(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防するための免疫原性組成物を作製する方法：
a．血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養であって、前記マイコプラズ菌がM.ヒオリーニス（M. hyorhinis）である、前記培養；および、
b．前記マイコプラズマ菌の抗原の入手であって、前記抗原が不活化バクテリン全体である、前記入手。
【請求項２】
血清がブタ血清を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイコプラズマ菌が血清の非存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫原性組成物がマイコプラズマ免疫原性組成物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して増大した免疫原性を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
不活化バクテリン全体がホルマリン不活化バクテリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫原性組成物が単一用量投与用に処方される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
対象動物がブタである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象動物がウシである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
対象動物がネコである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
対象動物がイヌである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに医薬的に許容できる担体を添加すること含み、前記医薬的に許容できる担体が、溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
医薬的に許容できる担体が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌（E. coli）の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS 1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択されるアジュバントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
医薬的に許容できる担体が、水中油中水エマルジョン又はカルボマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗原の免疫原性を増大させる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性の増大を示す、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象動物におけるマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防するための免疫原性組成物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ（Mycoplasma）属の細菌はモリクテス（Mollicutes）綱に属し、フィルミクテス（Firmicutes）系統から派生した一群の生物である。モリクテスは自律的に複製する最小の生物であり、細胞壁を欠くという点で他の真正細菌とは構造的に異なる。それらの一重膜の表面は、複雑な免疫応答能を有する宿主という環境において適応及び生存を左右する重要な境界面と考えられる。さらにまた、モリクテスは小さなゲノムと限られた数の代謝経路を有する。したがって、マイコプラズマ属のメンバーはまた“自己複製最小生物”と言い表されている。しかしながら、この外見的単純性にもかかわらず、多数のマイコプラズマ菌はヒト及び広範囲の動物の病原体である。ビルレンスがトキシン、インバシン及びサイトリシンによってほぼ決定される他の病原性細菌とは対照的に、マイコプラズマ菌はそのような典型的で直接的なビルレンス因子をもたないように思われる（Chambaud, I. et al, 2001, Nucleic Acids Res. 29: 2145-2153, Fraser et al, 1995, Science 270: 397-403）。病原性マイコプラズマが宿主細胞に細胞損傷、炎症及び疾患を引き起こすことを可能にする分子メカニズム及びエフェクターに関する利用可能な情報はこれまでのところほとんど存在しない。
【０００３】
病原性マイコプラズマ菌は、ヒト及び動物で主として非定型的肺炎、泌尿生殖器感染及び関節炎を引き起こす（Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.；Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605）。該徴候の再活性化及び悪化は繰り返され、徐々に慢性症に移行することが知られており、したがって早期診断及び早期治療とともに、悪化若しくは再活性化の予防又は治療が重要である。M.ヒオニューモニアエ（M. hyopneumoniae）は動物の風土病性肺炎の病因因子である。ブタでは、この疾患はもっとも一般的で、体重増加の減少及び低い飼料効率のために経済的に重要な疾患の1つである。この疾患は、肺病巣、慢性の咳、艶のない被毛皮膚（dull hair coat）、数週間持続する発育不全的外観をもたらす。肺病巣（特に腹側先端肺葉及び心臓側肺葉）は、上皮細胞の過形成並びに血管周囲及び細気管支周囲の単核細胞の蓄積増加を特徴とする。M.ヒオリーニス（M. hyorhinis）（また別のブタ気道における一般的なマイコプラズマ）は、仔豚で多発性漿膜炎及び関節炎を引き起こし得る。M.ヒオシノビアエ（M. hyosynoviae）は概して扁桃に定着し、関節炎症状を引き起こして経済的損失をもたらし得る。M.ヒオシノビアエは、関節及び咽頭/扁桃サンプルから単離され、血液及び関節液に抗体を誘導し得る。M.ボビス（M. bovis）はより病原性の強いマイコプラズマ菌の1つと考えられ、広く世界的に顕著な経済的損失を引き起こす。マイコプラズマ菌は、全年齢のウシで重篤な臨床徴候を引き起こす。M.ボビスはウシで肺炎、乳房炎及び関節炎を引き起こすことが判明したもっとも頻出する病源体であり、その病因学的役割はまた耳炎、角結膜炎、滑膜炎並びに雌牛及び雄牛の生殖器異常とも密接に関係している。
【０００４】
マイコプラズマは細胞壁を欠くので、一般的な多くの抗生物質（例えばペニシリン又は細胞壁合成を標的とする他のベータ-ラクタム抗生物質）の影響を受けない。特に有用なマイコプラズマ感染のための治療薬剤はいくつかの抗生物質、例えばマクロライド系、又は新規なキノリン系又はテトラサイクリン系抗生物質であるが、そのような抗生物質は重大な副作用を有し（例えば薬剤耐性株の出現）、前記副作用はマイコプラズマ感染の重篤化をもたらし、一方、十分な治療効果は期待できず、さらに慢性症への移行の原因となる。さらにまた、ワクチン免疫は有効なマイコプラズマ感染の制御方法である。しかしながら、ワクチン調製に必要な顕著な高収量は、通常は複合培養液で培養することによってのみ達成される（Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605；Gabridge M.G. et al. 1976, Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium, Applied and Environmental microbiology. 31, 986-989；Sotoodehnia A. et al 2007, Preparation of agalactia vaccine in fermentor, Archieves of razi institute, 62, 45-48；Dahlia et al., 2009, Isolation of Mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine, Tropical Biomedicine 26:341-345）。培養されるマイコプラズマ菌に応じて、当該複合培養液には10−30％の血清及び時には酵母抽出物が補充される。したがって、血清の高価格のためにマイコプラズマ菌の培養はコストがかかる。さらにまた、当該複合培養液における血清の削減は動物福祉の観点からもまた有益であろう。したがって、マイコプラズマ感染の予防に有効な免疫原性組成物の調製のために血清削減培養系でのマイコプラズマの顕著な高収量培養が希求される。さらにまた、ブタに固有のマイコプラズマ菌は概してブタ固有血清を含む複合培養液で培養される（Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605）。しかしながら、ブタ固有血清は他のブタ固有の病原体を含み得るか、又はブタ特異的病原体に対する抗体を含み得る（前記抗体は調製される免疫原性組成物の免疫原性を低下させ得る）。したがって、マイコプラズマ感染の予防に有効な免疫原性組成物を調製するためにブタ血清を含まない培養系でのマイコプラズマの顕著な高収量培養が希求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防するための免疫原性組成物の作製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防するための免疫原性組成物の作製方法に関する。
特に、本発明は、以下を含む、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物を作製する方法である：
