(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性領域よりも中性領域で高い粘度を示す粘稠剤の酸性溶液を加熱滅菌する加熱滅菌工程、及び
前記加熱滅菌工程の後、前記粘稠剤の酸性溶液の加熱滅菌処理物に塩基を添加して中和する中和工程
を含む、無菌化された粘稠性基剤の製造を行う工程と、
前記無菌化された粘稠性基剤と医薬成分とを混合して製剤化する工程と、
を含む、医薬製剤の製造方法であって、
前記粘稠剤がカルボキシビニルポリマーであり、前記医薬成分がワクチン抗原であり、前記医薬製剤が経鼻投与型ワクチン製剤である、医薬製剤の製造方法。
【請求項２】
前記塩基が塩基性アミノ酸である、請求項１に記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項３】
前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項２に記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項４】
前記塩基性アミノ酸が７０℃未満の水溶液に調製される、請求項２又は３に記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項５】
前記無菌化された粘稠性基剤において、前記塩基性アミノ酸の変性が抑制されている、請求項２から４のいずれかに記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項６】
前記中和工程の前に、前記塩基性アミノ酸を濾過滅菌する工程を更に含む、請求項２から５のいずれかに記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項７】
前記粘稠剤の酸性溶液の２０℃における粘度が１００〜１０００ｍＰａ・ｓである、請求項１から６のいずれかに記載の医薬製剤の製造方法。
【請求項８】
前記粘稠剤の酸性溶液の２６℃におけるｐＨが２．０〜３．５である、請求項１から７のいずれかに記載の医薬製剤の製造方法。                             
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘稠剤の無菌化技術に関する。より具体的には、本発明は、効率よく無菌化された粘稠性基剤を製造する方法及びそれを用いた医薬製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘稠性の性質を有する基剤（以下、粘稠性基剤）は食品、化粧品、医薬品、その他工業製品等の様々な分野で利用されている。粘稠性基剤は、液体の粘性を調節するために混入する添加物である。食品分野における粘稠性基剤の利用目的としては、液状のものをゼリー状に固める効果、及び粘性を高めて食品成分を均一に分散させる効果等が挙げられる。また化粧品分野における粘稠性基剤の利用目的としては、連続層の粘度の調整、製剤の安定化、及び使用感触のコントロール等が挙げられる。【０００３】
一方で、医薬品分野においても粘稠性基剤が幅広く利用されている。例えば医療用点眼剤においては、薬物の結膜のう内滞留性を向上させ、薬効の持続性や眼内移行性を高める目的で利用されている。更に、ワクチン分野においても粘稠性基剤の有用性が注目されている。ワクチンは、感染症の予防を目的として接種する薬液であり、感染症を引き起こす病原体の毒性を弱めた成分又は無毒化した成分が含まれている。ワクチンを接種することで当該感染症に対する免疫が誘導され、感染症の発症リスクの低下が期待される。【０００４】
従来のワクチンは、皮下接種が主な投与経路であった。ワクチンを皮下接種した場合、体内において免疫が誘導され感染症の発症を予防できるものの、感染自体を予防することは困難であると考えられる。そこで近年、鼻腔粘膜における免疫誘導を目的とした経鼻接種ワクチンの開発が試みられている。例えば気道粘膜において感染が起こり得る感染症に対して、感染の場である鼻腔内で免疫を誘導することにより、感染症の発症のみならず感染自体の予防も期待されている。【０００５】
気道粘膜において感染が起こり得る感染症の原因として、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、百日咳菌、肺炎球菌、ジフテリア菌等が挙げられる。例えばインフルエンザウイルスは、咳又はくしゃみなどを通じて鼻、口、喉といった気道粘膜から体内に侵入する。従来の皮下接種型のインフルエンザワクチンは、血液中にＩｇＧ抗体を産生することで、体内に侵入したウイルスに対して当該抗体が機能し、重症化を予防する。一方、インフルエンザワクチンを経鼻接種することで、血液中のＩｇＧ抗体に加えウイルスが侵入してくる粘膜面にＩｇＡ抗体を産生することが可能となるため、インフルエンザウイルスの体内への侵入の予防も期待できる。【０００６】
経鼻接種ワクチンは、鼻腔粘膜で有効な免疫応答を誘導するため、鼻腔粘膜に長く滞留させることを目的として、粘稠性基剤が添加される。たとえば非特許文献１及び非特許文献２には、粘稠剤としてカルボキシビニルポリマー（以下、ＣＶＰ）が用いられたインフルエンザワクチンが記載されている。また、特許文献１には、ＣＶＰ及びジェランガムを含み、外部からせん断力を加えて粘度を調整したスプレータイプの皮膚・粘膜付着型製剤が記載されている。【０００７】
医薬品を製造する上で、医薬品の無菌化は重要な要求事項であり、様々な滅菌方法にて無菌化された医薬品が市場に存在する。滅菌方法としては、加熱、濾過、ガス、放射線等による方法が挙げられる。特許文献２には、インフルエンザワクチンの調製において、ＣＶＰにＬ−アルギニン及び塩化ナトリウム溶液を加えた基剤に高圧蒸気滅菌を行い、その後、インフルエンザワクチンと混和することが記載されている。特許文献３には、点鼻用噴霧ノズルが設けられる医療用シリンジに収容する薬剤の調製において、ＣＶＰとＬ−アルギニンとを含んで調製された基剤に、更に加熱処理または高圧蒸気滅菌等の滅菌処理を行ってよいことが記載されている。【０００８】
ＣＶＰは、上述のように薬剤に用いられる基剤の他、超音波診断における接触子用の媒体に有用なゲル組成物としても用いられる。特許文献４には、このようなゲル組成物の調製において、ＣＶＰを中和した後にガンマ線滅菌等の滅菌処理を行ってよいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２３１９３号
【特許文献２】特開１９９１−０３８５２９号公報
【特許文献３】特開２０１６−００７４０９号公報
【特許文献４】特開２００１−０９７８４７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．  ２０１３  Ｎｏｖ；  ７（６）：  １２１８−１２２６．
【非特許文献２】Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１６  Ｆｅｂ  ２４；３４（９）：１２０１−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
医薬製剤の質的安定性の確保には、基剤を無菌化することが重要である。しかしながら、非特許文献１及び非特許文献２、並びに特許文献１には、ＣＶＰを含む基剤（図１４の基剤番号０に相当）の無菌化については何ら記載されていない。【００１２】
一方、特許文献２から特許文献４ではＣＶＰを含む基剤の無菌化についての記載がある。これらの技術においては、滅菌工程は調製後の基剤つまり中和されたＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号０に相当）に対して行われる。このような中和されたＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号０に相当）は非常に粘度が高い。このような粘度の高い基剤に対して特許文献２及び特許文献３に記載の高圧滅菌処理法を行って無菌化されたＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号１に相当）を製造することは、熱の浸透性が非常に悪く滅菌工程に極めて長い時間を要する点で問題となる。一方、特許文献４に記載のガンマ線滅菌法は、滅菌後の品質の変化に特に注意を要するため照射総線量の調節が困難である点で問題となる。
そこで本発明は、無菌化された粘稠性基剤の製造方法であって、滅菌効率が良く且つ簡便な方法を提供することを主たる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意検討の結果、粘稠性基剤を中和する前に滅菌を行うことによって上記本発明の課題を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下に掲げる発明を提供する。【００１４】
