(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、サッカロマイセス属に属する微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
を含み、
前記第２発酵工程において、前記固体成分に窒素源が添加されず、
前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、ソルガム由来化合物を得る、
ソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項２】
前記第２発酵工程において、前記固体成分に前記第２糖濃縮液のみを添加する、
請求項１に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項３】
前記第１発酵工程よりも前に、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する糖濃縮液準備工程をさらに含み、
前記第１糖濃縮液及び前記第２糖濃縮液は、それぞれ、前記糖濃縮液準備工程において得られた前記糖濃縮液の一部である、
請求項１又は２に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項４】
前記糖濃縮液準備工程よりも前に、ソルガムを原料として得られた糖液を、ナノろ過膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含み、
前記還元糖高濃度糖液を、前記糖濃縮液準備工程における前記糖液として用いて前記糖濃縮液を準備する、
請求項３に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項５】
前記スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程をさらに含む、
請求項４に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項６】
ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、サッカロマイセス属に属する微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
前記第２発酵工程の後に実施される第３〜第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）と、
を含み、
前記第２〜前記第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、前記第１〜第Ｌ−１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第１〜前記第Ｌ−１発酵工程のいずれかの前記発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離し、
前記第Ｌ発酵工程において、前記固体成分に窒素源が添加されず、
前記第１〜前記第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、ソルガム由来化合物を得る、
ソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項７】
前記第Ｌ発酵工程では、前記第Ｌ−１発酵工程で得られた固体成分に前記第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第Ｌ−１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させる、
請求項６に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項８】
前記第Ｌ発酵工程において、前記固体成分に前記第Ｌ糖濃縮液のみを添加する、
請求項６に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項９】
前記第１発酵工程よりも前に、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する糖濃縮液準備工程をさらに含み、
前記第１糖濃縮液及び前記第Ｌ糖濃縮液は、それぞれ、前記糖濃縮液準備工程において得られた前記糖濃縮液の一部である、
請求項６〜８のいずれか１項に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記糖濃縮液準備工程よりも前に、ソルガムを原料として得られた糖液を、ナノろ過膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含み、
前記還元糖高濃度糖液を、前記糖濃縮液準備工程における前記糖液として用いて前記糖濃縮液を準備する、
請求項９に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項１１】
前記スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程をさらに含む、
請求項１０に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項１２】
前記第１発酵工程で用いられる前記微生物を、ソルガムを原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた糖濃縮液で培養する培養工程をさらに含む、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項１３】
ソルガムを原料として得られた前記糖液は、前記ナノろ過膜及び前記逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮されるよりも前に、限外ろ過膜による前処理が施されている、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【請求項１４】
前記ソルガム由来化合物がエタノールである、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のソルガム由来化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソルガム等のイネ科の草本植物や、スイカ等のウリ科の草本植物には、高濃度の糖が含まれている。例えばソルガムは、生育期間が短いことや、乾燥や塩害に強く栽培適用範囲が広いことから、その収穫量も多い。したがって、近年、発酵による、イネ科又はウリ科の草本植物の搾汁液からのバイオエタノールの製造が注目されており、様々な技術が提案されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、ソルガム搾汁液から高濃度にエタノールを製造することによって、エタノール製造プロセスにおける蒸留・脱水のエネルギー消費を抑えるために、ソルガム搾汁液に糖（スクロース）をさらに添加して、発酵に用いられる糖液の初期濃度を高めることが提案されている。また、非特許文献２には、ソルガム搾汁液を２段階の膜分離工程によって濃縮することによって、発酵に用いられる糖液の初期濃度を高めることが提案されている。
