(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）の顕微鏡（１０）の落射装置（７６）内のレーザー偏向装置（７３）を較正する方法（２００）であって、
前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）のレーザーユニット（７０）によって生成され、前記落射装置（７６）によって、前記顕微鏡（１０）の顕微鏡対物レンズ（４１）を通るように案内されたレーザービームが、前記レーザー偏向装置（７３）に印加される駆動制御信号（７４）によって規定された、前記顕微鏡対物レンズ（４１）の対象物面（５１）内の位置へ、前記レーザー偏向装置（７３）によって偏向され、
前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）は、さらに、画像評価モジュール（６４）を備えたデジタル画像検出ユニット（６３）を有している方法において、
前記方法は、
較正対象物（５２）を、前記顕微鏡対物レンズ（４１）の前記対象物面（５１）内に位置付けることと、
前記レーザー偏向装置（７３）を、位置設定値（２１）に基づいて、かつ、第１の較正値（２２）を用いて計算された第１の駆動制御信号（２３）によって駆動制御することと、
前記第１の駆動制御信号（２３）で駆動制御された前記レーザー偏向装置（７３）によって偏向された前記レーザービームを用いて、少なくとも１つの較正マーク（５３）を前記較正対象物（５２）上に作成することと、
を含んでおり、
次に前記較正対象物（５２）を、前記デジタル画像検出ユニット（６３）によって検出し、前記画像評価モジュール（６４）によって、少なくとも１つの前記較正マーク（５３）の位置実際値（２４）を求め、前記位置設定値（２１）と前記位置実際値（２４）との関係に基づいて、第２の較正値（２５）を決定する、
方法（２００）。
【請求項２】
平面座標および／または極座標を前記位置設定値（２１）、前記位置実際値（２４）および／または前記較正値（２２、２５）に対して使用する、
請求項１記載の方法（２００）。
【請求項３】
少なくとも３つの較正マーク（５３）を前記較正対象物（５２）上に作成し、前記較正マークの位置実際値をそれぞれ求める、
請求項１または２記載の方法（２００）。
【請求項４】
較正対象物（５２）を、前記レーザービームによって処理可能な、対象物担体上に被着されたコーティングと一緒に使用する、
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項５】
少なくとも１つの点状の較正マーク（５３）、円形状の較正マーク（５３）および／または十字形（十字線状）の較正マーク（５３）を前記較正対象物（５２）上に作成する、
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項６】
前記第２の較正値（２５）を、前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）の再較正動作において、位置設定値（２１）に基づいて駆動制御信号（２３）を計算するために使用する、
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項７】
前記画像評価モジュール（６４）を用いて少なくとも１つの前記較正マーク（５３）の前記位置実際値（２４）を求めることは、少なくとも１つのデジタルパターン識別規則を使用することを含む、
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項８】
前記方法は、少なくとも、前記レーザービームのエネルギー、切断速度および／またはアパーチャを、少なくとも１つの前記較正マーク（５３）の少なくとも１つの特徴に基づいて調節することを含んでいる、
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項９】
顕微鏡（１０）を備えたレーザーマイクロダイセクションシステム（１００）であって、
前記レーザーマイクロダイセクションシステムは、落射装置（７６）とレーザー偏向装置（７３）とを有しており、
前記落射装置（７６）は、前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）のレーザーユニット（７０）によって生成されたレーザービームを、前記顕微鏡（１０）の顕微鏡対物レンズ（４１）を通るように案内し、
前記レーザー偏向装置（７３）は、前記レーザービームを、駆動制御信号（７４）によって規定された、前記顕微鏡対物レンズ（４１）の対象物面（５１）内の位置へ偏向し、
前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）は、さらに、画像評価モジュール（６４）を備えたデジタル画像検出ユニット（６３）を有しているレーザーマイクロダイセクションシステム（１００）において、
前記レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）は、前記レーザー偏向装置（７３）を較正する較正装置を有しており、前記較正装置は、
位置設定値（２１）に基づいて、かつ、第１の較正値（２２）を用いて計算された第１の駆動制御信号（２３）によって、前記レーザー偏向装置（７３）を駆動制御し、
前記第１の駆動制御信号（２３）で駆動制御された前記レーザー偏向装置（７３）によって偏向された前記レーザービームを用いて、少なくとも１つの較正マーク（５３）を、前記顕微鏡対物レンズ（４１）の前記対象物面（５１）内に位置付けされた較正対象物上に作成し、
次に少なくとも１つの前記較正マーク（５３）を、前記デジタル画像検出ユニット（６３）を用いて検出し、
前記画像評価モジュール（６４）によって、少なくとも１つの前記較正マーク（５３）の位置実際値（２４）を求め、
前記位置設定値（２１）と求められた前記位置実際値（２４）との関係に基づいて、第２の較正値（２５）を決定することによって、
前記レーザー偏向装置（７３）を較正する、
レーザーマイクロダイセクションシステム（１００）。
