(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブと、を含み、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記プローブは、標識子を内包する両親媒性粒子；凝集することによりウイルスを検出する有機・無機粒子；これらの組合よりなる群から選択されたもの；である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び/又は融合する表面タンパク質を含む、
前記有機・無機粒子において、無機物質は、金及び銀よりなる群から選択された一つ以上である、
前記有機・無機粒子において有機物質は、無機物質の安定化剤である、
ウイルス検出用キット。
【請求項２】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス又はパラミクソウイルスである、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項３】
前記ウイルスの表面タンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、スパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又はＦタンパク質（Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である、請求項１又は２に記載のウイルス検出用キット。
【請求項４】
前記酵素は、フーリン、トリプシン、セリン、エンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項５】
前記酵素は、組換えヒトフーリン、組換えマウスフーリン、トリプシン−ＥＤＴＡ、アセチル化されたトリプシン、ＴＰＣＫ−トリプシン、アクリリックトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ａｃｒｙｌｉｃ）、フーリン型プロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、膜貫通セリンプロテアーゼ（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｒｉｎｅ）、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４、トリプターゼクララ（Ｔｒｙｐｔａｓｅ  ｃｌａｒａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、セリン系プロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、サブチリシン型エンドプロテアーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上である、請求項４に記載のウイルス検出用キット。
【請求項６】
前記プローブは、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイドソーム（ｃｏｌｌｏｉｄｓｏｍｅ）、ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）又は液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）の形態である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項７】
前記標識子は、自己消光された染料、蛍光染料、電気化学発光物質及びこれらの組合よりなる群から選択されたものである、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項８】
前記両親媒性粒子は、親水性高分子及び疎水性高分子を含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項９】
前記親水性高分子は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリアクリリックアシッド（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン及びポリアクリルアミドよりなる群から選択される一つ以上である、請求項８に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１０】
前記疎水性高分子は、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリホスファジン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリバリン、ポリフェニルアラニン、ポリフロリン、ポリグリシン及びポリメチオニンよりなる群から選択される一つ以上である、請求項８に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１１】
前記無機物質の安定化剤は、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１２】
前記有機・無機粒子は、両親媒性高分子をさらに含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１３】
前記両親媒性高分子は、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂタイプの両親媒性ブロック共重合体、Ｂ−Ａ−Ｂタイプの三重ブロック共重合体又は脂質である、請求項１２に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１４】
前記キットは、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１５】
前記キットは、生体分子の反応補助剤をさらに含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１６】
前記生体分子の反応補助剤は、ケトンである、請求項１５に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１７】
ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブと、を含み、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記プローブは、標識子を内包する両親媒性粒子；凝集することによりウイルスを検出する有機・無機粒子；これらの組合よりなる群から選択されたもの；である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び/又は融合する表面タンパク質を含む、
前記有機・無機粒子において、無機物質は、金及び銀よりなる群から選択された一つ以上である、
前記有機・無機粒子において有機物質は、無機物質の安定化剤である、
ウイルス検出用組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含む、請求項１７に記載のウイルス検出用組成物。
【請求項１９】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス又はパラミクソウイルスである、
請求項１７に記載のウイルス検出用組成物。
【請求項２０】
前記酵素は、フーリン、トリプシン、セリン、エンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１７に記載のウイルス検出用組成物。
【請求項２１】
個体から収得した試料をウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、
前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階と、を含み、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記プローブは、標識子を内包する両親媒性粒子；凝集することによりウイルスを検出する有機・無機粒子；これらの組合よりなる群から選択されたもの；である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び/又は融合する表面タンパク質を含む、
前記接触は、ｐＨ６以下の条件下で行われる、
前記有機・無機粒子において、無機物質は、金及び銀よりなる群から選択された一つ以上である、
前記有機・無機粒子において有機物質は、無機物質の安定化剤である、
ウイルス検出方法。
【請求項２２】
前記検出方法は、試料に接触したプローブの蛍光強度の変化を測定する段階をさらに含む、請求項２１に記載のウイルス検出方法。
【請求項２３】
前記検出方法は、試料に接触したプローブの表面増強ラマンスペクトルの変化を測定する段階をさらに含む、請求項２１に記載のウイルス検出方法。
【請求項２４】
前記検出方法は、試料に接触したプローブに流れる電流の変化を測定する段階をさらに含む、請求項２１に記載のウイルス検出方法。
【請求項２５】
前記検出方法は、試料に接触したプローブの色変化を観察する段階をさらに含む、請求項２１に記載のウイルス検出方法。
【請求項２６】
前記検出方法は、試料に接触したプローブの凝集可否を確認する段階をさらに含む、請求項２１に記載のウイルス検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス検出用キット、ウイルス検出方法及びウイルス検出用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、細菌よりサイズが小さい伝染性病原体である。遺伝物質であるＲＮＡ又はＤＮＡと、該遺伝物質を取り囲んでいるタンパク質とで構成される。ウイルスは、宿主の種類によって、植物ウイルス、動物ウイルス及び細菌ウイルス（ファージ）に区分できる。しかし、大部分の場合、核酸の種類によって、ＤＮＡウイルス亜門とＲＮＡウイルス亜門とに分けられ、これらは、さらに、綱、目、科に細分化される。
【０００３】
このようなウイルスのうち、 鳥インフルエンザは、ニワトリ、アヒル、又は野生鳥類において鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染して起きる急性ウイルス性伝染病であり、珍しいことに、ヒトにも感染症を起こす。鳥インフルエンザウイルスは、病原性によって、高病原性、低病原性及び非病原性の３種類に区分され、２００３年末から２００８年２月までヒトに伝染されることもできる高病原性鳥インフルエンザウイルス（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ、Ｈ５Ｎ１）の人体感染事例が６４０件以上報告された。鳥インフルエンザは、鳥類の高い斃死率と産卵率の低下により莫大な経済的被害を引き起こし、人体感染可能性が高いものではないが、人体に感染される場合、高い死亡率を示す。根本的なワクチン開発が難しくて、拡散速度が非常に速いため、早期診断を通じて疾病の拡散及び経済的損失を最小化することが必要である。
【０００４】
このようなウイルスの診断方法としては、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）及び免疫蛍光検定法（ＩＦＡ）などの免疫学的検出方法と、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ検出方法などが知られたが、このような方法は、ウイルス診断に過度な時間がかかるか、高価の検査費用を必要とするか、非特異的な反応による特異度及び敏感度が低下するなどの問題がある。
【０００５】
したがって、低費用で短時間内に効率的にウイルスを検出する方法の開発が求められことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、短時間内に効率的にウイルスの検出が可能なウイルス検出用キット、ウイルスの検出方法及びウイルス検出用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含むウイルス検出用キットを提供する。
【０００８】
本発明は、また、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含むウイルス検出用組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、また、個体から収得した試料をウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階と、を含むウイルス検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、低費用でウイルスを短時間内に高効率で検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一例によるインフルエンザウイルス検出方法の模式図を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一例による両親媒性粒子（ＦｌｕＳｏｍｅ）の形状を観察したＴＥＭイメージを示す図である。
【図３】図３は、本発明の一例による両親媒性粒子の平均粒径を示す図である。
【図４】図４は、本発明の一例による両親媒性粒子のＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）効果を確認した結果を示す図である。
