(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
半結晶性のポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及び添加材を含むプラスチック製品の前記ＰＥＴをモノマーにまで脱重合するのに適するクチナーゼ(EC3.1.1.74)及びリパーゼ(EC 3.1.1.3)から選択される酵素を前記プラスチック製品と接触させて、前記ＰＥＴをモノマーに脱重合するステップと、得られたテレフタル酸（ＴＡ）モノマーを回収するステップとを備え、
前記脱重合するステップは、前記ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）未満の温度で行われ、前記脱重合するステップの間は常に前記酵素の反応液のｐＨを４〜１０に維持するように調整する、少なくとも１つのプラスチック製品をリサイクルする方法。
【請求項２】
前記脱重合するステップは、前記プラスチック製品を、前記酵素を発現し且つ排出する少なくとも１種の微生物と接触することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は、生成される前記モノマーの消費を抑制する変更された代謝を有する組換え型微生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物は、組換え型分解酵素を発現し且つ排出する組換え型微生物である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記プラスチック製品は、分解前に前処理される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記前処理は、前記プラスチック製品の機械的／物理的改変を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記前処理は、前記プラスチック製品の粉砕を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素と共に、少なくとも１つの親油性及び／又は親水性薬剤が用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＡモノマーを精製するステップと、該精製されたＴＡモノマーを再処理するステップとをさらに備えている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２つのプラスチック製品が同時に又は順次リサイクルされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、廃プラスチック等のプラスチック製品をリサイクルするための方法に関する。より具体的に、本発明は、プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーを脱重合し、新たなポリマーを合成して新たなプラスチック製品を製造するためにさらに再処理され得るモノマーを生成するための生物学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチックは、安価で且つ耐久性がある材料であり、幅広い適用範囲での使用が見られる種々の製品を製造するのに用いられ得るので、プラスチックの生産がここ数十年にわたって劇的に増大した。これらのプラスチックの約４０％は、製造の１年以内に捨てられるパッケージ、農業用フィルム、使い捨て消費財又は製品寿命が短い製品等の使い捨て適用に用いられる。含まれるポリマーの耐久性のため、相当量のプラスチックが世界中の埋立地及び自然生息地に積み上げられ、環境問題の増大が生じている。分解性及び生分解性プラスチックであっても、紫外線の曝露レベル、温度、適切な微生物の存在等のその土地における環境因子に依存して、数十年間存続し得る。
【０００３】
プラスチックの蓄積に関連する環境的及び経済的影響を低減するための１つの解決策は、クローズドループリサイクルであり、プラスチック材料は、新しい製品を製造するために機械的に再処理される。例えば、最も一般的なクローズドループリサイクルの１つは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のリサイクルである。廃ＰＥＴは、回収、分類、ベール内への圧縮、圧砕、洗浄、フレーク状への切断、ペレット状の溶解及び押し出し、並びに販売といった食品接触承認されたリサイクルＰＥＴ（ｒＰＥＴ）を生成する連続的な処理を受ける。その後、これらのリサイクルＰＥＴは、衣料産業のための布地、又はボトル若しくはブリスターパック等の新たなパッケージを形成するのに用いられ得る。
【０００４】
しかしながら、廃プラスチックは、通常、全て一緒に回収されるのでプラスチックベールは種々のプラスチックの混合物を含み、原料ごとに成分が異なり、ベールごとに割合が異なり得る。結果として、リサイクルプロセスは、プラスチック製品の成分、サイズ、樹脂型、色、用いられた機能性添加剤等に従って、プラスチック製品を分類する予備選択を必要とする。
【０００５】
さらに、実際のプラスチックリサイクルプロセスは、特に押し出しステップの際に大量の電力を使用し、用いられる装置は高価であり、未使用プラスチックと比較して非競合的な高値となる。
【０００６】
プラスチックのリサイクルのための他の潜在的プロセスは、ポリマーの化学成分を回復できる化学リサイクルからなる。生じるモノマーは、プラスチックの再製造に用いられ得る、又は他の合成化学物質の生成に用いられ得る。しかしながら、今まで、そのようなリサイクルプロセスは、精製されたポリマーにおいて実施されたのみであり、結晶化及びアモルファスポリマーと添加剤との混合物で構成された未精製プラスチック製品では有効でない。
【０００７】
従って、予備的分類及び高価な前処理を必要とせず、種々のプラスチック材料をリサイクルするのに用いられ得るプラスチック製品のリサイクルのための改良されたプロセスが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、低いエネルギー消費で少なくとも１つのプラスチック製品における少なくとも１つのポリマーを脱重合するための生物学的プロセスを提供する。本発明のプロセスは、プラスチック製品の元のポリマーを形成するモノマーを回復でき、該モノマーは同じ型の新たなポリマー鎖を合成するために再処理され得る。より具体的に、本発明者らは、プラスチック製品のポリマーを脱重合でき、元のポリマーを形成するモノマーの混合物を生成できる特定の酵素の使用を提案する。
【０００９】
これに関して、酵素を用いてプラスチック製品の少なくとも１つのポリマーをモノマーに脱重合することと、得られたモノマーを回収することとを含む少なくとも１つのプラスチック製品をリサイクルするための方法を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
本発明の更なる目的は、プラスチック製品の少なくとも２つの異なるポリマーをリサイクルするための方法に関し、前記少なくとも２つの異なるポリマーは、同時に又は順次脱重合され、得られたモノマーは回収される。
【００１１】
また、本発明は、少なくとも２つの異なるプラスチック製品を同時に又は順次リサイクルするための方法に関し、各プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーは少なくとも１つの酵素を用いてモノマーに分解され、得られたモノマーは回収される。
【００１２】
好ましくは、プラスチック製品は、ポリエステル及びポリアミドのうちから選択される少なくとも１つのポリマーを含む。
【００１３】
より好ましくは、ポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリＤ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリＤ，Ｌ乳酸（ＰＤＬＬＡ）、ＰＬＡ立体錯体（ｓｃＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（Ｐ（３ＨＢ）／ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＶ）／ＰＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ（３ＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）（Ｐ（３ＨＯ））、ポリ（３−ヒドロキシデカノエート）（Ｐ（３ＨＤ））、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）／ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）／  （ＰＨＢＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−５−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢ５ＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＢ３ＨＰ）、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシオクトノエート（ＰＨＢＯ）、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシオクタデカノエート（ＰＨＢＯｄ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−４ＨＢ））、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、及びこれらの材料の混合物から選択される。
