(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において膵臓がんの存在を決定するための方法であって、
ａ）該個体からの試験しようとするサンプルを用意する工程；
ｂ）該試験サンプル中における、ＨＡＤＨ２、ＴＮＦＲＳＦ３、Ｓｏｘ１１Ａ、インテグリンアルファ−１０、ＥＤＦＲ、ＥＰＦＲ、ＬＳＡＤＨＲ、ＳＥＡＨＬＲ、ＡＱＱＨＱＷＤＧＬＬＳＹＱＤＳＬＳ、ＷＴＲＮＳＮＭＮＹＷＬＩＩＲＬ、ＷＤＳＲ、ＤＦＡＥＤＫ、ＦＡＳＮタンパク質、ＧＡＫタンパク質、ＬＮＶＷＧＫ、ＬＴＥＦＡＫ、ＬＹＥＩＡＲ、ＭＡＴＫ、ＯＲＰ−３、ＱＥＡＳＦＫ、ＳＳＡＹＳＲ、ＱＥＡＳＦＫ、ＴＥＥＱＬＫ、ＴＬＹＶＧＫ、ＦＬＬＭＱＹＧＧＭＤＥＨＡＲ、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧ、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧ、及びＫＳＹＫからなる群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定し、ここで該１種またはそれ以上のバイオマーカーはＨＡＤＨ２を含み、かつインターロイキン−４、インターロイキン−６、ルイスｘ、リンフォトキシン−アルファ、血管内皮増殖因子、視覚系ホメオボックス２、アポリポタンパク質Ａ１、補体Ｃ３、補体Ｃ４、補体Ｃ５、サイクリン依存性キナーゼ２、細胞間接着分子１、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１３、ミオメシン−２、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤、プロパージン、及びシアリルルイスｘからなる群から選択される１種またはそれ以上の追加のバイオマーカーの発現を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程；
を含むかまたはからなり、
ここで、工程（ｂ）におけるバイオマーカーの試験サンプル中の発現は、膵臓がんの存在の指標である、上記方法。
【請求項２】
ｃ）膵臓がんに罹っていない個体からの対照サンプルを用意する工程；
ｄ）対照サンプル中における工程（ｂ）で測定されたバイオマーカーの発現を測定することによって、該対照サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程；
をさらに含むかまたはからなり、膵臓がんの存在は、試験サンプル中における工程（ｂ）で測定されたバイオマーカーの発現が、該対照サンプル中における工程（ｄ）で測定されたバイオマーカーの発現と異なっている場合に同定され；
場合により
ｅ）膵臓がんに罹った個体からの対照サンプルを用意する工程；
ｆ）対照サンプル中における工程（ｂ）で測定されたバイオマーカーの発現を測定することによって、該対照サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程
をさらに含むかまたはからなり、膵臓がんの存在は、試験サンプル中における工程（ｂ）で測定された該バイオマーカーの発現が、該対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された該バイオマーカーの発現と一致している場合に同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）は、ＨＡＤＨ２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、ルイスｘ、リンフォトキシン−アルファ、血管内皮増殖因子、視覚系ホメオボックス２、アポリポタンパク質Ａ１、補体Ｃ３、補体Ｃ４、補体Ｃ５、サイクリン依存性キナーゼ２、細胞間接着分子１、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１３、ミオメシン−２、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤、プロパージン、および、シアリルルイスｘの発現を測定することを含むかまたはからなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）は、試験サンプル中における、以下の、ＨＡＤＨ２、ＴＮＦＲＳＦ３、Ｓｏｘ１１Ａ、インテグリンアルファ−１０、ＥＤＦＲ、ＥＰＦＲ、ＬＳＡＤＨＲ、ＳＥＡＨＬＲ、ＡＱＱＨＱＷＤＧＬＬＳＹＱＤＳＬＳ、ＷＴＲＮＳＮＭＮＹＷＬＩＩＲＬ、ＷＤＳＲ、ＤＦＡＥＤＫ、ＦＡＳＮタンパク質、ＧＡＫタンパク質、ＬＮＶＷＧＫ、ＬＴＥＦＡＫ、ＬＹＥＩＡＲ、ＭＡＴＫ、ＯＲＰ−３、ＱＥＡＳＦＫ、ＳＳＡＹＳＲ、ＱＥＡＳＦＫ、ＴＥＥＱＬＫ、ＴＬＹＶＧＫ、ＦＬＬＭＱＹＧＧＭＤＥＨＡＲ、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧ、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧ、ＫＳＹＫ、アンギオモチン、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＬＰ−１、ＩｇＭ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ルイスｘ、ＴＮＦ−ｂ、ＴＧＦ−ｂ１、ＶＥＧＦ、ＣＨＸ１０、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ４、ＬＤＬ、ＡＴＰ−５Ｂ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、プロカテプシンＷ、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−３、ＣＤ４０、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｓ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、因子Ｂ、ＣＤＫ−２、シスタチン−Ｃ、エオタキシン、ＥＧＦＲ、ＧＬＰ−１Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ、インテグリンａ−１１、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ケラチン１９、レプチン、ルミカン、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ８、ＭＵＣ−１、ミオメシン−２、オステオポンチン、Ｐ８５Ａ、Ｃ１阻害剤、プロパージン、ＰＳＡ、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ−２、ＵＰＦ３Ｂ、ＲＰＳ６ＫＡ２、シアリルルイスｘ、ＳＴＡＰ２、ＵＢＣ９、ＴＢＣ１Ｄ９、Ｔｍペプチド、ＴＮＦ-a、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＢＴＫ、ＪＡＫ３、ＰＴＰ−１Ｂ、ＵＣＨＬ５、ＵＢＥ２Ｃ、及びＦＩＱＴＤＫの、全てのバイオマーカーの発現を測定することを含むかまたはからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
膵臓がんは、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、類肝細胞癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞未分化癌からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、前記バイオマーカーに結合することができる第１の結合剤を使用して行われ、ここで、第１の結合剤はそれぞれ、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むかまたはからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１の結合剤は、固体支持体の表面上に固定化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試験サンプルおよび／または対照サンプル中におけるバイオマーカーは、検出可能な部分で標識されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、前記バイオマーカーに結合すること
ができる第２の結合剤を含むアッセイを使用して行われ、第２の結合剤はそれぞれ検出可能な部分を含み、ここで、第２の結合剤はそれぞれ、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むかまたはからなる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）サンプル中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識する工程；
（ｉｉ）該ビオチンで標識されたタンパク質を、アレイの表面上に別々の位置で固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させる工程であって、ｓｃＦｖは表Ａ中のタンパク質の１種またはそれ以上に対する特異性を有する、工程；
（ｉｉｉ）該固定化されたｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジンコンジュゲートと接触させる工程；および
（ｉｖ）該アレイ表面上の別々の位置における該色素の存在を検出する工程
を含み、該アレイ表面上での該色素の発現は、サンプル中における表Ａからのバイオマーカーの発現の指標である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）は、前記バイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）における前記バイオマーカーの発現を測定することは、表Ａで同定されたバイオマーカーの１種をコードする核酸分子にそれぞれ個々に選択的に結合することができる１つまたはそれ以上の結合部分を使用して行われ、ここで１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ核酸分子を含むかまたはからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）で用意されるサンプルは、未分画の血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、膵液、胆汁および尿からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
個体において膵臓がんの存在を決定するための、２種またはそれ以上の結合剤を含む、アレイの使用であって、２種またはそれ以上の結合剤が、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法を実施するよう選択される、使用。
【請求項１５】
個体において膵臓がんの存在を決定するための診断マーカーとしての、ＨＡＤＨ２、並びにインターロイキン−４、インターロイキン−６、ルイスｘ、リンフォトキシン−アルファ、血管内皮増殖因子、視覚系ホメオボックス２、アポリポタンパク質Ａ１、補体Ｃ３、補体Ｃ４、補体Ｃ５、サイクリン依存性キナーゼ２、細胞間接着分子１、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１３、ミオメシン−２、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤、プロパージン、及びシアリルルイスｘからなる群から選択される１種またはそれ以上の追加のバイオマーカーの使用。
【請求項１６】
膵臓がんの存在を決定するためのキットであって：
Ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するよう選択された２種もしくはそれ以上の第１の結合剤または請求項１４に記載のアレイ；
Ｂ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法または請求項１５に記載の使用を行うための説明書
を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓がんを検出するための方法、ならびにそれにおいて使用するためのバイオマーカーおよびアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌、または膵臓がん（ＰＣ）は、４番目に最も一般的ながん関連の死亡原因であり、米国では、１０分の１の低さの発生率にもかかわらず乳がんとほぼ同数の死をもたらす［非特許文献１］。腫瘍発生から転移能の獲得まで５年より長い年数を要することがデータから裏付けられているにもかかわらず、予後不良は主として早期段階でＰＣを検出できないことに起因しており［非特許文献２］、すなわちマーカーが利用可能であれば、早期発見できる絶好の機会があることを明確に示している。現在、がんは、疾患の進行が進んだ状態で検出されることが多く、腫瘍は手術不能であり、すでに転移している［非特許文献１、３］。しかしながら、大きい腫瘍の切除の５年生存率はわずか１０〜２０％であるとしても［非特許文献４、５］、２０ｍｍ未満の腫瘍を切除することができる場合、５年生存率は３０〜６０％に増加し［非特許文献６、７］、切除時のサイズが１０ｍｍ未満である場合、５年生存率は７５％より高く増加する［非特許文献８］。遅い検出は、不特定な臨床症状、加えて早期診断のための高感度ならびに技術およびマーカーの欠如に起因する。興味深いことに、膵臓腫瘍は、無症状期で臨床診断前の６カ月もの早期に切除することが可能であることが研究から示唆されている［非特許文献９、１０］。
【０００３】
ＰＣに関してこれまでに最も評価されたマーカーであるＣＡ１９−９は、膵臓炎や他のがんでも高いレベルであり、ルイスａおよびｂ陰性の腫瘍では全く存在せず、特異度が不十分であるという問題がある。結果として、膵臓がんのスクリーニングのためのＣＡ１９−９の使用は推奨されていない［非特許文献１１］。多くの努力にもかかわらず、ＣＡ１９−９よりも性能が優れている他の単一のバイオマーカーは示されておらず、近年この分野は、感度および特異度を増加させるための多重化マーカーパネルに移行しつつある［非特許文献１２］。パネルは、主として、高度に豊富な血液タンパク質、しばしば急性期反応物質（例えばＣＲＰおよびＳＡＡ）、公知の腫瘍マーカー（例えばＣＡ２４２、ＣＡ１２５およびＣＥＡ）、接着分子（例えばＩＣＡＭ−１およびＡＤＣＡＭ）、細胞外マトリックス分解に関与するタンパク質（例えばＭＭＰおよびＴＩＭＰ１）、リポタンパク質（例えばＡｐｏ−Ｃ１、Ａｐｏ−Ａ２）、および数種の他のものからなっており、ほとんどの場合ＣＡ１９−９と組み合わせられている［非特許文献１３〜１８］。ＰＣと健康な対照または良性の膵臓の状態とに関して感度が高いことが報告されているにもかかわらず、これらのパネルはどれも臨床用途に関して未だ検証されていない。
【０００４】
がんと炎症との関係が解明され続けるにつれて、すでに述べられたマーカーの他にも数種の免疫調節タンパク質が腫瘍バイオマーカーとして興味深いものである可能性がある［非特許文献１９］。多くの免疫調節タンパク質の全身性作用と多数の機能を考慮すると、一般的に、２から５種のマーカーの小さいパネルは、特に膵臓炎および類似の症状を示す他の状態から膵臓がんを識別しようとする場合、膵臓がんに十分に特異的ではないと考えられている。しかしながら、これまでの研究から、これらの分析物の数を増加させること（≦２５）が、疾患に対する全身応答を反映する高度に疾患特異的な免疫シグネチャー（ｉｍｍｕｎｏｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をもたらす可能性があることが示されてきた［非特許文献２０〜２２］。
【０００５】
それにもかかわらず、免疫調節性のプロテオームの分析は、数々の問題を伴う。第１に、目的のタンパク質の血清濃度は、１ｍＬ当たり上はマイクログラムから下はピコグラムまで広いダイナミックレンジを提示し、それが、従来のプロテオーム手法を使用したそれらの同時検出を複雑にしている［非特許文献２３、２４］。第２に、最も量が少ない、しばしば低分子量のタンパク質のなかから有望ながんマーカーが見出される可能性がより高いという意見で一致しているようである［非特許文献２５、２６］。第３に、これらの量が少ない分析物の血清レベルにおける疾患関連の変化は小さいと予想されることから、十分な統計には有意な数の臨床サンプルが必要であると予想される［非特許文献２７］。これらの目的のために、本発明者らは、主として免疫調節タンパク質を標的とするほぼ３００種のｓｃＦｖ抗体を有する高度に多重化された組換え抗体のマイクロアレイを設計した［非特許文献２８］。これらのアレイを用いれば、高度に再現可能なハイスループットの方式で何百ものサンプルにおいてタンパク質発現を測定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｅｌ  Ｒ、Ｎａｉｓｈａｄｈａｍ  Ｄ、Ｊｅｍａｌ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２０１２．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ．２０１２；６２：１０〜２９．
【非特許文献２】Ｙａｃｈｉｄａ  Ｓ、Ｊｏｎｅｓ  Ｓ、Ｂｏｚｉｃ  Ｉ、Ａｎｔａｌ  Ｔ、Ｌｅａｒｙ  Ｒ、Ｆｕ  Ｂ、ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｌａｔｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６７：１１１４〜７．
【非特許文献３】Ｈｉｄａｌｇｏ  Ｍ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１０；３６２：１６０５〜１７．
【非特許文献４】Ｃｏｎｌｏｎ  ＫＣ、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＤＳ、Ｂｒｅｎｎａｎ  ＭＦ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｙｅａｒ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ．１９９６；２２３：２７３〜９．
