(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、並びに
配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域で構成された群から選択された一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに
配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
で構成された群から選択された一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ｐＨ６．０またはｐＨ７．４の条件でＫＤ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）が０．０１〜２ｎＭであるＦｃＲｎに結合する請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、デュアル−特異抗体、ミニボディ、二重特異抗体、三重特異抗体、多重特異抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、イントラボディ、を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号３の重鎖可変領域をコードする配列及び配列番号１３の軽鎖可変領域をコードする配列；
配列番号５の重鎖可変領域をコードする配列及び配列番号１５の軽鎖可変領域をコードする配列；
配列番号１の重鎖可変領域をコードする配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域をコードする配列；
配列番号７の重鎖可変領域をコードする配列及び配列番号１７の軽鎖可変領域をコードする配列；並びに
配列番号９の重鎖可変領域をコードする配列及び配列番号１９の軽鎖可変領域をコードする配列；
からなる群から選択される、重鎖可変領域をコードする配列及び軽鎖可変領域をコードする配列を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換え発現ベクターでトレンスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞を培養して抗体を生成する工程と；前記生成された抗体を分離及び精製してＦｃＲｎに特異的に結合する抗体を回収する工程と、を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、及び一つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
自己免疫疾患患者を治療するための医薬の製造における請求項１６の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患は、免疫性好中球減少症、ギラン・バレー症候群、てんかん、自己免疫性脳炎、アイザックス症候群、母斑症候群、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性貧血、自己免疫性グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、ループス及び特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ，ＩＴＰ）、ループス腎炎及び膜性腎症で構成された群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、及び検出ラベルを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いることを含むインビトロでＦｃＲｎを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧに高親和性を有する受容体であるＦｃＲｎ（Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒの略で、胎児Ｆｃ−受容体、ＦｃＲＰ、ＦｃＲＢまたはＢｒａｍｂｅｌｌ受容体とも呼ばれる）に特異的な抗体である分離された抗−ＦｃＲｎ抗体、これの製造方法、前記抗体を含む自己免疫疾患治療用組成物及び前記抗体を利用した自己免疫疾患の治療及び診断方法に関する。本発明に係るＦｃＲｎ特異的抗体は、ＦｃＲｎにＩｇＧと非競合的に結合して血中内病因性自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）の量を減少させることによって自己免疫疾患に対する治療に活用可能である。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、特定抗原に結合する免疫タンパク質でヒト及びマウスをはじめとする多くの動物で重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）と軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）のポリペプチドが対をなして、各鎖は、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）及び不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）と称する２個の区別される領域で構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗体間に相当な配列多様性を示し、標的抗原に特異的結合特性を担当して、不変領域は、抗体間配列多様性が少なく、重要な生化学的反応を誘導する多数の天然タンパク質への結合を担当する。
【０００３】
正常な条件下、血清内でＩｇＧ３アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）を除いた多くのＩｇＧの半減期はヒトで約２２〜２３日で、これは他の血しょうタンパク質の血清半減期に比べて比較的長い。このような長いＩｇＧの血中半減期によって細胞吸収作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞中に入ってきたＩｇＧは、ｐＨ６．０条件のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）でＦｃガンマ受容体の一種である新生児Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｃＲｎ）に強く結合して分解性リソソーム経路を回避することができ、再び細胞膜に循環するとＩｇＧは弱い塩基性ｐＨ（〜７．４）の血流内でＦｃＲｎから急速に解離する。このような受容体−媒介された再循環メカニズム（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によりＦｃＲｎはリソソームでＩｇＧの分解を効果的に遮断してＩｇＧの半減期を延長すると知られている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５２８，２００３）。
【０００４】
ＦｃＲｎは、ラット新生児の腸で母乳からＩｇＧ抗体の吸収を媒介する機能をして循環系でこれの輸送を促進するものとしても明らかになっている。ＦｃＲｎは、ヒトの胎盤でも分離されたが、ＦｃＲｎは、母系ＩｇＧの吸収と胎児循環（ｆｅｔａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）への輸送を媒介すると知られている。成人で、ＦｃＲｎは、肺、腸、腎臓の上皮組織、鼻、膣、及び胆管枝（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）の表面をはじめとする多数の組織で発現する。
【０００５】
ＦｃＲｎは典型的に、内皮細胞と上皮細胞のエンドソーム内に居住する非−共有ヘテロ二量体である。ＦｃＲｎは、三つの重鎖アルファドメイン（α１、α２とα３）と一つの水溶性軽鎖β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（β２ｍ）ドメインを有する膜結合受容体である。構造的に、これは共通軽鎖でβ２ｍを保有する主な組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１分子の集団に属する。αＦｃＲｎ鎖は、α１、α２とα３の三つの重鎖ドメインとβ２ｍ軽鎖ドメイン含み一つの糖鎖を有する細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、単一−通過膜間（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）、そして相対的に短い細胞質尾（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）で構成されて約４６ｋＤの分子量を有する。
【０００６】
ＩｇＧ恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）に対するＦｃＲｎの役割を確認するために、マウスのβ２ｍとＦｃＲｎ重鎖をエンコードする遺伝子を「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」させてこれらのタンパク質が発現しないように操作した時、これらのマウスで、ＩｇＧの血清半減期と濃度が急激に減少したが、これはＩｇＧ恒常性に対するＦｃＲｎ依存性メカニズムを暗示する。また、抗−ヒトＦｃＲｎ抗体が、これらのＦｃＲｎノックアウトマウスで産出されることができて、これらの抗体がＦｃＲｎにＩｇＧの結合を予防できることが提案された。ＦｃＲｎに対するＩｇＧ結合の阻害によって、ＩｇＧ血清半減期を減少させて自己抗体による自己免疫疾患を治療することができる可能性は、自己免疫皮膚水疱性疾患のマウスモデルで明らかになった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：３４４０，２００５）。従って、ＦｃＲｎとＩｇＧの結合を遮断したり拮抗する作用剤は、ＩｇＧによって媒介される自己免疫疾患及び炎症疾患などを治療または予防する方法に利用できる。
【０００７】
自己免疫疾患は、原因が分からない免疫体系異常で、免疫体系が自己の正常な組織、器官またはその他体内成分などを攻撃することによって発生する疾患を総称であり、神経系、胃腸管系、内分泌系、皮膚、骨格系、血管組織などほぼすべての身体部位で発生し得る全身的な疾患である。全世界の人口の約５〜８％で自己免疫疾患が現れると知られているが、自己免疫疾患に対する理解及び診断方法の限界性により有病率が実際の水準より低く報告されると知られている。
【０００８】
自己免疫疾患の原因は、遺伝的、環境的及び免疫学的な観点から長い間研究が進行されてきたが、依然として明確な疾患の発生原因は明らかになっていない。近年多くの研究によって多数の自己免疫疾患がＩｇＧ形態の自己抗体によって発生すると明らかになって、実際自己免疫疾患の診断及び治療研究で疾患特異的な自己抗体の存在有無と減少による治療効果との関連性が広く糾明されている。従って、現在多数の自己免疫疾患は、疾患特異的な自己抗体の存在及びそれの病理的役割が多く糾明されていて、該当自己抗体を血中で除去する場合、迅速な疾患治療効果が得られる。
【０００９】
自己免疫疾患及び同種免疫疾患は、病原性抗体によって媒介される疾患として、免疫性好中球減少症（ｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、テンカン、自己免疫性脳炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、アイザックス症候群（Ｉｓａａｃ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、母斑症候群（ｎｅｖｕｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、尋常性天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ）、落葉性天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｆｏｌｉａｃｅｕｓ）、水疱性類天疱瘡（Ｂｕｌｌｏｕｓ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、後天性表皮水疱症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ）、妊娠性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、粘膜類天疱瘡（ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性貧血、自己免疫性グレーブス病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、グッドパスチャー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、ループス（狼瘡：ｌｕｐｕｓ）及び特発性血小板減少性紫斑病（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  Ｐｕｒｐｕｒａ，ＩＴＰ）、ループス腎炎（ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、膜性腎症（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）等がある。
【００１０】
例えば、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ，ＭＧ）の場合、随意筋の神経筋接合部に位置したアセチルコリン受容体（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＣｈＲ）に対する自己抗体によって該当受容体が破壊または遮断されて随意筋の収縮機能を阻害すると知られていて、このような自己抗体を減少させる場合、筋肉の機能が回復すると知られている。
【００１１】
特発性血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）の場合は、特定血小板膜糖タンパク質に結合する自己抗体の発生によって末梢の血小板破壊が進行されて発生する疾患である。抗血小板抗体は、血小板をオプソニン化して細網細胞（例えばマクロファージ）による急速な血小板破壊をもたらす。
【００１２】
一般にＩＴＰを治療するために免疫系を抑制して血小板の濃度を高める試みが行われている。ＩＴＰは、男性より女性で有病率が高く、また成人より小児で多く発生して、有病率は人口１万人当たり１人である。慢性的ＩＴＰは、成人と小児の両方において主要な血液疾患の一つである。また、米国及び全世界において、巨額の入院費用及び治療費用を発生させる原因になっている。毎年米国で２万件の新しい症例が発生して、ＩＴＰの治療及び特別療法にかかる費用も莫大である。多くのＩＴＰ小児患者は、非常に低い数の血小板を有して突然の出血（典型的な症状として、挫傷、皮膚の小さい赤斑点、鼻血、及び歯ぐき出血）が起きる。小児は時には治療しなくても回復する場合があるが、多くの医者が綿密な観察と緩和及びガンマ・グロブリンの点滴静脈注射による治療を推薦している。
【００１３】
