(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−エチル−Ｎ−（４−フルオロフェニル）ビグアナイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、免疫疾患において制御性Ｔ細胞の活性を促進または増強し、病原性Ｔｈ１７細胞の活性を低減または抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｎ−エチル−Ｎ−（４−フルオロフェニル）ビグアナイドまたはその薬学的に許容される塩が、さらに炎症性サイトカインの産生を低減または抑制し、自己抗体の産生を抑制し、破骨細胞への分化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−９またはＳＴＡＴ−３であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記自己抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａであることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の濃度で前記Ｎ−エチル−Ｎ−（４−フルオロフェニル）ビグアナイドまたはその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記免疫疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、リウマチ性関節炎、ベーチェット病、多発性筋炎または皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、アトピー性皮膚炎、喘息、原発性肝硬変、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群、ループス、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、インスリン依存性糖尿病、栄養障害型表皮水疱症、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、類肉腫症、強皮症、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑症、粘液水腫、悪性貧血、ミトコンドリア関連疾患および潰瘍性大腸炎から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記移植拒絶疾患が、移植片対宿主病であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
免疫疾患において制御性Ｔ細胞の活性を促進または増強し、病原性Ｔｈ１７細胞の活性を低減または抑制するための医薬の製造のためのＮ−エチル−Ｎ−（４−フルオロフェニル）ビグアナイドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫疾患に対して優れた治療効果および予防効果を有する新規化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫疾患は、哺乳動物の免疫システムの構成要素が、哺乳動物の病態の原因となる疾患、哺乳動物の病態を媒介する疾患、または哺乳動物の病態に寄与する疾患である。特に、炎症性疾患は、健康問題の１つとして世界的に最も重要視されている。一般に、炎症は、宿主に侵入した外来物質や有害刺激に対する体組織の局所的な防御反応である。炎症の原因としては、細菌性感染症、ウイルス性感染症、または寄生虫感染症などの感染症；火傷または放射線照射などの物理的要因；毒素、薬物または産業的薬剤などの化学物質；アレルギー反応および自己免疫応答などの免疫応答；または酸化ストレスに関連する状態が挙げられる。
【０００３】
炎症は、疼痛、発赤、腫脹および発熱を特徴とし、最終的には感染部位の機能の損失を引き起こす。これらの症状は、免疫システムに関与する細胞間の一連の複雑な相互作用によって引き起こされる。細胞間の反応によって、様々な炎症性メディエーター群による相互作用ネットワークが形成される。炎症性メディエーター群としては、タンパク質（例えば、サイトカイン、酵素（例えば、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ））、主要塩基性タンパク質（major basic protein）、接着分子（ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ）、脂質メディエーター（例えば、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ））、活性酸素種（例えば、ヒドロペルオキシド、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、一酸化窒素（ＮＯ）など）が挙げられる。しかし、これらの炎症性メディエーターのほとんどは、正常細胞の活性を制御するレギュレーターとしても機能し、したがって、炎症反応に問題が起こった場合、宿主は損傷（すなわち感染症）を制御することができなくなる。慢性炎症は、様々な炎症性メディエーターの過剰な産生によって媒介される炎症性疾患である。
【０００４】
免疫疾患の１つである自己免疫疾患は、免疫システムの自発的な反応によって自己臓器が攻撃を受けることを特徴とする。この反応は、Ｔリンパ球による自己抗原の認識によって起こり、体液性免疫応答（自己抗原の産生）および細胞媒介性免疫応答（リンパ球やマクロファージの細胞傷害活性の増強）を誘導する。自己免疫疾患としては、リウマチ性疾患、乾癬、全身性皮膚筋炎、多発性硬化症、ループスエリテマトーデス、および抗原に対する免疫応答異常（すなわち、喘息、薬物アレルギーまたは食物アレルギーなど）が挙げられる。これらの疾患はいずれも、慢性拘束性疾患であり、場合によっては死に至る。しかし、このような疾患の効果的な治療法はいまだ存在しない。したがって、前記疾患の悪化を軽減または緩和できる薬物、医薬品または薬剤は、患者の健康を得る上で重要な手段になると期待される。
【０００５】
自己免疫疾患を治療するための適切な薬物や治療方法を見出すため、様々な研究が行われた。現在の自己免疫疾患の治療法の多くは、グルココルチコイド、カルシニューリン阻害剤、増殖抑制薬および代謝拮抗薬などの免疫抑制剤の使用に基づいている。しかし、これらの薬理学的治療法は、様々な標的に対して作用するため、全身の免疫機能を低下させる恐れがある。また、このような薬理学的治療法を長期間にわたって実施すると、細胞傷害性によって様々な問題が起こり、免疫システムが非特異的に抑制され、患者が感染症やがんに侵される危険性が増す恐れがある。カルシニューリン阻害剤およびグルココルチコイドは、腎毒性および糖尿病誘発性を有することから、別の問題を引き起こすことがあり、このような薬物は、特定の臨床症状（腎機能不全、糖尿病など）が見られる場合には限定的にしか使用できない。
【０００６】
したがって、副作用がなく優れた治療効果を発揮する、自己免疫疾患および炎症性疾患などの免疫疾患を治療するための新規治療剤の開発が必要とされている。
【０００７】
