(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の幹領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ）内エピトープに結合する１以上のインフルエンザウイルス中和結合分子を含む、インフルエンザウイルスワクチン用アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物であって、
前記１以上の結合分子は、
ｉ）カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）により、配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子；および
ｉｉ）カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）により、配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子
から構成された群より選択されるいずれか１つ以上の結合分子である、アジュバント組成物。
【請求項２】
前記１以上の結合分子は、
ｉ）配列番号１３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号１４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む結合分子；および
ｉｉ）配列番号１５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号１６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む結合分子
から構成された群より選択されるいずれか１つ以上の結合分子であることを特徴とする請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアジュバント組成物および標的抗原を含むワクチン組成物。
【請求項４】
前記標的抗原は、インフルエンザウイルス抗原であることを特徴とする請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記抗原とアジュバント組成物の重量比が１：０．０２〜１：２００であることを特徴とする請求項３または４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のアジュバント組成物および標的抗原を含むワクチン組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１以上のインフルエンザウイルス中和結合分子を含むアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関し、より具体的には、ワクチンによって誘導される免疫反応を増大させてワクチンの効能を増加させるアジュバントとしての用途を有する、インフルエンザウイルスに対して中和活性を有する１以上のヒト単一クローン抗体を含むアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）が呼吸器に感染して現れる疾病で、冬季によく現れ、感染性が非常に高くて全年令層を対象に伝播しやすいが、特に老弱年層で弱いことが知られている（非特許文献１）。オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する外被保有ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）で、８個の分節からなる陰性−極性および単鎖（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）のＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を遺伝体として有するインフルエンザウイルスは、Ａ、ＢおよびＣグループに分類され、インフルエンザＡウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）の場合、主要表面蛋白質であるＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）とＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）によってさらに複数のサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）に分けられる。今のところ、１７種のＨＡと１０種のＮＡが知られている（非特許文献２及び３）。インフルエンザウイルスは、種類によって、鳥類、豚および人間に感染し得るとの特性とＲＮＡ分節からなっている遺伝体により多様な遺伝子の組合せと突然変異で引き続き変種ウイルスが発生する（非特許文献４）。このような持続的な変異により永久的な免疫力を得ることが難しいので、現在最も効果的と考えられる予防法は毎年流行することが予測されるインフルエンザウイルスに対するワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）を接種して特定タイプ（ｔｙｐｅ）に合わせた免疫力を毎年形成させることである。
【０００３】
現在、毎年接種しているインフルエンザウイルスワクチンは、３価あるいは４価ワクチンで、ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＡのＨ１とＨ３  ｓｕｂｔｙｐｅのＨＡと、１種類あるいは２種類のｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｔｙｐｅのＨＡとを混合して使用している。
【０００４】
インフルエンザウイルスワクチンを含む様々な感染性疾患のワクチンに免疫原性を増加させるための物質を添加する場合があるが、これをアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）という。人間に使用が承認されたアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）は、ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅとａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅから構成されているＡｌｕｍと、Ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓを有するＭＦ５９、ＡＳ０３と、ＴＬＲ４  ａｇｏｎｉｓｔであるＭＰＬとａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅから構成されたＡＳ０４がある。（非特許文献５）
【０００５】
前記言及された物質以外にも、抗体を抗原と一緒に投与することによって免疫反応を増大させる報告があり、抗体をアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用しようとする試みが行われている。
【０００６】
既に本出願人が特許出願したインフルエンザＡウイルスに対する抗体は、多様なインフルエンザのｓｕｂｔｙｐｅに対して中和効能を示し、特に、特許文献１に開示された抗体は主に系統発生グループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ９等）に、特許文献２に開示された抗体は主に系統発生グループ２（Ｈ３、Ｈ７等）に中和効能を示した。そこで、２種類以上の抗体を混合して同時に投与することにより、流行する可能性があるグループ１とグループ２に属するウイルスに対してすべて予防と治療効果を示し得るカクテル製剤を開発し、特許文献３に開示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１１−００２００６１号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１２−０１０７５１２号公報
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１４−００３６６０１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ，２００４，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０（３）：２１８−２０
【非特許文献２】Ｃｈｅｕｎｇ  ＴＫ  ａｎｄ  Ｐｏｏｎ  ＬＬ２００７，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１１０２：１−２５
【非特許文献３】Ｔｏｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：４２６９−４２７４
【非特許文献４】Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ，２００４．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０（３）：２１８−２０
