(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が、単純ヘルペスウイルス１型および２型の一方に感染しているか、両方に感染しているか、またはいずれにも感染していないかを決定するための血清学的アッセイ方法であって、
ａ）アッセイされる前記対象からの抗体含有血清試料を、少なくとも３つの血清サブ試料に分割するステップ；
ｂ）前記各サブ試料を、
ｉ）物理的マトリクスにおける非感染細胞からの細胞抗原、
（ｉｉ）同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−１感染細胞からの細胞抗原、および
（ｉｉｉ）同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−２感染細胞からの細胞抗原
の１つまたは別の１つと別々に混合して少なくとも３つの血清サブ試料−細胞抗原混合物を形成するステップ、および前記各サブ試料中に存在する抗体が、前記列挙した細胞抗原に免疫反応および結合して、マトリクスに結合している抗体および少なくとも３つの予吸着された血清サブ試料ポーションを含むインキュベート混合物を形成するのに十分な期間、前記各混合物を維持するステップ；
ｃ）マトリクスに結合している抗体を、少なくとも３つの予吸着された血清サブ試料ポーションから分離するステップ；
ｄ）前記分離した予吸着された各血清サブ試料ポーションを、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれによっても非感染の細胞からの試験細胞抗原、ＨＳＶ−１により感染されている細胞からの試験細胞抗原、およびＨＳＶ−２により感染されている細胞からの試験細胞抗原の混合物と別々に混合するステップであって、前記各試験細胞抗原は第２のマトリクスに連結している、ステップ、ならびに予吸着された各血清サブ試料内に存在する抗体が、存在する試験細胞抗原と免疫反応して、第２のマトリクスに結合している３つの別々の免疫反応物を形成することを可能とするのに十分な時間、前記混合物を維持するステップであって、前記第２のマトリクスは第１に命名した前記マトリクスと同じ、または異なる、ステップ；ならびに
ｅ）どの試験細胞抗原と、予吸着されたサブ試料からの抗体が免疫反応したかを決定するために、第２のマトリクスに結合している各免疫反応物中の抗体の免疫反応の量を決定し、それによって、血清試料が得られた対象が、単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型の一方により感染されていたか、両方により感染されていたか、いずれにも感染していなかったかを決定するステップ
を含む血清学的アッセイ方法。
【請求項２】
ステップｂ）の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の物理的マトリクスにおける細胞抗原が、固定された非感染細胞、固定されたＨＳＶ−１感染細胞、および固定されたＨＳＶ−２感染細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）およびｅ）の第２のマトリクスが、正しい励起波長で照射された場合、蛍光発光により相互に識別可能である、固定された非感染細胞、固定されたＨＳＶ−１感染細胞、および固定されたＨＳＶ−２感染細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
外部から導入された蛍光着色剤を励起する光の波長で照射された場合、第２のマトリクスの、固定された細胞が蛍光発光する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
外部から導入された蛍光着色剤が、固定された細胞と共有結合による連結を形成し、または細胞内で発現された蛍光タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記外部から導入された蛍光着色剤が、細胞内で発現された蛍光タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記外部から導入された蛍光着色剤が、固定された細胞と共有結合による連結を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
予吸着されたサブ試料からの抗体が免疫反応した試験細胞抗原が、第２のマトリクスに結合している免疫反応物を標識抗ヒト抗体と免疫反応させて、抗体標識された免疫反応物を形成させることにより決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記標識抗ヒト抗体が、その蛍光発光スペクトルが、アッセイにおいて利用されるあらゆる他のフルオロフォアの蛍光発光スペクトルと識別可能である化合物で標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識抗ヒト抗体の標識が、抗体に連結している蛍光分子またはフルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象が、単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型の一方に感染しているか、両方に感染しているか、またはいずれにも感染していないかを決定するための血清学的アッセイキットであって、
ａ）
ｉ）物理的マトリクスにおける非感染細胞からの細胞抗原、
（ｉｉ）同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−１感染細胞からの細胞抗原、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と、同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−２感染細胞からの細胞抗原
を別々に含む３個の別々の容器；ならびに
ｂ）ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれによっても非感染の細胞からの試験細胞抗原、ＨＳＶ−１により感染されている細胞からの抗原、およびＨＳＶ−２により感染されている細胞からの抗原の混合物を含む第４の容器であって、前記各細胞抗原は、前記第１に命名したマトリクスと同じ、または異なる第２のマトリクスに連結している、第４の容器
を含み、前記各容器は、列挙した成分を、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量含む、血清学的アッセイキット。
【請求項１２】
少なくとも１つのアッセイを行うのに十分量の標識抗ヒト抗体を含む第５の容器をさらに含む、請求項１１に記載の血清学的アッセイキット。
【請求項１３】
前記標識抗ヒト抗体の標識が、照射された場合、アッセイにおいて利用されるあらゆる他のフルオロフォアの蛍光発光スペクトルと識別可能である蛍光発光スペクトルを生ずる化合物である、請求項１２に記載の血清学的アッセイキット。
【請求項１４】
前記第１および前記第２のマトリクスが、同じ属および種の、固定された細胞である、請求項１１に記載の血清学的アッセイキット。
【請求項１５】
前記第４の容器の、固定された細胞が、規定された発光スペクトルにおける蛍光の強度によって、列挙した３つの各試験細胞抗原を含む細胞が相互に識別可能である、外部から導入された蛍光着色剤をさらに含み、規定された発光スペクトルは、アッセイにおいて利用されるあらゆる他のフルオロフォアの蛍光発光スペクトルと識別可能であり、重複しない、請求項１４に記載の血清学的アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示を参照により本明細書に組み込む、２０１３年１２月１８日出願の出願第６１／９１７５８４号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
５０００万人の米国人が単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に感染しているが、感染者のうち８０−９０％は、自分がＨＳＶ−２を有することに気付いていない［ＣＤＣ、２０１０年；Ｐａｚ−Ｂａｉｌｅｙら、２００７年；Ｘｕら、２００６年］。患者が目に見える症状を有するか否かに関係なく、患者は感染性のウイルスを放ち、ＨＳＶ−２を性交渉のパートナーに伝播させ得る［Ｒａｔｔｒａｙら、１９７８年；Ｔｒｏｎｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ｗａｌｄら、２０００年］。抗ウイルス薬はＨＳＶ−２伝播のリスクを低減するが、排除しない［Ｓｐｅｒｌｉｎｇら、２００８年；Ｈａｎｄｓｆｉｅｌｄら、２００７年；Ｃｏｒｅｙら、２００４年；ＤｅＪｅｓｕｓら、２００３年］。自分がＨＳＶ−２を保有することを知っている患者は、抗ウイルス薬、コンドーム、パートナーへの公表、および些細な症状に気付くなど、伝播のリスクを低減するための事前措置をとることができ、これらは全て、伝播を減らす効果的な手段である［Ｇｕｐｔａら、２００７年；Ｒａｎａら、２００６年；Ｗａｒｒｅｎ、２００２年；Ｗａｌｄら、２００１年］。
【０００３】
ＨＳＶ−２感染の診断を確認するのに用いられる血清学的試験は不完全である。最も重大な問題は以下を含む：（１）ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＨＳＶ型特異的血清学的ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社である、Ｆｏｃｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、偽陽性結果を返すことがあり、（２）確証的なＨＳＶウエスタンブロット試験（すなわち、ＨＳＶ血清学的試験の黄金律［Ｗａｒｒｅｎら、２０１１年］）は「不確定」という結果を返すことがある。
【０００４】
ＨＳＶ−２  ＥＬＩＳＡ上で偽陽性の可能性がある患者はしばしば、指標値が１．１から３．５である「低陽性」というスコアを有し、このような患者のうち５０％は、確証的なＨＳＶウエスタンブロット上で偽陽性であることを証明する。しかし、確証的なウエスタンブロット試験は、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ試験からＨＳＶ−２「低陽性」の結果を得た患者のうちの約５０％の血清学的状態を明らかにすることができない。むしろ、ウエスタンブロット試験は、これらの患者に対する不確定の結果を返すのが典型的である。よって、現在のＨＳＶ−２血清学的試験では、患者の２−４％は結果があいまいなままであり［Ｎｇ’ａｙｏら、２０１１年；Ｇｏｌｄｅｎら、２００５年］、本明細書の目的で、これは「ＨＳＶ−２不確定」診断と呼ばれる。
【０００５】
不確定な診断を有することは、患者に、患者がＨＳＶ−２に感染しているのか否かの迷いを残し、感染していない患者に不要な苦痛をもたらす［Ｗａｒｒｅｎ、２００２年；ＷａｒｒｅｎおよびＥｂｅｌ、２００５年］。不確定の診断を有する患者は、真のＨＳＶ−２感染における派生問題に対処することが強いられる。具体的に述べると、患者は、潜在的な性交渉のパートナーに、拒絶され得るというリスクを冒して、自身の「ＨＳＶ−２状態」を公開しなければいけない気分になり、他人に感染させるリスクを減らすために抗ウイルス治療を毎日受けることもあり、ＨＳＶ−２のない者よりＨＩＶ感染を獲得する可能性が３倍高いと信じ込んでいる［Ｖｅｒｇｉｄｉｓら、２００９年；ＬｉｎｇａｐｐａおよびＣｅｌｕｍ、２００７年］。繰返し試験を受けても、自身の診断を明らかにすることができないことがしばしばあり、よって患者は数か月または数年間、自身のＨＳＶ−２感染状態を知らないことがあり、これは患者の自己認識および患者の生活の質に対して、深刻な負の影響があり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＣＤＣ、２０１０年
【非特許文献２】Ｐａｚ−Ｂａｉｌｅｙら、２００７年
【非特許文献３】Ｘｕら、２００６年
【非特許文献４】Ｒａｔｔｒａｙら、１９７８年
【非特許文献５】Ｔｒｏｎｓｔｅｉｎら、２０１１年
【非特許文献６】Ｗａｌｄら、２０００年
【非特許文献７】Ｓｐｅｒｌｉｎｇら、２００８年
【非特許文献８】Ｈａｎｄｓｆｉｅｌｄら、２００７年
【非特許文献９】Ｃｏｒｅｙら、２００４年
【非特許文献１０】ＤｅＪｅｓｕｓら、２００３年
【非特許文献１１】Ｇｕｐｔａら、２００７年
【非特許文献１２】Ｒａｎａら、２００６年
【非特許文献１３】Ｗａｒｒｅｎ、２００２年
【非特許文献１４】Ｗａｌｄら、２００１年
【非特許文献１５】Ｗａｒｒｅｎら、２０１１年
【非特許文献１６】Ｎｇ’ａｙｏら、２０１１年
【非特許文献１７】Ｇｏｌｄｅｎら、２００５年
【非特許文献１８】ＷａｒｒｅｎおよびＥｂｅｌ、２００５年
【非特許文献１９】Ｖｅｒｇｉｄｉｓら、２００９年
【非特許文献２０】ＬｉｎｇａｐｐａおよびＣｅｌｕｍ、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、ＨＳＶ−２の不確定診断を最小にし、または排除する、ＨＳＶ−２感染を診断するための改善された血清学的アッセイが必要とされており、対処されていない。本発明は、ウイルス感染細胞に対する血清抗体結合（ＡＢＶＩＣ）の親和性を測定する、新規なフローサイトメトリーベースの血清学的アッセイであり、より決定的なＨＳＶ−２血清学的試験であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、対象が、単純ヘルペスウイルス１型または２型の、一方もしくは他方に感染している、またはいずれにも感染していないかを決定するための血清学的アッセイを提供する。広範には、アッセイは、アッセイされる対象からの、抗体含有血清または血漿（集合的に「血清」）試料を提供するステップを含む。血清試料は、ＨＳＶ−１感染（ＨＳＶ−１＋）細胞、またはＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）細胞、またはＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に感染している細胞、またはＨＳＶ−１にもＨＳＶ−２にも感染していない細胞の上に存在する細胞抗原と免疫反応する抗体を含む。
【０００９】
血清試料は、少なくとも３つのサブ試料ポーションに分割される。別々の血清サブ試料ポーションは、（ａ）ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれにも非感染の細胞の抗原（ＨＳＶ−１−またはＨＳＶ−２−）、（ｂ）ＨＳＶ−１感染細胞の抗原および（ｃ）ＨＳＶ−２感染細胞の抗原の各々と接触され、接触は維持され（インキュベートされ）、それによって、各サブ試料中に存在する抗体を、列挙した細胞抗原の１つ以上に結合させる。このようなインキュベートされた各サブ試料ポーションは、抗体が結合している抗原から分離されて、少なくとも３つの予吸着された血清試料を形成し、この場合、非感染細胞の抗原とインキュベートされた予吸着された血清サブ試料は、（ａ）非感染細胞と免疫反応する抗体の含有量が低減されており、ＨＳＶ−１感染細胞の抗原とインキュベートされた予吸着された血清サブ試料は、（ｂ）ＨＳＶ−１感染細胞と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が低減されており、ＨＳＶ−２感染細胞の抗原とインキュベートされた予吸着された血清サブ試料は、（ｃ）ＨＳＶ−２感染細胞と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が低減されている。予吸着された各サブ試料ポーションは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれによっても非感染の細胞、ＨＳＶ−１により感染されている細胞、およびＨＳＶ−２により感染されている細胞からの抗原の混合物と混合され、インキュベートされ、どの１つ以上の抗原に対して、各サブ試料ポーション中に存在する抗体が結合したかを決定し、それによって、対象がＨＳＶ−１に感染していたか、ＨＳＶ−２に感染していたか、両方に感染していたか、またはいずれにも感染していなかったかを決定する。
【００１０】
一実施形態におけるアッセイは、血清または血漿（集合的に「血清」）試料をアッセイされる対象から提供するステップ、血清試料を、少なくとも３つの血清サブ試料に分割するステップ、血清サブ試料を、少なくとも３つの抗原の集団に、好ましくは固定された細胞の形態において予吸着させるステップ、血清サブ試料を、少なくとも３つの遊離細胞の集団とインキュベートするステップ、血清サブ試料を検出抗体とインキュベートするステップ、および血清サブ試料を細胞ソーティング装置またはフローサイトメーターで分析するステップを含む。
【００１１】
対象が、単純ヘルペスウイルス１型および２型ウイルスの一方に感染しているか、両方に感染しているか、またはいずれにも感染していないかを決定するための血清学的アッセイキットも企図される。キットは、ａ）ｉ）物理的マトリクスにおける非感染細胞からの抗原、（ｉｉ）同じもしくは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−１感染細胞からの抗原、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の物理的マトリクスと、同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−２感染細胞からの抗原を別々に含む、血清の予吸着のための３個の別々の容器を含む。キットの第４の成分は、様々な形態において提供され得る試験抗原である。一実施形態において、（１）固定および透過処理され、ならびに（２）細胞ソーティング装置またはフローサイトメーターが各３集団を区別できるようにフルオロフォアで示差的に標識された、非感染細胞、ＨＳＶ−１感染細胞およびＨＳＶ−２感染細胞の３集団の混合物を含む第４の容器がキットに含まれる。この実施形態において、キット容器１、２および３の中に提供される抗原含有マトリクスから分離された、予吸着された血清は、各マトリクスから分離され、キット容器４の中に提供される試験細胞と合わされて、細胞ソーティング装置またはフローサイトメーターにおいてＨＳＶ−１特異的抗体および／またはＨＳＶ−２特異的抗体の比存在度を決定する。これら４つの各容器は、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の、列挙された成分を含む。アッセイを行うための指示もキット中に存在するのが好ましい。
【００１２】
上記に記載した血清学的アッセイキットが、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の、標識抗ヒト抗体を含む第５の容器を含むのがさらに好ましい。抗ヒト抗体の標識は、その蛍光が、存在するあらゆる他の材料の蛍光と識別可能である蛍光材料であるのが好ましい。第４の容器の固定された試験細胞の混合物が、非感染の、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２抗原を含む細胞が蛍光によって相互に識別可能であり、アッセイにおいて利用されるあらゆる他の蛍光種からやはり識別可能である、外部から導入された蛍光着色剤をさらに含むのも好ましい。
【００１３】
本発明にはいくつかの利益および利点がある。
【００１４】
一利益は、多くの抗体アッセイは、ＨＳＶ血清陰性試料をＨＳＶ血清陽性試料と識別するのに十分であるが、あるヒトがＨＳＶ−１に感染しているか、ＨＳＶ−２に感染しているか、または両方に感染しているかを区別しないことである。
【００１５】
本発明の利点は、本発明のＨＳＶ−１に特異的な抗体アッセイポーションは、あるヒトがＨＳＶ−１に感染しているか否かを区別し、ヘルペスウエスタンブロットの結果を裏付けることである。
【００１６】
本発明の別の利益は、ＨＳＶ−２に特異的な抗体アッセイポーションは、あるヒトがＨＳＶ−２に感染しているか否かを区別し、ヘルペスウエスタンブロットの結果を裏付けることである。
【００１７】
本発明の別の一利点は、好ましい型特異的なＡＢＶＩＣアッセイは、（ｉ）非感染の対照アッセイ、（ｉｉ）ＨＳＶ−１特異的な抗体アッセイ、および（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２特異的な抗体アッセイを組み合わせることである。
【００１８】
本発明のさらなる一利益は、好ましい型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは高度に定量的であり、あるヒトがＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２血清陽性である確率の統計学的解釈を可能にすることである。
【００１９】
さらなる一利点は、好ましい型特異的ＡＢＶＩＣアッセイの定量的および統計学的な力は、アッセイが、ヘルペスウエスタンブロット試験の不確定試験結果を分離するのを可能にすることである。
【００２０】
本発明の付加的な一利益は、ヘルペスウエスタンブロットに対する型特異的ＡＢＶＩＣアッセイの感受性および定量的な力の増大は、ＨＳＶ−１による感染をＨＳＶ−２による感染と識別する能力を維持しながら、好ましい型特異的ＡＢＶＩＣアッセイを、通常のウエスタンブロット様式のアッセイよりも迅速に行えるようにできることである。
【００２１】
本発明の付加的な一利点は、好ましい型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、上記に記載した固定および透過処理された試験細胞中に存在し得る、最高７５個のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２タンパク質に対する抗体の存在をスクリーニングするため、本発明は、市販のＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）試験ＥＬＩＳＡアッセイよりも高感度な結果を提供できることである。対照的に、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２タンパク質７５個のうちたった１つ、すなわちＧ糖タンパク質に対する抗体に対して試験する。
【００２２】
その上さらなる利益および利点は、当業者であれば以下の記述から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルのフローサイトメトリーベースの測定を示す図である。Ａは、１：６，０００希釈の無処置マウス血清で免疫化したマウスから得たＨＳＶ−２抗血清の、固定されたＨＳＶ−２プラークの免疫蛍光標識化を示す図である［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０］。マウスＩｇＧ結合を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で可視化した。Ｂは、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスから得たＨＳＶ−２抗血清の、固定されたＨＳＶ−２プラークの免疫蛍光標識化を示す図である［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０］。マウスＩｇＧ結合を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で可視化した。Ｃは、非感染（ＵＩ）ベロ細胞と混合した、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）ベロ細胞の、固定された単一細胞懸濁液の２色フローサイトメトリー分析を示す図である。固定された細胞を、１：６，０００希釈の無処置マウス血清とインキュベートし、ＣＦＳＥ（ＦＬ１）およびＡＰＣ（ＦＬ４）の蛍光強度に対して分析した。
【図１−２】Ｄは、非感染（ＵＩ）ベロ細胞と混合した、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）ベロ細胞の、固定された単一細胞懸濁液の２色フローサイトメトリー分析を示す図である。固定された細胞を、１：６，０００希釈のマウスＨＳＶ−２抗血清およびＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧとインキュベートし、ＣＦＳＥ（ＦＬ１）およびＡＰＣ（ＦＬ４）の蛍光強度に対して分析した。Ｅは、ＨＳＶ−２＋とＵＩ細胞との間のΔＭＦＩによって決定した、無処置マウスｎ＝６対ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ免疫化マウスｎ＝６の、血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを示す図である。
