(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）富栄養培地から胞子形成培地に交雑酵母を移すステップと、
ｂ）前記胞子形成培地において前記交雑酵母を、Spo11依存性二本鎖分離の発生を誘導するのに十分な時間インキュベートするステップと、
ｃ）第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に、前記交雑酵母を炭素源及び窒素源に接触させて組換え酵母を得るステップと
ｄ）前記組換え酵母を回収するステップと、
ｅ）所望の改良がなされた酵母を同定するために、前記組換え酵母をスクリーニング又は選択するステップとを含み、
少なくとも１つの前記組換え酵母を用いて、前記ステップａ）〜ｄ）又は前記ステップａ）〜ｅ）を少なくとも１度繰り返す産業に関わる酵母株の改良方法。
【請求項２】
前記ステップｅ）のスクリーニング又は選択から所望の改良がなされた１つ又はそれ以上の組換え酵母を得るステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｄ）において回収された前記組換え酵母は、スクリーニング又は選択される前に酵母ライブラリの形態で保存される請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記産業に関わる酵母株は、２以上の倍数性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記産業に関わる酵母株は、二倍体交雑酵母である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記産業に関わる酵母株は、生殖不能菌株である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記産業に関わる酵母株は、生殖不能な二倍体交雑菌株である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え酵母は、細胞毎に複数の組換え現象を示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組換え現象は、ヘテロ接合性のレベルの低減を誘導する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記産業に関わる酵母株は、非遺伝子改変生物である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記改良された酵母は、非遺伝子改変生物である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記産業に関わる酵母に、減数分裂前期において二本鎖の分離の頻度を局所的に増大するために、又は染色体に沿ったそのような分離の分布を改変するために、Spo11タンパク質又はSpo11タンパク質のパートナーに作動可能に結合されるＤＮＡ結合ドメインを含む、好ましくは減数分裂特異的な、プロモーターの制御下の融合タンパク質をコードする核酸が導入される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記産業に関わる酵母株は、食品産業用、バイオ燃料の生産用、有益な分子の生産用、又はセルロース若しくはリグノセルロース系バイオマスの分解用である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記産業に関わる酵母株は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種、又はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から得られた交雑種である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記改良は、増殖速度、熱耐性、耐寒性、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性に関する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）交雑酵母を富栄養培地から胞子形成培地に移すステップと、
ｂ）前記交雑酵母を、前記胞子形成培地において、Spo-11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートするステップと、
ｃ）組換え酵母を得るために、前記交雑酵母を第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に、炭素源及び窒素源に接触させるステップと、
ｄ）前記組換え酵母を回収するステップとを備え、
少なくとも１つの前記組換え酵母を用いて、前記ステップａ）〜ｄ）を少なくとも１度繰り返し、組換え酵母ライブラリを生成するために前記組換え酵母を回収することを特徴とする交雑酵母から組換え酵母ライブラリを生成する方法。
【請求項１７】
前記交雑酵母は、２以上の倍数性を有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
交雑酵母において、好ましくは量的形質座位（ＱＴＬ）といった所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるための方法であって、
ａ）前記交雑酵母を富栄養培地から胞子形成培地に移すことと、
ｂ）前記交雑酵母を、前記胞子形成培地においてSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに
十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え酵母を得るために、前記交雑酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源と接触させることと、
ｄ）前記組換え酵母を回収することと、
ｅ）前記所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるために、前記組換え酵母の遺伝子型及び表現型を分析することとを備え、
少なくとも１つの前記組換え酵母を用いて、前記ステップａ）〜ｄ）又は前記ステップａ）〜ｅ）を少なくとも１度繰り返す方法。
【請求項１９】
前記交雑酵母は２以上の倍数性を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記所望の特性は、増殖速度、熱耐性、耐寒性、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵からなる群から選択される請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記胞子形成培地は、発酵可能な炭素源又は窒素源を含まない請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵母は、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に、富栄養培地に移されることにより炭素源及び窒素源に接触される請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分野に関し、特に酵母の分野に関する。本発明は、組換えDNA技術を用いることなく、産業に関わる酵母株、特に胞子形成ができない交雑菌株を改良又は改変するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、幅広い産業において用いられる。多くの種の無害性により、酵母は特に、食品産業において、パン製造、ビール醸造、ワイン醸造若しくは蒸留における発酵剤として、又は栄養素若しくは調味料のための抽出物として用いられる。また、それらは、バイオエタノール又はビタミン、抗生物質、ワクチン、酵素若しくはステロイドホルモン等の有益な分子の工業的生産、又はセルロース系材料の分解処理に用いられ得る。
【０００３】
酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeの工業的適用の多様性は、改良された特性を有する酵母株の一定の需要があること、又は少なくとも新規用法若しくは新規培養条件に適することを意味する。
当業者は、特定の特性を有する菌株を得るのに用いられる種々のツール及び方法を有する。特に、当業者は、内在性遺伝子の発現を改変する又は損なわせるように、1つ又はそれ以上の異種遺伝子を導入することにより菌株を遺伝子的に変異できる。しかしながら、菌株を遺伝子的に変異するための組換えＤＮＡ技術の使用は、規制、健康又は環境因子により、その工業的使用を制限し得る。
【０００４】
有性生殖は、所望の特性を有する二種の親株を交雑し、親株の特性の所望の組合せを提供する交雑菌株を選択することにより、酵母を改良するために用いられ得る。胞子形成からの一倍体細胞は、減数分裂組換えで所望の特性を産生する株を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０００５】
しかしながら、工業的に用いられる酵母株は、通常、遺伝子的に異なる菌株を交雑することにより得られる交雑細胞であり、生存する胞子を生成することができない性質により生殖不能となり得る。大きい経済的利益となるこれらの交雑細胞のために、有性生殖による遺伝子的多様性を生成すること及び胞子形成の産物のスクリーニングができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を用いることなく、生殖不能な交雑酵母を含む産業に関わる酵母株を改良するための新規の方法を提供すること、及び関心のある量的形質の急速な分析を可能とする組換え遺伝子型の酵母、好ましくは２以上の倍数性を含む酵母、特に二倍体の酵母を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、産業に関わる酵母株を改良するための方法に関し、その方法は、
ａ）酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵性炭素源又は窒素源を有さない胞子形成培地に移すことと、
ｂ）前記酵母を、胞子形成培地において、Spo11依存性二本鎖の切断の発生を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え型酵母を得るために、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に、酵母を炭素源及び窒素源に接触させることと、
ｄ）組換え型酵母を回収することと、
ｅ）所望の改良を有する組換え型酵母を同定するために、組換え型酵母をスクリーニング又はせんたくすることと、を含む。
【０００８】
その方法は、ステップｅ）のスクリーニング又は選択から所望の改良を有する１つ又はそれ以上の組換え型酵母を得ることをさらに含み得る。
【０００９】
また、その方法は、産業に関わる酵母株を改良するために酵母ＲＴＧプロセスを用いること、酵母を胞子形成培地において、Spo-11依存性二本鎖分離の発生を誘導するのに十分な時間インキュベートすること、及び第１の減数分裂の減数的染色体分離前に酵母を炭素源及び窒素源と接触させることに関し、該ＲＴＧプロセスは、酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは酵素性炭素源又は窒素源を有さない胞子形成培地に移すことにより誘導されるものである。
【００１０】
好ましくは、産業に関わる酵母は、２以上の倍数性を有する。
【００１１】
産業に関わる酵母は、交雑酵母であってもよい。
【００１２】
それは、一倍体、異数体、二倍体又は多倍数、好ましくは二倍体、異数体又は多倍体、より好ましくは二倍体であってもよい。
【００１３】
好ましくは、産業に関わる酵母は、二倍体交雑酵母である。
【００１４】
産業に関わる酵母株は、生殖不能酵母であってもよく、好ましくは生殖不能交雑菌株であってもよい。
【００１５】
好ましい実施形態において、産業に関わる酵母株は、生殖不能な二倍体交雑菌株である。
【００１６】
好ましい実施形態において、菌株は遺伝子組み換えがなされていない菌株である。
【００１７】
組換え型酵母は、細胞毎に１つ又はそれ以上の組換え現象、好ましくは複数の組換え現象を示す。好ましくは、その組換え現象は、ヘテロ接合性のレベルの低減を誘導する。
【００１８】
Spo11タンパク質又はSpo11タンパク質のパートナーに作動可能に結合されるＤＮＡ結合ドメインを含む、好ましくは減数分裂特異的な、プロモーターの制御下の融合タンパク質をコードする核酸は、減数分裂前期において二本鎖の分離の頻度を局所的に増大するために、又は染色体に沿ったそのような分離の分布を改変するために、産業に関わる酵母に導入され得る。
