(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルミナリア（Terminalia sericea Burck）抽出物及び／又はウスベニタチアオイ（Althaea officinalis）抽出物を有効成分として含有することを特徴とするメラノブラスト遊走促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のメラノブラスト遊走促進剤を有効成分として含有することを特徴とする白髪防止又は白髪改善化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノブラスト遊走促進剤および、白髪防止又は白髪改善化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
白髪は生理的老化現象のひとつであるが、見た目の変化が精神的苦痛を感じる場合もあり、美容上の悩みとなる。さらに、若白髪や病的機序による色素減弱をきたす疾患によって惹起されることもあり、老年層だけではなく、若年層の悩みともなるため、白髪予防、健康な黒髪への回復を切望する声が多くある。
【０００３】
毛髪は毛包メラノサイトにて生成されるメラニンが毛母細胞に受け渡されることによって黒く色づく。白髪の原因としては、毛包メラノサイトの消失、毛包メラノサイトのメラニン合成能の低下、毛包メラノサイトの毛母細胞へのメラニン受け渡し能の低下などが考えられている。
【０００４】
白髪および黒髪の毛包メラノサイトを観察した非特許文献１の報告によると、白髪の中で毛包メラノサイトが消失している毛髪は全体の８割、毛包メラノサイトは存在するが、メラニン産生能が低下している毛髪は全体の２割であるとの観察結果が得られている。つまり毛包メラノサイトが消失している白髪が白髪全体の中でも多く存在していると考えられる。
【０００５】
毛包メラノサイトは皮膚基底膜上の皮膚メラノサイトと異なる特徴を持っており、毛の生まれ変わりのサイクルであるヘアサイクルと同調して、消失・再生を繰り返している。毛包メラノサイトはヘアサイクルの退行期から休止期にかけて消失し、続く初期成長期にかけて毛包メラノサイトの「種」であるメラノブラストが外毛根鞘細胞に存在する色素幹細胞より分化・移動し、毛乳頭細胞周辺に毛包メラノサイトが再配置される（非特許文献２）。しかし、加齢やストレスによってこの色素幹細胞からメラノブラストへの分化・遊走の低下が起きると、メラノサイトが毛乳頭細胞周辺へ配置されなくなってしまい、毛包メラノサイトが消失したまま、ヘアサイクルが進行し、白髪化するという過程が考えられる。つまり、ヘアサイクルの移り変わりの時期、メラノサイトが消失し、再び補給される過程が白髪予防にとって重要であると考えられる。
【０００６】
従来白髪を改善する方法としては主に染毛剤、所謂白髪染めによる対処が行われてきた。例えば、２剤式のヘアカラー、１剤式のヘアマニキュアやメラニン前駆体、二価の鉄イオン、およびアニオン性の皮膜形成ポリマーからなる毛髪化粧料が白髪染めに用いられている（特許文献１）。しかし、染毛によって白髪を一時的に黒く染めても、黒髪を維持するためには定期的に染毛する必要があり、根本的な解決策となっていないのが現状である。
【０００７】
毛包メラノサイトへ働きかける白髪改善方法として、メラニン産生促進剤に関して種々の提案がなされている。例えば、特許文献２では、コショウの葉又はその抽出物を含有するメラニン産生促進剤およびチロシナーゼ活性促進剤、また、特許文献３では、オタネニンジン、田七人参、タンジン、ユッカ、ビワ、キンギンカおよびサルサから選ばれる１種又は２種以上の植物抽出物を主成分とすることを特徴とするメラニン産生促進剤などが提案されている。しかし、これらのメラニン産生促進剤は前述のような毛包メラノサイトが消失している白髪には改善効果が十分に期待できないと考えられ、未だに有効性の点で十分なものが得られていないのが現状である。
【０００８】
毛包メラノサイトが存在していない白髪に対する白髪改善方法としては、色素幹細胞からメラノサイトへの分化を誘導する方法が考えられる。例えば、特許文献４ではオオムギの抽出物を有効成分として含有するメラノサイト分化誘導促進剤が提案されているが、白髪が抜けた後に生えてくる毛に毛包メラノサイトを再配置するにはメラノサイト分化誘導だけではなく、メラノブラストの遊走を促進することが重要であると考えられる。しかし、特許文献４は幹細胞からメラノサイトへの分化促進・メラニン産生促進についての記載はあるが、メラノブラスト遊走についての記載はなく、十分な白髪改善効果を得られるまでには至っていない。
【０００９】
一方、テルミナリア（シクンシ科モモタマナ属、学名Terminalia sericea Burck、別名 コバテイシ）はβ-エンドルフィン産生促進剤（特許文献５）、殺菌剤（特許文献６）として従来、利用されている。また、特許文献７では６−ベンジルアミノプリンおよび／又はナンバンゲ抽出液を有効成分とする白髪防止用外用剤の頭皮浸透性を向上させる目的でテルミナリアを使用している。しかし、特許文献７の白髪改善効果は上記有効成分の効果であり、テルミナリア単独の白髪改善効果についての記載はない。特許文献８にはテルミナリアの染毛効果についての記載があるが、テルミナリアと他の数種類の混合物を使用した方法についての記載であり、テルミナリア単独の染毛効果を示したものではなく、また、染毛による白髪染めでは根本的な白髪改善効果は期待できない。また、非特許文献３ではテルミナリアを摂取することによる白髪改善効果について示されているが、テルミナリアを配合した化粧料塗布による白髪改善効果についての記載はない。
