(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、
（ａ）以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される置換、
（ｉ）Ｖ２７３Ｅ、
（ｉｉ）Ｖ２７３Ｆ、
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｍ、
（ｉｖ）Ｖ２７３Ｓまたは
（ｖ）Ｖ２７３Ｙ、
または
（ｂ）以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される置換の組合せ、
（ｉ）Ｖ２６３ＬおよびＶ２７３Ｅ、
（ｉｉ）Ｖ２６３ＬおよびＶ２７３Ｆ、
（ｉｉｉ）Ｖ２６３ＬおよびＶ２７３Ｍ、
（ｉｖ）Ｖ２６３ＬおよびＶ２７３Ｓ、または
（ｖ）Ｖ２６３ＬおよびＶ２７３Ｙ、
を有するＣＨ２ドメインを含む抗体。
【請求項２】
配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ置換を有するＣＨ２ドメインを含む抗体であって、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ置換を有するＣＨ２ドメインを含む抗体であって、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＩＭ３、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、Ｂ７−Ｈ４およびＤＣ−ＳＩＧＮから選択される副刺激分子に特異的に結合する抗体。
【請求項４】
ＣＨ２ドメインがＴ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌを含むＦｃドメインの一部である、請求項１−３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ＣＤ４０、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＨＬＡ分子、副刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、活性化マーカーまたは免疫調節性タンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
エフェクター部分または検出可能な標識に連結されている請求項１−５のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート化合物。
【請求項７】
請求項１−５のいずれか一項に記載の抗体および医薬として許容される担体または請求項６に記載のコンジュゲート化合物を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１−５のいずれか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む原核生物の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを含む真核生物の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項８に記載の核酸を発現するように操作された真核生物の宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物の宿主細胞である、請求項１２に記載の真核生物の宿主細胞。
【請求項１４】
抗体の生成方法であって、（ａ）請求項１−５のいずれか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現するように操作された真核生物の宿主細胞を培養すること、および（ｂ）抗体を回収することを含む方法。
【請求項１５】
免疫障害またはがんを治療する必要がある患者の治療に使用するための、請求項１−５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６に記載のコンジュゲート化合物または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗体が抗ＣＤ４０抗体であり、
がんが、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、カポジ肉腫から選択されてもよい血液がん、または卵巣がん、乳がん、肺がん、黒色腫、膵がんおよび腎臓がんから選択されてもよい固形腫瘍がんである、請求項１５に記載の抗体、コンジュゲート化合物または医薬組成物。
【請求項１７】
副刺激分子が、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＩＭ３、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、Ｂ７−Ｈ４およびＤＣ−ＳＩＧＮから選択される、請求項５に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１−５および１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が二重特異的抗体である、請求項１−５、１７および１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体がヒト化されている、請求項１８または１９に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体がＣＤ４０に特異的に結合する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２７３Ｅ置換を有する、請求項２１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第§１１９（ｅ）条の下、２０１３年３月１５日に出願され、参照により全体が組み込まれる、仮出願第６１／７９１，６２４号の権益を主張する。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、およびここに参照により全体が組み込まれる配列表を含む。２０１４年３月１３日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３８１４９３−８８４ＷＯ（１２５２３４）＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは３１，７０５バイトである。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
抗体の結晶性断片（「Ｆｃ」）領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片で構成される。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）として知られる免疫細胞上の受容体に結合して、活性化シグナルおよび阻害シグナルをもたらす。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６またはＣＤ１６ａとしても知られる）は、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージで見出され、Ｆｃ領域に低い親和性を有する。ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体へのＦｃリガンドの結合は、抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の誘導およびマクロファージによるサイトカイン放出の誘導をもたらすことができる。対照的に、ＦｃγＲＩＩＢ受容体（ＣＤ３２ｂとしても知られる）は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞および好酸球で見出され、ＦｃγＲＩＩＢ受容体へのＦｃリガンドの結合は細胞活性を阻害する。
【０００４】
異なるＦｃＲによる影響を受ける下流シグナル伝達の差は、構造差に基づく。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）を含むＦｃガンマ受容体（「ＦｃγＲ」）ファミリーの中で、Ｆｃ受容体は免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるモチーフを通して活性化シグナルを生成する。ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡの全ては、それらのＩＴＡＭを通して、またはＩＴＡＭ含有サブユニットとの相互作用によって活性化シグナルを生成する。あるいは、Ｆｃ受容体は、阻害シグナルを生成する免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有することができる。ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２、あるいはＦｃγＲＩＩＢのスプライシングされた形（「ＦｃγＲＩＩＢ」と総称される）はＩＴＩＭ配列を有し、したがって阻害Ｆｃ受容体として機能する（Ｂｌａｎｋら、２００９、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２３２（１）：５９−７１頁を参照）。
【０００５】
抗体のＦｃ領域を変化させることによって、抗体治療効力を増加させ、抗体半減期を増加させ、望ましくない副作用を低減するために、改良を加えることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｌａｎｋら、２００９、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２３２（１）：５９−７１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
４．要旨
ＦｃγＲＩＩＩＡは、免疫細胞、特にＡＤＣＣを媒介する細胞を活性化するシグナルを生成するので、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合を減少させることは免疫細胞活性化の減少およびＡＤＣＣレベルの低減になると考えられている。さらに、ＦｃγＲＩＩＢは免疫細胞を阻害するシグナルを生成するので、ＦｃγＲＩＩＢへのＦｃ結合を増加させることに加えてＦｃγＲＩＩＩへのＦｃ結合を減少させることの二重の作用は、単一の受容体の結合をモジュレートすることと比較して免疫細胞活性化のより大きな阻害をもたらす。本発明者らは、Ｆｃ分子のＣＨ２ドメインで両方のＦｃ受容体への結合に影響する単一のアミノ酸置換または点突然変異を同定した。例えば、下でさらに詳細に議論されるように、単一の位置（例えば、Ｖ２６３）のアミノ酸置換はＦｃγＲＩＩＢへの結合を有意に増加させることができ、およびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させることができる。抗体および他のＦｃをベースとした治療分子へのそのようなアミノ酸置換の組込みは、単一の受容体への結合をモジュレートする置換と比較して、免疫細胞活性化のより大きな阻害を有する変異体ポリペプチドをもたらすことができる。変異体ポリペプチドは、免疫活性化の誘導が望ましくない適応症の処置のために、例えば免疫障害の処置で特に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、一態様では、本開示は、対応する野生型ＣＨ２（配列番号２）またはＦｃ領域（配列番号１）の結合と比較してＦｃγＲＩＩＢへの結合を増加させおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減するアミノ酸置換を含む、改変（または変異体）ＣＨ２ドメインまたは全Ｆｃドメインを含むポリペプチド（「変異体ポリペプチド」または「変異体Ｆｃポリペプチド」と総称する）を提供する。開示のポリペプチドは単量体または多量体（例えば、二量体または四量体）であってもよく、各単量体単位は１つ以上のＣＨ２またはＦｃドメインを含む。開示のポリペプチドは、一般的に、開示の変異体ＣＨ２またはＦｃドメインを含む抗体またはＦｃ融合タンパク質である。本開示の変異体ＣＨ２または変異体Ｆｃドメインは、２６３位、２６６位、２７３位および３０５位に１つ以上の置換を一般的に含み、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。これらのアミノ酸位置は、図２でアスタリスク（＊）、ダガー（†）、ダブルダガー（‡）および番号符号（＃）によってそれぞれ示される。
【０００９】
したがって、一態様では、本開示は、配列番号２のＣＨ２ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドを提供する。配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、開示したポリペプチドは、（ａ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６３置換；（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６６置換；および（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２７３置換から選択される１つ以上の置換を含むことができる。
【００１０】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。具体的な実施形態では、ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換は、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙから選択される。
【００１１】
別の態様では、本開示は、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、（ａ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６３置換；（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６６置換；および（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２７３置換から選択される１つ以上の置換を含む、最高６つ、最高５つ、最高４つ、最高３つ、最高２つの置換を有する、または単一のアミノ酸置換を有する変異体ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドを提供する。
【００１２】
開示のポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む、最高６つ、最高５つ、最高４つ、最高３つ、最高２つの置換を有する、または単一のアミノ酸置換を有する変異体ＣＨ２ドメインを含むこともできる。具体的な実施形態では、ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換は、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙから選択される。
【００１３】
本明細書に詳述されるように、ＣＨ２ドメインは抗体のＦｃドメインの成分である。したがって、一態様では、Ｆｃドメインを含むポリペプチドが提供され、前記Ｆｃドメインは開示のＣＨ２ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１のＦｃドメインのＣＨ２ドメインと比較して、最高２０個、最高１５個、最高１２個、最高１０個、最高９個、最高８個、最高７個、最高６個、最高５個または最高４個のアミノ酸置換を有する。全体として、ポリペプチドのＦｃドメインは、配列番号１のＦｃドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有することができる。
【００１４】
当業者は、開示されるＦｃドメインが本明細書に記載される１つ以上のＣＨ２置換のいずれかを含むことができることを理解する。したがって、Ｖ２６３置換（例えば、Ｖ２６３Ｌ）、Ｖ２６６置換（例えば、Ｖ２６６Ｌ）、Ｖ２７３置換（例えば、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳまたはＶ２７３Ｙ）またはＶ３０５置換（例えば、Ｖ３０５ＫまたはＶ３０５Ｗ）を含むそれらを含むポリペプチドが提供される。
【００１５】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６３置換；およびＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２７３置換から選択される１つ以上の置換を有する変異体ＣＨ２ドメインを含む。
【００１６】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、置換Ｖ２６３Ｌ；および／またはＶ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換を有する、変異体ＣＨ２ドメインを含む。
【００１７】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６３置換；ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２６６置換；ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性を減少させるＶ２７３置換から選択される１つ以上の置換を含む、最高６つ、最高５つ、最高４つ、最高３つ、最高２つの置換を有する、または単一のアミノ酸置換を有する変異体ＣＨ２ドメインを含む。
【００１８】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、置換Ｖ２６３Ｌ；および／またはＶ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換から選択される１つ以上の置換を含む、最高６つ、最高５つ、最高４つ、最高３つ、最高２つの置換を有する、または単一のアミノ酸置換を有する変異体ＣＨ２ドメインを含む。
【００１９】
セクション３．５に記載の通り、ＦｃドメインはＦｃエフェクター機能を媒介することが知られている。したがって、本開示は、Ｆｃエフェクター機能を改変する１つ以上の追加の置換または置換の組合せをさらに含むポリペプチドを提供する。一般的に、改変することができるＦｃエフェクター機能には、（ａ）ＦｃＲＮへの結合の低減もしくは増加；（ｂ）ＦｃγＲＩへの結合の低減もしくは増加；（ｃ）ＦｃγＲＩＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＢへの結合の低減もしくは増加；（ｄ）ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減もしくは増加；または（ｅ）上述のものの２つ、３つ、４つもしくは全ての組合せが含まれる。
【００２０】
Ｆｃエフェクター機能を改変することが公知である例示的な置換はＦｃ置換Ｍ４２８Ｌであり、Ｍ４２８ＬはＦｃ置換Ｔ２５０Ｑと一緒に起こることができる。さらに、開示のＦｃドメインは、配列番号１のＦｃドメインと比較して、表１から選択される１つ以上の追加の置換を含むことができる。
【００２１】
一態様では、本開示は、セクション３．１でさらに詳述される、抗体であるポリペプチドを提供する。これらの抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよい。一般的な実施形態では、抗体は、ＣＤ４０、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＨＬＡ分子、副刺激分子、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−２）、ケモカイン、細胞接着因子（例えば、α４インテグリン）、活性化マーカーまたは免疫調節性タンパク質に特異的に結合する。副刺激分子は、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＩＭ３、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、Ｂ７−Ｈ４またはＤＣ−ＳＩＧＮであってもよい。一部の実施形態では、免疫調節性タンパク質は、細胞表面分子である。他の実施形態では、免疫調節性タンパク質は、可溶性分子である。
【００２２】
一般的な実施形態では、抗体はＣＤ２５に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体はＣＤ４０に特異的に結合する。
【００２３】
