(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多焦点多光子イメージングシステムであって、
多光子励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子及び試料を横切って前記複数の焦点を走査する走査素子を含む光励起経路であって、前記焦点生成素子は前記光励起経路に沿って前記走査素子に光学的に結合され、複数の走査焦点をレンズを介して選択可能な深度にて前記試料に伝送する、光励起経路と、
前記レンズ、ダイクロイック素子、前記試料内の前記複数の走査焦点からの蛍光放射を検出する複数の光電子増倍管素子を有する検出システムを含む光収集経路であり、前記光収集経路は、さらに、前記蛍光放射を前記検出システムに光学的に結合する複数のライトガイド素子を含み、前記レンズからの前記蛍光放射は、前記ダイクロイック素子によって前記光収集経路上に分離され、少なくとも１つの収集レンズを用いて前記複数のライトガイド素子に結合される、光収集経路と、
を備える、
システム。
【請求項２】
前記検出システムは、マルチアノード光電子増倍管（ＭＡ−ＰＭＴ）を有する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記複数のライトガイド素子は、放射された光を前記ＭＡ−ＰＭＴに連結する光ファイバを有し、前記光ファイバは、複数のスペクトルチャネルを検出すべく、前記ＭＡ−ＰＭＴの複数のチャネルに接続する、
請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数のライトガイド素子は、液体ライトガイドを含む、
請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記複数のライトガイド素子のそれぞれは、光ファイバを有する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記多光子励起ビームを生成する多光子光源をさらに備え、前記多光子光源はレーザを有する、
請求項１から５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記複数のライトガイド素子は、光を前記試料から各光電子増倍管素子に連結する複数の光ファイバをさらに有する、
請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
組織断面切断デバイスをさらに備える、
請求項１から７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
複数の異なる波長を検出する前記複数の光電子増倍管素子から、スペクトルデータを受信するデータプロセッサをさらに備える、
請求項１から８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記光励起経路に配置され、前記焦点生成素子から光を受信する光学素子をさらに備え、
前記光学素子は、前記焦点生成素子の色分散とは反対の色分散を導入し、
各光電子増倍管素子は、前記複数の焦点の位置のそれぞれに関して散乱分布に対応する収集エリアを有し、前記試料の各焦点から蛍光放射信号を検出する、
請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記走査素子は、回転ミラー又は共振ミラーを有する、
請求項１から１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記複数の光電子増倍管素子は、光電子増倍管素子のアレイを有し、
前記システムは、前記多光子励起ビームを生成するレーザを有する光源をさらに備える、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記光収集経路は、非デスキャン収集経路である、
請求項１から１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
多焦点多光子イメージングのための方法であって、
試料内の深度の関心領域を横切って複数の焦点を走査すべく走査素子を用いる段階であって、前記複数の焦点は、レンズを介して前記試料に結合される多光子の光励起経路に沿って焦点生成素子を使用して生成される、走査素子を用いる段階と、
複数の光電子増倍管素子を用いて前記関心領域の複数の焦点の位置からの光を検出して画像データを生成する段階であり、前記複数の焦点の位置は、前記関心領域を横切って走査されて、前記レンズを介して集光され、ダイクロイック素子を用いて光収集経路上に結合される蛍光放射を生成し、前記光収集経路は、前記複数の焦点からの前記蛍光放射を前記複数の光電子増倍管素子に結合された複数のライトガイド素子に結合する少なくとも１つの収集レンズを含む、画像データを生成する段階と、
を備える、
方法。
【請求項１５】
前記蛍光放射を前記複数の光電子増倍管素子に連結する光ファイバを有する前記複数のライトガイド素子を用いる段階をさらに備える、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記光ファイバのそれぞれは、各光電子増倍管素子と連結される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各ライトガイド素子は、放射された蛍光放射を各収集光学素子に連結する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料の一部を断面に切るべく組織断面切断デバイスを用いる段階をさらに備える、
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の光電子増倍管素子からスペクトルデータを受信するデータプロセッサを用いる段階をさらに備える、
請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
光電子増倍管素子のアレイを用いて検出する段階をさらに備え、
各素子は、複数の焦点の位置のそれぞれに関して蛍光放射の散乱分布に対応する収集エリアを有する、
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記走査素子は、回転ミラー又は共振ミラーである、
請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
データプロセッサ及びメモリに接続される前記複数の光電子増倍管素子のアレイを用いて検出する段階をさらに備える、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記焦点生成素子はマイクロレンズアレイ、回折光学素子、又は複数の照明用光ファイバである、
請求項１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第１アレイ及び第２アレイを含む前記アレイを用いて光を検出する段階をさらに備える、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
光源からの光を光ファイバデバイスを用いて前記走査素子に連結する段階をさらに備える、
請求項１４から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
イメージングシーケンスをシステムコントローラによって制御する段階と、
前記複数の光電子増倍管素子に接続されたデータ処理システムによってスペクトルデータを処理する段階と
をさらに備える、
請求項１４から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、又は、
誘導ラマン散乱プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、又は、
第２高調波生成プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、又は、
共焦点反射顕微鏡法システムによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、