【図２−１】汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、マウスにおける目のＨＳＶ−２誘発に対する保護と相関することを示す図である。Ａは、マウスにおけるワクチン−目のＨＳＶ−２誘発実験のデザインを示す図である。０日目、マウスの右目に培養培地、または示したウイルス５つのうち１つを片目あたり１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、マウスに初回接種した（１群あたりｎ＝８）。ＨＳＶ−２ＭＳを接種したマウスを、免疫化後０から２０日にアシクロビルで処置してウイルスの病原性を制限した。６０日目に血液を収集し、７０日目にマウスの左目を野生型ＨＳＶ−２ＭＳ１０５ｐｆｕで誘発した。
【図２−２】Ｂは、フローサイトメトリーベースのアッセイによって決定した、誘発前血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの平均値±ｓｅｍを示す図である。Ｃは、各マウスに対して（マウス１匹あたり記号１つ）同じマウスに観察された誘発前ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ軸）の関数としてプロットした、目の誘発後１、２および３日目に排出された感染性ＨＳＶ−２の平均量（ｙ軸）を示す図である。黒実線は、４８個のマッチさせたデータ対に対する、ｙ＝３．３５−０．５６ｘの最良適合の直線回帰モデルを表す。
【図２−３】Ｄは、ｘ軸上に各免疫化群におけるｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の平均値±ｓｅｍをプロットし、それに対してｙ軸上に目のＨＳＶ−２排出の平均値±ｓｅｍをプロットしたものを示す図である。黒実線は、これらの６個のマッチさせた平均に対する、ｙ＝３．４４−０．６４ｘの最良適合の直線回帰モデルを表す（ｒ２＝０．８６）。目のＨＳＶ−２排出において無処置マウスに対して有意な低減を表した免疫化マウスの群が、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定によって決定した通り、アステリスク１個（＊ｐ＜０．０５）またはアステリスク２個（＊＊ｐ＜０．００１）により示される。Ｅは、各群において観察される汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルの平均値±ｓｅｍの関数としてプロットした、各群における生存頻度を示す図である。生存頻度において、無処置のマウスに対して有意差を表す免疫化したマウスの群が、フィッシャーの正確確率検定によって決定される通り、アステリスク１個（＊ｐ＜０．０５）またはアステリスク２個（＊＊ｐ＜０．０００１）により示される。
【図３−１】汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、マウスにおける膣のＨＳＶ−２誘発に対する保護に相関することを示す図である。Ａは、マウスのワクチン誘発実験のデザインを示す図である。結果に記載する通り、０日目、マウスの右後足の足蹠に、ｇＤ−２、ＧＦＰ、培養培地（偽）、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳまたはＨＳＶ−２ＭＳで免疫化した（１群あたりｎ＝１０）。ＨＳＶ−２ＭＳで免疫化したマウスに、免疫化後０日目から２０日目まで飲料水中アシクロビル１ｍｇ／ｍｌを投与して、野生型ＨＳＶ−２に対する一次曝露（ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）の病原性を制限した。３０日目、全マウスの左後足の足蹠に等量の追加免疫を行ったが、ＭＳで免疫化したマウスは追加免疫の間アシクロビルを必要としなかった点が異なった。６０日目、血液を収集し、９０日目または１００日目、マウスを、膣あたり５００，０００ｐｆｕの野生型ＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。ＨＳＶ−２ＭＳ誘発７日前および３日前、各マウスにＤｅｐｏＰｒｏｖｅｒａ（登録商標）（メドキシプロゲステロン）２ｍｇを皮下注射してマウスの膣をＨＳＶ−２誘発に対して感受性にした。Ｂは、フローサイトメトリーベースのアッセイにより決定した、誘発前の血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの平均値±ｓｅｍを示す図である。マウスが誘発後３０日目まで生存した頻度が示される。
【図３−２】Ｃは、同じマウスにおいて観察された誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ軸）の関数としてプロットした各マウス（１匹あたり記号１つ；ｙ軸）に対する膣の誘発後１、３、５および７日目に排出された感染性ＨＳＶ−２の平均量を示す図である。黒実線は、５０個のマッチさせたデータ対に対する、ｙ＝３．８５−０．７６ｘの最良適合の直線回帰モデルを表す。Ｄは、各免疫化群におけるｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の平均値±ｓｅｍをｘ軸上にプロットし、それに対して膣のＨＳＶ−２の排出の平均値±ｓｅｍを、ｙ軸上にプロットしたものを示す図である。黒実線は、これら５個のマッチさせた平均値に対する最良適合の直線回帰モデル、ｙ＝３．８９−０．７９ｘを表す（ｒ２＝０．９８）。膣のＨＳＶ−２排出において、無処置マウスに対して有意な低減を表した免疫化マウスの群が、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定によって決定される通り、アステリスク１個（＊ｐ＜０．０５）またはアステリスク２個（＊＊ｐ＜０．００１）により示される。
【図４−１】汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、モルモットにおける膣のＨＳＶ−２誘発に対する保護と相関することを示す図である。Ａは、モルモットのワクチン誘発実験のデザインを示す図である。０日目、モルモットの右後足の足蹠に、ｇＤ−２、培養培地（偽）、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳまたはＨＳＶ−２ＭＳで免疫化した（１群あたりｎ＝５）。ＨＳＶ−２ＭＳで免疫化したモルモットに、免疫化後０日目から２０日目まで飲料水中アシクロビル１ｍｇ／ｍｌを投与して、野生型ＨＳＶ−２に対する一次曝露の病原性を制限した。３０日目、全モルモットの左後足の足蹠に等量の追加免疫を行った。第２の追加免疫の間、ＭＳ免疫化マウスにはアシクロビルを投与しなかった。７５日目、血液を収集し、９０日目、モルモットを野生型ＨＳＶ−２ＭＳを膣あたり２×１０６ｐｆｕで誘発した。
【図４−２】Ｂは、無処置（ｎ＝５）、またはｇＤ−２＋ミョウバン／ＭＰＬ（ｎ＝４）、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ（ｎ＝５）、もしくはアシクロビル（ＡＣＶ）で抑制したＨＳＶ−２ＭＳ感染（ｎ＝５）で免疫化したモルモットにおける誘発後１日目から８日目の間の、膣あたりに排出されたＨＳＶ−２の平均値±ｓｅｍのｐｆｕを示す図である。一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定によって決定される通り、アステリスク１個（＊）はｐ＜０．０５を意味し、アステリスク２個（＊＊）は、ＨＳＶ−２ＭＳの膣排出がその日の無処置モルモットに等しかった、ｐ＜０．００００１を意味する。Ｃは、各モルモットに対して（１匹あたり記号１つ）、同じモルモットにおいて観察された誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ軸）の関数としてプロットした、膣の誘発後１、２、３、４、６および８日目に排出された感染性ＨＳＶ−２の平均量（ｙ軸）を示す図である。黒実線は、これら１９個のマッチさせたデータ対に対する、最良適合の直線回帰モデル、ｙ＝３．７７−０．９５ｘを表す。
【図４−３】Ｄは、各免疫化群におけるｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の平均値±ｓｅｍをｘ軸上に対してプロットし、それに対して膣のＨＳＶ−２の排出の平均値±ｓｅｍをｙ軸上にプロットしたものを示す図である。黒実線は、これら４個のマッチさせた平均に対する、最良適合の直線回帰モデル、ｙ＝３．７７−０．９５ｘを表す（ｒ２＝０．９８）。膣のＨＳＶ−２排出において、無処置モルモットに対して有意な低減を表した免疫化モルモットの群が、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定によって決定される通り、アステリスク１個（＊ｐ＜０．０５）またはアステリスク２個（＊＊ｐ＜０．００１）により示される。Ｅは、誘発後７日目、無処置または免疫化したモルモットの各群における、膣周囲疾患の最悪の症例を示す図である。生存頻度は、各免疫化群における動物が誘発後３０日目まで生存した頻度を意味する。
【図５−１】ＨＳＶ−２抗血清の養子移入は、目のＨＳＶ−２ＭＳ誘発に対する限定された保護を提供することを示す図である。Ａは、年齢をマッチさせた１２９系統メスマウスに、１）誘発前に無処置血清０．２５ｍｌの養子移入、２）誘発直前にＨＳＶ−２抗血清０．２５ｍｌの養子移入、または３）誘発９０日前および６０日前にＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ生ウイルスでの能動免疫のいずれかを投与した。マウスの両目に、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発し、誘発ウイルスの排出および疾患の発症を記録した。誘発後１日目のマウスの目からのＨＳＶ−２排出の平均値±ｓｅｍを示す図である（１群あたりｎ＝５）。Ｂは、年齢をマッチさせた１２９系統メスマウスに、１）誘発前に無処置血清０．２５ｍｌの養子移入、２）誘発直前にＨＳＶ−２抗血清０．２５ｍｌの養子移入、または３）誘発９０日前および６０日前にＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ生ウイルスでの能動免疫のいずれかを投与した。マウスの両目に、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発し、誘発ウイルスの排出および疾患の発症を記録した。誘発後３日目のマウスの目からのＨＳＶ−２排出の平均値±ｓｅｍを示す図である（１群あたりｎ＝５）。
【図５−２】Ｃは、年齢をマッチさせた１２９系統メスマウスに、１）誘発前に無処置血清０．２５ｍｌの養子移入、２）誘発直前にＨＳＶ−２抗血清０．２５ｍｌの養子移入、または３）誘発９０日前および６０日前にＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ生ウイルスでの能動免疫のいずれかを投与した。マウスの両目に、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発し、誘発ウイルスの排出および疾患の発症を記録した。各群のマウスの生存期間の平均値±ｓｅｍを示す図である。各バーの上の数字は、各群のマウスにおける「生存」および「疾患の発生頻度」の頻度を報告するものである。生存の期間における、無処置マウスに対する有意な上昇が、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定により決定される通り、アステリスク１個（＊ｐ＜０．０５）またはアステリスク２個（＊＊ｐ＜０．００１）により示される。
【図６】ＨＳＶ−２特異的抗体の血清レベルを測定するために用いられる３方法の比較を示す図である。ａ抗ＨＳＶ−２抗体の存在量を推定するＨＳＶ−２抗血清希釈の範囲は、血清希釈における変化に対して直線関係で変化する。ｂ各アッセイの直線範囲における各血清希釈に対する３回反復測定の平均値±ｓｅｍの変動係数。各血清希釈を考慮して、変動係数＝１００×標準偏差÷平均値。ｃ直線範囲内で回帰モデルにより予想される値に対して、観察されるデータの適合度（ｒ２）。ｐ値は、各アッセイにより測定される量（すなわち、中和力価、ＯＤ４０５またはΔＭＦＩ）は、ＨＳＶ−２抗血清の希釈の関数として変動しなかった確率を意味する。
【図７】汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルは、マウスおよびモルモットにおける膣のＨＳＶ−２ＭＳ誘発に対する保護と相関することを示す図である。ａ動物を、図３Ａおよび４Ａに記載した通り、各免疫源で免疫化した。ｂ無処置および免疫化マウスは、図３に表される動物に対応する。モルモットは図４に表される動物に対応する。ｃｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の平均値±ｓｅｍは、マウスに対して図３のＣにおけるｘ変数に対応し、モルモットに対して図４のＣにおけるｘ変数に対応する。ｄｌｏｇ（膣のＨＳＶ−２排出における低減）の平均値±ｓｅｍは、マウスに対して図３のＣに表すｙ変数に由来し、モルモットに対して図４のＣに表すｙ変数に由来した。ｅＨＳＶ−２膣誘発後３０日目まで生存した動物の頻度。ｆ決定せず。同じ種の免疫化対無処置の動物を比べる、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定により決定される通り、＊ｐ＜０．０５。同じ種の免疫化対無処置の動物を比べる、一元配置のＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの事後ｔ検定により決定される通り、＊＊ｐ＜０．００１。同じ種の免疫化対無処置の動物の生存の頻度を比べる、フィッシャーの正確確率検定により決定される通り、†ｐ＝０．０１。同じ種の免疫化対無処置の動物の生存の頻度を比べる、フィッシャーの正確確率検定により決定される通り、††ｐ＝０．００００１。
【図８−１】抗ＨＳＶ−２抗体レベルを測定するための３方法の比較を示す図である。Ａは、マウスＨＳＶ−２抗血清のｌｏｇ０．３３の希釈段階におけるＨＳＶ−２中和活性を示す図である。中和抗体の力価は、１希釈あたりｎ＝３反復の平均値±ｓｅｍとして報告される。点線は、各アッセイの検出の低限を表す。Ｂは、ＨＳＶ−２抗血清のｌｏｇ０．３３の希釈段階における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルの抗体捕捉ＥＬＩＳＡベースの測定を示す図である（１希釈あたりｎ＝３反復の平均値±ｓｅｍ）。点線は、各アッセイの検出の低限を表す。
【図８−２】Ｃは、ＨＳＶ−２抗血清のｌｏｇ０．３３の希釈段階における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルのフローサイトメトリーベースの測定を示す図である（１希釈あたりｎ＝３反復の平均値±ｓｅｍ）。点線は、各アッセイの検出の低限を表す。
【図９−１】マウス血清における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの抗体捕捉ＥＬＩＳＡ対フローサイトメトリー測定を示す図である。Ａは、抗体捕捉ＥＬＩＳＡの検量線を示す。白丸はＨＳＶ−２抗血清のｌｏｇ０．３３希釈をされたＥＬＩＳＡウエルにおいて観察された比色分析の発色（ＯＤ４０５）を示す図である（平均値±ｓｄ；１希釈あたりｎ＝４）。ＯＤ４０５とｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）との間のＳ字形の関係は、示した双曲線正接の等式（ｒ２＝１．００）を用いて正確に記載され、逆数の双曲線逆正接の等式（方法において規定される）を用いて、ＥＬＩＳＡにおいて観察されるＯＤ４０５値から試験血清試料中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを引き出した。Ｂは、各マウスに対して（１匹あたり記号１つ）、目の誘発後１、２および３日目に排出された感染性ＨＳＶ−２の平均量（ｙ軸）を、ＥＬＩＳＡによって推定した、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ軸）の関数としてプロットしたものを示す図である。黒実線は、４８個のマッチさせたデータ対に対する、最良適合の直線回帰モデル、ｙ＝３．０５−０．５７ｘを表す。
【図９−２】Ｃは、ｌｏｇ０の「等価線」に対してｘ、ｙデータ対としてプロットした、ｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）のＥＬＩＳＡ対フローサイトメトリー推定値を示す図である。「ｌｏｇ＋１」の基準線を超えたデータ点は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルのフローサイトメトリーの推定が、同じ血清試料に対する汎ＨＳＶ−２ＩｇＧのＥＬＩＳＡ推定値よりｌｏｇ１大きい血清試料を示す。
【図１０−１】２つの細胞集団のＡＢＶＩＣアッセイは、「ＨＳＶ−２不確定」患者４人中２人が血清陰性であることを確立することを示す図である。Ａは、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２＋細胞および非感染の（ＵＩ）ベロ細胞の固定された懸濁液に対するヒトＩｇＧ抗体結合を、血清抗体で染色した。血清陰性の個体を示す図である。試験細胞に対するヒトＩｇＧの結合（ｙ軸）が、ＡＰＣコンジュゲートした抗ヒトγ鎖で検出された。Ｂは、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２＋細胞および非感染の（ＵＩ）ベロ細胞の固定された懸濁液に対するヒトＩｇＧ抗体結合を、血清抗体で染色した。ＨＳＶ−２性器ヘルペス患者を示す図である。試験細胞に対するヒトＩｇＧの結合（ｙ軸）が、ＡＰＣコンジュゲートした抗ヒトγ鎖で検出された。
【図１０−２】Ｃは、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２＋細胞および非感染の（ＵＩ）ベロ細胞の固定された懸濁液に対するヒトＩｇＧ抗体結合を、血清抗体で染色した。不確定血清試料１を示す図である。試験細胞に対するヒトＩｇＧの結合（ｙ軸）が、ＡＰＣコンジュゲートした抗ヒトγ鎖で検出された。Ｄは、ＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２＋細胞および非感染の（ＵＩ）ベロ細胞の固定された懸濁液に対するヒトＩｇＧ抗体結合を、血清抗体で染色した。不確定血清試料３を示す図である。試験細胞に対するヒトＩｇＧの結合（ｙ軸）が、ＡＰＣコンジュゲートした抗ヒトγ鎖で検出された。
【図１１】血清の予吸着は、ＨＳＶ型特異的抗体が濃縮された集団を生じることを示す図である。血清陽性の患者の血清は、ＨＳＶ型共通、ＨＳＶ−１特異的、またはＨＳＶ−２特異的である、３集団の抗体を含み得る。ＵＩベロ細胞に対する血清の予吸着は、ＨＳＶ抗体を除去しない（左の縦列）。ＨＳＶ−１＋細胞に対する予吸着は、ＨＳＶ−２特異的抗体に対して濃縮する（中央の縦列）。ＨＳＶ−２＋細胞に対する予吸着は、ＨＳＶ−１特異的抗体に対して濃縮する（右の縦列）。
【図１２−１】３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、「ＨＳＶ−２不確定」患者４人中２人はＨＳＶ−２血清陰性であるが、ＨＳＶ−１血清陽性であることを実証することを示す図である。Ａは、ＣＦＳＥ標識した非感染（ＵＩ）対ＨＳＶ−１＋対ＨＳＶ−２＋細胞に対する、ヒトＩｇＧ抗体結合が示される。血清陰性の血清で染色した細胞を示す図である。患者の血清試料を、ＵＩベロ細胞（左）、ＨＳＶ−１＋細胞（中央）およびＨＳＶ−２＋細胞（右）に対して予吸着させた。中央の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−２特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−２＋細胞の予想される位置を示す。右の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−１特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−１＋細胞の予想される位置を示す。
【図１２−２】Ｂは、ＣＦＳＥ標識した非感染（ＵＩ）対ＨＳＶ−１＋対ＨＳＶ−２＋細胞に対する、ヒトＩｇＧ抗体結合が示される。ＨＳＶ−２血清陽性の血清で染色した細胞を示す図である。患者の血清試料を、ＵＩベロ細胞（左）、ＨＳＶ−１＋細胞（中央）およびＨＳＶ−２＋細胞（右）に対して予吸着させた。中央の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−２特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−２＋細胞の予想される位置を示す。右の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−１特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−１＋細胞の予想される位置を示す。
【図１２−３】Ｃは、ＣＦＳＥ標識した非感染（ＵＩ）対ＨＳＶ−１＋対ＨＳＶ−２＋細胞に対する、ヒトＩｇＧ抗体結合が示される。不確定血清試料３で染色した細胞を示す図である。患者の血清試料を、ＵＩベロ細胞（左）、ＨＳＶ−１＋細胞（中央）およびＨＳＶ−２＋細胞（右）に対して予吸着させた。中央の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−２特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−２＋細胞の予想される位置を示す。右の縦列における囲み枠は、血清がＨＳＶ−１特異的抗体を含む場合、ＨＳＶ−１＋細胞の予想される位置を示す。
【図１３】ｇＧ特異的ＥＬＩＳＡは、全てのＨＳＶ−２特異的抗体のうち３−１０％に対して試験するにすぎないことを示す図である。Ａは、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染しているヒトにおける可能な全てのＨＳＶ特異的抗体を表す円グラフである。Ｂは、ｇＧ特異的抗体に対するＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ試験を説明する図である。Ｃは、ｇＧ特異的抗体は、患者のＨＳＶ血清学的状態を測定するのに用いられ得るＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２特異的抗体の全レパートリーのうち３−１０％に対応するにすぎないことを説明する図である。
【図１４−１】Ａは、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）は、フローサイトメーターが、ＣＦＳＥ（−）非感染細胞の純粋な集団を容易に識別可能にする示差的な標識を提供することを示す図である。Ｂは、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）は、フローサイトメーターが、ＣＦＳＥ（ｌｏ）ＨＳＶ−１＋細胞の純粋な集団と容易に識別可能にする示差的な標識を提供することを示す図である。
【図１４−２】Ｃは、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）は、フローサイトメーターが、ＣＦＳＥ（ｈｉ）ＨＳＶ−２＋細胞の純粋な集団と容易に識別可能にする示差的な標識を提供することを示す図である。
【図１５−１】Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの４パネルにおいて、４人の異なるＨＳＶ血清陰性患者からの、３つの集団の試験細胞に結合する抗体のバックグラウンドレベルを確立することを示す図である。各患者の血清に対して、フローサイトメトリーのプロットが３つ存在し、これらは：（１）一番左のプロット：非感染の（ＵＩ）抗原マトリクスに対して予吸着、（２）中央のプロット：ＨＳＶ−１に感染している（ＨＳＶ−１＋）抗原マトリクスに対して予吸着、および（３）一番右のプロット：ＨＳＶ−２に感染している（ＨＳＶ−２＋）抗原マトリクスに対して予吸着であった血清試料からである。