【００１９】
ステップａ）からｄ）又はａ）からｅ）は、１つ又はそれ以上の組換え酵母を用いて少なくとも一度繰り返され得る。
【００２０】
ステップｄ）において回収される組換え酵母は、ステップｅ）のスクリーニング又は選択の前に酵母ライブラリに保存され得る。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法により得られる組換え又は改良酵母は、遺伝子改変生物（ＧＭＯs）ではない。
【００２２】
産業に関わる酵母は、食品産業用、バイオ燃料、特にバイオエタノールの生産用、ビタミン、抗生物質、ワクチン、酵素若しくはステロイドホルモン等の有益な分子の生産用、又はセルロース若しくはリグノセルロースバイオマスの分解用であることが好ましい、及び／又はSaccharomycescerevisiae種若しくはSaccharomyces cerevisiaeから得られた交雑種であることが好ましい。
【００２３】
所望の改良は、増殖速度、熱耐性、耐寒性、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性に関する。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、酵母から組換え酵母ライブラリを生成するための方法に関し、それは、
ａ）富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能な炭素源又は窒素源を有さない培地に酵母を移すことと、
ｂ）その酵母を、胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることとと、
ｃ）その酵母を、組換え酵母を得るために第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源に接触させることと、
ｄ）組換え酵母ライブラリを生成するために組換え酵母を回収することとを含む。
【００２５】
その酵母は、一倍体、異数体、二倍体又は多倍数、好ましくは二倍体、異数体又は多倍体、より好ましくは二倍体であってもよい。
【００２６】
好ましくは、酵母は、２以上の倍数性を有する。
【００２７】
その方法に従って得られた組換え酵母のライブラリにも関する。
【００２８】
他の態様において、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母において、好ましくは量的形質座位（ＱＴＬ）といった所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は酵母において位置付けるための方法にも関し、それは、
ａ）富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能な炭素源又は窒素源を有さない培地に酵母を移すことと、
ｂ）酵母を、胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え酵母を得るために、酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源と接触させることと、
ｄ）組換え酵母を回収することと、
ｅ）所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるために、組換え酵母の遺伝子型及び表現型を分析することとを含む。
【００２９】
特に、所望の特性は、増殖速度、熱耐性、耐寒性、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵からなる群の１つまたはそれ以上の特性から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ＡＲＧ４対立遺伝子を有する組換え細胞を選択するために胞子形成の間に回収された細胞をアルギニン欠損選択培地に入れることを意味する「return-to-growth」プロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップである。２つの相同染色体の遺伝子型は、異質対立遺伝子（薄い灰色）、起源がＳＫ１の場合の単一対立遺伝子（濃い灰色）又は起源がＳ２８８Ｃの場合の単一対立遺伝子（黒色）のそれぞれのＲＴＧ二倍体において示される。図１Ａは、ＡＮＤ１７０８ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい２１の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の３４の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約６９１ｋｂ）。
【図１Ｂ】図１Ａと同様にプロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップであり、図１ＢではＡＮＤ１７０９ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい２９の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の５３の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約２６４ｋｂ）。
【図１Ｃ】図１Ａと同様にプロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップであり、図１ＣではＡＮＤ１７１０ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい１１の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の１５の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約４３１ｋｂ）。
【図１Ｄ】図１Ａと同様にプロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップであり、図１ＤではＡＮＤ１７１１ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい２５の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の３８の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約３９８ｋｂ）。
【図１Ｅ】図１Ａと同様にプロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップであり、図１ＥではＡＮＤ１７１２ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい７の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の７の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約４１５ｋｂ）。
【図１Ｆ】図１Ａと同様にプロトコール２により得られたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップであり、図１ＦではＡＮＤ１７２０ＲＴＧ細胞の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい１３の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の１８の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約５３７ｋｂ）。
【図２Ａ】顕微操作によりＲＴＧ細胞の単離を行う「return-to-growth」プロトコール３から生じる母／娘対におけるＳＮＰｓのマップである。各ＲＴＧ二倍体において、同一のＲＴＧ現象からの母細胞及び娘細胞がグループ化される。図２Ａは、ＡＮＤ１７３３ＲＴＧ細胞（母細胞）及びＡＮＤ１７３４ＲＴＧ細胞（娘細胞）の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい２９の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の４５の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約３００ｋｂ）。
【図２Ｂ】図２Ａと同様にプロトコール３から生じる母／娘対におけるＳＮＰｓのマップであり、図２ＢではＡＮＤ１７３５ＲＴＧ細胞（母細胞）及びＡＮＤ１７３６ＲＴＧ細胞（娘細胞）の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい５の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の６の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約３６１ｋｂ）。
【図２Ｃ】図２Ａと同様にプロトコール３から生じる母／娘対におけるＳＮＰｓのマップであり、図２ＣではＡＮＤ１７３７ＲＴＧ細胞（母細胞）及びＡＮＤ１７３８ＲＴＧ細胞（娘細胞）の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい３の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の３の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約３９３ｋｂ）。
【図２Ｄ】図２Ａと同様にプロトコール３から生じる母／娘対におけるＳＮＰｓのマップであり、図２ＤではＡＮＤ１７３９ＲＴＧ細胞（母細胞）及びＡＮＤ１７４０ＲＴＧ細胞（娘細胞）の遺伝子型である（２０ｋｂよりも大きい８の単一対立遺伝子領域；単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間又は異なる対立遺伝子の単一対立遺伝子領域の間の１０の接合部；ヘテロ接合性の損失の最も大きい領域のサイズ：約３５７ｋｂ）。
【図３】ＡＮＤ１７１０ＲＴＧ細胞から生じる四分子の４つの胞子の遺伝子型である。１６の染色体のそれぞれにおいて、四分子の胞子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの遺伝子型は縦に並んで示される。
【図４】ＲＴＧプロセスの繰り返しから生じる細胞のＳＮＰｓのマップである。ＡＮＤ１７３５ＲＴＧ細胞（図２Ｂ及び図４Ａ）は、組換え二倍体細胞ＡＮＤ２７１１（図４Ｂ）を生成する第２のＲＴＧサイクル、及びその後に組換え二倍体細胞ＡＮＤ２９０７（図４Ｃ）を生成する第３のＲＴＧサイクルを受けた。ヘテロ接合性の割合、及びヘテロ接合性損失の領域から算出されたＳ２８８ｃ又はＳＫ１遺伝的背景の対立遺伝子の相対的割合が示される（図４Ａ〜Ｃ）。ＲＴＧプロセスの繰り返しが、更なる組換え体、ヘテロ接合性のレベルの段階的低減、及び純粋なＳ２８８Ｃ及びＳＫ１遺伝子型の単一対立遺伝子領域の割合の変化を引き起こす（図４Ａ〜Ｃ）。
【図５Ａ】ＡＮＤ２２４８胞子形成欠陥菌株から生じるＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップである。ＲＴＧサイクルから生じるこれらの３つの細胞ＡＮＤ２６４２（図５Ａ）、ＡＮＤ２６５２（図５Ｂ）及びＡＮＤ２６５８（図５Ｃ）は、二倍体であり、組換え遺伝子型である。それらの遺伝子型は異なる。３つのケースのすべてにおいて、ヘテロ接合性のレベルは親細胞と比較して低減し（８４．４％、７９．３％及び９３．１％）、Ｓ２８８Ｃ又はＳＫ１単一対立遺伝子領域の可変比率を表す。
【図５Ｂ】ＡＮＤ２２４８胞子形成欠陥菌株から生じるＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップである。ＲＴＧサイクルから生じるこれらの３つの細胞ＡＮＤ２６４２（図５Ａ）、ＡＮＤ２６５２（図５Ｂ）及びＡＮＤ２６５８（図５Ｃ）は、二倍体であり、組換え遺伝子型である。それらの遺伝子型は異なる。３つのケースのすべてにおいて、ヘテロ接合性のレベルは親細胞と比較して低減し（８４．４％、７９．３％及び９３．１％）、Ｓ２８８Ｃ又はＳＫ１単一対立遺伝子領域の可変比率を表す。
【図５Ｃ】ＡＮＤ２２４８胞子形成欠陥菌株から生じるＲＴＧ細胞のＳＮＰｓのマップである。ＲＴＧサイクルから生じるこれらの３つの細胞ＡＮＤ２６４２（図５Ａ）、ＡＮＤ２６５２（図５Ｂ）及びＡＮＤ２６５８（図５Ｃ）は、二倍体であり、組換え遺伝子型である。それらの遺伝子型は異なる。３つのケースのすべてにおいて、ヘテロ接合性のレベルは親細胞と比較して低減し（８４．４％、７９．３％及び９３．１％）、Ｓ２８８Ｃ又はＳＫ１単一対立遺伝子領域の可変比率を表す。
