(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材に、電子線を照射する放射線グラフト重合法によりラジカル重合性化合物をグラフト重合してグラフト化基材を得る工程と、前記グラフト化基材を、溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液に浸漬してグラフト化基材に糖化合物を付与した後、前記基材の両面にフィルムをラミネートし、加熱をし、グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合する工程と、を含む糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項２】
前記溶媒が第三級アミンを含有することを特徴とする請求項１に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項３】
前記溶媒が非プロトン性極性溶媒を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項４】
前記溶媒中における糖化合物と第三級アミンのｍｏｌ／Ｌの比〔糖化合物（ｍｏｌ／Ｌ）／第三級アミン（ｍｏｌ／Ｌ）〕が、０．１以上、１．５以下である請求項２又は３に
記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項５】
前記溶媒中において糖化合物を０．０１０ｍｏｌ／Ｌ以上、５．０００ｍｏｌ／Ｌ以下含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項６】
前記溶媒中において第三級アミンを０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上、７．５００ｍｏｌ／Ｌ以下含有する請求項２〜５のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項７】
前記第三級アミンがＮ−メチルモルホリンである請求項２〜６のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項８】
前記非プロトン性極性溶媒が、アセトニトリル、アセトン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホリックトリアミドからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項３〜７のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項９】
前記ラジカル重合性化合物を少なくとも２種類用いてグラフト重合してなる請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１０】
前記ラジカル重合性化合物が、アクリル系モノマーである請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１１】
前記アクリル系モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジルからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１０に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１２】
前記糖化合物を少なくとも２種類用いて化学結合してなる請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１３】
前記糖化合物が、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１４】
前記糖化合物が、アミノ糖である請求項１３に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１５】
前記アミノ糖が、グルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１４に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１６】
前記高分子素材が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、レーヨン、ポリビニルアルコール及びセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法により得られた糖修飾高分子素材を、導入口と導出口を有する容器に充填する工程、を含む細胞分離フィルターの製造方法。
【請求項１８】
高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材にラジカル重合性化合物をグラフト重合したグラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物が直接化学結合され、前記グラフト鎖がラジカル重合性化合物のみからなり、前記ラジカル重合性化合物が、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジルからなる群から選ばれる少なくとも１種のアクリル系モノマーであり、前記糖化合物が、単糖、二糖及びオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種である糖修飾高分子素材。
【請求項１９】
前記グラフト鎖が少なくとも２種類のラジカル重合性化合物の共重合体からなる請求項１８に記載の糖修飾高分子素材
【請求項２０】
前記グラフト鎖に少なくとも２種類の糖化合物が化学結合された請求項１８又は１９に記載の糖修飾高分子素材。
【請求項２１】
前記糖化合物が、アミノ糖である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材。
【請求項２２】
前記アミノ糖が、グルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２１に記載の糖修飾高分子素材。
【請求項２３】
前記高分子素材が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、レーヨン、ポリビニルアルコール及びセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材からなる細胞分離材。