【図１５−２】Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの４パネルにおいて、４人の異なるＨＳＶ血清陰性患者からの、３つの集団の試験細胞に結合する抗体のバックグラウンドレベルを確立することを示す図である。各患者の血清に対して、フローサイトメトリーのプロットが３つ存在し、これらは：（１）一番左のプロット：非感染の（ＵＩ）抗原マトリクスに対して予吸着、（２）中央のプロット：ＨＳＶ−１に感染している（ＨＳＶ−１＋）抗原マトリクスに対して予吸着、および（３）一番右のプロット：ＨＳＶ−２に感染している（ＨＳＶ−２＋）抗原マトリクスに対して予吸着であった血清試料からである。
【図１５−３】Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの４パネルにおいて、４人の異なるＨＳＶ血清陰性患者からの、３つの集団の試験細胞に結合する抗体のバックグラウンドレベルを確立することを示す図である。各患者の血清に対して、フローサイトメトリーのプロットが３つ存在し、これらは：（１）一番左のプロット：非感染の（ＵＩ）抗原マトリクスに対して予吸着、（２）中央のプロット：ＨＳＶ−１に感染している（ＨＳＶ−１＋）抗原マトリクスに対して予吸着、および（３）一番右のプロット：ＨＳＶ−２に感染している（ＨＳＶ−２＋）抗原マトリクスに対して予吸着であった血清試料からである。
【図１５−４】Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの４パネルにおいて、４人の異なるＨＳＶ血清陰性患者からの、３つの集団の試験細胞に結合する抗体のバックグラウンドレベルを確立することを示す図である。各患者の血清に対して、フローサイトメトリーのプロットが３つ存在し、これらは：（１）一番左のプロット：非感染の（ＵＩ）抗原マトリクスに対して予吸着、（２）中央のプロット：ＨＳＶ−１に感染している（ＨＳＶ−１＋）抗原マトリクスに対して予吸着、および（３）一番右のプロット：ＨＳＶ−２に感染している（ＨＳＶ−２＋）抗原マトリクスに対して予吸着であった血清試料からである。
【図１６−１】Ａは、図１５において記載した通り、示した患者試料以外は強力にＨＳＶ−１＋の患者であることを示す図である。
【図１６−２】Ｂは、図１５において記載した通り、示した患者試料以外は弱くＨＳＶ−２＋の患者であることを示す図である。
【図１６−３】Ｃは、図１５において記載した通り、示した患者試料以外は強力にＨＳＶ−２＋の患者であることを示す図である。
【図１６−４】Ｄは、図１５において記載した通り、示した患者試料以外は強力にＨＳＶ−１＋およびＨＳＶ−２＋の患者であることを示す図である。
【図１７−１】Ａのパネルにおいて、図１５および１６において記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された不確定患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１７−２】Ｂのパネルにおいて、図１５および１６において記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された不確定患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１７−３】Ｃのパネルにおいて、図１５および１６において記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された不確定患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１８−１】Ａパネルにおいて、図１５−１７に記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１８−２】Ｂのパネルにおいて、図１５−１７に記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１８−３】Ｃのパネルにおいて、図１５−１７に記載した通り、患者試料以外は、ヘルペスウエスタンブロット試験により「ＨＳＶ−２不確定」と分類された患者からであることを示す図である。この患者はＨＳＶ−２を有していない。
【図１９−１】Ａ、ＢおよびＣの３パネルにおいて、対照群の３人、すなわちＨＳＶ血清陰性患者ｎ＝５（Ａ）、ＨＳＶ−１＋患者ｎ＝２（Ｂ）およびＨＳＶ−２＋患者ｎ＝２（Ｃ）の結果のグラフによる概要を示す図である。各図において下方を指す黒色矢印は、患者が実際にＨＳＶ−２に感染していた場合、赤色バーの予想される高さ（すなわち、ＨＳＶ−２＋細胞に結合している抗体）を示す。これらの条件はＨＳＶ−２＋患者において満たされるが、型特異的ＡＢＶＩＣ試験は、（Ａ）血清陰性または（Ｂ）ＨＳＶ−１＋であるヒトを容易に判別する。点線は、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に対するカットオフを示し、これらのグラフにおいて陽性であるバーは高度な有意差を表す（ｐ＜０．０００１）ことが重要である。
【図１９−２】Ａ、ＢおよびＣの３パネルにおいて、対照群の３人、すなわちＨＳＶ血清陰性患者ｎ＝５（Ａ）、ＨＳＶ−１＋患者ｎ＝２（Ｂ）およびＨＳＶ−２＋患者ｎ＝２（Ｃ）の結果のグラフによる概要を示す図である。各図において下方を指す黒色矢印は、患者が実際にＨＳＶ−２に感染していた場合、赤色バーの予想される高さ（すなわち、ＨＳＶ−２＋細胞に結合している抗体）を示す。これらの条件はＨＳＶ−２＋患者において満たされるが、型特異的ＡＢＶＩＣ試験は、（Ａ）血清陰性または（Ｂ）ＨＳＶ−１＋であるヒトを容易に判別する。点線は、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に対するカットオフを示し、これらのグラフにおいて陽性であるバーは高度な有意差を表す（ｐ＜０．０００１）ことが重要である。
【図２０】ＡおよびＢの２パネルにおいて、図１７および１８において示した型特異的ＡＢＶＩＣアッセイ結果により決定された２人の代表的な「不確定患者」の結果のグラフによる概要を示す図である。この試験においてスクリーニングされた不確定患者ｎ＝７中、ｎ＝３がＡに示す患者＃２同様、ＨＳＶ血清陰性であり、ｎ＝４がＢに示す患者＃６同様、ＨＳＶ−１血清陽性であった。各パネルにおいて下方を指す黒色矢印は、患者が実際にＨＳＶ−２に感染していた場合、赤色バーの予想される高さ（すなわち、ＨＳＶ−２＋細胞に結合している抗体）を示す。点線は、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に対するカットオフを示し、したがって試験データは、これらの個体がＨＳＶ−２血清陰性である可能性が非常に低いことを示す（例えば、ｐ＜０．０００１）。
【図２１】ＡおよびＢの２パネルにおいて、本発明のアッセイにより提供される高度に定量的なデータは、患者がＨＳＶ−２＋であるリスクに対する可能性を割り当てるためにいかに統計学的に分析され得るかを示す図である。Ａは、計算された「標準化された細胞が結合した抗体」の値の正規分布を示し、横軸の値が約３．６以上のとき確率ｐは０．０５未満であり、試験される抗体の特定の集団に対して患者がＨＳＶ血清陰性であることを示す図である（すなわち、総ＨＳＶ抗体に対するＵＩ予吸着試験；ＨＳＶ−２特異的抗体に対するＨＳＶ−１予吸着試験；およびＨＳＶ−１特異的抗体に対するＨＳＶ−２予吸着試験）。Ｂは、「標準化された細胞が結合している抗体」が正規分布であるため、所与の試料が血清陰性試料の平均をＸ倍上回る確率を計算することができることを示す図であり、この計算に用いる定義により、「標準化された細胞が結合している抗体」の平均値は常に１．０である。このグラフおよび基礎となる数学により、「標準化された細胞が結合している抗体」の値＝５．０である試料だけが、無作為抽出変動のため、高値をもたらす血清陰性試料である確率ｐ，＝０．０５を有する。ｐ＜０．０５のカットオフは点線で示される。
【図２２−１】Ａパネルにおいて、多様な患者試料の「細胞が結合している抗体」のレベルが、この試料が血清陰性試料である確率ｐを逆算するために、図２１ＢにおけるＳ字曲線を記述する等式において用いられ得る方法を示す図である。Ａは、ＨＳＶ−１抗原マトリクスに予吸着され、したがってこれらが患者試料中にもともと存在すればＨＳＶ−２特異的抗体を含んでいる血清を説明する。試験した７つの「不確定」試料のうちどれも、知られているＨＳＶ血清陰性試料（すなわち、ｐ＞０．０５）の正規分布と有意差がなく、知られている全てのＨＳＶ−２＋は高度に有意であった（ｐ＜０．０００１）。Ａはまた、予吸着が良好に働き、したがってＨＳＶ−１＋患者の血清は、ＨＳＶ−１細胞抗原マトリクスに予吸着された後、ＨＳＶ−２特異的抗体に陰性である（血清陰性と同じ）ことを説明する。
【図２２−２】Ｂは、ＨＳＶ−１特異的抗体に対するデータよりむしろ、ＨＳＶ−２特異的抗体に対するデータがプロットされる場合、Ａの結果と類似の結果を説明する。
【図２３】縦方向の２本の列における各々４枚の免疫蛍光顕微鏡写真の一連の８部分を示す図である。ベロ細胞の単層に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の一方もしくは他方を感染させてプラークを形成させ、または何もしなかった（非感染−ＵＩ）。患者血清をこれらの試験細胞（すなわち、固定し、浸透化した細胞の単層におけるＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２プラーク）に加える前、患者血清を、予吸着、ならびにＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２特異的抗体の除去に対するベースを提供するために、非感染（ＵＩ）ベロ細胞、ＨＳＶ−１＋ベロ細胞またはＨＳＶ−２＋ベロ細胞の抗原でコーティングした、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂのマトリクスに予吸着させた。一番上の顕微鏡写真は、希釈したが予吸着させなかった血清は、（ｉ）左に示すＨＳＶ−１プラークおよび（ｉｉ）右に示すＨＳＶ−２プラークの両方に集合的に結合する、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体の混合物を含んでいたことを示す。よって、非吸着の患者血清は、この個体がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染していたか否かを決定するのに不十分であった。血清を同じく希釈し、引き続き非感染（ＵＩ）の抗原マトリクスに予吸着させたものは、２段目の（ｉ）左に示すＨＳＶ−１プラークおよび（ｉｉ）右に示すＨＳＶ−２プラークの両方に集合的に結合する、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体の混合物を依然として含んでいた。よって、ＵＩ細胞抗原を予吸着させた患者血清は、この個体がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染していたか否かを決定するのに不十分であった。希釈した血清をＨＳＶ−１に感染している（ＨＳＶ−１＋）抗原のマトリクスと予吸着させた後、ＨＳＶ型共通抗体を枯渇させたが、ＨＳＶ−２特異的抗体は残留させた。よって、ＨＳＶ−２特異的抗体が濃縮された集団は、３段目の左のＨＳＶ−１プラークに不十分に結合したにすぎなかったが（ほとんど完全に暗い。）、右のより明るい顕微鏡写真において示されるＨＳＶ−２プラークに強力に結合した。よって、ＨＳＶ−１細胞抗原を予吸着させた患者血清は、この個体がＨＳＶ−２血清陽性であったことを決定するのに十分であり、これは基礎となるＨＳＶ−２感染に対する予測を示す。希釈した血清を、ＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）抗原のマトリクスに予吸着させ、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体を枯渇させた。この患者がＨＳＶ−１に感染しており、よってこの患者がＨＳＶ−１血清陽性であれば、ＨＳＶ−１特異的抗体は残留する。しかし、一番下の２枚の顕微鏡写真は、ＨＳＶ−２を予吸着させた血清は、左のＨＳＶ−１プラークに結合している抗体を、右に示すＨＳＶ−２プラークより高いレベルまで有していなかったことを示す（両方とも依然として暗い。）。よって、このＨＳＶ−２抗原を予吸着させた患者血清は、この個体がＨＳＶ−１血清陰性であったことを決定するのに十分であった。抗体結合は、顕微鏡写真において捕捉された赤色を生成する、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５９４がコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出された。
【図２４】同じ試薬であるが、ＨＳＶ−１血清陽性およびＨＳＶ−２血清陽性の両方であることが分かっている患者からの異なる血清を用いて得られた、図２３の蛍光顕微鏡写真同様の配列を示す図である。図２３に提供したのと同じ根拠を用いて、患者のＨＳＶ−１抗原を予吸着された血清で得たデータは、個体がＨＳＶ−２血清陽性であることを示す（３段目、左の顕微鏡写真は暗いが、右の顕微鏡写真は明るい。）。同様に、患者のＨＳＶ−２抗原を予吸着された血清から得られたデータは、個体がＨＳＶ−１血清陽性であることを示す（４段目、左の顕微鏡写真は明るいが、右の顕微鏡写真は暗い。）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、対象の血清試料から疾患を診断する目的で、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の一方に感染、または両方に感染、またはいずれにも感染していないことを検出し、それらを区別することができるアッセイを企図する。好ましい例示的な一実施形態は、本明細書においてフローサイトメトリーベースの血清学的アッセイと呼ぶ、ウイルス感染細胞に対する血清の抗体の結合（ＡＢＶＩＣ）のウイルスの型特異的親和性を測定する、３つの細胞集団のアッセイを企図する。
【００２５】
本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の一方に感染状態、他方に感染状態、両方に感染状態、またはどちらにも非感染状態を決定しようとする患者からの、抗体含有試料の使用を企図する。通常、この試料は、採血試料からの血清または血漿の形態である。試料はまた、よく知られている通り、血液または他の試料からの硫安沈澱などの抗体濃縮試料でも、または乾燥された、例えば凍結乾燥された血清もしくは血漿試料でもよい。便宜上、およびこれらは類似であるため、血清および血漿は本明細書において集合的に血清と呼ばれる。
【００２６】
患者（対象）試料は、少なくとも３つのポーションまたはサブ試料に分割される。各ポーション（サブ試料）は、（ａ）非感染細胞からの抗原と、（ｂ）ＨＳＶ−１感染細胞からの抗原と、および（ｃ）ＨＳＶ−２感染細胞からの抗原と、別々に混合され、接触される。
【００２７】
この接触は、列挙した抗原と免疫反応するサブ試料内の抗体が、抗原と免疫反応（結合）するのに十分な期間維持される。この接触および維持は、本明細書においてインキュベーションとも呼ばれる。維持時間は数分から約９６時間までの範囲であってよい。通常、維持時間は約１時間から約８時間であり、より好ましくは約２時間から約６時間である。
【００２８】
上記に言及した細胞抗原は、それ自体物理的マトリクスの一部であり、そのため反応した抗体は、物理的マトリクスに結合している抗体（マトリクスに結合している抗体とも呼ばれる。）を形成する。例示的な物理的マトリクスは、例えば、１）タンパク質でコーティングされた固体マトリクス（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）；２）細胞でコーティングされた固体マトリクス（例えば、固定された細胞でコーティングされた培養プレート）；３）浮動性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ）粒子（例えば、液体懸濁液中の生存細胞もしくは固定された細胞）；４）粒子のカラム（例えば、キャピラリ管中の生存細胞もしくは固定された細胞）；５）タンパク質でコーティングされた磁性ビーズ；６）液体中に懸濁された、または流動カラム中に充填された、タンパク質でコーティングされたマトリクスのスラリー（例えば、抗原が反応したＣＮＢｒで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ）を含む。
【００２９】
固定および透過処理された非感染（ＵＩ）細胞、ＨＳＶ−１＋細胞およびＨＳＶ−２＋細胞のスラリーは、本明細書において例示的に用いられた。生物学の技術分野でよく知られている通り、細胞の固定は、それだけには限定されないが、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、メタノール、エタノールおよびアセトンの１つ以上での処理を含めた、広範囲の化学物質により実現され得る。各物理的マトリクスとして用いられる細胞が、同じタイプであるのが好ましい。例示的な細胞型は、１）ヒトＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽腫細胞；２）ヒトＵ２０Ｓ骨肉腫細胞；３）ヒト２９３胎生腎細胞；４）サルＣＶ−１腎細胞（ベロ細胞）；５）サルＣＯＳ細胞；６）マウス３Ｔ３細胞；７）ハムスターＢＨＫ−２１細胞；８）ウシＢＩＥＣ細胞；９）ウシＢＵＶＥＣ細胞；１０）ヒトＣａｃｏ−２細胞；１１）ヒトＨｅＬａ細胞；１２）サルＭＡ１０４細胞；１３）イヌＭＤＣＫ細胞；１４）ブタＰＫ−１５細胞；および１５）ヒトＷｉＤｒ細胞を含む。
【００３０】
ＨＳＶ  ＩＣＰＯ−ウイルスが、今日まで試験された１５個の他の細胞系のうち１１個において、ベロ細胞と見分けのつかないほどの効率でプラークを形成することは注目に値する。具体的に述べると、本発明者らによる研究は、ＨＳＶ  ＩＣＰＯ−ウイルスの０．５−２％は、ヒト２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ウシＢＩＥＣ細胞、ウシＢＵＶＥＣ細胞、ヒトＣａｃｏ−２細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、サルＡ１０４細胞、イヌＭＤＣＫ細胞、ブタＰＫ−１５細胞およびヒトＷｉＤｒ細胞の単層においてプラークを形成することを示している。よって、このリストにおけるあらゆる細胞系が、定義上、野生型ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、ならびにテキストにおいて特に論じられる変異ＨＳＶ−１ウイルスの複製を支持する。ベロ細胞は、１つの好ましい細胞型であり、本明細書では以降、例示的に用いられている。
【００３１】
用いられる細胞は、それ自体、固体の物理的マトリクス（例えば、プラスチック製ディッシュ、磁性ビーズ、アガロースなど）に付着していてよく、またはＰＢＳなどのバッファー溶液のような水性媒体などの液体溶液中に懸濁され得る。物理的マトリクスに結合している（免疫反応した）抗体は、その後、反応したサブ試料中に存在するあらゆる未反応の抗体から分離される。この分離は、遠心分離およびデカンテーションにより行われ、または上清の液体をピペットで取り出してもよく、抗原が結合した抗体が培養プレートの壁上にある場合はピペット除去、溶出などでもよい。
【００３２】
上記で論じた、３つの各血清試料の、異なる細胞抗原マトリクスの１つとの混合およびインキュベーションも、本明細書において予吸着と呼ばれる。この予吸着は、固定された細胞で行われるのが好ましい。可能な様々な交差反応性を最小にするために、同じ細胞型が各予吸着に用いられるのが好ましい。
【００３３】
非感染の細胞抗原マトリクスの目的は、いかなる特異的な型の非感染の細胞抗原マトリクスが用いられる場合でも、患者がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染しているか否かを決定しようと求める患者から採取した試験試料中で、ヒト血清抗体の集団に対する効果が殆ど乃至全くない「予吸着処置対照」として働くことである（図１５−１８における生データの一番左のパネル、ならびに図１９および２０におけるグラフによる概要）。
【００３４】
同様に、ＨＳＶ−１＋細胞抗原マトリクスの目的は、いかなる特異的な型のＨＳＶ−１＋細胞抗原マトリクスが用いられる場合でも、（１）ＨＳＶ型共通抗体および（２）ＨＳＶ−１特異的抗体を、患者の血清試料から除去することである。よって、ＨＳＶ−１＋細胞抗原マトリクスとのインキュベーション後に除去される非結合画分（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）は、ＨＳＶ−２特異的抗体が高度に濃縮された集団を生じ、これは、患者がＨＳＶ−２ウイルスに感染していたか否かを決定するのに用いられ得る（図１５−１８における生データの中央のパネル、ならびに図１９および２０におけるグラフによる概要）。
【００３５】
同様に、ＨＳＶ−２＋細胞抗原マトリクスの目的は、いかなる特異的な型のＨＳＶ−２＋細胞抗原マトリクスが用いられる場合でも、（１）ＨＳＶ型共通抗体および（２）ＨＳＶ−２特異的抗体を、患者の血清試料から除去することである。よって、ＨＳＶ−２＋抗原マトリクスとのインキュベーション後に取り出される非結合画分は、ＨＳＶ−１特異的抗体が高度に濃縮された集団となり、これは、患者がＨＳＶ−１ウイルスに感染していたか否かを決定するのに用いられ得る（図１５−１８における生データの一番右のパネル、ならびに図１９および２０におけるグラフによる概要）。
【００３６】
予吸着の結果、少なくとも３つの予吸着された血清サブ試料が形成される。よって、非感染の細胞の抗原とインキュベートした予吸着された血清サブ試料は、（ａ）非感染細胞と免疫反応する抗体の含有量が低減されている。ＨＳＶ−１感染細胞の抗原とインキュベートした予吸着された血清サブ試料は、（ｂ）ＨＳＶ−１感染細胞と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が低減されており、そのため、ＨＳＶ−２と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が比較的上昇している。同様に、ＨＳＶ−２感染細胞の抗原とインキュベートした予吸着された血清サブ試料は、（ｃ）ＨＳＶ−２感染細胞と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が低減されており、ＨＳＶ−１と免疫反応する抗体が、提供される血清試料中に存在する場合、その含有量が比較的上昇している。
【００３７】
予吸着された各サブ試料ポーションを、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれによっても非感染の細胞からの第２のマトリクスに連結している試験抗原、ＨＳＶ−１により感染されている細胞からの試験抗原、およびＨＳＶ−２により感染されている細胞からの試験抗原の混合物とインキュベートして（上記に論じた通り）、各サブ試料内に存在する抗体を、存在する試験抗原と免疫反応させる。次いで、免疫反応が殆どまたは全くないものを含めた免疫反応の量を、試験抗原混合物を含む各サブ試料に対して決定して、どの試験抗原が、あるとすれば、予吸着されたサブ試料からの抗体に免疫反応したかを決定する。
【００３８】
アッセイのこの部分において利用される、第２のマトリクスに連結している試験抗原は、以前に論じたのと同じ試験抗原−物理的マトリクス構築物でも、または異なる構築物でもよい。好ましい一実施形態において、３つの試験抗原−物理的マトリクスの混合物は、試験細胞の各集団が、色素の色または蛍光の相対的な量に基づいて相互に識別され得るように、（ａ）非染色の、（ｂ）細胞の色素、フルオロフォア、または着色料で弱く染色されている、ならびに（ｃ）外部から供給された同じ、細胞の色素、フルオロフォア、または着色料で強力に染色されている、固定および透過処理された細胞からなる。
【００３９】
