合液を得る工程、
工程（２）：工程（１）で得られた混合液とセルロース加水分解酵素または粉砕済バイオマス原料を混合することにより、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を反応させ、バイオマス原料中のホロセルロース類を酵素糖化する工程、及び
工程（３）：工程（２）の酵素糖化工程の後、または、酵素糖化工程と同時に、糖類をアルコール発酵する工程。
【請求項３】
さらに、前記セルロース加水分解酵素を回収する工程を含む、請求項２に記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類を、セルロース加水分解酵素を使用して糖化するバイオマス原料の糖化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エネルギーや環境に対する問題を解決する手段として、再生可能な材料を有効利用する技術の開発が強く求められている。このような技術のひとつにバイオリファイナリー技術があり、バイオマス資源を有効利用し、化学品や燃料に効率的に変換する技術に注目が集まっている。とりわけ自然界に最も多量に存在するバイオマス資源であるホロセルロース類を利用する技術の開発が強く求められている。
【０００３】
ホロセルロース類を化学品や燃料等の有用物質に変換する場合、ホロセルロース類を分解し、たとえば糖等の低分子量のホロセルロース誘導体に変換（糖化）する必要がある。ホロセルロース類の分解方法としては、ホロセルロース類を酸やアルカリで加水分解する方法、熱により分解する方法、マイクロ波を照射する方法、超臨界水処理、レーザー加熱する等の方法を、単独あるいは組み合わせて使用する方法が知られている。しかしながら実際には、これらの方法は操作が煩雑であったり、装置が高価であったりすることから限定的に利用されているに過ぎない。一方、セルロース加水分解酵素等を用いる生物学的方法は、操作が簡便かつ管理が容易であることからホロセルロース類の糖化の手段として最も普及している方法である。
【０００４】
セルラーゼ等のセルロース加水分解酵素を用いてバイオマス原料の糖化を行う場合、糖化を効率的に進めるために、バイオマス原料を予め、粉砕処理、蒸煮、熱分解、加圧分解、電子線、γ線、マイクロウェーブ、酸処理、アルカリ処理等を行ったものが用いられる。
【０００５】
ホロセルロース類に対するセルロース加水分解酵素の作用を増強する目的で、バイオマス原料に、（メタ）アクリル酸エステルと（メタ）アクリル酸（塩）とを必須構成単量体とする高分子アニオン系界面活性剤を添加して、加水分解酵素によりバイオマスを糖化する方法（特許文献１）が開示されている。しかしながら、特許文献１にはポリ（メタ）アクリル酸（塩）を酵素糖化反応において用いることは開示されていない。
また、セルロースからのリグニン剥離を促進してセルロースに対する酵素の作用を増強する目的で、塩基性化合物とアニオン系ポリマーの同時存在下でバイオマス原料を粉砕処理することが開示されている（特許文献２）。特許文献２においては、粉砕処理後にポリアクリル酸塩を添加して、セルロースを酵素糖化することは開示されていない。
【０００６】
一方、前処理されたバイオマス原料中にリグニン類が共存する場合、リグニン類はセルロース加水分解酵素を強力に吸着し、この現象に起因して、セルロース加水分解酵素によるホロセルロース類の分解（糖化）反応の効率が著しく抑制されてしまうことが知られている。つまり、バイオマス原料中のホロセルロース類を効率的に分解するための重要なポイントの１つが、セルロース加水分解酵素のリグニン類への吸着をコントロールすることにあることがわかってきた。また、リグニン類にセルロース加水分解酵素が吸着すると、通常、セルロース加水分解酵素の再利用は難しくなってしまう。産業上、セルロース加水分解酵素のコスト削減は重要であることから、セルロース加水分解酵素を再利用することも望まれている。
【０００７】
リグニン類を含有するバイオマス原料中のホロセルロース類を酵素で糖化する際に、バイオマス原料中のリグニン類の影響を回避する方法として、酵素を混合する前に、例えば、アルカリ蒸解やクラフト蒸解、オゾン処理、過酸化水素処理等によりバイオマス原料を脱リグニン処理する方法（特許文献３）や、リグニン類への加水分解酵素の吸着阻害する物質であるスキムミルクを添加してバイオマス原料を糖化する方法（特許文献４）、リグニン類と親水性化合物との反応物であるリグニン誘導体を添加してからバイオマス原料を糖化する方法（特許文献５）等が知られている。
【０００８】
しかしながら、特許文献３〜５の糖化方法は、糖化効率および生産性において満足できるものではない。またこれらの方法は、糖化効率および生産性が改善されたとしても、操作が煩雑であり、装置が高価であり、さらには安全性等にも課題がある。より簡便な操作によりリグニン類の影響を回避し、効率良くバイオマス原料を糖化できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−７５３７８号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１７２０７号公報
【特許文献３】特開２００８−９２９１０号公報
【特許文献４】特開２００９−７２１４４号公報
