(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、
固体支持体に結合した核酸を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で、ヌクレオチドアナログに曝す工程、
を包含し、ここで該ヌクレオチドアナログは、非改変３’ヒドロキシル基とアミノ酸を含む切断可能な末端基とを含み、該切断可能な末端基が、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性をブロックするが、切断の際にヌクレオチジルトランスフェラーゼのヌクレオチド基質を生じさせる、方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチドアナログは、リボース糖もしくはデオキシリボース糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド基質は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５と少なくとも９０％同一であるタンパク質配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは生物に由来し、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記切断可能な末端基は、第２のヌクレオチドアナログの組み込みを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記切断可能な末端基は、荷電した部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記価電した部分は、負に荷電している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化３】
0006448097.tif 000022
【化４】
0006448097.tif 000023
を有し、ここでｎ＝２もしくは３であり、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、もしくは−ＣＨ２−である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化５】
0006448097.tif 000024
【化６】
0006448097.tif 000025
を有し、ここでｎ＝２もしくは３であり、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、もしくは−ＣＨ２−である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化７】
0006448097.tif 000026
【化８】
0006448097.tif 000027
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化９】
0006448097.tif 000028
【化１０】
0006448097.tif 000029
【化１１】
0006448097.tif 000030
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断可能な末端基は、化学的に切断可能であるか、光分解的に切断可能であるか、電気化学的に切断可能であるか、もしくは生物学的に切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体支持体に結合した核酸は、６．５〜８．５の間のｐＨを有する水性溶液の存在下で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記固体支持体に結合した核酸は、水性溶液の存在下で３５〜３９℃の間の温度で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体は、ビーズ、ウェル、もしくはペグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸は、１本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記切断可能な末端基は、前記ヌクレオチドアナログから切断された場合に、環式副生成物を形成する部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
天然のヌクレオチドを生成するために、前記切断可能な末端基を切断する工程；および
該天然のヌクレオチドを、トランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で第２のヌクレオチドアナログに曝す工程であって、ここで該第２のヌクレオチドアナログは、糖環および切断可能な末端基上に３’ヒドロキシル基を含む、工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を含む水性溶液を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドを合成するためのシステムであって、該システムは、
核酸が結合している固体支持体；
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素；
第１のヌクレオチドであって、遊離３’ヒドロキシル基と切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドに結合した、アミノ酸を含むブロッキング基とを含む、第１のヌクレオチド、
を含み、
ここで第２のヌクレオチドは、該ブロッキング基が該切断可能なリンカーによって除去されるまで、該ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって該第１のヌクレオチドの３’位を介して該第１のヌクレオチドに連結することができず、
ここで該システムは、核酸テンプレートを含まない、システム。
【請求項２２】
前記第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を独立して含む、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１０月１７日に出願された米国特許出願第１４／０５６，６８７号、２０１３年４月２日に出願された米国仮出願第６１／８０７，３２７号、および２０１３年１０月１５日に出願された米国仮出願第６１／８９１，１６２号に基づく優先権を主張し、その全ては、それらの全体が参照によって援用される。
【０００２】
本発明は、所望の配列を有し、テンプレートの必要がないポリヌクレオチドを（デノボ）合成するための方法および装置に関する。よって、本発明は、研究、遺伝子工学、および遺伝子治療のために、種々の配列および種々の長さのポリヌクレオチドのライブラリーを作製する能力を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
遺伝子工学は、遺伝物質の内容物を決定するためのツール、ならびに所望の遺伝物質を構築するためのツールを要する。上記遺伝物質の内容物を決定するためのツールは、約１日で、＄１，０００未満で全ヒトゲノムを配列決定することを可能にした（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ：  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｉｏｎ  ＰｒｏｔｏｎＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，  Ｊａｎｕａｒｙ  １０，  ２０１２を参照のこと）。対照的に、所望の遺伝物質を構築するためのツール（例えば、デノボＤＮＡ合成）は、同じ速度では改善されてこなかった。評価基準としては、過去２５年間にわたって、デノボ低分子核酸合成のコスト（１塩基あたり）は、１／１０に低下したが、核酸配列決定のコスト（１塩基あたり）は、１／１０，０００，０００超に低下した。ＤＮＡ合成における進歩のなさは、いまや、トランスレーショナルゲノミクス（すなわち、これによって、個々の配列バリエーションの役割が決定され、治療処置を開発するために使用される）の速度を制限している。
【０００４】