【請求項２５】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の糖修飾高分子素材を、導入口と導出口を有する容器に充填してなる細胞分離フィルター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子素材からなる基材に糖化合物が固定されて、親水性、湿潤性、吸着性等の機能が付与され、例えば、細胞分離基材、細胞培養基材等に用いられる糖修飾高分子素材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖が多様な生命現象（細胞認識や情報伝達、細胞接着、分化・増殖、ガン化、ウイルス感染、血液凝固、免疫反応など）に深く関わっていることが明らかになり、糖鎖を組み込んだ機能性材料や医薬品の開発研究が活発に行われている。
【０００３】
目的の生理機能を発現する糖鎖含有機能性材料を開発するために、糖鎖分子を高分子に導入する技術が求められている。このような背景のもと、種々の糖鎖含有高分子が報告されてきた。
【０００４】
例えば、単糖、二糖、オリゴ糖などの糖鎖を組み込んだ高分子としては、
１.  ポリビニルアルコール型（特許文献１）
２.  ポリアクリレート型（特許文献２）
３.  ポリスチレン型（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７）
４.  ポリエーテル型（特許文献８）
５.  ポリエチレンイミン型（特許文献９、特許文献１０）
６.  ポリアミノ酸型（特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５）
７.  ポリウレタン型（特許文献１６）などが知られている。
【０００５】
また、糖鎖分子を直接、汎用高分子支持体に導入する方法としては高分子支持体の表面をグラフト重合で改質する方法があり、例えば電子線照射法を用いたグラフト重合を利用して高分子基材に糖類を固定した高分子素材が知られている（特許文献１７〜２０参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−２３８１０５号公報
【特許文献２】特開昭６３−６８６０３号公報
【特許文献３】特開平７−３０４７８８号公報
【特許文献４】特開平８−２５３４９５号公報
【特許文献５】特開平８−３１９３１７号公報
【特許文献６】特開２００２−８８０９４号公報
【特許文献７】特開２００５−１１２９８７号公報
【特許文献８】特開平５−１４０２９４号公報
【特許文献９】特開平５−１４０２１３号公報
【特許文献１０】特開２００２−３０２５１１号公報
【特許文献１１】特開平５−１７８９８６号公報
【特許文献１２】特開平８−３３７５６６号公報
【特許文献１３】特開平９−２２７６００号公報
【特許文献１４】特開平１１−６０６０３号公報
【特許文献１５】特開２００３−７３３９７号公報
【特許文献１６】特開平１１−７１３９１号公報
【特許文献１７】特開２０１１−２２４３５０号公報
【特許文献１８】特開２０１１−２４５２６７号公報
【特許文献１９】特開２００８−２５５３４８号公報
【特許文献２０】特開平５−３１０８６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１〜１６に開示されている種々の糖鎖含有高分子を細胞分離基材、細胞培養基材として使用する場合は、糖鎖含有高分子からフィルム等を形成する、もしくは糖鎖含有高分子を高分子支持体にコーティングする必要がある。しかしながら、フィルム等を形成する場合は、一旦、糖鎖含有高分子を作る必要があるため、製造コストが高くなる問題点があり、高分子支持体にコーティングした場合は糖鎖含有高分子が支持体から溶出する恐れがある。これらの課題を解決するためには、糖鎖分子を直接、汎用高分子支持体に導入する技術が求められている。そこで、特許文献１８〜２１には糖鎖分子を直接、汎用高分子支持体に導入する方法が開示されている。これらの文献では、電子線照射によって表面に活性種（ポリマーラジカル）を発生させた高分子基材に、前記活性種（ポリマーラジカル）と反応可能なエチレン性不飽和結合と糖鎖とを有する重合性化合物（糖鎖を有する重合性化合物）を接触させ、一段階で反応させているが、反応収率が非常に低い。即ち、高分子基材と重合性化合物との反応は、固相である高分子基材と、液相である重合性化合物溶液との固相−液相反応であることに加え、糖鎖を有する重合性化合物の分子量が大きいことから、グラフト重合反応が促進され難いという問題を有する。
【０００８】
本発明は、上記のような表面を改質された高分子素材における問題に鑑み、細胞分離基材や細胞培養基材などとして有用な、糖化合物が固定された高分子素材を、反応収率よく、且つ簡便な方法で提供せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高分子素材からなる基材にラジカル重合性化合物を電子線照射法によりグラフト重合してグラフト化基材とし、該グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合させることにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）高分子素材からなるシャーレ状、シート状または繊維状の基材に、電子線を照射する放射線グラフト重合法によりラジカル重合性化合物をグラフト重合してグラフト化基材を得る工程と、前記グラフト化基材を、溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液に浸漬してグラフト化基材に糖化合物を付与した後、グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合する工程と、を含む糖修飾高分子素材の製造方法。
