(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基又はＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基、及び／又はＲＳＶ融合タンパク質の６２〜６９位若しくは６２〜７６位からのアミノ酸残基に特異的に結合することができ、前記ＲＳＶ融合タンパク質が、配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を有し、
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５Ｃ４によって産生される抗体であるか、又はそのヒト化抗体若しくはそのキメラ抗体であり、該ハイブリドーマ細胞株５Ｃ４は、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有し、
前記モノクローナル抗体が、
１）配列番号２０に記載される重鎖ＣＤＲ１、
２）配列番号２１に記載される重鎖ＣＤＲ２、
３）配列番号２２に記載される重鎖ＣＤＲ３、
４）配列番号２３に記載される軽鎖ＣＤＲ１、
５）配列番号２４に記載される軽鎖ＣＤＲ２、及び
６）配列番号２５に記載される軽鎖ＣＤＲ３
のＣＤＲを含む、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、下記の特徴の１つ以上を有する：
（１）前記モノクローナル抗体が、ａ）配列番号１７に記載される重鎖可変領域及びｂ）配列番号１９に記載される軽鎖可変領域を含み；
（２）前記その抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ又は単鎖抗体から選択され；
（３）前記モノクローナル抗体が非ＣＤＲ領域を含み、前記非ＣＤＲ領域がマウス種以外の種に由来し；
（４）前記モノクローナル抗体が、ＲＳＶに特異的に結合し、前記ウイルスに関する中和活性を有し；
（５）前記モノクローナル抗体が、ポスト−Ｆタンパク質に結合しない又は実質的に結合しないが、プレ−Ｆタンパク質に結合し、それを安定化し；及び
（６）前記モノクローナル抗体が、ヒトマウスキメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記単鎖抗体がｓｃＦｖである、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記非ＣＤＲ領域がヒト抗体に由来する、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有するハイブリドーマ細胞系５Ｃ４。
【請求項６】
プレ−Ｆタンパク質を安定化する、又は試料中のプレ−Ｆタンパク質の存在若しくはレベルを検出するための方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いるステップを含む上記方法。
【請求項７】
プレ−Ｆタンパク質又は抗原−抗体複合体を発現させるための方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、及びＦタンパク質をコードする核酸を細胞中で共発現させるステップを含む上記方法。
【請求項８】
（１）請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片；又は
（２）請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、及びＦタンパク質をコードする核酸
を含むキット。
【請求項９】
下記の１つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子：
（１）請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片；又は
（２）請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の単離された核酸分子又は請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤、及び請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、を含む薬学的組成物。
【請求項１３】
対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患を防止する、治療する又は阻害するために使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記ＲＳＶ感染に関連する疾患が肺炎である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記ＲＳＶ感染に関連する疾患が乳児の肺炎である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションとポスト−Ｆコンホメーションとを区別するための方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いるステップを含む上記方法。
【請求項１７】
対象がＲＳＶに感染しているかどうかを診断するためのキットの製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ウイルス学の分野、特に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンに関連する分野に関する。特に、本発明は、ＲＳＶ感染の防止のためのエピトープペプチド（又はそのバリアント）、並びにそのエピトープペプチド（又はそのバリアント）及び担体タンパク質を含む組換えタンパク質、並びにそのエピトープペプチド（又はそのバリアント）及びその組換えタンパク質の使用に関する。本発明はまた、そのエピトープペプチドに対する抗体、その抗体をコードする核酸分子、その抗体を生成するための細胞系、及びその使用に関する。さらに、本発明は、ＲＳＶ感染症に関連する１つ又は複数の症状を防止するための、本発明による組換えタンパク質又は抗体を含むワクチン又は薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、１９５０年代に発見されており、乳児における下気道感染の原因となる最も重要な病原体である。ＲＳＶは、ＵＳＡでは１歳未満の乳児が入院する主な理由であり（Ｄ．Ｋ．  Ｓｈａｙ，  Ｒ．Ｃ．  Ｈｏｌｍａｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ，  ２８２（１９９９）１４４０〜１４４６）、また５歳未満の小児が臨床診断をうける主な理由の１つである（Ｃ．Ｂ．  Ｈａｌｌ，  Ｇ．Ａ．  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６０（２００９）５８８〜５９８）。世界全体では、ＲＳＶによって引き起こされる３千万件を超える下気道感染が存在し、そのうちの３百万件を超えるケースは入院する必要がある。ＲＳＶは、５歳未満の小児が入院する最も一般的な理由である（Ｈ．  Ｎａｉｒ，  Ｗ．Ａ．  Ｂｒｏｏｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３７８（２０１１）１９１７〜１９３０）。ＲＳＶ感染率は、未熟児、気管支及び肺動脈低形成の乳児、先天性心疾患の乳児、及び免疫不全の乳児の５０〜７０％にまで達する（Ａ．Ｃ．  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｎ．Ｃ．  Ｂａｎａｓｉａｋ，  Ｐ．Ｊ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｕｒｓ，  ２９（２００３）４５２〜４５６）。毎年、１６００００〜６０００００の小児の死亡がＲＳＶに関連する（Ｔ．Ｓ．  Ｈｏｗａｒｄ，  Ｌ．Ｈ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ，  １３７（２０００）２２７〜２３２；Ｓ．  Ｌｅａｄｅｒ，  Ｋ．  Ｋｏｈｌｈａｓｅ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ，  １４３（２００３）Ｓ１２７〜１３２）。ＲＳＶに感染した乳児の入院期間は２．５月になりうることから、要する入院費はＵＳＡでは各年３．６〜５．７億ドルにまで達し得る（Ｅ．Ａ．  Ｓｉｍｏｅｓ．  Ｌａｎｃｅｔ，  ３５４（１９９９）８４７〜８５２）。高齢者もＲＳＶに感受性があり、各年１２０００超の高齢者がＲＳＶ感染で死亡しており、これは同じ群の人々におけるインフルエンザの死亡率の約１／３と計算される（Ａ．Ｒ．  Ｆａｌｓｅｙ，  Ｐ．Ａ．  Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３５２（２００５）１７４９〜１７５９；Ｗ．Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．Ｋ．  Ｓｈａｙ，  Ｅ．  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ，  ２８９（２００３）１７９〜１８６）。中国では、中国において開発された診断剤がないことに起因して、コストが高いことから、ＲＳＶ検出は広く適用されていない；したがって、これまで中国では、ＲＳＶの流行状況及び有害性は完全には明らかにされていない；しかしながら、いくつかの領域の研究は、ＲＳＶ感染が中国の小児においても下気道感染の誘発の原因となる重要な因子であることを示している（Ｘｕ  Ｇｕａｎｒｅｎ，  Ｓｕｎ  Ｓｏｎｇｗｅｎ，  Ｘｕ  Ｘｕｑｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  ４（２０００）３７〜３９；Ｘｉｅ  Ｊｉａｎｐｉｎｇ，  Ｈｅ  Ｃｕｉｊｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，  ３５（１９９７）４０２〜４０３；Ｚｈｕ  Ｒｕｎａｎ，  Ｄｅｎｇ  Ｊｉｅ，  Ｗａｎｇ  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２１（２００３）２５〜２��）。
【０００３】
今日まで、ＲＳＶに対して安全で有効なワクチンはいまだにない。ＲＳＶエピトープ（融合糖タンパク質Ｆ）を認識する唯一の中和抗体（パリビズマブ、商品名：シナジス）は、新生児において受身免疫効果を発生させることができることから、新生児における発生率を減少させる。その抗体剤は、ＲＳＶによって引き起こされる重大な下気道感染を防止するため、慢性肺疾患、気管支及び肺の異形成、又は先天性心疾患（Ｈ．Ｗ．  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｇ．  Ｃａｎｃｈｏｌａ，  Ｃ．Ｄ．  Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，  ８９（１９６９）４２２〜４３４）を有する、未熟児、及び高リスクの乳児に適用可能であるとして承認された。その抗体剤は、低い中和力価を有し、生産コストが高く、したがって、市場では非常に高価であり、その適用は感染のリスクが高い乳児に限定され、広く適用することはできない。
【０００４】
Ｓｙａｎｇｉｓの適用により、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に結合する中和モノクローナル抗体が臨床保護に使用することができること及びＦタンパク質が有効な中和活性部位を含有することが示されている。さらには、Ｆタンパク質は、ウイルスの表面にあり、細胞への進入及び合胞体の形成のため必要である。それ故、Ｆタンパク質は、防止性及び保護性の抗体をスクリーニングするための重要な標的タンパク質である。
【０００５】
ＲＳＶ（パラミクソウイルス科ニューモウイルス属のネガティブセンス、単一鎖、非セグメントＲＮＡウイルス）は、１５２２２ヌクレオチドを有し、１０の主タンパク質をコードしている。Ｆタンパク質（５７４アミノ酸の全長を有する）は、Ｎ−グリコシル化Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、ＲＳＶ感染の間に主な膜貫通タンパク質として重要な表面分子である。膜融合機構及びＦタンパク質のトリガリングプロセスに関しては、これまで依然として明らかにされていない。プレ融合Ｆコンホメーション（プレ融合Ｆ、プレ−Ｆ）が準安定で且つ高エネルギー状態にあるので、コンホメーションにおける変化が、標的細胞との結合に際して生じて、高度に安定なポスト−融合Ｆタンパク質（ポスト−融合Ｆ、ポスト−Ｆ）を形成し、ウイルス性膜の細胞膜への融合をもたらすことが推測されている。準安定性のプレ−Ｆコンホメーションと安定なポスト−Ｆコンホメーションの間の自由エネルギーの差は有意であるので、膜融合プロセスは可逆的ではない。ＭｃＬｅｌｌａｎら（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｍ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８４（２０１０）１２２３６〜１２２４４）は、哺乳動物発現システムを利用することによって安定なポスト−Ｆタンパク質構造を得た。
【０００６】
プレ−Ｆタンパク質は構造的に安定ではなく、いくつかの中間体を有するので、結晶を調製する手段によってプレ−Ｆタンパク質の構造を研究することは非常に困難である。したがって、ＭｃＬｅｌｌａｎら（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｍ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８４（２０１０）１２２３６〜１２２４４）は、既知の構造を有するＨＰＩＶ３プレ−Ｆタンパク質によりＲＳＶプレ−Ｆタンパク質の構造を刺激し、予測し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質がプレ−Ｆコンホメーションを有するであろうことを提案し、融合機構についての上記仮説も提案した。プレ−Ｆコンホメーションの正確な構造及び融合の間のコンホメーション変化プロセスに関して、安定なプレ−Ｆコンホメーションタンパク質を獲得することにより、さらに確認する必要がある。
【０００７】
今日、Ｆタンパク質の抗原エピトープを研究するための抗体のほとんどはＢａｌＢ／ｃマウスから単離され、中和エピトープはペプチドマッピング、抗体競合、及びエスケープ変異などの方法によって同定された。ウイルスの最も重要な表面の構造タンパク質の１つとして、Ｆタンパク質は、表面上に多くの中和抗体−認識エピトープを有する。現在、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の既知の中和抗体は、以下の抗原エピトープを主に対象とする（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｙ．  Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８５（２０１１）７７８８〜７７９６；Ｍ．  Ｍａｇｒｏ，  Ｄ．  Ａｎｄｒｅｕ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８４（２０１０）７９７０〜７９８２）。
【０００８】
エピトープＩ：エピトープＩに対する抗体は、残基ａ．ａ．２５５〜ａ．ａ．２７５を含むＦ１におけるエピトープを認識する、市販されている予防的なモノクローナル抗体シナジス及びその均等な誘導体モタビズマブを含む。ＭｃＬｅｌｌａｎら（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｍ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８４（２０１０）１２２３６〜１２２４４）は、モタビズマブモノクローナル抗体の結晶構造及びＦタンパク質のａ．ａ．２５３〜ａ．ａ．２７７残基のペプチドの結晶構造の分析によって、その領域が二次構造に基づいて「ヘリックス−ループ−ヘリックス」を形成することを示した。結晶構造は、モタビズマブモノクローナル抗体が、「ヘリックス−ループ−ヘリックス」の一面に結合すること、及びＡｓｎ２６８及びＬｙｓ２７２（その変異は抗体エスケープをもたらし得る）と水素結合又は塩橋相互作用を作ることを明らかにした。抗原エピトープＡ（モタビズマブが結合する）はポスト融合構造において著しくよく保存されており、抗体結合部位は十分に曝露される。モタビズマブ及びポスト−Ｆタンパク質の構造により、シナジス及びモタビズマブモノクローナル抗体が中和活性を有する機構が明らかにされた。このエピトープが、プレ−Ｆタンパク質のコンホメーションの内側に存在し、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質においては曝露されえないことを、ＲＳＶプレ−Ｆタンパク質構造のモデリングは示唆する。シナジス及びモタビズマブモノクローナル抗体が、ＲＳＶの細胞への融合のみを阻害でき、しかし、ＲＳＶの吸収を阻害できないことを、Ｇｒａｈａｍらは示した（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｙ．  Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８５（２０１１）７７８８〜７７９６；Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｍ．  Ｃｈｅｎ，  Ａ．  Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １７（２０１０）２４８〜２５０）。このことがプレ−Ｆタンパク質の結晶構造によってのみ確認できることは疑いない。
【０００９】
エピトープＩＩ：エピトープＩＩを認識する抗体は１３１−２ａを含み、これはＦ１のシステインリッチドメインを認識する。その抗体は５０％までＲＳＶウイルス感染を遮断することができ、これはエピトープが翻訳後に不均一性を有すること又はその抗体がウイルスの凝固などの間接的な効果による中和作用を発揮することを示している。その抗体は、エピトープＡ及びエピトープＣを認識する抗体とは異なり、ウイルスの標的細胞への吸収を部分的に遮断する。そのエピトープが、プレ−Ｆタンパク質のコンホメーションにおいてはウイルスの細胞膜に近く、ポスト−Ｆタンパク質のコンホメーションにおいては最上部に存在することが見込まれる。
【００１０】