開示のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインが少なくとも１つの融合パートナーに作動可能に連結されるＦｃドメインの一部であるＦｃ融合タンパク質も含む。Ｆｃ融合タンパク質は、セクション３．３で詳述される。そのようなＦｃタンパク質では、前記少なくとも１つの融合パートナーは、ＴＮＦ受容体ＩＩの細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）；リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）の第１のＥＣＤ；ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）のＥＣＤ；ＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質リガンド結合領域のＣ末端；ＩＬ−１ＲＩ  ＥＣＤのＮ末端；ペプチドトロンボポエチン（ＴＰＯ）模倣体；２つのアミノ酸置換Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙを有するＣＴＬＡ−４のＥＣＤ；ならびにＶＥＧＦ受容体１のＥＣＤおよび／またはＶＥＧＦ受容体２のＥＣＤであってもよい。
【００２４】
別の態様では、本開示は、本開示がエフェクター部分または検出可能な標識に連結したポリペプチドを含むコンジュゲート化合物を提供する。コンジュゲート化合物は、セクション３．６でさらに議論される。一部の実施形態では、コンジュゲート化合物は、検出可能な標識、例えば放射性化合物、蛍光化合物、酵素、基質、エピトープタグまたは毒素に連結させたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、コンジュゲート化合物は、細胞傷害剤などの、エフェクター部分に連結させたポリペプチドを含む。当業者は、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、デュオカルマイシン、マイタンシノイドまたはビンカアルカロイドを含む、開示のポリペプチドに連結させることができる様々な細胞傷害剤を理解する。他の例示的な細胞傷害剤は、抗チューブリン、ＡＦＰ、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである。
【００２５】
本開示は、開示のポリペプチドおよび医薬として許容される担体または開示のコンジュゲート化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物および処置方法は、セクション３．７で詳述される。
【００２６】
開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は本明細書で提供され、核酸を含むベクターも同様である。さらに、開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換される原核生物および真核生物の宿主細胞が本明細書で提供され、このヌクレオチド配列を発現するように操作される真核生物（例えば哺乳動物）の宿主細胞も同様である。宿主細胞を培養することおよびポリペプチドを回収することによってポリペプチドを生成する方法も提供され、下のセクション３．４でさらに議論される。
【００２７】
当業者は、開示のポリペプチドが、それを必要とする患者に開示の適当なポリペプチド、医薬組成物またはコンジュゲート化合物を投与することが適する、免疫障害またはがんなどの様々な疾患または障害の処置で有益であることを理解する。
【００２８】
一部の実施形態では、ポリペプチドはがんの処置のために有益な抗ＣＤ４０抗体である。特定の実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンストレームマクログロブリン血症またはカポジ肉腫から場合によって選択される血液がんである。特定の実施形態では、がんは、卵巣がん、乳がん、肺がん、黒色腫、膵がんおよび腎臓がんから場合によって選択される固形腫瘍である。抗ＣＤ４０抗体の例示的なＶＬおよびＶＨ配列は、配列番号３および配列番号４としてそれぞれ提供される。具体的な実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、多重特異的抗体である。
【００２９】
他の実施形態では、ポリペプチドは、関節リウマチまたは多発性硬化症である免疫障害の処置のために有益な抗ＣＤ２０抗体である。抗ＣＤ２０抗体の例示的なＶＬおよびＶＨ配列は、配列番号５および配列番号６としてそれぞれ提供される。
【００３０】
さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、多発性硬化症、喘息、乾癬、ブドウ膜炎、眼性炎症もしくは臓器移植拒絶反応である免疫障害の処置、またはヒトＴ細胞白血病ウイルス１関連Ｔ細胞白血病であるがんの処置のために有益である、抗ＣＤ２５抗体である。抗ＣＤ２５抗体の例示的なＶＬ配列には、配列番号７および配列番号９が含まれる。抗ＣＤ２５抗体の例示的なＶＬ配列には、配列番号８および配列番号１０が含まれる。
【００３１】
さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎またはプラーク乾癬である免疫障害の処置のために有益である、抗ＴＮＦα抗体である。抗ＴＮＦα抗体の例示的なＶＬ配列には、配列番号１１および配列番号１３が含まれる。抗ＴＮＦα抗体の例示的なＶＬ配列には、配列番号１２および配列番号１４が含まれる。
【００３２】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、関節リウマチまたはキャッスルマン病である免疫障害の処置のために有益である、抗ＩＬ−６受容体抗体である。抗ＩＬ−６受容体抗体の例示的なＶＬおよびＶＨ配列は、配列番号１５および配列番号１６としてそれぞれ提供される。ポリペプチドは、多発性硬化症である免疫障害の処置のために有益である、抗α４インテグリン抗体であってもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ関連周期熱症候群（「ＣＡＰＳ」）である免疫障害の処置のために有益である、抗ＩＬ−１抗体である。抗ＩＬ−６受容体抗体の例示的なＶＬおよびＶＨ配列は、配列番号１７および配列番号１８としてそれぞれ提供される。ポリペプチドは抗ＢＡＦＦ抗体であってもよく、全身性エリテマトーデスまたはアレルギーである免疫障害の処置のために役立つこともできる。抗ＢＡＦＦ抗体の例示的なＶＬおよびＶＨ配列は、配列番号１９および配列番号２０としてそれぞれ提供される。
【００３３】
上の概要は、本明細書に開示される様々な発明のあらゆる実施形態またはあらゆる実行例を記載することを意図しないことを理解すべきである。発明を実施するための形態および実施例のセクションは、例証的実施形態をさらに例示する。本明細書に記載される様々な実施形態は、各具体的な組合せが明示的に開示されているかのように、組合せで開示されることを意図する。実施例は代表させることだけを目的とし、排他的であるまたは本明細書に開示される様々な発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきでない。
【００３４】
本明細書に開示される様々な発明およびその付随する利点の多くのより完全な理解は、後に続く詳細な説明によって提供される。
【００３５】
ここに明細書全体および添付の請求項で用いるように、以下の用語および表現は以下の意味を有するものとする。
【００３６】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、それらが使用される文脈が明らかに別途示さない限り、単数形および複数形の両方を含むものとする。
【００３７】
「少なくとも１つ」および「１つ以上」は互換的に使用され、その冠詞が掲載要素の１つまたは複数を含むことができることを意味する。
【００３８】
特に明記しない限り、明細書および請求項で使用される、成分、反応条件などの量、比および数値的特性を表す全ての数字は、用語「約」によって全ての場合に修飾することができることが企図されることを理解すべきである。
５．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】天然のＩｇＧの概略図である。ジスルフィド結合は、ＣＨ１とＣＬドメインの間および２つのＣＨ２ドメインの間の太線によって表される。Ｖは可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｌは軽鎖を表し、Ｈは重鎖を表す。
【図２Ａ】ヒトＩｇＧ１（配列番号１）からの野生型Ｆｃドメインの配列を示す図である。Ｆｃドメインの中で、ＣＨ２ドメイン（その配列は
【００４０】
【化１】
0006449229.tif 000002
である）は二重下線を引かれ、ＣＨ３ドメイン（その配列は
【００４１】
【化２】
0006449229.tif 000003
である）は太字である。残基２６３、２６６、２７３および３０５は、アスタリスク（＊）、ダガー（†）、ダブルダガー（‡）および番号符号（＃）によってそれぞれ示される。
【図２Ｂ】ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインでのアミノ酸配列およびアミノ酸の番号付けを示す図である。図２ＢのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの完全長配列は、配列番号３８と呼ばれる。
【図３】Ｆｃ受容体への開示のポリペプチドの結合を測定するために使用される複合体の概略図を示す図である。
【図４】（Ａ）ＦｃγＲＩＩＢ１および（Ｂ）ＦｃγＲＩＩＩＡへの野生型ｈｕ１Ｄ１０の結合についてのＦＡＣＳ滴定曲線およびＥＣ５０測定を示す図である。
【図５】代表的なＦＡＣＳ分類結果を示す図である。
【図６】ＦｃγＲＩＩＢ結合が有意に増加し、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合が有意に減少した個々のクローンの濃縮比を提示するグラフである。
【図７】ＦｃγＲＩＩＢ結合の有意な増加およびＦｃγＲＩＩＩＡ結合の有意な減少を有すると同定された位置および置換を示す図である。各突然変異体の濃縮比が、表にされる。
【図８】ＦｃγＲＩＩＢへの開示のポリペプチドの結合の単点ＦＡＣＳデータを示す図である。
【図９】ＦｃγＲＩＩＩＡへの開示のポリペプチドの結合の単点ＦＡＣＳデータを示す図である。
【図１０Ａ】開示のポリペプチドがＦｃγＲＩＩＢへの野生型抗体より高い最大結合を実証したことを示す確証データを示す図である。図１０Ａは、ＦｃγＲＩＩＢに対するＷＴおよび変異体Ｆｃ領域の結合曲線を示す。
【図１０Ｂ】開示のポリペプチドがＦｃγＲＩＩＢへの野生型抗体より高い最大結合を実証したことを示す確証データを示す図である。図１０Ｂは、各変異体の結合のＥＣ５０および野生型結合に対する倍率を示す。
【図１１Ａ】開示のポリペプチドがＦｃγＲＩＩＩＡへの野生型抗体より高い最大結合を実証したことを示す確証データを示す図である。図１１Ａは、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するＷＴおよび変異体Ｆｃ領域の結合曲線を示す。
【図１１Ｂ】開示のポリペプチドがＦｃγＲＩＩＩＡへの野生型抗体より高い最大結合を実証したことを示す確証データを示す図である。図１１Ｂは、各変異体の結合のＥＣ５０および野生型結合に対する倍率を示す。
【図１２】非放射性ＡＤＣＣアッセイを用いた開示のポリペプチドの試験からのＦＡＣＳデータを示す図である。
【図１３Ａ】ＥＣ５０を判定するためにＩｇＧ濃度に対してグラフで示した細胞傷害性パーセントを示すデータを示す図である。
【図１３Ｂ】野生型より低いが多少のＡＤＣＣ活性を有するＦｃγＲＩＩＢ上方突然変異体を示す図である。
【図１３Ｃ】ＡＤＣＣ活性のほとんどないポリペプチドを示す図である。
【図１３Ｄ】非ＡＤＣＣ  ｈｕ１Ｄ１０ポリペプチドとＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少をもたらす既知の置換（Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、二重突然変異体「ＳＥＬＦ」）との比較を示す図である。
【図１４Ａ】クロム遊離試験を用いた開示のポリペプチドのためのＡＤＣＣの誘導の結果を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ａのシンボルキーを示す図である。
【図１５Ａ】単球由来の未熟樹状細胞を用いた開示のポリペプチドのための樹状細胞活性化の結果を示す図である。図１５Ａは、ＡＤＣＣを誘導する変異体による樹状細胞活性化を示す。
【図１５Ｂ】単球由来の未熟樹状細胞を用いた開示のポリペプチドのための樹状細胞活性化の結果を示す図である。図１５Ｂは、ＡＤＣＣを誘導しない変異体による樹状細胞活性化を示す。
【図１５Ｃ】単球由来の未熟樹状細胞を用いた開示のポリペプチドのための樹状細胞活性化の結果を示す図である。図１５Ｃは、ＩＬ−１２誘導のＥＣ５０を示す。
【図１６】最も低いＡＤＣＣ活性のＦｃ変異体を示す図であり、太字は保持された／改善されたＦｃγＲＩＩＢ結合である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
６．詳細な説明
６．１．Ｆｃ変異体ポリペプチド 
免疫グロブリンのＦｃドメインは、非抗原結合機能に関与し、エフェクター分子の結合によって媒介されるいくつかのエフェクター機能を有する。図１で例示されるように、Ｆｃドメインは２つの主ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインで構成され、ＣＨ２ドメインのＮ末端側に小さいヒンジ領域を有する。本開示は、本明細書において変異体ポリペプチド、Ｆｃ変異体または単に変異体もしくはポリペプチドと総称される、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド（および改変ＣＨ２ドメインを含む改変Ｆｃドメイン）を提供する。変異体ポリペプチドは、一般的に、抗体または抗体断片（本明細書において抗体変異体と総称される）またはＦｃ融合タンパク質である。
【００４３】
本明細書で用いるように、抗体アミノ酸残基の番号付けは、特に明記しない限りＫａｂａｔのＥＵ命名法に従って行われる。
【００４４】
本明細書で用いるように、用語「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの一般に認められた境界は異なることもあるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインは、通常Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からまたはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端に及ぶと規定される。一部の実施形態では、変異体はＦｃドメインの一部だけを含み、カルボキシル末端を含むことができまたは含むことができない。免疫グロブリンのＦｃドメインは、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を一般に含む。開示のＦｃ変異体ポリペプチドは、一般的に少なくともＣＨ２ドメインを含み、しばしばＣＨ３ドメインも含む。
【００４５】
本明細書で用いるように、「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン）のアミノ酸２３１あたりからアミノ酸３４０あたりまで延びるひと続きの残基を一般に含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと緊密に対合しない点で特異である。むしろ、２つのＮ連結分枝状炭水化物鎖が、そのままの天然のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。
【００４６】
本明細書で用いるように、「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃγ３」ドメインとも呼ばれる）は、ＦｃドメインのＣＨ２ドメインＣ末端側のひと続きの残基（例えば、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸残基３４１あたりからアミノ酸残基４４７あたりまで）を一般に含む。
【００４７】
用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、Ｆｃドメイン（例えば抗体または抗体断片のＦｃドメイン）に結合する受容体を記載するために用いられる。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の一部が特に企図される。好ましい実施形態では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。他の好ましい実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、例としてはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体があり、これらの受容体の対立遺伝子変異体あるいはスプライシングされた形が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。本用語には、新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれる。
【００４８】
開示のポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン定常領域、好ましくはＩｇＧ  Ｃドメインの全部または一部に実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するＦｃ変異体ドメインを含む。
【００４９】
ヒトＣ領域の多数の配列が公表されている；例えば、Ｃｌａｒｋ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：８８−１１０頁を参照する。ヒト免疫グロブリン重鎖の他の配列は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ）を使用して、ヒトＩｇγ−１鎖Ｃ領域については受託番号Ａ９３４３３、Ｂ９０５６３、Ａ９０５６４、Ｂ９１６６８、Ａ９１７２３およびＡ０２１４６の下で、ヒトＩｇγ−２鎖Ｃ領域についてはＡ９３９０６、Ａ９２８０９、Ａ９０７５２、Ａ９３１３２、Ａ０２１４８の下で、ヒトＩｇγ−４鎖Ｃ領域についてはＡ９０９３３、Ａ９０２４９、Ａ０２１５０の下で、ヒトＩｇγ−３鎖Ｃ領域についてはＡ２３５１１の下で、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＰＩＲデータベースから得ることができる。例示的なＦｃドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
様々な実施形態では、Ｆｃ変異体ドメインのアミノ酸配列は、参照の前述のＦｃドメインのいずれかと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましい実施形態では、参照のＦｃドメインは、配列番号１を含む。
【００５１】
配列比較は、「比較ウィンドウ」にわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、比較することによって一般的に実施される。「比較ウィンドウ」は、参照配列と比較される一般的に１２個の連続した残基の概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最適な整列のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、参照により本明細書に組み込まれる）のコンピュータによる実行、または検査および選択される様々な方法のいずれかによって生成される最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高百分率の相同性をもたらす。）によって実行することができる。ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−４０２頁によって開示されるものを参照することもできる。
【００５２】
本開示は、改変Ｆｃドメインを含むポリペプチドを提供し、そこにおいて、第１のＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＢへのポリペプチドの結合は野生型Ｆｃドメインのそれと比較して増加し、第２のＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡへのポリペプチドの結合は野生型Ｆｃドメインを有する抗体のそれと比較して減少する。ポリペプチドは、抗体またはＦｃ融合タンパク質であってもよい。
【００５３】
Ｆｃ変異体ポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインを有するポリペプチドのそれと比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加およびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少の両方をもたらす単一の置換を含むことができる。
【００５４】
