(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを含む、癌の治療または予防のための医薬組成物であって、治療または予防が、癌細胞に、または癌細胞の発生、維持、増殖もしくは転移において役割を果たす他の細胞にＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを投与することを含む、医薬組成物であって、
該ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドが、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）、Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＯＨ（配列番号１２１）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、ＭＡ−ＡＫＧＥ−ＯＨ（配列番号２１９）及びＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＮＨ２からなる群から選択される化学修飾されたペプチドである、医薬組成物。
【請求項２】
癌の治療または予防が、転移、癌細胞増殖、腫瘍成長または血管新生を治療、予防または抑制することを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
投与がペプチドの乾燥粉末製剤の吸入または液体溶液もしくは懸濁液の吸入によるものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
投与がペプチドの液体製剤の注射によるものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを静脈内、筋肉内もしくは腹腔内注射または経口もしくは坐剤投与により対象に投与する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
注射が、癌細胞を含有する腫瘍内へのものである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
注射が全身性である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍が非固形腫瘍である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ペプチドを約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ペプチドを約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）、Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＯＨ（配列番号１２１）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、ＭＡ−ＡＫＧＥ−ＯＨ（配列番号２１９）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＮＨ２およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチドの転移抑制量を含む、癌細胞の転移を抑制するための製剤であって、前記癌細胞に投与される製剤。
【請求項１３】
ペプチドがＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）である、請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
投与がペプチドの液体溶液もしくは懸濁液または乾燥粉末製剤の吸入によるものである、請求項１２記載の製剤。
【請求項１５】
投与がペプチドの液体製剤の注射によるものである、請求項１２記載の製剤。
【請求項１６】
癌の治療において有用な追加的薬物をさらに含む、請求項１２記載の製剤。
【請求項１７】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドの治療的有効量を含む、癌の治療または予防を要する対象における癌の治療または予防のための医薬組成物であって、該ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドが、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）、Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＯＨ（配列番号１２１）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、ＭＡ−ＡＫＧＥ−ＯＨ（配列番号２１９）及びＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１８】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを含む、哺乳動物における癌細胞の転移を抑制するための医薬組成物であって、前記ペプチドが、５０μＭの濃度の前記ペプチドでのＮＳＣＬＣ細胞の前処理および１２時間の遊走時間の後で少なくとも約１．５の遊走指数を示すペプチドを示す、医薬組成物であって、前記ペプチドが、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）、Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＯＨ（配列番号１２１）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、ＭＡ−ＡＫＧＥ−ＯＨ（配列番号２１９）及びＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１９】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを含む、哺乳動物における癌細胞の転移を抑制するための医薬組成物であって、前記ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドが、１００μＭの濃度の前記ペプチドでのＮＳＣＬＣ細胞の前処理および１２時間の遊走時間の後で少なくとも約２．０の遊走指数を示す、医薬組成物であって、前記ペプチドが、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＯＨ（配列番号１０６）、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）、Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＯＨ（配列番号１２１）、ＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、ＭＡ−ＡＫＧＥ−ＯＨ（配列番号２１９）及びＭＡ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１３年４月５日付け出願の米国仮特許出願第６１／８０８，９６６号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗体、核酸分子、ポリヌクレオチドおよびペプチドを含む組成物および製剤、ならびに転移癌の予防および治療のための、特に、癌細胞増殖、転移および／または血管新生の軽減、阻止または抑制のためのそれらの使用方法に関する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする［配列表のコンピューターで読取可能なフォーマットコピー（ファイル名：ＢＭＲＫ ００６ ０１ＷＯ ＳｅｑＬｉｓｔ ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１４年５月１２日、ファイルサイズ５８キロバイト）］。
【背景技術】
【０００４】
ＭＡＲＣＫＳタンパク質（ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質）はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の遍在性リン酸化標的である（Ｌｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６；４０９８２（２００２））。ＭＡＲＣＫＳは以下の３つの進化的に保存された領域を有する（Ａｄｅｒｅｍら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；Ｔｈｅｌｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；Ｈａｒｔｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２；Ｓｅｙｋｏｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）：Ｎ末端、リン酸化部位ドメイン（またはＰＳＤ；エフェクタードメインとしても公知である）および多重相同性２（ＭＨ２）ドメイン。Ｎ末端である、アミド結合を介してＮ末端グリシン残基に結合したミリスチン酸部分を有する２４アミノ酸残基を含むαアミノ酸配列は、細胞内の膜（Ｓｅｙｋｏｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）および恐らくはカルモジュリン（Ｍａｔｓｕｂａｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：４８８９８−４８９０２）へのＭＡＲＣＫＳの結合に関与している。この２４アミノ酸配列はＭＡＮＳペプチドとして公知である。ＭＡＮＳペプチドおよび関連ペプチドは米国特許第７，２６５，０８８号、第７，５２９，９２６号、第７，５４４，７７２号、第８，４９２，５１８号、第８，５０１，９１１号、第７，９１８，２９３，８７０号および第８，５６３，６８９号（それらのそれぞれの全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
【０００５】
癌細胞転移、癌細胞増殖、腫瘍成長および／または血管新生の抑制を含む、癌の予防、治療および抑制に向けられた安全な新規療法が当技術分野において必要とされている。本発明はこれら及び他の必要性に対処するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／８０８，９６６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２６５，０８８号明細書
【特許文献３】米国特許第７，５２９，９２６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，５４４，７７２号明細書
【特許文献５】米国特許第８，４９２，５１８号明細書
【特許文献６】米国特許第８，５０１，９１１号明細書
【特許文献７】米国特許第７，９１８，２９３，８７０号明細書
【特許文献８】米国特許第８，５６３，６８９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６；４０９８２（２００２）
【非特許文献２】Ａｄｅｒｅｍら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４
【非特許文献３】Ｔｈｅｌｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；
【非特許文献４】Ｈａｒｔｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２
【非特許文献５】Ｓｅｙｋｏｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｂａｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：４８８９８−４８９０２
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡潔な概要
