(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫治療に対する試験対象の免疫学的反応を予測するための方法であって、
リンパ球を含む１つ以上の固形腫瘍試料から核酸配列を増幅することであって、
前記試料は、前記免疫治療による処置の前および後の１つ以上の時点において前記試験対象から取得されたものであり、
前記核酸配列は、複数の適応免疫受容体（ＡＩＲ）  Ｖ−セグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、複数のＡＩＲ  Ｊ−セグメントオリゴヌクレオチドプライマーまたは１種以上のＡＩＲ  Ｃ−セグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を用いて多重ＰＣＲアッセイで増幅される、
増幅することと；
増幅された核酸配列から核酸配列情報を取得することであって、
それぞれが適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドをコードする複数の一意の再配列された核酸配列についての配列を前記核酸配列情報が含む、
取得することと；
前記試料中の観察される再配列された核酸配列の総数を決定することと、
前記試料中の一意の再配列された核酸配列の総数を決定することと、
前記１つ以上の固形腫瘍試料中の一意の再配列された核酸配列の前記総数に基づいて、前記１つ以上の固形腫瘍試料のＡＩＲ配列多様性スコアを定量することと、
複数の一意の再配列された核酸配列の発生頻度を、前記１つ以上の固形腫瘍試料中の観察される再配列された配列の前記総数のパーセンテージとして計算することにより、前記１つ以上の固形腫瘍試料のＡＩＲ配列分布スコアを定量することと、
前記ＡＩＲ配列多様性スコアと前記ＡＩＲ配列分布スコアとに基づいて前記１つ以上の固形腫瘍試料についての前記試験対象の格付スコアを決定することと；
前記試験対象の前記格付スコアを、前記免疫治療に対する既知の反応を有する対照となる対象に由来する試料から取得された、対照となる対象の格付スコアと比較することと；
前記比較に基づいて前記免疫治療に対する前記試験対象の免疫学的反応を予測することと；
を含み、
前記試験対象の格付けスコアと前記対照となる対象の格付けスコアとの間の差が統計的に有意である場合、前記試験対象は、前記対照となる対象と比較して、免疫治療に対する反応の結果が異なると予測され、前記試験対象の格付けスコアと前記対照となる対象の格付けスコアとの間に統計的有意差がない場合、前記試験対象は、前記対照となる対象と比較して、免疫治療に対する反応の結果が同一であると予測される、
方法。
【請求項２】
前記核酸がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の５０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと；
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の前記統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が所定の閾値以下である場合に、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特徴づけることと、
によって前記試験対象についてのＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の４０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと；
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の前記統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が所定の閾値以下である場合に、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特徴づけることと、
によって前記試験対象についてのＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の３０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと；
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の前記統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が所定の閾値以下である場合に、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特徴づけることと、
によって前記試験対象についてのＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の２０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと；
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の前記統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が所定の閾値以下である場合に、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特徴づけることと、
によって前記試験対象についてのＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の１０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと；
前記試料中の観察される再配列された配列の総数の前記統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が所定の閾値以下である場合に、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特徴づけることと、
によって前記試験対象についてのＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫治療が、
（ｉ）免疫治療抗体、サイトカイン、免疫抑制剤、またはワクチン；
（ｉｉ）免疫系の負の調節因子の阻害剤（任意選択で、（ａ）前記負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、およびＰＤ−１からなる群より選択されるか、あるいは（ｂ）前記阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、または、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群より選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である）；または
（ｉｉｉ）免疫反応の増強物質を標的とする薬剤（任意選択で、前記免疫反応の増強物質は、４１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４およびＣＤ４０から選択される）；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫治療の後に前記試験対象から得られた試料中の少なくとも１つのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンのクローン性増殖の存在を判定することをさらに含み、
前記少なくとも１つのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンは、前記試料中の残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組の平均発生頻度と統計的に有意に異なる発生頻度を有し、かつ、前記免疫治療よりも前に前記試験対象から得られた試料では残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組の平均発生頻度と統計的に有意に異なる発生頻度を有さなかったものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組が、それぞれ前記試料中の全クローンの上位５０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組が、それぞれ前記試料中の全クローンの上位４０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組が、それぞれ前記試料中の全クローンの上位３０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組が、それぞれ前記試料中の全クローンの上位２０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記残りのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの組が、それぞれ前記試料中の全クローンの上位１０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンの前記クローン性増殖は、前記免疫治療に対する前記試験対象の不良な反応を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験対象の格付スコアを決定することが、前記試料のうちの１つにおいて、前記１つ以上の試料中の他の一意の再配列された配列により設定される閾値発生頻度と比較して統計的に有意に、より高い発生頻度を有する一意の再配列された配列の組を選択することによって前記１つ以上の試料のＡＩＲ配列分布スコアを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的反応の予測に基づいて前記試験対象を免疫治療に対する非反応者または反応者として分類することと；
免疫治療に反応する相対的可能性に従って試験対象の患者集団を階層化することと；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）前記試験対象の格付スコアを決定することが、エントロピーモデルおよび未発見種モデルからなる群より選択される数学モデルに基づいて、前記試料の１つから前記核酸配列を配列決定することにより前記試験対象の全ＡＩＲレパートリー多様性を外挿することと、前記全ＡＩＲレパートリー多様性から前記試験対象の格付けスコアを決定することと、を含むか、または
（ｉｉ）前記試験対象の格付スコアを決定することが、ＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含み、前記ＡＩＲ配列分布スコアを定量することが、前記１つ以上の試料からの前記核酸配列情報を用いてシャノンエントロピーを算出することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドが哺乳動物ＡＩＲポリペプチドであり、Ｔ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲＧ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲＢ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ（ＴＣＲＤ）ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）ポリペプチド、および免疫グロブリン軽鎖（ＩＧＬ）ポリペプチドから選択される（任意選択で、（ｉ）前記ＩＧＨポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＡポリペプチド、ＩｇＧポリペプチド、ＩｇＤポリペプチドおよびＩｇＥポリペプチドから選択される；（ｉｉ）前記ＩＧＬポリペプチドは、ＩＧＬ−ラムダポリペプチドおよびＩＧＬ−カッパポリペプチドから選択される；または（ｉｉｉ）前記哺乳動物ＡＩＲポリペプチドは、ヒトＡＩＲポリペプチド、非ヒト霊長類ＡＩＲポリペプチド、げっ歯類ＡＩＲポリペプチド、イヌＡＩＲポリペプチド、ネコＡＩＲポリペプチドおよび有蹄動物ＡＩＲポリペプチドから選択される）、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験対象は、悪性状態を有するか、有する疑いのある対象であり、
任意選択で（ｉ）前記悪性状態は血液悪性腫瘍、黒色腫、肉腫およびがん腫から選択される；または（ｉｉ）前記悪性状態は悪性黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんから選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸配列情報が、増幅された核酸配列を配列決定することにより取得される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全開示が全ての目的において本明細書に組み込まれる、２０１２年１０月１日に出願された米国仮出願第６１／７０８，５３４号の利益を主張する。
政府権益に関する記述
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所の国立心臓、血液および肺研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により与えられた助成金番号ＲＨＬ１０６８６８Ａのもと、政府の援助を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、概して、特定の再配列されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または免疫グロブリン（ＩＧもしくはＩｇ）コード遺伝子配列を有する適応免疫細胞の多様性および発生頻度（例えば、クローン性増殖）の極めて高感度のハイスループットＤＮＡ配列ベース定量による、患者の適応免疫系の免疫能力の評価に関する。患者または患者集団の免疫学的状態に関する情報を使用して、例えば、個人を特性決定する、または、免疫反応を組み込む能力もしくは免疫治療に反応する可能性もしくは前記治療に対する反応における免疫媒介副作用を発生する可能性に関して、患者集団を階層化する、または別様に、臨床的免疫治療管理の経過の情報を与える。
関連技術の説明
【０００４】