【非特許文献５】Ｓｏｈｎ  ＴＡ、Ｙｅｏ  ＣＪ、Ｃａｍｅｒｏｎ  ＪＬ、Ｋｏｎｉａｒｉｓ  Ｌ、Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ、Ａｂｒａｍｓ  ＲＡ、ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ−６１６  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ、ｏｕｔｃｏｍｅｓ、ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  Ｔｒａｃｔ．２０００；４：５６７〜７９．
【非特許文献６】Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｈ、Ｏｋａｄａ  Ｓ、Ｓａｉｓｈｏ  Ｈ、Ａｒｉｙａｍａ  Ｊ、Ｋａｒａｓａｗａ  Ｅ、Ｎａｋａｉｚｕｍｉ  Ａ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９６；７８：９８６〜９０．
【非特許文献７】Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ、Ｙａｓｕｉ  Ｋ、Ｍａｔｓｕｅｄａ  Ｋ、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ａ、Ｙａｍａｏ  Ｋ．Ｓｍａｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｉｓ  ｃｕｒａｂｌｅ：ｎｅｗ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｆｉｎｄｉｎｇ、ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５；２０：１５９１〜４．
【非特許文献８】Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｏ、Ｏｈｉｇａｓｈｉ  Ｈ、Ｉｍａｏｋａ  Ｓ、Ｎａｋａｉｚｕｍｉ  Ａ、Ｕｅｈａｒａ  Ｈ、Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ、ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｕｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  １  ｃｍ  ｏｒ  ｌｅｓｓ  ｉｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ−−ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｈｅｐａｔｏ−ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９９；４６：８〜１５．
【非特許文献９】Ｇａｎｇｉ  Ｓ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＪＧ、Ｎａｔｈａｎ  ＭＡ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＡ、Ｈａｒｍｓｅｎ  ＷＳ、Ｃｒｏｗｎｈａｒｔ  ＢＳ、ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｓｅｅｎ  ｏｎ  ＣＴ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＴ  ｓｃａｎｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｅｆｏｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＡＪＲ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ．２００４；１８２：８９７〜９０３．
【非特許文献１０】Ｐｅｌａｅｚ−Ｌｕｎａ  Ｍ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＪＧ、Ｃｈａｒｉ  ＳＴ．Ｒｅｓｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＴ  ｓｃａｎｓ  ａｎｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｖａｌｕｅｓ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００７；１０２：２１５７〜６３．
【非特許文献１１】Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓ、Ｈａｒｒｉｓ  Ｊ、Ｊｅｓｓｕｐ  ＪＭ、Ｋｅｍｅｎｙ  Ｎ、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＪＳ、ｅｔ  ａｌ．ＡＳＣＯ  ２００６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００６；２４：５３１３〜２７．
【非特許文献１２】Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｊ、Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ＣＮ、Ｚｈａｎｇ  Ｚ、Ｃａｎｔｏ  ＭＩ、Ｂｒｏｗｎ  ＤＡ、Ｈｕｎｔｅｒ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １  ｖｅｒｓｕｓ  ＣＡ１９−９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６；１２：４４２〜６．
【非特許文献１３】Ｊｉａｎｇ  ＪＴ、Ｗｕ  ＣＰ、Ｄｅｎｇ  ＨＦ、Ｌｕ  ＭＹ、Ｗｕ  Ｊ、Ｚｈａｎｇ  ＨＹ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ＴＳＧＦ、ＣＡ２４２  ａｎｄ  ＣＡ１９−９  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ：ＷＪＧ．２００４；１０：１６７５〜７．
【非特許文献１４】Ｄｕｒａｋｅｒ  Ｎ、Ｈｏｔ  Ｓ、Ｐｏｌａｔ  Ｙ、Ｈｏｂｅｋ  Ａ、Ｇｅｎｃｌｅｒ  Ｎ、Ｕｒｈａｎ  Ｎ．ＣＥＡ、ＣＡ  １９−９、ａｎｄ  ＣＡ  １２５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｊａｕｎｄｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００７；９５：１４２〜７．
【非特許文献１５】Ｎｉ  ＸＧ、Ｂａｉ  ＸＦ、Ｍａｏ  ＹＬ、Ｓｈａｏ  ＹＦ、Ｗｕ  ＪＸ、Ｓｈａｎ  Ｙ、ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ａｎｄ  ＣＡ２４２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００５；３１：１６４〜９．
【非特許文献１６】Ｆａｃａ  ＶＭ、Ｓｏｎｇ  ＫＳ、Ｗａｎｇ  Ｈ、Ｚｈａｎｇ  Ｑ、Ｋｒａｓｎｏｓｅｌｓｋｙ  ＡＬ、Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＬＦ、ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；５：ｅ１２３．
【非特許文献１７】Ｆｉｒｐｏ  ＭＡ、Ｇａｙ  ＤＺ、Ｇｒａｎｇｅｒ  ＳＲ、Ｓｃａｉｆｅ  ＣＬ、ＤｉＳａｒｉｏ  ＪＡ、Ｂｏｕｃｈｅｒ  ＫＭ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｉｎ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｓｃｒｅｅｎ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ．２００９；３３：７１６〜２２．
【非特許文献１８】Ｏｒｃｈｅｋｏｗｓｋｉ  Ｒ、Ｈａｍｅｌｉｎｃｋ  Ｄ、Ｌｉ  Ｌ、Ｇｌｉｗａ  Ｅ、ｖａｎＢｒｏｃｋｌｉｎ  Ｍ、Ｍａｒｒｅｒｏ  ＪＡ、ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５；６５：１１１９３〜２０２．
【非特許文献１９】Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ＬＭ、Ｗｅｒｂ  Ｚ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４２０：８６０〜７．
【非特許文献２０】Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ、Ｗｕｔｔｇｅ  ＤＭ、Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  Ｊ、Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  ＡＡ、Ｓｔｕｒｆｅｌｔ  Ｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ：ＭＣＰ．２０１１；１０：Ｍ１１０  ００５０３３．
【非特許文献２１】Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  Ｊ、Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ、Ｅｌｌｍａｒｋ  Ｐ、Ｗａｈｒｅｎ  Ｂ、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ  Ｇ、ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００８；８：２２１１〜９．
【非特許文献２２】Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ａ、Ｓｅｇｅｒｓｖａｒｄ  Ｒ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｒ、Ｌｏｈｒ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；７２：２４８１〜９０．
【非特許文献２３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＮＬ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＮＧ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ、ｃｈａｒａｃｔｅｒ、ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ：ＭＣＰ．２００２；１：８４５〜６７．
【非特許文献２４】Ｚｈａｎｇ  Ｈ、Ｌｉｕ  ＡＹ、Ｌｏｒｉａｕｘ  Ｐ、Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ  Ｂ、Ｚｈｏｕ  Ｙ、Ｗａｔｔｓ  ＪＤ、ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ：ＭＣＰ．２００７；６：６４〜７１．
【非特許文献２５】Ｓｕｒｉｎｏｖａ  Ｓ、Ｓｃｈｉｅｓｓ  Ｒ、Ｈｕｔｔｅｎｈａｉｎ  Ｒ、Ｃｅｒｃｉｅｌｌｏ  Ｆ、Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ  Ｂ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；１０：５〜１６．
【非特許文献２６】Ｈａａｂ  ＢＢ、Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ  ＢＨ、Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｇ、Ｖｉｔｚｔｈｕｍ  Ｆ、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ  Ｓ、Ｏｋｏｎ  Ｒ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＵＰＯ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓａｍｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｄａｔａ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００５；５：３２７８〜９１．
【非特許文献２７】Ａｌｏｎｚｏ  ＴＡ、Ｐｅｐｅ  ＭＳ、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  ＣＳ．Ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００２；２１：８３５〜５２．
【非特許文献２８】Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ、Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｋｅｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００９；７２：９２８〜３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この多施設研究において、膵臓がん、良性の膵臓疾患を有する患者、加えて正常対照からの３３８人分の血清サンプルを、本発明者らの社内で設計された抗体マイクロアレイで分析した。最も識別力のあるマーカーシグネチャーを規定するために、本発明者らは、サポートベクターマシン分析に基づき、抗体の最適な組合せを予測するように設計された繰り返しの後退消去（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）手順を適用した［３１］。この目的を達成するために、独立した試験セットで前もって検証され、示差的なタンパク質発現の分析から導き出されたシグネチャーと比較されたトレーニングセットにおいて、良性および健康な対照からＰＣを識別するための２５プレックスの免疫シグネチャーを同定した。加えて、タンパク質プロファイリングを適用して、膵臓における腫瘍の元の位置に基づき血清サンプルを階層化することが可能になり、これは、本発明者らが知る限りにおいてこれまでプロテオミクスを用いてなされていなかった。総合すると、これらの発見は、膵臓がんのプロテオームの難題に重要な情報を追加し、それにより最終的に多重化バイオマーカーがもたらされ、何千もの患者にとっての利益が提供される可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の第１の態様は、個体において膵臓がんを検出するための方法であって、
ａ）個体からの試験しようとするサンプルを用意する工程；
ｂ）試験サンプル中における表Ａ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で規定された群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程
を含むかまたはからなり、試験サンプル中における表Ａ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で規定された群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、膵臓がんの存在の指標である前記方法を提供する。
【０００９】
「試験しようとするサンプル」、「試験サンプル」または「対照サンプル」には、個体から採取されたまたは得られた組織または流体サンプルが包含される。好ましくは、試験しようとするサンプルは、哺乳動物から提供される。哺乳動物は、あらゆる家畜または畜産動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。好ましくは、サンプルは、血漿、形質細胞、血清、組織細胞を含むかもしくはからなる細胞もしくは組織サンプル（またはそれらの派生物）であるか、または細胞もしくは組織サンプルから得られたタンパク質もしくは核酸も同等に好ましい。好ましくは、試験および対照サンプルは、同じ種から得られる。
【００１０】
代替または追加の実施形態において、組織サンプルは、膵臓組織である。代替または追加の実施形態において、細胞サンプルは、膵臓細胞のサンプルである。
【００１１】
「発現」とは、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの遺伝子産物のレベルまたは量を意味する。
【００１２】
タンパク質および／または核酸の濃度を検出および／または測定する方法は当業者周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００１３】
「バイオマーカー」とは、天然に存在する生体分子、またはその成分もしくはフラグメントを意味し、それらの測定は、膵臓がんの予後予測において有用な情報を提供することができる。例えば、バイオマーカーは、天然に存在するタンパク質もしくは炭水化物部分、またはそれらの抗原性の成分もしくはフラグメントであり得る。
【００１４】
代替または追加の実施形態において、本方法は、工程（ａ）および（ｂ）、ならびにさらなる工程：
ｃ）膵臓がんに罹っていない個体からの１つまたはそれ以上の対照サンプルを用意する工程；
ｄ）対照サンプル中における工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することによって、対照サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程
を含むかまたはからなり、膵臓がんの存在は、試験サンプル中における工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｄ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現と異なっている場合に同定される。
【００１５】
１つまたはそれ以上の対照サンプルは、健康な個体（すなわち、いかなる疾患もしくは状態にも罹っていない個体）、膵臓系ではない疾患もしくは状態に罹った個体、または良性の膵臓疾患もしくは状態（例えば、急性もしくは慢性膵臓炎）に罹った個体からのものであり得る。
【００１６】
別の実施形態において、本方法は、工程（ａ）および（ｂ）、ならびに場合により工程（ｃ）および（ｄ）、ならびに追加の工程：
ｅ）膵臓がんに罹った個体からの１つまたはそれ以上の対照サンプルを用意する工程；
ｆ）対照サンプル中における工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することによって、対照サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程