本発明は癌の予防または治療に有用な方法および組成物に関する。１つの実施形態においては、癌細胞転移、癌細胞増殖、腫瘍成長または血管新生の抑制のための方法および組成物を提供する。１つの実施形態においては、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）の抑制を含む、癌細胞転移、癌細胞増殖、腫瘍成長または血管新生の予防および抑制のための方法および組成物を提供する。１つの実施形態においては、該組成物は、ペプチド、ポリぺプチド、抗体またはそのフラグメント、ならびに核酸分子、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含むＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を含む。本明細書中で用いる「ＭＡＲＣＫＳ抑制性核酸分子」は、ＭＡＲＣＫＳの発現および／または機能を低減するポリヌクレオチドまたは核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを意味する。１つの実施形態においては、該組成物は１以上のＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドを含む。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドはＭＡＲＣＫＳのＭＨ２ドメインに対応する。もう１つの実施形態においては、該ペプチドはミリストイル化Ｎ末端配列（ＭＡＲＣＫＳの２４アミノ酸断片であるＭＡＮＳペプチド）関連ペプチド（すなわち、「ＭＡＮＳ関連ペプチド」）である。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチド；ＭＡＮＳペプチドにおけるＮ末端アミノ酸配列において見出されるのと同じ配列を含み、４以上のアミノ酸を含有するＭＡＮＳの非置換断片；ＭＡＮＳペプチドまたはＭＡＮＳペプチド断片において見出される配列と実質的に同一である配列を含むペプチド；例えばアセチル基でＮ末端においてアシル化された又はＮ末端においてミリストイル化された、ＭＡＮＳペプチドと同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＭＡＮＳペプチドまたはＭＡＮＳペプチドの断片；およびＣ末端において化学修飾された、ＭＡＮＳペプチドと同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＭＡＮＳペプチドまたはＭＡＮＳペプチドの断片からなる群から選択される。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはＮ末端およびＣ末端の両方において化学修飾されている。１つの実施形態においては、本発明において提供するＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は抗体またはそのフラグメントである。１つの実施形態においては、該抗体またはそのフラグメントはＭＡＲＣＫＳタンパク質の機能を抑制する。もう１つの実施形態においては、該抗体またはそのフラグメントはＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端またはＭＡＲＣＫＳタンパク質のＭＨ２に結合する。本発明者らは、驚くべきことに、種々のタイプのＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物の使用がインビトロにおいて癌細胞の遊走（移動）に対する抑制効果を示し、インビボにおいて転移を抑制することを見出した。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は侵襲性癌細胞系の遊走に対する抑制効果を示す。１つの実施形態においては、本発明において提供するＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は哺乳動物における腫瘍における癌細胞の転移を抑制する。もう１つの実施形態においては、該腫瘍は固形腫瘍である。もう１つの実施形態においては、該腫瘍は非固形腫瘍である。１つの実施形態においては、本発明において提供するＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、リンパ腫または白血病に関連した癌細胞の転移を抑制する。
【０００９】
１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物はＭＡＲＣＫＳ抑制性ポリヌクレオチドまたはＭＡＲＣＫＳ抑制性核酸分子を含む。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、ＭＡＲＣＫＳの発現および／または機能を抑制するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡポリヌクレオチドである。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、ＭＡＲＣＫＳ発現を調節するタンパク質またはポリヌクレオチドの模倣体、例えばｍｉＲ２１の模倣体である。
【００１０】
１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物はＭＡＲＣＫＳ関連またはＭＡＮＳ関連ペプチドである。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドはＭＡＲＣＫＳのＮ末端ミリストイル化ドメインに対応する。したがって、１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドはＭＡＮＳ関連ペプチドである。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドおよび或る化学修飾ＭＡＮＳ関連ペプチドは侵襲性癌細胞系の遊走を阻止する。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、癌細胞の転移に対する抑制効果を発現させるために使用される。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物はインビトロにおける癌細胞の転移に対する阻止効果を示す。転移疾患の抑制のインビボ部位には、少なくとも、肺組織、心臓組織、脾臓組織、腸組織および横隔膜組織が含まれる。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、癌細胞転移、癌細胞増殖、腫瘍細胞成長または血管新生を治療または予防するために使用される。
【００１１】
１つの態様においては、癌細胞に、または癌細胞の発生、維持、増殖もしくは転移において何らかの役割を果たしている細胞にＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を投与することを含む、癌を治療または予防するための方法および組成物を提供する。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物の転移抑制量を癌細胞に投与することを含む、癌細胞の転移を抑制するための方法を提供する。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドの転移抑制量を癌細胞に投与することを含む、癌細胞の転移を抑制するための方法を提供する。もう１つの実施形態においては、配列番号１〜配列番号２３１（配列番号１および２３１も含む）、配列番号２３４および配列番号２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの転移抑制量を癌細胞に投与することを含む、腫瘍における癌細胞の転移を抑制するための方法を提供し、ここで、該ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸は所望により化学修飾されていてもよい。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドの治療的有効量を投与することを含む、癌の治療を要する対象において癌を治療するための方法を提供する。もう１つの実施形態においては、配列番号１〜配列番号２３１（配列番号１および２３１も含む）、配列番号２３４および配列番号２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの治療的有効量を対象に投与することを含む、癌の治療を要する対象において癌を治療するための方法を提供し、ここで、該ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸は所望により化学修飾されていてもよい。
【００１２】
１つの実施形態においては、該ペプチドのＮ末端アミノ酸は、
・直鎖状、分枝状、飽和または不飽和でありうるＣ２（アセチル）〜Ｃ２４脂肪族カルボン酸のアミド、
・トリフルオロ酢酸のアミド、
・安息香酸のアミド、および
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキルスルホン酸のアミド
からなる群から選択されるアミドの形態で、該ペプチドのＮ末端アミノ酸のアシル化により化学修飾されている。あるいは、該ペプチドのＮ末端アミノ酸のＮ末端アミン基は、
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキル基、
・直鎖状２−（Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキル）オキシエチル基、
・オメガ−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチル基（ここで、ｎは０〜１０である）
からなる群から選択される基でアルキル化されうる。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、該Ｎ末端アミドは、アセチルおよびミリストイルからなる群から選択される。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、該ペプチドのＣ末端アミノ酸は、
・アンモニアのアミド、
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキルアミンのアミド、
・ヒドロキシル置換Ｃ２〜Ｃ２４脂肪族アルキルアミンのアミド、
・直鎖状２−（Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキル）オキシエチルアミン基のアミド、および
・オメガ−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチルアミン基（ここで、ｎは０〜１０である）のアミド
からなる群から選択されるアミドの形態で、該ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基におけるアミド形成により化学修飾されている。
【００１５】
１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドをそれぞれ癌細胞または対象に投与することを含む、癌細胞の転移を抑制するための、または癌を治療するための方法を提供する。１つの実施形態においては、該ペプチドは、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号２２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号２９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号３７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号４６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号５６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号６７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号７９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号９２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１３７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１５４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１７２）、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳ（配列番号１９１）、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦ（配列番号２１１）、Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号２３４）、Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）、Ｎ−アセチル−ＲＡＫＧＥ（配列番号２３５）およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
１つの実施形態においては、該ペプチドは、Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００６）；Ｎ−ミリストイル−ＡＫＧＥ（配列番号２１９；ＢＩＯ−９１２００）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０００）；Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１；ＢＩＯ−１０９０１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１２１；ＢＩＯ−１０９００）；およびＮ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６）からなる群から選択される。１つの実施形態においては、あるアミノ酸はｄ−配置で存在する。例えば、１つの実施形態においては、該ペプチドはＮ−アセチル−ＧＡＱＦＳ（ｄ）ＫＴＡＡ（ｄ）Ｋ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０３７）であり、ここで、該ペプチドの６位および１０位のリジン（Ｋ）はｄ−配置である。
【００１７】
幾つかの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、それらを治療用途における、例えば癌の治療における使用に適したものにする特性を示す。例えば、１つの実施形態においては、本明細書に開示されている或るＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドと比較して、またはＭＡＮＳ関連ペプチド以外のペプチドと比較して増加した溶解度を示す。もう１つの実施形態においては、本発明において提供する或るＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドより又はＭＡＮＳ関連ペプチド以外のペプチドより長い血漿中の半減期を示す。
【００１８】
１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは癌細胞遊走の低減を示す。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチド（例えば、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ１１００２、ＢＩＯ１０９０１、ＢＩＯ１０９００、ＢＩＯ１１０００またはＢＩＯ−９１２００）での癌細胞の前処理（予備治療）は、細胞が約１０μｍ〜約２００μｍのペプチドで前処理された場合、または約２０μｍ〜約２００μｍのペプチドで前処理された場合、または約２５μｍ〜約７５μｍのペプチドで前処理された場合、癌細胞の遊走を低減しうる。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約１μＭ〜約５００μＭ、約５μＭ〜約２５０μＭの濃度、または約１０μＭ〜約２００μＭの濃度で投与された場合、癌細胞遊走の低減を示す。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約２５μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭまたは約５００μＭの濃度で投与された場合、癌細胞遊走の低減を示す。１つの実施形態においては、該ペプチドの効果を判定するために、癌細胞をインビトロで該ペプチドで処理する。１つの実施形態においては、癌細胞は患者に由来する。もう１つの実施形態においては、患者が該ペプチドでの治療に応答しそうであるかどうかを判定するために、癌細胞をインビトロで該ペプチドで処理する。