エピトープＩＶ：認識領域はａ．ａ．４２２〜ａ．ａ．４３８であり、これは１９及び１０１Ｆなどのモノクローナル抗体に関する標的である。そのエピトープは、Ｆ１コンホメーションの相対的に保存的な領域にある。ＭｃＬｅｌｌａｎら（Ｊ．Ｓ．  ＭｃＬｅｌｌａｎ，  Ｙ．  Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ８５（２０１１）７７８８〜７７９６）は、１０１Ｆの複合体の結晶構造及びＦタンパク質のペプチド断片（ａ．ａ．４２２〜ａ．ａ．４３８）を得た。この領域におけるコアエピトープはａ．ａ．４２７〜ａ．ａ．４３７であり、エスケープ変異Ａｒｇ４２９及びＬｙｓ４３３が水素結合及び塩橋相互作用によって１０１Ｆと相互作用することが知られている。１０１Ｆと遊離ペプチドの親和性は、ポスト−Ｆとの親和性よりも何千倍も低い。１０１Ｆにより、ポスト−Ｆ構造において、１０１Ｆのエピトープが直鎖ペプチドよりも複雑であることが示される。
【００１１】
前記３つのエピトープに対する中和抗体は、中和力価の点で市販されているシナジスと比較してわずかに改善されており、プレ−Ｆ及びポスト−Ｆの両方と反応する。このようなことから、高い中和活性を有するプレ−Ｆに対するモノクローナル抗体が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を標的として用いることによってスクリーニングされるという、ＲＳＶの防止及び治療のための基礎が築かれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明において、他に規定されない限り、本明細書で使用される科学的技術的な用語は、当技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。さらには、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の検査室の操作は、対応する分野において広く使用される日常的な操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連性のある用語の定義及び説明が以下の通り提供される。
【００１３】
本明細書中で使用する用語「ＲＳＶ融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質」は、技術分野における当業者に周知である、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）を指す（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ０３４２０を参照されたい）。
【００１４】
本明細書中で使用する、Ｆタンパク質のアミノ酸配列が言及される場合に、それは配列番号１５に記載される配列によって記載される。例えば、「Ｆタンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基」の表現は、配列番号１５に記載されるポリペプチドの１９６〜２０９位からのアミノ酸残基を指す。しかしながら、当技術分野における当業者は、変異又は変形（Ｆタンパク質の異なるゲノタイプ又は異なる遺伝子サブタイプなどの、置換、欠失及び／又は付加が含まれるが、これらに限定されない）が、Ｆタンパク質のアミノ酸配列に、その生物学的特性に影響することなく、天然で生じ得る又は人工的に導入されることを理解する。したがって、本発明において、用語「Ｆタンパク質」は、例えば、配列番号１５に記載される配列及びその天然又は人工的なバリアントを含めた、全てのこのようなポリペプチドを含むものであることを意図する。加えて、Ｆタンパク質の配列断片が記載される場合に、それらは配列番号１５の配列断片だけでなく、その天然又は人工的なバリアントの対応する配列断片も含む。例えば、「Ｆタンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基」の表現は、配列番号１５の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基及びそのバリアント（天然又は人工的なバリアント）の対応する断片を含む。本発明による、「対応する配列断片」又は「対応する断片」の表現は、配列が最適化アラインメントに提出される（すなわち、配列がアラインメントされて、最大のパーセンテージの同一性が得られる）場合に、配列の同等のポジションに位置する断片を指す。
【００１５】
以前の研究により、Ｆタンパク質が１つの同定されたコンホメーションであるポスト−Ｆを有することが示されている。ＭｃＬｅｌｌａｎらは、ＲＳＶのＦタンパク質がプレ−Ｆコンホメーションを有し得ることを、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のＦタンパク質における研究結果から推定した（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），  Ｊ  Ｖｒｉｏｌ，  ８４：１２２３６〜１２２４４）。一般に、プレ−Ｆコンホメーションは、準安定性であり、安定なポスト−Ｆコンホメーションに自発的に転換する。したがって、細胞から発現及び精製されるＦタンパク質は、ポスト−Ｆコンホメーションにおいて主に存在する（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），  Ｊ  Ｖｒｉｏｌ，  ８４：１２２３６〜１２２４４）。
【００１６】
本明細書中で使用する用語「プレ−Ｆタンパク質」は、プレ−Ｆコンホメーションにおいて存在するＦタンパク質を指す。本明細書中で使用する用語「ポスト−Ｆタンパク質」は、ポスト−Ｆコンホメーションにおいて存在するＦタンパク質を指す。
【００１７】
本明細書中で使用する用語「抗体」は、二対のポリペプチド鎖（各々は軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を一般に指す。抗体の軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類され得る。重鎖はμ、δ、γ、α及びεに分類され得、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖における可変領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、重鎖は約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、ドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。相対的に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が間に入る、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に、ＶＨ及びＶＬ領域をさらに分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは、Ｎ末端からＣ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番の３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。様々な領域又はドメインにおけるアミノ酸の分布は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１〜９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３における定義に従う。用語「抗体」は、抗体を産生するための任意の特定の方法によって制限されない。例えば、抗体は、特に、組換え型抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なる抗体アイソタイプのもの、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であってもよい。
【００１８】
本明細書中で使用する、抗体の「抗原結合断片」の用語は、完全長抗体が特異的に結合する及び／又は同じ抗原に結合することについて完全長抗体と競合する抗原に特異的に結合する能力を保持する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、「抗原結合部分」としても知られている。一般に、全ての目的に関して、本明細書中に参照によって組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．，  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって又はインタクトな抗体の酵素若しくは化学的な切断によって産生され得る。いくつかの条件下で、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ及びポリペプチドに特異的な抗原結合能力を与えるため十分な抗体の少なくとも一部を含むようなポリペプチドを含む。
【００１９】
本明細書中で使用する用語「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指す；用語「Ｆｖ断片」は、単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を指す；用語「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指す；用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジ（単数又は複数）を介して互いに連結される２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
【００２０】
いくつかの条件下で、抗体の抗原結合断片は、ＶＬ及びＶＨドメインが対になり、それらが単一ポリペプチド鎖を産生することを可能にするリンカーを介して一価分子を形成する、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照されたい）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨの共通構造を一般に有する。先行技術における適切なリンカーは、反復型のＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーが使用されてもよい、及びそのバリアントも使用されてもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８）。本発明において使用されてもよい他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５〜７３１、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：９４〜１０６、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：３０５５〜３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：４１〜５６及びＲｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌによって記載されている。
【００２１】
いくつかの条件下で、抗体の抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖において発現される、ダイアボディ（すなわち、二価抗体）であってもよい；しかしながら、使用されるリンカーは、短すぎて、同じ鎖における２つのドメインの対形成を許容しなく；そのドメインが、別の鎖において相補的なドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を作り出す必要がある（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３（１９９４）を参照されたい）。
【００２２】
抗体の抗原結合断片（例えば、上記のような抗体断片）は、当技術分野における当業者に知られている従来技術（例えば、組換えＤＮＡ技術又は酵素的若しくは化学的な切断方法）によって所与の抗体（例えば、本発明において提供されるモノクローナル抗体５Ｃ４）から得てもよく、またインタクトな抗体をスクリーニングするのと同じ様式で、特異性についてスクリーニングされてもよい。
【００２３】
本発明では、明確に特定されなければ、用語「抗体」が言及される場合、インタクトな抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
【００２４】
本明細書中で使用する用語「ＭＡｂ」及び「モノクローナル抗体」は、高度に相同的な抗体分子の集団（すなわち、自発的に生じ得る自然突然変異を除く、完全に同一の抗体分子の集団）からの抗体又は抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープに関して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体（モノクローナル抗体と比べて）は、抗原における異なるエピトープを一般に認識する、少なくとも２つ以上の異なる抗体を一般に含む。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒらによって初めて報告されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５，  １９７５）によって一般に得られ得る、また組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ４，８１６，５６７を参照されたい）。
【００２５】
例えば、モノクローナル抗体は、以下のように調製されてもよい。最初に、マウス又は他の適切な宿主動物が、免疫原の注射によって免疫化される（必要な場合、アジュバントが添加される）。免疫原又はアジュバントの注射手段は、一般に皮下マルチポイント注射又は腹腔内注射である。いくつかの知られているタンパク質（例えば、血清アルブミン又は大豆トリプシン阻害剤）への免疫原のプレ−コンジュゲーションは、宿主における抗原の免疫原性を促進し得る。アジュバントは、フロイントアジュバント又はＭＰＬ−ＴＤＭなどであってもよい。動物の免疫化後、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球が、動物中で産生される。加えて、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化の手段によって得てもよい。目的のリンパ球は、収集され、適切な融合剤（例えば、ＰＥＧ）を用いてミエローマ細胞に融合され、それによって、ハイブリドーマ細胞を手に入れる（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．５９〜１０３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）。上記で調製されるハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地に播種され、その培地中で成長させる、その培養培地は、融合されていない親ミエローマ細胞の成長を阻害する能力のある１つ又は複数の物質を含む。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親ミエローマ細胞のケースにおいて、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン（ＨＡＴ培養培地）などの物質の培養培地への付加によって阻害される。好適なミエローマ細胞は、高い融合率、分泌抗体の安定的な能力を有すべきである、ＨＡＴ培養培地に感受性であるべきである、等々。ミエローマ細胞の第一選択は、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍由来細胞系（ＴＨＥ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．  ＵＳＡ）、及びＳＰ−２／０又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．  ＵＳＡ）などのマウスミエローマである。加えて、ヒトミエローマ及びヒト−マウス異種性骨髄腫細胞系を使用して、ヒトモノクローナル抗体を調製してもよい（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．５１〜６３，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）。成長しているハイブリドーマ細胞の培養培地を使用して、特異的な抗原に対するモノクローナル抗体の生成を検出する。免疫沈降又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の方法を使用して、ハイブリドーマ細胞において産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を決定してもよい。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７��２２０（１９８０）に記載されている、スキャッチャードアッセイを使用して、モノクローナル抗体の親和性を決定してもよい。ハイブリドーマにおいて産生される抗体の特異性、親和性及び反応性の決定後、目的の細胞系を、Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．５９〜１０３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６に記載されている限界希釈法によってサブクローン化してもよい。適切な培養培地は、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などであってもよい。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物体中で腹水腫の形態で成長させられ得る。プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーなどの免疫グロブリンを精製するための伝統的な方法を用いることによって、サブクローン細胞により分泌されるモノクローナル抗体を、細胞培養、腹水又は血清から単離してもよい。
【００２６】
