(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）受容体であるＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲに特異的に結合する新血管生成抑制用ペプチド；及び
前記新血管生成抑制用ペプチドに連結される親水性のエラスチン基盤ポリペプチド（親水性ＥＢＰ）
を含み、
前記親水性ＥＢＰは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、又は配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｆｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲに特異的に結合するペプチドは、抗−Ｆｌｔ１ペプチド［配列番号３８］である、請求項１に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０又は配列番号５１で表示されるものである、請求項１に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドは前記親水性ＥＢＰに連結される疎水性のエラスチン基盤ポリペプチド（疎水性ＥＢＰ）をさらに含み、
前記疎水性ＥＢＰは配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４６、又は配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号５２又は配列番号５３で表示されるものである、請求項４に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項６】
温度刺激により前記疎水性ＥＢＰがコア構造を形成し、前記親水性ＥＢＰ及び前記Ｆｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を形成する、請求項４又は請求項５に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記自己組立ナノ構造体は、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）の前記Ｆｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ特異的ペプチドをシェルとして有する、請求項６に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含み、
前記融合ポリペプチドのＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ特異的ペプチドがＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲと非共有結合をし、血管新生を抑制する、
新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。
【請求項９】
前記新血管生成に起因する疾患は、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、早熟児の網膜症、黄斑部変性症、脈絡膜新生血管生成症、新生血管性緑内障、角膜血管新生による眼球疾患、角膜移植時の拒絶反応、角膜浮腫、角膜混濁、癌（ｃａｎｃｅｒ）、血管腫、血管線維腫、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、及び乾癬の中から選択されるいずれか一つ以上である、請求項８に記載の新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。
【請求項１０】
請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含み、
前記融合ポリペプチドは、温度刺激により前記疎水性ＥＢＰがコア構造を形成し、前記親水性ＥＢＰ及び前記Ｆｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を構成し、
前記自己組立ナノ構造体のシェルは、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ特異的ペプチドを有することによって、Ｆｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲとの結合力が増加し、これにより、ＶＥＧＦがＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲに結合しないため、血管新生を抑制する、
新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。
【請求項１１】
前記新血管生成に起因する疾患は、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、早熟児の網膜症、黄斑部変性症、脈絡膜新生血管生成症、新生血管性緑内障、角膜血管新生による眼球疾患、角膜移植時の拒絶反応、角膜浮腫、角膜混濁、癌（ｃａｎｃｅｒ）、血管腫、血管線維腫、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、及び乾癬の中から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１０に記載の新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生血管抑制用融合ポリペプチド及び自己組立ナノ構造体に関する。より具体的に、本発明は、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）受容体に特異的に結合するペプチド；及び前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド（親水性ＥＢＰ）を含む新生血管抑制用融合ポリペプチドに関する。
【０００２】
また、本発明は、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）受容体に特異的に結合するペプチド；前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド（親水性ＥＢＰ）；及び親水性ＥＢＰに連結される疎水性エラスチン基盤ポリペプチド（疎水性ＥＢＰ）を含む新生血管抑制用融合ポリペプチド及びその自己組立ナノ構造体に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞浸透、細胞付着、標的分子に対して結合親和性、治療効能、及びサイト−特異性接合のような特異的機能を有するペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、互いに融合され、人工（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）又は融合タンパク質で形成されることによって、スマート（ｓｍａｒｔ）薬物伝達システムに適した多機能を有する。
【０００４】
このような融合タンパク質は、生体内で使用されるとき、高い特異性、高い活性、長い半減期、特定器官で低い蓄積、及び低い副作用を有する。最近、多機能融合タンパク質は、組み換えＤＮＡ技術で遺伝子水準で製作され、次のような事項が正確に調節される：（１）配列及びアミノ酸の構成、（２）融合の手順、（３）単分散（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）分子量、（４）親水性及び疎水性、（５）環境反応性、（６）生体適合性及び生物分解、（７）有毒性及び免疫原性、（８）薬物動力学及び薬力学。
【０００５】
前記融合タンパク質は、原核又は真核発現システムで高収率（１Ｌ培養当たり０．１〜０．５ｇ）で発現され、カラムクロマトグラフィー（ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製されるか又は融合タンパク質の刺激反応性（ｓｔｉｍｕｌｉ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）により誘発される特有の相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）挙動を分析する逆転移循環（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｉｎｇ、ＩＴＣ）により精製される。例えば、抗菌性宿主防御ペプチドとポリペプチドＦ４が遺伝的に融合され、抗菌性生体防御ペプチドが有する限界点（低い安定性、短い半減期及び高い生産費用）が克服された。さらに、腫瘍標的化抗体は、ハイブリードマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）技術でマウスから得られ、マウス抗体において抗原結合可変部位は、ヒトＩｇＧと結合され、患者で免疫原性を減少させた。相当数の人工融合タンパク質は、前臨床及び臨床開発中にあり、多機能性の人工キメラ又は融合タンパク質基盤治療技術は、幾何級数的に成長している。
【０００６】
エラスチン系ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＥＢＰｓ）は、弾性重合体ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）から由来した熱反応生体高分子である。エラスチンは、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）で主なタンパク質構成要素である。ＥＢＰｓは、弾性重合体ドメインを基盤として熱感応性（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を有するように変形され、５個のアミノ酸で構成されるペプチドである、ペンタペプチド（ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）の繰り返し単位であるＶａｌ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はＡｌａ）−Ｘａａ−Ｇｌｙ［ＶＰ（Ｇ又はＡ）ＸＧ］を有する。ＥＢＰｓは、熱−感応性ポリペプチドであり、これらの転移温度は、容易に調節され、薬物伝達ナノ構造体を形成する。
【０００７】
前記Ｘａａは、ゲスト残基（ｇｕｅｓｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）であり、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）を除いたすべてのアミノ酸であることができる。繰り返し単位の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって二つの種類のＥＢＰｓに区分でき、一つは、配列がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙである弾性を有するエラスチン基盤ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ、ＥＢＰＥ）であり、他の一つは、配列がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙである可塑性を有するエラスチン基盤ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ、ＥＢＰＰ）である。
【０００８】
ＥＢＰｓは、温度による可逆的相転移を示す下限臨界溶液温度（ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＬＣＳＴ）挙動を有する。前記ＬＣＳＴは、逆転移循環（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｉｎｇ、ＩＴＣ）のような簡易な精製方法を使用できる利点を提供し、熱に触発され、粒子、ゲル（ｇｅｌ）、繊維（ｆｉｂｅｒ）及び他の構造体で自己組立される利点も提供する。
【０００９】
互いに異なる配列を有するＥＢＰｓブロックで構成されるジブロックは、自己組立構造体を形成するために使用される。ＥＢＰｓジブロック共重合体は、二つのＥＢＰｓで構成され、前記二つのＥＢＰｓは、自己組立ミセル構造体を形成するために、互いに異なる配列及び転移温度（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｔ）を有する。ＥＢＰｓジブロック共重合体溶液の温度が下限Ｔｔ以上に温度が増加するとき、低いＴｔを有するＥＢＰｓは、不溶性になり、一方、高いＴｔを有するＥＢＰｓは可溶性になり、両親媒性ジブロックＥＢＰｓは、ミセル構造体に自己組立される。ＥＢＰｓジブロック共重合体は、ミセル構造体として機能的多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）を有するため、他の機能性ペプチドと融合されることもでき、例えば、細胞透過力を有する細胞透過性ペプチドと融合され得る。
【００１０】
可溶性状態のＥＢＰｓは、進歩された薬物伝達システム、再生医学、及び組織工学に適用され、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ＰＥＧ）のような不活性タンパク質基盤生体材料として使用されることがあり、薬物又は他の機能性タンパク質とともに薬物伝達担体として使用されることもある。
【００１１】
ＥＢＰｓの簡便な精製及び刺激触発式（ｓｔｉｍｕｌｉ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）相転移は、他の機能性タンパク質と遺伝的に容易に融合され得るようにし、ＥＢＰｓの長所を利用できるようにする。例えば、骨関節炎の治療のための注射薬物貯蔵所を作るために、ＥＢＰｓは、インターロイキン−１受容体拮抗剤（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ＩＬ−１Ｒａ）と融合され得る。
【００１２】
また、治療用ＥＢＰ融合タンパク質の進歩に伴い、ＥＢＰブロック共重合体（ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）の自己組立（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）が研究中である。ＥＢＰジブロック共重合体（ｄｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、二つの異なるＥＢＰブロックで構成され、それぞれのブロックは、それぞれ異なる配列、構成及び鎖（ｃｈａｉｎ）長さを有し、このような差異は、それぞれのＥＢＰブロックが固有な転移温度（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｔ）を有するようにする。温度が上昇するとき、低いＴｔを有するＥＢＰブロックは、不溶性になり、一方、高いＴｔを有する他のＥＢＰブロックは、前記低いＴｔ以上で可溶性になる。前記低いＴｔ以上でＥＢＰジブロック共重合体の両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）特性に起因して、前記ＥＢＰジブロック共重合体は、コア−シェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）ミセル（ｍｉｃｅｌｌａｒ）ナノ構造で自己組立される。さらに、ＥＢＰジブロック共重合体は、他の機能性ペプチド又はタンパク質と融合され、機能性多価性（ｍｕｌｔｉｖａｎｌｅｎｃｙ）を示す。前記ＥＢＰミセルナノ構造のコア（ｃｏｒｅ）及びシェル（ｓｈｅｌｌ）は、二つとも薬物伝達担体として相異に適用されて使用され得る。
【００１３】
最近、相当数の癌（ｃａｎｃｅｒ）関連疾病は、腫瘍（ｔｕｍｏｒ）においての非正常的な血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に起因すると知られた。生物体において生理的血管新生は、厳格な調節による特異的条件の下だけで活性化される。しかし、前記調節の崩壊による血管の過度な形成は、癌だけでなく、非腫瘍性疾患のような疾病を引き起こす。発生、成長、傷治癒、及び再生を含む生理的条件の下で血管新生刺激は、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）により活性化され、前記ＶＥＧＦは、細胞膜にあるＶＥＧＦＲ１（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−１又はＦｌｔ１）及びＶＥＧＦＲ２（ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ）を含む二つの種類のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＶＥＧＦＲｓ）に結合する。ＶＥＧＦＲｓにＶＥＧＦの選択的な結合は、成長信号を血管内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）に伝達し、以後、新しい血管生成（血管新生）を触発させる。
【００１４】
したがって、腫瘍成長、癌転移、網膜血管新生、角膜血管新生、糖尿網膜病症、喘息のような多様な疾病で血管新生を抑制するために、抗−血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関する多様な戦略が適用された。特に、眼球血管新生治療において抗−血管新生戦略としては、色素上皮性因子（ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＥＤＦ）又はカフェリン酸（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＣＡ）のような血管新生抑制剤を使用して抗−血管新生信号を開始すること、及びＶＥＧＦがその受容体（ＶＥＧＦＲｓ）と結合することを妨害することによって、新生血管形成信号を阻止することである。特に、ＶＥＧＦがその受容体に結合することを妨害することと関連した挑戦的な戦略としては、ＶＥＧＦＲ１に高い親和性を有し、且つ受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としてＶＥＧＦＲ１に競争的に結合する生体高分子（ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）又は標的化ペプチドを抗体として使用することである。
【００１５】
高速大量スクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、ＨＴＳ）システムのうち一つであるＰＳ−ＳＰＣＬ（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）探索を通じて確認された抗−Ｆｌｔ１ペプチド（ａｎｔｉ−Ｆｌｔ１  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（ＧＮＱＷＦＩ）のアミノ酸配列を有するヘキサ（ｈｅｘａ）−ペプチドである。抗−Ｆｌｔ１ペプチドは、ＶＥＧＦＲ１特異的拮抗剤としてＶＥＧＦＲ１に特異的に結合し、これにより、ＶＥＧＦだけでなく、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）を含むすべてのＶＥＧＦＲ１リガンドとＶＥＧＦＲ１が相互作用することを妨害する。生体内で抗−Ｆｌｔ１ペプチドの半減期を増加させるために、抗−Ｆｌｔ１ペプチド−ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ：ＨＡ）結合体は、ゼニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、デキサメサソン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）又はチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）特異的タンパク質キナーゼ（ｋｉｎａｓｅｓ）抑制剤が被膜化された自己組立ミセル構造の形成で研究された。たとえＨＡ重合体と抗−Ｆｌｔ１ペプチドの接合は、身体内で抗−Ｆｌｔ１ペプチドの半減期を増加させるが、接合効率及びミセル構造は、多分散ＨＡ重合体分子量、任意分布（ｒａｎｄｏｍ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、及びＨＡと抗−Ｆｌｔ１ペプチドの接合効率の非一貫性に起因して異質的（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）であるという問題点がある。
【００１６】
本発明者は、新血管生成抑制のための融合ポリペプチドに対する研究を続いた。その結果、血管内皮成長因子ターゲッティングペプチドとエラスチン基盤ポリペプチドが融合された新しい融合ポリペプチドを開発し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、新血管生成抑制用の新しい融合ポリペプチドを提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記融合ポリペプチドの自己組立ナノ構造体を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、新血管生成に起因する疾患の治療用組成物を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、個体の血管新生を抑制する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、下記を含む新血管生成抑制用融合ポリペプチドを提供する：
血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）受容体に特異的に結合するペプチド；及び前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド（親水性ＥＢＰ）。
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合するペプチドは、ＶＥＧＦ受容体であるＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲに特異的に結合するペプチドであることができる。
