(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物抽出物を得るための方法であって、以下の工程:
-  アシュワガンダの抽出物を生成する工程と、
-  前記抽出物を、好適な環境において、ノムシタケ科の糸状菌と共にインキュベートすることによって発酵させる工程と
を含む、抽出物を得るための方法。
【請求項２】
ノムシタケ科の糸状菌が、ボーベリア属、より特定するとボーベリア・バシアーナに由来する、請求項1に記載の抽出物を得るための方法。
【請求項３】
発酵工程後に培養培地の濾過工程を含む、請求項1又は2に記載の抽出物を得るための方法。
【請求項４】
発酵工程後に培養培地の滅菌工程を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抽出物を得るための方法。
【請求項５】
発酵工程後に培養培地の脱水工程を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抽出物を得るための方法。
【請求項６】
アムラの抽出物及びオトメアゼナの抽出物がアシュワガンダ抽出物に加えられてから、好適な培地中で前記糸状菌の前記抽出物の発酵が行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の抽出物を得るための方法。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、植物アシュワガンダの抽出物を含む組成物。
【請求項８】
請求項6に記載の方法によって得ることができる植物アシュワガンダ、アムラ及びオトメアゼナの抽出物を含む組成物。
【請求項９】
5〜100g/Lの間、好ましくは20g/Lの濃度でアシュワガンダの乾燥抽出物を含む、請求項7又は8に記載の組成物。
【請求項１０】
以下の植物:アムラ、オトメアゼナ、ザクロ、ウコン、ヒハツ又はキンセンカからの少なくとも1種の抽出物を更に含む、請求項7から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
液体、ゲル、エマルション、固体又は注射可能な形態であることを特徴とする、請求項7から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
栄養補助食品としての、請求項7から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物における血管新生と関係する障害を治療又は予防するための、医薬品としての、請求項7から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における血管新生と関係する障害を治療又は予防するための、請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、点状角膜症及び無秩序な血管新生と関連する緑内障の治療のための、請求項13又は14に記載の組成物。
【請求項１６】
関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、及び小児期に出現する又は遺伝性疾患と関連する種々の形態のあざの治療のための、請求項13又は14に記載の組成物。
【請求項１７】
がん、より特定すると固形腫瘍及び転移の治療のための、請求項13又は14に記載の組成物。
【請求項１８】
聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍の治療のための、請求項13又は14に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新血管新生(neovascularisation)に関連する障害又は疾患の治療又は予防を助ける組成物を植物抽出物から得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成(angiogenesis)又は血管新生(vascularisation)は、新しい血管が組織又は臓器で生成される、高度に制御される生理現象である。いわゆる「正常な」血管形成は、創傷治癒の局面で又は胎児環境の発生において活性化される。
【０００３】
病的な血管形成は、年齢に関連する可能性がある又はない細胞障害又は代謝障害によって活性化され、高度の身体障害を引き起こす可能性がある疾患の原因となる。これらには、いくつかの眼疾患が含まれ、そのうち最もよく知られているのは、ARMD(加齢性黄斑変性症)、糖尿病網膜症、並びに一連の点状角膜症及び無秩序な血管新生と関連する緑内障である。
【０００４】
病的な血管形成は、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、及び小児期に出現する又は遺伝性疾患と関連する種々の形態のあざにおいても疑われる。
【０００５】
最後に、血管形成は、固形腫瘍及び転移の発生の根底をなす。血管形成が重大な影響をもつ腫瘍には、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍も含まれる。血管形成の予防は、これらの腫瘍の成長及び結果として生じる損傷を止めることができる。
【０００６】
多くの分子、例えば、プロタミン、テトラヒドロコルチゾール、フマギリン、アスコルビン酸誘導体、動物糖タンパク質及びインターフェロン等の細胞因子が、新血管形成(neo-angiogenesis)に対して抑制効果を有することが知られている。しかし、これらの分子の効力の不足、それらの毒性又はそれらの投与の難しさは、特にタンパク質因子の場合、それらの有用性を制限する。加えて、使用者は、製品の起源及びそれらの投与方法に対して次第に敏感になり、特に天然起源の製品を好む。