【特許文献５】国際公開２０１１／１１１６６４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、バイオマス原料中のホロセルロース類をセルロース加水分解酵素により効率良く糖化すると同時に、セルロース加水分解酵素を効率的に利用し得る、簡便なバイオマス原料の糖化方法を提供することである。さらに本発明の課題は、バイオマス原料の糖化方法を用いたバイオエタノールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）が、リグニン類とセルロース加水分解酵素の吸着を阻害し得る物質として作用することに着目し、リグニン類が共存するバイオマス原料およびセルロース加水分解酵素の少なくとも一方に、予めポリ（メタ）アクリル酸（塩）を添加して、その後バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を混合してバイオマス原料を糖化する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１２】
さらに本発明者らは、上記糖化方法により、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を用いてバイオマス原料を糖化した後、または、糖化と同時に、酵母等の微生物により糖類をアルコール発酵させてエタノールを得ることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．下記工程（１）および工程（２）を含む、リグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類の糖化方法、
工程（１）：バイオマス原料およびセルロース加水分解酵素の少なくとも一方に、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を予め添加して、混合液を得る工程、
工程（２）：工程（１）で得られた混合液とセルロース加水分解酵素またはバイオマス原料を混合することにより、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を反応させ、バイ  オマス原料中のホロセルロース類を酵素糖化する工程。
２．前項１に記載された糖化方法において、工程（２）の酵素糖化工程の後、または、酵素糖化工程と同時に、糖類をアルコール発酵することを含む、エタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のリグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類の糖化方法は、リグニン類へのセルロース加水分解酵素の吸着が著しく抑制されたものであり、セルロース加水分解酵素によるホロセルロース類の糖化が阻害されることなく、バイオマス原料中のホロセルロース類を効率よく糖化することができる。
加えて、糖化反応後のセルロース加水分解酵素は再利用可能であり、セルロース加水分解酵素を効率的に利用することができる。本発明のバイオマス原料の糖化方法は、リグニン類を分解・除去するといった特別な処理を必要としないため、エネルギー的にも、時間的にも、実用上の操作的にも、非常に高効率で、ホロセルロース類の糖化が可能となる。
また、本発明の糖化方法により得られた糖類は、アルコール発酵や乳酸発酵等に使用することができ、高効率でバイオマス原料を利用して、エタノール等のアルコールや乳酸を生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明は、少なくとも工程（１）および工程（２）を含む、リグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類の糖化方法である。本発明の糖化方法では、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）により、リグニン類とセルロース加水分解酵素の不可逆的な吸着を抑制し、セルロース加水分解酵素によりバイオマス原料の酵素糖化反応を行うものである。本発明の糖化方法では、セルロース加水分解酵素がリグニン類に奪われることなくホロセルロース類の糖化に使われることから、効率よくホロセルロース類を糖化することができる。
【００１６】
〈工程（１）〉
工程（１）は、バイオマス原料およびセルロース加水分解酵素の少なくとも一方に、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を予め添加して、混合液を得る工程である。
【００１７】
本発明で用いることのできるバイオマス原料の種類には特に制限はなく、リグニン類が共存しており、ホロセルロース類が含まれるものであれば、いかなるものであってもよい。バイオマス原料としては例えば、木質系材料（針葉樹や広葉樹等の木本類の木の幹、枝、根、木の葉等、廃材、パルプ類、紙類等）、草本系材料（稲、麦、トウモロコシ、サトウキビ、豆類等の作物や雑草の茎や根、刈草等、それらの残渣）を挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。特に、リグニン類が多く含まれるリグノセルロース系のバイオマス原料である、針葉樹（スギ、カラマツやヒノキ等）に由来する木質系材料や、広葉樹（ナブラヤシ、アブラヤシ、クヌギ等）に由来する木質系材料等を用いることができる。
【００１８】
バイオマス原料は、工程（１）に用いられる前に、糖化反応が効率良く進むよう裁断処理または粉砕処理等の物理的処理をし、適当な形状や大きさにしておくことが好適である。バイオマス原料の裁断、粉砕等の物理的処理がより適切に行われるためには、バイオマス原料は乾燥している状態が良い。バイオマス原料は、例えば順風式乾燥法等で乾燥させ、好ましくは含水率２０質量％以下の状態に乾燥させておく。
