(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
種々の可変領域（１５０）を有する異なる遺伝子型の複数の細胞株のライブラリーを前記細胞株の遺伝物質（１００）の少なくとも一部において特徴付ける方法であって：
画像化のために透明であってかつ細胞を収容する寸法を有している複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）を有する基板（１０）を包含するマイクロ流体デバイス（１）の流体ソース（３１）に培地と共に前記細胞株の細胞を装填する；ここで前記複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）のそれぞれの第一の末端（２２）が、フローチャネル（３０）の第一の末端（３２）に前記流体ソース（３１）およびフローチャネル（３０）の第二の末端（３４）に流体シンク（３３）を有する前記フローチャネル（３０）と液体接続されており、かつ前記複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）のそれぞれの第二の末端（２８）が、洗浄シンク（５０）と液体接続するシンクチャネル（５２）と液体接続する第二の末端（４４）を有する個別の洗浄チャネル（４０）の第一の末端（４２）と液体接続されており、ここで前記洗浄チャネル（４０）が、細胞を収容するには小さ過ぎる寸法を有する、ことと；
前記細胞株の細胞を前記マイクロ流体デバイス（１）中の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で培養することと；
前記マイクロ流体デバイス（１）の中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で各細胞株の表現型の特徴を決定することと；
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）に前記細胞株の前記細胞を定着することと；
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で各細胞株の前記可変領域（１５０）をインサイチュ遺伝子型決定することと；
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）に基づいて各個別の遺伝子型に各個別の表現型の特徴を関連付けることと、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、インサイチュ遺伝子型決定が、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）での前記可変領域（１５０）または少なくともその一部のライゲーションによるインサイチュ配列決定を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、インサイチュ遺伝子型決定が、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）での前記可変領域（１５０）または少なくともその一部の合成によるインサイチュ配列決定を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、各細胞株が、個別の株特異的バーコード配列（１４０）をその遺伝物質（１００）中に有し、かつインサイチュ遺伝子型決定が、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で、各細胞株の前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）の少なくとも一部をインサイチュ配列決定によって前記個別の遺伝子型を決定することを包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで各細胞株が、既知のヌクレオチド配列の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列（１６０、１７０）に隣接してその遺伝物質（１００）中に個別の株特異的バーコード配列（１４０）および前記可変領域（１５０）を包含する個別の構築物を包含し、前記ライブラリー共通プライマー結合配列を用いて前記遺伝物質（１００）からもしくはｃＤＮＡ配列（３００）に逆転写される転写されたＲＮＡ配列（２００）を介して、前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を増幅できるか前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を配列決定できる、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、各細胞株について、転写されたＲＮＡ配列（２００）から前記転写されたＲＮＡ配列（２００）中の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列（２６０、２７０）に相補的なプライマー（３６０）および逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ配列（３００）を合成することをさらに包含し、ここでインサイチュ配列決定が、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で各細胞株の前記ｃＤＮＡ配列（３００）中の前記個別の株特異的バーコード配列（３４０）の前記少なくとも一部をインサイチュ配列決定することを包含する、方法。
【請求項７】
請求項５または６のいずれか１項に記載の方法であって、一本鎖ＤＮＡ、リガーゼもしくはパッドロックプローブを用いるサーキュレーション後のローリングサークル増幅によってまたはインサイチュポリメラーゼ連鎖反応によって、またはセルフハイブリダイゼーション後に前記ｃＤＮＡ配列（３００）をライゲーションすることによって前記ｃＤＮＡ配列（３００）をインサイチュ増幅することをさらに包含する、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、前記遺伝物質（１００）から前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を切除した後のローリングサークル増幅によって前記遺伝物質（１００）からの前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を増幅することまたは前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）をインサイチュ配列決定することをさらに包含する、方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法であって、ここでインサイチュ配列決定が、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）の前記少なくとも一部のライゲーションによってインサイチュ配列決定することを包含する、方法。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法であって、ここでインサイチュ配列決定が、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記個別の株特異的なバーコード配列（１４０）の前記少なくとも一部の合成によってインサイチュ配列決定することを包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記表現型の特徴を決定することが、顕微鏡、好ましくは微速度撮影顕微鏡を用いて前記マイクロ流体デバイス（１）中で前記細胞を培養する間に各細胞株の前記表現型の特徴を決定することを包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記マイクロ流体デバイス（１）中で前記細胞に少なくとも１つの試験因子を添加することを包含し、ここで前記表現型の特徴を決定することが、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記少なくとも１つの試験因子に対する各細胞株の表現型応答を決定することをさらに包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、各空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）が同じ遺伝子型の細胞のみを包含するように前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記細胞株の細胞をランダムに播種することをさらに包含する、方法。
【請求項１４】
種々の可変領域（１５０）を有する異なる遺伝子型の複数の細胞株のライブラリーを前記細胞株の遺伝物質（１００）の少なくとも一部において特徴付けるためのシステムであって：
マイクロ流体デバイス（１）中の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記細胞株の細胞を培養するために構成された前記マイクロ流体デバイス（１）であって、ここで、マイクロ流体デバイス（１）が、画像化のために透明であってかつ細胞を収容する寸法を有している複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）を有する基板（１０）を包含し、ここで前記複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）のそれぞれの第一の末端（２２）が、フローチャネル（３０）の第一の末端（３２）に流体ソース（３１）およびフローチャネル（３０）の第二の末端（３４）に流体シンク（３３）を有する前記フローチャネル（３０）と液体接続されており、かつ前記複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）のそれぞれの第二の末端（２８）が、洗浄シンク（５０）と液体接続するシンクチャネル（５２）と液体接続する第二の末端（４４）を有する個別の洗浄チャネル（４０）の第一の末端（４２）と液体接続されており、ここで前記洗浄チャネル（４０）が、細胞を収容するには小さ過ぎる寸法を有し、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）内の各細胞株のそれぞれの表現型の特徴を決定するように構成された顕微鏡と、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）に前記細胞を固定するための構成要素を包含する第１のキットと、
前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記細胞の定着後に各細胞株の前記可変領域（１５０）をインサイチュ遺伝子型決定するための構成要素を包含する第二のキットであって、ここで各細胞株の個別の表現型の特徴が、前記マイクロ流体デバイス（１）における前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）に基づいて各個別の遺伝子型に関連付けられ得る、第二のキットと、
を包含する、システム。
【請求項１５】
請求項１４に記載のシステムであって、前記複数の細胞株の前記ライブラリーをさらに包含する、システム。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のシステムであって、ここで各細胞チャネル（２０）が、前記フローチャネル（３０）と液体接続する第一の末端（４２）および前記シンクチャネル（５２）と液体接続する第二の反対側の末端（４４）を有する個別第二の洗浄チャネル（４０）とその長軸方向側（２４、２６）の少なくとも１つに沿って隣接され、前記第二の洗浄チャネル（４０）は、細胞を収容するには小さ過ぎる寸法を有する、システム。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のシステムであって、少なくとも１つのコンピューター制御ポンプを用いて前記チャネル（２０）に前記第一のキットの前記構成要素を分配するように構成された液体マニフォールドをさらに備える、システム。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のシステムであって、ここで各々の細胞株が、その遺伝物質（１００）中に個別の株特異的バーコード配列（１４０）を有し、かつ前記第二のキットが、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で各細胞株の前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）の少なくとも一部をインサイチュ配列決定することによって前記それぞれの遺伝子型を決定するための構成要素を包含する、システム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムであって、ここで各細胞株が、既知のヌクレオチド配列の少なくとも１つのライブラリー共通の配列（１６０、１７０）に隣接してその遺伝物質（１００）中に個別の株特異的バーコード配列（１４０）および前記可変領域（１５０）を包含する個別の構築物を有し、前記ライブラリー共通配列を用いて前記遺伝物質（１００）からもしくはｃＤＮＡ配列（３００）に逆転写される転写されたＲＮＡ配列（２００）を介して、前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を増幅できるか前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）を配列決定できる、システム。
【請求項２０】
