(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料の中で動いているナノ粒子を光透過式に検出する装置（100）であって、
試料を照射するために空間的インコヒーレントビームを放出する光源（10）と、
顕微鏡対物レンズ（31）を備えた撮像光学システム（30）と、
前記撮像光学システム（30）による前記顕微鏡対物レンズの物体焦点面と共役の検出面（41）を備え、１ミリ秒より短い予め設定された期間中に、取得すべき前記試料の分析容積の連続した像であって、各像は、前記試料上に入射している前記照射ビームと前記分析容積内に存在する前記各ナノ粒子によって散乱したビームとの光学的干渉によって生じるものである連続した像を取得可能とする二次元光学検出器（40）と、
前記分析容積の各ナノ粒子について前記散乱ビームの前記強度を測定するために、連続した各前記像の平均を取得して、前記平均を各像から引くことを可能とする画像処理手段（50）と、
を備える装置。
【請求項２】
前記光源はパルス源であり、前記予め設定された期間の各光パルスの前記連続放出を可能にしており、前記装置は前記連続した像の取得のために前記二次元検出器と前記パルス光源とを同期させる手段をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項３】
使用している前記顕微鏡対物レンズの開口数は１以上である、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
流体試料（20）の中で動いているナノ粒子を光透過式に検出する方法であって、
前記試料（20）を照射するための空間的インコヒーレント光ビームを放出することと、
顕微鏡対物レンズ（31）を備えた撮像光学システム（30）を用いて、二次元光学検出器（40）の検出面（41）上に、前記顕微鏡対物レンズの物体焦点面に近接して配置された前記試料の分析容積の像を形成することと、
前記二次元検出器を用いて前記試料の前記分析容積の連続した像であって、各像は、１ミリ秒より短い予め設定された期間中に前記照射ビームと前記分析容積内に存在する各前記ナノ粒子のそれぞれによって散乱された前記ビームとの各光学干渉によって生じるものである連続した像を取得することと、
前記分析容積の各ナノ粒子について前記散乱したビームの前記強度を測定すべく、連続した前記像の平均をとって前記平均を各像から引くために各前記像を処理することと、
を備える方法。
【請求項５】
前記光ビームを放出することは、
前記予め設定された期間中に連続して光パルスを放出することと、
前記光パルスの前記放出と同期して前記像を取得することと、
を備える請求項４に記載の方法。
【請求項６】
このような処理による前記連続した像を起点として前記ナノ粒子の前記軌跡を測定することをさらに備える請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料などの流体試料中あるいは空気中の、通常30nmから200nmのナノ粒子の光学的検出方法および装置に関する。より具体的に、本方法は、水中環境に存在する遊離ウィルスの検出、特に海水中または河川中のウィルスの集計および特性評価に適用される。
【背景技術】
【０００２】
ウィルスは、その寸法が通常30nmから200nmのナノ物体である。これらは、一般的に特定の宿主細胞に特有であり、そのためこれらはある種の、あるいはその種の変種または菌株の特性を示す。ようやく1989年にあるノルウェーチームの業績（K.J.Boersheim  他、"Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy"， Appl. Environ. Microbiol.，56巻，352-356ページ，1990年参照）のおかげで、我々は種々の水中環境における多数のウィルスを知るようになった。高度に集中しているこれらのウィルスは、湖、河川、深海の氷あるいは堆積物、時には雲の中でも測定されており、このことからこれらが生物圏の機能に重要な役割を果たしていることを示唆している。希少種にとってためになる優占種の破壊やウィルス遺伝子の宿主への移転など、種々のメカニズムのおかげで、ウィルスは水中生態系の多様性を維持し、遺伝子混合を容易にしている。このため、ウィルスと宿主との関係をよりよく理解するために、異なる水中生態系の中のウィルスの特性評価を行いそれらの分布を推定することが極めて重要である。