を含むかまたはからなり、膵臓がんの存在は、試験サンプル中における工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現と一致している場合に同定される。
【００１７】
代替または追加の実施形態において、１つまたはそれ以上の陽性または陰性対照の代わりに、またはそれに加えて、標準または参照値が使用される。従って、標準または参照値は、別々の手順で試験値から決定することができる。
【００１８】
代替または追加の実施形態において、本方法は、（ｉ）膵頭または（ｉｉ）膵体もしくは膵尾に由来する膵臓がんの存在を決定するための方法である。この実施形態において、工程（ｅ）は、（ｉ）膵頭に由来する膵臓がんに罹った個体からの１つもしくはそれ以上の対照サンプルを用意する工程、および／または（ｉｉ）膵体もしくは膵尾に由来する膵臓がんに罹った個体からの１つもしくはそれ以上の対照サンプルを用意する工程を含んでいてもよい。
【００１９】
この実施形態において、膵頭に由来する膵臓がんの存在は、（ｅ）（ｉ）の試験サンプル（存在する場合）中における工程（ｂ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された１種もしくそれ以上のバイオマーカーの発現と一致している場合、および／または（ｅ）（ｉｉ）の試験サンプル（存在する場合）中における工程（ｂ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された１種もしくそれ以上のバイオマーカーの発現と異なっている場合に同定される。
【００２０】
この実施形態において、膵体または膵尾に由来する膵臓がんの存在は、（ｅ）（ｉ）の試験サンプル（存在する場合）中における工程（ｂ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現と異なっている場合、および／または（ｅ）（ｉｉ）の試験サンプル（存在する場合）中における工程（ｂ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現が、対照サンプル中における工程（ｆ）で測定された１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現と一致している場合に同定される。
【００２１】
「対照サンプル中における発現に一致している」は、試験しようとするサンプル中における１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現が、陽性対照サンプルの１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現と同じであるかまたは類似していることを包含する。好ましくは、試験しようとするサンプル中における１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、陽性対照サンプルの１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現と同一である。
【００２２】
バイオマーカーの示差的発現（上方調節または下方調節）、またはそれらの欠如は、当業者公知のあらゆる好適な手段によって決定することができる。示差的発現は、少なくとも０．０５未満のｐ値（ｐ＝＜０．０５）まで、例えば、少なくとも＜０．０４、＜０．０３、＜０．０２、＜０．０１、＜０．００９、＜０．００５、＜０．００１、＜０．０００１、＜０．００００１または少なくとも＜０．０００００１のｐ値まで決定される。好ましくは、示差的発現は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して決定される。好ましくは、ＳＶＭは、後述されるＳＶＭである。最も好ましくは、ＳＶＭは、以下の表Ｂに記載されているＳＶＭである。
【００２３】
示差的発現は、組み合わせて（すなわちバイオマーカーシグネチャーとして）検討される単一のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーに関するものであり得ることが当業者には理解されるものと予想される。従って、ｐ値は、単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーの群に関連するものであり得る。実際には、個々に検討した場合に０．０５より大きい示差的発現のｐ値を有するタンパク質でも、それらの発現レベルが１種またはそれ以上の他のバイオマーカーと組み合わせて検討される場合、本発明に係るバイオマーカーとしてなお有用である可能性がある。
【００２４】
添付の実施例で例示されるように、組織、血液、血清または血漿試験サンプル中におけるある特定のタンパク質の発現は、個体における膵臓がんの指標であり得る。例えば、単一の試験サンプル中におけるある特定の血清タンパク質の相対的発現は、個体における膵臓がんの存在の指標であり得る。
【００２５】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。工程（ｂ）は、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーのそれぞれ、例えば表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００２６】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００２７】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００２８】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２、２３または２４種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００２９】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｖ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｖ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５６種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｖ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００３０】
工程（ｂ）は、表Ａ（ｖｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｖｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００３１】
工程（ｂ）は、表Ａに列挙されたバイオマーカーからの１種またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａに列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１１０種の発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。従って、工程（ｂ）は、表Ａに列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００３２】
本方法が膵臓腺癌の存在を決定するためのものである場合、工程（ｂ）は、好ましくは：
表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２種；
表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８もしくは９種；
表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７種；
表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４種；および／または
表Ａ（ｖ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｖ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５もしくは５６種
の発現を測定することを含むかまたはからなり、
表Ａ（ｖｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含むかまたはからなり；従って、工程（ｂ）は、表Ａ（ｖｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００３３】
本方法が（ｉ）膵頭または（ｉｉ）膵体もしくは膵尾に由来する膵臓腺癌の存在を決定するためのものである場合、工程（ｂ）は、好ましくは：
表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８もしくは９種；
表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーからの１種もしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表Ａ（ｉｖ）に列挙されたバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４種；および／または
表Ａ（ｖｉ）に列挙された１種もしくはそれ以上のバイオマーカー
の発現を測定することを含むかまたはからなる。
【００３４】
「正常な」病状と述べる場合、慢性膵臓炎（ＣｈＰ）または急性炎症性膵臓炎（ＡＩＰ）に罹っていない個体が包含される。好ましくは、個体は、いかなる膵臓疾患または障害にも罹っていない。最も好ましくは、個体は健康な個体であり、すなわち彼等は、いかなる疾患または障害にも罹っていない。
【００３５】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、転写因子ＳＯＸ−１１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インテグリンアルファ−１０の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＥＤＦＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＥＰＦＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＳＡＤＨＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＥＡＨＬＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＡＱＱＨＱＷＤＧＬＬＳＹＱＤＳＬＳの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＷＴＲＮＳＮＭＮＹＷＬＩＩＲＬの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＷＤＳＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＤＦＡＥＤＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＡＳＮタンパク質の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＡＫタンパク質の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＨＡＤＨ２タンパク質の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＮＶＷＧＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＴＥＦＡＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＹＥＩＡＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、巨核球関連チロシン−プロテインキナーゼの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、オキシステロール結合タンパク質関連タンパク質３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＱＥＡＳＦＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＳＡＹＳＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＱＥＡＳＦＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＥＥＱＬＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＬＹＶＧＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＬＬＭＱＹＧＧＭＤＥＨＡＲの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＳＹＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アンギオモチンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＣＤ４０リガンドの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、グルカゴン様ペプチド−１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｌｉｎ）Ｍの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１アルファの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１６の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１８の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−４の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−６の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−７の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−９の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ルイスｘの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、リンフォトキシン−アルファの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ−１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、血管内皮増殖因子の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、視覚系ホメオボックス（Ｖｉｓｕａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ａ１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ａ４の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ｂ−１００の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ミトコンドリアのＡＴＰシンターゼサブユニットベータの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ベータ−ガラクトシダーゼの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、カテプシンＷの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン７の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＣＤ４０タンパク質の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ１ｑの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ１ｓの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ４の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ５の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体因子Ｂの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、サイクリン依存性キナーゼ２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シスタチン−Ｃの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、エオタキシンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、上皮増殖因子受容体の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、グルカゴン様ペプチド１受容体の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追��の実施形態において、工程（ｂ）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インテグリンアルファ−１１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、細胞間接着分子１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターフェロンガンマの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１ベータの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１０の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−５の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−８の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ケラチン、Ｉ型細胞骨格１９の発現を測定することを含むかまたはからなる。
