(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）状態を決定する方法であって、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含み、
ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域が、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域
であり、
ここで、マイクロサテライト領域が、最小の長さが６モノヌクレオチド塩基であり、最大の長さが２０モノヌクレオチド塩基であるホモポリマー領域であり、ならびに、
ここで少なくとも１つのインデルの存在が、ＭＳＩの指標である、
前記方法。
表１．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料について、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル（１６例の腫瘍試料の少なくとも４つに存在する）。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表１−１】
0006578205.tif 000156
【表１−２】
0006578205.tif 000157
【表１−３】
0006578205.tif 000158
【表１−４】
0006578205.tif 000159
【表１−５】
0006578205.tif 000160
【表１−６】
0006578205.tif 000161
【表１−７】
0006578205.tif 000162
【表１−８】
0006578205.tif 000163
【表１−９】
0006578205.tif 000164
【表１−１０】
0006578205.tif 000165
【表１−１１】
0006578205.tif 000166
【表１−１２】
0006578205.tif 000167
【表１−１３】
0006578205.tif 000168
【表１−１４】
0006578205.tif 000169
【表１−１５】
0006578205.tif 000170
【表１−１６】
0006578205.tif 000171
【表１−１７】
0006578205.tif 000172
【表１−１８】
0006578205.tif 000173
【表１−１９】
0006578205.tif 000174
【表１−２０】
0006578205.tif 000175
【表１−２１】
0006578205.tif 000176
【表１−２２】
0006578205.tif 000177
【表１−２３】
0006578205.tif 000178
【表１−２４】
0006578205.tif 000179
【表１−２５】
0006578205.tif 000180
【表１−２６】
0006578205.tif 000181
【表１−２７】
0006578205.tif 000182
【表１−２８】
0006578205.tif 000183
【表１−２９】
0006578205.tif 000184
【表１−３０】
0006578205.tif 000185
【表１−３１】
0006578205.tif 000186
【表１−３２】
0006578205.tif 000187
【表１−３３】
0006578205.tif 000188
【表１−３４】
0006578205.tif 000189
【表１−３５】
0006578205.tif 000190
表２．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についての、エクソンの最も一般的な反復インデル。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表２−１】
0006578205.tif 000191
【表２−２】
0006578205.tif 000192
【表２−３】
0006578205.tif 000193
【表２−４】
0006578205.tif 000194
【請求項２】
表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロサテライト領域が、表３に列挙された遺伝子に存在するものである、請求項１または２に記載の方法。
表３．５６マーカーのパネル。
【表３−１】
0006578205.tif 000195
【表３−２】
0006578205.tif 000196
【請求項４】
マイクロサテライト領域の１つが、表３に列挙された遺伝子MYL1、DIDO1、UBE2Z、RYR3、TMEM65、BTBD7、KDM5A、ABAT、PPM1A、UBA6、ZNF185、ARL10、GRIA2およびTMC7におけるマイクロサテライト領域から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロサテライト領域の１つが、表３に列挙された遺伝子MYL1、DIDO1、UBE2Z、RYR3、TMEM65、BTBD7、KDM5A、ABAT、PPM1A、UBA6およびZNF185におけるマイクロサテライト領域から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
追加のマイクロサテライト領域が、表２に列挙された遺伝子MSH6のマイクロサテライト領域または表１に列挙された遺伝子SULF2のマイクロサテライト領域から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
３’UTR領域に存在する少なくとも１つのホモポリマー領域が、表１または表６に列挙された遺伝子WIPF2、NARG2、AHCYL1、C17orf63、CD5L、CEP170、COL5A2、CSNK1G3、DIDO1、EIF4G3、GSK3B、KCNMB4、MAPK1IP1L、NPR3、PI15、PRTG、RASGRP1、SH3KBP1、SHROOM3、SLC5A3、UBE2Z、ZBTB33、ZNF275、AGPAT3、APH1B、BCL11A、BMPR1B、CALN1、CASK、CBFB、CBX5、CCDC85C、CNOT7、CYP1B1、DRAM2、EDA2R、EDEM3、EGR1、EIF4G3、FAM20B、FCHSD2、FLT1、FMO2、G3BP2、HELZ、HRNR、IER3IP1、KCNG1、KCNK1、KLF3、LHX9、LRRC8D、LYRM1、MED13、MYO5B、NCEH1、PPP1R12A、PPP1R3D、RAB11FIP1、RAB6C、SAMD12、SEMA6A、SLAIN2、SMAD4、TMED7、TMEM57、TMEM65、TNPO1、TOR1AIP2、TRAK2、TRIP11、UST、VEGFA、ZBTB7A、ZKSCAN1、ZNF12、およびZNF169に存在するホモポリマー領域から選択される；および／または、エクソン領域に存在する少なくとも１つのホモポリマー領域が、表２または表７に列挙された遺伝子SETD1B、RBMXL1、CCDC150、OR7E24、C15orf40、KIAA2018、LTN1、SLC22A9、CDH26、DDX27、EXOSC9、FAM111B、KIAA0182、KIAA1919、MIS18BP1、PRRT2、TMEM60、AQP7、ARV1、CCDC168、ELAVL3、F8、FETUB、HPS1、NBEAL1、P4HTM、PIGB、RBM43、RG9MTD1、SRPR、TMEM97、SEC31A、RNF145、RNPC3、SLC35F5、TMBIM4、CD3G、DOCK3、MYO10およびPRRG1に存在するホモポリマー領域から選択される、請求項１または２に記載の方法。
表６．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍資料についての、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル。
【表４−１】
0006578205.tif 000197
【表４−２】
0006578205.tif 000198
【表４−３】
0006578205.tif 000199
【表４−４】
0006578205.tif 000200
【表４−５】
0006578205.tif 000201
【表４−６】
0006578205.tif 000202
【表４−７】
0006578205.tif 000203
【表４−８】
0006578205.tif 000204
【表４−９】
0006578205.tif 000205
【表４−１０】
0006578205.tif 000206
【表４−１１】
0006578205.tif 000207
【表４−１２】
0006578205.tif 000208
【表４−１３】
0006578205.tif 000209
【表４−１４】
0006578205.tif 000210
【表４−１５】
0006578205.tif 000211
【表４−１６】
0006578205.tif 000212
【表４−１７】
0006578205.tif 000213
【表４−１８】
0006578205.tif 000214
【表４−１９】
0006578205.tif 000215
【表４−２０】
0006578205.tif 000216
【表４−２１】
0006578205.tif 000217
【表４−２２】
0006578205.tif 000218
【表４−２３】
0006578205.tif 000219
【表４−２４】
0006578205.tif 000220
【表４−２５】
0006578205.tif 000221
【表４−２６】
0006578205.tif 000222
【表４−２７】
0006578205.tif 000223
【表４−２８】
0006578205.tif 000224
【表４−２９】
0006578205.tif 000225
【表４−３０】
0006578205.tif 000226
【表４−３１】
0006578205.tif 000227
【表４−３２】
0006578205.tif 000228
【表４−３３】
0006578205.tif 000229
【表４−３４】
0006578205.tif 000230
【表４−３５】
0006578205.tif 000231
【表４−３６】
0006578205.tif 000232
【表４−３７】
0006578205.tif 000233
【表４−３８】
0006578205.tif 000234
【表４−３９】
0006578205.tif 000235
表７．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についてのエクソン中の最も一般的な反復インデル。後の３列は、遺伝子が癌センサス遺伝子（cancer census gene）であるかどうか、これが以前にＭＭＲ欠損腫瘍において影響を受けたことが報告されているかどうか、および遺伝子の変異が他の癌と関連することが知られているかどうかを示す。
【表５−１】
0006578205.tif 000236
【表５−２】
0006578205.tif 000237
【表５−３】
0006578205.tif 000238
【請求項８】
マイクロサテライト領域がホモポリマー領域であり、ホモポリマーの長さが１５ヌクレオチドを超えない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
インデルの存在が、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、において決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２つのマイクロサテライト領域が、少なくとも８つのマイクロサテライト領域である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロサテライト領域が、表３に示す５６のマイクロサテライト領域である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＳＩが、さらに次のように特徴付けられる、請求項９または１１に記載の方法：マイクロサテライト領域の１７％以上がインデルを含む場合、腫瘍試料はＭＳＩ−Ｈであり、マイクロサテライト領域の２％〜１７％がインデルを含む場合、腫瘍試料はＭＳＩ−Ｌであり、マイクロサテライト領域の２％未満がインデルを含む場合、腫瘍試料はマイクロサテライト安定である。
【請求項１３】
インデルの存在を決定することが、単一塩基対伸長技術、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術、または融解曲線分析を介して行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍試料が、結腸直腸癌試料、子宮内膜癌試料、卵巣癌試料、胃癌試料、白血病試料、およびリンチ症候群の腫瘍試料から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍試料中のＭＳＩを決定するためのキットであって、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域；
の遺伝子型を決定するツールを含み、
ここで、マイクロサテライト領域が、最小の長さが６モノヌクレオチド塩基であり、最大の長さが２０モノヌクレオチド塩基であるホモポリマー領域である、
前記キット。
表１．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料について、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル（１６例の腫瘍試料の少なくとも４つに存在する）。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表６−１】
0006578205.tif 000239
【表６−２】
0006578205.tif 000240
【表６−３】
0006578205.tif 000241
【表６−４】
0006578205.tif 000242
【表６−５】
0006578205.tif 000243
【表６−６】
0006578205.tif 000244
【表６−７】
0006578205.tif 000245
【表６−８】
0006578205.tif 000246
【表６−９】
0006578205.tif 000247
【表６−１０】
0006578205.tif 000248
【表６−１１】
0006578205.tif 000249
【表６−１２】
0006578205.tif 000250
【表６−１３】
0006578205.tif 000251
【表６−１４】
0006578205.tif 000252
【表６−１５】
0006578205.tif 000253
【表６−１６】
0006578205.tif 000254
【表６−１７】
0006578205.tif 000255
【表６−１８】
0006578205.tif 000256
【表６−１９】
0006578205.tif 000257
【表６−２０】
0006578205.tif 000258
【表６−２１】
0006578205.tif 000259
【表６−２２】
0006578205.tif 000260
【表６−２３】
0006578205.tif 000261
【表６−２４】
0006578205.tif 000262
【表６−２５】
0006578205.tif 000263
【表６−２６】
0006578205.tif 000264
【表６−２７】
0006578205.tif 000265
【表６−２８】
0006578205.tif 000266
【表６−２９】
0006578205.tif 000267
【表６−３０】
0006578205.tif 000268
【表６−３１】
0006578205.tif 000269
【表６−３２】
0006578205.tif 000270
【表６−３３】
0006578205.tif 000271
【表６−３４】
0006578205.tif 000272
【表６−３５】
0006578205.tif 000273
表２．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についての、エクソンの最も一般的な反復インデル。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表７−１】
0006578205.tif 000274
【表７−２】
0006578205.tif 000275
【表７−３】
0006578205.tif 000276
【表７−４】
0006578205.tif 000277
【請求項１６】
表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域の遺伝子型を決定するツールを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
マイクロサテライト領域が、表３に列挙された遺伝子に存在するものから選択される、請求項１５または１６に記載のキット。
表３．５６マーカーのパネル。
【表８−１】
0006578205.tif 000278
【表８−２】
0006578205.tif 000279
【請求項１８】
マイクロサテライト領域の１つが、表３に列挙された遺伝子MYL1、DIDO1、UBE2Z、RYR3、TMEM65、BTBD7、KDM5A、ABAT、PPM1A、UBA6、ZNF185、ARL10、GRIA2およびTMC7におけるマイクロサテライト領域から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
マイクロサテライト領域の１つが、表３に列挙された遺伝子MYL1、DIDO1、UBE2Z、RYR3、TMEM65、BTBD7、KDM5A、ABAT、PPM1A、UBA6およびZNF185におけるマイクロサテライト領域から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
追加のマイクロサテライト領域が、表２に列挙された遺伝子MSH6のマイクロサテライト領域または表１に列挙された遺伝子SULF2のマイクロサテライト領域から選択される、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
３’ＵＴＲ領域に存在する少なくとも１つのホモポリマー領域が、表１または表６に列挙された遺伝子WIPF2、NARG2、AHCYL1、C17orf63、CD5L、CEP170、COL5A2、CSNK1G3、DIDO1、EIF4G3、GSK3B、KCNMB4、MAPK1IP1L、NPR3、PI15、PRTG、RASGRP1、SH3KBP1、SHROOM3、SLC5A3、UBE2Z、ZBTB33、ZNF275、AGPAT3、APH1B、BCL11A、BMPR1B、CALN1、CASK、CBFB、CBX5、CCDC85C、CNOT7、CYP1B1、DRAM2、EDA2R、EDEM3、EGR1、EIF4G3、FAM20B、FCHSD2、FLT1、FMO2、G3BP2、HELZ、HRNR、IER3IP1、KCNG1、KCNK1、KLF3、LHX9、LRRC8D、LYRM1、MED13、MYO5B、NCEH1、PPP1R12A、PPP1R3D、RAB11FIP1、RAB6C、SAMD12、SEMA6A、SLAIN2、SMAD4、TMED7、TMEM57、TMEM65、TNPO1、TOR1AIP2、TRAK2、TRIP11、UST、VEGFA、ZBTB7A、ZKSCAN1、ZNF12、およびZNF169に存在するホモポリマー領域から選択される；および／または、エクソン領域に存在する少なくとも１つのホモポリマー領域が、表２または表７に列挙された遺伝子SETD1B、RBMXL1、CCDC150、OR7E24、C15orf40、KIAA2018、LTN1、SLC22A9、CDH26、DDX27、EXOSC9、FAM111B、KIAA0182、KIAA1919、MIS18BP1、PRRT2、TMEM60、AQP7、ARV1、CCDC168、ELAVL3、F8、FETUB、HPS1、NBEAL1、P4HTM、PIGB、RBM43、RG9MTD1、SRPR、TMEM97、SEC31A、RNF145、RNPC3、SLC35F5、TMBIM4、CD3G、DOCK3、MYO10およびPRRG1に存在するホモポリマー領域から選択される、請求項１５または１６に記載のキット。
表６．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍資料についての、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル。
【表９−１】
0006578205.tif 000280
【表９−２】
0006578205.tif 000281
【表９−３】
0006578205.tif 000282
【表９−４】
0006578205.tif 000283
【表９−５】
0006578205.tif 000284
【表９−６】
0006578205.tif 000285
【表９−７】
0006578205.tif 000286
【表９−８】
0006578205.tif 000287
【表９−９】
0006578205.tif 000288
【表９−１０】
0006578205.tif 000289
【表９−１１】
0006578205.tif 000290
【表９−１２】
0006578205.tif 000291
【表９−１３】
0006578205.tif 000292
【表９−１４】
0006578205.tif 000293
【表９−１５】
0006578205.tif 000294
【表９−１６】
0006578205.tif 000295
【表９−１７】
0006578205.tif 000296
【表９−１８】
0006578205.tif 000297
【表９−１９】
0006578205.tif 000298
【表９−２０】
0006578205.tif 000299
【表９−２１】
0006578205.tif 000300
【表９−２２】
0006578205.tif 000301
【表９−２３】
0006578205.tif 000302
【表９−２４】
0006578205.tif 000303
【表９−２５】
0006578205.tif 000304
【表９−２６】
0006578205.tif 000305
【表９−２７】
0006578205.tif 000306
【表９−２８】
0006578205.tif 000307
【表９−２９】
0006578205.tif 000308
【表９−３０】
0006578205.tif 000309
【表９−３１】
0006578205.tif 000310
【表９−３２】
0006578205.tif 000311
【表９−３３】
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【表９−３４】
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【表９−３５】
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【表９−３６】
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【表９−３７】
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【表９−３８】
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【表９−３９】
0006578205.tif 000318
表７．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についてのエクソン中の最も一般的な反復インデル。後の３列は、遺伝子が癌センサス遺伝子（cancer census gene）であるかどうか、これが以前にＭＭＲ欠損腫瘍において影響を受けたことが報告されているかどうか、および遺伝子の変異が他の癌と関連することが知られているかどうかを示す。
【表１０−１】
0006578205.tif 000319
【表１０−２】
0006578205.tif 000320
【表１０−３】
0006578205.tif 000321
【請求項２２】
癌細胞の、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性をスクリーニングする方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって、または請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のキットを用いて、前記細胞におけるＭＳＩ状態を決定することを含む、前記方法。
【請求項２３】
癌細胞が、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍から選択される癌からのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤が、ＰＡＲＰ阻害剤である、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、癌の分野、特にミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損腫瘍に関する。腫瘍がミスマッチ修復欠損か否かを検出するための高感受性の新しいマーカーが、本明細書に提示されている。マーカーは特に、マイクロサテライト領域の変異である。したがって、これらのマーカーの存在を決定することを含む、腫瘍のマイクロサテライト不安定性を診断するための方法が提供される。さらに、試料中のこれらのマーカー（またはそのサブセット）の存在を検出するための、キットが提供される。
興味深いことに、変異は、相同組換え（ＨＲ）経路による二本鎖切断（ＤＳＢ）修復に優先的に影響を及ぼし、ＤＳＢ修復は、ＭＭＲ欠損腫瘍において機能的に障害されている。これらの腫瘍は、酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼの薬理学的阻害（ＰＡＲＰ阻害）による一本鎖切断の誘導に感受性であることが、本明細書に示されている。したがって、ＭＭＲとＰＡＲＰの間の合成致死性相互作用に基づく、ＭＭＲ欠損腫瘍に対する新規な処置法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍における欠損ＤＮＡミスマッチ修復に関連するゲノム不安定性の形態は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と呼ばれている。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、マイクロサテライトにおける反復ＤＮＡヌクレオチド単位の数の、クローナルな変化である。これは典型的には、欠損ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を有する腫瘍において生じ、ＤＮＡ複製中に生じるエラーを修復するＤＮＡ  ＭＭＲ系の機能不全は、ゲノム全体で普遍的に生じる、単純で反復的なマイクロサテライト配列の長さにおける単一ヌクレオチドの変異および変化の、加速的な蓄積をもたらす。
ＭＭＲ欠損は、子宮内膜（ＥＭ）または結腸直腸（ＣＲＣ）癌の２％〜５％を占める癌感受性の常染色体優性遺伝性疾患であるリンチ症候群の、良好に証明された原因を表す。リンチ症候群は、ＭＭＲ経路遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２）（Jiricny, 2006）における突然変異または欠失によって引き起こされる。さらに、ＭＬＨ１のエピジェネティックなサイレンシングは、しばしば「散発」リンチ症候群と呼ばれ、これらの腫瘍の別の１５％に寄与する（Kuismanen et al., 2002）。ＭＭＲ欠損はまた、卵巣、膵臓、胃、白血病、およびいくつかの他の癌の少数においても記載されている。 
【０００３】
ＭＭＲ機構の欠損は、腫瘍組織においてはＤＮＡ複製エラーにつながるが、周囲の正常組織においてはそうではない。具体的には、体細胞性エラーはモノおよびジヌクレオチド反復における挿入／欠失変異として蓄積され、これはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と呼ばれる現象である（Pinol et al., 2005）。
ＭＭＲ欠損腫瘍は、標準的な化学療法、例えば５−フルオロウラシルおよびテモゾロミドなどのアルキル化剤の後に、異なる予後および治療結果を示す（de la Chapelle and Hampel, 2010）。ＭＭＲ欠損腫瘍を有する未処置のＣＲＣ患者はやや良好な予後を有するが、ＣＲＣに対する第一選択化学療法である５−フルオロウラシルに基づくアジュバント化学療法からの恩恵を受けていないようにみえる。特に、ＭＭＲ欠損腫瘍において、５−フルオロウラシルによって誘導されたミスマッチは耐容され、細胞死の誘導の機能不全につながる（Hewish et al., 2010）。ＭＭＲ欠損腫瘍はまた、ＥＭにおいてよく使用される化学療法のシスプラチンとカルボプラチンに対して抵抗性である（Hewish et al., 2010）。さらに、ＭＭＲ欠損腫瘍は、抗ＥＧＦＲおよび抗ＶＥＧＦ療法を含む標的療法にも抵抗性となり得るが、その理由は、代替的または下流のシグナル伝達経路を活性化する遺伝子において、二次変異を獲得するからである。例えば、ＭＭＲ（−）腫瘍は、二本鎖切断修復遺伝子（例えば、ＭＲＥ１１、ＡＴＲおよびＲＡＤ５０）、既知の癌遺伝子または腫瘍抑制因子（例えば、ＰＩＫ３ＣＡまたはＰＴＥＮ）において突然変異を獲得することができる。別の可能性は、ＭＬＨ１のエピジェネティックなサイレンシングは、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異などの特定の変異と一致するということであり（Ogino et al., 2012）、これは、進行したＣＲＣにおける標的抗ＥＧＦＲ療法に対する応答の、確立された負の予測因子を表す（De Roock et al., 2010）。
【０００４】
ＭＭＲ欠損腫瘍の処置を個別化するための努力は、ＭＭＲ経路との合成致死性相互作用を同定することに焦点が当てられてきた。特に、研究では、酸化的損傷の増加（メトトレキサートの暴露やＰＩＮＫ１サイレンシングによる（Martin et al., 2011））および、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路との干渉（ＤＮＡポリメラーゼγまたはβ阻害による（Martin et al., 2010））が、ＭＭＲ欠損腫瘍を感作することが明らかにされた。特に、ＭＭＲ（−）腫瘍において、酸化的損傷は、８−オキソグアニン（８−ｏｘｏＧ）ＤＮＡ損傷を誘発し、この損傷はＢＥＲまたはＭＭＲ経路どちらかによる十分な修復に失敗して、ＤＮＡレベルにおいて主にＧＣからＴＡジヌクレオチドへの転換を生成し、結果的に細胞死をもたらす。加えて、腫瘍が耐容できる最大の変異頻度、すなわちそれを超えたさらなる変異の増加が有害となる頻度が存在すると仮定されてきた。したがって、変異の臨界レベルが得られるまで、ＭＭＲ（−）腫瘍を変異原性ヌクレオシド類似体でさらに処置して、腫瘍のエラーカタストロフィー様消失をもたらすことが提案されている。しかし今日まで、これらの努力は、臨床的に効果のある処置選択肢への移行に失敗してきた。代替的に、ＭＭＲ欠損の結果として生じる二次変異もまた、標的とすることができる（Dorard et al., 2011）。しかし、ＭＭＲ欠損腫瘍の二次変異スペクトルを特徴付ける研究は、１つまたは少数のレポーター遺伝子座での観測に限られるか、または既知のホットスポット配列での変異のみに焦点を当てている。これらは、変異が最も頻繁にモノおよびジヌクレオチド反復に影響を与えていることを証明できたが、これらの腫瘍で生じる体細胞突然変異のスペクトルは、未だ良好に特徴付けられていない。