【００２２】
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合するペプチドは、ＶＥＧＦ受容体であるＦｌｔ１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲに特異的に結合するペプチドであることができ、「ＶＥＧＦ受容体特異的ペプチド」又は「ＶＥＧＦ受容体ターゲッティングペプチド」とも呼ぶ。前記ＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドは、この技術分野に広く知られた抗−Ｆｌｔ１又は抗−Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ（ポリ）ペプチドであれば、いずれも使用可能である。例えば、抗−Ｆｌｔ１ペプチド［配列番号３８］であることができるが、必ずこれに制限されるのではない。
【００２３】
前記親水性ＥＢＰは、下記式１又は式２で表示されるアミノ酸配列よりなるものであることができる：
［式１］
［配列番号１］ｎ；又は
［式２］
［配列番号２］ｎ、
前記式１又は式２で、
前記配列番号１は、［ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ］で構成され；
前記配列番号２は、［ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ］で構成され；
前記ｎは、１以上の整数であり、前記配列番号１又は配列番号２の繰り返し回数であり；また、
前記Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ又はＶＰＡＸＧが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Ｘのうち少なくとも一つは、親水性アミノ酸である。
【００２４】
前記親水性ＥＢＰは、前記式１で、ｎは１であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２０］；
Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２２］；
Ｄ（Ａｓｐ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２４］；又は
Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなる［配列番号２６］；ものであるか、
又は
前記式２で、ｎは、１であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２１］；
Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２３］；
Ｄ（Ａｓｐ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなるか［配列番号２５］；又は
Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなる［配列番号２７］ものであることができる。
【００２５】
前記親水性ＥＢＰは、
前記式２で、ｎは、３、６、１２又は２４であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなる、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３又は配列番号４４で表示されものであるか；又は
前記式２で、ｎは、１２であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が１：４：１の比率よりなる配列番号４５で表示されるものであることができる。
【００２６】
本発明において前記融合ポリペプチドは、
前記親水性ＥＢＰに連結される疎水性エラスチン基盤ポリペプチド（疎水性ＥＢＰ）をさらに含んで構成され得る。
【００２７】
すなわち、次のように構成された融合ポリペプチドであることができる：
血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）受容体に特異的に結合するペプチド；
前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド（親水性ＥＢＰ）；及び
前記親水性ＥＢＰに連結される疎水性エラスチン基盤ポリペプチド（疎水性ＥＢＰ）。
【００２８】
前記疎水性ＥＢＰは、下記式１又は式２で表示されるアミノ酸配列よりなるものであることができる：
［式１］
［配列番号１］ｎ；又は
［式２］
［配列番号２］ｎ、
前記式１又は式２で、
前記配列番号１は、［ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ］で構成され；
前記配列番号２は、［ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ］で構成され；
前記ｎは、１以上の整数であり、前記配列番号１又は配列番号２の繰り返し回数であり；また、
前記Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ又はＶＰＡＸＧが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Ｘのうち少なくとも一つは、疎水性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。
【００２９】
前記疎水性ＥＢＰは、
前記式１で、ｎは１であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ｇ（Ｇｌｙ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなる［配列番号２８］ものであるか、又は
前記式２で、ｎは、１であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ｇ（Ｇｌｙ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなるか［配列番号２９］；
Ｋ（Ｌｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなるか［配列番号３０］；
Ｄ（Ａｓｐ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなるか［配列番号３１］；
Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が３：３の比率よりなるか［配列番号３２］；
Ｄ（Ａｓｐ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が３：３の比率よりなるか［配列番号３３］；
Ｈ（Ｈｉｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｉ（Ｉｌｅ）が３：２：１の比率よりなるか［配列番号３４］；
Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｇ（Ｇｌｙ）が５：１の比率よりなるか［配列番号３５］；又は
Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなる［配列番号３６］ものであることができる。
【００３０】
前記疎水性ＥＢＰは、
前記式２で、ｎは、１２であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ｇ（Ｇｌｙ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなるか［配列番号４６］、又は
前記式２で、ｎは、２４であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのＸは、
Ｇ（Ｇｌｙ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｆ（Ｐｈｅ）が１：３：２の比率よりなる［配列番号４７］のであることができる。
【００３１】
一実施例において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０又は配列番号５１で表示され得る。すなわち、次のようで表示される融合ポリペプチドであることができる：
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；及び前記抗−Ｆｌｔ１ペプチドに連結される親水性ＥＢＰ［ Ａ１Ｇ４Ｉ１］３で構成され、［配列番号４８］で表示；
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；及び前記抗−Ｆｌｔ１ペプチドに連結される親水性ＥＢＰ［ Ａ１Ｇ４Ｉ１］６で構成され、［配列番号４９］で表示；
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；及び前記抗−Ｆｌｔ１ペプチドに連結される親水性ＥＢＰ［ Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で構成され、［配列番号５０］で表示；又は
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；及び前記抗−Ｆｌｔ１ペプチドに連結される親水性ＥＢＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４で構成され、［配列番号５１］で表示。
【００３２】
他の実施例において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５２又は配列番号５３で表示され得る。すなわち、次のようで表示される融合ポリペプチドであることができる：
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；親水性ＥＢＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２；及び疎水性ＥＢＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２で構成され、［配列番号５２］で表示；又は
抗−Ｆｌｔ１ペプチド；親水性ＥＢＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２；及び疎水性ＥＢＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４で構成され、［配列番号５３］で表示。
【００３３】
本発明の融合ポリペプチドのうちＶＥＧＦ受容体特異的ペプチド；親水性ＥＢＰ；疎水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドは、温度刺激により前記疎水性ＥＢＰがコア構造を形成し、前記親水性ＥＢＰ及びＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を形成できる。
【００３４】
自己組立ナノ構造体は、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドをシェルとして有することができる。
【００３５】
具体的に、ＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドである抗−Ｆｌｔ１ペプチドを例に取って説明する。抗−Ｆｌｔ１ペプチド；親水性ＥＢＰ；疎水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドは、温度刺激により前記疎水性ＥＢＰがコア構造を形成し、前記親水性ＥＢＰ及び抗−Ｆｌｔ１ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を形成できる。 
【００３６】
前記自己組立ナノ構造体は、多価の抗−Ｆｌｔ１ペプチドをシェルとして有することができるので、ＶＥＧＦ受容体に対する結合力が非常に向上する効果を提供する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、前記融合ポリペプチドを含む新血管生成に起因する疾患の治療用組成物を提供する。
【００３８】
さらに他の態様において、本発明は、前記治療用組成物を個体に投与する工程を含む、個体の血管新生を抑制する方法を提供する。
【００３９】
ＶＥＧＦ受容体特異的ペプチド；及び親水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドを例に取って説明すれば、前記融合ポリペプチドのＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドがＶＥＧＦ受容体と非共有結合をし、血管新生を抑制できる（図５）。
【００４０】
また、ＶＥＧＦ受容体特異的ペプチド；親水性ＥＢＰ；及び疎水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドを例に取って説明すれば、次の通りである。
【００４１】
温度刺激により疎水性ＥＢＰがコア構造を形成し、親水性ＥＢＰ及びＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を構成し、前記自己組立ナノ構造体のシェルは、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のＶＥＧＦ受容体特異的ペプチドを有することによって、ＶＥＧＦ受容体との結合力が増加し、これにより、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合しないため、血管新生を抑制できる。
【００４２】
前記新血管生成に起因する疾患は、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、早熟児の網膜症、黄斑部変性症、脈絡膜新生血管生成症、新生血管性緑内障、角膜血管新生による眼球疾患、角膜移植時の拒絶反応、角膜浮腫、角膜混濁、癌（ｃａｎｃｅｒ）、血管腫、血管線維腫、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、及び乾癬の中から選択されるいずれか一つ以上であることができるが、必ずこれに制限されるものではない。
【００４３】
本発明において使用される用語「血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）」とは、新しい血管生成を刺激する因子を言う。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＶＥＧＦＲｓ）に結合し、成長信号を血管内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）に伝達し、以後に血管新生を触発させる。
【００４４】
本発明の融合ポリペプチドは、前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合しないように作用するものである。
【００４５】
本発明において使用される用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸又は人工アミノ酸を意味し、好ましくは、天然アミノ酸を意味する。例えば、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラジン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシン又はトリプトファン等を意味する。
【００４６】
前記アミノ酸の性質は、この技術分野に広く公知されている。具体的に親水性（陰電荷性又は陽電荷性）を示すか、疎水性を示し、脂肪族又は芳香族の性質をも示す。
【００４７】
本明細書で使用するＧｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）等の略語は、アミノ酸の略語である。Ｇｌｙは、グリシンの略語であり、Ａｌａは、アラニンの略語である。また、グリシンは、Ｇ、アラニンは、Ａとも表現する。前記略語は、この技術分野で広く使用される表現である。
【００４８】
本発明において「親水性アミノ酸」というのは、親水性性質を示すアミノ酸であり、リシン、アルギニン等がある。
【００４９】
また、「疎水性アミノ酸」というのは、疎水性性質を示すアミノ酸であり、フェニルアラニン、ロイシン等がある。
【００５０】
本明細書に使用された「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意の重合体鎖を意味する。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と混用できるものであって、これも、やはりアミノ酸の重合体鎖を意味する。「ポリペプチド」という用語は、天然又は合成タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を含む。ポリペプチドは、単量体又は重合体であることができる。
【００５１】
用語「相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）」というのは、水が水蒸気に変わるか、氷が水に変わることのように、物質の状態が変わることを意味する。
【００５２】
本発明による前記ポリペプチドは、基本的に、刺激反応性を有するエラスチン基盤ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＥＢＰｓ）である。前記「エラスチン基盤ポリペプチド」は、「エラスチン類似ポリペプチド（ｅａｌｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｅｄｓ：ＥＬＰ）」とも呼ばれる。本発明の技術分野で広く使用される用語である。
【００５３】
本明細書で、前記Ｘａａ（又はＸ）「ゲスト残基」と称する。前記Ｘａａを多様に導入し、本発明による多様な種類のＥＢＰを製造できる。
【００５４】
前記ＥＢＰは、転移温度（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｔ）とも称する下限臨界溶液温度（ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＬＣＳＴ）で可逆相転移を経る。これらは、Ｔｔ未満で水溶性が大きいが、温度がＴｔを超過すると、不溶性になる。
【００５５】
本発明において、ＥＢＰの物理化学的特性は、ペンタペプチド繰り返し単位であるＶａｌ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はＡｌａ）−Ｘａａ−Ｇｌｙの組合により主に制御される。具体的に、その繰り返し単位の３番目アミノ酸は、相対的機械的特性を決定する。例えば、本発明において、３番目アミノ酸であるＧｌｙは、弾性（ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を形成するか、又はＡｌａは、可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を決定する。前記弾性又は可塑性は、転移以後に現われる性質である。
【００５６】
一方、４番目アミノ酸であるゲスト残基Ｘａａの疎水性とペンタペプチド繰り返し単位の重合化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、いずれも、Ｔｔに影響を及ぼす。
【００５７】
本発明によるＥＢＰは、ペンタペプチドが繰り返されたポリペプチドであることができ、この繰り返されたポリペプチドは、ポリペプチドブロック（ＥＢＰブロック）を形成できる。具体的に、親水性ＥＢＰブロック又は疎水性ＥＢＰブロックを形成できる。本発明のＥＢＰブロックの親水性又は疎水性の性質は、ＥＢＰの転移温度が深い関連性がある。
【００５８】
ＥＢＰの転移温度は、また、アミノ酸配列及びその分子量による。ＥＢＰ配列とＴｔの相関関係については、Ｕｒｒｙ等が多い研究を行った（Ｕｒｒｙ  Ｄ．Ｗ．，  Ｌｕａｎ  Ｃ．−Ｈ．，  Ｐａｒｋｅｒ  Ｔ．Ｍ．，  Ｇｏｗｄａ  Ｄ．Ｃ．，  Ｐａｒａｓａｄ  Ｋ．Ｕ．，  Ｒｅｉｄ  Ｍ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓａｆａｖｙ  Ａ．  １９９１．  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｍｅａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：４３４６〜４３４８．）。Ｕｒｒｙ等は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙのペンタペプチドで、４番目アミノ酸である「ゲスト残基」をＶａｌよりさらに親水性を示す残基に置換する場合、元々の配列と比較して、Ｔｔが上がり、反対に、Ｖａｌより疎水性である残基にゲスト残基を置換すると、元々の配列よりＴｔが低くなることを知見した。すなわち、親水性ＥＢＰは、Ｔｔが高くて、疎水性ＥＢＰは、相対的にＴｔが低いことを知見した。このような知見を通じて、ＥＢＰ配列のゲスト残基としてどんなアミノ酸を使用すべきかを決定し、ゲスト残基の組成の比率に変化を与えることによって、特定Ｔｔを有するＥＢＰを製造できるようになった（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ、２００２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １８．  ｐｐ．  ３２９〜３４３）。
【００５９】
前述したように、Ｔｔが高いと、親水性を示し、Ｔｔが低いと、疎水性を示す。本発明によるＥＢＰブロックも、ゲスト残基を含むアミノ酸配列と分子量に変化を与えることによって、Ｔｔを高めるか、または低めることができる。これにより、親水性ＥＢＰブロック又は疎水性ＥＢＰブロックの製造が可能である。
【００６０】
参照として、体温より低いＴｔを有するＥＢＰは、疎水性ブロックとして使用され得、体温より高いＴｔを有するＥＢＰは、親水性ブロックとして使用され得る。ＥＢＰが有するこのような性質によって、ＥＢＰの親水性と疎水性の性質は、生体工学的に応用するときには、相対的に定義できる。
【００６１】