請求項１９に記載のシステムであって、各細胞株について、転写されたＲＮＡ配列（２００）から前記転写されたＲＮＡ配列（２００）中の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列（２６０、２７０）に相補的なプライマー（３６０）および逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ配列（３００）を合成するための構成要素を包含する第三のキットをさらに包含し、ここで前記第二のキットが、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で各細胞株の前記ｃＤＮＡ配列（３００）中の前記個別の株特異的バーコード配列（３４０）の前記少なくとも一部をインサイチュ配列決定するための構成要素を包含する、システム。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のシステムであって、一本鎖ＤＮＡ、リガーゼもしくはパッドロックプローブを用いるサーキュレーション後のローリングサークル増幅によってまたはインサイチュポリメラーゼ連鎖反応によって、または前記ｃＤＮＡ配列（３００）をセルフハイブリダイゼーション後にライゲーションすることによって前記ｃＤＮＡ配列（３００）をインサイチュ増幅するための構成要素を包含する第四のキットをさらに包含する、システム。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のシステムであって、前記第二のキットが、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）の前記少なくとも一部のライゲーションによってインサイチュ配列決定するための構成要素を包含する、システム。
【請求項２３】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のシステムであって、前記第二のキットが、前記マイクロ流体デバイス（１）中の前記空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル（２０）で前記個別の株特異的バーコード配列（１４０）の前記少なくとも一部の合成によるインサイチュ配列決定のための構成要素を包含する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は概して、遺伝子的に異なる細胞のライブラリーの表現型の特徴付けおよびインサイチュ遺伝子型決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム遺伝子工学における近年の発展、例えば、多重自動ゲノム工学（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＭＡＧＥ）およびクラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）アソシエイテッド・プロテイン（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）９（Ｃａｓ９）の適用または遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＴＡＬＥＮ）など）によって容易になる他の種類のゲノム編集は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成のためのコスト削減と組み合わせて、圧倒的な遺伝子多様性を有する大きい細胞ライブラリーを生成することを可能にする。同時に、技術の開発によって、細胞の表現型および遺伝子型の特徴を決定する可能性がもたらされる。例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ（商標）組み込みの流体回路（ＩＦＣ）は、単一のマイクロウェルプレート中で遺伝子型決定するために用いられ得る。しかし、分析できる細胞ライブラリーのサイズは、数百の異なる細胞に限定される。なぜなら遺伝子的に異なる細胞を仕分けして保持し個々に分析しなければならないからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ（商標）ＩＦＣよりもはるかに大きい株のライブラリーを扱うことができる別の技術は、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）である。しかし、ＦＡＣＳには、細胞ライブラリーの表現型特徴付けが時間内のある時点での蛍光読み取りに限定されるせいで、限界がある。インビトロ区画化（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ：ＩＶＣ）および液滴ベースの技術は、ＦＡＣＳと同様に、大きいライブラリーを取り扱うことができる。しかし、ＩＶＣで得られる表現型情報は、液滴中の画像化の光学的制約のせいで、および長期の細胞増殖実験が液滴中では行えないという事実によって、限られている。
【０００４】
さらに他の技術は、画像化後の細胞にバーコードのついたオリゴマーを加えることによる。特定の空間的位置へのオリゴマーの分布の必要性によって、細胞が増殖できる条件および分布できる種々のバーコードの数が制限される。
【０００５】
従って、細胞ライブラリーの表現型および遺伝子型の特徴付けの技術的分野内では改善の必要性がある。具体的には、大きい細胞ライブラリーを取り扱うことが可能であり、高度な空間的および時間的解像度で表現型の特徴をモニターできる技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
大型の細胞ライブラリーの表現型および遺伝子型の特徴付けを可能にする技術を提供することが一般的な目的である。
【０００７】
この目的および他の目的は、本明細書に記載される実施形態によって満たされる。
【０００８】
要するに、この実施形態の態様は、細胞株の遺伝物質の少なくとも一部において異なる可変領域を有する複数の細胞株のライブラリーを特徴付けるための方法に関する。この方法は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞株の細胞を培養することを包含する。表現型の特徴は、培養デバイス中の各々の細胞株について決定される。細胞株の細胞は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に定着される。この方法はまた、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で各々個別の細胞株の可変領域をインサイチュ遺伝子型決定することを包含する。次いで、各個別の表現型の特徴を、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に基づいて、各個別の遺伝子型に関連付ける。
【０００９】
この実施形態の別の態様は、細胞株の遺伝物質の少なくとも一部において種々の可変領域を有する複数の細胞株のライブラリーを特徴付けるためのシステムに関する。このシステムは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞株の細胞を培養するように構成された培養デバイスを包含する。このシステムはまた、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で細胞の定着後に各々の細胞株の可変領域をインサイチュ遺伝子型決定するための構成要素を包含する、第一のキットを包含する。各々の細胞株の個別の表現型の特徴を次いで、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に基づいて、各個別の遺伝子型に関連付けてもよい。
【００１０】
本発明の実施形態によって、大型の細胞ライブラリーの並行した表現型および遺伝子型の特徴付けが可能になる。この実施形態によって、種々の表現型を、培養デバイス中の細胞についてモニターして決定することがさらに可能になる。
【００１１】
この実施形態のシステムおよび培養デバイスによって、一定または可変の条件下で長期の単一細胞表現型実験が、続いて、細胞を失うことなく、インサイチュ配列決定に必要な複数の試薬の固定および適用が容易になる。
【００１２】
本実施形態は、そのさらなる目的および利点と一緒になって、添付の図面とまとめて以下の説明を参照することによって最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ある実施形態による培養デバイスの図示である。
【図２】図２は、ラインＡ−Ａに沿って、図１に示される培養デバイスの断面図である。
【図３】図３は、別の実施形態による培養デバイスの図である。
【図４】図４は、図３に示される培養デバイスのラインＡ−Ａに沿った断面図である。
【図５】図５は、さらなる実施形態による培養デバイスの図である。
【図６】図６は、なお別の実施形態による培養デバイスの図である。
【図７】図７は、さらなる実施形態による培養デバイスの図である。
【図８】図８は、ある実施形態による細胞株のゲノムの一部を図示する。
【図９】図９は、図８に示されるゲノムの一部から得られるｍＲＮＡ配列を図示する。
【図１０】図１０は、図９に示されるｍＲＮＡ配列から得られるｃＤＮＡ配列を図示する。
【図１１】図１１は、別の実施形態による細胞株のゲノムの一部を図示する。
【図１２】図１２は、図１１に示されるゲノムの一部から得られるｃＤＮＡ配列を図示する。
【００１４】
発明の詳細な説明
図面全体を通して、同様のまたは対応するエレメントについて、同じ参照番号を用いる。
【００１５】
本発明の実施形態は概して、細胞株のライブラリーの表現型の特徴付けおよびインサイチュ遺伝子型決定に関する。詳細には、本発明の実施形態によって、モニターされた表現型の特徴およびインサイチュで決定された遺伝子型を、極めて平行な方法で関連付けることが可能になる。これは、種々の遺伝子型を有する細胞株の巨大なライブラリーを並行して処理して、モニターされた表現型の特徴を細胞株の種々の遺伝子型に関連付けることが可能になることを意味する。
【００１６】
本明細書において用いられる細胞株とは、特定の遺伝子型を有する細胞の選択およびクローニングによって、初代培養物または細胞株から誘導される細胞を意味する。従って、細胞株の細胞は全てが、同じ遺伝子型を有する。従って、細胞株のライブラリーは、遺伝子的に異なる細胞のコレクションである。この実施形態のライブラリー中の細胞株は、細菌株、酵母株、真核生物細胞株、細胞株、初代細胞、幹細胞、組織または微小コロニー中の細胞、移動性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントに関して異なる同質遺伝子的な細胞、それらが保有するベクターまたはプラスミドを含む任意の細胞種であってよい。本明細書に用いられる細胞株はまた、それらが本明細書に開示されるようにインビトロで培養され得る限り、多細胞性複合体、組織なども包含する。
【００１７】
この実施形態の態様は、細胞株の遺伝物質の少なくとも一部において種々の可変領域を有する複数の細胞株のライブラリーを特徴付けるための方法に関する。この方法は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で細胞株の細胞を培養することを包含する。各々の細胞株の表現型の特徴は、培養デバイス中で決定される。細胞株の細胞は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に定着される。この方法はまた、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、各々の細胞株の可変領域をインサイチュ遺伝子型決定することを包含する。次いで、各個別その表現型の特徴を、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に基づいて、各個別の遺伝子型に関連付ける。
【００１８】
細胞株のライブラリーは、ゲノム工学内の種々の技術によって得てもよい。例えば、多重自動ゲノム工学（ＭＡＧＥ）を用いて、１日あたり何十億という異なる変異体ゲノムを作製してもよい（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０：８９４〜８９８）。細胞のライブラリーを作製するために用いられ得る他の技術としては、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  （ＣＲＩＳＰＲ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４３：８０〜８４；Ｋｏｉｋｅ−Ｙｕｓａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２：３０９〜３１２；Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５０９：４８７〜４９１）または大規模ＲＮＡ干渉（Ｂｅｒｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４２８：４３１〜４３７）が挙げられる。
【００１９】
本発明の実施形態は培養デバイスを用い、その中でライブラリー中の各々の細胞株の細胞が、他の細胞株および／または他の遺伝子型の細胞から隔てられて保持され培養され得る。このように、各々の細胞株は、細胞が培養されかつ研究され得る培養デバイス中に、それぞれ空間的に定義されかつ隔てられた位置を有する。
【００２０】
培養培地（単数または複数）は有利には、細胞培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で細胞に添加され得る。培養培地は細胞に連続的に添加されてもよいし、あるいは再補充されるかまたは定期的にもしくは選択された時点で交換される。培地交換は、好ましくは、過剰の細胞が、他の遺伝子型の細胞の空間的に定義されかつ隔てられた位置に結合せず、混入しないような方法である。
