(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤であって、
ここで、前記融合タンパク質の各々が、ちょうど２つの抗体コンポーネントを含み、前記融合タンパク質の各々が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
（ｉ）腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、
（ｉｉ）免疫エフェクター細胞上に存在する抗原に結合する第２の抗体コンポーネントと、
（ｉｉｉ）ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）エレメントを含む、ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントとを順に含み、
ここで、前記融合タンパク質は、前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを通して二量体化して、ホモ二量体を形成する、
二重特異性結合剤。
【請求項２】
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
前記免疫エフェクター細胞上に存在する抗原がＣＤ３である、請求項１に記載の結合剤。
【請求項４】
前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６】
ちょうど２つの抗体コンポーネントを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上に存在する抗原に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）エレメントを含むＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントとを順に含む融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＨＮＦ−１αエレメントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１のｓｃＦＶが腫瘍抗原に結合し前記第２のｓｃＦｖがＴ細胞上に存在する抗原に結合する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞上に存在する抗原がＣＤ３である、請求項９または１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１１に記載の融合タンパク質２つから構成される二量体型二重特異性結合剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の二量体型二重特異性結合剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項６〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から成る群より選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞から成る群より選択される、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
二量体型二重特異性結合剤の生産方法であって、前記二量体型二重特異性結合剤の発現に好適な条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することと、前記二量体型二重特異性結合剤を回収することとを含む方法。
【請求項２０】
第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントを含む二重特異性抗体薬を含む高親和性二重特異性抗体組成物を提供する方法であって、前記方法は、抗体コンポーネント−ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネント融合物がホモ二量体を形成できるように、そのような第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントのうちの少なくとも１つをヒトＨＮＦ−１α二量体化エレメントから構成されるＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを有する融合物として提供することを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍細胞を死滅させるための組成物であって、それぞれがちょうど２つの抗体コンポーネントを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤を含み、前記融合タンパク質の各々が、前記二重特異性結合剤が二量体化してホモ二量体を形成できるように、Ｎ末端からＣ末端に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含むＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントとを順に含み、前記二重特異性結合剤は前記ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍細胞の死滅を媒介するのに十分な条件下及び時間で前記腫瘍細胞と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
腫瘍の増殖を阻害するための組成物であって、それぞれがちょうど２つの抗体コンポーネントを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤を含み、前記融合タンパク質の各々が、前記二重特異性抗体が二量体化してホモ二量体を形成できるように、Ｎ末端からＣ末端に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含むＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントとを順に含み、前記二重特異性結合剤は前記ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下及び時間で腫瘍と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項２７】
前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１の抗体フラグメント及び前記第２の抗体フラグメントがｓｃＦｖである、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
それぞれがちょうど２つの抗体コンポーネントを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤であって、前記融合タンパク質の各々が、前記融合タンパク質が二量体化してホモ二量体の二重特異性結合剤を形成できるように、Ｎ末端からＣ末端に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含むＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントとを順に含み、
前記ホモ二量体の二重特異性結合剤は前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較して半減期がより長いことを特徴とする、二重特異性結合剤。
【請求項３１】
前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、請求項３０に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３２】
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、請求項３０または３１に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３３】
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３４】
前記二重特異性結合剤が、前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較して亢進された腫瘍抗原結合活性を有する、請求項１に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３５】
前記二重特異性結合剤が、前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較して免疫エフェクター細胞への結合活性が顕著に異ならない、請求項３４に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３６】
前記二重特異性結合剤が、前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較して亢進された腫瘍抗原結合活性を有する、請求項３０に記載の二重特異性結合剤。
【請求項３７】
前記二重特異性結合剤が、前記ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較してＴ細胞への結合活性が顕著に異ならない、請求項３６に記載の二重特異性結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７９１６００号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、「２００３０８０−０６３６＿ＳＴ２５」なる名称のアスキー.ｔｘｔファイルとして電子書式にて２０１４年３月１４日に提出された配列表を参照する。上記.ｔｘｔファイルは２０１４年３月７日に作成され、そのサイズは１００ｋｂである。
【背景技術】
【０００３】
様々な治療用途、診断用途、及び研究用途のために、二重特異性結合剤及び多重特異性結合剤が現在開発されている。そのような剤の多くは、異なる抗原を標的とする抗体コンポーネントを互いに結合させることにより、例えば融合タンパク質として生成されるか、または抗体コンポーネントの架橋により生成される。とりわけ、そのような手法には、各々が単一特異性抗体を発現する細胞の融合（例えば、ハイブリドーマ）、２種以上の単一特異性抗体の化学的コンジュゲーション、及び／または組換えＤＮＡ技術により多重特異性抗体を生成することが含まれている。しかし、そのような方法は制限を受けないことがない。
【０００４】
特に、組換えＤＮＡ技術は、多重特異性であり、且つ多機能性である改変抗体をいくつか生み出している。単鎖Ｆｖ分子の出現により、改変抗体において多くの進展がなされている。そのような改変抗体は、結果として生じた独特の構成に少なくとも部分的に起因して、従来の抗体よりも改善された特性を示している。多重特異性抗体薬を設計するためのストラテジーがいくつか存在するが、大部分の試みは、特定の機能面だけを改善することに集中している。その結果、抗体コンポーネントから作製される改変抗体の多くは、最大の薬理学的意義を付与するであろう所望の機能特性を全て有するわけでない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、多量体化コンポーネントを含む改善された多重特異性結合剤を提供する。提供されるそのような剤は、そのような多量体化コンポーネントを欠いた親にあたる結合剤と比較して改善された機能特性を有する。
【０００６】
ある実施形態において、提供される剤は個々のポリペプチドから構成され、各ポリペプチドは、特定の標的と特異的に相互作用する結合部分を少なくとも１つ、より一般的には少なくとも２つ以上含む。多くの実施形態において、そのような結合部分は抗体コンポーネントであるか、抗体コンポーネントを含む。とりわけ、一部の実施形態において、本発明は、少なくとも抗体５Ｆ１１の結合エレメントを含むアミノ酸配列を有する抗体コンポーネントを含むポリペプチドを提供する。本発明によれば、提供される剤中のそのような個々のポリペプチドは、多量体化コンポーネントを含むように設計される。多くの実施形態において、そのようなポリペプチドは二量体化コンポーネントを含む。多くの実施形態において、二量体化コンポーネントは、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−１  ａｌｐｈａ）のエレメントである。
【０００７】
本明細書に記載される、ある特定の実施形態において、提供される剤は、多量体化コンポーネントを含むように設計された二重特異性抗体ポリペプチドから構成される。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤を提供し、各融合タンパク質は、第１の抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、第２の抗原に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）のエレメントを含む二量体化コンポーネントと、を含む。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明の第１の抗原及び第２の抗原は同一ではない。一部の実施形態において、本発明の第１の抗原は腫瘍抗原である。一部の実施形態において、腫瘍抗原はＢ細胞またはＴ細胞に関連する。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ２である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ３である。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明の第２の抗原はＴ細胞上に存在する。一部の実施形態において、本発明の第２の抗原はＣＤ３である。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明の二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。一部の実施形態において、本発明の二量体化ドメインは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）と実質的に同一である配列を有する。一部の実施形態において、本発明の二量体化ドメインは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）を含む。一部の実施形態において、本発明の二量体化ドメインは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）である。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と実質的に同一である配列を有する。
【００１４】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と同一である配列を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３から選択される配列を含む。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
一部の実施形態において、５’から３’に向けて、第１の抗体コンポーネントと、第２の抗体コンポーネントと、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）のエレメントを含む二量体化コンポーネントと、を含む融合タンパク質が提供される。一部の実施形態において、ヒトＨＮＦ−１αのエレメントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントは、単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ｓｃＦｖ）である。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第１のｓｃＦｖは腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第１のｓｃＦｖは腫瘍抗原ＧＤ２に結合する。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第１のｓｃＦｖは腫瘍抗原ＧＤ３に結合する。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第２のｓｃＦｖは、Ｔ細胞上に存在する抗原に結合する。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質の第２のｓｃＦｖは、Ｔ細胞上に存在する抗原ＣＤ３に結合する。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と実質的に同一である配列を有する。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３と同一である配列を有する。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３から選択される配列を含む。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質２つから構成される二量体型二重特異性結合剤が提供される。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質２つから構成される二量体型二重特異性結合剤と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明の核酸配列を含むベクターが提供される。
【００２９】
一部の実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態において、本発明の宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から成る群より選択される。一部の実施形態において、本発明の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞から成る群より選択される。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明の二量体型二重特異性結合剤の生産方法が提供され、上記方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を二量体型二重特異性結合剤の発現に好適な条件下で培養することと、二量体型二重特異性結合剤を回収することと、を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントを含む二重特異性抗体薬を含む高親和性二重特異性抗体組成物を提供する方法において改善がもたらされる。上記改善は、そのような第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントのうちの少なくとも１つを、ヒトＨＮＦ−１αの二量体化エレメントから構成される二量体化コンポーネントを有する融合物として提供することを含み、そのため、抗体コンポーネント−二量体化コンポーネント融合物はホモ二量体を形成することができる。一部の実施形態において、本発明の二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む。
【００３２】
一部の実施形態において、腫瘍細胞を死滅させる方法が提供される。上記方法は、二重特異性結合剤がホモ二量体を形成するために二量体化できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αのエレメントを含む二量体化コンポーネントと、を含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤に腫瘍細胞を接触させるステップを含み、上記接触は、ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍細胞の死滅を媒介するのに十分な条件下及び時間でおこなわれる。一部の実施形態において、本発明の二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤の第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ２である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ３である。
【００３３】
一部の実施形態において、腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。上記方法は、二重特異性抗体がホモ二量体を形成するために二量体化できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αのエレメントを含む二量体化コンポーネントと、を含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤に腫瘍を接触させるステップを含み、上記接触は、ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下及び時間でおこなわれる。一部の実施形態において、本発明の二量体化ドメインは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤の第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ２である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ３である。
【００３４】
