(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド分析物を配列決定するための装置であって、
・第１ゾーンの中に置かれた粒子に結合した前記分析物の分子の漸進的消化により単一ヌクレオチドのストリームが生成され、該ストリームが流動水性媒体にさらされる第１ゾーンと；
・前記水性媒体と前記ヌクレオチドストリームとから対応する水性液滴のストリームが生成され、少なくとも一部の前記液滴が単一ヌクレオチドを含有する、第２ゾーンと；
・各液滴が保存および／または調査されて、それが含有し得る前記単一ヌクレオチドに特徴的な特性が明らかにされる第３ゾーンとを備え、
前記第１ゾーンは前記水性媒体が流れるマイクロ流体チャネルを備え、前記マイクロ流体チャネルは、吸引力を適用でき、その中に前記粒子を密着させることができるくぼんだ台座を前記マイクロ流体チャネルの壁に備えることを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記くぼんだ台座は、前記第２ゾーンのすぐ上流に置かれることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記粒子には、前記分析物分子が物理的または化学的に結合することが可能な表面を有するビーズが含まれることを特徴とする、請求項１または２の何れかに記載の装置。
【請求項４】
前記消化方法は、エキソヌクレアーゼ分解、加リン酸分解、または加ピロリン酸分解から選択されることを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載の装置。
【請求項５】
前記第３ゾーンは、レーザーとラマン散乱光を検出する光検出器とを備えることを特徴とする、請求項１〜４の何れかに記載の装置。
【請求項６】
前記分析物を構成する核酸塩基種の１つに対し選択的な少なくとも１つの単一ヌクレオチドプローブを前記第２ゾーンまたは第３ゾーンの少なくとも一方において含有する水性媒体を、処理できることを特徴とし、前記プローブは、それが単一ヌクレオチドを捕捉し、続いてエキソヌクレアーゼ分解されて初めて実質的に蛍光発光することが可能である、請求項１〜５の何れかに記載の装置。
【請求項７】
前記プローブを、各液滴が生成される前に、その際に、またはその後に、前記水性媒体に導入する手段をさらに備えることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記第３ゾーンは、各液滴を、液滴受け取り場所のアレイを含む表面にプリントするように適合させたプリンターノズルを備えることを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の装置。
【請求項９】
前記第３ゾーンは、各液滴から放出される蛍光放射を検出するための調査手段を備えることを特徴とする、請求項１〜８の何れかに記載の装置。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）流動水性媒体にさらされた粒子に結合した分析物分子の漸進的加ピロリン酸分解により単一ヌクレオチド三リン酸のストリームを生成するステップと；
（ｂ）前記水性媒体および前記単一ヌクレオチドストリームから液滴ストリームを生成するステップであって、少なくとも一部の前記液滴が単一ヌクレオチドを含有するステップと；
（ｃ）各液滴を保存および／または調査し、それが含有し得る前記単一ヌクレオチドに特徴的な特性を検出するステップとを含み、
ステップ（ａ）はさらに、吸引力を適用することが可能なマイクロ流体チャネル内の密着性のくぼんだ台座に、前記粒子を固定するサブステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記水性媒体は、所定の地点において、前記分析物を構成するヌクレオチド三リン酸種の１つを捕捉することに対し選択的な、少なくとも１つの単一ヌクレオチドプローブを含有することを特徴とし、前記プローブは、それらが単一ヌクレオチドを捕捉し、続いてエキソヌクレアーゼ分解されて初めて実質的に蛍光発光することが可能である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブは、（ａ）検出不能状態の特徴的なフルオロフォアで標識された第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記第１オリゴヌクレオチド上の相補的な領域にハイブリダイズすることが可能な第２一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