【０００７】
アシュワガンダ(Withania somnifera)、アムラ(Emblica officinalis)及びオトメアゼナ(Bacopa monnieri)は、抗血管形成活性を示すことが報告されている。しかし、これらの植物の抽出物は、抽出物、特にアシュワガンダの抽出物を得ることに関連する毒性が高いため、抗血管形成薬として使用されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP2138054
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Indian J Pharm Sci. 2010 Sep-Oct; 72(5): 659〜663頁
【非特許文献２】トゥールーズ大学からの論文、2010年にPetko Ivanov PENCHEVによって投稿された「Etude des procedes d'extraction et de purification de produits bioactifs a partir de plantes par couplage de techniques separatives a basses et hautes pressions」[Study of the methods of extraction and purification of bioactive products from plants by coupling of separation techniques at low and high pressures]
【非特許文献３】Ultrafiltration of a strongly clogging food fluid: flow limit, critical flow and cleanability of a polymeric membrane、Ndeye Wemsy Diagne、Murielle Rabiller-Baudry、IUT Rennes、University of Rennes I、UMR CNRS 6226
【発明の概要】
【００１０】
驚くべきことに、本出願人は、植物アシュワガンダを出発原料とする方法において抽出工程と糸状菌を使用する発酵工程とを組み合わせることによって、抽出物の毒性に影響を及ぼし得ることを見出した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、新血管新生に対して抑制効果を有する、アシュワガンダの抽出物をベースとする無毒性の組成物を得るための方法、及びこのようにして得られた組成物を提供することである。
【００１２】
したがって、本発明は、組成物を得るための方法であって、少なくとも以下の工程:
-  アシュワガンダの抽出物を生成する工程と、
-  前記抽出物を、好適な環境において糸状菌と共にインキュベートすることによって発酵させる工程と
を含む、方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる組成物に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、栄養補助食品としてのこの組成物の使用である。
【００１５】
本発明の別の目的は、医薬品としてのこの組成物の使用である。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴、態様及び利点は、以下の説明及び実施例を読めば、より明確に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】発酵を行わなかった、アシュワガンダ抽出からの抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図１Ｂ】ウィタノライドを用いなかった、アシュワガンダ抽出からの非発酵抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図２】発酵を行わなかった、オトメアゼナ抽出からの抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図３】発酵を行わなかった、アムラ抽出からの抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図４】発酵を行わなかった、キンセンカ(Calendula officinalis)抽出からの抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図５】発酵を行わなかった、ザクロ(Punica granatum)の市販抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図６】発酵を行わなかった、ウコン(Curcuma longa)の市販抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図７】発酵を行わなかった、ヒハツ(Piper longum)抽出からの抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図８】発酵工程前の最初の組成物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図９】実施例8による組成物の、菌株ボーベリア・バシアーナ(Beauveria bassiana)ATCC 7159の存在下で7日間発酵させた後のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図１０】実施例10による組成物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図１１】実施例11による組成物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図１２】実施例12による組成物のクロマトグラフィーフィンガープリントを示す図である。