一部の実施形態において、二重特異性結合剤がホモ二量体を形成するために二量体化できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αのエレメントを含む二量体化コンポーネントと、を含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤が提供され、ここで、上記ホモ二量体は、二量体化コンポーネントを含まないこと以外は、同等の二重特異性結合剤と比較して、より長い半減期を特徴とする。一部の実施形態において、本発明の二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤の第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ２である。一部の実施形態において、本発明の腫瘍抗原はＧＤ３である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤であって、
各融合タンパク質が、第１の抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、第２の抗原に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）エレメントを含む二量体化コンポーネントとを含む、
二重特異性結合剤。
（項目２）
前記第１の抗原及び前記第２の抗原が同一ではない、項目１に記載の結合剤。
（項目３）
前記第１の抗原が腫瘍抗原である、項目１または２に記載の結合剤。
（項目４）
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、項目１〜３のいずれか１項に記載の結合剤。
（項目５）
前記第２の抗原がＴ細胞上に存在する、項目１〜４のいずれか１項に記載の結合剤。
（項目６）
前記第２の抗原がＣＤ３である、項目５に記載の結合剤。
（項目７）
前記二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の結合剤。
（項目８）
項目１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目９）
５’から３’に向けて、第１の抗体コンポーネントと、第２の抗体コンポーネントと、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）エレメントを含む二量体化コンポーネントとを含む融合タンパク質。
（項目１０）
前記ＨＮＦ−１αエレメントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、項目９または１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記第１のｓｃＦＶが腫瘍抗原に結合し前記第２のｓｃＦｖがＴ細胞上に存在する抗原に結合する、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、項目１２に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記Ｔ細胞上に存在する抗原がＣＤ３である、項目１２または１３に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
項目１４に記載の融合タンパク質２つから構成される二量体型二重特異性結合剤。
（項目１６）
項目１５に記載の二量体型二重特異性結合剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目１７）
項目９〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
（項目１８）
項目１７に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１９）
項目１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目２０）
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から成る群より選択される、項目１９に記載の宿主細胞。
（項目２１）
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞から成る群より選択される、項目２０に記載の宿主細胞。
（項目２２）
二量体型二重特異性結合剤の生産方法であって、前記二量体型二重特異性結合剤の発現に好適な条件下で項目２１に記載の宿主細胞を培養することと、前記二量体型二重特異性結合剤を回収することとを含む方法。
（項目２３）
第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントを含む二重特異性抗体薬を含む高親和性二重特異性抗体組成物を提供する方法であって、前記改善は、抗体コンポーネント−二量体化コンポーネント融合物がホモ二量体を形成できるように、そのような第１の抗体コンポーネント及び第２の抗体コンポーネントのうちの少なくとも１つをヒトＨＮＦ−１α二量体化エレメントから構成される二量体化コンポーネントを有する融合物として提供することを含む、方法。
（項目２４）
前記二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
腫瘍細胞を死滅させる方法であって、二重特異性結合剤が二量体化してホモ二量体を形成できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含む二量体化コンポーネントとを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤に、前記腫瘍細胞を接触させるステップを含み、前記接触は前記ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍細胞の死滅を媒介するのに十分な条件下及び時間でおこなわれる、方法。。
（項目２６）
前記二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、項目２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
腫瘍の増殖を阻害する方法であって、二重特異性抗体が二量体化してホモ二量体を形成できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含む二量体化コンポーネントとを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤に、腫瘍を接触させるステップを含み、前記接触は前記ホモ二量体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下及び時間でおこなわれる、方法。
（項目３０）
前記二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の抗体フラグメント及び前記第２の抗体フラグメントがｓｃＦｖである、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、項目２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
二重特異性結合剤が二量体化してホモ二量体を形成できるように、それぞれが５’から３’に向けて、腫瘍抗原に結合する第１の抗体コンポーネントと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗体コンポーネントと、ヒトＨＮＦ−１αエレメントを含む二量体化コンポーネントとを含む２つの融合タンパク質から構成される二重特異性結合剤であって、
前記ホモ二量体は前記二量体化コンポーネントを含まないこと以外は同等の二重特異性結合剤と比較して半減期がより長いことを特徴とする、二重特異性結合剤。
（項目３４）
前記二量体化コンポーネントがヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基を含む、項目３３に記載の二重特異性結合剤。
（項目３５）
前記第１の抗体コンポーネント及び前記第２の抗体コンポーネントがｓｃＦｖである、項目３３または３４に記載の二重特異性結合剤。
（項目３６）
前記腫瘍抗原がＧＤ２である、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の二重特異性結合剤。
【００３５】
本明細書に包含される、以下の図から構成される図面は、例示を目的とするに過ぎず、限定を目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｓｃＦｖ５Ｆ１１−ｓｃＦｖＯＫＴ３（ＧＤ２ｘＣＤ３）二重特異性結合剤及び二量体型ｓｃＦｖ５Ｆ１１−ｓｃＦｖＯＫＴ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤の模式図（縮尺は一定ではない）を示す。
【図２Ａ】ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、ＧＤ２結合（上）及びＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ３結合（下）のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。
【図２Ｂ】ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、Ｊｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ３結合を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、ＧＤ２結合のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。以下の二重特異性抗体濃度での記録を示す：６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎＭ。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、ＧＤ２結合のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。以下の二重特異性抗体濃度での記録を示す：６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎＭ。
【図４】ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、インビトロにおけるＴ細胞が媒介するメラノーマ細胞系列及びニューロブラストーマ細胞系列の死滅の割合を示す。
【図５】異種移植片研究モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｓｔｕｄｙ  ｍｏｄｅｌ）の、対照（無処置）群、ＧＤ２ｘＣＤ３で処置した群、及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤで処置した群における、ＢＡＬＢ／ｃＡ−Ｒａｇ２ＫＯ／ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＤＫＯ）マウスに移植された皮下のＳＫＮＬＤ腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
【図６】異種移植片研究モデルの、対照（無処置）群、ＧＤ２ｘＣＤ３で処置した群、及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤで処置した群における、ＢＡＬＢ／ｃＡ−Ｒａｇ２ＫＯ／ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＤＫＯ）マウスに移植された皮下のＭ１４腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
【図７】３ＬＨＢＴ二重特異性結合剤及び３ＬＨＢＴ−ＨＤＤ二重特異性結合剤についての、ＧＤ２結合のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。
【図８】異なる二量体化ドメインを有するＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤についての、ＧＤ２結合のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。
【図９】異なる二量体化ドメインを有するＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤についての、インビトロにおけるＴ細胞が媒介するメラノーマ細胞系列及びニューロブラストーマ細胞系列の死滅の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ある実施形態の詳細な説明
本発明は、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されるものではなく、従って方法及び条件は変更されてよい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、示されない限り限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００３８】
特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語ならびに技術的表現及び科学的表現は、当業者によって一般に理解される場合と同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
定義
本発明がより容易に理解されるように、最初に特定の用語を以下で定義する。以下の用語及びその他の用語の追加的な定義は、本明細書を通じて記載される。
【００４０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、そうではないことが文脈上明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数表示（ｐｌｕｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を包含する。従って、例えば「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」なる言及は、１以上の方法、ならびに／あるいは本明細書に記載されるタイプのステップ及び／または本開示を閲覧すれば当業者には明らかとなるステップなどを包含する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「親和性の成熟した」（または「親和性の成熟した抗体」）は、そのＣＤＲの１つ以上において１以上の改変を有する抗体であって、これらの改変を有さない親にあたる抗体と比較した場合に上記改変が抗原に対する抗体の親和性を向上させる抗体、を指す。一部の実施形態において、親和性の成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度の親和性を有するか、さらには、ピコモル濃度の親和性を有する。親和性の成熟した抗体は、当技術分野において公知の様々な方法のいずれかによって生産されてよい。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ.Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６（１９９２）には、ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発が記載されている。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「抗体」は、その技術分野で理解される意味を有し、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。当業者には公知のように、天然において生産される抗体は一般に、２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）という４つのポリペプチド鎖から構成される。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、可変領域（本明細書においてそれぞれＨＣＶＲまたはＶＨならびにＬＣＶＲまたはＶＬと略される）及び定常領域から構成される。重鎖の定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン（及びＩｇＭならびにＩｇＥの場合には任意選択でＣＨ４ドメイン）を含む。軽鎖の定常領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称されるより保存された領域に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域をさらに含む。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて以下の順番で配置される３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「抗体コンポーネント」は、エピトープまたは抗原に特異的に結合するポリペプチドエレメント（完全なポリペプチド、あるいは、例えば本明細書に記載されるような融合ポリペプチドなどの、より大きなポリペプチドの一部、であってよい）を指し、免疫グロブリンの構造的特徴を１つ以上含む。一般に、抗体コンポーネントは、そのアミノ酸配列が抗体の結合領域（例えば、抗体の軽鎖あるいはその可変領域または１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、もしくは抗体の重鎖あるいはその可変領域または１つ以上のＣＤＲ、任意選択で１つ以上のフレームワーク領域が存在する）に特有のエレメントを含む、任意のポリペプチドである。一部の実施形態において、抗体コンポーネントは完全長の抗体であるか、完全長の抗体を含む。一部の実施形態において、抗体コンポーネントは完全長よりも短いが、（公知の抗体の「可変領域」の構造を有する配列を少なくとも１つ、及び、好ましくは少なくとも２つ、含む）結合部位を少なくとも１つ含む。一部の実施形態において、用語「抗体コンポーネント」は、免疫グロブリン−結合ドメインと相同であるか、または大部分において相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。特定の実施形態において、含まれる「抗体コンポーネント」は、免疫グロブリンの結合ドメインと少なくとも９９％の同一性を示す結合ドメインを有するポリペプチドを包含する。一部の実施形態において、含まれる「抗体コンポーネント」は、免疫グロブリンの結合ドメインと、例えば基準となる免疫グロブリンの結合ドメインと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す結合ドメインを有する任意のポリペプチドである。含まれる「抗体コンポーネント」は、天然源において見出される抗体（またはその一部、例えば、その抗原結合部分）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有してよい。抗体コンポーネントは、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってよい。抗体コンポーネントは、ヒトのクラスのいずれかを含む任意の免疫グロブリンのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、に特有の構造エレメントを含んでよい。抗体の抗原結合機能は完全長の抗体のフラグメントによってなされ得ることが示されている。このような抗体の実施形態もまた、２種以上の異なる抗原に特異的に結合する、二重特異性型、双特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）型、または多重特異性型であってよい。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１及びＣＬドメインから成る一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＨ及びＶＬドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が���げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＨとＶＬは異なる遺伝子にコードされているが、組換えの手法を用いて、ＶＨとＶＬを、ＶＨ領域とＶＬ領域が一対となって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）として作製することを可能にする合成リンカーによってＶＨとＶＬを連結することが可能である。一部の実施形態において、「抗体コンポーネント」は、本明細書に記載されるように、そのような単鎖の抗体であるか、またはそのような単鎖の抗体を含む。一部の実施形態において、「抗体コンポーネント」は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）であるか、ダイアボディを含む。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性抗体であるが、同一鎖上の２つのドメイン間で対をなすには短すぎるリンカーが用いられており、それにより、ドメインが別の鎖の相補的なドメインと対をなすようになり、２つの抗原結合部位を生じさせる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。このような抗体の結合部分は、当技術分野において公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５））。