【０００３】
水中生態系、季節あるいはサンプリング深さまでにも依存するが、遊離ウィルスの集中度は一般的に１ミリメートル当たり106から109の範囲にある。水中媒体中のウィルスの特性評価および集計方法は多く知られている。
【０００４】
例えば、非常に良い精度でウィルスを集計してそれらの形態の特性評価を可能にする透過電子顕微鏡法（すなわちTEM）が知られている。しかしながら、この破壊的な技術は巨大で高価な設備を必要とする。
【０００５】
水中環境におけるウィルスの特性評価のための光学的な技術では、核酸を蛍光マーカで染色した後に遊離ウィルスの集計を可能にする落射蛍光顕微鏡法が知られている（例えば、Bettarel他，"A comparison of Methods for Counting Viruses in Aquatic Systems"， Appl. Environ. Microbiol.，66巻，2283-2289ページ，2000年参照）。しかしながら、この技術にはマーカを固化させるステージが必要であり、従って後のステージの分子および生化学的分析にとって厄介であることと判明することもある。
【０００６】
ウィルスは、水（1.33）とは大きく異なり可視スペクトル中において1.5に近い屈折率の誘電ナノメートル粒子のように作用するという事実に基づいて、入射電磁場におけるこれらのナノ粒子が生じる摂動を測定することによりこれらの存在を検出し、潜在的に特徴づける方法が同様に知られている。
【０００７】
例えば、ウィルス粒子の懸濁を用いた光の散乱に基づいた方法が記載されている（例えば、WM Balch他，"Light scattering by Viral Suspensions" Limnol Oceanogr，45巻，492-498ページ，2000年参照）。しかしながら、これらの手法は検出感度が悪いため、ウィルスの均一溶液の分析に限定されており、所定の大きさおよび形状のウィルス濃度のみを測定できる。このため、これらは自然環境における一般的なケースである多様なウィルスの識別には適していない。
【０００８】
感度を上げるために、液体環境におけるウィルスの検出には干渉計測法が使用されてきた。例えば、Mitra他（"Real-time Optical Detection of Single Human and Bacterial Viruses Based on Dark-field Interferometry"，Biosens Bioelectron，31巻第1刊，499-504ページ，2012年1月15日）による論文は、ナノ流体の導管中において一つずつ動くナノ粒子の観察のため干渉計測検出法について記している。入射レーザビームによって照射されているナノ粒子によって散乱された低光強度は、高強度の参照ビームによって増幅されている。さらに、構造化照明は、導管のインタフェース上での付随的な反射から結果として生じるノイズを除去する（黒色背景での検出）。しかしながら、この技術には、コヒーレント光源（レーザ）の利用の他に複雑なナノ流体レイアウトが必要となる。
【０００９】
本発明は、水などの流体中で動いているナノ粒子の検出のための、レーザを不要とする、空間的インコヒーレント照明で動作する干渉計測技術を提供する。さらに、記載の技術は検査する流体が特定のレイアウトにあることを必要としない。しかしながら、本明細書に記載の技術は、非常に良い感度を有し、直径が数十ナノメートルの大きさしかないナノ粒子の検出を可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様によれば、本発明は、流体試料の中で動いているナノ粒子を光透過式に検出する装置であって、
試料を照射するために空間的インコヒーレントビームを放出する光源と、
顕微鏡対物レンズを備えた撮像光学システムと、
前記撮像光学システムによる前記顕微鏡対物レンズの物体焦点面と共役の検出面を備え、１ミリ秒より短い予め設定された期間中に、取得すべき前記試料の分析容積の連続した像であって、各像は、前記試料上に入射している前記照射ビームと前記分析容積内に存在する前記各ナノ粒子によって散乱したビームとの光学的干渉によって生じるものである連続した像を取得可能とする二次元光学検出器（40）と、
前記分析容積の各ナノ粒子について前記散乱ビームの前記強度を測定するために、連続した各前記像の平均を取得して、前記平均を各像から引くことを可能とする画像処理手段と、