本発明者らは、副作用が少なく、免疫疾患を効果的に予防または治療することが可能な薬剤を見出すために研究を行い、その結果、新しく合成された化合物によって免疫疾患を効果的に治療することができることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、新規化合物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記新規化合物を有効成分として含む、免疫疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、前記新規化合物を有効成分として含む免疫調節剤を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、未分化Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化およびＴｈ１７細胞の活性を低減する方法であって、インビトロにおいて未分化Ｔ細胞を前記新規化合物で処理することを含む方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、未分化Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化およびＴｒｅｇ細胞の活性を増強する方法であって、インビトロにおいて未分化Ｔ細胞を前記新規化合物で処理することを含む方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の前述した目的を達成するため、本発明は新規のビグアナイド誘導体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記新規化合物を有効成分として含む、免疫疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
一実施形態において、前記化合物は、炎症性サイトカインの産生を低減または抑制し、自己抗体の産生を抑制し、および破骨細胞への分化を抑制することができる。
【００１６】
一実施形態において、前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−９、ＳＴＡＴ−３のいずれであってもよい。
【００１７】
一実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａのいずれであってもよい。
【００１８】
一実施形態において、前記化合物は、制御性Ｔ細胞の活性を促進または増強し、病原性Ｔｈ１７細胞の活性を低減または抑制することができる。
【００１９】
一実施形態において、前記組成物は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で前記化合物を含んでいてもよい。
【００２０】
一実施形態において、前記免疫疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶疾患からなる群から選択されてもよい。
【００２１】
一実施形態において、前記免疫疾患は、リウマチ性関節炎、ベーチェット病、多発性筋炎または皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、アトピー性皮膚炎、喘息、原発性肝硬変、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群、ループス、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、インスリン依存性糖尿病、栄養障害型表皮水疱症、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、類肉腫症、強皮症、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑症、粘液水腫、悪性貧血、ミトコンドリア関連疾患および潰瘍性大腸炎から選択されてもよい。
【００２２】
一実施形態において、前記移植拒絶疾患は、移植片対宿主病であってもよい。
【００２３】
また、本発明は、前記新規化合物を有効成分として含む免疫調節剤を提供する。
【００２４】
また、本発明は、未分化Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化およびＴｈ１７細胞の活性を低減する方法であって、インビトロにおいて未分化Ｔ細胞を前記新規化合物で処理することを含む方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、未分化Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化およびＴｒｅｇ細胞の活性を増強する方法であって、インビトロにおいて未分化Ｔ細胞を前記新規化合物で処理することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、免疫疾患を効果的に予防および治療することができる新規化合物およびその使用に関する。本発明の新規化合物は、炎症性サイトカインの産生を抑制する効果、免疫制御機能を有する制御性Ｔ細胞の活性を増強する効果、自己抗体の産生を抑制して過剰な免疫応答を調節する効果、破骨細胞への分化を抑制する効果を有し、これらの効果を有することから、様々な免疫応答の異常調節によって引き起こされる免疫疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植拒絶疾患などを治療するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。さらに、化合物ＳＤ−２８１による処理によって、破骨細胞への分化が調節されるかどうかを観察した。
【図２】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、ならびに過剰に活性化されたＴｈ１７の抑制を分析した結果を示す。また、化合物ＳＤ−２８１による処理を行い、マウスの骨髄（ＢＭ）細胞から破骨細胞への分化に対するＳＤ−２８１の抑制能を分析した結果を示す。
【図３】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図４】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、ならびに破骨細胞への分化の抑制を分析した結果を示す。
【図５】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図６】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進を分析した結果を示す。
【図７】ヒト末梢血由来のリンパ球を所定濃度の化合物ＳＤ−２８１で処理し、細胞傷害性および炎症性サイトカインの産生を分析した結果を示す。
【図８】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図９】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、破骨細胞への分化の抑制、ならびに過剰に活性化されたＴｈ１７の抑制を分析した結果を示す。
【図１０】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図１１】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、ならびに破骨細胞への分化の抑制を分析した結果を示す。
【図１２】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図１３】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進を分析した結果を示す。