本発明のＥＢＰ配列を例に取ると、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙの可塑性ペンタペプチドが繰り返される可塑性ポリペプチドブロックとＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙの弾性ペンタペプチドが繰り返される弾性ポリペプチドブロックとを比較するとき、３番目アミノ酸であるＧｌｙがＡｌａより高い親水性を示す。したがって、可塑性ポリペプチドブロック（Ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＰ）が弾性ポリペプチドブロック（Ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＥ）よりＴｔが低く現われる。
【００６２】
本発明によるＥＢＰは、前述したように、Ｔｔを調節し、親水性又は疎水性の性質を示すことができるものである。また、電荷性アミノ酸を使用して電荷性を付与できる。
【００６３】
本発明による融合ポリペプチドは、図５ｂ及び図５ｃに模式的に示した。本発明は、ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する抗−Ｆｌｔ１ペプチドとＥＢＰを融合させた。本発明の融合ポリペプチドを利用すると、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲに容易に結合しないため、新血管の生成を抑制できる。
【００６４】
本明細書で使用される用語のうち「ＥＢＰジブロック」というのは、「親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰ」で構成されるブロックを言い、「ＥＢＰジブロック共重合体」、「ＥＢＰジブロックブロック」、「ジブロックＥＢＰ」、「ジブロックＥＢＰｓ」又は「ジブロックＥＢＰＰｓ」とも呼ぶ。
【００６５】
本発明は、遺伝的に暗号化された新しい種類の「刺激反応型ＶＥＧＦ受容体ターゲッティング融合ポリペプチド（ｓｔｉｍｕｌｉ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＶＥＧＦＲ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」に関する。
【００６６】
一実施例において、前記融合ポリペプチドは、具体的に、ＶＥＧＦＲ１を標的化する受容体拮抗剤として作用する抗−Ｆｌｔ１ペプチド及び可溶性単一体（ｕｎｉｍｅｒ）としての親水性ＥＢＰブロックで構成される。  
【００６７】
他の実施例において、前記融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１を標的化する受容体拮抗剤として作用する抗−Ｆｌｔ１ペプチド；親水性ＥＢＰブロック；及び疎水性ＥＢＰブロックで構成される。前記親水性ＥＢＰブロック；及び疎水性ＥＢＰブロックのＥＢＰジブロックは、温度触発式（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）コア−シェルミセル構造の形成に寄与する。
【００６８】
抗−Ｆｌｔ１ペプチド及び親水性ＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１と前記融合ポリペプチドの抗−Ｆｌｔ１ペプチドドメインとの間に強い非共有相互作用をする。
【００６９】
一方、抗−Ｆｌｔ１ペプチド；親水性ＥＢＰブロック；及び疎水性ＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドは、生理的条件の下で多価性抗−Ｆｌｔ１ペプチドと温度触発式コア−シェルミセル構造を形成でき、これにより、ＶＥＧＦＲ１に対する前記融合ポリペプチドの結合親和性を増加させることができる。
【００７０】
したがって、本発明の融合ポリペプチドが血管新生関連疾病治療のためのポリペプチド薬物として提示され得る。
【００７１】
本発明の融合ポリペプチドは、従来、ペプチド薬物及びペプチド−重合体結合体を生体内治療に適用するときに発生する次の限界を克服できる：（１）蛋白質分解酵素による早い除去；（２）時間と費用が消耗される接合及び精製；（３）任意分布及び（多様な重合体とペプチド薬物の重合時に現われる）一貫性ない接合効率；及び（４）ミセル構造の多分散分子量による異質的なミセル構造。
【００７２】
本発明においては、熱反応型エラスチン基盤ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＥＢＰｓ）及び血管内皮成長因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＥＧＦＲ）ターゲッティングペプチドよりなる、ＶＥＧＦＲ標的化融合ポリペプチド（ＶＥＧＦＲ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）を提供する。本発明の融合ポリペプチドは、遺伝的に操作され、発現及び精製され、また、その物理化学的特性が分析された。ＥＢＰｓは、非−クロマトグラフィー精製タッグ（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｇｓ）として導入され、また、ＥＢＰｓは、生体内でＶＥＧＦＲ１ターゲッティングペプチドの早い分解を最小化するための安定剤（ポリエチレングリコール接合のような）として導入された。一方、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドは、受容体拮抗剤としてＶＥＧＦＲに特異的に結合するために導入された。ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド−親水性ＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドは、可溶性単一体形態を示した。一方、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド−親水性ＥＢＰブロック−疎水性ＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドは、生理的条件の下で多価性ＶＧＦＲターゲッティングペプチドとともに温度触発式コア−シェルミセル構造を示した。酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）により分析されたように、このような構造は、ＶＥＧＦＲｓに対する融合ポリペプチドの結合親和性を大きく増加させた（下記実施例参照）。ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドの空間的ディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）によって、ＶＥＧＦＲに対するＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドの結合親和力が大きく調節された。本発明は、ＶＥＧＦＲ標的化ペプチドの結合親和力が多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）に基づいてどのように調節され得るかを示す。
【００７３】
本発明の新血管生成抑制用融合ポリペプチドを含む治療用組成物は、薬学的組成物である。前記薬学的組成物は、前記融合ポリペプチドを含み、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で新生血管生成抑制の用途に使用されることを妨害しない他の物質を含むことができる。このような他の物質は、制限されず、希釈剤、賦形剤、担体及び／又は他の新生血管生成抑制物質を含むことができる。
【００７４】
一部の実施態様において、本発明の新血管生成抑制用融合ポリペプチドは、例えば、殺菌水と一般的な食塩水を含む、適切な希釈液とともに製剤化することによって、通常的な人体投与のために製剤化される。
【００７５】
本発明による治療用組成物の投与又は伝達は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を通過できる。例えば、投与は、局所又は皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、冠状動脈内、硬膜内又は静脈内注射、又は眼球硝子体注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）等のような標的組織（例えば、心臓組織）内への直接注射によることができる。本発明に開示された融合ポリペプチドの安定性及び／又は効力は、皮下、皮内、静脈内及び筋肉内を含む便利な投与経路を考慮する。
【００７６】
本発明は、融合ポリペプチドを（例えば、本発明に記述された組成物又は製剤の一部として）細胞に伝達する方法、及び対象で疾患の進行を治療、軽減、又は予防する方法を提供する。本発明に使用された用語「対象」又は「患者」は、人間及び他の霊長類（例えば、チンパンジー及び他の類人猿及び猿種）、家畜（例えば、牛、羊、豚、山羊及び馬）、家庭用哺乳類（例えば、犬及び猫）、実験室動物（例えば、マウス、鼠及びギニアピッグのような齧歯類）及び鳥（例えば、ニワトリ、七面鳥及び家擒類のような家庭用、野生用及び競技用鳥、かも、がちょう等）を含むが、これに制限されない任意の脊椎動物を意味する。一部の実施態様で、対象は、哺乳類である。
【００７７】
他の実施態様において、哺乳類は、人間である。
【００７８】
本発明の融合ポリペプチド又は薬学的組成物は、標的細胞（例えば、哺乳類細胞）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触し得る。
【００７９】
他の態様において、本発明による治療用組成物を個体に投与する工程を含む、新生血管の生成に起因した疾患の治療又は予防する方法を提供する。
【００８０】
臨床的使用のために、本発明の融合ポリペプチドは、所望の治療結果を達成するのに効果的な任意の適合な投与経路を介して単独で投与されるか、薬学的組成物に剤形化され得る。本発明のオリゴヌクレオチドの投与「経路」  は、経腸、非経口及び局所投与又は吸入を意味する。本発明の融合ポリペプチドの経腸投与経路は、口腔、胃腸、腸、及び直腸を含む。非経口経路は、眼球注入、静脈内、腹腔内、筋肉内、脊椎腔内、皮下、局所注入、膣、局所、鼻腔、粘膜及び肺投与を含む。本発明の融合ポリペプチドの局所投与経路は、表皮、口腔及び耳、目及び鼻内へのオリゴヌクレオチドの外部適用を示す。
【００８１】
前記治療用組成物は、非経口、経口、経皮、持続された放出、制御された放出、遅延された放出、座薬、カテーテル又は舌下投与により投与され得る。
【００８２】
前記治療用組成物内の融合ポリペプチドは、他の薬物と併用投与するとき、静脈注射時に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）１５ｍｇ／ｋｇ以下の量で投与され得、眼球硝子体注射時に（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）２．５ｍｇ以下の量で投与され得る。
【００８３】
本発明は、制限的なものと解釈されてはならない次の追加例により追加に説明される。通常の技術者は、本発明の観点から、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施態様に対する様々な変化が可能であり、同等又は類似の結果を得ることができることを理解しなければならない。
【００８４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練された専門家により通常的に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。
【発明の効果】
【００８５】
本発明の新血管生成抑制用融合ポリペプチドは、網膜、角膜、及び脈絡膜新生血管形成、腫瘍成長、癌転移、糖尿網膜病症、及び喘息の治療のような抗−血管新生に対する薬物伝達システムの新しい方向を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】異なるＤＮＡサイズを有するＥＢＰ遺伝子ライブラリを暗号化するプラスミドの製作に対する概略図及びアダプターの配列である。（Ａ）ｐＥＴ−２１ａプラスミドの変形のためのアダプターの配列。（Ｂ）シームレス遺伝子クローニングのためのｐＥＴ−２１ａプラスミドの変形に対する図式、（Ｃ）変形されたｐＥＴ−２１ａベクターに単量体ＥＢＰ遺伝子の挿入に対する図式及び（Ｄ）異なるＤＮＡサイズを有するＥＢＰ遺伝子ライブラリを暗号化するプラスミドの製作に対する図式。
【図２】本発明に利用されたＥＢＰ遺伝子ライブラリのアガロースゲル電気泳動イメージである。（Ａ）ＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｂ）ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｃ）ＥＢＰＥ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｄ）ＥＢＰＰ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｅ）ＥＢＰＥ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｆ）ＥＢＰＰ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｇ）ＥＢＰＥ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｈ）ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｉ）ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］、（Ｊ）ＥＢＰＰ［Ｋ１Ａ３Ｆ２］、（Ｋ）ＥＢＰＰ［Ｄ１Ａ３Ｆ２］、ａｎｄ（Ｌ）ＥＢＰＰ［Ｈ３Ａ２Ｉ１］。ＥＢＰ繰り返し単位の個数を各ＤＮＡ帯域の下に表示した。すべてのアガロースゲル上の両側レーンは、互いに異なるＤＮＡサイズマーカー（下から上に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、１．０、１．５、２．０、及び３．０ｋｂｐ）を示す。
【図３】本発明に利用されたＥＢＰの銅染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％勾配）である。（Ａ）ＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｂ）ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｃ）ＥＢＰＥ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｄ）ＥＢＰＰ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］、（Ｅ）ＥＢＰＥ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］及び（Ｆ）ＥＢＰＰ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の両側レーンは、標準タンパク質サイズマーカー（下から上に７、１５、２４、３５、４０、５０、６５、９０、１１０、１５０ｋＤａ）を含む。
【図４】本発明に利用されたＥＢＰｓの熱的プロファイルである。（Ａ）ＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎ、（Ｂ）ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎ、（Ｃ）ＥＢＰＥ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］ｎ、（Ｄ）ＥＢＰＰ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］ｎ、（Ｅ）ＥＢＰＰ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］ｎ及び（Ｆ）ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ｎ。熱的プロファイルの３５０ｎｍにおいての光学吸光度は、１℃／分の加熱速度でＰＢＳ緩衝剤あるいは１、２及び３ＭのＮａＣｌが補充されたＰＢＳ緩衝剤内で２５μＭのＥＢＰ溶液を加熱することによって得た。
【図５ａ】ＥＢＰＰ及び抗−Ｆｌｔ１ペプチドで構成される融合ポリペプチドのクローニング、分子構造及び機能に対する模式図である。ＥＢＰＰジブロックを暗号化する遺伝子が製作され、その後、抗−Ｆｌｔ１ペプチドを暗号化する遺伝子は、ＥＢＰＰジブロックを暗号化する遺伝子を含むプラスミドにクローニングされた。
【図５ｂ】抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ；及び抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチド。
【図５ｃ】抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰで構成される融合ポルリペプチドは、熱（温度）刺激によりミセル構造を形成できた。
【図５ｄ】（ｉ）抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲに結合でき、ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦと相互作用することを妨害できた。（ｉｉ）抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰで構成される融合ポリペプチドのミセル構造は、ＶＥＧＦＲと結合でき、抗−Ｆｌｔ１ペプチドの多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）により増加した親和性を有しながら、ＶＥＧＦＲがＶＥＧＦと相互作用することを阻止できた。
【図６】（Ａ）アガロースゲル（１％）及び（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％増減率）ゲルイメージである。（ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、（ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］６、（ｃ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及び（ｄ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４。
【図７】混濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）プロファイルであって、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）のＬＣＳＴを示す。混濁度プロファイルは、（Ａ−Ｃ）２５μＭのＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）及び（Ｄ−Ｆ）２５μＭの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）の吸光度を測定することによって得られた。（Ａ、Ｄ）は、１０ｍＭのＰＢＳで、（Ｂ、Ｅ）は、１Ｍ塩化ナトリウムで補充された１０ｍＭのＰＢＳで、また、（Ｃ、Ｆ）は、２Ｍ塩化ナトリウムで補充された１０ｍＭのＰＢＳで吸光度が測定され、この際、吸光度は、１℃／分の速度で試料を加熱しつつ、３５０ｎｍで測定された。
【図８】融合ポリペプチドの（Ａ）アガロースゲル（１％）及び（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％増減率）ゲルイメージである。（ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び（ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４（Ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２又は抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４を暗号化する変形されたｐＥＴ２１−ａ（＋）プラスミドは、ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで切断された。（Ｂ）前記融合ポリペプチドは、大腸菌で発現され、ＩＴＣで精製された。４〜２０％増減率ゲルは、銅染色で視覚化された。予想分子量は、前記バンドの下側に表示される。
【図９】抗−Ｆｌｔ１ペプチドの有無によるＥＢＰＰジブロックの混濁度プロファイル。（Ａ）（ａ）２５μＭのＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び（ｂ）２５μＭのＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の混濁度プロファイル。（Ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２の混濁度プロファイル及び（Ｃ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の混濁度プロファイルは、１０ｍＭのＰＢＳで１２．５、２５、５０及び１００μＭの濃度に対して得られた。吸光度は、１℃／分速度で試料を加熱しながら、３５０ｎｍで測定された。相転移は、二回発生した。一次相転移は、疎水性ブロックの凝集により発生し、二次相転移は、極性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２により影響を受けた。ＥＢＰＰジブロック濃度が増加するにつれて、これらの一次及び二次Ｔｔが低くなった。
【図１０】（ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び（ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の流体力学的半径でＤＬＳ機構で測定された。ＥＢＰＰジブロックポリペプチドの流体力学的半径は、１０ｍＭのＰＢＳで２５μＭで測定された。一次相転移以前のＥＢＰＰジブロックポリペプチドの流体力学的半径は、１０ｎｍ以下であるが、これは、前記ポリペプチドが可溶性単一体形態で存在することを示す。