【００１９】
１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で患者に投与された場合、癌細胞転移の低減を示す。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で患者に投与された場合、癌細胞転移の低減を示す。更にもう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で患者に投与された場合、癌細胞転移の低減を示す。例えば、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドは、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約０．７５、約１．０、約１．０、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２．０、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３．０、約３．５、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０．０ｍｇ／ｋｇ／日以上の濃度で患者に投与された場合、癌細胞転移の低減を示す。
【００２０】
１つの実施形態においては、該ペプチドは該ペプチドの乾燥粉末製剤の吸入により、あるいは液体溶液または懸濁液の吸入により投与される。もう１つの実施形態においては、該ペプチドは該ペプチドの液体製剤または懸濁液の注射により投与される。もう１つの実施形態においては、該注射は、癌細胞を含有する原発性腫瘍領域内へのものである。もう１つの実施形態においては、癌細胞は哺乳動物における腫瘍内に存在する。１つの実施形態においては、該腫瘍は固形腫瘍である。もう１つの実施形態においては、該腫瘍は非固形腫瘍である。１つの実施形態においては、本発明において提供するＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、リンパ腫または白血病に関連した癌細胞の転移を抑制する。もう１つの実施形態においては、該液体製剤は等張性である。もう１つの実施形態においては、該液体製剤は緩衝化されている。
【００２１】
１つの実施形態においては、該ペプチドの転移抑制量は約０．１〜約１００マイクロモル／ミリリットルの範囲内である。もう１つの実施形態においては、該ペプチドの転移抑制量は約１〜約１０マイクロモル／ミリリットルの範囲内である。もう１つの実施形態においては、該ペプチドは、癌の治療において有用な追加的な薬物を含む製剤中に存在し、あるいは追加的薬物との投与用に製剤化される。
【００２２】
１つの態様においては、哺乳動物において癌細胞の転移を抑制するための、あるいは癌を治療または予防するための方法を提供し、ここで、該方法は、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を該哺乳動物に投与することを含む。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、ＭＡＲＣＫＳの発現または活性を低減するポリヌクレオチドまたは核酸分子である。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ポリヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ポリヌクレオチドは、約１０ｎＭ〜１０μＭ、または約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約３０ｎＭ〜約３００ｎＭ、または約４０ｎＭ〜約２００ｎＭ、または約５０ｎＭ〜約１００ｎＭの量で投与される。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ポリヌクレオチドは、ＭＡＲＣＫＳ発現を調節するｍｉＲＮＡの模倣体である。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ポリヌクレオチドはｍｉＲ２１の模倣体である。１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドおよび核酸分子は、運搬剤、例えば、ペプチド、タンパク質、脂質、ステロール、重合体、トランスフェクション試薬、または当技術分野で公知のポリヌクレオチドもしくは核酸運搬剤と共に投与される。
【００２３】
１つの態様においては、哺乳動物において癌細胞の転移を抑制するための、あるいは癌を治療または予防するための方法を提供し、ここで、該方法は、ＭＡＮＳ関連ペプチドを該哺乳動物に投与することを含み、ここで、該ペプチドは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞の前処理（予備治療）の後、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２．０、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、少なくとも約３．０、またはそれ以上の遊走指数を示す。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは該ペプチドの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００μモル濃度の濃度で存在する。もう１つの実施形態においては、遊走時間は３、４、５、６、７、８、１２、１５、２０、２１、２２、２３または２４時間である。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは５０μモル濃度の該ペプチドでのＮＳＣＬＣ細胞の前処理（予備治療）および約１２時間の遊走時間の後で少なくとも約１．５の遊走指数を示す。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは少なくとも約１００μモル濃度の該ペプチドでのＮＳＣＬＣ細胞の前処理（予備治療）および約１２時間の遊走時間の後で少なくとも約２．０の遊走指数を示す。
【００２４】
１つの態様においては、癌（癌転移を含む）の治療または予防を要する対象において癌を治療または予防するための方法を提供し、ここで、該方法は、ＭＡＮＳ関連ペプチドを約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で該対象に投与することを含む。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与される。更にもう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与される。例えば、ＭＡＮＳ関連ペプチドは約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約０．７５、約１．０、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２．０、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３．０、約３．５、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０．０ｍｇ／ｋｇ／日またはそれ以上の用量で癌の治療または予防のために投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】１２時間の遊走時間の後の陰性対照の細胞計数視野（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｆｉｅｌｄ）を示す。
【図２Ａ】５０μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図２Ｂ】１００μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図３Ａ】５０μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図３Ｂ】１００μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図４Ａ】５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１１００２での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図４Ｂ】１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１１００２での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図５Ａ】５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１０９０１での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図５Ｂ】１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１０９０１での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図６Ａ】５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−９１２００での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図６Ｂ】１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−９１２００での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【図７Ａ】５０μモル濃度のＭＡＮＳペプチド、ＢＩＯ１１００２、ＢＩＯ１０９０１、ＢＩＯ９１２００もしくはＲＮＳペプチドまたはペプチド無し（対照）での前処理の１２時間後に得られた遊走細胞数をグラフで示す。
【図７Ｂ】１００μモル濃度のＭＡＮＳペプチド、ＢＩＯ１１００２、ＢＩＯ１０９０１、ＢＩＯ９１２００もしくはＲＮＳペプチドまたはペプチド無し（対照）での前処理の１２時間後に得られた遊走細胞数をグラフで示す。
【図８Ａ】侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系細胞の遊走指数をグラフで示し、ここで、より高い値の遊走指数は、５０μモル濃度の本発明のペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の処理（該プロトコルによるもの）の後の、より低い遊走を示す。
【図８Ｂ】侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系細胞の遊走指数をグラフで示し、ここで、より高い値の遊走指数は、１００μモル濃度の本発明のペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の処理（該プロトコルによるもの）の後の、より低い遊走を示す。
【図９】５０μモル濃度の示されているペプチドおよび侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系を使用した実験におけるＭＡＮＳ、ＲＮＳ、ＢＩＯ−１１０００もしくはＢＩＯ−１１００６または対照（ペプチド無し）に関するそれぞれの細胞数（左パネル）および遊走指数（右パネル）をグラフで示す。
【図１０】１００μモル濃度の示されているペプチドおよび侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系を使用した実験におけるＭＡＮＳ、ＲＮＳ、ＢＩＯ−１１０００、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ−９１２００または対照（ペプチド無し）に関するそれぞれの細胞数（左パネル）および遊走指数（右パネル）をグラフで示す。
【図１１】ペプチド無し又は１０μモル濃度（左上パネル）、２５μモル濃度（右上パネル）または５０μモル濃度（下パネル）の示されている試験ペプチド（ＭＡＮＳ、ＲＮＳ、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ−１１０００、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−９１２００またはＢＩＯ−１０９０１）でのＡ５４９細胞の前処理の１２時間後の遊走細胞数を示す。
【図１２】ＢＩＯ−１１００６で処理された動物の左肺、右肺、心臓および横隔膜におけるマウス当たりの腫瘍の平均数を示す。ＢＩＯ−１１００６（ＰＢＳ中、１００μＭ）は、腹腔内注射（５０μＬ）または吸入（３０分間，Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）により、癌細胞接種の３日後から１日１回、２２日間にわたって投与された。
【図１３】ヒト腺癌細胞（ＰＣ−９）の注射から第１５日または第４日の時点から１日１回３０日間にわたって、ネブライザー運搬系（Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）を使用する吸入によりＢＩＯ−１１００６（ＰＢＳ中、１００μＭ）を投与したマウスの左肺、右肺、心臓および横隔膜におけるマウス当たりの腫瘍の平均数を示す。
