(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβ受容体のエキソドメイン、および
Toll-like  受容体２、またはＴＬＲ４由来のＴＧＦβ受容体以外のエンドドメイン
を含む、キメラなＴＧＦβ受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記エンドドメインが、ＴＬＲ４由来である、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記キメラなＴＧＦβ受容体とは別のポリペプチドとして、キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）、あるいは、Ｔ細胞に対して生来的であるαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、または操作されたＴＣＲであるαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記キメラなＴＧＦβ受容体の発現ならびに前記ＣＡＲおよび／またはαβＴＣＲの発現が１つまたは複数の同じ調節エレメントの制御のもとにある、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記キメラなＴＧＦβ受容体の発現ならびに前記ＣＡＲおよび／またはαβＴＣＲの発現が１つまたは複数の異なる調節エレメントの制御のもとにある、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体Ｒα、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数に結合する標的化ドメインを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
発現構築物または発現ベクターとしてさらに定義される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ベクターが、プラスミドまたはｍＲＮＡである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
キメラなＴＧＦβ受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、
該受容体が
ＴＧＦβ受容体のエキソドメイン、および
ＴＬＲ２、またはＴＬＲ４由来のＴＧＦβ受容体以外のエンドドメイン
を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
前記キメラなＴＧＦβ受容体が、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインおよびＴＬＲ４由来のエンドドメインを含む、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＴＧＦβ受容体のエキソドメイン、および
ＴＬＲ２またはＴＬＲ４由来のエンドドメイン
を含む、キメラなＴＧＦβ受容体。
【請求項１４】
請求項１１または１２記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗原特異的Ｔ細胞、あるいは、前記Ｔ細胞に対して生来的であるαβＴＣＲ、または操作されたＴＣＲであるαβＴＣＲを含むＴ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記抗原特異的Ｔ細胞がさらに、腫瘍特異的Ｔ細胞または病原体特異的Ｔ細胞として定義される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、さらに、キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１５記載の細胞。
【請求項１９】
前記キメラなＴＧＦβ受容体およびＣＡＲが同じポリヌクレオチドから発現する、請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
前記キメラなＴＧＦβ受容体およびＣＡＲが異なるポリヌクレオチドから発現する、請求項１８記載の細胞。
【請求項２１】
前記抗原特異的Ｔ細胞が、腫瘍特異的Ｔ細胞または病原体特異的Ｔ細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲが、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体Ｒα、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原に対して特異的である、請求項１８記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、該細胞のレシピエントに関して自己である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞が該細胞のレシピエントに関して同種である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１５〜２２のいずれか一項記載の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
ガンを個体において処置および／または予防する為の請求項２５記載の薬学的組成物であって、前記ガンは、ＴＧＦβを分泌する細胞を有し、かつ／または、前記ガンは、ＴＧＦβを産生する微小環境を有する、薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ガンが、前立腺ガン、乳ガン、メラノーマ、膵臓ガン、肺ガン、脳ガン、結腸ガン、食道ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮頸部ガン、胆嚢ガン、甲状腺ガン、肛門のガン、子宮内膜のガン、膀胱ガン、下垂体ガン、白血病、リンパ腫、脾臓ガン、結腸ガン、胃ガンまたは骨髄腫である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記細胞が、静脈内、腹腔内、腫瘍内、クモ膜下腔内および／または経直腸的に送達される、請求項２６または２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記細胞が、ＴＧＦβに暴露されることで、細胞の抗腫瘍活性が保護又は強化される、請求項２６〜２８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記薬物が、第二の抗ガン療法を含むか、又は第二の抗ガン療法と共に投与される、請求項２６〜２９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記細胞が、前記個人に対して、同種又は自己である、請求項２６〜３０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項１０又は１１記載のポリペプチド、請求項２５〜３１のいずれか一項記載の薬学的組成物、またはこれらの組み合わせを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮特許出願第６１／８１２，９１７号（２０１３年４月１７日出願；これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）の優先権を主張する。
連邦政府支援による研究開発に関する記載
【０００２】
本発明は、国防総省によって与えられるＷ８１ＸＷＨ−１１−１−０６２５のもとでの政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の実施形態は少なくとも、免疫学、細胞生物学、分子生物学および医療（ガン医療を含む）の分野を包含する。
【背景技術】
【０００４】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）は、免疫応答の調節における重要な役割を、主に免疫系の細胞に対するその抑制機能を介して果たすことが明らかにされている。ＴＧＦβは、アポトーシスの誘導とは対照的に、少なくとも細胞周期割合の低下を介した抗原特異的Ｔ細胞増殖の抑制因子である。具体的には、ＴＧＦβは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に作用して、少なくとも５つの細胞溶解性の遺伝子産物、すなわち、ＣＴＬ媒介の腫瘍細胞毒性のために重要であるパーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、Ｆａｓリガンドおよびインターフェロンガンマの発現を特異的に阻害する（ＴｈｏｍａｓおよびＭａｓｓａｇｕｅ、２００５）。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の実施形態には、ガン治療のための方法および組成物が含まれる。特定の実施形態において、ガンのための細胞療法に関連する方法および組成物がもたらされる。特定の実施形態が、どのようなガンに対してであっても有用である場合があるにもかかわらず、具体的な実施形態において、これらの方法および組成物は、ＴＧＦβを分泌するガン、または、ＴＧＦβを放出する腫瘍微小環境（腫瘍間質を含む）に存在するガンに対して特に効果的である。本明細書中に開示される組成物および方法による処置のために好適である例示的なガンには、前立腺、乳房、メラノーマ、膵臓、肺、脳、結腸、食道、肝臓、腎臓、精巣、卵巣、子宮頸部、胆嚢、甲状腺、肛門、子宮内膜、膀胱、下垂体、白血病、リンパ腫、腹（胃）および脾臓のガンが含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
本開示の様々な局面では、ＴＧＦβを分泌するガンに対して効果的であるようにする１つまたは複数の非生来的分子を発現するように改変される細胞が利用される。前記細胞は具体的な実施形態において養子細胞療法のために利用される場合がある。特定の局面において、前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、抗原特異的Ｔ細胞（腫瘍または病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に特異的なＴ細胞を含む）、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞、および、少なくとも１つのキメラな抗原受容体を含むＴ細胞などである。細胞は、ＴＧＦβの存在下において効果的であるように遺伝子操作される場合があり、加えて、自然界には存在しない他の遺伝子改変を有する場合があり、または有しない場合がある。キメラなＴＧＦβ受容体に加えて、細胞は、他の非生来的な分子を発現する場合がある。特定の実施形態において、非生来的な分子は細胞表面受容体である。前記分子は、例えば、腫瘍細胞表面分子またはαβＴＣＲに対して特異的であるキメラな抗原受容体（ＣＡＲ）である場合がある。ある特定の局面において、細胞は、１つまたは複数のキメラな抗原受容体と、キメラなＴＧＦβ受容体とを用いる場合がある。
【０００７】
本開示の実施形態において、本開示の細胞は、活性化シグナルが可能である別の実体に由来するエンドドメインに連携している細胞表面上のＴＧＦβについての細胞外受容体を用いるキメラなＴＧＦβ受容体を利用することによって、ＴＧＦβからの通常の場合には阻害性のシグナルをＴ細胞のための活性化刺激に転換する。特定の実施形態において、そのようなキメラな受容体により改変されるＴ細胞は、そのようなキメラな受容体を欠く細胞と比較した場合、増大した効力を有する。本開示の具体的な実施形態では、別の分子に由来するエンドドメインに連携させられるＴＧＦβＲＩＩのエキソドメインを発現するキメラなＴＧＦβ受容体が用いられる。具体的な実施形態において、エキソドメインおよびエンドドメインは膜貫通ドメインを介して連携させられ、また、ある特定の場合には、膜貫通ドメインは、選択されたエンドドメインについての自然界に存在する膜貫通ドメインである。ＴＧＦβについての受容体は、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２またはＴＧＦβ受容体３のいずれか１つの一部またはすべてであることが可能であり、具体的な実施形態において、ＴＧＦβについての受容体は当該受容体のＴＧＦβ受容体２イソ型を含む。具体的な実施形態において、エンドドメインは例示的なｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４のエンドドメインを含むが、例えば、他の受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４０、ＣＤ２７またはそれらの組合せ）のエンドドメインが用いられる場合がある。具体的な実施形態において、キメラなサイトカイン受容体は、例えば、ＧＦＰ、ｍＯｒａｎｇｅおよび青色蛍光タンパク質などにより標識される。
【０００８】
本開示のある特定の局面において、キメラなＴＧＦβ受容体を含む細胞はまた、キメラな抗原受容体を含む。キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）はどのような種類のものであってもよく、しかし、具体的な実施形態において、ＣＡＲは、ＴＧＦβ分子もまた分泌するガンを標的とする。例示的なＣＡＲには少なくとも、下記のいずれか１つまたは複数に対して特異的であるＣＡＲが含まれる：例えば、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、ガン胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および／または、腫瘍の細胞外マトリックスの内部に存在する他の例示的な抗原（例えば、フィブロネクチンのガン胎児性変化体、テネイシン、または、腫瘍の壊死性領域）、ならびに、腫瘍のゲノム分析および／または示差的発現研究を介して特定される他の腫瘍関連の抗原または使用可能な変異、あるいは、それらの組合せ。本開示の細胞は２つ以上のＣＡＲを有する場合があり、また、ＣＡＲが、異なる抗原に対して特異的である２つ以上のｓｃＦｖを有する場合がある。
【０００９】
本開示のある特定の局面において、キメラなＴＧＦβ受容体を含む細胞（例えば、キメラなＴＧＦβ受容体を発現する細胞）はまた、抗原特異的な受容体を含む（例えば、抗原特異的な受容体を発現する）。抗原は、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原（ウイルス抗原または細菌抗原を含む）である場合がある。
【００１０】
例示的な腫瘍抗原には、少なくとも下記のものが含まれる：腸ガンについてのガン胎児性抗原（ＣＥＡ）；卵巣ガンについてのＣＡ−１２５；乳ガンについてのＭＵＣ−１または上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）またはＣＡ１５−３；悪性メラノーマについてのチロシナーゼまたはメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）；および、様々なタイプの腫瘍についての、ｒａｓ、ｐ５３の異常な産物；ヘパトーマ、卵巣ガンまたは精巣ガンについてのアルファフェトプロテイン；精巣ガンの男性についてのｈＣＧのベータサブユニット；前立腺ガンについての前立腺特異的抗原；多発性骨髄腫についての、また、いくつかのリンパ腫におけるベータ２ミクログロブリン；結腸直腸ガン、胆管ガンおよび膵臓ガンについてのＣＡ１９−９；肺ガンおよび前立腺ガンについてのクロモグラニンＡ；メラノーマ、軟部組織肉腫ならびに乳ガン、結腸ガンおよび肺ガンについてのＴＡ９０。腫瘍抗原の様々な例が当技術分野では知られており、例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら（２００９）において知られている（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。腫瘍抗原の具体的な例には、少なくとも下記のものが含まれる：例えば、ＣＥＡ、ｇｐ１００、メソテリン、ＴＲＰ１、ＣＤ４０、ＥＧＦＰ、Ｈｅｒ２、ＴＣＲアルファ、ｔｒｐ２、ＭＵＣ１、ｃｄｒ２、ｒａｓ、ＧＩＴＲ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、Ａ３、ｐ５３非変異型、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、Ｍｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異型、ｇｐ１００、ｐ５３変異型、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２およびＦｏｓ関連抗原１。
【００１１】
抗原受容体Ｔ細胞が向けられることがある具体的なウイルスには、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウェストナイルウイルス、ＪＣ、ＨＨＶ７およびそれらの組合せからなる群から選択される１つが含まれる。場合により、ウイルスはＥＢＶであり、抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２およびＢＺＬＦ１からなる群から選択される；ウイルスがＣＭＶである場合があり、抗原が、ＩＥ１およびｐｐ６５からなる群から選択される場合がある；ウイルスがＡｄｖである場合があり、抗原が、ヘキソンおよびペントンからなる群から選択される場合がある；ウイルスがＢＫウイルスである場合があり、抗原が、ＬＴおよびＶＰ−１からなる群から選択される場合がある；ウイルスがＨＨＶ６である場合があり、抗原が、Ｕ１４、Ｕ１１、Ｕ７１、Ｕ５４およびＵ９０からなる群から選択される場合がある；ウイルスがＲＳＶである場合があり、抗原が、ＮおよびＦからなる群から選択される場合がある；ウイルスがインフルエンザである場合があり、抗原が、ＭＰ１およびＮＰ１からなる群から選択される場合がある。
【００１２】
本開示の実施形態において、新規な免疫抑制シグナルコンバーターのＴ細胞表面における遺伝子組換え発現がもたらされる。このシグナルコンバーターにより、免疫エフェクター細胞に対するＴＧＦβの通常の場合には阻害性の作用が、ＴＧＦβ受容体に由来しないエンドドメインに連携させられるＴＧＦβのエキソドメインを有し、かつ、活性化シグナルを提供するキメラなＴＧＦβ受容体の使用を介して当該免疫エフェクター細胞のための刺激性のシグナルに変えられる。
【００１３】