【図１４】ヒト末梢血由来のリンパ球を所定濃度の化合物ＳＤ−２８２で処理し、細胞傷害性および炎症性サイトカインの産生を分析した結果を示す。
【図１５】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図１６】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、破骨細胞への分化の抑制、ならびに過剰に活性化されたＴｈ１７の抑制を分析した結果を示す。
【図１７】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図１８】リウマチ性関節炎が誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進、ならびに破骨細胞への分化の抑制を分析した結果を示す。
【図１９】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、細胞傷害性、自己抗体の産生、炎症性サイトカインの産生、および炎症性遺伝子の発現を分析した結果を示す。
【図２０】ループスが誘発されたマウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、Ｔｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進を分析した結果を示す。
【図２１】ヒト末梢血由来のリンパ球を所定濃度の化合物ＳＤ−２８３で処理し、細胞傷害性および炎症性サイトカインの産生を分析した結果を示す。
【図２２】正常マウス由来の脾細胞を所定濃度の化合物ＳＤ−２８４で処理し、細胞傷害性、炎症性サイトカインの産生、およびＴｈ１７の抑制およびＴｒｅｇ活性の促進を分析した結果を示す。
【図２３】ヒト末梢血由来のリンパ球を所定濃度の化合物ＳＤ−２８４で処理し、細胞傷害性および炎症性サイトカインの産生を分析した結果を示す。
【図２４】炎症性サイトカインの産生、すなわち、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７の産生に対する本発明の新規化合物の抑制活性を分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、免疫疾患を効果的に予防または治療するための新規治療剤として使用することができる新規化合物を初めて同定したことを特徴とする。
【００２９】
したがって、本発明は、下記化学式：
【化１】
0006462002.tif 000002
（式中、Ｘは、１つ以上のＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＨであり；Ｒは、水素またはアルキル基である）
で表される新規化合物またはその薬学的に許容される塩を提供することができる。
【００３０】
好ましくは、前記化学式で表される前記化合物は、以下の表に示す２４種の化合物から選択される任意の１種の化合物であってもよい。
【表１−１】
0006462002.tif 000003
【表１−２】
0006462002.tif 000004
【表１−３】
0006462002.tif 000005
【００３１】
本発明者らは、本発明により合成された新規化合物が免疫疾患を治療することができるかどうかを確認するために実験を行なった。本発明の実施形態によれば、本発明の化合物はいずれも、炎症性サイトカインの産生を低減または抑制し、自己抗体の産生を抑制し、破骨細胞への分化を抑制する。前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−９、ＳＴＡＴ−３のいずれであってもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明において、前記化合物は、自己抗体の産生、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの産生を抑制することによって、過剰な免疫応答を抑制する調節活性を示すことが見出された。
【００３３】
また、本発明の化合物は、制御性Ｔ細胞の活性を促進または増強する活性および病原性Ｔｈ１７細胞の活性を低減または抑制する活性を有することが見出された。
【００３４】
したがって、このような結果から、本発明に従って合成された新規化合物は、免疫疾患を効果的に治療するための新規治療剤として使用できることが確認された。
【００３５】
Ｔ細胞は、様々な病原体に対する生体防御システムとしての免疫システムにおいて中心的役割を果たす細胞集団の１つである。Ｔ細胞は人体の胸腺で産生され、特定の特性を有する細胞へと分化する。分化したＴ細胞は、その機能に応じて、１型ヘルパー（Ｔｈ１）細胞と２型ヘルパー（Ｔｈ２）細胞に分類される。Ｔｈ１細胞は細胞媒介性免疫に関与し、Ｔｈ２細胞は体液性免疫に関与する。これらの２つの細胞集団は、自体の過剰な活性化を互いに抑制することによって、免疫システムの均衡を維持している。
【００３６】
したがって、免疫疾患の大部分は、これらの２種の免疫細胞間における不均衡に起因すると見ることができる。例えば、Ｔｈ１細胞活性の異常な増強は自己免疫疾患を引き起こすが、Ｔｈ２細胞活性の異常な増強は過敏症関連免疫疾患を引き起こすことが知られている。
【００３７】
一方、Ｔｈ１細胞への分化に関する最近の研究によれば、新しい集団、すなわち、Ｔｈ１細胞の活性を調節する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在が見出されており、これに伴って、Ｔｒｅｇを用いた免疫疾患の治療に関する研究が実施され始めている。Ｔｒｅｇ細胞は、異常に活性化された免疫細胞の機能を抑制して炎症反応を調節するという特性を有するため、Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強することによって免疫疾患を治療することを目的とした様々な研究が報告されている。
【００３８】
Ｔｒｅｇ細胞に加えて、分化過程においてＴｈ１７細胞が別のグループとして形成される。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇ細胞と類似した分化プロセスによって、未分化Ｔ細胞からの分化過程において形成されることが知られている。すなわち、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞への分化はいずれもＴＧＦ−βの存在下で行われる。しかし、Ｔｒｅｇ細胞への分化にはＩＬ−６は必要とされないが、Ｔｈ１７細胞への分化はＴＧＦ−βおよびＩＬ−６の両方の存在下で行われる。分化したＴｈ１７細胞はＩＬ−１７の分泌を特徴とする。
【００３９】
Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇ細胞とは異なり、免疫疾患に見られる炎症反応の最前線に関与して、炎症反応のシグナルを最大化させ、その結果、免疫疾患の進行を加速させることが明らかとなっている。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の制御を受けない自己免疫疾患の場合、Ｔｈ１７細胞活性の抑制を標的とする自己免疫疾患の治療剤の開発が大いに注目を集めている。
【００４０】
現在使用されている免疫疾患の治療剤として、Ｔ細胞のシグナル伝達経路を遮断する免疫抑制剤が最も広く用いられているが、このような免疫抑制剤は副作用の問題があり、例えば、毒性、感染症、リンパ腫、糖尿病、振戦、頭痛、下痢、高血圧、吐き気、腎不全などを引き起こすことがある。
【００４１】
