(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材の、
Ｔ細胞を接触させて体外で培養するための使用。
【請求項２】
前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材と、
前記細胞培養基材に接触するＴ細胞と、
を備える細胞付細胞培養基材。
【請求項４】
前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である請求項３に記載の細胞付細胞培養基材。
【請求項５】
金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させ、得られた前記細胞培養基材に前記Ｔ細胞を接触させる請求項３又は４に記載の細胞付細胞培養基材の製造方法。
【請求項６】
少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材にＴ細胞を接触させて、前記Ｔ細胞を培養する細胞培養方法。
【請求項７】
少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置の、Ｔ細胞を接触させて体外で培養するための使用。
【請求項８】
前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項３又は４に記載の細胞付細胞培養基材と、前記細胞付細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人の死亡原因の第一位は悪性新生物 (がん) である。がんの治療法としては外科的療法、化学療法、放射線療法といった三大療法が主に用いられているが、これらの療法には人体への悪影響や副作用が報告されており、患者の生活の質 (Quality of Life; QOL) の低下が懸念されている。そこで、QOL 向上が期待されるがんの治療法として、現在「免疫療法」が注目されている。この療法は人体への副作用が少ないことやがんの部位を選ばないことなどで新規のがん治療法として期待されている。
考案されている免疫療法としては、大きく２種類の免疫療法に分類されている。１つは、「能動免疫療法」と呼ばれ、患者の体にサイトカインや免疫賦活剤を取り入れることで免疫細胞を活性化させ、がんを治療する方法である。
もう一方の免疫療法は、「養子免疫療法」と呼ばれ、患者自身の免疫細胞を体外で培養、増殖、又は活性化し、患者にその免疫細胞を戻すことで、体内の免疫細胞を活性化させがんを治療する方法である。養子免疫療法には、高額なサイトカインを利用することなく、患者の回復力を増強させて病気を治癒させることが可能であるという利点がある。そのため、免疫細胞を体外で培養可能であり、免疫賦活作用を備えた細胞培養基材の登場が求められている。
【０００３】
イノシトールリン酸は、イノシトールの水酸基がリン酸化されたものである。イノシトールリン酸としては、リン酸エステル化された水酸基の数により、イノシトール一リン酸（ＩＰ）、イノシトール二リン酸（ＩＰ２）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、イノシトール五リン酸（ＩＰ５）、イノシトール六リン酸（ＩＰ６）（フィチン酸とも呼ばれる）が知られている。イノシトール六リン酸 (inositol hexaphosphate; IP6)は、抗がん作用や免疫細胞を活性化させる機能を有するということが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】A.M. Shamsuddin, I. Vucenik, K. E. Cole, Life Science, 61, 343-354 (1997).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫細胞等の細胞を培養可能な細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び細胞培養装置の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記の特徴を有する細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び細胞培養装置を提供するものである。
【０００７】
（１）少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材の、
Ｔ細胞を接触させて体外で培養するための使用。
（２）前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である前記（１）に記載の使用。
（３）少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材と、
前記細胞培養基材に接触するＴ細胞と、
を備える細胞付細胞培養基材。
（４）前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である前記（３）に記載の細胞付細胞培養基材。
（５）金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させ、得られた前記細胞培養基材に前記Ｔ細胞を接触させる前記（３）又は（４）に記載の細胞付細胞培養基材の製造方法。
（６）少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材にＴ細胞を接触させて、前記Ｔ細胞を培養する細胞培養方法。
（７）少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有し、