（２）前記糖化合物反応液に浸漬してグラフト化基材に糖化合物を付与した後に、前記基材の両面にフィルムをラミネートし、加熱をする（１）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（３）前記溶媒が第三級アミンを含有することを特徴とする（１）又は（２）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（４）前記溶媒が非プロトン性極性溶媒を含有することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（５）前記溶媒中における糖化合物と第三級アミンのｍｏｌ／Ｌの比〔糖化合物（ｍｏｌ／Ｌ）／第三級アミン（ｍｏｌ／Ｌ）〕が、０．１以上、１．５以下である（３）又は（４）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（６）前記溶媒中において糖化合物を０．０１０ｍｏｌ／Ｌ以上、５．０００ｍｏｌ／Ｌ以下含有する（１）〜（５）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（７）前記溶媒中において第三級アミンを０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上、７．５００ｍｏｌ／Ｌ以下含有する（３）〜（６）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（８）前記第三級アミンがＮ−メチルモルホリンである（３）〜（７）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（９）前記非プロトン性極性溶媒が、アセトニトリル、アセトン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホリックトリアミドからなる群より選ばれる少なくとも１種である（４）〜（８）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１０）前記ラジカル重合性化合物を少なくとも２種類用いてグラフト重合してなる（１）〜（９）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１１）前記ラジカル重合性化合物が、アクリル系モノマーである（１）〜（１０）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１２）前記アクリル系モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジルからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１１）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１３）前記糖化合物を少なくとも２種類用いて化学結合してなる（１）〜（１２）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１４）前記糖化合物が、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも１種である（１）〜（１３）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１５）前記糖化合物が、アミノ糖である（１４）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１６）前記アミノ糖が、グルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１５）に記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１７）前記高分子素材が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、レーヨン、ポリビニルアルコール及びセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１）〜（１６）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材の製造方法。
（１８）前記（１）〜（１７）のいずれかの製造方法により得られた糖修飾高分子素材を、導入口と導出口を有する容器に充填する工程、を含む糖修飾細胞分離フィルターの製造方法。
（１９）高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材にラジカル重合性化合物をグラフト重合したグラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物が化学結合された糖修飾高分子素材。
（２０）前記グラフト鎖がラジカル重合性化合物のみからなることを特徴とする（１９）に記載の糖修飾高分子素材。
（２１）前記グラフト鎖が少なくとも２種類のラジカル重合性化合物の共重合体からなる（１９）又は（２０）に記載の糖修飾高分子素材
（２２）前記ラジカル重合性化合物が、アクリル系モノマーである（１９）〜（２１）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材。
（２３）前記アクリル系モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジルからなる群から選ばれる少なくとも１種である（２２）に記載の糖修飾高分子素材。
（２４）前記グラフト鎖に少なくとも２種類の糖化合物が化学結合された（１９）〜（２３）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材。
（２５）前記糖化合物が、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも１種である（１９）〜（２４）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材。
（２６）前記糖化合物が、アミノ糖である（２５）に記載の糖修飾高分子素材。
（２７）前記アミノ糖が、グルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である（２６）に記載の糖修飾高分子素材。
（２８）前記高分子素材が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、レーヨン、ポリビニルアルコール及びセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１９）〜（２７）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材。
（２９）前記（１９）〜（２８）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材からなる細胞分離材。