Ｆｃ変異体ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される少なくとも１つの置換を有する、変異体定常領域重鎖ドメイン２（「ＣＨ２」）を含むことができる。変異体ＣＨ２ドメインは、配列番号２のＣＨ２ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を好ましくは有する。様々な実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙから選択される少なくとも１つの置換を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、合計で最高２０個、最高１５個、最高１２個、最高１０個、最高９個、最高８個、最高７個、最高６個、最高５個または最高４個のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下の数のアミノ酸置換を有することができる。
【００５６】
Ｆｃ変異体ポリペプチドは、配列番号２のＣＨ２ドメインと比較して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される少なくとも１つの置換を有するＣＨ２ドメインを含む変異体Ｆｃ領域を含むことができる。変異体Ｆｃ領域は、配列番号１のＦｃ領域と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を好ましくは有する。様々な実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙから選択される少なくとも１つの置換を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、変異体Ｆｃ領域ドメインは、配列番号１のＦｃドメインと比較して、合計で最高２０個、最高１５個、最高１２個、最高１０個、最高９個、最高８個、最高７個、最高６個、最高５個または最高４個のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、配列番号１のＦｃ領域と比較して、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下の数のアミノ酸置換を有することができる。
【００５８】
開示の変異体ポリペプチドは、抗体またはＦｃ融合タンパク質であってもよい。例えば、しかし限定することなく、Ｆｃ融合タンパク質は、例えばサイトカインタンパク質、毒素タンパク質または他の生体活性タンパク質との融合タンパク質として組換えで発現される抗体であってもよい。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、融合パートナーとの融合タンパク質として組換えで発現される、本明細書に開示される変異体Ｆｃドメインなどの、抗体のＦｃドメインを含有する。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、融合パートナーとの融合タンパク質として組換えで発現される、本明細書に開示される変異体ＣＨ２ドメインなどの、Ｆｃ領域のＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含有する。開示の変異体抗体は、抗体−薬物コンジュゲートであってもよい。例えば、しかし限定されずに、変異体抗体は、モル分子毒素または生体活性小分子化合物にコンジュゲートされてもよい。例示的な抗体および融合タンパク質は、セクションで記載される。
【００５９】
開示の変異体Ｆｃドメインは、（ＦｃγＲＩＩＢへの親和性の増加およびＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性の低減をもたらす１つ以上の置換に加えて）エフェクター機能に影響を与える１つ以上の置換を含むことができる。
【００６０】
一実施形態では、変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらす１つ以上の置換を含有し、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含み、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６１】
例えば、変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩへの結合の低減をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６２】
変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩへの結合の低減をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６３】
対象の変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩＩへの結合の低減をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６４】
別の実施形態では、変更されたＦｃγＲ結合親和性を有する変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲへの結合の向上をもたらす１つ以上の置換を含有し、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２７２、２７６、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９８、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２６、３３０、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８または４３０の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含み、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６５】
例えば、変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩＩへの結合の増加をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、ＦｃγＲＩＩへの結合の減少をもたらす１つ以上の置換を場合によってさらに含有することができる。例示的なそのような変異体は、Ｆｃドメインの位置（複数可）２９８および／または３３３でアミノ酸改変（複数可）を含み、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６６】
変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩへの結合の増加をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２７２、２７６、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２６、３３０、３３１、３３７、３４０、３７８、３９８または４３０の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。ＦｃγＲＩＩへの結合の増加を有するそのような変異体Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩＩへの結合の減少をもたらす１つ以上の置換を場合によってさらに含有することができ、例えば、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２６８、２７２、２９８、３０１、３２２または３４０の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。
【００６７】
さらに別の態様では、Ｆｃ変異体ポリペプチドは、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって、胎児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへのそれらの結合親和性を増加または低減させるように改変することができる（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０を参照）。したがって、本開示は、変更された新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合親和性を有する変異体Ｆｃドメインを含むポリペプチドをさらに提供し、このポリペプチドは、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９または４４７の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含み、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。ＦｃＲｎへの結合の低減を有するそのような変異体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９または４４７の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。あるいは上記の変異体Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の増加をもたらす１つ以上の置換を含有することができ、Ｆｃドメインのアミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の任意の１つ以上でアミノ酸改変を含むことができ、そこにおいて、Ｆｃドメインの残基の番号付けは、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスのそれである。さらに他の実施形態では、変異体Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎへの親和性を増強する少なくとも１つ以上の改変、例えば１つ以上のアミノ酸残基２５１−２５６、２８５−２９０、３０８−３１４、３８５−３８９および４２８−４３６の改変（例えば、Ｍ４２８Ｌ）、または位置２５０および４２８の改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ）を有する、例えば、Ｈｉｎｔｏｎら、２００４、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（８）：６２１３−６頁；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３４６３１；およびＷＯ０２／０６０９１９を参照、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４および４２８の少なくとも１つが単独で、またはその任意の組合せで、例えば位置２５０および４２８、または位置２５０および３１４、または位置３１４および４２８、または位置２５０、３１４および４２８で置換されるように突然変異させられ、位置２５０および４２８が具体的な組合せである。位置２５０については、置換するアミノ酸残基は、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基、例えば、限定されずに、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであってもよい。位置３１４については、置換するアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基、例えば、限定されずに、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであってもよい。位置４２８については、置換するアミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基、例えば、限定されずに、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであってもよい。そのような突然変異はＦｃＲｎへの抗体の結合を増加させ、そのことは抗体を分解から保護し、その半減期を増加させる。
【００６８】
Ｆｃエフェクター機能の改変につながる他の例示的な置換は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第７，６３２，４９７号に開示されているものである。具体的な実施形態では、追加の置換は、下の表１のものから選択される。表１は、示された置換についての示されたＦｃγＲへの結合に及ぼす効果（上方、下方または不変「ｎｃ」）を示す（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：６５９１−６０４頁）。
【００６９】
【表１】
0006449229.tif 000004
0006449229.tif 000005
【００７０】
ある特定の実施形態では、開示の変異体Ｆｃ領域は、例えばＷＯ２００９／００６５２０に記載されているようにそれらのヒンジ領域（ＣＨ２ドメインのＮ末端側の配列番号１の部分）に、特にＷＯ２００９／００６５２０の請求項７に示されているアミノ酸位置に、エフェクター機能に影響を与える１つ以上の置換を有することができる。具体的な実施形態では、ヒンジ領域は、ＷＯ２００９／００６５２０の請求項８に示されているようにａからｆｆと命名された置換の組合せの少なくとも１つを含むことができる。ＷＯ２００９／００６５２０は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【００７１】
６．２．変異体抗体
開示のポリペプチドは、「変異体抗体」と呼ばれる本明細書に記載されている変異体Ｆｃ配列を含む抗体であってもよい。
【００７２】
ある特定の実施形態では、開示の変異体抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で用いられている用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローンを含む単一のクローンから導かれる抗体を指し、それが生成される方法を指すものではない。本開示に関連して有益なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組換えおよびファージディスプレイ技術またはその組合せを含む、当技術分野で公知である各種の技術を使用して調製することができる。開示のＦｃ変異体には、キメラの、霊長類化された、ヒト化されたまたはヒト抗体が含まれる。
【００７３】
開示の変異体抗体は、キメラ抗体であってもよい。本明細書で用いられている用語「キメラ」抗体は、ヒト以外の免疫グロブリン、例えばラットまたはマウスの抗体から導かれる可変配列、およびヒト免疫グロブリン鋳型から一般的に選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体の生成方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７頁；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１頁；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２頁；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号を参照。
【００７４】
開示の変異体抗体は、ヒト化されてもよい。ヒト以外の（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖または断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の標的結合性サブドメイン）である。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、および一般的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこにおいて、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト以外の免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれの少なくとも一部を含むこともできる。抗体ヒト化の方法は、当技術分野で公知である。例えば、その全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７頁；米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０号、Ｑｕｅｅｎら；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ、２８：４８９−４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３頁；および米国特許第５，５６５，３３２号を参照。
【００７５】
開示の変異体抗体は、ヒト抗体であってもよい。完全「ヒト」Ｆｃ変異体が、ヒト患者の治療処置にとって望ましい場合がある。本明細書で用いられているように、「ヒト抗体」にはヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離されたまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ方法を含む、当技術分野で公知である様々な方法によって作製することができる。その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；そして、ＷＯ９１／１０７４１を参照。ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生成することもできる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；および第５，９３９，５９８号を参照。さらに、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）およびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの会社は、上の記載されているそれに類似の技術を使用して、選択された抗原に向けられるヒト抗体を提供することに従事している可能性がある。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチでは、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために、マウス抗体などの選択されたヒト以外のモノクローナル抗体が用いられる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３頁）。
【００７６】
開示の変異体抗体は、霊長類化されてもよい。用語「霊長類化された抗体」は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化された抗体の生成方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５８，５７０号；第５，６８１，７２２号；および第５，６９３，７８０号を参照。
【００７７】
開示の変異体抗体は、二重特異的抗体であってもよい。二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有する、モノクローナルの、しばしばヒトのまたはヒト化された抗体である。二重特異的抗体の抗原標的の非限定例には、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスコードエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質または細菌表面タンパク質などが含まれる。
【００７８】
開示の変異体抗体は、二重可変ドメイン（「ＤＶＤ」）免疫グロブリン（「ＤＶＤ−Ｉｇ」）であってもよい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁を参照）。ＤＶＤ−Ｉｇは、リンカーを通して２つのモノクローナル抗体の標的結合性可変ドメインを合わせて、四価の二重標的化単一薬剤を作製する。本開示のＤＶＤの軽鎖に用いるのに適するリンカーには、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁の３０頁の表２．１で特定されているそれら：κ短鎖リンカーＡＤＡＡＰ（配列番号２２）（マウス）およびＴＶＡＡＰ（配列番号２３）（ヒト）；κ長鎖リンカーＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰ（配列番号２４）（マウス）およびＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２５）（ヒト）；λ短鎖リンカーＱＰＫＡＡＰ（配列番号２６）（ヒト）；λ長鎖リンカーＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号２７）（ヒト）；ＧＳ−短リンカーＧＧＳＧＧ（配列番号２８）、ＧＳ−中間リンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２９）およびＧＳ−長リンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）（全てのＧＳリンカーはマウスおよびヒトである。）が含まれる。本開示のＤＶＤの重鎖に用いるのに適するリンカーには、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁の３０頁の表２．１で特定されているそれら：短リンカーＡＫＴＴＡＰ（配列番号３１）（マウス）およびＡＳＴＫＧＰ（配列番号３２）（ヒト）；長リンカーＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号３３）（マウス）およびＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号３４）（ヒト）；ＧＳ−短リンカーＧＧＧＧＳＧ（配列番号３５）、ＧＳ−中間リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）およびＧＳ−長リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３７）（全てのＧＳリンカーはマウスおよびヒトである。）が含まれる。好ましくはヒトリンカーは、ヒトのまたはヒト化されたＤＶＤ−Ｉｇのために使用されている。
