(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー不存在下における、ＤＮＡの複製、増幅、または配列決定のための方法であって、当該方法が、
ａ）ｉ）ポリメラーゼ、または
ｉｉ）ポリメラーゼコンジュゲート
を用意する工程であって、前記ポリメラーゼまたは前記ポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有し、かつポリメラーゼおよびプライマーゼ活性を有するものである工程と、
ｂ）テンプレート核酸を用意する工程と、
ｃ）核酸の相補鎖を取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド誘導体を用意する工程と、
ｄ）適切なバッファーを用意する工程と、
ｅ）第二のポリメラーゼを用意する工程と、そして
ｆ）工程ａ）乃至ｅ）の材料を適切な時間接触させる工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ｅ）で用意される前記第二のポリメラーゼが、真核生物ファミリーＡのポリメラーゼ、真核生物ファミリーＢのポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二のポリメラーゼが熱安定なポリメラーゼであって、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｅ）で用意される前記第二のポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼまたはそのコンジュゲートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ａ）ｉ）のポリメラーゼ、または前記ａ）ｉｉ）のポリメラーゼコンジュゲートの前記ポリメラーゼ残基が、配列番号１の配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）の核酸が、損傷を有するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記の損傷を有する核酸が、
ａ）一本鎖または二本鎖の破損を含むか、および／または
ｂ）化学的に修飾を受けたヌクレオチドであるか、および／または
ｃ）ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで包埋された組織に由来すること
を特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化学的に修飾を受けたヌクレオチドが、酸化ヌクレオチドおよび／または脱アミノ化ヌクレオチドからなる群から選択されるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学的に修飾を受けたヌクレオチドが、７，８−デヒドロ−８−オキソアデニン、７，８―デヒドロ―８―オキソグアニン、チミングリコール、５―ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシルからなる群から選択されるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）のヌクレオチド誘導体の少なくとも一種が、化学的に修飾を受けたヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）のヌクレオチド誘導体が、
ａ）酸化ヌクレオチド誘導体、および／または
ｂ）脱アミノ化ヌクレオチド、
ｃ）少なくとも一つの立体的に嵩高い側基を含む誘導体
からなる群から選択されたヌクレオチド誘導体の少なくとも一種からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）のテンプレート核酸が、１００未満の細胞に由来する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）のテンプレート核酸が、単一の細胞に由来する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
汚染ＤＮＡの増幅が抑制される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の工程ａ）に定義したポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲートの使用。
【請求項１６】
ＤＮＡテンプレートにおける改変を検出するための方法であって、工程ａ）からｆ）によるＤＮＡ複製を含んでなる、方法：
ａ．ｉ．ポリメラーゼ、または
ｉｉ．ポリメラーゼコンジュゲート
を用意する工程であって、前記ポリメラーゼまたは前記ポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有し、かつポリメラーゼおよびプライマーゼ活性を有するものである工程、
ｂ．テンプレート核酸を用意する工程、
ｃ．核酸の相補鎖を取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド誘導体を用意する工程、
ｄ．適切なバッファーを用意する工程、そして
ｆ．工程ａ）乃至ｄ）の材料を適切な時間接触させる工程；
ｇ．複数の配列のリードから各ヌクレオチドの位置に関して取り込まれたヌクレオチドの相対的な割合を計算する工程、および
ｈ．取り込まれたヌクレオチドの全割合と、テンプレートにおけるＤＮＡ改変の元の特徴とを関連づける工程。
【請求項１７】
前記工程ｄ．と前記工程ｆ．との間に、工程ｅ．一つ以上のプライマーを用意する工程をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ランダム変異のための方法であって、
ａ）核酸を酸化性化合物と接触させる工程であって、当該接触によって核酸の塩基を酸化する工程、および
ｂ）酸化された核酸を、請求項１〜５の工程ａ）いずれかに定義したポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲートを用いて複製する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１９】
ＤＮＡテンプレートにおける改変を検出するための方法が、ＤＮＡテンプレートにおける酸化工程の生成物を検出するための方法である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程ｆ．において、工程ａ）乃至ｄ）の材料を、４０℃超の温度で接触させる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程ｆ．において、工程ａ）乃至ｄ）の材料を、５０℃超の温度で接触させる、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広義には、高温菌株であるサーマス・サーモフィル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ２７の熱安定なプライマーゼ／ポリメラーゼタンパク質ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、ならびに核酸の合成、増幅および配列決定の方法への使用に関する。さらに本発明は、損傷ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌからなるプライマーを要さない方法とともに前記タンパク質からなるツールおよびキットを開示する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに知られているほとんど全てのＤＮＡ複製システムにおいて、複製の開始には、ＤＮＡポリメラーゼによって追加されたヌクレオチドの受容体であるフリーの水酸基を必要とする。この目的のため、複数の異なる解決法が述べられており、全ての細胞生命体とともに多くのウィルスおよびプラスミドにおいて、「プライマーゼ」と称される専門のＲＮＡポリメラーゼが、リボヌクレオチドを重合化し、ＤＮＡポリメラーゼによって続いて伸長される短ＲＮＡプライマーを生成させる（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ著、１９９１年）。レトロエレメントおよびレトロウィルスにおいて、逆転写酵素は、ｔＲＮＡを用いて複製を開始する（Ｌｏｄｉｓｈ、Ｂｅｒｋら著、１９９９年）。バクテリオファージＰｈｉ２９などのウィルスに由来のタンパク質刺激性システムにおいて、特定のセリン、スレオニンまたはチロシンの側鎖に由来のＯＨ基は、ＤＮＡ複製の開始点として用いられる（Ｓａｌａｓ著、１９９１年）。最後に、ローリングサークル複製モデルに従うウィルスにおいて、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖の一方においてニックを生じさせ、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるフリーの３‘ＯＨ基を生成する（ＩｌｙｉｎａおよびＫｏｏｎｉｎ著、１９９２年；ならびにＮｏｉｒｏｔ―ＧｒｏｓおよびＥｈｒｌｉｃｈ著、１９９６年）。
【０００３】
プライマーゼは、進化的に無関係な２つの系統群、すなわち、ＤｎａＧ様プライマーゼ（細菌）及びＡＥＰ様プライマーゼ（古細菌および真核生物）に分類され得る（Ａｒａｖｉｎｄ、Ｌｅｉｐｅら著、１９９８年；およびＩｙｅｒ、Ｋｏｏｎｉｎら著、２００５年）。近年、「ＰｒｉｍＰｏｌ」と称されるＡＥＰｓの新規の亜群について述べられており、グラム陽性細菌のプラスミッドにも孤発的に存在する（Ｌｉｐｐｓ著、２００４年；およびＬｉｐｐｓ、Ｗｅｉｎｚｉｅｒｌら著、２００４年）。ＰｒｉｍＰｏｌｓは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡプライマーゼの両方の活性を示し、また、複製開始複合体を形成するためにヘリカーゼにしばしば関与する。これらの特徴により、システムが、同一の酵素が開始と伸長段階の両方を行うことを可能とする。またごく最近、プライマーゼおよびポリメラーゼの活性も有するヘリカーゼについて述べられている（ＳａｎｃｈｅｚーＢｅｒｒｏｎｄｏ、Ｍｅｓａら著、２０１１年）。真核生物のプライマーゼとは異なり、古細菌のプライマーゼは、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖の両方の開始及び伸長を、それぞれ１ｋｂまたは７ｋｂまで行うことが可能である（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  Ｇａｌａｌ、Ｐａｎら著、２０１２年；Ｌａｏ―ＳｉｒｉｅｉｘおよびＢｅｌｌ著、２００４年；ならびにＬａｏ―Ｓｉｒｉｅｉｘ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら著、２００５年）。特定のＰｒｉｍＰｏｌファミリーメンバーのさらなる酵素的特徴について述べられており、例えば、Ｇａｒｃｉａ  Ｇｏｍｅｚは、ヒトＰＲＩＭＰＯＬ遺伝子（ＣＣＤＣ１１１としても知られている）によりコードされたヒトＰｒｉｍＰｏｌ（ＨｓＰｒｉｍＰｏｌ）が、鋳型ＤＮＡの酸化的ヌクレオチドの改変などの脱塩基部位のバイパスを可能とすることを示し、ＤＮＡのメンテナンスの役割およびアレストされた複製フォークの再開始について提案しており（Ｇａｒｃｉａ  Ｇｏｍｅｚ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊｉｍｅｎｅｚら著、２０１２年）、一方、サーモコッカス・ナウティラスの３０／１プラスミドであるｐＴＮ２の熱安定なｐｒｉｍｐｏｌは、末端トランスフェラーゼ活性を有する（国際公開２０１１／０９８５８８号）。
【０００４】
スルホロブス・イスランジクス由来のクレンアーキオータのプラスミドｐＲＮ１のＯＲＦ９０４タンパク質を含む、古細菌のプラスミッドに由来の二機能性複製酵素に見出されたタイプのプライマーゼ−ポリメラーゼ（ＰｒｉｍＰｏｌ）ドメインを含むと予測された、サーマス・ファーモフィルＨＢ２９由来の推定保存タンパク質ＡＡＳ８１００４．１をクローニングし、可溶性型および活性型でＥ．ｃｏｌｉに過剰発現させ、均一に精製した。単離タンパク質（以下、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと称する）の酵素学的特性を深く特徴付けする一方、発明者らが驚くべきことに、予測されたプライマーゼ活性とは別に、このタンパク質が、損傷または汚染鋳型に対する耐性を予期せず高度に有することを発見し、新たな増幅および配列決定方法の開発が可能となった。
【０００５】
例えばＭｕｌｌｉｓ（米国特許第５，６５６，４９３号明細書）によって提示されたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による核酸の増幅は、医学及び生物学的研究に用いられる不可欠な技術である。核酸のクローニング、操作または配列決定、遺伝子のＤＮＡを基礎とした機能的および系統発生学的分析、疾病の検出および診断ならびに法医科学および実父確定検査などの種々の適用例にうまく適用されてきた。
【０００６】
現在、第一世代配列決定、第二世代配列決定、またはしばしば次世代配列決定（ＮＧＳ）、及び第三世代もしくは単一分子配列決定（ＳＭＳ）と一般的に称される、複数の異なる配列決定技術が存在する。第一世代の配列決定は、マキサム・ギルバート法（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ著、１９７７年）またはサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｎｉｃｋｌｅｎら著、１９７７年；ならびにＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ著、１９７８年）と主に称され、後者のみが現在用いられている。
【０００７】
第二世代または次世代の配列決定は、塩基の位置を先進的な技術で（光学的に）に検出する方法を用いて同時に多数の配列を生成する技術を参照する。現存する方法の概観は、Ｍｅｔｚｋｅｒ著、２００９年に挙げられている。
【０００８】
第三世代または単一分子配列決定（ＳＭＳ）技術は、予めの増幅を必要とせず、ＤＮＡのクローンまたは類似物ではない配列でなくとも、しばしば、「リアルタイム」に一分子を、ポリメラーゼの活性をオンラインで記録することを意味する（Ｓａｍ、Ｌｉｐｓｏｎら著、２０１１年；ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＭｉｌｏｓ著、２０１１年）。
【０００９】
しかしながら、高温で作用可能であり、長鎖の生成物、好ましくは５ｋｂ長の生成物を、追加のタンパク質の存在の必要なく、製造可能な、プリムポールのＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼファミリーに属する、新規で熱安定な、高度に処理可能なポリメラーゼが、依然として大いに必要とされている。
【００１０】
特に、待たれるのは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を容易に生じかつ示し、また、好ましくはプライマーの不存在下で、未知のＤＮＡテンプレートを合成または増幅することが可能であり、忠実な長鎖生成物を製造し得る、熱安定なＤＮＡポリメラーゼである。
【００１１】
特に、法医学および臨床的な増幅適用例、ならびに第二および第三世代の配列決定の分野において、種々の基質であるヌクレオチドに高度に耐性であり、しばしば質の低い改変テンプレートを取り扱い可能であるポリメラーゼについて、特に興味が持たれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的の一つは、テンプレートの質が低い場合であっても、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートの、プライマーフリーな増幅方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的において、高温であっても、忠実な、ＲＮＡの逆転写の方法を提供する。
【００１４】
これらおよびその他の目的は、下記及び特許請求の範囲に述べられた本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、明細書および特許請求の範囲に定義された主題に関する。この主題は、核酸の複製、増幅または配列決定のための方法であって、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素を用意する工程、テンプレート核酸を用意する工程、核酸の相補鎖に取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを用意する工程、適切なバッファーを用意する工程、場合により任意で、一つ以上のプライマーを用意する工程、そして上記の材料を、場合により高温で、適切な時間、接触させる工程を含んでなる。
【００１６】
他の態様において、本発明は、ＤＮＡのプライマーフリーの増幅のための方法に関し、増幅反応のために用意された二つのポリメラーゼの両方によるＤＮＡの共同での合成を任意に有するものであって、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素を用意する工程、特にＰｈｉ２９型の第二のポリメラーゼを用意する工程、テンプレート核酸を用意する工程、核酸の相補鎖に取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを用意する工程、適切なバッファーを用意する工程、そして上記の材料を、場合により高温で、適切な時間、接触させる工程を含んでなる。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、ｃＤＮＡの合成またはＲＴ  ＰＣＲのための方法に関し、この方法は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素を用意する工程、テンプレートＲＮＡを用意する工程、ｄＮＴＰｓを用意する工程、適切なバッファーを用意する工程、場合により任意で、一つ以上のプライマーを用意する工程、そして上記の材料を、場合により高温で、適切な時間、接触させる工程を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】潜在性のあるプライマーゼ認識配列（ＧＴＣＣ）が複数のウィルス、原核生物および真核生物ＲＮＡプライマーゼによるプライミング反応の開始に関して好ましいテンプレートの状況に従ってチミジン残基によってフランキングされた（ＣａｖａｎａｕｇｈおよびＫｕｃｈｔａ著、２００９年）一本鎖オリゴヌクレオチドにおけるＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ  ＤＮＡのプライマーゼ活性を示している（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｃｈｅｒｉａｔｈｕｎｄａｍら著、１９８５年；ＰａｒｋｅｒおよびＣｈｅｎｇ著、１９８７年、ＦｒｉｃｋおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ著、２００１年）。プライミングは、「ＴＣ」配列の前部でのみ起こり、ポリｄＴトラックの反対ではプライミングは起こらない。プライマーとして作用するヌクレオチド（５‘位置）は、マンガンの存在下、リボヌクレオチド（ＡＴＰ）またはデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）のいずれであってもよいが、マグネシウムが金属補助因子である場合、デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）のみである。添加されたヌクレオチド（３’位置）は、金属補助因子にかかわらず、デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）でなければならない。条件：１μＭ  ＤＮＡ（配列番号３）、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１  ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１６ｎＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１６ｎＭ  ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ、１０μＭ  ＧＴＰ／ｄＧＴＰ、６０分間、５５℃。
