(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子を前記微生物内で発現させる工程１；及び
前記微生物の野生株と比較して、前記微生物が３３℃〜４７℃の範囲のいずれかの温度において培養した場合に増殖能力が高いことを確認する工程２；
を備えたことを特徴とする、野生株と比較して３３℃〜４７℃の範囲のいずれかの温度において培養した場合に増殖能力が高い耐熱性微生物の作製方法であって、前記活性酸素消去酵素をコードする遺伝子が、次の（ａ）、（ｃ）〜（ｅ）に示される酵素から選択される少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子であり、前記増殖能力の評価が、１８〜４０時間培養して培地の濁度を測定し、その濁度を指標として行うものであることを特徴とする前記作製方法。
（ａ）コリネ型細菌由来のスーパーオキシドディスムターゼ；
（ｃ）ザイモモナス属細菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又は鉄依存性ペルオキシダーゼ；
（ｄ）大腸菌由来のカタラーゼ、又はスーパーオキシドディスムターゼ；
（ｅ）酢酸菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシンレダクターゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又はチオレドキシン；
【請求項２】
活性酸素消去酵素をコードする遺伝子が、次の（ｃ’）又は（ｅ’）に示される酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
（ｃ’）ザイモモナス属細菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、又は鉄依存性ペルオキシダーゼ；
（ｅ’）酢酸菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシンレダクターゼ、又はチオレドキシン；
【請求項３】
活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を、前記遺伝子の由来源となる微生物に導入することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを微生物に導入することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性微生物の作製方法に関し、より詳しくは、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子を前記微生物内で発現させることを特徴とする耐熱性微生物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は、古来より、お酒、酢、醤油など、近年ではクエン酸やアミノ酸の工業的な発酵生産などにおいて、身近に存在する非常に多くの常温生育微生物を利用してきた。かかる微生物を培養して発酵を行った場合には発酵熱により培地の温度が上昇し、発酵生産能が損なわれる。そのため、工業的な発酵生産においては発酵槽の温度を３０℃以下に維持することが必要となるが、そのために多大な水道代や光熱費、冷却のための設備などの冷却コストが必要となる。
【０００３】
そこで、高温適応能力を有する変異株の開発が進められている。発明者らは、タイで耐熱性発酵微生物を分離し、段階的に培養温度を繰り返し培養することにより３９〜４１℃での適応能力が付与された、酢酸発酵能力を有する酢酸菌（特許文献１、非特許文献１参照）や、ＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素遺伝子を破壊し、３０〜３８℃で５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能を有するグルコノバクター属の変異株（特許文献２参照）やｍａｒＲ遺伝子又はｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子を破壊し、高温下での生育能力や酢酸発酵能力を備えた、酢酸生産能が向上した酢酸菌の育種方法（特許文献３参照）を提案した。
【０００４】
これらの高温適用能力を有する変異株により、高温下又は非温度制御条件で発酵生産を行うことが可能となるが、特定の株における変異株であり、かかる技術を他の発酵微生物において適用できるか明らかでなく、応用面で満足のいくものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１１０２９８号公報
【特許文献２】特開２０１２−０４４８６８号公報
【特許文献３】特開２０１４−０６４４７７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Matsutani M et. al., J Biotechnol. 165(2):109-119 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、高温において増殖能力が向上した微生物、又は生育限界温度が上昇した微生物の作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
古くより、新しい機能を持つ微生物を自然界に探索する研究は微生物学の基本であり、特に最近は、深海や地底などの極限の世界からこれまでに人類が遭遇していない微生物の探索が盛んである。発明者らは、こうした探索とは全く違う視点で、古来より利用してきた有用微生物の中に、まだ知られていない耐熱性に関わる因子を探索することで、耐熱性微生物の作製を試みた。そのなかで、微生物の高温下での生育に酸化ストレスが重要な役割を果たしていることを発明者ら自らの研究によって明らかにした。そこで、複数の発酵微生物において、それぞれの菌における酸化ストレス抑制に係る遺伝子の発現を試みたところ、高温での増殖能力を向上させることや、菌株の生育限界温度を上昇させることが可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子を前記微生物内で発現させることを特徴とする耐熱性微生物の作製方法。
（２）活性酸素消去酵素をコードする遺伝子が、スーパーオキシドディスムターゼ、細胞質カタラーゼ、ペルオキシゾームカタラーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、鉄依存性ペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、チオレドキシンからなる群から選択される少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）活性酸素消去酵素をコードする遺伝子が、次の（ａ）〜（ｅ）に示される酵素から選択される少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする上記（２）記載の方法。
（ａ）コリネ型細菌由来のスーパーオキシドディスムターゼ；
（ｂ）酵母由来の細胞質カタラーゼ、ペルオキシゾームカタラーゼ、又はチトクロムｃペルオキシダーゼ；
（ｃ）ザイモモナス属細菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又は鉄依存性ペルオキシダーゼ；
（ｄ）大腸菌由来のカタラーゼ、又はスーパーオキシドディスムターゼ；
（ｅ）酢酸菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又はチオレドキシン；
（４）活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を、前記遺伝子の由来源となる微生物に導入することを特徴とする上記（３）記載の方法。
