(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 長さが18〜21アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:1に示される配列を含むポリペプチド、
(b) 長さが49〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:2に示される配列を含むポリペプチド、
(c) 長さが50〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:3に示される配列を含むポリペプチド、
(d) 長さが51〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:4に示される配列を含むポリペプチド、
(e) 長さが51〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:5に示される配列を含むポリペプチド、
(f) 長さが50〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:6に示される配列を含むポリペプチド、
(g) 長さが46〜50アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:7に示される配列を含むポリペプチド、
(h) 長さが46〜50アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:8に示される配列を含むポリペプチド、
(i) 長さが40〜45アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:9に示される配列を含むポリペプチド、
(j) 長さが40〜45アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:10に示される配列を含むポリペプチド、
(k) 長さが56〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:11に示される配列を含むポリペプチド、
(l) 長さが56〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:12に示される配列を含むポリペプチド、
(m) 長さが50〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:13に示される配列を含むポリペプチド、
(n) 長さが50〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:14に示される配列を含むポリペプチド、
(o) 長さが55〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:15に示される配列を含むポリペプチド、
(p) 長さが55〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:16に示される配列を含むポリペプチド、
(q) 長さが58〜65アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:17に示される配列を含むポリペプチド、および
(r) 長さが58〜65アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:18に示される配列を含むポリペプチド
からなる群から選択され、グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
(a) SEQ ID NO:1に示される配列からなる、ポリペプチド、
(b) SEQ ID NO:2に示される配列からなる、ポリペプチド、
(c) SEQ ID NO:3に示される配列からなる、ポリペプチド、
(d) SEQ ID NO:4に示される配列からなる、ポリペプチド、
(e) SEQ ID NO:5に示される配列からなる、ポリペプチド、
(f) SEQ ID NO:6に示される配列からなる、ポリペプチド、
(g) SEQ ID NO:7に示される配列からなる、ポリペプチド、
(h) SEQ ID NO:8に示される配列からなる、ポリペプチド、
(i) SEQ ID NO:9に示される配列からなる、ポリペプチド、
(j) SEQ ID NO:10に示される配列からなる、ポリペプチド、
(k) SEQ ID NO:11に示される配列からなる、ポリペプチド、
(l) SEQ ID NO:12に示される配列からなる、ポリペプチド、
(m) SEQ ID NO:13に示される配列からなる、ポリペプチド、
(n) SEQ ID NO:14に示される配列からなる、ポリペプチド、
(o) SEQ ID NO:15に示される配列からなる、ポリペプチド、
(p) SEQ ID NO:16に示される配列からなる、ポリペプチド、
(q) SEQ ID NO:17に示される配列からなる、ポリペプチド、または
(r) SEQ ID NO:18に示される配列からなる、ポリペプチド
である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項1または2記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項3記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項3記載の核酸または請求項4記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核細胞である、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項1または2に示されるポリペプチドを含む、インスリン分泌を誘導するためのまたは糖尿病を治療するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年2月15日出願の米国仮出願第61/765,276号の恩典を主張するものである。この先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる(参照により本開示に組み入れられる)。
【０００２】
1.技術分野
本明細書は、インスリン分泌性ポリペプチドに関する。例えば、本明細書は、インスリン分泌を誘導する能力を有するポリペプチドに関連した方法および材料、ならびにインスリン分泌を誘導するための、そして糖尿病を治療するための、前記ポリペプチドの使用に関連した方法および材料を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2.背景情報
真性糖尿病(diabetes mellitus)は、高血糖に悩まされる代謝性疾患の一群を指す。それは、膵臓が十分なインスリンを産生しないことによるか、または細胞が産生されるインスリンに応答しないことに起因しうる。高血糖は、頻尿、著しい喉の渇き、および/または増長した空腹感の症状をもたらすことがある。
【０００４】
糖尿病には主に3つのタイプがある。1型糖尿病はインスリンを産生できないことから生じる。2型糖尿病はインスリン抵抗性に起因する。第3の主要な形は、以前に糖尿病と診断されたことのない妊婦が高血糖値を発症するときに起こる、妊娠糖尿病である。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書は、インスリン分泌性ポリペプチドに関連した方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、インスリン分泌を誘導する能力があるポリペプチド、ならびにインスリン分泌を誘導するために、そして糖尿病を治療するために、前記ポリペプチドを使用するための方法および材料を提供する。
【０００６】
本明細書に記載するように、ポリペプチドは、
0006480872.tif 000002
に示されるアミノ酸配列、またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去(subtraction)もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、を含むように設計することができる。例えば、本明細書中でCRRL-090 ISPと呼ばれるポリペプチドは、次のように設計することができる：
0006480872.tif 000003
本明細書に提供される該ポリペプチドは、糖尿病の哺乳動物に投与したとき、血中グルコースを低下させる、血漿インスリンを増加させる、糸球体濾過量(GFR)を増加させる、より少ない左心室肥大を可能にする、および/または心腎臓機能を改善する能力を持ち得る。いくつかの場合には、本明細書に提供されるポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)の特性を持ち得る。
【０００７】
一般的に、本明細書の一局面は、長さが15〜21アミノ酸残基のポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、SEQ ID NO:1に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含むか、該配列から本質的に成る。該ポリペプチドはグルカゴン様ペプチド-1活性を含み得る。該ポリペプチドは、3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に示される配列を含むことができる。
【０００８】
別の局面では、本明細書は、長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、SEQ ID NO:2に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含むか、該配列から本質的に成る。該ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド-1活性および/または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含み得る。該ポリペプチドは、3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に示される配列を含むことができる。
【０００９】
別の局面では、本明細書は、長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、SEQ ID NO:3に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含むか、該配列から本質的に成る。該ポリペプチドはグルカゴン様ペプチド-1活性を含み得る。該ポリペプチドは、3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:3に示される配列を含むことができる。
【００１０】
別の局面では、本明細書は、長さが30〜65(例えば、30〜60、30〜55、30〜50、30〜45、30〜40、35〜65、40〜65、45〜65、50〜65、55〜65、35〜60、40〜60、45〜60、50〜60、55〜60、40〜50、45〜55、35〜45、または55〜65)アミノ酸残基のポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列を含むか、該配列から本質的に成る。該ポリペプチドはグルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、および/または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含み得る。該ポリペプチドは、3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列を含むことができる。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18に示される配列を含むことができる。
【００１１】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、本発明を実施するために使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。コンフリクトの場合には、定義を含めた本明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【００１２】
[本発明1001]
長さが15〜21アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:1に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1002]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:1に示される配列を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1006]
SEQ ID NO:1に示される配列を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1007]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:2に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1008]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1007のポリペプチド。
[本発明1009]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含む、本発明1007のポリペプチド。
[本発明1010]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含む、本発明1007のポリペプチド。