Ｔ細胞の活性化の抑制による免疫疾患の治療方法に加えて、免疫細胞から分泌されるサイトカインの量を制御する治療法および免疫細胞から分泌されるサイトカインを標的とする抗体を用いる治療法が開発中である。しかし、前者の方法は臨床試験を経て患者に適用するまでに長い時間がかかり、抗体を用いる方法は、抗体の製造工程で高いコストが必要となるという問題がある。
【００４２】
これらの点に関して、本発明により提供される前記新規化合物は、炎症性サイトカインの産生の抑制、Ｔｈ１７細胞の抑制、およびＴｒｅｇ細胞の活性化を同時に行うことができるという機能を有し、従来の治療剤よりも効果的に免疫疾患を治療することができると期待される。
【００４３】
さらに、本発明の実施形態の結果によれば、本発明の化合物がＳＴＡＴ３遺伝子の発現に対しても抑制活性を有することが確認された。近年、様々な癌腫において、活性化形態のＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５が発見されている。このうち、ＳＴＡＴ３は、乳癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌などの様々な固形腫瘍および白血病などの血液がんで活性化されており、したがって、抗がん剤の標的として用いられている（Hua Yu and Richard Jove, Nature Review Cancer., 2004, 8, 945）。
【００４４】
また、ＳＴＡＴ３の活性化は、アポトーシスを抑制し、血管新生を誘導し、免疫特権を誘導することが知られている（Wang T. et al., Nature Medicine., 2004, 10, 48）。したがって、ＳＴＡＴ３の活性化を抑制することによって、複合的な抗がんメカニズムを介して腫瘍を制御できること、およびＳＴＡＴ３タンパク質が様々な細胞機能および腫瘍に関与していることから、ＳＴＡＴ３の阻害剤は免疫抑制剤として開発することができる。
【００４５】
また、正常状態の免疫システムが、自己抗原に対する特異的な免疫応答を制御するだけではなく、外来抗原に対する免疫応答も抑制する場合もある。このような例としては、妊婦の胎児に対する免疫反応、および慢性感染症における微生物に対する免疫応答が挙げられる。これらの現象は、抗原特異的な免疫寛容を誘導するメカニズムとしての、クローン除去、アネルギー、および免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）による能動的制御により誘導されることが知られている。偶然に免疫寛容を得た数名の患者および実験的に免疫寛容が誘導された動物モデルに関する研究では、上記３つのメカニズムはいずれも、移植における免疫寛容に関与していることが明らかとなった。近年、免疫制御性Ｔリンパ球は、移植における免疫応答だけでなく、例えば、自己免疫応答、腫瘍に対する免疫応答、感染症に対する免疫応答などの生体のほとんど全ての免疫応答の制御に関与する重要な細胞として注目されている。
【００４６】
近年見出された免疫制御性Ｔ細胞［すなわち免疫制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）］は、内在性Ｔｒｅｇ細胞（natural Treg）と誘導性Ｔｒｅｇ細胞（adaptive Treg）に分類することができる。内在性Ｔｒｅｇ細胞、すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、この細胞が胸腺で新しく形成されたときから免疫抑制機能を有し、正常個体の末梢ＣＤ４＋Ｔリンパ球において５〜１０％の頻度で存在する。内在性Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制メカニズムはいまだ明確に同定されていないが、転写因子Ｆｏｘｐ３が、内在性Ｔｒｅｇ細胞の分化および活性において重要な役割を果たしていることが最近見出された。また、末梢において内在性Ｔ細胞が特定の環境下で自己抗原または外来抗原による刺激を受けると、免疫抑制作用を示す細胞へ分化することがあり、この細胞を誘導性Ｔｒｅｇ細胞（adaptive Tregまたはinducible Treg）と呼ぶ。ＩＬ−１０を分泌するＴｒ１細胞ならびにＴＧＦ−βを分泌するＴｈ３細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞などがこれらに含まれる。
【００４７】
分化過程において、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞に加えＴｈ１７細胞にも分化する。Ｔｈ１７細胞への分化は、Ｔｒｅｇ細胞への分化と同様に、ＴＧＦ−βの存在下で起こる。しかし、Ｔｒｅｇ細胞への分化はＩＬ−６を必要としないものの、Ｔｈ１７細胞への分化はＩＬ−６およびＴＧＦ−βの存在下で起こる。分化したＴｈ１７細胞は、ＩＬ−１７の分泌を特徴とする。
【００４８】
さらに、Ｔｈ１７細胞は、炎症反応のシグナルを最大化するという特性を有し、それによって疾患の進行を加速させる細胞傷害性を示す。したがって、Ｔｈ１７細胞への分化の抑制またはＴｈ１７細胞の活性の抑制は、免疫疾患を治療する方法の１つとなる。
【００４９】
また、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３を発現する。Ｆｏｘｐ３は、胸腺に由来する制御性Ｔ細胞に主に存在しており、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表面抗原を有する細胞に存在する転写因子である。Ｆｏｘｐ３発現Ｔ細胞が抗原を認識すると、Ｆｏｘｐ３の作用によって、該抗原に対するＴ細胞の活性が低下する。また、Ｆｏｘｐ３は抑制性Ｔ細胞としての役割を有し、Ｆｏｘｐ３を発現していない胸腺由来の分化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のうち、自己免疫を誘導しうるＴ細胞のＩＬ−２の産生および細胞分裂を抑制する。また、Ｆｏｘｐ３は、ＩＬ−２の転写制御のみならず、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γなどの転写制御をも抑制する機能を有することが明らかにされている。したがって、上述のように作用するＦｏｘｐ３発現Ｔ細胞は、免疫応答を抑制または調節する活性を有することから、免疫疾患の治療に適用されている。また、細胞治療法として適用する試みもあり、これは、自己抗原に特異的なＴ細胞クローンを高濃度のＩＬ−２サイトカインで処理し、次いで抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で同時に処理することによって、ヒトＦｏｘｐ３発現ＣＤ４ Ｔ細胞の数を増加させることによって行われる。
【００５０】
したがって、従来の免疫疾患の治療方法と関連する技術開発の現状を踏まえると、本発明の新規化合物は、従来技術では解決できなかった問題に対して解決策を提供するとともに、従来技術よりも効果的な薬理学的効果を示し、したがって、免疫疾患の治療剤として非常に有用に用いることができる。
【００５１】
それに応じて、免疫疾患を予防または治療するための本発明の医薬組成物は、上記新規化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでいてもよい。好ましくは、前記塩は、薬学的に許容される遊離酸から誘導される酸付加塩であってもよい。遊離酸としては、有機酸を用いてもよく、無機酸を用いてもよい。前記有機酸としては、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。前記無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明による前記化合物は、天然物から単離されたものであってもよく、当技術分野で知られている化学的合成法を用いて製造されたものであってもよい。本発明者らは、後述の実施例に記載の方法に従った合成によって前記化合物を製造した。