【図２】ＣＴＣが、配列番号４によるチミジンリッチなｓｓＤＮＡの状態におけるＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの好ましいテンプレートの開始部位であることを示す。Ｃが開始部位に先行するヌクレオチドである場合、テンプレートのＴＣの開始部位に先行するヌクレオチドに、最大のプライマーゼ活性を有するという強力な効果が存在する。条件：１μＭ  ＤＮＡ  （配列番号４）、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ＋Ｈｉｓタグ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６ｎＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１μＭ  ＧＴＰ、５５℃で６０分間。
【図３】一本鎖の環状ＤＮＡテンプレート（Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ）に対するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのＤＮＡプライマーゼ活性を示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、合成に関してデオキシヌクレオチドに対して厳格に依存する一方、リボヌクレオチドが存在する場合、実質的に生成物は生じない。条件：４００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ＋Ｈｉｓタグ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１６ｎＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１００ｎＭ  ＡＴＰ／ｄＡＴＰ、１μＭ  ＣＴＰ／ｄＣＴＰ、１μＭ  ＧＴＰ／ｄＧＴＰ、１μＭ  ＵＴＰ／ｄＴＴＰ、５５℃で６０分間。
【図４】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのＤＮＡ重合反応を示す。この酵素は、デオキシヌクレオチドを重合することにより、提供されたテンプレート（配列番号５）に従って、プライマー分子（配列番号６）を完全に伸長することが可能である。マンガンがより効果的であるようではあるが、マグネシウムおよびマンガンが、ＤＮＡの重合に関する金属補助印紙として有効である。条件：５ｎＭ  ＤＮＡ、１ｍｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４０℃で６０分間。
【図５】配列番号７から９で形成された、ギャップを有する二本鎖ＤＮＡに対するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのＤＮＡ／ＲＮＡ重合活性を示す。ＲＮＡの重合の場合により低い有効性が見られ、マンガンに対して厳密に依存するようである。さらに、マンガンは、ギャップを有するＤＮＡに対して鎖置換合成を強力に刺激し、テンプレート配列全体の使用を可能とする。条件：５ｎＭ  ＤＮＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＮＴＰｓ／ｄＮＴＰｓ、４０℃で３０分間。
【図６】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌがＲＮＡ指向性ポリメラーゼでもあることを示す。ＤＮＡプライマー（配列番号８）から開始した配列番号のＲＮＡテンプレートの逆転写を示す。この反応の効率は、ＤＮＡテンプレートを用いた場合に達成する効率よりも低く、ＲＮＡで指示されたＤＮＡポリメラーゼ活性は、マンガンに厳格に依存するようである。同様のプライマーおよびＤＮＡテンプレート（配列番号１０）を用いたＤＮＡ指向性ポリメラーゼ活性について比較した結果を得た。条件：５ｎＭ  ＤＮＡ／ＲＮＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μＭ  ｄＮＴＰｓ、４０℃で６０分間。
【図７】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＤＮＡ合成の高い忠実性を示す。４つのｄＮＴＰｓのそれぞれについて、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンの存在下、４つの可能性のあるテンプレート塩基（配列番号１３によるテンプレート；配列番号１４によるプライマー）に対して取り込まれるべき基質として個々に検討した。全ての場合において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、高い忠実性を以て、第一の利用可能なテンプレート塩基によって指示された相補的なヌクレオチドを優先的に挿入する。マンガンであっても、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＤＮＡの重合中の塩基の識別は、正しく対となったプライマー末端を伸長する場合、正しいワトソン・クリック型の塩基対を形成するように高い忠実性を提供する。条件：１０ｎＭ  ＤＮＡ、４０℃で２０分間、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１μＭ  ｄＮＴＰｓ（上部パネル）；１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１００ｎＭ  ｄＮＴＰｓ（それぞれ下部のパネル）。
【図８】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの、その基質であるデオキシリボヌクレオチドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰに対する相当のアフィニティーを示す。単一の代謝回転の条件下、酵素の濃度がＤＮＡの濃度よりも高い場合、ｄＮＴＰｓの取り込みは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌがｄＮＴＰｓに関して高いアフィニティーを有すること、および特定のｄＮＴＰを最もよく取り込むことに対するバイアスを有さないことを明らかにしている。配列番号１３によるテンプレート；配列番号１４によるプライマー。条件：１０ｎＭ  ＤＮＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、４０℃で２０分間。
【図９】損傷を受けたＤＮＡに対するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの高い耐性を示す。このタンパク質は、脱塩基部位（ＡＰ）を含む、配列番号１３によるテンプレート、７，８−ジヒドロ−８−オキソアデニン（８ｏｘｏＡ）、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８ｏｘｏＧ）、チミングリコール（Ｔｇ）、５−ヒドロキシシトシン（５ＯＨＣ）または５−ヒドロキシウラシル（５ＯＨＵ）を与えた。示したように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、損傷部位の反対のプライマー（配列番号１４）のテンプレート依存性伸長により、または損傷部位および次のテンプレートの塩基（ｄＧ挿入物）をコピーすることにより、効果的な損傷部位のバイパスを行うことができる。条件：１０ｎＭ  ＤＮＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４０℃で２０分間。
【図１０】酸化ストレスの結果としてＤＮＡに生じる損傷の最も頻繁にみられる、主にｓｙｎコンフォメーションにおける形態のひとつである、８ｏｘｏＧ（７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン）の、ｄＡＴＰを導入する効果的なバイパスを示す。障害部位の反対側へのｄＡＴＰの導入の動態は、反対側の損傷を受けていないＴと同一である。配列番号１３によるテンプレート；配列番号１４によるプライマー。条件：１０ｎＭ  ＤＮＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、４０℃で２０分間。
【図１１】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが末端のトランスフェラーゼ活性とともにエキソヌクレアーゼ活性を欠くことを示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ホモポリマーであるｓｓＤＮＡ分子（配列番号１５および１６）の３‘末端に種々のヌクレオチドを追加することができず、このことは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが厳格にテンプレート依存性酵素であることを示唆する。複数のＤＮＡポリメラーゼファミリーにおいて進化的に保存された３’−５‘エキソヌクレアーゼの活性部位を形成するＥｘｏｌＩ、ＥｘｏＩＩおよびＥｘｏＩＩＩコンセンサスモチーフを欠くことと一致してＤＮＡ分子が分解されないことから（Ｂｅｒｎａｄ、Ｂｌａｎｃｏら著、１９８９年）、ｄＮＴＰｓを用いないコントロールの反応もまた、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが３’−５‘エキソヌクレアーゼ活性を欠くことを示す。条件：５ｎＭ  ＤＮＡ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、５８℃で６０分間。
【図１２】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるｓｓＤＮＡのプライマーフリーでの効果的な増幅を示す。両種類のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ（＋／−Ｈｉｓタグ）は、ｄＮＴＰ基質は存在するが特定のまたはランダムなプライマーの添加なく、大量の一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８テンプレートＤＮＡを増幅することが可能であり、このことは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの能力がＤＮＡプライマーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方として作用することを明確に示すものである。他方、リボヌクレオチド（ＮＴＰｓ）は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＤＮＡの増幅に関して貧弱な基質であるようである。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、６５℃で６時間。
【図１３】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが金属補助因子に依存することを示す。最も効果的な増幅は、ａ）１ｍＭ  Ｍｎ２＋またはｂ）５ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下で検出された一方、ｃ）Ｃｏ２＋およびｄ）Ｃａ２＋は、試験したいずれの濃度でも不適切な補助因子である。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、３２ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、６５℃で３時間。
【図１４】増幅されたＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡの収率が、ａ）Ｍｇ２＋の存在下、またはｂ）Ｍｎ２＋の存在下のいずれかで、プライマーフリーのアッセイにおいて用いたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの量に比例することを示す。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、６５℃で３時間。
【図１５】増幅されたＤＮＡの収率に対する、一本鎖テンプレートＤＮＡの濃度の影響を示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるプライマーフリーの増幅におけるＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ。産物の量は、Ｍｇ２＋の存在下（左側）、またはＭｎ２＋の存在下（右側）のいずれかにおいて、テンプレートＤＮＡの初期量に依存する。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、３２ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６５℃で３時間。
【図１６】ａ）Ｍｇ２＋の存在下、またはｂ）Ｍｎ２＋の存在下における、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡのプライマーフリーでの増幅における増幅産物の反応時間依存的な収率を示す。いずれの場合において、おそらくｄＮＴＰの欠乏により、増幅は、４時間で飽和する。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（補助因子としてＭｇＣｌ２を用いた場合、３２ｍＭ）、５％グリセロール、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、２００ｎＭ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６５℃。
【図１７】ｄＮＴＰ濃度の関数としての、量および移動度における増幅産物のバリエーションを示す。各金属補助因子に関する最も良好なｄＮＴＰ濃度は、マンガンを用いた場合の１００μＭからマグネシウムの場合の５００μＭの範囲であった。最も高い濃度では、阻害的であるようである。Ｍｇ２＋の存在下（左側）、またはＭｎ２＋の存在下（右側）のそれぞれにおける増幅産物は、各金属に関するｄＮＴＰの有効な間隔を考慮すると、同様の移動度および収率を有する。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、３２ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６５℃で３時間。
【図１８】ｓｓＤＮＡの増幅に用いた金属補助因子についてのインキュベーション温度の影響を示す。最適な温度範囲は、マグネシウムと比較して（５５〜６０℃）、マンガンの方が（５２〜６２℃）と広い。条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、３２ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３時間。
【図１９】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるランダムプライマーの置換、およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによる多重の変位増幅を示す。両酵素の組み合わせは、二本鎖プラスミドＤＮＡを良好に増幅可能である。増幅産物の量は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの用量依存的に、また２００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの存在下で増加し、増幅されたＤＮＡの収率および移動度は、ランダムオリゴヌクレオチドプライマー（ＲＰ）の使用で顕著である。条件：１ｎｇ  ｐＲＳＥＴ  ＤＮＡ（３ｋｂ）、５０μＭ  ランダムプライマー（ＲＰ）、４０ｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、３０℃で５時間。
【図２０】一連のＰｈｉ２９の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）実験における、増幅産物のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ用量依存的増加を示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡｐｏｌ）の両酵素の組み合わせは、ランダムプライマー（ＲＰ）を用いる、良好に確率されたＷＧＡ法と比較して、収率の点で、染色体ＤＮＡを良好に増幅可能である。条件：６５０ｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡｐｏｌ（ＱｕａｌｉＰｈｉ）、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１ｎｇ  染色体ＤＮＡ、５０μＭ  ランダムプライマー、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、３０℃で１６時間。