前記金属化合物がリン酸カルシウム系化合物のセラミックスである細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置の、Ｔ細胞を接触させて体外で培養するための使用。
（８）前記イノシトールリン酸がイノシトール六リン酸である前記（７）に記載の使用。
（９）前記（３）又は（４）に記載の細胞付細胞培養基材と、前記細胞付細胞培養基材を収容するための培養槽とを備えた細胞培養装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、免疫細胞等の細胞を培養可能な細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び上記細胞培養基材を備えた細胞培養装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。
【図２】本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。
【図３】本発明の細胞培養方法と別法の細胞培養の様子の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の細胞培養装置の一実施形態を示す構成図である。
【図５】実施例において、水酸アパタイト（ＨＡｐ）セラミックスの表面粗さ及び相対密度を測定した結果を示すグラフである。
【図６】実施例において、ＩＰ６を表面修飾したＨＡｐセラミックス（ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス）のＸ線回折（ＸＲＤ）の分析を行った結果を示すグラフである。
【図７】実施例において、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行った結果を示すグラフである。
【図８】実施例において、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行い、ナロースペクトルを比較した結果を示すグラフである。
【図９】実施例において、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の分析を行い、ナロースペクトルを比較し、さらにピーク分離を行った結果を示すグラフである。
【図１０】実施例において細胞培養を行った際の、ヘルパーＴ細胞の増減率の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例において細胞培養を行った際の、キラーＴ細胞の増減率の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪細胞培養基材≫
本実施形態の細胞培養基材は、少なくとも表面に、イノシトールリン酸又はその塩が結合された金属化合物を有するものである。
【００１１】
イノシトールリン酸は、イノシトール（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）の６つの水酸基の少なくとも１つがリン酸エステル化されたものである。本実施形態では、水酸基の３つ以上がリン酸エステル化されたイノシトールリン酸が好ましく、水酸基の４つ以上がリン酸エステル化されたイノシトールリン酸がより好ましく、イノシトールの水酸基全部がリン酸エステル化されたフィチン酸（イノシトール六リン酸、ＩＰ６）が最も好ましい。イノシトールリン酸を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよい。
【００１２】
また、免疫賦活作用を有するものであれば、イノシトールリン酸の塩であっても、イノシトールリン酸と同様に本実施形態の細胞培養基材の構成要素としてもよい。
イノシトールリン酸の塩としては、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が好ましく、ナトリム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等が挙げられ、より好ましくはナトリム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩である。これらの中でも、特に好ましくはイノシトール六リン酸ナトリウム塩、イノシトール六リン酸カリウム塩である。なお、イノシトール六リン酸ナトリウム塩には、結晶水含有量の異なる水和物が知られているが、いずれも好ましく用いることができる。また、イノシトールリン酸の塩を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよい。
【００１３】
上記金属化合物は、金属元素を含む化合物であり、有機金属化合物であっても、無機金属化合物であってもよく、好ましくは無機金属化合物である。イノシトールリン酸は、強いキレート作用を有する。イノシトール六リン酸は、様々な金属イオンと、キレート結合を形成することが知られている。イノシトール六リン酸と、キレート結合を形成することが知られている金属イオンとして、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、銀イオン、鉄イオン、亜鉛イオン等がある。したがって、金属化合物とイノシトールリン酸とはキレート結合により結合し得る。
【００１４】
上記金属化合物に含まれる金属元素は、第２族元素であることが好ましい。第２族元素とは、周期表の第２族に分類される元素であり、例えば、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムが挙げられ、カルシウムが好ましい。
また、上記金属化合物は、セラミックスであることが好ましい。セラミックスは安定な材料であり、滅菌操作が容易である。滅菌操作により微生物等のコンタミネーションの恐れを低減できることは、細胞培養基材として大変に有用である。