【００２１】
細胞は好ましくは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、単層で培養され増殖され得る。単層は概して、単層中に細胞が存在する場合に細胞をモニターして細胞の表現型特徴を決定することが通常はより容易であるという観点で、３Ｄの構造またはマトリクスよりも好ましい。しかし、細胞は、もし、例えば、細胞間の相互作用に関連する表現型を、例えば、分化または発達などにおいてモニターする場合、３Ｄ増殖を支持する構造中で増殖されてもよい。
【００２２】
培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で培養される細胞は、好ましくは、物理的および／または化学的な刺激または因子に対する細胞の応答をモニターするために、洗い流されることなく、種々の物理的および／または化学的な刺激または因子に好ましくは暴露され得る。例えば、栄養素、薬物、抗生物質、遺伝子発現の誘導因子または抑制因子など、種々の化学的試験因子を培養培地に添加して、それによって細胞と接触させてもよい。種々の試験因子に対する異なる細胞株の細胞の応答に関して、細胞株の表現型の特徴を、次に、例えば、顕微鏡を用いて決定してもよい。対応して、細胞が暴露され得る温度、ｐＨ、圧力、フロー、ガス、露光または機械的ストレスは変更されてもよく、このような変化する物理的条件に対する異なる細胞株の細胞の応答は、例えば、顕微鏡を用いて決定され得る。
【００２３】
細胞株は、それらの遺伝物質の少なくとも一部に種々の可変領域を有することによって示されるとおり、種々の遺伝子型を有する。可変領域は、通常は、細胞株のゲノムに存在する。あるいは、可変領域は、移動性の遺伝的エレメント、例えば、プラスミドまたはベクターに存在し、従って必ずしも細胞のゲノム中に安定に組み込まれる必要はない。以下では、実施形態は、ゲノム中に存在する可変領域に関して主に考察される。しかし、代替的な実施形態が可能であり、ここでは、本明細書に言及される可変領域およびさらなるＤＮＡエレメントが、細胞株のプラスミドまたは他の移動性の遺伝的エレメント中に代わりに存在する。可変領域、またはその一部はまた、トランスポゾン、ウイルスまたはファージのような不安定な遺伝的エレメントに存在してもよい。このようなコード化は時に、インサイチュ配列決定のために細胞を固定する前に、例えば、細胞を固定する前にｄｓＤＮＡゲノムから可変領域の一部を特異的に切り出すかまたは環化することによって、可変の配列を増幅することに関して利点を有する。
【００２４】
この実施形態によって用いられ得る種々の培養デバイスは、本明細書にさらに記載される。
【００２５】
ある実施形態では、この方法はまた、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞株の細胞をランダムに播種することを包含する。細胞をランダムに播種することは、好ましくは、各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置が、同じ遺伝子型の細胞、すなわち、同じ細胞株の細胞のみを含むように行われる。  
【００２６】
この実施形態の利点は、細胞の遺伝的同一性、すなわち、遺伝子型が、培養デバイス中での細胞の播種の前に決定されて既知である必要がないということである。従って、各々の細胞の遺伝的同一性を知る必要があること、および方法全体にわたって各々の遺伝子型の位置を連続してモニタリングすることに関して、播種前にソートされた細胞ライブラリー中に細胞を保持する必要はない。このことは、本発明の実施形態では明らかに対照的に、遺伝子型のなんら知識なしで並行して表現型特徴を最初に分析し、次いで遺伝子型を決定して、それらを表現型特徴に関連付けることを意味する。
【００２７】
個々の細胞株をインサイチュで配列決定することによって、例えば、特定のバーコード化された配列プライマーが表現型決定の前または後に空間的に隔てられた位置に分配されるならば可能であろうことよりも、異なる株をより高密度で増殖させることが可能である。
【００２８】
そのため、ランダムな播種を、バルクで生成されたライブラリーからの個々の細胞を空間的に定義されかつ隔てられた位置で沈降させることによって行って、同質遺伝子的な細胞の微小コロニーを形成してもよい。
【００２９】
代替的なアプローチでは、ランダムな播種は、モニターすべき全ての細胞株が培養デバイス中の種々の空間的に定義されかつ隔てられた位置の間で分配されるまで、ライブラリー中の第一の細胞株の細胞を培養デバイス中の第一の空間的に定義されかつ隔てられた位置に添加すること、ライブラリー中の第二の細胞株の細胞を培養デバイス中の第二の空間的に定義されかつ隔てられた位置に添加すること、などによって行ってもよい。
【００３０】
ライブラリー中の各々の細胞株について決定した表現型の特徴は、好ましくは、ライブラリー中の各々の遺伝子型に対応する表現型特徴である。従って、ライブラリー中の細胞は異なる遺伝子型、すなわち細胞株毎にそれぞれの遺伝子型を有する遺伝子的に異なる細胞である。遺伝子型の相違とは、その細胞が、各個別の遺伝子型に対応する異なる表現型の特徴を有することを意味する。
【００３１】
ある実施形態では、細胞の表現型の特徴は顕微鏡を用いて決定される。表現型をモニタリングおよび決定するための顕微鏡は、先行技術に比べていくつかの利点を有する。例えば、蛍光顕微鏡によって、多くの世代にまたがる細胞系列の広範な微速度撮影、単一分子検出感度およびなんらかの変化する増殖条件に対する時間的応答をモニターする可能性が可能になる。従って、延長された期間にまたがって並行して、かつＦＡＣＳでのように単回の時点だけでなく、細胞株の表現型をモニターすることが可能になる。
【００３２】
顕微鏡を用いる実施形態によってモニターされ決定され得る表現型の特徴の非限定的だが具体的な例としては、細胞の形態、リボ核酸（ＲＮＡ）またはタンパク質のような種々の分子の空間的および／または時間的な発現パターン、特定の代謝物のレベル、寿命または増殖速度の変化（例えば、種々の物理的または化学的刺激な刺激または因子の添加に応答するような）、遺伝子発現レベルにおける細胞間の変動、胚の発達、レポータータンパク質またはＲＮＡアプタマーの輝度などが挙げられる。
【００３３】
従って、細胞株の表現型の特徴付けは、必要に応じて長期間、顕微鏡下で並行して行ってもよい。表現型の特徴付けはさらに、ライブラリー中の種々の細胞株の遺伝子型の情報なしで行ってもよい。明らかに対照的に、表現型の特徴付けは代わりに、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置について、それぞれの表現型の特徴を決定する。例えば、細胞株について決定すべき関連の表現型の特徴は、試験因子の添加後の、可変の遺伝子調節性領域またはコード配列を有する、蛍光レポータータンパク質の標的遺伝子の遺伝子発現である。このような場合、顕微鏡を用いて、それぞれの遺伝子発現レベルが視覚的に決定され得る培養デバイス上で画像を撮影してもよい。各々の個々の遺伝子発現レベルを次いで量子化して、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置についてそれぞれの値を得てもよい。従って、表現型の特徴付けの決定の出力は、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置についての、１つ以上のそれぞれの値のリストまたは行列であってもよい。
【００３４】
空間的に定義された位置と表現型との間の関係（すなわち、どの空間的に定義された位置がどの表現型に対応するか）が容易に決定されるように、空間的に定義された位置が表示されるか、番号付けされるか記されるならば有利である。空間的に定義された位置の間での距離または順序に関して空間的位置を定義することも可能である。
【００３５】
例えば、リストは、位置０＝値０、位置１＝値１、位置２＝値２などの形態であってよい。行列は対応して、位置（ｘ，ｙ）＝値０、位置（ｘ＋１，ｙ）＝値１、などの形態であってよい。
【００３６】
ある実施形態では、表現型の特徴を決定することは、顕微鏡を用いて培養デバイス中で細胞を培養する間に各々の細胞株の表現型の特徴を決定することを包含する。実施形態で用いられ得る顕微鏡技術の例としては、例えば、明視野顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、ライトシート顕微鏡、または任意の種類の超解像イメージングモダリティ、例えば、誘導放出制御（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ：ＳＴＥＤ）顕微鏡、光活性化局在顕微鏡（ｐｈｏｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＰＡＬＭ）、走査型近接場光顕微鏡（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＮＳＯＭ）、４Ｐｉ顕微鏡、構造化照明顕微鏡（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＩＭ）、基底状態枯渇（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ：ＧＳＤ）顕微鏡、スペクトル精密距離顕微鏡（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＤＭ）、確率的光学再構築顕微鏡（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＴＯＲＭ）が挙げられる。さらに、細胞内の一粒子追跡法（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ：ＳＰＴ）または蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）もまた用いられてよい。顕微鏡解析は、固定した時点で、または微速度撮影画像化を用いて行ってよい。
【００３７】
原子間力顕微鏡を用いて機械的特性を測定すること、指標の色素もしくはマイクロ電極を用いる膜電位、イメージング質量分析法を用いる低分子分泌、または特化されたバイオセンサーアレイなど、表現型の他の測定もまた可能である。培養デバイスに直接接続された近接場光学アレイ検出器もまた可能である。
【００３８】
細胞株の表現型の特徴が一旦決定されれば、細胞は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に好ましくは定着される。細胞定着は、当該分野で周知の技術によって行ってよい。例えば、ホルムアルデヒドを細胞固定のために用いてよい。非限定的な例では、細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて約１５分またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて約３０分間固定する。
【００３９】
ある実施形態では、固定された細胞をインサイチュ遺伝子型決定の前に透過化する。細胞の透過化のために伝統的に使用される種々のプロトコールを、この実施形態によって用いてよい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（例えば、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）または別のサーファクタント、例えば非イオン性サーファクタントを用いてよい。あるいは、エタノール、例えば、７０％エタノールを、細胞透過化のために用いてもよい。さらなる例としては、塩酸、例えば、０．１Ｍの塩酸（必要に応じて、ペプシン、例えば、０．０１％ペプシンなどのプロテアーゼ、または細菌の細胞壁を分解するためのリゾチームと組み合される）が挙げられる。
【００４０】
ある実施形態では、固定の前に可変の配列またはその一部を改変または増幅するための１つ以上の酵素を発現または活性化するよう細胞を誘導する。非限定的な例としては、バーコードおよび近接する配列のＲＮＡへの転写を導く転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの活性化または不活性化、染色体ＤＮＡから可変配列を切り出す制限酵素、この可変配列を含むＤＮＡを切り出すトランスポザーゼ、ローリングサークル増幅のためのテンプレートを形成するためにｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを連結するリガーゼなどが挙げられる。
【００４１】
インサイチュ遺伝子型決定は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、各々の細胞株の可変領域の少なくとも一部をインサイチュ遺伝子型決定することを包含する。従って、各々の細胞株の完全な可変領域をインサイチュ遺伝子型決定することが絶対的に必要なわけではない。従って、本明細書に用いられるインサイチュ配列決定は、可変領域の少なくとも一部または実際に完全な可変領域をインサイチュ配列決定することを包含する。このインサイチュ配列決定は、異なる細胞株の間の可変領域における任意のヌクレオチドの相違およびどこでこれらのヌクレオチドの相違が異なる表現型を生じるかを示す情報を好ましくは出力する。
【００４２】
