(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意選択で補助基質の存在下で、エチレン性不飽和炭素−炭素二重結合を含む基質を触媒と接触させることにより、エチレン性不飽和炭素−炭素二重結合が還元されている還元型基質を生成することを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、
該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
該方法において、基質濃度が少なくとも５０ｍＭである、使用。
【請求項２】
方法において、基質濃度が、少なくとも１００ｍＭである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
方法において、基質濃度が、少なくとも３００ｍＭである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
エチレン性不飽和炭素−炭素二重結合が、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、ニトロ又はニトリル基に対してα，βにあるエチレン基を有する群に含まれる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
基質が、式（Ｉ）：
0006600352.tif 000023
（式中、
−Ｒ１は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ及びニトリルから独立して選択され、
−Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル及びオキシから独立して選択され、任意選択で、さらにアミドから選択され、
−Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノから独立して選択されるか、
又は、−Ｒ１がアシル、アシルオキシ又はアシルアミノである場合、−Ｒ１及び−Ｒ２は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、又は−Ｒ１及び−Ｒ３は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、
−Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノから独立して選択され、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール基は、置換されていてもよく、
又は−Ｒ２及び−Ｒ４は一緒に、非置換又は置換の環を形成してもよい）
の化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
補助基質が補助因子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
補助因子がＮＡＤＨである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
還元触媒としての触媒の使用であって、該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該触媒は、基質におけるエチレン基における不飽和炭素−炭素二重結合を還元するために使われる、使用。
【請求項１２】
触媒の使用が、水素化触媒としての使用である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
還元触媒としての触媒の使用であって、該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該触媒は、基質におけるエチレン基における不飽和炭素−炭素二重結合を還元するために使われる、使用。
【請求項１７】
触媒の使用が、水素化触媒としての使用である、請求項１６に記載の使用。 
【請求項１８】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項１９】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
触媒が、配列番号１、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
触媒及び基質を含む混合物であり、該触媒は、基質のエチレン性不飽和炭素−炭素二重結合における不飽和炭素−炭素二重結合を還元するために使われ、該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該基質の濃度は、少なくとも５０ｍＭである、混合物。
【請求項２２】
ａ）該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み；かつ／又は、
ｂ）該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み；かつ／又は、
ｃ）該触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドであり；かつ／又は、
ｄ）該基質の濃度は、少なくとも１００ｍＭであり；かつ／又は、
ｅ）該基質の濃度は、少なくとも３００ｍＭである、
請求項２１に記載の混合物。
【請求項２３】
ａ）該エチレン性不飽和炭素−炭素二重結合が、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、ニトロ又はニトリル基に対してα，βにあるエチレン基を有する群に含まれるか；又は、
ｂ）該基質が、式（Ｉ）：
0006600352.tif 000024
（式中、
−Ｒ１は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ及びニトリルから独立して選択され、
−Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル及びオキシから独立して選択され、任意選択で、さらにアミドから選択され、
−Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノから独立して選択されるか、
又は、−Ｒ１がアシル、アシルオキシ又はアシルアミノである場合、−Ｒ１及び−Ｒ２は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、又は−Ｒ１及び−Ｒ３は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、
−Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノから独立して選択され、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール基は、置換されていてもよく、
又は−Ｒ２及び−Ｒ４は一緒に、非置換又は置換の環を形成してもよい）
の化合物である、
請求項２１又は２２に記載の混合物。
【請求項２４】
補助因子である補助基質を含み、任意選択的に、該補助因子がＮＡＤＨである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのようなものとして使用するための生体触媒、生体触媒を使用する基質の還元のための方法及び生体触媒を含有するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
有機合成における酵素（生体触媒）の使用は、金属触媒の使用のより生態学的に持続可能な代替法を提案し、それに加えて触媒される反応における高度な化学、部位及び／又はエナンチオ選択性を可能とする。
【０００３】
アルケン誘導体の酵素的還元のための方法は、「旧黄色酵素」ファミリーのエンレダクターゼ（ｅｎｅ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）酵素を用いて説明されてきた。例えば、米国特許出願第２０１０／００３５３１５号は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の酵素ＹｑｊＭ並びにトマト植物由来の酵素ＯＰＲ１及びＯＰＲ３の存在下での基質の還元を説明しており、ここで、基質は５ｍＭの濃度のアルケン誘導体である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、還元反応、特に、不飽和炭素−炭素結合の還元が、本明細書に記載の触媒を用いて有利に実行されうることを見出した。具体的には、本発明者らは、本明細書に記載の触媒が、高い基質濃度に対するその許容性のおかげで、産業上の反応における応用に特に有用であることを見出した。
【０００５】
一般的態様において、本発明は、触媒、例えば、還元反応を触媒するための触媒としての本明細書に記載の触媒の使用、及び本明細書に記載の触媒を使用する還元反応を実行するための方法を提供する。
【０００６】
第１の展開において、本発明は、還元反応を触媒するための本明細書に記載の触媒の使用であって、基質濃度は高い、使用を提供する。例えば、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ又は少なくとも５００ｍＭである、使用を提供する。
【０００７】
本発明の第１の態様において、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用が提供される。
【０００８】
一実施態様において、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、基質濃度は、少なくとも１０ｍＭ、例えば、少なくとも２００ｍＭ又は少なくとも５００ｍＭのような、少なくとも１００ｍＭである、使用が提供される。該使用は、基質を触媒と接触させることを含みうる。
【０００９】
一実施態様において、還元反応を触媒するための触媒の使用、ここで、触媒は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。該使用は、基質を触媒と接触させることを含みうる。
【００１０】
一実施態様において、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、触媒は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。該使用は、基質を触媒と接触させることを含みうる。
【００１１】
一実施態様において、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、触媒は、配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。該使用は、基質を触媒と接触させることを含みうる。
【００１２】
第２の展開において、本発明は、基質の還元方法における本明細書に記載の触媒の使用であって、基質濃度は高い、使用を提供する。例えば、本発明は、基質の還元方法における触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ又は少なくとも５００ｍＭである、使用を提供する。
【００１３】
本発明の第２の態様において、基質を触媒と接触させることを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用が提供される。基質を触媒と接触させることを含む基質を還元するための方法であって、触媒は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、方法も提供される。基質を触媒と接触させることを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用も提供される。基質を触媒と接触させることを含む基質を還元するための方法であって、触媒は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、方法も提供される。該方法は、任意選択で補助基質の存在下で、基質を触媒と接触させることを含みうる。一実施態様において、基質を触媒と接触させることを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該方法における基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。
【００１４】
一実施態様において、基質を触媒と接触させることを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、触媒は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該方法における基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。
【００１５】
一実施態様において、基質を触媒と接触させることを含む基質の還元方法における触媒の使用であって、触媒は、配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該方法における基質濃度は、少なくとも５０ｍＭである、使用が提供される。
【００１６】
一実施態様において、基質は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ又はニトリル基に対してα，βにあるエチレン基のような活性型エチレン基を含む。
【００１７】
一実施態様において、基質は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ又はアシルアミノ基に対してα，βにあるエチレン基のような活性型エチレン基を含む。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載の触媒、該触媒をコードする核酸、該触媒をコードする核酸を含有する宿主細胞、該触媒を発現する宿主細胞、本明細書に記載の触媒を生成するための方法及び本明細書に記載の触媒を含む触媒調製物も提供する。本発明は、該触媒を、任意選択で、１つ又は複数のさらなる触媒と一緒に含むキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施態様による触媒を用いる、（示される）一連の基質のそれらの還元型（示されない）への変換パーセンテージの経時的な（時間）変化を示す。
【図２】本発明の実施態様による触媒を用いる、異なる基質濃度における、（示される）一連の基質のそれらの還元型（示されない）への変換パーセンテージの経時的な（時間）変化を示す。各基質は、５０ｍＭ（菱形）、１００ｍＭ（四角）及び３００ｍＭ（三角）で使用された。
【図３】本発明の実施態様による触媒を用いる、反応媒体のｐＨの変化にともなう触媒活性（Ｕ／ｍｇ）の変化を示す。基質シトラールが使用された。
【図４】本発明の実施態様による触媒を用いる、反応温度（℃）の変化にともなう触媒活性（Ｕ／ｍｇ）の変化を示す。基質シトラールが使用された。
【図５】本発明の実施態様による触媒を用いる、異なる反応温度における時間（時間）にともなう残存活性（Ｕ／ｍｇ）の変化を示す。反応は、３０℃（菱形）、４０℃（四角）及び５０℃（三角）において実行された。
【図６】本発明の実施態様による触媒を用いる、反応媒体共溶媒の変化にともなう基質の変換パーセンテージ（ＧＣにより決定した％ピーク面積、薄い陰影つき）の変化及び還元生成物のｅｅ（濃い陰影つき）の変化を示す。各共溶媒は、５体積％で使用された。
【図７】本発明による触媒を用いる、反応媒体共溶媒への添加物の変化にともなう基質の変換パーセンテージ（ＧＣにより決定した％ピーク面積、薄い陰影つき）の変化及び還元生成物のｅｅ（濃い陰影つき）の変化を示す。各界面活性剤は、０．１又は０．３体積％で使用された。
【図８】異なる基質濃度における、基質の変換パーセンテージの経時的（時間）な変化を示す。基質は、７５０ｍＭ（菱形）及び１，５００ｍＭ（四角）で使用された。
【図９】異なる基質濃度における、生成物濃度（ｍＭ）の経時的な（時間）変化を示す。基質は、７５０ｍＭ（菱形）及び１，５００ｍＭ（四角）で使用された。
【図１０】基質の変換パーセンテージの経時的な（時間）変化を示す。基質は、７３０ｍＭで使用された。
【図１１】生成物濃度（ｍＭ）の経時的な（時間）変化を示す。基質は、７３０ｍＭで使用された。
【図１２】異なる基質についてのＥＮＥ−１０１（四角）、ＥＮＥ−１０２（菱形）及びＥＮＥ−１０３（三角）の変換プロフィールを示す。
【図１３Ａ】異なる濃度の異なる基質についての、ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３の変換プロフィールを示す。
【図１３Ｂ】異なる濃度の異なる基質についての、ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３の変換プロフィールを示す。
【図１４】ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３についての、基質の変換パーセンテージの経時的（時間）な変化を示す。基質は、ＥＮＥ−１０２（丸）については３００ｍＭ、ＥＮＥ−１０１（黒三角）、ＥＮＥ−１０２（四角）及びＥＮＥ−１０３（白三角）については７５０ｍＭ、並びにＥＮＥ−１０１（菱形）については１．５Ｍで使用された。
【図１５】ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３についての生成物濃度（ｍＭ）の経時的（時間）な変化を示す。基質は、ＥＮＥ−１０２（丸）については３００ｍＭ、ＥＮＥ−１０１（黒三角）、ＥＮＥ−１０２（四角）及びＥＮＥ−１０３（白三角）については７５０ｍＭ、並びにＥＮＥ−１０１（菱形）については１．５Ｍで使用された。
【図１６】ＥＮＥ−１０１（黒三角）、ＥＮＥ−１０２（四角）及びＥＮＥ−１０３（白三角）についての、基質の変換パーセンテージの経時的（時間）な変化を示す。基質は、７３０ｍＭで使用された。
【図１７】ＥＮＥ−１０１（黒三角）、ＥＮＥ−１０２（四角）及びＥＮＥ−１０３（白三角）についての、生成物濃度（ｍＭ）の経時的（時間）な変化を示す。基質は、７３０ｍＭで使用された。