[本発明1011]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:2に示される配列を含む、本発明1007のポリペプチド。
[本発明1012]
SEQ ID NO:2に示される配列を含む、本発明1007のポリペプチド。
[本発明1013]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:3に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1014]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1016]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1017]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:3に示される配列を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1018]
SEQ ID NO:3に示される配列を含む、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1019]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:4に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:4に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1020]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1019のポリペプチド。
[本発明1021]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:4に示される配列を含む、本発明1019のポリペプチド。
[本発明1022]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:4に示される配列を含む、本発明1019のポリペプチド。
[本発明1023]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:4に示される配列を含む、本発明1019のポリペプチド。
[本発明1024]
SEQ ID NO:4に示される配列を含む、本発明1019のポリペプチド。
[本発明1025]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:5に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:5に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1026]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1027]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:5に示される配列を含む、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1028]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:5に示される配列を含む、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1029]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:5に示される配列を含む、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1030]
SEQ ID NO:5に示される配列を含む、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1031]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:6に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:6に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1032]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1031のポリペプチド。
[本発明1033]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:6に示される配列を含む、本発明1031のポリペプチド。
[本発明1034]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:6に示される配列を含む、本発明1031のポリペプチド。
[本発明1035]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:6に示される配列を含む、本発明1031のポリペプチド。
[本発明1036]
SEQ ID NO:6に示される配列を含む、本発明1031のポリペプチド。
[本発明1037]
長さが40〜50アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:7に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:7に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1038]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1039]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:7に示される配列を含む、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1040]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:7に示される配列を含む、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1041]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:7に示される配列を含む、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1042]
SEQ ID NO:7に示される配列を含む、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1043]
長さが40〜50アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:8に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:8に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1044]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1045]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:8に示される配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1046]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:8に示される配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:8に示される配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1048]
SEQ ID NO:8に示される配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1049]
長さが35〜45アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:9に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:9に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1050]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1051]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:9に示される配列を含む、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1052]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:9に示される配列を含む、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1053]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:9に示される配列を含む、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1054]
SEQ ID NO:9に示される配列を含む、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1055]
長さが35〜45アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:10に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:10に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1056]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1055のポリペプチド。
[本発明1057]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:10に示される配列を含む、本発明1055のポリペプチド。
[本発明1058]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:10に示される配列を含む、本発明1055のポリペプチド。
[本発明1059]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:10に示される配列を含む、本発明1055のポリペプチド。
[本発明1060]
SEQ ID NO:10に示される配列を含む、本発明1055のポリペプチド。
[本発明1061]
長さが50〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:11に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:11に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1062]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1063]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:11に示される配列を含む、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1064]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:11に示される配列を含む、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1065]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:11に示される配列を含む、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1066]
SEQ ID NO:11に示される配列を含む、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1067]
長さが50〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:12に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:12に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1068]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1067のポリペプチド。
[本発明1069]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:12に示される配列を含む、本発明1067のポリペプチド。
[本発明1070]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:12に示される配列を含む、本発明1067のポリペプチド。
[本発明1071]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:12に示される配列を含む、本発明1067のポリペプチド。
[本発明1072]
SEQ ID NO:12に示される配列を含む、本発明1067のポリペプチド。
