(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＩＭおよびＩＭＴＥＣＨでそれぞれ受入番号ＮＣＩＭ１３７０、ＭＴＣＣ５９７４で寄託された、セトスファエリア  モノセラスＡＧＷＨ＃１１に由来する除草剤、
界面活性剤および鉱油のうちいずれか、および
抗生剤
を含み、
除草剤が、菌糸接種菌液、胞子接種菌液、分生子接種菌液、培養液、および少なくとも部分的に精製された培養液からなる群から選択される、除草剤組成物。
【請求項２】
セトスファエリア  モノセラスのための培養液をさらに含む、請求項１に記載の除草剤組成物。
【請求項３】
セトスファエリア  モノセラスへの栄養源をさらに含む、請求項１または２に記載の除草剤組成物。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）の新規な除草性培養菌を提供する。また、本発明は、ホテイアオイの生物的制御のための組成物および方法に関する。培養菌の胞子、無細胞培養濾液、原代謝生成物、およびそれらから得られる精製された植物毒素は、ホテイアオイの潜在的な生物的制御剤を制御するのに役立つ。本発明は、生物的制御組成物を水草に適用する際の、製品の生存能力を維持するために、増殖培地に真菌培養菌を配合した除草剤組成物も開示する。本発明は、真菌培養菌が生物防除活性を示すかどうかを判断するための、真菌培養菌のスクリーニング方法も開示する。本発明は、ホテイアオイに対して生物防除活性を示すセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）培養菌を調べるための全ゲノム研究も開示する。
【背景技術】
【０００２】
ホテイアオイ（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｓｐ）は、有毒な水草の属である。このような水草には、エイクホルニア・アズレア（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａａｚｕｒｅａ）、エイクホルニア・クラシペス（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、エイクホルニア・ディバーシフォレア（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ）、エイクホルニア・パニクラタ（Ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｐａｎｉｃｕｌａｔａ）の種が含まれる。インドでは、２００，０００ｈａを超える水面が、この属の植物により汚染されている。このことは、インドや熱帯地方および亜熱帯地方の多くの国々で、経済的、社会的および環境的な問題となっている。これは、植物の繁殖能力、適応能力、栄養必要量、および環境に対する耐性により、根絶できず、また制御が困難となっていることを示している。水路および川岸においてホテイアオイが繁殖することにより、蒸散速度が上昇して水を無駄に消費し、それが魚やプランクトンの大敵となり、また、植物が腐敗し溶存酸素が消費される結果、水生生物が衰弱し、水質が変化する。浮遊性の大型水性植物は、匍匐枝上の腋芽から形成されるラミートにより植物的に、また種子生産を通して性的に、繁殖する。
【０００３】
水草の繁殖を抑制するために、さまざまな方法が試されてきた。除草剤は、即効性作用を有するので最もよく用いられるが、コストがかかり、説明書どおりに使用しないと有害な影響を及ぼし得る。グリホサート剤のような水草の繁殖を抑制するための合成化学除草剤を使用することについて、多くの関心が寄せられている。したがって、合成化学除草剤は、すでに世界の多くの地域で禁止または制限されている。
【０００４】
ホテイアオイは繁殖能力を有し生長が速いので、個体数の回復を低減するために、生物的ストレスを増大する生物防除剤の使用が必要となっている。ホテイアオイの天敵の中では、植物病原菌およびその代謝生成物が役に立ち得る。それは、それらが宿主特異性（作物、野生植物、または動物に危険がない）であることが多く、繁殖、播種、および自生が容易であり、それゆえ繰り返し適用する必要性を低減できるからである。しかしながら、他のバイオ農薬の場合には、微生物の除草剤は、高温、低湿度、および紫外線に曝される環境では不活性になる。実際、バイオ農薬の主な問題は、現地においてうまく適用できるような配合で大規模生産することである。植物性の病原体の中で、真菌は、最も重要な天然の植物性病原体である。多くの真菌病原体が、ホテイアオイの潜在的な生物防除剤として文書に引用されている。真菌病原体としては、セルコスポラピアロピ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｐｉａｒｏｐｉ）（＝Ｃ．ｒｏｄｍａｎｉｉ）、アクレモニウムゾナタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｚｏｎａｔｕｍ）、アルテルナリアエイクホルニアエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｅ）、ミロセシウムロリダム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｒｏｒｉｄｕｍ）、リゾクトニアソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、およびウレド  エイクホルニア（Ｕｒｅｄｏ ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｅ）が挙げられる。アルテルナリアエイクホルニア（Ａ．ｅｉｃｈｈｏｒｎｉａｅ）およびセルコスポラピアロピ（Ｃ．ｐｉａｒｏｐｉ）については、その生態、生物防除性、宿主特異的な形成について研究がなされており、実験的条件で試験されている。
【０００５】
しかしながら、ホテイアオイに対する市販の生物除草剤は手に入らない。生物的制御によって、また環境条件、その植物の生物季節学、および管理オプションの統合的な使用と組み合わせて、水草の活力は低減される。生物防除剤としての生物除草剤の使用は、それゆえかなり注目される。生物除草剤は、一般的にその土地特有のものであり、不要な草木の繁殖を制御するために多量に適用される。特に、微生物除草剤は、真菌植物病原体を基礎とする生物除草剤である。水草を処理する主な目的は、望ましい植物が自由に育つように、水草との生存競争を低減させることである。以上より、水草の生物防除は、化学物質の環境保全および人の健康への影響に関心を向けさせるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
第１の側面では、本発明はホテイアオイの繁殖の制御に適した除草剤組成物を提供し、その組成物は、セトスファエリアスプ（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａｓｐ）、特に系統ＡＧＷＨ＃１１由来の除草剤を含む。この系統は、ブダペスト条約に基づくＩＭＴＥＣＨの特許コレクションで寄託されており、受入番号ＭＴＣＣ  ５９７４が割り当てられている。また、ＮＣＩＭでも受入番号１３７０で寄託されている。別の側面では、本発明は、本発明による除草剤組成物をホテイアオイに接触させる工程を含む、ホテイアオイの繁殖を制御する方法に関する。
【０００７】