a．血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；
b．該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及び
c．医薬的に許容できる担体の添加。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の特徴を述べる前に、以下のことを特記せねばならない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうではないことを示さないかぎり複数形の対応語を含む。したがって、例えば“a（又はan） antigen”と言えば抗原の複数形を含み、“cell”と言えば1つ以上の細胞及び当業者に公知のその同等物を指す、云々。特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が関係する業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似するか又は同等であるいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料をこれから述べる。本明細書に記載する全ての刊行物は、当該刊行物に報告されている、本発明に関連して用いられる可能性がある細胞株、ベクター及び方法論を記載及び開示するという目的のために参照によって本明細書に取り込まれる。本明細書のいずれの記述も、先発明を理由としてそのような開示に先行する権利を付与されないことを容認するものと解されるべきではない。
本発明は先行技術に固有の問題を解決し、当該技術の現況に明確な進歩を提供する。
本発明は、概して対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の作製方法を提供する。前記方法は、a）血清を削減させた真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養、b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手、及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。
有利には、本発明が提供する実験データは、マイコプラズマ菌は血清削減真核細胞系で生産できることを示す。
【０００８】
“免疫原性組成物”という用語は少なくとも1つの抗原を含む組成物を指し、該免疫原性組成物が投与される宿主で免疫学的応答を誘引する。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物への細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答であり得る。該宿主はまた“対象動物”と記載される。好ましくは、本明細書に記載又は言及する宿主又は対象動物はいずれも動物である。
通常は、“免疫学的応答”は以下の作用の1つ以上を含む（ただしこれらに限定されない）：本発明の免疫原性組成物に含まれる1つの抗原又は複数の抗原を特異的に指向する、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞、及び／又はガンマ-デルタT細胞の産生又は活性化。好ましくは、該宿主細胞は防御性免疫学的応答又は治療性応答を示すであろう。
“防御性免疫学的応答”は、感染宿主が通常示す臨床徴候の軽減又は欠如、迅速な回復期間、及び／又は感染性を示す期間の減少、又は感染宿主の組織若しくは体液若しくは分泌物中の病源体力価の低下によって明示される。
新規感染に対する抵抗性が強化され、及び／又は当該疾患の臨床重篤度が軽減されるように宿主が防御性免疫学的応答を示す場合に、該免疫原性組成物を“ワクチン”と言う。
【０００９】
本明細書で用いられる“抗原”は、そのような抗原又は免疫学的に活性なその成分を含む問題の免疫原性組成物又はワクチンに対する免疫学的応答を宿主で誘引する成分を指す（ただし前記に限定されない）。該抗原又は免疫学的に活性な成分は微生物であって、前記微生物のまるごと全体（不活化又は改変生型）又は任意のフラグメント若しくは断片であり得る。これらは、宿主に投与されると当該宿主で免疫学的応答を誘引することができる。該抗原は、その元々の形態であるか又はいわゆる改変生ワクチン（MLV）中の弱毒生物として完全な生きた生物であり得るか若しくはこれらを含み得る。該抗原はさらに前記生物のエレメントを含むことができる（サブユニットワクチン）。これらエレメントは、生物まるごと全体又はそのような生物の増殖培養物を破壊しその後の精製工程で所望の構造物として採集することによって、又は適切な系（例えば細菌、昆虫、哺乳動物又は他の種であるが、ただしこれらに限定されない）の適切な操作により誘導される合成プロセス（及び場合によりその後の単離及び精製手順）によって、又は適切な医薬組成物を用いて遺伝物質を直接取り入れることによりワクチンを必要とする動物で前記合成プロセスを誘導することによって（ポリヌクレオチドワクチン免疫）生成される。該抗原は、適切な方法によって不活化された生物まるごと全体をいわゆる死菌ワクチン（KV）として含むことができる。該生物が細菌である場合は、死菌ワクチンはバクテリンと称される。
【００１０】
“治療及び／又は予防”という用語は、ある群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下、又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随する臨床徴候の重篤度の軽減を指す。したがって、“治療及び／又は予防”という用語はまた、本明細書で提供する免疫原性組成物の有効量を投与されていない一群の動物と比較して、そのような免疫原性組成物を投与されてある、ある群れにおける特定のマイコプラズマ菌感染動物の数の減少（＝特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下）、又は一群の動物におけるマイコプラズマ感染に通常付随するか若しくは前記感染によって引き起こされる臨床徴候の重篤度の軽減を指す。
“治療及び／又は予防”は概して、その必要があるか又はそのような治療/予防により利益を受け得る対象動物又は対象動物の群れに有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む。“治療”という用語は、ひとたび対象動物又は群れの少なくとも数匹の動物がそのようなマイコプラズマに感染したら、さらにそのような動物がそのようなマイコプラズマ感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいくつかの臨床徴候を示す場合に該免疫原性組成物の有効量を投与することを指す。“予防”という用語は、対象動物のマイコプラズマによるいずれの感染よりも前に、又は少なくともそのような動物若しくは一群の動物のいずれもがそのようなマイコプラズマによる感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいずれの臨床徴候も示さない場合に、そのような対象動物に投与することを指す。
【００１１】
本明細書で用いられる“有効量”という用語は、対象動物で免疫応答を誘引するか又は誘引することができる抗原の量を意味する（ただし前記に限定されない）。そのような有効量は、群れにおいて特定のマイコプラズマ感染の発生率を低下させるか、又は特定のマイコプラズマ感染の臨床徴候の重篤度を軽減させることができる。
好ましくは、臨床徴候の発生率又は重篤度は、治療されていないか又は本発明より前に利用可能であった免疫原性組成物で治療されたが続いて特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも％、さらに好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％軽減される。
【００１２】
本明細書で用いられる“臨床徴候”という用語は、マイコプラズマ菌による対象動物の感染の徴候を指す。該感染の臨床徴候は選択される病原体に左右される。そのような臨床徴候の例には呼吸困難、多発性漿膜炎（例えば腹膜炎、胸膜炎、心膜炎）、関節炎（跛行及び関節腫脹）、耳炎、粗雑化被毛、微熱、抑うつ状態、食欲減退及び菌血症が含まれる（ただしこれらに限定されない）。しかしながら当該臨床徴候はまた生きている動物から直接観察し得る臨床徴候を含む（ただし前記に限定されない）。生きている動物から直接観察され得る臨床徴候の例には、鼻及び眼の分泌物、嗜眠、咳、喘鳴、不整痙攣性呼吸（thumping）、体温上昇、体重増加又は減少、脱水、下痢、関節腫脹、跛行、るい痩、皮膚蒼白、発育不全、下痢などが含まれる。
対象動物における特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされるか又は前記感染に付随する臨床徴候の発生率の低下又は重篤度の軽減は、本発明の免疫原性組成物の1用量以上をその必要がある対象動物に投与することによって達成できる。実施例2及び3で示されるように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、その必要がある対象動物への単一用量の投与後に有効であることが証明された。
【００１３】
“感染”又は“感染した”という用語は、病原体（すなわちM.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエ）による対象動物の感染を指す。
“マイコプラズマ”という用語は当業者には公知である。“マイコプラズマ”は例えば以下に記載された細菌の属を指す：Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.；Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605。細菌は、それらの生化学的及び生物学的特性の他にそれらの形態学に基づいて分類できる。これらの分類基準は当業界で周知である。概して、当該マイコプラズマ感染は本記述の他の個所に記載した臨床徴候を伴う。
