(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる、３−５アミノ酸長の基質ペプチドを含んでなる、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来中性プロテアーゼの活性測定用合成ペプチド溶液。
【請求項２】
前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる請求項１記載の活性測定用合成ペプチド溶液。
【請求項３】
前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である請求項１又は２記載の活性測定用合成ペプチド溶液。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が以下のいずれか一である請求項１〜３のいずれか一項に記載の活性測定用合成ペプチド溶液。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。
【請求項５】
クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来中性プロテアーゼの活性を測定する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる、３−５アミノ酸長の基質ペプチドと、
前記中性プロテアーゼと、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
【請求項６】
前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が以下のいずれか一である請求項５−７のいずれか一項に記載の方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。
【請求項９】
組成物中に含まれるクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼの量を決定する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる、３−５アミノ酸長の基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
【請求項１０】
前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のタンパク質分解酵素組成物である請求項９−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が以下のいずれか一である請求項９−１２のいずれか一項に記載の方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。
【請求項１４】
組成物中のクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼの有無を検出する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる、３−５アミノ酸長の基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断を検出する手順と、
を含む方法。
【請求項１５】
前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のタンパク質分解酵素組成物である請求項１４−１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が以下のいずれか一である請求項１４−１７のいずれか一項に記載の方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼの基質ペプチド及びこれを用いたプロテアーゼの活性測定方法に関する。より詳しくは、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼによって特異的に切断される基質ペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織から細胞又は細胞集合体を分離するため、生体組織をタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理することが行われている。例えば、膵島移植のため、膵臓組織をコラゲナーゼで処理し、膵島を分離することが行われている。生体組織からの細胞又は細胞集合体（以下「細胞等」とも称する）の分離においては、分離後の細胞等に障害を与えることなく、良好な機能を保持した細胞等を得ることが望まれる。【０００３】
細胞等の分離に用いられる酵素組成物としては、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）が産生するコラゲナーゼを含む組成物が汎用されている（特許文献１参照）。クロストリジウム・ヒストリチクス菌は、コラゲナーゼＩ（ＣｏｌＧ）及びコラゲナーゼＩＩ（ＣｏｌＨ）の２つのコラゲナーゼと、システインエンドペプチダーゼであるクロストリパイン（Ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ：ＣＰ）、メタロエンドペプチダーゼであるクロストリジウム中性プロテアーゼ（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ：ＮＰ）の４つのプロテアーゼを産生する。このため、上記酵素組成物には、２種類のコラゲナーゼ以外にも、ＮＰ及びＣＰが含まれていることが知られている。【０００４】
クロストリジウム・ヒストリチクス菌に由来する酵素組成物に含まれる各プロテアーゼの量は、当該組成物による細胞等の分離効率や分離後の細胞等の状態に影響を与えると考えられる（非特許文献１参照）。このため、酵素組成物中の各プロテアーゼの量を予め測定しておくことは、酵素組成物の均一性と分離操作の再現性を担保するために有用となる。【０００５】
プロテアーゼの量は、一般に、活性測定用の基質を用いて測定されている。コラゲナーゼの活性測定用基質としては、「Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ」などのペプチドが市販されている（シグマアルドリッチ、Ｆ５１３５）。【０００６】