【請求項１０】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法（２００）を実行するように構成されているレーザーマイクロダイセクションシステム（１００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項の上位概念に記載された、レーザーマイクロダイセクションシステムのレーザー偏向装置を較正するための方法およびレーザーマイクロダイセクションシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザーマイクロダイセクションシステムによって生体試料を処理する方法は、既に、１９７０年代の中頃から存在し（例えば、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．等著、「Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｂｙ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  第１０７巻、１９７６年、１９〜２４頁）」を参照）、それ以降、継続的に開発されてきた。
【０００３】
レーザーマイクロダイセクション法では、細胞、組織領域等が、対象物（試料、標本）から切り抜かれ、いわゆる解剖体（Ｄｉｓｓｅｋｔａｔｅ、ダイセクション片）として採取される。レーザーマイクロダイセクション法の特別な利点は、対象物とレーザービームとの接触が短く、このような接触によって、対象物がほとんど変化しない、ということである。解剖体のこのような特別な採取は、種々の方法で行われる（例えば、Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｄ．およびＧａｍｂｌｅ，Ｍ．著「Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８年、５７５頁、章「Ｌａｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ」）」を参照）。
【０００４】
例えば、既知の方法では、対象物から、赤外線または紫外線のレーザー光線によって、解剖体が切り抜かれ、これは、重力の影響を受けて、適切な解剖体回収容器内に落下する。この解剖体は、この場合に、対象物から、付着している膜と一緒に切り出される。いわゆる、レーザキャプチャーマイクロダイセクションでは、これとは異なり、熱可塑性の膜が、相応するレーザービームによって加熱される。ここで、この膜は、対象物の所望の領域と溶融し、後続のステップにおいて、引きはがされる。更に別の方法では、解剖体は、レーザービームによって、解剖体回収容器のふたに留められる。レーザーマイクロダイセクションのための公知の倒立顕微鏡システムでは、上方に発射された解剖体が、接着性のコーティングが施されている解剖体回収容器の底面に付着する。
【０００５】
本発明は特に、解剖体を対象物から採取し、その下に配置されている解剖体回収容器内に回収する方法で使用される。特に、本発明は、解剖体用無接触型回収システムに適している。
【０００６】
例えば、国際公開第９８／１４８１６号に記載されている公知の、レーザーマイクロダイセクション用の顕微鏡システムは、落射装置を有しており、この落射装置のビーム路内にレーザービームが入力される。このレーザービームは、使用されている顕微鏡対物レンズを通って、対象物上に焦点合わせされる。この対象物は、モーターによって自動的に動かされる顕微鏡用ステージ上に載置されている。固定されているレーザービームに対して相対的に対象物を動かすために顕微鏡用ステージが切断時に動かされることによって、切断線が作成される。しかし、これは特に、切断線作成の間に対象物を容易に観察することができない、という欠点を有している。なぜなら、対象物は視界内で動いており、その画像は場合によってぼやけて見えるからである。
【０００７】
従って、固定されている対象物にわたって、レーザービーム若しくはレーザービームの入射点を偏向させることができるように構成されているレーザー偏向装置若しくはレーザースキャン装置を有しているレーザーマイクロダイセクションシステムが、有利である。本発明の範囲においても特別な利点を供するこのようなレーザーマイクロダイセクションシステムを以下で詳細に説明する。相互に位置調節がされる複数のガラスウェッジをレーザービーム路内に備えているレーザー偏向装置を有している、特に有利なレーザーマイクロダイセクションシステムは、例えば、欧州特許第１２７６５８６号明細書に記載されている。
【０００８】
これら両方の場合、すなわち、顕微鏡用ステージが移動するレーザーマイクロダイセクションシステムにおいても、レーザー偏向装置を有しているレーザーマイクロダイセクションシステムにおいても、通常は、パルス状のレーザーによって処理が行われる。ここでは、各レーザーパルスによって、穿孔若しくは凹部が対象物内に作成される。切断線は、このような穿孔若しくは凹部が連続して並び、場合によってこれらの穿孔若しくは凹部が重畳することによって作成される。
【０００９】
レーザーマイクロダイセクション法は、個別細胞または所定の組織領域を採取するために使用される。これらの細胞または組織領域には、これに続いて、例えば、種々の診断分析プロセスが施される。腫瘍学では、レーザーマイクロダイセクション法は、例えば、特別に、腫瘍細胞を極小切片から切り出し、特定の代謝産物または蛋白質を検査するために使用される。ここでは、次のことが保証されなければならない。すなわち、材料が、検査対象物の不所望の、場合にはよっては妨害をする領域から検査容器内に入らず、または、検査対象物の不所望の、場合にはよっては妨害をする領域から検査容器内に入る材料ができるだけ僅かであり、これによって、相応する分析を妨害しないことが保証されなければならない。これは、分子生物学的な検査、例えば公知のコメットアッセイに用いられるレーザーマイクロダイセクションシステムにも当てはまる。
【００１０】
従って、レーザーマイクロダイセクション実験を混合なく成功させるために重要なのは、使用されるレーザーの精度である。例えば所定の切断線に基づいたレーザーの切断、または、対象領域にわたったピンポイントの移動が正確になるほど、これに相応して、きれいな材料が得られる。
【００１１】
従って、レーザーマイクロダイセクションシステムのレーザー若しくは相応するレーザー偏向装置は、できるだけ正確に較正されなければならない。これによって、位置設定値と、試料へのレーザーの入射点に対する目標位置と、発生した位置実際値、すなわち実際の入射点との相互のずれができるだけ小さくなる。
【００１２】
しかし現行の較正方法はしばしば、十分に信用できるものではない、若しくは、正確ではない、および／または、ユーザーが実行するのに極めて多くの手間を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９８／１４８１６号