【図１１】コーティングされたＶＥＧＦにＶＥＧＦＲ１の結合を抑制させるＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］６、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４の生体外生物学的活性を示す。
【図１２】コーティングされたＶＥＧＦにＶＥＧＦＲの結合を抑制させるＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の生体外生物学的活性を示す図である。ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、３７℃で単一体（ｕｎｉｍｅｒ）である。他方で、３７℃で抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２は、準安定ミセルを形成し、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４は、安定したミセルを形成する。
【図１３】抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の生体外の管形成分析結果を示したのである。（Ａ）カルセイン−ＡＭで標識されたＨＵＶＥＣｓの蛍光顕微鏡イメージ及び（Ｂ）管形成の抑制程度である。抑制程度は、（Ａ）のイメージから定量化された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で処理された細胞の管長さは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］の濃度が増加するにつれて減少した。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、ＨＵＶＥＣｓの移動及び管形成を抑制した。管形成の長さは、平均値±ＳＥである。ｔテスト、＊Ｐ≦０．０５。
【図１４】レーザー−誘発脈絡膜新生血管形成モデルで抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の生体内抑制効果。Ｃ５７ＢＬ６マウス（グループ当たりｎ＝３）は、レーザー−誘発損傷後に運搬体（ＰＢＳ）、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２（２０ｍｇ）又は抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２（０．１、１、５及び２０ｍｇ）で処理され、前記処理は、５日間続いた。レーザー損傷後、１４日目、マウスは、安楽死され、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）−デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）が散布された全体脈絡膜フラットマウント（ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔｓ）が用意された。ＣＮＶ病変サイズは、ナノ−ズーム（ｎａｎｏ−ｚｏｏｍｅｒ）及びＦＩＳＨで定量化された。（Ａ）代表的なフラットマウント蛍光顕微鏡イメージ。（Ｂ）それぞれの処理されたグループのＣＮＶサイズに対するグラフ。各点は、ＣＮＶ病変に該当し、水平線は、各グループの平均値に該当する。対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔテスト、＊Ｐ≦０．０５。前記データは、二回の独立的な実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
実施例１：材料
ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター及びＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞は、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（米国、ウィスコンシン、メディソン）から得た。Ｔｏｐ１０収容細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）及びカルセイン−ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国、カリフォルニア、カルズベド）から購買し、ＨＵＶＥＣｓは、アメリカンタイプカルチュアコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）（米国、バージニア）から購買した。すべての注文製作されたオリゴヌクレオチドドルは、Ｃｏｓｍｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈ（韓国、ソウル）で合成され、組み換えヒトＶＥＧＦ−１６５（ｒｈＶＥＧＦ１６５）は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（中国、北京）から得た。子牛腸アルカリホスファターゼ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＩＰ）、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ、オンタリオ）から得た。ＡｃｕＩ及びＢｓｅＲＩは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国、マサチューセッツ、イプスイッチ）から購買した。Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）は、Ｅｌｐｉｓ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ（韓国、帯電）から得た。ＤＮＡ分離キット（ＤＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、ゲル抽出（ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、及びＰＣＲ精製キットは、Ｇｅｎｅａｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（韓国、ソウル）から得た。「Ｄｙｎｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ」は、ＤＹＮＥ  ＢＩＯ、Ｉｎｃ．（韓国、城南）から得た。Ｔｏｐ１０細胞は、ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（米国、カリフォルニア、カルズベド）から得た「ＴＢ  ＤＲＹ」培養培地で生育した。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（米国、オハイオ、ソロン）から得た「Ｃｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ」培養培地で生育した。「Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２〜２０％  ｐｒｅｃａｓｔ  ｇｅｌｓ」は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（米国、カリフォルニア、エルクルレス）から購入した。リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、カナマイシン、ポリエチレンアミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ）、ホルマリン及び牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国、ミズーリ、セントルイス）から得た。マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国、カリフォルニア、サンディエゴ）から購買した。ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とも呼ばれるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）は、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｔｄ．（スイス、ライナク）から購買した。ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）は、Ｈｕｏｎｓ（韓国、城南）から得た。キシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ）は、ＢＡＹＥＲ（ドイツ、レボクゼン）から購買した。トロピカミド（Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）は、Ｓａｎｔｅｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏ．  Ｌｔｄ（日本国、大阪、北区）から購買した。立体顕微鏡は、Ｌｅｉｃａ（ドイツ、ベツルラオ）から得た。組み換えヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質及び組み換えヒトＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１  Ｆｃは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国、ミネソタ、ミネアポリス）から購買した。ウサギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰキメラタンパク質及び３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（米国、マサチューセッツ）から得た。
【００８８】
実施例２：互いに異なるＥＢＰブロックとこれらのブロックポリペプチドに対する表記
ペンタペプチド繰り返し単位であるＶａｌ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はＡｌａ）−Ｘａａ−Ｇｌｙ［ＶＰ（Ｇ又はＡ）ＸＧ］を有する互いに異なるＥＢＰは、次のように命名する。前記Ｘａａは、Ｐｒｏを除いた任意のアミノ酸であることができる。第一に、可塑性を有するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ（ＶＰＡＸＧ）のペンタペプチド繰り返しは、可塑性を有するエラスチン系ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＰ）と定義する。一方、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ（ＶＰＧＸＧ）のペンタペプチド繰り返しは、弾性を有するエラスチン系ポリペプチド（ｔｈｅ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＥ）と称する。第二に、［ＸｉＹｊＺｋ］ｎで、括弧内の大文字は、ゲスト残基の単文字アミノ酸コード、すなわち、ＥＢＰペンタペプチドの４番目位置（Ｘａａ又はＸ）においてのアミノ酸であり、これらの該当する下付き文字は、繰り返し単位としてＥＢＰモノマー遺伝子のゲスト残基の比率（ｒａｔｉｏ）を示す。［ＸｉＹｊＺｋ］ｎの下付き文字の数ｎは、本発明の配列番号１［ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ  ＶＰＧＸＧ］又は配列番号２［ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ］のＥＢＰの繰り返し回数の総数を示す。例えば、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２は、配列番号２［ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ  ＶＰＡＸＧ］の単位が１２回繰り返されてなるＥＢＰＰブロックであり、ここで  ４番目ゲスト残基位置（Ｘａａ）においてのＧｌｙ、Ａｌａ、及びＰｈｅの比は、１：３：２である。最後に、ＥＢＰ−ＥＢＰジブロックポリペプチドは、ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２のように、ブロック間のハイフンとともにブラケット括弧でそれぞれのブロックの構成によって命名される。
【００８９】
実施例３：シームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓ）遺伝子クローニングのための変形されたｐＥＴ−２１ａベクターの製造
３７℃で２０分間ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ緩衝剤で５０ＵのＸｂａＩ、５０ＵのＢａｍＨＩ、１０Ｕの感熱（ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）アルカリリン酸フォスファターゼとともに４μｇのｐＥＴ−２１ａベクターを消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）及び脱リン酸化した。制限されたプラスミドＤＮＡをＰＣＲ精製キットを使用して精製した後、４０μＬの蒸留された脱イオン水で溶離した。ＸｂａＩとＢａｍＨＩ互換可能な接着末端を有する二つのオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号３９（５’−ｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇｇａｇｔａｃａｔａｔｇｇｇｃｔａｃｔｇａｔａａｔｇａｔｃｔｔｃａｇ−３’）及び配列番号４０（５’−ｇａｔｃｃｔｇａａｇａｔｃａｔｔａｔｃａｇｔａｇｃｃｃａｔａｔｇｔａｃｔｃｃｔｃｃｔｔｃｔｔａａａｇｔｔａａａｃａａａａｔｔａｔｔｔ−３’）を設計した。２分間９５℃でＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝剤で２μＭオリゴヌクレオチド濃度の５０μＬを加熱することによって、二つのオリゴヌクレオチドをアーニリングした後、その溶液を３時間にわたって室温までゆっくり冷却した。３０分間３７℃で２０ｐｍｏｌのアーニリングされたｄｓＤＮＡと０．１ｐｍｏｌの線形化されたベクターを、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝剤に培養することによって、ｐＥＴ−２１ａベクター内の多数の複製サイトへのＤＮＡインサートの連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を実施した。シームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓ）遺伝子クローニングと発現のための変形されたｐＥＴ−２１ａ（ｍｐＥＴ−２１ａ）ベクターをＴｏｐ１０の収容細胞で形質転換し、引き続いて、これらを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＳＯＣ（ｓｕｐｅｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）プレート上に塗布した。引き続いて、ｍｐＥＴ−２１ａベクターのＤＮＡ配列を蛍光色素終了子ＤＮＡシーケンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＡＢＩ  ３７３０）により検証した。
【００９０】
実施例４：ＥＢＰ遺伝子単位体合成及びそのオリゴマー化  
４番目残基が互いに異なるモル比で可変されるペンタペプチド繰り返し単位であるＶａｌ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はＡｌａ）−Ｘａａ−Ｇｌｙを有するＥＢＰ配列をＤＮＡレベルで設計し、生理的温度未満でＴｔを最適化した。１７個のＥＢＰライブラリに対して、多様なペンタペプチド繰り返し単位を有するＥＢＰのＤＮＡとアミノ酸配列が表１と表２にそれぞれ示されている。
【００９１】
【表１】
0006600405.tif 000002
【００９２】
ＥＢＰライブラリの遺伝子配列。Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙのペンタペプチド繰り返しを有する可塑性のＥＢＰ（ＥＢＰＰ）；及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙのペンタペプチド繰り返しを有する弾性のＥＢＰ（ＥＢＰＥ）は、いずれも、同一のゲスト残基組成と比率を有するように複製された
【００９３】
【表２】
0006600405.tif 000003
【００９４】
前記表１で、配列番号３〜１０は、親水性ＥＢＰブロックのための遺伝子配列に分類され得、配列番号１１〜１９番は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓが入った疎水性ＥＢＰブロックのための遺伝子配列に分類され得る。前記表２で、アミノ酸配列番号２０〜２７は、親水性に分類され得、Ｐｈｅ、Ｈｉｓが入ったアミノ酸配列番号２８〜３６は、疎水性ＥＢＰブロックに分類され得る。特に、前記表２で、配列番号２２、２３は、正電荷を帯びた親水性ＥＢＰブロックに分類され、配列番号２４〜２７は、負電荷を帯びた親水性ＥＢＰブロックに分類される。すなわち、前述したように、ＥＢＰのＬＣＳＴが体温より低い場合、疎水性を帯び、ＥＢＰのＬＣＳＴが体温より高い場合、親水性を帯びる。ＥＢＰが有するこのような性質によって、ＥＢＰの親水性と疎水性の性質は、生体工学的に応用するときには、相対的に定義できる。
【００９５】
温度とｐＨを含む固有な刺激反応性を有するように、ペンタペプチド繰り返し単位であるＶａｌ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はＡｌａ）−Ｘａａ−Ｇｌｙ［ここで、Ｘａａは、Ｐｒｏを除いた任意のアミノ酸であることができる］を有する互いに異なるＥＢＰをＤＮＡレベルで設計した。Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙであるペンタペプチド繰り返しを有する可塑性のＥＢＰＰ（ＥＢＰ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＰ）及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙであるペンタペプチド繰り返しを有する弾性のＥＢＰＥ（ＥＢＰ  ｗｉｔｈ  ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ＥＢＰＥ）の両方を、同一のゲスト残基組成と比率を有するように複製した。前記表１及び表２は、それぞれペンタペプチド繰り返し単位を有する互いに異なるＥＢＰの遺伝子及びアミノ酸配列を示す。例えば、ＥＢＰＥ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２とＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２は、ほぼ同一のモル質量（ｍｏｌａｒ  ｍａｓｓ）だけでなく、ＥＢＰペンタペプチド繰り返し単位の４番目残基が同一の組合を示す。また、ペンタペプチド繰り返し単位の互いに異なる３番目アミノ酸残基（Ａｌａ又はＧｌｙ）によって互いに異なる機械的特性を有する。正電荷及び負電荷を有するＥＢＰｓは、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及びＨｉｓのような電荷を帯びたアミノ酸をゲスト残基に導入することによって製作された。
【００９６】
多様なＥＢＰｓをエンコーディング（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）するオリゴヌクレオチドドルのそれぞれの対の場合、二つのオリゴヌクレオチド（それぞれ２μＭの濃度に合わせた）のそれぞれ５０μＬをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝剤で、９５℃で２分間加熱し、その後、前記反応溶液を常温で３時間にわたってゆっくり冷却することによってアーニリングした。３７℃で３０分間１５ＵのＢｓｅＲＩと１０ＵのＦａｓｔＡＰ感熱アルカリフォスファターゼで総４μｇの変形されたｍｐＥＴ−２１ａ複製ベクターを消化及び脱リン酸化した。制限プラスミドＤＮＡをＰＣＲ精製キットを使用して精製した後、４０μＬの蒸留された脱イオン水で溶離した。３０分間１６℃で９０ｐｍｏｌのアーニリングされたｄｓＤＮＡと３０ｐｍｏｌの線形化されたｍｐＥＴ−２１ａ複製ベクターを、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝剤で培養することによって、ｐＥＴ−２１ａベクター内の多数の複製サイトへのＤＮＡインサートの連結反応を実施した。連結反応したプラスミドをＴｏｐ１０の化学的収容細胞に形質転換し、引き続いて、これらを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＳＯＣ板上に塗布した。引き続いて、ＤＮＡシーケンシングによりＤＮＡ配列を確認した。すべてのＥＢＰ単位体遺伝子を構築した後、次のように、３６個の繰り返し遺伝子を含有する対応ベクター内への同一の３６個の繰り返しインサートを連結反応化することによって、各ＥＢＰ遺伝子を合成した。ＥＢＰライブラリのための複製手続及びこれらの融合が図１に概略的に示されている。単位体ＥＢＰの遺伝子のコピーを含有するベクターを、３０分間３７℃でＣｕｔｓｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＸｂａＩ、１５ＵのＢｓｅＲＩ、及び１０ＵのＦａｓｔＡＰ感熱アルカリフォスファターゼで消化及び脱リン酸化した。制限されたプラスミドＤＮＡをＰＣＲ精製キットを使用して精製した後、４０μＬの蒸留された脱イオン水で溶離した。インサートパートを製造するように、３０分間３７℃で総４μｇのＥＢＰモノマー遺伝子をＣｕｔｓｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＸｂａＩと１５ＵのＡｃｕＩで消化した。消化後に、アガロースゲルを利用した電気泳動により反応産物を分離し、ゲル抽出キットを使用してインサートを精製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝剤で３０分間１６℃で１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを有する３０ｐｍｏｌの線形化されたベクターとともに、９０ｐｍｏｌの精製されたインサートを培養することによって、連結反応を実施した。産物をＴｏｐ１０の化学的収容細胞で形質転換し、引き続いて、これらを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＳＯＣプレート上に塗抹された。形質転換体は、アガロースゲルで診断制限ダイジェストにより初期に選別され、前述したように、ＤＮＡシーケンシングにより追加確認された。