第３一本鎖オリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２オリゴヌクレオチドおよび前記第３オリゴヌクレオチドは、単一オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド領域であり、その結果、前記標的単一ヌクレオチドを付加すると、エキソヌクレアーゼ分解に対し耐性のある一本鎖クローズドループが生成されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブはオリジナルの流動水性媒体内に含有されるか、または、液滴が生成された後、各液滴に後から直接導入されることを特徴とする、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記粒子には、前記分析物分子が結合する反応性表面を有するビーズが含まれる、請求項１０〜１４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、天然物由来の遺伝物質またはその合成アナログに由来するＲＮＡおよびＤＮＡ断片などのポリヌクレオチドを配列決定するための改良された装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝物質の次世代配列決定は、ますます高速化する配列決定機の上市に伴い配列決定の単価が下落しているように、すでに生物科学全般、とくに医学に顕著な影響を与えている。当社の先願、国際公開第２０１４／０５３８５３号および国際公開第２０１４／０５３８５４号において、当社は、ポリヌクレオチド分析物を漸進的に消化して単一核酸塩基ヌクレオチド（以後、「単一ヌクレオチド」）のストリーム、好適には加ピロリン酸分解により生成されたその順序づけられたストリームを生成し、これをそれぞれ微小液滴ストリームの対応液滴中に１つずつ捕捉することが可能な、新しい配列決定法および関連の装置について記載した。その後、各液滴を化学的および／または酵素的に操作して、それが元来含む特定の単一ヌクレオチドを明らかにすることが可能である。一実施形態では、これらの化学的および／または酵素的な操作には、分析物を構成する単一ヌクレオチド種の１つ、例えば、天然発生のＤＮＡの場合は核酸塩基シトシン、チミン、グアニン、およびアデニンに対応する４種のうち１つを選択的に捕捉することができるようにそれぞれ適合させた、１つまたは複数の二成分オリゴヌクレオチドプローブ種を使用する方法が含まれる。典型的には、このようなプローブ種のそれぞれにおいて、２つのオリゴヌクレオチド成分のうち１つが独特で特徴的なフルオロフォアを含み、プローブが未使用の状態では、これらのフルオロフォアの蛍光発光能は、近接配置されたクエンチャの存在か、または自己消光の何れかにより失われた状態で維持されている。その後、いったん特定のプローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉したら、それはエキソヌクレアーゼ分解されやすくなることから、フルオロフォアはクエンチャからおよび／または互いに分離し、その特徴的な波長で自由に蛍光発光することが可能になる。これにより、各液滴に元来存在する単一ヌクレオチドの性質を分光分析により推測することが可能である。
【０００３】
J. Biotech. 102 (2003), pp.1-14、米国特許出願公開第２００８／０１９４０１２号明細書、およびLab on a Chip (2012), pp.906-915は、種々の異なる目的のためのビーズの真空固定について教示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当社はこのたび、最初のポリヌクレオチド消化のステップを容易かつ確実に実行することを可能にするこの種の配列決定法と共に用いられ、多重化して数千の液滴生成部位とともに機能させることが可能な改良型の装置を開発した。改良には、分析するポリヌクレオチド（以後、分析物）をまず粒子の表面に固定することと、その後、該粒子を、それに負圧勾配を適用することにより、消化が起こり得る装置内のある場所に固定することが含まれる。当社は、米国特許第６４７１９１７号明細書が、編成されたアレイに固体小ビーズを置くシステムおよび技法について以前記載していることを承知しているが、当社が知る限り、そのような技法が流動下で単一分子を保持することまたは単一分子の配列決定アプリケーションに適用されたことはない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の第１態様により、ポリヌクレオチド分析物を配列決定するための装置であって、