【非特許文献５】Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，２０１１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１，１１（１２）：８６５−７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ワクチン投与時に、本発明者が既開発のインフルエンザウイルス中和抗体を一緒に投与することによりワクチンの効果を増大できることを確認して、既開発の抗体のアジュバントとしての新たな用途を発見することにより、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、１以上のインフルエンザウイルス中和結合分子を含むアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物を提供することである。
【００１１】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記アジュバント組成物および標的抗原を含むワクチン組成物を提供することである。
【００１２】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記アジュバント組成物および標的抗原を含む製造方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記アジュバント組成物を宿主に投与して標的抗原に対する免疫反応を増大させる方法を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記ワクチン組成物を宿主に投与して免疫化する方法を提供することである。
【００１５】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記ワクチン組成物を宿主に投与して免疫化された宿主から免疫学的産物を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決すべく、本発明は、１以上のインフルエンザウイルス中和結合分子を含むアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一具体例において、前記結合分子は、インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の幹領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ）内のエピトープに結合することができる。
【００１８】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、
ｉ）ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、２５、２７、３２、３３、３８、４０、５４、５５、２７８、２９１、２９２、３１０、３１１、３１２および３１８から構成された群より選択されたいずれか１つのアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含むエピトープ；および
ｉｉ）ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５２、５３、５６、５７、５８、６０および９９から構成された群より選択されたいずれか１つのアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含むエピトープ
から構成された群より選択されるいずれか１つ以上のエピトープであることを特徴とするアジュバント組成物を含むことができる。
【００１９】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１、２９２および３１８のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含むことができる。また、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２０】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１、２９２および３１８のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２１】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含むことができる。また、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３アミノ酸残基を含むことができる。
【００２２】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡの第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよび／またはＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含んでもよい。
【００２３】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２４】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡの第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含んでもよい。
【００２５】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２、５３、５８および９９のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡの第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、２７、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含んでもよい。
【００２７】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置５４、５５、２７８、２９１および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５２、５３、５６、５７および６０のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２８】
本発明の一具体例において、前記結合分子のエピトープは、ＨＡの第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記ＨＡの第１単量体に隣接したＨＡの第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２、３３、３１０、３１１および３１２のアミノ酸残基を追加的に含んでもよい。
【００２９】
前記エピトープのアミノ酸位置ナンバリング（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、Ｈ３ＨＡナンバリング（Ｈ３  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づく。
【００３０】
本発明の一具体例において、前記結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）により、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子；および
ｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子
から構成された群より選択されるいずれか１つ以上の結合分子である。
【００３１】
本発明において、可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔなどによって考案されたシステムにより通常の方法で決定された（文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］参照）。本発明に使用されたＣＤＲナンバリングはＫａｂａｔ方法を用いたが、その他、ＩＭＧＴ方法、Ｃｈｏｔｈｉａ方法、ＡｂＭ方法などの他の方法により決定されたＣＤＲを含む結合分子も本発明に含まれる。
【００３２】
本発明の一具体例において、前記結合分子は、
ｉ）配列番号１３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号１４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む結合分子；および
ｉｉ）配列番号１５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号１６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む結合分子
から構成された群より選択されるいずれか１つ以上の結合分子を含む。