現在、大部分の新規核酸配列は、３０年よりもっと前に開発された固相ホスホルアミダイト技術を使用して合成される。この技術は、天然の（もしくは非天然の）核酸塩基に相当するホスホルアミダイト試薬から構成される配列の逐次的な脱保護および合成を含む。しかし、ホスホルアミダイト核酸合成は、長さが２００塩基対（ｂｐ）より大きな核酸は高い破損率および副反応率を経験するという点で、長さが制限される。さらに、ホスホルアミダイト合成は、毒性の副生成物を生じさせ、この廃棄物の廃棄は、核酸合成機の有効性を制限し、請負のオリゴ生成のコストを増大させる（例年のオリゴヌクレオチド合成の需要が、３００，０００ガロン超の有害化学廃棄物（アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフラン、およびピリジンが挙げられる）の原因になっていると予測される。ＬｅＰｒｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．  ３８（８），  ｐ．２５２２−２５４０，  （２０１０）（その全体において本明細書に参照により援用される）を参照のこと）。従って、オリゴヌクレオチド合成のためのより効率的かつコスト効率のよい方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ：  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｉｏｎ  ＰｒｏｔｏｎＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，  Ｊａｎｕａｒｙ  １０，  ２０１２
【非特許文献２】ＬｅＰｒｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．  ３８（８），  ｐ．２５２２−２５４０，  （２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドのより迅速でかつより長いデノボ合成を提供する。よって、本発明は、カスタム核酸合成のコスト全体を劇的に低下させる。本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、未改変３’ヒドロキシルおよび切断可能な末端基を有するヌクレオチドアナログを組み込むことによる、ポリヌクレオチドのテンプレート非依存的合成に関する。上記末端基が原因で、合成は、新たな塩基の各々が付加されると一時停止し、すると末端基が切断され、天然に存在するヌクレオチドに本質的に同一であるポリヌクレオチド（すなわち、さらなるヌクレオチド組み込みのための基質として酵素によって認識される）を残す。
【０００７】
本発明はさらに、カスタムポリヌクレオチドの生成のために本発明の方法を利用する装置を包含する。本発明の装置は、水性の条件およびヌクレオチドアナログの複数の供給源を提供する１つまたは複数のバイオリアクターを備える。上記バイオリアクターは、例えば、リザーバー、フローセル、もしくはマルチウェルプレートであり得る。固体支持体から開始して、上記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、またはテンプレート指示なしでＤＮＡ鎖もしくはＲＮＡ鎖を伸長する任意の他の酵素）の天然の活性を介して、連続的なヌクレオチドの付加によって、上記リアクターの中で成長する。上記末端基の切断の際に、天然のポリヌクレオチドは、上記固体支持体上で曝される。上記配列が完全になると、上記支持体は、天然に見出されるものと本質的に等価なポリヌクレオチドを残して切り離される。いくつかの実施形態において、上記装置は、ヌクレオチド付加後にヌクレオチドアナログ溶液を回収し、その後のヌクレオチド付加のために溶液を再使用することによって、上記ヌクレオチドアナログ溶液を再利用するように設計される。従って、生成される廃棄物は少なく、１塩基あたりの全体的なコストは、最先端の方法と比較して低下する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、
固体支持体に結合した核酸を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で、ヌクレオチドアナログに曝す工程、
を包含し、ここで該ヌクレオチドアナログは、非改変３’ヒドロキシルとヌクレオチジルトランスフェラーゼをブロックするが、切断の際にヌクレオチジルトランスフェラーゼのヌクレオチド基質を生じさせる切断可能な末端基とを含む、方法。
（項目２）
前記ヌクレオチドアナログは、リボース糖もしくはデオキシリボース糖を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヌクレオチド基質は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５と少なくとも約９０％同一であるタンパク質配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは生物に由来し、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記切断可能な末端基は、第２のヌクレオチドアナログの組み込みを阻害する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記切断可能な末端基は、荷電した部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記価電した部分は、負に荷電している、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記切断可能な末端基は、アミノ酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化３】
0006448097.tif 000002
【化４】
0006448097.tif 000003
を有し、ここでｎ＝２もしくは３であり、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、もしくは−ＣＨ２−である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化５】
0006448097.tif 000004
【化６】
0006448097.tif 000005
を有し、ここでｎ＝２もしくは３であり、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、もしくは−ＣＨ２−である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化７】
0006448097.tif 000006
【化８】
0006448097.tif 000007
を有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造：
【化９】
0006448097.tif 000008
【化１０】
0006448097.tif 000009
【化１１】
0006448097.tif 000010
を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記切断可能な末端基は、化学的に切断可能であるか、光分解的に切断可能であるか、電気化学的に切断可能であるか、もしくは生物学的に切断可能である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記固体支持体に結合した核酸は、約６．５〜８．５の間のｐＨを有する水性溶液の存在下で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記固体支持体に結合した核酸は、水性溶液の存在下で約３５〜３９℃の間の温度で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記固体支持体は、ビーズ、ウェル、もしくはペグである、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸は、１本鎖である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記切断可能な末端基は、前記ヌクレオチドアナログから切断された場合に、環式副生成物を形成する部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
天然のヌクレオチドを生成するために、前記切断可能な末端基を切断する工程；および
該天然のヌクレオチドを、トランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で第２のヌクレオチドアナログに曝す工程であって、ここで該第２のヌクレオチドアナログは、糖環および切断可能な末端基上に３’ヒドロキシルを含む、工程、