を備える装置に関する。
【００１１】
検出装置は、ナノ粒子、つまり、直径が数百ナノメートルより小さい粒子、より具体的には直径が30nmから200nmの間のナノ粒子の検出に使用する。
【００１２】
このように記載の装置は、非常に簡単に使用できて試料を特定の形態で配置する必要が無く、ナノ粒子が「凍結」されている非常に短い時間の間に光源から放出された信号と各ナノ粒子から散乱された信号との干渉から得られた散乱信号の増幅により、直径が数十ナノメートルの大きさしかないナノ粒子の検出を可能にする。
【００１３】
入射照射ビームと各ナノ粒子によって散乱されたビームとの間で直接生じた干渉は、干渉を形成するために、分離器を使用した干渉計など、参照波と試料を照射している波との間での物理的初期分離を必要としない。
【００１４】
空間的インコヒーレントビームを用いて照射することにより、その断面が顕微鏡対物レンズの開口数と反比例する「ボクセル」のレベルまで空間的コヒーレンスを制限可能にする。このため、その中にナノ粒子が置かれているボクセル中のみで干渉が可能であり、よってこれらの干渉はほぼ同心の球面波の間で起きる。
【００１５】
一つあるいはそれ以上の例示的な実施例によれば、光源はパルス線源であり、光パルスを予め設定した期間中に順次照射することを可能にする。一連の光の像を取得するために、装置は二次元光検出器とパルス状光源とを同期させる手段をさらに備えている。このようにすれば、使用している二次元検出器は、百ヘルツで動作する標準的なカメラでもよい。
【００１６】
代りに、連続光源と、通常一秒当たり数千像より大なる周波数を有する高速カメラを使用してもよい。
【００１７】
光源は、LEDなどの空間的インコヒーレント光源であり、検出領域内に付随的に発生する有害な背景を生じ得るあらゆるスペックル効果を防ぐことができる。
【００１８】
一つあるいはそれ以上の例示的な実施例によれば、使用している顕微鏡対物レンズは開口数が１以上であり、これにより各ナノ粒子によって散乱された光信号の強度を増大させてより小さい直径を有するナノ粒子の検出を可能にする。
【００１９】
第２の態様によれば、本発明は、流体試料の中で動いているナノ粒子を光透過式に検出する方法であって、
前記試料を照射するための空間的インコヒーレント光ビームを放出することと、
顕微鏡対物レンズを備えた撮像光学システムを用いて、二次元光学検出器の検出面（41）上に、前記顕微鏡対物レンズの物体焦点面に近接して配置された前記試料の分析容積の像を形成することと、
前記二次元検出器を用いて前記試料の前記分析容積の連続した像であって、各像は、１ミリ秒より短い予め設定された期間中に前記照射ビームと前記分析容積内に存在する各前記ナノ粒子のそれぞれによって散乱された前記ビームとの各光学干渉によって生じるものである連続した像を取得することと、
前記分析容積の各ナノ粒子について前記散乱したビームの前記強度を測定すべく、連続した前記像の平均をとって前記平均を各像から引くために各前記像を処理することと、
を備える方法に関する。
【００２０】
一つあるいはそれ以上の例示的な実施例によれば、光ビームの照射は予め設定した期間中に順次照射される光パルスであり、像の取得は光パルスの照射と同期して行われる。
【００２１】
一つあるいはそれ以上の例示的な実施例によれば、本方法はこのように処理した一連の像を起点としたナノ粒子の軌跡を測定することをさらに備えている。
【００２２】
本発明の他の利点および特徴は、記載の説明を熟読することにより明確になり、これらは以下の図面に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本明細書による流体試料中のナノ粒子の検出装置の例を示す。
【図２】図２は、図１に示すタイプの装置における液体試料支持体の例をより詳細に示す。