一部の実施形態において、抗体コンポーネントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に１組の抗原結合領域を形成する１組の直列Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖の「直鎖状の抗体」であるか、これを含む（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）、ならびに米国特許第５，６４１，８７０号）。一部の実施形態において、抗体コンポーネントは、キメラ抗体またはヒト化抗体に特有の構造エレメントを有してよい。一般に、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどのヒトではない種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の実施形態において、抗体コンポーネントは、ヒト抗体に特有の構造エレメントを有してよい。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「生物活性」は、目的の剤または実体によって達成される、観察可能な生物学的効果または結果を指す。例えば、一部の実施形態において、特異的な結合相互作用は生物活性である。一部の実施形態において、生物学的経路または現象の調節（例えば、誘導、亢進、または阻害）は生物活性である。一部の実施形態において、生物活性の存在または程度は、目的の生物学的経路または現象により生み出される直接的または間接的な産物の検出によって評価される。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「二重特異性抗体」は、結合部分の少なくとも１つが、及び一般には両方が、抗体コンポーネントであるか、抗体コンポーネントを含む、二重特異性結合剤を指す。様々な異なる二重特異性抗体の構造が当技術分野において公知である。一部の実施形態において、抗体コンポーネントであるか、抗体コンポーネントを含む二重特異性抗体の結合部分のそれぞれは、ＶＨ領域及び／またはＶＬ領域を含み、そのような一部の実施形態において、ＶＨ領域及び／またはＶＬ領域は、特定のモノクローナル抗体に見出されるＶＨ領域及び／またはＶＬ領域である。一部の実施形態において、二重特異性抗体が２つの抗体コンポーネントの結合部分を含む場合、それぞれが異なるモノクローナル抗体由来のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域を含む。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「二重特異性結合剤」は、それぞれ異なる標的に結合する２つの別個の結合部分を有するポリペプチド剤を指す。一部の実施形態において、二重特異性結合剤は、単一のポリペプチドである。一部の実施形態において、二重特異性結合剤は、複数のペプチドであるか、複数のペプチドを含み、そのような一部の実施形態において、複数のペプチドは、例えば架橋によって、共有結合で互いに結合されてよい。一部の実施形態において、二重特異性結合剤の２つの結合部分は、同一の標的（例えば、抗原）の異なる部位（例えば、エピトープ）を認識する。一部の実施形態において、上記２つの結合部分は、異なる標的を認識する。一部の実施形態において、二重特異性結合剤は、異なる構造の２つの標的に同時に結合することができる。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「担体」は、組成物と共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。一部の例示的な実施形態において、担体は、例えば水などの無菌の液体を、ならびに、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等などの石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油を含む油を含むことができる。一部の実施形態において、担体は１種以上の固形成分であるか、これを含む。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「ＣＤＲ」は、抗体の可変領域内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在し、可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と命名されている。「ＣＤＲのセット」または「ＣＤＲセット」は、抗原に結合できる単一の可変領域あるいは抗原に結合できる同源の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲのいずれかに存在する、３つまたは６つのＣＤＲの群を指す。ＣＤＲの境界の定義は、そのいくつかが当技術分野において公知であるシステム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ等）によって異なっている。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「ＣＤＲ−グラフト化抗体」は、マウスのＣＤＲのうちの１つ以上（例えばＣＤＲ３）がヒトのＣＤＲ配列で置換されているマウスのＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体などの、そのアミノ酸配列がある種に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を含むが、ＶＨ及び／またはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つ以上の配列が別の種のＣＤＲ配列で置換されている、抗体を指す。同様にまた、「ＣＤＲ−グラフト化抗体」は、ヒトのＣＤＲのうちの１つ以上（例えばＣＤＲ３）がマウスのＣＤＲ配列で置換されているヒトのＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体を指してもよい。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」は、そのアミノ酸配列が、第１の種において見出されるＶＨ領域及びＶＬ領域の配列と、第１の種とは異なる第２の種において見出される定常領域の配列とを含む、抗体を指す。多くの実施形態において、キメラ抗体は、ヒトの定常領域に連結されたマウスのＶＨ領域及びＶＬ領域を有する。一部の実施形態において、ヒトのものではない定常領域（例えばマウスの定常領域）に連結されたヒトのＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、「リバースキメラ抗体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」と呼ばれる。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「同等の」は、互いに同一ではなくてよいが、観察される差異または類似性に基づいて合理的に結論を得ることができるようにそれらの間で比較が可能なほどには十分に類似している、２以上の剤、実体、状況、条件のセット等に対して適用される。当業者であれば、２以上のこのような剤、実体、状況、条件のセット等が同等であるとみなされるには、任意の所定の環境においてどの程度の同一性が必要とされるかについて、文脈上、理解するであろう。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「二量体化コンポーネント」は、ポリペプチド鎖に含まれた場合に、その鎖と、二量体化コンポーネントをやはり含む１つ以上の他のポリペプチドとのより高次な複合体への非共有結合的な会合を媒介するポリペプチドのエレメントを指す。相互作用するポリペプチド鎖同士が同一の配列を有する場合、結果として生じる会合したより高次の複合体は、「ホモ二量体」（または、３以上の鎖が含まれる場合には「ホモ多量体」）と呼ばれる。相互作用するポリペプチド鎖同士が異なる配列を有する場合、結果として生じる会合した複合体は、「ヘテロ二量体」（または「ヘテロ多量体」）と呼ばれる。一部の実施形態において、二量体化コンポーネントの長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００アミノ酸であるか、それよりも長い。本明細書に記載されるように、多くの潜在的な二量体化コンポーネントが当技術分野において公知である。一部の実施形態において、二量体化コンポーネントは、例えばジスルフィド結合の形成による、共有結合による結合のための部位を含んでよい。ある実施形態において、本発明による使用のための二量体化コンポーネントは、ＨＮＦ−１α以外のポリペプチドに導入された場合に二量体化を媒介する、ヒトＨＮＦ−１αに見出されるエレメントであるか、これを含む。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「エピトープ」は、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）の結合コンポーネントによって特異的に認識される任意の部分を包含する。一部の実施形態において、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または化学基から構成される。一部の実施形態において、このような化学原子または化学基は、抗原が適切な３次元立体構造をとると表面に露出する。一部の実施形態において、このような化学原子または化学基は、抗原がそのような立体構造をとる場合、空間において互いに物理的に近い。一部の実施形態において、このような化学原子または化学基の少なくともいくつかは、抗原が別の立体構造をとると（例えば直鎖状になると）、互いに物理的に引き離される。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「賦形剤」は、例えば所望の粘稠度（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）または安定化効果を付与するか、これらに寄与するために、医薬組成物に含まれてよい非治療剤を指す。好適な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「フレームワーク」または「フレームワーク領域」は、ＣＤＲを除いた可変領域の配列を指す。ＣＤＲ配列は異なるシステムによって決定され得るため、同様にフレームワーク配列も、それに対応して異なった解釈をされる。６つのＣＤＲが重鎖及び軽鎖上のフレームワーク領域を各鎖上で４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、及びＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定のサブ領域を特定しない場合、フレームワーク領域は、他所で言及されるように、単一の天然起源の免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲを合わせたものを表す。本明細書において使用される場合、ＦＲは４つのサブ領域のうちの１つを表し、例えばＦＲ１は、可変領域のアミノ末端に最も近く、ＣＤＲ１に対して５’側である第１のフレームワーク領域を表し、ＦＲ（複数）は、フレームワーク領域を構成する２つ以上のサブ領域を表す。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、（組換えまたはその他の）外因性のＤＮＡが導入されている細胞を指す。本開示を閲覧する当業者は、このような用語が特定の対象の細胞だけではなく、そのような細胞の後代をも指すことを理解するであろう。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、後代において一定の変化が生じ得るため、そのような後代は、実際、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書において使用される「宿主細胞」なる用語の範囲にやはり包含される。一部の実施形態において、宿主細胞は、外因性のＤＮＡ（例えば組換え核酸配列）の発現に好適な、生物の界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞を包含する。例示的な細胞としては、原核生物及び真核生物の細胞（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．等の株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えばＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ等）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、あるいは、例えばハイブリドーマまたはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。一部の実施形態において、細胞は真核性であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えばＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えばＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞系列。一部の実施形態において、細胞は１つ以上のウイルス遺伝子を含み、これは例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えばＰＥＲ.Ｃ６（商標）細胞）である。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列から生成（または構築）された可変領域及び定常領域を有する抗体を包含することが企図される。一部の実施形態において、抗体（または抗体コンポーネント）は、たとえそのアミノ酸配列が、例えば１つ以上のＣＤＲにおいて、及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列にコードされない残基またはエレメントを含む場合（例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、あるいは、インビボでの体細胞突然変異によって（元来）導入されている可能性のある、配列の変種を含む場合など）であっても「ヒトの」ものであるとみなされてよい。
【００５８】
「ヒト化」；当技術分野において公知のように、用語「ヒト化」は一般に、そのアミノ酸配列が、ヒト以外の種（例えばマウス）で生産されたリファレンス抗体に由来するＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を含むが、そのアミノ酸配列はまた、それらをより「ヒト様」にすること、すなわちヒト生殖系列の可変配列により類似させることを意図してリファレンス抗体に対しＶＨ領域及びＶＬ領域の配列中に改変も含む、抗体（または抗体コンポーネント）を指すために使用される。一部の実施形態において、「ヒト化」抗体（または抗体コンポーネント）は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のものと実質的に同様のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、非ヒト抗体のものと実質的に同様のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、を有する抗体である。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、及び一般には２つの、可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含み、上記可変ドメインにおいて、全ての、または実質的に全てのＣＤＲ領域は、ヒトのものではない免疫グロブリン（すなわちドナー免疫グロブリン）のＣＤＲ領域に相当し、全ての、または実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域である。一部の実施形態において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部、を含む。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と重鎖のうちの少なくとも可変ドメインとの両方を含む。また、上記抗体は、重鎖の定常領域のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及び任意選択でＣＨ４領域を含んでよい。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＬ領域を含むだけである。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨ領域を含むだけである。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨ領域及びヒト化ＶＬ領域を含む。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「単離された」は、（１）（天然においても、及び／または実験環境においても）最初に生産された際にそれが一体となっていたコンポーネントの少なくとも一部から分離されており、及び／または（２）人の手によって設計され、生産され、調製され、及び／または製造された、物質及び／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に一体となっていたその他のコンポーネントの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離されてよい。一部の実施形態において、単離された剤の純度は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超である。本明細書において使用される場合、ある物質が他のコンポーネントを実質的に含まない時、その物質は「純粋」である。一部の実施形態において、当業者であれば理解するように、物質は、例えば、１種以上の担体または賦形剤（例えばバッファ、溶媒、水等）などの特定の他のコンポーネントと組み合わされた後でも、「単離された」、または、さらには「純粋」、とみなされてよい。このような実施形態において、物質のパーセント単離またはパーセント純度は、そのような担体または賦形剤を含めずに算出される。ほんの一例としては、一部の実施形態において、天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、（ａ）その起源または由来のソースに起因して、天然におけるその自然状態においてそれに付随するコンポーネントの一部または全てと一体となっていない場合、（ｂ）天然においてそれを生産する種に由来する同一の種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない場合、（ｃ）天然においてそれを生産する種のものではない細胞またはその他の発現系により発現されるか、または、上記細胞またはその他の発現系に由来するコンポーネントと一体となっている場合、に「単離された」とみなされる。従って、例えば、一部の実施形態において、化学合成されたポリペプチド、あるいは、天然においてそれを生産するものとは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。代替的には、または追加的には、一部の実施形態において、１以上の精製技術に供されたポリペプチドは、（ａ）天然においてそれが一体となっている他のコンポーネント、及び／または（ｂ）最初に生産された際にそれが一体となっていた他のコンポーネント、から分離されている限り、「単離された」ポリペプチドとみなされてよい。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「ＫＤ」は、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合コンポーネントが結合するエピトープ）との複合体からの結合剤（例えば、抗体またはその結合コンポーネント）の解離定数を指す。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「Ｋｏｆｆ」は、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合コンポーネントが結合するエピトープ）との複合体からの結合剤（例えば、抗体またはその結合コンポーネント）の解離についての解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）定数を指す。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「Ｋｏｎ」は、結合剤（例えば、抗体またはその結合コンポーネント）の、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合コンポーネントが結合するエピトープ）との結合についての結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）定数を指す。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「リンカー」は、異なるエレメントを互いに連結する、複数のエレメントを有するポリペプチドの一部を指すために使用される。例えば、当業者であれば、その構造が２つ以上の機能ドメインまたは構成ドメインを含むポリペプチドは、そのようなドメイン間に、それらを互いに連結するアミノ酸のストレッチを含むことが多いと認識する。一部の実施形態において、リンカーエレメントを含むポリペプチドは、一般的形態Ｓ１−Ｌ−Ｓ２という全体構造を有し、ここでＳ１及びＳ２は、同一であるか、または異なり、リンカーによって互いに結合している２つのドメインを表す。一部の実施形態において、リンカーの長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００アミノ酸であるか、それよりも長い。