【００７９】
本開示では、ＤＶＤ−Ｉｇは、２つの異なる標的の方に向けられる。標的は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、または２０１１年２月２４日に公表されたＴａｒｉｑら、米国特許出願公開第２０１１／００４４９８０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。）に記載されている任意の他の標的から選択することができる。
【００８０】
ＤＶＤ免疫グロブリンの標的結合性ドメインは一般的に縦に並んで配置され、１つの可変ドメインが別の上に積み重ねられて、内側および外側のＦｖドメインを形成する。
【００８１】
開示の変異体抗体は、誘導体化された抗体を含む。例えば、しかし限定せずに、誘導体化される抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結（抗体コンジュゲートの議論についてはセクション６．５を参照）などによって一般的に改変される。公知の技術、例えば限定されずに特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって、多数の化学的改変のいずれかを実行することができる。さらに、誘導体は、例えばＡｍｂｒｘ技術を用いて、１つ以上の非天然アミノ酸を含有することができる（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２頁を参照）。
【００８２】
６．２．１．Ｆｃ変異体抗体の標的
それらに限定されないが、サイトカインなどの可溶性因子および膜貫通受容体を含む膜結合因子の両方を含む、標的抗原の以下のリストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープを含む、事実上いかなる抗原も開示の抗体の標的にすることができる：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ  ＡＬＫ−２、アクチビン  ＲＩＢ  ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−抗トリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘ１、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂリンパ球刺激物質（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃ１、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２  ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３  オステオゲニン、ＢＭＰ−４  ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６  Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、癌腫関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ���２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ  ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎアーゼ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、１０ａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルキン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質１０ｂ／ＩＩＩａ（ＧＰ１０ｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ  ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ  ＵＬ、造血増殖因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ  Ｂ  ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ  ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ  ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在性ＴＧＦ−１、潜在性ＴＧＦ−１  ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、Ｌｅｆｔｙ、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺界面活性剤、黄体形成ホルモン、リンフォトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、メタロプロテアーゼ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制因子（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、���ＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリリシン、ニューロトロフィン−３、−４または−６、ニュールツリン、ニューロン成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰＩＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロリラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、レニン、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ  Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマチ因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリ性ホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータＰａｎ特異的、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ１  Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ２  ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、
ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ３  ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ４  ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ  ＯＤＦ  Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ  ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ  Ｒ  ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ  ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ  Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ  ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ  ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ  ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ  ＲＩ  ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ  ＲＩＩ  ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ  ＴＮＦ  ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０  ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０  ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ  Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１  ＢＢ  ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３  Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ  Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ  Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ  ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ  ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ  ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ  ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ  ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１  ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１��、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォンウィルブラント因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤならびにホルモンおよび成長因子の受容体。
【００８３】
本明細書に記載されている変異体Ｆｃドメインを含む開示の抗体は、公知の「親」抗体のＣＤＲ配列または可変ドメイン配列を含むことができる。一部の実施形態では、親抗体および開示の抗体は、本明細書に開示されているＦｃドメインへの改変を除いて類似したまたは同一の配列を共有することができる。
【００８４】
例えば、親抗体は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば米国特許第５，７３６，１３７号を参照）、非ホジキンリンパ腫を処置するために承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体；ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂによって現在開発中の抗ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号に記載されている抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）およびＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、表題「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）にかなり類似していてもよい。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮成長因子受容体のファミリーのメンバーを標的にするいくつかの抗体は、本発明のＦｃポリペプチドから恩恵を受けることができる。例えば、本発明のＦｃポリペプチドは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（例えば米国特許第５，６７７，１７１号を参照）、乳がんを処置するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；ペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標））、現在Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中；米国特許第４，７５３，８９４号に記載されている抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ  ＷＯ９６／４０２１０）、様々ながんのために臨床試験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；ＡＢＸ−ＥＧＦ（米国特許第６，２３５，８８３号）、現在Ａｂｇｅｎｉｘ−Ｉｍｍｕｎｅｘ−Ａｍｇｅｎによって開発中；ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（米国特許シリアルナンバー１０／１７２，３１７）、現在Ｇｅｎｍａｂによって開発中；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００およびＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号；Ｍｕｒｔｈｙら１９８７、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５２（２）：５４９−６０頁；Ｒｏｄｅｃｋら、１９８７、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５−２０頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３頁）；ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＰＣＴ  ＷＯ９５／２００４５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、１９９３、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９３、２２（１−３）：１２９−４６頁；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、１９９３、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９３、６７（２）：２４７−５３頁；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、１９９６、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７３（２）：２２８−３５頁；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、２００３、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１０５（２）：２７３−８０頁）；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎａｄａ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号；米国��許第６，５０６，８８３号；Ｍａｔｅｏら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３（１）：７１−８１頁）；ｍＡｂ−８０６（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈら２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（２）：６３９−４４頁）；ＫＳＢ−１０２（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲ１−１（ＩＶＡＸ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ  ＷＯ０１６２９３１Ａ２）；およびＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ  ＷＯ０１／８８１３８）にかなり類似している抗体での使用が可能である。別の好ましい実施形態では、本発明のＦｃポリペプチドは、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の処置のために現在承認されているヒト化モノクローナル抗体で使用できる。