特に好ましい、外部から供給される（通常、細胞の一部として存在しない）細胞の着色料は、典型的に紫外、可視、または赤外の範囲における規定された光の波長で（２００−８００ｎｍ）照射すると蛍光であり、その蛍光はフローサイトメーターによって検出され得る。例示的な、外部から供給される化学反応性の（共有結合により連結可能な）有用な蛍光着色料は、それだけには限定されないが、５−（および６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット）、およびリジン残基のイプシロンアミノ基などのアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル交換によりカップリングする、２，５−ジオキソピロリジン−ｌ−イル−７−（２−（（（ＩＥ，３Ｅ，４Ｅ）−１，５−ジクロロ−６−オキソヘキサ−ｌ，４−ジエン−３−イリデン）アミノ）−５−ヒドロキシフェニル）オクタノエート（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）近赤外ＤＤＡＯ−ＳＥ）、ならびに細胞のチオール基との反応により細胞を染色する、（２，３，６，７−テトラヒドロ−９−ブロモメチル−ｌＨ，５Ｈ−キノリジノ（９，１−ｇｈ）−クマリン（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）バイオレットＢＭＱＣ）、７−アミノ−４−クロロメチル−クマリン（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）ブルーＣＭＡＣ）、５−クロロメチル−フルオレセインジアセテート（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）グリーン）および５−クロロメチルローダミン（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッド）などのクロロメチル反応性着色料（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を含む。細胞はまた、ＧＦＰに対してＣｈａｌｆｉｅら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３巻：８０２−８０５頁において論じられる通り、それだけには限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を含めた、細胞内で発現される蛍光タンパク質の１つまたはそれ以上で示差的に標識され得る。
【００４０】
外部から導入される蛍光着色料は、それにより試験細胞抗原の各集団が蛍光により相互に識別可能である手段を提供する。試験細胞抗原含有マトリクスの、外部から供給される細胞着色料からの蛍光発光は、本明細書以降で論じられる２次抗体の蛍光発光、およびアッセイ中に存在するあらゆる他の材料の蛍光と識別可能である。
【００４１】
好ましい一実施形態において、免疫反応の量は、試験細胞と組み合わされる予吸着された各血清サブ試料に対して決定され、試験細胞の各集団に対するヒト抗体の結合は、試験細胞と混合される抗ヒト抗体での２次標識により検出される。抗ヒト抗体に好ましい標識は、その蛍光発光スペクトルが、（ｉ）非感染の、（ｉｉ）ＨＳＶ−１に感染している、および（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２に感染している抗原マトリクスを示差的に標識するのに用いられる着色料の蛍光発光スペクトルと重複しない、共有結合により連結されている蛍光化合物である。２次抗ヒト抗体にコンジュゲートすることができる、例示的な、共有結合により連結可能な蛍光色素は、それだけには限定されないが、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）を含む。
【００４２】
予吸着されたサブ試料からのあらゆる未反応の抗体が、以前に論じられている通り、免疫反応生成物から分離されるのが好ましい。
【００４３】
抗ヒト（２次）抗体に対する蛍光標識を用いることに加えて、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼなどの酵素標識は、よく知られている通り、好適な色素産生性の基質とのＥＬＩＳＡアッセイにおいてしばしば利用される、２次抗体に共有結合によりコンジュゲートされ得る。
【００４４】
抗ヒト（２次）抗体はそれ自体、ヒト以外の動物において産生される。例示的な２次抗体は、ヤギ、ロバ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットにおいて産生されたものを含む。これらの抗ヒト抗体が、ヒトＦｃ抗体ポーションと反応するのが好ましい。
【００４５】
どの試験細胞抗原に、予吸着された各サブ試料ポーション中に存在する抗体が結合したかを決定する際、それにより患者がＨＳＶ−１に感染していたか、ＨＳＶ−２に感染していたか、両方に感染していたか、またはいずれにも感染していなかったかを確認することができる。
【００４６】
それだけには限定されないが、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、フローサイトメーターまたは蛍光活性化細胞ソーターを含めた、免疫蛍光を検出するあらゆる方法を用いて、あるとすれば、どの予吸着されたサブ試料が、試験細胞抗原に結合したかを決定することができる。好ましくは、フローサイトメーターまたはＦＡＣＳは、このような機械が（１）試験細胞抗原含有マトリクスが、非感染であったか、ＨＳＶ−１＋またはＨＳＶ−２＋であったかを示す示差的な蛍光色の両方を測定することができ、機器は同時に（２）試験下で主要変数であることを示す第２の蛍光色、すなわち非感染対ＨＳＶ−１＋対ＨＳＶ−２＋試験細胞抗原に結合しているヒト抗体の量を測定するため、利用される。
【００４７】
以降の考察は、試験細胞抗原含有マトリクスとして、固定された細胞を利用する、特に好ましいアッセイを記載する。
【００４８】
本発明は、先に記載したアッセイを行うための血清学的アッセイキットも企図する。例示的なキットは、ａ）ｉ）物理的マトリクスにおける非感染細胞からの細胞抗原、（ｉｉ）同じまたは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−１感染細胞からの細胞抗原、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の物理的マトリクスと同じもしくは異なる物理的マトリクスにおけるＨＳＶ−２感染細胞からの細胞抗原のうちの１つを別々に含む、３つの別々の容器を含む。
【００４９】
第４の容器も含まれる。第４の容器は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれによっても非感染の細胞からの試験細胞抗原、ＨＳＶ−１により感染している細胞からの抗原、およびＨＳＶ−２により感染している細胞からの抗原の混合物を含み、これらの各細胞抗原は、第１に命名したマトリクスと同じまたは異なる第２のマトリクスに連結している。これら４つの各容器は、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の列挙した成分を含む。
【００５０】
アッセイを行うための指示も、キット中に存在する。企図されるキットが、列挙した成分を保持する入れ物として提供されるのが好ましい。
【００５１】
企図されるアッセイキットの容器は、それに対して列挙した試薬が十分に接着しない、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングおよびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のコーティングに対して、ガラスまたはプラスチックで作成されるのが典型的である。
【００５２】
上記に記載した血清学的アッセイキットは、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の標識抗ヒト抗体を含む第５の容器を含むのがさらに好ましい。抗ヒト抗体の標識は、その蛍光が、存在するあらゆる他の材料の蛍光と識別可能である蛍光材料であるのが好ましい。第４の容器の、固定された細胞の混合物が、それにより試験細胞抗原マトリクスの各集団が、規定された波長における蛍光発光の強度によって他から識別可能であり、アッセイにおいて利用されるあらゆる他の蛍光種とも識別可能である、外部から導入される蛍光着色料をさらに含むのも好ましい。
【００５３】
例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイ
【００５４】
好ましい一実施形態において、本発明は、対象が、ＨＳＶ−１に感染しているか、ＨＳＶ−２に感染しているか、両方に感染しているか、またはいずれにも感染していないかを決定するための血清学的アッセイである。アッセイは、対象から得た血清試料を、少なくとも３つの血清サブ試料に分割するステップ、血清サブ試料を、固定および透過処理された試験細胞の少なくとも３つの集団に予吸着させるステップ、予吸着した血清サブ試料を、懸濁液中の少なくとも３つの集団の試験細胞の混合物とインキュベートするステップ、血清サブ試料を検出抗体とインキュベートするステップ、ならびに細胞−血清サブ試料の混合物をフローサイトメーターで分析するステップを含む。
【００５５】
１つまたはそれ以上の単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）および単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）を含む群から選択されるのが好ましい。
【００５６】
固定および透過処理された細胞の少なくとも３つの集団がベロ細胞であるのが好ましく、この場合、第１の集団は非感染であり、第２の集団はＨＳＶ−１に感染しており、第３の集団はＨＳＶ−２に感染している。
【００５７】
懸濁液中の試験細胞の少なくとも３つの集団がベロ細胞であるのが好ましく、この場合、第１の集団は非感染で非標識であり、第２の集団はＨＳＶ−１に感染しており、低濃度の第１の蛍光分子で標識され、第３の集団はＨＳＶ−２に感染しており、高濃度の第１に記載した蛍光分子で標識されている。第１の蛍光分子が、カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）であるのが好ましい。
【００５８】
検出抗体が抗ＩｇＧ抗体であるのが好ましく、血清がアッセイされる対象がヒトである場合は抗ヒトＩｇＧが好ましい。検出抗体が第２の蛍光分子で標識されているのも好ましい。第２の蛍光分子は、試験細胞の各集団を標識するのに用いられる第１の蛍光分子の蛍光発光スペクトルと重複しない、蛍光発光スペクトルを有していなければならない。適切な第２の蛍光分子は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）であるが、本明細書に記載する他のフルオロフォアの多くも適切である。
【００５９】
フローサイトメトリー装置は、約１ミクロンから約２０ミクロンの、装置に好適な直径の、個々の抗原含有試験マトリクスに関連する蛍光を定量的に測定することができるあらゆる装置であってよい。このような好適なサイズに作られている抗原含有試験マトリクスの例は、それだけには限定されないが、（１）非感染の生ベロ細胞、（２）固定および透過処理された非感染のベロ細胞、（３）ＨＳＶ−１に感染している生ベロ細胞、（４）固定および透過処理されたＨＳＶ−１に感染しているベロ細胞、（５）ＨＳＶ−２に感染している生ベロ細胞、または（６）固定および透過処理されたＨＳＶ−２に感染しているベロ細胞を含む。細胞ソーティング装置がフローサイトメーターであるのが好ましいが、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が同じ目的で用いられ得るものの、一般的にこのような装置は約２０倍高価であり、よって細胞に関連する蛍光強度を測定するより初歩的な作業（フローサイトメーターで一般的に行われる）と対照的に、蛍光強度に基づいて「細胞を選別する（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」（ゆえに装置の名称である）行為のために確保される。
【００６０】
ウイルス感染細胞に対する抗体結合（ＡＢＶＩＣ）：汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡより高感度な方法−２つの細胞試験
【００６１】
本明細書で論じる通り、全てのＨＳＶ−２抗原に結合する血清ＩｇＧ抗体（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の存在は、ベロ細胞の単層におけるＨＳＶ−２プラークの赤色蛍光免疫染色によって可視化され得る（図１ＡおよびＢ）。無処置血清にはＨＳＶ−２抗体がなく、よってＨＳＶ−２＋細胞の赤色免疫蛍光染色は生じない（図１Ａ）。ＨＳＶ−２免疫動物からの血清はＨＳＶ−２抗体を含んでおり、この試験において赤色免疫蛍光染色を生じる（図１Ｂ）。新規なＡＢＶＩＣアッセイはこの同じ原理に頼るが、このアッセイははるかに定量的である、というのは、抗体試験は、フローサイトメーターにおける赤色免疫蛍光染色に対して分析され得る、懸濁液中の単一細胞の集団に対して行われるからである（図１Ｃおよび１Ｄにおけるｙ軸）。
【００６２】
このアッセイは、ウイルス感染細胞に対する抗体結合を測定するため、「ＡＢＶＩＣアッセイ」と呼ばれる。ＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）細胞は緑色フルオロフォアであるＣＦＳＥで標識されるが、非感染（ＵＩ）細胞にはこの標識がなく、これが２つの細胞集団がフローサイトメーターにおいて区別されるのを可能にする（図１Ｃおよび１Ｄのｘ軸）。
【００６３】
試験細胞懸濁液を、無処置マウスまたは免疫化マウスからの血清とインキュベートし、ＵＩまたはＨＳＶ−２＋細胞に結合しているＩｇＧ抗体の量を、赤色蛍光標識（アロフィコシアニン；ＡＰＣ）を保有する抗マウスＩｇＧ２次抗体によって検出した（図１ＣおよびＤのｙ軸）。細胞を無処置マウスの血清とインキュベートした場合、同様のレベルのＩｇＧ抗体がＨＳＶ−２＋およびＵＩ細胞に結合した。具体的に述べると、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、両集団において約７，０００であった（図１Ｃ）。対照的に、細胞懸濁液を、ＨＳＶ−２ワクチン接種したマウスからの血清とインキュベートした場合、ＨＳＶ−２＋細胞に対する抗体結合（ＭＦＩ約６００，０００）はＵＩ細胞より約２０倍高かった（図１Ｄ）。
【００６４】
抗体捕捉ＥＬＩＳＡおよびＡＢＶＩＣを並べて比較して、これらの相対感度を比較した（図９Ｃ）。マウスｎ＝４８におけるｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）のＥＬＩＳＡ推定値をｘ軸上にプロットし、同じマウスからのＡＢＶＩＣ推定値をｙ軸上にプロットした（図９Ｃ）。２つの方法が等しく高感度であれば、データ点は「ｌｏｇ０」の等価線の周りに点在しなければならない。しかし、陽性試料３６個のうち３５個は等価線より上にあり、ＡＢＶＩＣアッセイは、ＥＬＩＳＡよりも５±１倍高い汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体の存在量の推定値を生じた（図９Ｃ）。これは、ＡＢＶＩＣアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの、ＨＳＶ特異的抗体の存在量の推定値より高感度で正確であったという結果を支持したいくつかの分析のうちの１つである。
【００６５】
２つの細胞集団ＡＢＶＩＣアッセイは、「ＨＳＶ−２不確定」患者４人中２人が血清陰性であることを実証する
【００６６】
臨床血清試料は、２０１１年以来、Ｔｅｒｒｉ  Ｗａｒｒｅｎ（Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃ）から周期的に入手した。Ｑｕｏｒｕｍ  ＩＲＢ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）およびＳＩＵ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓは両方とも、脱同定した（ｄｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）血清だけが評価されたため、研究は「除外（ｅｘｅｍｐｔ）」であったと結論を下した。ＡＢＶＩＣアッセイを用いたヒト血清の分析は、以下の通り記載される。
【００６７】
血清陰性個体ｎ＝３からの血清が、ＨＳＶ−２＋細胞およびＵＩ細胞に対する抗体結合のバックグラウンドレベルを規定した（図１０Ａ）。ＨＳＶ−２性器ヘルペス患者ｎ＝３からの血清は、ＵＩ細胞よりも１０倍から２０倍高いレベルでＨＳＶ−２＋細胞に結合する抗体を所有していた（図１０Ｂ）。血清学的状態がＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡおよびＨＳＶウエスタンブロットにより不確定であった患者４人からの血清が、ＡＢＶＩＣアッセイにおいて試験された。ＡＢＶＩＣアッセイは、不確定血清試料１および２が実際にＨＳＶ−２血清陰性であったことを実証した（図１０Ｃ）。不確定血清試料３および４からの血清はＨＳＶ陽性結果を生じた（図１０Ｄ）が、ＡＢＶＩＣアッセイは、これらの個体がＨＳＶ−１に感染していたか、ＨＳＶ−２に感染していたか、または両方のウイルスに感染していたかを識別できなかった。この限界を克服し、ＨＳＶ型特異的ＡＢＶＩＣアッセイを開発するためにさらなるステップをとった。
【００６８】
例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイ
【００６９】
２つの修飾によって、２つの細胞集団ＡＢＶＩＣアッセイを、３つの細胞集団のＨＳＶ型特異的ＡＢＶＩＣアッセイに変換した。これらの変更は、１）ＵＩ細胞、ＨＳＶ−１＋細胞またはＨＳＶ−２＋細胞に対する血清の予吸着（図１１）；および２）ＵＩ細胞対ＨＳＶ−１＋感染細胞対ＨＳＶ−２＋感染細胞の３つの集団に対する予吸着された血清の試験であった（図１２）。
【００７０】
血清の予吸着に関して、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染している患者は、以下の最高３つの集団のＨＳＶ抗体を有する：１）ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２抗原タンパク質に結合する型共通抗体（図１１におけるＺ）；２）ＨＳＶ−１抗原タンパク質だけに結合するＨＳＶ−１特異的抗体（図１１におけるＸ）；および３）ＨＳＶ−２抗原タンパク質だけに結合するＨＳＶ−２特異的抗体（図１１におけるＹ）。
【００７１】
ＨＳＶ−２特異的抗体が濃縮された集団は、ＨＳＶに感染している対象（ヒトまたは他の動物）からの血清を、型共通およびＨＳＶ−１特異的抗体を枯渇する固定ＨＳＶ−１＋細胞に予吸着させ（図１１、中央の縦列）、存在するあらゆる抗ＨＳＶ−２抗体の相対的濃度を増強することにより得ることができる。同様に、ＨＳＶ−１特異的抗体が濃縮された集団は、血清をＨＳＶ−２＋細胞に予吸着することにより得ることができる（図１１、右の縦列）。ＵＩ細胞に対する予吸着（図１１、左の縦列）は、手順のあらゆる効果に対する対照として働く。
【００７２】
３つの細胞集団のアッセイに関して、フローサイトメーターにおいて分離され得る、ＵＩ細胞（ＣＦＳＥなし）、ＨＳＶ−１＋細胞（ＣＦＳＥｌｏ）およびＨＳＶ−２＋細胞（ＣＦＳＥｈｉ）の集団を生じる最適化されたＣＦＳＥ標識プロトコールが開発された（図１２）。ＵＩ細胞は２色プロットの左側に出現し、ＨＳＶ−１＋細胞およびＨＳＶ−２＋細胞は、低（ｌｏ）および高（ｈｉ）ＣＦＳＥレベルで標識され、よってそれぞれ中央および右側の集団として出現する（図１２Ａ）。血清予吸着およびこの３つの細胞集団のアッセイを組み合わせることにより、ＨＳＶ型特異的なウイルス感染細胞に対する抗体の結合（ＡＢＶＩＣ）アッセイが実現された。代表的な結果が、以下の通り表される。
【００７３】
血清陰性の血清試料を、各細胞集団に対する予吸着後、試験細胞とインキュベートした。ＵＩ細胞に対する予吸着の後、細胞に対する無視できる抗体結合が認められた（図１２Ａ、左グラフ）。ＨＳＶ−１＋細胞またはＨＳＶ−２＋細胞に対する予吸着の後、同様の結果が得られた（図１２Ａ、中央および右のグラフ）。
【００７４】
既知のＨＳＶ−２血清陽性個体の血清を、各細胞集団に対する予吸着の後、試験細胞とインキュベートした。ＵＩ細胞に対する予吸着の後、ＨＳＶ特異的抗体は、ＨＳＶ−１＋およびＨＳＶ−２＋細胞に、それぞれ１０倍および１５倍ＵＩ細胞より高いレベルで結合した（図１２Ｂ、左グラフ）。血清がＨＳＶ−１＋細胞に予吸着された場合、高レベルのＨＳＶ−２特異的抗体が残存し、ＨＳＶ−２＋細胞に結合し（図１２Ｂ、中央のグラフ、囲み）、よってこの患者はＨＳＶ−２血清陽性であった。この患者の血清がＨＳＶ−２＋細胞に予吸着された場合、ＨＳＶ−１＋細胞に対する抗体結合が消失し（図１２Ｂ、右のグラフ、囲み）、よってこの患者はＨＳＶ−１血清陰性であった。これらの結果は、先のウエスタンブロット試験と一致した。
【００７５】
先に論じた不確定血清試料３を、３つの各細胞集団に対する別々のサブ試料の予吸着の後、試験細胞とインキュベートした。ＵＩ細胞に対する予吸着の後、ＨＳＶ特異的抗体は、ＨＳＶ−１＋およびＨＳＶ−２＋細胞に、それぞれ１００倍および２０倍ＵＩ細胞より高いレベルで結合した（図１２Ｃ、左グラフ）。血清がＨＳＶ−１＋細胞に予吸着されると、ＨＳＶ−２＋細胞に対する抗体結合は消失し（図１２Ｃ、中央グラフ、囲み）、よってこの患者はＨＳＶ−２血清陰性であった。血清がＨＳＶ−２＋細胞に対して予吸着された場合、高レベルのＨＳＶ−１特異的抗体が残存し（図１２Ｃ、右グラフ、囲み）、よってこの患者はＨＳＶ−１血清陽性であった。
【００７６】
これらの所見は、不確定血清試料３を提供した患者はＨＳＶ−１に感染していたが、血清試料を得た時点でＨＳＶ−２には感染していなかったことを示した。不確定血清試料４は、等価な結果を生じた（示さず）。したがって、３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、不確定血清試料３および４は両方とも、ＨＳＶ−２血清陰性であり、ＨＳＶ−１血清陽性であったことを実証した。
【００７７】
ＨＳＶ−２不確定血清試料１、２、３および４は、患者がＨＳＶ−２に感染しておらず、よっていかなる性的接触に対してＨＳＶ−２性器ヘルペスを伝播し得ないことを正しく知らせるためのより良好なＨＳＶ血清学的アッセイが入手可能であれば、多くの不安および悩みを節約できる４人の患者を表す。
【００７８】
例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイはＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）よりも高感度である
【００７９】
ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）アッセイ（Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）は、ＨＳＶ−１（ｇＧ−１）またはＨＳＶ−２（ｇＧ−２）のＧ糖タンパク質に特異的な抗体の存在に対して試験する抗体捕捉ＥＬＩＳＡである［Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、２００１年］。これらは、知られている中で最も多岐にわたる２つのＨＳＶタンパク質である［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９１年；Ｒｏｉｚｍａｎら、１９８４年］。ＨＳＶ−１に感染している患者は、ｇＧ−１を含めた３０個のＨＳＶ−１タンパク質に対して抗体応答を開始することができ、同様にＨＳＶ−２感染は、ｇＧ−２を含めた３０個のＨＳＶ−２タンパク質に対する抗体応答を駆動することができる［Ｎｏｒｒｉｌｄら、１９８１年；Ｇｉｌｍａｎら、１９８１年］（図１３Ａおよび１３Ｃ）。
【００８０】
ＨＳＶ−２ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）アッセイの決定的な弱点は、このアッセイは、感染しているヒトのＨＳＶ−２特異的抗体の全レパートリーの３−１０％を表す、ｇＧ−２に対する抗体しか試験しないことである（図１３Ｂ対１３Ｃ）。ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）試験は、他の９０−９７％のｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＨに対するＨＳＶ−２特異的抗体、およびＨＳＶ−２の他の主要な２５個の抗原を考慮していない。ＨＳＶ−２特異的抗体を全て検出する潜在性のある試験は、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）試験に比べて、感受性の１０倍から３０倍の増大をもたらさなければならない（図１３Ｂ対１３Ｃ）。例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、約７５個全てのＨＳＶ−２タンパク質を含み、よってＨＳＶ−２特異的抗体全てに結合することができる、固定および透過処理されたＨＳＶ−２＋細胞からの細胞抗原を試験試薬として用いることにより、この目標を実現する。
