(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアクタ混合物からの細胞を保持し再循環させるための細胞分離器であって、流れが通過する滅菌可能なプラスチック袋またはプラスチック瓶（５０）を備え、このプラスチック袋またはプラスチック瓶（５０）内で、
上部領域に、収穫ストリーム収集領域（５６）から、上記細胞から分離された収穫ストリーム（７０）を取り出すための、１つ以上の通路／内部構造物（８０）を備え、
中央領域の上部セグメントに、動作時に水平に対して３０°から８０°までの角度（１０）で傾斜されている分離面積をもつ分離領域（１，５０１）を備え、
中央領域の下部セグメントに、上記リアクタ混合物（７４）の均一な水平方向の流れ分配のための１つ以上の通路または内部構造物（８４）、および水平ディストリビュータ（８５）を備え、
下部領域に、重力によって上記細胞を収集するための、底部で先細になっている固体収集領域（５７）を備え、
上記分離領域は、プレート積層体（１）内で互いに隣り合って配置された複数のチャネルからなり、
上記プレート積層体（１）は、このプレート積層体（１）の上記チャネルを形成する、上下に積層されたリッジプレートからなり、
前記リッジプレートは、接着によって接合されていないことを特徴とする細胞分離器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続フロー型またはバッチフロー型のプラスチック袋において細胞を保持し再循環させるための使い捨て分離器に関し、それは、好ましくは、バイオリアクタの外部で動作され得る。さらに、本発明は、本発明によるバイオリアクタの内部または外部で細胞を保持し再循環させるための方法に関する。さらに、本発明は、本発明による分離器を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物および植物の細胞の培養は、生物学的に活性な物質および薬学的に活性な生成物の生産に非常に重要である。特に、遊離懸濁液中の培地で頻繁に行われる細胞の培養は、要求が多い。その理由は、細胞は、微生物とは対照的に、機械的な剪断応力および栄養供給不足に関して非常に敏感だからである。
【０００３】
動物および植物の細胞株は、通常、バッチ的に培養される。これは、常に変化する基質、生成物、バイオマス濃度のせいで、細胞の最適な栄養が困難を伴ってのみ得られるという欠点を有する。また、発酵の終わりに、副生成物（例えば死細胞の成分）の蓄積がある。それは、通常、後の処理で大きな努力を払って除去する必要がある。上記理由から、特にタンパク質分解性攻撃によって損傷を受け得る不安定な生成物を生成するとき、連続運転されるバイオリアクタの使用がなされる。
【０００４】
連続バイオリアクタの使用は、次の要件が満たされたとき、高い細胞密度およびそれに伴う高い生産性を達成することを可能にする。
・  細胞への、基質、特に溶存酸素の十分かつ低剪断な供給
・  呼吸中に生じる二酸化炭素の十分な除去
・  高い細胞濃度を構築するための、効果的な、低剪断の、目詰まり無しの細胞保持システム、
・  バイオリアクタおよび保持システムの長期安定性（無菌性、流体力学的）。
【０００５】
連続的動作に加えて、例えば特に高い細胞密度を有するスターター培養物の培養のために、効率的な細胞保持システムを有するバイオリアクタを使用することが可能である。この場合、細胞保持システムは、バイオマスを事実上含まない細胞培養上澄み液を取り出すために、反復バッチモードで不連続的に使用される。その後、培養物を単純なバッチ処理の場合よりも高い細胞密度にするために、スターター培養リアクタは、新鮮な培地を補充され得る。
【０００６】
高い細胞密度（１ミリリットル当たり２０００万超の生細胞）が連続運転バイオリアクタで達成され得るように、細胞の効率的な保持が必要である。この場合、保持の必要な程度は、細胞の増殖速度および灌流速度ｑ／Ｖ（バイオリアクタ容積Ｖ当たりの培地スループットｑ）に依存する。
【０００７】
過去には、連続運転バイオリアクタのための種々の細胞保持システムが提案された。殆どの場合、それらはバイオリアクタの外部に配置された。この理由は、メンテナンスと洗浄の目的のための細胞保持システムの容易なアクセスである。
【０００８】
特にバイオリアクタ外部での不十分な酸素供給と二酸化炭素除去に起因する細胞の損傷、および、酵素の攻撃に起因する活性成分の分解を最小限にするために、小さな作動容積とそれに伴う短い細胞滞留時間を有する細胞保持システムを有することが望ましい。
【０００９】
メンブレンフィルタに加えて、固定及び可動のメンブレンで交差流濾過の原理に従って機能する設備が、従来技術の特定の遠心分離機と重力分離器で使用されている。
【００１０】
メンブレンフィルタを用いた細胞保持の場合には、堆積物または汚染が観測される。それらは、信頼性のあるメンテナンスフリーの長期運転を妨げる。メンブレン表面を横切る十分急速な流れがあるとき、この堆積物は低減され得る。これは、静止の又は振動する動作で達成され得る。振動する流れがメンブレンを横切るメンブレンシステムの例は、リファイン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Refine Technologies Inc.）社からの交互接線流れ（ATF）システムである。しかしながら、メンブレン表面を横切る急速な流れは、低剪断細胞培養の基本的な前提に反する。
【００１１】
遠心力場で細胞を分離するための低剪断遠心分離機は、わずか数週間にわたってメンテナンス費用なしで動作するのみで、遠心分離要素の交換を必要とする。このことは、汚染の危険性を増大させる。
【００１２】
細胞の培養において主に使用される重力分離器は、沈殿槽と傾斜チャネル分離器である。単純な沈殿槽と比較して、大規模な傾斜チャネル分離器は、分離面積に対してかなり容積が低いという利点がある。一つの刊行物（Ｈ・Ｊ・ヘンツラー（Henzler, H.-J.）著、ケミー・テヒニク（Chemie-Technik）、1、1992、3）は、対向流、交差流および並流で動作できる傾斜チャネル分離器内の細胞保持を記載している。流れが通過するチャネルの断面は、プレートまたはチューブを備えることができる。特許文献ＵＳ５，８１７，５０５とＥＰ０６９９１０１  Ｂ１は、対向流の分離器における細胞を保持するための傾斜チャネル分離器の使用をクレームしている。とりわけ、ＷＯ２００３０２０９１９  Ａ２は、細胞の保持のために、対向流と交差流の分離器、および様々な予備的な分離器（例えば、ハイドロサイクロン）との組み合わせを記載している。
【００１３】
上記傾斜チャネル分離器は、外部回路を介してバイオリアクタへ接続される。この目的のために、可撓性チューブとポンプが必要とされる。
【００１４】
重力分離器における代謝活性と細胞の不着を低減するために、重力分離器への途中で細胞培養液を冷却することが提案されている。低温で低下された代謝活性は、バイオリアクタ外部での細胞の滞留が延長された場合には確かに有利である。
【００１５】
ＷＯ２００９１５２９９０（Ａ２）は、流れが通過する容器内で細胞を保持し再循環させるための細胞保持システムであって、互いに隣接して配置された多数のチャネルを含み、それらのチャネルが直立した中空円筒を形成し、その中空円筒の縦軸に対して１０°と６０°との間の角度βで傾斜した状態にあるものを記載している。流れが通過する上記容器は、バイオリアクタ、または、細胞の保持および再循環のためにバイオリアクタに接続された容器であり得る。上記チャネルは下端で開口している。上端で、上記チャネルは、少なくとも１つのラインを有する共通の環状空間につながっている。そのラインを介して収穫ストリームが上記容器から搬送される。細胞と細胞培養液との分離は上記チャネル内で行われる。バイオリアクタからの収穫ストリームの連続的な取り出しの結果、細胞培養液と細胞とは、上記チャネル内に吸引される。細胞は、傾斜チャネル内で沈降し、古典的な傾斜チャネル分離器における通り、再び上記チャンネル（複数）の外へ、流入する収穫ストリームに対して対向流でスライドし、そして、それによって上記容器内に残る。細胞から分離された細胞培養液は、上記チャネルを介して上記チャネルの上方の環状空間に搬送され、最終的に容器の外に搬送される。
【００１６】