（３０）前記（１９）〜（２８）のいずれかに記載の糖修飾高分子素材を、導入口と導出口を有する容器に充填してなる細胞分離フィルター。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高分子素材からなる基材に電子線照射法によりラジカル重合性化合物をグラフト重合して得たグラフト化基材に、糖化合物を付与して反応させることで、糖化合物が固定された高分子素材を、反応収率よく且つ簡便な方法で提供することができる。本発明の糖修飾高分子素材は、結合した糖化合物の種類に応じて付与される親水性、湿潤性、吸着性などの各種機能により、細胞分離材、細胞培養材、その他の用途に好適に使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明は以下に記載した実施の形態によって何ら限定されるものではない。
【００１３】
本発明に係る糖修飾高分子素材の製造方法は、高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材に、電子線を照射する放射線グラフト重合法によりラジカル重合性化合物をグラフト重合してグラフト化基材を得る工程と、前記グラフト化基材を、溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液に浸漬してグラフト化基材に糖化合物を付与した後、グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合する工程とを含む。これにより、高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材にラジカル重合性化合物をグラフト重合したグラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物が化学結合された、本発明の糖修飾高分子素材が得られる。
【００１４】
＜グラフト化基材を得る工程＞
本発明では、まず高分子素材からなるシャーレ状、シート状又は繊維状の基材に、電子線を照射する放射線グラフト重合法によりラジカル重合性化合物をグラフト重合してグラフト化基材を得る。
【００１５】
前記の電子線を照射する放射線グラフト重合法には、予め基材に電子線を照射して活性種を発生させた後、該発生種が発生した基材にラジカル重合性化合物を付与し、その後の後重合によりグラフト重合性化合物の重合を促進させる、いわゆる前照射法と、基材にラジカル重合性化合物を付与した後、これに電子線を照射して活性種を発生させ、その後の後重合によりグラフト重合化合物の重合を促進させる、いわゆる同時照射法とがある。本発明では、前記前照射法と同時照射法のいずれも採用することができる。
【００１６】
前記前照射法によるグラフト化基材の製造は、例えば特開２００５−６０５５５号公報に記載された方法を採用できる。また、前記同時照射法によるグラフト化基材の製造は、例えば特開２００１−１６４４６７号公報に記載された方法を採用できる。
【００１７】
前記前照射法及び同時照射法のいずれの場合にも、基材へラジカル重合性化合物を付与した後、後重合が終了するまでの間は、基材の表面にフィルムをラミネートしておくことが好ましい。これにより、ラジカル重合性化合物の揮散を防ぐことができ、均一にグラフト重合が開始され、かつ空気を遮断することで空気中の酸素によるラジカルの失活が抑制される。また、同時照射法の場合には、電子線照射時にも基材表面がフィルムによりシールされていて、基材とラジカル重合性化合物は空気中の酸素と遮断されるため、空気中の酸素による基材の酸化が起こりにくくなる。
【００１８】
前記フィルムとしては、０．０１〜０．２ｍｍの厚みを有する高分子フィルムであって、使用する電子線の透過力に応じて、適宜の厚さのものを使用すればよい。その材質はポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系やポリオレフィン系などが挙げられるが、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。特に、同時照射法の場合には、電子線照射でポリマーラジカルの生成効率が低く、また酸素透過性の低いポリエチレンテレフタレートフィルムが好適である。
【００１９】
前記前照射法においては、先ず、高分子素材からなる基材に電子線を照射することにより、ラジカル重合を誘発する活性種（ポリマーラジカル）が生成する。電子線照射時の雰囲気温度は、低い温度の方がポリマーラジカルの生成効率が上がるが、通常の室温でもよい。
【００２０】
前照射法の場合の電子線の照射条件は、好ましくは照射雰囲気の酸素濃度を３００ｐｐｍ以下に設定した状態で、加速電圧１００〜２０００キロボルト（以下「ｋＶ」と略記する。）、好ましくは１２０〜３００ｋＶ及び電流１〜１００ｍＡの範囲において、基材の厚みや高分子素材の種類、目標グラフト率などに応じて適宜決定する。
【００２１】
また、電子線の照射線量は、目標グラフト率及び照射による基材の物性低下を考慮して適宜決定すればよく、通常１０〜３００キログレイ（以下「ｋＧｙ」と略記する。）程度が適当であり、好ましくは５０〜２００ｋＧｙである。照射線量が１０ｋＧｙ未満では充分なグラフト重合量に必要な活性種の生成が起こらず、３００ｋＧｙを越えると、基材が放射線耐性のある高分子素材からなる場合においても主鎖の切断による物性低下が起こるので好ましくない。
【００２２】
なお、前照射法の場合の照射雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、空気雰囲気でもよい。ただし、空気雰囲気では空気中の酸素により、基材が酸化される可能性がある。
【００２３】
次いで、前記電子線照射後の基材に、ラジカル重合性化合物を付与する。例えば、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記ラジカル重合性化合物溶液の槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、基材にラジカル重合性化合物を十分付与する。
【００２４】
なお、本発明における「浸漬」とは、基材がラジカル重合性化合物溶液に接触することを意味する。よって、基材にラジカル重合性化合物を付与する方法としては、様々なコーティング方法を用いることができる。その中でも含浸コート、コンマダイレクトコート、コンマリバースコート、キスコート、グラビアコート等は効率良くコーティングできるため、好ましい。