【図６】二倍体細胞ＡＮＤ１７０２、ＡＮＤ１７３５、ＡＮＤ２９０７及びＡＮＤ２２４８から生じる１９のＲＴＧ細胞の対立遺伝子の遺伝子型の比較分析である。それぞれのＲＴＧ細胞において、図は、二対立遺伝子（ヘテロ接合）、２８８Ｃ由来の場合の単一対立遺伝子、又はＳＫ１由来の場合の単一対立遺伝子であるＳＮＰｓの割合を示す。それらの割合は、各ＲＴＧ細胞の間で異なる。
【図７Ａ】単純な表現型に関するＳＮＰ多型の位置のマップである。各染色体の長さは、細い水平な黒線により表される。ＲＴＧから生じるいくつかの細胞の研究は、候補領域の数を低減する、及び残りの領域におけるマップの分析を改善することの効果を有する。少ない数のサンプル分析により、いくつかの候補領域は、メチオニン又はロイシンにおける栄養要求性表現型に関する。図７Ａは、メチオニンにおける栄養要求性表現型に関するＳＮＰ多型の位置のマップである。ＭＥＴ１５（三角形）の位置は、メチオニンにおける栄養要求性表現型に関する。
【図７Ｂ】図７Ａと同様に単純な表現型に関するＳＮＰ多型の位置のマップであり、図７Ｂでは、ロイシンにおける栄養要求性表現型に関するＳＮＰ多型の位置のマップである。ＬＥＵ２（三角形）の位置は、ロイシンにおける栄養要求性表現型に関する。
【図８】ＲＴＧ及び親細胞における増殖試験である。ＹＰＤ培地において３０℃、４０℃で増殖、及び亜ヒ酸ナトリウムを含むＹＰＤ培地（１．５ｍＭＮａＡｓＯ２）において３０℃で増殖させた。各菌株において、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２及び１０１の細胞をＹＰＤ培地に播き、ＮａＡｓＯ２の存在下及び非存在下で３０℃、又は４０℃（ＮａＡｓＯ２非存在）で２日間インキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
産業に用いられる酵母の様々な種のうち、Saccharomyces cerevisiaeは極めて一般的である。S cerevisiaeは、細胞増殖で一倍体と二倍体との両方を生じる生殖周期を有する生物である単複相の単細胞真核生物である。
【００３２】
細胞は、有糸分裂によりクローン的に増殖する。娘細胞は、ゲノム複製のＳ期に生じる芽として表れ、その後に成長し、母細胞から分離する。有糸分裂の際、全体のゲノム（核ゲノムにおいて１２０７１３２６ヌクレオチド）は、複製され、母細胞から娘細胞に正確に伝えられる。相同組換え現象が生じ得るが、相同組換え現象は、本質的に、複製が阻害される又は細胞が遺伝毒性剤に曝露されたときに、ＤＮＡに起こり得る偶然の二本鎖分離の修復のためのものである。この場合、姉妹染色分体は、マトリクスとして好適に用いられる。有糸分裂の際、栄養成長中の細胞において同一の遺伝子プールを維持させる相同染色体間の組換えは、稀に起こる。
【００３３】
また、酵母は、減数分裂及び胞子形成を通じて有性生殖により増殖できる。一方で、対応する接合型（ＭＡＴａ及びＭＡＴα）の２つの一倍体細胞は、有糸分裂により同型の複製をする二倍体ＭＡＴａ／ＭＡＴα細胞を形成するように融合できる。他方で、栄養不足の条件下で、二倍体細胞は、各二倍体細胞において四分子に含まれる４つの１倍体胞子を生成する減数分裂過程を通じて胞子形成をする。これらの胞子の発生は、新たな二倍体細胞を形成するために融合可能な一倍体細胞を生成する。
【００３４】
減数分裂周期の開始は、２つの接合対立形質ＭＡＴａ及びＭＡＴαの存在により示される二倍性の遺伝子的シグナルと、窒素源及び発酵可能炭素源の非存在並びに呼吸により代謝されることが可能な炭素源の存在を示す栄養的シグナルとの多数のシグナルの同時の細胞への伝達に依存する（Honigberg and Purnapatre, 2003）。
【００３５】
減数分裂の際、有糸分裂において起こるものと違い、二倍体親細胞からの遺伝情報は、一倍体細胞に等しく伝達されない。実際に、それは半数に減少され、相同染色体間の多くの遺伝子交換は減数分裂第Ｉ期の間に起こる。第Ｉ期に起こる減数分裂組換えは、（i）Spo11タンパク質による二本鎖分離の発生、（ii）分離されたものの５’末端におけるヌクレオチドの切断、（iii）相同染色体の染色分体における鎖の３’突出末端の侵食、及び（iv）交差（相同染色体間の相互交換）、遺伝子変換（相同染色体間の相互交換がないＤＮＡセグメントのコピー）又はその両方（交差と伴った遺伝子変換）を生じる分離されたものの修復に関する。
【００３６】
S. cerevisiae酵母の特別な特徴は、減数分裂第Ｉ期に入ることの誘導が可逆的であることである。「Return to Growth」（ＲＴＧ）と呼ばれるこのプロセスは、栄養不足に応じて減数分裂を開始した二倍体細胞が、Spo-11依存的二本鎖分離の発生後で、第１の減数分裂の前に炭素源及び窒素源の存在下に置かれたときに起こる（Honigberg and Esposito, 1994）。これらの条件下で、酵母は、Spo11により引き起こされる二本鎖分離の修復の際の組換えを誘導する一方で有糸分裂的増殖モードの再開のために、減数分裂の段階の進行を停止する(Sherman and Roman, 1963; Esposito and Esposito, 1974; Zenvirth etal., 1997)。ＲＴＧプロセスの際、細胞が富栄養培地に移された後に二本鎖分離が急速に修復されることが観察される(Zenvirth et al., 1997)。これらの修復に関わるメカニズムは、未だ明らかとなっていないが、それらは減数分裂の際に起こるメカニズムと区別され、ゲノムの完全性を保存し、ヘテロ接合性の損失を制限するために、交差を最小限にすると考えられる(Dayani et al., 2011)。
【００３７】
ＲＴＧプロセスの際の相同染色体間における遺伝子交換の正確なマップを確立するために、発明者らは、相同染色体がヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の６３９０１のマーカーで異なる、二倍体交雑酵母からＲＴＧにより得られた１４の二倍体細胞の１６の染色体について完全にシークエンシングした（平均で１８７ｂｐ毎のマーカーを意味する）。発明者らは、このプロセスの際に細胞毎に起こる組換え現象の数及び性質（交差又は遺伝子変換）を決定できた。
【００３８】
全く予想外に、発明者らは、ＲＴＧから生じた細胞で組換えが頻発しており（細胞毎に３〜５１の組換え現象）、同一の組換えプロファイルを有する細胞がなく、その細胞が相同染色体の極めて高い遺伝子多様性により特徴付けられることを観察した。さらに、発明者らは、ＲＴＧから生じた細胞が、１つ又はそれ以上のＳＮＰｓを含む可変長のヘテロ接合性の損失に関わる組換えを示すことを証明した。ヘテロ接合性の損失の物理的大きさは、２ｂｐ〜７００ｂｐの範囲である。ゲノムスケールでの組換え現象のこの全体像で、発明者らは、前記のものとは異なり、ＲＴＧプロセスの際の二本鎖分離の修復のメカニズムが、ヘテロ接合性の損失を制限せず、親交雑細胞のゲノムからの遺伝子情報の大きい多様性を生じることを証明した。
【００３９】
驚くことに、ＲＴＧプロセスが高い遺伝子多様性を生じるのに用いられ得ることが明らかとなった。このプロセスは、交雑酵母、特に胞子から組換え遺伝子型を得るのが不可能である生殖不能交雑酵母の改良又は改変において特に興味深い。
【００４０】
本発明は、
ａ）酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能炭素源又は窒素源を有さない培地に移すことと、
ｂ）酵母を胞子形成培地においてSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え酵母を得るために、酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源に接触させることと、
ｄ）組換え酵母を回収することと、
ｅ）所望の改良を有する酵母を同定するために組換え酵母のスクリーニング又は選択をすることと、を備えている産業に関わる酵母株を改良するための方法に関する。
【００４１】
好ましくは、産業に関わる酵母株は、２以上の倍数性を有する。
【００４２】
本発明は、産業に関わる酵母株を改良するための、酵母ＲＴＧプロセスの使用に関し、そのＲＴＧプロセスは、酵母を富栄養培地から胞子形成培地、このましくは発酵可能炭素源及び窒素源を有さない培地に移すことと、その酵母を胞子形成培地においてSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、その酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源に接触させることとにより誘導される。好ましくは、産業に関わる酵母株は２以上の倍数性を有する。
【００４３】
ＲＴＧプロセスは、酵母における有糸分裂増殖のモードを再開する前の減数分裂周期及び二本鎖分離の開始に関する。減数分裂周期の開始は、ＭＡＴａ及びＭＡＴαの２つの対立形質の存在、窒素源及び発酵可能炭素源の非存在といったいくつかのシグナルに依存する。
【００４４】
本明細書で用いられる「富栄養培地」の用語は、発酵可能炭素源及び窒素源、並びに有糸分裂により酵母が増殖するのに必要な全ての栄養を備えた培養培地を意味する。この培地は、当業者により容易に選択され、例えばＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン及び２％グルコース）、ＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン及び３％グリセロール）(Treco and Lundblad, 2001)、並びに合成完全培地（又はＳＣ培地）からなる群から選択され得る。
【００４５】
本明細書で用いられる「胞子形成培地」の用語は、栄養成長なく減数分裂前期に入るように酵母を誘導する培地、特に発酵可能炭素源又は窒素源を含まないがアセテート等の呼吸により代謝可能な炭素源を含む培養培地を意味する。この培地は、当業者により容易に選択され、例えば１％ＫＡｃ培地(Wu and Lichten, 1994)、ＳＰＭ培地(Kassir andSimchen 1991)、及びShermanの論文に記載された胞子形成培地(Sherman, 1991)からなる群から選択され得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、胞子形成培地でインキュベートする前に、細胞は、有効で同時性の胞子形成を得るために、前胞子形成培地で数回の分裂のために培養される。前胞子形成培地は、当業者により容易に選択され得る。この培地は、例えばＳＰＳ培地である(Wu and Lichten, 1994)。
【００４７】
培地（富栄養培地、前胞子形成培地、胞子形成培地）の選択は、特に酵母株が１つ又はそれ以上の化合物についての栄養要求性をもつ場合、改良するための酵母株の生理学的及び遺伝子的特性に依存する。減数分裂前期の可逆性は一時的である。実際に、Spo11依存性二本鎖分離の発生の前に細胞が富栄養培地で再インキュベートされる場合、その細胞は、ゲノムの改変がなく有糸分裂を急速に再開する。反対に、第１の減数分裂（ＭＩ）の際の減数的染色体分離の前で開始段階が起こった後に細胞が富栄養培地で培養された場合、胞子形成が正常に進み、組換え胞子が生成する。組換え遺伝子型を生成するＲＴＧプロセスは、Spo11依存性二本鎖分離の発生と、ＭＩでの減数的染色体分離前の開始段階との間の時間内に起こり得る。
【００４８】
胞子形成培地でのインキュベート時間は、酵母株によって異なり得る。栄養不足シグナルにゆっくりと反応する菌株において、この培地でのインキュベートは長くなり得る。
【００４９】
胞子形成培地でのインキュベート時間は、（i）Spo11依存性二本鎖分離の発生の期間、（ii）減数的染色体分離の期間、及び（iii）減数的染色体分離の前の開始段階を測定することにより所望の菌株毎で、当業者により決定され得る。代替的に、胞子形成培地でのインキュベート期間は、開始段階のみの測定により所望の菌株毎で当業者により決定され得る。炭素源及び窒素源の追加は、例えば開始段階前１、２、３又は４時間、好ましくは１又は２時間に想定される。
【００５０】
Spo11依存性二本鎖分離の発生は、サザンブロット等の従来の分子生物学技術によりわかり得る。同様に、例えばＤＡＰＩ染色といった単純なＤＮＡマーキングにより減数的染色体分離を観察できる。細胞が炭素源及び窒素源の存在下に置かれる前の開始段階は、減数的染色体分離の直前である。この段階は、細胞が種々のインキュベート時間で炭素源及び窒素源の存在下に置かれるＲＴＧ試験の実施により決定され得る。それは、有糸分裂（芽細胞の発生により証明される）を再開する細胞の割合が最も高い（胞子形成プロセスを継続する細胞の割合が最も低い）時間を定義することができる。例えば、実施例で用いられるSaccharomyces cerevisiae酵母のＳ２８８Ｃ又はＳＫ１の遺伝的背景において、この時間は胞子形成培地に細胞を移した後５〜７時間である。