【００１０】
一方、ウスベニタチアオイ（アオイ科タチアオイ属、学名Althaea officinalis、別名 ビロードアオイ、マーシュマロウ、ゼニアオイ、アルテア）は化粧料として従来から使用されており、例えば、ヒアルロニダーゼ阻害能を有する抗炎症剤として使用されている（特許文献９）。また、頭髪頭皮用化粧料としては、５αレダクターゼ阻害剤として使用されている（特許文献１０）。５αレダクターゼ阻害によって育毛効果が期待できることは公知であるが、白髪改善との直接の因果関係はないと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１４−１１４２６４号公報
【特許文献２】特開２００３−２２６６４９号公報
【特許文献３】特開２００１−２８８０９８号公報
【特許文献４】特開２０１３−１０２７５２号公報
【特許文献５】特許第４６８５３７４号
【特許文献６】特許第３７２６１３５号
【特許文献７】特開２０１３−１５９５９２号公報
【特許文献８】中特抄１０２３０２４２２
【特許文献９】特開２００６−２４１０３６号公報
【特許文献１０】特開２００１-１３１０２６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】白髪のメカニズムとその制御成分の開発  ２００４年１２月、フレグランスジャーナル社、Ｐ４０−４５
【非特許文献２】アンチ・エイジングシリーズ１白髪・脱毛・育毛の実際  ２００５年７月、ＮＴＳ、Ｐ４９−６１
【非特許文献３】MAILERINDIA INFOTEK株式会社 （MAILERINDIA INFOTEK LIMITED）白髪（White Hair）、［online］、［平成２７年5月１０日］、インターネット〈URL：http://www.mailerindia.com/health/mdir/w.php?whitehair〉
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、メラノブラスト遊走を促進する素材を見出し、これまでにない根本的な白髪防止又は白髪改善化粧料を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上述の課題解決のために鋭意研究した結果、テルミナリア抽出物及び／又はウスベニタチアオイ抽出物を用いることで上記課題を解決した。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、優れたメラノブラスト遊走促進効果及び、白髪の発生の防止又は白髪の改善効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に用いるテルミナリアはシクンシ（Combretaceae）科モモタマナ（Terminalia）属sericea Burckである。使用される部位は特に限定されない。根、樹皮、幹、葉、花が使用できるが、特に根が好適である。
【００１７】
テルミナリア抽出物の抽出溶媒は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種又は２種以上を用いることが出来る。中でも、メチルアルコールが特に好適である。
【００１８】
本発明に用いるウスベニタチアオイはアオイ（Malvaceae）科（Althaea）属officinalisである。使用される部位は特に限定されない。全草、根、葉、茎、花が使用できるが、特に根が好適である。
【００１９】
ウスベニタチアオイ抽出物の抽出溶媒は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種又は２種以上を用いることが出来る。中でも、エチルアルコールが特に好適である。
【００２０】
本発明に用いることのできる植物抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものを用いる場合、質量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１〜２時間、加熱抽出しても良い。
【００２１】
以上のような条件で得られる植物抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、本発明の効果を損なわない範囲で適宜濾過・濃縮・粉末化・脱色・精製などの処理を施して用いることができる。
【００２２】
本発明のメラノサイト遊走促進剤を白髪防止又は白髪改善化粧料に配合する場合、植物抽出物の配合量は特に限定されないが、蒸発乾燥分に換算して０．０１〜２０．０質量％が好ましく、特に０．１〜１０．０質量％の範囲が最適である。
【００２３】
本発明のメラノブラスト遊走促進剤を化粧料に配合する場合、本発明の効果を損なわない範囲で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、たとえば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、皮膚保護剤、美白剤、シワ改善剤、老化防止剤、植物抽出物、防腐剤、消炎剤、pH調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤、安定化剤、香料、色素、顔料等などを必要に応じて適宜配合することができる。