【００１９】
バイオマス原料を裁断処理する場合、裁断処理のための機器や、裁断処理後のバイオマス原料の大きさは特に限定されないが、例えばロータリーカッター等で必要に応じて５ｃｍ以下、好ましくは２ｃｍ以下、特に好ましくは１ｃｍ以下のチップ片とすれば良い。
バイオマス原料を粉砕処理する場合、粉砕処理のための機器や、粉砕処理後の大きさは特に限定されないが、例えば、高圧圧縮ロールミル等でバイオマス原料の平均粒径が５００μｍ以下、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以下とすれば良い。平均粒径は後述する実施例に記載の方法により測定することができる。
【００２０】
裁断、粉砕処理時の温度は特に制限はなく、−１００〜２００℃の範囲であれば良いが、余計なエネルギーを消費しないためには２〜１００℃が好ましい。
裁断、粉砕処理の時間は、用いる機器や裁断、粉砕処理後のバイオマス原料の大きさ、バイオマス原料の乾燥等の状態によって変わるが、経済性の面からは３０分以内が望ましい。
【００２１】
裁断、粉砕処理後のバイオマス原料は、そのまま工程（１）に供しても良いし、さらに前処理を行ってもよい。前処理としては例えば、蒸煮処理、爆砕処理、水熱処理、酸（硫酸、希硫酸等）処理又はアルカリ処理等が挙げられ、これらの処理により、セルロース加水分解酵素のホロセルロース類への反応性を向上させることができる。また前処理として、アルカリ水溶液中において過酸化物と混合する等の処理を行っても良い。
【００２２】
バイオマス原料中に含まれるホロセルロース類とは、β−１，４グルコシド結合を多く含む多糖類を意味する。ホロセルロース類には、具体的には、セルロース、ヘミセルロース、または、それらの変性体等が含まれる。また、バイオマス原料は、リグニン類の除去、分解処理がされていないものであり、リグニン類を含むものである。リグニン類には、リグニンまたはその変性体等が含まれる。
【００２３】
本発明に用いるセルロース加水分解酵素としては、ホロセルロース類を加水分解できるセルロース加水分解酵素であれば制限無く使用することができ、動物、植物、微生物に由来するセルロース加水分解酵素を、単独、あるいは混合して利用できる。セルロース加水分解酵素としては、糖化効率の点から、セルラーゼやヘミセルラーゼ等がよく使用される。ここでセルラーゼとは、セルロースのβ１，４グルカンのグルコシド結合を加水分解する酵素のことであり、セルラーゼ（ＥＣ番号３．２．１．４）、エキソ−１，４β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ番号３．２．１．７４）およびエキソセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ番号２．２．１．９１）が使用できる。
さらに具体的には、セルラーゼとしては「セルラーゼ"オノヅカ"３Ｓ、セルラーゼＹ−ＮＣ等」（ヤクルト薬品（株）製）、「スクラーゼＣ等」（三菱化学フーズ（株）製）、「セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４等」（天野エンザイム（株）製）、「ＴＰ−６０、メイセラーゼ」（明治製菓（株）製）、「セルロシンＡＣ４０」、「セルロシンＡＬ」、「セルロシンＴ３」等（エイチビィアイ（株）製）、「エンチロンＣＭ、ＭＨＣ、バイオヒット、バイオスター等」（洛東化成工業（株）製）、「セルクラスト１．５Ｌ」、「ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２」、「ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ２」、「ウルトラフロＬ」、「ノバザイム１８８」、「フェニザイム」、「ビスコザイム」等（ノボザイムジャパン社製）、「Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ」（ジェネンコア社製）等を利用することができる。
【００２４】
工程（１）では、糖化反応を効率的に行うために、高分子量体を添加剤として用いる。高分子量体としては、リグニン類とセルロース加水分解酵素の吸着を抑制する機能を有する必要がある。本発明では、かかる機能を有する高分子量体として、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を用いることを特徴とするものである。
【００２５】
本発明にて用いられる高分子量体であるポリ（メタ）アクリル酸（塩）は、（メタ）アクリル酸（塩）単量体（以下「ＭＡ」と称する）を、溶液重合、乳化重合、懸濁重合等の公知の重合方法に従って重合することで、得ることができる。
なお、本発明において（メタ）アクリル酸とは、メタクリル酸及び／又はアクリル酸を表わし、（メタ）アクリル酸（塩）とは、（メタ）アクリル酸及び／又は（メタ）アクリル酸の塩を表わす。なお、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を構成する単量体には、（メタ）アクリル酸エステルは含まれない。
加えて、本発明の好ましいポリ（メタ）アクリル酸（塩）は、ポリアクリル酸ナトリウム塩、ポリアクリル酸アンモニウム塩、ポリメタクリル酸ナトリウム塩、ポリメタクリル酸アンモニウム塩を例示することができる。