本発明のＦｃポリペプチドは、他の臨床製品および候補、例えばそれらに限定されずに、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標））、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体、ゲムツズマブオゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、Ｈｕｍｉｃａｄｅ（商標）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、ＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＣＤ１４７抗体、ＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＩＬ８抗体、ＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＭＵＣ１８抗体、ペムツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１抗体、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のチオプラチン（ＡＳ１４０７）、Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体、ＶＬＡ−１  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体、ＬＴＢＲ  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体、ＣＡＴ��１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗ＴＧＦβ２抗体、Ｊ６９５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔによって開発中の抗ＩＬ−１２抗体、ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅによって開発中の抗ＴＧＦβ１抗体、ＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗エオタキシン１抗体、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によって開発中の抗Ｂｌｙｓ抗体、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１  ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発中の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、抗組織因子（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗組織因子抗体、Ｘｏｌａｉｒ（商標）（オマリズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＩｇＥ抗体、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（エファリズマブ）、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＸｏｍａによって開発中の抗ＣＤ１１ａ抗体、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中のＭＬＮ−０２抗体（旧称ＬＤＰ−０２）、ＨｕＭａｘ  ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中の抗ＩＬ１５抗体、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘによって開発中のＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、ＨｕＭａｘ−がん、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ  ＧｅｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発中の抗ヘパラナーゼＩ抗体、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中のＨｕＭａｘ−リンパ腫、Ｇｅｎｍａｂによって開発中のＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ８０抗体、ＩＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ２３、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）抗体、ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗イディオタイプ抗体、ＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＫＤＲ抗体、ＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ｆｌｋ−１抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＶＥカドヘリン抗体、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（商標）（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗がん胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗ＣＤ２２抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、ＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＤ３０抗体、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ−０７０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ−０１８、Ｏｓｉｄｅｍ（商標）（ＩＤＭ−１）、ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発中の抗Ｈｅｒ２抗体、ＨｕＭａｘ（商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＩＬ１５抗体、ＣＮＴＯ  １４８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗ＴＮＦα抗体、ＣＮＴＯ  １２７５、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗サイトカイン抗体、ＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体、ＭＯＲ２０１、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体、Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗ＣＤ３抗体、ＨｕＺＡＦ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗ガンマインターフェロン抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗α５β１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗ＩＬ−１２、ＩＮＧ−１、Ｘｏｍａによって開発中の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、ならびにＭＬＮ０１、Ｘｏｍａによって開発中の抗ベータ２インテグリン抗体、にかなり類似している様々な抗体またはＦｃ融合体で使用でき、この段落の上で引用した参照の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８５】
一実施形態では、本発明の変異体は、自己免疫性、炎症性または移植適応症の処置のために使用される。そのような疾患に関連する標的抗原および臨床製品および候補には、限定されずに抗α４β７インテグリン抗体、例えばＬＤＰ−０２、抗ベータ２インテグリン抗体、例えばＬＤＰ−０１、抗補体（Ｃ５）抗体、例えば５Ｇ１．１、抗ＣＤ２抗体、例えばＢＴＩ−３２２、ＭＥＤＩ−５０７、抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３、抗ＣＤ４抗体、例えばＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１４抗体、例えばＩＣ１４、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２３抗体、例えばＩＤＥＣ１５２、抗ＣＤ２５抗体、例えばＺｅｎａｐａｘ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば５ｃ８、Ａｎｔｏｖａ、ＩＤＥＣ−１３１、抗ＣＤ６４抗体、例えばＭＤＸ−３３、抗ＣＤ８０抗体、例えばＩＤＥＣ−１１４、抗ＣＤ１４７抗体、例えばＡＢＸ−ＣＢＬ、抗Ｅ−セレクチン抗体、例えばＣＤＰ８５０、抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばＲｅｏＰｒｏ／Ａｂｃｉｘｉｍａ、抗ＩＣＡＭ−３抗体、例えばＩＣＭ３、抗ＩＣＥ抗体、例えばＶＸ−７４０、抗ＦｃＲ１抗体、例えばＭＤＸ−３３、抗ＩｇＥ抗体、例えばｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５、抗ＩＬ−４抗体、例えばＳＢ−２４０６８３、抗ＩＬ−５抗体、例えばＳＢ−２４０５６３、ＳＣＨ５５７００、抗ＩＬ−８抗体、例えばＡＢＸ−ＩＬ８、抗インターフェロンガンマ抗体、抗ＴＮＦ（ＴＮＦ、ＴＮＦａ、ＴＮＦａ、ＴＮＦ−アルファ）抗体、例えばＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、インフリキシマブ、ＭＡＫ−１９５Ｆ、および抗ＶＬＡ−４抗体、例えばＡｎｔｅｇｒｅｎが含まれる。
【００８６】
開示の変異体Ｆｃ領域を組み込むように操作することができる例示的な抗体を、下の表２に示す：
【００８７】
【表２】
0006449229.tif 000006
0006449229.tif 000007
【００８８】
このセクションで記載されている抗体のいくつかは、それらの生体特性を改善するために突然変異分析にかけた。望ましい特性を有するそのような突然変異体抗体は、開示の変異体ＣＨ２ドメインおよびＦｃ領域を組み込むように改変することができる。例えばＵＳ２０１０／０２６６６１３Ａ１は、抗ＴＮＦα抗体アダリムマブの変異体ＶＬおよびＶＨ配列を開示している。開示の変異体ＣＨ２ドメインおよびＦｃ領域は、参照により本明細書にその全体が組み込まれているＵＳ２０１０／０２６６６１３Ａ１に開示されている変異体抗ＴＮＦα抗体のいずれかに組み込むことができる。一部の実施形態では、変異体抗ＴＮＦα抗体は、ＵＳ２０１０／０２６６６１３の表５の置換、すなわちＶＬ鎖中のＡ２５Ｗ、Ｑ２７Ｒ、Ｑ２７Ｔ、Ｉ２９Ｖ、Ｒ３０ＱおよびＬ３３Ｅの１つ以上を含む。他の実施形態では、変異体抗ＴＮＦα抗体は、ＵＳ２０１０／０２６６６１３の表１０からの置換の組合せ、すなわちＶＬ鎖中のＩ２９Ｔ／Ａ３４Ｇ、Ｎ３１Ｔ／Ａ３４Ｇ、Ｒ３０Ｑ／Ａ３４Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｑ２７Ｇ／Ａ３４Ｇ、Ｑ２７Ｈ／Ａ３４Ｓ、Ｑ２７Ｒ／Ａ３４Ｓ、Ｇ２８Ｓ／Ａ３４Ｓ、Ｎ３１Ｔ／Ａ３４ＳまたはＮ３１Ｓ／Ａ３４Ｓを含み、最も好ましくはＧ２８Ｓ／Ａ３４Ｓを含む。上の表２において、Ａ２５からＡ３４までのひと続きのアミノ酸は、太字で、下線を引いたフォントである。
【００８９】
一部の実施形態では、感染性疾患に対する抗体が使用される。真核生物の細胞に対する抗体には、酵母細胞、例えば限定されずに、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・ギレリモンジ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、プラスモディウム・ファルシパリウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）およびヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を標的にする抗体が含まれる。
【００９０】
カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）およびＣ．マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）を含むカンジダ属の株、ならびにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種に関連した標的抗原を含む、追加の真菌細胞に対する抗体も有益である。
【００９１】
原生動物に関連した標的抗原に対する抗体には、限定されずに、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉｉ）を含むリーシュマニア属種；プラスモディウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、エントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）およびシクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）に関連した抗体が含まれる。
【００９２】
原核生物の抗原に対する抗体、例えば、病原性および非病原性の原核生物などの適する細菌、例えば限定されずに、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばバシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、例えばＶ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）；エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ）、例えば腸内毒素原性Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、例えばＳ．ジセンテリエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）例えばＭ．ツバークローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．レプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、例えばＣ．ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばＣ．ジフテリエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；スタフィロコッカス属、例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、例えばＨ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、例えばＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｄｓ）、Ｎ．ゴノローエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、例えばＹ．ランブリア（Ｙ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｙ．ペスチス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばＰ．アエルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、例えばＣ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、例えばＢ．ペルタシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、例えばＴ．パラジウム（Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ）；Ｂ．アンスラシス、Ｙ．ペスチス、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．マレイ（Ｂ．ｍａｌｌｅｉ）、Ｂ．シュードマレイ（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｂ．マレイ、Ｂ．シュードマレイ、Ｃ．ボツリナム、サルモネラ属種、ＳＥＢＶ．コレラ毒素Ｂ、Ｅ．コリーＯ１５７：Ｈ７、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、ロドトルラ属種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、リステリア属種、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）などに対する抗体も有益である。
【００９３】
一部の態様では、抗体はウイルス感染症に向けられる；これらのウイルスには、オルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パラミキソウイルス（例えばＲＳウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば乳頭腫ウイルス）、ポリオーマウイルスおよびピコルナウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
６．３．Ｆｃ融合タンパク質
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。Ｆｃをベースとした融合タンパク質は、別のペプチドに直接連結されている免疫グロブリンＦｃドメインで一般的に構成される。Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙら、２０１２、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ４：１０１５−１０２８頁によって説明されているように、融合パートナーは対象の任意の他のタンパク性分子、例えば細胞表面受容体との相互作用によりタンパク質を活性化するリガンド、難しい病原体に対するペプチド抗原（Ａｇ）またはタンパク質マイクロアレイで組み立てられた結合パートナーを同定するための「餌」タンパク質であってもよい。最も頻繁には、Ｆｃドメインは治療潜在能力を有するポリペプチドに融合されて、いくつかの追加の有益な生物学的および薬理学的特性を融合に与える。Ｆｃドメインの存在は、タンパク質の血漿半減期を著しく増加させることができ、それはサルベージ新生児Ｆｃ受容体とのその相互作用（ＦｃＲｎ；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ＆Ａｋｉｌｅｓｈ、２００７、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：７１５−７２５頁）、ならびにより大きな分子のより遅い腎クリアランス（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２０１１、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：８６８−８７６頁）のためにその治療活性を長引かせる。付着しているＦｃドメインは、これらの分子が免疫細胞の上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）と相互作用することも可能にする（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ＆Ｒａｖｅｔｃｈ、２００８、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：３４−４７頁）。
【００９５】
したがって、Ｆｃ融合体は、抗体のＦｃ領域、したがってその好都合のエフェクター機能および薬物動態を、受容体の標的結合領域、リガンドまたは一部の他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインと組み合わせる。後者の役割は標的認識を媒介することであり、したがってそれは抗体可変領域に機能的に類似している。Ｆｃ融合体の抗体との構造的および機能的重複のために、本開示での抗体に関する議論は特記しない限りＦｃ融合体に拡張する。
【００９６】
例示的な実施形態では、Ｆｃ融合パートナーは、ＴＮＦ受容体ＩＩの細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）；リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）の第１のＥＣＤ；ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）のＥＣＤ；ＩＬ−１ＲＩ  ＥＣＤのＮ末端に融合しているＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質リガンド結合領域のＣ末端；ペプチドトロンボポエチン（ＴＰＯ）模倣体；２つのアミノ酸置換Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙを有するＣＴＬＡ−４のＥＣＤ；またはＶＥＧＦ受容体１および２のＥＣＤである。
【００９７】
本明細書に記載されている変異体Ｆｃドメインを含む開示のＦｃ融合タンパク質は、公知の「親」Ｆｃ融合体、例えば表３に記載されている承認された生物製剤に基づいてもよい。
【００９８】
【表３】
0006449229.tif 000008
【００９９】
一部の実施形態では、開示の親Ｆｃ融合体およびＦｃ融合体は、本明細書に開示されているＦｃドメインへの改変を除いて類似したまたは同一の配列を共有することができる。
【０１００】
Ｆｃ融合タンパク質は、完全なＦｃ領域の代わりに変異体ＣＨ２ドメインだけを含有することもできる。変異体ＣＨ２ドメインを含有する融合タンパク質は、例えば二量体化ドメインとしておよび／または融合ポリペプチドをＦＣγＩＩＢに誘導するために使用することができる。一実施形態では、融合パートナーは、「直列型の」Ｆｃポリペプチドを形成する、ＩｇＥ  Ｆｃドメインなどの別のＦｃドメインである。ＩｇＧ−ＩｇＥ融合ポリペプチドは、ＦｃεＲおよびＦｃγＲＩＩＢに結合し、肥満細胞脱顆粒を停止することが示された。Ｃｅｒｍｅｒｓｋｉら、２０１２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４３：３４−４３頁を参照。
【０１０１】
６．４．核酸および発現系
本開示は、開示のＦｃ変異体ポリペプチドをコードする核酸分子および宿主細胞を包含する。
【０１０２】
抗体である開示の変異体抗体は、宿主細胞での免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。例えば、組換えで抗体を発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞で発現され、場合によって、抗体を回収することができる、宿主細胞が培養される培地に分泌されるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を運ぶ１つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞に導入するために、標準の組換えＤＮＡ方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９）、および米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法が使用される。