【００２４】
本発明のメラノブラスト遊走促進剤および白髪防止又は白髪改善化粧料の剤型は、毛髪あるいは頭皮に適用可能なものであればいずれでもよく、噴霧用剤、液状、ジェル状、クリーム状、固形状、パック、浴用剤等、又は二剤式など、剤型は特に問わない。
【００２５】
本発明のメラノブラスト遊走促進剤は、頭皮頭髪用化粧料に配合して白髪防止剤又は白髪改善剤として用いることができる。これらの頭皮頭髪用化粧料は化粧料ほかに医薬品、医薬部外品等の分野において好適に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。
【００２７】
＜被験物質１＞テルミナリア
テルミナリア根の乾燥物１．０ｇに１０倍質量のメタノール１０ｇを加え、室温で３日間抽出・乾燥を行い、テルミナリア抽出物を０．１ｇ得た。
【００２８】
＜被験物質２＞ウスベニタチアオイ
ウスベニタチアオイ根の乾燥物１．０ｇに１０倍質量の５０（V/V）%エチルアルコール１０ｇを加え、室温で３日間抽出・乾燥を行い、ウスベニタチアオイ抽出物を０．０８ｇ得た。
【００２９】
本実施例では、過去に山根らが開発したマウス胚性幹細胞からのメラノサイト分化誘導系（Yamane T., Hayashi S., Mizoguchi M., Yamazaki H., Kunisada T., Developmental Dynamics, １９９９年, Vol. ２１６, Issue ４−５, pp. ４５０−４５８）を一部改変し、メラノブラストの遊走能評価系を構築し、素材の評価を行った。以下に詳細を説明する。
【００３０】
＜メラノブラストの分化誘導＞
マウスES細胞（D３ES株）２．００×１０４  Cells／mLをES細胞用培地（１５％ FBS DMEM with １００ U/mL LIF、０．１ mM ２−メルカプトエタノール）に分散し、ゼラチンでコートした２４ウェルプレートの各ウェルに５００ μLずつ播種した。３７℃, ５％CO２下で２４時間インキュベート後、培地を除去し、PBS (-) で洗浄した。色素細胞分化用培地（１０％ FBS  α−MEMを１００ nM Dexamethasone、２０ pM bFGF、１０ pM Cholera Toxin 及び１００ ng/mL EDN３）と培地交換を行い、マウスES細胞からメラノブラストへ分化誘導を行った。分化誘導前（０日目）、分化誘導後、３日目、６日目、9日目のES細胞のTotal RNAの抽出をTotal RNA Purification Kit（JenaBioscience）を用いて行った。回収したTotal RNAはPrimeScriptTM RT Reagent Kit (Perfect Real Time) （TaKaRa）を用いてcDNAに逆転写し、Real time PCRに供した。Real time PCRはPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて７５００ Real Time PCR System（Applied Biosystems）で行い、色素細胞分化進行度の指標となる遺伝としてTYR, TRP２, TRP１ mRNA及びハウスキーピング遺伝子としてHPRT mRNAの発現度を測定した。Real Time PCR用プライマーを表１に示す。TYR, TRP２, TRP１ mRNAの発現量の変化は、コントロールを分化誘導前（０日目）とし、分化誘導後、TYR, TRP２, TRP１ mRNAのCt値をHPRTのCt値で補正した値を１とし、それに対する相対量としてmRNA発現度（ratio/control）を求めた。結果を表２に示した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
【表２】
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【００３３】
分化６日目のES細胞にメラノブラストに分化した細胞において発現増加が認められるTYR mRNAの発現増加が認められた。また、分化９日目のES細胞にメラノサイトに分化したES細胞において発現増加が認められるTRP２、TRP１ mRNAの発現の増加が認められた。以上の結果より、分化誘導６日目のマウスES細胞をメラノブラストとして使用することにした。
【００３４】
＜メラノブラストの遊走試験＞
マウスES細胞を上述の分化誘導系に供し、６日間培養したものをメラノブラストとして使用し、細胞遊走能をOris Cell Migration Assay Plate（Platypus Technologies）を用いて評価した。メラノブラストを１.０×１０６ cells/mLとなるように１０％ FBS α−MEMに分散し、１００ μLをSeeding Stopperの隙間から分注し、Seeding Stopperの周囲に細胞を播種した。３７℃, ５% CO２で１８ hr培養後、Seeding Stopperを取り除いた。PBS (-) で洗浄し、接着していない細胞を除いたあと、テルミナリア、ウスベニタチアオイの固形蒸発残分が２００ ppm, ２０ ppmとなるように１０％ FBS α−MEMで希釈した培地を添加し培養を開始した。被験物質を添加せず、１０％ FBS α−MEMを添加したものをcontrolとした。３７℃, ５% CO２で４８ hr培養後、PBS (-) で洗浄した。
【００３５】
＜細胞増殖度の測定＞