【００５１】
炭素源及び窒素源の再度の曝露のために、酵母は、上記の富栄養培地に移され得る。代替的に、炭素源及び窒素源は、胞子形成培地に直接に加えられ得る。
【００５２】
炭素源は、発酵可能炭素源であってもよく、例えばグルコース、ガラクトース、グリセロール、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され得る。窒素源は、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム又は硝酸カリウム等の無機性窒素、及び例えばアミノ酸（グルタミン酸、グルタミン）又は酵母エキス(Albers et al., 1996)の形態の有機性窒素からなる群から選択され得る。
【００５３】
発酵可能炭素源及び窒素源と接触された酵母は、二本鎖分離が修復される調節期間の後、有糸分裂を再開する。発明者らにより観察された多くの組換え現象は、これらの分離の修復する期間に起こる。調節期間の持続は、種に依存し、当業者により容易に調整される。通常、１〜３時間取られ、好ましくは１．５時間である。
【００５４】
この調節期間の後、組換え酵母は、スクリーニング又は選択のために回収され得る（当該方法のステップ（ｄ））。任意に、スクリーニング又は選択の前に、組換え酵母は、組換え酵母ライブラリの形態で保存され得る。
【００５５】
産業に関わる酵母株は、一倍体（ｎ染色体）、二倍体（２ｎ染色体）又は多倍数体（２ｎ、３ｎ、４ｎ又はそれ以上の染色体）であってもよい。産業に関わる酵母株は、その倍数性レベルが一倍体の正確な倍数でないものを意味する異数体であってもよい。この場合、酵母は、例えばｎ＋ｘ、２ｎ＋ｘ又は３ｎ＋ｘ染色体を含み、ｘは一倍体の正確な倍数を超える更なる染色体の数である。酵母は、例えば１つ又はそれ以上の染色体の２つのコピー（例えばｎ＋１、ｎ＋２又はｎ＋３染色体）を意味するダイソミーを１つ以上有してもよく、又は１つ又はそれ以上の染色体の３つのコピー（例えばｎ＋２、２ｎ＋１又は２ｎ＋２染色体）を意味するトリソミーを１つ以上有してもよい。
【００５６】
特定の一実施形態において、産業に関わる酵母株は少なくともダイソミーを含む。
【００５７】
好ましくは、産業に関わる酵母株は、２以上の倍数性を有する。特に、それは、二倍体（２ｎ）、異数体（例えば２ｎ＋ｘ又は３ｎ＋ｘ）、又は多倍数体（例えば３ｎ、４ｎ又は５ｎ）であってもよく、好ましくは二倍体である。
【００５８】
ＲＴＧプロセスを受けることで、所望の酵母株は、胞子形成可能で、二本鎖分離の発生の段階に進むことができる。しかしながら、それは、後期において不十分であり、成体及び／又は生存可能な胞子を形成できない。胞子形成段階に進むことは、ａとαとの２つの対立形質で構成される接合シグナルに依存する。酵母が一倍体又は異数体であり、これらの対立形質の１つのみを含む場合、２つの接合型の発現を引き起こす変異を誘導し得る（例えばＨＭＲ及びＨＭＬ接合遺伝子座の発現を制御するsir遺伝子における変異）、又はゲノムに欠損した対立形質を含む接合遺伝子を導入し得る。そのような変更は、例えばSaccharomyces cerevisiaeにおける一倍体株の減数分裂の開始の誘導において説明されている(De Massy et al., 1994)。
【００５９】
好ましい実施形態において、産業に関わる酵母株は、交雑酵母であり、好ましくは二倍体交雑酵母である。特に、産業に関わる酵母株は、所望の菌株を遺伝子的に異なる所望の特性を有する菌株と交雑することにより得られ得る。そのように得られた交雑細胞は、胞子形成培地に移される（当該方法のステップ（ａ））。本発明の方法は、ステップａ）の前に、産業に関わる酵母株と遺伝子的に異なり、その酵母株を改良するための所望の特性を有する酵母株を選択するステップ（i）と、交雑菌株を得るために産業に関わる酵母株とそれと遺伝的に異なる菌株とを交雑するステップ（ii）とをさらに備えていてもよい。２つの親株の遺伝形質は、本発明の方法を用いて組み換えられる。
【００６０】
本明細書において用いられる「交雑菌株」の用語は、互いに異なる遺伝子型を有する又は少なくとも１つの異なる遺伝形質を有する２つの菌株である２つの遺伝子的に異なる菌株を交雑することにより得られた酵母を意味する。好ましくは、親株同士は、例えば増殖速度、熱耐性、耐寒性、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵等の少なくとも１つの表現型特性で異なる。交雑酵母は、二倍体、異数体、多倍数体、及び複数の種からの複数の染色体のセットを含む異質多倍数体であってもよい。交雑酵母は、好ましくは二倍体である。交雑の種類は、種内又は種間であり、好ましくは種間である。種間交雑は、通常生殖不能である。交雑酵母は、当業者に周知の方法により得られ、特に、２つの胞子又は２つのプロトプラストを融合することにより得られ得る（体細胞交雑）。
【００６１】
種内又は種間交雑で得られた酵母は、産業において一般に用いられる。交雑は、親株からの特性の組み合わせがなされた新規の酵母株を生成するために用いられ得る。ワイン産業において、例えば良好なエタノール体制を有する菌株と高温に対する耐性を有する菌株とを交雑することがなされ得る。親株からの所望の特性が組み合わされた交雑菌株は、その後に選択される。
【００６２】
交雑菌株の使用の主要な欠点のうちの１つは、これらの菌株が生殖不能であることが多いという事実に基づく。菌株の生殖不能性は、成熟胞子の生成ができないこと、又は胞子の非生存性に起因し得る。例えば、Saccharomyces cerevisiaeとSaccharomycesparadoxusとの融合により得られ、赤ワインの製造に用いられる二倍体交雑酵母は、有糸分裂により増殖できるが、生存可能な一倍体配偶子を生成できない(Greig, 2007)。従って、これらの生殖不能交雑菌株は、子孫を交雑することにより、又は所望の他の菌株と融合することによって更なる変更がなされない。
【００６３】
しかしながら、これらの菌株は、本発明の方法を用いて組換えが可能である。好ましい一実施形態において、産業に関わる酵母株は、生殖不能な交雑菌株であり、特に生殖不能な二倍体交雑菌株である。実際に、発明者らは、ＲＴＧプロセスが胞子形成プロセスを完了することが必要でない組換え菌株を多く取得可能にすることを証明した。従って、本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術を使用せずに、生殖不能交雑菌株からの組換え細胞を多く取得可能にし、交雑株の改良を可能とする。
【００６４】
本明細書において用いられる「生殖不能酵母」の用語は、成熟胞子を生成することができない若しくはそのための能力が低減された酵母、及び／又は非生存胞子若しくは生存能力が低減した胞子を有する酵母を意味する。しかしながら、その生殖不能酵母は、胞子形成段階に入ることができ、二本鎖分離の発生の段階に進むことができる。生殖不能酵母は、同一種の参照菌株と比較して、また、交雑菌株の場合は親株の１つ比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％低減された成熟胞子を生成するための能力を有する。生殖不能酵母は、低減された生存性を有する胞子を生成し得る。特に、この酵母により生成された胞子のうち、少なくとも２５％、５０％又は７５％は、非生存となり得る。好ましくは、生殖不能菌株は、成熟胞子を生成できない、又は成熟胞子を生成しない。
【００６５】
産業に関わる酵母株は、ワイン醸造、ビール醸造、蒸留若しくはパン製造等の食品産業、バイオ燃料製造、有益な分子の製造、又はセルロースの分解に関わる産業を対象としてもよく、また、そのような産業に用いられてもよい。
【００６６】
産業に関わる酵母は、炭素源及び窒素源の存在下に戻したときに、減数分裂前期における二本鎖分離の誘導後に有糸分裂を再開できる酵母株であってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態において、産業に関わる酵母株は、非遺伝子改変生物である。本明細書において用いられる「非遺伝子改変生物」の用語は、遺伝子工学、特に遺伝子組換えにより遺伝子材料が変更された酵母を意味する。
【００６８】
好ましくは、本発明の方法により生成された組換え酵母は、遺伝子改変生物（ＧＭＯｓ）とみなされない。
【００６９】
特定の一実施形態において、産業に関わる生物は、Saccharomyces sensustricto属に属する、又はSaccharomyces sensu strictoに属する菌株から得られた交雑菌株である。好ましくは、産業に関わる酵母株は、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomycesbayanus、Saccharomyces castelli、Saccharomyceseubayanus、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces kudriavzevii、Saccharomycesmikatae、Saccharomyces uvarum、Saccharomycesparadoxus及びSaccharomyces pastorianus（Saccharomyces carlsbergensisとしても知られている）からなる軍から選択される種に属する、又はこれらの種のうちの１つの菌株から得られた交雑菌株である。より好ましくは、産業に関わる酵母株は、Saccharomyces cerevisiae種、又は、例えばS.cerevisiae/S. paradoxus交雑菌株若しくはS. cerevisiae/S. uvarum交雑菌株等のSaccharomyces cerevisiae種の菌株から得られた交雑菌株である(Ranieriet al., 1999)。
【００７０】
一実施形態において、ＲＴＧプロセス後に得られた組換え細胞（本発明に係る方法のステップ（ｄ））は、組換えが多く起こり、細胞毎に複数の組換え現象が起こり、好ましくは細胞毎に２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の組換え現象を有する。各組換え現象は、二本鎖分離の修復に関するメカニズムに依存する交差、遺伝子変換、又は交差に伴う遺伝子変換であってもよい。本明細書において用いられる「組換え現象」の用語は、（i）好ましくは少なくとも２０ｋｂの単一対立遺伝子領域と二対立遺伝子領域との間、又は（ii）好ましくは１つが少なくとも２０ｋｂのサイズを有する２つの異なる対立形質の単一対立遺伝子領域同士の間での、ＲＴＧから生じた細胞の遺伝子型で観察される組換え接合を意味する。
【００７１】
特定の一実施形態において、組換え現象は、ヘテロ接合度の低減を誘導する。これは、ヘテロ接合性の損失をもたらすことを意味する。ホモ接合領域の生成は、潜在的に興味深い劣性形質の発現をさせるため、酵母改良プロセスにおいて特に関心がもたれる。ヘテロ接合度の低減は、例えば遺伝的多型、特にヌクレオチド多型のマーカーを追跡により評価され得る。
【００７２】
本発明の方法の他の利点は、組換え細胞が２以上、好ましくは２の倍数性を有することである。このため、ヘテロ接合状態（ヘテロシス現象）を発現する量的形質は、容易に分析可能であり、組換え細胞は、他の組換えのために、本発明の方法に従って直接に用いられ得る。
【００７３】
一実施形態において、組換え酵母は、酵母が減数分裂前期に入ること誘導するために、酵母を胞子形成培地、好ましくは発酵炭素源又は窒素源を含まない培地に再び移され、酵母は胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートされ、酵母は回収される前に第１の減数分裂の減数的染色体分離前に炭素源及び窒素源に接触される。組換え酵母のスクリーニング又は選択は、各周期の最後又は複数の周期後に行われ得る。組換え酵母のスクリーニング又は選択が各周期の最後に行われる場合、選択された酵母のみが再度改良プロセスを受けることができる。本発明の方法のステップａ）〜ｄ）又はａ）〜ｅ）は、１回以上繰り返され得る。特に、本発明の方法のステップａ）〜ｄ）又はａ）〜ｅ）は、少なくとも１、２、３、４又は５回繰り返され得る。好ましくは、本発明の方法のステップａ）〜ｄ）は、所望の改良を有する組換え酵母のスクリーニング又は選択の前に、少なくとも１、２、３、４又は５回繰り返され得る。
【００７４】
