(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール部位を含む標識化合物の調製のための方法であって、チオール部位を含む化合物を、式（Ｉ）：
【化１】
0006578275.tif 000108
式中、Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ：
−  水素原子、
−  Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
−  アリール基、
−  アルコキシ基、
−  ハロゲン原子、
−  アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、アルキル、アルケン、アルキンまたはアリール基である、
−  ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
−  ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
−  ニトロ（−ＮＯ２）基、
−  アジド（−Ｎ３）基、
−  ジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
−  マレイミド基、
−  アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、
−  アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、
−  ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
−  ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
−  ホスフィンまたはホスホニウム基、
−  イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
−  クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
−  −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
−  −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、過フッ素化エステルおよびアシルウレアから選択される活性化エステル、
−  −Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｎ基、ならびに
−  先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、場合により、リンカー基を通じてフェニル環に結合し、かつ、抗体、薬物、または蛍光プローブから選択される、タグ部位を含む；
の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化２】
0006578275.tif 000109
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、請求項１に定義されている通りである、
の化合物。
【請求項３】
以下：
【化３−１】
0006578275.tif 000110
【化３−２】
0006578275.tif 000111
【化３−３】
0006578275.tif 000112
からなる群から選択される、化合物。
【請求項４】
化合物が、以下：
【化４】
0006578275.tif 000113
からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）：
【化５】
0006578275.tif 000114
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、請求項１に記載の通りであり、Ｒ６−Ｓが、少なくとも１つのチオール部位を含むＲ６−ＳＨであるタンパク質に由来する；
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール部位を含む化合物を３−アリールプロピオニトリル化合物によって標識するための方法、タグ部位によって置換された３−アリールプロピオニトリル化合物、および特定の３−アリールプロピオニトリルリンカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトタンパク質の９０％超がシステインを含有する一方で、ヒトプロテオームのコンピュータ内消化では、質量分析（ＭＳ）によって検出可能な全てのヒトトリプシンペプチドのうち約１５％だけが、その配列において、少なくとも１種のシステインを含有することが明らかになった。この観察は、側鎖における高反応性チオール基の存在と組み合わされて、システインを化学標識の魅力的な標的にする。システインは、タンパク質に存在する傾向にあるあらゆる他の求核官能基の反応性を大幅に超える求核スルフヒドリル（またはチオール）基（−ＳＨ）を持つ唯一のコード化アミノ酸である。その結果、化学特異的なシステイン誘導体化は、間違いなく、タンパク質の化学的タグ付けのための最も広く用いられている方法である。これまで文献において報告されている膨大な量の化学的なシステイン修飾方法の中でも、Ｎ−置換マレイミド、４−ビニルピリジンおよびヨードアセトアミドなどの試薬が最も一般的に用いられている。これらはいずれも、この役割には適しているが、システイン標識のための理想的な方法ではないという欠点を持っている。かかる欠点は、主に、特にヨードアセトアミドおよびマレイミドに関する望ましくない副反応が存在すること、ならびに、可逆性のチオール交換および他の副反応に起因して、付加物が生体環境において不安定であるということである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物、例えばシステインを、タグ部位および３−アリールプロピオニトリル部位を含む化合物によって標識するための方法に関する。上記化合物およびシステイン誘導体を含むその付加物は、広範な条件において予想外の安定性を示す。そのため、本発明のチオール部位を含む化合物を標識するための方法は、広範な用途に用いられ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１目的は、チオール部位を含む標識化合物の調製のための方法であって、チオール部位を含む化合物を式（Ｉ）の化合物：
【化１】
0006578275.tif 000002
式中、Ｒ１〜Ｒ５は下記の通りであり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つがタグ部位を含む；と接触させることを含む方法である。
【０００５】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）：
【化２】
0006578275.tif 000003
式中、Ｒ１〜Ｒ５は以下に定義の通りであり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つがタグ部位を含む；の化合物である。
【０００６】
本発明の別の目的は、式（ＩＩ）：
【化３】
0006578275.tif 000004
式中、Ｒ１〜Ｒ５は以下に定義の通りであり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが水素原子とは異なる；の化合物である。
【０００７】
本発明の別の目的は、式（ＩＩＩ）：
【化４】
0006578275.tif 000005
式中、Ｒ６−Ｓは、上記で特定された、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物の部位に相当する；の化合物である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１：同濃度の化合物ＡおよびＢについてヒト血漿において得られた蛍光強度の経時的発展。
【図２ａ】図２ａ）：同濃度の化合物ＡおよびＢについてインセルロで得られた蛍光強度の経時的発展。
【図２ｂ】図２ｂ）：インセルロでの種々の時間における化合物Ｂ／化合物Ａの強度比。
【図２ｃ】図２ｃ）：化合物ＡおよびＢ、ＴＡＭＲＡの重ね合わせならびにヘキスト標識によって処理した細胞の顕微鏡写真。核の周囲の白色スポットは、加水分解されたプローブに相当する。Ａ−アリールプロピオニトリルプローブ、Ｂ−マレイミドプローブ。
【図３】図３：２５℃、１ｍＭの濃度におけるＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中のフェニルマレイミド（２）の加水分解のＨＰＬＣモニタリング；ピークは、最古から最新のものまで
【化５】
0006578275.tif 000006
に相当する；転換は、出発物質（ａ）の消失によってモニタリングした。反応の疑似一次速度定数は、ｌｎ（［フェニルマレイミド］）対時間をプロットし、線形回帰によって分析することにより求めた。この定数は、求めた傾きの絶対値（ｂ）に相当する。
【図４】図４：２５℃、１ｍＭの濃度におけるＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中のＮ−（４−（シアノエチニル）フェニル）アセトアミド（ｐＮＨＡｃ−ＡＰＮ、１１）の加水分解のＨＰＬＣモニタリング。転換は、出発物質の消失によってモニタリングした；ピークは、最古から最新のものまで
【化６】
0006578275.tif 000007
に相当する。アリールプロピオニトリル１１の検出不能な転換は、５時間のモニタリング後に観察した。
【図５】図５：化合物１、２、３、５、７、１１、１０および９についてのＭＴＴ試験結果。
【図６】図６ａ）：ＣＤ３８およびＣＤ３８Ａ２７５Ｃ突然変異体の概略構造および測定されたＤＬＳスペクトル；ｂ）：４９によるＣＤ３８Ａ２７５Ｃ修飾のスキーム；ｃ）得られたコンジュゲートのＤＬＳ（動的光散乱）スペクトル。
【図７】図７：精製前（ａ）および精製後（ｂ）の、本発明の化合物によっておよび対応するマレイミド化合物によって標識したＣＤ３８−Ｃ３７５突然変異体のゲル電気泳動。
【図８】図８：本発明の化合物による抗体−ＴＡＭＲＡコンジュゲートの調製のストラテジー、および対応するマレイミドとの比較。
【図９】図９：本発明の化合物（ＣＢＴＦ）によっておよび対応するマレイミド（ＳＭＣＣ）によってそれぞれ得られたコンジュゲートのゲル電気泳動。
【図１０】図１０：本発明の化合物によって得られたコンジュゲートの質量スペクトル。
【図１１】図１１：図１０の質量スペクトルの拡大。
【図１２】図１２：マレイミドによって得られた質量スペクトル。
【図１３】図１３：図１２の質量スペクトルの拡大。
【図１４】図１４：部分還元トラスツズマブに対する化合物５８の直接コンジュゲーションの一般スキーム。
【図１５】図１５：得られたコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、化合物５８が抗体に共有結合していることを示す。
【図１６】図１６：化合物３３および３４を用いた抗体フラグメントの再架橋の一般スキーム。
【図１７】図１７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、抗体フラグメントが、化合物３３および３４によって成功裏に架橋されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１目的は、チオール部位を含む化合物の標識のための方法であって、チオール部位を含む化合物を、式（Ｉ）：
【化７】
0006578275.tif 000008
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ：
−  水素原子、
−  Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
−  アリール基、
−  アルコキシ基、
−  ハロゲン原子、
−  アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、以下に定義するアルキル、アルケン、アルキンまたはアリール基である、
−  ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
−  ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
−  ニトロ（−ＮＯ２）基、
−  アジド（−Ｎ３）基、
−  場合により対イオンの存在下にジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
−  マレイミド基、
−  アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、式中、Ｒは、上記の通りである、
−  アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、式中、Ｒは、上記の通りである、
−  ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
−  ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
−  ホスフィンまたはホスホニウム基、
−  イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
−  クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
−  −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
−  活性化エステル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、式中、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロスクシンイミジル、過フッ素化エステル、およびアクリルウレアを表す、
−  −Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｎ基、
−  タグ、ならびに
−  先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、タグ部位を含み、好ましくはタグ部位であり、
代替的には、Ｒ１〜Ｒ５のうち２つが、これらが連結するフェニル環の炭素原子と一緒になって、少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＰ、ＯまたはＳを場合により含む、飽和、不飽和または芳香族の単または多環式環を形成していてよい；
の化合物と接触させることを含む方法である。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物から構成されているタグ部位は、フェニル環に直接結合していてよい。また、該タグ部位は、「リンカー」基、例えばＣＯＯ、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ、トリアゾール、またはＣＯＮＨ基を通してフェニル環に結合していてもよい。また、該タグ部位は、上記のＲ１〜Ｒ５基の１つの置換基として存在していてもよい。好ましい実施形態において、Ｒ３は、タグ部位を含み、Ｒ３は、好ましくはタグ部位である。
【００１１】
本発明において、用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、特に１〜３個の炭素原子を含む線状、環状または分枝状炭化水素基に関する。アルキル基の中でも、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびシクロヘキシル基を挙げることができる。本発明によるアルキル基は、Ｓｉ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子によって中断されていてよい。少なくとも１つのヘテロ原子によって中断されたアルキル基の中でも、式−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨ：式中、ｎは１〜１０００、好ましくは１〜１００、特に１〜８である；のポリエチレングリコール基を挙げることができる。本発明によるアルキル基は、少なくとも１つのハロゲン原子によって置換されていてよい。
【００１２】
用語「アルケン」は、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合をさらに含む、先に定義したアルキル基に関する。
【００１３】
用語「アルキン」は、少なくとも１つのＣ≡Ｃ三重結合をさらに含む、先に定義したアルキル基に関する。アルキン基の中でも、例えば、アセチレンおよびシクロオクチン基を挙げることができる。
【００１４】
用語「アルコキシ」は、分子の残部に酸素原子を介して連結している、先に定義したアルキル基に関する。
【００１５】
用語「アリール」は、二重結合および／または非結合二重項からなる共役π系を含む少なくとも１つの平面環を含む基であって、該環の各原子がｐ軌道を含んでおり、ｐ軌道が、互いに重複しており、π電子の非局在化が分子エネルギーを低下させる、上記基に関する。好ましくは、アリール基は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を場合により含む炭化水素アリール基である。好ましくは、アリール基は、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ジヒドロイソオキサゾリル、トリアゾリル、ジアジニル、テトラジニル、ピラゾリルおよびナフチル基からなる群から選択される。特に、アリール基は、オキサゾリル、ジヒドロオキサゾリル、トリアゾリル、ジアジニル、テトラジニルおよびピラゾリル基からなる群から選択される。
【００１６】
用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ原子からなる群から選択される原子に関する。好ましくは、ハロゲンは、ＣｌまたはＢｒ原子である。
【００１７】
化合物の光学および幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、塩、水和物、溶媒和物ならびにこれらの混合物も、本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の範囲に包含される。
【００１８】
本発明の化合物は、塩の形態であるとき、好ましくは薬学的に許容可能な塩である。かかる塩として、薬学的に許容可能な酸付加塩、薬学的に許容可能な塩基付加塩、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩として、無機酸および有機酸の塩が挙げられる。好適な無機酸の代表例として、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。好適な有機酸の代表例として、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩などが挙げられる。薬学的に許容可能な無機または有機酸の酸付加塩のさらなる例として、J.Pharm.Sci.1977,66,2に列挙されている薬学的に許容可能な塩が挙げられる。好ましくは、当該塩は、いずれのチオール部位も含まない。
【００１９】
「対イオン」は、ジアゾニウム基の電荷を補償するのに適切ないずれのイオンであってもよく、当業者によって容易に選択され得る。例えば、対イオンは、ハロゲン化物、ＢＦ４−、ＮＯ３−、ＨＳＯ４−、ＰＦ６−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｎ（ＳＯ２ＣＦ３）２−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＣＯＯ−，（ＣＨ３Ｏ）（Ｈ）ＰＯ２−およびＮ（ＣＮ）２−からなる群から選択されてよい。
【００２０】
本発明において、ヒドロキシル（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ２またはＮＨＲ）およびカルボキシル（ＣＯＯＨ）基は、適切な保護基によって保護されていてよい。T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,New York,1999を参照することができる。
【００２１】
ヒドロキシル基のための保護基の中でも、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびトリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）を挙げることができる。
【００２２】
アミノ基のための保護基の中でも、カルバミン酸ｔ−ブチル（Ｂｏｃ）、カルバミン酸２−トリメチルシリルエチル（Ｔｅｏｃ）、カルバミン酸１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチル（Ａｄｐｏｃ）、カルバミン酸１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチル（Ｂｐｏｃ）、カルバミン酸１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチル（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、カルバミン酸１−アダマンチル（Ａｄｏｃ）、カルバミン酸ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｚ）、カルバミン酸９−アントリルメチル、カルバミン酸ジフェニルメチル、カルバミン酸９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、カルバミン酸９−（２−スルホ）フルオレニル(Fluoroenyl)メチル、カルバミン酸９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチル、カルバミン酸２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチル（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、カルバミン酸２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミド）エチル、カルバミン酸２−ホスホリノ(Phosphonio)エチル（Ｐｅｏｃ）、カルバミン酸２−フェニルエチル、カルバミン酸ベンジル（Ｃｂｚ）、カルバミン酸アリル（Ａｌｌｏｃ）、カルバミン酸１−イソプロピルアリル（Ｉｐａｏｃ）、カルバミン酸４−ニトロシンナミル（Ｎｏｃ）、カルバミン酸８−キノリルおよびＮ−フタルイミドを挙げることができる。
【００２３】
カルボキシル基のための保護基の中でも、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、シリルエステル、２，６−ジメチルフェノール、２，６−ジイソプロピルフェノール、および２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールを挙げることができる。
【００２４】
用語「タグ」または「タグ部位」は、以下のうち１つまたはいくつかを可能にするのに適切な化学基に関する：
−  化合物の検出、
−  化合物による対象薬剤のベクトル化、
−  化合物の可溶化、
−  化合物の安定化、
−  化合物の抽出および／または精製の改善、
−  化合物のＡＤＭＥ（投与、分布、代謝、排泄）パラメータの少なくとも１つの変更；
−  化合物への生物活性の付加；
−  クリック化学のための適切な官能性の付加。
【００２５】
したがって、かかるタグを含む、本発明の化合物は、検出、対象薬剤のベクトル化、可溶化、安定化、抽出および／もしくは精製の改善、ＡＤＭＥ（投与、分布、代謝、排泄）パラメータの少なくとも１つの変更；生物活性の付加；ならびに／またはクリック化学のための適切な官能性の付加のためのツールとして用いられ得る。
【００２６】
本発明の化合物の検出を可能にするのに適切な化学基は、当業者に公知のいずれの分析技術によっても同定および／または定量化され得るいずれの化学基であってもよい。検出のためのタグの中でも、蛍光、例えば蛍光プローブ、例えばフルオレセイン、量子ドット、シアニン染料Cy3（登録商標）およびCy5（登録商標）、Alexa Fluor（登録商標）染料、Dylight fluor（登録商標）染料、IRIS（登録商標）染料、Seta（登録商標）染料、SeTau（登録商標）染料、SRfluor（登録商標）染料、Square（登録商標）染料、Nile red、FL[AM1]またはカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）タグ、例えばキセノンまたはランタノイド（特にテルビウムＴｂまたはユーロピウムＥｕ）；磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）造影剤、例えばＧｄキレート；質量分析タグ、例えばトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム（ＴＭＰＰ）または同位体コード化タグ；赤外（ＩＲ）タグ；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）タグ；単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）タグ；三重水素または重水素原子；顕微鏡タグ、例えば金ナノ粒子；消光剤、例えばダブシル（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）を挙げることができる。
【００２７】
本発明の化合物によって対象薬剤のベクトル化を可能にするのに適切な化学基は、化合物および／または対象薬剤が適切な組織または器官、例えば肝臓または膀胱に到達するのを助けるのに適切ないずれの化学基または生体部位であってもよい。例えば、ベクトル化タグは、ミセル、逆ミセルもしくはリポソーム、例えば両親媒性化学基、ナノもしくはミクロ粒子、ウイルスベクター、ポリマー、フォレート、アンモニウム基、ペプチド、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）リガンドまたは抗体を形成することができる化学基であってよい。
【００２８】
化合物の安定化を可能にするのに適切な化学基は、好ましくはインビボで化合物の半減期の増加を提供する化学基である。例えば、安定化タグは、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンＨＡＳまたはウシ血清アルブミンＢＳＡであってよい。
【００２９】
化合物のＡＤＭＥパラメータの変更を可能にするのに適切な化学基は、例えば、治療剤、薬物、プロドラッグ、式−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＲ”のポリエチレングリコール（式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基であり、ｎは、１〜１０００、好ましくは１〜１００、特に１〜８である）、ペプチド、例えばプロリン−アラニン−セリン（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）またはポリ−Ｇｌｕ、ポリペプチド、例えばＸＴＥＮ組み換えポリペプチド、脂質、例えばパルミチン酸、炭化水素、ヒドロキシエチルデンプン、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡであってよい。用語「プロドラッグ」は、薬物にインビボで変換可能な薬物の変異体に関する。用語「ペプチド」は、１〜２０、好ましくは１〜１０のアミノ酸を含むペプチドに関する。
【００３０】
適切なタグの選択、例えば、エチレングリコール部位の数の決定は、所望のＡＤＭＥの変更に応じて当業者によって容易に調整され得る。
【００３１】
化合物の抽出および／または精製を可能にするのに適切な化学基は、本発明の化合物の抽出および／または精製を好ましいものにするおよび／または促進するいずれの化学基であってもよい。抽出および／または精製タグの中でも、ビオチン、キレートタグ、例えばＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）およびＤ４（オクタメチルシクロテトラシロキサン）、タンパク質タグ、例えばポリアルギニンもしくはポリヒスチジンタグ、好ましくはＨｉｓ６またはＨｉｓ１０タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、ＳＢＰ−タグ、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡおよびＤｓｂＡタグ、ボロン酸タグ、例えば［（３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（イミノメチレン−２，１−フェニレン）］ビス−（９Ｃｌ）、パーフルオロアルキル基、イオン性（カチオン性またはアニオン性）基、例えばアンモニウム基、ならびに固体表面、例えばポリマー材料、特にポリエチレンビーズ、ナノ粒子、特に磁気ナノ粒子、チップ、シリカビーズまたはシリカウェハを挙げることができる。
【００３２】
生物活性の付加に適切な化学基は、少なくとも１つの放射性同位体、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、もしくは１５３Ｓｍを含む化学基、またはこれらの誘導体であってよい。
【００３３】
クリック化学における反応に適切な化学基は、例えば、アジド（例えば、Ｎ３）および歪みアルキン、特に環状アルキンからなる群から選択される化学基であってよい。環状アルキンの中でも、例えば、ビシクロノニン（ＢＣＮ）およびテトラメチルチエピニウム（ＴＭＴＩ）部位を挙げることができる。
【００３４】
実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ：
−  アルキン基、
−  アミノ基、
−  ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
−  ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
−  アジド（Ｎ３）基、
−  好ましくは対イオンの存在下にジアゾニウム（Ｎ２＋）基、
−  マレイミド基、
−  カルボン酸基、
−  アルデヒド（−ＣＨＯ）基、
−  ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は上記の通りである、および
−  活性化エステル；からなる群から独立して選択される。
【００３５】
好ましい実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のいずれもが、遊離ＳＨ基を含まない。好ましい実施形態において、Ｒ１および／またはＲ５は、アミノ基、ヒドロキシルアミン基、ヒドラジン基またはヒドロキシル基などのいずれの求核基も含まない。
【００３６】
特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のうち１、２、３、４または５つが、水素原子とは異なる。