また別の側面では、本発明は、ホテイアオイの生長を制御するのに効果的な除草剤を製造するためのセトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）系統の使用に関する。好ましく用いられる系統は、受入番号ＭＴＣＣ５９７４で、ＩＭＴＥＣＨで寄託されたセトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）系統ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有する系統である。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）（ＡＧＢＩＯが命名したＡＧＷＨ＃１１／ＮＣＩＭ１３７０／ＭＴＣＣ５９７４）に対する９６％ヌクレオチド相同性を示す真菌の１８ｓｒＲＮＡ配列解析だけでなく、ホテイアオイのような水草の繁殖を制御するための合成化学除草剤の代わりとなる環境適応型のものを含む、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、プレオスポラセアエ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コキリオボラス（Ｃｏｃｈｉｌｉｏｂｏｌｕｓ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）といった他の公知の属に由来する真菌のヌクレオチド変異を明らかにする１８ｓｒＲＮＡ配列解析を提供する。
【０００９】
本発明の別の目的は、ホテイアオイの繁殖を制御するための除草剤組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、ホテイアオイの繁殖の制御方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の側面では、本発明は、ホテイアオイの繁殖を制御するのに適した組成物を提供する。その組成物は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）由来の除草剤を含む。セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）は、好ましくは、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）（ＭＴＣＣ５９７４）の特徴を有する系統である。
【００１１】
さらなる側面では、本発明は、ホテイアオイの繁殖を制御する方法に関する。その方法には、効果的な量の本発明の除草剤組成物をホテイアオイの繁殖が制御されるべき区域に接種する工程を含む。
【００１２】
また別の側面では、ホテイアオイの繁殖を抑制するためのセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）の使用に関する。好ましく用いられる系統は、ＩＭＴＥＣＨで寄託され、受入番号ＭＴＣＣ５９７４を受け、最終的にセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）と同定される、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有する系統である。
【００１３】
また別の側面では、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）の全ゲノム研究および分子研究に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子に基づく、真菌と選択された他の属に由来する種との系統学的な関係性を示すものである。
【図２】図２は、典型的なＨＰＬＣの結果であり、本発明による除草剤（植物毒素）のＣ１８逆相系カラム溶出プロファイルを示すものである。
【図３】図３は、本発明による系統の肉眼で見える特徴を示すものである。
【図４】図４は、本発明による系統の顕微鏡で見える特徴を示すものである。
【図５】図５は、本発明によるサンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における左端（Ｒ１）の、塩基クオリティスコア分布を示すものである。
【図６】図６は、本発明によるサンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における右端（Ｒ２）の、塩基クオリティスコア分布を示すものである。
【図７】図７は、本発明による真菌サンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における左端の、塩基組成物分布を示すものである。
【図８】図８は、本発明による真菌サンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における右端の、塩基組成物分布を示すものである。
【図９】図９は、本発明による真菌サンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における左端の、ＧＣ分布を示すものである。
【図１０】図１０は、本発明による真菌サンプルについて、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）における右端の、ＧＣ分布を示すものである。
【図１１】図１１は、本発明による真菌サンプルのＢＬＡＳＴＸ  Ｅ値分布を示すものである。
【図１２】図１２は、本発明による真菌サンプルのＢＬＡＳＴＸにおいて発見された上位１５個の微生物についてのアノテートされた結果である。
【図１３】図１３は、本発明により、サンプルについて遺伝子オントロジーアノテーションを用いて同定される生物的特徴カテゴリーにおける上位１３の用語を示すものである。
【図１４】図１４は、本発明により、サンプルについて遺伝子オントロジーアノテーションを用いて同定される分子特徴カテゴリーにおける上位１３の用語を示すものである。
【図１５】図１５は、本発明により、サンプルについて遺伝子オントロジーアノテーションを用いて同定される細胞の構成要素カテゴリーにおける上位１３の用語を示すものである。
【００１５】
表１：ホテイアオイにおけるＡＧＷＨ＃１１の影響。
表２：ホテイアオイのバイオマス削減。
表３：切り取ったホテイアオイの葉におけるＡＧＷＨ＃１１の影響。
表４：作物、同様の植物および水草における感受性試験の結果。
表５：ホテイアオイから採取された真菌。
表６：ホテイアオイから採取された真菌の病原性（切り取ったホテイアオイの葉での試験）。
表７：単離した系統の第２のスクリーニング。
表８：ＡＧＷＨ＃１１培養菌の宿主特異性試験において使用した植物。
表９：ＡＧＷＨ＃１１  ｓｐ．培養菌間で行われたＤＮＡ配列の比較。
表１０：２０日間ＡＧＷＨ＃１１に汚染されたことによるホテイアオイにおける病状の変化。
表１１：ＡＧＷＨ＃１１から溶媒抽出された化合物のバイオアッセイ。
表１２：植物全体のバイオアッセイによるＡＧＷＨ＃１１の様々な配合の適合性試験。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の主な目的は、ホテイアオイに対して効果的な新規な除草剤を提供することである。本発明の他の目的は、Ｓ．ｍｏｎｏｃｅｒａｓ  ＭＴＣＣ５９７４の無細胞培養濾液と添加剤およびキャリアーとを含む除草剤を提供することである。１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子に基づいて、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）属に由来する選択された種の系統学的な関係性を決定した。アダビラマンパラム（ＡｄａｖｉＲａｍａｎｐａｌａｍ）村、ペヌバリマンダル（ＰｅｎｕｂａｌｌｉＭａｎｄａｌ）、カンマム（Ｋｈａｍｍａｍ）地方、アーンドラ・プラデーシュ（Ａｎｄｈｒａ  Ｐｒａｄｅｓｈ）州を調査する間、新規の真菌種セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）が、病気にかかったホテイアオイから単離された。切除された病巣を、７０％エタノールに３０秒間浸漬することで表面消毒し、滅菌水でゆすいで、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）の入ったシャーレに置き、蛍光灯の２０ｃｍ下で（１２時間の昼間周期）で３日間培養した。セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）のコロニーを、新しいＰＤＡシャーレに移し、続いて保存用のＰＤＡ傾斜培地に移した。培養菌は、ポテトデキストロース寒天培地で育ち、その貯蔵培地は研究所で保管されて研究番号ＡＧＷＨ＃１１が与えられ、また、インドのプネー県のＮＣＩＭに寄託されて受入番号ＮＣＩＭ１３７０が与えられ、また、ブタペスト条約に基づいて、インドのチャンディガールにあるＩＭＴＥＣＨに寄託されて、受入番号ＭＴＣＣ５９７４を与えられた。