【図３】図３は、図１に示すタイプの装置などの例における、顕微鏡対物レンズの物体焦点面の前後に置かれたナノ粒子から来る球面波を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、顕微鏡対物レンズの物体焦点面の後ろに粒子を置いた場合の、伝送波とナノ粒子によって散乱された波との間で起きる干渉の原理を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、顕微鏡対物レンズの物体焦点面の前に粒子を置いた場合の、伝送波とナノ粒子によって散乱された波との間で起きる干渉の原理を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、顕微鏡対物レンズの物体焦点面の前または後ろに粒子を置いた場合の、伝送波といくつかのナノ粒子のそれぞれによって散乱された波との間で起きる干渉の原理を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、検出器の検出面に生じた干渉パターンを示す。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ平均の除去処理後の液体試料について取得した像と、「ファージλ」型ウィルスに対応する粒子に関連した像の干渉パターンの拡大図と、その粒子の領域において検出器の検出面におけるピクセル数を関数として測定した光強度プロフィールとを示す。
【図７】図７は、異なるナノ粒子（ファージT4型のウィルス）の、二つの連続した像の間での一連のジャンプとして参照する軌跡の曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一貫性を持たせるために、異なる図面における同一要素は同一参照番号を付して示す。
【００２５】
図１には、本明細書による流体試料中で動いているナノ粒子を検出するための装置の例を概略的に示し、図２は、図１に示す型の装置における試料の具体的な配置例を示す。
【００２６】
図１に示す検出装置１００は、入射ビームを液体または気体状の試料２０を通して照射するようになっている光源１０を備えている。光源は、熱源またはLED（発光ダイオード）などの空間的インコヒーレント光源である。光源１０は、通常１より大なる大きな開口数を有する顕微鏡対物レンズ３１の場を照射する。図１に示す装置１００は、一般に筒レンズと呼ばれている光学部品３２をさらに備え、光学部品３２は顕微鏡対物レンズ３１と共に、顕微鏡対物レンズの光学焦点面の像を二次元光学検出器４０の検出面上に形成するために適した光学撮像システム３０を形成している。対物レンズは、例えば標準的な油浸顕微鏡対物レンズであり、二次元検出器は、例えば、CCDまたはCMOSなどの、通常100ヘルツ程度の最低周波数と例えば、少なくとも１０万電子程度の大きな収容容量（well capacity）で動作するカメラである。収容容量は、信号対雑音比を設定してこれにより測定可能なウィルスの最小寸法を設定する。図１の例において、検出装置１００は、検出器４０およびスクリーン６０に、また、この例では、パルスモードで動作しているときに光源と検出とを同期させるために光源１０の制御装置１１にも連結している処理手段５０をさらに備えている。
【００２７】
図２においてより詳細に示すように、試料２０は、例えば、その容積が１マイクロリットル程度の液体試料である。ここで容積は、２つの顕微鏡カバースリップ２２の間に配置された厚さが概ね100マイクロメートルと等しいプラスチック製の膜２３に円形（例えば、半径が１ミリメートル程度）の穴を空けて形成されている。これらカバースリップ２２と膜２３とで試料ホルダ２１を形成している。非常に大きな粒子を分けて数百ナノメートルより小さい、好適には例えば、100ナノメートルより小さい直径を有する粒子のみを保持するために予めフィルタリングを時々行う以外には、液体試料の分析には特別な準備を必要ない。しかしながら、特に「きれいな」試料（ウィルスの濃度が低い）の場合には既知の方法でウィルス試料を「集め」なければならないこともある。
【００２８】
液体試料の場合について記載したように、本明細書によるナノ粒子の検出方法は、空気などの気体中で動くナノ粒子にも適用できる。この場合、装置１００を分析する空気環境中に直接設置してもよい。検出対象の直径が数100ナノメートルより小さい粒子となるように制限すべく予めフィルタリングしてもよい。
【００２９】
目標場の１つの「ピクセル」または「ボクセル」に対応する容積について図３を用いて本発明の原理を示している。図３には、それぞれ顕微鏡対物レンズの物体焦点面の前と後ろの目標場に配置された２つのナノ粒子から来る球面波を概略的に示している。
【００３０】
目標場の１ピクセルまたは「ボクセル」とは、１ピクセルの画像フィールドにつき顕微鏡対物レンズ３１の目標空間に規定された基本容積Ｖiを意味する。ここで画像フィールドは検出器４０の有効検出面で規定されている。
【００３１】