【００３７】
特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、チオール（ＳＨ）部位、アミン（ＮＨ２）部位およびカルボン酸（ＣＯＯＨ）部位からなる群から選択される化学基との共有結合をさらに形成するのに適切な少なくとも１つの部位を含む。チオール部位との共有結合を形成するのに適切な部位の中でも、マレイミド部位を挙げることができる。アミン部位との共有結合を形成するのに適切な部位の中でも、ＮＨＳ−エステル部位を挙げることができる。
【００３８】
本発明の式（Ｉ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：
【化８−１】
0006578275.tif 000009
【化８−２】
0006578275.tif 000010
【化８−３】
0006578275.tif 000011
【００３９】
式（Ｉ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることもできる：
【化９−１】
0006578275.tif 000012
【化９−２】
0006578275.tif 000013
【化９−３】
0006578275.tif 000014
【化９−４】
0006578275.tif 000015
【００４０】
本発明の化合物の合成
本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、例えば薗頭カップリングを介してプロパルギルアルコールとのカップリングによって、例えば、対応するヨードアレーンから二工程で合成され得る。カップリングには、好ましくは酸化が続く；例えば、酸化は、アンモニア溶液の存在下にＭｎＯ２によって実施されるタンデム酸化であってよい。代替的には、本発明の化合物は、アリールアルキンのシアノ化によって合成され得る。シアノ化は、例えば、ＣｕＣＮ、アリールイソシアネート、シアノベンゾトリアゾールまたはシアノイミダゾールによって実施されてよい。
【００４１】
少なくとも１つのチオール部位を含む化合物の標識
式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１つのチオールＳＨ部位を含む化合物を標識するための方法において用いられ得る。好ましくは、本発明の方法は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つのチオールＳＨ部位を含む化合物、またはかかる化合物を含む傾向にあるサンプルと接触させることを含む。好ましくは、サンプルは、生体サンプル、特に水性サンプルである。
【００４２】
本発明において用語「標識」は、チオール部位の硫黄原子と式（Ｉ）の化合物のプロピオニトリル部位との間の共有結合の形成を称する。
【００４３】
チオール部位（Ｒ６−ＳＨ化合物）を含む化合物は、例えば、フルオロフォア、消光剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、薬物、プロドラッグおよび／または薬物代謝産物であり得る。
【００４４】
Ｒ６は、チオール（ＳＨ）基に結合して「チオール部位を含む化合物」を形成するいずれの化学基であってもよい。Ｒ６は、炭素、水素、酸素、窒素、リン、および／または硫黄原子を好ましくは含む。
【００４５】
特に、チオール部位を含む化合物は、システイン、または誘導体、例えばそのエステル、または少なくとも１つのシステイン残基を含むペプチドもしくはンパク質であり得る。代替的には、チオール部位を含む化合物は、少なくとも１つの遊離ＳＨ基を与える表面であってよい。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、多数の用途に用いられ得る。
【００４７】
第１実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、サンプルにおけるチオール部位を含む化合物の検出および／または定量化に用いられ得る。検出とは、本発明では、サンプルにおいて所望の化合物の有無を特定することを意味する。サンプルは、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物を含む傾向にあるいずれのサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、生体サンプル、例えば、生体液、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿など、天然産物の抽出物、生体組織、もしくはその一部、または細胞を含む媒体であってよい。
【００４８】
第２実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、チオール部位を含む化合物の、その物理化学特性を改善する部位によるコンジュゲーションに用いられ得る。例えば、コンジュゲート部位は、チオール部位を含む化合物の溶解度を改善し、またはその合成および／もしくは精製を改善することができる。
【００４９】
第３実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、チオール部位を含む化合物の、対象化合物、例えば薬物、プロドラッグ、炭化水素またはタンパク質によるバイオコンジュゲーションに用いられ得る。
【００５０】
例えば、タグとして対象化合物を含む式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物に対する対象化合物の選択的ベクトル化および／または結合を可能にすることができる。
【００５１】
本発明の別の目的は、記載した特定の実施形態を含めた、先に定義した式（Ｉ）：
【化１０】
0006578275.tif 000016
の化合物である。
【００５２】
また、本発明は、式（ＩＩ）：
【化１１】
0006578275.tif 000017
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ：
−  水素原子、
−  Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
−  アリール基、
−  アルコキシ基、
−  ハロゲン原子、
−  アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、または先に定義したアルキル、アルケン、アルキンもしくはアリール基である、
−  ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
−  ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
−  ニトロ（−ＮＯ２）基、
−  アジド（−Ｎ３）基、
−  好ましくは対イオンの存在下にジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
−  マレイミド基、
−  アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、
−  アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、
−  ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
−  ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
−  ホスフィンまたはホスホニウム基、
−  イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
−  クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
−  Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
−  活性化エステル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、過フッ素化エステルおよびアクリルウレア、
−  タグ、ならびに
−  先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基；からなる群から独立して選択される；
の化合物も開示する。
【００５３】
式（ＩＩ）の化合物は、上記のように少なくとも１つのタグが付加されて式（Ｉ）の化合物を形成することができるリンカーである。
【００５４】
本発明の式（ＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：
【化１２−１】
0006578275.tif 000018
【化１２−２】
0006578275.tif 000019
【００５５】
本発明の式（ＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることもできる：
【化１３−１】
0006578275.tif 000020
【化１３−２】
0006578275.tif 000021
【化１３−３】
0006578275.tif 000022
【００５６】
本発明のチオール部位を含む化合物を標識するための方法は、チオール部位を含む化合物を式（Ｉ）の化合物と接触させる工程の前に、式（ＩＩ）の化合物を、タグ部位を含む化合物またはその前駆体と接触させる、式（Ｉ）の化合物の調製の予備工程をさらに含むことができる。
【００５７】
用語「前駆体」は、この場合、式（ＩＩ）の化合物との接触の後に、タグ部位を形成することができる化学基を称する。
【００５８】
好ましくは、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、水素原子とは異なる。
【００５９】
本発明の目的は、式（ＩＩ）：式中、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、マレイミド、アジド（Ｎ３）基、アルキンまたはＮＨＳ−エステル部位を含み、好ましくは、マレイミド、アジド（Ｎ３）基、アルキンまたはＮＨＳ−エステル部位である；の化合物である。
【００６０】
マレイミドおよびＮＨＳ−エステル部位は、それぞれ、化合物の、別のチオールまたはアミン基へのさらなる連結を可能にし；Ｎ３基は、化合物の、別のアルキン基へのさらなる連結を可能にし、アルキン基は、化合物の、別のＮ３基へのさらなる連結を可能にする。
【００６１】
実施形態において、本発明の式（ＩＩ）の化合物は、以下の化合物から選択される：
【化１４】
0006578275.tif 000023
【００６２】
本発明はまた、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物であって、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、対象化合物にさらに結合している、上記化合物にも関する。
【００６３】
対象化合物は、例えば、分子、例えば、フルオロフォア、例えばローダミン、少なくとも１つの放射性原子（例えば１４Ｃ、３Ｈ、もしくは１３１Ｉ）を含む原子の基、公知のマス（マスタグ）の原子の基、リガンド、薬物、治療剤、生体分子、例えば抗体、タンパク質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＤＮＡフラグメント、ナノ対象物、例えばナノ粒子（すなわち、０．１〜１０００ｎｍの対象物または粒子）、または支持体、例えばポリマーであってよい。
【００６４】
本発明の標識方法が、かかる式（Ｉ）または（ＩＩ）：式中、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが対象化合物にさらに結合している；の化合物によって実施されるとき、該方法は、対象化合物とチオール部位を含む化合物との間のコンジュゲートの形成を提供する。
【００６５】
実施形態において、対象化合物は、生体分子、例えばタンパク質または抗体であり、チオール部位を含む化合物は、フルオロフォア、例えばＴＡＭＲＡ部位およびチオール部位を含む化合物（ＴＡＭＲＡ−ＳＨ）である。
【００６６】
実施形態において、対象化合物は、生体分子、例えばタンパク質または抗体であり、チオール部位を含む化合物は、薬物または治療剤である。本発明の標識方法によって得られるコンジュゲートは、治療抗体である。
【００６７】
本発明の別の目的は、式（ＩＩＩ）：
【化１５】
0006578275.tif 000024
式中、Ｒ６−Ｓは、先に定義した少なくとも１つのチオール部位を含む化合物の部位に相当する；の化合物である。特に、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）：
【化１６】
0006578275.tif 000025
式中、Ｒ７およびＲ８は、ＯＨ、タグ、アルキル、Ｏ−アルキル、およびペプチド部位からなる群から選択され、アルキル基は、少なくとも１つのタグ部位によって置換されていてよい；を含む。ペプチド部位は、少なくとも１つのアミノ酸を含む部位であり、該部位が、１を超えるアミノ酸（２、３、４、５、・・・）を与えるとき、該アミノ酸は、ペプチド結合によって互いに連結している。好ましくは、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の二重結合は、（Ｚ）配置を有する。タグおよびアルキル基は、先に定義した通りである。
【００６８】
本発明の式（ＩＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：
【化１７】
0006578275.tif 000026
【００６９】
式（Ｉ）の化合物は、チオール部位の標識に古典的に用いられている、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位で置き換えられている対応する化合物よりも、水性媒体中でより安定であることが驚くべきことに見出された。例えば、化合物１：
【化１８】
0006578275.tif 000027
は、緩衝溶液（ｋｏｂｓ＝７×１０−５ｓ−１）中、１時間後に約５％が加水分解されたが、化合物１１：
【化１９】
0006578275.tif 000028
に関する加水分解は検出され得なかった。興味深いことに、室温において１週間後でさえも、化合物１１に関して微量の加水分解生成物も検出され得なかった。
【００７０】
また、本発明の式（ＩＩ）の化合物は、遊離チオール部位を含まない他のアミノ酸と比較して、システインに対して顕著な選択性を示した。比較すると、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位によって置き換えられている対応する化合物に関して得られた化学選択性の方が低い。
【００７１】
最後に、上記の式（ＩＩＩ）の化合物は、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位によって置き換えられている対応する化合物よりも、生体条件において、高度により安定であることが示された。例えば、化合物：
【化２０】
0006578275.tif 000029
と、システイン誘導体３：
【化２１】
0006578275.tif 000030
との間の付加物：
【化２２】
0006578275.tif 000031
は、広範な条件、例えば生理的条件において特に安定であった。特に、上記付加物は、広範なｐＨ（０〜１４）において安定であり、過剰のフェニルチオールおよびグルタチオンとの反応の１時間後にも、交換生成物が観測され得なかった。
【００７２】
本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されると見なされると理解されてはならない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：本発明の化合物の合成
式（ＩＩ）の化合物の合成
式（Ｉ）または（ＩＩ）の一連の化合物を以下の手順に従って合成し、特性決定した。
【００７４】
一般的なプロトコール：
薗頭カップリング
【化２３】
0006578275.tif 000032
標準の反応プロトコール：
Ａ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１０当量、１０ｍｍｏｌ）脱気溶液に、予め混合したＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．０３当量、３０μｍｏｌ）およびＣｕＩ（０．０６当量、６０μｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を脱気し、さらに５分間撹拌し、続いてプロパルギルアルコール（１．２当量、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊を１〜２４時間撹拌した（ＴＬＣによってモニタリングした）。１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）を添加し（遊離アミノ基を含有するときには、代わりに５０ｍＬの水を添加し）、反応混合物を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル画分を水で洗浄し（１×１０ｍＬ）、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて粗生成物を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【００７５】
Ｂ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）およびＴＥＡ（５ｍＬ）脱気溶液に、予め混合したＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．０３当量、３０μｍｏｌ）およびＣｕＩ（０．０６当量、６０μｍｏｌ）を添加し、続いてプロパルギルアルコール（２当量、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊を１〜２４時間撹拌した（ＴＬＣによってモニタリングした）。ＴＨＦおよびＴＥＡを蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【００７６】
Ｃ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のプロピルアミンまたはピロリジン（３ｍＬ）脱気溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０５当量、５０μｍｏｌ）を添加した。反応塊を一晩加熱し（３０〜５０℃）、蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【００７７】
高活性なＭｎＯ２の調製
７０℃のＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１当量、１モル、２００ｇ）の水（２Ｌ）溶液を、フードにおいて６０℃でＫＭｎＯ４（１当量、１モル、１６０ｇ）の水（２Ｌ）溶液に撹拌しながら１０分間で徐々に添加した。激しい反応により、結果として塩素が発生した；懸濁液を２時間撹拌し、室温で一晩保持した。沈殿を濾去し、ｐＨが６．５〜７となるまで水（４Ｌ）で完全に洗浄し、この洗浄により、無視できるほどの塩化物試験を与えた。次いでフィルタケーキを１２０〜１３０℃で１８時間乾燥させ；これにより、チョコブラウン色の高分散アモルファス粉末を得た。
【００７８】
ＭｎＯ２酸化
【化２４】
0006578275.tif 000033
McAllisterら８２４によって記載された、僅かに変更された手順。適当なプロパルギルアルコール（１当量、１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．５ｍＬ）溶液に、ＭｇＳＯ４（１５当量、１５ｍｍｏｌ）、高活性なＭｎＯ２（２５当量、２５ｍｍｏｌ）および２Ｍ  ＮＨ３のＩＰＡ（４当量、４ｍｍｏｌ、２ｍＬ）溶液を添加した。得られた反応塊を室温で０．５〜１２時間激しく撹拌した（ＴＬＣによってモニタリングした）。ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し、得られた反応塊をセライトを通して濾過し、蒸発させて粗生成物を得、必要に応じてフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
【００７９】
置換３−（アリール）プロプ−２−イン−１−オール（１ａ−１２ａ）：
【化２５】
0006578275.tif 000034
【表１】
0006578275.tif 000035
【００８０】
３−（２−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１ａ）。
反応時間：１８時間；収率：７２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．５，７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．３３（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８６−６．９３（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６１．６，１３４．５，１３１．０，１２１．５，１１３．４，１１２．０，９２．７，８２．０，５６．２，５１．５。
【００８１】
３−（３−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（２ａ）。
反応時間：１６時間；収率：８７％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１５−７．２４（ｐｓｅｕｄｏ−ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９３−６．９８（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝２．１３，７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６０．９，１３０．６，１２５．４，１２５．１，１１７．８，１１５．７，８８．８，８５．６，５５．９，５１．４。
【００８２】
３−（４−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（３ａ）。
反応時間：１６時間；収率：９２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４０（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５９．８，１３３．２，１１４．６，１１４．０，８５．９，８５．７，５５．３，５１．７。
【００８３】
３−（２−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（４ａ）。
反応時間：２４時間；収率：６２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１９（ｄｄ，Ｊ＝１．２５，７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０３−７．１２（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５６−６．６５（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５０．３，１３３．０，１３０．６，１１８．２，１１５．６，９３．８，７８．９，６９．５，５１．０。
【００８４】
３−（３−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（５ａ）。
反応時間：１８時間；収率：７７％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｄｄ，Ｊ＝１．５，７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），２．１７（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４６．３，１２９．２，１２３．４，１２２．０，１１８．０，１１５．５，８７．０，８５．６，５１．４。
【００８５】
３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（６ａ）。
反応時間：１８時間；収率：４２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１１−７．２１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５３−６．６８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１４９．７，１３３．８，１１５．７，１１２．５，８６．７，８５．９，５１．４；
【００８６】
３−（２−ニトロフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（７ａ）。
反応時間：１５時間；収率：３５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．５４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．４４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），１．６８（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４９．９，１３４．８，１３２．８，１２８．９，１２４．６，１１８．０，９５．２，８０．９，５１．７。
【００８７】
４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド（８ａ）。
反応時間：１２時間；収率：９１％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７２−７．８２（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），７．４１−７．５３（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６９．９，１３５．２，１３２．７，１２８．３，１２７．６，９１．５，８４．７，５１．３，２７．１。
【００８８】
Ｎ−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）アセトアミド（９ａ）。
反応時間：１８時間；収率：８５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５６−７．６４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４７−７．５６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７１．９，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，８４．５，６２．７，２４．１。
【００８９】
３−（ｏ−トリル）プロプ−２−イン−１−オール（１０ａ）。
反応時間：５時間；収率：７０％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１１−７．２４（ｍ，３Ｈ），４．５４（ｓ，２Ｈ），２．４３（ｓ．，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３８．２，１３１．２，１２８．４，１２８．０，１１９．３，１１５．３，８６．５，８５．２，５１．２，２１．２。
【００９０】
３−（２，６−ジメチルフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１１ａ）。
反応時間：２４時間；収率：２５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），２．３４（ｓ，７Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４０．５，１２７．９，１２６．７，１２２．３，９５．６，８３．３，５１．９，２１．１。
【００９１】
３−（２，６−ジメトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１２ａ）。
反応条件：３０℃、プロピルアミン、１６時間；収率：３８％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．２５（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６３．０，１３１．０，１０４．７，１０２．５，９７．０，７８．１，５６．４，５１．７。  
【００９２】
置換３−アリール−プロピオニトリル（１−１２）：
【化２６】
0006578275.tif 000036
【表２】
0006578275.tif 000037
【００９３】
３−（２−メトキシフェニル）プロピオニトリル（１，ＡＰＮ−ｏ−ＯＭｅ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５１−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６４．７，１３６．４，１３５．３，１２２．０，１１２．６，１０７．７，１０６．４，８１．８，６６．７，５６．７；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９４６，２２６４，２１４２  １５９６，１４９０，１２４５，１１６４，１１２２，１０４７，１０２１，７５２，４９８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５０４４。
【００９４】
３−（３−メトキシフェニル）プロピオニトリル（２，ＡＰＮ−ｍ−ＯＭｅ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．２４（ｍ，１Ｈ），７．１２−７．２０（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６１．２，１３１．４，１２７．１，１２０．０，１１９．４，１１９．２，１０６．０，８４．１，６２．７，５６．１；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２４９１，２２６４，２１４４，１５９５，１５７３，１４８８，１４６４，１４２０，１３２４，１２９４，１２０７，１１７８，１０４５，７８３，６８１，４９４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５２９８。
【００９５】