【００１７】
本発明は、ホテイアオイ草に対して宿主特異性を示す、新規の培養菌セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）に広く関連する。ポテトデキストロース寒天培地上のコロニーは、最初の白色から灰色がかった茶色になり、オリーブ色になって、成熟すると盛り上がった灰色の周辺部を有する黒色になる。裏面も黒ずんで着色しており、オリーブ色から黒色になっている。コロニーは５日間以内で成熟する。その質感は、ビロードのようなものから綿毛のようなものがある。菌糸は、隔膜を有し、茶色である。分生子柄（幅４．５〜６μｍ）は茶色で、単純なものまたは枝分かれものがあり、膝状体および仮軸性であり、それぞれの分生子が生じる位置で折れ曲がっている。この特徴により、分生子柄はジグザグ形の見た目となる。分生子は、ポロ型分生子とも呼ばれるが、３〜６細胞であり、形状は紡錘形から円柱状であり、薄い茶色から濃い茶色であり、仮軸性膝状体の生長パターンを有す。ポロ型分生子（３０〜３５μｍ×１１〜１３．５μｍ）は、異隔壁であり、わずかに短い突起があり、濃く着色された痕跡がある。この基部の分離痕は、分生子柄の付着部を示す。分生子の末端細胞から、発芽管が発達し、分生子の縦軸方向に長く伸びる。１８ｓ  ＲＮＡ配列解析は、真菌のセトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）に対するヌクレオチド相同性が９６％であると示すだけでなく、他の公知の属からの、この真菌のヌクレオチド変異も明らかにした（図１）。生物除草剤としての、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）の病原性を試験した。生物除草剤を用いて宿主範囲を特定するために系統を試験した。植物は生後４週齢であり、１％開発配合剤で処理した。
【００１８】
したがって、本発明は、ホテイアオイの繁殖を抑制する除草剤組成物を提供し、その組成物はセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）由来の除草剤を含む。セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）は、好ましくはセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有する系統である。この系統の特徴は、その１８ｓ  ｒＲＮＡ配列にある。配列解析は、ＡＧＷＨ＃１１のセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）に対する９６％ヌクレオチド相同性を示しただけでなく、他の公知のセトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属の種からの、この系統のヌクレオチド変異も明らかにした。さらに、ＡＧＷＨ＃１１は、除草性活性に関して、特にホテイアオイに対して、驚くべき特徴を有する。セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有するセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）は、好ましくは、ＭＴＣＣ５９７４またはＮＣＩＭ１３７０として寄託されたセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）ＡＧＷＨ＃１１である。
【００１９】
本発明の実施形態では、除草剤は、分生子の接種菌液のような、菌糸のまたは胞子の接種菌液である。接種菌液という用語は、真菌のバイオマスを含む液をいう。接種菌液は、生菌または非生菌であり得る。非生菌接種菌液は、生菌接種菌液を当該技術分野において公知の不活処理することで得られ得る。加熱処理は、接種菌液を不活化するのに適することがある。菌糸のおよび／または（分生子の）胞子の接種菌液は、固体のまたは液体の発酵物から得られ得る。菌糸の接種菌液は菌糸の懸濁液として選択され得る。同様に、（分生子の）胞子の接種菌液も、胞子の懸濁液から選択され得る。
【００２０】
本発明の実施形態では、除草剤は培養液（発酵培養液）であり得る。本発明において、培養液という用語は、真菌が生長する液をいう。培養液は、液体の発酵物から得られるものとして用いることができ、真菌のバイオマス、例えば菌糸のおよび／または（分生子の）胞子のバイオマスを含むことができる。ある好ましい実施形態によれば、培養液は、少なくとも部分的に精製される。「少なくとも部分的に精製される」との用語は、部分的に精製されることを含む。部分的に精製された培養液は、培養液のある成分の含有量が増加する（他の成分が除去される一方で）いくつかの精製工程を実施することにより得られる。部分的に精製された培養液には、成分の混合物が残留している。例えば、部分的に精製された培養液は、例えば精密濾過のような公知の方法で真菌バイオマスを濾過することで得られる無細胞培養濾液（ＣＦＣＦ）であり得る。部分的に精製された培養液は、培養液から、またはそのＣＦＣＦからある成分を（有機）溶媒抽出することにより得ることもできる。ある実施形態によれば、該溶媒として、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール、またはこれらの混合物が選択される。選択された溶媒は、好ましくはクロロホルムを含み、より好ましくはクロロホルムである。溶媒としてクロロホルムを用いる場合、実施例で詳述するような、強力な除草剤が得られる。したがって、本発明は、さらに、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）のＣＦＣＦの、有機溶媒抽出、特にクロロホルム抽出によって得られる除草剤に関する。クロロホルム溶媒抽出物は、図２のＨＰＬＣ  Ｃ１８のグラフに示された溶出プロファイルを有し得る。本発明による除草剤は、多くの派生的な代謝生成物を含む。本発明において、「多くの」とは、１以上、すなわち、例えば３〜９、４〜８、または６などの２〜１０といった複数を意味するように解釈されるべきである。ある実施形態によれば、派生的な代謝生成物は、純度８０％超まで、好ましくは純度８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、上限９９．９％まで精製される。
【００２１】
本発明の組成物および方法は、新規の除草剤を製造するための、無細胞培養濾液およびその代謝生成物の適用を提供することを含む。除草剤組成物は、培養液、無細胞培養液のように部分的に精製された培養液、原代謝生成物または精製された代謝生成物を懸濁させて、水草またはその生息地に適用するための農業で使用可能な液体配合物として調製され得る。本発明の組成物に関して、農業的または園芸的な配合で採用できるかぎり、液体でも固体でも、農業で使用可能ないかなる媒体が用いられ、好ましくは生物学的に不活性である。農業で使用可能な液状媒体の典型例は、これに限定されるものではないが、水、界面活性剤、植物油、および鉱油である。好ましい実施形態では、液体配合剤の農業で使用可能な媒体は水であり、除草剤は無細胞培養液を含む。
【００２２】
除草剤は、農業で使用可能な媒体と混合することにより、粒状、流動性のある形態、または水和剤の形態としても調製され、水草に適用される。
【００２３】
適切な農業で使用可能な固体媒体には、粘土、タルク、ベントナイト、炭酸カルシウム、珪藻土、およびホワイトカーボンのような鉱物粉末、大豆粉およびスターチのような野菜粉末、およびポリビニルアルコールおよびポリアルキレングリコールのようなポリマーが含まれる。