適応免疫系は、リンパ系の造血細胞により発現され、また宿主における非自己分子から自己分子を区別することができる抗原特異的認識タンパク質である、適応免疫受容体を使用して、外来物質に起因し得る感染および他の病理学的イベントから高等動物を保護する。これらのリンパ球は、宿主の循環および組織中に見出すことができ、リンパ節高内皮細静脈からの、ならびに感染、炎症、組織損傷および他の臨床的傷害部位における溢出を含む、血液とリンパ管との間の再循環が説明されている。（例えば、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１６：１−１２、ＤｅＮｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：８７−１０９、Ｍａｒｅｌｌｉ−Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３０：１５８、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ４１８：１３、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２１５、Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３４：１０７、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｓｃｈｏｌ．Ｅｄ．）１：１３を参照されたい。）
【０００５】
したがって、宿主生物全体にわたるリンパ球による移動の動的性質は、宿主免疫状態の変化の関数としての、組織の間のリンパ球の質的な（例えば、クローン発現適応免疫受容体（免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体）、Ｔ細胞対Ｂ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞対Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞、エフェクターＴ細胞対記憶Ｔ細胞の抗原特異性等）、および量的な分布の変化に反映される。
【０００６】
適応免疫系は、多くの潜在的病原体を認識するための十分な多様性を有するＴ細胞およびＢ細胞抗原受容体のレパートリーを生成するために、いくつかの戦略を使用する。Ｂリンパ球は、成熟して、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドのヘテロ二量体として生じる抗体（免疫グロブリン、Ｉｇ）を発現し、一方Ｔリンパ球は、ヘテロ二量体Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。様々ながんまたは感染性微生物に関連した多くの抗原を認識するＴ細胞の能力は、α（アルファ）鎖およびβ（ベータ）鎖、またはγ（ガンマ）およびδ（デルタ）鎖を含むヘテロ二量体である、そのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの驚異的な多様性を生成するための独特の機構を使用するＤＮＡによりコードされる。このマルチサブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体に関連し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩタンパク質により提示されるペプチドに結合する。ＡＰＣ上の抗原ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点での免疫学的シナプスにおいて生じるＴ細胞活性化の中心的イベントである。
【０００７】
各ＴＣＲペプチドは、可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含有する。αβＴ細胞の配列多様性は、概して、αおよびβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列により決定され、この多様性は、それぞれ、β鎖遺伝子座における可変（Ｖβ）、多様性（Ｄβ）、および連結（Ｊβ）遺伝子断片の間、ならびにα鎖遺伝子座における類似ＶαおよびＪα遺伝子断片の間の組み換えの結果である。ＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子座における複数のそのような遺伝子断片の存在は、多数の異なるＣＤＲ３配列がコードされるのを可能にする。ＣＤＲ３配列多様性はＴＣＲ遺伝子再配列のプロセス中の、Ｖβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ、およびＶα−Ｊα連結点におけるヌクレオチドの欠失およびテンプレート依存的付加により、さらに増加される。この点で、免疫能力は、ＴＣＲの多様性に反映される。
【０００８】
γδＴＣＲは、自然免疫系と密接に相互作用する受容体をコードするという点で、αβＴＣＲから区別される。ＴＣＲγδは、発達の早期に発現され、特殊な解剖学的分布を有し、独特の病原体および小分子特異性を有し、また広範な自然および適応細胞間相互作用を有する。ＴＣＲγδ細胞の制限されたサブセットは、出生前に口、皮膚、消化管、膣、および肺に存在するため、ＴＣＲγ  ＶおよびＪ断片発現の偏ったパターンは、個体発生の早期に確立される。したがって、成人組織における多様なＴＣＲγレパートリーは、病原体および毒性分子に対する環境暴露による刺激後の、広範な周辺的増殖の結果である。
【０００９】
Ｂ細胞により発現されるＩｇは、Ｈ２Ｌ２構造を形成する２つの重鎖（Ｈ鎖）および２つの軽鎖（Ｌ鎖）の４つのポリペプチド鎖からなるタンパク質である。ＨおよびＬ鎖の各対は、ＶＬおよびＶＨ領域からなる超可変ドメイン、ならびに定常ドメインを含有する。ＩｇのＨ鎖は、μ、δ、γ、α、およびβのいくつかの種類がある。個体内のＩｇの多様性は、主に、超可変ドメインにより決定される。ＴＣＲと同様に、Ｈ鎖のＶドメインは、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子断片の組み合わせ連結により形成される。超可変ドメイン配列多様性は、Ｉｇ遺伝子再配列のプロセス中の、ＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ、およびＶＨ−ＪＨ連結点におけるヌクレオチドの欠失およびテンプレート依存的付加により、さらに増加される。この点で、免疫能力は、Ｉｇの多様性に反映される。
【００１０】
そのような細胞における、適応免疫受容体の生産的発現を誘導する機能的再配列ＩｇおよびＴＣＲコード化遺伝子の存在に基づく、適応免疫細胞の定量的特性決定は、血液、リンパ液または他の生体液等の、適応免疫細胞が多数容易に単離され得る生体試料を使用して達成されている。これらの試料において、適応免疫細胞は、懸濁流体中の粒子として生じる。例えば、米国特許第２０１０／０３３０５７１号を参照されたく、また、例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊａｎｅｗａｙｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （８ｔｈ  Ｅｄ．），２０１１  Ｇａｒｌａｎ’ｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，  ｐｐ．  ７１７−７６２も参照されたい。
【００１１】
適応免疫系は、がん細胞の認識、および腫瘍を排除するための免疫反応の生成の確保において役割を担うことが示唆されている（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （８ｔｈ  Ｅｄ．），２０１１  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ６８２−６９７、Ｐａｎｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ８９４７０４、Ｄｒａｇｈｉｃｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ４３９０５３を参照されたい）。異なるがん細胞により提示される抗原プロファイル間の変動性、および異なる個体の抗腫瘍免疫反応の確実性における変動性は、一般にがん免疫治療と呼ばれる多くの広く異なる臨床的アプローチをもたらし、これによって、この文脈において、抗腫瘍免疫を促進することにより、適応免疫反応を誘発、動員、向上または別様に強化するための取り組みがなされている。
【００１２】
そのような免疫治療アプローチは、非がん細胞特異的となり得、また放射線および化学治療等の強い細胞障害性の投与計画を伴い得る従来のがん治療の好ましい代替法である。がん免疫治療は、時折、化学治療および／または放射線治療を受けている患者にも施されるが、化学治療および放射線は分裂細胞に対して特に細胞傷害性であり、一方免疫細胞増殖は多くの免疫反応の基本的特徴となり得るため、そのようなアプローチは、適応免疫系に非生産的に影響し得、したがって、効果的な治療計画に達する上で困難を伴い得る。
【００１３】
したがって、がんに関連して、および、例えば、微生物感染の処置における、造血細胞移植または固形臓器移植の場合において、効果的な免疫治療計画を設計するために（例えば、移植片の免疫拒絶を検出および適切に処置するために）、ならびに、ワクチンに対する反応を最適化するために、患者の免疫学的状態の詳細な理解を有することが望ましい。ここで説明される実施形態は、これらの必要性に対応し、他の関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明のある特定の実施形態によれば、試験対象の免疫学的状態を決定するための方法であって、前記試験対象のリンパ系細胞からの核酸を含む１つ以上の試料から生成された核酸配列情報を得ることであって、前記核酸配列情報は、複数の一意の再配列された核酸配列に対する配列を含み、前記複数の一意の再配列された核酸配列のそれぞれは、ＡＩＲポリペプチドをコードし、前記１つ以上の試料は、１つ以上の時点で前記試験対象から得られる、核酸配列情報を得ることと、前記１つ以上の試料に対して、前記核酸配列情報を使用することと、前記試料中の観察される再配列された配列の総数を決定することと、前記試料中の一意の再配列されたＤＮＡ配列の総数を決定することと、一意の再配列されたＤＮＡ配列の前記総数に基づいて、前記１つ以上の試料のＡＩＲ配列多様性スコアを定量することと、各一意の再配列されたＤＮＡ配列の発生頻度を、前記１つ以上の試料中の観察される再配列された配列の前記総数のパーセンテージとして計算することにより、前記１つ以上の試料のＡＩＲ配列分布スコアを定量することと、前記試験対象の前記ＡＩＲ配列多様性スコアおよび前記ＡＩＲ配列分布スコアに基づいて、前記試験対象の前記免疫学的状態を決定するための試験対象格付けスコアを決定することとを含む方法が提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、方法は、前記１つ以上の試料の前記試験対象格付けスコアを、対照対象からの試料から得られた第２の組の対照対象格付けスコアと比較することと、前記１つ以上の時点における前記試験対象の前記免疫学的状態を決定することとをさらに含み、前記試験対象格付けスコアと前記対照対象格付けスコアとの間の差が統計的に有意である場合、前記試験対象は、前記１つ以上の時点において前記対照対象の免疫学的状態と異なる免疫学的状態を有すると決定され、前記試験対象格付けスコアと前記対照対象格付けスコアとの間に統計的有意差がない場合、前記試験対象は、前記対照対象と同じ免疫学的状態を有すると決定される。
【００１６】
ある特定の実施形態において、核酸は、ゲノムＤＮＡを含む。他の実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、メッセンジャーＲＮＡを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法はまた、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の５０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の５０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が、所定の閾値以下である場合、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特性決定することとを含む、前記対象のＡＩＲ配列分布スコアを定量するためのステップを含む。
【００１８】
一実施形態において、方法は、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の４０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の４０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が、所定の閾値以下である場合、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特性決定することとを含む、前記対象のＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む。
【００１９】
別の実施形態において、方法は、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の３０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の３０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が、所定の閾値以下である場合、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特性決定することとを含む、前記対象のＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む。
【００２０】
さらに別の実施形態において、方法は、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の２０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数を決定することと、前記試料中の観察される再配列された配列の総数の２０％までの統合発生頻度を有する一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が、所定の閾値以下である場合、ＡＩＲ配列分布スコアを低スコアとして特性決定することとを含む、前記対象のＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む。
