(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを含む、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択されるヒト癌細胞に対する抗腫瘍形成効果を誘導するための医薬組成物。
【請求項２】
有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを含む、細胞接着分子の発現を有意に低下させる効果をもたらし、それによって、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択されるヒト癌細胞の進行および転移を阻害するための医薬組成物。
【請求項３】
細胞接着分子がＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択されるヒト癌細胞に対する抗腫瘍形成効果を誘導するための医薬の製造における、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
【請求項５】
細胞接着分子の発現を有意に低下させる効果をもたらし、それによって、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択されるヒト癌細胞の進行および転移を阻害するための医薬の製造における、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
【請求項６】
細胞接着分子がＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月７日に出願された米国仮特許出願第６２２７５８４７号の優先権を主張する国際ＰＣＴ出願である。
本発明は一般に癌療法に関する。より具体的には、本発明は、抗腫瘍形成活性および抗転移活性を発揮する（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン［ＤＭＰＢＤ］の能力に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性炎症によって癌のリスクが増大し、炎症の排除によって癌発症のリスクが低減することはよく知られている。したがって、抗炎症剤を化学療法剤と平行して（アジュバントとして）使用することが勧められ、この場合これらの抗炎症剤は、付随する化学療法剤の毒性を低減することによって、化学療法剤の薬物動態を変えより良い有効性と相応の排除をもたらすことによって、およびさらに化学療法剤自体に癌細胞を感作させることによってその活性を発揮する（Elizabeth R. Raybum et al,”Anti-inflammatory agents for cancer chemotherapy”, Mol Cell Pharmacol. 2009; 1(1): 29-43）。抗炎症物質が抗癌効果も有し得ることも、従来技術から知られている。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）は様々な癌細胞においてアポトーシスを誘導する。シクロオキシゲナーゼ阻害、活性酸素阻害、およびＮＦ−ｋＢ媒介シグナル阻害を含めたＮＳＡＩＤＳの抗癌効果に関する多くの示唆されたメカニズムにもかかわらず、どのようにしてそれらが癌細胞における細胞周期停止およびアポトーシスを誘導するかは、依然として確かではない。言い換えると、抗炎症剤媒介抗癌効果の選択性に関する情報はほとんど存在しないが、首尾よい抗癌療法および将来的癌療法の進展のため、この情報は非常に重要である（M. Adachi et al, ”Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and oxidative stress in cancer cells”, Histol Histopathol (2007) 22: 437-442）。したがって、癌増殖または転移におけるこのような抗炎症分子の直接的影響を予想するのは困難であり（Laurie E Walker, ”NSAIDS as anticancer drugs” in clinician’s brief）、相当な科学的評価が必要である。（Ｅ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタジエン（ＤＭＰＢＤ）の抗炎症性は従来技術からよく知られている（Jeenapongsa et al, ”Anti-inflammatory activity of (E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl) butadiene from Zingiber cassumunar Roxb”, J Ethnopharmacol. 2003 Aug; 87(2-3): 143-8）。さらに、ＤＭＰＢＤのトランス二量体、すなわち（＋／−）トランス−３−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−４−［（Ｅ）−３’’’，４’’’−ジメトキシ−スチリル］シクロヘキシ−１−エンの有効性は、肺癌におけるその抗増殖効果の点で論じられている（Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2015; 4(1): 01-06）。
【０００３】
本発明者らは、細胞増殖アッセイを介して癌細胞株ＰＡＮＣ−１（膵臓癌）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）およびＳＫＯＶ３（卵巣癌）に対する（Ｅ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタジエンの濃度依存的ｉｎ−ｖｉｔｒｏ抗腫瘍形成活性を初めて実証する。さらに、膵臓癌細胞に関するフローサイトメトリー試験によって評価した、細胞接着分子（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン）の有意な発現倍率の低下を引き起こすＤＭＰＢＤの独自能力は、抗転移剤としての分子の特異的機能を示唆する。腫瘍転移におけるセレクチンの役割を強調する重要な従来技術には以下のものがある。
ａ．  H. Laubli et al, ”Selectins promote tumor metastasis”, Sernin Cancer Biol. 2010 Jun; 20(3):169-77;
ｂ．  Hariri. G et al, ”Radiation guided P-selectin antibody targeted to lung cancer”, Ann Biomed Eng. 2008 May; 36(5):821-830;
ｃ．  Chen M et al, ”P-selectin mediates adhesion of leucocytes, platelets and cancer cells in inflammation, thrombosis, cancer growth and metastasis”, Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2006 Mar-Apr; 54(2)75-84;および