【００２４】
配合の好ましい実施形態によれば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ、パラフィン油、およびツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０のような界面活性剤は抗生剤と組み合わされる。組み合わせの結果などの実験項目で示すとおり、ホテイアオイの繁殖を制御する活性は増加する。配合の他の好ましい実施形態では、パラフィン油などの鉱物油は抗生剤（抗菌剤）と組み合わされる。組み合わせの結果などの実験項目で示すとおり、ホテイアオイの繁殖を制御する活性は驚くほど増加する。ストレプトマイシン、アンピロックス、アジスロマイシンは、それら抗生剤から選択される。一般的な配合では、処界面活性剤および鉱物油は、０．２〜０．９％ｗ／ｗ、好ましくは０．３〜０．８％、０．４〜０．７％、０．４〜０．６％であり、より好ましくはおよそ０．５％ｗ／ｗの含有量で除草剤に添加される。抗菌剤は、０．０５〜０．５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０６〜０．４％、０．０７〜０．３％、０．０８〜０．３％、０．０９〜０．３％、０．１〜０．３％、より好ましくはおよそ０．２％ｗ／ｗの含有量で除草剤に添加される。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）系統への栄養源をさらに含む。栄養は、大豆粉およびスターチなどの野菜粉から選択され、０．５％の含有量で培地に添加される。
【００２６】
本発明の別の側面では、水草、特にホテイアオイおよびそれに関連する種の繁殖を制御する方法に関する。本発明の方法には、ホテイアオイに、除草剤を含む、本発明による組成物を接触させる工程を含む。本発明の組成物は、ホテイアオイに液体配合物を噴霧することによって接触させて、適用できる。噴霧量は、好ましくは、水草の葉を実質的に覆うのに十分な量である。１回の適用では、通常の繁殖を抑制するのに十分かもしれない。しかしながら、抵抗性のある構造体または表面より下の構造体から植物が再び繁殖する場合には、繰り返し適用する必要がある。本発明の方法は、他の制御方法に加えて、または組み合わせて用いることができる。
【００２７】
そのような方法は、ホテイアオイの繁殖を抑制または阻止するためのものであり、該方法には、本発明の組成物をホテイアオイに接触する工程を含む。本発明の組成物の技術的特徴の詳細は、上述したとおりである。当業者であれば、本発明の組成物を、効果、特にホテイアオイの繁殖を制御（減少または抑制）する効果をもたらすのに十分な量で接種することを理解するだろう。効果的な量を決定するのは、当業者の知識および技術の範囲内である。ある実施形態によれば、効果的な量は、配合された無細胞培養液１０ｍＬを適用する水１Ｌに添加する量の範囲である。１エーカーあたりおよそ１．０〜１．５Ｌを、噴霧等の方法で適用する。本発明の除草剤は、大量培養によって得られる胞子を水中に懸濁させて配合されるが、配合の方法はこの１つに限定されない。この方法では、胞子の含有量は、およそ２×１０８胞子／ｍＬであるが、この範囲に限定されるものではない。水中に懸濁する胞子には、界面活性剤およびスプレッダーなどの補助剤を添加してもよい。主な配合剤であるセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）系統は、発酵直後の新鮮な系統でよい。もしくは、一度貯蔵した系統を水等で再生した後に使用してもよい。貯蔵の方法としては、超低温貯蔵（−１０℃）、または真空凍結乾燥等の系統を貯蔵する方法として周知のものを用いてよい。
【００２８】
本発明の実施形態において、接種は、ホテイアオイの発芽段階で実施される。本発明における方法のいくつかの実施形態によれば、ホテイアオイのバイオマスは、例えば、機械的にホテイアオイのバイオマスを除去するなどの機械的方法により、減少し得る。
【００２９】
本発明のさらなる側面は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）系統、好ましくは、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）系統ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有する系統の、ホテイアオイの繁殖を制御する効果を有する除草剤を製造するための使用に関する。その除草剤の技術的特徴は、本発明の組成物についての議論に関連して上記で議論したとおりである。本発明の組成物について議論したことと同様に、除草剤組成物は、菌糸の接種菌液、胞子の接種菌液、好ましくは分生子の接種菌液、培養液、好ましくは少なくとも部分的に精製された培養液、派生的な代謝生成物から選択され得る。
【００３０】
本発明のまた別の側面は、セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）の無細胞培養濾液（ＣＦＣＦ）のクロロホルム抽出を含む方法で得られ得る除草剤に関する。該方法において、ＣＦＣＦは、好ましくは、液体培地で選択された系統を培養し、その培養液からＣＦＣＦを製造することによって提供される。次に、該ＣＦＣＦにおいてクロロホルム抽出を行う。代謝生成物の抽出は、完全になされた。１Ｌ培養液に菌を接種し、２８℃でおよそ１４日間培養した。同量のクロロホルムを上澄み液に加えた。原代謝生成物は、水液層を注意深く注ぎ出して取り出した。クロロホルムによる培養液の上澄み液の抽出物から、９．５ｇｍの原代謝生成物が得られた。該セトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）は、好ましくはセトスファエリア  モノセラス（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）ＡＧＷＨ＃１１の特徴を有する系統である。
【００３１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
実施例１
調査、分離、および真菌の分類
アーンドラ・プラデーシュ（Ａｎｄｈｒａ  Ｐｒａｄｅｓｈ）州のさまざまな場所で、ホテイアオイ（葉柄および葉）の感染した部分を集めるために調査した。試料は、清潔なプラスチック袋に入れて研究室に運び、試験するまで４℃で貯蔵した。貯蔵した植物片を流水で洗って表面の岩屑を取り去り、小片（およそ１×１ｃｍ）に切断して、３０秒間９６％エタノール、３０秒間次亜塩素酸に連続して浸漬させて表面殺菌し、１分間滅菌水ですすいだ。葉柄および葉の表面殺菌片を、０．５ｍｇのストレプトマイシンを添加したポテトデキストロース寒天培地に置いた。該培地を２５℃で７日間培養した。単離した純粋培養が得られた。異なる真菌の属は、それぞれ生長する菌のコロニーの形態学的な特徴に基づいて同定した。死物寄生植物（すなわち、ＰＤＡ培地上での早い生長および胞子形成）の明確な特徴を有する菌類、およびアオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の属の培養菌は、最初の単離後にさらに考慮して除去した。保持された死体栄養性の真菌培養菌は、同定された。該真菌培養菌は、研究室で保存した。最初に起きた症状は小さな壊死スポットであり、それが葉の胴枯れ病に発展し、葉の表面および葉柄に広がった。その感染している真菌（糸状菌の４６の培養菌）は、その形態学的特徴、および分生子の配置や構造に基づいて、７つの周知の属（表７）に属するように同定した。候補となる真菌ＡＧＷＨ＃１１を１０日間培養した無細胞濾液は、ホテイアオイの細胞の壊死を起こす際の胞子懸濁液と同様の活性を有することが分かった。これは、真菌が培養液の中で毒性の代謝生成物を作り上げ、それは通常はホテイアオイの細胞内容物の破壊、およびの細胞壁の崩壊を招くそのような病的症状を誘発することを示している。該植物毒素は、液状媒体上で培養したＡＧＷＨ＃１１の無細胞培養濾液から抽出された。無細胞濾液は、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルムおよびメタノール溶媒で、連続的に抽出した（図１）。植物毒素化合物は、少量のクロロホルムでより毒性を示す。