【図１３Ａ】実施例8の組成物40μlへの曝露後0時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１３Ｂ】実施例8の組成物40μlへの曝露後0時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１３Ｃ】実施例8の組成物40μlへの曝露後24時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１３Ｄ】実施例8の組成物40μlへの曝露後24時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１４Ａ】実施例9の組成物40μlへの曝露後0時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１４Ｂ】実施例9の組成物40μlへの曝露後24時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１４Ｃ】実施例9の組成物40μlへの曝露後48時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【図１４Ｄ】実施例9の組成物40μlへの曝露後72時間におけるニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
アシュワガンダ植物は、インドから入手する。この植物の根は、Alp Erbo社(マルセーユ)によって販売されている。
【００１９】
抽出物の生成は、当業者に公知の任意の手段、例えば、植物の種々の部分、例えば、根、葉、茎、枝、果実又は花の1つ又はそれ以上に由来する植物粉末の水溶液、アルコール溶液又はアルコール-水溶液中での浸軟を使用して、並びに煎出によって、超臨界又は亜臨界流体抽出によって及び吸着によって行う。(Indian J Pharm Sci. 2010 Sep-Oct; 72(5): 659〜663頁)、EP2138054、トゥールーズ大学からの論文、2010年にPetko Ivanov PENCHEVによって投稿された「Etude des procedes d'extraction et de purification de produits bioactifs a partir de plantes par couplage de techniques separatives a basses et hautes pressions」[Study of the methods of extraction and purification of bioactive products from plants by coupling of separation techniques at low and high pressures]。
【００２０】
発酵に使用する糸状菌は、ノムシタケ科(Cordycipitaceae)の真菌から選択する。好ましくは、真菌は、ボーベリア属(Beauveria)に属する真菌の中から選択する。更に好ましくは、糸状菌は、菌株ボーベリア・バシアーナ、より特定すると寄託番号ATCC 7159を有する菌株に由来する。
【００２１】
菌株ボーベリア・バシアーナは、有利な触媒特性を示し、ヒトに対して有毒でない。この菌株は、農業において昆虫の生物学的駆除によく使用されると共に、動物のためのプロバイオティクスとして使用されている。
【００２２】
したがって、菌株ボーベリア・バシアーナATCC 7159(American Type Culture Collection)の制御された発酵を含む、制御された発酵は、アシュワガンダ抽出物を、この抽出物に含有される種々の分子、より特定すると、抽出物の毒性の主な原因である物質、ウィタノライドアグリコンの化学的ファミリーに一連の生体触媒作用をもたらすことによって解毒する。
【００２３】
用語「発酵」は、微生物の作用下での植物性物質の変換を意味するのに使用する。
【００２４】
用語「好適な培地」は、発酵に必要な真菌バイオマスを成長させるのに使用される、当業者に公知の任意の培地を意味するのに使用する。好適な培地の例は、サブローデキストロース寒天(SAB:Sabouraud Dextrose Agar)(Gibco社、フランス)、ブレイン-ハートインフュージョン寒天(BHI:Brain-Heart Infusion Agar)(Gibco社、フランス)、Malt Extract Broth(MEB)(Gibco社、フランス)、酵母麦芽エキス(YM:Yeast Malt extract)(Gibco社、フランス)、酵母エキス-リン酸塩培地(YEP:Yeast Extract-Phosphate Medium)(Gibco社、フランス)、皮膚糸状菌試験培地(DTM:Dermatophyte Test Medium) (Gibco社、フランス)、ポテトデキストロース寒天-ブロス(PDA、RDB:Potato dextrose Agar and Broth) (Gibco社、フランス)、又はC-培地(C-Medium)である。好ましくは、以下の組成を有するC-培地を使用する。モラセス10g、MgSO4 0.5g、NaNO3 2g、KCl 0.5g及びFeSO4 0.02gを水1リットルに加えたもの[化合物は、Sigma社(フランス)から入手]。