【００１４】
また、ポリアミドは、ポリアミド−６又はポリ（β−カプロラクタム）又はポリカプロアミド（ＰＡ６）、ポリアミド−６，６又はポリ（ヘキサメチレンアジパミド）（ＰＡ６，６）、ポリ（１１−アミノウンデカノアミド）（ＰＡ１１）、ポリドデカノラクタム（ＰＡ１２）、ポリ（テトラメチレンアジパミド）（ＰＡ４，６）、ポリ（ペンタメチレンセバカミド）（ＰＡ５，１０）、ポリ（ヘキサメチレンアゼラアミド）（ＰＡ６，９）、ポリ（ヘキサメチレンセバカミド）（ＰＡ６，１０）、ポリ（ヘキサメチレンドデカノアミド）（ＰＡ６，１２）、ポリ（ｍ−キシリレンアジパミド）（ＰＡＭＸＤ６）、ポリヘキサメチレンアジパミド／ポリヘキサメチレンテレフタルアミドコポリマー（ＰＡ６６／６Ｔ）、ポリヘキサメチレンアジパミド／ポリヘキサメチレンイソフタルアミドコポリマー（ＰＡ６６／６Ｉ）、及びそれらの材料の混合物から選択されることが好ましい。
【００１５】
有利に、回収されたモノマーは、新たなポリマーを合成するためにさらに再処理される。
【００１６】
好ましくは、酵素は、プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーをモノマーに脱重合するのに適する分解酵素である。
【００１７】
分解酵素は、クチナーゼ(EC 3.1.1.74)、リパーゼ(EC 3.1.1.3)、エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ(EC 3.1.1.1)、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ、セリンプロテアーゼ(EC 3.4.21.64)、プロテアーゼ、アミダーゼ、アリール−アシルアミダーゼ(EC3.5.1.13)、６−アミノヘキサノエートサイクリックダイマーヒドロラーゼ(EC 3.5.2.12)、６−アミノヘキサノエートダイマーヒドロラーゼ(EC 3.5.1.46)及び６−アミノヘキサノエート−オリゴマーヒドロラーゼ(EC 3.5.1.B17)等のオリゴマーヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、並びにラッカーゼ(EC 1.10.3.2)から選択されることが好ましい。
【００１８】
他の特定の実施形態において、酵素は、プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーをモノマーに脱重合するのに適する少なくとも１つの中間分子を生成する及び／又は活性化する中間酵素であってもよい。
【００１９】
他の特定の実施形態において、方法は、以下のステップを含む：
ａ）プラスチック製品をデポリメラーゼ又は中間酵素を発現及び排出する少なくとも１つの微生物と接触するステップ；
ｂ）前記プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーの脱重合から生じたモノマーを回収するステップ。
【００２０】
特定の実施形態において、前記酵素を発現し且つ排出する微生物は、生成されるモノマーの消費を抑制する変更された代謝を有する組換え型微生物である。
【００２１】
さらなる特定の実施形態において、微生物は、組換え型分解酵素を発現し且つ排出する組換え型微生物である。
【００２２】
他の特定の実施形態において、方法は以下のステップを含む：
ａ）プラスチック製品を少なくとも１つの脱重合酵素と接触するステップ；
ｂ）前記プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーの脱重合から生じたモノマーを回収するステップ。
【００２３】
本発明において、分解酵素は、少なくとも１つの親油性薬剤及び／又は親水性薬剤と共に用いられ得る。
【００２４】
プラスチック製品は、分解前に前処理され得る。より具体的に、前処理は、切断及び圧砕、押圧及び粉砕、分別、低温冷却ステップ、乾燥、脱水、凝集、又は顆粒化等のプラスチック製品の機械的／物理的改変を含み得る。
【００２５】
特定の実施形態において、プラスチック製品は、分解前に、さらに分類、洗浄、及び又は生化学的浄化がなされてもよい。
【００２６】
本発明のこれらの目的及び実施形態は、一般用語で示す好ましい実施形態を含む本発明の詳細な説明の後により明確となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明のプロセスに係るプラスチックペレットに含まれるポリ乳酸ポリマーの加水分解後の乳酸の生成量を示すグラフである。ｐＨ８程度に維持するｐＨの調整は、４８時間後又は７２時間後でさえもモノマー生成量を増大する。
【図２】図２は、プラスチック製品に含まれるポリエチレンテレフタレートが本発明のプロセスにより加水分解され、テレフタル酸モノマーが回収されることを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のプロセスの効率におけるＰＥＴプラスチック製品の粒径の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、プラスチック製品の少なくとも１つのポリマー構成を脱重合することによりプラスチック製品をリサイクルするための完全なリサイクルプロセスに関し、再重合可能なモノマー混合体が生成されて回収される。
【００２９】
（定義）
本開示は、以下の定義を参照することによって良く理解されるであろう。
【００３０】
本発明において、「プラスチック製品」の用語は、プラスチックシート、チューブ、ロッド、プロファイル、型材、塊、ファイバー等の少なくとも１つのプラスチック材料からなる品目を意味し、それは、少なくとも１つのポリマーと、任意に可塑剤、無機又は有機フィラー等の他の物質又は添加剤を含む。好ましくは、プラスチック製品は、半結晶性ポリマー及び／又はアモルファスポリマーの混合の構成、又は半結晶性ポリマー及び添加剤の混合の構成である。より好ましくは、プラスチック製品は、パッケージ、農業用フィルム又は使い捨て消費財等の工業製品である。本発明のプラスチック材料は、合成、分解可能及び生分解性プラスチックを含む。本発明において、天然及び合成ゴムは、プラスチック材料としてみなされず、ゴム製品は、本発明の範囲から除かれる。
【００３１】
「ポリマー」は、構造が共有結合により結合された複数の繰り返し単位からなる化合物又は化合物の混合物を意味する。本発明において、ポリマーの用語は、単一の型の繰り返し単位からなる（すなわちホモポリマー）、又は異なる繰り返し単位の混合体からなる（すなわちブロックコポリマー及びランダムコポリマー）天然又は合成ポリマーを含む。
【００３２】
プラスチック製品に関する「リサイクルプロセス」は、再使用されるために回収される再重合可能なモノマーを生成するための、プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーを分解するプロセスを意味する。
【００３３】
本明細書において、「組換え型微生物」は、そのゲノムが少なくとも１つの核酸配列又はユニットの挿入により変異された微生物を意味する。一般に、挿入された核酸配列又はユニットは、微生物のゲノムに自然に存在しない。その核酸配列又はユニットは、組換えＤＮＡ技術（遺伝子クローニング又は分子クローニングとも呼ぶ）を用いてその微生物又はその祖先に構築される及び又は挿入され、その組換え技術は一生物から他の生物にＤＮＡを移す技術を意味する。核酸配列又はユニットは、微生物染色体に統合され得る又はプラスミドに提供され得る。さらに、「組換え型微生物」は、そのゲノムが少なくとも１つの核酸配列又はユニットの不活化又は欠失により変異された微生物を意味する。生じた組換え型微生物は、種々の方法により製造され、一度製造すると、更なる組換えＤＮＡ技術を使用することなく再生成され得る。他に、組換え型微生物は、メタゲノムライブラリから得られ得る。
【００３４】
「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」の用語は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を意味する。ヌクレオチド配列は、例えば組換え技術、酵素的技術及び／又は科学的技術により、まず調製され、続いて宿主細胞内で又はインビトロシステムで複製され得る。ヌクレオチド配列は、（ポリ）ペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。ヌクレオチド配列は、転写ターミネーター、シグナルペプチド、イントロン等の追加配列を含み得る。