【特許文献２】欧州特許第１２７６５８６号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第１１８６８７９号明細書
【特許文献４】欧州特許第１７１９９９８号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００７／００６６９６７号明細書
【特許文献６】独国特許発明第１００１８２５５号１次公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．等著、「Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｂｙ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  第１０７巻、１９７６年、１９〜２４頁）」
【非特許文献２】Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｄ．およびＧａｍｂｌｅ，Ｍ．著「Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８年、５７５頁、章「Ｌａｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ」）」
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明は、独立請求項の特徴部分に記載されている構成を有するレーザーマイクロダイセクションシステムのレーザー偏向装置を較正する方法およびレーザーマイクロダイセクションシステムを提案する。有利な構成は、従属請求項並びに後続の明細書に記載されている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、レーザーマイクロダイセクションシステムの顕微鏡の落射装置内に配置されているレーザー偏向装置の、それ自体公知の較正方法に基づく。このレーザー偏向装置によって、レーザーマイクロダイセクションシステムのレーザーユニットによって生成され、落射装置によって、顕微鏡の顕微鏡対物レンズを通って案内されたレーザービームが、レーザー偏向装置に印加される駆動制御信号によって決められた、顕微鏡対物レンズの対象物面内の位置に偏向される。相応するレーザーマイクロダイセクションシステムはさらに、画像評価モジュールを備えたデジタル画像検出ユニットを有している。
【００１７】
本発明では、較正対象物は、顕微鏡対物レンズの対象物面に位置付けされる。次に、レーザー偏向装置が、第１の駆動制御信号によって駆動制御される。ここでこの第１の駆動制御信号は、位置設定値に基づいて、第１の較正値を用いて計算される。レーザービームを活性化することによって、特に、信号シーケンスにまとめることもできるこの駆動制御信号による駆動制御時に、または、駆動制御が終了する度に、少なくとも１つの較正マークが較正対象物上に作成される。この較正対象物は、次に、デジタル画像検出ユニットを用いて検出され、画像評価モジュールを用いて、少なくとも１つの較正マークの位置実際値が求められる。位置設定値と位置実際値との相互関係に基づいて、第２の較正値が特定される。
【００１８】
ユーザーは位置設定値を、例えば、コンピューターマウスまたはコンピューターモニター上の他の適切な入力装置を用いて指定する。これは、通常、レーザービーム若しくは顕微鏡対物レンズによって生成されたレーザービーム焦点が対象物に入射すべき位置を示す、位置目標値である。従来のレーザーマイクロダイセクションシステムにおいても、この位置設定値から、レーザー偏向装置に対する駆動制御信号が計算される。レーザー偏向装置には、相応する駆動制御信号が加えられる。
【００１９】
駆動制御信号とは、ここでは、説明したレーザー偏向ユニットを用いて、顕微鏡対物レンズの軸に対する任意の方向に、すなわち、対象物面内で、若しくは対象物面に関連して、レーザービームの偏向を可能にする全ての信号のことである。運動範囲および運動速度は、場合によっては、相応するレーザーマイクロダイセクションシステムの技術的な限界によって定められる。駆動制御信号は例えば、数値による、レーザー偏向装置に割り当てられている制御ユニットのための駆動制御値を含む、かつ／または、相応するレーザー偏向ユニットのアクチュエーター、例えばウェッジプレート装置のステップモータまたはピエゾモータのためのアナログ信号またはデジタル信号を含む。
【００２０】
位置実際値は、相応する駆動制御から得られるレーザーの実際の入射点を示す。位置実際値が、位置設定値から、少なくともある程度は偏差を有してしまうのは避けられない。ここで、相応する較正の目的は、位置設定値と、生じた位置実際値との間の偏差を可能な限り低減する較正値を提供することである。この較正値はここで、駆動制御信号の計算に用いられる。
【００２１】
較正のために、位置設定値と位置実際値との相互関係、例えば、位置説明のために使用される値集合体の要素間の差が用いられる。元来の較正は、このような関係から、変換規則のための値を求めることを含んでおり、この変換規則を用いて、位置設定値と位置実際値とを一致させることができる。較正値はこの場合には、駆動制御信号の計算のための計算方法の任意の箇所において使用可能である。例えば、これ（相応に既知の事前制御方法）は、既に、位置設定値によって再計算され、従って、駆動制御信号の計算は相応に適した位置設定値によって行われる。すなわち、較正方法は、本願で提案された方法においては、適切な計算規則によって、目標値と実際値との間の偏差を補償する。簡素化される場合には、これは単に、座標値の加算若しくは減算であり、これによって、相応する座標が全体的に動かされる。これとは異なり、複数の較正マークが、較正対象物上に付けられており、これらの較正マーク若しくはこれらの較正マークに基づいて求められた位置実際値と位置設定値との間に種々の偏差が生じているケースでは、場合によって、全体的な観察領域にわたって、全ての値のできるだけ正確な変換を可能にする、整合された若しくは場合によっては補間する計算規則を用いることが必要である。
【００２２】
本発明は、それ自体公知のレーザーマイクロダイセクションシステムに基づく。このようなレーザーマイクロダイセクションシステムは、落射装置と顕微鏡対物レンズとレーザーユニットとを備えた顕微鏡を含んでいる。ここでは、レーザーユニットのレーザービームのビーム路は、落射装置と顕微鏡対物レンズとを通り、顕微鏡対物レンズの対象物面と、レーザー偏向装置に印加される駆動制御信号によって設定された調整可能な交点で交差する。