【００２５】
用語「解毒」は、培地中の有毒である可能性がある分子を微生物によって排除することを意味するのに使用する。
【００２６】
1つの特徴によれば、本発明による方法は、発酵において使用した微生物を排除するために発酵段階において使用したインキュベーション培地を濾過する工程を含む。この濾過工程は、デカンテーション、又は当業者に公知の任意の手段、例えば、濾紙又は濾過器を用いた機械的濾過によって行い得る。
【００２７】
別の特徴によれば、本発明による方法は、当業者に公知の任意の手段、例えば、オートクレーブを例えば120℃で20分間使用することによって、限外濾過によって又は放射線照射によって行い得る滅菌工程を含むことができる。
【００２８】
好ましくは、発酵、濾過及び滅菌工程後、次に、インキュベーション培地を限外濾過に供して、植物抽出物を構成する溶液を得る[(Millipore、Applied Membranes社)、Ultrafiltration of a strongly clogging food fluid: flow limit, critical flow and cleanability of a polymeric membrane、Ndeye Wemsy Diagne、Murielle Rabiller-Baudry、IUT Rennes、University of Rennes I、UMR CNRS 6226]。
【００２９】
好ましい一実施形態において、本発明の方法は、アシュワガンダ以外の植物について実施し得る。特に、抽出物は、同じ手順を使用して、Infrag社(Bengalore)によって販売されている、インド原産のアムラ、Alp Erbo社(マルセーユ)によって販売されているオトメアゼナ(インド)、ザクロ(中国)[Shanghai Brightol International社(上海)]、ウコン(インド)(Omnipharm社、Chambery)、ヒハツ(タイ)(Omnipharm社、Chambery)又はキンセンカ(中国)[Shanghai Brightol International社(上海)]からも生成できる。
【００３０】
別の生成方法によれば、本発明の方法は、アムラ抽出物及びオトメアゼナ抽出物をアシュワガンダ抽出物に加えてから、好適な培地中で前記抽出物を前記糸状菌と共に発酵させる工程を含む。
【００３１】
この生成方法によれば、この方法は、前記配合物を得るのに使用する各植物抽出物に関する独立した抽出工程を含む。即ち、植物抽出物は、互いに独立して生成される。
【００３２】
本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られる組成物に関する。
【００３３】
したがって、本発明によるこの組成物は、アシュワガンダの抽出物を含有する。これはまた、以下の抽出物:アムラ、オトメアゼナ、ザクロ、ウコン、ヒハツ又はキンセンカの抽出物の少なくとも1つを含み得る。
【００３４】
有利には、この組成物は、質量で、アシュワガンダ5〜100g/Lの間、好ましくは20g/Lを含む。優先的には、この組成物はまた、質量で表された以下の抽出物の1つを含む:
-  アムラ5〜100g/Lの間、好ましくは15g/L、
-  オトメアゼナ5〜100g/Lの間、好ましくは15g/L、
-  ザクロ5〜50g/Lの間、好ましくは10g/L、
-  ウコン5〜250g/Lの間、好ましくは20g/L、
-  ヒハツ20〜50mg/Lの間、好ましくは30mg/L、
-  キンセンカ5〜50g/Lの間、好ましくは10g/L。
【００３５】
好ましくは、本発明による組成物は、本発明の方法によって得ることができる植物アシュワガンダ、アムラ及びオトメアゼナの抽出物を含む。
【００３６】
組成物は、液体、ゲル、エマルション、固体又は注射可能な形態とすることができる。
【００３７】
本発明による組成物は、局所投与、点眼、経皮投与、経口投与、直腸内投与又は非経口投与のために製剤化される。
【００３８】
医薬製剤の技術分野における当業者は、本発明の製品及び/又は栄養補助剤の種々の有用な投与形態を実施するであろう。
【００３９】
本発明による組成物は、従来使用されている不活性希釈剤、及び場合によっては他の物質、例えば、湿潤剤、甘味剤、保存剤、増粘剤、着色剤又は経口投与若しくは点眼に好適な、当業者に公知の任意の他の物質、特にソルビン酸ナトリウム(E201)(Sigma-Aldrich社)、アントシアン(E163)(FBC Industries社、米国)、メタ亜硫酸ナトリウム(E223)(Sigma-Aldrich社)、α-トコフェロール(E307)(FBC Industries社、米国)を含有する懸濁液、エマルション、シロップを更に含むことができる。
【００４０】
本発明による組成物はまた、溶媒又は他の添加剤、例えば、水、プロピレングリコール、植物油又は他の好適な有機溶媒を含み得る。
【００４１】
用語「添加剤」は、本発明による組成物の生物活性の有効性を妨げず、且つ投与される宿主に対して有毒でない任意の化合物を意味するのに使用する。
【００４２】