【図５】図５は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用してインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用して多様なインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図７ａ】図７は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用して多様なインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図７ｂ】図７は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用して多様なインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図７ｃ】図７は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用して多様なインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図７ｄ】図７は、本発明の一例による両親媒性粒子を利用して多様なインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図８】図８は、本発明の一例による有機・無機粒子を利用してインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図９】図９は、本発明の一例による有機・無機粒子を利用したインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図１０ａ】図１０は、表面増強ラマン散乱信号の測定を通じてインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図１０ｂ】図１０は、表面増強ラマン散乱信号の測定を通じてインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図１０ｃ】図１０は、表面増強ラマン散乱信号の測定を通じてインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、目視で色の変化を観察することによってインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の一例によるリポソームを利用してインフルエンザウイルスを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
インフルエンザウイルス、エボラウイルスを含んですべてのウイルスは、宿主細胞侵入のために宿主細胞に結合する表面タンパク質であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）、成熟したビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が宿主細胞から放出されるのに関与するノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）、水素イオン濃度の均衡を調節するＭ２イオンチャネル、ウイルスの遺伝情報を持っているＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）などよりなる。
【００１３】
本発明者らは、前述したウイルスの共通された特性に基づいて、ウイルスを早期に検出できる方法を開発するために研究した。その結果、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子を通じてウイルスを活性化し、かくして活性化されたウイルスと反応し、前記ウイルスの存在有無を検出できるプローブを利用して、簡単な方法でウイルスを検出できることを知見し、本発明を完成した。
【００１４】
したがって、本発明は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含むウイルス検出用キットを提供する。
【００１５】
本発明において使用した用語「ウイルス」は、偏性細胞内寄生体（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒａｓｉｔｅ）であって、核酸としてＤＮＡ又はＲＮＡを有し、増殖は、核酸から始まり、二分裂増殖されず、ＡＴＰ生産に必要な酵素系を持っていないことを意味する。本発明のウイルスは、露出ウイルス（ｎａｋｅｄ  ｖｉｒｕｓ）と外膜ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）を含み、具体的に、本発明の一例によるウイルスは、外膜ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）であることができる。
【００１６】
前記外膜ウイルスは、具体的に、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）及びヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）を含むＤＮＡウイルスと、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヘパタイティスＤ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）及びレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を含むＲＮＡウイルスに属するものであれば、すべて含む。
【００１７】
前記オルトミクソウイルスは、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス（ｉｓａｖｉｒｕｓ）、トゴトウイルス（ｔｈｏｇｏｔｏｖｉｒｕｓ）及びクアランジャウイルス（ｑｕａｒａｎｊａｖｉｒｕｓ）属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００１８】
前記コロナウイルスは、アルファコロナウイルス（ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス（ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス（ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）及びデルタコロナウイルス（ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００１９】
前記パラミクソウイルスは、パラミクソウイルス、ルブラウイルス、モルビリウイルス及びニューモウイルス属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００２０】
前記ウイルスは、核酸と、これを取り囲んでいるタンパク質を含む。このようなウイルスのタンパク質は、ウイルス遺伝物質を保護し、ウイルス粒子が細胞に吸着及び／又は融合するのに関与し、ウイルスの抗原性を決定し、ウイルスの形態を維持する構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と、タンパク質と核酸などを合成するのに関連するタンパク質である非構造タンパク質（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。
【００２１】
本発明において使用した用語「ウイルスの表面タンパク質」は、前記構造タンパク質を意味する。具体的に、本発明の「表面タンパク質」は、ウイルスの特異抗原性を持って、ウイルスが細胞に吸着及び／又は融合するのに関与する外膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）に存在する外在性タンパク質は、すべて含む。一例として、本発明のウイルスは、糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよく、細胞への融合（ｆｕｓｉｏｎ）に関与する融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。
【００２２】
本発明の一例によれば、前記ウイルスの表面タンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、スパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又はＦタンパク質（Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。
【００２３】
本発明の一例によれば、本発明のウイルスは、宿主細胞の細胞膜に吸着し、膜融合を起こす表面タンパク質を含むものであることができる。具体的に、本発明のウイルスは、不活性型状態に存在する表面タンパク質が生体分子により活性型に変わると、宿主細胞の細胞膜と吸着及び／又は膜融合を起こす性質を有する表面タンパク質を含むものであることができる。
【００２４】
本発明の一例によれば、「ウイルス」は、インフルエンザウイルス又は高病原性インフルエンザウイルスであることができる。インフルエンザウイルスは、「ウイルスの表面タンパク質」として、糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。ヘマグルチニンは、一つのポリペプチド（前駆体ＨＡ０）で発現された後、タンパク質の加水分解によってＨＡＯの切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）がＨＡ１及びＨＡ２に分けられると、酸性条件の下で疎水性アミノ酸残基で構成された融合ペプチド（ｆｕｓｉｏｎｐ  ｅｐｔｉｄｅ）が活性化される。ＨＡは、インフルエンザウイルスの病原性の程度によって切断部位のアミノ酸と融合ペプチドのアミノ酸の構成が異なる。
【００２５】
本発明の他の一例によれば、「ウイルス」は、コロナウイルスであることができる。コロナウイルスは、表面タンパク質としてスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含み、前記スパイクタンパク質は、Ｓ１とＳ２部位を含む。スパイクタンパク質のＳ１部位が宿主細胞に結合すると、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によってＳ１とＳ２に切断され、Ｓ２の終端部分にある疎水性部位が露出され、活性化される。
【００２６】
本発明のさらに他の一例によれば、「ウイルス」は、パラミクソウイルスであることができる。パラミクソウイルスは、表面タンパク質としてＨＮタンパク質（ＨＮ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。ＨＮタンパク質は、ウイルスを宿主細胞に付着又は吸着させる付着（又は吸着）タンパク質であって、ウイルス不活性状態では、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）ＨＮ０として存在するが、加水分解によってＣ−末端でアミノ酸残基が除去されると、活性化される。また、パラミクソウイルスは、表面タンパク質としてＦタンパク質（Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。Ｆタンパク質は、ウイルス不活性状態で前駆体Ｆ０として存在するが、生体分子によりＦ１とＦ２に切断された後、新しいＮ−末端形態のＦ１として活性化される。前記Ｆタンパク質は、切断部位に多塩基性残基を有するものと、単一塩基性残基を有するものをすべて含む。好ましくは、多塩基性残基を有するＦタンパク質であることができる。
【００２７】
本発明において使用した用語「反応」は、或る物質が他の物質と接触し、状態、色、形状又は化学結合などの物理及び／又は化学的状態の変化が起こること、又はその現象を意味する。
【００２８】
一具体例において、ウイルスの表面タンパク質が生体分子と反応する場合、ウイルスの表面タンパク質が変化し、融合ペプチドなどを形成するなどの活性化されたウイルスに状態変化が起こる。他の具体例において、活性化されたウイルスとプローブの反応は、融合反応又は凝集反応であることができる。
【００２９】
前記融合反応は、一具体例において、活性型ウイルスと本発明のプローブの一部が結合される現象であることができる。融合反応は、融合によってプローブ内部の物質などが外部に排出される現象まで含むものと理解され得る。一例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがエンドソームの細胞膜を融合する原理を利用して、活性型ウイルスとプローブの融合可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。
【００３０】
前記凝集反応は、溶液内で分子又は粒子などが互いにくっついて結合する現象を意味する。本発明の一具体例において、凝集反応は、検出対象であるウイルスによって本発明のプローブの安定性が低くなって、プローブ同士が互いに結合して、凝集及び／又は沈殿される現象を意味する。
【００３１】
