(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジング（１）を備えるフローサイトメーターのためのノズルであって、当該ハウジングは、当該ハウジングの長手軸線（５）に対して回転対称である内壁を有しており、
当該ハウジングの内部断面は、当該ハウジングの長手軸線（５）に沿って当該ハウジングの第２端部（４）から、当該ハウジングの第１端部（３）における出口（２）へと先細になり、
前記ハウジング内に中心流液体のために、円形の、または細長い内部断面を有する供給管（７）が設けられており、
当該供給管は、流入開口部（１１）を有しており、
当該供給管は、当該供給管の第１端部（８）に設けられた流出開口部（９）において、前記出口（２）に対して距離をおいて終結しており、
シース流液体のための入口（２３）が、前記ハウジング（１）に設けられており、
前記ノズルは、ガイド要素（１２）を備え、当該ガイド要素は、前記長手軸線（５）に沿って、前記長手軸線（５）に対して垂直な第１次元（１６）に沿って、当該ガイド要素が前記長手軸線（５）および前記第１次元（１６）に対して垂直な第２次元（１７）において延在するよりも大きな程度で、前記ハウジング（１）の内壁に対してある距離をおくまで延在し、
前記ガイド要素（１２）は、前記供給管（７）の前記第１端部（８）の平面内にある、または、前記供給管の前記第１端部（８）からある距離の分だけ対向してずらされている、前記ガイド要素の第１端部（１３）から、前記ハウジング（１）の前記第２端部（４）から距離をおいて設けられている前記ガイド要素の第２端部（１４，１４ａ，１４ｂ）まで延在する、ノズルにおいて、
前記ガイド要素（１２）は、前記ガイド要素の第１端部（１３）に第１端部部分（２５）を有しており、当該第１端部部分は、前記ハウジング（１）の先細になる部分に設けられており、当該第１端部部分の縁は、前記ハウジング（１）の前記内壁に対して距離をおいて設けられており、
前記ガイド要素（１２）は、前記第１端部（１３）に対向しながら前記第１端部部分に隣接する第２端部部分（２６）を有しており、
当該第２端部部分は、前記第１端部（１３）に対向する前記ガイド要素（１２）の前記第２端部（１４，１４ａ，１４ｂ）に向かって、前記ガイド要素の第１次元において先細になり、
前記ガイド要素（１２）は、第１端部部分と第２端部部分（２５，２６）の間で、前記第１次元における前記ガイド要素の最大の延在（２９）を有していることを特徴とする、ノズル。
【請求項２】
前記ガイド要素（１２）は、前記供給管（７）によって支持され、
前記ガイド要素は、前記供給管（７）上の前記ガイド要素の第２端部（１４，１４ａ，１４ｂ）において終結し、
前記ガイド要素（１２）の前記第２端部（１４，１４ａ，１４ｂ）の距離は、前記ハウジング（１）内部に設けられている前記供給管（７）の長さの少なくとも２０％であることを特徴とする請求項１に記載のノズル。
【請求項３】
移行部分（２７）は、前記ガイド要素（１２）の前記第２端部（１４，１４ａ，１４ｂ）に隣接して設けられており、
当該移行部分は、前記ガイド要素（１２）とともに狭窄部（３０）を形成するとともに、前記ガイド要素（１２）に対向し、かつ前記移行部分（２７）に隣接する状態でのシリンダ部分（２８）に隣接しており、
当該シリンダ部分は、前記供給管（７）に沿って延在することを特徴とする請求項１または２に記載のノズル。
【請求項４】
前記ガイド要素（１２ａ）の前記第１端部（１３ａ）は、前記流出開口部（９）が延在する平面内に設けられていることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項５】
前記ガイド要素（１２，１２ａ，１２ｂ）の断面（１５ａ，１５ｂ）の前記第２次元（１７）は、前記長手軸線（５）からの距離が増大するにつれて減少することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項６】
前記ガイド要素（１２）は、前記ガイド要素の第１端部（１３）に隣接する第１端部部分（２５）において、前記第１次元（１６）において前記ハウジング（１）の前記内壁に対して平行に設けられている縁（１８）まで延在することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項７】
前記供給管（７）は、前記長手軸線（５）に対して同軸に延在することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項８】
前記供給管（７）は、前記ガイド要素（１２，１２ａ，１２ｂ）内に孔として形成されていることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項９】
前記供給管（７）は、前記ガイド要素（１２，１２ａ，１２ｂ）内に固定されていることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１０】
前記ガイド要素（１２，１２ａ，１２ｂ）は、前記供給管（７）とともに、前記ハウジング（１）を当該ハウジングの第２端部（４）において被覆するカバー（６）に可逆的に固定可能であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１１】
前記ノズルは、中心流液体のためのバッファ容器（１９）を有しており、
当該バッファ容器内において、前記供給管（７）の前記流入開口部（１１）は、出口を有していることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１２】
前記ノズルは、シース流液体のためのバッファ容器（２２）を有しており、