３−（４−メトキシフェニル）プロピオニトリル（３，ＡＰＮ−ｐ−ＯＭｅ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４６−７．７０（ｍ，Ｊ＝８。８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６−６．９６（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１６１．４，１３４．４，１１３．７，１０８．２，１０４．８，８２．７，６１．５，５４．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９８５，２３５８，２３４２，２２６３，２１７８，２１４９，１６０３，１５１４，１３０７，１２７０，１１８０，１０２８，８３５，８０８，６６９，４２４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５３３７。
【００９６】
３−（２，６−ジメトキシフェニル）プロピオニトリル（４，ＡＰＮ−ｏ，ｏ’−ジメトキシ）：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．３８（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），３．８８（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１６４．４，１３３．８，１０６．２，１０３．４，９６．５，７７．７，７０．５，５６．２；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２８４７，２３５９，２２５９，２２０１，２１３９，１９２６，１５８６，１５７４，１４７８，１４３２，１３０２，１２５５，１１８８，１１０９，１０２５，７７８，７２７，６４８，６３２，５４５，５０６，４８８，４２０；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８７．０６３３３；実測値１８４．０６４６５。
【００９７】
３−（２−アミノフェニル）プロピオニトリル（５，ＡＰＮ−ｏ−ＮＨ２）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ６．８１（ｄ，Ｊ＝７．８８Ｈｚ，１Ｈ），６．６５−６．７６（ｍ，１Ｈ），６．０８−６．１９（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５１．４，１３４．０，１３３．４，１１８．２，１１５．０，１０５．８，１０１．０，８１．６，６８．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４１３，３３３２，３２１１，２９２５，２８５３，２２５０，２１３６，１６３２，１６００，１５６３，１４８６，１４５２，１３１２，１２７３，１２５２，１１６１，７４０，６７３，４９３；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５４５８。
【００９８】
３−（３−アミノフェニル）プロピオニトリル（６，ＡＰＮ−ｍ−ＮＨ２）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．１７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７４−６．８９（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４６．８，１２９．８，１２３．６，１１８．７，１１８．７，１１８．０，１０５．７，８３．７，６２．３；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４２６，３３４０，２９２３，２８５２，２２６５，２１４２，１６３０，１５９４，１５７９，１５１３，１４４８，１３２６，１３１３，１３００，１２２０，１１６４，９９３，８８２，８６２，７８４，６８０，５３４，４５６；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５１９７。
【００９９】
３−（４−アミノフェニル）プロピオニトリル（７，ＡＰＮ−ｐ−ＮＨ２）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．２６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５２．５，１３５．１，１１３．６，１０５．６，１０２．３，８６．３，６０．２；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４３１，３３３３，３２１１，２２５０，２１３２，１６３２，１５９９，１５１３，１４３８，１３０３，１１７８，１０４３，９４９，８２６，８１４，５２６，４９５，４５２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５４６４。
【０１００】
３−（ｏ−トリル）プロピオニトリル（８，ＡＰＮ−ｏ−メチル）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４７（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），７．２８−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．１６（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４３．４，１３４．１，１３１．８，１３０．１，１２６．１，１１７．４，１０５．６，８２．４，６６．４，２０．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２２９５，２２５７，２１４１，１５９９，１４８４，１４５６，１３８３，１２９１，１１９９，１１６２，１１１６，１０３９，７５７，７１１，６７２，５４８，４９０，４５２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４１．０５７８５；実測値１４１．０５９２６。
【０１０１】
３−（２，６−ジメチルフェニル）プロピオニトリル（９，ＡＰＮ−ｏ，ｏ’−ジメチル）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．１２−７．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４３．８，１３１．２，１２７．３，１１７．６，１０５．６，８１．５，７０．２，２０．８；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９２３，２８５６，２２６１，２１３８，１７３２，１５９５，１４６８，１３８１，１２６５，１１６８，１０３３，７７４，７２８，４９０；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５５．０７３５０；実測値１５５．０７５０７。
【０１０２】
３−（２−ニトロフェニル）プロピオニトリル（１０，ＡＰＮ−ｏ−ＮＯ２）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．２８−８．３５（ｍ，１Ｈ），７．９６−８．０６（ｍ，１Ｈ），７．８１−７．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５１．９，１３８．３，１３５．２，１３４．１，１２６．６，１１４．２，１０５．７，７９．０，６８．６；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２２６８，１６０４，１５６７，１５２８，１５０２，１４８０，１３４５，８５１，７８７，７４４，７０９，６８７，５３７，４９１；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１７２．０２７２８；実測値１７２．０２８６９。
【０１０３】
Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）アセトアミド（１１，ＡＰＮ−ｐ−ＮＨＡｃ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５６−７．６３（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．５６（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７１．９，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，８４．５，６２．７，２４．１；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３３０３，３１７４，３０９８，２２７８，２２６２，２１３９，１６７０，１５９４，１５３５，１４０７，１３６４，１３２１，１２６３，１１７７，８３４，５３４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８４．０６３６６；実測値１８４．０６２１２。
【０１０４】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−メチルベンズアミド（１２，ＡＰＮ−ｐ−ＣＯＮＨＭｅ）：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９６−８．０５（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．８５−７．９３（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６９．１，１３８．３，１３４．９，１２９．０，１２１．６，１０５．９，８３．０，６４．６，２８．８；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３３４８，２２７０，１６４１，１５４９，１５０２，１４０８，１３９２，１３２７，１３０３，１２８３，１１６２，８５４，７６０，６１７，４８８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８４．０６３６６；実測値１８４．０６４６５。
【０１０５】
３−（４−ヨードフェニル）プロピオニトリル（１３）：
【化２７】
0006578275.tif 000038
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：３０分間；収率：６１％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．７８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３８．１，１３４．４，１１６．８，１０５．２，９９．２，８１．９，６４．２。
化合物１３を本発明による標識方法に用いることができる（放射性同位体１２５Ｉによる）。
【０１０６】
３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロピオニトリル（１４）：
【化２８】
0006578275.tif 000039
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：１時間；収率：４５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．７６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１４を、（放射性同位体１８Ｆによる）本発明による標識方法に用いることができる。
【０１０７】
４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５ａ）：
【化２９】
0006578275.tif 000040
生成物をカップリングに関する一般手順Ｂに従って合成した。収率：９８％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１６５．１，１３１．７，１３１．４，１２９．３，１２６．６，８９．８，８５．１，８１．４，５１．６，２８．１。
【０１０８】
４−（シアノエチニル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５）：
【化３０】
0006578275.tif 000041
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：１５分間；収率：４８％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１６４．３，１３４．８，１３３．３，１２９．７，１２１．３，１０５．２，８２．２，８１．９，６４．８，２８．１。
【０１０９】
４−（シアノエチニル）安息香酸（１６）：
【化３１】
0006578275.tif 000042
４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量、３５０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１４ｍＬ）溶液にＴＦＡ（３０．６当量、５．３７２ｇ、３．５ｍＬ、４７．１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３６時間撹拌し、次いで濾過し、３×２ｍＬのＥｔ２Ｏで洗浄した。沈殿は、純粋な４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸（１４０ｍｇ、０．８２３ｍｍｏｌ、５３％収率）からなった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝８．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，３Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１１０】
４−（シアノエチニル）安息香酸パーフルオロフェニル（１７）：
【化３２】
0006578275.tif 000043
ペンタフルオロフェノール（１当量、８９．２ｍｇ、０．４８４ｍｍｏｌ）および４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸（１当量、８２．９ｍｇ、０．４８４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．８４ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、ＤＣＣ（１当量、９９．９ｍｇ、０．４８４ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。得られた溶液を室温で１４時間撹拌し、次いで濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄した。濾液を蒸発させて、４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸ペンタフルオロフェニル（１２０ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ、７４％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１７を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１１１】
４−（（４−（シアノエチニル）ベンゾイル）オキシ）−２，３，５，６−テトラフルオロベンゼンスルホン酸ナトリウム（１８）：
【化３３】
0006578275.tif 000044
４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸（１当量、５４．２ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）および２，３，５，６−テトラフルオロ−４−ヒドロキシベンゼン−１−スルホン酸ナトリウム（１当量、８４．９ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（０．７９２ｍＬ）溶液に、ＤＣＣ（１当量、６５．３ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３６時間撹拌し、次いで０℃に冷却し、１時間撹拌し、濾過し、０．８ｍＬの乾燥ＤＭＦで洗浄した。濾液を１６ｍＬのＥｔ２Ｏで希釈し、１５分間撹拌して完全に結晶化させ、沈殿を濾過して４−（（４−（シアノエチニル）ベンゾイル）オキシ）−２，３，５，６−テトラフルオロベンゼンスルホン酸ナトリウム（７２．５ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ、５４％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１８を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１１２】
Ｎ−（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド（２０）：
【化３４】
0006578275.tif 000045
５−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（プロプ−２−イン−１−イル）ナフタレン−１−スルホンアミド（１当量、３９５ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）および３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、２３０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）をｔＢｕＯＨ（６．９１ｍＬ）に可溶化させた。この混合物に硫酸銅五水和物（１０％、３４．２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）の０．５ｍＬの水溶液を添加し、次いでアスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、１３５ｍｇ、０．６８５ｍｍｏｌ）の０．５ｍＬの水溶液を添加した。得られた溶液を２時間撹拌し、次いでロータリーエバポレータで濃縮した。残渣をＤＣＭで抽出した。有機層をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液および水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて、２０（５４４ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、８７％収率）を緑色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．５９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ）８．２６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１５１．２，１４４．８，１３８．４，１３５．７，１３５．６，１２９．４，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２７．８，１２３．４，１２１．３，１１９．９，１１９．０，１１６．０，１１４．９，１０５．３，８２．５，６３．１，４４．９，３７．６。
化合物２０を、本発明による検出方法（例えば、染料による）に用いることができる。
【０１１３】
３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピオニトリル（２１）：
【化３５】
0006578275.tif 000046
５０ｍＬのＲＢフラスコにおいて炭酸水素ナトリウム（８８６ｍｇ、１０．５５ｍｍｏｌ）の１０ｍＬの水溶液を１０分間撹拌し、これにジクロロメタン（１０ｍＬ）、続いて３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（５００ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃に冷却し、チオホスゲン（４０２μＬ、５．２８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下導入し、室温で１時間連続的に撹拌した。有機相を分離し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥した。溶液を濃縮させ、純粋な２１（６０９ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ、９４％収率）を黄色固体の形態で与えた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ＝７．７１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物２１を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１１４】
（１−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−１−チオキソ−６，９，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２）：
【化３６】
0006578275.tif 000047
（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量、９１．５ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、５０ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）の１ｍＬのＤＣＭ溶液をゆっくりと添加し、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を１ｍＬに濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配、１００／０〜９０／１０）によって精製し、（１−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−１−チオキソ−６，９，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、９２％収率）を黄色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．６６（ｓ，４Ｈ），３．６５−３．５４（ｍ，１２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝１８２．０，１５８．５，１４４．６，１３５．６，１０６．４，８４．８，８０．０，７１．６，７１．５，７１．３，７１．３，７０．０，６８．２，６３．０，３８．８，３１．０，２９．８，２９．０
【０１１５】
塩化４−（シアノエチニル）ベンゾイル（２３）：
【化３７】
0006578275.tif 000048
４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸（１当量、３０ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＳＯＣｌ２（３１．５当量、４００μＬ、５．５１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を固体が完全に溶解するまで還流撹拌し、次いで蒸発させて、純粋な２３（２９．６ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ、８９％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物２３を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１１６】
（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４）：
【化３８】
0006578275.tif 000049
（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量、５０ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（５当量、７８．９ｍｇ、０．１０８ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＣＭに溶解し、−７８℃に冷却した。この溶液に、１ｍＬのＤＣＭ中の２３（１当量、２９．６ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を室温まで徐々に加温し、２時間撹拌した。次いで反応混合物をフラッシュクロマトグラフィカラムに注入し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（勾配１００／０〜９０／１０）で溶離し、純粋な２４（４０．６ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、５５％）を黄色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．９２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７２−３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０１１７】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−（１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザノナトリアコンタ−２４，２６−ジイン−１−イル）ベンズアミド（２５）：
【化３９】
0006578275.tif 000050
４−（２−シアノエチ−１−イン−１−イル）安息香酸（１当量、２９．７ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）をＤＣＭに懸濁させ、ＳＯＣｌ２（３９．８当量、８２０ｍｇ、０．５ｍＬ、６．８９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１．５時間還流撹拌し、蒸発させ、ＤＣＭに溶解させ、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）ペンタコサ−１０，１２−ジインアミド（１当量、１００ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（４当量、７０．２ｍｇ、０．０９６４ｍＬ、０．６９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に−７８℃で添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１０／０〜９／１）によって精製し、所望の生成物（３５．４ｍｇ、０．０４８５ｍｍｏｌ、２８％収率）を黄色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），６．１８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），３．７１−３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．３２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔｄ，Ｊ＝６．０，１１．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６５−１．４２（ｍ，６Ｈ），１．４１−１．３２（ｍ，４Ｈ），１．３２−１．１９（ｍ，２２Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
化合物２５を、化合物を結合および／または固定化させるための本発明による標識（例えば光標識）方法に用いることができる。
【０１１８】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸エチル（２６）：
【化４０】
0006578275.tif 000051
トリホスゲン（１当量、４９．５ｍｇ、２７．８μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液に、３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（３当量、７１．１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を添加した。次いで、１ｍＬのＤＣＭ中のトリエチルアミン（６当量、１０１ｍｇ、１３８μＬ、１ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を１５分間撹拌してイソシアネート中間体を形成させ、次いで、エタノール（０．１ｍＬ）を滴加した。反応混合物をを１時間撹拌し、次いで２×５ｍＬの水で洗浄し、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィによって精製し、（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸エチル（１０２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、９６％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．７９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．２６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１１９】
１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−３−（プロプ−２−イン−１−イル）ウレア（２７）：
【化４１】
0006578275.tif 000052
トリホスゲン（１当量、４９．５ｍｇ、２７．８μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（３当量、７１．１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液を添加した。次いで、トリエチルアミン（６当量、１０１ｍｇ、１３８μＬ、１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５分間撹拌し、次いで、１ｍＬのＤＣＭ中のプロパルギルアミン（４．６９当量、４３ｍｇ、５０．１μＬ、０．７８２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２当量、３３．７ｍｇ、４６．３μＬ、０．３３３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間撹拌し、次いで５ｍＬの水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配）によって精製し、１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−３−（プロプ−２−イン−１−イル）ウレア（９４．９ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ、８５％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．６０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