【０００５】
主に結腸直腸および子宮内膜腫瘍におけるＭＭＲ欠損の存在は癌の家族型を表すため、また腫瘍はＭＭＲ欠損の突然変異スペクトル特性を示すために、ＭＭＲ欠損を評価する診断テストが一般的に使用されている。
ＭＳＩを検出する最も一般的な方法は、マイクロサテライト全体を含むポリメラーゼ連鎖反応アンプリコンの長さを測定することである。これには、ＤＮＡ、１対のプライマーでその１つが多くの場合末端蛍光標識されたもの、シーケンサー、および適切なソフトウェアが必要である。代替的に、アンプリコンが配列決定されている場合は、反復単位の数を簡単にカウントすることができる。ＭＳＩはまた、ミスマッチ修復遺伝子の１つの、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の喪失を検出することにより、これがミスマッチ修復の異常を指しているので、間接的に診断することができる。免疫組織化学的および遺伝的方法は両方とも、相当数の偽陰性によっても特徴付けられ、そしてこのために、免疫組織化学および遺伝子レベルでの組み合わせの評価が、日常的な診断設定において行われている。
【０００６】
ヒトゲノム中には少なくとも５００，０００のマイクロサテライトがあり、欠損ＭＭＲは所定の腫瘍内の全てのマイクロサテライトには影響しないため、１より多くのマイクロサテライトを検討すること、および、不安定の影響を頻繁に受けるマイクロサテライトを検討することが重要である。マイクロサテライトマーカーは当初、研究者によってそれぞれの実験に基づきかなりランダムに取り上げられていたため、メリーランド州ベセスダで会議が開催されてこの問題が議論され、研究間の一貫性を促進するための提案がなされた。これにより、ベセスダパネルとして知られている「黄金標準」マーカーパネルの勧告がもたらされた９。このパネルは、３つのジヌクレオチド反復（Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０）と２つのモノヌクレオチド反復（ＢＡＴ２６、ＢＡＴ２５）で構成されており、現在でもＭＳＩのための標準的な試験である。腫瘍は、試験したマーカーの４０％以上が不安定であれば、ＭＳＩ陽性とする（高ＭＳＩまたはＭＳＩ−Ｈとも呼ぶ）ことが提案された。５マーカーパネルを使用する場合、これは、それらの少なくとも２つが陽性である場合に、ＭＳＩがコールされることを意味する；しかし、ＭＳＩを有する腫瘍においては、４つ、または５つ全てが陽性である場合が多い。５つ全てのマーカーについて陰性と判定された腫瘍は、マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）と呼ぶ。１つの腫瘍マーカーで（または腫瘍マーカーの＜３０％について）陽性と判定された腫瘍については、ＭＳＩ−Ｌの用語が提案された９。
ベセスダパネルは現在でも標準と考えられるが、これはかなり低い感度を有することが知られている（どのＭＭＲ遺伝子が変異しているかにも依存する）。例えば、ＭＬＨ１変異を有する患者に対して感度は８０％であるが、ＭＳＨ６変異を有する患者に対して感度はわずか５５％である１０。これは、さらにマーカーを追加することによって改善することができるが１０、それでも実際のＭＳＩ−Ｈ患者がＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳと表される場合がある。これは重要性がないわけではなく、その理由は、ＭＳＩの状態はいくつかの癌（例えばリンチ症候群のもの）の予後（特にＭＳＩ−Ｈ患者について１１）、処置（フルオロウラシル（ＦＵ）改変ＤＮＡによって細胞のアポトーシスを誘導するためには無傷のＭＭＲ系が必要であるため、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍はＦＵに基づくアジュバント療法に反応しない１１〜１３）、および診断に重要であるからであり、新しく診断された結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者は、ＭＳＩ状態について定期的にスクリーニングされる。
【０００７】
もう１つの重大な欠点は、ベセスダパネルが、ＭＳＩを示す他の癌も知られているにも関わらず、結腸癌にのみ推奨されていることである９。これはおそらく、５つのマーカーが、マイクロサテライト不安定結腸癌において突然変異していることがランダムに同定されたが、生物学的メカニズムは未知である、という事実に起因すると思われる。
さらなる欠点は、技術的な性質のものである。ベセスダマーカーパネルはかなり長い反復を含み（例えば、ＢＡＴ２６マーカーは２６ヌクレオチドのＡ反復を含有する）、ＭＳＩ状態を決定するために使用される典型的なＰＣＲ産物は、１００ｂｐよりはるかに大きい。これらの断片を正確に配列決定し、反復の正確な長さを決定するために、マルチキャピラリーゲル電気泳動法と組み合わせたサンガーに基づく配列決定法が一般的に使用されている。しかし、より多くの研究室が、大規模並列配列決定技術を使用するいわゆる「次世代」シーケンシングと呼ばれるものを用いている。安価ではあるが、これらの技術はより短いリードを利用し、ベセスダマーカーパネル上のマイクロサテライト不安定性を検出するために使用することはできない。その結果、研究室は２つのシーケンサーを維持する必要がある：１つはベセスダマーカーパネルスクリーニングのためであり、もう１つはその他の実験のためである。ＭＳＩの状態を決定するために特別のシーケンサーが必要ではなければ、そしてこの決定が一般に使用される装置上で実施できるならば、非常に便利である。
【０００８】
したがって、ＭＳＩに対する特異性を保持しつつ、現在使用されているベセスダパネルよりも感度の高い、マイクロサテライト不安定性のマーカーを見出すことは有利であろう。理想的には、これらのマーカーは、バイアスのない検出方法を用いて見出される（すなわち、疾患の設定で改変されると考えられる特定の領域をチェックするのではなく、ゲノム全体を見る）。さらなる利点は、そのようなＭＳＩの指標であるマーカーの同定であろう。すなわち、これらはマイクロサテライト不安定性についての一般的なマーカーであり、結腸癌におけるマイクロサテライト不安定性についてのみのマーカー（ベセスダパネルの場合のように）ではない。これは確かに、ＭＳＩが存在可能な各癌に対する新しいマーカーを発見する必要性をなくすであろう。追加の利点は、その状態を技術から独立して決定することができるマーカーの同定である。より具体的には、次世代シーケンシング技術を用いて同定することができるマーカーである（サンガー配列決定を用いてのみ同定される代わりに）。これにより研究室は、ベセスダパネルマーカーをチェックするためにのみ使用する装置を持ち続ける必要はない。
さらに、ＭＭＲ特異的な治療法をさらに最適化する、例えば、標的療法に対するその反応をより合理的に予測する、大きな必要性も存在する。また、一般的に使用される治療法に対する抵抗性を克服する方法を見出すことが必要であり、例えば、標準的な処置に抵抗性であっても、ＭＭＲ欠損腫瘍が感受性である治療法を同定することなどによる。
【発明の開示】
【０００９】
概要
本発明の目的は、特定の癌のＭＳＩ状態を決定するための、より優れたマーカーを提供することである。検出にバイアスがないことを保証するために、我々はここに初めて、ミスマッチ修復欠損腫瘍の次世代シーケンシングを報告する。マーカーは、その検出がサンガー配列決定法に依存しないような様式で、長いマイクロサテライト中には存在しないように選択される。さらに、マーカーの適用性を拡大するために、マーカーを異なる腫瘍タイプにおいて評価して、それらが癌タイプ特異的マーカーではなく、種々の癌にわたるマイクロサテライト不安定性のマーカーを表すようにした。最後に、マーカーを、腫瘍において反復的に発生するように選択した。興味深いことに、反復（ホットスポット）変異の多くはＤＮＡ二本鎖切断修復経路に影響を与える遺伝子においてクラスター化しており、この経路も機能的に影響を受けることを示すことができた。その結果、これらのマーカーについて陽性の腫瘍は、ＰＡＲＰ阻害剤などのＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による阻害に感受性であり、これは合成致死性相互作用をもたらすことを実証することができた。
【００１０】
実施例のセクションで展開されるように、次世代シーケンシングは、ＭＭＲ欠損を検出するために使用することができ、またこれらの条件と一致する、マーカーの新しいパネルの同定を可能にした。
同定されたマーカーは、２つのクラスに分けることができる：特定遺伝子の、コード領域（すなわちエクソン）のマイクロサテライト領域に存在するインデル、および非コード領域（最も特に５’および３’ＵＴＲ領域）に存在するインデルである。
したがって、腫瘍のＭＳＩ状態を診断する方法が本明細書に提供され、該方法は、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含み、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在が、ＭＳＩの指標である。
【００１１】
さらなる特定の態様によれば、マイクロサテライト領域は、ホモポリマー領域である。なおさらなる特定の態様によれば、マイクロサテライト領域は、表１または表２に同定されたマイクロサテライト領域と同一である（すなわち、少なくとも２つのマイクロサテライト領域が、表１または表２に列挙されたマイクロサテライト領域のリストから選択される）。 
特定の態様によれば、ＵＴＲに存在するマイクロサテライト領域は、表１の代わりに表４から選択することができる。別の特定の態様によれば、これらのマイクロサテライト領域は、表１の代わりに表６から選択することができる。
代替的であるが非排他的な特定の態様によれば、遺伝子のエクソンに存在するマイクロサテライト領域は、表２の代わりに表５から選択することができる。別の特定の態様によれば、領域は、表２の代わりに表７から選択することができる。 
非常に特定の態様によれば、マイクロサテライト領域は、表８に列挙された遺伝子から選択することができる。
【００１２】
特定の態様によれば、ＭＳＩ状態が診断される癌または腫瘍は、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍の群から選択される。 
非コード領域（例えば、５’および３’ＵＴＲ領域など）のマイクロサテライトのインデルは、コード領域のインデルよりも選択圧が低いため（これにより、後者はフレームシフト突然変異を引き起こし、元のものとは完全に異なる翻訳がもたらされる）、非コード領域からのマイクロサテライトのインデルが、癌タイプにわたってＭＳＩのより信頼性の高いマーカーであることを実証することができた。実際、本明細書で同定された非コードマーカーの５０％以上は、証明されたＭＳＩを有するＭＭＲ欠損腫瘍で試験された場合に、陽性スコアを有する。エクソンマーカーについては、これらの腫瘍で試験された場合に、３分の１をはるかに超えるものが陽性スコアを有する。このことは、マーカーの少なくとも一部がエクソンの領域にある場合に、少なくとも３つのマーカーを使用することが想定されている理由を説明する。 
また、エクソン領域のマーカーと非コード領域のマーカーの組み合わせを使用することも、特に想定される。例えば、特定の態様によれば、インデルの存在が決定される少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも２つのマイクロサテライト領域である。
【００１３】
特定の態様によれば、少なくとも２または３より多くのマーカーを使用することが想定される。より多くのマーカーの使用は一般に、より正確な診断を生み出す（ただしこの利点は、コストの増加と相殺される。また、マーカーの特定の閾値を一度上回ると、別のマーカーを追加することは必ずしも情報を追加しないため、その相対的価値が限定される）。したがって特定の態様によれば、少なくとも４、５、６、７、または８個のマーカーを使用する（すなわち、表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択されるマイクロサテライト領域中のインデル）。さらなる特定の態様によれば、表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択されるマイクロサテライト領域中の、少なくとも８、９、１０、１１または１２個のインデルを用いて、ＭＳＩ状態を決定する。よりさらなる特定の態様によれば、さらに多くのマーカーが使用され、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、または少なくとも５０のマーカーが使用される。
【００１４】
具体的な態様によれば、使用される少なくとも１つのマーカーは、以前には癌に関連されていない遺伝子、または以前にはＭＭＲ欠損腫瘍において影響を受けることが知られていない遺伝子中の、エクソンマーカーである。したがって、表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択されるマイクロサテライト（単数または複数）は、以下のリストから選択される遺伝子に存在する、少なくとも１つのマイクロサテライトを含むことが想定される：ＳＥＴＤ１Ｂ、ＲＢＭＸＬ１、ＣＣＤＣ１５０、ＯＲ７Ｅ２４、Ｃ１５ｏｒｆ４０、ＫＩＡＡ２０１８、ＬＴＮ１、ＳＬＣ２２Ａ９、ＣＤＨ２６、ＤＤＸ２７、ＥＸＯＳＣ９、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＫＩＡＡ０１８２、ＫＩＡＡ１９１９、ＭＩＳ１８ＢＰ１、ＰＲＲＴ２、ＴＭＥＭ６０、ＡＱＰ７、ＡＲＶ１、ＣＣＤＣ１６８、ＥＬＡＶＬ３、Ｆ８、ＦＥＴＵＢ、ＨＰＳ１、ＮＢＥＡＬ１、Ｐ４ＨＴＭ、ＰＩＧＢ、ＲＢＭ４３、ＲＧ９ＭＴＤ１、ＳＲＰＲ、およびＴＭＥＭ９７。さらにより具体的な態様によれば、少なくとも１つのマイクロサテライトは、以下のリストから選択される遺伝子に存在する：ＳＥＴＤ１Ｂ、ＴＭＥＭ６０、ＤＤＸ２７、ＥＸＯＳＣ９、ＦＡＭ１１１Ｂ、およびＫＩＡＡ１９１９。代替の態様によれば、ＳＥＣ３１Ａ、ＣＮＯＴ２、ＲＮＦ１４５、ＲＮＰＣ３、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＴＭＢＩＭ４、ＣＤ３Ｇ、ＤＯＣＫ３、ＭＹＯ１０およびＰＲＲＧ１もまた、これらのリスト中で用いることができる。
代替の具体的態様によれば、使用される少なくとも１つのマーカーは、５’または３’ＵＴＲ領域に位置する１０〜１５反復塩基のホモポリマー中のインデルである。
【００１５】
特に想定されるマーカーパネルは、表３に示す遺伝子中のマイクロサテライトである。したがって、これらの態様によれば、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域におけるインデルの存在を決定することを特徴とする方法が提供され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、表３に示す５６遺伝子からのマイクロサテライト領域である。
特定の態様によれば、ＭＳＩの状態は、以下のようにさらに特徴付けることができる：試験したマイクロサテライト領域の１７％以上がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｈであり、２％〜１７％のマイクロサテライト領域がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｌであり、２%未満のマイクロサテライト領域がインデルを含む場合、腫瘍はマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）である。一例として、５６のマーカーのパネルに対して、０または１つのマーカーが陽性である場合、腫瘍はＭＳＳとして分類され、２〜９の陽性マーカーの場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｌであり、１０以上の陽性マーカーに対して、腫瘍はＭＳＩ−Ｈと分類される。代替的に、ベセスダパネルから範囲を推定することができる（１０の内０の陽性マーカーはＭＳＳであり、１０の内１または２の陽性マーカーはＭＳＩ−Ｌであり、３以上の陽性マーカーはＭＳＩ−Ｈである；これは、ＭＳＳとＭＳＩ−Ｌの区別に対して１〜９％の間の陽性マーカーの境界に、およびＭＳＩ−Ｈの分類に対して２０％を超える陽性マーカーに対応する）。
【００１６】
具体的な側面によれば、本明細書に提供されるマイクロサテライトインデルマーカーは、使用される技術とは無関係に検出することができる。しかしながらインデルの存在の決定は、サンガー配列決定に基づく方法によらないことが特に想定される。その理由は、ベセスダマーカーパネルを用いてマイクロサテライト不安定性を検出するプロセスは、通常、非常に面倒であると証明されたプロトコルであるサンガー配列決定を介して行われるためである。さらなる態様によれば、インデルの存在を、単一塩基対伸長法（例えば、Sequenom MassArrayなど）、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術（例えばTaqman）、融解曲線分析（ＨＲＭを含む）または同様の技術によって決定することが、特に想定される。
別の側面によれば、腫瘍試料中のＭＳＩを決定するための、バイオマーカーパネルが提供される。かかるバイオマーカーパネルは、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含む。非常に特定の態様によれば、バイオマーカーパネルは、表３に列挙されているマイクロサテライト領域の少なくとも半分を含む。さらに特定の態様によれば、バイオマーカーパネルは、表３に列挙された５６のマイクロサテライト領域により表される。
【００１７】
このバイオマーカーパネルを用いて、癌におけるＭＳＩの状態を検出できることが特に想定される。したがって、癌におけるマイクロサテライト不安定性の診断における、このバイオマーカーパネルの使用が提供される。
したがって、本明細書に記載のバイオマーカーパネルは、医薬としての使用のために提供される。より特に、本明細書に記載のバイオマーカーパネルは、診断薬としての使用のために提供される。さらにより特に、本明細書に記載のバイオマーカーパネルは、癌におけるマイクロサテライト不安定性の診断における使用のために提供される。
さらに別の態様によれば、腫瘍試料中のＭＳＩを決定するための、バイオマーカーパネル（すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域）の遺伝子型を決定するためのツールを含むキットが提供される。最も具体的には、キットは、特に想定されるバイオマーカーパネル（単数または複数）に適合される。具体的な態様によれば、キットはまた、マーカーのベセスダパネル、またはマーカーの拡張ベセスダパネルの遺伝子型を決定するためのツールを含んでもよい。かかるキットは、マーカーをベセスダパネルと対照比較するために特に適している。
【００１８】
実施例のセクションに示すように、本明細書で提供されるインデルマーカーは、ＤＮＡ二本鎖切断修復経路に関与する遺伝子で濃縮されており、それらの機能に影響を与えている。結果として、これらのマーカーが存在する細胞は、ＤＮＡ塩基除去修復の阻害による合成致死性に感受性である。ＭＳＩ陽性腫瘍は使用される標準的な化学療法に抵抗性である場合が多いため、これは、新たな治療機会を提供する。 
したがって、さらなる側面において、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する、癌細胞の感受性をスクリーニングするための、癌細胞におけるＭＳＩ状態を決定することを含む方法が提供される。特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、次のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍から選択される癌からのものである。これらの方法は、原理的にin vivo、ex vivoおよびin vitroで行うことができるが、in vitroでの実施が特に想定される。 
【００１９】
特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する癌細胞の感受性の指標である；すなわち癌細胞は、かかる阻害剤で処理した場合に、死滅するか、成長を停止するか、または増殖が減少する。
具体的な態様によれば、癌細胞は、対象から得た細胞であり、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性のスクリーニングは、対象の処置をガイドするために使用される。代替的な態様によれば、感受性のスクリーニングは、対象を臨床試験について階層化または分類するのに使用される。
特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載の方法によって、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法によって証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
【００２０】
さらに特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。
したがって、癌細胞の感受性をスクリーニングする方法を提供するだけでなく、癌を有する対象の、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性を診断する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される：
−  対象から得た癌細胞の試料中のＭＳＩ状態を決定すること；
−  ＭＳＩ状態を、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性と相関させること、ここで、ＭＳＩの存在は、処置に対する感受性の指標である。
任意に、これらの方法は、対象から癌細胞の試料を取得する追加のステップを含む（決定するステップの前に）。ＭＳＩ状態を決定することは、典型的には得られた試料の細胞内で行われる。癌細胞の試料中のＭＳＩ状態の決定をin vitroで実施することが、特に想定される。 
【００２１】
特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、次のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍（またはリンチ症候群スペクトラムのいかなる他の腫瘍）から選択される癌からのものである。特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載方法により、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法により証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
【００２２】
さらなる特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。
また、この側面による方法は、対象をＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤で処置するさらなるステップを含んでもよい（対象が、ＭＳＩの状態によって決定されるように、かかる処置に対して感受性である場合）。
したがって、必要とする対象においてＭＳＩを有する癌を処置する方法であって：
−  癌におけるＭＳＩの存在を証明すること；
−  対象に対して、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤を投与すること、
を含む前記方法が提供される。
癌は、対象に対して阻害剤を投与することによって処置することが想定される。前記方法は任意に、対象から癌細胞の試料を取得する追加のステップを含んでもよい（ＭＳＩを決定するステップ、およびＭＳＩの存在を証明するステップの前に）。
【００２３】
特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、次のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍から選択される癌からのものである。特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載された方法により、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法により証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される、少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
さらなる特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＭＳＨ６欠損ハイパーミューテーター（hypermutator）における体細胞置換およびインデル。（ａ）ＭＭＲ欠損腫瘍および２つのＭＭＲ熟達腫瘍における平均変異頻度（塩基当たりの変異数、ｍｐｂ）。（ｂ）インデルおよび置換について階層化した変異頻度。（ｃ−ｄ）マイクロサテライト、ホモポリマー（５ｂｐを超える長さ）、短いホモポリマー（３〜５ｂｐの長さ）、および「反復領域以外」において観察されたインデル（ｃ）および置換（ｄ）の割合を、これらの領域におけるそれらの予想割合と比較したもの。（ｅ−ｆ）エクソン、遺伝子間およびイントロン領域に階層化した、ＭＭＲ欠損腫瘍におけるインデル（ｅ）および置換（ｆ）の頻度。
【００２５】
【図２】ＭＳＨ６欠損ハイパーミューテーターにおける体細胞置換およびインデルのパターン。（ａ）黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ＭＭＲ欠損子宮内膜腫瘍、２つのＭＭＲ熟達子宮内膜腫瘍、および子宮内膜腫瘍患者からの対応する生殖細胞系ＤＮＡ（周辺の白血球細胞）における、全ゲノム配列中の体細胞置換パターン。（ｂ−ｃ）ＭＭＲ欠損（ｂ）およびＭＭＲ熟達（ｃ）腫瘍における、最初のヌクレオチドが変異したジヌクレオチド当たりの体細胞置換頻度の階層化。正規化された置換頻度は、影響を受けたジヌクレオチドの数をこれらのジヌクレオチドの全ゲノムでの数で割り、総置換頻度のパーセンテージとして表したもの。（ｄ）ゲノム特徴の多変量線形回帰モデルは、ＭＭＲ欠損腫瘍での置換頻度を予測する。表示されているのは、ゲノム特徴データのヒートマップを、置換数に従って順序付けしたものであり、置換頻度とゲノム特徴の相関を可視化する。線形モデルから得られるＴ値を、各ゲノム特徴についてヒートマップの右側のバープロットに表示し、相関の有意性（網掛けグレーはＰ＞０．０１に等しい）および方向を示す。単一のヒートマップにある各特徴の異なるスケールに対応するために、ゲノム特徴データは分布パーセンタイルで表示し、白および赤はそれぞれ低および高パーセンタイルを示す。ＣｐＧ部位におけるＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位は１０Ｍｂのウィンドウにビン化されているが、これは、数が１Ｍｂウィンドウ毎のモデル化には不十分だったためである。（ｅ）１Ｍｂウィンドウ当たりのハイパーミューテーターにおける、置換、転位（ＣＧにおけるＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔを除く）および転換の頻度ｖｓデサイル当たりビン化されたそのウィンドウの複製時間。頻度は、最も早く複製されたウィンドウに相対的に表示される。エラーバーは、平均の標準誤差を示す（０．２を超える複製時間での置換および転位について、Ｐ＜０．０１）。（ｆ）ハイパーミューテーターにおける全ゲノムでの頻度と比較した、ＣｐＧアイランドの中側および外側での置換、転位（ＣＧにおけるＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔを除く）および転換の頻度。（ｇ）ＭＭＲ欠損腫瘍でのインデル頻度を予測する、ゲノム特徴の多変量線形回帰モデル。ヒートマップおよびバープロットは、パネル（ｄ）について記載した通りである。（ｈ）インデルにより影響を受けるホモポリマーの割合を、ＭＭＲ欠損腫瘍においてヌクレオチド当たり階層化したものを、そのヌクレオチド含有量を有するホモポリマーの、全ゲノムにおける割合と比較したもの。（ｉ）示された数の塩基の挿入または欠失を有するインデルの割合。（ｊ−ｋ）ハイパーミューテーターにおける体細胞置換と最も近い体細胞インデル（ｊ）または置換（ｋ）との間の距離、および２００のランダムモデルに基づいて予想される距離。
【００２６】
【図３】１０のＭＭＲ欠損エクソームの体細胞変異パターン。（ａ）１０例のＭＭＲ欠損腫瘍および４例のＭＭＲ熟達腫瘍のコードエクソンの平均変異頻度。（ｂ）インデルおよび置換について階層化した、１０例のＭＭＲ欠損腫瘍ｖｓ４例のＭＭＲ熟達腫瘍のコードエクソンの平均変異頻度。（ｃ−ｄ）ＭＭＲ欠損エクソンにおけるジヌクレオチド（最初のヌクレオチドが変異した状態で）当たりの置換頻度の階層化（ｃ）、および公開された生殖細胞系のde novo置換のセット（ｄ）。プロットされた正規化された置換頻度は、影響を受けたヌクレオチドの数を、これらのジヌクレオチドの全ゲノムでの数で割り、総体細胞置換頻度のパーセンテージとして表わしたものを反映する。（ｅ）ＭＬＨ１欠損およびＭＳＨ２欠損腫瘍における、マイクロサテライト、ホモポリマー、短いホモポリマー、および反復領域以外で観察されたインデルの割合を、これらの領域の全ゲノムでの割合と比べたもの。
【００２７】
【図４】ＭＭＲ欠損腫瘍のエクソーム、５’および３’ＵＴＲでのホットスポット変異。（ａ）コード領域、５’および３’ＵＴＲにおける、その長さの関数としてのホモポリマーの割合。（ｂ）コード領域、５’および３’ＵＴＲについて、ホモポリマーの長さの関数としてのインデルに影響を受けたホモポリマーの割合。（ｃ）ＭＭＲ欠損腫瘍のコード領域、５’および３’ＵＴＲにおける、平均体細胞インデル頻度。（ｄ）コード領域、５’および３’ＵＴＲについて、ホモポリマーの長さの関数としての、インデルにより反復的に影響を受けたホモポリマーの割合。
【図５】ＭＳＩを評価するためのベセスダおよび５６マーカーホットスポット変異パネル。  エクソーム配列決定により同定されたエクソン、５’および３’ＵＴＲにおける、拡張ベセスダパネルおよび５６のホットスポット変異のパネルを、１１４例の未選択の原発性子宮内膜腫瘍の独立した系列で解析した。結果は、拡張ベセスダパネルに基づき、高マイクロサテライト不安定（ＭＳＩ−Ｈ）、低マイクロサテライト不安定（ＭＳＩ−Ｌ）またはマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）状態に応じて、色分けした。