【０００４】
また、非特許文献３には、トウモロコシの穂軸に固定化された酵母による繰り返し回分発酵によって、ソルガム搾汁液からエタノールを製造する方法が提案されている。非特許文献３で提案されている方法では、回分発酵を繰り返す毎に、酵母エキスやペプトン等の窒素源や糖（スクロース）等の発酵に必要な栄養源がさらに添加された新たなソルガム搾汁液が用いられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌ．  Ｌａｏｐａｉｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｊｕｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｇｒａｖｉｔｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ”，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １００  （２００９），  ４１７６−４１８２
【非特許文献２】Ｋ．  Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｊｕｉｃｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ”，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６９  （２０１４），  ８２１−８２５
【非特許文献３】Ｌ．  Ｌａｏｐａｉｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｊｕｉｃｅ  ｉｎ  ｒｅｐｅａｔｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ｃｏｒｎｃｏｂ”，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１２）  ２８，  ５５９−５６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、従来、発酵によってソルガム等の草本植物の搾汁液からエタノールを製造する様々な方法が提案されている。しかし、ソルガム等の草本植物の搾汁液から高濃度エタノールを製造する従来の方法については、高濃度エタノールをより効率良く、且つより簡便な方法で製造するという観点から、更なる改善の余地があった。
【０００７】
そこで、本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を発酵原料として用いて、発酵により、エタノール等のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物をより効率良く、且つより簡便に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、
イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
を含み、
前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、
イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
前記第２発酵工程の後に実施される第３〜第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）と、
を含み、
前記第２〜前記第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、前記第１〜第Ｌ−１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第１〜前記第Ｌ−１発酵工程のいずれかの前記発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離し、
前記第１〜前記第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の第１の態様に係る製造方法は、少なくとも第１発酵工程及び第２発酵工程を含む、繰り返し回分発酵によりイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造する方法である。本発明の第１の態様に係る製造方法は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を特定の膜で濃縮することによって得られた糖濃縮液を、第１発酵工程及び第２発酵工程において発酵原料として使用することにより、第２発酵工程において第１発酵工程で用いた微生物を繰り返し使用するにも関わらず、窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくても発酵が進んでイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。また、発酵工程が３回以上実施される本発明の第２の態様に係る製造方法においても、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を特定の膜で濃縮することによって得られた糖濃縮液を発酵原料として使用することにより、本発明の第１の態様に係る製造方法と同様に、窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくても、微生物を繰り返し使用してイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。このように、本発明の第１及び第２の態様に係る製造方法は、発酵のための微生物を繰り返し使用でき、さらに窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくてもよいため、従来の方法と比較して、より効率良く、且つより簡便にイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法の第１実施形態であるソルガム由来化合物の製造方法について、その概略を示すフロー図である。
【図２】本発明のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法の第２実施形態であるソルガム由来化合物の製造方法について、その概略を示すフロー図である。
【図３】実施例及び比較例で実施した膜濃縮に用いられた装置を示す概略図である。
【図４Ａ】実施例１の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例１の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。