【図１４】ＰＣ−９の注射から第１５日または第４日の時点から１日１回３０日間にわたって、ネブライザー運搬系（Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）を使用する吸入によりＢＩＯ−１１００６（ＰＢＳ中、１００μＭ）を投与したマウスにおける腫瘍の総数を示す。
【図１５】ビヒクル対照、エアゾール化ＢＩＯ−１１００６（Ａ５４９癌細胞注射から第−１日または第＋３日の時点から開始）またはエアゾール化ＭＡＮＳ（Ａ５４９癌細胞注射から第−１日または第＋３日の時点から開始）で隔日で処理されたマウスにおいて見出された転移性小結節の数を示す。エアゾール化ペプチド（ＰＢＳ中、１００μＭ）は、ネブライザー運搬系（Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）を使用する吸入により投与された。＊，ｐ＜０．０５，対照群と比較して統計的に有意；ａ，群間比較において統計的に非有意。
【図１６】ＰＣ９細胞における１００ｎＭ  ＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの投与の後のＭＡＲＣＫＳタンパク質のレベルを示す。
【図１７】Ａ５４９細胞における１００ｎＭ  ＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの投与の後のＭＡＲＣＫＳタンパク質のレベルを示す。
【図１８】１００ｎＭ  ＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでの処理の後のＰＣ９癌細胞の遊走を示す。
【図１９】１００ｎＭ  ＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでの処理の後のＡ５４９癌細胞の遊走を示す。
【図２０】５０ｎＭ  陰性対照（ＨｉＰｅｒｆｅｃｔビヒクル；レーンＡ）または５０ｎＭ  ｍｉＲ２１インヒビター（レーンＢ）での処理の後のウエスタンブロットによるＰＣ９細胞におけるＭＡＲＣＫＳの発現を示す。
【図２１】ｍｉＲ２１抑制（５０ｎＭまたは１００ｎＭ  ｍｉｒ−２１インヒビター）またはｍｉＲ２１活性化（５０ｎＭまたは１００ｎＭ  ｍｉＲ−２１模倣体）の後のＰＣ９癌細胞の遊走を示す。
【００２６】
発明の詳細な説明
ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質は複数の細胞過程に既に関連づけられている。例えば、ＭＡＲＣＫＳタンパク質は細胞分泌、脱顆粒、遊走および遺伝子発現に一体的に関与していることが示されている。これらの研究は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のミリストイル化Ｎ末端配列と同じペプチド（すなわち、ＭＡＮＳペプチド）が、刺激前に細胞がＭＡＮＳペプチドで処理された場合、異なる細胞型における過程に影響を及ぼしうることに基づくものであった。これらの場合の全てにおいて、ミスセンス対照ペプチド（ＭＡＮＳペプチドのアミノ酸のランダムなアミノ酸配列からなるものであり、本明細書においてはＲＮＳペプチドと称される）は、ＭＡＮＳペプチドにより示される活性に関して無効であった。
【００２７】
１つの実施形態においては、該組成物は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはそのフラグメント、ならびにポリヌクレオチドまたは核酸分子、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む当技術分野で公知のいずれかのタイプの抑制性化合物のようなＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を含む。１つの実施形態においては、該組成物は１以上のミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）関連ペプチドを含む。もう１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチドはＭＡＲＣＫＳのＭＨ２ドメインに対応する。もう１つの実施形態においては、該組成物は、Ｎ末端配列に対応するペプチドを包含するＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドを含む。
【００２８】
１つの実施形態においては、本発明において提供するＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は抗体である。本明細書中で用いる「抗体」なる語は、少なくとも１つの抗原結合性ドメインを有する結合性タンパク質を意味し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに抗体フラグメントおよび／または変異体、例えば組換えポリペプチド、融合タンパク質およびイムノコンジュゲート（免疫複合体）を含む。本発明の抗体フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離されたＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２、２つの連結Ｆａｂフラグメントを含む２価フラグメント、および一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明において提供する抗体またはフラグメントは、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ラマおよびヒト（これらに限定されるものではない）を含む任意の種から作製されうる、と当業者は認識するであろう。本発明において提供する抗体またはフラグメントはキメラ体、ヒト化体または完全ヒト体でありうる、と当業者は更に認識するであろう。
【００２９】
１つの態様においては、癌を治療または予防するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示されている、癌を治療または予防するための方法は、転移、腫瘍成長、癌細胞増殖および血管新生（これらに限定されるものではない）を含む癌の全態様を治療または予防することを含む。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を癌細胞に、または癌細胞の発生、維持、増殖もしくは転移において何らかの役割を果たしている細胞、例えば内皮細胞に投与することを含む、癌を治療または予防するための組成物および方法を提供する。
【００３０】
１つの態様においては、癌細胞の転移を抑制するための組成物および方法を提供し、ここで、該方法は、ＭＡＲＣＫＳ抑制性組成物を投与することを含む。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物は、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチド、抗体もしくはそのフラグメント（ＭＡＲＣＫＳまたはＭＡＲＣＫＳペプチドに結合するもの）、またはＭＡＲＣＫＳタンパク質の機能を抑制するアンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含むポリヌクレオチドもしくは核酸分子である。もう１つの実施形態においては、該ペプチドはＭＡＮＳ関連ペプチドであり、ここで、該ペプチドは癌細胞の転移を抑制する。１つの実施形態においては、癌細胞の転移を抑制するＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドを提供する。もう１つの態様においては、本明細書に開示されている組成物を使用して癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態においては、提供する方法は、癌細胞をＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドと接触させることを含む。もう１つの実施形態においては、癌細胞は腫瘍に存在する。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドはＭＡＮＳ関連ペプチドである。本明細書中で用いる「ＭＡＮＳ関連ペプチド」なる語はＭＡＮＳペプチド、またはＭＡＮＳと実質的に同一であるペプチド；あるいはＭＡＮＳペプチドにおいて見出される少なくとも４個の連続的アミノ酸を含有する、またはＭＡＮＳペプチドにおいて見出される少なくとも４個の連続的アミノ酸を含有するペプチドと実質的に同一である、ＭＡＮＳペプチドの断片を意味する。したがって、ＭＡＮＳ関連ペプチドは４〜２４アミノ酸長である。本明細書中で用いる「実質的に同一」なる語は、２つのペプチドのアミノ酸配列の比較または２つのペプチドセグメント（例えば、参照ペプチドアミノ酸配列のセグメント）のアミノ酸配列の比較に関して、該ペプチドまたはペプチドのセグメントのアミノ酸配列が少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０の配列同一性または少なくとも約９５％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、該ペプチドのアミノ酸配列はＭＡＮＳペプチドまたはＭＡＮＳペプチド断片に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドと同一または実質的に同一である４〜２４アミノ酸長のペプチドを含むことが可能であり、１以上の追加的アミノ酸を更に含むことが可能である。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドと同一または実質的に同一である４〜２４個の連続的アミノ酸を含み、ＭＡＮＳペプチドに存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸、例えばアルギニンを更に含む。
【００３１】
１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドは化学修飾されている。１つの実施形態においては、ＭＡＲＣＫＳ抑制性ペプチドは、Ｎ末端位置においてアシル化されたＭＡＮＳ関連ペプチドである。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはＮ末端位置においてアセチル基でアシル化されている。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはＮ末端位置においてミリストイル化されている。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはＣ末端位置において化学修飾されている。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはアミン（例えば、アンモニア）とのアミドの形成によりＣ末端位置において化学修飾されている。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはＮ末端およびＣ末端位置の両方において化学修飾されている。表１は、Ｎ末端位置においてはミリストイル化されているがＣ末端位置においては置換されていない本発明に関連したペプチドの一覧である。ある対照ペプチド（ＲＮＳペプチド）が表１および２に列挙されており、これらはミリストイル化されている。しかし、ＲＮＳペプチドは本発明の範囲内に含まれないとみなされる。
【００３２】
【表１】
0006449849.tif 000002
【００３３】
表２は、Ｎ末端および／またはＣ末端位置において置換または化学修飾されうる本発明のＭＡＮＳ関連ペプチド断片の一覧である。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳペプチドのこれらの活性断片は、表１におけるものと同様に、Ｎ末端位置においてミリストイル化されうる。もう１つの実施形態においては、Ｃ末端位置における化学修飾はアミド化、例えば、アミン（例えば、アンモニア）とのアミドの形成を含む。ペプチド２３４（配列番号２３４）は、Ｎ末端において化学修飾されうる（例えば、Ｎ末端アセチル類似体，Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ）、そしてまた、Ｎ末端およびＣ末端において化学修飾されうる（例えば、Ｎ末端アセチル−、−Ｃ末端アンモニアアミド類似体，Ａｃ−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２）、ペプチド１０６（配列番号１０６；ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ）のＮ末端アルギニン置換ペプチドホモログである。ペプチド２３５（配列番号２３５）は、Ｎ末端において化学修飾されうる（例えば、Ｎ末端アセチル類似体，Ａｃ−ＲＡＫＧＥ）、そしてまた、Ｎ末端およびＣ末端において化学修飾されうる（例えば、Ｎ末端アセチル−、−Ｃ末端アンモニアアミド類似体，Ａｃ−ＲＡＫＧＥ−ＮＨ２）、ペプチド２１９（配列番号２１９；ＲＡＫＧＥ）のＮ末端アルギニン置換ペプチドホモログである。好ましいＮ末端修飾または置換体はミリストイルおよびアセチル基ならびにＮ末端アルギニン基、Ｎ末端アセチル−アルギニン基およびＮ末端ミリストイル−アルギニン基を含む。好ましいＣ末端修飾体はアンモニアからのアミド基を含む。
【００３４】
【表２】
0006449849.tif 000003
0006449849.tif 000004
0006449849.tif 000005
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【００３５】
ＭＡＮＳペプチドはミリストイル化されており（ＭＡと称される）、２４個のアミノ酸配列ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＲＰＧＥＡＡＶＡを含有する。理論により束縛されるものではないが、該ペプチドは、完全長ＭＡＲＣＫＳタンパク質が天然で細胞膜に結合するのを妨害し、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）によるＭＡＲＣＫＳタンパク質のリン酸化を妨害すると理論上想定される。
【００３６】