（５）活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを微生物に導入することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、高温において増殖能力が向上した微生物、又は生育限界温度が上昇した微生物を作製することが可能となる。かかる微生物を用いれば、工業的な発酵生産において、多大な水道代や光熱費、冷却のための設備などの冷却コストを低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】染色体sodA遺伝子破壊株、及び、染色体sodA遺伝子発現株の作製方法の概略を示す図である。
【図２】ＳＯＤ活性染色アッセイにおけるｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法による電気泳動の結果を示す図である。
【図３】KY9002株のsodA遺伝子破壊株（−▲−）、sodA発現株（−●−）、野生株（（−○−）：vector control）の生育を調べた結果を示す図である。
【図４】プラスミドp[KmCDC19p-yEmRFP-ADE2c-KmCenD-ARS7-URA3]のマップを示す図である。
【図５】CTT1遺伝子、CCP1遺伝子、CTA1遺伝子を発現する形質転換体RAK11257株（−◆−）、RAK11258株（−▲−）、RAK11259株（−■−）の生育を調べた結果を示す図である。
【図６】CTT1遺伝子のみ、CTT1遺伝子及びCCP1遺伝子、CTT1遺伝子及びCTA1遺伝子を発現する形質転換体RAK11985株、RAK11988株、RAK11989株の生育を調べた結果を示す図である。
【図７】活性酸素消去酵素をコードする遺伝子が導入されたベクター（pZA-ahpC、pZA-sod、pZA-ZMO1573）の作製概要を示す図である。
【図８】ザイモモナス・モビリスにおいて、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を発現させた場合の細胞濁度（上段：Cell growth））と培養液中のエタノール濃度（下段：Ethanol production））の測定結果を示す図である。
【図９】大腸菌において、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を発現させた場合のＬＢ寒天培地上のコロニー数の測定結果を示す図である。
【図１０】アルキルヒドロペルオキシダーゼをコードする遺伝子を含む領域の配列を示す図である。
【図１１】ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼをコードする遺伝子を含む領域の配列を示す図である。
【図１２】スーパーオキシドディスムターゼをコードする遺伝子を含む領域の配列を示す図である。
【図１３】チオレドキシンをコードする遺伝子を含む領域の配列を示す図である。
【図１４】酢酸菌において、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を発現させた場合のＬＢ寒天培地上の生育結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の耐熱性微生物の作製方法としては、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子を前記微生物内で発現させることを特徴とする耐熱性微生物の作製方法であれば特に制限されず、活性酸素消去酵素とは、生体中に発生する活性酸素を除去しうる酵素を意味する。なお、活性酸素としては、スーパーオキシドアニオンラジカル（スーパーオキシドともいう）、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素などが挙げられる。
【００１３】
上記活性酸素消去酵素としては、活性酸素消去に関わる酵素であれば特に制限されず、スーパーオキシドディスムターゼ、細胞質カタラーゼ、ペルオキシゾームカタラーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、鉄依存性ペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、チオレドキシン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン還元酵素、グルタチオンＳ基転移酵素、ミトコンドリアペルオキシレドキシンを挙げることができ、スーパーオキシドディスムターゼ、細胞質カタラーゼ、ペルオキシゾームカタラーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ、鉄依存性ペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、チオレドキシンを好適に挙げることができ、（ａ）コリネ型細菌由来のスーパーオキシドディスムターゼ；（ｂ）酵母由来の細胞質カタラーゼ、ペルオキシゾームカタラーゼ、又はチトクロムｃペルオキシダーゼ；（ｃ）ザイモモナス属細菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又は鉄依存性ペルオキシダーゼ；（ｄ）大腸菌由来のカタラーゼ、又はスーパーオキシドディスムターゼ；（ｅ）酢酸菌由来のアルキルヒドロペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、又はチオレドキシン；の（ａ）〜（ｅ）に示される酵素をより好適に挙げることができる。
【００１４】
上記コリネ型細菌としては特に制限されないが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、アースロバクター属、に属する細菌を挙げることができ、コリネバクテリウム属に属する細菌を好適に挙げることができ、コリネバクテリウム・グルタミクムをより好適に挙げることができる。
【００１５】
上記酵母としては特に制限されないが、クルイベロマイセス属、サッカロマイセス属、ピキア属、カンジダ属、デバリオマイセス属、ハンゼヌラ属、メチニコウィア属、ネマトスポラ属、サッカロマイコデス属、シゾサッカロマイセス属、シュワニオマイセス属、トリコスポロン属、トルロプシス属、ロドトルラ属、ヤローウィア属に属する酵母を挙げることができ、クルイベロマイセス属に属する酵母を好適に挙げることができ、クルイベロマイセス・マルシアヌスをより好適に挙げることができる。
【００１６】
上記ザイモモナス属細菌としてはザイモモナス属に属する細菌である限り特に制限されないが、ザイモモナス・モビリスを挙げることができる。
【００１７】
上記酢酸菌としては特に制限されないが、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、タンチカロエニア属、アセトバクター属、アサイア属、アシドモナス属、グラニュリバクター属に属する細菌を挙げることができ、グルコンアセトバクター・ユーロピアス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコンアセトバクター・キシリナス、タンチカロエニア・サカエラテンシス、アセトバクター・パスツリアナスを好適に挙げることができ、グルコンアセトバクター・ユーロピアス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコンアセトバクター・キシリナスをより好適に挙げることができる。
【００１８】
本発明において、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子を前記微生物内で発現させる方法としては特に制限されないが、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを微生物に導入することにより、前記遺伝子を前記微生物内で発現させる方法を好適に挙げることができる。また、複数の活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を微生物で発現させてもよく、たとえば、酵母由来の細胞質カタラーゼ及びペルオキシゾームカタラーゼや、酵母由来の細胞質カタラーゼ及びチトクロムｃペルオキシダーゼを酵母で発現させる方法を挙げることができる。