当該バッファ容器は、シース流液体のための入口（２３）と連通していることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１３】
前記ガイド要素（１２）は、当該ガイド要素の断面の前記第２次元（１７）において延在する厚さを有しており、当該厚さは、前記ガイド要素の前記第１次元（１６）における延在よりも小さいことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１４】
前記ガイド要素（１２）は前記第２次元（１７）において、前記第１次元（１６）における延在に対して最大５０％で延在することを特徴とする請求項１３に記載のノズル。
【請求項１５】
前記ガイド要素（１２）の断面は、前記第２次元（１７）において、前記第１次元（１６）に沿って前記ハウジング（１）の前記長手軸線（５）から前記ガイド要素の前記縁（１８）に至るまで減少することを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載のノズル。
【請求項１６】
粒子を含む中心流液体を請求項１から１５のいずれか一項に記載のノズルのうち中心流液体のための流入開口部（１１）に流入させ、シース流液体を請求項１から１５のいずれか一項に記載のノズルのうちシース流液体のための入口開口部（２３）に流入させることによって、シース流に包囲されるとともに粒子を含む中心流を備える液体流を作り出すための方法。
【請求項１７】
前記粒子は、前記ノズルの前記ハウジング（１）の前記長手軸線（５）に対して垂直な第１次元（１６）において、前記長手軸線（５）および前記第１次元（１６）に対して垂直な第２次元（１７）におけるよりも小さい断面を有していることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ノズルから流出する液体流において、前記中心流に含まれる前記粒子の少なくとも一つの特性を検出し、
前記粒子は、検出される前記特性に応じて少なくとも二つの画分に分けられる、または、検出される前記特性に応じて異なって処理されることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１次元と第２次元とを備える断面を有する粒子の試料を製造するための請求項１８に記載の方法であって、前記粒子が前記第１次元において前記第２次元におけるよりも小さい、方法において、
前記粒子は、人間以外の哺乳動物の精子であり、検出される前記特性は、前記精子におけるＸ染色体またはＹ染色体の存在であり、前記方法は、検出される前記特性に応じて前記精子を照射すること、または、検出される前記特性に応じて前記精子を少なくとも二つの異なる画分へと偏向させること、によって行われることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメーターのためのノズルと、当該ノズルを有するフローサイトメーターと、当該ノズルもしくは当該ノズルを有するフローサイトメーターを用いて実施可能である方法と、に関し、この方法では、粒子を含む中心流をシース流内部に有する、または中心流から成る液体流において粒子を一列に並べるための方法と、に関する。本発明は、特に、粒子を一列に並べるとともに、粒子がノズルを通過するのに続いて検出される特性に応じて、粒子を仕分けるための方法におけるノズルの使用に関する。このとき仕分は、好ましくは、液体流、特に当該液体流から形成されている液滴の部分を、少なくとも二つの画分へと偏向することである。当該実施形態において、本発明は、本発明に係るノズルを用いて液体流において粒子を一列に並べることによって粒子の画分を製造することに関する。
【背景技術】
【０００２】
上記方法によって一列に並べられ、任意選択的に画分に仕分けられる粒子は、好適に、全体的に平坦な形状であり、例えば切断面に対して対称であり、それにより、粒子は、当該粒子の長手軸線に対して垂直に第１次元と第２次元とを備える断面を有しており、当該断面は、第１次元において、第２次元におけるよりも小さい。好適な粒子は、生体細胞、例えば血液細胞、特に血小板細胞および人間以外の哺乳動物の精子、特にオスの動物から得られる精子であり、当該動物は、特にウシ、ブタ、ヒツジ、ゾウ、ラクダ、ウマ、またはヤギである。
【０００３】
特許文献１は、哺乳類の精子を性染色体特異的な精子画分に仕分けるためのノズルを有する同属の装置および方法を説明している。当該方法は、ノズルを有するフローサイトメーターを使用し、当該ノズルのハウジングは、円錐状に先細になり、当該ハウジング内に精子を含む中心流のための導管を有しており、それにより、ノズル出口において、精子を含む中心流は、シース流に包囲された状態で流出する。
【０００４】
特許文献２は、精子を仕分けるためのフローサイトメーターで使用するためのノズルを説明しており、当該ノズルは、以下の点を特徴とする。すなわち、ノズルのハウジングは、精子を含む中心流液体のための供給小管の流出開口部との間の部分において、概ね漏斗状に先細になる内面を有しており、当該内面は、第１楕円形断面と、当該第１楕円形断面に隣接するとともに楕円形断面を備える軸方向部分と、を有しており、当該軸方向部分は、上流に設けられた部分の楕円形断面に対して９０°回転されていることを特徴とする。
【０００５】
特許文献３は、精子を仕分けるためのフローサイトメーターのためのノズルを説明しており、当該フローサイトメーターにおいて、ノズル内に同軸的に設けられた精子のための供給細管を含む中心流液体は、シリンダ状の外径を備える部分からノズルの円錐台形部分内部にある概ね矩形の部分へと流入し、当該流入細管の下流には、楕円形断面を備えるとともに先細になるノズルの部分が続いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６１４９８６７号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／０５５０４号