本明細書で用いられる“マイコプラズマ”という用語は、M.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエを指す。しかしながら、マイコプラズマという用語はまたM.ボビスを包含する。M.ヒオリーニスの完全なゲノム配列は、代表例として例えば以下に提供されている：Liu, W. et al., J. Bacteriol. 2010, vol. 192 (21), 5844-45 doi: 10.1128/JB.00946-10. Epub 2010 Aug 27；又はCalcutt MJ. et al., 2012, J. Bacteriol. Vol. 194 (7), 1848 doi: 10.1128/JB.00033-12。M.ヒオシノビアエの単離株は、代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25591又はATCC 27095で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエの単離株は、代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25095、ATCC 25617及びATCC 25934で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエJ-株のゲノムDNAは、アメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25934Dで寄託されている。マイコプラズマ・ボビスの単離株は当業者には周知であり、いくつかの単離株が代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25025、ATCC 25523及びATCC 27368で寄託されている。
【００１４】
“培養”という用語は当業者には公知である。前記用語は、当該生物の外部において培養状態で細胞を増殖させることに関する。特に“培養”という用語は、当該生物の外部において細胞系で細胞を増殖させることに関する。
“細胞系”という用語は当業者には公知である。特に、“細胞系”という用語は、微生物（例えばマイコプラズマ菌）の培養のためのin vitro細胞培養系である。そのような細胞系は、宿主細胞及び当該生物の外部でそのような細胞を増殖させるために適切な細胞培養培養液を含む。特に、宿主細胞は、マイコプラズマ菌の感染に感受性であることもないこともある。そのような宿主細胞は、生きている細胞として、不活化形で又は細胞フラグメントとして存在し得る。好ましくは、そのような宿主細胞は真核細胞系の真核細胞である。
【００１５】
“真核細胞系”という用語は、初代真核細胞及び多細胞生物（例えば植物又は動物）から誘導された真核細胞を含む。さらにまた、真核細胞系は、真核単細胞生物（微生物とも称される）、例えば細菌又はカビ（酵母を含む）を包含する。しかしながら、真核細胞はマイコプラズマ菌とは異なることは理解されよう。本明細書に記載の方法の実施に用いることができる真核宿主細胞には、メイジン-ダービー（Madin-Darby）イヌ腎上皮（MDCK）細胞（例えばアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC CCL-34又はATCC CRL-2285で寄託されたメイジン-ダービーイヌ腎上皮細胞）又はマッコイ（McCoy）細胞（例えばアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC CRL-1696で寄託されたもの）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられる“無細胞培養系”という用語は、マイコプラズマ菌を除いて細胞を全く含まない培養系を指す。
【００１６】
“血清が削減された”という用語は、無細胞培養系でマイコプラズマ菌の培養に用いられる血清の量と比較して、真核細胞系で同じ種のマイコプラズマ菌の培養に添加される血清の量の削減を指す。無細胞培養系でのマイコプラズマ菌培養のための血清の量と比較して、真核細胞系でのマイコプラズマ菌培養のための血清の量は、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％軽減される。したがって、本発明にしたがえば、マイコプラズマ菌はもっとも好ましくは血清を全く欠く真核細胞系で培養されることを理解しなければならない。
【００１７】
真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−10％（v/v）、より好ましくは約1−9％（v/v）、さらに好ましくは約1−8％（v/v）、さらに好ましくは約1−7％（v/v）、さらに好ましくは約1−6％（v/v）、もっとも好ましくは約2−5％（v/v）の間の血清濃度を含む。
MDCK細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−6％（v/v）、より好ましくは約1−5％（v/v）、さらに好ましくは約2−4％（v/v）、さらに好ましくは約2−3％（v/v）の間の血清濃度、もっとも好ましくは約2％（v/v）の血清濃度を含む。
マッコイ細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−10％（v/v）、より好ましくは約1−9％（v/v）、さらに好ましくは約2−8％（v/v）、さらに好ましくは約3−7％（v/v）、さらに好ましくは約4−6％（v/v）の間の血清濃度、もっとも好ましくは約5％（v/v）の血清濃度を含む。
【００１８】
本発明のある特徴にしたがえば、該真核細胞系の真核細胞はマイコプラズマ菌で感染させられることは理解されよう。真核細胞のマイコプラズマ菌による感染及びインキュベーション期間後の条件は当業者には周知である。しかしながら好ましくは、細胞は、トランスフェクション後21日間、より好ましくは約2日から約14日、より好ましくは約2日から約8日、さらに好ましくは約3から5日の期間にわたってインキュベートされる。好ましいインキュベーション条件は、約32−42℃、より好ましくは約34−40℃、さらに好ましくは約35−39℃、さらに好ましくは約36−38℃、もっとも好ましくは約37℃の温度を含む。好ましいインキュベーション条件はまた、約2％から8％、より好ましくは約3％から7％、さらに好ましくは約4％から6％の間のCO2濃度、もっとも好ましくは約5％のCO2濃度を含む。好ましくは、トランスフェクションに続いて、当該真核細胞は、特徴的な変化、例えば細胞密度の傾向、生命活性の低下（感染期間後の細胞変性効果を含む）及びpH変化による培養液の色の変化について観察される。
【００１９】
“入手する”という用語は、抗原の採集、単離、精製及び／又は処方（例えば仕上、不活化及び／又はブレンド）を含む。
“採集”という用語はマイコプラズマ菌の抗原をトランスフェクトした真核細胞系から収集又は回収することを指す。当業界で公知の任意の通常的方法（例えば任意の分離方法）を前記マイコプラズマ抗原の回収に用いることができる。当業界で周知の方法は遠心分離又はろ過（例えば一定の孔サイズを有する半透膜を用いる）を含む。
“単離”という用語はマイコプラズマ抗原の単離工程を含む。マイコプラズマ菌の抗原を感染真核細胞系から単離する方法は当業者には公知である。そのような方法は物理的及び／又は化学的方法を含み、凍結融解の繰り返し、超音波処理などが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
単離株から抗原を“精製”する方法は当業者には公知であり、前記精製は例えば以下に記載の方法による：Protein purification methods - a practical approach, E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press。そのような方法には、遠心分離又はろ過による分離、沈殿、サイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。抗原は、精製された純粋な形態で入手し得るか、或いは他の細胞性物質若しくは培養液などを含まないか又は実質的に前記を含まない状態であり得る。前記単離及び／又は精製後、抗原は、少なくとも80％、好ましくは80％−90％、より好ましくは90％−97％、もっとも好ましくは97％から夾雑物を全く含まない完全に純粋な形態までの純度を示す。
【００２０】
更なる特徴にしたがえば、本明細書で用いられる“入手”はまた、さらに別の仕上工程（例えば緩衝液の添加、不活化、中和工程など）を最終的な処方プロセスの部分として含むことができる。
任意の通常的な“不活化”方法を本発明の目的のために用いることができる。したがって、不活化は、当業者に公知の化学的及び／又は物理的処置によって実施できる。好ましい不活化方法には、2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（BEA）（環化されて二元性エチレンイミンを形成している）の溶液の添加を含む環化二元性エチレンイミンの添加が含まれる。さらに別の好ましい化学的不活化剤は、トリトンX-100、デオキシコール酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、β-プロピオラクトン、チメロサール、フェノール及びホルムアルデヒド（ホルマリン）を含むが、ただし前記に限定されない。しかしながら、不活化はまた中和工程を含むことができる。好ましい中和剤にはチオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましいホルマリン不活化条件は、約0.02％（v/v）−2.0％（v/v）、より好ましくは約0.1％（v/v）−1.0％％（v/v）、さらに好ましくは約0.15％（v/v）−0.8％（v/v）、さらに好ましくは約0.16％（v/v）−0.6％（v/v）、もっとも好ましくは約0.2％（v/v）−0.4％（v/v）のホルマリン濃度を含む。インキュベーション時間はマイコプラズマ種の耐性に左右される。概して、不活化プロセスは、適切な培養系でマイコプラズマの増殖が検出できなくなるまで実施される。