モノクローナル抗体は、遺伝子操作組換え技術によって得てもよい。ＭＡｂ重鎖及び軽鎖遺伝子に特異的に結合する核酸プライマーは、ＰＣＲ増幅に付され、それによって、ハイブリドーマ細胞からＭＡｂ重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ分子が単離される。得られるＤＮＡ分子は発現ベクターに挿入され、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、又は免疫グロブリンを産生しない他のミエローマ細胞）は、それらでトランスフェクトされ、適切な条件下で培養されて、組換え発現によって目的の抗体が得られる。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「キメラ抗体」は、その軽鎖及び／又は重鎖の一部が１つの抗体（これは特定の種に由来し得る又は特定の抗体タイプ又はサブタイプに属する）に由来し、その軽鎖及び／又は重鎖の他の部分が別の抗体（これは同一の又は異なる種に由来し得る又は同一の又は異なる抗体タイプ又はサブタイプに属する）に由来するような抗体（但し、抗体は、目的の抗原に結合する活性をなおも保持する）を指す（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４）に対するＵ．Ｓ．Ｐ４，８１６，５６７）。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域の全て又はＣＤＲ領域の一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置き換えられ、ドナー抗体が期待される特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット又はウサギ）抗体であってもよい、抗体又は抗体断片を指す。加えて、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸も、抗体の特性をさらに改善する又は至適化するように、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基、又は別の抗体のアミノ酸残基によって置き換えられてもよい。ヒト化抗体に関するより詳細な内容に関しては、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３〜５９６（１９９２）；及びＣｌａｒｋ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７〜４０２（２０００）を参照されたい。
【００２９】
本明細書中で使用する用語「中和抗体」は、目的のウイルスのビルレンス（例えば、細胞に感染する能力）を排除又は有意に減少させることができる抗体又は抗体断片を指す。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原における部分を指す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても知られている。エピトープ又は抗原決定基は、一般にアミノ酸、炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に特異的な三次元構造及び特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、ユニークな立体的コンホメーションの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の連続的な又は非連続的なアミノ酸を一般に含み、「直鎖」又は「コンホメーション」に対するものであってもよい。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇ．  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。コンホメーションエピトープにおいて、相互作用部位は、タンパク質中で互いに分離したアミノ酸残基におよぶ。
【００３１】
本明細書中で使用する用語「エピトープペプチド」は、エピトープとして作用する抗原におけるペプチド断片を指す。いくつかの条件下で、エピトープペプチド単独は、エピトープに対する抗体によって特異的に認識／結合されうる。いくつかの他の条件下で、エピトープペプチドは、担体タンパク質に融合されて、エピトープが抗体によって特異的に認識されることが促進される必要がある。本明細書中で使用する用語「担体タンパク質」は、エピトープペプチドの担体として作用し得る、すなわち、エピトープペプチドがタンパク質の特異的なポジション（例えば、タンパク質の内側、Ｎ−末端又はＣ末端）に挿入されて、エピトープペプチドが提示されることが可能であることから、抗体又は免疫系によって認識されることが可能である、タンパク質を指す。このような担体タンパク質は、当技術分野における当業者に周知であり、例えば、以下のものが含まれる、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質（このタンパク質の１３０〜１３１位のアミノ酸又は４２６〜４２７位のアミノ酸の間にエピトープペプチドが挿入され得る、Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｃａｐｓｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｏｐｓ  ［Ｊ］．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００１，  ８２：２７９９〜２８０４；Ｖａｒｓａｎｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６（ＨＰＶ−１６）  Ｌ１  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌ２  ｍｉｎｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＰＶ−６  ａｎｄ  ＨＰＶ−１６  ［Ｊ］．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００３，  ７７：８３８６〜８３９３を参照されたい）、ＨＢＶコア抗原（このタンパク質の７９〜８１位のアミノ酸がエピトープペプチドで置き換えられ得る、Ｋｏｌｅｔｚｋｉ，  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．  ＨＢＶ  ｃｏｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｔｈｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｕｍａｌａ  ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｊ］．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９９，  ３８０：３２５〜３３３を参照されたい）、マーモット肝炎ウイルスコアタンパク質（このタンパク質の７９〜８１位のアミノ酸がエピトープペプチドで置き換えられ得る、Ｓａｂｉｎｅ  Ｋｏｎｉｇ，  Ｇｅｒｔｒｕｄ  Ｂｅｔｅｒａｍｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｎａｓｓａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８，  ７２（６）：４９９７を参照されたい）、及びＣＲＭ１９７タンパク質（エピトープペプチドは、このタンパク質又はその断片のＮ末端若しくはＣ末端に連結され得る）。任意選択で、リンカー（例えば、可動性の又はリジッドなリンカー）をエピトープペプチドと担体タンパク質との間に使用して、それらのフォールディングをそれぞれ促進し得る。
【００３２】
抗体は、当技術分野における当業者に知られている従来技術によって同じエピトープへの結合の競合性に応じてスクリーニングされてもよい。例えば、競合又は交差競合の研究を行って、抗原（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）への結合に関して互いに競合する又は交差競合する抗体を得てもよい。それらの交差競合に基づいて、同じエピトープに結合する抗体を得るための、ハイスループットな方法は、国際特許出願ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。したがって、ＲＳＶ融合タンパク質における同じエピトープに結合することに関して、本発明によるモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体５Ｃ４）と競合する、抗体及びその抗原結合断片（すなわち、抗原結合部分）は、当技術分野における当業者に知られている従来技術によって得ることができる。
【００３３】
本明細書中で使用する用語「単離」は、人工的な手段によって天然状態から得られた状態を指す。ある「単離された」物質又はコンポーネントが天然で存在する場合に、その天然環境が変化する又は物質が天然環境から単離される又はその両方のために単離は可能である。例えば、ある生きた動物の体に天然で存在する、ある未単離のポリヌクレオチド又はポリペプチド及びこのような天然状態から高純度で単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと称される。用語「単離」は、混合された人工的な又は合成された物質も、単離された物質の活性に影響しない他の純粋ではない物質も除外しない。
【００３４】
本明細書中で使用する用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）が、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）が含まれるがこれらに限定されない市販されている株から由来する、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指す。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「ベクター」は、そこに挿入されるポリヌクレオチドを有することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターがそこに挿入されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を許容する場合、ベクターは発現ベクターと称される。ベクターは、宿主細胞への形質転換、伝達、又はトランスフェクションによって宿主細胞において発現される、保有される遺伝物質要素を有しうる。ベクターは、当技術分野における当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えば、λファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、疱疹ウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、痘瘡ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント及びレポーター遺伝子が含まれるが、これらに限定されない、発現を制御するための複数の要素を含み得る。加えて、ベクターは、複製開始点を含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」は、原核生物細胞、例えば、大腸菌又は枯草菌、真菌細胞、例えば、酵母細胞又はアスペルギルス、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞又はＳｆ９、及び動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない、ベクターを導入することができる細胞を指す。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「同一性」は、２つのポリペプチド又は２つの核酸の間のマッチ度を指す。比較のための２つの配列が、ある部位（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が、ある部位でアデニンを有する又は２つのポリペプチドの各々が、ある部位でリシンを有する）で同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットを有する場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、２つの配列によって共有される同一の部位の数／比較のための部位のトータル数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０部位のうち６部位がマッチする場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６部位のうち３部位がマッチ）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性を生じる様式で行われる。このようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３〜４５３，  １９７０）の方法に基づく、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを用いることによって行うことができる。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ４：１１〜１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムによって決定することができる。
【００３８】
本明細書中で使用する用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの必須な特性に不利に影響する又は変化させることのないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において知られている標準技術によって導入されてもよい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖、例えば、物理的に又は機能的に類似する残基（例えば、類似するサイズ、形、電荷、化学的特性を有する、共有結合又は水素結合などを形成する能力を含む）を有する別のアミノ酸残基で、対応するアミノ酸残基へと置換される置換を含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で好ましくは置換される。アミノ酸保存置換を同定するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：１１８０〜１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １２（１０）：８７９〜８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４１２〜４１７（１９９７）を参照されたい、これらは本明細書中に参照によって組み込まれる）。
【００３９】
本明細書中で使用する用語「免疫原性」は、生物中の特異的な抗体又は感作されたリンパ球の形成を刺激する能力を指す。その用語は、最終的に抗体及び感作されたリンパ球などの免疫性エフェクター物質を発生させるように、特異的な免疫細胞を刺激して、活性化させる、増殖させる及び分化させる抗原の特性を指すだけではなく、抗体又は感作されたＴリンパ球が、生物を抗原で刺激した後に生物の免疫系において形成されうる特異的な免疫応答も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が免疫応答の発生を成功裡に誘導することができるのかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性、及び免疫化手段の３つの因子に依存する。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「特異的に結合する」は、抗体とそれが対象とする抗原の間の反応などの、非ランダム様式における二分子の結合を指す。いくつかの実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に特異的な抗体）は、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。
【００４１】
本明細書中で使用する用語「ＫＤ」は、抗原に対する抗体の結合親和性を記載するため使用される、特異的な抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数がより低いほど、抗体は抗原とより密接に結合し、抗原に対する抗体の親和性がより高くなる。一般に、抗体（例えば、本発明によるモノクローナル抗体５Ｃ４）は、抗原（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）に、ＢＩＡＣＯＲＥ装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」及び用語「ＭＡｂ」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される；用語「ポリクローナル抗体」及び用語「ＰＡｂ」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される；用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される。さらには、本発明では、アミノ酸は、一文字表記又は三文字表記によって一般に表される。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａによって表され得る。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「ハイブリドーマ」及び用語「ハイブリドーマ細胞系」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される。用語「ハイブリドーマ」及び用語「ハイブリドーマ細胞系」が言及される場合、それらはハイブリドーマのサブクローン及び子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞系ＲＳＶ−Ｙ−５Ｃ４−２（略して、ハイブリドーマ細胞系５Ｃ４とも呼ばれる）が言及される場合、それはハイブリドーマ細胞系ＲＳＶ−Ｙ−５Ｃ４−２のサブクローン及び子孫細胞とも呼ばれる。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」は、当技術分野において周知である、対象及び活性薬剤と薬理学的及び／又は生理的に適合性の担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，  １９ｔｈ  ｅｄ．  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５を参照されたい）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度強化剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤には、リン酸緩衝剤が含まれるが、これに限定されない；界面活性剤には、陽イオン性、陰イオン性、又は非イオン性の界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が含まれるが、これらに限定されない；イオン強度強化剤には、塩化ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。