【００９７】
前述したように、設計されたプラスミドベクターとともに、三つの互いに異なる制限エンドヌクレアーゼを使用して互いに異なるＤＮＡサイズのＥＢＰ遺伝子ライブラリを合成した。図１は、ＲＤＬ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法を示し、この方法を利用してＥＢＰモノマー遺伝子が連結されてオリゴマー化されたＥＢＰ遺伝子を形成する。例えば、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２に対する遺伝子は、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］６のためのプラスミド系遺伝子ベクターとインサート間の連結反応により構築された：ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］６に対するプラスミド系遺伝子（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ  ｇｅｎｅ）のインサートは、ＸｂａＩとＡｃｕＩによる二重消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）により製造された。一方、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］６に対するプラスミド系遺伝子ベクターは、ＸｂａＩとＢｓｅＲＩによる二重消化とアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化により製造された。二つの互いに異なる二重制限酵素を利用するこのＲＤＬ方法は、様々な長所を有する。第一に、インサート及びベクターの両方の突出部の互いに異なる形状によって、制限ベクターの自己連結反応が発生せず、これらは、頭−しっぽ配向で効率的に連結された。第二に、これは、類型III制限エンドヌクレアーゼのメカニズムに起因して、各ブロック間のリンカーをエンコーディングするのに追加ＤＮＡ配列を有しない。各ＥＢＰ遺伝子をオリゴマー化し、３６、７２、１０８、１４４、１８０、及び２１６ＥＢＰペンタペプチド繰り返しを生成した。二つの制限エンドヌクレアーゼであるＸｂａＩとＢａｍＨＩを使用して、５４０、１０８０、１６２０、２１６０、２７００、及び３２４０塩基対（ｂｐｓ）を有するオリゴマー化された遺伝子サイズを確認した。アガロースゲル電気泳動により特徴化されるもののように、図２は、両末端レーン上のＤＮＡサイズマーカーとともに、ＥＢＰライブラリの制限されたＤＮＡ帯域を示す。例えば、図２（Ａ）のＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅをゲスト残基にして１：４：１の比で含有するオリゴマー化されたペンタペプチド配列をエンコーディングする制限ＤＮＡ帯域を明確に示す。制限ＤＮＡ帯域すべては、分子サイズマーカーと比べて、該当する長さで図示されている。
【００９８】
ＥＢＰ遺伝子とこれらのブロックコポリペプチドを、Ｔ７プローモーターを有するＥ．ｃｏｌｉで過発現し、ＩＴＣ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｉｎｇ）の多数のサイクルにより精製した。図３は、精製されたＥＢＰの銅染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示す。ＥＢＰは、理論的に算出された分子量より少なくとも２０％大きく移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の両側レーンは、標準タンパク質サイズマーカー（底から上部に７、１５、２４、３５、４０、５０、６５、９０、１１０、１５０ｋＤａ）を含有する。図３（Ａ）と図３（Ｂ）のＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］とＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］は、理論的分子量より大きい分子量を有する一連の対応タンパク質を示す（ＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］は、左から右に１４．０、２７．７、４１．３、５５．０、６８．６ｋＤａ）。一般的に、図３（Ｃ）と図３（Ｄ）のＥＢＰＥ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］とＥＢＰＰ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］を含む正に帯電されたＥＢＰライブラリは、ＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］とＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］の非極性ＥＢＰライブラリより大きい分子量で移動した。さらに、図３（Ｅ）と図３（Ｆ）のＥＢＰＥ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］とＥＢＰＰ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］の負に帯電されたＥＢＰライブラリは、相異に帯電された特徴を有するため、正に帯電されたＥＢＰライブラリより大きい分子量を示す。
【００９９】
ＥＢＰライブラリの特徴を分析した。図４は、１℃／分の加熱速度で３５０ｎｍにおいての光学吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ３５０）を測定することによって、ＥＢＰの熱的転移挙動を示す。逆転移温度（Ｔｔ）は、温度に対する関数である混濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）の第１微分値（ｄ（ＯＤ３５０）／ｄＴ）が最大であった温度として定義される。塩濃度とｐＨ等の環境的条件とＥＢＰペンタペプチド繰り返し単位の互いに異なる３番目及び４番目アミノ酸によって、ＥＢＰのＴｔをＰＢＳで微細制御し、ＰＢＳには、１〜３ＭのＮａＣｌを補充した。例えば、ＥＢＰペンタペプチド繰り返しの３番目アミノ酸においてのＧｌｙを有するＥＢＰＥ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２（図４（Ａ））は、ＥＢＰペンタペプチド繰り返しの３番目アミノ酸においてのＧｌｙがＡｌａより高い親水性を有するため、１ＭのＮａＣｌを有するＰＢＳでＥＢＰペンタペプチド繰り返しの３番目アミノ酸でＡｌａを有するＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２（図４（Ｂ））より高い約１５℃を示す。一般的に、帯電されたＥＢＰライブラリは、帯電された残基をＥＢＰペンタペプチド繰り返しの４番目アミノ酸に導入するため、非極性ＥＢＰライブラリより高いＴｔを有するものと現われる。ＥＢＰＰ［Ｄ１Ｇ４Ｉ１］（図４（Ｅ））の負電荷に帯電されたＥＢＰライブラリは、ＥＢＰペンタペプチド繰り返しの４番目アミノ酸においてのＡｓｐとＬｙｓの互いに異なるｐＫａ値を有するため、ＥＢＰＥ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］（図４（Ｃ））とＥＢＰＰ［Ｋ１Ｇ４Ｉ１］（図４（Ｄ））の正電荷に帯電されたＥＢＰライブラリより高いＴｔを有する。参照として、図４の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は、親水性を示し、（Ｆ）ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及びＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４は、疎水性を示す。
【０１００】
実施例５：抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロック（ｄｉｂｌｏｃｋ）ブロック（ｃｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）の遺伝子設計
ＶＥＧＦＲ１拮抗剤として作用する抗−Ｆｌｔ１ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドドルの一対は、Ｃｏｓｍｏ  Ｇｅｎｅｔｅｃｈ（韓国、ソウル）で化学的に合成され、ＡｃｕＩ及びＢｓｅＲＩを含む粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄｓ）を有するオリゴヌクレオチドカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）に連結された。抗−Ｆｌｔ１ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドカセットは、シームレス遺伝子クローニングのために、ＢｓｅＲＩ、ＸｂａＩ、ＡｃｕＩ及びＢａｍＨＩにより認識されるどんな部位も有しないように、合理的に設計され、これは、下記表３に示された通りである。
【０１０１】
【表３】
0006600405.tif 000004
【０１０２】
表４は、親水性ＥＢＰブロック又は親水性ＥＢＰブロック−疎水性ＥＢＰブロックのＥＢＰジブロックを有する融合ポリペプチドの配列、遺伝子長さ及び分子量を示す。
【０１０３】
【表４】
0006600405.tif 000005
【０１０４】
ＢｓｅＲＩ、ＸｂａＩ、ＡｃｕＩ及びＢａｍＨＩの認識部位を有するＥＢＰを含むそれぞれのプラスミド、及び前記オリゴヌクレオチドカセットは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックの融合ポリペプチドライブラリのための遺伝子を創出するために使用された。まず、抗−Ｆｌｔ１を暗号化するオリゴヌクレオチドドル対の場合、二つのオリゴヌクレオチド（それぞれ２μＭの濃度に合わせた）のそれぞれ５０μＬを、Ｔ４ＤＮＡ連結酵素緩衝剤において９５℃で２分間加熱し、その後、前記反応溶液を常温で３時間にわたってゆっくり冷却することによって連結された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎを分子的に複製するために、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎを暗号化するプラスミドベクターがＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝剤で１５ＵのＢｓｅＲＩで３７℃で３０分間切断された。前記切断されたプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ精製キットを使用して精製され、その後、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＦａｓｔＡＰ（温度感応性アルカリホスファターゼとして作用する）で３７℃で１時間脱リン酸化された。前記切断され、脱リン酸化されたプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ精製キットを使用して精製され、その後、４０μＬの蒸留及び脱イオン化された水で抽出された。連結（又は結紮、ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、９０ｐｍｏｌの前記精製された挿入部分と３０ｐｍｏｌの前記線形化されたベクターをＴ４ＤＮＡ連結酵素緩衝剤において１ＵのＴ４ＤＮＡ連結酵素で１６℃で３０分間恒温処理することによって行われた。その結果、得られた生成物は、（化学的方法に製作された）Ｔｏｐ１０収容細胞に導入され、次に、ＳＯＣ平板培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補充された）上に前記細胞が塗抹された。形質転換体は、アガロースゲル上で制限酵素により切断された断片を確認する過程を通じて優先的に検証され、次に、前記言及したように、ＤＮＡシーケンシングでさらに検証された。
【０１０５】
同様に、互いに異なる長さの疎水性ＥＢＰブロックを有する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックを暗号化するために、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ｎを暗号化するプラスミドベクターは、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＸｂａＩ及び１５ＵのＢｓｅＲＩで３７℃で３０分間切断された。前記切断されたプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ精製キットを使用して精製され、その後、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＦａｓｔＡＰ（温度感応性アルカリホスファターゼとして作用する）で３７℃で１時間脱リン酸化された。前記切断及び脱リン酸化されたプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ精製キットを使用して精製され、その後、４０μＬの蒸留及び脱イオン化された水で抽出された。４マイクログラムのＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］ｎ遺伝子は、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝剤で１０ＵのＸｂａＩ及び１５ＵのＡｃｕＩで３７℃で３０分間切断された。切断後、前記反応産物は、アガロースゲル電気泳動で分離され、挿入部分は、ゲル抽出キットを使用して精製された。連結は、９０ｐｍｏｌの前記精製された挿入部分と３０ｐｍｏｌの前記線形化されたベクターをＴ４ＤＮＡ連結酵素緩衝剤において１ＵのＴ４ＤＮＡ連結酵素で１６℃で３０分間恒温処理することによって行われた。その結果、得られた生成物は（化学的方法で製作された）Ｔｏｐ１０収容細胞に導入され、次に、ＳＯＣ平板培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補充された）上に前記細胞が塗抹された。形質転換体は、アガロースゲル上で制限酵素により切断された断片を確認する過程を通じて優先的に検証され、次に、ＤＮＡシーケンシングでさらに検証された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックを暗号化するプラスミドベクターは、ＢｓｅＲＩの使用で用意され、連結及び連結による産物に対する確認は、前記言及したように行われた。
【０１０６】
実施例６：ＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックの遺伝子発現及び精製
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、ＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックを含むそれぞれのベクターで形質転換され、その後、５０μｇ／ｍＬアンピシリンで補充されたＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地５０ｍＬに接種された。前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）は、３７℃でひと晩２００ｒｐｍで振とう培養器で行われた。次に、５０ｍＬのＴＢＤＲＹ培養培地は、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５００ｍＬのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培養培地に接種され、３７℃で１６時間２００ｒｐｍで振とう培養器で培養された。光学濃度が６００ｎｍ（ＯＤ６００）で１．０に到逹したとき、ＥＢＰ又はそのブロックポリペプチド遺伝子の過発現は、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加することによって誘導された。前記細胞は、４℃で１０分間４５００ｒｐｍで遠心分離された。前記発現されたＥＢＰｓ及びこれらのブロックポリペプチドは、既存に報告されたように、逆転移循環（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｉｎｇ、ＩＴＣ）で精製された。細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）は、３０ｍＬのＰＢＳ緩衝剤に再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた後、氷の上で超音波分解（ＶＣ−５０５、Ｓｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（米国、デンベリ）機器を使用して２０秒間隔で１０秒間超音波を付加する条件）で細胞を溶解させた。細胞溶解物の不溶性残余物を沈澱させるために、５０ｍＬ遠心分離機チューブに細胞溶解物を収容し、４℃で１５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、可溶性ＥＢＰｓを含む上層液は、新しい５０ｍＬの遠心分離機チューブに移され、核酸汚染物を沈澱させるために、ＰＥＩを０．５％ｗ／ｖになるように入れた後、４℃で１５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。ＥＢＰｓの逆位相転移は、４Ｍの最終濃度で塩化ナトリウムを添加することによって触発され、また、凝集された（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）ＥＢＰｓは、４℃で１５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離することによって、溶解物溶液から分離された。前記凝集されたＥＢＰｓは、冷たいＰＢＳ緩衝剤に再浮遊され、このＥＢＰ溶液は、４℃で１５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離され、他の凝集されたタンパク質汚染物が除去された。このような凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及び再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）過程は、ＥＢＰの純度が約９５％まで到逹するまで５〜１０回繰り返され、ここで、純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定された。
【０１０７】
図５ａ〜図５ｄは、本発明による融合ポリペプチドの分子的設計、クローニング及び抗−血管新生機能を図式的に示す。図５ｃに示したように、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドは、生理的条件下で多価性ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドとともに、温度触発式コア−シェルミセル構造を形成する。
【０１０８】
図５ｄの（ｉ）に示されたように、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰの融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ（特に、ＶＥＧＦＲ１）及び前記抗−Ｆｌｔ１ペプチド間の強い非共有相互作用を通じて治療用ポリペプチドとして作用できる。また、図５ｄの（ｉｉ）に示されたように、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドは、多価性抗−Ｆｌｔ１ペプチドとともにミセルを形成し、これは、ＶＥＧＦＲに対する前記融合ポリペプチドの結合親和力を増加させて、前記融合ポリペプチドの使用で血管新生と関連した疾患に対する治療効率を増進させることができる。抗−Ｆｌｔ１ペプチドの急速な分解を最小化し、抗−Ｆｌｔ１ペプチドを生体内受容体拮抗剤として提示するために、ＥＢＰは、非−クロマトグラフィー（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）精製ポリペプチドタッグ及び安定剤として抗−Ｆｌｔ１ペプチドに導入された。
【０１０９】
ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎ、ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］ｎ又はＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ｎを含む変形されたｐＥＴ−２１ａ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐＥＴ−２１ａ、ｍｐＥＴ−２１ａ）プラスミド（ここで、［ＸｉＹｊＺｋ］ｎの下付き文字ｎは、６、１２、１８、２４、３０又は３６である）は、標準分子生物学方法論を使用してシームレスにクローニングされた。特に、ＥＢＰＰ遺伝子の多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び融合は、異なる分子量を有するＥＢＰＰ及びＥＢＰＰブロック共重合体を暗号化する遺伝子を製作するために、再帰方向結紮（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＲＤＬ）で実行された。図５ａは、一つの遺伝子クローニング方法を示し、前記方法により二つの異なるＥＢＰＰｓに対する遺伝子及び抗−Ｆｌｔ１ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドカセットに対する遺伝子が結合され、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の遺伝子が作成される。ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４を含むｍｐＥＴ−２１ａプラスミドは、ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで二重−切断され、脱リン酸化されて線形化されたベクターになり、一方、ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２を含むｍｐＥＴ−２１ａプラスミドは、ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで二重−切断され、挿入される部位（ｉｎｓｅｒｔ）として用意された。連結を通じてクローニングされたＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４のＥＢＰＰジブロック遺伝子は、ＢｓｅＲＩで切断され、脱リン酸化された後、抗−Ｆｌｔ１ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドカセットと融合され、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４が製作された。同様に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、６、１２、２４及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２、２４に対する遺伝子のシリーズは、クローニングされ、これら融合ポリペプチドは、図１（Ｂ）に示すように、大腸菌でプラスミド由来遺伝子から合成された。
【０１１０】
ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−融合ポリペプチドで、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、６、１２、２４は、生理的条件の下で可溶性であり、ＶＥＧＦに対応してＶＥＧＦＲ拮抗剤として作用し、これにより、血管新生信号が細胞に伝達されることが抑制される（図５ｄの（ａ））。本発明の実施例では、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎが選択されたが、その理由は、すべての長さのＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎは、極性アミノ酸残基なしに身体温度で親水性であり、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、６、１２、２４の４個の異なる長さのＥＢＰＰブロックによるＥＢＰＰ長さ及び抗−Ｆｌｔ１ペプチドの結合親和力間の相関に対する理解を提供するからである。さらに、図５ｃ及び図５ｄの（ｂ）に示されたように、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチド［抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２、２４］は、多価性ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドとともに、温度触発式コア−シェルミセル構造を形成できる。その理由は、生理的条件の下で親水性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２及び疎水性ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２、２４の両親媒特性を有するからであり、このような特性は、ＶＥＧＦＲに対する前記融合ペプチドルの結合親和力を大きく増進させて、高い接着力を有することができるようにする。特に、二つの異なる長さの疎水性ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２、２４は、ミセルサイズの調節に使用され、ＶＥＧＦＲに対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２、２４の結合親和力に対するミセルサイズの効果を研究するのに使用された。
【０１１１】
実施例７：ＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの特性化
ＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＳｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱ（Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｃｏ．，日本国、東京）カラムを使用する高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）１２６０シリーズ機構（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、カリフォルニア、ペルロエルト）とともに、ゲル透過クロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）で決定された。２０℃の脱イオン水は、１ｍｌ／分の流速で溶離液として使用され、ＧＰＣカラムは、２０℃で維持された。５９００から２０００００ｇ／ｍｏｌの範囲内にある低分散ポルランは、基準として使用された。ＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックのシリーズは、屈折率検出器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＲＩＤ）及び２８０ｎｍで可変型吸光度検出器（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＶＷＤ）で分析された。ＰＢＳに２５μＭの濃度である多様なＥＢＰｓ、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの逆位相転移に対する温度の効果は、Ｃａｒｙ  １００  Ｂｉｏ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（マルチセル熱電温度調節器（Ｖａｒｉａｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、カリフォルニア、ワルノックリック）を備える）を利用して１０から８５℃の間で１℃／分の速度でＯＤ３５０を測定することによって決定された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の可溶性単一体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｕｎｉｍｅｒｓ）からミセルへの自己組立挙動は、温度−調節Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（ＺＥＮ３６９０）動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）機構（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、イギリス、ウストショ）により分析された。ＰＢＳで２５μＭでこれらの流体力学的半径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ、ＲＨ）は、１℃／分の加熱速度で１８から５０℃の温度範囲でそれぞれの温度で１１連続で測定された。これらのＴｔは、それぞれのＤＬＳプロット（ｐｌｏｔ）から計算された相転移に対する開始温度として定義される。
【０１１２】
抗−Ｆｌｔ１ペプチド及び互いに異なる長さを有する親水性ＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドに対する遺伝子は、分子的クローニングで製作され、ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで切断されたこれら遺伝子の長さは、図６（Ａ）に示されたように、アガロースゲル電気泳動で確認された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］６、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２又は抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４（左側から右側に３５４、６２４、１１６４又は２２４４ｂｐ）を暗号化する各遺伝子のＤＮＡ長さは、それぞれの遺伝子断片の下に表記される。ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで切断されたＤＮＡ配列は、融合ポリペプチドの遺伝子の外に位置し、これらＤＮＡの長さは、表４においての元々の遺伝子サイズより６６塩基対がさらに長くなる。抗−Ｆｌｔ１ペプチド及びそれぞれ異なる鎖長さを有するＥＢＰブロックで構成される融合ポリペプチドは、前記温度−反応型ＥＢＰｓに対して記述されたように大腸菌で発現され、ＩＴＣで精製された。図６（Ｂ）に示された銅−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％増減率）は、下記の事項を図示する：抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ｎ（下付き文字ｎは、３、６、１２、又は２４）は、ＨＰＬＣで特性化されたように、平均的に５回のＩＴＣにより少なくとも９５％均質性で精製され、それぞれの融合ポリペプチドは、基準タンパク質の移動した距離と比較したとき、表４においての理論的分子量より約２０％さらに移動し、これは、以前研究とよく一致する。融合ポリペプチドの予想分子量は、バンド（ｂａｎｄ）の下に表示（左側から右側に８．１９、１５．２７、２９．４２及び５７．７２ｋＤａ）され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の両端にあるレーンは、移動した基準タンパク質サイズマーカー（下から上に７、１５、２４、３５、４０、５０、６５、９０、１１０、及び１５０ｋＤａ）を示す。
【０１１３】
図７は、ＥＢＰブロックの熱転移挙動、及び抗−Ｆｌｔ１ペプチド及びそれぞれ異なる鎖長さを有するＥＢＰブロックよりなる融合ポリペプチドの熱転移挙動を示しており、これを通じて転移温度（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｔ）に対するＥＢＰブロック長さ、塩化ナトリウム濃度及び抗−Ｆｌｔ１ペプチド融合の効果を調査できる。図７においての混濁度プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅｓ）は、（Ａ−Ｃ）の場合、２５μＭのＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）及び（Ｄ−Ｆ）の場合、２５μＭの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）の吸光度を３５０ｎｍで測定することによって得られたが、この際、１℃／分速度で試料を加熱しながら、（Ａ、Ｄ）は１０ｍＭのＰＢＳで、（Ｂ、Ｅ）は、１Ｍ塩化ナトリウムで補充された１０ｍＭのＰＢＳで、また、（Ｃ、Ｆ）は、２Ｍ塩化ナトリウムで補充された１０ｍＭのＰＢＳで吸光度が測定された。Ｔｔは、図７の各熱プロット（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｌｏｔ）の変曲点として定義され、下記表５に示した。
【０１１４】
【表５】
0006600405.tif 000006
【０１１５】
表５のＴｔ値は、図７においての熱プロファイルの変曲点を測定することによって決定される。ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ブロック長さ及び塩化ナトリウム濃度によって転移温度が変化した。
【０１１６】
一般的に、極性アミノ酸残基がないＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎは、生理的条件の下で３７℃より高いＴｔを有し、その理由は、ＥＢＰＰの繰り返し的ペンタペプチド単位のゲスト残基としてＡｌａ、Ｇｌｙ及びＩｌｅが１：４：１比率で導入されるからである。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎの親水性とともに、これらＶＥＧＦＲ結合−融合ポリペプチドは、生理的条件の下で可溶性であったが、このような特性は、どんな立体障害なしにＶＥＧＦＲに対する特異的結合が可能にする。これにより、本発明の融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦに反対してＶＥＧＦＲ拮抗剤として作用する。さらに、ＥＢＰＰブロック長さ及びイオン強度の機能について熱反応性の調節側面で調査したとき、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのＥＢＰブロック長さ、及びＰＢＳにおいての塩化ナトリウム濃度が増加するほど、これらのＴｔは低くなった。特に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのＴｔは、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのＴｔより極めて低いが、その理由は、ＶＥＧＦＲ標的化のための抗−Ｆｌｔ１ペプチド配列のＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（ＧＮＱＷＦＩ）が疎水性であるからであり、これは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのＴｔを減少させる。例えば、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４のＴｔは、ＰＢＳでＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及びＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４のＴｔよりそれぞれ約１８及び１１℃低かった。ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３と抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３との間のＴｔ差（Ｔｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ＤＴｔ）は、２Ｍ塩化ナトリウムを有するＰＢＳで３６℃以上であり、一方、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３と抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３との間のＤＴｔは、１Ｍ塩化ナトリウムを有するＰＢＳでは、２３℃であった。したがって、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ブロック長さが短くなるほど、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのＴｔは、多様な塩化ナトリウム濃度に関係なく大きく減少し、恐らく、これは、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ブロックの熱転移に対する抗−Ｆｌｔ１ペプチドが有する疎水性の効果がさらに大きく影響を及ぼすからである。
【０１１７】
次に、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドの特性について説明する。「抗−Ｆｌｔ１ペプチド」及び多様な鎖長さの疎水性ＥＢＰブロックを有する、親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの「両親媒性ＥＢＰジブロック」で構成される融合ポリペプチドを暗号化する二つの異なる遺伝子は、シームレス分子的クローニング方法でＲＤＬを使用して製作され、ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで切断されたこれらの遺伝子の全体長さは、図８（Ａ）に示されたように、アガロースゲル電気泳動で確認された。（ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２又は（ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４（左側から右側に２２４４及び３３２４ｂｐ）を暗号化する各遺伝子のＤＮＡ長さは、各遺伝子断片の下に表記する。ＸｂａＩ及びＢｓｅＲＩで切断されたＤＮＡ配列は、前記融合ポリペプチドを暗号化する遺伝子の外に位置するため、これらＤＮＡの長さは、表４で要約されたように、融合ポリペプチドの元々の遺伝子サイズより６６塩基対が長くなる。（ａ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び（ｂ）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４を含む二つの異なる抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドは、大腸菌で発現され、非−クロマトグラフィー精製方法のうち一つであるＩＴＣにより精製され、これは、温度−反応型抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎのシリーズの精製に対して前記言及された。図８（Ｂ）においての銅−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％増減率）のイメージは、下記の事項を示す：抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の両方とも平均的に５回のＩＴＣによりそれぞれ一つの主要ポリペプチドバンドを有するように精製され、これらバンドは、基準タンパク質の移動した距離と比較するとき、表４においての理論的分子量より約２０％さらに移動した。追加的に、前記ポリペプチドは、ＨＰＬＣで特性化されたように、平均的に５回のＩＴＣを実行した後、少なくとも９５％均質性を有する。前記ポリペプチドの予想分子量は、バンドの下に表記され（左側から右側に５９．９及び９０．０ｋＤａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の両端に位置するレーンは、移動した基準タンパク質サイズマーカーを示す（下から上に７、１５、２４、３５、４０、５０、６５、９０、１１０、及び１５０ｋＤａ）。
【０１１８】
図９は、疎水性ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ブロックの長さ及び濃度による抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの熱転移挙動を示す。混濁度プロファイルは、１０ｍＭのＰＢＳで１℃／分の加熱速度で４つの異なる濃度（１２．５、２５、５０及び１００ｍＭ）で吸光度（３５０ｎｍ）を測定することによって得た。前記言及したように、Ｔｔは、図９の各熱プロットの変曲点で測定され、下記表６に示した。
【０１１９】
【表６】
0006600405.tif 000007
【０１２０】
表６のＴｔ値は、図７においての熱プロファイルの変曲点を測定することによって決定される。一次相転移は、疎水性ＥＢＰＰブロックの凝集により発生し、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ３Ｆ２］の長さによって大きく影響を受けた。前記融合ポリペプチドは、同一の極性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２ブロックを有する。二次相転移は、極性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２ブロックにより影響を受け、これらの融合ポリペプチドは、類似した二次Ｔｔを有する。
抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックの濃度が増加するほど、一次−及び二次Ｔｔが漸進的に低くなった。一般的に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの温度触発式相転移は、二度発生し、その理由は、低いＴｔを有する脂肪族−及び疎水性ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ３Ｆ２］ブロック及び高いＴｔを有する極性−及び親水性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］ブロックのこれら二つの互いに異なる熱特性に起因する。２５ｍＭで抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２の相転移は、３６．２及び８１．２℃で発生し、一方、同一の濃度で抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４の相転移は、２８．０及び７８．０℃で発生したが、これは、二倍になった疎水性ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ３Ｆ２］のブロック長さが大きい影響を及ぼし、一次−及び二次Ｔｔを８．２及び３．２℃低くしたことを示す。特に、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）として抗−Ｆｌｔ１融合がないＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及びＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４のジブロックポリペプチドは、図９（Ａ）に示されたように、これ以上の位相転移なしにただ３９．０及び２９．１℃の一次Ｔｔを示した。他方では、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドは、抗−Ｆｌｔ１がないジブロックポリペプチドの位相転移挙動と対照的に低くなった一次−及び二次Ｔｔを明確に示したが、これは、ジブロックポリペプチドの親水性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］ブロックとともに、疎水性抗−Ｆｌｔ１ペプチド（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（ＧＮＱＷＦＩ））の融合は、ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］の一次Ｔｔ及び親水性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］ブロックの二次Ｔｔを大きく減少させるからであり、このような減少は、二つのブロックの隣接に起因する。さらに、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドにおいて正確に１：１及び１：２の比率で調節されたブロック長さを有するＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ３Ｆ２］及びＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］は、これらの一次Ｔｔの直上に（ｒｉｇｈｔ  ａｂｏｖｅ）固有の準安定ミセル相（ｐｈａｓｅ）を作り、これは、前記熱−触発式両親媒性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドが準安定ミセルに自己組立されたことを示し、この際、一次Ｔｔから二次Ｔｔに至る温度範囲で準安定ミセルは、安定したミセルに継続的に発達される。これは、既存に報告された他のＥＢＰ基盤ジブロック共重合体基盤ミセルのように、抗−Ｆｌｔ１と融合されないＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及びＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４のジブロックポリペプチドの自己組立挙動とよく一致する。
抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの固有な熱転移と符合するように、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４が可溶性単一体からミセルに自己組立される挙動は、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）で特性化された。ＰＢＳで２５μＭで存在するこれらの流体力学的半径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ、ＲＨ）は、１℃／分の加熱速度で１８から５０℃の温度内の各温度で１１連続で測定された。これらのＴｔは、相転移に対する開始温度として定義され、図１０の各ＤＬＳプロットから計算され、下記表７に示した。
【０１２１】
【表７】
0006600405.tif 000008
【０１２２】
表７を見ると、融合ポリペプチドの一次凝集は、ミセルの形成によりこれらの流体力学的半径を増加させた。
【０１２３】
抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２に対しては、３６℃の一次Ｔｔ以下で、また、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４に対しては、２７℃の一次Ｔｔ以下で可溶性単一体形態であり、ＰＢＳに２５μＭで存在するこれらの流体力学的半径（ＲＨ）は、約１０ｎｍであった。一次Ｔｔ以上に温度が増加するにつれて、これらのＲＨは、一次Ｔｔを少し超過する温度で１６０ｎｍ及び２４０ｎｍの範囲で瞬間的に増加し、その後、２８．４ｎｍ及び４３．６ｎｍまで減少した。両親媒性基盤自己組立の非平衡化された熱力学及び互いに異なる親水性−対−疎水性ブロックの長さ比率によって抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドが準安定ミセルを形成し、その後、これらは、甚だしくは５０℃でも一定のＲＨを有する安定したミセルを示したが、これは、これらの自己結合が平衡状態に到逹したからである。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４ミセルのＲＨは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２のミセルより１５．２ｎｍさらに大きかったが、これは、二倍になったＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ブロック長さ及びこれらのミセル構造の中心部にあるＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］ブロックのさらに大きい集合ドメインによる。さらに、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの臨界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＣＭＣ）を決定するために、０．１〜２５ｍＭの範囲の多様な濃度でこれらミセルサイズは、Ｔｔより低い２０℃及びＴｔより高い３７℃で測定された。３７℃、０．５ｍＭの環境条件の下で、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２は、〜１２５ｎｍのＲＨを有する準安定ミセルを相変らず形成し、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４は、〜４４ｎｍのＲＨを有する安定したミセルを形成した。しかし、３７℃、０．１ｍＭでは、二つの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドは、ミセルを形成しなかったが、これは、０．１ｍＭ濃度は、これらのＣＭＣｓより低いことと、これらは、０．１〜０．５ｍＭの範囲にあることを示す。したがって、親水性ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］及び疎水性ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］の両親媒性に起因して抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドは、生理的条件の下でＦｌｔ１標的化のために多価性抗−Ｆｌｔ１ペプチドとともに温度触発式コア−コロナ（ｃｏｒｏｎａ）ミセル構造を形成する。特に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドで疎水性ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］のそれぞれ異なるブロック長さは、ミセルサイズを細密に調節し、これは、Ｆｌｔ１に対するこれらの結合親和力に影響を及ぼし、高い接着力を有するようにする。
【０１２４】
実施例８：Ｆｌｔ１に対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロックの特異的結合測定
Ｆｌｔ１に対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：１、２、４、及び８）及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドの特異的結合は、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）により測定された。まず、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で二硫化−連結されたホモ二量体状態で存在する組み換えヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｒｈＶＥＧＦ１６５）（Ｍ．Ｗ．３８．４ｋＤａ）の５０μＬを４℃でひと晩９６孔平板（９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に恒温処理し、前記平板をコーティングした。前記ｒｈＶＥＧＦ１６５でコーティングされた孔（ｗｅｌｌｓ）は、コーティングされないｒｈＶＥＧＦ１６５を完全に除去するために、ツイン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を０．０５％含有するＰＢＳで洗浄され、各孔のコーティングされない表面をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、ＢＳＡを３ｗｔ．％含有するＰＢＳで常温で２時間恒温処理され、また、非結合ＢＳＡの除去のために、ツイン−２０を０．０５％含有するＰＢＳで洗浄された。二番目に、抗−Ｆｌｔ１ペプチドとＦｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）間の特異的結合力を付与するために、０．５μｇ／ｍｌ濃度で二硫化−連結されたホモ二量体で存在する組み換えヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質（Ｍ．Ｗ．２００．０ｋＤａ）は、１ｗｔ．％ＢＳＡを含有するＰＢＳで（１）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：１、２、４、及び８）で前恒温処理（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）されるか、又は（２）異なる長さの疎水性ブロックを有する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチド（抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４）で前恒温処理され（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄ）、この際、前恒温処理は、０．５−５００μＭ内の異なる濃度で２時間常温で実施された。その後、ｒｈＶＥＧＦ１６５でコーティングされた孔（ｗｅｌｌｓ）に前記混合溶液を添加し、常温で追加に２時間恒温処理した。前記ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及び異なる長さの疎水性ブロック（同一の濃度を有する）を有するＥＢＰジブロックコポリペプチド（ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４）は、基準として使用された。それぞれの孔は、０．０５％ツイン−２０で補充されたＰＢＳで洗浄され、前記孔の表面でｒｈＶＥＧＦ１６５と結合しないＦｌｔ１−Ｆｃタンパク質が除去された。ｒｈＶＥＧＦ１６５でコーティングされた孔に特異的に結合するヒトＦｌｔ１−Ｆｃタンパク質の結合可否は、ウサギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）結合体を二次抗体として使用して、タンパク質−抗体結合時に発生する酸化された色素気質の吸光度を４５０ｎｍで測定することによって確認された。抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰが希釈されたＰＢＳ（０．３ｗ％ＢＳＡ含有）を各���に添加して常温で１時間恒温処理し、その後、０．０５％ツイン−２０を含むＰＢＳで８回洗浄された。３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）が各孔に添加され、ＶＥＧＦに対するＦｌｔ１−Ｆｃタンパク質の特異的結合程度が間接的に測定され、これは、Ｆｌｔ１−Ｆｃタンパク質と抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰタンパク質間の特異的相互作用とそれによるＨＲＰにより触媒されるＴＭＢの酸化程度を測定することによって決定された。酸化されたＴＭＢの色相強度は、４５０ｎｍで測定された。それぞれのＥＬＩＳＡ実験は、再現性のために３回行われた。
【０１２５】
ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰの融合ポリペプチドの特異的結合特性について説明する。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）融合ポリペプチドの特異的結合は、図１１に示されたように、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で特性化された。二硫化−連結されたホモ二量体で存在する３８．４ｋＤａの組み換えヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質は、ウェルの上に先にコーティングされ、次に、前記孔は、牛血清アルブミン（ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）された。二硫化−連結されたホモ二量体で存在する２００．０ｋＤａの組み換えヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質は、０．５−５００μＭ内の異なる濃度で抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：１、２、４、及び８）とともに、恒温処理され、これら二つ間の特異的結合を誘導し、次に、前記混合溶液をＶＥＧＦでコーティングされた孔に添加した後、常温で２時間恒温処理した。ＶＥＧＦでコーティングされた孔に特異的に結合したヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質は、二次抗体としてウサギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合体の結合と、これにより発生する酸化された色素基質の吸光度を４５０ｎｍで測定することによって検出された。他の様々な濃度とは関係なく、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２がＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質及びＶＥＧＦ間の特異的結合を大きく阻害しなかった。前記特異的結合に対してＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２が最小限に阻害することとは相反するように、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎコポリペプチドは、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］ブロック長さと関係なく、投与量に依存する方式でＦｌｔ１−ＦｃとＶＥＧＦ間の結合を非常に抑制した。このような結果は、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎは、ヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質に高い特異的結合力を有することを明白に示し、これにより、ヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質がＶＥＧＦに結合することを妨害する。特に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、５００μＭで約７５％の最大阻害効果を示し、一方、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］２４は、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２より低い阻害効果を示したが、これは、長くなったＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］鎖長さの立体障害によって現われる結果であろう。たとえ異なる鎖長さを有する親水性ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎブロックがＶＥＧＦＲ１特異的拮抗剤として作用する抗−Ｆｌｔ１ペプチドに導入されたが、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎコポリペプチドは、Ｆｌｔ１結合に対する抗−Ｆｌｔ１ペプチドの高い特異性を維持したが、これは、ＥＢＰｓの不活性特徴のためである。抗−Ｆｌｔ１ペプチド−ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ、ＨＡ）結合体のような従来のペプチド−重合体結合体とは相反するように、前記抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎコポリペプチドは、遺伝子次元で製作され、抗−Ｆｌｔ１ペプチドの単分散分子量及び増加し���安定性を付与し、このような特性は、ＰＥＧのような作用をするＥＢＰｓの不活性特性に起因するものである。そして、このような単分散分子量及び安定性は、生体内で抗−Ｆｌｔ１ペプチドの半減期を増進させる。
【０１２６】
次に、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドの結合特性について説明する。ヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質に対する可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎの特異的結合とともに、異なる長さの疎水性ブロックを有する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックブロック（抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２及び抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４）は、生理的条件の下で多価性抗−Ｆｌｔ１ペプチドとともに、温度触発式コア−シェルミセル構造を形成できる。また、形成された自己組立ミセルの外表面のシェル（ｓｈｅｌｌ）に位置する多価性抗−Ｆｌｔ１により接着力が増加し、これにより、ヒトＦｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）に対する前記ユングアブポリペプチドの結合親和力を増加させる。図１２で、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）により測定されたように、抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドの濃度が増加するほど、Ｆｌｔ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦ間の特異的結合が融合ポリペプチドにより非常に抑制されたが、これは、可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎの実施例の結果とよく一致する。Ｆｌｔ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦ間の特異的結合に対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチドの抑制程度とは異なって、準安定状態で〜１２５ｎｍのＲＨを有する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２ミセルは、Ｆｌｔ１−Ｆｃｃ及びＶＥＧＦ間の特異的結合に対して非常に増加した抑制（〜９５％）を示し、これは、ミセル相の抗−Ｆｌｔ１標的化ペプチドの空間的多価性ディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）に依存する。他方では、安定した状態で〜４４ｎｍのＲＨを有する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］２４ミセルは、可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎブロックにおいての抑制程度と比較したとき、類似の抑制程度を示した。たとえ、二つの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロックコポリペプチドがいずれも生理的条件の下で３７℃、０．５μＭで５００ｍＭの濃度範囲内でミセルを形成するが、これらのミセルの安定性に基盤してＦｌｔ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦ間の特異的結合に対して大きく異なる抑制程度を示したが、これは、恐らく、ミセルナノ構造の多価性抗−Ｆｌｔ１ペプチドのＦｌｔ１−Ｆｃとの互いに異なる結合力及び調節された空間的ディスプレイのためである。重要なことは、２５０μＭで抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２ミセルは、５００μＭで抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチドよりさらに大きい抑制効果を有するが、これは、少ない量の抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ｅ１Ｇ４Ｉ１］１２−ＥＢＰＰ［Ｇ１Ａ３Ｆ２］１２が抗−血管新生に対して生体内ヒトＦｌｔ１タンパク質に高い結合親和力を有することを提示する。