[本発明1073]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:13に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:13に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1074]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1075]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:13に示される配列を含む、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1076]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:13に示される配列を含む、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1077]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:13に示される配列を含む、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1078]
SEQ ID NO:13に示される配列を含む、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1079]
長さが45〜55アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:14に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:14に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1080]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1081]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:14に示される配列を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1082]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:14に示される配列を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1083]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:14に示される配列を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1084]
SEQ ID NO:14に示される配列を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1085]
長さが50〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:15に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:15に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1086]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1085のポリペプチド。
[本発明1087]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:15に示される配列を含む、本発明1085のポリペプチド。
[本発明1088]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:15に示される配列を含む、本発明1085のポリペプチド。
[本発明1089]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:15に示される配列を含む、本発明1085のポリペプチド。
[本発明1090]
SEQ ID NO:15に示される配列を含む、本発明1085のポリペプチド。
[本発明1091]
長さが50〜60アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:16に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:16に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1092]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1091のポリペプチド。
[本発明1093]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:16に示される配列を含む、本発明1091のポリペプチド。
[本発明1094]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:16に示される配列を含む、本発明1091のポリペプチド。
[本発明1095]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:16に示される配列を含む、本発明1091のポリペプチド。
[本発明1096]
SEQ ID NO:16に示される配列を含む、本発明1091のポリペプチド。
[本発明1097]
長さが50〜65アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:17に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:17に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1098]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1097のポリペプチド。
[本発明1099]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:17に示される配列を含む、本発明1097のポリペプチド。
[本発明1100]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:17に示される配列を含む、本発明1097のポリペプチド。
[本発明1101]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:17に示される配列を含む、本発明1097のポリペプチド。
[本発明1102]
SEQ ID NO:17に示される配列を含む、本発明1097のポリペプチド。
[本発明1103]
長さが50〜65アミノ酸残基のポリペプチドであって、SEQ ID NO:18に示される配列、または4つ以下のアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:18に示される配列を含むポリペプチド。
[本発明1104]
グルカゴン様ペプチド-1活性、インスリン分泌を増加させる能力、または粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性を含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1105]
3つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:18に示される配列を含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1106]
2つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:18に示される配列を含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1107]
1つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を有するSEQ ID NO:18に示される配列を含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1108]
SEQ ID NO:18に示される配列を含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1109]
本発明1001〜1108のいずれかのポリペプチドを哺乳動物に投与することを含んでなる、インスリン分泌を誘導するための、または糖尿病を治療するための方法。
本発明の1つ以上の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、こうした説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面の説明
【図１】対照の正常ラットおよびCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)を投与された正常ラットにおいて測定された血中グルコースのレベル(mg/dL)をプロットしたグラフである。
【図２】対照の正常ラットおよびCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)を投与された正常ラットにおいて測定された血漿インスリンのレベル(ng/mL)をプロットしたグラフである。
【図３】対照の正常ラット(対照)、糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置したラット(STZ DM)、および糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置し、続いてストレプトゾトシン処置の2ヶ月後に開始してCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)で1ヶ月間治療したラット(STZ DM + ISP)において測定された血中グルコース(mg/dL)をプロットした棒グラフである。測定は、時間ゼロ(バックグラウンドレベル；BL)、ストレプトゾトシン処置後1ヶ月、ストレプトゾトシン処置後2ヶ月、およびストレプトゾトシン処置後3ヶ月で行った。
【図４】対照の正常ラット(対照)、糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置したラット(STZ DM)、および糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置し、続いてストレプトゾトシン処置の2ヶ月後に開始してCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)で1ヶ月間治療したラット(STZ DM + ISP)において測定された血漿インスリン(ng/mL)をプロットした棒グラフである。各群について、血漿インスリンの測定は、ストレプトゾトシン処置の3ヶ月後に得られた血漿サンプルを用いて行った。
【図５】対照の正常ラット(対照)、糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置したラット(STZ DM)、および糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置し、続いてストレプトゾトシン処置の2ヶ月後に開始してCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)で1ヶ月間治療したラット(STZ DM + ISP)において測定された糸球体濾過量(GFR；mL/分)をプロットした棒グラフである。各群について、糸球体濾過量の測定は、ストレプトゾトシン処置の3ヶ月後に行った。
【図６】対照の正常ラット(対照)、糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置したラット(DM)、および糖尿病を誘発させるために時間ゼロでストレプトゾトシンにより処置し、続いてストレプトゾトシン処置の2ヶ月後に開始してCRRL-090 ISP(1pmol/kg/分)で1ヶ月間治療したラット(DM + ISP)において測定された左心室重量対体重比(LV/BW比；mg/g)をプロットした棒グラフである。各群について、LV/BWの測定は、ストレプトゾトシン処置の3ヶ月後に行った。
【図７】30分間のベースライン期間後に測定された(BL)、表示したポリペプチドによる45分間の注入期間後に測定された(D1；pmolでの量)、または30分間のウォッシュアウト期間後に測定された(W1)、正常なイヌにおける血漿インスリンレベル(μU/mL)をプロットしたグラフである。
【図８】30分間のベースライン期間後に測定された(BL)、表示したポリペプチドによる45分間の注入期間後に測定された(D1；pmolでの量)、または30分間のウォッシュアウト期間後に測定された(W1)、正常なイヌにおける血中グルコースレベル(mg/dL)をプロットしたグラフである。
【図９】30分間のベースライン期間後に測定された(BL)、表示したポリペプチドによる45分間の注入期間後に測定された(D1；pmolでの量)、または30分間のウォッシュアウト期間後に測定された(W1)、正常なイヌにおける血漿cGMPレベル(pmol/mL)をプロットしたグラフである。
【図１０】対照ラットおよびCRRL-092 ISP-NPポリペプチドで処置したラットにおける注入後0分、60分、210分での血漿インスリンレベル(ng/mL)をプロットしたグラフである。
【図１１】対照ラットおよびCRRL-092 ISP-NPポリペプチドで処置したラットにおける麻酔前(BF)、麻酔後(AF)、および注入後0分、60分、120分、180分、210分での血中グルコースレベル(mg/dL)をプロットしたグラフである。
【図１２】対照ラットおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドで処置したラットにおける注入後0分、60分、210分での血漿インスリンレベル(ng/mL)をプロットしたグラフである。