本発明において使用した用語「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、生物の構造、機能、情報伝達などに必要な分子を意味する。前記生体分子は、機能、情報伝達などを行うための特異的構造及び／又は部位を含むことができる。このような生体分子の特異的構造は、分子間の結合反応を通じて反応を起こす原動力である。生体分子は、アミノ酸とタンパク質、糖と炭水化物、脂肪酸と脂質、及びヌクレオチドと核酸などを含み、生体内で作われたもの及び／又は人為的に合成されたものをすべて含む。本発明の一例によれば、「生体分子」は、約６２個〜２５００個のアミノ酸残基よりなるタンパク質である酵素であることができる。
【００３２】
一つの具体例において、前記酵素は、タンパク質分解酵素であることができる。一例として、最初合成された形態では不活性化されているが、特定部位が除去（又は切断）されると、活性を示すタンパク質において、タンパク質分解酵素は、前記特定の部位を切断（ｃｌｅａｖｅ）し、不活性化タンパク質を活性化させる。タンパク質分解酵素は、特定の部位を切断すできるものであれば、種類に制限なしに使用できる。
【００３３】
一具体例において、タンパク質分解酵素は、フーリン（ｆｕｒｉｎ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、エンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上であるこどができる。前記タンパク質分解酵素は、誘導体又は改質された形態をすべて含む。例えば、タンパク質分解酵素は、組換えヒトフーリン、組換えマウスフーリン、トリプシン−ＥＤＴＡ、アセチル化されたトリプシン、ＴＰＣＫ−トリプシン（Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ−ｔｒｙｐｓｉｎ）、アクリリックトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ａｃｒｙｌｉｃ）、フーリン型プロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、膜貫通セリンプロテアーゼ（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｒｉｎｅ）、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４、トリプターゼクララ（Ｔｒｙｐｔａｓｅ  ｃｌａｒａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、セリン系プロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、サブチリシン型エンドプロテアーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）及びこれらの組合を含むことができる。
【００３４】
一具体例において、トリプシンがインフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）と反応する場合、トリプシンの酵素分解作用は、Ｈｉｓ５７−Ａｓｐ１０２−Ｓｅｒ１９５位置で起こり、フーリンの酵素分解作用は、Ｈｉｓ１９４−Ａｓｐ１５３−Ｓｅｒ３６８位置で起こる。トリプシンは、高病原性及び低病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを全部分解できるため、トリプシンを利用して高／低病原性インフルエンザウイルスを検出できる。また、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのみを分解できるため、フーリンを利用して高病原性インフルエンザウイルスを検出できる。
【００３５】
他の一具体例において、タンパク質分解酵素とコロナウイルスの表面タンパク質が反応する場合、加水分解酵素の作用は、Ｓ１とＳ２の部位の境界で起こる。したがって、前記加水分解酵素の作用によって切断後、Ｓ２の疎水性部位が露出されることによって、コロナウイルスが活性化され、本発明のプローブを利用して検出できる。
【００３６】
さらに他の具体例において、パラミクソウイルスの表面タンパク質と反応する生体分子は、Ｃ−末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｓｉｄｅ）のアルギニン残基で切断が可能なタンパク質分解酵素又はカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ）であることができる。前記タンパク質分解酵素は、Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ配列を含むＦタンパク質を認識して切断し得る。具体的な例として、フーリン又はサブチリシン型エンドプロテアーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）であることができる。
【００３７】
本発明において使用した用語「活性型ウイルス」又は「活性化されたウイルス」は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子によりウイルスの表面タンパク質が活性化されたウイルスを意味する。ここで、ウイルスの表面タンパク質が活性化されたというのは、ウイルスの表面タンパク質が宿主細胞及び／又はプローブと反応、例えば特異的に反応し得る状態に変化したことを意味する。ここで、「ウイルスの活性化」は、不活性型ウイルスが前記活性型ウイルスに変換される過程を意味する。ウイルスが感染を起こすためには、ウイルスの活性化過程が必須に要求されるので、前記活性型ウイルスの存在有無を検出することによって、ウイルスによる感染可否を判別できる。
【００３８】
一つの具体例において、ウイルス表面タンパク質が活性化されたものというのは、ウイルスの表面タンパク質に存在する融合タンパク質又は融合ペプチドが宿主細胞の膜又は本発明のプローブの表面と融合反応を起こすことができる状態であることを意味する。
【００３９】
一つの具体例において、インフルエンザウイルスの場合、活性化されたウイルスとは、表面タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）が酵素により分解され、不活性形態からヘマグルチニンの内部に存在する融合ペプチドが露出した形態に変換されたことを意味する。すなわち、前記ＨＡの切断部位を特異的に分解する酵素には、フーリン及び／又はトリプシンが含まれる。フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのみを分解できるため、インフルエンザウイルスのＨＡがフーリンにより分解される場合、前記インフルエンザウイルスは、高病原性を示す。また、トリプシンは、高病原性及び低病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを全部分解できるため、トリプシンにより分解される場合には、高病原性又は低病原性を示す。低病原性インフルエンザウイルスの切断部位は、Ｃ−末端が−Ｒ−よりなり、高病原性インフルエンザウイルスの切断部位は、Ｒ／Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒよりなる。
【００４０】
ＨＡの切断部位を特異的に分解する酵素によってＨＡが活性化されると、ＨＡの再配列が起こり、ＨＡ内の融合ペプチドが外側に露出し、活性型ウイルスになる。このように、酸性条件の下で活性化されたインフルエンザウイルスが本発明の一例によるプローブに会うと、インフルエンザウイルスの融合ペプチドによってインフルエンザウイルスとプローブの反応が起こる。プローブの反応によって変わる信号を測定することによって、ウイルス感染可否を検出できる。
【００４１】
他の具体例において、コロナウイルスの場合、活性化されたウイルスというのは、表面タンパク質であるスパイクタンパク質（Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が生体分子により不活性形態からスパイクタンパク質の内部に存在した疎水性部位が露出した形態に変換されたことを意味する。具体的に、スパイクタンパク質のＳ１部分が宿主細胞と結合すると、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によりＳ１とＳ２に切断され、Ｓ２の終端部にある疎水性部位が露出し、ウイルスが活性化される。前記Ｓ２で露出した疎水性部位が宿主細胞の細胞膜内疎水性領域に付着され、他の一方は、ウイルス外膜と結合された状態でＳ２部位の中間が折れる構造変形（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ）が起こり、膜融合が起こる。したがって、本発明のプローブと活性化されたコロナウイルスが会って反応すると、プローブの安定性に変化が起こり、多様な信号を発生し、前記変化を測定することによって、ウイルス感染可否を検出できる。
【００４２】
さらに他の具体例において、パラミクソウイルスで活性化されたウイルスというのは、ＨＮタンパク質が生体分子によりＣ−末端の残基が除去された状態を意味する。具体的に、ＨＮタンパク質は、不活性化状態（ＨＮ０）を維持しつつ、Ｃ−末端の約９０個の残基が除去されると、ＨＮタンパク質が活性化され、宿主細胞又は標的の膜にパラミクソウイルスが付着される。また、活性型パラミクソウイルスは、Ｆタンパク質が生体分子によりＦ１とＦ２に切断された状態を意味する。不活性型パラミクソウイルスにおいてＦタンパク質は、前駆体Ｆ０状態で、生体分子に会うと、Ｆ１とＦ２に切断され、宿主細胞の細胞膜と融合できる活性型ウイルスになる。すなわち、ＳＳ−結合鎖Ｆ１とＦ２を含有する活性表面タンパク質を形成し、広範囲な疎水性を示すＦ１のＮ−末端残基を宿主細胞の細胞膜又はターゲットの細胞膜に固定しながら膜融合が始まる。したがって、パラミクソウイルスは、本発明の生体分子が表面タンパク質と反応して活性化され、さらに活性化されたウイルスが本発明のプローブと反応し、プローブの変化を起こす。したがって、前記変化を測定することによって、ウイルスを検出できる。
【００４３】
本発明において「プローブ」は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子により活性化されたウイルスと反応して、前記ウイルス又は活性型ウイルスの存在有無を検出できる物質を意味する。プローブは、ウイルス以外の物質又は不活性型ウイルスと比較して活性型ウイルスとの反応能力が格別に優れているか、又は、活性型ウイルスと特異的に反応し、活性型ウイルスの存在有無を有意に検出できる物質であれば、すべて含まれ、その種類及び形態は、特に制限されない。本明細書で前記プローブは、「検出因子」と混用して使用される。
【００４４】
本発明のプローブは、検出対象ウイルス又はウイルスの表面タンパク質の種類によって多様な構造又は形態を示すことができる。
【００４５】
本発明の一具体例において、プローブは、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造を有することができる。
【００４６】
本発明において使用した用語「膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造」とは、膜又はシェル（ｓｈｅｌｌ）によって内部が取り囲まれている構造を意味する。ベシクル（ｖｅｓｉｃｅｌ）、人工細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ）又はマイクロカプセルのようなカプセル形態の粒子（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、その種類を制限せず、すべて含む。本明細書で前記膜構造は、シェル（ｓｈｅｌｌ）構造と混用して使用する。前記膜構造は、前記内部には、流体又は別途の構成を含む構造まで含む。
【００４７】
前記膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）又は二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）構造を含む。前記単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）は、「疎水性領域−親水性領域」を含む膜構造であって、一具体例において、水溶性溶液内で疎水性コアと親水性シェルを含む構造であることができる。前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、「親水性領域−疎水性領域−疎水性領域−親水性領域」を含む膜構造である。一具体例において、前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、前記２個の単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）が結合された形態であることができる。また、前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、親水性コアと前記親水性コアを取り囲んでいる疎水性領域及び前記疎水性領域を取り囲んでいる親水性シェルを含む構造であることができる。
【００４８】