【００２５】
ラジカル重合性化合物を付与した基材を、前記溶液槽から取り出す。その際、基材の表面にフィルムをラミネートすることが好ましい。例えば、基材がシート状又は繊維状の場合には、２枚のフィルムの間に、ラジカル重合性化合物溶液を付与した基材を挟み、密着させる。ラジカル重合性化合物溶液を付与した基材にフィルムを密着させることで、ラジカル重合性化合物溶液の付与率を一定に制御でき、かつ基材に対してラジカル重合性化合物を均一に付与できる。また、フィルムをラミネートして密閉された空間内で、基材とラジカル重合性化合物とを反応させることで、グラフト反応がより促進される。なお、本発明における「ラミネート」とは、基材とフィルムを接触させることを意味する。
【００２６】
前記溶液槽から取り出した基材を、所定温度の後重合槽に所定の時間滞留させることで、ラジカル重合性化合物のグラフト重合を促進させる（後重合）。このときの後重合温度は、０℃〜１３０℃、より好ましくは４０℃〜７０℃である。これにより、基材とラジカル重合性化合物のグラフト重合反応が促進される。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化基材を得ることができる。なお、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
【００２７】
また、前記同時照射法の場合は、窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去されたラジカル重合性化合物溶液の槽に浸漬する、又は前記槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、基材にラジカル重合性化合物を十分に付与する。その後、前記溶液槽から取り出し、電子線を照射する。溶液槽から取り出す際、基材の表面にフィルムをラミネートし、この状態で、電子線を照射することが好ましい。
【００２８】
同時照射法の場合の加速電圧は、高分子素材の種類、ラジカル重合性化合物溶液を付与した基材及びラミネートしたフィルムの合計厚さ、目標グラフト率に応じて適宜決定すればよいが、通常、加速電圧１００〜２０００ｋＶ程度が適当である。また、電子線の照射線量は前記前処理法の場合と同様でよい。電子線照射時の雰囲気は、窒素やヘリウムなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、基材の表面にフィルムをラミネートした場合には、照射雰囲気によるグラフト重合への影響はないので、経済性を考慮して、空気中照射が適当である。
【００２９】
電子線照射された基材は、前記前照射法の場合と同様にして、ラジカル重合性化合物の後重合を行う。その後、洗浄・乾燥することで、グラフト化基材を得ることができる。なお、同時照射法においても、後重合雰囲気は、窒素ガスなど不活性ガス雰囲気が好ましいが、フィルムをラミネートした状態で後重合を行う場合には空気雰囲気でもよい。
【００３０】
本発明に用いる高分子素材には特に限定はなく、電子線照射によりラジカル反応の活性種（ポリマーラジカル）が生成するものであればよい。高分子素材としては、例えば、ポリエチレン若しくはポリプロピレン等のポリオレフィン類、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル類、ナイロン等のポリアミド類、レーヨン、ポリビニルアルコール、又はセルロース等が挙げられる。
【００３１】
また、本発明の糖修飾高分子素材を白血球除去フィルター材に使用する場合は、基材としての高分子素材は、血球にダメージを与えにくいものであれば特に制限はなく、具体例としては、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリアルキルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリクロロプレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリブタジエン、ブタジエン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、セルロースジアセテート、エチルセルロース等が挙げられる。
【００３２】
前記高分子素材からなる基材の形態は特に限定されないが、例えば、シャーレ状、シート状、繊維状が挙げられる。基材が繊維状の場合、編織布、不織布等のいずれでもよい。本発明の糖修飾高分子素材を、細胞分離材、例えばフィルター材等に使用する場合は、織布や不織布が好ましく、より好ましくは不織布である。ここで不織布とは、編織によらずに繊維又は繊維の集合体が、化学的、熱的、又は機械的に結合された布状のものをいう。繊維と繊維とが互いに接触することによる摩擦により、又は互いにもつれ合うことなどにより、一定の形状を保っている場合、機械的に結合されたものとする。
【００３３】
基材が繊維状の場合、平均繊維直径が小さいほど、グラフト率が向上する。なお、前記「平均繊維直径」とは、繊維素材の一部をサンプリングし、走査電子顕微鏡写真を撮り、無作為に選択した１００本以上の繊維の直径を測定し、それらを数平均して得られた値である。また、本発明で前記「グラフト率」とは、グラフト反応前の基材乾燥重量（Ｗ１）とグラフト反応後のグラフト化基材乾燥重量（Ｗ２）から以下のように算出した値である。
グラフト率＝〔（Ｗ２−Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
【００３４】
本発明の糖修飾高分子素材をフィルター材などの細胞分離材として用いる場合は、平均繊維直径が１．０〜２０μｍであることが好ましい。１．０μｍ未満のものは、安定して不織布を製造することが難しく、細胞含有液の粘性抵抗も高くなりすぎる傾向がある。一方、２０μｍを超えると細胞除去能力が低くなる傾向がある。
【００３５】
また、本発明で使用されるラジカル重合性化合物は、電子線照射により基材に生成したポリマーラジカル（活性種）と結合を生じる化合物である。具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、メタクリルスルホン酸、スチレンスルホン酸などの酸性基を有する不飽和化合物やこれらのエステル、アクリルアミド、メタクリルアミドなどの不飽和カルボン酸アミド、末端にグリシジル基や水酸基を有する不飽和化合物、ビニルホスホネート等の不飽和有機燐酸エステル、第４アンモニウム塩、第３アンモニウム塩などの塩基性を有するメタクリル酸エステル、フルオロアクリレート、アクリロニトリルなどを挙げることができるが、これらに限られるものではない。これらは単独又は２種以上混合して用いることができる。２種類以上のラジカル重合性化合物を用いることで、グラフト鎖が少なくとも２種類以上のラジカル重合性化合物の共重合体からなる複合グラフト化基材が得られる。