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を含む水性溶液を提供する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２２）
オリゴヌクレオチドを合成するためのシステムであって、該システムは、
核酸が結合している固体支持体；
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素；
第１のヌクレオチドであって、遊離３’ヒドロキシルと切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドに結合したブロッキング基とを含む、第１のヌクレオチド、
を含み、
ここで第２のヌクレオチドは、該ブロッキング基が該切断可能なリンカーによって除去されるまで、該ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって該第１のヌクレオチドの３’位を介して該第１のヌクレオチドに連結することができず、
ここで該システムは、核酸テンプレートを含まない、システム。
（項目２３）
前記第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を独立して含む、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
オリゴヌクレオチド合成のための方法であって、該方法は、
核酸テンプレートの非存在下で複数の結合した核酸を含む固体支持体を提供する工程；
該基質を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ならびに遊離３’ヒドロキシル基および切断可能なリンカーを介して結合しているブロッキング基を有するヌクレオチドアナログに、ただ１個のヌクレオチドアナログが該複数のうちの少なくとも１個のメンバーに付加されるような条件下で曝す工程；
該切断可能なリンカーを切断する工程；ならびに
該曝す工程を反復する工程、
を包含する方法。
（項目２５）
前記条件は、約６．５〜８．５の間のｐＨを有する水性溶液を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記水性溶液は、約３５〜３９℃の間の温度にある、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
遊離３’ヒドロキシル基および切断可能なリンカーを介して結合しているブロッキング基を含む前記ヌクレオチドアナログは、溶液として提供される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記溶液を前記基質から除去する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
オリゴヌクレオチド合成のための方法であって、該方法は、核酸テンプレートを含まない支持体に結合した核酸を、以下：
ヌクレオチドアナログであって、切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドアナログに結合した部分を含み、遊離３’ヒドロキシルを有する、ヌクレオチドアナログ、および
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、
に曝す工程、
それによって、該ヌクレオチドアナログを、該固体支持体に結合した核酸に組み込む工程；
該ヌクレオチドアナログを組み込んだ際に該固体支持体を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチドアナログを除去する工程；
該切断可能なリンカーを切断する工程；ならびに
該曝す工程、洗浄する工程、および切断する工程を、オリゴヌクレオチドを合成するために反復する工程、
を包含する方法。
（項目３０）
前記ヌクレオチドアナログは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、同じ溶液中に存在し、該溶液は、前記曝す工程、洗浄する工程、および切断する工程をその後に反復する工程の間に、実質的に再利用される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
水性環境において所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するための装置であって、該装置は、
固体支持体と流体連絡状態にある、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）試薬溶液および酵素溶液の第１の、第２の、第３のおよび第４の供給源であって、ここで該第１の、第２の、第３のおよび第４の供給源の中の該試薬溶液は、ＮＴＰ−アデニン、ＮＴＰ−グアニン、ＮＴＰ−シトシン、ＮＴＰ−チミン、および上記のうちのいずれかの改変物から選択される、第１の、第２の、第３のおよび第４の供給源、を備える装置。
（項目３３）
前記ヌクレオチドトリホスフェートのうちの少なくとも一部は、改変されていない３’ヒドロキシルおよび切断の際に天然のヌクレオチドを生じさせる切断可能な末端基を含む、項目３２に記載の装置。
（項目３４）
前記ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである、項目３２に記載の装置。
（項目３５）
前記固体支持体と流体連絡状態にある洗浄リザーバーをさらに備える、項目３２に記載の装置。
（項目３６）
前記固体支持体と流体連絡状態にある水性脱ブロック化薬剤の供給源をさらに備える、項目３２に記載の装置。
（項目３７）
前記ヌクレオチドトリホスフェート試薬は、前記固体支持体へと流される、項目３２に記載の装置。
（項目３８）
前記試薬溶液はまた、前記固体支持体から流し出される、項目３７に記載の装置。
（項目３９）
前記試薬溶液は、前記固体支持体から流し出された後に、実質的に再使用される、項目３８に記載の装置。
（項目４０）
前記固体支持体は、ヌクレオチドトリホスフェート試薬溶液／酵素溶液の供給源へと移動させられる、項目３２に記載の装置。
（項目４１）
前記固体支持体を移動するように構成された、プログラム可能なマニピュレーターをさらに備える、項目４０に記載の装置。
（項目４２）
ヌクレオチドトリホスフェート試薬／酵素の供給源を保持するためのウェルをさらに備える、項目３２に記載の装置。
【０００８】
本発明の他の局面は、以下の図面および詳細な説明を考慮すれば当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｎ−４位において連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）アナログの部類を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、「天然の」ｄＣＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図１ＡのｄＣＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｎ−６位において連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）アナログの部類を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、「天然の」ｄＡＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図２ＡのｄＡＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｎ−２位において連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）アナログの部類を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、「天然の」ｄＧＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図３ＡのｄＧＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｎ−３位において連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）アナログの部類を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