酵素組成物中に含まれる各プロテアーゼの量を正確に測定するためには、測定対象とするプロテアーゼのみが切断可能な基質を用いることが必要である。ＣＰに特異的な基質ペプチドとして、「Ｂｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ」（Benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide）が知られている。ＣＰは基質特異性が高く、Ａｒｇ又はＬｙｓを含まないペプチドに対しては切断活性を示さないことが明らかとなっている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第１９９６／０００２８３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D Brandhorst et al., Transplantation Proceedings, 37(8), 3450-3451 (2005)
【非特許文献２】William M Mitchell et al., Method Enzymol, 19, 635-642 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述の通り、細胞等の分離に用いられる酵素組成物中に含まれる各プロテアーゼの量を正確に測定するためには、測定対象とするプロテアーゼのみが切断可能な基質を用いることが必要である。しかしながら、クロストリジウム・ヒストリチクス菌が産生する中性プロテアーゼに特異的な基質はこれまで得られていなかった。【００１０】
そこで、本発明は、クロストリジウム・ヒストリチクス菌が産生する中性プロテアーゼによって特異的に切断される基質を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題に解決のため、本発明は、以下の［１］〜［２５］を提供する。
［１］  Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなるプロテアーゼの基質ペプチド。
［２］  前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる［１］の基質ペプチド。
［３］  前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である［１］又は［２］の基質ペプチド。
［４］  前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼである［１］〜［３］のいずれかの基質ペプチド。【００１２】
［５］  Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
［６］  前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる［５］のペプチド。
［７］  前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である［５］又は［６］のペプチド。
［８］  クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼによって特異的に切断される［５］〜［７］のいずれかのペプチド。
［９］  クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼＧ、コラゲナーゼＨ及びクロストリパインによって切断されない［５］〜［８］のいずれかのペプチド。【００１３】
［１０］  グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。【００１４】
［１１］  目的とするプロテアーゼの活性を測定する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記プロテアーゼと、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
［１２］  前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる［１１］の方法。
［１３］  前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である［１１］又は［１２］の方法。
［１４］  前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼである［１１］〜［１３］のいずれかの方法。
［１５］  前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である［１１］〜［１４］のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。【００１５】
［１６］  組成物中に含まれる特定のプロテアーゼの量を決定する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
［１７］  前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる［１６］の方法。
［１８］  前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である［１６］又は［１７］の方法。
［１９］  前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである［１６］〜［１８］のいずれかの方法。
［２０］  前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である［１６］〜［１９］のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。【００１６】
［２１］  組成物中の特定のプロテアーゼの有無を検出する方法であって、
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断を検出する手順と、
を含む方法。
［２２］  前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する保護基を含んでなる［２１］の方法。
［２３］  前記保護基が、３−（２−フリル）アクロイル基である［２１］又は［２２］の方法。
［２４］  前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである［２１］〜「２３」のいずれかの方法。