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、レプチンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ルミカンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ムチン−１の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ミオメシン−２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、
オステオポンチンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ調節サブユニットアルファの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、プロパージンの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、前立腺特異的抗原の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ−２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ナンセンス転写物３Ｂのレギュレーターの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼアルファ−２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シアリルルイスｘの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シグナル伝達アダプタータンパク質２の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＵＭＯコンジュゲート酵素ＵＢＣ９の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー９の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、膜貫通ペプチドの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子アルファの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＢＴＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＪＡＫ３の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体１型の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ５の発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ユビキチンコンジュゲート酵素Ｅ２Ｃの発現を測定することを含むかまたはからなる。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＩＱＴＤＫの発現を測定することを含むかまたはからなる。
【００３６】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、転写因子ＳＯＸ−１１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インテグリンアルファ−１０の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＥＤＦＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＥＰＦＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＳＡＤＨＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＥＡＨＬＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＡＱＱＨＱＷＤＧＬＬＳＹＱＤＳＬＳの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＷＴＲＮＳＮＭＮＹＷＬＩＩＲＬの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＷＤＳＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＤＦＡＥＤＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＡＳＮタンパク質の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＡＫタンパク質の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＨＡＤＨ２タンパク質の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＮＶＷＧＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＴＥＦＡＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＬＹＥＩＡＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、巨核球関連チロシン−プロテインキナーゼの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、オキシステロール結合タンパク質関連タンパク質３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＱＥＡＳＦＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＳＡＹＳＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＱＥＡＳＦＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＥＥＱＬＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＬＹＶＧＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＬＬＭＱＹＧＧＭＤＥＨＡＲの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＧＩＶＫＹＬＹＥＤＥＧの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＳＹＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アンギオモチンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＣＤ４０リガンドの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、グルカゴン様ペプチド−１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、免疫グロブリンＭの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１アルファの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１６の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１８の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−４の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−６の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−７の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−９の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ルイスｘの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、リンフォトキシン−アルファの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ−１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、血管内皮増殖因子の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、視覚系ホメオボックス２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ａ１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ａ４の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、アポリポタンパク質Ｂ−１００の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ミトコンドリアのＡＴＰシンターゼサブユニットベータの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ベータ−ガラクトシダーゼの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、カテプシンＷの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン７の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＣＤ４０タンパク質の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ１ｑの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ１ｓの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ４の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体Ｃ５の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、補体因子Ｂの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、サイクリン依存性キナーゼ２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シスタチン−Ｃの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、エオタキシンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、上皮増殖因子受容体の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、グルカゴン様ペプチド１受容体の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インテグリンアルファ−１１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、細胞間接着分子１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターフェロンガンマの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１ベータの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１０の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−１３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−５の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、インターロイキン−８の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ケラチン、Ｉ型細胞骨格１９の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、レプチンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ルミカンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ムチン−１の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ミオメシン−２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、オステオポンチンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ調節サブユニットアルファの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、プロパージンの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、前立腺特異的抗原の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ−２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ナンセンス転写物３Ｂのレギュレーターの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼアルファ−２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シアリルルイスｘの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、シグナル伝達アダプタータンパク質２の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＳＵＭＯコンジュゲート酵素ＵＢＣ９の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー９の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、膜貫通ペプチドの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子アルファの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＢＴＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−プロテインキナーゼＪＡＫ３の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、チロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体１型の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ５の発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ユビキチンコンジュゲート酵素Ｅ２Ｃの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）は、ＦＩＱＴＤＫの発現を測定することを含まないかまたはそれからなっていない。
【００３７】
「膜貫通ペプチド」または「ＴＭペプチド」とは、以下の配列番号１のｓｃＦｖ抗体コンストラクトが特異性を有する１０ＴＭタンパク質から誘導されたペプチドを意味する（ここでＣＤＲ配列は、太字、イタリック体で提示される）：
【化１】
0006600637.tif 000002
【００３８】
従って、このｓｃＦｖ、または１０ＴＭタンパク質への結合に関してこのｓｃＦｖと競合するあらゆる抗体、もしくはそれらの抗原結合フラグメントを使用することができる。例えば、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１中に存在するものと同じＣＤＲを含んでいてもよい。
【００３９】
このような抗体は、精製目的で（例えばＣ末端に）親和性タグを含めて生産することができることが当業者には理解されるものと予想される。例えば、以下の配列番号２の親和性タグを利用してもよい：
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ
［配列番号２］
【００４０】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーは：
アンギオモチン、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ４、ＡＴＰ−５Ｂ、ＢＴＫ、Ｃ１ｉｎｈ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、シスタチンＣ、エオタキシン、因子Ｂ、ＧＡＫ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＡＤＨ２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＫＳＹＫ−１、ＬＤＬ、ＭＡＰＫ１、ＭＣＰ−１、ＰＴＰ−１Ｂ、シアリルルイスｘ、Ｓｏｘ１１Ａ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＵＣＨＬ５およびＵＰＦ３Ｂ
からなる群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーを含むかまたはからなる。
【００４１】