前身性紅斑性ループス腎炎（ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）の場合は、自己免疫疾患の一種で抗核抗体（ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）のような自己抗体の不適切な過剰生産により増加した免疫複合体（Ｉｍｍｕｎｅ−Ｃｏｍｐｌｅｘ）が全身の臓器に蓄積されて炎症反応を起こすことが重要な病因と知られている。このようなループス患者の約４０〜７０％は腎臓に侵入して、約３０％はループス腎炎に発展するが、これはループスの病態中悪性予後因子と知られていて、既存の免疫抑制剤による治療法が試みられているが、約２２％では免疫抑制剤使用時にも寛解が来なく、寛解が来た場合にも免疫抑制剤を減らせば、１０〜６５％の患者が再発すると報告されている。結局、重症のループス腎炎（ＷＨＯ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ）患者は、１０年後に５〜１０％が死亡して、５〜１５％は末期腎不全に達することになる深刻な疾患であり、いまだに適切なループス腎炎の治療が行われていない。
【００１４】
従って、病原性自己抗体を除去して自己免疫疾患を治療する新規作用機序の抗体を介して、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｐｔｉｃａ）、重症筋無力症のような病原性抗体誘導自己免疫疾患（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＩｇＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含み、ループス腎炎や膜性腎症のような免疫複合体誘発腎臓系疾患（Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）への治療効果の拡張も期待する。
【００１５】
様々な自己免疫疾患に過量のＩｇＧを点滴静脈投与（ＩＶＩＧ）して、自己免疫疾患を治療する方法が広く使用されている（Ａｒｎｓｏｎ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２：５５３，２００９）。ＩＶＩＧ効果は、様々な機序によって説明されるが、それらの中の一つは、ＦｃＲｎに対する内因性ＩｇＧとの競合によって病原性抗体のクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を増加させる機序としても説明される。大量のヒト免疫グロブリンの静脈投与（ＩＶＩＧ）は、免疫性ＩＴＰに苦しんている小児の血小板数を増加させて、複数の他の自己免疫疾患の治療に有益であることが証明された。多くの研究で、ＩＶＩＧの自己免疫疾患治療において効果を発揮するメカニズムが糾明された。ＩＴＰと関連して、初期研究でＩＶＩＧの効果は、主に抗体−オプソニン化血小板の食菌作用に関与するＦｃ受容体を遮断して発生すると知らされてきた。その後の研究は、Ｆｃ−欠損ＩＶＩＧは、一部のＩＴＰ患者において血小板数の増加をもたらすことが明らかになり、近年はＩＶＩＧの効果は、血小板貪食の阻害につながるマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）細胞上のＦｃγＲＩＩｂ発現を刺激することに起因するとの報告もある。
【００１６】
しかし、このようなＩＶＩＧ治療は、大きい副作用を有して投与に非常に大きい費用がかかる。また、ＩＶＩＧ以外の自己免疫／同種免疫性疾患の治療に使用される他の治療法としては、ポリクローナル抗−Ｄ免疫グロブリンと、副腎皮質ステロイド及び化学療法剤を含む免疫抑制剤などを利用する方法、サイトカイン血しょう分離交換法、体外抗体吸着（例えばＰｒｏｓｏｒｂａカラムを使用する方法）または脾臓摘出などの外科的処置などが含まれる。しかし、ＩＶＩＧと同様に、このような治療法も充分ではない効力及び高費用のため、その利用が限られてしまう。また、ＩＶＩＧがＦｃＲｎ結合を阻害する仮想機序意競合的阻害は、ＩｇＧの生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ７．２〜７．４）でＦｃＲｎに対する低い親和性により、病原性抗体のクリアランスの実質的な増加をもたらすために非常に多量のＩＶＩＧが求められるが、ＩＶＩＧの典型的な臨床容量は２ｇ／ｋｇ程度である。
【００１７】
ＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合を競合的に抑制することによって、自己免疫疾患を治療する概念を有する阻害剤を利用することは、有望な治療法中一つであるが、現在では内因性ＩｇＧのＦｃＲｎに対する高親和性及び血中の内因性ＩｇＧの濃度によって相当多量の阻害剤が必要で、それによって現在のＩＶＩＧ治療法と同様の限界を有していると知られている。
【００１８】
従って、抗−ＦｃＲｎ抗体は、ＷＯ２００６／１１８７７２、ＷＯ２００７／０８７２８９、ＷＯ２００９／１３１７０２、ＷＯ２０１２／１６７０３９に開示されているが、ＦｃＲｎに対する高親和力かつ少ない量で病因性抗体を除去することができて、免疫原性を減らすことができるより向上したヒト抗体に対する開発必要性が切に求められているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
前記のような問題を解決しようと、本発明は効果的にＩＴＰを含む自己免疫疾患を効率よく根本的に治療できる治療剤を提供するため、ＦｃＲｎに特異的に結合できる能力を有する抗体及びそのような抗体の製造方法を提供することを目的とする。本発明に係るＦｃＲｎ特異的抗体は、ＦｃＲｎに特異的でありｐＨ非依存的に結合してＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃの結合を非競合的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）に妨害して自己免疫疾患の原因である生体内自己抗体を減少させることによって自己免疫疾患を治療することができる。
本発明のさらに他の目的は、前記のＦｃＲｎ特異的抗体を含有する免疫性好中球減少症、ギラン・バレー症候群、テンカン、自己免疫性脳炎、アイザックス症候群、母斑症候群、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性貧血、自己免疫性グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、ループス及び特発性血小板減少性紫斑病、ループス腎炎、膜性腎症などの自己免疫疾患治療用薬学組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４２で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０及び配列番号４３で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１及び配列番号４４で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＦｃＲｎに特異的に結合する分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４２で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０及び配列番号４３で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１及び配列番号４４で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片を提供する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号２０で構成された群から選択される一つ以上のアミノ酸配列を含む一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片を提供する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号２０で構成された群から選択される一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含む分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片を提供する。
【００２４】
本発明はまた、抗体またはこれの断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９で構成された群から選択される一つ以上の配列を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９で構成された群から選択される一つ以上の配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、及び前記組換え発現ベクターで形質感染された宿主細胞を提供する。本発明は追加的に、前記宿主細胞を培養して抗体を生成する工程と；及び前記生成された抗体を分離及び精製してＦｃＲｎに特異的に結合する抗体を回収する工程と、を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、前記抗体またはこれの断片、及び一つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、前記組成物を患者に投与する工程を含む自己免疫疾患患者を治療する方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、前記抗体またはこれの断片、及び検出ラベルを含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、前記抗体またはこれの断片を用いることを含む試験管内または生体内でＦｃＲｎを検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
ＩｇＧに高親和性を有する受容体であるＦｃＲｎに特異的な本発明に係る抗体またはこれの断片は、高い親和度及び特異性を有していて、免疫原性による問題が殆どなく、ＦｃＲｎにＩｇＧなどと非競合的に結合して、血中内病因性自己抗体の量を減少させる特性を有しているため、自己免疫疾患の治療及び診断に非常に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＣＨＯ−Ｓ細胞を利用した抗体発現とＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製を介して確保されたＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１Ｂ、ＨＬ１６１Ｃ及びＨＬ１６１Ｄ抗体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で還元または非還元状態で分析した結果を示す図面で、それぞれのＨＬ１６１抗体は、非還元状態で約１６０ｋＤａの完全な形態のヒトＩｇＧ１類型の構造をなすことを確認して、還元状態で重鎖は、約５５ｋＤａ、そして軽鎖は、約２５ｋＤａで典型的な抗体構造単位からなることを確認した。図１でＬａｎｅ１は、Ｍ．Ｗ．ｍａｒｋｅｒ、Ｌａｎｅ２は、非還元状態（＊ＮＥＭ−ｔｒｅａｔｅｄ）２μｇ、Ｌａｎｅ３は、還元状態２μｇを示す。
【図２】ＦｃＲｎに結合する４種のａｎｔｉ−ＦｃＲｎ抗体、ＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１Ｂ、ＨＬ１６１Ｃ及びＨＬ１６１Ｄのキネティック分析（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＫＤ）を決定するためにＳＰＲ機器を利用した分析結果を示した図面で、Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＧＬＣ  ｃｈｉｐとＰｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）装備を使用してヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１Ｂ、ＨＬ１６１ＣまたはＨＬ１６１Ｄ抗体の相互反応をｐＨ６．０及びｐＨ７．４でそれぞれ分析した：
【図２Ａ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ａ抗体の相互反応をｐＨ６．０で分析した結果である。
【図２Ｂ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ａ抗体の相互反応をｐＨ７．４で分析した結果である。
【図２Ｃ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｂ抗体の相互反応をｐＨ６．０で分析した結果である。
【図２Ｄ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｂ抗体の相互反応をｐＨ７．４で分析した結果である。
【図２Ｅ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｃ抗体の相互反応をｐＨ６．０で分析した結果である。
【図２Ｆ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｃ抗体の相互反応をｐＨ７．４で分析した結果である。
【図２Ｇ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｄ抗体の相互反応をｐＨ６．０で分析した結果である。
【図２Ｈ】ヒトＦｃＲｎとＨＬ１６１Ｄ抗体の相互反応をｐＨ７．４で分析した結果である。
【図３】選別された２種の抗体の細胞表面のヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に対する結合能を示した図面で、細胞表面に存在するヒトＦｃＲｎに結合する選別されたＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体をヒトＦｃＲｎが過発現するＨＥＫ２９３細胞に処理してｐＨ６．０とｐＨ７．４で細胞表面ＦｃＲｎに結合する抗体を確認した結果である。ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体のヒトＦｃＲｎ結合は、各抗体をｐＨ別に細胞に処理した後、Ａｌｅｘａ４８８標識（ｌａｂｅｌｌｅｄ）された抗−ヒトヤギ抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を使用して蛍光活性化セルソーター（Ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ，ＦＡＣＳ）分析を介してＭＦＩ値で表現した。
【図４】ｐＨ６．０条件でヒトＩｇＧとヒトＦｃＲｎ発現細胞結合抑制能分析結果で、細胞表面ヒトＦｃＲｎに結合する選別された２種の抗体がヒトＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧの結合を阻害できるかを細胞レベルで観察した結果を示す図面である。ヒトＦｃＲｎが過発現するＨＥＫ２９３細胞に結合することが確認されたＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体をそれぞれ２００ｎＭから４倍順次希釈を介してＡｌｅｘａ４８８標識されたヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎに対する結合抑制能力に対するプロファイルを確保した。