【図６】ＨＲ経路によるＤＮＡ  ＤＳＢ修復に影響を与える体細胞突然変異。  ＨＲ経路によるＤＳＢ修復の図（ＩＰＡ相同組換え経路図から採用）。オレンジ色でマークされた遺伝子（背景がグレー）は、ＭＭＲ欠損腫瘍の我々のセット内、または公的に利用可能なＴＣＧＡデータセットからのＭＳＩ−Ｈ腫瘍内のいずれかに、体細胞突然変異を有する。
【００２８】
【図７】ＭＭＲ欠損細胞はＰＡＲＰ阻害に対して感受性である。（ａ）０または１０μＭのオラパリブに暴露され、ＤＮＡ修復マーカーＲＡＤ５１（緑色）について染色され、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色された、ＭＭＲ欠損およびＭＭＲ熟達原発腫瘍細胞の代表的な共焦点画像。矢印（黄色）は、５より多くの緑の核焦点を含むＲＡＤ５１陽性細胞を示す。（ｂ）＞５のＲＡＤ５１焦点を含む細胞の定量化。平均値は、オラパリブ（１０μＭ）または担体対照を用いた処置の２４時間後に、８例の異なるＭＭＲ欠損細胞および４例の異なるＭＭＲ熟達細胞の培養物について示されている。（ｃ−ｄ）増加濃度のオラパリブ（１μＭ、３μＭ、１０μＭ）を有する、８例のＭＭＲ欠損細胞（ｃ）および４例のＭＭＲ熟達細胞（ｄ）の平均細胞増殖。リアルタイムの細胞増殖は、xCELLigence RTCA DPシステム（Roche Applied Science）を用いて処置後４８時間まで測定した。値は、モック処置対照（０μＭオラパリブ）に対して正規化されている。エラーバーは平均の標準誤差を表す。アスタリスクは、示された時点における、処置細胞ｖｓモック処置細胞の間の統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。（ｅ）各細胞培養物についての細胞増殖率（ＭＭＲ欠損細胞は青色で示し（グラフ中、下の８つ）、ＭＭＲ熟達細胞は赤色で示す（グラフ中、上の４つ））。要約すると、ＭＭＲ欠損細胞は増殖において用量依存性の減少を特徴とし、一方ＭＭＲ熟達細胞は、オラパリブに応答しなかった（反復測定によりＰ＝２．０Ｅ−７、図７ｃも参照）。
【００２９】
詳細な説明
定義
本発明を特定の態様に関し特定の図面を参照しながら説明するが、本発明はこれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項における任意の参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載した図面は、概略的かつ非限定的である。図面において、いくつかの要素のサイズは誇張されている場合があり、説明目的のため縮尺通りには描かれていない。「含む」という用語は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、他の要素またはステップを除外するものではない。単数名詞を参照するときに不定冠詞または定冠詞、例えば「a」または「an」、「the」が使用される場合、別のことが明確に述べられていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
さらに、本明細書および特許請求の範囲において第１、第２、第３等の用語は、同様の要素を識別するために用いられ、必ずしも順次的または時間の順番を記述するためには用いられない。このように用いられる用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載される発明の態様は、本明細書で説明または図示した以外の他の順序で動作可能であることが、理解されるべきである。
【００３０】
以下の用語または定義は、本発明の理解を支援するためにのみ提供される。本明細書において具体的に定義しない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の分野の当業者に対するものと同じ意味を持つ。開業医は特に、当分野の定義および用語について、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)を参照のこと。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるものより狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用する用語「マイクロサテライト」または「マイクロサテライト領域」とは、少なくとも２つの反復単位から構成された、６塩基の最小の長さのモノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタまたはヘキサヌクレオチド反復を指す。マイクロサテライトの特定のサブクラスは、ホモポリマーを含む。本明細書で使用する「ホモポリマー」は、少なくとも６塩基のモノヌクレオチド反復である、マイクロサテライト領域を意味する；換言すれば、ＤＮＡレベルで見る場合、少なくとも６つの連続したＡ、Ｃ、ＴまたはＧ残基のストレッチである。最も具体的には、マイクロサテライトを決定する場合、対象のゲノムＤＮＡ（または対象に存在する癌のゲノムＤＮＡ）を見る。
【００３１】
本出願において使用される用語「ＭＳＩ状態」とは、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の存在、すなわち、マイクロサテライトにおける反復ＤＮＡヌクレオチド単位の数におけるクローナルなまたは体細胞性変化の存在を指す。ＭＳＩ状態は、３つの別のクラスのいずれかであることができる：ＭＳＩ−Ｈ、これは高ＭＳＩ、ＭＳＩ陽性とも呼ばれる；ＭＳＩ−Ｌ、これは低ＭＳＩとも呼ばれる；またはマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）、これはＭＳＩの欠如とも呼ばれる。典型的には、ＭＳＩ−Ｈと分類するためには、ＭＳＩ状態の分類に使用したマーカーの少なくとも２０％が陽性スコアでなければならず、ＭＳＳ分類のためには、２．５％未満が陽性スコアでなければならない。中間数のマーカーが陽性スコアの場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｌに分類される。留意すべきは、これらの初期境界が拡張ベセスダマーカーパネル（これはわずか１０のマーカーで構成されている）に由来するため、典型的には１００未満のマーカーが評価され、陽性マーカーの数は整数であり、パーセンテージは近似であることである。ＭＳＳとＭＳＩ−Ｌとの違いは一般的に、陽性スコアのマーカーが１％〜９％の間であり（１０のマーカーが評価される場合、これはすなわち、陽性マーカーが１つであればＭＳＩ−Ｌの分類のとなる）、一方ＭＳＩ−ＬとＭＳＩ−Ｈの間の差は一般に、１５〜２５％の陽性マーカーである（すなわち、この閾値を超えると腫瘍はＭＳＩ−Ｈであり、下であればＭＳＩ−Ｌである）。代替的に、３つのクラスに区別する代わりに、マイクロサテライト不安定性の存在と不在の間の違いのみを評価し、その場合、状態は、ＭＳＩの存在またはＭＳＩの不在（＝ＭＳＳ）のいずれかである。無傷のミスマッチ修復（ＭＭＲ）系の不在と、ＭＳＩの存在の間の相関を考慮すると、ＭＳＩの存在の診断（またはＭＳＩ状態の診断）は、ＭＭＲ欠損症の診断と解釈することができる。ただし、ＭＭＲが機能的または欠損であることに注意すべきであり、中間クラスはない。したがってＭＳＩ−ＬもＭＭＲ欠損に対応する――このような状況は、ＭＳＩの存在または不在のみを評価することと等価である。
【００３２】
「腫瘍のＭＳＩ状態を診断する」または「対象における腫瘍のＭＳＩ状態を診断する」または「対象のＭＳＩ状態を診断する」または「腫瘍（または対象）のＭＳＩ状態を決定する」は全て、本明細書において同義語であると考えられる。ＭＳＩ状態を決定すること（または診断すること）とは、典型的には、調査しているマイクロサテライト領域中の１または２以上のインデルの存在を検出することに基づいてＭＳＩとの結論を、または調査しているマイクロサテライト領域中にインデルを検出しないことに基づいてマイクロサテライト不安定性が存在しないとの結論を、引き出すことを意味する。したがって、マイクロサテライト領域中で「インデルの存在を決定する」とは、前記マイクロサテライト領域中のインデルの存在または不在を、評価または検出することを意味する。同様に、少なくとも２つのマイクロサテライト領域においてインデルの存在を決定するとは、前記少なくとも２つのマイクロサテライト領域の各々の中でのインデルの存在または不在を、評価または検出することを意味する。少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である（本出願で説明したように、ＭＳＩを証明するのに必要な陽性マーカーの正確な数は、使用するマーカーの数に依存する）。
【００３３】
本明細書で使用される「インデル」は、挿入と欠失の両方およびそれらの組合せを含む、突然変異クラスを指す。マイクロサテライト領域のインデルは、ヌクレオチドの正味の増加または減少をもたらす。インデルの存在は、インデルの存在しないＤＮＡと比較すること（例えば、腫瘍試料からのＤＮＡを、腫瘍を有する対象からの生殖細胞系ＤＮＡと比較すること）、または、特に単形マイクロサテライトまたはホモポリマーの場合には、これを既知の長さのマイクロサテライトと比較すること、特に反復単位数をカウントすることによって、証明することができる。具体的な態様によれば、特に想定されるインデルは、１〜５個のヌクレオチドの長さを有する（すなわち、マイクロサテライトまたはホモポリマーの長さは、マイクロサテライトまたはホモポリマーの通常の既知の長さよりも１〜５個のヌクレオチドだけより長いまたは短い）。さらなる具体的な態様によれば、インデルは、１〜４個のヌクレオチド、１〜３個のヌクレオチド、または１もしくは２個のヌクレオチドの長さを有する。留意すべきは、インデルは挿入と欠失の組み合わせであり得るため、改変された核酸配列は、長さの差よりも大きい可能性がある（例えば、５ヌクレオチドの欠失を３ヌクレオチドの挿入と組み合わせると、長さの変化は２であるが、マイクロサテライトの配列もまた変化し得る）。しかし最も典型的には、インデルは、１または２個のヌクレオチドの、挿入または欠失のいずれかである。
「単形マイクロサテライト」は、全ての個体、特に所与の集団の全ての個体が、同数の反復単位を共有するものである。これは、所与の集団の１％より多くが反復単位数についてヘテロ接合性を示すところのマイクロサテライトを指すのに用いられる「多型マイクロサテライト」とは対照的である。一例として、ＢＡＴ２６マーカーは、ヨーロッパ民族の９９％以上において２６のアデニンから構成され、一方この位置における異なるアデニン数のアレル（例えば１５、２０、２２、２３）は、２５％までのアフリカ民族（アフリカ系アメリカ人含む）にみられる。したがって、ＢＡＴ２６は、ヨーロッパ人においては単形マイクロサテライトであり、アフリカ人においては多型マイクロサテライトである。
【００３４】
「腫瘍ＤＮＡの試料」は、配列決定のためのベースとして使用することができ、癌からのＤＮＡが存在する任意の試料を指す。本明細書で使用する「癌」という用語は、悪性新生物とも呼ばれる、無秩序な細胞増殖を伴う異なる疾患を指す。用語「腫瘍」は、本出願において同義語として使用される。この用語が、全ての固形腫瘍タイプ（癌腫、肉腫、芽細胞腫）をカバーすることが想定されるが、これはまた、白血病、リンパ腫または骨髄腫などの非固形癌の種類も明示的に包含する。したがって「腫瘍ＤＮＡの試料」は、白血病者からの血液試料であることもできる。一般的に、腫瘍ＤＮＡの試料は、１時点において、対象から、特に癌の対象から単離されている。任意にこれは、ＤＮＡの配列決定のために、１または２以上の形態の前処理（例えば、溶解、分画、分離、精製）を受けているが、未処理の試料からのＤＮＡが配列決定されることもまた想定される。本明細書で使用する場合、名詞「対象」とは、個々の脊椎動物、より具体的には個々の哺乳動物、最も具体的には個々のヒトを指す。本明細書で用いられる「対象」は、典型的にはヒトであるが、哺乳動物、特に家畜、例えばネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、フェレット、ラット、マウスなど、またはウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラマなどの家畜であることができる。対象はまた、魚、爬虫類、両生類や鳥などの非哺乳類脊椎動物であることができる；本質的に、癌を発症することができる任意の動物は、この定義を満たす。
【００３５】
本明細書で使用する用語「結腸直腸癌」とは、結腸の悪性新生物（ＩＣＤ−１０のＣ１８）、Ｓ状結腸直腸連結部の悪性新生物（ＩＣＤ−１０のＣ１９）、直腸の悪性新生物（ＩＣＤ−１０のＣ２０）および肛門と肛門管の悪性新生物（ＩＣＤ−１０のＣ２１）を含むことを意味する。 
本明細書で使用する用語「リンチ症候群」とは、結腸または結腸直腸癌、ならびに子宮内膜、卵巣、胃、小腸、肝胆管、上部尿路、脳および皮膚癌を含む他の癌の高いリスクを有する、常染色体優性遺伝状態を指す。これらの癌のリスク増加は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう遺伝性突然変異に起因する。この状態の古い名前はＨＮＰＣＣである。
【００３６】
本明細書で使用される「ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤」とは、ＤＮＡレベルで（関連する遺伝子産物の形成を阻害することによって、すなわち転写を妨害または干渉することにより）、またはＲＮＡレベルで（ｍＲＮＡを中和または不安定化して、翻訳を妨害または干渉することにより）、またはタンパク質レベル（ＢＥＲに関与するタンパク質を中和または阻害することにより）のいずれかで、遺伝子産物の塩基除去修復機能を妨害し得る物質を指す。阻害剤はＰＡＲＰ阻害剤であることが想定され、なぜならばかかる阻害剤が良好に特徴付けられているからである。最もよく想定されるのは、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２の阻害剤であり、これら酵素がＢＥＲに最も活発に関与するＰＡＲＰだからである。しかし、他のＰＡＲＰの阻害剤も、同様に有用であり得る。この点に関し、最近の刊行物は、使用のために明示的に想定されるＰＡＲＰ阻害剤のイニパリブは、ＰＡＲＰ−１および２よりも他のＰＡＲＰ、特にＰＡＲＰ−５および６を阻害することを示唆している（Ji J, Lee MP, Kadota M, et al Pharmacodynamic and pathway analysis of three presumed inhibitors of poly (ADP-ribose) polymerase: ABT-888, AZD 2281, and BSI201. Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2011 Apr 2-6; Orlando, Fla. AACR. 2011. Abstract nr 4527；Maegley KA, Bingham P, Tatlock JH, et al. All PARP inhibitors are not equal: an in vitro mechanistic comparison of PF-01367338 to iniparib. J Clin Oncol. 2011;29 (suppl; abstr e13576)；Nagourney RA, Kenyon KR, Francisco FR, et al. Functional analysis of PARP inhibitors AZD 2281 and BSI-201 in human tumor primary cultures: a comparison of activity and examination of synergy with cytotoxic drugs. J Clin Oncol. 2011;29 (suppl; abstr e13599)）。
ＰＡＲＰ阻害剤の例としては、限定されないが、イニパリブ、オラパリブ、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＭＮ−６７３、および３−アミノベンズアミドが挙げられる。
【００３７】
説明
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損細胞で起こるＤＮＡ複製のエラーは、ミスマッチ変異として存続し、一定範囲の腫瘍の素因となる。ここでは、ＭＭＲ欠損腫瘍から最初のゲノムを配列決定し、ＤＮＡ複製エラーのバイアスのない評価を可能にした。突然変異率は、ＭＭＲ熟達腫瘍と比較して急激に増加したことが観察された。挿入または欠失（インデル）の変異が最も頻繁に発生し、大部分はホモポリマーストレッチに限定され、一方単一塩基対置換は主にＡ：Ｔ＞Ｇ：ＣおよびＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位から構成され、これらはより頻繁にインデルの近くに位置していた。置換率は体細胞インデルの近くでより高いので、これは、インデル変異がＤＮＡ複製中に変異原性部位として作用することを示唆している。ネガティブなクローン選択により、体細胞突然変異率は、ゲノムの残りの部分よりもエクソームにおいて低く、一方ポジティブな選択により、いくつかのエクソン変異は、いくつかのＭＭＲ欠損腫瘍において発生した。これらの反復変異は、正常な対応する組織において発現される遺伝子に特異的に影響を与え、これらがＭＭＲ欠損腫瘍の進行のドライバーを表すことを示唆した。
【００３８】
興味深いことに、インデルは、主にホモポリマー、特に長さが増加したホモポリマーに位置していた。これらの観察はまた、即時の臨床含意を有する。ＭＳＩ腫瘍の診断分類のために現在使用されている拡張ベセスダパネルは９，１４−１５、限られた感受性、すなわちＭＬＨ１−、ＭＳＨ２−、およびＭＳＨ６欠損腫瘍に対してそれぞれ８０％、８４％および５５％を有し１６、その理由はおそらく、このパネルが、それぞれ２５および２６ヌクレオチドの長さの８つのマイクロサテライトおよび２つのホモポリマーマーカーのみから構成されているからである。５６の反復インデルの我々の現在のパネルを、１１４例の子宮内膜腫瘍に適用することにより、４３％までの腫瘍が、様々な程度のＭＳＩを示すことを実証できた。これは以前に報告されたよりも顕著に高かったが、その理由はおそらく、これらのインデルがランダムに選択されておらず、エクソーム、５’および３’ＵＴＲに反復的に影響を与える変異のバイアスのない評価を通じて同定されているからである。我々はまた、子宮内膜腫瘍における反復インデルが、他の癌タイプのＭＭＲ（−）腫瘍に位置していたことも観察した。３’ＵＴＲ中のインデルは影響を受けたホモポリマーの長さによって決定され、一方エクソームでは、これらは元の組織によって発現される遺伝子中で積極的に選択される必要があるため、各種の癌タイプで共有されるほとんどのインデルは、５’および３’ＵＴＲ中に位置した。したがって、５’および３’ＵＴＲまたは他の非コード配列中の反復変異は、各種の癌タイプにわたってＭＳＩを検出するのに、特に適しているように見える。興味深いことに、ほとんどの反復変異の選択パネルは、各種の癌タイプにおけるマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を検出するために非常に感受性であった。１１４例の原発性子宮内膜腫瘍において、ＭＳＩの連続スペクトルは腫瘍のほぼ半分で観察され、ＭＳＩが予想よりもより頻繁に発生することを示唆した。
【００３９】
実施例のセクション、特に例５で詳述するように、ＭＭＲ欠損腫瘍のインデルによって頻繁に影響を受ける、５’および３’ＵＴＲ領域中の特定のホモポリマーが存在する。最も頻繁に反復的に変異した遺伝子のリストを、表１に提供する。
表１．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料について、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル（１６例の腫瘍試料の少なくとも４つに存在する）。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表１−１】
0006578205.tif 000002
【００４０】
【表１−２】
0006578205.tif 000003
【００４１】
【表１−３】
0006578205.tif 000004
【００４２】
【表１−４】
0006578205.tif 000005
【００４３】
【表１−５】
0006578205.tif 000006
【００４４】
【表１−６】
0006578205.tif 000007
【００４５】
【表１−７】
0006578205.tif 000008
【００４６】
【表１−８】
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【００４７】
【表１−９】
0006578205.tif 000010
【００４８】
【表１−１０】
0006578205.tif 000011
【００４９】
【表１−１１】
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【００５０】
【表１−１２】
0006578205.tif 000013
【００５１】
【表１−１３】
0006578205.tif 000014
【００５２】
【表１−１４】
0006578205.tif 000015
【００５３】
【表１−１５】
0006578205.tif 000016
【００５４】
【表１−１６】
0006578205.tif 000017
【００５５】
【表１−１７】
0006578205.tif 000018
【００５６】
【表１−１８】
0006578205.tif 000019
【００５７】
【表１−１９】
0006578205.tif 000020
【００５８】
【表１−２０】
0006578205.tif 000021
【００５９】
【表１−２１】
0006578205.tif 000022
【００６０】
【表１−２２】
0006578205.tif 000023
【００６１】
【表１−２３】
0006578205.tif 000024
【００６２】
【表１−２４】
0006578205.tif 000025
【００６３】
【表１−２５】
0006578205.tif 000026
【００６４】
【表１−２６】
0006578205.tif 000027
【００６５】
【表１−２７】
0006578205.tif 000028
【００６６】
【表１−２８】
0006578205.tif 000029
【００６７】
【表１−２９】
0006578205.tif 000030
【００６８】
【表１−３０】
0006578205.tif 000031
【００６９】
【表１−３１】
0006578205.tif 000032
【００７０】
【表１−３２】
0006578205.tif 000033
【００７１】
【表１−３３】
0006578205.tif 000034
【００７２】
【表１−３４】
0006578205.tif 000035
【００７３】
【表１−３５】
0006578205.tif 000036
【００７４】
注目すべきことには、表１に列挙された遺伝子のいくつかはＵＴＲ領域に１より多くの反復インデルを有し（例えば、ＣＡＬＮ１、ＥＩＦ４Ｇ３、ＫＤＭ５Ａ）、これらのゲノム領域がランダムに影響を受けないがポジティブな選択を受けるという可能性を増加させる。
重要なことには、また、エクソン領域のホモポリマーも、ＭＭＲ欠損腫瘍においてインデルの影響をより頻繁に受けている。例えば例４で説明するように、これは配列の長さには基づかず、ポジティブなクローン選択による。したがって通常はより少なく反復的に変異するにも関わらず、これらの変異は、腫瘍進行のドライバーとなる可能性がある。エクソン領域のインデルに最も頻繁に影響される３１の遺伝子のリストを、表２に提供する。
【００７５】
表２．１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についての、エクソンの最も一般的な反復インデル。後ろの２列は、ホモポリマーが、挿入または欠失によってそれぞれどの程度頻繁に影響を受けるかを示す。
【表２−１】
0006578205.tif 000037
【００７６】
【表２−２】
0006578205.tif 000038
【００７７】
【表２−３】
0006578205.tif 000039
【００７８】
【表２−４】
0006578205.tif 000040
【００７９】
実施例のセクションで詳述したように、表１からとったマーカーの５０％より多くが、ＭＭＲ欠損腫瘍のランダムなセットで陽性スコアであり、一方でこれは、表２に列挙されたエクソンマーカーの３分の１以上についても同様である。これにより、ＭＭＲ欠損腫瘍をＭＳＩ陽性として、高い精度と確実性で正しく分類することを可能とする。
したがって、腫瘍のＭＳＩ状態を診断する方法であって、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含み、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域が、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在が、ＭＳＩの指標である、前記方法が提供される。
特に、マイクロサテライト領域は、ホモポリマー領域である。これらは、表１または２に列挙されているホモポリマー領域と、最も特には同一である。
【００８０】
いくつかのマーカーを使用することが特に想定され、その理由は、これがＭＳＩ分類のパワーを増加させ、感受性を高めるからである。特に、表１からのＵＴＲマーカーと表２からのエクソンマーカーの組み合わせが使用される。いくつかのマーカーは、各リストから少なくとも２つであってよいが、マーカーの総数は特に、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０である。
代替的に、表１の代わりに、マーカーを表４から、または表６から、または表８から選択することができる。表２の代わりに、マーカーを表５から、または表７から、または表８から選択することができる。
具体的な態様によれば、使用される少なくとも１つのマーカーは、以前に癌と関連されていなかった遺伝子、または以前にＭＭＲ欠損腫瘍に影響を受けることが知られていなかった遺伝子中における、エクソンマーカーである。したがって、表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択されるマイクロサテライト（単数または複数）は、次のリストから選択される遺伝子に存在する少なくとも１つのマイクロサテライトを含むことが想定される：ＳＥＴＤ１Ｂ、ＲＢＭＸＬ１、ＣＣＤＣ１５０、ＯＲ７Ｅ２４、Ｃ１５ｏｒｆ４０、ＫＩＡＡ２０１８、ＬＴＮ１、ＳＬＣ２２Ａ９、ＣＤＨ２６、ＤＤＸ２７、ＥＸＯＳＣ９、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＫＩＡＡ０１８２、ＫＩＡＡ１９１９、ＭＩＳ１８ＢＰ１、ＰＲＲＴ２、ＴＭＥＭ６０、ＡＱＰ７、ＡＲＶ１、ＣＣＤＣ１６８、ＥＬＡＶＬ３、Ｆ８、ＦＥＴＵＢ、ＨＰＳ１、ＮＢＥＡＬ１、Ｐ４ＨＴＭ、ＰＩＧＢ、ＲＢＭ４３、ＲＧ９ＭＴＤ１、ＳＲＰＲ、およびＴＭＥＭ９７。さらにより具体的な態様によれば、少なくとも１つのマイクロサテライトは、次のリストから選択される遺伝子に存在する：ＳＥＴＤ１Ｂ、ＴＭＥＭ６０、ＤＤＸ２７、ＥＸＯＳＣ９、ＦＡＭ１１１Ｂ、およびＫＩＡＡ１９１９。代替的な態様によれば、ＳＥＣ３１Ａ、ＣＮＯＴ２、ＲＮＦ１４５、ＲＮＰＣ３、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＴＭＢＩＭ４、ＣＤ３Ｇ、ＤＯＣＫ３、ＭＹＯ１０およびＰＲＲＧ１もまたこれらのリストで使用することができる。
【００８１】
代替の具体的な態様によれば、使用される少なくとも１つのマーカーは、５’または３’ＵＴＲ領域に位置する１０〜１５の反復塩基のホモポリマー中のインデルである。かかるホモポリマーの特定の例としては、限定はされないが、次のリストの遺伝子の３’ＵＴＲ領域中のホモポリマーである：ＷＩＰＦ２、ＮＡＲＧ２、ＡＨＣＹＬ１、Ｃ１７ｏｒｆ６３、ＣＤ５Ｌ、ＣＥＰ１７０、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＳＮＫ１Ｇ３、ＤＩＤＯ１、ＥＩＦ４Ｇ３、ＧＳＫ３Ｂ、ＫＣＮＭＢ４、ＭＡＰＫ１ＩＰ１Ｌ、ＮＰＲ３、ＰＩ１５、ＰＲＴＧ、ＲＡＳＧＲＰ１、ＳＨ３ＫＢＰ１、ＳＨＲＯＯＭ３、ＳＬＣ５Ａ３、ＵＢＥ２Ｚ、ＺＢＴＢ３３、ＺＮＦ２７５、ＡＧＰＡＴ３、ＡＰＨ１Ｂ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＣＡＬＮ１、ＣＡＳＫ、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ５、ＣＣＤＣ８５Ｃ、ＣＮＯＴ７、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＲＡＭ２、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＥＭ３、ＥＧＲ１、ＥＩＦ４Ｇ３、ＦＡＭ２０Ｂ、ＦＣＨＳＤ２、ＦＬＴ１、ＦＭＯ２、Ｇ３ＢＰ２、ＨＥＬＺ、ＨＲＮＲ、ＩＥＲ３ＩＰ１、ＫＣＮＧ１、ＫＣＮＫ１、ＫＬＦ３、ＬＨＸ９、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＬＹＲＭ１、ＭＥＤ１３、ＭＹＯ５Ｂ、ＮＣＥＨ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＲＡＢ６Ｃ、ＳＡＭＤ１２、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＬＡＩＮ２、ＳＭＡＤ４、ＴＭＥＤ７、ＴＭＥＭ５７、ＴＭＥＭ６５、ＴＮＰＯ１、ＴＯＲ１ＡＩＰ２、ＴＲＡＫ２、ＴＲＩＰ１１、ＵＳＴ、ＶＥＧＦＡ、ＺＢＴＢ７Ａ、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ１２、およびＺＮＦ１６９。
表１および表２からとった５６マーカーの選択からなるバイオマーカーパネルを設計した（例のセクションを参照）。特定の態様によれば、これらのマーカーは、ＭＳＩ状態を診断するために使用される。これらの５６のマーカーを、表３に列挙する。
【００８２】
表３．５６マーカーのパネル。
【表３−１】
0006578205.tif 000041
【００８３】
【表３−２】
0006578205.tif 000042
【００８４】
使用に特に想定されるこのパネルからのマーカーとしては（これらはインデルの反復的発生に特に感受性であるため）、ＭＹＬ１、ＤＩＤＯ１、ＵＢＥ２Ｚ、ＲＹＲ３、ＴＭＥＭ６５、ＢＴＢＤ７、ＫＤＭ５Ａ、ＡＢＡＴ、ＰＰＭ１Ａ、ＵＢＡ６およびＺＮＦ１８５のリストからの１または２以上を含む。またさらに想定されるのは、特に結腸直腸腫瘍のＭＳＩ状態を評価する場合、ＡＲＬ１０、ＧＲＩＡ２、およびＴＭＣ７である。これらは感受性かつ特異的である（すなわち、偽陽性のＭＳＩケースをほとんど検出しない）。
非常に具体的な態様によれば、５６マーカーパネルには、ＭＳＨ６（エクソンインデル）および／またはＳＵＬＦ２（３’ＵＴＲ欠失）からマイクロサテライトを補充することができる。
代替的な態様によれば、ＭＳＨ６のインデルは評価されず、その理由はこれが既知のＭＭＲ欠損遺伝子だからである。ＭＳＨ３もまたＭＭＲ欠損遺伝子として知られているが、この遺伝子の欠損は、一般的にＭＳＩに関連付けられていない２７。それにもかかわらず、特定の態様によれば、ＭＳＨ３のインデルはマーカーとして使用されない。