高度に規制された医薬品製造では、洗浄および滅菌されたバイオリアクタおよび例えば細胞保持システムのようなバイオリアクタ要素を設けることに対して、時間、設備、人員の面で、大幅な出費が割り当てられている。多目的プラント内の生産物の変更時または２つの生産物ロット間で交差汚染を安全に回避するために、洗浄の他に、非常に複雑な洗浄検証が必要とされる。検証は、おそらくプロセス適用の場合に繰り返される必要がある。ステンレス鋼製の従来のバッチ、フェドバッチまたは灌流の発酵槽の洗浄及び殺菌のために、一般的に、いわゆる永久設備システム内において、スチーム・イン・プレイス（ＳＩＰ）技術と組み合わせてクリーン・イン・プレイス（ＣＩＰ）技術が使用される。また、連続的なプロセス制御の場合に十分な長期的無菌性を保証するために、オートクレーブ技術が使用される。しかしながら、それは、リアクタまたはリアクタ要素のオートクレーブへの不便な輸送を必要とし、比較的小さなリアクタの規模でのみ適用される。老朽化消耗部品、例えば封止された撹拌シャフトの使用、不適切な滅菌または機器の輸送、オートクレーブ後における接続ラインの動作または接続への持ち込み、および定期的なサンプリングの場合に、汚染の危険性は特に高い。
【００１７】
バッチまたはフェドバッチモードで使用されるＣＩＰ／ＳＩＰシステムの場合には、設置手順に起因するリアクタの停止時間は、特に頻繁な生産物の変更の場合には、使用の短時間のせいで、リアクタの利用可能性に大幅に影響を与え得る。
【００１８】
最大の清潔さと無菌性を維持しながら、生産システムの迅速かつ柔軟な新たな装備の必要性に対応するために、使い捨てリアクタの設計は、市場で常に増加する関心を受けている。
【００１９】
それゆえ、従来技術から進んで、本発明の目的は、連続的またはバッチ的な運転プロセスにおいて、動物細胞、特にヒト細胞、および植物細胞を保持し再循環させるための効率的な方法であって、その方法は機械的な剪断応力に関する細胞の敏感さ、細胞への十分な栄養供給を考慮し、その方法は非常に大きな規模まで規模拡大可能であり、その方法は製薬産業のメンテナンス、洗浄及び殺菌の要求を満たし、その方法の使用は複雑さとエラーの危険性を低減し、その方法は、資源の最小限の使用で、使い捨てシステムとして経済的および環境的に最適な使用（生産・廃棄）を可能にするものを提供することにある。
【発明の概要】
【００２０】
上述の目的は、バイオリアクタ混合物からの細胞を保持し再循環させるための使い捨て細胞分離器であって、流れが貫通するプラスチック袋を備え、そのプラスチック袋は、先行技術、例えば好ましくはガンマ線照射、オートクレーブ滅菌または化学的滅菌によって滅菌可能であり、または、それに対応して取り扱い可能なプラスチック瓶を備え、以下の内部構造を有するものによって達成される。
−  上記プラスチック袋またはプラスチック瓶の上部領域に、収穫ストリーム収集領域（５６）から、上記細胞から分離された収穫ストリーム（７０）（＝収穫）を取り出すための、１つ以上の通路／内部構造物（８０）を備え、
−  上記プラスチック袋の中央領域の上部セグメントに、分離面積（５００）または上記分離面積を含むプレート積層体（１）をもつ分離領域を備え、このプレート積層体は、動作時に水平に対して０°から８０°までの角度（１０＝β）で傾斜され、
−  上記プラスチック袋またはプラスチック瓶の中央領域の下部セグメントに、導入面（５１０）にわたる細胞培養液（＝供給物）７４の均一な水平方向の流れ分配のための１つ以上の通路または内部構造物（８４）を備え、
−  上記プラスチック袋またはプラスチック瓶の下部領域に、重力によって上記固体を収集するための、底部で円錐状に先細になっている固体収集領域（５７）を備える。通常、上記固体収集領域（５７）は、上記細胞を取り出すための、１つ以上の通路（８９）または内部構造物（８８）を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
それゆえ、本発明は、リアクタ混合物からの固体を保持するための固体分離器であって、流れが通過する滅菌可能なプラスチック袋またはプラスチック瓶（５０）を備え、このプラスチック袋またはプラスチック瓶（５０）内で、
上部領域に、収穫ストリーム収集領域（５６）から、上記固体から分離された収穫ストリーム（７０）を取り出すための、１つ以上の通路／内部構造物（８０）を備え、
中央領域の上部セグメントに、動作時に水平に対して０°から８０°までの角度（１０＝β）で傾斜されている分離面積（分離エリア）をもつ分離領域（１，５０１）を備え、
中央領域の下部セグメントに、上記リアクタ混合物（７４）の流れ分配のための１つ以上の通路または内部構造物（８４）を備え、任意に水平ディストリビュータ（８５）を有し、
下部領域に、重力によって上記固体を収集するための、下方へ向かって、通常は円錐状または角錐状に、先細になっている固体収集領域（５７）を備える。
【００２２】
通常、固体収集領域（５７）は、固体を取り出すための１つ以上の通路（８９）または内部構造物（８８）を有している。それにより、
その固体は、必要に応じて、リアクタに再循環され得る。
【００２３】
下方へ向かって先細になった固体収集領域は、鉛直に対して１０°から６０°までの角度５８，５９を有するのが好ましい。ここで、角度５８と５９は、個別に選択可能である。
【００２４】
収穫ストリーム収集領域５６の形状は、所望により、特に平坦にまたは上方へ向かって先細にされ得る。
【００２５】
通常、プラスチック袋またはプラスチック瓶は、単層または多層の透明なポリマ材料で構成される。これは、装置の内部が動作中に見られることを可能にする。
【００２６】
ｓ＜１ｍｍの慣用の低膜厚の場合には、上記プラスチック袋のポリマ材料は、比較的小さな質量分率をもつ装置を可能にする。それは、設備し、処理するのにコスト効率が高く、また、使い捨てシステムの構築に非常に高度に適している。したがって、使用された分離器の廃棄と新しい使い捨て可能な分離器の使用は、使用された分離器の洗浄よりも経済的である。特に注射用水（ＷＦＩ）を用いた高価な洗浄と、時間がかかる洗浄検証は、使い捨て可能な分離器を使用しているときは適用されない。本発明による分離器は、対応する滅菌結合可能な連結要素とフィルタ要素を有し、滅菌包装されて、可撓性チューブを介してバイオリアクタシステムへ連結するのに適して組み立てられる。
【００２７】
上記プラスチック袋に適した材料は、特許明細書、米国６１８６９３２  Ｂ１、第２欄および第３欄で使用され、その中で言及された輸送袋（sachets）のための材料や材料の組み合わせである。また、そこに引用された壁の強度は、本発明による分離装置に転用され得る。
【００２８】
好ましい実施形態では、プラスチック袋の壁は、当業者に知られたフィルム複合材料からなり、２層以上（ラミネートまたは共押出）からなる。展開性、延伸性、ガス拡散性、安定性、プロセス互換性（生成物と細胞の最小限の吸着）および溶接性に関して、プラスチック袋の特性を向上させるためである。
【００２９】
ポリマフィルムで構成されたプラスチック袋を含む本発明による固体分離器は、例えば、米国６１８６９３２  Ｂ１に記載の方法に従って製造され得る。それは、溶接シームを調整することを必要とする。本発明による分離装置の好ましい実施形態を製造するための例示的な実施形態が、以下でさらに説明される。
【００３０】
通路は、通常、生産物接触フィルムと同じ材料から製造される。そのフィルムで滅菌性や強度の点で欠点の無いことを可能にするためである。好ましい生産物接触フィルム材料は、当業者に知られている様々な程度の架橋ポリエチレンである。外側ジャケットフィルムとしては、用途およびプロセス要件に応じて、内側のフィルムに対して熱溶接法の使用のための高い融点、および/またはより良好な強度、および/または拡散特性をもつ、当業者に知られている様々な材料が用いられる。
【００３１】
通常、内部構造物８０、８８および８４は通路に溶接されている。その通路に対して、バイオリアクタまたは他の外部システムに接続するための導管、好ましくは可撓性チューブが接続され得る。それに代えて、上記通路は、接続ラインの通過のために、１つ以上の接続プレート、カバーまたはストッパに導入され得る。
【００３２】
本発明による分離器の特定の実施形態では、上部領域において、プラスチック袋（四面体）の壁上またはコーナ（立方体）に、１つ以上の接続プレート９０（好ましくは１つ）（これもカバーであり得る。）が配置されている。その接続プレートは、接続ラインを貫通させるための通路を含み、その接続の領域において、分離器の支持が可能となる。それは、通常、組み立ての間に分離器のハウジングに接続される。
【００３３】
それに代えて、先細になった固体収集領域５７の端部に、ネックに、カバーまたはストッパ２２０が導入され得る。この実施形態では、カバーまたはストッパは、接続ラインを貫通させるための通路を含む。