【００２１】
他の実施形態において、方法は、前記試料中の残りの一意の再配列された配列のそれぞれの発生頻度と比較して、各時点において最高発生頻度を有する少なくとも１つの一意の再配列された配列を選択することと、前記試験対象における、前記少なくとも１つの一意の再配列された配列のＡＩＲ配列分布の経時的なプロファイルを決定することとを含む、ＡＩＲ配列分布スコアを定量することを含む。
【００２２】
別の実施形態において、方法は、一意の再配列されたＤＮＡ配列の総数の平均発生頻度よりも統計的に有意に高い各時点における発生頻度を有する、複数の最も豊富な一意のＡＩＲ再配列された配列を選択することと、前記試験対象における、前記最も豊富な一意の再配列された配列のそれぞれのＡＩＲ配列分布の経時的なプロファイルを決定することとを含む。
【００２３】
さらに別の実施形態において、方法は、前記試料中の一意のクローンの総数を決定することを含む、前記ＡＩＲ配列多様性スコアを定量することを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態において、対照対象は、既知の免疫学的状態を有する。一実施形態において、対照対象は、健康な対象であり、欠陥のない免疫学的状態を有する。別の実施形態において、対照対象は、欠陥のある免疫学的状態を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、対照対象は、免疫治療に対する反応の既知の転帰を有する。一実施形態において、反応は、免疫治療に対する肯定的な反応である。一実施形態において、反応は、免疫治療に対する不良な反応である。
【００２６】
別の実施形態において、試験対象は、対照対象と比較して、免疫治療に対する反応の同じ転帰を有すると予測される。さらに別の実施形態において、試験対象は、対照対象と比較して、免疫治療に対する反応の異なる転帰を有すると予測される。
【００２７】
ある特定の実施形態において、対照対象は、幹細胞移植に対する反応の既知の転帰を有する。一実施形態において、反応は、幹細胞移植に対する肯定的な反応であってもよい。別の実施形態において、反応は、幹細胞移植に対する不良な反応である。さらに別の実施形態において、試験対象は、対照対象と比較して、幹細胞移植に対する反応の同じ転帰を有すると予測される。他の実施形態において、試験対象は、対照対象と比較して、幹細胞移植に対する反応の異なる転帰を有すると予測される。
【００２８】
ある特定の態様において、対照対象は、処置に対する反応の既知の転帰を有する。いくつかの態様において、処置は、免疫治療抗体、サイトカイン、造血細胞移植、免疫抑制剤、またはワクチンを含む。
【００２９】
他の態様において、１つ以上の試料は、試験対象から得られた固形組織試料を含む。
【００３０】
一態様において、１つ以上の試料は、試験対象から得られた血液試料を含む。ある特定の実施形態において、１つ以上の試料が血液試料を含む場合、低いＡＩＲ配列多様性スコアおよび低いＡＩＲ配列分布スコアは、低い試験対象格付けスコアとして特性決定され、前記試験対象における高いＴＣＲクローン性を示す。他の実施形態において、低い試験対象格付けスコアは、前記試験対象における免疫治療に対する不良な反応を予測するものである。別の実施形態において、高いＡＩＲ配列多様性スコアおよび高いＡＩＲ配列分布スコアは、高い試験対象格付けスコアとして特性決定され、低いＴＣＲクローン性を示す。他の実施形態において、高い試験対象格付けスコアは、前記試験対象における免疫治療に対する肯定的な反応を予測するものである。
【００３１】
他の実施形態において、試験対象は、免疫治療で処置されている。いくつかの実施形態において、免疫治療は、免疫系の負の調節因子の阻害剤の投与を含む。一実施形態において、負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１からなる群から選択される。別の実施形態において、負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４である。さらに別の実施形態において、負の調節因子は、ＰＤ−１である。ある特定の態様において、阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。別の態様において、阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。
【００３２】
さらに他の態様において、１つ以上の試料は、試験対象から得られた固形腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態において、固形腫瘍試料中、高いＡＩＲ配列多様性スコアおよび高いＡＩＲ配列分布スコアは、低い試験対象格付けスコアとして特性決定され、前記試験対象における低いＴＣＲクローン性を示す。
【００３３】
一実施形態において、固形腫瘍試料中、低い試験対象格付けスコアは、免疫治療に対する不良な反応を予測するものである。別の実施形態において、低いＡＩＲ配列多様性スコアおよび低いＡＩＲ配列分布スコアは、高い試験対象格付けスコアとして特性決定され、高いＴＣＲクローン性を示す。一実施形態において、高い試験対象格付けスコアは、前記対象における免疫治療に対する肯定的な反応を予測するものである。
【００３４】
別の実施形態において、試験対象は、免疫治療で処置されている。一実施形態において、免疫治療は、免疫系の負の調節因子の阻害剤の投与を含む。いくつかの態様において、負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１からなる群から選択される。一実施形態において、負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４であってもよい。別の実施形態において、負の調節因子は、ＰＤ−１であってもよい。他の実施形態において、阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。さらに他の実施形態において、阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。
【００３５】
方法はまた、前記免疫治療処置後に得られた試料における残りのクローンの組の平均発生頻度と統計的に有意に異なる発生頻度を有する少なくとも１つのクローンのクローン性増殖により示される、前記試験対象の免疫治療処置の副作用を決定することを含む。一実施形態において、残りのクローンの組は、それぞれ前記試料中の全クローンの上位５０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む。別の実施形態において、残りのクローンの組は、それぞれ前記試料中の全クローンの上位４０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む。さらに別の実施形態において、残りのクローンの組は、それぞれ前記試料中の全クローンの上位３０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む。他の実施形態において、残りのクローンの組は、それぞれ前記試料中の全クローンの上位２０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む。一実施形態において、残りのクローンの組は、それぞれ前記試料中の全クローンの上位１０％以内にある発生頻度を有するクローンを含む。一態様において、少なくとも１つのクローンは、それぞれ前記試料における発生頻度の上位４分の１以内にある発生頻度を有するクローンと統計的に有意に異なる発生頻度を有する。他の態様において、前記少なくとも１つのクローンのクローン性増殖は、前記免疫治療処置に対する前記試験対象の不良な反応を示す。
【００３６】
ある特定の態様において、方法はまた、（１）複数のＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマー、および（２）複数のＡＩＲ  Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーまたは複数のＡＩＲ  Ｃ断片オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかを使用した、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、試験対象のリンパ系細胞を含む前記試料の少なくとも１つから得られた核酸配列を増幅することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、複数のＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｖ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各ＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記複数のＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、前記試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｖコード遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。一実施形態において、複数のＪ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｊ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各Ｊ断片プライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲ  Ｊコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記複数のＪ断片プライマーは、前記試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｊコード遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、複数のＣ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｃ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各Ｃ断片プライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲ  Ｃコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記複数のＣ断片プライマーは、前記試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｃコードまたは遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。
【００３８】
ある特定の態様において、複数のＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに（２）前記複数のＡＩＲ  Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記複数のＡＩＲ  Ｃ断片オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかは、前記試料中の適応免疫細胞の集団から複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子を生成するために、前記試料中の実質的に全ての再配列されたＡＩＲ  ＣＤＲ３コード領域の前記多重ＰＣＲにおける増幅を促進することができ、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子は、前記少なくとも１つの試料における前記ＡＩＲ  ＣＤＲ３コード領域の完全な多様性を定量するのに十分である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、各機能的ＡＩＲ  Ｖコード遺伝子断片は、Ｖ遺伝子組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含み、各機能的ＡＩＲ  Ｊコード遺伝子断片は、Ｊ遺伝子ＲＳＳを含み、各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも１０、２０、３０または４０の連続ヌクレオチドの前記ＡＩＲ  Ｖコード遺伝子断片のセンス鎖であって、前記少なくとも１０、２０、３０または４０の連続ヌクレオチドは、前記Ｖ遺伝子ＲＳＳに対して５’に位置する、センス鎖と、（ｉｉ）少なくとも１０、２０または３０の連続ヌクレオチドの前記ＡＩＲ  Ｊコード遺伝子断片のセンス鎖であって、前記少なくとも１０、２０または３０の連続ヌクレオチドは、前記Ｊ遺伝子ＲＳＳに対して３’に位置する、センス鎖とを含む。一実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、１５００ヌクレオチド未満の長さである。別の実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、１０００ヌクレオチド未満の長さである。さらに別の実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、６００ヌクレオチド未満の長さである。他の実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、５００ヌクレオチド未満の長さである。一態様において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、４００ヌクレオチド未満の長さである。別の態様において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、３００ヌクレオチド未満の長さである。さらに別の態様において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、２００ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、１００ヌクレオチド未満の長さである。好ましい実施形態において、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、５０〜６００ヌクレオチドの間の長さである。
【００４０】