・第１ゾーンの中に置かれた粒子に結合した前記分析物の分子の漸進的消化により単一ヌクレオチドのストリームが生成され、該ストリームが流動水性媒体にさらされる第１ゾーンと；
・前記水性媒体と前記ヌクレオチドストリームとから対応する水性液滴のストリームが生成され、少なくとも一部の前記液滴が単一ヌクレオチドを含有する、第２ゾーンと；
・各液滴が保存および／または調査されて、それが含有し得る前記単一ヌクレオチドに特徴的な特性が明らかにされる第３ゾーンとを備え、
前記第１ゾーンは前記水性媒体が流れるマイクロ流体チャネルを備え、前記場所は、第１ゾーンの壁に、吸引力を適用でき、その中に前記粒子を密着させることができるくぼんだ台座を備えることを特徴とする、装置を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の装置は、単一ヌクレオチドのストリーム、好適には順序づけられたストリームが、酵素を用いてポリヌクレオチド分析物を漸進的に消化することにより生成されるゾーンを備える。一実施形態では、この漸進的消化には、エキソヌクレアーゼを用いたエキソヌクレアーゼ分解が含まれる。別では、それには、ホスホリラーゼを用いた加リン酸分解が含まれる。さらに別では、消化には、ポリメラーゼを用いた加ピロリン酸分解が含まれる。選択された特定の形式の消化に応じて、分析物は一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のポリヌクレオチドであってよく、該分析物は、長さを原則的に無制限とすることが可能なヌクレオチド鎖、例えば、ゲノム断片に見られる数百万以下のヌクレオチドまたはヌクレオチド対を有することができる。一実施形態では、そのため、分析物の長さは少なくとも５０、好適には少なくとも１５０のヌクレオチドまたはヌクレオチド対となろう。適切にはその長さは５００超、１０００超、および一部の場合では５０００＋のヌクレオチド対となろう。分析物自体は、適切には天然物由来のＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、植物、動物、バクテリア、またはウイルスに由来する遺伝物質）からなるが、ただし、本方法は、部分的もしくは全体的に合成のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または、実際には、自然の中では一般的に見られないヌクレオチド塩基からなるヌクレオチド、つまり、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外の核酸塩基を有するヌクレオチドで全体的または部分的に構成されている他の核酸の配列決定にも等しく適用することができる。このような核酸塩基の例としては、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、および２−Ｏ−メチルウリジンが挙げられる。エキソヌクレアーゼ分解、加リン酸分解、および加ピロリン酸分解の場合、生成される単一ヌクレオチドはそれぞれ、分析物がＤＮＡかＲＮＡかに応じて、正確な形状を有するヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオシド三リン酸である。
【０００７】
あるバージョンの装置では、分析物は３´−５´方向に漸進的に加ピロリン酸分解されて単一ヌクレオチド三リン酸のストリームが生成され、その順序は分析物の配列のそれに対応している。加ピロリン酸分解自体は、概して、ポリメラーゼを含む反応媒体の存在下で２０〜９０℃の範囲内の温度で行われる。適切には、それはまた、単一ヌクレオチドが流動水性媒体により粒子の周りの加ピロリン酸分解領域から連続的に除去されるように行われる。この除去は液滴が生成される出口で、または該出口のすぐ隣で起き得る。一実施形態では、この媒体は緩衝化され、また、加ピロリン酸分解反応を維持するために必要な他の成分（ポリメラーゼ、ピロリン酸アニオン、マグネシウムカチオンなど）を含有する。別では、それは追加で、（ａ）以下で特定するプローブ種（または、同等の機能を有するプローブ）と；（ｂ）プローブを関連の単一ヌクレオチドに結合および捕捉させるのに必要な種々の化学物質および酵素（例えば、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ）と、（３）後続の、使用済みプローブをエキソヌクレアーゼ分解するのに必要な酵素とのうち１つまたは複数を含有する。代わりに、これらの成分の一部またはすべてを、第３ゾーンの上流の他の地点で、一緒にまたは段階的に流動水性媒体または液滴（場合によって）に導入することができる。このように、これらの成分を直接液滴に後から導入することは、例えば、注入器を用いた注入または液滴合体により達成することが可能である。 