実施例のセクションで詳述するように、追加のフィルタリングステップを、独自のゲノムデータベースの生殖細胞系のバリアントとして存在するマーカーを除く、表１のマーカーに適用することができる。これらはｄｂＳＮＰまたは１０００ゲノムのデータベースに存在しないことから、全て希少バリアントであることに留意すべきである。このマーカーのリストを、表４に示す（１６例の腫瘍試料のうち４例における最小の反復）。
【００８５】
表４．追加のフィルタリングステップ後の、１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についての５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル。
【表４−１】
0006578205.tif 000043
【００８６】
【表４−２】
0006578205.tif 000044
【００８７】
【表４−３】
0006578205.tif 000045
【００８８】
【表４−４】
0006578205.tif 000046
【００８９】
【表４−５】
0006578205.tif 000047
【００９０】
【表４−６】
0006578205.tif 000048
【００９１】
【表４−７】
0006578205.tif 000049
【００９２】
【表４−８】
0006578205.tif 000050
【００９３】
【表４−９】
0006578205.tif 000051
【００９４】
【表４−１０】
0006578205.tif 000052
【００９５】
【表４−１１】
0006578205.tif 000053
【００９６】
【表４−１２】
0006578205.tif 000054
【００９７】
【表４−１３】
0006578205.tif 000055
【００９８】
【表４−１４】
0006578205.tif 000056
【００９９】
【表４−１５】
0006578205.tif 000057
【０１００】
【表４−１６】
0006578205.tif 000058
【０１０１】
【表４−１７】
0006578205.tif 000059
【０１０２】
【表４−１８】
0006578205.tif 000060
【０１０３】
【表４−１９】
0006578205.tif 000061
【０１０４】
【表４−２０】
0006578205.tif 000062
【０１０５】
【表４−２１】
0006578205.tif 000063
【０１０６】
【表４−２２】
0006578205.tif 000064
【０１０７】
【表４−２３】
0006578205.tif 000065
【０１０８】
【表４−２４】
0006578205.tif 000066
【０１０９】
【表４−２５】
0006578205.tif 000067
【０１１０】
【表４−２６】
0006578205.tif 000068
【０１１１】
【表４−２７】
0006578205.tif 000069
【０１１２】
【表４−２８】
0006578205.tif 000070
【０１１３】
【表４−２９】
0006578205.tif 000071
【０１１４】
【表４−３０】
0006578205.tif 000072
【０１１５】
【表４−３１】
0006578205.tif 000073
【０１１６】
【表４−３２】
0006578205.tif 000074
【０１１７】
【表４−３３】
0006578205.tif 000075
【０１１８】
【表４−３４】
0006578205.tif 000076
【０１１９】
【表４−３５】
0006578205.tif 000077
【０１２０】
同様の追加のフィルタリングを、表２のマーカーにも適用した；結果を表５に示す。
表５．追加のフィルタリングステップ後の、１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についてのエクソン領域中の最も一般的な反復インデル。
【表５−１】
0006578205.tif 000078
【０１２１】
【表５−２】
0006578205.tif 000079
【０１２２】
【表５−３】
0006578205.tif 000080
【０１２３】
【表５−４】
0006578205.tif 000081
【０１２４】
特定の態様によれば、１より多くの反復インデルがＵＴＲ領域に存在する遺伝子は、マーカーとして特に適している。これらの態様において、遺伝子の少なくとも１つは、以下のリストから選択される：ＡＲＨＧＥＦ１１、ＣＢＬＮ２、ＤＩＯ２、ＭＢＮＬ１（全て５’ＵＴＲマーカー）、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＡＮＫＩＢ１、ＡＴＸＮ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ７Ａ、ＢＯＤ１Ｌ、ＢＴＢＤ７、Ｃ１１ｏｒｆ５８、Ｃ１４ｏｒｆ１０１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＮ１、ＣＡＮＸ、ＣＡＳＫ、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＸ５、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＬＣＮ５、ＣＲＴＣ１、ＣＳＮＫ１Ｅ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＣＵＮ１Ｄ５、ＤＤＨＤ１、ＤＬＧＡＰ２、ＤＳＴＹＫ、ＤＴＮＡ、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ２、ＥＢＦ１、ＥＦＮＡ５、ＥＩＦ４Ｇ３、ＥＬＡＶＬ３、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２ＩＰ、ＥＲＢＢ４、ＥＶＩ５、ＦＡＭ１１６Ａ、ＦＡＭ１２６Ｂ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＦＡＭ４６Ａ、ＦＢＮ２、ＦＢＸＯ２７、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ１ＯＰ２、ＦＯＸＮ２、ＦＯＸＮ３、ＦＯＸＰ１、ＧＡＢＲＢ２、ＧＤＡＰ２、ＧＮＡＩ２、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＡＳ２、ＨＤＡＣ４、ＨＥＬＺ、ＨＩＰＫ２、ＨＮＲＮＰＡ３、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＵＷＥ１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＮＳＲ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＩＡＡ０８２５、ＫＩＡＡ１３２４、ＫＩＦ１Ｂ、ＫＬＨＬ４、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＩＮ７Ｃ、ＬＭＯ４、ＬＰＨＮ３、ＬＹＲＭ７、ＭＡＰ１Ｂ、ＭＡＰＫ１ＩＰ１Ｌ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ２８、ＭＥＳＤＣ１、ＭＥＸ３Ａ、ＭＧＡＴ４Ａ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＬ２、ＮＡＲＧ２、ＮＣＥＨ１、ＮＰＮＴ、ＮＰＲ３、ＮＲ２Ｆ２、ＮＵＦＩＰ２、ＯＰＡ３、ＯＴＵＤ４、ＯＸＲ１、ＰＡＬＭ２、ＰＡＰＤ５、ＰＤＧＦＡ、ＰＩＧＭ、ＰＬＡＧＬ２、ＰＰＰ２Ｒ３Ａ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＲＴＧ、ＲＡＢ１１ＦＩＰ２、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＢＭ１２Ｂ、ＲＢＭＳ３、ＲＣ３Ｈ１、ＲＯＲＡ、ＲＰＲＤ２、ＲＵＮＤＣ３Ｂ、ＳＡＭＤ１２、ＳＡＲ１Ａ、ＳＡＴＢ２、ＳＤＣ４、ＳＥＮＰ１、ＳＥＮＰ５、ＳＨ３ＫＢＰ１、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＩＰＡ１Ｌ３、ＳＬＡＩＮ２、ＳＬＣ７Ａ１１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＯＲＬ１、ＳＯＳＴ、ＳＯＸ４、ＳＰＣＳ３、ＳＲＲＭ４、ＳＴ７Ｌ、ＳＹＮＪ２ＢＰ、ＴＡＣＣ１、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＬＣＤ２、ＴＭＥＭ５７、ＴＭＴＣ３、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＮＲＣ６Ｃ、ＴＲＩＭ６６、ＴＲＰＳ１、ＵＢＮ２、ＵＳＰ４３、ＶＥＺＦ１、ＷＤＲ８２、ＸＫＲ６、ＸＹＬＴ１、ＺＢＴＢ７Ａ、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ７３７、ＺＮＦ７４０（全て３’ＵＴＲマーカー）、ＣＰＬＸ４、ＤＤＸ３Ｘ、ＧＡＢＲＧ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＰ４Ａ２、ＳＡＴＢ１、ＳＥＭＡ６Ａ、およびＳＴＫ１１（５’および３’ＵＴＲにおいて影響される）。 
【０１２５】
しかしながら、１つのホモポリマーのみがＵＴＲ領域で反復的に影響される遺伝子も、例えば、１つのホモポリマー領域のみがＵＴＲに存在するために、または１つのホモポリマーにおいて、別のものにおけるよりもインデルの出現についての明確な選好があるために、マーカーとして同等に良好であり得ることに注意すべきである。後者は、例えばＣＡＣＮＢ４、ＥＩＦ４Ｇ３、ＦＡＭ２０Ｂ、ＬＰＨＮ３またはＰＲＴＧなどの遺伝子のＵＴＲに見られ、ここで１つよりも多くのホモポリマーが反復的に影響を受けており、しかし１つのホモポリマーは、ホモポリマーの長さおよび組成が同等であるにも関わらず、他（単数または複数）よりも頻繁に影響を受けている。
１つよりも多くのインデルにより反復的に影響を受けるエクソン領域を有する遺伝子も、マーカーとして特に想定される。したがって、具体的な態様によれば、ＣＡＳＰ５、ＭＩＡＴ、ＴＲＯＶＥ２およびＴＳＩＸは、エクソンマーカーとして特に想定される；最も特に、ＣＡＳＰ５およびＴＳＩＸが想定される。 
想定されるＵＴＲマーカーの別の特定のリストは、最初の１１例の固体ＭＭＲ欠損腫瘍において同定されたものである。このリストは表６に提供され、共通の反復インデルは、１１試料中の少なくとも３つの試料で生じるものとして定義される。 
【０１２６】
表６．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についての、５’および３’ＵＴＲ領域中の最も一般的な反復インデル。
【表６−１】
0006578205.tif 000082
【０１２７】
【表６−２】
0006578205.tif 000083
【０１２８】
【表６−３】
0006578205.tif 000084
【０１２９】
【表６−４】
0006578205.tif 000085
【０１３０】
【表６−５】
0006578205.tif 000086
【０１３１】
【表６−６】
0006578205.tif 000087
【０１３２】
【表６−７】
0006578205.tif 000088
【０１３３】
【表６−８】
0006578205.tif 000089
【０１３４】
【表６−９】
0006578205.tif 000090
【０１３５】
【表６−１０】
0006578205.tif 000091
【０１３６】
【表６−１１】
0006578205.tif 000092
【０１３７】
【表６−１２】
0006578205.tif 000093
【０１３８】
【表６−１３】
0006578205.tif 000094
【０１３９】
【表６−１４】
0006578205.tif 000095
【０１４０】
【表６−１５】
0006578205.tif 000096
【０１４１】
【表６−１６】
0006578205.tif 000097
【０１４２】
【表６−１７】
0006578205.tif 000098
【０１４３】
【表６−１８】
0006578205.tif 000099
【０１４４】
【表６−１９】
0006578205.tif 000100
【０１４５】
【表６−２０】
0006578205.tif 000101
【０１４６】
【表６−２１】
0006578205.tif 000102
【０１４７】
【表６−２２】
0006578205.tif 000103
【０１４８】
【表６−２３】
0006578205.tif 000104
【０１４９】
【表６−２４】
0006578205.tif 000105
【０１５０】
【表６−２５】
0006578205.tif 000106
【０１５１】
【表６−２６】
0006578205.tif 000107
【０１５２】
【表６−２７】
0006578205.tif 000108
【０１５３】
【表６−２８】
0006578205.tif 000109
【０１５４】
【表６−２９】
0006578205.tif 000110
【０１５５】
【表６−３０】
0006578205.tif 000111
【０１５６】
【表６−３１】
0006578205.tif 000112
【０１５７】
【表６−３２】
0006578205.tif 000113
【０１５８】
【表６−３３】
0006578205.tif 000114
【０１５９】
【表６−３４】
0006578205.tif 000115
【０１６０】
【表６−３５】
0006578205.tif 000116
【０１６１】
【表６−３６】
0006578205.tif 000117
【０１６２】
【表６−３７】
0006578205.tif 000118
【０１６３】
【表６−３８】
0006578205.tif 000119
【０１６４】
【表６−３９】
0006578205.tif 000120
【０１６５】
同様に、想定されるエクソンのマーカーの別の特定のリストは、最初の１１例の固体ＭＭＲ欠損腫瘍において同定されたものである。このリストは表７に提供され、一般的な反復インデルは、１１の試料中少なくとも３つに起こるものとして定義されている。 
表７．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍試料についてのエクソン中の最も一般的な反復インデル。後の３列は、遺伝子が癌センサス遺伝子（cancer census gene）であるかどうか、これが以前にＭＭＲ欠損腫瘍において影響を受けたことが報告されているかどうか、および遺伝子の変異が他の癌と関連することが知られているかどうかを示す。
【表７−１】
0006578205.tif 000121
【０１６６】
【表７−２】
0006578205.tif 000122
【０１６７】
【表７−３】
0006578205.tif 000123
【０１６８】
マーカーを選択可能なさらなる特定の想定リストを、表８に示す。具体的な態様によれば、少なくとも２つのＵＴＲマイクロサテライト領域または少なくとも３つのマイクロサテライト領域（上述のように）は、表８に列挙されたものから選択される領域である。しかし代替的な非常に具体的態様によれば、マーカーは表１および／または２から選択され、表８に列挙されたマーカーは含まない。この場合の例示的なマーカーとしては、限定はされないが、ＬＬＲＣ８Ｄ、ＳＡＭＤ１２、ＳＥＰＴ７、ＣＡＳＫ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＨＥＬＺ、ＫＣＮＫ１、ＬＨＸ９、ＬＹＲＭ１、ＴＭＥＭ２６、ＴＲＩＰ１１、ＺＢＴＢ７Ａ、ＺＫＳＣＡＮ１、ＺＮＦ２１７、ＷＩＰＦ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＺＢＴＢ３３、ＡＧＰＡＴ３、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＣＮＯＴ７、ＥＤＥＭ３、Ｇ３ＢＰ２、ＨＲＮＲ、ＫＬＦ３、ＴＮＰＯ１、ＴＲＡＫ２、ＺＮＦ１６９、ＢＤＮＦ、ＯＩＴ３、ＣＮＯＴ２、ＬＴＮ１、ＭＢＤ４、ＳＬＣ２２Ａ９、ＡＴＲ、ＣＤＨ２６、ＫＩＡＡ２０１８、ＲＮＦ１４５、ＴＧＦＢＲ２、およびＴＭＢＩＭ４が挙げられる。 
表８．ＭＭＲ欠損腫瘍試料についての５’および３’ＵＴＲ領域およびエクソン中の反復インデル。
【表８−１】
0006578205.tif 000124
【０１６９】
【表８−２】
0006578205.tif 000125
【０１７０】
【表８−３】
0006578205.tif 000126
【０１７１】
【表８−４】
0006578205.tif 000127
【０１７２】
【表８−５】
0006578205.tif 000128
【０１７３】
特定の態様によれば、マーカーとして使用されるホモポリマーの長さは、２０ヌクレオチドを超えないか、または１５ヌクレオチドを超えない（例えば、インデルの存在のより効率的な検出を可能にするため）。したがって、特定の態様によれば、マーカーは例えば表１から表８の任意のものから、ただし２０ヌクレオチドより短いか、または１５ヌクレオチドより短いマーカーからのみ、選択される。この短い長さは、従来技術のマーカー（例えばＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６マーカー）と比較して特に有利である。
特に、いくつかの態様において、マーカーとして使用されるホモポリマーの長さは、１５ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、さらには１１ヌクレオチドを超えない。一方、特定の態様によれば、想定されるホモポリマーは、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、またはさらには少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。特定の具体的な態様によれば、少なくとも１つのマーカー（および使用される全てのマーカー）の長さは、７〜１５ヌクレオチドの間、８〜１５ヌクレオチドの間、８〜１４ヌクレオチドの間、８〜１３ヌクレオチドの間、９〜１３ヌクレオチドの間、１０〜１３ヌクレオチドの間、８〜１２ヌクレオチドの間、９〜１２ヌクレオチドの間、８〜１１ヌクレオチドの間、または９〜１１ヌクレオチドの間である。
【０１７４】
重要なことには、上記のマーカーは、癌タイプとは独立してＭＳＩ状態を決定するために使用することができる。したがって、原理的には、ＭＳＩ状態の診断は、全ての種類の癌について、本明細書に提供されるマーカーを用いて行うことができる。しかしＭＳＩは、ミスマッチ修復遺伝子に欠損を有する癌において最も頻繁に存在するため、ＭＭＲ欠損が他の種類よりも頻繁に発生する腫瘍の腫瘍試料中のＭＳＩ状態を診断することが、特に想定される。したがって、癌試料は典型的には、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群スペクトルの腫瘍の癌から選択される試料である。 
ＭＳＩ状態を診断することは典型的には、ＭＳＩの存在を検出したか否かの結論を引き出すことを意味する（これはＭＳＩの不在の検出と等価である）。典型的には、ＭＳＩの存在の検出は、調査中のマイクロサテライト領域内の１または２以上のインデルの検出に基づく。マイクロサテライト領域内にインデルを有する本明細書の表１〜３に示されたマーカー遺伝子の数が多いほど、腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を特徴とする可能性が高い。
【０１７５】
典型的には、ＭＳＩは、ＭＳＩ−Ｈ、ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳとして分類することができる。特定の態様によれば、ＭＳＩ状態を診断するために使用したマイクロサテライト領域の２０％（または２５％）以上がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｈであり、マイクロサテライト領域の２．５％〜２０％（２５％）がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｌであり、マイクロサテライト領域の２．５％未満がインデルを含む場合、腫瘍はマイクロサテライト安定である。代替的態様によれば、ＭＳＩ状態を診断するために使用したマイクロサテライト領域の１７％以上がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｈと分類することができ；２％（または２．５％）〜１７％のマイクロサテライト領域がインデルを含む場合、腫瘍はＭＳＩ−Ｌであり、２％（または２．５％）未満のマイクロサテライト領域がインデルを含む場合、腫瘍はマイクロサテライト安定である。多くのマーカー（例えば、２５またはそれ以上）が使用される場合に、後者の分類が特に好ましい。マーカー数は当業者によって変えることができるため、絶対数よりパーセンテージが使用される。一般的なガイドラインとして、パーセンテージは、よく認識されたベセスダパネルに適用されるパーセントに多かれ少なかれ対応すべきである。例えば、８つのマーカーが使用される場合、マイクロサテライトマーカーのいずれもインデルを含まない場合にのみ、腫瘍はＭＳＳである；２つ以上のマーカーが陽性である場合はＭＳＩ−Ｈであり、１マーカーのみがインデルを含む場合はＭＳＩ−Ｌである。この例から、限定数のマーカーが使用される場合には、１つの陽性マーカーが多かれ少なかれ診断に影響を与え得ることが明らかであるので、複数のマーカーを使用することが特に想定される。これは、腫瘍を確実にＭＳＩ−Ｌと分類するために特に便利である。例えば２〜１７％の分類で、５６マーカーの好ましいマーカーパネルが使用される場合、０または１つのマーカーが陽性であれば腫瘍はＭＳＳであり、２〜９のマーカーが陽性であれば腫瘍はＭＳＩ−Ｌであり、１０以上のマーカーが陽性であれば腫瘍はＭＳＩ−Ｈである。
【０１７６】
公開された研究もまた、ＭＭＲ（−）腫瘍が標準的な処置および新興の標的治療に対して特徴的な応答を有することを示唆している。前臨床研究では、例えば、ＭＭＲ欠損腫瘍が５−フルオロウラシル、抗ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ療法に対して抵抗性を示すことを示唆している２５，２６。この異質性（heterogeneity）の正確な理由は不明であるが、ＭＭＲ欠損の結果としての二次（反復）変異の存在または不在が、処置の成果を決定する可能性がある。例えば、抗ＥＧＦＲ療法の確立された否定応答予測因子として機能するＫＲＡＳにおける反復変異を観察した。興味深いことに、子宮内膜腫瘍におけるほとんどの反復変異は、正常な子宮内膜で発現する遺伝子にも影響を与え、ＭＭＲ（−）ｖｓＭＭＲ（＋）腫瘍において差別的に発現され、これらの変異のポジティブなクローン選択を示唆している。反復変異の同定はまた、ＭＭＲ欠損腫瘍の処置のための、いくつかの新規な治療標的を明らかにする。
したがって、いくつかの特定の態様によれば、本明細書に提示されるように、腫瘍のＭＳＩ状態を診断する方法は、ＭＳＩ状態に基づく（すなわち、腫瘍がＭＳＩ−Ｈ、ＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳと見出されたかどうかに基づく）処置レジメンを選択するステップを、さらに含んでよい。
本方法の全ては、ゲノムのマイクロサテライト領域でのインデルの検出に依存する。インデルを検出するための、核酸試料の解析に頻繁に使用される方法論を簡単に説明するが、しかし、当分野で知られている任意の方法を本発明で用いて、インデルの存在を検出することができる。
【０１７７】
ａ．アレル特異的ハイブリダイゼーション 
一般にアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）と呼ばれるこの技術（例えば、Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991；Saiki et al., Nature 324, 163-166, 1986；EP 235,726；およびWO 89/11548）は、一塩基が異なる２つのＤＮＡ分子間の識別を、バリアントの１つに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、核酸試料の増幅から得られた増幅産物にハイブリダイズすることにより行うことに依存する。この方法は、典型的には、例えば１５〜２０塩基の短いオリゴヌクレオチドを用いる。プローブは、１つのバリアントに他とは差別的にハイブリダイズするように設計されている。かかるプローブを設計するための原則と指針は、当技術分野において、例えば本明細書に引用された参考文献に利用可能である。ハイブリダイゼーション条件は、アレル間のハイブリダイゼーション強度に有意差があるほどに十分ストリンジェントでなければならず、本質的にバイナリ応答を生成し、これによりプローブは、アレルの一方のみにハイブリダイズする。いくつかのプローブは、多型部位が中心位置とアラインメントするような様式で、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計されているが（例えば、１５塩基のオリゴヌクレオチドの７位において；１６塩基のオリゴヌクレオチドの８または９位において）、この設計は必須ではない。
アレルの量および／または存在は、試料にハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドの量を測定することによって決定される。典型的に、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識などの標識で標識される。例えば、アレル特異的オリゴヌクレオチドは、異なるマイクロサテライト長さを有する配列を表す固定化されたオリゴヌクレオチドに適用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の後、蛍光強度を、各マイクロサテライトオリゴヌクレオチドについて測定する。
【０１７８】
プローブと試料中の標的核酸配列との間に形成されたハイブリッドを検出するための適切なアッセイ形式は、当技術分野で知られており、固定化標的（ドットブロット）フォーマットおよび固定化プローブ（逆ドットブロットまたはラインブロット）アッセイ形式を含む。ドットブロットおよび逆ドットブロットアッセイ形式は、米国特許第5,310,893号；第5,451,512号；第5,468,613号；および第5,604,099号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ドットブロット形式においては、増幅された標的ＤＮＡを、例えば、ナイロン膜などの固体支持体上に固定化する。膜−標的複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識プローブとインキュベートし、ハイブリダイズしなかったプローブは、適切なストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去し、膜を、結合したプローブの存在についてモニタリングする。
逆ドットブロット（またはラインブロット）形式においては、プローブを、ナイロン膜またはマイクロタイタープレートなどの固体支持体上に固定化する。標的ＤＮＡは、典型的には、標識プライマーの取り込みによる増幅中に標識される。プライマーの一方または両方を標識することができる。膜−プローブ複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で、標識され増幅された標的ＤＮＡとインキュベートし、ハイブリダイズしなかった標的ＤＮＡは、適切なストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去し、膜を、結合した標的ＤＮＡの存在についてモニタリングする。逆ラインブロット検出アッセイは、実施例に記載されている。
【０１７９】
ｂ．アレル特異的プライマー
インデルはまた、アレル特異的増幅法またはプライマー伸長法を用いて検出することができる。これらの反応は、典型的には、プライマーの３’末端のミスマッチを介して多型を特異的に標的とするように設計されたプライマーの使用を含む。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼがエラー修正活性を欠いている場合に、プライマーを伸長するポリメラーゼの能力に影響を与える。例えば、アレル特異的増幅または伸長に基づく方法を用いてアレル配列を検出するために、マイクロサテライトの正常なアレル（すなわちインデルなし）に相補的なプライマーは、３’末端ヌクレオチドが、正しい数の反復を含む配列とハイブリダイズするように設計される。特定のアレルの存在は、伸長を開始するプライマーの能力によって決定することができる。３’末端がミスマッチの場合は、伸長は妨げられる。
いくつかの態様において、プライマーは、増幅反応において第２のプライマーと共に使用される。第２のプライマーは、マイクロサテライトとは無関係の部位にハイブリダイズする。増幅は、特定の対立形質の存在を表す検出可能な生成物をもたらす、２つのプライマーから進行する。アレル特異的増幅または伸長に基づく方法は、例えば、WO 93/22456；米国特許第5,137,806号；第5,595,890号；第5,639,611号；および第4,851,331号に記載されている。
【０１８０】
アレル特異的増幅に基づく遺伝子型決定を使用し、アレルの同定には、増幅された標的配列の存在または不在の検出のみが必要である。増幅された標的配列の検出のための方法は当分野で周知である。例えば、記載のゲル電気泳動およびプローブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を検出するためによく使用される。 
代替のプローブレス法では、増幅された核酸は、反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの総量の増加をモニターすることにより検出され、これは例えば、米国特許第5,994,056号；および欧州特許公開第487,218号および第512,334号に記載されている。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、二本鎖ＤＮＡに結合した場合の、SYBR GreenなどのさまざまなＤＮＡ結合色素の蛍光の増加に依存する。
当業者が理解するように、アレル特異的増幅法は、特定のアレルを標的化するために、複数のアレル特異的プライマーを使用する反応において実施することができる。かかる多重用途のためのプライマーは、一般的に識別可能な標識で標識されるか、またはアレルから産生される増幅産物がサイズによって識別可能であるように選択される。したがって、単一試料中の両方のアレルが、増幅産物のゲル分析により単一の増幅を用いて同定することができる。
アレル特異的プローブの場合と同様に、アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイズ領域における多型アレルの１つに厳密に相補的であってもよく、または、オリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置でいくつかのミスマッチを有していてもよく、このミスマッチは、両方のアレルの配列中の非多型部位で生じる。