一部の実施形態において、リンカーは、強固な３次元構造をとらない傾向があり、むしろポリペプチドに柔軟性を付与することを特徴とする。ポリペプチド（例えば融合ポリペプチド）を設計する場合に適切に使用され得る様々な異なるリンカーエレメントが当技術分野において公知である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「多価結合剤」は、同一分子上または異なる分子上にあってよい２つ以上の抗原に結合できる結合剤を指す。本明細書に記載される多価結合剤は、一部の実施形態において、３つ以上の抗原結合部位を有するように設計され、一般に、天然に存在するタンパク質ではない。本明細書に記載される多価結合剤は、２つ以上の、関連する標的または関連のない標的に結合できる結合剤を指す。多価結合剤は、単一の抗体コンポーネントの複数のコピー、または異なる抗体コンポーネントの複数のコピー、から構成されてよい。このような結合剤は、２つ以上の抗原に結合することができ、４価または多価の結合剤である。多価結合剤は、例えば免疫調節薬、トキシンまたはＲＮＡ分解酵素などの治療剤をさらに含んでよい。本明細書に記載される多価結合剤は、一部の実施形態において、例えば、２つの異なる抗原、同一抗原上の２つの異なるエピトープ、あるいはハプテン及び／または抗原もしくはエピトープといった、異なる構造の少なくとも２つの標的に同時に結合できる。多くの実施形態において、本発明の多価結合剤は、本明細書に記載される多価結合剤の特徴を有するように設計されたタンパク質である。本発明の多価結合剤は、単一特異性（１種類の抗原に結合できる）または多重特異性（２種類以上の抗原に結合できる）であってよく、２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドから構成されてよい。一部の実施形態において、各結合部位は、抗原結合部位による抗原への結合に関与する合計６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成される。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「核酸」は、その最も広範な意味においては、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る、任意の化合物及び／または物質を指す。一部の実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合によりオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る、化合物及び／または物質である。文脈から明らかなように、一部の実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えばヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡであるか、ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、「核酸」は、ＤＮＡであるか、ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、１つ以上の天然の核酸残基を含むか、または１つ以上の天然の核酸残基から成る。一部の実施形態において、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、１つ以上の核酸類似体を含むか、または１つ以上の核酸類似体から成る。一部の実施形態において、核酸類似体はホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態において、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、１つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、または１つ以上の「ペプチド核酸」から成り、上記「ペプチド核酸」は当技術分野において公知であり、その骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内にあるとみなされる。代替的には、または追加的には、一部の実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエート結合及び／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を１つ以上有する。一部の実施形態において、核酸は、１つ以上の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、これらを含むか、またはこれらから成る。一部の実施形態において、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５  プロピニル−シチジン、Ｃ−５  プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレートされた塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、これらを含むか、またはこれらから成る。一部の実施形態において、核酸は、天然の核酸のものと比較して、１つ以上の修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する��一部の実施形態において、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態において、核酸は、天然源からの単離、（インビボまたはインビトロでの）相補的鋳型を基にした重合による酵素的合成、組換え細胞または組換え系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。一部の実施形態において、核酸の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基であるか、それよりも長い。一部の実施形態において、核酸は一本鎖である。一部の実施形態において、核酸は二本鎖である。一部の実施形態において、核酸は、ポリペプチドをコードするか、あるいはポリペプチドをコードする配列の相補配列である、少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態において、核酸は酵素活性を有する。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「機能可能に連結された」は、記載されるコンポーネントが、それらの意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列に「機能可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結される。「機能可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と隣接した発現制御配列、及びトランスに、あるいは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列、の両方を包含する。本明細書において使用される用語「発現制御配列」は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始配列、転写終結配列、転写プロモーター配列及び転写エンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの有効なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を向上させる配列；及び、望ましい場合には、タンパク質の分泌を亢進する配列、を含む。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含むのに対し、真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセシングに不可欠である要素を含むことを企図され、また、その存在が有益である追加的な要素を、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を、含み得る。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「生理的条件」は、細胞または生物が生存及び／または繁殖する条件を引用する、当技術分野において理解される意味を有する。一部の実施形態において、上記用語は、生物または細胞系にとって天然に存在する可能性のある外部環境または内部環境の条件を指す。一部の実施形態において、生理的条件は、ヒトまたはヒト以外の動物の体内に存在する条件であり、特に手術部位に、及び／または手術部位内に存在する条件である。生理的条件は一般に、例えば、２０〜４０℃の温度範囲、１気圧、ｐＨ６〜８、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気レベルの酸素濃度、及び地球上で観察されるような重力、を包含する。一部の実施形態において、実験室での条件は、生理的条件に操作及び／または維持される。一部の実施形態において、生理的条件は、生物内に観察される。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意の重合鎖を指す。一部の実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、人の手によって設計及び／または生産されるという点において操作されたアミノ酸配列を有する。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「組換えの」は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現されるポリペプチド、組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．  １５：６２−７０、Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．，（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：４２５−４４５、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）から単離されたポリペプチド、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入された動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：６２８７−６２９５、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０を参照のこと）、または選択された配列エレメントを互いにつなぎ合わせることを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成または単離されるポリペプチドなどの、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、生成または単離されるポリペプチド（例えば、抗体または抗体コンポーネント、あるいは本明細書に記載される多重特異性結合剤）に対して適用されることが企図される。一部の実施形態において、そのような選択された配列エレメントの１つ以上は、天然に見出される。一部の実施形態において、そのような選択された配列エレメントの１つ以上は、コンピュータで設計される。一部の実施形態において、そのような選択された配列エレメントの１つ以上は、例えば天然源または合成源由来の、公知の配列エレメントの（例えばインビボまたはインビトロでの）変異誘発により生じる。例えば、一部の実施形態において、組換え抗体ポリペプチドは、目的のソース生物（例えば、ヒト、マウス等）の生殖系列において見出される配列から構成される。一部の実施形態において、組換え抗体は、（例えばインビボまたはインビトロでの、例えばトランスジェニック動物における）変異誘発により生じるアミノ酸配列を有し、そのため、上記組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、生殖系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来及び関係するもののインビボにおける生殖系列の抗体レパートリーに天然には存在しない可能性のある配列である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「回収」は、例えば単離（例えば当技術分野において公知の精製技術を用いた単離）によって、それ以前に一体となっていた他のコンポーネントを実質的に含まない剤または実体をもたらすプロセスを指す。一部の実施形態において、剤または実体は、天然源及び／または細胞を含むソースから回収される。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「特異的結合」は、結合剤の、結合の生じるべき環境において潜在的パートナー間の判別ができる能力に対して適用される。他の潜在的な標的が存在する場合に１種の特定の標的と相互作用する結合剤は、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態において、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の結合の度合を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態において、特異的結合は、結合剤−パートナー複合体の解離の度合を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態において、特異的結合は、結合剤の、そのパートナーと別の実体との間の代替的な相互作用に競合する能力を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態において、特異的結合は、そのような検出または決定を様々な濃度にわたって実施することにより評価される。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒトを含む任意の動物を意味する。本発明のある実施形態において、対象は、成体、若年体（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ）または乳児である。一部の実施形態において、用語「個人」または「患者」は、「対象」と交換可能に使用され、及び、「対象」と交換可能であることが企図される。また、子宮内における医薬組成物の投与及び／または治療方法の実施も、本発明により企図される。
【００７３】
「実質的に」：本明細書において使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性を完全なまたはほぼ完全な程度または度合で示すという定性的条件を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的現象及び化学的現象が完了に至ること、及び／または完全に進行すること、あるいは完全な結果を達成または回避すること、は極めて稀であると理解するであろう。従って、用語「実質的に」は本明細書において、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を取り込むために使用される。
【００７４】
「実質的な配列相同性」：「実質的な相同性」なる表現は本明細書において、アミノ酸配列間の比較または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解するように、２つの配列は一般に、対応する位置に相同的な残基を含む場合に「実質的に相同」であるとみなされる。相同的な残基は、同一残基であってよい。あるいは、相同的な残基は、適切に類似である構造的特徴及び／または機能的特徴を有する非同一残基であってよい。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は一般に、「疎水性」または「親水性」アミノ酸に分類され、及び／または「極性」側鎖または「非極性」側鎖を有するとして分類される。あるアミノ酸を同タイプの別のアミノ酸で置換することは、多くの場合、「相同的な」置換とみなされてよい。表１及び表２に一般的なアミノ酸分類について概要を記載する。
【表１】
0006480907.tif 000002
【表２】
0006480907.tif 000003
【００７５】
当技術分野において周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの商業用コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてよい。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載され、上記のものは全て、参照により本明細書に組み込まれる。相同配列の同定に加えて、上述のプログラムは一般に、相同性の度合の指標を提供する。一部の実施形態において、２つの配列の対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９％超が、残基のうちの関連性のあるストレッチにわたって相同である場合、２つの配列は実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態において、関連性のあるストレッチは全配列である。一部の実施形態において、関連性のあるストレッチは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００残基または５００残基超である。
【００７６】
「実質的な同一性」：「実質的な同一性」なる表現は本明細書において、アミノ酸配列間の比較または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解するように、２つの配列は一般に、対応する位置に同一の残基を含む場合に「実質的に同一」であるとみなされる。当技術分野において周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの商業用コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてよい。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：  ４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列の同定に加えて、上述のプログラムは一般に、同一性の度合の指標を提供する。一部の実施形態において、２つの配列の対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超が、残基のうちの関連性のあるストレッチにわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態において、関連性のあるストレッチは全配列である。一部の実施形態において、関連性のあるストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基または５００残基超である。ＣＤＲに関する場合、「実質的な同一性」なる言及は一般に、基準となるＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲに対して適用される。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）などを用いたバイオセンサーマトリックス内でのタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムでの特異的結合相互作用の解析を可能にする光学的現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７を参照のこと。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「治療上有効な量」は、その投与目的である所望の効果をもたらす量を意味する。一部の実施形態において、上記用語は、疾患、障害及び／または状態に罹患した、または罹患しやすい集団に、治療的投与計画に従って投与した場合に上記疾患、障害及び／または状態を治療するのに十分な量を指す。一部の実施形態において、治療上有効な量は、疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状の発症率及び／または重症度を低減させる量、及び／または疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状の発症を遅らせる量である。当業者であれば、用語「治療上有効な量」は、特定の個体において治療が成功することを実際には必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療上有効な量は、そのような治療を必要とする患者に投与した場合に、対象の大多数において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量であってよい。一部の実施形態において、治療上有効な量なる言及は、１つ以上の特定の組織（例えば、疾患、障害または状態に罹患した組織）または流体（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿等）において測定された量を指してよい。当業者であれば、一部の実施形態において、特定の剤または治療の治療上有効な量が単一用量で製剤化及び／または投与されてよいことを理解するであろう。一部の実施形態において、治療上有効な剤は複数用量で、例えば投与計画の一部として、製剤化及び／または投与されてよい。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「形質転換」は、外因性のＤＮＡを宿主細胞に導入する任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野において周知の様々な方法を用いて天然条件下または人工条件下で生じてよい。形質転換は、原核宿主細胞または真核宿主細胞に外来性の核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依存してよい。一部の実施形態において、形質転換される宿主細胞に基づいて特定の形質転換の方法論が選択され、上記方法論は、限定されるものではないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、接合、リポフェクションを包含してよい。一部の実施形態において、「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミド、あるいは宿主の染色体の一部、のいずれかとして複製可能であるという点で安定に形質転換されている。一部の実施形態において、形質転換された細胞は、限られた期間の間、導入された核酸を一過的に発現する。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を運搬できる核酸分子を指す。ベクターの１種が「プラスミド」であり、その中に追加のＤＮＡセグメントが連結されてよい環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別種のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがそのウイルスゲノム中に連結されてよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳類ベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｖｅｃｔｏｒ））。その他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳類ベクター（ｎｏｎ−ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｖｅｃｔｏｒ））は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００８１】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチドの合成、及び組織培養ならびに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的な技術が使用されてよい。製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に実施されるように、あるいは本明細書に記載されるように、酵素反応及び精製技術が実施されてよい。当技術分野において周知である従来の方法に従って、及び、本明細書の全体にわたって引用ならびに議論されている様々な一般的な、より詳細な参考文献に記載されるように、上述の技術及び手法が一般に実施されてよい。例えば、任意の目的で参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