前記膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造は、単一膜（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）及び単一膜を２つ以上有する多重膜（ｍｕｌｔｉｍｅｍｂｒａｎｅ）をすべて含む。一例として、単一膜を有する粒子がさらに一つの単一膜で取り囲まれた場合、多重膜を有する粒子になり得る。前記単一膜及び多重膜は、単一層及び二重層と区別される概念である。具体的に、二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）構造の膜を一つだけ含む粒子は、単一膜を有するものであり、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）構造の膜を含む粒子をさらに単一層構造の膜が取り囲んでいる粒子は、多重膜構造の粒子を意味する。
【００４９】
前記膜構造を有するプローブは、本発明の属する通常の方法によって製造され得、一具体例において、微細溶液化装備を利用した微細流動化方法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｚａｔｉｏｎ）、超高圧均質法（Ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、乳液法（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）又は超音波などを利用して製造できるが、これに制限されるものではない。
【００５０】
前記膜構造を有する粒子は、その種類に制限されず、すべて本発明のプローブに含まれることができる。一具体例として、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイドソーム（ｃｏｌｌｏｉｄｓｏｍｅ）、ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）及びこれらの組合よりなる群から選択されたものを含むが、前記例に制限されるものではない。
【００５１】
前記「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）」は、疎水性コアと親水性シェルを有する粒子を意味する。一具体例において、前記ミセルは、界面活性剤のミセル又は高分子自己組織化ミセルであることができる。自己組織化によるミセルの場合、共重合体を形成する高分子の種類によって多様な形態を有することができ、その形態に制限を受けるものではない。前記ミセルは、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を２つ以上含む多重膜形態をも含む。前記ミセルは、その形態の制限はないが、一例によって、球形、楕円形（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）又はシリンダー形（ｃｙｌｉｎｄｅｒ）を含む。前記ミセル構造のプローブは、疎水性コア領域に標識子及び無機粒子のような構成をさらに含むことができる。
【００５２】
前記「ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）」は、「親水性領域−疎水性領域−疎水性領域−親水性領域」を有する２重層膜構造を持って、前記疎水性及び親水性領域に高分子又は共重合体を含む粒子を意味する。前記高分子又は共重合体は、人為的に合成されたものと脂質（ｌｉｐｉｄ）を一緒に含むか、人為的に合成されたものを含むことができる。前記人為的に合成されたものは、自然的に発生する脂質（ｌｉｐｉｄ）を除いたすべての高分子及び共重合体を含む意味である。前記ポリマーソームは、二重層膜構造の単一膜及び単一膜を２つ以上含む多重膜をすべて含む。
【００５３】
前記ポリマーソームは、リポソームと区分して人為的に合成された高分子又は共重合体を含むことができる。前記ポリマーソームは、二重層形態の膜だけよりなる単一膜及び前記２重層の単一膜を２つ以上含む多重膜形態をも含む。
【００５４】
前記「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）」は、少なくとも一つの脂質二重層を有する粒子を意味する。両親媒性の生体膜を模倣した脂質膜を有するものであれば、単一膜及び多重膜をすべて含む。リポソームを形成する方法は、当業界によく知られており、通常、リン脂質を塩類水溶液中に懸濁するか、リン脂質を含む水溶液を超音波処理などを行うことによって収得することができるが、製造方法によって本発明が制限されない。
【００５５】
前記「コロイドソーム」は、１ｎｍ〜１０００ｎｍサイズのコロイド状粒子又は前記粒子が緻密にパッキングされた構造物を意味する。膜を形成する親水性及び疎水性領域の高分子の種類によって、単一層及び二重層を含むことができる。また、単一膜及び多重膜をすべて含む。
【００５６】
前記「液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）」は、前記膜構造粒子中において水玉の形態を示すものを意味する。単一層及び二重層を含み、単一膜及び多重膜をすべて含む。
【００５７】
本発明のプローブは、形態（ｓｈａｐｅ）によって区分できるが、前記形態に制限されない。一具体例において、前記プローブの形態（ｓｈａｐｅ）は、ロッド（ｒｏｄ）、球、リング（ｒｉｎｇ）、板（ｆｌａｔ）、シリンダー、楕円形、膜で取り囲まれた形態及びこれらの組合を含む。
【００５８】
前記ロッド（ｒｏｄ）形態は、ロッド、棒又は竿のような一直線形態を総称する意味である。前記球形態は、丸い形の形態を意味するもので、完全球形と不完全球形をすべて含む。前記リング（ｒｉｎｇ）形態は、一般的に、球又は円形の形態において中央が空いている形態を意味する。前記板（ｆｌａｔ）形態は、薄くて、平たい形態の平板、板状の形態を意味する。一具体例において、板形態のプローブは、基材又は担体の上部又は外部に板状のプローブがコーティングされた形態であることができる。
【００５９】
本発明のプローブは、前記プローブを構成する成分又は活性型ウイルスと反応する方法によって区分できる。
【００６０】
本発明の一具体例において、前記プローブは、標識子を含む両親媒性粒子；有機・無機粒子；抗体；アプタマー；及びこれらの組合よりなる群から選択されたもの；であることができる。
【００６１】
本発明の一例によれば、「標識子を含む両親媒性粒子」は、前記プローブと活性型ウイルスの反応可否を判別できる標識子を内部に含む両親媒性プローブであることができる。両親媒性というのは、親水性及び疎水性の性質を共に有するものを意味する。前記両親媒性プローブの形態は、単に両親媒性を示すものであれば、特に制限されない。
【００６２】
本発明において「標識子」は、プローブと活性型ウイルスの反応可否を判別できる物質を意味する。標識子の種類は、特に制限されず、プローブの反応前後の変化によって特性が変化し、試験などを通じて前記変化した特性を確認できる標識子であれば、制限なしに利用可能である。例えば、プローブの融合可否を判別できる標識子は、自己消光された染料（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）、蛍光染料（ｄｙｅ）、電気化学発光物質及びこれらの組合よりなる群から選択され得る。
【００６３】
本発明において自己消光された染料は、染料（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）が互いに隣接する位置にある場合には、消光作用が起こり、結合している染料が放出され、広がると、脱消光作用によって蛍光が現われる物質を意味する。
【００６４】
一具体例において、自己消光された染料は、３、３−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（３、３−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ；Ｄｉｏ；Ｄｉｏｃ）、３、３−ジオクタデシル−５、５−ジ（４−スルホフェニル）オキサカルボシアニンソジウム塩（３、３−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−５、５−ｄｉ（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、４−（４−（ジヘキサデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド（４−（４−（ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＤｉＡ；４−Ｄｉ−１６−ＡＳＰ）、４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド（４−（４−（Ｄｉｄｅｃｙｌａｍｉｎｏ）Ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ；４−Ｄｉ−１０−ＡＳＰ）、１、１−ジオクタデシル−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（１、１−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ；Ｄｉｌ）、１、１−ジオクタデシル−６、６−ジ（４−スルホフェニル）−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニン（１、１−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−６、６−Ｄｉ（４−Ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）、４、４−ジイソチオシアナトスチルベン−２、２−ジスルホン酸ジソジウム塩（４、４−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２、２−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ；ＤＩＤＳ）、１、１−ジオクタデシル−３、３、３、３−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（１、１−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ；ＤｉＲ）、１、１−ジオレイル−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニン（１、１−ｄｉｏｌｅｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）、フルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）、テトラメチルローダミン （Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、オクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）及びアロピコシアニン（ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）よりなる群から選択される一つ以上であることができる。前記蛍光染料の平均粒径は、２００ｎｍ以下、又は５０ｎｍ〜１００００ｎｍであることができる。
【００６５】
一具体例において、電気化学発光物質は、これに制限されるものではないが、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］を含む。
【００６６】
本発明において蛍光染料（ｄｙｅ）は、蛍光を示す物質であって、光に含まれた波長を吸収し、色光を替えて再放射する性質を有する物質を意味する。蛍光染料は、発光染料とも言い、当業界によく知られている蛍光染料を制限なしに利用できる。一具体例において、蛍光染料は、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ；ＮＢＤ−Ｃｌ）、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）及び芳香族基を含む化合物よりなる群から選択される一つ以上であることができる。
【００６７】
一具体例において、燐光染料は、照明光中で吸収した波長を替えて再放射することによって、光輝性効果を示す物質を意味する。一例として、硫化鉱物（ＸｍＺｎＸは、金属原素、Ｚは、非金属元素）又はアルカリ土金属の硫化物であることができるが、その種類に制限されない。
【００６８】
本発明において両親媒性粒子は、親水性を示す領域と疎水性を示す領域を有する粒子を意味する。両親媒性粒子は、親水性領域及び疎水性領域がある粒子であれば、制限なしに利用可能である。両親媒性粒子は、親水性高分子、疎水性高分子、脂質高分子及びこれらの組合を含む。前記高分子は、共重合体形態で含まれることができる。
【００６９】
一具体例において、親水性高分子は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリアクリリックアシッド（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及び親水性ポリアミノ酸よりなる群から選択される一つ以上及びその誘導体を含む。例えば、親水性高分子は、（モノ）メトキシポリエチレングリコール、（モノ）アセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリグルタミン、ポリグルタミン酸、ポリスレオニン、ポリアスパラギン、ポリアルギニン及びポリセリンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。また、前記親水性高分子は、その誘導体を含む。例えば、前記ポリエチレングリコールの誘導体は、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）であることができる。