【００２３】
ここで本発明は特に、いわゆる無接触型のレーザーマイクロダイセクションシステムにおいて使用される。これは、次のような特徴を有している。すなわち、解剖体が膜等に付着されず、重力によって、対象物から落下する、という特徴を有している。この対象物は、ここで、保持システムにおいて、対象物担体の下面に配置されており、対象物は対象物担体を通じて、その上面から処理される。
【００２４】
すなわち、落射装置を用いて、レーザー光源からのレーザービームが、顕微鏡の観察ビーム路内に入力される。レーザービームは、対象物の観察にも用いられる顕微鏡対物レンズを通って、対象物上に焦点合わせされる。
【００２５】
誤解を避けるために、ここで、本発明において使用されるレーザーマイクロダイセクションシステムは、既に顕微鏡に適した準備がなされている対象物とともに使用される、ということを強調しておく。これは例えば、大きい組織ブロックからミクロトームによって取り出された薄い切片である。このような組織ブロックは例えば、固定された臓器または相応する臓器の生検である。従って本発明のレーザーマイクロダイセクションシステムは、対象物を採取するために使用されるのではなく、対象物を処理するため、並びに、対象物から特定の領域を切り抜くために使用される。本発明は、ミクロトームによって得られたのではない対象物とも、使用可能であることを理解されたい。これは例えばストリーキング（Ａｕｓｓｔｒｉｃｈｅｎ）、解離等である。
【００２６】
ミクロトームは、主に、極小対象物を提供する際に使用される。ミクロトームはこれに加えて、レーザーも有している。ミクロトームによって得られた折片は、上述のように対象物担体上に被着され、場合によってはそこに固定され、染色等が行われる。この後にようやく、この切片は、レーザーマイクロダイセクションシステムにおいて使用される。ミクロトームは、その動作において、特に、レーザーマイクロダイセクションシステムと次のことによって基本的に異なっている。すなわち、ミクロトームでは、できるだけ均一な切断力によって切片が行われる、ということによって異なっている。従ってミクロトームは、平行する切断面を有する多数の同一の切片を生成するように構成されている。これに対して、レーザーマイクロダイセクションシステムは、解剖体を、対象物に依存した判断基準、例えば視覚的な判断基準で切り出すように構成されている。従って当業者はミクロトームで使用されている技術的なソリューションを、レーザーマイクロダイセクションシステムに転用することはしないだろう。
【００２７】
ミクロトームは、さらに、観察ビーム路内にレーザービームが入力される顕微鏡を含んでいない。従ってミクロトームにおいてレーザービームが、観察にも使用される顕微鏡対物レンズによって、対象物上に、例えば組織ブロック上に焦点合わせされることは決してない。
【００２８】
顕微鏡用ステージは、本発明に相応して使用されるレーザー偏向装置を有するレーザーマイクロダイセクションシステムにおいて、解剖体の切り出し時に、すなわち、ダイセクション過程の間、ｘ−ｙ方向（すなわち、顕微鏡対物レンズの光軸に対して垂直な方向において）に関して、顕微鏡対物レンズに対して固定して配置されている。
【００２９】
ダイセクション過程の間、モーターによって動かされる顕微鏡用ステージ（スキャニング台）を備えたレーザーマイクロダイセクションシステムと比べて、レーザー偏向装置を備えたレーザーマイクロダイセクションシステムは、製造においてより容易かつ低コストであることが判明しており、かつ、正確性における利点を有している。モーターによって動かされる顕微鏡用ステージは、特に対象物が著しく拡大されている場合には、正確な切断を可能にするために、高い位置決め精度を有していなければならない。
【００３０】
レーザー偏向装置は、特に有利な実施形態では、２つの、厚い、光軸に対して傾斜しており、相互に依存せずに光軸を中心に回転可能な、ガラス製のウェッジプレート（ガラスウェッジ）を有している。これらは、自身のウエッジ角度によって、ビーム偏向を生じさせる。ガラス製のウェッジプレートのこの回転によって、レーザービームの、結果として生じる、光軸に対する方向角を変えることができる。レーザー偏向装置の出力側で、レーザービームは、ガラス製のウェッジプレートの厚さおよび傾斜姿勢によって、光軸に対する側方のビームオフセットを有しており、全ての方向角に対して、顕微鏡対物レンズの対物レンズの瞳の中心に入射する。従ってレーザービームと対象物面との交点が調節可能である。
【００３１】
従ってこの種のレーザー偏向装置は特に、他のレーザー偏向装置、例えばミラースキャナー、ガルバノメータースキャナーまたはステップモータースキャナーと比べて有利である。なぜなら、この種のレーザー偏向装置は、対物レンズの瞳に対する共役面に配置される必要がないからである。従って、偏向されたビームが対物レンズの瞳に入射することを実現するために、いわゆる瞳結像も必要無い。ＵＶレーザー光によるマイクロダイセクションの場合には、この際に、例えば、ＵＶに適した瞳結像が必要になるだろう。ウェッジプレートを有する、このようなレーザー偏向装置のさらなる利点は、例えば、欧州特許第１２７６５８６号明細書に挙げられている。
【００３２】
位置設定値、位置実際値および／または較正値に対して、平面座標および／または極座標が、基準面において使用される場合、本発明の方法は特に有利である。基準面として、例えば、対象物面、対象物の表面、対象物ステージの表面および／またはレーザーマイクロダイセクションシステムの他のあらゆる実際または仮想の面を使用することができる。相応する平面座標および／または極座標は、それぞれ、基準面に固定して位置している、または、基準面に対して固定した空間関係にある基準点に関する。平面座標とはここでは通常のｘ−ｙ座標（「経度線および緯度線（Ｒｅｃｈｔｓ−ｕｎｄ  Ｈｏｃｈｗｅｒｔｅ）」または、相応する表示）のことであり、これは各基準点に関係している。これに対して極座標は、空間（若しくはここでは基準面）内の、各基準点に対する角度および距離に関する位置を規定する。平面座標および極座標が、ユーザーに、生の形態で提供される必要はない。むしろ相応する平面座標および／または極座標が、システム内部で、ユーザー設定から、例えば、ユーザーがコンピューターのマウスを使って、デジタル表示された対象物の関心領域の周りに規定した線から計算されてもよい。
【００３３】