目標場のボクセルＶiは、顕微鏡対物レンズ３１の被写界深度で規定される長さＬと顕微鏡対物レンズの回折点で規定される断面Ｓを有する円筒形の容積で表すことができる。被写界深度Ｌと断面Ｓの直径Φは以下の方程式で与えられる。
0006596498.tif 000002
【００３２】
ここでＮＡは顕微鏡対物レンズの開口数であり、ｎは目標空間の媒体（例えば、油浸顕微鏡対物レンズの場合には指数ｎ≒1.5の媒体）の指数であり、λは光源１０から照射された光波の作用波長である。
【００３３】
よって、試料の分析容積ＶaをボクセルＶiの総体で規定できる。分析容積Ｖaは、その内部で液体中を動いている粒子を検出できる容量を表す。分析容積の横方向寸法は、目標場の大きさで規定される。つまり、分析容積は、検出面の大きさと撮像システム３０の倍率の逆数の積であり、軸方向寸法は被写界深度Ｌで規定される。
【００３４】
図３に示すように、顕微鏡対物レンズ３１の焦点面Ｆの点Ｆiから来る光は中心をＦiとした球面波Ｗ0であり、顕微鏡対物レンズでこの球面波Ｗ0を平面波Ｗ’0に変換する。以下にて「参照波」と呼ぶこの平面波Ｗ’0は、（図３では図示していない）顕微鏡筒レンズに到達する。検出器４０の検出面において、この平面波はその直径が顕微鏡対物レンズの開口数と撮像システム３０の倍率の関数である回折点を形成する。
【００３５】
ボクセルＶiの中では、サブ波長ナノ粒子Ｐ1およびＰ2、つまり、寸法が動作波長（working wavelength）より小さくて、点Ｆiに近接しているが被写界深度の限度内に位置するものは、光源１０からの光波で照射されるとそれぞれ散乱球面波を放出し、顕微鏡対物レンズ３１がこれらを図３においてそれぞれＷ’1，Ｗ’2として表す疑似平面波に変換する。ナノ粒子は非常に小さいので位相シフトは生じない。一方、ナノ粒子が存在するボクセル内での空間的コヒーレンスにより、照射ビームのそれぞれから来るほぼ同心の各球面波とナノ粒子によって散乱されたビームとの間で干渉が起きる。
【００３６】
本明細書による検出方法は、二次元検出器４０を用いた試料の分析容積の一連の像の取得に基づいている。通常は１ミリ秒より短い、ナノ粒子の動作時間と比べて十分に短い予め設定した期間中に照射した入射ビームと、入射ビームで形成した分析容積内に存在するナノ粒子のそれぞれによって散乱されたビームとの間での光学干渉の結果として各像を生じる。このため、図３の例では、各波Ｗ’1，Ｗ’2は、参照波Ｗ’0と干渉する。ナノ粒子が、顕微鏡の物体焦点面に対して下流（例えば、粒子Ｐ1）に位置するか上流（例えば、粒子Ｐ2）に位置するかによって干渉が建設的か破壊的かになることがわかる（以下参照）。この違いは、焦点の前あるいは後ろに位置する点から来る球面波との間での180°の位相シフトを生じる「グーイ位相（Gouy shift）」による。
【００３７】
図４Ａおよび図４Ｂは、顕微鏡対物レンズの物体焦点面に対してそれぞれ下流および上流に置かれた常に被写界深度内にあるナノ粒子の、それぞれ建設的および破壊的干渉を示す。これらの図では、光源１０および顕微鏡対物レンズ３１のみを示している。
【００３８】
図４Ａの例は、顕微鏡対物レンズ３１の物体焦点面に対して下流に位置するナノ粒子Ｐ1の場合を示す。ナノ粒子Ｐ1は、（図４Ａには示していない）検出器の場と顕微鏡対物レンズ３１の被写界深度Ｌで規定されている分析容積内に位置している。干渉信号の解釈の妨げとなり得るスペックルの形成を防ぐために、LEDなどの好ましくは空間的かつ一時的インコヒーレント光源である、光源１０によりナノ粒子を照射している。
【００３９】
ここで、焦点Ｆiから来て顕微鏡対物レンズの口径によって妨害されている参照波をＷ0と表示し、ナノ粒子Ｐ1によって散乱されて同様に顕微鏡対物レンズの口径によって妨害されている波をＷとして表示している。図４Ａの場合、参照波および散乱波は、同相の球面波である。これらの波の間で建設的な干渉が起きて、顕微鏡対物レンズの口径領域において光干渉パターンＩに変換される。ナノ粒子と焦点との間の位置で位相シフトが被写界深度より小さいために波ＷおよびＷ0は、顕微鏡対物レンズの口径内で散乱した全ての光線角度について、つまり、顕微鏡対物レンズの光軸と目標物の開放口径（maximum aperture）との間で形成された全ての角度、すなわち油浸目標物では通常54°について同相にある。よって、図４Ａの干渉場では輪が見られない。
【００４０】