請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］本願は、「多焦点多光子イメージングシステム及び方法」と題された米国仮出願番号第６１／９２０，６５４号（出願日：２０１３年１２月２４日）に対する優先権を主張し、これによりその全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
生物学者が直面する基本的且つ進行中の課題は、複雑な生体系の機能を理解することである。この課題に取り組むとき、その系の全体的な構造を知ることの重要性が、極めて重大であることが繰り返し分かってきた。ＤＮＡから生物全体に至る範囲の複数の例。ＤＮＡの二重らせんが発見されたことで、その複製機構がすぐに提案され、ポリペプチド鎖内のアミノ酸の２次元直鎖状配列の３次元配置が、酵素特異性の基礎を明らかにするのに不可欠になった。臓器の場合、基本的な構造単位及び遺伝子単位は細胞であり、その構成を正確に表現するには、臓器全体にわたる個々の細胞の３次元位置、体型測定、及び生化学的状態を解明することが必要である。残念ながら、全臓器の３次元細胞内画像を迅速に生成できるイメージングツールは存在しない。このことは、蛍光ベースの遺伝子導入モデルや標識プロトコルの急激な増加、並びに、ゲノムツール及びプロテオームツール全体の急速な発展が、次に表現型分類を必要とすることを特に考えると、生物医学の進歩に対する深刻な障害を表している。
【０００３】
２光子（又は多光子）励起イメージング、例えば、２光子顕微鏡法（ＴＰＭ）は、蛍光イメージング技術を利用しており、この技術によって比較的高いイメージング深度で生体組織を（生体内で）イメージングすることが有利に可能になる。概して、２光子励起イメージングは赤方偏移した励起光を利用して、試料に蛍光発光を誘起する（特に、赤外光を用いることで、組織内の散乱を最小限に抑える）。励起光の１つより多くの光子が吸収されて、励起状態に到達する。励起プロセスの非線形の特質に起因して、２光子励起イメージングは、固有の３次元断面切断、数百ミクロンの優れたイメージング深度、焦点領域外の最小の光退色、並びに、励起及び放射波長が広く分離していることから生じる優れた背景放射除去を有利に提供する。したがって、２光子励起イメージングは、そのより深い組織侵入、効率的な光検出、及び光毒性の減少によって共焦点顕微鏡法に対する優れた代替手段になり得る。２光子励起イメージングは生体外イメージングにとって重要な利点も提供する。光シート手法と異なり、２光子励起イメージングは不透明又は部分的に透明な試料でうまく働き、焦点領域外の光退色がほとんどない。さらに、対物レンズの光学系によってのみ制約される、小焦点深度を伴った広視野が用いられ得る。それに対して、光シートの共焦点パラメータは、視野を５００ミクロン未満に制限することが多く、この領域内でも、ｚ方向の照度プロファイルは２０ミクロン又はそれより大きくなり得る。
【０００４】
以前には、試料からの光が走査システムを通過した後に検出器に到達する「デスキャン」方法を、多光子イメージングが利用した。デスキャン手法は非デスキャン手法より大幅な改善を示したが、かなりの制約がまだ存在する。最初に、非近軸焦点において点広がり関数（ＰＳＦ）収差によって、視野は制限される。次に、励起光学系を通るデスキャンから、かなりの放射信号がある（例えば、７０％又はそれを超える損失）。また、高レーザ出力、及びこれによる高光子束が、ＭＡ−ＰＭＴの一般的なアノードに大電流をもたらし、その結果、ＰＭＴの飽和又は損傷を引き起こす。したがって、これらの制約及び他の制約に対処する、改善された多焦点多光子イメージングシステム及び方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の複数のシステム及び方法が、連続断面切断と併せて高速イメージングを実装し、多焦点多光子励起を利用して、例えば、臓器全体をミクロン単位の解像度で１日もしないうちに有利にイメージングする。このシステム及び方法は、深部組織イメージングのための多焦点、多光子顕微鏡法（ＭＭＭ）システムを用いて、長年にわたるいくつかの技術的課題を有利に克服し、生体外の全臓器イメージングに適している。全臓器を３次元（３Ｄ）で１ミクロンのＸＹ試料採取及び２ミクロンのＺ試料採取において１日もしないうちに蛍光的にイメージングする能力は、本明細書で説明される複数のシステム及び方法によって可能になるが、３Ｄの組織学に変革を起こすほどの影響を有し、神経科学及び他の分野において広範囲の用途を扱う研究者に重要なツールを提供する用意ができている。本開示の複数のシステム及び方法は、蛍光細胞内全臓器イメージングに利用可能な最高イメージング速度及び最高感度を提供する。さらに、本開示の複数のシステム及び方法は、とりわけ、中間光学系によって誘起される収差に起因して視野が制約される課題、及びデスキャン経路内の放射光子の損失に伴う課題を含む、既存の多焦点多光子イメージング技術に関連するいくつかの主要課題に対処する。
【０００６】
より具体的には、本開示の複数のシステム及び方法は、収差及び視野の制限を回避し、更に焦点間クロストークを最小限に抑える独自のインタレーススキャン方法を用いた高効率のファイバ結合検出を採用する非デスキャン検出を使用する、複数の励起方法を有利に実装し得る。したがって、本開示の複数のシステム及び方法は、以前の構成よりも８〜１２倍増加したイメージング速度をもたらし得る。さらに、非デスキャン検出を用いることで、デスキャン検出を用いる以前の構成に対して、収集効率の向上がもたらされる。本開示の複数のシステム及び方法の他の利点には、ＰＳＦ収差を最小にした広い視野、高い画像信号対ノイズ比（ＳＮＲ）、散乱環境の存在下においても隣接焦点間のクロストークの最小化、多重チャネル、例えば複数のスペクトルチャネルに対応（いくつかの例では、４つ又はそれより多くのスペクトルチャネルが存在し得る。また他の例では、最大１６又はそれより多くのスペクトルチャネルが存在し得る）、高画素滞留時間、焦点領域外の光退色の最小化、より大きい臓器に適合し易い、並びに、不透明な試料及び光学的に透明な試料の両方に対する適合性が含まれる。
【０００７】
複数の好ましい実施形態は、本明細書で説明される断面切断作業及びイメージング作業を実行するようプログラムされた自動制御及びデータ処理システムを利用する。複数のさらに好ましい実施形態は、コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱（ＣＡＲＳ）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）、第２高調波イメージング（ＳＨＧ）、及び共焦点反射顕微鏡法などのイメージング法を利用する。その結果として、多様なイメージング作業が、本明細書で説明される複数のシステム及び方法と併せて実行され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本開示に従って、連続断面切断処理を用いる多光子イメージングシステムの例を図示する。
【０００９】
【図２】本開示に従って、（ｉ）単一の焦点がイメージングプレーン内に生成される、及び（ｉｉ）複数の焦点がイメージングプレーン内に生成されるイメージングシステムの例を図示する。
【００１０】
【図３】本開示に従って、非デスキャン及びデスキャン収集経路の両方を含む多焦点多光子イメージングシステム例を図示する。
【００１１】
【図４Ａ】本開示に従って、多焦点多光子イメージングシステムのレイアウト例を図示する。
【００１２】
【図４Ｂ】本開示に従って、連続２光子断層顕微鏡のレイアウト例を図示する。
【００１３】
【図４Ｃ】本開示に従って、多焦点多光子イメージングのための励起スキームの例を図示する。ここで焦点生成素子は走査素子の下流にある。
【００１４】
【図５】本開示に従って、（ｉ）図１の構成、及び（ｉｉ）図３の構成のそれぞれに対する収差のＺＥＭＡＸシミュレーションを図示する。
【００１５】
【図６】本開示に従って、液体ライトガイド（ＬＬＧ）への蛍光信号の結合例を図示する。
【００１６】