項１．  酸性領域よりも中性領域で高い粘度を示す粘稠剤の酸性溶液を加熱滅菌する加熱滅菌工程と；前記加熱滅菌工程の後、前記粘稠剤の酸性溶液の加熱滅菌処理物に塩基を添加して中和する中和工程と；を含む、無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項２．  前記粘稠剤がカルボキシビニルポリマーである、項１に記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項３．  前記塩基が塩基性アミノ酸である、項１又は２に記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項４．  前記塩基性アミノ酸がＬ−アルギニンである、項３に記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項５．  前記塩基性アミノ酸が７０℃未満の水溶液に調製される、項３又は４に記載の粘稠性基剤の製造方法。
項６．  前記無菌化された粘稠性基剤において、前記塩基性アミノ酸の変性が抑制されている、項３〜５のいずれかに記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項７．  前記中和工程の前に、前記塩基性アミノ酸を濾過滅菌する工程を更に含む、項３〜６のいずれかに記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項８．  前記粘稠剤の酸性溶液の２０℃における粘度が１００〜１０００ｍＰａ・ｓである、項１から７のいずれかに記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項９．  前記粘稠剤の酸性溶液の２６℃におけるｐＨが２．０〜３．５である、項１から８のいずれかに記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法。
項１０．  項１から９のいずれかに記載の無菌化された粘稠性基剤の製造方法を行う工程と；  前記製造方法によって得られた無菌化された粘稠性基剤と医薬成分とを混合して製剤化する工程と；を含む、医薬製剤の製造方法。
項１１．  前記医薬成分がワクチン抗原であり、前記医薬製剤が経鼻投与型ワクチン製剤である、項１０に記載の医薬製剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、無菌化された粘稠性基剤の製造方法であって、滅菌効率が良く且つ簡便な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の粘稠性基剤の製造方法の概略フロー（基剤番号２、基剤番号３及び基剤番号５を経るフロー）を示す。
【図２】試験例１における熱浸透確認試験の結果を示す。
【図３】試験例１における熱浸透確認試験の結果を示す。
【図４】試験例１の非無菌未中和ＣＶＰ基剤の熱処理効率試験における、ステンレスタンク内のＢＩ試験紙及び温度センサ配置箇所、及びステンレスタンク外且つスタークレーブ缶内の温度センサ配置箇所を示す。
【図５】試験例１における熱浸透確認試験の結果を示す。
【図６】試験例１における熱浸透確認試験の結果を示す。
【図７】試験例１における熱浸透確認試験の結果を示す。
【図８】試験例２におけるＬ−アルギニン水溶液を４０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を示す。
【図９】試験例２におけるＬ−アルギニン水溶液を５０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を示す。
【図１０】試験例２におけるＬ−アルギニン水溶液を６０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を示す。
【図１１】試験例２におけるＬ−アルギニン水溶液を７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２１℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を示す。
【図１２】試験例４における粘度測定試験の結果を示す。
【図１３】試験例４におけるｐＨ測定試験の結果を示す。
【図１４】従来の粘稠性基剤の製造方法の概略フローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［１．粘稠性基剤の製造方法］
図１に、粘稠性基剤の製造方法の概略フロー（基剤番号２、基剤番号３及び基剤番号５を経るフロー）を示す。なお、図１では、粘稠剤の一例としてＣＶＰ、中和剤の一例としてＬ−アルギニンを挙げて示している。本発明の粘稠性基剤の製造方法では、加熱滅菌工程と中和工程とをこの順で行う。本発明の粘稠性基剤の製造方法では、中和工程の前に中和剤の濾過滅菌工程が行われてもよい。これらの工程によって無菌化された粘稠性基剤を得る。
【００１８】
なお、本発明において、無菌とは、微生物が死滅又は除去された状態をいい、具体的には、医療現場で国際的に求められる無菌性保証水準(sterility assurance level; SAL、適切な滅菌工程により滅菌された製品中の汚染菌の最大生存確率をいう)が１０-6未満となる水準、つまり、１０6個の菌を殺滅したときに、生存する菌が１個未満である水準をいう。１０-6未満という無菌性保証水準（SAL）は、「最終滅菌法による無菌医薬品の製造に関する指針」（２０１２年１１月９日：日本国全面改訂，厚生労働省医薬食品局監視指導・麻薬対策課事務連絡）においても定められている。また、無菌化とは、このような無菌の状態にすることをいう。滅菌とは、無菌状態にするための手法、つまり微生物を死滅又は除去する手法をいう。
【００１９】
また、以下において、粘稠性基剤とは、溶液に対して粘稠剤を分散させること、又は、溶液に対して粘稠剤の分散及び中和を行うことで得られる、増粘された溶液をいう。
【００２０】
［１−１．加熱滅菌工程］
加熱滅菌工程では、酸性領域よりも中性領域で高い粘度を示す粘稠剤の酸性溶液（図１の基剤番号２に相当）を加熱滅菌し、その加熱滅菌処理物として無菌化された未中和基剤（図１の基剤番号３に相当）を得る。加熱滅菌を粘稠性基剤の粘度が低くなる液性（つまり酸性）条件下で行うことで、熱処理効率を向上させ、これによって滅菌効率を向上させることができる。また、滅菌手段として加熱滅菌を採用することにより、加熱温度及び時間を調整する簡便な操作で滅菌を行うことができる。加熱滅菌工程に供される粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）は、粘稠剤と水とを含んでいればよい。
【００２１】
粘稠剤は、酸性領域よりも中性領域で高い粘度を示す物質であり、具体的には水溶性ポリマーであり、より具体的には側鎖にカルボキシル基を有するポリマーである。このようなポリマーは、水中に分散させると酸性を呈し、側鎖カルボキシル基が未中和の状態で比較的柔軟な立体配置をとる一方、側鎖カルボキシル基が中和されてイオン化されると、側鎖間のイオン反発により分子が伸張し粘度を上昇させると考えられている。なお、酸性領域は、具体的には、粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２）のｐＨの領域に相当し、中性領域は、具体的には、無菌化された粘稠性基材（基剤番号５）のｐＨの領域に相当する。
【００２２】
粘稠剤の例としてはカルボキシビニルポリマー（ＣＶＰ）が挙げられる。カルボキシビニルポリマーは、カルボキシポリメチレン又はカルボマーとも呼ばれ、アクリル酸を主な単位構造とする水溶性ポリマーであり、水に溶解又は膨潤し、増粘させることができれば特に制限されず、部分的に架橋がされていてもよく、また、他の単位構造を含むコポリマーであってもよい。粘稠剤の分子量としては、例えば１万〜１０００万、好ましくは５万〜５０万であってよい。カルボキシル基含量は、カルボキシビニルポリマーにおいて例えば５０モル％〜７５モル％であってよい。粘稠剤としては、１種を単独で用いてもよく、２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）中の粘稠剤の量は、最終物（後述基剤番号５に相当）において適切な粘性を得る等の観点から、例えば０．１〜２．０質量％、好ましくは０．５〜１．８質量％、更に好ましくは１．０〜１．５質量％であってよい。
【００２４】
粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）は、更にグリセリン及び／又はポリグリセリンを含んでいてよい。ポリグリセリンの重合度としては特に制限されないが、例えば２〜１６、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜６、特に好ましくは２であってよい。グリセリン及び／又はポリグリセリンとしては、１種を単独で用いてもよく、２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）の２０℃における粘度は、加熱滅菌を効率的に行う観点から、例えば２５００ｍＰａ・ｓ以下、好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは４００ｍＰａ・ｓ以下が挙げられ。最終物（基剤番号５に相当）において十分な粘性を得る観点から、１０ｍＰａ・ｓ以上、好ましくは１００ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上が挙げられる。具体的には、粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）の２０℃における粘度範囲としては、１０〜２５００ｍＰａ・ｓ、１０〜１０００ｍＰａ・ｓ、１０〜４００ｍＰａ・ｓ、１００〜２５００ｍＰａ・ｓ、１００〜１０００ｍＰａ・ｓ、１００〜４００ｍＰａ・ｓ、２００〜２５００ｍＰａ・ｓ、２００〜１０００ｍＰａ・ｓ、２００〜４００ｍＰａ・ｓが挙げられる。
なお、当該粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）についての上述の粘度は、日本薬局方「一般試験法」の粘度測定法における回転粘度計法に準じて得られる。具体的には、あらかじめ２０℃に設定したＴＶＥ−２５Ｈ形粘度計（コーン・プレート形）のサンプルカップに検体１．１ｍＬを気泡が入らないように入れ、５分間静置した後、回転数２．５ｒｐｍにて３分間せん断力を加えた時の粘度値として得るものとする。ローターは１°３４’×Ｒ２４（ローターコード：０１）を使用する。
【００２６】
粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）のｐＨとしては、加熱滅菌を効率的に行う等の観点から、２１〜２７℃のいずれかで測定した場合において、例えば１．５〜４．５、好ましくは２．０〜４．０、より好ましくは２．０〜３．５、更に好ましくは２．３〜３．３、一層好ましくは２．５〜３．０、特に好ましくは２．５〜２．９が挙げられる。具体的には、粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２に相当）のｐＨとして、２６℃で測定した場合において例えば２．０〜３．５、好ましくは２．３〜３．３、より好ましくは２．５〜３．０、更に好ましくは２．５〜２．９が挙げられる。
【００２７】
加熱滅菌工程における具体的な滅菌方法としては特に限定されず、当業者によって適宜選択されるが、通常、高圧蒸気滅菌法が挙げられる。本発明においては、滅菌を加熱処理によって行うことで、簡便な滅菌が可能となる。したがって、非加熱滅菌法の一例である濾過滅菌法で生じる粘稠性基剤のフィルター集積の問題、及び非加熱滅菌法の他の例である放射線滅菌法で生じる設備の導入困難性の問題等を回避することができる。
【００２８】
加熱滅菌工程における具体的な条件としては特に限定されず、達成すべき無菌性水準(SAL)に応じて当業者によって適宜選択される。例えば「最終滅菌法による無菌医薬品の製造に関する指針」（２０１２年１１月９日：全面改訂，日本国厚生労働省医薬食品局監視指導・麻薬対策課事務連絡）を参照して１０-6未満の無菌性保証水準(SAL)を確保するための工程パラメータを特定し、当該指針に記載される１１章及び参考情報Ａ．２及びＡ．３に基づいて適切な滅菌条件を設定することができる。製品の無菌性保証水準を保証する方法としては、ハーフサイクル法、オーバーキル法、ＢＩとバイオバーデン併用法、絶対バイオバーデン法が挙げられ、これらの方法に基づき、容器の材質及び基剤の量に応じて、具体的な滅菌条件（滅菌温度、滅菌時間）を設定することができる。高圧蒸気滅菌の場合は、ハーフサイクル法では１４Ｄ〜１６Ｄを達成する滅菌時間が求められている。加熱滅菌温度の具体例として、１１０℃〜１４０℃が挙げられる。
【００２９】
高圧蒸気滅菌は、容器内の基剤を静置させた状態で行ってもよいが、加熱効率を更に向上させる観点から、基剤を撹拌しながら行ってもよい。撹拌の方法は基剤の対流を促進可能である限り特に限定されないが、たとえば、基剤を入れた容器自体を所定の回転数で回転させる方法、所定時間ごとに容器自体の回転方向を変更する方法、及び基剤内に投入した撹拌子等により容器内の基剤を対流させる方法等が挙げられる。この場合、所定の回転数及び所定時間は基剤の対流が促進されるものであれば特に限定されない。基剤を撹拌しながら高圧蒸気滅菌を行う場合、無菌性保証水準(SAL)を達成する条件を容器の材質及び基剤の量に応じて設定する。たとえば、ハーフサイクル法で要求される１４Ｄ〜１６Ｄの滅菌時間の半分の滅菌時間における無菌性を確認する場合は、Ｆ0値として１１分〜２６０分、望ましくは２０〜２００分、更に望ましくは２０〜６０分を設定することができる。なお、Ｄ値は、微生物の死滅率を表す値で、供試微生物の９０％を死滅させ、生存率を１／１０に低下させるのに要する時間又は放射線量をいう。Ｆ0値は、プロセスの微生物致死量であって、１０℃のz値（Ｄ値が１０倍変化するのに必要な温度）を持つ微生物について、１２１．１℃の温度に等価な加熱時間（分）で表される値である。加熱効率を更に向上させる他の方法として、振とうを行ってもよい。更に、撹拌と振とうを組み合わせてもよい。
【００３０】
［１−２．中和工程］
中和工程では、加熱滅菌処理物としての無菌化未中和基剤（基剤番号３に相当）に、塩基（好ましくは、中和剤番号１２に相当する無菌化した塩基）を中和剤として添加することで、中和するとともに増粘し、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）を得る。
【００３１】
塩基としては特に限定されず、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物；水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アンモニア水、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、アミノメチルプロパノール、トリエチルアミン及びテトラヒドロキシプロピルエチレンジアミンなどの有機アミン類；Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、ヒスチジン、オルチニン、カナバニン等の塩基性アミノ酸などが挙げられる。これらの塩基の中でも、基剤が生体へ適用されることを考慮すると塩基性アミノ酸であることが好ましい。塩基は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
塩基は、得られる無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）が所定のｐＨとなる量で適宜用いられる。例えば、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）１００質量％に対して１〜２０質量％、好ましくは２〜１０質量％となる量で用いることができる。
【００３３】
塩基は、水溶液の態様で用いることができる。効率的に中和を行うために、塩基水溶液を加温状態とし、室温の飽和濃度より高い濃度の水溶液として用いることもできる。加温状態とする場合であって、且つ塩基として塩基性アミノ酸を用いる場合、水溶液を効果的に高濃度化するとともに塩基性アミノ酸の熱変性を回避する観点で加温条件を設定することが好ましい。例えば、温度としては、水溶液を効果的に高濃度化する観点から４０℃以上であってよく、塩基性アミノ酸の熱変性を回避する観点から７０℃未満であってよい。後述の濾過滅菌をあらかじめ行う場合にあっては濾過作業時に溶液が冷却されうることを考慮すると、塩基の析出を抑制しやすくする観点から５０℃以上であることが好ましく、加温時間を十分（例えば３０分以上、好ましくは４５分以上）確保しつつ熱変性を良好に抑制する観点から６０℃未満であることが好ましい。より具体的には、４０℃以上５０℃未満で６時間以下；５０℃以上６０℃未満で６時間以下、好ましくは３時間以下、より好ましくは２時間以下；又は６０℃以上７０℃未満で６時間以下、好ましくは３時間以下、より好ましくは１時間以下などの加温条件が挙げられる。なお、加温時間とは、溶質としての塩基が水溶液調製のために当該加温時間に供された時から中和が完了（増粘が完了）するまでの時間をいう。
【００３４】