一方、図４Ｂの例では、顕微鏡対物レンズ３１の物体焦点面に対して下流に位置するがその幅が顕微鏡対物レンズ３１の被写界深度で規定される分析容積内にあるナノ粒子Ｐ2の場合を示す。この例では、参照波Ｗ0および散乱波Ｗは、グーイ位相が導入されているために位相が一致していない。これらの波の間で破壊的な干渉が起きて顕微鏡対物レンズの口径領域内を暗い干渉パターンＩに変換している。上記と同様に、ナノ粒子の位置と焦点との間の位相シフトが被写界深度より小さいため、全ての角度について波ＷおよびＷ0の位相は一致していないが、輪は全く見られない。
【００４１】
図４Ａおよび図４各Ｂにおいて示すように、各粒子によって散乱されている場合などの非常に弱い信号間での干渉現象が、また、光源から来る強い信号の場合、干渉による増幅が観察でき、これにより非常に小さい散乱信号の検出を、さらに数十ナノメートルより小さい直径を有するナノ粒子の識別を可能にする。
【００４２】
従って、光源の光子により直接誘導された光電子の数をＮSとし、散乱しているナノ粒子によって生じる光電子の数をＮDとすると、これら二つの波の間での干渉から光電子の数Ｎが以下として得られる。
0006596498.tif 000003
ここでΦは、光源ビームと散乱ビームとの間での位相シフトである。
【００４３】
ここで、散乱しているナノ粒子によって生じる光電子の数ＮDは、光源によって放出される光電子の数ＮSと比べて非常に少ない（通常1/106の比）。さらに、今回の場合に顕微鏡対物レンズの被写界深度における粒子の位置に起因して、散乱粒子と焦点との相対位置によって位相シフトΦはゼロまたは180°に近い。このため、cos(Φ)は+１または-１に等しい。
【００４４】
0006596498.tif 000004
【００４５】
１ピクセル当たり160,000の電子を収容できる検出器で信号対ノイズ比を計算すると、平均を引いた処理後では、残留測定ノイズは直径が20ナノメートルの粒子によって生成される信号に対応する。
【００４６】
さらに、大開口数ＮＡ、典型的には１以上の通常ＮＡを有する顕微鏡対物レンズの利用により、集光の立体角を増大させるだけでなく、各ナノ粒子によって散乱された信号の強度を上げることを可能にし、従って、観察可能なナノ粒子の最小直径を小さくする。実際に、ナノ粒子によって散乱される強度は、σをナノ粒子の有効散乱断面、Sを回折点の表面とすると、σ/Sとして変動する。このため、上記方程式（２）により、ナノ粒子によって散乱される強度は、開口数ＮＡの二乗とともに変化する。
【００４７】
図５Ｂには、例えば、図５Ａで示すような、流体媒体中で動いている複数のナノ粒子の観察のために一定時間の間に取得した像を概略的に示す。
【００４８】
図５Ａには、Ｐ1からＰ4として表示する４つのナノ粒子を示す。ここで、ナノ粒子Ｐ1，Ｐ3，Ｐ4は顕微鏡対物レンズの焦点面の下流に位置し、粒子Ｐ2は、顕微鏡対物レンズの焦点面の上流に位置している。全ての粒子は検出器の場によって規定されている分析容積Ｖaと顕微鏡対物レンズの被写界深度Ｌの中に置かれている。
【００４９】
ナノ粒子は、流体媒体中で動いている。例えば、水中環境中のウィルスなどの数十ナノメートルから数百ナノメートルのナノ粒子であってもよい。本明細書による検出方法を実施している時に、分析容積内の粒子の動きを「凍結」するために、十分に短い一定時間に、それぞれが照射した入射ビームと各ナノ粒子によって散乱されたビームとの光学干渉から生じる像である、一連の像を取得する。
【００５０】
既に知られているように、ブラウン運動中の半径ｒの球状ナノ粒子の散乱能力は以下の方程式で表すことができる。
0006596498.tif 000005
ここで、kBはボルツマン定数であり、ηは温度Tでその中にナノ粒子が浸漬されている流体の粘度である。
【００５１】
時間間隔ｔについて、カメラで二次元状に結像される粒子の飛躍lは、l=√4Dtとして表する。ここで、Dは方程式（4）から得られる散乱能力である。
【００５２】
従って実際には、ナノ粒子が回折点のわずか一部より大なる距離にも及ばないように、十分に短い時間ｔの間での像の形成を試みる。一般には１ミリ秒を超えない時間の間に像が形成されるべきであることが示されている。
【００５３】
第１の変形例によれば、典型的には１秒当たり数千像より多い非常に速い取得速度を有するカメラを利用した、検出によって動きを凍結できる。
【００５４】