【図５】実施例２の発酵液中のスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。
【図６】実施例２の発酵液中の酵母濃度を濁度法によって求めた結果を示すグラフである。
【図７Ａ】比較例１の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。
【図７Ｂ】比較例１の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。
【図８Ａ】比較例２の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。
【図８Ｂ】比較例２の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。
【図９Ａ】実施例３の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。
【図９Ｂ】実施例３の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、以下の記載は本発明を限定するものではない。
【００１３】
（第１実施形態）
第１実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、
イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜（ＮＦ膜）及び逆浸透膜（ＲＯ膜）の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
前記第１発酵工程で得られた第１発酵液を固液分離し、得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
を含み、前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る。
【００１４】
本実施形態の製造方法は、少なくとも第１発酵工程及び第２発酵工程を含む、繰り返し回分発酵によりイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造する方法である。本実施形態の製造方法では、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、特定の膜（ＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜）で濃縮することによって得られた糖濃縮液が発酵原料として使用される。この糖濃縮液は、微生物の培養に必要な窒素源等の栄養源を添加しなくても、微生物の培養が可能な液である。本実施形態の製造方法は、この糖濃縮液を発酵原料として使用するので、第２発酵工程において第１発酵工程で用いた微生物を繰り返し使用するにも関わらず、窒素源等の栄養源をさらに添加しなくても発酵が進んで、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。また、この糖濃縮液を使用することにより、発酵と並行して微生物の培養も進むので、第２発酵工程で新たな微生物を追加する必要もなくなる。なお、この糖濃縮液に窒素源を添加しなくても微生物の培養が可能な理由は明らかではないが、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を上記の特定の膜で濃縮することにより、糖だけでなくアミノ酸等の微生物の培養に必要な栄養源も十分に濃縮されるので、新たに窒素源等を添加しなくても微生物の培養が可能となるのではないかと考えられる。
【００１５】
一方、繰り返し回分発酵によってエタノール等の植物由来化合物を製造する従来の方法は、本実施形態の製造方法とは異なり、さとうきび等から得られる一般的な糖液や、非特許文献３で提案されているようなソルガム搾汁液を、上記の特定の膜で濃縮することなくそのまま使用している。従来の製造方法で用いられているこれらの糖液は、栄養源が添加されない場合に微生物の培養を行うことは困難である。したがって、従来の繰り返し回分発酵を利用した製造方法では、発酵を繰り返す際に、窒素源等の栄養源の添加や、新たな微生物の添加が必要となる。
【００１６】
以上のとおり、本実施形態の製造方法は、発酵のための微生物を繰り返し使用でき、さらに窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくてもよいため、従来の方法と比較して、より効率良く、且つより簡便にイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造できる。
【００１７】
なお、本実施形態の製造方法では、上記した栄養源や微生物の新たな添加を一切排除するものではない。イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を更により効率良く、あるいは更により簡便に製造できるようにするために、栄養源や新たな微生物を添加することも可能である。
【００１８】
本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法では、発酵工程が３回以上実施されてもよい。すなわち、本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、第２発酵工程の後に実施される第３〜第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）をさらに含んでいてもよい。その場合、第２〜第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、第１〜第Ｌ−１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、第１〜第Ｌ−１発酵工程のいずれかの発酵工程で用いられた微生物を用いて第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する。発酵工程が３回以上実施される場合は、第１発酵工程及び第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分に代えて、第１〜第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得るとよい。発酵工程が３回以上実施される場合、製造方法の効率化及び簡便化のために、各発酵工程では１回前の発酵工程で用いられた微生物を用いて発酵処理することが望ましい。すなわち、第Ｌ発酵工程では、第Ｌ−１発酵工程で得られた固体成分に第Ｌ糖濃縮液を添加して、第Ｌ−１発酵工程で用いられた微生物を用いて第Ｌ糖濃縮液を発酵させることが望ましい。
【００１９】
イネ科の草本植物としては、例えばソルガムが例示される。ソルガムは、生育期間が短いことや、乾燥や塩害に強く栽培適用範囲が広いことからその収穫量も多く、バイオマスとして好適である。ここで、ソルガムとはイネ科の一年草であり、様々な種類が存在する。本実施形態の製造方法において、ソルガムを原料として得られる糖液を用いる場合は、ホワイトソルガム等の糖含有量が多い種類のソルガムが好適に用いられる。また、ウリ科の草本植物としては、例えばスイカが例示される。