【図５Ａ−５Ｂ】ヒトＦｃＲｎが発現する形質感染マウスであるＴｇ３２（ｈＦｃＲｎ＋／＋，ｈβ２ｍ＋／＋，ｍＦｃＲｎ−／−，ｍβ２ｍ−／−）から選別された抗体であるＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体がｈＩｇＧ１の異化作用に及ぼす影響を確認した結果を示す図面で、０時間に５ｍｇ／ｋｇのｂｉｏｔｉｎ−ｈＩｇＧと４９５ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを腹腔投与して体内のＩｇＧを飽和させた。薬物の投与は、ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの投与後２４、４８、７２、９６時間後に、５、１０、及び２０ｍｇ／ｋｇの容量でヒトＩｇＧ１、ＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１ＢまたはＰＢＳを１日１回腹腔注射（ｉｐ）して収得した結果である。試料採取は、ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの投与後、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８時間後に行われ、２４、４８、７２、９６時間には、薬物投与前採血をしてＥＬＩＳＡ法でｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの残存量を確認した。結果は、２４時間採血サンプルの残存量を１００％にして各時間帯の残存量を相対的な割合で示した。
【図６】ヒトＦｃＲｎと９６％配列相同性を有するシノモルグス猿を利用して、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂの２種の抗体投与による猿ＩｇＧの血液内変化量を分析した結果を示す図面で、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体をシノモルグス猿に５、２０ｍｇ／ｋｇの容量で週１回静脈投与した結果、猿ＩｇＧの場合、０時間対比最大７０％まで減少して、２９日まで３０％程度減少した：
【図６Ａ】ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体濃度別猿血液内ＩｇＧ減少効果を示したものである。
【図６Ｂ】ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体５ｍｇ／ｋｇ濃度）の猿個体別血液内ＩｇＧ減少効果を示したものである。
【図６Ｃ】ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体（２０ｍｇ／ｋｇ濃度）の猿個体別血液内ＩｇＧ減少効果を示したものである。
【図７Ａ−７Ｂ】シノモルグス猿を利用した試験で、ＨＬ１６１Ａ及びＨＬ１６１Ｂの薬物動態学的プロファイルを分析した結果を示す図面で、全体的にＨＬ１６１Ａに比べてＨＬ１６１Ｂが半減期、ＡＵＣ及びＣｍａｘが高い傾向を示した。
【図８Ａ−８Ｃ】シノモルグス猿を利用した試験で、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体投与による猿ＩｇＭ、ＩｇＡ、そしてアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）の血液内変化量を分析した結果を示す図面で、いずれも数値的に若干の変化はあったが、シノモルグス猿の正常範囲内の変化であるため、試験物質による影響というよりは個体差による結果であると判断された：
【図８Ａ】猿血液内猿ＩｇＭ変化を示したものである。
【図８Ｂ】猿血液内猿ＩｇＡ変化を示したものである。
【図８Ｃ】猿血液内猿アルブミン変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
前記目的を達成するために、本発明では、ＦｃＲｎに高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有して特異的でｐＨ非依存的に結合することができ、ヒトから由来した配列からなって体内投与時免疫反応誘発が殆どない抗体を提供する。
【００３５】
本発明で提供される抗体は、ＦｃＲｎに対する特異性を有する結合分子である。前記抗体は、モノクルロナル抗体（例えば、免疫グロブリンとＦｃ領域を有する全長抗体）、多重エピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及び単一鎖分子だけでなく抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を含むことができるが、これに制限されない。本発明で提供される抗体は、例えば、ヒトＦｃＲｎに対するモノクルロナル抗体であり得る。
【００３６】
モノクルロナル抗体は、マウス抗体を含むことができる。また、モノクルロナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定種、例えばマウスから由来したり、特定抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同じであったり相同性である一方、鎖の残りは、他の種から由来したり、他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同じであったり相同性である「キメラ」抗体だけでなく目的する生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片を含む。「ヒト化抗体」は「キメラ抗体」の下位セットで使用される。
【００３７】
ヒト化に対する代案として、ヒト抗体が生成できる。「ヒト抗体」は、ヒトによって生産されたり、任意のヒト抗体製造技術を使用して製造された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含み、当業界に公示された種々の技術を使用して製造することができる。ヒト抗体は、抗原試験接種に反応して抗体を生産するように変形されたが、その内因性ローカス（ｌｏｃｕｓ）が機能しないトランスジェニック動物、例えば免疫処理されたゼノマウス（ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）に抗原を投与して作られる。本発明で提供される抗体は、例えば、ヒト抗体の形態を有することができる。
【００３８】
基本４鎖抗体単位は、２個の同じ軽鎖（Ｌ）及び２個の同じ重鎖（Ｈ）からなる異種４量体糖タンパク質である。軽鎖は、Ｎ−末端で可変領域（ＶＬ）を有し、続いてその他の端部で不変領域を有する。重鎖は、Ｎ−末端で可変領域（ＶＨ）を有し、続いてそれぞれα及びγ鎖に対して３個の不変領域（ＣＨ）及びμ及びεイソ型に対して４個の不変領域（ＣＨ）を有する。
【００３９】
「可変」は、可変領域の特定の部分が抗体の間で配列が大きく異なることを示す。Ｖ領域は、抗原結合を媒介して、その特定抗原に対する特定抗体の特異性を規定する。可変性は、軽鎖及び重鎖可変領域共に超可変領域（ＨＶＲ）、すなわち、ＣＤＲで呼ばれる３個のセグメントに集中する。可変領域のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖及び軽鎖可変領域は、Ｎ−末端からＣ−末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４構造を有する。
【００４０】
本発明では、ヒト免疫グロブリンと形質転換動物を利用して、ヒトＦｃＲｎに親和度と特異性を有する抗体を収得した。形質転換動物は、動物のＩｇ生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）遺伝子を不活性化させ、ヒトのＩｇ生殖細胞遺伝子ローカスを移植して製造することができる。形質転換動物を利用した場合、動物の免疫体系によって自然に抗体が最適化されて親和度改善（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）が必要でなく、速い時間内に免疫原性が低く高い親和度を有する抗体医薬品の開発が可能な長所がある（ＵＳ２００９００９８１３４，ＵＳ２０１００２１２０３５，Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４０：２９３２，２０１０）。
【００４１】
本発明では、ヒト免疫グロブリンと形質転換ラットに対する特許技術を保有しているＯＭＴ社（米国）のＯｍｎｉＲａｔＴＭを活用した。ＯｍｎｉＲａｔＴＭは、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインがラット遺伝子でＶ、Ｄ、Ｊ領域とＣＨ１ドメインがヒト遺伝子で構成された重鎖を含み、ヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖とラムダ（ｌａｍｄａ）軽鎖を含んで効率よくヒトＦｃＲｎに対する親和度が高い抗体を選別することができる（Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４０：２９３２，２０１０）。
【００４２】
ＦｃＲｎに対する親和度が高いモノクルロナル抗体を得るために、形質転換ラット（ＯｍｎｉＲａｔＴＭ）にヒトＦｃＲｎを注射して免疫化させた後、Ｂ細胞を抽出して骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを製造した後、製造されたハイブリドーマから生産された抗体を精製した。
【００４３】
本発明に係る抗体は、ＦｃＲｎとの結合に当たり、ＩｇＧの非競合的阻害剤として作用する。本発明に係る抗体とＦｃＲｎ結合によってＦｃＲｎに対する病原性抗体の結合が阻害されて、これにより、個体の体内から病原性抗体の体内から病原性抗体のクリアランス、すなわち除去が促進されて半減期が減少することになる。
【００４４】
本発明で使用される「病原性抗体」とは、病的な状態または疾病を引き起こす抗体を意味する。このような抗体は、例えば、抗血小板抗体、抗アセチルコリン抗体、抗核酸抗体、抗リン脂質抗体（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗コラーゲン抗体（ａｎｔｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗ガングリオシド抗体（ａｎｔｉ−ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗デスモグレイン抗体（ａｎｔｉ−ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）などであってもよいが、これに限定されない。
本発明に係る抗体は、生理学的ｐＨ、すなわちｐＨ７．０〜７．４で病原性抗体とＦｃＲｎとの結合を非競合的に阻害することができる長所がある。ＦｃＲｎは、そのリガンド、すなわちＩｇＧにｐＨ依存的に結合して、酸性でない生理学的ｐＨでは、ＩｇＧに対して実質的に親和性を示さない。従って、生理学的ｐＨでＦｃＲｎに特異的に結合する抗−ＦｃＲｎ抗体は、ＩｇＧとＦｃＲｎの結合に非競合的阻害剤として作用して、この場合、ＦｃＲｎへの抗−ＦｃＲｎ抗体の結合は、ＩｇＧの存在の有無に影響されない。従って、ｐＨ非依存性によってＩｇＧと非競合的にＦｃＲｎと結合する本発明に係る抗体は、競合的阻害剤、すなわちＩｇＧと競争的にＦｃＲｎに結合する既存の抗体に比べてずっと低い濃度だけでもＩｇＧのＦｃＲｎ媒介信号伝達による疾病の治療が可能である長所がある。また、ＦｃＲｎと結合した状態で細胞内移動の過程において、本発明に係る抗ＦｃＲｎ抗体は、ＦｃＲｎに対して血中ＩｇＧより高い親和度で結合を維持するので、ＩｇＧとＦｃＲｎが結合できる酸性ｐＨ環境であるエンドソーム内でもＩｇＧとＦｃＲｎの結合を阻害できて、ＩｇＧのクリアランスを促進できる効果を有する。
【００４５】
本発明に係る抗体は、ＩｇＧがＦｃＲｎに結合できない環境である生理学的ｐＨ、すなわちｐＨ７．０〜７．４でもＦｃＲｎに親和性を有してｐＨ６．０では血中内ＩｇＧよりＦｃＲｎにさらに高い親和性を有して非競合的阻害剤として作用する。
【００４６】
一観点において、本発明は、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４２で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０及び配列番号４３で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１及び配列番号４４で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＦｃＲｎに特異的に結合する分離された抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片に関する。
【００４７】
本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は、本発明の要旨を利用して前記配列番号に記載されたアミノ酸配列を一部欠失、付加または置き換えても本発明の目的を達成できる限り、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
また、前記配列番号に記載されたヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と特定範囲で相同性を有する配列も本発明の目的を達成できる限り、本発明の範囲に含まれる。「相同性」とは、配列番号１〜４４からなるグループで選択される一つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と類似する程度を示すものであって、９０％以上同じ配列を含み、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同じ配列を含むことができる。相同性の比較は、公示の目視または比較プログラムを利用して行う。市販されるコンピュータプログラムは、２個以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができる。相同性（％）は、隣接した配列に対して計算されることができる。
【００４９】
さらに、本発明の目的を達成できる限り、ｐＨ６．０とｐＨ７．４の条件でＫＤ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）が０．０１〜２ｎＭであるＦｃＲｎに特異的に結合する抗体も本発明の範囲に含まれることができる。本明細書で使用される「ＫＤ」とは、抗体抗原の結合に対する平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を意味して、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ（ｋａは、ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔを意味し、ｋｄは、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔを意味する）を介して導き出すことができ、ｋｄまたはｋａの測定は、２５℃または３７℃で実行されることができる。
【００５０】