【図２１】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが長時間安定かつ活性を有することを示す。２０１１年７月７日および１９ヶ月後（２０１３年３月６日）にそれぞれ行った実験において、同様のバッチのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素で大量の増幅核酸を得た。一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡａ）のプライマーフリーの増幅を示す。１６ヶ月を超える期間ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを保存しても、テンプレート依存的なプライマーの伸長能力に変化はないｂ）。条件：ａ）に関して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡ、３２ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、２００ｎｇ  Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、６５℃で３時間。ｂ）に関して、５ｎＭ  ＤＮＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、４０℃で６０分間。テンプレートおよびプライマーは、それぞれ配列番号５および６。
【図２２】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、ＨｓＰｒｉｍＰｏｌよりもより効果的なであることを示す。ＮＴＰｓおよびｄＮＴＰの存在下でのＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡの増幅を示す。より低量（２００ｎＭ）のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌであっても、Ｈｓよりも多くの増幅核酸を生成する。他方、両酵素は、同様の範囲において、ｄＮＴＰｓよりも低い効率性でＮＴＰｓを利用する。
【図２３】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが蛍光標識されたｄＮＴＰｓを取り込むことができることを示す。Ｃｙ５で標識されたｄＣＴＰの取り込みを示す。条件：１０ｎＭ  ＤＮＡ（配列番号１０および８）、１００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、温度４０℃で２０分間。
【図２４】本発明に用いたアミノ酸および核酸の全体像を示す。
【図２５】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによる効果的な増幅に要するテンプレートＤＮＡの最小量を示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよび野生型のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの両酵素の組み合わせは、少なくとも１０ｆｇのテンプレートＤＮＡからヒト染色体ＤＮＡを良好に増幅することができる。二つの独立した一連の実験（図２５ａおよび図２５ｂ）を示しており、各反応条件でｎ数３で行う。インキュベーションの混合物には、５０μＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、７００ｎｇ  野生型のＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ、および指示量のヒト染色体ＤＮＡを含む。ＮＴＣ（非テンプレートのコントロール）は、反応にテンプレートＤＮＡに添加していないことを示す。３０℃で６時間、反応混合物をインキュベートした。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｑｕａｎｔ―ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅産物を定量した。アスタリスクは、三つの複製物のうちの二つについてＤＮＡの増幅が失敗した反応を示す。Ｘ軸：ヒト染色体テンプレートＤＮＡの量；Ｙ軸：ＤＮＡの収率（μｇ）。
【図２６】ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌとＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを組み合わせたことによる、非特異的なバックグラウンドのＤＮＡ増幅が抑制されることを示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの両酵素の組み合わせは、試験したいずれのインキュベーション時間（１６時間未満）においても、外的に添加したテンプレートＤＮＡ分子が存在しない場合にＤＮＡ増幅が起きない。他方、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼとランダムプライマーとの組み合わせによって、反応を３時間のみインキュベートする場合であっても有意にＤＮＡの収率を増加させる。従って、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを使用することで、外的に添加したテンプレートＤＮＡの存在しない場合に非特異的なバックグラウンドのＤＮＡ増幅を阻止する。逆に、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの両酵素の組み合わせでは、外的に添加したテンプレートＤＮＡ分子の存在下、かなりの量の増幅したＤＮＡを生成する（図２６ｂ）。各反応条件は、ｎ数３で行う。インキュベーションの混合物は、５０μＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、７００ｎｇ  ＱｕａｌｉＰｈｉ  Ｐｈｉ２９ＤＮＡＰｏｌ（酵素の向上型）、４００ｎＭ  ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭ  ランダムプライマーを含む。ＮＴＣ（非テンプレートのコントロール）は、反応に外的にテンプレートＤＮＡを添加しないことを示す。ＤＮＡは、１ｎｇのヒト染色体ＤＮＡが、反応にテンプレートとして添加されることを示す。３０℃で示した時間、反応混合物をインキュベートした。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｑｕａｎｔｉ―ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、増幅産物を定量した。
【図２７】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを組み合わせたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによる酵母染色体ＤＮＡの増幅を示す。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９の両酵素の組み合わせは、ランダムプライマー（ＲＰ）を用いる、良好に確立されたＷＧＡ法と比較して、収率について酵母染色体ＤＮＡを良好に増幅することができる。インキュベーションの混合物は、５０μＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｎｇ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体ＤＮＡ、７５０ｎｇ  野生型Ｐｈｉ２９ＤＮＡＰｏｌ（Ｒｅｐｌｉ―Ｇ  単一細胞型、Ｑｉａｇｅｎ）、５０μＭ  ランダムヘキサマーまたは指示量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含む。３０℃で３時間、反応混合物をインキュベートした。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｑｕａｎｔｉ―ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、増幅産物を定量した。
【図２８】参照ゲノムに対する、得たＭｉＳｅｑ配列リードマップを拡張したものを示す。このまとめは、各サンプルに関するリード数の全数、ゲノムに対してマッピングされたリード数、および参照ゲノムに対してマッピングされなかったリード数を詳細に示す。さらに、マッピングされまたマッピングされなかったリード数のサンプル画分当たり、質のクリッピング後の平均リード長とともにゲノムに対してマッピングされまたはマッピングされなかった塩基の全数および画分を示す。最も顕著な点として、増幅されなかったサンプルおよびＴｔｈ／Ｐｈｉの増幅サンプルが同様の程度（＞９０％）でマッピングされ、一方、ランダムにプライミングされたサンプル（ＲＰ）の８３．９２％のみ、参照に対してマッピングされた。
【図２９】個々の染色体を基礎とした、シグネチャーのオーバーリプリゼントおよびアンダーリプリゼントの分析を示す。非増幅サンプル（ＮＡ）に対する、ランダムにプライミングしたサンプル（ＲＰ）およびＴｔｈ／Ｐｈｉの増幅サンプルの両方を比較すると、ＮＡサンプルとＴｔｈ／Ｐｈｉサンプルとで１７％の相対差で低下したことが明らかとなった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の種々の態様を以下に述べ、そして特許請求の範囲を記載する。
【００２０】
推定保存タンパク質ＡＡＳ８１００４．１は、サーマス・サーモフィラスＨＢ２７に由来し、スルフォロブス・イスランジカス由来のクレナーキオータプラスミッドｐＲＮ１（ｐＲＮ１  ｐｒｉｍｐｏｌ）のＯＲＦ９０４タンパク質を含む、アーキオータプラスミドに由来の二機能性複製物に見出されるタイプのプリマーゼ−ポリメラーゼ（ＰｒｉｍＰｏｌ）を含むと推定され、これをクローニングし、溶解型および活性型にて大腸菌内に過剰発現させ、均質に精製した。
【００２１】
本発明者らは、精製されたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、潜在的なプライマーゼ認識配列（ＧＴＣＣ）がチミン残基でフランキングされた一本鎖オリゴヌクレオチドに対して強力なＤＮＡプライマーゼ活性を示すことを見出した（ＣａｖａｎａｕｇｈおよびＫｕｃｈｔａ著、２００９年）。ピリミジンのこのようなトラクトは、複数のウィルス、原核生物および真核生物のＲＮＡプライマーゼによるプライミング反応の開始に関する好ましいテンプレートコンテキストであることが示された（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｃｈｅｒｉａｔｈｕｎｄａｍら著、１９８５年；ＰａｒｋｅｒおよびＣｈｅｎｇ著、１９８７年；ＦｒｉｃｋおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ著、２００１年）。驚くべきことに、本発明者らは、プライミングが「ＴＣ」配列の前部にのみ生じ、ポリｄＴトラックの反対側ではプライミングは生じないことを見出した。テンプレート配列の要件に関するさらなる分析によって、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのプライマーゼ活性に対する、テンプレートの開始部位に先行するヌクレオチドの効果、すなわち、Ｃは、Ａ、ＧまたはＴに対して好ましいこと、を明らかとした。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌがテンプレートの開始部位としてＣＴＣを好むとしても、一般的に、遺伝型であるＸＴＣ（Ｘは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）の任意の配列に対するプライマーゼとして作用可能である。適度な配列の要件は、ほぼすべての天然のテンプレートのランダムプライミングに関して優れた基礎を形成する。
【００２２】
本発明者らは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖の両方の開始および伸長を各々１ｋｂまたは７ｋｂ未満まで実行可能である他のＡＥＰプライマーゼとも知られる、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することをさらに見出した（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  Ｇａｌａｌ、Ｐａｎら著、２０１２年；Ｌａｏ―ＳｉｒｉｅｉｘおよびＢｅｌｌ著、２００４年；Ｌａｏ―Ｓｉｒｉｅｉｘ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら著、２００５年）。また、本発明者らは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写可能であったこと、したがって、逆転写酵素として作用可能であり、また、ギャップを有するテンプレートに対して作用する場合に鎖変位活性を保持することを見出した。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼの場合、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、金属補助因子としてマンガンに厳格に依存すること、およびあまり効果的でない。
【００２３】
これらの知見は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの能力を、種々のテンプレートとともに基質を利用することについての第一のヒントを与えた。したがって、本発明者らは、損傷を有するＤＮＡに対するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの耐性を試験した。このタンパク質は、脱塩基部位（ＡＰ）である、７，８―ジヒドロ―８―オキソアデニン（８ｏｘｏＡ）、７，８―ジヒドロ―８―オキソグアニン（８ｏｘｏＧ）、チミングリコール（Ｔｇ）、５−ヒドロキシシトシン（５ＯＨＣ）または５−ヒドロキシウラシル（５ＯＨＵ）を含むテンプレートを与えられた。本発明者らは、障害部位の反対側にヌクレオチドを挿入することにより、または障害部位をスキップすることおよび次のテンプレートの塩基をコピーすることにより、有効な損傷部位のバイパスを行うことが可能であることを驚くべきことに見出した。酸化ストレスの結果としてＤＮＡに生じる障害の最も頻繁な形態のひとつである８ｏｘｏＧ（ＢｅｒｑｕｉｓｔおよびＷｉｌｓｏｎ著、２０１２年）は、ｄＡＴＰを導入するｓｙｎコンフォメーションにおいて主としかつ効果的にパイパスされた。
【００２４】
さらに、本発明者らは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、プライマーフリーの環境においても、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に関して、また、共有的に閉鎖したＤＮＡのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に関して、魅力的なポリメラーゼとする強力な鎖変位活性を有することを示した。
【００２５】
上記の知見が、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの全般的な酵素的特徴を述べているが、この酵素の日常の実験室内での使用への技術的な適用もまた、溶解性や安定性などの基礎的なタンパク質の特徴に依存する。Ｃ末端近傍にジンクフィンガードメインを含むより複雑な構造に起因する場合もある、単離後まもなくそのプライマーゼ活性を少なくとも欠いたＨｓＰｒｉｍＰｏｌとは異なり（Ｇａｒｃｉａ  Ｇｏｍｅｚ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊｉｍｅｎｅｚら著、２０１２年）、本発明者らは、ジンクフィンガーフリーのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、長期間、高度に安定で、プライマーゼおよびポリメラーゼ活性を保持することを見出した。驚くべきことに、本発明者らは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのプライマーゼ活性、ポリメラーゼ活性のいずれも−８０℃で２０カ月以上保存した場合にあっても有意に低下しないことを見出し（図２１）、これはこの物質を、通常の実験室内において使用される信頼性のある方法の開発のための魅力的なタンパク質とする。
【００２６】
本明細書に述べるこれらおよびその他の知見により、新規で、好ましくはプライマーフリーでの、核酸の増幅、複製および配列決定に関して信頼性のある方法の開発が可能になる。さらなる態様において、これらの知見により、ランダム変異導入に関する新規の方法の開発も可能になる。
【００２７】
したがって、第一の態様において、本発明は、下記の工程を有する核酸の複製、増幅または配列決定のための方法に関し、この方法は、
ａ．ｉ．ポリメラーゼ、または
ｉｉ．ポリメラーゼコンジュゲート、
を用意する工程であって、ポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を有する配列を有し、かつポリメラーゼおよびプライマーゼ活性を有するものである工程と、
ｂ．テンプレート核酸を用意する工程と、
ｃ．核酸の相補鎖を取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド誘導体を用意する工程と、
ｄ．適切なバッファーを用意する工程と、
ｅ．場合により、一つ以上のプライマーを用意する工程と、そして
ｆ．工程ａ乃至ｅの材料を適切な時間、場合により高温で、接触させる工程とを含んでなる。
【００２８】
好ましい実施例において、本発明は、プライマーの存在しない条件において、ＤＮＡの複製、増幅または配列決定のための方法であって、
ａ）ｉ）ポリメラーゼ、または
ｉｉ）ポリメラーゼコンジュゲート、
を用意する工程であって、ポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を有する配列を有し、かつポリメラーゼおよびプライマーゼ活性を有する、工程と、
ｂ）テンプレート核酸を用意する工程と、
ｃ）核酸の相補鎖を取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド誘導体を用意する工程と、
ｄ）適切なバッファーを用意する工程と、
ｅ）第二のポリメラーゼを用意する工程と、そして
ｆ）工程ａ）乃至ｅ）の材料を適切な時間接触させる工程
とを含んでなる。
【００２９】
複製、増幅、配列決定、ポリメラーゼまたは「ポリメラーゼ活性」ならびにプライマーまたは核酸の用語は、本技術分野において周知である。
【００３０】
核酸の用語は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの全体的な名称であって、ポリヌクレオチドと同義語である。核酸は、全ての生命体において豊富に見出され、遺伝の基礎となる遺伝的情報のエンコーディング、伝達および発現の機能を有する。