本発明によって得られる無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の２０℃における粘度は、粘稠性基剤の粘膜における滞留性を良好に確保する観点からたとえば３０００ｍＰａ・ｓ以上、好ましくは４０００ｍＰａ・ｓ以上であってよく、投与の際の噴霧容易性及び／又は噴霧される液滴径の均一性等を確保する観点から１００００ｍＰａ・ｓ以下、好ましくは９０００ｍＰａ・ｓ以下であってよい。具体的には、本発明によって得られる無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の２０℃における粘度範囲としては、３０００〜１００００ｍＰａ・ｓ、３０００〜９０００ｍＰａ・ｓ、４０００〜１００００ｍＰａ・ｓ、４０００〜９０００ｍＰａ・ｓが挙げられる。なお、ここに示す無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の粘度は、日本薬局方「一般試験法」の粘度測定法における回転粘度計法に準じて得られる。具体的には、あらかじめ２０℃に設定したＴＶＥ−２５Ｈ形粘度計（コーン・プレート形）のサンプルカップに検体１．１ｍＬを気泡が入らないように入れ、５分間静置した後、回転数２．５ｒｐｍにて３分間せん断力を加えた時の粘度値として得るものである。ローターは１°３４’×Ｒ２４（ローターコード：０１）を使用する。
【００３５】
また、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５）のｐＨは、上述の粘度を得る観点、及び／又は製剤化後に医薬成分の適切な安定性及び／又は吸収性を得る観点等から、２１〜２７℃のいずれかで測定した場合において、例えば６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８．０、更に好ましくは６．８〜８．０であってよい。好ましくは、２６℃で測定した場合において、例えば６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８．０、更に好ましくは６．８〜８．０であってよい。
【００３６】
更に、中和剤として塩基性アミノ酸を用いた場合、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５）においては、塩基性アミノ酸の変性が抑制されていることが好ましい。塩基性アミノ酸の変性が抑制されているとは、塩基性アミノ酸を高圧蒸気滅菌の加熱条件下（例えば、１１０℃以上）で処理した場合に比べて、変性していない塩基性アミノ酸に対する変性した塩基性アミノ酸の割合が少ないことをいい、具体的には、クロマトグラムにおいて変性されていない塩基性アミノ酸のピーク面積を１００％とした場合の変性された塩基性アミノ酸のピーク面積の割合（以下、変性率（％）と記載する。）が例えば０％以上３０％以下、好ましくは０％以上２５％以下、より好ましくは０％以上２０％以下、更に好ましくは０％以上１０％以下であることをいう。塩基性アミノ酸の変性がこのように抑制されることで、中和工程による粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の増粘効果を好ましく得ることができる。
【００３７】
なお、アミノ酸の変性率の測定法としては特に限定されず、当業者によって適宜測定されるが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はＵｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＵＰＬＣ）などの一般的な液体クロマトグラフィーにて取得したクロマトグラムにおいて、変性していないアミノ酸のピーク面積とアミノ酸の変性による分解物のピーク面積との比較に基づき、アミノ酸の変性による分解物のピーク面積比を導出する方法により測定することができる。無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５）を、塩基性アミノ酸の変性が抑制されているものとして得るためにとりうる手段としては、塩基性アミノ酸を、上述の加温条件（すなわち、７０℃未満、好ましくは６０℃未満、より具体的には、４０℃以上５０℃未満で６時間以下；５０℃以上６０℃未満で６時間以下、好ましくは３時間以下、より好ましくは２時間以下；又は６０℃以上７０℃未満で６時間以下、好ましくは３時間以下、より好ましくは１時間以下）を採用すること、又は、当該加温条件を採用することに加えて後述のように中和剤の滅菌工程において加熱を要さない滅菌法を採用することが挙げられる。
【００３８】
［１−３．中和剤の滅菌工程］
中和工程で用いる中和剤としては、塩基水溶液（図１の中和剤番号１１に相当）として調製された後に滅菌を経て無菌化された塩基水溶液（図１の中和剤番号１２に相当）を用いることが好ましい。中和剤に用いる塩基が塩基性アミノ酸以外の耐熱性を有する塩基であれば、高圧蒸気滅菌などの加熱滅菌処理により滅菌しても構わない。一方、中和剤に用いる塩基が塩基性アミノ酸である場合は、熱変性を回避する観点から、加熱を要さない滅菌法を用いることが好ましい。加熱を要さない滅菌法としては、濾過滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等が挙げられ、好ましくは濾過滅菌が利用される。滅菌手段として濾過滅菌を採用することにより、濾過の簡便な操作で滅菌を行うことができる。なお、濾過滅菌は加熱を要さないが、フィルターの材質に影響しない限り、加熱された塩基水溶液に対しても用いることができる。上述のように、塩基水溶液を加温し室温の飽和濃度より高い濃度の水溶液として調製する場合は、加熱温度は塩基性アミノ酸の変性を抑制する限度において加熱されるが、このような場合においても濾過滅菌は好ましく用いられる。
【００３９】
濾過滅菌の方法として特に限定されないが、具体的には、第十七改正日本薬局方における濾過法による滅菌法が好ましい。濾過装置としては特に限定されないが、滅菌用フィルターを用いることができ、第十七改正日本薬局方における濾過法による滅菌法で用いられる滅菌用フィルターが好ましい。かかる滅菌用フィルターとしては特に限定されないが、孔径が０．４５μｍ以下、好ましくは０．３０μｍ以下、より好ましくは０．２２μｍ以下の滅菌用フィルターであってよい。滅菌用フィルターとしては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等の樹脂製フィルター、陶土製（シャンベラン型）フィルター、珪藻土製（ベルケフェルド型）フィルター、多孔性半融ガラス製フィルター、メンブランフィルター等が挙げられる。
【００４０】
［２．医薬製剤の製造方法］
本発明の医薬製剤の製造方法は、上述の無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の製造を行う工程と、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）と医薬成分とを混合して製剤化する工程とを含む。これによって、製剤化された医薬組成物を得る。得られる医薬組成物は、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５に相当）の粘性によって、粘膜における滞留性が付与されているため、特に経鼻用医薬組成物として有用である。
【００４１】
医薬成分としては、生体内で所望の効果を奏する任意の生理活性物質が挙げられる。たとえば、インフルエンザウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、ｂ型インフルエンザ菌抗原、肺炎球菌抗原、髄膜炎菌抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、水痘ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、おたふくかぜウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ＨＳＶ−１抗原、ＨＳＶ−２抗原、狂犬病ウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、パルボウイルス抗原、ジカウイルス抗原、コクサッキーウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、レオウイルス３型抗原、黄熱ウイルス抗原、アデノウイルス１型〜４７型抗原、ポリオウイルス抗原、ラッサウイルス抗原及びワクシニアウイルス抗原等のワクチン抗原；ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ヒト副甲状線ホルモン（ｈＰＴＨ）およびそのＮ末断片ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトモチリン、ヒトグレリン、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウムペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウムペプチド（ＣＮＰ）、ヒトインスリン、レプチン、レジスチン、グルカゴン、リラキシン、ガラニン、ガストリン、アペリン、セレクチン、カルシトニン、アドレノメデュリン、アミリン、ヒューマニン、チモシン、エンドルフィン、エンドモルフィン、ノシスタチン、エンケファリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＳ、ニューロメジンＵ、アンジオテンシン、エンドセリン、グアニリン、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、ニューロフィジン、メラニン細胞刺激ホルモン、ウロコルチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メスタチン、プロラクチン放出ペプチド、ソマトスタチン、コルチスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジンＮ、オベスタチン、オレキシンインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、メラニン凝集ホルモン、副腎刺激ホルモン放出ホルモン、エクセンジン−４、カタカルシン、コレシストキニン、コルチコトロピン、メラノトロピン、ニューロメジンＣ、コペプチン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ペプチドＹＹ、チロリベリン等のホルモン；が挙げられる。