【図７】本開示に従って、隣接する領域が順次走査されるインタレーススキャン方法の例を図示する。
【００１７】
【図８】本開示に従って、４チャネル検出用のＰＭＴ構体の例を図示する。
【００１８】
【図９Ａ】本開示に従って、走査ミラーの配置を検出するためのレイアウト例を図示する。
【図９Ｂ】本開示に従って、走査ミラーの配置を検出するためのレイアウト例を図示する。
【００１９】
【図１０Ａ】本開示に従って、回折光学素子を用いことにより生じうる色収差の例を図示する。
【００２０】
【図１０Ｂ】本開示に従って、屈折率ｎ１、ｎ２、ｎ３、及びアッベ数ｖ１、ｖ２、ｖ３を有し、色収差を補償するのに用いられ得る光学素子の例を図示する。
【００２１】
【図１１Ａ】本開示に従って、様々な種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１１Ｂ】本開示に従って、様々な種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１１Ｃ】本開示に従って、様々な種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１１Ｄ】本開示に従って、様々な種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１１Ｅ】本開示に従って、様々な種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【００２２】
【図１２Ａ】本開示に従って、さらなる種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１２Ｂ】本開示に従って、さらなる種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【図１２Ｃ】本開示に従って、さらなる種類の検出構成のレイアウト例を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
多焦点多光子イメージングシステム及び方法が本明細書に提供され、これらにより、既存システムの収差及びさらに多くの視野制限を回避する励起システムが有利に実装される。本開示に従って、システム例は、焦点間クロストークを減少させるインタレーススキャンを伴う高効率ファイバ結合検出を利用する非デスキャン検出システムを含み得る。
【００２４】
自動制御、及び全臓器などの組織のデータ処理のための多光子イメージング及びシステムに関するさらなる詳細が、ＰＣＴ公開第２００６／１２７９６７号（出願日：２００６年５月２５日）に説明され、「Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に向けられている。本開示も、米国特許公開第２０１３／０１４２４１３号（出願日：２０１２年１２月２６日）に説明され、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」に向けられている、イメージング、プロセス制御、及びデータ処理作業を基礎にして、それらを関連させる。前述のＰＣＴ公開及び米国特許公開の内容全体は、これにより参照によって組み込まれる。これらのシステムは、組織の自動断面切断を分光イメージング及び分光検出と組み合わせて利用し、その後の処理及び画像解析のために組織アトラスを生成する。
【００２５】
２光子励起イメージングは、散乱組織の深さ数百ミクロンをイメージングすることができるが、不透明な臓器全体をイメージングすべく数センチメートルにわたってイメージングすることはできない。一連の断面をイメージングするために、寒天を埋め込んで固定されたマウスの臓器が、ＴＰＭシステムの対物レンズの下の統合Ｘ−Ｙステージ上に配置され、自動画像取得のためにイメージングパラメータが入力される。これらが一旦配置されると、器械は完全に自動的に有利に働き得る。図１に図示されるように、まず段階１１０において、ｘ−ｙ−ｚステージ２０によって試料１０が対物レンズ３０の下に移動させられる。これにより、光学的断面（又は光学的ｚスタック）が、視野のモザイクとしてイメージングされる。次に、試料は移動させられ（段階１２０）、組み込みの振動刃ミクロトームが、試料１０の上面から試料断面を機械的に切断する（段階１３０）。試料中をくまなくステッピングさせながら（段階１２０）試料の完全なデータセットが収集されるまで、光学的切断（段階１１０）及び機械的切断（段階１３０）を重ね合わせる段階が、その後連続的に繰り返される。したがって、共に記録される異なる複数の層からの画像のための隣接する複数の薄片の間に十分な重なりを有する状態で、臓器イメージングシーケンスは臓器中をくまなく進行する。特に、組織が切断される前に組織をイメージングすることで、大幅に向上した忠実度が提供され、組織が切断された（したがって歪められた）後に組織をイメージングする標準的な組織学的切断に関する複雑な状況が回避される。
【００２６】
ＴＰＭを用いた連続断面切断はロバストであることが分かったが、単一点スキャンの速度制約によって、高スループット用途ではイメージング速度がネックになり得る。取得速度を増大させるべく、様々な方法が導入されてきた。１つの解決手段は、多角スキャナ又は共鳴スキャナを用いて、単一の焦点を迅速に走査することである。しかしながら、この解決手段は、少数の光子／画素によって短画素滞留時間をもたらし、これにより不十分なコントラストにつながる。ＭＭＭ手法では、小型レンズアレイ又は回折光学素子が用いられ、イメージングプレーン内に複数の焦点を生成する。例えば、図２を参照されたい。左側にはフルオレセイン溶液に単一の焦点があり、右側には４×４の焦点のアレイが図示されている。有利なことに、複数の焦点は並列に走査されて、フレームレートを増大させ得る。
【００２７】
図３を参照すると、小型レンズアレイ３１０又は回折光学素子が用いられ、イメージングプレーン内に複数の焦点３２０を生成する。複数の例において、これらの焦点は（走査ミラー３３０を用いて）並列に走査され得て、非デスキャン経路３５０に沿って蛍光光子を検出すべくＣＣＤカメラ３４０又は他の検出手段が用いられ得る。しかしながら、この方法はいくつかの制約を生じさせ得る。不透明な試料をイメージングするとき、放射光子は隣接する複数のＣＣＤ画素に散乱し得て、イメージング深度は非常に制限されるようになり得て、５０ミクロン未満になることが多い。
【００２８】
さらに図３を参照すると、散乱の問題に取り組む１つのやり方は、デスキャン検出構成を用いることであり、これは、例えばマルチアノード光電子増倍管（ＭＡ−ＰＭＴ）検出器３６０又は他の検出器をデスキャン経路３７０に沿って利用する。複数の走査焦点３２０は、その複数の焦点と同じ構成を表し得るＭＡ−ＰＭＴ検出器３６０の方へ戻るように方向付けられた（例えば、４×４マルチアノードＭＡ−ＰＭＴアレイの方へ方向付けられた４×４焦点のアレイ）。図３はデスキャン構造を例示する。ここでは、放射光子が入射レーザ光と同じ経路３７０に沿って戻り、走査ミラー３３０を通過した後にダイクロイック素子３８０で分割され、ＭＡ−ＰＭＴ検出器３６０の方へ方向付けられる。各アノードの広い面積で、散乱した放射光子は指定されたチャネルに収集されるため、散乱の影響は抑制され、高い信号対ノイズ比（ＳＮＲ）がもたらされる。
【００２９】
本明細書で説明されるように、図３に示されるデスキャンＭＭＭシステムの考えられる制約は、低いＦ値の中間光学系Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４により誘起される収差によって、イメージング視野が制限されることである。特に、励起ビームが小型レンズアレイ３１０を通過した後、そのビーム径は小さい走査ミラーに適合すべく縮小させられ、その後、対物レンズの後方開口部をはみ出して満たすように再拡大させられる。したがって、図３の光学系Ｌ２及びＬ３は特にＦ値が劣るけれども、特に端の焦点では大きな収差を生成する。このことが、最終的な有効視野を制限し得る。縮小及び拡大による収差を軽減すべく、より大きいサイズの走査ミラーが利用可能であるが、これらのミラーは概して高速走査に十分な帯域幅が無い。さらに、複数の走査ミラーの間がより広く分離していると、走査面積全体にわたり不均一な励起レーザ出力を生成し得る。
