(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め得られた樹状細胞に分化可能なヒト由来の前駆体細胞としてヒトＣＤ１４+単球を準備するステップと、
ケモカインであるヒトＧＲＯ−γもしくはヒトＧＲＯ−α、並びに、ヒトＧＭ−ＣＳＦ及びヒトＩＬ−４を含有する培地において、前記前駆体細胞が樹状細胞に分化可能な十分な時間にわたって前記前駆体細胞を培養するステップと、
を含み、免疫抑制細胞を得る方法であって、
前記樹状細胞は免疫抑制表現型を示すことを特徴とする免疫抑制細胞作成方法。
【請求項２】
前記培地は、５％〜２０％プールヒト血清、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（２０〜２５０ｎｇ／ｍＬ）及びヒトＩＬ−４（２０〜２５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するα−ＭＥＭ完全培地である請求項１に記載の免疫抑制細胞作成方法。
【請求項３】
前記培地は、組み換えヒトＧＲＯ−γを含有する請求項１に記載の免疫抑制細胞作成方法。
【請求項４】
予め得られた樹状細胞に分化可能なマウス由来の前駆体細胞としてマウス骨髄細胞を準備するステップと、
マウスＧＲＯ−γ及びマウスＧＭ−ＣＳＦ（２〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた後、培地の一部を、マウスＧＲＯ−γ及びｒｈＧＭ−ＣＳＦを含有する完全ＲＰＭＩ培地に代え、前記前駆体細胞が樹状細胞に分化可能な十分な時間にわたって前記前駆体細胞を培養するステップと、
を含み、免疫抑制細胞を得る方法であって、
前記樹状細胞は免疫抑制表現型を示すことを特徴とする免疫抑制細胞作成方法。
【請求項５】
前記免疫抑制表現型は、
（ａ）以下の遺伝子：ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＭＭＰ−９、ＩＤＯ、ＡＲＧ−１及びｉＮＯＳの１つ以上の発現の増加、
（ｂ）以下の遺伝子：ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の１つ以上の発現の減少、並びに、
（ｃ）Ｔ細胞応答を抑制する能力を含む請求項１または４に記載の免疫抑制細胞作成方法。
【請求項６】
免疫抑制細胞を含む組成物の使用方法であって、請求項１または４に記載の免疫抑制細胞作成方法を含み、個体における免疫応答の抑制のための医薬品の作成に用いられる組成物の使用方法。
【請求項７】
免疫抑制細胞を含む組成物の使用方法であって、請求項１または４に記載の免疫抑制細胞作成方法を含み、個体の状態の処置のための医薬品の作成に用いられ、
該状態は、自己免疫性障害、炎症性障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）又は移植拒絶である組成物の使用方法。
【請求項８】
前記状態は自己免疫性障害である請求項７に記載の組成物の使用方法。
【請求項９】
前記状態は炎症性障害である請求項７に記載の組成物の使用方法。
【請求項１０】
前記状態は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である請求項７に記載の組成物の使用方法。
【請求項１１】
前記状態は移植拒絶である請求項７に記載の組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抑制細胞作成方法、及び、免疫抑制細胞を含む組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、顆粒球、マクロファージ及び樹状細胞の初期骨髄祖先／前駆体の異種個体群を表す。これらの細胞は、一般に、骨髄系統マーカーのＧｒ−１及びＣＤ１１ｂの発現により特徴決定される。ＭＤＳＣは、アルギナーゼ１（ＡＲＧ−１）及び一酸化窒素シンターゼ２（ＮＯＳ２）のような免疫抑制因子の発現の上方制御を介してＴ細胞エフェクター機能を抑制することによって、腫瘍免疫回避機構、自己免疫疾患、移植拒絶、慢性炎症及び感染において重要な役割を果たす。例えば、非特許文献１を参照すること。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１６２−１７４（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの免疫抑制特性に起因して、ＭＤＳＣは免疫疾患を処置する有望な候補である。したがって、エキソビボにおいて生成される安定し、かつ安全なＭＤＳＣへの需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、成長関連癌遺伝子（ＧＲＯ：ｇｒｏｗｔｈ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）ケモカイン、特にＧＲＯ−γが、ヒト末梢血単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）の分化及び機能に対して抑制効果を有するという発見に基づいている。更に、ＧＲＯ−γは、ＭＤＤＣの分化を、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）様表現型へ導くことが発見された。
【０００６】
したがって、本明細書に記載されるものは、免疫抑制細胞を得る方法である。この免疫抑制細胞作成方法は、樹状細胞に分化可能な前駆体細胞を得るステップと、ケモカインを含有する培地において、前駆体細胞が樹状細胞に分化可能な十分な時間にわたって前駆体細胞を培養するステップとを含む。ここで樹状細胞は免疫抑制表現型を示すので、それによって免疫抑制細胞が得られる。ケモカインは、ＧＲＯ（成長関連癌遺伝子）ケモカイン、例えばＧＲＯ−γ又はＧＲＯ−αでありうる。
【０００７】
別の態様では、本明細書において考慮されるものは、上記の免疫抑制細胞作成方法により得られる免疫抑制細胞、及び、その細胞を含有する組成物である。
【０００８】
また本明細書では、使用対象における多様な状態の処置に用いられる「免疫抑制細胞又は細胞組成物の使用方法」について記載する。例えば、免疫抑制細胞又は細胞組成物を、必要性のある使用対象における免疫応答の抑制に用いることができる。さらに、腫瘍新生（ｔｕｍｏｒｇｅｎｅｓｉｓ）に関連する血管新生を制御すること、自己免疫性障害を処置すること、炎症性障害を処置すること又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置することに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】間葉幹細胞（ＭＳＣ）調整培地がＭＤＣＣ分化に対して抑制効果を発揮することを示す一連のグラフである。ヒトＰＢＭＣから精製されたＣＤ１４+単球を、ＤＣ分化培地において、ＭＳＣ調整培地（ＭＳＣ−ＣＭ）（１／２×容量）の存在又は不在下で培養した。ＭＤＤＣは、未処理（ｉＤＣ）であったか、又は５日目にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）により更に２日間処理された（ｍＤＣ）。ＭＤＤＣの表現型及び機能を７日目に分析した。（Ａ）ＤＣ成熟と関連する表面マーカーを染色し、フローサイトメトリーにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、１０，０００個の細胞により決定した。（Ｂ）未熟ＭＤＤＣを、ＦＩＴＣ−デキストラン（１ｍｇ／ｍＬ）により３７℃で３０分間パルスし、これらのエンドサイトーシス能力を、フローサイトメトリーで測定したＦＩＴＣ−デキストラン取り込みにより評価した。ＦＡＣＳプロファイルが、陰性対照としてのＦＴＩＣ−デキストランの不在下でのｉＭＤＤＣ（ＮＣ、灰色線）、ｉＭＤＤＣ（ｉＤＣ、破線）及びＦＴＩＣ−デキストラン取り込み後のＭＳＣ−ＣＭの存在下でのｉＭＤＤＣ（ｉＤＣ＋ＭＳＣ−ＣＭ、黒色実線）について示されている。データは、２人の提供者により実施した３つの独立した実験の代表値である。（Ｃ）成熟ＭＤＤＣを同種Ｔ細胞（ＤＣ：Ｔ＝１：１０）と共に４日間同時培養し、チミジン取り込みを、１μＣｉ／ウエルの［3Ｈ］−チミジンによる１６時間パルスの後で測定した。Ｔ細胞増殖を、３人の異なる提供者から三重の［3Ｈ］−チミジン取り込みによって決定した。データを、［3Ｈ］−チミジン取り込みのＭＳＣ−ＣＭ補充（ＭＦＩ±ＳＤ）又はＣＰＭ（平均±ＳＤ）なしの群と比べた倍数として表す。データは、３つの別個の実験の代表値である。（ｎ＝実験毎に３人の提供者）。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。
【図２Ａ】ＭＤＤＣへのＭＳＣ−ＣＭの抑制効果が、抗ＧＲＯ−γ中和抗体をＭＳＣ−ＣＭに添加することにより逆転されたことを示す一連のグラフである。（Ａ）ＭＳＣ調整培地（ＭＳＣ−ＣＭ）及び血清含有培地対照のサイトカインプロファイルの比較を、市販のヒトサイトカイン／ケモカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏ）の使用により実施した。培養培地におけるサイトカイン及びケモカインの量は、アレイ膜を、特定のサイトカイン又はケモカインに対するビオチン標識抗体と共に、続いて、ＨＲＰ抱合ストレプトアビジンと共にインキュベートし、次にＸ線フィルムに曝露することによって決定した。実験は２回実施した。