【００２１】
更なる特徴にしたがえば、本発明の不活化バクテリン成分は、公知の技術（例えば以下に記載されたもの：Nature, 1974, 252, 252-254 or Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13）を用いてリポソームに取り込むことができる。別の特徴にしたがえば、本発明の不活化バクテリン成分は、適切な生物学的化合物（例えば多糖類、ペプチド、タンパク質など又は前記の組み合わせ）と複合物を形成させることができる。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記免疫原性組成物はマイコプラズマ免疫原性組成物である。
本発明のある特徴では、マイコプラズマ菌の培養に用いられる血清はブタ血清を含まない。“ブタ血清を含まない”という用語は、真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養プロセス中にブタ血清が添加されないことを意味する。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記血清はブタ血清を含まない。更なる特徴にしたがえば、マイコプラズマ菌の抗原の全てがブタ血清を含まない真核細胞系で生成される。
【００２２】
更なる特徴では、マイコプラズマ菌の培養は血清の非存在下で行われる。このことは、真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養中に血清は添加されないことを意味する。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清の存在しない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。更なる特徴にしたがえば、マイコプラズマ抗原の全てが血清の非存在下で生成される。
本発明のある特徴では、マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンである。マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化マイコプラズマバクテリンであり得ることは理解されよう。
【００２３】
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ抗原は全不活化バクテリンである。更なる特徴にしたがえば、免疫原性組成物中のマイコプラズマ抗原の全てが全不活化バクテリンである。不活化マイコプラズマ抗原は、上記に記載の方法の工程b）が不活化工程を含むような工程で入手できる。したがって、更なる特徴にしたがえば、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法が提供され、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手及び該マイコプラズマ抗原の不活化；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。
全不活化バクテリンは、マイコプラズマ菌全体を丸ごと好ましくは上記に記載の方法によって不活化することにより入手できる。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手及び該マイコプラズマ抗原の不活化；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ抗原は完全なマイコプラズマ菌である。
【００２４】
好ましくは、マイコプラズマ菌は、上記に記載したようにホルマリンで不活化される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手及び該マイコプラズマ抗原のホルマリンによる不活化；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ抗原は完全なマイコプラズマ菌である。好ましくは、ホルマリンは上記に記載の濃度で用いられる。
【００２５】
本発明のある特徴では、真核細胞系はMDCK細胞株を含む。MDCK（メイジン-ダービーイヌ腎上皮細胞）細胞株は、雌のコッカースパニエル成犬の腎組織から誘導された。しかしながら、MDCK細胞株は当業者には公知である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記真核細胞系はMDCK細胞株を含む。繰り返せば、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。
本発明の更なる特徴では、真核細胞系はマッコイ細胞株を含む。マッコイ細胞株は当業者には公知である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記真核細胞系はマッコイ細胞株を含む。繰り返せば、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。
【００２６】
本発明のある特徴では、マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ボビスから成る群から選択される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ボビスから成る群から選択される。好ましくは、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明の更なる特徴では、マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００２７】
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのM.ヒオニューモニアエ菌の培養；b）M.ヒオニューモニアエ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、M.ヒオニューモニアエの抗原は全不活化M.ヒオニューモニアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記M.ヒオニューモニアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化M.ヒオニューモニアエバクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのM.ヒオリーニス菌の培養；b）M.ヒオリーニス菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、M.ヒオリーニスの抗原は全不活化M.ヒオリーニスバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記M.ヒオリーニス抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化M.ヒオリーニスバクテリンであり得ることは理解されよう。
【００２８】
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのM.ヒオシノビアエ菌の培養；b）M.ヒオシノビアエ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、M.ヒオシノビアエの抗原は全不活化M.ヒオシノビアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記M.ヒオシノビアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化M.ヒオシノビアエバクテリンであり得ることは理解されよう。
更なる特徴にしたがえば、免疫原性組成物は、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ抗原を含む。マイコプラズマ免疫原性組成物の調製に用いられる、上記記載のマイコプラズマ種（例えばM.ヒオニューモニアエ又はM.ヒオリーニス又はM.ヒオシノビアエ）の少なくとも1つの細菌が、本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、マイコプラズマ免疫原性組成物の調製に用いられるマイコプラズマ菌の全てが、本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。
【００２９】
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び／又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエから成る群から選択される少なくとも1つのマイコプラズマ菌の血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該マイコプラズマ菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び／又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での少なくともM.ヒオニューモニアエ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該M.ヒオニューモニアエ菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該M.ヒオニューモニアエ抗原の少なくとも１つは全不活化M.ヒオニューモニアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記M.ヒオニューモニアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３０】