【００３４】
上記固体は、通常、１つ以上の通路または分離器の下部頂点付近にある内部構造物８８を介して、固体収集領域５７から取り出される。内部構造物８８は、通常、バイオリアクタに接続される。収集された細胞は、圧力勾配を介して、またはポンプを介して、そのバイオリアクタ内へ再循環される。好ましくは、内部構造物８８は、吸引によって、上記固体の中央鉛直取り出しのために使用される。このことは、分離器の生産および動作のための容器内でのその配置を簡素化する。また、上記取り出しは、分離器の頂点内へ溶接された通路、またはカバーやストッパ内にで導入された通路を介して、進行され得る。
【００３５】
本発明の第１の実施形態では、上記分離領域は、プレート積層体１内の隣接して配置された多数のチャネルから構成され、好ましくは、プレート積層体１内のチャネルを形成する上下に積み重ねられた複数のリッジプレートから製造される。好ましくは、プラスチックプレートが使用される。上記チャネルは下端及び上端で開口している。上記下端では、上記チャネルは、導入面、特に、円錐状または角錐状の態様で下方へ向かって先細になっている共通の固体収集領域５７につながっている。上記上端では、上記チャネルは、共通の収穫ストリーム収集領域５６につながっている。その収穫ストリーム収集領域は、少なくとも１つの通路８０を有し、その通路を通して上記収穫ストリームが上記容器外へ搬送され得る。
【００３６】
上記チャンネルでは、細胞と細胞培養液とが分離される。上記バイオリアクタからの上記収穫ストリームの連続的な取り出しの結果として、細胞培養液と細胞とは、チャネル内に吸い込まれる。プラスチック袋またはプラスチック瓶の中央領域の下部セグメント内に、上記リアクタ混合物７４の流れ分配のための１つ以上の通路または内部構造物８４が導入されている。細胞培養液（＝供給物）７４の均一な水平方向の流量分布は、導入面５１０を介して求められる。通常、プレート積層体１の幅に依存して、ストレートのポートを有する１から４個の通路が、プラスチック袋の壁内またはプラスチック瓶の同じ高さに導入される。そのような通路の間の高さおよび距離に依存して、水平ディストリビュータ８５は、内部構造として有利であり得る。
【００３７】
細胞は、傾斜して配置されたチャネル内で沈降し、古典的な傾斜チャネル分離器における通り、再び上記チャンネル（複数）の外へ、流入する収穫ストリームに対して対向流でスライドし、そして、円錐状に先細になった固体収集領域５７内に集められる。通常、固体収集領域５７は、上記収集された細胞を吸い出し、上記バイオリアクタ内へ再循環させるための、上記バイオリアクタに接続された１つ以上の通路／内部構造物８８／８９を有する。
【００３８】
上記プレート積層体１の上記チャネルは、矩形、楕円形、円形または半円形の断面（図４）を持つことができる。
【００３９】
チャネルの寸法決定（数、直径、長さ）は、いずれの場合にも、保持されるべき細胞の種類、バイオリアクタのサイズ、およびスループットに依存する。
【００４０】
チャネルの目詰まりを防止するために、チャネル幅ｄは、ｄ≧１ｍｍであるのが好ましい。好ましい実施形態では、３ｍｍから１００ｍｍまで、好ましくは４ｍｍから２０ｍｍまで、特に好ましくは５ｍｍから７ｍｍまでのチャネル幅を有するチャネルが、第１に、目詰まり状態を確実に避けるため、第２に、分離器空間とバイオリアクタ空間との間の容積比（空時収量を低減する）を最小化するために、用いられる。
【００４１】
必要な分離面積Ａｅｒｆは、式Ｅｑ．１に従って、沈降速度ｗｓ、潅流速度ｑ／Ｖ（バイオリアクタ容積Ｖ当たりの培地スループットｑ）、およびバイオリアクタ容積から生じる。効率係数ηは、縦型分離器に対する傾斜チャネル分離器の性能低下または性能差を考慮している（式Ｅｑ．２）。
【００４２】
矩形および円筒形の断面の場合の理論的な分離面積Ａｔｈは、下記の式Ｅｑ．３およびＥｑ．４から、文献（Ｈ．Ｊ．ビンダー（H.-J. Binder）著、「傾斜した層流の円形と矩形のパイプ内における単一粒子とマルチ粒子の懸濁液からの沈降（Sedimentation aus Ein- und Mehrkornsuspensionen in schraeg stehenden, laminar durchstroemten Kreis- und Rechteckrohren）」、学位論文、ベルリン、１９８０年）に発表のアプローチに従って、近似的に決定され得る。
【数１】
0006474616.tif 000002
【数２】
0006474616.tif 000003
【数３】
0006474616.tif 000004
【数４】
0006474616.tif 000005
ここで、Ｚはチャネルの数、βはチャネルが重力の方向に対して傾斜されている角度、ｄは内径、Ｌはチャネルの長さ、πは円周率（π＝３．１４１４９…）である。
【００４３】
チャネル長の寸法決定は、層流状態（レイノルズ数Ｒｅ＜２３００）の遵守が考慮されるべきことを必要とする。チャネル長Ｌは、利用可能な袋内寸法（＝袋ＬＫの長さ）の長さによって決定される。実現されるべき袋の長さＬＫは、プラスチック袋内で実現されるべき充填レベルによって、および、プラスチック袋内で実現されるべき静水圧によって、決定される。過度に高い静水圧は、必要に応じて、適切に寸法設定され、生産物に非接触の、したがって、再利用可能なハウジングへ送られ得る。
【００４４】
これに関連して、収穫ストリーム取り出し部位（＝通路／内部構造物８０）での動圧は、不均衡配分という効率低下現象を排除するために、チャネル内の圧力降下よりも少なくとも５〜１０倍低くあるべきである。十分な圧力降下は、０．１ｍからのチャネル長については技術的に実現可能であると考えられ得る一方、好ましくは０．２ｍから５ｍまでのチャネル長、特に好ましくは０．４ｍから２ｍまでのチャネル長については、実現されている。
【００４５】
通常、チャネル長Ｌは、プラスチック袋の長さＬＫの３０％から９５％まで、特に好ましくは６０％から９０％まで、である。
【００４６】
低減された圧力降下に起因して、短いチャネル長Ｌは、分配の問題につながる可能性がある。このことは、特に上部の収穫ストリーム収集領域５６から収穫ストリームを取り出す場合は、取り出し速度を低減するための分配装置を必要とするかも知れない。したがって、必要に応じて、通路／内部構造物８０は、収穫ストリーム収集領域５６から、細胞から分離された収穫ストリーム７０（＝収穫）の均質化された取り出しのための流れインバータ８１を有する。
【００４７】
通常、本発明による分離器は、１から１０６までのチャンネルを含むことができ、好ましくは１０から１００，０００まで、特に好ましくは１０〜１０，０００までのチャンネルを含むことができる。必要に応じて、チャンネルは、スペース要件の最適化のために、プレート積層体１内の１つ以上のリッジプレートにわたって分散され得る。好ましくは、規模に応じて、プレート積層体１は、１から４００までのリッジプレートを備え、特に好ましくは１から５０までのリッジプレートを備える。本発明を限定しない一実施形態では、リッジプレート（複数）は支持プレート（単数）に接合され得る。この支持プレートはサポートを提供し、正確な位置決めのために上記プラスチック袋に対して接着または溶接によって接合され得る。
【００４８】
上記支持プレートを含む単層または多層のリッジプレートからなるプレート積層体１の幅と高さの比は、上記プラスチック袋の形状に対して適合され得る。
【００４９】
３Ｄの袋（４つのフィルムシートが一緒に溶接された袋）では、正方形、円筒形、長方形または楕円形の断面を有し、高さ対幅の比Ｈ／Ｄが ０．３ ＜ Ｈ／Ｄ ＜１．５、好ましくは ０．６ ＜ Ｈ／Ｄ ＜ １．２、特に好ましくは ０．９ ＜ Ｈ／Ｄ ＜ １．０ であるプレート積層体１を使用することが、好ましく可能である。
【００５０】
より簡単で、より安価な２Ｄの袋（２つのフィルムシートが一緒に溶接された袋）に適したのは、長方形の断面を有し、Ｈ／Ｄ比が ０．００５ ＜ Ｈ／Ｄ ＜ １、好ましくは ０．０２ ＜ Ｈ／Ｄ ＜ ０．６、特に好ましくは０．０４である平面的なプレート積層体である。
【００５１】