【００３３】
【表１−１】
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【表１−２】
0006600645.tif 000003
【００３４】
実施例２
病原性試験：
実験中は、最初の分生子接種菌液は、４℃にて６か月未満で保存されたＰＤＡ上のシャーレ培養から取り、使用前には培地で２５℃にて二次培養した。健康なホテイアオイを自然に寄生したところから採取し、研究室の温室で保持した。予備的なスクリーニングでは、真菌病原体の、健康なホテイアオイから切り取った葉の断片への影響を試験した。断片はそれぞれ、水を含んだ吸い取り紙を有するシャーレの表面に置いた。胞子懸濁液（２０ｍＬ）を、該真菌の培養菌（胞子数２×１０、Ｔｗｅｅｎ２０で懸濁）から調製し、葉の断片の上に手作業で噴霧した。接種後、シャーレをパラフィルムで直ちに密閉して水分喪失を防ぎ、２５℃にて１６時間の光周期で４週間培養した。
【００３５】
植物は病気の症状を有すると評価された。実験は３回繰り返した。葉の断片および植物は、葉のスポット、葉の病変、朽ち葉をそれぞれ含む病気の症状を有すると評価された。病原体の影響は、損傷のタイプ（損傷の重症度、ＤＳ）を評価することで判断した。それぞれの葉についてのＤＳは、以下の尺度で決定した；０＝影響なし、１＝葉の面積の２０％までが壊死、２＝葉の面積の４０％までが壊死、３＝葉の面積の６０％までが壊死、４＝葉の面積の８０％までが壊死、５＝葉の面積の１００％までが壊死。
【００３６】
予備的なスクリーニングでは、４４の真菌の培養菌全てについて、ホテイアオイの葉の断片上で、インビトロ試験を行った。真菌の培養菌全てが、植物に影響を与えることでき、病気の症状を引き起こした（表２）。病気は、小さな壊死のスポットから始まり、葉全体に広がりやすい葉の胴枯れ病に発展するが、９この病原体だけは、４週間の培養期間の最後までに、葉の全面積の５０％を超える部分で症状を引き起こした。それらは、ＡＧＷＨ＃１１（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）、ＡＧＷＨ２０（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）、ＡＧＷＨ０６（Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．）、ＡＧＷＨ１５（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、ＡＧＷＨ２１（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｓｐ．）、ＡＧＷＨ１６（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．）、ＡＧＷＨ８（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ＡＧＷＨ１０（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、およびＡＧＷＨ９（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）である。損傷の重症度評価は、４６の培養菌全てについて４週間以上行った（表３）。９この真菌に対する実験の終了時に最も損傷を与えた真菌のＤＳ値は、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ  ＡＧＷＨ１１およびＡＧＷＨ２０それぞれについての８０〜１００％、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．の培養菌ＡＧＷＨ１６、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．の培養菌ＡＧＷＨ０８、ＡＧＷＨ１０、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．のＡＧＷＨ０６、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．のＡＧＷＨ０９、ＣｕｒｖｕｌａｒｉａのＡＧＷＨ１５、ＰｅｓｔａｌｏｔｉａのＡＧＷＨ２１それぞれについての６０〜７９％である。
【００３７】
【表２−１】
0006600645.tif 000004
【表２−２】
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【００３８】
切り取った葉に対する表中の略字は、０＝影響なし、１＝葉の面積の２０％までが壊死、２＝葉の面積の４０％までが壊死、３＝葉の面積の６０％までが壊死、４＝葉の面積の８０％までが壊死、５＝葉の面積の１００％までが壊死を示す。系統ＡＧＷＨ０６、０８、０９、１０、１１、１５、１６、２０、および２１は、５０％を超えるＬＡＤを引き起こすものであり、第２のスクリーニングのために選択した。
【００３９】
第２スクリーニング
スクリーニングは、インビトエロで最も高い除草活性を示している９つの真菌の培養菌を用いて実施した。その中で、培養菌ＡＧＷＨ＃１１（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ）だけが、９６時間の培養後に少なくとも１００％のＤＳを示した（表３）。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．の培養菌ＡＧＷＨ１６、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．の培養菌ＡＧＷＨ０８、ＡＧＷＨ１０、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．のＡＧＷＨ０６、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．のＡＧＷＨ０９、ＣｕｒｖｕｌａｒｉａのＡＧＷＨ１５、ＰｅｓｔａｌｏｔｉａのＡＧＷＨ２１においては、ＤＳは４０％〜４７％の範囲だった。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
表中の略字は、０＝影響なし、１＝葉の面積の２０％までが壊死、２＝葉の面積の４０％までが壊死、３＝葉の面積の６０％までが壊死、４＝葉の面積の８０％までが壊死、５＝葉の面積の１００％までが壊死を示す。
【００４２】
これらの結果は、ＡＧＷＨ＃１１が、ホテイアオイの繁殖を制御するのに用いる除草剤となりうることを示している。
【００４３】
実施例４
宿主特異性試験
選択した真菌の宿主特異性も、温室で試験した。非水生植物は、いかなる真菌もいない無菌の市販の固形物で満たした鉢の中で育てた。実験は、３回再現した。ホテイアオイ生態型および作物への接種は、２×１０６胞子／ｍＬの濃度の懸濁液を噴霧することにより行った。植物は、病気の症状に関してモニターされた。そこから培養菌ＡＧＷＨ＃１１の宿主範囲が導き出された。表４および図１は、真菌の系統が作物および水草に拡散した場合に得られる結果を示す。いずれかの培養菌を適用してから４週間後、ホテイアオイは葉に病変を示し、一方で、他の植物はいかなる感染も示さなかった。この結果から、真菌の培養菌は、経済的に重要な植物には影響を及ぼさないことが予期され、寄生するホテイアオイを管理する候補となり得るとみなされる。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
実施例５
形態学的な特徴：