【特許文献３】欧州特許第１２３８２６１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術に対して、本発明は、液体流において粒子を一列に並べるための代替的なノズルと、液体流における回転対称でない粒子を一列に並べるための方法と、を提供することを課題とする。好適な課題は、容易に製造され得るノズルであって、特に内面を備える構成部材のみを有しており、回転対称であり、それゆえ容易に作り出し得るノズルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記の課題を請求項にかかる特徴、特にノズルによって解決し、このノズルは、当該ノズルのハウジングが出口へと先細になり、当該ハウジング内に中心流液体のための供給管が設けられており、当該供給管の流出開口部がハウジングの出口の前に距離をおいて設けられている。ハウジングの出口は、ノズルの出口を形成する。ノズルのハウジングは、当該ハウジングの出口であって、当該ハウジングの第１端部に設けられている出口から、対向する当該ハウジングの第２端部へと延在し、内部容積と連通されたシース流液体のための入口を有している。ハウジングの第２端部は、カバーによって被覆されてもよく、当該カバー内には、任意選択的にシース流液体のための入口が設けられている。ハウジングの内部断面は、好適に回転対称もしくは円形であり、それに応じて回転対称である内面によって形成され、当該回転対称である内面は、少なくとも部分的に円錐状に、出口へと先細になる。ハウジング内部に設けられた供給管は、好ましくは、ハウジングの長手軸線に対して同軸的に設けられている。供給管の流入開口部は、粒子を含む中心流液体のための導管と接続されている。供給管は、好ましくは、金属から成る。
【０００９】
本発明に係るノズルは、以下の点を特徴とする。すなわち、ハウジング内で供給管の両側には断面を備えるガイド要素が延在し、当該断面は、ハウジングの長手軸線に対して垂直な第１次元において、当該第１次元に対して垂直に設けられ、第２ガイド要素の厚さとも称される第２次元におけるよりも大きく延在する。ノズル内で供給管の両側に延在するガイド要素は、液体流、特に中心流に含まれている粒子を一列に並べることを促進し、それにより、特に、細長い断面を備える粒子は、共通の向きに並べられ、好適には、粒子の断面の長い方の延在がガイド要素の第１次元に対して概ね平行に設けられている向きに並べられる。供給管は、ガイド要素内部に設けられてもよく、またはガイド要素内部の孔として形成されてもよい。従って、ガイド要素は、第１次元において、ハウジングの内壁に対してわずかな距離をおくまで延在する一方、第２次元においてハウジングの内壁からさらに離間している。ガイド要素は、当該ガイド要素を当該ガイド要素の第１次元において画定するとともに、第２次元の厚さを有する縁において終結する。ガイド要素は、ハウジングの内壁とともに有効断面を形成し、当該有効断面は、ガイド要素によって離間される二つの部分に区分されており、当該二つの部分は、好適に、有効断面の領域においてのみ接触もしくは交差し、当該有効断面の領域の周囲にあるガイド要素は、第１次元においてハウジングの内壁から離間されている。ガイド要素は、当該ガイド要素の断面の第２次元において延在する厚さを有しており、当該厚さは、前記ガイド要素の第１次元に沿った延在よりも小さい。第２次元において、ガイド要素は、第１次元における延在に対して例えば最大７０％、好ましくは最大５０％、より好ましくは最大３０％、最大２０％、または最大１０％で延在する。ガイド要素の断面は、第２次元において、第１次元に沿って変化し得、特に第１次元に沿ってハウジングの長手軸線からガイド要素の縁に至るまで減少または増大し得る。
【００１０】
ガイド要素はハウジングの長手軸線に沿って、当該ガイド要素の第１次元においてハウジングの長手軸線から、もしくはハウジングの内壁まで、等しい距離をおくまで延在し得、または、ハウジングの長手軸線の長手方向において異なる距離を有して延在し得、もしくは、ハウジングの内壁から異なる距離をおくまで延在し得る。従って、ガイド要素の断面は、当該ガイド要素の第１次元において、縁において終結し、この縁は、ハウジングの長手軸線の長手方向においてハウジングの内壁に対して等しい距離をおいて設けられている、または、ハウジングの長手軸線の長手方向においてハウジングの内壁から異なる距離をおいて設けられている。縁は、例えばガイド要素の第１端部に隣接して一般的に第１端部部分とも称される部分において、当該部分に隣接しかつ供給管の流出開口部に対向する部分におけるよりも、ハウジングの内壁から小さい距離をおいて設けられてもよい。縁は例えばガイド要素の第１端部に隣接する部分において、ハウジングの長手軸線の長手方向において、ハウジングの内壁に対して等しい距離をおいて設けられてもよく、流出開口部に対向する隣接する部分において、ハウジングの内壁に対して距離をおいて設けられてもよく、当該距離は流出開口部からの距離が増大するとともに大きくなる。任意選択的に、縁は、部分的に、直線状または曲線状、ハウジングの長手軸線に対して凸状または凹状である。第２次元に関して、縁は、平坦、凹状、または凸状であってもよく、特にハウジングの内壁に対して平行であってよい。
【００１１】