したがって、前記金属化合物としては、第２族元素を含むセラミックスであることがより好ましい。
【００１５】
また、上記金属化合物は、リン酸カルシウム系化合物であることが好ましい。代表的なリン酸カルシウム系化合物として、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2;ＨＡｐ）、α―リン酸三カルシウム、β―リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ニ水素カルシウム、非結晶リン酸カルシウム、フルオロアパタイトが挙げられ、好ましくは水酸アパタイト、α―リン酸三カルシウム、β―リン酸三カルシウムであり、より好ましくは水酸アパタイトである。なお、アパタイトとはリン酸塩の無機質結晶物質であり、生体適合性に優れる。
【００１６】
本実施形態の細胞培養基材が有する前記金属化合物としては、カルシウムを構成元素とするリン酸カルシウム系化合物のセラミックスであることがより好ましい。前記金属化合物を、カルシウムを構成元素とするリン酸カルシウム系化合物のセラミックスとすることにより、滅菌容易性、免疫細胞培養性能、及びイノシトールリン酸結合性能に優れる細胞培養基材とすることができる。更には、高い生体適合性を有することから、水酸アパタイトのセラミックスであることがさらに好ましい。
【００１７】
細胞培養基材の形状は特に制限されず、粒状、微粒子状、シート状、板状、円板状、棒状、円柱状、多角柱状などいずれの形状であってもよい。少なくとも表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合された金属化合物を有するものであれば、例えば、細胞培養基材全体が該金属化合物で構成され、その表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合されたものでもよく、基材表面層が該金属化合物で構成され、基材内部は該金属化合物以外のもので構成されていてもよい。
細胞培養基材は緻密体であっても、多孔質であってもよい。多孔質である場合、少なくとも表面にイノシトールリン酸、又はその塩が結合された金属化合物を有するものであれば、孔内部にイノシトールリン酸が配置されていてもよい。
【００１８】
図１は、本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。細胞培養基材１は、円板状の金属化合物２に、イノシトールリン酸４が結合した構造になっている。
図２は、本発明に係る細胞培養基材の一実施形態を示す模式図である。細胞培養基材１１は、中心層１３の表面に水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）層１２が形成されており、水酸アパタイト層１２に、イノシトールリン酸４が結合した構造になっている。
【００１９】
上記図１及び上記図２に示されるように、本発明に係る細胞培養基材は、少なくとも表面にイノシトールリン酸が結合された金属化合物を有するので、細胞培養を行うために該細胞培養基材と細胞とを接触させると、細胞はイノシトールリン酸と接触し、効率的に細胞が活性化され、免疫が賦活化され得る。
【００２０】
≪細胞培養基材の製造方法≫
本発明の細胞培養基材の製造方法は、金属化合物に、イノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させるものである。
【００２１】
イノシトールリン酸を含有する溶液は、水、各種緩衝液等の液とイノシトールリン酸とを混合することにより得られる。イノシトールリン酸を含有する溶液のｐＨは、ｐＨ６〜８程度とすればよい。
【００２２】
イノシトールリン酸を含有する溶液中のイノシトールリン酸の濃度は、５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上であることが好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上であることがより好ましい。溶液中のイノシトールリン酸の濃度の上限は特に制限されず、飽和濃度とすればよい。ただし、後述する実施例において、金属化合物を３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上のイノシトールリン酸を含有する溶液に浸漬させたとき、金属化合物へのイノシトールリン酸の結合量が飽和していると考えられる傾向がみられたことから、イノシトールリン酸を含有する溶液中のイノシトールリン酸の濃度は、５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上６０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以下であることが好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上６０００ｐｐｍ以下であることがより好ましく、２５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以上４０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）以下であることがさらに好ましい。
【００２３】
金属化合物に、イノシトールリン酸を含有する溶液を接触させる方法は、特に制限されず、金属化合物にイノシトールリン酸を含有する溶液を塗布する、金属化合物にイノシトールリン酸を含有する溶液を噴霧する、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬する等の方法が挙げられる。