【００３０】
図４Ａは、多光子、ＣＡＲＳ、及びＳＨＧ顕微鏡法などの非線形光学顕微鏡法に用いられ得る、高速連続断層顕微鏡のブロック図を示す。本開示に従って、好ましい一実施形態は、多焦点多光子イメージングシステム４００に関する。本明細書で説明されるように、多焦点多光子イメージングシステム４００の一例は、高速連続２光子断層顕微鏡として構成され得る。多焦点多光子イメージングシステム４００は、電磁放射の光源４１０、走査素子４２０、及び焦点生成素子４３０を含む。光源４１０から試料４５０までの光励起経路４４０は、励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子４３０と、試料４５０を横切って焦点を走査する走査素子とを含む。多焦点多光子イメージングシステム４００のこの例では、焦点生成素子４３０は光励起経路４４０に沿って走査素子４２０から光を受信する。１又は複数の光学素子４６０は、光励起経路４４０に沿って配置され得る。また、図４Ａに図示されるように、光収集経路４７０は、試料４５０からの蛍光放射を検出する検出器４８０を含む。図４Ａのこの例において、多焦点多光子イメージングシステム４００のレイアウトは、複数の作業ユニットに分割され、顕微鏡のモジュール式の特質を反映している。本明細書で説明される原則に従って、システムの個々の作業ユニットにカスタマイズされた複数の変更が行われ、残りの光学系には最小の調整が成され得る。イメージングシステム４００は、組織のイメージングをより効率的に行うべく、光源、スキャナ、検出器、移動ステージ、及び他の可動又は動的な作業ユニットの自動化されたコンピュータ制御の作業を含み得る。本明細書で概して説明されるように、画像データを処理すべく、データプロセッサが検出器に接続される。制御システム及びデータプロセッサは、メモリに格納されたソフトウェアに応答して動作可能であり、複数のイメージングパラメータを自動的に選択し、本明細書で説明される選択された事前設定処理動作に従って画像処理を実行する。
【００３１】
図４Ｂは、本開示に従って、連続２光子断層顕微鏡として構成された多焦点多光子イメージングシステム８００の一例のブロック図を示す。多焦点多光子イメージングシステム８００は、電磁放射の光源８１０、走査素子８２０、及び焦点生成素子８３０を含む。光源８１０から試料８５０までの光励起経路８４０は、励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子８３０と、試料８５０を横切って焦点を走査する走査素子とを含む。多焦点多光子イメージングシステム８００において、焦点生成素子８３０は光励起経路８４０に沿って走査素子８２０から光を受信する。１又は複数の光学素子８６０は、光励起経路８４０に沿って配置され得る。また、図４Ｂに図示されるように、光収集経路８７０は、試料８５０からの蛍光放射を検出する１又は複数の検出器８８０を含む。図４Ｂのこの例において、多焦点多光子イメージングシステム８００のレイアウトは、複数の作業ユニットに分割され、顕微鏡のモジュール式の特質を反映している。
【００３２】
図４Ｂに示されるように、光源８１０からの励起光は適切に配置された走査素子８２０に入射し、これにより、走査素子８２０はビームを偏向させて、水平方向（Ｘ−Ｙ）の平面内を試料８５０を横切って走査させる。図４Ｂの非限定的な例は、単一の次元に沿って光を走査するよう実装され得る単一の走査素子８２０を示す。別の例では、少なくとも２つのそのような走査素子８２０が、多次元走査に用いられ得る。試料８５０も、走査素子８２０の例に関するミラーの走査と併せて走査され得る。
【００３３】
また、図４Ｂに示されるように、多焦点多光子イメージングシステム８００の例は光リレー８９０を含む。励起光は、走査素子８２０から光リレー８９０まで続き得て、光リレー８９０は励起光ビームを拡大又は縮小するよう構成される。励起光は、入射光ビームを複数のビームに分割する焦点生成素子８３０（ビーム分割デバイスとして構成される）を通過する。各ビームは、ユーザによって前もって又はリアルタイムに決定され得る角度で広がる。このビーム分割デバイスは、広がり角度、焦点の数、各焦点をオンにするか（すなわち、試料において蛍光放射をもたらす）オフにするか、のうち１又は複数の制御を容易にすべく、パッシブ又はアクティブであるよう構成され得る。様々な例において、焦点生成素子８３０は、限定されないが、回折光学素子、ホログラフィック素子、又は空間光変調器など、多くの異なる種類のビーム分割要素であり得る。励起光の複数のビームは、対物レンズＬ３の後方開口部上にビーム分割デバイスをイメージングする光学トレイン（Ｌ１及びＬ２）として形成される１又は複数の光学素子８６０通って続く。励起光の複数のビームは、励起光を信号光から分離するダイクロイック９００を通過し得る。この場合、ダイクロイックは励起光を対物レンズ（Ｌ３）の方へ反射し、様々なビームが試料上に焦点を合わせる。複数の焦点が走査素子８２０を用いて試料８５０に沿って走査されるとき、信号は複数の焦点から生成される。信号は伝搬し対物レンズＬ３を通って戻り、ダイクロイック９００及び検出光学系９１０を通過してから、１又は複数の検出器８８０上に投射される。
【００３４】
複数のスポットを有する利点は、これによりシステムのスループットが上がるということである。この並列化は、画素当たりの滞留時間が長い、時間がかかる処理の場合に大きな利点になる。そのような複数の例は、緩和がミリ秒のオーダにであるリン光寿命イメージング又は蛍光寿命イメージングを含み、広い面積を点走査するには時間がかかりすぎる。このことは、所望のタンパク質の発現、従って蛍光信号が弱い状況では特に重要である。
【００３５】
図４Ｃを参照すると、励起システム１０００の例が、図４Ａ及び図４Ｂのシステム例と同様に図示される。この励起システム１０００は、Ｆ値が劣る課題を有利に回避するが、小さく高速なミラー並びに非デスキャン構成をまだ可能にする。励起システム１０００は、回折光学素子（ＤＯＥ）として図示される焦点生成素子１０１０の前に走査素子１０３０を有利に配置するが、ビームスプリッタ又は小型レンズアレイを代替的に含み得る。ダイクロイック素子１０８０は、光学系Ｌ４と対物レンズ１０９０との間に位置し、これにより、放射光子は比較的短い経路長を介して検出器１０６０（ＭＡ−ＰＭＴとして図示される）に到達し得る。
【００３６】
走査素子１０３０が励起経路において焦点生成素子１０１０の前にあるので、レーザビーム径（およそ２．５ｍｍ）は最小化されたままにすることができ、したがって高速で小さい（４ｍｍ未満、好ましくは約３ｍｍ又はそれより小さい）走査ミラーを用いることが可能となる。走査ミラーを通過した後に初めてレーザビームは、レンズペアＬ１及びＬ２を用いて（図示された例では、４つのＦレンズシステムを形成する）、焦点生成素子１０１０全体を満たすように拡大される（図示された例では、２３ｍｍの最大ＤＯＥ径）。図示されるように、焦点生成素子１０１０は走査素子１０３０の共役面にあり、したがって入射角が異なるだけであることに留意されたい。  焦点生成素子１０１０の後に、レーザビームは対物レンズ１０９０の後方開口部を僅かにはみ出して満たすように（第２のレンズペアＬ３及びＬ４を用いて）再度拡大される。この段階的なビーム拡大により、問題の対物レンズ１０９０に関する全てのＦ値は許容可能な範囲を保っている。
【００３７】
例示するように表１は、図３の光学系と、２０倍対物レンズ（Ｗプランアポクロマート、ＮＡ：１．０、Ｚｅｉｓｓ、ソーンウッド、ニューヨーク州）の全視野（試料面において１ｍｍ径）を実現するのに用いられ得る図４Ｃの光学系とにおいてＦ値を比較している。図４Ｃの光学系は、約８００μｍ×８００μｍの走査面積を提供する。概して、シングレットレンズには少なくとも１０のＦ値、ダブレットレンズには５より大きいＦ値が推奨される。図３の構成では、光学系は２つの非常に低いＦ値（レンズ素子Ｌ２及びＬ３）を必要とし、これにより、より大きい収差がもたらされる。それに対して、図３の構成に対する最も低いＦ値は５．９である。ここでＬ１は、５．９のＦ値を容易に提供できるシータレンズであり、Ｌ３はダブレットである。