この実施形態において、本方法は、膵臓がん（ＰＣ）と、非膵臓がん（ＮＣ）および／または良性の膵臓状態（ＢＣ）とを識別するためのものであり得る。
【００４２】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーは：
アンギオモチン、ＡＴＰ−５Ｂ、Ｃ１ｉｎｈ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ５、ＣＤ４０、シスタチンＣ、エオタキシン、因子Ｂ、ＧＡＫ、ＨＡＤＨ２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＬＤＬおよびＴＮＦ−アルファ
からなる群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーを含むかまたはからなる。
【００４３】
この実施形態において、本方法は、膵臓がん（ＰＣ）と、非膵臓がん（ＮＣ）とを識別するためのものであり得る。
【００４４】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーは：
Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ４、ＢＴＫ、Ｃ１ｉｎｈ、Ｃ５、ＣＤ４０Ｌ、ＣＩＭＳ、因子Ｂ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＡＤＨ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＫＳＹＫ−１、ＭＡＰＫ１、ＭＣＰ−１、ＰＴＰ−１Ｂ、シアリルルイスｘ、Ｓｏｘ１１Ａ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＮＦＲＳＦ３、ＵＣＨＬ５およびＵＰＦ３Ｂ
からなる群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーを含むかまたはからなる。
【００４５】
この実施形態において、本方法は、膵臓がん（ＰＣ）と、良性の膵臓状態（ＢＣ）とを識別するためのものであり得る。
【００４６】
代替または追加の実施形態において、本方法は、工程（ａ）および（ｂ）、場合により、工程（ｃ）および（ｄ）、場合により、工程（ｅ）および（ｆ）、ならびに追加の工程：
ｇ）工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現に基づき、膵臓がんの存在を決定する工程
を含むかまたはからなる。
【００４７】
代替または追加の実施形態は、表２で同定された傾向（上方または下方調節）に基づいている。
【００４８】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）、および存在する場合、工程（ｄ）および（ｆ）は、例えば以下で定義される第１の結合部分のような、工程（ｂ）で測定された１種またはそれ以上のバイオマーカーに関する結合部分と、試験しようとするサンプルを接触させることによって行われる。
【００４９】
代替または追加の実施形態において、本方法は、表３に列挙されたバイオマーカーの使用を含むかまたはからなる。
【００５０】
一般的に、診断は、少なくとも０．５５のＲＯＣ  ＡＵＣ、例えば、少なくとも、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９のＲＯＣ  ＡＵＣ、または１．００のＲＯＣ  ＡＵＣを用いてなされる。好ましくは、診断は、少なくとも０．８５のＲＯＣ  ＡＵＣ、最も好ましくは１のＲＯＣ  ＡＵＣを用いてなされる。
【００５１】
典型的には、診断は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、例えばｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（例えばｅ１０７１  １．５−２４）より入手可能なものを使用して行われる。しかしながら、他のあらゆる好適な手段を使用することもできる。
【００５２】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰のために使用される関連する教師付き学習方法のセットである。トレーニング例のセットがそれぞれ２つのカテゴリーのうち１つに属するとマークされていると仮定すると、ＳＶＭトレーニングアルゴリズムは、新しい例が一方のカテゴリーに分類されるのか、または他方のカテゴリーに分類されるのかを予測するモデルを構築する。直覚的に、ＳＶＭモデルは、別個のカテゴリーの例が可能な限り広い明確なギャップによって分割されるようにマッピングされた空間中のポイントとしての例の表示である。次いで新しい例は、その同じ空間にマッピングされ、それらがギャップのどちら側に行き当たるのかに基づくカテゴリーに属すると予測される。
【００５３】
より形式的には、サポートベクターマシンは、高次元または無限次元の空間における超平面または超平面のセットを構築し、これは、分類、回帰または他のタスクに使用することができる。直覚的に、一般的にマージンが大きいほど分類装置の汎化誤差がより低くなることから、優れた分離は、いずれかのクラスの最短のトレーニングデータポイントに対する最も大きい距離（いわゆる関数マージン）を有する超平面によって達成される。ＳＶＭに関するより多くの情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ、１９９８、Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２：１２１〜１６７を参照されたい。
【００５４】
本発明の代替または追加の実施形態において、疾患の状態がわかっている個体（例えば、膵臓がんを有することがわかっている個体、急性炎症性膵臓炎を有することがわかっている個体、慢性膵臓炎を有することがわかっている個体または健康であることがわかっている個体）からのバイオマーカープロファイルを使用して本発明の方法を行う前に、ＳＶＭは「トレーニングされる」。このようなトレーニングサンプルを試行することにより、ＳＶＭは、どのようなバイオマーカープロファイルが膵臓がんと関連があるのかを学習することができる。トレーニングプロセスが完了したら、ＳＶＭは、試験されたバイオマーカーサンプルが膵臓がんを有する個体からのものかどうかが可能になる。
【００５５】
しかしながら、このトレーニング手順は、必要なトレーニングパラメーターを用いてＳＶＭを事前にプログラミングすることによって回避することができる。例えば、診断は、表Ａに列挙されたバイオマーカーのいずれかまたは全ての測定に基づいて、表Ｂで詳述されるＳＶＭアルゴリズムを使用する公知のＳＶＭパラメーターに従い行うことができる。
【００５６】
好適なＳＶＭパラメーターは、データ（すなわち膵臓がんの状態がわかっている個体からのバイオマーカー測定値）の適切な選択を用いてＳＶＭマシンをトレーニングすることによって、表Ａに列挙されたバイオマーカーのあらゆる組合せごとに決定できることが、当業者には理解されるものと予想される。その代わりに、表２および３のデータは、当業界において公知の他のあらゆる好適な統計的方法に従って特定の膵臓がん関連の病状を決定するのに使用される場合もある。
【００５７】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の精度、例えば６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の精度を有する。
【００５８】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の感度、例えば６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の感度を有する。
【００５９】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の特異度、例えば６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の特異度を有する。
【００６０】
「精度」とは、方法の正しい結果の比率を意味し、「感度」とは、正確に陽性と分類される全てのＰａＣ陽性サンプルの比率を意味し、「特異度」とは、正確に陰性と分類される全てのＰａＣ陰性サンプルの比率を意味する。
【００６１】
代替または追加の実施形態において、膵臓がんに罹っていない個体は、膵臓がん（ＰａＣ）、慢性膵臓炎（ＣｈＰ）または急性炎症性膵臓炎（ＡＩＰ）に罹っていない。より好ましくは、健康な個体は、いかなる膵臓疾患または状態にも罹っていない。さらにより好ましくは、膵臓がんに罹っていない個体は、いかなる疾患または状態にも罹っていない。最も好ましくは、膵臓がんに罹っていない個体は、健康な個体である。「健康な個体」は、当業者によって、身体的に丈夫であり身体的な疾患がないとみなされる個体を包含する。
【００６２】
しかしながら、別の実施形態において、膵臓がんに罹っていない個体は、慢性膵臓炎に罹っている。さらに別の実施形態において、膵臓がんに罹っていない個体は、急性炎症性膵臓炎に罹っている。
【００６３】
上述したように、本発明の方法は、個体において膵臓がんの存在を決定するためのものである。代替または追加の実施形態において、膵臓がんは、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、類肝細胞癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞未分化癌からなる群から選択される。好ましくは、膵臓がんは、膵臓腺癌である。より好ましくは、膵臓がんは、外分泌膵臓がんとしても知られている膵管腺癌である。
【００６４】
さらなる実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、１種またはそれ以上のバイオマーカーに結合することができる第１の結合剤を使用して（すなわち、１種またはそれ以上の第１の結合剤を使用することであり、ここで各結合剤は、１種またはそれ以上のバイオマーカーの１種に特異的に結合することができる）行われる。第１の結合剤は、タンパク質バイオマーカーの１種に特異性を有する単一の種、またはそれぞれ異なるタンパク質バイオマーカーに特異性を有する複数の異なる種を含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよいことが、当業者には理解されるものと予想される。
【００６５】
好適な結合剤（また、結合分子とも称される）は、以下で論じられるように、所与のモチーフと結合するそれらの能力に基づいてライブラリーから選択することができる。
【００６６】
結合剤の少なくとも１つのタイプ、より典型的には全てのタイプは、抗体もしくはその抗体の抗原結合フラグメント、またはそれらのバリアントを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００６７】
抗体を生産および使用するための方法は当業界において周知であり、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８８、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９３１４５、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９９８、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９５４４６、ならびにＭａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２００６、ＨｏｗａｒｄおよびＫａｓｅｒ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３３５２８０を参照されたい（これらの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００６８】
従って、フラグメントは、可変重鎖（ＶＨ）または可変軽鎖（ＶＬ）ドメインの１つまたはそれ以上を含んでいてもよい 。例えば、抗体フラグメントという用語は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０、１０３８）；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２、４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、５８７９）ならびに分離したＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４）を包含する。
【００６９】
用語「抗体バリアント」は、あらゆる合成抗体、組換え抗体または抗体ハイブリッド、例えば、これらに限定されないが、免疫グロブリン軽鎖および／もしくは重鎖可変ならびに／もしくは定常領域のファージディスプレイによって生産された単鎖抗体分子、または当業者公知のイムノアッセイフォーマットで抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子を包含する。
【００７０】
それらの特異的な結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総論は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、２９３〜２９９で見出すことができる。
【００７１】
分子ライブラリー、例えば抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、６２４〜６２８；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２（３）：５８１〜９７）、ペプチドライブラリー（Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８（４７０５）：１３１５〜７）、発現されたｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｔｉら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６（２）：４９７〜５０８）、アフィボディなどの抗体フレームワーク以外の他の足場上のライブラリー（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５（９）：４１３４〜４０）またはアプタマーをベースとしたライブラリー（Ｋｅｎａｎら、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８、２１７〜３１）が、本発明の方法で使用するための所与のモチーフに特異的な結合分子が選択される源として使用される可能性がある。
【００７２】
分子ライブラリーを、インビボにおいて原核細胞（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前掲書中；Ｍａｒｋｓら、１９９１、前掲書中）もしくは真核細胞（Ｋｉｅｋｅら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１０）：５６５１〜６）で発現してもよいし、またはインビトロにおいて細胞を関与させずに発現してもよい（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１０）：４９３７〜４２；ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（２４）：５１３２〜４；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４１４（２）：４０５〜８）。
【００７３】
タンパク質ベースのライブラリーが使用されるケースにおいて、しばしば可能性のある結合分子のライブラリーをコードする遺伝子は、ウイルス中にパッケージ化され、可能性のある結合分子は、ウイルス表面に提示される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前掲書中；Ｍａｒｋｓら、１９９１、前掲書中；Ｓｍｉｔｈ、１９８５、前掲書中）。
【００７４】
今日最も一般的に使用されるこのようなシステムは、それらの表面に抗体フラグメントを提示する糸状バクテリオファージであり、抗体フラグメントは、バクテリオファージのマイナーコートタンパク質への融合体として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前掲書中；Ｍａｒｋｓら、１９９１、前掲書中）。しかしながら、他のウイルス（ＥＰ３９５７８）、細菌（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、前掲書中；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（９）：８２５〜３２；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（７）：６１３〜２１）、および酵母（Ｓｈｕｓｔａら、１９９９、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９２（５）：９４９〜５６）を使用するディスプレイのための他のシステムも使用されている。
【００７５】
加えて、いわゆるリボソームディスプレイシステムでポリペプチド産物のそのコード化ｍＲＮＡへの連結（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、前掲書中；ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、１９９７、前掲書中；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、前掲書中）、またはその代わりにポリペプチド産物のコード化ＤＮＡへの連結（米国特許第５，８５６，０９０号およびＷＯ９８／３７１８６を参照）を利用するディスプレイシステムが開発されている。
【００７６】
可能性のある結合分子がライブラリーから選択される場合、通常、規定されたモチーフを有する１つまたは少数のセレクターペプチドが採用される。セレクターペプチドに関するモチーフの設計において、ペプチド中のフレキシビリティーを減少させる構造をもたらすアミノ酸残基、または結合分子との相互作用を可能にする荷電、極性もしくは疎水性側鎖が使用される可能性がある。
【００７７】
例えば：
（ｉ）プロリンは、その側鎖がアルファ炭素と窒素との両方に結合しているため、ペプチド構造を安定化する可能性がある；
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、高度に疎水性であり、それに対してロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、疎水性でもある；