【００２４】
上記に挙げた方法のなかでは、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬することが好ましい。この場合、イノシトールリン酸を含有する溶液に金属化合物を浸漬する時間は、０．１時間〜１００時間が好ましく、１時間〜７５時間がより好ましく、１０時間〜５０時間がさらに好ましい。イノシトールリン酸を含有する溶液の温度は、１０℃〜６０℃が好ましく、より好ましくは２０℃〜５０℃であり、特に好ましくは３０℃〜４０℃である。
イノシトールリン酸を含有する溶液中に金属化合物を浸漬する方法は特に制限されず、例えば、水中に金属化合物を浸漬した後に該水中にイノシトールリン酸を添加する方法、水にイノシトールリン酸を添加した後に該水中に金属化合物を浸漬させる方法等が例示できる。
上記浸漬の状態は特に制限されず、例えば、該溶液中で金属化合物を静置すること、該溶液中で金属化合物を撹拌すること、該溶液中で静置された金属化合物に対して溶液を撹拌すること等の方法により行うことが挙げられる。
【００２５】
金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させると、イノシトールリン酸が金属化合物に含まれる金属元素とキレート結合を形成し、金属化合物表面にイノシトールリン酸が結合される。
【００２６】
本発明の細胞培養基材の製造方法は、金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させて得られた基材から、金属化合物と結合していないイノシトールリン酸又はその塩を取り除くための洗浄工程を有していてもよい。当該製造方法において、当該洗浄工程を有している方法が、金属化合物と結合していない、高濃度のイノシトールリン酸による細胞の活性化の阻害を防止する観点から好ましい。
洗浄工程としては、例えば、金属化合物にイノシトールリン酸又はその塩を含有する溶液を接触させて得られた基材に、イノシトールリン酸を含まない液、又は金属化合物に接触させた上記溶液よりも低いイノシトールリン酸濃度の溶液に浸漬させることが挙げられ、イノシトールリン酸を含まない液としては、水、各種緩衝液等を例示できる。
【００２７】
上記イノシトールリン酸に係る説明は、上記イノシトールリン酸の塩についても同様である。
【００２８】
≪細胞培養方法≫
本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養基材に細胞を接触させて、前記細胞を培養するものである。本発明の細胞培養基材に細胞を接触させることで、細胞培養基材の金属化合物に結合された前記イノシトールリン酸又はその塩に細胞が接触することとなる。
【００２９】
図３は、本発明の細胞培養方法と別法とにおける、細胞培養の様子の一例を模式的に示した図である。図３（ａ）は、イノシトールリン酸を含有する液体培地中で、細胞培養を行う場合を示す。図３（ｂ）は、本発明の細胞培養方法の一例であり、イノシトールリン酸が結合された金属化合物を有する細胞培養基材上で、細胞培養を行う場合を示している。
【００３０】
発明者らは、後述する参考例３〜１２において示されるように、図３（ａ）に示すような培養系を用いて、イノシトールリン酸を含有する液体培地中で細胞を培養したとき、本発明の細胞培養方法に比べて細胞培養系（細胞培養液）に存在するイノシトールリン酸の濃度が高くなければ、良好な細胞の培養が達成されないことを見出した。また細胞培養系（細胞培養液）に存在するイノシトールリン酸の濃度が高すぎることで、むしろ細胞の良好な培養が妨げられる場合があることを、本願で初めて明らかにした。
これに対して、発明者らは、図３（ｂ）に一例として示す本発明の細胞培養方法では、イノシトールリン酸が結合されている基材上で細胞を培養することで、図３（ａ）に示すような培養系と比べて、基材に結合された少量のイノシトールリン酸によって良好な細胞の培養が達成されることを見出した。また、少量のイノシトールリン酸の使用であっても良好な細胞の培養が達成されることから、細胞の培養が妨げられるおそれもない。図３（ｂ）に示すような培養系における細胞培養基材の表面に結合されたイノシトールリン酸の量は、ＨＡｐ粉体に対するＩＰ６の飽和吸着量０．４２７ｍｇ・ｍ−２を用いて計算すると、直径１５ｍｍ、厚さ 1 ｍｍのセラミックスを利用した場合、約９５ｎｇとなる。
【００３１】
上記の細胞培養における、細胞とイノシトールリン酸との関係を考察する。
図３（ａ）に示すような培養系では、培養液中にイノシトールリン酸が溶解している。このとき細胞は、培養液中に溶解するイノシトールリン酸と、次々に接触すると考えられる。細胞がイノシトールリン酸との反応により細胞が活性化される一方で、高濃度のイノシトールリン酸との反応により細胞の活性化が阻害されると考えられる。そして、このことが細胞培養液に存在するイノシトールリン酸の濃度が高くなければ、良好な細胞の培養が達成されないこと、及び、イノシトールリン酸の濃度が高すぎることで、細胞の良好な培養が妨げられることが生じるものと考えられる。
これに対して、図３（ｂ）に示すような培養系では、イノシトールリン酸が表面に結合されている基材を用いている。このとき細胞は、基材表面のイノシトールリン酸と接触するので、細胞は培養系に適量のイノシトールリン酸が存在しているものと感知することができ、更にはイノシトールリン酸との反応による細胞の活性化についても良好な結果を生むものと考えられる。
【００３２】
本発明の細胞培養方法としては、培養対象の細胞及び本発明の細胞培養基材を液体培地中で培養することが挙げられる。培養対象の細胞及び本発明の細胞培養基材を同じ培養液中に共存させることで、細胞が細胞培養基材に接触する。
【００３３】