【００７０】
一具体例において、疎水性高分子は、親水性高分子とともに両親媒性粒子を形成できる物質であれば、制限なしに利用可能である。例えば、疎水性高分子は、ポリエステル、ポリアンヒドリド、疎水性ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファジンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。前記ポリアミノ酸は、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリバリン、ポリフェニルアラニン、ポリフロリン、ポリグリシン、ポリトリプトファン、ポリアラニン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、及びポリメチオニンよりなる群から一つ以上を含む。また、前記疎水性高分子は、その誘導体を含む。
【００７１】
本明細書で使用した用語「脂質」又は「脂質高分子」は、二重層の膜構造を形成できるものであれば、リン脂質、脂質タンパク質、糖脂質、陽イオン性脂質などをすべて含み、その種類に制限されない。また、前記脂質は、自然的に誘導されて得られたもの及び合成された脂質誘導体をすべて含む。前記リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）は、グリセロリン脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓ  ｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）及びスフィンゴリン脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）を含む。前記グリセロリン脂質は、ジアクリルグリセリド構造を有するものであることができ、具体的に、ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＡ）、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＣ）、セファリン（ｃｅｐｈａｌｉｎ）及びホスホイノシタイド類（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ）を含む。前記セファリンリン脂質は、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）及びホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）を含む。また、前記ホスホイノシタイド類リン脂質は、ホスファチジルイノシトール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールフォスフェート（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ２）及びホスファチジルイノシトール三リン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ３）を含む。前記スフィンゴリン脂質は、セラミドホスホリルコリン（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、Ｃｅｒ−ＰＥ）及びセラミドフォスフォリルリピッド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ）を含む。
【００７２】
前記合成リン脂質誘導体は、その種類に制限されないが、一具体例として、１、２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＥＰＣ、１、２−ｄｉｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１、２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ、１、２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＯＰＳ、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ）及びこれらの組合よりなる群から選択され得る。
【００７３】
本発明の一例による両親媒性粒子は、公知された方法を自由に利用して製造し得る。例えば、親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性ブロック共重合体を水溶液に分散させた後、超音波を加える方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で有機溶媒を抽出又は蒸発させる方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で透析する方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、均質器又は高圧乳化器を利用して強く溶媒を蒸発させる方法、又は薄膜水和法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）などを使用して製造し得る。
【００７４】
前記両親媒性粒子に使用される高分子の種類、製造方法によって多様な構造及び形態を有するプローブが形成され得る。
【００７５】
本発明の一具体例において、両親媒性粒子は、膜構造を有する粒子であることができ、具体的に、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイドソーム（ｃｏｌｌｏｉｄｓｏｍｅ）、ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、及びこれらの組合よりなる群から選択された構造であることができる。
【００７６】
本発明の一具体例において、両親媒性粒子が下記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が０．２５〜０．４０を満足するとき、両親媒性粒子は、ポリマーソーム形態を示し、質量分率が０．４０超過且つ０．７０以下であるとき、両親媒性粒子は、ミセル構造を示す。
【００７７】
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子の質量／（親水性高分子の質量＋疎水性高分子の質量）
【００７８】
また、前記質量分率を質量％（ｐｅｒｃｅｎｔ）で示す場合、質量％が２５％〜４０％を満足するとき、両親媒性粒子は、ポリマーソーム形態を示し、質量％が４０％超過７０％以下であるとき、両親媒性粒子は、ミセル構造を示す。
【００７９】
一具体例において、両親媒性粒子のサイズは、制限されない。両親媒性粒子は、ナノ又はマイクロ粒子であることができ、例えば、両親媒性粒子の平均粒径は、５０〜１００００ｎｍであることができる。
【００８０】
本発明の他の一例によれば、プローブは、「有機・無機粒子」であることができる。
【００８１】
前記有機・無機粒子プローブの場合、活性型ウイルス又は活性化された表面タンパク質とプローブの反応によって前記プローブの溶液内安定性が低くなって、凝集が起こる。したがって、前記反応の有無によって本発明の有機・無機粒子プローブを利用してウイルスを検出できる。
【００８２】
本発明において使用した用語「有機・無機粒子」は、有機物質と無機物質を含む粒子を意味する。具体的に、無機物質よりなるコアの表面（又はシェル）に有機物質がコーティング又は結合されている形態の粒子であることができる。前記有機・無機粒子の形態は、制限されず、一具体例において、ロッド（ｒｏｄ）形、球形、シリンダー形、板（ｆｌａｔ）形、楕円形又はリング形などの形態であることができる。
【００８３】
前記無機物質は、金属よりなることができ、前記金属は、一例として、金、銀、これらを含む混合物及びその組合であることができる。好ましくは、金、銀及びこれらの組合であることができる。
【００８４】
前記有機物質は、無機物質の安定化剤であることができる。本発明において、用語安定化剤は、粒子の凝集を防止するための物質を意味し、分散剤と混用して使用される。前記安定化剤は、好ましくは、金属の安定化剤であることができる。前記安定化剤は、無機物質が溶媒内でよく分散した状態に維持されるようにするものであれば、その種類に関係なく含まれ、一例として、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）であることができる。
【００８５】
前記界面活性剤の具体的な例に制限されず、陽イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤をすべて含む。具体的に、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ、Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＴＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＴＡＢ）、Ｔｗｅｅｎ２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、Ｔｗｅｅｎ４０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ）、Ｔｗｅｅｎ８０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００よりなる群から選択された一つ以上であることができる。
【００８６】
本発明の一具体例において、有機・無機粒子は、両親媒性高分子をさらに含むことができる。前記両親媒性高分子は、有機・無機粒子の表面に両親媒性高分子が結合された状態であるか、両親媒性高分子層又は両親媒性高分子シェル（ｓｈｅｌｌ）構造にコーティングされた状態であることができる。
【００８７】
本発明の一具体例において、両親媒性高分子をさらに含む有機・無機粒子は、両親媒性高分子と有機・無機粒子の表面との間に作用基層をさらに含むことができる。具体的な例において、前記作用基層は、無機粒子の表面に結合がよくできる作用基を有する化合物を結合させ、前記化合物に高分子層を結合する構造であることができる。
【００８８】
前記作用基を有する化合物は、無機粒子の表面に−ＳＨ結合が可能なものであれば、すべて使用でき、一例としてシステアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を使用できるが、これに制限されない。
【００８９】
本発明の一具体例において、前記無機粒子が金である場合、金粒子の表面にＳＨ結合が可能な化合物を結合して作用基層を形成し、前記作用基と両親媒性高分子を結合する構造を有することができる。
【００９０】
本発明の一具体例において、前記両親媒性高分子を含む有機・無機粒子は、作用基層と両親媒性高分子の結合との間にアミノ酸重合を開始するための作用基をさらに含むことができる。前記作用基は、ＮＨ２であることができる。
【００９１】
前記両親媒性高分子は、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂタイプの両親媒性ブロック共重合体又はＢ−Ａ−Ｂタイプの三重ブロック共重合体形態であることができる。また、前記両親媒性高分子は、脂質であることができる。
【００９２】
一具体例において、親水性Ａブロックは、親水性高分子として、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリリックアシッド（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、親水性ポリアミノ酸及びその誘導体よりなる群から選択される一つ以上であることができる。好ましくは、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体、ポリグルタミン、ポリグルタミン酸、ポリスレオニン、ポリアスパラギン、ポリアルギニン、ポリセリン及びポリビニルピロリドンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。親水性Ａブロックは、２００〜５０，０００ダルトン又は１，０００〜２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。
【００９３】
一具体例において、疎水性Ｂブロックは、疎水性高分子であることができる。具体的に、ポリエステル、ポリアンヒドリド、疎水性ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファジンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。好ましくは、疎水性Ｂブロックは、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリバリン、ポリフェニルアラニン、ポリフロリン、ポリグリシン、ポリメチオニン、ポリトリプトファン、ポリアラニン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとカプロラクトンの共重合体、及びポリグリコリドとカプロラクトンの共重合体よりなる群から選択される一つ以上であることができる。疎水性Ｂブロックは、５０〜５０，０００ダルトン、又は２００〜２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。