【図１８】配列番号１、７及び９のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（１．２．１）多重配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列
本発明における使用のための触媒が、以下に列挙される配列番号に関連して本明細書に記載される。配列は、配列表に開示される。
【００２１】
配列番号１  触媒アミノ酸配列（ＥＮＥ−１０１アミノ酸配列）
配列番号２  触媒をコードする（配列番号１をコードする）核酸配列
配列番号３  触媒をコードする（配列番号１をコードする）コドン最適化された核酸配列
配列番号４  Ｔ７タグを含む、触媒アミノ酸配列
配列番号５  Ｈｉｓタグ及びＴ７タグを含む、触媒アミノ酸配列
配列番号６  Ｈｉｓタグ及びＴ７タグを含む触媒をコードする（配列番号５をコードする）核酸配列
配列番号７  触媒アミノ酸配列（ＥＮＥ−１０２アミノ酸配列）
配列番号８  触媒をコードする（配列番号７をコードする）核酸配列
配列番号９  触媒アミノ酸配列（ＥＮＥ−１０３アミノ酸配列）
配列番号１０  触媒をコードする（配列番号９をコードする）核酸配列
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、基質反応における触媒の使用を提供する。以下にさらに詳細に記載されるとおり、触媒は、活性型エチレン基の還元のような還元反応における使用に好適である。触媒は、反応生成物の、高収率の、例えば、９０％超の変換、及び／又は立体選択性の高い、例えば、９９％超のｅｅ、生成を可能とする。触媒は、高い基質濃度、例えば、５０、１００及び３００ｍＭにおいて使用されうる。実際に、発明者らは、触媒が７５０及び１，５００ｍＭもの高い基質濃度において使用されうることを確立した。
【００２３】
本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は高い、使用を提供する。本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は高く、触媒は、図１８に示すアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。
【００２４】
本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。該使用は、水素化触媒としての使用でありうる。
【００２５】
本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。該使用は、水素化触媒としての使用でありうる。
【００２６】
本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、使用を提供する。本発明は、還元触媒としての触媒の使用であって、触媒は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、使用を提供する。該使用は、水素化触媒としての使用でありうる。
【００２７】
本発明者らは、本明細書に記載の触媒が、高い基質濃度の存在下で、反応を触媒できることを示した。高い基質又は生成物濃度による酵素活性の阻害は、酵素法のスケールアップにおける大きな問題であることが多い。したがって、本明細書に開示された触媒、使用及び方法は、方法のスケールアップのために有益である。
【００２８】
本発明は、還元反応を触媒するための本明細書に記載の触媒の使用であって、基質濃度は高い、使用を提供する。例えば、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ又は少なくとも１５００ｍＭでありうる、使用を提供する。触媒は、本明細書に記載の触媒であり、例えば、触媒は、配列番号１、７又は９のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１、７又は９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。
【００２９】
一実施態様において、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭであり、触媒は、配列番号１、７又は９のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも１００ｍＭであり、触媒は、配列番号１、７又は９のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、使用を提供する。
【００３１】
一実施態様において、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも５０ｍＭであり、触媒は、配列番号１、７又は９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、使用を提供する。
【００３２】
一実施態様において、本発明は、還元反応を触媒するための触媒の使用であって、基質濃度は、少なくとも１００ｍＭであり、触媒は、配列番号１、７又は９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドである、使用を提供する。
【００３３】
触媒−構造
触媒は、ポリペプチドである。ポリペプチド触媒は、酵素として知られ、したがって、触媒は酵素である。酵素は、生体触媒としても知られている。より具体的には、触媒はレダクターゼである。特に、触媒は、２−シクロ−ヘキセン−１−オン又は２−シクロペンテン−１−オン構成要素を有する基質を還元することができるレダクターゼである。触媒は、補助因子としてＮＡＤＨを用いることができる。触媒は、フラビン依存性酵素である。
【００３４】
触媒は、「旧黄色酵素」として知られる群に属する酵素でありうる。国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の命名法を用いて、該触媒は、クラス１（オキシドレダクターゼ）に属する酵素である。触媒は、ＥＣ１．３（この群は、ドナーのＣＨ−ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼを含む）に属する酵素でありうる。触媒は、ＥＣ１．３．１（この群は、補助因子としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを使用する）に属する酵素でありうる。触媒は、ＥＣ１．３．１．４２（この群は、１２−オキソフィトジエノエートレダクターゼを含む）に属する酵素でありうる。
【００３５】
触媒は、組換えポリペプチドありうる、すなわち、触媒は、以下により詳細に議論されるように、組換え核酸配列から発現されたものでありうる。触媒は、本明細書に提供される核酸から発現されたものでありうる。触媒は、配列番号３に示す核酸配列から発現されたものでありうる。
【００３６】
或いは、触媒は、天然のポリペプチドでありうる。触媒は、細菌中の内因性の（自然の）遺伝子から発現されるレダクターゼでありうる。
【００３７】
触媒は、フィトバクテリウムのアシドボラクス・アヴェナ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）により発現された酵素でありうる。触媒は、Ａ．アヴェナにより発現されたレダクターゼでありうる。具体的に、触媒は、ＡＴＣＣ  １９８６０として寄託されたＡ．アヴェナにより発現されたレダクターゼでありうる（Lucas等、2011）。受け入れ番号Ｆ０Ｑ０９８（ＵｎｉＰｏｒｔデータベースのバージョン１）により同定されるポリペプチドは、受け入れ番号ＡＤＸ４３９８１．１（バージョン１、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ、Lucas等、2011）により同定されるＡ．アヴェナ核酸配列によりコードされるレダクターゼである。
【００３８】
配列番号１に示すアミノ酸配列は、Ｆ０Ｑ０９８のアミノ酸配列である。配列番号２に示す核酸配列は、ＡＤＸ４３９８１．１の核酸配列である。
【００３９】
触媒は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）により発現された酵素でありうる。触媒は、Ｃ．ビオラセウムにより発現されたレダクターゼでありうる。具体的に、触媒は、ＡＴＣＣ１２４７２として寄託されたＣ．ビオラセウムにより発現されたレダクターゼでありうる。受け入れ番号Ｑ７ＮＳＣ５により同定されるポリペプチドは、Ｃ．ビオラセウムによりコードされるレダクターゼである（２００３年１２月１５日に発売されたバージョン１、Ｕｎｉｐｒｏｔ）。
【００４０】
配列番号７に示すアミノ酸配列は、Ｑ７ＮＳＣ５のアミノ酸配列である。
【００４１】
触媒は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）により発現された酵素でありうる。触媒は、バチルス種により発現されたレダクターゼでありうる。具体的に、触媒は、バチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１により発現されたレダクターゼでありうる。受け入れ番号Ｑ２Ｂ６Ｄ５により同定されるポリペプチドは、バチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１によりコードされたレダクターゼである（２００６年４月４日に発売されたバージョン１、Ｕｎｉｐｒｏｔ）。
【００４２】
配列番号９に示すアミノ酸配列は、Ｑ２Ｂ６Ｄ５のアミノ酸配列である。
【００４３】
図１８は、配列番号１、配列番号７及び配列番号９のアラインメントを示す。図１８及び本願のその他の場所において、配列番号１のアミノ酸配列は、ＥＮＥ−１０１と呼ばれ、配列番号７のアミノ酸配列は、ＥＮＥ−１０２と呼ばれ、配列番号９のアミノ酸配列は、ＥＮＥ−１０３と呼ばれる。
【００４４】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１に１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。
【００４５】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。
【００４６】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。
【００４７】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号１に示すアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。
【００４８】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号７に示すアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。
【００４９】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号９に示すアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。
【００５０】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。
【００５１】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。
【００５２】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができ、すなわち、触媒は、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。
【００５３】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。配列類似性は、配列相同性としても知られている。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と１００％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができる。
【００５４】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。配列類似性は、配列相同性としても知られている。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができる。
【００５５】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。配列類似性は、配列相同性としても知られている。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることができる。
【００５６】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができる。
【００５７】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができる。
【００５８】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであることができる。
【００５９】
触媒は、配列番号１と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。
【００６０】
触媒は、配列番号７と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号７と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。
【００６１】
触媒は、配列番号９と少なくとも約５０％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号９と１００％の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。
【００６２】
触媒は、上で示した配列番号１、配列番号７又は配列番号９とある一定の配列同一性及び／又は配列類似性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。該ポリペプチドは、１つ又は複数の追加のアミノ酸を含みうる。例えば、該ポリペプチドは、さらにアフィニティータグを含みうる。アフィニティータグは、触媒を精製するために有用でありうる。そのようなアフィニティータグは、本分野で周知である。例えば、アフィニティータグは、ニッケルカラムを用いて触媒を精製するためのポリ−ヒスチジンタグ（「Ｈｉｓタグ」）であることができ、それは、抗Ｔ７タグ抗体を含むカラムを用いてタンパク質を精製するためのＴ７エピトープタグ（Ｔ７タグ）であることができるか、又はそれは、グルタチオンカラムを用いて触媒を精製するためのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（「ＧＳＴタグ」）であることができる。アフィニティータグは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に配置されてもよい。或いは又はさらに、ポリペプチドは、Ｎ末端にリーダー配列をさらに含みうる。リーダー配列は、組換え発現系におけるポリペプチドの分泌及び／又は細胞内標的化を方向づけるために有用でありうる。リーダー配列は、シグナルペプチドとしても知られており、本分野で周知である。或いは又はさらに、ポリペプチドは、蛍光標識のような標識をさらに含みうる。
【００６３】
触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９プラス上で示した１つ又は複数の追加のアミノ酸にある一定の配列同一性及び／又は配列類似性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。具体的に、触媒は、配列番号４に示すポリペプチドのような、配列番号１に示すアミノ酸配列プラスＮ末端Ｔ７タグからなるアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。触媒は、配列番号５に示すポリペプチドのような、配列番号１に示すアミノ酸配列プラスＮ末端Ｈｉｓタグ及びＴ７タグからなるアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。
【００６４】
触媒−機能
触媒は、レダクターゼである。触媒は、本明細書に定義される基質の還元を触媒することができる。具体的に、触媒は、不飽和炭素−炭素二重結合を還元することができる。特に、触媒は、以下の反応スキーム：
0006600352.tif 000002
（式中、
−Ｒ１から−Ｒ４のそれぞれは、以下にさらに詳細に定義されるとおりである。）
に示す反応を、例えば、補助基質の存在下で触媒することが可能な場合もある。
【００６５】
本発明のある一定の実施態様において、触媒は、以下の反応スキーム：
0006600352.tif 000003
（式中、
−Ｒ１から−Ｒ４のそれぞれは、以下にさらに詳細に定義されるとおりである。）
に示す反応を、例えば、補助基質の存在下で触媒することが可能な場合もある。
【００６６】
触媒の活性は、測光法で、例えば、補助因子としてのＮＡＤＨの存在下で反応を実行すること、及びＮＡＤＨの酸化によって引き起こされた、３４０ｎＭにおける吸収の減少を測定することによって、測定することができる。
【００６７】
一実施態様において、本発明の触媒は、ＮＡＤＨ補助因子の存在下で基質の還元における活性を有する酵素である。
【００６８】
酵素の量は、酵素単位を用いてその活性を単位として表することができる。１酵素単位（Ｕ）は、１分あたり１μモルの基質を変換する酵素の量である。典型的に、触媒調製物中に存在する酵素単位数は、参照基質を用いてアッセイされて、例えば、Ｕ／ｍｇの触媒調製物を提供する。本発明の触媒の１Ｕは、ｐＨ７、２２℃において１分あたり１μモルのＮＡＤＨからＮＡＤを触媒する触媒の量として定義されることができ、例えばここで、参照基質は、１−オクテン−３−オンである。参照基質は、アッセイ混合物中に０．９８ｍＭの濃度で存在しうる。ＮＡＤＨからＮＡＤへの反応は、当業者に知られた技術を使用し、３４０ｎｍの吸収における変化を用いてモニターされうる。
【００６９】