ある実施形態では、インサイチュ遺伝子型決定は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４３（６１７７）：１３６０〜１３６３に記載されるような、蛍光インサイチュ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）の技術に基づく。要するに、ＦＩＳＳＥＱでは、細胞内のｃＤＮＡアンプリコンを、逆転写酵素および逆転写（ＲＴ）の間のアミノアリルデオキシウリジン５’−三リン酸塩（ｄＵＴＰ）の組み込みを用いて、固定された細胞中で生成する。このｃＤＮＡを、４ｎｍのスペーサーを有するアミン反応性リンカーであるＢＳ（ＰＥＧ）９を用いて再固定する。ｃＤＮＡフラグメントを次いで、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の前に環化する。ＢＡ（ＰＥＧ）９を次いで用いて、アミノアリルｄＵＴＰを含むＲＣＡアンプリコンを架橋する。ライゲーションによるＳＯＬｉＤ配列決定を次いで用いて、ＲＣＡアンプリコン中の関連の配列を配列決定して、可変領域のヌクレオチド配列を得てもよい。
【００４３】
ある実施形態では、可変領域のインサイチュ遺伝子型決定は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置での可変領域または少なくともその一部のライゲーションによるインサイチュ配列決定を好ましくは包含する。ライゲーションによる配列決定は、塩基対ミスマッチに対するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）リガーゼの感度に依存する。一般には、配列決定すべき可変領域は、好ましくは、アンカープライマー結合配列として機能する既知の配列によって少なくとも１端に隣接される、一本鎖ＤＮＡ配列の形態である。既知の配列に対して相補的であるアンカープライマーは、公知の配列に結合される。
【００４４】
通常は８〜９塩基長であるプローブオリゴヌクレオチドの混合されたプールが次いでもたらされ、配列決定される位置によって、通常は蛍光色素を用いて標識される。これらの標識されたオリゴヌクレオチドは、アンカープライマーの隣の可変領域にハイブリダイズして、ＤＮＡリガーゼはオリゴヌクレオチドを、そのヌクレオチド配列が未知の可変領域にマッチする場合、アンカープライマーに優先的に連結する。この分子によって生じる蛍光に基づいて、当業者は、可変領域のこの位置で塩基の同一性を推測し得る。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプローブはまた切断可能連結で構築されてもよく、それは標識を特定した後に切断され得る。これにより、標識の除去およびライゲーションされたプローブの末端上での５’−リン酸塩の再生の両方が行われ、それによってライゲーションの新しい回が可能になる。ライゲーションおよび切断のこのサイクルを数回繰り返して、より長い配列を読み取ってもよい。この技術によって可変領域中でＮ番目の塩基ごとに配列を決定し、ここでＮとは切断後に残るプローブの長さである。可変領域中のスキップした位置を配列決定するために、アンカープライマーおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドが可変領域から取り除かれて、ライゲーションによる別の回の配列決定が、塩基が１つ以上短いアンカープライマーで開始される。
【００４６】
別の技術は、標識がプローブ中の種々の位置に対応する単一ライゲーション、続いてアンカープライマーおよびライゲーションされたプローブを取り除くことを反復回行うことである。
【００４７】
ライゲーションによる配列決定は、標識によってブロックされるオリゴヌクレオチドプローブの末端がどちらか次第で、いずれの方向に（５’−３’または３’−５’）進行されてもよい。
【００４８】
ある実施形態では、配列決定される配列は、好ましくは、可変領域から得られるＲＮＡ転写物の逆転写によって得られる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列である。この実施形態では、この可変領域には、アンカープライマーが結合する少なくとも１つの既知の配列が隣接する。
【００４９】
ライゲーションによる配列決定を定着された細胞で行って、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、可変領域または少なくともその一部のライゲーションによるインサイチュ配列決定を達成してもよく、例えば、その教示がライゲーションによるインサイチュ配列決定を行うことに関して参照によって援用される、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４，３４３：１３６０〜１３６３、およびＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，１０：８５７〜８６０を参照のこと。
【００５０】
要するに、１つの変形では、可変領域から得られたＲＮＡ、またはバーコード（下をさらに参照のこと）を逆転写によってｃＤＮＡにコピーし、その後に、ＲＮａｓｅを用いてｍＲＮＡ鎖を分解する。
【００５１】
第一の実施形態では、パッドロックプローブは、ライゲーションによる配列決定のために標的される塩基にまたがってプローブ末端の間にギャップを有してｃＤＮＡに結合する。このギャップをＤＮＡ重合およびＤＮＡライゲーションによって充填してＤＮＡ環を生成する。
【００５２】
第二の実施形態では、ｃＤＮＡ環化は、ｓｓＤＮＡライゲーションのみで行われる。
【００５３】
第三の実施形態では、可変配列および近接するＤＮＡの少なくとも一部を含むｄｓＤＮＡを、囲んでいるＤＮＡから、例えば、制限酵素またはトランスポザーゼによって切り出す。切り出したｄｓＤＮＡを次いでエンドヌクレアーゼによってｄｄＳＮＡに消化して、自己ハイブリダイズしライゲーションして環状ＤＮＡを形成してもよい。
【００５４】
いずれの場合でも、形成されたＤＮＡ環を、ライゲーションによる配列決定に供されるローリングサークル生成物（ＲＣＰ）を生成する標的プライミングのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅する。アンカープライマーは、オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションの前に、標的化配列の隣にハイブリダイズされる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、８つのランダムな位置（Ｎ）および１つの固定位置（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）を有する、９マーの４つのライブラリーからなる。各々のライブラリーを、４つの蛍光色素のうちの１つで標識する。固定位置でベストマッチするオリゴヌクレオチドプローブが、その蛍光標識と共にライゲーションによって組み込まれる。このサンプルは画像化され、各々のＲＣＰはマッチした塩基に相当する色を呈する。オリゴヌクレオチドプローブを、次の塩基についてのオリゴヌクレオチドプローブの適用の前に洗い流す。ライゲーション、洗浄、画像化およびストリッピングのステップを、所望の数の塩基が読み取られるまで反復する。
【００５５】
別の実施形態では、インサイチュ遺伝子型決定は、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、可変領域または少なくともその一部の合成によるインサイチュ配列決定を包含する。
【００５６】
例えば、さらなる重合化をブロックするターミネーターを含む修飾された４種のｄＮＴＰを追加する。ターミネーターはまた、カメラによって検出可能な蛍光標識を含む。非組み込みのヌクレオチドを洗い流し、蛍光的に標識されたヌクレオチドの画像を撮る。ターミネーターと共に蛍光標識をＤＮＡから化学的に取り除き、次のサイクルの配列決定を可能にする。
【００５７】
インサイチュ遺伝子型決定の結果は好ましくは、各々の細胞株についての可変領域または少なくともその一部のヌクレオチド配列である。各々のヌクレオチド配列を、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置にさらに関連付ける。これは、遺伝子型決定が、ライゲーションまたは合成によるインサイチュ配列決定などのインサイチュ遺伝子型決定として行われるので、可能である。ここで、インサイチュとは、遺伝子型決定が、部位上でまたは位置中で、すなわち、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で行われることを意味する。
【００５８】
以前に記載されている表現型検査の出力は、各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置について決定された表現型の特徴（単数または複数）を列挙するリストまたは行列の形態でのような、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置についての、それぞれの決定された表現型の特徴であった。
【００５９】
インサイチュ遺伝子型決定の出力は、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置で可変領域について決定されるヌクレオチド配列である。この出力はまた、各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置について決定されるヌクレオチド配列を列挙するリストまたは行列の形態であってもよい。
【００６０】
例えば、リストは、位置０＝配列０、位置１＝配列１、位置２＝配列２などの形態であってよい。行列は、位置（ｘ，ｙ）＝配列０、位置（ｘ＋１，ｙ）＝配列１の形態であってよい。
【００６１】
各個別の表現型の特徴は次いで、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に基づいて、各個別の遺伝子型に関連付けされても、または関係付けされてもよい。例えば、培養デバイス中の０位置での細胞株の細胞について決定される表現型の特徴は、この細胞株の細胞の遺伝子型の結果であり、この遺伝子型は、位置０について決定されるヌクレオチド配列から得られる。従って、表現型および遺伝子型の関連は、培養デバイス中の各々の空間的に定義されかつ隔てられた位置について決定される表現型の特徴および遺伝子型を単にマッチさせることによって達成され得る。
【００６２】
ある実施形態では、各々の細胞株は、その遺伝物質中で、好ましくはそのゲノム１００中で、それぞれの株特異的なバーコード配列１４０を有する（図８を参照のこと）。このような場合、インサイチュ遺伝子型決定は、培養デバイス１中の空間的に定義されかつ隔てられた位置での各細胞株のそれぞれのバーコード配列１４０の少なくとも一部をインサイチュ配列決定することによって、それぞれの遺伝子型を決定することを好ましくは包含する。
【００６３】
従って、バーコード配列１４０は、細胞株中の可変領域１５０の決定への橋渡しを行う。具体的には、インサイチュ遺伝子型決定は、可変領域１５０を配列決定する代わりに比較的かなり短いバーコード配列１４０を、ライゲーションまたは合成によるインサイチュ配列決定などのインサイチュ配列決定によって行われてもよい。可変領域１５０のヌクレオチド配列を次いで、配列決定されたバーコード配列１４０およびマッピング情報に基づいて下記のように得てもよい。
【００６４】
方法は、各可変領域１５０とそれぞれのバーコード配列１４０との間の関連を特定するマッピング情報を決定することを好ましくは包含する。それぞれの遺伝子型を決定することはしたがって、インサイチュで配列決定された少なくとも一部のそれぞれのバーコード配列およびマッピング情報に基づいて、それぞれの遺伝子型を決定することを好ましくは包含する。
【００６５】
マッピング情報はしたがって、少なくとも一部のバーコード配列１４０の入力ヌクレオチド配列を受けた可変領域１５０のヌクレオチド配列を出力する参照テーブルとみなしてもよい。このマッピング情報はしたがって、各々の可変領域１５０についてそれぞれのバーコード配列１４０を列挙する表の形態であってもよい。
【００６６】
マッピング情報は、細胞株のライブラリーを生成することに関連して得てもよい。例えば、ゲノム工学を用いて、図８の種々のポイントミューテーション１５５で示されるように、可変領域１５０に関して遺伝的多様性を有する細胞株の大型ライブラリーを作製できる。このような技術はまた、種々の可変領域１５０についてそれぞれのバーコード配列１４０を仕立てるために用いられてもよい。例えば、細胞株のライブラリーは、バーコード配列番号１が可変配列番号１を有する細胞株のゲノム１００に含まれるなど、のように設計されてもよい。これは、バーコード１４０が可変領域１５０に含まれるか、またはその直近にあることを通常は必要とする。
【００６７】
別の実施形態では、バーコード配列１４０および可変領域１５０は、同じ反応では導入されない。マッピング情報は次いで細胞株のライブラリーをバルクで配列決定することによって決定されて、各細胞株について、可変領域１５０およびそれぞれの特異的なバーコード配列１４０を包含する配列読み取りを得る。これによって、バーコード配列１４０は単一の配列読み取りができるほど可変領域１５０から離される。
【００６８】
したがって、ライブラリー中のほとんどの細胞のゲノムまたは染色体の関連の領域は、個々の読み取りが可変領域１５０およびバーコード配列１４０を包含するような方法で、バルクで配列決定される。バルク配列決定の結果はしたがって、各細胞株について読み取られた配列のヌクレオチド配列である。この情報はしたがって記憶されマッピング情報として用いられてよい。
【００６９】
バーコード配列１４０はまた、染色体中の別の位置に導入されてもよいし、またはプラスミドのような移動性の遺伝的エレメント中で維持されてもよい。これらの場合には、可変領域１５０およびバーコード配列１４０を細胞内に同時に導入する方法によって、バーコード配列１４０を可変領域１５０に関連付ける。例えば、可変領域１５０は、対応するバーコード配列１４０も担持するプラスミドの一部として細胞に送達されてもよい。