【００３３】
本発明の一具体例において、前記結合分子は、細胞表面のＦｃ受容体に結合される結合分子を含む。
【００３４】
また、本発明は、前記アジュバント組成物および標的抗原を含むワクチン組成物を提供する。前記標的抗原は、ウイルス抗原であってもよいが、これに限定されるものではない。好ましくは、前記ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス抗原である。前記インフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルス抗原を含む。前記インフルエンザウイルス抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
さらに、本発明の他の具体例として、前記ワクチン組成物は、抗原と前記アジュバント組成物の重量比が１：０．０２〜１：２００で含まれてもよく、好ましくは１：０．２〜１：２０で含まれてもよいが、これに限定されるものではない。抗原とアジュバント組成物の重量比は、免疫原性活性調節のために減少または増加し得る。
【００３６】
また、本発明の他の具体例として、前記アジュバント組成物のほか、追加的なアジュバント組成物が添加されたワクチン組成物を提供する。前記追加的なアジュバント組成物は、これに限定されるものではないが、アルム（Ａｌｕｍ）、代謝可能なオイル（例えば、スクアレン）、トコール（例えば、アルファ−トコフェロール）、ステロール（例えば、コレステロール）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのリガンド（例えば、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドおよび／またはＬＰＳ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）であってもよい。
【００３７】
さらに、本発明は、前記アジュバント組成物および標的抗原を含むワクチン組成物を製造する方法を提供する。前記ワクチン組成物は、インフルエンザウイルスワクチン組成物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
また、本発明は、前記アジュバント組成物を宿主に投与して標的抗原に対する免疫反応を増大させる方法を提供する。前記ワクチン組成物は、インフルエンザウイルスワクチン組成物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
さらに、本発明の他の具体例として、前記免疫反応は、Ｆｃ受容体を細胞表面に有する細胞によって誘導されることを特徴とする方法であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
また、本発明は、対象に前記アジュバント組成物を含むワクチン組成物を有効な量で投与するステップを含むウイルス由来疾患を予防する方法を提供する。例えば、前記ウイルス由来疾患は、インフルエンザウイルス由来疾患であってもよい。
【００４１】
さらに、本発明は、前記ワクチン組成物を宿主に投与して免疫化する方法を提供する。
【００４２】
また、本発明は、
ａ）前記ワクチン組成物を宿主に投与して免疫化するステップと；
ｂ）前記免疫化された宿主から免疫学的産物を得るステップと
を含む免疫学的産物を製造する方法を提供する。
【００４３】
また、本発明の他の具体例として、前記免疫学的産物がＴ細胞、Ｂ細胞、または抗体であってもよい。さらに、前記免疫学的産物は、Ｂ細胞のように、Ｆｃ受容体を細胞表面に有する他の種類の細胞、例えば、好中球、大食細胞、自然殺害細胞または樹状細胞であってもよい。
【００４４】
以下、本発明で使用された用語を次のように定義する。
【００４５】
本発明に記載された「インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）」は、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する外被保有ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）で、８個の分節からなる陰性−極性および単鎖（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）のＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を遺伝体として有し、Ａ、ＢおよびＣグループに分類され、主要表面蛋白質であるＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）とＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）によりさらに複数のサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）に分けられる。今のところ、１７種のＨＡと１０種のＮＡが知られている。
【００４６】
本発明に記載された「Ｈ１サブタイプ」には、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９およびＨ１Ｎ１０が含まれる。
【００４７】
本発明に記載された「Ｈ２サブタイプ」には、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ６、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９およびＨ２Ｎ１０が含まれる。
【００４８】
本発明に記載された「Ｈ５サブタイプ」には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９およびＨ５Ｎ１０が含まれる。
【００４９】
本発明に記載された「Ｈ９サブタイプ」には、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９およびＨ９Ｎ１０が含まれる。
【００５０】
本発明に記載された「Ｈ３サブタイプ」には、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ７、Ｈ３Ｎ８、Ｈ３Ｎ９およびＨ３Ｎ１０が含まれる。
【００５１】
本発明に記載された「Ｈ７サブタイプ」には、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ６、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９およびＨ７Ｎ１０が含まれる。
【００５２】
本発明に記載された「ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、以下、「ＨＡ」と称する）」は、インフルエンザウイルスの外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）糖蛋白質を表す。ＨＡは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に吸着して侵入することを媒介する。今のところ、１７種類のサブタイプが報告されている。
【００５３】
本発明に記載された「ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、以下、「ＮＡ」と称する）」は、インフルエンザウイルスの外被（ｅｖｅｏｌｏｐｅ）糖蛋白質を表す。ＮＡは、インフルエンザウイルスが増殖後拡散する時に重要な役割を果たす。今のところ、１０種類のサブタイプが報告されている。
【００５４】
本発明に記載された「インフルエンザワクチン（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ）」は、季節またはパンデミック（ｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザを予防する最も良い方法で、大別して、生ワクチンと不活性化ワクチンとに分けられる。生ワクチンは、弱毒化生ワクチン（ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）が開発されて使用されている。不活性化ワクチンは、孵化卵あるいは細胞培養で培養したウイルスを精製してホルマリンなどで不活性化させたウイルス全体を使用する全ウイルスワクチン（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、エーテルなどでウイルスの外被を粉砕させた分割ワクチン（ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ＨＡとＮＡ成分を精製したサブユニットワクチン（ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）などがある。インフルエンザＡグループのＨ１とＨ３  ｓｕｂｔｙｐｅと共に、インフルエンザＢグループを１種類含むワクチンは３価ワクチン、２種類のインフルエンザＢグループを含むワクチンは４価ワクチンという。
【００５５】