【００５３】
本明細書において「免疫疾患」とは、哺乳動物の免疫システムの構成要素が、哺乳動物の病態の原因となる疾患、哺乳動物の病態を媒介する疾患、または哺乳動物の病態に寄与する疾患を意味する。また、「免疫疾患」は、免疫応答を刺激または中断することによって進行が遅延するあらゆる疾患を含んでいてもよく、過敏性免疫応答を引き起こす疾患を含んでもよい。免疫疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
また、最も重要な特性の１つとして、あらゆる正常個体は、非自己抗原を認識し、応答し、除去する能力を有するが、自己抗原物質には有害な応答を示さない。このような無反応状態を、「免疫学的不応答」または「寛容」と呼ぶ。
【００５５】
しかし、自己寛容の誘導または維持において問題が発生すると、自己抗原に対する免疫応答が起こり、それによって自分自身の組織を攻撃するという現象が引き起こされる。このようなプロセスによって起こる疾患を「自己免疫疾患」と呼ぶ。
【００５６】
また、前記の「炎症性疾患」とは、炎症誘導因子や放射線照射などの有害な刺激に起因して免疫システムの過剰な亢進が起こった結果、免疫細胞（例えばマクロファージ）から炎症性物質（炎症性サイトカイン）が分泌され、その炎症性物質によって引き起こされた疾患を意味し、炎症性物質（炎症性サイトカイン）としては、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−６、プロスタグランジン、ロイコトリエン、一酸化窒素（ＮＯ）などが挙げられる。
【００５７】
また、臓器移植を成功させるには、移植される細胞とレシピエントの臓器との間の免疫拒絶を克服する必要がある。Ｔ細胞は移植免疫拒絶の主なメディエーターである。Ｔ細胞受容体は、移植片に発現されている主要組織適合複合体（MHC）を認識して免疫応答を誘導し、移植拒絶反応を引き起こす。主要組織適合複合体は、自体が有する糖タンパク質抗原の種類に依存する。組織適合抗原のミスマッチに起因する免疫応答によって移植の成功が妨げられるため、組織適合抗原検査の正確性および組織適合抗原の一致率の検討は大変重要である。
【００５８】
ヒトは様々な組織適合抗原を有し、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣなどのクラスＩ抗原；およびＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱなどのクラスII抗原を有する。これらの抗原は、Ｔ細胞に抗原性を付与することを生物学的機能とする。クラスＩ抗原は有核細胞の大部分で発現されており、クラスＩ抗原によって付与された抗原は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される。クラスII抗原は、抗原提示細胞として知られている樹状細胞、Ｂリンパ球、活性化されたＴリンパ球、マクロファージなどに発現され、ＣＤ４＋Ｔリンパ球に抗原性を付与する。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞に付与された抗原をＴリンパ球上の受容体に結合することによって該抗原を認識する。移植の過程では、Ｔリンパ球は、自分自身の組織適合抗原よりも他者に由来する組織適合抗原を高頻度に認識する。ドナーまたは患者の全Ｔリンパ球中１％〜１０％のＴリンパ球が、患者またはドナー由来の組織適合抗原を認識し、これに応答して増殖し、一連の免疫応答を引き起こす。これを「アロ反応」と呼ぶ。また、ドナーのＴリンパ球が患者の組織適合抗原に対して引き起こす免疫応答を、「移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）」と呼ぶ。これに対して、患者のＴリンパ球がドナーの組織適合抗原に対して引き起こす免疫応答を、「移植片拒絶反応」と呼ぶ。
【００５９】
したがって、免疫抑制剤は、移植の過程で引き起こされる免疫応答に起因する異常反応を低減するために用いられる。免疫抑制剤は、通常、移植片に対するＴ細胞媒介性免疫応答を抑制する。近年、制御性Ｔ細胞を用いて免疫応答を抑制することによる、移植拒絶疾患の治療法が試みられている。
【００６０】
また、本発明で予防および治療することができる免疫疾患としては、リウマチ性関節炎、ベーチェット病、多発性筋炎または皮膚筋炎、自己免疫性血球減少症、自己免疫性心筋炎、アトピー性皮膚炎、喘息、原発性肝硬変、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性髄膜炎、シェーグレン症候群、ループス、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、インスリン依存性糖尿病、栄養障害型表皮水疱症、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、類肉腫症、強皮症、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑症、粘液水腫、悪性貧血、ミトコンドリア関連疾患および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
したがって、本発明による組成物は、免疫疾患を予防または治療するための医薬組成物として用いることができる。
【００６２】
「治療法」とは、特に明記しない限り、この用語が適用される疾患もしくは障害、もしくは該疾患または該障害の少なくとも１つの症状を回復または緩和すること、またはその進行を抑制または予防することを意味する。本明細書において「治療」とは、「治療法」が上記のように定義された場合、治療する行為を意味する。したがって、哺乳動物における免疫疾患の「治療」または「治療法」とは、
（１）免疫疾患の進展を抑制すること、すなわち、その発展を遮断すること、
（２）免疫疾患の拡散を予防すること、すなわち、その転移を予防すること、
（３）免疫疾患を緩和すること、
（４）免疫疾患の再発を予防すること、および
（５）免疫疾患の症状を軽減すること
の１以上を含んでいてもよい。
【００６３】
免疫疾患を予防または治療するための本発明の組成物は、薬理学的有効量の１つ以上の本発明の新規化合物またはその塩を単独で含んでいてもよく、あるいは薬理学的有効量の１つ以上の本発明の新規化合物またはその塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤とを含んでいてもよい。薬理学的有効量とは、免疫疾患の症状を予防、改善および治療するのに十分な量を意味する。
【００６４】
本発明の新規化合物またはその塩の薬理学的有効量は、免疫疾患の症状の重症度、患者の年齢、体重、健康状態および性別、投与経路および治療期間などに応じて適宜変更してもよい。
【００６５】