【０１８１】
ｃ．検出可能なプローブ 
ｉ）５’−ヌクレアーゼアッセイプローブ
遺伝子型決定はまた、「TaqMan（登録商標）」または「５’−ヌクレアーゼアッセイ」を用い、米国特許第5,210,015号；第5,487,972号；および第5,804,375号；およびHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載のようにして行うことができる。TaqMan（登録商標）アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識された検出プローブが、増幅反応中に添加される。プローブは修飾されて、プローブがＤＮＡ合成のプライマーとして作用するのを防止するようにされる。増幅は、５’−から３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。増幅の各合成ステップの間、伸長されたプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’−から３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。したがって、新しい標的鎖の合成はまた、プローブの分解をもたらし、分解産物の蓄積は標的配列の合成の測度を提供する。
【０１８２】
ハイブリダイゼーションプローブは、インデル有りまたは無しのアレルを識別する、アレル特異的プローブであることができる。代替的に、本方法は、アレル特異的プライマーおよび増幅産物に結合する標識プローブを用いて行うことができる。
分解産物の検出に適した任意の方法を、５’−ヌクレアーゼアッセイで使用することができる。多くの場合、検出プローブは２つの蛍光色素で標識され、そのうちの１つは、他の色素の蛍光を消光することができるものである。色素はプローブに付着され、通常、１つは５’末端に、他方は内部部位に付着し、プローブがハイブリダイズしていない状態にあるときに消光が起こるように、およびＤＮＡポリメラーゼの５’−から３’−エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの色素の間で起きるようにする。増幅により、色素の間でプローブの切断が起き、同時に消光の消失および、最初に消光された染料からの観察可能な蛍光の増加がもたらされる。分解産物の蓄積は、反応蛍光の増加を測定することによってモニターされる。米国特許第5,491,063号および第5,571,673号には、増幅と同時に起こるプローブの分解を検出するための代替方法が記載され、これらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
ｉｉ）二次構造プローブ
二次構造変化の際に検出可能なプローブも、インデルを含む多型の検出に適している。例示の二次構造またはステムループ構造のプローブとしては、分子ビーコンまたはScorpion（登録商標）プライマー／プローブを含む。分子ビーコンプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーがオリゴヌクレオチドの反対側に通常配置された、ヘアピン構造を形成できる一本鎖オリゴ核酸プローブである。プローブの両端において、短い相補的な配列が分子内ステムの形成を可能にし、これがフルオロフォアとクエンチャーが近接することを可能にする。分子ビーコンのループ部分は、目的の標的核酸に対して相補的である。このプローブの目的の標的核酸への結合は、ステムを強制的に遠ざけるハイブリッドを形成する。これは、フルオロフォアとクエンチャーを互いに離すよう移動させるコンフォメーション変化を引き起こして、より強い蛍光シグナルをもたらす。分子ビーコンプローブはしかし、プローブ標的における小さな配列変化に高度に感受性である（Tyagi S. and Kramer F. R., Nature Biotechnology, Vol. 14, pages 303-308 (1996)；Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 49-53(1998)；Piatek et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 359-363 (1998)；Marras S. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 14, pages 151-156 (1999)；Tpp I. et al, BioTechniques, Vol 28, pages 732-738 (2000)）。Scorpion（登録商標）プライマー／プローブは、プライマーに共有結合で連結されたステムループ構造プローブを含む。
【０１８４】
ｄ．ＤＮＡ配列決定および単一塩基伸長法
インデルはまた、直接的な配列決定によって検出することができる。方法としては、例えば、含まれるジデオキシ配列決定に基づく方法や、マクサム・ギルバート配列決定などの他の方法が挙げられる（例えば、上記Sambrook et al.を参照）。
他の検出方法としては、オリゴヌクレオチド長の産物のパイロシーケンシング（Pyrosequencing）（商標）を含む。かかる方法は多くの場合、ＰＣＲなどの増幅技術を用いる。例えば、パイロシーケンシングでは、配列決定プライマーを一本鎖ＰＣＲ増幅のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせ；酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ、および基質、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）およびルシフェリンとともにインキュベートする。４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の最初の１つを反応に添加する。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチド三リン酸のＤＮＡ鎖への取り込みを、もしこれが鋳型鎖中の塩基に相補的である場合に、触媒する。各取り込みイベントには、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量のピロリン酸（ＰＰｉ）の放出が伴う。ＡＴＰスルフリラーゼは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生じさせるオキシルシフェリンへの、ルシフェリンのルシフェラーゼ媒介性の変換を駆動する。ルシフェラーゼ触媒反応において生成される光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、パイログラム（Pyogram）（商標）におけるピークとして観察される。各光シグナルは、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。ヌクレオチド分解酵素であるアピラーゼは、取り込まれなかったｄＮＴＰおよび過剰ＡＴＰを継続的に分解する。分解が完了すると、別のｄＮＴＰが添加される。
インデルを特徴づけるための別の類似の方法は、完全なＰＣＲの使用を必要としないが、一般には、調査されるヌクレオチドに相補的な、単一の蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ｄｄＮＴＰ）によるプライマーの伸長のみを使用する。多型部位のヌクレオチドは、１つの塩基によって伸長され蛍光標識されたプライマーの検出によって、同定することができる（例えば、Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995）。
【０１８５】
ｅ．電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅産物は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動を用いて分析することができる。異なるアレルは、溶液中のＤＮＡの異なる配列依存性融解特性および電気泳動に基づいて特定することができる（例えばErlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7を参照）。
マイクロサテライト多型の識別は、キャピラリー電気泳動を用いて行うことができる。キャピラリー電気泳動は、特定のマイクロサテライトアレルの反復数を、便利に同定することができる。キャピラリー電気泳動の、ＤＮＡ多型解析への適用は、当業者に知られている（例えば、Szantai, et al, J Chromatogr A. (2005) 1079(1-2):41-9; Bjorheim and Ekstrom, Electrophoresis (2005) 26(13):2520-30およびMitchelson, Mol Biotechnol. (2003) 24(1):41-68を参照）。
【０１８６】
ｆ．一本鎖高次構造多型解析
標的配列のアレルは一本鎖高次構造多型解析を用いて識別することができ、これは、例えばOrita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に記載のように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化によって塩基の相違を識別する。増幅ＰＣＲ産物は上述のように生成することができ、加熱または他の方法で変性されて、一本鎖増幅産物を形成する。一本鎖核酸は、リフォールディングまたは塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成することができる。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的遺伝子のアレル間の塩基配列の相違に関連付けることができる。
【０１８７】
ｇ．融解曲線分析
融解曲線分析は、加熱時の二本鎖ＤＮＡの解離特性の評価である。温度が上昇すると二本鎖は解離し始め、吸光度の強度の上昇、濃色性につながる。ＤＮＡの５０％が変性される温度は、融点として知られている（物理学で使用される用語の融点と混同しないこと）。ＤＮＡの二本鎖の間の塩基−塩基水素結合を破壊するのに必要なエネルギーは、それらの長さ、ＧＣ含量およびそれらの相補性に依存する。Ｇ−Ｃ塩基対が、それらの間に３つの水素結合を有し、一方Ａ−Ｔ塩基対は２つのみの水素結合を有するという事実により、より高いＧＣ含量を有するＤＮＡは、ＡＴ含量が高いＤＮＡよりも高い融解温度を有するであろう。二本鎖ＤＮＡ配列を含有する反応混合物を加熱し、温度に対する解離を測定することによって、一塩基多型（ＳＮＰ）の存在および同一性を決定することができる。
もともと、鎖解離はＵＶ吸光度測定を用いて観察されたが、蛍光測定に基づく技術は、現在最も一般的なアプローチである。２つのＤＮＡ鎖の間の温度依存性解離は、SYBR Green、EvaGreenまたはフルオロフォア標識ＤＮＡプローブなどのＤＮＡにインターカレートするフルオロフォアを用いて測定することができる。
【０１８８】
バリアント技術は、高解像度融解（ＨＲＭ）分析である。多くの色素と高解像度の機器が、融解曲線分析またはＨＲＭの実施用に市販されており、ほとんどのｑＰＣＲ器械が含まれる。
インデル検出方法は、多くの場合、標識されたオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な標識を組み込むことによって標識することができる。有用な標識には以下を含む：蛍光色素、放射性標識、例えば３２Ｐ、電子密度試薬、酵素、例えばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質。標識技術は当技術分野で知られている（例えば上記Sambrook et al.参照）。
本明細書で提供されるマイクロサテライトインデルマーカーは、これらの技術のいずれかを、または他を用いて検出することができ、マーカーパネルは、使用する技術とは無関係である。しかしながら、インデルの存在の決定は、サンガー配列決定に基づく方法を介して行われないことが想定される。これはベセスダマーカーパネルを使用してマイクロサテライト不安定性を検出するプロセスが、通常、非常に面倒であると証明されたプロトコルであるサンガー配列決定を介して行われるためである。さらなる態様によれば、インデルの存在を、単一塩基対伸長法（例えば、Sequenom MassARRAYなど）、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術（例えばTaqman）、融解曲線分析、または同様の技術によって決定することが、特に想定されている。
【０１８９】
別の態様によれば、本明細書に記載されるバイオマーカーパネルは、医薬として使用するために提供される。特に、本明細書に記載されるバイオマーカーパネルは、診断薬としての使用のために提供される。このバイオマーカーパネルは、癌におけるＭＳＩ状態を検出するために、または腫瘍試料中のＭＳＩを決定するために使用できることが、特に想定される。したがって、このバイオマーカーパネルの使用は、癌におけるマイクロサテライト不安定性（またはＭＳＩ状態）の診断において、提供される。
より少ないマーカーの使用も明示的に想定されるが、腫瘍試料中のＭＳＩの決定に特に適したバイオマーカーパネルは、少なくとも８つのマーカー（マイクロサテライト領域）を含むバイオマーカーパネルである。かかるバイオマーカーパネルは、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含む。少なくとも８つのマーカーは、少なくとも１０のマーカー、少なくとも１２のマーカー、少なくとも１６のマーカー、少なくとも２０のマーカー、少なくとも２５のマーカー、またはそれ以上であってよい。非常に特定の態様によれば、バイオマーカーパネルは、表３に列挙されたマイクロサテライト領域の少なくとも半分を含む。よりさらなる特定の態様によれば、バイオマーカーパネルは、表３に列挙された５６マイクロサテライト領域によって表される。
【０１９０】
特定の態様によれば、マーカーは、最も反復性のものから、すなわちＭＭＲ欠損腫瘍の少なくとも３分の１または少なくとも半分において生じるマーカーから選択される。したがってマーカーは、１６例の腫瘍のうち少なくとも５回（例えば表１および表２、または表４および表５）、１６例のうち６回、１６例のうち７回、または１６例のうち少なくとも８回生じるマーカーから選択される。または、これは１１例の腫瘍のうち少なくとも４回（例えば表６および表７）、１１例のうち少なくとも５回、１１例のうち少なくとも６回生じるマーカーから選択される。
さらに他の態様によれば、腫瘍試料中のＭＳＩを決定するための、バイオマーカーパネル（表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域）の遺伝子型を決定するためのツールを含むキットが提供される。最も具体的には、キットは、特に想定されるバイオマーカーパネル（単数または複数）に適合させることができる。具体的な態様によれば、キットはまた、マーカーのベセスダパネル、またはマーカーの拡張ベセスダパネルの遺伝子型を決定するためのツールを含むことができる。かかるキットは、マーカーとベセスダパネルの対照比較を行うのに特に適している。キットは、マーカーのベセスダパネルのサブセットのみ（例えば、全１０の代わりに１〜５のマーカー）をとることも、想定される。かかるケースにおいて、ＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６マーカーは、これらが一般的に最も信頼できるとみなされるので、明示的に含まれることが想定される。言うまでもなくこのことは、本明細書に記載のＭＳＩを診断する方法はさらに、拡張ベセスダマーカーパネルの１または２以上のマーカーの状態を決定するステップを含んでよいことを意味する（本明細書に記載のマーカーの使用に加えて）。
【０１９１】
実施例のセクション（特に例８および９）に示すように、本明細書に提供されるインデルマーカーは、ＤＮＡ二本鎖切断修復経路に関与する遺伝子において濃縮されており、それらの機能に影響を与える。結果として、これらのマーカーが存在する細胞は、ＤＮＡ塩基除去修復の阻害による合成致死性に感受性である。ＭＳＩ陽性腫瘍は、使用される標準的な化学療法にしばしば抵抗性であるので、これは新たな治療機会を提供する。
したがって、さらなる側面において、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する癌細胞の感受性をスクリーニングするための、癌細胞におけるＭＳＩ状態を決定することを含む、方法が提供される。特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、以下のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍、から選択される癌からの癌細胞である。さらなる具体的な態様によれば、癌細胞は、標準療法に抵抗性の癌からのものである。かかる標準療法は、以下から選択されることが特に想定される：５−ＦＵ（５−フルオロウラシル、Efudex）、カルボプラチン、シスプラチン、または標的療法（特にＥＧＦＲ（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ）に対する、またはＢｒａｆに対する標的療法）。これらの方法は、原理的にin vivoで、ex vivoでおよびin vitroで行うことができるが、特に、それらがin vitroで実施されることが想定される。
【０１９２】
特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する癌細胞の感受性の指標である；すなわち、かかる阻害剤で処置すると、癌細胞は死滅し、成長を停止し、または増殖が減少する。
特定の態様によれば、癌細胞は対象から得た細胞であり、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性のスクリーニングは、対象の処置をガイドするのに使用される。代替的な態様によれば、感受性のスクリーニングは、対象を臨床試験のために階層化または分類するのに使用される。
特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載の方法によって、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法によって証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
【０１９３】
さらに特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。さらに具体的な態様によれば、バイオマーカーパネルは、表３に列挙されたものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含む。
非常に具体的な態様によれば、方法はまた、相同組換え経路に関与する遺伝子の配列決定のステップを含んでいてもよい。
したがって、癌細胞の感受性をスクリーニングする方法を提供するだけでなく、癌を有する対象の、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性を診断する方法であって、以下のステップ：
−  対象から得た癌細胞の試料中のＭＳＩ状態を決定すること；
−  ＭＳＩ状態を、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性と相関させること、ここで、ＭＳＩの存在は、処置に対する感受性の指標である、
を含む方法が提供される。
【０１９４】
任意に、これらの方法は、対象から癌細胞の試料を取得する追加のステップを含む（決定ステップの前に）。次にＭＳＩ状態の決定を、一般には得られた試料の細胞内で実施する。癌細胞の試料中のＭＳＩ状態の決定はin vitroで実施されることが、特に想定される。
特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、以下のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群（またはリンチ症候群スペクトルの任意の他の腫瘍）の腫瘍、から選択される癌からのものである。特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載の方法によって、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法によって証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
【０１９５】
さらに特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。
また、この側面による方法は、対象をＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤で処置するさらなるステップを含んでもよいことが想定される（ＭＳＩ状態によって決定されるように、対象がかかる処置に対して感受性である場合）。
したがって、必要とする対象において、ＭＳＩ（または同等に、ＭＭＲ欠損）を有する癌を処置する方法が提供され、該方法は、
−  癌におけるＭＳＩの存在を証明すること； 
−  対象に対する、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤の投与、
を含む。
【０１９６】
癌を有する対象の、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤による処置に対する感受性を診断すること、またはＭＳＩの癌を有する対象を処置すること、に関連する方法について、この癌が、少なくとも１つの標準療法に抵抗性であること、特に５−ＦＵ（５−フルオロウラシル、Efudex）、カルボプラチン、シスプラチン、または標的療法（特にＥＧＦＲ（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ）に対する、またはＢｒａｆに対する標的療法）、から選択される標準療法に抵抗性であることが、特に想定される。
癌は、対象に阻害剤を投与することによって処置されることが想定される。前記方法は任意に、対象から癌細胞の試料を得る追加のステップを有してもよい（ＭＳＩを決定し、ＭＳＩの存在を証明するステップの前に）。
特定の態様によれば、ＤＮＡ塩基除去修復酵素の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。具体的な態様によれば、癌細胞は、以下のリスト：結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、白血病、およびリンチ症候群の腫瘍、から選択される癌からのものである。特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載の方法によって、すなわち、腫瘍ＤＮＡの試料中の少なくとも２つのマイクロサテライト領域中のインデルの存在を決定することを含む方法によって証明され、ここで少なくとも２つのマイクロサテライト領域は、
−  表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在する、少なくとも２つのマイクロサテライト領域、または
−  表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するもの、および／または表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するものから選択される少なくとも３つのマイクロサテライト領域であり、
ここで少なくとも１つのインデルの存在は、ＭＳＩの指標である。
【０１９７】
さらに特定の態様によれば、ＭＳＩの存在は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域に存在するもの、および表２に列挙された遺伝子のエクソンに存在するものから選択される、少なくとも８つのマイクロサテライト領域を含むバイオマーカーパネルを使用して証明される。
特定の態様、具体的な構成、ならびに材料および／または分子について、本発明による細胞および方法に対して本明細書で説明してきたが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、形態および詳細におけるさまざまな変更または修正がなされ得ることが理解されるべきである。以下の実施例は、特定の態様をより良好に例示するために提供されており、これらは本出願を限定するものと考えるべきではない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１９８】
実施例
例１．ＭＭＲ欠損を有する子宮内膜腫瘍の全ゲノム配列決定
全ゲノム配列決定用のＭＭＲ欠損腫瘍を選択するために、ＭＭＲタンパク質（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６）の免疫組織化学、拡張ベセスダパネルを用いたマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の評価（Pinol et al., 2005）、およびＭＬＨ１プロモーターのメチル化プロファイリングを含む、標準的な診断テストを使用した。免疫組織化学およびＭＬＨ１プロモーターの高メチル化の結果を、表９の上の３行に示す。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）状態の解析を、モノまたはジヌクレオチド反復配列（それぞれ２および８のマーカー）を含む１０の異なる遺伝子座で、ＭＳＩの評価について国際的なガイドラインにより推奨されたパネル、すなわち改訂ベセスダパネル（Boland et al., 1998; Dietmaier et al., 1997）を使用して行った。ＰＣＲ増幅は、２つのペンタプレックス（pentaplexes）で行った：マルチプレックスＡ（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、Ｄ２Ｓ１２３）およびマルチプレックスＢ（ＢＡＴ４０、Ｄ１７Ｓ７８７、Ｄ１８Ｓ５８、Ｄ１８Ｓ６９、ＴＧＦβ−ＲＩＩ）。フォワードプライマーは、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣまたはＴＥＴで標識した。腫瘍および同じ患者の正常ＤＮＡからのアンプリコンは、ABI 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上で解析した。腫瘍１は、８つの成功したマーカーのうち７つについて強く陽性であり、一方、他の２つの腫瘍は陰性であった。これは腫瘍１がＭＭＲ欠損であることを確認する。結果を、表１０にまとめる。腫瘍試料についてのさらなる情報は、表１１に含まれている。 
陽性のＭＳＩ状態およびＭＳＨ６発現の不在を示す１例のＭＭＲ欠損ＥＭ腫瘍、および２例のＭＭＲ熟達ＥＭ腫瘍を選択した。Complete Genomics（登録商標）（ＣＧ）技術を用いて、腫瘍および対応する正常試料の高カバレッジの配列決定データを得（平均でそれぞれ９５．２ｘおよび７７．１ｘ）、これを次に、以前に開発された、アノテーションおよびフィルタリングパイプラインを用いて解析した（Reumers et al., 2011）。ＭＭＲ欠損腫瘍は、確認されたCGAtools（商標）calldiff法（http://cgatools.sourceforge.net）を用いて、他の腫瘍より有意に多くの新規な体細胞突然変異を含む（表１２、calldiffを使った体細胞変異）、明確なハイパーミューテーターの表現型を示した。このアルゴリズムは、腫瘍−正常ペアなどの、同じ個体に由来する２つのゲノムの間の差を見つけるように設計されている。
【０１９９】
次に我々は、ランダムに選択された変異の独立した検証に基づく品質スコア閾値を適用し、変異コール（mutation calling）の推定９４．６％の全体的な精度を得た。これにより、ＭＭＲ欠損腫瘍の突然変異荷重が、２０．３倍高いことが確認された（図１ａおよび表１２）。ハイパーミューテーター試料中の体細胞バリアントの詳細な検査は、ＭＳＨ６のエクソン５における体細胞フレームシフト挿入を明らかにし（Ｆ１０８８ｆｓ；Note S2）、これはＭＳＨ６発現の不在と一致した。ＰＯＬＥなどの、ＤＮＡポリメラーゼにおける突然変異は認められなかった。実際には、３４の既知のＤＮＡポリメラーゼのうち、ＲＥＶ３Ｌのみが、ハイパーミューテーター内で体細胞変異していた。しかし、ＲＥＶ３Ｌは損傷乗り換え（translesion）ＤＮＡ合成に関与しているので、ＲＥＶ３Ｌにおける変異が我々のハイパーミューテーターの表現型を引き起こす可能性は低い。さらに、コピー数の解析をＡＳＣＡＴアルゴリズムを用いて行った（Van Loo et al., 2010）。ＡＳＣＡＴは、腫瘍試料においてコピー数の異常を検出するように特に設計されている。これは、全体的な腫瘍倍数性および試料中の有効な腫瘍画分について推定し調整することにより、固形腫瘍におけるアレル特異的コピー数を正確に決定する。ＭＭＲ熟達腫瘍とは異なり、ハイパーミューテーターは、染色体安定腫瘍である（データ示されず）。
【０２００】
表９．ＭＭＲ欠損を評価する標準診断テスト 
全ての腫瘍は、Complete Genomics（CG）全ゲノム配列決定技術またはTruseqのエクソーム濃縮のいずれかを、イルミナシーケンステクノロジーと組み合わせて使用して、配列決定した。各腫瘍について、拡張ベセスダパネルを用いたマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、ＭＭＲタンパク質（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６）の標準免疫組織化学、およびＭＬＨ１プロモーターのメチル化状態が示されている。アスタリスク（＊）は、腫瘍細胞の少数における、弱い陽性の核染色の存在を示す。
【表９】
0006578205.tif 000129
【０２０１】
表１０．３例の子宮内膜腫瘍についての拡張ベセスダパネルのデータ
【表１０】
0006578205.tif 000130
【０２０２】
表１１．腫瘍試料および臨床情報。表には、選択した３例の腫瘍試料の詳細情報が示されている。全ての腫瘍は、遺伝性の癌の家族歴のない患者からの原発性化学療法未処置の腫瘍であった。
【表１１】
0006578205.tif 000131
【０２０３】
表１２．腫瘍−正常ペアに適用したcalldiff法の結果（ＭＭＲ−１、ＭＭＲ＋１、およびＭＭＲ＋２）
【表１２】
0006578205.tif 000132
【０２０４】
例２．ＭＳＨ６欠損ハイパーミューテーターにおける体細胞変異パターン
モデル生物および細胞株での研究は、ＭＭＲの欠損に起因する体細胞変異には、マイクロサテライト配列（６塩基の最小長さおよび少なくとも２つの反復単位のジ〜ヘキサヌクレオチド反復）およびホモポリマー（６塩基の最少長さのモノヌクレオチド反復）に影響を与える挿入／欠失（インデル）が主に関与することを明らかにした（Ellegren, 2004）。この仮説を試験するために、以下の定義を用いて、ゲノムを４つの異なるクラスに階層化した。
−  マイクロサテライト領域：少なくとも２つの反復単位で構成され、６塩基の最小長さのジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、またはヘキサヌクレオチド反復。