本発明に記載された「インフルエンザワクチン」は、３価、４価の季節性、パンデミックの生ワクチンと不活性化ワクチンをすべて含む。
【００５６】
本発明に記載された「結合分子」は、キメラ、ヒト化またはヒト単一クローン抗体のような単一クローン抗体を含む無傷（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、イムノグロブリンのＦｃ部分の有する融合蛋白質または抗原に結合するイムノグロブリン、例えば、インフルエンザＡウイルスの単量体ＨＡまたは三量体ＨＡとの結合のために無傷（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンと競争するイムノグロブリン断片を含む可変性ドメインまたは基質と結合可能な酵素、受容体、蛋白質を意味する。構造とはかかわらず、抗原−結合断片は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンによって認識された同一の抗原と結合される。抗原−結合断片は、結合分子のアミノ酸配列の２個以上の連続基、２０個以上の連続アミノ酸残基、２５個以上の連続アミノ酸残基、３０個以上の連続アミノ酸残基、３５個以上の連続アミノ酸残基、４０個以上の連続アミノ酸残基、５０個以上の連続アミノ酸残基、６０個以上の連続アミノ酸残基、７０個以上の連続アミノ酸残基、８０個以上の連続アミノ酸残基、９０個以上の連続アミノ酸残基、１００個以上の連続アミノ酸残基、１２５個以上の連続アミノ酸残基、１５０個以上の連続アミノ酸残基、１７５個以上の連続アミノ酸残基、２００個以上の連続アミノ酸残基、または２５０個以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。
【００５７】
本発明に記載された「抗原−結合断片」は、特に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ、テトラボディ、ポリペプチドへの特定抗原に結合するのに十分なイムノグロブリンの１つ以上の断片を含有するポリペプチドなどを含む。前記断片は、合成でまたは完全なイムノグロブリンの酵素的または化学的分解によって生成されたり、組換えＤＮＡ技術によって遺伝工学的に生成されてもよい。生成方法は当業界によく知られている。
【００５８】
本発明に記載された「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、ワクチンまたは薬学的に活性のある成分に添加されて免疫反応を増加させたり、および／または影響を与える物質または組成物をいう。代表的に、免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）用キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）または補助物質、および／または他の薬学的に活性のある物質または組成物を通常意味する。典型的に、用語「アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、広い概念で解釈されなければならず、前記アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）に統合されたり、前記アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と一緒に投与された抗原の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増進させられる広い範囲の物質または策略（ｓｔｒａｔａｇｅｍ）を意味する。また、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）は、これに制限されず、免疫強化剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）、抗原伝達系またはこれらの組合せに分けられる。
【００５９】
本発明に記載された「免疫学的産物」は、抗原および／またはアジュバント組成物の投与によって免疫化された宿主から発生する防御免疫媒介物質または細胞などを意味し、例えば、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞または抗体などを意味することができるが、これに限定するものではない。
【００６０】
本発明に記載された「薬剤学的に許容可能な賦形剤」という用語は、容認可能なまたは便利な投薬形態を製造するための薬物、製剤または結合分子のような活性分子で組合わされる不活性物質を意味する。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、非毒性であるか、少なくとも毒性が使用された用量および濃度で受容者にその意図された用途のために許容可能な賦形剤であり、薬物、製剤または結合粉剤を含む剤形化の他の成分と両立できる。
【００６１】
本発明に記載された「有効な量」という用語は、インフルエンザＡウイルスのワクチンと一緒に投与時に、ワクチンの効果を増大させる有効な本発明の結合分子の量を表す。
【００６２】
本発明では、既特許出願（韓国公開特許第１０−２０１１−００２００６１号公報、韓国公開特許第１０−２０１２−０１０７５１２号公報、韓国公開特許第１０−２０１４−００３６６０１号公報）の抗体がインフルエンザワクチン接種時に、免疫反応を増加させることをｍｏｕｓｅ実験で確認することにより、既開発の抗体がアジュバントとしての新たな用途を有することを確認した。本出願人が既出願の韓国公開特許第１０−２０１１−００２００６１号公報、韓国公開特許第１０−２０１２−０１０７５１２号公報および韓国公開特許第１０−２０１４−００３６６０１号公報は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【発明の効果】
【００６３】
本発明の１以上のインフルエンザウイルス中和結合分子を含む組成物は、ワクチンの効果を増大させることを確認したため、ワクチン投与時に免疫反応を増加させるアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用することができ、ウイルスによる疾患の予防に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１参照）、１番目の筋肉注射から１３日、１７日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図２】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表３参照）、１番目の筋肉注射から２８日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ＨＡ蛋白質とＨ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図３】免疫化されたｍｏｕｓｅにＨ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓを１０ＭＬＤ５０で接種した後、免疫化されたｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した結果である。
【図４】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表５参照）、１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図５】免疫化されたｍｏｕｓｅにＨ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓを１０ＭＬＤ５０で接種した後、免疫化されたｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した結果である。
【図６】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表７参照）、１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図７】免疫化されたｍｏｕｓｅにＨ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓを１０ＭＬＤ５０で接種した後、免疫化されたｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した結果である。
【図８】Ｈ３Ｎ２ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表９参照）、１番目の筋肉注射から１３日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ３Ｎ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図９】免疫化されたｍｏｕｓｅにＨ３Ｎ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓを１０ＭＬＤ５０で接種した後、免疫化されたｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した結果である。