いくつかの態様において、方法は、前記試料中の他の一意の再配列された配列と比較して、統計的に有意により高い発生頻度を有する前記試料の１つにおける、一意の再配列された配列の組を選択することを含む。ある特定の態様において、高い発生頻度は、所定の閾値パーセンテージにより決定される。一態様において、前記組における一意の再配列された配列の選択された数は、所定の数により決定される。他の実施形態において、方法は、前記高頻度の一意の再配列された配列の１つが、持続的または一時的であるかどうかを、前記組から決定することを含み、持続的な一意の再配列された配列は、その後の期間にわたり前記試験対象から得られる２つ以上の試料にわたって存在し、一時的な一意の再配列された配列は、前記対象から１つの時点において得られる１つだけの試料中に存在する。
【００４１】
方法はまた、前記試験対象の前記２つ以上の試料中の１つ以上の持続的な一意の再配列された配列の存在に基づいて、前記対象に対する免疫治療の経過を決定することを含み、持続的な一意の再配列された配列の前記存在は、前記対象が健康な免疫状態を有する増加した可能性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象における前記１つ以上の持続的な一意の再配列された配列の存在は、前記対象による免疫治療処置に対する肯定的な反応を予測するものである。本発明の方法は、前記試験対象の前記１つ以上の試料における１つ以上の一時的な一意の再配列された配列の存在に基づいて、前記対象に対する免疫治療の経過を決定することを含み、前記１つ以上の一時的な一意の再配列された配列の前記存在は、前記対象が欠陥のある免疫状態を有する増加した可能性を示す。別の実施形態において、前記対象における前記１つ以上の持続的な一意の再配列された配列の存在は、前記対象による免疫治療処置に対する不良な反応を予測するものである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記１つ以上の試料において低い試験対象格付けスコアを有する試験対象を、より高い格付けスコアを有する第２の対象と比較して、免疫治療に対する反応のより低い相対的可能性を有するものとして分類するステップと、免疫治療に対する反応の相対的可能性に従って、試験対象の患者集団を階層化するステップとを提供する。方法は、数学モデルに基づいて、前記試料の１つからの前記核酸配列を配列決定することにより前記試験対象の全ＡＩＲレパートリー多様性を外挿することと、前記全ＡＩＲレパートリー多様性から試験対象格付けスコアを決定することとを含む、前記試験対象格付けスコアを決定することを含む。一実施形態において、数学モデルは、未発見種モデルである。
【００４３】
別の実施形態において、前記試験対象格付けスコアを決定することは、シャノンエントロピースコアおよびクローン性スコアを計算することと、前記シャノンエントロピースコアおよび前記クローン性スコアに基づいて、試験対象格付けスコアを決定することとを含む。一実施形態において、クローン性スコアは、シャノンエントロピースコアの変換である。
【００４４】
本発明の他の態様において、適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドは、哺乳動物ＡＩＲポリペプチドであり、Ｔ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲＧ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲＢ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）ポリペプチド、Ｔ細胞受容体デルタ（ＴＣＲＤ）ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）ポリペプチド、および免疫グロブリン軽鎖（ＩＧＬ）ポリペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、ＩＧＨポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＡポリペプチド、ＩｇＧポリペプチド、ＩｇＤポリペプチドおよびＩｇＥポリペプチドから選択される。ＩＧＬポリペプチドは、ＩＧＬ−ラムダポリペプチドおよびＩＧＬ−カッパポリペプチドから選択され得る。一実施形態において、哺乳動物ＡＩＲポリペプチドは、ヒトＡＩＲポリペプチドである。別の実施形態において、哺乳動物ＡＩＲポリペプチドは、非ヒト霊長類ＡＩＲポリペプチド、げっ歯類ＡＩＲポリペプチド、イヌＡＩＲポリペプチド、ネコＡＩＲポリペプチドおよび有蹄動物ＡＩＲポリペプチドから選択される。
【００４５】
ある特定の実施形態において、試験対象は、悪性状態を有する、または有する疑いのある対象、造血細胞移植を受けた対象、固形臓器移植を受けた対象、および微生物感染を有する対象から選択される。いくつかの実施形態において、悪性状態は、血液悪性腫瘍、黒色腫、肉腫およびがん腫から選択される。悪性状態は、悪性黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんから選択される。
【００４６】
他の実施形態において、造血細胞移植は、臍帯血移植、自家造血細胞移植、同種造血細胞移植、および骨髄移植から選択される。一実施形態において、造血細胞移植は、自家Ｔ細胞移植を含む。
【００４７】
他の態様において、複数の時点は、免疫治療中またはその後の時点を含む。別の態様において、複数の時点は、免疫治療の前の時点を含む。
【００４８】
他の実施形態において、方法は、前記試験対象の前記免疫学的状態の決定に基づいて、免疫治療を受けている前記試験対象の処置を管理するステップを含む。一実施形態において、免疫治療は、免疫治療抗体、サイトカイン、造血細胞移植、免疫抑制剤、およびワクチンから選択される免疫治療薬剤による処置を含む。
【００４９】
別の実施形態において、免疫治療は、免疫反応の負の調節因子の阻害剤による処置を含む。いくつかの態様において、免疫反応の負の調節因子は、ＣＴＬＡ４／ＣＤ１５２、ＬＡＧ３／ＣＤ２２３、およびＰＤ−１／ＣＤ２７９から選択される。一実施形態において、負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２であってもよく、免疫反応の前記負の調節因子の前記阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体であってもよい。別の実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択される。いくつかの実施形態において、免疫反応の負の調節因子は、ＰＤ−１／ＣＤ２７９であり、免疫反応の負の調節因子の前記阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。別の実施形態において、免疫治療は、免疫反応の増強物質を標的化する薬剤による処置を含む。さらに別の実施形態において、免疫反応の増強物質は、４１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４およびＣＤ４０から選択される。
【００５０】
他の実施形態において、免疫治療は、炎症経路の阻害剤による炎症状態または自己免疫疾患の処置を含む。ある特定の実施形態において、炎症状態または前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、および若年性特発性関節炎から選択される。一実施形態において、炎症経路は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）の少なくとも１つを含む。他の実施形態において、炎症経路は、ＴＮＦαを含み、炎症経路の前記阻害剤は、ＴＮＦαに特異的に結合する薬剤である。別の実施形態において、ＴＮＦαに特異的に結合する薬剤は、抗ＴＮＦα抗体および人工可溶性ＴＮＦα受容体から選択される。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体は、アダリムマブおよびインフリキシマブから選択され、前記人工可溶性ＴＮＦα受容体は、エタネルセプトである。
【００５１】
他の実施形態において、試験対象の免疫学的状態を決定するためのコンピュータ実装方法であって、様々な時点において複数の試料から得られた対照対象のデータを保存することであって、前記データは、各試料に対して、前記試料中の複数の一意の再配列された核酸配列の核酸配列情報、前記試料のＡＩＲ配列多様性スコア、前記試料中の各一意の再配列された核酸配列の発生頻度、および前記対象の決定された免疫学的状態を含む、保存することと、プロセッサにより、前記対照対象の前記データに基づいて、試験対象の免疫学的状態を評価するための規則を決定することと、免疫治療前および免疫治療後の様々な時点において得られた複数の試料に関する試験対象のデータを入力することであって、前記データは、各試料に対して、前記試料中の複数の一意の再配列された核酸配列の核酸配列情報、前記試料のＡＩＲ配列多様性スコア、および前記試料中の各一意の再配列された核酸配列の発生頻度を含む、入力することと、前記試験対象の免疫学的状態の決定を受信することとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、前記試験対象の免疫治療に対する予測される反応を決定することを含む。一実施形態において、前記対照対象のデータは、免疫治療処置前の時点において前記対照対象から得られた核酸配列情報を含む。別の実施形態において、前記対照対象のデータは、免疫治療処置後の時点において前記対照対象から得られた核酸配列情報を含む。
【００５２】
本明細書に記載の本発明の実施形態のこれらの態様および他の態様は、以下の発明を実施するための形態および添付の図面を参照すれば明らかとなる。本明細書において参照される、および／または出願データシートにおいて列挙される、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献は全て、参照することにより、それぞれが個々に組み込まれるのと同等に、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明の態様および実施形態は、様々な特許、出願および出版物の概念を使用してさらなる実施形態を提供するために、必要に応じて修正され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】骨髄破壊的処置後の経時的に残ったＴＣＲクローンを示すグラフである。幹細胞移植後に残留したクローンにより示される各患者のレパートリーの割合に対する値の範囲が示されている。下位４分の１は、ゼロまでの範囲であった。残留クローンの割合は、移植前に（任意のレベルで）観察されたクローンに対応する全ＴＣＲ配列決定リードの割合として計算された。値は、これらの患者のＴＣＲレパートリーにおける移植前クローンのある程度の持続を示した。
【図２】健康な対照と比較した、移植から２８、５６、１００および１８０日後の初期免疫再構成中に患者において観察される一時的ＴＣＲクローンの数を示すグラフである。各試料において、頻度による上位１０のＴＣＲクローンのそれぞれは、持続的（後の時点で同じ患者において再び観察される）または一時的（同じ患者からはその後の試料においていかなるレベルでも再び観察されない）のいずれかとして分類された。一時的クローンの数は、患者の間で極めて変動性であり、０から９の範囲であったが、一時的クローンの中央の数値は時間と共に減少した。４つの健康な対照もまた分析したが、一時的ＴＣＲクローンの数は、０から２の範囲であり、中央値は０であった。
【図３】造血幹細胞移植後の全ての患者にわたりＴＣＲレパートリーサイズで示された、幹細胞移植後のＴＣＲレパートリー再構成を示すグラフである。試料は、移植前、および移植後の５つの時点（２８、５６、１００、１８０および３６５日目）で採取された。各患者に対するＴＣＲレパートリーサイズは、ＴＣＲ再配列のハイスループット配列決定を使用して推定され、推定ＴＣＲレパートリーサイズの幾何平均が示されている。移植後、患者は、緩やかな回復を始める前に、移植後５６日でその最小値に達する大いに低減されたＴＣＲレパートリーを有していた。
【図４】最終的な非再発死亡率（ＮＲＭ）を有する、および有さない、全ての患者に対するＴＣＲβ再配列のハイスループット配列決定に基づく推定ＴＣＲレパートリーサイズの比較を示すグラフである。ＴＣＲレパートリーサイズ値は、両方の集団に対して四分位数として示されている。有意性は、片側マン−ホイットニーＵ検定を使用して評価された。続いて非再発死亡率に見舞われた患者は、移植から５６および１００日後に有意に低い推定レパートリーサイズを有していた。
【図５】ＣＤ３＋カウントおよび推定ＴＣＲレパートリーサイズの比較を示すグラフである。ＣＤ３＋カウント（細胞の数／ｍＬ）を、両方のメトリクスが利用可能である２８、５６および１００日目からの全ての生存患者からの試料に対して、推定ＴＣＲレパートリーサイズと比較した。ＣＤ３＋カウントとレパートリーサイズとの間に弱い相関があり（ｒ＝０．０６）、配列決定により得られたＴＣＲβ多様性の下限に対する推定により、循環Ｔ細胞の全密度とは独立した情報が明らかとなったことを示している。
【図６】血液試料におけるＴＣＲレパートリークローン性を示すグラフである。血液試料において、低いＴＣＲレパートリークローン性は、免疫治療（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）による処置）反応者状態の予測因子であり、高いＴＣＲレパートリークローン性は、免疫治療非反応者状態の予測因子であった。
【図７】腫瘍組織試料からのＴＣＲコードＤＮＡの定量的配列決定からの結果を示すグラフである。結果は、免疫治療（ＡＴ）前に得られた腫瘍試料において検出されたＴＣＲクローン性のレベルと比較した、免疫治療（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）による処置）（ＤＴ）を施した後に得られた固形腫瘍組織試料中に存在するリンパ球におけるＴＣＲクローン性の増加を示している。
【図８】免疫治療（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）による処置）前および免疫治療後に得られた血液試料中および固形腫瘍試料中の、個々のＴＣＲクローン集団の経時的な相対的提示における動力学を示すグラフである。時点Ａ、Ｂ、およびＣは、血液試料から採取された時点である。時点Ａは、免疫治療前であり、時点ＢおよびＣは、免疫治療計画開始後の２つの時点である。時点ＡＴ、ＢＴ、ＣＴは、対化腫瘍試料である（ＡＴは免疫治療前であり、時点ＢＴおよびＣＴは、免疫治療計画開始後の２つの時点である）。矢印は、治療後に優位性が増加した単一クローンを示し、時点ＣＴにおいてレパートリーの１０％を占めた。時点ＡおよびＢにおいて血液中でそれぞれＴＣＲ配列の７〜９％を占めた２つのクローン（Ｘ１およびＸ２）は、その後、相対的存在度において有意に低下し、一方、血液中で始めは非常に低い頻度を有していたいくつかのＴ細胞受容体配列は、時点Ｃまでに有意に増加した。時点Ａにおける腫瘍試料中の３つの最も多数のクローンは、後の時点において決定されるように、その後の相対的提示において有意に減少した。