【００８１】
例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイはウエスタンブロットよりも高感度である
【００８２】
例示的な３つの細胞集団の型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、汎ＨＳＶ型特異的抗体に対して試験し、内部コントロールされ、数千の反復測定に基づくという点で、ＨＳＶの血清学的アッセイの中でも独特である。ＡＢＶＩＣアッセイでは、数千のＨＳＶ−２＋細胞対ＵＩ細胞に結合する患者のＩｇＧ抗体のレベルが測定され、これらの量が、血清陰性およびＨＳＶ−２血清陽性の対照血清のパネルによって生成される量と比較される。
【００８３】
よって、「血清陰性」と「血清陽性」との間のカットオフは、好適とみなされる任意のレベルの統計学的有意性に設定することができる（例えば、不確定の血清試料３を提供した患者がＨＳＶ−２である確率は１００万分の１未満であった；図１２Ｃ；ｐ＜０．０００００１）。対照的に、ウエスタンブロット分析は定性的なアッセイであり、それ自体、統計的に決定された確率を、「ＨＳＶ−２血清陰性」の診断に対して割り当てるものではない。
【００８４】
（ｉ）非感染の、（ｉｉ）ＨＳＶ−１＋、および／または（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２＋の試験細胞に対するヒト抗体結合の検出
【００８５】
Ａ．免疫蛍光顕微鏡検査
感染の小型病巣（別名「プラーク」）を形成させる、少量のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ウイルスに感染している単層のベロ細胞の状況において、非感染細胞対ウイルス感染細胞に結合する患者血清試料の能力を比べることにより、患者血清試料がＨＳＶ−２抗体を含んでいるか否かを決定することが可能である。型特異的ＡＢＶＩＣ試験のこの実施形態において、ウイルス感染細胞に対するヒト抗体の結合は、蛍光顕微鏡で可視化され得る（図２３−２４）。このような実験系の、「ＨＳＶ−２特異的抗体」に対する試験への変換は、以下などの３エレメントで実現され得る：
１．単層の哺乳動物細胞におけるＨＳＶ−１プラーク；
２．単層の哺乳動物細胞におけるＨＳＶ−２プラーク；
３．非感染（ＵＩ）抗原マトリクス、ＨＳＶ−１＋抗原マトリクス、およびＨＳＶ−２＋抗原マトリクス。
【００８６】
このような試験の特定の例は、図２３において説明され、この場合、用いられる哺乳動物細胞系は「ベロ細胞」として知られるアフリカミドリザル腎細胞系であり、予吸着のために抗原を固定化するのに用いられたマトリクスは臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。ＨＳＶ−１プラークおよびＨＳＶ−２プラークの両方（すなわち、ウイルス感染細胞の領域）が、細胞の収集および固定時にウイルスが未だ到達していない、非感染（ＵＩ）細胞の「黒色領域」によって取り囲まれていることに留意されたい。
【００８７】
よって、「平均赤色蛍光強度」（ΔＭＦＩ）における差は、ある人の目が、この個体が「ＨＳＶ特異的抗体」を有するにちがいないことをある人に告げることを留意するものであり、これは型特異的ＡＢＶＩＣ試験の、より定量的なフローサイトメトリーベースの変形形態において比較されるのと正確に同じ量である。図２３の画像において、抗体結合は、顕微鏡写真において捕捉される赤色を生成する「ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ」抗体で可視化された。
【００８８】
具体的に述べると、ＨＳＶ−２血清陽性であることが分かっていた患者の血清を用いて、これら３セットの試薬がＨＳＶ−２特異的抗体の存在を試験するのに有用であったことを確証した。図２３Ａに示した一番上のパネルで始め、この患者の血清試料を１：２，０００希釈し、いかなる抗原マトリクスに対して予吸着させなかった場合、これは、（ｉ）左に示すＨＳＶ−１プラークおよび（ｉｉ）右に示すＨＳＶ−２プラークの両方に集合的に結合する、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体の混合物を含んでいた。よって、非吸着の患者血清は、この個体がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染していたか否かを決定するのに不十分であった。
【００８９】
この患者の血清試料を１：２，０００希釈し、非感染（ＵＩ）細胞抗原のマトリクスに予吸着させた場合、これは（ｉ）左に示すＨＳＶ−１プラークおよび（ｉｉ）右に示すＨＳＶ−２プラークの両方に集合的に結合する、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体の混合物を依然として含んでいた。よって、ＵＩ細胞抗原を予吸着された患者血清は、この個体がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染していたか否かを決定するのに不十分であった（図２３Ｂ）。
【００９０】
この患者の血清試料を１：２，０００希釈し、ＨＳＶ−１感染（ＨＳＶ−１＋）細胞抗原のマトリクスに予吸着させた場合、ＨＳＶ型共通抗体は枯渇されたが、ＨＳＶ−２特異的抗体は残存した。よって、ＨＳＶ−２特異的抗体が濃縮された集団は、左のＨＳＶ−１プラークに不十分にしか結合しなかったが、右に示すＨＳＶ−２プラークに強力に結合した。ＨＳＶ−１細胞抗原を予吸着させた患者血清は、この個体がＨＳＶ−２血清陽性であったことを決定するのに十分であり、これは基礎となるＨＳＶ−２感染に関する予測を示す（図２３Ｃ）。
【００９１】
最後に、この患者の血清試料を１：２，０００希釈し、ＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）細胞抗原のマトリクスに予吸着させた場合、ＨＳＶ型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体が枯渇された。この患者がＨＳＶ−１に感染しており、よってＨＳＶ−１血清陽性であれば、存在するＨＳＶ−１特異的抗体は残存する。しかし、最後のパネルに観察されるのは、ＨＳＶ−２を予吸着させた血清は、左のＨＳＶ−１プラークに結合している抗体を、右に示すＨＳＶ−２プラークより高いレベルまで有していなかったことである。よって、このＨＳＶ−２細胞抗原を予吸着させた患者血清は、この個体がＨＳＶ−１血清陰性であったことを決定するのに十分であった（図２３Ｄ）。
【００９２】
図２４において、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に血清陽性であることが分かっていた患者の血清を用いた、同一の試験の結果を示す。図２３に提供したのと同じ原理を用いて、患者のＨＳＶ−１細胞抗原を予吸着させた血清で得たデータは、個体がＨＳＶ−２血清陽性であることを示す（図２４Ｃ）。同様に、患者のＨＳＶ−２細胞抗原を予吸着させた血清で得たデータは、個体がＨＳＶ−１血清陽性であることを示す（図２４Ｄ）。
【００９３】
Ｂ．フローサイトメトリー
非感染の、ＨＳＶ−１に感染している、およびＨＳＶ−２に感染している哺乳動物細胞の懸濁液の状況において、非感染細胞対ウイルス感染細胞に結合する患者の血清試料の能力を比較することにより、患者の血清試料がＨＳＶ−２特異的抗体を含むか否かを決定することができる。型特異的ＡＢＶＩＣアッセイのこの実施形態において、ウイルス感染細胞に対するヒト抗体の結合は、フローサイトメーターを用いて定量的に測定することができる（図１５−１８）。
【００９４】
このような実験系は、以下の３つのエレメントを用いて「ＨＳＶ−２特異的抗体」を測定するのに用いることができる：
１．ＨＳＶ−１に感染している哺乳動物細胞；
２．ＨＳＶ−２に感染している哺乳動物細胞；ならびに
３．非感染（ＵＩ）の試験細胞抗原マトリクス、ＨＳＶ−１に感染している試験細胞の抗原マトリクス、およびＨＳＶ−２に感染している試験細胞の抗原マトリクスの３つの集団。
【００９５】
このような試験の具体的な例は図１５−１８において説明され、この場合、用いられた哺乳動物細胞系はベロ細胞であり、用いられた抗原マトリクスは、非感染の、ＨＳＶ−１に感染している、またはＨＳＶ−２に感染している、ベロ細胞の、ホルムアルデヒド固定およびメタノール固定および透過処理された懸濁液であった。
【００９６】
ＡＢＶＩＣアッセイのこの特定の実施形態において、固定および透過処理されたＵＩ細胞、ＨＳＶ−１＋細胞およびＨＳＶ−２＋細胞を含む試験細胞懸濁液に対する患者の抗体の結合は、フローサイトメーターのＦＬ４チャンネルにおいて測定される近赤外色を生成する、「アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ」抗体を用いて測定された（図１５−１８における各サブパネルのｙ軸）。具体的に述べると、各パネルにおいて示す比較は、バックグラウンド対照として働く非感染（ＵＩ）細胞に結合しているヒト抗体の量、対、ＨＳＶ−１＋細胞またはＨＳＶ−２＋細胞に対する抗体の結合である。型特異的ＡＢＶＩＣアッセイのこの特定の実施形態において、試験細胞の３つの集団は、緑色フルオロフォアであるカルボキシフルオレセインＮ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で示差的に標識することにより、フローサイトメーターのＦＬ１チャンネルにおいて区別されている。
【００９７】
図１４におけるデータは、ＣＦＳＥで示差的に標識したＵＩ細胞（図１４Ａ）、ＨＳＶ−１＋細胞（図１４Ｂ）またはＨＳＶ−２＋細胞（図１４Ｃ）の純粋な集団は、フローサイトメーターで＞９９．７％の信頼度のレベルで容易に区別されることを確証する。同様に、図１５−１８におけるデータは、試験細胞の３つの集団全ての混合物は、依然としてＦＬ１チャンネルにおいて容易に区別されることを直接的に実証し、このためＦＬ４チャンネル（近赤外色）は、ＨＳＶ細胞対ＵＩ細胞間の「平均蛍光強度における差」（ΔＭＦＩ）を測定するようにフリーにされ、ΔＭＦＩはＨＳＶ感染細胞対ＵＩバックグラウンド対照細胞のサブ集団に結合しているＨＳＶ特異的抗体の量と直接相関する（Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１３年）。
【００９８】
図１５は、試験細胞のこれらの集団が、ＨＳＶ血清陰性であることが分かっている４個体の血清と組み合わされた場合、ＨＳＶ−１＋細胞およびＨＳＶ−２＋細胞対非感染（ＵＩ）のバックグラウンドの対照細胞に対する、抗体結合のバックグラウンドの量を説明する（図１５Ａ−１５Ｄ）。
【００９９】
型特異的ＡＢＶＩＣ試験のフローサイトメトリーベースの実施形態に独特である、３つの重要な定量上の特徴が存在し、これらは以下の通りである：
１．「ＨＳＶ特異的抗体」レベルの推定値は、ｎが約２０，０００個のＵＩ細胞対ｎが約２０，０００個のＨＳＶ−１＋細胞対ｎが約２０，０００個のＨＳＶ−２＋細胞の間のＦＬ４チャンネル（ｙ軸）における平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）における差に基づいており、これは患者の血液中のＨＳＶ特異的抗体の存在量の定量的推定値における高度の信頼度を提供する；
２．ＵＩ細胞は、アッセイのバックグラウンドを規定する内部標準を提供し、よってアッセイは、血液がより高いバックグラウンドのシグナルを引き起こす抗体を有する患者に対して非感受性であり、この高いバックグラウンドのシグナルは、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）アッセイおよびヘルペスウエスタンブロットを混乱させる主要な変数であり、患者がＨＳＶ−２感染／ＨＳＶ−２血清陽性であるという誤った結果に多くの人を誤解させる「不確定」結果の少なくとも５０％の根拠となる可能性がある；
３．患者自身のΔＭＦＩＨＳＶ−１またはΔＭＦＩＨＳＶ−２値が、対照のＨＳＶ血清陰性試料に対するΔＭＦＩＨＳＶ−１またはΔＭＦＩＨＳＶ−２値の正規分布になる場合に基づいて、ＨＳＶ−１＋細胞に関連するΔＭＦＩＨＳＶ−１（ＭＦＩＨＳＶ−１−ＭＦＩＵＩ）の平均値および標準偏差、ならびにＨＳＶ−２＋細胞に関連するΔＭＦＩＨＳＶ−２（ＭＦＩＨＳＶ−２−ＭＦＩＵＩ）の平均値および標準偏差を規定することは、所与の患者がＨＳＶ−１血清陰性またはＨＳＶ−２血清陰性である確率を統計学的に分析する機会を作り出す（図２１および２２）。これらの考察に基づき、１×バックグラウンドは、ＨＳＶ血清陰性対照における全てのΔＭＦＩＨＳＶ−１およびΔＭＦＩＨＳＶ−２値の平均に等しく設定される。
【０１００】
図１６は、ＨＳＶ−１血清陽性（図１６Ａ）、弱くＨＳＶ−２血清陽性（図１６Ｂ）、強くＨＳＶ−２血清陽性（図１６Ｃ）、またはＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２二重血清陽性（図１６Ｄ）であることが分かっている（ヘルペスウエスタンブロットに基づき）個体での、型特異的ＡＢＶＩＣ試験のフローサイトメトリーベースの実施形態により生成されたデータを説明する。各タイプの個体は、以下の通りに考えられる。
【０１０１】
ＨＳＶ−１血清陽性である個体に対して、対照の「ＵＩ予吸着」血清試料（図１６Ａにおける左パネル）は、バックグラウンドを６３倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−１、およびバックグラウンドを１１倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−２を示す。同じ血清試料がＨＳＶ−１抗原マトリクスに予吸着される場合、型共通抗体およびＨＳＶ−１特異的抗体が除去される。よって、図１６Ａの中央パネルにおいて、ΔＭＦＩＨＳＶ−１はバックグラウンドを超えて１．０倍まで低減し、ΔＭＦＩＨＳＶ−２はバックグラウンドを超えて約１．４倍まで低減し、これは、この個体がＨＳＶ−２特異的抗体を保有しないことを示す。最後に、同じ血漿試料がＨＳＶ−２抗原マトリクスに予吸収される場合、型共通抗体およびＨＳＶ−２特異的抗体が除去される。よって、図１６Ａの一番右のパネルにおいて、ΔＭＦＩＨＳＶ−１はバックグラウンドを超えて４１倍まで回復し、よってこのヒトは高力価のＨＳＶ−１特異的抗体を有することを示す。
【０１０２】
後続の統計学的考察に基づいて（図２１−２２）、図１６Ａに表す分析用に採血された個体について以下の数学的結論に到達することができる（「患者１６Ａ」として血清試料を提供した患者に関して）。
−  ＨＳＶ−１：患者１６ＡがＨＳＶ−１血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  ＨＳＶ−２：患者１６ＡがＨＳＶ−２血清陰性である確率は５５％である。
−  結論：患者１６ＡはＨＳＶ−１血清陽性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
【０１０３】
ＨＳＶ−２血清陽性である個体に対して、対照の「ＵＩ予吸着」血清試料（図１６Ｂおよび図１６Ｃにおける左パネル）はそれぞれ、バックグラウンドを７倍および３０倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−１を示し、バックグラウンドを８倍および４７倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−２を示す。これらの血清試料がＨＳＶ−１抗原マトリクスに予吸着された場合（図１６Ｂおよび図１６Ｃの中央パネル）、ΔＭＦＩＨＳＶ−１はそれぞれ、バックグラウンドを超えて約０．２倍および０．９倍まで低減し、ΔＭＦＩＨＳＶ−２は、バックグラウンドを超えて４倍および２９倍まで低減するにすぎず、これは、両方の個体がＨＳＶ−２特異的抗体を有すると思われることを示す。最後に、これら同じ血清試料がＨＳＶ−２抗原マトリクスに予吸着された場合（一番右のパネル）、患者＃１のΔＭＦＩＨＳＶ−１は０．３まで低減し、患者は明らかにＨＳＶ−１血清陰性であることを示すが（図１６Ｂ）、患者＃２のΔＭＦＩＨＳＶ−１はバックグラウンドを４．２倍超えたままである（図１６Ｃ）。後続の統計学的考察に基づいて（図２１−２２）、図１６Ｂおよび図１６Ｃにおいて分析したこれらの個体について以下の数学的結論に到達することができる（「患者１６Ｂ」は「患者＃１」でもあり、「患者１６Ｃ」は「患者＃２」でもある）：
−  ＨＳＶ−１：患者１６ＢがＨＳＶ−１血清陰性である確率は８７％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１６ＢがＨＳＶ−２血清陰性である確率は０．１％である。
−  結論：患者１６ＢはＨＳＶ−１血清陰性であり、ＨＳＶ−２血清陽性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１６ＣがＨＳＶ−１血清陰性である確率は３％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１６ＣがＨＳＶ−２血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  結論：患者１６ＣはＨＳＶ−１不定（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）であり、ＨＳＶ−２血清陽性である。
【０１０４】
ＨＳＶ−１血清陽性であり、ＨＳＶ−２血清陽性である個体に対して、対照の「ＵＩ予吸着」血清試料（図１６Ｄにおける左パネル）は、バックグラウンドを２９０倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−１、およびバックグラウンドを１００倍超えるΔＭＦＩＨＳＶ−２を示す。この血清試料がＨＳＶ−１抗原マトリクスに予吸着された場合（図１６Ｄの中央パネル）、ΔＭＦＩＨＳＶ−１はバックグラウンドを超えて２倍まで低減するが、ΔＭＦＩＨＳＶ−２はバックグラウンドを超えて５２倍まで低減するにすぎず、この個体はＨＳＶ−２特異的抗体を有することを示す。この血清試料がＨＳＶ−２抗原マトリクスに予吸着された場合（一番右のパネル）ΔＭＦＩＨＳＶ−１はバックグラウンドを超えて９５倍まで低減するにすぎず、これらは明らかにＨＳＶ−１血清陰性であることを示す（図１６Ｄ）。後続の統計学的考察に基づいて（図２１−２２）、この個体について以下の数学的結論に到達することができる：
−  ＨＳＶ−１：患者１６ＤがＨＳＶ−１血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  ＨＳＶ−２：患者１６ＤがＨＳＶ−２血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  結論：患者１６ＤはＨＳＶ−１血清陽性であり、ＨＳＶ−２血清陽性である。
【０１０５】
非感染、ＨＳＶ−１＋またはＨＳＶ−２＋抗原マトリクスに対するヒト抗体の予吸着
【０１０６】
Ａ．ＣＮＢｒ活性化したセファロース（登録商標）４Ｂマトリクスに対する予吸着
型特異的ＡＢＶＩＣ試験における、予吸着ステップのための、ＵＩ、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２細胞抗原マトリクスとしての、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用例を、図２３および２４に示す。
【０１０７】
Ｂ．固体マトリクスに付着させた固定ベロ細胞に対する予吸着
型特異的ＡＢＶＩＣ試験における、予吸着ステップのための、ＵＩ、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２細胞抗原マトリクスとしての、固定および透過処理されたベロ細胞の使用例を、図１５、１６、１７および１８に示す。この特定の試験において、ＵＩ、ＨＳＶ−１＋またはＨＳＶ−２＋ベロ細胞を、プラスチック製ディッシュの基質に固定し、ディッシュ中でこれらを培養し、培養したものはヒト血清が予吸着された細胞抗原マトリクスとして作用した。同様に、ＵＩ、ＨＳＶ−１＋またはＨＳＶ−２＋ベロ細胞の懸濁液は、試験細胞に対するヒト抗体結合のフローサイトメトリー分析前に、ヒト血清の予吸着のための細胞抗原マトリクスとして用いた。
【０１０８】
（ｉ）非感染の、（ｉｉ）ＨＳＶ−１＋、および／または（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２＋である、固定試験細胞または細胞抗原マトリクスは、長時間安定である。固定の概念は、この語が意味するように、生物学的組織を、崩壊せず、よって長時間安定である形態に「固定」することを伴う。これは、人間を葬式の準備用にエンバーミングする基本であり、古代エジプトにおいて保存されるミイラを生成するために実践された。ホルムアルデヒド、メタノール、エタノール、アセトンなどの固定液の使用は、生物学では１９世紀以来、通常のことである。本発明者らの実験室における試験では、（１）固定された、非感染の、ＨＳＶ−１＋、もしくはＨＳＶ−２＋ベロ試験細胞の懸濁液、または（２）非感染の、ＨＳＶ−１＋、または（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２＋細胞抗原マトリクスは、４℃で少なくとも１か月間安定である。
【０１０９】
非感染（ＵＩ）対照の抗体試験は、ＨＳＶ血清陰性をＨＳＶ血清陽性と識別するのに十分であるが、ある個体がＨＳＶ−１に感染しているか、ＨＳＶ−２に感染しているか、または両方に感染しているかを識別しない。図１６Ｄにおけるパネルの一番左の縦列は、ＨＳＶ−１血清陽性およびＨＳＶ−２血清陽性の個体全てが、ＨＳＶ−１＋およびＨＳＶ−２＋両方のベロ試験細胞と交差反応する、両方の型共通抗体を有することを説明する。よって、予吸着の非存在下、またはＵＩ細胞に対する予吸着後、患者がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に感染しているか否かを明らかに区別するのは不可能である。
【０１１０】
対象の血清中にＨＳＶ−１特異的抗体が存在することは、対象がＨＳＶ−１血清陰性であった確率の計算を可能にし、よって、対象がＨＳＶ−１血清陰性である確率が０．５％未満であれば、対象はＨＳＶ−１血清陽性であると推測することができる。これらの点を支持するデータは図１６（一番右の縦列）、図１９−２０（ＨＳＶ−２予吸着）および図２２Ａに表される。
【０１１１】
ＨＳＶ−２特異的抗体の存在は、対象がＨＳＶ−２血清陰性である確率を計算できるようにし、よって、対象がＨＳＶ−２血清陰性である確率が０．５％未満であれば、対象はＨＳＶ−２血清陽性であると推測することができる。これらの点を支持するデータは、図１６（中央の縦列）、図１９−２０（ＨＳＶ−１予吸着）および図２２Ｂに表される。
【０１１２】
型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは、（ｉ）非感染の対照試験、（ｉｉ）ＨＳＶ−１特異的抗体試験および（ｉｉｉ）ＨＳＶ−２特異的抗体試験を組み合わせる。これらの点を支持するデータは、図１５−１８および図２３−２４に表される。
【０１１３】
型特異的ＡＢＶＩＣアッセイは高度に定量的であり、対象がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２血清陽性である確率の統計学的な解釈を可能にする。これらの点を支持するデータは図２１−２２において表される。
【０１１４】
型特異的ＡＢＶＩＣアッセイの定量的および統計学的検出力は、試験が、ヘルペスウエスタンブロットの不確定試験結果を分離できるようにする。これらの点を支持するデータは図１７、１８、２０および２２に表される。試験下での不確定患者は全員、以前のヘルペスウエスタンブロットに基づいて、ＨＳＶ−２に感染している可能性があることを知らされた。不確定患者ｎ＝７の血清を、型特異的ＡＢＶＩＣアッセイにおいて分析し（図２１−２２による）、これら７人中６人からの生データは図１７および１８に表され、以下の通り「患者１７Ａ−１７Ｃ」および「患者１８Ａ−１８Ｃ」に対して統計学的に概要される：