【図２Ｂ】（Ｂ）未熟ＭＤＤＣにおけるＣＤ４０の発現に対するＧＲＯケモカイン及びＩＬ−８の影響を、フローサイトメトリー分析により評価した。ヒトＣＤ１４+単球を、１０％のヒトＡＢ+血清を含有するα−ＭＥＭ培地において、ＩＬ−４（８０ｎｇ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で分化させた。ＣＤ１４+単球、未熟ＭＤＤＣ単独又はＧｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ若しくはＩＬ−８を補充した未熟ＭＤＤＣを、ＣＤ４０発現のために染色し、７日目にフローサイトメトリーにより分析した。灰色線は、未染色対照に対応する。指定されたケモカインにおけるＣＤ４０陽性細胞の割合が示されている。結果は、３つの別個の実験の代表値である。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＭＳＣ−ＣＭのＧＲＯ−γ活性を、抗ＧＲＯ−γ（１０μｇ／ｍＬ）又はアイソタイプ適合対照抗体により、３７℃で６０分間、次に４℃で一晩かけて中和した。ＭＤＤＣを、ＭＳＣ−ＣＭ（１／２×容量）を有する又は有さないＤＣ分化培地において、中和抗ＧＲＯ−γ抗体の存在下又は不在下で分化させた。ＭＤＤＣの表現型分析をフローサイトメトリーにより実施し、結果を、未処理ｉＤＣから得た値と比べた平均蛍光強度（ＭＦＩ±ＳＤ）の倍数として表す。結果は、それぞれ２人の提供者を含む２つの実験の平均値である。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。
【図３】ＧＲＯ−γがＭＤＤＣの分化を抑制することを示す一連のグラフである。ヒトＰＢＭＣから精製されたＣＤ１４+単球を、ＣＸＣＲ２アゴニストＳＢ２２５００２（２５０ｎＭ）で前処理した又はしなかった組み換えＧＲＯ−γ（２５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は不在下で３０分間分化させた。ＭＤＤＣの表現型及び機能を７日目に分析した。（Ａ）表面マーカーで標識した後、ＭＤＤＣの表現型分析をフローサイトメトリーにより実施した。棒グラフは、未処理ｉＤＣから得たＭＦＩに対するＭＦＩの倍数（ＭＦＩ±ＳＤの倍数）として表す。値は、実験毎に２〜３人の提供者を含む３つの別個の実験の平均値に相当する。（Ｂ）未熟ＭＤＤＣを、ＦＩＴＣ−デキストラン（１ｍｇ／ｍＬ）により３７℃で３０分間パルスし、その取り込みをフローサイトメトリーにより測定した。５つの別個の実験の代表値であり、ｉＤＣ群と比べたＭＦＩ±ＳＤの倍数として表されるデータ。ｎ＝２〜３。（Ｃ）成熟ＭＤＤＣを同種Ｔ細胞（ＤＣ：Ｔ＝１：１０）と共に４日間同時培養し、チミジン取り込みを、１μＣｉ／ウエルの［3Ｈ］−チミジンによる１６時間パルスの後で測定した。Ｔ細胞増殖を、［3Ｈ］−チミジン取り込みによって決定した。データは、未処理ＭＤＤＣと比べたＣＰＭ（平均±ＳＤ）の倍数として表され、また、５つの別個の実験の代表値である。ｎ＝２〜３。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。
【図４】ＧＲＯ−γの存在下で分化したＭＤＤＣが、免疫寛容原性サイトカインプロファイルを示したことを示す、一連のグラフ及び画像である。ヒトＰＢＭＣから精製されたＣＤ１４+単球を、ＳＢ２２５００２（２５０ｎＭ）で前処理した又はしなかった組み換えＧＲＯ−γ（２５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は不在下で３０分間分化させた。（Ａ）７日培養ＭＤＤＣのｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲにより決定した。Ｃｔ値をＧＡＰＤＨ遺伝子の発現に正規化した。差を、２−ΔＣｔ法により計算し、データを未処理ＤＣから得た値と比べた割合として表す。結果を、５つの別個の実験からの三重の決定値の平均±ＳＤとして表す。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。（Ｂ）培養培地のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。データを、未処理ＤＣから得たものと比べたサイトカイン濃度の倍数として表す（平均±ＳＤ）。ｎ＝２〜３。結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表値である。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。（Ｃ）５日間分化させた未熟ＭＤＤＣを、スライドガラスに固定し、０．１％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０／ＰＢＳを浸透させた。細胞内ＩＤＯ発現を、マウス抗ヒトＩＤＯ抗体（１／５０）、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８抱合抗体（１／１５０）により、ＭＤＤＣを染色することによって検出した。画像を共焦点顕微鏡検査法により収集した。棒＝１０μｍ。
【図５】ＧＲＯ−γ処理ＭＤＤＣで初回刺激したＴ細胞が、免疫寛容原性の特性を表すことを示す一連のグラフである。ヒトＣＤ３+Ｔ細胞（３×１０5個）を、ＳＢ２２５００２を有する又は有さない組み換えＧＲＯ−γの存在下又は不在下で分化した３×１０4個のＭＤＤＣにより刺激した。（Ａ）ＭＤＣＣ及びＴ細胞同時培養物から精製したＣＤ３+Ｔ細胞における選択遺伝子ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲにより評価した。相対的遺伝子発現をＧＡＰＤＨに正規化した。データを、ＤＣ初回刺激Ｔ細胞群から得た値と比べた遺伝子発現（平均±ＳＤ）の倍数として表す。ｎ＝３。結果は、５つの別個の実験の代表値である。（Ｂ）Ｔリンパ球と同時培養したＧＲＯ−γ処理ＭＤＤＣ及び未処理ＭＤＤＣから収集した上澄みのサイトカインプロファイルを、ＥＬＩＳＡにより分析した。データを、サイトカイン濃度の平均±ＳＤとして表す。ｎ＝２〜３。結果は、３つの別個の実験の代表値である。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。
【図６Ａ】ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣが、ＭＤＳＣ細胞の細胞プロファイルを示すことを示している一連のグラフである。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞を収集し、ＧＭ−ＣＳＦ単独、ＧＭ−ＣＳＦ／ＧＲＯ−γ又はＧＭ−ＣＳＦ／ＧＲＯ−γ／ＳＢ２２５００２のいずれかにより６日間処理して、ＢＭＤＣに分化させた。抗ＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１抗体を使用したＢＭＤＣの表面標識を、ＦＡＣＳにより分析した。次にＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１二重陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ細胞選別機の使用により単離し、アルギナーゼ−１及びｉＮＯＳ遺伝子の転写レベルを、リアルタイムＰＣＲにより決定した。ｍＲＮＡ発現レベルを、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現に正規化したＢＭＤＣ群から得たｍＲＮＡレベルと比べた、遺伝子発現の倍数として表す。データを三重決定値の平均±ＳＤとして示す。（ｎ＝３）。結果は、３つの独立した実験の代表値である。
【図６Ｂ】（Ｂ）ＯＴ−１／ＣＤ８+Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより選別し、ＯＶＡ257-264ペプチドの存在下でＧＲＯ−γ処理又は未処理ＢＭＤＣと３日間同時培養した。Ｔ細胞増殖を、3Ｈ−チミジン取り込みアッセイの使用によって決定した。
【図６Ｃ】（Ｃ）インビボにおけるＧＲＯ処理細胞の免疫抑制活性を評価する概略実験フローチャート。  工程１：Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞から誘導したＢＭＤＣの異なる群を、ＢＭＤＣ免疫化の６日前に調製した。  工程２及び工程３：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１Ｇｙを照射し、次にマウスにＯＴ−１脾細胞（４×１０7細胞／マウス）を、ＢＭＤＣ免疫化の１日前に静脈内注射した。  工程４：ＢＭＤＣの多様な調製物（５×１０4細胞／マウス）を収集し、次に０日目に６〜８週齢のＯＴ−１脾細胞再構成Ｂ６マウスに皮下注射した。  工程５：ＢＭＤＣ刺激の７日後に、各実験群のマウスを殺処分し、個別のマウスの脾細胞を収集し、次に９６ウエルＵ底プレートにおいてＯＶＡ（１μｇ／ｍＬ）又はＲＡＨ（１μｇ／ｍＬ）ペプチドにより刺激した。  工程６：脾細胞の増殖活性を、3Ｈ−チミジン取り込みにより決定した。
【図６Ｄ】（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞から誘導され、ＧＲＯ−γを用いて又は用いないで処理されたＢＭＤＣを収集し、ＯＶＡ257-264ペプチドでパルスした。洗浄緩衝剤により非結合ペプチドを除去した後、ＢＭＤＣの異なる調製物を、１５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、次に、ＯＴ−１脾細胞（４×１０7細胞／マウス）で再構成した照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。全ての処理群の個別のマウスの脾細胞を単離し、ＢＭＤＣ投与の７日後に、ＯＶＡ257-264ペプチドにより１２、３６及び６０時間かけて刺激してから増殖活性を分析した。（Ｅ）ＯＶＡ257-264ペプチド刺激細胞の上澄みを（Ｄ）から収集し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方の分泌レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。  （Ｄ）及び（Ｅ）のデータを、３つの独立した実験（ｎ＝２〜３）の平均±ＳＤとして示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して決定し、ｐ値を示す。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意性なし。ｎｄ：検出不可。