化合物２７を本発明によるクリック化学に用いることができる。
【０１２０】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸プロプ−２−イン−１−イル（２８）：
【化４２】
0006578275.tif 000053
トリホスゲン（１当量、４９．５ｍｇ、２７．８μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（３当量、７１．１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液を添加した。次いで、トリエチルアミン（６当量、１０１ｍｇ、１３８μＬ、１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、次いで、１ｍＬのＤＣＭ中の２−プロピン−１−オール（６当量、５６．１ｍｇ、５９．１μＬ、１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２当量、３３．７ｍｇ、４６．３μＬ、０．３３３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間撹拌し、次いで、５ｍＬの水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配）によって精製し、（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸プロプ−２−イン−１−イル（１０４ｍｇ、０．４６５ｍｍｏｌ、９３％収率）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．８０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）。
化合物２８を、本発明によるクリック化学に用いることができる。
【０１２１】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２９）：
【化４３】
0006578275.tif 000054
トリホスゲン（１当量、３４．８ｍｇ、１９．５μＬ、０．１１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液に３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（３当量、５０ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を添加した。次いで、トリエチルアミン（６当量、７１．２ｍｇ、９７．８μＬ、０．７０３ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を５分間室温で撹拌し、次いで、１ｍＬのＤＣＭ中のビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（３当量、５２．８ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２当量、２３．７ｍｇ、３２．６μＬ、０．２３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。ＨＰＬＣによって完全な転換を確認した後、混合物を１ｍＬの体積に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配）によって精製し、（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（６８．３ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ、１８３％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），２．３８−２．１４（ｍ，６Ｈ），１．６７−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），１．０４−０．９１（ｍ，２Ｈ）
化合物２９を本発明によるクリック化学（例えば、歪促進クリック）に用いることができる。
【０１２２】
３−（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）プロプ−２−イン−１−オール（３０ａ）：
【化４４】
0006578275.tif 000055
生成物をカップリングに関する一般手順Ｂに従って合成した。収率：９９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．４１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），１．８９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），０．２５（ｓ，９Ｈ）。
【０１２３】
３−（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）プロピオニトリル（３０）：
【化４５】
0006578275.tif 000056
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：３時間；収率：２９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），０．２７（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１３３．２，１３２．２，１２６．９，１１７．１，１０５．３，１０３．４，９９．４，８２．３，６４．５，−０．３。
【０１２４】
３，３’−（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル（３１）：
【化４６】
0006578275.tif 000057
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：３時間；収率：１１％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．２０（ｔ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０２（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１４７．１，１２７．５，１２１．６，１１９．５，１０５．０，８１．０，６３．６。
化合物３１を本発明による再架橋（ジＡＰＮ）に用いることができる。
【０１２５】
３−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）プロピオニトリル（３２）：
【化４７】
0006578275.tif 000058
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：４時間；収率：６３％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３６（ｓ，１２Ｈ）。
【０１２６】
３，３’−（１，２−フェニレン）ジプロピオニトリル（３３）：
【化４８】
0006578275.tif 000059
３３ａ：３，３’−（１，２−フェニレン）ビス（プロプ−２−イン−１−オール）。
１，２−ジヨージドベンゼン（１当量、６６１ｍｇ、０．２６２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアルコール（２．３当量、２７２μＬ、４．６１ｍｍｏｌ）のブチルアミン（１５．８ｍＬ）脱気溶液にＰｄ（ＰＰｈ３）４（４％，９２．６ｍｇ、０．０８０１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を一晩還流した。溶媒を蒸発させ、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（２０分、勾配ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）によって精製し、３３ａ（１５０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４０％）を褐色がかった固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．３８（ｍ，２Ｈ），４．４８（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）ｄ１３５．６，１３１．９，１２９．２，９５．６，８６．６，５３．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．１。
【０１２７】
３３：３，３’−（１，２−フェニレン）ジプロピオニトリル。
化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：７５分間。褐色固体、収率：４２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．８９（ｄｄ，Ｊ＝３．３０，５．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｄｄ，Ｊ＝３．３０，５．８０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３６．０，１３３．５，１２６．５，１０５．５，８０．２，６７．２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．０。 
【０１２８】
３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル（３４）：
【化４９】
0006578275.tif 000060
３４ａ：３，３’−（１，３−フェニレン）ビス（プロプ−２−イン−１−オール）。
３３ａの合成と同じ手段。褐色がかった固体、収率：５５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２９−７．３６（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３５．３，１３２．５，１２９．８，１２４．８，８９．７，８４．５，５１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．０。
【０１２９】
３４：３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル。
化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：２時間。褐色固体、収率：３５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．１０（ｄ，Ｊ＝１．５０Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，Ｊ＝１．５０，８．００Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３９．３，１３７．８，１３１．２，１２０．０，１０５．７，８１．７，６４．２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．１。
【０１３０】
３，３’−（１，４−フェニレン）ジプロピオニトリル（３５）：
【化５０】
0006578275.tif 000061
３５ａ：３，３’−（１，４−フェニレン）ビス（プロプ−２−イン−１−オール）。
３３ａの合成と同じ手段であるが、７２時間還流。褐色がかった固体、収率：３５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３９（ｓ，４Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３２．６，１２４．３，１０１．４，９０．８，８４．９，５１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．１。
【０１３１】
３５：３，３’−（１，４−フェニレン）ジプロピオニトリル。
化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：２時間。褐色固体、収率：１９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９４（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３５．０，１２１．６，１０５．５，８２．０，６５．９；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．０。
化合物３３〜３５を本発明による再架橋（ジＡＰＮ）に用いることができる。
【０１３２】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（（トリフルオロメチル）スルホニル）オキシ）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６ｂ）：
【化５１】
0006578275.tif 000062
２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量、５１８ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の０℃に冷却したピリジン（２．５ｍＬ）溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．１当量、４７６ｍｇ、０．２８ｍＬ、１．６９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて（シリンジプレッサーを用いて）滴加した。得られた暗色溶液を室温まで加温させ、水（１０ｍＬ）に注ぎ、エチルエステル（１５ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出物を水（５ｍＬ）、１Ｎ  ＨＣｌ（２×５ｍＬ）、水（５ｍＬ）、塩水（５ｍＬ）で順次洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて、標的生成物（６１４ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、８５％）を暗赤色油として得た。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０３−７．１８（ｍ，３Ｈ），６．８２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，１Ｈ），２．６５−２．９５（ｍ，２Ｈ），１．１７（ｓ，９Ｈ），１．２１（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７０．５，１４８．５，１３７．３，１３１．３，１２１．１，１２０．３，１１７．１，８２．５，８０．０，５４．７，３８．１，２８．３，２７．９。
【０１３３】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６ａ）：
【化５２】
0006578275.tif 000063
フェノールトリフラート(tryphlate)（１当量、１３６ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）のモルホリン（１ｍＬ）溶液に、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（５％、１０．２ｍｇ、０．０１４５ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１０％、５．５３ｍｇ、０．０２９１ｍｍｏｌ）、およびプロパルギルアルコール（２当量、３２．６ｍｇ、０．０３４３ｍＬ、０．５８１ｍｍｏｌ）を続けて添加した。得られた反応混合物を脱気し、６０℃で２４時間加熱した。得られた黒色溶液を水（１０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を１Ｎ  ＨＣｌ（２×１０ｍＬ）、水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて粗生成物を得、フラッシュクロマトグラフィによる精製後に標的生成物（８．７３ｍｇ、０．０２３２ｍｍｏｌ、８％）を黄色がかった固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３０−７．４５（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．１４−７．３０（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．１８−４．３２（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｄｄ，Ｊ＝６．２７，１３．８０Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．６６，１３．６８Ｈｚ，１Ｈ），１．４５−１．５３（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝３．２６Ｈｚ，１９Ｈ）。
【０１３４】
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（シアノエチニル）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６）：
【化５３】
0006578275.tif 000064
反応物をＭｎＯ２酸化の一般手順に従って合成した。反応時間：２時間；収率：５６％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），５．０５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｔｄ，Ｊ＝６．１，７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１７０．３，１５４．９，１４１．４，１３３．４，１３０．１，１１５．９，１０５．５，８２．９，８２．５，７９．９，６３．２，５４．５，３８．８，２８．３，２７．９。
化合物３６を本発明による精製および／または固定化に用いることができる。
【０１３５】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−（２−（２−（２−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド（３７）
【化５４】
0006578275.tif 000065
Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（１当量、２２２ｍｇ、０．５９３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、４−（（４−（シアノエチニル）ベンゾイル）オキシ）−２，３，５，６−テトラフルオロベンゼンスルホン酸ナトリウム（１．２当量、３００ｍｇ、０．７１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５．１当量、３９１ｍｇ、０．５ｍＬ、３．０３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いでセミ分取ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物（６８．８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、２２％収率）を黄色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．９２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝４．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ＝４．５，７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７１−３．５６（ｍ，８Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２４−３．１４（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７８−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．４８−１．３５（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝１７６．３，１６８．８，１６６．２，１３８．９，１３５．０，１２９．１，１２１．５，１０５．９，８３．１，７１．５，７１．４，７０．７，７０．６，６４．６，６３．５，６１．８，５７．１，４１．２，４０．４，３６．９，２９．９，２９．６，２７．０。  
【０１３６】
２−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）−アミノ）−２−オキソエチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート（３８）：
【化５５】
0006578275.tif 000066
３８ｄ：（４−（（４−ヨードフェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。
Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ（１当量、０．９２８ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（３当量、１．３９ｇ、１．９ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０５当量、０．０２７９ｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）の０℃に冷却したＤＣＭ（１１．７ｍＬ）溶液に、ＥＤＣ（１当量、０．８７５ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊をさらに１０分間０℃で撹拌し、氷浴を除去し、ｐ−ヨードアニリン（１当量、１ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２５℃で一晩放置した。得られた反応塊を１Ｍ  ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して３８ｄ（１１２５ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ、６１％）を得、これをさらに精製することなく用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ９．０４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．５８−７．７２（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．５１（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），４．８１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．２７（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．５０（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７４．２，１５７．４，１３７．８，１２０．９，１２０．０，８７．３，７７．０，３３．１，３２．８，２８．４，２６．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ３＋［Ｍ＋Ｈ］＋，４０５．０；実測値４０５．１。
【０１３７】
３８ｃ：（４−（（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）−アミノ）−４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。
薗頭カップリングのプロトコールＢに従って合成した。黄色がかった固体、収率：７９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５４−７．５８（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．３８（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．０，１５８．６，１４０．１，１３３．２，１２０．８，１１９．５，８８．３，８５．３，８０．１，５１．３，４０．９，３５．３，２８．８，２７．１；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２５Ｎ２Ｏ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３３２．１；実測値３３２．０。
【０１３８】
３８ｂ：（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。
ＭｎＯ２酸化のプロトコールを用いて合成した。反応時間：１時間。白色固体、収率：８５％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６１−７．６５（ｍ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．５９（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），１．７４−１．８１（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．３，１５９．１，１４３．８，１３５．７，１２０．８，１１２．８，１０６．３，８４．６，６２．７，４０．８，３５．３，３４．８，２８．８，２６．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ３＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３２８．１；実測値３２８．１。
【０１３９】
３８ａ：４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート。
３８ｂ（１当量、６２．８ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）懸濁液に、ＴＦＡ（２０当量、２８５μＬ、３．８３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた２５℃で３０分間撹拌した。反応塊の蒸発後に標的生成物３８ａ（ＴＦＡ塩、６５．０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、９９％）を得、さらに精製することなく次の工程に用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７１−７．７９（ｍ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，２Ｈ），７．６３−７．７０（ｍ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，２Ｈ），２．６（ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−２．０８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．１，１４３．６，１３５．７，１２０．７，１１２．９，１０６．２，８４．５，６２．７，４０．４，３４．５，２４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１４Ｎ３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２８．１；実測値２２８．１。
【０１４０】
３８：（２−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）アミノ）−２−オキソエチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート。
３８ａ（１当量、１０．１ｍｇ、０．０２９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２５０μＬ）溶液に、ＴＥＡ（１当量、４μＬ、０．０２９６ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（１当量、２２．７ｍｇ、０．０２９６ｍｍｏｌ）を得られた溶液に添加し、反応塊を１５分間室温で。粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、３８（９．９ｍｇ、０．０１２６ｍｍｏｌ、４２％）を主生成物として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４４−７．５９（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝４．５２Ｈｚ，６Ｈ），３．７５（ｓ，９Ｈ），３．５０（ｓ，１８Ｈ），３．００（ｔｄ，Ｊ＝７．９１，１５．３１Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．６４−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．２５−１．４３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．２，１６７．４，１６７．４，１６５．３，１４３．６，１３５．８，１２０．６，１１２．８，１０６．３，９２．２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），８４．５，６２．７，５６．５，５６．２，３７．５，２９．４（ｄ，Ｊ＝６４Ｈｚ），２７．９，２７．７，２４．９；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４２Ｈ４７Ｎ３Ｏ１１Ｐ＋［Ｍ］＋，８００．２９４２７；実測値８００．２９４０１。  
【０１４１】
（５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（３９）：
【化５６】
0006578275.tif 000067
３９ｄ：塩化５−ブロモペンタノイル。