−  ＨＳＶ−１：患者１７ＡがＨＳＶ−１血清陰性である確率は６１％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１７ＡがＨＳＶ−２血清陰性である確率は７９％である。
−  結論：患者１７ＡはＨＳＶ−１血清陰性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１７ＢがＨＳＶ−１血清陰性である確率は７７％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１７ＢがＨＳＶ−２血清陰性である確率は４１％である。
−  結論：患者１７ＢはＨＳＶ−１血清陰性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１７ＣがＨＳＶ−１血清陰性である確率は３％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１７ＣがＨＳＶ−２血清陰性である確率は８５％である。
−  結論：患者１７ＣはＨＳＶ−１不定であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１８ＡがＨＳＶ−１血清陰性である確率は０．４％である。
−  ＨＳＶ−２：患者１８ＡがＨＳＶ−２血清陰性である確率は４５％である。
−  結論：患者１８Ａは弱くＨＳＶ−１血清陰性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１８ＢがＨＳＶ−１血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  ＨＳＶ−２：患者１８ＢがＨＳＶ−２血清陰性である確率は８％である。
−  結論：患者１８ＢはＨＳＶ−１血清陽性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
−  ＨＳＶ−１：患者１８ＣがＨＳＶ−１血清陰性である確率は０．０１％未満である。
−  ＨＳＶ−２：患者１８ＣがＨＳＶ−２血清陰性である確率は３０％である。
−  結論：患者１８ＣはＨＳＶ−１血清陽性であり、ＨＳＶ−２血清陰性である。
【実施例】
【０１１５】
全般的な展開（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）
【０１１６】
２つの細胞集団ＡＢＶＩＣ（ウイルス感染細胞に対する抗体結合）アッセイの開発
【０１１７】
序論
単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）ワクチンが、性器ヘルペスに対して強い保護を誘発するか、または弱々しい保護を誘発するかを区別するのに用いられ得る、ＨＳＶ−２に対する免疫性の相関が必要とされる。
【０１１８】
ＨＳＶ−２に対する免疫の臨床的に有用な相関を同定する上での以前の障害は、インビボでＨＳＶ−２を制御するＴ細胞の応答の正しいパラメータを同定することができないことから生じ得たことが示唆されていた［ＲｏｕｓｅおよびＫａｉｓｔｈａ、２００６年］。しかし、第２の可能性が存在する。ＨＳＶ−２に対する免疫性の相関を同定しようとする試みの殆どは、アミノ酸４０，０００個のＨＳＶ−２のプロテオームの３％未満を免疫系に対して提示する、１価（ｇＤ−２）または２価（ｇＢ−２＋ｇＤ−２）のサブユニットワクチンに注目していた［Ｓｈｌａｐｏｂｅｒｓｋｙら、２０１２年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１０年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００５年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、２００５年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００３年；Ｋｈｏｄａｉら、２０１１年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ａｌｌｅｎら、１９９０年；Ｗｅｉｒら、１９８９年；Ｋｕｋｌｉｎら、１９９７年；Ｍａｎｉｃｋａｎら、１９９５年；Ｅｏら、２００１年；Ｎａｔｕｋら、２００６年；Ｏｒｒら、２００７年；Ｋａｒｅｍら、１９９７年；ＢｒａｎｓおよびＹａｏ、２０１０年；Ｍｅｉｇｎｅｒら、１９８８年］。この取組みは、ＨＳＶ−２における抗原の総体を考慮していない。少なくとも２０個のウイルスタンパク質が、ＨＳＶ−２に対するヒトＢ細胞およびＴ細胞応答の知られている標的なのである［Ｈｏｓｋｅｎら、２００６年；Ｌａｉｎｇら、２０１０年；Ｇｉｌｍａｎら、１９８１］。したがって、１）動物が、生ウイルスなどの多価免疫源で免疫されれば；および／または２）ワクチン誘発性免疫応答の規模が、全てのＨＳＶ−２の抗原に対するＩｇＧ抗体（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の応答に関して測定されれば、免疫の相関がもっと容易に同定され得ることが想定された。
【０１１９】
本試験は、これらの予測を試験するために始められた。汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを測定するために、新規な、フローサイトメトリーベースのアッセイが開発された。このアッセイを用い、無処置動物および免疫化された動物１１７匹を分析して、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの誘発前血清レベルを、ＨＳＶ−２に対する保護の２つの尺度と比べた。誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルおよびＨＳＶ−２に対する保護を、ｇＤ−２サブユニットワクチン、野生型ＨＳＶ−２、またはいくつかのＨＳＶ−２ＩＣＰ０−弱毒化ウイルス（０Δ２５４、０Δ８１０、０ΔＲＩＮＧ、もしくは０ΔＮＬＳ）のうち１つで免疫化したマウスおよび／またはモルモットにおいて比較した。これら６個のＨＳＶ−２の免疫源は、約５００倍の範囲にまたがる広範な汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを誘発した。試験した免疫源６個のうち５個に対して、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの誘発前レベルは、ＨＳＶ−２誘発ウイルス排出における低減に定量的に相関し、ＨＳＶ−２誘発後の生存頻度を増大した。まとめると、結果は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、ＨＳＶ−２ワクチンの候補がＨＳＶ−２性器ヘルペスに対する保護を誘発する潜在性を評価するための、単純で有用なスクリーニングツールを提供し得る。
【０１２０】
材料と方法
【０１２１】
倫理的配慮（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）
マウスおよびモルモットは、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って取り扱われた。この試験は、南イリノイ大学医学部実験動物ケアおよび使用委員会（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可され、認可されたプロトコール２０５−０８−０１９の下に記載される通りに行われた。
【０１２２】
細胞およびウイルス
ベロ細胞およびＵ２０Ｓ細胞はアメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られ、ＩＣＰ０相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）Ｌ７細胞はＮｅａｌ  Ｄｅｌｕｃａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ；Ｓａｍａｎｉｅｇｏら、１９９８年）の好意により提供された。細胞は全て、本明細書以後「完全ＤＭＥＭ」と呼ぶ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５％、ペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌを補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。野生型ＨＳＶ−２ＭＳ（ＡＴＣＣ）はベロ細胞上で増殖させ、滴定した。この試験で用いたＨＳＶ−２ＩＣＰ０−変異ウイルス（ＨＳＶ−２０Δ８１０、０Δ２５４および０ΔＲＩＮＧ：Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０年）は、Ｕ２０Ｓ細胞中で増殖させ、ＩＣＰ０相補的Ｌ７細胞において滴定した。
【０１２３】
ＨＳＶ−２誘発試験
２年前に得た血清の遡及分析を、本試験において実施した（図２Ａおよび３Ａ）。これらの試験の詳細は、他所に記載されている［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年；Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０年］。モルモットにおける、ワクチン誘発の前向き研究を、以下の通り、詳しく記載する。
【０１２４】
平均体重２５０ｇのＨａｒｔｌｅｙメスモルモットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。０日目、モルモットを、キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により麻酔し、１）完全ＤＭＥＭ（無処置）；２）ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ２×１０６ｐｆｕ；３）ＨＳＶ−２ＭＳ２×１０６ｐｆｕ；または４）組換え糖タンパク質Ｄ−２（ｇＤ−２）抗原５μｇ＋モノホスホリル脂質Ａ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｂｉｏｌｉｐｉｄｓ）２０μｇ＋Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）ミョウバンアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１００μｌを右後足の足蹠に注射することにより免疫化した。ｇＤ−２抗原はバキュロウイルスベクターから発現されたものであり［Ｎｉｃｏｌａら、１９９６年］、多数の試験においてワクチン抗原として用いられていた［Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１０年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年］。このＨｉｓタグ付けしたｇＤ−２タンパク質の精製の詳細は、他所に記載されている［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年］。免疫化後０日目から２０日目の間、ＨＳＶ−２ＭＳで免疫化したモルモットの飲料水中にアシクロビル１ｍｇ／ｍｌを経口投与してウイルスの病原性を制限し、１００％のモルモットが、明白な疾患の徴候を発症せずにＨＳＶ−２ＭＳに対する一次曝露後も生存した。３０日目、モルモットの左後足の足蹠に等量の免疫化を与えた（図４に示す１デザインあたり）。ＨＳＶ−２ＭＳで免疫化したモルモットは、第２の追加免疫化時、アシクロビルで処置しなかった。免疫化後７５日目に、２５ｇニードルで伏在静脈穿刺することによりモルモットを出血させ、血液を、ヘパリン添加したＮａｔｅｌｓｏｎ採血管に収集した。血清分画を収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０１２５】
９０日目、全てのモルモットを、以下の通りＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。ウイルス接種前、モルモットにキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより麻酔した。無処置モルモットおよび免疫化モルモットを、１）最初に、膣からの粘液栓をコットンスワブで正常にし；２）膣円蓋内部で第２のコットンスワブをくるくる回して、膣の壁をさらに乾燥させ；および３）２×１０６ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳを含む完全ＤＭＥＭ４０μｌを膣円蓋に注入することにより、野生型ＨＳＶ−２ＭＳで膣内誘発した。
【０１２６】
誘発したモルモットの膣円蓋におけるウイルス力価を、誘発８時間後（暗黒期）、ならびに誘発後１、２、３、４、６および８日目、スワブをモルモットの膣円蓋に挿入し、くるくる回し、チップを完全ＤＭＥＭ０．４ｍｌ中に移すことにより決定した。ウイルス力価を、上記に記載した通り決定した。モルモットを毎日モニタリングし、重篤な膣周囲の潰瘍形成を表した動物を、できるだけ早い時期に安楽死させた。全てのモルモットの膣周囲領域を、誘発後７日目に写真撮影した。生存するモルモットを、誘発後３０日目に安楽死させた。
【０１２７】
近交系１２９マウスに対するＨＳＶ−２抗血清の養子移植
６週齢から８週齢の１２９系統メスマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｉｏｎ、ＭＡ）から得た。０日目および３０日目、マウスｎ＝１０に、キシラジン（７ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより麻酔し、１０６ｐｆｕのＨＳＶ−２０ΔＮＬＳを含む５０μｌを、右足および左足の足蹠にそれぞれ注射することにより免疫化した。８５日目、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスｎ＝５を屠殺してＨＳＶ−２抗血清を収集し、年齢をマッチさせた無処置マウスｎ＝５を屠殺して無処置血清を収集した。９０日目、無処置マウスに、プールしたＨＳＶ−２抗血清０．２５ｍｌ、またはプールした無処置血清０．２５ｍｌの養子移植を与えた。養子移植直後、これらの無処置マウスｎ＝１０に、キシラジン（７ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより麻酔し、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。同様に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスｎ＝５に（０日目および３０日目）麻酔し、同時に片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。ＨＳＶ−２ＭＳ排出を、他所に記載されている通り、これらのマウスにおいてモニタリングした［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年］。
【０１２８】
血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルを計数するための抗体捕捉ＥＬＩＳＡ
高結合性ＥＩＡ９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を、総ＨＳＶ−２抗原１ｍｌあたり０．２μｇを含む、１ウエルあたり１００μｌの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で、４℃で一夜（約１８時間）コーティングした。総ＨＳＶ−２抗原を、ＨＳＶ−２に感染しているベロ細胞から、以下の通り単離した：１００ｍｍディッシュ５枚のベロ細胞（ディッシュ１枚あたり細胞８００万個）に、細胞１個あたり３ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳを接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。培養培地をディッシュから吸引し、細胞を１枚あたり５ｍｌのＰＢＳですすぎ、細胞を１枚あたり２ｍｌの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中に覆い、−８０℃で凍結させた。ＨＳＶ−２細胞可溶化物を解凍し、低速遠心分離により澄明にして細胞デブリを除いた。澄明にした上清のタンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌであり、アリコート０．２ｍｌにおいて凍結させた。各９６ウエルプレートをＨＳＶ−２抗原でコーティングするために、単一アリコートの総ＨＳＶ−２抗原を１：５０希釈し（１ｍｌあたり０．２μｇ）、高結合性ＥＩＡプレートをコーティングするのに用いた。総ＨＳＶ−２抗原で一夜（約１８時間）コーティングした後、ウエルを、本明細書以後ＰＢＳ−Ｔバッファーと呼ぶ、２％乾燥ミルクをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレン−２０−ソルビタン）０．０２％中に溶解したもの４００μｌで、２時間ブロックした。
【０１２９】
試験しようとする各血清試料を、ＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０中、２．５：２５０希釈した。ブロッキングバッファーをＥＬＩＳＡプレートから廃棄した後、希釈した血清試料１００μｌを２つずつ、総ＨＳＶ−２抗原でコーティングしたウエルに加え、２時間インキュベートした。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡプレートを、過剰のＰＢＳ−Ｔバッファーで３回すすいだ後、ＰＢＳ−Ｔバッファー中１：１５００希釈した２次抗体１００μｌを加え、２次抗体はアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメントであった（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）。１時間放置後、２次抗体をＰＢＳ−Ｔバッファーで７回、プレートからすすぎ、ｐ−ニトロフェニルリン酸基質２００μｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を各ウエルに加え、室温で３０分インキュベートした後、比色分析の発色（ＯＤ４０５）を測定した。ｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の存在量（ｘ）とＯＤ４０５（ｙ）との間の定量的関係を、ｌｏｇ０．３３希釈段階のＨＳＶ−２抗血清および双曲線正接ベースの標準曲線を用いて規定した（図９Ａ）。各血清試料中のｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の存在量を、他所に記載される通り、
【０１３１】
【数１】
0006449325.tif 000002
の形の、逆数の双曲線逆正接の等式を用いてＯＤ４０５値から引き出した［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０年；Ｈａｌｆｏｒｄら、２００５年ａ］。
【０１３２】
マウスおよびモルモット血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを計数するためのフローサイトメトリーアッセイ
ＨＳＶ−２＋細胞および非感染（ＵＩ）細胞の混合物の単一細胞懸濁液を、以下の通り産生した。１００ｍｍディッシュ１２枚に、１枚あたり完全ＤＭＥＭ中ベロ細胞７×１０６個を接種し、６時間後、ディッシュ６枚に細胞１個あたり３ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳを接種した。ＨＳＶ−２＋ベロ細胞を接種１２時間後に収集し、ＵＩベロ細胞を同時に並行して収集した。
【０１３３】
培養培地を吸引し、各ディッシュをＰＢＳ５ｍｌですすぎ、ＰＢＳ２ｍｌ＋５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０を加えることにより両方の細胞集団を分散させた。ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡは、ベロ細胞を持ち上げ、トリプシンを使用せずに相互に剥離させるのに十分であったことに留意されたい。ＨＳＶ−２＋細胞の場合、ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に、１μＭカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ａｎａｓｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を補充して、ＨＳＶ−２＋細胞を緑色フルオロフォアで標識した。
【０１３４】
細胞が持ち上がり始めるまで、細胞を、浸透機（ｒｏｃｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で１０分間、室温でインキュベートし、次いでＰ−１０００ピペッターの助けで粉砕することにより分散させた。分散させた全てのＵＩ細胞を、単一の５０ｍｌ円錐中に配置し、分散させた全てのＨＳＶ−２＋細胞を第２の５０ｍｌ円錐中に配置し、両方とも２００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット状にした。上清をデカントし、細胞ペレットをＰＢＳ１２ｍｌ中に再懸濁し、等体積の２×固定液（７．４％ホルムアルデヒド＋４％ショ糖）を加えた。
【０１３５】
細胞を１×固定液中、２０分間インキュベートし、遠心分離し、９０％メタノール２４ｍｌ中に再懸濁して細胞を透過処理した。インキュベート１０分後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳ＋３％ウシ胎児血清（ＰＢＳ−Ｆ）中に再懸濁し、４０μＭ、ナイロンメッシュ細胞こし器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通過させ、引き続き２５ゲージニードルを通過させることにより細胞クランプを除去した。
【０１３６】
ＵＩベロ細胞およびＣＦＳＥ標識したＨＳＶ−２＋細胞の単一細胞懸濁液中の細胞密度を決定し、ＵＩ細胞およびＨＳＶ−２＋細胞をおよそ２：１の比率で合わせた。細胞を遠心分離し、ＰＢＳ−Ｆ−Ｉｇブロック溶液（すなわち、ロバγグロブリン、ヤギγグロブリンおよびヒトγグロブリン各々２０μｇ／ｍｌを補ったＰＢＳ−Ｆ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）中、１ｍｌあたり１．２５×１０６細胞の濃度で再懸濁した。
【０１３７】
ＵＩおよびＨＳＶ−２＋細胞のアリコート（４００μｌ；細胞５００，０００個）を１．７ｍｌ微量遠心管中に配置し、１：３０希釈した血清２μｌを各細胞懸濁液に加えて、正味の血清希釈１：６，０００を実現した。細胞を、ＬａｂＱｕａｋｅ（登録商標）ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅハイブリダイゼーションローテータ上、室温で４時間インキュベートして、回転により細胞を懸濁液中に維持し（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｄｕｂｕｑｕｅ、ＩＡ）、１次抗体をＰＢＳ−Ｆ１．２５ｍｌで逐次的に２回すすぐことにより除去し、この際スイングバケット遠心分離機（ｓｗｉｎｇｉｎｇ  ｂｕｃｋｅｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて細胞をペレット状にし、すすぎの上清を吸引した。
【０１３８】
ＨＳＶ−２＋対ＵＩ細胞に結合しているＩｇＧ抗体の量を計数するために、細胞を１：１，０００希釈のＡＰＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメントまたはＡＰＣコンジュゲートロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とインキュベートした（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。１時間インキュベートした後、過剰の２次抗体を、ＰＢＳ−Ｆ１．２５ｍｌで逐次的に３回すすぐことにより除去した。
【０１３９】