２Ｄの袋を、挿入されたプレート積層体と一緒に溶接するために、最小間隔比を０．５≦ Ｘ／Ｈ ≦ ２に、好ましくは１ ≦ Ｘ／Ｈ ≦ １．６に維持することが有利である。ここで、Ｘは、プレート積層体１と先細の始まりとの間の距離であり、また、Ｈはプレート積層体の厚さである。プレート積層体は、輪郭が付けられたプレート３４０または３２０（図４参照）から形成され得る。輪郭が付けられたプレートは、好ましくは、滑らかな側面と、一定の間隔でリッジと溝の連続を有する側面とを有する。チャネルは、一つ以上の層になっているプレートの積層の上に、例えば支持プレート３０上に形成されている。この場合、チャネルは、隣接する層の滑らかな側によって、またはステータの壁によって、各場合における開放側に向かって閉じられている。プレート積層体を押出成形し、または、単層またはは多層の態様でサブ積層体を押出形成し、それらを結合してプレート積層体１を形成することも可能である。
【００５２】
チャネルの形状は、チャネル幅ｄに対するリッジ高さｈｓの比によって確定される（図４）。技術的に実現可能なｈｓ／ｄ比は、特性（鍛造性、弾性、深絞りのための容量）に応じて、０．０１ ≦ ｈｓ／ｄ ≦ ５の範囲内である。通常、ｈｓは、１ｍｍ以上であり、好ましくは３ｍｍ以上であるべきである。好適なｈｓ／ｄ比は０．５から５までである。リッジ幅ｂｓは、フィルム材料の機械的安定性によって決定される。リッジ幅ｂｓは、単位分離器容積当たりの高い分離面積を可能にするように、できるだけ小さくすべきである。同時に、それらのリッジ幅は、形状の変化なしに下層との圧力嵌め接続を可能にするために、過度に低く選択されるべきではない。押出成形されたプレート積層体１、または、押出成形されたプレートサブ積層体若しくはリッジプレートから構築されたプレート積層体の場合には、分離面積の大きな損失なしに、小さなリッジ幅をもつ非常に高い剛性を実現することができる。だから、この製造形態が好ましい。
【００５３】
リッジプレートから構築されたプレート積層体は、チャネル開口部の平面がプレート積層体１の支持面に対して直角であるストレートな直方体（図３）、または、組み込まれた状態でのチャネル開口部が水平面上にある傾いた直方体（図２）のいずれかとして、設計されている。後者の解決策は、下部チャネル開口部に向かった沈降起因の濃度勾配を防止するために好ましい。チャンネルは、必要に応じて水平ディストリビュータ８５の助けを借りて、リアクタ混合物の均質化された流れを受ける。
【００５４】
上記リッジプレートは、接着又は溶接により接合されるのが好ましい。プレート積層体は、接合の結果として、主に空間的に固定されるべきである。別の目的は、いわゆるデッドゾーン（リッジプレートの外面の周りで分離に使用されない空間）を最小化することである。しかしながら、この場合、上記デッドゾーンの完全な回避は絶対に必要というわけではない。好適な接着剤は、当業者に知られており、かつ、チャネルの材料及び表面特性に一致している接着剤成分である。特に、必要なＦＤＡの品質クラスで市場で入手可能な接着剤を使用することが好ましい。溶接のためには、熱、レーザおよび超音波などの熱接合技術を用いることができる。特に好ましい接合技術はレーザ溶接である。レーザ溶接は、プレート積層体をこの目的に適した装置におけるサイズに切断することと組み合わせて使用され得る。溶接技術は、製薬プロセスに導入されるプラスチックの数がこの接合技術によって増加されない、という利点を有する。
【００５５】
輪郭が付けられたプレートは、プレート製造時に直接成形することによって、または、平滑なプレートに対して、エンボス加工され、加熱成形または冷間成形されたプレートを接合（例えば、接着）することによって、作製され得る。エンボス加工されたおよび平滑なプレートの材料特性は、それらの異なる機能（エンボス加工されたプレートについての良好なスライド特性、形状安定性、平滑なプレートについての良好なシール特性）に関して、当業者に知られた適切な材料を選択し、適切な表面品質を有することによって、最適に調整され得る。
【００５６】
通常、商業的に入手可能で、安価で、製薬プロセスに適するリッジプレート、特にプラスチックリッジプレートは、例えばポリカーボネートからプレートサブ積層体として押し出され、プレート積層体１を製造するために、切断され、適切な長さに製造され、そして、互いに取り付けられる。
【００５７】
上記分離器の製造のために、通路または更なる内部構造物が調製され、プラスチックフィルム内で、適切な部位に付加的に取り付けられる。
【００５８】
続いて、プラスチック袋５０は、プラスチックフィルムから一緒に溶接され（図５）、プレート積層体１を取り囲む。この結果、溶接シーム５５をもつプラスチック袋５０が得られる（図５）。
【００５９】
その後、支持プレートを含むプレート積層体１は、通常、プラスチック袋５０とプレート積層体１との間の細胞の侵入、したがって汚染を防止するために、プラスチック袋５０の内面に対して押圧される。
【００６０】
製造方法の第１実施形態では、プラスチック袋５０がプレート積層体１上に引き締められ（図５）、形成された折り畳み箇所５２は、１つ以上の締付ストラップ６０を使用して平らに押圧され固定される（図６）。また、袋とプレート積層体の周りにしっかりと巻かれたプラスチックフィルムは、締付ストラップとして適している。有利な締付け特性は、例えば、家庭用フィルム、または可撓性の薄いシリコーンフィルムに見出される。また、上記袋の壁へプレート積層体１を溶接することは、袋とプレート積層体との間の密な接続を確立するためにも適切であるかもしれない。
【００６１】
記載されている方法は、細胞を保持し再循環させるための本発明による傾斜チャネル固体分離器の、簡単で安価な製造を可能にする。広い範囲内で可変なプレート積層体の構成のおかげで、後続の装置の形状が容易かつ正確に定められ、また、ステンレス鋼のシステムとは対照的に、非常に大型のバイオリアクタに設けられ得る。記載されている方法は、特に、使い捨て可能な要素の安価な製造を可能にする。その使用は、医薬ガイドラインに従って洗浄される保持システムを設けるために必要とされる支出を最小限に低減することを可能にする。
【００６２】
動作のために、本発明による装置は、水平に対して角度１０＝βに方向付けられる。その角度βは、細胞／固体の沈降とスライドの振る舞いによって決定され、動作中に水平に対して３０°≦β≦８０°である。好ましい実施形態では、角度βは、水平に対して３５°から７５°まで、特に好ましくは４５°から６０°までである。
【００６３】
動作中の角度βを確保するために、本発明の固体分離器は、動作のためのスタンド１４０に固定される（図１１〜図１３）。
【００６４】
スタンド１４０は、通常、スタンド足１４５と、設置面に対して予め定められた角度１０（＝β）を有するサポート１４８とを備えている。サポート１４８上に、支持プレート３０を含むプレート積層体１は、突起１４２および／またはカバー１１０および締付要素１１５などを用いて、収穫ストリーム収集領域５６（上方）と固体収集領域５７との両方が動作中に最小限のしわで上記サポート上に置かれ得るように、予め定められた高さに保持されている。これはデッドスペースとそれに対応する汚染を軽減する。
【００６５】
好ましい実施形態では、スタンド１４０は、プレート積層体１を収納するためのハウジング１００とカバー１１０を有する。
【００６６】
この場合、締め付けプロセスは、本発明による固体分離器をスタンド１４０上に、より具体的には、おそらく締付ストラップ６０で包むことなく、ハウジング１００およびカバー１１０内に取り付ける間に、起こり得る（図６及び図７）。ここで、プラスチック袋５０は、ハウジング１００によって支持プレート３０上およびプレート積層体１上の位置に保持される。そして、折り畳み箇所５２は、カバー１１０によってプレート積層体１上へ押し付けられる。好ましくは、カバー１１０は、一方の側で例えばヒンジによって、また、他方の側で１つ以上のロック可能な締付要素１１５によって、ハウジング１３０に固定される。これにより、スタンド１４０は、本発明による固体分離器を起動するための操作を、より簡単にする。
【００６７】
好ましい実施形態では、カバー１１０は、延長部１１２および／または枠体１３０を有する。それらは、円錐状に先細になった固体収集領域５７の形状を保持し、より具体的には角度５９を一定にし、動作中に充填状態でその拡張を防ぐ。このような形状が固定された容器は、大型バイオリアクタへの接続の際に予想されるような比較的大きな静水圧力でのシステムの動作にとって、とりわけ有利である。
【００６８】
プレート積層体のチャネル内での、および、円錐状に先細になった固体収集領域の内壁上での、細胞のスライドの振る舞いを改善するために、本装置は、適切な手段、例えば空気圧のまたは電気的なバイブレータを用いて、振動させられ得る。
【００６９】