【図７】無腫瘍及び腫瘍担持マウスにおける脾細胞の多様なサブセットの免疫抑制活性を示す一連のグラフである。ＥＬ４細胞を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与して、腫瘍担持マウスを生じた。ＰＢＳ緩衝剤の投与を受けたマウスは、無腫瘍対照として機能した。動物を２８日目に殺処分した。（Ａ）脾臓におけるＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+発現細胞の頻度を評価した。（Ｂ）無腫瘍対照及び腫瘍担持マウスから採取した、総脾細胞、選別ＣＤ１１ｂ+細胞及び選別ＣＤ１１ｂ-細胞の抑制効果を分析した。３つの独立した実験から得た平均及び標準偏差を示す。有意な差は、スチューデントｔ検定を使用して決定し、ｐ値を示す。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意性なし。
【図８】ＧＲＯ−γ処理及び未処理ＢＭＤＣにおける骨髄由来細胞の異なるサブセットの免疫抑制活性を示すグラフである。マウスのＢＭＤＣを、ＧＲＯ−γの存在下又は不在下で分化させた。ＧＲＯ−γ処理又は未処理ＢＭＤＣのいずれかから非分離細胞（総細胞）、ＣＤ１１ｂ+細胞及びＣＤ１１ｂ-細胞を選別した。同種反応性リンパ球の増殖活性を、多様な群の選別細胞の存在下で推定した。３つの独立した実験から得た平均及び標準偏差を示す。有意な差は、スチューデントｔ検定を使用して決定し、ｐ値を示す。*：ｐ＜０．０５。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．０００１。ｎｓ：有意性なし。
【図９】ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣが、ＧｖＨＤマウスの体重減少及び生存率を改善したことを示す一連のグラフである。ＧｖＨＤは、ＭＨＣ不適合野生型Ｂ６マウス（ドナー、Ｄ）の骨髄細胞及び脾細胞を静脈内注入することにより、致死照射Ｂａｌｂ／ｃマウス（レシピエント、Ｒ）に誘発した。異なる細胞群をレシピエントに注射した。ドナーマウスからの５×１０6個の骨髄細胞単独（ＢＭ、Ｄ）（−□−）（ｎ＝３）、ドナーマウスからの５×１０5個の脾細胞単独（ＳＰ、Ｄ）（−△−）（ｎ＝３）、ドナーマウスからのＢＭとＳＰの組み合わせ（ＢＭ（Ｄ）＋ＳＰ（Ｄ））（−○−）（ｎ＝４）、並びにドナーマウスからのＢＭとＳＰの組み合わせに加えて１×１０7個のＧＲＯ−γ−処理ＢＭＤＣ（ＧＢＭＤＣ）を移植の０日目（−■−）、２日後（−▲−）または７日後（−●−）に注射した群。動物を、体重変化（Ａ）及び生存（Ｂ）について移植後１０日間モニターした。ＢＭ細胞のみの投与を受けた動物は対照として機能した。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を実施した。生存にはＰ＝０．０２５５。３つの実験結果のうちの１つを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、特定のケモカイン、例えば成長関連癌遺伝子（ＧＲＯ）ケモカインが、ヒト末梢血単球由来樹状細胞の分化を、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）様表現型に導くという発見に基づいている。
【００１１】
したがって、本明細書に記載されているものは、ＭＤＳＣ様表現型を示す免疫抑制細胞を得る方法である。前記方法は、樹状細胞（ＤＣ）、例えば単球由来ＤＣに分化することができる前駆体細胞を得ること及び前駆体細胞を、ケモカインを含有する培地において、前駆体細胞が樹状細胞に分化することを可能にする十分な時間にわたって培養することを含む。このように培養された樹状細胞は、ＭＤＳＣ様表現型、例えば免疫抑制表現型を示す。
【００１２】
前記方法に適した前駆体細胞には、ＣＤ１４+単球、骨髄細胞及び骨髄前駆体細胞が含まれる。好ましくは、前駆体細胞は、ＣＤ１４+単球又は骨髄細胞である。前駆体細胞は、当該技術分野において既知である又は下記に記載されている従来の方法を使用して得ることができる。
【００１３】
前駆体細胞は、１つ以上のケモカインを含有する培養培地において、細胞が、ＭＤＳＣ様表現型を示すＤＣに分化するのを可能にする期間（例えば、３〜７日間）にわたって培養される。多様な培養培地を使用することができ、例えば、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調整培地、α−ＭＥＭ完全培地及びＲＯＭＩ−１６４０培地である。培地には、他の因子、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はＩＬ−４を補充することができる。ケモカインは、ＧＲＯケモカインでありうる。
【００１４】
ＧＲＯケモカイン、すなわちＣＸＣＬ１／ＧＲＯ−α、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ−β及びＣＸＣＬ３／ＧＲＯ−γは、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）モチーフを含有し、ＩＬ−８血管新生サイトカインファミリーに属する。ケモカインは、市販の供給源から得るか、又は当該技術分野に既知の従来の方法、例えば組み換えタンパク質技術を使用して調製することができる。ヒトＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β（ＭＩＰ２α）及びＧＲＯ−γ（ＭＩＰ２β）は、３つの特有の非対立ヒト遺伝子の産物である。ＧＲＯ−β及びＧＲＯ−γは、それぞれ、ＧＲＯ−αと９０％及び８６％のアミノ酸配列相同性を共有する。
ＧＲＯケモカインのアミノ酸配列は、当該技術分野において知られている。
例えば、ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿００１５０２．１（ヒトＧＲＯ−α：ＡＧＡＳＶＡＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＰＫＮＩＱＳＶＮＶＫＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＲＫＡＣＬＮＰＡＳＰＩＶＫＫＩＩＥＫＭＬＮＳＤＫ（配列番号１））；
ＮＣＢＩ基準配列ＮＭ＿００２０８９．３（ヒトＧＲＯ−β：ＡＧＡＰＬＡＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＬＫＮＩＱＳＶＫＶＫＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＱＫＡＣＬＮＰＡＳＰＭＶＫＫＩＩＥＫＭＬＫＮＧＫ（配列番号２））、及び、
ＮＣＢＩ基準配列ＮＭ＿００２０９０．２（ＧＲＯ−γ：ＡＳＶＶＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＬＫＮＩＱＳＶＮＶＲＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＫＫＡＣＬＮＰＡＳＰＭＶＱＫＩＩＥＫＩＬＮＫＧＳＴＮ（配列番号３））を参照すること。
【００１５】
上記に記載された方法により生成された免疫抑制細胞は、特定の特徴、例えばＭＤＳＣ様表現型を示し、下記により詳細に記載される。例えば、これらの細胞は、ＩＬ−１０及びＩＬ−４分泌の増加、Ｆｏｘｐ３発現の増加、並びにＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ産生の低減によって特徴決定される、Ｔ細胞増殖を刺激する能力、また、Ｔ細胞分化を免疫寛容原性免疫表現型に向ける能力の低減を示す。免疫抑制細胞は、従来の方法及び下記に記載された方法、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して特徴決定することができる。
【００１６】
本発明は、上記に記載された免疫抑制細胞を含有する組成物も含む。組成物は、薬学的又は生理学的に許容される賦形剤を更に含むことができる。
【００１７】
また本明細書で考慮されるものは、免疫応答を抑制するため、腫瘍新生に関連する血管新生を制御するため及び対象において他の多様な免疫学的状態、すなわち移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性疾患、自己免疫性疾患及び移植拒絶を処置するための、上記に記載された細胞組成物の使用方法である。免疫抑制細胞は、異種又は自己前駆体細胞から生成することができる。前者の場合では、ＨＬＡ適合を実施して、宿主反応を回避する又は最小限にすることができる。
【００１８】
炎症性障害には、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、骨関節炎、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、喘息、アテローム動脈硬化症、クローン病、結腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群及び全身性エリテマドーテスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
自己免疫性障害には、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマドーテス及びＩ型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
対象は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。非ヒト動物の例には、免疫系を有する全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、モルモット、ネコ、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタ）のような哺乳動物及び鳥類、両生類、爬虫類などのような非哺乳動物が挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験動物又は疾患モデルとして適した動物である。
【００２１】
上記記載の障害の１つが処置される対象は、その特定の障害に標準的な診断技術により識別することができる。「処置する」は、障害、障害の症状、障害の二次的な疾患状態又は損傷／障害に対する素因を、治癒する、緩和する、軽減する、治療する、その発症を遅延する、予防する又は寛解する目的のため、障害を罹患している又は発生する危険性のある対象に組成物（例えば、細胞組成物）を投与することを意味する。「有効量」は、処置対象に医学的に望ましい結果を生じることができる組成物の量を意味する。処置方法は、単独で又は他の薬剤若しくは療法と組み合わせて実施することができる。