ＭＡＮＳペプチドはインビトロおよびインビボの両方における杯状細胞の脱顆粒の有意な低下をもたらすことが示されている。ＭＡＮＳは好中球および間葉系幹細胞の遊走の速度にも影響を及ぼす。ヒト白血球の脱顆粒もＭＡＮＳにより抑制される。本発明の１つの態様においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドでの或る癌細胞系の処理はそれらの癌細胞系の遊走を低下させる。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは癌細胞の転移の抑制を示す。したがって、１つの実施形態においては、提供するＭＡＮＳ関連ペプチドは、転移癌の治療または予防を要する対象における転移癌を治療または予防するために使用されうる。幾つかの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、それらを治療用途における、例えば癌の治療における使用に適したものにする特性を示す。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドと比較して増加した溶解度を示す。もう１つの実施形態においては、幾つかのＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドより又はＭＡＮＳ関連ペプチド以外のペプチドより長い血漿中の半減期を示す。１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは癌細胞の増殖の治療において有用でありうる。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは癌細胞の増殖および／または遊走を抑制しうる。もう１つの実施形態においては、幾つかのＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳペプチドまたはＭＡＮＳ関連ペプチド以外のペプチドより低い濃度において、癌細胞の増殖および／または遊走の、より大きな抑制をもたらしうる。
【００３７】
１つの態様においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、
Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０００）；
Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００６）；
Ｎ−ミリストイル−ＡＫＧＥ（配列番号２１９；ＢＩＯ−９１２００）；
Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００２）；
Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１；ＢＩＯ−１０９０１）；
Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０２６）；
Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳ（ｄ）ＫＴＡＡ（ｄ）Ｋ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０３７）（該ペプチドの６位および１０位のＬｙｓはｄ配置である）；
Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号２３４；ＢＩＯ−１１０２７）；
Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４；ＢＩＯ−１１０２８）；および
Ｎ−アセチル−ＲＡＫＧＥ（配列番号：２３５；ＢＩＯ−９１２０４）
からなる群から選択される。
【００３８】
１つの態様においては、ＭＡＮＳペプチドにおいて見出されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一であるアミノ酸配列を有し、４〜２４アミノ酸を有するペプチドは本発明の１以上の態様において有用でありうる。これらのペプチドは本明細書においてはＭＡＮＳ関連ペプチドと称され、典型的なＭＡＮＳ関連ペプチドが配列番号１〜２３１、２３４および２３５として表２に列挙されている。表２は、アミノ酸配列の順序が本発明における有効性に重要でありうることを示すために及び対照として使用されるランダム配列（ＲＮＳ）ペプチド番号２３２（配列番号２３２）のアミノ酸配列、ならびに第２のランダム配列対照ペプチド２３３（ＲＮＳ２；配列番号２３３）をも含む。ペプチド２３４および２３５（配列番号２３４および２３５）は、それぞれ、ペプチド１０６および２１９のＮ末端アルギニン置換ペプチドホモログである。該アルギニンは例えばアシル基またはミリストイル基でアシル化されうる。
【００３９】
１つの実施形態においては、本発明において有用でありうるペプチドは、表２に列挙されているアミノ酸配列を有する合成ペプチド（ランダム配列ペプチド２３２および２３３を除く）からなる群から選択されうる。
【００４０】
もう１つの実施形態においては、本発明において有用でありうるペプチドは、所望によりＮ末端および／またはＣ末端において化学修飾されていてもよい表２に列挙されているアミノ酸配列（配列番号１〜２３１（配列番号１および２３１を含む）、２３４および２３５）のペプチドから選択されうる。
【００４１】
表２に列挙されているペプチドの好ましい独立したＮ末端化学修飾は、
・直鎖状、分枝状、飽和または不飽和でありうるＣ２（アセチル）〜Ｃ２４脂肪族カルボン酸のアミド、
・トリフルオロ酢酸のアミド、
・安息香酸のアミド、および
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキルスルホン酸のアミド
からなる群から選択されるアミドの形態での該ペプチドのＮ末端アミノ酸のアシル化によるＮ末端アミン基修飾を含む。あるいは、該ペプチドのＮ末端アミノ酸のＮ末端アミン基は、
・Ｃ１（メチル）〜Ｃ２４脂肪族アルキル基、
・直鎖状２−（Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキル）オキシエチル基、
・オメガ−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチル基（ここで、ｎは０〜１０である）
からなる群から選択される基でアルキル化されうる。
【００４２】
表２に列挙されているペプチドの好ましい独立したＣ末端化学修飾は、
・アンモニアのアミド、
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキルアミンのアミド、
・ヒドロキシル置換Ｃ２〜Ｃ２４脂肪族アルキルアミンのアミド、
・直鎖状２−（Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキル）オキシエチルアミン基のアミド、および
・オメガ−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチルアミン基（ここで、ｎは０〜１０である）のアミド
からなる群から選択されるアミドの形態での該ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基におけるアミド形成を含む。
【００４３】
また、該ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基は、所望により、
・Ｃ１〜Ｃ２４脂肪族アルキルアルコールのエステル、
・２−（オメガ−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ）−エタノール基（ここで、ｎは０〜１０である）のエステル、
・１，０００〜２５，０００ダルトンの分子量のＰＥＧ成分、直鎖状ＰＥＧ−アミンのエステル
からなる群から選択されるエステルの形態であってもよい。
【００４４】
１つの実施形態においては、基の脂肪族部分、例えばカルボン酸基およびスルホン酸基ならびにアルコールおよびアミノ基は少なくともＣ３の環（すなわち、少なくともシクロプロピル環）を含みうる。
【００４５】
１つの実施形態においては、該ペプチドは、例えば、それぞれアセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（Ｎ−末端アセチル配列番号１０６）およびミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（Ｎ−末端ミリストイル配列番号１０６）のようなＮ末端アミドとして、アセチル基またはミリストイル基によりＮ末端において修飾されうる。もう１つの実施形態においては、該ペプチドは、例えばＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６  Ｃ−末端アミド）のように（例えば、アンモニアとのアミドにより）Ｃ末端において修飾されうる。もう１つの実施形態においては、該ペプチドは、例えば、（アンモニアとの）Ｎ−アセチル−ペプチド−Ｃ−アミド、例えばアセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（Ｎ−末端アセチル配列番号１０６Ｃ−末端アミド）およびミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（Ｎ−末端ミリストイル配列番号１０６  Ｃ−末端アミド）として、Ｎ末端およびＣ末端において修飾されうる。これらのペプチドは、本発明の方法において、および癌細胞の転移を抑制する能力を判定するために使用されうる。
【００４６】
１つの実施形態においては、本発明において有用でありうるペプチドは、アミノ酸配列ＡＫＧＥ（配列番号２１９）を含有するペプチドの群から選択されうる。そのようなペプチドには、配列番号１〜配列番号５４、配列番号５６〜配列番号６４、配列番号６７〜配列番号７５、配列番号７９〜配列番号８７、配列番号９３〜配列番号１００、配列番号１０８〜配列番号１１４、配列番号１２４〜配列番号１２９、配列番号１４１〜配列番号１４５、配列番号１５９〜配列番号１６２、配列番号１７８〜配列番号１８０、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２１９および配列番号２３５が含まれる。１つの現在好ましい実施形態においては、これらのペプチドはＮ末端アミノ基においてミリストイル化またはアセチル化されている。
【００４７】
１つの実施形態においては、本発明は、流体または組織における走化性物質の漸増濃度勾配に対する癌細胞の転移を低減する方法を開示し、該方法は、遊走調節性ペプチドの遊走抑制量で該癌細胞を処理し、該ペプチドと共に該細胞をインキュベートして、遊走抑制癌細胞を形成させることを含み、ここで、該ペプチドはＭＡＮＳ関連ペプチドである。
【００４８】
１つの態様においては、遊走調節性ペプチドは、ＭＡＮＳ関連ペプチドからなる群から選択される。もう１つの態様においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドはアミノ酸配列ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）を含む。
【００４９】
もう１つの態様においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号２２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号２９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号３７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号４６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号５６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号６７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号７９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号９２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１３７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１５４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１７２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳ（配列番号１９１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦ（配列番号２１１）；Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号２３４）；Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４）；Ｎ−アセチル−ＲＡＫＧＥ（配列番号２３５）；およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５０】
もう１つの態様においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、
・Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１；ＭＡＮＳペプチド）；
・Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０００）；
・Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００６）；
・Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１０２６）；
・Ｎ−ミリストイル−ＡＫＧＥ（配列番号２１９；ＢＩＯ−９１２００）；
・Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号１０６；ＢＩＯ−１１００２）；
・Ｎ−アセチル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１；ＢＩＯ−１０９０１）；
・Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号２３４；ＢＩＯ−１１０２７）；