【００３１】
例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性の用語は、デオキシリボヌクレオチドをＤＮＡへの重合を触媒する酵素の活性を示す。ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ鎖をコピーする工程であるＤＮＡの複製におけるその役割について最もよく知られており、ポリメラーゼは、生のＤＮＡ鎖をテンプレートとして「読み取り」、これを新たな鎖を合成するのに使用する。ポリメラーゼ活性は、例えば、実施例１によるアッセイ、または当業者に周知の種々のＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイにおいて測定されてもよい。
【００３２】
一般に、増幅の用語は、遺伝子が過剰発現され得る多くの方法の一つを意味する。ここで用いるように、増幅の用語は、一片のＤＮＡまたは全ＤＮＡ分子がコピーされまたは多重化され得る多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法の一つを主として意味する。ｉｎ―ｖｉｔｒｏでの増幅方法の非限定的な例には、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＤＣ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、ＮＡＳＶＡまたはＰｈｉ２９ポリメラーゼを用いた等温増幅（ＵＳ  ５００１０５０；ＷＯ／２０１１／０００９９７）が挙げられ、共有結合的に閉鎖されたＤＮＡの場合のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、または線形のゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅（ＷＧＡ）などの鎖変位増幅として主として実行されるものである。
【００３３】
熱安定性および鎖変位能に起因して、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＰＣＲ法とともに、強力な鎖変位能を要する等温条件で有益に使用され得る。両ケースにおいて、本発明の方法は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、損傷を有するＤＮＡを増幅する際に特に有用である、複製の再開を可能とすることから、従来の増幅方法に対して有益性を付加するであろう。
【００３４】
ＤＮＡの配列決定の用語は、ＤＮＡ鎖におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの四つの塩基の並びを決定するのに用いられる種々の方法および技術論を含む、ＤＮＡ分子中のヌクレオチドの正確な並びを決定する工程を定義する。今日現在、第一世代の配列決定、第二世代の配列決定および第三世代の配列決定、または一分子配列決定（ＳＭＳ）と一般的に称される、異なる複数の配列決定技術が存在する。第一世代の配列決定は、マキサム・ギルバート法（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ著、１９７７年）またはＳａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒ。Ｎｉｃｋｌｅｎら著、１９７７年；ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ著、１９７８年）を主に意味し、そのうち、後者のみが現在使用されている。
【００３５】
第二のまたは次世代の配列決定は、塩基の一を先進的な技術的（光学的）検出技術を用いて同時に多くの配列を生成する技術を意味する。現存する方法に対する概説は、（Ｍｅｔｚｋｅｒ著、２００９年）に述べられている。
【００３６】
ＮＧＳ技術は、合成による配列決定技術とも称されるサイクルシークエンシング技術である：Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら著、２００８年）、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ―ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ―ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ―ｓｐｅｅｄ）。最も古い次世代の配列決定技術の一つは、ピロシークエンスである（Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄら著、１９９６年；Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｕｈｌｅｎら著、１９９８年）。この技術は、鎖の伸長中に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の検出を基礎とする。可視光は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例して生成される。放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換される。ＡＴＰは、その後、ルシフェリンを酸化し閃光を生じるエネルギーをルシフェラーゼに提供する。ＤＮＡの配列は、ヌクレオチドが連続する前もって決定された並びに添加されることから、決定され得る。
【００３７】
配列決定の応用例において用いられる蛍光で改変されたヌクレオチドは、酵素に対して天然の基質と同様に挙動しないことから、利用されるポリメラーゼに問題をしばしば引き起こす。これらのヌクレオチドは、高い特異性で成長する鎖に取り込まれなければならず、蛍光の残基は、効果的に続く画像化において分解されるべきであり、次のサイクルで効果的に伸長されるべきである。サイクルシークエンシング技術において、一つの改変されたヌクレオチドの取り込みは、反応の可逆的な終了をもたらし、改変されたヌクレオチドは、したがって、「可逆的ターミネーター」として分類される。２‘−デオキシリボース糖の３’−酸素に結合された分解可能基を有する３‘−ブロックされたターミネーター、および３’−ブロックされていないターミネーターという可逆的なターミネーターの二つのグループが存在する。可能なブロッキング基としては、３‘−Ｏ−アリル（例えば、ｆ３’−アリル−ｄＣＴＰ―アリル―ｂｏｄｉｐｙ―ＦＬ―５１０［λａｂｓ（ｍａｘ）＝５０２ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝５１０ｎｍ］、３’―Ｏ―アリル―ｄＵＴＰ―アリル―Ｒ６Ｇ［λａｂｓ（ｍａｘ）＝５２５ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝５５０ｎｍ］、３’―Ｏ―アリル―ｄＡＴＰ―アリル―ＲＯＸ［λａｂｓ（ｍａｘ）＝５８５ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝６０２ｎｍ］３’―アリル―ｄＧＴＰ―アリル―ｂｏｄｉｐｙ―６５０［λａｂｓ（ｍａｘ）＝６３０ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝６５０ｎｍ］（Ｊｕ、Ｋｉｍら著、２００６年）、現在Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより用いられている／Ｑｉａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。３’―オアジドメチルに用いた他のブロッキング基（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら著、２００８年；Ｇｕｏ、Ｘｕら著、２００８年）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより用いられた。これらのヌクレオチドの例には、下記のものが含まれる：ｄｄＣＴＰ―Ｎ３―Ｂｏｄｉｐｙ―ＦＬ―５１０（λａｂｓ（ｍａｘ）＝５０２ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝５１０ｎｍ）、ｄｄＵＴＰ―Ｎ３―Ｒ６Ｇ（λａｂｓ（ｍａｘ）＝５２５ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝５５０ｎｍ）、ｄｄＡＴＰ―Ｎ３―ＲＯＸ（λａｂｓ（ｍａｘ）＝５８５ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝６０２ｎｍ）、およびｄｄＧＴＰ―Ｎ３―Ｃｙ５（λａｂｓ（ｍａｘ）＝６４９ｎｍ；λｅｍ（ｍａｘ）＝６７０ｎｍ）。ヌクレオチドの３’―末端により大きな基を付加することは、改変されていない基質と比較して、これらのヌクレオチドの取り込みに不利である。この問題の共通の解決法は、３’―ブロックされたターミネーターヌクレオチドが良好に耐性を有する突然変異されたＤＮＡ−ポリメラーゼである。
【００３８】
３’―ブロックされていない可逆的なターミネーターは、ポリメラーゼについて問題が少なく、天然の基質として同様の取り込みの特徴をしばしば有し得る（Ｗｕ、Ｓｔｕｐｉら著、２００７年）。これらのヌクレオチドは、Ｎ６―アルキル化され、光分解性を有する。
【００３９】
最近、正確性およびリード長を改善する、さらに好ましい化学が紹介されている（Ｌｉｔｏｓｈ、Ｗｕら著、２０１１年）。このターミネーターの改変は、５−ヒドロキシメチル―２’―デオキシウリジン三リン酸（ＨＯＭｅｄＵＴＰ）を基礎とする。
【００４０】
その他の３’―ブロックされていないターミネーターは、第一の改変されたヌクレオチドが取り込まれた後に追加のヌクレオチドを取り込むことを阻害するように大型の色素基の立体障害を用いる（Ｔｕｒｃａｔｔｉ、Ｒｏｍｉｅｕら著、２００８年）。
【００４１】
本発明の第一の態様の特定の実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、高い保持性、テンプレートＤＮＡの改変に対する無感受性、および用いるヌクレオチドに対する高い耐性に起因して良好に適合されるために、次世代の配列決定に有利に用いられるであろう。
【００４２】
単一分子配列決定技術は、フルオロフォアが核酸塩基ではなく末端のリン酸に結合され、ポリメラーゼによる取り込みが大きな問題ではなく天然の塩基が成長するＤＮＡ鎖に取り込まれる、ヌクレオチドに依存する（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＶｉｓｉＧｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｅｉｄ、Ｆｅｈｒら著、２００９年））。
【００４３】
第三世代の配列決定または単一分子配列決定（ＳＭＳ）は、事前の増幅を必要とせず、またクローンもＤＮＡの集合体などの配列も必要としないが、ポリメラーゼの活性のオンラインでの記録を意味する、しばしば「リアルタイム」で単一分子を必要とする（Ｓａｍ、Ｌｉｐｓｏｎら著、２０１１年；ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＭｉｌｏｓ著、２０１１年）。
【００４４】
重要なＳＭＳの配列決定プラットフォームは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＲＥＴを基礎とした技術を含み、これは、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ポリメラーゼにリンクされた量子ドットを用い、蛍光的に結合されたヌクレオチドの近似値を測定するゼロモードの導波装置の中心に固定化されたＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌを用い、またはプライマーがガラス表面に固定化されたＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのものを用いる。
【００４５】
根本的に異なる技術は、メンブレンを通じてＤＮＡまたはヌクレオチドを移動可能とする「ナノポア」を基礎とする（Ｂｒａｎｔｏｎ、Ｄｅａｍｅｒら著、２００８年）。この技術は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）により主として市販されている。最初のアイディアが合成中およびイオン電流がポアを通過するという変化の測定中単一のＤＮＡ鎖がポアを貫通することに基づくものであった一方（Ｍａｇｌｉａ、Ｒｅｓｔｒｅｐｏら著、２００８年）、別の可能性は、エキソヌクレアーゼを用いること、および放出されたヌクレオチドがポアを通過するのを検出することに関係している（Ｃｌａｒｋｅ、Ｗｕら著、２００９年）。この技術は、高価な蛍光標識したヌクレオチドがもはや必要なくなることから、配列決定に関する価格の革命を起こし得るものであった。
【００４６】
これらのナノポアに用いられるタンパク質としては、α−ヘモリシン（Ｍａｇｌｉａ、Ｒｅｓｔｒｅｐｏら著。２００８年；Ｊｅｔｈａ、Ｗｉｇｇｉｎら著、２００９年）またはＭｓｐＡ（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｂｕｔｌｅｒら著、２０１０年；Ｍａｎｒａｏ、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら著、２０１１年；Ｍａｎｒａｏ、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら著、２０１２年；Ｐａｖｌｅｎｏｋ、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら著、２０１２年；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｐａｖｌｅｎｏｋら著、２００８年）が挙げられる。
【００４７】
これまで、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡｐｏｌは、Ｌｉｅｖｅｒｍａｎｎ、ＭａｎｒａｏまたはＷｅｎｄｅｌｌにより述べられた適用例に主として用いられている（Ｌｉｅｖｅｒｍａｎ、Ｃｈｅｒｆら著、２０１０年；Ｍａｎｒａｏ、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら著、２０１２年；Ｗｅｎｄｅｌｌ、Ｊｉｎｇら著、２００９年）。本発明の第一の態様の他の特別な実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、単一分子のナノポアの配列決定を向上させるように、α−ヘモリシンまたはＭｓｐＡまたは同様のタンパク質とともに、またはこれらと共有的にリンクされて使用されている。この実施形態におけるＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを用いることの具体的な利点の一つは、反応において異なるヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｏｘｏＮＴＰｓ）に対する高い耐性である。より多くの適用例において異なる改変されたヌクレオチド（例えば、蛍光標識されたもの）を用いていることから、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、改変されたヌクレオチドについて高い処理性および質を提供するようである。
【００４８】
酵素は、特別な生物学的機能を有する複雑なタンパク性の生体分子である。インタクトのタンパク質は、一次構造、二次構造、三次構造および時に四次構造を有する。
【００４９】
それらの生物学的機能およびそれらの分子安定性さえ、これらの構造の保存性に依存し、また、温度、凍結／融解サイクル、ｐＨ、タンパク質濃度、塩条件、溶媒などの種々の因子により影響されることは当業者に周知である。さらに、タンパク質の構造および安定性は、個々のアミノ酸の酸化により影響され、そのうち、主に、メチオニン、システイン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジンは、酸化に影響されやすい（Ｋｉｍ、Ｂｅｒｒｙら著、２００１年）。本技術分野において用いられているように、タンパク質の安定性は、ユニークな三次元構造がランダムなコイル状のポリペプチド鎖に展開することに関与する、標準ギブスエネルギー変化ΔＧ０により定量的に記述される（Ｈｉｎｚ、Ｓｔｅｉｆら著、１９９３年）。
【００５０】
対照的に、本明細書で用いられるように、タンパク質または酵素の安定性との用語は、主に、長時間に渡ってその酵素活性の保持を意味する。
【００５１】
本明細書に述べるように酵素活性の保持は、プライマーゼおよびポリメラーゼ活性が、新鮮に単離されたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの、少なくとも３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、約１００％保持することを意味するものと好ましく意図される。
【００５２】
酵素の活性とともに安定性に影響を与える一つの態様は、保存に用いられるバッファー、および酵素反応を実行するために用いられるバッファーである。本発明の方法に用いられるバッファーは、特に限定されないが、当業者は、本発明の方法に実行とともに保存のためのバッファーの条件の最適化を日常的に行い得る。
【００５３】
本発明の方法のいずれにも用いられるタンパク質は、従って、適した条件で保存される場合、本明細書で定義されるように、長期間、プライマーゼおよびポリメラーゼ活性を保持するタンパク質として特徴付けられる。タンパク質の安定性およびしたがって保存可能期間が、タンパク質の本質的性質、および保存条件の両方に依存することは、当業者に周知であり、また、種々の方法および技術が、保存条件を最適化するのに本技術分野において既に利用可能であることは、当業者に周知である。総括的概論については、Ｓｉｍｐｓｏｎに述べられている（Ｓｉｍｐｔｏｎ著、２００５年）。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明の第一の態様の方法は、従って、適した保存条件下、その活性、少なくとも４、５、６ヶ月、好ましくは少なくとも７、８、９ヶ月、好ましくは少なくとも１０、１１、１２ヶ月、好ましくは少なくとも１３、１４、１５ヶ月、好ましくは少なくとも１６、１７、１８ヶ月、好ましくは少なくとも１９、２０、２１ヶ月、好ましくは少なくとも２２、２３、２４ヶ月保持することが好ましいＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素を有する。
【００５５】
最も好ましい実施形態において、本発明の方法は、適した条件下、その活性を２年以上保持するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ酵素を有する。