形態学的分析によると、ホテイアオイの感染した葉から単離した土着の系統ＡＧＷＨ＃１１（ＮＣＩＭ１３７０）は、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓである。ＡＧＷＨ＃１１は、日本およびオーストラリアではＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓと分類される（インドの分類ではドレックスレラｓｐ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｓｐ）である）。
【００４６】
肉眼で見える特徴
Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓのコロニーは生長が速く、ポテトデキストロース寒天培地で２５℃７日間培養すると、直径３〜９ｃｍに達する。コロニーは５日間以内で成熟する。その質感は、ビロードのようなものから綿毛のようなものがある。コロニーの表面は、最初の白色から灰色がかった茶色になり、オリーブ色になって、成熟して盛り上がった灰色の周辺部を有する黒色になる。裏面も黒ずんで着色しており、オリーブ色から黒色になっている。
【００４７】
顕微鏡で見える特徴
菌糸は、隔膜を有し、茶色である。分生子柄は茶色で、単純なものまたは枝分かれものがあり、膝状体および仮軸性であり、分生子が生じる各位置で折れ曲がっている。この特徴により、分生子柄はジグザグ形の見た目となる。分生子は、ポロ型分生子とも呼ばれるが、３〜６細胞であり、形状は紡錘形から円柱状であり、薄い茶色から濃い茶色であり、仮軸性膝状体の生長パターンを有す。
【００４８】
実施例６
分子分析
この研究は、培養菌ＡＧＷＨ＃１１の分子レベルでの分類学的位置づけを、ＤＮＡ配列の比較を用いて提供するよう構成される。
内部転写スペーサー１および２[ＩＴＳ−１および２]、および核リボソームＤＮＡ[ｒＤＮＡ]転写ユニットの５．８Ｓ領域は、培養菌ＡＧＷＨ＃１１と、それに最も近い種またはそのＤＮＡ配列が手に入る培養菌との間で実施された。ＩＴＳ  ｒＤＮＡ遺伝子の比較からは、ＡＧＷＨ＃１１培養菌は、他の２つの培養菌と９９％一致することがわかった（表５）。本研究からは、培養菌ＡＧＷＨ＃１１は、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓと９６％の同一性を示したことがわかった。ＩＴＳ  ｒＤＮＡと同様に、培養菌ＡＧＷＨ＃１１の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列は、４つの異なるＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐと９１％を超える同一性を示した。ＩＴＳ  ｒＤＮＡと同様に、培養菌ＡＧＷＨ＃１１の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列は、コクリオボルス  ラナツム（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ）と９３％を超える同一性を示し、他のＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐとは９４％相同性を示した。同様に、ビポラリスエレクシネス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓｅｌｅｃｕｓｉｎｅｓ）と９５％同一性を示した。
【００４９】
【表６】
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【００５０】
ＤＮＡ配列の比較および形態学の記載は、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ培養菌ＡＧＷＨ＃１１は、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属に属しており、他の公知のＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓｅｃｉｅｓのいずれから十分に区別されるという十分な証拠を提供した。検体培養は、受け入れ番号１３７０でＮＣＩＭに寄託し、ＭＴＣＣ５９７４でＩＭＴＥＣＨに寄託した。
【００５１】
実施例７
ＡＧＷＨ＃１１無菌培養濾液のバイオアッセイ：
この研究では、ＡＧＷＨ＃１１の属が、植物の中で病状を強く引き起こすことが分かった。ＡＧＷＨ＃１１の無菌培養濾液は、その胞子の懸濁液と同じように病状を引き起こすことができた。ＣＦＣＦの作用物質はＨＰＬＣで分析した。分離された活性成分は、葉の壊死を示した。この物質は、ホテイアオイに対する生物防除剤となり得る見込みがあることが明らかになった。
【００５２】
その方法には、生物除草剤としてＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓを接種することが含まれる。Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａは、改変したポテトスクロースブイヨン（ＰＳＢ）培地を用いて、１Ｌフラスコに２５０ｍＬの改変培地を入れて２８℃±１℃で培養した。培養濾液は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１露紙に連続的に通すことで回収した。培養濾液には、パラフィンオイルおよび２％グリセロールのような非植物的毒素の界面活性剤などの液体キャリアーを組み合わせることができる。Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓの培養液由来の菌糸および／または分生子は、熱処理、およびミクロシドとして０．２％安息香酸ナトリウムを培養液に入れることで、死滅する。濃度は、製品およそ１０ｍＬを１Ｌの水に混合する範囲で、ホテイアオイに適用すべきである。ホテイアオイに対する生物除草剤の効果は、植物のしおれや死となるような茶色の病変または壊死した部分の状態から明らかである。本試験の結果を表１０に示す。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
実施例８
切り離した葉のバイオアッセイ：
切り離したホテイアオイの葉は、無細胞濾液、原濾液および部分的に精製された毒素の生物的活性を試験するために用いた。切り離した葉は、直径９ｃｍの無菌シャーレの中の湿らせた濾紙の上に置いた。原濾液、無細胞および無胞子濾液、部分的に精製された植物毒素の接種源は、マイクロピペットを用いて葉に適用した。それぞれの処理に対して１０枚の葉を用いた。対照（コントロール）の葉には、蒸留水を用いた。シャーレはパラフィルムで密封し、室温で１２時間の光条件で培養した。処理された切り取った葉への植物毒素の影響は、５日間の損傷に対して視覚的に評価した。本試験の結果を表３に示す。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
植物毒素による損傷は、５日間、視覚的に評価した。−＝植物毒素の影響無し、＋＝植物毒素の影響有り。
【００５７】
実施例９
溶媒抽出した原代謝生成物のバイオアッセイ：
ホテイアオイの切り離した葉を溶媒抽出代謝生成物で試験した。植物毒性成分は、少量のヘキサンおよび酢酸エチルの中で検出した。クロロホルムは１００％の毒性を示している。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
植物毒素の活性の指標は、以下の尺度とした。０＝水で処理し、病変なし、＋＝直径の５％、＋＋＝２５％、＋＋＋＝７５％、＋＋＋＋＝１００％。
【００６０】
クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する多くの死体栄養性の植物の植物毒性真菌は、植物毒性の代謝生成物、および病原性に対して通常要求されるペプチド類を生産する。広範囲の植物種に対して影響を与える植物毒素は、非宿主特性の毒素（ｎｏｎ−ＨＳＴｓ）として知られているが、一方で、ＨＳＴｓは、特定の植物種のみ、またはほとんどの場合にはその種の遺伝子型のみに対して影響を与える。ＨＳＴｓを生産する病原体に関して、病原性および宿主特異性は、毒素を生産する能力によって大きく区別できるが、一方で、植物の感受性は、毒素の標的の存在に依存する。ｎｏｎ−ＨＳＴｓは、植物毒性の主な決定因子ではないが、生産する植物毒素の毒性に寄与する。クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、毒素、特にＨＳＴｓの生産が顕著であり、それは、その毒素を生産すると知られる唯一の真菌種だからである。