本発明は、デジタル画像検出ユニットの画像評価モジュールを用いた自動識別に基づいて、および、レーザー偏向装置を用いたレーザービーム制御に基づいて、ユーザーが介入しない、レーザービームの自動的な較正を可能にする。これによって、ユーザーによる誤った操作が不可能になる。レーザービームの較正は、客観的かつ後追い可能なパターン識別に基づいて、例えば、欧州特許出願公開第１１８６８７９号明細書に基づく、従来の方法若しくはレーザーマイクロダイセクションシステムよりも格段に正確になる。
【００３４】
従来の方法若しくはレーザーマイクロダイセクションシステムでは、レーザー若しくはレーザーのレーザー偏向装置は手動で、基準十字記号に基づいて較正される。このような手動の較正方法は、本発明のように、較正対象物上に、較正マークを生成することを含む。しかしこれは、次に手動で、デジタル画像に基づいて、コンピューターマウスによって、印付けされなければならない。この方法は絶対的に信用できるものではなく、各ユーザー、ユーザーの経験および較正マークの正確な検出に依存してしまう。これによって、特に、著しく偏差した較正が生じてしまう。これは特に、例えば医療的な診断学における相応するプロセスの再現性および証明の可能性に関して、欠点となる。さらに、誤った較正が原因で較正を繰り返すと、余計な時間がかかってしまう。
【００３５】
レーザービーム若しくはレーザー偏向装置の較正に、少なくとも２つ、特に３つまたは３つよりも多くの、較正マークの形態の較正点が使用される場合に、本発明は、特別な利点を供する。公知の較正方法では、典型的に、４つの較正用十字記号が、相応するレーザー偏向装置によるソフトウェアサポートタイプのレーザービーム制御を手動で較正するために使用される。このために、まずは、１つの十字記号が特定の位置に、伝統的には視界の右上に、レーザーによって、適切な対象物内に切り込まれる。ここでこの対象物は、レーザーの焦点に、ひいては顕微鏡対物レンズの焦点内に位置する。次にこの十字記号の中心に、マウスまたはタッチスクリーンによって、手動で印が付けられる。次に、別の十字記号が、レーザーによって、対象物内の別の位置（左上）に切り込まれる。第１の十字記号と同様に、第２の十字記号に印が付けられる。上述したステップは、次に、別の箇所（右下および左下）に、レーザーによって切り込まれた十字記号によって繰り返される。これらの十字記号にはそれぞれ手動の印付けがされる。このような方法は、本発明によって、より容易に、かつ正確になる。
【００３６】
本発明によって、較正対象物内に作成された較正マークを全自動で識別することが可能になり、ピクセルレベルの正確さで中心点を計算することができる。これは、自動的に、較正のために記憶され、転送される。説明したこの方法は、自動的な計算、および、レーザー焦点合わせユニットおよび／またはレーザー偏向ユニットのレーザーマイクロダイセクション制御ソフトウェアへの転送によって、極めて正確である。
【００３７】
較正マークの各識別用の領域（例えば、レーザー十字またはレーザー点の領域）が事前に制限されている場合に簡素化が実現される。ここでは、図４にも示されているように、固定レーザーに対する視界の中心のみが識別に使用される、かつ／または、はじめに視界の右上、次に左上、次に右下と左下の領域が識別に使用される。これは、その箇所に、事前に較正マークが付けられていた場合である。これによって誤りが低減する。
【００３８】
上述のように、少なくとも３つの較正マークが較正対象物上に作成され、これらの較正マークの位置実際値が求められる場合には、特に良好な較正精度が得られる。
【００３９】
本発明によって提案された較正の精度は、特別な較正対象物が、レーザービームによって処理可能な、対象物担体上に被着可能なコーティングとともに使用される場合に、さらに高められる。この種のコーティングは、例えば、後から処理される対象物とは異なって、次のように選択することができる。すなわち、レーザービームによって、できるだけ微細な線が形成されるように選択することができる。ここでこの線は微細であると同時に、十分なコントラストをレーザービームによる処理時に提供する。この種のコーティングに、適切な、光反応性の顔料および／または熱反応性の顔料を付けることもできる。これらの顔料は、レーザーの照射によって、自身の色を変える。これによって、カラーの較正マークの作成が可能になる。このようなカラーの較正マークは、相応する画像検出ユニット若しくはこの種の画像検出ユニットの画像識別モジュールにおいて、容易に、例えば、色選択性の識別規則によって識別可能である。
【００４０】
ここで使用可能な較正対象物は、例えば、一色の較正用スライドである。ここでは例えば、レーザー処理可能な膜を有する、通常は何も設けられていない対象物担体が使用可能である。この膜には、有利には、カラーのコーティングが設けられている。このカラーのコーティングは、より高いコントラストを得るために、レーザー処理によって除去可能または色を消すことが可能である。最も簡単な場合には、相応する膜には、例えば、ユーザーによって、適切なカラーコートが設けられる。規則的または一色の表面が設けられた他の試料も、迅速な自動較正に適している。なぜならこれは、有利に行われる自動パターン評価に対して、極めて容易に処理される画像情報を提供するからである。
【００４１】
光反応性および／または熱反応性の顔料は、例えば、蛍光色素であり得る。これは、ＵＶまたはＩＲ領域のレーザービームによって励起される。このようにして、例えば、種々の照明様式におけるレーザー較正が可能である（明領域、位相コントラスト、蛍光、欧州特許第１７１９９９８号明細書を参照）。さらに、特別な対象物が使用可能である。この対象物は、表面領域上で、異なる色を有しており、黒または他の色（例えば、ユーザーによって付けられたカラーコート）によって覆われている。色の選択はここでは、例えば、顕微鏡用ステージ若しくは顕微鏡用ステージ上の対象物担体の出発点に合わせられる。ここでは、例えば、種々の、露出された色が、較正マークのシーケンスを識別するために若しくはその形状を識別するために使用される。これによって同様に、時間が省かれる。
【００４２】
一般的に、較正対象物は、その上に相応する較正マークが作成可能な対象物である。これは、後に処理される対象物のことである。ここでこの較正マークは、特に、後続の分析が不必要な領域内に作成される。または、これは、特別な「較正用スライド」である。
【００４３】