【００１９】
上記遺伝子を微生物に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、リン酸カルシウムトランスフェクション法、マイクロインジェクション法などの一般的な遺伝子導入手法を用いることができる。
【００２０】
上記活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターとしては上記活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む限り特に制限されないが、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御配列を含有している発現ベクターを好適に挙げることができる。また、上記発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましい。
【００２１】
本発明においては、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を、前記遺伝子の由来源となる微生物に導入することが好ましく、前記遺伝子の由来となった微生物としては、前記遺伝子の由来となった微生物と同じ門、好ましくは同じ科、より好ましくは同じ属、さらに好ましくは同じ種に属する微生物を挙げることができる。たとえば、酢酸菌アセトバクター  パスツリアヌス由来の活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を、酢酸菌グルコノバクター・オキシダンス、グルコンアセトバクター・ユーロピアス、グルコンアセトバクター・キシリナスに導入することができる。
【００２２】
本発明において、耐熱性微生物としては、野生株（活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を導入していない株）と比較して３３℃〜４７℃の範囲のいずれかの温度において培養した場合に増殖能力が高い微生物や、生育限界温度が上昇した微生物を挙げることができる。
【００２３】
上記増殖能力は、例えば、微生物を一般的な微生物の培地で１８〜４０時間培養して培地の濁度を測定し、その濁度を指標として評価でき、具体的には、上記条件で培養した場合に、野生株と比較して培地の濁度が１．１倍、好ましくは１．２倍、より好ましくは１．５倍、さらに好ましくは１．８倍である微生物は、増殖能力が高い微生物と評価することができる。培地の濁度は、例えばクレットサマーソン光電光度計（ベルアート社製）を用いて測定することができる。
【００２４】
また、上記生育限界温度は、例えば、微生物を一般的な微生物の培地で、生育限界温度及び段階的に生育限界温度から温度を上昇させて１８〜４０時間培養した場合の微生物の生育で評価することができ、具体的には、生育限界温度より１℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上、さらに好ましくは４℃以上の高温の培地で生育可能な微生物は、生育限界温度が上昇した微生物と評価することができる。上記高温での微生物の生育については、高温の培地で培養し、培地の濁度をクレットサマーソン光電光度計や分光光度計で測定することや、高温の培地で継代培養を複数回行い、安定して増殖するか否かを調べることによって確認することができる。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現によるコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の耐熱化］
（コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体sodA遺伝子破壊株の作製）
プライマーSodA-L（配列番号１:5’-CAACTTCGCCGTCTGGATTGTAG-3’）とプライマーSodA-R（配列番号２:5’-CCTTGCTATCTATTGCTTGGCTCAT-3’）を用い、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9714株（Hirasawa T. et al., J Bacteriol. 182(10):2696-701(2000)：以下、単に「KY9714株」ともいう）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９５℃ ３０sec，４５℃ ３０sec，７５℃ １．５min，３５サイクル）を行い、３．７ｋｂのKY9714株sodA遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpGEM（登録商標）-Teasyベクター(プロメガ社製)に連結して組換えプラスミドpT-3.7SodAを作製した。pTKm（Yoshida et al., Microbiology 149:431-444(2003)）プラスミドのＥｃｏＲＶ部位から分離したカナマイシン耐性遺伝子カセットをpT-3.7SodAに連結し、ＡａｔＩで処理した。得られたプラスミドpT-3.7SodA-Kmを用い、エレクトロポレーション法によりコリネバクテリウム・グルタミクムKY9002株（Kinoshita et al.,(1958)、以下、単に「KY9002株」ともいう）を形質転換し、カナマイシン耐性クローンを選択してKY9002-sodA遺伝子破壊株を得た。カナマイシンカセットがこれらのクローンのsodA遺伝子に連結していることはＰＣＲによって確認した。
【００２７】
コリネバクテリウム・グルタミクムにおける染色体sodA遺伝子破壊株の作製方法、及び、後述する染色体sodA遺伝子発現株の作製方法の概略を図１に示す。
【００２８】
（コリネバクテリウム・グルタミクムにおける染色体sodA遺伝子の発現株の作製）
自己のプロモーターを含む全sodA遺伝子をＰＣＲによって増幅することによって、コリネバクテリウム・グルタミクムのsodA遺伝子の発現プラスミドを作製した。
【００２９】
まず、KY9714株のゲノムＤＮＡからsodA遺伝子を増幅するために、プライマーSod-1.4-BamL（配列番号３：5’-TTCTTTCCACGGATCCGTCA-3’）とプライマーSod-1.4-BamR（配列番号４:5’-GGTTGGTGTGGATCCTGGAGG-3’）を用いて上述と同様の条件でＰＣＲを行った。得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をpGEM-Teasyベクターにクローニングし、組換えプラスミドpT-1.4SodAを作製した。
【００３０】
次に、pT-1.4SodAをＢａｍＨＩで処理した。なお、プライマーSod-1.4-BaｍＬとプライマーSod-1.4-BamRにはＢａｍＨＩで消化される「GGATCC」配列を含んでいる。ＢａｍＨＩで処理した断片をpCS299Pベクター（国際公開第2000/63388号パンフレット）にサブクローニングし、組換えプラスミドpCS-1.4SodAを作製した。得られたプラスミドpCS-1.4SodAを用い、エレクトロポレーション法によりKY9002株を形質転換した。カナマイシン耐性クローンを選択し、KY9002-sodA発現株を得た。プラスミドの存在は上記sodA発現株からのプラスミドＤＮＡの単離、消化によって確認した。なお、コントロールとして空pCS299Pベクターを用い、KY9002株を形質転換して野生株（vector control）を得た。
【００３１】
（ＳＯＤ活性染色アッセイ）