必要な分離面積は、細胞の沈降特性によって、および、得ようと努められる灌流速度および細胞濃度によって、決定される。好適な灌流速度は、０．１〜４０リットル／日、特に好ましくは０．５〜２０リットル／日の範囲内である。バイオリアクタ容積当たりの好ましい分離面積は、細胞の沈降特性（細胞の濃度、サイズ、凝集傾向に依存する）に応じて、０．１〜１００ｍ２／ｍ３の範囲内であり、特に好ましくは２〜２０ｍ２／ｍ３である。
【００７０】
プレート積層体１は、プラスチック袋に代えて、多角形の断面をもつプラスチック瓶内に据え付けられ得る（図２１）。ここで、上記プラスチック瓶は、下方へ向かって先細になった領域（瓶のネックで終端する）を有し、その下方へ向かって先細になった領域は、重力によって固体を収集するための固体収集領域５７を形成している。動作のために、プラスチック瓶のネックは、接続ラインを通過させるための通路を有するカバー２２０を用いて閉じられる。代替の実施形態では、プレート積層体１は、プラスチック瓶５０の壁に固定された１個以上の基体によって、分離領域として置き換えられる。
【００７１】
上記プラスチック瓶に適した材料は、例えば、市販されている、メルクミリポア（Merck Millipore）（http://www.millipore.com/catalogue/module/c85149）からのミリセル（Millicell；登録商標）培養瓶からの材料である。
【００７２】
本発明による固体分離器は、好ましくは、洗浄の問題を回避するために、使い捨て製品として実現される。
【００７３】
通常は、本発明による固体分離器は、可撓性チューブによって、外部でバイオリアクタへ、例えばＵＳ２００９−０１８０９３３に記載されているような使い捨て可能なバイオリアクタへ連結される。本発明による分離器の供給は、少なくとも２つのポンプ、好ましくは低剪断蠕動ポンプ（図１８）によって、確実に達成される。上記ポンプは、バイオリアクタ空間からの細胞培養液の取り出し、熱交換器を横切って冷却された後に分離器装置へのその細胞培養液の供給、収穫ストリームの上記分離器装置からの取り出し、上記バイオリアクタへの固体流（＝戻り物７０）のリターン輸送を可能にする。
【００７４】
本発明による固体分離器（複数）の保存は、スペースを節約する。それらの固体分離器は、何の問題もなく互いの上に積み重ねられ、起動時に適切な角度にセットアップされるのみだからである。その後、それらの固体分離器は、バイオリアクタ（単数）の外部で簡単に接続して動作され得る。それらの固体分離器は、作業ベンチの内部または外部で、可撓性チューブの端部に取り付けられた、様々なメーカ（ポール（Pallr）、ザルトリウス（Sartorius）、コウルダ（Coulder））からの滅菌カプラによって、発酵槽へ接続される。しかし、好ましくは、チューブ溶接による。それゆえ、本発明による固体分離器に取り付けられる可撓性チューブは、好ましくは、少なくとも部分的に、可撓性チューブ溶接に適した可撓性チューブ要素を備える。さらに、サスペンションを搬送するために、可撓性チューブは、通常、機械的応力に対して高い耐性がある少なくとも２つの特定のチューブ要素（例えば、フェルダ（Verder）からのフェルダプレネ（Verderprene；登録商標）エラストマチューブで構成される）を含む。それらのチューブ要素は、分離器の無菌性を危険にさらすことなく、蠕動ポンプに非侵襲的に挿入され得る。接続、動作およびメンテナンスは、問題が無い。使い捨て可能な要素としての本発明による装置または本発明による装置の部品の実現は、洗浄の問題を無くす。
【００７５】
それゆえ、本発明の更なる項目は、プラスチック袋内にプレート積層体を有する本発明による固体分離装置を作製する方法である。
【００７６】
好気性バイオリアクタ内にプレート積層体１を直接挿入することは、ガス適用のために必要なガスの気泡が入口開口から離れたままにされるならば、原理的には考えられる。この場合、プラスチック袋の円錐状の収集部分、および環流ポンプは、省略され得る。
【００７７】
しかしながら、好ましくは、本発明による分離器は、バイオリアクタの外部での使用を意図されている。
【００７８】
本発明による細胞分離器の第２の実施形態では、上記プラスチック袋は多面体状または円錐状である。ここで、上記プラスチック袋は、動作中、上記底部で先細になっている上記固体収集領域５７が上記プラスチック袋の壁および上記多面体または上記円錐の頂点またはコーナ部によって形成されるように、配置されている。上記プラスチック袋内では、分離領域５００の角度１０は、伝統的な縦型分離器と同様に、水平に対して０°である。
【００７９】
上記分離器の容積は、例えば０．１リットルから１０００リットルまでの値をとり得る。
【００８０】
特に、本発明による多面体の形状は、両せつ体（＝図１４及び図１５に示すような４つの合同な三角形で囲まれた多面体）、特に四面体、正角錐（＝４つの合同な三角形と正方形で囲まれた多面体、図示せず）、八面体、および立方体（図１６及び図１７に示すような）からなる群から選択されている。
【００８１】
同様に適しているのは、円錐（＝円錐状の外郭と円形のブランクシートからなる）である。
【００８２】
プラスチックフィルムからの簡単な製造のために、両せつ体、特に四面体、円錐および立方体が好ましい。本発明による細胞分離器は、通常、最大幅に対する高さの比を、０．２〜３の範囲、好ましくは０．５〜２の範囲、特に好ましくは０．７〜１．５の範囲内に有する。
【００８３】
本発明による細胞分離器は、好ましくは、この分離器の上部にあるポートおよび接続ラインを介してバイオリアクタまたは他の外部システムに接続される。このことは、容器が、通路無しすなわち漏れ無しの分離器器具を受けるために設計され得るという利点を有する。これにより、付加的な安全設備無しに、遺伝的に改変された生産細胞の漏れを防止し得る。
【００８４】
バイオリアクタ混合物は、通常、動作のために配置されたプラスチック袋の縦軸に沿ってバイオリアクタ混合物を導入するための内部構造物８４を介して導入される。好ましくは、本発明による細胞分離器では、内部要素８４の入口開口で、水平ディストリビュータ８５が、リアクタ混合物７４の均一な水平方向の流れ分配のために使用される。この場合における供給は、環状ノズルによって、または、例えばＴ形部品のような水平方向に向けられた内部構造物若しくはＹ形部品のような下方へ向けられた内部構造物の２つ以上の出口開口によって、入口面５１０にわたって、好ましくは入口面５１０のコーナ部の方向へ、分配される。図２５は、単一のＴ形またはＹ形ディストリビュータを持つバイオリアクタ混合物を導入するための内部構造物８４と、２重のＴ形またはＹ形ディストリビュータを持つそれとの、比較を示している。Ｙ形ディストリビュータの場合には、入口ストリームは下方へ向けられている。小さな清浄化表面負荷ｖ≦０．１ｍ／ｈの場合におけるディストリビュータの効果は、低い。良好な保持は、２重のＴ形またはＹ形ディストリビュータを用いるよりも、単一のＴ形またはＹ形ディストリビュータを用いて達成された。高い表面負荷ｖ≧０．１ｍ／ｈでは、下方へ向けられた入口ストリームを持つＹ形ディストリビュータは、Ｔ形ディストリビュータよりも優れており、したがって好ましい。
【００８５】
通常、２〜８個、好ましくは２〜４個の、水平または下方へ向けられた開口部を有するディストリビュータが使用される。ここで、プラスチック袋のエッジ長さＤに対する幅ｃ（＝２つの開口の間の距離）として０．０３ ≦ ｃ／Ｄ ≦ ０．２５、好ましくは０．０４ ≦ ｃ／Ｄ ≦ ０．１５が、通常使用される。円錐状の分離器の場合、Ｄは円形ブランクシートの直径である。
【００８６】
固体は、通常、分離器の下部頂点の近傍にある１つ以上の通路または内部構造物８８を介して、固体収集領域５７から取り出される。内部構造物８８はバイオリアクタに接続されている。そのバイオリアクタ内へ、収集された細胞が、圧力勾配を介して、またはポンプを介して戻される。好ましくは、内部構造物８８は、固体の吸引による中央の、鉛直の取り出しのために使用される（図１４、図１５、図１６、図１７）。これは、製造と、動作のために分離器の容器内にその分離器を配置することを簡素化する。取り出し物は、上記分離器の頂部に溶接された通路を介して取り出され得る。この場合、ハウジングの漏れ無し設計のためには、可撓性の接続チューブは、上記分離器を受けるためのハウジングの内部（すなわち、ハウジングの壁とプラスチック袋との間）に置かれなければならない。
【００８７】