、「天然の」ｄＴＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図４ＡのｄＴＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｎ−３位において連結された切断可能なターミネーターを有するデオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）アナログの部類を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｄＵＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図５ＡのｄＵＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図６】図６は、ブロックしているＡｓｐ−Ａｓｐ分子とデオキシシチジンのＮ−４位にとを接続するシュタウディンガーリンカーを有する例示的なデオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）アナログ、ならびにｄＣＴＰおよび脱離基を得るための水性条件下でのシュタウディンガーリンカーのその後の切断を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｎ−４位において連結された切断可能なターミネーターを有するシチジントリホスフェート（ｒＣＴＰ）アナログの部類を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、「天然の」ｒＣＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図７ＡのｒＣＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｎ−６位において連結された切断可能なターミネーターを有するアデノシントリホスフェート（ｒＡＴＰ）アナログの部類を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、「天然の」ｒＡＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図８ＡのｒＡＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｎ−２位において連結された切断可能なターミネーターを有するグアノシントリホスフェート（ｒＧＴＰ）アナログの部類を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、「天然の」ｒＧＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図９ＡのｒＧＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｎ−３位において連結された切断可能なターミネーターを有するチミジントリホスフェート（ｒＴＴＰ）アナログの部類を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、「天然の」ｒＴＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図１０ＡのｒＴＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｎ−３位において連結された切断可能なターミネーターを有するウリジントリホスフェート（ｒＵＴＰ）アナログの部類を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｒＵＴＰおよび環式脱離分子を得るための、図１１ＡのｒＵＴＰアナログからの切断可能なターミネーターの切断を示す。
【図１２】図１２は、ブロックしているＡｓｐ−Ａｓｐ分子とシチジンのＮ−４位とを接続するシュタウディンガーリンカーを有する例示的なシチジントリホスフェート（ｒＣＴＰ）アナログ、およびｒＣＴＰおよび脱離基を得るための水性条件下でのシュタウディンガーリンカーのその後の切断を示す。
【図１３】図１３は、（ａ）切断可能なターミネーター、ｄＮ＊ＴＰ−ＯＨを含むヌクレオチドトリホスフェートアナログの組み込み、および（ｂ）末端ブロッキング基（＊によって示される）の除去（従って、次のｄＮ＊ＴＰ−ＯＨが組み込まれることを可能にする）（ここでＮ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴ）を含む、例示的な末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性ポリヌクレオチド合成サイクルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
本発明は、酵素および核酸アナログを使用して、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を合成するための改善された方法を提供する。開示される方法を使用すると、ポリヌクレオチドの特定の配列が、１塩基ずつ水性環境において、核酸テンプレートを使用せずにデノボ合成され得る。さらに、上記ヌクレオチドアナログは、非改変３’ヒドロキシル（すなわち、「天然の」デオキシリボースおよびリボース分子において見出されるとおり）を有するので、上記アナログは、切断可能なブロッキング基が上記塩基から除去される場合、「天然の」ヌクレオチドを生じる。他のヌクレオチドアナログもまた使用され得る（例えば、自己削除リンカー（ｓｅｌｆ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ）、または改変されたホスフェート基を有するヌクレオチドが挙げられる）。大部分の場合、上記ブロッキング基は、実質的なさらなる分子を後に残さないように設計される、すなわち、上記酵素によって「天然の」ヌクレオチドとして認識される「傷なしの（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」ヌクレオチドを後に残すように設計される。従って、上記合成の結果として、その最後のブロッキング基を除去すると、その合成されたポリヌクレオチドは、同じ配列を有する天然に存在するポリヌクレオチドと化学的にかつ構造的に等価である。上記合成ポリヌクレオチドは、従って、その合成されたポリヌクレオチドが生化学的経路もしくは代謝を妨害するという懸念なく、生体系に組み込まれ得る。
【００１１】
本発明のプロセスおよびアナログは、有用なオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチド、特に、長いオリゴヌクレオチド（＜５０００ｎｔ）のテンプレートに拠らない酵素による合成のために使用され得る。生成物は、使用されるイニシエーターに依存して、１本鎖もしくは部分的に２本鎖であり得る。長いオリゴヌクレオチドの合成は、高効率の組み込みおよび高効率の可逆的ターミネーター除去を要する。上記固体支持体に結合するイニシエーターは、ユーザー定義配列の短い小片もしくはユーザー定義１本鎖生成物が除去されるユニバーサルイニシエーターのいずれかである短い１本鎖ＤＮＡ配列からなる。
【００１２】
一局面において、開示される方法は、市販のヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））を使用して、１工程ずつの様式でヌクレオチドアナログからポリヌクレオチドを合成する。上記ヌクレオチドアナログは、以下の形態のものである：
ＮＴＰ−リンカー−インヒビター
ここでＮＴＰは、ヌクレオチドトリホスフェート（すなわち、ｄＮＴＰもしくはｒＮＴＰ）であり、上記リンカーは、塩基のピリジンもしくはピリミジンの間の切断可能なリンカーであり、上記インヒビターは、上記酵素がその後のヌクレオチドを組み込むのを防止する基である。各工程において、新たなヌクレオチドアナログは、その成長しつつあるポリヌクレオチド鎖へと組み込まれ、すると、上記酵素は、上記インヒビター基によって、さらなるヌクレオチドが付加されることからブロックされる。上記酵素がいったん停止すると、過剰なヌクレオチドアナログが、上記成長しつつある鎖から除去され得、上記インヒビターは、上記ＮＴＰから切断され得、新たなヌクレオチドアナログが、次のヌクレオチドを上記鎖に付加するために導入され得る。上記工程を連続して反復することによって、所望の長さおよび配列のヌクレオチド配列を迅速に構築することが可能である。ポリヌクレオチド合成のためにヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用することの利点としては、以下が挙げられる：１）テンプレート非依存的重合において１本鎖（ｓｓ）開始プライマーを使用する３’−伸長活性、２）数千ものヌクレオチドの付加を生じさせることができる、高効率の様式でプライマーを伸長する能力、および３）有効な基質として広く種々の改変ＮＴＰおよび置換ＮＴＰの受容。さらに、本発明は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの基質であるイニシエーター配列を利用し得る。上記イニシエーターは、固体支持体に結合し、上記酵素の結合部位として働く。上記イニシエーターは、好ましくは、上記酵素のユニバーサルイニシエーター（例えば、ホモポリマー配列）であり、固体支持体上で再利用可能であり、形成されるオリゴヌクレオチドは、上記イニシエーターから切断可能である。