【図９】免疫治療（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）による処置）の開始前（時点Ａ）ならびに開始後（時点ＢおよびＣ）に得られた末梢血液試料において決定されたＴＣＲ配列多様性および分布エントロピーを示し、治療前（時点Ａ）ならびに治療後（時点ＢおよびＣ）における、経時的な個々のＴＣＲクローン提示の動力学を示すグラフである。矢印は、治療後に優位性が増加した単一クローンを示し、時点Ｃにおいてレパートリーの１０％超を占めた。
【図１０Ａ】抗ＰＤ−１抗体による免疫治療前、治療中および治療後の、末期転移黒色腫患者から得られた黒色腫損傷からの組織試料からのＴＣＲレパートリークローン性の測定値を示すグラフである。ＴＣＲレパートリークローン性の平均および標準偏差（各試料中に存在する一意のＴＣＲ配列の数を考慮することにより範囲（０〜１）に正規化されたＴＣＲ配列分布エントロピーに基づく修正されたメトリクス）が、免疫治療に対する反応に従い示されている。試験した１２名の患者のうち、８名が処置に反応し（疾患の安定化または部分的反応）、一方４名は反応しなかった（疾患の進行）。ＴＣＲレパートリークローン性は、反応しなかった４名の患者と比較して、反応した８名の患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定によりｐ＝０．０１５）。
【図１０Ｂ】１２名の末期転移黒色腫患者のコホートから得られた黒色腫損傷の組織試料から得られた、免疫治療に対する反応に従うＴ細胞浸潤の平均および標準偏差（２倍体ゲノム当たりのＴ細胞受容体再配列として測定）を示すグラフである。両側の対応のないｔ検定により測定すると、Ｔリンパ球浸潤のレベルは、反応しなかった４名の患者と比較して、反応した８名の患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定によりｐ＝０．０５６）。免疫治療は、抗ＰＤ−１抗体による処置であった。
【図１１Ａ】ＴＣＲレパートリークローン性、ならびにコホート１（１２名の患者）、コホート２（１３名の患者）、および組み合わされたコホート（黒色腫損傷の組織試料から得られた）における免疫治療に対する反応の測定値を示すグラフである。免疫治療は、抗ＰＤ−１抗体による処置であった。ＴＣＲレパートリークローン性の平均および標準偏差（各試料中に存在する一意のＴＣＲ配列の数を考慮することにより範囲（０〜１）に正規化されたＴＣＲ配列分布エントロピーに基づく修正されたメトリクス）が、コホート１（無地の四角）、コホート２（斜線縞模様の四角）および組み合わされたデータ（水平線縞模様の四角）における免疫治療に対する反応に従い示されている。ＴＣＲ配列分布クローン性は、反応しなかった患者と比較して、反応した患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定により、組み合わされたデータにおいてｐ＝０．０００６５）。
【図１１Ｂ】コホート１（無地の四角）、コホート２（斜線縞模様の四角）および組み合わされたデータ（水平線縞模様の四角）における免疫治療に対する反応に従うＴ細胞浸潤の平均および標準偏差（２倍体ゲノム当たりのＴ細胞受容体再配列として測定）を示すグラフである。Ｔ細胞は、黒色腫損傷の組織試料から得られた。免疫治療は、抗ＰＤ−１抗体による処置であった。Ｔリンパ球浸潤のレベルは、反応しなかった患者と比較して、反応した患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定により、組み合わされたデータにおいてｐ＝０．００１５）。
【図１１Ｃ】Ｔ細胞浸潤およびＴＣＲレパートリークローン性のレベルに関する、各患者のランク（全２５名の患者のうちのランクの降順で）の比較を示すグラフである。Ｔ細胞は、黒色腫損傷の組織試料から得られた。免疫治療は、抗ＰＤ−１抗体による処置であった。反応者（菱形）と比較して、非反応者（丸）は、低いＴＣＲレパートリークローン性および低レベルの浸潤Ｔリンパ球への傾向を同時に示す。
【図１２】本発明の一実施形態によるコンピュータの例を示すハイレベルブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
１．概要
本発明は、ある特定の実施形態において、および本明細書に記載のように、例えば個人の適応免疫系の免疫能力を評価することができる適応免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）クローン性を定性的に（例えば、Ｔ細胞受容体または免疫グロブリン配列多様性により）、および定量的に（例えば、ＴＣＲまたはＩＧ配列分布により）特性決定することにより、対象または複数の対象の免疫学的状態を決定するための予想外にも有利な方法を提供する。したがって、本実施形態は、個人の免疫能力を評価するため、および免疫系状態に従い集団を階層化するための新規な方法を提供し、個人におけるリンパ系細胞により発現されたＴＣＲおよび／またはＩＧの配列多様性、ならびに個人におけるＴ細胞および／またはＢ細胞クローン性の相対的程度の両方の決定は、様々な臨床状況において、免疫関連副作用の発生の可能性を含む予後診断、診断、および転帰に関連する。
【００５５】
本実施形態は、初めて、（ｉ）ＴＣＲおよびＩＧレパートリー多様性、ならびに（ｉｉ）ＴＣＲおよびＩＧレパートリー分布のＤＮＡ配列レベルでの特性決定により、免疫能力の高分解能の大規模ハイスループット評価を可能とする。本発明は、リンパ系細胞ＤＮＡを含有する試料中に存在し得る、実質的に全ての可能なＴＣＲおよびＩＧ遺伝子再配列の配列の定量的決定のための組成物および方法を含む。
【００５６】
ある特定の実施形態において、対象からのリンパ系細胞ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または代替としてメッセンジャーＲＮＡ）を含有する試料が、特定のＴＣＲまたはＩＧ鎖をコードする実質的に全ての可能なＤＮＡ再配列を増幅することができるように特別設計されたプライマーセットを使用した多重ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用される。多重ＰＣＲ増幅産物は、迅速なハイスループット高品質定量ＤＮＡ配列決定に適している。試料中の構造的ＴＣＲまたはＩＧレパートリー多様性は、ＤＮＡ配列情報から複数の一意の再配列されたＤＮＡ配列を特定し、またそれから試料中の一意の配列の総数を決定することにより決定される。
【００５７】
所望により、既知の推定または外挿法を使用して、配列情報から、患者の全適応免疫系におけるレパートリー多様性を決定することができる。各一意の配列の相対的分布を定量するために、本明細書に記載され、当業者により実践される定量的配列決定方法はまた、一意の配列の総数のうちのそれぞれの特定の一意に再配列されたＤＮＡ配列の発生頻度の決定を可能とする。ある特定の実施形態において、リンパ系細胞ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが抽出されてＰＣＲテンプレートを提供し得るリンパ形細胞の源として、血液試料を得ることができる。
【００５８】
これらの、および関連した方法は、本明細書に記載のような様々な用途が見出される。例えば、本明細書に記載の方法は、それぞれの個々の対象の適応免疫系内の適応免疫受容体（ＡＩＲ）レパートリーの多様性および分布を定量するために使用される。本明細書に記載の方法はまた、患者の免疫能力状態、または免疫治療に対して反応する、もしくは免疫関連副作用を発生する個人の相対的可能性に従って、患者集団を階層化するために使用される。ＡＩＲ配列多様性（例えば、試料中の特定のＡＩＲポリペプチドをコードする全ての再配列されたＤＮＡに対して特徴的なヌクレオチド配列情報を得ることにより特定される、異なる一意のＡＩＲコード配列の数）およびＡＩＲ配列分布（例えば、各一意の再配列されたＡＩＲコードＤＮＡ配列の発生頻度）の定量は、有利にも、臨床的に有用な情報により、前例のない正確性をもって定義されるＴまたはＢ細胞クローン性の関連付けを可能とする。
【００５９】
限定されない理論によれば、この配列分布は、患者からの各試料中のＴ細胞またはＢ細胞クローン性の程度（例えば、提示の量的程度、または相対的存在度）を表し得るこの分布パラメータを処理するためのいくつかの既知のコンピュータツールのいずれかを使用して、分布値（例えば、各一意の配列の発生頻度）および多様性値（例えば、異なる一意の配列の総数）を生成することができる。分布および多様性値を格付けステップにおいて使用して、個々の試料を格付けし、それらを対照試料および／または互いと比較することができる。
【００６０】
本明細書に記載のように、血液悪性腫瘍を処置するために臍帯血移植を受けている患者において、臍帯血移植後の患者における比較的低い程度のＴＣＲレパートリー多様性は、感染に対する感受性、および感染を除去する免疫機能不全の相対的可能性の予測因子であることが示された（例えば、不良な反応）。一方、血液悪性腫瘍を処置するための臍帯血移植後のヒト患者における比較的高い程度のＴＣＲレパートリー多様性は、感染への抵抗性および免疫能力、すなわち、感染を除去する免疫学的能力の相対的可能性の予測因子であることが示された。
【００６１】
免疫反応の負の調節因子の阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体）による免疫治療前および治療後の患者から得られた血液試料において、患者の血液における高いＴＣＲ配列多様性および低いクローン性は、肯定的な臨床転帰と相関していた。一方、低いＴＣＲ配列多様性（高いクローン性）およびＴＣＲ配列分布のより低いエントロピーを特徴とするＴＣＲレパートリーは、欠陥のある適応免疫能力に起因するより不良な臨床転帰と関連していた。
【００６２】
免疫反応の負の調節因子の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）による免疫治療前および治療後の患者から得られた固形腫瘍試料において、高レベルの浸潤Ｔ細胞の存在および高いクローン性（すなわち、腫瘍へのＴ細胞移動および腫瘍内のクローン性増殖の証拠）は、免疫治療に対する肯定的な反応と関連していた。対照的に、固形腫瘍における最小限の浸潤Ｔ細胞レパートリーおよび低いクローン性（すなわち、腫瘍内の制限された非特異的なＴ細胞反応の証拠）は、処置に対する反応の不良と関連していた。
【００６３】
ここで開示される実施形態は、所与の時点における患者の免疫能力をプロファイリングすることにより、例えば予後診断もしくは診断としての、または治療戦略の情報を与えるための、および他の目的のための広範な用途が見出される。
【００６４】
２．定義
特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、別段に指定されない限り、以下に記載のように定義される。
【００６５】
本明細書において使用される場合、適応免疫受容体（ＡＩＲ）は、哺乳動物細胞において見出される、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体等の免疫細胞受容体を指す。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「プライマー」という用語は、好適な条件下でＤＮＡ合成の起点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。そのような条件は、核酸と相補的なプライマー伸長産物の合成が、適切な緩衝液中および適切な温度における４つの異なるヌクレオシド三リン酸および伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で誘導されるものを含む。
【００６７】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、パーセント「同一性」という用語は、後述の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査により測定されるように、最大対応について比較および整列されるときに、同一である特定のパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に依存して、パーセント「同一性」は、比較されている配列の領域、例えば、機能ドメインにわたり存在してもよく、または、代替として、比較される２つの配列の全長にわたり存在してもよい。
【００６８】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。
【００６９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２  （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、下記参照）により行うことができる。
【００７０】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に入手可能である。
【００７１】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生成するために十分な量、例えば、細胞における免疫反応を調整するために十分な量を意味する。
【００７２】
「治療上効果的な量」という用語は、疾患の症状を改善するのに効果的な量である。治療上効果的な量は、予防が治療であるとみなされ得る場合、「予防的に効果的な量」となり得る。
【００７３】
具体的な定義がなされない限り、本明細書に記載の分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験室手順および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用される。組み換え技術、分子生物学的、微生物学的、化学的合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に、標準的技術を使用することができる。
【００７４】