WST asaay試薬（Cell Counting Kit, DOJINDO）１０%を配合した１０% FBS α−MEMを各ウェルに２００ μLずつ添加した。３７℃, ５%CO２下で３０ minインキュベートした。９６ウェルプレートに１００ μLずつ取り分けた。マイクロプレートリーダーにて６５５ nmと４５０ nmの吸光度を測定した。４５０ nmの吸光度 (Abs(４５０ nm)) から６５５ nmの吸光度 (Abs(６５５ nm)) を引き、Abs (４５０ nm) に与える被験物質の濁度の影響を除去した。下記の式で算出された値を細胞増殖度として解析に用いた。
細胞増殖度= 被験物質 (Abs (４５０ nm)- Abs(６５５ nm))-blank(Abs (４５０ nm)- Abs(６５５ nm))
【００３６】
＜細胞遊走率の測定＞
細胞増殖度を算出した後の各ウェルから培地を除き、PBS (-) で洗浄した。Calcein-AM水溶液（５ μL Calcein-AM溶液 (１ mg/mL in DMSO) を１０ mL PBS (-) に加え、Calcein-AM水溶液を調製）を添加し、１５ min反応させた。Calcein-AM水溶液を除き、PBS (-) に交換した。Detection Maskをプレートに取り付け、蛍光マイクロプレートリーダーで各ウェルのexcitation:４８５ nm, emission:５２０ nmの蛍光強度を測定し、ウェルの中央部に遊走した細胞数を検出した。細胞を播種していないCalcein-AM水溶液のみを添加したプレートの蛍光強度を測定し、blankとした。各プレートの蛍光強度からblankを差し引いた値を細胞遊走度とし、測定した細胞増殖度で割った値から以下の式でcontrolに対する遊走率を算出した。結果を表３に示す。テルミナリアおよびウスベニタチアオイにメラノブラスト遊走促進効果が見出された。
遊走率（%）＝（（被験物質 細胞遊走度-blank 細胞遊走度）/被験物質 細胞増殖度）／（（control細胞遊走度-blank細胞遊走度）/control細胞増殖度）×１００
【００３７】
【表３】
0006474681.tif 000004
【００３８】
＜効果確認試験＞
累積塗布によるヒトによる白髪防止効果被験者として、各被験物質ごとに白髪のある４０〜６０歳の男女、各１５名に１日２回（朝、夜）連続３ヵ月間、本発明品と比較例のそれぞれを一定区画内で左右頭皮に別々に使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、白髪防止、改善効果を調べた。本試験には、次の配合組成により各種白髪防止用ヘアトニックを調製し、その累積塗布による、白髪防止効果について調べた。本発明の有効成分を配合したローションを毎日塗布しながら白髪の発生を防止する割合を塗布開始前及び塗布開始後３ヵ月における毛髪１００本あたりの白髪の本数を数えた。
具体的には、左右とも一定区画を設け、その区画内の毛髪を100本数える。毛髪100本中５０本が白髪であった場合に、3月使用後、同一区画内の１００本の毛髪の根元の状態で白髪の本数を数え、もともと白髪であった髪の根元が黒くなっていれば、黒髪としてカウントし、白髪が４０本になっていれば、４０／５０×１００＝８０％となる。一方、毛髪１００本中５０本が白髪であった場合に、３月使用後同一区画内の１００本の毛髪の根元の状態で白髪の本数を数え、もともと黒かった髪の根元が白くなっている場合は、白髪としてカウントし、白髪が１００本中６０本になっていれば、６０／５０×１００＝１２０％となる。
【００３９】
以下、比較例ヘアローション、白髪防止改善ローションの配合組成を示す。なお、含有量は質量％である。
0006474681.tif 000005
結果は表４に示す。表４からも明らかなように、ヒトによる塗布試験においても、テルミナリアおよびウスベニタチアオイに高い効果が認められた。
尚、表４中「テルミナリア」と記載しているのは、上記白髪防止用ヘアトニックで「テルミナリア」を有効成分とした場合であることを示す。同様に「ウスベニタチアオイ」とし記載しているのは、同様に上記白髪防止用ヘアトニックで「ウスベニタチアオイ」を有効成分とした場合を示す。
【００４０】
＜判定基準＞
***（著効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の白髪の本数が８０％未満
**（有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の白髪の本数が、８０％以上９０％未満
*（やや有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の白髪の本数が、９０％以上１００％未満
−（無効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の白髪の本数が１００％以上
【００４１】
【表４】
0006474681.tif 000006
【００４２】
以下、本発明に係る化粧料の処方例を示す。なお、含有量は質量％である。
【００４３】
0006474681.tif 000007
【００４４】
0006474681.tif 000008
【００４５】
0006474681.tif 000009
【００４６】
0006474681.tif 000010
【００４７】
0006474681.tif 000011
【００４８】
0006474681.tif 000012