【００３５】
本発明において、酵素又は（ポリ）ペプチドに関する「微生物由来」の用語は、酵素又は（ポリ）ペプチドがそのような微生物から単離されたこと、又は酵素又は（ポリ）ペプチドがそのような微生物から単離又は特徴付けられる酵素又は（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列の全て又は生物学的に活性部分を含むことを意味する。
【００３６】
「ベクター」の用語は、宿主細胞内に組換え型遺伝子物質を移すための媒体として用いられるＤＮＡ分子を意味する。ベクターの主要な型は、プラスミド、バクテリオファージ、ウィルス及び人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート（異種性核酸配列、導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」となるより大きい配列とからなるＤＮＡ配列である。宿主に遺伝子情報を送るベクターの目的は、通常、標的細胞においてインサートを単離する、増やす又は発現することである。発現ベクターと呼ばれるベクター（発現コンストラクト）は、特に標的細胞における異種配列の発現のために適用され、一般に、ポリペプチドをコードする異種配列の発現をさせるプロモーター配列を有する。一般に、発現ベクター内に存在する調節エレメントは、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び任意に存在するオペレーターを含む。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製開始点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数のための潜在力をも含む。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾型クローニングベクター、具体的に、設計されたプラスミド及びウィルスである。異なる宿主における適切なレベルのポリペプチド発現を提供する発現ベクターは、本技術分野において周知である。本技術分野において周知の細菌性発現ベクターは、ｐＥＴ１１ａ（Novagen）、ｌａｍｄａ ｇｔ１１（Invitrogen）を含む。
【００３７】
発現ベクターは、標準的な技術を用いて宿主細胞内に導入され得る。そのような技術の例は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、リポトランスフェクション、原形質融合、及びエレクトロポレーションを含む。細胞内に核酸を導入し、タンパク質を生成するように核酸を発現するための技術の例は、Ausubel,Current Protocols in molecular biology, John wiley, 1987-1998、及びSambrook, et al., in Molecular cloning, A laboratory Manual 2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989等の参考文献から得られる。
【００３８】
（プラスチック製品）
本発明は、モノマーレベルにまでプラスチック製品を分解することを提案し、そのモノマーは、ポリマーに再重合し、新たなプラスチック製品を製造するために再利用され得る。
【００３９】
本発明の方法は、種々の異なるプラスチック材料からなるプラスチック製品をリサイクルするために用いられ得る。例えば、プラスチック製品は、異なるプラスチック材料の連続的な層を含み得る。
【００４０】
本発明のリサイクルプロセスは、予備的なプラスチックの分離及び／又は洗浄の必要がなく、全ての種類のプラスチック製品を分解するために用いられ得る。より具体的に、本発明のプロセスは、廃プラスチック収集物に由来するプラスチック製品に直接に適用され得る。例えば、本発明のプロセスは、プラスチックボトル、プラスチックバッグ、プラスチックパッケージ、織物廃棄物等を含む家庭の廃プラスチック混合物に適用され得る。
【００４１】
本発明のプロセスの標的となるプラスチック製品は、石油化学製品由来の合成プラスチック材料、又は（生物学的製品の全部又は大部分で構成された）バイオベースプラスチック材料を含む種々のプラスチック材料を含み得る。
【００４２】
標的プラスチック製品は、１つ又は複数のポリマー及び添加剤を含み得る。一プラスチック製品は、異なる層に配置された又は共に溶解された複数の種類のポリマーからなり得る。さらに、プラスチック製品は、半結晶性ポリマー、又は半結晶性及びアモルファスポリマーと添加剤との混合物により構成され得る。
【００４３】
特定の実施形態において、プラスチック製品は、飽和型直鎖状の炭素主鎖を含むポリマーのみからなり、それは、さらに芳香環等の飽和型又は不飽和型環を含み得る。
【００４４】
特定の実施形態において、標的プラスチック製品は、ポリエステル及び／又はポリアミドを含む。好ましくは、プラスチック製品は、ポリエステル及び／又はポリアミドのみを含む。好ましいポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリＤ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリＤ，Ｌ乳酸（ＰＤＬＬＡ）、ＰＬＡ立体錯体（ｓｃＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（Ｐ（３ＨＢ）／ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＶ）／ＰＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ（３ＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）（Ｐ（３ＨＯ））、ポリ（３−ヒドロキシデカノエート）（Ｐ（３ＨＤ））、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）／ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）／  （ＰＨＢＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−５−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢ５ＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＢ３ＨＰ）、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシオクトノエート（ＰＨＢＯ）、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシオクタデカノエート（ＰＨＢＯｄ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−４ＨＢ））、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、及びこれらの材料の混合物であり、好ましいポリアミドは、ポリアミド−６又はポリ（β−カプロラクタム）又はポリカプロアミド（ＰＡ６）、ポリアミド−６，６又はポリ（ヘキサメチレンアジパミド）（ＰＡ６，６）、ポリ（１１−アミノウンデカノアミド）（ＰＡ１１）、ポリドデカノラクタム（ＰＡ１２）、ポリ（テトラメチレンアジパミド）（ＰＡ４，６）、ポリ（ペンタメチレンセバカミド）（ＰＡ５，１０）、ポリ（ヘキサメチレンアゼラアミド）（ＰＡ６，９）、ポリ（ヘキサメチレンセバカミド）（ＰＡ６，１０）、ポリ（ヘキサメチレンドデカノアミド）（ＰＡ６，１２）、ポリ（ｍ−キシリレンアジパミド）（ＰＡＭＸＤ６）、ポリヘキサメチレンアジパミド／ポリヘキサメチレンテレフタルアミドコポリマー（ＰＡ６６／６Ｔ）、ポリヘキサメチレンアジパミド／ポリヘキサメチレンイソフタルアミドコポリマー（ＰＡ６６／６Ｉ）、及びそれらの材料の混合物である。
【００４５】
特定の実施形態において、プラスチック製品は、ポリ乳酸、より具体的には半結晶性ポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルにより構成される。
【００４６】
他の実施形態において、プラスチック製品は、ポリエチレンテレフタレート及び／又はポリトリメチレンテレフタレート、より具体的には半結晶性のそれら等の芳香族ポリエステルにより構成される。
【００４７】
（プラスチック分解）
プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーのモノマー間における化学結合を加水分解するのに適する分解酵素を提供することが本発明の目的である。