文脈上別の意味が必要とされない限り、本明細書および特許請求の範囲全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびその変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定されない包含的意味で、すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」として解釈されるべきである。「〜からなる」とは、「〜からなる」という語句の後に来るものを含み、典型的にはそれに限定されることを意味する。「本質的に〜からなる」とは、その語句の後に列挙された任意の要素を含み、その列挙された要素に関して本開示において指定された活動または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は必要ではなく、それらが、列挙された要素の活動または作用に影響するか否かに依存して存在し得る、または存在し得ないことを示す。
【００７５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別の意味が明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。本明細書において使用される場合、具体的実施形態において、「約」または「近似的に」という用語は、数値の前に置かれた場合、その値プラスまたはマイナス５％、６％、７％、８％または９％等の範囲を示す。他の実施形態において、「約」または「近似的に」という用語は、数値の前に置かれた場合、その値プラスまたはマイナス１０％、１１％、１２％、１３％または１４％等の範囲を示す。さらに他の実施形態において、「約」または「近似的に」という用語は、数値の前に置かれた場合、その値プラスまたはマイナス１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％等の範囲を示す。
【００７６】
本明細書全体にわたる「一実施形態」または「実施形態」または「態様」の言及は、実施形態に関連して記載される特定の機能、構造または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所での「一実施形態における」または「実施形態における」という語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の機能、構造、または特徴が、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
【００７７】
３．定量法
対象の免疫能力を定量および評価するために、様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、免疫能力は、対象の適応免疫受容体（ＡＩＲ）配列多様性およびＡＩＲ配列分布を測定することにより評価される。
Ａ．適応免疫受容体（ＡＩＲ）配列多様性
【００７８】
試料中のリンパ系細胞における一意の再配列されたＴＣＲまたはＩＧコードＤＮＡ配列の多様性は、対象からの試料中の異なるＴまたはＢ細胞クローンの数を反映する。配列多様性は、例えば試料中での直接計数または加重計数により、特定サイズの試料中のクローンの数として決定され得る。試料は、例えば、血液試料または組織試料（固形腫瘍試料）であってもよい。代替として、対象における異なるクローンの数は、副次標本中のクローンの数に基づいて推定されてもよい。別の実施形態において、多様性のために全てのＴ細胞または全てのＢ細胞の０．０１％超を占めるクローンのみを計数する等、任意カットオフ値を割り当てて異なる「効果的」クローンの数を推定することができる。加重または外挿多様性決定のための他のモデル、例えばエントロピーモデル、「未発見種モデル」（例えば、Ｅｆｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ６３：４３５、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９４３  Ｊ．  Ａｎｉｍ．Ｅｃｏｌ．１２：４２を参照されたい）、または当該技術分野に精通した者に知られるような他の好適なモデルが、ある特定の関連した実施形態における使用に企図される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＡＩＲ多様性は、特定の試料中の全ＡＩＲ観察配列の定量的配列決定により測定され得る。再配列された適応免疫受容体遺伝子配列の定量的配列決定および適応免疫受容体クローン型決定のための組成物および方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５５０，３１１、およびＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５６９，１１８に記載されている。それらの文献中、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドプライマーおよび配列決定プライマーの配列、ＰＣＲ増幅産物の配列決定、配列決定データの処理、ならびに適応免疫受容体多様性の測定値の使用に関する詳細もまた見出すことができ、それらの全ては、本明細書に記載の方法に従う使用に採用され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、Ｒａｗ  ＨｉＳｅｑ（商標）等の配列決定プログラムを使用して配列データを前処理し、各リードの一次配列におけるエラーを除去し、配列データを圧縮することができる。最近傍アルゴリズムを使用して、密接に関連した配列をマージすることによりデータを一意の配列に折り畳み、ＰＣＲおよび配列決定のエラーの両方を除去することができる。
【００８１】
本明細書に記載のようなＴＣＲまたはＩＧの定量的配列決定により、試料に多様性スコアまたは格付けを割り当てることができる。いくつかの実施形態において、試料中の観察される再配列されたＡＩＲ配列の総数と比較してレパートリー中の一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が少数である場合、多様性スコアまたは格付けは低いものとして決定され得る。試料中の観察される再配列されたＡＩＲ配列の総数と比較してレパートリー中の一意の再配列されたＡＩＲ配列の数が多数である場合、多様性スコアまたは格付けはより高いものとして決定され得る。低い、または高い多様性スコアまたは格付けの決定は、当業者により決定され得るような所定の閾値または統計的有意性の計算に基づいてもよい。例えば、多様性スコアまたは格付けを「低」として分類するための所定の閾値は、いくつかの実施形態において、対象集団の血液試料から得られたものより高くない（統計的有意性をもって）スコアであってもよく、集団は、免疫治療的介入に対する反応において不良な転帰を経験すると決定される集団であってもよい。他の実施形態において、所定の閾値は、試料からの再配列されたＡＩＲ配列から決定される多様性または格付けスコアの上位または最高５０％、２５％、１０％または５％の計算に基づいて決定される。
【００８２】
相対的なスケールとして、格付けシステムは、試料サイズ、多様性定量の方法（例えば、直接的配列決定、または外挿、「隠された種」によるか否か等）、試料が得られる患者集団の臨床兆候および症状等を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子を考慮して変更または調節されてもよい。例えば、ある特定の限定されない例において、患者集団のメンバーは、相対的多様性および／または分布格付けに基づいて分類されてもよく、ある特定の実施形態において、集団の任意のセグメンテーションが実践されてもよい。ある特定の実施形態において、患者集団は、（ｉ）四分位数、五分位数、十分位数等による配列多様性もしくは分布の程度に従って、または（ｉｉ）クローン性の相関因子として、配列の総数の５０、４０、３０、２０または１０パーセントにおける相対的ＡＩＲ配列多様性および分布エントロピーを格付けすることにより、または（ｉｉｉ）一連の時点のそれぞれにおける、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の最も豊富な一意のＡＩＲ配列を選択することにより、階層化され得る。分類は、免疫能力を評価することができるパラメータの組を提供する。
【００８３】
また上述のように、これらの配列多様性計算を使用して、造血幹細胞移植を受けた患者から得られた血液試料中において、より高いＡＩＲ配列多様性スコアが、感染を除去する能力等の好ましい臨床転帰のより高い可能性と相関することが決定された。抗ＰＤ−１抗体による免疫治療を受けている患者から得られた固形腫瘍試料においては、高レベルのＴ細胞浸潤および低い浸潤Ｔ細胞レパートリー多様性が、免疫治療に対する肯定的な反応と関連していた。
【００８４】
当業者に知られているように、ＡＩＲ配列多様性を計算するための他の既知の方法が使用されてもよい。例えば、参照によりその全体が組み込まれる以下の研究は、種存在度データから多様性指数を推定する現在の理論および実践を要約するとともに、多様性指数測定のいくつかの一般的な実施形態の詳細な例を示している。Ａｎｎｅ  Ｅ．Ｍａｇｕｒｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｉａｎ  Ｊ．  ＭｃＧｉｌｌ．２０１１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。多様性スコア格付けを計算するために適用可能な遺伝的多様性推定のための方法の他の例は、Ｊａｍｅｓ  Ｆ．Ｃｒｏｗ  ａｎｄ  Ｍｏｔｏｏ  Ｋｉｍｕｒａ．２００９．Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｔｈｅｏｒｙ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  Ｐｒｅｓｓに見出すことができる。
Ｂ．  適応免疫受容体（ＡＩＲ）配列分布
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＡＩＲ配列分布を使用して、対象の免疫学的状態（例えば、免疫能力）を決定および評価することができる。ＴＣＲまたはＩＧ配列分布等のＡＩＲ配列分布は、試料中の異なるＴ細胞またはＢ細胞クローンの数、例えば、同一のＴＣＲまたはＩＧを発現する細胞の数の間の変動を指す。例えば、ＡＩＲ配列分布は、各一意の再配列されたＡＩＲコードＤＮＡ配列の発生頻度を、観察される再配列されたＡＩＲコードＤＮＡ配列の総数のパーセンテージとして定量することにより決定され得る。ＡＩＲ配列の定量された分布を、任意選択でＡＩＲ配列多様性と共に使用して、免疫学的状態を決定するためのここで企図されるある特定の実施形態に従って、対象の免疫能力を格付けまたはランク付けすることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＡＩＲ配列分布は、これらに限定されないが、以下の方法により決定され得る：（ｉ）ある時間間隔にわたり、対象における少なくとも１〜２０の最も豊富な一意の再配列された（クローン）ＡＩＲ配列を特定および定量すること、または（ｉｉ）対象からの試料中の観察される再配列された配列の総数の所与のパーセンテージ（例えば、１０、２０、３０、４０もしくは５０％まで）を占めるために必要な一意の再配列された（クローン）ＡＩＲ配列を特定およびその数を定量すること。他の計算を追加的または代替的に使用して、対象からの試料のＡＩＲ配列分布を決定し、既知の免疫学的状態を有する対照または別の試料と比較して試料を格付けするために、配列分布値を特定の試料に割り当てることができる。これらには、例えば、エントロピー（すなわち、試料セット内の要素の数の対数で除すことにより［０〜１］の範囲に正規化され得る、典型的に情報理論において定義されるようなシャノンエントロピー）の決定、または、分布の１つ以上のモード（例えば、平均、歪み、尖度等）を決定するための他の既知の方法の使用が含まれ得る。本発明の方法は、以前は不可能であった精度での配列分布およびクローン性の決定を可能にし、様々な予後診断、診断、処方、および他の能力を可能にする。  
Ｃ．  免疫学的状態の決定
【００８７】
ある特定の実施形態によれば、試験対象の免疫学的状態を決定するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、試験対象の免疫学的状態を特定、定量、格付け、比較、および分類するためのステップを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の時点のそれぞれにおいて試験対象から得られたリンパ系細胞ＤＮＡを含有する１つ以上の試料中の適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドをコードする複数の一意の再配列されたＤＮＡ配列のそれぞれに対してＤＮＡ配列情報を特定すること、および、１つまたは複数の時点のそれぞれにおいて試験対象内のＤＮＡ配列をコードする一意の再配列されたＡＩＲポリペプチドの総数を決定して、対象におけるＡＩＲ配列多様性を定量することは、上述のように、ならびに参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５５０，３１１、およびＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５６９，１１８に記載のように行うことができる。これらの参考文献は、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドプライマーおよび配列決定プライマーの配列、ＰＣＲ増幅産物の配列決定、配列決定データの処理、ならびに適応免疫受容体多様性の測定値の使用に関する説明を提供する。
【００８９】
前記１つまたは複数の時点のそれぞれにおいて、試験対象における一意の再配列されたＡＩＲポリペプチドコードＤＮＡ配列の総数を決定した後、各一意の再配列されたＤＮＡ配列の発生頻度が、観察される再配列されたＡＩＲポリペプチドコードＤＮＡ配列の総数のパーセンテージとして定量され得る。例えば、実際の配列データのカウントからＡＩＲ配列多様性値が決定される場合、その値を使用してＡＩＲ配列分布を決定することができる。別の例において、例えば対象の完全適応免疫系への副次標本の外挿により、または「未発見種モデル」を使用して、または任意の他の推定法により、ＡＩＲ配列多様性データが推定される場合、分布の特性を捕らえるための広く知られている方法のいずれも使用することができる。
１．対象からの試料の免疫学的状態の格付け
【００９０】