【００２２】
上記記載の免疫抑制細胞を、注入若しくは注射（例えば、静脈内、鞘内、筋肉内、腔内、気管内、腹腔内若しくは皮下）、経口、経皮又は当該技術分野で既知の他の方法を介して、個体に投与することができる。投与は、２週間に１回、１週間に１回又はそれ以上若しくは以下でありうる。容量及び頻度は、上記記載の細胞による処置が考慮される疾患状態又は障害の病理学的兆候、並びに臨床及び準臨床的症状の退縮によって部分的に決まる。当業者に理解されるように、投与量及び投与レジメンは、多様な要因、例えば、状態の重篤度、対象の年齢、性別又は身体状態、副作用及び医師の判断に応じて調整することができる。上記記載の方法の全てにおいて、細胞を、例えば注射毎に１×１０6〜１×１０9で対象に投与することができる。
【００２３】
下記の特定の例は、単なる例示として解釈され、本開示の残りの部分に対して制限的であるとどのようにも解釈されるべきではない。更に詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されている全ての出版物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２４】
［材料及び方法］
（１）マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）マウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｉｗａｎから購入した。
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）／ＯＴ−１遺伝子導入マウス（ＴＣＲ特異的ペプチドＯＶＡ２５７−２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４０）の遺伝子導入）は、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｋｕｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，Ｔａｉｗａｎから寄贈された。
６〜８週齢のマウスをこの研究に使用した。全ての動物実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールに従って実施した。（プロトコール番号ＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−１００００３及びＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−０９７０７７−Ａ）
【００２５】
（２）化学試薬
組み換えヒトＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ及び組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。
組み換えマウスＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β及びＧＲＯ−γは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。
Ｎ−（２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ'−（２−ブロモフェニル）尿素（ＳＢ２２５００２）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
リポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０５５：Ｂ５）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から得た。
Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）標識マウス抗ヒトＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８３抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合マウス抗ヒトＣＤ８６、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４０及びＣＤ８０抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【００２６】
（３）ＭＳＣ調整培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の調製
臍帯間葉幹細胞（ｕＭＳＣ）を、臍帯血から精製し、以前に報告されたように（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）特徴決定した。ｕＭＳＣは、１０％ＥＳ−ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）を有する、α−ＭＥＭを含有する培養培地に維持した。ｕＭＳＣ（１５ｃｍ2細胞培養皿中の３×１０5細胞／１５ｍＬ、第７継代）を、プールＡＢ型ヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充した培地において更に２継代拡大した。各継代の持続期間は、５日間であった。３×１０5個のｕＭＳＣ（ｐ９）を、１５ｍＬの完全培養培地（１５ｃｍ2皿中の１０％プールＡＢ型ヒト血清及び１×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するα−ＭＥＭ）に再接種し、加湿ＣＯ2インキュベーターにより３７℃で５日間培養した。ｕＭＳＣの上澄みを３００×ｇ及び４℃で１０分間遠心分離して、壊死細胞片を除去し、収集し、−８０℃で保存し、次に調整培地（ＭＳＣ−ＣＭ）として使用した。
【００２７】
（４）サイトカイン／ケモカインアレイアッセイ
１０％ヒトプールＡＢ型血清を有するα−ＭＥＭにおけるサイトカイン及び増殖因子の、ｕＭＳＣの存在下又は不在下での分泌プロファイルを、製造会社の説明書に従ってＨｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｃ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｉｇｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙｓ  Ｃ  ｓｅｒｉｅｓ  １０００．１，ＲａｙＢｉｏ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して確立した。化学発光シグナルは、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  Ｌｉｇｈｔフィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）によりＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を使用して検出し、続いてデジタル化した。
シグナル強度は、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  １２２０  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＵＫ）を使用して、スポットデンシトメトリーにより定量化した。各スポットシグナルを近接するバックグラウンド強度に対して補正し、膜の陽性対照に正規化した。
【００２８】
（５）ヒトＭＤＤＣの生成
ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）は、健康な提供者から得た白血球除去輸血から生成した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｙｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）密度遠心分離により精製した。
ＣＤ１４+単球は、製造会社の説明書に従ってヒトＣＤ１４+Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して単離した。
続いて、精製ＣＤ１４+細胞（１×１０6／ｍＬ）を、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＩＬ−４（８０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＮＪ）を補充した、１０％プールＡＢ型ヒト血清を有する２ｍＬのＭＳＣ−ＣＭ又はα−ＭＥＭ完全培地において、ＧＲＯケモカインの存在下又は不在下で培養して、ＤＣへの分化を誘発した。
同じ濃度のｒｈＧＭ−ＣＳＦ及びｒｈＩＬ−４を含有し、ＧＲＯケモカインを有する又は有さない追加の１ｍＬの培地を、３日目に各細胞群に加えた。培養培地の半分の量を、５日目に、同じ濃度のｒｈＧＭ−ＣＳＦ及びｒｈＩＬ−４を含有する等量の新たな培地に代えた。ＭＤＤＣの成熟化（成熟ＤＣ、ｍＭＤＤＣ）を、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを５日目にｉＭＤＤＣの培養培地に加えることによって誘発し、細胞は更に４８時間培養された。未熟ＤＣ（ｉＭＤＤＣ）及び成熟ＤＣ（ｍＭＤＤＣ）の表現型変化を、７日目にＦＡＣＳ分析によりモニターした。
研究プロトコールは、Ａｃａｄｅｍｉａ  ＳｉｎｉｃａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＳ−ＩＲＢ０１−１０１１３）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＥＣ１００１１０１）により承認された。
【００２９】
（６）ＦＡＣＳ分析