【００４５】
本明細書中で使用する用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強させることができる又は抗原と共に生物に送達される若しくはあらかじめ生物に送達される場合に、生物における免疫応答のタイプを変化させることができる、非特異的な免疫賦活薬を指す。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（ｃｏｒｙｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどを含む、種々のアジュバントが存在するが、これらに限定されない。フロイントアジュバントは、現在動物実験において最も一般的に使用されている。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床治験において最も一般的に使用されている。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「タンパク質ワクチン」は、任意選択でアジュバントを含む、ポリペプチドに基づくワクチンを指す。ワクチン中のポリペプチドは、遺伝子操作技術によって又は化学合成の方法によって得てもよい。本明細書中で使用する用語「核酸ワクチン」は、任意選択でアジュバントを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡに基づくワクチン（例えば、発現プラスミドなどのプラスミド）を指す。
【００４７】
本明細書中で使用する用語「有効量」は、期待される効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、ＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患）を防止するため有効な量は、疾患（例えば、ＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患）の出現を、防止する、抑制する、又は遅延させるため有効な量を指す。疾患を治療するための有効量は、疾患を有する患者における疾患及びその合併症を、治癒させる又は少なくとも部分的に遮断するための有効な量を指す。このような有効量の決定は、当技術分野における当業者の能力の範囲内である。例えば、治療上の使用のため有効な量は、治療される疾患の重症度、患者における免疫系の一般的な状態、年齢、重量及び性別などの患者の一般的な状態、薬物の投与手段、同時に使用される付加的な治療法などに依存する。
【００４８】
本明細書中で使用する、本発明によるエピトープペプチドの生物学的機能には、以下の１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない：
１）抗体５Ｃ４に対する特異的な結合；
２）対象におけるＲＳＶ融合タンパク質の血清レベルを減少させる能力（任意選択で、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合させた後）；
３）ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＳＶ及びＲＳＶ感染細胞の有効なクリアランスの抗体応答を誘導する能力（任意選択で、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合させた後）；及び
４）対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、肺炎）を治療する能力（任意選択で、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合させた後）。
【００４９】
驚くべきことに、本発明者は、ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸に含まれるエピトープ、又はＲＳＶ融合タンパク質の６２〜６９位及び１９６〜２０９位からのアミノ酸残基を含むエピトープ）のいくつかのエピトープ及びこれらのエピトープを認識する抗体が、Ｆ−タンパク質のプレ−Ｆコンホメーションの安定化及び維持を促進すること、並びに、これらのエピトープ及びプレ−Ｆコンホメーションの安定化及び維持が、生物中の免疫応答の誘導に重要な意義をもつこと、並びに、前記抗体が、優れた生物活性（例えば、非常に高い中和活性）を有することから、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）の防止又は治療に非常に適切であることを、多くの実験研究を行うことによって見出した。
【課題を解決するための手段】
【００５０】
したがって、一態様では、本発明は、単離されたエピトープペプチド又はそのバリアントであって、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質又はその断片の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、少なくともＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基を含み、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する、単離されたエピトープペプチド又はそのバリアントを提供する。
【００５１】
本発明による種々の実施形態では、好ましくは、本発明によるエピトープペプチドは、プレ−Ｆタンパク質におけるその立体的なコンホメーションで提示され、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドの立体的なコンホメーションを保持する。
【００５２】
好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３又は４）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５３】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５４】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１８５〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５５】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１８５〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１８５〜１９４位からのアミノ酸は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成し、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５６】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１７６〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５７】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１７６〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１７６〜１８１位からのアミノ酸及び１８５〜１９４位からのアミノ酸残基は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成し、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５８】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００５９】
別の好適な実施形態では、エピトープペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１７６〜１８１位からのアミノ酸及び１８５〜１９４位からのアミノ酸は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成し、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、第１のペプチド及び第２のペプチドからなる単離されたエピトープペプチド又はそのバリアントであって、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質又はその断片の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、少なくともＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基を含み、第２のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の６２〜６９位又は６２〜７６位からのアミノ酸残基からなり、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドと単に１つ又はいくつかの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９）アミノ酸残基の保存的置換によって異なり且つそれが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持する、単離されたエピトープペプチド又はそのバリアントを提供する。
【００６１】
本発明による種々の実施形態では、好ましくは、第１のペプチド及び第２のペプチドは、プレ−Ｆタンパク質におけるその立体的なコンホメーションで提示され、バリアントは、それが由来するエピトープペプチドの立体的なコンホメーションを保持する。
【００６２】
好適な実施形態では、第１のペプチド及び第２のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質のプレ−Ｆコンホメーションに存在する空間的な構造を共に形成する。
【００６３】
さらに好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基からなる。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２１６位からのアミノ酸残基からなる。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１８５〜２１６位からのアミノ酸残基からなる。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１８５〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１８５〜１９４位からのアミノ酸は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成する。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１７６〜２１６位からのアミノ酸残基からなる。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１７６〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１７６〜１８１位からのアミノ酸及び１８５〜１９４位からのアミノ酸は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成する。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなる。別の好適な実施形態では、第１のペプチドは、ＲＳＶ融合タンパク質の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基からなり、１７６〜１８１位からのアミノ酸及び１８５〜１９４位からのアミノ酸は、タンパク質の二次構造においてβシートを形成する。
【００６４】
当技術分野における当業者によって知られているように、エピトープペプチド又はそのバリアントが、生物中の免疫系によって認識され且つウイルス感染の有効な防止を誘導しうるように、エピトープペプチド又はそのバリアントを担体タンパク質に融合して、エピトープペプチド又はそのバリアントの免疫原性を増強してもよい。
【００６５】
したがって、一態様では、本発明は、本発明による単離されたエピトープペプチド又はそのバリアント、及び担体タンパク質を含む組換えタンパク質であって、ここで、組換えタンパク質は、天然に存在するタンパク質又はその断片ではない、組換えタンパク質も提供する。組換えタンパク質において、エピトープペプチド又はそのバリアントは、使用される担体タンパク質に応じて、担体タンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に連結されてもよい、担体タンパク質に挿入されてもよい、又は担体タンパク質のアミノ酸配列の部分を置き換えるため使用されてもよい。加えて、任意選択で、エピトープペプチド又はそのバリアントは、リンカー（リジッドな又は可動性のリンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３）を介して担体タンパク質に連結されてもよい。本発明による組換えタンパク質は、遺伝子操作法（組換え技術）又は化学合成の方法などの任意の方法によって産生され得る。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本発明によるエピトープペプチド若しくはそのバリアント、又は本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供する。別の態様では、本発明は、上記のような単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明によるベクターは、クローニングベクター、又は発現ベクターであってもよい。好適な実施形態では、本発明によるベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどであってもよい。好適な実施形態では、ベクターは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において、本発明によるエピトープペプチド若しくはそのバリアント又は本発明による組換えタンパク質を発現しうる。
【００６７】
別の態様では、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供する。このような宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌細胞、及び真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）を含むが、これらに限定されない。本発明による細胞は、細胞系、例えば、２９３Ｔ細胞であってもよい。
【００６８】
別の態様では、本発明は、本発明による組換えタンパク質を産生するための方法であって、本発明による宿主細胞を培養するステップ、及び細胞培養から本発明による組換えタンパク質を回収するステップを含む方法も提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）を含むタンパク質ワクチンを提供する。好適な実施形態では、タンパク質ワクチンは、本発明による１つ又は複数のエピトープペプチドを含み、前記エピトープペプチドは、分離型又は直列型、修飾型又は無修飾型、別のタンパク質との結合型又は非結合型であってもよい。
【００７０】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するための方法であって、治療有効量の本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質又はタンパク質ワクチンをそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するためのタンパク質ワクチンの製造における、本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質の使用を提供する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するための、本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質を提供する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクター、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）を含む遺伝子ワクチンを提供する。好適な実施形態では、遺伝子ワクチンは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。このような実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは、裸であってもよい又は送達機能及び／又は保護機能を有するシェルにカプセル化されてもよい。さらに好適な実施形態では、シェルは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどのシェルであってもよい、又は化学的な方法によって合成され且つ類似する機能を発揮する能力のある別の物質であってもよい。