一実施例において、本発明の抗体またはこれの断片は、
配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含んでもよい。
【００５１】
前記配列番号で表されたアミノ酸配列は、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に該当するアミノ酸配列であってもよい。
【００５２】
さらに他の実施例において、本発明の抗体またはこれの断片は、
配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含んでもよい。
【００５３】
前記配列番号で表されたアミノ酸配列は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に該当するアミノ酸配列であってもよい。
【００５４】
本発明に係る抗体またはこれの断片は、具体的に、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域で構成された群から選択された一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５５】
一実施例において、本発明に係る抗体またはこれの断片は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号２０で構成された群から選択される一つ以上のアミノ酸配列を含む一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５６】
具体的に、本発明に係る抗体またはこれの断片は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／または配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５７】
本発明に係る抗体またはこれの断片は、具体的に、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域で構成された群から選択された一つ以上の重鎖及び軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５８】
本発明に係る「断片」または「抗体断片」とは、全長（ａ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）抗体ポリペプチドを含まないが、抗体ポリペプチド分子（例えば、抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチド）由来ポリペプチドを意味するか、依然として全長抗体ポリペプチドの少なくとも部分を含む。抗体断片は、切断断片に限定されないが、全長抗体ポリペプチドの切断部分を含むポリペプチドをたびたび含む。抗体を参照して使用される用語として断片は、抗体ポリペプチド由来単一鎖ポリペプチド（ｅ．ｇ．重鎖または軽鎖抗体ポリペプチド）を含む断片を含むので、抗体断片は、それ自体で抗原に結合できないことがある。
【００５９】
本発明に係る抗体は、抗体の断片も含む。本発明での抗体の断片は、単一鎖抗体、二重特異抗体、三重特異抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディのような多重特異抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、デュアル−特異抗体、ミニボディ、スキャップ（ｓｃａｐ：ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、キレート組換え抗体、トリボディ、バイボディ（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ、ナノボディ、ＳＭＩＰ（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、結合ドメイン免疫グロブリンと融合タンパク質、ラクダ抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、含ＶＨＨ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、抗体不変領域誘導体、及びＦｃＲｎに結合能を保有するタンパク質スキャフォールドに基づいた合成抗体を含むか、これに制限されない。
【００６０】
ＦｃＲｎに対する結合機能が維持される限り、本発明に係るいかなる形態の抗体の断片も本発明に係る抗体と同じ特性を示す点は、通常の技術者には自明である。
【００６１】
また、本発明の抗体または断片の特性が維持される限り、可変領域内での変移が起きた抗体も本発明の権利範囲に含まれる。その例として、可変領域でのアミノ酸の保存的置換が起きた抗体が挙げられる。保存的置換は、本来のアミノ酸配列と類似する特性を有する他のアミノ酸残基への置換を意味するが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンは、塩基の側鎖を有していて、類似する特性を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸は、酸側鎖を有する点で類似する特性を有する。また、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンは、比電荷極性の側鎖を有する点で特性が類似して、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンは、非極性の側鎖を有している点で、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンは、芳香族の側鎖を有している点で類似する特性を有する。従って、前記の通りに類似する特性を有するグループ内でのアミノ酸置換が起きても特別な特性変化が見られない点は、通常の技術者には自明なことであるため、本発明に係る抗体の特性が維持される限り、可変領域内での保存的置換による変移が起きた抗体も本発明の権利範囲に含まれる。
【００６２】
また、本発明に係る抗体またはその断片は、他の物質と接合された複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形態でも利用可能である。本発明に係る抗体またはその断片と接合して利用できる物質としては、通常自己免疫疾患の治療に利用される治療剤及びＦｃＲｎの活性を阻害できる物質、または血液、血清、リンパ、またはその他組織の循環系内でこれの安定化及び／または維持を向上させるモイアティ（ｍｏｉｅｔｙ）と物理的に連結される。例えば、ＦｃＲｎ−結合抗体は、重合体、例えば、ポリアルキレン酸化物またはポリエチレン酸化物とのような非−抗原性重合体と連結されることができる。適切な重合体は、重量によって実質的に変わる。約２００〜約３５，０００（または、約１，０００〜約１５，０００、そして２，０００〜約１２，５００）の範囲の平均分子量を有する重合体が利用されることができる。例えば、ＦｃＲｎ−結合抗体は、水溶性重合体、例えば親水性ポリビニール重合体、例えば、ポリビニルアルコールとポリビニルピロリドンに接合されることができる。このような重合体の種類には、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化されたポリオールのようなポリアルキレン酸化物のホモポリマー、共重合体、そしてこれらのブロック共重合体などが代表的な例であるが、これに限定されない。但し、これらのブロック共重合体の水溶解度が維持されなければならない。
【００６３】
他の観点において、本発明は、前記抗体またはこれの断片、及び一つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物、自己免疫疾患治療用薬学組成物に関する。また、本発明は、自己免疫疾患の治療を必要とする患者に有効量のＦｃＲｎに特異的に結合する抗体またはこれの断片を投与する工程を含む自己免疫疾患の治療方法に関する。
【００６４】
前記薬学組成物には、薬学的に許容可能な通常の担体及び賦形剤などが追加的に含まれることができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明に係る抗体などの有効性分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、散剤、精製、カプセル剤、液剤、注射剤、軟こう剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００６５】
前記薬学的組成物は、ＩｇＧとＦｃＲｎによって媒介されるいずれの自己免疫疾患に適用されるが、代表的な疾患としては、免疫性好中球減少症、ギラン・バレー症候群、テンカン、自己免疫性脳炎、アイザックス症候群、母斑症候群、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性貧血、自己免疫性グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、ループス及び特発性血小板減少性紫斑病、ループス腎炎、膜性腎症などがあるが、これに限定されない。
【００６６】
本発明に係る治療方法で、抗体の投与量は、患者の重症度、状態、年齢、疾患経歴などを考慮して適切に決定されるが、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜２ｇ／ｋｇの投与量で投与されることができる。前記抗体は、単回または数回投与されることができる。
本発明に係る抗体またはこれの断片を治療が必要な個体に投与することを含む自己免疫性または同種免疫性状態を緩和する方法を提供して、同時に特定抗−ＦｃＲｎ療法も提供する。
【００６７】
本発明に係る自己免疫性または同種免疫性状態を緩和する方法または抗−ＦｃＲｎ療法は、本発明に係る薬学組成物を個体に投与することによって達成されてもよいが、本発明に係る薬学的組成物は、経口または、非経口投与が可能で、具体的には、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能であるが、これに限定されない。本発明に係る薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができるが、単回または繰り返し投与されることができる。一般に１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜４０ｍｇ／ｋｇを自己免疫性または同種免疫性症状を有する患者に投与できて、このような投与計画は、好ましくは血清内因性ＩｇＧ濃度を治療前の値の７５％未満に減らすように設計することができ、患者の状態などを勘案して間欠的または慢性的（継続的）投薬方針を適用することができる。
【００６８】
本発明はさらに、本発明に係る抗体またはこれの断片を含む診断用組成物及びこれを利用した診断方法を提供する。すなわち、本発明に係るＦｃＲｎに結合する抗体またはこれの断片は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）と生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）診断的有用性を有する。
【００６９】
さらに他の観点において、本発明は、ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体またはこれの断片を含むＦｃＲｎ検出用組成物に関する。本発明はさらに、前記ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体またはこれの断片を処理する工程を含む試験管内または生体内でＦｃＲｎの存在を検出するための方法に関する。
【００７０】
試験管内検出方法は、例えば（１）サンプルをＦｃＲｎ−結合抗体と接触させる工程；（２）ＦｃＲｎ−結合抗体とサンプルとの間に複合体の形成を検出する工程；及び／または（３）参考サンプル（例えば、対照サンプル）を抗体と接触させる工程；（４）参考サンプルと比較して抗体とサンプルとの間に複合体の形成の程度を決定する工程を含むことができる。対照サンプルまたは個体と比較して、サンプルまたは個体内に複合体の形成における変化、例えば、統計的に有意な変化は、サンプル内にＦｃＲｎの存在を意味することになる。
【００７１】
生体内検出方法は、（１）ＦｃＲｎ−結合抗体を個体に投与する工程；（２）ＦｃＲｎ−結合抗体と個体との間に複合体の形成を検出する工程を含むことができる。検出は、複合体形成の位置または時点を決定することを含むことができる。ＦｃＲｎ−結合抗体は、結合または結合しなかった抗体の検出を容易にする検出可能物質で、直接的にまたは間接的に標識化されることができる。適切な検出可能物質には、様々な酵素、補綴グループ、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。ＦｃＲｎ−結合抗体とＦｃＲｎとの間に複合体形成は、ＦｃＲｎに結合した抗体または結合しなかった抗体を測定したり可視化させることによって検出されることができる。伝統的な検出分析、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）または組織免疫組織化学（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が利用されることができる。ＦｃＲｎ−結合抗体の標識化に加えて、ＦｃＲｎの存在は、検出可能物質で標識化された基準及び標識化されなかったＦｃＲｎ−結合抗体を利用した競合免疫分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によってサンプル内で分析されることができる。このような分析の一つ実例で、生物学的サンプル、標識化された基準、そしてＦｃＲｎ−結合抗体が結合して、そして標識化されなかった抗体に結合した標識化された基準の量が測定される。サンプル内にＦｃＲｎの量は、ＦｃＲｎ−結合抗体に結合した標識化された基準の量と反比例する。
【００７２】
診断目的での使用のために、本発明に係る抗体またはこれの断片は、蛍光団または発色団で標識化されることができる。抗体及び他のタンパク質が、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するため、蛍光モイアティは、３１０ｎｍ超、好ましくは４００ｎｍ超の波長で実質的な吸収を有するように選択されなければならない。様々な適切な蛍光物質と発色団は、蛍光発色団群で標識化されることができる。蛍光発色団群中一群の蛍光物質は、キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅ）染料であるが、ここにはフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）とローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）が含まれる。他の群の蛍光化合物は、ナプチルアミン（ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）である。蛍光団または発色団で一度標識されると、抗体は、例えば、蛍光鏡検（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）またはデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）鏡検）を利用してサンプル内でＦｃＲｎの存在または局地化を検出するのに利用されることができる。