【００６１】
実施例１０
植物毒素の製造および精製、および高性能液体クロマトグラフィ：
Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓは、２５０ｍＬの改変ＰＳＢ培地の入った１Ｌフラスコで培養した。滅菌培地に真菌の胞子懸濁液１ｍＬを接種し、静かに振盪させ、静置培地として１４日間培養した。培養液の濾液は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙およびザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）のメンブレンフィルター（０．２０μｍ）に連続的に通過させて回収した。培養液の濾液は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓのメンブレンフィルターを通過させた。クロロホルムで抽出した無細胞培養濾液は、溶媒抽出物を得るためのものである。クロロホルム抽出滅菌濾液は、試験および分別に応じて４℃で保存した。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、Ｃ１８逆相カラムにおける溶媒システムとしてエタノール：水（３０分間で０〜１００％勾配）を用いて実施した。図１に、部分的に精製された毒素の、典型的なＨＰＬＣのＣ１８逆相カラムの溶出プロフィールを示す（図１）。
【００６２】
ＡＧＷＨ＃１１の代謝生成物のさまざまなピークの区別、およびその化学的な特徴は、ＮＭＲおよびＧＣ  ＭＳ分析によって特徴付けられ、結果に付け加えられる。
【００６３】
実施例１１
配合の研究：
配合とは、派生的な代謝生成物または病原菌を不活性担体と混ぜ合わせて、その物理的特徴を変化させて貯蔵寿命および現場性能を高める工程をいう。配合には、アジュバント、界面活性剤、湿潤剤、分散剤および防腐剤を含む補助成分の使用が含まれる。生物的制御のための配合剤の使用は、化学的除草剤産業にはよく知られた技術の、比較的新しい応用である。アジュバントは、対象表面の表面張力を低下させて湿潤性を増加させることで、発芽後施用除草剤としての効果を増大させる。アジュバントは、浸透力を高めることでも知られている。試験で製造した植物毒素の適合性を調べるために、さまざまな配合の真菌を試験した。本研究の目的は、対象の水草に対して、一重項および組み合わせによる異なる配合剤の適合性を評価することである。病原体から合成した毒素の適合性を試験するために、７つの配合剤、すなわちＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｅｋ  Ｂｏｎｄ大豆油、マスタードオイル、ココナッツオイル、ピーナッツオイル、グリセロールを用いた。配合剤は、０．５％を、抗菌剤０．２％とともに植物毒素を含むＣＦＣＦに添加し、植物全体のバイオアッセイにより適合性を決定した。
【００６４】
試験真菌が生産した植物毒素の適合性を調べるために、様々な配合を試験した。表１２に示すデータにおいて、植物毒素による損傷の研究では、最も適合性のある配合は、防腐剤入りのパラフィンオイルであり、続いてココナッツオイル、Ｅｋ  Ｂｏｎｄ、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、グリセロールであることが明らかに示された。上記の結果に基づくと、ＡＧＷＨ＃１１の派生的代謝生成物は、パラフィンオイルとともに用いることで高い除草剤能力を有し、ホテイアオイの繁殖を管理するために用いることのできる除草剤として開発し得ることを結論づけられる。
【００６５】
【表１０】
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【００６６】
コントロールａ−代謝能力のない培地、コントロールｂ−滅菌蒸留水、採用した植物毒素を含有するＣＦＣＦ量＝１０ｍＬ／植物
【００６７】
植物の症状の評価（ＰＤＲ）
０〜１＝わずかに委縮およびしおれ、１〜２＝わずかに白化、２〜３＝明らかな白化、わずかに壊死、３〜４＝高度な壊死および明らかな白化、４〜５＝深刻な壊死および明らかな白化、５＝実生の死につながる深刻な壊死および深刻な白化。
【００６８】
実施例１２
バイオマス減少の研究：
植物全体の病原性試験は、開発した生物除草剤を試験するために、温室跡地で行った。この調査の目的は、ホテイアオイに対する１％濃度のＳ．ｍｏｎｏｃｅｒａｓの適用の効果を調べることであった。Ｓ．ｍｏｎｏｃｅｒａｓの無細胞培養濾液には、安息香酸ナトリウムを配合した。適用比率は、１Ｌのホテイアオイに与える水に、配合製品およそ１０ｍＬを混合する範囲とした。該製品のホテイアオイに対する影響は、茶色の病変または壊死部分といった外観、それに続く植物のしおれおよび死滅によって明らかになる。結果では、ステージ１〜３および５〜７の葉の植物において、１％濃度にも関わらず、バイオマスの乾燥重量で８０％を超える大幅な減少を示された。死滅は７日間以内に達成された。得られた結果からは、製品１０ｍＬ／水１Ｌを、全ての処理において適用することで、バイオマスは大幅な減少し、反対に植物の再生に影響を与えることがわかった。この試験の結果を表１１に示す。
【００６９】
【表１１】
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【００７０】
全ゲノム研究
Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓのＤＮＡは、Ｓｃｉｇｅｎｏｍ開発のプロトコルによって抽出され、配列ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ＤＮＡ試料調製キットを用いて調製した。配列決定は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）遺伝子分析器で行った。短い読み出し（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄｓ）はｖｅｌｖｅｔを用いてｄｅ  ｎｏｖｏアセンブルし、アセンブリの質は、Ｅｄｅｎａ  ａｎｄ  Ｍｉｎｉｍｕｓｎｏの２つの交互アセンブラを含むパイプラインで改善した。
【００７１】
Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ系統ＡＧＷＨ＃１１（ＮＣＩＭ１３７０）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ遺伝子分析器を用いた全ゲノムショットガンアプローチにより配列決定した。ｆａｓｔｑクオリティチェック、ゲノム研究におけるｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリ、遺伝子予測、ＯＲＦアノテーション、Ｂｌａｓｔｘサーチを行った。
【００７２】
ｆａｓｔｑクオリティチェックおよびフィルタリングした結果を表１２に示す。
【００７３】
【表１２】
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【００７４】
ｆａｓｔｑクオリティチェックには、シークエンサから得られる配列に関するクオリティパラメータを確認することが含まれた。塩基クオリティスコア分布、ｒｅａｄあたりの平均塩基含有量、およびｒｅａｄにおけるＧＣ分散を、入力ｆａｓｔｑファイルに関して実施した。塩基クオリティスコア分布、すなわち、試料について、読み出し配列の一対の端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）の左（Ｒ１）端および右（Ｒ２）端のクオリティを、図５、６に示す。ｘ軸はシークエンスサイクルであり、ｙ軸は塩基のｐｈｒｅｄクオリティスコアである。平均塩基クオリティは、８０％超の塩基に対してＱ３０以上（誤差確率＞＝０．００１）であることが分かった。