【０１０３】
一実施形態では、Ｆｃ変異体ポリペプチドは、それらのＦｃドメインでの変化を除いてそれらの野生型同等物に類似している。そのようなＦｃ変異体ポリペプチドをコードする核酸を生成するために、野生型抗体のＦｃドメインまたはＦｃドメインの一部（「野生型Ｆｃドメイン」と呼ぶ）をコードするＤＮＡ断片を合成して、日常の突然変異誘発技術を使用して本明細書に記載されているポリペプチドを生成する突然変異誘発のための鋳型として使用することができ；あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を直接に合成することができる。
【０１０４】
野生型ＦｃドメインをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば定常領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に変換するために、標準の組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作することができる。これらの操作では、ＣＨをコードするＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば抗体可変領域またはフレキシブルリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用されるように、用語「作動可能に連結される」は、その２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するものとする。
【０１０５】
開示のＦｃ変異体ポリペプチドを発現させるために、その遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、上記のように得られる部分的なまたは完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが発現ベクターに挿入される。この文脈において、用語「作動可能に連結される」は、ベクターの中の転写および翻訳制御配列がポリペプチド遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、ポリペプチド遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。変異体抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されてもよく、またはより一般的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。
【０１０６】
ポリペプチド遺伝子は、標準の方法によって発現ベクターに挿入される（例えば、ポリペプチド遺伝子断片およびベクターの上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）。変異体Ｆｃドメイン配列の挿入の前に、発現ベクターは既に抗体可変領域配列をもっていてもよい。さらに、または代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、または異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質からのシグナルペプチド）であってもよい。
【０１０７】
抗体鎖遺伝子に加えて、開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を運ぶ。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって決めることができることは、当業者に理解される。哺乳動物宿主細胞での発現のために適する調節配列には、哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照。
【０１０８】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば複製開始点）などの追加の配列、および選択マーカー遺伝子を運ぶことができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物への耐性を付与する。適する選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅と使用するために）およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のために）が含まれる。軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準の技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形は、原核生物または真核生物の宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。
【０１０９】
原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞で開示のポリペプチドを発現させることが可能である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、適切に折り畳まれている、免疫活性のあるポリペプチドの最適な分泌のために、真核生物細胞、例えば哺乳動物の宿主細胞で実行される。開示の組換えポリペプチドを発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカー、例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載されているものと使用された、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０頁に記載されているＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＳＰ２／０細胞が含まれる。ポリペプチド遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞でのポリペプチドの発現を可能にするまたは宿主細胞が増殖する培地へのポリペプチドの分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによってポリペプチドは生成される。ポリペプチドは、標準のタンパク質精製方法を使用して培地から回収することができる。宿主細胞は、無傷のポリペプチドの一部、例えばＦａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を生成するために使用することもできる。上記の手順の変形が本開示の範囲内であると理解される。
【０１１０】
組換えＤＮＡ技術は、抗原への結合のために必要でない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡの一部または全部を取り除くために使用することもできる。そのようなトランケーションされたＤＮＡ分子から発現される分子も、開示のポリペプチドに包含される。
【０１１１】
一部の実施形態では、開示のポリペプチドは、二官能基抗体であってもよい。１つの重鎖および１つの軽鎖が１つの抗原に特異的であり、他の重鎖および軽鎖が第２の抗原に特異的であるそのような抗体は、標準の化学架橋法によって開示の抗体を第２の抗体へ架橋させることによって生成することができる。二官能基の抗体は、二官能基抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによって作製することもできる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、二重特異抗体、すなわち同じ結合部位を使って１つの抗原および第２の無関係な抗原に結合する抗体は、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲのアミノ酸残基を突然変異させることによって生成することができる。例示的な第２の抗原には、炎症誘発性サイトカイン（例えばリンフォトキシン、インターフェロン−γまたはインターロイキン−１）が含まれる。二重特異的ポリペプチドは、例えば、抗原結合部位の末梢のアミノ酸残基を突然変異させることによって生成することができる（例えば、Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１６１４頁を参照する）。二重官能性のポリペプチドは、二重特異的ポリペプチドをコードするように操作された核酸を発現させることによって作製することができる。
【０１１３】
開示のポリペプチドは、化学的合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌに記載されている方法による）によって生成することもできる。ポリペプチドは、無細胞プラットホームを使用して生成することもできる（例えば、Ｃｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  ２号、２００１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を参照）。
【０１１４】
Ｆｃ融合タンパク質の組換え発現のための方法は、Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７８巻：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されている。
【０１１５】
開示のポリペプチドが組換え発現によって生成されると、それは免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、プロテインＡまたはプロテインＧ選択の後の抗原については特に親和性、およびサイズ処理カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差別的溶解性、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準技術によって精製することができる。さらに、本開示のポリペプチドまたはその断片は、精製を促進するために、本明細書に記載されているさもなければ当技術分野で公知である異種ポリペプチド配列に融合させることができる。
【０１１６】
単離されると、ポリペプチドは所望により、例えば高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｏｒｋおよびＢｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０））、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製されてもよい。
【０１１７】
６．５．Ｆｃ変異体ポリペプチドの生体活性
ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＢへの結合に影響を与えるＦｃ領域中のアミノ酸置換の組込みのために、開示のポリペプチドは、改変された生体活性、例えば改変されたエフェクター機能ならびに／またはＦｃγＲＩＩＩＡおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＢへの結合を提示する。
【０１１８】
一実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。したがって、本開示は、非変異体Ｆｃポリペプチド、すなわち、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増加させおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させる置換（複数可）、例えば置換Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗの１つ以上を除いて同一であるポリペプチドと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％またはそれ以上も低減されるＡＤＣＣを示すことで特徴付けられる変異体Ｆｃポリペプチドを提供する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、ＡＤＣＣの低減は、例えば３以上、６以上、１０以上または５０以上の数の健康なドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞を使用するときに、例えば２５：１、４０：１、５０：１または６０：１のエフェクター対標的細胞比を使用して、１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬ以上（例えば、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬ）のポリペプチド濃度でのインビトロアッセイで測定される。実施例９に記載されているようにＡＤＣＣ活性はフローサイトメトリーによって測定することができ、または実施例１０に記載されているように５１クロム放出を測定することによって測定することができる。ＡＤＣＣアッセイで利用される標的細胞は変異体ポリペプチドの結合特異性に依存し、当業者ならば容易に決定することができる。例えば、実施例９に記載されているように、Ｒａｊｉ細胞は、抗体Ｈｕ１Ｄ１０（およびそのＦｃ変異体）のＡＤＣＣ活性の検査のための適する標的細胞であり、実施例１０に記載されているように、リンパ腫ＲＬ細胞は、抗ＣＤ４０抗体（およびそのＦｃ変異体）のＡＤＣＣ活性の検査のための適する標的細胞である。
【０１２０】
別の実施形態では、エフェクター機能は架橋Ｆｃポリペプチドによる標的細胞の免疫活性化である。例えば１つのアッセイでは、標的細胞は樹状細胞であり、架橋Ｆｃポリペプチドは抗ＣＤ４０抗体である。一般的に、ＦｃγＲＩＩＢへのＦｃ領域の結合は、受容体のＩＴＡＭモチーフを通してＦｃγＲＩＩＢ陽性細胞に負のシグナルを提供する。しかし、樹状細胞の表面でのＦｃγＲＩＩＢへの抗ＣＤ４０抗体のＦｃ領域の結合はＣＤ４０の架橋を向上させ、樹状細胞によるＩＬ−１２生成の増加をもたらす。したがって、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性を増加させることは、より高いＩＬ−１２分泌をもたらす。したがって、開示は、ＣＤ４０抗体に接いだときに、そのＦｃ領域が樹状細胞でＩＬ−１２分泌を増加させる変異体Ｆｃポリペプチドを提供する。様々な実施形態では、Ｆｃ領域は、非変異体抗ＣＤ４０抗体、すなわち、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増加させ、場合によってさらにＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させる置換（複数可）、例えば置換Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗの１つ以上を除いて同一である抗ＣＤ４０抗体と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、またはそれ以上も樹状細胞を活性化することができる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、樹状細胞の免疫活性化は、ＩＬ−１２ｐ７０分泌アッセイで測定される。簡潔には、単球由来の未熟な樹状細胞（「ｍｏＤＣ」）は、開示のポリペプチドで刺激することができ、ＩＦＮγでプライミングすることができ、生成されたＩＬ−１２ｐ７０の生じた量は例えばＥＬＩＳＡによって検査することができる。例示的な実施形態では、ＩＬ−１２ｐ７０分泌アッセイは、下記の実施例１１に記載されているように実施される。
【０１２２】
さらに他の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加および／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減を提示する。例示的な結合アッセイは、実施例７および８に記載されている。ある特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢへの変異体ポリペプチドの結合は、非変異体Ｆｃポリペプチド、例えば、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗの置換の１つ以上を除いて同一であるポリペプチドのＦｃγＲＩＩＢへの結合より少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％大きい。さらなる実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡへの変異体ポリペプチドの結合は、非変異体Ｆｃポリペプチド、例えば、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗの置換の１つ以上を除いて同一であるポリペプチドのＦｃγＲＩＩＩＡへの結合より少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％小さい。
【０１２３】
６．６．ポリペプチドコンジュゲート
開示のポリペプチドには、例えば、共有結合が抗原への結合に干渉しないような、ポリペプチドへの任意の種類の分子の共有結合によって改変されるポリペプチドコンジュゲートが含まれる。
【０１２４】
ある特定の態様では、開示のポリペプチドは、エフェクター部分または標識にコンジュゲートされてもよい。本明細書で用いられる用語「エフェクター部分」には、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、抗体もしくは抗体断片、合成されたもしくは天然に存在するポリマー、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば蛍光性化合物またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物が含まれる。
【０１２５】
１つの例では、所与の生体応答を改変するために、ポリペプチドはエフェクター部分、例えば細胞傷害剤、放射性核種または薬物部分にコンジュゲートされてもよい。エフェクター部分は、タンパク質またはポリペプチド、例えば、限定せずに、毒素（アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素など）、シグナル伝達分子（α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子または組織プラスミノーゲン活性化因子など）、血栓剤もしくは抗血管新生剤（例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン）または生体応答調整剤、例えばサイトカインもしくは成長因子（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ））であってもよい。
【０１２６】
別の例では、エフェクター部分は、細胞毒素または細胞傷害剤であってもよい。細胞毒素および細胞傷害剤の例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、およびその類似体または相同体が含まれる。
【０１２７】
エフェクター部分には、限定されずに、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ５およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシンまたはデュオカルマイシン）、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。
【０１２８】
他のエフェクター部分には、放射性核種、例えば限定されずに、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８、ならびに薬物、例えば限定されずに、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンが含まれてもよい。
【０１２９】
そのようなエフェクター部分をポリペプチドにコンジュゲートする技術は当技術分野で周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、６２３−５３頁（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７））；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３頁）。
【０１３０】