本発明による組成物はまた、補助剤、例えば、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、塩又は補助剤として使用し得る当業者に公知の任意の他の物質[ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール(PVA)、ヒドロゲル(Carbopol)、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ポロキサマー188、EDTA、クロロブタノール][Lubrizol社(フランス)、Dow Corning社(米国)]を含有し得る。
【００４３】
有利には、本発明による組成物は、前記栄養補助食品又は薬物の製剤中に他の物質、例えば、ビタミン、無機塩、医薬として許容される担体(vector)、安定剤、酸化防止剤、又は当業者に公知であり、且つ栄養補助食品若しくは薬物中に組み入れることが意図される任意の他の物質を含み得る。
【００４４】
用語「医薬として許容される担体」は、本発明による組成物の生物活性の有効性を妨げず、且つ投与される宿主に対して有毒でない任意の担体を意味するのに使用する。
【００４５】
この方法の後、得られた組成物は、新血管新生と関係する障害又は疾患の治療又は予防を助けるために、哺乳動物、より特定するとヒトに使用できる。
【００４６】
したがって、前記組成物は、栄養補助食品として使用できる。
【００４７】
用語「栄養補助食品」は、前記組成物を含有する製品であって、ヨーロッパ指令2002/46/ECによる定義による、健康に有益な栄養をもたらすことによって食品を補うことが意図される製品を意味するのに用いる。例えば、栄養補助食品は、飲み下すためのカプセル若しくはタブレット、又は食品と混ぜて有益な健康効果を提供する粉末若しくは小さいバイアルであることができる。
【００４８】
前記組成物は、医薬品としても使用できる。
【００４９】
用語「医薬品」は、正確な用量の、ヨーロッパ指令65/65/ECによる前記配合物、即ち、ヒト又は動物の疾患に関して治癒又は予防特性を有すると記載されている任意の物質又は組成物を含有する製品を意味するのに使用する。例えば、前記配合物を治療用量で含有する医薬品は、カプセル剤若しくは錠剤として経口的に投与し、又は硝子体内に注射し、又は任意の他の経路で投与して、有益な効果をもたらすことができる。
【００５０】
本発明による組成物は、新血管新生と関係する障害又は疾患、例えば、ARMD、糖尿病網膜症、並びに点状角膜症及び無秩序な血管新生と関連する緑内障の治療又は予防を助けるのに使用できる。これはまた、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、及び小児期に出現する又は遺伝性疾患と関連する種々の形態のあざの治療に、がん、より特定すると固形腫瘍及び転移の治療に、並びに聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍の治療に有用である。
【００５１】
本発明による組成物/又は栄養補助剤の一日量は、患者の必要度及び患者の症状の重症度によって異なり得る。典型的には、一日量は、発酵後の溶液で10mg/ml〜300mg/mlの間である。
【００５２】
好ましくは、ヒト成人の一日量は、発酵後の溶液で30〜100mg/mlの間である。
【００５３】
本発明を次に、実施形態を使用して説明する。これらの実施形態は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定しない。
【実施例１】
【００５４】
発酵前のアシュワガンダの抽出物
アシュワガンダ(南アジア原産、インドから供給)の抽出物を、650gの量の根(Alp Erbo社、マルセーユ)から、アルコール-水溶媒、エタノール/水(60:40)の8リットルの混合物中で生成した。
【００５５】
87g、即ち、収率13.4%の非晶質抽出物が得られた。これは、ウィタノシドA及びB、ウィタノシド並びにシトインドシドを含有していた(図1A)。
【００５６】
有毒であると考えられるウィタノシドを排除するために、CH2Cl2を用いて液/液抽出を行った。有機相をすすいで、乾燥させた後、81.5g、即ち、収率94%の非晶質粉末が得られた。
【００５７】
続いて、この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、アシュワガンダ抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図1B)。
【００５８】
得られた試料を、Waters 2996 PDA検出器を装着したSunfire III C18(4.6x150mm)3.5μm(Waters社)逆相カラム、Alliance(登録商標)Waters W2695 HPLCシステムを備えたHPLCシステムで分析した。このクロマトグラフィーシステムをWaters 2424蒸発光散乱検出器(ELSD)に連結した。HPLCシステムは、Empower 2ソフトウェア(Waters社)によって制御した。
【００５９】
使用した溶媒は、HPLC水(milli Q)+0.1%ギ酸、アセトニトリル(HPLC等級)+0.1%ギ酸から構成された。使用した標準勾配は、40分でアセトニトリル0から100%+アセトニトリル100%で10分(全持続時間50分)であった。流量は0.7ml/分であり、注入容量は試料に応じて20〜100μlであった。
【００６０】
質量分析に関しては、HPLC-MS分析を、Waters 2998 PDA型紫外線検出器、Waters 2420蒸発光散乱検出器ELSD及びMicromass(登録商標)ZQ質量検出器(Waters社)に連結されたWaters Alliance(登録商標)HPLCシステムで行った。