【００４８】
本発明において、そのような分解酵素は、加水分解するポリマーに依存して、クチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ、セリンプロテアーゼ、プロテアーゼ、アミダーゼ、アリール−アシルアミダーゼ、オリゴマーヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びラッカーゼ等である。
【００４９】
例えば、セリンプロテアーゼ（Tritirachiumalbum由来のプロテイナーゼＫ、又はAmycolatopsis sp.由来のＰＬＡデポリメラーゼ等）、リパーゼ（Candida antarctica、Cryptococcus sp.又はAspergillus niger由来のリパーゼ等)、又はエステラーゼ（Thermobifida halotolerans由来のエステラーゼ等）は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）を含むプラスチック製品を脱重合するために用いられ得る。クチナーゼ（Thermobifida fusca、Thermobifida alba又はFusarium solani pisi由来のクチナーゼ等）、又はリパーゼ（Burkholderiacepacia由来のリパーゼＰＳ等）は、ＰＥＴ又はＰＴＴを含むプラスチック製品を脱重合するために用いられ得る。クチナーゼ（Fusarium solani由来のクチナーゼ等）、アリール−アシルアミダーゼ（Nocardiafarcinica由来のアリール−アシルアミダーゼ等）、オリゴマーヒドロラーゼ（Arthrobactersp.由来の６−アミノヘキサノエートオリゴマーヒドロラーゼ等）、又はアミダーゼ（Beauveria brongniartii由来のアミダーゼ等）は、ＰＡ６又はＰＡ６，６を含むプラスチック製品を脱重合するために用いられ得る。
【００５０】
特定の実施形態において、リサイクルされるためのプラスチック製品は、天然型又は合成型の分解酵素に接触される。
【００５１】
例えば、分解酵素は、組み換え技術により生成されてもよく、又は自然に発生している場合、それは天然源から単離若しくは精製されてもよく、又はそれは人工的に生成されてもよい。その酵素は、可溶型であってもよく又は固相にあってもよい。特に、それは、細胞膜若しくは脂質小胞に結合されることができ、また、例えばビーズ、カラム及びプレート等の形態のガラス、プラスチック、ポリマー、フィルタ、膜等の合成担体に結合され得る。
【００５２】
その酵素は、単離型又は精製型の形態であることが好ましい。好ましくは、本発明の酵素は、微生物から、発現され、誘導され、分泌され、単離され、又は精製される。その酵素は、本技術分野において周知の技術により精製され、従来技術により保存され得る。その酵素は、例えばその安定性又は活性を改善するようにさらに修飾され得る。
【００５３】
他の実施形態において、リサイクルするためのプラスチック製品は、分解酵素を合成し、排出する微生物と接触される。本発明において、その酵素は、培養培地に排出され得る、又は微生物の細胞膜に向かい固着され得る。
【００５４】
前記微生物が分解酵素を自然に合成してもよく、それは、例えばベクターを用いて分解酵素をコードする組換え型ヌクレオチド配列が挿入された組換え型微生物であってもよい。
【００５５】
例えば所定の分解酵素をコードするヌクレオチド分子は、例えばプラスミド、組換え型ウィルス、ファージ、エピソーム及び人工染色体等のベクター内に挿入される。有利には、ヌクレオチド分子は、特定のプロモーターの制御下にある。ベクターは、組換え型微生物を形成するために宿主微生物内にトランスフェクションされる。宿主は、該宿主に適する培養条件下で培養され、本発明の酵素を含む組換え型細胞が得られる。宿主に適する培養条件は、当業者に周知である。
【００５６】
本発明のヌクレオチド分子は、単離型又は精製型であってもよく、また、例えばｃＤＮＡライブラリのクローニング及び発現、増幅、酵素的合成又は組み換え技術といった本技術分野において周知の技術により単離及び／又は操作され得る。ヌクレオチド分子は、周知の化学合成技術によりインビトロで合成され得る。本発明のヌクレオチド分子は、選択された宿主細胞又は系における酵素の発現を引き起こす又は制御するために用いられ得る制御領域等、すなわちプロモーター、エンハンサー、サイレンサー及びターミネーター等の追加的ヌクレオチド配列を含み得る。
【００５７】
組換え型微生物は、直接に用いられ得る。そうしない場合、又はそれに加えて、組換え型酵素は、培養培地から精製され得る。塩析、ゲルろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィー等の一般に用いられる分離／精製手段は、この目的のために用いられ得る。
【００５８】
特定の実施形態において、分解酵素を合成及び排出することが知られる微生物が用いられ得る。例えば、クチナーゼを合成及び排出するAspergillus oryzae、Humicola insolens、Penicillium citrinum、Fusarium solani、及びThermobifida cellulolysiticaは、ＰＥＴを含むプラスチック製品を分解するために用いられ得る。同様に、Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Burkholderia sp.、及びTriticum aestivumは、ＰＥＴを脱重合するリパーゼを合成する。Amycolatopsis sp. K104-1及びK104-2、Tritirachium album ATCC 22563、Paenibacillusamylolyticus TB-13、Kibdelosporangium aridum JCM 7912、Saccharothrix waywayandensis JCM 9114、Amycolatopsisorientalis IFO 12362、Actinomadura keratinilytica T16-1は、ＰＬＡを含むプラスチック製品を分解するために用いられ得る。Aspergillus fumigatus NKCM1706、Bionectriaochroleuca BFM-X1は、ＰＢＳを含むプラスチック製品を分解するために用いられ得る。Thermomonosporafusca K13g及びK7a-3、Isariafumosorosea NKCM1712は、ＰＢＡＴを含むプラスチック製品を分解するために用いられ得る。マンガンペルオキシダーゼを生成するBjerkandera adustaは、ＰＡを含むプラスチック製品を分解するために用いられ得る。
【００５９】
本発明において、いくつかの微生物及び／又は精製型酵素及び／又は合成酵素は、同一のプラスチック製品又は異なるプラスチック製品に含まれる異なる種類のポリマーを脱重合するために、共に又は順に用いられ得る。
【００６０】
有利には、本発明の微生物は、分解されたポリマーから得られたモノマーの消費を抑制するために修飾された代謝を示す。例えば、微生物は、組換え型微生物であり、そのモノマーを分解する酵素は、欠失又はノックアウトされている。この他に、本発明のプロセスは、微生物により用いられ得る少なくとも１種の炭素源を含む培養培地内で行われてもよく、その微生物はモノマーの代わりにこの炭素源を消費することが好ましい。
【００６１】
有利には、プラスチック製品は、微生物と、炭素源としてのグルコース等と、有機窒素源（例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー）又は無機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム）を含む微生物により同化され得る窒素源とを含む培養培地に接触される。必要であれば、培養培地は、無機塩（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン）をさらに含み得る。さらに、培地は、ビタミン、少数元素及びアミノ酸等の微量成分が追加され得る。
【００６２】
（リサイクルプロセスのパラメータ）
本発明において、プラスチック製品は、該プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーを標的とする分解酵素、及び／又はそのような分解酵素を合成及び排出する微生物を該プラスチック製品と接触することによりリサイクルされ得る。
【００６３】
本発明のプロセスは、半結晶性ポリマー、並びに結局は１つ又は複数の他の半結晶性及び／又はアモルファスポリマー及び／又は添加剤を含むプラスチック製品に含まれる半結晶性ポリマーを分解するのに部分的に有益である。
【００６４】
特定の実施形態において、プラスチック製品は、ポリマーと酵素との間の接触面を増大するために、その構造を物理的に変更するための前処理がなされ得る。例えば、プラスチック製品は、エマルジョン又は粉末に変換されてもよく、それは、微生物及び／又は酵素に接触する液体培地に加えられる。これの他に、プラスチック製品は、微生物及び／又は酵素に接触する液体培地に加えられる前にその材料の外形及びサイズを小さくするために、機械的に粉砕、粒化、ペレット化等され得る。