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び／又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での少なくともM.ヒオリーニス菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該M.ヒオリーニス菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該M.ヒオリーニス抗原の少なくとも１つは全不活化M.ヒオリーニスバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記M.ヒオリーニス抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び／又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での少なくともM.ヒオシノビアエ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該M.ヒオシノビアエ菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該M.ヒオシノビアエ抗原の少なくとも１つは全不活化M.ヒオシノビアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記M.ヒオシノビアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３１】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は単一用量投与用に処方される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、免疫原性組成物は一用量投与用に処方される。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されようよう。
有利には、本発明が提供する実験データは、本発明の免疫原性組成物の一用量投与が防御性免疫応答を確実にかつ効果的に刺激したことを示す。特に、測定可能な抗体応答がM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエについて示された。
本明細書で用いられる“対象動物”という用語は、動物（好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル若しくはウシ、好ましくはまたヒト）に関する。
【００３２】
本発明のある特徴では、対象動物はブタである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はブタである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明の更なる特徴では、対象動物はウシである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はウシである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３３】
本発明の更なる特徴では、対象動物はネコである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はネコである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明の更なる特徴では、対象動物はイヌである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はイヌである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
“医薬的に許容できる担体”という用語には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせが含まれる。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はアジュバントである。
【００３４】
本明細書で用いられる“アジュバント”には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン（例えばQuilA、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA））、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは特に以下を基剤にすることができる：軽質流動パラフィン油（欧州局方タイプ）；イソプレノイド油（例えばスクワラン又はスクワレン）；アルケン（特にイソブタン又はデセン）のオリゴマー化から生じる油；酸又は直鎖アルキル基含有アルコールのエステル、具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ(カプリレート/カプレート)又は二オレイン酸プロピレングリコール；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油を乳化剤と一緒に用いてエマルジョンを生成する。好ましくは、乳化剤は、非イオン性界面活性剤（特にソルビタン、マンニド（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びオレイン酸、イソステアリン酸、レシノール酸のエステルで、前記は場合によってエトキシル化される）、及びポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニックの製品（特にL121）である。以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.).  JohnWiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；及びTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997。
例えば、SPTエマルジョン（以下の文献の147ページに記載されている：Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach (M. Powell and M. Newman eds.), Plenum Press, 1995）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載されている）を用いることが可能である。さらにまた別の適切なアジュバントには、多くのものの中でとりわけRIBIアジュバント系（RIBI Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS 1314又はムラミルジペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中ではとりわけEMA（Monsanto）（無水マレイン酸とエチレンとのコポリマー）が含まれる。これらのコポリマーの水への溶解は酸性溶液を生じ、好ましくは生理学的pHに中和されてアジュバント溶液が得られ、前記に免疫原性組成物、免疫学的組成物又はワクチン組成物そのものが取り込まれるであろう。
【００３５】
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有益なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーで、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol.  8, No.  2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照できる。この特許は、少なくとも3つの（好ましくは8つを超えない）ヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物（少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されている）で架橋されたアクリル酸ポリマーを記載している。好ましいラジカルは、2つから4つの炭素原子を含むもの（例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基）である。該不飽和ラジカルはそれら自体他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。カルボポール（CARBOPOL(商標)）の名称で販売されている製品（BF Goodrich, Ohio, USA）が特に適切である。それらは、ポリアルケニルエーテル又はジビニルグリコールで架橋されているか、又はアリルシュクロース若しくはアリルペンタエリトリトールで架橋されているアクリル酸のポリマーである。それらの中ではとりわけ、CARBOPOL(商標)974P、934P及び971Pを挙げることができる。もっとも好ましいものはCARBOPOL(商標)971Pの使用である。
【００３６】
好ましくは、アジュバントは1用量につき約100μgから約10mgの量で添加される。より好ましくは、アジュバントは1用量につき約100μgから約10mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは1用量につき約500μgから約5mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは1用量につき約750μgから約2．5mgの量で添加される。もっとも好ましくは、アジュバントは1用量につき約1mgの量で添加される。
本発明の好ましい実施態様では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌の易熱性エンテロトキシン（組換え又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、医薬的に許容できる担体はアジュバントである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３７】