ｄ．  Okegawa T et al, ”The role of cell adhesion molecule in cancer progression and its application in cancer therapy”, Acta Biochim Pol. 2004;51(2):445-57。
【０００４】
癌療法の目的が、
１．特定の癌型に対する化学療法剤の特異性、および
２．過度の細胞増殖およびさらに腫瘍転移の予防における前記薬剤の二重有効性
に依存すると仮定して、これらの科学的進展は重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述で解明した本発明の発明的特徴は、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌に対するＤＭＰＢＤの抗腫瘍形成特異性、ならびにさらに、細胞接着分子Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンの阻害によりこれらまたは他の癌の蔓延もしくは転移を予防するＤＭＰＢＤの能力を実証することによって前述の目的を明らかに満たし、したがって膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌の化学療法ならびにそれらの転移の予防に有用な新規で非自明の技術情報をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン［ＤＭＰＢＤ］の抗腫瘍形成性および抗転移性に関する。具体的には本発明は、膵臓癌、前立腺癌および卵巣癌に対するＤＭＰＢＤの抗腫瘍形成性を開示する。さらに本発明は、膵臓癌細胞に関するフローサイトメトリー試験によって評価した、細胞接着分子（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン）の有意な発現倍率の低下を引き起こすＤＭＰＢＤの能力も開示する。後者の試験はＤＭＰＢＤの抗転移性を開示する。
本発明の利点は、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌に対するＤＭＰＢＤの抗腫瘍形成特異性、ならびにさらに、細胞接着分子Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンの阻害により蔓延または転移を予防するＤＭＰＢＤの能力の開示を含む。
本発明の他の特徴および利点は、例えば本発明の原理を例示する添付の図面と共に、以下のより詳細な記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】接着分子Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）の発現の低下におけるＤＭＰＢＤの効果を示す図である。
【図２】接着分子Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）の発現の低下におけるＤＭＰＢＤの効果を示す図である。
【図３】接着分子Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の発現の低下におけるＤＭＰＢＤの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（図１、図２および図３）
最も好ましい実施形態では、本発明は、ヒト癌細胞に対する抗腫瘍形成効果を誘導する方法であって、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンで前記癌細胞を処置(treating)する工程を含む方法に関する。好ましい実施形態では、前記ヒト癌細胞は前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択される。
別の最も好ましい実施形態では、本発明は、ヒト癌細胞の進行および転移を阻害する方法であって、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンで前記癌細胞を処置して細胞接着分子の発現を有意に低下させる効果をもたらし、それによって癌の進行および転移を阻害する工程を含む方法に関する。好ましい実施形態では、細胞接着分子はＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される。
【０００９】
さらに他の最も好ましい実施形態では、本発明は以下に関する。
１．膵臓癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン。
２．卵巣癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン。
３．前立腺癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン。
４．癌転移の治療において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンであって、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される細胞接着分子の発現を阻害することにより転移を阻止する（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエン。
【００１０】
５．膵臓癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを有効量含む組成物。
６．卵巣癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを有効量含む組成物。
７．前立腺癌を治療する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを有効量含む組成物。
８．Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される細胞接着分子の発現を阻害することにより癌転移を阻止する方法において使用するための（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンを有効量含む組成物。
【００１１】
９．膵臓癌の治療において使用するための医薬品を製造するための有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
１０．卵巣癌の治療において使用するための医薬品を製造するための有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
１１．前立腺癌の治療において使用するための医薬品を製造するための有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
１２．Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される細胞接着分子の発現を阻害することによる癌転移の阻止において使用するための医薬品を製造するための有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンの使用。
最も好ましい実施形態を述べる具体的かつ例示的な実施例は、本明細書中の以下に含まれる。
【実施例】
【００１２】
（例１：ｉｎ−ｖｉｔｒｏでのヒト癌細胞株に対するＤＭＰＢＤの抗腫瘍形成効果）