各試料のＡＩＲ配列多様性およびＡＩＲ配列分布値を使用して、試料の免疫学的状態を格付けすることができる。多種多様な単純な加重および／または精密化格付けシステムのいずれをも使用することができるが、使用される多様性および分布推定法に依存し得る。好ましくは、およびある特定の限定されない実施形態において、所定の閾値に対して少数の一意の再配列された配列が、観察される再配列された配列の総数の５０％以下の統合発生頻度を有する試験対象の試料に、低い格付けが割り当てられる。より高い試験対象格付けは、所定の閾値に対してより多数の一意の再配列された配列が、観察される再配列された配列の総数の５０％以下の発生頻度を有する試料に割り当てられる。換言すれば、格付けは、１つまたはいくつかの優勢なクローンまたはオリゴクローン性が存在する場合のように、より少数の異なるクローンが、観察される再配列された配列の総数の５０パーセントを占める場合により低い。同様であるが関連した実施形態において、より低い試験対象格付けは、より少数の一意の再配列された配列が、観察される再配列された配列の総数の４０、３０、２０または１０パーセント以下の統合発生頻度を有する試料に割り当てられ、より高い試験対象格付けは、より多数の一意の再配列された配列が、それぞれ、試料中の観察される再配列された配列の総数の４０、３０、２０または１０パーセント以下の統合発生頻度を有する試料に割り当てられる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、割り当てられた格付けは、次いで、既知の免疫学的状態を有する第２の対象から得られた対照リンパ系細胞ＤＮＡ試料から生成された対照対象格付けと比較され得る。ある特定の実施形態において、第２の対象は、当業者により定義されるような欠陥を有する既知の免疫学的状態を有する。他の実施形態において、第２の対象は、当該技術分野において確立された基準（例えば、Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｍｏｓｂｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）に従う、欠陥を有さない既知の免疫学的状態を有する健康な対照個体であってもよい。いくつかの実施形態において、試験対象は、試験対象格付けが対照対象格付けよりも統計的に有意に低い前記時点のそれぞれにおいて、欠陥のある免疫学的状態を有するものとして分類され得、したがってそれにより試験対象の免疫学的状態が決定される。本明細書において言及される場合、「対照対象」は、それぞれ関連する臨床表現型を共有する対照対象の集団を指し得る。
【００９２】
例えば、ある特定の好ましい実施形態において、試験対象からの試料のＴＣＲまたはＩＧ配列多様性スコアが、統計的有意性をもって、対照対象からの試料のものよりも２標準偏差分低い場合（前記対照対象は、欠陥のない免疫学的状態または健康な免疫状態を有することが既知である）、試験対象は、欠陥のある免疫学的状態および／または不健康な免疫状態を有すると分類される。同様に、ある特定の好ましい実施形態において、試験対象からの試料のＴＣＲまたはＩＧ配列分布（エントロピー）スコアが、統計的有意性をもって、対照対象からの試料のものよりも２標準偏差分低い場合（前記対照対象は、欠陥のない免疫学的状態または健康な免疫状態を有することが既知である）、試験対象は、欠陥のある免疫学的状態および／または不健康な免疫状態を有するとみなすことができる。次いで、状態の分類化は、診断、予後診断および／または処置戦略の情報を与えることができる。
【００９３】
例えば、限定されない例として、ワクチンに対して免疫学的に反応し得るかどうかを予測することを目的として高齢患者が免疫学的にプロファイルされ得るように、加齢に関連した適応免疫系機能の低下が、本明細書に記載の方法により検出され得る。別の限定されない例として、予防的抗感染（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤等）および／または免疫抑制治療（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するため）が、不変の治療計画に基づく代わりに、各患者の適応免疫系状態に基づいて調節され得るように、造血細胞移植受容者は、移植された細胞により適応免疫性が再構成されたかどうか、またはいつ再構成されたかを決定するために、移植後に定期的に試験され得る。別の限定されない例として、固形臓器移植受容者（例えば、移植肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、心臓、または皮膚の全てまたは一部の受容者）の免疫レパートリーおよび免疫能力は、宿主適応免疫系が移植片拒絶に関与し得るかどうか、およびどの程度関与し得るかを決定するために、定期的に試験され得る。そのような試験結果から、臨床医学者は、必要に応じて免疫抑制治療を調節して、例えば、拒絶を軽減する、または過剰な免疫抑制治療の潜在的に有害な副作用を低減もしくは回避することができる。
【００９４】
さらに別の限定されない例において、免疫能力は、どの患者が免疫治療に肯定的に反応し得る可能性があるか、およびどの患者がその可能性がないかを予測するために、がん患者等の候補免疫治療受容者において本明細書に記載のように評価され得る。
【００９５】
また、本明細書のいずれかの箇所に記載のように、本開示の方法を使用して、ＴＣＲ（ＴＣＲＢ）レパートリーが比較的高いＴＣＲ配列多様性およびＴＣＲ配列分布の高いクローン性（すなわち、腫瘍へのＴ細胞移動および腫瘍内でのクローン性増殖の証拠）を示した患者から得られた腫瘍組織試料が、適応免疫機構の負の調節因子を阻害するように設計された免疫治療（例えば、抗ＰＤ−１抗体）から利益を得る可能性がより高いことが示された。そのような患者は、免疫治療に対し有益に反応し、本発明の方法により検出されるような腫瘍組織内の確実な免疫反応に起因し得るより良好な臨床転帰を有していた（図１０、図１１）。したがって、ＰＤ−１試験において、反応者は非反応者よりもはるかに多くの浸潤Ｔ細胞を有する（すなわち、より多くの全浸潤Ｔ細胞が存在する）が、それらのＴ細胞は、極めて不均一に分布する（すなわち、高いクローン性）ことが確定された。
【００９６】
異なる試験において、非反応者対象のサブセット内で、免疫治療（抗ＣＴＬＡ−４抗体による）が最初に施された後まもなくして、ＴＣＲＢ配列多様性および配列分布エントロピーの両方に低下が見られることがさらに観察されたが、これは、本発明の方法により測定され得る免疫治療に対する反応の差を示している（図８、図９）。
２．増幅およびプライマー
【００９７】
本明細書に記載の方法のこれらの、および関連した実施形態によれば、方法は、（１）複数のＡＩＲ  Ｖ断片オリゴヌクレオチドプライマー、および（２）複数のＡＩＲ  Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーまたは複数のＡＩＲ  Ｃ断片オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかを使用した多重ＰＣＲにおいて、試料から抽出または生成されたＤＮＡを増幅することを含む。これらのプライマーもまた、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９；  Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５５０，３１１、およびＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５６９，１１８に記載されている。複数のＶ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｖ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各Ｖ断片プライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＶ断片プライマーは、試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｖコード遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。複数のＪ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｊ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各Ｊ断片プライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲ  Ｊコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＪ断片プライマーは、試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｊコードまたは遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。さらに、複数のＣ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ独立して、哺乳動物ＡＩＲ  Ｃ領域ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができ、各Ｃ断片プライマーは、少なくとも１つの機能的ＡＩＲ  Ｃコード遺伝子断片に相補的である、少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＣ断片プライマーは、試料中に存在する実質的に全ての機能的ＡＩＲ  Ｃコードまたは遺伝子断片に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、Ｖ断片およびＪまたはＣ断片プライマーは、試料中の適応免疫細胞の集団から前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子を生成するために、試料中の実質的に全ての再配列されたＡＩＲ  ＣＤＲ３コード領域の前記多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における増幅を促進することができ、前記複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子は、Ｔ細胞の集団におけるＡＩＲ  ＣＤＲ３コード領域の多様性を定量するのに十分である。代替として、方法は、単純に、試料中に存在する異なるクローンの絶対的および／または相対的数に関して試料を特性決定するのに十分な、上述の増幅されたＤＮＡ配列データの配列分析を含んでもよい。本明細書において使用される場合、機能的ＡＩＲコード遺伝子断片は、リンパ系細胞のＤＮＡにおける再配列を受け、また、例えば、好ましい実施形態において偽遺伝子を含む再配列が含まれないように、およびフレーム外または時期尚早に停止されたＡＩＲポリペプチドをもたらす再配列ではないように、生産的に発現するＴＣＲまたはＩＧコード遺伝子断片を指す。
【００９８】
増幅の方法、配列決定およびプライマーは、本明細書においてさらに詳細に議論される。
３．患者集団の階層化
【００９９】
本明細書において開示されるある特定の関連した実施形態によれば、免疫治療に対する反応の相対的可能性に従い患者集団を階層化するための方法であって、
【０１００】
（ａ）候補免疫治療受容者である複数の患者のそれぞれからのリンパ系細胞核酸を含有する少なくとも１つの試料（例えば、固形腫瘍試料）において、適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドをコードする複数の一意の再配列された核酸配列のそれぞれの核酸配列情報を特定し、それから、各患者における一意の再配列されたＡＩＲポリペプチドコード核酸配列の総数を決定して、対象におけるＡＩＲ配列多様性を定量するステップと、
【０１０１】
（ｂ）複数の患者のそれぞれにおいて、（ａ）において特定された各一意の再配列された核酸配列の発生頻度を、観察される再配列されたＡＩＲポリペプチドコード核酸配列の総数のパーセンテージとして定量し、対象におけるＡＩＲ配列分布を決定するステップと、
【０１０２】
（ｃ）（ａ）からの患者における一意の再配列された配列の総数に従い、および（ｂ）からの患者における各一意の再配列された配列の発生頻度に従い、複数の患者のそれぞれを格付けし、シャノンエントロピー（各一意の再配列されたＡＩＲの頻度の分布から計算され、一意の再配列されたＡＩＲの数の対数で除すことにより［０〜１］の範囲に正規化される）が高い（すなわち、特異的クローン性増殖をほとんど有さないＡＩＲレパートリーを示す）患者には、より低いクローン性格付けを与え、シャノンエントロピー（各一意の再配列されたＡＩＲの頻度の分布から計算され、一意の再配列されたＡＩＲの数の対数で除すことにより［０〜１］の範囲に正規化される）が低い（すなわち、広範な特異的クローン性増殖を有するＡＩＲレパートリーを示す）患者には、より高いクローン性格付けを与えるステップと、
【０１０３】
（ｄ）より低いクローン性格付け（固形腫瘍試料から測定されるように）を有する患者を、より高いクローン性格付けを有する患者よりも低い免疫治療に対する反応の相対的可能性を有するものとして分類し、それにより、免疫治療に対する反応の相対的可能性に従い患者集団を階層化するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの試料は、固形腫瘍試料である。
【０１０４】
これらの方法ステップの実践においては、本明細書のいずれかの箇所に記載のものと同様の組成物および方法が使用される。
４．処置を管理するための免疫学的状態の決定
【０１０５】
ある特定の他の関連した実施形態によれば、免疫治療を受けている試験対象の処置を管理するために免疫学的状態を決定するための方法であって、
【０１０６】
（ａ）免疫治療前の１つまたは複数の時点のそれぞれにおいて、および免疫治療中またはその後の１つまたは複数の時点のそれぞれにおいて試験対象から得られたリンパ系細胞ＤＮＡを含有する１つ以上の試料において、適応免疫受容体（ＡＩＲ）ポリペプチドをコードする複数の一意の再配列された核酸配列のそれぞれの核酸配列情報を特定し、それから、前記１つまたは複数の時点のそれぞれでの試験対象における一意の再配列されたＡＩＲポリペプチドコード核酸配列の総数を決定して、対象におけるＡＩＲ配列多様性を定量するステップと、
【０１０７】
（ｂ）１つ以上の試料のそれぞれにおいて、（ａ）において特定された各一意の再配列された核酸配列の発生頻度を、前記１つまたは複数の時点のそれぞれでの試験対象における一意の再配列されたＡＩＲポリペプチドコード核酸配列の総数のパーセンテージとして定量し、前記１つまたは複数の時点のそれぞれでの対象におけるＡＩＲ配列分布を決定するステップと、
【０１０８】