【００７４】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するための方法であって、治療有効量の本発明による遺伝子ワクチン又は単離された核酸分子又はベクターをそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するための遺伝子ワクチンの製造における、本発明による単離された核酸分子又はベクターの使用を提供する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する、治療する又は阻害するための、本発明による単離された核酸分子又はベクターを提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質、又は単離された核酸分子又はベクター及び薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）を含む組成物を提供する。好適な実施形態では、薬学的組成物は、本発明による１つ又は複数のエピトープペプチドを含み、前記エピトープペプチドは、分離型又は直列型、修飾型又は無修飾型、別のタンパク質との結合型又は非結合型であってもよい。
【００７８】
別の態様では、本発明は、ＲＳＶに特異的に結合しそれを中和し、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションを安定化し維持する能力のある抗体を産生するための方法であって、１）抗体が動物中で生成されるように、非ヒト動物（例えば、マウス）を本発明によるエピトープペプチド（又はそのバリアント）又は組換えタンパク質で免疫化するステップ；及び
２）ＲＳＶに関する中和活性を有するが、ポスト−Ｆタンパク質と反応性ではない（すなわち、ポスト−Ｆタンパク質に結合しない又は実質的に結合しない）抗体をスクリーニングするステップ
を含む方法を提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、上記のような方法によって産生される、ＲＳＶに特異的に結合しそれを中和し、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションを安定化し維持する能力のある抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００８０】
一態様では、本発明は、モノクローナル抗体が本発明によるエピトープペプチドに特異的に結合することができる、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。好ましくは、モノクローナル抗体は、ＲＳＶ融合タンパク質又はその断片の１４８〜２１６位からのアミノ酸残基（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質の１９６〜２０９位からのアミノ酸残基）、及び／又はＲＳＶ融合タンパク質の６２〜６９位又は６２〜７６位からのアミノ酸残基に特異的に結合することができる。
【００８１】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）、又は二重特異的又は多重特異的抗体から選択される。
【００８２】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体は非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域はマウス種以外の種に由来し、例えば、ヒト抗体に由来する。
【００８３】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体は、ＲＳＶに特異的に結合し、ウイルスに関する中和活性を有する。好適な実施形態では、モノクローナル抗体は、ポスト−Ｆタンパク質に結合しない又は実質的に結合しないが、プレ−Ｆタンパク質に結合し、それを安定化する。
【００８４】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体は、以下のＣＤＲを含む：
１）配列番号２０に記載される重鎖ＣＤＲ１；
２）配列番号２１に記載される重鎖ＣＤＲ２；
３）配列番号２２に記載される重鎖ＣＤＲ３；
４）配列番号２３に記載される軽鎖ＣＤＲ１；
５）配列番号２４に記載される軽鎖ＣＤＲ２；及び
６）配列番号２５に記載される軽鎖ＣＤＲ３。
【００８５】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体は、以下を含む
ａ）配列番号１７に記載される重鎖可変領域；及び
ｂ）配列番号１９に記載される軽鎖可変領域。
【００８６】
好適な実施形態では、モノクローナル抗体は、以下の群から選択されるモノクローナル抗体に由来する、又は以下の群から選択される抗体である：
ハイブリドーマ細胞系５Ｃ４によって産生されるモノクローナル抗体（ここで、ハイブリドーマ細胞系５Ｃ４は、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有する）。
【００８７】
別の態様では、本発明は、本発明によるエピトープペプチド又はプレ−Ｆタンパク質とハイブリドーマ細胞系５Ｃ４によって産生される抗体との結合を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は好ましくは少なくとも９９％遮断する能力のある、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片（ここで、ハイブリドーマ細胞系５Ｃ４は、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有する）を提供する。
【００８８】
このような抗体によって認識されるエピトープは、モノクローナル抗体５Ｃ４によって認識されるエピトープと同じであり又は立体的に重複し、そのため、このような抗体は、モノクローナル抗体５Ｃ４と本発明によるエピトープペプチド又はプレ−Ｆタンパク質との結合を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は好ましくは少なくとも９９％減少させることができる。
【００８９】
本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子も提供する。このような核酸分子は、ハイブリドーマ細胞から単離され得る、又は遺伝子操作組換え技術又は化学合成の方法によって得てもよい。
【００９０】
一態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００９１】
好適な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７に記載される。別の好適な実施形態では、核酸分子は、配列番号１６に記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００９２】
別の態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００９３】
好適な実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１９に記載される。別の好適な実施形態では、核酸分子は、配列番号１８に記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００９４】
別の態様では、本発明は、本発明による単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明によるベクターは、クローニングベクター、又は発現ベクターであってもよい。
【００９５】
好適な実施形態では、本発明によるベクターは、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００９６】
別の態様では、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供する。このような宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌細胞、及び真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）を含むが、これらに限定されない。本発明による細胞は、細胞系、例えば、２９３Ｔ細胞であってもよい。
【００９７】
別の態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を産生するための方法であって、本発明による宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ、及び細胞培養から本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収するステップを含む方法を提供する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有する、ハイブリドーマ細胞系５Ｃ４を提供する。
【００９９】
重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、従来の方法によって、モノクローナル抗体５Ｃ４から決定することができる。
【０１００】
モノクローナル抗体５Ｃ４の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１９に記載される；同じものをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１６及び１８に記載される。
【０１０１】
モノクローナル抗体５Ｃ４の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０〜２５に記載される。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。好適な実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能なマーカーをさらに含む。好適な実施形態では、キットは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に特異的に結合する二次抗体をさらに含む。好ましくは、二次抗体は、検出可能なマーカーをさらに含む。検出可能なマーカーは、当技術分野における当業者がよく知っており、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、プレ−Ｆタンパク質を安定化するための方法であって、本発明によるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又はＤ２５若しくはＡＭ２２モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を用いるステップを含む方法を提供する。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、試料中のプレ−Ｆタンパク質の存在又はレベルを検出するための方法であって、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いるステップを含む方法を提供する。好適な実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能なマーカーをさらに含む。別の好適な実施形態では、方法は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、検出可能なマーカーを保有する二次抗体を用いてことによって、検出するステップをさらに含む。方法は、診断目的又は非診断目的（例えば、試料が、患者からの試料の代わりに、細胞試料である）であってもよい。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、対象がＲＳＶに感染しているかどうかを診断するための方法であって：対象からの試料中のＲＳＶの存在を、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いることによって、検出するステップを含む方法を提供する。好適な実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能なマーカーをさらに含む。別の好適な実施形態では、方法は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、検出可能なマーカーを保有する二次抗体を用いることによって、検出するステップをさらに含む。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、プレ−Ｆタンパク質を安定化する、又は試料中のプレ−Ｆタンパク質の存在若しくはレベルを検出する、又は対象がＲＳＶに感染しているかどうかを診断するためのキットの製造における、本発明によるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はＤ２５若しくはＡＭ２２モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片の使用を提供する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する又は治療するための方法であって、予防若しくは治療有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片或いは本発明による薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する又は治療するための薬学的組成物の製造における、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎などの肺炎）を防止する又は治療するための、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１１】
本発明において提供されるワクチン（タンパク質ワクチン及び遺伝子ワクチン）、医薬、及び薬学的組成物は、単独で又は組み合わせて使用されてもよい、又は付加的な薬学的活性薬剤（例えば、インターフェロン薬、例えば、インターフェロン又はＰＥＧ化インターフェロン）と組み合わせて使用することができる。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、プレ−Ｆタンパク質又は抗原−抗体複合体を発現させるための方法であって、本発明によるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はＤ２５若しくはＡＭ２２モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸、及びＦタンパク質をコードする核酸を共発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はＤ２５若しくはＡＭ２２モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸、及びＦタンパク質をコードする核酸を含むキットを提供する。
【発明の効果】
【０１１４】
本発明者らは、ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆタンパク質）の新たなエピトープを初めて発見し、驚くべきことに、新しいエピトープ及び新しいエピトープを特異的に認識する抗体が、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションの安定化及び維持において重要な役割を果たすことを見出した。
【０１１５】
加えて、本発明者は、先行技術において知られているようなＲＳＶ融合タンパク質に対する抗体と比較して、新しいエピトープを特異的に認識する本発明の抗体がより高い中和活性を有することも見出し、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーション及び本発明において発見された新しいエピトープが、ＲＳＶに対する免疫応答の誘導において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１６】
したがって、本発明によるエピトープペプチド又はエピトープペプチドを含む組換えタンパク質は、対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎）を防止するためのタンパク質ワクチンとして有効である。
【０１１７】
加えて、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、より高い中和活性を有することから、より低量で使用してＲＳＶによる細胞の感染を有効に遮断することができ、さらに対象におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染に関連する疾患（例えば、乳児の肺炎）の防止又は治療において有効に使用することができる。
【０１１８】
本発明の実施形態は、図面及び実施例を参照して詳細に記載される。しかしながら、当技術分野における当業者は、以下の図面及び実施例が、本発明の範囲を規定するというよりむしろ、本発明を例示することのみを意図していることを理解するであろう。以下の図面及び好適な実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び利点が当技術分野における当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】５Ｃ４モノクローナル抗体とポスト−Ｆの間の反応性を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。結果は、市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブと比較して、５Ｃ４抗体はポスト−Ｆと有意な反応性がないことを示す。
【図２】５Ｃ４モノクローナル抗体の中和活性を決定するためのアッセイを示す図である。結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体がＲＳＶに関してより高い中和活性を有することを示す。特に、市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブ、並びに以前報告された抗体Ｄ２５（米国特許出願第１２／６００，９５０号参照）及びＡＭ２２（米国特許出願第１２／８９８，３２５号参照）と比較して、５Ｃ４モノクローナル抗体はＲＳＶに関してより高い中和活性を有する。