高分子量体を得るための具体的な重合方法としては、例えば、溶液重合の場合、単量体組成物を低級アルコール等の有機溶媒中に溶解し、窒素、アルゴン等不活性ガス雰囲気下、過酸化物やアゾ化合物等のラジカル重合開始剤を添加して加熱、攪拌することにより高分子量体を得る方法が挙げられる。また得られた高分子量体の形態としては、粉状、溶液状のいずれでもよいが、水に溶解した際には透明溶液状態が好ましい。また、高分子量体を精製する場合は、再沈殿法、透析法、限外濾過法等一般的な精製方法により行うことができる。高分子量体を得るための単量体として（メタ）アクリル酸を用いた場合には、重合後に水酸化ナトリウムやアンモニア水等で中和して、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を得ることができる。
【００２６】
また、本発明に用いる高分子量体は、簡単には市販品を利用することも可能である。市販品として、以下の商品名のものが挙げられる。例えば、「アクアリックシリーズ」（アクアリックは三洋化成（株）の登録商標である）、「アロンシリーズ」「アロンビスシリーズ」「ジュリマーシリーズ」（アロン、アロンビス、ジュリマーは東亞合成（株）の登録商標である）、「ビスコメートシリーズ」（ビスコメートは東亞合成の登録商標）等があげられる。その他の市販品のポリ（メタ）アクリル酸を用いる場合には、水酸化ナトリウムやアンモニア水等で中和した、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を用いることが好ましい。
【００２７】
本発明の高分子量体は、平均分子量が、２，５００以上が好ましく、取り扱いの容易さの点で１０，０００，０００以下が好ましい。より好ましくは５，０００以上、１，０００，０００以下であり、さらに好ましくは約５００，０００である。なお本発明においては、平均分子量とは質量平均分子量を意味する。なお質量平均分子量は、ポリエチレングリコールを標準サンプルとするゲル浸透クロマトグラフィー法で測定することができる。
【００２８】
高分子量体の添加量は、バイオマス原料中に共存するリグニン類の量に依存するが、バイオマス原料の乾燥質量に対して０．０１〜５０質量％、好ましくは０．１〜２０質量％、より好ましくは１〜１０質量％である。高分子量体の量が少なすぎると、リグニン類によるセルロース加水分解酵素への影響を回避することができない。
【００２９】
高分子量体の添加方法には、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を混合する前であれば特に制限は無く、一括投入、分割投入のどちらでも良い。また高分子量体は、バイオマス原料と予め混合してもよいし、セルロース加水分解酵素と予め混合してもよい。バイオマス原料と高分子量体を予め混合する場合は、バイオマス原料の粉砕、裁断処理の後に高分子量体を混合することが好ましい。これにより、高分子量体によるリグニン類またはセルロース加水分解酵素のマスキング効果が十分に発揮されることとなる。また、セルロース加水分解酵素の活性を回収するという観点からは、セルロース加水分解酵素と高分子量体を予め混合するのが望ましい。また、高分子量体を均一に分散させるためには、攪拌しながら混合するのが良い。水やアルコール等、糖化反応に必要な溶媒は、適時投入、混合すれば良い。その他、ホロセルロース類の結晶構造を緩める機能を示す成分として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン性の界面活性剤や、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子、マレイン酸を含む共重合体等のアニオン系界面活性剤およびその塩等を、単独または適宜組合せて、適量投入しても良い。
【００３０】
バイオマス原料と高分子量体の混合液、または、セルロース加水分解酵素と高分子量体の混合液のｐＨ条件は特に制限はないが、酵素糖化反応にスムーズに移行するために、ｐＨ７未満、好ましくはｐＨ４〜６が良い。ｐＨの調整は酸やアルカリを用いて行うことができる。酸としては硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸等、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、各種有機アミン等を用いることができる。
【００３１】
バイオマス原料と高分子量体、または、セルロース加水分解酵素と高分子量体の攪拌混合は、混合物が均一分散可能な装置であれば、特に限定はないが、例えば、リボン型混合機やパドル型混合機等があげられ、攪拌効率が高いものが好ましい。
また、上記攪拌混合の時間には特に限定は無く、バイオマス原料と高分子量体、または、セルロース加水分解酵素と高分子量体が、均一に混合攪拌されれば良いが、３０分程度で十分である。
さらに、上記攪拌混合の温度は特に限定されず、高分子量体が、リグニン類またはセルロース加水分解酵素をマスキングできる温度であればよい。通常１〜１００℃、余分なエネルギーを消費しないために、６０℃以下が好ましい。
【００３２】
工程（１）を行うことにより、酵素糖化反応用のバイオマス原料と高分子量体の混合液、または、セルロース加水分解酵素と高分子量体の混合液が得られる。この混合液は、通常、スラリー液として得ることができる。
【００３３】
〈工程（２）〉
工程（２）は、工程（１）で得られた混合液に、バイオマス原料またはセルロース加水分解酵素を混合して、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を反応させることにより、バイオマス原料中のホロセルロース類を酵素糖化する工程である。