「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物をヒトに投与した場合に、胃腸疾患、アレルギー反応またはそれに類似した反応を起こさない生理学的に許容可能な組成物をいう。前記担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、乳糖、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。また、充填剤、抗凝血剤、滑沢剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤および防腐剤をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与した後に、有効成分の迅速放出、持続放出または遅延放出を達成するため、当技術分野で知られている方法を用いて製剤化してもよい。前記製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾル剤、ソフトゼラチンカプセル剤またはハードゼラチンカプセル剤、滅菌注射溶液剤、または滅菌粉末の形態であってもよい。
【００６７】
また、免疫疾患を予防または治療するための本発明の組成物は、経口投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与などの様々な経路を介して投与してもよい。有効成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、および重症度などの様々な要因に応じて適宜選択してもよい。免疫疾患を予防または治療するための本発明の組成物は、免疫疾患の症状を予防、改善または治療する効果を有する他の公知の化合物と組み合わせて投与してもよい。
【００６８】
さらに、本発明は、免疫疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、前記化合物を有効成分として含む組成物の使用を提供する。本発明の化合物を有効成分として含む本発明の組成物は、免疫疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための使用として用いることができる。
【００６９】
さらに、本発明は、免疫疾患を予防または治療する方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００７０】
本明細書において「哺乳動物」は、治療、観察または実験の対象である哺乳動物を指し、好ましくはヒトを指す。
【００７１】
本明細書において「治療有効量」とは、組織系、動物またはヒトにおいて生物学的反応または医学的反応を誘導できる有効成分の量または医薬組成物の量を意味し、この量は、研究者、獣医師、もしくは医師または他の臨床医によって決定される。「治療有効量」は、治療される疾患または障害の症状の軽減をもたらす量を包含する。本発明の有効成分の治療に有効な投与量および投与頻度は、所望の効果によって異なり、当業者であればこれらを容易に理解できる。したがって、最適な投与量は、当業者によって容易に決定されてもよく、疾患の種類、疾患の重症度、本発明の組成物中に含まれる有効成分の量および他の成分の量、剤形の種類、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食餌、投与時間、投与経路および本発明の組成物の投与速度、治療期間、ならびに同時投与される薬物などの様々な要因に応じて調整してもよい。
【００７２】
また、本発明は、本発明の化合物を有効成分として含む免疫調節剤を提供してもよい。
【００７３】
また、本発明は、インビトロにおいて細胞を本発明の化合物で処理することを含む、Ｔｈ１７細胞の活性を低減する方法；およびインビトロで細胞を本発明の化合物で処理することを含む、Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強する方法を提供してもよい。
【００７４】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明する。以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をなんら限定するものではない。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１＞
免疫疾患に対して治療効果を有する本発明の新規化合物の合成
以下の表１の化学式で表される新規化合物を以下の反応式に従って製造した。具体的には、密封可能な反応容器中において、それぞれの化合物に対応するアニリン化合物（１．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル溶媒に溶解させた後、ジシアノジアミド（１．０ｍｍｏｌ）および濃硫酸（１．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密封した後、反応混合物を１７５℃で１時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却して白色固体を得た。溶媒を除去した後、得られた固体をヘキサンおよびイソプロピルアルコールで洗浄して、白色固体の化合物を合成した。
【００７６】
以下の２４種の化合物はいずれも、異なるアニリン化合物を使用したこと以外は同じ条件で合成した。それぞれの化合物の合成で用いたアニリン化合物ならびに合成された化合物の化学名および化学構造を以下の表に示した。
【００７７】
前記化合物を合成するために用いた代表的な反応スキームを以下に示す。
【化２】
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【００７８】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００７９】
上記のように合成された本発明の各誘導体を、１Ｈ−ＮＭＲ分析で同定し、その結果を以下の表に示した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００８０】
＜実験方法＞
＜１＞分析対象細胞
本発明において新しく合成した各化合物によって、免疫疾患を治療および予防することができるかどうかを確認するため、本発明者らは以下の実験群に基づいて以下の実験を行った。
【表４】
0006462002.tif 000013
【００８１】
具体的には、正常マウス群において、正常ＤＢＡ／１Ｊマウス由来の脾細胞は、本発明の化合物で処理する前に、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）による刺激条件下で７２時間培養することによって活性化させた。
【００８２】
リウマチ性関節炎誘発マウスは、ＤＢＡ／１Ｊ正常マウスを用いて作製した。II型コラーゲン（ＣII）の０．１Ｎ酢酸水溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を透析緩衝液（５０ｍＭトリス、０．２Ｎ ＮａＣｌ）に対して透析した後、結核菌（M.tuberculosis）を含有する同量のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ、Chondrex）と混合した。得られた免疫原を、マウス一匹当たり１００μｌ（すなわち１００μｌ／１００μｇ）の用量で正常マウスの尾の付け根に皮下注射した（一次注射）。２週間後、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ、Chondrex）とＣIIとを同量で混合することによって得られた溶液（１００μｌ）を片方の後肢（足蹠）に注射（すなわち１００μｌ／１００μｇ）（二次注射）して、リウマチ性関節炎が誘発されたマウスを作製した。作製したリウマチ性関節炎誘発マウスから得られた脾細胞を抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）による刺激条件下で７２時間培養することによって活性化させた後、実験に用いた。