任意に、ステップｄ）で回収された又はステップｅ）で選択された組換え酵母は、一倍体酵母を得るために胞子形成が誘導され得る。組換え細胞から得られた四分子の胞子は、その組換え細胞の染色体のハプロタイプを決定するためにシークエンシングされ得る。代替的に、ステップｄ）で回収された又はステップｅ）で選択された組換え酵母は、「母／娘」細胞対を得るために出芽したままであってもよい。組換え細胞から得られたこの母／娘細胞は、その組換え細胞の染色体のハプロタイプを決定するためにシークエンシングされ得る。
【００７５】
本発明の方法は、ＲＴＧプロセスの際に酵母における組換え現象を増大する又は促進するために他のステップをさらに含んでもよい。一実施形態において、酵母が本方法（ステップａ）の胞子形成培地に置かれるとき、酵母は、１つ又はそれ以上のメチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）等の化学的突然変異誘発物質、又は紫外線若しくは電離放射線等の物理的突然変異誘発物質に曝露される。この曝露は、多型マーカーの組換え及びランダム突然変異誘発を通じて二重遺伝子的多様化をさせる。
【００７６】
他の実施形態において、欧州特許EP 1523564に記載されているような核酸コンストラクトは、酵母が胞子形成培地に移される前に、改良するための酵母に導入される。この核酸は、Spo11タンパク質に作動可能に結合されたＤＮＡ結合ドメイン（例えばGal4BD）を含む減数分裂特異的又は非減数分裂特異的プロモータにより制御される融合タンパク質をコードし、減数分裂前期における特定の染色体領域の二本鎖分離の頻度を増大させる、又はゲノム全体におけるそのような分離の分布を変更する。代替的に、その融合タンパク質は、減数分裂特異的プロモータにより制御され、二本鎖分離の発生に関わり、Spo11をリクルートできるSpo11のパートナータンパク質に作動可能に結合されたＤＮＡ結合ドメインを含む。Spo11のパートナータンパク質は、Keeney (2001)、Smith and Nicolas (1998)、Acquaviva et al.(2012)による論文に記載されたものから選択され得る。特に、それは、ME14、MER2/REC107、REC102、REC104、REC114、REC103/SK18、MRE2/NAM8、MRE11、RAD50、XRS2/NBS1、HOP1、RED1、MER1、MEK1、SET1及びSPP1からなる群から選択され得る。
【００７７】
所望の改良を提供する組換え酵母のスクリーニング又は選択は、当業者に周知の方法により行われ、所望の特性に依存する。酵母、特にSaccharomyces cerevisiae種の酵母の産業的適用の広さのため、本発明の方法を用いて多くの特性が改良され得る。例えば、これらの特性は、特定の条件化での増殖速度、高温に対する耐性（耐熱性）又は逆に低温に対する耐性（耐寒性）、ｐＨ感受性、発酵性、発酵速度、エタノール耐性、発酵培地に存在する若しくは細胞培養物から排出された特定の化合物に対する耐性、細胞形態、凝集、特定の分子に対する感受性、胞子形成の効率、芳香性プロファイル、栄養必要量、耐乾燥性、および特定の糖の発酵であってもよい。
【００７８】
本発明は、本発明の改良方法に従って得られた組換え酵母、又はそれ由来の酵母にも関する。
【００７９】
本発明者らは、ＲＴＧプロセスから発生する細胞のゲノムのシークエンシングを完了することにより、それは広い遺伝的多様性を生じること、及びこのプロセスから生じる細胞が同一の組換えプロファイルを有さないことを証明した。
【００８０】
他の態様において、本発明は、一酵母から組換え酵母ライブラリを生成するための酵母ＲＴＧプロセスの使用に関し、そのＲＴＧプロセスは、その酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵炭素源又は窒素源を有さない培地に移すこと、酵母を胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすること、並びに酵母を第１の減数分裂の減数的染色体分離前に炭素源及び窒素源に接触させることにより誘導される。
【００８１】
好ましくは、その酵母は、２以上の倍数性を有し、より好ましくは二倍体である。好ましくは、その酵母は交雑菌株であり、特に生殖不能交雑菌株である。
【００８２】
また、それは、酵母、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母から組換え酵母ライブラリを生成するための方法に関し、
ａ）酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能炭素源又は窒素源を有さない培地に移すステップと、
ｂ）酵母を、胞子形成培地において、Spo-11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートするステップと、
ｃ）組換え酵母を得るために、酵母を第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に、炭素源及び窒素源に接触させるステップと、
ｄ）組換え酵母ライブラリを生成するために組換え酵母を回収するステップとを含む。
【００８３】
本発明に係る改良プロセスの上述の実施形態は、この態様にも適用される。
【００８４】
好ましい実施形態において、二倍体組換え酵母は、細胞毎に複数の組換え現象を有し、好ましくは細胞毎に２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の組換え現象を有する。
【００８５】
一実施形態において、当該方法は、ステップａ）の前に、２つの所望の酵母を交雑することにより、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母を得るステップをさらに含む。
【００８６】
好ましくは、２以上の倍数性を有する酵母は二倍体である。好ましくは、その酵母は交雑菌株であり、特に生殖不能交雑菌株である。好ましい実施形態において、酵母は、産業に関わる菌株であり、特に産業に関わる二倍体菌株である。より好ましくは、酵母は、Saccharomyces sensu stricto属であり、より具体的にはS.cevevisiae種であり、又はSaccharomyces sensu stricto属、より具体的にはS. cevevisiae種から得られた交雑株である。
【００８７】
そのように生成された酵母ライブラリは、特定の特性を有する酵母株を選択するため、及び組換え酵母の遺伝子型及び表現型を比較することによって、所望の遺伝形質、特に所望の量的形質（又はＱＴＬ）を配置するために、特に用いられ得る。
【００８８】
本発明は、本発明に係る酵母ライブラリを生成するための方法により得られた組換え酵母ライブラリにも関する。
【００８９】
本発明は、酵母、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母において所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるための方法にも関し、
ａ）酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能炭素源又は窒素源を有さない培地に移すことと、
ｂ）酵母を、胞子形成培地においてSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え酵母を得るために、酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源と接触させることと、
ｄ）組換え酵母を回収することと、
ｅ）所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるために、組換え酵母の遺伝子型及び表現型を分析することとを含む。
【００９０】
また、それは、酵母、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母において所望の特性をコードする遺伝子情報を同定する又は位置付けるための酵母ＲＴＧプロセスの使用にも関し、そのＲＴＧプロセスは、その酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵炭素源又は窒素源を有さない培地に移すこと、酵母を胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすること、並びに酵母を第１の減数分裂の減数的染色体分離前に炭素源及び窒素源に接触させることにより誘導される。
【００９１】
好ましくは、所望の特性は、所望の量的形質（又はＱＴＬ）である。
【００９２】
本発明に係る改良プロセスの上記実施形態は、この態様にも適用される。
【００９３】
本発明者らは、ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の６３９０１のマーカーの分析をしめし、それらのうちの平均２７％でＲＴＧから生じた細胞のヘテロ接合性の損失を示した。この観察は、ＲＴＧの際に導入される二本鎖分離を修復するためのメカニズムがゲノムの完全性を保存するため、及びヘテロ接合性の損失を制限するために交差現象により二本鎖分離の解決を最小限にすると思われることを示した先行文献の教示と異なり、全て驚くべきことである。
【００９４】
他の態様において、本発明は、酵母、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母、特に二倍体交雑酵母のヘテロ接合度を低減するためのＲＴＧプロセスの使用に関し、該ＲＴＧプロセスは、その酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵炭素源又は窒素源を有さない培地に移すこと、酵母を胞子形成培地でSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすること、並びに酵母を第１の減数分裂の減数的染色体分離前に炭素源及び窒素源に接触させることにより誘導される。
【００９５】
また、それは、酵母、好ましくは２以上の倍数性を有する酵母、特に二倍体交雑酵母のヘテロ接合度を低減するための方法に関し、
ａ）酵母を富栄養培地から胞子形成培地、好ましくは発酵可能炭素源又は窒素源を有さない培地に移すことと、
ｂ）酵母を、胞子形成培地においてSpo11依存性二本鎖分離を誘導するのに十分な時間インキュベートすることと、
ｃ）組換え酵母を得るために、酵母を、第１の減数分裂の減数的染色体分離の前に炭素源及び窒素源と接触させることと、
ｄ）組換え酵母を回収することとを含み、その組換え酵母は、ステップａ）の酵母のヘテロ接合度よりも低いヘテロ接合度を有する。
【００９６】
また、本発明の改良プロセスのための上述の実施形態は、この態様に適用する。
【００９７】
好ましくは、２以上の倍数性を有する酵母は２倍体である。好ましくは、該酵母は交雑菌株、特に生殖不能交雑菌株であり、好ましくは産業に関わる菌株である。より好ましくは、酵母は、Saccharomyces sensu stricto属であり、特にS.cevevisiae種である、又はSaccharomyces sensu stricto属、より具体的にはS. cevevisiae種の菌株から得られた交雑菌株である。
【００９８】
以下の実施例は、説明のためのものであり、非限定的な目的のものである。
【実施例】
【００９９】
材料及び方法：
酵母株
用いた菌株、それらの由来及びそれらの遺伝子型に関する情報を以下の表１に示す。
【０１００】
【表１】
0006482030.tif 000002
0006482030.tif 000003
0006482030.tif 000004
【０１０１】
遺伝的背景がS288C (Mortimer and Johnston, 1986)又はSK1 (Kane and Roth, 1974)であるSaccharomycescerevisiae属の酵母株がある。ORT7235及びORT7236菌株、arg4-Bgl及びarg4-RV変異それぞれのキャリアは、２つの形質転換ステップで得られた。事前に、EUROSCARF deletion collection(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/YHR018c.html)からの、ARG4遺伝子がKanMXに置換されたY00981菌株を、KanMXをARG4位置においてURA3と置換するために、エレクトロポレーション法(Becker and Guarente, 1991)によりM4758プラスミド(Voth et al., 2003)を用いて形質転換した。ＲＬ１及びＲＬ２プライマー（表２に記載）をarg4Δ::URA3断片の増幅のために用いた。
【０１０２】
【表２】
0006482030.tif 000005