【００３４】
工程（１）で得られた混合液では、高分子量体により、リグニン類またはセルロース加水分解酵素がマスキングされている。よって工程（２）において、バイオマス原料とセルロース加水分解酵素を混合した場合に、セルロース加水分解酵素へのリグニン類の吸着が抑制され、工程（２）のホロセルロース類の糖化が効率よく進行する。しかも、リグニン類を除去、分解するような特別な処理を必要としないため、エネルギー的にも、時間的にも、実用上の操作的にも非常に効率高く、グルコースやキシロース等の単糖や、セロビオース、セロトリオース等のオリゴ糖を得ることができる。酵素糖化処理により得られた糖を、アルコール発酵や乳酸発酵等に使用する場合は、単糖まで分解することが好ましい。
【００３５】
工程（２）における糖化処理の条件は、糖化反応をスムーズに進行させ得るものであればいかなるものであっても良い。例えば、反応溶媒としては、水、有機溶媒、およびそれらの混合溶媒を使用できる。水は、水道水、工業用水、蒸留水、イオン交換水等を利用でき、単独でも複数を混合してもよい。有機溶媒は、炭化水素系の溶媒、エーテル系の溶媒、塩素系の溶媒、アルコール系の溶媒、ケトン系の溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ピリジン等を利用でき、単独でも複数を混合してもよい。有機溶媒としては、エタノール等のアルコール系の溶媒を用いることが好適である。有機溶媒は、１０質量％以下、好ましくは５質量％以下の濃度で用いることができる。またバイオマス原料とセルロース加水分解酵素との混合液はｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜７である。ｐＨの調整には酸やアルカリを用いることができる。酸としては硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸等、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、各種有機アミン等を用いることができる。反応温度は１０〜９０℃、好ましくは２０〜７０℃、より好ましくは４０〜６５℃である。反応時間は通常３０分から５日間、好ましくは１２時間〜３日間である。
【００３６】
酵素糖化工程後または酵素糖化工程と同時に、公知の方法を利用してアルコール発酵をさせることにより、エタノールを得ることができる。アルコール発酵は、糖類をエタノールに発酵することが可能な酵母や細菌等の微生物、遺伝子組換えにより糖類をエタノールに発酵することが可能となった酵母や細菌等の微生物を用いて行えば良い。アルコール発酵可能な微生物としては、サッカロマイセス属、ザイモモナス属、ピキア属等のエタノール発酵菌を用いることができる。
【００３７】
酵素糖化工程と同時にアルコール発酵を行う場合、酵素糖化工程の反応条件のｐＨと温度は、糖化反応とアルコール発酵のどちらも実施可能な条件とすることが望ましい。例えばｐＨは４〜７、温度は２０〜４０℃が好ましい。
酵素糖化工程とアルコール発酵を別々に行う場合、アルコール発酵工程では、アルコール発酵に適した条件とすることが望ましく、ｐＨは４〜８、温度は４０〜６０℃が好ましい。
【００３８】
なお、アルコール発酵においては、反応液中のエタノール濃度が上昇すると、反応効率が悪くなるので、反応液中からエタノールを随時分離して回収しても良い。例えば、エバポレーション装置等でエタノールを分離回収しながらアルコール発酵を行っても良いが、この場合の温度はセルロース加水分解酵素や微生物の失活を避けるため、６０℃以下が望ましい。最終的に、得られたエタノールを蒸留等により回収することができ、エタノールの純度を上げるために再蒸留等を実施すればよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４０】
まず以下の調製例１〜６において、本発明のホロセルロース類の糖化方法に用いる高分子量体の調製例を示す。
〈調製例１〉
ポリアクリル酸（平均分子量５，０００、和光純薬工業（株）製）を準備した。当該ポリアクリル酸をイオン交換水に溶解し、６Ｎおよび１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に中和しながら５質量％に調整し、高分子量体１溶液を得た。
〈調製例２〉
ポリアクリル酸（平均分子量２５，０００、和光純薬工業（株）製）を用いる以外は調製例１と同様に操作し、高分子量体２溶液を得た。
【００４１】
〈調製例３〉
ポリアクリル酸（平均分子量１，０００，０００、和光純薬工業（株）製）を用いる以外は調製例１と同様に操作し、高分子量体３溶液を得た。
〈調製例４〉
ポリアクリル酸（平均分子量１，０００，０００、和光純薬工業（株）製）を準備した。当該ポリアクリル酸をイオン交換水に溶解し、３０質量％および１０質量％アンモニア水でｐＨ７に中和しながら５質量％に調整し、高分子量体４溶液を得た。
【００４２】
〈調製例５〉
ポリメタクリル酸（平均分子量１００，０００、和光純薬工業（株）製）を用いる以外は調製例１と同様に操作し、高分子量体５溶液を得た。
〈調製例６〉
ポリアクリル酸ナトリウム（重合度２，７００〜７，５００、和光純薬工業（株）製）を準備した。当該ポリアクリル酸ナトリウムを５質量％となるようにイオン交換水に溶解し、高分子量体６溶液を得た。
【００４３】
〈比較調製例１〉