ガイド要素は、好適に、当該ガイド要素の第１端部に隣接する当該ガイド要素の第１端部部分において、ハウジングの内壁に対して概ね平行な縁を有している。第１端部部分は、特に、ノズルの先細になる部分に設けられており、当該ノズルは、流出開口部に隣接している。第１端部部分をハウジングの先細になる部分に設ける当該構成は、特に人間以外の哺乳類の精子の平坦な細胞を効果的に一列に並べることを可能にする。ガイド要素の第１端部部分は、ガイド要素の第１端部からの距離が増大するのに応じて、第１次元における延在が大きくなり、それにより、第１端部部分の縁は、ハウジングの内壁に対して距離をおいて、先細になる、特に円錐状に先細になるハウジング部分に対して概ね平行に推移する。このとき、第１端部部分の縁は、先細になる、特に円錐状に先細になるハウジング部分に対して距離をおいて曲線状、特に凸状に推移し得る。第１端部部分は、当該第１端部部分がノズルの当該先細になる部分に設けられることを可能にしている。第１端部部分は、ハウジングおよび／または供給管の長手軸線とハウジング壁との距離の１％から１０％、例えば２％から５％の距離にある縁を有している。ガイド要素は、第１端部部分に隣接するとともにガイド要素の第１端部に対向して、第２端部部分を有しており、当該第２端部部分は、第２端部に向かって先細になる。ガイド要素は、当該ガイド要素の第２端部部分において、第１端部部分に対向してまたは当該ガイド要素の第２端部において、先細になり、それにより、ガイド要素は、供給管において終了または終結する。当該実施形態において、供給管は、支持体もしくはハウジングのカバーとガイド要素との結合部を形成し、それにより、供給管のみは、ガイド要素を支持する。当該実施において、供給管は、カバーから離間されたガイド要素に対してシリンダ状の支持体を形成している。
【００１２】
ガイド要素は、好適に、第１端部部分と第２端部部分との間で第１次元における当該ガイド要素の最大の延在を有している。
【００１３】
ガイド要素は、任意選択的に、第１端部部分および第２端部部分に沿って、細いもしくは鋭い縁、または、第２次元におけるガイド要素の最小の延在を有している。細いまたは鋭い縁は、ガイド要素とノズルの内壁との間の層流を助長させ得る。
【００１４】
第２端部部分は、第１端部部分に対向して供給管に接するまで先細になる、または、供給管において終結する。第２端部部分は、ハウジング内部の供給管の長またはハウジングのカバーとハウジングの第１端部との間の供給管の長さの少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％の距離をおいてハウジングのカバーから離間されてもよい。当該実施形態では、供給管のみがガイド要素を支持し、当該ガイド要素は、好適に、円形の内部断面および外部断面を有する、または、シリンダ状である。ガイド要素をカバーに対して距離をおいて供給管に設ける当該構成は、好適である。
【００１５】
これに対して、代替的に、第１端部部分に対向して第２端部部分には、移行部分を接続してもよく、当該移行部分の外部断面は、増大し、当該移行部分には、シリンダ部分が隣接する。このとき、当該シリンダ部分は、カバーに接するまで延在し、ハウジングとともにリング状の有効断面を形成し得る。シリンダ部分は、好適に、第２端部部分が移行部分に隣接する状態で当該第２端部部分の第１次元において延在するよりも大きい外径を有しており、それにより、第２端部部分は、移行部分とともに、第１および第２次元のうちの少なくとも一方において狭窄部を形成する。特に、第１端部部分が任意選択的かつ好適には第２端部部分も非常に細長い断面を有している実施形態において、例えば第２次元における延在が第１次元における延在の１０％から３０％、または最大２０％もしくは１５％までの大きさである場合、移行部分は、シリンダ部分の外面をガイド要素の外面と結合する。シリンダ部分は、例えば、狭窄部よりも大きく、かつガイド要素の第１次元における当該ガイド要素の最大延在よりも小さい外径を有し得る。
【００１６】
中心流液体内に粒子として動物の細胞を有する液体流を作り出すために、例えばおよそ４ｍｍから１０ｍｍの直径を有するハウジングの内壁は、例えば０．２ｍｍから１ｍｍまたは０．５ｍｍまでの直径を有し得る出口へと先細になり得る。ガイド要素は、例えば、ハウジングの長手軸線に沿って、３ｍｍから５ｍｍにわたって延在し得、第１次元において第１端部でおよそ０．５ｍｍから１．５ｍｍまで、最大でおよそ３ｍｍから５ｍｍまで延在し得る一方、第２次元においておよそ０．５ｍｍから１ｍｍの大きさだけ、それぞれ長手軸線の両側において延在する。ガイド要素は、好適に、ハウジングの長手軸線に対して対称であり、特に二つの部分から成り、当該二つの部分は、当該二つの部分の第１次元で共通の平面内に延在し、当該共通の平面にハウジングの長手軸線が設けられており、さらに好適に、ガイド要素の断面は、ハウジングの長手軸線に沿って対称に形成されている。
【００１７】
ガイド要素は、中心流液体内に含まれる粒子を当該粒子の形に応じて、供給管の流出開口部とノズルの出口との間の部分において一列に並べることを行わせる。粒子をこのように一列に並べることは、目下のところ、ガイド要素の第２次元における当該ガイド要素の延在が、特にガイド要素の第１次元を介して、シース流液体の異なる流れ速度を生じさせることに起因すると考えらえる。当該流れ速度が異なることによって、粒子を一列に並べる結果が生じると想定され、当該粒子は、ノズルの出口から流出した後もその並びを概ね有している。
【００１８】