酵素単位で表した触媒の活性は、触媒調製物中に存在する酵素の量を表すために使用されることができ、これは、以下に記載される比較的未精製の形態の触媒を提供しうる。
【００７０】
（カタールは、ＳＩ基本単位を用いて酵素活性を表し、１カタールは、１秒あたり１モルの基質を変換する酵素の量であり、したがって、１Ｕは、１／６０μカタールに等しい。）
【００７１】
例えば、触媒調製物中に存在する酵素単位数は、以下に示されるアッセイ手順に従って決定されうる。
【００７２】
９８０μＬの溶液Ａ（０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０中、１ｍＭの１−オクテン−３−オン溶液）を含有する２つのキュベットが、少なくとも５分間、２２℃でインキュベートされて、試験キュベット及びブランクキュベットを提供する。試験キュベットにおいて、反応は、１０μＬの溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ中、１５ｍＭのＮＡＤＨ）及び１０μＬの溶液Ｃ（Ｈ２Ｏ中、酵素（例えば、凍結乾燥酵素）溶液；１ｍＬのＨ２Ｏあたり、０．８ｍｇの触媒調製物）を添加すること、及び徹底的に混合することによって開始される。１０μＬの溶液Ｂ及び１０μＬのＨ２Ｏがブランクキュベットに添加され、徹底的に混合される。２２℃における１分間にわたる３４０ｎｍの吸収の減少が決定される。（減少が直線的でない場合、酵素溶液（溶液Ｃ）は、Ｈ２Ｏで希釈されるべきである。）ΔＡ３４０分−１が、試験キュベット及びブランクキュベットの両方についての最大線形速度を用いて決定される。触媒調製物のＵ／ｍｇで表した酵素活性が、以下の式を用いて決定される。
【００７３】
（ΔＡ３４０分−１試験−ΔＡ３４０分−１ブランク）／（６．２×０．０１×０．８）
ここで、６．２×１０３Ｌモル−１ｃｍ−１は、ＮＡＤＨについての３４０ｎｍにおけるモル吸光計数であり、０．０１は、ｍＬで表した酵素溶液の体積であり、０．８は、ｍｇ／ｍＬで表した触媒調製物の質量で（かつ、溶液Ｃの任意の希釈倍率に基づいて適合可能で）ある。
【００７４】
本明細書に開示された触媒はレダクターゼである。それらは、３−メチル（２−シクロへキセン）−１−オン（表１のエントリー４から６に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上のｅｅ値を有する生成物を生成する。ここで、触媒は、本明細書に記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００７５】
配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含むポリペプチドである触媒は、３−メチル（２−シクロへキセン）−１−オン（表１のエントリー４から６に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上のｅｅ値を有する生成物を生成しうる。ここで、触媒は、本明細書に記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００７６】
配列番号７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含むポリペプチドである触媒は、３−メチル（２−シクロへキセン）−１−オン（表１のエントリー４から６に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上のｅｅ値を有する生成物を生成しうる。ここで、触媒は、本明細書に記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００７７】
本明細書に記載の触媒はレダクターゼである。それらは、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００７８】
配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含むポリペプチドである触媒は、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は２に示される方法において使用されうる。
【００７９】
配列番号７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含むポリペプチドである触媒は、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００８０】
配列番号９と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号９のアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含むポリペプチドである触媒は、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。
【００８１】
本明細書に記載の触媒は、高い基質許容性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を有するレダクターゼである。それらは、基質濃度が５０ｍＭである場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。反応時間は１８時間でありうる。触媒は、以下に示される「試験反応条件」において、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせることができうる。
【００８２】
本明細書に記載の触媒は、高い基質許容性を有するレダクターゼである。それらは、基質濃度が１００ｍＭである場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。反応時間は１８時間でありうる。触媒は、以下に示される「試験反応条件」において、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせることができうる。
【００８３】
本明細書に記載の触媒は、高い基質許容性を有するレダクターゼである。それらは、基質濃度が３００ｍＭである場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせうる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は実験手順２に示される方法において使用されうる。反応時間は１８時間でありうる。触媒は、以下に示される「試験反応条件」において、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせることができうる。
【００８４】
「試験反応条件」は、３５℃において、２５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７、１．１ｍＭのＮＡＤ＋、３０ｍＭのＤ−グルコース、１０Ｕ／ｍＬのＧＤＨでありうる。反応時間は、３、６又は１８時間でありうる。
【００８５】
当業者は、高い基質許容性を有し、したがって、本明細書に記載の使用及び方法のために好適な本開示の触媒を、高い基質許容性を有さない触媒から識別することができる。高い基質許容性を有する触媒は、上述の機能的能力を有する。対照的に、高い基質許容性を有さない触媒は、それらの機能的能力を有さない。高い基質許容性を有さない触媒は、基質濃度が５０ｍＭである場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オン（表１のエントリー７から９に示される基質）の還元を触媒して、２０％以下、１０％以下、５％以下又は２％以下の変換率を有する生成物を生じさせうる。高い基質許容性を有さない触媒は、基質濃度が２０ｍＭ以下である場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オンの還元を触媒して、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせることができ、基質濃度が５０ｍＭ以上である場合に、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は２％以下の変換率を有する生成物を生じさせることができる。高い基質許容性を有さない触媒は、基質濃度が２０ｍＭ以下である場合に、２−メチル（２−シクロペンテン）−１−オンの還元を触媒して、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．９％以上の変換率を有する生成物を生じさせることができ、基質濃度が３００ｍＭ以上である場合に、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は２％以下の変換率を有する生成物を生じさせることができる。ここで、触媒は、実験セクションに記載の実験手順１又は２、あるいは上記「実験条件」に示される方法において使用されうる。反応時間は、１８時間でありうる。
【００８６】
核酸
触媒をコードする核酸配列が本明細書中に提供される。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。核酸は、一本鎖又は二本鎖でありうる。触媒は、配列番号２に示される核酸配列によってコードされることができ、これは、Ａ．アヴェナゲノム由来の核酸配列である（Lucas等、2011）。配列番号２の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。遺伝コードが縮重しているため（１つより多くのコドンが１つのアミノ酸をコードしうる）、配列番号２の核酸配列が変更されて、これも配列番号１のアミノ酸配列をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。
【００８７】
触媒は、配列番号８に示される核酸配列によってコードされうる。配列番号８の核酸配列は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする。遺伝コードが縮重しているため（１つより多くのコドンが１つのアミノ酸をコードしうる）、配列番号８の核酸配列が変更されて、これも配列番号７のアミノ酸配列をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。
【００８８】
触媒は、配列番号１０に示される核酸配列によってコードされうる。配列番号１０の核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列をコードする。遺伝コードが縮重しているため（１つより多くのコドンが１つのアミノ酸をコードしうる）、配列番号１０の核酸配列が変更されて、これも配列番号９のアミノ酸配列をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。
【００８９】
触媒をコードする核酸配列は、宿主細胞中へ導入されて、触媒を発現する組換え宿主細胞を提供しうる。触媒を発現する宿主細胞を提供することによって、触媒が細胞中で提供されうる。触媒は、触媒を発現する宿主細胞を提供すること、触媒を宿主細胞中で発現させること、及び触媒を単離することによって、単離された形態で提供されうる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌又はシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のような原核細胞でありうる。宿主細胞は、真核細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母細胞あるいはＨｅＬａ細胞又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞でありうる。
【００９０】
触媒をコードする核酸配列は、組換え宿主細胞中での発現のために最適化されうる。遺伝コードが生物間で変化しうる（コドン選択が生物間で変化しうる）ため、特定の宿主細胞中での所望のポリペプチドの発現は、宿主細胞のコドン選択に従ってポリペプチドをコードする核酸を変更することによって改善されうる。大腸菌のような宿主細胞中での触媒の改善された発現のために、Ａ．アヴェナ核酸配列、配列番号２が変更されて配列番号３を提供した。遺伝子コードが縮重しているため、配列番号３の核酸配列は、変更されて、大腸菌のような宿主細胞中でも触媒をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。コドン使用頻度が生物間で変化しうるため、配列番号２及び／又は配列番号３の核酸配列は、変更されて、他の宿主細胞中で触媒を発現するために好適なさらなる核酸を提供しうる。触媒が、配列番号１のアミノ酸配列の変異体でありうるため、配列番号１の変異体をコードする核酸配列は、宿主細胞中で触媒を発現するために好適でありうる。同様に、配列番号８及び配列番号１０の核酸配列は、変更されて、他の宿主細胞中で触媒を発現するために好適なさらなる核酸を提供することができ、触媒が、配列番号７及び配列番号９のアミノ酸配列の変異体でありうるため、配列番号７又は配列番号９の変異体をコードする核酸配列は、宿主細胞中で触媒を発現するために好適でありうる。
【００９１】
触媒をコードする核酸配列は、配列番号３と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号３に１００％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号３に示される核酸配列を含みうる。
【００９２】
触媒をコードする核酸配列は、配列番号８と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号８と１００％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号８に示される核酸配列を含みうる。
【００９３】
触媒をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号１０と１００％の同一性を有する核酸配列を含みうる。触媒をコードする核酸配列は、配列番号１０に示される核酸配列を含みうる。
【００９４】
触媒をコードする核酸は、単離された及び／又は精製された形態、あるいはＡ．アヴェナゲノム中で配列番号２に隣接する核酸配列を含まないか又は実質的に含まないような、それが自然に結合される材料を含まないか又は実質的に含まない可能性がある。触媒をコードする核酸は、単離された及び／又は精製された形態、あるいはＣ．ビオラセウムゲノム中で配列番号８に隣接する核酸配列を含まないか又は実質的に含まないような、それが自然に結合される材料を含まないか又は実質的に含まない可能性がある。触媒をコードする核酸は、単離された及び／又は精製された形態、あるいはバチルス種ゲノム中で配列番号１０に隣接する核酸配列を含まないか又は実質的に含まないような、それが自然に結合される材料を含まないか又は実質的に含まない可能性がある。
【００９５】
一般に、触媒をコードする核酸は、配列番号２又は配列番号３の改変により得られうる。配列番号２又は配列番号３を改変するために、部位特異的突然変異誘発のような組換え技術が使用されて、触媒をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。そのようなさらなる核酸配列は、配列番号１の変異体をコードしうる。触媒をコードする核酸は、配列番号８の改変により得られうる。配列番号８を改変するために、部位特異的突然変異誘発のような組換え技術が使用されて、触媒をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。そのようなさらなる核酸配列は、配列番号７の変異体をコードしうる。触媒をコードする核酸は、配列番号１０の改変により得られうる。配列番号１０を改変するために、部位特異的突然変異誘発のような組換え技術が使用されて、触媒をコードするさらなる核酸配列を提供しうる。そのようなさらなる核酸配列は、配列番号９の変異体をコードしうる。
【００９６】
本発明は、配列番号３に示される核酸配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、触媒をコードする核酸も提供する。本発明は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、該核酸は、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドはレダクターゼである、核酸を提供する。
【００９７】
本発明は、配列番号８に示される核酸配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、触媒をコードする核酸も提供する。本発明は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、該核酸は、配列番号７と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドはレダクターゼである、核酸を提供する。
【００９８】
本発明は、配列番号１０に示される核酸配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、触媒をコードする核酸も提供する。本発明は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、該核酸は、配列番号９と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ポリペプチドはレダクターゼである、核酸を提供する。
【００９９】
触媒の生成のためのベクター、宿主細胞及び方法
触媒をコードする核酸は、複製可能なベクター中に組み込まれうる。ベクターは、適合性の宿主細胞中で核酸を複製するために使用されうる。よって、触媒をコードする核酸は、触媒をコードする核酸を複製可能なベクター中に導入すること、ベクターを適合性の宿主細胞中に導入すること、及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を培養することによって生成することができる。
【０１００】