【００２０】
また、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物とは、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として製造される糖液を発酵原料とし、これを発酵処理して得られる全ての化合物を意味しており、例えば、エタノール及びブタノール等のアルコール、バイオプラスチック原料である乳酸、及び、コハク酸等が挙げられる。
【００２１】
以下、図１のフロー図を参照しながら、本実施形態の製造方法の一例について説明する。なお、以下で説明するのは、糖液の原料としてソルガムを用い、かつ発酵工程を３回以上繰り返す例、すなわち第１〜第Ｎ発酵工程を実施する例である。しかし、本発明の製造方法は、以下の例に限定されるものではなく、ソルガムの代わりに他のイネ科又はウリ科の草本植物を用いてもよいし、発酵工程の繰り返し回数を２回としてもよい。
【００２２】
まず、ソルガムを原料として得られる糖液を準備する。ソルガムを原料として得られる糖液とは、例えばソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液等であり、ソルガムを原料としている公知の糖液を利用可能である。
【００２３】
例えば、ソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液には、ソルガムの搾りかすやゴミ等が含まれていることも多い。したがって、ソルガムを原料として得られた糖液を限外ろ過膜（ＵＦ膜）に透過させてろ過し、ＵＦ膜上の残渣を取り除いて前処理することが望ましい。図１のフロー図では、前処理を実施する例が示されている。なお、ＵＦ膜とは、平均細孔径が０．００１μｍ〜０．０１μｍ程度である膜のことである。
【００２４】
ＵＦ膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン等の高分子材料を使用できる。耐久性や洗浄性の観点からポリフッ化ビニリデンやポリエーテルスルホンが好ましい。
【００２５】
ＵＦ膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチュプラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。
【００２６】
ＵＦ膜を用いて糖液をろ過する方法は、特には限定されず、公知のＵＦ膜によるろ過方法を用いることができる。
【００２７】
次に、糖濃縮液準備工程が実施される。糖濃縮液準備工程では、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する。なお、膜による糖液の濃縮とは、糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜に透過させて、非透過側の液を回収することにより実施できる。糖よりも低分子の物質は膜を透過するので、非透過側の液は糖が精製濃縮された溶液となる。
【００２８】
なお、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液は、後述の第１〜第Ｎ発酵工程で用いられる第１〜第Ｎ糖濃縮液に用いることができる。なお、第１〜第Ｎ糖濃縮液として用いられる糖濃縮液の全てを本工程で予め準備してよい。すなわち、図１のフロー図に示されているように、本工程で得られた糖濃縮液の一部が、第１〜第Ｎ糖濃縮液として用いられてもよい。また、各発酵工程で、糖濃縮液をそれぞれ準備することも可能である。
【００２９】
ここで、ＲＯ膜とは、操作圧力０．５〜３．０ＭＰａで塩化ナトリウム濃度５００〜２，０００ｍｇ／Ｌの試験液をろ過した時の塩化ナトリウム除去率が９３％以上である膜のことである。
【００３０】
ＮＦ膜は、一般的にＲＯ膜よりも阻止性能が低く、２価のイオン類を除去する性能に優れるという特性を持っているが、有機物や脱色などにも使われる半透膜である。ここで、ＮＦ膜とは、操作圧力０．３〜１．５ＭＰａで塩化ナトリウム濃度５００〜２，０００ｍｇ／Ｌの試験液をろ過した時の塩化ナトリウム除去率が５％以上９３％未満である膜のことである。
【００３１】
ＮＦ膜及びＲＯ膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリアミド等の高分子材料を使用できる。複数の材料が使用されてもよい。これらの中でも、高い阻止性能の実績があることから、ＲＯ膜には例えばポリアミドが好適に用いられる。また、ＮＦ膜には、ポリアミドやポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコールやそれらの混合物などが好適に用いられる。
【００３２】
ＮＦ膜及びＲＯ膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチューブラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。
【００３３】
ＮＦ膜及び／又はＲＯ膜を用いた膜濃縮の方法は、特には限定されず、公知の膜濃縮方法を用いることができる。例えば、膜濃縮を連続して複数回繰り返してもよい。その場合、全ての回で同じ種類の膜を用いてもよいし、各回で異なる種類の膜を用いてもよい。膜濃縮を複数回行うことにより、最終的に得られる糖濃縮液の濃度を上げることができる。したがって、ＮＦ膜及び／又はＲＯ膜による膜濃縮は、糖濃度が所望の濃度になるまで複数回繰り返して実施されてよい。最終的に得られる糖濃縮液の望ましい糖濃度は、例えば２３０ｇ／Ｌ以上である。
【００３４】
次に、第１発酵工程を実施する。第１発酵工程では、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して、前記第１糖濃縮液を発酵させる。前述のとおり、第１糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。
【００３５】
第１糖濃縮液を発酵原料とする発酵方法には、公知の方法を使用できる。発酵に使用される微生物は、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の、公知の微生物を使用できる。使用される微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組み換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。発酵に用いられる微生物を、十分な濃度となるまで、予めＹＰＤ培地等の公知の培地を用いて培養してもよい。また、発酵に用いられる微生物は、本実施形態で準備されたソルガムから作製された糖濃縮液を用いて培養することも可能である。例えば、本実施形態の製造方法が、第１発酵工程で用いられる微生物を培養する培養工程を含んでいてもよく、この培養工程において用いられる培養液として、本実施形態において特定されている糖濃縮液（イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた糖濃縮液）を使用することができる。なお、この培養工程は、第１発酵工程よりも前に実施されてもよいし、第１発酵工程における発酵と同時に実施される、すなわち第１発酵工程が培養工程を兼ねていてもよい。この糖濃縮液を微生物の培養に用いる場合、窒素源等の微生物の培養に必要な栄養源をさらに添加しなくても、培養が可能である。この糖濃縮液に窒素源を添加しなくても微生物の培養が可能な理由は明らかではないが、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及び／又はＲＯ膜で濃縮することにより、糖だけでなくアミノ酸等の微生物の培養に必要な栄養源も十分に濃縮されるので、新たに窒素源等を添加しなくても微生物の培養が可能となるのではないかと考えられる。