【図１０】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１１参照）、１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図１１】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１４参照）、２番目の筋肉注射１日、３日、７日後に脾臓内免疫細胞中にＢ細胞の占める割合を確認した結果である。
【図１２】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１４参照）、２番目の筋肉注射１日、３日、７日後に鼡径リンパ節内免疫細胞中にＢ細胞の占める割合を確認した結果である。
【図１３】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１５参照）、２番目の筋肉注射から４週後にＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを接種して１日、３日後に脾臓と体内リンパ節内のＢ細胞の割合を確認した結果である。
【図１４】Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射し（表１６参照）、１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後に血清を採取して、血清内Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓに対する特異抗体逆価をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、発明の範囲が実施例によって限定されるものではない。本発明で引用された文献は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【実施例】
【００６６】
実施例１：インフルエンザウイルス中和抗体のワクチンのアジュバント効果確認
１−１．ＥＬＩＳＡ実験
下記表１のように、治療用抗体であるＣＴ１２０抗体とＣＴ１４９抗体がインフルエンザウイルスワクチンのアジュバントとしての効果があるかを確認するために、動物実験を行った。下記表１と同じく、Ｈ１Ｎ１  ｓｐｌｉｔワクチン０．２ｕｇを単独で投与したり、代表的に使用するアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）のＡｌｕｍ（１ｍｇ）免疫補助剤と一緒に投与したり、ＣＴ１２０抗体（０．５ｕｇ、１ｕｇ、５ｕｇ、１０ｕｇ）またはＣＴ１４９抗体（０．５ｕｇ、１ｕｇ、５ｕｇ、１０ｕｇ）を免疫補助剤として一緒に投与した後、ｍｏｕｓｅでインフルエンザウイルスに対する抗体逆価を確認した。
【００６７】
【表１】
0006496409.tif 000002
【００６８】
前記表１のように、Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、それぞれの実験群で誘導される免疫反応を確認した。１番目の筋肉注射から１３日、１７日、２７日後にそれぞれの実験群で血清を採取して、抗体の逆価をＥＬＩＳＡにより確認した。
【００６９】
図１の結果のように、ワクチンのみを投与したグループに比べて、ＣＴ１２０、ＣＴ１４９、またはＡｌｕｍをワクチンと一緒に投与したグループが全体的に投与したワクチンに相当するウイルスを感知できる抗体の生成が多いことを確認することができた。ワクチンとアジュバント投与から２７日後に抗体の量を比較した時、ＣＴ１２０  ５ｕｇまたはＣＴ１４９  １０ｕｇを投与したグループは、Ａｌｕｍを投与したグループと類似する抗体の生成を示し、ＣＴ１４９  １ｕｇまたは０．５ｕｇを投与したグループは、Ａｌｕｍを投与したグループと比較してより多い抗体が生成されることを確認した。
【００７０】
１−２．血球凝集反応実験（ＨＩ  ａｓｓａｙ、ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
下記表２のように、治療用抗体であるＣＴ１２０抗体とＣＴ１４９抗体がインフルエンザウイルスワクチンのアジュバントとしての効果があるかを確認するために、血球凝集反応実験（ＨＩ  ａｓｓａｙ、ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によりワクチンの有効性を評価した。ワクチンとアジュバント投与から１３日、１７日、２７日後にｍｏｕｓｅから血清を得て、インフルエンザウイルスとチキン赤血球の凝集反応を抑制できる抗体逆価を確認した。
【００７１】
【表２】
0006496409.tif 000003
【００７２】
図１の結果と同じく、ワクチンとアジュバント投与から２７日後に抗体の量を比較した時、ＣＴ１２０  ５ｕｇ、ＣＴ１４９  １０ｕｇを投与したグループ（グループ６および９）は、Ａｌｕｍを投与したグループ（グループ１３）と類似のＨＩ  ｔｉｔｅｒを示し、ＣＴ１４９  １ｕｇ、０．５ｕｇを投与したグループ（グループ１１および１２）は、Ａｌｕｍを投与したグループと比較してより多いＨＩ  ｔｉｔｅｒを示した。
【００７３】
ＣＴ１２０あるいはＣＴ１４９をインフルエンザウイルスワクチン投与時に一緒に投与すると、アジュバントのＡｌｕｍと類似の、あるいはより良い免疫原性増強効果を確認した。これにより、ＣＴ１２０およびＣＴ１４９がインフルエンザウイルスワクチンのアジュバントとして効果があることを確認した。
【００７４】
実施例２：Ｈ１Ｎ１ワクチンを抗原としてＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果を確認するための抗原濃度決定
２−１．抗体生成結果
下記表３のように、治療用抗体の免疫補助剤効果を検証する前に、適切な抗原濃度決定のための動物実験を先に行った。Ｈ１Ｎ１ワクチン（ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ）を０．０１ｕｇから１ｕｇまで単独で投与したり、Ａｌｕｍ免疫補助剤と一緒に投与した後、ＥＬＩＳＡにより抗体逆価を確認し、ＨＩにより中和抗体逆価を確認した。Ｓｔａｎｄａｒｄは販売されている３価ワクチンで、実験結果の比較のために進行させた。
【００７５】
【表３】
0006496409.tif 000004
【００７６】
前記表３のように、Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、それぞれの実験群で誘導される免疫反応を確認した。１番目の筋肉注射から２８日後にそれぞれの実験群で血清を採取して、血清内ＨＡ蛋白質とｖｉｒｕｓに対する抗体逆価をＥＬＩＳＡにより確認し、中和抗体逆価をＨＩ  ａｓｓａｙにより確認した。
【００７７】
図２の結果のように、抗体の逆価は、投与された抗原の量に大体比例して増加することを確認することができ、Ａｌｕｍ免疫補助剤を一緒に入れた場合に大体抗体逆価がより高くなることを確認した。また、ＨＡ蛋白質に対する抗体逆価と、Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価との差は大きくなかった。
【００７８】
【表４】
0006496409.tif 000005
【００７９】
前記表４の結果のように、抗原のみを入れた実験群に比べて、Ａｌｕｍを一緒に入れた実験群でのＨＩ  ｔｉｔｅｒが増加する結果を確認した。また、抗原濃度０．１ｕｇ実験群（グループ９および１０）と抗原濃度０．０５ｕｇ実験群（グループ１２および１３）では、抗原のみを入れた時に比べて、免疫補助剤のＡｌｕｍを入れた時のＨＩ  ｔｉｔｅｒがそれぞれ８倍、４倍上昇し、免疫補助剤の有無に応じてワクチンの効果の差を明確に確認することができた。
【００８０】
２−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した。
【００８１】
図３の結果のように、すべての濃度において、抗原単独で投与した実験群に比べて、免疫補助剤のある実験群でインフルエンザウイルスに対する防御免疫効果が高いことを確認した。また、ＨＩ  ｔｉｔｅｒの結果において免疫補助剤の有無に応じてワクチンの効果の差が多く見られた、２つの抗原濃度（０．１ｕｇと０．０５ｕｇ）の実験群の結果では、０．１ｕｇ実験群の場合、抗原単独で投与した実験群が８０％の生存率を示し、免疫補助剤と一緒に投与した実験群では１００％の生存率を示した。反面、０．０５ｕｇ実験群の場合、抗原単独で投与した実験群の場合に６０％の生存率を示し、免疫補助剤と一緒に投与した実験群では１００％の生存率を示した。
【００８２】
２−３．小結
ＨＩ  ｔｉｔｅｒの結果とインフルエンザウイルスに対する防御免疫効果を総合的に判断した時、０．１ｕｇ実験群の場合、ＨＩ  ｔｉｔｅｒは差があるものの、防御免疫効果において免疫補助剤の有無による差が少なく、ＨＩ  ｔｉｔｅｒと防御免疫での免疫補助剤の有無による差が大きくなる０．０５ｕｇを最終抗原濃度として決定した。これを用いて免疫補助剤の効果を確認する動物実験を進行させた。
【００８３】
実施例３：Ｈ１Ｎ１ワクチンを抗原としてＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果確認