触媒をコードする核酸は、宿主細胞による触媒の発現を提供することのできる制御配列に作動可能に連結されうる。例えば、触媒をコードする核酸は、発現ベクター中にありうる。例えば、触媒をコードする核酸は、プラスミド又はクロモソーム中にありうる。用語「作動可能に連結された」は、記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許容する関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で連結されている。
【０１０１】
任意選択で、配列番号２のＮ末端ｔｔｇコドンは、ａｔｇのような開始コドンで置換されうる。
【０１０２】
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適宜、他の配列を含む適切な調節配列を含有する好適なベクターが選択又は構築されうる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、ファージミド若しくはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ又はＰＡＣでありうる。ベクターは、遺伝子療法ベクター、例えば、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ関連ウイルス、（ＨＩＶ又はＭＬＶのような）レトロウイルス又はアルファウイルスベクターを含む。
【０１０３】
ベクターには、複製開始点、任意選択で、触媒の発現のためのプロモーター及び任意選択で、プロモーターの制御因子が提供されうる。ベクターは、低コピープラスミド、中程度コピープラスミド又は高コピープラスミドでありうる。ベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピリシン耐性遺伝子又は哺乳動物ベクターのためのネオマイシン耐性遺伝子を含有しうる。ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生のために、又は宿主細胞をトランスフェクト若しくは形質転換するために、インビトロで使用されうる。多様な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニング及び発現のための系が周知である。
【０１０４】
ベクターは、挿入された核酸の発現を推進するためのプロモーター又はエンハンサーのようは他の配列を含みうる。プロモーターは、宿主細胞の増殖培地にインデューサーを添加することによって触媒の発現が開始又は促進されるような、誘導性プロモーターでありうる。例えば、プロモーターは、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド）がそのためのインデューサーである、ｌａｃオペロンに基づくことができる。或いは、プロモーターは、構成的活性型のプロモーターでありうる。プロモーターは、強力なプロモーターでありうる。
【０１０５】
ベクターは、触媒が融合タンパク質（例えば、触媒及びアフィニティータグを含む融合タンパク質）として産生されるように、他の核酸配列を含み及び／又は宿主細胞中で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるように、リーダー配列をコードする核酸配列を含みうる。
【０１０６】
上記のような、触媒の発現をもたらす条件下で培養されうる宿主細胞が、本明細書に提供される。触媒は、宿主細胞内で提供されうる。この方法において、触媒は、還元反応においてインビボで使用されることができ、すなわち、触媒は、細胞内還元反応において使用されうる。或いは、触媒の発現に、宿主細胞からの触媒の単離が続くことができる。触媒は、電気泳動及び／又はクロマトグラフィー技術を用いて単離されうる。触媒は、例えば、アフィニティータグを含む融合タンパク質として触媒を発現し、アフィニティータグを結合して融合タンパク質を回収する作用物質を使用することによって単離されうる。該作用物質は、例えば、セファロースカラムに結合されうる。アフィニティータグは、タンパク質が単離された後、タンパク質から切断されうる。
【０１０７】
触媒調製物
触媒は、純粋な又は実質的に純粋な形態で提供されうる。純粋な又は実質的に純粋な形態の触媒は、他の分子又は天然にタンパク質に付随する細胞構成要素（例えば、リボソーム、細胞膜構成要素）から分離される。
【０１０８】
触媒は、触媒調製物として比較的未精製の形態で提供されることができ、例えば、触媒調製物は、触媒を発現する組換え細胞のライセート又は清澄化されたライセートでありうる。触媒調製物は、触媒を発現する組換え細胞のホモジネート又はペーストでありうる。
【０１０９】
触媒は、宿主細胞に含まれうる。触媒は、遊離形態又は固定化形態で提供されうる。固定化形態において、触媒は、セルロース粉末又はポリエチレンのような合成ポリマーのような不活性担体に結合されうる（Lalonde及びMargolin, 2002）。
【０１１０】
触媒を生成する方法が本明細書中に提供され、この方法は、触媒をコードする核酸を宿主細胞中で発現させること及び宿主細胞から触媒を単離することを含む。該方法は、宿主細胞を溶解して、細胞ライセートを提供することを含むことができ、さらに、（例えば、遠心分離によって）宿主細胞のデブリを除去して、清澄化された細胞ライセートを提供することを含みうる。宿主細胞を溶解する工程は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む溶解バッファーを使用することができ、例えば、溶解バッファーは、約１−５０μＭのＦＭＮ又は約５−２５μＭのＦＭＮ又は約２０μＭのＦＭＮを含みうる。さらに又は或いは、宿主細胞を溶解する工程は、ＭｇＳＯ４を含有する溶解バッファーを使用することができ、例えば、溶解バッファーは、約１−５０ｍＭのＭｇＳＯ４、約１−５ｍＭのＭｇＳＯ４又は約５ｍＭのＭｇＳＯ４を含みうる。溶解バッファーは、ＦＭＮ及びＭｇＳＯ４を含みうる。
【０１１１】
触媒又は触媒調製物から水が除去されて、凍結乾燥形態の触媒を提供しうる。触媒は、凍結乾燥物として提供されうる。触媒又は触媒調製物は、凍結されうる。
【０１１２】
触媒調製物中の触媒の量は、触媒調製物１ｍｇあたりの酵素の単位（Ｕ）、例えば、凍結乾燥物１ｍｇあたりの酵素の単位として表することができる。
【０１１３】
触媒調製物中の触媒の量は、（例えば、上記のアッセイ方法を用いて決定して）触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも約０．２５Ｕ、触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも約１Ｕ又は触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも３Ｕでありうる。触媒調製物中の触媒の量は、（例えば、上記のアッセイ方法を用いて決定して）触媒調製物１ｍｇあたり最大約５Ｕ、触媒調製物１ｍｇあたり最大約１０Ｕ、触媒調製物１ｍｇあたり最大約２０Ｕ、又は触媒調製物１ｍｇあたり最大約５０Ｕでありうる。触媒調製物は、（例えば、上記のアッセイ方法を用いて決定して）凍結乾燥物１ｍｇあたり少なくとも約０．２５Ｕ、凍結乾燥物１ｍｇあたり少なくとも約１Ｕ、又は凍結乾燥物１ｍｇあたり少なくとも約３Ｕを含む凍結乾燥物でありうる。凍結乾燥物中の触媒の量は、（例えば、上記のアッセイ方法を用いて決定して）凍結乾燥物１ｍｇあたり最大約５Ｕ、凍結乾燥物１ｍｇあたり最大約１０Ｕ、凍結乾燥物１ｍｇあたり最大約２０Ｕ、又は凍結乾燥物１ｍｇあたり最大約５０Ｕでありうる。
【０１１４】
調製物中の触媒の量は、上で与えられた高いほうの量及び低いほうの量から選択される範囲内、例えば、触媒調製物１ｍｇあたり１−２０Ｕの範囲内にありうる。
【０１１５】
本発明は、本明細書に定義される触媒を含む、触媒調製物を提供する。触媒調製物は、（触媒調製物１ｍｇあたりの触媒のＵを単位として定義される）少なくともある一定量の、上で定義された触媒を含みうる。例えば、触媒調製物は、配列番号１と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドである触媒を含むことができ、ここで、触媒調製物中の触媒の量は、触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも０．２５Ｕである。例えば、触媒調製物は、配列番号７と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドである触媒を含むことができ、ここで、触媒調製物中の触媒の量は、触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも０．２５Ｕである。例えば、触媒調製物は、配列番号９と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドである触媒を含むことができ、ここで、触媒調製物中の触媒の量は、触媒調製物１ｍｇあたり少なくとも０．２５Ｕである。
【０１１６】
類似性及び配列同一性
アミノ酸配列同一性及び類似性並びに核酸配列同一性は、無料で利用可能なＥＭＢＯＳＳ又はＢＬＡＳＴソフトウェアツールのような、標準的なバイオインフォマティクスのソフトウェアツールを用いて測定されうる。デフォルトパラメータが一般的に使用される。例えば、ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅペアワイズ配列アラインメントが、アミノ酸配列同一性を決定するために使用されうる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48): 444-453(1970)）を使用するＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅペアワイズ配列アラインメントは、例えば、デフォルトパラメータを用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのようなＢＬＯＳＵＭスコアリングマトリックスを用いて、アミノ酸配列類似性を決定するために使用されうる。デフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティー＝１２及びギャップ伸長ペナルティー＝４とともに使用されうる。ＧＡＰの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えば、一般にデフォルトパラメータを採用する、（Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:405-410の方法を使用する）ＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ、（Pearson及びLipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448の方法を使用する）ＦＡＳＴＡ、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith及びWaterman (1981) J. Mol Biol. 147:195-197）が使用されてよい。
【０１１７】
上で議論したように、触媒は、配列番号１と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであって、基質の還元を触媒することができる。配列番号１に５０％未満のアミノ酸配列同一性を有する触媒は、基質の還元を触媒することができ、したがって、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する多くのポリペプチドも、基質の還元を触媒することができる。例えば、枯草菌由来のＹｑｊＭとして知られる酵素（ＥＣ１．６．９９．１、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ５４５５０）は、配列番号１に約３０％の配列同一性を有し、ある一定のアルケン誘導体を還元することができ、トマトＯＹＰＲ１遺伝子によりコードされる酵素（ＥＣ１．３．１．４２、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＸＧ５４）は、配列番号１に約４２％の配列同一性を有し、ある一定のアルケン誘導体を還元することができ、トマトＯＹＰＲ３遺伝子によりコードされる酵素（ＥＣ１．３．１．４２、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＦＥＷ９）は、配列番号１に約４２％の配列同一性を有し、ある一定のアルケン誘導体を還元することができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／００３５３１５号を参照されたい）。
【０１１８】
配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである触媒は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、１つ又は数個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、１−１５０個、１−１００個、１−５０個、１−２０個又は１−１０個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。
【０１１９】
配列番号７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである触媒は、配列番号７のアミノ酸配列に対して、１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号７のアミノ酸配列に対して、１つ又は数個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号７のアミノ酸配列に対して、１−１５０個、１−１００個、１−５０個、１−２０個又は１−１０個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。
【０１２０】
配列番号９と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである触媒は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、１つ又は数個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。触媒は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、１−１５０個、１−１００個、１−５０個、１−２０個又は１−１０個のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含みうる。
【０１２１】
本発明の触媒は、配列番号１、７及び９のいずれか１つに示されるポリペプチドの変異体でありうる。変異体は、配列番号１、７及び９に示される配列から、１アミノ酸、２、３、４、５−１０、１０−２０、２０−３０、３０−５０、５０−１００又は１５０を超えるアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により異なる。変異体は、日常的な分子クローニング方法を用いて作られうる。
【０１２２】
当業者は、そのような変異体をどのように作るかを知っており、触媒の機能的能力に影響を与える可能性のある因子を認識している。例えば、当業者は、比較的少数のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換を有する変異体が、比較的多数のアミノ酸置換を有する変異体よりも、配列番号１、７及び９に示される触媒の機能性を保持する可能性が比較的高いことを理解する。当業者は、１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有する変異体が、１つ又は複数の非保存的置換を有する変異体よりも機能性を保持する可能性が高いことも理解している。
【０１２３】
配列番号１、７及び９のアラインメントが、図１８に示される。図１８に表される配列番号１、７及び９の間で、（＊により示される）保存されたアミノ酸、（：により示される）強い類似性を有するアミノ酸及び（．により示される）弱い類似性を有するアミノ酸に関する情報は、置換が回避されることが望ましい可能性のあるアミノ酸位置を示唆する。保存されないか又は類似しないか若しくは弱い類似性のみを有するアミノ酸位置は、置換をより受けやすい可能性があるが、機能性を保持している。よって、当業者は、配列番号で示されたポリペプチドの変異体を生成することができる。当業者は、変異体ポリペプチドが、例えば、本明細書に記載の方法を用いて本発明に従う触媒としての使用に好適であるかを決定することができる。アミノ酸置換は、配列番号１、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸が、類似の特性を有するアミノ酸によって置換される、保存的アミノ酸置換でありうる。例えば、疎水性アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ）は、別の疎水性アミノ酸（例えば、Ｉｌｅ）により置換される。アミノ酸及び保存的置換が、以下の表に示される。
0006600352.tif 000004
【０１２４】
使用
本発明の触媒は、そのようなものとして、例えば、インビトロのようなエクスビボの反応における触媒として使用されうる。これに関連してインビトロの反応は、細胞外の又は細胞を含まない反応を指す。
【０１２５】
本発明の触媒は、還元反応における触媒としての使用を有することがわかった。一実施態様において、還元反応は、エチレン結合のような不飽和炭素−炭素結合のような不飽和結合の還元である。触媒は、水素化活性を有するか又は移動水素化活性を有すると言われうる。よって、本発明の触媒は、一般に、例えば、対応する還元生成物をもたらすための、アルケニル含有化合物の還元において有用である。
【０１２６】