（ｉｉｉ）リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性ｐＨで正電荷を有すると予想され、それに対してアスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、中性ｐＨで負電荷を有すると予想される；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミンは、中性ｐＨで中性であるが、水素結合に参加する可能性があるアミド基を含む；
（ｖ）セリン、スレオニンおよびチロシン側鎖は、水素結合に参加する可能性があるヒドロキシル基を含む。
【００７８】
典型的には、結合剤の選択は、様々な結合分子に対応するスポットへの結合を分析するためのアレイ技術およびシステムの使用を含んでいてもよい。
【００７９】
代替または追加の実施形態において、第１の結合剤は、表面上に（例えばマルチウェルプレートまたはアレイ上に）固定化されている。
【００８０】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与し、これは初期のプロテアーゼ消化実験で初めて認識された事実である。げっ歯類抗体の「ヒト化」によってさらなる確証が得られた。結果生じる抗体が親のげっ歯類抗体の抗原特異性を保持するように、げっ歯類由来の可変ドメインをヒト由来の定常ドメインに融合してもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、６８５１〜６８５５）。
【００８１】
抗原特異性が可変ドメインによって付与されたものであり定常ドメインとは無関係であることは、全て１つまたはそれ以上の可変ドメインを含む抗体フラグメントの細菌発現を含む実験から公知である。これらの分子としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０、１０３８）；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２、４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、５８７９）ならびに分離したＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４）が挙げられる。それらの特異的な結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総論は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、２９３〜２９９で見出すことができる。
【００８２】
「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。
【００８３】
抗体全体よりも抗体フラグメントを使用することの利点は、何倍もある。フラグメントのより小さいサイズは、薬理学的特性の改善、例えばより優れた固形組織の浸透性をもたらす可能性がある。抗体全体のエフェクター機能、例えば補体結合は取り除かれる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントはいずれも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させてそれから分泌させることができるため、前記フラグメントの容易な大量生産が可能になる。
【００８４】
抗体全体、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「２価」である。「２価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが２つの抗原の結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは１価であり、１つのみの抗原の結合部位を有する。
【００８５】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好適なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、いずれも参照によって本明細書に組み入れられる「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２）で開示された技術によって調製することができる。
【００８６】
代替または追加の実施形態において、第１の結合剤は、表面上に（例えばマルチウェルプレートまたはアレイ上に）固定化されている。
【００８７】
抗体全体よりも抗体フラグメントを使用することの利点は、何倍もある。フラグメントのより小さいサイズは、薬理学的特性の改善、例えばより優れた固形組織の浸透性をもたらす可能性がある。抗体全体のエフェクター機能、例えば補体結合は取り除かれる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントはいずれも、大腸菌で発現させてそれから分泌させることができるため、前記フラグメントの容易な大量生産が可能になる。
【００８８】
抗体全体、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「２価」である。「２価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが２つの抗原の結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは１価であり、１つのみの抗原の結合部位を有する。
【００８９】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好適なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、いずれも参照によって本明細書に組み入れられる「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２）で開示された技術によって調製することができる。
【００９０】
従って、第１の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン分子のｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および結合ドメインからなる群から選択することができる。
【００９１】
第１の結合剤を表面上に固定化してもよい。
【００９２】
試験サンプル中における１種またはそれ以上のバイオマーカーを、検出可能な部分で標識してもよい。
【００９３】
「検出可能な部分」は、その部分が検出可能な部分であり、その部分の相対量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）が決定されるという意味を包含する。
【００９４】
好適な検出可能な部分は当業界において周知である。
【００９５】
従って、検出可能な部分は、特定の条件に晒されると検出することができる蛍光性および／または発光性および／または化学発光性の部分であり得る。例えば、蛍光性の部分は、蛍光性の部分の励起を引き起こすために、放射線（すなわち光）に特定の波長および強度で晒されることが必要な場合があり、それによって、検出することができる特定の波長でその部分が検出可能な蛍光を放出することが可能になる。
【００９６】
その代わりに、検出可能な部分は、（好ましくは検出不可能な）基質を可視化および／または検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であり得る。好適な酵素の例は、以下において、例えばＥＬＩＳＡアッセイに関してより詳細に論じられる。
【００９７】
その代わりに、検出可能な部分は、イメージングにおいて有用な放射性原子であり得る。好適な放射性原子としては、シンチグラフィーによる研究の場合、９９ｍＴｃおよび１２３Ｉが挙げられる。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、ここでも１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のためのスピン標識が挙げられる。明らかに、検出しようとする作用物質（例えば、本明細書で説明される試験サンプルおよび／もしくは対照サンプル中における１種またはそれ以上のバイオマーカー、ならびに／または選択されたタンパク質の検出で使用するための抗体分子など）は、検出可能な部分を容易に検出可能にするために十分な適切な原子同位体を有していなければならない。
【００９８】
放射性または他の標識は、本発明の作用物質（すなわち本発明の方法のサンプルおよび／または本発明の結合剤中に存在するタンパク質）に公知の方法で取り入れることができる。例えば、結合部分がポリペプチドである場合、結合部分を生合成してもよいし、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成によって合成してもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、結合部分中でシステイン残基を介して接続させることができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して接続させることができる。１２３Ｉを取り入れるためには、ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９〜５７）を使用することができる。他の方法は、参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」、Ｊ−Ｆ  Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）で詳細に説明されている。他の検出可能な部分（例えば酵素的、蛍光性、発光性、化学発光性または放射性の部分）をタンパク質にコンジュゲートするための方法が当業界において周知である。
【００９９】
好ましくは、対照サンプル中における１種またはそれ以上のバイオマーカーは、検出可能な部分で標識されている。検出可能な部分は、蛍光性の部分；発光性の部分；化学発光性の部分；放射性の部分；酵素的な部分からなる群から選択することができる。しかしながら、検出可能な部分は、ビオチンであることが好ましい。
【０１００】
追加の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、１種またはそれ以上のバイオマーカーに結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを使用して行われ、第２の結合剤は検出可能な部分を含む。好ましくは、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むかまたはからなる。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。最も好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン分子のｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび結合ドメインからなる群から選択される。代替または追加の実施形態において、検出可能な部分は、蛍光性の部分；発光性の部分；化学発光性の部分；放射性の部分および酵素的な部分からなる群から選択される。好ましくは、検出可能な部分は、蛍光性の部分（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えばＡｌｅｘａ６４７）である。
【０１０１】
代替または追加の実施形態において、本発明の第１の態様の方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）を含むかまたはからなる。
【０１０２】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）、例えばモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイなどが挙げられる。例示的なサンドイッチアッセイは、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号でＤａｖｉｄらにより説明されている。当業者周知のように、細胞学実験の診断試験において周知の方法では、スライド上の細胞の抗体染色を使用する場合もある。
【０１０３】
典型的には、アッセイは、通常固相アッセイで着色された反応生成物を生じる酵素の使用を典型的に含むＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）である。ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く採用されてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、直ちに第２の酵素系のための補酵素として作用するＮＡＤを生成するための基質としてＮＡＤＰを使用することである。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのピロホスファターゼは、組織中に存在せず、安定であり、優れた反応色を示すことから、この酵素は優れたコンジュゲートを提供する。ルシフェラーゼなどの酵素をベースとした化学発光系も使用することができる。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ方法は当業界において周知であり、例えばＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０００、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８９６０３７２８１（この開示は参照によって組み入れられる）を参照されたい。
【０１０５】
ビタミンであるビオチンとのコンジュゲーションは、ビオチンと、ビオチンが大きな特異性および親和性で結合する酵素に連結されたアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出することができるため、頻繁に使用される。
【０１０６】
しかしながら、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）はその代わりに、アレイを使用して行われる。アレイそれ自体は当業界において周知である。典型的には、アレイは、間隔を置いた（すなわち別々の）領域（「スポット」）を有し、それぞれ固体支持体の表面上に形成された有限の領域を有する線状または二次元構造から形成される。またアレイは、ビーズ構造であってもよく、その場合各ビーズは、分子コードまたはカラーコードによって同定することもでき、または連続フロー中で同定することもできる。また分析を逐次的に行うこともでき、その場合、サンプルは一連のスポット上を通過して、それぞれが溶液から所定クラスの分子を吸着する。固体支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、なかでも、プラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマー製のピン、もしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチドおよび他の好適な分子の固定化ならびに／もしくはイムノアッセイの遂行に好適な他のあらゆる表面の形態であり得る。結合プロセスは当業界において周知であり、一般的に、タンパク質分子、ポリヌクレオチドまたは同種のものを、固体支持体に架橋すること、共有結合させること、または物理的に吸着させることからなる。周知の技術、例えば接触型もしくは非接触型のプリンティング、マスキングまたはフォトリソグラフィーを使用することによって、各スポットの位置を規定することができる。総論については、Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｒ．Ｅ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ、Ｓ．Ｒ．（２００１、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２、１３〜２９）およびＬａｌら（２００２、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １５；７（別冊１８）：Ｓ１４３〜９）を参照されたい。
【０１０７】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」は、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の別々の領域の密度を有する領域のアレイを意味することを包含する。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば、約１０〜２５０μｍの範囲の直径を有し、ほぼ同じ距離でアレイ中の他の領域から隔てられている。またアレイは、マクロアレイまたはナノアレイであってもよい。
【０１０８】
好適な結合分子（上記で論じられた）が同定され単離されたら、当業者は、分子生物学分野において周知の方法を使用してアレイを製造することができる。
【０１０９】
従って、アレイは、ビーズベースのアレイまたは表面ベースのアレイであってもよい。好ましくは、アレイは、マクロアレイ、マイクロアレイおよびナノアレイからなる群から選択される。
【０１１０】
代替または追加の実施形態において、本発明の第１の態様に係る方法は：
（ｉ）サンプル中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識する工程；
（ｉｉ）ビオチンで標識されたタンパク質を、アレイの表面上に別々の位置で固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させる工程であって、ｓｃＦｖは表ＩＩＩ中のタンパク質の１種またはそれ以上に対する特異性を有する、工程；
（ｉｉｉ）固定化されたｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジンコンジュゲートと接触させる工程；および
（ｉｖ）アレイ表面上の別々の位置における該色素の存在を検出する工程
を含み、アレイ表面上での該色素の発現は、サンプル中における表Ａからのバイオマーカーの発現の指標である。
【０１１１】