ノズルは、当該ノズルのハウジングの内壁または断面が回転対称であってもよく、従って、例えばドリル加工によってなど簡単な方法で製造可能であるという有利点を有している。これに応じて、ハウジングは、内壁が出口に向かって減少し特にハウジングの長手軸線周りに回転対称に形成されている断面を展開することによって、先細になる。ハウジングの内壁によって展開される断面は、好適に、出口に隣接する状態で円錐状である。任意選択的に、ハウジングの内壁によって展開される断面は、供給管の流出開口部とハウジングの出口との間に延在する部分にわたって先細になり得、特に円錐状に先細になり得る。任意選択的に、ハウジングの内壁によって展開される断面であって、供給管の流出開口部とガイド要素の第２端部との間の部分にわたって、またはハウジングの第２端部まで延在する断面は、特に供給管の流出開口部とハウジングの出口との間に延在する部分に隣接する状態で、先細になり得、特に円錐状に先細になり得、または他の形を有し得、例えばシリンダ状であり得る。出口も回転対称であってもよく、特に丸い孔であってよい。ノズルは、好適に、当該ノズルの第１端部に硬質材料、例えばセラミックまたはサファイアから成る挿入体を有しており、当該挿入体内に出口としての孔が形成されている。シース流液体の流れを制御するノズルの有効断面の形成は、ハウジング内に設けられたガイド要素によって行われ、当該断面は、ガイド要素の外面を成形することによって、または、長手軸線に対して垂直であるとともに互いに垂直であるガイド要素の第１次元および第２次元における当該ガイド要素の延在が異なることによって、作り出される。従って、ノズルは、ガイド要素の回転対称でない表面を外面として製造可能である一方、ハウジングの内壁は、回転対称な平面として製造可能であるという有利点を有している。
【００１９】
ガイド要素は、当該ガイド要素の第１端部からハウジングの長手軸線に沿って対向する当該ガイド要素の第２端部まで延在し、第１端部は、供給管の流出開口部に隣接する状態で、あるいは供給管の流出開口部よりもさらに、ハウジングの出口からわずかな距離をおいて、例えば供給管の流出開口部のハウジングの出口からの距離の１０％までの大きさ、好ましくは５％までの、または２％までの大きさだけ離れて設けられている。第１端部は、好適に、供給管の流出開口部が設けられている平面に設けられている。ガイド要素の第２端部は、ハウジングの第２端部に隣接し得、あるいはハウジングの第２端部から距離をおいて、例えばハウジングの出口からハウジングの第２端部までの、またはガイド要素の第２端部までの当該ハウジングの延在の１％から８０％、好ましくは１０％から５０％の距離をおいて設けられてもよい。
【００２０】
ガイド要素は、好適に、当該ガイド要素の第１次元および第２次元において、供給管に対して垂直かつハウジングの長手軸線に沿って延在し、特に供給管は、ハウジングの長手軸線に対して同軸的に設けられている。
【００２１】
ノズルは、好適に、供給管の流入開口部に、中心流液体のためのバッファ容器を有しており、当該バッファ容器内において、粒子を含む中心流液体のための導管が出口を有している。このようなバッファ容器は、ハウジングによって所定の向きに配置される粒子の比率を増大させる。この点は、目下のところ、バッファ容器が導管からの流れの影響であって、供給管内へと続く流れの影響を弱める結果であると考えられる。ノズルは、さらに好適に、振動発生器を有しており、当該振動発生器は、中心流液体のためのバッファ容器のうち供給管の流入開口部に対向する壁部に固定されている。振動発生器は、好適に、電圧を印加可能な圧電素子である。特に好適に、振動発生器、例えば圧電素子は、プレストレスをかけた状態で中心流液体のためのバッファ容器の壁に固定されており、例えば振動発生器とバッファ容器の内部容積との間に設けられているカバーによってバッファ容器の壁に対して負荷をかけている。
【００２２】
ノズルは、好適に、シース流液体のためのノズルの流入開口部に、シース流液体のためのバッファ容器を有しており、当該バッファ容器は、任意選択的に、中心流液体のためのバッファ容器に隣接して、例えば中心流液体のためのバッファ容器とハウジングの第２端部との間に設けられており、さらに任意選択的に、供給管は、シース流液体のためのバッファ容器を介してガイドされている。シース流液体のためのバッファ容器は、ハウジングの有効断面内でシース流液体の導管がシース流液体の流れに及ぼす影響を低減し、粒子を所定の向きに一列に並べることを向上させる。
【００２３】
供給管は、好適に、円形の内部断面を有しており、当該内部断面は、ハウジングの長手軸線に沿って先細になり得、好適に、ハウジングの長手軸線に沿って一定である。
【００２４】
圧電素子は、振動発生器として役立ち、当該振動発生器は、好適に、ハウジングの長手軸線に対して垂直に推移する圧縮波を作り出し、それにより、ハウジングの出口を気体で満たされた空間内に設ける際に液滴流を生じさせる。
【００２５】
本発明に係るノズルを有するフローサイトメーターは、好適に、例えばレーザなど、ノズルのハウジングから流出する液体流の第１部分に向けられている少なくとも一つの第１放射源と、当該放射源に対向して液体流の第１部分に向けられた第１検出器と、を有しており、当該検出器は、任意選択的に、信号を生じさせ、当該信号は、偏向装置を作動させ、それにより、信号を用いた検出に応じて液体流の部分を偏向させる、例えば仕分ける。任意選択的に、前記装置は、例えば第１放射源とノズルとの間の液体流の第２部分に向けられている第２放射源と、当該第２部分に向けられている第２検出器と、を有している。第２検出器は、好適に、第２信号を生じさせ、当該第２信号は、偏向装置を制御し、それにより、液体流の部分は、付加的に、第２信号に応じて偏向させられる。
【００２６】