【００３６】
第１発酵工程において得られた第１発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
【００３７】
次に、第２発酵工程が実施される。第１発酵工程で得られた固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、第２糖濃縮液を発酵させる。ここで、第１発酵工程で得られた固体成分は微生物を含んでいる。このため、第１発酵工程で用いられた微生物が、第２糖濃縮液の発酵に用いられる。前述のとおり、第２糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。なお、固体成分に第２糖濃縮液を添加する際に、窒素源をさらに添加しなくても、微生物の発酵能力は維持される。したがって、第２発酵工程において、固体成分に新たに窒素源が添加されなくてもよく、発酵のために第２糖濃縮液のみ添加されてもよい。また、第２発酵工程では、新たな微生物を添加しなくても十分な発酵を行うことが可能であるが、新たな微生物を追加することも可能である。
【００３８】
第２発酵工程において得られた第２発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
【００３９】
次に、第３発酵工程が実施される。第２発酵工程で得られた固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第３糖濃縮液を添加して、第３糖濃縮液を発酵させる。すなわち、第２発酵工程で用いられた微生物が、第３糖濃縮液の発酵に用いられる。前述のとおり、第３糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。なお、固体成分に第３糖濃縮液を添加する際に、窒素源をさらに添加しなくても、微生物の発酵能力は維持される。したがって、第３発酵工程において、固体成分に新たに窒素源が添加されなくてもよく、発酵のために第３糖濃縮液のみ添加されてもよい。
【００４０】
第３発酵工程において得られた第３発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
【００４１】
引き続き、第３発酵工程と同様の手順で、第Ｎ発酵工程まで実施されてもよい。なお、ここで説明した例では、ある発酵工程では、その１回前の発酵工程において得られた発酵液を固液分離して得られた固形成分（微生物）を用いて発酵処理を実施しているが、前述のとおり、必ずしもこれに限定されない。１回前の発酵工程で用いた微生物のみでなく、それ以前の発酵工程で用いた微生物を用いることも可能である。
【００４２】
各発酵工程における固液分離で得られた液体成分からは、エタノール等の発酵産物（イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物）が回収される。発酵産物の回収方法は、特には限定されず、得られた発酵産物に応じて公知の回収方法を適宜選択することができる。
【００４３】
以上のように、本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、繰り返し回分発酵において、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及び／又はＲＯ膜で膜濃縮して得られた糖濃縮液を用いることにより、新たに窒素源を添加しなくても微生物の発酵能力を維持させて、高濃度の発酵産物を得ることができる。
【００４４】
（第２実施形態）
第２実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、第１実施形態の製造方法において、糖濃縮液準備工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、ＮＦ膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含む製造方法である。この糖分離工程で得られた還元糖高濃度糖液が、糖濃縮液準備工程における糖液として用いられ、発酵工程で用いられる糖濃縮液が準備される。一方、糖分離工程で得られたスクロース高濃度糖液は、砂糖を製造する原料として用いることができる。したがって、本実施形態の製造方法は、スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程も含んでいてもよい。
【００４５】
図２は、本実施形態の製造方法の一例を示すフロー図である。図２に示す例は、図１に示された第１実施形態の製造方法の一例に、上記の糖分離工程及び製糖工程がさらに含まれた製造方法である。したがって、糖分離工程及び製糖工程以外の各工程は、第１実施形態で説明したとおりであるため、ここでは糖分離工程及び製糖工程についてのみ説明する。
【００４６】
糖分離工程は、ソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液に対してＵＦ膜を用いた前処理が施された後の糖液であって、かつ糖濃縮液準備工程が施されるよりも前の糖液に対して実施される。糖分離工程では、ＮＦ膜を用いて、糖液をスクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する。糖分離工程で用いられるＮＦ膜には、スクロースの阻止性能がグルコースの阻止性能の２倍以上である膜が用いられる。すなわち、糖分離工程では以下の式（１）を満たすＮＦ膜が用いられる。
スクロースの阻止性能／グルコースの阻止性能≧２      …（１）
ここで、ＮＦ膜のスクロースの阻止性能とは、操作圧力１ＭＰａでスクロース濃度２０００ｐｐｍの試験液を２５℃の条件下でろ過した時のスクロースの除去率のことである。また、グルコース阻止性能とは、操作圧力１ＭＰａでグルコース濃度２０００ｐｐｍの試験液を２５℃の条件下でろ過した時のグルコースの除去率のことである。
【００４７】
膜を用いた糖分離の方法は、特には限定されず、公知の膜分離方法を用いることができる。例えば、糖分離を連続して複数回繰り返してもよい。その場合、全ての回で同じ種類の膜を用いてもよいし、各回で異なる種類の膜を用いてもよい。膜を用いた糖分離を複数回行うことによりスクロースと還元糖との分離の程度を高くできるので、その結果、スクロース高濃度糖液におけるスクロースの濃度、及び、還元糖高濃度糖液における還元糖の濃度を、それぞれ高めることができる。