【００９４】
前記有機・無機粒子は、安定剤として、両親媒性高分子の存在の下で、イオン状態の無機物と前記無機物を還元させることができる還元剤を一緒に反応させて製造し得る。有機・無機粒子の製造時、使用される安定剤として、セチルトリメチルアンモニウムブロミドを含むが、これに制限されない。また、前記有機・無機粒子が両親媒性高分子層をさらに含む場合、有機・無機粒子の安定剤の役目をすることができる二重層構造を有することが好ましい。
【００９５】
一具体例において、有機・無機粒子のサイズは、制限されず、ナノ又はマイクロサイズであることができる。例えば有機・無機粒子の平均粒径は、５０〜１０００ｎｍであることができる。
【００９６】
本発明の有機・無機粒子は、エマルジョン法、薄膜水和法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）又は透析方法（ｄｉａｌｙｓｉｓ）を利用して製造され得る、具体的な製造条件は、有機物質及び無機物質、そして高分子の種類によって通常使用される範囲内で変更して行われることができる。
【００９７】
本発明の有機・無機粒子は、ウイルスとの反応可否をさらに明確に判断するために、標識子をさらに含むことができる。
【００９８】
本発明のさらに他の一例によれば、プローブは、「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」であることができる。本発明において使用した用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、単一、二重螺旋のＤＮＡ、ＲＮＡ形態で標的分子に結合できる物質を意味する。
【００９９】
本発明のさらに他の一例によれば、プローブは、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」であることができる。本発明において使用した用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、アミノ酸と糖鎖で結合されたタンパク質であって、標的分子に結合できる物質を意味する。
【０１００】
本発明において前記標的分子は、活性型ウイルス、活性化された表面タンパク質、活性型ウイルスの抗原性を示すタンパク質及びこれらの組合であることができる。前記アプタマー又は抗体は、標的分子に特異的に結合できるものであり、好ましくは、標的分子に相補的に結合できる構造を有するものであることができる。
【０１０１】
前記アプタマー又は抗体の場合、活性型ウイルス、活性化された表面タンパク質及び／又は活性型ウイルスの抗原性タンパク質とアプタマー又は抗体の特異的結合反応の有無によってウイルスを検出できる。
【０１０２】
本発明の一具体例において、前記標的分子は、ウイルスの表面タンパク質に存在する膜融合タンパク質であることができる。また、一具体例において、インフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニン（ＨＡ）の融合ペプチドであることができる。前記ＨＡの融合ペプチドの検出のためのアプタマー又は抗体は、前記融合ペプチドに特異的に結合できる相補的構造又は配列を含む。また、コロナウイルスの場合、スパイクタンパク質であることができ、パラミクソウイルスの場合、Ｆタンパク質であることができる。
【０１０３】
前記アプタマー又は抗体は、標的分子との結合反応をさらに容易又は明確に確認するために、金属粒子又は標識子をさらに含むことができる。
【０１０４】
本発明の一具体例によるアプタマー又は抗体の製造方法は、当業界によく知られており、公知された方法を利用してアプタマー又は抗体を製造、選別し得る。また、アプタマー又は抗体の結合可否を確認する方法は、当業界によく知られている。例えば、アプタマー又は抗体を金粒子に結合して使用する場合、金粒子に結合されたアプタマー又は抗体がウイルスの融合ペプチドに結合すると、粒子のサイズ変化によって色の変化が現われる。このような色の変化を観察することによって、活性型ウイルスを検出できる。
【０１０５】
本発明のキット又は組成物は、前記プローブを単一種類だけ含むか、２種類以上のプローブを一緒に含むことができる。
【０１０６】
本発明の一具体例において、キット又は組成物は、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含むことができる。例えば、ｐＨ６以下の酸性物質は、酸性溶液であることができ、前記ｐＨ範囲の酸性溶液をキットに含むこともでき、使用時、直接製造して使用することもできる。ｐＨ６以下の酸性溶液は、前記ｐＨ条件を満足する溶液であれば、制限なしに使用できる。市販される保存溶液を利用することもでき、直接製造して使用することもできる。例えば、濃い酸性溶液である保存溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をｐＨ６以下になるように水に希釈して使用できる。例えば、前記酸性溶液は、ｐＨ４〜６又はｐＨ５〜ｐＨ５．７であることができる。前記範囲が、宿主細胞内のｐＨ範囲と同様なので、検出効率を高めることができる。
【０１０７】
一具体例において、本発明のキット及び組成物は、反応補助剤をさらに含むことができる。
【０１０８】
前記反応補助剤は、生体分子とウイルスの反応を補助する生体分子の反応補助剤であることができ、又はプローブと標的分子の反応を補助する反応補助剤であることができる。具体的な一例として、タンパク質分解酵素と表面タンパク質の反応を補助する補助剤、又はプローブと活性型ウイルス活性化された表面タンパク質、活性型ウイルスの抗原性タンパク質を含む標的分子との反応を補助する補助剤であることができる。
【０１０９】
本発明において使用した用語「補助剤」は、前記などの作用を通じてウイルスの検出敏感度及び／又は特異度を高めることができるものであれば、すべてを含む意味である。前記ウイルスの検出敏感度及び／又は特異度を高めるものの例として、反応の速度を速くするか、反応が起こる最小値を低める作用又は表面タンパク質と生体分子の反応外に、他の反応を抑制する作用があるが、前記メカニズムに制限されない。補助剤は、生体分子及びこれと反応する表面タンパク質の種類によって検出敏感度及び／又は特異度を高めることができるものであれば、種類に制限なしにすべてを含む。
【０１１０】
具体的な一例として、前記補助剤は、ケトンであることができる。
【０１１１】
前記ケトン化合物は、例えばフェニルエチルクロロメチルケトン、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ、Ｔｏｓｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）及びこれらの組合を含むが、これに制限されない。
【０１１２】
本発明の一具体例において、インフルエンザウイルスの検出時、補助剤としてケトンをさらに含むことができる。この場合、他の酵素の活性を低め、ヘマグルチニン（ＨＡ）分解酵素、特にトリプシンの活性を高め、キットの敏感度をさらに高めることができる。
【０１１３】
本発明は、ウイルス検出方法に関する。
【０１１４】
本発明の検出方法は、試料を生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料をプローブに接触させる段階とを含む。具体的に、個体から収得した試料をウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階とを含む。
【０１１５】
本発明の検出方法は、前記接触によって起こる反応の可否を確認することによって、ウイルスを検出できる。一例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがエンドソームの細胞膜を融合する原理を利用して、活性型ウイルスとプローブの融合反応可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。他の例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがプローブの安定性を低める原理を利用して、プローブの凝集反応可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。
【０１１６】
本発明において反応の可否を確認する方法で、反応によるプローブの信号又は変化を測定できる。一例として、活性型ウイルスとプローブが反応する場合に現われる変化又は信号は、蛍光強度、発光強度、燐光強度、吸光強度、電気的信号、表面増強ラマン分光（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＲＳ）信号、ＦＥＴ（ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）、色及びプローブの分散度よりなる群から選択された一つ以上の変化であることができるが、これに制限されない。
【０１１７】
例えば、プローブの反応可否を判別できる標識子として自己消光された染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブとの融合が起こると、プローブ内に担持された自己消光された染料のような標識子が放出され、脱消光が起こり、蛍光が現われる。したがって、蛍光強度の変化を測定することによって、ウイルスの感染可否を検出できる。
【０１１８】
また、プローブの反応可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブとの融合が起こると、プローブ内に担持された蛍光染料が放出され、蛍光強度を測定することによって、ウイルスの感染可否を検出できる。蛍光強度外に、発光強度、燐光強度、吸光強度も、蛍光強度と同様に、波長によって変わるため、これらを測定し、ウイルスの感染可否を検出できる。特に、蛍光染料のうち、ルミノールやフラーレンなどは、特別な機器により蛍光強度を測定することなく、目視でも色の変化を感知できる。
【０１１９】
蛍光染料以外にも、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］）のような電気化学発光物質を含むことができ、この場合、目視で色の変化観察が可能である。
【０１２０】
また、ナノギャップセンサーを利用して電気的信号を測定することによって、ウイルスを検出できる。電気的信号は、電流変化を測定するか、又はＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）を利用して測定することもできる。ナノギャップセンサーとは、ギャップの間隔が約１００ｎｍ以下の電極が含まれたセンサーを意味する。例えば、プローブの反応可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブの融合が起こると、プローブ内部の蛍光染料が放出され、ナノギャップセンサーのナノギャップに位置する。この際、ナノギャップセンサーにあらかじめ位置させた金、銀、クロム、チタン、白金、銅、パラジウム、ＩＴＯ（ｉｎｄｉｕｍ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ）、又はアルミニウムなどの金属粒子の電流変化を測定することによっで、ウイルスの感染可否を検出できる。金属粒子の平均粒径は、数ナノメートルであることができ、例えば、２〜４ｎｍであることができる。
【０１２１】
また、表面増強ラマン分光信号を測定し、ウイルスを検出できる。表面増強ラマン分光信号を測定するために、試料と結合可能な基材を利用できる。基材は、ナノ粒子、コロイド、液状であることができるが、これに制限されない。例えば、プローブの融合可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブの融合が起こると、プローブ内部の蛍光染料が放出される。放出された蛍光染料を基材と結合させた後、前記基材と結合された蛍光染料にさらに金属粒子を導入する。金、銀などの金属粒子を導入することによって、ラマン分光を増幅させることができる。その後、ラマン分光器で前記蛍光染料のラマンスペクトルを測定することによって、ウイルスの感染可否を検出できる。
【０１２２】
他の例として、活性型ウイルスによってプローブの凝集が起こることによって、プローブの凝集可否、すなわち分散度の変化を確認することによって、ウイルスを検出できる。例えば、プローブとして有機・無機粒子を利用する場合、活性型ウイルスによって有機・無機粒子の安定性が低くなるにつれて、前記粒子の凝集が起こる。
【０１２３】
本発明の一具体例において、活性型ウイルスに存在する融合ペプチドが有機・無機粒子の周辺に存在する界面活性剤などの安定化剤又は両親媒性高分子を引き寄せて、有機物質の安定性が低下し、これによって、有機・無機粒子同士の凝集が起こる。このような凝集可否は、目視でも容易に観察でき、簡易にウイルス感染可否を検出できる。
【０１２４】
一具体例において、少なくとも一つ以上の段階は、ｐＨ６以下の条件下で行われることができる。例えば、ｐＨ４〜ｐＨ６、ｐＨ５〜ｐＨ５．５の酸性条件の下で行われることができる。本発明の一具体例において、インフルエンザウイルスを検出する場合、酸性条件で行うことが、宿主細胞内環境と非常に類似の条件を提供でき、検出正確度を高めることができる利点がある。
【０１２５】