【００６１】
溶媒は、HPLC水(milli Q)+0.1%ギ酸及びアセトニトリル(HPLC等級)+0.1%ギ酸から構成された。使用した標準勾配は、40分でアセトニトリル0から100%+アセトニトリル100%で10分(全持続時間50分)であった。流量は0.7ml/分であり、注入容量は試料に応じて20〜100μlであった。
【００６２】
HPLC分析のための各組成物の試料は、0.45ミクロンフィルター(Ait-France、ref:SFNY 013045N)を用いて濾過し、次いでほぼ50μl程度の容量を注入した。
【実施例２】
【００６３】
発酵前のオトメアゼナ抽出物
オトメアゼナ抽出は、ほぼ418g程度の量の出発原料を用いて、アルコール-水溶媒、エタノール/水(50:50)の5リットルの混合物中で行った。
【００６４】
77.1g、即ち、収率18.4%の非晶質抽出物が得られた。これは、バゴシドA及びBを含有していた。
【００６５】
この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、オトメアゼナ抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図2)。
【実施例３】
【００６６】
発酵前のアムラの抽出物
アムラ抽出は、ほぼ512g程度の量で、100%エタノールを含むアルコール溶媒の7リットルの混合物中で行った。
【００６７】
166.5g、即ち、収率32.5%の非晶質抽出物が得られた。これは、没食子タンニン、ビタミンC及びエラグ酸を含有していた。
【００６８】
この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、アムラ抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図3)。
【実施例４】
【００６９】
発酵前のキンセンカの抽出物
10%ルテイン及び0.9%ゼアキサンチンで滴定されたキンセンカ抽出物を、Shanghai Brightol International社(上海)から入手した。
【００７０】
この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、キンセンカ抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図4)。
【実施例５】
【００７１】
発酵前のザクロの抽出物
40%エラグ酸で滴定されたザクロ抽出物を、Shanghai Brightol International社(上海)から入手した。
【００７２】
この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、ザクロ抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図5)。
【実施例６】
【００７３】
発酵前のウコンの抽出物
95%のクルクミンで滴定されたウコン根茎の抽出物は、COOPER社(Melun)に由来した(バッチno.:120 105 B CE no.207-280-5)。
【００７４】
この抽出物を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、ウコン抽出物のクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図6)。
【実施例７】
【００７５】
発酵前のヒハツ粉末
ヒハツを粉末として使用した。これは、ピペリンを含有している。
【００７６】
この粉末を分析し、次いでHPLC、HPLC-MS及びNMR技術によって同定することにより、ヒハツのクロマトグラフィーフィンガープリントを得た(図7)。
【実施例８】
【００７７】
発酵前の植物抽出物を含有する組成物
濃度20g/Lのアシュワガンダの抽出物、濃度15g/Lのアムラの抽出物、濃度15g/Lのオトメアゼナの抽出物、濃度10g/Lのザクロの抽出物、濃度20g/Lウコンの抽出物、濃度0.03g/Lのヒハツの抽出物、及び濃度10g/Lのキンセンカの抽出物を含む組成物を植物から調製した。
【００７８】
植物材料を簡単に粉砕した。各植物は、HGB50E-Blender型の粉砕機を用いて、互いに独立して細断し、直径ほぼ80ミクロン程度の可能な限り最も微細な粉末を得た。
【００７９】
次いで、各植物抽出物について浸軟によって抽出を行った。浸軟によるこのような抽出において、温度は40℃〜60℃の間、圧力は2つの1時間周期において100バールである。抽出後、得られた不均質な溶液を、厚さ870μm及び直径170mmの濾紙で濾過した。得られた溶液を収集し、BUCHI R-220-SE Rotavaporを使用して減圧濃縮して、水溶液を得た。これらの溶液を-80℃で凍結してから、凍結乾燥機(Edwards Modulyo Freeze Dryer)中に入れて-55℃及び圧力0.1ミリバール下で、乾燥抽出物を生成した。
【００８０】
次に、種々の乾燥抽出物を、一定容量の水と混合した。得られた溶液を分析して、次いでNMR、HPLC、HPLC-MS技術によって同定することにより、図8に示すようなクロマトグラフィーフィンガープリントを得た。
【実施例９】
【００８１】
発酵後の実施例8の組成物
インキュベーションの前に、実施例8から得られた組成物を、グルコースを濃度50g/Lで及び硝酸アンモニウムを濃度20g/Lで添加した水中で希釈した。次いで、得られた組成物を、菌株ボーベリア・バシアーナATCC7159を使用する制御された発酵による生物変換に供した。