【００７３】
本発明に係る抗体またはこれの断片を利用したＦｃＲｎの存在または局地化の可否は、組織学的分析、タンパク質アレイ（ａｒｒａｙｓ）、ＦＡＣＳ（蛍光活性化した細胞分類）等の様々な方法によって検出が可能である。
【００７４】
本発明で生体内ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎ−発現組織の存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像検出方法により確認されることができる。前記方法は（１）個体（例えば、自己免疫疾患患者）に、検出可能マーカーに接合された抗−ＦｃＲｎ抗体を投与する工程；（ｉｉ）ＦｃＲｎ−発現組織または細胞に対する検出可能マーカーを検出するための手段に前記個体を露出させる工程を含む。例えば、個体は、一例として、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段によって画像診察される。診断的画像診察に有用なラベルの例として、放射性ラベル、蛍光ラベル、陽電子放出同位元素（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｉｓｏｔｏｐｅ）、化学発光物質、発光酵素などが挙げられる。放射性標識化された抗体は、試験管内診断検査にも利用されることができる。同位元素−標識化された抗体の特異的な活性は、半減期、放射性ラベルの同位元素純度、そしてラベルが抗体内に統合される方法に左右される。
【００７５】
本発明はさらに、ＦｃＲｎに結合する抗体またはこれの断片、及び診断的用途、例えば、試験管内で、例えば、サンプル、例えば、自己免疫疾患患者から生検または細胞内で、または生体内で、例えば、個体を画像診察することによってＦｃＲｎを検出するための、ＦｃＲｎ−結合抗体またはこれの抗原−結合断片の用途に対する使用説明書を含むキットを提供する。前記キットは、少なくとも一つの追加的な試薬、例えばラベルまたは追加の診断剤をさらに含むことができる。生体内利用の場合に、抗体は、製薬学的組成物として調製されることができる。
【００７６】
他の観点において、本発明は、前記ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体またはこれの断片をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００７７】
一実施例において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９で構成された群から選択される一つ以上の配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む抗−ＦｃＲｎ抗体またはこれの断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００７８】
具体的に、本発明に係る抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９及び／または本発明に係る抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９である。
【００７９】
さらに他の観点において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター主細胞を利用してＦｃＲｎに特異的に結合する抗体またはこれの断片を製造する方法に関する。
【００８０】
一実施例において、前記抗体またはこれの断片は、特に遺伝子組換え法で発現及び精製して製造することが好ましいが、具体的に本発明に係るＦｃＲｎに特異的に結合する抗体をコードする可変領域をそれぞれ別々に、または一つの宿主細胞で同時に発現させて製造することが好ましい。
【００８１】
本発明で「組換えベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。本発明で「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と目的するタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で周知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができて、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、本発明が属する技術分野で一般に知られた酵素などを使用して容易に行うことができる。
【００８２】
本発明で使用されることができる適した発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終結コドンは、一般に免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされて、遺伝子作製物が投与された時、個体で必ず作用を示すべきであり、コード配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）になければならない。一般プロモーターは、構成的または誘導性でありうる。原核細胞にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７プロモーターがあるが、これに制限されない。真核細胞には猿ウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）由来のプロモーターがあるが、これに制限されない。前記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。選択マーカーはベクターで形質感染された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されることができる。選択剤が処理された環境で選別マーカーを発現する細胞だけ生存するので、形質感染された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターである場合、複製が開始される特定核酸配列である複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。組換え発現ベクターでは、プラスミド、ウイルス、コズミド（ｃｏｓｍｉｄｓ）等様々な形態のベクターを使用することができる。組換えベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の種々の宿主細胞で所望の遺伝子を発現して所望のタンパク質を生産する機能をする限り特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しながら自然状態と類似した形態の外来タンパク質を大量生産できるベクターが好ましい。
【００８３】
本発明に係る抗体またはこれの断片を発現させるために種々の発現宿主／ベクターの組合せが利用されることができる。核細宿主に適した発現ベクターとしては、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した現調節配列などが使用されるが、これに限定されない。細菌宿主に使用できる発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴＲ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示することができるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性一本鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２℃プラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１である。
【００８４】
前記組換えベクターは、宿主細胞に挿入されて形質感染体を形成するが、適切な宿主細胞は大腸菌、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のような原核細胞であってもよい。また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような真菌、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサのような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫から由来した細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であってもよい。
【００８５】
前記宿主細胞は、好ましくは植物、ほ乳動物から由来されるが、猿腎臓細胞（ＣＯＳ７）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８、子ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に好ましくはＣＨＯ細胞である。
本発明で宿主細胞での「形質感染」または「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法が含まれて、当分野で公示された通り、宿主細胞により適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を利用した撹はん、アグロバクテリアが媒介された形質感染、ＰＥＧ、デキストランサルフェート、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質感染方法などが含まれるが、これに制限されない。
【００８６】
組換えベクターが発現する形質感染体を栄養培地で培養することによって、本発明に係るＦｃＲｎ特異的抗体を大量生産できて、培地と培養条件は、宿主細胞により慣用できるものを適当に選択利用することができる。培養時細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適切に調節することができる。前記通り組換え的に生産された抗体または抗体断片は、培地または細胞分解物から回収できて、通常の生化学分離技術によって分離、精製が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））。例示的に、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、エレクトロフォーカシング及びこれの様々な変化及び複合方法などが利用可能であるが、これに限定されず、特にプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）を利用して分離、精製することが好ましい。
【００８７】
本発明で選別された抗体がｐＨ７．４条件でそれぞれ約３００ｐＭ以下と約２ｎＭ以下の抗原結合力（ＫＤ値）を示し、ｐＨ６．０条件ではそれぞれ２００ｐＭ以下と９００ｐＭ以下のＫＤ値を示した。このように本発明で選別された抗体は、ｐＨ６．０とｐＨ７．４条件で共に０．０１〜２ｎＭレベルの強いｈＦｃＲｎ結合力を有していて、細胞外部で結合した抗体がエンドソームまで結合を維持することで、抗体とｈＦｃＲｎとの結合を抑制する効果が優れると判断される。また、このような抗体及びｈＦｃＲｎ結合抑制効果は、ヒトＦｃＲｎを発現する細胞株とＦＡＣＳを利用した抑制能分析でも確認された。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００８９】
［実施例１］形質転換ラットを利用した抗ＦｃＲｎ抗体発現ライブラリー製作
計６匹の形質転換ラット（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）、ＯＭＴ社）を使用して免疫（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を行った。免疫原は、ヒトＦｃＲｎを使用した。ラットの両側足の裏に０．００７５ｍｇずつヒトＦｃＲｎを補強剤と共に２４日間３日間隔で８回免疫して２８日目に最後に５〜１０μｇの免疫原をＰＢＳバッファーに希釈して免疫した。２８日目にラット血清を取って抗体価（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ）確認に使用した。３１日にラットを安楽死させて膝窩リンパ節（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）と鼠径リンパ節（ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）をＰ３Ｘ６３／ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞と融合するために回収した。
【００９０】
ラット血清上の抗体価を測定するために、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。まず、ヒトＦｃＲｎをＰＢＳ（ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）バッファーで希釈して２μｇ／ｍＬの溶液を作った後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μＬずつ付着（ｃｏａｔｉｎｇ）した後、４℃で１８時間以上放置した。洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）３００μＬで３回洗浄して結合しなかったヒトＦｃＲｎを除去した後、各ｗｅｌｌにｂｌｏｃｋｉｎｇバッファー２００μＬを入れて常温で２時間放置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。分析血清サンプルを１／１００に希釈した後、この溶液を２倍連続希釈して計１０個の希釈倍率（１／１００〜１／２５６，０００）の分析試料を作った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ後、洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄した後、分析試料を入れて常温で２時間放置した。３回洗浄後、２次測定抗体をＰＢＳバッファーに１：５０，０００になるよう希釈してｗｅｌｌに１００μＬずつ入れて常温で２時間放置した。さらに３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を１００μＬずつ入れて常温で１０分間反応させた後、１Ｍの含硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）反応停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）５０μＬを入れて反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍのＯＤ値を測定した。免疫による抗ｈＦｃＲｎ  ＩｇＧ役価は、多くは１／１００希釈条件でＯＤ４５０ｎｍ値が１．０以上で免疫しなかったラットの血清に比べて高く測定されて免疫が良好にできたことを確認した。
【００９１】