本発明の一具体例によるインフルエンザ検出方法に対する模式図を図１に示した。要約するに、ｐＨ６以下、ｐＨ４〜ｐＨ６、又はｐＨ５〜ｐＨ５．５の下で、フーリン及び／又はトリプシンが存在するウェルに個体から収得した試料を入れ、前記試料内に存在するインフルエンザウイルスを活性化した後、本発明の一例によるプローブを処理する。インフルエンザウイルスが存在する場合、融合ペプチドによって活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応が起こり、反応可否によって変わる信号を測定することによって、インフルエンザウイルスの存在有無が分かる。前記で記述したように、活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応は、融合又は凝集であることができる。前記活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応及びこれによって変わる信号について、前述した通りである。
【０１２６】
本発明において使用した用語「試料」は、ウイルスの検出のために母体を代表するように採取されたものを意味する。一具体例において、試料は、唾液、口腔粘膜又は糞尿試料であることができる。
【０１２７】
本発明は、また、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含むウイルス検出用組成物に関する。前記でウイルス検出キット及びウイルス検出方法について記述したすべての内容がウイルス検出用組成物にも適用又は準用され得る。
【０１２８】
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されない。
【０１２９】
［実施例］
【０１３０】
［製造例１］自己消光された染料（Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）が担持された宿主細胞模倣型両親媒性粒子（ＦｌｕＳｏｍｅ）形態のプローブ製造
【０１３１】
宿主細胞表面のような両親媒性の二重層粒子を製造するために、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ共重合体を利用して、標識子を内部に含んでいるミセル（Ｍｉｃｅｌｌｅ）又はポリマーソーム（Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）形態の両親媒性粒子形態のプローブを製造した。
【０１３２】
具体的に、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ（Ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）を２ｍＬに分散させた後、自己消光された染料でＤｉＯ（Ｅｘ：４８４ｎｍ）及びＤｉｌ（Ｅｍ：５６５ｎｍ）を溶解し、過量の水で透析し、自己消光された染料が担持された両親媒性粒子を製造した。ｍＰＥＧ高分子とポリラクチド（ＰＬＡ高分子）の分子量の質量分率が０．３になるようにし、ポリマーソームを製造し、前記質量分率が０．７になるようにして、ミセルをそれぞれ製造した。
【０１３３】
製造された両親媒性粒子の形状をＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）イメージで確認した。
【０１３４】
その結果、図２に示されたように、疎水性コアと親水性シェルを有するミセル形態の球形粒子及び疎水性メンブレインで取り囲まれている親水性コア及び親水性シェルを有するポリマーソーム形態の球形粒子が製造されたことを確認することができた。
【０１３５】
また、製造された両親媒性粒子のサイズをＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法を利用して測定した。
【０１３６】
その結果、図３に示されたように、両親媒性粒子のサイズが、ミセルの場合、３６．７９±１．５２ｎｍ、ポリマーソームの場合、１２２．１２±２．５０ｎｍであることが確認された。
【０１３７】
また、前記ポリマーソームの分子量は、６７００ｇ／ｍｏｌであり、製造したミセルは、分子量が４５００ｇ／ｍｏｌであった。
【０１３８】
また、前記共重合体の種類だけをｍＰＥＧ−ｂ−ポリロイシン（ｐｏｌｙ  ｌｅｕｃｉｎｅ）ブロック共重合体に変更して前記と同一の方法で両親媒性粒子形態のプローブを製造した。
【０１３９】
［製造例２］有機・無機粒子プローブの製造
【０１４０】
ゴールドイオンであるゴールドクロリドトリハイドレート（Ｇｏｌｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に安定剤として界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と還元剤ナトリウムボロハイドライド（Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、シード溶液（ｓｅｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作って、安定剤ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、ゴールドクロリドトリハイドレート（Ｇｏｌｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、還元剤であるシルバーニトラート（Ｓｉｌｖｅｒ  ｎｉｔｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と前記シード溶液を順に添加し、ゴールド粒子の表面が安定化剤ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドでコーティングされたロッド形態の有機・無機粒子を製造した。
【０１４１】
製造された有機・無機粒子を観察した結果、ゴールドナノロッド形態であり、粒子のサイズは、平均１０ｎｍであった。
【０１４２】
［製造例３］両親媒性高分子を含む有機・無機粒子プローブの製造
【０１４３】
有機・無機粒子と両親媒性高分子を反応させて、両親媒性高分子を含む有機・無機粒子プローブを製造した。
【０１４４】
具体的に、安定剤としてセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の存在の下でイオン状態の金（ｇｏｌｄ）と還元剤を反応させて、製造例２と同一の方法で有機・無機粒子を製造した。次に、４−アミノチオフェノール（４−Ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）とポリフェニルアラニン（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）を１：３５モル比で含む共重合体を用意し、製造された有機・無機粒子とｍＰＥＧ−ｐＰｈｅ（ポリフェニルアラニン）共重合体を混合及び撹拌し、前記ゴールドナノロッドの表面に高分子を接着させて、両親媒性高分子を含む有機・無機粒子を製造した。これをテトラヒドロフラン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ、ＴＨＦ）に溶かし、回転しつつ、ＴＨＦを蒸発させ、フラスコ壁面に沿って薄いフィルムを形成させた後、前記フィルムを水和させて、ゴールドナノロッド−高分子が自己組織化されたミセル形態の有機・無機粒子プローブを製造した。
【０１４５】
［製造例４］リポソーム構造の両親媒性粒子プローブ製造
【０１４６】
製造例１の両親媒性粒子の製造方法において下記条件外に同一の方法で製造し、リポソーム形態のプローブを製造した。
【０１４７】
具体的に、ホスファチジルコリン、コレステロール及びモノフォスフォリルリピッドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ；ＭＰＬ）を５：２：０．０２重量部で混合し、有機物質が総１０ｍｇになるようにして、クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ、ＣＦ）１ｍＬに分散させた後、ＣＦを蒸発させた後、形成されたフィルムに自己消光された染料（Ａｖａｎｔｉ購入）でＤｉＯ（Ｅｘ：４８４ｎｍ）及びＤｉｌ（Ｅｍ：５６５ｎｍ）４０μｇを入れ、６０℃で１２時間水和させた後、１２時間撹拌し、透析する方法で、自己消光された染料が担持されたリポソーム粒子を製造した。
【０１４８】
［実験例１］ＦｌｕＳｏｍｅのＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）効果確認
【０１４９】
製造例１の方法によって製造された両親媒性粒子形態のプローブ（ＦｌｕＳｏｍｅ）のＦＲＥＴ効果を確認するために、インフルエンザウイルスがない状態での消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）及び脱消光（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）効果を確認した。
【０１５０】
インフルエンザウイルスがない状態で、陰イオン性界面活性剤として二重層構造を分解させて、粒子を崩壊させるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を利用して脱消光効果を確認した。蛍光測定器の一種であるｈｙｂｒｉｄｍｕｌｔｉ−ｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）で蛍光強度を測定した。
【０１５１】
その結果、図４に示されたように、フーリン、トリプシン、又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を処理した直ち、及び処理２時間後、酵素を処理しない対照群、フーリン処理群及びトリプシン処理群は、蛍光強度に変化がないが、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を処理した群は、蛍光強度に変化があることを確認することができた。フーリン及びトリプシン処理群の場合、インフルエンザウイルスがない場合には、フーリン及びトリプシンを処理しても、ウイルスの活性化及び融合ペプチドによる融合作用が起こらないため、何らの変化がなかった。一方、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって両親媒性粒子が崩壊された場合には、自己消光された染料の脱消光によって蛍光強度に変化が現われた。
【０１５２】
［実験例２］ＦｌｕＳｏｍｅを利用したインフルエンザウイルス検出確認
【０１５３】
製造例１の方法によって製造された両親媒性粒子形態のプローブ（ＦｌｕＳｏｍｅ）の高病原性インフルエンザウイルスの検出能力を確認する実験を行った。
【０１５４】
具体的に、高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に分解できるフーリン（ｆｕｒｉｎ）と、低病原性及び高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に分解できるトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を利用して前記酵素処理によって高／低病原性インフルエンザウイルスを検出できるかを確認した。
【０１５５】
低病原性インフルエンザウイルスは、緑十字社の医薬品から、高病原性ウイルスは、Ｈａｎｏｉ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅから提供されて使用した。
【０１５６】
ＦｌｕＳｏｍｅ単独処理群（酵素を含まない群）とそれぞれの酵素処理群を分け、酸性条件（ｐＨ５．５）の可否によって各実験群の蛍光強度の変化を測定した。ｐＨ５．５になるように、酸性保存溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をＦｌｕＳｏｍｅを含む溶液に混合した。蛍光強度の測定結果を下記表１及び図５に示した。下記表１で、第一の行は、高病原性インフルエンザウイルス、第二の行は、低病原性インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）、そして、第三の行は、低病原性インフルエンザウイルス（Ｈ９Ｎ２）に対する蛍光強度の測定結果である。
【０１５７】
【表１】
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【０１５８】
図５及び表１に示されたように、酵素を含まない群、非酸性条件の実験群では、プロープの蛍光変化が観察されなかった。しかし、高病原性インフルエンザウイルス実験群において酸性条件が満足された場合、ＦｌｕＳｏｍｅとフーリンを一緒に処理した場合、ＦｌｕＳｏｍｅとトリプシンを一緒に処理した場合、及び酸性条件でＦｌｕＳｏｍｅ、フーリン及びトリプシンを一緒に処理した場合、すべての場合において、ＦｌｕＳｏｍｅ内の自己消光された染料が脱消光され、蛍光が検出されることを確認し、これは、酸性条件、ヘマトグルチニン分解酵素及びＦｌｕＳｏｍｅを利用して高病原性インフルエンザウイルスを特異的に検出できることを意味する。
【０１５９】
［実験例３］ＦｌｕＳｏｍｅを利用した多様な高病原性インフルエンザウイルス検出確認
【０１６０】
ＦｌｕＳｏｍｅの多様な高病原性インフルエンザウイルスの検出効能を確認するために、高病原性インフルエンザウイルスの種類を異ならしめて、実験例２と同一の方法でＦｌｕＳｏｍｅの高病原性インフルエンザウイルス検出能力を確認した。すべての実験は、同一の酸性条件（ｐＨ５．５）の下で行い、高病原性インフルエンザウイルスとして、５つの種類のＨ５Ｎ１タイプウイルスを使用した。