本発明の方法では、有利には、点状の、円形の、および／または、十字形（十字線）の較正マークが較正対象物上に作成される。点状の較正マークの作成は、特に、固定レーザーの場合に可能であり、かつ、有利である。較正マーク、例えば、円形の、十字形および／または十字線状の較正マークの形成は、相応する画像評価モジュールにおいて、「暗記」される。これは特に、信用できる、迅速な識別を可能にする。
【００４４】
有利な発展形態では、本発明の方法は、第２の較正値を、レーザーマイクロダイセクションシステムの再較正動作において、位置設定値に基づいて駆動制御信号を計算するために用いることを含む。「再較正動作」とは、このようなレーザーマイクロダイセクションシステムの通常の動作であり、例えば、生体対象物若しくは医学的な対象物のルーティン検査若しくは処理のためのものである。このような再較正動作は、例えば、質の基準が悪化したことによって、新たな較正が必要になるまで実行される。質の基準が悪化した場合には、「第２の」較正値が、新たに求められた（例えば「第３の」）較正値によって置き換えられる。
【００４５】
上述したように、画像評価モジュールによる少なくとも１つの較正マークの位置実際値の検出は、少なくとも１つのデジタルパターン識別規則の使用を含んでいる。これに相応したパターン識別規則が基本的に公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００７／００６６９６７号明細書に開示されている。
【００４６】
上述の画像識別規則（これに関する詳細は、上述した米国特許出願公開第２００７／００６６９６７号明細書を参照されたい）は、例えば、シェーディング修正、グレー画像処理、２値画像への変換、２値画像処理、分割および対象物特徴の特定、例えば、較正マークの特定および画像処理分野から公知の他の方法も含んでいる。
【００４７】
特に、対象物の少なくとも１つの画像部分の電子画像が撮影され、続いて、画像分析によって検査される。上述した、米国特許出願公開第２００７／００６６９６７号明細書では、少なくとも１つの、切り出されるべき解剖体が自動的に求められ、これを中心にした目標切断線が自動的に特定される。この技術は、本発明の範囲では、較正マークに転用され、位置実際値を求めるために使用される。
【００４８】
画像分析的な方法は、通常、特徴分析に基づいている。このような手法では、各画像要素、この場合には、較正マークが、ある程度の数の個々の特徴に関して識別され、分類されるという事実が利用される。特徴は、例えば、面積、ボリュームおよび直径等のサイズであってよいが、質量、テクスチャー、色、形状等であってもよい。適切な特徴セットを選択することによって、画像要素を分類し、他の画像要素と区別することができる。
【００４９】
この適切な特徴セットは、通常、ｎ次元の特徴空間において供される。この詳細は、上述した文献に記載されている。例えば、特徴である色、面積および直径を有する特徴空間が選択される。使用される特徴空間は、本発明では、所期のように較正マークに整合される、および、その逆である。比較的少ない色と、短い直径と、小さい面積とを有する画像要素が、この場合には、例えば、第１の特徴クラスターによって分類される。他の特徴クラスターによってまとめられる画像要素が、これと区別される。例えば、後者は、比較的多い色と、短い直径と、小さい面積とを有している。付加的な画像要素は、さらに別の特徴クラスターによって表され、これは例えば、少ない色、長い直径並びに大きい面積を有している。説明された、較正マークの作成は、特に、説明された形状、場合によっては色および較正対象物のコーティングを用いた較正マークの作成は、相応する較正対象物上にも存在する別の画像要素から、較正マークを区別するのを容易にする。
【００５０】
較正マークを識別するために、さらに、較正マークの作成前および作成後の、個別画像からの重ね合わせ画像および／または減法画像も使用可能である。これによって、その形状が不明な場合にも、較正マークを迅速に見つけ出すこともできる。さらに、相応する重ね合わせ画像および／または減法画像を、レーザー焦点の正確な中央点を計算するために使用することができる。
【００５１】
本発明の有利な発展形態では、較正の間にも、較正マークおよび／または較正マークの形状に基づいて、レーザーを自動的に調整することができる。この調整は全体的に調整可能なレーザーパラメータを含んでおり、少なくともレーザーエネルギー、切断速度、アパーチャおよび／または周波数を含んでいる。較正マークの形状および構造の評価に応じて、個々のパラメータが適合される。例えば、少ないエネルギー、および、小さいアパーチャは、較正マークの幅が広い線の場合に使用可能であり、遅い速度は、過度に高いレーザー誘導速度によって発生し得る、「湾曲した線」の場合に使用可能である。相応するレーザーのアパーチャの調整は、例えば、独国特許発明第１００１８２５５号１次公報から公知である。
【００５２】
上述した特徴および利点は、同様に、本発明によって提案されたレーザーマイクロダイセクションシステムに関する。このレーザーマイクロダイセクションシステムは、落射装置を備えた顕微鏡とレーザー偏向装置とを有している。ここでこの落射装置は、レーザーマイクロダイセクションシステムのレーザーユニットによって生成されたレーザービームを、顕微鏡の顕微鏡対物レンズを通って案内し、レーザー偏向装置は、駆動制御信号によって規定された範囲においてレーザービームを偏向する。このレーザーマイクロダイセクションシステムは、さらに、画像評価モジュールを備えたデジタル画像検出ユニットを有している。
【００５３】
レーザーマイクロダイセクションシステムには本発明に相応して、レーザー偏向装置を較正するための較正装置が設けられている。この較正装置は、位置設定値に基づいて、および第１の較正値を使用して計算された第１の駆動制御信号をレーザー偏向装置に与えるように構成されている。これは、少なくとも１つの較正マークを、顕微鏡対物レンズの対象物面内に位置付けされた較正対象物上にレーザービームによって作成し、次に、少なくとも１つの較正マークをデジタル画像検出ユニットによって検出し、少なくとも１つの較正マークの位置実際値を、画像評価モジュールを用いて求め、位置設定値と、求められた位置実際値との関係に基づいて第２の較正値を特定することによって行われる。
【００５４】
特に、この種のレーザーマイクロダイセクションシステムは、上述した方法を実行するように構成されている。
【００５５】