【図１３】対照ラットおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドで処置したラットにおける麻酔前(BF)、麻酔後(AF)、および注入後60分、120分、180分、210分での血中グルコースレベル(mg/dL)をプロットしたグラフである。
【図１４】無処理、または10-10M、10-8M、もしくは10-6MのCRRL-092 ISP-NPポリペプチドもしくはCRRL-093 ISP-NPポリペプチドによる処理にさらされた、GC-A受容体細胞またはGC-B受容体細胞についてのcGMPレベル(pmol/mL)をプロットしたグラフを含む。
【図１５】無処理、または10-10M、10-8M、もしくは10-6MのCRRL-094 ISP-NPポリペプチドもしくはCRRL-095 ISP-NPポリペプチドによる処理にさらされた、GC-A受容体細胞またはGC-B受容体細胞についてのcGMPレベル(pmol/mL)をプロットしたグラフを含む。
【図１６】生理食塩水で処置した正常な非糖尿病対照ラット(正常対照)、生理食塩水で処置した糖尿病対照ラット(糖尿病対照)、およびCRRL-094 ISP-NPで処置した糖尿病ラット(DM+CRRL 094)において、ベースライン時、2ヶ月間糖尿病を誘発した後、2週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後、または4週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後に測定された血中グルコースレベル(mg/dL)をプロットしたグラフである。**は正常対照に対してp＜0.05を示す；**$$は糖尿病対照に対してp＜0.05を示す。
【図１７】生理食塩水で処置した正常な非糖尿病対照ラット(正常対照)、生理食塩水で処置した糖尿病対照ラット(糖尿病対照)、およびCRRL-094 ISP-NPで処置した糖尿病ラット(DM+CRRL 094)において、4週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後に測定された血漿インスリンレベル(ng/mL)をプロットしたグラフである。
【図１８】生理食塩水で処置した正常な非糖尿病対照ラット(正常対照)、生理食塩水で処置した糖尿病対照ラット(糖尿病対照)、およびCRRL-094 ISP-NPで処置した糖尿病ラット(DM+CRRL 094)において、ベースライン時、2ヶ月間糖尿病を誘発した後、2週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後、または4週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後に測定された体重(グラム)をプロットしたグラフである。**は正常対照に対してp＜0.05を示す。
【図１９】生理食塩水で処置した正常な非糖尿病対照ラット(正常対照)、生理食塩水で処置した糖尿病対照ラット(糖尿病対照)、およびCRRL-094 ISP-NPで処置した糖尿病ラット(DM+CRRL 094)において、4週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後に測定された血漿cGMPおよび尿中cGMPレベル(pmol/mL)をプロットしたグラフを含む。**は正常対照に対してp＜0.05を示す；*$$は糖尿病対照に対してp＜0.05を示す。
【図２０】生理食塩水で処置した正常な非糖尿病対照ラット(正常対照)、生理食塩水で処置した糖尿病対照ラット(糖尿病対照)、およびCRRL-094 ISP-NPで処置した糖尿病ラット(DM+CRRL 094)において、4週間の生理食塩水もしくはCRRL-094 ISP-NP処置後に測定された左心室重量(LVMd；グラム)をプロットしたグラフである。**は正常対照に対してp＜0.05を示す；$は糖尿病対照に対してp＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本明細書は、インスリン分泌性ポリペプチドに関連した方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、インスリン分泌を誘導する能力を有するポリペプチド、ならびにインスリン分泌を誘導するために、そして糖尿病を治療するために、前記ポリペプチドを使用するための方法および材料を提供する。
【００１５】
本明細書に提供されるポリペプチドは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、を含むように設計することができる。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドは、CRRL-090 ISPポリペプチドであり得る。ある場合には、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、糖尿病の哺乳動物に投与したとき、血中グルコースを低下させる、血漿インスリンを増加させる、糸球体濾過量(GFR)を増加させる、より少ない左心室肥大を可能にする、および/または心腎臓機能を改善する能力を持ち得る。場合によっては、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)の特性を持ち得る。
【００１６】
本明細書はまた、ナトリウム利尿ペプチド(例えば、ANP、BNP、CNP、UROまたはDNP)の少なくとも1つのアミノ酸セグメント(例えば、N末端尾部、環構造、C末端尾部、またはこれらの組み合わせ)と、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸セグメントとを有する、キメラポリペプチドを提供する。本明細書に提供されるこのようなキメラポリペプチドの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
0006480872.tif 000004
(CRRL-092 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:2)、
0006480872.tif 000005
(CRRL-093 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:3)、
0006480872.tif 000006
(CRRL-094 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:4)、
0006480872.tif 000007
(CRRL-095 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:5)、
0006480872.tif 000008
(CRRL-096 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:6)、
0006480872.tif 000009
(CRRL-097 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:7)、
0006480872.tif 000010
(CRRL-098 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:8)、
0006480872.tif 000011
(CRRL-099 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:9)、
0006480872.tif 000012
(CRRL-100 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:10)、
0006480872.tif 000013
(CRRL-101 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:11)、
0006480872.tif 000014
(CRRL-102 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:12)、
0006480872.tif 000015
(CRRL-103 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:13)、
0006480872.tif 000016
(CRRL-104 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:14)、
0006480872.tif 000017
(CRRL-105 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:15)、
0006480872.tif 000018
(CRRL-106 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:16)、
0006480872.tif 000019
(CRRL-107 ISP-NPと指定される; SEQ ID NO:17)、および
0006480872.tif 000020
(CRRL-108 ISP-NPと指定される; SEQ ID N0:18)。
【００１７】
いくつかの例では、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、糖尿病の哺乳動物に投与したとき、血中グルコースを低下させる、血漿インスリンを増加させる、糸球体濾過量(GFR)を増加させる、より少ない左心室肥大を可能にする、および/または心腎臓機能を改善するために使用することができる。場合によっては、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、血中グルコースを低下させる、血漿インスリンを増加させる、糸球体濾過量(GFR)を増加させる、より少ない左心室肥大を可能にする、および/または心腎臓機能を改善することに加えて、ナトリウム利尿作用を増加させるために、それを必要とする対象者において使用することができる。本明細書に提供されるキメラポリペプチドを用いて増加させることができるナトリウム利尿作用の例としては、限定するものではないが、血漿cGMPレベル、尿中へのcGMP排泄、正味の腎臓cGMP生成、尿流量、尿中へのナトリウム排泄、尿中へのカリウム排泄、ヘマトクリット、血漿BNP免疫反応性、腎血流量、および/または血漿ANP免疫反応性の増加が挙げられる。いくつかの場合には、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、腎血管抵抗、近位および遠位分別ナトリウム再吸収、平均動脈圧、肺毛細血管楔入圧、右心房圧、肺動脈圧、血漿レニン活性、血漿アンギオテンシンIIレベル、血漿アルドステロンレベル、腎臓の灌流圧、および/または全身性血管抵抗を低下させるために使用することができる。ある場合には、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、特に急性心筋梗塞(AMI)および/または急性心不全(AHF)の後の、心臓リモデリングおよび虚血-再灌流障害を治療する、抑制する、および/または防止するために使用することができる。例えば、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、血漿cGMPを増加させるために使用することができ、このことは心筋虚血-再灌流障害を軽減させる際に適用するのに望ましいかもしれない(Padilla et al., Cardiovasc. Res., 51:592-600 (2001))。
【００１８】
本明細書に記載するように、本明細書に提供されるポリペプチドは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、を含むように設計することができる。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドは、1つの付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むように設計することができる。ある場合には、本明細書に提供されるポリペプチドは、3つ以下の付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むように設計することができる。
【００１９】
本明細書に記載するように、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、ナトリウム利尿ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸セグメント(例えば、N末端尾部、環構造、C末端尾部、またはこれらの組み合わせ)と、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸セグメントと、を含むように設計することができる。ある場合には、本明細書に提供されるキメラポリペプチドに含まれるナトリウム利尿ペプチドのN末端、環構造、および/またはC末端は、1以上の位置(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の位置)での変異型(例えば、置換、付加、または欠失)を含むことができる。このような変異型ナトリウム利尿ペプチド配列、例えば、天然のナトリウム利尿ペプチドに対して1つ以上のアミノ酸置換(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の置換)を有するものは、標準的な方法を用いて調製および改変することができる。
【００２０】