本開示の実施形態において、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインと、ＴＧＦβ受容体以外のエンドドメインとを含むキメラなＴＧＦβ受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがもたらされる。具体的な実施形態において、エンドドメインは免疫刺激タンパク質のエンドドメインまたはその機能的フラグメントを含み、ただし、この場合、前記エンドドメインまたはそのフラグメントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ２８、４１ＢＢ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７またはそれらの組合せに由来する。具体的な場合において、エンドドメインはｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４に由来する。特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドはさらに、キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）またはαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体の発現ならびにＣＡＲおよび／またはαβＴＣＲの発現が１つまたは複数の同じ調節エレメントまたは異なる調節エレメントの制御のもとにある。
【００１４】
１つまたは複数のポリヌクレオチドが利用される実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、発現構築物または発現ベクターとして定義される場合があり、ベクターはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む））である場合がある。
【００１５】
ある特定の実施形態において、本明細書中に提供されるようなポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の細胞が本明細書中には提供される。そのような細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗原特異的Ｔ細胞、あるいは、αβＴＣＲを含むＴ細胞、または、ＣＴＬである場合がある。具体的な実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞はさらに、腫瘍特異的Ｔ細胞または病原体特異的Ｔ細胞として定義される。具体的な場合において、ＴＧＦβ受容体はＴＧＦβ受容体ＩＩの一部またはすべてを含む。場合により、抗原特異的Ｔ細胞の抗原特異性は天然型であり、これに対して、ある特定の場合には、抗原特異的Ｔ細胞の抗原特異性が組換えにより生じる。特定の場合において、細胞は抗原特異的Ｔ細胞であり、ならびに／あるいは、Ｔ細胞に対して生来的であることがあるαβＴＣＲ、または操作された分子であるαβＴＣＲを含む。特定の局面において、抗原特異的Ｔ細胞はさらに、腫瘍特異的Ｔ細胞または病原体特異的Ｔ細胞として定義される。場合により、抗原特異的Ｔ細胞の抗原特異性は天然型であり、これに対して、ある特定の場合には、抗原特異的Ｔ細胞の抗原特異性が組換えにより生じる。場合により、細胞表面のαβＴＣＲは天然型であり、これに対して、他の場合には、細胞表面のαβＴＣＲが組換えにより生じる；αβＴＣＲがライブラリーについて、例えば、ライブラリーから選択される場合がある。
【００１６】
本開示の実施形態において、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインと、ＴＧＦβ受容体以外のエンドドメインとを含むキメラなＴＧＦβ受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに、ＣＡＲおよび／またはαβＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の細胞がもたらされる。場合により、第１および第２の発現構築物は同じ分子または異なる分子である。抗原特異的Ｔ細胞は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体または病原体特異的Ｔ細胞受容体である場合がある。ＣＡＲは、抗原に対して、例えば、下記の１つに対して特異的である場合がある：ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体Ｒα、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８またはそれらの組合せ。
【００１７】
いくつかの実施形態において、１）抗原特異的Ｔ細胞、および／または、ＣＡＲを含む細胞、および／または、αβＴ細胞受容体を含む細胞であるとして、かつ、２）ＴＧＦβ受容体のエキソドメインと、ＴＧＦβ受容体以外のエンドドメインとを含むキメラなＴＧＦβ受容体を含むとして定義されるような１つまたは複数の細胞が本明細書中には提供される。具体的な実施形態において、細胞は前記細胞のレシピエントに関して自己である。場合により、細胞は前記細胞のレシピエントに関して同種である。
【００１８】
本開示の実施形態において、ガンを個体において処置および／または防止する方法であって、本明細書中に提供されるような複数の細胞の治療効果的な量を前記個体に送達する工程を含み、ただし、個体は、ＴＧＦβを分泌する細胞を有するガンを有し、かつ／または、ガンは、ＴＧＦβを産生する微小環境を有する、方法が本明細書中には提供される。場合により、ガンはどのような種類のものであってもよいにもかかわらず、具体的な場合には、ガンは、前立腺、乳房、メラノーマ、膵臓、肺、脳、結腸、食道、肝臓、腎臓、精巣、卵巣、子宮頸部、胆嚢、甲状腺、肛門、子宮内膜、膀胱、下垂体、白血病、リンパ腫、腹（胃）、脾臓または骨髄腫である。具体的な実施形態において、細胞は、静脈内、腹腔内、腫瘍内、クモ膜下腔内および／または経直腸的に送達される。いくつかの実施形態において、細胞へのＴＧＦβの暴露により、当該細胞が保護されるか、または、当該細胞の抗腫瘍活性が強化される。特定の局面において、個体には、別のガン治療法が施され、例えば、手術、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、放射線またはそれらの組合せなどが施される。ある特定の実施形態において、細胞は前記個体に対して同種または自己である。いくつかの局面において、本開示の方法はさらに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記個体から、または別の個体から得る工程を含む。具体的な実施形態において、上記方法は、Ｔ細胞を前記ＰＢＭＣから得て、前記Ｔ細胞を、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインと、ＴＧＦβ受容体以外のエンドドメインとを含むキメラなＴＧＦβ受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むように改変する工程を含む。本開示の実施形態において、細胞が個体に２回以上施される。具体的な場合において、細胞が２回以上施され、かつ、細胞が、特定の腫瘍抗原に対して特異的であるＣＡＲを含むとき、１回または複数回のその後の送達を行ったときには、細胞は、異なる腫瘍抗原に対して特異的であるＣＡＲを含む。
【００１９】
本開示の実施形態において、Ｔ細胞阻害性のサイトカインシグナルをＴ細胞刺激性のシグナルに転換する方法であって、前記阻害性サイトカインをＴ細胞表面の受容体にさらす工程を含み、ただし、前記受容体は、エキソドメインと、前記エキソドメインに自然界では連携しないエンドドメインとを有し、前記エキソドメインは前記阻害性サイトカインと結合することができ、かつ、前記エンドドメインにより、前記Ｔ細胞に対する刺激性シグナルが提供され、この場合、前記エキソドメインおよび前記エンドドメインはホモダイマーとして対形成する方法がもたらされる。具体的な実施形態において、サイトカインはＴＧＦβまたはＶＥＧＦである。
【００２０】
本開示の実施形態において、Ｔ細胞阻害性のサイトカインシグナルをＴ細胞刺激性のシグナルに転換する方法であって、前記阻害性サイトカインをＴ細胞表面の受容体にさらす工程を含み、ただし、前記受容体は、エキソドメインと、前記エキソドメインに自然界では連携しないエンドドメインとを有し、前記エキソドメインは前記阻害性サイトカインと結合することができ、かつ、前記エンドドメインにより、前記Ｔ細胞に対する刺激性シグナルが提供され、この場合、前記阻害性サイトカインはＩＬ４またはＩＬ７または両方ではない方法がもたらされる。具体的な実施形態において、サイトカインはＴＧＦβまたはＶＥＧＦである。
【００２１】
本開示の実施形態は、阻害剤であるＴＧＦβを分泌するガン細胞の存在下におけるインビボでの養子移入療法のための細胞の活性における改善を提供する。
【００２２】
本開示の実施形態において、本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドならびに／あるいは本明細書中に記載されるような細胞（１つまたは複数）を含むキットがもたらされる。
【００２３】
前記は、下記の開示の詳細な記載がよりよく理解され得るために、本開示の特徴および技術的利点を概説している。本開示の請求項の主題を形成する本開示のさらなる特徴および利点が本明細書中下記において記載されるであろう。開示される概念および具体的な実施形態は、本開示の同じ目的を行うために他の構造を改変するための、または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されなければならない。そのような同等な組み立ては、添付された請求項において示されるような開示の精神および範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されなければならない。さらなる目的および利点と一緒になって、本開示に特徴的であると考えられる新規な特徴がその構成および操作方法の両方に関して、添付された図面に関連して考慮されるときには下記の記載からよりよく理解されるであろう。しかしながら、図のそれぞれが、例示および記載の目的のためだけに提供されており、本開示の境界を規定するものとして意図されないことが明確に理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本開示のより完全な理解のために、添付された図面と併せて解釈される下記の記載が次に参照される。
【００２５】
【図１】阻害性の腫瘍微小環境に耐えるためにＴ細胞を武装化する例示的な実施形態を例示する。
【００２６】
【図２】コントロールＤＮＲＩＩ、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４の例示的なレトロウイルスベクターマップを提供する。
【００２７】
【図３】ＤＮＲＩＩ、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４による遺伝子組換えＴ細胞の生成を示す。
【００２８】
【図４Ａ−４Ｂ】ＤＮＲＩＩ、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４のＣＡＲ−ＰＳＣＡ．２Ｇとの共発現の定量を明らかにする。
【００２９】
【図５】ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４が、ＴＧＦβにさらされるＣＡＲ改変Ｔ細胞を保護するかどうかを明らかにする。
【００３０】
【図６Ａ−６Ｃ】抑制条件において、ＲＩＩＤ２改変Ｔ細胞およびＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞が保護されるかどうかを示す。
【００３１】
【図７】ＴＧＦβ１の投与により、ＲＩＩＤ２形質導入Ｔ細胞およびＲＩＩＤ４形質導入Ｔ細胞が選択されることを示す。
【００３２】
【図８】ＣＡＲＰＳＣＡ．２Ｇ／ＲＩＩＤ２  Ｔ細胞およびＣＡＲＰＳＣＡ．２Ｇ／ＲＩＩＤ４  Ｔ細胞は抗原刺激をそれらの拡大のために必要とすることを明らかにする。
【００３３】
【図９】ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４はＤＵ１４５細胞に対するＣＡＲＰＳＣＡ．２Ｇの抗腫瘍効果を強化することを規定する。
【００３４】
【図１０】例示的なＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＴＧＦβ暴露の影響を示す。Ａ）シグナル伝達、Ｂ）細胞溶解機能、Ｃ）拡大、Ｄ）生存性、および、Ｅ）ＰＤ１発現。
【００３５】
【図１１】Ａ）野生型ＴＧＦβＲのシグナル伝達、および、Ｂ）ＲＩＩＤ４のシグナル伝達を例示する。
【００３６】
【図１２】Ａ）ＲＩＩＤ４構築物の一例のためのレトロウイルスベクター、Ｂ）形質導入された細胞におけるＲＩＩＤ４の発現、Ｃ）ＴＧＦβの存在下または非存在下でのＴ細胞培養物の顕微鏡写真、および、Ｄ）フローによって測定される場合のＴ細胞におけるＰＤ１の発現を例示する。
【００３７】
【図１３】例示的なキメラなサイトカインレトロウイルス受容体を例示する。
【００３８】
【図１４】ＴＧＦβ１はｐＳｍａｄ２／３をＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞において誘導しないことを明らかにする。
【００３９】
【図１５】Ｔ細胞がＴＧＦβ１誘導アポトーシスからＲＩＩＤ４によって保護されることを示す。
【００４０】
【図１６】ＲＩＩＤ４がＰＤ１のアップレギュレーションを妨げることを明らかにする。
【００４１】
【図１７】ＲＩＩＤ４が細胞溶解機能のＴＧＦβ１誘導による阻害を妨げることを明らかにする。
【００４２】
【図１８】ＲＩＩＤ４＋細胞がＴＧＦβ１暴露によって選択されることを示す。
【００４３】
【図１９】抗原およびＴＧＦβ１の中断は培養不良を引き起こすことを明らかにする。
【００４４】
【図２０】共培養実験設定の一例を例示する。
【００４５】
【図２１】２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４細胞は腫瘍をＴＧＦβ１の存在下で排除したという証拠を提供する。
【００４６】
【図２２】２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞はＴＧＦβ１の存在下では増殖しなかったことを示す。
【００４７】
【図２３】２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４細胞は拡大することができたこと、および、この細胞は抗原の存在に依存することを明らかにする。
【００４８】
【図２４】ＴＧＦβ１の投与により、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４  Ｔ細胞の増殖が促進されることを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
「ａ」および「ａｎ」の単語は、請求項を含めて、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）の単語と一緒に本明細書において使用されるとき、「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」（１つまたは複数）を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法からなる場合があり、あるいは、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法から本質的になる場合がある。本明細書中に記載される方法または組成物はどれも、開示され、また、同様な結果または類似した結果を本開示の精神および範囲から逸脱することなく依然として得る本明細書中に記載された実施形態のどのような他の方法または組成物に関してでも実行され得ることが意図される。
【００５０】
本開示の実施形態は、免疫細胞の増殖を抑制する阻害性シグナルを、免疫細胞の増殖を高め、また、少なくともいくつかの場合には抗腫瘍活性を高める刺激性シグナルに切り替えるために改変されている養子細胞移入のための細胞を包含する。特定の実施形態において、本開示の免疫細胞は、阻害性分子に結合し、しかし、抑制シグナルではなく、むしろ、正のシグナルを伝えるために設計される受容体を備える。すなわち、本開示の免疫細胞は「ブレーキ」シグナル（例えば、ＴＧＦβ）を「アクセル」シグナルに転換して、それぞれの免疫細胞の抗腫瘍効果を改善する。
【００５１】
上記細胞はある特定の実施形態において、ＴＧＦβのエキソドメインと、（例えば）別の分子に由来するエンドドメインとのキメラ体を包含するキメラなサイトカイン受容体を含み、その結果、ＴＧＦβがエキソドメインに結合すると、エンドドメインがＴ細胞の活性を刺激することを生じさせるようにされる。細胞は、例えば、他の分子についての受容体（少なくとも、αβＴＣＲ、抗原特異的受容体（腫瘍特異的受容体を含む）および／またはキメラな抗原受容体を含む）を含めて、他の形質（天然型および／または人によって遺伝子操作されたもの）を有する場合があり、または有しない場合がある。
【００５２】
Ｉ．キメラなサイトカイン受容体
【００５３】
本開示の実施形態において、Ｔｈ２または免疫抑制サイトカイン（ＴＧＦβが一例である）に結合するが、免疫刺激性のシグナル伝達を免疫抑制の代わりに誘導し、これにより、Ｔｈ１（エフェクター）表現型、増殖および細胞毒性プロフィルの維持をもたらすキメラなサイトカイン受容体を含む組成物がもたらされる。ポリペプチドとしての受容体、および、該ポリペプチドをコードするヌクレオチドとしての受容体が本開示において包含される。
【００５４】
本開示の実施形態には、免疫抑制サイトカインについての受容体のエキソドメインを免疫刺激性分子のエンドドメインと融合されて含むポリペプチド（および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）が含まれる。具体的な実施形態において、ＴＧＦβＲのエキソドメインが、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０または前記のいずれかの組合せを含む１つまたは複数の刺激性エンドドメインと融合される。そのようなキメラなサイトカイン受容体を含んでいる細胞により、腫瘍反応性の免疫細胞が免疫抑制サイトカイン（例えば、ＴＧＦβ）から保護される。
【００５５】
ある特定の実施形態において、ＴＧＦβ受容体またはそのＴＧＦβ結合フラグメントのエキソドメインのみを含むキメラなＴＧＦβ受容体が本明細書中には提供される。
【００５６】