【０００８】
好適には、装置は、加ピロリン酸分解の速度が可能な限り早いように設計され、一実施形態では、この速度は毎秒１〜５０の単一ヌクレオチドの範囲内にある。ポリヌクレオチドの漸進的分解に適用されるような加ピロリン酸分解反応についてのさらなる情報は、例えばJ. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028にある。
【０００９】
本発明の装置では、消化の対象となる分析物分子は、適切には粒子に予め結合している。一実施形態では、この粒子には、ガラス、シリカ、アルミナ、金属、または非分解性ポリマーなどの不活性物質でできたビーズ、例えばマイクロビーズが含まれる。別の実施形態では、ビーズは、該ビーズが装置に導入され所望の場所まで磁気的に運ばれることを可能にする磁性材料からなる。
【００１０】
好適には、粒子はさらに、分析物に物理的または化学的に結合するように特異的に適合させた外面を備える。原則的に何れを用いても分析物をそのように結合させることができる、多くの方法がある。例えば、１つのアプローチとして、ガラスビーズの表面を、エポキシシラン、アミノヒドロカルビルシラン、またはメルカプトシランなどの官能化シランでプライミングすることが挙げられる。こうして生成された反応性部位は、次に、末端アミン、スクシニル、またはチオール基を含むように相応に修正された分析物の誘導体で処理することが可能である。一実施形態では、化学的結合は、アダプターオリゴヌクレオチドへのライゲーションまたはビオチン−ストレプトアビジン結合を介して起き得る。
【００１１】
別の実施形態では、このようにプライミングされた粒子は、分析物の１分子のみがそれに結合可能であるように、反応性部位を１つのみ有するだろう。これは、さもなければ不所望なことに多数の分子が結合することになるため、分析物がポリヌクレオチド小断片の場合は重要である。断片が大きい場合は、立体効果が作用してこのような現象が起きることは妨げられるだろうことから、それほど懸念はない。適切には、粒子の最大直径は１〜５ミクロンの範囲だろう。
【００１２】
装置で利用される第１ゾーンは、適切にはマイクロ流体寸法であり、粒子が位置付けられ、負圧勾配の適用により固定され得る少なくとも１つの場所を備える。一実施形態では、第１ゾーンは、ミクロンサイズのチャンバまたは一本のマイクロ流体管などのマイクロ流体チャネルを備え、前記場所は、粒子が密着し得るチャンバまたは管の壁において、円錐台状の台座のようなくぼんだ台座を備える。この配置では、台座のくぼんだ内部は、真空吸引力が適用され得る第２チャネルの入り口に接続している。いったん粒子が所定位置にはまれば、負圧勾配はその後、例えば、連続吸引力を適用することにより、または、くぼんだ台座の内部を真空にしてそれを静的真空下で封止することにより、維持され得る。この機種では、くぼんだ台座は適切には、第２ゾーンのすぐ上流に置かれる。
【００１３】
水性媒体は、空間的かつ時間的に互いに離れ、分析物のヌクレオチド配列の順序に対応した順序で配置された単一ヌクレオチドを含有する液体ストリームの形で第１ゾーンから出てくる。その後、この水性ストリームは次に、第２ゾーンにおいて、水性媒体を適切な寸法および形状の液滴生成ヘッドから、鉱物油または炭化水素油、例えばシリコーン油などの不混和性溶媒を含む流動担体媒体へ前進させることにより、水性液滴、適切には微小液滴の対応ストリームに変化し、その少なくとも一部には単一ヌクレオチドが含まれる。あるいは、および、好適な実施形態では、粒子は、プリンターノズル等の構成要素の上流の第１ゾーンに固定され得、この場合、オプションとして、当該担体媒体はなしで済ませるか、または非流動的にすることができる。所定の微小液滴が２つ以上の単一ヌクレオチドを含有するリスクを避けるため、ノズルにより生成された各充填微小液滴が１〜２０個、好適には２〜１０個の空の液滴で離されるように加ピロリン酸分解ステップにおいて単一ヌクレオチドを放出すること、および／または、第１ゾーンを通る水性媒体の流れを調節することが好ましい。その後、溶媒中の充填されたおよびオプションとして充填されていない微小液滴のストリームを、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って、微小液滴が離散状態に維持され且つ互いに合体する機会を持たないような速度および方法で、第３ゾーンにプリントするか、または流動させる。適切には、用いられる微小液滴の直径は１００ミクロン未満、好適には５０ミクロン未満、より好適には２０ミクロン未満、さらにより好適には１５ミクロン未満である。全てのうち最も好適には、直径は２〜２０ミクロンの範囲内である。１つの実施形態において、第２〜第３ゾーンの微小液滴流量は、毎秒５０〜３０００液滴、好適には１００〜２０００液滴の範囲内である。