５−ブロモペンタン酸（１当量、２．８５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびＳＯＣｌ２（１当量、１．８７ｇ、１．１４ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）脱気溶液を３時間還流した。得られた反応塊を減圧下で蒸発させて３９ｄ（３．１１ｇ、１００％）を黄色がかった油として得た。粗生成物を精製することなく次の工程に用いた。
【０１４２】
３９ｃ：５−ブロモ−Ｎ−（４−ヨードフェニル）ペンタンアミド。
３９ｄ（１当量、３．１１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液を、４−ヨードアニリン（１当量、３．４５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１当量、２．０３ｇ、２．６ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却したＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液に注いだ。得られた反応塊を室温まで加温させ、さらに３０分間撹拌し、１Ｎ  ＨＣｌ（２ｘ２５ｍＬ）、水（１×２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて、３９ｃ（５．６０ｇ、１４．６６ｍｍｏｌ、９３％）を褐色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６２−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．４３（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），１．８１−１．９８（ｍ，４Ｈ），１．３７−１．４２（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．０，１４０．５，１３８．９，１２３．１，８７．６，３６．９，３３．８，３３．４，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１１Ｈ１４ＢｒＩＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３８１．９；実測値３８１．８。
【０１４３】
３９ｂ：５−ブロモ−Ｎ−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）ペンタンアミド：
薗頭カップリングのプロトコールＡに従って合成した。褐色固体、収率：９２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４９−７．６３（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．４３（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｓ，１Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ），１．９０−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．９，１４０．０，１３３．１，１２０．７，１１９．６，８８．２，８５．２，５１．２，３６．８，３３．７，３３．３，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１７ＢｒＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３１０．０；実測値３１０．０。
【０１４４】
３９ａ：５−ブロモ−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド。
ＮＨ３（４当量、９４．８ｍｇ、５．５６ｍｍｏｌ）のＩＰＡ溶液（２Ｍ）および無水ＭｇＳＯ４（１５当量、２５１１ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を３９ｂ（１当量、４３１ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３．４２ｍＬ）撹拌溶液に添加した。この溶液に活性化したＭｎＯ２（１５当量、１８１４ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で４時間撹拌し（ＴＬＣによって制御、さらなる出発アルコールなし；ＮＢ：反応時間が長すぎて加水分解生成物が得られた）、ＤＣＭ（１３ｍＬ）で希釈した。混合物を濾過し、ＤＣＭで完全に洗浄し、合わせた濾液を減圧下に濃縮させた。固体残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ−シクロヘキサン、２０分間勾配、０〜１００％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、３９を白色固体として得た（２８８ｍｇ、０．９４６ｍｍｏｌ、６８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６９−７．７９（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．６９（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），１．７９−１．９９（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．３，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，１０１．４，８４．６，３７．０，３３．７，３３．４，２５．２。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１４ＢｒＮ２Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３０４．０；実測値３０４．０。
【０１４５】
３９：（５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンチル）トリス（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）ホスホニウムブロミド。
３９ａ（１当量、２０ｍｇ、０．０６５５ｍｍｏｌ）およびトリス（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）ホスファン（ＴＭＰＰ、１．２当量、４１．９ｍｇ、０．０７８６ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン（１ｍＬ）に溶解し、室温で一晩撹拌した。３９（ＴＦＡ塩、２２ｍｇ、３９％）を逆相ＨＰＬＣ後に白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５１−７．５５（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，６Ｈ），３．７５（ｓ，９Ｈ），３．５０（ｓ，１８Ｈ），３．００（ｔｄ，Ｊ＝６．９０，１５．３１Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．２２−１．４５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．２，１６７．４，１６５．３，１４３．６，１３５．８，１２０．６，１１２．８，１０６．２，９３．６，９２．３，９２．２，８４．５，６２．７，５６．３，３７．５，２９．７，２７．７，２４．９；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４１Ｈ４６Ｎ２Ｏ１０Ｐ＋［Ｍ］＋，７５７．２８８４６；実測値７５７．２９５５２。 
【０１４６】
（４−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）ブチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート（４０）：
【化５７】
0006578275.tif 000068
４０ｃ：Ｎ−（４−ブロモブチル）−４−ヨードベンズアミド。
４−ヨード安息香酸（１当量、１．４５ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（９当量、３．８ｍＬ、５２．６ｍｍｏｌ）中１１０℃で完全に溶解するまで（およそ１５分）加熱した。過剰のＳＯＣｌ２を真空中で除去し、得られた固体をＤＣＭ（１５ｍＬ）に注ぎ、−７８℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（３．１当量、３ｍＬ、１８．２ｍｍｏｌ）を激しい撹拌下に添加した。得られた反応塊に３−ブロモプロピルアミンヒドロブロミド（１．５当量、１．９０ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）を添加し、−７８℃で５分間撹拌したままにし、さらに２０分間撹拌しながら室温まで加温させた。酢酸エチル（１００ｍＬ）を１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）と共に添加し、得られた固体を濾過し（生成物）、水で洗浄し、乾燥して４０ｃ（２．０９ｇ、５．６７ｍｍｏｌ、９７％）を白色固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．８５（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５６（ｍ，４Ｈ），２．１２−２．２３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６０．１，１３９．２，１３６．０，１３２．８，１０２．４，５０．１，４３．２，２３．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１２ＢｒＩＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３６７．９；実測値３６８．０。
【０１４７】
４０ｂ：Ｎ−（４−ブロモブチル）−４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミド。
薗頭カップリングのプロトコールＢに従って合成した。褐色固体、収率：８１％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７３（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｔ，Ｊ＝５．３０Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝５．８０Ｈｚ，２Ｈ），１．９２−１．９８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５９．２，１３４．２，１３２．４，１２８．２，１２７．１，９１．２，８４．８，６７．２，５１．２，４３．３，２２．５；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１５ＢｒＮＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２９５．０；実測値２９５．０。
【０１４８】
４０ａ：Ｎ−（３−ブロモプロピル）−４−（シアノエチニル）ベンズアミド。
ＭｎＯ２酸化のプロトコールを用いて合成した。反応時間：４５分間。褐色固体、収率：５２％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９０（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），３．４２−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２５−３．３５（ｍ，２Ｈ），２．１３−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．９２−１．９８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６８．７，１３８．８，１３４．９，１２８．９，１２１．４，１０５．８，８３．０，６７．３，４１．９，３９．８，２２．８；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１２ＢｒＮ２Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２９１．０；実測値２９１．２。
【０１４９】
４０：（４−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）ブチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート。
４０ａ（１当量、３０ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）およびトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスファン（ＴＭＰＰ、１当量、５４．９ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン（２ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液を室温で一晩放置した。沈殿を濾過し、ＤＭＳＯに再溶解させ、ＨＰＬＣによって精製し、４０（３５ｍｇ、０．０４０９ｍｍｏｌ、４０％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），６．１６（ｄ，Ｊ＝４．７０Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｓ，９Ｈ），３．５１（ｓ，１８Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝７．１０Ｈｚ，２Ｈ），２．９８−３．１０（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．６４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６８．５，１６７．５，１６５．３，１３８．７，１３４．９，１２８．８，１２１．２，１０５．８，９４．０，９２．９，９２．３，８２．９，６４．５，５６．５，４１．７，２７．８，２５．７；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４０Ｈ４４Ｎ２Ｏ１０Ｐ＋［Ｍ］＋，７４３．２２７２８；実測値７４３．２３９４６。
化合物３８〜４０を本発明による検出および／または分離方法に用いることができる。  
【０１５０】
３−（４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（４１）：
【化５８】
0006578275.tif 000069
４１ａ：（Ｚ）−４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブタ−２−ン酸。
７（１当量、７６．８ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）のアセトン（２ｍＬ）溶液に、無水マレイン酸（２当量、１０６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。約７時間の撹拌後、黄色がかった固体を得た。反応塊を蒸発させ、過剰の無水マレイン酸およびマレイン酸をメタノールで洗浄した。４１ａ（１２７ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、９８％）を黄色がかった固体として得、さらに精製する必要はなかった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．９０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１０．７０（ｓ，１Ｈ），７．６２−７．９０（ｍ，４Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝１１．９０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１１．９０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６６．８，１６３．８，１４２．４，１３５．０，１３１．７，１３０．１，１１９．３，１１０．２，１０５．６，８４．３，６１．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ７Ｎ２Ｏ３−［Ｍ−Ｈ］−，２３９．０；実測値２３９．０。
【０１５１】
４１：３−（４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル）−プロピオニトリル。
４１ａ（１当量、７５ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１．２１ｍＬ）溶液に、無水トリフルオロ酢酸（２当量、８６．９μＬ、０．６２４ｍｍｏｌ）を添加した。室温でさらに５分間撹拌を継続し、Ｋ２ＣＯ３（３当量、１２９ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊をさらに６０分間撹拌し、次いでＨＰＬＣによって直接精製し、４１（６５．９ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、９５％）を僅かに黄色の固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８１（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．０，１３４．４，１３４．０，１２６．０，１１７．３，１１７．０，８２．２，７８．５，６２．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ７Ｎ２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２３．０；実測値２２９．９。
化合物４１を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。  
【０１５２】
５−（（４−（シアノエチニル）−フェニル）−アミノ）−５−オキソペンタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４２）：
【化５９】
0006578275.tif 000070
４２ａ：５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸。
７（１当量、２００ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）のアセトン（１ｍＬ）溶液に、無水グルタル酸（２当量、３２１ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を２４時間室温で撹拌した。アセトンを蒸発させ、粗生成物をＩＰＡ−シクロヘキサンから再結晶し、４２ａ（３２４ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、９０％）を灰色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２１（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．７２Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．７２Ｈｚ，２Ｈ），２．５２−２．６２（ｍ，４Ｈ），２．２２−２．３２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．０，１６８．５，１４０．９，１３４．２，１１９．０，１１１．９，１０５．４，８４．１，６３．３，３０．１，２９．０，２１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１１Ｎ２Ｏ３−［Ｍ−Ｈ］−，２５５．１；実測値２５５．１。
【０１５３】
４２：５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）−アミノ）−５−オキソペンタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル。
４２ａ（１当量、１８ｍｇ、０．０７０２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液に、ＤＣＣ（１．０２当量、１４．８ｍｇ、０．０７１６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１当量、６．５２ｍｇ、０．００８９５ｍＬ、０．０６４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を５分間撹拌し、ＮＨＳ（１当量、８．０８ｍｇ、０．０７０２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をさらに２時間室温で撹拌した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）によって精製し、４２（６．４５ｍｇ、０．０１８３ｍｍｏｌ、２６％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．２７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），２．９４（ｓ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）ｄ１７０．３，１６９．５，１６８．２，１４１．３，１３４．６，１１９．４，１１２．４，１０５．７，８３．２，６２．９，３５．６，２９．９，２５．７，２１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ１６Ｎ３Ｏ５＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３５３．１；実測値３５３．２。
化合物４２を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。  
【０１５４】
３−（４−アジドフェニル）プロピオニトリル（４３）：
【化６０】
0006578275.tif 000071
７（１当量、１５１ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの丸底フラスコにおいてアセトニトリル（２．３４ｍＬ）に溶解させ、氷浴において０℃に冷却した。この撹拌混合物にイソアミルニトリル（ＩＡＮ、１．５当量、２１５μＬ、１．６ｍｍｏｌ）、続いてトリメチルシリルアジド（１．２当量、１４７ｍｇ、０．１６８ｍＬ、１．２８ｍｍｏｌ）を滴加した。得られた溶液を室温で４５分間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃに再溶解させ、水で洗浄し、乾燥し、蒸発させて、４３（１７７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ７．５８−７．８１（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．１１−７．２６（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１４４．９，１３６．０，１２０．４，１１３．６，１０５．９，８３．４，６２．９；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ９Ｈ５Ｎ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１６９．０；実測値１６９．０。 
【０１５５】
５−アジド−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド（４４）：
【化６１】
0006578275.tif 000072
４４ａ：塩化５−アジドペンタノイル。
５−アジドペンタン酸（１当量、１．１ｇ、６．９９ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（１０当量、５．１ｍＬ、６９．９ｍｍｏｌ）中で３０分間還流した。過剰のＳＯＣｌ２を真空中で除去し、得られた粗固体を精製することなく次の工程に用いた。
【０１５６】
４４：５−アジド−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド。
７（１当量、１６．１ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．５当量、２４μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解させ、−７８℃に冷却し、４４ａ（１．１当量、２０．１ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いで、これを、さらに１時間撹拌しながら室温まで加温させた。反応塊を１Ｍ  ＨＣｌ（２×１ｍＬ）、水（２ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて粗生成物を得、これををフラッシュクロマトグラフィによって精製し、４４（２５．５ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ、８９％）を灰色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５８−７．６７（ｍ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．５８（ｍ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ，２Ｈ），３．２３−３．２８（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），１．６１−１．７２（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．６１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．０，１４４．０，１３５．７，１３４．３，１２０．７，１１３．０，１０６．２，８４．５，４０．４，３４．４，２８．８，２４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１４Ｎ５Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２６８．１；実測値２６８．１。 
【０１５７】
１−［４−（シアノエチニル）ベンジル］−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフラート（４５）：
【化６２】
0006578275.tif 000073
４５ｃ：３−（ｐ−トリル）プロプ−２−イン−１−オール。
薗頭カップリングのプロトコールＡを用いて合成した。黄色がかった固体、収率：８８％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ７．２５−７．４９（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．０４−７．２５（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｄ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｔ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１３９．８，１３２．４，１３０．３，１２０．８，８８．８，８５．１，５１．２，２１．５；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１１Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１４６．１；実測値１４６．０。
【０１５８】
４５ｂ：３−（ｐ−トリル）プロピオニトリル。
化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：３時間。白色固体、収率：６７％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３７−７．５９（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．０２−７．３１（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）１４３．２，１３３．３，１２９．５，１１４．０，１０４．８，８３．２，６１．３，２０．４；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ８Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１４１．１；実測値１４１．０。
【０１５９】
４５ａ：３−（４−（ブロモメチル）フェニル）プロピオニトリル。
４５ｂ（１当量、６８ｍｇ、０．４８２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）脱気溶液を５分間ＭＷ照射した（１００℃）。反応混合物を蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、４５ａ（４２．４ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ、４０％）を黄色がかった固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．５６−７．７１（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．４９（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）１４１．８，１３３．９，１２９．５，１１７．５，１０５．３，８２．３，６３．７，３１．８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ７ＢｒＮ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２１９．０；実測値２１９．０。
【０１６０】
４５：１−［４−（シアノエチニル）ベンジル］−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフラート。