１つの例では、ポリペプチドは、共有結合（例えば、ペプチド結合）により、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端を通して、または内部的に別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその一部、例えばタンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分）に融合される。ポリペプチドは、他のタンパク質にポリペプチドのＦｃドメインのＮ末端で連結することができる。そのような融合体を作製するために、例えばＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５に記載されているように、組換えＤＮＡ方法を使用することができる。別の例では、エフェクター分子はインビボ半減期を増加させることができ、および／または上皮障壁を横断する免疫系へのポリペプチドの送達を増強することができる。このタイプの適するエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質またはアルブミン結合性化合物、例えばＷＯ２００５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【０１３１】
ある特定の態様では、ポリペプチドは小分子毒素にコンジュゲートされる。ある特定の例示的な実施形態では、開示のポリペプチドは、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド類似体もしくは誘導体、例えばオーリスタチンにコンジュゲートされる（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号）。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、そのＮ（アミノ）末端、Ｃ（カルボキシル）末端を通して、または内部的にポリペプチドに付着させることができる（ＷＯ０２／０８８１７２）。ここに参照によりその全体が組み込まれている米国特許第７，４９８，２９８に開示されているように（例えば、リンカーおよびリンカーにコンジュゲートされるＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物の調製方法を開示している）、例示的なオーリスタチン実施形態には、Ｎ末端に連結されたモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦが含まれる。
【０１３２】
他の例示的実施形態では、小分子毒素には、限定されずに、カリケアマイシン、マイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｎｅ）およびＣＣ１０６５が含まれる。本開示の一実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上のマイタンシン分子（例えばポリペプチド１分子につき約１から約１０の数のマイタンシン分子）にコンジュゲートされる。マイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元してポリペプチドと反応させて（Ｃｈａｒｉら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１頁）、マイタンシノイド−ポリペプチドまたはマイタンシノイド−Ｆｃ融合コンジュゲートを生成することができる、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換することができる。同じく用いることができるカリケアマイシンの構造類似体には、限定されずに、γ１１、γ３１、γ３１Ｎ−アセチル−γ１１、ＰＳＡＧおよびθ１１が含まれてもよい（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２頁；Ｌｏｄｅら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８頁；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。
【０１３３】
開示のポリペプチドは、標的送達のためにリポソームにコンジュゲートされてもよい（例えば、Ｐａｒｋら、１９９７、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５頁；Ｍａｒｔｙ  ＆  Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０９：３８９−４０１頁を参照）。
【０１３４】
１つの例では、本開示のポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着させることができる。１つの特定の例では、ポリペプチドは抗体断片であり、ＰＥＧ部分は抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端のアミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を通して付着させることができる。そのようなアミノ酸は抗体断片に天然に存在してもよくまたは組換えＤＮＡ方法を用いて断片に導入することができる。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照。２つ以上のＰＥＧ分子を付着させるために、多部位を使用することができる。ＰＥＧ部分は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通して共有結合することができる。チオール基が付着点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター部分（例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体）を使用することができる。
【０１３５】
本明細書で用いるとき、語「標識」は、開示のポリペプチドと直接または間接にコンジュゲートさせることができる検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であってもよく（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）または、酵素標識の場合は検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。有益な蛍光性部分には、限定されずに、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル塩化物、フィコエリトリンなどが含まれる。有益な酵素標識には、限定されずに、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが含まれる。
【０１３６】
６．７．医薬組成物および治療方法
それらの低いＡＤＣＣ活性のために、開示のポリペプチドは、細胞殺滅が望ましくない、自己免疫性疾患を含む免疫疾患および障害の状況で特に有益である。そのような疾患および障害の例には、アジソン病、耳の自己免疫性疾患、ブドウ膜炎などの眼の自己免疫性疾患、自己免疫性肝炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブズ病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常天疱瘡、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、乾癬、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎および／または血管炎が含まれる。しかし、開示のポリペプチドは、特にポリペプチドが標的分子を通してシグナル伝達することが可能であるときおよび／またはエフェクター部分にコンジュゲートされるときは、細胞殺滅が望ましい適応症、例えば腫瘍適応症の処置で使用することもできる。Ｆｃ変異体ポリペプチドを使用する処置のために適する具体的な適応症（複数可）は、Ｆｃ変異体ポリペプチドの非Ｆｃ部分の配列および／または特性に依存し、当業者が容易に判定することができる。例示的な実施形態を、下に示す。
【０１３７】
一実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＣＤ４０抗体であり、ＣＤ４０発現がん、例えば慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、カポジ肉腫、卵巣がん、乳がん、肺がん、黒色腫、膵がんまたは腎臓がんを処置するために使用される。抗ＣＤ４０抗体は、多重特異的抗体であってもよい。
【０１３８】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＣＤ２０抗体であり、関節リウマチまたは多発性硬化症を処置するために使用される。
【０１３９】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＣＤ２５抗体であり、多発性硬化症、乾癬、喘息、ブドウ膜炎、眼性炎症またはヒトＴ細胞白血病ウイルス−１関連のＴ細胞白血病を処置するために、または臓器移植拒絶反応を予防するために使用される。
【０１４０】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＴＮＦα抗体であり、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎またはプラーク乾癬を処置するために使用される。
【０１４１】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＩＬ−６受容体抗体であり、関節リウマチまたはキャッスルマン病を処置するために使用される。
【０１４２】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗α４−インテグリン抗体であり、多発性硬化症を処置するために使用される。
【０１４３】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＩＬ−１抗体であり、Ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ関連周期熱症候群（「ＣＡＰＳ」）を処置するために使用される。
【０１４４】
別の実施形態では、開示の変異体ポリペプチドは抗ＢＡＦＦ抗体であり、全身性エリテマトーデスまたはアレルギーを処置するために使用される。
【０１４５】
本開示は、それを必要とする患者で上述の疾患のいずれかを処置する方法であって、開示の適当なポリペプチドを治療的有効用量で患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１４６】
本明細書で用いるように、ポリペプチドの「治療的有効」量は、単一の用量としてまたは治療レジメンクールにわたって、例えば、１週、２週、３週、１カ月、３カ月、６カ月、１年もしくはそれより長いクールにわたって投与することができる。
【０１４７】
投与される開示のポリペプチドの投薬量は、特定の抗原特異性、自己免疫性または炎症性疾患の種類、対象、および疾患の性質および重症度、対象の身体状態、治療レジメン（例えば、組合せ治療薬が使用されるかどうか）、ならびに選択される投与経路によって異なり；適当な投薬量は、当分野の技術者が容易に判定することができる。
【０１４８】
ヒトおよび動物での自己免疫性または炎症性の疾患の処置および／または予防のために、任意の適する投与経路、例えば注射および当技術分野で公知である抗体ベースの臨床製品のための他の投与経路を使用して、患者（例えば、ヒト対象）にポリペプチドを含む医薬組成物を治療的または予防的に有効な投薬量（例えば、自己免疫性または炎症性の疾患の阻止および／または自己免疫性または炎症性の疾患症状の軽減をもたらす投薬量）で投与することができる。
【０１４９】
開示のポリペプチドの個々の投薬の最適な量および間隔は、処置されている状態の性質および程度、投与の形、経路および部位、ならびに処置されている特定の対象の年齢および状態によって決定されること、ならびに使用する適当な投薬量を最終的に医師が決定することは、当業者によって認識される。この投薬は、適宜何回でも繰り返すことができる。副作用が生じる場合は、通常の医療慣行に従って、投薬の量および／または頻度を変更または低減することができる。
【０１５０】
本開示に従って、疾患の処置は、任意の臨床ステージまたは徴候の任意の形の疾患を有すると既に診断されている患者の処置；疾患の症状もしくは徴候の開始もしくは進展もしくは悪化もしくは増悪の遅延；ならびに／または疾患の予防および／もしくはその重症度の低減を包含する。
【０１５１】
開示のポリペプチドが投与される「対象」または「患者」は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルまたはヒト）などの哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者はヒトである。ある特定の態様では、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。
【０１５２】
開示のポリペプチドを含む組成物が本明細書で提供される。組成物は、医薬として許容される担体を通例含む、無菌の医薬組成物の一部として一般的に供給される。この組成物は、任意の適する形であってよい（患者にそれを投与する所望の方法による）。
【０１５３】
医薬組成物は、１用量につき開示のポリペプチドの所定量を含有する単位用量形で便利に提供することができる。そのような単位は、例えば、限定されずに、５ｍｇから５ｇ、例えば１０ｍｇから１ｇ、または２０から５０ｍｇ、４０ｍｇから１００ｍｇ、または５０ｍｇから３００ｍｇを含有することができる。開示で用いられる医薬として許容される担体は、例えば処置される状態または投与経路によって多種多様の形をとることができる。
【０１５４】
開示のポリペプチドの治療製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、当技術分野で一般的に用いられる場合による医薬として許容される担体、賦形剤または安定剤（その全ては本明細書において「担体」と呼ばれる）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および他の雑多な添加剤と混合することによって、保存のために凍結乾燥製剤または水性溶液として調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ編、１９８０）を参照。そのような添加剤は、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに無毒でなければならない。
【０１５５】
緩衝剤は、生理的条件に近似した範囲にｐＨを維持するのを助ける。それらは、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲内の濃度で存在してもよい。本開示の使用に適する緩衝剤には、有機および無機の酸およびその塩、例えばクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合液、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合液、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合液など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合液、コハク酸−水酸化ナトリウム混合液、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合液など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合液、酒石酸−酒石酸カリウム混合液、酒石酸−水酸化ナトリウム混合液など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合液、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合液、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合液など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム混合液、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合液、グルコン酸−グリコン酸カリウム混合液など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合液、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合液、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合液など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合液、乳酸−水酸化ナトリウム混合液、乳酸−乳酸カリウム混合液など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合液、酢酸−水酸化ナトリウム混合液など）が含まれる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えばトリスを使用することができる。
【０１５６】
微生物の増殖を遅らせるために保存剤を加えてもよく、０．２％−１％（ｗ／ｖ）の範囲内の量で加えることができる。本開示の使用に適する保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンズアルコニウムハライド（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、ならびにアルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが含まれる。本開示の液体組成物の等張性を確保するために、時には「安定剤」として知られる等張剤を加えることができ、多価の糖アルコール、例えば三価またはより高級である糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。安定剤は、増量剤から治療薬剤を可溶化するまたは変性もしくは容器壁への接着を阻止するのを助ける添加剤まで機能が様々であってよい広いカテゴリーの賦形剤を指す。一般的な安定剤は、多価の糖アルコール（上で列挙される）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、例えばイノシトールなどのシクリトール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫黄還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；乳糖、マルトース、スクロースなどの二糖およびラフィノースなどの三糖；ならびにデキストランなどの多糖であってよい。安定剤は、１重量部の活性タンパク質につき０．１から１０，０００重量部までの範囲で存在してもよい。
【０１５７】
治療薬剤の可溶化を助けるために、ならびに撹拌によって誘導される凝集から治療的タンパク質を保護するために、非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）を加えてもよく、そのことはタンパク質の変性を引き起こすことなくストレス下の剪断表面に製剤を曝露させることも可能にする。適する非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在してもよい。
【０１５８】
追加の雑多の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および助溶剤が含まれる。開示のポリペプチドのために適するさらなる製剤は米国特許出願第２００４／００３３２２８Ａ１号に開示されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１５９】
７．実施例
［実施例１］  ＣＨ２のポイントごとの（Ｐ×Ｐ）ライブラリーの構築
Ｈｕ１Ｄ１０、ＨＬＡ−ＤＲのベータ鎖に特異的なモノクローナル抗体（Ｓｈｉら、２００２、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．４３（６）：１３０３−１２頁）を、モデル系として使用した。Ｈｕ１Ｄ１０の合成ＶＬおよびＶＨドメインは、民間の遺伝子合成供給業者（ＤＮＡ  ２．０  Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって構築され、ベクターｐＹＡ２０６にクローニングしてｐＹＡ２０６−Ｈｕ１Ｄ１０プラスミドを作製した。ベクターｐＹＡ２０６は、哺乳動物細胞の表面での抗体の発現およびディスプレイのために設計された、ＥＢウイルス由来のエピソームベクターである。
【０１６０】
定常領域重鎖ドメイン２（ＣＨ２）の８４アミノ酸位置を、ＮＮＫランダム化アプローチを使用する突然変異誘発の標的にした。以下の理由により、ＮＮＫコード体系を使用した（そこでは、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴおよびＫ＝ＧまたはＴ）。１）全２０個の天然に存在するアミノ酸をコードするために３２個のコドンだけが必要とされる、２）単一の終止コドン（ＴＡＧ）だけが３２個の中に含まれる、３）完全な６４コドン遺伝子コードに存在する最大６倍の縮重ではなしに、最大縮重（単一のアミノ酸をコードする異なるコドンの数）が３である。