［２５］  前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である［２１］〜［２４］のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、クロストリジウム・ヒストリチクス菌が産生する中性プロテアーゼによって特異的に切断される基質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＮＰ，ＣｏｌＧ，ＣｏｌＨによる合成ペプチドの切断によって生成するペプチド断片を検出したクロマトグラムである。
【図２】ＮＰ，ＣｏｌＧ，ＣｏｌＨによる合成ペプチドの切断によって生成するペプチド断片のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＮＰ，ＣｏｌＧ，ＣｏｌＨによるＮＰ特異的基質ペプチド（ＦＡＧＦＹＡ）の切断によって生成するペプチド断片とそのアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２０】
１．基質ペプチド
本発明に係るプロテアーゼの基質ペプチドは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
【００２１】
本発明者らは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｒｐから選択されるいずれか一のアミノ酸、ＹａａはＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ及びＧｌｙから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す）のアミノ酸配列を含むペプチドが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）が産生する中性プロテアーゼ（ＮＰ）によって、当該アミノ酸配列のＧｌｙとＸａａとの間で特異的に切断されることを見出した（実施例参照）。ここで、本明細書において、ペプチドに関する「切断」との用語は「加水分解」と同義に用いられるものとする。また、「特異的に切断される」とは、ＮＰ以外のプロテアーゼによっては全く切断されないか、少なくとも当分野において周知の技術によっては切断を検出できないことを意味する。「ＮＰによって特異的に切断される」とは、例えば、ＮＰによる基質ペプチドの加水分解反応によって生じるペプチド断片の量に対して、ＮＰ以外の他のプロテアーゼによる基質ペプチドの加水分解反応によって生じるペプチド断片の量が５％以下、好ましくは１％以下、より好ましくは０．５％以下、さらに好ましくは０．１％以下であることをいう。
【００２２】
本発明に係る基質ペプチドは、プロテアーゼによる切断を光学的に検出可能とするため、及び／又はエキソペプチダーゼによる消化を防止するため、Ｎ末端及び／又はＣ末端に保護基を有することが好ましい。保護基は、特に限定されず、例えば、３−（２−フリル）アクロイル基（ＦＡ基）、ベンジルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、アセチル基、サクシニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、アミド基などが用いられる。例えば、ＦＡ基をＮ末端に付加した場合、「ＦＡ−Ｇｌｙ」は波長３３４ｎｍに吸収を有するため、同波長の吸光度減少を検出することによって、「ＦＡ−Ｇｌｙ」の遊離、すなわちプロテアーゼによる基質ぺプチドの切断を検出できる。
また、例えば、Ｎ末端及びＣ末端の一方に蛍光物質を結合させ、他方の末端に消光物質を結合させた場合、基質ペプチドの切断によって消光物質（クエンチャー）から解離した蛍光物質からの蛍光を検出することによって、プロテアーゼによる基質ぺプチドの切断を検出できる。蛍光物質及び消光物質には、従来公知の物質を組み合わせて用いればよく、例えば蛍光物質として２−（Ｎ−メチル  アミノ）ベンゾイル（2-(N-methyl amino)benzoyl）基又は７−メトキシコウマリン−４−イル）アセチル（7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl）基を、消光物質として２，４−ジニトロロフェニル（2, 4-dinitorophenyl）を用いることができる。
【００２３】
本発明に係る基質ペプチドの長さは、特に限定されないが、ＮＰに対する基質特異性を担保するため、３アミノ酸長以上とされる。また、本発明に係る基質ペプチドには、ＮＰに対する基質特異性を維持し得る限り、蛍光物質や発色団による修飾や、基質ペプチドの切断に伴って吸光度変化をもたらす官能基の付加などが行われてもよい。なお、上記のクエンチャーを用いる場合には、Ｎ末端又はＣ末端に結合された消光物質が、多端に結合された蛍光物質に近接して位置でき、蛍光物質の励起を阻止し得るように基質ペプチドのアミノ酸配列長を設計する必要がある。
【００２４】
本発明に係る基質ペプチドは、より具体的には、以下のアミノ酸配列のいずれか１以上を含む。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
【００２５】
基質ペプチドに対するＮＰの切断活性の高さの観点から、以下のアミノ酸配列のいずれか１以上を含むものがより好ましい。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
【００２６】
本発明に係る基質ペプチドの好適な具体例としては以下のものが挙げられる。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−セリン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−グリシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−ヒスチジン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−セリン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−グリシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−ヒスチジン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−セリン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−グリシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−ヒスチジン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−セリン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−グリシン  アミド。