キメラなＴＧＦβ受容体は、ある特定の実施形態においては、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインを含む。天然型ＴＧＦβ受容体のどのようなイソ型も、そのエキソドメインのために使用される場合があり、そのようなイソ型には、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２およびＴＧＦβ受容体３が含まれる。特定の実施形態において、ＴＧＦβ受容体２のエキソドメインが本開示の（例えば、発現構築物および細胞を含む）組成物において用いられる。ＴＧＦβ受容体２をコードする例示的なヌクレオチド配列には、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション番号ＮＭ＿００１０２４８４７．２（配列番号３）（ポリペプチドはＮＰ＿００１０２００１８である；配列番号４）または同ＮＭ＿００３２４２．５（ポリペプチドはＮＭ＿００３２４２である）が含まれる。エンドドメインの一例がＴＬＲ４であり、ＴＬＲ４についての例示的な配列が、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション番号Ｕ８８８８０（配列番号５）（ポリペプチドはＡＡＣ３４１３５である；配列番号６）におけるものである。
【００５７】
上記受容体についてのポリヌクレオチドは、具体的な実施形態においてはＴＧＦβ受容体のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。ある特定の実施形態において、シグナルペプチドは下記の通りである（ＴＧＦβ＿受容体２に由来するアミノ酸位置１〜２２）：ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳ（配列番号１）。具体的な実施形態において、エキソドメイン（これは細胞外ドメインとして示される場合がある）には、下記の配列番号２において示されるようなＴＧＦβ受容体２に由来するアミノ酸位置２３〜１６６が含まれる：ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ（配列番号２）。他の具体的な実施形態において、エキソドメインは、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体３、あるいは、いずれかの他のＴＧＦβ受容体またはその変化体に由来する。
【００５８】
本開示には、キメラなＴＧＦβ受容体についてのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに、キメラなＴＧＦβ受容体を含んでいる細胞が含まれる。本開示は、ＴＧＦβを分泌するガン、または、ＴＧＦβをもたらす腫瘍環境に存在するガンを処置する方法におけるキメラなＴＧＦβ受容体の使用を包含する。キメラなＴＧＦβ受容体は、１つまたは複数のＣＡＲもまた含む細胞と併せて使用される場合がある。
【００５９】
特定の実施形態において、本開示のキメラなＴＧＦβ受容体は、内因性のＴＧＦβ受容体に由来しないエンドドメインを含む。エンドドメインは、キメラなＴＧＦβ受容体のエキソドメインにＴＧＦβが結合したとき、当該エンドドメインにより、活性化シグナルが、当該エンドドメインが存在する免疫エフェクター細胞に与えられる限り、例えば、キメラなＴＧＦβ受容体を発現するＴ細胞がＴＧＦβの存在下で増殖することが引き起こされる限り、どのような種類のものであってもよい。例示的なエンドドメインには、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４０、ＣＤ２７またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数に由来する免疫刺激性のエンドドメインまたはそのフラグメントが含まれる。
【００６０】
本開示の実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体はまた、膜貫通ドメインをエキソドメインとエンドドメインとの間に含む場合がある。膜貫通ドメインはどのような起源に由来してもよく、だが、具体的な実施形態において、膜貫通ドメインは、エンドドメインと同じ分子に由来する。特定の実施形態において、キメラな受容体は、ＴＧＦβ受容体のエキソドメイン、免疫刺激性分子のエンドドメイン、および、膜貫通ドメインを含む；特定の局面において、膜貫通ドメインは、免疫刺激性分子と同じ分子に由来する。具体的な実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体は、膜貫通ドメインと、この膜貫通ドメイン（ＴＭ）と同じ分子に由来する１つまたは複数のさらなるアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のさらなるアミノ酸（ａａ））とを含む。キメラなＴＧＦβ受容体についての１つの例示的なパターンが下記の通りである：
【００６１】
ＴＧＦβＲエキソドメイン−ＴＭ由来の１個、２個、３個またはそれ以上のａａ−ＴＭ−ＴＧＦβＲ以外のエンドドメイン
【００６２】
ある特定の実施形態において、エキソドメインは、エキソドメイン全体を含まない場合があり、しかし、代わりに、エピトープと、いくつかの場合にはエンドドメインにつながれるスペーサーとを含む場合がある。
【００６３】
ＩＩ．キメラなサイトカイン受容体を含む宿主細胞
【００６４】
本開示の実施形態において、細胞が治療のために用いられる。本開示において包含される細胞は免疫細胞である場合があり、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（これはまた、ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはキラーＴ細胞として知られている）を含むＴ細胞を包含する免疫エフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；およびエフェクター機能を誘発することができる他の免疫細胞である場合がある。具体的な実施形態において、本開示の受容体を取り込む細胞は、バイスタンダー効果を、例えば、少なくとも阻害性サイトカインを腫瘍微小環境から激減させることによって腫瘍微小環境において示す。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、用語「細胞株」および用語「細胞培養物」は交換可能に使用される場合がある。これらの用語のすべてがまた、ありとあらゆる後続の世代であるそれらの子孫を含む。すべての子孫は、意図的な変異または故意でない変異のために同一でない場合があることが理解される。異種核酸配列を発現させることに関連して、「宿主細胞」は、ベクターを複製すること、および／または、ベクターによってコードされる異種遺伝子を発現させることが可能である真核生物細胞を示す。宿主細胞はベクターのためのレシピエントとして使用することができ、また、これまで使用されてきている。宿主細胞は「トランスフェクション」または「形質転換」される場合があり、これは、外因性の核酸が宿主細胞に移入されるプロセス、または導入されるプロセスを示す。形質転換された細胞には、初代の対象細胞およびその子孫が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「操作された」および「組換え（の）」細胞または宿主細胞は、外因性の核酸配列（例えば、ベクターなど）が導入されている細胞を示すことが意図される。したがって、組換え細胞は、導入された組換え核酸を含有しない天然に存在する細胞と区別可能である。
【００６６】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡまたはタンパク質配列が、同じ細胞（例えば、同じＣＴＬ）において他の選択されたＲＮＡまたはタンパク質配列とともに共発現される場合があることが意図される。共発現が、ＣＴＬを２つ以上の異なった組換えベクターにより共トランスフェクションまたは共形質導入することによって達成される場合がある。代替において、１つだけの組換えベクターが、ＲＮＡのための多数の異なったコード領域を含むために構築されることがあり、この場合、これらのコード領域がその後、この１つだけのベクターによりトランスフェクションまたは形質導入されるＣＴＬにおいて発現させられ得るかもしれない。
【００６７】
いくつかのベクターでは、ベクターが原核生物細胞および真核生物細胞の両方において複製され、かつ／または発現されることを可能にする制御配列が用いられる場合がある。当業者はさらに、宿主細胞を維持するために、また、ベクターの複製を可能にするために上記宿主細胞のすべてをインキュベーションするための条件を理解しているであろう。ベクターの大規模産生、同様にまた、ベクターによってコードされる核酸、および、それらの同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの産生を可能にするであろう様々な技術および条件もまた理解されており、また、知られている。
【００６８】
細胞は、当該細胞を受ける個体に関して、自己の細胞、同系の細胞、同種の細胞、および、それどころか、場合によっては異種の細胞であることが可能である。
【００６９】
改変された細胞を殺すことができることが望まれるかもしれない多くの状況で、処置を終了することが望まれる場合、細胞が存在した後での細胞の非存在に関心がある研究において、または、他の事象において、細胞は新生物性になる。この目的のために、改変された細胞を制御された条件のもとで殺すことができるある特定の遺伝子産物（例えば、誘導可能な自殺遺伝子）の発現を提供することができる。
【００７０】
Ａ．さらなる細胞特徴
細胞がキメラなサイトカイン受容体を含むことに加えて、細胞は、細胞免疫療法のために有用である１つまたは複数の他の特徴を有する場合がある。そのようなさらなる特徴は細胞にとって本来的である場合があり、または、人による遺伝子操作の後における細胞の一部である場合がある。キメラなＴＧＦβ受容体に加えて、２つ以上の特徴が存在する場合がある。具体的な実施形態において、細胞がキメラなＴＧＦβ受容体を有することに加えて、細胞は、キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）、αβＴ細胞受容体および／または抗原特異的受容体（例えば、腫瘍特異的受容体）を有する場合がある。
【００７１】
１つの実施形態において、宿主細胞は、１つまたは複数のキメラなＴＧＦβ受容体を含み、かつ、操作されたαβＴＣＲ受容体、腫瘍抗原に対して特異的な生来的受容体、またはＣＡＲのうちの１つまたは複数を含むＴ細胞である；それぞれの場合において、さらなる改変により、選ばれた腫瘍抗原が標的化される場合がある。
【００７２】
天然に存在するＴ細胞受容体は、２つのサブユニット、すなわち、α−サブユニットおよびβ−サブユニット（これらのサブユニットのそれぞれが、それぞれのＴ細胞ゲノムにおける組換え事象によって産生される独特のタンパク質である）を含み、また、ＴＣＲのライブラリーが、腫瘍抗原を含めて特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングされる場合がある。「操作されたＴＣＲ」は、養子免疫療法のために選択され、養子免疫療法のためにクローン化され、および／または、続いて、養子免疫療法のために使用されるＴ細胞の集団に導入される標的抗原に対する高アビディティーおよび反応性を有する天然型ＴＣＲを示す。操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲが、標的抗原とＭＨＣ非依存的様式で結合するように操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗体またはその抗原結合フラグメント（これらに限定されない）を含めて細胞外の結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の細胞内の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および、元来のシグナル伝達ドメインを含む。
【００７３】
Ｔ細胞受容体が、キメラなサイトカイン受容体を発現するか、または発現することになる細胞において生じる実施形態において、具体的な実施形態においては、上記方法は、腫瘍抗原に由来するペプチドの混合物のライブラリーとの末梢単核血液細胞の暴露を使用する（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２５３４２を参照のこと。これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００７４】
本開示のある特定の実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体を含む免疫エフェクター細胞で、しかも、タンパク質−抗原のプロセシングおよび提示における異常に起因にする腫瘍免疫回避機構を迂回することを可能にする少なくとも１つのＣＡＲを含むように改変される免疫エフェクター細胞がもたらされる。
【００７５】
特定の場合において、細胞は、キメラであり、非天然型であり、かつ、少なくとも一部が人の手によって操作されるＣＡＲを含む。特定の場合において、操作されたＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の成分を有しており、いくつかの実施形態において、そのような１つまたは複数の成分により、腫瘍抗原を含むガン細胞に対する細胞（例えば、Ｔリンパ球）の標的化または結合が容易になる。具体的な実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍抗原についての抗体の一部、細胞質シグナル伝達ドメインの一部またはすべて、ならびに／あるいは、１つまたは複数の共刺激分子の一部またはすべて（例えば、共刺激分子のエンドドメイン）を含む。具体的な実施形態において、抗体は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある特定の局面において、抗体は、例えば、ＴＧＦβを分泌するガン細胞の細胞表面の標的抗原に向けられる。ある特定の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖に由来する細胞質シグナル伝達ドメインが、キメラな受容体が標的抗原と会合した後でのＴリンパ球の増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルをもたらすために、キメラな受容体の少なくとも一部として用いられる。例には、共刺激分子に由来するエンドドメイン、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＯＸ４０に由来するエンドドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、共刺激分子が、抗原会合後にＣＡＲによってもたらされるＴ細胞の活性化、増殖および細胞毒性を高めるために用いられる。具体的な実施形態において、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢである。
【００７６】
ＣＡＲは、例えば、第一世代、第二世代または第三世代（シグナル伝達が、ＣＤ２８および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）によって提供される共刺激（例えば、４−１ＢＢまたはＯＸ４０）と一緒にＣＤ３ζによって提供されるＣＡＲ）である場合がある。ＣＡＲは、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、腫瘍によって発現されるウイルス関連抗原、あるいは、腫瘍のゲノム分析および／または示差的発現研究を介して特定される他の腫瘍関連抗原などに対して特異的である場合がある。ただ１つの細胞が、異なる腫瘍抗原を標的とするＣＡＲを含めて多数のＣＡＲを有する場合がある。
【００７７】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、キメラなＴＧＦβ受容体をコードする場合がある発現ベクターに、または、キメラなＴＧＦβ受容体もまたコードしない場合がある発現ベクターにコードされる。ベクターは特定の実施形態においてはバイシストロン性である場合がある。同じ発現構築物に存在するとき、ＣＡＲをコードする配列は、キメラなＴＧＦβ受容体をコードする配列に対して５’側または３’側に配置される場合がある。ＣＡＲおよびキメラなＴＧＦβ受容体の発現が、同じ調節配列または異なる調節配列の指揮下にある場合がある。
【００７８】
Ｂ．構築物の宿主細胞への導入
キメラなサイトカイン受容体をコードし、かつ、必要な場合には少なくとも１つのＣＡＲ、αβＴＣＲおよび／または抗原特異的受容体を含む発現ベクターを１つまたは複数のＤＮＡ分子または構築物として導入することができ、ただし、この場合、ＤＮＡ分子または構築物には、当該構築物を含有する宿主細胞の選抜を可能にするであろう少なくとも１つのマーカーが存在する場合がある。そのような構築物は従来の方法で調製することができ、この場合、遺伝子および調節領域が適するように単離され、連結され、適切なクローニング用宿主においてクローン化され、制限または配列決定あるいは他の従来的手段によって分析されることがある。具体的には、ＰＣＲを使用して、機能的ユニットのすべてまたは一部分を含む個々のフラグメントが単離される場合があり、この場合、１つまたは複数の変異が、「プライマー修復」、連結、インビトロ変異誘発などを適するように使用して導入されることがある。構築物は、完了し、かつ、適切な配列を有することが明らかにされると、その後、いずれかの従来的手段によってＣＴＬに導入される場合がある。構築物は、細胞への感染または形質導入のために、レトロウイルスベクターを含めて、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのような複製しない不完全なウイルスゲノムに組み込まれ、パッケージングされる場合がある。構築物は、所望されるならば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含む場合がある。代替において、構築物は、融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック法、トランスフェクションまたはリポフェクションなどによって導入される場合がある。宿主細胞は、構築物が導入される前に培養において成長させられ、拡大され、その後、構築物の導入および構築物の組み込みのための適切な処理に供される場合がある。その後、細胞は拡大され、構築物に存在するマーカーに基づいてスクリーニングされる。首尾よく使用されることがある様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシン耐性などが含まれる。