アミノ酸置換は、ある場合には、(a)置換の領域におけるペプチド骨格の構造、(b)標的部位での該分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩、を維持することへのその影響が有意に異ならない置換を選択することによって、行うことができる。例えば、天然に存在する残基は、側鎖の性質に基づいてグループに分けることができる：(1)疎水性アミノ酸(ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン)；(2)中性親水性アミノ酸(システイン、セリン、およびトレオニン)；(3)酸性アミノ酸(アスパラギン酸およびグルタミン酸)；(4)塩基性アミノ酸(アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、およびアルギニン)；(5)鎖の配向に影響するアミノ酸(グリシンおよびプロリン)；(6)芳香族アミノ酸(トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン)。これらのグループ内で行われる置換は、保存的置換とみなすことができる。有用な置換の非限定的な例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：アラニンに代わるバリン、アルギニンに代わるリシン、アスパラギンに代わるグルタミン、アスパラギン酸に代わるグルタミン酸、システインに代わるセリン、グルタミンに代わるアスパラギン、グルタミン酸に代わるアスパラギン酸、グリシンに代わるプロリン、ヒスチジンに代わるアルギニン、イソロイシンに代わるロイシン、ロイシンに代わるイソロイシン、リシンに代わるアルギニン、メチオニンに代わるロイシン、フェニルアラニンに代わるロイシン、プロリンに代わるグリシン、セリンに代わるトレオニン、トレオニンに代わるセリン、トリプトファンに代わるチロシン、チロシンに代わるフェニルアラニン、および/またはバリンに代わるロイシンでの置換。
【００２１】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドを作製するために使用されるSEQ ID NO:1および/またはナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列内の任意の位置で行うことができる保存的置換のさらなる例には、限定するものではないが、表1に記載したものが含まれる。
【００２２】
（表1）保存的アミノ酸置換の例
0006480872.tif 000021
【００２３】
場合によっては、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドを作製するために使用されるSEQ ID NO:1および/またはナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列は、1つ以上の非保存的置換を含むことができる。非保存的置換は、典型的には、上記のクラスのうちの1クラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要がある。このような作製は、こうした化合物を大量に提供するために、または該化合物の別の具体例を提供するために望ましいことがある。アミノ酸の変化が機能性ポリペプチドをもたらすかどうかは、そのペプチド変異体の特異的活性をアッセイすることで容易に判別することができる。
【００２４】
本明細書に提供されるポリペプチドは、任意の適切な長さをもつことができる。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドは、長さが16〜25(例えば、17〜25、18〜25、19〜25、16〜24、16〜23、16〜22、16〜20、16〜19、または17〜19)アミノ酸残基であり得る。16または25アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドは、16〜25アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドに含まれることが理解されるであろう。
【００２５】
本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、任意の適切な長さをもつことができる。例えば、本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、長さが40〜60(例えば、40〜58、40〜56、40〜54、40〜52、42〜60、44〜60、46〜60、48〜60、または48〜52)アミノ酸残基であり得る。40または60アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドは、40〜60アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドに含まれることが理解されるであろう。
【００２６】
本明細書に提供されるポリペプチドおよびキメラポリペプチドは、任意の適切なアッセイ、例えば、限定するものではないが、本明細書に記載されるアッセイ、を用いて生物学的活性について評価することができる。例えば、本明細書に記載される変異型ナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列を有するキメラポリペプチドの活性は、心臓線維芽細胞(CF)により生成されるcGMPレベルに対するその影響を測定することによって、またはCFの増殖を抑制するその能力を試験することによって、インビトロで評価され得る。このような実験は、例えば、他に(Tsuruda et al., Circ. Res. 91:1127-1134 (2002))記載されるようにヒトCF(ScienCell社, San Diego, CA)で、行うことができる。細胞を、評価すべきポリペプチド(例えば、10-11〜10-6M)に暴露し、競合RIA cGMPキット(Perkin-Elmer社, Boston, MA)を用いてcGMPについてサンプルをアッセイすることができる。CF増殖試験では、細胞増殖を誘導するために細胞をカルジオトロフィン-1で処理することができる。評価すべきキメラポリペプチドをカルジオトロフィン-1で刺激したCFに添加して、細胞増殖に対するその影響を調べることができる。細胞増殖は、例えば、比色ブロモデオキシウリジン(BrdU)細胞増殖ELISA(Roche社, Indianapolis, IN)を用いて、検出および測定することができる。
【００２７】
ある場合には、保存的および/または非保存的置換を(例えば、SEQ ID NO:1または天然のANP、BNP、CNP、DNP、もしくはUROに関して)有する本明細書に提供されるキメラポリペプチドは、例えば、動物における以下のような要因に対するその影響を試験することによって、インビボで評価することができる：インスリン分泌、血中グルコースレベル、肺毛細血管楔入圧、右心房圧、動脈圧、平均動脈圧、尿中ナトリウム排泄量、尿流量、近位および遠位分別ナトリウム再吸収、血漿レニン活性、血漿cGMPレベル、尿中cGMP排泄量、cGMPの正味の腎生成、糸球体濾過量、および左心室重量。場合によっては、このようなパラメータは、誘発された心筋梗塞(例えば、冠動脈結紮により誘発された心筋梗塞)後に、または糖尿病の誘発後に評価することができる。
【００２８】
ある場合には、本明細書に提供されるポリペプチドは、参照配列(例えば、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18)に対して少なくとも85％(例えば、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％)の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。配列同一性パーセントは、アライメントしたアミノ酸配列(同定されたアミノ酸配列にアライメントされた標的アミノ酸配列)で一致した位置の数を決定し、その一致した位置の数を、同定されたアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:1)のアミノ酸の数で割り、100を掛けることによって算出される。一致した位置とは、アライメントしたアミノ酸配列中の同じ位置に同一のアミノ酸が存在している位置を指す。配列同一性パーセントは、任意の核酸配列についても決定することができる。
【００２９】
配列同一性パーセントは、BLASTNバージョン2.0.14およびBLASTPバージョン2.0.14を含むBLASTZのスタンドアロン・バージョンからのBLAST 2 Sequences(Bl2seq)プログラムを用いて、標的アミノ酸配列を同定されたアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:1)と比較することによって決定される。このBLASTZのスタンドアロン・バージョンは、Fish & Richardsonのウェブサイト(fr.com/blast)または米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov)からワールドワイドウェブ上で取得することができる。Bl2seqプログラムの使い方を説明する指示書は、BLASTZに添付されるリードミー(readme)ファイルに見出すことができる。
【００３０】
Bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを用いて2つの配列間の比較を実行する。BLASTNは核酸配列を比較するために用いられ、一方BLASTPはアミノ酸配列を比較するために用いられる。2つの核酸配列を比較するために、オプションは次のように設定される：-iは比較される第1の核酸配列を含むファイルに設定される(例えば、C:/seq1.txt)；-jは比較される第2の核酸配列を含むファイルに設定される(例えば、C:/seq2.txt)；-pはblastnに設定される；-oは任意の所望のファイル名に設定される(例えば、C:/output.txt)；-qは-1に設定される；-rは2に設定される；他の全てのオプションはデフォルト設定のままである。次のコマンドは、2つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成する：C:/Bl2seq -i c:/seq1.txt -j c:/seq2.txt -p blastn -o c:/output.txt -q -1 -r 2。標的配列が同定された配列の任意の部分と相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、アライメントされた配列として、相同性の領域を提示する。標的配列が同定された配列の任意の部分と相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、アライメントされた配列を提示しない。
【００３１】
例えば、(1)標的配列がSEQ ID NO:1に示される配列と比較され、かつ(2)Bl2seqプログラムが、SEQ ID NO:1に示される配列の領域とアライメントされた標的配列を、一致の数が17であると、提示する場合、そのアミノ酸標的配列は、SEQ ID NO:1に対して94.4(すなわち、17÷18×100＝94.4)の同一性パーセントを有する。同一性パーセント値は、小数第2位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、78.11、78.12、78.13、および78.14は78.1に切り捨てられ、一方78.15、78.16、78.17、78.18、および78.19は78.2に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることに留意されたい。
【００３２】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、固相合成法などの、任意の適切な方法を用いて作製され、手動法または自動化された技術を用いて(例えば、Applied BioSystems社(Foster City, CA)のペプチド合成装置またはBiosearch社(San Rafael, CA)の自動ペプチド合成装置を用いて)生成され得る。システイン残基間のジスルフィド結合は、他に記載されるように(米国特許第4,757,048号)、KCNを用いる線状ポリペプチドの穏和な酸化によって導入することができる。場合によっては、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、本明細書に記載されるように、組換え的に生産することができる。
【００３３】
ある場合には、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドであり得る。ポリペプチドに関して本明細書で使用する用語「実質的に純粋な」とは、他のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸を実質的に含まないことを意味する。ある場合には、実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも60％純粋であるポリペプチド、または化学的に合成されたポリペプチドであり得る。実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも約60、65、70、75、80、85、90、95、または99％純粋であり得る。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを生じる。
【００３４】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドのカルボキシル基の塩は、例えば、該ポリペプチドを、1当量以上の所望の塩基、例えば、金属水酸化物の塩基(例えば、水酸化ナトリウム)、金属炭酸塩もしくは重炭酸塩の塩基(例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム)、またはアミン塩基(例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなど)と接触させることによって調製することができる。本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドの酸付加塩は、該ポリペプチドを、1当量以上の無機または有機酸(例えば、塩酸)と接触させることによって調製することができる。