・Ｎ−アセチル−ＲＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ−ＮＨ２（配列番号２３４；ＢＩＯ−１１０２８）；および
・Ｎ−アセチル−ＲＡＫＧＥ（配列番号２３５；ＢＩＯ−９１２０４）
からなる群から選択される。
【００５１】
１つの態様においては、本発明のペプチドの転移抑制用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲でありうる。もう１つの実施形態においては、ペプチドの転移抑制用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日である。更にもう１つの実施形態においては、ペプチドの転移抑制用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。例えば、本発明のペプチドの転移抑制用量は約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約０．７５、約１．０、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２．０、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３．０、約３．５、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０．０ｍｇ／ｋｇ／日またはそれ以上である。
【００５２】
１つの実施形態においては、本発明は、癌細胞の転移を抑制するための方法を提供し、ここで、該投与は経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、吸入または坐剤経路によるものである。もう１つの実施形態においては、本発明は、癌細胞の転移を抑制するための方法を開示し、ここで、該投与はＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物の液体溶液もしくは懸濁液または乾燥粉末製剤の吸入によるものである。１つの実施形態においては、癌を治療するための方法を提供し、ここで、それを要する対象にＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物の液体溶液もしくは懸濁液または乾燥粉末製剤の吸入によりＭＡＲＣＫＳ抑制性化合物を投与する。例えば、１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは、ＭＡＮＳ関連ペプチドの液体溶液もしくは懸濁液または乾燥粉末製剤の吸入により、それを要する対象に投与される。もう１つの実施形態においては、ＭＡＮＳ関連ペプチドは静脈内、腹腔内もしくは筋肉内注射により、または経口もしくは坐剤投与により投与される。
【００５３】
もう１つの態様においては、本発明は、癌細胞の転移の抑制または癌の治療を要する対象において、癌細胞の転移を抑制するための、または癌を治療するための方法を開示し、ここで、ＭＡＮＳ関連ペプチドを該ペプチドの液体製剤の注射により投与し、該液体製剤は等張性であり、該液体または懸濁製剤は緩衝化されており、該注射は対象への全身性注射である。もう１つの実施形態においては、該注射は腫瘍の領域内へのものである。もう１つの実施形態においては、該注射は腫瘍内へのものである。
【００５４】
もう１つの態様においては、本発明は、癌細胞の転移を抑制するための方法を開示し、ここで、該癌細胞は哺乳動物に存在する。１つの実施形態においては癌を治療するための方法を提供し、ここで、それを要する対象にＭＡＮＳ関連ペプチドを投与し、該対象は腫瘍を有する。本発明のペプチドは、癌細胞、例えば原発性腫瘍内の癌細胞への投与に有用な医薬組成物を得るための１以上の医薬上許容される賦形剤または製剤を使用して製剤化されうる。そのような組成物は、液体中、特に緩衝化溶液中の溶液または懸濁液としてのものであることが可能であり、ここで、注射または吸入による投与が有用である場合には、リン酸バッファーが有用である。等張性溶液または懸濁液は、好ましい実施形態である。
【００５５】
哺乳動物、例えばイヌ、ネコおよびヒト患者における本発明の抗体、ポリヌクレオチド、核酸分子またはペプチド組成物の投与は、哺乳動物における原発性腫瘍領域内への（例えば、原発性腫瘍内または原発性腫瘍の周縁部内または原発性腫瘍に血液供給する血管内への直接的な）注射により行われた場合に有効でありうると予想され、ここで、該注射は、一定間隔（例えば、１〜７２時間ごと）で、所望により１以上の他の又は追加的な化学療法薬と組合せて又はそれらとは別に行われる。
【００５６】
ＭＡＲＣＫＳ抑制性抗体、ポリヌクレオチド、核酸分子またはペプチド製剤に加えて、化学療法薬および癌特異的抗体を含む１以上の追加的治療剤が、該ペプチド投与の前、途中または後で投与されうる。典型的な化学療法薬には、限定的なものではないが、以下のものが含まれる：カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアナジン（ｔｈｉｏｇｕａｎａｄｉｎｅ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドクスルビシン（ｄｏｘｕｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、およびドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）。典型的な癌特異的物質および抗体には、限定的なものではないが、以下のものが含まれる：アファチニブ（Ａｆａｔｉｎｉｂ）、アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、ボスチニブ（Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ブレンツキシマブ・ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カーフィルゾミブ（Ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、ダブラフェニブ（Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イブルチニブ（Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａ��ｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）、ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）、シプロイセル（Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ）−Ｔ、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、テムシロリムス（Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、トクリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トファシチニブ（Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラメチニブ（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、ベムラフェニブ（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）、ビスモデギブ（Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）およびジブ−アフリベルセプト（Ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）。
【００５７】
投与は、例えば、癌を有する患者の気道内などへの液体または乾燥粉末エアゾールまたはスプレー（該スプレーは、癌細胞を含有する組織上にコーティングを形成しうる）としての吸入によるもの、あるいは癌細胞を含有する又は転移前に癌細胞に接触している流体または組織内への注射のための液体としてのものでありうる。穏やかな界面活性剤、例えばリン脂質の使用はＭＡＮＳ関連ペプチドの可溶化および膜貫通取り込みを補助すると想定される。投与は、例えば、癌細胞を含有する組織上への散布により適用可能な乾燥粉末、好ましくはナノ粒子または微粒子粉末によるものであってもよい。該ペプチドの製剤への微粒子炭水化物担体の添加は気道および上皮組織領域内へのナノ粒子ペプチドの吸入運搬を促進するであろう。
【００５８】
ＭＡＲＣＫＳ抑制性抗体、ポリヌクレオチド、核酸分子またはペプチド組成物の適用の好ましい方法は、転移前に癌細胞を含有する腫瘍またはその近傍の組織内への注射を含む。
【００５９】
本明細書中で用いる「有効量」または「治療的有効量」なる語は、所望の効果を達成するのに、すなわち、それを要する対象において癌細胞の転移および／もしくは増殖を抑制するのに、ならびに／または癌を抑制、治療もしくは予防するのに有効である、本発明の実施において使用される組成物の無毒性であるが十分な量を意味する。したがって、本方法により想定される活性は、適宜、医学的な治療的および／または予防的処置の両方を含み、これらは、例えば、癌の徴候、症状または原因の低減および／または改善を含む。本発明の化合物の治療的有効量は、典型的には、それが、生理的に許容される賦形剤組成物中で投与された場合に、有効な細胞内濃度および組織内局所濃度を達成するのに十分である量である。
【００６０】
本明細書における「癌」は、無制御な細胞増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を意味し又は示す。癌の例には、限定的なものではないが、以下のものが含まれる：癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、破骨細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、脊索腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫および白血病またはリンパ性悪性疾患。そのような癌のより詳細な例には、以下のものが含まれる：扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌、小細胞肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異型性疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫および他の癌腫、頭頸部癌、骨髄新生物、例えば急性骨髄性白血病、例えば成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄増殖性障害、例えば慢性骨髄性白血病、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵臓癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣または子宮頚癌、卵巣癌、原発性肝癌または子宮内膜癌、血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫）、血液新生物および腫瘍様状態、例えばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病）、リンパ球前駆細胞の腫瘍、例えばＢ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、胸腺腫、成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、例えば末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病、溶骨性骨癌および骨転移。
【実施例】
【００６１】
実施例１．癌細胞系の遊走に対するペプチドの効果
遊走アッセイのプロトコール
ヒト腺癌由来の侵襲的転移性細胞系であるＣＬ１−５細胞を、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地内で３７℃、９５％  酸素／５％  ＣＯ２において、使用準備が整うまで培養した。トランスウェルプレート（２４ウェル、８μｍ孔径；Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、該遊走アッセイを行うために使用した。該トランスウェルプレートの下部チャンバーを、１０％  ＦＢＳを含有する６００μｌの基礎培地で満たした。該細胞（１×１０５個）を５０または１００μＭの示されている試験ペプチドで３０分間にわたって前処理し、ついで、１％  ＢＳＡを含有する１００μｌの基礎培地に懸濁させ、上部チャンバーに加え、ついで該細胞を３７℃で１２時間インキュベートした。フィルターの上部表面の細胞を、綿棒を使用して除去し、フィルターの下部表面に遊走した細胞を洗浄し、固定し、ヘマトキシリンで染色し、顕微鏡下で計数した。フィルターの下部表面に遊走した細胞の数を計数することにより、遊走における変化率（％）を決定した。少なくとも３つの別々の顕微鏡視野を膜（ｎ＝４）ごとに計数した。
【００６２】
代替的トランスウェル法
初代ＣＬ１−５細胞はヒト腺癌肺癌に由来する。２４ウェル、８μ孔径を有するトランスウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、該遊走アッセイを行うために使用した。該トランスウェルプレートの下部チャンバーを、１０％  ＦＢＳを含有する６００μＬの基礎培地で満たした。該細胞（１〜２×１０５個）を、１％  ＢＳＡを含有する１００μＬの基礎培地に懸濁させた。所望の濃度の試験ペプチドを直接的に、または癌細胞とのプレインキュベーションの後、上部チャンバーに加えた。ついで該プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。フィルターの上部表面の細胞を、綿棒を使用して除去した。フィルターの下部表面に遊走した細胞を洗浄し、固定し、ヘマトキシリンで染色し、顕微鏡下で計数した。少なくとも５つの別々の顕微鏡視野を膜（ｎ＝３）ごとに計数した。フィルターの下部表面に遊走した細胞の数を計数することにより、遊走における変化率（％）を決定した。