本発明のレーザーマイクロダイセクションシステムによって、従来技術と比べて、極めて多くのより正確な、対象物の個別細胞または組織領域（細胞集合体）が回収容器内に運ばれ、所期のように検査される。個別細胞または組織領域は、一義的に、対象物の特定の領域に割り当て可能であり、レーザーの格段に高い切断精度に基づいて、混合が低減される。対象物は例えば、固定組織の切片、線条（Ａｕｓｓｔｒｉｃｈ）または採取物、例えば臓器の微小切片、付着細胞培養等である。
【００５６】
本発明および本発明の実施形態を、以降で、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の方法を実行するために使用されるレーザーマイクロダイセクションシステムの概略図
【図２】本発明の実施形態に従った、レーザー偏向装置を較正する方法の概略図
【図３】本発明の実施形態に従った、レーザー偏向装置を較正するための較正マークの概略図
【図４】本発明の実施形態に従った、レーザー偏向装置を較正する方法の概略図
【発明を実施するための形態】
【００５８】
図面では、対応する部材には同一の参照符号が示されており、繰り返して説明されない。
【００５９】
図１には、本発明の方法を実行するのに用いられるレーザーマイクロダイセクションシステムが概略的に示されており、全体で、参照番号１００が付けられている。このレーザーマイクロダイセクションシステム１００は、大部分において、欧州特許第１２７６５８６号明細書に開示されているレーザーマイクロダイセクションに相当し、この文献は、この文章をもって、参考として本願に取り入れられる。それに基づいて、以降で述べられる軸若しくは方向ｘ、ｙおよびｚが示されている座標系は、図１において参照番号１１０が付けられている。
【００６０】
レーザーマイクロダイセクションシステム１００は、顕微鏡１０を有している。顕微鏡１０の鏡脚１１には、ここでは部分的にしか示されていない照明装置１２が設けられる。この照明装置１２は例えば、（図示されていない）光源と、この光源によって提供された照明用の光に影響を与える適切な手段と、を含んでいる。これは例えばフィルターおよび／または絞りである。透過光照明および適切なコントラスト方法若しくは観察方法を調節するために、コンデンサーユニット９０が設けられる。
【００６１】
鏡脚１１には、例えば、ユーザー入力ユニットおよび／またはユーザーインフォメーションユニット１３も配置される。これは例えば、タッチスクリーンとして構成可能であり、これを介して、ユーザーは、例えば、考察パラメータおよび／または動作パラメータを入力すること、および／または、読み出すことができる。
【００６２】
さらに、駆動ネジ１４が設けられている。これは、顕微鏡用ステージ３０の高さを調節するために、粗動駆動部および微動駆動部を操作するために用いられる。対象物ホルダー５０上の対象物担体上に位置している対象物は、例えば、対象物担体上に載せられている切片であり、この対象物はこれによって、対物レンズ４１の対象物面５１内に入れられる。対物レンズ４１は、別の対物レンズ４２の隣で、対物レンズリボルバー４０内に固定されている。レーザービームから保護するために、保護カバー１５を設けることができる。
【００６３】
対象物面５１内の対象物から出た観察光は、観察ビーム路ａに沿って、延在する。適切な出力装置６１を備えた管状ユニット６０において、有利には、観察光の可変の部分が、例えば６０°で取り出され、接眼レンズ対６２を用いて、ユーザーに提供される。観察光の別の部分は、デジタル画像検出ユニット６３内に入力され、画像検出される。画像検出ユニット６３には、現場で、制御ユニット８２または制御計算器８１（下方を参照）または他の空間的装置において、画像評価モジュール６４が割り当てられる。
【００６４】
レーザーマイクロダイセクションシステム１００は、レーザー光源７５を備えたレーザーユニット７０を有している。例えば、ＵＶレーザー光源であるレーザー光源７５を通って、提供されたレーザービームｂは、ここでは全体として参照番号７６が付与されている落射ユニットにおいて、第１の偏向ミラー７１と第２の偏向ミラー７２とで偏向され、対物レンズ４１によって、対象物面５１内の対象物に焦点合わせされる。
【００６５】
レーザーマイクロダイセクションシステム１００では、レーザービームｂが対象物面５１内の対象物に入射する場所は基本的に、種々異なる方法で調節される。１つの方法では、手動の位置調節装置３１を設けることができ、この位置調節装置によって、ｘｙテーブルとして形成されている顕微鏡用ステージ３０の位置が、ｘ方向およびｙ方向（すなわちここでは紙面に対して垂直若しくは平行に）に調節される。この位置調節装置３１の他に、電気機械式の調節手段を設けることもできる。これは例えば、制御ユニット８２によって駆動制御される、若しくは、この調節手段の位置が制御ユニット８２によって検出される。
【００６６】
制御ユニット８２は、レーザーマイクロダイセクションシステム１００の任意の別のモーター駆動式の機能も制御することができ、特に、切断箇所を、相応する接続部８３を介して結合される外部の制御計算器８１に対して提供することができる。
【００６７】
レーザーマイクロダイセクションの場合には、特に、レーザー偏向装置７３が設定される。このレーザー偏向装置７３を用いて、レーザービームｂが、第１の偏向ミラー７１と第２の偏向ミラー７２との間で延在する光軸ｃに対して偏向される。レーザービームは従って、種々の箇所で、例えば二色分割器として構成可能である第２の偏向ミラー７２上に入射し、これによって、同様に、種々の箇所で、対象物面５１内の対象物に焦点合わせされる。レーザー偏向装置７３を用いた偏向の詳細は、欧州特許第１２７６５８６号明細書に記載されている。ここで、レーザービームｂを偏向する、若しくは、対象物を対象物面５１において、レーザービームｂに対して位置付けする種々の手法が使用可能であることを強調しておく。本発明は上述の例に制限されない。
【００６８】
図示の例では、レーザー偏向装置７３は、２つの中実の、ガラス製のウェッジプレート７３１を有している。これらは、光軸ｃに対して傾斜しており、かつ、相互に依存しないで、光軸ｃを中心に回転可能である。このためにウェッジプレート７３１は、ボールベアリング７３２によって支承されている。各ウェッジプレートは歯車７３３と接続されている。この歯車７３３はそれぞれ、アクチュエーター７３４によって回転される。このアクチュエーターには、駆動制御信号が加えられ、これに相応して歯車７３３は駆動制御する。アクチュエーター７３４は位置センサ７３５を有している（ここでは、位置センサは、右側のアクチュエーター７３４のみで示されている）。位置センサ７３５によって検出された位置は、制御ユニット８２に伝達される。
【００６９】