【０１２７】
実施例９：抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を利用したＨＵＶＥＣｓの生体外の管形成分析
可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を利用したＨＵＶＥＣｓの生体外の管形成分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｕｂｉｎｇ  ａｓｓａｙ）は、内皮細胞の増殖、移動及び管形成（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に対する可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２コポリペプチドの効果を評価するために実施された。コーティングのために、８．７ｍｇ／ｍｌのマトリゲル２００μＬを４８孔（ｗｅｌｌ）平板培地に３７℃で１時間恒温処理し、固めた。ＨＵＶＥＣｓを蛍光で付着するために、１０μＭのカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）−ＡＭで３７℃で１５分間恒温処理した後、ＰＢＳで数回洗浄した。２×１０４細胞／孔（ｗｅｌｌ）のカルセイン−付着されたＨＵＶＥＣｓは、マトリゲルでコーティングされた孔（ｗｅｌｌｓ）で培養され、５０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトｒｈＶＥＧＦ１６５及びそれぞれ異なる濃度の（Ｆｌｔ１特異的拮抗剤として）抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で３７℃で４時間恒温処理され、内皮細胞の増殖、移動及び管形成がどのように刺激されるか測定された。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２がどれほどＨＵＶＥＣｓの管形成を抑制できるかを明白に示すために、同一の濃度のＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２が基準に評価された。追加に、Ｆｌｔ１特異的拮抗剤として抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の治療効率を基礎とする抗−血管新生の治療効率を比較するために、ＶＥＧＦに対する組み換え人間単一クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）であるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）が他の基準として使用された。ＨＵＶＥＣｓの管形成は、Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本国、東京）でイメージを獲得した後、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、カリフォルニア、エルクルレス）を使用して孔（ｗｅｌｌ）当たり三つの無作為領域で全体管長さを測定することによって定量化されたが、この際、ＰＢＳで４時間恒温処理されたときに移動したＨＵＶＥＣｓの管形成に基づいて測定された。これらの管形成は、三回繰り返された。
【０１２８】
図１１に示されたように、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）結果を通じて抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ（ｎ：整数）融合ポリペプチドがヒトＦｌｔ１−Ｆｃキメラタンパク質と高い特異的結合力を有することを確認した。２９．４ｋＤａの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、異なる長さのＥＢＰ鎖を有する可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチドと比較するとき、最高値の抑制程度を示すことを確認した。したがって、内皮細胞の増殖、移動及び管形成に対する可溶性抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２融合ポリペプチドの効果が生体外ＨＵＶＥＣｓで測定された。カルセイン−付着されたＨＵＶＥＣｓ（２×１０４細胞／孔）は、マトリゲルであらかじめコーティングされた４８−孔平板培地に培養され、内皮細胞の増殖、移動及び管形成を刺激するために、５０ｎｇ／ｍｌ濃度の組み換えヒトＶＥＧＦ−１６５（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ−１６５、ｒｈＶＥＧＦ１６５）で恒温処理され、また、Ｆｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）特異的拮抗剤として作用する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を異なる濃度で処理した後、恒温培養した。同一の濃度のＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を対照群として使用し、どれほど抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２がＨＵＶＥＣｓの管形成を抑制できるかを明白に示すようとした。さらに、抗−血管新生に対する治療効率を比較するために、ＶＥＧＦに対抗する組み換え人間単一クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）であるアバスチン（ベバシズマブとも知られている）を対照群として使用した。アバスチンを使用した理由は、アバスチン及びＶＥＧＦ間の特異的結合に基づいて加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）及び糖尿網膜病症のような多様な新生血管眼疾患を治療するのにアバスチンが広く使用されているからである。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎは、ＨＵＶＥＣ細胞膜でヒトＦｌｔ１タンパク質に特異的な結合を示すので、ＨＵＶＥＣｓの管形成に対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ及びアバスチンの抑制効果は、特異的タンパク質−タンパク質相互作用から由来し、一方、特に、アバスチンは、ｒｈＶＥＧＦ１６５に結合し、管形成に関与するｒｈＶＥＧＦ１６５−触発式細胞信号伝逹及びＨＵＶＥＣｓの新生血管形成を最小化するものと仮定した。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の生体外の管形成分析により特性化されたように、カルセイン−ＡＭで標識されたＨＵＶＥＣｓの蛍光イメージ及びこれらイメージでＨＵＶＥＣｓの標準化された管長さに基づく管形成の抑制程度は、図１３に示された。前記ＨＵＶＥＣｓの管長さは、ＨＵＶＥＣｓの蛍光信号の追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）を通じて測定され、各条件で平均化され、ＰＢＳで４時間培養されて移動したＨＵＶＥＣｓの管長さが基準として使用された。ＨＵＶＥＣｓが４時間ｒｈＶＥＧＦ１６５で処理されたとき、ＨＵＶＥＣｓの管長さは、１００％に設定され、各濃度においての管長さは、標��化された。対照群であるＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で恒温処理されたＨＵＶＥＣｓの管長さは、ｒｈＶＥＧＦ１６５で処理されたＨＵＶＥＣｓの管長さと類似したが、これは、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２がＨＵＶＥＣｓの管形成に相当な効果を有しないことを示す。他方では、Ｆｌｔ１特異的拮抗剤である抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の場合には、０．１〜１０ｍＭ濃度範囲で抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の濃度が増加するほど、ＨＵＶＥＣｓの管長さは漸次的に減少した。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で恒温処理されたとき、減少するＨＵＶＥＣｓの管長さと符合し、蛍光イメージは、ＨＵＶＥＣｓの移動及び管形成の抑制程度が抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の濃度を増加させるほど顕著になることを明確に示す。これは、抗−Ｆｌｔ−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２がＨＵＶＥＣｓの管形成を抑制し、その抑制程度は、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２濃度により大きく調節されることを示す。特に、１０ｍＭの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で恒温処理されたＨＵＶＥＣｓは、甚だしくは、ｒｈＶＥＧＦ１６５があっても、顕著な移動及び管形成を示さないが、これは、アバスチンを０．２ｍｇ／ｍｌで使用した場合と類似な管形成抑制程度を示すものである。したがって、ＥＬＩＳＡで立証されたように、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２融合ポリペプチドは、Ｆｌｔ１に対抗する抗−Ｆｌｔ１ペプチドの高い特異性を相変らず保有している。
【０１２９】
実施例１０：レーザー（ｌａｓｅｒ）−誘発脈絡膜新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）モデルで抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を利用した生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗−新生血管形成（新生血管形成の抑制）
６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ−６マウスにケタミン及びキシラジンそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注射して麻酔させ、５ｍｇ／ｍＬのトロピカミドで瞳孔を拡張させた後、生体内脈絡膜新生血管形成を誘発させるために、５３２ｎｍダイオード（ｄｉｏｄｅ）レーザー（１５０〜２１０ｍＷ、０．１秒、５０〜１００μＭ）がそれぞれの眼底（ｆｕｎｄｕｓ）に適用された。眼球の後極部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｐｏｌｅ）の６、９、１２、及び３時位置は、スリットランプ（ｓｌｉｔ−ｌａｍｐ）伝達システムで複数回のバーン（ｂｕｒｎｓ）が行われた。レーザーを受けるときに生成される気泡は、ブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の破裂を指示し、これは、ＣＮＶモデルを得るのに重要な要素である。生体内レーザー−誘発脈絡膜新生血管形成モデルにおいて抗−新生血管形成に対する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎコポリペプチドの効果を評価するために、ＰＢＳ（運搬体）、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２又は多様な濃度の抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を５日間一日に一回ずつＣＮＶモデルマウスの硝子体内に（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）注入し、１４日後にケタミン及びキシラジンそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注射して麻酔させた。前記マウスに２５ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストランを含む超純水１００ｍＬを眼窩後方（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）方式で注入した。次に、摘出された目は、常温で１０％ホルマリンで３０分間固定された。角膜、虹彩、水晶体、及び硝子体は、立体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ベツルラオ）の下で慎重に除去された。解剖された網膜は、放射性で４回切開され、カバーガラス（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）が使用され、平坦になった。各生体内の抗−新生血管形成実験は、３回繰り返された。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡ及びＨＵＶＥＣ管形成分析法により、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチドがＶＥＧＦＲ１対抗した拮抗剤として抗−血管新生活性を保有していることが証明された。本発明者は、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチドが新生血管眼疾患（特に網膜新生血管疾患、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ））に対する治療活性を示すものと思った。抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の硝子体内への注入でＣ５７ＢＬ−６マウスでＡＭＤに対する動物モデルであるレーザー−誘発脈絡膜新生血管形成（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ、ＣＮＶ）が抑制されるかについて評価した。レーザー損傷後、すぐタンパク質溶液の注入が始まったが、５日間毎日注入された。陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）で運搬体ＰＢＳ又はＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２注入が使用された。ＣＮＶ病変体積は、レーザー損傷後、１４日目に、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＦＩＴＣ）−デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）が撒布された全体脈絡膜フラットマウント（ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔｓ）でイメージ化され、評価された（図１４Ａ）。５日間一日に０．１、１、５及び２０ｍｇの投与量で抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２を処理したとき（全体として０．５、５、２５及び１００ｍｇ）、それぞれ３２％、５２．３％（Ｐ＜０．０５）、５４．４％（Ｐ＜０．０５）、２５．９％までＣＮＶ病変サイズが抑制されたことを定量的分析を通じて分かった。これは、ＰＢＳ対照マウスと比較した分析である（図１４Ｂ）。ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２で処理された動物のＣＮＶ病変サイズは、ＰＢＳで処理された動物の病変サイズと類似していた。ＣＮＶ病変に対するＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の抑制効果は、全体として０．５〜２５ｍｇまでの範囲で投与量に依存的である。しかし、１００ｍｇの抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、ＣＮＶ病変の抑制に対して減少した効果を示し、これは、恐らく、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２の過多な投与量によるものである。
【０１３１】
細胞で生長因子受容体（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＦＲ）に対抗する標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）リガンド（ｌｉｇａｎｄ）の結合親和力は、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のように、細胞成長と関連した多様な疾病に対して重要である。なぜなら、前記結合親和力は、細胞内信号伝達の進行可否を決定するからである。本発明においては、熱−反応型（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）エラスチン基盤ポリペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＥＢＰｓ）及び血管内皮成長因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＥＧＦＲ）ターゲッティングペプチドよりなるＶＥＧＦＲターゲッティング融合（ｆｕｓｉｏｎ）ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）を遺伝的に操作し、発現させ、精製し、また、これらの物理化学的特性を分析した。ＥＢＰｓは、非−クロマトグラフィー（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）精製タッグ（ｔａｇ）及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ＰＥＧ）接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のような安定剤に導入され、生体内でＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドの急速な分解を最小化し、一方、ＶＥＧＦＲ標的化ペプチドは、受容体拮抗剤としてＶＥＧＦＲを標的化して結合するために導入された。
【０１３２】
ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰの融合ポリペプチドは、可溶性単一体（ｕｎｉｍｅｒ）形態を示した。一方、ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド）−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰの融合ポリペプチドは、生理的条件の下で多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ＶＧＦＲ標的化ペプチドを含む温度触発式（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）コア−シェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）ミセル（ｍｉｃｅｌｌａｒ）構造を示した。これは、ＶＥＧＦＲｓに対する前記融合ポリペプチドの結合親和力を大きく増加させ、これは、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で分析された。ＶＥＧＦＲターゲッティングペプチドの空間的ディスプレイ（ｓｐａｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）によって、ＶＥＧＦＲに対する前記融合ポリペプチドの結合親和力が大きく調節された。
【０１３３】
転移温度以下で可溶性単一体形態で存在する抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］３ｎ融合ポリペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ）は、対照群であるＥＢＰブロックと比較するとき、ＣＮＶモデルで高い抗−血管新生効果を示した。追加に、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰジブロック融合ポリペプチド（抗−Ｆｌｔ１ペプチド−親水性ＥＢＰ−疎水性ＥＢＰ）は、生理的条件の下で温度触発式、自己組立多価性ミセルナノ構造体を形成した。これらのミセルナノ構造体の安定性によってＦｌｔ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦ間の特異的結合に対する抑制程度が変わった。ＨＵＶＥＣｓの管形成測定の生体外実験で、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、管形成を大きく減少させ、一方、ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、管形成に大きい影響を及ぼさなかったが、これは、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２及びＨＵＶＥＣ細胞膜上に位置するＦｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）間の特異的相互作用のためである。最後に、マウスのレーザー−誘発ＣＮＶモデルで、抗−Ｆｌｔ１−ＥＢＰＰ［Ａ１Ｇ４Ｉ１］１２は、高い抗−新生血管形成効果を示した。したがって、このような融合ポリペプチド及び抗−Ｆｌｔ１を有するこれらの自己組立多価性ミセルナノ構造体は、網膜、角膜、及び脈絡膜新生血管形成、腫瘍成長、癌転移、糖尿網膜病症、及び喘息の治療のように、抗−血管新生を標的化する治療用ポリペプチドに利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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