収穫ストリームは、通常、内部構造物８０を介して取り出される。その内部構造物は、プラスチック袋内で、分離領域５００の上方で収穫ストリーム収集領域５６内に配置されている。好ましい実施形態では、収穫ストリーム収集領域５６から、細胞（＝収穫）から分離された収穫ストリーム７０を均一に取り出すのための流れインバータ８１が、収穫ストリーム収集領域５６内に据え付けられている。その収穫ストリーム収集領域は、内部構造物８０に接続されている（図１５）。この内部構造物８０は、通常、収穫ストリーム収集領域５６の外側輪郭を有する逆にされた傘の形状を有する（四面体の場合には、三角形の内部構造物が使用される）。それは、エッジ長さまたは直径ａを有し、０．２５ ≦ ａ／Ｄ ≦ ０．７５、好ましくは０．４ ≦ ａ／Ｄ ≦ ０．６は、特に好ましくは０．５であり得る。
【００８８】
通常、内部構造物８０、８８および８４は、通路内に溶接される。それらの内部構造物に対して、バイオリアクタまたは他の外部システムに接続するための導管、好ましくは可撓性チューブが接続され得る。
【００８９】
本発明による分離器の好ましい実施形態では、上部領域において、プラスチック袋（四面体）の壁に、または、コーナ部（立方体）に、１つ以上（好ましくは１つ）の接続プレート９０（カバーであっても良い）が配置されている。その接続プレートは、接続ラインを貫通させるための通路を含み、そして、接続の領域において、分離器のサポートが可能となる。その接続プレートは、通常、組立中に、分離器のハウジングに接続される。
【００９０】
最大の分離領域５００は、入口表面５１０の上方に位置している。細胞の分離は、図１４〜１７による縦型分離器内で、分離領域５１０の最大の断面まで円錐状に上方へ向かって広がる容器断面で、重力と、収穫ストリーム収集領域５６からの収穫ストリームの連続した取り出しの結果としての鉛直流入との間の正の力の差にしたがって、進行する。
【００９１】
沈降分離器の寸法決めは、保持されるべき細胞の種類、バイオリアクタのサイズおよびスループットに依存する。
【００９２】
必要な分離面積Ａｒｅｆは、本発明の第１の実施形態と同様に、式Ｅｑ．１にしたがって、沈降速度ｗｓ、灌流速度ｑ／Ｖ（バイオリアクタ容積Ｖ当たりの培地スループットｑ）、バイオリアクタの容積から生ずる。効率係数ηは、下方からの流れに晒される個々の粒子の理想化された考察に比して、技術的な分離器の性能低下を考慮している（式Ｅｑ．２）。その理想化された場合の落下速度ｗｓは、分離のための条件を満たすために、流入速度＝灌流速度×Ｖ／Ａｅｒｆ（式Ｅｑ．２）よりも少し大きくなければならない。
【００９３】
既述のように、
【数５】
0006474616.tif 000006
【数６】
0006474616.tif 000007
多面体プラスチック袋の分離器についての理論的な分離面積は、式Ｅｑ．５〜Ｅｑ．６からの近似に決定される。
【００９４】
エッジ長さＤを有する四面体については、最大の分離面積を決定するために、次の第１近似が適用される。
【数７】
0006474616.tif 000008
取り出し点は上記四面体のエッジ長さによって与えられる最大断面よりも構造的に幾分下方にあるため、効率係数ηは１よりも幾分少ない。
【００９５】
同じことは、円錐形の分離器にも適用される。その場合の最大分離面積は、円形のブランクシートの直径Ｄによって与えられる。
【数８】
0006474616.tif 000009
【００９６】
エッジ長さＤを有する立方体については、最大分離面積として、η＝１で、次の断面領域をもつ六角形という結果になる。
【数９】
0006474616.tif 000010
【００９７】
本発明による分離器の第２の実施形態の寸法決めの間、同様に、層流状態を維持することが考慮に入れられなければならない。プラスチック袋（５０）の寸法決めの間、実現されるべきエッジ長さＤとその袋の長さＬＫは、プラスチック袋内で実現されるべき充填レベルによって、決定される。過度に高い静水圧は、必要に応じて、適切に寸法設定され、かつ生産物に非接触の、したがって、再利用可能なハウジングへ送られ得る。
【００９８】
通常は、入口表面５１０は、プラスチック袋の高さＨＫに基づいて、０．３ ≦ ｈ／ＨＫ ≦ ０．７、好ましくは０．４ ≦ ｈ／ＨＫ ≦ ０．６となる高さｈに位置している。図２６は、立方体分離器の保持についての入口表面の高さの影響を示す。
【００９９】
意図された通りの使用のために、上記分離器は、この分離器が満杯であるとき上記プラスチック袋の可撓性の壁を支持する容器内に導入される。それゆえ、容器と分離器の形状は互いに一致しているのが好ましい。
【０１００】
それゆえ、本発明は、さらに、本発明による固体分離器と、上記固体分離器を受けるための容器とを備えた固体分離装置であって、上記容器が少なくとも、
−  上記固体分離器を受けるための内部空間を備え、上記内部空間は、上記固体分離器の形状によって上記固体分離器の形状に合わされる壁を備え、上記壁は上記内部空間を取り囲んで、外界から上記内部空間を画定し、
上方から上記容器内へ上記固体分離器を導入するための開口を有する
ものに関する。
【０１０１】
好ましくは、特に第２の実施形態の分離装置のために、上記容器はチャネルを有する。そのチャネルを介して、可撓性チューブおよび/またはチャネルおよび/または測定プローブが上記細胞分離装置まで導かれ得る。
【０１０２】
上記細胞分離装置を導入するための開口部は、閉鎖可能であるのが好ましい。
【０１０３】
本発明による容器は、閉鎖状態では、液密となるように構成されるのが好ましい。すなわち、上記容器は、液体がその容器の内部から外部へ故意でなく通過しないように、外部から密封され得る。
【０１０４】
また、プラスチック袋またはプラスチック瓶が矩形断面を有し、下部領域では、下方へ向かって先細になった固体収集領域５７が、重力によって固体を収集することも可能である（図２４）。内部構造物および通路は８０，８８および８４は、プラスチック袋またはプラスチック瓶内に溶接され得る。それに代えて、下方へ向かって先細になった固体収集領域５７が、ネックで終端してもよい。プラスチック袋のネックとプラスチック瓶のネックの両方とも、全ての必要な通路が組み込まれているカバーまたはストッパで閉じられている。両方の実施形態では、収穫ストリーム収集領域５６の形状は、所望通りにされ得る。これらのプラスチック袋またはプラスチック瓶は、０．０２〜２リットルの小さな発酵槽容積について、特に有利である。動作のために、１つ以上のプラスチック袋またはプラスチック瓶が、スタンド上に吊される。複数の分離器が並行になっている省スペース用途の場合、図２４の吊されたプラスチック袋またはプラスチック瓶は、有利である。
【０１０５】
本発明はさらに、バイオリアクタと上述の本発明による細胞分離装置の１つとからなるバイオリアクタシステムを提供する。好ましくは、バイオリアクタは、使い捨てリアクタであり、より具体的には、米国２００９−０１８０９３３に記載されたリアクタである。
【０１０６】
上記バイオリアクタシステムは、例えば、既知の方法で動作され得る灌流リアクタである。培養液が上記バイオリアクタ中へ連続的に供給され、細胞に乏しい細胞培養上澄み液が連続的に取り出される。灌流リアクタは、生物学的に意味があり、かつ、十分な分離領域が設けられている場合は、高い灌流速度ｑ／Ｖ（バイオリアクタ容積Ｖ当たりの培地スループットｑ）で動作され得る。この場合には、分離器を通る流れは連続的である。
【０１０７】
また、上記灌流リアクタは、培養物が最初にバッチ的に成長される態様で動作され得る。培地がバイオマスの感知できる蓄積が最早できない程度まで消費されてしまった場合には、バイオマスを事実上含まない培養上澄み液は、外部の細胞分離器を介して取り出される。その後、バイオリアクタで得られた空間は、新鮮な培地を供給するために使用され得る。これにより、さらなる成長と、したがってより高い総バイオマス生産性（反復バッチモード）が可能になる。この場合、流れはバッチ的に細胞分離器を通して通過する。この方法は、例えば、スターター培養物（それで、非常に大型のバイオリアクタが植菌される）に適している。その方法は、既存のスターター培養リアクタの生産性を大きく向上できるからである。
【０１０８】
バイオリアクタ上での動作のために、本発明による固体分離器の連続的な流れが好ましい。
【０１０９】