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体は水中油中水エマルジョン又はカルボマーである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、医薬的に許容できる担体は水中油中水エマルジョン又はカルボマーである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明のある特徴では、水中油中水エマルジョンはモンタニド（Montanido）ISA207 VGである。モンタニドISA207 VGは、非鉱物油中に溶液の無水マンニトールのオレイン酸エステルを含むアジュバントであり、水中油中水ワクチンエマルジョンを生成するように考案されている。モンタニドISA207 VGは当業者に周知であり利用することができる。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、医薬的に許容できる担体はモンタニドISA207 VG又はCARBOPOL(商標)である。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも１つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３８】
本発明はまた、マイコプラズマ抗原の免疫原性を増大させる上記に記載の方法に関する。有利には、本発明が提供する実験データは、上記に記載の方法によって提供されるマイコプラズマ菌抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性が増大していることを示す。特に、MDCKによるM.ヒオリーニスワクチンは、血清転換のより早期の開始、はるかに多数の血清陽性豚及びより高い血清学的力価を示した。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、抗原の免疫原性を増大させる方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明のある特徴では、抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性が増大している。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、抗原の免疫原性を増大させる方法を提供し、前記方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、該免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して免疫原性が増大している。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００３９】
本明細書で用いられる“増大した免疫原性”という用語は、問題の抗原を含む免疫原性組成物によって引き起こされる免疫学的応答が、同じ抗原を含む参照免疫原性組成物と比較して増加していることを意味し、ここで参照免疫原性組成物の抗原は無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される。
“増大した”という用語は、細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答が、同じ抗原を含む参照免疫原性組成物（参照免疫原性組成物の抗原は無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される）によって誘引される細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答と比較して少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも75％、もっとも好ましくは少なくとも100％増加することを意味する。細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答の測定の仕方は当業者の一般的な知識である。特に、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の細胞媒介免疫応答との比較、又は問題の免疫原性組成物の抗体媒介免疫応答と参照物のそれとの比較はそのような当業者には明白であるが、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の抗体媒介免疫応答との比較又はその逆は自明ではない。さらにまた、細胞媒介免疫応答は、例えば問題の免疫原性組成物/抗原による細胞傷害性T細胞の活性化の測定によって測定できる。抗体媒介免疫応答は、例えば、当該抗原を含む免疫原性組成物を動物に投与することによって生成される抗原特異的抗体の量の測定によって測定できる。細胞及び／又は抗体媒介免疫応答は、マウスモデル、ネコモデル、ウシモデル又はブタモデルを用いることによって測定できる。しかしながら、実施例4及び5に記載するアッセイは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエに対する免疫学的応答を検出する参照アッセイとして用いられるであろう。
【００４０】
“同じ抗原”という用語は当該抗原の性質が同一であることを意味する。したがって、血清を削減した真核細胞系で生産された免疫原性組成物のマイコプラズマ抗原がM.ヒオリーニスの全不活化バクテリンである場合、同じ抗原とは、無細胞系のマイコプラズマ抗原もまたM.ヒオリーニスの全不活化バクテリンであることを意味する。さらにまた、血清を削減した真核細胞系で生産された免疫原性組成物のマイコプラズマ抗原が特別な方法にしたがって調製又は精製されるならば、“同じ抗原”は、無細胞系のマイコプラズマ抗原が同じ方法にしたがって調製又は精製されることを意味する。
“参照”免疫原性組成物という用語は、本発明の血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でマイコプラズマ菌を培養することによって入手されたものではない免疫原性組成物を指す。
より適切な言い方をすれば“参照”免疫原性組成物という用語は、血清補充無細胞培養系でマイコプラズマ菌を培養することによって入手された、同じ抗原を用いる免疫原性組成物を指す。血清補充無細胞培養系でのマイコプラズマ菌の培養は当業者には周知である。血清の由来及び血清濃度は、培養されるマイコプラズマ菌及び得られるマイコプラズマ菌の収量に左右される。M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエは、概して10−20％（v/v）ブタ血清及び5−10％（v/v）酵母抽出物を補充した無細胞培養系で培養され、高収量が得られる。しかしながら、血清濃度は変更可能であり、酵母抽出物を欠いていてもよく、血清の由来は例えばウシ胎児血清に変更できることは理解されよう。
【００４１】
本発明は、免疫原性組成物の調製方法又は上記に規定する抗原の免疫原性の増大方法を提供するだけでなく、本発明はまた上記に記載の方法によって入手できる免疫原性組成物に関する。したがって更なる特徴では、本出願は、本発明にしたがい本明細書に記載の方法によって入手できる免疫原性組成物に関する。慨すれば、そのような方法は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は参照免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示し、ここで、参照免疫原性組成物の抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される。
したがって更なる特徴にしたがえば、本出願は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供する。更なる特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される同じ抗原を含む参照免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００４２】
更なる特徴では、免疫原性組成物は、前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。
“真核細胞の成分”という用語は前記真核細胞の細胞全体及びフラグメントを含む。“フラグメント”という用語は、真核細胞の任意の部分（例えば細胞膜の部分）又は細胞内小器官をその全体若しくは部分として含む。しかしながら、フラグメントという用語はまた、脂質、タンパク質、糖、DNA、RNA及びその類似物並びに前記の組み合わせを含む前記真核細胞の任意の部分を包含する。さらにまた、真核細胞成分及びマイコプラズマ抗原は、別々に若しくは互いに付着して又は前記の組み合わせで免疫原性組成物中に存在し得る。
したがってある特徴にしたがえば、本出願は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供し、ここで免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
更なる特徴では、前記真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原に付着している。
【００４３】
“付着”という用語は、前記真核細胞の成分とマイコプラズマ抗原との任意の相互作用、緊密な結びつき、結合、接着又は連結を指す。したがって、付着という用語は、直接的若しくは間接的、不可逆的若しくは可逆的、物理的及び化学的、静電気的、及び／又は共有結合的な結合を含む任意の相互作用を包含する。したがって、例えば、真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原と例えば結合し得ると理解されねばならない。しかしながら、真核細胞の成分はまたマイコプラズマ抗原に結合することができると理解されねばならない。そのような結合は、当業者に周知のいくつかの方法（例えばホルムアルデヒド処理など）によって生じ得る。