【００７０】
ある実施形態では、各々の細胞株は、既知のヌクレオチド配列のライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０に隣接して、そのゲノム１００中にそれぞれの株特異的なバーコード配列１４０および可変領域１５０を含んでいる構築物を有する。ライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を用いてそれぞれの株特異的なバーコード配列１４０を増幅してもよい。あるいは、少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を用いて、ゲノム１００から直接または転写されたＲＮＡ配列２００を介して、それぞれの株特異的なバーコード配列１４０を配列決定してもよく（図９を参照のこと）、それはｃＤＮＡ配列３００に逆転写される（図１０を参照のこと）。
【００７１】
したがって、この実施形態では、各々の細胞株は、そのゲノム１００または移動性の遺伝的エレメント中にバーコード配列１４０を有する。このバーコード配列１４０は、本明細書において前に記載されるように細胞株のライブラリーを作成する場合に可変領域１５０と一緒に有利に作成される。バーコード配列１４０は株特異的であり、このことは、各細胞株、すなわち、可変領域１５０の遺伝子型またはバーションが、バーコード１４０についてそれ自体の特異的なヌクレオチド配列を有することを意味する。したがって、このライブラリーは、異なる可変領域１５０を有するが同じバーコード配列１４０を有する２つの異なる細胞株を好ましくは含まない。
【００７２】
株特異的なバーコード配列１４０とは対照的に、少なくとも１つのプライマー結合配列１６０、１７０は、好ましくはライブラリー共通または株共通であって、このことは、この少なくとも１つのプライマー結合配列１６０、１７０がライブラリーの全ての細胞株中に同じヌクレオチド配列を好ましくは有することを意味する。よって、プライマー結合配列１６０または配列１６０、１７０に相補的である全く同じプライマーまたはプライマー対がしたがって、全ての細胞株中で増幅または配列決定の目的で用いられ得る。
【００７３】
第一の実施形態では、構築物は、１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を含む。このような場合、ライブラリー共通プライマー結合配列１６０はバーコード配列１４０（および可変領域１５０）の上流に提供されてよく、またはライブラリー共通プライマー結合配列１７０はバーコード配列１４０（および可変領域１５０）の下流である。
【００７４】
第二の実施形態では、構築物は、２つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を含む。このような場合、図８に示されるように、１方はバーコード配列１４０（および可変領域１５０）の上流に好ましくは提供され、もう１方はバーコード配列１４０（および可変領域１５０）の下流に位置する。次いで、これらの２つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を、バーコード配列１４０の周囲のパッドロックプローブの結合部位として用いてもよい。
【００７５】
図８は、ライブラリーの細胞株中のゲノム１００の一部分の例を示す。図９は、株特異的バーコード配列１４０、可変領域１５０および少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を有する構築物を転写することによって得られる、転写されたＲＮＡ配列２００またはｍＲＮＡ配列２００を示す。図１０は、図９のＲＮＡ配列２００を逆転写することによって得られるｃＤＮＡ配列３００を示す。
【００７６】
図８〜１０では、参照番号１Ｘ０、２Ｘ０、３Ｘ０を用いており、Ｘ＝３−７はゲノム１００中、転写されたＲＮＡ配列２００中またはｃＤＮＡ配列３００中の対応するヌクレオチド配列部分を表す。
【００７７】
図８はさらに、株特異的バーコード配列１４０、可変領域１５０および少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を含む構築物を転写するのに用いられるプロモーター配列１１０を示す。ゲノム１００は、プロモーター配列１００および構築物の転写を制御する、少なくとも１つの調節性配列１２０を必要に応じて含んでよい。
【００７８】
ある実施形態では、ライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を用いて、株特異的バーコード配列１４０および必要に応じてまた可変領域１５０を、例えば、インサイチュポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。少なくとも株特異的バーコード配列１４０の増幅は、株特異的バーコード配列１４０の十分なコピー数を得てインサイチュ配列決定を行うために、株特異的バーコード配列１４０をインサイチュ配列決定する前が有利であり得る。
【００７９】
増幅は、細胞ライブラリー中のゲノム配列１００に対して直接行ってもよい。しかし、ゲノム１００中に株特異的バーコード配列１４０、おそらく可変領域１５０および少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を有する構築物を転写することによって得られる転写ＲＮＡ配列２００のインサイチュ逆転写を最初に行うことが好ましい場合がある。このような場合には、ＲＮＡ配列２００中のライブラリー共通プライマー結合配列２６０に対して相補的なＤＮＡプライマー３６０を、逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと一緒に加えて、図９に模式的に図示されるようにｃＤＮＡ配列３００をインサイチュ生成する。増幅は次いで、生成されたｃＤＮＡ配列３００から行う。
【００８０】
増幅は、ある実施形態では、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼまたはパッドロックプローブのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを用いる環化後の、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるｃＤＮＡ配列３００のインサイチュ増幅の形態であってよい。あるいは、ｃＤＮＡ配列３００のインサイチュ増幅は、インサイチュＰＣＲによって行われてもよい。
【００８１】
ｃＤＮＡ配列から環状ＤＮＡ配列を形成するためのパッドロックプローブの用法は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，１０：８５７〜８６０に記載されており、その文書の図１を例えば、参照のこと。
【００８２】
得られたｃＤＮＡ配列３００を次いで、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｃＤＮＡ配列３００中のライブラリー共通プライマー結合配列３６０に相補的なＤＮＡプライマーによって増幅してもよい。得られたｃＤＮＡ配列３００中の株特異的バーコード配列３６０のインサイチュ配列決定を次いで、本明細書にさらに記載されるように行ってもよい。
【００８３】
ある実施形態では、方法は、遺伝物質１００からそれぞれの株特異的バーコード配列１４０を切除、好ましくはインサイチュまたはインビボ切除後に、ローリングサークル増幅によって、遺伝物質１００からのそれぞれの株特異的バーコード配列１４０をインサイチュ増幅すること、またはそれぞれの株特異的バーコード配列１４０をインサイチュ配列決定することを包含する。
【００８４】
それぞれの株特異的バーコード配列１４０を、消化またはトランスポーズ活性を用いて、遺伝物質１００から好ましくは切り出す。方法は好ましくはまた、パッドロックプローブをハイブリダイズすることによって、または自己ハイブリダイゼーション後のｓｓＤＮＡライゲーションもしくはｄｓＤＮＡライゲーションによって、エキソヌクレアーゼ反応および環化において、切り出された株特異的バーコード配列１４０からｓｓＤＮＡを作製することを包含する。
【００８５】
少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を、代替的に、または追加して用いて、ゲノム１００由来のそれぞれの株特異的バーコード配列１４０を配列決定してもよい。このような場合には、ライブラリー共通プライマー結合配列１６０は、ライゲーションによるインサイチュ配列決定のためのアンカープライマー結合配列、または合成によるインサイチュ配列決定のためのプライマー結合配列に相当する。
【００８６】
インサイチュ配列決定は、上記のように細胞株のゲノム１００で直接行ってもよい。しかし、株特異的バーコード配列１４０、可変領域１５０および少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０を含むゲノム１００中の構築物を転写することによって得られるＲＮＡ配列２００を逆転写することによって、ｃＤＮＡ配列３００を生成することが一般には好ましい。このような場合には、株特異的バーコード配列３４０のインサイチュ配列決定を開始する前に、ｃＤＮＡ配列３００をインサイチュ増幅することが可能である。
【００８７】
ループ媒介性等温性増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）またはニッキング（ｎｉｃｋｉｎｇ）酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）のような等温性増幅技術を用いることによって、バーコード配列１４０を含むゲノム領域を直接増幅することも可能である。
【００８８】
別の実施形態では、ＲＣＡテンプレートは、２つの末端のハイブリダイゼーションおよび連続的ライゲーションを媒介する逆転写プライマーを用いることによって、ｃＤＮＡ３００を自己ライゲーションさせることにより形成される。例えば、ｃＤＮＡ３００は、好ましくは少なくとも６塩基対を超える、ニックのある二本鎖ＤＮＡへとそれが自己ハイブリダイズした後に、ライゲーションされる。
【００８９】
ある実施形態では、方法は、各々の細胞株について、転写されたＲＮＡ配列２００中の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列２６０に相補的なプライマー３６０、および逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、転写されたＲＮＡ配列２００からｃＤＮＡ配列３００を合成することを包含する。このような場合には、インサイチュ配列決定は、培養デバイス１中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、各細胞株のｃＤＮＡ配列３００中のそれぞれの株特異的バーコード配列３４０の少なくとも一部をインサイチュ配列決定することを好ましくは包含する。
【００９０】
インサイチュ配列決定は、それぞれの株特異的バーコード配列３４０の少なくとも一部のライゲーションによるもしくは合成によるインサイチュ配列決定によって行ってもよい。
【００９１】
株特異的バーコード配列３４０のインサイチュ配列決定は、以前に言及された少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列３６０，３７０を用いて行ってもよい。あるいは、専用の配列決定プライマー結合配列１３０が、ゲノム１００中に、好ましくはバーコード配列１４０の直接上流に提供されてもよい。この配列決定プライマー結合配列１３０は、好ましくは既知のヌクレオチド配列を有し、かつ有利なことに、ライゲーション中の全ての細胞株についてライブラリー共通である。
【００９２】
このアプローチでは、少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列１６０、１７０は、逆転写および増幅目的に主に用いられ、配列決定プライマー結合配列１３０は、株特異的バーコード配列１４０のインサイチュ配列決定に用いられる。
【００９３】
特異的な実行では、バーコード配列１４０のみが、対応するｃＤＮＡの増幅または環化のために、隣接する配列１６０、１７０と共に転写される（図１１を参照のこと）。転写されたバーコード配列１４０は、可変領域１５０から離れて組み込まれるが、可変領域１５０とバーコード配列１４０との間のマッピングは、細胞ライブラリーの対応する領域がバルクで配列決定されるとき、個々の配列決定読み取りを通じて得ることができる。この実行の利点は、バーコード配列１４０およびその隣接する領域１６０、１７０が、バーコード配列１４０が可変領域１５０よりもかなり大きい多様性を有する限り、可変領域１５０の組織とは独立して選択され得るということである。例えば、１５塩基対（ｂｐ）のランダムなバーコード配列によって、４１５〜１０９個の異なるバーコードの組み合わせが可能になる。対応する可変領域が１０６個の改変体を有する場合、１つのバーコード配列が２つの異なる可変領域に適合するリスクは、０．００１でしかない。
【００９４】
図１２は、図１１に示されるゲノム１００の転写された部分から得られたｃＤＮＡ配列３００を示す。ｃＤＮＡ配列３００中のバーコード配列または領域３４０に隣接する、２つのライブラリー共通プライマー結合配列３６０、３７０は、本明細書において前に記載のとおり、増幅、パッドロックプロービングまたはアンカー−プライマーライゲーションに用いてよい。
【００９５】
一旦、株特異的バーコード配列１４０のヌクレオチド配列が決定されれば、マッピング情報を用いて、この特別な株特異的バーコード配列１４０にマッチする可変領域１５０の対応するヌクレオチド配列を得てもよい。これを好ましくは、ライブラリー中の各細胞株について行い種々の遺伝子型を決定する。この結果は従って、培養デバイス中の各空間的に定義されかつ隔てられた位置についてのそれぞれの遺伝子型である。この遺伝子型は次いで、以前に決定された表現型の特徴にマッチされるか、または関連付けされ、それによって、細胞株のライブラリー中の決定された表現型の特徴を生じた特定の遺伝子型の情報が得られる。