ポリエチレングリコールを使用して融合した計３個のハイブリドーマライブラリーＡ、Ｂ、Ｃを作った。まず形質転換ラット１と５を使用してハイブリドーマライブラリーＡを作って、ラット２と６を使用してハイブリドーマライブラリーＢを、ラット３と４を利用してハイブリドーマライブラリーＣを作った。各ハイブリドーマライブラリー製作のための融合混合液は、７日間ＨＡＴが含まれた培地で培養して、ＨＡＴによって融合した細胞だけ選別されるようにした。ＨＡＴ培地で生き残ったハイブリドーマ細胞は集めてＨＴ培地で６日程度培養した後、上澄み液を取ってラットＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＲＤ−ｂｉｏｔｅｃｈ社）を利用したラットＩｇＧの定量を測定した。まず、各試料を１：１００に希釈してＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  ｗｅｌｌに１００μＬずつ入れて、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された抗ラットＩｇＧと混ぜた後、１５分常温で反応させた。ＴＭＢ溶液を１００μＬずつ入れて常温で１０分間反応させた後、１Ｍの含硫酸反応停止液５０μＬを入れて反応を終了させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【００９２】
［実施例２］ハイブリドーマライブラリーの抗ｈＦｃＲｎ抗体の抗原結合力及びＩｇＧ結合妨害能力評価
ヒトＦｃＲｎに対する抗体結合力を分析するために前記方法と同じＥＬＩＳＡ分析（ｐＨ６．０とｐＨ７．４）を実施した。３種のハイブリドーマライブラリー（Ａ、Ｂ、Ｃ）のｈＦｃＲｎ結合力評価結果は、ｐＨ６．０の条件とｐＨ７．４の条件共にＡ＞Ｃ＞Ｂライブラリー順であった。
【００９３】
３種のハイブリドーマライブラリー培養上澄み液を利用して５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬでＦＡＣＳを利用したｈＦｃＲｎ結合力評価をｐＨ６．０とｐＨ７．４で行った。ヒトＦｃＲｎ発現安定化ＨＥＫ２９３細胞をフラスコから剥ぎ取った後、反応溶液（０．０５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ，ｐＨ６．０  ｏｒ  ｐＨ７．４）に混合した。２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞数になるべく希釈した後、５０μＬずつ９６ｗｅｌｌに入れて、これに１０ｎｇ／ｍＬと５０ｎｇ／ｍＬに希釈したハイブリドーマライブラリー培養上澄み液を５０μＬずつｗｅｌｌに入れて混合して抗体を結合させた。Ａ４８８  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｒＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ａｂを１：２００で反応溶液に希釈して１００μＬずつｗｅｌｌに分注して細胞ペレットに混合して結合反応を進めた後、反応溶液１５０μＬを入れてＦＡＣＳ（ＢＤ）で測定判読した。ＥＬＩＳＡ結果と同様にハイブリドーマライブラリーＡが最も抗原結合力（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）が高いことを確認することができた。
【００９４】
ＦＡＣＳを利用したハイブリドーマライブラリーのヒトＦｃＲｎ抑制能評価は、ｐＨ６．０で実施した。まず、ｎａｉｖｅ  ＨＥＫ２９３細胞とヒトＦｃＲｎと発現ＨＥＫ２９３細胞を反応溶液（０．０５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ，ｐＨ６．０）に混合した。１ｘ１０５細胞を９６ｗｅｌｌに入れた後、それぞれのハイブリドーマライブラリー培養上澄み液は、４ｎＭとこれを１０倍に希釈した０．４ｎＭ濃度を処理した。ｈＩｇＧ結合抑制能の可否を確認するために、１００ｎＭ  Ａ４８８−ｈＩｇＧ１を各ｗｅｌｌに添加した後、氷で９０分間反応させた。反応が終わると、反応溶液１００μＬを入れて細胞ペレットを洗浄して、Ｕ字型底試験管に移した後、ＦＡＣＳで測定判読した。ヒトＦｃＲｎと発現安定化細胞に１００ｎＭ  Ａ４８８−ｈＩｇＧ１が残っている量を測定した後、結合抑制能（％）を求めた。基準対照群（Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）でｈＩｇＧ１を使用して、陽性対照群で以前に開発したＨＬ１６１−１Ａｇ抗体を使用して抗体結合抑制能を比較評価した。各対照群は、１μＭと２μＭの濃度で分析して、ハイブリドーマライブラリー試料は、０．４ｎＭと４ｎＭの二つの濃度で測定した。その結果、ハイブリドーマライブラリーＡが最も高い結合抑制能効果を示すことを確認した。
【００９５】
［実施例３］ＦＡＣＳを利用したハイブリドーマ細胞クローン分離及びヒト抗体確保
最も高いヒトＦｃＲｎ結合力と抑制能を示したハイブリドーマライブラリーＡを使用してＦＡＣＳでクローンを分離して計４４２個の単一クローンを確保した。再び分離した単一クローンをＨＴ培地で培養後、上澄み液を得てＦＡＣＳでｈＦｃＲｎに結合する抗体発現ハイブリドーマクローンを選別した結果、１００個のクローン（Ｍ１〜Ｍ１００）がｈＦｃＲｎ発現ＨＥＫ２９３細胞に強く結合することを確認することができた。
【００９６】
ＦＡＣＳ分析を介して選別された１００個のｓｉｎｇｌｅクローンのＲＮＡを分離して、シーケンスを分析した。１次シーケンス分析結果、１００個中８８個のシーケンスが分析されて、これをアミノ酸配列を基準に計３５個のグループ（Ｇ１〜Ｇ３８）に分けた。培養液を確保することができなかった２個のクローン（Ｇ３３、Ｇ３５）を除いて３３個のグループの代表クローンの培養上澄み液を１００ｎｇ／ｍＬ濃度に希釈してｈＦｃＲｎに対する結合力をＥＬＩＳＡで評価した。
【００９７】
前の実験と同じにＦＡＣＳを利用したｈＦｃＲｎ結合力評価をｐＨ６．０と７．４条件で実施した。クローン間結合力程度による順位は、ｐＨ別に類似して分析されて、結合強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は様々なレベルで示された。
【００９８】
また、前記３３個のクローンに対するｐＨ６．０でｈＦｃＲｎ抑制能評価をＦＡＣＳを利用して分析した。測定されたＭＦＩ値に基づいて抑制能（％）を算出した。１６６７ｐＭ濃度で抑制能分析結果値を基に計４個のグループに分けて、７０〜１００％であるグループをＡ、３０〜７０％であるグループをＢ、１０〜３０％であるグループをＣ、１０％以下であるグループをＤと定めた。
【００９９】
ＳＰＲを利用したハイブリドーマクローンのキネティック分析は、ヒトＦｃＲｎを固定化した後、ハイブリドーマ培養液を分析試料として使用して進めた。いくつかのクローンを除いた多くのクローンは、１０６Ｍ以上のｋｏｎ値を示し、ｋｏｆｆ値は１０−３Ｍ以下で測定された。結論的に、全てのクローンが、１０−９〜１０−１１ＭのＫＤ値を有することが確認された。
【０１００】
３５種のハイブリドーマクローン中ｈＦｃＲｎ抑制能結果に応じて分けたＡとＢグループの抗体配列中ＣＤＲシーケンス部位にＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎまたはｆｒｅｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅが存在しない１８種クローンの遺伝子を完全な形態のヒトＩｇＧ配列に転換した。
【０１０１】
まず１８種の選別された抗体ＶＨとＶＬとヒト抗体生殖細胞系列（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）抗体群のアミノ酸配列相同性をＮＣＢＩのウェブページ（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）のＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用して調べた。
【０１０２】
１８種のヒト抗体遺伝子をクローニングするために、遺伝子両端に次の通り制限酵素認識部位を挿入した。重鎖可変領域（ＶＨ）にはＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ、軽鎖ラムダ可変領域（ＶＬ（λ））にはＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを軽鎖カッパ可変領域（ＶＬ（κ））にはＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ制限酵素認識部位を入れて設計して、軽鎖可変領域（ＶＬ）の場合、遺伝子クローニング時、軽鎖ラムダ可変（ＶＬ（λ））遺伝子配列は、ヒト軽鎖不変（ＬＣ（λ）  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子、そして軽鎖カッパ可変（ＶＬ（κ））遺伝子配列は、ヒト軽鎖不変（ＬＣ（κ）  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子に連結した。
【０１０３】
動物細胞で抗体発現のためのｐＣＨＯ１．０発現ベクタークローニングは、軽鎖と重鎖遺伝子をＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩ、ＡｖｒＩＩそしてＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で切断して、それぞれ挿入した。計１８種の確認されたヒト抗体遺伝子を含むｐＣＨＯ１．０発現ベクターは、合成遺伝子配列と一致するかを確認するために、遺伝子塩基配列分析（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。
【０１０４】
発現用ｐＣＨＯ１．０ベクターには、抗体軽鎖と重鎖遺伝子を共に含む動物細胞発現システムとして完全なヒトＩｇＧ形態を発現した。ヒト抗体は、前記各抗体のプラスミドＤＮＡをＣＨＯ−Ｓ細胞に一時的形質感染させて、培地で分泌された抗体をプロテインＡカラムを利用して精製することによって収得した。
【０１０５】
ｈＦｃＲｎが発現するＴｇ３２（ｈＦｃＲｎ＋／＋、ｈβ２ｍ＋／＋、ｍＦｃＲｎ−／−、ｍβ２ｍ−／−）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にヒトＩｇＧを注射した後、前記ヒトＩｇＧ配列に転換した１８種のヒト抗体を投与してヒトＩｇＧの異化作用に影響を与えるかを調べてみた。
【０１０６】
先述の抗原に対する結合力（ＫＤ）とＦＡＣＳを利用したヒトＦｃＲｎ結合力及び抑制能分析等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析結果とＴｇ３２マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏヒトＩｇＧの異化作用に最も効果的に作用した４種のヒト抗ＦｃＲｎ抗体、ＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１Ｂ、ＨＬ１６１Ｃ、そしてＨＬ１６１Ｄ抗体タンパク質を確保した（図１）。また、ＨＬ１６１Ｂ抗体の重鎖可変フレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域８３番目Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ（Ｎ）をＬｙｓｉｎｅ（Ｋ）に置き換えてＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅを除去したＨＬ１６１ＢＫ抗体を確保した。これらのそれぞれの軽鎖と重鎖可変領域の遺伝子塩基配列とアミノ酸配列及びＣＤＲ配列は下記の表１、２、３のとおりである。
【０１０７】
【表１】
0006449441.tif 000002
0006449441.tif 000003
0006449441.tif 000004
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
［実施例４］ＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１Ｂ／ＨＬ１６１Ｃ／ＨＬ１６１ＤのＳＰＲを介した抗体の抗原結合力測定
ＳＰＲを介したＨＬ１６１Ａ、ＨＬ１６１Ｂ、ＨＬ１６１Ｃ、及びＨＬ１６１Ｄ抗体の結合力は、水溶性ｈＦｃＲｎをリガンドでＰｒｏｔｅｏｎ  ＧＬＣ  ｃｈｉｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に固定化して親和度を測定する方法で進めた。キネティック分析は、Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６装備を使用して、ｓｈＦｃＲｎをＧＬＣ  ｃｈｉｐに固定化させて、抗体試料を５濃度で反応させた後、センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）結果を確保した。キネティック分析は１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌを適用して、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４の各条件で６回繰り返し分析して、平均ＫＤ値を求めた。固定化段階により、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、ＥＤＡＣ／ＮＨＳ  ０．５Ｘ、３０μＬ／ｍｉｎ、３００ｓｅｃの条件でｃｈｉｐ活性化を進めた後、固定化は、アセテートバッファー（ｐＨ５．５）を使用してｓｈＦｃＲｎを２μｇ／ｍＬ、２５０μＬで製造して３０μＬ／ｍｉｎで流しながら固定化レベル２００〜３００ＲＵに該当する時、反応を中止した。以後、非活性化は、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を使用して３０μＬ／ｍｉｎ、３００ｓｅｃで進めた。各ＨＬ１６１抗体は、１０ｎＭ濃度を基準に５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、０．３１２ｎＭなど１／２ずつ段階希釈して試料を準備した。試料希釈は、分析ｐＨにより１Ｘ  ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）または、１Ｘ  ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）バッファーを使用して進めた。試料分析条件は、結合は５０μＬ／ｍｉｎ、２００ｓｅｃで反応させて、解離段階は、５０μＬ／ｍｉｎ、６００ｓｅｃで進めた後、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）バッファー（ｐＨ２．５）を使用して１００μＬ／ｍｉｎ、１８ｓｅｃで反応させて再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）した。試料当たり６回キネティック分析後、平均抗原結合力（ＫＤ）を測定した。ＳＰＲ分析結果として出てきた抗体のキネティックパラメーター（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）は表４に示した（図２Ａ〜図２Ｈ）。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
［実施例５］ＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１ＢのＦＡＣＳを利用した抗体のヒトＦｃＲｎ結合分析