細胞を総体積０．２ｍｌのＰＢＳ−Ｆ中に再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーターのＦＬ１およびＦＬ４チャンネルにおいて、ＣＦｌｏｗソフトウエア（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、２色フローサイトメトリーにより分析した。１試料あたり平均１２５，０００イベントが記録されたが、具体的に述べると、単一のＨＳＶ−２＋細胞２５，０００個がデータセットに含まれるまでイベントを記録するよう、フローサイトメーターを設定した。平均蛍光強度における差（ΔＭＦＩ）、ＨＳＶ−２＋細胞２５，０００個対ＵＩ細胞およそ５０，０００個に基づいて、各血清試料中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを計算した（図１）。バックグラウンドの蛍光を、無処置血清とインキュベートした細胞懸濁液中に観察された平均ΔＭＦＩ値と規定した。
【０１４０】
結果の数学的分析および統計学的分析
別段の記載がなければ、表される値は全て、反復試料の平均値±平均値の標準誤差（ｓｅｍ）である。ウイルス力価は、マイクロタイタープラークアッセイにより決定され、対数スケール上で（例えば、ｌｏｇ［ｐｆｕ／膣］）統計学的に分析された。感染性ウイルスは、十分に免疫化した動物の目または膣のスワブのいくつかでは検出できなかった。このような場合、全ての試料が対数スケール上で分析され得るように、試料に、スワブ１個あたり８ｐｆｕの値（すなわち、アッセイの検出の下限）を割り当てた。複数の群の比較における差の有意性を、一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）、引き続きＴｕｋｅｙの事後ｔ検定により、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｓｔａｔ（商標）ｖ３．１０ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて比較した。２群間の差の有意性は、マイクロソフトエクセルの「等分散を推定するｔ検定」の機能を用いて行った。生存頻度における差の有意性を、フィッシャーの直接確率検定により、自由に利用できるオンラインソフトウエアを用いて決定した（ＰｒｅａｃｈｅｒおよびＢｒｉｇｇｓ、２００１年）。
【０１４１】
全てのデータを、対数値を用いて統計学的に分析した。直線回帰分析を、最小二乗法によりマイクロソフトエクセルにおける「回帰」分析機能を用いて行い、適合度（ｒ２値）、およびｙ変数がｘ変数の関数として変化しなかった確率（ｐ）を計算するのに用いた。
【０１４２】
図６に報告する変動係数の値を、式、１００×（３回反復試料の標準偏差÷３回反復試料の平均値）により、各ＨＳＶ−２抗血清の希釈に対して計算した。図６に報告する値は、アッセイの直線範囲における全てのＨＳＶ−２抗血清の希釈に対する、平均値±ｓｅｍの変動係数を表す（すなわち、中和アッセイに対して１：２１−１：１，０００希釈；抗体捕捉ＥＬＩＳＡに対して１：１００−１：１００，０００希釈；およびフローサイトメトリーアッセイに対して１：６，０００−１：６，０００，０００希釈）。
【０１４３】
結果
【０１４４】
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルを測定するためのフローサイトメトリーベースのアッセイ
総ＨＳＶ−２抗原に結合する血清ＩｇＧ抗体（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の存在は、固定ベロ細胞の単層におけるＨＳＶ−２プラークの免疫蛍光染色によって定量的に試験され得る（図１Ａおよび１Ｂ）。このアッセイのより定量的な、フローサイトメトリーベースの変形形態が開発された。ＨＳＶ−２感染（ＨＳＶ−２＋）ベロ細胞および非感染（ＵＩ）ベロ細胞の単一細胞の懸濁液を、培養物の単層を分散させ、細胞を固定し、透過処理し、４０μｍメッシュおよび２５ｇニードルを通して濾過して細胞クランプを除去することにより得た。単一の反応におけるＨＳＶ−２＋細胞対ＵＩ細胞の抗体染色を可能にするために、ＨＳＶ−２＋細胞を、緑色フルオロフォアであるカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。
【０１４５】
ＨＳＶ−２＋細胞約３０％およびＵＩ細胞約７０％の懸濁液を、無処置マウスまたはＨＳＶ−２免疫化マウスからの血清とインキュベートし、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント２次抗体で蛍光的に標識した。抗体標識した細胞を、２色フローサイトメトリーにより分析した（図１Ｃおよび１Ｄ）。細胞懸濁液を１：６，０００希釈の無処置マウス血清とインキュベートした場合、同様のレベルのＩｇＧ抗体がＨＳＶ−２＋細胞およびＵＩ細胞に結合した（ＨＳＶＭＦＩ＝６，５１０；ＵＩＭＦＩ＝７，９７０；図１Ｃ）。対照的に、細胞懸濁液を１：６，０００希釈のＨＳＶ−２抗血清とインキュベートした場合、ＨＳＶ−２＋細胞に結合している抗体のレベルはＵＩ細胞よりはるかに高かった（ＨＳＶＭＦＩ＝６０８，１８０；ＵＩＭＦＩ＝２９，４２０；図１Ｄ）。
【０１４６】
「汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ」抗体のマウスの血清レベルを、ＨＳＶ−２＋細胞対ＵＩ細胞間の平均蛍光強度における差（ΔＭＦＩ）に基づいて推定した。各血清試料に関連する、得られたΔＭＦＩ値を、以下の計算式により「バックグラウンドを超えた倍数増大」に対して標準化した：ΔＭＦＩ試験試料÷平均ΔＭＦＩ無処置血清。この取組みが適用される場合、無処置マウスｎ＝６からの血清は、バックグラウンドの１．０±０．２倍である汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを有すると推定された（図１Ｅ）。対照的に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ弱毒化生ウイルスで免疫化したマウスｎ＝６は［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年］、バックグラウンドの９４０±２４０倍である汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを有した（図１Ｅ）。したがって、抗体染色したＨＳＶ−２＋対ＵＩ細胞のフローサイトメトリーは、ワクチン接種した動物の血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの存在量を測定する潜在的な手段を提供した。
【０１４７】
ＨＳＶ−２特異的抗体の血清レベルを計数するための方法の比較
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの存在量のフローサイトメトリーベースの測定法を、より伝統的な２つのアッセイ、すなわちＨＳＶ−２中和アッセイおよび抗体捕捉ＥＬＩＳＡに対して比較した。この比較では、マウスＨＳＶ−２抗血清を無処置血清中、４６４０倍の範囲にまたがってｌｏｇ０．３３の増大で希釈することにより、抗血清の希釈段階を構築した。無処置マウスの血清を希釈液として使用することで、確実に、血清タンパク質濃度（例えば、ＩｇＧ）は一定のままであり、ＨＳＶ−２特異的抗体はｌｏｇ０．３３の増大で選択的に希釈された。
【０１４８】
ＨＳＶ−２抗血清は、ＨＳＶ−２の感染力を、１：２１から１：１，０００の希釈の間で中和し、１：２，１５０またはこれを超える希釈では中和活性を殆どから全く表さなかった（図８Ａ）。よって、ＨＳＶ−２中和アッセイのダイナミックレンジは１：２１から１：１，０００であり、測定の変動係数は、この範囲内で１６±８％であった（図６）。
【０１４９】
抗血清の希釈段階におけるＨＳＶ−２抗体の存在量を、ＨＳＶ−２に感染しているベロ細胞の可溶化液をコーティング抗原として用いて、抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより評価した。抗体捕捉ＥＬＩＳＡは、１：１００から１：１００，０００の間の血清希釈で、パラニトロフェニルホスフェート基質（ＯＤ４０５）の著しい変換を生じた（図８Ｂ）。この直線範囲において、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルのＥＬＩＳＡベースの測定の変動係数は１３±３％であった（図６）。
【０１５０】
抗血清の希釈段階におけるＨＳＶ−２抗体の存在量を、新規なフローサイトメトリーベースのアッセイにより評価した（図１）。血清染色した試験細胞のフローサイトメトリーは、抗血清の１：６，０００から１：６，０００，０００の希釈間の、ＨＳＶ−２＋細胞対ＵＩ細胞に対するＩｇＧ抗体結合の著しいΔＭＦＩを生じた（図８Ｃ）。この直線範囲において、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルのフローサイトメトリーベースの測定の変動係数は、５±１％であった（図６）。
【０１５１】
３つのアッセイは全て、汎ＨＳＶ−２抗体の存在量について同傾向の推定値を生じたが、フローサイトメトリーベースのアッセイが最も高感度であった。具体的に述べると、フローアッセイの検出の下限は、ＨＳＶ−２抗血清に対して１：６，０００，０００であったが、ＨＳＶ−２中和アッセイおよび抗体捕捉ＥＬＩＳＡの下限はそれぞれ、１：２，１００および１：１００，０００であった（図６）。加えて、フローサイトメトリーベースのアッセイは最も正確であり、他のアッセイに比べて２分の１から３分の１の低さの変動係数を表した（図６）。最後に、フローサイトメトリーベースのアッセイは、一次測定基準（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｔｒｉｃ）であるΔＭＦＩが、ＨＳＶ−２＋細胞２５，０００個対バックグラウンドの対照細胞約５０，０００個に対するＩｇＧ抗体の平均の結合を表す点で独特であった。測定におけるこの広範囲の反復が、フローサイトメトリーベースの方法の正確さの増大の説明となった。
【０１５２】
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧは、マウスにおける目のＨＳＶ−２誘発に対する保護と相関する
以前に公開された目のＨＳＶ−２誘発実験において用いたマウスに由来する血清試料ｎ＝４８に対して遡及分析を行った（Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０年における図５および６）。この分析の目標は、保存されていた血清中の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、ＨＳＶ−２で目を誘発したマウスに観察された保護に比例して変動したか否かを決定することであった。
【０１５３】
オリジナルの実験のデザインを概説する。マウス６群中５群の右目に、培養培地（無処置対照）または右目に片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＩＣＰ０−変異体ウイルスである、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ、０Δ８１０、０Δ２５４もしくは０ΔＲＩＮＧを接種した（図２Ａ）。６番目の群に野生型ＨＳＶ−２ＭＳを同様に接種したが、マウスをアシクロビルで処置することにより感染の病原性を抑制した（図２Ａ）。６０日目に血液を抜き、７０日目、マウスの左目に片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した（図２Ａ）。これらのマウスの左目を、誘発後１日目から３日目の間毎日、スワブで拭ってウイルスの複製をモニタリングし、３０日の期間にわたり疾患の発症を観察した（図２Ａ）。
【０１５４】
免疫化群における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの誘発前のレベルを決定し、順位付けした（図２Ｂ）。ＨＳＶ−２  ０Δ８１０、０Δ２５４または０ΔＲＩＮＧウイルスで免疫化したマウスは、バックグラウンドを平均５倍から２３倍上回る、低から中レベルの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧを有していた（図２Ｂ）。対照的に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳまたはアシクロビルで制限したＨＳＶ−２ＭＳで免疫化したマウスは、バックグラウンドをそれぞれ平均１１０倍および２９０倍上回る、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを有していた（図２Ｂ）。
【０１５５】
回帰分析を適用して、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、目の誘発後のＨＳＶ−２排出の低減に相関したか否かを決定した。帰無仮説は、これら４８個のマッチさせたデータ対に対する最良適合の直線回帰モデル（ｙ＝ｂ＋ｍｘ）のスロープ（ｍ）は０であると予想した（図２Ｃ）。この帰無仮説が正しい確率はｐ＜１０−１１であった。むしろＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出（ｙ変数）は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ変数）が増大する対数１毎に、平均で対数０．５６低下した（図２Ｃにおける黒線）。
【０１５６】
最良適合の直線回帰モデルに対する適合度（ｒ２）値は０．６５であり、これは多くのマウスにおけるＨＳＶ−２排出の観察されるレベルは、等式、ｙ＝３．３５−０．５６ｘにより予想される量に完全に一致しなかったという事実を反映した（図２Ｃにおける黒線）。しかし、目のＨＳＶ−２排出の平均レベルは、測定の標準誤差内で、免疫化群６群中５群における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルに直接比例して低下した（図２Ｄ；ｒ２＝０．８６）。この傾向に対する例外は、ＨＳＶ−２０Δ２５４ウイルスで免疫化したマウスであり、ＨＳＶ−２０Δ２５４ウイルスは、ＨＳＶ−２に対する極めて可変的な保護を誘発し、よって生存性のＨＳＶ−２生ワクチンの候補として考慮から速やかに排除された［Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１０年］。
【０１５７】
免疫化マウスが目のＨＳＶ−２誘発後も生存した頻度を、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの関数としてプロットした（図２Ｅ）。無処置マウスの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧは検出不可能なレベルであり、ＨＳＶ−２誘発後も生存したものはなかった（図２Ｅ）。ＨＳＶ−２０Δ８１０またはＨＳＶ−２０Δ２５４で免疫化したマウスの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧは最低レベルであり、１群あたり８匹中３匹（４３％）だけがＨＳＶ−２誘発後も生存した（図２Ｅ）。ＨＳＶ−２０ΔＲＩＮＧで免疫化したマウスの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは中度であり、８匹中５匹がＨＳＶ−２誘発後も生存した（図２Ｅ）。ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳまたはアシクロビルで抑制したＭＳで免疫化したマウスの誘発前汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは最高であり、１００％が目のＨＳＶ−２誘発後も生存した（図２Ｅ）。まとめると、これらの結果は、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、１）ＨＳＶ−２誘発ウイルスの目の排出の低減；および２）生存頻度の増大に関して、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護に相関した。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡ対フローサイトメトリーの、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの推定値
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルのフローサイトメトリー測定が、抗体捕捉ＥＬＩＳＡに比べてあらゆる実際的な利点をもたらしたか否かを決定するために試験を行った。この目的で、上記で考慮したのと同じマウス血清試料を、抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより、ＨＳＶ−２感染細胞の可溶化液をコーティング抗原として用いて再分析した。ＨＳＶ−２抗血清のｌｏｇ０．３３希釈段階を用いて、双曲線正接の等式を用いて、Ｄ４０５吸光度値とｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）レベルとの間のＳ字状の関係を正確に規定した（図９Ａ；ｒ２＝１．００）。各血清試料に対するｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）レベルの推定値を、各血清試料のＯＤ４０５吸光度値をこの検量線に適合させることにより、数学的に引き出した。
【０１５９】
ｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）のＥＬＩＳＡベースの推定値は、目のＨＳＶ−２排出の低減に相関した（図９Ｂにおける黒線；ｒ２＝０．５４）。しかし、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧのＥＬＩＳＡ推定値の適合度は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧのフローサイトメトリーの推定値との等価の相関ほど強くなかった（図２Ｃ；ｒ２＝０．６５）。一部には、これは、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの、ＥＬＩＳＡベースの推定値対フローサイトメトリーベースの推定値の分散が２．５倍高いためであった（図６）。
【０１６０】
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧのＥＬＩＳＡ対フローサイトメトリーの推定値の相対感度を、図表により分析した。ｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）のＥＬＩＳＡ推定値をｘ軸上にプロットし、対応するフローサイトメトリーの推定値をｙ軸上にプロットした（図９Ｃ）。ＥＬＩＳＡ対フローサイトメトリーの推定値が等しく高感度であれば、これらｎ＝４８のデータ点は、「ｌｏｇ０」の等価線の周囲に図形的に分散していなければならない（図９Ｃ）。しかし、血清陽性試料３６個中３５個は等価線より上にあり、フローサイトメトリーがＥＬＩＳＡよりも高いｌｏｇ（汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ）の推定値を生じたことを示唆した。血清陽性試料３６個中６個では、フローサイトメトリーは、ＥＬＩＳＡに比べてｌｏｇ＋１を超えて高い、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの推定値を生じた（図９Ｃ）。これらｎ＝３６の血清陽性試料では、フローサイトメトリーは、ＥＬＩＳＡに比べて平均５±１倍高い、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの推定値を生じた。汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの２つの極値では、データ点は等価線付近に密集していた（図９Ｃ）。しかし、低範囲から中範囲の感度では、フローサイトメトリーアッセイは、ＥＬＩＳＡよりも高感度であった（ＨＳＶ−２  ０ΔＮＬＳ、０Δ８１０、０Δ２５４、または０ΔＲＩＮＧに対してｐ＜０．０１；両側ｔ検定）。この分析および先の分析に基づいて（図６）、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡは、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルについて同傾向の推定値を生じたが、フローサイトメトリー法は正確さおよび感度の改善をもたらしたことが結論付けられた。
【０１６１】
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧは、マウスにおける膣のＨＳＶ−２誘発に対する保護に相関する
以前に公開された実験に由来するマウス血清に対して、第２の遡及分析を行った（Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年における図４）。この分析の目的は、保存されていた血清における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、ＨＳＶ−２で膣に誘発したマウスに観察される保護に比例して変動するか否かを決定することであった。
【０１６２】
オリジナルの実験のデザインを概説する。マウスを、０日目および３０日目、右後足および左後足の足蹠にそれぞれ、１）培養培地（無処置対照）；２）ミョウバンおよびＭＰＬ１０μｇをアジュバント追加した（ａｄｊｕｂａｎｔｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）２．５μｇ；３）ミョウバンおよびＭＰＬ１０μｇをアジュバント追加したｇＤ−２３０６ｔ２．５μｇ［Ｎｉｃｏｌａら、１９９６年］；４）ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ１０６ｐｆｕ；または５）野生型ＨＳＶ−２ＭＳ１０６ｐｆｕ（アシクロビルを用いて、ＭＳに対する一次曝露の病原性を制限した。）で免疫化した（図３Ａ、１群あたりｎ＝１０）。６０日目に血液を抜き、９０日目または１００日目、マウスを、膣あたり５００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。誘発後１日目から７日目の間に、マウスｎ＝５０全てをスワブで拭って、膣のＨＳＶ−２排出を測定し、３０日の期間にわたって疾患の発症を観察した（図３Ａ）。
【０１６３】
免疫化群における汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを決定し、順位付けした（図３Ｂ）。無処置マウスおよびＧＦＰ免疫化マウスは、検出可能な汎ＨＳＶ−２ＩｇＧを有しておらず、これらのマウスのどれも膣のＨＳＶ−２誘発後は生存しなかった（図３Ｂ）。ｇＤ−２で免疫化したマウスは、バックグラウンドを平均１０倍超えた汎ＨＳＶ−２ＩｇＧを有し、１０匹中１匹が膣のＨＳＶ−２誘発後も生存した（図３Ｂ）。重要なことに、ｇＤ−２免疫化マウスにおける抗ｇＤ−２力価はおよそ２００，０００であったが（Ｈａｌｆｏｒｄら、２０１１年の図３Ｃ）、これは他の公開されている試験に匹敵する［Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１０年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００５年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００３年］。ＨＳＶ−２ＭＳまたは０ΔＮＬＳの生ウイルスで免疫化したマウスはそれぞれ、バックグラウンドを平均３９０倍および６５０倍上回る誘発前汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルを有し、これらのマウスの１００％が、目に見える疾患の症状なく、膣のＨＳＶ−２誘発後も生存した（図３Ｂ）。
【０１６４】