【００１４】
第２ゾーンに流体接続した第３ゾーンは、液滴を受け取り、それを保存するように適合させる。一実施形態では、この第３ゾーンは、第２ゾーンの出口地点（例えば、プリンターノズル）に対して相対的に移動可能な、金属またはプラスチックシートまたはスライドガラスなどの表面を備え、実際に各液滴を、インクジェットプリンタに類似した繰り返し可能な方法で該表面の特定の地点にプリントすることを可能にする。この設計の一実施形態では、受け取り面は、ウェルまたは液滴結合部位などの分離した液滴受け取り場所のアレイでパターン化されており、これに各液滴は運ばれ、固定され得る。別の実施形態では、表面は、隣接する液滴が乗り換えおよび合体するのを防ぐのを助ける液滴不混和性液層で予め覆われている。この設計の好適なバージョンでは、この液層は紫外線硬化型モノマーを含み、その結果、いったん全ての液滴受け取り場所が充填されたら、液体は硬化し、液滴を透明の固体ポリマーマトリックスに永久的に封じ込めることができる。
【００１５】
その後、パターン化された表面の各液滴受け取り場所を順に調査して、各液滴が含有し得る単一ヌクレオチドに特徴的な特性を明らかにする。この調査は、装置から離れて、例えば分光計などの別の特化したデバイス内でオプションとして行うことも可能だが、好適にはそれは、第３ゾーンの一体部分である調査手段を用いて実行される。
【００１６】
調査手段により検出される特性は、原則として、直接的または間接的に明らかにされる単一ヌクレオチドの任意の特徴的な特性であり得る。例えば、一実施形態では、各単一ヌクレオシド一リン酸、二リン酸、または三リン酸の性質は、場合によっては、各液滴を電磁放射を用いて調査し、ラマン散乱する光を研究することにより直接決定される。この実施形態では、単一ヌクレオチドから生じるラマン散乱を、好適には、刺激を受けてプラズモン共鳴することが可能な金または銀などの金属のコロイドを液滴内に含めることにより、強化する。別の好適な実施形態では、液滴内に存在するフルオロフォアから生じる蛍光放射を測定する。これらの両実施形態において、調査手段には、集束入射光、例えばレーザー光線の光源と；ヌクレオチドの振動モードまたはフルオロフォアの蛍光モードの何れかの、特徴的な波長または波長エンベロープに合わせた光検出器等のデバイスと；表面において、入射光源、光検出器、および液滴を互いに相対的に移動させるための手段（例えばメカニカルステージ）および入射蛍光の光線を方向付け集束させるための関連した光学素子とが適切に含まれる。
【００１７】
両機種はさらに、調査手段によって生成された分析物の配列に特徴的なデータを分析するための、それと一体になったマイクロプロセッサを備え得る。あるいは、この任務は、所望によりスタンドアローンのコンピュータを用いて遠隔で遂行することが可能である。
【００１８】
装置は、液滴を生成し調査するのに特に有用であり、ここにおいて、それらが含有する単一ヌクレオチドは、使用されて、その後エキソヌクレアーゼ分解を受けた後にのみ実質的に蛍光することが可能なプローブにより予め選択的に捕捉されている。概して言えば、これは、分析物を構成する種々の単一ヌクレオチドのうち１つに対し選択的な少なくとも１つのプローブ種の分子と、酵素とを一部の地点で備える装置が、例えばポリメラーゼおよび／またはリガーゼを用いて単一ヌクレオチドをそれに対応するプローブへ組み込めるように液滴を処理できるようにすることにより達成される。各液滴はまた、一部の地点で、３´−５´エキソヌクレアーゼまたは同等の活性を示すポリメラーゼ；ピロホスファターゼ、緩衝液、界面活性剤、および生化学技術において慣例的な他の成分を含もう。一実施形態では、一部、全て、または任意の順列のこれらのプローブ、酵素、エキソヌクレアーゼ、および他の成分を、第１ゾーンにおいてオリジナルの水性媒体に導入するか、または、オリジナルの水性媒体の供給装置自体の中に含める。別では、一部、全て、または任意の順列のこれらのプローブ、酵素、エキソヌクレアーゼ、および他の成分を、各液滴が生成される際にまたはその後に、水性媒体に導入する。この場合、これらの物質は、例えば、直接注入するか、または、それらをまず第２液滴ストリームを含む第２液滴に置き、その後、該ストリームからの液滴を第１ストリームの対応する液滴と合体させることにより、導入することができる。