−  ホモポリマー領域：６塩基の最小長さのモノヌクレオチド反復。
−  短いホモポリマー領域：３、４または５塩基の長さのモノヌクレオチド反復。
−  非反復領域：ゲノムの残りの部分、すなわち、単純な反復配列の一部ではない全ての塩基。
これらの定義に従うゲノム領域を、配列ファイル（ＦＡＳＴＡ形式）をスキャンすることにより、「grepseq」ツール（http://code.google.com/p/grepseq/）を使用して決定した。全ゲノムレベルでは、全体の反復の組成は以下であった：マイクロサテライト（７．９％）、ホモポリマー（１．９％）、短いホモポリマー（１９．８％）、および非反復領域（７０．４％）。
【０２０５】
我々のハイパーミューテーターにおいて、体細胞変異は、全ゲノムでの発生に基づき、予想されるより頻繁にホモポリマーに位置していることを観察した（データ示されず）。我々は、体細胞変異は、それらの全ゲノムでの発生（１．９％）と比較して、ホモポリマー（４７．７％）でより頻繁に蓄積することを観察した。体細胞変異の３５．５％、１０．７％および６．２％は、それぞれ、非反復領域、短いホモポリマーおよびマイクロサテライトに位置していた。これらの領域の全ゲノムにおける発生と比較すると（すなわち、非反復、短いホモポリマーおよびマイクロサテライトについてそれぞれ、７０．４％、１９．８％および７．９％）、体細胞変異はこれらの領域で、予想よりも少なく影響を受けていた。
さらに我々は、インデルが実際に、単一の塩基対置換よりも頻繁だったが（５７．４％のインデルに対して４２．６％の置換、図１ｂ）、主にホモポリマーに影響し（８１．３％）、マイクロサテライトには影響しない（図１ｃ）ことを観察した。置換は、ホモポリマーまたはマイクロサテライトには選択的に影響しなかった（図１ｄ）。変異は、イントロンにおいて、ゲノムの他の部分と同様に頻繁に発生したが、エクソンでは明らかに少なかった（５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を除く）。インデルでは、この減少は、置換の場合よりも顕著であった（７４．７％対１４．３％；図１ｅ、ｆ）。エクソン、遺伝子間およびイントロン領域におけるホモポリマーの数またはホモポリマーの長さの補正により、この減少が、より少ないまたはより短いホモポリマーに帰することができなかったことを確認した。ほとんどのエクソンインデルは、ヘテロ接合性フレームシフト変異をもたらし（１６０のフレームシフトインデル対３つの非フレームシフトインデル）、それらがネガティブなクローン選択を受ける機能喪失型突然変異であることを示唆した。
【０２０６】
ＭＳＨ６欠損ハイパーミューテーターにおける体細胞置換
ＵＶ光誘発性黒色腫における体細胞置換を評価する研究（Pleasance et al., 2010a）、およびタバコの煙によって誘発される肺腺癌を評価する研究（Pleasance et al., 2010b）はそれぞれ、Ｇ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位およびＧ：Ｃ＞Ｔ：Ａ転換がこれらの腫瘍において頻繁に発生することを明らかにした。我々のハイパーミューテーターにおける体細胞置換を評価する場合、明らかに異なるパターン、すなわち、ＭＭＲ熟達腫瘍における５０．１％と比較して、全ての置換の７１．５％がＡ：Ｔ＞Ｇ：ＣおよびＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位であるパターンが観察された（図２ａ）。注目すべきことに、ハイパーミューテーターにおいて、Ｇ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位はＣＧジヌクレオチドの文脈において最も頻繁に発生し（ここでＣは置換を受けており、Ｇは、次のヌクレオチドを表す）、一方Ａ：Ｔ＞Ｇ：Ｃ転位はジヌクレオチドの文脈からは独立して発生し、ＭＭＲ熟達腫瘍におけるよりも頻繁であった（図２ｂ−ｃ）。
【０２０７】
次に、ハイパーミューテーターの変異パターンにベストフィットを提供する特徴を特定するために、線形回帰を使用して、種々のタイプの置換を、以前にヒト集団において遺伝的多様性の説明に関与するとされた９つゲノム特徴と相関させた（Hodgkinson and Eyre-Walker, 2011）（図２ｄ；９つの特徴とは、テロメアまでの距離、複製時間、単純反復、ＧＣ組成、ＣｐＧ含量、ＣｐＧアイランド、遺伝子含量、ＤＮアーゼ過感受性、および核ラミナの結合部位である）。遺伝子含量、ＤＮアーゼ過感受性またはラミナ関連ドメインとの相関は観察できなかったが（示されず）、テロメアまでの距離、複製時間、単純反復含量、ＧＣ組成（ＧＣ％）、ＣｐＧ頻度およびＣｐＧアイランドの割合は、重要で独立した予測因子を表した。全体的に、転位に対して、転換よりも良い予測モデルが観察され（それぞれＲ2＝０．２２対０．０７、図２ｄ）、一方個々のレベルでは、次の関連相関が認められた。第１に、複製時間と転位の間に正の相関が見出されたが、転換との間には相関はなく（図２ｅ）、後期Ｓ相におけるＤＮＡ複製の忠実度の低減は、転位突然変異を増加させるが、転換は増加させないことを示し、これは、前に観察された後期Ｓ相転換における増加（Koren et al., 2012）が、この時のＭＭＲ活性の低下に起因することを示唆するものであり、なぜならば、ＭＭＲ機構の欠如は、現在と以前に検討されたデータセットとの間の主要な違いを構成するからである。第２に、単純な反復について、ホモポリマーに直接隣接する塩基における置換の４２％の増加が観察された。これは転位および転換の両方に当てはまり、おそらく反復ＤＮＡ配列内で失速する（stalling）ＤＮＡポリメラーゼが、エラーにつながる複製をもたらすことに関連する（Hodgkinson and Eyre-Walker, 2011）。第３に、ＧＣ％は、転位および転換頻度と逆相関していた。これは多数の生物において以前に記載されており、この相関関係を説明するための支配的なモデルはまだないが、本発明者らのデータは、差分のＭＭＲ活性はこの効果に寄与しないことを示している。第４に、ＣｐＧ部位におけるＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位はＣｐＧ含有量に強く依存するが、ＣｐＧアイランドの割合と逆相関している（図２ｄ）。ゲノム中でほとんどのＣｐＧは、ＣｐＧアイランドのものを除いてメチル化されているので、これは、脱アミノ駆動型の変異と同様のシトシンメチル化とのリンクを示し、これによりＣＧ＞ＴＧ転位が、シトシン脱アミノ化の自発的な複製に依存しないプロセスを介して発生する。ＭＭＲは複製に関連すると、標準的に（canonically）考えられているため、ＭＭＲ熟達腫瘍と比較した、ＭＭＲ欠損腫瘍で観察されたＣＧ＞ＴＧ転位のはるかに大きな増加（３０４２対４５２の突然変異）は、分子レベルにおいて最近記載された（Hombauer et al., 2011; Liu et al., 2008; Pena-Diaz et al., 2012）複製に依存しない非標準的ＭＭＲが、ゲノムの完全性のために重要であることを実証する。最後に、ＣｐＧアイランドの頻度は、全体の変異頻度に逆相関していた。実際、ＣｐＧアイランドの外側の塩基は、ＣｐＧアイランドの中にあるものよりもほぼ２倍も変異を受ける可能性が高かった（図２ｆ）。エクソン置換は同程度には減少されないので、ネガティブ選択がこの減少を説明する可能性は低い。ＤＮＡメチル化は、それが誘導できるポリメラーゼの失速を通じて別の説明を提供するが（Song et al., 2012）、ただし他の可能性は、エラーが発生しやすいポリメラーゼによって触媒され得る、脱アミノ化の修復を介して行われるものである。
【０２０８】
全体として、一般集団における変異頻度と相関するほとんどのゲノム特徴は、ＭＭＲ欠損腫瘍における体細胞の置換とも相関し、ヒトの遺伝的多様性のかなりの部分は、ＭＭＲを逃れたミスマッチによって生じることを示唆する。この考えを支持して、我々は、１０００ゲノムプロジェクトおよびマウスのｄｂＳＮＰデータベースにおいて、ハイパーミューテーターの体細胞ＤＮＡおよび生殖細胞系ＤＮＡ中に、非常によく似た突然変異頻度を観察した（転位を示した全置換の、それぞれ７１．５％、６８．３％、６６．９％、および６７．１％）。特に、ハイパーミューテーター染色体ユニット（１００ｋｂ）当たりの体細胞置換頻度は、同じユニットの、対応する生殖細胞系（Ｒ2＝０．９０）および１０００ゲノムプロジェクトのＳＮＰ（Ｒ2＝０．９０）の数と強く相関したが、肺腺癌または黒色腫のゲノムにおける体細胞置換頻度とは相関しなかった（Ｒ2＝０．５３および０．３７）。
【０２０９】
ＭＳＨ６欠損ハイパーミューテーターの体細胞インデル
次に、ハイパーミューテーターにおける体細胞インデルパターンを評価した。予想されるように、インデルの大部分はホモポリマーに位置していたので、単純な反復とインデル頻度との間に強い相関が観察された（図２ｇ）。ほとんど全てのインデルは、ＡまたはＴホモポリマーに影響を与えたが（９４．０％；図２ｈ）、ホモポリマーの９２．２％はＡまたはＴの塩基から構成されているため、ＣまたはＧホモポリマーは等しくインデルを蓄積しやすいようである。さらに、９６．４％までのインデルは、１または２ｂｐのフレームシフトから構成されていたため（図２ｉ）、ＭＳＨ６が１または２ｂｐのインデルの修復に主に関与していることが確認された。欠失は、挿入よりもわずかに頻度が少なかった（４７．７％対５２．３％；Ｐ＜１０Ｅ−６）。全ての体細胞置換について最も近い体細胞インデルまでの距離を計算すると、置換およびインデルのランダムな分布に基づく予想よりもそれぞれ３．８および３．４倍高い頻度で、＜５または＜１０ｂｐの距離内に位置していた（図２ｊ）。同様に、kataegis（体細胞ストーム）の証拠はなかったが（Nik-Zainal et al., 2012）、体細胞置換は、ランダムモデリングによる予測よりも７．６倍頻繁にクラスター化された（図２ｋ）。置換の同じクラスタリングは、全体的により低い頻度ではあるがＭＭＲ熟達腫瘍でも観察され（示されず）、これらのクラスターの発生がＭＭＲによって抑制されることを示唆した。注目すべきことに、これらの観察は、置換の数が他の置換およびインデルの近くで上昇している真核生物ゲノムと類似である（McDonald et al., 2011; Tian et al., 2008）。
【０２１０】
例３．ミスマッチ修復欠損／熟達腫瘍およびその対応する正常試料におけるエクソーム配列決定
我々は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれかが存在しないことを特徴とする追加の１０例のＭＭＲ欠損ＥＭおよびＣＲＣ腫瘍、ならびに４例のＭＭＲ熟達腫瘍を選択した（表９、表１３）。したがって、１１例の子宮内膜腫瘍（ＥＭ）およびそれらの対応する生殖細胞系試料と、３例の結腸直腸腫瘍（ＣＲＣ）およびそれらの対応する生殖細胞系のペアを含む合計１４の腫瘍−正常ペアを、エクソーム配列決定のために採取した。全ての腫瘍は、原発性で化学療法未処置の腫瘍であった。腫瘍ＤＮＡは、新鮮凍結腫瘍組織から抽出し、一方これらの試料についての対応する生殖細胞系ＤＮＡは、末梢白血球から抽出した。これらの試料についての詳細な臨床情報を表１３に示す。さらに、ＭＭＲ欠損の５例の原発性子宮内膜腫瘍細胞株を解析に含めて、合計１６例のＭＭＲ欠損腫瘍試料となるようにした。
【０２１１】
表１３．追加の腫瘍試料についての臨床情報
【表１３】
0006578205.tif 000133
【０２１２】
３．１  標準診断テスト 
下記の表１４および１５は、配列決定された子宮内膜腫瘍および結腸腫瘍に対して実施された、ＭＳＩ決定の標準的な診断テストの結果を記載する（ＭＭＲ遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の免疫組織化学；ＭＬＨ１プロモーター領域の過剰メチル化状態；８ヌクレオチドおよび２モノヌクレオチド反復マーカーの拡張ベセスダパネルを使用したマイクロサテライト不安定性）。免疫組織化学実験において、アスタリスク（＊）は、少数の腫瘍細胞における弱い陽性核染色を示す。ＭＭＲ欠損状態の分類は、主要なＭＭＲタンパク質（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６）の免疫組織化学を用いて行った。これらのタンパク質のいずれかが、腫瘍細胞の核内に存在しなかった場合には、腫瘍はＭＭＲ欠損として（ＭＭＲ−）、それ以外はＭＭＲ熟達（ＭＭＲ＋）として分類した。
【０２１３】
表１４．ＭＭＲ欠損を評価するための標準診断テスト
【表１４】
0006578205.tif 000134
【０２１４】
マイクロサテライト不安定性テストについて、拡張ベセスダパネルに含まれる全マーカーの詳細な結果を下に示す。
表１５．拡張ベセスダパネルのデータ
【表１５】
0006578205.tif 000135
【０２１５】
意外なことに、免疫組織化学による評価では、ＭＭＲ−４、７および８は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のいずれに対しても陰性であったが、ベセスダパネルを使用して、ＭＳＩ陽性腫瘍として識別することはできなかった。この観察は、ＭＳＩの診断のための現在のベセスダパネルが、多くのＭＳＩ陽性腫瘍を認識できないことを示す。しかし、我々の５６マーカーの改善されたパネルを使用して（表３、および例７）、これらのＭＭＲ欠損腫瘍がＭＳＩ陽性であることを確認することができた。
【０２１６】
３．２  イルミナのHiSeq2000技術を用いて配列決定したエクソームに対する、配列決定、マッピングおよびバリアントコール
独立した配列決定技術を使用した（イルミナ（Illumina）（登録商標））、腫瘍および対応する生殖細胞系ＤＮＡのエクソーム配列決定により、各ＭＭＲ欠損腫瘍が平均して１，４９７の体細胞イベントを含み、これに対してＭＭＲ熟達腫瘍は３９であることが明らかになった（３８．９倍の増加；図３ａ）。ＭＭＲ欠損腫瘍においては、これらの大多数（７８．４％）は置換を表し（図３ｂ）、そのほとんどはＡ：Ｔ＞Ｇ：ＣおよびＧ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位であった（８１．５％）。残りの変異は体細胞インデルを表し、これはホモポリマーにおいて高度に濃縮されていた（５５．９％）。
簡潔に述べると、エクソームをイルミナのTruSeq Exome Enrichment Kit（8 rxns）を使用して捕獲し、濃縮後、濃縮されたライブラリーをイルミナ配列決定（HiSeq2000）に供した。ペアエンド配列決定（２ｘ７５ｂｐ）はTruSeq SBSキットを用いて行った。ＢＷＡを用いて、各配列決定レーン（fastq形式）からの生のリードを、デフォルトパラメータを用いてヒト参照ゲノム（NCBI37/ hg19）にアラインメントさせた。アラインメントさせたリードを処理し、SAMtools（v.0.1.13）でソートし、ＰＣＲ重複をPicard MarkDuplicates（http://picard.sourceforge.net、V1.32）で除外した。塩基の再校正、インデルの周りの局所的再アラインメント、および単一ヌクレオチドバリアントコールを、GenomeAnalysisToolKit（GATK v1.0.4487）を用いて行った。さらに、体細胞変異リストから全ての一般的なバリアントをフィルタリングした。これは各種のデータトラックを用いて行い、これをBEDTools（Quinlan and Hall, 2010）のintersectBedコマンドを使用してバリアントリストに適用した。体細胞置換およびインデルは、Sequenom MassARRAY遺伝子型決定を使用して検証した。品質フィルタリングおよび検証後の全体的な変異データを、表１６に示す。
【０２１７】
表１６．品質フィルタリングおよび検証後の全体的な変異データ
【表１６】
0006578205.tif 000136
【０２１８】
コンテクスト依存性の効果は、Ｇ：Ｃ＞Ａ：Ｔ転位に対する強力なＣＧ効果を明らかにした（図３ｃ）。興味深いことに、エクソーム配列決定により同定された生殖細胞系de novo置換は類似のコンテクスト依存性の効果を示し、ヒトの遺伝的バリエーションと疾患の基礎となる変異は、多くの場合、ＭＭＲを逃れるミスマッチに起因して発生するという考えを確認した（図３ｄ）。さらに、体細胞イベントの数はＣＲＣにおいてＥＭ腫瘍よりもわずかに高いが（平均して、２，２７８対１，１６１イベント）、両方の癌のタイプの間の変異パターンには、明確な差異は観察されなかった（示されず）。
同様に、ＭＬＨ１またはＭＳＨ２欠損に応じた変異パターンの階層化は、明らかな違いを明らかにすることができなかった。特に、インデルはマイクロサテライトにやや多いことを観察したが（１２．０％および１１．２％対過剰突然変異子のエクソームにおいて５．４％）、ホモポリマーは依然として最も頻繁に影響を受け（図３ｅ）、ＭＬＨ１またはＭＳＨ２欠損腫瘍のインデルは、マイクロサテライトよりホモポリマーに優先的に影響を与えることを確認した。
【０２１９】
例４．ＭＭＲ欠損腫瘍におけるポジティブなクローン選択および反復変異
４．１  反復的に影響を受けるホモポリマーの解析（ホットスポット変異）
ＭＭＲ欠損腫瘍のエクソームで観察された変異頻度は、ネガティブな選択の証拠を明らかにしたが、いくつかの変異はポジティブな選択を受ける可能性がある。かかる変異は、ホットスポット（反復）突然変異として現れる可能性が高い。したがって我々は、何個のホモポリマーがＭＭＲ欠損腫瘍において反復的に影響を受けたかを評価した。そこで１０のＭＭＲ欠損エクソームを、ハイパーミューテーターの全ゲノムから抽出したエクソームと共に、反復置換およびインデルの存在について解析した。２セットの反復変異が生成された：１１例の腫瘍のうち少なくとも３例、または少なくとも４例における反復置換またはインデルについてのデータ。
ホットスポット変異は、１１例のＭＭＲ欠損腫瘍において検出された。３（４）以上の試料で反復する変異についてのバリアントリストを生成した。我々は最初に、これらのホットスポット変異が配列決定エラーを表すという事実を除外することを目的とした。ホットスポット変異が偽陽性である可能性が存在しており、なぜならばこれらは、腫瘍における系統的な偽陽性のバリアントコール、または正常試料における系統的な偽陰性のコールのいずれかによって、発生可能だからである。そこで、追加のフィルタリングステップを実施した。特に、我々は、１１の子宮内膜正常エクソームと３つの結腸直腸の正常エクソームのそれぞれにおいて、同定された全てのバリアントを収集した。これらのエクソームの少なくとも１つにおいて生殖細胞バリアントとしても存在していた各ホットスポット変異は系統誤差と考えられ、これをデータセットから除外した。これにより反復置換の大幅な減少をもたらし、一方反復インデルへの影響は非常に限定された（表１７）。
【０２２０】
表１７．ホットスポット変異からの偽陽性のフィルタリング
【表１７】
0006578205.tif 000137
【０２２１】
３つ以上の腫瘍における５つのホットスポット置換について、Sequenomの検証を行った。これらの置換のうち、１つのみが確認された。さらに、我々は４または５以上の試料中に生じる全てのインデルの検証を試みた。これらの４４の反復インデルのうち、２６インデルが正常に遺伝子型を決定することができ、全てがSequenom遺伝子型決定を用いて確認された（１００％検証率）。反復および非反復体細胞インデルの高い検証率を考えて、我々は残りのインデル（ｎ＝１８）についての更なる検証を進めなかったが、全ての反復インデルは真の陽性インデルと考えられた。
ＭＭＲ欠損腫瘍において、インデルは主にホモポリマーに限られていたため、解析はホモポリマー領域に反復的に影響を与えるインデルに限定した。我々は、１１例のＭＭＲ欠損腫瘍のそれぞれにおいて、全て３０，１１１のイルミナTruSeq捕獲のエクソンホモポリマーをスクリーニングした。表１８は、ＭＭＲ欠損腫瘍において反復的に影響を受けたホモポリマーの数を示す。
【０２２２】
表１８．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍のエクソン領域のインデルを有するホモポリマーのリスト
【表１８】
0006578205.tif 000138
【０２２３】
合計で、１，４９３のホモポリマーが少なくとも一度影響を受け、２５５は少なくとも２回、８２は３回、および４４は、１１例の腫瘍のうち少なくとも４例において反復的に影響を受けた。これらの８２の影響を受けたホモポリマーは、ホットスポット変異とみなした。８２のホットスポット変異のうちの４つは、既知の癌センサス遺伝子に位置していた（ＲＰＬ２２、ＭＳＨ６、ＭＬＬ３、およびＢＲＡＦ）。８２のホットスポット変異のうちの４１は、以前にＭＭＲ欠損腫瘍または他の癌のタイプに関与するとされた遺伝子に位置していた。これらの突然変異のリストを、表７に示す。解析を、５例の原発腫瘍細胞株をさらに解析することによって拡張した。これにより、１６例のＭＭＲ欠損腫瘍中少なくとも４例において反復的に影響を受ける、合計１４９のエクソンホモポリマーが導かれた。これらのホットスポット変異の詳細は、表２に見ることができる。追加のフィルタリングステップを適用すると、１０００ゲノムデータベースおよびｄｂＳＮＰデータベースに存在する一般的なバリアントだけでなく、１００以上の個人の独自のデータベースのバリアントを除外して、表５に示す１０３の反復的に影響を受けたエクソンホモポリマーが導かれる。
１１例の腫瘍のうち少なくとも４例において影響を受けた４４のホモポリマーのうち、２１、１８、１および４はそれぞれ、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのストレッチから成る。１１例の腫瘍のうち少なくとも３例において影響を受けた８２のホモポリマーのうち、３４、３１、７および１０は、それぞれ、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのストレッチから成る（示されず）。反復的に影響を受けたホモポリマーの長さは、７ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまで変化した。しかし、１１回のうち少なくとも３回影響を受けた、長さ７〜１１ヌクレオチドのホモポリマーに対する強いバイアスを、観測することができる（示されず）。
【０２２４】
４．２  反復インデルの予想対観測された頻度 
ＭＭＲ欠損腫瘍において、反復インデルがポジティブな選択の結果として発生するのか、増加したインデル頻度の結果としてランダムに発生するのかを評価するために、ハイパーミューテーターにおいて観察された全ゲノムのインデル頻度に基づいて、反復インデル数の予想値を算出した。複製中のポリメラーゼ滑りは長いホモポリマーで発生しやすいので、インデル変異は、長さの増加したホモポリマーに対してより容易に影響を与えることが予想される。したがって、エクソンのホモポリマーの大部分を表す６〜１１塩基の間の各ホモポリマーについて、予想頻度（ｆｅ，ゲノム）を算出した（９９．７％、図４ａ）。
【０２２５】
表１９．ホモポリマーの長さの関数としてのホモポリマーの分布
【表１９】
0006578205.tif 000139
【０２２６】
前述したように、ハイパーミューテーターにおいて観察された頻度（ｆｅ，ゲノム）を用いて、エクソーム中で影響を受けるホモポリマーの予想値を算出した（ホモポリマー当たりの予想インデル数に、エクソーム中のこの長さのホモポリマーの数を乗じて）。次に、１１例のＭＭＲ欠損腫瘍で影響を受けている所定の長さのホモポリマーの数を算出した。この数を、１１のＭＭＲ欠損エクソームについて平均をとり、これを、影響を受ける、与えられた長さのホモポリマーの観察された頻度（ｆｏ，エクソーム）と呼ぶ。この長さのホモポリマー中のインデルの予想数に対する濃縮倍数を、観察および予想頻度の比率として算出する。これらのエクソーム中の８〜１１の長さのホモポリマーに生じるインデル数の、弱い濃縮が存在した（表２０参照）。
表２０．
【表２０】
0006578205.tif 000140
【０２２７】
同じ長さの全てのホモポリマーが、影響を受けることの等しく高い可能性を有すると仮定すると、２または３例の独立した腫瘍において影響を受けるホモポリマーの確率は、１つの腫瘍において影響を受けるホモポリマーの確率の積として算出することができる（すなわち、観察された全ゲノムでの頻度ｆゲノム）。
したがって、３つの腫瘍において影響を受けるホモポリマーの予想確率は次のように計算される：
ｆｅ、３つで反復＝（ｆｅ，ゲノム）３
４つの腫瘍において影響を受けるインデルについては：
ｆｅ、４つで反復＝（ｆｅ，ゲノム）４
それぞれ、３および４の腫瘍における反復インデルの予想数を算出するには、予想頻度に、エクソーム中のホモポリマーの数と、１１試料のうちのそれぞれ３および４試料を取り出し得る方法の数（すなわち、組み合わせの数Ｃ（３，１１）およびＣ（４，１１））を乗じる。したがって、１１の腫瘍における予想反復インデルの数は、次のように計算される：
Ｎ３つで反復＝Ｃ（３，１１）＊Ｎホモポリマー＊ｆｅ、３つで反復
Ｎ４つで反復＝Ｃ（４，１１）＊Ｎホモポリマー＊ｆｅ、４つで反復
【０２２８】
３つの腫瘍で反復するインデルの場合、データは次のとおりである： 
表２１．１１の腫瘍のうち３つで反復するホモポリマー中の予想および観察されたインデル
【表２１】
0006578205.tif 000141
【０２２９】
３つの試料中で反復するインデルの濃縮を既に見ているが、４または５以上の試料中で反復するインデルの濃縮はさらに強い：
表２２．１１の腫瘍のうち４つで反復するホモポリマー中の予想および観察されたインデル
【表２２】
0006578205.tif 000142
【０２３０】
要約すれば、エクソームにおけるホモポリマーの大部分は６ヌクレオチドからなるが、最も反復的に影響を受けるホモポリマーは、８〜１１ヌクレオチドの長さを示した。そこで、これらのホモポリマーが、それらの増加した長さのために反復的に影響を受けた可能性を評価した。特定長さのホモポリマーがハイパーミューテーター中のインデルにより影響を受ける、全ゲノムでの確率を計算し、エクソーム中で観察された変異の数は、全てのホモポリマーの長さについて、予想よりも高かったことを見出した。また、特定長さのホモポリマー中の反復インデルを観察する、全ゲノムでの確率を計算し、＞２または３＞の腫瘍におけるエクソン反復変異の観察数は、各ホモポリマーについて予想されたより遥かに高かったことを見出し、これはエクソンホモポリマーが、長さの増加のためには反復的に影響を受けないことを示す。このことは、これらのホモポリマー中のこれらのインデルが、これらの癌で積極的に選択されていることを示す。
【０２３１】
結論
全体として、３０，１１１のホモポリマーのうち１，２３８は１度影響を受け、一方１７３のホモポリマーは２度影響を受けた。さらに、８２のホモポリマーは、少なくとも３例の腫瘍において同一インデルの影響を受けた。これらのうち、４または５例の腫瘍中に２７および８のホモポリマーが存在し、６例の腫瘍には５つのホモポリマーが存在した（表７および表２３）。対照的に、２例以上のＭＭＲ欠損腫瘍中には、単一の置換（ＫＲＡＳ中のＧ１３Ｄ）のみが同定された。
表２３．１１例のＭＭＲ欠損腫瘍うち少なくとも３例においてインデルに影響される遺伝子。
【表２３】
0006578205.tif 000143
【０２３２】
例５．５’および３’ＵＴＲにおける反復インデルは長いホモポリマーに影響を与える
５’および３’ＵＴＲは遺伝子発現を決定する上で非常に重要であるので、これらの領域における突然変異も評価した。特に、ＭＭＲ欠損腫瘍からのエクソームデータを用いて、これらの領域の８３．９％および９１．９％までを、信頼性高く評価することができた。
５．１  調節領域における反復インデル
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域のいずれかが反復変異により影響を受けたかどうかを評価するために、１０例のＭＭＲ欠損腫瘍の、エクソームを捕獲した５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに位置する、それぞれ５，３６７および５９，２５９のホモポリマーをスクリーニングした。これらのホモポリマーはまた、全ゲノム配列決定したハイパーミューテーター試料の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにおいてもスクリーニングし、この時、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲをスクリーニングすることができる腫瘍の総数が、１１例のＭＭＲ欠損腫瘍であるようにした。１１例のＭＭＲ欠損腫瘍試料の少なくとも１つにおいて生殖細胞系バリアントとしても存在していた各ホットスポット変異は除外した。
【０２３３】
ホモポリマーにおける反復インデルは、５’および３’ＵＴＲ領域において、エクソームでの観察から予想されるよりはるかに頻繁であった：３’ＵＴＲ領域において、１１例の腫瘍のうち少なくとも４例において１，１４２の反復インデルを、１１例の腫瘍のうち少なくとも３例において１，８１２の反復インデルを観察し、一方５’ＵＴＲ領域においては、１１例の腫瘍のうち少なくとも４例において５０の反復インデルを、１１例の腫瘍のうち少なくとも３例において８９の反復インデルを観察した。これらの反復インデルを表６に示す。さらに５例の追加のＭＭＲ欠損試料を考慮すると、これは、３’ＵＴＲ領域について、１６例の腫瘍のうちの４例において２６４８の反復インデルを、および５’ＵＴＲ領域について、１６例の腫瘍のうちの４例において１５５の反復インデルをもたらした。ＵＴＲ領域のホモポリマーにおける頻繁な反復インデル（１６例のＭＭＲ欠損腫瘍の少なくとも４例に存在する）のこのリストを、表１に示す。ここでもまた、追加のフィルタリングステップにより、１０００ゲノムデータベースおよびｄｂＳＮＰデータベースに存在する一般的なバリアントのみでなく、１００を超える個体の我々独自のデータベース中のバリアントを除外すると、ＵＴＲ領域中で反復的に影響を受けるホモポリマーの数は、３’ＵＴＲ領域について、１６例の腫瘍のうちの４例において１３１４の反復インデルに、および５’ＵＴＲ領域について、１６例の腫瘍のうちの４つにおいて８８の反復インデルに、低減した；これを表４に示す。
対照的に、反復置換は非常に稀であった：３つの反復置換が、１１例の腫瘍のうち少なくとも４例において、また１８の反復置換が、１１例の腫瘍のうち少なくとも３例において見出され、一方、５’ＵＴＲ領域においては、１つの反復置換が３例の試料中に観察され、４または５例以上の試料中には置換は見られなかった。
【０２３４】
５．１．１．エクソン領域、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにおけるホモポリマーの長さおよび体細胞突然変異の反復