【００３６】
これらラジカル重合性化合物の中でも、本発明においては、グラフト率の観点からアクリル系モノマーを用いることが好ましい。更に、糖化合物との反応性の観点から、分子末端にカルボキシ基やエポキシ基を有するアクリル系モノマーが好ましく、より好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸及びメタクリル酸グリシジルからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
【００３７】
ラジカル重合性化合物が、アクリル酸やメタクリル酸など分子末端にカルボキシ基を有するアクリル系モノマーや、メタクリル酸グリシジルなど分子末端にエポキシ基を有するアクリル系モノマーは、該モノマー分子の一端にあるエチレン性不飽和基により、高分子素材からなる基材へのグラフト重合が良好に行われるとともに、後述する糖化合物との結合反応において、該モノマー分子の他末端にあるカルボキシ基やエポキシ基と、糖化合物のヒドロキシ基やアミノ糖のアミノ基とが良好に反応し、反応収率に優れる。
【００３８】
上記のラジカル重合性化合物は、水、低級アルコールのような有機溶剤又はこれらの混合溶液を溶媒とした希釈溶液であってもよい。この希釈溶液のラジカル重合性化合物の濃度は希望するグラフト率により変化するが、１〜７０容量％で調製することができる。また、ホモポリマーの生成しやすいラジカル重合性化合物を用いる場合は、ラジカル重合性化合物の希釈溶液に、銅や鉄の金属塩を添加することで、ホモポリマーの生成を抑制してもよい。前記溶液中のラジカル重合性化合物の濃度の下限値としては、１重量％以上が好ましく、２．５重量％以上がより好ましく、５重量％以上がさらに好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。また、ラジカル重合性化合物の濃度の上限値としては、７０重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましく、５０重量％以下がさらに好ましく、４０重量％以下が特に好ましい。
【００３９】
また、前記ラジカル重合性化合物溶液が溶剤を含むと、グラフト率が向上する。この場合において、溶媒中における乳化剤の濃度は０．１〜５重量％の範囲となるように調整することが好ましい。乳化剤としては、例えばポリソルベートが好ましく、ポリソルベートとしては、ポリソルベート２０、６０、６５、８０等が挙げられるが、これらの中でも親水性が高いポリソルベート２０がより好ましい。
【００４０】
なお、ラジカル重合性化合物溶液はあらかじめ、窒素ガスなど不活性ガスを吹き込むことで、溶存酸素を除去することが望ましい。
【００４１】
＜グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合する工程＞
前記のようにして得られたグラフト化基材を、溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液に浸漬してグラフト化基材に糖化合物を付与した後、グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合することで、本発明の糖修飾高分子素材を得ることができる。
【００４２】
このように、本発明では、まず高分子素材からなる基材にラジカル重合性化合物をグラフト重合してグラフト化基材を得、次いで、得られたグラフト化基材に対して糖化合物を、固相（グラフト化基材）−液相（糖化合物反応液）反応で直接反応させるため、糖鎖を有するラジカル重合性化合物を直接高分子素材からなる基材と反応させる場合に較べて、糖化合物の反応収率が高くなる。また、得られる糖修飾高分子素材のグラフト鎖（主鎖）は、ラジカル重合性化合物のみからなっている。
【００４３】
なお、本発明で前記「反応収率」とは、糖化合物反応液との反応前のグラフト化基材乾燥重量（Ｗ３）、反応後の糖修飾高分子素材乾燥重量（Ｗ４）、及びグラフト鎖の官能基と反応する想定最大糖化合物重量（Ｗ５）から、以下のように算出した値である。
反応収率（％）＝〔（Ｗ４−Ｗ３）／Ｗ５〕×１００
【００４４】
前記「グラフト鎖の官能基と反応する想定最大糖化合物重量（Ｗ５）」は、グラフト化基材のグラフト率から、反応したラジカル重合性化合物量を算出し、前記ラジカル重合性化合物と反応する糖化合物量を算出することで求めることができる。
【００４５】
グラフト化基材へ糖化合物を付与する方法としては、例えば、溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液の槽に浸漬する、又は前記溶媒に糖化合物を溶解した糖化合物反応液の槽を浸漬通過させることにより所定時間滞留させて、グラフト化基材に糖化合物を付与する。次いで、前記溶液槽から取り出した後、所定の温度、時間で反応を促進させ、グラフト化基材のグラフト鎖に糖化合物を化学結合させる。その後、洗浄・乾燥することで、本発明の糖修飾高分子素材を得ることができる。
本発明における「溶解」とは、溶質の少なくとも一部が溶媒に溶けていることを意味する。したがって、不均一な糖化合物溶液を反応に用いてもよく、品質管理の観点から均一な溶液を反応に用いることがより好ましい。
【００４６】
前記糖化合物を付与したグラフト化基材を加熱して反応させる際にも、グラフト化基材を得る工程におけるグラフト重合反応と同様に、糖化合物を付与したグラフト化基材の表面にフィルムをラミネートすることが好ましい。例えば、グラフト化基材がシート状又は繊維状の場合には、２枚のフィルムの間に、糖化合物反応液を付与したグラフト化基材を挟み、密着させる。糖化合物反応液を付与したグラフト化基材にフィルムを密着させることで、例えば基材が編織布や不織布のような繊維状の場合には、基材内部への糖化合物反応液の浸透を促進し、かつ糖化合物反応液の付与率を一定に制御できるとともに、基材に対して糖化合物反応液を均一に付与できる。また、フィルムをラミネートして密閉された空間内でグラフト化基材と糖化合物を反応させることにより、反応がより促進される。