【００９６】
ある実施形態では、細胞株のライブラリーは、異なる細胞株が、示差的にバーコードを付けられた染色体外の遺伝的エレメントから異なるＲＮＡ生成物を発現するということによって特徴付けられる。このＲＮＡ生成物は、例えば、ｄＣａｓ９のｍＲＮＡ、ｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡであってよい。
【００９７】
実施形態の別の局面は、細胞株のゲノムの少なくとも一部において異なる可変領域を有する複数の細胞株のライブラリーを特徴付けるためのシステムに関する。このシステムは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞株の細胞を培養するために構成される培養デバイスを含む。このシステムはまた、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞の固定後に各細胞株の可変領域をインサイチュ遺伝子型決定するための構成要素を含む第一のキットを備える。このようなシステムを用いて、各細胞株のそれぞれの表現型の特徴が、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に基づいて、各個別の遺伝子型にて関連付けられ得る。
【００９８】
ある実施形態では、システムはまた、培養デバイス中の各々の細胞株の表現型の特徴および遺伝子型を決定するために構成される顕微鏡を備える。従って、このシステムの顕微鏡を用いて、培養デバイス中のそれぞれの空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞株のそれぞれの表現型の特徴をモニターおよび決定する。この顕微鏡を好ましくは、インサイチュ配列決定の間にも用いて、蛍光シグナルを読み取る。
【００９９】
ある実施形態では、システムはまた、複数の細胞株のライブラリーを含む。細胞株のこのライブラリーは、種々の遺伝子型の大きいライブラリーを生成するためにゲノム遺伝子工学のための技術を用いて、本明細書に以前に記載のとおり生成され得る。
【０１００】
このようなライブラリーでは、可変領域とバーコード配列との間のマッピングは、好ましくはバーコード配列のみが遺伝子型を決定するために配列決定される必要があるように、提供される。
【０１０１】
ライブラリーは、例えば、特定の生物体由来の細胞中の各々の遺伝子に関する活性の条件付き抑制または活性化に基づいてもよい。例えば、可変領域が、個々の遺伝子の遺伝子活性がｄＣａｓ９媒介性の調節によって変更可能であるように、生物体中の各々の転写された領域について１つまたは２〜３個の短いガイドＲＮＡをコードしてもよい。
【０１０２】
システムの培養デバイスは、種々の実施形態によって構築されてよい。ある実施形態では、培養デバイスは、複数のウェル、パッチまたは区画、好ましくはライブラリーの１つの細胞株あたり少なくとも１つのウェル、パッチまたは区画を含む培養デバイスまたはプレートである。例えば、９６×９６ウェルなど数千個のウェルを有する細胞プレートは、細胞培養目的のために市販されている。このような細胞プレートを、実施形態において培養デバイスとして用いてもよい。このような場合、各々のウェルは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置に対応する。
【０１０３】
培養プレートは好ましくは、画像化のために透明であるプラスチック材料もしくはガラスであるか、または空間的にアドレス可能であるバイオセンサーもしくは光検出器アレイ上に直接構築される。
【０１０４】
別の実施形態では、培養デバイスは、そこで細胞株の細胞が接着して増殖できる、複数の空間的に定義されかつ隔てられたパッチを有する基板である。この基板は、画像化のために透明であるプラスチック材料またはガラスから好ましくはできている。この基板は、ある実施形態では、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置を構成する複数のマイクロウェルを有する顕微鏡スライドの形態であってよい。このマイクロウェルの表面は、必要に応じて、細胞接着を容易にするために処理されても、またはコーティングされてもよい。
【０１０５】
代替的なアプローチは、複数のパッチを有する顕微鏡スライドまたは他の基板を有することであり、この複数のパッチは細胞接着を容易にして促進するために表面処理されるかもしくはコーティングされた、顕微鏡スライドまたは他の基板のそれぞれの部分を構成する。このことは、ライブラリーの細胞はパッチ上では容易に接着して増殖するが、この細胞は、接着促進性の表面処理またはコーティングを欠いている顕微鏡スライドまたは他の基板の中間表面部分には効率的に接着しないことを意味する。このことは、顕微鏡スライドまたは他の基板に培養培地を加えることによって、中間表面部分に存在する細胞はフラッシュされるが、パッチ上で増殖する細胞は表面に固く接着されたままであることを意味する。まばらに播種した場合、この方式は、各々のパッチでの同質遺伝子細胞の増殖を支持する。
【０１０６】
パッチまたはウェルは、例えば、ポリリジン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ラミニンおよび／またはゼラチンでコーティングされてよい。
【０１０７】
実施形態によって用いられ得る培養デバイスのさらなる情報は、Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２０，１０９９〜１１０３，２０１０に見ることができる。
【０１０８】
ある実施形態では、培養デバイスは、マイクロ流体デバイス１である（図１〜７を参照のこと）。このマイクロ流体デバイス１は、画像化のために透明であって、かつ複数の空間的に定義され隔てられた細胞チャネル２０を有する基板１０を備える。このチャネル２０は、単層で細胞を収容する寸法を有する。複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル２０のそれぞれの末端２２はフローチャネル３０と液体接続されており、フローチャネル３０はフローチャネル３０の第一の末端３２中に流体ソース３１およびフローチャネル３０の第二末端３４に流体シンク３３を有している。
【０１０９】
基板１０は、その中で細胞株の細胞が培養される、複数の細胞チャネル２０を有する。細胞チャネル２０は、図１および図３〜７に示されるように並行して配列されてよく、それぞれの末端２２は、フローチャネル３０と液体接続されており、かつこのフローチャネル３０から伸びている。細胞チャネル２０の総数を増大するために、細胞チャネル２０は、フローチャネル３０のいずれの長軸方向側から伸びてもよく、それによって、フローチャネル３０の片側上に細胞チャネル２０を有するだけであることと比較して、細胞チャネル２０の数を実質的に倍にする（図６を参照のこと）。
【０１１０】
また、細胞チャネル２０およびフローチャネル３０のさらに複雑な配置によって、基板１０中で、フローチャネル３０の数を増やすことが可能になる（図７を参照のこと）。重要な特徴は、各細胞チャネル２０がフローチャネル３０と液体接続して末端２２を有すること、ならびに細胞が１つの細胞チャネル２０から脱出すること、および別の細胞チャネル２０に入ることを防ぐように細胞チャネル２０が隔てられていることである。
【０１１１】
細胞チャネル２０は、細胞を単層で収容するように寸法付けられる。これは、細胞チャネル２０の高さまたは直径が、ライブラリー中の細胞の直径とほぼ同じであるかまたはわずかに大きくなるように選択されることを意味する。例えば、細胞チャネル２０は、図２および４に示されるように断面が実質的に正方形であってよく、チャネルの側面は細胞の細胞径に実質的に適合する。あるいは、この細胞チャネルは、円形またはＵ字形状の断面を有してもよく、ここで直径は実質的に細胞径に実質的に適合する。また他の断面形状も、細胞が、細胞チャネル２０中で、好ましくは単層で、生存可能に培養され得る限り、可能である。これは、細胞チャネル２０が、数個の細胞の幅であるが、優先的に１つの細胞の高さしかない場合があることを意味する。この場合、細胞は細胞チャネル中で増殖して、２Ｄの単層（１つの細胞よりは広い幅であってもよいが、好ましくはやはり単層である）を形成し得る。２Ｄ単層は一般に、単一のライン、１つの細胞幅で細胞を増殖することに比較して、細胞の位相差画像化を容易にする。
【０１１２】
フローチャネル３０は好ましくは、細胞の直径よりも有意に大きい寸法を有する。このことは、フローチャネル３０に入るいずれの細胞も、液体ソース３１からフローチャネル３０を通じてフローシンク３３への培養培地の好ましくは連続フローによって、フローチャネル３０を通じて流体シンク３３に向かってフラッシュされることを意味する。
【０１１３】
ライブラリーの細胞は、各々の細胞チャネル２０中にそれぞれの細胞株の細胞を添加することによって播種される。細胞はそれによって、細胞チャネル２０の長さに沿って、単層で増殖され得る。各細胞チャネル２０はそれによって、単一の細胞株および遺伝子型の細胞を含む。細胞チャネル２０中の細胞は、細胞チャネル２０が１細胞の幅である場合、糸上の真珠のように見える場合がある。細胞チャネル２０がより幅広の場合、細胞は細胞チャネル２０中で２Ｄ層を形成する。  
【０１１４】
細胞チャネル２０の末端２２を超えて増殖および遊走する細胞はフローチャネル３０に入り、したがってフラッシュされる。細胞チャネル２０の他の反対側の末端２８は好ましくは、細胞がこの末端２８から脱出することを防ぐように閉じられるか、または寸法決めされる。あるいは、細胞チャネル２０のこれらの末端２８は、第二のフローチャネルと液体接続されてもよい。このような場合、細胞チャネル２０から脱出するいかなる細胞も、この第二のフローチャネル中の培養培地のフローからフラッシュされる。  
【０１１５】
流体ソース３１を用いて、培養培地をフローチャネル３０中に、さらに細胞チャネル２０中に入れる。培養培地は、フローシンク３３を通じて出される。好ましくは、流体シンク３１からフローチャネル３０を通じ細胞チャネル２０中へのおよび流体シンク３３の外側への、培養培地の連続フローがある。
【０１１６】
培養培地は好ましくは、生存度および必要に応じてまた細胞増殖をも支持するためにライブラリー中の細胞により必要とされる成分を含む。使用する特定の培養培地は細胞種のライブラリーに依存し、システムの使用者によって選択され得る。
【０１１７】
流体ソース３１を用いて細胞チャネル２０中の細胞に試験因子として任意の化学薬品または薬物を、例えば流体ソース３１に入る培養培地に少なくとも１つの試験因子を添加することにより、添加することも可能である。このような場合、培養デバイス１中での少なくとも１つの試験因子に対する細胞株の表現型応答は、例えば、顕微鏡によって決定され得る。
【０１１８】
細胞チャネル２０の内面または少なくともその底面は、細胞接着を促進するために、および／または酵素的段階での酵素およびプローブの結合を低下するために、表面処理またはコーティングされてよい。
【０１１９】
図１および図２は、ラインＡ−Ａに沿う、図１におけるマイクロ流体デバイス１の断面図を示しており、最新技術に関する実施形態が、細胞チャネル２０を通じた培養培地のフローを著しく改善するが、細胞チャネル２０中の細胞の固定の前、間および後に、細胞チャネル２０中での細胞ローディング、細胞の洗浄およびインキュベーションのステップを促進もすることを示す。
【０１２０】
図示された実施形態では、各々の細胞チャネル２０は、その長軸方向側２４、２６のうちの少なくとも１つに沿って、フローチャネル３０と液体接続した第一の末端４２、および洗浄シンク５０と液体接続した第二の反対側末端４４を有する、それぞれの洗浄チャネル４０と隣接する。この洗浄チャネル４０は、細胞を収容するには小さすぎる寸法を有する。
【０１２１】
ある実施形態では、各々の細胞チャネル２０は、細胞チャネル２０と液体接続しており、かつその長軸方向側２４、２６の１つに沿って配列される少なくとも１つの洗浄チャネル４０を有する。図１および２に示される実施形態は、各々の細胞チャネル２０の両方の長軸方向側２４、２６に沿って配列された洗浄チャネル４０を有する。
【０１２２】
ある実施形態では、洗浄チャネル４０は、それらの末端４４の一方または両方でなど、相互接続されてもよく、それによって細胞チャネル２０の周囲の連続洗浄層が形成される。
【０１２３】
洗浄チャネル４０（または洗浄層）の寸法、例えば、深さ、高さおよび／または幅は、細胞を収容するには小さ過ぎる。これは、細胞チャネル２０中に存在する細胞が、隣接する洗浄チャネル４０には入れないが、細胞チャネル２０中に保持されていることを意味する。図２は、細胞チャネル２０と比較して洗浄チャネル４０の比較的小さい深さを明らかに示す。この洗浄チャネル４０は、正方形、長方形、円形、Ｕ字形など任意の断面構成を有してもよい。
【０１２４】
ある実施形態では、洗浄チャネル４０は、図１に示されるような洗浄層を形成する。これは、洗浄チャネル４０が、細胞チャネル２０の長軸方向側２４、２６に沿ってのみ存在するのではなく、細胞チャネル２０のそれぞれの第二の末端２８からシンクチャネル５２に伸びてもよいことを意味する。従って、第一のセットの洗浄チャネル４０は、細胞チャネル２０に沿って延び、フローチャネル３０からシンクチャネル５２に伸びる。第二のセットの洗浄チャネル４０は、細胞チャネル２０の第二の末端２８から始まり、シンクチャネル５２で終わる。第一および第二のセットの洗浄チャネル４０は、一緒になって洗浄層を形成する。
【０１２５】