上記バイオリアクタまたは灌流リアクタは、インビトロ（人工環境）および遊離懸濁液で、またはマイクロサポート上で、成長する細胞を培養するために使用され得る。好ましい細胞は、原生動物と、ヒト（神経、血液または組織細胞、および、胚または成体起源の幹細胞）、動物または植物起源の接着性及び非接着性の真核細胞と、を含む。それらは、例えばウイルス、タンパク質、酵素、抗体、ニューロン、組織細胞または診断構造のような、遺伝的改変の結果として特定の医薬品有効成分を生産する能力がある。特に好ましくは、高性能の医薬製造のために、例えば、繊毛虫類、昆虫細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＫＢ細胞（ヒトＨＥＫ２９３細胞株とヒトバーキットリンパ腫細胞株２Ｂ８との融合から得られた）、ハイブリドーマ細胞、および幹細胞のような、適切な細胞が、使用される。
【０１１０】
上記システムの変形実施形態では、本発明による固体分離器の１つは、バッチ的な動作で、発酵の完了後、細胞の取り出し前に、フィルタに適用されるべき細胞塊、したがって必要なフィルタ面積を削減することを目的に、更なるバイオリアクタまたは収穫タンクに接続される。
【０１１１】
本発明は、さらに、流れが通過する容器内で、固体、特に細胞を保持し再循環させる方法であって、固体を含む培地が連続的またはバッチ的に上記容器に供給され、上記固体を含まない培地が上記容器から取り出される方法において、上記容器は、流れが通過するプラスチック袋またはプラスチック瓶であり、下部領域に、傾斜してセットされた面を有し、好ましくは、重力によって上記固体を収集するための、底部で先細になっている固体収集領域（５７）を備える方法に関する。本方法の特定の実施形態では、分離領域は、傾斜チャネルによって形成され、好ましくはＲｅ＜２３００に従って層流状態の維持を許容する流速が支配的である。そのことは、堆積した細胞の、重力場に抗した、効率を低下させる再懸濁を回避する。
【０１１２】
上記レイノルズ数Ｒｅは、式Ｅｑ．７に従って、断面にわたって平均化された流量ｗ、流動媒体の動粘度ν、およびチャネルの内径ｄから、計算され得る。
Ｒｅ ＝ （ｗ・ｄ／ν）              （Ｅｑ．７）
【０１１３】
傾斜チャネルでは、チャンネル中心よりもチャネル内壁上で、より低い流速が支配的である。細胞は、チャンネル内で沈降し、チャネルの下側で流れ方向に抗して下部チャネル端部へスライドする。細胞から解放された細胞培養液は、チャネルによって収穫ストリーム収集領域５６（上記チャネルの上方に配置されている）中へ放され、最終的に容器から外へ搬送される。
【０１１４】
多面体または円錐状の分離器では、ｄは最大の分離領域の断面の幅または直径である。プラスチックの壁上で、チャンネル中心よりも、より低い流速が支配的である。細胞は、流れの方向に抗して、固体収集領域５７へ向かってスライドする。細胞から解放された細胞培養液は、収穫ストリーム収集領域５６（分離領域の上方に配置されている）内に上昇し、最終的に容器から外へ搬送される。
【０１１５】
本発明による方法は、好ましくはバイオリアクタの外部で実行されてもよい。この目的へ向けて、細胞を含む細胞培養液は、バイオリアクタから本発明による細胞分離器へ搬送される。新陳代謝を遅くし、したがって細胞の生産性を低下させる栄養不足に反対に作用するために、細胞は、分離器に入る前に、外部の容器内で冷却されるのが好ましい。冷却された懸濁液では、沈降した細胞に酸素を供給することは、必要とされない。殆どの場合、細胞培養液を分離器の周囲の温度まで冷却することは、完全に十分である。それだから、所望の代謝効果に加えて、対流が安全に回避される。細胞の十分な栄養を監視するために、分離器は、例えば酸素濃度および／またはｐＨを測定するための、少なくとも１つの使い捨て可能なセンサを備えることができる。センサの収容は、壁内と、バイオリアクタまたは収穫容器への接続ラインとの両方で可能である。
【０１１６】
上記方法は、流れが連続的に通過する無菌のプラスチック袋内の細胞の効果的な保持と再循環を可能にする。保存と再循環の間、細胞は、中程度の剪断力のみによって作用され、それは、通常、細胞によって良く許容される。細胞は、発酵温度または低下された温度レベルで分離装置内に保持され、栄養素の供給が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
以下では、本発明の実施形態が、本発明を制限することなく、図面を参照しながら説明される。
【図１】図１は、プレート積層体を含む、本発明による使い捨て可能な固体分離器を示す図である。
【図２】図２は、プレート積層体１（縦断面）を示す図である。
【図３】図３は、プレート積層体１（縦断面）を示す図である。
【図４】図４は、様々な構成のプレート積層体（図３からのＡＡ‘断面）を示す図である。
【図５】図５は、プレート積層体１（図３からのＡＡ‘断面）へのプラスチック袋５０の適用の図である。
【図６】図６は、プレート積層体１（断面）上のプラスチック袋５０の締め付けおよび取り付けを示す図である。
【図７】図７は、プレート積層体１（断面）上のプラスチック袋５０の締め付けおよび取り付けを示す図である。
【図８】図８は、枠体１３０とカバー１１０（断面）を使用した、プレート積層体１上のプラスチック袋５０の代替の締め付けおよび取り付けを示す図である。
【図９】図９は、枠体１３０とカバー１１０（断面）を使用した、プレート積層体１上のプラスチック袋５０の代替の締め付けおよび取り付けを示す図である。
【図１０】図１０は、スタンド１４０上にプレート積層体１を含む、本発明による固体分離器の側面図である。
【図１１】図１１は、スタンド１４０上にプレート積層体１を含む、本発明による固体分離器の正面図である。
【図１２】図１２は、枠体１３０とカバー１１０をもつスタンド１４０上にプレート積層体１を含む、本発明による固体分離器の縦断面図である。
【図１３】図１３は、枠体１３０とカバー１１０をもつスタンド１４０上にプレート積層体１を含む、本発明による固体分離器の正面図である。
【図１４】図１４は、両せつ体の実施形態にある、本発明による固体分離器の模式的な３次元の図である。
【図１５】図１５は、流れインバータ８４を有する両せつ体の実施形態にある、本発明による固体分離器の模式的な縦断面図である。
【図１６】図１６は、立方体の実施形態にある、本発明による固体分離器の模式的な図である。
【図１７】図１７は、立方体の実施形態にある、本発明による固体分離器の模式的な図である。
【図１８】図１８は、灌流リアクタのプロセス図である。バイオリアクタ出口における細胞の呼吸活性を減少させるために、取り出しの後、細胞の温度が冷却装置内で可能な限り迅速に低いレベルに低下される。これは、細胞分離器内の細胞が、酸素制限の状態（それは生理的に細胞を損傷する可能性がある）にあまりに長く滞留するのを妨げる。図示の例では、分離器６４０は、分離袋６２０と一体化された冷却装置６００とからなる。バイオリアクタ６１０と分離器６４０との間の液体の流れは、低剪断ポンプ６３０および６３１によって調整される。また、他の相互接続、例えば２つのポンプ６３０及び６３１のうちの１つをバイオリアクタ出口に位置決めすることも、考えられる。
【図１９】図１９は、分離システムの比較である。
【図２０】図２０は、単位分離面積当たりの分離器容積の比較である。
【図２１】図２１は、分離面積１としてのトレー、水平流れディストリビュータ８５およびストッパ２２０を有する瓶分離器の縦断面である。
【図２２】図２２は、図２１による瓶分離器であって、それのスタンド上にあるものの横断面である。
【図２３】図２３は、カラー２３０を有するストッパ２２０、および、下方へ向けられた入口流を有する流れディストリビュータ８５の詳細図である。
【図２４】図２４は、固体分離器としての吊されたプラスチック袋（＝袋沈殿器）の正面図、および、スタンド上の横断面である。
【図２５】図２５は、変化する有効上昇速度ｖ＝ｑ／Ａｅｆｆの下での、保持性能Ｒ上の様々な流れディストリビュータ８５の効果を示す。
【符号の説明】
【０１１８】
１  プレート積層体／分離領域
５  リッジ幅
８  プレート間隔
１０  角度
１３  長さ
１５  幅
１８  高さ
３０  支持プレート
５０  プラスチック袋
５２  余り／折り畳み箇所
５５  溶接シーム
５６  収穫ストリーム収集領域
５７  固体収集領域
５８  角度
５９  角度
６０  締付ストラップ
７０  収穫ストリーム（収穫）
７４  バイオリアクタ混合物／供給物
７９  再循環
８０  通路
８１  流れインバータ
８４  通路
８５  水平ディストリビュータ
８６  入口流
８８  中央吸引口
８９  通路
９０  接続プレート
１００  ハウジング
１１０  カバー
１１２  延長部
１１５  締付要素
１３０  枠体
１４０  スタンド
１４２  突起
１４５  スタンド足
１４８  サポート
２００  バイブレータ