【表１】
0006596001.tif 000002
【００３８】
図５に最初のＺＥＭＡＸシミュレーションが示され、ここには、図４Ｃの構成が図３の構成よりもかなり低い収差を提供することが示されている。有利なことに、図４Ｃの構造は低いＦ値を回避し、わずかな収差しか発生させない。収差係数は計算され、スポット図がエミュレートされた。収差係数が改善されると、二乗平均平方根（ＲＭＳ）半径は３倍以上小さくなり、はるかに効果的な２光子励起をもたらす。このシミュレーションは、８×８アレイの角の焦点という最悪ケースに関して行われたことに留意されたい。非球面光学素子を使うと、さらなる改善が実現され得る。
【００３９】
放射経路を参照すると、本明細書に示されるように、非デスキャン検出の１つの難点は、イメージングプレーンにおいて蛍光信号がもはや定常ではないということである。ＣＣＤ又はＣＭＯＳイメージングデバイスを用いるとき、イメージングプレーン上の信号の移動（焦点の移動に起因）は容易に説明されるが、さらに大きい課題がＰＭＴ検出及びＭＡ−ＰＭＴ検出に示される。ＭＡ−ＰＭＴの各アノードが比較的広い面積を有していても、複数の焦点が対物レンズのオブジェクトプレーン内を走査されるとき、イメージングプレーン内の隣接する複数のＰＭＴ画素に放射光子が散乱することがあり、特にＰＭＴ画素の端に近いところではそうなる可能性がある。さらに、ＭＡ−ＰＭＴには各画素を取り囲む不感領域があり、これにより、未補正の場合には画像内に空白領域がもたらされる。これに関しては、原理上は、蛍光がＰＭＴ画素の中央部に焦点を合わされたままにさせるための小型レンズアレイ又は非結像コレクタのアレイを配置することで対処し得る。しかしながら、この対処によって光学的クロストークが光子を散乱させるのを防ぐことができず、ＭＡ−ＰＭＴによる電子的クロストークの発生も防ぐことができないので、まだ理想的とは言えない。生体外の全臓器イメージングにとってさらに厄介なのは、高光子束が予期される場合、ＭＡ−ＰＭＴデバイスは、シングルＰＭＴと同じ電流制限を有することだが、この電流制限はいくつかの焦点の間にすぐに広がるはずである。したがって、検出器の飽和は現実の問題になる。
【００４０】
これらの全ての問題を解決すべく、複数のシステム及び方法の例が、（ｉ）区域ごとのインタレーススキャンを利用して光学的クロストークを除去することを可能にする、（ｉｉ）検出光の光ファイバ結合を焦点１つ当たりに利用して焦点ごとに１つのシングルＰＭＴを用いることを可能にする、検出を実装する。有利なことに、光ファイバは立体的な制約を克服する。さらに、この検出システムは、光学的クロストークの大幅な減少、並びに、検出器の電子的クロストーク及びデッドスペースの除去をもたらす。収集効率も増加し（実際に、収集効率は通常の空気結合検出より優れる）、ライトガイドを通過した後に光をランダム化することによって、より良好なスペクトル識別が実現される。光ファイバを用いることで、高いモジュール性、及びイメージングユニット自体から離れた検出器の使いやすい配置も可能になる。最後に、この検出システムによって、焦点ごとに、スペクトルチャネルごとに、シングルＰＭＴを用いることが可能になるので、ＭＡ−ＰＭＴの電流飽和はもはや問題ではない。
【００４１】
ＴＰＭシステムで蛍光信号を結合するファイバは、空気結合検出と比較して、これまで非効率的だとみなされていた。しかしながら、高開口数（ＮＡ）、低倍率の対物レンズを有する大口径コア光ファイバ蛍光検出は、収集効率に関して、従来の空気結合検出スキームに勝る大幅な改善を示す。例えば、Ｍａｔｈｉｅｕ  Ｄｕｃｒｏｓ他による次の論文を参照されたい。「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆｉｂｅｒ−ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ  Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｕｎｍｉｘｉｎｇ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８，  ｎｏ．  ２  （Ｊｕｎｅ  １５，  ２０１１）：  １７２−１８０，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｎｅｕｍｅｔｈ．２０１１．０３．０１５．具体的には、光ファイバを対物レンズの近くに配置し、ＡＲコーティング及び液浸油結合を活用して、インデックスの不整合を減少させることにより、標準的な空気結合経路の７倍の改善となる高い収集効率が達成可能である。さらに、ファイバ内のモードスクランブルによって、空間不均質性の検出感度はそれ自体を相殺して、スペクトル識別の改善をもたらす。ＡＲコーティング及び液浸油結合を利用するファイバは、本明細書では液体ライトガイド（ＬＬＧ）とも称される。
【００４２】
図６は、蛍光信号を液体ライトガイド（ＬＬＧ）に結合した例を図示する。具体的には、光学レイアウト２０００の放射経路例が左側に図示され、レンズ２０１０は液体ライトガイド（２０２０）上に放射光の焦点を合わせる。液体ライトガイド接続部２５００の詳細な描写が右側に図示される。具体的には、接続部はＡＲコーティングされたウィンドウ２５１０を含み、ウィンドウ２５１０は、インデックスがＬＬＧ２０２０の入力部に適合する油２５２０に連結される。損失は０．４％未満であることが示された。
【００４３】
本開示の複数のシステム及び方法は、１×Ｎ配置の焦点を、１×Ｎアレイのファイバ、例えばＬＬＧに結合することを可能にするインタレーススキャン方法を有利に実装し得る。図７はインタレーススキャン方法の例を説明する。ここでは、ＬＬＧの焦点上に放射光子を再配置すべく放射経路内に追加の可動ミラーを用いることにより、又は試料を対物レンズの下に物理的に移動させることにより、隣接する領域が順次走査される。１つ１つのインタレーススキャンには、半分の時間がかかるので、インタレーススキャンを行う際の性能低下はほとんどない。この方法は、光子散乱クロストークを減少させ、ＬＬＧを配置する立体空間を提供する。図示されるように、領域Ｓは対物レンズのオブジェクトプレーン内の現在走査されている領域を表し、領域ＮＳは前に走査された、又は次に走査される領域を表す。複数のファイバＦは、散乱光子をさらに良くキャプチャすべく、選択された走査領域Ｓより意図的に大きくしていることに留意されたい。
【００４４】
図７から分かるように、複数のファイバＦは水平、つまり遅軸Ｙ走査方向の走査領域を扱うが、速軸Ｘ走査方向は扱わない。一手法は、画像をＸ方向に縮小する／焦点を合わせる。これは、放射経路に円柱レンズを用いることで行われ得る。例えば、オリンパスのＮＡが１．０の２０倍レンズ、これは９ｍｍの前面焦点距離を有し２００ｍｍのチューブレンズを伴うが、これを結合するとき、システムは高さ１７．６ｍｍの画像を生成する。例えば、１つ１つの走査は２．５ｍｍの高さを有する。４ｍｍのコア中央部を持つファイバが、各走査領域上で利用され得る。Ｘ走査を縮小すべく、８０ｍｍの焦点距離（４０ｍｍの有効焦点距離）を持つダブレットの２つの円柱レンズが、５倍の縮小率を得るのに用いられ得て、ｘ軸に１７．６ｍｍ／５＝３．５ｍｍの縦方向の広がりを与える。これは４ｍｍのライトガイド入力部に適合し得る。図示された例では、全ての焦点を一度に単一の光ファイバ構体上に集めるのに単一のレンズ（円柱ダブレット）が用いられるが、矩形円柱レンズ又は斜めのミラーを用いることも可能であり、これにより、各焦点からの蛍光は各ファイバ上に個別に集められ、例えば、ファイバ及び下流側の光学系の倍率及び配置に広い柔軟性を持たせることが可能になることに留意されたい。
【００４５】
図８は、単一のファイバＦからの４チャネル検出（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、及びＣ４）用のＰＭＴ構体例を例示する。ファイバＦ内のモードスクランブルによって、ファイバＦの出力は入力入射角と無関係であり、スペクトル的に４つのＰＭＴに分割される。例えば、光は６２０、５８０、５４０、及び５００ｎｍにおいて分割され、これらの波長で４チャネル検出を提供した。