【００５６】
本明細書に用いられるように、本発明の方法のいずれにも用いられるタンパク質は、例えば配列番号１との相同性が７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、配列番号１に少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するタンパク質であり、任意にポリメラーゼおよび／またはプライマーゼ活性を有する。
【００５７】
最も好ましい実施形態において、本発明の方法のいずれにも用いられるタンパク質は、配列番号１の配列を有するタンパク質である。
【００５８】
相同性のパーセンテージは、当業者によって容易に決定され得る。非限定的な例として、２０アミノ酸のペプチドに関して、第一の態様による配列に対して７０％の相同性とは、２０アミノ酸のうちの１４アミノ酸が同一であることを意味する。また、ＮＣＢＩまたはＥＢＩなどの最も有名な生物学的情報登録ウェブサイトは、相同性の計算および／または核酸配列のホモロジーとともに、アミノ酸の相同性および／またはホモロジーの計算に関するサービスを提供する。当業者には、例えば、一般的なＢＬＡＳＴ  （Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）が、このような計算に適することが知られている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｇｉｓｈら著、１９９０年）。
【００５９】
本明細書に定義するように、本発明の方法のいずれにも用いられるタンパク質が、配列番号１を有するタンパク質の誘導体であってもよいこと、および一つ以上のアミノ酸の変換、および／または一つ以上の連続するアミノ酸の挿入、および／または連続するアミノ酸の逆位、および／またはアミノ酸の欠失を有してもよいことは、当業者に理解されるであろう。本発明の方法のいずれにも用いるためのタンパク質誘導体は、当業者に周知であり、特に限定されない一つ以上の共有的改変をさらに有していてもよい。好ましくは、この一つ以上の共有的改変は、アセチル化、アミド化、ジスルフィド結合形成、ホルミル化、糖化、メチル化、リン酸化、硫酸化からなる群から選択される。
【００６０】
一般的に、本発明の方法のいずれにも用いるためのタンパク質またはタンパク質誘導体は、キメラタンパク質、キメラタンパク質誘導体またはキメラタンパク質コンジュゲートであってもよい。キメラペプチドなどは、特に限定されず、当業者に一般的に周知である。
【００６１】
好ましくは、このようなキメラタンパク質またはキメラタンパク質誘導体は、本発明の方法のいずれにも用いるためのタンパク質またはタンパク質誘導体を有するタンパク質コンジュゲートであり、上記に開示した通りである。本明細書で用いる場合、「タンパク質コンジュゲート」は、追加の部分とともに本明細書で開示のタンパク質またはタンパク質誘導体を有するコンジュゲートを意味する。この追加の部分は、特に限定されない。好ましくは、追加の部分は、本明細書に開示するタンパク質またはタンパク質誘導体に共有的に結合される。本発明の方法に用いるための追加の部分は、一つ以上の斯かる部分をも意味してもよい。よって、タンパク質コンジュゲートは、例えば所与のタイプの部分のうちの二つ以上の部分および／または異なるタイプの部分の二つ以上の部分など、一つ以上の斯かる部分を有してもよい。前記部分は、好ましくはＨｅｌｉｘ―ヘアピン−ヘリックス部分などの核酸、ジャイレース部分などのＤＮＡ巻き戻し部分、大腸菌のＰｒｉＢタンパク質の部分又は天然痘のｉｃｐ８の部分などの一本鎖結合部分と相互作用すると知られる部分から好ましく選択される。
【００６２】
一般に、このような誘導体またはコンジュゲートが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％の増加など、配列番号１を有するタンパク質のタンパク質活性と比較して、増加したプライマーゼおよび／またはポリメラーゼ活性を有してもよいことは、当業者により理解されるであろう。
【００６３】
本発明によると、本発明の方法のいずれにも用いるためのタンパク質、タンパク質誘導体またはコンジュゲートは、従って、例えば配列番号２を有する分子に存在するようＨｉｓ―タグなどのタンパク質、タンパク質誘導体またはコンジュゲートの単離が容易な、検出可能なラベルまたはタグを有してもよい。
【００６４】
このようなタンパク質誘導体またはタンパク質コンジュゲートは、例えば、化学合成、宿主細胞における製造またはこれらの組み合わせを含む方法によるなど、当業者により容易に取得可能である。
【００６５】
分子生物学における長らくの問題は、ＲＮＡからＤＮＡへの転写（逆転写）である。これには、ＰＣＲを基礎とした分析など、ｃＤＮＡの構築が必要である。これまで、この逆転写は、例えば、元々レトロウィルスから単離されたＭＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、ＨＩＶ―１  ＲＴなどの可能性のある複数の酵素によって行われている。今までのところ、ＲＴｓの一つの問題は、これらの酵素の通常の反応温度（３７または４２℃）中で溶融され得ない複雑な二次構造に起因して、全細胞ｍＲＮＡの不均一な転写である。これは、ｍｉＲＮＡなどのヘアピン構造を含むｍＲＮＡを逆転写しようとする場合、特に問題である。
【００６６】
ＲＴ酵素のより熱安定性の高い複数のバージョンが紹介されている：ＭＭＬＶ―ＲＴの突然変異体（Ｇｅｒａｒｄ、Ｆｏｘら著、１９９７年）（Ｍａｘｉｍａ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、突然変異ＭＭＬＶ  ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂｉｏ．ｃｏｍ／ｒｅｖｅｒｓｅ―ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ―ｒｔｐｃｒ―ｒｔｑｐｃｒ／ｍａｘｉｍａ―ｒｅｖｅｒｓｅ―ｔｒａｎｓｃｒｉｐａｔｓｅ／）、７０℃で作動するように要求される突然変異ＭＭＬＶ  ＲＴであるＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ（Ｂｉｏｎｅｅｒによるｕｓ．ｂｉｏｎｅｅｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｃｃｕｐｏｗｅｒ／ａｃｃｕｐｏｗｅｒ―ｒｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔ―ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ａｓｐｘ）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ  ＲＴ  （ｗｗｗ．ｌｕｃｉｇｅｎ．ｃｏｍ）（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら著、２００８年；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ、Ｌｉｌｅｓら著、２００９年；Ｍｏｓｅｒ、ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏら著、２０１２年）、Ｔｔｈ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ／  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（マンガンイオン存在下、ＲＮＡをも転写し得るが高度に不正確であるサーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）ＰｏｌＩ）（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ著、１９９１年）。
【００６７】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、高い熱安定性および高い処理性を有することから、複雑なＲＮＡを逆転写する際の問題点に関して優れた解決法を提供する。
【００６８】
従って、本発明の好ましい実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、適切なバッファーを有するＲＴとして用いられるであろう。
【００６９】
上記の延長において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＰＣＲ反応において、ＲＴおよびＤＮＡ−ポリメラーゼとしても同時に使用されるであろう。その利点は、ＲＮＡがテンプレートとして直接用いられ得ることであって、二つの異なる反応について追加の労力やコストを回避し、また二つの異なる反応による可能性のあるバイアスや汚染を回避することである。専門家に知られているように、典型的な温度プロファイルは、斯かる組み合わされた反応に使用され得る（例えば、９４℃での初期の変成、７０℃で３０分間のＲＴ反応、およびＰＣＲ反応に関する９４、５０および７０℃の追加のサイクリングなど）。
【００７０】
本明細書に用いられる、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの用語は、特に限定されず、例えば、限定されないｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴｐ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰまたはこれらの誘導体などのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を含むことを意味する。このような誘導体に関する非限定的な例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴｐ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＵＴＰなどのジデオキシヌクレオチド、または８ｏｘｏＡ、８ｏｘｏＧ、５ＯＨＣ、５ＯＨＵなどの酸化誘導体、または蛍光標識された誘導体などの標識誘導体、または第三世代の配列決定に用いられる標識などのさらにより複雑な標識などが挙げられる。
【００７１】
本明細書に用いられる、難解なテンプレート、損傷ＤＮＡ、損傷核酸または汚染ＤＮＡの用語は、相互に置き換え可能なものとして用いられ、従来の増幅または配列決定方法で取り扱うことが難しいヌクレオチドの塩基における変化を有する核酸を意味する。非限定的な例としては、例えば８ｏｘｏＡ、８ｏｘｏＧなどの酸化ストレスにより導入された変化、またはホルムアルデヒドなどの架橋剤により導入された変化などの生理的に生じる変化が挙げられる。
【００７２】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは異なるＤＮＡ改変を高度に受け入れるものであることから、本発明の第一の態様のさらなる実施形態は、かかる損傷ＤＮＡの配列決定または増幅のためのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを包含する。
【００７３】
本分野における一つの大きな要求はＦＦＰＥサンプルを配列決定することであり、それは多くの臨床的試料がこのような形態で保存されているからである。ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドなどの架橋剤は、従来の手法で取り扱うことが困難なようにＤＮＡに変化を導入し得る。よって、特別な実施形態において、核酸の配列決定および増幅の方法は、ＦＦＰＥ試料のサンプルからのＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートを含む方法である。
【００７４】
さらなる特別な実施形態において、核酸の配列決定または増幅の方法は、例えば８ｏｘｏＡ、８ｏｘｏＧ、５ＯＨＣ、５ＯＨＵなどの酸化ヌクレオチド塩基を含む方法である。
【００７５】
同様に、テンプレートの組成における高い耐性ゆえ、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、法医学的ＤＮＡ材料または考古学的サンプルに由来のＤＮＡを増幅しかつ配列決定するのに用いられ得る。
【００７６】
他の実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、生理学的に生じるＤＮＡの改変を解読するのに用いられ得る。このような改変の例としては、８ｏｘｏＡ、８ｏｘｏＧ、５ＯＨＣ、５ＯＨＵが挙げられる。８ｏｘｏＧの例によって特徴付けられるように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、特定の確度でヌクレオチドを合成された鎖に挿入することにより改変を「リード」することができる。８ｏｘｏＧの場合、ｄＡは、障害部位に対向するｄＣよりもより頻繁に少なくとも５回挿入されるであろう。異なる改変について、挿入に関する特別な特徴的な分布または優先度が存在する。ディープ配列決定を行う場合、位置Ｘにおける元のＤＮＡの改変は、同様の配列の多くの異なるリードが得られることから（例えば、３０〜５０リード）、この位置におけるリードヌクレオチドの部分分布から推察され得る。同様に、チミジンダイマーについて、ＤＮＡの改変は、元の配列に由来する塩基の欠失から確立され得る。
【００７７】
この適用例は、薬物の効果がＤＮＡ改変の性質および程度を決定することによりモニタリングされ得た場合、例えば、加齢の分野において有利である。同様に、このような適用例は、特定の療法の効果を決定しまたは癌細胞を分類するのに、腫瘍学の分野において有用であり得る。
【００７８】
臨床的な診断応用例とともに基礎的なゲノム研究の両方において、サンプルが単一細胞へとより小さくなる分析へと向かっている。同様に、法医学的分析もまた、非常に少量の遺伝子材料にしばしば依存する。これら全ての場合において、配列決定やＤＮＡアレイハイブリダイゼーションなどの下流の目的のため、サンプルの採取から遺伝子情報の取り扱いおよび増幅までの工程のいずれにも核酸を持ち込まないことは、極めて重要である。
【００７９】
回避することがしばしば困難な汚染の一つの源は、酵素の調製および試薬（例えば、バッファー、ヌクレオチドなど）に付随する核酸材料である。
【００８０】
ｐｈｉ２９  ポリメラーゼおよびランダムヘキサマープライマーを用いるＭＤＡ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼの高い忠実性およびその高い加工性のため、単一細胞ＷＧＡに関して好ましい方法となっている（Ｍａｃａｕｌａｙ  ＩＣ、Ｖｏｅｔ  Ｔ著、２０１４年）。しかしながら、ＭＡＬＢＡＣなどのＰＥＰ―ＰＣＲやＤＡ―ＰＣＲに基づく適用例などのランダムプライマーを用いるその他の不利な方法もまた、存在する（Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ら著、１９９２年）。
【００８１】
例えば、Ｗｏｙｂｅらは、通常のＭＤＡ試薬において細菌由来の汚染物を見出している。また、Ｂｌａｉｎｅｙおよび同僚（２０１１年）は、デジタルＭＤＡ（ｄＭＤＡ）と称される新規の高感度検出方法を用いた三つの市販のＰｈｉ２９ポリメラーゼ調製物に存在するＤＮＡを見出している。大腸菌ＤＮＡによるＰｈｉ２９ポリメラーゼの汚染もまた、Ｙｏｋｏｕｃｈｉおよび同僚によって見出されている（Ｙｏｋｏｕｃｈｉ  Ｈ．ら著、２００６年）。
【００８２】
Ｔａｑポリメラーゼまたはその変異体を用いるＰＣＲ型の反応における外部のＤＮＡ汚染物が存在することは、例えば、Ｈｅｉｎら著（２００７年）；Ｃｏｒｌｅｓｓら著（２０００年）およびＣｈａｍｐｌｏｔ  Ｓ．ら著（２０１０年）など、文献に広く報告されている。
【００８３】
本発明の例１５は、汚染増幅を抑制するため、ランダムプライマーをＰｒｉｍＰｏｌと置き換える一つの実施例を説明している。この例は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを述べており、その他のポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）もまた、ここに用いられ得る。
【００８４】
川下における分析に関して、非常に少量のＤＮＡを増幅する必要性がこれまでになく増している。このことは、例えば、法医学または病理学的試料、また単一細胞または少数の細胞にも適用される。特に興味深い適用例は、例えば、健常者の細胞または疾病を有する組織との遺伝的差異についての情報を得るための斯かる増幅材料の配列決定である。医学において、このことは、同定された変異に基づく薬物（例えば、キナーゼ阻害剤）の選択がなされる、腫瘍学の分野において極めて貴重である。従って、増幅材料が、サンプルの元の配列特徴を最大限の忠実性で反映することは、極めて重要である。
【００８５】
しかしながら、少量のサンプルから遺伝材料を増幅するための現在の方法論は不完全である。元の核酸材料の代表例にはバイアスが存在する。これは、複数の科学論文において体系的に評価されている。
【００８６】
例えば、Ｐｉｎａｒｄおよび同僚（Ｐｉｎａｒｄら著、２００６年）は、ＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む事なる増幅方法を検討した。増幅されていないサンプルと比較して、ゲノム領域の適用範囲に有意な偏差が存在した。また、増幅されていないサンプルに対してＧＣ含量がずれるというバイアスが存在した。
【００８７】
また、Ｐａｅｚら（２００４年）は、増幅された核酸材料に対して選択的な過小評価および損失を報告した。Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎら（２００５年）は、単一の大腸菌細胞からＭＤＡにより増幅されたＤＮＡのｑＰＣＲ手法を用いて、バイアスを見出した。さらに、ヒトおよび酵母の染色体の両方の末端に対する領域的な近接度に関連した配列の損失について述べている（Ｌａｇｅら著（２００３年））。Ｈｏｓｏｎｏら（２００３年）は、ＭＤＡ型の増幅が、ｑＰＣＲにより判断された遺伝子座の過大評価または過小評価をもたらすと説明している。
【００８８】
Ｈａｎら（２０１２年）は、ＭＤＡにより増幅されたヒトＤＮＡにおいて、見かけのコピー数多型（ＣＮＶｓ）の変化を見出した。彼らは、一貫して低度に増幅された領域が、より高いＧＣ含量をも有したことを見出した。Ｐｕｇｈら（２００８年）もまた、ＧＣ含量に関連しまた染色体末端近傍におけるＣＮＶｓの有意な見かけの変化を同定した。
【００８９】
ＭＤＡ法により導入されたこれらのアーチファクトは、特に、診断および治療決定を行う際の臨床的な使用に関して、重大な問題を引き起こす。用いられるランダムプライマーの種類の変化が導入されるバイアスの種類を改変することから（Ａｌｓｍａｄｉら著、２００９年）、このバイアスの少なくとも一部が、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼとともにＭＤＡ法に本質的に必要とされるランダムプライマーに起因することは、明らかである。従って、導入されるバイアスが少なくまたは少なくとも異なるタイプである代替的な増幅方法が必要とされている。