５ｍＬのＬＢ培地で１８時間培養して調製した前培養液１ｍＬを、０．０１％の酵母エキスを添加した１００ｍＬのグルコース最少培地を入れた５００ｍＬの三角フラスコに移して、上記で作製した各菌体を３０℃にて、２００ｒｐｍで振とう培養した。グルコース最少培地の組成は、１Ｌ中に１０ｇのグルコース又は２０ｍＬの乳酸ナトリウム、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、３ｇのＫ2ＨＰＯ4、３ｇのＮＨ4Ｃｌ、２ｇの尿素、０．５ｇのＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、１ｍｇのＭｎＳＯ４−７Ｈ2Ｏ、３０μｇのビオチン、１ｍｇのｔｈｉａｍｉｎ‐ＨＣｌ、２０ｍｇのｃｙｓｔｅｉｎ−ＨＣｌ、０．５ｇのカザミノ酸、１ｍＬの金属混合液とした。金属混合液の組成は、１Ｌ中に９９０ｍｇのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、８８０ｍｇのＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、３９３ｍｇのＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ、７２ｍｇのＭｎＣｌ2−４Ｈ2Ｏ、８８ｍｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7−１０Ｈ2Ｏ、３７ｍｇの（ＮＨ４）6Ｍｏ7Ｏ24−４Ｈ2Ｏとした。
【００３２】
上記で培養した培地を遠心により回収し、２０ｍＭのpotassium phosphate buffer（ＫＰＢ、ｐＨ７．５）で２回洗浄した。洗浄した菌体を、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームの存在下、上記ＫＰＢを菌体１湿重量（ｇ）あたり２．５ｍＬとなるように加えて再懸濁した。懸濁した菌体は８０ｒｐｍで１時間、３０℃でインキュベートした。その後、リゾチームで処理した菌体はフレンチプレス（１６、０００ｐｓｉ）で２回破砕し、菌体の破壊片を６，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心して除いた。上澄みを４０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃で超遠心し、可溶性画分と沈殿に分離した。可溶性細胞質画分を菌体のＳＯＤ活性の測定に用いた。細胞質画分をｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法（１０％、４℃）で電気泳動した。ゲルは最初に２．４５ｍＭのNitroblue tetrazolium(NBT)液中、暗所でインキュベートし、その後２０μＭのリボフラビン溶液中、室温で２０分インキューベートした。さらに、白色光照射下で２８ｍＭのtetramethylethylenediamine(TEMED)に浸した。照射中、光はリボフラビンのスーパーオキシドアニオン(Ｏ2-)への還元を誘導し、かかるＯ2-がＮＢＴを還元し、青色を呈するフォルマザン顆粒を生成する。ゲル中のＳＯＤはＯ2-を除去し、ＮＢＴからフォルマザンへの還元を妨げ、その結果、ＳＯＤ活性を有する領域が無彩色バンドとして現れる。
【００３３】
ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法による電気泳動結果を図２に示す。図２に示すように、KY9002株のsodA遺伝子破壊株はＳＯＤ活性が見られず、一方、sodA発現株は野生株と比較して過剰にＳＯＤが発現していることが確認された。
【００３４】
（菌体の生育）
５ｍＬのＬＢ培地で１８時間培養して調製した前培養液１ｍＬを、０．０１％の酵母エキスを添加した１００ｍＬのグルコース最少培地を入れた５００ｍＬの三角フラスコに移して、上記で作製したKY9002株のsodA遺伝子破壊株、sodA発現株及び野生株（vector control）を３０℃、３７℃、３９℃、４０℃にて、２００ｒｐｍで振とう培養した。グルコース最少培地の組成は、上述と同様である。菌体の生育はクレットサマーソン光電光度計によって濁度を測定することによって調べた。
【００３５】
KY9002株のsodA遺伝子破壊株、sodA発現株、野生株（vector control）の生育を調べた結果を図３に示す。図中、横軸は時間（ｈｏｕｒ）、縦軸は濁度（クレットユニット）である。図３に示すように、耐熱性を示すKY9002株において、sodA遺伝子の破壊によって耐熱性、すなわち３７℃、３９℃、４０℃の高温下における増殖能力が野生株と比較して低下し、逆にsodA遺伝子を発現させることによって耐熱性が野生株と比較して向上していた。
【実施例２】
【００３６】
［活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現によるクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の耐熱化］
（クルイベロマイセス・マルシアヌスにおけるカタラーゼ（CTT1）遺伝子の発現株とチトクロムｃペルオキシダーゼ（CCP1）遺伝子の発現株とペルオキシゾーム・カタラーゼ（CTA1）遺伝子の発現株の作製）
図４に示すプラスミドp[KmCDC19p-yEmRFP-ADE2c-KmCenD-ARS7-URA3]をテンプレートとして、プライマーにURA3+771c（配列番号５）とADE2+1716c（配列番号６）を用いて、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６０℃ １５sec，６８℃ ６．０min，３５サイクル）により、ベクターとなるＤＮＡ断片(URA3+771)c-KmCenD-KmARS7-ADE2を増幅した。実施例２で用いる上記配列番号５、６及び後述する配列番号７〜２２の配列を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0006474063.tif 000002
【００３８】
発現プロモーターであるクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）のＣＤＣ１９プロモーターと、コントロールとなる赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を次のように増幅した。テンプレートＤＮＡはp[KmCDC19p-yEmRFP-ADE2c-KmCenD-ARS7-URA3]、プライマーにKmCDC19-970（配列番号７）と3CG9-yEmRFP+711c（配列番号８）を用い、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６０℃ １５sec，６８℃ ６．０min，３５サイクル）によりKmCDC19p-yEmRFP-3CG9 断片を増幅した。かかる断片をテンプレートとし、プライマーにKmCDC19-970（配列番号７）とURA3771786taa-3CG9（配列番号９）を用いて、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６０℃ １５sec，６８℃ ６．０min，３５サイクル）により、yEmRFP遺伝子の下流にＵＲＡ３マーカー機能相補配列を持つＤＮＡ断片KmCDC19p-yEmRFP-3CG9-(URA3+772786)cを増幅した。
【００３９】
上記で作製した２つのＤＮＡ断片、(URA3+771)c-KmCenD-KmARS7-ADE2とKmCDC19p-yEmRFP-3CG9-(URA3+772786)を混合し、K. marxianus ura3-株（RAK3605株）（Yarimizu T et al., Yeast 30:485-500(2013)）に導入した。導入方法は次のとおりである。
【００４０】