細胞チャネル２０は好ましくは、フローチャネル３０のその第一の末端２２からその第二の末端２８へ向かう場合、実質的に同じ深さを有する。この深さは好ましくは、細胞チャネル２０内で細胞が単層であることが可能であるように、細胞直径に対応するか、またはそれよりわずかに長い。細胞チャネル４０の第二の末端２８では、その深さは、第二の２８からシンクチャネル５２へ伸びている洗浄チャネル４０に入る時は、より浅い。このより浅い深さ（好ましくは、細胞径より小さい）は、細胞チャネル２０中に存在する細胞が洗浄チャネル４０に入ることを妨げる。
【０１２６】
本明細書では、この後に、マイクロ流体デバイス１の操作の短い説明が続く。  
【０１２７】
細胞ローディングの間、培地と共に細胞が流体ソース３１に入り、フローチャネル３０に流れ入る。好ましい実施形態では、流体シンク３３および洗浄シンク４０の両方が開いており、培地および細胞を細胞チャネル２０内へ押し出すことが可能である。過剰な細胞は、洗浄チャネル４０の深さ（洗浄層）が細胞をシンクチャネル５２に入らせ洗浄シンク５０に到達させるには浅すぎるので、流体シンク３３を通じて洗い流される。培地は、洗浄シンク５０および流体シンク３３の両方からマイクロ流体デバイス１を出る。
【０１２８】
マイクロ流体デバイス１の操作の間、培養培地は、上記のように流体ソース３１に入る。第一の実施形態では、洗浄シンク５０および流体シンク３３は開いている。これは、培養培地が、流体シンク３３を通じてだけでなく洗浄シンク５０を通じても出ていくことを意味する。これは、インサイチュ配列決定のための培養培地および試薬が、細胞チャネル２０内の全ての細胞に効率的に達することを意味する。過剰な細胞はフローチャネル３０に流れ込み、さらに流体シンク３３から流れ出るが、培地は、全ての細胞を渡ってシンクチャネル５０の中へ、および洗浄シンク５０から外へと流れて、全ての細胞に新鮮な培養培地を供給し続ける。
【０１２９】
第二の実施形態では、洗浄シンク５０が閉じられ、その結果、培養培地および過剰な細胞は両方とも、流体シンク３３を通って出ていく。この実施形態では一般に、第一の実施形態に比べて、細胞チャネル内の細胞に渡る細胞培地のフローの効率が低い。
【０１３０】
洗浄および反応ステップでは、洗浄シンク５０は好ましくは開いている。このことは、洗浄流体または反応試薬を含む液体または溶液が流体ソース３１に入り、かつフローチャネル３０、細胞チャネル２０および洗浄チャネル４０を通って洗浄シンク５０へ向かって流れることを意味する。ある実施形態では、流体シンク３３は、洗浄するステップの間閉じている。別の実施形態では、流体シンク３３は、洗浄ステップの間開いている。このような場合、洗浄流体または液体は、洗浄シンク５０または流体シンク３３を通じて出てもよい。
【０１３１】
細胞の洗浄は、培養培地を洗い流すために細胞チャネル２０中での細胞の固定の前に、ホルムアルデヒドなどの固定化学物質を洗い流すために細胞の固定の間および／または細胞の固定の後に行ってよい。洗浄および反応ステップはまた、反応成分および反応培地を変更する必要がある場合、インサイチュ遺伝子型決定と関連させて行ってもよい。
【０１３２】
洗浄チャネル４０は好ましくは、洗浄シンク５０と液体接続しているシンクチャネル５２によって、それらの末端４４中で相互接続される。これらの図では、このシンクチャネル５２はフローチャネル３０と並行であり、洗浄チャネル４０がそれらの間に伸びている。しかし、細胞チャネル２０はフローチャネル３０と液体接続して一端２２を有するが、他の末端は好ましくはシンクチャネル５２から離れて終わり、細胞が細胞チャネル２０からシンクチャネル５２へ出ていくことを妨げる。流体ソース３１から流体シンク３３へ向かうだけでなく洗浄シンク５０へも向かう培養培地のフローが存在するように、細胞の培養の間に洗浄シンク５０が開いている場合、これによって、細胞チャネル２０全体を通じて均一な増殖条件が可能になる。
【０１３３】
細胞チャネル２０および洗浄チャネル４０は好ましくは、図２に示されるように開口チャネルである。これは、カバープレート７０が好ましくは基板１０上に位置して、細胞チャネル２０と洗浄チャネル４０のためのフタを形成して密閉することを意味する。
【０１３４】
基板１０は好ましくは、基板１０の全厚を通じて伸びてその安定性を増大するための構造または部分６０を備える。図１および図２は、細胞チャネル２０の長軸方向の長さに沿う洗浄チャネル４０のいくつかの間に提供される支柱の形態で、このような構造６０を示す。これらの支柱は、それらが洗浄層を支持し、かつフローを提供する限り、任意の形状を有してよい。それらは、例えば、長方形、星形、丸または三角であってよく、一定にもしくは不規則に配置されていてよい。これらの構造６０は、全洗浄層を通じて、すなわち、洗浄チャネル４０の間で洗浄液のフローを促進するために図に示されるような別個の構造であってもよい。別のアプローチでは、図に示される支柱の各々の支えは、フローチャネル３０とシンクチャネル５２との間の全長にわたって伸びる単一構造を形成する。このような解決法により、より効率の低い洗浄を代償にして、より安定な基板１０を得られる場合がある。
【０１３５】
図５は、マイクロ流体培養デバイス１の別の実施形態を示す。この実施形態は、細胞チャネル２０の長軸方向側２４、２６に沿って延びる洗浄チャネルを欠く。明らかに対照的に、支持性構造６０が、図に示されるように、隣接の細胞チャネル２０の間に存在し、かつフローチャネル３０からシンクチャネル５２に伸びる。洗浄チャネル４０が好ましくは存在して、細胞チャネル２０の第二の末端２８からシンクチャネル５２へ伸びる。従って、洗浄チャネル４０は、細胞チャネル２０の第二の末端２８と液体接続して第一の末端４２、およびシンクチャネル５２と液体接続して第二の反対側の末端４４を有する。この実施形態は一般には、図１に示されるような支柱様構造を用いることと比較して、より安定なマイクロ流体デバイス１を提供する。
【０１３６】
細胞チャネル２０の構造は、多重化されてもよい（例えば、図６および図７を参照のこと）。一般的な特徴は、細胞が単層で増殖するように機械的に拘束されるということ、および細胞が、それらが洗浄チャンネル４０中に押し入れられるには物理的に大きすぎるために、洗い流されることなく培地、緩衝液、酵素などで浸されるということである。細胞チャネルについてまた２つのシンクを必要とする（１つは単層に適合しない過剰な細胞を収容するため、すなわち流体シンク３３、および１つは細胞の上を流れる培地を収容するため、すなわち洗浄シンク５０）。
【０１３７】
図６のマイクロ流体デバイス１は、図５に示されるように２つの構造を基本的に多重化する。これは、細胞チャネル２０および洗浄チャネル４０の２つの構造（図の左および右）が、流体ソース３１にその第一の末端３２でおよび流体シンク３３にその第二の末端３４で接続される共通のフローチャネル３０を共有することを意味する。細胞チャネル２０および洗浄チャネル２０の各構造は、共通の洗浄シンク５０に相互接続されて、接続されるそれぞれのシンクチャネル５２で終わる。
【０１３８】
左側の構造中の細胞チャネル２０に存在する細胞は、図の右側の構造中の細胞チャネルに存在する細胞と同じ培養培地および試薬および化学薬品の流体ソース３１での入力に曝される。
【０１３９】
図７は、共通の流体シンク３３および洗浄シンク５０を共有するが別々の、すなわち個々の、流体ソース３１を有する複数の、すなわち少なくとも２つの細胞チャネル２０および洗浄チャネル４０の構造を有する、マイクロ流体デバイス１の実施形態を示す。これは、細胞チャネル２０の別の構造に存在する細胞と比較して、異なる培養培地および／または試薬または化学薬品が細胞チャネル２０の構造の１つに存在する細胞へ入れられ得ることを意味する。
【０１４０】
ローディングの間に、細胞および培養培地は流体シンク３３に入り、培地は洗浄シンク５０および別々の流体ソース３１を通って流れ出るが、過剰な細胞は流体ソース３１を通って流れ出る。別の実施形態では、細胞は個々の流体ソース３１に入り、過剰な細胞は共通の流体シンク３３を出ていく。操作の間、培地は、別々の流体ソース３１に入り、それによって異なる培地が細胞チャネル２０および洗浄チャネル４０の異なる構造に入ることが可能になる。過剰の細胞は流体シンク３３を通って洗い流され、培地は洗浄シンク５０から、また共通の流体シンク３３を通って流れ出る。
【０１４１】
図３および図４は、洗浄チャネル、洗浄ソースおよび洗浄シンクを欠くマイクロ流体デバイス１の別の実施形態を示す。明らかに対照的に、マイクロ流体デバイス１は、細胞の平均径よりも小さい平均細孔サイズを有する半透性の膜８０を備える。この半透性の膜８０は、基板１０上に配列されて、複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル２０のためのフタを形成する。
【０１４２】
この実施形態では、細胞チャネル２０は、基板１０の主要表面１２の１つにおいて開口を有する開口チャネルである。半透性のバリヤ８０が次いで、この主要表面１２上に配置されて、細胞チャネル２０のフタを形成する。  
【０１４３】
洗浄の間、洗浄流体または液体は、細胞チャネル２０を通って流体ソース３１およびフローチャネル３０から、ならびに半透性のバリヤ８０を通って外へと効率的に流れ得る。半透性のバリヤ８０の平均細孔サイズは、細胞が半透性のバリヤ８０を通過することを妨げるが、洗浄流体または液体がそれを通って流れることを可能にするように選択される。
【０１４４】
基板１０は、プラスチック材料などの任意の透明な材料でできていてよく、ここで、細胞チャネル２０、流体ソース３１、流体シンク３３、フローチャネル３０および必要に応じて洗浄チャネル４０、シンクチャネル５２および洗浄シンク５０を構成する構造が定義され得る。適切な材料の非限定的な例としては、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）およびＺＥＯＮＯＲ（登録商標）（ＺＥＯＮ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌ．Ｐ．が市販する環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ））、ならびにＴＯＰＡＳ（登録商標）（Ｔｏｐａｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓが市販する環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ））が挙げられる。これらの材料は、透過およびバックグラウンドの蛍光に関して優れた光学的特徴を有する。それらはまた、加熱された場合良好なフロー特徴を有し、従って、図１〜７に示されるような基板１０の形成を可能にする小さい構造を複製し得る。
【０１４５】
基板１０の適切な材料の他の例としては、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびポリ（ｐ−フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）が挙げられる。
【０１４６】
半透性の膜８０は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．が市販するような、透析膜の間で選択されてもよい。あるいは、半透性の膜８０は、基板１０について上記される任意のプラスチック材料から製造されてもよい。
【０１４７】
カバープレート７０は、画像化を可能にするために好ましくは透明である、種々の材料で製造され得る。非限定的な例としては、ガラスおよびプラスチック材料が挙げられる。
【０１４８】
ある実施形態では、システムはまた、少なくとも１つのコンピューター制御ポンプを用いて、細胞チャネル２０に第一のキットの構成要素を分配するように構成される流体のマニフォールドを備える。流体のマニフォールドは好ましくは、コンピューター制御およびプログラミングされたポンプを用いて、表現型検査のための培地の交換、細胞固定のために用いられる化学薬品の分配ならびにインサイチュ配列決定のために必要な適用を可能にするように構成される。特定の実施形態では、試薬および細胞培養培地は、実験全体にわたって異なる温度で維持してもよい。
【０１４９】
ある実施形態では、各細胞株は、それぞれの株特異的バーコード配列を、そのゲノムまたは移動性の遺伝的エレメント中に有する。第一のキットは次いで、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、各細胞株のそれぞれの特異的なバーコード配列の少なくとも一部をインサイチュ配列決定することによって、それぞれの遺伝子型を決定するための構成要素を備える。
【０１５０】
実施形態のシステムは、例えば、細菌を表現型検査および遺伝子型決定するために用いられ得る。このような場合、細胞チャネル２０は好ましくは８００〜１２００ｎｍの寸法を有し、かつ洗浄チャネル４０は好ましくは４００ｎｍ未満の高さである。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイス１は好ましくは、有利に個々に印を付けられており、従って、認識可能である、１０００を超える細胞チャネル２０を備える。
【０１５１】
実施形態のマイクロ流体デバイス１は、複数の細胞株のライブラリーを特徴付けするためのシステムでの使用に極めて好適である。しかし、マイクロ流体デバイス１は、抗生物質耐性についてのスクリーニングおよび他のスクリーニング操作など、細胞株のライブラリーの表現型および遺伝子型の両方の決定を可能にする以外の他の目的のために用いられてもよい。
【０１５２】