【００９０】
例１６は、ＭＤＡ型の増幅におけるランダムプライマーをＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと置き換えることが代替例を提供することを示す。
【００９１】
そのため、好ましい実施形態において、本発明は、汚染ＤＮＡの増幅が抑制された本発明による方法に関する。
【実施例】
【００９２】
次に、以下の非限定的な例を参照して、本発明についてさらに述べる。
【００９３】
例１：特定の材料および方法
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのクローニング：サーマス・サーモフィラスＨＢ２７ゲノム（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＥ０１７２２１．１；  ＧＩ：４６１９７９１９）の配列分析により、アーキアル／ユーカリアルプライマーゼ（ＡＥＰ）スーパーファミリーに属するタンパク質をコードするＯＲＦ  ＴＴＣ０６５６を明らかにした。この配列の情報を用いて、我々は、サーマス・サーモフィラスのゲノムＤＮＡからＰＣＲによりＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ遺伝子の増幅のための二つのプライマー（配列番号１１および１７）を合成した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（ロッシュ）を用いてＰＣＲにより増幅された遺伝子断片は、ＴＡクローニングによりｐＧＥＭ  Ｔ―ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートし、配列決定により確認した。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いて、標的遺伝子を有する断片は、ｐＥＴ２１およびｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲートした。ｐＥＴ２８ベクターにより、Ｎｉ２＋―アフィニティー樹脂上での精製のためのヘキサヒスチジル配列を有する多機能性リーダーペプチドとの融合物として組み換えタンパク質の発現を可能とする。
【００９４】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの過剰生産および精製：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの発現は、ａｒｇＵ、ｉｌｅＹおよびｌｅｕＷ  ｔＲＮＡ遺伝子の過剰なコピーを有する、大腸菌株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  （ＤＥ３）―ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内で行われた。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの発現は、ＬＢ中３０℃で６００ｎｍの吸光度０．５まで成長させたログフェーズの大腸菌細胞１．５Ｌに１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより誘導された。誘導後、細胞を、３０℃で５時間インキュベートした。続いて、培養された細胞を回収し、ペレット化した細胞を計量し凍結させた（−２０℃）。
【００９５】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ−Ｈｉｓタグの精製：４℃で行われた精製の直前、凍結細胞（３．７ｇ）を解凍し、１ｍＭ  ＮａＣｌを添加した２０ｍＬのバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁し、その後、氷上で超音波処理することで、破砕した。細胞の破片は、３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、廃棄された。不溶性材料は、１１０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離により、ペレット化された。ＤＮＡは、０．４％ポリエチレンイミン（水中１０％のストック溶液、ｐＨ７．５）で沈殿させ、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行うことで、堆積させた。バッファーＡで最終濃度０．２５Ｍ  ＮａＣｌの最終濃度になるように上清を希釈し、３０％の飽和度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、ポリエチレンイミンを有さないタンパク質ペレットを得た。このペレットを、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡに再懸濁し、０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したこのバッファーで前もって平衡化されたＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡを用いて完全に洗浄した後、０．２〜０．８Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配でタンパク質を溶出させた。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを有する溶出物を、最終濃度０．２ＭのＮａＣｌとなるようにバッファーＡで希釈し、０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡで前もって平衡化したｍｏｎｏＳ  ４．６／１００ＰＥカラム（１．７ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムを洗浄し、０．１〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配でタンパク質を溶出させた。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを有する画分をプールし、０．２Ｍ  ＮａＣｌに希釈し、同様のバッファーで前もって平衡化されたＨｉｔｒａｐヘパリンＨＰカラム（５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムを洗浄し、１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡを用いてタンパク質を溶出させた。この画分は、高度に精製された（＞９９％）ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。既知の濃度の標準品を用いて、クマシーブルー染色１０％ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルのデンシトメーターにより、タンパク質濃度を計算した。５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調節された最終画分を−８０℃で保存した。
【００９６】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ＋Ｈｉｓタグの精製：４℃で行われた精製の直前、凍結された細胞（３．５ｇ）を解凍し、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０および３０ｍＭ  イミダゾールを添加した２０ｍＬのバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁し、その後、氷上での超音波処理により破砕した。４００００ｇでの５０分間の遠心分離の後、細胞の破片および不溶性材料を廃棄した。１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０および３０ｍＭ  イミダゾールを添加したバッファーＡで前もって平衡化されたＨｉＴｒａｐ粗ＦＦカラム（５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０および３０ｍＭ  イミダゾールを添加したバッファーＡで完全に洗浄した後、３０〜２５０ｍＭイミダゾールの線形勾配でタンパク質を溶出させた。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを有する溶出物を、最終濃度０．１Ｍ  ＮａＣｌになるように０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡで希釈し、１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡで前もって平衡化されたＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムを洗浄し、タンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０を添加したバッファーＡで溶出した。この画分は、高度に精製された（＞９９％）ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。既知の濃度の標準品を用いて、クマシーブルー染色１０％ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルのデンシトメーターにより、タンパク質濃度を計算した。５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調節された最終画分を−８０℃で保存した。
【００９７】
ＤＮＡ基質：ＰＡＧＥで精製した合成オリゴヌクレオチドをＳｉｇｍａ社から得た。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのポリメラーゼ活性を評価するため、Ｐ１プライマー（５’ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣ；配列番号６）をＴ１テンプレート（５’ＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧ；配列番号５）に、Ｐ２プライマー（５’ＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣ；配列番号１４）をＴ２テンプレート（５’ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＸＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣ；配列番号１３）であって、Ｘが、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、脱塩基部位（ＡＰ）、７，８―ジヒドロ―８―オキソアデニン（８ｏｘｏＡ）、７．８―ジヒドロ―８―オキソアデニン（８ｏｘｏＧ）、チミングリコール（Ｔｇ）、５―ヒドロキシシトシン（５ＯＨＣ）または５−ヒドロキシウラシル（５ＯＨＵ）であるテンプレートに、Ｐ３プライマー（５’ＧＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＴＡＣ；配列番号８）をＴ３テンプレート（Ｔ３ＤＮＡ  ５’ＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣ；配列番号１０またはＴ３ＲＮＡ  ５’ＡＧＡＡＧＵＧＵＡＵＣＵＵＧＵＡＣＵＣＡＣＵＧＵＧＡＵＣ；配列番号１２）に、アニーリングすることにより、テンプレート／プライマー分子を生成した。Ｐ３プライマー（配列番号８）をＴ４テンプレート（５’ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＡＴＴＧＴＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣ；配列番号７）および下流のオリゴヌクレオチドＤＧ５Ｐ（５‘―リン酸基を有する５‘ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ；配列番号９）にアニーリングすることにより、５−ヌクレオチドのギャップを有する分子を生成した。プライマーを、その５’末端に蛍光標識（Ｃｙ５）した。各プライマーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０．３Ｍ  ＮａＣｌの存在下、異なるＤＮＡ分子を生成するため、テンプレート、またはテンプレートおよび下流のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、一昼夜室温で緩徐に冷却する前に８０℃で１０分間加熱した。プライマーゼ活性を測定するため、我々は、推定上のヘルペスウィルスのプライミング部位を含むＸＴＣＣオリゴヌクレオチド（５’Ｔ１５ＣＣＴＸＴ１０、Ｘは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；配列番号４）を用いた（ＣａｖａｎａｕｇｈおよびＫｕｃｈｔａ著、２００９年）。
【００９８】
プライマーゼアッセイ：プライマーゼ活性を測定するため、テンプレートとして、Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ（２０μｇ／μＬ）またはＸＴＣＣオリゴヌクレオチド（１μＭ）を用いた。反応混合物（２０μＬ）は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ（４００ｎＭ）の存在下、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（１６ｎＭ；３０００Ｃｉ／ミリモル）または［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（１６ｎＭ；３０００Ｃｉ／ミリモル）、指示量の各ｄＮＴＰまたはＮＴＰを含有する。５５℃で６０分後、ホルムアミド充填バッファー（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５％ｖ／ｖホルムアミド、０．３％ｗ／ｖキシレンシアノール）を添加することにより、反応を停止した。８Ｍ尿素含有２０％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で反応を行った。電気泳動後、オートラジオグラフィーによりｄｅ  ｎｏｖｏで合成されたポリヌクレオチド（プライマー）を検出した。
【００９９】
ＤＮＡおよびＲＮＡポリメライゼイションアッセイ：インキュベーション混合物は、２０μＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、各ケースに示したＤＮＡハイブリッド５ｎＭ、指示量の各ｄＮＴＰまたはＮＴＰおよび指示量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。４０℃で示した時間の間、反応混合物をインキュベートし、１０μＬの停止溶液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび９７．５％脱イオン化ホルムアミド）を添加することにより反応を停止した。標識化プライマー鎖の伸長は、８Ｍ尿素および２０％ＰＡＧＥにより分析され、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化された。
【０１００】
循環ＤＮＡ増幅反応：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの増幅能を測定するため、テンプレートとしてＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡおよびｐＥＴ２８ｄｓＤＮＡを用いた。インキュベーション混合物は、２０μＬ中、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、指示量のテンプレートＤＮＡ、示した濃度のＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２、指示量の各ｄＮＴＰまたはＮＴＰおよび指示量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。示した時間、異なる温度（３５〜８５℃の範囲）で反応混合物をインキュベートし、氷上で温度を低下させることで、反応を停止した。増幅産物は、ネーティブゲル電気泳動により分析された。
【０１０１】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌを基礎としたローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のためのランダムプライマーの合成：インキュベーション混合物は、１２．５μＬ中、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、５０μＭ  ランダムヘキサマー、１ｎｇ  ｐＲＳＥＴ、４０ｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡｐｏｌおよび指示量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。酵素を添加する前にテンプレートＤＮＡを変性するため、反応混合物を沸騰（９５℃で３分間）させた。その後、反応混合物を３０℃で５時間インキュベートした。増幅産物を、ＨｉｎｄＩＩで消化し、ネーティブゲル電気泳動で分析した。
【０１０２】
Ｐｈｉ２９  ＤＮＡｐｏｌを基礎とした全ゲノム増幅（ＷＧＡ）のためのランダムプライマーの合成：インキュベーション混合物は、５０μＬ中、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ―２０、５００μＭ  ｄＮＴＰｓ、５０μＭ  ランダムヘキサマー、１ｎｇ  ヒトゲノムＤＮＡ、６５０ｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡｐｏｌおよび指示量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを含有する。反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートした。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｑｕａｎｔ―ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、増幅産物を定量した。
【０１０３】