【００４７】
前記フィルムは、前記グラフト重合において使用するものと同様でよく、例えば、厚み０．０１〜０．２ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムなどが好適である。
【００４８】
本発明で使用する糖化合物には特に限定はなく、例えば単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも１種を用いることができ、糖修飾高分子素材の用途に応じた機能を付与できる糖化合物を適宜選択すればよい。また、糖類としては、アミノ糖を用いることもできる。
【００４９】
糖化合物は１種類を単独で使用できるし、２種類以上を併用することもできる。２種類以上の異なる糖化合物を用いると、グラフト鎖に少なくとも２種類の糖化合物が化学結合され、それぞれの糖化合物による異なる２種以上の機能性が付与された複合糖修飾高分子素材を得ることができる。
【００５０】
グラフト化基材のグラフト鎖と糖化合物との化学結合は、グラフト化基材のグラフト鎖を構成するラジカル重合反応性化合物が有する官能基、例えばアクリル酸やメタクリル酸のカルボキシ基、メタクリル酸グリシジルのエポキシ基と、糖化合物のヒドロキシ基との反応による。これにより、基材に糖化合物が固定された糖修飾高分子素材が得られる。
【００５１】
また、前記糖類としてアミノ糖を用いた場合には、アミノ糖におけるアミノ基と、グラフト化基材のグラフト鎖を構成するラジカル重合反応性化合物の官能基との化学結合によっても、糖化合物をグラフト化基材のグラフト鎖に化学結合させることもできる。例えば、アクリル酸グリシジルのグリシジル基とアミノ糖のアミノ基とが化学結合し、アミノ糖が高分子素材からなるグラフト化基材のグラフト鎖に結合される。
【００５２】
前記アミノ糖としては、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。そのなかでもグルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましく、グルコサミンが入手容易な点でより好ましい。
【００５３】
糖化合物反応液の溶媒中における糖化合物の濃度の下限値としては、０．０１０ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．１００ｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、０．４００ｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましい。また、糖化合物の濃度の上限値としては、５．０００ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、２．０００ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、１．０００ｍｏｌ／Ｌ以下がさらに好ましい。溶媒中に糖化合物を前記範囲の量で含有させることで、糖化合物とグラフト化基材とが収率よく反応する。
【００５４】
前記糖化合物反応液の溶媒としては、グラフト化基材を溶解させず、糖化合物を溶解できる溶媒であれば特に限定はないが、溶媒が非プロトン性溶媒を含有することが好ましい。非プロトン性極性溶媒は、糖化合物の溶解性、グラフト化基材との湿潤性などの観点から、糖化合物とグラフト化基材との反応性を高めるうえで好ましい。非プロトン性極性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキサメチルホスホリックトリアミドからなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。なかでも、グラフト化基材との湿潤性の観点からジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく、糖化合物の反応収率が高くなる。
【００５５】
前記糖化合物反応液には、第三級アミンを含有することが好ましい。塩基である第三級アミンにより、糖化合物の求核性を高めることができる。また、糖化合物としてアミノ糖を用いる場合、通常、アミノ糖は塩酸塩又は硫酸塩として安定化されているため、これを溶媒に溶解した糖化合物反応液は酸性に傾くが、塩基である第三級アミンにより反応系が中和され、反応が促進される。
【００５６】
前記第三級アミンとしては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、キヌクリジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、テトラメチルエチレンジアミン等が挙げられる。それらの中でも、前述した非プロトン性極性溶媒、特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との相溶性が良いことから、Ｎ−メチルモルホリンであることが好ましい。
【００５７】
糖化合物反応液の溶媒中における前記第三級アミンの濃度の下限値としては、０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．５００ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。また、前記第三級アミンの濃度の上限値としては、７．５００ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、１．０００ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。糖化合物の溶媒中に第３級アミンを前記範囲の量で含有させることで、糖化合物とグラフト化基材との反応が促進される。
【００５８】
前記糖化合物溶液の溶媒中における糖化合物と第三級アミンとのｍｏｌ／Ｌの比［糖化合物（ｍｏｌ／Ｌ）／第３級アミン（ｍｏｌ／Ｌ）］の下限値としては、０．１以上が好ましく、０．２以上がより好ましく、０．４以上がさらに好ましい。また、溶媒中における糖化合物と第三級アミンとのｍｏｌ／Ｌの比［糖化合物（ｍｏｌ／Ｌ）／第３級アミン（ｍｏｌ／Ｌ）］の上限値としては、１．５以下が好ましく、１．０以下がより好ましく、０．６以下がさらに好ましい。糖化合物と第三級アミンとのｍｏｌ／Ｌの比が前記の範囲内にあることで、糖化合物とグラフト化基材との反応が促進される。