【００６３】
数（計数、カウント）は、下部チャンバーに遊走した、４０倍の倍率の光学顕微鏡により計数された細胞の実際の数を意味し、各処理に関する１０個のランダムに選択された視野における細胞の平均数として示される。
【００６４】
「指数」は、ペプチドの存在下で遊走した細胞の数を、ランダムに遊走した細胞の数（対照群）で割り算することにより計算された。指数＝対照細胞数／処理細胞数。この計算は、ＭＡＮＳ関連ペプチドでの３０分間の前処理により細胞の遊走が阻止された度合を反映しうる。
【００６５】
図１は１２時間の遊走時間の後の陰性対照の細胞計数視野（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｆｉｅｌｄ）を示す。
【００６６】
図２Ａは、５０μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００６７】
図２Ｂは、１００μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００６８】
図３Ａは、５０μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００６９】
図３Ｂは、１００μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７０】
図４Ａは、５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１１００２（Ｎ−ミリストイル−配列番号１０６−ＮＨ２）での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７１】
図４Ｂは、１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１１００２での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７２】
図５Ａは、５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１０９０１（Ｎ−アセチル−配列番号１２１）での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７３】
図５Ｂは、１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−１０９０１での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７４】
図６Ａは、５０μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−９１２００（Ｎ−ミリストイル−配列番号２１９）での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７５】
図６Ｂは、１００μモル濃度のＭＡＮＳ関連ペプチドＢＩＯ−９１２００での前処理およびそれに続く１２時間の遊走時間の後で得られた細胞計数視野を示す。
【００７６】
図７Ａは、５０μモル濃度のＭＡＮＳペプチド、ＲＮＳペプチドならびにＭＡＮＳ関連試験ペプチドＢＩＯ−１１００２（配列番号６）、ＢＩＯ−１０９０１（配列番号１２１）およびＢＩＯ−９１２０（配列番号２１９）ならびに対照（無ペプチド）での前処理の１２時間後に得られた遊走細胞数を示す。ＭＡＮＳペプチドに関しては、細胞数は約４０であり、ＲＮＳペプチドに関しては、細胞数は約９５であり、ＢＩＯ−１１００２（配列番号１０６）に関しては、細胞数は約５０であり、ＢＩＯ−１０９０１（配列番号１２１）に関しては、細胞数は約６０であり、ＢＩＯ−９１２００（配列番号２１９）に関しては、細胞数は約６５であった。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−１０９０１およびＢＩＯ−９１２００のそれぞれは、対照およびＲＮＳランダム配列ペプチドと比較して有意に減少した、侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系（ＣＬ１−５）の遊走細胞数を示した。
【００７７】
図７Ｂは、１００μモル濃度のＭＡＮＳペプチド、ＲＮＳペプチドならびにＭＡＮＳ関連試験ペプチドＢＩＯ−１１００２（配列番号１０６）、ＢＩＯ−１０９０１（配列番号１２１）およびＢＩＯ−９１２００（配列番号２１９）ならびに対照（無ペプチド）での前処理の１２時間後に得られた遊走細胞数を示す。ＭＡＮＳペプチドに関しては、細胞数は約２０であり、ＲＮＳペプチドに関しては、細胞数は約９０であり、ＢＩＯ−１１００２（配列番号１０６）に関しては、細胞数は約２５であり、ＢＩＯ−１０９０１（配列番号１２１）に関しては、細胞数は約３５であり、ＢＩＯ−９１２００（配列番号２１９）に関しては、細胞数は約４０であり、対照（無ペプチド）に関しては、細胞数は約９０であった。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−１０９０１およびＢＩＯ−９１２００のそれぞれは、対照およびＲＮＳランダム配列ペプチドと比較して有意に減少した、侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系（ＣＬ１−５）の遊走細胞数を示した。
【００７８】
図８Ａは侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系細胞の遊走指数を示し、ここで、より高い値の遊走指数は、５０μモル濃度の本発明のペプチドまたはペプチド組成物での前処理およびそれに続く１２時間の処理（該プロトコルによるもの）の後の、より低い遊走を示す。以下に遊走指数値を示す：対照＝１；ＭＡＮＳペプチド＝約２．５；ＲＮＳペプチド＝約１．１；ＢＩＯ−１１００２＝約２．７；ＢＩＯ−１０９０１＝約１．７５；およびＢＩＯ−９１２００＝約１．７。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−１０９０１およびＢＩＯ−９１２００のそれぞれは、対照およびＲＮＳペプチドと比較して有意に増加した遊走指数を示した。
【００７９】
図８Ｂは侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系細胞の遊走指数を示し、ここで、より高い値の遊走指数は、１００μモル濃度の本発明のペプチドまたはペプチド組成物での前処理およびそれに続く１２時間の処理（該プロトコルによるもの）の後の、より低い遊走を示す。以下に遊走指数値を示す：対照＝１；ＭＡＮＳペプチド＝約４．３；ＲＮＳペプチド＝約１；ＢＩＯ−１１００２＝約３．８；ＢＩＯ−１０９０１＝約２．７；およびＢＩＯ−９１２００＝約２．４。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−１０９０１およびＢＩＯ−９１２００のそれぞれは、対照およびＲＮＳペプチドと比較して有意に増加した遊走指数を示した。
【００８０】
図９は、侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系（ＣＬ１−５）を使用した実験における５０μモル濃度のペプチドでの前処理の、並べられたそれぞれの細胞数および遊走指数の結果をグラフで示す。無ペプチド前処理の対照は約１０５の細胞数および遊走指数＝１．０を示している。５０μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間（該プロトコールに従う）の後の結果は約４５の細胞数および約２．５の遊走指数を示している。５０μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理の後の結果は約９０の細胞数および約１．３の遊走指数を示している。５０μモル濃度のＢＩＯ−１１０００での前処理の後の結果は約７０の細胞数および約１．５の遊走指数を示している。５０μモル濃度のＢＩＯ−１１００６での前処理の後の結果は約５０の細胞数および約２の遊走指数を示している。該結果は、より高い遊走指数値がより低い遊走に関連づけられ、より低い遊走がより高い遊走指数値に関連づけられることを示している。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１０００およびＢＩＯ−１１００６のそれぞれは、対照およびＲＮＳペプチドと比較して減少した遊走細胞数および増加した遊走指数を示した。
【００８１】
図１０は、侵襲性ヒトＮＳＣＬＣ細胞系（ＣＬ１−５）を使用した実験における１００μモル濃度のペプチドでの前処理の、並べられたそれぞれの細胞数および遊走指数の結果をグラフで示す。無ペプチド前処理の対照は約１０５の細胞数および遊走指数＝１．０を示している。１００μモル濃度のＭＡＮＳペプチドでの前処理およびそれに続く１２時間（該プロトコールに従う）の後の結果は約３５の細胞数および約３．５の遊走指数を示している。１００μモル濃度のＲＮＳペプチドでの前処理の後の結果は約９５の細胞数および約１．２の遊走指数を示している。１００μモル濃度のＢＩＯ−１１０００での前処理の後の結果は約５０の細胞数および約２．３の遊走指数を示している。１００μモル濃度のＢＩＯ−１１００６での前処理の後の結果は約５０の細胞数および約２．１の遊走指数を示している。１００μモル濃度のＢＩＯ−９１２００での前処理の後の結果は約５５の細胞数および約２．１の遊走指数を示している。該結果は、より高い遊走指数値がより低い細胞遊走に関連づけられ、より低い細胞遊走がより高い遊走指数値に関連づけられることを示している。ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１０００、ＢＩＯ−１１００６およびＢＩＯ−９１２００のそれぞれは、対照およびＲＮＳペプチドと比較して減少した遊走細胞数および増加した遊走指数を示した。
【００８２】
実施例２．同所性肺注射異種移植モデルを使用したＭＡＮＳペプチドまたはＢＩＯ−１１００６による肺癌転移の抑制
ＭＡＮＳペプチドまたはＢＩＯ−１１００６での処理の後のインビボにおける癌細胞の転移活性を同所性肺注射異種移植モデルにおいて評価した。ＰＢＳまたはＰＢＳ＋ＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００６（配列番号１０６）または対照ＲＮＳペプチド（１００μＭ）のいずれかでの４時間の前処理の後、ＰＣ−９細胞をヌードマウスの肺の左葉内に注射した。７日後、これらのマウスにＰＢＳのみ（対照）、ＲＮＡ（追加的対照ペプチド）、ＭＡＮＳまたはＢＩＯ−１１００６（腹腔内注射当たり５０ｎｍｏｌ）での全身処理を３日に１回行った。これらの腫瘍細胞の播種の後の第２５日（６回の注射）の時点で、マウスを犠死させ、対側肺および他の器官における転移腫瘍小結節の数を計数した。以下の表３に示されているとおり、ＭＡＮＳ、ＲＮＳまたはＢＩＯ−１１００６処理群は、ＰＢＳ処理群またはお互いと比較して注射部位における腫瘍の平均サイズにおいて相違を示さなかった。このことは、これらの処理が腫瘍形成に影響を及ぼさないことを示唆している。しかし、ＭＡＮＳおよびＢＩＯ−１１００６処理マウスにおいては、ＰＢＳまたはＲＮＳ処理群と比較して、転移小結節の有意な減少が対側肺および他の器官において認められた。実際、ＭＡＮＳまたはＢＩＯ−１１００６ペプチドでの処理は腫瘍から他の肺部位および他の器官への全転移を実質的に完全に阻止した。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
これらのインビボ結果は、ＭＡＮＳ関連ペプチドによるＭＡＲＣＫＳ機能の抑制がインビボでの肺癌細胞の転移の広がりを低減しうるという考えを支持している。
【００８５】
実施例３．癌Ａ５４９細胞系の遊走に対するペプチドの効果
ヒト腺癌由来の肺胞上皮細胞株Ａ５４９（浸潤性細胞系）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、７５ｃｍ２  組織培養フラスコ内で、１０％  ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＲＰＭＩ−１６４０内で培養した。該細胞は３７℃、９５％  空気および５％  ＣＯ２の雰囲気中の培養の第３日までにコンフルエンスに達し、連続継代により維持した。
【００８６】
試験ペプチド（ＭＡＮＳ、ＲＮＳ、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ−１１０００、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−９１２００およびＢＩＯ−１０９０１）を７．０のｐＨのＰＢＳに溶解した。約２時間の低速ボルテックス混合が溶解を助けた。
【００８７】
トランスウェルプレート（２４ウェル、８μＭ孔径；Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、該遊走アッセイを行うために使用した。該トランスウェルプレートの下部チャンバーを、１０％  ＦＢＳを含有する６００μｌの基礎培地で満たした。該細胞（１×１０５個）を、１％  ＢＳＡを含有する１００μｌの基礎培地に懸濁させ、上部チャンバーに加え、ついで該プレートをＰＢＳ（対照）、または１０、２５もしくは５０μＭの、示されているペプチドにおいて、３７℃、５％  ＣＯ２で１２時間インキュベートした。フィルターの上部表面の細胞を、綿棒を使用して除去した。フィルターの下部表面に遊走した細胞を洗浄し、固定し、ヘマトキシリンで染色し、顕微鏡下で計数した。フィルターの下部表面に遊走した細胞の数を計数することにより、遊走における変化率（％）を決定した。各濃度において合計３回の重複実験において、少なくとも４つの別々の顕微鏡視野を膜ごとに計数した。統計ソフトウェア「プリズム（Ｐｒｉｚｍ）」をデータ解析に使用した。
【００８８】
図１１に示されているとおり、該試験ペプチドのそれぞれでの処理は、対照（無ペプチド）またはＲＮＡペプチドと比較して、処理後に細胞数の減少をもたらした。５０μｍにおいては、ＭＡＮＳ関連ペプチドＭＡＮＳ、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ−１１０００、ＢＩＯ−１１００２、ＢＩＯ−９１２００およびＢＩＯ−１０９０１のそれぞれは、対照およびＲＮＳペプチドと比較して減少した遊走細胞数および増加した遊走指数を示した。より低い濃度においては、幾つかのＭＡＮＳ関連ペプチドの効果はＭＡＮＳペプチドとの比較においてさえも有意に異なっていた。特に、２５μｍにおいては、ＢＩＯ−１１００６、ＢＩＯ−１１００２またはＢＩＯ−９１２００での処理は、対照（無ペプチド）または対照ＲＮＳペプチドと比較して及びＭＡＮＳペプチドと比較して有意に減少した細胞数をもたらした（図１１）。