【００４２】
ワクチンとは、身体中に投与されて免疫を活性化する、通常感染性因子または感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液または溶液をいう。弱毒生ワクチン、不活化ワクチン、組換えタンパク質やウイルス様粒子を抗原とするワクチン等が挙げられる。弱毒生ワクチンには、細胞培養継代や遺伝子操作をすることにより弱毒したウイルスや細菌等の抗原が含まれている。不活化ワクチンには、不活化した抗原（以下、不活化抗原）が含まれている。抗原の不活化方法としては、例えば、物理的な方法（Ｘ線照射、熱、超音波などを用いる方法）、化学的な方法（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素などを用いる方法）が挙げられ、感染力を失わせ免疫原性を保持させた抗原であればよい。不活化抗原としては、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、ウイルス非構造タンパク質、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどが挙げられる。
【００４３】
インフルエンザウイルスは、脂質二重膜構造のエンベロープを有する。エンベロープの内層は主としてマトリックスタンパク質及びＲＮＡとタンパク質の複合体であるＲＮＰから成る。外層にはいわゆる表面タンパク質であるインフルエンザＮＡタンパク質及びインフルエンザＨＡタンパク質が突起物として存在する。インフルエンザウイルスは、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳ分節の８つのゲノム分節からなる。ＨＡおよびＮＡのゲノム分節は、それぞれＨＡ及びＮＡの抗原タンパク質をコードしている。ＨＡの種類としてＨＡ１〜ＨＡ１６が知られており、ＮＡの種類としてはＮＡ１〜ＮＡ９が知られている。抗原タンパク質は、天然のウイルス等の病原体から精製してもよく、合成または組換え技術により作製してもよい。そのような方法は当業者によって適宜選択され、市販される機器、試薬、ベクターなどを用いて実施することができる。また、抗原タンパク質は、弱毒化、細胞培養増殖適合化、鶏卵培養増殖適合化、粘膜投与適合化等の改変を加えた組換えウイルスから精製してもよい。
【００４４】
医薬組成物における医薬成分の量としては特に限定されず、生体内で所望の効果を奏する有効量が当業者によって適宜選択される。例えば医薬成分がワクチンであり、医薬製剤を経鼻投与型ワクチン製剤として調製する場合は、医薬組成物中のワクチン量は、鼻腔粘膜に免疫を誘導するのに十分な量が当業者によって適宜選択される。
【００４５】
医薬組成物には上述の成分の他、各種塩類、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、矯臭剤等を適宜含ませることができる。これらの成分は、適宜滅菌されていてよい。
【００４６】
各種塩類を含有させる目的は特に限定されないが、たとえば粘度調整の目的で含有させることができる。各種塩類としては、水溶性の塩が挙げられ、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、炭酸カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩や、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、アルギニン塩酸塩、リジン塩酸塩、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸マグネシウム、カプリル酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム等の有機塩等が挙げられる。これらは単独でも、１種または２種以上混合してもよい。
【００４７】
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、ベンザルコニウム塩化物、ソルビン酸カリウム、エデト酸ナトリウム、クロロブタノール、フェノキシエタノール、安息香酸ナトリウム等が挙げられるが、好ましくはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラベン類が挙げられる。これらは単独でも、１種または２種以上混合してもよい。
【００４８】
安定化剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、トコフェロール等が挙げられる。矯臭剤としては、例えばメントール、カンキツ香料等が挙げられる。これらは単独でも、１種または２種以上混合してもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下において、ＣＶＰ、Ｌ−アルギニン、濃グリセリン及び水の混合処理物である基剤番号０の非無菌中和ＣＶＰ基剤は、国際公開第２０１４／１０３４８８号の段落００３６の記載に従って調製することができるものである。また、ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水の混合物である基剤番号２の非無菌未中和ＣＶＰ基剤は、Ｌ−アルギニンと、水の一部（具体的には、当該Ｌ−アルギニンを２４w/w％の濃度で溶解する分量の水）とを捨象したことを除き、基剤番号０の基剤の調製と同様にして調製することができるものである。【００５０】
（試験例１）従来法及び本発明における熱処理効率の比較
粘稠剤としてカルボキシビニルポリマー（ＣＶＰ）を用いた。中和及び未中和ＣＶＰ基剤の高圧蒸気滅菌を行い、熱処理効率を比較した。なお、中和ＣＶＰ基剤（図１４における基剤番号０）の熱処理は、従来法（図１４における基剤番号１の無菌化中和ＣＶＰ基剤を得る方法）の過程で行われる熱処理であり、未中和ＣＶＰ基剤（図１における基剤番号２）の熱処理は、本発明（図１における基剤番号５の無菌化中和ＣＶＰ基剤を得る方法）の過程で行われる熱処理である。従って、両熱処理効率を比較することによって、従来法と本発明とにおける熱処理効率の比較を行った。熱浸透の確認は、高精度温度測定器（エラブジャパン株式会社製、ＩＤ：Ｓ００４９６）を用い、滅菌中の温度を測定することによって行った。【００５１】
滅菌の確認は、ＢＩ（バイオロジカルインジケータ；生物学的指標）を用いたチャレンジテストにより行った。用いたＢＩは、ＳＴＥＲＩＳ製スポアストリップス試験紙（菌種：Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、菌数：２．２×１０6（ＣＦＵ）、Ｄ121値：１．７（Ｍｉｎ）、Ｌｏｔ．Ｎｏ．：１２０５Ａ）である。ハーフサイクル法で要求される滅菌時間１４Ｄ〜１６Ｄの半分の滅菌時間である７Ｄ〜８Ｄの熱負荷を達成するため、熱浸透状態などの確認を行った。Ｄ121値が２分である１０6ＣＦＵのＢＩを死滅させるのに必要な熱負荷がＦ0値１４〜１６分であるところ、本試験例では、当該時間よりも高負荷であるＦ0値２０分を滅菌の基準とした。【００５２】
［参考例１］
（１）中和ＣＶＰ基剤の熱処理効率−１（従来法における熱処理効率）
ＣＶＰ、Ｌ−アルギニン、濃グリセリン、及び水の混合物である非無菌中和ＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号０）１０．８ｋｇを、１０Ｌステンレスタンクに投入し、オートクレーブ（メーカー：株式会社讃岐田製作所）を用いて滅菌温度１２２℃に設定し熱処理することで、高圧蒸気滅菌を行った。滅菌中において、タンクは静置状態とし、内容物を機械的に振とうさせる操作及び撹拌させる操作は行わなかった。ステンレスタンクの内壁表面からの距離が異なる複数の測定点におけるタンク内温度の経時的変化を調べた。測定点における温度の経時的変化を示す熱浸透確認試験の結果を図２に、滅菌時のＦ0値（滅菌の基準：Ｆ0値＝２０分）の経時的変化を示す熱浸透確認試験の結果を図３に示す。図２に示されるように、タンク内中心部まで滅菌温度１２１℃に到達させた。図３に示されるように、タンク内中心部のＦ0値が滅菌の基準（Ｆ0値＝２０分）に到達するには、１０時間以上の時間が必要であった。【００５３】