【００８３】
ループスが誘発されたマウスモデル群として、当技術分野でループスモデルとして用いられるsanroqueマウスを用いた。ヒトＰ.Ｂ群では、ヒト末梢血由来のリンパ球を用いた。マウスおよびヒト末梢血からの脾細胞およびリンパ球の単離は、当技術分野で知られている通常の方法に従って実施した。得られた単離細胞はいずれも、抗ＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍｌ）による刺激条件下で７２時間培養することによって活性化させた後、実験に用いた。
【００８４】
＜２＞細胞傷害性分析（ＭＴＴアッセイ）
本発明において合成された化合物が細胞傷害性を起こすかどうかを評価するため、ＭＴＴアッセイを行った。各細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加え（ウェル当たり２×１０５個）、所定の濃度の本発明の化合物で処理し、７２時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液（０．５％、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）を各細胞に加え、さらに４時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）リーダーを使用して５４０ｎｍで吸光度を測定し、細胞傷害性を測定した。
【００８５】
＜３＞自己抗体の産生による免疫応答に対する調節の分析
本発明の新規化合物が血清中の総ＩｇＧ抗体、総ＩｇＧ１抗体および総ＩｇＧ２ａ抗体の産生に影響を及ぼすかどうかを評価するため、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。すなわち、本発明の化合物で処理した細胞において、総ＩｇＧ量ならびに抗体特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウェルプレートにおいて、それぞれのＩｇＧに対応するモノクローナル抗マウスＩｇＧとＣIIとを室温で１時間反応させた。ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）を加えて、非特異的結合をブロックした。マウス対照血清の２倍段階希釈系列を作製し、基準（スタンダード）として用いた。上記反応混合物に細胞培養の上清を加え、室温で１時間反応させた。次いで、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰおよび抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰと室温で１時間反応させた後、４回洗浄した。得られた反応混合物をＴＭＢシステムで発色させ、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００８６】
＜４＞炎症性サイトカインの産生に対する効果の分析
炎症および免疫疾患の原因物質である炎症性サイトカインの産生に本発明の新規化合物が影響を及ぼすかどうかを評価するため、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−９、およびＳＴＡＴ−３の産生量およびそのｍＲＮＡ発現量を測定した。本発明の化合物で処理して培養した細胞から上清を得た後、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法を用いて分析して、炎症性サイトカインの産生量を測定した。具体的には、各細胞とサイトカイン特異的抗体（抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＭＭＰ−９抗体および抗ＳＴＡＴ−３抗体）とを４℃で一晩反応させた。ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）を加えて、非特異的結合をブロックした。次いで、各抗体に対応するビオチン標識抗体と室温で２時間反応させた後、４回洗浄した。希釈したExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugateを加え、室温で２時間反応させた。反応混合物をＰＮＰＰ／ＤＥＡ溶液で発色させた後、４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００８７】
また、ｍＲＮＡ量を分析するため、各細胞から総ＲＮＡを得た。次いで、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γに特異的に結合するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、炎症性サイトカインの発現量を測定した。
【００８８】
＜５＞Ｔｈ１７細胞に対する抑制活性およびＴｒｅｇ細胞への誘導活性の分析
さらに、本発明者らは、本発明の新規化合物が、炎症に関連するＴｈ１７細胞の分化および活性を抑制するかどうか、ならびに免疫制御機能を有するＴｒｅｇ細胞の活性を促進するかどうかを評価するため、フローサイトメトリー分析を行った。すなわち、Ｔ細胞をＴｈ１７細胞へと分化させる条件またはＴ細胞をＴｒｅｇ細胞へと分化させる条件でＴ細胞を培養し、その後、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の数またはＩＬ−１７＋Ｔｈ１７細胞の数をフローサイトメトリー装置で測定した。
【００８９】
＜６＞破骨細胞への分化に対する抑制効果
破骨細胞への分化に対する本発明の新規化合物の効果を調査するため、ＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）および可溶性ＲＡＮＫＬの存在下において、マウス骨髄細胞を分化誘導した（Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67）。６週齢マウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を調製し、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ：R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）の存在下の８ウェルチャンバースライド（３×１０５個／ウェル；Nalge Nunc International、イリノイ州ネイパービル）において３７℃で維持した。３日後にリンパ球を含む非接着性細胞を除去した後、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ；Strathmann、ドイツ、ハンブルク）の存在下において破骨細胞の接着性前駆細胞をさらに４日間培養して破骨細胞を得た。細胞培養培地は、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で１回交換した。細胞を固定した後、製造者のプロトコルに従って染色キット（Sigma）を用いてＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）染色を行った。各チャンバーを顕微鏡で観察し（４０倍）、３つ以上の核を含有するＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞としてカウントした（Sugatani. et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67）。