図２には、本発明の特に有利な実施形態に即した方法が、概略的なフローチャートの形態で示されており、全体として、参照番号２００が付けられている。この方法２００は、このために構成されたレーザーマイクロダイセクションシステム、例えば図１に示されたレーザーマイクロダイセクションシステム１００において実行される。
【００７０】
この方法はステップ２１０で始まる。ここでは、相応するレーザーマイクロダイセクションシステムが、較正されていない状態で存在している。この較正されていない状態では、何度か説明したように、次のことは保証されない。すなわち、上述した位置設定値と位置実際位置とが必要な程度に合致していることは保証されない。これを保証するために、較正方法２００が実行される。
【００７１】
ステップ２２０では、このために、例えば制御ユニット８２によって、上述した位置設定値２１が設定される。これは、顕微鏡対物レンズ４１の対象物面５１内のレーザービームの所望の位置を示す目標値である。このステップ２２０では、これに加えて、位置設定値２１が、例えば較正データメモリ２０から呼び出された「第１の」較正値２２によって再計算される。ステップ２２０において使用される較正データ２２は、例えば、相応するレーザーマイクロダイセクションシステムにおいて一般的に使用される標準的な較正データ、または、相応するレーザーマイクロダイセクションシステム１００の長期動作後に存在する較正データである。ステップ２２０では、位置設定値２１と較正値２２とから駆動制御信号２３が計算され、レーザー偏向ユニット、例えば、図１に示されたレーザーマイクロダイセクションシステム１００のレーザー偏向ユニット７３に出力される。これは、特に、駆動制御信号２３の相応する信号シーケンスであってもよい。この信号シーケンスは、レーザー偏向ユニット７３においてレーザーの継続的な偏向および／またはステップ毎の偏向を引き起こす。同時に（図示されていない）、相応するレーザーが継続的にまたはパルス状に活性化される。従って、レーザービームによって、少なくとも１つの較正マークが、顕微鏡対物レンズ４１の対象物面５１内に位置付けされている較正対象物上に設けられる。所望の数の相応する較正マークが較正対象物上に作成され、ステップ２２０の処理が成功した後、この方法はステップ２３０に進む。
【００７２】
ステップ２３０では、デジタル画像検出ユニットを用いて、例えば、図１に示されたレーザーマイクロダイセクションシステム１００のデジタル画像検出ユニット６３を用いて、顕微鏡対物レンズ４１の対象物面５１内に入れられた較正対象物５２が、デジタルで検出される。このデジタル画像検出ユニットに割り当てられている画像評価モジュール６４によって、ここでは、少なくとも１つの較正マーク５３の位置実際値２４が求められる。位置実際値は、ステップ２３０において、位置設定値と比べられる。例えば、位置設定値２１と位置実際値２４との間の、対象物面におけるｘおよびｙ偏差が求められる。これに基づいて、ここで、新たな（「第２の」）較正値２５が求められ、較正データメモリ２０に伝送される。ここでは、例えば、元来の（第１の）較正値２２が、新たに求められた（「第２の」）較正値２５によって書き換えられる。
【００７３】
レーザーマイクロダイセクションシステム１００はこれによって、ステップ２４０において示されている較正された状態になる。このステップ２４０では、レーザーマイクロダイセクションのために、同様に、相応する位置設定値２１が、例えば制御ユニット８２によって設定される。しかしここでこれは、新たに求められた較正値２５によって再計算される。これに基づいて計算された駆動制御信号（ここでは参照番号が付けられていない）は、レーザー偏向装置７３に出力され、位置設定値と位置実際値との間の一致を改善する。
【００７４】
図３には、較正対象物５２上の較正マーク５３の択一的な形状が、大きく拡大されて示されている。図３Ａは、ここで、点状の較正マーク５３を示している。これは例えば、上述したように、固定レーザービームが使用される場合に、較正対象物５２の中心に形成される。図３Ｂには、レーザー偏向装置７３によって形成可能であり、図示の例では十字の形を有している較正マーク５３が示されている。デジタル画像検出ユニット６３若しくはこの種のデジタル画像検出ユニット６３の画像評価モジュール６４において実行される画像評価ルーティン、例えば、適切にパラメータ化されたデジタル評価手段は、較正対象物５２上の較正マーク５３の相応する形状を識別するように構成されている。特徴的な形状、例えば、図３Ｂに示されている十字形は、識別を容易にする。さらに、相応する形状によって、これによって規定される基準点、ここでは例えば中心点Ｍが特に容易に規定される。
【００７５】
図４には、部分図４Ａ〜４Ｄにおいて、本発明の特に有利な実施形態に即した方法の、相互に連続する部分ステップが概略的に示されている。全部分図４Ａ〜４Ｄにおいて、図３の部分図３Ａおよび３Ｂと同様に、デジタル画像検出ユニット６３によって検出される較正対象物５２が部分的に示されている。
【００７６】
図４Ａに示された第１の部分ステップでは、較正対象物５２の右上のコーナーに、相応する較正マーク５３が設けられる。ここで、画像評価モジュール６４によって評価される領域には、参照番号６４０が付けられており、破線で囲まれている。この領域６４０内で、画像評価モジュールは、その中に含まれている較正マーク５３を備えた存在する画像データを評価し、これに基づいて、位置実際値を特定する。この位置実際値は例えば、ｘおよびＹの画像座標の形態において示される。ここでこの画像座標は、相応に検定された画像評価モジュールにおいて規定された、較正対象物５２の座標に相当する。図４Ａに示された部分ステップが成功裏に終了し、較正マーク５３の位置実際値２４が検出されると、この方法は、較正対象物５２の任意の位置での相応する部分ステップによって継続される。
【００７７】
例えば、図４Ｂに示された部分ステップでは、別の較正マーク５３が、較正対象物の左上の領域に形成され（検出領域６４０を参照）、検出され、評価される。これと相応のことが、図４Ｃおよび４Ｄに示された部分ステップに対しても当てはまる。これらの部分ステップは相応する方法で実行される。複数回の較正が行われることによって、特に確実な較正値が得られる。この較正値は例えば、図２に示された較正データメモリ２０内に書き込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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