【００２７】
基質ペプチドに対するＮＰの切断活性の高さの観点から、以下のものがより好ましい。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−チロシン  アミド。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−チロシン  アミド。
【００２８】
２．プロテアーゼ活性の測定方法
本発明に係る基質ペプチドは、プロテアーゼ活性の測定のために利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、ＮＰに対して特異的な基質となるため、ＮＰの活性の測定のために好適に用いられる。
【００２９】
本発明に係るプロテアーゼ活性の測定方法は、目的とするプロテアーゼと本発明に係る基質ペプチドとを混合する手順と、前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、を含む。
【００３０】
混合手順は、プロテアーゼと基質ペプチドとを適当な溶媒に溶解し、反応させることによって行うことができる。反応時の溶媒、プロテアーゼ及び基質ペプチドの濃度、時間、温度などの条件は、従来公知のプロテアーゼ活性測定と同様に設定すればよい。
【００３１】
定量手順は、混合手順で得られた反応溶液を、液体クロマトグラフィーとＵＶ検出器によって分析し、生成したペプチド断片を検出、定量することによって行うことができる。生成したペプチド断片の検出、定量は、例えば、基質ペプチドの吸光度を測定してプロテアーゼによる切断に起因する吸光度変化を検出するなどの従来公知の手法によって行うこともできる。
【００３２】
ＮＰの活性値が既知の標品酵素を用いて予め作成した検量線を用いることで、定量手順で得られた基質ペプチドの切断量から酵素の活性値を算出できる。製造されたＮＰやＮＰを含む酵素組成物について、製品単位であるいは製造ロット単位でＮＰの酵素活性値を算出することで、ＮＰ製品の品質管理に利用することができる。
【００３３】
３．組成物中のプロテアーゼの検出方法
本発明に係る基質ペプチドは、組成物中のプロテアーゼの有無を検出するために利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、ＮＰによって特異的に切断されるため、組成物中にＮＰが含まれているか否かを検出するために好適に用いられる。
【００３４】
本発明に係るプロテアーゼの検出方法において、試料となる組成物は、ＮＰが含まれている可能性があるものであれば特に限定されないが、特に好ましくはクロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解酵素組成物とされる。本発明に係る基質ペプチドは、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＧ（ＣｏｌＧ）、コラゲナーゼＨ（ＣｏｌＨ）及びクロストリパイン（ＣＰ）によって切断されず、ＮＰによって特異的に切断されるため、本発明に係るプロテアーゼの検出方法は、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解酵素組成物中におけるＮＰの有無を検出するために適用できる。
【００３５】
クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解酵素組成物には、菌体、菌体破砕物、培養上清あるいはこれらの抽出物又は精製物であって、同菌が産生するプロテアーゼを含む組成物が広く含まれ得る。
【００３６】
本発明に係るプロテアーゼの検出方法は、目的とする組成物と本発明に係る基質ペプチドとを混合する手順と、前記基質ペプチドの切断を検出する手順と、を含む。混合手順は、上述したプロテアーゼ活性の測定方法と同様にして行えばよい。また、検出手順は、上述したプロテアーゼ活性の測定方法の定量手順に従って行えばよい。
【００３７】
４．組成物中のプロテアーゼの定量方法
本発明に係る基質ペプチドは、組成物中に含まれるプロテアーゼの量を決定するためにも利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、ＮＰに対して特異的な基質となるため、組成物中に含まれるＮＰの定量のために好適に用いられる。
【００３８】
本発明に係るプロテアーゼの定量方法は、目的とする組成物と本発明に係る基質ペプチドとを混合する手順と、前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、を含む。混合手順及び定量手順は、上述したプロテアーゼ活性の測定方法と同様にして行えばよい。ＮＰの含有量が既知の標品酵素を用いて予め作成した検量線を用いることで、定量手順における基質ペプチドの切断量から酵素の含有量を算出できる。
【００３９】
先の説明したように、細胞等の分離に用いられる酵素組成物として、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解酵素組成物が汎用されている。このタンパク質分解酵素組成物には、クロストリジウム・ヒストリチクス菌が産生するＣｏｌＧ、ＣｏｌＨ、ＣＰ及びＮＰが含まれており、細胞等の分離効率や分離後の細胞等の状態は組成物中の各プロテアーゼの量に影響される。
【００４０】
本発明に係る組成物中のプロテアーゼの定量方法によれば、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解酵素組成物において、細胞等の分離効率や分離後の細胞等の状態を最適化し得るＮＰの含有量を決定することができる。なお、本発明に係る組成物中のプロテアーゼの定量方法において、ＮＰに加えて、ＣｏｌＧ、ＣｏｌＨ及びＣＰなどのプロテアーゼの定量も併せて行う場合には、「Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ」及び「Ｂｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ」などの従来公知の基質ペプチドを用いて行えばよい。