偏向装置は、電気的に反対の負荷を有する一対のプレートであってもよく、当該プレートは、液体流の両側に設けられており、ノズル内、特にハウジング内に設けられている電気的接触子を有している。任意選択的に、接触子は、中心流液体のための供給管であってもよい。電気的接触子は、好ましくは、第１および／または第２信号に応じて制御されており、それにより、第１および／または第２信号に応じて正の荷電または負の荷電が行われる。あるいは、偏向装置は、液体流に向けられているレーザであってもよく、当該レーザは、液体流に向けられているとともに、国際公開第２０１０／１４９７３９号に説明されているように、液体流を表面的にのみ、当該液体流の表面蒸発に至るまで蒸発させるように構成されている。
【００２７】
ノズルまたは当該ノズルを有するフローサイトメーターを用いる本発明に係る方法は、以下のステップを有している。すなわち、
−粒子を含む中心流液体を準備するステップと、
−シース流液体を準備するステップと、
−シース流液体のための入口開口部を介してシース流液体をポンプで注入するステップと、
−供給管の流入開口部を介して粒子を含む中心流液体をポンプで注入するステップであって、ハウジングの長手軸線に沿ってガイド要素が延在し、好適に、供給管がハウジングの長手軸線に対して同軸的に設けられており、ガイド要素がハウジングの内部容積の有効断面を二つの部分に区分し、ガイド要素が長手軸線に沿って、長手軸線に対して垂直な第１次元に沿って、当該ガイド要素が長手軸線に対して、かつ第１次元に対して垂直な第２次元において延在するよりも大きな程度で、ハウジングの内壁に対してある距離をおくまで延在する、ステップと、
−ハウジングの有効断面をシース流液体によって貫流させるとともに、供給管を中心流液体によって貫流させるステップであって、中心流液体が供給管の流出開口部から流出した後、シース流液体に接触され、中心流液体に含まれる粒子が所定の向きに移動させられる、ステップと、
−任意選択的に、供給管の流出開口部とハウジングの出口との間の先細になる部分を貫流させるステップであって、それにより、シース流液体と中心流液体との断面が減少させられる、ステップと、
−シース流液体に包囲された中心流液体をハウジングの出口を介して流出させるステップと、を有しており、
当該方法は、
任意選択的に、粒子の特性を検出するステップを含んでおり、
さらに任意選択的に、検出される特性に応じて粒子を（例えばレーザ照射によって）処理するステップおよび／または粒子を分離された画分もしくは容器へと偏向させるステップと、を含んでいる。
好適に、ハウジングは、回転対称である。
【００２８】
特に方法は、人間以外の精子の性染色体特異的に仕分けられた画分を製造するために好適であり、当該方法において、精子は、ノズルを介して所定の向きに移動され、当該向きにおいて検出装置の光路の前で移動されるとともに検出される。
【００２９】
ガイド要素は、任意選択的に、好ましくは可逆的にすなわち着脱自在に供給管に被せられており、例えばハウジングの第２端部に固定されている。ガイド要素は、好適に、供給管と一体的に形成されており、当該供給管の流出開口部に対向する端部に固定されており、例えばハウジングの内部容積を当該ハウジングの第２端部において画定しているカバーとの係合によって固定されている。
【００３０】
供給管は、円形の内部断面を有し得る。代替的に、供給管は、例えば楕円形など細長い内部断面または例えば丸みをつけられた内縁を有する矩形の内部断面を有し得、細長い内部断面の長い方の延在は、好適に第１次元に対して概ね平行に設けられている。ガイド要素は、好適に、対称面を有しており、当該対称面を長手軸線が通過しており、特に好適に、供給管の内部断面は、ガイド要素と共通の対称面において延在している。供給管の細長い内部断面は、例えば、短い延在に対する長い延在の比率が最大０．３、または最大０．２であってもよい。
【００３１】
ノズルは、好ましくはセラミックまたはサファイアから成り、ハウジングの第１端部において出口を形成する挿入体を有しているが、第１挿入体ノズルは、プラスチック、例えばＰＥＥＫまたはＰＯＭから成ってもよく、任意選択的に、セラミックから成ってもよい。供給管は、金属から成ってもよく、ガイド要素は、プラスチック、例えばＰＥＥＫまたはＰＯＭから成ってもよく、供給管は、好ましくは、プラスチック、例えばＰＥＥＫまたはＰＯＭから成るガイド要素内で、丸い断面の孔として形成されている。当該方法は、好適に、人間以外の哺乳動物の精子の画分を製造するための方法であり、人間以外の個体の精液を含む中心流液体でノズルの供給管を貫流させた後、人間以外の他の個体の精液を含む中心流液体がノズルの供給管を貫流させられる前に、供給管およびガイド要素を、他の供給管およびガイド要素と交換するか、または無菌化するステップを有している。
【００３２】
ここで本発明を例に基づいて図面を参照しながらより詳しく説明する。図面が概略的に示すのは以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係るノズルをノズルの長手軸線の長手方向における断面において示す図である。
【図２】ノズル内に設けられたガイド要素をノズルの長手軸線に対して垂直な断面において示す図である。
【図３】本発明に係るノズルであって、当該ノズルのカバーを有さないものを示す図である。
【図４Ａ】ガイド要素を示す図である。
【図４Ｂ】ガイド要素を示す図である。
【図４Ｃ】ガイド要素を示す図である。
【図４Ｄ】ガイド要素を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図面において同じ参照番号は、機能の同等の要素を表している。
【００３５】