本発明の細胞培養方法で培養される対象の細胞は特に制限されないが、前記細胞は免疫細胞であることが好ましく、Ｔ細胞であることがより好ましい。
免疫細胞としては、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらに分化可能な前駆細胞若しくは幹細胞等が挙げられる。
【００３４】
上記イノシトールリン酸に係る説明は、上記イノシトールリン酸の塩についても同様である。
【００３５】
≪細胞培養装置≫
本発明の細胞培養装置は、本発明の細胞培養基材と、前記細胞培養基材を収容するための培養槽とを備える。
図４は、本発明の細胞培養装置の一実施形態を示す構成図である。細胞培養装置２０は、培養槽２５を備え、培養槽の内部に細胞培養基材１が配置されている。細胞培養基材１は、円板状の金属化合物２に、イノシトールリン酸４が結合している。
【００３６】
本実施形態の細胞培養装置２０は、前述の少なくとも表面にイノシトールリン酸が結合された金属化合物を有する細胞培養基材１を有するので、培養槽２５に細胞を添加し、該培養基材と細胞とを接触させると、細胞はイノシトールリン酸と接触し、効率的に細胞が活性化され、免疫が賦活化される。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
１−１．  ＨＡｐ  セラミックスの作製
ＨＡｐ 成形体は既報(Z. Zhuang, T. J. Fujimi, M. Nakamura, T. Konishi, H.Yoshimura and M. Aizawa, Acta Biomaterialia, 9, 6732-6740 (2013).)に従って作製した。ＨＡｐ−１００（太平化学製）１ｇを秤量し、直径２１ｍｍΦ、高さ〜２ｍｍ、成形圧５０ＭＰａの条件で加圧成形し、ＨＡｐ成形体を得た。このＨＡｐ成形体を、温度１２００ ℃、保持時間５時間、昇温速度１０ ℃・ｍｉｎ−１焼成することでＨＡｐ セラミックスを得た。得られたＨＡｐセラミックスは、直径１５〜１６ｍｍ、高さ１〜２ｍｍの円板状であった。
ＨＡｐ セラミックスをエタノール中で超音波洗浄し、その後、耐水研磨紙 （＃４００， ＃１０００， ＃２０００ の順）で鏡面研磨を行ない、研磨した試料を再度エタノール中で超音波洗浄し、１６０ ℃で１．５時間乾熱滅菌を行なった。
【００３９】
１−１−２．  ＨＡｐセラミックスのキャラクタリゼーション
上記超音波洗浄、鏡面研磨、超音波洗浄、及び乾熱滅菌の工程を経たＨＡｐセラミックスの表面粗さ及び相対密度を測定した。表面粗さは、Ｒａ＝約０．１μｍであり、測定機（ミツトヨ社製 ＳＵＲＦＴＥＳＴ ＳＶ−３１００  ＪＩＳＢ０６０１：２００１）を用いて行った。相対密度は、製造した上記ＨＡｐセラミックスのかさ密度を測定し、ＨＡｐセラミックスのかさ密度の理論値３．１６ｇ／ｃｍ3を１００％として算出した。
結果を図５に示す。鏡面研磨により、ＨＡｐセラミックスサンプル間での誤差が少ない均一な表面にすることができた。また、ＨＡｐセラミックスは、相対密度が９７．７１％の緻密体であることがわかった。
【００４０】
１−２．  ＩＰ６溶液の調製
５０重量％ＩＰ６溶液を、ＩＰ６の濃度がそれぞれ１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ），２０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ），３０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ），５０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）となるように希釈し、ＮａＯＨ 水溶液で、ｐＨをすべて７．３に調整して、上記各濃度のＩＰ６溶液を得た。なお細胞培養実験に用いたＩＰ６溶液は０．２μｍ滅菌フィルターで滅菌を行なった。
【００４１】
１−３．  ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスの作製
（実施例１）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用い、上記１−２．項で得られた１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液３ｃｍ３に浸漬させた。
浸漬は３７ ℃，５ ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で、２４ 時間行なった。浸漬後は滅菌した超純水により３回洗浄し、乾燥後培養基材とした。作製したＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ６溶液の濃度に応じて「ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）」、と表記する。
【００４２】
（実施例２）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた２０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液３ｃｍ３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ６溶液の濃度に応じて「ＩＰ６−ＨＡｐ（２０００）」と表記する。
（実施例３）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた３０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液３ｃｍ３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ６溶液の濃度に応じて「ＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）」と表記する。