回帰分析を適用して、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、膣誘発後のＨＳＶ−２排出の低減に相関したか否かを決定した。帰無仮説は、これら５０個のマッチさせたデータ対に対する最良適合の直線回帰モデルのスロープ（ｍ）は０であると予想した（図３Ｃ）。この帰無仮説が正しい確率は、ｐ＜１０−１４であった。むしろ、ＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出（ｙ）は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ）が増大する対数１ごとに平均で対数０．７６低減した（図３Ｃにおける黒線）。この回帰直線に対する適合度（ｒ２）は０．７３であり、これは、多くのマウスにおいて観察されるＨＳＶ−２排出のレベルは、等式、ｙ＝３．８５−０．７６ｘによって予想される量に完全に一致しなかったという事実を反映した（図３Ｃにおける黒線）。しかし、膣のＨＳＶ−２排出の平均レベルは、免疫化群５群全てにおける汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルに直接比例して、測定の標準誤差以内で低減した（図３Ｄ；ｒ２＝０．９８）。したがって、誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルは、１）ＨＳＶ−２誘発ウイルスの膣の排出の低減、および２）生存頻度の増大に関して、マウスにおけるＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護と相関した。
【０１６５】
汎ＨＳＶ−２ＩｇＧは、モルモットにおける膣のＨＳＶ−２誘発に対する保護と相関する
誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、マウス以外の種におけるＨＳＶ−２に対する保護に比例して変動したか否かを決定するために、第３の遡及分析を行った。この疑問に取り組むために、モルモットｎ＝５の群を、０日目および３０日目、右後足および左後足の足蹠にそれぞれ、１）培養培地（無処置）；２）ミョウバンおよびＭＰＬ２０μｇでアジュバント追加したｇＤ−２  ５μｇ；３）ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳ２×１０６ｐｆｕ；または４）野生型ＨＳＶ−２ＭＳ２×１０６ｐｆｕ（アシクロビルを用いてＭＳに対する一次曝露の病原性を制限した。）で免疫化した（図４Ａ）。７５日目にモルモットを出血させ、９０日目に膣あたり２×１０６ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した（図４Ａ）。残念なことに、ｇＤ−２で免疫化したモルモットの１匹が麻酔薬の過剰投与で死亡し、よってｇＤ−２で免疫化したモルモットのｎ＝４だけが、ＨＳＶ−２の膣誘発後に利用できた。無処置のモルモットは、誘発後２日目、膣あたりピーク力価約２００，０００ｐｆｕを排出した（図４Ｂ）。ｇＤ−２で免疫化したモルモットは、誘発後１日目から８日目の間に、無処置のモルモットに比べて平均５倍少ないＨＳＶ−２を排出した（図４Ｂ）。対照的に、ＨＳＶ−２ＭＳまたは０ΔＮＬＳで免疫化したモルモットは、無処置のモルモットに比べて、それぞれ平均１５０倍および２００倍少ないＨＳＶ−２を排出した（図４Ｂ）。
【０１６６】
回帰分析を適用して、モルモットにおける誘発前の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、膣誘発後のＨＳＶ−２排出の低減に相関したか否かを決定した。帰無仮説は、これらｎ＝１９のマッチさせたデータ対に対する最良適合の直線回帰モデルのスロープ（ｍ）は０であると予想した（図４Ｃ）。この帰無仮説が正しい確率はｐ＜１０−７であった。むしろ、ＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出（ｙ）は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ）が増大する対数１ごとに平均対数０．９５低減した（図４Ｃにおける黒線）。この回帰直線に対する適合度（ｒ２）は０．８５であり、これは多くのモルモットに観察されたＨＳＶ−２排出のレベルは、等式、ｙ＝３．７７−０．９５ｘによって予想される量に完全に一致しなかったという事実を反映した（図４Ｃ）。しかし、膣のＨＳＶ−２排出の平均レベルは、免疫化群４群全てにおける汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルに直接比例して、測定の標準誤差以内で低減した（図４Ｄ；ｒ２＝０．９８）。
【０１６７】
疾患の進行に関して、無処置のモルモットは鮮紅色の膣周囲疾患を一様に発症し、誘発後１１日目または１１日目前に屠殺しなければならなかった（図４Ｅ）。ｇＤ−２で免疫化したモルモットは、低レベルの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧを有し、４匹中３匹が鮮紅色の膣周囲疾患を発症し、そのため、誘発後１１日目または１１日目前に屠殺する必要があった（図４Ｅ）。対照的に、生ＨＳＶ−２ウイルスＭＳまたは０ΔＮＬＳで免疫化したモルモットは、高レベルの誘発前汎ＨＳＶ−２ＩｇＧを有し、これらのモルモットの１００％が、疾患のいかなる目に見える徴候も発症せずに、膣のＨＳＶ−２誘発後も生存した（図４Ｅ）。
【０１６８】
マウスおよびモルモットにおける膣のＨＳＶ−２誘発実験の結果を比較した（図７）。両方の種において、ｇＤ−２での免疫化は、バックグラウンドを平均１０倍から２０倍上回る汎ＨＳＶ−２ＩｇＧにおける著しい増大を誘発し、これは膣のＨＳＶ−２誘発に対する部分的な保護と相関した（図７）。対照的に、ＨＳＶ−２ＭＳまたは０ΔＮＬＳの生ウイルスで免疫化したマウスまたはモルモットは、ｇＤ−２で免疫化した動物より３０倍から４０倍高い、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体の応答を開始した（図７）。同様に、ＭＳまたは０ΔＮＬＳで免疫化したマウスまたはモルモットは、ｇＤ−２で免疫化した動物に比べて、膣あたり平均２０倍から３５倍少ないＨＳＶ−２を排出した（図７）。まとめると、これらの結果は、免疫化マウスおよびモルモットにおける汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの増大は、１）ＨＳＶ−２誘発ウイルスの膣排出の低減、および２）生存頻度の増大に関して、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護の増大と相関した。
【０１６９】
ＨＳＶ−２抗血清単独は、ＨＳＶ−２ＭＳ誘発に対して弱い保護をもたらす
高レベルの汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体は、いくつかのＨＳＶ−２生ワクチンで免疫化したマウスにおける、ＨＳＶ−２ＭＳ誘発に対する強い保護に相関した。最終的な実験を行って、ＨＳＶ−２抗血清の養子移植は、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳウイルスで免疫化したマウスに観察されるＨＳＶ−２に対する保護のレベルを繰り返したか否かを決定した。
【０１７０】
この目的で、１２９系統マウス（ｎ＝１０）の右後足および左後足の足蹠においてそれぞれ、０日目および３０日目、１０６ｐｆｕのＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化した。８５日目、免疫化マウス５匹を屠殺してＨＳＶ−２抗血清を収集し、この時、年齢をマッチさせた対照から無処置血清を収集した。９０日目、無処置マウスに、無処置血清またはＨＳＶ−２抗血清をプールしたもの０．２５ｍｌの養子移植を与え（１群あたりｎ＝５）、次いで、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。同様に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスｎ＝５も、片目あたり１００，０００ｐｆｕのＨＳＶ−２ＭＳで誘発した。
【０１７１】
ＨＳＶ−２ＭＳの目の排出を比較した。誘発後１日目、無処置血清で処置したマウスは片目あたり平均３，０００個のＨＳＶ−２ＭＳを排出し、ＨＳＶ−２抗血清で処置したマウスは平均１６倍少ないＨＳＶ−２を排出し、この差は有意であった（図５Ａ）。しかし、ＨＳＶ−２抗血清処置マウスおよび無処置血清処置マウスは、目の誘発後３日目、高い、同等のレベルのＨＳＶ−２を排出した（図５Ｂ）。対照的に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスは、無処置血清処置マウスに比べて、それぞれ１日目および３日目に、平均３００倍および６０倍少ないＨＳＶ−２ＭＳを排出した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１７２】
ＨＳＶ−２抗血清の養子移植は、ＨＳＶ−２誘発性の病原性の進行を遅らせたが、防ぐことはなかった。具体的に述べると、無処置血清で処置したマウスは１００％が、誘発後７日目または８日目、目のＨＳＶ−２誘発で死亡した（図５Ｃ）。
【０１７３】
ＨＳＶ−２抗血清で処置したマウス５匹中２匹は目のＨＳＶ−２誘発後も生存し、１群として、これらのマウスは誘発後１９±５日間生存した（図５Ｃ）。ＨＳＶ−２抗血清で処置したマウスは有意に長く生存したが、これらの動物は十分に保護されなかった。
【０１７４】
具体的に述べると、ＨＳＶ−２抗血清で処置したマウスの１００％が、明白な眼窩周囲の毛の喪失および疾患を誘発後１０日目から１４日目の間に発症し、これらのマウスの６０％が誘発で死亡した（図５Ｃ）。対照的に、ＨＳＶ−２０ΔＮＬＳで免疫化したマウスの１００％が、誘発後３０日間、疾患のいかなる明白な徴候なく生存した（図５Ｃ）。したがって、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体レベルは、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護に相関したが（図２、３および４）、抗ＨＳＶ−２抗体単独が、ＨＳＶ−２誘発に対するワクチン誘発性の保護の唯一のメディエータであった見込みはない。
【０１７５】
考察
【０１７６】
全体的な考察
本試験は、ワクチン接種したマウスおよびモルモットにおける汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体の血流中レベルは、ＨＳＶ−２に対する保護と相関したことを実証するものである。この試験では、養子免疫応答の他の成分も、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護と相関するか否かは決定されていない。例えば、ＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞の頻度［Ｌａｉｎｇら、２０１０年；Ｓｔ  ｌｅｇｅｒら、２０１１年；Ｐｏｓａｖａｄら、２０１０年］または膣粘膜における抗ＨＳＶ−２ＩｇＡの存在量［Ｔｉｒａｂａｓｓｉら、２０１１年］は、ＨＳＶ−２ワクチンに対する免疫の、より良好な相関をもたらし得る。しかし、免疫の相関の有用性は、保護の媒介におけるワクチンの役割によるものではないことに留意されたい。むしろ、免疫の相関は、その用性が、もっぱら微生物の病原に対するワクチン誘発性の保護の規模を測る能力にある、スクリーニングツールである。汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、ヒトの臨床試験においてＨＳＶ−２のワクチンの効力を測る上で有用であるか否かは未だ決定されていない。
【０１７７】
ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護における体液性免疫対細胞免疫の関連性
ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護における体液性免疫対細胞免疫の関連性は、未だ不完全にしか規定されていない。Ｏａｋｅｓ、１９７５年に遡り、数十年の試験から明らかであるのは、養子移植された抗ＨＳＶ抗体またはＢ細胞単独は、免疫不全のヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスにおける末梢のＨＳＶ−１感染の致死的疾患への進行を防ぐのに十分ではないが［Ｎａｇａｆｕｃｈｉら、１９７９年；Ｈａｌｆｏｒｄら、２００５年ｂ］、養子移植したＴ細胞は、免疫不全動物を、ＨＳＶ−１の低病原性株での末梢感染後も生存させるのに十分であることである［Ｎａｇａｆｕｃｈｉら、１９７９年；Ｈａｌｆｏｒｄら、２００５年ｂ］。さらに、Ｔ細胞は、感覚神経節におけるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染を制御する上で直接的な役割を果たす［Ｄｉｖｉｔｏら、２００６年；Ｋｈａｎｎａら、２００３年；Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎら、２００８年；Ｔｈｅｉｌら、２００３年；Ｌｉｕら、２０００年；ＳｉｍｍｏｎｓおよびＴｓｃｈａｒｋｅ、１９９２年；Ｚｈｕら、２００７年］。よって、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護は、ＨＳＶ−２抗原に対するＴ細胞の応答に、殆ど確実に依存する［ＫｏｅｌｌｅおよびＣｏｒｅｙ、２００８年；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、２０１２年；Ｌａｉｎｇら、２０１２年；ＤｕｄｅｋおよびＫｎｉｐｅ、２００６年；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、２００２年］。
【０１７８】
ＨＳＶ−２性器ヘルペス病変に対する、完全な、ワクチン誘発性の保護は、ＨＳＶ−２の抗原に対するＢ細胞（抗体）およびＴ細胞のバランスのとれた応答に依存する可能性が高い。２系統の証拠がこの仮説を支持している。第１に、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方で再構成されたＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞単独で再構成されたＳＣＩＤマウスより有意に速やかにＨＳＶ−１感染を制御し（Ｈａｌｆｏｒｄら、２００５ｂにおける図１Ｃ）、多くの研究者が、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２での同様の所見を報告している［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００１年；Ｃｈｕら、２００８年；Ｓｔａａｔｓら、１９９１年］。第２に、ケモカイン［ＳｈｉｎおよびＩｗａｓａｋｉ、２０１２年］または炎症刺激［Ｍａｃｋａｙら、２０１２年］を用いてＴ細胞動員の速度を人工的に増大させなければ、Ｔ細胞単独は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の誘発の部位に浸潤するのが遅い。対照的に、抗体はＴ細胞よりおよそ１０００億倍小さく、ウイルスが感染している組織に速やかに侵入し得、よって抗体は最初の２４時間の間に、ＨＳＶ−２の複製および／または伝播を制限するように働き得る（図５Ａ）。
【０１７９】
このバックグラウンドに反して、抗ＨＳＶ−２抗体の論理的な機能は、ＨＳＶ−２が侵入する入口（例えば、膣）で、ウイルスが感染している組織中に速やかにＴ細胞を動員するのを促進する、炎症促進性のイベント（例えば、補体カスケード）を誘発する適応免疫防御の第一線として作用することである。
【０１８０】
ＨＳＶ−２に対する免疫の相関：本試験対以前の所見
ＨＳＶ−２に対する免疫の相関を同定するための以前の試みは、試験下の免疫源、すなわちｇＢおよび／またはｇＤに対する免疫応答に注目していた［Ｓｈｌａｐｏｂｅｒｓｋｙら、２０１２年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１０年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００５年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、２００５年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００３年；Ｋｈｏｄａｉら、２０１１年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ｎａｔｕｋら、２００６年；Ｃｈｅｎｔｏｕｆｉら、２０１０年］。これらの取組みは、ＨＳＶ−２における抗原の総体を考慮していない。少なくとも２０個のウイルスタンパク質が、ＨＳＶ−２に対するヒトＢ細胞およびＴ細胞応答の知られている標的なのである［Ｈｏｓｋｅｎら、２００６年；Ｌａｉｎｇら、２０１０年；Ｇｉｌｍａｎら、１９８１年］。このような糖タンパク質に注目した試験は、ｇＢ−２およびｇＤ−２以外のウイルス抗原もＨＳＶ−２に対する免疫に寄与し得ることを十分に考慮していなかった。
【０１８１】
糖タンパク質中心の免疫の相関は、ｇＢ−２および／またはｇＤ−２サブユニットワクチンが、ヒトにおけるＨＳＶ−２性器ヘルペスを防ぐのに十分であることを示唆する［Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２０１０年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００５年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、２００５年；Ｂｏｕｒｎｅら、２００３年］。この予測は、過去２３年にまたがるヒトの臨床試験からのデータによって裏付けられていない［Ｂｅｌｓｈｅら、２０１２年；Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら、２００２年；Ｓｔｒａｕｓら、１９９７年；Ｃｏｒｅｙら、１９９９年；Ｓｔｒａｕｓら、１９９４年；Ｍｅｒｔｚら、１９９０年］。汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの計測は、ＨＳＶ−２の全ての抗原に対するＩｇＧ抗体の比存在度を比較検討するため、より現実的な免疫の相関であり、よって１つまたは２つの特異的なタンパク質に対する免疫応答が、ＨＳＶ−２に対する免疫の正確な測定を必ず提供するという仮定に左右されない。
【０１８２】
この２つの細胞試験の結果は、ｇＤ−２ワクチンでの免疫化は、有意な汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体応答、および膣のＨＳＶ−２排出における有意な低減を誘発することを実証するものである（図７）。しかし、多価ＨＳＶ−２ウイルスで免疫化した動物は、ｇＤ−２で免疫化した動物よりも約３０倍大きい汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ応答を開始し、誘発後、約２５分の１の低さの膣のＨＳＶ−２排出を同様に表す（図７）。これらの結果は、ｇＤ−２に加えて、ＨＳＶ−２の他の２０個の抗原に対する免疫応答もＨＳＶ−２生ワクチンの保護効力に寄与し得る可能性を提起する。
【０１８３】
ＨＳＶ−２に対する免疫の相関を検出するための回帰分析の使用
ＨＳＶ−２ワクチン誘発試験をいくつか試みて、ＨＳＶ−２誘発後の疾患スコア、生存、または体重増加に関して、ＨＳＶ−２に対する保護を測定した［Ｋｈｏｄａｉら、２０１１年；ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、１９９６年；Ｐｙｌｅｓら、２００２年］。ノンパラメトリック統計（すなわち、疾患および生存の）、または接線のパラメータ（すなわち、体重増加）は、試験下で主要変数であるＨＳＶ−２に対する保護の弱い尺度である可能性がある。対照的に、ＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出における低減は、ＨＳＶ−２に対する保護の正確な尺度であり、約５００倍の範囲を超えて変動する。保護のこの頑強な尺度の使用により、目または膣のＨＳＶ−２排出における低減により測定される通り、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（ｘ）の増大がＨＳＶ−２に対する保護（ｙ）に相関するか否かを決定するための本試験において、直線回帰分析が適用できるようになる（図２Ｃ、３Ｃおよび４Ｃ）。
【０１８４】
直線回帰分析は、２変数間に相関が存在するか否かを決定するのに利用可能な、最も強力な統計上のツールの１つである。本試験は、適応免疫応答のパラメータとＨＳＶ−２に対する保護との間の相関を検出するために、回帰分析に第一に適用されると考えられている。この技術革新は、本試験の成功に決定的であった。回帰分析により２つのパラメータ間の相関を検出する能力は、３つの変数に依存する。変数１は、データセットにおける、マッチさせたｘ、ｙデータ対の数である。変数２は、ｘ変数およびｙ変数の測定の精度である。変数３は、それにわたって相関が観察され得る、ΔｘおよびΔｙの範囲である。
【０１８５】
変数２に関して、本明細書で紹介したフローサイトメトリーアッセイは、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの推定値の精度および感度を改善し（図６および９Ｃ）、よって、抗体捕捉ＥＬＩＳＡに比べた相関のｒ２値を改善した。この技術革新は、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ（ｘ変数）とＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出における低減（ｙ変数）との間の相関を検出する能力を増強した。
【０１８６】
変数３に関して、本試験がＨＳＶ−２０ΔＮＬＳワクチンなど１ワクチンのモダリティにもっぱら注目した場合、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの観察された範囲（Δｘ）は非常に狭かったため（約５倍）、意味のある相関を検出することができなかった（図３Ｃおよび４Ｃ）。しかし、独立した３つの誘発実験において６つのＨＳＶ−２免疫源を使用したことにより、試験は、観察される汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルの範囲を約５００倍の範囲に拡張することができた（図２Ｃ、３Ｃおよび４Ｃ）。よって、本試験の成功は、それにわたって試験がＨＳＶ−２誘発ウイルスの排出（ｙ）における比例的な低減に対して試験することができた、５００倍の範囲の汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベル（Δｘ）を集合的に提供した、合計ｎ＝１１７の動物の使用に大いに依存するものであった。
【０１８７】
結論
本試験は、本開示が、ワクチン接種したマウスおよびモルモットにおいて、いくつかのワクチンに対する汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体の応答は、ＨＳＶ−２に対する保護に比例して変動することを実証することを説明するものである。この同じ取組みが、ＨＳＶ−２ワクチンのヒト臨床試験における有用なスクリーニングツールを提供し得る可能性がある。結果に基づくと、最も強力で耐久性のある汎ＨＳＶ−２ＩｇＧ抗体のヒトにおける応答を誘発するＨＳＶ−２ワクチン製剤は、ＨＳＶ−２性器ヘルペスに対して最大の保護を誘発しなければならない。しかし、ＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護の潜在的な相関として提唱される汎ＨＳＶ−２ＩｇＧの有用性は、ヒトでは未だ試験されていない。したがって、数年のうちにこの予測を試験し、汎ＨＳＶ−２ＩｇＧレベルが、ヒトにおいてＨＳＶ−２に対するワクチン誘発性の保護の有用な相関を提供するか否かを決定すれことに興味が持たれる。
【０１８８】
【表１】
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【０１８９】
本明細書に引用する特許、特許出願および文献は各々、参照により組み込まれる。冠詞の「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」の使用は、１つ以上を含むものとされる。
【０１９０】
本発明の血清学的アッセイのいくつかの特定の実施形態が本明細書に記載されているが、当業者であれば、より広い態様における本発明から逸脱せずに、および以下の特許請求の範囲に記載する通り、本明細書に対して変更および修飾を行うことができることが理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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