【００１９】
プローブ自体に関しては、有利に用いることのできるあるクラスは、当社の特許出願国際公開第２０１４／０５３８５３号、同第２０１４／０５３８５４号、同第２０１４／１６７３２３号、同第２０１４／１６７３２４号で教示する種々の捕捉システムおよびその利用方法に基づくものであり、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。簡単に言うと、これらのプローブのあるサブクラスは、未使用の状態で、末端がそれぞれ２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合する、一本鎖ヌクレオチド領域を含むことにより特徴付けられる。好適には、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、特徴的な蛍光を示す多数のフルオロフォアとオプションとしてクエンチャを含む。フルオロフォアは、それが示す蛍光が、同数のフルオロフォアが対応する数の単一ヌクレオチドに結合した場合よりも実質的に弱いように、オリゴヌクレオチド領域に配置する。好適には、未使用状態のプローブは、蛍光を全く示さないか、または、実質的に全く示さない。これらのプローブは、ポリメラーゼおよびオプションとしてリガーゼを用いてその対応する単一ヌクレオチドを捕捉して使用済みプローブを生成し、次にエキソヌクレアーゼ分解されてフルオロフォアを担持する多数の単一ヌクレオチドを生成し、次に完全に蛍光発光可能になることにより、機能する。別の好適なサブクラスでは、これらのプローブは２つの成分、捕捉的なｉおよびｊ形状のオリゴヌクレオチドから構成され、その一方または両方が標識され得、これはそれの標的単一ヌクレオチドの存在下で共にハイブリダイズして実質的に二本鎖オリゴヌクレオチドになる可能性があり、これはまた、上記で説明したようにエキソヌクレアーゼにより消化され得る。
【００２０】
係属中の出願であり、参照により本明細書にも組み込まれるＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５２１１９で開示されるさらに別の好適なサブクラスでは、プローブは、（ａ）検出不能状態の特徴的なフルオロフォアで標識された第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記第１オリゴヌクレオチド上の相補的な領域にハイブリダイズすることが可能な第２一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第３一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む。この特定のサブクラスの場合、使用済みプローブは二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で消化されて、検出可能状態の検出可能要素と、少なくとも一部において第１オリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖第４オリゴヌクレオチドとをもたらす。結果として、第４オリゴヌクレオチドを、別の標識した第１オリゴヌクレオチドと反応させて、使用済みプローブに対応する実質的に二本鎖のオリゴヌクレオチド生成物を再度生成することが可能である。これとエキソヌクレアーゼ分解ステップの両方を周期的に繰り返すことにより、蛍光発光することが可能な遊離フルオロフォアの数をカスケード化させて著しく増加させることが可能である。クラスの最も好適なアイテムには、第２および第３のオリゴヌクレオチドが共通の第４オリゴヌクレオチドの単一オリゴヌクレオチド領域を含むプローブが含まれ、該第４オリゴヌクレオチドは、その相補的な標的単一ヌクレオチドを捕捉する際にエキソヌクレアーゼ分解に対し耐性のある一本鎖クローズドループオリゴヌクレオチドを生成し、一連の第１オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびその後のエキソヌクレアーゼ分解の鋳型として機能し得る。
【００２１】
上記より、本発明の装置は、一実施形態において、単一ヌクレオチドを含有する液滴において蛍光を生成するための特定の方法と共に用いるように好適に設計されていることが明らかであろう。したがって、本発明の第２態様により、さらに、ポリヌクレオチド分析物を配列決定する方法であって、
（ａ）流動水性媒体にさらされた粒子に結合した分析物分子の漸進的加ピロリン酸分解により単一ヌクレオチド三リン酸のストリームを生成するステップと；