（実施例４）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液の代わりに、上記１−２．項で得られた５０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液３ｃｍ３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを、浸漬させたＩＰ６溶液の濃度に応じて「ＩＰ６−ＨＡｐ（５０００）」と表記する。
【００４３】
（参考例１）
上記１−１で得られたＨＡｐセラミックスを、１０００ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液の代わりに、０ ｐｐｍ（ｗ/ｖ）のＩＰ６溶液として滅菌した超純水３ ｃｍ３に浸漬させた以外は、上記実施例１と同様にして、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを作製した。作製したＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを、「ＩＰ６−ＨＡｐ（０）」と表記する。
【００４４】
２．  ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスのキャラクタリゼーション
ＩＰ６−ＨＡｐセラミックスの結晶構造を確認するため、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて分析を行なった。図６にＸＲＤにて得られたスペクトルを示す。実施例１〜４の全てのセラミックスにおいて、ＨＡｐ単一相であることが確認された。
【００４５】
ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス表面のＩＰ６の存在を確認するため、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いて化学状態分析を行なった。図７にＸＰＳにおけるワイドスペクトルを示す。全てのサンプルにおいて、ＨＡｐに起因するＣａ、Ｐ及びＯのピークが確認された。
さらに、炭素のピークに注目し、各サンプルのナロースペクトルを比較したもの図８に示す。それぞれのスペクトルはＣ １ｓで確認された表面にコンタミネーションするハイドロキシカーボンの値（２８５．２ ｅＶ）を基準値とし、その値でサンプルのチャージアップを補正した。
また、ナロースペクトルはガウス−ローレンツ複合関数を用いてピーク分離を行なった。ピーク分離前後のＩＰ６−ＨＡｐ（５０００）のナロースペクトルを図９に示す。不純物およびＩＰ６の分子構造中に存在するＣ−ＣおよびＣ−Ｈ結合由来であると思われるＣ １ｓの大きなピークの左側に重なった小さなピークが観測された。このピークはＣ−Ｏ結合由来のものであると考えられ、これはＩＰ６の分子構造中に存在するＣ−Ｏ結合由来のものであるといえる。したがって、実施例１〜４の全てのＩＰ６−ＨＡｐセラミックスで、ＩＰ６がＨＡｐセラミックス上に存在しているものと推定される。
【００４６】
上記ＨＡｐセラミックス上に存在するＩＰ６の量をＨＡｐ粉体に対するＩＰ６の飽和吸着量０．４２７ｍｇ・ｍ−２を用いて計算すると、約９５ｎｇとなった。
【００４７】
３．  マウス由来脾臓細胞のＩＰ６−ＨＡｐセラミックスにおける培養
（実施例５）
１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ・ｃｍ−３のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を上記１−３．項で得られたＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）上に播種し、１日後にフローサイトメーターを用いて、脾臓細胞の割合を調査した。コントロールとして２４ ｗｅｌｌのポリスチレンプレートを使用した。上記脾臓細胞にLive/Dead細胞染色（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を行い、取り分けた生細胞に対して下記抗体と反応させ、細胞を分別した。
抗体は、Ｔ細胞の表面マーカーとして抗ＣＤ３抗体（ＢＤ製）、成熟Ｔ細胞のヘルパーサブセットマーカーとして抗ＣＤ４抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ製）、Ｂ細胞の表面マーカーとして抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ製）および成熟Ｔ細胞の細胞障害性サブセットマーカーとして抗ＣＤ８抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用した。
【００４８】
（実施例６）
ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ６−ＨＡｐ（２０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（実施例７）
ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（実施例８）
ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ６−ＨＡｐ（５０００）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
（参考例２）
ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）に代えて、上記ＩＰ６−ＨＡｐ（０）上にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来脾臓細胞を播種した以外は、実施例５と同様にして、培養を行った。
【００４９】
結果をコントロールにおける細胞の割合に対する増減率として表１に示す。
【００５０】
表１中の細胞の増減率は、上記コントロールの細胞を基準として、以下の式により算出した。
【００５１】
【数１】
0006474219.tif 000002
【００５２】
表１に示される結果から、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞の増加率がＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）およびＩＰ６−ＨＡｐ（５０００）において顕著に高くなっていることがわかる。
【００５３】
Ｂ細胞については、Ｔ細胞と逆の傾向を示した。これは、サンプル中に占めるＢ細胞の割合がコントロールと比較して相対的に減少したことを示すものであり、Ｔ細胞の割合増加の結果とも考えられる。
ＩＰ６−ＨＡｐ（０）においてヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞の割合が上記コントロールよりも増加しているのは、ＨＡｐセラミックスの細胞に対する親和性に加えて、ＨＡｐセラミックスから僅かに溶出されるカルシウムイオンが、細胞の培養効率を高めた結果であると考えられる。
【００５４】
【表１】
0006474219.tif 000003
【００５５】
４．ＩＰ６含有培地におけるマウス由来脾臓細胞の応答性
（参考例３）
実験方法
培地の調製
培地にはＲＰＭＩ培地を用いた。ＲＰＭＩ培地はＲＰＭＩ ５．２０ ｇ，ペニシリン ０．０３５ ｇ，ストレプトマイシン ０．０７０ ｇ， メルカプトエタノール １．７６９ μｌを ５００ ｃｍ３ の超純水に加え撹拌したのち ＮａＨＣＯ３ ０．８ ｇを加え、ｐＨ を調整しＦＢＳ を５５ ｃｍ３ 加えたものを用いた。
また、ＲＰＭＩ培地 １０ ｃｍ３ 中に ５ ｖｏｌ％ 以内でＩＰ６ 溶液を加え、ＩＰ６濃度が１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）となるように、ＩＰ６含有培地を調製した。
【００５６】
マウス脾臓細胞の培養
１２週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ）１匹をジエチルエーテルで屠殺し、脾臓を４ ℃に冷却したＲＰＭＩ 培地 （６ ｃｍ シャーレ） に取り出した。滅菌したナイロンメッシュシートにはさみ、潰すことで脾臓細胞を取り出し、１５ ｍｌ 遠沈管にナイロンメッシュシートを通して移した。培地をシャーレに加え細胞を遠沈管に ２回洗い込んだ。Ａｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、５ 分間赤血球をバーストさせ、２ 倍量のＰＢＳを加え１５００ ｒｐｍ， ５ ｍｉｎ， ４ ℃で遠心分離する操作を２回行なうことで赤血球を取り除いた。ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地を加え懸濁液を調製し、懸濁液をトリパンブルーで １０倍希釈し、血球計数盤を用いて細胞数を求めた。
１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製し、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。３７ ℃， ５％ ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で２４時間培養したのち、上記３．項と同様にＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞染色を行い、抗体と反応させ、フローサイトメーターにより解析を行なった。
【００５７】
（参考例４）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を５０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例５）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を１００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例６）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を１５０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例７）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を３００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例８）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を５００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例９）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を１０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１０）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を２０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１１）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を３０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１２）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を４０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