３−１．Ｈ１Ｎ１ワクチンを抗原としてＣＴ１２０の免疫補助剤効果確認
３−１−１．抗体生成結果
抗原濃度を決定するための動物実験の結果（実施例２）から決定された抗原濃度０．０５ｕｇを用いて、治療用抗体であるＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果を検証する動物実験を進行させた。ただし、ｍｏｕｓｅ実験では、ＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体のｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍであるＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）とＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）の免疫補助剤効果がＣＴ１２０やＣＴ１４９よりも効率的になり得ると予想され、ＣＴ１２０およびＣＴ１４９およびそのｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍのすべてを用いて動物実験を進行させた。
【００８４】
前記ｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍ抗体は、ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｆｏｒｍであるＣＴ１２０、ＣＴ１４９において、Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎのｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎをｍｏｕｓｅのＩｇＧ１あるいはＩｇＧ２ａ  ｒｅｇｉｏｎに切り替えて作製された。
【００８５】
ＣＴ１２０およびＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）の量は、予備実験（本明細書には作成されていない）を通して免疫補助剤としての効果を示した濃度を選択した。
【００８６】
Ｈ１Ｎ１ワクチン（ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ）を多様な濃度の治療用抗体と混合して、３７℃で１時間反応させた後、下記表５のように、ｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後にそれぞれの実験群で血清を採取して、血清内ＥＬＩＳＡによるＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価とＨＩ  ａｓｓａｙによる中和抗体逆価を確認した。
【００８７】
【表５】
0006496409.tif 000006
【００８８】
図４の結果のように、Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価は、ｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍであるＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として用いた実験群で、ＣＴ１２０を免疫補助剤として用いた実験群に比べて全般的に高かった。また、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を使用した実験群の場合、Ａｌｕｍを免疫補助剤として用いた実験群よりも全般的に抗体逆価が高くなり、１番目の免疫３週後に採取した血清（図５のＤ２０）で抗体逆価が急激に高くなることを確認した。
【００８９】
【表６】
0006496409.tif 000007
【００９０】
前記表６の結果のように、全般的にＣＴ１２０を免疫補助剤として用いた実験群に比べて、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として用いた実験群で濃度に応じて最大４倍までＨＩ  ｔｉｔｅｒが高くなった。抗体逆価で最も高かったＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを使用した実験群（グループ１０）は、ＨＩ  ｔｉｔｅｒでも全実験群の中で最も高いＨＩ  ｔｉｔｅｒの１６０となった。
【００９１】
３−１−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した。
【００９２】
図５の結果のように、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として用いた時、ＣＴ１２０を免疫補助剤として用いた実験群や抗原単独で使用した実験群に比べて生存率が高く、体重変化も最も少ない幅となった。特に、抗体逆価とＨＩ  ｔｉｔｅｒで最も高かったＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを免疫補助剤として用いた実験群では１００％の生存率を示し、これは、Ａｌｕｍを免疫補助剤として用いた実験群に比べても生存率が３０％増加したものである。
【００９３】
この結果を通して、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）がＣＴ１２０に比べて免疫補助剤としての効果がより高いことを確認し、０．５ｕｇの濃度で投与した時に効果が最も良いことを確認した。
【００９４】
３−２．Ｈ１Ｎ１ワクチン抗原としてＣＴ１４９の免疫補助剤効果確認
３−２−１．抗体生成結果
下記表７のように、ＣＴ１４９に対する予備実験（本明細書には作成されていない）で免疫補助剤としての効果を示した濃度を選定して、前記実施例３−１−１と同様の実験を進行させた。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
図６の結果のように、ＣＴ１２０とは異なり、ＣＴ１４９の免疫補助剤効果は全般的に弱く、ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを使用した実験群で、Ａｌｕｍ免疫補助剤を使用した実験群と類似の抗体逆価を示すことを確認した。
【００９７】
【表８】
0006496409.tif 000009
【００９８】
前記表８の結果のように、ＣＴ１４９やＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として用いた実験群でＨＩ  ｔｉｔｅｒが大きく高くならず、ＥＬＩＳＡで測定した抗体逆価の結果と類似して、ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを使用した実験群（グループ１０）で、Ａｌｕｍ免疫補助剤を使用した実験群（グループ１１）と同一のＨＩ  ｔｉｔｅｒを示した。
【００９９】
３−２−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した。
【０１００】
図７の結果のように、ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを免疫補助剤として用いた実験群で、Ａｌｕｍより１０％高い生存率である８０％の生存率を示した。体重変化幅もＡｌｕｍと比較して大きく改善されなかった。
【０１０１】
３−３．小結
このような結果をまとめた結果、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）がＨ１Ｎ１ワクチンに対しては最も高い免疫補助剤の効果を示し、なかでも０．５ｕｇを使用した時、効果が最も高くなった。ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）の場合、０．５ｕｇを使用した時に免疫補助剤の効果が見られたが、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）に比べては低くなった。
【０１０２】
実施例４：Ｈ３Ｎ２ワクチンを抗原としてＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果確認
Ｈ１Ｎ１ワクチンに対するＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤としての効果を実施例１〜３により確認したのに続き、他のｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎであるＰｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２（Ｈ３Ｎ２）を用いてＨ３Ｎ２ワクチン（ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ）を生産した後、これを用いてＨ３Ｎ２ワクチンに対するＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果を確認するための動物実験を進行させた。
【０１０３】
４−１．抗体生成結果