【００１３】
本発明の方法は、合成核酸、例えば、ホスホルアミダイト合成ＤＮＡオリゴを現在使用する種々の適用に十分適合する。例えば、本発明の方法で合成されるポリヌクレオチドは、核酸増幅のためのプライマー、特異的マーカーの検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして、および遺伝子工学のためのプラスミドへの組み込みのために使用され得る。しかし、開示される方法は、ヌクレオチドのより長い合成鎖をより迅速にかつ水性環境で生成するので、開示される方法はまた、ハイスループット適用（例えば、細胞アッセイにおける遺伝的バリエーションの発現に関するスクリーニング、および合成生物学）に役立つ。さらに、本発明の方法は、次世代の適用（例えば、合成読み取り／書き込みメモリとしてＤＮＡを使用する、またはＤＮＡから完全に（もしくは部分的に）合成される肉眼で見える材料を作る）のために必要とされる機能性を提供する。
【００１４】
本発明および本明細書で記載されるシステムは、ポリヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む）の合成を提供する。「天然の」ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）のための合成経路は、一般的な核酸塩基（例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ））の状況で記載される一方で、本発明の方法が、いわゆる「非天然の」ヌクレオチド（ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシドおよび５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシド、αホスホロチオレート、ホスホロチオエートヌクレオチドトリホスフェート、または他の望ましい特性（例えば、蛍光）を有するプリンもしくはピリミジンコンジュゲート）を組み込むヌクレオチドを含む）に適用され得ることは、理解されるべきである。プリンおよびピリミジン塩基の他の例としては、以下が挙げられる：ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［ｌ，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；ならびに１，３，５トリアジン。いくつかの場合、それは、非反応性であるが、ほぼ等価な塩基、すなわち、他のタンパク質（すなわち、転写酵素）と反応しない塩基を有するヌクレオチド配列を生成し、従って、配列情報の影響が、上記塩基の構造的効果から切り離されることを可能にするために有用であり得る。
【００１５】
（アナログ）
本発明は、水性環境においてポリヌクレオチドを合成するために、式、ＮＴＰ−リンカー−インヒビターを有するヌクレオチドアナログを提供する。形態、ＮＴＰ−リンカー−インヒビターというアナログに関して、ＮＴＰは、任意のヌクレオチドトリホスフェートであり得る：例えば、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、チミジントリホスフェート（ＴＴＰ）、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）、ヌクレオチドトリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、もしくはデオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）。
【００１６】
上記リンカーは、上記インヒビターを上記ＮＴＰに連結するいずれかの分子部分であり得、切断され得る（例えば、化学的に切断され得るか、電気化学的に切断され得るか、酵素により切断され得るか、または光分解により切断され得る）。例えば、上記リンカーは、周りの環境のｐＨを調節することによって切断され得る。上記リンカーはまた、所定の温度で活性化されるが、別の温度では不活性化される酵素によって切断され得る。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【００１７】
上記リンカーは、例えば、シトシンのＮ４、チミンのＮ３もしくはＯ４、グアニンのＮ２もしくはＮ３、およびアデニンのＮ６、またはウラシルのＮ３もしくはＯ４において結合し得る。なぜなら炭素での結合は、上記ポリメラーゼ阻害基の除去後に、残りの傷の存在を生じさせるからである。上記リンカーは、代表的には、少なくとも約１０Å長、例えば、少なくとも約２０Å長、例えば、少なくとも約２５Å長の程度であり、従って、上記インヒビターを、ピリジンもしくはピリミジンから十分に遠く離れさせ、上記酵素が上記ＮＴＰを上記ポリヌクレオチド鎖に、結合した糖骨格を介して結合させることを可能にする。いくつかの実施形態において、上記切断可能なリンカーが、成長しつつあるヌクレオチド鎖に対して特に非反応性である環分子を形成するという点で、それらは自己環化している。
【００１８】
上記ヌクレオチドアナログは、上記酵素によるその後のヌクレオチドの結合を阻害する、上記ＮＴＰに連結される任意の部分を含み得る。上記阻害性基は、荷電基（例えば、荷電したアミノ酸）である得るか、または上記阻害性基は、周囲の条件に依存して荷電する基であり得る。いくつかの実施形態において、上記インヒビターは、負に荷電している部分であるか、または負に荷電し得る部分を含み得る。他の実施形態において、上記インヒビター基は、正に荷電しているか、または正に荷電し得る。いくつかの他の実施形態において、上記インヒビターは、アミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。上記インヒビターは、２〜２０個の単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、２〜１０個の単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、３〜７個の単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、３〜５個の単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、上記インヒビターは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓ、ならびにこれらの組み合わせ（例えば、Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＧｌｕもしくはＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐなど）からなる群より選択される基を含む。ペプチドもしくは基は、同じかもしくは異なるアミノ酸もしくはアナログの組み合わせであり得る。上記阻害性基はまた、上記酵素の活性部位において残基と反応し、従って、上記酵素によるその後のヌクレオチドの結合を妨害する基を含み得る。
【００１９】
上記タイプ、ＮＴＰ−リンカー−インヒビターのヌクレオチドアナログの例は、図１Ａに示される。図１Ａ中のアナログは、ｄＣＴＰのＮ４位にジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合を介して連結した阻害性の（−Ａｓｐ−Ａｓｐ−）基を含み、他方で、ブロックされていない、非改変３’−ＯＨをその糖環上に提供する。上記リンカーは、全てのリンカー原子（第２の組み込み阻害部分を含む）が除去され得、それによって、新生ＤＮＡ鎖が天然のヌクレオチドに戻ることを可能にするように、構築される。図１Ｂに示されるように、水性の還元剤（例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）もしくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、−Ｓ−Ｓ−結合を切断し、インヒビター機能の喪失（脱ブロック）を生じさせるために使用され得る。図１Ｂに示されるように、自己環化リンカーが組み込まれ得、ヌクレオチド合成の結果において、試薬溶液から容易に除去される環式の酸化型テトラヒドロチオフェン脱離基が生じる。