ポリエチレングリコール２００００（平均分子量２０，０００±５，０００、和光純薬工業（株）製）を準備した。当該ポリエチレングリコール２００００を５質量％となるようにイオン交換水に溶解し、高分子量体７溶液を得た。
【００４４】
以下の実施例１−１〜１−７では、上記調製例１〜６により得られた高分子量体溶液を用いて、本発明のバイオマス原料中のホロセルロース類の酵素糖化を行った。
【００４５】
（実施例１−１）
バイオマス原料と高分子量体１溶液を予め混合して混合液を調製し、当該混合液にセルロース加水分解酵素を添加して反応させることにより、酵素糖化を行った。
【００４６】
（ｉ）バイオマス原料の粉砕処理
バイオマス原料であるスギ粉末は、タンデムリングミル（商品名ＨＶ−３０、TRU合同会社）を用いて粉砕した。ＨＶ−３０は、粉砕ポットの内径が２８４ｍｍ、材質Ｓ４５Ｃであり、その内部に外径２５２ｍｍ、内径１９８ｍｍ、厚さ２１ｍｍのＳ４５Ｃ製のリングを１０枚積層して用いた。乾燥粉砕装置KDS-2（（株）北川鉄工所製）を使用して平均粒径２００μｍに粉砕したスギ粉末を、ＨＶ−３０に投入した。その後、ＨＶ−３０を、振幅８ｍｍで振動数１，５００ｃｐｍ（circle per minute）でリングを運動させることにより、平均粒径２０μｍのスギ粉末の粉砕物を得た。粒径測定は、粒度測定専用機器である、マイクロトラック  ＭＴ３３００ＥＸ2（日機装株式会社）を用いて測定を行った。
【００４７】
（ii）バイオマス原料と高分子量体の混合液の調製（工程（１））
バイオマス原料として上記（ｉ）により得られたスギ粉末粉砕物、高分子量体１溶液およびイオン交換水を混合した。得られた混合液を、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。このように調製された液を「スギ粉末−高分子量体混合液」とした。なお、後述する糖化反応液の終濃度で、スギ粉末粉砕物の濃度は２０質量％に、高分子量体１の濃度は０．５質量％になるように調整した。
【００４８】
（iii）バイオマス原料の酵素糖化（工程（２））
上記工程（ii）により調製したスギ粉末−高分子量体混合液に、セルロース加水分解酵素としてＣｅｌｌｉＣＴｅｃ２（商品名）（ノボザイム社製）を、対スギ粉末粉砕物の質量当たりのタンパク量で０．２７質量％となるよう添加し、糖化反応液とした。糖化反応液を１２０ｒｐｍで振盪しながら５０℃で４８時間反応させることにより、酵素糖化を行い、酵素糖化液を得た。
【００４９】
（ｉ）〜（iii）により得られた酵素糖化液について、糖化率および酵素回収率を以下に示す方法により求めた。糖化率と酵素回収率の結果は後述する表１に示す。
【００５０】
〈糖化率〉
糖化率は、工程（１）のバイオマス原料中のグルコース濃度と酵素糖化液中のグルコース濃度を測定することにより、以下の手順で算出した。
【００５１】
（ａ）バイオマス原料１ｇ中のグルコース単位量
バイオマス原料（スギ粉末粉砕物）１．０ｇに、７２質量％の硫酸０．６ｍＬを加え、３０℃で１時間保持した後、水１６．８ｍＬを加えてオートクレーブにて１２０℃で１時間処理した。処理後の試料について、液量を測定した（バイオマス原料試験液量）。その後、当該試料の一部を用いて酵素法（Ｆ−キット  グルコース：ＪＫインターナショナル）でグルコース濃度を測定した。本測定で得られたグルコース濃度とバイオマス原料試験液量より、バイオマス原料１ｇ中のグルコース単位量を算出した。
バイオマス原料１ｇ中のグルコース単位量（ｇ）＝グルコース濃度（質量／容量％）×バイオマス原料試験液量（ｍＬ）×０．０１
【００５２】
（ｂ）酵素糖化液中のグルコース量
酵素糖化液について、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、回収された上清液量を測定した（糖化試験液量）。上清液のグルコース濃度を酵素法（Ｆ−キット  グルコース：ＪＫインターナショナル）で測定した。本測定で得られたグルコース濃度と糖化試験液量より、酵素糖化液のグルコース量を算出した。
酵素糖化液のグルコース量（ｇ）＝グルコース濃度（質量／容量％）×糖化試験液量（ｍＬ）×０．０１
【００５３】
（ｃ）糖化率の測定
上記（ａ）および（ｂ）により得られたグルコース量、および、工程（１）（ii）にて用いたバイオマス原料（スギ粉末粉砕物）量から、下記式に従い糖化率を算出した。結果を後述する表１に示した。
糖化率（％）＝酵素糖化液のグルコース量（ｇ）／｛バイオマス原料１ｇ中のグルコース単位量（ｇ／ｇ）×バイオマス原料量（ｇ）｝×１００
【００５４】
〈酵素回収率１〉
酵素回収率１は、以下の手順で算出した。
上記（iii）の酵素糖化処理後の試料を準備し、遠心分離によって沈殿物と上清液１を分離した。得られた上清液１のタンパク量を、プロテインアッセイ（商品名）（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定した。スギ粉末粉砕物およびセルロース加水分解酵素を添加しないこと以外は、実施例１−１（ｉ）〜（iii）に従って調製した溶液を、ブランク液１とした。スギ粉末粉砕物を添加しないこと以外は、実施例１−１（ｉ）〜（iii）に従って調製した溶液を、酵素液１とした。ブランク液１および酵素液１について、前述と同様にプロテインアッセイにてタンパク量を測定した。
測定して得られた、上清液１、ブランク液１、酵素液１の各タンパク量を用いて、次式より酵素回収率を算出した。結果を後述する表１に示した。なお、回収されたセルロース加水分解酵素に活性のあることは、スギ粉末粉砕物をバイオマス原料として用いて酵素糖化を行い、糖が産生されることにより確認した。