【００８２】
多価結合剤
当業者であれば認識するように、多価結合剤は、２つ以上の標的（例えばエピトープ）に特異的に結合する結合コンポーネントを含む分子実体または複合体である。このような多価結合剤には、治療用途を含む、当技術分野における様々な用途が見出される。ほんの一例としては、当業者であれば認識するように、多価結合剤は、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍部位に導く（あるいはリクルートする）ことによって腫瘍細胞の死滅を促進するように設計されている。腫瘍抗原の例としては、限定されるものではないが、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルレチニン、癌胎児性抗原、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１  ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ｇｒｏｓｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、ＣＤ４５、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（メラン−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異抗原、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィジン、サイログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、及びビメンチンが挙げられる。
【００８３】
Ｔ細胞を誘導する多重特異性結合剤の潜在的有効性は、Ｔ細胞が媒介する死滅を目的として、これらの剤がＴ細胞を腫瘍部位に導くことができることにある。Ｔ細胞は、異常な細胞を死滅させることにおいて、免疫系における最も強力なエフェクター細胞であり、Ｆｃが媒介する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が不可能である。そのような多価結合剤がＴ細胞を腫瘍部位に導くメカニズムは、腫瘍表面上の腫瘍抗原とＴ細胞表面上の共受容体であるＣＤ３との結合を介したものである。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の表面上に発現する３つの鎖（γ、δ及びε）の複合体である。ＣＤ３の発現は、ほぼ完全にＴ細胞に限定される。二重特異性結合剤の抗ＣＤ３コンポーネントは、それ以前には刺激されていない中立の非クローン性Ｔ細胞を、腫瘍細胞に対する強力なシリアルキラー（ｓｅｒｉａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）となるように変化させることができる（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０：１２３７−１２４４）。このタイプの結合剤は、他の標的に加えて上皮細胞接着分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＥｐＣＡＭ）抗原を発現する固形腫瘍の動物異種移植片研究において有効性を実証している（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ、Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：１１２９−１１４３、Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４９４１−４９４４）。
【００８４】
一部の実施形態において、本発明に従って使用するための多価結合剤は、二重特異性結合剤である。多くの実施形態において、このような二重特異性結合剤はＴ細胞に結合できる。多くの実施形態において、このような二重特異性結合剤はＴ細胞上のＣＤ３に結合できる。
【００８５】
一部の実施形態において、本発明に従って使用するための多価結合剤または二重特異性結合剤は、抗体コンポーネントであるか、抗体コンポーネントを含む。抗体コンポーネントを含む多重特異性結合剤または二重特異性結合剤を設計、構築、及び／または生産するための様々な技術が当技術分野において公知である。
【００８６】
例えば、完全な免疫グロブリンのフレームワーク（例えばＩｇＧ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはそれらの組み合わせ、のいずれかを利用する二重特異性結合剤が構築されている。直列に並ぶ２つのｓｃＦＶユニットから構成される二重特異性結合剤は、臨床的に最も成功した二重特異性抗体の様式の１つであることが示されている。抗腫瘍免疫療法の場合において、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を直列で２つ含む二重特異性結合剤は、ＣＤ３に結合することによりＴ細胞を誘導するｓｃＦｖに、腫瘍抗原に結合するｓｃＦＶが連結されるように設計されている。この方法においては、特定のＴ細胞が有する細胞傷害特性によって腫瘍を構成する腫瘍細胞の死滅を媒介できることを期待して、Ｔ細胞が腫瘍部位にリクルートされる。リンパ腫のためにＣＤ１９及びＣＤ３を標的とするこのような二重特異性結合剤の例が作製されており（二重特異性Ｔ細胞誘導（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｉｎｇ）またはＢｉＴＥと呼称される；例えば、Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４３９７−４４０２、Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９７４−９７７を参照のこと）、動物異種移植片研究において腫瘍の増殖を防止することに成功している。ヒトでの研究においては、この二重特異性結合剤によって、５例の部分的な寛解及び２例の完全な寛解を含む目的の腫瘍応答が実証された。
【００８７】
例示的な二重特異性結合剤としては、腫瘍抗原に特異的な第１の抗体コンポーネントと、細胞傷害性マーカー、例えばＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ等）またはＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８等）、に特異的な第２の抗体コンポーネントと、を有する二重特異性結合剤が挙げられる。さらに、第２の抗体コンポーネントを、異なる所望の特異性を有する抗体コンポーネントで置換することができる。例えば、トキシン（例えば、サポリン、ビンカアルカロイド等）を腫瘍細胞に送達するために、腫瘍抗原に特異的な第１の抗体コンポーネントと、トキシンに特異的な第２の抗体コンポーネントと、を有する二重特異性結合剤が組み合わされ得る。その他の例示的な二重特異性結合剤としては、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩ、Ｔ細胞受容体等）に特異的な第１の抗体コンポーネントと、抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａ等）に特異的な第２の抗体コンポーネントと、を有する二重特異性結合剤が挙げられる。さらに別の例では、第１の抗体コンポーネントが特異的である細胞型と同じ細胞型上の異なる抗原、例えばＢ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣ１及びＣＤ２２、に特異的な第２の抗体コンポーネントが含まれる。細胞活性化に関連した治療上の状態（例えばアレルギー及び喘息）のために、このような二重特異性結合剤を構築できる。例えば、同一の抗原または異なる抗原の異なるエピトープを認識する重鎖及び／または軽鎖を組み合わせることにより、二重特異性結合剤を作製できる。一部の実施形態において、分子機能によって、二重特異性結合剤は、その２つの結合腕のうちの１つ（一方のＶＨ／ＶＬのペア）で１つの抗原（またはエピトープ）と結合し、その第２の腕（別のＶＨ／ＶＬのペア）で別の抗原（またはエピトープ）と結合する。この定義によれば、二重特異性結合剤は、２つの異なる抗原結合腕（特異性ならびにＣＤＲ配列の両方の点において）を有し、それが結合する抗原のそれぞれに対して１価である。
【００８８】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、異なる構造の２つの標的に同時に結合できる能力を特徴とする。一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、例えばＢ細胞の、Ｔ細胞の、骨髄の、血漿の、あるいは肥満細胞の抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのコンポーネントと、標的となることが可能な、治療剤または診断剤を有するコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のコンポーネントと、を有する。
【００８９】
通常、ＧＤ２などの糖鎖抗原に結合する抗体は一般に低親和性である。従って、ホモ二量体化を誘導するために本明細書に記載される安定な非免疫原性ペプチドの配列を使用することにより、癌免疫療法のためにＴ細胞の標的化（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を亢進するための独特な手法が提供される。さらに、単量体型で約５０〜５５ｋＤａである直列に並ぶ抗体コンポーネント（例えばｓｃＦｖ）から構成される本発明の二重特異性結合タンパク質の二量体化は、血清半減期ならびに潜在的治療有効性を、腫瘍親和性に関係なく実質的に増加させる。
【００９０】
腫瘍抗原ＧＤ２は、いくつかの転移性の癌種において高発現しており、現在、有効な治療は存在しない。抗ＧＤ２抗体は、無作為試験において安全且つ有効であることが証明されている。しかし、大きな欠点として、抗体注入中の補体媒介性急性疼痛（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐａｉｎ）が報告されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔｕｒｅ  ３５（８）：６６５）。本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質は、従来の抗体のコンポーネントであるＦｃが存在しない場合でも二価結合が可能である。このような二価性は、補体の活性化を誘導しない二量体化コンポーネントの使用に起因する。従って、記載されるような二重特異性結合タンパク質の二量体化のためのストラテジーは、腫瘍の死滅の亢進、有害作用の低減のための独特な手法となり、いくつかのＧＤ２−陽性癌の治療のための有効な治療法を示す。
【００９１】
二量体化コンポーネント
本発明は、二量体化コンポーネントと連結された場合に、本明細書に記載される多重特異性結合剤（及び、特に、二重特異性抗体などの二重特異性結合剤）の例示的特性が特定のインビボでの用途において特に有用であり、及び／または特定の利点を付与する、という見識を提供する。例えば、とりわけ、本発明は、本明細書に記載されるような二量体化可能に構築された多重特異性結合剤が、その標的に対する多重特異性結合剤の機能的な親和性を増加させるという認識を包含する。特に、本明細書に提示される様々な実施例は、二重特異性抗体二量体（それぞれが第１の抗体コンポーネントと第２の抗体コンポーネントと二量体化コンポーネントとを含む、２つの融合ポリペプチドから構成される）の特性が、二量体化コンポーネントを有さない、その対応する単量体ポリペプチドと比較して改善されたことを証明する。特定の例示的な二重特異性抗体二量体は、ジシアロガングリオシドＧＤ２及びＣＤ３を標的とした。一部の実施形態において、示されるように、二量体は、Ｔ細胞による腫瘍細胞の破壊を誘発する効力が亢進されることを特徴とする。
【００９２】
一部の実施形態において、本発明は、とりわけ、二重特異性結合剤の場合における二量体化コンポーネントの使用により、二重特異性結合剤の、その標的のうちの少なくとも１つに対する二価結合を引き起こすことができるという認識を包含する。完全長のＩｇＧ抗体は、ｓｃＦｖフラグメントの一価結合特性と比較して、抗原に対する結合活性を数桁分亢進できる二価結合を利用する（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｋ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：８３−１０５）。本発明は、二量体化コンポーネントを二価結合剤ポリペプチドに導入することにより、同様の、または、さらに大幅な、結合活性の改善を達成できるという認識を包含する。
【００９３】
一部の実施形態において、本発明は、とりわけ、本明細書に記載される二量体化コンポーネントは、それが取り付けられた任意の改変タンパク質を二量体化させるのに好適であるという認識を包含する。一部のある実施形態において、改変タンパク質は、抗体コンポーネント、二重特異性結合剤または多価結合剤を含む。一部の実施形態において、本発明は、とりわけ、二量体化コンポーネントに機能可能に連結された二重特異性結合剤を提供し、ここで、このような二量体型二重特異性結合剤は、二量体化コンポーネントを有さない二重特異性結合剤と比較して、少なくとも１つの標的に対する結合活性がより大きいことを特徴とする。一部の実施形態において、治療標的に対して、例えば腫瘍抗原に対して、より大きな結合活性が達成される。一部の実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の抗体コンポーネントについて、より大きな結合活性が達成される。一部の実施形態において、本明細書に記載される二量体化コンポーネントは、ジシアロガングリオシドＧＤ２に結合する抗体コンポーネントを含む二重特異性結合剤の結合の改善において特に有用であり、及び／または特定の利点を付与する。例示的な抗体コンポーネントとしては、例えば５Ｆ１１及び３Ｆ８などの、以前に特徴が明らかにされた抗体から構築された抗体コンポーネントが挙げられる。
【００９４】
本発明に従って使用できる、様々な二量体化コンポーネントの配列が当技術分野において公知である（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｋ，ｓｕｐｒａ、Ｃｕｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２８：３５５−３６２を参照のこと）。このようなコンポーネントのうちの一部の特定の例としては、へリックスバンドルまたはコイルドコイルである、合成ペプチドまたは酵母のペプチドが挙げられる（表３）。
【表３】
0006480907.tif 000004
【００９５】
本発明は特に、多価結合剤に組み込むための、及び特に二価抗体に組み込むための、特に有用な二量体化コンポーネントは、ヒト肝細胞核内因子−１アルファ（ＨＮＦ−１α）の二量体化エレメントであるか、これを含むという知見を包含する。
【００９６】
ＨＮＦ−１αは、アミノ末端の二量体化コンポーネント、可動性リンカー、２つに分かれたＤＮＡ結合モチーフ、及びカルボキシ末端のトランス活性化コンポーネントという４つの領域から構成される。可動性リンカーは、ＤＮＡ結合モチーフと二量体化コンポーネントを連結する。ＨＮＦ−１αは、腎臓及び肝臓の両方の遺伝子発現の重要な制御因子である。ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目の残基の例示的なアミノ酸配列を以下の配列番号１に示す。
ヒトＨＮＦ−１α１−３２  ＭＶＳＫＬＳＱＬＱＴＥＬＬＡＡＬＬＥＳＧＬＳＫＥＡＬＩＱＡＬＧＥ（配列番号１）
【００９７】
一般に、自己会合することが知られているタンパク質のアミノ酸配列を参照して二量体化コンポーネントを設計または選択してよい。当技術分野において公知の、このような二量体化コンポーネントの例としては、へリックスバンドル、コイルドコイル（例えばロイシンジッパー）、合成ペプチド、及び酵母のタンパク質が挙げられる。本発明は、密接に巻かれた４へリックスバンドルを形成することが報告されている（Ｎａｒａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３１０：６３５−６５８）ヒト肝細胞核内因子−１αのエレメントを含む二量体化コンポーネントを利用する二重特異性結合剤の見識を提供する。例えば、ヒトＨＮＦ−１αのエレメントを含む二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）と実質的に同一である配列を有してよい。一部の実施形態において、本発明による二量体化コンポーネントは、ヒトＨＮＦ−１αの１〜３２番目のアミノ酸残基（配列番号１）に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）である配列を有する。
【００９８】
本発明の例示的な二重特異性結合剤を表４に示す。本発明の例示的な抗体の可変領域に下線を施す。本発明の例示的な二量体化コンポーネントを斜体で示す。
【表４−１】
0006480907.tif 000005
【表４−２】
0006480907.tif 000006
【表４−３】
0006480907.tif 000007
【表４−４】
0006480907.tif 000008
【表４−５】
0006480907.tif 000009
【表４−６】
0006480907.tif 000010
【表４−７】
0006480907.tif 000011
【表４−８】
0006480907.tif 000012
【００９９】
様々な実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合コンポーネントと第２の結合コンポーネントと二量体化コンポーネントと、から構成される。多くの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の第１の結合コンポーネント及び第２の結合コンポーネントはそれぞれ、異なる特異性を特徴とする抗体コンポーネントから構成される。多くの実施形態において、抗体コンポーネントは表４から選択される。
【０１００】
様々な実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントに連結された二量体化コンポーネントと、を含む。様々な実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、第１の結合コンポーネントに連結された二量体化コンポーネントと、を含む。様々な実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、第１の結合コンポーネント及び第２の結合コンポーネントの両方に連結された（例えば、第１の結合コンポーネントと第２の結合コンポーネントとの間に配置された）二量体化コンポーネントと、を含む。