代わりに、１ミリ秒より短い継続時間で、検出器上で取得する各像と同期させたパルス源を用いることができる。この場合の検出器は、例えば、100Hzの取得速度を有する標準的なカメラであってもよい。半径が数十ナノメートルの、例えば、概ね40nmを有するナノ粒子が経験する、２つの連続した像の間で測定される「飛躍」は１ミクロンより大きく、使用している顕微鏡対物レンズの分解能が既知として容易に測定できる。
【００５５】
上記にて図４Ａおよび４Ｂを用いて説明したように、顕微鏡対物レンズの焦点面の下流に位置するナノ粒子は、建設的な干渉を生じ、結果として図５Ｂに示す検出面４１上に明るい回折点（Ｐ’1，Ｐ’3，Ｐ’4）をつくる。一方、顕微鏡対物レンズの焦点面の上流に位置するナノ粒子は、破壊的な干渉を生じ、結果として検出面上に暗い回折点（Ｐ’2）をつくる。
【００５６】
上記にて説明したように、実際には検出面４１上に実体的な背景を観察し、その背景上で干渉が建設的か破壊的かによって背景より明るいあるいは暗い回折点が重なり合う。本明細書の検出方法によれば、好都合に、例えば、数百の一連の像を記録してこれらの平均をとる。各ナノ粒子と関連付けられた各信号のみを含んでいる像を取得するためには、取得したそれぞれの像から平均を引けばよい。
【００５７】
図６および７は、存在する可能性のあるウィルスの検出および識別のために、本明細書による検出方法を用いて分析した液体試料について得た最初の実験結果を示す。ここでは、それぞれ、ファージλ型のウィルスを含んでいる試料と、ブリタニー沿岸で見つかる特に代表的な試料であるファージT4型のウィルスを含んでいる試料に関する。
【００５８】
図６Ａは、平均の除去処理後の液体試料から取得した像である。この像を取得するために使用した装置は図１に示す装置と同種であり、THORLABS（商標登録）（ソーラボ）インペリアルブルーLED、油浸対物レンズオリンパス（商標登録）100X 、回折点をオーバサンプリングするための焦点距離300mmの筒レンズ、及びCMOS  PhotonFocus（登録商標）PHF-MV-D1024E-160-CL-12カメラを有する。図６Ａでは、それぞれ顕微鏡対物レンズの焦点面の上流または下流に位置するナノ粒子に対応する、明るい点と暗い点の集合を確認できる。
【００５９】
図６Ｂには、分離したナノ粒子と関連付けられた図６Ａの像の干渉パターンを拡大したものを示し、図６Ｃは検出器の検出面内におけるピクセル数を関数として、ナノ粒子によって散乱されたビームの強度に対応する、その粒子の領域内で測定した（既知の寸法を有するナノ粒子を用いて校正した単位での）光強度プロフィールを図示している。
【００６０】
取得した像でウィルスの存在を確認することが可能なだけでなく、特に、これらウィルスの寸法の関数として、これらウィルスを特定することが可能である。このケースでは、散乱した光強度の測定により、「ファージλ」ウィルスに対応する直径60nmを有するナノ粒子を推測可能にしている。
【００６１】
図７は、図６Ａに示す像を形成するために使用した装置と同様のものを用いて1/10秒程度の期間に測定した特定数の粒子の軌跡を図示している。この例では、概ね１５の粒子が二つの連続した像との間で飛んでいる一連のジャンプによって各軌跡が形成されており、それぞれ図７の凡例に示す記号で識別されている。
【００６２】
これらの実験的な測定値を起点として散乱した光強度（凡例の各記号の反対側に示す任意の単位の値）を（前回と同様に）測定することができる。ここで、散乱の強度は全てのナノ粒子について概ね同等であり、直径が90ナノメートルの「ファージT4」型のウィルスの均質集団の存在を推測できるであろう。
【００６３】
軌跡の分析は、散乱した強度の測定値に補足情報を提供できる。実際に、ブラウン運動の分析により、各粒子についての、例えば、それらの寸法、ブラウン運動に摂動する尾の存在などの特定情報をも推定可能にする。
【００６４】
いくつかの例示的な実施例について記載しているが、本発明による流体環境におけるナノ粒子の検出のための光学的な方法および本方法を実施するための装置は、種々の変更、改良および改善を含んでおり、これらの種々の変更、改良および改善は当業者に明らかであり、以下に定義した請求項に記載の発明の範囲の一部であることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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