（ｂ）前記水性媒体および前記単一ヌクレオチドストリームから液滴ストリームを生成するステップであって、少なくとも一部の前記液滴が単一ヌクレオチドを含有するステップと；
（ｃ）各液滴を保存および／または調査し、それが含有し得る単一ヌクレオチドに特徴的な特性を検出するステップとを含み、
ステップ（ａ）はさらに、吸引力を適用することが可能なマイクロ流体チャネル内の密着性のくぼんだ台座に、前記粒子を固定するサブステップを含むことを特徴とする、方法を提供する。
【００２２】
本方法の一実施形態では、水性媒体は所定の地点において、分析物を構成するヌクレオチド種の１つを捕捉することに対し選択的な、少なくとも１つの単一ヌクレオチドプローブを含有し、前記プローブは、それらが単一ヌクレオチドを捕捉し、続いてエキソヌクレアーゼ分解されて初めて実質的に蛍光発光することが可能である。好適には、これらのプローブは上記のクラスの構成要素である。別の実施形態では、プローブはオリジナルの流動水性媒体内に含有されるか、または、液滴が生成された後、各液滴に後から直接導入される。さらに別では、本方法はさらに、各液滴から放出される蛍光放射を検出し、それから配列データを集めることを含むステップ（ｄ）を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本方法は、分析物分子を複数の粒子の表面に結合させ、用いる粒子を選択し選択した粒子を、吸引力によりその場所に結合させるというプレステップを含む。ここでの粒子には、適切には、反応性表面を有するビーズが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の装置をここで、以下の図１および２に示すが、これは本発明の配列決定デバイスを模式的に示し、ここでは単一ヌクレオチドとヌクレオチドを検出するオリゴヌクレオチドプローブシステムとを含有する水性液滴が生成され、調査される。
【図２】本発明の配列決定デバイスを模式的に示す図である。
【００２５】
直径１０ミクロンのチューブ１は、真空吸引力を適用することが可能なサイドチャネル２を備える。２は１と、内部直径が２ミクロンの円形断面の円錐台状開口部３を含む連結点で交わる。直径が４ミクロンの球状ガラスビーズ４を予め１に導入し、３に位置させ、その結果、後者を３の上流の導入地点から１に流すと、その外面のかなりの部分が水性媒体５のストリームに突き出るようにする。１０００個のＤＮＡ核酸塩基二本鎖断片を含む分析物を、ストレプトアビジン結合により４に結合させる。５は、Bst Large Fragment DNA Polymeraseと、それぞれリットルあたり２ミリモル濃度のピロリン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含む、３７℃の緩衝化（ｐＨ７．５）反応媒体を含む。ビーズの温度は３７℃に維持され、これらの条件下でポリメラーゼにより分析物を３´から５´の方向に漸進的に消化することにより単一ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）のストリームが放出され、これは次に、媒体の流動により４の下流に運ばれる。したがって、５の下流部分での単一ヌクレオチドの順番は、分析物におけるその元の配列に対応する。５の下流部分は液滴ヘッド６から第１チャンバ７に入り、ここでそれは、軽質シリコーン油８の１つ以上のストリームと接触する。接触地点におけるこれらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、各直径が約８ミクロンの、油中に懸濁した実質的に水性の球状液滴９を生成するように選択される。９のストリームは次に、同一直径の第２マイクロ流体チューブに沿って毎秒１０００液滴の速度で、５ミクロンの水性球状液滴１１の第２ストリームも第２液滴ヘッド１２を用いて供給される第２チャンバ１０まで前進する。液滴１１は、以下で略述するようなヌクレオチドを検出するオリゴヌクレオチドプローブシステムを含み、９と順次合体し、直径約９ミクロンの肥大した水性液滴１３を形成する。このように生成された液滴１３のストリームは次に、液滴プリンタヘッド１４ａを備えるプリンタアセンブリ１４に運ばれ、ここで各液滴は順に、表面を定義する平面の両軸に沿って移動可能で、個々の液滴を含有するためのウェル１６の二次元アレイでパターン化されたスライドガラス１５にプリントされる。
【００２６】
液滴を次に、スライドガラスの上でインキュベーションした後、プローブシステムで用いられている蛍光色素からの蛍光の励起と検出のために、適切な波長に合わせた１つまたは複数のレーザー１７と検出器１８を含む検出システムにより調査する。確定した閾値以上の所定の波長での蛍光の検出は次に、液滴内の所定の種類の単一ヌクレオチド塩基の存在を示す。したがって、液滴を順に調査すると、元のポリヌクレオチド分析物のヌクレオチド塩基の配列を実質的に読み取ることが可能である。