したがってある特徴にしたがえば、本出願は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供し、ここで、前記真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原に付着している。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００４４】
典型的には、細菌抗原（例えばマイコプラズマバクテリン）が用いられるとき、免疫原性組成物は、1用量につき約103から約1010コロニー形成単位（CFU）の細菌抗原、好ましくは1用量につき約104から約109CFUの細菌抗原、より好ましくは1用量につき約105から約106CFUの細菌抗原の量を含む。不活化バクテリンが免疫原性組成物に用いられる場合は、CFU値は不活化前のマイコプラズマ菌の量を指す。
例えば、M.ヒオニューモニアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオリーニスの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオシノビアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。
【００４５】
したがってある特徴にしたがえば、本出願は、a）血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；b）該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む免疫原性組成物を提供する方法を提供し、ここで免疫原性組成物は1用量につき約103から約1010コロニー形成単位（CFU）の細菌抗原を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
【００４６】
本発明の具体的な実施態様をいくつか例示的に列挙する。
〔１〕以下を含む、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する免疫原性組成物を調製する方法：
a．血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養；
b．該マイコプラズマ菌の抗原の入手；及び
c．医薬的に許容できる担体の添加。
〔２〕血清がブタ血清を含まない、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕マイコプラズマ菌が血清の非存在下で培養される、前記〔1〕に記載の方法。
〔４〕免疫原性組成物がマイコプラズマ免疫原性組成物である、前記〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して増大した免疫原性を有する、前記〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕抗原が不活化バクテリン全体である、前記〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕不活化バクテリン全体がホルマリン不活化バクテリンである、前記〔6〕に記載の方法。
〔８〕真核細胞系がMDCK細胞株を含む、前記〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕真核細胞系がマッコイ細胞株を含む、前記〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕マイコプラズマ菌が、M.ヒオニューモニアエ（M. hyopneumoniae）、M.ヒオリーニス（M. hyorhinis）、M.ヒオシノビアエ（M. hyosynoviae）、それらの任意の組み合わせ、及びM.ボビス（M. bovis）から成るリストから選択される、前記〔1〕から〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕マイコプラズマ菌が、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエから成るリストから選択される、前記〔1〕から〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕免疫原性組成物が単一用量投与用に処方される、前記〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕対象動物がブタである、前記〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕対象動物がウシである、前記〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕対象動物がネコである、前記〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕対象動物がイヌである、前記〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕医薬的に許容できる担体が、溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される、前記〔1〕から〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕医薬的に許容できる担体が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌（E. coli）の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択されるアジュバントである、前記〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕医薬的に許容できる担体が、水中油中水エマルジョン又はカルボマーである、前記〔1〕から〔18〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕抗原の免疫原性を増大させる、前記〔1〕から〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性の増大を示す、前記〔20〕に記載の方法。
〔２２〕前記〔1〕から〔21〕のいずれかに記載の方法によって入手できる、免疫原性組成物。
【００４７】
本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する方法の多様なプロセス工程を組み合わせて、本明細書に記載する発明を実施できることは当業者には理解されよう。
実施例
以下の実施例は本発明を詳述することのみを意図する。それらは特許請求の範囲を如何なる態様でも制限するものではない。
【実施例１】
【００４８】
それぞれMDCK細胞又はマッコイ細胞でのマイコプラズマ菌の培養
A．M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエのMDCK細胞での培養 M.ヒオリーニス：
MDCK細胞のコンフルエントなT75フラスコをトリプシン処理し、MEM＋5％FBSを用いて5枚のT150フラスコに継代培養する（1：10分割）。ほぼ95−100％コンフルエントな単層が認められるまで、37℃＋5％CO2でフラスコをインキュベートする。培養液をデカントし、フラスコを1ｘPBSで2回洗浄する。4−5mLのM.ヒオリーニスを各フラスコに添加する（MOI＝10−100）。上記と同じインキュベーション条件下で2時間を下まわらない時間でフラスコのコンフルエントな細胞を感染させる。感染期間後に、ほぼ37℃に予め温めた十分な感染培養液（MEM＋2％FBS）を合計体積60mL/フラスコで各フラスコに添加する。CPE が90％を超えるまで（ほぼ3−7日）フラスコをインキュベートする。細胞懸濁物を各フラスコから収集し、一緒にプールする（継代＝n）。前記プールした材料を用いて、ほぼ95−100％コンフルエントなMDCK細胞の新しいフラスコを先の感染と同じ態様で感染させ（継代＝n＋1）、用いるフラスコの数を増加させながら必要と考える十分な最終体積達成する（継代＝n＋2、継代＝n＋3）。
M.ヒオシノビアエ：
以下のようにいくらか改変しつつM.ヒオリーニスと同じ態様でM.ヒオシノビアエを培養する：感染培養液はDMEM＋2％FBS＋1％アルギニン溶液を含む、M.ヒオシノビアエは典型的なCPEを示さないので、培養液の色の変化及び濁度が次の継代培養への重要な指標である。
M.ヒオニューモニアエ：
M.ヒオニューモニアエをM.ヒオリーニスと同じ態様で培養する。感染に用いる株に応じて、CPEが提示されることもされないこともある。したがって、培養液の色の変化及び濁度を次の継代培養への指標として用いることができる。
B．マッコイ細胞でのM.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエの培養条件
M.ヒオリーニス：
攪拌フラスコ中の10％FBS補充改変EMEMでマッコイ細胞を懸濁培養として増殖させる。105−106細胞/mLの最終濃度を有するように細胞を新しいフラスコに播種することによって継代する。M.ヒオリーニスの場合、3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mL）を1mLの107−108CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上で3−7日間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。マイコプラズマの増殖は眼に見える酸性pH変化及び濁度の増加によって確認される。マイコプラズマ増殖はまたPFUアッセイで評価して総数を決定する。
M.ヒオシノビアエ：
M.ヒオシノビアエはM.ヒオリーニスと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mL）を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定する。
M.ヒオニューモニアエ：