ＹＰＤ培地（２％ペプトン，１％酵母エキス，２％グルコース）２ｍＬで酵母を培養した。その培養液１．５ｍＬを１．５ｍＬチューブに取り出し、１分間遠心し、上清を捨てた。形質転換液（４０％ポリエチレングリコール，２００ｍＭ酢酸リチウム，１００ｍＭジチオスレイトール）２００μＬを加え、細胞を懸濁した後再び遠心し、上清を捨てた。形質転換液５０μＬを加え、ＤＮＡ断片各２μＬを加えて十分に混合し、４７℃の温浴槽で１５分インキュベートした。インキュベート後、滅菌水１５０μＬを加え、細胞を含む形質転換液をＳＤ−Ｕｒａ寒天培地（０．１７％ Yeast Nitrogen Base,０．５％硫酸アンモニウム，２％グルコース，０．００２４％ adenine sulfate，０．１％ L-Histidine HCl，０．２％ L-Leucine，０．１％ L-Lysine HCl，０．１％ L-Methionene，０．１％ L-Tryptphan，２％寒天末）に広げ３０℃のインキュベータで培養し、形質転換体（RAK11256株）を得た。
【００４１】
次に、クルイベロマイセス・マルシアヌスの活性酸素消去酵素をコードする遺伝子であるCTT1遺伝子（細胞質カタラーゼ遺伝子：KmCTT1）、CTA1遺伝子（ペルオキシゾームカタラーゼ遺伝子：KmCTA1）、CCP1遺伝子（チトクロムｃペルオキシダーゼ遺伝子：KmCCP1）の３つの遺伝子をそれぞれ発現させるために、上記で作製したRAK11256株が持つプラスミドp[KmCDC19p-yEmRFP-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]のyEmRFPを、以下に示すように、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子のコーディング配列と置換した。
【００４２】
上記で作製したRAK11256株が持つプラスミドp[KmCDC19p-yEmRFP-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]をテンプレートとして、プライマーに  KmCDC19-1c（配列番号１０）とURA3+771c（配列番号５）を用いて、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製) ９８℃ １０sec,６５℃ １５sec,６８℃ ６．０min，３０サイクル）によりＤＮＡ断片(URA3+771)c-KmCenD-KmARS7-ADE2-KmCDC19pを増幅した。活性酸素消去酵素をコードする遺伝子はK. marxianusの染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーには、KmCTT1遺伝子用に10CA-KmCTT1+1（配列番号１２）と3CG9-KmCTT1+1647c（配列番号１３）、KmCCP1遺伝子用に10CA-KmCCP1+1（配列番号１４）と3CG9-KmCCP1+1140c（配列番号１５）、KmCTA1遺伝子用に10CA-KmCTA1+1（配列番号１６）と3CG9-KmCTA1+1683c（配列番号１７）を用いて、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６５℃ １５sec，６８℃ ２．０min，３０サイクル）により増幅した。増幅した活性酸素消去酵素をコードする遺伝子は、それぞれのＤＮＡ断片をテンプレートとして10CA-KmCTT1+1（配列番号１２）、10CA-KmCCP1+1（配列番号１４）、又は10CA-KmCTA1+1（配列番号１６）とURA3771786taa-3CG9（配列番号９）をプライマーとしてＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６５℃ １５sec，６８℃ ２．０min，３０サイクル）を行い、10CA-KmCTT1-3CG9-URA3+772786、10CA-KmCCP1-3CG9-URA3+772786又は10CA-KmCTA1-3CG9-URA3+772786断片を増幅した。
【００４３】
(URA3+771)c-KmCenD-KmARS7-ADE2-KmCDC19pと10CA-KmCTT1-3CG9-URA3+772786、10CA-KmCCP1-3CG9-URA3+772786、又は10CA-KmCTA1-3CG9-URA3+772786とを混合し、K. marxianus ura3-株（RAK10063株）に上記の方法で遺伝子導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌスのCTT1遺伝子、CCP1遺伝子、CTA1遺伝子を発現するそれぞれの形質転換体（RAK11257株、RAK11258株、RAK11259株）を得た。
【００４４】
上記RAK10063株は以下の方法で得た。K.marxianus DMKU3-1042株にＵＶを用いて変異処理を行い、５−フルオロオロチン酸を含む培地で増殖できる株を取得した。ウラシル欠損培地での増殖欠損とウラシルだけを添加した最少培地での増殖から、ウラシル要求性株（RAK3606株; ura3-2）と決定した。次に、RAK4152株（ura3-1 ade2-2 [ScURA3],Yarimizu T et al., Yeast 30:485-500(2013)）とRAK3606株を２％グルコース培地で交配させ、最少培地で増殖する株（２倍体）を得て、１コロニーを選択した（RAK10054株）。選択したRAK10054株を胞子形成させ、５−フルオロオロチン酸を含む培地で増殖できる株を選択した。これらの株のウラシル欠損培地での増殖欠損とウラシルだけを添加した最少培地での増殖から、ウラシル要求性株を選択し、その１つとしてRAK10063株を得た。
【００４５】
さらに、コントロールとして、上記のp[KmCDC19p-yEmRFP-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]をテンプレートとして、プライマーにKmCDC19-1c（配列番号１０）とURA3+771c（配列番号５）、yEmRFP+1（配列番号７）とURA3772786taa-3CG9（配列番号９）をそれぞれ用いて、(URA3+771)c-KmCenD-KmARS7-ADE2-KmCDC19pとyEmRFP-URA3+772786 の２つのＤＮＡ断片を合成し、K. marxianus ura3-株（RAK10063株）に上記の方法で遺伝子導入し、形質転換体（RAK11653株）を得た。
【００４６】
なお、上記それぞれの形質転換体において、それぞれの遺伝子が導入されていることはＰＣＲを行い増幅したＤＮＡの長さを電気泳動することによって確認した。
【００４７】
得られた形質転換体RAK11257株、RAK11258株、RAK11259株、及びRAK11653株をそれぞれＳＤ−Ｕｒａ液体培地で１晩培養した前培養液を用いて、細胞濃度がＯＤ600＝０．０１となるように新しいＳＤ−Ｕｒａ液体培地５ｍＬに植菌した。これを、３０℃、３７℃、４０℃の各温度にて、７０ｒｐｍで振とう培養したときの６６０ｎｍの濁度の変化を経時的に測定した。
【００４８】
結果を図５に示す。図５において、横軸は培養時間（ｈ）、縦軸はＯＤ660の値である。図５に示すようにCTT1遺伝子、CCP1遺伝子、CTA1遺伝子を発現させたRAK11257株、RAK11258株、RAK11259株（図中、それぞれ+KmCTT1、+KmCCP1、+KmCTA1）においては、いずれの温度においてもコントロールとなる赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を発現させたRAK11653株（図中、Vector control）と比較して増殖しており、特に３７℃、４０℃において、ベクターコントロールは増殖能力が劣っているが、RAK11257株、RAK11258株、RAK11259株は、若干増殖開始時間が遅れるものの、３０℃とほぼ同様の増殖能力を有していた。したがって、クルイベロマイセス・マルシアヌスの活性酸素消去酵素をコードする遺伝子であるCTT1遺伝子、CCP1遺伝子、CTA1遺伝子をそれぞれ発現させることによって、クルイベロマイセス・マルシアヌスの耐熱性を向上させることが可能であることが明らかとなった。
【００４９】
（クルイベロマイセス・マルシアヌスにおけるCTT1遺伝子及びCTA1遺伝子の発現株とCTT1遺伝子及びCCP1遺伝子の発現株の作製）