【００４１】
また、本発明に係る組成物中のプロテアーゼの定量方法を用いて、ＮＰ含有量が未知のタンパク質分解酵素組成物についてＮＰ含有量を決定すれば、精製されたＮＰあるいはＮＰの活性を補うための他のプロテアーゼ（例えばサーモリシン）を、最適なＮＰ含有量あるいは最適なプロテアーゼ含有量となるまで添加することも可能である。これにより、均質な性能を有するタンパク質分解酵素組成物を調製でき、細胞分離操作の再現性を向上させることが可能となる。
【実施例】
【００４２】
＜試験例１：ＮＰによる合成ペプチドの分解＞
ＮＰに特異的な基質ペプチドの候補として、「Tyr-Gly-Phe-Tyr-Glu」（配列番号１）及び「Tyr-Gly-Phe-Tyr-Arg」（配列番号２）のペンタマーペプチドを合成した。これらの合成ペプチドを用いて、ＮＰ（参考例１参照）、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＧ（ＣｏｌＧ、Meiji Seikaファルマ（株））、コラゲナーゼＨ（ＣｏｌＨ、Meiji Seikaファルマ（株））による切断によって生成するペプチド断片を以下の方法で分析した。【００４３】
合成ペプチド溶液（375 μM in 50 mM Tris-HCl Buffer）２４μｌと、ＮＰ溶液（2 μg/ml）、ＣｏｌＧ溶液（9 mg/ml）又はＣｏｌＨ溶液（4 mg/ml）６μｌを混合し、３０℃で３０分反応させた。ギ酸を添加して反応を停止させた。反応液を逆相高速液体クロマトグラフィーにロードし、以下の条件で生成したペプチド断片の分離を行った。ペプチド断片の検出と分析は、Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  Ｄ−２５００（Hitachi High-Technologies Co.）及びＣｈｒｏｍａｔｏ−Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Run Time Instruments Co.）を用いて行った。また、分離されたペプチド断片の分子量を、ＥＳＩ−ＭＳ（equire 6000, Bruker Daltonics）を用いて決定した。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔ（φ4.6×250 mm, Tosho Co.）
溶媒：０．１％ギ酸添加アセトニトリル（0-10 min: 4 %, 10-40 min: 4-80 %, 40-50 min: 80 %）、流速０．５ｍｌ／分【００４４】
結果を図１及び図２に示す。ＣｏｌＧ及びＣｏｌＨはいずれの合成ペプチドも切断しなかった。一方、いずれの合成ペプチドもＮＰによって２番目のアミノ酸（Gly）と３番目のアミノ酸（Phe）の間（Gly-Phe）で切断された。図１及び図２の結果を「表１」にまとめて示す。これらの結果から、「Tyr-Gly-Phe-Tyr-Glu/Arg」がＮＰに特異的な基質ペプチドとなり得ることが確認された。【００４５】
【表１】
0006497683.tif 000002
（表中、各合成ペプチドのアミノ酸配列の下方に付した線は、生成したペプチド断片を示す。）【００４６】
＜試験例２：特異的基質ペプチドを用いたＮＰによる特異的分解の確認＞
プロテアーゼによる切断を光学的に検出可能とし、エキソペプチダーゼによる消化を防止するため、試験例１の合成ペプチドに基づいて、Ｎ末端にＦＡ基、Ｃ末端にアミド基を付加した「FA-Gly-Phe-Tyr-amide」（Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−チロシン  アミド：ＦＡＧＦＹＡ）を設計した。ＮＰ特異的基質ペプチド（ＦＡＧＦＹＡ）を用いて、試験例１と同様にして、ＮＰによる切断によって生成するペプチド断片を分析した。【００４７】
結果を図３に示す。ＮＰ特異的基質ペプチド（ＦＡＧＦＹＡ）が、ＣｏｌＧ及びＣｏｌＨによっては切断されず、ＮＰによってのみグリシンとフェニルアラニンとの間で切断されることが確認できた。【００４８】
さらに、ＮＰ特異的基質ペプチド（ＦＡＧＦＹＡ）に基づき、ＮＰに特異的な基質ペプチドの候補として以下の合成ペプチドを調製した。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン  アミド（FA-Gly-Phe-His-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−セリン  アミド（FA-Gly-Phe-Ser-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−フェニルアラニン−グリシン  アミド（FA-Gly-Phe-Gly-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−チロシン  アミド（FA-Gly-Leu-Tyr-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−ヒスチジン  アミド（FA-Gly-Leu-His-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−セリン  アミド（FA-Gly-Leu-Ser-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−ロイシン−グリシン  アミド（FA-Gly-Leu-Gly-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−チロシン  アミド（FA-Gly-Ile-Tyr-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−ヒスチジン  アミド（FA-Gly-Ile-His-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−セリン  アミド（FA-Gly-Ile-Ser-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−イソロイシン−グリシン  アミド（FA-Gly-Ile-Gly-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−チロシン  アミド（FA-Gly-Trp-Tyr-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−ヒスチジン  アミド（FA-Gly-Trp-His-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−セリン  アミド（FA-Gly-Trp-Ser-NH2）。