【００３５】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドのカルボキシル基のエステルは、カルボン酸またはその前駆体をエステルに変換するための任意の適切な手段を用いて調製することができる。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドのエステルを調製するための1つの方法は、メリフィールド合成法を使用する場合、樹脂に応じて、塩基性または酸性のいずれかの条件下で、所望のアルコールの存在下に、完成したポリペプチドを樹脂から切断することである。その後、ポリペプチドのC末端は、遊離酸の単離なしに、樹脂から解放されたとき、直接エステル化され得る。
【００３６】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドのアミドは、カルボン酸基またはその前駆体をアミドに変換するための技術を用いて調製することができる。C末端カルボキシル基におけるアミド形成のための1つの方法は、適切なアミンを用いて固相支持体から該ポリペプチドを切断すること、またはアルコールの存在下で切断してエステルを生成させ、続いて所望のアミンを用いてアミノリシスを行うことを含む。
【００３７】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドのアミノ基のN-アシル誘導体は、最終的な縮合反応のためにN-アシル保護アミノ酸を利用することによって、または保護もしくは非保護ポリペプチドをアシル化することによって調製することができる。O-アシル誘導体は、例えば、遊離ヒドロキシペプチドまたはペプチド樹脂のアシル化により、調製することができる。いずれのアシル化も、ハロゲン化アシル、酸無水物、アシルイミダゾールなどの標準的なアシル化試薬を用いて実施される。所望であれば、N-およびO-アシル化の両方を一緒に行ってもよい。
【００３８】
場合によっては、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマーへの結合により、またはアルブミンなどの別のポリペプチドへの融合により、修飾され得る。例えば、1つ以上のPEG部分を、リシン残基を介して、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドにコンジュゲートすることができる。PEGもしくは他の適切なポリマーへの結合、またはアルブミンもしくは他の適切なポリペプチドへの融合は、修飾されていないポリペプチドまたはキメラポリペプチドと比較して、増大した半減期を有する修飾されたポリペプチドまたはキメラポリペプチドをもたらすことができる。特定の作用機序に縛られるものではないが、増大した血清半減期は、修飾されたポリペプチドまたはキメラポリペプチドの減少したタンパク質分解、免疫認識、または細胞スカベンジング(cell scavanging)から生じる可能性がある。適切な方法はどれも、PEGへの結合(「PEG化」とも呼ばれる)により、または他のポリマーへの結合、例えば、限定するものではないが、他に記載されるポリマー(米国特許第6,884,780号; Cataliotti et al., Trends Cardiovasc. Med., 17:10-14 (2007); Veronese and Mero, BioDrugs, 22:315-329 (2008); Miller et al., Bioconjugate Chem., 17:267-274 (2006); およびVeronese and Pasut, Drug Discov. Today, 10:1451-1458 (2005))への結合により、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドを修飾するために、使用することができる。アルブミンへの融合により本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドを修飾するための方法の例には、限定するものではないが、他に記載される方法(米国特許出願公開第20040086976号、およびWang et al, Pharm. Res., 21:2105-2111 (2004))が含まれる。
【００３９】
核酸、ベクター、および宿主細胞
本明細書はまた、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、ならびに該核酸および/または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用する用語「核酸」は、RNAとDNAの両方を指し、DNAはcDNA、ゲノムDNA、および合成(例えば、化学的に合成された)DNAを含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖)であり得る。核酸には、例えば、本明細書に提供されるキメラポリペプチドをコードするcDNAが含まれる。
【００４０】
「単離された核酸」とは、脊椎動物のゲノムにおいて該核酸の片側または両側に通常隣接する核酸を含めて、脊椎動物のゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸のことである。核酸に関して本明細書で使用する用語「単離された」はまた、任意の非天然の核酸配列をも包含する。というのは、そのような非天然の配列は自然界に見出されず、天然のゲノム中で直接隣接する配列を持たないからである。
【００４１】
単離された核酸は、例えば、DNA分子とすることができるが、ただし、天然に存在するゲノム中で該DNA分子にすぐ隣接して通常見出される核酸配列の1つが除去されているか、または存在しないことを条件とする。したがって、単離された核酸には、限定するものではないが、以下が含まれる：他の配列から独立して別個の分子(例えば、化学的に合成された核酸、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたcDNAもしくはゲノムDNA断片)として存在するDNA分子、ならびにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス)、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれているDNA。さらに、単離された核酸は、遺伝子工学的に操作された核酸、例えばハイブリッドまたは融合核酸の一部であるDNA分子、を含むことができる。例えば、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー内、またはゲノムDNA制限消化物を含むゲルスライス内の、数百〜数百万の他の核酸の間に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００４２】
単離された核酸分子は、一般的な分子クローニングおよび化学的核酸合成技術を含むがこれらに限らない、標準的な技術を用いて作製することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術は、ナトリウム利尿ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を得るために使用することができる。PCRは、標的核酸が酵素的に増幅される手法または技術を指す。対象となる領域の末端からの、典型的には該末端を越えた、配列情報が、増幅される鋳型の反対の鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために利用される。PCRは、全ゲノムDNAまたは全細胞RNAからの配列を含めて、DNAならびにRNAから特定の配列を増幅するために使用される。プライマーは、典型的には、長さが14〜40ヌクレオチドであるが、10ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。一般的なPCR技術は、例えばPCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。鋳型源としてRNAを使用する場合は、逆転写酵素を用いて相補的DNA(cDNA)鎖を合成することができる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製(self-sustained sequence replication)、または核酸配列ベースの増幅もまた、単離された核酸を得るために使用することができる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; および Weiss (1991) Science 254:1292を参照されたい。
【００４３】
単離された核酸はまた、単一の核酸分子(例えば、ホスホロアミダイト技術を用いる3'から5'方向での自動DNA合成を使用する)として、または一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することができる。例えば、所望の配列を含む、一対以上の長いオリゴヌクレオチド(例えば、＞100ヌクレオチド)を合成することができ、その場合、オリゴヌクレオチドの対がアニーリングされたとき二本鎖が形成されるように、各対は相補性の短いセグメント(例えば、約15ヌクレオチド)を含む。DNAポリメラーゼを用いて該オリゴヌクレオチドを伸長させると、オリゴヌクレオチドの対あたり単一の二本鎖核酸分子がもたらされ、これはその後ベクターに連結され得る。
【００４４】
単離された核酸(例えば、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸)はまた、突然変異誘発によっても得ることができる。例えば、PCRを介したオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発を含む標準的な技術を用いて、参照配列を突然変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Ausubel et al編, 1992を参照されたい。
【００４５】
ナトリウム利尿ポリペプチドをコードする核酸分子またはその核酸相補体が得られるヌクレオチド配列の供給源は、当技術分野で公知の方法によってcDNAを誘導することができる爬虫類(例えば、ヘビ)または哺乳類(例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはネコ)の細胞源を含めて、任意の真核生物の供給源から得られる全RNAまたはポリA+ RNAを含む。核酸分子の他の供給源には、哺乳類の供給源を含めて、任意の真核生物の細胞源から誘導されたゲノムライブラリーが含まれる。
【００４６】
天然のナトリウム利尿ポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)に記載されるような、標準方法を用いて同定し、単離することができる。例えば、逆転写酵素PCR(RT-PCR)を用いて、対象となるRNA配列を含む単離されたRNA(例えば、ヒト組織から単離された全RNA)からナトリウム利尿ポリペプチドのcDNAを単離し、クローニングすることができる。ナトリウム利尿ポリペプチドのcDNAを同定し、単離し、クローニングするための他のアプローチには、例えば、cDNAライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。
【００４７】
また、本明細書に記載されるような核酸を含むベクターが提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、その中に別のDNAセグメントを挿入して、挿入されたセグメントの複製をもたらすようにすることができる。「発現ベクター」は1つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は別のDNA配列の転写および/または翻訳を制御し、かつ調節するDNA配列である。
【００４８】
発現ベクターにおいて、核酸(例えば、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸)は、1つ以上の発現制御配列に機能的に連結され得る。本明細書で使用する「機能的に連結される」とは、発現制御配列が対象となるコード配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が含まれる。プロモーターは、典型的には、転写開始点の上流100〜500ヌクレオチド以内(一般には、RNAポリメラーゼIIの開始部位の近く)にある、DNA分子の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、そのプロモーターの下流1〜約50ヌクレオチドの間にそのポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を位置づける必要がある。エンハンサーは、時間、場所、およびレベルの観点から発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位からさまざまな距離で位置づけられたときに、機能することができる。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置づけることもできる。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写することができ、該mRNAがその後該コード配列によりコードされたタンパク質に翻訳され得る場合、そのコード配列は、細胞内で発現制御配列に「機能的に連結」されており、かつ発現制御配列の「制御下」にある。
【００４９】
適切な発現ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、ならびにウイルスベクター、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス由来のもの、が含まれる。多数のベクターおよび発現系が以下のような会社から市販されている：Novagen社(Madison, WI)、Clontech社(Palo Alto, CA)、Stratagene社(La Jolla, CA)、およびInvitrogen/Life Technologies社(Carlsbad, CA)。