４５ａ（１当量、４３．７ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）およびＴＭＴＨ（１．２９当量、４３ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ；上述の手順８３１に従って合成した）のＤＣＭ（１．３４ｍＬ）脱気溶液に、ＬｉＯＴｆ（１１．６当量、３６０ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の蒸留かつ脱気したＨ２Ｏ（０．６６８ｍＬ）溶液を添加した。得られた二相混合物を２５℃で５日間激しく撹拌した（１日に１回脱気）。二相を分離し、有機相をＤＣＭ（５×２ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機分を蒸発させ、粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、４５（４６．９ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、５６％）を無色油として得た（０℃でゆっくりと結晶化して白色固体を生成した）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．６５−７．７３（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．６５（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ），１．３０（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３５．１，１３３．６，１３１．９，１１７．８，１０６．４，１０５．８，８３．３，６３．６，６０．１，４３．２，３４．６，２６．４，２５．４；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２０Ｈ２２ＮＳ＋［Ｍ］＋，３０８．１；実測値３０８．１。
化合物４３〜４５を本発明によるクリック化学（例えば、反応クリック−アジド）に用いることができる。
化合物４５を本発明による歪促進クリックに用いることができる。
【０１６１】
１‐（｛４‐［１‐｛［２‐（｛３‐カルボキシラト‐４‐［６‐（ジメチルアミノ）‐３‐（ジメチルイミニウミル）‐３Ｈ‐キサンテン‐９−イル］フェニル｝ホルムアミド）エチル］スルファニル｝‐２‐シアノエタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート（４６）：
【化６３】
0006578275.tif 000074
４６ａ：２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（２−メルカプトエチル）カルバモイル）ベンゾエート。
ＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、６８．３ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２２８ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１当量、６０．３ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６当量、１２３ｍｇ、０．１５７ｍＬ、０．９５２ｍｍｏｌ）および二塩化シスタミン（５当量、１７８ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）を続けて添加した；得られた溶液塊を一晩撹拌した。ＤＴＴ（５当量、１２２ｍｇ、０．１１８ｍＬ、０．７９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．９１１ｍＬ）溶液を反応塊に添加し、撹拌を２時間継続させた。溶媒を蒸発させた；得られた粗塊をＨＰＬＣによって精製し、４６ａ（３３．５ｍｇ、０．０５５５ｍｍｏｌ、３５％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ，８．７０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．０２（ｍ，４Ｈ），６．９５（ｓ，２Ｈ），３．５２−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｓ，１２Ｈ），２．７２（ｄｔ，Ｊ＝６．８，８．０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６６．０，１６４．７，１５６．８，１５６．６，１３５．９，１３１．２，１３０．６，１１４．６，９６．３，４２．９，４０．５，２３．３；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ２７Ｎ３Ｏ４Ｓ：４８９．１７２２；実測値４８９．１７２３。
【０１６２】
４６：１‐（｛４‐［（１Ｚ）‐１‐｛［２‐（｛３‐カルボキシラト‐４‐［６‐（ジメチルアミノ）‐３‐（ジメチルイミニウミル）‐３Ｈ‐キサンテン‐９−イル］フェニル｝ホルムアミド）エチル］スルファニル｝‐２‐シアノエタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート（ＴＡＭＲＡ−ＡＰＮ−ＴＭＴＩ）。
４５（１当量、６．７４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（１ｍＬ）溶液を４６ａ（１当量、９．６４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液と混合させた。次いでＤＩＰＥＡ（５当量、１３２μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を５分の反応後にＨＰＬＣに注入し、４６（１１．９ｍｇ、０．０１４９ｍｍｏｌ、９３％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．９８（ｔ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），８．１０−８．２０（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．５７−７．６９（ｍ，４Ｈ），６．９７−７．１５（ｍ，５Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），２．８１−２．９０（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｂｒ．ｓ．，１６Ｈ），１．２５（ｓ，６Ｈ），１．０５（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）−情報なし（低い分割シグナル）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ４７Ｈ４９Ｎ４Ｏ４Ｓ２＋，７９７．３１８９７；実測値７９７．３２７３９。
【０１６３】
１‐（｛４‐［２‐シアノ‐１‐［（２‐｛４‐［（Ｅ）‐２‐［４−（ジメチルアミノ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］ベンゼンスルホンアミド｝エチル）スルファニル］エタ‐１‐エン−１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウム（４７，ＢＨＱ２−ＡＰＮ−ＴＭＴＩ）：
【化６４】
0006578275.tif 000075
４７ａ：（Ｅ）−４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）−Ｎ−（２−メルカプトエチル）ベンゼンスルホンアミド。
塩化ダブシル（１当量、１００ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）の０℃に冷却した乾燥ＡＣＮ（３ｍＬ）溶液に、ＴＥＡ（７当量、２１８ｍｇ、０．３ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ）および二塩酸シスタミン（５当量、３４７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を続いて添加した。２時間の撹拌後、ＤＴＴ（６当量、２８５ｍｇ、０．２７５ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）を反応塊に添加した。得られた溶液をさらに２時間撹拌し、蒸発させ、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）によって精製して４７ａ（１０５．９ｍｇ、９４％）を橙色固体として生成した。
【０１６４】
４７：１‐（｛４‐［（２‐シアノ‐１‐［（２‐｛４‐［（Ｅ）‐２‐［４‐（ジメチルアミノ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］ベンゼンスルホンアミド｝エチル）スルファニル］エタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート。
４６の合成と同じ手順。収率：９４％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０３（ｔ，Ｊ＝４．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．８０−７．８７（ｍ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，２Ｈ），７．７２−７．７９（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｓ，４Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，２Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．１０（ｓ，６Ｈ），２．７１−２．８７（ｍ，４Ｈ），１．３２（ｓ，６Ｈ），１．１７（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６０．２，１５８．６，１５８．３，１５５．１，１５３．７，１４３．１，１４０．３，１３６．８，１３１．９，１３１．３，１２９．５，１２８．２，１２５．９，１２２．８，１１７．２，１１２．１，１０６．４，９９．４，６０．０，４３．３，４２．９，３４．５，２６．４，２５．３；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３６Ｈ４２Ｎ５Ｏ２Ｓ３＋，６７２．２４９５１；実測値６７２．２５０４２。
化合物４６〜４７を、他の場合には到達可能でない化合物（ＴＭＴＩ）の調製に用いることができる。  
【０１６５】
５‐（３‐｛４‐［１‐（４‐｛［４‐（２‐シアノエタ‐１‐イン‐１‐イル）フェニル］カルバモイル｝ブチル）‐１Ｈ‐１，２，３‐トリアゾール‐４−イル］ブタンアミド｝プロピル）‐２‐［（Ｅ）‐２‐［４‐ヒドロキシ‐２‐（２‐｛２‐［２‐（２‐｛５‐［（４Ｓ）‐２‐オキソ‐ヘキサヒドロ‐１Ｈ‐チエノ［３，４‐ｄ］イミダゾリジン‐４−イル］ペンタンアミド｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］安息香酸（４８，ＡＰＮ−ＨＡＺＡ−ビオチン）：
【化６５】
0006578275.tif 000076
化合物４８を本発明による精製および／または固定化に用いることができる。
【０１６６】
４８ａ：２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（２−メルカプトエチル）カルバモイル）ベンゾエート。
この化合物を、先に報告したプロトコールに従って合成した。
【０１６７】
４８：５‐（３‐｛４‐［１‐（４‐｛［４‐（２‐シアノエタ‐１‐イン‐１‐イル）フェニル］カルバモイル｝ブチル）−１Ｈ‐１，２，３‐トリアゾール‐４−イル］ブタンアミド｝プロピル）‐２‐［（Ｅ）‐２‐［４‐ヒドロキシ‐２‐（２‐｛２‐［２‐（２‐｛５‐［（４Ｓ）‐２‐オキソ‐ヘキサヒドロ‐１Ｈ‐チエノ［３，４‐ｄ］イミダゾリジン‐４−イル］ペンタンアミド｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］安息香酸（ＡＰＮ−ＨＡＺＡ−ビオチン）。
４８ａ（１当量、１０ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）および７７（１当量、３．１２ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．４７２ｍＬ）溶液に、アスコルビン酸ナトリウム（１０当量、２４．４ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（５当量、１５．４ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ）の水溶液を添加した。得られた反応塊を脱気し、２５℃で一晩撹拌した。反応塊をＨＰＬＣによって直接精製し、４８（８．３ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ、６３％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），３．７０−３．８１（ｍ，８Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，２Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝５．０２Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．４１−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．０７（ｍ，６Ｈ），２．８９−３．００（ｍ，１０Ｈ），２．７８（ｄｄ，Ｊ＝４．８９，１２．９３Ｈｚ，１Ｈ），２．５２−２．６７（ｍ，８Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−２．１９（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．９１（ｍ，４Ｈ），１．６５−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．６３（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．５２（ｍ，１Ｈ），１．２３−１．３１（ｍ，１Ｈ）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ５６Ｈ６７Ｎ１１Ｏ１１Ｓ，１０７７．４７４２２；実測値１０７７．４５９３１。
【０１６８】
２−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソエタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（４９）：
【化６６】
0006578275.tif 000077
４９ａ：２−クロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソエタン−１−アミニウム。
VasselおよびSkelly（１０．１００２／０４７１２６４１８０．ｏｓ０３５．０９）によって先に記載されているように合成した。
【０１６９】
４９：２−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソエタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート。
３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、６６．３ｍｇ、０．４６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．１当量、６６．３ｍｇ、０．０８４８ｍＬ、０．５１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、（２−クロロ−２−オキソエチル）トリメチルアザニウムクロリド（１．１当量、８８．３ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）の−２０℃に冷却したＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を添加した。得られた反応塊を２５℃で１０時間撹拌し、ＲＰフラッシュクロマトグラフィによって精製し、４９を黄色がかった固体として得た（３９ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、２４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１１．１４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．７０−７．８３（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．７０（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．３３（ｓ，２Ｈ），３．２８（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１６３．５，１４２．５，１３５．８，１２１．２，１１３．５，１０６．５，８４．４，６６．３，６３．１，５５．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１６Ｎ３Ｏ＋［Ｍ］＋，２４２．１３；実測値２４２．１３。
【０１７０】
３−（１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド）ペンタン二酸（５０）：
【化６７】
0006578275.tif 000078
４３（１当量、５．６５ｍｇ、０．０３３６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．０３３１ｍＬ）溶液に、二酸アルキン（１当量、１４．６ｍｇ、０．０３３６ｍｍｏｌ）の水（０．０３３１ｍＬ）溶液を添加した。得られた反応塊に硫酸銅五水和物（０．１当量、０．８３９ｍｇ、０．００３３６ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加し、続いて、アスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、３．３３ｍｇ、０．０１６８ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加した。この添加を、３０分後、出発物質が完全に消失するまで（全体で２回）繰り返した。過剰の水を真空まで蒸発させ（加熱を用いてはならない、そうしないと、加水分解生成物が生じ始める）、得られた粗塊を、シリンジフィルタを通した銅塩の濾過後にＨＰＬＣによって精製し、５０（１１ｍｇ、０．０１８２８ｍｍｏｌ、５４％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４１（ｓ，１Ｈ），７．９５−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．８８−７．９４（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），４．４９（ｔｄ，Ｊ＝６．７１，８．４１Ｈｚ，１Ｈ），３．６８−３．７６（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．６８（ｍ，２１Ｈ），２．５３−２．６４（ｍ，５Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝２．４２，４．９６Ｈｚ，１５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１８８．７，１７３．３，１６１．６，１４６．５，１３５．１，１３１．３，１３０．８，１２２．５，１２１．０，１１７．９，１１５．４，６４．２，４０．４，３９．５，３６．７，３０．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２８Ｈ３４Ｎ５Ｏ１０−［Ｍ−Ｈ］−，６００．２１；実測値６００．２３。
【０１７１】
Ｎ１，Ｎ５−ビス（２３−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）−３−（１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド）ペンタンジアミド（５１）：
【化６８】
0006578275.tif 000079
４３（１当量、１．６４ｍｇ、０．００９７３ｍｍｏｌ）およびＰＥＧ−アルキン（１当量、１１ｍｇ、０．００９７３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液を、ＤＭＳＯ（０．００９５８ｍＬ）および水（０．００９５８ｍＬ）の混合物に添加した。得られた反応塊に硫酸銅五水和物（０．１当量、０．２４３ｍｇ、０．０００９７３ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加し、続いて、アスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、０．９６４ｍｇ、０．００４８７ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加した。反応塊を濾過し、ＨＰＬＣによって精製し、５１（５ｍｇ、０．００３８３９ｍｍｏｌ、３９％）を無色液体として得た。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ６０Ｈ１０３Ｎ９Ｏ２２，１３０１．７２１７７；実測値１３０１．７２２０４。
【０１７２】
Ｎ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデシル）−１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド（５２）：
【化６９】
0006578275.tif 000080
３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、１４．９ｍｇ、０．０８８６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．０８７２ｍＬ）溶液、ＰＥＧ−アルキン（１当量、５０．２ｍｇ、０．０８８６ｍｍｏｌ）の水（０．０８７２ｍＬ）溶液。得られた混合物に硫酸銅五水和物（０．１当量、２．２１ｍｇ、０．００８８６ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加し、続いて、アスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、８．７７ｍｇ、０．０４４３ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加した。硫酸銅五水和物（０．１当量、２．２１ｍｇ、０．００８８６ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、８．７７ｍｇ、０．０４４３ｍｍｏｌ）の添加を、３０分後、出発アジドが依然として存在するとき、繰り返した。過剰の水を真空まで蒸発させ、粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、５２（５５ｍｇ、０．０７４８５ｍｍｏｌ、８４％）を無色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４２（ｓ，１Ｈ），７．９５−８．０２（ｍ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．８６−７．９５（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．１９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６５−３．７３（ｍ，７Ｈ），３．５４−３．６５（ｍ，２９Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｑ，Ｊ＝５．３５Ｈｚ，２Ｈ），３．１３（ｄ，Ｊ＝４．５２Ｈｚ，２Ｈ），２．３７−２．４６（ｍ，２Ｈ），１．９２−２．０１（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７７．５，１５１．３，１４４．６，１４０．７，１４０．７，１４０．６，１２７．２，１２６．０，１２５．９，１２５．８，１２２．４，１１０．５，８７．２，７５．４，７５．３，７５．３，７５．２，７５．２，７５．１，７５．１，７５．１，７５．０，７４．９，７４．８，７４．８，７２．２，７１．９，６８．９，６８．５，４５．０，４４．２，４１．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３５Ｈ５５Ｎ６Ｏ１１＋［Ｍ＋Ｈ］＋，７３５．３９；実測値７３５．２０。
【０１７３】
１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）ウレア（５３）：
【化７０】
0006578275.tif 000081
トリホスゲン（１当量、５６．３ｍｇ、３１．６μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．４０４μＬ）溶液に、３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（３当量、８０．９ｍｇ、０．５６９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．４０４μＬ）を添加し、次いで、トリエチルアミン（６当量、１１５ｍｇ、１５８μＬ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、次いで、３−ジメチルアミノプロピルアミン（３当量、５８．１ｍｇ、７１．８μＬ、０．５６９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２当量、３８．４ｍｇ、５２．７μＬ、０．３７９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．４０４μＬ）中に添加した。反応混合物を１０分間撹拌し、次いで、濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣによって精製し、５３（４７ｍｇ、０．１７６４ｍｍｏｌ、９３％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４５−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４５（ｍ，２Ｈ），３．２３−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０４−３．１１（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｓ，６Ｈ），１．７７−１．９１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５６．５，１４３．７，１３４．４，１１８．０，１０９．３，１０５．０，８３．７，６１．０，５５．２，４２．１，３５．９，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２０Ｎ４Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２７１．１６；実測値２７１．１５。
【０１７４】
３−（（３−（３−（４−（シアノエチニル）フェニル）ウレイド）プロピル）ジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート（５４）：
【化７１】
0006578275.tif 000082
５３（１当量、２７ｍｇ、０．０７０２ｍｍｏｌ）および１，３−プロパンスルトン（１．１当量、９．４４ｍｇ、０．００６７８ｍＬ、０．０７７３ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（０．５ｍＬ）に溶解し、３時間還流した。反応混合物を室温まで冷却し、沈殿を濾過し、冷蒸留水で洗浄してあらゆる未反応プロパンスルトンを除去し、５４（２７ｍｇ、０．０６８８ｍｍｏｌ、９８％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，酸化重水素）δ７．４５−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．６１（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ），３．５３（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．３９（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．３１（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．２５（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．０３（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），２．８９（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），２．１３（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１．８９（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），１．０８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１８Ｈ２４Ｎ４Ｏ４Ｓ，３９２．１５１８３；実測値３９２．１５２５４。
化合物４９〜５４を、例えばＡＤＭＥパラメータを変更するための（可溶化剤）本発明によるコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１７５】
３−（４−（４−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（５５）：
【化７２】
0006578275.tif 000083