ヒトＦｃＲｎを発現するＨＥＫ２９３安定化細胞を対象にＦｃＲｎに対するｐＨ別結合程度をＦＡＣＳシステムを使用して分析した。ＦＡＣＳを利用したＦｃＲｎ結合試験は、評価しようとするｐＨにより反応溶液をｐＨ６．０とｐＨ７．４の条件で実施した。まず１００，０００個のヒトＦｃＲｎ安定化ＨＥＫ２９３ｃｅｌｌをＰＢＳバッファーで洗浄して、卓上用マイクロ遠心分離機で４５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞ペレットで作った。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４  ＰＢＳ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  １００μＬに抗体を添加した。残っている細胞ペレットに反応溶液を入れて混合して細胞計数（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を行った。細胞懸濁液１０μＬをｓｌｉｄｅに入れてＴＣ１０機器で細胞数を計数して、２ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬになるべく反応溶液で希釈した。各抗体試料は、５００ｎＭに希釈した後、ｐＨ６．０分析の場合、９６ｗｅｌｌ  ｖ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅから２０ｎＭに希釈して５０μＬずつを取って各ｗｅｌｌに分注した。ｐＨ７．４分析の場合は、５００ｎＭ抗体試料を３倍連続希釈法（３  ｆｏｌｄ  ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で希釈して最終２５０ｎＭから０．１１ｎＭ濃度区間で分析した。２ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに希釈された細胞を５０μＬずつ入れて混合した。プレート（ｐｌａｔｅ）は、４℃に設置されたｒｏｔａｔｏｒに定着させて１５度角度、１０ｒｐｍで９０分間回転させた。反応が終わると、プレートを取り出して２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、上澄み液を除去した。Ａ４８８  ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ  Ｇｏａｔ  Ａｂを１：２００で反応溶液に希釈して１００μＬずつｗｅｌｌに分注して混合した。再びプレートを４℃に設置されたｒｏｔａｔｏｒに定着させて１５度角度、１０ｒｐｍで９０分間回転させた。反応が終わると、プレートを取り出して２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、上澄み液を除去した。この洗浄過程を再度進めた後、反応溶液１００μＬを入れて細胞ペレットを解いてｂｌｕｅ  ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅに移した。ここに反応溶液２００μＬを添加した後、ＦＡＣＳで測定判読した。ＦＡＣＳ測定条件は、ＦＳ  １０８  ｖｏｌｔｓ、ＳＳ  ４２６  ｖｏｌｔｓ、ＦＬ１  ３２４  ｖｏｌｔｓ、ＦＬ２  ３００  ｖｏｌｔｓである。これらの細胞は、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａＴＭ  ｖ６．１．３ソフト（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用したＦＡＣＳで分析された。結果は、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）として表示された（図３）。ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体は、１０ｎＭ濃度、ｐＨ６．０の条件でそれぞれ１０．５９と８．３４のＭＦＩ値を示して、ｐＨ７．４の条件の０．１１〜２５０ｎＭ濃度区間では、ＭＦＩ値を利用した４因子ロジステック回帰分析（４  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を介してＥＣ５０（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０％）値を分析した結果、それぞれ２．４６ｎＭと１．２０ｎＭ値を示した。
【０１１３】
［実施例６］ＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１ＢのＦＡＣＳを利用した抗体の抑制能機能分析
細胞表面ヒトＦｃＲｎに対する結合能分析を進めた２種の抗体を細胞表面にｈＦｃＲｎが発現するＨＥＫ２９３細胞に処理して、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏ−４８８蛍光標識されたｈＩｇＧ１の結合が減少することで、抗体の抑制能効果を確認した。分析過程を詳しく説明すると次のとおりである。
【０１１４】
Ｎａｉｖｅ  ＨＥＫ２９３  ｃｅｌｌとヒトＦｃＲｎと発現安定化ＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ１  ｘ  ＴＥ  ２ｍＬを入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１分間放置した。フラスコから細胞を回収した後、ｐＨ６．０の反応溶液８ｍＬを入れて混合して５０ｍＬ  ｃｏｒｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅに移した。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を除去して、それぞれの細胞ペレットにｐＨ６．０反応溶液を１ｍＬずつ入れて混合した後、新しい１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅに移した。再び４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去して、残った細胞ペレットにｐＨ６．０反応溶液を添加して混合した細胞懸濁液の細胞数を計測した。最終的に細胞懸濁液を２．５ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬになるべく反応溶液で希釈した。
【０１１５】
各抗体試料は、４００ｎＭに希釈した後、９６ｗｅｌｌ  ｖ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅで４倍連続希釈法を行った。最終分析濃度が、２００ｎＭから０．０１ｎＭになるべく希釈した試料を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ分注した。これに１μＭでｐＨ６．０の反応溶液に希釈されたＡｌｅｘ４８８−ｈＩｇＧ１  １０μＬずつを分注した。最後に２．５ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに希釈された細胞を４０μＬずつ入れて混合した。プレートは、４℃に設置されたｒｏｔａｔｏｒに定着させて１５度角度、１０ｒｐｍで９０分間回転させた。反応が終わると、プレートを取り出して２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を除去した。反応溶液１００μＬを入れて細胞ペレットを解いてｂｌｕｅ  ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅに移した後、反応溶液２００μＬを添加してＦＡＣＳで測定判読した。ＦＡＣＳ測定条件は、ＦＳ  １０８  ｖｏｌｔｓ、ＳＳ  ４２６  ｖｏｌｔｓ、ＦＬ１  ３２４  ｖｏｌｔｓ、ＦＬ２  ３００  ｖｏｌｔｓである。これらの細胞は、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａＴＭ  ｖ６．１．３ソフト（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用したＦＡＣＳで分析された。結果は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表示された。実験群のＭＦＩは、細胞だけを介して測定されたＭＦＩ値（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）を引いた後、処理した。対照チューブ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８単独、そして競合因子なし）のＭＦＩを１００％に換算して競合因子を含むチューブのＭＦＩの百分率を換算した。
【０１１６】
【数１】
0006449441.tif 000008
【０１１７】
ヒトＩｇＧ１の競合因子含むチューブのＭＦＩより低い場合、競合抗体の競合率が高いと判断して、ｐＨ６．０の条件、０．０１〜２００ｎＭ濃度区間でＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体の抑制能測定値（％）を利用して４因子ロジステック回帰分析を実施した。結果的に、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体のＩＣ５０（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０％）値は、それぞれ０．９２ｎＭと２．２４ｎＭ値を示した（図４）。
【０１１８】
［実施例７］ｍＦｃＲｎ−／−ｈＦＣＲＮ形質転換３２（Ｔｇ３２）マウスでＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１Ｂの効力試験
ヒトＦｃＲｎが発現するＴｇ３２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にヒトＩｇＧを注射した後、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ及びヒトＩｇＧを投与して、ヒトＩｇＧの異化作用に影響を与えるかを調べてみた。
【０１１９】
ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体とヒトＩｇＧ（Ｇｒｅｅｎｃｒｏｓｓ，ＩＶｇｌｏｂｕｌｉｎＳ）を５、１０、そして２０ｍｇ／ｋｇ容量で４日投与のために分注して保管して、伝達体と２０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１対照物質としてｐＨ７．４のＰＢＳバッファーを使用した。ヒトＦｃＲｎ  Ｔｇ３２マウスは、約７日間適応させて使用して、水と飼料は自由に摂取するようにし、温度（２３±２℃）、湿度（５５±５％）及び明暗周期（１２時間）は、自動調節できるようにした。各群ごとに４匹で実験を進行した。ヒトＩｇＧを追跡物質として使用するために、Ｂｉｏｔｉｎが接合されたｈＩｇＧをｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ♯．２１３２７）を使用して製造した。０時間に５ｍｇ／ｋｇのｂｉｏｔｉｎ−ｈＩｇＧと４９５ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを腹腔投与して体内のＩｇＧを飽和させた。薬物の投与は、ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの投与後、２４、４８、７２、９６時間後に、５、１０そして２０ｍｇ／ｋｇの容量で１日１回腹腔注射した。採血は、フォラン液（ｆｏｒａｎ  ｓｏｌｎ．）（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ，ＪＷ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を利用して軽く麻酔させた後、ヘパリン処理されたマイクロ−ヘマトクリトチューブ（Ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ  Ｍｉｃｒｏ−ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ，Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、眼窩静脈叢で採血を行った。ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの投与後、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８時間後に行って、２４、４８、７２、９６時間には採血後薬物を投与した。０．１ｍＬの全血をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅに受けた後、直ちに遠心分離機で血しょうを分離して分析前までディープフリーザー（ｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ）に−７０℃の状態で保管した。
【０１２０】
採血された血液中ｂｉｏｔｉｎ−ｈＩｇＧ１量は次のとおりＥＬＩＳＡ法によって分析された。９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２５９２）に１．０μｇ／ｍｌ濃度になるべく１００μＬニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ，３１０００）を注入した後、４℃で１６時間固定化した。バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を利用して３回プレートを洗浄後、１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で２時間常温で反応させた。バッファーＡを利用して３回プレートを洗浄した後、１μｇ／ｍｌに該当するように０．５％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液でニュートラアビジンプレートを製造した。各ｗｅｌｌにバッファーＢ（１００ｍＭ  ＭＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％  ＢＳＡ  ＩｇＧ−ｆｒｅｅ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ６．０）を利用して血液試料を５００倍から１０００倍の範囲に順次希釈を進めて、各１５０μＬずつプレートに注入した。注入された試料は、常温で１時間反応させた。バッファーＡを利用して３回プレートを洗浄した後、ＨＲＰが接合された抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を１ｎＭで製造した後、２００μＬずつ注入して３７℃で２時間反応させた。氷を利用して冷却されたバッファーＢを使用して３回プレートを洗浄後、基質溶液である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＲｎＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００μＬ注入した後、常温で１５分反応させた。１．０Ｍ硫酸溶液（Ｓａｍｃｈｕｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０μＬを注入して反応を中止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１２１】