宿主に K. marxianus ade2- ura3-株（RAK10330株）を用いて，複数の活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を発現させた。
【００５０】
上記で作製したRAK11256株が持つプラスミドp[KmCDC19p-yEmRFP-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]をテンプレートとして、KmCDC19-850（配列番号１８）とpKM100-URA3-229（配列番号１９）をプライマーに用いてＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６５℃ ３０sec，６８℃ ６min，３０サイクル）によりKmCDC19p-yEmRFP-URA3cを増幅した。KmCDC19p-yEmRFP-URA3cをK. marxianus ade2- ura3-株（RAK10330株）に上記の方法で導入し、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地で形質転換体（RAK11984株）を得た。
【００５１】
次に、上記で作製したRAK11257株が持つプラスミドp[KmCDC19p-KmCTT1-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]をテンプレートとして、KmCDC19-850（配列番号１８）とpKM100-URA3-229（配列番号１９）をプライマーに用いてＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６５℃ ３０sec，６８℃ ５min，３０サイクル）によりKmCDC19p-KmCTT1-URA3cを増幅した。かかるKmCDC19p-KmCTT1-URA3cをK. marxianus ade2- ura3-株（RAK10330株）に上記の方法で導入し、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地で形質転換体（RAK11985株）を得た。
【００５２】
上記RAK10330株は以下の方法で得た。RAK10063株とRAK4152株を２％グルコース培地で交配させ、最小培地で増殖する株（２倍体）を得て、１コロニーを選択した（RAK10287株）。次に、RAK10287株を胞子形成させ、ＹＰＤ培地でコロニーを形成させた。コロニーをいくつか選択し、それらの株のアデニン要求性及びウラシル要求性を調べ、アデニン要求性だけを示す株の１つをRAK10298株（ade2-2）とした。さらに、RAK10063株とRAK10298株を２％グルコース培地で交配させ、最小培地で増殖する株（２倍体）を得て、１コロニー（２倍体）を選択した。この株を胞子形成させ、５−フルオロオロチン酸を含む培地で増殖できる株を選択した。これらの株のアデニン要求性及びウラシル要求性を調べ、アデニン要求性とウラシル要求性の両方の要求性を示す株の１つとしてRAK10330株（ade2-2 ura3-2）を得た。
【００５３】
さらに、このRAK11985株に対して、KmCCP1遺伝子又はKmCTA1遺伝子を次のように導入した。テンプレートにKanMX遺伝子を用いて、KanMX-334（配列番号２０）とKanMX+801c（配列番号２１）をプライマーに、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，６０℃ ３０sec，６８℃ ３min，３０サイクル）により、KanMX遺伝子のＣ末端アミノ酸残基をコードする配列の一部を欠損したKanMXマーカー遺伝子、KanMX+801を増幅した。テンプレートに上記のp[KmCDC19p-KmCCP1-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]、プライマーにKanMX+802807TGA-KmCDC19-850（配列番号２２）と3CG9-KmCCP1+1140c（配列番号１５）、又は、テンプレートにp[KmCDC19p-KmCTA1-URA3c-KmCenD-KmARS7-ADE2]、プライマーに KanMX+802807TGA-KmCDC19-850（配列番号２２）と3CG9-KmCTA1+1683c（配列番号１７）を用いて、ＰＣＲ（PrimeSTAR GXL(Takara-bio社製)，９８℃ １０sec，５５℃ ３０sec，６８℃ ４min，３０サイクル）により、それぞれ、KanMX+802807TGA-KmCDC19p-KmCCP1又はKanMX+802807TGA-KmCDC19p-KmCTA1を増幅した。KanMX+802807TGA-KmCDC19p-KmCCP1とKanMX+801、又はKanMX+802807TGA-KmCDC19p-KmCTA1とKanMX+801をそれぞれ混合して上記RAK11985株に導入しＹＰＤ＋Ｇ４１８培地（YPD＋200μg/mL G418）で選択して、クルイベロマイセス・マルシアヌスのCTT1遺伝子及びCCP1遺伝子、又は、CTT1遺伝子及びCTA1遺伝子をそれぞれ発現するそれぞれの形質転換体（RAK11988株、RAK11989株）を得た。
【００５４】
また、上記のRAK11984株に対して、KanMX遺伝子を導入し、ＹＰＤ＋Ｇ４１８培地で選択して形質転換体（RAK11986株）を得た。
【００５５】
なお、上記それぞれの形質転換体において、それぞれの遺伝子が導入されていることはＰＣＲを行い増幅したＤＮＡの長さを電気泳動することによって確認した。
【００５６】
９６−マルチウェルプレートの各ウェルに１００μＬの−Ｕ液体培地をいれ、それぞれクルイベロマイセス・マルシアヌスのCTT1遺伝子のみを発現するRAK11985株とCTT1遺伝子及びCCP1遺伝子を発現するRAK11988株とCTT1遺伝子及びCTA1遺伝子を発現するRAK11989株とCTT1遺伝子、CTA1遺伝子、CCP1遺伝子のいずれも発現しないコントロールのRAK11986株を植菌し３０℃で１日培養した。撹拌後ＯＤ600を測定し、細胞濃度がＯＤ600＝１，０．１，０．０１，０．００１となるように滅菌水で希釈した。これら希釈液各８μＬをＳＤ−Ｕｒａ培地にスポットし、３０℃、４０℃の各温度で培養した。
【００５７】
結果を図６に示す。図中、３０℃、４０℃におけるそれぞれのスポットは左から順に細胞濃度がＯＤ＝１，０．１，０．０１，０．００１となるように滅菌水で希釈してスポットしたものである。図６に示すように、クルイベロマイセス・マルシアヌスのCTT1遺伝子及びCCP1遺伝子を発現するRAK11988株や、CTT1遺伝子及びCTA1遺伝子を発現するRAK11989株（図中、それぞれ「+KmCTT1,KmCCP1」、「+KmCTT1,KmCTA1」）においては、CTT1遺伝子のみを発現するRAK11985株（図中、+KmCTT1）と比較して４０℃においても増殖能力が高く、CCP1遺伝子又はCTA1遺伝子をCTT1遺伝子と共発現させることにより、CTT1遺伝子、CTA1遺伝子、CCP1遺伝子のいずれも発現しないコントロールのRAK11986株（図中、marker only）と比較して、相乗的にクルイベロマイセス・マルシアヌスの耐熱性を向上させることが可能であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５８】
［活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現によるザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の耐熱化］
（ザイモモナス・モビリスにおけるアルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子の発現株とスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子の発現株と鉄依存性ペルオキシダーゼ遺伝子の発現株の作製）