【００２７】
上記のシステムで用いることができるオリゴヌクレオチドプローブシステムの例についてここで詳しく記載する。
【００２８】
以下のヌクレオチド配列を有する一本鎖第１オリゴヌクレオチド１を用意する。
5'TCGTGCCTCATCGAACATGACGAGGXXQXXGGTTTGTGGT3'
ここにおいて、Ａ，Ｃ、Ｇ、およびＴは関連する特徴的なＤＮＡヌクレオチド塩基を担持するヌクレオチドを表し；Ｘは、従来のアミン結合化学反応を用いてＡｔｔｏ６５５色素で標識したデオキシチミジンヌクレオチド（Ｔ）を表し、Ｑは、ＢＨＱ−２クエンチャで標識したデオキシチミジンヌクレオチドを表す。それはさらに、デオキシチミジン三リン酸ヌクレオチド（ｄＴＴＰ）を捕捉するのに選択的な、捕捉領域（Ａヌクレオチド）を含む。
【００２９】
（１）第１オリゴヌクレオチドの３´末端に対し相補的で、単一塩基ミスマッチが１つある配列を有する第２オリゴヌクレオチド領域と；（２）第１オリゴヌクレオチドの５´末端に対し相補的な配列を有する第３オリゴヌクレオチド領域と；７６塩基対一本鎖リンカー領域とを含む、別の一本鎖オリゴヌクレオチド２も用意する。それは以下のヌクレオチド配列を有する。
5'PCATGTTCGATGAGGCACGATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGATATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAAAAACCTCG3'
ここにおいて、追加として、Ｐは５´リン酸基を表す。
【００３０】
次に、以下の配合に由来するものに対応する成分を有するプローブシステムを含む反応混合物を用意する。
５６μＬ  ５ｘ緩衝液  ｐＨ７．５
２８μＬ  オリゴヌクレオチド１、１００ｎＭ
２８μＬ  オリゴヌクレオチド２、１０ｎＭ
２．８μＬ  ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰを含む）の混合物、１０ｎＭ
０．４Ｕ  Phusion II Hot Startポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ）
１．６Ｕ  Bst Large Fragmentポリメラーゼ
２０Ｕ  大腸菌リガーゼ
４Ｕ  耐熱性無機ピロホスファターゼ
２８０μＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝液は以下の混合物を含む。
２００μＬ  Trizma（登録商標）塩酸塩、１Ｍ、ｐＨ７．５
１３．７５μＬ  ＭｇＣｌ２水溶液、１Ｍ
２．５μＬ  ジチオトレイトール、１Ｍ
５０μＬ  トリトンＸ−１００界面活性剤（１０％）
２０μＬ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１００μＭ
１６６．６７μＬ  ＫＣｌ
１ｍＬまでの水
【００３１】
単一ｄＴＴＰヌクレオチドの存在下では、前記ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド２のうちの１つの３´末端に組み込まれ、クローズドループを用いたプローブを形成するオリゴヌクレオチド２のライゲーションが起きる。混合物を３７℃で５０分間インキュベーションすることにより、このプロセスを実行する。反応媒体を次に７０℃でさらに５０分間インキュベーションし、Phusion IIポリメラーゼを活性化させる。オリゴヌクレオチド１の１つはこの温度で環状化オリゴヌクレオチド２にアニールさせることが可能であり、この二本鎖型においてポリメラーゼにより消化されて、そのフルオロフォアを放出し、検出可能状態にする。次に、さらなるオリゴヌクレオチド１を環状化プローブにアニールさせ、このプロセスを連続サイクルで繰り返し、時が経つにつれて蛍光強度の増大をもたらすことが可能である。
【００３２】
さらに、異なる捕捉部位、配列、およびフルオロフォアを有し、第１プローブセットと組み合わさって、４つのヌクレオチド塩基の捕捉、検出、および識別を達成することを可能にする、類似のオリゴヌクレオチドプローブセットも用意する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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