従って、実施形態のある態様は、画像化のために透明であって、かつ細胞を単層で収容する寸法を有する複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネルを有する基板１０を備えるマイクロ流体デバイス２１に関する。複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル２０のそれぞれの第一の末端２２は、流体ソース３１と液体接続された第一の末端３２および流体シンク３３と液体接続された第二の末端３４を有するフローチャネル３０と液体接続されている。複数の空間的に定義されかつ隔てられた細胞チャネル２０のそれぞれの第二の末端２８は、シンクチャネル５２（洗浄シンク５０と液体接続されている）と液体接続された第二の末端４４を有するそれぞれの洗浄チャネル４０の第一の末端４２と液体接続される。この洗浄チャネル４０は、細胞を収容するには小さすぎる寸法を有する。
【０１５３】
ある実施形態では、各々の細胞チャネル２０は、その長軸方向側２４、２６の少なくとも一方に沿って、フローチャネル３０と液体接続されている第一の末端４２および洗浄チャネル５２と液体接続されている第二の末端４４を有する第二の洗浄チャネル４０と隣接される。
【０１５４】
ある実施形態では、第一のキットは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、それぞれの特異的バーコード配列の少なくとも一部のライゲーションによってインサイチュ配列決定するための構成要素を備える。
【０１５５】
この実施形態では、第一のキットは好ましくは、ＤＮＡリガーゼ、細胞株のゲノム中のライブラリー共通プライマー結合配列のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するアンカープライマー、標識されたインタロゲーションプローブオリゴヌクレオチドの混合プールを含む。第一のキットは好ましくはまた、ライブラリー共通プライマー結合配列を有するアンカープライマー塩基対合に標識されたプローブオリゴヌクレオチドを連結するＤＮＡリガーゼのために必要な構成要素（ＡＴＰ、緩衝液）、およびウラシルでハイブリダイズされたプローブを切断するために必要な構成要素（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）を含んでいる反応混合物を含む。
【０１５６】
別の実施形態では、第一のキットは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、それぞれの特異的バーコード配列の少なくとも一部の合成による、インサイチュ配列決定のための構成要素を備える。
【０１５７】
この実施形態では、第一のキットは好ましくは、蛍光標識を含む可逆性のターミネーターを含む４種の修飾されたｄＮＴＰを含む。第一のキットは、好ましくはまた、ＤＮＡポリメラーゼ、および細胞株のゲノム中のライブラリー共通プライマー結合配列のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する配列決定プライマーを含む。第一のキットはまた、配列決定プライマーに修飾されたヌクレオチドを組み込むためのＤＮＡポリメラーゼに必要な構成要素を含む反応混合物を備える。
【０１５８】
システムは好ましくはまた、各々の可変領域とそれぞれの株特異的バーコード配列との間の関連を特定するマッピング情報を含む。それぞれの遺伝子型は次いで、インサイチュで配列決定されたそれぞれの株特異的バーコード配列の少なくとも一部およびマッピング情報に基づいて決定される。
【０１５９】
ある実施形態では、ライブラリーの各細胞株は、既知のヌクレオチド配列のライブラリー共通プライマー結合配列に隣接されるそれぞれの株特異的バーコード配列および可変領域をそのゲノム中に含んでいる、それぞれの構築物を有する。従って、このライブラリー共通プライマー結合配列を、ゲノムからまたは、ｃＤＮＡ配列へと逆転写される転写されたＲＮＡ配列を介してそれぞれの株特異的バーコード配列を増幅するために用いてもよい。
【０１６０】
ある実施形態では、システムは、各々の細胞株について、転写されたＲＮＡ配列中の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列に相補的なプライマーおよび逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて転写されたＲＮＡ配列からｃＤＮＡ配列を合成するための構成要素を備える、第二のキットを備える。第一のキットは次いで好ましくは、培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、各々の細胞株のｃＤＮＡ配列中のそれぞれの株特異的バーコード配列の少なくとも一部をインサイチュ配列決定するための構成要素を備える。
【０１６１】
第二のキットは好ましくは、転写されたＲＮＡ配列中の少なくとも１つのライブラリー共通プライマー結合配列に相補的であるプライマー配列および逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。第二のキットはまた、ｃＤＮＡ配列を生成するために酵素によって用いられるヌクレオチドを備える。第二のキットはまた、ヌクレオチドを組み込むための逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに必要な構成要素、例えば、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤を含む反応混合物を含む。第二のキットは好ましくはまた、逆転写後の残留ＲＮＡを分解するためのＲＮａｓｅを含む。
【０１６２】
ある実施形態では、システムはまた、ｓｓＤＮＡリガーゼもしくはパッドロックプローブを用いる環化後のローリングサークル増幅によって、またはインサイチュＰＣＲによってｃＤＮＡ配列をインサイチュ増幅するための構成要素（ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ｄＮＴＰ）を備える第三のキットを備える。
【０１６３】
ある実施形態では、システムは、細胞培養デバイス中の空間的に定義されかつ隔てられた位置で、細胞を固定するための構成要素を備える第四のキットをさらに備える。この第四のキットは好ましくは、細胞を固定するために用いられ得るホルムアルデヒドを含む。
【０１６４】
システム中のキットの構成要素は、専用の容器中に別々の構成要素として提供されてよい。あるいは、キットの構成要素のうちの少なくとも１つが、同じ容器中に存在する混合物として提供されてもよい。
【０１６５】
実施形態の方法およびシステムは、細胞株のライブラリーを表現型的に特徴付けライブラリー中の異なる遺伝子型に種々の表現型を関連付ける必要がある、種々の適用で用いられ得る。
【０１６６】
例えば、実施形態は、高速成熟細胞内シグナル（ｆａｓｔ  ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ）について選択するための蛍光タンパク質またはＲＮＡアプタマーを最適化するために用いられ得る。この適用では、タンパク質またはレポーターのＲＮＡコード領域、すなわち、蛍光タンパク質またはアプタマーが、ゲノムの可変領域中にコードされる。レポーターの発現はイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの化学薬品によって誘発され得、またはレポーターはｌａｃリプレッサータンパク質によって調節される。培養培地または細胞はまた、レポーター蛍光に必要とされる任意の補因子を含む。表現型は、誘導後、経時的に蛍光を測定することによってモニターされ、複数の表現型が、特定のレベルの蛍光に達するための時間、または特定の時間後に達する蛍光、または定常状態の蛍光値へと緩和するための時間定数によってスコア付けされる。
【０１６７】
ある実施形態では、細胞株のライブラリーは、ｄＣＡＳ９のガイドＲＮＡの発現などの化学的シグナルによって遺伝子が下方制御され得るライブラリーであってよい。細胞株は次いで、バーコードと特定の遺伝子との間の既知のマッピング情報によってバーコードを付けられてもよい。
【０１６８】
さらに、実施形態は、インビボにおける調節因子特性の鋭敏な検出によって、遺伝子調節性のＲＮＡ配列またはタンパク質を特定するために用いられ得る。従って、可変領域は次いで、このような遺伝子調節性のＲＮＡ配列またはタンパク質をコードする。ＲＮＡ配列またはタンパク質の調節性効果を次いで、例えば、顕微鏡によってモニターして、遺伝子調節によって生じる種々の表現型の特徴を検出してもよい。
【０１６９】
実施形態はまた、細胞中の生物学的プロセスの阻害または活性化のためのタンパク質またはペプチドを選択するためにも用いられ得る。これによって、可変領域は、異なるバーションのタンパク質またはペプチドをコードする。表現型のモニタリングは従って、関連の生物学的プロセスの阻害または活性化のためのモニタリングを包含する。
【０１７０】
さらに、ライブラリーの細胞株中の可変領域は、特定の遺伝子の発現または調節を抑制または増強する１セットの発現される配列であってよい。これは例えば、構成的に発現されるかまたは条件付きであり得る干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）または短いガイドｍＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列であってよい。表現型を、発達、増殖、分化における問題、ならびに添加された試験因子に対するそれらの種々の応答などの表現型の相違に関してスクリーニングしてもよい。
【０１７１】
実施形態は、幹細胞のような分化細胞における特定のステップにおいて、または試験因子に対する応答において必要とされるのはどの遺伝子であるかを特定するためにさらに用いられ得る。可変領域は、異なる遺伝子が異なる細胞中で効率的に遮断されるように、異なる遺伝子の発現を抑制する異なるｓｇＲＮＡまたはｉＲＮＡをコードし得る。表現型の特徴付けは、増殖因子または薬物のような化学的試験因子に応答する細胞の分化をモニタリングする形態であってよい。もし細胞、組織または臓器が分化のいくつかの段階で変化を示す場合、その細胞株で発現が変化した遺伝子は、変化した分化に関連する。極めて似たアプローチを用いて、多細胞の臓器もしくは組織における発達または癌細胞の増殖に重要である遺伝子を研究および決定することが可能である。
【０１７２】
多数の調節配列を有するレポータータンパク質発現をモニタリングすることによって、特異的な刺激に応答する調節配列についてスクリーニングすることも可能である。従って、このように可変領域は、調節配列と対応する。表現型の決定はこのように、細胞中のレポータータンパク質発現をモニタリングすることに基づき、ここでレポーター遺伝子をコードする遺伝子は、調節配列の調節性の制御下にある。細胞は次いで、物理的刺激、例えば温度変化、または化学的刺激、例えば試験因子の添加などの特異的な刺激に暴露され、およびそれに対する応答が、レポーター遺伝子発現を通じてモニターされる。
【０１７３】
実施形態の方法およびシステムを用いて、他の遺伝子産物が選択的にかつ条件的にノックダウンされているライブラリー中の遺伝子または遺伝子産物の局在化、分散または濃縮をモニタリングすることによって、遺伝子または遺伝子産物の相互作用パートナーおよび調節因子を特定してもよい。この場合、可変領域は、選択的および条件付けのノックダウンを達成する異なる生成物、例えばｉＲＮＡおよびｓｇＲＮＡをコードし得る。同様の適用では、当業者は、蛍光的にタグ付けした目的のタンパク質の表現型のモニタリングと組み合わせてノックダウンライブラリーを用いて、その細胞内拡散、局在化または濃度を研究してもよい。ライブラリースクリーニングは、この場合、潜在的な相互作用のパートナーまたは調節因子を直接特定し得る。
【０１７４】
バーコード付けされたゲノムの変異ライブラリーが、細胞に３つのエレメントを導入することによって、例えば、同じプラスミド中にそれらを有することによって、並行して作製されてもよい。３つのエレメントとしては、（１）所望の導入された変化に対応する相同だが部分的に変異したＤＮＡ配列（可変性領域）、（２）対応する変異していないＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲ媒介性ＤＮＡ切断のためのガイドＲＮＡ、および（３）インサイチュ配列決定のためのバーコード配列が挙げられる。バーコード配列は、移動性の遺伝的エレメント上で維持されてもよいし、または染色体上の別の位置に導入されてもよい。
【０１７５】
顕微鏡で、または培養デバイス中に組み込まれたバイオセンサーによって目的の化合物の生合成をモニターすることが可能な場合、これを、表現型の読み取りとして用いて、生合成経路中の酵素についての発現レベルまたはそれらのアミノ酸配列を最適化してもよい。
【０１７６】
上記の適用は、これらの実施形態の方法およびシステムのいくつかの例示的な使用と単にみられるべきである。
【０１７７】
上記の実施形態は、本発明の２〜３の例示的な例として理解されるべきである。種々の改変、組み合わせおよび変化が本発明の範囲から逸脱することなく実施形態に対してなされてもよいことが当業者によって理解される。具体的には、異なる実施形態における異なる部分の解決法は、技術的に可能である他の構成と組み合わされてもよい。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
0006600349.tif 000002
【図２】
0006600349.tif 000003
【図３】
0006600349.tif 000004
【図４】
0006600349.tif 000005
【図５】
0006600349.tif 000006
【図６】
0006600349.tif 000007
【図７】
0006600349.tif 000008
【図８】
0006600349.tif 000009
【図９】
0006600349.tif 000010
【図１０】
0006600349.tif 000011
【図１１】
0006600349.tif 000012
【図１２】
0006600349.tif 000013