（２）中和ＣＶＰ基剤の熱処理効率−２（従来法における熱処理効率 ）
ＣＶＰ、Ｌ−アルギニン、濃グリセリン、及び水の混合物である非無菌中和ＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号０）７Ｋｇを、３０Ｌステンレスタンクに投入し、スタークレーブ（高圧蒸気滅菌機、メーカー：Ｂｉｏｔｔ、  型式：ＳＣ−４０）を用いて滅菌温度１２２℃に設定して熱処理することで、高圧蒸気滅菌を行った。滅菌中において、タンクは静置状態とし、内容物を機械的に振とうさせる操作及び撹拌させる操作は行わなかった。ステンレスタンク内のＢＩ試験紙及び温度センサ配置箇所、及びステンレスタンク外且つスタークレーブ缶内の温度センサ配置箇所を図４に示す。図４中符号１の箇所における中和ＣＶＰ基剤の加熱後２．７時間のＦ0値は０．００分であった。また、測定点における温度の経時的変化を示す熱浸透確認試験の結果を図５に示す。図５に示すように、設定滅菌温度に到達しなかった。【００５４】
［参考例２］
（１）未中和ＣＶＰ基剤の熱処理効率−１（本発明における熱処理効率）
ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水の混合物である非無菌未中和ＣＶＰ基剤（図１の基剤番号２）７Ｋｇを、３０Ｌステンレスタンクに投入し、スタークレーブ（高圧蒸気滅菌機、メーカー：Ｂｉｏｔｔ、  型式：ＳＣ−４０）を用いて滅菌温度１２２℃に設定して熱処理することで、高圧蒸気滅菌を行った。滅菌中において、タンクは静置状態とし、内容物を機械的に振とうさせる操作及び撹拌させる操作は行わなかった。図４中符号１の箇所における未中和ＣＶＰ基剤の加熱後２．７時間のＦ0値は６．４１分だった。また、測定点における温度の経時的変化を示す熱浸透確認試験の結果を図６に示す。図６に示すように、図５に比して顕著に速やかな温度上昇が認められ、熱処理時間を大幅に軽減することができた。【００５５】
（２）未中和ＣＶＰ基剤の熱処理効率−２（本発明における熱処理効率）
ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水の混合物である非無菌中和ＣＶＰ基剤（図１の基剤番号２）７Ｋｇを、３０Ｌステンレスタンクに投入し、スタークレーブ（高圧蒸気滅菌機、メーカー：Ｂｉｏｔｔ、  型式：ＳＣ−４０）を用いて滅菌温度１２２℃に設定して熱処理することで、高圧蒸気滅菌を行った。滅菌中において、タンクを回転数１５ｒｐｍで内容物を機械的に撹拌させる操作を行った。図４の符号１の箇所における未中和ＣＶＰ基剤の加熱後２．７時間のＦ0値は３８．６５分だった。また、測定点における温度の経時的変化を示す熱浸透確認試験の結果を図７に示す。図７に示されるように、３時間以下の熱処理によってタンク内中心が滅菌温度１２１℃まで到達し、熱処理時間を大幅に軽減することができた。【００５６】
本試験は３回行った。ＢＩを用いたチャレンジテストにおいては、ＢＩ試験紙を図示された配置において滅菌した後、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地を用いて、５５〜６０℃で７日間（以上）の培養を行った。結果、３回の試験全てにおいて陰性を確認した。また、熱浸透確認試験の結果を表１に示す。【００５７】
【表１】
0006480649.tif 000002
【００５８】
熱浸透確認より算出された未中和ＣＶＰ基剤中のＦ0値（３回の試験の平均値：５１．９６分）は、滅菌基準値であるＦ0値２０分を超えていることが確認された。このことから、本滅菌条件は非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）を滅菌するために必要な熱負荷を与えることができると考えられる。
以上より、ハーフサイクル法にて要求される滅菌時間の半分の滅菌時間における熱負荷にて６ｌｏｇ以上のＢＩが死滅したため、実製造滅菌工程において微生物負荷が１２ｌｏｇ以上減少することが確認された。【００５９】
以上に示すように、従来法のように中和後の状態でＣＶＰ基剤を熱処理する場合（参考例１）に比べ、本発明のように未中和の状態でＣＶＰ基剤を熱処理する場合（参考例２）は滅菌処理にかかる熱処理の効率を顕著に向上させることができた。つまり、本発明のように未中和の状態でＣＶＰ基剤を熱処理することによって、熱処理効率を顕著に向上させ、これによって、滅菌効率を顕著に向上させることができた。熱処理効率の比較のため、参考例１及び参考例２の方法によってタンク内中心部が１２１℃になるまでの時間を表２にまとめた。なお、非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）の粘度（ＴＶＥ−２５Ｈ形粘度計を用いて測定した粘度）は後述の試験例５での表７に示すとおり４７４１ｍＰａ・ｓであり、非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）の粘度は後述の試験例４での表５に示すとおり３回測定の平均値が２７４ｍＰａ・ｓ、ｐＨは後述の試験例４での表６に示すとおり２．７であった。【００６０】
【表２】
0006480649.tif 000003
【００６１】
（試験例２）中和剤の熱に対する性状解析
中和剤としてＬ−アルギニンを用いた。Ｌ−アルギニン粉末（協和発酵バイオ株式会社）を用いて、２４w/w％及び２．４w/w％のＬ−アルギニン水溶液を調製した。調製した２４w/w％Ｌ−アルギニン水溶液を４０℃、５０℃及び６０℃、２．４w/w％のＬ−アルギニン水溶液を７０℃、８０℃、９０℃、１００℃及び１２１℃で熱処理した後、ＵＰＬＣ分析を行った。ＵＰＬＣ分析は、下記条件にて行った。
使用装置  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
使用カラム  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ
検出  ＵＶ（２１０ｎｍ）【００６２】
Ｌ−アルギニン水溶液を４０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を図８に、５０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を図９に、６０℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を図１０に示した。また、Ｌ−アルギニン水溶液を７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２１℃で処理した時のＵＰＬＣ分析結果を未処理のＬ−アルギニン水溶液の結果と共に図１１に示した。
図８に示すように、４０℃で３０分、２時間、６時間処理したＬ−アルギニン水溶液についてＵＰＬＣ分析を行ったところ、処理時間を長くするに従い、保持時間０．６分及び０．９分付近に異なる波形が確認された。なお、６時間処理時の変性率は１８．２３％であった。図９に示すように、５０℃で３０分、１時間、２時間、３時間、６時間処理したＬ−アルギニン水溶液についてＵＰＬＣ分析を行ったところ、処理時間を長くするに従い、保持時間０．６分及び０．９分付近に異なる波形が確認された。なお、２時間処理時の変性率は５．４７％、３時間処理時の変性率は１５．５７％、６時間処理時の変性率は１７．７０％であった。図１０に示すように、６０℃で３０分、１時間、２時間、３時間、６時間処理したＬ−アルギニン水溶液についてＵＰＬＣ分析を行ったところ、処理時間を長くするに従い、保持時間０．６分及び０．９分付近に異なる波形が確認された。なお、３０分処理時の変性率は５．７８％、1時間処理時の変性率は１８．５２％、２時間処理時の変性率は２３．０６％、３時間処理時の変性率は２３．０８％、６時間処理時の変性率は３６．４８％であった。従って、２４w/w％Ｌ−アルギニン水溶液を４０℃で処理した場合は６時間まで、５０℃の場合は６時間まで、６０℃の場合は３時間までであれば、Ｌ−アルギニンの変性を好ましく抑制できることを確認した。【００６３】
また、図１１に示すように、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２１℃で各２０分間処理したＬ−アルギニン水溶液のＵＰＬＣ分析結果から、処理温度を高くするに従い、保持時間０．６分付近に異なる波形が確認された。高圧蒸気滅菌で供される温度である１２１℃で処理するとその傾向は顕著となり、保持時間０．４分付近にも未処理時とは異なる波形が確認された。なお、１００℃２０分処理時の変性率は４．２０％、１２１℃で２０分処理時の変性率は７６．３３％であった。従って、２．４w/w％Ｌ−アルギニン水溶液を１２１℃で処理した場合は、わずか２０分でＬ−アルギニンが顕著に変性されることが分かった。【００６４】