【００６５】
プラスチック製品の分解に必要な時間は、プラスチック製品自体（すなわち、プラスチック製品の性質及び起源、その成分、形状等）、用いられる微生物／酵素の型及び量、並びに種々のプロセスパラメータ（すなわち、温度、ｐＨ、追加の薬剤等）に依存して異なり得る。当業者は、プロセスパラメータをプラスチック製品及び／又は分解酵素に、容易に適合し得る。
【００６６】
有利には、そのプロセスは、２０℃〜８０℃、より好ましくは２５℃〜６０℃を含む温度で行われ、その温度は、少なくとも脱重合ステップの間は２５℃〜５０℃に維持される。より具体的に、その温度は、酵素が不活化される及び／又は微生物がもはや分解酵素を合成しない温度に対応する不活性化温度未満に維持される。驚くべきことに、本発明者らは、本発明のプロセスが標的とされるポリマーのＴｇ未満の温度で行われ得ることを発見した。本発明において、脱重合ステップのための酵素の添加量は、プラスチック製品の重量の少なくとも０．００５％であり、好ましくは少なくとも０．１％であり、より好ましくは少なくとも１％である。また、その添加量は、プラスチック製品の重量の多くとも１５％であり、より好ましくは多くとも５％であることが有利である。有利には、分解酵素の量は、プラスチック製品の重量の０．００５％〜１５％の範囲であり、好ましくは０．１％〜１０％の範囲であり、より好ましくは１％〜５％の範囲である。
【００６７】
培地のｐＨは、４〜１０の範囲であってよい。有利には、そのｐＨは、プロセス効率を改善するために標的とされるポリマー／酵素の組合せに従って調整される。より具体的に、そのｐＨは、酵素の最適ｐＨに維持されるように調整される。実際に、ポリエステル及びポリアミドの脱重合は、ｐＨの低減を誘導する酸性モノマーを産生する。希釈アルカリの添加は、この酸性化を補償し、最適ｐＨにｐＨを維持するのに用いられ得る。
【００６８】
特定の実施形態において、少なくとも１種の親油性薬剤及び／又は親水性薬剤は、脱重合ステップを改善するために培地に添加される。ゼラチン等のインダクタは、酵素産生を改善するために培地に添加され得る。Tween等の界面活性剤は、ポリマーと酵素又は微生物との間の界面エネルギーを変更する、及び分解効率を改善するために培地に添加され得る。有機物質は、ポリマーを膨潤させる、及び微生物又は酵素に対するその接近可能性を増大させるのに用いられ得る。
【００６９】
有利には、本発明のプロセスは、分解促進剤なしで行われる。特定の実施形態において、本発明のプロセスは、分解酵素及び水のみを含む分解液体内で行われる。特定の実施形態において、本発明のプロセスは、有機溶媒なしで行われる。
【００７０】
プラスチック製品の少なくとも１つのポリマーの脱重合のための反応時間は、有利には、５時間から７２時間の間に含まれる。そのような反応時間は、脱重合を十分に進行させることができ、経済的に不利益はないであろう。
【００７１】
（回収されたモノマーの処理及び再利用）
標的ポリマーの脱重合から得られるモノマーの混合物は、脱重合ステップの最後に、経時的又は連続的に回収され得る。単一のモノマー又は複数の異なるモノマーは、脱重合されるポリマー及び／又はリサイクルされるプラスチック製品に依存して回収され得る。
【００７２】
モノマーは、全ての適当な精製方法を用いてさらに精製され得る、及び再重合可能な形態にされ得る。精製方法の例は、ストリッピング処理、水溶液による分離、水蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後の培地の濾過及び濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈殿、結晶化、濃縮及び酸付加加水分解及び沈殿、ナノろ過、酸触媒処理、半連続式蒸留又は連続式蒸留、溶媒抽出、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液体／液体抽出、水素添加、共沸蒸留処理、吸着、カラムクロマトグラフィー、単純減圧蒸留、並びに精密ろ過であり、それらを組み合わせる又は組み合わせない。
【００７３】
再重合可能モノマーは、ポリマーを合成するために再使用され得る。有利には、同一の性質のポリマーは再重合される。しかしながら、新たなコポリマーを合成するために、回収されたモノマーを他のモノマー及び／又はオリゴマーと混合可能である。
【００７４】
特定の実施形態において、再重合は、重合反応させるための適切な条件での加水分解を用いて行われる。イニシエータは、重合反応を助けるためにモノマー溶液に添加され得る。
【００７５】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実施例に開示され、それは、説明としてみなされるべきであり、本願の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７６】
Ａ］酵素を用いた脂肪族ポリエステルのリサイクル
ＰＬＡ等の脂肪族ポリエステルを含むプラスチック製品は、本発明のプロセスによってリサイクルされ得る。本実施例は、半結晶性ＰＬＡで構成されたプラスチック製品を、プロテイナーゼＫを用いて処理することによる乳酸の回収を示す。
【００７７】
（プラスチック製品及び前処理）
ＰＬＡペレットは、NaturePlast (PLLA001)から購入し、それをユニバーサルミルCondux CUM 100を用いて５００μｍよりも小さい粒径の粉末に粉砕した。
【００７８】
プラスチック製品におけるポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）及び結晶度を測定するために、約８ｍｇのサンプルにおいて、アルミニウム製パンで、５０℃〜３００℃で１０℃／ｍｉｎの走査速度、窒素雰囲気下（５０ｍＬ／ｍｉｎ）でQ 100 TA - RCS 90装置を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）テストを行った。
【００７９】
ＰＬＡ粉末は５９℃のＴｇを有し、１４．９％の結晶度を有する半結晶であった。
【００８０】
（加水分解反応）
乳酸を回収するために、Tritirachiumalbum 由来のプロテイナーゼＫ(Sigma)を用いて、ＰＬＡ粉末の加水分解を行った。ｐＨ８であり、５ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓを溶媒として１０ｍｇ／ｍＬの濃度で酵素溶液を調製した。２０ｍｇのＰＬＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）を溶媒とする２００μｇのプロテイナーゼＫにより３７℃で最終容量が５ｍＬとなるように処理し、マグネチックスターラーで７日間撹拌した。
【００８１】
試験において、乳酸の産生による酸性化を補償するために、インキュベーションの間、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨ８（プロテイナーゼＫの最適ｐＨに対応する）に維持した。試験はトリプリケートで行った。
【００８２】
コントロールとして、ｉ）酵素を含まないバッファーに含まれたＰＬＡ、ｉｉ）ＰＬＡを含まないバッファーに含まれた酵素を用いた。
【００８３】
（乳酸（ＬＡ）アッセイ）
１６０μＬの反応媒体を分析の各時間でサンプリングした。サンプルに対して、０℃、１６０００ｇで３分間の遠心分離をした。分析のための上清を、０．４５μｍのフィルタに通し、２０μｌをＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣにはUltimate-3000 (Dionex, Thermo Scientific)を用い、オートサンプラーの恒温装置を１０℃にし、カラム部分の恒温装置を５０℃にした。ＬＡの分析のために、Aminex H+ HPX-87Hカラムを用いた。溶出剤として５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４を用いて分析を行った。流速を０．５ｍＬ／ｍｉｎに設定し、カラムを５０℃の温度に維持した。ＬＡの検出を、可変波長検出器を用いて２２０ｎｍで行った。ｐＨ８の２０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌに溶解されたSigma (L-1750)からのＬ−乳酸を用いて、０〜３００ｍＭの濃度範囲で調製されたスタンダードを考慮して、定量化を可能とした。
【００８４】
（結果）
ＰＬＡ粉末をプロテイナーゼＫにより加水分解し、乳酸を回収した。コントロールでは乳酸は検出されなかった。図１に示すように、乳酸の最大濃度は、ｐＨ調節が行われない場合、７２時間の加水分解の後に得られた。ｐＨを調節した場合、乳酸濃度は７日間の反応まで増加し続けた。ｐＨ調節が無い場合、３．４７±０．５７ｍＭのＬＡが回収される代わりに、加水分解の間、ｐＨ８にｐＨを維持することで、７２時間で５．８７±０．９２ｍＭのＬＡを回収できる。従って、ｐＨ調節は、プロセス効率を変更するためのパラメータとして用いられ得る。