３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、３００ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）および２−プロピン−１−オール（２当量、２００ｍｇ、０．２１１ｍＬ、３．５７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（９ｍＬ）に可溶化させた。この混合物に、硫酸銅五水和物（１０％、４４．５ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）の１．５ｍＬの水溶液、続いてアスコルビン酸ナトリウム（０．５当量、１７６ｍｇ、０．８９２ｍｍｏｌ）の１．５ｍＬの水溶液を添加した。得られた溶液を２時間撹拌し、次いで、ロータリーエバポレータで濃縮させた。残渣をＤＣＭで抽出した。有機層をＮＨ４Ｃｌ（飽和）および水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、次いで、蒸発させた。残渣をＤＣＭに再可溶化させ、生成物を濾過して５５（２３．２８ｍｇ、０．０８１０８ｍｍｏｌ、９２％）を僅かに黄色がかった固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．５８（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），４．７７（ｓ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ９Ｎ４Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２５．０８；実測値２２５．０５。
【０１７６】
３−（４−（４−（ブロモメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（５６）：
【化７３】
0006578275.tif 000084
５５（１当量、１９．８ｍｇ、０．０８８１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に、窒素下、室温で溶解させ、３−｛４−［４−（ブロモメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］フェニル｝プロプ−２−インニトリル（２３．３ｍｇ、０．０８１１ｍｍｏｌ、９２％）を添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、５６（２３．３ｍｇ、０．０８１１ｍｍｏｌ、９２％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４４（ｓ，１Ｈ），７．７８−８．０３（ｍ，５Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５０．９，１４４．３，１４０．６，１４０．５，１２６．０，１２５．９，１１０．４，８７．１，６８．５，２７．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ８ＢｒＮ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２８６．９９；実測値２８７．０８。
化合物５６を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【０１７７】
１−（｛１−［４−（シアノエチニル）フェニル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル｝メチル）−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフルオロアセテート（５７）：
【化７４】
0006578275.tif 000085
３−｛４−［４−（ブロモメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］フェニル｝プロプ−２−インニトリル（１当量、１９．６ｍｇ、０．０６８４ｍｍｏｌ）およびＴＭＴＨ（１．８９当量、２１．７ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．９８２ｍＬ）脱気溶液に、リチウムトリフラート（１０当量、１０６ｍｇ、０．６８４ｍｍｏｌ）の水（０．９８２ｍＬ）溶液を添加した。得られた二相混合物を２５℃で２日間激しく混合した。相を分離し、有機相をＤＣＭ（５×２ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機分を蒸発させ、粗生成物をＨＰＬＣによって精製して５７（２３．７ｍｇ、０．０４５１，６６％）を白色固体として得た。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｓ，３７５．１６４３４；実測値３７５．１６４９７。
化合物５７を本発明によるクリック化学（歪促進クリック）に用いることができる。
【０１７８】
４−（（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（５８）：
【化７５】
0006578275.tif 000086
２−［６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニウミル）−３Ｈ−キサンテン−９−イル］−４−［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］ベンゾエート（１当量、５２．８ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）および３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、１９ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に可溶化させた。得られた反応混合物にＨ２Ｏ（１ｍＬ）を添加し、続いて、硫酸銅五水和物（１０％、２．８２ｍｇ、０．０１１３ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５０％、１１．２ｍｇ、０．０５６５ｍｍｏｌ）の最小量の水の溶液を添加した（別々に）。得られた反応混合物をさらに３０分間撹拌し、蒸発させ、ＨＰＬＣによって精製して５８（６６．８ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ、９３％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．５１（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄｄ，Ｊ＝１．５１，８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．８６−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．８６（ｍ，３Ｈ），７．０２−７．１２（ｍ，２Ｈ），６．８４−７．０２（ｍ，４Ｈ），４．５８−４．７１（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ３７Ｈ２９Ｎ７Ｏ４，６３５．２２８１１；実測値６３５．２２８６１。
【０１７９】
３−（９−（ジエチルアミノ）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−２−イル）プロピオニトリル（５９）：
【化７６】
0006578275.tif 000087
５９ｂ：８−（ジエチルアミノ）−３−ヒドロキシ−１２Ｈ−１０−オキサ−５−アザテトラフェン−１２−オン（１当量、６５ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させ、５℃に冷却した。次いで、ＴＥＡ（１．２当量、２３．６ｍｇ、０．０３２４ｍＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＴｆＣｌ（１．２当量、３９．３ｍｇ、０．０２４９ｍＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を添加した。出発物質が完全に消失するまでＴｆ２Ｏの添加を繰り返した。溶媒を蒸発させ、残渣を水で処理した。沈殿を濾去し、水およびヘプタンで洗浄して所望の生成物（７６ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、８４％）を暗紫色固体として得た。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２１Ｈ１７Ｆ３Ｎ２Ｏ５Ｓ，４６６．０８１０３；実測値４６６．０８２２１。
【０１８０】
５９ａ：不活性雰囲気下、ＤＩＰＥＡ（２当量、１６．１ｍｇ、０．０２０６ｍＬ、０．１２４ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアルコール（１．５当量、５．２３ｍｇ、０．００５５１ｍＬ、０．０９３３ｍｍｏｌ）を５９ｂ（１当量、２９ｍｇ、０．０６２２ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（５％、２．１８ｍｇ、０．００３１１ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（１０％、１．１８ｍｇ、０．００６２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に添加した。９０℃で２時間撹拌後、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ−メチルＯＨ１００−０〜８０−２０）によって精製した。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ３，３７２．１４７３９；実測値３７２．１４７３５。
【０１８１】
５９：５９ａ（１当量、１０ｍｇ、０．０２６９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．１２１ｍＬ）溶液にＭｇＳＯ４（１５当量、４８．５ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）、ＮＨ３（４当量、２Ｍ、０．０５３７ｍＬ、０．１０７ｍｍｏｌ）およびＭｎＯ２（１５当量、３５ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、続いてＨＰＬＣに供した。完了後、混合物を、セライトを通して濾過し、ＴＨＦで完全に洗浄した。濾液の蒸発により粗生成物５９（９．４７ｍｇ、０．０２５８ｍｍｏｌ、９６％）を得、これをＨＰＬＣによって精製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．９１（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝１．５１，８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝２．６３，９．１６Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝２．５１Ｈｚ，１Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），３．４９（ｑ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，４Ｈ），１．０９−１．３６（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ１７Ｎ３Ｏ２，３６７．１３２０８；実測値３６７．１３１４５。
【０１８２】
（Ｅ）−３−（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）フェニル）プロピオニトリル（６０）：
【化７７】
0006578275.tif 000088
７（１当量、１６７ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．５８ｍＬ）に溶解した。この撹拌混合物にイソアミルニトリル（１．５当量、２０６ｍｇ、０．２３７ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに２分間継続させ、次いでジメチルアニリン（１．１当量、１５６ｍｇ、０．１６５ｍＬ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を一晩撹拌し（赤色になった）、蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ、最初のピーク）によって精製して６０（１２０ｍｇ、０．４３７ｍｍｏｌ、３７％）を赤色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．８２−７．８８（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．６２−７．７７（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），３．０８−３．１８（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５４．７，１５３．２，１４３．７，１３４．４，１２５．８，１２２．５，１１７．３，１１１．６，１０５．６，８３．３，６４．２，４０．３；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ１４Ｎ４，２７４．１２１８５；実測値２７４．１２２４７。
化合物５８〜６０を、本発明による検出方法方法に用いることができる。
【０１８３】
（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６１）：
【化７８】
0006578275.tif 000089
４３（１当量、５１．５ｍｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）およびｂｏｃ−プロパルギルアミン（１当量、４７．５ｍｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液にＨ２Ｏ（１ｍＬ）ならびにＣｕＳＯ４（１０％、４．８９ｍｇ、０．０３０６ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５０％、３０．３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）の水（各５０μＬ）溶液を添加した。撹拌を１０分間継続させ、ＣｕＳＯ４（１０％、４．８９ｍｇ、０．０３０６ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５０％、３０．３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のうちもう一方の部分を添加した。さらに１５分間撹拌した後、Ｅｔ２Ｏ（１５ｍＬ）およびＮＨ４Ｃｌ（飽和、１０ｍＬ）を添加した。有機相をＮＨ４Ｃｌ（飽和、１０ｍＬ）でもう二回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて６１（９８ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ、９９％）を黄色固体として得た。さらに精製することなく用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９７（ｓ，１Ｈ），７．７４−７．８１（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．６７−７．７４（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，２Ｈ），１．３２−１．４１（ｍ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３９．０，１３５．１，１２０．４，１１７．８，１０７．２，１０５．１，８１．３，６４．５，２８．４；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ５Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３２３．１４；実測値３２３．１３。
【０１８４】
（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メタンアミニウムトリフルオロアセテート（６２）：
【化７９】
0006578275.tif 000090
６１（１当量、２１．５ｍｇ、０．０６６５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液にＴＦＡ（２０当量、１５１ｍｇ、０．０９８８ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で一晩（または３７℃で２時間）放置し、全ての揮発性化合物の蒸発後に標的生成物（２２．４ｍｇ、０．０６６５ｍｍｏｌ、１００％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．７４（ｓ，１Ｈ），７．９９−８．１５（ｍ，２Ｈ），７．８５−７．９７（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．４５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１４１．２，１３８．９，１３５．２，１２２．３，１２０．３，１１７．７，１０４．４，８１．１，６２．９，３４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１０Ｎ５＋［Ｍ］＋，２２７．０９；実測値２２７．１０。
【０１８５】
Ｎ−（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンズアミド（６３）：
【化８０】
0006578275.tif 000091
４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸（１当量、５７．８ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１当量、９５．５ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（３当量、９７．４ｍｇ、０．１２５ｍＬ、０．７５３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を６２（１当量、８４．７ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）上に添加した。得られた反応塊を１０分間撹拌し、ＨＰＬＣによって精製して標的化合物（７６．５ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ、７０％）を白色固体として得た。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２１Ｈ１２Ｆ３Ｎ７Ｏ，４３５．１０５５４；実測値４３５．１０５１２。
化合物６３を、例えばタンパク質の光標識のための本発明による標識方法に用いることができる。
【０１８６】
（２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６４）：
【化８１】
0006578275.tif 000092
２３（１当量、３６ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）のａｃｎ（１ｍＬ）溶液に、Ｎ−｛２−［（２−アミノエチル）ジスルファニル］エチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量、３６ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．１２当量、３９．１ｍｇ、０．０５ｍＬ、０．３０３ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（１ｍＬ）溶液を添加した。得られた反応混合物を１０分間放置し、次いで溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して標的生成物（２９．３ｍｇ、０．０７２３ｍｍｏｌ、５１％）を黄色がかった固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７４−７．８４（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．５８−７．７４（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．２３−３．３５（ｍ，２Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６７．３，１５７．０，１３７．３，１３３．５，１２７．５，１２０．１，１０４．４，８１．５，７８．８，６３．１，３９．３，３９．１，３７．８，２７．４，２６．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２４Ｎ３Ｏ３Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，４０６．１２；実測値４０６．１０。
【０１８７】
２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（６５）：
【化８２】
0006578275.tif 000093
６４（１当量、２９．３ｍｇ、０．０７２３ｍｍｏｌ）のＡＣＮ−ＤＣＭ混合物（１ｍＬの各溶媒）溶液にＴＦＡ（１０当量、８２．４ｍｇ、０．０５３７ｍＬ、０．７２３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を２４時間撹拌し、蒸発させて標的化合物６５（３０ｍｇ、０．０７１５ｍｍｏｌ、９９％）を無色液体として得た。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１４Ｈ１６Ｎ３ＯＳ２＋，３０６．０７２９３；実測値３０６．０７３１２。
【０１８８】
２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（６６）：
【化８３】
0006578275.tif 000094
６２（０．５６７当量、１０．１ｍｇ、０．０２９９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（０．０８８１ｍＬ）溶液を２−［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１−イル］酢酸（１当量、２１．４ｍｇ、０．０５２８ｍｍｏｌ）の水（０．６６１ｍＬ）溶液にゆっくり添加した。混合物を氷によって冷却し、ＤＩＰＥＡ（２５．２当量、１７２ｍｇ、０．２２ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を用いてｐＨを５に調整した。ＥＤＣ（０．６５当量、６．５９ｍｇ、０．０３４４ｍｍｏｌ）の水溶液を滴加し、氷冷しながら２０分間撹拌した。ＤＩＰＥＡを用いてｐＨを８まで上昇させ、３０分間室温で反応させた。反応の終点をＨＰＬＣを用いてモニタリングした。
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２８Ｈ３５Ｎ９Ｏ７＋，６０９．２６５９４；実測値６０９．２６４１７。
化合物６６をキレート剤として用いることができる。 
【０１８９】
５−（（４−（（４−（２−シアノ−１−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニルフェニル）−（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）ビニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（Ａ）：
【化８４】
0006578275.tif 000095
４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）−ブタン酸（ＢＨＱ−２）。
FastBlackKヘミ（塩化亜鉛）塩（実用等級、約３０％の染料分）（７．７６ｇ）を冷水（１５０．０ｍＬ、０℃）に懸濁させ、２０分間撹拌した。懸濁液を濾過し、赤色溶液を、水アセトン混合物（１：１）（１５０．０ｍＬ）中の４−（メチル（フェニル）アミノ）ブタン酸（１．３３ｇ、６．８８ｍｍｏｌ）、濃塩酸（３．１ｍＬ）および酢酸ナトリウム（３．６ｇ、４３．９０ｍｍｏｌ）の冷（０℃）混合物に滴加した。反応混合物を１０℃で１５分間および室温で２時間撹拌した。次いで、反応粗生成物を酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（１００％ＥｔＯＡｃ、次いで１００％ＤＣＭ〜ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５：５））によって精製した。ＢＨＱ−２（１．３６ｇ、３９％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．３１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−１．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７６．２，１５７．１，１５４．３，１５３．０，１５１．４，１４９．０，１４７．４，１４５．０，１４２．６，１２６．９，１２５．３，１２４．２，１１２．１，１０１．７，１００．７，５７．２，５２．３，３９．０，３１．６，２２．９。
【０１９０】
６５ｂ：４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）−Ｎ−（２−メルカプトエチル）ブタンアミド（（ＢＨＱ−２）−ＳＨ）。
ＢＨＱ−２（１当量、９２．２ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＴＥＡ（６当量、１５２μＬ、１．０９ｍｍｏｌ）および二塩化シスタミン（５当量、２０４ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１当量、６９ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温に到達させ、１５時間撹拌した。全て転換したら、ＤＴＴ（６当量、１６８ｍｇ、０．１６２ｍＬ、１．０９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１０分間撹拌した後、粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（７５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：０〜９５：５）によって精製して（ＢＨＱ−２）−ＳＨ（６０．７ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、５９％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．３３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝９．００Ｈｚ，２Ｈ），５．９０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４１（ｄｔ，Ｊ＝６．２，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｔｄ，Ｊ＝６．４，８．４７Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０１−１．９４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７２．２，１５６．６，１５３．８，１５２．４，１５１．１，１４８．５，１４７．０，１４４．７，１４２．３，１２６．４，１２４．９，１２３．７，１１１．６，１０１．２，１００．３，５７．０，５６．９，５１．８，４２．５，３８．７，３３．４，２４．９，２３．０；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ７Ｏ５Ｓ，５６５．２１０７；実測値５６５．２１０５。
【０１９１】
６７：５−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。
６２ａ（１当量、１７．３ｍｇ、０．０５０７ｍｍｏｌ）およびＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、２１．８ｍｇ、０．０５０７ｍｍｏｌ）の０℃に冷却したＤＭＦ（１．４ｍＬ）脱気溶液に、ＨＢＴＵ（１当量、１９．２ｍｇ）を０℃で添加した。得られた反応塊を５分間撹拌し、ＴＥＡを添加した。反応塊を２５℃で１時間撹拌し、蒸発させ、ＨＰＬＣによって精製し、６５ａ（２２ｍｇ、６８％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７（ｓ，１Ｈ），８．０８−８．１６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．７０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．５８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．３９（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），δ７．０１（ｓ，４Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），３．４８−３．５８（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｓ，１２Ｈ），２．４４−２．５４（ｔ，Ｊ＝７．１７Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−２．１２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）−情報なし；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：６３９．２４８１７；実測値６３９．２４３１０。
【０１９２】
Ａ：５−（（４−（（４−（２−シアノ−１−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニルフェニル）−（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）ビニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。