単球、ｉＭＤＤＣ及びｍＭＤＤＣの表現型プロファイルは、１×１０5個の細胞を、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０及びＤＣ−ＳＩＧＮに対する蛍光色素標識抗体（Ａｂ）で染色することによって得た。蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。使用した対応するイソタイプ適合対照は、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ２ａ、ＰＥ−ＩｇＧ２ａ及びＰＥ−ＩｇＧ２ｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）であった。表面標識細胞は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。細胞の精製では、選別は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ細胞選別機（ＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により実施した。個別の選別細胞個体群の純度は、９５％を越えていた。
【００３０】
（７）エンドサイトーシス試験
ｉＭＤＤＣ又はｍＭＤＤＣのエンドサイトーシス活性は、フローサイトメトリーにより定量化したＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤ、ＦＤ４０Ｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の細胞取り込みを分析することによって測定した。細胞（５×１０4細胞／試料／９６ウエルＶ底プレート）を、１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストランを有するＲＰＭＩ−１６４０培地において３７℃で３０分間インキュベートした。
インキュベートした後、細胞を染色緩衝剤で２回洗浄して、遊離試薬を除去し、次に１％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞によりエンドサイトーシスされたＦＩＴＣ−デキストランからのシグナルを、ＦＡＣＳにより分析した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏバージョン５．７．２ソフトウエアを使用して実施した。ＦＩＴＣ−デキストランが不在の培地でインキュベートした細胞から得たシグナルを、陰性対照として使用した。
【００３１】
（８）ＭＬＲアッセイ
異なる分化段階の単球由来細胞（３×１０4）に、Ｘ線生物照射器（Ｘ−ｒａｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）（Ｘ−ｒａｙ  Ｒ−２０００、Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ）を使用して３０Ｇｙで照射し、次に９６ウエルＵ底プレートにおいて完全培養培地中で精製同種ＣＤ３+Ｔ細胞（１：１０）と共に培養した。Ｘ線照射骨髄細胞及び同種Ｔリンパ球を、加湿ＣＯ2インキュベーターに３７℃で入れた。９６時間後、［3Ｈ］−チミジン（１μＣｉ）を、Ｔ細胞と混合した、単球、ｉＭＤＤＣ又はｍＭＤＤＣのいずれかを含有する各ウエルに加え、１６時間更にインキュベートした。
次に細胞を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ９６ウエル採取機を使用して採取し、放射能（ｃｐｍ）を、Ｐａｋａｒｄマイクロプレートシンチレーション及びルミネセンスカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｐａｃｋａｒｄ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により細胞増殖の指数として測定した。
【００３２】
（９）ＲＮＡ調製及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬により抽出し、製造会社の説明書に従ってＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｓｅｔ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用してｃＤＮＡに変換した。リアルタイムＰＣＲ分析を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。試料を以下のプログラムに従って処理した。５℃で２分間、９４℃で１０分間、そして、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を４０サイクル。分析は三重に実施した。それぞれの試料において、サイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。
結果を、同じプレートのＧＡＰＤＨ遺伝子に正規化した。異なる細胞群のｍＲＮＡ発現のレベルを、２ΔＣｔ法の使用により計算した。それぞれの遺伝子に特異的なイントロンスパニングプライマー（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）を設計した。
これらの配列は、以下の通りである。
ヒトＧＡＰＤＨ、ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（順方向プライマー、Ｆ、配列番号４）、ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（逆方向プライマー、Ｒ、配列番号５）；
ヒトＩＬ−１０、ＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣ（Ｆ、配列番号６）、ＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡ（Ｒ、配列番号７）；
ヒトＩＤＯ、ＣＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧ（Ｆ、配列番号８）、ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴ（Ｒ、配列番号９）；ヒトマトリックス−メタロペプチダーゼ−９（ＭＭＰ−９）、ＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＧ（Ｆ、配列番号１０）、ＡＣＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡ（Ｒ、配列番号１１）；
ヒトＩＬ−４、ＧＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（Ｆ、配列番号１２）、ＧＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣ（Ｒ、配列番号１３）；
ヒトＩＬ−１２ｐ４０、ＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＡ（Ｆ、配列番号１４）、ＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＴ（Ｒ、配列番号１５）；
ヒトＴＮＦ−α、ＧＧＴＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ（Ｆ、配列番号１６）、ＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧ（Ｒ、配列番号１７）；
ヒトＩＦＮ−γ、ＣＣＡＡＣＧＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＣ（Ｆ、配列番号１８）、ＣＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣ（Ｒ、配列番号１９）；
ヒトＣｏｘ２、ＣＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧ（Ｆ、配列番号２０）、ＧＣＡＡＡＣＣＧＴＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡ（Ｒ、配列番号２１）；
ヒトＰＤ−Ｌ１、ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡ（Ｆ、配列番号２２）、ＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＧ（Ｒ、配列番号２３）；
ヒトＰＤ−Ｌ２、ＴＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＧＴＧ（Ｆ、配列番号２４）、ＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧ（Ｒ、配列番号２５）；
ヒトＴＧＦ−β、ＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＣ（Ｆ、配列番号２６）、ＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣ（Ｒ、配列番号２７）；
ヒトＩＬ−６、ＡＴＴＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡＧＧＡ（Ｆ、配列番号２８）、ＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＣＣ（Ｒ、配列番号２９）；
ＩＬ−１β、ＡＣＧＡＡＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＴ（Ｆ、配列番号３０）、ＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＡＣ（Ｒ、配列番号３１）；
マウスＧＡＰＤＨ、ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣ（Ｆ、配列番号３２）、ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ（Ｒ、配列番号３３）；