下記表９のように、治療用抗体の免疫補助剤効果を検証する前に、適切な抗原濃度決定のための動物実験を進行させた。Ｈ３Ｎ２ワクチンを０．０１ｕｇから１ｕｇまで単独で投与したり、Ａｌｕｍ免疫補助剤と一緒に投与した後、ＥＬＩＳＡにより抗体逆価を確認し、ＨＩにより中和抗体逆価を確認した。また、防御免疫効果を確認するために、ｍｏｕｓｅ  ａｄａｐｔｅｄ  Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓを感染させ、生存率および体重の変化様相も確認した。
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
前記表９のように、Ｈ３Ｎ２ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、それぞれの実験群で誘導される免疫反応を確認した。各筋肉注射２週後、それぞれの実験群で血清を採取して、血清内Ｈ３Ｎ２  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価をＥＬＩＳＡにより確認し、中和抗体逆価をＨＩ  ａｓｓａｙにより確認した。
【０１０６】
図８の結果のように、抗体の逆価は、投与された抗原の量に比例して増加することを確認することができ、Ａｌｕｍ免疫補助剤を一緒に入れた場合に、大体抗体逆価がより高くなることを確認した。
【０１０７】
【表１０】
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【０１０８】
前記表１０の結果のように、抗原のみを入れた実験群に比べて、Ａｌｕｍを一緒に入れた実験群でのＨＩ  ｔｉｔｅｒが高いことを確認した。また、抗原０．０１ｕｇと０．０５ｕｇを入れた実験群（グループ１２および１０）ではＨＩ  ｔｉｔｅｒを確認できなかったが、免疫補助剤のＡｌｕｍを一緒に入れた実験群（グループ１３および１１）ではＨＩ  ｔｉｔｅｒがそれぞれ１６０、６４０に上昇することを確認した。
【０１０９】
４−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＡ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２Ｈ３Ｎ２  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率と体重変化を確認した。
【０１１０】
図９の結果のように、低用量の抗原、すなわち、抗原０．０１ｕｇと抗原０．０５ｕｇを単独投与した実験群を除いた実験群で免疫反応効果が高いことを確認した。
【０１１１】
４−３．小結
Ｈ３Ｎ２ワクチン組成物の場合も、実施例３で行ったＨ１Ｎ１実験で使用した抗原濃度（０．０５ｕｇ）において、免疫補助剤の有無によるＨＩ  ｔｉｔｅｒと生存率の差を示した。したがって、これから決定されたＨ３Ｎ２抗原濃度０．０５ｕｇを用いて、治療用抗体であるＣＴ１２０とＣＴ１４９の免疫補助剤効果を確認する動物実験を実施例３と同様の方法で進行させることにより、Ｈ３Ｎ２ワクチンを抗原としたＣＴ１２０およびＣＴ１４９の免疫補助剤としての効果を確認した。
【０１１２】
実施例５：インフルエンザワクチンの免疫補助剤の役割に対する機序研究
前記実施例１〜４の実験から、治療用インフルエンザ抗体がインフルエンザワクチンの効果を増進させる免疫補助剤としての役割を果たすという結果を得た。したがって、このような免疫補助剤の効果を発生させる機序を研究するための動物実験を進行させた。
【０１１３】
治療用抗体がインフルエンザワクチンに対する免疫補助剤の効果を示す機序に対する仮説は、抗体のＦｃ部分が免疫細胞に存在するＦｃ受容体にｂｉｎｄｉｎｇすることにより、インフルエンザワクチンに対する免疫反応がより効率的に起こり得るということである。
【０１１４】
前記仮説を証明するために、実施例３で免疫補助剤としての効果を最も明らかに示したＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．１ｕｇと０．５ｕｇの抗体濃度を選定して、無傷形態のＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）とＦｃ部分が除去されたＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２を、表１１のような多様な量で０．０５ｕｇのＨ１Ｎ１ワクチンと反応させてｍｏｕｓｅに筋肉注射した後、誘導される免疫反応を確認した。
【０１１５】
５−１．抗体生成結果
下記表１１のように、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）投与群の場合、実施例３でＨ１Ｎ１ワクチンの免疫補助剤として最も良い効果を示した濃度である０．１ｕｇと０．５ｕｇで実験を進行させ、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２投与群の場合、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）と同量を投与するグループと、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇ、０．１ｕｇの時のワクチン物質とのｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏと同一となるように、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２の量を計算して投与するグループに分けて実験を進行させた。
【０１１６】
【表１１】
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【０１１７】
Ｈ１Ｎ１ワクチンを多様な濃度のＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）あるいはＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２を混合して、３７℃で１時間反応させた後、前記表１１のように、ｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、それぞれの実験群で誘導される免疫反応を確認した。１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後にそれぞれの実験群で血清を採取して、血清内ＥＬＩＳＡによるＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価とＨＩによるＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する中和抗体逆価を確認した。
【０１１８】
図１０の結果のように、抗体の逆価は、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２を入れた場合に相対的に低かったりしたが、抗体逆価の差はすべての実験群で有意味な差を示していなかった。
【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
前記表１２の結果のように、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２を免疫補助剤として用いたすべての実験群（グループ８〜１１）でのＨＩ  ｔｉｔｅｒは、免疫補助剤なしにＨ１Ｎ１ワクチンを単独で投与した実験群（グループ２）で現れるＨＩ  ｔｉｔｅｒと類似の値を示した。それに対し、無傷形態のＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として用いた実験群（グループ６および７）は、ＨＩ  ｔｉｔｅｒがそれぞれ１６０と８０で、Ｈ１Ｎ１ワクチンを単独で投与した実験群（グループ２）に比べてＨＩ  ｔｉｔｅｒが８倍、４倍増加した。
【０１２１】
５−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率を確認した。
【０１２２】
【表１３】
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【０１２３】
前記表１３の結果のように、無傷形態のＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を免疫補助剤として入れた実験群（グループ６および７）は、実施例３のように高い生存率を確認したのに対し、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）Ｆ（ａｂ’）２を免疫補助剤として入れた実験群（グループ８〜１１）は、抗原を単独で投与した実験群（グループ２）と類似の生存率を示すことを確認した。
【０１２４】
５−３．小結
この結果を通して、抗体のＦｃ部分がインフルエンザワクチンの免疫補助剤として役割を果たすのに重要な作用をすることを確認した。
【０１２５】
実施例６：インフルエンザワクチンの免疫補助剤のターゲット免疫細胞発掘
６−１．ターゲット免疫細胞確認の結果