【図３】５Ｃ４モノクローナル抗体の結合阻害を決定するためのアッセイを示す図である。結果は、試験したいずれのモノクローナル抗体も、細胞とウイルスの結合に影響を与えないことを示す。
【図４】５Ｃ４モノクローナル抗体の融合阻害活性を決定するためのアッセイを示す図である。結果は、市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブ、並びに以前報告された抗体Ｄ２５（米国特許出願第１２／６００，９５０号参照）及びＡＭ２２（米国特許出願第１２／８９８，３２５号参照）と比較して、５Ｃ４抗体がより強い融合阻害活性を有することを示す。
【図５】ウイルスを捕捉する５Ｃ４モノクローナル抗体の能力を決定するためのアッセイを示す図である。結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体がＲＳＶと特異的に結合できたことを示す。特に、市販のパリビズマブ（シナジス）と比較して、５Ｃ４抗体はＲＳＶを捕捉するより強力な能力を有する。
【図６】５Ｃ４モノクローナル抗体の反応性を決定するためのウエスタンブロットアッセイを示す図である。結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体が、コンホメーションエピトープを認識し、非変性ＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰを認識するが、変性ＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰは認識しないモノクローナル抗体であることを示す。さらに、５Ｃ４モノクローナル抗体はＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰを特異的に認識することはできるが、ポスト−Ｆには実質的に反応しない。
【図７】５Ｃ４モノクローナル抗体を使用した免疫蛍光アッセイを示す図である。結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体が、ＲＳＶ  Ａ２による細胞の感染を検出するのに有用であることを示す。
【図８】５Ｃ４モノクローナル抗体と他のモノクローナル抗体の競合的結合を決定するためのアッセイを示す図である。結果は、ＡＭ２２モノクローナル抗体、Ｄ２５モノクローナル抗体及び５Ｃ４モノクローナル抗体の間に競合的結合が存在し、５Ｃ４モノクローナル抗体は、ＡＭ２２モノクローナル抗体又はＤ２５モノクローナル抗体の結合を最大９９％遮断し得ることを示す。これは５Ｃ４モノクローナル抗体が、ＡＭ２２モノクローナル抗体及びＤ２５モノクローナル抗体と同じエピトープを認識することを示す。
【図９】電子顕微鏡による抗原−抗体複合体ＡＭ２２／Ｆタンパク質、５Ｃ４／Ｆタンパク質及びＤ２５／Ｆタンパク質の観察結果を示す図である。結果は、抗原−抗体複合体ＡＭ２２／Ｆタンパク質、５Ｃ４／Ｆタンパク質及びＤ２５／Ｆタンパク質が同じ構造を有することを示す。これは、ＡＭ２２モノクローナル抗体、５Ｃ４モノクローナル抗体及びＤ２５モノクローナル抗体がＦタンパク質の同じエピトープに結合し、同じコンホメーション（プレ−Ｆコンホメーション）のＦタンパク質に結合することを示す。
【図１０】電子顕微鏡による抗原−抗体複合体パリビズマブ／Ｆタンパク質及び５Ｃ４／Ｆタンパク質の観察結果の比較を示す図である。左図は電子顕微鏡によるポスト−Ｆとパリビズマブの複合体の観察結果を示し、左下図は電子顕微鏡下で観察した左上図の白いボックス内のポスト−Ｆの構造を示し、右図は電子顕微鏡によるプレ−Ｆと５Ｃ４の複合体の観察結果を示し、右図内の白いボックスは電子顕微鏡下で観察したプレ−Ｆの構造を示す。結果は、抗原−抗体複合体パリビズマブ／Ｆタンパク質及び５Ｃ４／Ｆタンパク質は有意に異なる構造を有し、Ｆタンパク質のコンホメーションも２つの抗原−抗体複合体で有意に異なり、パリビズマブ／Ｆタンパク質複合体においてＦタンパク質はポスト−Ｆコンホメーションであり、一方５Ｃ４／Ｆタンパク質複合体においてＦタンパク質はプレ−Ｆコンホメーションであることを示す。
【図１１】Ｄ２５／Ｆタンパク質複合体の結晶構造を示す図である。
【図１２】Ｄ２５モノクローナル抗体とＦタンパク質のエピトープの間の結合界面の空間構造を示す図である。
【図１３】プレ−Ｆタンパク質及びポスト−Ｆタンパク質分子におけるＤ２５結合エピトープの三次構造の変化を示す図である。
【図１４】プレ−Ｆタンパク質のモノマーとトリマー、及びポスト−Ｆタンパク質のモノマーとトリマーの結晶構造を示す図である。結果は、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質は、空間構造（コンホメーション）の点で互いに有意に異なることを示す。
【図１５】プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の空間構造、及びその空間構造を構成する相当アミノ酸配列、及びＤ２５によって認識されるエピトープ配列を示す図である。結果は、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の空間構造間に有意な差があることを示す。特に、プレ−Ｆタンパク質の空間構造はα１〜α１０ヘリックス及びβ１〜β２３シートを含み、一方ポスト−Ｆタンパク質の空間構造はα１ヘリックス、α５〜α８ヘリックス、α１０ヘリックス、β１〜β２シート及びβ５〜β２１シートを含む。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
さらに、図１５中の結果は、Ｄ２５モノクローナル抗体によって認識されるプレ−Ｆタンパク質のコアエピトープは、立体的に互いに隣接した２つのペプチドセグメント、即ちａ．ａ．６２〜６９とａ．ａ．１９６〜２０９であることも示す。２つのペプチドセグメントの相互作用界面は、Ｆタンパク質の２つのセグメント（ａ．ａ．６２〜７６とａ．ａ．１３７〜２１６（又はより詳細にはａ．ａ．１４８〜２１６））又はその断片は、このような抗体（本発明の抗体（例えば５Ｃ４）、Ｄ２５とＡＭ２２）によるプレ−Ｆタンパク質の認識と安定化に対して重要な影響があり、２つの領域、ａ．ａ．１７６〜１８１とａ．ａ．１８５〜１９４はＦタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションとポスト−Ｆコンホメーションの間に有意な変化がある、即ちそれらはプレ−Ｆタンパク質ではβシート（β３〜β４シート）のコンホメーションであるが、ポスト−Ｆタンパク質では（α５ヘリックス中に含まれる）αヘリックスのコンホメーションであることを示す。
【０１２１】
本発明に関与する配列の情報は、以下の表１に提供される。
【表１−１】
0006462599.tif 000002
【表１−２】
0006462599.tif 000003
【表１−３】
0006462599.tif 000004
【０１２２】
生物学的物質の寄託の説明
２０１２年１０月２２日に中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ、武漢大学、武漢、中国）に寄託された、本発明のハイブリドーマ細胞系ＲＳＶ−Ｙ−５Ｃ４−２は、ＣＣＴＣＣの寄託番号：Ｃ２０１２１４７を有する。
【０１２３】
発明を実施するための具体的な形態
本発明は、以下の実施例（例示の目的のみに使用され、本発明の保護範囲を限定することを意図していない）を参照して例示される。
【０１２４】
別段に示されない限り、本発明において使用される分子生物学的な実験方法及び免疫学的なアッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９、及びＦ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５に記載されるような方法に実質的に従って実施され、制限酵素は、製品の製造者によって推奨される条件下で使用される。条件が実施例において特定されない場合、実験は従来の条件又は製品の製造者によって推奨されるに条件に従って実施される。製造者が示されない、本発明において使用される試薬又は装置は、当技術分野における従来の製品であり、市販されている。当技術分野における当業者は、実施例が、本発明を例示するために使用されるが、本発明の保護範囲を限定することを意図していないことを理解する。
【実施例】
【０１２５】
（例１）
ＲＳＶウイルスの調製
ＲＳＶ  Ａ２株の調製及び増幅
ＲＳＶ  Ａ２株はＮＩＨ  Ｄｒ．Ｂａｒｎｅｙ  Ｓ．Ｇｒａｈａｍ（Ｇｒａｈａｍら、１９８８）研究所により調製され寄贈された。
【０１２６】
８０％のコンフルエンス率でＨｅｐ２細胞を６時間３７℃で培養し、上清を除去し、１ｍｌのＲＳＶ  Ａ２株を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで１０％のＭＥＭ培地を１５ｍｌの体積まで加え、培養は４日間３７℃で実施した。細胞と細胞上清を回収し、予め冷却した５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、ハンドグラスプ型Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒによって破壊した後（５０％、１秒間破壊及び３秒間停止）、冷却遠心分離機中に置き、１５分間、１０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。得られた上清は予め冷却した５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、次いでチューブ当たり１ｍｌでサブパッケージ化し、ドライアイス−アルコール混合液中に急速凍結し、最終的に−８０℃で保存した。
【０１２７】
ＲＳＶ  ＧＦＰウイルスの調製及び増幅
ＲＳＶ  ＧＦＰウイルスはＮＩＨ  Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｈａｌｌａｋら）により調製され、ＮＩＨ  Ｄｒ．Ｂａｒｎｅｙ  Ｓ．Ｇｒａｈａｍ研究所により寄贈された。
【０１２８】
８０％のコンフルエンス率でＨｅｐ２細胞を６時間３７℃で培養し、上清を除去し、１ｍｌのＲＳＶ  ＧＦＰウイルスを加え、室温で１時間インキュベートした。次いで１０％のＭＥＭ培地を１５ｍｌの体積まで加え、培養は４日間３７℃で実施した。細胞と細胞上清を回収し、予め冷却した５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、ハンドグラスプ型Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒによって破壊した後（５０％、１秒間破壊及び３秒間停止）、冷却遠心分離機中に置き、１５分間、１０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。得られた上清は予め冷却した５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、次いでチューブ当たり１ｍｌでサブパッケージ化し、ドライアイス−アルコール混合液中に急速凍結し、最終的に−８０℃で保存した。
【０１２９】
（例２）
ポスト−Ｆタンパク質の発現及びＤＮＡ−Ｆベクターの構築
ポスト−Ｆタンパク質の発現
ポスト−Ｆタンパク質の配列はＲＳＶ−Ａ２ウイルス由来であった。ポスト−Ｆタンパク質の発現を高めるため、そのアミノ酸配列の１０２位（Ｐ１０２）、３７９位（Ｉ３７９）及び４４７位（Ｍ４４７）におけるアミノ酸を、それぞれアラニン（Ｐ１０２Ａ）、バリン（Ｉ３７９Ｖ）及びバリン（Ｍ４４７Ｖ）で置換した。さらに、１３７〜１４６位の融合ペプチド断片をポスト−Ｆタンパク質の配列から除去した。コドン最適化ポスト−Ｆ配列を（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｃｏｍｐａｎｙにより合成された）真核生物用発現ベクターｐＬＥＸｍ中に挿入し、それによってＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ及び８×ヒスタグによりそのＣ末端で認識される部位を含有するポスト−Ｆ発現プラスミドｐＬＥＸｍ−ポストＦを得た。
【０１３０】
一過性トランスフェクションシステム（Ｕｎｉｔｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入したＴｒｕｅＦｅｃｔ−Ｍａｘ）を介して、ｐＬＥＸｍ−ポストＦを（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質転換した。形質転換した細胞には、４〜５日間、１２０ｒｐｍ、９％ＣＯ２、３７℃で振とうテーブルにおいて懸濁培養を行った。細胞を回収し、タンパク質は最初に（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した）Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂により精製し、溶出緩衝液は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌと２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０であり、次いで説明書に従い（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した）ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ樹脂によりさらに精製した。精製したタンパク質はＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）により切断し、次いでＮｉ２＋−ＮＴＡに再度通して、非切断タンパク質とアフィニティータグを除去した。次いでタンパク質を（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに通すことによって精製し、この場合緩衝液は２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０２％のＮａＮ３であり、次いでタンパク質は最終的に約６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０１３１】
ＤＮＡ−Ｆの構築
目的の断片（ＲＳＶの完全長Ｆタンパク質）をｐｔｒａｃｋ−ＣＭＶシャトルプラスミドに構築して、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−ＲＳＶ  Ｆを得た。７時間より長く３７℃でのＰｍｅｌ単独の酵素による切断によってプラスミドを直鎖状にし、酵素による切断の系は５０ｕＬであった。緩衝液とホスファターゼをチューブに加え、反応は７時間より長く３７℃で実施した。次いで、エタノール沈殿を実施し、遠心分離後の生成物は滅菌水に再懸濁した。（ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−ＲＳＶ  ＦとｐＡｄＥａｓｙ−１が大腸菌ＢＪ５１８３において組換えられるように）ＢＪＡｄＥａｓｙコンピテントセルをトランスフェクトし、次いでカナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で培養した。６〜８個の小さな細菌コロニーを採取し、その中のプラスミドを抽出し、プラスミドの大きさを確認した（アデノウイルスプラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１は３３４１４ｂｐであった）。ＰａｃＩ酵素による切断によって確認を実施した。２つの断片を切断により得て、１つは約３０ｋｂであり、他方は３．０ｋｂ又は４．５ｋｂであった。正確であることを確認した陽性組換え体を大腸菌ＤＨ５αに移し、細菌は保存し、さらに使用するため抽出して高コピー数でプラスミドを得た。１つ〜２つのフラスコの２９３β５細胞（フラスコ当たり２×１０６個の細胞）を２４時間培養した。ＰａｃＩを使用して４ｕｇの組換えアデノウイルスプラスミドを消化した。プラスミドはエタノールで沈殿させ、２０ｕＬの滅菌水中に再懸濁した。（１つのフラスコの細胞に関して）４ｕｇのＰａｃＩ消化プラスミドと２０ｕＬのリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を５００ｕＬのＯｐｔｉＭｅｍ  Ｉ培地中で混合し、１５〜３０分間室温でインキュベートした。細胞は４ｍＬの無血清培地で１回洗浄した。２．５ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ  Ｉをそれぞれのフラスコに加えた。細胞は約１０分間３７℃でインキュベートした。リポフェクタミン−ＤＮＡ混合液を細胞培養フラスコに加え、３７℃でインキュベートした。４時間後、リポフェクタミン−ＤＮＡ混合液を含む上清を吸い出し、６ｍＬの新たな完全培地を加え、培養物は一晩３７℃でインキュベートした。トランスフェクション後７〜１０日で、（トリプシンの代わりに）ラバースクレーパーを使用することにより細胞をかき取り、次いで５０ｍＬの円錐形チューブに移した。遠心分離後、２ｍＬのＨＢＳＳ又は滅菌ＰＢＳを細胞の再懸濁用に使用した。細胞はドライアイス／メタノール浴中で凍結させ、水浴内で３７℃において解凍し、激しく振り動かした。「凍結／解凍／振とう」のプロセスは３回繰り返し、生成物は−２０℃で保存した。２９３β５細胞は前記ウイルス懸濁液でトランスフェクトし、蛍光が非常に強くなるまで、培養物を４８時間３７℃でインキュベートした。培地をピペッティングすることにより感染細胞を剥離し、次いで３分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。沈殿物を再懸濁し、（細胞が溶解するまで）液体窒素中で６回凍結−解凍を施し、次いで３０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を保存した。超遠心分離チューブに、５ｍｌの４０％Ｃｓｃｌ、４．５ｍｌの１５％Ｃｓｃｌを加え、次いで上清を加え、混合物は層状にするため残した。均衡状態に達した後、超遠心分離を１６時間、４℃、３２０００ｒｐｍで実施し、２つのバンドを得た。底部に位置した濃厚なバンドを注意深く吸い出した。５％スクロース、２０ｍＭのＴＢ８．０のＭｇＣｌ２での透析後、精製組換えアデノウイルスを得た。
【０１３２】
（例３）
モノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマの調製：
尾静脈内注射によるＤＮＡ免疫化法及びＰＥＧ融合法を使用してモノクローナル抗体を得た。詳細に関しては、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８８を参照されたい。要約すると、このプロセスは以下の通りであった。