【０１０３】
ORT7235菌株を得るために、ORT7219strain [ARG+ ura-]を、ＡＲＧ４位置にＰＣＲ産物のarg4Δ::URA3を組み込むように、エレクトロポレーション法により形質転換した。ウラシル欠損培地で選択されて得られた形質転換体であるORT7205 [arg- URA+]に対して、PstI制限酵素によるpMY232プラスミド(Rocco et al., 1992)の切断によって得られたarg4-Bgl断片を用いてエレクトロポレーションによる形質転換を行った。得られた形質転換体であるORT7235 [arg- ura-]を5-FOA培地で選択した。
【０１０４】
ORT7236菌株を得るために、ORT7221strain [ARG+ ura-]を、ＡＲＧ４位置にＰＣＲ産物のarg4Δ::URA3を組み込むように、エレクトロポレーション法により形質転換した。ウラシル欠損培地で選択されて得られた形質転換体であるORT7217 [arg- URA+]に対して、PstI制限酵素によるpNPS308プラスミド(Rocco et al., 1992)の切断によって得られたarg4-RV断片を用いて酢酸リチウム法(Schiestl and Gietz,1989)による形質転換を行った。得られた形質転換体であるORT7236 [arg- ura-]を5-FOA培地で選択した。
【０１０５】
AND1702二倍体菌株を、一倍体菌株のORT7235とORT7236との交雑により得た。遺伝子型がそれぞれhis3Δ200及びhis4::LEU2の両方の親株は、ヒスチジンの栄養要求性であるが、得られた二倍体は機能相補によりヒスチジンに対して原栄養性であり、従って、ヒスチジン欠損培地で選択可能である。AND1702菌株は、S288C-SK1交雑遺伝子背景を有し、遺伝子マーカーMATa/MATα、arg4-Bgl/arg4-RV、lys2Δ0/lys2、ura3(PstI-SmaI)::hisG/ura3Δ0、leu2Δ0/leu2::hisG、his3Δ200/HIS3、met15Δ0/MET15、trp1Δ63/trp1::hisG、his4B::LEU2/HIS4において、及び２つの親株のゲノムを区別する全ての多型マーカーにおいてヘテロ接合性である。
【０１０６】
AND2248菌株を得るために、ORT7235及びORT7236菌株を、NDT80位置でＰＣＲ産物のndt80Δ::KanMXを組み込むように、エレクトロポレーション法により形質転換した。２つの得られた菌株であるORT7469及びORT7477を、二倍体菌株AND2248を生成するために交雑した。
【０１０７】
用いた培養培地の成分
ＹＰＤ増殖培地は、１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース（固体培地の場合は２％バクトアガー）を含み、pH5.5であり、H2Oで１リッターに調整された富栄養培地である(Treco and Lundblad, 2001)。亜ヒ酸ナトリウム(NaASO2)を含むＹＰＤ培地は、最終濃度１．５ｍＭで添加された。
【０１０８】
ＹＰＧ増殖培地は、呼吸可能細胞の選択のための培地であり、１％酵母エキス、２％バクトペプトン、３％グリセロール、２％バクトアガーを含み、H2Oで１リッターに調整された培地である(Treco andLundblad, 2001)。ＹＰＧ培地＋ジェネティシン(200mg/l)は、KanMX遺伝子の発現で生じるジェネティシン耐性菌株の選択を可能とする。
【０１０９】
Ｘ欠損培地は、完全合成培地から栄養素（Ｘ）が欠損した培地であり、他の全てが存在する（例えば、アルギニン欠損培地には、アルギニンを除く全ての栄養素が存在する）。それらは、栄養素Ｘに対して原栄養性の菌株を選択可能であり、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない０．１７％酵母窒素源基礎培地（yeast nitrogen base）、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、２％バクトアガーを含み、１つを除く栄養素が添加され、H2Oで１リッターに調整された培地である。その栄養素は、以下の量で添加される：０．００２％アルギニン／ヒスチジン／メチオニン／ウラシル、０．００３％リジン／チロシン、０．００４％アデニン／トリプトファン、０．００５％フェニルアラニン、０．００６％ロイシン、０．０１％アスパラギン酸、０．０１５％バリン、０．０２％トレオニン、０．０３７５％セリン。挙げられていないアミノ酸は、０．００４％で添加され得る(Treco and Lundblad, 2001)。完全合成増殖培地又はＳＣは、栄養素の欠損が無いこと以外は欠損培地と同等である。
【０１１０】
ＤＯＢＡ培地は、原栄養性細胞のみが増殖できる最少培地である。それは、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない０．１７％酵母窒素源基礎培地、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、２％バクトアガーを含み、H2Oで１リッターに調整された培地である(Treco andLundblad, 2001)。それは、機能相補によって、試験菌株MATa his1 (ORT3805)又はMATα his1 (ORT3806)の１つとHIS1菌株との交雑から得られた二倍体の選択を可能とする。
【０１１１】
5-FOA 培地は、ura3-菌株を選択するための培地であり、２％ＴＲＰ欠損培地（TRP dropout）、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない０．１７％酵母窒素源基礎培地、０．５％硫酸アンモニウム、０．００２０４％トリプトファン、０．００３％ウラシル、０．１５％５−フルオロオロチン酸、２％グルコース、２％バクトアガーを含み、pH4.5であり、H2Oで１リッターに調整された培地である(Treco andLundblad, 2001)。
【０１１２】
ＳＰＳ増殖培地は、前胞子形成培地であり、０．５％酵母エキス、１％バクトペプトン、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない０．１７％酵母窒素源基礎培地、０．５％硫酸アンモニウム、１％酢酸カリウム、１．０２％フタル酸水素カリウムを含み、pH5.5であり、H2Oで１リッターに調整された培地である(Wu and Lichten, 1994)。
【０１１３】
１％ＫＡｃ培地は、栄養が枯渇された胞子形成培地であり、１％酢酸カリウムを含み（菌株の栄養要求性に依存して０．００１％アミノ酸を添加する又は添加せず、０．００１％ＰＰＧ２０００を含む）、H2Oで１リッターに調整された培地である(Wu andLichten, 1994)。
【０１１４】
胞子形成プロトコール
二倍体菌株を−８０℃で保管されたストックからＹＰＤディッシュにストリークした。３０℃で３日間培養後、シングルコロニーから得た細胞を、固体ＹＰＧ培地を含むディッシュに播種した。３０℃で約６時間培養した後、その細胞を５ｍｌの液体ＹＰＤに懸濁し、撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃で２４時間培養した。この前培養物は、105cells/mlの濃度で５０ｍｌのＳＰＳ培地に播種するために用いられ、その後2-4.107cells/mlに達するまで３０℃で約１８時間培養される。その細胞を、３０℃に予め温められた５０ｍｌの１％ＫＡｃ培地で洗浄し、遠心処理し、予め温められた１００ｍｌの１％ＫＡｃ胞子形成培地で再懸濁した。その培養物を、撹拌しながら３０℃で、実験要求事項に依存する種々の時間培養した。サンプルを胞子形成の際の異なる時間で回収した(Wu and Lichten, 1994)。
【０１１５】
「Return-to-growth」プロトコール
プロトコール１：ＲＴＧから生じた細胞のプレーティングによる単離
胞子形成培地での所定時間のインキュベーション後、１ｍｌの培養物を回収した。細胞を１ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し（８０００ｇで３分の遠心処理）、最終体積が５００μｌのＨ２Ｏに再懸濁した。この段階で、ＲＴＧプロセスから生じたそれぞれのコロニーを増殖するために、細胞をＹＰＤ培地に播種した（約100 cells/dish、３０℃でインキュベート）。
【０１１６】
プロトコール２：ＲＴＧから生じた組換え細胞のプレーティングによる単離
プロトコール１に代わる方法として、アルギニンの非存在下で細胞増殖が可能なＡＲＧ４対立遺伝子を含む組換え細胞を選択するために、胞子形成の際に回収された細胞を選択的アルギニン欠損培地に播種した（約104 cells/dish）。
【０１１７】
プロトコール３：ＲＴＧ細胞の顕微操作による単離
胞子形成の際に回収された１０μｌの細胞懸濁液を、ＹＰＤ培地の入ったディッシュの上部に播種した。４４の非出芽細胞を、マイクロマニピュレータにより解剖顕微鏡(Singer MSM System)のグリッド上に移した。それらのディッシュを３０℃でインキュベートし、第１の娘細胞の存在をモニターするために、及び胞子形成培地の回収の約４時間後に母細胞と娘細胞とを物理的に分離するために、定期的に観察した。それらのディッシュを「母／娘」コロニーのそれぞれの対を得るために、３０℃でインキュベートした。
【０１１８】
ＲＴＧから生じる細胞の表現型分析
接合サインの表現型試験
ＲＴＧから生じた細胞(菌株AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739、AND1740、AND2711、AND2907、AND2642、AND2652、AND2658)の接合サインを試験するために、細胞をＹＰＤ固体培地に播種し、MATa his1 (ORT3805)又はMATα his1 (ORT3806)一倍体試験細胞の存在下に播種した。この培地において細胞増殖がないことは、試験細胞及びＲＴＧから生じた菌株の接合不能を示す。これは、ＲＴＧから生じた細胞のMATa/MATα二倍体特性の表現型指標である。
【０１１９】
表現型組換え試験
ＲＴＧから生じた細胞の組換え特性を表現型的に特徴付けるために、AND1702親株により含まれるマーカーの遺伝子型を示す種々の選択培地（アルギニン欠損、ヒスチジン欠損、ロイシン欠損、メチオニン欠損）で細胞増殖を試験した。この菌株がアルギニンを含まない培地（アルギニン欠損培地）での細胞増殖を妨げるarg4-RV及びarg4-Bglマーカーにおけるヘテロ接合であるため、ＡＲＧ４対立遺伝子を含むＲＴＧ細胞の組換え体の生成はこの培地での細胞増殖を可能とする。ヘテロ接合状態のAND1702菌株は、対立遺伝子his3Δ200/HIS3、his4B::LEU2/HIS4、及びmet15Δ0/MET15を含み、その表現型は、中でも[HIS+ LEU+ MET+]である。ＲＴＧ細胞の組換え特性は、原栄養性の１つの欠損によって示され得る([his-]=his3Δ200/his3Δ200又はhis4B::LEU2/his4B::LEU2、[leu-]= HIS4/HIS4、[met-]=met15Δ0/met15Δ0)。
【０１２０】
ＲＴＧ二倍体の胞子形成により得られた四分子における表現型的試験
ＲＴＧ細胞の組換え特性は、表現型の変化がない遺伝子マーカーのヘテロ接合性の損失に関する。例えば、ＲＴＧ細胞は、組換えによりMET15/MET15になり得るが、二倍体親株AND1702のようにメチオニンの原栄養性を維持するであろう。これらの事象を検出するために、ＲＴＧ二倍体から生じた四分子の表現型を、アルギニンＤＯ（欠損）、ヒスチジン（ＤＯ）、ロイシンＤＯ及びメチオニンＤＯ培地で分析して、遺伝子マーカーの分離を観察した。また、細胞の接合型を、上記の方法を用いて決定した。
【０１２１】
ＮＧＳシークエンシングによるＲＴＧから生じた細胞の遺伝子型分析