【００８５】
Ｂ］酵素を用いた芳香族ポリエステルのリサイクル
ＰＥＴ及び／又はＰＴＴ等の芳香族ポリエステルを含むプラスチック製品は、本発明のプロセスによってリサイクルされる。本実施例は、ＰＥＴ及び／又はＰＴＴを含むプラスチック製品を処理することによるテレフタル酸の回収を示す。
【００８６】
（プラスチック製品及び前処理）
異なる基質として、以下を用いた。
‐Goodfellow (ES 301445)から購入した０．２５ｍｍの厚さでアモルファスのＰＥＴフィルム
‐DuPont (Sorona（登録商標） 3301 NC010)から購入したＰＴＴペレット
‐ＰＥＴボトル（商標Cristallineのミネラルウォーターを以前に含んでいたもの）
ペットフィルムを１０ｍｇ（約０．５ｃｍ×１ｃｍ）の片に切断した。それを、タンパク質又は脂質の汚染物質を除去するために３つの連続したステップにおいて洗浄した。第１ステップでは５ｇ／ＬのTriton-X 100で洗浄し、第２ステップでは１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３で洗浄し、最終ステップでは脱イオン水で洗浄した。各洗浄ステップは、５０℃で３０分間行った。その後、ＰＥＴフィルムを圧縮空気で乾燥した。
【００８７】
５分間の切断ミルSM-2000 (Retsch)の使用によりＰＴＴを粉末に粉砕し、１ｍｍの粉末を得るために１．５ｍｍの目開きのシーバーAS 200 (Retsch)を用いて１０分間篩いにかけた。
【００８８】
ＰＥＴと酵素との接触面を増大するために、全てのボトルを前処理した。それらを、５分間の切断ミルSM-2000 (Retsch)の使用により種々の粒径の粉末に機械的に粉砕した。その後、回収された粉末を、１ｍｍ、５００μｍ及び２５０μｍの粒径の３種の粉末の得るために、１．５ｍｍの目開きのシーバーAS 200 (Retsch)を用いて１０分間篩いにかけた。
【００８９】
プラスチック製品におけるポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）及び結晶度を測定するために、約８ｍｇのサンプルにおいて、アルミニウム製パンで、５０℃〜３００℃で１０℃／ｍｉｎの走査速度、窒素雰囲気下（５０ｍＬ／ｍｉｎ）でQ 100 TA - RCS 90装置を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験を行った。
【００９０】
ＰＴＴ及びＰＥＴのボトルの粉末は、それぞれ５０．６℃及び７７．２℃のＴｇを有し、それぞれ３６％及び３０％の結晶度を有する半結晶性であった。
【００９１】
（クチナーゼ産生）
German Resource Centre forBiological Material (DSMZ, Germany)からThermobifidacellulosilytica DSM44535を得た。その菌株をＬＢアガープレート上で維持し、５００ｍＬ振とうフラスコ（２００ｍＬ ＬＢ培地）において３７℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した。細胞を３２００ｇ、４℃で２０分間遠心処理することにより回収した。
【００９２】
Escherichia coli BL21-Gold(DE3) (Stratagene, Germany)におけるThermobifidacellulosytica由来のクチナーゼTHC_Cut2の発現のために、ベクターpET26b(+) (Novagen, Germany)を用いた。
【００９３】
クチナーゼのためのTHC_Cut2をコードする遺伝子を、標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりT. cellulosilytica DSM44535のゲノムＤＮＡから増幅した。T.fusca YX (Genbank accession numbers YP_288944 and YP_288943,33)由来のクチナーゼをコードする遺伝子の周知の配列に基づいて、5’-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3’ (SEQ ID 1- 順方向プライマー) 、及び5’-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3’(SEQ ID 2 - 逆方向プライマー)の２つのプライマーを設計し、シグナルペプチドが無いそれぞれの遺伝子の増幅、及びクチナーゼのＣ末端における６×His-Tagの導入を行った。設計したプライマーは、pET26b(t)ベクターに遺伝子をクローニングするためにNdeI及びHindIIIの制限酵素サイトを含む。鋳型としてのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、５ユニットのPhusion DNA polymerase (Finnzymes)、及びサプライヤにより提供された１×反応バッファーを含む５０μＬの溶液でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Gene Amp PCR 2200 thermocycler (Applied Biosystems, USA)で行った。３５サイクルを行い、各サイクルは、反応混合液に対する９８℃（３０秒、変性）、６３℃（３０秒、アニーリング）、及び７２℃（３０秒、伸長）の連続的な温度処理を含む。プラスミド及びＤＮＡ断片をQiagen DNA purification kits (Qiagen, Germany)により精製した。精製され、増幅されて得られたＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼNdeI及びHindIII (New England Biolabs, USA)を用いて切断し、アルカリホスファターゼ(Roche, Germany)で脱リン酸化し、T4 DNA-ligase(Fermentas, Germany)を用いてpET26b(t)にライゲーションし、製造者の説明書に従ってE. coli BL21-Gold(DE3)に導入した。
【００９４】
遺伝子の配列を5’-GAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAA-3’(SEQID 3)、及び5’-CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT-3’ (SEQ ID 4)のプライマーを用いてＤＮＡシークエンシングにより決定した。ＤＮＡをカスタムサービス(Agowa, Germany)で配列決定した。ＤＮＡ配列の分析及び操作をVectorNTi Suite 10 (Invitrogen, USA)を用いて行った。タンパク質の配列を、ClustalW program (Swiss EMBnet node server)を用いて整列させた。単離された遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankデータベースにおいて、アクセス番号HQ147786 (Thc_cut2)で登録されている。
【００９５】
新鮮な形質転換されたE. coli BL21-Gold(DE3)細胞を４０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含む２０ｍＬのＬＢ培地に播種し、１６０ｒｐｍ、３７℃で一晩中培養した。一晩培養した培養液を４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２００ｍＬのＬＢ培地に、ＯＤ６００＝０．１となるように播種し、ＯＤ６００＝０．６〜０．８に達するまでインキュベートした。その後、その培養液を２０℃に冷却し、最終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導は１６０ｒｐｍ、２０℃で２０時間行った。細胞を遠心分離（２０分、４℃、３２００ｇ）により回収した。
【００９６】
２００ｍＬの細胞培養液からの細胞ペレットを、３０ｍＬの結合バッファー（20 mM NaH2PO4*2H2O, 500mM NaCl, 10mM imidazole, pH 7.4）に再懸濁した。再懸濁細胞に対して、氷冷下で３０−ｓパルスで３回の超音波処理を行った(Vibra Cell, Sonics Materials, Meryin/ Satigny, Switzerland)。ライセートを遠心分離（３０分、４℃、４０００ｇ）し、０．２μｍの膜を用いて濾過した。細胞ライセートをHisTrap FF カラム(溶出バッファー 20 mM NaH2PO4*2H2O, 500 mM NaCl, 500 mM イミダゾール, pH 7.4)を用いたAkta精製システムを用いて精製した。クチナーゼの特徴付けのために、HisTag溶出バッファーをPD-10 脱塩カラム (GE Healthcare)の使用により、100 mM Tris HCl pH7.0と交換した。