実施例５において、インフルエンザ抗体のＦｃ部分が免疫補助剤としての役割に重要な作用をすることを確認した。これに基づいて、Ｆｃ受容体を発現する免疫細胞中のＦｃ部位と結合することによって免疫反応が変化する細胞を発掘すべく、動物実験を進行させた。抗体の量は、実施例３によりＨ１Ｎ１ワクチンの免疫補助剤として最も良い効果を示したｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍのＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを選定した。
【０１２６】
【表１４】
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【０１２７】
Ｈ１Ｎ１ワクチンと免疫補助剤とを混合して、３７℃で１時間反応させた後、前記表１４のように、ｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した。それから１日、３日、７日後にそれぞれのｍｏｕｓｅで脾臓と鼡径リンパ節を分離して、多様な免疫細胞数と割合を確認した。
【０１２８】
図１１および図１２の結果のように、Ｈ１Ｎ１ワクチンとＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を入れた場合、２回の筋肉注射後１日経過した時点で、脾臓および鼡径リンパ節ともにおいて、Ｂ細胞が他の投与群に比べて約２倍以上増加したことを確認した。３日と７日目では、比較的類似する程度の細胞の割合が見られた。
【０１２９】
この結果を通して、ＣＴ１２０免疫補助剤は、Ｆｃ部位を通してＢ細胞の免疫反応を増進させることを確認した。ＣＴ１２０Ｆ（ａｂ’）２を投与したグループの場合、対照群であるＰＢＳを投与したｍｏｕｓｅと差異点を発見できなかったため、Ｆｃ部位の重要性をもう一度確認することができた。これから、ＣＴ１２０免疫補助剤は、商業化された免疫補助剤のＡｌｕｍとは異なる機序でＨ１Ｎ１ワクチン物質の免疫原性を高めることが分かった。
【０１３０】
６−２．Ｂ細胞防御免疫結果
前記実施例６−１において、ＣＴ１２０免疫補助剤がＢ細胞免疫を増進させることを確認した。これに基づいて、ｖｉｒｕｓを接種した状態でもＣＴ１２０免疫補助剤がＢ細胞防御免疫に関与できるかを確認する動物実験を進行させた。
【０１３１】
【表１５】
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【０１３２】
前記表１５のように、Ｈ１Ｎ１ワクチン組成物をｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射後、４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種した。ウイルス感染から１日、３日経過した時、それぞれのｍｏｕｓｅで脾臓と体内リンパ節を分離して、全体細胞内でＢ細胞の占める割合を流細胞分析機で確認した。
【０１３３】
図１３の結果のように、ウイルス感染後１日目に脾臓を分析した結果、Ｈ１Ｎ１ワクチンとＣＴ１２０を一緒に投与した実験群でＰＢＳ対照群対比約１０％程度増加したＢ細胞を確認することができた。ワクチンにＡｌｕｍを一緒に投与した実験群も、ＰＢＳ対照群に比べて有意に増加したが、ＣＴ１２０を入れた実験群よりＢ細胞の割合が大きく増加しなかった。また、他の群は、未成熟のＢ細胞の形態であるＢ−１細胞（ＣＤ１９＋Ｂ２２０−）が存在しているが、Ｈ１Ｎ１ワクチンにＣＴ１２０を注射した実験群は、Ｂ−１細胞でより成熟した形態のＢ−２細胞（ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋）のみ存在している。リンパ節の場合、脾臓から見られる現象のようにＢ細胞の割合が急激に増加しなかったが、３回の繰り返し実験で有意に増加することを確認することができた。
【０１３４】
６−３．小結
この結果を通して、ＣＴ１２０を免疫補助剤として用いると、より成熟した形態のＢ細胞が速やかに形成されることが分かった。
【０１３５】
実施例７：商業化免疫補助剤とＣＴ１２０の効果の比較
前記実施例により、ＣＴ１２０がインフルエンザワクチンの免疫補助剤として効果があることを確認したのに続き、このような効果を現在のインフルエンザワクチンに使用される免疫補助剤の効果と比較する実験を進行させた。現在市販中の季節性インフルエンザワクチンで使用する免疫補助剤は、ノバルティスのＦｌｕａｄに使用されるＭＦ５９である。下記の比較実験では、ＭＦ５９と同一の組成を有しているＡｄｄａＶａｘＴＭ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ｖａｃ−ａｄｘ−１０）を使用した。
【０１３６】
７−１．抗体生成結果
実施例３において、Ｈ１Ｎ１ワクチンの免疫補助剤として最も良い効果を示したｍｏｕｓｅ  ｆｏｒｍのＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇ、０．１ｕｇを選定して、実験を進行させた。下記表１６において、Ａｄｄｖａｘ１００％は、季節性インフルエンザワクチンのＨＡ含有量４５ｕｇに入る免疫補助剤の量を意味する。
【０１３７】
【表１６】
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【０１３８】
Ｈ１Ｎ１ワクチンをＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）あるいは商業化された免疫補助剤と同一の組成を有するＡｄｄｖａｘと混合して、３７℃で１時間反応させた後、前記表１６のように、ｍｏｕｓｅに２週間隔で２回筋肉注射した後、それぞれの実験群で誘導される免疫反応を確認した。１番目の筋肉注射から１３日、２０日、２７日後にそれぞれの実験群で血清を採取して、血清内ＥＬＩＳＡによるＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する抗体逆価とＨＩによるＨ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓに対する中和抗体逆価を確認した。
【０１３９】
図１４の結果のように、Ａｄｄａｖａｘ１００％を投与した実験群だけが、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を０．５ｕｇ、０．１ｕｇ投与した実験群と類似の抗体逆価を示しており、Ａｄｄａｖａｘ１０％、１％を投与した場合は、抗体逆価が低くなることを確認することができた。
【０１４０】
【表１７】
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【０１４１】
前記表１７の結果のように、Ａｄｄｖａｘ１００％投与実験群（グループ８）は、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を０．５ｕｇ、０．１ｕｇ投与した実験群（グループ６および７）と類似のＨＩ  ｔｉｔｅｒを示したが、Ａｄｄｖａｘ１％、１０％投与実験群（グループ１０および９）は、Ｈ１Ｎ１ワクチンを単独で投与した実験群（グループ２）と類似の、あるいはＨＩ  ｔｉｔｅｒが測定されなかった。
【０１４２】
７−２．防御免疫結果
インフルエンザウイルスに対する防御免疫を確認するために、２番目の免疫４週後に１０ＭＬＤ５０のＣＡ／０４／０９Ｈ１Ｎ１  ｖｉｒｕｓを免疫化されたｍｏｕｓｅの鼻腔に接種して感染させ、以後１５日間、前記ｍｏｕｓｅの生存率を確認した。
【０１４３】
【表１８】
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【０１４４】
前記表１８の結果のように、Ａｄｄａｖａｘ１００％投与した実験群（グループ８）が、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を０．５ｕｇ、０．１ｕｇ投与した実験群（グループ６および７）と類似の生存率を示すことを確認し、Ａｄｄｖａｘ１％、１０％投与実験群（グループ１０および９）は、生存率が減少することを確認した。
【０１４５】
７−３．小結
この結果を通して、Ｈ１Ｎ１ワクチンにＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）を０．５ｕｇ、０．１ｕｇで投与した時に現れる免疫補助剤としての効果が、商業化インフルエンザワクチンＨＡ４５ｕｇに入る含有量（Ａｄｄａｖａｘ１００％）の免疫補助剤を投与した時に現れる免疫補助剤の効果と類似することを確認した。また、実施例４において、ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）０．５ｕｇを免疫補助剤として用いた場合にも、ＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）０．１ｕｇと０．５ｕｇで投与したのと類似の結果を得たことから、ＣＴ１４９（ｍＩｇＧ２ａ）もＣＴ１２０（ｍＩｇＧ２ａ）の結果と類似の効果を期待することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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