一実施態様において、本発明の触媒は、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の基質の還元における触媒としての使用を見出す。本発明の触媒は、レダクターゼと呼ばれうる。よって、該触媒は一般に、還元反応及びより具体的には水素化反応における使用を見出す。よって、触媒は、形式上、炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）にわたる水素の付加をもたらす還元反応を触媒しうる。典型的に、本明細書に記載の還元反応における水素化物の供給源は、ＮＡＤＨのような補助因子によって提供される。
【０１２７】
一実施態様において、本発明の触媒は、上記のように、細胞内反応のために細胞内に提供される。
【０１２８】
一態様において、任意選択で補助因子と一緒の、触媒としての配列番号１の触媒の使用が提供される。別の態様において、任意選択で補助因子と一緒の、触媒としての配列番号７の触媒の使用が提供される。さらなる態様において、任意選択で補助因子と一緒の、触媒としての配列番号９の触媒の使用が提供される。
【０１２９】
一実施態様において、触媒は、炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）の水素化のような、水素化活性のような還元活性を有する。
一実施態様において、触媒は、エンレダクターゼ活性を有する。
一実施態様において、本発明の触媒は、本明細書に記載の方法における使用を見出す。
【０１３０】
方法
一態様において、本発明は、合成方法であって、本発明の触媒の存在下で基質を反応させ、それによって生成物を提供する工程を含む方法を提供する。該方法は、基質を触媒と接触させることを含みうる。
【０１３１】
該方法は、還元であることができ、したがって、触媒及び還元剤の存在下で基質が還元される。
【０１３２】
一実施態様において、反応は、立体特異的反応である。
【０１３３】
任意選択で、方法は、生成物を触媒及び任意の残留基質から単離するような、生成物を単離する工程をさらに含む。単離工程は、エナンチオマーを含む、生成物の立体異性体である生成物のような、副生成物からの生成物の単離を含みうる。単離工程は、反応媒体から生成物を単離する工程も含みうる。
【０１３４】
一実施態様において、方法は、触媒を単離する工程を含む。触媒は、その後、必要に応じて、本発明のさらなる方法において再使用されうる。
【０１３５】
本発明の触媒は、還元生成物のような生成物の高収率の調製を可能としうる。実施例は、触媒が還元反応において使用されて、６０％以上のような５０％以上の収率で生成物を得ることができることを示す。
【０１３６】
本発明の方法は、水中で、典型的には、別の溶媒（「共溶媒」）の存在下で実行されうる。反応媒体は、単相性又は二相性でありうる。
【０１３７】
一実施態様において、共溶媒が、最大１０体積％、最大１５体積％又は最大２５体積％の量で存在する。
一実施態様において、共溶媒は、少なくとも０．５体積％、少なくとも１体積％又は少なくとも２体積％の量で存在する。
一実施態様において、共溶媒は、約５体積％の量で存在する。
【０１３８】
共溶媒は、トルエン、キシレン、エタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択されうる。
【０１３９】
一実施態様において、共溶媒はトルエンである。
【０１４０】
反応は、溶媒の総体積に対して５ｖ／ｖ％以下のような非常に少ない量で水が存在する反応媒体中で実行することもできる。これは、あまり好ましくない。
【０１４１】
反応は、周囲温度又は高温で実行されうる。反応は、最大３５℃、最大４０℃、最大４５℃、最大５０℃又は最大５５℃の温度で実行されうる。予想どおり、非常に高温の維持された温度は、酵素活性の損失と関連する。
反応は、少なくとも３０℃、少なくとも２５℃、少なくとも２０℃、少なくとも１５℃又は少なくとも０℃の温度で実行されうる。
発明者らは、触媒が、上で示された高いほうの温度及び低いほうの温度から選択される範囲内、例えば、２０から４５℃の範囲内又は２０から３５℃の範囲内の温度で使用される場合に、最適の結果が得られることを見出した。
【０１４２】
水性媒体中の反応は、限定された範囲内のｐＨにおいて実行されうる。
【０１４３】
一実施態様において、反応媒体のｐＨは、最大で８、最大で９、又は最大で１０である。
一実施態様において、反応媒体のｐＨは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも６．５、又は少なくとも７である。
【０１４４】
発明者らは、触媒が、上で示された高いほうの数量及び低いほうの数量から選択される範囲内、例えば、ｐＨ６．５から８の範囲内のｐＨにおいて使用される場合に、最適の結果が得られることを見出した。
【０１４５】
反応媒体のｐＨは、反応開始時の反応媒体のｐＨを指し得る。さらに又は或いは、ｐＨは反応のエンドポイントにおける反応のｐＨを指し得る。
【０１４６】
バッファーは、反応媒体のｐＨを、上で示された上限値及び下限値から選択される範囲内に維持するために、反応媒体中に提供されうる。
【０１４７】
本発明者らは、本発明の触媒が、高い基質濃度において使用されうることを確立した。実施例は、３００ｍＭ、７５０ｍＭ及び１，５００ｍＭの基質濃度における触媒の使用を実証する。対照的に、米国特許出願第２０１０／００３５３１５号中の研究は、多くて５ｍＭの基質濃度のみにおける生体触媒の使用を実証する。
【０１４８】
一実施態様において、基質は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１，０００ｍＭ、少なくとも１，５００ｍＭ、少なくとも２，０００ｍＭ、少なくとも２，５００ｍＭ、又は少なくとも３，０００ｍＭの濃度で存在する。
【０１４９】
一実施態様において、基質は、最大で５０ｍＭ、最大で１００ｍＭ、最大で２００ｍＭ、最大で３００ｍＭ、最大で５００ｍＭ、最大で１，０００ｍＭ、最大で１，５００ｍＭ、最大で２，０００ｍＭ、最大で２，５００ｍＭ、最大で３，０００ｍＭ、最大で３，５００ｍＭ、最大で４，０００ｍＭ、最大で４，５００ｍＭ、又は最大で５，０００ｍＭの濃度で存在する。
【０１５０】
発明者らは、基質が、上で示された高いほうの量及び低いほうの量から選択される範囲内、例えば、５ｍＭから１，５００ｍＭの範囲内の濃度で使用される場合に、最適の結果が得られることを見出した。
【０１５１】
基質濃度は、５０ｍＭから５，０００ｍＭ、５０ｍＭから３，０００ｍＭ、５０ｍＭから１，５００ｍＭ、５０ｍＭから１，０００ｍＭ、５０ｍＭから５００ｍＭ、１００ｍＭから５，０００ｍＭ、１００ｍＭから３，０００ｍＭ、１００ｍＭから１，５００ｍＭ、１００ｍＭから１，０００ｍＭ、５００ｍＭから５，０００ｍＭ、５００ｍＭから３，０００ｍＭ、５００ｍＭから１，５００ｍＭ、又は５００ｍＭから１，０００ｍＭの範囲内にありうる。
【０１５２】
一実施態様において、基質は、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも７５ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｇ／Ｌ、少なくとも２００ｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｇ／Ｌ、又は少なくとも３００ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一実施態様において、基質は、最大で５ｇ／Ｌ、最大で１０ｇ／Ｌ、最大で２０ｇ／Ｌ、最大で３０ｇ／Ｌ、最大で５０ｇ／Ｌ、最大で１００ｇ／Ｌ、最大で１５０ｇ／Ｌ、最大で２００ｇ／Ｌ、最大で２５０ｇ／Ｌ、最大で３００ｇ／Ｌ、最大で３５０ｇ／Ｌ、最大で４００ｇ／Ｌ、最大で４５０ｇ／Ｌ、又は最大で５００ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【０１５３】
反応において必要とされる触媒調製物の量は、存在する基質の量に対して少なく、反応媒体中のその濃度の点から低くてもよい。例えば、０．４ｇ／Ｌの触媒調製物が使用されうる。
一実施態様において、触媒調製物は、最大で５ｇ／Ｌ、最大で１０ｇ／Ｌ、最大で５０ｇ／Ｌ又は最大で１００ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。
一実施態様において、触媒調製物は、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも０．１０ｇ／Ｌ、少なくとも０．２５ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、又は少なくとも１．０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。
一実施態様において、触媒調製物は約０．４ｇ／Ｌで存在する。
【０１５４】
一実施態様において、触媒調製物は、約０．４ｇ／Ｌで存在する。
【０１５５】
上で議論されたとおり、酵素の量は、酵素単位Ｕを用いてその活性を単位として表することができる。Ｕは、上記のアッセイを用いて決定されうる。同様に、酵素の濃度はＵ／ｍＬとして表されうる。
一実施態様において、酵素は、最大で５００Ｕ／ｍＬ、最大で３００Ｕ／ｍＬ、最大で２００Ｕ／ｍＬ又は最大で１５０Ｕ／ｍＬの濃度で存在しうる。いくつかの実施態様において、酵素は、最大で５０Ｕ／ｍＬの濃度で存在しうる。
一実施態様において、酵素は、少なくとも１Ｕ／ｍＬ、少なくとも５Ｕ／ｍＬ、少なくとも１０Ｕ／ｍＬ、又は少なくとも２０Ｕ／ｍＬの濃度で存在しうる。いくつかの実施態様において、酵素は、少なくとも５０Ｕ／ｍＬの濃度で存在しうる。
発明者らは、酵素が、上で示された高いほうの量及び低いほうの量から選択される範囲内の量で使用される場合に、最適の結果が得られることを見出した。
【０１５６】
反応において必要とされる酵素の量は、存在する基質の量に対して少なくてもよい。例えば、基質１ミリモルあたり約７０Ｕの酵素が存在しえ、又は基質１ミリモルあたり約１４０Ｕの酵素が存在しうる。例えば、基質１ミリモルあたり１２５０Ｕの酵素が存在しうる。
一実施態様において、酵素は、基質１ミリモルあたり最大で５０００Ｕ、基質１ミリモルあたり最大で２５００Ｕ、基質１ミリモルあたり最大で２０００Ｕ、又は基質１ミリモルあたり最大で１５００Ｕの量で存在する。いくつかの実施態様において、酵素は、基質１ミリモルあたり最大で５００Ｕ、基質１ミリモルあたり最大で３００Ｕ、又は基質１ミリモルあたり最大で２００Ｕの量で存在する。
一実施態様において、酵素は、基質１ミリモルあたり少なくとも１Ｕ、基質１ミリモルあたり少なくとも１０Ｕ、基質１ミリモルあたり少なくとも２０Ｕ、基質１ミリモルあたり少なくとも４０Ｕ、又は基質１ミリモルあたり少なくとも６０Ｕの量で存在する。
発明者らは、酵素が、上で示された高いほうの量及び低いほうの量から選択される範囲内の量で使用される場合に、最適の結果が得られることを見出した。
【０１５７】
反応は、所望量の材料の生成を可能とするのに十分な時間、行われうる。その後、生成材料を単離するために反応混合物がまとめられうる。
一実施態様において、反応時間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、又は少なくとも３時間である。
一実施態様において、反応時間は、最大で１８時間、最大で２４時間、最大で３６時間、最大で４８時間、最大で７２時間、最大で９６時間又は最大で１２０時間である。
【０１５８】
反応の終了は、触媒と生成物が分離される時点でありうる。
【０１５９】
反応は、所望の生成物の収量が経時的に実質的に増加しない場合に、完了したとみなされうる。
【０１６０】
一実施態様において、反応はインビトロで実行される。
【０１６１】
反応は、連続的又は断続的に実行されうる。
【０１６２】
基質
本発明の触媒は、そのようなものとして、基質の反応において使用されうる。基質は、触媒の存在下で反応して生成物をもたらす。基質は、補助基質とともに反応して、生成物をもたらしうる。
【０１６３】
一実施態様において、基質は、還元されうる官能基を有する化合物である。したがって、反応の生成物は還元生成物である。
【０１６４】
一実施態様において、基質はエチレン結合（Ｃ＝Ｃ）を有する。反応の生成物は、還元されたエチレン結合、例えば、−ＣＨ−ＣＨ−を有する基質でありうる。
【０１６５】
一実施態様において、エチレン結合は、活性化型エチレン結合である。よって、エチレン結合は、活性化基に対してα，βにありうる。活性化基の例としては、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ及びニトリル基が挙げられる。したがって、基質は、α，β−不飽和アシル、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ及びニトリル基を有しうる。
【０１６６】
一実施態様において、エチレン結合は、活性型エチレン結合である。よって、エチレン結合は、活性化基に対してα，βにありうる。活性化基の例としては、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ又はアシルアミノ基が挙げられる。したがって、基質は、α，β−不飽和アシル、アシルオキシ、ニトロ又はアシルアミノ基を有しうる。
【０１６７】
一実施態様において、基質は、式（Ｉ）：
0006600352.tif 000005
（式中、
−Ｒ１は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ、アシルアミノ及びニトリルから独立して選択され、
−Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル及びオキシから独立して選択され、−Ｒ２は任意選択で、さらにアミド若しくはニトリルから選択され、
−Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノであるか、
又は、−Ｒ１がアシル、アシルオキシ又はアシルアミノである場合、−Ｒ１及び−Ｒ２は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、又は−Ｒ１及び−Ｒ３は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成してもよく、
−Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ、ニトリル及びアシルアミノであり、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール基は、置換されていてもよく、
又は−Ｒ２及び−Ｒ４は、一緒になって非置換又は置換された環を形成してもよい。）
の化合物である。
【０１６８】
一実施態様において、−Ｒ１は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ及びアシルアミノからなる群から独立して選択される。
一実施態様において、−Ｒ１は、アシル又はアシルオキシである。発明者らは、−Ｒ１に存在するそのような基を有する基質は、本発明の触媒の存在下で、良好な収率及び／又は高いエナンチオマー過剰率で還元されることを確立した。
一実施態様において、−Ｒ１は、アシルアミノである。
【０１６９】
一実施態様において、−Ｒ２は水素である。この実施態様において、−Ｒ３及び−Ｒ４は異なってよい。この場合、発明者らは、還元反応が、特に高いエナンチオマー過剰率を有する生成物を提供することを見出した。
一実施態様において、−Ｒ２は、非置換又は置換アルキル、例えば、非置換アルキルである。
一実施態様において、−Ｒ２は、−Ｒ４及びそれらが結合している炭素原子と一緒になって、非置換又は置換炭素環、例えば非置換又は置換炭素環を形成する。例えば、該環は、非置換又は置換シクロヘキセン環のようなシクロペンテン又はシクロへキセン環でありうる。該環は、任意選択で、ヘテロ原子を含みうる。
【０１７０】
一実施態様において、例えば、−Ｒ１がアシルオキシである場合、−Ｒ２はアミドである。
【０１７１】
一実施態様において、−Ｒ１がアシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基である場合、−Ｒ１及び−Ｒ２は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する環を形成しうる。この実施態様において、炭素−炭素二重結合は、環に対して外部にある。環は、５又は６個の環原子のような、４−７個の環原子を有しうる。−Ｒ１がアシルオキシである場合、１つの環原子は酸素原子であり、−Ｒ１がアシルアミノである場合、１つの環原子は窒素原子である。
一実施態様において、−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合する炭素原子（α炭素）と一緒になって、シクロペンテノン又はシクロヘキセノン環を形成する。ここで、−Ｒ１はアシルである。
−Ｒ１及び−Ｒ２が環を形成する場合、その環は、置換されていてもよい。
【０１７２】
一実施態様において、−Ｒ３は、水素、及び非置換又は置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル及びアルキニルから選択される。
一実施態様において、−Ｒ３は水素である。
一実施態様において、−Ｒ３は、非置換又は置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル及びアルキニルから選択される。
一実施態様において、−Ｒ３は、非置換又は置換アルキルから選択される。
一実施態様において、−Ｒ１が、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基である場合、−Ｒ３及び−Ｒ１は、アシル、アシルオキシ又はアシルアミノ基を含有する、非置換又は置換環を形成する。該環は、５又は６個の環原子のような、４−７個の環原子を有しうる。例えば、該環は、シクロペンテノン又はシクロヘキセノン環でありうる。
環は、任意選択でヘテロ原子を含みうる。環は、オキソ（＝Ｏ）置換基を環炭素原子に提供されうる。オキソ−置換炭素環原子は、アシルアミノ基と一緒になって、環状イミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−）を形成しうる。そのような構造は、例えば、ＳＹＥ−４酵素（Iqbal等を参照されたい）の存在下で、活性な基質であることが示される。