【００４８】
糖分離工程では、還元糖は膜を透過することができるが、スクロースは膜を透過できずに膜の非透過側に残りやすい。したがって、膜の非透過側の液をスクロース高濃度糖液として回収することができる。膜を透過した液は還元糖高濃度糖液として回収され、次の糖濃縮準備工程において濃縮される糖液として用いられる。糖濃縮液準備工程及びその後の発酵工程は、第１実施形態で説明したとおりである。
【００４９】
図２に示されたフロー図においては、糖分離工程は１回のみ実施されているが、複数回実施されてもよい。例えば、膜の非透過側の糖液を回収し、回収された糖液を水で希釈してさらに糖分離用の膜に透過させて、膜を透過した糖液を還元糖高濃度糖液として糖濃縮工程で用い、膜の非透過側の液をスクロース高濃度糖液として製糖工程で用いてもよい。
【００５０】
糖分離工程で得られたスクロース高濃度糖液は、製糖工程において砂糖を製造する際の原料として用いられる。製糖工程における製糖方法には、ソルガム搾汁液から上記の工程によって得られたスクロース高濃度糖液を原料として用いる点を除き、公知の製糖方法を利用できる。
【００５１】
本実施形態の製造方法によれば、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、エタノール等のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を発酵により製造するための発酵原料としてだけでなく、製糖原料としても用いることが可能となる。したがって、本実施形態の製造方法によれば、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液から、発酵により得られる草本植物由来化合物と砂糖との両方を製造できる。
【００５２】
さらに、本実施形態の製造方法では、糖分離工程によって得られる還元糖高濃度糖液を発酵原料として用いることにより、糖分離工程を経ずに得られた糖液を発酵原料に用いる場合と比較して、繰り返し回分発酵での発酵効率を向上させることができる。その結果、発酵速度が向上し、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造効率をより高めることができる。なお、糖分離工程によって得られた還元糖高濃度糖液を発酵原料として用いた場合に発酵効率を向上させることができる理由は明らかではないが、本実施形態における糖分離工程によって得られる還元糖高濃度糖液では、微生物が分解しやすいグルコース及びフルクトース等の単糖が濃縮されていること、さらに微生物にとって好適なアミノ酸であるアスパラギン、アルギニン、セリン、バリンが濃縮されていることにより、発酵効率を向上させることができると考えられる。
【実施例】
【００５３】
次に、本発明のイネ科又はウリ科の草本植物化合物の製造方法について、実施例を用いて具体的に説明する。
【００５４】
（実施例１）
［糖濃縮液の準備］
まず、ソルガム搾汁液を準備した。本実施例では、ソルガム（名古屋大学大学院生命農学研究科付属フィールド科学教育研究センター東郷フィールドより入手、栽培品種「ＳＩＬ−０５」）を搾汁機（有限会社奥原鉄工製）を用いて圧搾することによって、ソルガム搾汁液（ソルガムを原料とする糖液）を得た。得られたソルガム搾汁液（ｐＨ５．２）には、６２．３ｇ／Ｌのスクロース、３５．９ｇ／Ｌのグルコース、２６．８ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
【００５５】
次に、ソルガム搾汁液をＵＦ膜（日東電工社株式会社製「ＲＳ５０」、分画分子量１５００００Ｄａ）でろ過して、残渣を取り除いた（ＵＦ膜ろ過）。残渣を取り除いて得られたソルガム搾汁液の糖濃度（スクロース、グルコース及びフルクトースの濃度）は、残渣を取り除く前と同じであった。ＵＦ膜ろ過は、バッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター  Ｃ４０−Ｂ」、直径１０４ｍｍ、高さ１４７ｍｍ、最大容量３８０ｍＬ）にＵＦ膜を設置して実施された。具体的には、図３に示すように、ＵＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中のソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ろ過は、窒素ガスによりテストセル２１内に０．５ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。このろ過により、ＵＦ膜２５の非透過側の残渣を取り除いて、ＵＦ膜透過液を残渣が取り除かれたソルガム搾汁液として得た。
【００５６】
次に、残渣が取り除かれたソルガム搾汁液を、ＮＦ膜（分画分子量１５０Ｄａ、日東電工株式会社製「ＥＳＮＡ３」）を用いて濃縮した（ＮＦ膜濃縮）。ＮＦ膜濃縮には、ＵＦ膜ろ過でも用いられたバッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター  Ｃ４０−Ｂ」、）を用いて実施された。具体的には、図３に示すように、ＮＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中の残渣が取り除かれたソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ＮＦ膜濃縮は、窒素ガスによりテストセル２１内に２．８ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で実施された。このＮＦ膜濃縮により、ＮＦ膜２５の非透過側に、糖が約２．２倍に濃縮された糖濃縮液が得られた。詳しくは、糖濃縮液には、１６４．４ｇ／Ｌのスクロース、６０．０ｇ／Ｌのグルコース、５４．２ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
【００５７】
［糖濃縮液のエタノール発酵］
上記方法で得られた糖濃縮液のエタノール発酵を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株を準備した。これを５ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中にて３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ前培養し、次に同様のＹＰＤ培地５００ｍＬ中で２４時間培養したものを回収して、ＢＹ４７４１株として使用した。上記方法で得られた糖濃縮液に、５０ｗｅｔ−ｇ／Ｌ（乾燥状態の１０ｇ／Ｌに相当）に酵母ＢＹ４７４１株を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第１発酵工程）。発酵は、ＣＯ2ガスを逃がす排気口を備えた５０ｍＬボトル（作業体積１０ｍＬ）中にて、発酵液を回転させながら行った。４８時間のエタノール発酵の後、得られた発酵液（第１発酵液）を遠心分離によって固液分離し、液体成分を取り除いた。得られた固体成分に、取り除かれた液体成分と同体積の糖濃縮液（第２糖濃縮液）を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第２発酵工程）。第２発酵工程と同様の手順で、第３発酵工程、第４発酵工程及び第５発酵工程が実施された。すなわち、同じ酵母を用い、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜濃縮して得られた糖濃縮液のみを添加しながら、５回の繰り返し回分発酵を行った。なお、第１〜第５発酵工程で用いた糖濃縮液には、全て、本実施例において上記方法にて準備された糖濃縮液が用いられた。