５’および３’ＵＴＲ領域の反復インデルが、ポジティブなクローン選択に起因するのか、または単にホモポリマー含量によって起こるのかを評価するために、ホモポリマーの長さの分布を、それらのエクソン、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにおける位置の関数として評価した。３’ＵＴＲにはさらに多くのホモポリマーが、５’ＵＴＲにはさらに少ないホモポリマーが存在することを観察した。３’ＵＴＲのホモポリマーも、エクソームにおけるよりも長かった。例えば、エクソームは、長さが＜９ヌクレオチドの２９，７３３（９８．７％）のホモポリマーを含み、一方５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、長さが＜９ヌクレオチドのホモポリマーを、それぞれ４，８５７（９０．５％）および４９，７６９（８４．０％）含む。３’ＵＴＲにはエクソームにおけるよりも長さの短い（６または７）のホモポリマーが多いにも関わらず（示されず）、３’ＵＴＲとエクソームにおいて影響を受けたホモポリマーの数は、多かれ少なかれ等しかった（示されず）。３’ＵＴＲには、多くのインデルが長いホモポリマー（ずなわち、長さ９、１０、１１、≧１２塩基対）に位置していた。
【０２３５】
５’および３’ＵＴＲおよびエクソームにおける反復インデルを評価する場合、反復インデルの数は、５’ＵＴＲまたはエクソームよりも３’ＵＴＲにおいて遥かに多いことを観察した。３’ＵＴＲの反復インデルは、主に長さ＞９塩基対のホモポリマーに影響を与えた。驚くべきことに、エクソームよりも３’ＵＴＲにおいて、長さ７または８のホモポリマー数が多いにもかかわらず、および、エクソームよりも３’ＵＴＲにおいて、長さ７または８のホモポリマー中のインデル数が多いにもかかわらず、長さ７または８のホモポリマーに影響する反復インデルの数は、３’ＵＴＲよりもエクソームに多い。３’ＵＴＲの反復インデルは、長さ１１および≧１２のホモポリマーに主に影響を与える。
エクソームにおいて反復的に影響を受ける長さ＜９のホモポリマーの割合の増加が、異なる領域におけるホモポリマーの長さ分布の全体的な違いによるものではないことを確認するために、長さ＜９のホモポリマー中のインデルの頻度（すなわち、影響を受けたホモポリマーの割合）を、異なる領域におけるこれらのホモポリマーの全体的発生について補正した。補正割合は、次のように計算される：
【数１】
0006578205.tif 000144
【０２３６】
この補正変異頻度を次に、３つの異なる領域について計算した（エクソーム、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ）。この補正後、エクソームにおいて、短い反復ホモポリマーの濃縮（長さ＜９で３９．２％）が、５’（１９．５％）および３’ＵＴＲ（２．２％）と比較して観察された。これらのデータが明白に示すのは、ホモポリマーの長さは、５’および３’ＵＴＲ領域においてどのホモポリマーが反復的に影響を受けるかを決定的に決定し、一方エクソームにおいては、ホモポリマーの長さおよびクローナルな増殖の利点に対する変異の効果が、どのホモポリマーが反復的に影響を受けるかを決定することである。表２４は、前の段落で説明したデータの概要を示す。
表２４．長さの関数としてのホモポリマーの分布
【表２４】
0006578205.tif 000145
【０２３７】
したがって、要約すると、５’および３’ＵＴＲにおいて、ホモポリマーはコード領域におけるより長い（図４ａ）；ＵＴＲにおけるより長いホモポリマーはさらに、インデルが蓄積する傾向の増加を有する（図４ｂ）。一緒にすると、これは、５’および３’ＵＴＲにおいてコード領域におけるよりも高いインデル頻度につながる（それぞれ３．８および１０．７倍の増加；図４ｃ）。ＵＴＲにおいてはしかし、ホットスポット変異は長いホモポリマーで枯渇している。例えば、５’および３’ＵＴＲにおいて３（８９のうち；３．４％）および７１（１，８１２のうち；３．９％）のみのホットスポット変異が、長さ＜９ｂｐのホモポリマーに影響を与え（表２４）、一方コード領域においては、３４まで（８２のうち；４１．５％）のかかるホットスポット変異が存在していた（図４ｄ）。全体としてこれが示唆するのは、ホモポリマーの長さが、どのホモポリマーが５’および３’ＵＴＲ領域において頻繁に影響を受けるかを決定的に決定し、一方コード領域においては、突然変異のクローナルな増殖の利点に対する影響が、どのホモポリマーが頻繁に影響を受けるかを決定することである。
【０２３８】
例６．反復変異遺伝子の遺伝子発現プロファイル
我々は反復変異が、腫瘍の成長に有利であるためにポジティブな選択にリンクされているという仮説を立てているので、これらの反復変異の影響を受けた遺伝子は、少なくとも正常な子宮内膜組織で発現されるべきである。また、これらの遺伝子の少なくともサブセットが、他のミスマッチ修復欠損腫瘍において見出される可能性があり、またホットスポット変異は、影響を受けた遺伝子の発現を変化させることが予想される。したがって我々は、子宮内膜特異的発現の文脈および結腸直腸ＭＭＲ欠損腫瘍において差別的に発現される遺伝子の文脈の両方で、反復変異によって影響された遺伝子の発現プロファイルを解析した。
【０２３９】
６．１  正常な子宮内膜での遺伝子発現
正常な子宮内膜組織での遺伝子の発現データを、Gene Expression Atlas２３（http://www.ebi.ac.uk/gxa/）から「all genes over/under/non-differentially expressed in Homo sapiens, endometrium」のクエリを使用してダウンロードした。このクエリにより１４，６６４の遺伝子が得られ、そのうち９，０２１は正常な子宮内膜で過剰発現され、４６３は過少発現され、および５，１８０には差別的発現を示さなかった。過剰および過少発現は、異なる組織タイプにわたる一般的な遺伝子発現プロファイルに対して算出したので、過小発現遺伝子が効果的に存在しない（発現されない）のか、または単に低いレベルで発現されただけなのかどうかを評価することは困難である。しかし、子宮内膜組織において顕著に過剰発現された遺伝子については、これらが正常な子宮内膜内で少なくともある役割を果たしていると、安全に主張することができる。したがって、この解析においては、正常な子宮内膜で過剰発現された遺伝子のみに限定した。
異なるデータセットからの変異を、誘導された発現データと比較した：ＭＭＲ熟達腫瘍において変異した全ての遺伝子（ＭＭＲ＋遺伝子）、ＭＭＲ欠損腫瘍において変異した全ての遺伝子（ＭＭＲ−遺伝子）、ＭＭＲ欠損腫瘍において反復的に影響を受けた全ての遺伝子（１１試料中の３として定義、反復遺伝子）、およびエクソン領域における全ての反復インデル（反復エクソン）。この解析は、反復（ホットスポット）変異が、正常な子宮内膜組織で過剰発現された遺伝子に過剰出現していることを示した。これらの解析のための完全なデータを表２５に示す。
【０２４０】
表２５．正常子宮内膜での遺伝子発現
【表２５】
0006578205.tif 000146
【０２４１】
マイクロサテライト不安定な結腸直腸癌に特異的な遺伝子における解析
マイクロサテライト不安定（ＭＳＩ−Ｈ）およびマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）な結腸直腸癌の間で差別的に発現した遺伝子は、Banerjea et al22からのものである。この研究において、１３３例の結腸直腸腫瘍を解析し、２９（２２％）の腫瘍はＭＳＩ−Ｈとして同定された。遺伝子発現データは、Affymetrix  HG-U133Aチップからのものである。得られたデータセットは、マイクロサテライト不安定および安定な癌の間で差別的に発現する、４，８７４の遺伝子を含む（（Ｐ＜０．０５、BenjaminiおよびHochbergの偽発見率））。
異なるデータセットからの変異を、得られた発現データと比較した：ＭＭＲ熟達腫瘍において変異した全ての遺伝子（ＭＭＲ＋遺伝子）、ＭＭＲ欠損腫瘍において変異した全ての遺伝子（ＭＭＲ−遺伝子）、およびＭＭＲ欠損腫瘍において反復的に影響を受けた全ての遺伝子（１１試料中の３として定義、反復遺伝子）、およびエクソン領域における全ての反復インデル（反復エクソン）。この解析は、ホットスポット変異が、マイクロサテライト不安定な腫瘍で差別的に発現されたセット遺伝子の間で濃縮されたことを明らかにした。 
【０２４２】
表２６．ＭＳＩを有する結腸直腸癌に特異的な遺伝子の解析
【表２６】
0006578205.tif 000147
要約
Gene Expression Atlas（Kapushesky et al., 2010）から公的に入手可能な発現データを使用して、少なくとも３例のＭＭＲ欠損腫瘍において同一の変異（以下、ホットスポット変異と呼ぶ）によって影響を受ける遺伝子が、正常なＥＭ組織で発現されたかどうかを評価する。ＭＭＲ熟達およびＭＭＲ欠損腫瘍において変異した全ての遺伝子のうち、５８％および６４％がＥＭ組織で発現され、これをホットスポット変異の影響を受けた遺伝子の８８％と比較した（表２５）。同様のデータが、正常な粘膜組織について得られた（示されず）。さらに、ＭＭＲ欠損対ＭＭＲ熟達腫瘍の間の発現の差異を評価すると（Banerjea et al., 2004）、非ホットスポット変異により影響を受けた遺伝子の２０％対、ホットスポット変異により影響を受けた遺伝子の３２％が、差別的に発現されたことを観察した。したがって、ホットスポット変異は、正常組織において発現される遺伝子に優先的に影響を与えてそれらの発現を変化させており、ホットスポット変異が腫瘍におけるポジティブなクローン選択に起因することを示す。
【０２４３】
例７．反復変異はさまざまな腫瘍タイプにおいてＭＳＩを確実に検出する
８つのマイクロサテライトマーカーおよび２つのホモポリマーマーカーから構成される拡張ベセスダパネルは、現在、ＭＳＩをＭＭＲ欠損のマーカーとして診断的に評価するために使用されている９，１５。これらのマーカーは、それらがＭＭＲ（−）腫瘍に影響を与える相対的な頻度に基づいて選択されていないので、このパネルは、時にはＭＭＲ（−）腫瘍の検出に失敗する２４。そこで、反復変異がＭＳＩの検出を改善することができるかどうかを評価した。
【０２４４】
７．１  診断パネルの構成
マイクロサテライト不安定性の検出に現在使用されている診断パネルの向上が可能であると考えられる、２つの基準がある。まず第１に、我々は、ＭＭＲ欠損腫瘍における反復変異を、バイアスのない方法で決定した：これは、全ゲノムおよびエクソームの配列決定実験を行い、どの位置が反復的に影響を受けたかを単純に観察することによる。バイアスのない方法での検出は、最も頻繁なホットスポット変異が、ＭＳＩを検出するために最も感受性であることを示唆する。第２に、我々が同定した反復インデルの大部分は、３’ＵＴＲに位置していた。５’および３’ＵＴＲの反復インデルは、ストリンジェントなポジティブな選択を受けず、影響を受けたホモポリマーの長さによって主に決定され、組織特異的な濃縮が起こるとは考えにくい。これらの２つの基準は、ｉ）それらの機能についての事前知識なしに、複数の腫瘍試料中で反復的に影響を受けているマーカーを選択したこと、ｉｉ）癌タイプに依存しない可能性が高い多数のマーカーを有すること、を保証する。後者については、５’および３’ＵＴＲから選択されたインデルが、最も有用であり得る。
最も高い感受性を得るために、４または５以上の試料中で生じる変異のみを使用した。５’および３’ＵＴＲ反復インデルについては、優先度は、５または６以上の試料に影響を与えるインデルに与えられた。得られた４４の反復エクソンインデル、１，１４２の反復３’ＵＴＲインデルおよび５０の反復５’ＵＴＲインデルを用いて、ＭＭＲ欠損を検出するためのSequqnomに基づくパネルを設計した。反復インデルはホモポリマー領域内に位置していたことから、SequqnomのマルチプレックスＰＣＲのプライマー設計は複雑であった。大規模な最適化実験の後、５６のホットスポット変異の遺伝子型を決定した６つのアッセイを、成功して生成した。５６のホットスポット変異のうち、１１個はエクソンに、４０個は３’ＵＴＲに、および５個は５’ＵＴＲにそれぞれ位置していた。このパネルを、５６マーカーパネルと呼ぶ。これら５６の変異の完全な詳細を表３に示す。
【０２４５】
７．２  子宮内膜腫瘍におけるＭＳＩの診断評価 
次に、５６マーカーパネルを、１１４例の未選択の外科的に切除された子宮内膜腫瘍の追加の系列（これは、７例の明細胞癌、６９例の類内膜癌、１８例の漿液性／類内膜癌の混合、１０例の漿液性癌および１０例の未分類の子宮内膜癌からなる）に適用した。全ての腫瘍は、原発性化学療法未処置の子宮内膜腫瘍であった。新鮮凍結組織が、これらの腫瘍の各々に対して利用可能であった。選択されたマーカーの遺伝子型判定成功率は高かった（平均９８．７％）。１試料の陽性マーカーの数は０から３３の間で変化し、全体平均で試料当たり６．５の陽性マーカーであった。ベセスダパネルと同様に、マイクロサテライト不安定性の３つのカテゴリーを定義した：マイクロサテライト安定（ＭＳＳ、ベセスダにおいて１０マーカーのうち０、５６マーカーパネルにおいて５６マーカーのうち０または１）、低マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｌ、ベセスダパネルにおいて１０マーカーのうち１〜２、５６マーカーパネルにおいて２〜９マーカー）、および高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ、ベセスダにおいて１０マーカーのうち３または４以上、５６マーカーパネルにおいて５６のうち１０または１１以上）。５６マーカーパネルのこれらのカテゴリーに基づいて、６５例の腫瘍（５７．０％）はＭＳＳとして定義され、３３例の腫瘍（２９．０％）および１６例の腫瘍（１４．０％）は、それぞれＭＳＩ−ＨおよびＭＳＩ−Ｌとして定義される。これらの３３例のＭＳＩ−Ｈ腫瘍のうち、ベセスダでは、２９例の腫瘍がＭＳＩ−Ｈ（＞２のマーカーが陽性）、３例の腫瘍がＭＳＩ−Ｌ、および１例の腫瘍がＭＳＳと識別された。逆に、ベセスダは、ホットスポット変異の我々のパネルで識別されなかったどのＭＳＩ−Ｈ腫瘍も、識別できなかった（図５に示すように）。この結果は、５６マーカーパネルが、子宮内膜腫瘍のこの系列について、ベセスダパネルより優れていることを示す。結腸直腸腫瘍におけるデータもこれに匹敵する（示されず）。
【０２４６】
７．３  他の腫瘍タイプにおける変異サイン。
５６マーカーパネルをさらに、他の腫瘍タイプに適用した（卵巣腫瘍および白血病）。４例のＭＳＩ−Ｈ試料を選択し、これは、１例の卵巣腫瘍および３例の白血病細胞株試料（ＤＮＤ４１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＳＵＰＴ１）を含む。ＭＭＲ欠損子宮内膜／結腸直腸腫瘍における我々の観察が、他の腫瘍タイプに拡張可能であるかどうかを評価するために、ＭＳＩ−Ｈ卵巣腫瘍、ＭＳＳと検出された２例の卵巣腫瘍、およびその対応する正常試料、ならびに３例のＭＳＩ−Ｈ白血病細胞株および１例のＭＳＳ白血病細胞株（ＲＰＭＩ−８４０２）を配列決定した。
３つの卵巣腫瘍−正常ペアは、手術中に収集された原発性化学療法未処置の腫瘍であった。ＭＭＲ欠損卵巣腫瘍（ＭＭＲ−卵巣１）とその対応する正常ＤＮＡを、イルミナのTruSeqキャプチャを使用して配列決定した。前述と同じ解析パイプラインを、これらのエクソームデータの解析のために使用した。２つのＭＭＲ＋卵巣腫瘍（ＭＭＲ＋卵巣１および２）とそれらの対応する正常試料のエクソームデータを、既存の全ゲノムデータから抽出した。具体的には、両方のＭＭＲ熟達腫瘍−正常のペアは、別のプロジェクトからすでに入手可能であり、Complete Genomicsを用いて配列決定した。全ゲノム配列データは、European Genome-Phenome Archiveに、アクセッション番号EGAS00001000158として寄託した。本明細書の前の例において記載されたものと同じ解析を、これらのゲノムに使用した。
【０２４７】
また、４例の白血病細胞株を、Nimblegenのキャプチャを使用してエクソーム配列決定した。エクソームはNimblegen SeqCap EZ Human Exome Libvrary v2.0を使用して捕獲した。前濃縮されたＤＮＡライブラリーは、イルミナのペアエンドＤＮＡ試料調製ガイドからの標準プロトコルに従って構築した。エクソームの濃縮は、製造業者の指示に従って行った。ビオチン化ベイトに基づくハイブリダイゼーションの１ラウンド（７２時間）を実施し、次にストレプトアビジン磁気ビーズ結合、洗浄ステップおよび溶出ステップを実施した。１８サイクルのＰＣＲ濃縮を溶出後に実施し、濃縮されたライブラリーは、イルミナ配列決定（HiSeq2000）に供した。ペアエンド配列決定（２ｘ５１ｂｐ）はTruSeq SBSキットを用いて行った。１つのレーンを、１つのエクソームのために使用した。全ての試料について、詳細な臨床情報を表２７に示す。表２８には、全ての卵巣および白血病試料のＭＭＲ遺伝子で見出だされた全ての変異を示す。
表２７．卵巣および白血病の腫瘍についての臨床情報
【表２７】
0006578205.tif 000148
【０２４８】
表２８．卵巣および白血病の腫瘍におけるＭＭＲ遺伝子の変異状態。
【表２８】
0006578205.tif 000149
【０２４９】
ＭＭＲ欠損卵巣腫瘍（ＭＭＲ−卵巣１）において、２，０４５の新規な体細胞置換および２８０の新規な体細胞インデルが検出された。他のＭＭＲ欠損腫瘍における検証率は、全ゲノムおよびエクソーム配列決定腫瘍（上記参照）の両方で非常に高かったため、この腫瘍のためにこれ以上の検証は実施しなかった。２例のＭＭＲ熟達卵巣腫瘍において、それぞれ３２および４２の新規な体細胞置換、ならびに１２および１８の新規な体細胞インデルが検出された。ＭＭＲ熟達腫瘍における一般的に低い検証率のために、２例のＭＭＲ熟達卵巣腫瘍内の全ての体細胞変異を、Sequenom MassARRAYを使用して検証した。それぞれ１６および２０の置換が、２例のＭＭＲ熟達卵巣腫瘍における真の置換として確認された。インデルはいずれの腫瘍においても確認されなかった。これらの体細胞変異について、ＥＭ／ＣＲＣ腫瘍において観察されたのと同じパターンを観察した（示されず）。
上述のように、４例の白血病細胞株のエクソームを、イルミナHiSeq技術を用いて配列決定した。これらの細胞株に対して使用可能な、対応する正常なＤＮＡ試料がないため、体細胞または生殖細胞系の変異は識別できなかった。しかし、前述した一般的なバリアントフィルタリングパイプラインを使用して、最も頻繁に発生するバリアントを除外することができた。ＭＭＲ欠損腫瘍において以前に観察されたように、インデルは主にＭＭＲ欠損白血病試料のホモポリマーに位置していた。一方、ＭＭＲ熟達試料は、このパターンを示さなかった（示されず）。
置換について、ＭＭＲ欠損とＭＭＲ熟達の試料のパターンは非常に類似していた（示されず）。特に、これらのパターンは、置換の大部分が反復領域内に位置しないことを明らかにした。子宮内膜／結腸直腸ＭＭＲ欠損腫瘍におけるように、ＭＭＲ欠損試料中の置換は、主に転位で構成されていた（７３．０％対、転換２７．０％）。
【０２５０】
要約
エクソーム配列決定により同定した最も頻度の高い５６のホットスポット変異を選択した：４５はＵＴＲにあり、これらはクローン選択を受けにくいため、異なる組織タイプの腫瘍においてＭＳＩを検出でき、１１はコード領域にあった。１１４例の外科的に切除されたＥＭ腫瘍の、これら５６の変異についての遺伝子型決定では、３３例（２９．０％）の腫瘍は≧１０のマーカーについて陽性であり（ＭＳＩ−高またはＭＳＩ−Ｈ）、１６例（１４．０％）の腫瘍は２~９個のマーカーについて陽性である（ＭＳＩ−低またはＭＳＩ−Ｌ）ことが明らかになった。残りの６５例（５７．０％）の腫瘍は＜２のマーカーについて陽性であり、マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）の腫瘍であった（図５）。３３例のＭＳＩ−Ｈ腫瘍のうち、ベセスダは、２９例の腫瘍のみをＭＳＩ−Ｈと同定した（＞２のマーカーが陽性）。４例の不一致の腫瘍は、ＭＳＨ６にフレームシフト変異を含むか、または組織病理でＭＳＨ６欠損であり、これにより、これらがＭＳＩ−Ｈであることが確認された。逆にベセスダは、我々のホットスポット変異パネルで同定されなかったいずれのＭＳＩ−Ｈ腫瘍も、同定できなかった。
【０２５１】
最後に、ホットスポット変異が卵巣腫瘍および白血病にも存在したかどうかを評価した。まず、我々の５６マーカーパネルを使用して、それぞれが２０、２５、２３、および２１マーカーについて陽性であった１例の卵巣腫瘍と３例の白血病細胞株（ＤＮＤ４１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＳＵＰＴ１）、ならびに、陽性マーカーなしの２例の卵巣腫瘍と１例の白血病細胞株（ＲＰＭＩ８４０２）を選択した。卵巣腫瘍とその対応する正常試料のエクソーム配列決定により、ＭＳＩ−Ｈ卵巣腫瘍が、ＭＳＨ６におけるフレームシフト欠失を含む対応する２例のＭＳＳ腫瘍よりも、実質的に多くの体細胞イベントを含むことが確認された。対応する生殖細胞系ＤＮＡが利用できなかったために、白血病細胞株における体細胞変異または生殖細胞系変異を区別できなかったが、置換およびインデルは、ＭＳＩ−Ｈ細胞株でもより頻度が高かった（注Ｓ９）。ＭＬＨ１における２つの機能喪失型変異およびＭＳＨ６におけるフレームシフト欠失が観察され、ＭＳＩ−Ｈ細胞株はＭＭＲ欠損であることを確認した。子宮内膜腫瘍で同定された反復変異が、卵巣および白血病のゲノム中にも存在したかを評価するとき、我々は、子宮内膜ＭＭＲ−腫瘍における３８４の反復変異のうち、６０、２５、８および１個は、それぞれ１、２、３または４例のＭＭＲ−腫瘍に存在したことに気付いた（示されず）。反復変異を少なくとも３例の子宮内膜腫瘍に存在するものに限定すると、より顕著な濃縮が見られた。最後に、エクソームにおける反復インデルは腫瘍組織により積極的に選択され、一方５’および３’ＵＴＲにおける反復インデルはホモポリマーの長さに大きく依存するため、ＵＴＲのインデルは、より良好なＭＳＩのマーカーを表す可能性がある。
【０２５２】
例８．ＭＭＲ欠損腫瘍の変異パターンは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に影響を与える
ＭＭＲ欠損腫瘍におけるホットスポット変異の生物学的関連性を探求するために、２種類のツール、すなわちＩＰＡ（登録商標）およびGenomeMuSiCを用いて、経路解析を行った。これら２つのツールは、４つの異なる経路データベース、すなわちＩＰＡ、KEGG、BioCartaおよびReactomeデータベースを使用する。複数のツールおよびデータベースの使用により、影響を受けた経路の詳細な印象を得ることが可能となった。 
８．１．  ＩＰＡ（登録商標）およびGenomeMuSiCを用いた経路解析
Ingenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ（登録商標）、http://www.ingenuity.com/）は、目的の遺伝子に最も関連する生物学的経路の同定を可能にする。ＩＰＡ（登録商標）を用いた、体細胞インデルを有する全ての遺伝子の経路解析により（ＭＭＲ遺伝子のインデルを除く、２，２３１の遺伝子中の３，０２２のインデル、なぜならば、ＭＭＲ欠損に起因する二次変異に興味があったため）、２４の経路が大幅に濃縮されていることを明らかにした（Ｐ＜０．０５）（示されず）。「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」および「相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復」が、それぞれトップ１位および３位にランクされた。目的の遺伝子のリストをホットスポット変異を有する遺伝子のみに限定すると（４５２遺伝子中の１，３８２のインデル）、１３の顕著に濃縮された経路が、表２９に示すように明らかにされた。「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」および「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡチェックポイント制御」経路は、それぞれトップ１位および２位にランクされた。
【０２５３】
表２９．ホットスポット変異を有する遺伝子の経路
【表２９】
0006578205.tif 000150
【０２５４】
要約すると、ＩＰＡ（登録商標）は、目的の遺伝子の異なる２組、すなわち体細胞インデルを有する全ての遺伝子およびホットスポット変異を有する全ての遺伝子を用いて、トップの濃縮経路としての「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」を明らかにした。「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡチェックポイント制御」および「相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復」もまた、非常に重要であった。 
同様の解析を、GenomeMuSiC（http://gmt.genome.wustl.edu/genome-music/0.3/index.html）を使用して、（ＭＭＲ遺伝子上の全てのインデルを除く）全ての体細胞インデルを入力として用いて行った。GenomeMuSiCを使用した、ＭＭＲ欠損腫瘍における全ての体細胞インデル（２，２３１の遺伝子の３，０２２インデル、ＭＭＲ遺伝子のインデルは除外）の経路解析により、５１の顕著に変異した経路（ＦＤＲ＜０．０５）が明らかになった。「ＤＮＡ修復」、「塩基除去修復」および「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント」経路は最高位にランクされ、これによりＩＰＡ（登録商標）解析からの結果を確認した。
【０２５５】
８．２  エクソン／イントロン境界におけるインデルの経路解析
さらに、遺伝子が、エクソン／イントロン境界に位置するホモポリマーに影響を与えるインデルによっても不活性化されることが知られているため、全てのエクソンの２５塩基対上流および下流の配列中に発生したインデルに対して、我々の変異コールを延長した。同じ変異コールおよびフィルタリングパイプラインを、先に記載のようにして実施した。我々は、１，７００の追加のインデルをエクソン／イントロン境界で検出したが、これには、ＡＴＭのイントロン７のホモポリマーにおける欠失および、ＭＲＥ１１のイントロン４のホモポリマーにおける欠失、およびＦＡＮＣＤ２のイントロン５のホモポリマーにおける挿入を含む。これら３つのインデルは、それぞれ７、５および１つの試料に影響を与える。エクソン領域における３，０２２のインデルと共に、全４，７２２の変異のGenomeMuSiC解析は、５４の顕著に変異した経路（ＦＤＲ＜０．０５）を明らかにした。エクソン／イントロン境界におけるインデルを含めることで、ＤＮＡ  ＤＳＢ修復についてのさらに強力なシグナルが、最高に濃縮された経路として生成された。
全ての解析を考慮すると、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復に関与する１１の遺伝子が存在する。次の表３０は、これらの遺伝子および、これらの遺伝子中に変異を有するＭＭＲ欠損腫瘍を示す。
【０２５６】
表３０．ＨＲ経路によるＤＳＢ修復に関与する遺伝子
【表３０】
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【０２５７】
要約
ＭＭＲ欠損腫瘍におけるインデルは、ポジティブまたはネガティブなクローン選択を受けることができるため、特定の経路が、これらの突然変異について濃縮されているかどうかを評価した。平均して、各ＭＭＲ欠損腫瘍は３０９のインデルを含み、そのうち３０はホットスポット変異であった。ＩＰＡ（登録商標）を使用した、体細胞インデルに影響される全ての遺伝子（ただし、ＭＭＲ遺伝子は、これらの遺伝子のインデルがＭＭＲ欠損の原因となっているので除外する）の経路解析は、「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」および「相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復」が、最高に濃縮された経路であることを明らかにした（それぞれＰ＝６．５Ｅ−０３、およびＰ＝１．１Ｅ−０２）。全てのホットスポット変異のＩＰＡ（登録商標）解析は、「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」に加えて（Ｐ＝２．０Ｅ−０３）、「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント制御」経路も濃縮されていることを明らかにした（Ｐ＝３．１Ｅ−０３）。これらの経路で最も頻繁に変異する遺伝子としては、なかでも特に、ＡＴＲ、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ１およびＦＡＮＣＭが挙げられる（それぞれ４、２、２、２、および２の変異；表３０）。GenomeMuSiCを使用した、ＭＭＲ欠損腫瘍における全てのインデルの経路解析では、バックグラウンド突然変異率について補正しつつ、KEGG、BioCartaまたはReactomeデータベースに基づいて特異的に変異している経路を計算し、これにより、それぞれ「ＤＮＡ修復」、「塩基切断修復」および「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント」経路が最高位にランクされた（それぞれＰ＝６．３Ｅ−０５、Ｐ＝３．１Ｅ−０４、およびＰ＝９．８Ｅ−０４）。さらに、ＤＳＢ修復遺伝子はまた、エクソン／イントロン境界に位置するホモポリマー中の機能喪失インデルの影響も受ける可能性があるため（Ham et al., 2006）、我々の変異コールを、全てのエクソンの２５ｂｐ上流および下流に発生するインデルに拡張した。全ての変異のGenomeMuSiC解析（１，７００のエクソン／イントロン境界インデルおよび３，０２２のエクソンインデル）は、最高に濃縮された経路として、ＤＮＡ  ＤＳＢ修復に対するより強いシグナルを生成した（例えば、BioCartaの「ＡＴＲ／ＢＲＣＡ」経路についてＰ＝６．８Ｅ−０７、およびReactomeの「Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント」経路についてＰ＝３．０Ｅ−０５）。全体として各ＭＭＲ欠損腫瘍は、平均して３．０±０．５のインデルを、ＨＲ経路（図６）によるＤＳＢ修復において含む。
【０２５８】
これらの知見を再現しようとする試みにおいて、The Cancer Genome Atlas network（TCGA、2012）の文脈において配列決定された２７例のＣＲＣのＭＳＩ−Ｈ腫瘍のエクソームデータを解析した。これらの腫瘍は、２０倍という低い平均カバレッジ深度を用いて配列決定され、これはホモポリマーにおいて確実にインデルを検出するには非常に低いものであるが（Reumers et al., 2011）、我々は、これらの腫瘍について報告された１，４２６のフレームシフトインデル（１２８４の遺伝子中、ＭＭＲ遺伝子は含まず）の各々を選択し、さらに、候補遺伝子アプローチによって選択された２９のホモポリマーの個別の評価に基づくＴＣＧＡによって同定された、１９のインデルも選択した。注目すべきことに、インデルに影響を受けた１，３０３の遺伝子のＩＰＡ解析は、「ＤＮＡ損傷応答におけるＢＲＣＡ１の役割」を再度最高に濃縮された経路として確認した（Ｐ＝０．０１４８）。この経路において変異した遺伝子としては、特にＲＡＤ５０、ＡＴＲ、ＢＬＭおよびＣＨＥＫ１が挙げられる（それぞれ７、５、２、１の突然変異；図６）。
【０２５９】
８．３  ＭＭＲ欠損細胞におけるＨＲ経路によるＤＳＢ修復の不活性化
ＨＲ経路によるＤＳＢ修復が、ＭＭＲ欠損腫瘍で機能的に不活性化されているかどうかを調べるために、８例のＭＭＲ欠損および４例のＭＭＲ熟達の原発腫瘍培養物および癌細胞株において、ＤＳＢ修復活性を評価した。これらの細胞のＭＭＲ状態は、５６マーカーパネルを用いて解析し、ベセスダパネルによって確認した。