【００２０】
図１ＡのｄＣＴＰアナログを合成するための例示的スキームは、以下に示される：
【化１】
0006448097.tif 000011
【００２１】
図１に類似の様式において、上記タイプ、ＮＴＰ−リンカー−インヒビターのヌクレオチドアナログはまた、リンカー−インヒビター部分を、アデニンのＮ６に（図２）、グアニンのＮ２に（図３）、チミンのＮ３に（図４）、もしくはウラシルのＮ３に（図５）結合させ、それによって、「天然に存在する」ｄＮＴＰ、ならびにデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のアナログを提供することによって、形成され得る。ｄＵＴＰの幅広い用途がある可能性は小さいが、その合成は、化学に基づいて簡単である。
【００２２】
本発明は、スキーム１の連結化学に限定されないが、カルバメート、アミド、もしくは他の自己削除連結もまた使用され得る。例えば、ヌクレオチドはまた、スキーム２に示されるように、シュタウディンガーリンカーとともに調製され得る。
【化２】
0006448097.tif 000012
【００２３】
Ａｓｐ−Ａｓｐブロッキング基へのシュタウディンガーリンカー（スキーム２）で作製されたデオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）アナログは、図６に示される。図６に示されるように、上記シュタウディンガーｄＣＴＰアナログは、水性条件下で、アジドおよびトリフェニルホスフィンの付加により切断を受ける。図６に示される上記シュタウディンガーアナログはまた、上記で記載されそして図１〜５で例示されるように、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（例えば、ＴｄＴ）を使用するヌクレオチド伸長に適している。図中には明確に示されていないが、当業者は、完全なデノボヌクレオチド合成に必要とされる場合、シュタウディンガーリンカーを有する他のヌクレオチドアナログを生成するために適切な反応物とともに、スキーム２を使用し得る。図６に類似の様式で、スキーム２のヌクレオチドアナログは、シュタウディンガー部分を、アデニンのＮ６に、グアニンのＮ２に、チミンのＮ３に、もしくはウラシルのＮ３に結合させ、それによって、「天然に存在する」ｄＮＴＰ、ならびにデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のアナログを提供することによって、形成され得る。
【００２４】
スキーム１の方法論は、例えば、図７〜１０に示されるように、適切なリボヌクレオチド反応物で出発することによって、相当するリボヌクレオチドアナログを生成するために使用され得る。上記シュタウディンガーリンカーを含むリボヌクレオチドアナログはまた、必要とされるリボヌクレオチドアナログ（図１２に示されるように、例えば、ＣＴＰアナログが挙げられる）を形成するために、スキーム２を使用して作製され得る。さらに、上記リボヌクレオチドアナログのうちの全て、すなわち、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕは、スキーム２に類似の反応を使用して形成され得る。
【００２５】
（酵素）
本発明の方法は、ヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドへと構築するために、ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する。ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、関連トランスフェラーゼおよびポリメラーゼ酵素のいくつかのファミリーを含む。いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドよりもデオキシリボヌクレオチドを効率的に重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシリボヌクレオチドよりもリボヌクレオチドを効率的に重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドをほぼ同じ速度で重合する。
【００２６】
本発明にとって特に重要なことには、ポリメラーゼ活性を有するトランスフェラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））は、ヌクレオチド鎖の３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒し、それによって、ＤＮＡヌクレオチドの鎖長を増大させ得る。ＴｄＴは、ＤＮＡ鎖の成長しつつある末端への１〜２個のリボヌクレオチドの付加を触媒するのみであり、部位特異的ＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの構築において有用であり得る。特に、仔ウシ胸腺ＴｄＴ（操作されたＥ．ｃｏｌｉから入手される）は、本発明での使用に適しており、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）のような商業的供給元から入手可能である。仔ウシＴｄＴに相当するアミノ酸配列は、表１中に配列番号１として列挙される。
【表１】
0006448097.tif 000013
【００２７】
仔ウシＴｄＴに相当するヌクレオチド配列は、表２中に配列番号２として列挙される。
【表２−１】
0006448097.tif 000014
【表２−２】
0006448097.tif 000015
【００２８】
市販のＴｄＴは、本発明の方法での使用に適している一方で、改変ＴｄＴ（例えば、配列番号１と少なくとも９５％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９８％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９９％共通するアミノ酸配列を有する）も、本発明の方法で使用され得る。適切なヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する生物は、配列番号２と少なくとも９５％共通する、例えば、配列番号２と少なくとも９８％共通する、例えば、配列番号２と少なくとも９９％共通する核酸配列を含み得る。いくつかの場合に、改変ＴｄＴは、ポリヌクレオチドのより効率的な生成を生じさせるか、または鎖長のより良好なコントロールを可能にする。上記ＴｄＴに対する他の改変は、上記酵素の放出特性を変化させ得、それによって、ＴＣＥＰもしくはＤＴＴのよいうな水性還元剤の必要性を低下させ得る。
【００２９】
ＲＮＡポリヌクレオチドの合成のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ａ）ポリメラーゼのようなヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドイニシエーターの３’末端へのリボヌクレオチドの付加を触媒するために使用され得る。他の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用により適切であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは両方とも、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）から入手可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ｕ）ポリメラーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、以下に再現される。改変Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ａ）ポリメラーゼもしくはＥ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用に適切であり得る。例えば、配列番号３と少なくとも９５％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９８％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９９％共通するアミノ酸配列を有する酵素は、本発明の方法で使用され得る。適切な酵素を発現する生物は、配列番号４と少なくとも９５％共通する、例えば、配列番号４と少なくとも９８％共通する、例えば、配列番号４と少なくとも９９％共通する核酸配列を含み得る。あるいは、配列番号５と少なくとも９５％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９８％共通するアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９９％共通するアミノ酸配列を有する酵素は、本発明の方法で使用され得る。適切な酵素を発現する生物は、配列番号６と少なくとも９５％共通する、例えば、配列番号６と少なくとも９８％共通する、例えば、配列番号６と少なくとも９９％共通する核酸配列を含み得る。