ＢＨＱ−ＳＨ（１．１３当量、２ｍｇ、０．００３５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）脱気溶液に、６７（１当量、２ｍｇ、０．００３１３ｍｍｏｌ）のメタノール（０．５ｍＬ）脱気溶液を添加した。ＴＥＡ（４．６当量、２μＬ、０．０１４４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を２５℃で一晩放置した。溶媒を蒸発させ；粗生成物をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）に再溶解させ、ＨＰＬＣによって精製し、ＢＨＱ−ＡＰＮ−ＴＡＭＲＡ（Ａ，２．７ｍｇ、０．００２２５ｍｍｏｌ、７２％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．６３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．２２（ｄｄ，Ｊ＝７．８，２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．７５−６．８６（ｍ，８Ｈ），５．４８（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．４５−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｓ，１２Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．０８−２．１６（ｍ，２Ｈ），１．８８−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）−情報なし；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ６５Ｈ６５Ｎ１２Ｏ１０Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１２０５．４６６１８；実測値１２０５．４６７４８。 
【０１９３】
５−（（３−（３−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジ−メチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（Ｂ）：
【化８５】
0006578275.tif 000096
Ｂ−４：３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−４，７−エポキシイソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン。
この化合物を先に記載した手順に従って合成した。８４５
【０１９４】
Ｂ−３：（３−（（３ａＲ，７ａＳ）−１，３−ジオキソ−３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−４，７−エポキシイソインドール−２（３Ｈ）−イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。
Ｂ−４（１当量、１．７６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２当量、５．０７ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．２当量、１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を５０℃で１８時間加熱した。溶液を冷却させ；固体残渣を濾過してＤＭＦで洗浄した。合わせた有機分を蒸発させ、ヘキサン（５０ｍＬ）を添加してスラリー塊を得た。得られた懸濁液をさらなる時間にわたって撹拌し、濾過し、ヘキサンで洗浄してＢ−３（３．３６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、９８％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ６．４９（ｓ，２Ｈ），５．２３（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９６−３．０９（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｓ，２Ｈ），１．６６−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７６．５，１５５．９，１３６．５，８１．０，７９．３，４７．５，３７．１，３６．０，２８．４，２７．８。
【０１９５】
Ｂ−２：１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＴＦＡ塩）。
６６ｃ（１当量、２４３ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）溶液を３時間還流した。トルエンを蒸発させ；得られた白色粗生成物をＤＣＭ（５ｍＬ）に再溶解させ、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。撹拌を出発物質が完全に消失するまで（ＴＬＣによって制御）２時間継続させた。メタノール（３ｍＬ）によって反応をクエンチした後、溶媒を蒸発させた。得られた１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（Ｂ−２、ＴＦＡ塩、１９０ｍｇ、９４％）をさらに精製することなく用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ６．７６（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８０−２．８８（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．８８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７０．６，１３５．６，３８．５，３５．４，２８．０。
【０１９６】
Ｂ−１：２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル）カルバモイル）ベンゾエート（ＴＡＭＲＡ−マレイミド）：
ＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、７１．５ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．２１ｍＬ）溶液に、ＴＥＡ（２．５当量、５７．７μＬ、０．４１５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１．１２当量、７０．７ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊をさらに５分間撹拌し、Ｂ−２（１当量、７１．５ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を２５分間継続し、反応塊を約１ｍＬの体積になるまで減圧下で蒸発させ、反応塊を分取ＨＰＬＣによって精製してＴＡＭＲＡ−マレイミド（Ｂ−１、３４．８ｍｇ、０．０６１５ｍｍｏｌ、３７％）を桃色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．６６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．７２（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１７（ｓ，１２Ｈ），１．８０−１．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７２．５，１６８．２，１６７．４，１６０．６，１５９．０，１５８．９，１３８．１，１３７．７，１３７．６，１３５．５，１３２．９，１３２．３，１３２．０，１３１．４，１１５．６，１１４．８，９７．５，８２．４，４１．０，３８．６，３６．４，２９．３。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３２Ｈ３０Ｎ４Ｏ６，５６６．２１６５３；実測値５６６．２１６５４。
【０１９７】
Ｂ：５−（（３−（３−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロ−フェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。
ＢＨＱ−ＳＨ（１．１５当量、４．６ｍｇ、０．００８１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）脱気溶液に、ＴＡＭＲＡ−マレイミド（Ｂ−１）（１当量、４ｍｇ、０．００３１３ｍｍｏｌ）のメタノール（０．５ｍＬ）脱気溶液を添加した。ＴＥＡ（５当量、５μＬ、０．０３５３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を２５℃で一晩放置した。溶媒を蒸発させ；粗生成物をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）に再溶解し、ＨＰＬＣによって精製してＢ（７ｍｇ、０．００６２１ｍｍｏｌ、８８％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．９１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０１−８．１０（ｍ，３Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，３Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝３．９，８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．２７−３．３８（ｍ，６Ｈ），３．２３（ｍ，１２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），２．８５−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．７２−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７４−１．８８（ｍ，４Ｈ）。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ５９Ｈ６２Ｎ１１Ｏ１１Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１１３２．４３４５５；実測値１１３２．４３３８４。
【０１９８】
実施例２：本発明の化合物によるシステイン誘導体の標識
【化８６】
0006578275.tif 000097
一般手順
９８５μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに、５μＬのベンズアミド原液（水中１０ｍＭ）、５μＬのアリールプロピオニトリル原液（１−１２、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）および５μＬのＡｃＣｙｓＮＨＢｎ原液（７ｍ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を続けて添加した。反応混合物（５０μＬ）のアリコートをＨＰＬＣ（反応の０および３０分で注入）によって分析した。出発物質および加水分解生成物のピーク下の面積を内部標準のピークの面積に従って正規化した。
【０１９９】
結果
得られた結果を以下の表２にまとめる。表２は、５０μＭの濃度の各試薬において２５℃で７ｍの存在下に３０分での化合物１〜１２の転化率を提示する。反応は、プロピオニトリル基に対してオルト位の置換基に由来する立体障害（エントリー１、５、８〜９、４）、ならびに置換基：−Ｉおよび−Ｍ置換基；の電子効果の増加（エントリー１０および１２）に対して極めて感受性であるが、＋Ｍ置換基は、化合物の反応性を低下させる（エントリー３および７）。
【表３】
0006578275.tif 000098
【０２００】
実施例３：式（Ｉ）の化合物の加水分解安定性およびフェニルマレイミドとの比較
９８０μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに、１０μＬのベンズアミド原液および１０μＬの求電子剤原液（フェニルマレイミド１または
【化８７】
0006578275.tif 000099
を続けて添加し、最終濃度を１ｍＭとした（内部標準および求電子剤の両方）。反応混合物（５０μＬ）のアリコートをＨＰＬＣによって分析し、５時間加水分解した（３０分ごとに注入）。出発物質および加水分解生成物のピーク下の面積を内部標準のピークの面積に従って正規化した。
【０２０１】
得られた結果を図４および５に提示する。顕著な加水分解はフェニルマレイミド１についてのみ観察された（ＰｈＭａｌ、ｋｏｂｓ＝７×１０−５ｓ−１）。１１は、検出可能な濃度変化を示さなかった。
【０２０２】
実施例４：式（ＩＩＩ）の化合物の安定性
種々の条件における以下の化合物の安定性
「付加物」
【化８８】
0006578275.tif 000100
の１００ｍＭ原液をＤＭＳＯ中で調製し、−２０℃で保存した。１μＬの上記原液を９９９μＬの希釈標準溶液に添加し、最終濃度が１００μＭの基質を得た。アリコートを０、３０および６０分で分析した。出発物質のピーク下の面積を内部標準（ベンズアミド）のピークの面積に従って正規化した。全ての測定を２５℃で行った。
【０２０３】
以下の表３は、種々の媒体中の１時間での「付加物」の転化率を示す。
【表４】
0006578275.tif 000101
【０２０４】
この実験は、付加物が安定であり、広範な条件、特に０〜１４の範囲のｐＨにおいて非常に僅かな分解しか経験しないことを明確に示している。
【０２０５】
また、付加物が、過剰の別のチオール、例えばフェニルチオールまたはグルタチオンを含む媒体に１時間暴露されたとき、いずれのチオール交換もほとんど観察されない。
【０２０６】
式（ＩＩＩ）の化合物の安定性およびマレイミドとの比較
以下の化合物Ａ（本発明による）およびＢ（参照化合物）の安定性を種々の生体条件において調査した。
【化８９】
0006578275.tif 000102
【０２０７】
細胞培養：
マウスからの正常な肝臓ＢＮＬ  ＣＬ．２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Perbio,Brebieres,France）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Eurobio）を補充した１ｇ／ｌのグルコース（Eurobio,Les Ulis,France）を含むダルベッコＭＥＭ培地において成長させた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２湿気環境に維持した。
【０２０８】
顕微鏡
実験の２４時間前に、ウエルあたり２．５×１０４のＢＮＬ  ＣＬ．２細胞を８ウエルのLab-Tek IIチャンバーカバーガラス（参照番号１５５４０９，Nunc,Naperville,IL,USA）に播種した。所要量のプローブＡおよびＢをＭＥＭ完全培地において３００μｌまで希釈して１μＭの最終濃度を得、次いで、上記細胞上に添加した。５μｇ／ｍｌのHoechst118溶液を核マーカーとして用いた。細胞を、１０％ＦＢＳフェノールレッドフリーイーグルＭＥＭ培地で洗浄した後、共焦点Leica TSC SPE II顕微鏡によって観察した。
【０２０９】
サイトメトリー：
実験前日、ＢＮＬ  ＣＬ．２細胞をダルベッコＭＥＭ完全培地中２．０×１０４細胞／ウエルで９６プレート（Greiner Bio One,Frickenhausen,Germany）に播種した。両方のプローブ（ＡおよびＢ）をダルベッコＭＥＭ完全培地中１μＭの濃度で調製し、種々の時間（２、６および２４時間）の間、細胞上に添加した。ＰＢＳ（Eurobio）で洗浄し、４０μｌのトリプシンで５分間インキュベーションし、１６０μＬのＰＢＳ  ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を添加した後、細胞を、緑色レーザーによるPCA-96Guavaサイトメーター（Guava Technologies Merck Millipore,Billerica,MA,USA）におけるフローサイトメトリーによって分析した。
【０２１０】
第１に、化合物Ａは、ヒト血漿において化合物Ｂよりもはるかに安定であった（図１参照）。第２に、化合物Ａは、インセルロにおいて、化合物Ｂよりも、はるかに安定であった（図２参照）。
【０２１１】
実施例４：チオール部位に対する本発明の化合物の選択性
選択性についてのスクリーニングを、非保護アミノ酸のベンジルアミドにおいて行った。アミノ酸（ＴＦＡ塩の形態）のベンジルアミドおよび求電子剤（フェニルプロピオニトリルおよびフェニルマレイミド）の１００ｍＭの原液をＤＭＳＯ中で調製し、−２０℃で保存した。１００ｍＭのベンズアミド原液（内部標準として使用）を蒸留水中で調製し、−２０℃で保存した。反応混合物の分析をShimadzu LC with SunFire（商標）Ｃ１８（５μＭの４．６×１５０ｍｍのカラム）によって行った（Waters）。ＨＰＬＣパラメータは以下の通りであった：流量：１ｍＬ／分、勾配：５〜９５％の移動相Ｂ、０〜２０分、続いて９５％の移動相で５分、およびポスト時間５分。移動相Ａは０．０５％ＴＦＡ水溶液（ｍＱ）（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂはアセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）であった。データを、Shimadzu分析ソフトウェアを用いて分析した。シグナルを、内部標準（ベンズアミド）のピークの面積に従って正規化した。アミノ酸ベンジルアミドのピーク下の面積を用いて反応の際の転化率を算出した。
【０２１２】
１０μＬのアミノ酸ベンズアミド原液および２．５μＬのベンズアミド原液を、９７７．５μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに添加した。溶液を撹拌し、１０μＬの求電子剤原液を添加して１ｍＭの最終濃度の試薬および０．２５ｍＭの濃度のベンズアミドを得た。反応混合物（５０μＬ）のアリコートを１時間の加水分解（０、３０および６０分で注入）でＨＰＬＣによって分析した。出発物質および加水分解生成物のピーク下の面積を内部標準のピークの面積に従って正規化した。フェニルプロピオニトリルの場合、いずれのアミノ酸モデルも１．６％超の転化率を得られなかった（以下の表３を参照）。逆に、フェニルマレイミドを試験したとき、いくつかのアミノ酸ベンジルアミドが最大で８．５％の転化率を示した。対応するアダクトの塊をいくつかの場合において（表４の太字を参照）質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）によって検出した。
【０２１３】
以下の表４は、フェニルプロピオニトリル（１）の存在下、ＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中１時間でのベンジルアミドの転化率を提示する。
【表５】
0006578275.tif 000103
【０２１４】
以下の表５は、フェニルマレイミドの存在下、ＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中１時間でのベンジルアミドの転化率を提示する。太字の値は、対応するアダクトの塊がＥＳＩ−ＬＣＭＳによって検出されたものに相当する。
【表６】
0006578275.tif 000104
【０２１５】
結論として、チオール部位に対する本発明の化合物の選択性は、他の部位と比較したとき、プロピオニトリル部位がマレイミド部位で置き換えられている対応する化合物について得られた選択性よりも明らかに高い。
【０２１６】
実施例５：毒性試験
以下の式（ＩＩ）の「リンカー」化合物の毒性をＨａＣａＴ細胞株におけるＭＴＴアッセイによって検討した：
【化９０】
0006578275.tif 000105
インビトロ細胞毒性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いて測定した。この実験を、細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清および１ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地、ウエルあたり２００μＬ）においてコンフルエンスまで成長させたＨａＣａＴ細胞を含む９６ウエルプレートにおいて実施した。細胞を化学試薬によって種々の濃度（１／２段階希釈により１００μＭ〜０．７８μＭ）で３７℃において２４時間インキュベートした。インキュベーション後、上澄みを、ＭＴＴ（３００μｇ／ｍＬ）を含有する新たな培養培地で置き換えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、培地を注意深く除去し、１００μＬのＤＭＳＯを添加し、ＭＴＴのミトコンドリア内酵素誘導還元によって生成したホルマザン結晶を溶解した。吸光度をマイクロプレートリーダー（Biotek,Synergy HT）を用いて５９５ｎｍで測定した。細胞生存性を未処理の対照細胞の百分率として表した。
【０２１７】
ＭＴＴ試験の結果を図５に提示する。式（ＩＩ）の化合物は毒性でなく、そのため、例えば生体用途に用いられ得ることが明確に示されている。
【０２１８】
実施例６：式（Ｉ）の化合物によるリゾチームの標識：
リゾチームのトリプシン消化物の標識
１ｎｍｏｌのリゾチームをＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）に可溶化させ、１時間の間５７℃で１ｍＭのＴＣＥＰによって還元した。ＡＰＮ−ＴＭＰＰの溶液（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を１：２００のモル比でタンパク質に添加した。次いで、標識タンパク質をブタトリプシン（Promega V5111）によるタンパク質分解に供した。サンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中１：１００（ｗ／ｗ）トリプシンによって３５℃で一晩消化させた。反応に続いてナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。得られたペプチド混合物を、ナノエレクトロスプレー源を備えたQ-TOF maXis（Bruker Daltonics,Bremen,Germany）質量分析器に連結されたnanoACQUITY Ultra-Performance-LC system（Waters,Milford,MA）においてＣ１８逆相ナノＨＰＬＣによって分析した。クロマトグラフィ分離をnanoACQUITY Ultra-Performance-LCにおいて実施した。ペプチドをACQUITY UPLC（登録商標）BEH130 C18カラム（Waters Corp.）（７５μｍ×２００ｍｍ、１．７μｍ粒径）において分離した。溶媒系は、０．１％ギ酸の水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）からなった。トラッピングを、９９％の溶媒Ａおよび１％の溶媒Ｂによって５μＬ／分で３分間、２０×０．１８ｍｍの５μｍのSymmetry C18プレカラム（Waters Corp.）において実施した。溶離を、１〜５０％勾配の溶媒Ｂを用いて３００ｎＬ／分の流量で５０℃において３０分、続いて、８０％（５分間）の溶媒Ｂにおいて高速上昇で実施した。完全系をHystar 3.2（Bruker Daltonics）によって完全に制御した。Q-TOF機器を以下の設定で操作した：電源温度を２００℃に設定し、乾燥気体流量が４ｌ／時間であり、ナノエレクトロスプレー電圧が４ｋＶであった。ＴＯＦの質量検量線を５０〜２２００ｍ／ｚの範囲においてポジティブモードでES-TOF Tuning Mix（Agilent Technologies）を用いて得た。タンデムＭＳ実験では、系をｍ／ｚ範囲［５０〜２２００］においてＭＳおよびＭＳ／ＭＳモードの両方の間での自動切り替えによって操作した。ＭＳにおいて、総時間は０．２秒であった。ＭＳ／ＭＳにおいて、総時間は、親イオン強度の関数において０．２秒と１．４秒との間で加重した。２つの最も豊富なペプチド（強度閾値４００ａｕ）、好ましくは２、３、４または５つの電荷を有するイオンを各ＭＳスペクトルにおいて選択してさらに単離し、衝突エネルギープロファイルを用いて設定された２つのエネルギーによりＣＩＤフラグメント化した。衝突ガスとしてアルゴンを用いてフラグメント化を実施した。トリプシンペプチドを（初めから）手動で配列決定してその配列を確認し、APN-TMPPプローブによってタグ付けされたシステインを位置付けた。ペプチドを、算出されたペプチド配列のモノアイソトピック質量に基づいて、抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を用いて同定した。
【０２１９】
ＡＰＮ−ＴＭＰＰ化学選択性の評価を、ＡＰＮ−ＴＭＰＰ（１μＭ）対タンパク質のモル比２００：１（システイン部位に対しておよそ１０：１）で、室温で１時間のトリプシン消化物による反応の研究によって実施した。化学的誘導体化によらずおよびこれによって得られたペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。全ての検出可能なシステイン含有ペプチドは、システイン不含ペプチドが影響を受けることなく、プローブと反応し、遅延された。標識効率を、ＬＣ−ＭＳによる、標識および非標識ペプチドの強度間の比に基づいて評価した。検出されたペプチドのうち９８％超が完全に標識された。ＬＣ−ＭＳ結果により、システイン含有ペプチドは、疎水性ＴＭＰＰ基の添加に起因して保持時間が増加する一方で、他の全てのペプチドの保持時間は変化しないということが明確に示されている（表６）。
【０２２０】
以下の表６は、ＡＰＮ−ＴＭＰＰとの反応前後のリゾチームのトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【表７】
0006578275.tif 000106
【０２２１】
実施例７：ＣＤ３８Ａ２７５Ｃ突然変異体による可溶化ＡＰＮ試薬（４９〜５４）のコンジュゲーション。
（４９によるＣＤ３８突然変異体の修飾の例における）実験の一般スキームを図６に示す。
３００μＬのＣＤ３８Ｃ２７５溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に可溶化ＡＰＮ試薬（４９〜５４）の６μＬの５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を添加した。平行して、対照として、３００μＬのＣＤ３８Ｃ２７５に、６μＬのＤＭＳＯを添加した。両方のサンプルを２５℃で１５時間インキュベートし、次いで５回透析し（メンブレンカットオフ１０ｋ）、最終体積が３０μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）のそれぞれを得た。凝集物のサイズをＤＬＳによって測定した。
【０２２２】
実施例８：ＣＤ３８−ＣＤ３７５突然変異体の標識およびマレイミドとの比較
ａ）本発明の化合物および対応するマレイミドの安定性
以下の化合物を合成した:
【化９１】
0006578275.tif 000107
安定性の研究により、本発明の化合物がＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で２４時間安定であることが実証された。比較して、マレイミド部位を含む対応する化合物は、１時間後にＰＢＳ中で７０％が分解した。
【０２２３】
ｂ）ＣＤ３８突然変異体との反応
両方の化合物をＣＤ３８−Ｃ３７５突然変異体の２μＭ溶液と反応させた。
精製後のゲル電気泳動により、対応するマレイミド化合物によってよりも、本発明の化合物によって、より高い標識速度が得られ得ることが示された。図７は、精製前後に本発明の化合物およびマレイミドによって得られたゲル電気泳動を提示する。
【０２２４】
実施例９：化合物１８を用いたトラスツズマブおよびＴＡＭＲＡのコンジュゲーション
実験の一般スキームを図８に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中１０ｍｇ／ｍＬ）に１８の溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬ）１．７４μＬを添加した。２５℃で１時間インキュベーション後、０．６９μＬのＴＡＭＲＡ−ＳＨ（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で１６時間インキュベートし、コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
１８の代わりに４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を用いて比較実験を行った。
得られたコンジュゲート（図９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、化合物１８がＳＭＣＣと比較して高いレベルのコンジュゲーションを可能にすることが示された。
１８を用いて調製したコンジュゲートのネイティブＥＳＩ−ＭＳ分析（図１０、図１１）により、抗体あたり平均１分子のＴＡＭＲＡがコンジュゲートしたことが示された。
ＳＭＣＣを用いて調製したコンジュゲートのネイティブＥＳＩ−ＭＳ分析（図１２、図１３）により、識別不能な種の複合混合物が示された。
実験により、化合物１８が、一般に適用されるＳＭＣＣと比較して、より高いレベルのコンジュゲーションを可能にし、よりクリーンなコンジュゲート集団を与えることが示されている。
【０２２５】
実施例１０：部分還元トラスツズマブへの化合物５８の直接コンジュゲーション。
実験の一般スキームを図１４に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰの溶液（水中１０ｍＭ、１．１または２．２当量）に添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、５８の溶液（８．２５μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で１６時間インキュベートし、コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
得られたコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１５）により、化合物５８が抗体に共有結合したことが示された。ＥＳＩ−ＭＳ分析により、２．２当量のＴＣＥＰを用いて抗体あたり平均４分子がコンジュゲートしたことが示された。
【０２２６】
実施例１１：化合物３３および３４を用いた抗体フラグメントの再架橋。
実験の一般スキームを図１６に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍＬ）を、ＴＣＥＰの溶液（水中１０ｍＭ、５当量）に添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、３３または３４の溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、１５当量）を添加した。得られた溶液を２５℃で１６時間インキュベートし、次いで、還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体フラグメントが化合物３３および３４によって成功裏に架橋されたことが示された（図１７）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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