【００７５】
ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ配列の左端および右端の塩基組成分布を、図７、８に示す。ｘ軸はシークエンスサイクルであり、ｙ軸はヌクレオチドパーセンテイジ割合である。我々は、塩基組成において、ｒｅａｄの始めに向かうバイアスを観察した。配列組成におけるバイアスは、通常、ＮＧＳ試験で観察される。
【００７６】
ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ配列の左端および右端のＧＣ分布を行った（図９、１０）。ｘ軸は配列における平均ＧＣ含有量であり、ｙ軸はｒｅａｄの全パーセンテイジ割合である。試料におけるｒｅａｄの平均ＧＣ含有量は、正規分布に従うものだった。
【００７７】
ｆａｓｔｑファイルは、ｄｅ  ｎｏｖｏコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）アセンブリを行う前に切り取って調整した。Ｓｃｉｇｅｎｏｍの科学者は、ｒｅａｄ始まりから３つの塩基を切り取り、ｒｅａｄの終わりから２つの塩基を切り取った。切り取ったｒｅａｄのまとめを表１３に示す。
【００７８】
【表１３】
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【００７９】
さらに、フィルターを通したｒｅａｄは、イルーミン（ｉｌｌｕｍｉｎｅ）アダプタを含む。Ｋｍｅｒ  Ｇｅｎｉｅを用いて最適なｋ値およびアセンブリサイズを予測した。Ｋｍｅｒ  Ｇｅｎｉｅの結果を表１４に示す。
【００８０】
【表１４】
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【００８１】
さまざまにアセンブルした独立のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）は、コンティグを統合するのに用いた。ＡＧＷＨ＃１１について、最終的なアセンブリは１５０のコンティグを有し、最も長いコンティグは１２６１５０５ｂｐであった。アセンブリの統計を表１５に示す。
【００８２】
【表１５】
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【００８３】
遺伝子予測およびアノテーションについて、真菌試料ＡＧＷＨ１１におけるコンティグからのＯＲＦは、オーガスタス法を用いて予測された。ＡＧＷＨ１１の遺伝子予測と比較して、我々は、ＯＲＦをそれぞれ予測するために、アスペルギルス  ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からのトレーニング済みデータを用いた。我々は、これらの予測から、試料ＡＧＷＨ１１中に１３，９５０の独自のＯＲＦを発見した。この予測されたＯＲＦは、ｄｅｎｏｖｏアセンブリのためのハウスパイプライン（ＣＡＮｏＰＩコンティグアノテータ）でＳｃｉｇｎｏｍを用いてアノテートした。ＯＲＦのアノテーションにおける工程は、ＢＬＡＳＴＸプロプラムを用いたＮＣＢＩデータベースとの比較、微生物アノテーション、対応するＯＲＦに対する遺伝子およびタンパク質アノテーション、遺伝子オントロジーアノテーション、およびパスウェイアノテーションである。
【００８４】
予測されたＯＲＦは、ＢＬＡＳＴＸを用いたＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースと比較された。Ｅ値＜＝１ｅ−５および相同性スコア＞＝４０％の場合には、さらなるアノテーションを続けた。ＢＬＡＳＴＸのまとめを表１６に示す。全てのＡＧＷＨ＃１１サンプルにおいて、我々は、予測したＯＲＦの１３，６０２（９７．３８％）がＮＣＢＩデータベースにおいて少なくとも１つのヒットを有することが分かった。
【００８５】
【表１６】
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【００８６】
ＢＬＡＳＴＸサーチのＥ値の分散を図１１に示す。試料に対するＢＬＡＳＴＸを用いて見つけたＯＲＦのおよそ９１％は、少なくとも１ｅ−５のレベルの信頼性を有しており、これはタンパク質を多く保持していることを示している。試料ＡＧＷＨ１１において、ＢＬＡＳＴＸを用いて見つけた、予測されたＯＲＦの９１％は、ＮＣＢＩデータベースに存在するタンパク質と、タンパク質レベルで６０％を超える相同性を有する。
【００８７】
微生物のアノテーションに関して、それぞれのＯＲＦにおける上位にあるＢＬＡＳＴＸヒットを研究して微生物の名前を抽出した。試料についてのアノテーションで見つかった上位１５の微生物を図１２に示す。
【００８８】
本試料に関して、上位にあるＢＬＡＳＴＸヒットの大多数はセトスファエリア  ツルカ（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｔｕｒｉｃａ）に属す。
【００８９】
遺伝子およびタンパク質のアノテーションに関して、ＢＬＡＳＴＸによる予測されたタンパク質は、ＮＣＢＩ、ＵｎｉＰｒｏｔパスウェイ、およびその他のデータベースに対してアノテートされた。有意にＢＬＡＳＴＸヒットしたＯＲＦの総数の中で、１３，３８０のＯＲＦを、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースを用いてアノテートした。残るＢＬＡＳＴＸヒットについて、ＮＣＢＩ予測タンパクアノテーションを行った。全部のアノテーションは、以下の３つの区分に区別した。
【００９０】
【表１７】
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【００９１】
ＯＲＦに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）の用語は、可能な限り抽出された。分子機能、生物学的プロセスおよび細胞の構成要素のカテゴリーで区別されたＧＯのさまざまな用語の総数を、表１８に示す。
【００９２】
【表１８】
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【００９３】
３つの異なる用語、すなわち、生物学的プロセス、分子機能および細胞の構成要素について、それぞれのカテゴリーにおける上位１３の用語を図１３〜１５に示す。微生物ＡＧＷＨ１１について、遺伝子オントロジーの総数を異なるカテゴリーについてそれぞれ研究したところ、生物学的プロセスでは６４３、分子機能では８４９、細胞の構成要素では２３４であることが示された。
【００９４】
本発明における前述の記載は、その特別な実施形態および適用例を参照して示し、述べたものであるが、これらは説明のために例示し、述べたものであり、開示した特別な実施形態および適用例に、発明を包括し、または限定することを意図するものではない。用量、希釈、適用、異なる使用態様について、本発明の意図および範囲を逸脱しない範囲で、ここで述べたような本発明の変更、修正、変種、転換を行うことは当業者には明らかである。特別な実施形態および適用例は、発明の主旨およびその具体例を最もよく例示するために選択され、記載されており、それゆえ、当業者は、さまざまな実施形態で、熟考された特別な使用に対して研究されたさまざまな修正を以て、本発明を利用できる。このような全ての変更、修正、変種、および転換は、それゆえ、公平に、法律的に、および公正に権利付与された範囲で解釈される、添付のクレームにより決定される本発明の範囲内と見るべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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