９例の原発性子宮内膜および卵巣腫瘍細胞培養物は、ルーベン（ベルギー）のGasthuisberg大学病院の婦人科腫瘍部門で手術を受けた患者から樹立された。インフォームドコンセントを提供した場合にのみ、患者は研究に含められた。以下のプロトコルを用いて、原発腫瘍培養物を生成した。まず、腫瘍試料を、手術室から細胞培養実験室への移送のために、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０００Ｕ／ｍｌ）およびファンギゾン（０．５μｇ／ｍｌ）を補足した滅菌ＲＰＭＩ培地（全てLife Technologiesより）に入れた。細胞組織は、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびファンギゾンを補足したＰＢＳで洗浄し、殺菌した刃で組織を細かくした。腫瘍組織を、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびファンギゾンを補足したＲＰＭＩ培地（Life Technologies）中のコラゲナーゼＩＶ型（１ｍｇ／ｍｌ；Roche）を用いて消化した。ＤＮアーゼＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ；Roche）を消化培地に添加した。消化は、３７℃で３時間振盪しながら行った。その後、単一細胞懸濁液を７０μｍのフィルターを通した濾過により調製し、赤血球を、塩化アンモニウム溶液（Stem Cell Technologies）を用いて溶解した。単一細胞は最終的に、２５ｃｍ２の培養フラスコに播種し、培地を翌日交換した。１〜３週間後、細胞が６０〜７０％の集密度に達した時、線維芽細胞をマウスの抗ヒトＣＤ９０（Clone AS02; Dianova）およびMouse Pan IgG Dynabeads（Life Technologies）によるネガティブな選択を用いて除去した。細胞培養物は、続いて７０〜９０％の集密性に継代し、細胞培養物を異なる継代における細胞バンク中に保存した。表３１は、このプロトコルに従って生成された種々の原発腫瘍培養物のリストである。
【０２６０】
表３１．原発腫瘍細胞培養物
【表３１】
0006578205.tif 000152
原発腫瘍細胞培養物を、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのファンギゾンおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ培地１６４０（Gibco）中で、２０継代まで増殖させた。全ての細胞培養は、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気下３７℃で行った。これらはまた、マイコプラズマ汚染について定期的にモニターし、マイコプラズマの増殖は検出されなかった。 
【０２６１】
ＨＥＣ−１−Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７細胞は全てAmerican Type Culture Collections （ATCC, Manassas, VA, USA）から入手した。ＨＥＣ−１−Ａ細胞は、マッコイ５Ａ培地（Gibco-BRL、Life technologies）中で培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco-BRL）中で培養し、培地には全て、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Gibco-BRL）、２ｍＭのＬグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（全てLife technologiesより）を補足した。全てのヒト細胞は、加湿５％ＣＯ２含有雰囲気下３７℃に維持した。細胞株を表３２に示す。
【表３２】
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【０２６２】
要約
ＭＭＲ欠損腫瘍に、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復に影響を与える機能喪失変異が濃縮されていることを証明したので、この経路も機能的に不活性化されるのかを検討した。このことは関連性があり、なぜならばこれらの変異は、その機能喪失効果を影響を受けないアレルによって補償することができる、ヘテロ接合インデルを表すからである。ＤＮＡ複製中、一本鎖切断（ＳＳＢ）はＤＳＢに変換され、これによってＨＲによるＤＳＢ修復を活性化するため、８例のＭＭＲ欠損腫瘍および４例のＭＭＲ熟達腫瘍（９例の原発腫瘍培養物および３例の癌細胞株）を、ＳＳＢ修復を阻害するＰＡＲＰ阻害剤オラパリブに暴露し、続いて、それぞれＤＮＡ損傷および活性ＨＲの尺度としての、γＨ２ＡＸ−およびＲＡＤ５１陽性病巣を有する細胞の相対数を定量化した。腫瘍はどれもエクソーム配列決定を行っておらず、ＭＭＲ欠損腫瘍の独立したセットを表すために、ＭＭＲ状態を我々の５６マーカーパネルを使用して決定し、ベセスダパネルを用いて確認した。オラパリブなしのＭＭＲ欠損およびＭＭＲ熟達腫瘍培養物の間に、ＲＡＤ５１病巣形成の違いを観察しなかったが（１０±２％の細胞対１３±２％の細胞が、ＲＡＤ５１病巣形成を示した、Ｐ＝０．７４；図７ａ、ｂ）、１０μＭのオラパリブへの曝露は、ＭＭＲ欠損細胞において、ＭＭＲ熟達細胞よりも有意に少ないＲＡＤ５１病巣形成を引き起こした（１９±３％対３７±４％、Ｐ＝０．０２；図７ａ、ｂ）。対照的に、未修復ＤＮＡ損傷の程度をＨ２ＡＸ免疫蛍光により調べると、オラパリブは、ＭＭＲ状態とは無関係に、全細胞においてγＨ２ＡＸ病巣の数を大幅に増加させ（示されず）、ＤＮＡ損傷の程度は、両方の培養物の間で類似していたことを示した。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２欠損細胞において、ＲＡＤ５１病巣の形成はＰＡＲＰ阻害によって完全になくなるため（Farmer et al., 2005）、これらのデータは、ＭＭＲ欠損細胞において、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復が部分的にのみ不活性化されることを示唆する。
【０２６３】
例９．ＰＡＲＰ阻害剤オラパリブはＭＭＲ欠損腫瘍を感作する
ＭＭＲ欠損腫瘍はＨＲ経路によるＤＳＢ修復活性の低下を特徴とするため、我々は、これらの腫瘍を、ＢＲＣＡ１欠損腫瘍と同様に（Farmer et al., 2005）、ＰＡＲＰ阻害により選択的に標的とすることができるという仮説を立てた。全８例のＭＭＲ欠損および４例のＭＭＲ熟達培養物を、用量依存的（１、３および１０μＭ）にオラパリブに暴露し、増殖への影響を評価した。６例のＭＭＲ欠損原発腫瘍培養物の各々を含む個別のＭＭＲ欠損培養物は、オラパリブに暴露されると、用量依存的な増殖の減少を示したが、一方いずれのＭＭＲ熟達細胞も、同様の応答を特徴としなかった。平均して、１、３、および１０μＭのオラパリブは、ＭＭＲ欠損細胞の増殖をそれぞれ１５％、２０％および４２％減少させ（未処置細胞に対して、それぞれＰ＝０．０２、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．００１；図７ｃ）、一方、ＭＭＲ熟達腫瘍では、４８時間において効果は見られなかった（オラパリブの全濃度についてＰ＝ＮＳ；図７ｄ）。全体として、増殖はまた、ＭＭＲ欠損とＭＭＲ熟達瘍の間で非常に有意に異なった（反復測定によりＰ＜０．００１）。それぞれ３μＭおよび１０μＭのオラパリブに暴露されたＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２欠損細胞は、生存率の７８％および９１％の減少によって特徴付けられるため（Farmer et al., 2005；Patel et al., 2012）、これらの「ex vivo」のデータは、ＭＭＲ欠損細胞が、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復の部分的不活性化と一致して、ＰＡＲＰ阻害により感作されていることを確認する。
【０２６４】
xCELLigence Systemによる細胞増殖 
Real-Time Cell Analyzer (RTCA) xCELLigence System（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）を用いて、細胞増殖速度を動的にモニターした。システムは、組織培養Ｅプレートの底面の微小電極を横切る電気インピーダンスを測定する。インピーダンス測定は、細胞数、生存率、形態および接着性についての定量的情報を提供する。５，０００個の細胞／ウェルを、２００μｌの培地中のＥプレート１６（Roche）に播種した。播種の２４時間後、細胞をオラパリブで所望の最終濃度（１、３、１０μＭオラパリブ）に処理した。全てのウェルにおける最終ＤＭＳＯパーセントは０．１％であった。各処理条件はトリプリケートで測定した。動的な細胞指数値は、処置後４８時間、５分間隔でモニターした。細胞指数値を、各セル用のビヒクル処理対照に対して正規化した。以下の図は、細胞培養物のそれぞれについて、細胞増殖率を示した（ＭＭＲ欠損細胞は青色で、ＭＭＲ熟達細胞は赤色で表示）。要約すると、ＭＭＲ欠損細胞は、増殖の用量依存の減少を特徴とし、一方ＭＭＲ熟達細胞は、オラパリブに応答しなかった（反復測定により、Ｐ＝２．０Ｅ−７；図７ｃおよびｅ）。
【０２６５】
考察
ここでは、ＭＭＲ欠損腫瘍の最初の全ゲノム配列を決定した。我々は、体細胞置換の大半はヌクレオチド転位から構成されていること、および隣接するヌクレオチドが、どのヌクレオチドが影響を受けるかを決定することに対して重要なコンテクスト依存性の効果を有したことを観察した。驚くべきことに、これらの置換パターンは、生殖細胞系ＤＮＡおよび他の真核生物においても観察され、これらのゲノムにおいて、同様の様式で重要なゲノム特徴と相関していた（Hodgkinson and Eyre-Walker, 2011）。特に我々は、メチル化ＣｐＧ配列における多数の置換を観察して、メチル化シトシンの脱アミノ化の修復にＭＭＲ機構が関与し、非標準的ＭＭＲがゲノムの完全性を維持するために重要であることを実証した。
さらに、脱アミノ化は、ヒトの疾患に関連する変異および進化の基礎をなす最も重要なプロセスの１つである。その観点から、非常によく似たサインが、ＭＭＲ欠損腫瘍からの１０の追加のエクソームに、de novoの生殖細胞系置換に、ならびにヒトおよびマウスのＳＮＰデータベースに観察されたことは興味深い。全体として、これらの観察は、細菌集団と同様に（Saint-Ruf and Matic, 2006）、ヒトにおける不完全なミスマッチ修復が、遺伝的適応を介して自然淘汰に寄与することを示している。
【０２６６】
ハイパーミューテーターにおける変異の約半数が、インデルを表した。重要なのは、ハイスループット配列決定では、インデル検出は非常に高い偽陽性率を抱えているが、我々は、直交技術（orthogonal technology）を使用してインデルの９２．７％を検証した。ほとんどのインデルは、ホモポリマーストレッチに特異的に影響を与える。これには関連性があり、なぜならば、ＭＳＩの診断分類のために現在使用されている拡張ベセスダパネルの感受性が、おそらくはこれが８つのマイクロサテライトと２つのホモポリマーマーカーのみから構成されているために、限られているからである（ＭＬＨ１−、ＭＳＨ２−およびＭＳＨ６欠損腫瘍に対して８０％、８４％および５５％（de la Chapelle and Hampel, 2010））。我々の、エクソーム配列決定により同定されたホットスポット変異の５６マーカーパネルは、ＭＳＩを検出するのに、特に、ＭＬＨ１欠損またはＭＳＨ２欠損よりも頻繁にＭＳＨ６欠損であることが知られているＥＭ腫瘍を検出するのに、より感受性であった。さらに、５６のマーカーのうち４５個はＵＴＲに位置しており、これらはクローン選択を駆動する可能性が低いため、我々は、異なる組織に影響を与える癌においてＭＳＩ−Ｈを検出することができた。最後に、５６マーカーのほとんどが≦１０ｂｐの長さのホモポリマーに位置していたので、これらのマーカーは、種々の低および高スループット遺伝子型決定技術、例えば単一塩基対伸長（Sequenom MassARRAY）、アレル特異的ハイブリダイゼーション（TaqMan）技術、および融解曲線分析（ＨＲＭ含む）などと互換性がある。ベセスダにおける最も感受性の高いマーカー（ＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６）は明らかにあまり互換性がなく、それは、これらが２５および２６ｂｐのホモポリマー中のインデルを検出するからである。興味深いことに、我々はエクソーム中にいくつかのインデルを観察し、これらの全ては機能喪失変異を表し、ホットスポット変異として発生した。平均して各腫瘍は、３０のホットスポット変異を含んでおり、これは、ＭＭＲ熟達腫瘍の以前の癌配列決定と比較して、はるかに高い（Nik-Zainal et al., 2012；Rausch et al., 2012）。経路解析はさらに、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復が突然変異において濃縮されていることを明らかにした；平均して３つの突然変異が、各腫瘍においてこの経路に影響を与えた。ＭＲＥ１１ＡまたはＲＡＤ５０などのＤＳＢ修復遺伝子の変異は以前に報告されているが、これらの研究は経路よりもむしろ、個別の遺伝子の特定の変異に着目し、そのため、これらの遺伝子の１つにおいてＭＭＲ欠損腫瘍の一部が変異していることのみを証明することができた（Miquel et al., 2007）。さらに、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２欠損細胞、ならびにFanconi貧血またはその他のＨＲ関連の遺伝子が欠損した細胞が、ＰＡＲＰ阻害剤に選択的に高感受性であることは、良好に証明されているにも関わらず（Murai et al., 2012）、ＭＭＲ欠損細胞株のＰＡＲＰ阻害に対する選択性を実証するデータは、決定的ではなかった。これまでの最も有望な研究によれば、ＭＲＥ１１の発現レベルとＰＡＲＰ阻害剤ＡＢＴ−８８８に対する細胞毒性との間の、弱いが有意な相関が観察されたが、しかしＭＳＳ細胞株におけるＭＲＥ１１のその後のノックダウンは、阻害剤の高濃度において、増殖を適度にのみ変化させた（Vilar et al., 2011）。これとは対照的に、我々の仮説なしの発見、すなわち、ＨＲによるＤＳＢ修復が、我々自身のデータセットおよび公共のＴＣＧＡデータセットの両方において、ＭＭＲ欠損ＥＭおよびＣＲＣ腫瘍における機能喪失変異によって影響を受けるトップ経路であることは、経路におけるいくつかの遺伝子の突然変異が協働して、ＭＭＲ欠損腫瘍におけるＨＲによるＤＳＢ修復を不活性化することを示唆する。各ＭＭＲ欠損原発腫瘍培養物は、ＭＲＥ１１変異のないものであっても、オラパリブのチャレンジにより用量反応効果を示したとの知見は、これらのヘテロ接合変異の累積効果を機能的に確認する。
【０２６７】
いくつかのＰＡＲＰ阻害剤、例えばオラパリブ（ＡＺＤ２２８１）、ベリパリブ（ＡＢＴ−８８８）およびニラパリブ（ＭＫ−４８２７）などが開発されている。これらの阻害剤の初期の研究は、過剰な毒性を引き起こすことなく、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２変異を有する乳癌または卵巣癌患者において著しい臨床的有益性を明らかにした（Tutt et al., 2010）。これらの有望な結果にもかかわらず、ＰＡＲＰ阻害剤は、いまだに承認されていない（Maxwell and Domchek, 2012）。主なハードルの１つは、費用効果的な、ＦＤＡ承認の診断試験の欠如である。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２変異検査のための診断試験はＦＤＡに承認されておらず、関連するコストは非常に高い。その結果、製薬会社は、ＰＡＲＰ阻害剤の第３相臨床研究の開始を躊躇していた（Maxwell and Domchek, 2012）。ＭＭＲ欠損腫瘍がＰＡＲＰ阻害に対して感受性であるという我々の観察は、この点で非常に興味深い。第１に、我々の研究は、ＰＡＲＰ阻害に感受性となる可能性のある腫瘍の第２のサブグループを同定する。ＭＳＩ腫瘍はＣＲＣおよびＥＭ腫瘍のごく一部のみを表していると考えられるかもしれないが、ＭＳＩ腫瘍を有し利益を得ることができる絶対的な患者集団は、ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２突然変異または他の標的薬剤を有する患者集団と比べて、より大きくはないにしても同等に大きい。第２に、ＭＳＩ腫瘍についてのコンパニオン診断試験は、ベセスダパネルなどの伝統的な方法を使用するか、または頻繁なホットスポット変異のプロファイリングを介して、すでに利用可能である。したがって我々の観測結果の臨床現場への翻訳は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異キャリアに対するより迅速に進む可能性があり、我々のより高い感受性かつ自動化可能／スケーラブルなマーカーパネルを通してさらに加速できるかもしれない。第３に、ＭＳＩ腫瘍における標的処置オプションに対して、多大な臨床的必要性が存在する。特に、ＭＳＩを有するステージＩＩまたはＩＩＩのＣＲＣ腫瘍は、適度に改善された予後を特徴としているが、進行状態でのＭＳＩ腫瘍には、化学療法レジメンに関わらず、より多くの腹膜転移と全体的にさらに悪化した生存が関連する（Smith et al., 2013）。
さらに、ＰＡＲＰ阻害に対する臨床的抵抗性は、完全長ＢＲＣＡ１または２タンパク質を復元する二次変異に起因し、こうして腫瘍細胞においてその機能が再確立されるが（Barber et al., 2012）、かかるメカニズムは、体細胞変異によって影響を受けるＤＳＢ修復遺伝子の各々には生じにくい。これは、ＭＭＲ欠損腫瘍がＰＡＲＰ阻害剤に対する抵抗性を発生しにくく、長期的および治療的に、阻害剤をより価値あるものにすることを示唆する。
【０２６８】
材料および方法 
ミスマッチ修復欠損の検出：腫瘍および対応する生殖細胞試料におけるＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６発現を評価するために、免疫組織化学を、以下のモノクローナル抗体を用いて実施した：ＭＬＨ１（ＤＡＫＯ）に対してクローンＥＳ０５、ＭＳＨ２に対してクローンＧ２１９−１１２９（BD Pharmagen）、およびＭＳＨ６に対してクローンＥＰ４９（Epitomics）。ＭＬＨ１プロモーター領域の過剰メチル化状態は、SALSA MS-MLPAキット（MRC-Holland）を用いて決定した。ＭＳＩ状態は、拡張ベセスダパネルによって検出した。
試料選択および調製：１４例の子宮内膜、３例の結腸直腸および３例の卵巣の腫瘍−正常ペアを、配列決定用に選択した。腫瘍ＤＮＡは、新鮮凍結腫瘍組織から抽出した。全ての試料は、原発性化学療法未処置の腫瘍を表した。これらの２０例の試料についての対応する正常なＤＮＡは、末梢白血球から抽出した。インフォームドコンセントを全ての患者から得た。また、４つの商業的なＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株を配列決定した（DSMZ、http://www.dsmz.de/から入手したＤＮＤ４１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＳＵＰＴ１およびＲＰＭＩ−８４０２）。ＤＮＡは、全ての試料についてQiagen DNAeasyキットを用いて抽出した。
【０２６９】
全ゲノム配列決定：３例のＥＭおよび２例の卵巣のペアを含む、５例の腫瘍−正常ペアを、全ゲノム配列決定のために選択した。ペアエンド配列決定は、一次データ解析（画像解析、塩基コール、アラインメントおよびバリアントコール）を含むComplete Genomics（登録商標）サービスを使用して行った。CGAtools（http://cgatools.sourceforge.net）のcalldiff法を用いて、体細胞突然変異を選択した。各体細胞変異について、CGAtoolsは、コールされた体細胞突然変異の信頼性を反映した体細胞スコアを報告する。より高いスコアは信頼性の増加を示す。Sequenom MassARRAYによって生成された検証データを用いて、真の体細胞変異を選択して偽陽性配列決定エラーを除外するための最適なカットオフを決定した。体細胞スコアのカットオフを全ての体細胞変異リストに適用し、さらなる解析に対しては、これらの閾値よりも高いスコアの変異のみを使用した。
【０２７０】
ＭＭＲ欠損腫瘍のエクソーム配列決定：１５例の子宮内膜、結腸直腸および卵巣の腫瘍−正常ペアのエクソームを、TruSeq Exome Enrichment Kit（イルミナ）を使用して捕獲した。ペアエンド配列決定は、HiSeq2000上TruSeq SBSキットを用いて実施した（ＥＭおよび卵巣試料に対して２×７５ｂｐ、ＣＲＣ試料に対して２×１００ｂｐ）。４つの白血病ゲノムのエクソームは、NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0を使用して捕獲した。ペアエンド配列決定（２×５０ｂｐ）は、HiSeq2000上TruSeq SBSキットを用いて行った。全エクソームについて、ＢＷＡを用いて、各配列決定レーンからの生のリードを、デフォルトパラメータを用いてヒト参照ゲノムにアラインメントさせた。アラインメントさせたリードを処理し、SAMtools（v.0.1.13）でソートし、ＰＣＲ重複は、Picard MarkDuplicatesで除去した。塩基の再校正、インデルの周りの局所的再アラインメント、および単一塩基のバリアントコールは、GenomeAnalysisToolKit（McKenna et a.l, 2010）（GATK v1.0.4487）を使用して行った。置換は、GATK Unified Genotyperを使用してコールし、一方インデルは、Dindel（Albers et al., 2011）（v1.01）を用いて検出した。置換の初期品質のフィルタリングは、GATKバリアントコール元によって提供される品質スコアに基づいて実施した。変異は、品質スコアが腫瘍および対応する正常試料内でＱ３０よりも大きい場合にのみ、保持された。
全ゲノムおよびエクソームデータのアノテーションの付加：全ゲノム配列データに、ANNOVARおよびUCSC RefGene hg18アノテーショントラックを使用してアノテーションを付加した。反復領域は、「grepseq」（http://code.google.com/p/grepseq/）を用いて決定した。マイクロサテライトは、少なくとも２つの反復単位から構成され６塩基の最小長さの、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサヌクレオチド反復として定義され、ホモポリマーは、６塩基の最小長さのモノヌクレオチド反復として、短いホモポリマーは、３、４、または５塩基の長さのモノヌクレオチド反復として定義された。反復領域へのアノテーションの付加は、BEDtoolsのintersectBedコマンドを使用して行った。
【０２７１】
全ゲノムおよびエクソームデータの利用可能性：全ての全ゲノムおよびエクソームデータのフィルタリングされていない統合バリアントファイルは、European Genotype Phenotype Archive（http://www.ebi.ac.uk/ega）に、制限されたアクセスの下で、アクセッション番号EGAS00001000182およびEGAS00001000158として寄託された。
原発腫瘍培養物および免疫蛍光：９例の原発性子宮内膜および卵巣腫瘍細胞培養物は、手術を受けた患者の腫瘍から樹立した。原発腫瘍細胞培養物を、２０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのファンギゾンおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）中で、２０継代まで増殖させた。２５，０００細胞／ウェルを、４００μｌの培地中の８ウェルスライド（Nunc）上に播種し、２４時間増殖させた。０または１０μＭのオラパリブへの曝露後に、スライドをＰＢＳですすぎ、３７℃のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００で透過処理し、ＢＳＡでブロックした。細胞は、マウス抗ホスホ−ヒストンＨ２Ａ．Ｘモノクローナル抗体（Millipore clone JBW301、１：１００）またはウサギ抗Ｒａｄ５１（Ｈ−９２）ポリクローナル抗体（Santa Cruz H-92、１：１０００）で染色し、ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００で洗浄した。Alexa Fluor 488（Invitrogen）を使用して、スライドを、ＤＡＰＩを含有するProlong Gold Antifade試薬（Molecular Probes）中にマウントした。病巣陽性細胞のパーセンテージ（核当たり＞５の病巣）を、Plan-Neofluar４０×／１．３油浸対物レンズを使用してZeiss LSM 510倒立共焦点顕微鏡で測定した。各実験について、少なくとも１００個の核を分析した。
細胞増殖：Real-Time Cell Analyzer（RTCA）xCELLigence System（Roche）を用いて、細胞増殖速度を動的にモニターした。５，０００個の細胞／ウェルを、２００μｌの培地中のＥ−プレート１６（Roche）に播種した。オラパリブ（AZD-2281, JS Research Chemicals Trading）をＤＭＳＯに溶解した。播種の２４時間後、細胞をオラパリブ（１、３、１０μＭのオラパリブ）で処理した。各条件はトリプリケートで測定し、全ての実験は、異なる時点においてデュプリケートで行った。動的な細胞指数値は、処理後４８時間モニターした。
【０２７２】
材料
マウス抗ホスホ−ヒストンＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）モノクローナル抗体（クローンＪＢＷ３０１）はMillipore Corporation, Billerica, MA, USAから入手した。ウサギ抗Ｒａｄ５１（Ｈ−９２）ポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USAから入手した。オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１、バッチ３−８／１０）は、JS Research Chemicals Trading, Schleswig Holstein, Germanyから購入し、ＤＭＳＯ中の原液として調製し、１０アリコートを使用まで−２０℃で保存した。オラパリブは、プレートのウェルにて１：２０希釈の前に、それぞれの培地でさらに１：５０に希釈した。
【０２７３】
γＨ２ＡＸ免疫染色
オラパリブ処理時の未修復のＤＮＡ損傷の程度は、γＨ２ＡＸ免疫蛍光で測定した。ＤＮＡに二本鎖切断がある場合に、Ｈ２ＡＸはセリン１３９上でリン酸化され、γＨ２ＡＸと呼ばれる。γＨ２ＡＸ免疫染色のために、２５，０００個の細胞／ウェルを４００μｌの培地中の８ウェルLab-tek Permanox Chamberスライド（Nunc）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。続いて、２４時間のインキュベーション後、細胞を、０または１０μＭのオラパリブに暴露し、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中３７℃にて１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００で５分間の透過処理および、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１０分間のブロッキングを、両方とも室温で行った。細胞は、１：１００希釈のマウス抗ホスホ−ヒストンＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）モノクローナル抗体（クローンＪＢＷ３０１、Millipore）で染色した。一次抗体は、Alexa Fluor-488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Alexa）で可視化し、ＤＡＰＩを有するProlong Gold Antifade試薬（Molecular Probes）中にマウントした。１０μＭのオラパリブ処理は、γＨ２ＡＸ病巣の数を、ＭＭＲ状態に関係なく全ての細胞におけるベースラインと比較して、４〜６倍増加させ、ＤＳＢ  ＤＮＡ損傷の程度が、両方の培養物の間で類似していたことを示した。
【０２７４】
Ｒａｄ５１の免疫染色
ＲＡＤ５１タンパク質は、ＨＲ経路によるＤＳＢ修復復に重要な役割を果たし、ＲＡＤ５１陽性病巣の形成は、ＨＲによる継続中のＤＳＢ修復のマーカーとして使用される。ＲＡＤ５１免疫染色を行うために、２５，０００細胞／ウェルを、４００μｌの培地中の８ウェルのLab-tek Permanox Chambeスライド（Nunc）上に播種し、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間、オラパリブによる処理までインキュベーションした。２４時間のインキュベーションおよび０または１０μＭオラパリブへの暴露の後、細胞を室温にてＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００を有する３％パラホルムアルデヒド中に、３７℃で２０分間固定した。スライドを、１：１０００希釈のウサギ抗Ｒａｄ５１（Ｈ−９２）ポリクローナル抗体（Santa Cruz H-92）で４℃にて１６時間染色し、次にＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００で１５分間、４回洗浄した。一次抗体は、Alexa Fluor-488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Alexa）で可視化し、ＤＡＰＩを有するProlong Gold Antifade試薬（Molecular Probes）中にマウントした。
共焦点顕微鏡法
γＨ２ＡＸおよびＲＡＤ５１病巣は、Plan-Neofluar４０×／１．３油浸対物レンズおよび、４８８と７５０ｎｍの励起波長（Chameleonコヒーレント二光子レーザー）を用いて、Zeiss LSM 510倒立共焦点顕微鏡で可視化した。焦点最大投影を介して、画像を、０．５μｍの切片厚さの、１．２０μｍ離れた光学的断面から取得した。画像は、LSM510ソフトウェアを用いて処理した。＞５個の病巣を有する核は陽性とし、培養物および条件当たり、少なくとも１００個の核をカウントした。
【０２７５】
参考文献
【表３３】
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【０２７６】
【表３４】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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