【００９７】
タンパク質濃度をBio-Rad proteinassay kit (Bio-Rad Laboratories GmbH)により測定し、ウシ胎児血清アルブミンをタンパク質のスタンダードとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをLaemmli (Laemmli, U. K. Nature 1970, 227 (5259), 680-685)に従って行い、タンパク質をCoomassie Brillant Blue R-250で染色した。
【００９８】
全ての化学物質は、Sigma (Germany)からの分析グレードのものである。
【００９９】
（加水分解反応）
プラスチック製品の加水分解を以下のように行った。各サンプルにおいて、１０ｍｇのプラスチック製品を、1 mLのK2HPO4/KH2PO4 100 mM, pH 7.0のバッファーを溶媒とする５μＭクチナーゼと、Thermomixer Comfort (Eppendorf)を用いた５０℃、３００ｒｐｍの撹拌条件で、６〜７２時間インキュベートした。全ての試験をトリプリケートで行った。
【０１００】
コントロールとしては、ｉ）酵素を含まないバッファーに含まれたプラスチック製品、ｉｉ）プラスチック製品を含まないバッファーに含まれた酵素を用いた。
【０１０１】
（テレフタル酸（ＴＡ）アッセイ）
酵素処理後、氷上において、タンパク質を１：１（ｖ／ｖ）無水メタノール(Merck)を用いて沈殿させた。サンプルを１６０００ｇ、０℃で１５分間遠心処理した（HettichMIKRO 200 R, Tuttlingen, Germany）。測定用の上清を、ＨＰＬＣバイアルに移し、3.5μLの6N HClを添加することにより酸性化した。用いたＨＰＬＣは、ASI-100 自動サンプルインジェクタ及びPDA-100フォトダイオードアレイ検出器を含むDIONEX P-580 PUMP (Dionex Cooperation, Sunnyvale, USA)である。ＴＡの分析のために、逆相カラムRP-C18 (Discovery HS-C18, 5 μm, 150 x 4.6 mmのプレカラム付き, Supelco, Bellefonte, USA)を用いた。溶出液として６０％の水、１０％の0.01N H2SO4、及び３０％のメタノールを用い、段階的に（１５分）５０％のメタノール及び１０％の酸とし、段階的に（２０分）９０％メタノール及び酸を用い、２分間維持した後、ラン後の５分間、段階的に開始点にした。流速を１ｍＬ／ｍｉｎに設定し、カラムの温度を２５℃に維持した。注入体積は１０μＬにした。２４１ｎｍの波長でフォトダイオードアレイ検出器を用いてＴＡの検出を行った。定量化は、サンプルと同様の方法で調製され、種々の濃度(1, 5, 10, 50, 100, 250 μM)に、バッファー：ＭｅｔＯＨが１：１の溶液で希釈されたテレフタル酸(Merck code: 800762)を用いた。
【０１０２】
（結果）
本実施例では、ポリマーと添加剤とを含むプラスチック製品が本発明のプロセスを用いてリサイクル可能であることを示す。さらに、モノマーの回収を改善するために、プラスチック製品の機械的な前処理は、プラスチック製品と酵素との接触面を増大するのに有利となる。
【０１０３】
より具体的に、ＰＥＴフィルムは、ＴＡを得るためにクチナーゼにより７２時間加水分解された。より長い時間の反応は、より多くのＴＡを産生する（図２）。
【０１０４】
ＰＴＴはクチナーゼにより加水分解され、２４時間で４．０８７±０．１２２μＭのＴＡが得られた。
【０１０５】
１ｍｍの粒径を有する粉末の形態で、ＰＥＴボトルをクチナーゼにより加水分解すると、２４時間で７．３０１±０．１６２μＭのＴＡが得られた。従って、本発明のプロセスは、廃プラスチックに見られる一つとしての添加剤を含むＰＥＴ製品に適用できる。
【０１０６】
異なる粒径のＰＥＴボトル粉末を、ＴＡを得るためにクチナーゼにより２４時間加水分解した。機械的粉砕による粒径の低減は、より多くのＴＡを産生するための酵素効率を改善し、１ｍｍの粒径では７．３０１±０．１６２μＭのＴＡが得られ、２５０μＭの粒径では１５．２９６±１．０１２μＭのＴＡが得られた（図３）。
【０１０７】
Ｃ］酵素を用いたポリアミドのリサイクル
ポリアミドを含むプラスチック製品は、本発明のプロセスによりリサイクル可能である。本実施例は、組換え型Escherichia coliにより発現されたポリアミダーゼを用いて、ＰＡで構成されるプラスチック製品を処理することによるアジピン酸の回収することを示す。
【０１０８】
（プラスチック製品及び前処理）
市販のポリアミド織物を、Rhodia(Switzerland)から購入し（PA6,6, 63g/m2）、３ｃｍ×３ｃｍの片に切断した。それに対して、表面仕上を除去するために、５ｍＭのNa2HPO4,2H2Oで３０分間洗浄した
（ポリアミダーゼの産生）
Nocardia farcinica IFM10152 (NCBIアクセス番号 NC 006361)由来のポリアミダーゼをコードする遺伝子は、Escherichia coli (GeneArt AG, Germany)において発現するのに最適化されたコドンを有し、タンパク質のＣ末端において６×HisTagを導入させるヌクレオチド配列を融合させた。その遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼNdeI及びHindIII (New England Biolabs, USA)で切断し、アルカリホスファターゼ（Roche, Germany）を用いて切断し、精製し、T4 DNA-ligase(Fermentas, Germany)を用いてpET26b(+) (Novagen, Merck KGaA,Germany)にライゲーションし、製造者の説明書に従って、E. coli BL21-Gold(DE3)に導入した。プラスミドＤＮＡの調製のために、Qiagen (Germany)のPlasmid Mini Kit を用いた。新鮮な形質転換された細胞を、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２０ｍＬのＬＢ培地に播種した。その培養液を回転式振とう器において１６０ｒｐｍ、３０℃で一晩中培養した。その後、一晩培養した１ｍＬの培養液を、２００ｍＬの同一の液体培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移し、光学密度（６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達するまで３０℃でインキュベートした。その培養液を２０℃に冷却し、最終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導培養は１６０ｒｐｍ、２０℃で一晩中行った。細胞を遠心分離（２０分、４℃、３２００ｇ）により回収した。
【０１０９】
タンパク質の溶出のために１００ｍＭのイミダゾールを用いることを除いて、製造者のプロトコール(IBA GmbH, Germany)に従ってNi-NTA Sepharoseを用いた重力流クロマトグラフィーにより精製を行った。ポリアミダーゼの特徴付けのために、HisTag溶出バッファーを、PD-10 脱塩カラム(Amersham Biosciences)の使用により、100 mM Tris HClpH 7.0と交換した。
【０１１０】
タンパク質濃度を、Interchim (France)からのUptima BC Assay protein quantification kitにより測定し、タンパク質スタンダードとしてウシ胎児アルブミンを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをLaemmli (Laemmli, U. K. Nature 1970, 227 (5259), 680-685)に従って行い、タンパク質をCoomassie Brillant Blue R-250で染色した。
【０１１１】
（加水分解反応）
ポリアミド織物を、２ｍｇ／ｍＬのポリアミダーゼを含む１００ｍＬのクエン酸リン酸塩バッファー(25 mM, pH 5.0)にインキュベートした。加水分解後、その織物を炭酸ナトリウム(9.4mM, pH 9.5)で洗浄し、吸着タンパク質を除去するために蒸留水で４回リンスした。全てのステップを３０℃で３０分間行った。最後のステップの後、織物を室温で一晩中乾燥した。
【０１１２】
コントロールとしては、ｉ）酵素を含まないバッファーに含まれたプラスチック製品、ｉｉ）プラスチック製品を含まないバッファーに含まれた酵素を用いた。
【０１１３】
（アジピン酸アッセイ）