マウスアルギナーゼ１（Ａｒｇ−１）、ＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＡＧ（Ｆ、配列番号３４）、ＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ（Ｒ、配列番号３５）；
マウスｉＮＯＳ、ＡＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡ（Ｆ、配列番号３６）、ＴＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＴＡＧＧＧＴＣＡＴＣＴＴＧＴＡ（Ｒ、配列番号３７）；
マウスＩＦＮ−γ、ＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＧＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＡＡＣ（Ｆ、配列番号３８）、ＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧ（Ｒ、配列番号３９）。
【００３３】
（１０）ＥＬＩＳＡ
ＭＤＤＣ単独（５×１０4）、ＣＤ３＋精製Ｔ細胞単独（ヒトＣＤ３+Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．により単離、５×１０5）又はＣＤ３+精製Ｔ細胞（５×１０5）と同時培養したＭＤＤＣ（５×１０4）の上澄みを採取し、上澄みにおけるＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの濃度を、製造会社のプロトコール（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って市販のＥＬＩＳＡキットを使用して三重に決定した。
【００３４】
（１１）共焦点顕微鏡法
ＭＤＤＣを、ＧＲＯ−γの存在下又は不在下で生成し、次にＩＤＯタンパク質の細胞内発現について分析した。細胞（５×１０4）を、ポリ−Ｌ−リシン被覆スライドガラスで１５分間平板培養し、０．５ｍＬのＰＢＳで素早く２回洗浄した。細胞を、０．５ｍＬの１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加により１０分間固定し、次に続いてＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより室温で３０分間インキュベートした。細胞を、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０／ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０希釈マウス抗ヒトＩＤＯ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有する０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳと共に、室温で１時間インキュベートした。細胞を０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０／ＰＢＳで更に洗浄して、非結合抗体を除去し、次にＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と抱合した１：５０希釈抗マウスＩｇＧと共に、室温で１時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０／ＰＢＳで３回最終洗浄した後、スライドに１０％グリセロール／ＰＢＳを載せ、マニキュア液で密閉した。蛍光画像は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５カメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｃａｍｅｒａ  ＡＧ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し撮影した。
【００３５】
（１２）マウスＢＭＤＣの生成
ネズミ骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）を採取し、前記のように樹状細胞に分化させた（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。簡潔には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞を、２００Ｕ／ｍＬ（２０ｎｇ／ｍＬ）の組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦを有する１０ｍＬの完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を入れたペトリ皿にて、組み換えマウスＧＲＯケモカインの存在下又は不在下で、２×１０5細胞／ｍＬの密度により培養した。３日目に、培養培地の半分の量を、ＧＲＯと組み合わせた又は組み合わせない２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦを含有する完全ＲＰＭＩ培地に代えた。６日目に、異なる処理群のＢＭＤＣをそれぞれの皿から収集し、洗浄し、特徴決定した。
【００３６】
（１３）マウスＧＲＯ処理細胞のインビトロ及びインビボでの免疫抑制活性を測定するアッセイ
ＧＲＯ−γ処理細胞のインビトロ免疫抑制活性を、ＯＶＡ初回刺激ＤＣにより刺激されたＯＶＡ特異的ＯＴ−１ＣＤ８＋精製Ｔ細胞の増殖の阻害を測定することによって評価した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）ＢＭＤＣを、ＧＲＯ−γの存在下又は不在下で分化させ、６日目に収集し、次にＬＣＭ培地（５％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２−ＭＥ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁した。
ＯＴ−１ＣＤ８+Ｔ細胞（２×１０5細胞／ウエル）を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターを使用した細胞選別により収集し、次に９６Ｕウエルマイクロプレート中の２００μＬのＬＣＭ培地において、ＯＶＡ257-264ＣＴＬエピトープ（１μｇ／ｍＬ）若しくはヒトパピローマウイルスＲＡＨ対照ペプチド（１μｇ／ｍＬ）の存在下、単独で又はＢＭＤＣ（１×１０5細胞／ウエル）若しくはＢＭＤＣ／ＧＲＯ−γ細胞（１×１０5細胞／ウエル）のいずれかと組み合わせて培養した。培養物を、５％ＣＯ2インキュベーターにより３７℃で３日間インキュベートし、［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）を各ウエルに加え、続いて更なるインキュベーションを１６時間行った。次に細胞を、半自動試料採取機の使用により採取し、放射能（ｃｐｍ）を、Ｐａｃｋａｒｄマイクロプレートシンチレーション及びルミネセンスカウンターにより細胞増殖の指数として測定した。
【００３７】
インビボ免疫抑制アッセイでは、異なる処理に曝露されたマウスＢＭＤＣを（−６）日目に調製した。ＯＴ−１脾細胞（４×１０7／マウス）を調製し、６〜８週齢のＸ線前照射（１Ｇｙ）Ｂ６マウスに（−１）日目に静脈内投与した。ＧＲＯ−γの存在下又は不在下で分化したＢＭＤＣを収集し、ＯＶＡ257-264ペプチド（１μｇ／ｍＬ）を伴い又は伴わずに３７℃で１時間インキュベートし、次に移入当日に洗浄して非結合ペプチドを除去した。次にＢＭＤＣ（５×１０4細胞／マウス）の多様な調製物を、ＯＴ−１脾細胞再構成Ｂ６マウスに皮下注射して、抗原特異的活性化を０日目にインビボで開始した。ＨＢＳＳ、ＢＭＤＣ、ＢＭＤＣ／ＧＲＯ−γ、ＢＭＤＣ／ＯＶＡ又はＢＭＤＣ／ＧＲＯ−γ／ＯＶＡのいずれかにより処理されたそれぞれの群のマウスを、７日目に殺処分した。
個別のマウスから採取した脾細胞（２×１０5細胞／ウエル）を、９６ウエルＵ底プレートにおいてＯＶＡ（１μｇ／ｍＬ）又はＲＡＨ（１μｇ／ｍＬ）ペプチドにより刺激した。培養物を、５％ＣＯ2により３７℃で１２、３６及び６０時間インキュベートした。ＨＢＳＳ群又はＢＭＤＣ初回刺激マウスの異なる群のいずれかにおける脾細胞の増殖は、3Ｈ−チミジン取り込みにより決定した。アッセイは、二重に実施した。データは、３つの独立した実験における１群あたり３匹のマウスの代表値である。
【００３８】
（１４）統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して実施した。データを、少なくとも３つの独立した実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。群間の差の統計的有意性は、片側スチューデントｔ検定を使用して評価した。
【００３９】
本発明者たちは、ｐ値＜０．０５を有意であると考慮し、有意性の程度を以下のように示す。*  Ｐ＜０．０５、**  Ｐ＜０．０１、***  Ｐ＜０．００１。
【００４０】
［結果］
（１）ＭＳＣ調整培地は、ＭＤＤＣ分化及び機能に対して抑制効果を発揮する。
本発明者たちは、ヒトＣＤ１４+単球の、ＭＤＤＣへの分化を誘発するインビトロ標準操作手順を確立し、分化経路の各段階における骨髄細胞の細胞表現型を特徴決定するアッセイを確立した。
【００４１】
ＭＳＣ調整培地（ＭＳＣ−ＣＭ）がＭＤＤＣ分化に影響を与えるかを調査するため、培養培地を、ヒト末梢血ＣＤ１４+単球の分化及び成熟プロセスの際にＭＳＣ−ＣＭに代えた。本発明者たちは、未処理ｉＤＣと比較して、ＭＳＣ−ＣＭで処理した未熟ＭＤＤＣ（ｉＤＣ）のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃ及びＨＬＡ−ＤＲ表面発現において有意な低減を観察した（図１Ａ、上側パネル）。同様の結果が、培養の最後の２日間のＬＰＳ刺激により生成された成熟ＭＤＤＣ（ｍＤＣ）について得られた（図１Ａ、下側パネル）。
【００４２】