【００５０】
発現ベクターは、発現された核酸配列のその後の操作(例えば、精製または局在化)を容易にするように設計されたタグ配列を含むことができる。タグ配列、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-myc、ヘマグルチニン、またはFlag(商標)タグ(Kodak社, New Haven, CT)配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。このようなタグは、カルボキシルまたはアミノのどちらかの末端部を含めて、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【００５１】
本明細書はまた、本明細書に提供される核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」は、組換え核酸またはベクター(例えば、発現ベクター)を導入することができる原核細胞および真核細胞を含むことが意図される。本明細書で使用する「形質転換された」および「トランスフェクトされた」とは、多くの技術のいずれかによる細胞内への核酸分子(例えば、ベクター)の導入を包含する。特定の技術に限定されるものではないが、多くのこうした技術は当技術分野で確立されている。宿主細胞の形質転換およびトランスフェクションのための適切な方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)に見出すことができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸導入を用いて、細胞に核酸を導入することができる。さらに、他に記載されるように(米国特許第5,580,859号および第5,589,466号)、裸のDNAをインビボで細胞に直接送達することが可能である。
【００５２】
組成物および投与方法
本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物(例えば、糖尿病に罹っているか、または糖尿病のリスクがあるヒト)に投与するための組成物中に組み込むことができる。治療用の組成物を製剤化し、その後投与するための方法は、当業者によく知られている。投与量は、一般的に、化合物への対象者の応答性に依存しており、治療過程は数日から数ヶ月まで、または適切な応答が達成されるまで続く。当業者は、最適な投与量、投与方法、および繰り返し数を定期的に決定する。最適な投与量は、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドの相対的効力に依存して変化し、一般的にはインビトロおよび/またはインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したEC50に基づいて推定され得る。本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)または本明細書に提供される核酸を含有する組成物は、日に、週に、月に1回以上、またはそれより少ない頻度でさえも、与えることができ、ある期間(例えば、数時間、数日、または数週間)連続的に投与することもできる。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)を含有する組成物は、糖尿病患者に、少なくとも約0.01ngポリペプチド/kg〜約100mgポリペプチド/kg体重の用量で投与することができ、または特定の時期に開始して1〜7日間続ける点滴(例えば、約0.01ngポリペプチド/kg/分〜約0.5μgポリペプチド/kg/分の用量で)として連続的に投与することができる。
【００５３】
本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)または本明細書に提供される核酸は、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体もしくは細胞標的化分子、または摂取、分布および/もしくは吸収を助けるための経口、局所もしくは他の処方物と、混合する、カプセル化する、コンジュゲートする、または他の方法で関連付けることができる。
【００５４】
いくつかの態様では、組成物は、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)を薬学的に許容される担体と組み合わせて含むことができる。薬学的に許容される担体には、例えば、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、または対象者に抗体を送達するための他の薬理学的に不活性なビヒクルが含まれる。薬学的に許容される担体は、液体または固体であってよく、1種以上の治療化合物と所与の薬学的組成物の他の成分を組み合わせたとき、所望のかさ、稠度、他の適切な輸送特性および化学的特性を提供するように、計画された投与方法を考慮して、選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：水；生理食塩水；結合剤(例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトースもしくはデキストロースおよび他の糖類、ゼラチン、または硫酸カルシウム)；滑沢剤(例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム)；崩壊剤(例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)；ならびに湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)。
【００５５】
本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)を含有する薬学的組成物は、局所的または全身的な治療が望ましいかどうかに応じて、多数の方法によって投与することができる。投与は、例えば、非経口(例えば、皮下、髄腔内、脳室内、筋肉内、もしくは腹腔内注射によるか、または静脈内(i.v.)点滴による)；経口；局所(例えば、経皮、舌下、眼、または鼻腔内)；または肺(例えば、粉末もしくはエアロゾルの吸入または送気による)投与とすることができ、このような方法を組み合わせて行うこともできる。投与は、(例えば、注射により)急速であってもよいし、ある期間にわたって(例えば、遅い点滴注入または徐放性製剤の投与により)行ってもよい。
【００５６】
非経口、髄腔内または脳室内投与用の組成物および製剤は、滅菌水溶液(例えば、滅菌生理食塩水)を含むことができ、該溶液はさらに、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤(例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体)をも含有することができる。
【００５７】
経口投与用の組成物および製剤には、例えば、粉剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の溶液剤もしくは懸濁液剤、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。このような組成物はまた、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤をも組み込むことができる。
【００５８】
薬学的組成物には、溶液剤、エマルション剤、水性懸濁液剤、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、例えば、予め形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を含む種々の成分から生成することができる。エマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに可溶化、吸収および生物学的利用能の効果のために、治療用組成物の経口送達にとって特に有用である。リポソームは、それらの特異性、およびそれらが薬物送達の観点から提供する作用持続時間のために、特に有用であり得る。
【００５９】
組成物はさらに、薬学的組成物中に通常見出される他の補助成分を含むことができる。こうして、組成物はまた、薬学的に活性な物質、例えば、かゆみ止め、収斂剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤、または組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加の物質、例えば、色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤を含むことができる。さらに、組成物は、補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、浸透促進剤、および芳香物質、と混合することができる。しかし、添加する場合、このような物質は、組成物中の他の成分(例えば、CRRL-090 ISPなどの本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド)の生物学的活性を過度に妨害してはならない。
【００６０】
ある場合には、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)は、持続放出剤形として製剤化することができる。場合によっては、コーティング、エンベロープ、または保護マトリックスは、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドの1種以上を含有するように製剤化され得る。このようなコーティング、エンベロープ、および保護マトリックスを用いて、ステント、カテーテル、腹膜透析チューブなどの留置器具をコーティングすることが可能である。場合によっては、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド(例えば、CRRL-090 ISP)は、ポリマー物質、リポソーム、マイクロエマルション、微小粒子、ナノ粒子、またはワックス内に組み込まれる。
【００６１】
本明細書に開示される薬学的製剤は、単位剤形で便利に提示され得るものであり、製薬業界で周知の従来技術に従って調製することができる。このような技術は、活性成分(例えば、CRRL-090 ISPなどの本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド)を、所望の薬学的担体(複数可)と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、活性成分を液状担体もしくは微細な固形担体またはその両方と均質かつ密接に会合させ、その後、必要に応じて、その産物を成形することによって調製され得る。製剤は、所望により、滅菌することができるが、ただし、その滅菌方法は、製剤中に含まれる分子(複数可)(例えば、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチド)の有効性を妨げないことを条件とする。
【００６２】
インスリン分泌を増加させるための、または糖尿病を治療するための方法
本明細書はまた、例えば糖尿病を、治療するための本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドの使用を提供する。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、インスリン分泌を増加させるために哺乳動物(例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物)に投与することができる。いくつかの態様では、例えば、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは本明細書に提供される組成物は、糖尿病と診断された哺乳動物に投与され得る。本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは組成物は、選択された薬剤、疾患の重症度、および達成しようとするのは予防であるのかそれとも治療であるのか、を含むがこれらに限定されない各種の要因に応じて、適切な用量で投与され得る。投与は局所的であっても全身的であってもよい。
【００６３】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含有する組成物は、少なくとも約0.01ngポリペプチド/kg〜約100mgポリペプチド/kg体重(例えば、約10ngポリペプチド/kg〜約50mgポリペプチド/kg、約20ngポリペプチド/kg〜約10mgポリペプチド/kg、約0.1ngポリペプチド/kg〜約20ngポリペプチド/kg、約3ngポリペプチド/kg〜約10ngポリペプチド/kg、または約50ngポリペプチド/kg〜約100μgポリペプチド/kg体重)の用量で投与することができるが、他の投与量も有益な結果をもたらす可能性がある。場合によっては、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含有する組成物は、ある期間(例えば、1〜7日間、例えば、1、2、3、4、5、6、または7日間)にわたって連続静脈内注入として投与することができる。このような組成物は、例えば、約0.1ngポリペプチド/kg/分〜約500ngポリペプチド/kg/分(例えば、約0.5ngポリペプチド/kg/分、約1ngポリペプチド/kg/分、約2ngポリペプチド/kg/分、約3ngポリペプチド/kg/分、約5ngポリペプチド/kg/分、約7.5ngポリペプチド/kg/分、約10ngポリペプチド/kg/分、約12.5ngポリペプチド/kg/分、約15ngポリペプチド/kg/分、約20ngポリペプチド/kg/分、約25ngポリペプチド/kg/分、約30ngポリペプチド/kg/分、約50ngポリペプチド/kg/分、約100ngポリペプチド/kg/分、または約300ngポリペプチド/kg/分)の用量で投与され得る。