酵素処理の後、タンパク質を、カレス沈殿を用いて沈殿させた。従って、サンプルのｐＨは４〜６の間である。2%の溶液C1 (0.252 M  K4[Fe(CN)6],3 H2O)を、サンプルに加え、ボルテックスをした後、１分間インキュベートし、２％の溶液C2 (1 mM ZnSO4,7 H2O)を加えた。ボルテックスをし、５分間インキュベートした後、サンプルを遠心処理した(30分, 16000g, 25°C)。上清を０．４５μｍのフィルタ膜に通して濾過して、ＨＰＬＣ分析(Hewlett Packard Series 1100, Refractive Index Detector: AgilentSeries 1100)のためのガラスバイアルに入れた。カラムION-300 (Transgenomic,Inc.)を用い、流速を0.1 mL/minに設定し、0.01NH2SO4を液相として用いた。温度を４５℃に設定し、注入体積を４０μＬとした。検出を２２０ｎｍの波長で行った。校正はアジピン酸標準溶液を用いて行った。
【０１１４】
（結果）
ＰＡをポリアミダーゼにより加水分解し、４８時間で９．４μＭのアジピン酸が得られた。
【０１１５】
Ｄ］組換え型微生物を用いた脂肪族ポリエステルのリサイクル
ＰＬＡ等の脂肪族ポリエステルを含むプラスチック製品は、実施例Ａで示すような酵素、並びにデポリメラーゼを発現及び排出し、得られるモノマーの消費を抑制する変更された代謝を有する組換え型微生物を用いる本発明のプロセスによりリサイクル可能である。変更された代謝は、遺伝子欠失、遺伝子破壊又はノックアウトのいずれかにより得られる。本実施例では、Lactococcus lactis又はEscherichia coliの組換え株を用いて、半結晶性ＰＬＡで構成されるプラスチック製品を処理することによる乳酸の回収を示す。実施例で示される菌株の変異は、他の微生物でも行われ得る。
【０１１６】
（プラスチック製品及び前処理）
ＰＬＬＡペレットをNaturePlast (PLLA001)から購入し、ユニバーサルミルCondux CUM 100を用いて５００μｍよりも小さい粒径の粉末に粉砕した。
【０１１７】
プラスチック製品におけるポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）及び結晶度を測定するために、約８ｍｇのサンプルにおいて、アルミニウム製パンで、５０℃〜３００℃で１０℃／ｍｉｎの走査速度、窒素雰囲気下（５０ｍＬ／ｍｉｎ）でQ 100 TA - RCS 90装置を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験を行った。
【０１１８】
ＰＬＬＡ粉末は５９℃のＴｇを有し、１４．９％の結晶度を有する半結晶性であった。その質量的特徴は、Mw 71000 g/mol及びMn 45000 g/molがＳＥＣにより測定された。
【０１１９】
（L. lactis構築）
L. lactis MG1363の野生型菌株に対して、「Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor, NY.」に記載された従来法に従って、Amycolatopsis sp. K104-1由来のＰＬＡデポリメラーゼをコードするｐｌｄ遺伝子 (SEQ ID 5); (Nakamura et al. 2001 - Appl. Environ. Microbiol.67:345-353)を用いて、組換えを行った。従って、pNZ8048プラスミド(Kuipers et al. 1998 - J.Biotechnol. 64:15-21)で相同組換えを行った。ｐｌｄ遺伝子を含む組換えプラスミドを「pNZ-pld」と呼ぶ。「Ho et al. 1995 - Transformationof Lactococcus by electroporation - Methods Mol. Biol. 47:195-199」に記載の従来法に従って、エレクトロポレーションによりL. lactisにpNZ-pldプラスミドを導入した。組換えL. lactis株をMG1363-pNZ-pldと呼ぶ。陰性コントロールとして、空プラスミドpNZ8048で形質転換されたL. lactis MG1363株を用いた。
【０１２０】
（E. coli構築）
E. coli K12-MG1655は、３つのラクターゼデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨｓ）を含む。１つのＬＤＨは、Ｄ−乳酸異性体に特異的である。もう１つのＬＤＨは、嫌気性条件下でピルビン酸を乳酸に変換する。最後のＬＤＨは、Ｌ−乳酸異性体に特異的であり、この基質で増殖できる(Haugaard, N. (1959) D- and L-lactic acid oxidases of Escherichiacoli. Biochim Biophys Acta 31, 66-77; Kline, E. 5. & Mahler, E. R. (1965).The lactic acid dehydrogenases of Escherichia coli. Ann N Y Acad Sci119,905-917)。リサイクルプロセスにおいて、この最後のＬＤＨの発現は、乳酸が消費されずに乳酸を回収するために抑制されなければならない。
【０１２１】
E. coliにおいてＬＤＨをコードするlldD遺伝子(SEQ ID 6)の破壊は、乳酸の消費を抑制させる。lldD遺伝子を破壊するために、lldD遺伝子の配列と相同な配列及びａｍｐ遺伝子と相同な配列を有するプライマーDlldD-F (SEQ ID 7)及び DlldD-R (SEQ ID 8)を用いて、Datsenko and Wanner (2000)に記載されるように、pKD4プラスミドからのアンピシリン（Ａｍｐ）耐性ａｍｐ遺伝子を、相同組換えによりlldD遺伝子の配列に挿入した。その後、Ａｍｐ耐性形質変換体を選択し、変異座の染色体構造を、lldD遺伝子(SEQ ID 9及びSEQID 10)の上流及び下流配列と相同な適切なプライマーを用いたＰＣＲ分析、並びにＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１２２】
その後、E. coliを、「Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor, NY.」に記載された従来法に従って、Amycolatopsis sp. K104-1 (SEQ ID 5; Nakamura et al. 2001 - Appl.Environ. Microbiol. 67:345-353)由来のＰＬＡデポリメラーゼをコードするｐｌｄ遺伝子を用いて組み換えた。従って、pNZ8048プラスミド(Kuipers et al. 1998 -J.Biotechnol. 64:15-21)で相同組換えを行った。ｐｌｄ遺伝子を含む組換えプラスミドを「pNZ-pld」と呼ぶ。lldDが破壊されたE. coliをpNZ-pldプラスミドにより形質転換した。その組換え型の破壊されたE. coliをK12DlldD-pNZ-pldと呼ぶ。陰性コントロールとして、空プラスミドpNZ8048で形質転換されたE. coli株を用いた。
【０１２３】
（加水分解反応）
L. lactis MG1363-pNZ-pld及びMG1363-pNZの２株、並びにE. coli K12DlldD-pNZ-pld及びK12DlldD-pNZ8048の２株を、２Ｌのバイオリアクターにおいて、Ｒ２培地を用いて３０℃で培養した。各培養液を２つのサブカルチャーに分け、ロット１はＰＬＬＡを含有させず、ロット２には0.1% (m/v) PLLAを含有させた。
【０１２４】
（乳酸アッセイ）
２ｍＬの各反応培地を、２日間の培養後にサンプルとした。サンプルを１６０００ｇ、０℃で３分間遠心処理した。分析のための上清を０．４５μｍフィルタで濾過し、２０μＬをＨＰＬＣに導入した。ＨＰＬＣには、Ultimate-3000 (Dionex, Thermo Scientific)を用い、オートサンプラーの恒温装置を１０℃にし、カラム部分の恒温装置を５０℃にした。ＬＡの分析のために、Aminex H+ HPX-87Hカラムを用いた。溶出液として5 mM H2SO4を用いて分析を行った。流速を0.5 mL/minに設定し、カラムの温度を５０℃に維持した。可変波長検出器を用いて、２２０ｎｍでＬＡの検出を行った。ｐＨ８の２０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌに溶解されたSigma (L-1750)からのＬ−乳酸を用いて、０〜３００ｍＭの濃度範囲で調製されたスタンダードを考慮して、定量化を可能とした。
【０１２５】
（結果）
ＰＬＡデポリメラーゼを発現する組換え型L.lactis MG1363-pNZ-pld及び組換え型破壊E. coli株K12DlldD-pNZ-pldのみがＰＬＡから乳酸を産生した。乳酸デヒドロゲナーゼを破壊することで、菌株により消費されることなく乳酸を回収可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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