【０１０１】
一部のある実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、５’から３’に向けて、第１の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、二量体化コンポーネントと、を含む。一部のある実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、５’から３’に向けて、二量体化コンポーネントと、第１の結合コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、を含む。一部のある実施形態において、本発明による二重特異性結合剤は、５’から３’に向けて、第１の結合コンポーネントと、二量体化コンポーネントと、第２の結合コンポーネントと、を含む。
【０１０２】
様々な実施形態において、本明細書に記載される第１の結合コンポーネント及び／または第２の結合コンポーネントは、抗体コンポーネントを含むか、または抗体コンポーネントである。様々な実施形態において、本明細書に記載される第１の結合コンポーネント及び／または第２の結合コンポーネントは、リンカー配列を含む。
【０１０３】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される配列と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１０４】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される配列と実質的に同一である配列を有する。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される配列と同一である配列を有する。
【０１０６】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される配列から選択される。
【０１０７】
様々な実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の第１の結合コンポーネントは、表４に示される抗体コンポーネントと少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超）同一である配列を有する抗体コンポーネントを含む。
【０１０８】
様々な実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の第１の結合コンポーネントは、表４に示される抗体コンポーネントと同一の配列を有する抗体コンポーネントを含む。
【０１０９】
様々な実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の第２の結合コンポーネントは、表４に示される抗体コンポーネントと少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超）同一である配列を有する抗体コンポーネントを含む。
【０１１０】
様々な実施形態において、本明細書に記載される二重特異性結合剤の第２の結合コンポーネントは、表４に示される抗体コンポーネントと同一の配列を有する抗体コンポーネントを含む。
【０１１１】
様々な実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される二重特異性結合剤と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超）同一である配列を有する。
【０１１２】
様々な実施形態において、本発明の二重特異性結合剤は、表４に示される二重特異性結合剤と同一の配列を有する。
【０１１３】
標的
とりわけ、本発明は、多重特異性結合剤の二量体化が、及び特に、二重特異性抗体などの二重特異性結合剤の二量体化が、細胞の死滅の促進に特に有用及び／または有効であるという見識を包含する。特に、本出願は、標的細胞関連エピトープ及びリンパ球関連エピトープの両方に特異的に結合する多価結合剤の活性を、二量体化ドメインの導入によって劇的に増加させることができるということを証明する。
【０１１４】
例えば、本発明の一部の実施形態において、多価結合剤は、腫瘍細胞関連エピトープ及びＴ細胞エピトープに特異的に結合する。このような実施形態によれば、多価結合剤に二量体化ドメインを含めることで、上記剤の、その標的エピトープのうちの１つまたは両方に対する結合を促進することができ、及び／または標的Ｔ細胞により媒介される標的腫瘍細胞の死滅を亢進することができる。
【０１１５】
一部の実施形態において、死滅させるべき標的細胞には、例えば、ウイルスに感染した細胞（例えば、ＨＣＶ感染細胞、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＨＰＶ感染ケラチノサイト）、細胞内細菌または原虫に感染した細胞、及び癌細胞が包含される。当業者であれば、本明細書に記載される多価結合剤が望ましく結合する、そのような細胞上の適切な標的エピトープを認識するであろう。代表的なこのようなエピトープを、例えばエンベロープタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素タンパク質、インテグラーゼタンパク質等などの抗原に見出すことができる。
【０１１６】
一部の実施形態において、本明細書に記載される標的細胞の死滅を媒介できるリンパ球細胞には、Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球及び抗体依存性細胞傷害性細胞（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ）が包含される。当業者であれば、本明細書に記載される多価結合剤が望ましく結合する、そのようなリンパ球上の適切な標的エピトープを認識するであろう。代表的なこのようなエピトープを、例えばＩｇＧのＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩＩＢ）、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＭＡＣ−１／ＭＡＣ−３、ＩＬ−２Ｒα、ＯＸ４０、Ｌｙ４９、及びＣＤ９４などの抗原に見出すことができる。
【０１１７】
核酸の構築及び発現
本明細書に記載される二量体化コンポーネントを含む多重特異性結合剤は、当技術分野において公知の分子生物学的方法を用いて核酸分子から生産されてよい。核酸分子は、適切な宿主細胞に導入された場合に融合タンパク質を発現できるベクターに挿入される。適切な宿主細胞には、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が包含される。ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するための、当業者に公知である方法のいずれかが、転写／翻訳制御シグナルの制御下にある本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築するために使用されてよい。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術及び合成技術ならびにインビボでの組換えを含んでよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。
【０１１８】
本発明による核酸分子の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において上記分子が発現するように、第２の核酸配列によって調節されてよい。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当技術分野において公知のプロモーターエレメント及び／またはエンハンサーエレメントによって制御されてよい。
【０１１９】
核酸コンストラクトは、抗体及び／または抗体コンポーネントから生成された多重特異性結合タンパク質をコードする領域を含む。一般に、このような多重特異性結合タンパク質は、ＶＨ領域及び／またはＶＬ領域から生成されるであろう。所望の結合特性及び／または機能特性を示す抗体の同定及び選択後に、それぞれの抗体の可変領域が単離、増幅、クローン化ならびに配列決定される。ＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列に対して改変が為されてよく、上記改変には、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列及び／または制限酵素部位を有するヌクレオチド配列の付加、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列の欠失、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の置換が包含される。抗体及び／または抗体コンポーネントは、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体から生成されてよい。
【０１２０】
本発明の核酸コンストラクトは、当技術分野で公知の方法によって発現ベクターまたはウイルスベクターに挿入され、核酸分子は、発現制御配列に機能可能に連結される。
【０１２１】
核酸分子を含む発現ベクターは、核酸コンストラクトによりコードされるタンパク質の生産を可能にするために、好適な宿主細胞に形質転換される。例示的な宿主細胞としては、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）及び真核生物（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）が挙げられる。発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、本発明の融合タンパク質の生産を可能にする条件下で増殖させ、その後、融合タンパク質から形成される多重特異性結合剤を回収する。
【０１２２】
本発明の多重特異性結合剤は、その後に安定な二量体の形成を可能とする任意の技術によって精製されてよい。例えば、理論に束縛されることを望むものではないが、多重特異性結合剤は、可溶性ポリペプチドまたは封入体のいずれかとして細胞から回収されてよく、封入体からは、８Ｍのグアニジン塩酸塩及び透析によって定量的に抽出されてよい。本発明の多重特異性結合剤をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過を使用してよい。また、本発明の多重特異性結合剤は、真核細胞または原核細胞から分泌された後に馴化培地から回収されてもよい。
【０１２３】
スクリーニング方法及び検出方法
また、本発明の多重特異性結合剤は、細胞（単数）または細胞（複数）の、１種以上の活性（例えば、アポトーシスまたは細胞の増殖）を検出または測定するのに望ましいインビトロまたはインビボでのスクリーニング方法において使用されてもよい。スクリーニング方法は当技術分野において周知であり、無細胞アッセイ、細胞アッセイ、及び動物アッセイを包含する。インビトロのアッセイは、固体状態または可溶性のいずれかであってよい。標的分子（例えば、細胞表面の抗原）に結合した多重特異性結合剤を識別できるラベルまたは検出可能な基を使用することを含む、当技術分野で公知の数多くの方法で標的分子の検出が達成されてよい。検出可能なラベルが、本発明の多重特異性結合剤を使用するアッセイと合わせて使用されてよい。
【０１２４】
治療方法
本発明の多重特異性結合剤は、標的抗原のうちの１つに対して高親和性結合を示すことができるため、標的抗原を発現する細胞を効率的に標的とすることにおいて治療上有用である。従って、一部の実施形態において、１つの標的抗原に対する多重特異性結合剤の親和性を増加させ、且つ、上記多重特異性結合剤がやはり結合する他の標的抗原に対する親和性を増加させないことが望ましい可能性がある。例えば、腫瘍の死滅に関する場合、特定の状態は、腫瘍の死滅を媒介できる細胞（例えばＴ細胞）の表面上の抗原ではなく、腫瘍抗原に対する親和性の増加から恩恵を受ける可能性がある。従って、本明細書に記載される多重特異性結合剤を使用することによって、腫瘍抗原を発現する腫瘍を有する患者において腫瘍抗原に対する多重特異性結合剤の結合親和性を増加させることは有利である可能性がある。
【０１２５】
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合剤を、そのような多重特異性結合剤が結合できる抗原を発現する腫瘍を有する患者の治療のための治療薬として提供する。このような多重特異性結合剤は、人体または動物体の治療方法において、あるいは診断方法において使用されてよい。
【０１２６】
投与
本発明は、本明細書に記載される治療的活性剤（例えば多重特異性結合剤）の有効量を、治療を必要とする対象に投与する方法を提供する。
【０１２７】
対象における標的細胞の死滅または増殖阻害のための、多重特異性結合剤の治療的送達あるいは本発明の多重特異性結合剤をコードする核酸の治療的送達のために使用できるタンパク質または核酸などの剤の治療的送達のための当技術分野において公知の様々な方法によって、例えば、細胞のトランスフェクション、遺伝子治療、送達ビヒクルまたは薬学的に許容される担体を用いた直接投与、本発明の多重特異性結合剤をコードする核酸を含む組換え細胞を与えることによる間接的送達によって、本明細書に記載される多重特異性結合剤が投与されてよい。
【０１２８】
例えば、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、化合物の発現が可能な組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスベクターまたはその他のベクターの一部として核酸を構築すること等、様々な送達システムが公知であり、本発明の多重特異性結合剤を投与するためにこれらを使用できる。投与経路は、経腸または非経口であってよく、投与経路には、限定されるものではないが、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口または経鼻）が包含される。一部の実施形態において、本発明の多重特異性結合剤は静脈内投与される。一部の実施形態において、本発明の多重特異性結合剤は皮下投与される。一部の実施形態において、多重特異性結合剤は、他の生物学的に活性のある剤と共に投与される。
【０１２９】
医薬組成物
本発明は、本発明の多重特異性結合剤と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む医薬組成物をさらに提供する。また、所望の場合、組成物は、１種以上の治療上活性のある物質を追加的に含むこともできる。
【０１３０】
本明細書に提示される医薬組成物の記載は、主に、ヒトへの倫理的な投与に好適な医薬組成物を対象とするが、当業者であれば、このような組成物は一般に、全ての種類の動物への投与に好適であることを理解するであろう。様々な動物への投与に好適な組成物をもたらすためにヒトへの投与に好適な医薬組成物を改変することが十分に理解されており、通常の知識を有する獣医学の薬理学者は、たとえあったにせよ、単なる通常の実験法を用いて、このような改変を設計及び／または実施できる。
【０１３１】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知の、または今後開発される、任意の方法によって調製されてよい。一般に、このような調製方法は、有効成分を希釈剤または別の賦形剤及び／または１種以上の他の副成分と一体化させるステップを含み、その後、必要であれば、及び／または所望の場合、その産物を所望の単一用量単位または複数用量単位に成形または包装するステップを含む。
【０１３２】
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、包装、及び／または販売されてよい。本明細書において使用される場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は一般に、対象に投与されるであろう有効成分の用量に等しく、及び／または、例えばそのような用量の２分の１または３分の１など、そのような用量の都合の良い割合に等しい。
【０１３３】
本発明による医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、サイズ、及び／または状態
に応じて、及び、さらには上記組成物が投与されるべき経路に応じて、異なるであろう。例としては、組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでよい。
【０１３４】
医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤を追加的に含んでよく、本明細書において使用される場合、上記賦形剤には、所望の特定の剤形に適合化された任意の全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体溶媒、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固形バインダー、潤滑剤等が包含される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６、参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤ならびにそれらの調製のための公知技術を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、そうでなければ医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用するなど、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用は本発明の範囲内にあることが企図される。
【０１３５】
一部の実施形態において、薬学的に許容される賦形剤の純度は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％である。一部の実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用ならびに獣医学的使用が承認されている。一部の実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態において、賦形剤は医薬等級である。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たす。
【０１３６】
医薬組成物の製造において使用される薬学的に許容される賦形剤としては、限定されるものではないが、不活性希釈剤、分散剤及び／または造粒剤、界面活性剤及び／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、及び／または油が包含される。このような賦形剤は任意選択で医薬製剤に含まれてよい。配合者の判断に従って、カカオバター及び坐薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び／または芳香剤などの賦形剤が組成物中に存在できる。
【０１３７】
医薬品の製剤化及び／または製造における一般論を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１３８】
キット
本発明は、少なくとも１種の本明細書に記載される多重特異性結合剤で充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたは医薬キットをさらに提供する。キットは、例えば診断に使用されることを含め、任意の適用可能な方法で使用されてよい。医薬品または生物学的生産物の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が、そのような容器と任意選択で一体化され得る。上記通知は、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用または販売に対する上記機関による承認、（ｂ）使用法、またはその両方を示す。
【実施例】
【０１３９】
実施例
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために記載されており、いかなる形でもその範囲を限定することを意図してはおらず、いかなる形でもその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者には周知であるはずの従来の方法（分子クローニング技術等）についての詳細な説明は実施例に含まれない。特に指示のない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で表示され、圧力は大気圧であるか、または大気圧付近である。
【０１４０】
実施例１．二量体化コンポーネントを有する二重特異性融合タンパク質の設計及び構築
本実施例では、その腫瘍死滅能を向上させるためのストラテジーとして二量体化できるように特に操作された多重特異性結合剤の生産について説明する。このストラテジーは、Ｔ細胞によるＧＤ２陽性腫瘍細胞の死滅を媒介できる二重特異性結合タンパク質で試験された。ジシアロガングリオシドＧＤ２は、ニューロブラストーマ、網膜芽細胞腫、メラノーマ、脳腫瘍、肉腫及び小細胞肺癌を含む、小児癌及び成人癌の両方の腫瘍において高発現している（Ｍｏｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２５：６７−７７）。本実施例では特に、ＨＮＦ−１α二量体化コンポーネントによって互いに連結された抗ＧＤ２抗体由来ｓｃＦＶポリペプチド及び抗ＧＤ３抗体由来ｓｃＦｖポリペプチドから構成されており、ＧＤ２及びＣＤ３を標的とする、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤと呼称される二量体化可能な融合タンパク質の構築について説明する。ＨＮＦ−１αは、それ自身が二量体化することが知られていたが、それが取り付けられ得る他のタンパク質を、特に抗体またはそのコンポーネントを、二量体化させるためにＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントを利用できるかどうかは不明であった。例えば、本発明者等は、それ自身で二量体化することが知られているヒトペプチドホルモンエンドセリン−１（ＥＴ１）が、抗体コンポーネントに取り付けられた場合に、二量体化できなかったことを決定している。