【表３】
0006448097.tif 000016
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ａ）ポリメラーゼに相当するヌクレオチド配列は、表４中に配列番号４として列挙される。
【表４−１】
0006448097.tif 000017
【表４−２】
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【表５】
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【００３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ポリ（Ｕ）ポリメラーゼに相当するヌクレオチド配列は、表６中に配列番号６として列挙される。
【表６−１】
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【表６−２】
0006448097.tif 000021
【００３２】
上記で考察されるように、上記ヌクレオチドアナログに結合したインヒビターは、上記トランスフェラーゼ（例えば、ＴｄＴ）が、上記ポリヌクレオチドから放出されないようにするか、または他のアナログが上記成長しつつある鎖に組み込まれないようにする。荷電した部分は、よりよい阻害を生じさせるが、研究から、上記インヒビターの特定の化学的性質が特に重要ではないことが示唆されている。例えば、ホスフェートおよび酸性ペプチドの両方が、酵素活性を阻害するために使用され得る。例えば、Ｂｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｖｏｌ．  ６，  （２００９）  ｐ．  ５９３−９５および米国特許第８，０７１，７５５号（ともに、それらの全体が本明細書に参照により援用される）を参照のこと。いくつかの実施形態において、上記インヒビターは、単一のアミノ酸もしくは−（Ａｓｐ）２のようなジペプチドを含むが、そのサイズおよびその部分の電荷は、必要であれば、第１のヌクレオチドの組み込みおよび第２のヌクレオチドの組み込みの経験的に決定された速度に基づいて調節され得る。すなわち、他の実施形態は、さらに荷電したもしくは異なる電荷のアミノ酸または他の生体適合性の荷電分子を使用し得る。
【００３３】
ヌクレオチド合成の他の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼもしくは改変ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、テンプレート非依存的様式でデノボオリゴヌクレオチドを構築するために使用され得る。一実施形態において、上記ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素は、それらが３’非改変ｄＮＴＰアナログのホスフェートに対する改変に遭遇する場合、それらがヌクレオチド付加を中止するように、改変され得る。このスキームは、その後のヌクレオチドの組み込みのために新生鎖を解放する、上記ヌクレオチドアナログのホスフェート末端を改変する脱ブロック試薬／反応を必要とする。このアプローチの好ましい実施形態は、ホスフェート（α、βもしくはγ）でのみ改変されたヌクレオチドアナログを使用するが、上記ヌクレオチドのプリン／ピリミジン塩基の改変は許容される。
【００３４】
非テンプレート依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、タンパク質工学もしくはタンパク質進化を使用して、強く結合し、各単一ヌクレオチドの組み込み後に新生鎖に対して不活性なままであり、従って、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼが、放出試薬／条件の使用によって上記鎖から放出されるような時まで、いかなるその後の組み込みをも防止するように、上記酵素を改変することである。このような改変は、可逆性のターミネーターｄＮＴＰの代わりに、天然の非改変ｄＮＴＰの使用を可能にするように選択される。放出試薬は、高塩緩衝液、変性剤などであり得る。放出条件は、高温、撹拌などであり得る。例えば、ＴｄＴのループ１およびＳＤ１領域への変異は、テンプレート非依存的活性から、どちらかというとテンプレート依存的活性へと、活性を劇的に変化させることが示された。目的の具体的変異としては、Δ３３８４／３９１／３９２、ｄｅｌ  ｌｏｏｐ１（３８６→３９８）、Ｄ３３９Ａ、Ｆ４０１Ａ、およびＱ４０２Ｋ４０３Ｃ４０４→Ｅ４０２Ｒ４０３Ｓ４０４が挙げられるが、これらに限定されない。組み込み後に強く結合するＴｄＴ酵素という目的を達成する他の手段は、上記イニシエーター鎖の３個のホスフェートへの結合を担う残基に対する変異を含み得、Ｋ２６１、Ｒ４３２、およびＲ４５４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
非テンプレート依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、上記酵素を改変して、高効率で３−ブロックされた可逆的ターミネーターを受容するためのタンパク質工学もしくはタンパク質進化を使用することである。大部分の天然に存在するポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素は、上記酵素の活性部位における立体的制約に起因して、３’−ブロックされた可逆的ターミネーターを組み込まない。上記酵素の活性部位において単一のもしくはいくつかのａａ残基のいずれかを改変すると、上記で記載されるものに完全に類似したプロセスにおいて、支持体に結合したイニシエーターへの３’−ブロックされた可逆的ターミネーターの非常に効率的な組み込みが可能になり得る。組み込み後に、上記３’−可逆的ターミネーターが脱ブロック試薬／条件で除去され、従って、その後の制御された伸長反応の準備ができている、完全に天然の（傷のない）１本鎖分子を生成する。その入ってくるｄＮＴＰの３’−ＯＨに近い数個の残基が、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートと同程度に容易にリボヌクレオチドトリホスフェートを組み込むためのＴｄＴの性質の説明となる；β１とβ２との間にあるもの（特に、Ｒ３３４）、ループ１、およびα１３とα１４との間にあるもの（特に、Ｒ４５４）が挙げられるが、これらに限定されない残基は、おそらく、３’−可逆的ターミネーター基のバルクを収容し、それらの効率的組み込みを可能にするための変異誘発の標的である。テンプレート依存的ポリメラーゼを使用するための別の実施形態は、３’ブロックされたかもしくは３’ブロックされていないｄＮＴＰアナログのいずれかと、固体支持体に結合した複数のプライマー−テンプレート対とを使用することである。
【００３６】
非テンプレート依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、上記酵素を改変して、アナログ特異的様式で、４種の異なるヌクレオチドもしくはさらに異なる改変ヌクレオチドアナログの各々の使用を最適化するために、タンパク質工学もしくはタンパク質進化を使用し得る。ヌクレオチド特異的もしくはヌクレオチドアナログ特異的な酵素改変体は、所望のポリヌクレオチドの合成のコストをさらに低減する、低下したＫｍもしくは高められた付加速度のような望ましい生化学的属性を有するように操作され得る。
【００３７】
（固相合成）