（参考例１３）
ＩＰ６を１０ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地に代えて、ＩＰ６を５０００ｐｐｍ（ｗ/ｖ）の濃度で含有するＩＰ６含有培地中でマウス脾臓細胞を培養した以外は、参考例３と同様にして培養を行った。
【００５８】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０のグラフの縦軸は、播種した細胞の培養1日後のコントロールにおけるヘルパーＴ細胞の割合に対する、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上又はＩＰ６含有培地中で培養後のヘルパーＴ細胞の増減率である。上記３．項の参考例２及び実施例５〜８でのＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上で培養されたヘルパーＴ細胞の増減率の結果を図１０（ａ）に、参考例３〜７及び参考例９〜１３でのＩＰ６含有培地中で培養されたヘルパーＴ細胞の増減率の結果を図１０（ｂ）に示す。
ＩＰ６含有培地中で細胞を培養させた場合、ＩＰ６濃度が３０００ｐｐｍの条件のとき、細胞の増減率が１２％程度であった。ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上で細胞を培養させた場合、ＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）を用いたとき、細胞の増減率が約１４％であり、培地中とほぼ同程度の値であった。しかし、ＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）は、ＩＰ６濃度が３０００ｐｐｍのＩＰ６溶液に浸漬させて得られた基材であるので、実際にＩＰ６―ＨＡｐ（３０００）に結合しているＩＰ６の総量は、３０００ｐｐｍでＩＰ６を含有するＩＰ６含有培地中のＩＰ６の総量と比較して、極めて少量である。
したがって、ＩＰ６が結合されたＩＰ６−ＨＡｐセラミックスを用いることで、ＩＰ６含有培地を使用した場合と比較して、少量のＩＰ６の使用で同程度の効果が得られることがわかる。
【００５９】
上記３．項又は上記４．項において培養した脾臓細胞に対して、Live/Dead細胞染色を行った結果を示す。ＩＰ６含有培地で、ＩＰ６濃度が、１０， ５０, １００， １５０， ３００, １０００, ２０００， ３０００，４０００， ５０００ ｐｐｍの各条件で培養された細胞全体における生細胞の割合は、平均で４９．１５％であった。
対して、ＩＰ６−ＨＡｐ（０）、ＩＰ６−ＨＡｐ（１０００）、ＩＰ６−ＨＡｐ（２０００）、ＩＰ６−ＨＡｐ（３０００）、ＩＰ６−ＨＡｐ（５００００）の各条件で培養された細胞全体における生細胞の割合は、平均で７３．４６％であった。
したがって、ＩＰ６‐ＨＡｐセラミックス上では、ＩＰ６含有培地中よりも、細胞の生存率が高まっており、良好に細胞を培養可能であることが分かる。
【００６０】
図１１のグラフの縦軸は、播種した細胞の培養1日後のコントロールにおけるキラーＴ細胞の割合に対する、ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上又はＩＰ６含有培地中で培養後のキラーＴ細胞の増減率である。上記３．項の参考例２及び実施例５〜８でのＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上で培養されたキラーＴ細胞の増減率の結果を図１１（ａ）に、参考例３〜１３でのＩＰ６含有培地中で培養されたキラーＴ細胞の増減率の結果を図１１（ｂ）に示す。
ＩＰ６−ＨＡｐセラミックス上で細胞を培養させた場合、ＩＰ６―ＨＡｐ（３０００）を用いたときの細胞の増減率が約１０％であった。しかし、ＩＰ６含有培地中で細胞を培養させた場合では、ＩＰ６濃度が５０００ｐｐｍの条件のとき、細胞の増減率がマイナス１５％程度と著しく低下していた。
この結果から、高すぎるＩＰ６濃度は、細胞死を誘発する傾向にあることがわかる。ＩＰ６がＨＡｐに結合されたＩＰ６−ＨＡｐセラミックスでは、実際にＩＰ６―ＨＡｐ（３０００）に結合しているＩＰ６の総量は、極めて少量であるため、このような細胞死を誘発するリスクが低く、良好に細胞を培養できることが分かる。
【００６１】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、免疫細胞を培養可能であり、免疫賦活作用を備えた細胞培養基材、上記細胞培養基材の製造方法、上記細胞培養基材を用いた細胞培養方法、及び上記細胞培養基材を備えた細胞培養装置を提供できる。
【符号の説明】
【００６３】
１，１１…細胞培養基材、２…金属化合物、１２…水酸アパタイト層、１３…中心層、４…イノシトールリン酸、２０…細胞培養装置、２５…培養槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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