【００４６】
図９Ａ及び図９Ｂ示されるように、走査素子４２０、８２０又は１０３０のうち任意の１又は複数を含む本開示による走査素子のいかなる例も、試料を横切る焦点の走査を容易にすべく、１又は複数の走査ミラー３０１０含み得る。走査ミラーの配置（位置又は方向を含む）は、走査ミラーが画像の再構成に影響を及ぼし得る機械的な誤差を受けやすいので、知られているものとする。一例では、１又は複数の走査ミラー３０１０の配置（位置及び／又は方向など）は、走査ミラーの背面に方向付けられるレーザのビーム３０２０を用いて決定され得る。１又は複数の走査ミラー３０１０の前面は、前述の部分において説明された励起光経路にある。ビーム３０２０の偏向はセンサ３０３０を用いて検出され得る。ビーム３０２０は１又は複数の走査ミラー３０１０から偏向されるので、センサ３０３０の検出器はビーム３０２０の移動に適合するのに十分な大きさである。検出器は、十分に高い解像度を有するようにも構成され（限定されないが、ＣＣＤ又はリニアＣＣＤなど）、ビームの位置を決定し得る。図９Ａは、１又は複数の走査ミラー３０１０が走査を実行するときに起こり得るビーム３０２０の偏向を例示する。図９Ｂの例において、ビーム３０２０の焦点を絞り、１又は複数の走査ミラー３０１０の位置検出を改善するのに１つのレンズが用いられ得る。
【００４７】
本明細書のいかなるシステム実装例においても、焦点生成素子は回折光学素子であり得る。回折光学素子は、光を所望される次数に回析させることで働き、ビーム分割素子として用いられ得る。しかしながら、回折光学素子は、回折光学素子に入射する光の波長に敏感であり得る。概して、回折角は次の回析格子方程式に従う。
【数１】
0006596001.tif 000003
【００４８】
θｉ、θｄはそれぞれ入射角及び回折角であり、ｍは回折次数であり、λは入射光の波長であり、Ｇは格子周波数の尺度となる格子定数である。図１０Ａは、色補正光学系を使わずに回折光学素子（ＤＯＥ）例を用いた結果として起こり得る色収差を例示する。回折角の波長依存性は、色収差をもたらし得る。この収差を補正することで、システムの性能向上が促進され、より良い画像が提供され得る。それは、（ｉ）画像の解像度は画像全体にわたって均一でないことがあるが、収差に起因して画像の端に向かって低下し得る、（ｉｉ）２光子励起の効率は焦点における分散の結果として低下する、（ｉｉｉ）複数の波長（限定されない、８００ｎｍ及び１０６４ｎｍなど）を用いるとき、又は複数の励起ビームの重なりが１つの要因となる状況において（例えばコヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱（ＣＡＲＳ）、ポンププローブ分光法、ＳＲＳ、及び／又は、和周波発生において）、共局在化分析を実行することが可能であることを確実にする、という理由からである。
【００４９】
色収差を補償して解像度を最大化するよう構成された多焦点多光子イメージングシステムの例が本明細書に提供される。一例において、１又は複数の光学素子が励起光経路に沿って用いられ得る。１又は複数の光学素子は、回折光学素子により生成される色分散と等しく且つそれと反対の色分散を導入する。一例において、１又は複数の光学素子は、回折光学素子と対物レンズとの間の中間光学系において、光パワーとレンズの種類を慎重に選択することによって構成され得る。一例として、図１０Ｂは、色収差を補償すべく、屈折率ｎ１、ｎ２、ｎ３、アッベ数ｖ１、ｖ２、ｖ３を有する１又は複数の光学素子４０１０（限定されないが、異なるレンズの種類など）の使用例を図示する。１又は複数の光学素子４０１０の異なる分散及び光パワーにより、全ての色が焦点で重なり得るようにして色収差は減少する、又は除去される。
【００５０】
共焦点反射顕微鏡法を実行するよう構成され得る多焦点多光子イメージングシステムの例が本明細書に提供される。追加構成要素が用いられ、システムが共焦点反射顕微鏡法を実行することを可能にし得る。共焦点反射顕微鏡法は、試料からの反射光を検出することで働く。これは、システムを通って戻ってくる反射光をピックオフすることで行われ得る。この変形を伴った多焦点多光子イメージングシステムが、共焦点反射顕微鏡法に用いられ得る、又は試料面を検出することに用いられ得る。
【００５１】
本開示による実装例において、多焦点多光子イメージングシステムの例は複数の検出素子で構成され得る。例えば、図４Ｂの多焦点多光子イメージングシステム８００の例では、１又は複数の検出器８８０は複数の検出素子であり得る。図４Ａ〜図４Ｃに関連して説明されるのと同様に、光励起経路は、励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子と、試料を横切って焦点を走査する走査素子とを含む。図４Ｂに図示されるように、焦点生成素子は走査素子から励起経路に沿って光を受信する。この実装例では、光収集経路は、試料からの蛍光放射を検出する複数の検出素子と、複数の収集光学素子とを含み得る。複数の収集光学素子の各収集光学素子は蛍光放射の光を複数の検出素子の各検出素子に連結する。非限定的な例示として、検出光学系９１０は、焦点からの信号を検出素子上に集める光学レンズを含み得る。検出素子は、限定されないが、画像を形成すべく信号を受信して出力を提供するマルチアノード光電子増倍管など、個々の検出器の１次元又は２次元アレイであってよい。非限定的な例示として、各焦点がそれぞれの検出素子にマッピングされるようにして、多焦点多光子イメージングシステムの例が構成され得る。
【００５２】
図１１Ａ〜図１２Ｃは、多焦点多光子イメージングシステムの例が複数の検出素子と複数の収集光学素子とを含む、様々な構成例を図示する。
【００５３】
図１１Ａ〜図１１Ｅは、様々な種類の検出モードの例を示す。図１１Ａの例では、検出光学系５０１０は様々な検出素子５０２０上に信号の焦点を合わせるよう構成される。検出光学系５０１０及び検出素子５０２０は、各焦点が検出素子５０２０のアクティブエリア内を走査するよう構成され、配置される。１つ１つの焦点の走査範囲が検出器のアクティブエリアを越え得る場合（点線）、試料は、検出素子５０２０の非アクティブ領域を占めるように走査され得る、又は検出素子５０２０は移動させられ得る。
【００５４】
図１１Ｂは、検出素子５０２０の前、約１焦点距離のところに配置される小型レンズアレイ５０３０と、検出光学系５０１０との中に複数の収集光学素子がある別の構成例を示す。これにより、焦点が走査するときに、信号は実質的に移動しない。
【００５５】
示される通り、図１１Ｃは、複数の収集光学素子が、検出光学系５０１０の背後、且つ検出素子５０２０の前面に配置された複数の光収集器５０４０である、別の構成例を示す。図１１Ｄに示されるように、光が光収集器５０４０の特定の受光角内に入る限り、入力角にかかわらず、光収集器５０４０に入るいかなる光も（例示された光経路に示されるように）出口開口部に向かって、したがって、それぞれの検出素子５０２０のアクティブ領域に向かって方向変更させられるように、光収集器５０４０は構成され得る。所定の光収集器５０４０では、光収集器５０４０が散乱された信号光子を全て収集し、従って、多焦点多光子イメージングシステム例の信号対ノイズ比を改善させるように、この受光角は指定され得る。
【００５６】
図１１Ｅは、蛍光放射光のビームが収集光学系（この例では小型レンズアレイとして例示される）の接続部を横切って走査するときに起こり得ることの一例を示す。信号は隣接する検出器内に散乱され得て、これにより、検出器間のクロストーク及びゴーストイメージがもたらされ得る。一実装例において、ビームが接続部を横切って走査されず、そして試料の走査されていない領域に適合すべく試料が移動させられるように（すなわち、焦点が試料の走査されていないこれらの領域を照明するように、試料は移動させられる）、ステージ及びビーム走査の組み合わせが行われ得る。代替的に、ゴーストイメージは、様々な処理ソフトウェアを用いた後処理段階の間に、捕えられ除去され得る。
【００５７】