図１は、ハウジング１を備えるノズルを示しており、当該ハウジングは、当該ハウジングの第１端部３における丸い出口２から、長手軸線５に沿って当該ハウジングの対向する第２端部４へと延在している。第２端部４は、カバー６によって覆われており、供給管７は、当該カバーを介して、長手軸線５に対して同軸に延在している。供給管７は、当該供給管の第１端部８において流出開口部９内に出口を有しており、当該供給管の対向する第２端部１０において、粒子を含む中心流液体のための流入開口部１１を有している。ガイド要素１２ａ，１２ｂは、ハウジング１を当該ハウジングの第２端部４において塞いでいるカバー６に対して距離をおいて設けられており、供給管７に支持されている。
【００３６】
図１は、構成が異なるガイド要素１２ａ，１２ｂを示しており、当該構成は、それぞれ半分の状態で、供給管７の両側に表示されており、それにより、一の構成それぞれは、長手軸線５に対して対称に延在する。ガイド要素１２ａ，１２ｂは、供給管７の第１端部８から離間しているガイド要素の第１端部１３ａ，１３ｂから、当該ガイド要素の第２端部１４ａ，１４ｂへと延在している。ガイド要素１２ｂの例において、好適な実施形態に対応して、ガイド要素の第１端部１３ｂは、供給管７の第１端部８にあり、当該供給管の第１端部と面一に終結し得ることが示されている。代替的なガイド要素１２ｂの第２端部１４ｂは、ガイド要素１２ａ，１２ｂがハウジング１の長手軸線５に沿って異なる程度で延在し得ることを示しており、例えば流出開口部９よりもハウジング１の出口からさらに距離をおいて設けられてもよいこと、または、ガイド要素１２ｂが第１端部１３ｂにおいて示されているように、供給管７から突出してよいこと、または、例えば当該ガイド要素の第１端部１３ｂ’がわずかな距離の分だけ、ハウジングの出口からより遠くに設けられていること、を示している。ガイド要素１２ａ，１２ｂの概略的に描き込まれた断面１５ａ，１５ｂは、長手軸線５に対して垂直に第１次元１６において延在し、当該第１次元に対してガイド要素１２ａ，１２ｂの厚さは、第１次元に対して垂直な第２次元１７において延在する。断面１５ａにおいて例として示されているように、ガイド要素１２ａは、第２次元１７において一定の厚さを有してもよく、あるいは、例として断面１５ｂにおいて示されているように、ガイド要素１２ｂは、第２次元１７において第１次元１６に沿って変化する、例えば長手軸線５に対する距離が増大するにつれて減少する断面１５ｂを有し得る。
【００３７】
図１において、ガイド要素１２ａ，１２ｂは、特に、当該ガイド要素の第１端部１３ａ，１３ｂに隣接する部分において、第１次元１６に沿って長手軸線５から、ハウジング１の内面から概ね一定の距離をおくまで延在する、または、ハウジング１の内面から概ね一定の距離をおく縁１８まで延在する。
【００３８】
ガイド要素１２ａ，１２ｂののうちガイド要素１２ａ，１２ｂの第１端部１３ａ，１３ｂに隣接する第１端部部分２５は、出口２に向かって円錐状に先細になるハウジング１の部分内部に設けられている。第２端部部分２６は、ガイド要素１２ａ，１２ｂの第１端部１３ａ，１３ｂに対向しながら第１端部部分２５に隣接し、ガイド要素は、第１端部部分および第２端部部分２５，２６が互いに隣接するところにおいて、第１次元における当該ガイド要素の最大の延在２９を有している。ガイド要素１２ａ，１２ｂの第１端部部分２５が円錐状に先細になるハウジング１の部分内部に設けられているようにガイド要素１２ａ，１２ｂを構成することによって、平坦な形状を有する細胞、例えば人間以外の哺乳動物の精子を、続いて仕分けるために効果的に、一列に並べることが可能になる。
【００３９】
図１は、第１端部部分２５の縁１８が、ハウジング１の内壁に対して概ね平行に、かつ距離をおいて設けられており、このときわずかに凸状に形成されてもよいことを示している。当該実施形態では、一般的にガイド要素１２ａ，１２ｂは、供給管７に取り付けられてもよく、任意選択的に締結されているか、スナップ式結合部またはネジを用いて供給管７に設けられてもよい。
【００４０】
好適な実施形態に対応して、図１は、中心流液体のためのバッファ容器１９を備えるノズルを示しており、当該バッファ容器内に中心流液体のための供給導管２０が出口を有しているとともに、当該バッファ容器に供給管７の流入開口部１１が接続されている。圧電素子２１は、プレストレスをかけられて中心流液体のためのバッファ容器１９内に、供給管７の流入開口部１１に対向するように固定されている。さらにシース流液体のためのバッファ容器２２は、ハウジング１内に流入するシース流液体のための入口２３と連通されており、シース流液体のためのバッファ容器２２は、シース流液体のための供給導管２４と接続されている。シース流液体のためのバッファ容器２２は、ノズル１の第２端部４と中心流液体のためのバッファ容器１９との間に設けられており、供給管７は、シース流液体のためのバッファ容器２２を介して設けられている。
【００４１】
図２は、ノズルもしくはハウジング１の長手軸線５に対して垂直なガイド要素１２ａ，１２ｂの断面１５ａ，１５ｂを示しており、ガイド要素１２ａ，１２ｂの半分のみが示されており、当該ガイド要素は、第２次元１７もしくは長手軸線５に対して鏡面対称に延在している。供給管７は、好適に、円形に、第１次元１６と第２次元１７との交点にあるハウジング１の長手軸線５周りに設けられている。一般に好適であるように、ハウジング１の出口２は、ハウジング１の長手軸線５周りに対称に設けられている。
【００４２】
図３は、ノズルを示しており、当該ノズルのハウジング１内には、ガイド要素１２ａが設けられており、供給管７は、当該ガイド要素内にある孔として実施されており、当該孔は、ハウジング１の長手軸線５に対して同軸的に設けられている。ハウジング１の出口２は、挿入体１ａによって形成されており、当該挿入体は、出口２に隣接する部分では円錐台状であり、それに隣接するところではシリンダ状である。第１端部部分２５は、一般に好適であるようにハウジング１の先細になる部分内部に設けられている。ガイド要素１２ａ，１２ｂは、当該ガイド要素の第２端部部分２６に隣接して、移行部分２７を有しており、また、当該移行部分には、シリンダ部分２８が隣接する。シリンダ部分２８は、供給管７の全長にわたって延在する。移行部分２７は、ガイド要素１２の第２端部部分２６とともに狭窄部３０を形成する。