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）において、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の高発現による耐熱化を試みるため、Z. mobilisTISTR548株のゲノムを鋳型として、活性酸素消去酵素をコードする遺伝子であるアルキルヒドロペルオキシダーゼ（alkyl hydroperoxidase:AhpC）、スーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase:Sod）及び鉄依存性ペルオキシダーゼ（iron-dependent peroxidase:ZMO1573）遺伝子を、プライマーにそれぞれzmahpc-pdc-p-5’（配列番号２３）とzmahpc-3’（配列番号２４）(AhpC遺伝子増幅用)、sod-pdc-p-5’（配列番号２５）とzmsod-3’（配列番号２６）(Sod遺伝子増幅用)、zmo1573-pdc-p-5’（配列番号２７）とzmo1573-3’（配列番号２８）(ZMO1573遺伝子増幅用)を用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS(Takara-bio社製),９８℃ １０sec,５５℃ ５sec,７２℃ ２min,３０サイクル）により増幅した（図７）。これらの活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を恒常的に発現させるためにZ. mobilisTISTR548株のゲノムを鋳型として、pyruvate decarboxylase(Pdc)遺伝子のプロモーター領域を、プライマーにpdc-p-SalI-5’（配列番号２９）とpdc-p-zmahpc-3’（配列番号３０）（AhpC遺伝子との融合用）、pdc-p-EcoRV-5’（配列番号３１）とpdc-p-zmosod-3’（配列番号３２）（Sod遺伝子との融合用）、pdc-p-BamHI-5'（配列番号３３）とpdc-p-zmo1573-3’（配列番号３４）（ZMO1573との融合用）を用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS(Takara-bio社製),９８℃ １０sec,５５℃ ５sec,７２℃ ５０sec,３０サイクル）により増幅した。得られたそれぞれの遺伝子の増幅産物とプロモーター領域の増幅産物とをテンプレートとして、プライマーにpdc-p-SalI-5’（配列番号２９）とzmahpc-3’（配列番号２４）、pdc-p-EcoRV-5’（配列番号３１）とzmsod-3’（配列番号２６）、pdc-p-BamHI-5'（配列番号３３）とzmo1573-3’（配列番号２８）を用いてＦｕｓｉｏｎＰＣＲ（PrimeSTAR HS(Takara-bio社製),９８℃ １０sec,５５℃ ５sec,７２℃ ３min,３０サイクル）により、pdcプロモーターとそれぞれの活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を融合したＤＮＡ断片(Ppdc-ahpC、Ppdc-sod、Ppdc-zmo1573)を得た。上記配列番号２３〜３４の配列を表２に示す。
【００５９】
【表２】
0006474063.tif 000003
【００６０】
上記で作製したpdcプロモーターと活性酸素消去酵素をコードする遺伝子との融合断片、及び大腸菌とZ. mobilisのシャトルベクターであるpZA22を図７に示す制限酵素(Takara-bio社製) SalI (Ppdc-ahpC)、EcoRV/BamHI (Ppdc-sod)、BamHI/SalI(Ppdc-ZMO1573)で処理した後、ライゲーション（DNA Ligation Kit Ver.2.1(Takara-bio社製)）により連結し、大腸菌DH5α株を形質転換して終濃度１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール添加ＬＢ寒天培地に播いて３７℃で一晩、静置培養した。出現したコロニーの中からテトラサイクリン感受性株を選出した後、プラスミドを回収し、これを鋳型にしてプライマーにpdc-p-SalI-5’（配列番号２９）とzmahpc-3’（配列番号２４）、pdc-p-EcoRV-5’（配列番号３１）とzmsod-3’（配列番号２６）、pdc-p-BamHI-5’（配列番号３３）とzmo1573-3’（配列番号２８）を用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS(Takara-bio社製),９８℃ １０sec,５５℃ ５sec,７２℃ ３min,３０サイクル）によりpZA22への各活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の導入を確認した。これらの活性酸素消化酵素をコードする遺伝子が導入されたプラスミド（pZA-ahpC、pZA-sod、pZA-ZMO1573）とpZA22をそれぞれZ. mobilis TISTR548株にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、それぞれの形質転換体{TISTR548 (pZA-ahpC)、TISTR548 (pZA-sod)、TISTR548 (pZA-ZMO1573)、TISTR548 (pZA22)}を得た。なお、上記それぞれの形質転換体において、それぞれの遺伝子が導入されていることは、形質転換体からプラスミドを抽出しpZA22への活性酸素消去酵素導入時と同様にプライマーにpdc-p-SalI-5’（配列番号２９）とzmahpc-3’（配列番号２４）、pdc-p-EcoRV-5’（配列番号３１）とzmsod-3’（配列番号２６）、pdc-p-BamHI-5’（配列番号３３）とzmo1573-3’（配列番号２８）を用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS(Takara-bio社製),９８℃ １０sec,５５℃ ５sec,７２℃ ３min,３０サイクル）を行った後、電気泳動によって確認した。
【００６１】
上記活性酸素消去酵素をコードする遺伝子発現による耐熱性効果を確認する為に、得られた形質転換体を２ｍＬの終濃度１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール添加３％ＹＰＤ培地で一晩培養した前培養液を用いて、細胞濁度がＯＤ５５０＝０．０１になるように３０ｍＬの３％ＹＰＤ培地に植菌した。これを３０℃と４１℃で静置培養して本培養とした時の吸光度５５０ｎｍの細胞濁度の変化とＨＰＬＣによる培養液中のエタノール濃度測定を経時的に測定した。
【００６２】
結果を図８に示す。図８の上段（Cell growth）において、横軸は本培養の培養時間、縦軸は吸光度５５０ｎｍの細胞濁度を示す。また、図８の下段（Ethanol production）において、横軸は本培養の培養時間、縦軸はエタノール生産量を示す。図８に示すように、pZA-ahpC、pZA-sod、pZA-ZMO1573による形質転換株は、pZA22による形質転換株に比べて、４１℃の高温下での生育（増殖）能力とエタノール生産能力が高いことが明らかとなった。
【実施例４】
【００６３】
［活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現による大腸菌（Escherichia coli）の耐熱化］
（大腸菌におけるカタラーゼ遺伝子の発現株とスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子の発現株の作製）