ヒト膵臓ＰＡＮＣ−１癌細胞株（膵臓癌細胞）、ヒト前立腺ＤＵ１４５癌細胞株（前立腺癌）およびヒト卵巣癌ＳＫＯＶ３（卵巣癌）細胞株を、当技術分野で知られている標準的なプロトコールを使用して増殖させ培養した。これらの癌細胞株は、細胞毒性を測定するため様々な濃度のＤＭＰＢＤで処理した。細胞の生存率アッセイの評価は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色定量アッセイによって行った。ＭＴＴアッセイは細胞増殖率、および逆に代謝事象がアポトーシスまたは壊死をもたらすときは、細胞生存率の低下を測定する。データは細胞数と吸光度をプロットすることによって分析し、細胞増殖の変化を定量化することができる。テトラゾリウム還元の割合は細胞増殖率に比例する。
【００１３】
計算：
サンプルの細胞毒性はＩＣ50値、細胞増殖の５０％を阻害する濃度として表す。
細胞毒性％＝（Ｅ−Ｔ／Ｅ）×１００
上式で
Ｅ＝サンプルの非存在下での細胞生存率。
Ｔ＝サンプルの存在下での細胞生存率。
【００１４】
実施したＭＴＴアッセイは、（１）Tim Mosmann. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Immunological Methods, 65(1983)55-63;（２）A.A.van de Loosdrecht, R.H.J.Beelen, G.J.Ossenkoppele, M.G.Broekhoven, M.M.A.C.Langenhuijsen. A tetrazolium-based colorimetric MTT assay to quantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemic cells from cell lines and patients with acute myeloid leukemia. Journal of Immunological Methods 174(1994)311-320 and Denis Gerlier and Nicole Thomasset. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Journal of Immunological Methods, 94(1986)57-63から適用した。
【００１５】
結果
【表１】
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【００１６】
（例２：接着分子Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンの発現に対するＤＭＰＢＤの効果（ＤＭＰＢＤの抗転移効果）−膵臓癌細胞に関する例示的実施例（図１、図２および図３））
膵臓癌細胞の平板培養を行った。コンフルエントな培養物をトリプシン処理によって採取し、それらを実験で使用する前に、さらに２回の継代において増殖させた。培地および他の培養成分は４８〜７２時間後に交換した。全ての細胞培養物は、ＣＯ２インキュベーター中に９５％空気および５％ＣＯ２で、３７℃において維持した。１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを細胞培養物に加えた。ＤＭＰＢＤは段階的濃度で加えた。７２時間後、細胞を異なるセットの特異的抗体ＰＥ標識ＣＤ６２Ｅ、ＦＴＴＣ標識ＣＤ６２ＰおよびＰＥ標識ＣＤ６２Ｌと５時間インキュベートした。次いで細胞をトリプシン処理し、ＤＭＰＢＤの影響を分析するために、フローサイトメーターでデータを得た。フローサイトメトリー分析は、（１）Curvers J, de Wildt-Eggen J, Heeremans J, Scharenberg J, de Korte D, van der Meer PF. Flow cytometric measurement of CD62P(P-selectin) expression on platelets: a multicenter optimization and standardization effort. Transfusion. 2008. 48(7): 1439-46, （２）Choi YW. Kim HJ ParkSS. Chung HW. Lee SO. Oh BS. Kim JB. Kim HY. Chung BP. Yu CD Kim SY. Inhibition of endothelial cell adhension by the new anti-inflammatory agent alpha-iso-cubebene. Vascul Pharmacol. 2009; 51: 215-224および（３）Yen YT, Liao F, Hsiao CH, Kao CL, Chen YC, Wu-Hsieh BA. Modeling the early events of severe acute respiratory syndrome coronavirus infection in vitro. J Virol. 2006 Mar; 80(6)2684-93の教示から適用した。
【００１７】
前述の実験中で使用したＤＭＰＢＤは、専有の方法によってＺｉｎｇｉｂｅｒ  ｃａｓｓｕｍｕｎａｒのリゾーム（ｒｈｉｚｏｍｅｓ）から入手し、その工程は本明細書中以下に詳述する。
１．Ｚ．ｃａｓｓｕｍｕｎａｒのリゾームの粉末状物質を、６０〜７０℃で絶えず攪拌しながらメタノール（４体積×４）で抽出した。メタノール抽出物はプールし濃縮した。
２．次いで工程１の濃縮物を５５〜６０℃においてヘキサン（４体積×４）で洗浄し、得られた生成物（ヘキサン抽出物）はプールし濃縮した。
３．次いで工程２のヘキサン抽出物をメタノールに溶かし、適切に還流しながら２：３の比でγ−シクロデキストリンと混合し、５５〜６０℃において真空乾燥し７．７９％の収率で９０％水溶性最終生成物を得て、ＤＭＰＢＤのアッセイは１０．７３％、ＤＭＰＢ−１−エンのアッセイは０．４４％であった。
【００１８】
好ましい実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明がそれらに限られないことは当業者によって明らかに理解されよう。そうではなくて、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に関連してのみ解釈されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ヒト癌細胞に対する抗腫瘍形成効果を誘導する方法であって、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンで前記癌細胞を処置する工程を含む方法。
〔２〕前記ヒト癌細胞が前立腺癌細胞、卵巣癌細胞および膵臓癌細胞からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕ヒト癌細胞の進行および転移を阻害する方法であって、有効量の（Ｅ）−１−（３’，４’−ジメトキシフェニル）ブタジエンで前記癌細胞を処置して細胞接着分子の発現を有意に低下させる効果をもたらし、それによって癌の進行および転移を阻害する工程を含む方法。
〔４〕細胞接着分子がＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択される、前記〔３〕に記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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