図１２Ａ〜図１２Ｃは、多焦点多光子イメージングシステム例が複数の検出素子及び複数の収集光学素子を含む他の構成例を図示する。
【００５８】
図１２Ａは、ライトガイド５０５０が検出光学系５０１０の後、及び複数の光収集器５０４０のそれぞれの後の光収集経路に配置され、ほとんど損失のない信号をある程度離れて配置されたそれぞれの検出素子５０２０に送る、多焦点多光子イメージングシステム例を示す。図１２Ａにも示されるように、１又は複数の収集光学系５０６０はそれぞれのライトガイド５０５０の出口ポートに配置され得る。この構成例により、検出システムの改善又は置換に対するモジュール手法が可能となる。
【００５９】
図１２Ｂは、ライトガイド５０５０が検出光学系５０１０の後、及び複数の光収集器５０４０のそれぞれの後の光収集経路に配置され、ほとんど損失のない信号をある程度離れて配置された検出素子５０２０に送る、多焦点多光子イメージングシステム例を示す。１又は複数の収集光学系５０６０は、それぞれのライトガイド５０５０の出口ポートに配置され得る。図１２Ｂにも示されるように、多重チャネルが異なる蛍光物質の検出に用いられ得るようにして、１又は複数のダイクロイックフィルタ（５０７０ａ、５０７０ｂ、及び５０７０ｃ）が配置され得る。
【００６０】
図１２Ｃは、ライトガイド５０５０が検出光学系５０１０の後、及び複数の光収集器５０４０のそれぞれの後の光収集経路に配置され、ほとんど損失のない信号をある程度離れて配置された検出素子５０２０に送る、多焦点多光子イメージングシステム例を示す。図１２Ｃは、複数のライトガイド及び複数の光収集器を使用して可能となるスペクトル検出システム例を示す。ライトガイド５０５０を用いて信号が収集され、検出器に送られる。光学構成要素５０８０（これは、コリメートレンズ及びミラーのうち少なくとも１つであり得る）が、ライトガイドの出口ポートに配置され、信号ビームをコリメートして信号光を分散素子５０９０（限定されないが、回折格子又はプリズムなど）上に誘導し得る。これにより、信号はスペクトル的に分散され、限定されないが、マルチアノードＰＭＴ又はラインＣＣＤなどの検出素子で信号は検出され得る。図１２Ｂの例に関連して説明されたように、ダイクロイックミラーが、各チャネルのスペクトル検出を作り出すのに用いられ得る。概して、非デスキャン検出システムは、関係している経路長がより短いことから、効果的である。散乱された光信号は、より大きい収集光学系及び検出器を用いてより効率的に収集される。このことは、生体試料が概して非常に散乱を起こしやすいので、生体試料のイメージングには重要である。それは、第２高調波発生信号を検出する際にも有用であり、ＳＨＧは主に前方へ方向付けられるが、検出信号はほとんど後方散乱ＳＨＧ信号によるものである。
【００６１】
本開示の複数のシステム及び方法が、本明細書に明記される複数の実施形態例及び複数の図を参照して詳細に示され説明されたが、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、形状及び詳細における様々な変更がその中で行われ得ることが、当業者によって理解されるであろう。したがって、本開示の複数のシステム及び方法は複数の実施形態例及び図に限定されない。
（項目１）
多焦点多光子イメージングシステムであって、
励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子及び試料を横切って上記複数の焦点を走査する走査素子を含む光励起経路であって、上記焦点生成素子は上記励起経路に沿って上記走査素子から光を受信する、光励起経路と、
上記試料からの蛍光放射を検出する検出器を含み、走査素子を含まない光収集経路と、
を備える、
システム。
（項目２）
上記検出器は、マルチアノード光電子増倍管（ＭＡ−ＰＭＴ）である、
項目１に記載のシステム。
（項目３）
１又は複数のファイバを含む光ファイバデバイスが、放射された上記光を上記ＭＡ−ＰＭＴに連結するのに用いられる、
項目２に記載のシステム。
（項目４）
上記１又は複数のファイバは、１又は複数の液体ライトガイドを含む、
項目３に記載のシステム。
（項目５）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、複数のスペクトルチャネルを検出すべく、上記ＭＡ−ＰＭＴの複数のチャネルに連結される、
項目３に記載のシステム。
（項目６）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、上記試料のインタレーススキャンを形成すべく、複数の隣接する領域を走査する、
項目３に記載のシステム。
（項目７）
上記試料の上記インタレーススキャンは、複数のＭＡ−ＰＭＴチャネル間のクロストークを減少させる、
項目６に記載のシステム。
（項目８）
多光子光源をさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目９）
上記多光子光源はレーザを有する、
項目８に記載のシステム。
（項目１０）
光を上記試料から上記検出器に連結する複数の光ファイバをさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目１１）
組織断面切断デバイスをさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目１２）
上記検出器からスペクトルデータを受信するデータプロセッサをさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目１３）
上記検出器は、複数の異なる波長を検出する複数の検出素子を含む検出システムを有する、
項目１に記載のシステム。
（項目１４）
上記走査素子に結合され、上記走査素子の位置及び上記走査素子の方向のうち少なくとも１つを検出するための配置検出システムをさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目１５）
上記光励起経路に配置され、上記焦点生成素子から光を受信する光学素子をさらに備え、
上記光学素子は、上記焦点生成素子の色分散とは反対の色分散を導入する、
項目１に記載のシステム。
（項目１６）
上記光収集経路は小型レンズアレイをさらに含み、上記検出器は上記小型レンズアレイから蛍光放射を受信する、
項目１に記載のシステム。
（項目１７）
上記走査素子は、回転ミラー又は共振ミラーを有する、
項目１に記載のシステム。
（項目１８）
各検出素子は、上記複数の焦点の位置のそれぞれに関して散乱分布に対応する収集エリアを有する、
項目１に記載のシステム。
（項目１９）
上記検出器のアレイは、上記試料の各焦点から蛍光信号を検出する、
項目１に記載のシステム。
（項目２０）
上記検出器は、複数の光電子増倍管素子のアレイを有する、
項目１に記載のシステム。
（項目２１）
光源をさらに備える、
項目１に記載のシステム。
（項目２２）
上記光源はレーザを有する、
項目２１に記載のシステム。
（項目２３）
多焦点多光子イメージングシステムであって、
励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子及び試料を横切って上記複数の焦点を走査する走査素子を含む光励起経路であって、上記焦点生成素子は上記励起経路に沿って上記走査素子から光を受信する、光励起経路と、
上記試料からの蛍光放射を検出する検出器を含む光収集経路と、
を備える、
システム。
（項目２４）
上記光収集経路は、非デスキャン収集経路である、
項目２３に記載のシステム。
（項目２５）
上記検出器は、マルチアノード光電子増倍管（ＭＡ−ＰＭＴ）である、
項目２３に記載のシステム。
（項目２６）
１又は複数のファイバを含む光ファイバデバイスが、放射された上記光を上記ＭＡ−ＰＭＴに連結するのに用いられる、
項目２５に記載のシステム。
（項目２７）
上記１又は複数のファイバは、１又は複数の液体ライトガイドを含む、
項目２６に記載のシステム。
（項目２８）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、複数のスペクトルチャネルを検出すべく、上記ＭＡ−ＰＭＴの複数のチャネルに連結される、