【０１６１】
蛍光強度測定結果を下記表２、図６及び図７に示した。
【０１６２】
【表２】
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【０１６３】
表２及び図６に示されたように、フーリンを処理した場合、ＦｌｕＳｏｍｅ内の自己消光された染料が脱消光され、蛍光が検出されることを確認することができた。
【０１６４】
また、図７に示されたように、多様な高病原性インフルエンザウイルスにフーリン又はトリプシンを処理した場合、全部、５７０ｎｍの付近で蛍光が検出され、低病原性インフルエンザウイルスの場合、トリプシンを処理した場合にのみ、５７０ｎｍの付近で蛍光が検出されることを確認することができた。
【０１６５】
［実験例４］検出可能な高病原性インフルエンザウイルスの濃度確認
【０１６６】
本発明のプローブを利用して検出可能なインフルエンザウイルスの濃度を確認するために、製造例１によるＦｌｕＳｏｍｅ及び高病原性インフルエンザウイルスを利用して、ウイルスの濃度による蛍光強度の変化を測定した。実験群として、高病原性インフルエンザウイルス処理群、高病原性インフルエンザ及び糞便の混合処理群を設定し、対照群として糞便溶液処理群（糞便Ｓｌｎ）、ＤＰＢＳ処理群及び糞便処理群（糞便の種類によって総１０個の群を実験）を設定した。すべての実験群及び対照群を同一のｐＨ条件（ｐＨ５．５）の下で、フーリンを処理した後の蛍光強度変化を測定した。
【０１６７】
その結果を、下記表３に示した。
【０１６８】
表３
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１６９】
前記表３に示されたように、インフルエンザウイルスだけを処理する場合には、１／２〜１／（２７）濃度（希釈倍率）で蛍光強度が変わることを確認することができた。また、インフルエンザウイルスと糞便が混合処理された群の場合、１／１０以上で蛍光強度が変わることを確認することができた。これは、インフルエンザウイルスが１／２〜１／（２７）濃度で存在する場合、又はインフルエンザウイルスが糞便と混合して１／１０以上存在する場合、検出が可能であることを意味する。
【０１７０】
これとは異なって、糞便だけがある場合には、蛍光強度の変化がなかった。これは、蛍光強度の変化は、インフルエンザウイルスによって生じたものであり、糞便がこれに影響を及ぼさないことを意味する。
【０１７１】
［実験例５］両親媒性高分子を含む有機・無機粒子を利用したインフルエンザウイルスの検出確認
【０１７２】
有機・無機粒子のインフルエンザウイルスの検出効能を確認するために、製造例３の方法によって製造された両親媒性高分子を含む有機・無機粒子プローブと、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に分解する酵素としてフーリン、トリプシン及びＴＰＣＫ（Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）−トリプシンを利用して低病原性インフルエンザウイルスの検出効能を確認した。
【０１７３】
対照群として、酵素未処理群（両親媒性高分子を含む有機・無機粒子の粒子原液）を設定し、フーリン処理群、トリプシン処理群、ＴＰＣＫ−トリプシン処理群を実験群に設定した。すべての実験条件は、ｐＨ５．５の下で行い、対照群及び各実験群に低病原性ウイルスを処理した後、ウイルス処理前後の変化を目視で観察し、その結果を、図８に示した。
【０１７４】
図８に示されたように、酵素を処理しない対照群は、明らかな変化が現われなかったが、ＴＰＣＫ−トリプシン処理群の場合、ウイルスによって両親媒性高分子を含む有機・無機粒子の安定性が低くなって、凝集が生じ、沈殿及び塊が形成されたことを目視で明確に確認することができた。
【０１７５】
［実験例６］有機・無機粒子を利用したインフルエンザウイルスの検出確認
【０１７６】
ヘマグルチニン分解酵素によって活性化されたウイルスのペプチドは、有機・無機粒子プローブ（ＧＮＲ）が表面にある安定化剤と反応し、有機・無機粒子の凝集が起こるので、ウイルスが存在する場合、凝集可否によって速くウイルスを検出できる。したがって、このような有機・無機粒子のインフルエンザウイルスの検出効能を確認する実験を行った。
【０１７７】
製造例２の方法によって製造された有機・無機粒子プローブ（ＧＮＲ）と、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に分解する酵素として、フーリン、トリプシン及びＴＰＣＫ（Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）−トリプシンを利用して高病原性インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ６）の検出効能をｒａｐｉｄ  ｋｉｔを利用して確認した。Ｇ１、Ｇ２は、高病原性インフルエンザの検出を確認したものであり、Ｇ３は、低病原性インフルエンザウイルスの検出を確認したものである。
【０１７８】
また、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、酵素がない条件と、ビーグルの鼻から採取した鼻水を酵素、ｐＨ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れた条件でＧＮＲを入れた後、反応を確認した。その結果は、図９に示した。
【０１７９】
図９に示されたように、プローブがない陰性対照群及び酵素を含まない陰性対照群の場合、色の変化が観察されなかったが、Ｇ１、Ｇ２実験群の場合、すべての場合に色の変化が目視で観察され、Ｇ３である低病原性実験群の場合、フーリンだけを含む場合には、色の変化が低いことを除いて、目視で観察され得る水準の変化が感知された。したがって、本発明の有機・無機粒子プローブを利用する場合、インフルエンザウイルスの存否を速く検出できることを確認した。
【０１８０】
［実験例７］酵素補助剤の処理有無によるインフルエンザウイルス検出能確認
【０１８１】
ウイルスのヘマグルチニンを特異的に分解する酵素の補助剤をさらに含む場合、検出能の変化を確認する実験を行った。
【０１８２】
酵素補助剤としてケトンを使用し、製造例１の方法によって製造されたプローブ（ＦｌｕＳｏｍｅ）を利用し、ケトンをさらに含むことを除いて、実験例２と同一の方法で実験した。酵素補助剤としてケトンを処理した群をＴｒｙ−ＴＰＣＫで示した。
【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
【表５】
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【０１８５】
【表６】
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【０１８６】
その結果を表４〜表６に示されたように、すべての実験群においてＴｒｙ−ＴＰＣＫを処理した場合が、フーリンやトリプシン単独処理群と比べて検出能に優れていることを確認することができた。これは、酵素補助剤がヘマグルチニン分解酵素外に、他の酵素の活性を低減することによって、ヘマグルチニン分解酵素の活性を高めるからであると判断され、よって、これは、酵素補助剤を使用することによって、ウイルス検出能をさらに向上させて、少量のウイルスまで検出することができ、検出キットの敏感度を高めることができる。
【０１８７】
［実験例８］表面増強ラマン散乱信号の測定を利用したインフルエンザウイルス検出確認
【０１８８】
表面増強ラマン散乱信号の測定によるインフルエンザウイルス検出を確認するために、製造例１において自己消光染料の代わりに、ラマンレポーターである２−ナフタレンチオールを担持させて製造されたＦｌｕＳｏｍｅをウイルス試料と反応させた後、放出された２−ナフタレンチオールをナノサイズの金とコンジュゲーションした後、次の測定条件の下でラマン散乱信号の変化を観察した。測定条件：Ｌａｓｅｒ：７８５ｎｍ、Ｐｏｗｅｒ：０．７ｍＷ、Ｇｒａｔｉｎｇ：３００ｇｒ／ｍｍ、Ｈｏｌｅ：５００ｕｍ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｒａｎｇｅ：３００〜１７００ｃｍ−１、Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：１２０ｓｅｃ
【０１８９】
その結果、図１０に示されたように、ウイルスがない対照群と比べて、低病原性及び高病原性ウイルス実験群において、トリプシンとトリプシン−ＴＰＣＫ処理群において２−ナフタレンチオール−金コンジュゲートの存在によってラマン信号が変化したことを確認することができた。フーリンの場合、高病原性ウイルスが存在する場合にのみ、ラマン信号が変化したことを確認することができた。
【０１９０】
このような結果は、表面増強ラマン散乱信号を測定することによって、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を、トリプシンは、低病原性／高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出できることを確認した。
【０１９１】
［実験例９］目視で色変化の観察によるインフルエンザウイルス検出確認
【０１９２】
目視で色の変化を観察することによって、インフルエンザウイルス検出が可能であるかを確認するために、製造例１において自己消光染料の代わりに、フラーレン（ＴＣＩ）を担持させて製造されたＦｌｕＳｏｍｅをウイルス試料と反応させた後、放出されたフラーレンをトルエン溶液に加えて、色の変化を観察した。フラーレンは、炭素原子が球、楕円体、円周形状に配置された分子を意味する。
【０１９３】
その結果、図１１に示されたように、ウイルスがない対照群と比べて、低病原性及び高病原性ウイルス実験群において、トリプシンとトリプシン−ＴＰＣＫ処理群においてフラーレンの存在によって色が変化したことを目視で確認することができた。フーリンの場合、高病原性ウイルスが存在する場合にのみ、色が変化したことを確認することができた。
【０１９４】
このような結果は、フラーレンを利用した目視による色変化の観察によって、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出でき、トリプシンは、低病原性／高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出できることを意味する。
【０１９５】
［実験例１０］蛍光変化の測定によるインフルエンザウイルス検出確認
【０１９６】
蛍光染料を利用して蛍光変化を測定することによって、インフルエンザウイルス検出が可能であるかを確認するために、製造例１で自己消光染料の代わりに、蛍光染料であるルミノール（Ｓｉｇｍａ）を担持させて製造されたＦｌｕＳｏｍｅをウイルス試料と反応させた後、放出されたルミノールをアルカリ性水溶液で過酸化反応させて、ハイブリッド多重−モードマイクロプレートリーダー（ｈｙｂｒｉｄ  ｍｕｌｔｉ−ｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を利用して蛍光変化を測定した（Ｅｘ：３０３ｎｍ、Ｅｍ：４２５ｎｍ）。ルミノールは、アルカリ性水溶液で過酸化反応によって紫青色の蛍光を示すので、蛍光変化の測定によってウイルスの存在有無を検出できる。
【０１９７】
その結果、下記表７に示されたように、ウイルスがない対照群と比べて、低病原性及び高病原性ウイルス実験群において、トリプシンとトリプシン−ＴＰＣＫ処理群においてルミノールの過酸化によって蛍光強度が変化したことを確認することができた。フーリンの場合、高病原性ウイルスが存在する場合にのみ、蛍光強度が変化したことを確認することができた。
【０１９８】
【表７】
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【０１９９】
このような結果は、ルミノールを利用した蛍光強度の測定によって、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出でき、トリプシンは、低病原性／高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出できることを意味する。
【０２００】
［実験例１１］リポソームを利用したインフルエンザウイルス検出確認
【０２０１】
両親媒性粒子としてリポソームを利用してインフルエンザウイルス検出が可能であるかを確認するために、製造例４で製造されたリポソームをウイルス試料と反応させた後、実験例３と同一の方法で蛍光強度の変化を測定した。
【０２０２】
その結果、図１２に示されたように、ウイルスがない対照群と比べて、低病原性及び高病原性ウイルス実験群において、トリプシン処理によって蛍光強度が変化したことを確認することができた。フーリンの場合、高病原性ウイルスが存在する場合にのみ、蛍光強度が変化したことを確認することができた。
【０２０３】
このような結果は、両親媒性粒子としてリポソームを利用して、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出でき、トリプシンは、低病原性／高病原性インフルエンザウイルスの存在有無を検出できることを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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