【０１４１】
本明細書に提示されるさらなる実施例は、この融合タンパク質がうまく二量体化することにより、動的光散乱法によって評価されるように、ＧＤ２に対する機能的な親和性が増大し、インビトロでのＴ細胞が媒介する腫瘍細胞の死滅が亢進され、ならびに腫瘍を移植したマウスにおける腫瘍の増殖阻害が亢進されたことを証明する。これらの実施例は、癌の免疫療法のためのＴ細胞誘導抗体の効力を増加させる本ストラテジーの潜在能力を証明する。
【０１４２】
分子クローニング
ＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントを有さない、ならびにＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントを有する、抗ＧＤ２モノクローナル抗体５Ｆ１１（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：５７４８−５７５５、Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．  ４５：８６７−８７７）のｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３  ＯＫＴ３（Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：２７５６−２７６３）のヒト化ｓｃＦｖを含む単一ポリペプチド鎖から、抗ＧＤ２×抗ＣＤ３直列ｓｃＦｖ（ＧＤ２ｘＣＤ３）二重特異性結合タンパク質を構築した（ＧＤ２ｘＣＤ３ならびにＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤと呼称される）。ＨＤＤコンポーネントを、抗ＧＤ２ｓｃＦｖに対して遠位となるように、且つ、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに対して近位となるように配置した。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、幾何学的に制限されるであろう、近位の抗原（ＣＤ３）ではなく遠位の抗原（ＧＤ２）に対する機能的な親和性の潜在的亢進を最大化するために、この配置を選択した。ＧＤ２結合の亢進は、おそらく腫瘍の死滅を亢進するが、これに対し、ＣＤ３結合の亢進は、Ｔ細胞誘導二重特異性抗体の公知の副作用であるサイトカインストームの亢進を招く可能性がある（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：８４３−８５３）。さらに、直列ｓｃＦｖ二重特異性結合タンパク質（ＭＷ約５５〜６０ｋＤａ）の二量体化は血清半減期を向上させる可能性があり、これは、ホモ二量体型直列ｓｃＦｖ二重特異性結合タンパク質であれば、６０ｋＤａ未満のタンパク質が対象となる腎クリアランス経路を回避できるためである。
【０１４３】
簡潔に説明すると、抗ＧＤ２抗体５Ｆ１１の可変領域ならびにヒト化抗ＣＤ３  ＯＫＴ３（マウスＯＫＴ３抗体由来）抗体の可変領域については、以前に説明されている。５Ｆ１１抗体ならびにヒト化ＯＫＴ３（ｈＯＫＴ３）抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、１５アミノ酸のリンカー（（Ｇ４Ｓ）３）を用いて異なる配置方向で遺伝学的に構築し、及び別々に合成した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。５Ｆ１１抗体の可変領域を用いてＶＨＶＬまたはＶＬＶＨの配置方向を構築し、抗ＣＤ３  ｈＯＫＴ３抗体の可変領域を用いてＶＨＶＬの配置方向を構築した。二量体化コンポーネントを追加することで、２種の抗原を標的とする抗体コンポーネントから構成される多重特異性結合剤の活性が改善されるという提供された見識にとって、本発明において利用される抗体コンポーネントの特定のアイデンティティは重要ではない。
【０１４４】
５Ｆ１１抗体から構築した単鎖可変フラグメントをＮｈｅＩ及びＡｐａＩで消化し、ｈＯＫＴ３から構築したｓｃＦｖをＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化フラグメントをグルタチオン合成（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＧＳ）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に順次連結して二重特異性結合タンパク質５ＨＬＢＴ及び５ＬＨＢＴを作製した。
【０１４５】
製造業者の仕様書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に従い、変異誘発によって５Ｆ１１  ｓｃＦｖの２つのシステイン残基への安定化変異を起こし（重鎖のＳ４４Ｃ、軽鎖のＡ１００Ｃ）、５ＨＬＤＳＢＴならびに５ＬＨＤＳＢＴを得た。１５アミノ酸（（Ｇ４Ｓ）３）または５アミノ酸（Ｇ４Ｓ）のいずれかの長さのリンカー配列を、比較のために５ＨＬＤＳＢＴでも５ＬＨＤＳＢＴでも５Ｆ１１  ｓｃＦｖとｈＯＫＴ３  ｓｃＦｖとの間にクローン化した。また同様に、安定化システイン変異をＯＫＴ３  ｓｃＦｖにも導入し、５ＨＬＤＳ−ＤＳＢＴを得た。さらに、２つの親和性成熟変異（Ｐ１０４Ｙ及びＥ３１Ｑ；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：５７４８−５７５５）を５ＨＬＤＳＢＴへ別々に導入し、それぞれＹ−ＢＴ及びＱ−ＢＴを得た。
【０１４６】
上述の方法を用いて、ヒト化抗ＧＤ２抗体３Ｆ８（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌ．１：４，４７７−４８６）及びヒト化抗ＣＤ３  ＯＫＴ３（Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）とＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントに基づき、その他の抗ＧＤ２ｘ抗ＣＤ３直列ｓｃＦｖ（ＧＤ２ｘＣＤ３）二重特異性結合タンパク質を構築し、モノクローナル抗ＧＤ３抗体ＫＭ６４１（Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６（４）：２６０−２６６）及びヒト化抗ＣＤ３  ＯＫＴ３（Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）とＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントに基づき、抗ＧＤ３ｘ抗ＣＤ３直列ｓｃＦｖ（ＧＤ３ｘＣＤ３）二重特異性結合タンパク質を構築した。ヒトＩｇＧ３のヒンジの一部（ＴＰＬＧＤＴＴＨＴＳＧ）を用いて、二量体化コンポーネントを抗ＣＤ３抗体コンポーネントのＣ末端に融合した。上述の例示的な融合タンパク質を表５に示す。
【表５】
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【０１４７】
生産及び精製
ｓｃＦｖ５Ｆ１１−（Ｇ４Ｓ）３−ｓｃＦｖｈＯＫＴ３融合タンパク質（Ｙ−ＢＴ、配列番号１０）のＤＮＡを用いて、６Ｘヒスチジンタグの前にＨＮＦ−１αのエレメント（１〜３２番目のアミノ酸）を含む二量体化コンポーネントを有する（ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ）、及び有さない（ＧＤ２ｘＣＤ３）発現コンストラクトを作製した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｍａｘａ）及びｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖを用いたエレクトロポレーションによりＤＮＡをＤＧ４４  ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いた薬剤選抜に供した。約２週間後に、単一の細胞を９６ウェルプレートに段階希釈で播種した。照射されたＣＨＯ−Ｓ細胞を、５０００細胞／ウェルの濃度にてフィーダー細胞として使用した。各クローン由来の上清を３週間までに回収し、ＧＤ２結合アッセイに供した。ＧＤ２に対して最も強い結合を示したクローンを選択し、細胞が２００万／ｍＬに達し対数増殖期にある時に、３７℃及び８％ＣＯ２における１２５ｒｐｍでの軌道振とう（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇ）を伴う大型培養へとスケールアップした。所望の抗体収量に達した時、または生存率が＜４０％にまで低下した時、培養上清を回収した。培養上清中に分泌された二重特異性融合タンパク質（ＧＤ２ｘＣＤ３及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ）を、Ｎｉ２＋セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン）により精製し、３００ｍＭのイミダゾールで溶出した。
【０１４８】
実施例２．二重特異性融合タンパク質のインビトロスクリーニング及び親和性
この実施例では、実施例１に従って作製された単鎖の二重特異性融合タンパク質の二量体化がそれらの標的に対する機能的な親和性に与える効果について説明する。一部の場合において、二重特異性単量体は、それらの標的に短時間結合する可能性がある（例えば、サイズに起因する貧弱な保持）。この実施例において、ホモ二量体を形成するように操作された二重特異性融合タンパク質は、抗原に対して増加した親和性を示す。
【０１４９】
動的光散乱法
二重特異性融合タンパク質におけるＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントの二量体化誘導能を動的光散乱法により試験した。精製した二重特異性融合タンパク質を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）上で動的光散乱法を用いて流体力学的半径について測定した。実施例１に記載される二重特異性融合タンパク質を用いた例示的測定を表６に記載する。また、精製した二重特異性融合タンパク質のさらなる試料を、上述のように動的光散乱法を用いて流体力学的半径について測定した。その結果を表７に示す。
【０１５０】
表６及び表７に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３（ＭＷ  ５５ｋＤａ）の流体力学的半径は７．２±１．７ｎｍであり、これに対し、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ（ＭＷ  単量体は５９ｋＤａ、二量体は１１８ｋＤａ）の流体力学的半径は１３．６±０．７ｎｍ（または１１．１±０．５）であった。光散乱法によって示されたサイズの増加は、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤについての二量体型立体構造を示している。
【表６】
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【表７】
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【０１５１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＨＤＤがＧＤ２またはＣＤ３に対する機能的な親和性を向上させるかどうかについて決定するために、精製したＧＤ２ならびに全Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３を含む培養Ｔ細胞）を用いてＥＬＩＳＡアッセイをおこなった。簡潔に説明すると、９０％エタノール中でウェルごとに１μｇ／ｍＬのＧＤ２で９６ウェルプレートを室温にて一晩コーティングした。次の日に、１５０μｌ／ウェルの０．５％ＢＳＡでプレートを室温にて１時間ブロッキングした。洗浄後、二重特異性抗体の希釈系列をプレートに加え、室温にて２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、次に、０．５％ＢＳＡ中で１：１０００に希釈したマウス抗Ｈｉｓ−タグ抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）１００μｌ／ウェルと共に室温にて１時間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、次に、０．５％ＢＳＡ中で１：３０００に希釈したヤギ抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌ／ウェルと共に室温にて１時間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＯＰＤバッファ（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色させた。３０μｌ／ウェルの５ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止させた。その後、分光光度計上で４９０ｎｍにてプレートを読み取った。表８及び図２Ａ（上のパネル）に、実施例１に従って作製された二重特異性融合タンパク質の例示的なＧＤ２結合について記載する。図２Ａ（下）に、実施例１に従って作製された二重特異性融合タンパク質のＣＤ３／Ｊｕｒｋａｔ細胞結合について記載する。また、精製した二重特異性融合タンパク質のさらなる試料を、ＣＤ３／Ｊｕｒｋａｔ細胞結合について測定した。その結果を図２Ｂに示す。
【０１５２】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、インビトロの結合キネティクスを決定した。ＣＭ５センサーチップならびに関連試薬はＢｉａｃｏｒｅ  ＵＳＡから購入した。ガングリオシドＧＭ１はＡＬＥＸＩＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＡＸＸＯＲＡ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．）から、ＧＤ２はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌから購入した。簡潔に説明すると、疎水性相互作用を介してガングリオシドをＣＭ５センサーチップ上に直接固定した。参照表面（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）をＧＭ１で固定化した。活性表面（ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）を、１：１の比率のＧＤ２及びＧＭ１で固定化した。ＧＤ２及びＧＭ１の希釈混合物（５０μｇ／ｍｌ）を流速１５μｌ／分にて２０分注入した（３００μｌ）。その後、安定したベースラインが得られるまで、１０ｍＭのＮａＯＨで大規模洗浄をおこなった（通常、流速５μｌ／分にて２０μｌの洗浄を５回）。
【０１５３】
解析前に、精製した抗ＧＤ２モノクローナル抗体（５Ｆ１１）を、２５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＢＳ−Ｅバッファ中で様々な濃度（５０〜１６００ｎＭ）に希釈した。流速３０μｌ／分にて２分間、試料（６０μｌ）をセンサー表面上に注入した。結合段階の完了後、同じ流速にて３００秒間、２５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＢＳ−Ｅバッファ中で解離をモニターした。各サイクルの終了時に、２０ｍＭのＮａＯＨを５０μｌ（流速５０μｌ／分にて１分）及び４ＭのＭｇＣｌ２を１００μｌ（流速５０μｌ／分にて２分）用いて、表面を再生した。固定化されたＧＤ２に対する試料の注入後に得られたバイオセンサー曲線から、キネティクス解析の前に固定化されたＧＭ１に対して注入された試料により得られた対照の曲線を差し引いた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、二価のアナライトモデルならびに初期状態のパラメータ設定により、データを速度定数について解析した。結合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。表９及び図３Ａに、実施例１に従って作製された二重特異性融合タンパク質についての例示的なＫＤ値ならびにセンサーグラムを記載する。また、精製した二重特異性融合タンパク質のさらなる試料を、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した。例示的な結果を表１０及び図３Ｂに示す。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１５４】
表８に示すように、ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合タンパク質と比較して、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤのＧＤ２結合が６倍亢進されることを示した（図２Ａ及び図２Ｂの上のパネルも参照のこと）。Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合は、顕著には異ならなかった（図２Ａ及び図２Ｂの下のパネルを参照のこと）。ＧＤ２結合のＢｉａｃｏｒｅ解析（図３Ａ及び図３Ｂ、ならびに表９及び表１０）により、腫瘍標的ＧＤ２への親和性が３〜６倍亢進されることが確認される。
【０１５５】
同様の実験において、上述の通りに３ＬＨＢＴ−ＨＤＤ（配列番号１１）をＧＤ２結合について試験した。結果を表１１及び図７に示す。この結果により、本明細書に記載されるように、３ＬＨＢＴ−ＨＤＤは、ＧＤ２結合に基づいて、より良好な活性を示すことが確認される。特に、３ＬＨＢＴ−ＨＤＤは、３ＬＨＢＴよりも約２．５倍低いＥＣ５０を示した。
【表１１】
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【０１５６】
まとめると、ヒトＨＮＦ−１αの二量体化コンポーネントは、単鎖の二重特異性抗体の二量体化を効率的に誘導してホモ二量体を形成させ、二重特異性抗体の抗原のうちの１つ（例えば腫瘍抗原）に対する機能的な親和性を向上させることが、これらのデータにより証明される。
【０１５７】
実施例３．インビトロでのＴ細胞が媒介する腫瘍細胞の細胞死滅
この実施例は、Ｔ細胞を通じて媒介される腫瘍細胞の死滅を開始させる二重特異性ホモ二量体の能力が向上したことを証明する。一般に、Ｔ細胞を誘導する二重特異性結合タンパク質は、Ｔ細胞が媒介する腫瘍の死滅のためにＴ細胞を腫瘍部位に導くことができる。この実施例では、例示的な二重特異性ホモ二量体が、二重特異性単鎖タンパク質と比較した場合に、より効率的に腫瘍細胞のＴ細胞による死滅を効率的に媒介することが示される。
【０１５８】
クロム５１（５１Ｃｒ）放出アッセイ
５％ＣＯ２加湿インキュベータ内において３７℃にて、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中でメラノーマ細胞及びニューロブラストーマ細胞（ＳＫＭＥＬ１、ＮＭＢ−７、Ｍ１４、ＢＥ  （１）Ｎ、ＨＴＢ６３、Ｈ５２４、ＳＫＮＪＣ２、ＳＫＭＥＬ２８、Ｈ６９、Ｈ１９６及びＨ３４５）を培養した。ニューロブラストーマ細胞系列ＬＡＮ１及びメラノーマＭ１４は、カリフォルニア大学（ロサンゼルス）から得た。ＳＫＮＬＤは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにて開発された。ＳＫＮＬＤ細胞系列はＡＴＣＣ  ＩＭＲ−３２に由来した。ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）のＤＮＡ配列決定により照合をおこなった。
【０１５９】
１ｘＥＤＴＡで接着細胞を回収した。製造業者の仕様書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従いＰａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＴ細胞をヒトＰＢＭＣから精製した。製造業者の仕様書に従いＣＤ３／ＣＤ２８  ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴ細胞を刺激し、増殖させた。増殖したＴ細胞を、ＦＢＳ及び３０Ｕ／ｍＬのインターロイキン−２（ＩＬ−２）を追加したＲＰＭＩ中で、培養及び維持した。ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）を用いたフローサイトメトリーにより、抗−ＣＤ３−ｐｅｒｃｅｐ  ｃｙ５．５抗体、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体及び抗ＣＤ５６−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＴ細胞集団を同定及び解析した。
【０１６０】