酵母の増殖およびゲノムＤＮＡの単離：酵母株ＢＹ４７４１を、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｅｔｈｅ―Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）から受け取り、ＹＰＤ（１Ｌ当たり、１０ｇ酵母エキス、２０ｇペプトン、２０ｇデキストロース）培地中、３０℃で増殖させた。Ｑｉａｇｅｎのゲノムチップ１００／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２０１２年４月）の推奨プロトコルに従って、ゲノムＤＮＡの単離のため、二つの異なる一昼夜の培養物５０ｍＬ（ＯＤ６００＝１；〜１．５×１０９細胞）を用いた。
【０１０４】
１％アガロースゲル上で単離ＤＮＡを分析し、ＯＤ２６０／２８０およびＯＤ２６０／２３０の吸光度を測定した。最終的に、消化性について、ＤＮＡを試験した：１単位のＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間、１００ｎｇのｙｇＤＮＡを消化した。
【０１０５】
２００ｎｇ／μＬの濃度の酵母ＤＮＡの二つのサンプルを単離した。下流の実験において、サンプル番号１を用いた。
【０１０６】
酵母ＤＮＡのＭｉＳｅｑ配列決定：Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（サンプル名Ｔｔｈ―１００／Ｐｈｉ、Ｔｔｈ―２００／ＰｈｉおよびＴｔｈ―４００／Ｐｈｉ）と組み合わせた、増幅されていない酵母ＤＮＡ（サンプルＮＡ）、従来の増幅酵母ＤＮＡ（サンプルＲＰ）、および一定のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ（それぞれ１００、２００および４００ｎｇ）をリンスすることにより増幅された酵母ＤＮＡのいずれか２μｇから出発して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に関する正規のサービス提供者であるＧＡＴＣ（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ、ドイツ）により、ＭｉＳｅｑ配列決定機（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）を用いて、五つのサンプルにつき、ライブラリーの調製、多重化および配列決定を行った。選択された配列決定パラメータは、以下の通りである：対となった末端のリード、リード長３００ｂｐ。ＧＡＴＣは、各サンプルの一つおよびリード指示について、１０ｆａｓｔｑファイルのデータを返送した。
【０１０７】
例２：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ｄＮＴＰｓを用いて核酸合成を開始し得る活性型プライマーゼである
精製されたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、潜在的なプライマーゼ認識配列（ＧＴＣＣ）がチミン残基によってフランキングされた一本鎖オリゴヌクレオチドに対してＤＮＡプライマーゼ活性を示した（ＣａｖａｎａｕｇｈおよびＫｕｃｈｔａ著、２００９年）。このようなピリミジンのトラクトは、複数のウィルス、原核生物および真核生物のＲＮＡプライマーゼによるプライミング反応の開始に関して好ましいテンプレートコンテキストであることが示されている（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｃｈｅｒｉａｔｈｕｎｄａｍら著、１９８５年；ＰａｒｋｅｒおよびＣｈｅｎｇ著、１９８７年；ＦｒｉｃｋおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ著、２００１年）。示したように（図１）、プライミングは、「ＴＣ」配列の前部でのみ生じ、ポリｄＴトラックの対向部位ではプライミングは存在しない。プライマー（５‘位置）として作用するヌクレオチドは、マンガン存在下、リボヌクレオチド（ＡＴＰ）またはデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）のいずれかであり得るが、マグネシウムが金属補助因子である場合にデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）のみである。添加されたヌクレオチド（３’位置）は金属補助因子にかかわらず、デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ）でなければならない。テンプレート配列の要件に関する分析は、テンプレート開始部位に先行するヌクレオチドの強力な効果を示した。図２に示すように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのプライマーゼ活性は、Ｃが開始部位に先行するヌクレオチドである場合に、最大となった。さらに、示したように（図３）、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、一本鎖環状ＤＮＡテンプレート（Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ）に対してＤＮＡプライマーゼ活性を示した。興味深いことに、タンパク質は、合成のためのデオキシヌクレオチドに厳格に依存したが、実質的には、リボヌクレオチドの存在下では産物は生成しなかった。
【０１０８】
一般に、プライマーゼは、ＲＮＡプライマーを生じるが、始原細菌およびいくつかの細菌のＡＥＰに関連したプライマーゼは、プライミングに関する有効な基質としてｄＮＴＰｓを用いる場合、このルールの例外である（Ｓａｎｃｈｅｚ―Ｂｅｒｒｏｎｄｏ、Ｍｅｓａら著、２０１１年；Ｌａｏ―Ｓｉｒｉｅｉｘ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら著、２００５年）。この独自のＲＮＡ／ＤＮＡプライマーゼ活性は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌに固有のものでもあることが示された。
【０１０９】
例３：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、有効なポリメラーゼでもある
真核生物のプライマーゼと異なり、始原細菌のプライマーゼは、それぞれ１ｋｂ未満または７ｋｂ未満のＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖の両方の開始および伸長を実行可能である（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ、Ｇａｌａｌ、Ｐａｎら著、２０１２年；Ｌａｏ―ＳｉｒｉｅｉｘおよびＢｅｌｌ著、２００４年；Ｌａｏ―Ｓｉｒｉｅｉｘ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら著２００５年）。したがって、これらの酵素は、プライマーゼおよびポリメラーゼの両方、または「ＰｒｉｍＰｏｌｓ」である（Ｌｉｐｐｓ、Ｒｏｔｈｅｒら著、２００３年）。このことから、我々は、ＤＮＡ／ＲＮＡのプライマーゼ活性に加えて、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するかどうかを最初に検討した。図４に示すように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、１８デオキシヌクレオチド未満の重合によりテンプレート／プライマー分子を完全に伸長可能であった。マンガンが最も効率的な金属イオンであるが、マグネシウムおよびマンガンは、ＤＮＡ重合のための金属補助因子として有効であった。示したように（図５）、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＲＮＡ重合の場合にはより低い効率であるが、ギャップを有するＤＮＡ分子に対してＤＮＡおよびＲＮＡ合成を行うことも可能であった。さらに、ＲＮＡポリメラーゼ活性は、マンガンに厳格に依存するようであった。また、マンガンは、ギャップを有するＤＮＡに対して鎖変位合成を強力に刺激し、全テンプレート配列の使用を可能とする（＋１８）。
【０１１０】
例３：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、逆転写酵素活性を有する
示したように（図６）、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、反応の効率性がＤＮＡテンプレートで達成されるよりも低いが、相補的ＤＮＡ鎖を合成するのにＲＮＡテンプレートを使用可能であった。さらに、ＲＮＡで指示されたＤＮＡポリメラーゼ活性は、マンガンに厳格に依存するようであった。
【０１１１】
例４：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、忠実にｄＮＴＰｓを取り込む
忠実なＤＮＡ合成を触媒するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの能力を分析するため、四つのｄＮＴＰｓのそれぞれは、マグネシウムまたはマンガンのいずれかの存在下、四つの可能性のあるテンプレートの塩基に対向して取り込まれるべき基質として個々に測定された。図７は、全てのケースにおいて、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、第一の利用可能なテンプレートの塩基によって指示される相補的なヌクレオチドを好ましく挿入したことを示す。マンガンの場合であっても、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＤＮＡ重合中の塩基の識別は、正しい対となるプライマーの末端を伸長する際、正しいワトソン・クリック型塩基対を形成するように強力なバイアスを提供した。また、ｄＮＴＰｓに関するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのアフィニティーを決定するため、複数の測定を行った。単一の代謝回転の条件下、酵素の濃度がＤＮＡの濃度よりも高い場合（図８）は、ｄＮＴＰの取り込みは、酵素が、低濃度で提供された相補的なヌクレオチドを効率的に挿入し得たことから、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌがｄＮＴＰｓに対して高いアフィニティーを有することが明確に明らかとなった。
【０１１２】
例５：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、損傷ＤＮＡに対して高い耐性を有する
損傷ＤＮＡに対するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの耐性を同定するため、タンパク質は、脱塩基部位（ＡＰ）、７，８―ジヒドロ―８―オキソアデニン（８ｏｘｏＡ）、７，８―ジヒドロ―８―オキソグアニン（８ｏｘｏＧ）、チミングリコール（Ｔｇ）、５−ヒドロキシシトシン（５ＯＨＣ）または５−ヒドロキシウラシル（５ＯＨＵ）を有するテンプレートを受けた。図９に示すように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、障害に対向してヌクレオチドを挿入することにより、または障害をスキップすることおよび次のテンプレート塩基（ｄＧ挿入）をコピーすることにより、効果的な障害のバイパスを行い得た。酸化ストレスの結果としてＤＮＡに生じる損傷の最も頻繁な形態のひとつである（ＢｅｒｑｕｉｓｔおよびＷｉｌｓｏｎ著、２０１２年）グアニンの酸化型（８ｏｘｏＧ）は、ｄＡＴＰを導入するｓｙｎコンフォメーションにおいて主としてかつ効果的にパイパスされた。示したように（図１０）、８ｏｘｏＧに対向したｄＡＴＰの挿入の動態は、損傷されていないＴに対向するものと同一であった。
【０１１３】
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌがテンプレート−プライマーおよびギャップを有するＤＮＡ分子に対して合成を行い得たが、ホモポリマーｓｓＤＮＡ分子の３‘末端に種々のヌクレオチドを追加することはできなかった（図１１）が、したがって、このことは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、厳格に、テンプレート依存性酵素であることを示唆する。ＤＮＡ分子は、複数のＤＮＡポリメラーゼファミリーにおける進化的に保存された３’―５‘エキソヌクレアーゼ活性部位を形成する、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩおよびＥｘｏＩＩＩコンセンサスモチーフを欠くことと一致して、分解されなかったから、ｄＮＴＰｓを有しないコントロール反応もまた、３’―５‘エキソヌクレアーゼ活性を欠くことを示した。
【０１１４】
例６：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、効果的な環状ＤＮＡの増幅を行う
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、高度に効果的なＤＮＡプライマーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を組み合わせるが、我々は、酵素が、ＤＮＡの増幅を上手く行い得ると仮説した。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの増幅能を同定するため、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびｄＮＴＰまたはＮＰＴｓは存在するが特定のまたはランダムなプライマーは存在しない条件で、テンプレートＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡを用いた。図１２に示したように、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ（＋／−Ｈｉｓタグ）の両方のバージョンは、ｄＮＴＰｓの存在下で入力したＤＮＡを大量に増幅可能であった。一方、リボヌクレオチドは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌによるＤＮＡ増幅に関して貧弱な基質であるようである。
【０１１５】
例７：補助因子
図１３ａ−ｄに示すように、コバルトおよびカルシウムは、金属イオンを活性化するのに有用ではなかったが、マンガンおよびマグネシウムのみが、増幅反応中、金属補助因子として作用し得た。増幅産物の量は、マンガンの濃度範囲が０．５〜２．５ｍＭおよびマグネシウムが２．５〜１０ｍＭにおいて最大であった。
【０１１６】
我々は、次に、増幅産物を得るのに必要なタンパク質の量を分析した。図１４ａ〜ｂに示したように、増幅反応の収率は、金属補助因子としてマグネシウムまたはマンガンのいずれかを用い、測定に用いたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの量に比例した。同様に、増幅産物の量は、テンプレートＤＮＡの初期量に依存した（図１５参照）。反応時間に反して、示したように（図１６ａおよびｂ）、増幅は、用いられた金属補助因子（Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋）に依存せずに、４時間の見かけの限度に達し、これは、おそらく、ｄＮＴＰの枯渇に起因する。また、ヌクレオチドの濃度の効果についても検討した。図１７はｄＮＴＰ濃度の関数として、量および移動度における増幅産物の変動を示す。各金属補助因子に関する最も良好なｄＮＴＰ濃度は、マンガンを用いた場合の１００μＭからマグネシウムの場合の５００μＭの範囲であった。これより高い濃度では、阻害的であるようであった。増幅産物は（Ｍｇ２＋対Ｍｎ２＋）、各金属に関するｄＮＴＰの効果的な間隔を考慮すると同様の移動度および収率を有した。最終的に、増幅の収率を最大化した各金属補助因子に関する温度を同定するため、インキュベーション温度を分析した。示したように（図１８）、各金属補助因子に関する最適な温度は、マグネシウムを用いた場合には、５５〜６０℃であり、マンガンの場合に５２〜６２℃であった。
【０１１７】
例８：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによる次なる増幅に関するＤＮＡをプライミングし得る
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが効率的で多用途のＤＮＡプライマーゼであるという前提から出発して、我々は、環状ｄｓＤＮＡをランダムにプライミングするというＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの能力を分析した。このプライミングされたＤＮＡは、その結果、Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌによる多重の変位増幅に関して有効であろう。その後、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにより生成した変位された鎖はＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌに関する新たな基質を構成するが、この場合、酵素が新たなプライマーをランダムに合成でき、したがって、Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌに関する新たな開始部位を生成し、かつ対数的ＤＮＡ増幅に達するであろう。図１９に示すように、両酵素の組み合わせは、プラスミドＤＮＡを上手く増幅可能であり、増幅産物の量は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの用量依存的に増加し、ランダムな合成プライマーの追加の必要をなくす。ゲノムＤＮＡを効率的にプライミングするＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの能力を分析するため、本発明者らは、一連の全ゲノム増幅実験を実行した。再び言及するが、本発明者らは、増幅されたＤＮＡをＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの用量依存的に得て、４００ｎＭのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを添加した際に最高に達した。これより多くの量は、検討しなかった。これらの例は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌが、線形ＤＮＡの増幅においても、また環状ＤＮＡの増幅においても、合成ヘキサヌクレオチドを置換し得ることを明確に示す（図２０）。
【０１１８】
例９：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＨｓＰｒｉｍＰｏｌよりもより効率的なポリメラーゼである