一実施態様において、−Ｒ１がアシル基を含有する場合、−Ｒ３及び−Ｒ１は、非置換又は置換環を形成する。
【０１７３】
アルケニル又はアルキニル基が、−Ｒ２、−Ｒ３及び−Ｒ４のいずれかの中に存在する場合、−Ｒ１基に対してα，βにある不飽和結合とコンジュゲーションされないことが好ましい。
【０１７４】
一実施態様において、−Ｒ４は、水素及び非置換又は置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル及びアルキニルから選択される。一実施態様において、−Ｒ４は水素である。
【０１７５】
一実施態様において、−Ｒ２、−Ｒ３及び−Ｒ４のうちの１つは水素でない。
一実施態様において、−Ｒ２、−Ｒ３及び−Ｒ４のうちの１つは水素である。例えば、−Ｒ２が水素であるか又は−Ｒ３が水素である。
一実施態様において、−Ｒ３及び−Ｒ４は水素である。
【０１７６】
一実施態様において、基質は、１２−オキソ−シス−１０，１５−フィトジエノエートではない。
【０１７７】
発明者らは、ＥＮＥ−１０３が、基質３−メチル−２−シクロペンテノン及び３−メチル−２−シクロヘキセノンに対するわずかな活性を有することを見出した。しかしながら、この場合の実施例において示されるように、このわずかな活性は、これらの特定の基質と関連し、ＥＮＥ−１０３は、他の構造的に関連した基質に触媒活性を示すと考えられる。
【０１７８】
一実施態様において、例えば、触媒が配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである場合、例えばポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含む場合、基質は、３−メチル−２−シクロペンテノン又は３−メチル−２−シクロへキセノンではない。
【０１７９】
一実施態様において、−Ｒ４は水素である。一実施態様において、−Ｒ２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル及びオキシから独立して選択される。
これらの実施態様は、−Ｒ１がアシルであり、−Ｒ１と−Ｒ３が一緒になって、シクロペンテノン環のような、アシル基を含有する環を形成する場合に当てはまりうる。
【０１８０】
一実施態様において、基質はニトリル（−ＣＮ）基を含有しない。例えば、−Ｒ１、−Ｒ３及び−Ｒ４は、それぞれニトリルでない。したがって、−Ｒ１基は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、ニトロ及びアシルアミノから独立して選択されうる。−Ｒ３基は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ及びアシルアミノから独立して選択されうる。−Ｒ４基は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アミノ、ヒドロキシル、オキシ、カルボキシ、アシルオキシ及びアシルアミノから独立して選択されうる。
【０１８１】
アルキル基は、直鎖又は分枝鎖のＣ１−２０飽和アルキル基を指し得る。アルキル基は、Ｃ１−４、Ｃ１−６又はＣ１−１０アルキル基でありうる。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル及び１−メチルエチル（イソ−プロピル）が挙げられる。
【０１８２】
アルケニル基は、直鎖又は分枝鎖のＣ２−２０アルケニル基を指し得る。アルケニル基は、Ｃ２−４、Ｃ２−６又はＣ２−１０アルケニル基でありうる。アルケニル基の例としては、エテニル及びプロペニルが挙げられる。アルケニル基に置換基が提供される場合、基のエチレンは、置換基のα，βに提供される。アルケニル基は、１つ又は複数の不飽和結合を有しうる。
【０１８３】
アルキニル基は、直鎖又は分枝鎖のＣ２−２０アルキニル基を指し得る。アルキニル基は、Ｃ２−４、Ｃ２−６又はＣ２−１０アルキニル基でありうる。アルキニル基の例としては、エチニル及びプロピニルが挙げられる。アルキニル基は、１つ又は複数の不飽和結合を含みうる。
【０１８４】
シクロアルキル基は、Ｃ６−１０シクロアルキル基を指し得る。アルキル基の例としては、シクロヘキシル及びシクロペンチルが挙げられる。
一実施態様において、シクロアルキル基は、任意選択で不飽和である。
【０１８５】
シクロアルキル基は、縮合環系の一部でありうる。縮合系において、シクロアルキル基は、２つ以上の縮合環を含む環系を有し、ここで、縮合環系の１つの環は、（ヘテロ芳香環を含む）芳香環であることができ、該基は非芳香族環原子（すなわち、環系の一部である非芳香族環の一部である環原子）によって、分子の残りに結合される。よって、縮合環系は、シクロアルキル環の環原子を介して連結される。縮合系の例としては、テトラリニル及びインダニルが挙げられる。縮合環系は、任意の利用可能な環原子において置換されていてもよい。
【０１８６】
ヘテロシクリル基は、Ｃ５−１０ヘテロリクリル基を指し得る。ヘテロシクリル基は、Ｃ５−７、Ｃ５−６又はＣ６ヘテロシクリル基でありうる。ヘテロ環基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は２つのヘテロ原子のような、１つ又は複数のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリル基は、環炭素原子又は存在する場合には、環窒素原子を介して連結されうる。窒素環原子は、ＮＨ基でありうるか又は窒素環原子が置換されうる。イオウ環原子は、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−又は−Ｓ（Ｏ）２−基でありうる。
ヘテロシクリル基の例としては、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、１，４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン及び１，４−ジアゼピンが挙げられる。
【０１８７】
ヘテロシクリル基は、縮合環系の一部でありうる。縮合系において、ヘテロシクリル基は、２つ以上の縮合環を含む環系を有し、ここで、縮合環系の１つの環は、（ヘテロ芳香環を含む）芳香環であることができ、該基は、非芳香族環原子（すなわち、環系の一部である非芳香族環の一部である環原子）によって、分子の残りに結合される。よって、縮合環系は、ヘテロシクリル環の環原子を介して連結される。例としては、インドリニル、インドリル、ジヒドロベンゾフラニル、クロマニル、及び２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニルが挙げられる。縮合環系は、任意の利用可能な環原子において置換されていてもよい。
【０１８８】
アリール基は、Ｃ５−１４カルボアリール又はヘテロアリール基を指し得る。
カルボアリール基は、Ｃ６−１４又はＣ６−１０カルボアリール基でありうる。
カルボアリール基の例としては、フェニル及びナフチルが挙げられる。
カルボアリール基は、縮合環系の一部でありうる。縮合系において、カルボアリール基は、２つ以上の縮合環を含む環系を有し、ここで、縮合環系の少なくとも１つの環は、（ヘテロ芳香環を含む）芳香環であり、該基は、芳香族環原子（すなわち、環系の一部である芳香族環の一部である環原子）によって、分子の残りに結合される。よって、縮合環系は、芳香環の環原子を介して連結される。例としては、ナフチル、インドリニル、インドリル及びジヒドロベンゾフラニル、クロマニル及び２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニルが挙げられる。縮合環系は、任意の利用可能な環原子において置換されていてもよい。
【０１８９】
へテロアリール基は、Ｃ５−１４、Ｃ５−１０又はＣ５−６ヘテロアリール基でありうる。
ヘテロアリール基の例としては、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリドニル、ピラジニル、キノリニル及びイソ−キノリニルが挙げられる。
ヘテロアリール基は、縮合環系の一部でありうる。縮合系において、ヘテロアリール基は、２つ以上の縮合環を含む環系を有し、ここで、縮合環系の少なくとも１つの環は、ヘテロ芳香環であり、該基は、ヘテロ芳香族環の環原子（すなわち、環系の一部である芳香環の一部である環原子）によって、分子の残りに結合される。よって、縮合環系は、芳香環の環原子を介して連結される。ヘテロアリール基は、環炭素原子又は存在する場合には環窒素原子を介して連結されうる。例としては、インドリル、ベンゾールフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾキサゾイル、プリニル、キノリニル及びイソ−キノリニルが挙げられる。
【０１９０】
アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール基は、置換されていてもよい。基は、一、二又は三置換されうる。
【０１９１】
基が置換されると言われる場合、それは、ハロ、ヒドロキシル（−ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、オキシ、チオ、アミノ、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、オキシアシル、アミド及びアシルアミノからなる群から独立して選択される置換基により置換されうる。これらの基は、以下において議論される。
【０１９２】
窒素環原子が、ヘテロ環基中に存在する場合、環原子は、非置換（ＮＨ）又は本明細書に記載されたようなアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アシル及びアシルオキシにより置換されていてもよい。
【０１９３】
ハロ、ヒドロキシル（−ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、オキシ、チオ、アミノ、アシル、カルボキシ、アシルオキシ、オキシアシル、アミド及びアシルアミノ基は、以下に記載の基でありうる。
【０１９４】
アシル基は、−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ基であり、ここで−Ｒは、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される。
一実施態様において、アシル基は−Ｃ（Ｏ）Ｒである。
アシル基が窒素環原子に置換される場合、アシル基は窒素環原子と一緒になってアミド基を形成する。
【０１９５】
一実施態様において、−Ｒ１がアシル基である場合、−Ｒは、置換又は非置換アルキルから選択される。
【０１９６】
一実施態様において、−Ｒ１がアシル基である場合、この基は、−Ｒ３基と一緒になって形成された環の一部でありうる。例えば、−Ｒ１及び−Ｒ３は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、２−シクロヘキセン−１−オン又は２−シクロペンテン−１−オン環を形成しうる。
【０１９７】
カルボキシ基は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又はこの基のカルボキシレート形態である。
【０１９８】
アシルオキシ基は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基であり、ここで−Ｒは、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及び又はアリールから選択される。
アシル基が窒素環原子に対する置換基である場合、アシルオキシ基は窒素環原子と一緒になって、カルバメート基を形成する。
【０１９９】
−Ｒ１基は、アシルオキシ基でありうる。一実施態様において、−Ｒは、−Ｒ３と一緒になって環を形成しうる。一実施態様において、−Ｒ６及び−Ｒ３及びそれらに結合する原子は、非置換又は置換環を形成し、ここで、該環は、５−７個のような、４−８個の環原子を有する。該環は、例えば、シクロへキセン又はシクロペンテン環でありうる。該環は、置換されていてもよい。
一実施態様において、−Ｒ１がアシルオキシ基である場合、−Ｒは、置換又は非置換アルキルから選択される。
【０２００】
ハロ基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉ及び−Ｂｒから独立して選択される。
【０２０１】
オキシ基は、−ＯＲ基であり、ここで−Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択される。
【０２０２】
チオ基は、−ＳＨ又はＳＲ基であり、ここで−Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択される。
【０２０３】
アミノ基は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ及び−Ｎ（Ｒ）２から選択される基であり、ここで各−Ｒは、アルキル、シクロアルキル及びアリールのように、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択される。
【０２０４】
オキシアシル基は、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ基であり、ここで−Ｒは、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択される。
【０２０５】
アミド基は、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基であり、ここで−Ｒは、置換又は非置換アルキルのように、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択される。
【０２０６】
アシルアミノ基は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２基であり、ここで−Ｒは、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから独立して選択されるか、又は２つのＲ基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意選択で、１つのさらなる環ヘテロ原子を含有する置換又は非置換窒素ヘテロ環を形成しうる。ヘテロ環は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールで置換されていてもよい。
【０２０７】
置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される−Ｒ基が、上で記載される。
一実施態様において、−Ｒは、存在する場合、置換又は非置換アルキル、アルケニル、アルキニル及びシクロアルキルから選択される。
一実施態様において、−Ｒは、存在する場合、アルキルのような、置換又は非置換アルキル及びシクロアルキルから選択される。
一実施態様において、−Ｒは、存在する場合、置換又は非置換アルキル、アルケニル及びアリールから選択される。
一実施態様において、−Ｒは、存在する場合、置換又は非置換アリールである。
【０２０８】
アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、アルキル、アルケニル又はアルキニル基で置換されない。
【０２０９】
各置換基は、さらに置換されていてもよい。
【０２１０】
一実施態様において、−Ｒ３及び−Ｒ４は同じでない。一実施態様において、−Ｒ２、−Ｒ３及び−Ｒ４は同じでない。
【０２１１】
一実施態様において、−Ｒ２、−Ｒ３及び−Ｒ４は、アシル、カルボキシ、アシルオキシ又はニトロ基に対するα，βのような、活性化基に対してα，βにあるエチレン基を含有しない。ここで、基質は、活性化エチレン基を１つだけ有し、すなわち、−Ｒ１に対してα，βにあるエチレン基である。
一実施態様において、基質は、最大で５００、最大で７５０又は最大で１，０００の分子量を有する化合物である。
一実施態様において、基質はアキラルである。
【０２１２】
補助基質
本発明の方法において、基質は補助基質と一緒に反応して、生成物を生じさせることができる。還元反応において、補助基質は、還元剤とみなされうる。還元剤は、形式上、還元のための水素を提供しうる。還元剤は、典型的に補助因子である。
【０２１３】
補助因子
触媒は、還元反応のための還元当量を提供するために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補助因子として使用しうる。例えば、不飽和炭素−炭素二重結合の還元を触媒することにおいて、触媒はＮＡＤ（Ｐ）Ｈからの還元当量を使用し、それによってこれをＮＡＤ（Ｐ）＋に酸化しうる。酸化された補助因子に対する還元された補助因子の割合、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）＋に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの割合は、補助因子の酸化及び付随する基質の還元に好都合とするために、比較的高くなければならない。
【０２１４】
補助因子は、補酵素としても知られ、補助基質としても知られうる。用語「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」は、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを示すために使用され、該用語及び「ＮＡＤ（Ｐ）＋」は、ＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＰ＋を示すために使用される。例えば、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」を補助因子として使用する触媒は、ＮＡＤＨを補助因子として使用することができ、さらに又は或いは、ＮＡＤＰＨを補助因子として使用することができる。
【０２１５】