【００５８】
［発酵液中の各成分濃度測定］
第１〜第５発酵工程で得られた第１〜第５発酵液におけるスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を、固液分離によって得られた液体成分を高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）で分析することによって、測定した。結果は、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。
【００５９】
（実施例２）
［糖濃縮液の準備］
実施例１と同じ方法で、糖濃縮液を準備した。
【００６０】
［糖濃縮液のエタノール発酵］
実施例２では、実施例１とは異なり、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株の培養にＹＰＤ培地を用いずに、上記方法で準備されたソルガムを原料として得られた糖濃縮液を用いた。すなわち、実施例２では、酵母の培養が発酵工程と並行して行われた。具体的には、第１発酵工程において糖濃縮液に添加する酵母ＢＹ４７４１株の濃度を、実施例１よりも低い０．０４ｗｅｔ−ｇ／Ｌとした点と、繰り返す発酵工程の回数を７回にした点と、発酵工程を繰り返す際に添加する糖濃縮液を分離された液体成分の半分量とした点（液体成分の半分量のみを糖濃縮液に置き換える点）とを除いては、実施例１のエタノール発酵と同じ方法でエタノール発酵を行った。
【００６１】
［発酵液中の各成分濃度測定］
実施例１と同じ方法で、発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果を図５に示す。
【００６２】
［酵母濃度の測定］
実施例２では、第１〜第７発酵工程の間に糖濃縮液中で酵母がどの程度培養されたか、すなわち発酵液中の酵母濃度を、濁度法を用いて求めた。具体的には、発酵液を採取して、分光光度計（島津製作所製「ＵＶｍｉｎｉ−１２４０」）にて６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。
【００６３】
（比較例１）
エタノール発酵に用いた糖液を、実施例１で使用したソルガムを原料として作製された糖濃縮液ではなく、糖のみ（スクロース、グルコース及びフルクトースのみ）を含む糖液（スクロース１４９ｇ／Ｌ、グルコース５６ｇ／Ｌ及びフルクトース４６ｇ／Ｌ）を用いた点を除いては、実施例１と同じ方法でエタノール発酵を行った。また、発酵液中の各成分濃度の測定を実施例１と同じ方法で行った。結果を図７Ａ及び図７に示す。
【００６４】
（比較例２）
エタノール発酵に用いた糖液を、実施例１で使用したソルガムを原料として作製された糖濃縮液ではなく、モラセスのみを含む糖液（スクロース１２７ｇ／Ｌ、グルコース７５ｇ／Ｌ及びフルクトース８３ｇ／Ｌ）を用いた点を除いては、実施例１と同じ方法でエタノール発酵を行った。また、発酵液中の各成分濃度の測定を実施例１と同じ方法で行った。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【００６５】
図４Ａからわかるように、実施例１の繰り返し回分発酵では、窒素源が添加されない糖濃縮液のみが使用されたにも関わらず、酵母が５回の繰り返し回分発酵で高濃度エタノール生成を維持し続けた。例えば、５回目のエタノール発酵で得られたエタノールの濃度は１１３．７±３．１g／Ｌであり、これは１回目のエタノール発酵で得られたエタノールの濃度（１１５．２±７．３ｇ／Ｌ）と同程度であった。
【００６６】
また、図６に示す結果から、窒素源等の栄養素を添加しなくても、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液によって酵母が培養できることが確認された。なお、実施例２では、１回目及び２回目のエタノール発酵で生成されたエタノール濃度が低くなっているが、これは酵母の培養が不十分で酵母濃度が低かったからであると考えられる。酵母が十分に培養された３回目以降のエタノール発酵では、図５に示すように、糖濃縮液のみで酵母によって高濃度エタノールが生成された。このように、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液によって培養された酵母を用いた実施例２でも、実施例１と同様に、窒素源が添加されない糖濃縮液のみが使用されたにも関わらず、酵母が複数回の繰り返し回分発酵で高濃度エタノール生成を維持し続けた。
【００６７】
一方、比較例１では、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液ではなく、糖のみを含む糖液を窒素源を添加せずに用いて繰り返し回分発酵を行ったが、図７Ａに示すように、２回目の発酵ではエタノール生成濃度が非常に低くなり、３回目以降の発酵ではエタノールは生成されなかった。また、比較例２では、モラセスを含む糖液を窒素源を添加せずに用いて繰り返し回分発酵を行ったが、図８Ａに示すように、２回目以降のエタノール発酵では、エタノール生成濃度が１回目のエタノール発酵と比較して非常に低くなった。
【００６８】
以上の結果から、繰り返し回分発酵において、各回の発酵原料として、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜で濃縮して得られた糖濃縮液を用いることにより、窒素源を添加しなくても、酵母による発酵能力を維持させて高濃度エタノールを生成できることが確認された。
【００６９】
（実施例３）
［糖分離工程］
まず、ソルガム搾汁液を準備した。本実施例では、ソルガム（名古屋大学大学院生命農学研究科付属フィールド科学教育研究センター東郷フィールドより入手、栽培品種「ＳＩＬ−０５」）を搾汁機（有限会社奥原鉄工製）を用いて圧搾することによって、ソルガム搾汁液（ソルガムを原料とする糖液）を得た。得られたソルガム搾汁液（ｐＨ５．２）には、８４．０ｇ／Ｌのスクロース、２６．２ｇ／Ｌのグルコース、１８．０ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
【００７０】