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの熱安定性にもかかわらず、酵素は、良好に特徴付けれたＨｓＰｒｉｍＰｏｌと基本的な機能のほとんどを共有する（Ｇａｒｃｉａ  Ｇｏｍｅｚ著、２０１２年参照）。我々は、従って、両酵素が、ランダムプライマーも特定のプライマーも添加せず、比較様式にてＤＮＡを増幅し得るかどうか、知りたかった。従って、プライマーの不存在下、それぞれの最適な反応温度にて、Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡを増幅するのに、かなりの量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＨｓＰｒｉｍＰｏｌを用いた。ＮＴＰｓの存在下、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＨｓＰｒｉｍＰｏｌは、かなりの量の産物を生成したが、逆に、ＤＮＡの存在下では、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＨｓＰｒｉｍＰｏｌよりもさらにより効率的に作用し、ＨｓＰｒｉｍＰｏｌと比較して、かなり大量の増幅ＤＮＡをもたらした（図２２）。
【０１１９】
例１０：キットの化合物としてのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ
長期間実験室でしばしば保存される、特にキットの開発に関して、化合物の安定性は、常に重要な特性である。この論点を解決するため、単離ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、保存バッファー中で−２０℃で複数ヶ月保存可能である。本明細書において述べたＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのプライマーゼおよびポリメラーゼの活性を検討した、頻繁に繰り返した実験において（例えば、図２１参照）、測定された活性に有意な減少は示されない。
【０１２０】
例１１：異なるポリメラーゼと組み合わせた、プライマーゼとしてのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの使用
本発明の一つの実施形態は、ＤＮＡ増幅に関するその他のポリメラーゼとともにプライマーゼとしてのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌの使用である。現在、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌおよびランダムオリゴヌクレオチド（ＭＤＡ、多重変位増幅）を用いて好ましく行われる（Ｓｐｉｔ、Ｌｅ  Ｃａｉｇｎｅｃら著、２００６年；Ｓｐｉｔｓ、Ｌｅ  Ｃａｉｇｎｅｃら著、２００６年；ＳｉｌａｎｄｅｒおよびＳａａｒｅｌａ著、２００８年；Ａｌｓｍａｄｉ、Ａｌｋａｙａｌら著、２００９年）。ＷＧＡは、線形ゲノムＤＮＡに対して実行される、一種の鎖変位増幅である。他の種の鎖変位増幅は、共有的に閉鎖した環状ＤＮＡの増幅に使用される、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。再び言及するが、Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌは、ＲＮＡ法に関して好ましい酵素である。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、図１９および２０に示す増幅方法であるＷＧＡおよびＲＣＡの両方において、オリゴヌクレオチドを置き換え得る。アレストされた複製フォークの再開としての提唱された生来の役割に起因して、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、従来のＰＣＲ法において共同的な方法で有益に使用されるであろう。
【０１２１】
例１２：ＤＮＡラベリング
一つの実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、標識されたヌクレオチドを相補的なＤＮＡ鎖に取り込むことを有する核酸の複製または増幅のための方法に用いられる。たとえば、蛍光部分を有するヌクレオチド（図２３）または放射性ヌクレオチドは、測定における検出のためのＤＮＡ分子を標識するのに使用され得る。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、その高い加工性および取り込まれるべきヌクレオチドに関する高い耐性のため、良好に適合されている。斯かる標識化は、たとえば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイなどのＤＮＡアレイ用のサンプル調製にも用いられ得る。
【０１２２】
例１３：ＤＮＡの突然変異化
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、テンプレート鎖を重度に酸化しＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌで親ＤＮＡを増幅させることにより、ＤＮＡを突然変異するのに使用され得る。異なるヌクレオチドを取り込むことにより（図７および８）、ランダム変異導入が達成される。
【０１２３】
例１４：ＤＮＡおよびＲＮＡの増幅
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いる一つに同様の適用例において、プライマーを用いまたは用いずにＤＮＡを増幅するのに、高い加工性に起因して、用いられ得る。さらに、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしての機能において、ＲＮＡを増幅するのに用いられ得る。このことは、例えば、ＣＮＳにおける神経細胞に由来する、または腫瘍学研究における細胞に由来するなど、単一細胞または少数の細胞の発現プロファイルを得ようとする場合に、特に必要とされている。今までのところ、ＲＮＡの増幅プロトコルは、多くの工程を有する手技に依拠している（Ｒｏｓｓｎｅｒ、Ｈｉｒｒｌｉｎｇｅｒら著、２００６年；Ｎｅｗｒｚｅｌｌａ、Ｐａｈｌａｖａｎら著、２００７年）。ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌに基づくＲＮＡ増幅は、均一でバイアスを有さない増幅産物を生成するであろう。追加の利点は、関連するＲＮＡｓｅｓを阻害するであろう、増幅が行われ得る間の高い温度であり、また、二次構造を溶解することである。
【０１２４】
例１５：非特異なバックグラウンドＤＮＡの抑制
驚くべきことに、本発明者らは、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの両酵素の組み合わせは、試験したインキュベーション時間（１６時間以下）のいずれにおいても、外的に添加したテンプレートＤＮＡ分子の不存在下で（図２６ａ）、ＤＮＡ増幅を行わない。斯かる条件において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのプライマーゼ活性は、未変性のＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）の存在に依存するようである。
【０１２５】
従って、さらなる実施形態において、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせは、等温性ＭＤＡにおいて、汚染ＤＮＡの増幅を回避するのに用いられる。斯かる汚染ＤＮＡは、酵素の調製および試薬に由来する核酸材料を回避するのが困難な場合にしばしば見られる。
【０１２６】
例１６：ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９ポリメラーゼの組み合わせにより増幅されたＤＮＡプローブの全ゲノム配列決定
ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびＰｈｉ２９―ｐｏｌの組み合わせ（Ｔｔｈ／Ｐｈｉ）を用いた共同的な増幅は、最も少量のＤＮＡの増幅を可能とし（例１４）、これを、限定的な量のテンプレートＤＮＡから全ての目的のＤＮＡプローブの生成に関して理想的な方法とする。従来のＭＤＡが、標的のＤＮＡおよびランダムプライマーの組成に依存して、主としてコピー数のバイアスであるバイアスを招来させるが（Ａｌｓｍａｄｉ著、２００９年）、我々は、ＤＮＡのＴｔｈ／Ｐｈｉ増幅がバイアスの少ない増幅を可能にするかどうかを検討した。
【０１２７】
従って、また、Ｔｔｈ／Ｐｈｉで増幅されたＤＮＡの量を同定するため、我々は、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国）配列決定機を用いて、非増幅酵母（ＢＹ７４７１株）ＤＮＡ（ＮＡ）、増幅（ランダムにプライミングされた）酵母ＤＮＡ（ＲＰ）および（種々の量のＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ：１００ｎｇ、２００ｎｇおよび４００ｎｇを用いて）Ｔｔｈ／Ｐｈｉにより増幅されたＤＮＡを配列決定した。
【０１２８】
塩基の量の値の評価は、ＦａｓｔＸ―ｔｏｏｌｋｉｔ（ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ）を用いて行われたが、これは、試験した全てのサンプルには有意な差異は明らかにされず、従って、Ｔｔｈ／Ｐｈｉの増幅方法が、次世代の配列決定（ＮＧＳ）プローブの調製に良好に適合されていると結論付け得る。
【０１２９】
配列ライブラリーの調製に由来する変化量を区別するため、等量（１４０万）で。ランダムに選択された、高品質（Ｐｈｒｅｄ値＞２０；Ｅｗｉｎｇ  Ｂ．ら著。１９９８年）の対となった末端配列のリード（２８０万の単一末端のリード）を、全てのさらなる分析工程のため、用いた。
【０１３０】
ＮＧＳデータデットをさらに分析するため、ソフトウェア「ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ」バージョン７．０（ＣＬＣ  Ｂｉｏ；デンマーク）を用いた。このソフトウェアは、ＮＧＳ配列分析に特徴に富んだ統合ソフトウェアソリューションであって、参照ゲノムに対して全てのリードをマッピングすることを可能にするだけでなく、（このマッピングに基づいて）オーバーリプリゼントおよびアンダーリプリゼントのゲノム領域を同定することを可能にする。全てのサンプルについてこのマッピング分析を行うことで、本発明者らは、ＲＰリードの８３．９２％のみが参照に対してマッピングされた一方、９０％以上の全てのＮＡ（９０．４８％）およびＴｔｈ／Ｐｈｉリード（９１．９２％および９１．９０％）が、参照に対してマッピングされたことを見出した（図２８）。Ｔｔｈ／ＰｈｉとＲＰとのこの差異は、染色体レベルに対するオーバーリプリゼントおよびアンダーリプリゼントの領域における有意差（ｐ＝０．０００２９）によっても実証された。
【０１３１】
増幅されたＤＮＡの場合、オーバーリプリゼントおよびアンダーリプリゼントの領域の全数は、配列決定法および増幅法の両方によって提示された全体的なバイアスの値である。対照的に、ＮＡサンプルについて。オーバーリプリゼントおよびアンダーリプリゼントの領域の全数は、配列決定法に依存するのみである。
【０１３２】
ＮＡに対してＲＰおよびＮＡに対してＴｔｈ／Ｐｈｉを比較する場合の相対的な差異は、従って、増幅法によってのみ提示されるバイアスの値である。従って、Ｔｔｈ／Ｐｈｉ増幅は、ＲＰ増幅よりも１７％少ないバイアスを示しており、このことは、ＲＰ増幅に対するＴｔｈ／Ｐｈｉ増幅の明確な有益性を示すものである（図２９）。
【０１３３】
参考文献
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【０１３４】
本発明は、以下の項目１から２３にさらに関する。
項目１．  核酸の複製、増幅または配列決定のための方法であって：
ａ）ｉ）ポリメラーゼ、または
ｉｉ）ポリメラーゼコンジュゲート
を用意する工程であって、前記ポリメラーゼまたは前記ポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を有する配列を有し、かつポリメラーゼおよびプライマーゼ活性を有するものである工程と、
ｂ）テンプレート核酸を用意する工程と、
ｃ）核酸の相補鎖を取り込むための、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド誘導体を用意する工程と、
ｄ）適切なバッファーを用意する工程と、
ｅ）場合により、一つ以上のプライマーを用意する工程と、そして
ｆ）適切な時間、場合により高温で、好ましくは４０℃以上の温度で、最も好ましくは５０℃超の温度で、工程ａ）乃至ｅ）の材料を接触させる工程
とを含んでなる、方法。
項目２．  ａ）ｉ）のポリメラーゼ、またはａ）ｉｉ）のポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する配列を有するものである、項目１に記載の方法。
項目３．  ａ）ｉ）のポリメラーゼ、またはａ）ｉｉ）のポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列を有するものである、項目１に記載の方法。
項目４．  ａ）ｉ）のポリメラーゼ、またはａ）ｉｉ）のポリメラーゼコンジュゲートのポリメラーゼ残基が、配列番号１の配列を有するものである、項目１に記載の方法。
項目５．  工程ｂ）の核酸が、損傷を有するものである、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項目６．  前記の損傷を有する核酸が：
ａ）一本鎖または二本鎖の破損を有するか、および／または
ｂ）好ましくは、酸化ヌクレオチドおよび／または脱アミノ化ヌクレオチドからなる群から選択され、最も好ましくは７，８−デヒドロ−８−オキソデアニン、７，８−デヒドロ―８―オキソグアニン、チミングリコール、５―ヒドロキシシトシン５−ヒドロキシウラシルからなる群から選択される、化学的に修飾を受けたヌクレオチドを有すること、および／または
ｃ）ホルムアルデヒド、またはパラホルムアルデヒドで包埋された組織に由来すること
を特徴とする、項目５に記載の方法。
項目７．  工程ｃ）のヌクレオチド誘導体の少なくとも一種が、化学的に修飾を受けたヌクレオチドである、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
項目８．  工程ｃ）のヌクレオチド誘導体が：
ａ）酸化ヌクレオチド誘導体、および／または
ｂ）脱アミノ化ヌクレオチド、
ｃ）少なくとも一つの立体的に嵩高い側基を含む誘導体
からなる群から選択されたヌクレオチド誘導体の少なくとも一種からなる、項目７に記載の方法。
項目９．  工程ｂ）のテンプレート核酸は、１００未満の細胞、好ましくは単一の細胞に由来する、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０．  工程ｅ）にはプライマーが用意されない、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１．  工程ｂ）の核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２．  工程ｂ）の核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１３．  ＲＮＡの逆転写を含んでなる、項目１２に記載の方法。
項目１４．  第二のポリメラーゼを含んでなる、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
項目１５．  前記の第二のポリメラーゼが、真核生物ファミリーＡのポリメラーゼ、真核生物ファミリーＢのポリメラーゼからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
項目１６．  前記の第二のポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
項目１７．  前記の第二のポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼまたはそのコンジュゲートである、項目１４に記載の方法。
項目１８．  項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法に用いられる、項目１〜４のいずれか一項に定義したポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲート。
項目１９．  改変を検出するための方法であって、特に、ＤＮＡテンプレートにおける酸化工程の生成物を検出するための方法であって：
ａ）項目１〜４のいずれか一項に記載の多重の配列の読み取りを実行する工程と、
ｂ）工程ａの配列のリードの全体に渡って各ヌクレオチドの位置に関して取り込まれたヌクレオチドの全割合を計算する工程と、そして
ｃ）取り込まれたヌクレオチドの全割合を、テンプレートにおけるＤＮＡ改変の元の性質と関連づける工程
とを含んでなる、方法。
項目２０．  ランダム変異のための方法であって、
ａ）核酸を酸化性化合物と接触させる工程であって、前記接触によって、核酸の塩基を酸化させる、工程、および
ｂ）酸化された核酸を、項目１〜４のいずれか一項に定義したポリメラーゼまたはポリメラーゼコンジュゲートを用いて複製させる工程
を含んでなる、方法。
項目２１．  ２０ヶ月を超えて適切な条件下で保存可能である、ＤＮＡ分子を増幅するためのキットであって：
ａ）項目１〜４に記載のポリメラーゼを有する第一の容器と、
ｂ）一つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を有する第二の容器と
を備えてなる、キット。
項目２２．  ２０ヶ月を超えて適切な条件下で保存可能である、ＲＮＡ分子を増幅するためのキットであって：
ａ）項目１〜４に記載のポリメラーゼを有する第一の容器と、
ｂ）一つ以上のリボヌクレオシド三リン酸を有する第二の容器と
を備えてなる、キット。
項目２３．  ２０ヶ月を超えて適切な条件下で保存可能である、核酸分子を配列決定するためのキットであって：
ａ）項目１〜４に記載のポリメラーゼを有する第一の容器と、
ｂ）一つ以上のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を有する第二の容器と、
ｃ）一つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を有する第三の容器と
をそなえてなる、キット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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