代替の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）は、１種またはそれ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む。好ましくは、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。最も好ましくは、核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。
【０１１２】
従って、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）における１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィーおよびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行ってもよい。好ましくは、工程（ｂ）における１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、ＤＮＡマイクロアレイを使用して決定される。
【０１１３】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）における１種またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することは、表Ａで同定されたバイオマーカーの１種をコードする核酸分子にそれぞれ個々に選択的に結合することができる１つまたはそれ以上の結合部分を使用して行われる。
【０１１４】
さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ、核酸分子を含むかまたはからなる。従って、１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯを含んでもよいし、またはそれからなっていてもよい。しかしながら、１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡを含むかまたはからなることが好ましい。
【０１１５】
好ましくは、１つまたはそれ以上の結合部分は、５から１００ヌクレオチドの長さである。より好ましくは、１つまたはそれ以上の核酸分子は、１５から３５ヌクレオチドの長さである。さらにより好ましくは、結合部分は、検出可能な部分を含む。
【０１１６】
追加の実施形態において、検出可能な部分は、蛍光性の部分；発光性の部分；化学発光性の部分；放射性の部分（例えば、放射性原子）；および酵素的な部分からなる群から選択される。好ましくは、検出可能な部分は、放射性原子を含むかまたはからなる。放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群から選択することができる。
【０１１７】
しかしながら、結合部分の検出可能な部分は、蛍光性の部分（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えばＡｌｅｘａ６４７）であり得る。
【０１１８】
代替または追加の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）で用意されるサンプルは、未分画の血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、膵液、胆汁および尿からなる群から選択される。好ましくは、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）で用意されるサンプルは、未分画の血液、血漿および血清からなる群から選択される。より好ましくは、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）で用意されるサンプルは、血漿である。別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）で用意されるサンプルは、血清である。
【０１１９】
代替の実施形態において、本発明の第１の態様の方法は、膵体および／または膵尾がんを膵頭がんから区別するためであり：
ａ）個体からの試験しようとするサンプルを用意する工程；
ｂ）試験サンプル中における表Ａ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および／または（ｖｉ）で規定された群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程
を含むかまたはからなり、試験サンプル中における表Ａ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）で規定された群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現は、膵体および／もしくは膵尾がん、または膵頭がんの存在の指標である。この実施形態において、試験サンプルは、膵臓がんサンプルであるとすでに同定されている可能性がある（例えば、上述した方法を使用して）。その代わりに、試験サンプルは、膵臓がんサンプルであると同定されていない可能性がある。陽性および陰性対照サンプルは、適切に選択することができる。
【０１２０】
代替または追加の実施形態において、患者は、膵臓がんの同定後に適切に処置される。例えば、腫瘍を外科的に除去（切除）して、化学療法（すなわち、抗新生物薬）で処置するか、および／または放射線治療で処置することができる。従って、本発明は、膵臓がんを有するヒトの処置方法であって、患者は、本発明の第１の態様の方法を使用して膵臓がんを有すると同定される、前記方法を包含する。
【０１２１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で規定されたような１種またはそれ以上の結合剤を含む、個体において膵臓がんの存在を決定するためのアレイを提供する。
【０１２２】
本発明の方法で使用するのに好適なアレイは、上記で論じられている。
【０１２３】
好ましくは、１種またはそれ以上の結合剤は、表Ａで規定されたバイオマーカーの全てに結合することができる。
【０１２４】
本発明の第３の態様は、個体において膵臓がんの存在を決定するための診断マーカーとしての、本発明の第１の態様で規定された群から選択される１種またはそれ以上のバイオマーカーの使用を提供する。好ましくは、表ＩＩＩで規定されたタンパク質の全てが、個体において膵臓がんの存在を決定するための診断マーカーとして使用される。
【０１２５】
本発明の第４の態様は、膵臓がんの存在を決定するためのキットであって：
Ａ）本発明の第１の態様に係る１種またはそれ以上の第１の結合剤または本発明の第２の態様に係るアレイ；および
Ｂ）本発明の第１の態様に係る方法を行うための説明書
を含む前記キットを提供する。
【０１２６】
本発明の第５の態様は、個体において膵臓がんの存在を決定するための、本発明の第１の態様で規定された群から選択される１種またはそれ以上の結合剤／部分の使用を提供する。好ましくは、表ＩＩＩで規定されたタンパク質の全てに関する結合剤／部分が、個体において膵臓がんの存在を決定するための診断マーカーとして使用される。
【０１２７】
ここで、本発明のある特定の態様を例示する好ましい非限定的な例を以下の表および図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】診断に従ってサンプルを着色したＰＣＡ（赤色＝ＰＣ、黄色＝ＢＣ、青色＝ＮＣ）の図である。データを、ｐ＝１ｅ−１０までフィルタリングした（６３種の抗体）。
【図２】後退消去分析の図である。第１のトレーニングセットにおける各抗体消去ラウンド後のカルバック−ライブラー（Ｋ−Ｌ）の誤差を（Ａ）ＰＣ対ＮＣおよび（Ｂ）ＰＣ対ＢＣに関してプロットした。（Ｃ）ＡＵＣ値のボックスプロットを、トレーニング／試験セットの１０の異なる対における２５種の抗体のＳＶＭモデルから生成した。
【図３】腫瘍の局在性に従ってサンプルを着色したＰＣＡ（赤色＝頭の腫瘍、黄色＝体および尾の腫瘍、青色＝正常対照）の図である。データを、ｐ＝１ｅ−１０までフィルタリングした（４６種の抗体）。
【図４】サンプルのハイブリダイゼーションおよびスキャニング後の、Ａ１〜６およびＢ１〜７と表示された１３のサブアレイを用いたマイクロアレイスライドの代表的な画像である。サブアレイＢ４を拡大して、３３×３１個のスポットを有するアレイのレイアウトを示す。アレイは、標識されたＢＳＡのプリントされた列（列１、１１、２１、および３１）で隔てられた３つのセグメントからなる。各セグメント内の異なる位置に分布した各セグメントにつき１つの計３つの複製スポットに、各抗体をプリントした。
【図５】ＰＣＡプロットとして示されるデータの前処理の図である。Ａ）Ｒ１〜Ｒ５と表示された５ラウンド（日）の分析に従って着色された生データ。Ｂ）分析のラウンドに基づくクラスタリングが消去されたことを示す正規化したデータ。
【図６】ＰＣ対ＮＣに関するｐ値および変化倍率を対応させた、抗体の完全セットからのデータに基づきバイオマーカーによって同定された疾患に対する経路分析の図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
〔実施例〕
材料および方法
サンプル
インフォームドコンセント後、スペインの５つの異なる場所で、膵臓がんを有する患者（ＰＣ、ｎ＝１５６）、良性対照（ＢＣ、ｎ＝１５２）、および正常対照（ＮＣ、ｎ＝３０）から３３８個の血清サンプルを収集した（表１）。事前に最適化されたプロトコールを使用して単一の機会でサンプルの全セットを標識した［３２、３３］。簡単に言えば、粗サンプルをＰＢＳで１：４５に希釈し、結果として概算で２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得て、０．６ｍＭのＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質に対して１５：１の過量モル濃度のビオチンで標識した。ＰＢＳに対して７２時間透析することによって未結合のビオチンを除去した。標識されたサンプルを等分し、−２０℃で保存した。
【０１３０】
抗体
合計で、９８種の公知の血清抗原および３１種の４〜６アミノ酸のモチーフに対して向けられた２９３個のヒト組換えｓｃＦｖ抗体（ここではＣＩＭＳ１−３１と表示される）［３４］を、抗体マイクロアレイの内容物として使用した（使用された抗体の完全なリストについては表４を参照）。１５ｍＬの大腸菌培養物中で抗体を産生し、ＭａｇｎｅＨｉｓタンパク質精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して３００μＬ中のペリプラスムから精製した。Ｚｅｂａ  ９６ウェル脱塩スピンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、溶出緩衝液をＰＢＳと交換した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質収量を測定し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して純度をチェックした。
【０１３１】
抗体マイクロアレイ
非接触型プリンター（ＳｃｉＦｌｅｘａｒｒａｙｅｒ  Ｓ１１、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して黒いＭａｘｉＳｏｒｐスライド（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に抗体マイクロアレイを生産した。各スライド上に１３個の同一なサブアレイをプリントし、各アレイは、３１×３３個のスポットからなり、直径１３０μｍであり、スポットの中心間の距離は２００μｍであった。各サブアレイは、標識されたＢＳＡのプリントされた列で隔てられた３つのセグメントからなっていた（図４）。各サブアレイセグメントにつき１つの計３つの複製において各抗体をプリントし、十分な再現性を確保するために異なる位置に置いた。８つのスライド、すなわち１０４のサブアレイを５日間毎日プリントした。プリンティングを一晩行い、スライドを即座に翌日のアレイ分析に使用した。
【０１３２】
各スライドをハイブリダイゼーションガスケット（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にマウントし、ＰＢＳＭＴ（ＰＢＳ中、１％（ｗ／ｖ）乳汁、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロックした。その間、標識されたサンプルのアリコートを氷上で融解させ、９６ウェルプレート中、ＰＢＳＭＴで１：１０に希釈した。スライドを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄し、その後、希釈プレートからサンプルを添加した。揺動テーブル上でサンプルを２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、揺動テーブル上でＰＢＳＭＴ中の１μｇ／ｍＬストレプトアビジン−Ａｌｅｘａと共に１時間インキュベートし、再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。最後に、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り外し、迅速にｄＨ２Ｏ中に浸し、Ｎ２流下で乾燥させた。共焦点マイクロアレイスキャナー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）において、１０μｍの解像度で、６０％のＰＭＴゲインおよび９０％のレーザー出力を使用してスライドを即座にスキャンした。ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバージョン４．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、固定されたサークルオプションを使用して、シグナル強度を定量した。ローカルバックグラウンドサブトラクションを用いた強度値をデータ分析に使用した。
【０１３３】
データの前処理
いずれかの複製ＣＶが平均値から１５％を超えない限り３つの複製スポットの平均値を使用したが、いずれかの複製ＣＶが除外される場合は、その代わりに２つの残りの複製の平均値を使用した。平均複製ＣＶは８．３％（±５．５％）であった。１５％のカットオフＣＶを適用して、全ての３つの複製スポットからデータ値の７０％を計算し、残りの３０％を２つの複製から計算した。
【０１３４】
分散の正規化戦略および初期分析の評価のために、３Ｄ主成分分析（Ｑｌｕｃｏｒｅ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してデータを可視化した。１つの（慢性膵臓炎）サンプルを異常値とみなし（いかなるシグナルもほとんど得られなかった）、データから排除した。ｌｏｇ１０生データでの主成分分析から、ｉ）スライド上のサンプルのサブアレイの配置、ｉｉ）患者の性別、ｉｉｉ）患者の年齢、およびｉｖ）血清サンプル収集センターにおける差を見出すことができなかったことが示された。分析の日間についてのみわずかな系統的な差を観察することができ（ラウンド１〜５、特に１日目に関しては、アレイのプリンティング中の湿度の小さい差に起因する可能性がある。図４を参照）、これは正規化によって無効にされた。データを二段階で正規化した。第１に、減算グループ平均戦略（ｓｕｂｔｒａｃｔ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅａｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して分析のラウンド（日）間の差を消去した。分析の各ラウンド中に各抗体からの平均強度を計算し、単一の値から引くことにより、ゼロをデータの中心にした。それぞれの個々のデータポイントに各抗体からの全範囲の平均シグナルを足して、負の値を回避した。第２に、アレイとアレイとの間の差（例えば固有のサンプルバックグラウンドの蛍光差（図４を参照））を、これまでに説明されているようにして、最も低いＣＶを有する抗体の２０％に基づき、各サブアレイにつきスケーリング因子を計算することによって操作した［２３、３５］。データの正規化をＰＣＡプロットで可視化した（図５）。
【０１３５】
データ分析
分析は、ＰＣＡ、階層的クラスター分析、スチューデントのｔ検定および変化倍率、加えて多群ＡＮＯＶＡ（ＰＣ、ＮＣおよびＣＰ）（Ｑｌｕｃｏｒｅ）を使用したＰＣ対ＮＣおよびＰＣ対ＢＣの２グループの比較に基づいていた。Ｒ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）で、制約のコストを１（デフォルト値）に設定した線状の核を使用してサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分析を行った。データをトレーニングセットと試験セットとに無作為に分け、各グループからのサンプルの３分の２がトレーニングセットに、サンプルの残りの３分の１が試験セットになった。これまでに説明されているようにして、トレーニングセットデータを使用して、その時点で１つの抗体を排除して、分類分析において最も小さいカルバック−ライブラーダイバージェンスが得られたときに除去された抗体を繰り返して消去する後退消去アルゴリズムを適用した［３１］。消去しようとする最後の２５種の抗体を使用して、対応する試験セットで直接適用されたトレーニングセットにおいて分類モデルを構築した。ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下の面積を、試験セットにおけるシグネチャーの精度の尺度として使用した。１０の異なる無作為に生成されたトレーニングおよび試験セットの対で、この手順を１０回繰り返した。最終的に、各抗体に、１０のトレーニングセットにおける消去の順番に基づくスコアが付与された。消去プロセスにおける平均耐久度からスコアを計算した（消去しようとする第１の抗体＝１、消去しようとする最後の抗体＝２９３）。ここではＳＮ＋ＳＰの最大合計値と定義されるＳＶＭ予測値の最適な閾値から、感度（ＳＮ）および特異度（ＳＰ）を計算した。最後に、ＭｅｔａＣｏｒｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｒｅｕｔｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して経路分析を行った。
【０１３６】
結果
示差的なタンパク質発現の分析
分散の分析から、血清サンプル中、がんと対照とで強い示差的なシグナル伝達パターンを有する多数の抗体が明らかになった。実際に、多群ＡＮＯＶＡから、抗体の７５％が、血清データ中、ｐ＜０．００１の有意レベルを提示したことが示された。主成分分析から、がんサンプルは、明らかに、良性対照よりも正常対照からよりよく区別されたことが実証された（図１）。
【０１３７】