酵素回収率１（％）＝（上清液１中のタンパク量−ブランク液１中のタンパク量）／（酵素液１中のタンパク量−ブランク液１中のタンパク量）×１００
【００５５】
（実施例１−２）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、調製例２の高分子量体２溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００５６】
（実施例１−３）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、調製例３の高分子量体３溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００５７】
（実施例１−４）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、調製例４の高分子量体４溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００５８】
（実施例１−５）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、調製例５の高分子量体５溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００５９】
（実施例１−６）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、調製例６の高分子量体６溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００６０】
（比較例１−１）
調製例１の高分子量体１溶液を添加しない以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００６１】
（比較例１−２）
調製例１の高分子量体１溶液の代わりに、比較調製例１の高分子量体７溶液を用いる以外は実施例１−１と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００６２】
（実施例１−７）
セルロース加水分解酵素と高分子量体６溶液を予め混合して混合液を調製し、当該混合液にバイオマス原料を添加して反応させることにより、酵素糖化を行った。具体的な手法を以下に示す。
【００６３】
（ｉ）バイオマス原料の粉砕処理
実施例１−１の（ｉ）と同様にして、スギ粉末の粉砕物を得た。
【００６４】
（ii）セルロース加水分解酵素と高分子量体の混合液の調製（工程（１））
セルロース加水分解酵素ＣｅｌｌｉＣＴｅｃ２（商品名）（ノボザイム社製）を高分子量体６溶液により希釈し、「酵素−高分子量体液」を調製した。なお、後述する糖化反応液の終濃度で、酵素濃度が対スギ粉末質量当たりのタンパク量として０．２７質量％、高分子量体６の濃度が０．５質量％となるように調整した。
【００６５】
（iii）バイオマス原料液の調製
スギ粉末粉砕物およびイオン交換水を混合した。続いてこの溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。このように調製された液をバイオマス原料液とした。なおスギ粉末粉砕物は、後述する糖化反応液の終濃度で２０質量％になるように調整した。
【００６６】
（iv）バイオマス原料の酵素糖化（工程（２））
上記（iii）にて調製したバイオマス原料液に、（ii）にて得られた酵素−高分子量体液を添加し、糖化反応液を調製した。糖化反応液を、１２０ｒｐｍで振盪しながら５０℃で４８時間反応させることにより酵素糖化を行い、酵素糖化液を得た。
【００６７】
工程（ｉ）〜（iv）により得られた酵素糖化液について、糖化率および酵素回収率を、実施例１−１と同様に算出した。得られた結果を、後述する表１に示した。
【００６８】
（比較例１−３）
調製例６の高分子量体６溶液の代わりに、スキムミルクを最終濃度２％で用いる以外は実施例１−７と同様にして酵素糖化を行い、糖化率および酵素回収率を求めた。結果を後述する表１に示した。
【００６９】
実施例１−１〜１−７および比較例１−１〜１−３の糖化率および酵素回収率を以下の表１に示す。
【表１】
0006474150.tif 000002
【００７０】
以下の実施例２−１では、本発明の糖化方法により得られた糖類を用いて、エタノールの製造を行った。
【００７１】
（実施例２−１）
セルロース加水分解酵素と高分子量体６溶液を予め混合して混合液を調製し、当該混合液にバイオマス原料を添加し、さらに、酵母を加えることによって糖化とアルコール発酵を同時に行った。具体的な手法を以下に示す。
【００７２】
（ｉ）バイオマス原料の粉砕処理
実施例１−１の（ｉ）と同様にして、スギ粉末の粉砕物を得た。
【００７３】
（ii）セルロース加水分解酵素と高分子量体の混合液の調製（工程（１））
セルロース加水分解酵素ＣｅｌｌｉＣＴｅｃ２（商品名）（ノボザイム社製）を高分子量体６溶液により希釈し、「酵素−高分子量体液」を調製した。なお、後述する糖化反応液の終濃度で、酵素濃度が対スギ粉末質量当たりのタンパク量として０．２７質量％、高分子量体６の濃度が０．５質量％となるように調整した。
【００７４】
（iii）バイオマス原料液の調製