【０１６１】
各々異なるＣＨ２位置にＮＮＫ縮重を有する、ヒトＦｃγアイソタイプ（Ｆｃγ）をコードする８４個の異なるＤＮＡ断片が、合成遺伝子の民間供給業者（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成された。合成Ｆｃγ遺伝子をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＹＡ２０６−ｈｕ１Ｄ１０にサブクローニングした。そのサブライブラリー中の可能なコドンの総数より少なくとも１０倍多くのＥ．コリー形質転換体が得られるように、ライゲーションをＥ．コリーＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に形質転換させた。生じたＣＨ２ライブラリーは、８４個の異なる位置で合計１６８０個の異なるコドンで構成された。
【０１６２】
［実施例２］  ＦｃγＲＩＩＢ結合性判定
未改変の対照ＦｃγへのＦｃγＲＩＩＢの結合を評価するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）滴定を実施した。ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγの間の低親和性相互作用のため、フローサイトメトリーのために８：４：１の複合体を使用した（図３）：５マイクログラムのＦｃγＲＩＩＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１８７５−ＣＤ）を、１２．５μｇのビオチン化抗ポリヒスチジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＭ０５０）とプレインキュベートし、次に３．５μｇのストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号７１００−１１Ｌ）に加えた。この複合体を次に４倍に連続希釈し、ヤギ抗ヒトカッパ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０６０−０９）と合わせた。ＦｃγＲ−複合体結合のＥＣ５０を判定するために、１００μｌの複合体を各濃度で２×１０５個の細胞に加え、１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回の洗浄の後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーにより分析した。二重正の象限での細胞のパーセントを判定し、ＦｃγＲＩＩＢ濃度に対してプロットした。ＥＣ５０は、３．６μｇ／ｍＬと判定された（図４Ａ）。
【０１６３】
［実施例３］  ＦｃγＲＩＩＩＡ結合性判定
ＦｃγへのＦｃγＲＩＩＩＡの結合を評価するために、ＦＡＣＳ滴定を実施した。ＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγの間の低親和性相互作用のため、フローサイトメトリーのために２：１：１の複合体を使用した（図３）。９μｇのＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２５−ＦＣ）を、１５μｇのビオチン化抗ポリヒスチジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＭ０５０）とプレインキュベートし、次に１５μｇのストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号７１００−１１Ｌ）に加えた。この複合体を次に４倍に連続希釈し、ヤギ抗ヒトカッパ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０６０−０９）と合わせた。ＦｃγＲ−複合体結合のＥＣ５０を判定するために、１００μｌの複合体を各濃度で２×１０５個の細胞に加え、１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回の洗浄の後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーにより分析した。二重正の象限での細胞のパーセントを判定し、ＦｃγＲＩＩＩＡ濃度に対してプロットした。ＥＣ５０は、０．１７μｇ／ｍＬと判定された（図２Ｂ）。
【０１６４】
［実施例４］  ＣＨ２ライブラリーの蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）
ＣＨ２ライブラリーは、０．５μｇのライブラリープラスミド、１００μｇのｐＡＣＹＣ１８４担体プラスミドおよび２５０μｌリポフェクタミンで２９３ｃ１８細胞にトランスフェクトさせ；２日後に０．８μｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して選択し、さらなる１８日間培養してからＦＡＣＳ選別を実施した。
【０１６５】
細胞は、１：２００のＰＥ標識抗ヒトカッパ−ＰＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、滴定によって判定される５０％最大結合以下のＦｃγＲＩＩＩＡ−またはＦｃγＲＩＩＢ−複合体（図３）とで同時染色した。ＦｃγＲへの差別的結合に基づいて、最小限１×１０５個の細胞を３つの集団、高（Ｈ）、中間（Ｍ）および低（Ｌ）から選別した。代表的なＦＡＣＳ選別結果を、図５に示す。所望の特性を有する変異体は、ＦｃγＲＩＩＢ結合のＨ−ゲートで濃縮され、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合のＬ−ゲートで濃縮された。
【０１６６】
［実施例５］  「発現され」、「選別された」集団の大規模並行配列決定
実施例４に記載されている選別されたＨ、ＭおよびＬ細胞集団からプラスミドを回収し、大規模並行配列決定に適する短いアンプリコンを調製するためにＰＣＲ増幅を実施した。製造業者（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）の指示通りにゲノムシーケンサーＦＬＸを用いて、次にアンプリコンを配列決定した。ＦＡＣＳ選別された細胞の各集団について、およそ８００，０００個の個々の配列を判定した。
【０１６７】
配列を検査し、「発現され」、「選別された」集団で各点突然変異が見出された回数を表にした。各アミノ酸コドンを最初に同定して、表にした。複数のコドンを有するアミノ酸については、各アミノ酸の異なるコドンの発生を一緒に加えて、各亜集団でのそのアミノ酸変異体の行動の全体的概要を作製した。ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃｙＲＩＩＢへの結合を評価するためのＣＨ２ライブラリーの３方向選別のために、濃縮比（ＥＲ）スコアを各コドン変異体に割り当てた。ＥＲは、その全体頻度と比較してどの程度高いまたは低い頻度で変異体がＨ集団で見出されるかを表す。同様に、ＭおよびＬ集団の各々での各変異体について濃縮比を計算することができる。より高い親和性の変異体は、Ｈ集団で濃縮され（ＥＲ＞１）、Ｌ集団で減損する（ＥＲ＜１）ことが予想される。反対に、より低い親和性の突然変異体は、Ｈ集団で減損し（ＥＲ＜１）、Ｌ集団で濃縮される（ＥＲ＞１）ことが予想される。Ｈ集団の濃縮比を単に観察することによって、より高い、より低いおよび中間の親和性の変異体を同定することが可能である。
【０１６８】
［実施例６］  所望の特性を有する点突然変異体の同定
ＣＨ２での８４個の位置の包括的突然変異誘発は、有意に増加したＦｃγＲＩＩＢ結合および減少したＦｃγＲＩＩＩＡ結合（ＷＴより低い）を有する変異体を同定した、図６の右下の四半部。この例では、野生型平均より上の２つの標準偏差は有意に増加したととられ、野生型平均より低いものは減少したととられた。
【０１６９】
有意に増加したＦｃγＲＩＩＢ結合および減少したＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を有すると同定された位置および置換を、図７に示す。変異体ヒトＩｇＧは、可溶性ＩｇＧ１としてまたは２９３ｃ１８細胞の表面で発現されて、Ｈｕ１Ｄ１０結合ドメインで発現された。
【０１７０】
［実施例７］  単一ポイント（ワンポイント）ＦＡＣＳを用いた向上した結合の確認
ＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合を確認するために、２９３ｃ１８細胞の上で発現された親ＩｇＧと変異体を比較した、ワンポイントＦＡＣＳ分析を実施した。ＩｇＧ変異体を発現する２９３ｃ１８および対照を、ＥＣ５０濃度のＦｃγＲＩＩＢ複合体で染色した。Ｎ２９７Ａ改変を含有するＦｃ変異体を発現する２９３ｃ１８は、陰性対照として使用した。Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆおよび二重突然変異体「ＳＥＬＦ」は、陽性対照として含まれた。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置でフローサイトメトリーによって分析し、各変異体の結果はＦｃγＲ結合はｙ軸に、ＩｇＧ発現はｘ軸に、野生型に対してプロットした（図８）。
【０１７１】
ＦｃγＲＩＩＩＡへの減少した結合を確認するために、２９３ｃ１８細胞の上で発現された親ＩｇＧと変異体を比較した、ワンポイントＦＡＣＳ分析を実施した。ＩｇＧ変異体を発現する２９３ｃ１８および対照を、ＥＣ５０濃度のＦｃγＲＩＩＩＡ複合体で染色した。Ｎ２９７Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆおよび二重突然変異体「ＳＥＬＦ」を発現する２９３ｃ１８は、対照として使用した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置を使用してフローサイトメトリーによって分析し、各変異体の結果はＦｃγＲ結合はｙ軸に、ＩｇＧ発現はｘ軸に、ＷＴに対してプロットした（図９）。最も有意な下方シフトを有する変異体は、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙであることが見出された。
【０１７２】
［実施例８］  ＦｃγＲ発現細胞への変異体の結合
Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体抗体は可溶形で発現され、精製されて、ＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞への結合を評価するために次に使用された。ＩｇＧ変異体は、２０μｇ／ｍＬまたは１３３ｎＭから開始して３倍に連続希釈され、次に１試験につき細胞数２×１０５に加えられた。変異体ＩｇＧ結合を検出するために、抗ヒトカッパ抗体を使用した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析し、蛍光をＩｇＧ濃度に対してプロットした。図１０は、全ての変異体がＦｃγＲＩＩＢに対して野生型抗体より高い最大結合を有することを確認する。
【０１７３】
Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体を精製し、ＦｃγＲＩＩＩＡ  ＣＨＯトランスフェクタントへの結合を評価するために使用した。ＩｇＧ変異体は、２０μｇ／ｍＬまたは１３３ｎＭから開始して３倍に連続希釈され、次に１試験につき細胞数２×１０５に加えられた。変異体ＩｇＧ結合を検出するのに、抗ヒトカッパ抗体の二次染色を使用した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析し、図１１で蛍光をＩｇＧ濃度に対してプロットした。全ての変異体は、野生型Ｆｃ含有抗体と同等以下でＦｃγＲＩＩＩＡに結合した。
【０１７４】
［実施例９］  ＦＡＣＳに基づく抗体依存細胞媒介細胞傷害性
非放射性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを最適化し、Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体を試験するために使用した。Ｒａｊｉ細胞および新たに引き抜かれた全血から精製されたＰＢＭＣをそれぞれ標的およびエフェクター細胞として１：４０の比で使用した。
【０１７５】
Ｒａｊｉ細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に細胞数１０６／ｍＬで再懸濁させ、次に３０分の間ＣＳＦＥ（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、パート４００２）の１：２０００希釈溶液とインキュベートした。ＣＦＳＥで負荷したＲａｊｉ細胞を次に洗浄し、ＲＰＭＩ＋１０％熱不活性化ＦＢＳからなる増殖培地に４×１０５／ｍＬに再懸濁させた。Ｖ底プレートの各ウェルに、５０μＬの細胞懸濁液を加えた。１８μｇ／ｍＬから開始して３倍連続希釈のＩｇＧ変異体の５０μＬを各ウェルに加えた。
【０１７６】
６６５ＲＣＦで３０分の間Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ、１７−１４４０−０２）で遠心分離された、新たに引き抜かれたヘパリン添加血からＰＢＭＣを精製した。ＰＢＭＣ層を収集し、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳで３回洗浄し、１回目の洗浄は１３５０ＲＣＦで１５分間、２回目の洗浄は２２５ＲＣＦで１０分間、３回目の洗浄は２２５ＲＣＦで１０分間であった。最終洗浄の後、細胞を増殖培地に再懸濁させ、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  Ｒｘを使用して数えた。細胞を遠心分離し、増殖培地において細胞数８×１０６／ｍＬに再懸濁させた。１００μＬの細胞懸濁液を標的／ＩｇＧ懸濁液の各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。細胞懸濁液を７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５９９２５）の１：５希釈溶液で染色し、３０分間インキュベートした。標的細胞の自然死を判定するために、ＣＳＦＥを負荷したＲａｊｉ細胞を培地だけ（０ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ、ＰＢＭＣなし）とインキュベートし、次に７ＡＡＤで染色した。試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した。
【０１７７】
各試料についてＣＦＳＥ（ＦＬ１）をｘ軸に、７ＡＡＤ（ＦＬ３）をｙ軸に、ＦＡＣＳデータをグラフに示した。四半部を引き抜き、標的細胞（ＣＦＳＥ＋）をＰＢＭＣ（ＣＦＳＥ−）と区別し、ならびに７ＡＡＤ陽性細胞を７ＡＡＤ陰性細胞と区別した（図１２）。右上四半部の細胞数は「死」と規定し、右下四半部のそれは「生」と規定した。細胞傷害性パーセントを計算し、自然死を引き算した。ＥＣ５０を判定するために、ＩｇＧ濃度に対して細胞傷害性パーセントをグラフに示した（図１３Ａ）。
【０１７８】
Ｈｕ１Ｄ１０変異体を、ＡＤＣＣ活性に基づいて分類した。図１３Ｂは、野生型より低いが多少のＡＤＣＣ活性を有するＦｃγＲＩＩＢ上方突然変異体を示す。図１３Ｃは、ＡＤＣＣ活性のほとんどない変異体を示す。図１３Ｄは、非ＡＤＣＣ  ｈｕ１Ｄ１０変異体と、文献によりＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少をもたらす置換（Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、二重突然変異体「ＳＥＬＦ」）とを比較する。図１４Ｄは、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３ＹがＬ３２８Ｆと同等の応答ならびにＳ２６７ＥおよびＳＥＬＦより低いＡＤＣＣ応答を導き出したことを示す。
【０１７９】
［実施例１０］  抗ＣＤ４０  ｍＡｂのＦｃ結合変異体の抗体依存細胞媒介細胞傷害性
Ｆｃγ改変を有する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を使用して、抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイを標準プロトコルに従って設計した（Ｌａｗら、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８３３１−８頁）。標的細胞として、リンパ腫ＲＬ細胞を５１クロムで１時間標識した。エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用し、５０：１の比で標的と混合した。抗ＣＤ４０を連続希釈し、標的／エフェクター細胞混合物に加えた。３７℃、５％ＣＯ２で４時間のインキュベーションの後に、１００μｌの培養上清を収集し、放出された放射能をガンマ計数器によって監視した。抗体のない培養物は培地処理陰性対照として記録し、最大５１クロム放出は標識標的細胞のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００処理によって達成された。細胞傷害性の最終パーセントは、以下の式を用いて計算した：（（試料−（標的＋培地））／（（標的＋Ｔｒｉｔｏｎ）−（標的＋培地）））＊１００。Ｆｃγ変異体Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙは、ＡＤＣＣ活性を誘導しなかった。（図１４）。
【０１８０】
［実施例１１］  Ｆｃγ置換を有する抗ＣＤ４０  ｍＡｂの機能的活性
ＦｃγＲＩＩＢへの差別的結合が樹状細胞の免疫活性化に影響を及ぼすかどうかについて試験するために、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体をＦｃγの置換で構築し、ＩＬ−１２ｐ７０分泌アッセイで試験した。
【０１８１】
等量のＰＢＳで希釈した健康ヒトドナーからの全血を、フリット未満（１５ｍＬ）のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓを含有するＬｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）管に加えた。次にブレーキなしで１５分間、血液を１，０００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで一度洗浄し、室温で５分間、１，３００ｒｐｍで遠心分離し、ＲＰＭＩ  １６４０で一度洗浄した。細胞は、ＳＮ１２Ｃ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）に再懸濁させた。
【０１８２】
単球由来の未熟な樹状細胞（ｍｏＤＣ）の生成：ＳｔｅｍＣｅｌｌからの濃縮キットで単球をＰＢＭＣから単離し、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を付加したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地で培養した。ＤＣ分化の維持を助けるために、３日目に培養物に新鮮なＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加えた。６日間の培養の後、未熟ＤＣの表現型：Ｌｉｎ−、ＣＤ８０／ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１Ｃ＋を検証するために、単球由来の未熟ＤＣをＦＡＣＳ分析にかけた。
【０１８３】
ｍｏＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０を刺激することにおける抗ＣＤ４０のアゴニスト活性の監視：未熟なｍｏＤＣを抗ＣＤ４０で刺激し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を付加したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地において４８時間、ＩＦＮγで初回刺激した。培養上清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキットによってＩＬ−１２ｐ７０生成について分析した。図１５は、ＡＤＣＣ誘導（図１５Ａ）および非ＡＤＣＣ誘導（図１５Ｂ）変異体のＩＬ−１２ｐ７０生成を示す。ＩＬ−１２ｐ７０分泌によって測定したとき、非ＡＤＣＣ変異体のうち、Ｖ２７３ＦおよびＶ２７３Ｙは最も増強された樹状細胞活性化を示した（図１５Ｃ）。
【０１８４】
本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれていることが個々に示されているかのように、全ての目的のためにここに参照によりその全体が組み込まれる。
【０１８５】
様々な具体的な実施形態が例示され、記載されたが、本発明（複数可）の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができることが理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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