Ｎ−［３−（２−フリル）アクロイル］−グリシン−トリプトファン−グリシン  アミド（FA-Gly-Trp-Gly-NH2）。【００４９】
各合成ペプチドに対するＮＰの特異性を以下の方法で分析した。合成ペプチド溶液（0.4 mM, Tris-HCl 緩衝液, pH 7.5）４８０μｌを３７℃に５分間予温した。ＮＰ溶液、ＣｏｌＧ溶液又はＣｏｌＨ溶液２０μｌを添加し、酵素反応を開始した。吸光スペクトルメーター（日立、U-3010 UV-visible scanning spectrophotometer）を用いて３７℃における吸光度変化（344 nm）を測定し、吸光度の減少量を指標として各合成ペプチドの分解量を計測した。結果を「表２」に示す。【００５０】
【表２】
0006497683.tif 000003
（表中、「＋」及び「＋＋」は、ＮＰによる切断活性の強度（＋＋＞＋）を示す。）【００５１】
いずれの合成ペプチドも、ＣｏｌＧ及びＣｏｌＨによっては切断されず、ＮＰによってのみ切断され、ＮＰ特異的基質ペプチドとなり得ることが確認できた。なお、本試験例では、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のプロテアーゼのうちクロストリパイン（ＣＰ）による切断を確認していない。しかし、先に説明した通り、ＣＰは基質特異性が高く、Ａｒｇ又はＬｙｓを含まないペプチドに対しては切断活性を示さない。このため、本試験例で同定されたＮＰ特異的基質ペプチドがＣＰによって切断されないことは明らかである。【００５２】
＜参考例１：リコンビナントＮＰの調製＞
クロストリジウム・ヒストリチクス菌の中性プロテアーゼ（ＮＰ）を以下の手順で調製した。【００５３】
クロストリジウム・ヒストリチクス菌のゲノムから、シグナルペプチドを含まないＮＰをコードする領域をＰＣＲによって増幅した。プライマーの配列を以下に示す。
フォワードプライマーＮＰ：5'-CGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTCAC-3'（配列番号３）
リバースプライマーＮＰ：5'-TACGGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAAAC-3'（配列番号４）【００５４】
ＰＣＲ増幅産物をプラスミド（pHT43, MoBiTec, Germany）に挿入し、発現ベクター（pHT43-NP）を得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＮ２（Agric. Biol. Chem.,1990, 54(5), 1307-1309参照）を発現ベクターで形質転換し、クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天培地で形質転換体を選別した。【００５５】
形質転換体を培地Ａ（組成を以下に示す）１５０ｍｌに接種し、３０℃で１８時間培養した。
培地Ａ組成
2% Polypepton N
1% yeast extract
1% NaCl,
20 μg/ml chloramphenicol
pH 7.5【００５６】
培養物を９倍量の培地Ｂ（組成を以下に示す）に移し、３７℃で３時間好気的に培養した。ＩＰＴＧ（終濃度2 mM）と酢酸カルシウム（同100 mM）を添加し、さらに３７℃で２４時間好気的に培養した。
培地Ｂ組成
4% Polypepton N
2% yeast extract
2% NaCl
10 mg/ml chloramphenicol
pH 7.5【００５７】
培養物を遠心分離して培養上清を得た。培養上清に３０％飽和まで硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間撹拌した。遠心分離後の上清に８０％飽和まで硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１８時間撹拌した。遠心分離によって沈殿物を回収し、３０％飽和濃度で硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａ（10 mM Tris-HCl, 1 mM 塩化カルシウム, pH 8.0）に溶解した。【００５８】
３０％飽和濃度で硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡化したカラム（Toyopearl（登録商標）Butyl-650M column, f3 x 8 cm; Tosoh Co.）に上清を充填した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、３０％〜０％のライナーグラディエントの硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで洗浄した。０％〜１２．５％のライナーグラディエントのエタノールを含む緩衝液Ａで酵素を溶出させた。酵素を含む分画を回収し、緩衝液Ａに対して透析した。【００５９】
緩衝液Ａで平衡化したカラム（Toyopearl（登録商標）DEAE-650S column, f2 x 5 cm; Tosoh Co.）に酵素溶液を充填した。１０％エタノールと５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜２００ｍＭのライナーグラディエントの酢酸ナトリウムと１０％エタノールを含む緩衝液Ａで酵素を溶出させた。酵素を含む分画を回収し、同緩衝液に対して透析し、精製酵素を得た。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１：基質ペプチド
配列番号２：基質ペプチド
配列番号３：フォワードプライマーＮＰ
配列番号４：リバースプライマーＮＰ
【図１】
0006497683.tif 000004
【図２】
0006497683.tif 000005
【図３】
0006497683.tif 000006
【配列表】
0006497683000001.app