ＭＳＣ−ＣＭがｉＤＣのエンドサイトーシス活性に影響を与えるかについて更に検査するため、ＦＩＴＣ−デキストラン取り込みをフローサイトメトリー分析により測定した。結果は、ＭＳＣ−ＣＭ処理群のｉＤＣのエンドサイトーシス能力が有意に低減されたことを明らかにした（図１Ｂ）。ＭＤＤＣの別の機能性である、混合リンパ球反応において同種Ｔ細胞増殖を刺激する能力も、ＭＳＣ−ＣＭ培養物から生成されたｍＤＣにおいて下方制御された（図１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＭＳＣ−ＣＭがＭＤＤＣ分化及び機能性に抑制効果を示すことを示している。
【００４３】
（２）ＧＯＲ−γは、ＭＤＤＣの分化及び機能に対するＭＳＣの阻害効果の仲介に主要な役割を果たす。
本発明者たちは、ＭＳＣ−ＣＭにおいてどの可溶性因子が、ＭＤＤＣ分化に対する抑制活性の原因であるかを調査した。ＧＲＯ濃度の有意な増加がＭＳＣ−ＣＭにおいて検出された（図２Ａ）。本発明者たちは、ヒトｉＭＤＤＣの表現型に対するＧＲＯの異なるアイソフォームの生物学的効果を更に検査した。ＧＲＯ−α及びＧＲＯ−γのみがＣＤ４０発現に対して有意な阻害効果を有することが見出された（図２Ｂ）。サイトカイン／ケモカインアレイにおいては、ＧＲＯ−αの強度は、非常にわずかしか増加しかなかったので（図２Ａ）、本発明者たちは、続く実験で、ＧＲＯ−γの特性に研究を集中させた。
ＭＤＤＣ分化に対するＭＳＣ−ＣＭに存在するＧＲＯ−γの効果を更に確認するため、本発明者たちは、ｉＤＣ及びｍＤＣの両方に対する調整培地の抑制効果が、中和抗ＧＲＯ−γ抗体の添加により部分的に逆転されるが、そのアイソタイプ対照ではされないことを示した（図２Ｃ）。この抗体の存在下では、ｉＤＣにおけるＣＤ８０、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＤ８３の表面レベルでの発現は、アイソタイプ対照又はＭＳＣ−ＣＭで処理された細胞と比較して有意に増加した（図２Ｃ、上側パネル）。同様に、抗ＧＲＯ−γ抗体は、成熟ＤＣにおけるＣＤ８０、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４０及びＣＤ１１ｃの表面発現に対するＭＳＣ−ＣＭの抑制効果を実質的に逆転した（図２Ｃ、下側パネル）。
【００４４】
ＭＤＤＣ分化の阻害及びこれらの機能の抑制を行う組み換えＧＲＯ−γの能力を、評価した。単球−ｉＤＣ分化におけるＧＲＯ−γの存在下では、ｉＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６及びＤＣ−ＳＩＧＮの表面発現は、ＧＲＯ−γの不在下で培養された細胞と比較して有意に低減された（図３Ａ、上側パネル）。同様の結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現がＧＲＯ−γの添加により影響を受けなかったことを除いて、ｍＤＣにおいて観察された（図３Ａ、下側パネル）。ＣＸＣＲ２インヒビターであるＳＢ２２５００２の、培養培地への添加は、ｉＤＣ及びｍＤＣの両方における選択された表面マーカーの発現に対するＧＲＯ−γの抑制効果を有意に逆転した（図３Ａ）。ここでも、ｉＤＣ及びｍＤＣにおけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＳＢ２２５００２の添加により影響を受けなかった。ＭＤＤＣの機能に関して、ＧＲＯ−γは、ｉＤＣのエンドサイトーシス活性及び混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖を刺激するｍＤＣの能力をそれぞれ有意に下方制御した。そのような効果も、ＳＢ２２５００２の添加により遮断された（図３Ｂ及び３Ｃ）。
【００４５】
これらのデータは、ＭＳＣにより分泌されたＧＲＯ−γが、ＭＤＤＣの分化及び機能の抑制に主要な役割を果たすことを実証している。
【００４６】
（３）ＧＲＯ−γは、ＭＤＤＣ分化を、骨髄由来サプレッサー細胞様免疫表現型に導く。
ＭＤＤＣ分化及び機能に対するＧＲＯ−γの抑制効果に加えて、ＧＲＯ−γは、ＭＤＤＣ分化の際のサイトカイン発現のプロファイルに影響を及ぼす。リアルタイムＰＣＲを実施して、７日培養のＭＤＤＣにおける選択された遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルを検査した。結果は、炎症性サイトカイン遺伝子、すなわちＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２のｍＲＮＡレベルが、ＧＲＯ−γの存在下でのＭＤＤＣ分化において有意に下方制御されたことを示した（図４Ａ）。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１β及びＩＬ−６遺伝子、並びにＣＯＸ２、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）、とりわけＩＤＯをコードする遺伝子の発現レベルは、有意に上方制御された（図４Ａ）。ヒトＭＤＳＣは、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を分泌する能力、並びにＣＯＸ２、ＰＤ−Ｌ１、ＭＭＰ−９及びＩＤＯを発現する能力によって特徴決定される。ｑＰＣＲ分析は、ＧＲＯ−γによるＭＤＤＣの処理が、これらのＭＤＳＣマーカー遺伝子の発現を、未処理ＭＤＤＣ対照と比較して増加させることを明らかにした（図４Ａ）。
【００４７】
分化した細胞の多様な群に放出されたサイトカインのプロファイルを更に分析するため、ＭＤＤＣを培養の７日後に収集し、洗浄し、３日間更に再培養した。ＥＬＩＳＡを実施して、異なる実験群の上澄みにおけるサイトカインレベルを測定した。リアルタイムＰＣＲデータと一致して、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のレベルの上昇、並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２のレベルの低減が、ＧＲＯ−γの存在下で分化したＭＤＤＣの上澄みから検出された（図４Ｂ）。ＤｙＬｉｇｈｔ４８８抱合抗ＩＤＯ抗体も、ＧＲＯ−γの存在下で分化したｉＤＣにおけるＩＤＯの細胞内発現の増加を示した（図４Ｃ）。
【００４８】
これらの結果は、ＧＲＯ−γが、ＭＤＤＣ分化を抑制するのみならず、分化をＭＤＳＣ様免疫表現型に導くことも示す。
【００４９】
（４）ＧＲＯ−γ初回刺激ＭＤＤＣは、Ｔ細胞分化を免疫寛容原性免疫表現型に導く。
ＧＲＯ−γ処理ＭＤＤＣの、Ｔ細胞応答への効果を更に調査するため、ヒトＣＤ３+  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製されたＣＤ３+Ｔ細胞を、ＧＲＯ−γで処理された又は未処理の自己分化ＭＤＤＣに曝露した。ＣＤ３+Ｔ細胞を同じ方法によりＴ／ＭＤＤＣ混合物から更に単離した。ＲＮＡを抽出し、選択されたサイトカイン遺伝子の発現を、リアルタイムＰＣＲにより評価した。
本発明者たちは、ＧＲＯ−γ初回刺激ＭＤＤＣと同時培養されたＣＤ３+Ｔ細胞が、未処理ＭＤＤＣ対照と同時培養されたＴ細胞と比較して、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のｍＲＮＡをより高いレベルで発現する一方で、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２のｍＲＮＡをより低い量で発現することを見出した（図５Ａ）。ＭＤＤＣ／Ｔ細胞同時培養培地のサイトカインプロファイルも、ＥＬＩＳＡにより分析した。リアルタイムＰＣＲデータと一致して、本発明者たちは、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌レベルが、非初回刺激ＭＤＤＣ対照Ｔ群と比較して、ＧＲＯ−γ初回刺激ＭＤＤＣと同時培養されたＴ細胞の上澄みにおいて有意に上昇しことを見出した（図５Ｂ）。同時培養培地中のＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの濃度は、ＧＲＯ−γ初回刺激ＭＤＤＣの存在下で有意に低減した（図５Ｂ）。
【００５０】
これらのデータは、ＧＲＯ−γ初回刺激ＭＤＤＣが、Ｔ細胞をより免疫寛容原性の表現型に導きうることを示唆している。
【００５１】
（５）ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣは、ＭＤＳＣ様特徴をインビボで示した。
ＧＲＯ−γ初回刺激ＤＣのインビボでの機能を更に調査するため、本発明者たちは、マウス系におけるＧＲＯ−γの存在下又は不在下でのＤＣの分化を研究した。分化したＢＭＤＣを収集し、ＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１蛍光抗体を使用して、マウスＭＤＳＣマーカーを染色した。二重陽性ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１+細胞を、更なる分析のために更に選別した。本発明者たちは、ＢＭＤＣの二重陽性ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ−１+細胞の割合が、ＧＲＯ−γの存在によって左右されないことを見出した（図６Ａ、上側パネル）。
しかし本発明者たちは、ＡＲＧ−１遺伝子及び誘発性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子の発現を分析した。これらは、マウスにおいてＴ細胞の増殖及びアポトーシスを阻害することが知られているＭＤＳＣにおいて上方制御されることが知られている（Ｃｏｎｄａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１１）。予測されたように、ＡＲＧ−１及びｉＮＯＳのｍＲＮＡレベルは、ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣにおいて上昇したことが見出され（図６Ａ、下側パネル）、ＣＸＣＲ２インヒビターのＳＢ２２５００２の添加は、ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣにおける両方の遺伝子の誘発を逆転した。本発明者たちのデータは、ＧＲＯ−γの免疫抑制活性が、ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ−１+二重陽性細胞の数の増加により仲介されるのではなく、むしろＢＭＤＣの特性における機能的変化の結果であることを示している。