【００７９】
いくつかの場合において、構築物が特定の遺伝子座において組み込まれることが所望される相同的組換えのための標的部位を有する場合がある。例えば、相同的組換えのために当技術分野において知られているような材料および方法を使用して、内因性遺伝子をノックアウトし、また、その内因性遺伝子を構築物によってコードされる遺伝子により（同じ遺伝子座において、またはどこか他のところで）置き換えることができる。相同的組換えのために、．ＯＭＥＧＡ．またはＯ−ベクターのどちらかが使用される場合がある。例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１、５０３〜５１２；Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６、３４８〜３５２；およびＪｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８、１５３〜１５６を参照のこと。
【００８０】
構築物は、少なくともキメラなＴＧＦβ受容体と、必要に応じた随意的なＣＡＲ（１つまたは複数）、または、１つもしくは複数の遺伝子とを有する異なるＤＮＡ分子をコードするただ１つのＤＮＡ分子として導入される場合がある。構築物が、同時に、または連続して導入される場合があり、それぞれが、同じマーカーまたは異なるマーカーを有する。
【００８１】
有用なエレメント（例えば、細菌または酵母の複製起点、選択マーカーおよび／または増幅可能マーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター／エンハンサーエレメントなど）を含有するベクターで、構築物ＤＮＡのストックを調製するために、また、トランスフェクションを行うために使用されることがある様々なベクターが当技術分野では広く知られており、多くが市販されている。
【００８２】
ＩＩＩ．キメラなサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチド
【００８３】
本開示はまた、上記で定義されるようなキメラなサイトカイン受容体をコードする核酸配列と、前記核酸配列を含んでいる細胞とを含む組成物を包含する。核酸分子は特定の局面においては組換え核酸分子であり、また、核酸分子は合成である場合がある。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、同様にまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む場合があり、また、核酸分子はそれらのハイブリッドである場合がある。
【００８４】
１つまたは複数の調節配列が、本開示の組成物に含まれる核酸分子に加えられる場合があることが当業者には明らかである。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、および／または、本開示のポリヌクレオチドの誘導された発現を可能にする配列が用いられる場合がある。好適な誘導可能な系が、例えば、テトラサイクリンによって調節される遺伝子発現、例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９（１９９２）、５５４７〜５５５１）、ならびに、Ｇｏｓｓｅｎら（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２（１９９４）、５８〜６２）によって記載されるようなテトラサイクリン調節の遺伝子発現、または、デキサメタゾンにより誘導可能な遺伝子発現系、例えば、Ｃｒｏｏｋ（１９８９）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８、５１３〜５１９によって記載されるようなデキサメタゾンにより誘導可能な遺伝子発現系である。
【００８５】
ある特定の実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体が細胞またはベクターによって構成的に発現される。他の実施形態において、キメラなＴＧＦβ受容体の発現が、誘導可能なプロモーターの制御下にあり、例えば、ＴＧＦβによって誘導可能であるプロモーター、または、腫瘍微小環境に存在する別の分子によって誘導可能であるプロモーターの制御下にある。
【００８６】
さらに、核酸分子が、例えば、チオエステル結合および／またはヌクレオチドアナログを含有する場合があることが、さらなる目的のために想定される。これらの修飾は、細胞内のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化のために有用である場合がある。核酸分子が、細胞における前記核酸分子の転写を可能にするキメラな遺伝子を含む適切なベクターによって転写される場合がある。この点で、そのようなポリヌクレオチドは「遺伝子標的化」または「遺伝子治療」の取り組みのために使用され得ることもまた理解されなければならない。別の実施形態において、核酸分子は標識される。核酸の検出のための様々な方法が当技術分野では広く知られている（例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲまたはプライマー伸長）。この実施形態は、上記で記載される核酸分子の成功した導入を遺伝子治療取り組みの期間中に確認するためのスクリーニング方法のために有用である場合がある。
【００８７】
核酸分子は、上記核酸分子のいずれかを単独で、または組合せでのどちらかで含む組換え産生されたキメラな核酸分子である場合がある。具体的な局面において、核酸分子はベクターの一部である。
【００８８】
したがって、本開示はまた、本開示において記載される核酸分子を含むベクターを含む組成物に関連する。
【００８９】
多くの好適なベクターが分子生物学における当業者には知られており（ただし、その選定は、所望される機能に依存するであろう）、これらには、遺伝子操作において従来から使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターが含まれる。当業者には広く知られている様々な方法を、様々なプラスミドおよびベクターを構築するために使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）に記載される技術を参照のこと。代替において、本開示のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム中に再構成することができる。クローニングベクターが、ＤＮＡの個々の配列を単離するために使用される場合がある。関連のある配列を、特定のポリペプチドの発現が要求される発現ベクターに移入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【００９０】
具体的な実施形態において、本明細書中で定義されるキメラなサイトカイン受容体構築物をコードする核酸配列に機能的に連結される調節配列である核酸配列を含むベクターがもたらされる。様々なそのような調節配列（制御エレメント）が当業者には知られており、これらには、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳、および、挿入物をベクターに導入するための挿入部位が含まれる場合がある。具体的な実施形態において、核酸分子は、発現を真核生物細胞または原核生物細胞において可能にする前記発現制御配列に機能的に連結される。
【００９１】
ベクターが、本明細書中で定義されるキメラなサイトカイン受容体構築物をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。具体的な局面において、ベクターはウイルスベクターであり、例えば、レンチウイルスベクターである。様々なレンチウイルスベクターが、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）またはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含めて様々なところから市販されている。
【００９２】
用語「調節配列」は、ＤＮＡ配列が連結されるコード配列の発現を達成するために必要であるＤＮＡ配列を示す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。原核生物では、制御配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターが含まれる。真核生物では一般に、制御配列には、プロモーター、ターミネーター、および、場合により、エンハンサー、トランス活性化因子または転写因子が含まれる。用語「制御配列」は、発現のためにその存在が必要であるすべての成分を少なくとも含むことが意図され、また、さらなる好都合な成分を同様に含む場合がある。
【００９３】
用語「機能的に連結される」は、そのように記載される様々な成分が、これらの成分がそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある状態での並置を示す。コード配列に「機能的に連結される」制御配列は、このコード配列の発現がそのような制御配列と適合し得る条件のもとで達成されるような様式で連結される。制御配列がプロモーターである場合には、二重鎖の核酸が好ましくは使用されることが当業者にとって明白である。
【００９４】
したがって、示されたベクターはある特定の実施形態においては発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換するために使用することができ、また、コード配列の発現をその選択された宿主においてもたらす構築物である。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたは組み込みベクターであることが可能である。発現は、核酸分子が好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡに転写されることを含む。発現を原核生物および／または真核生物細胞において保証する様々な調節エレメントが当業者には広く知られている。真核生物細胞の場合には、調節エレメントは通常、転写の開始を保証するプロモーターと、必要な場合には、転写の終結および転写物の安定化を保証するポリＡシグナルとを含む。発現を原核生物宿主細胞において可能にする可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターまたはｔａｃプロモーターを含み、発現を真核生物宿主細胞において可能にする調節エレメントの例には、酵母におけるＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＬ１プロモーター、あるいは、哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーまたはグロビンイントロンが挙げられる。
【００９５】
転写の開始に関わるエレメントのほかに、そのような調節エレメントはまた、転写終結シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位）をポリヌクレオチドの下流側に含む場合がある。さらに、使用される発現系に依存して、ポリペプチドを細胞区画に向かわせることが可能であるリーダー配列、または、ポリペプチドを培地中に分泌させることが可能であるリーダー配列が、示された核酸配列のコード配列に加えられる場合があり、そのようなリーダー配列が当技術分野では広く知られている。このようなリーダー配列は、翻訳配列、開始配列および終結配列と適切に同調して組み立てられ、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部を細胞膜周辺腔または細胞外培地に分泌することを導くことができるリーダー配列である。必要な場合には、異種配列は、所望される特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製をもたらすＮ末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる；上掲を参照のこと。これに関連して、好適な発現ベクターが当技術分野では知られている；例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲおよびｐＥＦ−ＡＤＡ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）、５０（３）、１４１〜１５０）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）。
【００９６】
いくつかの実施形態において、発現制御配列は、真核生物宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションが可能であるベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主のための制御配列もまた使用される場合がある。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現のために好適である条件のもとで維持され、そして、所望に応じて、本開示のポリペプチドの回収および精製が続く場合がある。
【００９７】
さらなる調節エレメントには、転写エンハンサー、同様にまた、翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。好都合には、本開示の上記ベクターは選択マーカーおよび／またはスコア化（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーを含む。形質転換細胞の選抜のために有用である様々な選択マーカー遺伝子が当業者には広く知られており、これらは、例えば、代謝拮抗剤抵抗性をｄｈｆｒ（これは、メトトレキサートに対する抵抗性を与える）（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）、１３（１９９４）、１４３〜１４９）についての選抜の基礎として含む；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシドのネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに対する抵抗性を与える）（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２（１９８３）、９８７〜９９５）、および、ｈｙｇｒｏ（これは、ヒグロマイシンに対する抵抗性を与える）（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ、３２（１９８４）、４８１〜４８５）。さらなる選択遺伝子が記載されている；すなわち、ｔｒｐＢ、これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする；ｈｉｓＤ、これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５（１９８８）、８０４７）；マンノース−６−リン酸イソメラーゼ（これは、細胞がマンノースを利用することを可能にする）（国際公開ＷＯ９４／２０６２７）、および、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（これは、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤の２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する抵抗性を与える（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編））、または、ブラストサイジンＳに対する抵抗性を与えるアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９（１９９５）、２３３６〜２３３８）。
【００９８】
有用なスコア化マーカーもまた当業者には知られており、また、市販されている。好都合には、前記マーカーは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｇｉａｃｏｍｉｎ、Ｐ１．Ｓｃｉ．、１１６（１９９６）、５９〜７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７８（１９９６）、１２１）、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（Ｇｅｒｄｅｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３８９（１９９６）、４４〜４７）、または、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６（１９８７）、３９０１〜３９０７）である。この実施形態は、示されたベクターを含有する細胞、組織および生物の簡便かつ迅速なスクリーニングのために特に有用である。
【００９９】
上記で記載されるように、示された核酸分子は、コードされたポリペプチドを細胞において発現させるために単独で、またはベクターの一部として細胞において使用することができる。上記で記載されたキメラなサイトカイン受容体構築物のいずれか１つをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含有する核酸分子またはベクターが、目的とするポリペプチドを結果として産生する細胞に導入される。示された核酸分子およびベクターは、細胞への直接的な導入のために、あるいは、リポソームを介した、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス型、レトロウイルス型）を介した細胞への導入のために設計される場合がある。ある特定の実施形態において、細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、ニューロン幹細胞または造血幹細胞である。
【０１００】