次に、ソルガム搾汁液をＵＦ膜（日東電工社株式会社製「ＲＳ５０」、分画分子量１５００００Ｄａ）でろ過して、残渣を取り除いた（ＵＦ膜ろ過）。残渣を取り除いて得られたソルガム搾汁液の糖濃度（スクロース、グルコース及びフルクトースの濃度）は、残渣を取り除く前と同じであった。ＵＦ膜ろ過は、バッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター  Ｃ４０−Ｂ」、直径１０４ｍｍ、高さ１４７ｍｍ、最大容量３８０ｍＬ）にＵＦ膜を設置して実施された。具体的には、図３に示すように、ＵＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中のソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ろ過は、窒素ガスによりテストセル２１内に０．５ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。このろ過により、ＵＦ膜２５の非透過側の残渣を取り除いて、ＵＦ膜透過液を残渣が取り除かれたソルガム搾汁液として得た。
【００７１】
次に、残渣が取り除かれたソルガム搾汁液を、ＮＦ膜（日東電工株式会社製「ＮＴＲ−７４５０」）を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離した（糖分離）。なお、糖分離に用いられたＮＦ膜「ＮＴＲ−７４５０」は、スクロース阻止性能／グルコース阻止性能の値が２．４であり、分画分子量が約１０００Ｄａの膜である。糖分離には、ＵＦ膜ろ過でも用いられたバッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター  Ｃ４０−Ｂ」）を用いて実施された。具体的には、図３に示すように、ＮＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中の残渣が取り除かれたソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。糖分離は、窒素ガスによりテストセル２１内に２．０ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で実施された。この糖分離により、ＮＦ膜２５の非透過側に、スクロースが濃縮され、且つグルコース及びフルクトース等の還元糖の濃度が低減した糖液（スクロース高濃度糖液）が得られた。このスクロース高濃度糖液を５倍希釈し、再び（２回目の）ＮＦ膜（日東電工株式会社製「ＮＴＲ−７４５０」）を用いた糖分離を実施した。２回目の糖分離も１回目の糖分離と同じ方法で実施し、ＮＦ膜２５の非透過側に、スクロースが濃縮され、且つグルコース及びフルクトース等の還元糖の濃度が低減した糖液を、最終的に得られたスクロース高濃度糖液として、製糖工程の原料として用いた。最終的に得られたスクロース高濃度糖液には、１４３．２ｇ／Ｌのスクロース、８．５ｇ／Ｌのグルコース、４．５ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。なお、１回目及び２回目の糖分離でＮＦ膜２５を透過した糖液は、還元糖高濃度糖液として、後の工程である糖濃縮液の準備に用いられた。
【００７２】
［糖濃縮液の準備］
糖分離工程で得られた還元糖高濃度糖液を糖濃縮の原料として用いた点以外は、実施例１と同じ方法で糖濃縮液を準備した。得られた糖濃縮液には、９６．３ｇ／Ｌのスクロース、７６．１ｇ／Ｌのグルコース、５５．５ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
【００７３】
［糖濃縮液のエタノール発酵］
上記方法で得られた糖濃縮液のエタノール発酵を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株を準備した。これを５ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中にて３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ前培養し、次に同様のＹＰＤ培地５００ｍＬ中で４８時間培養したものを回収して、ＢＹ４７４１株として使用した。上記方法で得られた糖濃縮液に、５０ｗｅｔ−ｇ／Ｌ（乾燥状態の１０ｇ／Ｌに相当）に酵母ＢＹ４７４１株を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第１発酵工程）。発酵は、ＣＯ2ガスを逃がす排気口を備えた５０ｍＬボトル（作業体積１０ｍＬ）中にて、発酵液を回転させながら行った。２４時間のエタノール発酵の後、得られた発酵液（第１発酵液）を遠心分離によって固液分離し、液体成分を取り除いた。得られた固体成分に、取り除かれた液体成分と同体積の糖濃縮液（第２糖濃縮液）を添加して、３０℃で２４時間のエタノール発酵を行った（第２発酵工程）。第２発酵工程と同様の手順で、第３発酵工程、第４発酵工程及び第５発酵工程が実施された。すなわち、同じ酵母を用い、ソルガムを原料として得られた糖液を糖分離工程して得られた還元糖高濃度糖液をＮＦ膜濃縮して得られた糖濃縮液のみを添加しながら、５回の繰り返し回分発酵を行った。なお、第１〜第５発酵工程で用いた糖濃縮液には、全て、本実施例において上記方法にて準備された糖濃縮液が用いられた。
【００７４】
［発酵液中の各成分濃度測定］
第１〜第５発酵工程で得られた第１〜第５発酵液におけるスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を、固液分離によって得られた液体成分を高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）で分析することによって、測定した。結果は、図９Ａ及び図９Ｂに示されている。
【００７５】
実施例１の結果（図４Ａ）と実施例３の結果（図９Ａ）とを比較すると、糖分離工程が実施された実施例３では、各発酵工程の時間が２４時間であり実施例１の各発酵工程の時間（４８時間）の半分であるにも関わらず、各発酵工程で実施例１と同程度の濃度のエタノールが得られていた。この結果から、糖分離工程によって得られた還元糖高濃度糖液を発酵原料に用いた場合、糖分離工程を経ずに得られた糖液を発酵原料に用いる場合と比較して、繰り返し回分発酵での発酵効率を向上させて発酵速度が向上することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の製造方法によれば、繰り返し回分発酵によって、エタノール等の、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を効率良く、且つ簡便に製造できる。したがって、本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を発酵により化学品に変換する幅広い用途に利用できる。
【符号の説明】
【００７７】
２１    テストセル
２２    マグネチックスターラー
２３    ソルガム搾汁液
２４    攪拌子
２５    膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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