標的の腫瘍細胞を５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔ，ＩＬ）で、１００μＣｉ／１０６細胞にて３７℃で１時間標識した。細胞を２回洗浄した。９６ウェルポリスチレン丸底プレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、標的細胞（５０００細胞／ウェル）をエフェクター細胞ならびに二重特異性融合タンパク質と混合し、最終的な体積を２５０μｌ／ウェルとした。プレートを３７℃にて４時間インキュベートし、その後、４００ｇにて５分間遠心分離した。上清中への５１Ｃｒの放出をガンマカウンター（Ｐａｃｋｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）内でカウントした。式１００％（実験のｃｐｍ−バックグラウンドのｃｐｍ）／（５％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］のｃｐｍ−バックグラウンドのＣＰＭ）を用いて特異的な放出の割合を算出した。ここでｃｐｍは、放出された５１Ｃｒの１分あたりのカウント数である。５％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）での溶解により総放出を評価し、エフェクター細胞の非存在下で、バックグラウンドの放出を測定した。実施例１に従って作製された二重特異性融合タンパク質についてのＴ細胞が媒介する腫瘍細胞の死滅の例示的な結果を表１２及び図４に記載する。
【表１２】
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【０１６１】
表１２及び図４に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性融合タンパク質及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ二重特異性融合タンパク質は、選択されたＧＤ２陽性腫瘍細胞系列のＴ細胞による死滅を媒介できた。特に、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤでは、ＧＤ２ｘＣＤ３と比較して、Ｔ細胞が媒介する腫瘍細胞の死滅を導く能力が顕著に向上した（１２〜２７倍増、ｐ＜０．００１）。
【０１６２】
本実施例はまさに、とりわけ、腫瘍抗原及びＣＤ３に結合する二重特異性融合タンパク質の二量体化が、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞のＴ細胞による死滅を媒介する二重特異性融合タンパク質の能力を効率的に亢進できることを証明する。
【０１６３】
実施例４．二重特異性融合タンパク質ホモ二量体のインビボでの有効性
前述の実施例に記載された多重特異性融合タンパク質を、そのインビボでの有効性について試験した。
【０１６４】
異種移植片マウスモデル
繁殖マウス系統ＢＡＬＢ／ｃＡ−Ｒａｇ２ＫＯ／ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＤＫＯ）を、Ｍａｍｏｒｕ  Ｉｔｏ博士（実験動物中央研究所（ＣＩＥＡ）、宮前区、川崎市、日本）より譲り受け、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにて繁殖させた。動物には、スルファトリム（Ｓｕｌｆａｔｒｉｍ）入りの餌を与えた。全ての動物のケアについては、動物のケアについてのカナダ会議（ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）のガイドラインに従った。マウスが６週齢〜１２週齢に達した時にインビボの実験をおこなった。
【０１６５】
健康なドナー由来の廃棄されたバフィーコート（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＹ）から健康なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを分離し、ＰＢＳ中で洗浄した。ＡＣＫ溶解バッファ（ＧＩＢＣＯ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ）で３０〜６０秒インキュベートすることにより赤血球を枯渇させた。
【０１６６】
マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、精製したＰＢＭＣをＳＫＮＬＤ細胞（増殖の速い皮下のニューロブラストーマ）と１：１の割合（５０,０００のＰＢＭＣ：５０,０００のＳＫＮＬＤ細胞）で混合した。ＤＫＯマウスにＰＢＭＣ／ＳＫＮＬＤ混合細胞を移植した。移植後４日の時点で、１グループあたり５匹のマウスに対して、無処置か、ＧＤ２ｘＣＤ３の静脈内注射（５回／週で２週間）、またはＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤの静脈内注射（５回／週で２週間）を施した。１４日目〜４４日目まで、１週間に２回、キャリパーで腫瘍のサイズを測定した。５０μｇの二重特異性融合タンパク質のボーラス注入後８時間にわたって、ＤＫＯマウスの尾静脈から血液を採取した。二重特異性融合タンパク質の血清中濃度をダブルサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。上記ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡでは、固相のラット抗５Ｆ１１イディオタイプ抗体を用いて二重特異性融合タンパク質を捕捉し、結合した二重特異性融合タンパク質を、ビオチン化マウス抗Ｈｉｓ−タグ抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。各グループについての腫瘍体積の例示的な測定を図５に示す。各マウスについて曲線下面積を算出した。その平均を表１５に示す。
【０１６７】
ＧＤ２ｘＣＤ３及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤの例示的な薬物動態解析を表１６に示す。精製した二重特異性融合タンパク質のさらなる試料を薬物動態解析のために試験した（表１７）。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１６８】
表１５に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３は腫瘍の増殖を中程度に減少させた（約１８％低いＡＵＣ）が、これは統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．５９）。しかし、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤは腫瘍の増殖を有意に減少させ（約６９％低いＡＵＣ、ｐ＝０．０２）、その減少はＧＤ２ｘＣＤ３よりも大きかった。薬物動態解析により、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤの血清半減期が、ＧＤ２ｘＣＤ３と比較して、３倍超（または約４倍）増加することが示された（ｐ＝０．００２、表１６及び表１７を参照のこと）。
【０１６９】
同様の実験において、上述のようにＰＢＭＣ／Ｍ１４混合細胞をＤＫＯマウスに移植した。各グループについての腫瘍体積の例示的な測定を図６に示す。
【０１７０】
まとめると、腫瘍抗原を標的とし、且つＣＤ３を介してＴ細胞を標的とする、二量体型多重特異性結合タンパク質（この場合にはホモ二量体型二重特異性抗体タンパク質）の投与はインビボで腫瘍の増殖を効率的に減少させることが、これらのデータにより示される。特に、腫瘍の増殖のこのような減少は、単鎖の立体構造である同じ二重特異性結合タンパク質の場合よりも大きい。さらに、ホモ二量体型二重特異性結合タンパク質は、単鎖の立体構造の同じ二重特異性結合タンパク質と比較して、より長い半減期を示す。
【０１７１】
実施例５．サイトカイン放出アッセイ
二量体化タグ（ＨＤＤ、配列番号１）が、ＣＤ３への結合の増加により生じるサイトカインの放出を亢進しないことを確認するために、前述の実施例に記載された多重特異性融合タンパク質を試験した。
【０１７２】
簡潔に説明すると、リンパ球分離培地の遠心分離（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）によって、ＰＢＭＣを健康なドナーの血液から単離した。製造業者の仕様書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従いＰａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔによって、ヒトＴ細胞を精製した。３７℃にてＢｓＡｂと共に９６ウェルプレート中で、Ｔ細胞（５０,０００／ウェル）をニューロブラストーマＳＫＮＬＤ細胞（１０,０００／ウェル）と共培養した。２４時間後に上清を回収した。製造業者の仕様書に従いＥＬＩＳＡベースのサイトカインアッセイキット（ＯｐｔＥＩＡ（商標）  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｅｔ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４種の異なるサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−α）の濃度を測定した。アッセイキットに付属の標準に従って、各サイトカインのレベルを定量した。適切なサイトカインの検出を確認するために、ポジティブコントロールの試料として、ＣＤ３／ＣＤ８イムノビーズで活性化したＴ細胞を用いて実験をおこなった。表１８に、ＢｓＡｂあるいは親にあたるヒト化ＯＫＴ３抗体の存在下におけるヒトＴ細胞からの例示的なサイトカインの放出を記載する（単位はｐｇ／ｍＬである）。表１９に、ＢｓＡｂ及びニューロブラストーマＳＫＮＬＤ細胞あるいは親にあたるヒト化ＯＫＴ３抗体の存在下におけるヒトＴ細胞からの例示的なサイトカインの放出を記載する（単位はｐｇ／ｍＬである）。
【表１８】
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【表１９】
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【０１７３】
表１８及び表１９に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３と比較してＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ  ＢｓＡｂでは、腫瘍細胞を加えたＴ細胞（ｐ＝０．７）または腫瘍細胞を加えなかったＴ細胞（ｐ＝０．５）においてサイトカインの放出の有意な亢進は観察されなかった。まとめると、本明細書に記載されるように、実施例１に記載される二重特異性融合タンパク質は、近位の抗原（ＣＤ３）ではなく遠位の抗原（ＧＤ２）に対する機能的な親和性の亢進を最大化し、それにより、Ｔ細胞誘導二重特異性抗体の公知の副作用であるサイトカイン放出の亢進を伴うことなく腫瘍の死滅が亢進される結果となることが、これらの結果により確認される。
【０１７４】
実施例６．二量体化コンポーネントを有する多重特異性融合タンパク質の特性評価
本実施例では、異なる二量体化コンポーネント、例えば合成のへリックス−ターン−へリックスドメイン（「ｄＨＬＸ」、ＧＥＬＥＥＬＬＫＨＬＫＥＬＬＫＧ−ＰＲＫ−ＧＥＬＥＥＬＬＫＨＬＫＥＬＬＫ、配列番号２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（２）：８３）ならびにヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、を利用することによって二量体化できるよう特に操作された多重特異性結合剤のさらなる作製について説明する。ＨＤＤと同様、ｄＨＬＸは、非共有結合性の二量体を形成するへリックス−ループ−へリックスドメインから構成される。対照的に、ｄＨＬＸは合成物であり、人間に注入した場合に免疫原性となる可能性がある。
【０１７５】
それらのそれぞれのＣ末端にＨＤＤ、ｄＨＬＸドメインまたはヒトＩｇＧ１  Ｆｃのいずれかを有するＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤を（実施例１で説明したように）作製し、ＧＤ２結合について（実施例２で説明したように）、ならびにインビトロでのＴ細胞が媒介するメラノーマＭ１４及びニューロブラストーマＬＡＮ−１腫瘍細胞系列の死滅について（実施例３で説明したように）、試験した。表２０及び図８に、異なる二量体化ドメインを有するＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤の例示的なＧＤ２結合について記載する。表２１及び図９に、異なる二量体化ドメインを有するＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性結合剤による、例示的なインビトロでのＴ細胞が媒介するメラノーマＭ１４及びニューロブラストーマＬＡＮ−１腫瘍細胞系列の死滅について記載する。
【表２０】
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【表２１】
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【０１７６】
表２０及び図８に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ及びＧＤ２ｘＣＤ３−Ｆｃ二量体型二重特異性融合タンパク質については、同様のＧＤ２に対する結合が観察された（０．６ｎＭ対０．３ｎＭ）。これらの二量体はそれぞれ、非共有結合性の相互作用ならびに共有結合性の相互作用により生じる。対照的に、二量体型ＧＤ２ｘＣＤ３−ｄＨＬＸならびに単量体型ＧＤ２ｘＣＤ３は、ＧＤ２に対して数倍低い結合活性を示した（すなわち、それぞれ、２．９ｎＭならびに５．０ｎＭ）。さらに、その他の二量体型融合タンパク質とは異なり、ＧＤ２ｘＣＤ３−ｄＨＬＸは顕著な凝集性を示した（データは示さない）。
【０１７７】
表２１及び図９に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤは、最も効率的な、インビトロでのＴ細胞が媒介するメラノーマＭ１４及びニューロブラストーマＬＡＮ−１腫瘍細胞系列の死滅を示す。さらに、わずかに高いＧＤ２結合活性を有するにもかかわらず、ＥＣ５０ならびに腫瘍死滅の最大パーセントの両方を測定すると、ＧＤ２ｘＣＤ３−Ｆｃが示すインビトロでの腫瘍細胞の死滅は、ＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤよりも低かった。
【０１７８】
まとめると、これらは、本明細書に記載されるように、ＨＤＤが、亢進された、且つ共有結合性の二量体化ドメイン（例えばヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）により達成される結合活性と類似の、腫瘍抗原への結合活性を有する二量体型二重特異性剤を提供できることをさらに証明する。ＨＤＤは、他の二量体化ドメインで観察される場合と比較して、Ｔ細胞が媒介する死滅を改善し、本発明が比類なく有用な二量体化コンポーネントを、特にＴ細胞誘導二重特異性結合剤において使用するための二量体化コンポーネントを、提供することが確認された。
【０１７９】
前述の実施例に示すように、ヒトＨＮＦ−１α由来の二量体化コンポーネントをＧＤ２ｘＣＤ３直列ｓｃＦｖのカルボキシ末端に融合させることで、安定な二量体の形成が促進され、二重特異性二量体の遠位の抗腫瘍抗体コンポーネントの機能的な親和性が亢進される。通常、腫瘍は、ＨＬＡをダウンレギュレートし、制御性Ｔ細胞をアップレギュレートすることによりＴ細胞を回避し、一般的には出現頻度の低いクローンである細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のホーミングを妨害する。Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する二重特異性抗体は、ポリクローナルなＴ細胞を活性化し、腫瘍へ再度導くことができる。本発明の二重特異性二量体は、ＧＤ２を発現する腫瘍細胞に対して向上した機能的な親和性を有し、活性化Ｔ細胞をエフェクターとして用いるＧＤ２陽性腫瘍細胞系列のインビトロアッセイにおいて、腫瘍細胞の死滅を有意に亢進させる。本発明の二量体化コンポーネントは、Ｔ細胞誘導二重特異性抗体免疫療法の有害な副作用であることが知られているＴ細胞の結合またはサイトカインの放出を有意には亢進しない。
【０１８０】
さらに、ＧＤ２ｘＣＤ３二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）において例示されるように、ＨＤＤタグは、抗体コンポーネントに適用された場合に特に有用であることが、上記実施例により証明される。発明者等は、ＢｓＡｂの１つの結合腕（すなわち、近位の抗ＣＤ３端ではなく、遠位の抗ＧＤ２端）の特異的エピトープに対する結合活性を亢進できるＢｓＡｂのための独特な設計（図１を参照のこと）を示している。Ｔ細胞誘導二重特異性抗体の開発における主な障害は、ＣＤ３結合により生じるＴ細胞の過剰刺激であった。このような結合は、患者において深刻な有害作用をもたらすサイトカインの過剰放出（サイトカインストームとして知られる）を招き得る。実施例に示すように、ＧＤ２ｘＣＤ３ＢｓＡｂにＨＤＤタグを利用することで、サイトカインの放出においていかなる有意な差を生じさせることなく（単量体型のＧＤ２ｘＣＤ３と二量体型のＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤとを比較した表１８及び表１９を参照のこと）、ＣＤ３ではなくＧＤ２への結合が亢進される（図２を参照のこと）。ＧＤ２ｘＣＤ３抗体及びＧＤ２ｘＣＤ３−ＨＤＤ抗体のいずれも、二価の抗ＣＤ３  ＩｇＧ  ｈｕＯＫＴ３よりも数倍低いサイトカインの放出を示した。
【０１８１】
まとめると、本発明の二重特異性二量体の実体は、それらの非二量体型の対応物と比較して、親和性ならびに死滅効率を向上させ、血清半減期の増加を伴う場合、ニューロブラストーマのマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍を有意に減少させた。
【０１８２】
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様について、このように説明したが、様々な変更、改変、及び改良が当業者には直ちに明らかであろうことが理解されるべきである。このような変更、改変、及び改良は、本開示の一部であることが企図され、ならびに本発明の精神及び範囲内にあることが企図される。従って、前述の説明ならびに図面は単なる例示であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によって詳細に記載される。
【０１８３】
均等物
請求項の要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」等などの序数の用語の使用は、それ自体では、１つの請求項の要素の、別の要素に対するいかなる優先順位、順位、または順序、あるいは、方法の行為を実施する時間的な順序も意味せず、請求項の要素を区別するために、特定の名称を有する１つの請求項の要素を、同じ名称（ただし序数の用語の使用について）を有する別の要素と区別するためのラベルとして使用されるに過ぎない。
【０１８４】
本明細書ならびに特許請求の範囲において使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その逆であることが明確に示されない限り、複数の対象を含むものと理解されるべきである。１群のうちの１つ以上の要素の間に「または（ｏｒ）」を含む請求項または記載は、その逆であることが示されない限り、あるいはそうでなければ、文脈から明らかでない限り、上記群の要素のうちの１つの、２つ以上の、または全ての要素が、所定の産物またはプロセスに存在する、利用される、またはそうでなければ、関連する場合に、満足したとみなされる。本発明は、厳密に、上記群のうちの１つの要素が所定の産物またはプロセスに存在する、利用される、またはそうでなければ、関連する、実施形態を包含する。また、本発明は、２つ以上の要素または群の要素全体が所定の産物またはプロセスに存在する、利用される、またはそうでなければ、関連する、実施形態を包含する。さらに、本発明は、記載される請求項の１つ以上に由来する１以上の限定、要素、条項、記述用語等が、特に示されない限り、あるいは、矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、同一の基本となる請求項に従属する別の請求項（または、関連する場合、任意の他の請求項）に導入される、全てのバリエーション、組み合わせ、ならびに順列を包含することが理解されるべきである。要素がリストとして（例えば、マーカッシュグループまたは同様の様式で）存在する場合、上記要素の各サブグループも開示されることが理解されるべきであり、任意の要素が上記群から排除され得る。一般に、発明または発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むものとして言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴等から成る、または本質的に成ることが理解されるべきである。本明細書においては、簡略化を目的として、これらの実施形態は、全ての場合において数多くの言葉で具体的に記載されているわけではない。また、特定の除外について明細書に記載されているかどうかにかかわらず、本発明のいかなる実施形態または態様も、特許請求の範囲から明確に除外することができると理解されるべきである。本発明の背景を説明するために、ならびにその実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において言及した刊行物、ウェブサイトならびにその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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