上記によれば、本開示は、本明細書中で定義されるキメラなサイトカイン受容体構築物のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子操作において従来から使用されるベクター（特に、プラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージ）を得るための方法に関連する。特定の実施形態において、前記ベクターは発現ベクターおよび／または遺伝子移入ベクターもしくは遺伝子標的化ベクターである。ウイルスに由来する発現ベクター、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターが、標的化された細胞集団への示されたポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用される場合がある。当業者には広く知られている様々な方法を、組換えベクターを構築するために使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記引用文献中）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９、上記引用文献中）または他の標準的教本に記載される技術を参照のこと。代替において、示された核酸分子およびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム中に再構成することができる。本開示の核酸分子を含有するベクターは、広く知られている方法によって宿主細胞に移入することができ、ただし、この場合、その方法は細胞宿主のタイプに依存して変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核生物細胞のために一般に利用され、これに対して、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞宿主のために使用される場合がある；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照のこと。
【０１０１】
ＩＶ．医薬組成物
【０１０２】
本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物に関連し、免疫療法のための細胞の組成物を包含する。具体的な実施形態において、免疫療法のための細胞は、少なくともキメラなサイトカイン受容体を発現するように操作される。ある特定の実施形態において、細胞は１つまたは複数のさらなる改変を含み、例えば、１つまたは複数の受容体（腫瘍抗原についての受容体を含む）を含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、経皮投与、腔内投与、動脈内投与、クモ膜下腔内投与または静脈内投与のための、あるいは、ガンに直接に注入するための組成物を含む。前記医薬組成物が個体に注入または注射により投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、局所的投与または皮内投与によって行われる場合がある。
【０１０４】
本開示の医薬組成物はさらに、医薬的に許容されるキャリアを含む場合がある。好適な医薬用キャリアの様々な例が当技術分野では広く知られており、これらには、リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルション）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。
【０１０５】
投薬計画が主治医および様々な臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野では広く知られているように、任意の１人の患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。投与のための特定の投薬量が、５×１０６／ｍ２〜３×１０８／ｍ２の間における範囲にある場合があるかもしれない。
【０１０６】
本開示の組成物は局所投与または全身投与により投与される場合がある。本明細書中に提供される組成物、例えば、本明細書中に提供される構築物を発現する細胞はある特定の実施形態において、非経口投与により、例えば、静脈内投与、動脈内投与、クモ膜下腔内投与、皮下投与または筋肉内投与によって投与される場合がある。ある特定の他の実施形態において、本明細書中に提供される構築物をコードするＤＮＡが、標的部位に対して直接に、例えば、バリスティック送達によって内部または外部の標的部位に、あるいは、カテーテルによって動脈内の部位に投与される場合がある。好ましい実施形態において、医薬組成物は皮下投与され、一層より好ましい実施形態においては静脈内投与される。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水および緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルションまたは懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、補液および栄養補充液ならびに電解質補充液（例えば、リンゲルのデキストロース液に基づくものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなど）。加えて、本開示の医薬組成物は、タンパク質性キャリア、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性キャリアを含む場合があるかもしれない。本開示の医薬組成物は、（本開示において記載されるような）タンパク質性のキメラなサイトカイン受容体構築物あるいは該構築物をコードする核酸分子またはベクターに加えて、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる生物学的に活性な作用因を含むことがあるかもしれないことが想定される。具体的な実施形態において、細胞は、１０％ＤＭＳＯ、４０％生理的食塩水および５０％ヒト血清アルブミンにおいて静脈内注入される。
【０１０７】
Ｖ．キメラなサイトカイン受容体およびキメラなサイトカイン受容体を含む宿主Ｔ細胞の治療的使用
【０１０８】
様々な実施形態において、本明細書中で意図されるようなキメラなサイトカイン受容体構築物、核酸配列、ベクターおよび／または宿主細胞、ならびに／あるいは、これらを含む医薬組成物が、ガン性疾患（例えば、腫瘍性疾患）の防止、処置または改善のために使用される。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、例えば、固形腫瘍を含めて、ガンを防止すること、改善すること、および／または処置することにおいて特に有用である場合がある。ある特定の場合において、ガンは腫瘍抗原を有する。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、「処置」または「処置する」には、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するあらゆる有益な影響または望ましい影響が含まれ、また、処置されている疾患または状態（例えば、ガン）の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の低下さえも含まれる場合がある。処置は場合により、疾患または状態の症状の軽減または改善、あるいは、疾患または状態の進行を遅らせることのどちらかを伴うことが可能である。「処置」は、疾患または状態あるいはその関連した症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示していない。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、「ｐｒｅｖｅｎｔ」（防止する）および類似する言葉、例えば、「ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ」（防止される）、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ」（防止する）などは、疾患または状態（例えば、ガン）の出現または再発の可能性を防止するための、阻害するための、または低下させるための取り組みを示している。疾患または状態の発症または再発を遅らせること、あるいは、疾患または状態の症状の出現または再発を遅らせることもまた示す。本明細書中で使用される場合、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」（防止）および類似する言葉はまた、疾患または状態の発症または再発の前における当該疾患または状態の強さ、影響、症状および／または負荷を軽減することを包含する。
【０１１１】
特定の実施形態において、本発明は一部において、単独で、あるいは、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達システムを使用する任意の組合せのどちらかで、また、少なくともいくつかの局面では医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤と一緒に投与することができる細胞、キメラなサイトカイン受容体構築物、核酸分子および／またはベクターを意図する。ある特定の実施形態において、投与後、前記核酸分子またはベクターが対象のゲノムに安定に組み込まれる場合がある。
【０１１２】
具体的な実施形態において、ある特定の細胞または組織に対して特異的であり、前記細胞において持続するウイルスベクターが使用される場合がある。好適な医薬用の様々なキャリアおよび賦形剤が当技術分野では広く知られている。本開示に従って調製される組成物は、上記で特定された疾患の防止または処置または遅延化のために使用することができる。
【０１１３】
さらに、本開示は、腫瘍性疾患の防止、処置または改善のための方法であって、本明細書中で意図されるような、および／または、本明細書中で意図されるようなプロセスによって製造されるような、キメラなサイトカイン受容体分子を含んでいる細胞、核酸配列、ベクターの効果的な量を、その必要性のある対象に投与する工程を含む方法に関連する。
【０１１４】
例示的なキメラなサイトカイン受容体を含む細胞の組成物を投与するための可能な適応症が、腫瘍性疾患を含めて、ガン性疾患であり、これらには、乳房、前立腺、肺および結腸のガンまたは上皮ガン／ガン腫、例えば、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、頭頸部ガン、皮膚ガン、尿生殖路のガン（例えば、卵巣ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガンおよび腎臓ガン）、肺ガン、胃ガン、小腸のガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管のガン、食道ガン、唾液腺のガンおよび甲状腺のガンが含まれる。本開示の組成物の投与は、例えば、最小限の残存疾患、早期ガン、進行ガン、ならびに／あるいは、転移性ガンおよび／または難治性ガンの場合を含めて、ガンのすべての段階およびタイプについて有用である。
【０１１５】
本開示はさらに、免疫細胞を介して作用する他の化合物（例えば、二重特異性抗体構築物、標的化毒素または他の化合物）との共投与プロトコルを包含する。本発明の化合物を共投与するための臨床的療法は、他の成分を投与するのと同時での共投与、他の成分を投与する前での共投与、または、他の成分を投与した後での共投与を包含する場合がある。特定の併用療法には、化学療法剤（例えば、下記の第ＶＩＩ．Ａ．節で列挙される化学療法剤）、放射線、手術、ホルモン療法または他のタイプの免疫療法を、本明細書中に提供される、キメラなＴＧＦβ受容体を発現する細胞との組合せで使用することが含まれる。
【０１１６】
様々な実施形態が、上記で定義されるようなキメラなサイトカイン受容体構築物、上記で定義されるような核酸配列、上記で定義されるようなベクター、および／または、上記で定義されるような宿主を含むキットに関連する。本開示のキットは、本明細書中上記で記載されるような医薬組成物を、単独で、あるいは、医学的な処置または介入の必要性のある個体に投与されるためのさらなる医薬品との組合せでそのどちらかで含むこともまた意図される。
【０１１７】
例示として、ガン患者、あるいは、ガンに罹りやすいか、または、ガンを有することが疑われる患者が、下記のように処置される場合がある。本明細書中に記載されるように改変される細胞が個体に投与され、長期間にわたって保持される場合がある。個体は細胞の１回または複数回の投与を受ける場合があり、投与の間隔の時間設定は、数日、数週間、数ヶ月または数年の程度である場合がある。具体的な実施形態において、多数回の投与が、互いに数週間または数ヶ月のうちに、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間またはそれ以上のうちに、あるいは、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上のうちに行われる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞が、免疫認識を妨げるためにカプセル封入され、腫瘍の部位に置かれる。細胞が、本開示の細胞により最初に処置した後における腫瘍再発後の個体に与えられる場合、細胞は、異なる標的腫瘍抗原を認識するように変更される場合がある。例えば、最初の何回かの処置が、キメラなサイトカイン受容体と、特定の抗原について特異的である別の受容体とを含んでいる細胞を含むとき、その後の何回かの処置（腫瘍再発が存在するならば、腫瘍再発時を含む）では、異なる特定の抗原についての受容体が利用される場合がある。
【０１１８】
特定の場合において、個体には、キメラなＴＧＦβ受容体と、必要な場合には、２）ＣＡＲ、αβＴＣＲおよび／または抗原特異的受容体とを包含する治療用細胞の効果的な量が与えられる。細胞は、同時に、あるいは、１回または複数回の他のガン治療とは異なる時間で送達される場合がある。細胞および他のガン治療は、同じ配合物または別個の配合物において送達される場合がある。細胞および他のガン治療は別個の送達経路で個体に与えられる場合がある。細胞および／または他のガン治療は、例えば、腫瘍部位における注射によって、あるいは、静脈内送達または経口送達により送達される場合がある。そのような組成物のための様々な日常的送達経路が当技術分野では知られている。
【０１１９】
構築物により改変されている細胞はその後、選抜的条件のもとでの培養において成長させられ、その後、構築物を有するとして選抜される細胞が拡大され、そして、例えば、宿主細胞における構築物の存在を明らかにするためのポリメラーゼ連鎖反応を使用してさらに分析される場合がある。改変された宿主細胞が特定されると、改変された宿主細胞はその後、計画されるように使用される場合があり、例えば、培養で拡大される場合があり、または、宿主生物に導入される場合がある。
【０１２０】
細胞の性質に依存して、細胞は広範囲の様々な方法で宿主生物（例えば、哺乳動物）に導入される場合がある。細胞は、具体的な実施形態においては腫瘍の部位において導入される場合があるが、代替の実施形態において、細胞はガンに向かうか、または、ガンに向かうように改変される。用いられる細胞の数は、いくつかの状況、導入目的、細胞の寿命、使用されることになるプロトコル（例えば、投与回数）、細胞増殖能力および組換え構築物の安定性などに依存するであろう。細胞は、分散物として、一般には目的とする部位またはその近くに注入される分散物として適用される場合がある。細胞は、生理学的に許容される媒体において存在する場合がある。
【０１２１】
ＤＮＡ導入は組込みをどの場合においても生じさせる必要はない。状況により、導入されたＤＮＡの一過性の維持が十分である場合がある。このようにして、短期間の効果が、細胞が宿主に導入され、その後、所定の時間の後で、例えば、細胞が特定の部位に向かうことができた後で作用するようになることが可能となる場合には得ることができるかもしれない。
【０１２２】
細胞は、所望される通りに投与される場合がある。ある特定の実施形態において、療法パラメーターが、様々なプロトコルを使用して調整される場合がある。具体的な実施形態において、投与の経路または回数または時期、細胞の寿命、ならびに／あるいは、存在する細胞の数が変更される場合がある。投与回数は、例えば、少なくとも部分的には上記で記載される要因に依存する場合がある。
【０１２３】
系は多くの変数に左右されやすく、例えば、リガンドに対する細胞応答、発現効率、ならびに、該当する場合には分泌レベル、発現産物の活性、個体の特定の必要性（これは時間および状況とともに変化する場合がある）、および、細胞の喪失または個々の細胞の発現活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失速度などに左右されやすいことを理解しなければならない。したがって、それぞれの個々の患者について、全体として集団に投与することが可能であると思われる万能的な細胞がたとえ存在したとしても、それぞれの患者が当該個体のための適切な投薬量についてモニターされるであろうことが予想され、患者をモニターするそのような慣行は当技術分野では日常的である。
【０１２４】
具体的な実施形態において、本開示の方法の一部として用いられるスクリーニングアッセイ、または一部として用いられないスクリーニングアッセイがもたらされる。例えば、ある特定の実施形態において、生検試料が採取され、ＴＧＦβ産生のレベルが評価され、その結果、構築物が、生検試料が採取される個体において機能しているであろうかどうかが明らかにされる。具体的な実施形態において、アッセイ方法により、ＴＧＦβまたはある特定のレベルのＴＧＦβを検出可能に発現するガンが特定された。
【０１２５】
ＶＩ．本発明のキット
【０１２６】
本明細書中に記載される組成物のどれもがキットに含まれる場合がある。限定されない一例において、細胞療法において使用されるための、キメラなサイトカイン受容体を発現する細胞、ならびに／あるいは、組換え発現ベクターを含んでいる細胞療法における使用のための１つまたは複数の細胞を作製するための試薬が、キットに含まれる場合がある。キットの構成成分は、好適な容器手段において提供される。
【０１２７】
キットのいくつかの構成成分が、水性媒体において、または凍結乾燥形態でそのどちらかで包装される場合がある。キットの容器手段には一般に、構成成分が入れられることがある、好ましくは、好適に小分けして入れられることがある少なくとも１つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ビン、シリンジまたは他の容器手段が含まれるであろう。２つ以上の構成成分がキットに存在する場合、キットはまた一般には、さらなる構成成分が別々に入れられることがある第２、第３または他のさらなる容器を含有するであろう。しかしながら、構成成分の様々な組合せがバイアルに含まれる場合がある。本開示のキットはまた典型的には、構成成分を商用販売のための厳重な閉じ込めで含有するための手段を含むであろう。そのような容器には、所望されるバイアルが保持される射出成形されたプラスチック容器またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれる場合がある。