M.ヒオニューモニアエは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mL）を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定することができる。
C．種々の血清タイプによるマイコプラズマ種の培養
あるマイコプラズマ種が種々の種に由来する血清中で培養できるか否かを評価するために、MDCK細胞をM.ヒオリーニスに感染させ、ウシ胎児血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清又はウマ血清中で培養する。各血清タイプについて、MDCK細胞でのM.ヒオリーニスの培養を上記のように実施する（すなわち細胞増殖に5％血清及び感染に2％血清）。M.ヒオリーニスを標準的方法により感染後4日で採集する。CCU（色変化単位（color changing unit））アッセイを実施してM.ヒオリーニスの生力価を決定する。さらにまた、qPCR（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）を実施して、M.ヒオリーニスの総ゲノム含有量を決定する。例示的実験を表1に示す。
【００４９】
表1：種々の血清タイプによるM.ヒオリーニスの培養
0006449364.tif 000002
表1は、CCUアッセイ又はqPCRのどちらかによって測定された力価は種々の血清タイプについて類似することを示す。さらにまた、ウェスタンブロットのデータ（表示されていない）は前記のデータを支持する。したがって、M.ヒオリーニスはどの血清タイプを培養に用いるかに関係なくMDCK細胞で培養できる。
【実施例２】
【００５０】
ワクチンの調製
最後の継代で採集できるようになった（90％を超えるCPEが存在する）ときに凍結融解を1回だけ実施する。凍結融解は以下の工程によって実施する：全フラスコをフリーザー（＜-60℃）に2時間より長く静置する、37℃で急速融解する、溶解物を収集及びプールする、さらに数回ピペットで上下させて均質化する。概して、その後10−20％のグリセロールを懸濁物に添加し均質化する。懸濁物を作業に適した体積に小分けする。必要とされるまでストックを-60℃より低温で維持する。
上記ストックの適切な体積を0.2％のホルマリンで不活化する。ワクチンをブレンドするときに、過剰なホルマリンを重亜硫酸ナトリウムで中和する。ワクチンをモンタニドISA207 VG又はCARBOPOL(商標)アジュバントとブレンドする。ワクチンは2−7℃で保存する。
【実施例３】
【００５１】
ワクチンの有効性の判定
ワクチンの有効性は、ブタに投与した後で抗体応答を誘発する能力（及びELISAによる力価）を基準に評価する。
動物のケア：
動物は試験開始前まで良好な健康及び栄養状態にある。任意抽出手順の前に、健康審査を実施する。試験期間を通して医薬が添加されていない飼料を用いる。飼料比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢、状態及び種について適切である。試験の間水は自由供給される。
ブタに投与後のM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエワクチンの有効性の判定
M.ヒオリーニス：
D0及びD21に再度、通常の仔豚（6週齢±5日）の筋肉内にM.ヒオリーニスワクチンの2mL用量（7.1−7.3log10CCU/用量）を投与する。M.ヒオリーニスは上記のように調製する（すなわち上記のようにMDCK細胞で培養する）。ワクチンにモンタニドISA207VG又はCARBOPOL(商標)をアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。ワクチン接種前D0、7、14、21、28、35及び42に血液を収集する。BIVI R&DインダイレクトELISAにより、M.ヒオリーニス特異抗体について血清を検査する。BIVI R&D ELISAの場合、0.200を超えるS/P比を陽性とみなす。
表2に示す例では、M.ヒオリーニスELISAは強い抗体応答を示す。M.ヒオリーニス-MDCK＋モンタニドISA207VG でワクチン接種した6/6（100％）の動物が、第1回目の投与後2週間（D14）で陽性であった。全動物がD42までずっと陽性を維持し、2回目の投与後1週間（D28）で力価は上昇する。
【００５２】
表2：M.ヒオリーニスのELISAの結果
0006449364.tif 000003
ワクチン接種後に同様な抗体応答の結果が、マッコイ細胞で培養されたM.ヒオリーニスを用いて得られた(データは示されていない)。同様な結果は単一用量投与後に得られた（データは示されていない）。
【００５３】
M.ヒオニューモニアエ：
D0及びD21に再度、通常の仔豚（6週齢±5日）の筋肉内にM.ヒオニューモニアエワクチンの2mL用量（8.0−8.5log10CCU/用量）を投与する。ワクチンにモンタニドISA207VGをアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。ワクチン接種前D0、7、14、21、28、35及び42に血液を収集し、M.ヒオニューモニアエ抗体の存在について検査する。ある例では、市販のIDEXX ELISAを用い、0.400を超えるS/P比を陽性とみなした。
表3に示す例では、M.ヒオニューモニアエELISAは強い抗体応答を示した。M.ヒオニューモニアエMDCK＋ISA207ワクチン接種動物の場合、D14で3/6（50％）の動物が、D21で5/6（83.3％）が、D28，35及び42で6/6（100％）が陽性であった。
【００５４】
表3：M.ヒオニューモニアエのIDEXX ELISAの結果
0006449364.tif 000004
同様な結果が一用量投与後に得られた（データは示されていない）。
【実施例４】
【００５５】
真核細胞株培養マイコプラズマ菌から入手したワクチンと無細胞系培養マイコプラズマ菌から入手したワクチンの有効性対比
54匹のCD/CD動物（8週齢±5日）を6グループに分ける。グループV1及びV2は各々、それぞれMDCK細胞及びCM（複合培養液：例えばブタ血清及び酵母抽出液を含むプロテオースペプトン系培養液又はフリース（Friis）系培養液）で培養された、不活化M.ヒオリーニスMHRN001単離株を投与され、グループV3及びV4は、それぞれMDCK細胞及びCMで培養された不活化M.ヒオリーニスMHRN002単離株を投与される。全てのワクチンはモンタニドISA207VGアジュバントを添加され、投与量及び経路は2ｘ2mLの用量でD0に1用量及びD21に2回目の用量が筋肉内注射される。グループCC（コントロールグループ）には抗原を含まないプラセボ（PBS）が同じ態様で投与される。グループSC（厳密コントロール）は試験を通して全く処置を受けず、厳密なコントロール動物として供される。D42、43及び44に、グループV1−V4及びCCのブタをビルレントなM.ヒオリーニスでチャレンジする。投与の量及び経路は、それぞれ40mL腹腔内、15mL静脈内及び15mL鼻内である。M.ヒオリーニス特異的ELISA検査のためにD0から試験の終了（D58）まで毎週血液を収集する。R&D M.ヒオリーニスELISAの場合、0.200を超えるS/Pを陽性とみなした。表4に示す例示的な試験では、グループSCの全てのブタがこの試験を通して陰性を維持し、M.ヒオリーニスに曝露されていないことを示した。グループV1−V4及びCCはD0及び7では陰性であった。しかしながら血清学の結果はCM系及びMDCK系ワクチン間で変化を示した。CM系ワクチンと比較したとき、MDCK系ワクチンは、血清転換のより早期の開始、はるかに多数の血清陽性豚、及びより高い血清学的力価を示した。
【００５６】
表4：M.ヒオリーニスのELISAの結果
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【００５７】
力価測定実験を実施して、細胞培養系ワクチンと無細胞系で培養したマイコプラズマ菌由来ワクチンとを比較する。
M.ヒオリーニスをそれぞれ上記に記載したようにマッコイ細胞で培養するか、又はCM（複合培養液）で培養する。
未希釈抗原（未希釈）、1：10抗原及び1：100抗原を用いマッコイ抗原からワクチンを作製し、いずれもアジュバントとしてモンタニドISA207VGとブレンドする。CM由来抗原を用いるワクチンを同じ態様で作製する。
ブタ（ワクチン接種時に3週齢）を2mLの1用量でD0のIM投与によりワクチン免疫する。
表5に示すように、例示的試験のグループ平均はいずれもチャレンジ前（D0−D21）には“陰性”であったが、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”は、陽性傾向の応答を示した。チャレンジ後1週間（D28）で、CM1:100を除いて全ワクチングループが応答した。
表5から、各抗原タイプ（マッコイ、CM）が標準的な滴定効果（未希釈＞1：10＞1：100）を示すことは明らかである。さらにまた表5から、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”ワクチンは、“CM＋ISA未希釈”抗原よりも高い平均スコアを有すること、及びD42の終了まで前記を維持することは明白である。チャレンジ後に陽性（S/Pが0.200以上）平均を有するグループは、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”グループである。マッコイ未希釈ワクチン及び1:10稀釈は、チャレンジ前及びチャレンジ後の両方でCM未希釈ワクチンよりも高い血清応答を示した。さらにまた、マッコイ1:100でワクチン免疫した動物もまた、プラセボグループ（非ワクチン接種動物）及びCM1:100グループとは区別し得る応答を示した（CM1:100応答又はその欠如は非ワクチン接種動物と同等であった）。力価測定実験は、細胞培養系ワクチンは、無細胞系で培養したマイコプラズマ菌に由来するワクチンと比較してより良好な血清学的結果を有することを示した。
【００５８】
表5：M.ヒオリーニスのELISAの結果
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