スギ粉末粉砕物およびイオン交換水を混合した。続いてこの溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。このように調製された液をバイオマス原料液とした。なおスギ粉末粉砕物は、後述する糖化反応液の終濃度で２０質量％になるように調整した。
【００７５】
（iv）バイオマス原料の酵素糖化およびアルコール発酵（工程（２））
上記（iii）にて調製したバイオマス原料液に、（ii）にて得られた酵素−高分子量体液を添加し、糖化反応液を調製した。この糖化反応液１００ｇに酵母（Shizosaccharomyces japonicus）を１．０×１０９個／ｍＬ添加し、５００ｍＬのバッフル付きフラスコで８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で７２時間反応させ、酵素糖化と同時にアルコール発酵した。
【００７６】
工程（ｉ）〜（iv）により得られたアルコール発酵後の試料について、次の方法によりエタノール濃度と酵素回収率を測定した。
〈エタノール濃度〉
アルコール濃度計を用いて、以下の手順でエタノール濃度の測定を行った。アルコール発酵終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離した。得られた上清液中のエタノール濃度を、アルコメイト  ＡＬ−３（製品名）（ウッドッソン社）により測定した。
その結果、アルコール発酵後の試料のエタノール濃度は６１質量／容量％であった。
【００７７】
〈酵素回収率〉
アルコール発酵後の試料についての酵素回収率は、以下の手順で算出した。
アルコール発酵後の試料を準備し、遠心分離によって沈殿物２と上清液２を分離した。得られた上清液２のタンパク量をプロテインアッセイ（商品名）（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定した。バイオマス原料および酵素を添加しない以外は、同様に調製して遠心分離によって得られた溶液をブランク液２とした。バイオマス原料を添加しない以外は同様に調製して遠心分離によって得られた溶液を酵素液２とした。上清液２、ブランク液２、酵素液２について、前述と同様にして、プロテインアッセイにてタンパク量を測定した。次式より酵素回収率２を算出した。
酵素回収率２（％）＝（上清液２中のタンパク量−ブランク液２中のタンパク量）／（酵素液２中のタンパク量−ブランク液２中のタンパク量）×１００
アルコール発酵後の試料についての酵素回収率は４０％であった。
【００７８】
（比較例２−１）
「酵素−高分子量体液」の調製に高分子量体６溶液の代わりにスキムミルクを最終濃度で２％使う以外は実施例２−１に従いアルコール発酵を実施した。アルコール発酵終了後にエタノール濃度、酵素回収率を測定した。
その結果、アルコール発酵後のエタノール濃度は５８％および酵素回収率は４％であった。
【００７９】
（総論）
実施例１−１〜１−７の結果から明らかなように、本発明の糖化方法によれば、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を、バイオマス原料またはセルロース加水分解酵素の少なくともどちらか一方に添加することにより、リグニン類によるセルロース加水分解酵素の吸着を抑制することができ、これによるセルロース分解酵素の機能低下を防ぐことができる。従って、本発明の糖化方法により、バイオマス原料に含まれるホロセルロース類から効率的に糖類を製造することができる。
また実施例１−７は、本発明の糖化方法が、セルロース加水分解酵素の回収率にも優れており、セルロース加水分解酵素の再利用を可能とし、効率的に糖類を製造することができることを示す。さらに実施例２−１に示すように、本発明の糖化方法により得られた糖類はエタノールの生産に有効に用いることができ、同様にして他の糖類の生産にも有効に用いることができる。
一方、比較例１−１の結果から、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）を添加しない場合は、リグニン類にセルロース加水分解酵素が吸着し、セルロース分解酵素の機能を阻害するとともに、ほとんどセルロース加水分解酵素の回収ができないことがわかった。また比較例１−２の結果から、ポリ（メタ）アクリル酸（塩）の代わりにポリエチレングリコールを用いた場合は、セルロース加水分解酵素の回収がほとんどできなかった。これは、ポリエチレングリコールがアニオン性官能基を有さないことから、リグニン類またはセルロース加水分解酵素と相互作用せず、リグニン類によるセルロース加水分解酵素の吸着を抑制できなかったためと考えられる。比較例１−３の結果からは、スキムミルクを添加した場合、リグニン類へのセルロース加水分解酵素の吸着は若干抑制されるものの吸着抑制作用は十分ではなく、セルロース加水分解酵素の回収率は十分ではなかった。 
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のリグニン類が共存するバイオマス原料中のホロセルロース類の糖化方法は、リグニン類へのセルロース加水分解酵素の吸着が著しく抑制されたものであり、セルロース加水分解酵素によるホロセルロース類の糖化が阻害されることなく、バイオマス原料中のホロセルロース類を効率よく糖化することができ、有用である。加えて、酵素糖化反応後のセルロース加水分解酵素は再利用可能であり、セルロース加水分解酵素を効率的に利用することができ、経済的にも有利である。また、本発明の糖化方法により得られた糖類は、アルコール発酵や乳酸発酵等に使用することができ、高効率でバイオマス原料を利用してアルコールやエタノールを生産することができる。