【０１２８】
キットの構成成分が１つおよび／または複数の液体溶液で提供されるとき、液体溶液は水溶液であり、無菌の水溶液が特に有用である。場合により、容器手段はそれ自体が、シリンジ、ピペットおよび／または他のそのような同様の装置である場合があり、ただし、この場合、そのような容器手段からの配合物が身体の感染領域に適用されることがあり、動物に注射されることがあり、ならびに／あるいは、それどころか、キットの他の構成成分に適用されることがあり、および／または、キットの他の構成成分と混合されることがある。
【０１２９】
しかしながら、キットの構成成分は、乾燥された粉末として提供される場合がある。試薬および／または構成成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成されることが可能である。溶媒もまた別の容器手段において提供される場合があることが想定される。キットはまた、無菌の医薬的に許容される緩衝剤および／または他の希釈剤を含有するための第２の容器手段を含む場合がある。
【０１３０】
本開示の特定の実施形態において、細胞療法のために使用されることになる細胞がキットにおいて提供され、また、場合により、そのような細胞がキットの本質的には唯一の構成成分である。キットは、所望される細胞を作製するための試薬および材料を含む場合がある。具体的な実施形態において、そのような試薬および材料には、所望される配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、好適な緩衝剤または緩衝剤試薬、塩などが含まれ、また、場合により、そのような試薬には、本明細書中に記載されるようなキメラなサイトカイン受容体および／またはそのための調節エレメントをコードするベクターおよび／またはＤＮＡが含まれる。
【０１３１】
特定の実施形態において、１つまたは複数のサンプルを個体から取り出すために、ならびに／あるいは、細胞を個体に送達するために好適である１つまたは複数の装置がキットには存在する。そのような装置はシリンジおよび外科用メスなどである場合がある。
【０１３２】
本開示のいくつかの場合において、キットは、細胞療法実施形態に加えて、例えば、第２のガン治療法、例えば、化学療法、ホルモン療法および／または別の免疫療法などを同様に含む。キットは個体のために特定のガンに合わせて調整される場合があり、また、当該個体のためのそれぞれの第２のガン治療法を含む場合がある。
【０１３３】
ＶＩＩ．併用療法
【０１３４】
本開示のある特定の実施形態において、臨床的局面のための本開示の方法は、過剰増殖性疾患の処置において効果的である他の作用因（例えば、抗ガン剤）と組み合わされる。「抗ガン」剤は、対象においてガンに負の影響を与えることが、例えば、ガン細胞を殺すこと、アポトーシスをガン細胞において誘導すること、ガン細胞の成長速度を低下させること、転移物の発生または数を減らすこと、腫瘍サイズを縮小させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍細胞またはガン細胞への血液供給を減らすこと、免疫応答をガン細胞または腫瘍に対して促進させること、ガンの進行を防止または阻害すること、あるいは、ガンを有する対象の寿命を増大させることによって可能である。より一般的には、これらの他の組成物が、細胞を殺すために、または細胞の増殖を阻害するために好適である併用量で与えられるであろう。このプロセスは、ガン細胞を同時に発現構築物および作用因または多数の因子と接触させることを伴う場合がある。このことが、細胞を、両方の作用因を含むただ１つの組成物または薬理学的配合物と接触させることによって、あるいは、細胞を同時に２つの異なった組成物または配合物（ただし、一方の組成物が発現構築物を含み、他方が第２の作用因を含む）と接触させることによって達成される場合がある。
【０１３５】
化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞耐性が臨床腫瘍学における大きな問題を表している。現在のガン研究の１つの目標が、化学放射線療法を他の治療法と組み合わせることによって化学放射線療法の効力を改善するための方法を見出すことである。本開示の関連において、細胞療法が、化学療法介入、放射線療法介入および／または免疫療法介入と併せて同様に使用され得るであろうことが意図される。
【０１３６】
代替において、本発明の細胞療法は、数分から数週間にまで及ぶ間隔によって他の作用因処置の前または後で行われる場合がある。他の作用因および本開示が個体に対して別々に適用される実施形態においては、かなりの期間がそれぞれの送達のときとの間において終了していなかったことが一般に保証されるであろうし、その結果、作用因および本発明の治療法が依然として細胞に対する好都合な併用効果を発揮することができるであろうようにされる。そのような場合、細胞が、互いに約１２時間〜２４時間のうちに、より好ましくは互いに約６時間〜１２時間のうちに両方の様式と接触させられることがあることが意図される。状況により、処置のための期間を著しく延ばすことが望ましい場合があり、しかしながら、この場合、数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）がそれぞれの施与の間で経過する。
【０１３７】
様々な組合せが用いられる場合がある。本開示が「Ａ」であり、二次的な作用因（例えば、放射線療法または化学療法など）が「Ｂ」である場合：
【０１３８】
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【０１３９】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【０１４０】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１４１】
処置サイクルは、必要に応じて繰り返されるであろうことが予想される。様々な標準的治療法、同様にまた、外科的介入が、本発明の細胞療法との組合せで適用される場合があることもまた意図される。
【０１４２】
Ａ．化学療法
【０１４３】
ガン治療法にはまた、化学剤処置および放射線に基づく処置の両方との様々な併用療法が含まれる。併用抗ガン剤には、例えば、下記のものが含まれる：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチマー（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴール（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；クロラムブシル；シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；デザグアニンメシラート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロマート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；エソルビシン塩酸塩；エストラルヌスチン（ｅｓｔｒａｒｎｕｓｔｉｎｅ）；リン酸エストラムスチンナトリム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン（ｆｌｕｏｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサンントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）塩酸塩；マソプロコル；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）；メツレデパ；ミチンド��ド（ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルホサート（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）ナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；セロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン；チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビンピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）；硫酸ビングリシナート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）；ボロゾール；ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩；２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン（ａｍｂａｍｕｓｔｉｎｅ）；アミドクス（ａｍｉｄｏｘ）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）；抗背側化形態形成タンパク質（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１；���アンドロゲン物質、前立腺ガン；抗エストロゲン物質；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節剤；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）；アタメスタン（ａｔａｍｅｓｔａｎｅ）；アトリムスチン（ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅ）；アキシナスタチン（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ）１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン（ａｌｅｔｈｉｎｅ）；ベタクラマイシン（ｂｅｔａｃｌａｍｙｃｉｎ）Ｂ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ビスアジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビスナフィド；ビストラテン（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅ）Ａ；ビゼレシン；ブレフラート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブロピリミン；ブドチタン（ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅ）；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロルルン類（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシン（ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン（ｃｏｎａｇｅｎｉｎ）；クラムベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシン（ｃｕｒａｃｉｎ）Ａ；シクロペンタアントラキノン類（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ）；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロジデンミン（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｎｍｉｎ）Ｂ；デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドクス（ｄｉｄｏｘ）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン（ｅｃｏｍｕｓｔｉ��ｅ）；エデルホシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン（ｆｌｅｚｅｌａｓｔｉｎｅ）；フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；ホルフェニメクス（ｆｏｒｆｅｎｉｍｅｘ）；ホルメスタン；ホストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモホシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ；ラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）−Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸；レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）；ロンブリシン（ｌｏｍｂｒｉｃｉｎｅ）；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサント
ロン；ロキソリビン；ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解性ペプチド；マイタンシン（ｍａｉｔａｎｓｉｎｅ）；マンノスタチン（ｍａｎｎｏｓｔａｔｉｎ）Ａ；マリマスタット；マソプロコル；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）；メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド（ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅ）；ミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）；モルグラモスチム；Ｅｒｂｉｔｕｘ；ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ；モピダモール；マスタード抗ガン剤；ミカペルオキシド（ｍｙｃａｐｅｒｏｘｉｄｅ）Ｂ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）；Ｎ−アセチルジナリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｌｉｎｅ）；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；ニルタミド；ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）；一酸化窒素調節剤；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ．ｓｕｐ．６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン（ｏｋｉｃｅｎｏｎｅ）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（ｏｒａｃｉｎ）；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オサテロン（ｏｓａｔｅｒｏｎｅ）；オキサリプラチン；オキサウノマイシン（ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）；パルミトイルリゾキシン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｈｉｚｏｘｉｎ）；パミドロン酸；パナキシトリオール（ｐａｎａｘｙｔｒｉｏｌ）；パノミフェン（ｐａｎｏｍｉｆｅｎｅ）；パラバクチン（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）；パゼリプチン（ｐａｚｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン（ｐｅｌｄｅｓｉｎｅ）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセタート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフ���ロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｅｄ）ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン（ｒｅｔｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）脱メチル化体；エチドロン酸レニウムＲｅ１８６；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノン（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅ）Ｂ１；ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）；サフィンゴール；サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプタート（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）；スピカマイシンＤ；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スプレノペンチン（ｓｐｌｅｎｏｐｅｎｔｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）１；スクアラミン；スチピアミド（ｓｔｉｐｉａｍｉｄｅ）；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン（ｓｕｌｆｉｎｏｓｉｎｅ）；超活性な血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；タリムスチン（ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅ）；タモキシフェンメチオジド（ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）；タウロムスチン；タザロテン；テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）；タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）；チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）；サイモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン（ｔｈｙｍｏｔｒｉｎａｎ）；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン（ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンチン（ｔｏｐｓｅｎｔｉｎ）；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド（ｔｕｒｏｓｔｅｒｉｄｅ）；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン類；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド（ｖａｐ��ｅｏｔｉｄｅ）；バリオリン（ｖａｒｉｏｌｉｎ）Ｂ；ベラレソル（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン類（ｖｅｒｄｉｎｓ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール；ザノテロン（ｚａｎｏｔｅｒｏｎｅ）；ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジラスコルブ（ｚｉｌａｓｃｏｒｂ）；およびジノスタチンスチマラマー、あるいは、前記の任意のアナログまたは派生変化体、しかもまた、それらの組合せ。