【００５２】
次に、本発明者たちは、オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的抗原投与系を使用して、ＧＲＯ−γエキソビボ処理により誘発されたＭＤＳＣが、インビトロ及びインビボで免疫寛容原性であるかを評価した。ＯＴ−１脾細胞を収集し、ＯＴ−１／ＣＤ８+Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ細胞選別機を使用して単離した。選別されたＯＴ−１／ＣＤ８+Ｔ細胞を、９６ウエルプレートにおいてＯＶＡ257-264ペプチドの存在下でＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣ又は未処理ＢＭＤＣにより更に刺激した。Ｔ細胞増殖を［3Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。結果は、３日目にパルスしたＯＶＡ257-264ペプチドの存在下でインビトロ分化ＢＭＤＣにより刺激されたＯＴ−１／ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖が、ＧＯＲ−γ初回刺激ＢＭＤＣにより下方制御されたことを明らかにした（図６Ｂ）。
【００５３】
ＧＲＯ−γ生成ＭＤＳＣの、Ｔ細胞に対する抑制効果を、次にインビボで試験した。ＧＲＯ−γ生成ＭＤＳＣの機能を評価するために設計された概略実験フローチャートを、図６Ｃに示す。骨髄細胞を、ＧＲＯ−γの存在下又は不在下で６日間かけてＧＭ−ＣＳＦにより分化させた。マウスを、ＯＶＡ257-264ペプチドパルスＢＭＤＣの異なる調製物により免疫化した。ＢＭＤＣ注射の１日前に、レシピエントマウスを照射（１Ｇｙ）し、同じハプロタイプのＯＴ−１脾細胞により静脈内で再構成した。次にＢＭＤＣの多様な調製物を収集し、ＯＴ−１脾細胞適合Ｂ６マウスに皮下注射した。
次に、ＯＶＡ257-264ペプチドパルスＢＭＤＣで免疫化した７日目後に動物を殺処分し、免疫化マウスの脾細胞を収集し、ＯＶＡ257-264ペプチドによりインビトロで１２、３６及び６０時間刺激した。
結果は、３６及び６０時間のＯＶＡ257-264ペプチド再刺激の後、ＧＲＯ−γ初回刺激ＢＭＤＣを注射したマウスの、ＯＶＡ257-264ペプチド刺激脾細胞の増殖が、対照ＢＭＤＣの投与を受けたマウスの細胞と比較して有意に低減したことを明らかにした（図６Ｄ）。異なる実験群のＯＶＡ257-264ペプチド刺激脾細胞の上澄みも、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン分泌について分析した。本発明者たちは、未処理ＢＭＤＣ群と比較して、ＧＲＯ−γ初回刺激ＢＭＤＣ群におけるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αレベルが低減したことを観察した（図６Ｅ）。
【００５４】
これらのデータは、ＧＲＯ−γ初回刺激ｉＤＣがインビボにおいてＭＤＳＣ様表現型及び機能性を示すことを示している。
【００５５】
（６）ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣのＣＤ１１ｂ＋サブセット及びＣＤ１１ｂ−サブセットが免疫抑制効果を示した。
本発明者たちは、ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣ及びＧＲＯ−γ未処理ＢＭＤＣにおけるＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+細胞の数及び細胞特性を分析した。結果は、Ａｒｇ−１遺伝子、ｉＮＯＳ遺伝子及びＭＤＳＣ関連遺伝子の発現が、ＢＭＤＣ分化の際にＧＲＯ−γの存在下で上方制御されたばかりでなく、Ａｒｇ−１及びｉＮＯＳのタンパク質発現及び酵素活性もＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣにおいて増加したことを示した。一方、ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+細胞の頻度は、対照とＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣとの間で類似していた。
【００５６】
本発明者たちは、以前の報告に記載されているように、インビボでＭＤＳＣを発生しうる腫瘍担持実験マウスを確立した。Ｙｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：５７９１−５８０２（２００８）を参照すること。ＥＬ４細胞を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与して、腫瘍担持マウスを生じた。ＰＢＳ緩衝剤の投与を受けたマウスは、無腫瘍対照として機能した。動物を２８日目に殺処分し、脾臓におけるＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+細胞の頻度を評価した（図７Ａ）。ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+ＭＤＳＣの頻度は、正常なマウスでは脾細胞のおよそ２％であったが、腫瘍担持マウスでは１９％まで増加した（図７Ａ）。腫瘍担持マウス及び無腫瘍マウスにおける、総脾細胞、並びにＣＤ１１ｂ+選別サブセット及びＣＤ１１ｂ-選別サブセット（純度＞９５％）を含む、多様な細胞の抑制活性を評価した。
データは、無腫瘍マウスでは、総脾細胞又はＣＤ１１ｂ-サブセットではなく、ＣＤ１１ｂ+サブセットのみが同種混合リンパ球反応（同種ＭＬＲ）を実質的に抑制しうることを示した（図７Ｂ）。一方、腫瘍担持マウスから採取した総脾細胞、ＣＤ１１ｂ+細胞及びＣＤ１１ｂ-サブセットは、全て、ＭＬＲを抑制する著しい能力を示した（図７Ｂ）。
【００５７】
加えて、本発明者たちは、非ＧＲＯ−γＢＭＤＣの総脾細胞、ＣＤ１１ｂ+細胞及びＣＤ１１ｂ-細胞が同種ＭＬＲに有意な効果を有さなかったことも実証した（図８）。しかし、３群全てのＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣの細胞は、これらの増殖リンパ球に対する顕著な抑制を示した（図８）。データは、ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣのＣＤ１１ｂ+サブセット及びＣＤ１１ｂ-サブセットの両方が、免疫抑制効果に寄与したことを示す。
【００５８】
（７）ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣは、ＧｖＨＤマウスの体重減少及び生存率を改善した。
ＭＨＣ不適合野生型Ｂ６ドナーマウスの５×１０6個の骨髄細胞及び５×１０5個の脾細胞を、致死照射Ｂａｌｂ／ｃマウス（レシピエント）に静脈内輸注することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＧｖＨＤを誘発した。ドナーマウスの異なる細胞群がレシピエントに静脈内注射され、すなわち、５×１０6個の骨髄細胞単独、５×１０5個の脾細胞単独、骨髄細胞と脾細胞の組み合わせ及び１×１０7個のＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣを補充した骨髄細胞と脾細胞の組み合わせが、移植の０日目、２及び７日後に注射された。対照マウスは、骨髄細胞のみの投与を受けた。レシピエントでは、生存、食餌摂取、体重減少及び臨床ＧｖＨＤをモニターした。
【００５９】
対照マウスは、移植後に小さな体重変化を示した（図９Ａ）。脾細胞の投与を受けたマウスは、移植後に体重の著しい低減を示した（図９Ａ）。移植の２日後または７日後にＧＲＯ処理ＢＭＤＣの投与も受けたマウスにおいては、体重が回復している（図９Ａ）。
対照マウスは、骨髄細胞及び脾細胞の両方の投与を受けたレシピエントと比較して、有意に高い生存率（１００％）を有した（図９Ｂ）。ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣの投与を受けたマウスの生存率は、骨髄細胞及び脾細胞のみの投与を受けたマウスより高かった（図９Ｂ）。
【００６０】
データは、ＧＲＯ−γ処理ＢＭＤＣが、ＧｖＨＤマウスの体重減少及び生存率を改善したことを実証する。
【００６１】
［他の実施形態］
本明細書に開示されている全ての特徴を任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されているそれぞれの特徴を、同じ、同等又は同様の目的を果たす代替的特徴に代えることができる。したがって、特に明確に記述のない限り、開示されているそれぞれの特徴は、同等又は同様の特徴の一般的な一連の例にすぎない。
【００６２】
上記の記載から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多様な変更及び修正を行って多様な用途及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
0006449148.tif 000002
【図２Ａ】
0006449148.tif 000003
【図２Ｂ】
0006449148.tif 000004
【図２Ｃ】
0006449148.tif 000005
【図３】
0006449148.tif 000006
【図４】
0006449148.tif 000007
【図５】
0006449148.tif 000008
【図６Ａ】
0006449148.tif 000009
【図６Ｂ】
0006449148.tif 000010
【図６Ｃ】
0006449148.tif 000011
【図６Ｄ】
0006449148.tif 000012
【図７】
0006449148.tif 000013
【図８】
0006449148.tif 000014
【図９】
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