インビトロの反応においては、還元型補助因子が化学量論的量で基質とともに存在しうる。或いは、還元型補助因子は、基質とともに化学量論的量よりも顕著に少ない量で存在しうる。還元型補助因子は、反応の間に酸化された補助因子を還元し、それによって補助因子が化学量論的量よりも顕著に少ない量で基質とともに存在することを可能とする、還元型補助因子再生系を用いて再生されうる。還元型補助因子再生系は、本分野で知られている。そのような系は、還元剤を、任意選択で、還元剤から酸化型補助因子へ還元当量を移動させることのできる酵素と一緒に含みうる。還元剤は、糖、特に、グルコース、マンノース、フルクトースのようなヘキソースを含み、還元剤は、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールのような酸化可能なアルコールも含み、還元剤は、ギ酸塩、亜リン塩及び分子水素も含む。そのような系は、還元剤としての糖を、任意選択で、糖から酸化型補助因子への還元当量の移動を触媒するための適合性の糖デヒドロゲナーゼとともに含みうる。補助因子としてのＮＡＤＨのためには、スキーム１に示すように、還元型補助因子再生系は、グルコース及びグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含みうる。補助因子としてのＮＡＤＨのためには、還元型補助因子再生系は、ギ酸及びギ酸デヒドロゲナーゼを含みうる。補助因子としてのＮＡＤＰＨのためには、補助因子再生系は、グルコース−６−リン酸塩及びグルコース−６−ホスファターゼを含みうる。
【０２１６】
インビボの反応においては、触媒が細胞中で提供される場合、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが細胞内酵素によって再生される。そのような酵素は、内因性又は組換えによるものでありうる。例えば、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼのような解糖に関与する細胞内酵素が、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元しうる。
【０２１７】
触媒は、フラビン依存性酵素でありうる。すなわち、触媒は補助因子から還元当量を受け取り、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）補欠分子族を介して不飽和炭素−炭素二重結合を還元しうる。
【０２１８】
立体選択的反応
本発明の触媒は、生成物中の２つのような、１つ又は複数の炭素原子が特定の立体化学を有する生成物を生成するために使用されうる。よって、本発明の触媒は、キラル化合物を調製するために有利に使用されうる。
【０２１９】
本発明の触媒は、７０％以上、８０％以上、９５％以上、９９％以上のｅｅ値を有する生成物を生成するために使用されうる。
【０２２０】
したがって、本発明の触媒は、エナンチオマーのような、１つの立体異性体が圧倒的であり、別の立体異性体が少量である生成物を調製するために使用されうる。
【０２２１】
本発明の触媒は、アキラルの基質と一緒に使用されうる。よって、該基質は、不斉中心を有する原子を有することができない。本明細書に記載の方法は、生成物中に１つ又は２つの不斉中心を生成することを可能とする。よって、本発明の触媒は、アキラルの出発材料からキラリティーを与えるために使用されうる。
【０２２２】
なお、本明細書に記載の反応方法は、立体選択的な合成方法に限定されない。実施例に示すように、本発明の触媒は、高収量の還元型基質を生成するために使用されうる。基質の立体選択的還元が、生成物の高収量をともない又はともなわずに、起こりうる。
【０２２３】
基質がエチレン結合を含有する場合、触媒を用いる該結合の還元は、該結合の反対面（ａｎｔｉ）へ幾何学的な水素付加により起こると理解される。式（Ｉ）の化合物において、エチレン結合は、右下に位置する−Ｒ１基とともに示される。描かれるように、触媒の存在下でのこの結合の還元は、−Ｒ３及び−Ｒ４に結合した炭素における上面（紙の平面の上方）からの水素原子の付加並びに−Ｒ１及び−Ｒ２に結合した炭素における下面（紙の平面の下方）からの水素原子の付加により起こりうる。
【０２２４】
よって、一実施態様において、式（Ｉ）の化合物の還元は、このように起こる：
0006600352.tif 000006
【０２２５】
生成物中のエナンチオマーの量又はエナンチオマーの割合は、キラル固定相を用いるＨＰＬＣのような標準的な分光光学技術によって決定されうる。本明細書に記載のとおり、還元反応の生成物のｅｅ値が、生成物混合物のＧＣ分析によって決定された。
【０２２６】
発明者らは、−Ｒ３及び−Ｒ４が結合した炭素原子がプロキラルな炭素原子（還元に際してキラル炭素原子になる炭素原子）である場合、高いエナンチオマー過剰率が得られることを見出した。対照的に、−Ｒ１及び−Ｒ２が結合する炭素原子（α炭素）がプロキラルな炭素原子である場合、高いエナンチオマー過剰率は時として達成されない。これは、α炭素に結合した水素原子の相対的不安定性が還元後に高く、α炭素がキラル炭素原子であると、（例えば、−Ｒ１がアシルである場合、エノール形態を介して）これがラセミ化反応をもたらしうることによると考えられる。したがって、高いエナンチオマー過剰率が望まれる場合には、−Ｒ３及び−Ｒ４が結合する炭素原子がプロキラルな炭素原子であることが好ましいかもしれない。−Ｒ１及び−Ｒ２が結合する炭素原子はプロキラルな炭素原子でないことが好ましいかもしれない。
【０２２７】
特に、発明者らは、−Ｒ２が水素であり、−Ｒ３及び−Ｒ４がそれぞれ水素でなく、かつ同じでない化合物に関して、高いエナンチオマー過剰率が得られうることを見出した。ここで、−Ｒ３及び−Ｒ４が結合する炭素は、還元に際してキラル炭素原子となるため、プロキラルな中心とみなされうる。対照的に、−Ｒ１に結合したα炭素は、反応の結果としてこの炭素原子が２つの水素原子を有するため、還元に際して四級不斉中心を生じない。
【０２２８】
当業者は、本明細書中で使用される用語、キラル炭素原子を容易に理解する。これは、そのうちの１つが水素原子でありうる４つの異なる基がそこに結合した炭素原子を含む。
【０２２９】
キット
一態様において、本発明は、キット中の本発明の触媒を提供する。
【０２３０】
キットは、１つ又は複数のさらなる触媒を含みうる。さらなる触媒は、本明細書に記載のエチレン基の還元のような還元反応における使用のためのものであることができる。
【０２３１】
さらに又は或いは、さらなる触媒は、還元反応でないか又はエチレン基の還元でない反応における使用のためのものであることができる。
【０２３２】
一実施態様において、さらなる触媒は生体触媒である。よって、各触媒は酵素活性を有する。
【０２３３】
触媒は、他の触媒又はキットの他の構成要素から空間的に分離されうる。よって、触媒は、ウエルプレートのウエル中、又は別々のバイアル若しくは他の容器中に提供されうる。
【０２３４】
本発明のキットは、還元触媒を１つ又は複数の他の触媒と一緒に有するキットであることができ、ここで、還元触媒は、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。これは、還元触媒を１つ又は複数の他の触媒と一緒に有するキットであることができ、ここで、還元触媒は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。これは、還元触媒を１つ又は複数の他の触媒と一緒に有するキットであることができ、ここで、還元触媒は、配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０２３５】
キットは、キットの使用のための説明書とともに提供されうる。任意選択で、キットは、触媒とともに使用するための追加の試薬とともに提供されうる。例えば、補助因子、バッファー、溶媒などが提供されうる。バッファーは、後の再水和のために濃縮形態で提供されうる。
【０２３６】
さらなる触媒のうちの１つ又はすべてが酵素触媒でありうる。
一実施態様において、キットは、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性及びリガーゼ活性からなる群から選択される活性を有する１つ又は複数の触媒をさらに含む。
【０２３７】
一実施態様において、キットは、リパーゼ活性、エステラーゼ活性、（ペプチダーゼ活性を含む）アミダーゼ活性、グリコシダーゼ活性、グリコールトランスフェラーゼ活性、エポキシダーゼ活性、（ニトリルヒドラターゼ活性を含む）ニトリラーゼ活性、ヒドロキシル化活性、（アルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む）デヒドロゲナーゼ活性、ジヒドロキシル化活性、バイヤー・ビリガー（Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ）酸化活性、アルドラーゼ活性、オキシニトリラーゼ活性、アミノトランスフェラーゼ活性及び補助因子再生活性からなる群から選択される活性を有する１つ又は複数の触媒をさらに含む。
【０２３８】
さらに又は或いは、キットは、エンレダクターゼ活性である活性を有する触媒を含む。
【０２３９】
一実施態様において、キットは、キット中の１つ又は各触媒のための基質とともに提供される。基質は、例えば、キット内の触媒の活性を確立するための、参照基質として提供されうる。
【０２４０】
一実施態様において、キットは、各触媒の使用のための説明書とともに提供される。
【０２４１】
他の実施態様
上記の実施態様の適合性の組み合わせはいずれもみな、いずれの組み合わせも個別にかつ明白に記述されるかのように、明白に本明細書に開示される。
【０２４２】
本開示を考慮して、本発明の多様なさらなる態様及び実施態様が当業者に明らかとなる。
【０２４３】
本明細書中で使用される場合、「及び／又は」は、２つの特定された特徴又は構成要素それぞれの、他方と一緒の又は一緒でない具体的な開示として受け止められるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書中にそれぞれが個別に示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として受け止められるべきである。
【０２４４】
別段の定めのない限り、上で示される特徴の説明及び定義は、本発明のいかなる特別な態様又は実施態様に限定されるものでなく、記載されたすべての態様及び実施態様に等しく当てはまる。
【０２４５】
本発明のある一定の態様及び実施態様が、例として、そして上記の図面を参照して例解される。
【実施例】
【０２４６】
実験
触媒
ＥＮＥ−１０１を、標準的な発現技術を用いて大腸菌内で発現させた。大腸菌内でのＥＮＥ−１０１の発現のために最適化された核酸配列（配列番号３）を、ＩＰＴＧ誘導性の発現のための標準的な発現ベクター中へクローニングした。
【０２４７】
いくつかの実験において、１つ又は複数のＮ末端タグを有する、ＥＮＥ−１０１をコードする（非コドン最適化）核酸配列（配列番号５及び配列番号７）を発現させ、触媒活性を有することを確認した。
【０２４８】
細胞を採取すること、バイオマスを回収すること及びバイオマスをバッファー（０．１Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．０）に再懸濁すること、懸濁液を溶解すること及び細胞デブリを除去して、清澄化した細胞ライセートを提供することによって、ＥＮＥ−１０１調製物を生成した。いくつかの実験において、溶解バッファーは、２０μＭのＦＭＮ（フラビンモノノヌクレオチド）及び５ｍＭのＭｇＳＯ４を含有した。２０μＭのＦＭＮ及び５ｍＭのＭｇＳＯ４を溶解バッファーに含めることは、ＥＮＥ−１０１活性の１０％増大をもたらした。清澄化した細胞ライセートを最初に、０．５μｍ及び０．２μｍの孔サイズのフィルターを通してろ過し、次いで、限外ろ過によってさらに濃縮して、ＥＮＥ−１０１調製物を提供した。そのようなＥＮＥ−１０１調製物は、直接使用するか又は後の再構成及び使用のために凍結乾燥しうる。ＥＮＥ−１０１調製物は、１−オクテン−３−オンを参照基質として用いる上記アッセイによって決定した、典型的に約５Ｕｍｇ−１の触媒を含む。
【０２４９】
活性試験のために、配列番号３を発現するベクターを用いてＥＮＥ−１０１調製物を作成した。
【０２５０】
配列番号１の触媒の使用を以下に記載する。これを、ＥＮＥ−１０１と呼ぶ。
【０２５１】
実験手順１
５０μＬの凍結乾燥したＥＮＥ−１０１調製物の水溶液（１試験あたり、１００ｍｇ／ｍＬ；５ｍｇの酵素）を、９００μＬの水性媒体、ｐＨ７（２５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７、１．１ｍＭのＮＡＤ＋、３０ｍＭのＤ−グルコース、１０Ｕ／ｍＬのＧＤＨ）及び５０μＬの基質のトルエン溶液（４００ｍＭ、基質の最終濃度２０ｍＭ）を含有した反応バイアルに添加した。バイアルを３５℃で３、６及び１８時間、振盪した。１ｍＬのＥｔＯＡｃを添加後、反応バイアルをボルテックスし、遠心分離した。有機相のサンプルを、ＧＣにより分析して、変換及びｅｅを測定した。
【０２５２】
結果を表１に示す。
【０２５３】
いくつかの実験における変換値は、採用した特定の反応条件下では比較的低いことがわかった。しかしながら、副生成物は観察せず、未反応の基異質が残った主な構成要素だった。基質が回収され、次の反応において再使用されうると仮定すると、生成物の収率は、比較的高いと考えられる。
0006600352.tif 000007
a GCにおける生成物のピークの積算(未補正のGC面積)。b 反応媒体中における生成物eeの浸食が観察された。この浸食は、酵素により触媒されたものではない。c eeは決定されなかった。c Stereo.は、生成物の割り当てられた立体化学を指す。
【０２５４】
３−メチル−２−シクロペンテノン（エントリー１、２及び３）及び３−メチル−２−シクロヘキセノン（エントリー４、５及び６）の還元は、両場合において、遅くかつ一部のみの変換が得られたことを証明した。エナンチオ選択性は、両基質で卓越していた。
【０２５５】
一方、２−メチル−２−シクロペンテノンは、非常に活性で、迅速に反応したことを証明した。対応する生成物、２−メチルシクロペンタノンが、反応条件下でラセミ化することに注目されたい。
【０２５６】
図１は、表１に列挙した基質のうちの４つに関する、反応時間（時間）の変化にともなう変換％の変化を示す。
【０２５７】
濃度試験
ＥＮＥ−１０１によってより活性であることが証明された基質を、次に、３つの異なる濃度：５０、１００及び３００ｍＭで試験した。これらの試験では、実験手順１に従った。グルコース、ＥＮＥ−１０１、ＧＤＨ及びＮＡＤの量を、基質濃度に従ってスケールアップしたため、当量数は一定のままであった。上記実験手順に記載のとおり、反応のために、２５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．０を使用した。反応が起こるときのｐＨを調節することは試みなかった。これは、高い基質濃度においては、生成されたグルコン酸が完全に中和されず、したがって、媒体のｐＨを、ＥＮＥ−１０１が働くには酸性としすぎる可能性があることを意味する。
【０２５８】
結果を表２に示す。
0006600352.tif 000008
a GCにおける生成物のピークの積算(未補正のGC面積)。b 反応媒体中における生成物eeの浸食が観察された。この浸食は、酵素により触媒されたものではない。c eeは決定されなかった。
【０２５９】
図２は、表１に列挙した基質のうちの３つに関する、反応時間（時間）の変化及び基質濃度の変化にともなう変換％の変化を示す。
【０２６０】
試験したほとんどの基質について、反応時間を３から１８時間に増加させた場合に、変換が顕著に改善しなかったことが注目される。これは、高い基質濃度において特に顕著であり、反応媒体のｐＨが、酵素が働くには、酸性に変化しすぎて、変換を停止させたことを示す。これを、３及び１８時間後の反応バイアルのｐＨを測定することによって証明した。
【０２６１】
試験した例のいずれにおいても、３００ｍＭもの高濃度においてさえ、生成物又は基質による阻害の証拠はなかった。これは、３００ｍＭ以下の濃度で（おそらくより高濃度でも）これらの還元を行うことが可能であるはずで、反応媒体のｐＨの制御を一緒に行うことが理想的であることを示す。
【０２６２】
ｐＨ試験
ｐＨ試験においては、さらなる試験のための試験基質として、シトラール（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール）を選択した。次いで、バッファーのｐＨの効果を試験し、結果を図３に示す。
【０２６３】
短い反応時間（典型的に、約１分）から見て、反応混合物のｐＨは、反応手順の間を通じて実質的に一定であると仮定した。
【０２６４】
反応性を側光アッセイにより決定した−ＮＡＤＨの酸化により引き起こされた３４０ｎｍの吸収の減少は、ＥＮＥ−１０１の触媒活性の尺度である。アッセイ濃度：１ｍＬの反応混合物中、最終濃度は、０．１Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭの基質、１５ｍＭのＮＡＤＨ及び０．４ｍｇのＥＮＥ−１０１である。
【０２６５】
バックグラウンド活性（基質非存在下におけるＮＡＤＨの吸収の減少）を、各ｐＨ値について測定した。ｐＨ６から６．５及びｐＨ８から９ではより高いことがわかった。ＥＮＥ−１０１は、ｐＨ６．５から８の間で安定かつより活性であることがわかった。
【０２６６】
温度プロフィール及び安定性
ＥＮＥ−１０１の温度プロフィールも試験し、バックグラウンド活性を各温度について測定し、酵素を用いて測定した活性から差し引いた。結果を図４に示す。
【０２６７】
ｐＨ試験に関して上記した側光アッセイによって反応性を決定した。基質はシトラールであった。
ＥＮＥ−１０１の安定性を、３つの異なる温度（３０、４０及び５０℃）において試験した。前のとおり、バックグラウンド活性を測定し、除した。残存活性の結果を図５に示す。ここでも、反応性を側光アッセイにより決定し、基質はシトラールであった。
【０２６８】
図５の結果は、ＥＮＥ−１０１が、４０℃未満の温度ではかなり安定であるが、５０℃においては急速に失活することを示している。
【０２６９】
溶媒及び添加物の効果
比較的反応性の基質、２−メチルシクロペンテノンを用いて、溶媒及び添加物の効果を試験した。実験手順１に従って、異なる共溶媒を５体積％において比較した。生成物の収率及びｅｅに関するこの比較の結果を図６に示す。
【０２７０】