【００８２】
この菌株を、KH2PO4 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 1g/L、NaNO3 2g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4 0.02g/L、グルコース30g/L及びコーンスティープリカー(Rocket社)10g/L(水1リットル当たり)から構成される培養培地中で予め培養した。次いで、培養物を27℃において200回転/分で72時間撹拌した。次に、これを非無菌的方法により濾紙で濾過して、培養培地から真菌バイオマスを分離した。次に、真菌バイオマスを十分に水洗し、インキュベーション1リットル当たり60gの、グルコース37.5g及び硝酸アンモニウム15gを含有する新鮮なバイオマスと共にインキュベートした。
【００８３】
インキュベーション後、この播種された組成物を、27℃の温度において200rpmで7日間撹拌した。
【００８４】
7日後、インキュベーション培地を濾紙で濾過し、HPLCアッセイ用の試料も、0.45ミクロンフィルター(Ait-France、ref:SFNY 013045N)を用いて濾過した。
【００８５】
帯褐色の溶液が得られた。次いで、これを分析し、NMR、HPLC、HPLC-MS技術によって同定することにより、図9に示すようなクロマトグラフィーフィンガープリントを得た。
【００８６】
得られた試料は、実施例1と同様にして分析した。
【実施例１０】
【００８７】
発酵前の本発明による組成物
組成物は、40g/Lの濃度のアシュワガンダ、30g/Lの濃度のアムラ及び30g/Lの濃度のオトメアゼナから構成されている。
【００８８】
これを、前の実施例と同様な技術によって分析した(図10)。
【実施例１１】
【００８９】
実施例10による組成物の要素の特性決定
発酵工程後、実施例11の組成物をより正確に特性決定した(図11)。
【００９０】
インキュベーション培地を濾紙で濾過し、HPLC分析用の試料も、分析のための注入の前に0.45ミクロンフィルター(Ait-France、ref:SFNY 013045N)を用いて濾過した。組成物中の同定されたマーカーは、ウィタノシドIV、ウィタノシドVI、バコサイドA3、バコパシドX、バコパサポニンC並びに没食子酸及びその誘導体であった。
【００９１】
【化１Ａ】
0006600626.tif 000002
【化１Ｂ】
0006600626.tif 000003
【実施例１２】
【００９２】
発酵前の本発明による組成物
配合物は、20g/Lの濃度のアシュワガンダ、15g/Lの濃度のアムラ、15g/Lの濃度のオトメアゼナ、20mg/Lの濃度のヒハツ及び20g/Lの濃度のウコンから構成されている(図12)。
【実施例１３】
【００９３】
本発明による組成物
配合物は、20g/Lの濃度のアシュワガンダ、15g/Lの濃度のアムラ及び15g/Lの濃度のオトメアゼナから構成されている(これも図10)。
【実施例１４】
【００９４】
実施例8及び実施例9の組成物の抗血管形成特性(発酵前及び発酵後)
ニワトリ絨毛尿膜(CAM)技術によるin ovoでの生物学的試験を、実施例8及び実施例9の組成物を使用して行った。
【００９５】
卵は、EARL Les Bruyeres, DANGERSによって供給された。試験に使用した卵は、産卵日当日に、又は産卵日の翌日までに配達された。卵は、通常はI657ニワトリひなを生産することが意図される、JA57雌鶏とI66雄鳥との異種交配から得られた。
【００９６】
12個1セットの2セットの卵を、受精7日後に処置した。
-  第1のセットには、実施例8からの組成物40μLをCAMに投与した。
-  第2のセットには、実施例9からの組成物40μLをCAMに投与した。
【００９７】
組成物の投与前並びに組成物の投与の24時間、48時間及び72時間後にCAMの写真を撮ることによって、血管新生の発生を追跡した(図14A〜図14D)。
【００９８】
24時間の時点で、第1のセットからの胚は100%が、重度の出血後に死滅していた(図13A〜図13D)。これはおそらく、CAMの破壊をもたらす組成物の毒性によると思われる。
【００９９】
72時間後に、第2のセットの12個の胚のうち2個のみが死滅している。加えて、実施例9の発酵組成物は、図14A〜図14Dにおいて観察されるように、処理された全ての卵において血管網の非常に著しい減少をもたらした。
【０１００】
したがって、本発明による組成物は、抗血管新生特性を有する。
【０１０１】
加えて、この試験は、本発明の方法に従って得られた組成物のin ovoでの解毒を立証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
0006600626.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006600626.tif 000010
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ．１３Ｃ】
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【図１３Ｂ．１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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