【０１３３】
マウスの免疫化：ＲＳＶの完全長Ｆ遺伝子を含むプラスミドを、初回免疫化に使用した。免疫化前に、ＰＢＳを混合し、等体積のフロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した。マウスには、それぞれのマウスに関して３００ｕｌを毎回、腕と脚の筋肉を介して多数の地点に注射した。ＲＳＶの完全長Ｆ遺伝子を含むプラスミドをＰＢＳで５０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、流体力学的注射により尾静脈を介してそれぞれのマウスに２ｍｌを投与した。初回免疫化の１０日後と１７日後に、それぞれ同量のＰＢＳ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用することにより、マウスにブースター免疫化を施した。それぞれのマウスに、ＲＳＶの完全長Ｆ遺伝子の１０６コピーを含有する２ｍｌアデノウイルスを次いで注射した。２回目のブースター後、ＨＩの阻害力価を決定するため血液を回収した。力価が１：６４０に達したとき、マウスの脾臓を融合用に採取した。融合７２時間前にブースター免疫化を再度実施し、ＲＳＶ−Ａ２ウイルス液を、それぞれのマウス当たり５０ｕｌで脾臓を介して１回注射した。１５の融合プレートを調製した。
【０１３４】
融合：血清中の抗体がＲＳＶ  ＧＦＰ中和に関して最高力価を有するマウス由来の脾臓細胞を、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と融合させた。脾臓を粉砕し脾臓細胞の懸濁液を得て、次いでマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と混合し、その数は１０倍少なくそれらは指数関数的増殖期に存在していた。１分間ＰＥＧ１５００の作用下で、２種類の細胞を１つに融合させた。次いで融合細胞の液体（１００ｍｌ）を、培養用に１０枚の９６ウエルプレートにサブパッケージ化した。融合培地は、ＨＡＴ及び２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０完全スクリーニング培地である。抗原特異的クローンは、間接的ＥＬＩＳＡ及び中和試験によってスクリーニングした。中和活性がありポスト−Ｆとの反応性がないモノクローナル抗体細胞系をスクリーニングした。３回のクローニング後、安定状態のモノクローナル抗体細胞系を得た。
【０１３５】
ハイブリドーマのスクリーニング：１０日間９６ウエルプレート中で融合細胞を培養した後、ＲＳＶ−ポストＦ酵素結合免疫吸着アッセイ及びＲＳＶ−Ａ２中和試験用に上清を採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ又はＲＳＶ−Ａ２陽性ウエルを、細胞系により分泌された抗体がＲＳＶ−Ａ２を安定的に遮断するのを可能にし、ポストＦと反応しなくなるまで、さらなるクローニング用に使用した。
【０１３６】
スクリーニングの結果：１つのハイブリドーマ細胞系ＲＳＶ−Ｙ−５Ｃ４−２を得た。それによって分泌されたモノクローナル抗体５Ｃ４はポスト−Ｆとの反応性がなく、高い中和活性を有していた。
【０１３７】
ハイブリドーマの培養：安定状態のハイブリドーマ細胞系を最初にＣＯ２インキュベーター中での増幅培養に供し、９６ウエルプレートから２４ウエルプレートに移し、その後増幅培養用に５０ｍｌの細胞培養フラスコに移した。細胞培養フラスコから回収した細胞をマウスの腹膜腔に注射し、７〜１０日後マウスの腹膜腔から腹水を吸収した。
【０１３８】
モノクローナル抗体の精製：腹水を５０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いでＰＢ、ｐＨ７．４中で透析、及びＤＥＡＥカラムを介したＨＰＬＣ精製に供し、精製モノクローナル抗体を得た。精製モノクローナル抗体の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１３９】
（例４）
モノクローナル抗体５Ｃ４の特徴付け
ポスト−Ｆとの反応性を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
ポスト−Ｆを１×ＣＢで１００μＬ当たり２０ｎｇの濃度に希釈し、３７℃で２時間ポリスチレンプレートのマイクロウエルをコーティングするのに使用した（ウエル当たり１００μＬ）。プレートはＰＢＳＴで１回洗浄した。２％（質量／体積）ＢＳＡを含有する１８０μＬのＰＢＳをブロッキング用に加え、３７℃で２時間インキュベーションを実施した。試験対象の抗体は初期力価として１ｍｌ当たり１μｇの濃度に希釈し、１００μＬを加え、１０倍勾配希釈を施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）標識ヤギ抗マウスは１：５０００に希釈し、検出用二次抗体として１００μＬで加えた。ＥＬＩＳＡ中で読み取った値が０．５を超えたとき、それは陽性として検出した。結果は図１中に示した。図１の結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体はポスト−Ｆとほとんど結合しなかったことを示した。市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブと比較して、５Ｃ４抗体はポスト−Ｆと有意な反応性がなかった。
【０１４０】
中和活性を決定するためのアッセイ
試験対象の抗体は初期力価として１ｍｌ当たり１００μｇに希釈し、Ｕ型プレートに１００μＬを加え、４倍希釈を施した。７５μＬの１×１０６ＰＦＵ  ＲＳＶ懸濁液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後の１００ｕｌ混合溶液を、１００ｕｌのＨｅｐ２細胞を平板培養した９６ウエルプレートに次いで加え、３７℃で２４時間インキュベートした。パラジム（Ｐａｒａｄｉｍ）を使用して中和活性を決定した。結果は図２中に示した。図２の結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体がＲＳＶに関して強い中和活性を有したことを示した。特に、市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブ、並びに以前報告された抗体Ｄ２５（米国特許出願第１２／６００，９５０号参照）及びＡＭ２２（米国特許出願第１２／８９８，３２５号参照）と比較して、５Ｃ４モノクローナル抗体はＲＳＶに関してより強い中和活性を有していた。
【０１４１】
結合阻害活性を決定するためのアッセイ
細胞の調製：１００μＬ当たり５×１０４個の細胞でＨｅｐ２細胞を９６ウエルプレートの各ウエルに平板培養し、３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを４℃中に置き１時間冷却した。
【０１４２】
試料の調製：１０μＬの１ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体試料を９０μＬのＭＥＭ培地に加え、次いでＭＥＭ培地で４倍希釈を施し１１勾配を得た。７５μＬのウイルス試料を７５μＬの希釈モノクローナル抗体試料と混合し、２５℃で１時間インキュベートした。混合物はその後４℃に冷却した。１００μＬのモノクローナル抗体−ウイルス混合物をＨｅｐ２細胞に加え、４℃で１時間インキュベートした。
【０１４３】
試料の検出：上清を除去し、１００μＬの予め冷却したＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。細胞は５分間、４℃、１７００Ｇで２回遠心分離した。次いで１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ＲＳＶ抗体（１：１０００希釈、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を加え、４℃で４５分間インキュベートした。上清を除去し、１００μＬの予め冷却したＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。細胞は５分間、４℃、１７００Ｇで遠心分離した。上清を除去した後、１５０μＬの０．５％パラホルムアルデヒドを各ウエルに加えて細胞を固定した。最後に、フローサイトメーターを検出用に使用した。結果は図３中に示した。
【０１４４】
融合阻害活性を決定するためのアッセイ
細胞の調製：１００μＬ当たり５×１０４個の細胞でＨｅｐ２細胞を９６ウエルプレートの各ウエルに平板培養し、３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを４℃中に置き１時間冷却した。
【０１４５】
試料の調製：１０μＬの１ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体試料を９０μＬのＭＥＭ培地に加え、次いでＭＥＭ培地で４倍希釈を施し１１勾配を得た。さらに使用するため試料を４℃に置いた。ＲＳＶ−ＧＦＰはＭＥＭ培地で８倍希釈した。５０μＬのＲＳＶ−ＧＦＰを細胞に加え、４℃で１時間インキュベートした。上清を除去し、５０μＬの予め冷却したＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。細胞は５分間、４℃、１７００Ｇで３回遠心分離した。次いで５０μＬの予め冷却したＭＥＭ培地を細胞に加え、５０μＬの希釈モノクローナル抗体試料も細胞に加えた。混合物は４℃で１時間インキュベートした。その後細胞は、１８時間の間インキュベートするため３７℃環境に移した。
【０１４６】
試料の検出：上清を除去し、１００μＬの予め冷却したＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。細胞は５分間、４℃、１７００Ｇで２回遠心分離した。１５０μＬの０．５％パラホルムアルデヒドを各ウエルに加えて細胞を固定した。最後に、フローサイトメーターを検出用に使用した。結果は図４中に示した。結果は、市販のパリビズマブ（シナジス）及びモタビズマブ、並びに以前報告された抗体Ｄ２５（米国特許出願第１２／６００，９５０号参照）及びＡＭ２２（米国特許出願第１２／８９８，３２５号参照）と比較して、５Ｃ４抗体がより強い融合阻害活性を有したことを示した。
【０１４７】
ウイルスを捕捉する能力を決定するためのアッセイ
モノクローナル抗体を２０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．４で１００μＬ当たり３μｇの濃度に希釈し、４℃で１０時間、及び次に３７℃で１時間、ウエル当たり３００μＬでポリスチレンプレートのマイクロウエルをコーティングするのに使用した。プレートはＰＢＳＴで１回洗浄した。２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する３５０μＬのＰＢＳをブロッキング用に加え、インキュベーションは３７℃で２時間実施した。２００μＬの１×１０６ＰＦＵ  ＲＳＶ懸濁液を加え、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５回洗浄した。プレートを洗浄した後、それぞれのウエルに、２００μＬのトリゾールを溶解用に加えた。４℃で１０分間の溶解後、試料中のＲＳＶのＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲアッセイを施した。結果は図５中に示した。図５の結果は、ＲＳＶと５Ｃ４モノクローナル抗体の結合が非常に特異的であることを示した。市販のパリビズマブ（シナジス）と比較して、５Ｃ４抗体はＲＳＶを捕捉するより強力な能力を有していた。
【０１４８】
５Ｃ４モノクローナル抗体の反応性を決定するためのウエスタンブロットアッセイ
１０ｕｌの煮沸及び非煮沸ポスト−Ｆ、ＲＳＶ−Ａ２、ＲＳＶ−ＧＦＰを、電気泳動用にそれぞれ１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに載せ、次いで１時間３５ｍＡの電流で膜貫通を実施した。膜貫通後、５％スキムミルクを加え、４℃で一晩ブロッキングを実施した。それぞれ１０分間で３回、ＴＮＴで膜を洗浄した。１ＸＴＮで１：２０００希釈した試験対象の抗体を膜に加えた。インキュベーションは、振とうテーブルにおいて室温で１時間実施した。膜はＴＮＴでそれぞれ１０分間３回洗浄した。１：５０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）標識ヤギ抗マウス抗体を、５Ｃ４検出用の二次抗体として加えた。１：２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）標識マウス抗ヒト抗体は、モタビズマブ検出用の二次抗体として加えた。インキュベーションは、振とうテーブルにおいて室温で１時間実施した。膜はＴＮＴでそれぞれ１０分間３回洗浄した。発色させ写真を撮った。結果は図６中に示した。図６の結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体が、コンホメーションエピトープを認識し、非変性ＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰを認識するが、変性ＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰは認識しないモノクローナル抗体であったことを示した。さらに、５Ｃ４モノクローナル抗体はＲＳＶ−Ａ２及びＲＳＶ−ＧＦＰを特異的に認識することはできたが、ポスト−Ｆには実質的に反応しない。
【０１４９】
免疫蛍光アッセイ
細胞の調製：１ｍＬ当たり１×１０５個の細胞でスライドに平板培養したＨｅｐ２細胞を２４ウエルプレートに加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いでプレートを４℃中に置き１時間冷却した。
【０１５０】
試料の調製：細胞培養の上清を除去し、１００μＬの予め冷却したＲＳＶ−Ａ２を加え（ＲＳＶ−Ａ２はＭＥＭ培地で５倍希釈した）、４℃で１時間インキュベートし、次いで上清を除去した。１ｍｌのＭＥＭ培地を加えた。試料は、それぞれ５分、１時間、６時間、１６時間及び２４時間で検出用に採取した。
【０１５１】
試料の検出：１ｍｌの予め冷却したＰＢＳを加え、混合物は振とうテーブル中に５分間置き、上清を除去した。このプロセスを２回繰り返した。次いで０．４％パラホルムアルデヒド１００μＬを加え、混合物は１５分間室温で暗所においてインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。１００μＬの０．３％トリトンＸ−１００を加え、混合物は１０分間室温でインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。次いで１００μＬのヤギ血清を加え、混合物は３０分間室温でインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。（ＰＢＳで１０倍希釈した）１００μＬのモノクローナル抗体試料を加え、混合物は３時間室温でインキュベートした。次いで１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスポリクローナル抗体（１：６００、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を次いで加え、混合物は３０分間室温でインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。１００μＬのＤＡＰＩ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を次いで加えた。５分間室温で暗所中のインキュベーション後、１ｍｌのＰＢＳを加え、混合物は５分間振とうテーブル中に置き、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。最後に、スライドを取り出し、マウンティング溶液を含むスライドガラス上に置いた。ネイルエナメルをマウンティングに使用し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を観察に使用した。結果は図７中に示した。図７の結果は、５Ｃ４モノクローナル抗体が、ＲＳＶ  Ａ２による細胞の感染を検出するのに有用であったことを示した。
【０１５２】
５Ｃ４モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域／ＣＤＲの配列の決定
５Ｃ４モノクローナル抗体６を分泌したハイブリドーマ細胞系ＲＳＶ−Ｙ−５Ｃ４−２を１ｍｌ当たり１０８個まで増幅し、ブローパイプで半接着状態の細胞を吹き落とすことにより細胞を懸濁させた。１ｍｌの細胞懸濁液を５分間１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去した。１ｍｌのＰＢＳ（ＰＨ７．４４）を加え、再懸濁し細胞を洗浄し、次いで細胞を５分間１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去した。このプロセスを３回繰り返した。８００μＬのトリゾール（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を細胞沈殿物に加え、混合物は激しく振り動かし、次いで１０分間放置して試料を溶かした。次いで２００μＬのＤＥＰＣ水を加え、水相を補充した。２５０μＬのＣＨＣｌ３を試料に加え、混合物は１０秒間激しく振り動かし、次いで５分間、１２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。５００〜６００μＬの上清水相を新たな１．５ｍｌのＥＰチューブに移し、６００μＬの予め冷却したイソプロパノールを加え（イソプロパノールと上清の体積比は約１：１である）、混合物は軽く逆混合し、１０分間４℃で放置し、次いで１０分間、１２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を吸い出し、白い沈殿物は残した。７００μＬの７５％エタノールを沈殿物に加え、混合物は５分間、１２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を吸い出し、ポンプ装置で汲み出し、又は白い沈殿物が透明になるまで焼いた。沈殿物に２０μＬのＤＥＰＣ水を加えｍＲＮＡを溶かし、混合物は２本のチューブにサブパッケージ化した。それぞれのチューブに１ｕｌの逆転写プライマーを加え、この場合１本のチューブに加えた逆転写プライマーは、軽鎖可変領域の遺伝子を増幅するためのＭＶｋＲ（５’−ＡＣＴｇｇＡＴｇｇＴｇｇｇＡＡｇＡＴｇｇＡ−３’）であった。他方のチューブに加えた逆転写プライマーは、重鎖可変領域の遺伝子を増幅するためのＭＶｈＲ（５’−ＣＣＡｇｇｇＲＣＣＡＲＫｇｇＡＴＡＲＣＡＮｇＲＴｇｇ−３’）であった。次いで１ｕｌのｄＮＴＰをそれぞれのチューブに加え、チューブは１０分間７２℃の水浴中に置き、次いですぐに５分間氷浴中に置いた。１０ｕｌの５×逆転写緩衝液、１ｕｌのＡＭＶ（１ｕｌ当たり１０ｕ、Ｐｏｒｍｅｇａ）、及び１ｕｌのＲｎａｓｉｎ（１ｕｌ当たり４０ｕ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を次いで加えた。混合物のウエルを混合した後、４２℃で逆転写を実施し、それによってＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