【００９０】
また、骨髄細胞を破骨細胞へと分化させ、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で所定濃度の本発明の新規化合物で処理した。４８時間培養後、細胞をＴＲＡＰ染色し、ＴＲＡＰ陽性の多核細胞をカウントした。
【００９１】
＜実験例１＞
本発明の新規化合物の細胞傷害性の分析結果
実施例１で合成した新規化合物が細胞傷害性を起こすかどうかを評価するため、表３に記載した各群の細胞の細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。すなわち、各群の細胞（２×１０５個）を本発明において合成した新規化合物で処理した後、これらの細胞の生存率を分析した。
【００９２】
その結果、化合物ＳＤ−２８１、ＳＤ−２８２、ＳＤ−２８３またはＳＤ−２８４による処理は、対照群またはメトホルミン処理群と比べて細胞傷害性を示さなかった。したがって、これらの化合物は、正常細胞に対しても、疾患が誘発された細胞に対しても細胞傷害性を示さないことが確認された。
【００９３】
＜実験例２＞
自己抗体の産生による免疫応答に対する本発明の新規化合物の調節作用の分析結果
実施例１で合成した新規化合物の、自己抗体の産生による免疫応答に対する効果を調査するため、上記４つの群のマウスの眼窩静脈叢から血液サンプルを採取し、各血清中のＩｇＧ量、ＩｇＧ１量およびＩｇＧ２ａ量を測定した。
【００９４】
その結果、病態における自己抗体の産生状態を反映する免疫グロブリンの量（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２）は、本発明のいずれの化合物についても、処理濃度に依存して低下した。表４に示した化合物は、過剰な免疫応答を抑制する優れた免疫調節活性を有することが確認された。
【表５】
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【００９５】
＜実験例３＞
炎症性サイトカインの産生およびその遺伝子発現量に対する抑制の分析結果
本発明の新規化合物が、炎症および免疫疾患を誘導する炎症性サイトカインの産生を抑制するかどうか、また、遺伝子レベルで炎症性サイトカインを抑制するかどうかを評価するため、上記の＜４＞に記載した炎症性サイトカインの産生に対する効果の分析に従って実験を行った。
【００９６】
その結果、本発明で合成した新規化合物はいずれも、炎症性サイトカイン、すなわち、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−９およびＳＴＡＴ−３の産生ならびにその遺伝子の発現を濃度依存的に抑制した。したがって、この結果から、本発明の新規化合物は、炎症性サイトカインの産生を抑制することによって、免疫疾患を予防および治療できることが分かる。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００９７】
＜実験４＞
Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞における調節活性の分析結果
本発明の新規化合物が、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７を分泌するＴｈ１７細胞への分化およびその活性を調節し、かつ免疫制御機能を有するＴｒｅｇ細胞への分化およびその活性を調節するかどうかを調査するため、上記の＜５＞に記載したＴｈ１７細胞に対する抑制活性およびＴｒｅｇ細胞への誘導活性の分析を行った。
【００９８】
その結果、本発明の新規化合物はいずれも、Ｔｈ１７細胞へと分化させる条件下で、疾患誘発細胞におけるＩＬ−１７の発現とＴｈ１７細胞への分化とをいずれも抑制した。また、本発明の新規化合物はいずれも、Ｔｒｅｇ細胞へと分化させる条件下で、Ｆｏｘｐ３（免疫制御細胞のマーカー）の発現とＦｏｘｐ３発現細胞の数とをいずれも増加させた。また、前記化合物は、過剰に活性化されたＴｈ１７細胞を効果的に抑制することができることが分かった。
【表９】
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【表１０】
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【００９９】
したがって、これらの結果から、本発明の新規化合物は、Ｔｈ１７およびＴｒｅｇを（別個にではなく）同時に調節することによってさらに効果的に免疫調節活性を誘導することができ、このことから、本発明の新規化合物は、免疫調節剤または免疫疾患治療剤としてさらに効率的に使用できることが分かる。
【０１００】
＜実施例５＞
破骨細胞への分化に対する抑制の分析結果
本発明の新規化合物が免疫疾患を効果的に治療することができるかどうかを調査するため、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬで刺激された細胞の破骨細胞への分化に対する本発明の化合物による抑制の程度を、破骨細胞分化因子であるＴＲＡＰの染色によって確認した。
【０１０１】
その結果、本発明の新規化合物はいずれも、破骨細胞の分化マーカーであるＴＲＡＰを発現する細胞の数を低減した。この結果から、本発明の新規化合物は、関節破壊を誘発する破骨細胞への分化能を効果的に低減することができ、このことから、本発明の新規化合物は、破骨細胞への分化による疾患を予防または治療するために使用できることが分かる。
【表１１】
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【０１０２】
＜実施例６＞
マウス脾細胞における炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７の産生に対する抑制効果
さらに、実施例で合成した化合物の炎症性サイトカインに対する抑制効果の有効性を評価するため、ＤＢＡ１／Ｊ正常マウスの脾臓から得た細胞を０．５μｇ／ｍｌの濃度の抗マウスＣＤ３抗体で処理し、次いで２００μＭまたは５００μＭの濃度の各化合物で処理した。炎症性サイトカインであるＩＬ−１７およびＴＮＦ−αの抑制の程度は、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０１０３】
その結果、図２４に示したように、化合物ＳＤ−５６３、ＳＤ−５６４、ＳＤ−５６６、ＳＤ−５６７、ＳＤ−５７３、ＳＤ−５７４、およびＳＤ−５８０は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７およびＴＮＦ−αに対して同時に抑制活性を示し、その抑制活性は濃度依存的に増加する。
【０１０４】
例示的な実施形態を参照して本発明について述べた。当業者であれば、本発明の要旨や本質的な特徴から逸脱することなく、本発明を別の特定の形態で実施してもよいことを理解するであろう。上述した実施形態は、どのような観点からも、例示のみを目的として述べられており、本発明をなんら限定するものではないと見なされる。したがって、本発明の範囲は、上述の記載ではなく、添付の請求項によって定義される。請求項の均等物の意味や範囲における変更は、どのようなものであっても本発明の範囲内に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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