２１０  取付プレート
プレート積層体の輪郭
３１１  プレート積層体  
３２０  矩形の輪郭
３２１  プレート積層体
３３０  丸い輪郭
３３１  プレート積層体
３４０  丸い輪郭
３４１  プレート積層体
３５０  六角の輪郭
３５１  プレート積層体
５００  理論上最大の分離器面積
５０１  分離器領域
５１０  入口面
６００  冷却装置
６１０  バイオリアクタ
６２０  分離装置
６３０，６３１  ポンプ
６４０  分離器 ＝ 分離袋 ＋ 冷却装置（上記スタンドまたは容器内に一体化され得る）
６５０  培地
【実施例】
【０１１９】
以下、本発明による装置の応用についての研究報告を、本発明を限定することなく、記載する。
【０１２０】
粒子系
細胞のシミュレーションのために、粒子系ポリアクリロニトリルＸポリマ「ＰＡＮ−Ｘ」が使用される。水不溶性ポリマは、主に繊維を製造するための衣料産業で使用されている。次は、製造者ドゥラロン（ＤＲＡＬＯＮ）社、ドルマーゲンの製品のデータシートからの抜粋である。
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【０１２１】
上記粒子サイズ分布は、マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）社からのマスターサイザーレーザー回折測定機を使用して測定された１５μｍと３０μｍとの間に最も頻度の多い粒径を示している。その粒径は、概ね真核細胞（ＣＨＯ、ＢＨＫ）に対応している。
【０１２２】
分離系
傾斜チャネル分離器
比較の目的のために、この研究は、図２に従う本発明による分離器のモデルとして、ＷＯ０３／０２０９１９に従って理論上の分離面積Ａｔｈ＝１．４２ｍ２とＡｔｈ＝０．０２７ｍ２を有するステンレス鋼製の大および小のプレートの分離器でなされた。大きな分離器は、１７．４リットルの分離器容積に収容されている２０枚のプレートを有する。小さな分離器は、０．３リットルの分離器容積中の４枚のプレートで構成されている。
【０１２３】
立方体の分離器
２つの立方体は、Ｄ＝２００ｍｍとＤ＝４００ｍｍのエッジ長さを有する流体力学モデルとして、プレキシガラスプレートから製造された。立方体の上部コーナは可撓性チューブを通すための開口を持っていた。粒子懸濁液の流れ分配（（流れ）ディストリビュータ８５とも称する。）のための、可撓性チューブに固定されたＴ形部品またはＹ形部品（各場合において２つの入口）の形にある１つの内部構造物が、プラスチックモデルの中心（ｈ＝５０％ＨＫ）まで挿入された。ディストリビュータの幅ｃは変化された。下部円錐の頂点（固体収集領域５７、また、コレクタ）まで延びる更なる可撓性チューブを介して、沈殿物は、流れ反転方式で鉛直上方へ向かって取り出された。更なる通路を介して、クリア相（＝収穫ストリーム７０）が流れ反転方式で下方へ向けられた面（Ｕ形チューブ）から取り出されるように、そのクリア相を収集するためのプラスチックチューブ＝通路８０が固定された。下部および上部の分離器頂点へ向かう徐々の断面の広がりは、良好な流れ調和を可能にする。それによって、既に流れコレクタ（底部に固体収集領域５７、頂部に収穫ストリーム収集領域５６）として機能する。それは、流れを反転させる内部構造物なしに、十分に機能すべきでもある。
【０１２４】
四面体の分離器
四面体は、エッジ長さＤ＝４００ｍｍを有する正三角形からプレキシガラスモデルとして製造された。円錐状の固体収集領域５７として選択されたコーナの反対側で、固体分離器は、上部で開いていた。開口を介して、懸濁液（＝供給物７４）、堆積物、クリアラン（＝収穫ストリーム７０）の導入および取り出しのための様々な通路が、据え付けられ得た。それらの通路に、立方体に対するのと類似の態様で、クリア相を収集するための概ね可撓性のチューブ、ディストリビュータおよびプラスチックチューブ（＝通路８０）が構築および位置決めされた。
【０１２５】
四面体は、立方体に比べて、主に、流れに有利な先細りが戻りコレクタに対して下向きにのみ存在し、また、クリア相が最大面積の点で収集されるという点で、その流動特性が異なっている。それゆえ、四面体では、均一な取り出しのために、この最大分離領域に配置された流れディストリビュータ８５が使用される。研究されたシステム内の分離面積Ａｔｈは、７．６リットルの容積で０．０６９ｍ２だった。
【０１２６】
円錐状の供給部を有する縦型分離器−ドルトムント槽（Dortmund Tank）タイプ
この縦型分離器は、しばしば、水処理業界で使用されている。研究された分離器は、下部領域で収集漏斗を形成する１４５ｍｍの断面を有する円筒形の外郭と、上部領域で、５１ｍｍの断面を有し中央に配置された円錐状の供給部とからなっている。どちらの要素も、ガラスから作製された。非清澄液は、頂部から円錐状の供給部を介して円筒状の領域（縦型分離領域）中へ導入され、上記分離領域中へ上昇した。一方、懸濁物質は収集漏斗内に沈降した。上記分離領域の上端部で、クリア相が４点で収集された。研究された縦型分離器は、０．０１４ｍ２の分離器面積Ａｔｈの１．７リットルの容積を有していた。
【０１２７】
方法
分析方法
試料は、ブフナー漏斗（孔サイズ＜２μｍ）を用いて濾過され、濾紙は１４０℃で乾燥され、秤量された。そのために、乾燥バランス（ザルトリウスＭＡ４５）が使用された。
【０１２８】
実験手順
３ｇ／ｌのＰＡＮ−Ｘが貯槽内に供給され、蠕動ポンプ（ワトソン・マーローＤｕ３２３）によってそれぞれの分離器中へ導入された。蠕動ポンプｑのポンプ速度によって、所望の上昇速度ｖ（ｖ＝ｑ／Ａｔｈである。ここで、ｑは収穫ストリームであり、それによって、分離器は、与えられた灌流速度およびバイオリアクタ容積Ｖのために装荷される。）が設定される。
【０１２９】
最初に、粒子懸濁液は、循環するように圧送される。２回の流体力学的滞留時間の待ち時間の後、定常状態を確立するために、収穫ストリームからのサンプリングが開始された。
【０１３０】
試料体積は、フィルタ上の粒子の質量に応じて定められている。これは、測定精度の範囲内で、約１００ｍｇ±２５ｍｇであるべきである。その結果生じる試料体積は、４０〜８００ミリリットルの粒子濃度を決定するためのものであり、三重に測定された。
【０１３１】
結果
表１
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【０１３２】
分離システムの比較は、培地ストリームまたは収穫ストリームｑまたは有効上昇速度ｖ＝ｑ／Ａｅｆｆが増大したときの、保持の程度Ｒの予想された落ち込みを示している（図１９）。
【０１３３】
効率係数η１を導入することによる有効上昇速度の結果は、ドルトムント槽に比べて、分離器が用いる最大面積の異なる保持性能を識別する。図１９は、この効率係数の付加後に、分離器が、最良にフィットする接合線によって記述され得ることを示している。
【０１３４】
分離器の性能は図２０で比較されている。この提示は、有効な分離面積を収容するために多数の分離器容積が必要とされることを示している。小さな分離器容積は、細胞培養において、供給された発酵空間外での滞留時間を最小限にするために、望ましい。この比較では、傾斜チャネル分離器が好ましいことが分かる。それは、規模とは無関係に、５０リットル／ｍよりも大きい単位分離器容積当たりの非常に高い分離面積で動作され得る。この例は、これらの分離器システムの優れた拡張性を明確にしている。これとは対照的に、縦型分離器の場合には、その中に水平分離領域を展開するためには、かなり大きな容積が必要とされる。さらに、規模拡大での収容の効率は、Ｖ＝Ａ３／２で落ちる。驚くべきことに、使い捨てモデル、立方体および四面体の効率は、ドルトムント槽の標準システムに対してかなり優れている。したがって、これらの非常に簡単で安価なシステムが、ドルトムント槽よりかなり大きなバイオリアクタ（約６倍まで）において使用されうる。
【０１３５】
供給ディストリビュータと収穫ストリームコレクタの更なる適合（幾何学的形状および/または位置）は、保持の程度Ｒの最適化につながり得るだろう。
【０１３６】
本出願につながる研究は、欧州地域開発基金（ＥＲＤＦ）の下で、財政援助協定「Ｂｉｏ．ＮＲＷ：ＭｏＢｉＤｉｋ−モジュラ・バイオプロダクション−使い捨ておよび連続的」（資金調達コードｗ１００４ｈｔ０２２ａ）に基づいて資金供給された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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