項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、上記試料のインタレーススキャンを形成すべく、複数の隣接する領域を走査する、
項目２７に記載のシステム。
（項目３０）
上記試料の上記インタレーススキャンは、複数のＭＡ−ＰＭＴチャネル間のクロストークを減少させる、
項目２９に記載のシステム。
（項目３１）
多光子光源をさらに備える、
項目２３に記載のシステム。
（項目３２）
上記多光子光源はレーザを有する、
項目３１に記載のシステム。
（項目３３）
光を上記試料から上記検出器に連結する複数の光ファイバをさらに備える、
項目２３に記載のシステム。
（項目３４）
組織断面切断デバイスをさらに備える、
項目２３に記載のシステム。
（項目３５）
上記検出器からスペクトルデータを受信するデータプロセッサをさらに備える、
項目２３に記載のシステム。
（項目３６）
上記検出器は、複数の異なる波長を検出する複数の検出素子を含む検出システムを有する、
項目２３に記載のシステム。
（項目３７）
上記走査素子に結合され、上記走査素子の位置及び上記走査素子の方向のうち少なくとも１つを検出するための配置検出システムをさらに備える、
項目２３に記載のシステム。
（項目３８）
上記光励起経路に配置され、上記焦点生成素子から光を受信する光学素子をさらに備え、
上記光学素子は、上記焦点生成素子の色分散とは反対の色分散を導入する、
項目２３に記載のシステム。
（項目３９）
上記光収集経路は小型レンズアレイをさらに含み、上記検出器は上記小型レンズアレイから蛍光放射を受信する、
項目２３に記載のシステム。
（項目４０）
多焦点多光子イメージングシステムであって、  
励起ビームから複数の焦点を生成する焦点生成素子及び試料を横切って上記複数の焦点を走査する走査素子を含む光励起経路であって、上記焦点生成素子は上記励起経路に沿って上記走査素子から光を受信する、光励起経路と、
上記試料からの蛍光放射を検出する複数の検出素子及び複数の収集光学素子を含む光収集経路であって、上記複数の収集光学素子の各収集光学素子は、上記蛍光放射の光を上記複数の検出素子の各検出素子に連結する、光収集経路と、
を備える、
システム。
（項目４１）
上記複数の収集光学素子の各収集光学素子は、上記複数の焦点のそれぞれの焦点により生成された蛍光放射を受信する、
項目４０に記載のシステム。
（項目４２）
１又は複数のファイバを含む光ファイバデバイスが、上記蛍光放射の光を上記複数の収集光学素子から上記複数の検出素子に連結するのに用いられる、
項目４０に記載のシステム。
（項目４３）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、上記複数の検出素子のそれぞれの検出素子と連結される、
項目４２に記載のシステム。
（項目４４）
複数のライトガイドをさらに備え、
上記複数のライトガイドの各ライトガイドは、蛍光放射の光を上記複数の収集光学素子のそれぞれの収集光学素子から上記複数の検出素子のそれぞれの検出素子に連結する、
項目４３に記載のシステム。
（項目４５）
多光子光源をさらに備える、
項目４０に記載のシステム。
（項目４６）
上記多光子光源はレーザを有する、
項目４５に記載のシステム。
（項目４７）
組織断面切断デバイスをさらに備える、
項目４０に記載のシステム。
（項目４８）
検出器からスペクトルデータを受信するデータプロセッサをさらに備える、
項目４０に記載のシステム。
（項目４９）
上記走査素子に結合され、上記走査素子の位置及び上記走査素子の方向のうち少なくとも１つを検出するための配置検出システムをさらに備える、
項目４０に記載のシステム。
（項目５０）
上記光励起経路に配置され、上記焦点生成素子から光を受信する光学素子をさらに備え、
上記光学素子は、上記焦点生成素子の色分散とは反対の色分散を導入する、
項目４０に記載のシステム。
（項目５１）
多焦点多光子イメージングのための方法であって、
試料の関心領域を横切って複数の焦点を走査すべく走査素子を用いる段階であって、上記複数の焦点は、上記走査素子により光励起経路に沿って焦点生成素子に方向付けられた光から生成される、走査素子を用いる段階と、
複数の焦点の位置と上記関心領域との間を相対移動することなく画像データを生成すべく、上記関心領域の上記複数の焦点の位置からの光を検出する段階と、
を備える、
方法。
（項目５２）
蛍光放射の光を複数の収集光学素子から複数の検出素子に連結すべく、１又は複数のファイバを含む光ファイバデバイスを用いる段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記１又は複数のファイバのそれぞれは、上記複数の検出素子のそれぞれの検出素子と連結される、
項目５２に記載の方法。
（項目５４）
複数のライトガイドをさらに備え、
上記複数のライトガイドの各ライトガイドは、蛍光放射の光を上記複数の収集光学素子のそれぞれの収集光学素子から上記複数の検出素子のそれぞれの検出素子に連結する、
項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記試料の一部を断面に切るべく組織断面切断デバイスを用いる段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目５６）
検出器からスペクトルデータを受信するデータプロセッサを用いる段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目５７）
複数の検出素子を有する検出器のアレイを用いて検出する段階をさらに備え、
各検出素子は、複数の焦点の位置のそれぞれに関して蛍光放射の散乱分布に対応する収集エリアを有する、
項目５１に記載の方法。
（項目５８）
上記走査素子は、回転ミラー又は共振ミラーである、
項目５１に記載の方法。
（項目５９）
複数の光電子増倍管素子のアレイを用いて検出する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６０）
上記焦点生成素子はマイクロレンズアレイ、回折光学素子、又は複数の光ファイバである、
項目５１に記載の方法。
（項目６１）
第１検出器のアレイ及び第２検出器のアレイを有する検出器のアレイを提供する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６２）
上記関心領域と上記検出器のアレイとの間の光学経路に沿って光を伝送する光ファイバデバイスを提供する段階をさらに備える、
項目６１に記載の方法。
（項目６３）
光源を上記走査素子に連結する光ファイバデバイスを提供する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６４）
イメージングシーケンスをシステムコントローラによって制御する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６５）
検出器に接続されたデータ処理システムによってスペクトルデータを処理する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６６）
コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６７）
誘導ラマン散乱プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６８）
第２高調波生成プロセスによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目６９）
共焦点反射顕微鏡法システムによってスペクトルデータを検出する段階をさらに備える、
項目５１に記載の方法。
（項目７０）
項目１から５０の何れか一項に記載のシステムによって試料をイメージングする段階をさらに備える、
項目５１から６９の何れか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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