【００５９】
＜糖修飾高分子素材＞
本発明の糖修飾高分子素材は、細胞分離フィルター材などの細胞分離材、細胞培養用シャーレなどの細胞培養材などとして好適に使用することができる。
【００６０】
本発明の糖修飾高分子素材からなる細胞分離フィルター材は、高分子素材からなる編織布状又は不織布状の基材に糖化合物が固定されており、高い細胞分離性能を発揮できる。しかも糖化合物が化学結合により基材に固定されているので、コーティング等によるフィルター細孔の閉塞のおそれもなく、かつ耐久性に優れる。
【００６１】
本発明の細胞分離フィルターは、フィルター材としての本発明の糖修飾高分子素材を、導入口と導出口を有する容器に充填することで得られる。例えば、フィルター材としての糖修飾高分子素材を、少なくとも、液の導入口及び導出口を持つ容器内に適切に充填する。前記容器は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとり得る。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜１０００ｍｌ程度、直径約０．１〜１５ｃｍ程度の透明又は半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ０．１〜２０ｃｍ程度の正方形又は長方形で、厚みが０．１〜５ｃｍ程度の四角柱状の形態等が挙げられる。フィルター材としての糖修飾高分子素材は、細胞含有液の流れ方向に１枚又は複数枚積層して容器内に充填してもよい。また、前記容器に充填した糖修飾高分子素材の上流側及び／又は下流側に他のフィルター材を更に充填してもよい。
【００６２】
前記のようなフィルター材として用いる場合の糖修飾高分子素材の基材形状は、液層で細胞含有液との接触を行うために接触頻度の観点から表面積が大きいことが望ましい。例えば、編織布、不織布などの繊維状構造体が挙げられる。特に細胞の吸着性、分離材としての取り扱い性からみて、織布、不織布が好ましく、中でも細胞との多点的な接触が可能である点で不織布が最も好ましい。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
＜グラフト化基材の製造＞
水とエタノールを１：１（重量比）の割合で混合した溶媒に、メタクリル酸グリシジルを溶解し、モノマー濃度１０重量％のメタクリル酸グリシジル溶液を調製した。該メタクリル酸グリシジル溶液に窒素ガスを通気することで溶存酸素を除去し、ラジカル重合性化合物溶液とした。
縦１４ｃｍ×横２０ｃｍ×厚み０．４３ｍｍのポリプロピレン不織布（平均繊維直径３μｍ、目付４０ｇ／ｍ２）に加速電圧２５０ｋＶ、照射線量５０ｋＧｙとなる条件で、窒素ガス雰囲気下、室温で電子線照射を行った。
電子線照射後の不織布を、前記ラジカル重合性化合物溶液に浸漬し、不織布に重合性化合物を付与した。該重合性化合物を付与した不織布の上下にポリエステルフィルム（上側のフィルム厚み：２５μｍ、下側のフィルム厚み：５０μｍ）をラミネートし密着させた。該フィルムをラミネートした不織布を、フィルムごとオーブン内で５０℃、３０分間加熱して、重合反応を促進させた。その後、不織布両面のフィルムを剥離し、水、メタノールで不織布を洗浄した後、乾燥し、グラフト化ポリプロピレン不織布を得た。
得られたグラフト化ポリプロピレン不織布について、電子線照射前の不織布乾燥重量（Ｗ１）とグラフト反応後の不織布乾燥重量（Ｗ２）から、以下のようにグラフト率を算出したところ、１０５％であった。
グラフト率＝〔（Ｗ２−Ｗ１）／Ｗ１〕×１００（％）
【００６４】
＜グラフト化ポリプロピレン不織布のグラフト鎖への糖化合物の結合＞
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、グルコサミン塩酸塩とＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を溶解し、グルコサミン塩酸塩濃度０．４６ｍｏｌ／Ｌ、Ｎ−メチルモルホリン濃度０．９２ｍｏｌ／Ｌの糖化合物反応液を得た。
前記グラフト化ポリプロピレン不織布を、前記糖化合物反応液に浸漬し、グラフト化ポリプロピレン不織布にグルコサミン塩酸塩とＮ−メチルモルホリンを付与した。該不織布の上下にポリエステルフィルム（上側のフィルム厚み：２５μｍ、下側のフィルム厚み：５０μｍ）をラミネートして密着し、フィルムごとオーブン内で１００℃、１０分間加熱して、反応を促進させた（以下、フィルムラミネート法という。）。その後、不織布両面のフィルムを剥離し、水、メタノールで不織布を洗浄した後、乾燥し、グルコサミンがメタクリル酸グリシジルからなるグラフト鎖に化学結合した糖修飾ポリプロピレン不織布を得た。
得られた糖修飾プロピレン不織布のＡＴＲ−ＩＲスペクトルにおいて、３３００ｃｍ−１付近にグルコサミン由来のＯＨ基ピークが新たに出現することを確認した。
【００６５】
得られた糖修飾ポリプロピレン不織布について、糖化合物反応液との反応前の不織布乾燥重量（Ｗ３）、反応後の不織布乾燥重量（Ｗ４）及びグラフト鎖のエポキシ基と反応する想定最大グルコサミン量（Ｗ５）から、以下のようにグルコサミンの反応収率を算出したところ、２％であった。
反応収率（％）＝〔（Ｗ４−Ｗ３）／Ｗ５〕×１００
【００６６】
（実施例２）
糖化合物溶液との反応時間を６０分間とした以外は実施例１と同様にしてフィルムラミネート法により糖修飾ポリプロピレン不織布を得た。グルコサミンの反応収率は１９％であった。
【００６７】
（実施例３）
糖化合物溶液との反応時間を３００分間とした以外は実施例１と同様にしてフィルムラミネート法により糖修飾ポリプロピレン不織布を得た。グルコサミンの反応収率は２９％であった。
【００６８】
（実施例４）
実施例１と同様にして得たグラフト化ポリプロピレン不織布を、実施例１と同じ糖化合物反応液に浸漬し、反応液を１００℃で３００分間加熱して、反応を促進させた（溶液法）。その後、反応液から不織布を取り出し、水、メタノールで不織布を洗浄した後、乾燥し、グルコサミンがメタクリル酸グリシジルからなるグラフト鎖に結合した糖修飾ポリプロピレン不織布を得た。得られた糖修飾ポリプロピレン不織布における、グルコサミンの反応収率は１０％であった。
【００６９】
以上の実施例１〜４の糖修飾高分子素材の製造条件及び結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0006596766.tif 000002