【００６４】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含有する組成物は、第1の期間に第1の経路を介して(例えば、静脈内に)投与され、その後、第2の期間に別の経路を介して(例えば、局所または皮下に)投与され得る。例えば、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含有する組成物は、哺乳動物(例えば、ヒト)に、約0.1ngポリペプチド/kg/分〜約300ngポリペプチド/kg/分(例えば、約1ngポリペプチド/kg/分〜約15ngポリペプチド/kg/分、約3ngポリペプチド/kg/分〜約10ngポリペプチド/kg/分、または約10ngポリペプチド/kg/分〜約30ngポリペプチド/kg/分)の用量で1〜7日間(例えば、1、2、3、4、5、6、または7日間)静脈内投与され、続いて、該哺乳動物に、約10ngポリペプチド/kg/日〜約100ngポリペプチド/kg/日(例えば、約10ngポリペプチド/kg/日、約20ngポリペプチド/kg/日、約25ngポリペプチド/kg/日、約30ngポリペプチド/kg/日、約50ngポリペプチド/kg/日、または約100ngポリペプチド/kg/日)の用量で5〜30日間(例えば、7、10、14、18、21、24、または27日間)皮下投与され得る。
【００６５】
本明細書に提供される前記方法は、哺乳動物に、インスリン分泌を増加させるのに、または糖尿病の症状を軽減させるのに有効な量の、本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、または本明細書に提供されるポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含有する組成物を投与することを含むことができる。
【００６６】
本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例1 - CRRL-090 ISPは血中グルコースを低下させかつインスリン分泌を増加させる
CRRL-090 ISPを直接タンパク質合成によって合成し、正常ラットにおける生物学的活性を以下のように試験した。正常ラットの2つのグループを用いた。第1のグループには5匹の正常ラットが含まれ、これらに生理食塩水を投与した。第2のグループには7匹の正常ラットが含まれ、これらのラットにCRRL-090を(1pmol/kg/分で210分間)投与した。どちらの投与も静脈内注入で行った。
【００６８】
CRRL-090 ISPの注入を受け取った正常ラットは、生理食塩水を受け取った対照ラットと比較して、より低い血中グルコースレベルと増加した血漿インスリンを示した(図1および2)。
【００６９】
これらの結果は、CRRL-090 ISPがインスリン分泌の増加と共に血中グルコースを低下させることを実証している。
【００７０】
実施例2 - CRRL-090 ISPは糖尿病の哺乳動物に投与したとき心腎臓作用と体液作用を与える
CRRL-090 ISPを直接タンパク質合成によって合成し、糖尿病ラットにおける生物学的活性を以下のように試験した。雄Wistarラットの3つのグループ(グループあたり6匹のラット)を用いた：正常対照グループ、糖尿病対照グループ、およびCRRL-090 ISPで治療された糖尿病グループ。糖尿病対照グループとCRRL-090 ISPで治療される糖尿病グループのラットには糖尿病を誘発させるために1回量のストレプトゾトシンを腹腔内投与した。糖尿病の誘発の2ヶ月後、0.1μg/kg/分のCRRL-090 ISPまたは対照としての生理食塩水を放出するように構成されたアルゼット(ALZET)ポンプ(DURECT社から入手、アルゼット浸透圧ポンプ、P.O. Box 530, Cupertino, CA; モデル1007D)を1ヶ月間にわたって14日ごとに連続的に皮下移植した(2つのポンプ、0日目に1つと14日目にもう1つ)。心機能を心エコー検査により評価し、神経ホルモンをラジオイムノアッセイにより測定した。線維症はピクロシリウス赤染色により確認した。
【００７１】
糖尿病対照と比較して、CRRL-090 ISPで治療された糖尿病ラットは、血中グルコースレベルの低下、血漿インスリンレベルの増加、糸球体濾過量(GFR)の増加、およびより少ない左心室肥大を示した(図3〜6)。
【００７２】
これらの結果は、CRRL-090 ISPが、糖尿病の哺乳動物において血中グルコースレベルを低下させかつ心腎臓機能を改善する形で、インスリン分泌を増加させるために使用され得ることを実証している。
【００７３】
実施例3 - キメラポリペプチドはイヌにおいて粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性とインスリン分泌特性を有する
以下は、正常イヌ(n＝2)における血中グルコース、血漿インスリン、および血漿cGMPに及ぼすCRRL-092 ISP-NP、CRRL-093 ISP-NP、およびCRRL-094 ISP-NPポリペプチドの効果を明らかにするために行った。CRRL-092 ISP-NP、CRRL-093 ISP-NP、およびCRRL-094 ISP-NPポリペプチドを直接タンパク質合成によって合成し、ベースライン測定後45分間にわたり正常イヌに10pmol/kg/分または100pmol/kg/分で静脈内注入した。45分間の注入後、30分のウォッシュアウト期間を設けた。各期間の終了時に血液サンプルを採取した。
【００７４】
CRRL-092 ISP-NP、CRRL-093 ISP-NP、およびCRRL-094 ISP-NPポリペプチドの注入は、血漿グルコースの低下と共に血漿インスリンおよびcGMPの増加をもたらした(図7〜9)。これらの結果は、ナトリウム利尿ペプチド(例えば、ANP、BNP、CNP、URO、またはDNP)の少なくとも1つのアミノ酸セグメント(例えば、N末端尾部、環構造、C末端尾部、またはこれらの組み合わせ)と、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸セグメントとを有する、キメラポリペプチドが、インビボで粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性とインスリン分泌特性を示すことができることを実証している。
【００７５】
実施例4 - キメラポリペプチドはラットにおいて粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性とインスリン分泌特性を有する
以下は、正常ラットにおける血中グルコースおよび血漿インスリンに及ぼすCRRL-092 ISP-NPおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドの効果を明らかにするために行った。1つの実験において、7匹の正常ラットは生理食塩水を受け取り、4匹の正常ラットはCRRL-092 ISP-NPポリペプチドのIV注入を1pmol/kg/分で210分間受け取り、3匹の正常ラットはCRRL-092 ISP-NPポリペプチドのIVボーラスを100pmol/kgで受け取った。別の実験において、5匹の正常ラットは生理食塩水を受け取り、10匹の正常ラットはCRRL-093 ISP-NPポリペプチドのIV注入を1pmol/kg/分で210分間受け取った。
【００７６】
CRRL-092 ISP-NPおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドの注入を受け取った正常ラットは、プラセボ対照ラットと比較して、より低い血中グルコースおよび増加した血漿インスリンを示した(図10〜13)。これらの結果は、ナトリウム利尿ペプチド(例えば、ANP、BNP、CNP、URO、またはDNP)の少なくとも1つのアミノ酸セグメント(例えば、N末端尾部、環構造、C末端尾部、またはこれらの組み合わせ)と、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはそれが1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸付加、除去もしくは置換を含むことを除いてSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸セグメントとを有する、キメラポリペプチドが、インビボで粒子状グアニル酸シクラーゼ活性化特性とインスリン分泌特性を示すことができることを実証している。
【００７７】
実施例5 - グアニル酸シクラーゼ活性化特性を有するキメラポリペプチドの評価
以下は、CRRL-092 ISP-NP、CRRL-093 ISP-NP、CRRL-094 ISP-NP、およびCRRL-095 ISP-NPポリペプチドがGC-A粒子状グアニル酸シクラーゼ受容体またはGC-B粒子状グアニル酸シクラーゼ受容体を活性化して、二次メッセンジャーcGMPを生成するかどうかを確かめるために行った。
【００７８】
ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞を、リポフェクタミン(Invitrogen社, Grand Island, NY)を用いてGC-AまたはGC-Bのいずれかで安定的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、10％ウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100U/mlのストレプトマイシン、および250μg/mlのG418を補充したダルベッコ改変イーグル培地中に維持した(全ての試薬はInvitrogen社(Grand Island, NY)から入手した)。
【００７９】
細胞のcGMPアッセイを行うために、細胞を6ウェルプレートに播種し、他に記載されるように(Tsuruda et al., Circ. Res, 91:1127-1134 (2002))処理した。簡単に述べると、細胞を、20mmol/LのN-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'[2-エタンスルホン酸]、0.1％ウシ血清アルブミン、および0.5mmol/Lの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(Sigma社, St. Louis, MO)を含有するハンクス平衡塩溶液(Invitrogen社, Carlsbad, CA)中でインキュベートした。処理された細胞は10-6M、10-8M、または10-10Mのポリペプチドを10分間受け取った。細胞を300μLの6％TCA中で溶解し、10分間超音波処理した。サンプルを4倍容量のエーテル中に4回エーテル抽出し、乾燥させて、300μLのcGMPアッセイ緩衝液中に再構成した。他に記載されるように(Tsuruda et al., Circ. Res, 91:1127-1134 (2002))、競合RIA cGMPキット(Perkin-Elmer社, Boston, MA)を用いてサンプルをアッセイした。
【００８０】
CRRL-092 ISP-NPおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドはGC-A受容体を活性化したが、GC-B受容体を活性化しなかった(図14)。CRRL-094 ISP-NPおよびCRRL-095 ISP-NPポリペプチドはGC-AとGC-Bの両受容体を活性化した(図15)。
【００８１】
これらの結果は、CRRL-092 ISP-NPおよびCRRL-093 ISP-NPポリペプチドがGC-A受容体のみを活性化するのに対して、CRRL-094 ISP-NPおよびCRRL-095 ISP-NPポリペプチドはGC-AとGC-Bの両受容体を活性化することを実証している。
【００８２】
実施例6 - CRRL-094 ISP-NPによる長期治療はcGMPを活性化し、インスリン分泌を増加させ、血中グルコースと体重を低下させる
雄Wistarラットの3つのグループを用いた：(1)正常な非糖尿病対照ラット、(2)糖尿病対照ラット、および(3)CRRL-094 ISP-NPで治療された糖尿病ラット。糖尿病の誘発の2ヶ月後、生理食塩水中のCRRL-094 ISP-NP(用量＝1pmol/kg/分)または対照としての生理食塩水を充填したアルゼットポンプ(DURECT社から入手、アルゼット浸透圧ポンプ、P.O. Box 530, Cupertino, CA; モデル1007D)を1ヶ月間にわたって14日ごとに連続的に皮下移植した。4週間の治療後、血中グルコースレベル、血漿インスリンレベル、体重、血漿および尿中cGMPレベル、および左心室肥大を測定した。血中グルコースレベルと体重は2週間の治療後にも測定した。
【００８３】
生理食塩水対照で治療された糖尿病ラットと比較して、CRRL-094 ISP-NPで治療された糖尿病ラットは血中グルコースの低下(図16)、血漿インスリンの増加(図17)、体重の減少(図18)、血漿および尿中cGMPの増加(図19)、ならびに左心室肥大の減少(図20)を示した。これらの結果は、CRRL-094 ISP-NPによる4週間の長期治療が、げっ歯類の糖尿病モデルにおいて血中グルコースと体重の低下をもたらすインスリン分泌の増加という結果につながることを実証している。CRRL-094 ISP-NPによる長期治療はまた、cGMP系を活性化し、これは左心室肥大の減少につながった。したがって、CRRL-094 ISP-NPはインスリン分泌特性とcGMP活性化特性の両方を示した。これらの結果はまた、CRRL-094 ISP-NPが、高血糖症を治療またはコントロールし、かつ糖尿病を患っている哺乳動物における心血管・腎臓機能を保護するために使用され得ることを実証している。
【００８４】
他の態様
本発明は、その詳細な説明に関連して説明されているが、前述の説明は、例示するためのもので、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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