（試験例３）従来法及び本発明による粘稠性基剤の性状比較
粘稠剤としてＣＶＰを用いた。中和及び未中和ＣＶＰ基剤の高圧蒸気滅菌を経て無菌化中和ＣＶＰ基剤を調製し、化学的性状変化を比較した。中和ＣＶＰ基剤の高圧蒸気滅菌を経て無菌化中和ＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号１）を調製する方法は従来法に該当し、未中和ＣＶＰ基剤の高圧蒸気滅菌を経て無菌化中和ＣＶＰ基剤（図１の基剤番号５）を調製する方法は本発明に該当する。化学的性状の比較においては、粘度及びｐＨを評価し、比較基準としては、非無菌中和ＣＶＰ基剤（図１４の基剤番号０）の粘度及びｐＨを用いた。【００６５】
（３−１）基剤
［参考例３］
非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）：ＣＶＰ、Ｌ−アルギニン、濃グリセリン、及び水の混合処理物である非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）を用意した。【００６６】
［比較例１］
無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）：非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）５０ｇを２００ｍＬのステンレスボトルに投入し、オートクレーブ（メーカー：株式会社  トミー精工、型番：BS-235）を用いて１２１．０℃で６時間、高圧蒸気滅菌を行った。滅菌中において、ボトルは静置状態とし、内容物を機械的に振とうさせる操作及び撹拌させる操作は行わなかった。これによって、無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）を得た。【００６７】
［実施例１］
無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）：ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水の混合物である非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）５０ｇを２００ｍＬのステンレスボトルに投入し、滅菌温度１２１．０℃で６時間熱処理を行った。滅菌中において、内容物は静置状態とした。これによって、まず、無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）を得た。別途、Ｌ−アルギニン粉末（協和発酵バイオ株式会社）を加温溶解し、２４w/w％に調製した非無菌Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１１）を濾過滅菌（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）、孔径：０．２２μｍ、メンブレン材質：ＰＶＤＦ）し、２４w/w％の無菌化Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１２）を得た。上記の無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）と無菌化Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１２）を９：１の質量比で混合し、均質になるまで撹拌し、無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）を得た。【００６８】
（３−２）化学的性状確認試験
非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）、無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）及び無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）について、化学的性状を確認するため、粘度測定試験及びｐＨ測定試験を行った。【００６９】
粘度測定には、第十七改正日本薬局方「一般試験法」の粘度測定法である回転粘度計法を準用した。検体０．３  ｍＬを、気泡が入らないようあらかじめ２０℃に設定したＴＶＥ−２２Ｌ形粘度計（コーン・プレート形）のサンプルカップに入れて５分間放置した後、３分間せん断力を加えた時の粘度を測定した。ローターは３°×Ｒ１２（ローターコード：０５）を使用した。粘度測定試験の結果を表３に示す。【００７０】
【表３】
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【００７１】
表３に示した比較例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）及び実施例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）について、参考例３の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）を基準とした相対粘度はそれぞれ７６．２％、９８．２％であった。つまり、中和ＣＶＰ基剤に滅菌処理を施した比較例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）では、粘度の低下が認められるのに対し、実施例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）では、粘度の実質的な低下が認められなかった。【００７２】
ｐＨ測定には、第十七改正日本薬局方「一般試験法」のｐＨ測定法を準用して測定した。２６℃におけるｐＨ測定試験の結果を表４に示す。【００７３】
【表４】
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【００７４】
表４に示した比較例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号１）及び実施例１の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）について、参考例３の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）を基準とした相対ｐＨはそれぞれ９８．６％、１０７％であった。【００７５】
（試験例４）本発明による粘稠性基剤の性状解析−１
本発明の方法による無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）の化学的性状を解析した。具体的には、化学的性状として粘度及びｐＨを測定し、非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）、無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）、及び非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号４）の当該化学的性状と比較した。【００７６】
（４−１）基剤
［参考例４］
非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）：ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水の混合処理物である非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）を用意した。【００７７】
［参考例５］
無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）：非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）７ｋｇを３０Ｌステンレスタンクに投入し、スタークレーブ（高圧蒸気滅菌機、メーカー：Ｂｉｏｔｔ、  型式：ＳＣ−４０）を用いて高圧蒸気滅菌を行い、無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）を得た。高圧蒸気滅菌は、１２２℃で、２４０分間熱処理を行った。滅菌中において、タンクを回転数１５ｒｐｍで内容物を機械的に攪拌させる操作を行った。【００７８】
［参考例６］
非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号４）：２４w/w％の非無菌Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１１）を６０℃１時間にて加温溶解を行って調製し、上記の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）と非無菌Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１１）とを９：１の質量比で混合し、均質になるまで撹拌し、非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号４）を得た。【００７９】