【００８９】
総合すると、該研究の結果は、ＭＡＮＳ関連ペプチドが侵襲性癌細胞系の遊走を阻止しうること、および幾つかの異なるＭＡＮＳ関連ペプチドが少なくとも３つの異なる癌細胞系の遊走に対する効果を示すことを示した。該研究の結果はまた、少なくとも２つの異なるＭＡＮＳ関連ペプチドが、哺乳動物（すなわち、マウス）内に注射された癌細胞の転移を阻止または抑制しうることを示した。
【００９０】
実施例４．肺癌移植におけるペプチドＢＩＯ−１１００６の効果
この研究においては、ＳＣＩＤマウスの同所性肺癌移植モデルにおけるペプチドＢＩＯ−１１００６による肺癌転移の抑制を評価した。ヒト腺癌細胞（ＰＣ−９）（１〜２×１０５個）を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する４０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁させ、２９ゲージ針を有するシリンジを使用してＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）の左肺内に注射した。ＢＩＯ−１１００６（ＰＢＳ中、１００μＭ）を、（ａ）癌細胞播種後の第３日の時点から開始する１日１回、２２日間のｉ．ｐ．注射（５０μＬ）により、または（ｂ）癌細胞播種後の第３日の時点から開始する、１日１回３０分間で２２日間にわたる、ネブライザー運搬系（Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）を使用するエアゾール吸入により投与した。該研究の結果を図１２に示す。図１２は、試験化合物の投与経路（ｉｐ注射対吸入）の関数としての右肺、心臓および横隔膜内の腫瘍の平均数をグラフで示す。ＢＩＯ−１１００６のｉ．ｐ．およびエアゾール投与の両方が、右肺および心臓においては５０％以上、そして横隔膜においては１００％、癌細胞転移を低減した。したがって、両方の投与経路が癌細胞転移に対する有意な抑制効果を示した。
【００９１】
実施例５．肺癌転移の抑制
この研究においては、ＢＩＯ−１１００６による肺癌転移の抑制をＳＣＩＤマウスにおける同所性肺癌移植モデルにおいて調べた。ヒト腺癌細胞（ＰＣ−９）（１〜２×１０５個）を、０．５ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する４０μＬのＰＢＳに懸濁させ、２９ゲージ針を使用してＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）の左肺内に注射した。癌細胞播種の４日後または１５日後から、１日１回３０分間、癌細胞播種後の２５日間にわたって、ネブライザー運搬系（Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）により、ＰＢＳ中の１００μＭ溶液を使用するエアゾールによりＢＩＯ−１１００６を投与した。実験の終了時に、マウスを犠死させ、肺、心臓および横隔膜組織を集め、各組織における腫瘍小結節の数を測定した。この実験の結果を図１３および１４にグラフで示す。図１３は、該処理（治療）を癌細胞の播種の４日後に開始した場合、腫瘍転移が左肺、心臓および横隔膜においては６０〜９０％、そして右肺においては１００％抑制されたことを示している。該処理を該細胞の播種の１５日後に開始した場合には、腫瘍転移の抑制は肺、心臓および横隔膜において約５０％であった。図１４は、ペプチド処理を癌細胞播種の１５日後または癌細胞播種の４日後に開始した場合に全組織において見出された腫瘍小結節の総数を示す。図１４において示されているとおり、癌細胞播種の１５日後に開始したペプチド処理は腫瘍小結節の減少をもたらし、播種の４日後に開始したペプチド処理は腫瘍小結節のより一層の減少をもたらした。
【００９２】
実施例６．ペプチドの抗転移効力
本実施例は、ヒト肺腺癌細胞を担持するＳＣＩＤマウスにおいて、本発明の試験化合物の抗転移効力を実証する。個別に換気された檻に収容された雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮＣｒＨｓｄ，ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各群８匹の６つの群にランダム化した。Ａ５４９細胞（２．５×１０６個）をマウスの尾部静脈に注射した。対照群にはエアゾール化ビヒクルＰＢＳを投与し、一方、群２および３には、癌細胞注射の１日前（群２）または癌細胞注射の３日後（群３）から隔日で７週間にわたって、ネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）によりエアゾル化試験化合物ＢＩＯ−１１００６を投与した。群４および５には、癌細胞系注射の１日前（群４）または細胞系注射の３日後（群５）から隔日で７週間にわたって、ネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ）によりエアゾール化試験化合物ＭＡＮＳペプチドを投与した。エアゾール運搬のために、各試験化合物（１００μＭ）の溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で調製した。各処理のために、５ｍＬの試験化合物溶液を、一度で４匹のマウスを含むチャンバー内に３０分にわたってエアゾール化した。体重に関して隔日で７週間にわたってマウスをモニタリングした。
【００９３】
マウスの１群（ｎ＝７）を正常対照として用いた。これらは、研究期間中にマウスの健康状態をモニタリングするために使用した未処理ナイーブマウスであった。全群からの全動物を第５３日に犠死させた。結果を表４および図１５に示す。図１５はＡ５４９細胞注射後の第５３日におけるＢＩＯ−１１００６およびＭＡＮＳペプチドのそれぞれの投与の後の肺における転移性小結節の数を比較している。表４は肺における転移性小結節の数、ならびに限局性腫瘍小結節および／または遠隔転移を有する動物の数を示す。全体的に、該試験ペプチドは、Ａ５４９細胞注射を基準とした場合の第−１日または第＋３日からＢＩＯ−１１００６またはＭＡＮＳペプチドを投与した動物においては、腫瘍転移の実質的な抑制（７０〜８０％）を示した（図１５）。更に、処理マウスにおける転移性小結節の数は、ビヒクル対照被投与マウスと比較して有意に減少し、処理マウスはいずれも遠隔転移の証拠を示さなかった（表４）。Ａ５４９細胞注射を基準とした場合の第−１日または第＋３日からＢＩＯ−１１００６ペプチドで処理された８匹中７匹のマウスにおいては、限局性腫瘍小結節はほとんど存在しなかった。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
実施例７．マウス黒色腫におけるＭＡＮＳ関連ペプチドの抗転移活性
本研究においては、４つの異なる経路により投与されたＭＡＮＳ関連ペプチドの相対的抗転移活性を、同系マウスモデルを使用して判定する。ＤＭＥＭ培地中の２００μｌの細胞懸濁液中のマウス黒色腫細胞系Ｂ１６Ｆ１０の２×１０６個の細胞を耳の背側の皮膚と軟骨との間または足蹠内に、あるいは静脈内、筋肉内または腹腔内注射により注射する。
【００９６】
細胞播種の２日後、動物をランダム化し、各群ｎ＝１０からなる群に分ける。異なる群の動物にＭＡＮＳ関連ペプチドを約６．２５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）または筋肉内（ｉｍ）経路により投与する。幾つかの群においては、前臨床ネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｌａｂ；Ａｅｒｏｇｅｎ）を使用して吸入経路（ＰＢＳ中の０．１ｍＭ  ＭＡＮＳ関連ペプチド５ｍｌ）により動物を処理する。１群のマウスをビヒクル対照として用い、ｉｍ経路によりＰＢＳで処理する。ペプチドを隔日で６週間投与する。
【００９７】
腫瘍評価を毎週行う。６週間の処理の後、全動物を人道的に犠死させ、リンパ節および他の組織サンプルを集め、ホルマリン中で固定し、組織病理検査に付して、転移性黒色腫細胞の存在を評価する。６週間の投与期間中に臨床的毒性徴候および症状を評価する。研究期間の終了時に腫瘍量および死亡率を評価する。該研究の結果は、ＭＡＮＳ関連ペプチドがマウス黒色腫モデルにおいて腫瘍転移を抑制することを示すであろう。
【００９８】
実施例８：癌細胞におけるＭＡＲＣＫＳのｓｉＲＮＡノックダウン
本研究は、癌細胞の遊走に対するＭＡＲＣＫＳ発現のｓｉＲＮＡノックダウンの効果を判定するために行った。ＰＣ−９またはＡ−５４９ヒト肺癌細胞をプラスチックウェル内に播き、細胞が７０％コンフルエンスに達するまで培養した。ついで、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  ＤｕｏＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を使用することにより、１００ｎＭのＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）（Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））で細胞をトランスフェクトした。７２時間後、細胞を集め、ＭＡＲＣＫＳ特異的抗体を使用する免疫ブロット分析のためにＳＤＳ／ＰＡＧＥにより同等量のタンパク質を分離した。内因性ＭＡＲＣＫＳのｓｉＲＮＡ誘導性ダウンレギュレーションを証明するために、ウエスタンブロット分析を行った。図１６および１７に示されているとおり、ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較して、ＰＣ９細胞においては約６０％（図１６）、そしてＡ５４９細胞において約５０％（図１７）、ノックダウンされた。
【００９９】
細胞遊走に対するｓｉＲＮＡによるＭＡＲＣＫＳノックダウンの効果を、トランスウェルアッセイを用いて判定した。ｓｉＲＮＡノックダウン後、ＰＣ−９またはＡ５４９細胞を、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地内で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスウェル（Ｒ）プレート（２４ウェル、８μｍ孔径）を該遊走アッセイに使用した。下部チャンバーは６００μｌの基礎培地＋１０％  ＦＢＳを含有していた。細胞（１×１０５個）を１００μｌの基礎培地＋１％  ＢＳＡに懸濁させ、上部チャンバーに加えた。プレートを１２時間インキュベートした。フィルターの下部表面に遊走した細胞をヘマトキシリンで染色し、計数した。少なくとも３つの別々の顕微鏡視野を膜ごとに計数した。
【０１００】
該研究の結果を図１８および図１９に示す。ＭＡＲＣＫＳ  ｓｉＲＮＡでの処理はＰＣ−９およびＡ５４９細胞の両方の遊走を抑制した。ＭＡＲＣＫＳのｓｉＲＮＡノックダウンはＰＣ９細胞系に関する細胞遊走における９０％の低減をもたらし（図１８）、Ａ５４９細胞系に関する細胞遊走における約５０％の低減をもたらした（図１９）。したがって、ＭＡＲＣＫＳ発現の抑制は癌細胞遊走の有意な低減をもたらす。
【０１０１】
実施例９．マイクロＲＮＡ２１抑制はＭＡＲＣＫＳを増加させ、癌細胞遊走を増強する
マイクロＮＡ２１（ｍｉＲＮＡ）は細胞内のＭＡＲＣＫＳのレベルを調節する。これらの研究においては、ＰＣ９ヒト肺癌細胞を５０ｎＭまたは１００ｎＭのｍｉＲ２１インヒビターまたはｍｉｒ２１模倣体あるいはビヒクルのみの陰性対照でトランスフェクトした。４８時間後にウエスタンブロットによりＭＡＲＣＫＳのレベルを測定した。ｍｉＲ２１インヒビター（５０ｎＭ）での処理は該細胞におけるＭＡＲＣＫＳのレベルを〜２．５倍増加させた（図２０）。これらの値は、１２時間にわたって遊走チャンバー内に配置された細胞の遊走能と相関した。５０または１００ｎＭのｍｉＲ２１インヒビターで処理された細胞は遊走の増強を示し、これはＭＡＲＣＫＳのレベルの増加と相関し、一方、ｍｉＲ２１模倣体で処理された細胞は遊走の低減を示し、これはＭＡＲＣＫＳのレベルの低下と相関した（図２１）。ＨｉＰｅｒｆｅｃｔビヒクル対照で処理された細胞は未処理ＰＣ９細胞と同レベルの遊走を示した（図２１）。該研究の結果は、ｍｉＲ２１抑制によるＭＡＲＣＫＳ発現の増強が癌細胞遊走を増強することを示した。更に、ｍｉＲ２１の活性化はＰＣ９細胞の遊走の低減をもたらした。
【０１０２】
総合すると、これらの研究は、癌細胞遊走および癌細胞の転移が、ＭＡＮＳ関連ペプチドおよび抑制性マイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲ２１模倣体）を含むＭＡＲＣＫＳ抑制の幾つかの異なる手段を用いてＭＡＲＣＫＳを標的化することにより、抑制されうることを示した。
【０１０３】
特に示されていない限り、本明細書における全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用されうるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書中で引用されている全ての刊行物を、該刊行物が引用されている本発明の特定の態様を開示および記載する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１０４】
本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、それは更なる修飾が可能であり、本出願は、本発明が属する技術分野における公知の又は一般的な慣例に含まれ前記の本質的特徴に適用可能であり添付の特許請求の範囲に従う本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明の任意の変更、用途または適合化を包含すると意図されると理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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