各サブグループの比較につき、最低のｐ値を提示する２５種の抗体を表２に示す。ＰＣ対ＮＣの比較から、強く上方および下方調節された分析物が明らかになったが、ＰＣ対ＢＣの分析から、より控えめな変化倍率を示す分析物が同定され、これらはほとんど例外なくＰＣ対ＢＣで上方調節されていた（表２）。最高レベルの示差的発現を示す分析物は、ＰＣ対ＮＣに関して、ＧＡＫ、ＩＬ−６、ＬＤＬ、およびＭＡＰＫ８（ｐ≦４×１０−２０）であり、一方でＰＣ対ＢＣに関して有意に異なるタンパク質のセットを同定したところ、シスタチンＣ、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１αが最低のｐ値（ｐ≦３×１０−１０）を提示した。
【０１３８】
ＰＣ対ＮＣに関するｐ値および変化倍率を対応させた抗体の全セット（ｎ＝２９３）に基づく経路分析から、バイオマーカーによって疾患を検索した場合、上位ヒットとしてインスリン産生に関する疾患（高インスリン血症およびインスリン耐性）が示唆された（図６）。また代謝に関連する状態、例えばグルコース代謝障害、肥満症、および過体重も有意な関連を示し、ＩおよびＩＩ型糖尿病、クローン病、肝炎、自己免疫および感染性の状態、および様々な種類の新生物（膵臓の新生物を包含する）のコアバイオマーカーネットワークも同様であった。従って経路分析によって同定された疾患の大半は、ＰＣに関連していたか、または症状の面でＰＣと相関している。
【０１３９】
分類のためのシグネチャー
次に、データを無作為にトレーニングおよび試験セットにさらに分けた。トレーニングセットを使用して、ＳＶＭ分析に基づく後退消去アルゴリズムを適用して、抗体を１つずつ排除することによって、最も識別力のある抗体の組合せを同定した。消去プロセス全体にわたりカルバック−ライブラー（Ｋ−Ｌ）ダイバージェンスが小さかったこと（≦３３．２）によって示されるように、ＰＣおよびＮＣの分類は高度に正確であった（図２Ａ）。消去プロセス中に７種の抗体のみが残ったとき、突出したＫ−Ｌ最小値（１２．０）が達成された。この７プレックスのタンパク質パネルは、ＩＬ−６、シスタチンＣ、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｃ１阻害剤、エオタキシン、およびＨＡＤＨ２を包含し、事前に見たことがないサンプルの対応する試験セットでそれぞれ１００％および９６％の感度（ＳＮ）および特異度（ＳＰ）を提示したことから、ごく少数の分析物を組み合わせることによってＰＣおよびＮＣの分類がほぼ完全になることが実証された。対照的に、ＰＣをＢＣと比較した場合、Ｋ−Ｌ値はそれより有意に高かった（≦１８１．３）。ここで、最小のＫ−Ｌ値（５０．０）はそれほど突出していなかったことから、ＰＣとＢＣとの最適な区別には、よりかなり大きい抗体パネルが必要であったことが示された（図２Ｂ）。各サブグループの比較につき、１０の異なる無作為に生成されたトレーニングセットが後退消去に使用されるまで手順を繰り返した。結果得られたＫ−Ｌ曲線は図２に示した曲線に高度に類似していたことから、ＰＣ対ＢＣの最適な分類のためには、平均６７種の抗体が必要であると予想されることが示された（図２Ｂ）。
【０１４０】
実現可能な数の抗体のシグネチャーを生成して評価するために、本発明者らは、各消去プロセスから上位２５種の抗体を選び、これらを使用してトレーニングセットにおいてＳＶＭ分類モデルを構築した。対応する試験セットにおけるモデルによって生成されたＡＵＣ値を、分類精度の尺度として使用した（図２Ｃ）。生成されたそれぞれ２５抗体のシグネチャーは、高い精度で（平均ＡＵＣは０．９８）ＮＣからＰＣを予測することができた。１０のシグネチャーの感度および特異度は、９０％ＳＮおよび８５％ＳＰから、１００％ＳＮおよびＳＰまでの範囲であり、平均ＳＮおよびＳＰは９５％であった。対照的に、ＢＣからＰＣを予測することはより難しく（平均ＡＵＣは０．６７）、最良性能のシグネチャーで７６％ＳＮおよび６７％ＳＰであった。
【０１４１】
最後に、各抗体に、消去プロセスにおけるその平均耐久度に対応するスコアが付与された（表３）。ＰＣ対ＮＣ分析中、１０種のシグネチャーが高度に類似していた。例えば、上位の抗体は、ＩＬ−１１を標的化するものであり、２９３回の消去から２９１．４の総合スコアを示し、１０回のうち４回において消去しようとする最後の抗体であった。合計で、ＰＣ対ＮＣに関して２５種の最高のスコア付けされた抗体は、サイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびエオタキシン）、補体成分（Ｃ１阻害剤、Ｃ１ｑ、Ｃ５、および因子Ｂ）、酵素（ＨＡＤＨ２、ＧＡＫ、およびＡＴＰ−５Ｂ）からより多くに至る２０種の重複のない分析物に相当していた。高度に異なるタンパク質のセットは、ＰＣ対ＢＣに関して上位マーカーのようであり、上位にスコア付けされた分析物のなかでも、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ３、ＵＣＨＬ５、ＩＬ−４、Ａｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ４、ＣＤ４０リガンド、ＫＳＹＫおよびその他を含んでいた（表３）。
【０１４２】
抗体スコアに基づくシグネチャー（表３）がｐ値から導き出されたもの（表２）と異なっていたとしても、特にＰＣ対ＮＣのシグネチャーに関して有意なオーバーラップが観察され、２５種の抗体のうち８種（ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＨＡＤＨ２、ＬＤＬ、ＧＡＫ、Ｃ１ｑ、およびＴＮＦ−α）が両方のシグネチャーで出現した。実際には、全てが上位２５種のｐ値リストに存在していないとしても、ＰＣ対ＮＣに関する上位２５種のスコア付けされた抗体の全てが有意に示差的に発現されていた。
【０１４３】
腫瘍の局在性
血清タンパク質プロファイルに基づいて、膵臓における腫瘍の由来に従ってがんサンプルを階層化することもできた。主成分分析から、膵体または膵尾に位置する腫瘍からのサンプルは、膵頭に位置する腫瘍からのサンプルがそうするよりも正常対照に近似してある程度クラスター化されること、および腫瘍の局在性に基づくがんサンプルの分離（頭対体／尾）を観察することができたこと（図３）が示された。示差的なタンパク質発現の分析から、頭および体／尾の腫瘍からの血清サンプル中で有意に異なるレベルを有する分析物の大規模リストが明らかになり、そこで抗体の３９％がｐ値＜０．００１を提示し、ほとんど例外なく体および尾の腫瘍と比較して頭の腫瘍で上方調節されたレベルを示した（表５）。
【０１４４】
考察
この研究は、これまでに遂行されてきた膵臓がんを予測するためのバイオマーカーパネルの最大の多施設分析の１つを表す。これまで本発明者らが知る限りにおいて、これは、このような親和性プロテオミクスを使用した大きい膵臓がんコホート（＞３００サンプル）における血清分析物の最も多重化された分析である。社内の組換え抗体マイクロアレイを使用して分析を行ったが、このマイクロアレイは、数年かけて進化させた、現在主として免疫調節プロテオームの様々な標的に対して厳重に選択されたほぼ３００種の抗体を包含するプラットフォームである［３２、３６］。ハイスループット生産および精製のために新規のプロトコールを採用して、これらの抗体を１週間未満で容易に生成し、平面マイクロアレイ上で３つの複製スポットにピコリットルスケールで迅速にプリントした。現行の設定で、ほんのわずかな体積（＜１μＬ）の希釈していない血清を使用して、１日および１つのワークステーション当たり１００個を超えるサンプルを並行して分析することができ、大きいサンプルコホートを数日中に分析することを可能にする。
【０１４５】
本発明の研究において、これらのアレイで３３８種の血清サンプルをプロファイリングし、膵臓がんを正常対照および良性対照と比較した。現行のアッセイなどの高度に多重化されたアッセイを使用すれば、特に免疫系のタンパク質などの高度に相互連結したタンパク質が標的化される場合、一定レベルの相関がみられる可能性が高い。単一のｐ値によって表された個々の抗体の識別力がそれでもなお興味あるものだとしても、最適な抗体の組合せを同定することに関して他の統計アプローチがより正確である可能性がある［３７］。ここで、サポートベクターマシン分析に基づく教師付きモデルを使用した。データをトレーニングセットに分け、繰り返しの後退消去アルゴリズム、およびシグネチャーの分類力を試験した相補的な検証セットによって、それからバイオマーカーシグネチャーを同定した。
【０１４６】
このアプローチを採用することにより、ｐ値によって表された示差的発現パターンと後退消去分析との両方から目的のタンパク質のリストを導き出した。後者から、ＰＣ対ＮＣのほぼ完全な識別にわずか４から１０種の抗体で十分であると予想されることが示され、この結果は、非常に励みになるものであり、免疫調節プロテオームをアッセイすることによって健康な対照からＰＣを容易に識別することができるという本発明者らの以前の観察を確認するものである［２３、２４］。しかしながら、ＰＣをＢＣ（主として慢性膵臓炎）と比較した場合、６７種もの多くの抗体が最適な分類力に必要なようであった。これは、測定されたタンパク質のタイプによって部分的に説明することができる；免疫調節性の分析物は、いずれの状態においても免疫系が高度に影響を受けるために、単独の疾患特異性を示す可能性が低い。実際に、この研究で遂行された経路分析から、ＰＣの高度に類似した全身性の影響、ならびに様々な他の状態、例えば高インスリン血症、インスリン耐性および代謝性疾患、加えて自己免疫および感染が確認され、ここでも症状の面で関連する良性の状態からＰＣを区別することにおける課題が実証された。従ってＰＣに関する関連免疫シグネチャーを同定することは、バランスを取る作業である。各結合剤がアッセイのコストと複雑さを増加させるため小さいパネルが望ましいが、それでもなおシグネチャーは、高感度で特異的な疾患のフィンガープリントを構成するほど十分に大きいことが必要である。この発見段階で、本発明者らは、２５種の分析物が実現可能な開始点であると推論し、追跡研究によって、診断イムノアッセイに必要な感度および特異度をなお提示しつつも、これらのシグネチャーをよりいっそう小さいバイオマーカーパネルに簡略化できるかどうかが判定されると予想される。
【０１４７】
シグネチャーの同定に２つの極めて異なる戦略を採用しているにもかかわらず、異なる分析から導き出されたシグネチャー間でそれでもなお大きいオーバーラップがあり、すなわち最高の総合後退消去スコアを獲得したマーカーは、一般的にも高度に示差的に発現されていた。例えば、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、Ｃ１阻害剤、ＩＬ−１３、ＨＡＤＨ２、ＬＤＬ、ＧＡＫ、Ｃ１ｑ、およびＴＮＦ−αは両方のシグネチャーで出現することから、ＰＣ対ＮＣに関して低いｐ値および高い後退消去スコアの両方が実証された。ＰＣ対ＢＣに関して、Ｃ５、Ａｐｏ−Ａ４、ＢＴＫ、ＴＧＦ−β１、ＭＣＰ−１、およびＵＰＦ３Ｂで２つのシグネチャーがオーバーラップした。注目すべきことに、多数のマーカーが、ＮＣおよびＢＣと比較した場合、両方でＰＣに関して可能性を示した。本発明者ら［２３、２４］および他者［３８〜４０］による以前の研究では、Ｃ１阻害剤、Ｃ５、因子Ｂ、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−αを含むこれらのうち数種がＰＣに関連していたが、一方でＨＡＤＨ２、アセチルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、本発明者らが知る限りにおいてＰＣに関してこれまで報告されていなかった。加えて、これまでに本発明者らによって測定されてこなかった他のタンパク質もＰＣを区別する可能性を示した。例えば、ＧＡＫ、セリン／スレオニンキナーゼはＰＣ対ＮＣにおいて大きく下方調節され、ＰＣ対ＮＣに関する後退消去シグネチャーにも出現した。加えて、ＰＣ対ＢＣに関して、ＴＮＦＲＳＦ３（ＴＮＦ−β受容体）、およびＵＰＦ３Ｂ、ｍＲＮＡレギュレータータンパク質がｐ値および抗体スコアシグネチャーの両方に包含された。最終的に、ＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）は、ＰＣで脱調節されることが示されているＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路のキナーゼであるが［４１］、ＰＣ対ＢＣに関して、後退消去シグネチャーで最高にスコア付けされたタンパク質であった。
【０１４８】
また血清サンプルも膵臓中の腫瘍位置に基づき階層化したが、これは本発明者らが知る限りにおいてこれまでプロテオミクスを用いてなされていなかった。腫瘍の由来に基づきサンプルを一定の程度に分離することができたこと、さらに、尾および体の腫瘍を有する患者からのサンプルの主要部分が、膵頭の腫瘍を有する患者からの血清がそうするよりも正常対照にわずかに近似してクラスター化されたことが示された。従ってこれらの結果から、膵臓中のその由来に基づくがんの全身性の影響における不一致が実証された。体／尾の腫瘍からのサンプルと比較して頭の腫瘍からのサンプル中で上方調節されることが見出された莫大な数の血清免疫調節タンパク質が、しばしば膵臓を十二指腸につなぐ周囲の腸間膜血管に侵入する膵頭に位置する腫瘍からのより深刻な全身性の影響を反映する可能性がある［３］。従ってこれらの発見から、抗体マイクロアレイでの血清プロファイリングは、膵頭の腫瘍と膵体／膵尾の腫瘍とを区別するのに適用できることから、潜在的に腫瘍処置の決定に役立つ可能性があることが示唆される。
【０１４９】
米国では、４番目に最も致死的ながんであるにもかかわらず、ＰＣの発生率は低く、個体１０００００人当たり約１１人である［４２］。医療経済的な観点から、低い発生率が、一般集団でのＰＣに関するスクリーニングの動機を与えることを難しくしている。しかしながら、本発明者らがこれまでに示した感度および特異度に基づいて［２４］、近年の研究は、ＰＣに関してハイリスクの個体をスクリーニングすることの費用対効果を確認している［４３］。ＰＣに関する危険因子は、膵臓炎および良性新生物だけでなく、例えば家族性膵臓がん、遺伝性膵臓炎、ＢＲＣＡ変異、ポイツ−ジェガース症候群、糖尿病、およびヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染も包含する［４４］。次の工程は、診断ＰＣイムノアッセイのための関連標的集団の代表であるＰＣのリスクが高い個体のなかからＰＣを診断するために、本発明の研究において同定されたシグネチャーを調査することと予想される。
【０１５０】
結論として、９０〜１００％の範囲で感度および特異度を提示する膵臓がんに関連する免疫シグネチャーを明らかにしたこの大規模に多重化された多施設研究は、ＰＣ診断の適用可能性を明確に実証したことに加え、膵臓中の腫瘍位置に基づき血清サンプルを階層化するための組換え抗体マイクロアレイの潜在力も示した。
【０１５１】
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【０１５２】
【表１】
0006600637.tif 000003
【０１５３】
【表２】
0006600637.tif 000004
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
【表４】
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【０１５６】
【表５】
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【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
【表８】
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【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
【表１０】
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【０１６２】
【表１１】
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【０１６３】
【表１２】
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【０１６４】
【表１３】
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【０１６５】
【表１４】
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【０１６６】
【表１５】
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【０１６７】
【表１６】
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【０１６８】
【表１７】
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【０１６９】
【表１８】
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【０１７０】
【表１９】
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【０１７１】
【表２０】
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【０１７２】
【表２１】
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【０１７３】
【表２２】
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【０１７４】
【表２３】
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【０１７５】
【表２４】
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【０１７６】
【表２５】
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【０１７７】
【表２６】
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【０１７８】
【表２７】
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【図１】
0006600637.tif 000030
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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