【０１４４】
具体的な実施形態において、個体のための化学療法が、例えば、本開示の施与の前、期間中および／または後において本開示とともに用いられる。
【０１４５】
Ｂ．放射線療法
【０１４６】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、これまで広く使用されている他の因子には、γ線、Ｘ線、および／または、腫瘍細胞への放射性同位体の指向送達として一般に知られているものが含まれる。ＤＮＡ損傷因子の他の形態もまた意図される（例えば、マイクロ波およびＵＶ照射）。これらの因子のすべてが、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、また、染色体の組立ておよび維持に対して広範囲の損傷をもたらすことが最も考えられる。Ｘ線についての適用線量範囲が、長期間（３週間〜４週間）にわたる５０レントゲン〜２００レントゲンの１日線量から、２０００レントゲン〜６０００レントゲンの単回線量までに及ぶ。放射性同位体についての適用線量範囲は広範囲に変化し、同位体の半減期、放射される放射線の強さおよびタイプ、ならびに、新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１４７】
用語「接触される（させられる）」および「さらされる」は、細胞に対して適用されるとき、治療用構築物および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達され、または標的細胞と直接に並置して置かれるプロセスを記載するために本明細書中では使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、両方の作用因が、細胞を殺すために、または、細胞が分裂することを妨げるために効果的である併用量で細胞に送達される。
【０１４８】
Ｃ．免疫療法
【０１４９】
免疫療法剤は一般には、ガン細胞を標的化し、破壊するための免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に依拠しており、また、キメラなサイトカインを発現する本開示の細胞とは別の免疫療法剤がある特定の実施形態においては使用される場合がある。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面における何らかのマーカーに対して特異的な抗体である場合がある。抗体は単独で治療のエフェクターとして役立つ場合があり、または、抗体は、細胞殺傷を実際に行うための他の細胞を補充する場合がある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲート化される場合があり、単に標的化剤として役立つ場合がある。代替において、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のどちらかで相互作用する表面分子を有するリンパ球である場合がある。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性のＴ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１５０】
したがって、本明細書中に記載される本発明の治療法とは異なる免疫療法が、現在の細胞療法と併せて併用療法の一部として使用され得るかもしれない。併用療法のための一般的な取り組みが下記で議論される。一般には、腫瘍細胞は、標的化を受け入れる何らかのマーカー、すなわち、大多数の他の細胞には存在しない何らかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのどれもが本開示の関連において標的化のために好適である場合がある。一般的な腫瘍マーカーには、ガン胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐ１５５が含まれる。
【０１５１】
ある特定の他の実施形態において、免疫療法は、例えば、ＤＬＬ４、ＮｏｔｃｈまたはＷｎｔ経路タンパク質に対する抗体の使用を含む。
【０１５２】
Ｄ．遺伝子
【０１５３】
さらに別の実施形態において、二次的処置が、治療用ポリヌクレオチドが本開示の臨床実施形態の前に、本開示の臨床実施形態の後で、または本開示の臨床実施形態と同時に施される遺伝子治療である。様々な発現産物が本開示の範囲内に包含され、これらには、細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害剤またはプログラム化細胞死の調節因子が含まれる。
【０１５４】
Ｅ．手術
【０１５５】
およそ６０％のガン患者が何らかのタイプの手術を受けるであろう。この場合、そのような手術には、予防的、診断的または病期分類、治療的および緩和的な手術が含まれる。治療的手術は、他の治療法と併せて、例えば、本開示の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法と併せて使用される場合があるガン処置である。
【０１５６】
治療的手術には、ガン性組織のすべてまたは一部が物理的に除かれる、摘出される、および／または破壊される切除が含まれる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を示す。腫瘍切除に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。本開示は、表在性ガン、前ガン物または偶発的量の正常組織の除去と併せて使用される場合があることがさらに意図される。
【０１５７】
ガン性の細胞、組織または腫瘍の一部またはすべてが摘出されるとき、空洞が体内に形成される場合がある。処置が、さらなる抗ガン治療法による領域の灌流、直接的注入または局所的適用によって達成される場合がある。そのような処置が、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎または７日毎に、あるいは、１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎および５週間毎に、または、１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、６ヶ月毎、７ヶ月毎、８ヶ月毎、９ヶ月毎、１０ヶ月毎、１１ヶ月毎もしくは１２ヶ月毎に繰り返される場合がある。これらの処置は同様に、様々な投薬量のものである場合がある。
【０１５８】
Ｆ．他の作用因
【０１５９】
他の作用因が、処置の治療効力を改善するために本開示との組合せで使用される場合があることが意図される。これらのさらなる作用因には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションのアップレギュレーションに影響を及ぼす作用因、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、または、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる作用因が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータおよびインターフェロンガンマ、ＩＬ−２および他のサイトカイン、Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ、または、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカインが含まれる。細胞表面受容体またはそれらのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）のアップレギュレーションは本開示のアポトーシス誘導能を過剰増殖性細胞に対するアートクリン影響またはパラクリン影響の確立によって増強するであろうことがさらに意図される。ＧＡＰジャンクションの数を高めることによる細胞間のシグナル伝達における増大は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の抗過剰増殖効率を改善するために本開示との組合せで使用することができる。細胞接着の阻害剤が、本開示の効力を改善するために意図される。細胞接着阻害剤の例には、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンが挙げられる。アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の作用因（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置効力を改善するために本開示との組合せで使用され得るかもしれないことがさらに意図される。
【実施例】
【０１６０】
下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本開示の実施において十分に機能すると本発明者らによって認められる技術を表しており、したがって、その実施のための様々な好ましい態様を構成すると見なされ得ることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は、多くの変化が、開示される具体的な実施形態において行われ得ること、そして、多くの変化により、同様な結果または類似する結果が依然として、本開示の精神および範囲から逸脱することなく得られ得ることを、本開示を考慮して理解しなければならない。
【０１６１】
実施例１
本開示の例示的な実施形態
図１は、阻害性の腫瘍微小環境に打ち勝つためにＴ細胞を武装化するための例示的な方法を例示する。本方法は、（例えば）ＴＧＦβからの阻害性シグナルを腫瘍特異的ＣＴＬの増殖のための正のシグナルに転換することを可能にする。この転換場所が、ＴＧＦβについての受容体において存在し、ただし、この場合、前記受容体では、サイトカイン受容体のエキソドメインが、前記シグナルをそれに代わって正のシグナルとして伝達するエンドドメインと一緒に用いられる。図２は、ＴＬＲ２のエンドドメインを用いるベクター（ＲＩＩＤ２）、または、ＴＬＲ４のエンドドメインを用いるベクター（これは本明細書中ではＲＩＩＤ４として示される）を含めて、キメラなＴＧＦβ受容体をコードすることによる本開示のために好適である例示的なベクターを提供する。ＴＧＦβ受容体のエキソドメインを含み、エンドドメインを何ら伴わないドミナントネガティブな受容体であるコントロールが示される。どのようなタイプのベクターであってもこのような発現構築物を含む場合があるにもかかわらず、レトロウイルスベクターが用いられた。
【０１６２】
図３は、ＤＮＲＩＩコントロール、ならびに、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４の例示的なキメラなＴＧＦβ受容体の生成を明らかにする。フローサイトメトリー画像は、特定のキメラな受容体（図３）を発現する細胞の百分率を明らかにする。
【０１６３】
図４Ａは、ドミナントネガティブなコントロールＤＮＲＩＩ、ならびに、ＲＩＩＤ２（ｍＯｒａｎｇｅにより標識される）およびＲＩＩＤ４（ＧＦＰにより標識される）の例示的なキメラなＴＧＦβ受容体と、ＰＳＣＡについて特異的である例示的な第二世代のキメラな抗原受容体（ＣＡＲ）との共発現を明らかにする。図４Ｂはさらに、ＲＩＩＤ４が、第二世代ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞において発現され得ることを明らかにする。
【０１６４】
図５は、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４が、ＴＧＦβにさらされるＣＡＲ改変Ｔ細胞を保護することを示す。健康な環境にあり、かつ、増殖中であるＴ細胞が、細胞のクラスターとして顕微鏡により可視化される（毎週の抗原刺激および５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１の投与；ＩＬ２の投与は行われない）。図５は、コントロールＤＮＲＩＩおよびＲＩＩＤ２が細胞のある程度のクラスター化をＴＧＦβ１の存在下において示すにもかかわらず、ＲＩＩＤ４細胞は、ＴＧＦβ１の非存在および存在を比較したときにはほとんど識別できないことを示す。
【０１６５】
図６Ａ〜図６Ｃは、抑制条件において、ＲＩＩＤ２改変Ｔ細胞およびＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞がＴＧＦβの存在下において保護されることを示す。図６Ａは、ＣＡＲのみを含んでいるコントロール細胞において、Ｔ細胞の増殖がＴＧＦβ１の存在下では特に速く低下することを明らかにする。ドミナントネガティブな受容体ＤＮＲの存在下において、増殖における低下が、より後の時間で生じている。図６Ｂでは、キメラなＴＧＦβ受容体のＲＩＩＤ２の存在により、増殖がＴＧＦβの存在下でさえ高まっている。ほぼ１００日の後でさえ、細胞はＴＧＦβの存在下において増殖する。図６Ｃもまた、キメラなＴＧＦβ受容体のＲＩＩＤ４の存在により、増殖がＴＧＦβの存在下でさえ高まることを示す。
【０１６６】
図７は、例示的なキメラなＴＧＦβ受容体のＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４を含んでいる細胞がＴＧＦβ１の存在下において選択されることを明らかにする。図８は、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４を含んでいる細胞は抗原刺激をそれらの拡大のために必要とすることを明らかにする。したがって、細胞が、腫瘍負荷を減らすことに成功しているときのインビボにおいて、その増殖が、具体的な実施形態においては低下するであろう。
【０１６７】
図９は、ＲＩＩＤ２およびＲＩＩＤ４が、例示的なＤＵ１４５前立腺ガン細胞に対する例示的なＰＳＣＡ  ＣＡＲの抗腫瘍効果を高めることを示す。
【０１６８】
実施例２
免疫抑制ＴＧＦ−βシグナルコンバーター
キメラな抗原受容体（ＣＡＲ）が形質導入されたＴ細胞は、ガンを処置するための有望なツールである。この治療様式を前立腺ガンに拡張するために、本発明者らは、腫瘍抗原ＰＳＣＡを標的とする第２世代のＣＡＲ（２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ）を作製した。これにより、細胞には、ＰＳＣＡ＋の前立腺腫瘍細胞を殺す能力がもたらされている（２０：１のＥ：ＴにおいてＤｕ１４５細胞の５１．７±１．２％の特異的溶解）。しかしながら、前立腺ガンを含めて多くの腫瘍が、インビボでのＴ細胞の増殖、活性化および機能を阻害するＴＧＦβを分泌する。本開示は、Ｔ細胞のこのインビボ制限を克服しなければならない当技術分野におけるこの要求に対処する。
【０１６９】
養子移入されたＴ細胞が、ＴＧＦβシグナルの伝達を阻止する短縮型のドミナントネガティブな受容体（ＤＮＲＩＩ）の遺伝子組換え発現によりＴＧＦβの阻害性影響から保護され得ることが以前に明らかにされている。本発明者らは本明細書中において、この戦略を、ＴＧＦβからの阻害性シグナルをＴ細胞のための活性化刺激に転換することによって拡張している。本発明者らは、例示的なｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４のエンドドメインに連結されるＴＧＦβＲＩＩのエキソドメインと、ＧＦＰとを発現するキメラなサイトカイン受容体（ＲＩＩＤ４）を作製した。
【０１７０】
本発明者らは、例示的なｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４のエンドドメインに連結されるＴＧＦβＲＩＩのエキソドメインと、ＧＦＰとを発現するキメラなサイトカイン受容体（ＲＩＩＤ４）を作製した。本発明者らは、ＲＩＩＤ４を用いて初代Ｔ細胞を形質導入し、６０日を超える培養にわたって安定であった６９．３±６．０％の形質導入を得た。
【０１７１】