【００４３】
図４Ａ）は、縮小された表示において、図３のガイド要素１２ａを長手軸線５周りに９０°回転させた状態で示している。図３および図４Ａ）から、ガイド要素１２ａが長手軸線５に対して垂直な第１次元１６において、長手軸線５および第１次元１６に対して垂直な第２次元１７におけるよりも大きく延在することが明らかである。
【００４４】
図４Ｂ）は、ガイド要素１２ａの任意選択的な実施を示しており、当該ガイド要素は、流出開口部９に隣接する部分内で、当該ガイド要素の第１次元１６において、第２画面に対して垂直である当該ガイド要素の第２次元１７におけるよりも大幅に大きく延在する一方、ガイド要素１２ａの断面は流出開口部９から離間している隣接部分では、第１次元１６において先細になっている。
【００４５】
図４Ｃ）は、ハウジングの長手軸線５に対して垂直なガイド要素１２ａの断面１５ａを示しており、当該断面内に供給管７は、中央の孔として円形断面を有して形成されている。
【００４６】
図４Ｄ）は、図４Ｃ）に対応するガイド要素を示しており、当該ガイド要素では、供給管７が楕円形の内部断面を有しており、当該楕円形の内部断面の長い延在は、第１次元１６に対して平行であり、当該楕円形の内部断面の短い延在は、第２次元１７に対して平行である。図４Ｄ）は、さらに、供給管７の内部断面がガイド要素１２ａの断面と同一である長手軸線を貫通する（画面に対して垂直である）対称面を有していることを示している。
【００４７】
例１：新鮮精液中のＹ染色体を含む精子の検出と性特異的仕分
新鮮に得られた雄牛の精液は、通常の方法で希釈剤において希釈され、ＤＮＡ特異的色素、例えばビスベンズイミドＨ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と共に２０℃から４０℃の温度で３０分から６０分培養され、続いて米国特許第５１２５７５９号明細書または独国特許第１０２００５０４４５３０号明細書に記載のフローサイトメーターにおいて、前記色素に対する励起波長の光が照射された。個々の発光を測定した。
【００４８】
精子の並びは、ノズルに対して直接的に下流にあって、個別化された液滴から成る流出する液体流に向けられている検出器を用いて決定された。ＤＮＡ含有量全体は、さらに下流において液体流に向けられている、さらなる検出器を用いて決定された。偏向装置は、反対に荷電された二つのプレートを液体流の両側に有し、ノズル内に液体を荷電させるための接触子を有していた。当該荷電は、周知のように検出器の信号に応じて中止された。当該検出器は、精子の並びを決定するとともに、ＤＮＡ含有量全体を決定するための検出器の信号に応じて電荷の極性を決定する。このように精子は、検出された信号に応じて電界を介して性染色体特異的な画分へと偏向させられた。
【００４９】
例えば選別法の間に用いられるシース流もしくは搬送流中に、および／または、色素を添加する前または色素を添加する間に、精子を静止させるために任意選択的にフッ化物を添加し、それにより、精子への色素の浸透を高めた。フッ化物イオンは、０．１ｍＭから１００ｍＭまでの範囲内、好ましくは１０ｎＭから１０ｍＭの範囲内で添加された。フッ化物、例えばＮａＦまたはＫＦの最適な濃度は、異なる種の間で、かつ個体により異なることが見出された。種に対する最適な濃度は特異的であり、一般的に顕微鏡観察の際、精子の少なくとも９０％、好ましくは概ね全ての精子を静止させる濃度として決定され得た。これに応じて、本発明は、また、本発明に係る方法を用いて製造された精子画分の組成と、人間以外の哺乳動物の性特異的精子画分と、を製造し、続いて当該精子画分を保存するための方法であって、それぞれ好ましくはフッ化物および／または抗酸化剤の存在下での方法と、に関する。
【符号の説明】
【００５０】
１  ハウジング
１ａ  挿入体
２  出口
３  ハウジングの第１端部
４  ハウジングの第２端部
５  長手軸線
６  カバー
７  供給管
８  供給管の第１端部
９  流出開口部
１０  供給管の第２端部
１１  流入開口部
１２ａ，１２ｂ  ガイド要素
１３ａ，１３ｂ，１３ｂ’  ガイド要素の第１端部
１４，１４ａ，１４ｂ  ガイド要素の第２端部
１５ａ，１５ｂ  ガイド要素の断面
１６  第１次元
１７  第２次元
１８  縁
１９  中心流液体のためのバッファ容器
２０  中心流液体のための供給導管
２１  圧電素子
２２  シース流液体のためのバッファ容器
２３  シース流液体のための入口
２４  シース流液体のための供給導管
２５  第１端部部分
２６  第２端部部分
２７  移行部分
２８  シリンダ部分
２９  第１次元における最大の延在
３０  狭窄部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ）】
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【図４Ｂ）】
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【図４Ｃ）】
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【図４Ｄ）】
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