前述のとおり、還元生成物、２−メチルシクロペンタノンは、反応条件下でラセミ化した。試験した共溶媒の中では、変換を改善し又は顕著な程度にラセミ化を防止するものはないように見えた。
【０２７１】
同一条件下で、反応混合物への（０．１及び０．３体積％の）界面活性剤の添加の効果を評価した。結果を図７に示す。
【０２７２】
示した体積で試験した共溶媒の中では、変換を改善し又は顕著な程度にラセミ化を防止するものはないように見えた。
【０２７３】
スケールアップ実験
工業的に有用なレベルの触媒の有用性を示すために、続いて、より大規模に触媒反応を実行した。
【０２７４】
以下のスキーム１に示すとおり、スケールアップした反応で還元を検討した。
0006600352.tif 000009
【０２７５】
手順１−試薬及び方法
0006600352.tif 000010
【０２７６】
温度制御し（４０℃）、ｐＨ制御した投与ポンプを備え、磁力により攪拌した（６００ｒｐｍ、卵型の攪拌子）５０ｍＬ丸底フラスコ中へ、脱イオン水（３６．３ｍＬ）、Ｋ２ＨＰＯ４（５９７ｍｇ）及びＫＨ２ＰＯ４（２７ｍｇ）を導入した。これは、０．１Ｍのリン酸バッファー溶液、ｐＨ８．０をもたらした。次いで、Ｄ−グルコース一水和物（８．２ｇ）を添加し、溶液のｐＨを７．１まで低下させた。温度が安定した後、ＮａＣｌ（１．６８ｇ）、続いてＥＮＥ−１０１（１．０ｇ）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）、ＮＡＤ（１６６ｍｇ）及び１−アセチルシクロヘキセン（４．６７ｇ；３７．６ミリモル）を添加した。
【０２７７】
ＧＣ分析によって完全な変換が観察されるまで、反応を４０℃で攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
変換をモニターするために、規則的な間隔で反応からサンプル（５０μＬ）を採取した。それらをＤＣＭ（１．５ｍＬ）で処理し、ボルテックスし、遠心分離して、不溶性の材料を除去し、ＧＣにより分析して、変換を測定した。２０時間後、ＧＣによって、生成物への９９．３％の変換を観察した。図８及び９に反応プロフィールを見出すことができる。
【０２７８】
手順２−試薬及び方法
0006600352.tif 000011
【０２７９】
前に記載したものと同一の手順に従って、２倍の基質濃度で反応を繰り返した。この場合、リン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０（２４．８ｍＬ）中、Ｄ−グルコース一水和物（１５．４ｇ；７７．７ミリモル）、塩化ナトリウム（１．６８ｇ）、ＮＡＤ（３１６ｍｇ；０．４７ミリモル）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）及びＥＮＥ−１０１（１．０ｇ）の溶液を、１−アセチルシクロヘキセン（９．３４ｇ；７５．２ミリモル）で処理する前に、４０℃の磁力により攪拌した丸底フラスコに入れた。反応を４０℃において９６時間攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
【０２８０】
変換をモニターするために、規則的な間隔で反応からサンプル（２５μＬ）を採取した。それらをＤＣＭ（１．５ｍＬ）で処理し、ボルテックスし、遠心分離して、不溶性の材料を除去し、ＧＣにより分析して、変換を測定した。２６時間後、ＧＣによって、生成物への７５％の変換を観察した（１．１２５Ｍの生成物濃度）。反応をスローダウンし、９５％変換で停止した。図８及び９に反応プロフィールを見出すことができる。
【０２８１】
以下のスキーム２に示すとおり、スケールアップしたさらなる反応で還元を検討した。
0006600352.tif 000012
【０２８２】
手順３−試薬及び方法
0006600352.tif 000013
【０２８３】
温度制御し（４０℃）、ｐＨ制御した投与ポンプを備え、磁力により攪拌した（６００ｒｐｍ、卵型の攪拌子）５０ｍＬ丸底フラスコ中へ、脱イオン水（３６．８ｍＬ）、Ｋ２ＨＰＯ４（５９７ｍｇ）及びＫＨ２ＰＯ４（２７ｍｇ）を導入した。これは、０．１Ｍのリン酸バッファー溶液、ｐＨ８．０をもたらした。次いで、Ｄ−グルコース一水和物（８．２ｇ）を添加し、溶液のｐＨを７．１まで低下させた。温度が安定した後、ＮａＣｌ（１．６８ｇ）、続いてＥＮＥ−１０１（１．０ｇ）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）、ＮＡＤ（１６６ｍｇ）及びイタコン酸ジメチル（５．９ｇ；３７．３ミリモル）を添加した。ＧＣ分析によって完全な変換が観察されるまで、反応を４０℃で攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
変換をモニターするために、規則的な間隔で反応からサンプル（５０μＬ）を採取した。それらをＤＣＭ（１．５ｍＬ）で処理し、ボルテックスし、遠心分離して、不溶性の材料を除去し、ＧＣにより分析して、変換を測定した。４３時間後、ＧＣによって、生成物への９９％の変換（＞９９．９％ｅｅ、Ｒエナンチオマー）を観察した。図１０及び１１に反応プロフィールを見出すことができる。
【０２８４】
さらなる実験データ
触媒
ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３を、タグを含んで（例えば、Ｎ末端Ｔ７及びＨｉｓタグとともに）又はタグを含まずに生成した。
【０２８５】
ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３を、上記のＥＮＥ−１０１と類似した方法で生成した。ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３調製物は、典型的に、１−オクテン−３−オンを参照基質として使用する上記のアッセイにより一般的に記載した、ＮＡＤＰＨを補助因子として使用する約１−２Ｕｍｇ−１の触媒調製物を含む。
【０２８６】
これらのさらなる実験データは、比較の容易のために、すでに上で提示したデータを含む。
【０２８７】
酵素ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３の基質範囲を定義するために、それらを多数の基質（活性型Ｃ＝Ｃ結合）に対して試験した。（「実験手順２」に記載の）同一の条件下で反応を行い、３、６及び１８時間後にサンプルを採取し、ＧＣにより分析して、変換及びエナンチオマー過剰率を測定した。これらの反応からの結果を表３に記載する。
【０２８８】
実験手順２：５０μＬの凍結乾燥した酵素ＥＮＥ−１０１、ＥＮＥ−１０２及びＥＮＥ−１０３調製物の水溶液（１試験あたり、１００ｍｇ／ｍＬ；５ｍｇの酵素）を、９００μＬの水性媒体、ｐＨ７（２５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７、１．１ｍＭのＮＡＤ＋、３０ｍＭのＤ−グルコース、１０Ｕ／ｍＬのＧＤＨ）及び５０μＬの基質のトルエン溶液（４００ｍＭ、基質の最終濃度２０ｍＭ）を含有した反応バイアルに添加した。バイアルを３５℃で３、６及び１８時間、振盪した。１ｍＬのＥｔＯＡｃを添加後、反応バイアルをボルテックスし、遠心分離した。有機相のサンプルを、ＧＣにより分析して、変換及びｅｅを測定した。
0006600352.tif 000014
0006600352.tif 000015
a GCにおける生成物のピークの積算(未補正のGC面積)。b 反応媒体中における生成物eeの浸食が観察された。この浸食は、酵素により触媒されたものではない。c eeは決定されなかった。
【０２８９】
３−メチル−２−シクロペンテノン及び３−メチル−２−シクロヘキセノンの還元は、ＥＮＥ−１０１及びＥＮＥ−１０２の両方において、遅くかつ一部のみの変換が得られたことを証明した。しかしながら、エナンチオ選択性は、両基質で卓越していた。ＥＮＥ−１０３は、これらの基質に対して明らかに不活性であった（データは示さない）。ＥＮＥ−１０３が、２−メチル−２−シクロペンテノン及び１−（シクロヘキセン−１−イル）エタノン（表３中のエントリー１６及び１７）のような、構造的に関連した形態について活性を有することを観察したため、これは、不活性のめったにない事例のように見える。
【０２９０】
２−メチル−２−シクロペンテノンは、３つの酵素によって急速に還元された。あいにく、対応する生成物、２−メチルシクロペンタノンは、反応条件下でラセミ化した。
【０２９１】
α−置換されたエノンが、β−置換されたものよりも、より急速に、旧黄色酵素によって還元されることが報告されている。例えば、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）ＯＹＥ（ＳＹＥ−４）（Iqbal等、2012）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のエノエートレダクターゼ並びにクリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来（ＫＹＥ１）及びエルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来（Ｙｅｒｓ−ＥＲ）のＯＹＥ（Yanto等、2011；Hall等、2008）で還元ついての報告を参照されたい。
【０２９２】
図１２は、表３に報告したデータを示す。
【０２９３】
より還元が容易であることが証明された基質を、次に、３つの異なる濃度：５０、１００及び３００ｍＭで試験した。３つの試験について実験手順２に従った。グルコース、ＥＮＥ、ＧＤＨ及びＮＡＤの量を、基質濃度に従って増加させたため、当量数は一定のままであった。実験手順に記載のとおり、反応のために、２５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．０を使用した。反応が起こるときのｐＨを調節することは試みなかった。これは、高い基質濃度においては、生成されたグルコン酸が完全に中和されず、媒体のｐＨを、ＥＮＥが働くには酸性としすぎる可能性があることを意味する。
【０２９４】
表４並びに図１３Ａ及び１３Ｂに、これらの試験からの結果を見出すことができる。
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a GCにおける生成物のピークの積算(未補正のGC面積)。b 反応媒体中における生成物eeの浸食が観察された。この浸食は、酵素により触媒されたものではない。c eeは決定されなかった。
【０２９５】
試験したほとんどの基質について、反応時間を３から１８時間にした場合に、変換が顕著に改善しなかった。これは、高い基質濃度において特に顕著であり、反応媒体のｐＨが、酵素が働くには、酸性に変化しすぎて、変換を停止させたことを示す。これを、３及び１８時間後の反応バイアルのｐＨを測定することによって証明した。
【０２９６】
実験のいずれにおいても、３００ｍＭもの高濃度においてさえ、生成物又は基質による阻害の証拠はなかった。これは、３００ｍＭ以下、又は３００ｍＭよりも高い濃度でこれらの還元を行うことが可能であることを示す。反応媒体のｐＨを調節することは、高い基質濃度を使用する反応をさらに改善しうる。
【０２９７】
スケールアップ実験
１−アセチルシクロヘキセンの還元
0006600352.tif 000018
【０２９８】
手順ａ．１（０．７５Ｍ）
0006600352.tif 000019
【０２９９】
温度制御し（４０℃）、ｐＨ制御した投与ポンプを備え、磁力により攪拌した（６００ｒｐｍ、卵型の攪拌子）５０ｍＬ丸底フラスコ中へ、脱イオン水（３６．３ｍＬ）、Ｋ２ＨＰＯ４（５９７ｍｇ）及びＫＨ２ＰＯ４（２７ｍｇ）を導入した。これは、０．１Ｍのリン酸バッファー溶液、ｐＨ８．０をもたらした。次いで、Ｄ−グルコース一水和物（８．２ｇ）を添加し、溶液のｐＨを７．１まで低下させた。温度が安定した後、ＮａＣｌ（１．６８ｇ）、続いてＥＮＥ（−１０１、−１０２又は−１０３、１．０ｇ）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）、ＮＡＤ（１６６ｍｇ）及び１−アセチルシクロヘキセン（４．６７ｇ；３７．６ミリモル）を添加した。ＧＣ分析によって完全な変換が観察されるまで、反応を４０℃で攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
ＥＮＥ−１０２については、７５０ｍＭにおいて長時間後でさえ、変換が不完全であったため、３００ｍＭにおいて反応を繰り返し、結果として、一夜で完全な変換を生じた。ＥＮＥ−１０１については、２倍の濃度、１５００ｍＭで反応を繰り返した
【０３００】
手順ａ．２（１．５Ｍ）
0006600352.tif 000020
【０３０１】
前に記載したものと同一の手順に従って、２倍の基質濃度で反応を繰り返した。この場合、リン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０（２４．８ｍＬ）中、Ｄ−グルコース一水和物（１５．４ｇ；７７．７ミリモル）、塩化ナトリウム（１．６８ｇ）、ＮＡＤ（３１６ｍｇ；０．４７ミリモル）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）及びＥＮＥ−１０１（１．０ｇ）の溶液を、１−アセチルシクロヘキセン（９．３４ｇ；７５．２ミリモル）で処理する前に、４０℃の磁力により攪拌した丸底フラスコに入れた。反応を４０℃で９６時間攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
【０３０２】
変換をモニターするために、規則的な間隔で異なる反応からサンプル（５０μＬ）を採取した。それらをＤＣＭ（１．５ｍＬ）で処理し、ボルテックスし、遠心分離して、不溶性の材料を除去し、ＧＣにより分析して、変換を測定した。図１４及び１５に異なる反応のプロフィールを見ることができる。
【０３０３】
イタコン酸ジメチルの還元
0006600352.tif 000021
【０３０４】
手順ｂ．１（０．７３Ｍ）
0006600352.tif 000022
【０３０５】
温度制御し（４０℃）、ｐＨ制御した投与ポンプを備え、磁力により攪拌した（６００ｒｐｍ、卵型の攪拌子）５０ｍＬ丸底フラスコ中へ、脱イオン水（３６．８ｍＬ）、Ｋ２ＨＰＯ４（５９７ｍｇ）及びＫＨ２ＰＯ４（２７ｍｇ）を導入した。これは、０．１Ｍのリン酸バッファー溶液、ｐＨ８．０をもたらした。次いで、Ｄ−グルコース一水和物（８．２ｇ）を添加し、溶液のｐＨを７．１まで低下させた。温度が安定した後、ＮａＣｌ（１．６８ｇ）、続いてＥＮＥ（−１０１、−１０２又は−１０３、１．０ｇ）、ＧＤＨ（１０３ｍｇ；４．８８Ｕ／ｍｇ；５００Ｕ）、ＮＡＤ（１６６ｍｇ）及びイタコン酸ジメチル（５．９ｇ；３７．３ミリモル）を添加した。
ＧＣ分析によって完全な変換が観察されるまで、反応を４０℃で攪拌した。定常的なｐＨ７．０を維持するために、反応に４５％のＮａＯＨ溶液を投与した。
変換をモニターするために、規則的な間隔で反応からサンプル（５０μＬ）を採取した。それらをＤＣＭ（１．５ｍＬ）で処理し、ボルテックスし、遠心分離して、不溶性の材料を除去し、ＧＣにより分析して、変換を測定した。ＧＣによって、生成物への９５％を超える変換（＞９９．９％ｅｅ、Ｒエナンチオマー）を３つの酵素に関して観察した。図１６及び１７に反応プロフィールを見ることができる。
【０３０６】
参考文献
【０３０７】
本発明及び本発明の属する分野の技術水準をより完全に説明し、開示するために、多くの刊行物が上で引用される。これらの参考文献の完全な引用が以下に提供される。これら各参考文献の全体が本明細書に組み込まれる。
【０３０８】
標準的な分子生物学並びにタンパク質の発現及び単離の技術については以下を参照されたい：
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Hirata et al.(2009) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 59: 158-162.
Iqbal  et al. (2012) Tetrahedron. 68: 7619-7623
Lalonde and Margolin (2002) “Immobilization of Enzmes” in Drauz K. and Waidmann H., Enzyme catalysis in Organic Synthesis, Vo. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim
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Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)
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Yanto et al. (2011), Org. Lett. 13: 2540
【図１】
0006600352.tif 000025
【図２】
0006600352.tif 000026
【図３】
0006600352.tif 000027
【図４】
0006600352.tif 000028
【図５】
0006600352.tif 000029
【図６】
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【図７】
0006600352.tif 000031
【図８】
0006600352.tif 000032
【図９】
0006600352.tif 000033
【図１０】
0006600352.tif 000034
【図１１】
0006600352.tif 000035
【図１２】
0006600352.tif 000036
【図１３Ａ】
0006600352.tif 000037
【図１３Ｂ】
0006600352.tif 000038
【図１４】
0006600352.tif 000039
【図１５】
0006600352.tif 000040
【図１６】
0006600352.tif 000041
【図１７】
0006600352.tif 000042
【図１８】
0006600352.tif 000043
【配列表】
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