【０１５３】
抗体可変領域の遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって単離した。重鎖可変領域用の上流プライマーの組合せ（表２）、及び軽鎖可変領域用の上流プライマーの組合せ（表３）を合成した。さらに、ＭＶｋＲは軽鎖可変領域の遺伝子の増幅用下流プライマーとして使用し、ＭＶｈＲは重鎖可変領域の遺伝子の増幅用下流プライマーとして使用した。ＰＣＲ鋳型は上で合成した２つのｃＤＮＡである。ＰＣＲ条件は、９４℃５分間（９４℃４０秒間、５３℃１分間、７２℃５０秒間）×３５サイクル；７２℃１５分間であった。増幅産物を回収し、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングし、次いで配列決定のためＳｈａｎｇＨａｉ  Ｂｏｙａ  Ｃｏｍｐａｎｙに送った。抗体の可変領域及びＣＤＲの配列は表４〜５中に示し、この場合相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列はＫａｂａｔ法（Ｋａｂａｔ  ＥＡ、Ｗｕ  ＴＴ、Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ、Ｃｏｅｌｌｅｒ  Ｋ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１）によって決定する。
【表２】
0006462599.tif 000005
【表３】
0006462599.tif 000006
【表４】
0006462599.tif 000007
【表５】
0006462599.tif 000008
【０１５４】
Ｖｋは、軽鎖可変領域（ＶＬ）の一型であるｋａｐｐａ鎖可変領域を指す。
【０１５５】
（例５）
５Ｃ４モノクローナル抗体と他のモノクローナル抗体の競合的結合を決定するためのアッセイ
抗体の競合的結合をＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞で実施した。ＨＥｐ−２細胞は１８〜２０時間感染用量の３倍量のＲＳＶを感染させ、感染後、細胞解離法を細胞単離に利用し（セルストリッパー、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、細胞はＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に懸濁し、Ｕ型底９６ウエルプレートにおいてウエル当たり５×１０４個の細胞でインキュベートした。モノクローナル抗体５Ｃ４、ＡＭ２２、Ｄ２５及び１０１Ｆ（ＭｃＬｅｌｌａｎら、（２０１０）、Ｊ  Ｖｒｉｏｌ、８４：１２２３６〜１２２４４参照）を、１ｍｌ当たり１００μｇの初回希釈濃度でＨＥｐ−２細胞に加えた。３０分後、１００ｕｌのＡｌｅｘａ４８８及び１ｍｌ当たり１μｇのＤ２５複合体を加え、混合物は４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後の細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、次いで０．５％パラホルムアルデヒドを充填した。細胞とＤ２５及びＡｌｅｘａ４８８の結合から生じた生成物は、フローサイトメトリー（ＬＳＲ  ＩＩ装置、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって検出し、検出したデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン８．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）によって分析した。結果は図８中に示した。図８の結果は、ＡＭ２２、Ｄ２５及び５Ｃ４の間に競合的結合が存在し、５Ｃ４は、ＡＭ２２又はＤ２５の結合を最大９９％遮断し得ることを示した。これは５Ｃ４モノクローナル抗体が、ＡＭ２２モノクローナル抗体及びＤ２５モノクローナル抗体と同じ抗原上のエピトープ（Ｆタンパク質）を認識したことを示した。
【０１５６】
（例６）
抗原−抗体複合体の分析
抗原−抗体複合体の調製
ＲＳＶ  Ｆタンパク質はＲＳＶ  Ａ２株（受託番号Ｐ０３４２０）から誘導し、３つの天然に存在するアミノ酸変異（Ｐ１０２Ａ、Ｉ３７９Ｖ及びＭ４４７Ｖ）を含んでいた。ＲＳＶ  Ｆ残基１〜５１３及びＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフをコードする哺乳動物コドン最適化遺伝子を合成し、トロンビン部位、ヒスタグ、及びＳｔｒｅｐｔａｇＩＩをさらに含有する哺乳動物発現ベクターｐＬＥＸｍにサブクローニングした。ＲＳＶ  Ｆタンパク質、（ヒンジ領域内に停止コドンを有するか又は有さない）Ｄ２５軽鎖及びＤ２５重鎖を発現するプラスミドを懸濁ＨＥＫ２９３  ＧｎＴＩ細胞に同時トランスフェクトした。或いは、ＲＳＶ  Ｆプラスミドだけをトランスフェクトし、精製Ｄ２５Ｆａｂをトランスフェクションの３時間後にＨＥＫ２９３  ＧｎＴＩ細胞に加えた。４〜５日後、細胞上清を回収し、遠心分離し、濾過及び濃縮した。得られた細胞上清は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０からなる溶出緩衝液を使用し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を介して最初に精製した。次いで生成物を濃縮し、製造者（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）の説明書に従いＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ樹脂でさらに精製した。ヒスタグとストレプトシンタグは、一晩トロンビンプロテアーゼ処理によって除去した。過剰量のＤ２５抗体Ｆａｂを加え、次いで混合物を、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０２％のＮａＮ３のランニング緩衝液を用いてＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。溶出した複合体は等体積の水で希釈し、次いで１ｍｌ当たり約５ｍｇの濃度に濃縮した。同じ方法を使用して、ＡＭ２２／Ｆタンパク質又は５Ｃ４／Ｆタンパク質の抗原−抗体複合体を発現させ精製した。
【０１５７】
電子顕微鏡による複合体の分析
試料をグロー放電炭素コーティンググリッドに新たに吸収させ、水で軽くすすぎ、新たに調製した０．７５％ギ酸ウラニルで染色した。ＦＥＩ  Ｔ２０顕微鏡とＥａｇｌｅ  ＣＣＤカメラでイメージを集めた。イメージ解析及び２ＤアベレージはＢｓｏｆｔ（Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１５７、３（２００７）とＥＭＡＮ（Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２８、８２（１９９９））を使用することにより実施した。結果は図９中に示した。結果は、抗原−抗体複合体ＡＭ２２／Ｆタンパク質、５Ｃ４／Ｆタンパク質及びＤ２５／Ｆタンパク質が同じ構造を有することを示した。これは、ＡＭ２２モノクローナル抗体、５Ｃ４モノクローナル抗体及びＤ２５モノクローナル抗体がＦタンパク質の同じエピトープに結合し、同じコンホメーション（プレ−Ｆコンホメーション）のＦタンパク質に結合することを示した。
【０１５８】
さらに、電子顕微鏡による抗原−抗体複合体パリビズマブ／Ｆタンパク質及び５Ｃ４／Ｆタンパク質の観察結果を比較した。結果は図１０中に示し、左図は電子顕微鏡によるポスト−Ｆとパリビズマブの複合体の観察結果を示し、左下図は電子顕微鏡下で観察した左上図の白いボックス内のポスト−Ｆの構造を示し、右図は電子顕微鏡によるプレ−Ｆと５Ｃ４の複合体の観察結果を示し、右図内の白いボックスは電子顕微鏡下で観察したプレ−Ｆの構造を示した。結果は、抗原−抗体複合体パリビズマブ／Ｆタンパク質及び５Ｃ４／Ｆタンパク質は有意に異なる構造を有し、Ｆタンパク質のコンホメーションも２つの抗原−抗体複合体間で有意に異なり、パリビズマブ／Ｆタンパク質複合体においてＦタンパク質はポスト−Ｆコンホメーションであり、一方５Ｃ４／Ｆタンパク質複合体においてＦタンパク質はプレ−Ｆコンホメーションであることを示す。
【０１５９】
図９及び１０中の結果は、Ｆタンパク質のエピトープ及びそのエピトープを認識する抗体は、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションを安定化及び維持する際に重要な役割を果たすことを示す。
【０１６０】
複合体の結晶化
初期結晶を蒸気拡散法によって培養した。２０℃において、０．１ｕｌの貯蔵溶液（４０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４００、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０、及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）と複合体を混合した（５４）。結晶はハンギングドロップ法で再生し、３．６Åに回折した結晶を、３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４００、３．７５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、及び１％（ｖ／ｖ）の１，２−ブタンジオールを含有する貯蔵溶液を使用して増殖させた。結晶は液体窒素中で直接凍結させた。Ｘ線回折データは１．００Åの波長でＳＥＲ−ＣＡＴ光線ＩＤ−２２によって得た。
【０１６１】
複合体結晶の回折及びデコンストラクション
Ｘ線回折データをＨＫＬ２００（Ｚ．Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｗ．Ｍｉｎｏｒ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）、ｖｏｌ．２７６、ｐｐ．３０７〜３２６）で統合及びスケール調整し、検索モデルとして非結合Ｄ２５Ｆａｂ構造並びにＲＳＶ  Ｆタンパク質のポスト−Ｆ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＲＲＲ、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８５、７７８８（２０１１））由来の残基アミノ酸２９〜４２、４９〜６０、７８〜９８、２１９〜３０６、３１３〜３２２、３３３〜３４３及び３７６〜４５９を使用して、ＰＨＡＳＥＲ（Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙら、Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４０、６５８（２００７））によって分子置換法の解答を得た。ＮａＡｕＣＩ４誘導体由来の６部位を反応性側鎖にマッピングした（Ｆ残基Ｍｅｔ９７／Ｈｉｓ１５９、Ｍｅｔ２６４／Ｍｅｔ２７４、Ｈｉｓ３１７、及びＭｅｔ３９６、Ｄ２５重鎖残基Ｍｅｔ１９／Ｈｉｓ８１及びＨｉｓ５８）。手動モデル構築をＣＯＯＴ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、６６、４８６（２０１０））を使用して実施し、二次構造要素を最初に確定した。個々の部位、ＴＬＳパラメーター、及び個々のＢ−因子の精密化を、参照モデルとして非結合Ｄ２５Ｆａｂ構造とポスト−Ｆ構造を精密化中に使用して、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６、２１３（２０１０））で実施した。Ｆ２Ｃ末端からＭｅｔ９７の残基以外の、成熟タンパク質中の全てのＲＳＶ  Ｆ残基を確定した。最終データコレクション及び精密化統計値は表６中に要約した。複合体の結晶構造は図１１〜１３中に示した。
【表６】
0006462599.tif 000009
【０１６２】
さらに、同じ方法を使用してプレ−Ｆタンパク質のモノマーとトリマー、及びポスト−Ｆタンパク質のモノマーとトリマーの結晶構造を分析した。図１４中の結果は、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質は、空間構造（コンホメーション）の点で互いに有意に異なることを示した。
【０１６３】
複合体結晶のＸ線回折及び構造決定の結果は、（図１１〜１２中に示すように）Ｄ２５モノクローナル抗体がプレ−Ｆトリマーの頂部で２つのプロトマーにまたがるエピトープと結合し、Ｄ２５の重鎖はモノマーと結合し、軽鎖はそのモノマーに近い別のモノマーと結合することを示す。Ｄ２５抗体の６個のＣＤＲ中５個がＲＳＶ  Ｆタンパク質と結合し、重鎖ＣＤＲ３は（Ｆタンパク質の１９６〜２０９位由来のアミノ酸残基からなる）Ｆタンパク質のα４ヘリックスと結合し、（Ｆタンパク質の３８〜６０位由来のアミノ酸残基からなる）β２シートと（Ｆタンパク質の７４〜９６位由来のアミノ酸残基からなる）α１ヘリックスの間の（Ｆタンパク質の６２〜７２位由来のアミノ酸残基からなる）ループ構造と結合する。Ｄ２５によって認識されるエピトープはプレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の二次構造間で大きく変化することはないが、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の三次構造間では有意に変化する。即ち（図１３中に示すように）、α４ヘリックスは１８０°回転し、β２シートから遠く離れている。Ｄ２５によって結合されるエピトープの三次構造の変化は、Ｄ２５抗体がプレ−Ｆタンパク質と結合しポスト−Ｆタンパク質と結合しない理由を示し、Ｄ２５抗体がプレ−Ｆタンパク質の構造を安定化させ、したがってＲＳＶを中和することができる理由を説明する。
【０１６４】
図１１〜１３及び表２中の結果として、Ｄ２５モノクローナル抗体によって認識されるＦタンパク質のエピトープは、ＲＳＶ融合タンパク質又はその断片のアミノ酸残基ａ．ａ．１４８〜２１６からなり、ＲＳＶ融合タンパク質のアミノ酸残基ａ．ａ．１９６〜２０９を少なくとも含むことを決定した。さらに、ＲＳＶ融合タンパク質のａ．ａ．６２〜６９又はａ．ａ．６２〜７６由来のアミノ酸残基は、Ｄ２５モノクローナル抗体／Ｆタンパク質の特異的結合を促進することができることが分かっている。類似の方法によって、ＡＭ２２モノクローナル抗体と５Ｃ４モノクローナル抗体もＦタンパク質の前記エピトープを認識すると決定することができた。
【０１６５】
結果は図１５中にも示す。図１５は、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の構造、その空間構造を構成する相当アミノ酸配列、及びＤ２５によって認識されるエピトープの配列を示す。図１５中の結果は、プレ−Ｆタンパク質とポスト−Ｆタンパク質の三次構造間に有意な差があることを示す。特に、プレ−Ｆタンパク質の空間構造はα１〜α１０ヘリックス及びβ１〜β２３シートを含み、一方ポスト−Ｆタンパク質の空間構造はα１ヘリックス、α５〜α８ヘリックス、α１０ヘリックス、β１〜β２シート及びβ５〜β２１シートを含む。
【０１６６】
さらに、図１５中の結果は、Ｄ２５モノクローナル抗体によって認識されるプレ−Ｆタンパク質のコアエピトープは、立体的に互いに隣接した２つのペプチドセグメント、即ちａ．ａ．６２〜６９とａ．ａ．１９６〜２０９であることも示す。２つのペプチドセグメントの相互作用界面は、Ｆタンパク質の２つのセグメント（ａ．ａ．６２〜７６とａ．ａ．１３７〜２１６（又はより詳細にはａ．ａ．１４８〜２１６））又はその断片は、このような抗体（本発明の抗体（例えば５Ｃ４）、Ｄ２５とＡＭ２２など）によるプレ−Ｆタンパク質の認識と安定化に対して重要な影響があり、２つの領域、ａ．ａ．１７６〜１８１とａ．ａ．１８５〜１９４はＦタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションとポスト−Ｆコンホメーションの間に有意な変化がある、即ちそれらはプレ−Ｆタンパク質ではβシート（β３〜β４シート）のコンホメーションであるが、ポスト−Ｆタンパク質では（α５ヘリックス中に含まれる）αヘリックスのコンホメーションであることを示す。
【０１６７】
これらの結果は、Ｄ２５モノクローナル抗体、ＡＭ２２モノクローナル抗体及び５Ｃ４モノクローナル抗体はＦタンパク質上の同じエピトープを認識し、エピトープとの相互作用によりＦタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションを安定状態にし、維持することを示す。本発明において発見した新たなエピトープとそのエピトープを認識する抗体は、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーションを安定状態にすることができる。
【０１６８】
さらに前述の結果は、エピトープを認識する抗体はより高い中和活性を有することを示す。これは、Ｆタンパク質のプレ−Ｆコンホメーション及び新たなエピトープは生物において強力な免疫応答を誘導する際に重要な役割を果たし、そのエピトープを認識する抗体が、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染と関連がある疾患を有効に防止し治療することができることを示す。
【０１６９】
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者は、開示した全ての教示に従い、様々な改変と変更を施すことができること、及びこのような改変と変更が本発明の範囲内にあることを理解しているはずである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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