２４時間（マウスでｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの概略的なＴｍａｘでありながら、ｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの異化作用が起きる前の時間）経過後のｂｉｏｔｉｎ−ＩｇＧの濃度を１００％に固定して、残りの時間の濃度を％で表示した結果は、図５に図示されている。分析結果、伝達体群と２０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１対照物質の半減期は、それぞれ１０３時間と１１８時間であった。一方、先のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析上でヒトＦｃＲｎ結合力及び抑制能が優れて、ヒトＦｃＲｎ形質転換Ｔｇ３２マウスで最も速いＩｇＧ異化作用を示したＨＬ１６１Ａ抗体の血液内ＩｇＧ半減期は、容量別にそれぞれ３０、２３、そして１８時間であった。それだけでなく、ＨＬ１６１Ｂ抗体も容量別にそれぞれ４１、２２、そして２１時間のＩｇＧ半減期を示した。これにより、ｈＦｃＲｎにｐＨ非依存的、Ｆｃ非競合的な抗体が、内因性抗体の異化作用増加に効力があることを確認した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【０１２２】
［実施例８］猿でＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１Ｂの効力試験
ヒトＦｃＲｎと９６％相同性を有するシノモルグス猿を利用してＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体投与による猿ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミンレベルを確認して薬物動態学的（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ＰＫ）プロファイルを確認した。
【０１２３】
１）猿血液内ＩｇＧ抗体変化量分析結果
まず、猿ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡ分析を介して変化を測定した。９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２５９２）に４．０μｇ／ｍＬ濃度になるべく１００μＬ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂ，Ａ８０−１０４Ａ）をローディングした後、４℃で１６時間固定化した。洗浄溶液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を利用してプレートを３回洗浄した後、１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で２時間室温で反応させた。標準品である猿ＩｇＧは、３．９〜５００ｎｇ／ｍＬ濃度、そして血液試料は１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を使用して８０，０００倍に希釈した後、プレートにローディングして室温で２時間反応させた。洗浄溶液を利用してプレートを３回洗浄した後、ｈＩｇＧに対する抗体（Ｂｉｏｒａｄ，２０１００５）を２０，０００倍希に釈して１００μＬをローディングして、室温で１時間反応させた。各プレートを洗浄後、基質溶液である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＲｎＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００μＬ注入して室温で７分反応させて、１．０Ｍ硫酸溶液（Ｓａｍｃｈｕｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０μＬを注入して反応を中止した。分析結果は、４５０と５４０ｎｍの吸光度判読機（ＭＤ，モデル名：ＶｅｒｓａＭａｘ）を利用して吸光度（ＯＤ）を測定した。結果的に、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体をシノモルグス猿に５、２０ｍｇ／ｋｇの容量で週１回静脈投与した結果、猿ＩｇＧは投与容量により容量依存的に減少して、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用をＨＬ１６１抗体が効果的に遮断することを確認した。５ｍｇ／ｋｇのＨＬ１６１Ａの場合、最大９日目に４７．１％まで減少させて、２０ｍｇ／ｋｇは、１０日目に２９．６％まで減少させた。ＨＬ１６１Ｂの５ｍｇ／ｋｇの場合、１０日目に５３．６％まで減少させて、２０ｍｇ／ｋｇの場合は、９日目に３１％まで減少させて、二つの抗体で類似する結果が確認された（表５と図６Ａ〜図６Ｃ）。また、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂの静脈投与による猿ＩｇＧの個体別変化を比較した結果、各個体別に非常に類似するように猿ＩｇＧが減少する傾向を示した。
【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
２）猿血液内ＨＬ１６１Ａ／ＨＬ１６１Ｂの薬物動態学的プロファイル（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）分析結果
ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂの静脈投与後、経時的な血中薬物動態学的プロファイルは、競合的ＥＬＩＳＡ法を利用して分析した。まず、ニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）２μｇ／ｍＬの溶液を作った後、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μＬずつ固定化（ｃｏａｔｉｎｇ）した後、４℃で１８時間放置した。洗浄バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４）３００μＬで３回洗浄した後、各ｗｅｌｌに１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で２５℃で２時間常温で反応させた。Ｂｉｏｔｉｎ結合ｈＦｃＲｎをＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍＬの溶液を作った後、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μＬずつ分注した後、さらに２５℃で１時間反応した。洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄して結合しなかったｈＦｃＲｎを除去した後、基準試料（０．１５６〜２０ｎｇ／ｍＬ）を入れて２５℃で２時間反応した。さらに洗浄バッファーで３回洗浄後、二次抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をＰＢＳに１：１０，０００になるべく希釈してｗｅｌｌに１００μＬずつ入れて２５℃で１．５時間反応した。最後に３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を１００μＬずつ入れて常温で５分間反応させた後、１Ｍ硫酸反応停止液５０μＬを入れて反応を終了させた後、吸光度判読機で４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＨＬ１６１Ａ及びＨＬ１６１Ｂの分析結果は表６のとおりであり、容量依存的に増加することを確認することができた。半減期（Ｔ１／２）は、約６日〜１２日と一般に知られた抗体の半減期に比べて短く、全体から見てＨＬ１６１Ａに比べてＨＬ１６１Ｂが、半減期、ＡＵＣ及びＣｍａｘが高く示された（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
３）猿血液内ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体変化量分析結果
猿血液内ＩｇＭとＩｇＡを測定するためのＥＬＩＳＡ分析は、ＩｇＧ測定のためのＥＬＩＳＡ法と類似するように行われた。まず、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．０μｇ／ｍＬ濃度になるべく１００μＬ抗猿ＩｇＭ抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，７００３３）またはＩｇＡ抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，７００４３）を分注した後、４℃で１６時間固定化した。洗浄溶液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を利用してプレートを３回洗浄した後、１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で２時間室温で反応させた。標準品である猿ＩｇＭは、７．８〜１，０００ｎｇ／ｍＬ濃度区間、そしてＩｇＡは、１５．６〜２，０００ｎｇ／ｍＬ濃度区間で分析して、血液試料は、１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を使用して１０，０００または２０，０００倍に希釈した後、各ｗｅｌｌに添加して、室温で２時間反応させた。さらに洗浄溶液を利用してプレートを３回洗浄した後、猿ＩｇＭに対する二次抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，７００３１）と猿ＩｇＡに対する二次抗体（ＫＰＬ，０７４−１１−０１１）をそれぞれ５，０００倍に希釈して１００μＬを室温で１時間反応させた。最後に３回洗浄した後、基質溶液である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＲｎＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００μＬを注入して室温で７分反応させて、１．０Ｍ硫酸溶液（Ｓａｍｃｈｕｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０μＬを注入して反応を中止して、４５０、５４０ｎｍの吸光度判読機（ＭＤ，モデル名：ＶｅｒｓａＭａｘ）を利用して吸光度を測定した。
【０１２８】
４）猿血液内アルブミン変化量分析結果
血液内猿アルブミン変化量分析は、商用化されたＥＬＩＳＡキット（Ａｓｓａｙｐｒｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＥＫＡ２２０１−１）を利用して分析した。方法を簡単に要約すると、分析試料である猿血清を４，０００倍に希釈した後、猿アルブミンと結合できる抗体が固定化された９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２５μＬずつ分注した。Ｂｉｏｔｉｎが結合した猿アルブミン溶液を２５μＬ入れて混ぜて、２５℃で２時間反応した。洗浄バッファー２００μＬで３回洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合した二次抗体を１：１００希釈した溶液５０μＬずつを各ｗｅｌｌに入れて、２５℃で３０分間反応した。最後に３回洗浄した後、基質を５０μＬずつ入れて常温で１０分間反応させた後、反応停止液５０μＬを入れて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結論的に、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体投与による猿ＩｇＭ、ＩｇＡ、そしてアルブミンは、全試験期間中明確な変化が見られなかった（図８Ａ〜図８Ｃ）。従って、ＨＬ１６１抗体は、ＩｇＧにだけ関与して、その他ＩｇＭとＩｇＡの濃度には影響を及ぼさず免疫グロブリンと濃度減少による免疫低下に影響が少ないと判断された。また、猿アルブミンの濃度も全試験期間中大きい変化が見られず、ＨＬ１６１ＡとＨＬ１６１Ｂ抗体がＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用だけを特異的に遮断することを意味する。
【０１２９】
５）血液生化学的数値及び尿成分分析結果
最後に、抗体投与による血液生化学的検査及び尿検査を試験１４日目に試料を利用して実施した。血液生化学的標識因子は、Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ），Ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ），Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ（ＣＰＫ），Ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ＴＢＩＬ），Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＬＵ），Ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＴＣＨＯ），Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ），Ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ），Ａｌｕｍｉｎｅ（Ａｌｂ），Ａｌｂｕｍｉｎｅ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ａ／Ｇ），Ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ），Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ），Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ（ＩＰ），Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｃａ），Ｎａｔｒｉｕｍ（Ｎａ），Ｋａｌｉｕｍ（Ｋ），Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｃｌ）をＨｉｔａｃｈｉ  ７１８０機器を利用して分析して、尿分析のための標識因子は、Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＳＣ）をＭｉｓｓｉｏｎ  Ｕ１２０機器を利用して変化を測定した。全般的に若干の数値変化はあったが、シノモルグス猿の正常数値範囲内に含まれる数値で測定された。
【０１３０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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