［実施例２］
無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）：２４w/w％の非無菌Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１１）を６０℃１時間にて加温溶解を行って調製した後、濾過滅菌（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）、孔径：０．２２μｍ、メンブレン材質：ＰＶＤＦ）し、２４w/w％の無菌化Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１２）を得た。上記の無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）と無菌化Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１２）とを９：１の質量比で混合し、均質になるまで撹拌し、無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）を得た。【００８０】
（４−２）化学的性状確認試験
粘度測定には、第十七改正日本薬局方「一般試験法」の粘度測定法である回転粘度計法を準用して試験を実施した。あらかじめ２０℃に設定したＴＶＥ−２５Ｈ形粘度計（コーン・プレート形）のサンプルカップに検体１．１ｍＬを気泡が入らないように入れた。５分間静置した後、回転数２．５ｒｐｍにて３分間せん断力を加えた時の粘度値を測定した。ローターは１°３４’×Ｒ２４（ローターコード：０１）を使用した。【００８１】
粘度測定試験の試験結果を以下表５及び図１２に示した。参考例４の基剤はｎ＝１、参考例５、参考例６及び実施例２の各基剤はｎ＝３で調製後、試験を実施し、得られた各基剤の粘度の平均値（平均粘度）を算出した。なお、図１２に示したエラーバーは標準偏差を示す。表５に示した参考例５の無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）については、その滅菌前の態様である参考例４の非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）を基準にした相対粘度が１０１％であった。実施例２の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）については、滅菌せずに中和した態様である非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号４）を基準にした相対粘度が９５．４％であった。【００８２】
【表５】
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【００８３】
試験例３と同様の手法でｐＨ測定を行った。ｐＨ測定試験の結果を以下表６及び図１３に示した。参考例４の基剤はｎ＝１、参考例５、参考例６及び実施例２の各基剤はｎ＝３で調製後、試験を実施し、得られた各基剤のｐＨの平均値（平均ｐＨ）を算出した。なお、図１３に示したエラーバーは標準偏差を示した。表６に示した無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）については、その滅菌前の態様である非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）を基準にした相対ｐＨが１００％であった。無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）については、滅菌せずに中和した態様である非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号４）を基準にした相対ｐＨが９５．９％であった。【００８４】
【表６】
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【００８５】
（試験例５）本発明による粘稠性基剤の性状解析−２
本発明の方法による無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）の化学的性状を解析した。具体的には、化学的性状として粘度及びｐＨを測定し、非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）の当該化学的性状と比較した。【００８６】
（５−１）基剤
［参考例７］
非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）としては、試験例３と同じ基剤を用いた。【００８７】
［実施例３］
無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）：ＣＶＰ、濃グリセリン、及び水を混合して得られた非無菌未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号２）５０ｇを２００ｍＬステンレスボトルに投入し、ボトルを静置状態とし、内容物を機械的に振とうさせる操作及び撹拌させる操作は行わなかった。オートクレーブ（メーカー：株式会社  トミー精工、型番：BS-235）を用いて１２１℃にて高圧蒸気滅菌を６時間行い、無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）を得た。無菌化未中和ＣＶＰ基剤（基剤番号３）と６０℃１時間にて加温溶解を行った無菌化Ｌ−アルギニン水溶液（中和剤番号１２）を９：１の質量比で混合し、均質になるまで撹拌し、無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）を得た。【００８８】
（５−２）化学的性状確認試験
非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）及び無菌化中和ＣＶＰ記載（基剤番号５）について、化学的性状を確認するため、粘度測定試験及びｐＨ測定試験を行った。なお、参考例７の基剤はｎ＝１、実施例３の基剤はｎ＝２で調製後、試験を実施した。【００８９】
試験例４と同様の手法で、ＴＶＥ−２５Ｈ形粘度計を用いた粘度測定を行った。粘度測定結果及び参考例７の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）の粘度を基準とした相対粘度を表７に示した。表７が示すように、実施例３の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）は、参考例７の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）と同等（９９．５％及び１０１％）の粘度であった。【００９０】
【表７】
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【００９１】
試験例３と同様の手法でｐＨ測定を行った。ｐＨ測定試験成績を表８に示した。ｐＨ測定結果及び参考例７の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）のｐＨを基準とした相対ｐＨを表８に示した。表８に示すように、実施例３の無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）は、参考例７の非無菌中和ＣＶＰ基剤（基剤番号０）と同等（１０１％及び１０４％）のｐＨであった。【００９２】
【表８】
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【００９３】
なお、上述の本発明による無菌化中和ＣＶＰ基剤（基剤番号５）にワクチン抗原を加えて医薬製剤を調製したところ、ワクチンの免疫原性に影響はなかった。【００９４】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形例が実施される。
【要約】
無菌化された粘稠性基剤の製造方法であって、滅菌効率が良く且つ簡便な方法を提供する。酸性領域よりも中性領域で高い粘度を示す粘稠剤の酸性溶液（基剤番号２）を加熱滅菌する加熱滅菌工程と；前記加熱滅菌工程の後、前記粘稠剤の酸性溶液の加熱滅菌処理物（基剤番号３）に塩基を添加して中和する中和工程と；を含む、無菌化された粘稠性基剤（基剤番号５）の製造方法。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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