本発明の方法は、種々の反応条件下で実施され得るが、所望のポリヌクレオチドの秩序だった構築および回収は、ほとんどの場合、上記ポリヌクレオチドが成長し得る固体支持体を要する。いくつかの実施形態において、上記方法は、図７に図示されるように、固体支持体上でのポリヌクレオチドの酵素媒介性合成を含む。上記で考察される切断可能なターミネーターヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）アナログとともに使用される場合、例えば、ＴｄＴもしくはポリ（Ａ）ポリメラーゼを水性環境で使用することによって、ＤＮＡおよびＲＮＡの特定のポリヌクレオチド配列を構築することが可能である。図１３に示されるように、上記ＴｄＴを使用して、ポリヌクレオチド配列を段階的様式で伸長することによって、カスタムポリヌクレオチドの段階的な構築をもたらし得る。先で考察されるように、各ＮＴＰアナログの上記インヒビター基は、ヌクレオチドの付加により、上記酵素を停止させる。各ヌクレオチド伸長工程の後に、その反応物は、上記リンカーを切断することによって上記インヒビターを除去する前に、上記固体支持体から洗い流され、次いで、新たな反応物が添加され、サイクルが改めて開始させる。伸長−除去−脱ブロック−洗浄のｎ回のサイクルの結果として、最終の全長１本鎖ポリヌクレオチドが完成し、上記固体支持体から切断され得、ＤＮＡ配列決定もしくはＰＣＲのような適用においてその後使用するために回収され得る。あるいは、最終の全長１本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション分析、タンパク質もしくはＤＮＡアフィニティー捕捉のような適用におけるその後の使用のために、上記固体支持体に結合したままであり得る。他の実施形態において、部分的に２本鎖のＤＮＡは、イニシエーターとして使用され得、２本鎖ポリヌクレオチドの合成を生じさせる。
【００３８】
本発明の方法での使用に適した固体支持体としては、ビーズ、スライド、ペグ、もしくはウェルを含むガラス製およびシリカ製の支持体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、上記支持体は、ポリマーウェルプレートもしくはピペットチップのような別の構造に繋がれ得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、さらなる磁性特性を有し得、従って、上記支持体が、磁石を使用してある位置から操作もしくは除去されることを可能にする。他の実施形態において、上記固体支持体は、シリカ被覆ポリマーであり得、それによって、自動化処理に役立つ種々の構造的形状の形成を可能にする。
【００３９】
（合成機）
開示される方法の効率を利用するために、水相ＤＮＡ合成機が、実質的な量で所望のポリヌクレオチドを生成するように構築され得る。一実施形態において、合成機は、ポリヌクレオチド成長をもたらすために十分な濃度で、記載されるＮＴＰアナログ試薬、すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４つのウェル、ならびにＴｄＴを含む。複数の開始配列が、例えば、実験ロボットを使用して、上記４つのウェルの各々に反復して浸漬されるように設計される固体支持体に結合し得る。上記ロボットは、ヌクレオチド付加の間に上記固体支持体を洗浄緩衝液中ですすぎ、上記支持体を脱ブロック化薬剤に曝すことによって上記連結基を切断し、そして上記固体支持体を２回洗浄して、その後、上記固体支持体を次の所望のヌクレオチドのウェルに移動させるようにさらにプログラムされ得る。単純なプログラミングにより、ほんの数時間で、かつ有害廃棄物を実質的に減少させて、所望のヌクレオチド配列の有用な量を作ることが可能である。注意深く制御された条件下で進行中の合成は、数千もの塩基対の長さを有するポリヌクレオチドの合成を可能にする。完了すると、その伸長生成物は、上記固体支持体から放出され、すると、それらは、最終的なヌクレオチド配列として使用され得る。
【００４０】
高度に並行した実施形態は、９６ウェル形式もしくは３８４ウェル形式のいずれかにあるペグ上の一連のイニシエーター−固体支持体からなり得、これは、上記ペグをインデックス化して、制御された様式で上記ウェル中の液体と接触するように、個々に引っ込めたり下げられたりされ得る。上記合成機は、従って、無作為にアドレス可能なペグデバイス、上記ペグデバイスと同じ形式（９６もしくは３８４の間隔）にある４種の酵素−ｄＮＴＰアナログリザーバー、上記ペグデバイスと同じ形式（９６もしくは３８４の間隔）にあるさらなる試薬リザーバー（洗浄、脱ブロックなど）、および上記ペグデバイスを１つのリザーバーから別のリザーバーへと、ユーザープログラム可能な制御がなされているがランダムアクセス様式で移動するための輸送機構（例えば、実験ロボット）からなり得る。上記４種の酵素−ｄＮＴＰリザーバーの各々の汚染を回避するために注意が払われなければならない。なぜなら、その内容物は、各ポリヌクレオチド合成の費用を低減するために、合成プロセス全体を通じて、再使用されるからである。
【００４１】
代替の実施形態において、上記試薬（例えば、ヌクレオチドアナログ、酵素、緩衝液）は、上記試薬が再利用されるのを可能にして、固体支持体間で移動させられる。例えば、リザーバーおよびポンプのシステムは、１つまたは複数のリアクター（この中でオリゴヌクレオチドが形成される）の間を４種の異なるヌクレオチドアナログ溶液、洗浄緩衝液、および／もしくは還元剤溶液を移動し得る。上記リアクターおよびポンプは、従来どおりであり得るか、または上記デバイスは、微小流体デバイスを使用して構築され得る。このプロセスの無水でない（水性の）性質が原因で、水への曝露を排除するために使用されるハードウェアの設計に、特別注意を払う必要はない。この合成プロセスは、蒸発による損失を制御するための予防措置のみで起こり得る。高度に並行した実施形態は、同じ釣り合った様式で一連のウェルに接合し得る９６ウェル形式もしくは３８４ウェル形式いずれかにあるペグ上の一体的な一連のイニシエーター−固体支持体からなり得る。各ウェルは、実際には、適切なバルブ付きの４種の酵素−ｄＮＴＰアナログリザーバーおよびさらなる試薬リザーバー（洗浄、脱ブロックなど）によって供給される反応チャンバである。設備は、上記酵素−ｄＮＴＰ反応物を各伸長反応後に清潔な様式で回収するために、流体工学の論理で作製される。なぜならそれらは、各ポリヌクレオチド合成のコストを低減するために、合成プロセス全体を通じて再使用されるからである。他の実施形態において、ピペットチップのシステムは、試薬を添加および除去するために使用され得る。
【００４２】
合成後に、放出された伸長生成物は、上記イニシエーターが、コントロールと比較して予期された塩基数だけ伸長したか否かを決定するために、高分解能ＰＡＧＥによって分析され得る。上記回収された合成ＤＮＡの一部はまた、その合成されたポリヌクレオチドが、予期された配列のものであるか否かを決定するために配列決定され得る。
【００４３】
上記合成機は、比較的単純でかつホスホルアミダイト合成に必要とされる毒性成分を要しないので、本発明の合成機は、研究機関、生体工学、および病院にとっても広く利用しやすい。さらに、試薬を再使用／再利用できることから、生成される廃棄物を減少させ、消耗品のコストを低減する一助となる。本発明者らは、上記方法およびシステムが、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ、および合成生物学のような多くの適用において有用であると予想する。
【００４４】
（参照による援用）
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、科学雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）への参照および引用は、本開示全体を通じてなされた。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参照により援用される。
【００４５】
（均等物）
本明細書で示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書で引用される科学文献および特許文献への参照を含め、この文書の全内容から当業者にとって明らかになる。本明細書中の主題は、本発明の実施に対して、その種々の実施形態およびその均等物において適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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