Mobile Plasmidコレクション(Saka K. et al., DNA Res. 12:63-68(2005))のうち、大腸菌のカタラーゼ（KatEとKatG）をコードしているpNTRKATE、pNTRKATGと、大腸菌のスーパーオキシドディスムターゼ（SodA）をコードしているpNTRSODAと、コントロールとして空ベクターpNTR-SDとを大腸菌W3110にエレクトロポレーション法により導入し形質転換を行った。得られた形質転換体を２ｍＬの終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリン添加ＬＢ培地に植菌して一晩前培養を行った。前培養液の細胞濃度がＯＤ６００＝０．０１になるようにＬＢ培地で希釈した後、３０ｍＬの終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリン添加ＬＢ培地にＯＤ６００で濁度が０．００１になるように植菌して、３７℃、１００ｒｐｍの条件で本培養を行った。本培養開始６時間後に終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧ(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)を本培養液に加えて上記活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現を誘導し、その影響をＬＢ寒天培地上のコロニー数で測定することで検討した。なお、pNTRKATE、pNTRKATG、pNTRSODA、pNTR-SDの遺伝子型を表３に示す。
【００６４】
【表３】
0006474063.tif 000004
【００６５】
結果を図９に示す。図９の横軸は本培養の培養時間、縦軸は１ｍＬあたりのコロニー数を示す。図９に示すように、カタラーゼやスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子をクローン化して大腸菌に導入した株は、コントロールのpNTR-SDベクターを導入した株と比較して４７℃の高温下で増殖能力が高く、また、より長時間生存できることが明らかとなった。
【実施例５】
【００６６】
［活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の発現による酢酸菌の耐熱化］
（酢酸菌の活性酸素消去酵素をコードする遺伝子の同定）
一般的な酢酸菌の生育限界温度は３３℃程度であるが、日本の食酢醸造に使用されてきた酢酸菌アセトバクター  パスツリアヌス（Acetobacter pasteurianus）の生育限界温度は３８℃であり、この高い生育限界温度が日本の温暖な地域でさえも食酢醸造が可能であった１つの理由といえる。その準耐熱性酢酸菌であるAcetobacter pasteurianus（IFO3283-01:Ap01株）を元株として、４２℃まで生育が可能となった耐熱性酢酸菌Acetobacter pasteurianus IFO3283-01/42C（Ap01/42C株）を育種し、そのゲノムＤＮＡ配列を文献（Azuma Y. et al, Nucleic Acid Research 37(17):5768-83 (2009)）に記載の方法に従い、次世代ＤＮＡシークエンサーであるIllumia社HiSeqを用いて決定し、サンガー法によりその変異部位を同定した。
【００６７】
一方で、３０℃で培養した時に菌体内で蓄積するタンパク質プロファイルを２次元電気泳動により可視化した。元株であるAp01株のタンパク質プロファイルと比較し、Ap01/42C株で蓄積が著しい耐熱性関連タンパク質のアミノ酸配列を質量分析装置（AXIMA（登録商標） Resonance：島津製作所社製）によって同定した。同定した耐熱性関連タンパク質には活性酸素消去酵素が多数含まれていた。その活性酸素消去酵素のうち、配列番号３５〜３９に示すアミノ酸配列からなる５つの活性酸素消去酵素（アルキルヒドロペルオキシダーゼ(Alkylhydroperoxidase)、ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin）、ペルオキシレドキシン  レダクターゼ、スーパーオキシドディスムターゼ（Superoxide dismutase）、チオレドキシン（Thioredoxin）をコードする遺伝子（配列番号４０〜４４）をクローニングするために、各遺伝子に特異的なプライマー（表４）を作製した。
【００６８】
【表４】
0006474063.tif 000005
【００６９】
また、各活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む領域の配列を図１０〜１３に示す。図１０〜１３において、大文字が活性酸素消去酵素をコードする遺伝子であり、小文字がノンコーディング領域である。
【００７０】
（酢酸菌における活性酸素消去酵素遺伝子の発現株の作製）
Ap01/42C株のゲノムＤＮＡと表４に示すプライマーを用いてＰＣＲ法により標的遺伝子を増幅し、それぞれの遺伝子を、発明者らが自ら作製した複数のアンピシリン耐性遺伝子を含む大腸菌−酢酸菌シャトルベクターpAp01に導入した。得られたA. pasteurianusの活性酸素消去酵素をコードする遺伝子を含む４つの大腸菌−酢酸菌シャトルベクター、及び大腸菌−酢酸菌シャトルベクターコントロールを使って、表５に示す各酢酸菌を形質転換した。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
各酢酸菌の形質転換体をアンピシリン含有ＹＰＧＤ寒天培地上で、３日ごとに継代培養し、２週間安定して増殖する株を分離した。３０℃及び３４℃から１℃刻みで４１℃までの温度環境下での培養を実施し、各形質転換体の熱耐性を検討した。形質転換に使用した元株の生育限界温度よりも形質転換体の生育限界温度が１℃以上高くなったGluconacetobacter oxydans、Gluconacetobacter europaeus、Gluconacetobacter xylinusの形質転換株については、更にアンピシリン含有ＹＰＧＤ寒天培地上で耐熱性を再確認するとともに、アンピシリン含有ＹＰＧＤ液体培地でも耐熱性を確認した。同時に、各菌体内に含まれる導入遺伝子が、正しい大きさで維持されていることをＰＣＲにより確認した。
【００７３】
結果を図１４に示す。図１４（ａ）には、それぞれの位置で培養した形質転換体が発現する遺伝子を示す。図１４（ｂ）上段の結果から、Gluconacetobacter xylinusにThioredoxin（Ｔ）、PeroxiredoxinとPeroxiredoxin reductaseのオペロン（Ｐ）、Alkylhydroperoxidase（Ａ）を導入した株では、１℃程度の生育限界温度の上昇が確認された。図１４（ｂ）中段の結果から、Gluconacetobacter europaeusにAlkylhydroperoxidase（Ａ）を導入した株では、３℃程度の生育限界温度の上昇が確認された。図１４（ｂ）下段の結果から、Gluconacetobacter oxydansにThioredoxin（Ｔ）、PeroxiredoxinとPeroxiredoxin reductaseのオペロン（Ｐ）、Superoxide dismutase（SOD）を導入した株では、４℃程度の生育限界温度の上昇が確認され、Alkylhydroperoxidase（Ａ）を導入した株でも３℃程度の生育限界温度の上昇が確認された。なお、Gluconacetobacter xylinus、Gluconacetobacter europaeus、Gluconacetobacter oxydansの生育限界温度は３３℃である。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により、高温における増殖能力が向上した微生物を作製することが可能となることから、工業的な発酵生産分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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