親酵母ORT7219、ORT7221及びAND1702、並びにＲＴＧから生じた細胞AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739、AND1740、AND2711、AND2907、AND2642、AND2652及びAND2658を、ＮＧＳ（次世代シークエンシング）シークエンシング法(NGS platform of the Institut Curie, Paris, France)によりシークエンシングした。一倍体菌株ORT7219及びORT7221において、ゲノムＤＮＡ断片ライブラリを生成し、販売者の「Life Technologies」のプロトコールに従って、SOLiD v4sequencerでペアエンド方法論(50+35 nt)を用いてシークエンシングした。二倍体菌株AND1710-1A、AND1710-1B、AND1710-1C及びAND1710-1Dにおいて、ゲノムＤＮＡ断片ライブラリを構築し、販売者の「Life Technologies」のプロトコールに従って、SOLiD V5500sequencerでペアエンド方法論(50+35 nt)を用いてシークエンシングした。二倍体菌株(AND1702、AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739及びAND1740)において、接合対（Mate-pair）ライブラリ(50+50nt)をゲノムＤＮＡ調製物から構築し、販売者の「Life Technologies」のプロトコールに従って、Institut CurieのNGS platformのSOLiD v4 sequencerでシークエンシングした。ペアエンドライブラリ(100+100nt)のAND2711、AND2907、AND2642、AND2652及びAND2658菌株をゲノムＤＮＡから生成し、販売者の「Illumina」のプロトコールに従って、HiSeq 2500 sequencerにおけるInstitut CurieのNGS platformでシークエンシングした。
【０１２２】
ＮＧＳシークエンシングデータのバイオインフォマティクス分析
一倍体親株ORT7219及びORT7221によって寄与される多型を決定するために、ＮＧＳから得られたシークエンスを、Bioscopeソフトウェア(Life Technologies)を用いて参照ゲノムのＳ２８８Ｃのシークエンスに位置合わせした。用いた参照配列のバージョン(R64)は、「Saccharomyces Genome Database」(SGD) (http://downloads.yeastgenome.org/sequence/S288C_reference/genome_releases/S288C_reference_genome_R64-1-1_20110203.tgz)のウェブサイトから得られる。１６の染色体及びミトコンドリアゲノムのエントリーナンバーは、染色体(Chr.) I: NC_001133; Chr. II: NC_001134; Chr. III: NC_001135; Chr.IV: NC_001136; Chr. V: NC_001137; Chr. VI: NC_001138; Chr. VII: NC_001139; Chr.VIII: NC_001140; Chr. IX: NC_001141; Chr. X: NC_001142; Chr. XI: NC_001143;Chr. XII: NC_001144; Chr. XIII: NC_001145; Chr. XIV: NC_001146; Chr. XV:NC_001147; Chr. XVI: NC_001148, 及びミトコンドリアChr.:NC_001224である。親株ORT7219 (S288C)とORT7221(SK1)との間のＳＮＰｓ（一塩基多型）のリスト及び座標を、Bioscope の"Find SNP"ツールを用いて確立した。ＲＴＧから生じた細胞である二倍体細胞AND1702、及び四分子AND1710-1の４つの胞子のＮＧＳシークエンスを、Lifescopeソフトウェア(Life Technologies)を用いて参照ゲノムシークエンスＳＧＤと位置合わせした。シークエンシングされた菌株のそれぞれの遺伝子型を決定するために、確立されたＳＮＰｓのリスト内でオーバーラップする多型位置のリード（read）を、BEDToolsの「IntersectBED」ツール(Quinlan et al., 2010)を用いて選択した。各リードを、それがカバーする多型と関連付け、そのリードにおける多型の位置を算出した。この位置における塩基を抽出し、ORT7219及びORT7221親株におけるこの位置で見られる塩基と比較した。各多型の位置において、Ｓ２８８Ｃ対立遺伝子、ＳＫ１対立遺伝子又は他の対立遺伝子を有するリードをカウントした。Ｓ２８８Ｃ対立遺伝子が８２％よりも大きいリードであった場合、ＳＮＰはＳ２８８Ｃ由来の単一対立遺伝子であることが示された。ＳＫ１対立遺伝子が６８％よりも大きいリードであった場合、ＳＮＰはＳＫ１由来の単一対立遺伝子であることが示され、ＳＫ１対立遺伝子が１８〜６８％のリードを示す場合、又はＳ２８８Ｃ対立遺伝子３２〜６８％のリードを示す場合、ＳＮＰは二対立遺伝子であることが示される。分析された各サンプルについて、Ｒソフトウェア環境(http://www.r-project.org)を用いて多型位置のマップをプロットした。各多型位置の遺伝子型を色により示した：単一対立遺伝子Ｓ２８８Ｃを黒色、単一対立遺伝子ＳＫ１を中間の灰色、二対立遺伝子を薄い灰色とした。シークエンシングされた全てのサンプルについて、位置のカバー度をBEDToolsの「genomeCoverageBed」ツールを用いて算出した。Illumina sequencerからの100nt + 100ntのリードを、ＢＷＡソフトウェアを用いて参照ゲノム（ＳＧＤ）と位置合わせした。
【０１２３】
結果
表現型的分析
組換えＲＴＧ細胞の選択
ＲＴＧ（親株AND1702、プロトコール２でアルギニンの原栄養性の細胞を選択）から生じた６つの独立コロニー（菌株AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720)、並びにＲＴＧ（親株AND1702、プロトコール３で第１の細胞分裂後の母／娘細胞を顕微操作により単離）から生じた４つの「母（Ｍ）及び娘（Ｄ）」ＲＴＧ対(AND1733(M)-AND1734(D)、AND1735(M)-AND1736(D)、AND1737(M)-AND1738(D)及びAND1739(M)-AND1740(D))を遺伝子型決定のために選択した。これらの菌株の二倍体特性を、２つの表現型的試験により確認した：接合サインMATa (ORT3805)及びMATα (ORT3806)の試験一倍体細胞との交雑が無い、胞子形成段階に入る能力及び４つの生存する胞子形成する能力（以下）。ヘテロ接合マーカー(ARG、HIS、LEU、MET)のためのＲＴＧ細胞の表現型を以下の表３に示した。
【０１２４】
【表３】
0006482030.tif 000006
【０１２５】
MATa及びMATα試験細胞と交雑された細胞は無く、従って、二倍体を維持した細胞は無かった。ＲＴＧから生じたシークエンシングされた全ての細胞の中から、７つがアルギニンについて原栄養性となり(AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720及びAND1733)、９つがヒスチジンについて栄養要求性となり(AND1708、AND1710、AND1711、AND1712、AND1733、AND1734、AND1735、AND1738、AND1740)、２つがロイシンについて栄養要求性となり(AND1734及びAND1737)、２つがメチオニンについて栄養要求性となった(AND1709、AND1720)。これは、ＲＴＧから生じた細胞の表現型的多様性を示し、組換え現象の結果である。
【０１２６】
四分子分析によるＲＴＧ細胞の遺伝子型の同定
ＲＴＧ細胞の遺伝子マーカーの分離の観察のために、これらの細胞を胞子形成させ、１０個の四分子を解剖し分析した。１４のケースのうち１３のケース(AND1708、AND1709、AND1710、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739及びAND1740)において、４つの生存する胞子を有する四分子を観察して、これらのＲＴＧ細胞の二倍体特性を確認し、これらのＲＴＧ二倍体のゲノムにおける致死突然変異が無いことがわかった。AND1711において、解剖された四分子は、２つのみ生存する胞子を有し、リードのシークエンスカバー度の深さを分析することにより検出され、サザンブロットにより確認された異数性の存在を示す。この異数性は、Chr. V の１１０ｋｂのコピーの増大と関連付けられるChr. XVIの一端の１７０ｋｂのコピーの損失に関する。解剖された四分子における遺伝子マーカーの分離は、表１に示されるように各二倍体のマーカーの遺伝子型を明らかにした。
【０１２７】
バイオインフォマティクス分析
親一倍体ORT7219及びORT7221のゲノム、交雑二倍体AND1702のゲノム、並びにＲＴＧ細胞AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739及びAND1740のゲノムをＮＳＧによりシークエンシングし、リードを上記方法を用いて分析した。
【０１２８】
シークエンシングデータの一次分析
各サンプルにおいて、６千万を超えるＮＧＳリードを、１００Ｘを超える全体のゲノムに対する同質のカバー度（位置毎のリードの数）で得た。サンプル毎の平均カバー度を表４に示す。
【０１２９】
【表４】
0006482030.tif 000007
【０１３０】
親一倍体を識別する多型の同定
ＳＧＤ参照配列と比較されたORT7219菌株のＮＧＳシークエンスの分析で１１５のＳＮＰｓを同定した。ＳＧＤ参照配列と比較されたORT7221菌株のＮＧＳシークエンスの分析で６５１３４のＳＮＰｓを同定した。これらのうち、６３９０１のＳＮＰｓを、AND1702交雑二倍体及びＲＴＧから生じた細胞のＮＧＳリードの遺伝子型決定のために選択した。ＳＮＰｓ間の物理的距離は、２〜３８０３６ヌクレオチドの間で異なり、中間値は９６ヌクレオチドであり、平均値は１８７ヌクレオチドである。
【０１３１】
ＲＴＧ細胞の遺伝子型
全ての親の多型をシークエンシングされた細胞において発見した。各ＲＴＧ菌株は、種々の数での単一対立遺伝子ＳＮＰｓ及び二対立遺伝子ＳＮＰｓのキャリアであった。以下の表５に示す結果は、６１〜８９％のＳＮＰｓが二対立遺伝子であることを示し、ＲＴＧから生じたこれらの細胞の二倍体特性を確認する。他のＳＮＰｓは単一対立遺伝子であり、６〜２６％の場合においてＳ２８８Ｃ対立遺伝子に対応し、１〜１８％の場合においてＳＫ１対立遺伝子に対応し、ＳＮＰｓの平均１７％は単一対立遺伝子性状態で見られることを意味する。これらの単一対立遺伝子性位置での単一の対立遺伝子の存在は、同一の対立遺伝子を含む２つの相同染色体の存在、又は相同染色体のうちの１つの染色体領域の損失のいずれかを反映し得るヘテロ接合性（ＬＯＨ）の損失を示す。各染色体の１ｋｂを超える平均化されたカバー度の分析は、２つのヘテロ接合相同染色体の仮説を支持するような、単一対立遺伝子領域及びヘテロ対立遺伝子領域が一様なカバー度インデックスを有する。
【０１３２】
【表５】
0006482030.tif 000008
【０１３３】
分析されたＲＴＧ細胞のＳＮＰｓ（Ｓ２８８Ｃ由来の二対立遺伝子、単一対立遺伝子、又はＳＫ１由来の単一対立遺伝子）の状態のマップは、図１及び２に示される。上記プロトコール２に従って単離された細胞は、図１に示される。上記プロトコール３に従って単離された細胞は、図２に示される（同一のＲＴＧ現象から得た母及び娘細胞は、２つの遺伝子型の対比較のために、同一の図中に集められている）。
【０１３４】
これらの細胞の遺伝子型は全く異なる。ほとんどの場合において、各染色体は、Ｓ２８８Ｃ及び／又はＳＫ１起源の１つ又は複数のＳＮＰ位置を含む異なるサイズ（１ヌクレオチドから約７００ｋｂ）の二対立遺伝子及び単一対立遺伝子領域を含む。接合点での局所的な組換えの存在を明らかにする二対立遺伝子領域及び単一対立遺伝子領域の配置は、細胞によって異なる。少なくとも２０ｋｂの単一対立遺伝子領域のみを考える場合、染色体毎の組換え接合部の数は０〜７で異なり、細胞毎の総推定数は、ＲＴＧ菌株であるAND1708 (図１Ａ)、AND1709(図１Ｂ)、AND1710 (図１Ｃ)、AND1711 (図１Ｄ)、AND1712 (図１Ｅ)、AND1720(図１Ｆ)において、３４、５３、１５、３８、７、１８であり、母‐娘対AND1733-AND1734 (図２Ａ)、AND1735-AND1736 (図２Ｂ)、AND1737-AND1738 (図２Ｃ)及びAND1739-AND1740 (図２Ｄ)において、４５、６、３、１１である。我々は、（i）セントロメア付近に位置するＳＮＰｓが二対立遺伝子を維持し、ＲＴＧにおける姉妹染色分体の有糸分裂的分離を確認し、（ii）母及び娘細胞の遺伝子型が相補的であり、二対立遺伝子領域において同一であり、単一対立遺伝子領域において互いに反対の対立遺伝子であることを示す。それぞれのＲＴＧ細胞の単離（プロトコール１及び２）と異なり、母及び娘対の単離方法（プロトコール３）は、二対立遺伝子性ＳＮＰｓのための相同的な背景における表現型の可能な分析の利点を有する。
【０１３５】
四分子をシークエンシングすることによるAND1710菌株における遺伝子型確認