ＲＩＩＤ４の遺伝子組換え発現がＴＧＦβから保護したかどうかを検討するために、本発明者らは、ドミナントネガティブなＤＮＲＩＩ受容体またはＲＩＩＤ４受容体のどちらかを共発現するように、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞を改変した。その後、これらのＴ細胞を、外因性のＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍＬ）を伴って、または伴うことなく、ＰＳＣＡ＋の腫瘍細胞（Ｋ５６２−ＰＳＣＡ）により毎週刺激した。ＴＧＦβ１の非存在下において、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ（ＤＮＲＩＩ）Ｔ細胞または２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ（ＲＩＩＤ４）Ｔ細胞は、３０日間にわたって類似したレベルで増殖した（それぞれ、６．４×１０２倍、２．５×１０３倍、５．９×１０３倍）。しかし、ＴＧＦβ１の存在下では、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞は拡大せず、培養が２週間以内に停止した。対照的に、ＤＮＲＩＩまたはＲＩＩＤ４の遺伝子組換え発現は細胞をこのサイトカインの阻害性影響から保護した（それぞれ、２週間の培養において７．４倍および２１倍）。長期間の違いがＤＮＲＩＩ改変細胞とＲＩＩＤ４改変細胞との間に存在したかどうかを明らかにするために、本発明者らは細胞の拡大をモニターし、ＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞のみがＴＧＦβ１の存在下において６０日超にわたって拡大することができ（３．０×１０５倍）、一方、ＤＮＲＩＩ細胞は培養において３０日後に収縮し始めたこと（０．７２倍）を見出した。ＴＧＦβ１の投与はまた、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ（ＲＩＩＤ４）Ｔ細胞を選択し、これにより、この遺伝子組換え細胞集団における経時的な（６３．６％から９３．３％への）富化を引き起こした。この改変は安全である。なぜならば、ＴＧＦβ１単独の投与は、遺伝子組換えＴ細胞の増殖を生じさせるためには不十分であり（０．０４倍）、また、抗原刺激の中断はＴ細胞の収縮をもたらした（０．０２倍）からである。最後に、この改変がＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善し得るかどうかを検討するために、本発明者らは、１×１０６個のホタルルシフェラーゼ−Ｄｕ１４５細胞（これはＰＳＣＡを発現し、ＴＧＦβ１を産生する）を、１×１０５個の２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ（ＤＮＲＩＩ）Ｔ細胞または２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ（ＲＩＩＤ４）Ｔ細胞と共培養した。６日後、ＲＩＩＤ４を発現するＴ細胞による腫瘍成長の優れた抑制が、ＤＮＲＩＩまたはＣＡＲだけの条件と比較して認められた（総流束がそれぞれ、９±０．１×１０９ｐ／ｓ、１０±１×１０９ｐ／ｓ、２０±１×１０９ｐ／ｓであった）。したがって、ＲＩＩＤ４は細胞をＴＧＦβの阻害影響から保護するだけではなく、このサイトカインシグナルを、刺激性であるシグナルに転換する。
【０１７２】
実施例３
腫瘍微小環境におけるキメラなサイトカイン受容体
ＴＧＦβが、少なくとも前立腺ガンを含めて、エフェクターＴ細胞の機能を抑制し、一方で、Ｔｒｅｇの発達を促進させることによってＴＧＦβが作用するガンの患者において高レベルで検出されている。野生型条件のもとでは、ＴＧＦβの会合はＳｍａｄ２／３のリン酸化をもたらし、これにより、何重にもなった阻害経路の引き金が引かれる（図１０Ａ）。腫瘍特異的Ｔ細胞に対するＴＧＦβの影響を評価するために、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞をＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）とともに培養し、ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）を週に２回投与した。予想されたように、これは、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞においてＳｍａｄ２／３のリン酸化をもたらし、細胞溶解機能を低下させた（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。加えて、ＴＧＦβ暴露は、部分的にはより大きい細胞死のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大における低下をもたらした（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。興味深いことに、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞のＴＧＦβへの暴露はまた、ＰＤ１のアップレギュレーションをもたらし、このことはＴ細胞の消耗を示唆していた（図１０Ｅ）。興味深いことに、ＴＧＦβ１はｐＳｍａｄ２／３をＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞において誘導していない（図１４）。
【０１７３】
ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞をＴＧＦβに対して武装化すること：キメラなサイトカイン受容体が、腫瘍特異的Ｔ細胞をＴＧＦβの免疫抑制影響から保護するために利用され得るかどうかを明らかにするために、ＴＧＦβのエンドドメインを免疫刺激性分子のエンドドメインの代わりに置換した。エンドドメインの１つの例が、自然免疫応答の重要な成分を構成するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーに由来する。特に、Ｔ細胞におけるＴＬＲ４シグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化を改善し、その一方で、共刺激の必要性を低下させることが明らかにされている。したがって、ＴＧＦβの阻害性シグナルを免疫刺激性のシグナルに変換するという目的により、ＴＧＦβＲのエンドドメインをＴＬＲ４のエンドドメインの代わりに置換した（これは本明細書中では「ＲＩＩＤ４」として示される）（図１１Ｂおよび図１２Ａ）。
【０１７４】
ＲＩＩＤ４の発現は、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＴＧＦβから保護する。
キメラなサイトカイン受容体が、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＴＧＦβから保護し得るかどうかを評価するために、ＴＧＦβＲの細胞外成分と、ＴＬＲ４の細胞内シグナル伝達ドメインとを発現するレトロウイルスベクターを作製した（ＲＩＩＤ４）。その後、この配列を、ＩＲＥＳを使用してＧＦＰと連結し、これにより、遺伝子組換えＴ細胞集団の検出を可能にした（図１２Ａ）。その後、活性化されたＴ細胞を、図１２Ｂに示されるように、ＲＩＩＤ４／ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。Ｔ細胞表面におけるＲＩＩＤ４の発現は、ＧＦＰとの受容体発現の直接的な相関によって例示されるように安定であった。構築物の保護特性を評価するために、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞におけるＲＩＩＤ４の共発現、および、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞のＴＧＦβ存在下での培養を行った。重要なことではあるが、ＲＩＩＤ４を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞のみが、図１２Ｃにおける培養物の写真によって示されるように、ＴＧＦβと共培養されたときに拡大することができた。予想されたように、ＣＡＲ  Ｔ細胞にＴＧＦβを投与することにより、ＰＤ１発現のアップレギュレーションが誘導された。対照的に、ＲＩＩＤ４構築物により改変されるＴ細胞はＰＤ１を発現せず、このことは、これらのＴ細胞における消耗がないことを示していた（図１２Ｄ）。
【０１７５】
本開示の実施形態により、キメラなサイトカイン受容体の標的範囲が拡大される。具体的な実施形態には、ＴＧＦβ受容体のエキソドメインを、図１３において例により示されるような異なる共刺激性分子のエンドドメインとともに発現するキメラなサイトカイン受容体の種々の並べ替え体の一群が含まれる。次に、これらの構築物のうちのどれが、Ｔ細胞の機能をＴＧＦβの存在下で高めることにおいて最も効率的であるかを特定することができ、また、そのような改変の組み込みが、抑制的なＴＧＦβ産生Ｔｒｅｇの機能を低下させることによって正のバイスタンダー効果をもたらし得るかどうかを明らかにすることができる。
【０１７６】
ベクターの作製および評価：様々な異なるＴＧＦβ／免疫刺激性エンドドメイン構築物（ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１）が当技術分野における標準的な組換え手段によって作製され得る。ＴＧＦβ受容体のエキソドメインとＴＬＲ４のエンドドメインとを発現するレトロウイルスベクターの一例（ＲＩＩＤ４）が図１２Ａに示される。このベクターをテンプレートの一例として使用して、さらなる配置物を、ＴＬＲ４の膜貫通ドメインおよびエンドドメインを、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、４１ＢＢおよびＣＤ２８／４１ＢＢにより置換することによってサブクローン化することができる。具体的な実施形態において、ベクターはまた、マーカー（例えば、ＧＦＰ）を共発現する場合がある。これらの異なるベクターがその後、Ｔ細胞における発現および機能について比較される場合がある。
【０１７７】
構築物の評価：これらの異なる構築物を、ＴＧＦβの阻害性シグナル伝達を取り消すための好適性について特徴づけるために、ウイルス上清を作製し、Ｔ細胞を形質導入することができる。タンパク質発現を、図１２Ｂに示されるようにＴＧＦβ受容体をＧＦＰ発現と相関させることによってフローサイトメトリー分析により評価することができる。遺伝子組換えによる機能を、例えば、Ｔ細胞の（ｉ）拡大、（ｉｉ）サイトカイン産生、（ｉｉｉ）エフェクターマーカー、記憶マーカーおよび消耗マーカーの発現を含む表現型プロフィル、ならびに、（ｉｖ）ＴＧＦβの存在下または非存在下における細胞溶解機能を比較することによって評価することができる。
【０１７８】
具体的な実施形態において、種々のＴＧＦβサイトカイン受容体構築物が、６０％を超える形質導入効率を達成することができる。具体的な実施形態において、これらの構築物は、フローサイトメトリー分析によって検出されるように、Ｔ細胞の表面に安定的に発現される。一般的な実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１構築物の様々な並べ替え体が、優れたＴ細胞の拡大、サイトカイン産生、表現型プロフィルおよび細胞溶解機能をＴＧＦβの存在下において示す。しかしながら、ある特定の実施形態においては共刺激性エンドドメインにおける違いのために、ＣＤ２８／４１ＢＢ構築物により改変されるＴ細胞は、ただ１つのエンドドメインを含有する受容体を発現する細胞よりも大きい拡大能を有する。ある特定の局面において、この高まった増殖能力は、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３のアップレギュレーションによって測定されるように、過剰活性化および細胞消耗を引き起こす。
【０１７９】
二重特異的ＣＴＬにおけるＴＧＦβＲ／Ｔｈ１のインビトロ機能およびインビボ機能が評価される場合がある。これらの研究は、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１が二重特異的ＣＴＬによって発現され得るかどうか、また、遺伝子組換えＣＴＬがそれらの増殖能力および抗腫瘍活性をＴＧＦβの存在下においてさえ維持するかどうかを示すことができる。ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１構築物の１つまたは複数がバイシストロン性レトロウイルスベクターに含まれる場合がある。具体的な一例において、バイシストロン性レトロウイルスベクターはＣＡＲ−ＰＳＣＡおよびＴＧＦβＲ／Ｔｈ１をコードする。
【０１８０】
ＣＴＬがそれらの機能および抗腫瘍活性をＴＧＦβの存在下で維持することを、例えば、刺激因子としてのＰＳＭＡおよびＰＳＣＡのペプミックス（ｐｅｐｍｉｘｅｓ）を用いるＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔを使用することによって、また、ＴＲＰＣ腫瘍をＴＧＦβの存在下において標的として使用する殺傷を、短期間の細胞毒性アッセイ（４時間のＣｒ５１アッセイ）、長期間の細胞毒性アッセイ（４日の共培養）において、ならびに、ＴＲＰＣ腫瘍保有マウスにおいて測定することによって確認することができる。
【０１８１】
特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１を発現する二重特異的ＣＴＬは、それらのそれぞれの標的（例えば、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡ）に対する抗原特異性を保持する。しかしながら、具体的な実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１を発現するＴ細胞のみがＴＧＦβの存在下において機能的であり、その結果、より強力なインビトロ抗腫瘍効果およびインビボ抗腫瘍効果をもたらす（表１）。
【０１８２】
表１：キメラなサイトカイン受容体を発現する二重ＣＴＬの予想された評価
【表１】
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【０１８３】
ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１のバイスタンダー効果の評価  レシピエントの免疫系に対する正のバイスタンダー効果をもたらすＴＧＦβＲ／Ｔｈ１の能力を、阻害性サイトカインを腫瘍微小環境から激減させることによって評価することができる。このことを評価するために、免疫抑制的な腫瘍環境を、ＴＧＦβを腫瘍部位において送達するであろうＴＧＦβ産生Ｔｒｅｇの自己移入を行うことによって動物モデルにおいて再現することができる。実験群が、（ｉ）二重ＣＴＬ−ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１、または、（ｉｉ）コントロールとしての二重ＣＴＬの２つに分けられる場合がある。Ｔ細胞処理の２週間後、マウスのコホートを屠殺して、ＴＧＦβの腫瘍内レベル、同様にまた、Ｔｒｅｇの数および機能を評価することができる。
【０１８４】
具体的な実施形態において、二重ＣＴＬ（単独）からのほんのわずかな抗腫瘍応答のみがＴｒｅｇの存在下において認められる（表２）。特定の実施形態において、また、対照的に、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１を発現する二重ＣＴＬによる処理は、Ｔｒｅｇの機能および永続性に影響を及ぼす腫瘍微小環境からのＴＧＦβのレベルを激減させ（表２）、これにより、全体的な高まった抗腫瘍応答をもたらす。
【０１８５】
表２：キメラなサイトカイン受容体を含む二重ＣＴＬによる結果の例
【表２】
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【０１８６】
ＲＩＩＤ４を含んでいるＴ細胞がＴＧＦβ１誘導のアポトーシスから保護される（図１５）；さらに、ＲＩＩＤ４はＰＤ１のアップレギュレーションを妨げ（図１６）、また、細胞溶解機能のＴＧＦβ１誘導による阻害を妨げる（図１７）。
【０１８７】
図１８は、ＲＩＩＤ４＋の細胞がＴＧＦβ１暴露によって選択され、これに対して、抗原およびＴＧＦβ１の中断が培養不良を引き起こすことを示す（図１９）。
【０１８８】
図２０は共培養実験設定の一例を例示する。
【０１８９】
図２１は、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４細胞が腫瘍をＴＧＦβ１の存在下において排除したことを明らかにする。
【０１９０】
図２２は、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞はＴＧＦβ１の存在下で増殖しなかったことを示す。
【０１９１】
図２３は、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４細胞は拡大することができ、抗原の存在に依存したことを明らかにする。図２４は、ＴＧＦβ１の投与により、２Ｇ．ＣＡＲ−ＰＳＣＡ／ＲＩＩＤ４  Ｔ細胞の増殖が促進されることを例示する。したがって、ＲＩＩＤ４改変Ｔ細胞はＴＧＦβ１をその増殖のために使用することができる。
【０１９２】
具体的な実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１のキメラなサイトカイン受容体が別のキメラなサイトカイン受容体とともに使用される場合がある。具体的な実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１のキメラなサイトカイン受容体が、ＩＬ４Ｒα／ＩＬ７Ｒ（４／７Ｒ）のキメラなサイトカイン受容体として同じ細胞において使用される。具体的な実施形態において、ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１のキメラなサイトカイン受容体と、さらなるキメラなサイトカイン受容体とにより、協同的なシグナル伝達がもたらされる。したがって、具体的な実施形態において、（ｉ）４／７Ｒ、（ｉｉ）ＴＧＦβＲ／Ｔｈ１、または、（ｉｉｉ）４／７ＲおよびＴＧＦβＲ／Ｔｈ１を発現する二重ＣＴＬが提供される。ある特定の実施形態において、４／７ＲおよびＴＧＦβＲ／Ｔｈ１の両方のキメラなサイトカイン受容体の使用により、相乗的な応答がもたらされる。
【０１９３】
本開示およびその利点が詳しく記載されているにもかかわらず、様々な変更、置換および変化が、添付された請求項によって規定されるような本開示の精神及び範囲から逸脱することなく本明細書中において行われ得ることが理解されなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は本開示の開示から容易に理解するであろうように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を成し遂げ、または実質的に同じ結果を達成するプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程は、現時点で存在するものであれ、または今後開発されることになるものであれ、本開示に従って利用される場合がある。したがって、添付された請求項は、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲の範囲内に包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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