AND1710ＲＴＧ二倍体の胞子形成から生じた四分子由来の４つの胞子についてシークエンシングし、多型位置の遺伝子型を決定した。四分子の４つの胞子(A, B, C, D)の多型遺伝子型を図３に示す。
【０１３６】
AND1710ＲＴＧ二倍体の単一対立遺伝子領域において、我々は、４つの胞子がＳ２８８Ｃ又はＳＫ１起源の同一の対立遺伝子を有することを観察する。二倍体の二対立遺伝子領域は、Ｓ２８８Ｃ対立遺伝子を含む２つの胞子とＳＫ１対立遺伝子を含む２つの胞子とに分離し、これらの領域における二倍体のヘテロ接合特性を確認する。AND1710ＲＴＧ二倍体の１５の組換え接合部が確認される。さらに、遺伝子変換に関連付けられた追加的組換え現象(chr. VII、chr. VIII及びchr. IX（２つの場合）)が、ND1710二倍体の４つの短い単一対立遺伝子領域において同定された。他の組換え現象は、この四分子の生成を引き起こす減数分裂の際に起こり、組換え体の遺伝子型は、親ＲＴＧ二倍体に存在しない。
【０１３７】
ＲＴＧプロセスの繰り返し
ＲＴＧプロセスが遺伝子的多様性を増大するために繰り返され得るかどうか評価するために、発明者らは、親二倍体AND1702の第１のＲＴＧサイクルから生じたAND1735菌株（図４Ａ）を用いて２つの連続するＲＴＧサイクルを行い、ＳＮＰマーカーの進化をシークエンシングすることにより分析した。第２のＲＴＧサイクルの際、AND2711細胞は、ヘテロ接合性の全体のレベルの低減（９０．２％の代わりに６７．６％）、及びＳ２８８Ｃ又はＳＫ１遺伝子背景の新規の単一対立遺伝子領域の存在に証明されるように組換えの他のサイクルを受けた（図４Ｂ）。第３のＲＴＧサイクルの際、AND2907細胞は、ヘテロ接合性の全体のレベルの低減（６７．６％の代わりに５３．５％）、及びＳ２８８Ｃ又はＳＫ１遺伝子背景の新規の単一対立遺伝子領域の存在に証明されるように組換えの他のサイクルを受けた（図４Ｃ、表５及び６）。従って、ＲＴＧプロセスは、二倍体細胞の遺伝子的多様性を順次増大するために繰り返され得る。
【０１３８】
胞子形成欠陥AND2248二倍体細胞におけるＲＴＧ
ＲＴＧプロセスが生存不能二倍体細胞のゲノムを組み替えるのに用いられ得るか否かを評価するために、発明者らは、S288C/SK1交雑遺伝子背景であるが、ホモ接合状態でＮＴＤ８０遺伝子が欠失した二倍体菌株(AND2248)を構築した。ＮＤＴ８０遺伝子の不活性化は、胞子の不形成を引き起こすが、二倍体細胞が減数分裂前期に入ることを妨げない。これらの細胞は、Spo11依存性ＤＮＡ二本鎖分離の発生後で、減数的染色体分離の段階（Ｍ１）前の段階で減数分裂の進行を停止する(Chu & Herskowitz, 1998)。減数分裂前期で停止されたndt80Δ/ndt80Δ二倍体細胞は、生存し続け、ＲＴＧプロセスを介して栄養成長に戻ることができる(Dayani et al., 2011)。AND2248変異株からＲＴＧ（プロトコール３）後に単離された３つの菌株に対し、シークエンシングを行った。これらの菌株(AND2642、AND2652及びAND2658)のＳＮＰｓのマップは、それぞれ図５Ａ〜Ｃに示される。これらの遺伝子型は、組換え体であり、異なる（表５）。それぞれのヘテロ接合度は、８４．４％、７９．３％及び９３．１％であり、Ｓ２８８Ｃ又はＳＫ１起源の単一対立遺伝子位置を含むゲノムの残りであり、組換え接合部の総数は細胞毎に１２、２４及び５である。従って、ＲＴＧ法は、自然なSpo11依存性二本鎖分離を形成できる生殖不能菌株に適用可能である。
【０１３９】
ＲＴＧ細胞の遺伝子型の変化性の分析
ＲＴＧ細胞は、通常、二倍体であるため（AND1711を除く)、細胞毎のヘテロ接合度の減少率は、Ｓ２８８Ｃ又はＳＫ１遺伝子型のホモ接合性領域の出現に関連する。ＲＴＧプロセスから生じた１９の菌株（表５）のヘテロ接合度及びホモ接合度の差異を図６に示す。ヘテロ接合性の割合（Ｓ２８８Ｃ＋ＳＫ１二対立遺伝子の遺伝子型）は、３つのＲＴＧサイクルから生じた９３．３％（プロトコール３から生じたAND1738及びAND1739）と５３．５％(AND2907)とで異なる。Ｓ２８８Ｃホモ接合領域の割合は、０．２％(AND1738)と２６．８％(AND2907)とで異なる。ＳＫ１ホモ接合領域の割合は、０．２％(AND1737)と１９．７％(AND2907)とで異なる。これらのホモ接合領域のサイズは短く、いくつかの近接するＳＮＰｓマーカーのみを含み、又は非常に大きく、大きい染色体領域を含む。少なくとも２０ｋｂの長さの組換え領域のみを考慮に入れて概算されたＲＴＧ細胞毎の組換え接合部の総数は、３(AND1737)と５３(AND1709)とで異なる。従って、ＲＴＧ法は、生殖可能細胞及び生殖不能細胞の両方において、交雑親株の異なるサイズの遺伝子型のうちの１つにおけるヘテロ接合領域及びホモ接合領域を同時に含む種々の組換え細胞の集団を生成できる。
【０１４０】
メチオニン及びロイシンの栄養要求性のマッピングの例
単一の形質を同定する及び位置付けることにおけるＲＴＧ法の性能を評価するために、発明者らは、メチオニン欠損下における増殖のためのＲＴＧ細胞の遺伝子型及び表現型を分析した。Ｓ２８８Ｃ菌株は、ＭＥＴ１５遺伝子が欠失している(met15Δ0)。従って、親二倍体は、MET15/met15Δ0二対立遺伝子形質を含む。メチオニンの栄養要求性の組換え二倍体は、ＭＥＴ１５位置(chr. XII)の周辺にＳ２８８Ｃ対立遺伝子の単一対立遺伝子マーカーを有する。逆に、メチオニン原栄養性の二倍体は、ＭＥＴ１５位置の周辺にＳＫ１対立遺伝子の単一対立遺伝子マーカー又は二対立遺伝子マーカーを含み得るが、Ｓ２８８Ｃ対立遺伝子の単一対立遺伝子マーカーは含まない。{S288C - SK1 - 二対立遺伝子}のうちの１つ又は２つの対立遺伝子が特異的に見られ、一方又は他方の表現型に排他的に関連するＳＮＰ位置を探索することにより、表現型に関連する染色体領域のマッピングが可能となる。このため、発明者らは、メチオニンＤＯ培地において、一倍体親細胞ORT7221及びORT7219、交雑二倍体AND1702、並びにＲＴＧ細胞AND1708、AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739及びAND1740の増殖を試験した。それらの遺伝子型（表１）に従って、二対立遺伝子性二倍体細胞MET15/met15Δ0（交雑親株AND1702、ＲＴＧAND1708、AND1712、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739、AND1740)及び単一対立遺伝子性二倍体MET15/MET15 (ＲＴＧAND1710及びAND1711)は、メチオニン欠損下で増殖できたが、単一対立遺伝子性二倍体細胞met15Δ0/met15Δ0(ＲＴＧAND1709及びAND1720)は、メチオニン欠損下で増殖できなかった。この形質を含むゲノムの領域を決定するために、発明者らは２つのカテゴリーにＲＴＧ細胞を分類し、すなわち、原栄養性(ＲＴＧAND1708、AND1710、AND1711、AND1712、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739、AND1740)、及び栄養要求性(ＲＴＧAND1709及びAND1720)に分け、原栄養性個体で見られる対立遺伝子がこの分類内で排他的に見られるゲノムの領域を同定するために、また、栄養要求性個体で見られる対立遺伝子がこの分類内で排他的に見られるゲノムの領域を同定するために、それらの遺伝子型を比較した。栄養要求性の分類における２つのサンプルのみで、この方法はＭＥＴ１５遺伝子の所望の領域を含む非常に限られた数の候補領域（図７Ａ）において形質を同定する（６つの領域及びいくつかの単離されたＳＮＰｓ）。２つのMET15/MET15ホモ接合サンプル(AND1710及びAND1711)が、単一対立遺伝子位置の対立遺伝子の逆位により人工的にホモ接合met15Δ0/ met15Δ0を与えられる、バイオインフォマティクスシミュレーションを用いて、発明者らは、２つの分類におけるサンプルの数を釣り合わせることにより、ＭＥＴ１５遺伝子を含む候補領域の数を１に容易に減らすことができることを示すことができた。この例において、同定された領域は、約４０ｋｂである。多くのＲＴＧ細胞を試験することは、候補領域のサイズを低減することに効果的である。
【０１４１】
同様に、発明者らは、ロイシン欠損化での増殖のためのＲＴＧ細胞の遺伝子型及び表現型を分析した。２つの親株は、ＬＥＵ２位置に変異を有する(Ｓ２８８親株においてleu2Δ0 、及びＳＫ１親株においてleu2::hisG、Chr. III)。しかしながら、ＳＫ１親株は、隣接位置に挿入されたＬＥＵ２遺伝子の野生型コピーを有する(染色体IIIにおいてhis4B::LEU2マーカー)。ＲＴＧ後、これは、ロイシンの原栄養性ＲＴＧ細胞の群を構成する単一対立遺伝子性二倍体his4B::LEU2/his4B::LEU2(AND1708、AND1733、AND1738)、二対立遺伝子性二倍体his4B::LEU2/HIS4 (AND1709、AND1710、AND1711、AND1712、AND1720、AND1735、AND1736、AND1739、AND1740)、及びロイシンの栄養要求性の群を構成する単一対立遺伝子性二倍体HIS4/HIS4(AND1734、AND1737)を取得することにつながる。ここで、栄養要求性における２つのサンプルのみで、ロイシンＤＯ培地における増殖表現型をマッピングすることは、ＬＥＵ２及びＨＩＳ４遺伝子の所望の領域を含む２つの候補領域（図７Ｂ）のみの同定につながる。
【０１４２】
生殖不能交雑株に適用可能なのは、少数のＲＴＧ細胞をシークエンシングすることによる例えばメンデル形質のマッピングである。
【０１４３】
ＲＴＧ法による量的形質の改良の例
量的形質を同定する及び位置付けることにおけるＲＴＧ法の性能を評価するために、発明者らは、３０℃及び４０℃における一倍体親細胞ORT7221及びORT7219、交雑二倍体AND1702、並びにＲＴＧ細胞AND1708、AND1709、AND1710、AND1712、AND1720、AND1733、AND1734、AND1735、AND1736、AND1737、AND1738、AND1739及びAND1740の増殖を試験した。図８に示す結果は、一倍体細胞ORT7235及びORT7236は、４０℃でほとんど増殖しなかったことを示す。その代わりに、AND1702交雑細胞は、この温度で各親株よりも良好な増殖をし、雑種強勢（ヘテローシス）を示した。ＲＴＧから生じた細胞は、４０℃での増殖をより良くする、又はあまり良くしない可変の表現型を示す。特に、ＲＴＧ細胞は、AND1708、AND1710、AND1712、AND1735、AND1736及びAND1737は、親細胞よりも強い熱耐性を有し、少なくとも交雑二倍体細胞AND1702と同等の熱耐性を有する。また、発明者らは、亜ヒ酸ナトリウム(1.5mMNaAsO2)の存在下での細胞増殖を試験した。ＲＴＧ細胞の増殖は可変である。例えば、AND1736及びAND1737細胞は、親二倍体細胞AND1702よりも耐性が強く、一方、AND1735及びAND1738細胞は、より感受性が高い。
【０１４４】
所望の量的形質を改良する２つの例がある。原因となる多型マーカーの数及び位置は、シークエンシングにより得られた細胞の遺伝子型の比較分析から推測できる。
（参考文献）
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【図１Ａ】
0006482030.tif 000009
【図１Ｂ】
0006482030.tif 000010
【図１Ｃ】
0006482030.tif 000011
【図１Ｄ】
0006482030.tif 000012
【図１Ｅ】
0006482030.tif 000013
【図１Ｆ】
0006482030.tif 000014
【図２Ａ】
0006482030.tif 000015
【図２Ｂ】
0006482030.tif 000016
【図２Ｃ】
0006482030.tif 000017
【図２Ｄ】
0006482030.tif 000018
【図３】
0006482030.tif 000019
【図４】
0006482030.tif 000020
【図５Ａ】
0006482030.tif 000021
【図５Ｂ】
0006482030.tif 000022
【図５Ｃ】
0006482030.tif 000023
【図６】
0006482030.tif 000024
【図７Ａ】
0006482030.tif 000025
【図７Ｂ】
0006482030.tif 000026
【図８】
0006482030.tif 000027
【配列表】
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