（ｃ）（ａ）において決定された一意の再配列された配列の総数に従い、および（ｂ）において定量された各一意の再配列された配列の発生頻度に従い、１つ以上の試料のそれぞれを格付けし、ＡＩＲ頻度分布を使用して前記１つまたは複数の時点のそれぞれでの対象における一意のＡＩＲ配列の総数を外挿し、試験対象における経時的なＡＩＲ配列多様性のプロファイルを得るステップと、（ｄ）外挿された全ＡＩＲ配列多様性に基づいて、対象に変更された免疫治療工程を割り当てるステップであって、高い外挿された全ＡＩＲ配列多様性は、対象が健康な免疫状態を有し、感染の除去に成功し得るであろう可能性の増加を示し、低い外挿された全ＡＩＲ配列多様性は、対象が不健康な免疫状態を有し、感染の除去に成功し得ないであろう可能性の増加を示すステップとを含む方法が提供される。
【０１０９】
これらの方法ステップの実践においては、本明細書のいずれかの箇所に記載のものと同様の組成物および方法が使用される。
４．免疫治療および免疫能力
【０１１０】
免疫能力は、有益にも、効果的な免疫反応、例えば特定の腫瘍または病原体（例えば、感染性細菌、ウイルス、真菌または他の微生物もしくは疾患を引き起こす物質）が根絶または中和されるような、腫瘍または病原体に対する免疫反応を備える個人の適応免疫系の能力または可能性を含むものとして理解され得る。本開示のある特定の実施形態によれば、免疫能力を評価するための方法が記載され、この方法は、個人が免疫治療に対して臨床的に有益な様式で反応する可能性を予測し得る。
【０１１１】
したがって、本明細書のいずれかの箇所でも説明されるように、免疫応答性適応免疫系、例えば臨床基準により疾患または免疫障害の存在のいかなるリスクも有さないことが既知である臨床的に健康な正常個人、または個人の集団の免疫応答性適応免疫系は、対象の血液から得られた試料における比較的高程度のＡＩＲ配列多様性およびＡＩＲ配列分布の高いエントロピーを特徴とする。逆に、非免疫応答性適応免疫系（例えば、免疫反応を備える適応免疫系の比較的低い能力）は、本明細書において、対象の血液から得られた試料における比較的低いＡＩＲ配列多様性およびＡＩＲ配列分布の低いエントロピーを特徴とすることが示される。ＡＩＲ配列多様性およびＡＩＲ配列分布のエントロピーは、本明細書において、経時的に動的であることが示され、年齢の増加、疾患への感受性の増加、ワクチンもしくは他の免疫治療に対して確実に反応する可能性の低下、および／または他の臨床的に関連する基準と相関して経時的に低下する傾向を有し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、免疫反応の負の調節因子の阻害剤による免疫治療前または治療後の患者から得られた固形腫瘍試料において、高レベルの浸潤Ｔ細胞および高いクローン性は、免疫治療に対する肯定的反応に関連していた。対照的に、固形腫瘍における低レベルの浸潤Ｔ細胞および低いクローン性は、処置に対する反応の不全に関連していた。
【０１１３】
免疫治療は、適応免疫系の１つ以上の細胞の活性レベルが改変される（例えば、統計的に有意な様式で上方調節または下方調節される）様々な介入のいずれをも含み得る。例えば、介入は、好ましい実施形態において抗原特異的免疫反応である適応免疫反応を誘発、動員、向上または別様に強化することを含み得る。ある特定の実施形態において、免疫治療は、適応免疫系細胞を認識してそのような細胞の免疫活性を改変する、１種以上の特異的抗体の投与を含み得る。他の免疫治療アプローチは、直接的または間接的に同様に免疫細胞活性を改変するサイトカイン；腫瘍関連抗原に対して抗原特異的反応等の適応免疫反応を惹起するワクチン；骨髄移植、臍帯血移植、および自家Ｔ細胞移植を含む自家造血細胞移植を含む、造血細胞移植（例えば、Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，  ２０００  Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．６（１）：１−１２）；適応免疫反応の負の調節因子の阻害剤、例えばＣＴＬＡ４／ＣＤ１５２の阻害剤（例えば、イピリムマブ，  トレメリムマブ；Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．３７：４７３）、ＬＡＧ３／ＣＤ２２３の阻害剤（Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６  Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：１１８０、Ｂａｉｘｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９２  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：３２７、Ｈａｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：４０５８、Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：３２１６）；ならびに、いくつかの場合において免疫抑制剤を含む他の免疫治療薬剤（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  （１２ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｂｒｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ＮＹ，  ２０１１，  ｐａｇｅｓ  ９０９−１０９９；  １８９１−１９９０、Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （８ｔｈ  Ｅｄ．），２０１１  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ６６９−７１６）の使用を含む。
【０１１４】
したがって、ある特定の実施形態において、免疫治療は、免疫治療薬剤、例えば免疫治療抗体、サイトカイン、造血細胞移植、免疫抑制剤、またはワクチンによる処置を含み得る。ある特定の実施形態において、免疫治療は、免疫反応の負の調節因子の阻害剤による処置を含む。免疫反応の負の調節因子は、ＣＴＬＡ４／ＣＤ１５２、ＬＡＧ３／ＣＤ２２３、およびＰＤ−１／ＣＤ２７９の１つ以上であってもよい。例えば、免疫反応の負の調節因子は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２であってもよく、免疫反応の負の調節因子の阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばイピリムマブ（例えば、Ｌｙｓｅｎｇ−Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ａｍ  ．Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３：３４９、Ｊｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｏｎｃｏｌ．６：２７５、Ｗａｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．７２：４３０）またはトレメリムマブ（例えば、Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．３７：４７３、Ａｓｃｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．  ９：１９６、Ｃａｌａｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．３７：４６０、Ｒｉｂａｓ，  ２０１０  Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．３７：４５０）である。ある特定の実施形態において、免疫反応の負の調節因子は、ＰＤ−１／ＣＤ２７９であってもよく、免疫反応の負の調節因子の阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態において、免疫治療は、免疫反応の増強物質を標的化する薬剤による処置を含み得る。免疫反応の増強物質は、４１ＢＢ／ＣＤ１３７（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１９６３）、ＯＸ４０／ＣＤ１３４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．  ＡＪ２７７１５１）またはＣＤ４０  （Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：８８１）であってもよい。
【０１１５】
ある特定の他の実施形態において、免疫治療は、炎症経路の阻害剤による炎症状態または自己免疫疾患の処置を含み得る。企図される炎症状態または前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、および若年性特発性関節炎を含む。炎症機構は、広範囲に特性決定されており（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  （１２ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｂｒｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ＮＹ，  ２０１１，  ｐａｇｅｓ  ９０９−１０９９；  １８９１−１９９０、Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （８ｔｈ  Ｅｄ．），２０１１  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ）、これらの、および関連した実施形態において、炎症経路は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）の少なくとも１つを含む。例えば、ＴＮＦαを含む炎症経路の場合、ＴＮＦαに特異的に結合する炎症経路の阻害剤、例えば抗ＴＮＦα抗体（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ）および人工可溶性ＴＮＦα受容体（例えば、エタネルセプト）が知られている。
Ａ．  免疫治療のための例示的標的
【０１１６】
免疫調整薬による処置または処置計画の前に患者の適応免疫系の免疫能力（血液における多様性、または固形腫瘍の場合には腫瘍組織におけるクローン性として定義される）を定量する能力は、処置に対する反応を予測し、全生存率に関連する。
【０１１７】
免疫カスケードにおいて、がんおよび他の治療領域に対する処置の可能性があるものとして標的化され得る多くの標的が存在する。いくつかは、Ｔ細胞の表面上に発現し、免疫反応の負の調節因子であり、いくつかは、抗原提示細胞の表面上に発現し、免疫カスケードを上方調節すると考えられる。以下は、臨床において（抗ＣＴＬＡ、イピリムマブ）、または進行中の臨床試験において使用される、または使用されている免疫治療における例示的標的であり、現在、患者における成功した早期データを報告した後に、複数の製薬業者により使用されている。これらの標的、およびその阻害剤または調節因子は、本明細書に記載の発明の方法に従い、免疫治療または処置対策において使用され得る。
【０１１８】
抗ＣＴＬＡ．  Ｔ細胞の表面上の２つのタンパク質、すなわちＣＤ２８および細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は、免疫活性化および耐容性の調節において重要な役割を果たす。ＣＤ２８は、免疫反応の早期段階において肯定的な調整シグナルを提供し、一方ＣＴＬＡ−４シグナル伝達は、特に強いＴ細胞反応中に、Ｔ細胞活性化を阻害する。抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体治療を使用したＣＴＬＡ−４遮断は、阻害シグナルの抑制が抗腫瘍Ｔ細胞反応の生成をもたらすため、非常に魅力的である。臨床および臨床前データの両方が、ＣＴＬＡ−４遮断がＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター細胞の直接的活性化をもたらすことを示しており、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体治療は、多くのがん、特に黒色腫における有望性を示している。Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００８；１３  Ｓｕｐｐｌ  ４：２−９．  ｄｏｉ：  １０．１６３４／ｔｈｅｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．１３−Ｓ４−２。（ｉ）Ｙｅｒｖｏｙ、またはイピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  （ＢＭＳ））および（ｉｉ）トレメリムマブ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）の２つの抗ＣＴＬＡ４化合物がある。
【０１１９】
ＰＤ−１．    細胞死１（ＰＤ−１）およびそのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞活性化、耐容性、および免疫病理学の間のバランスを調節する阻害シグナルを伝達する。外来および自己抗原に対する免疫反応は、病原体および腫瘍を除去しながらも自己抗原に対する耐容性を維持するために、特定のバランスの取れた反応を必要とする。Ｔ細胞耐容性の誘発および維持にはＰＤ−１が必要であり、非造血細胞上のそのリガンドＰＤ−Ｌ１は、エフェクターＴ細胞反応を制限し、免疫媒介組織損傷から組織を保護することができる。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路はまた、微生物および腫瘍により侵害されており、微生物または腫瘍免疫性が減衰され、慢性的感染および腫瘍生存が促進される。ＰＤ−Ｌ１に対する追加的結合パートナーとしてのＢ７−１の特定は、ＰＤ−Ｌ１とＢ７−１との間の阻害的双方向性相互作用の発見と共に、Ｂ７：ＣＤ２８ファミリーがＴ細胞活性化および耐容性を調節する新たな様式を明らかにしている。Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８；２６：６７７−７０４．  ｄｏｉ：  １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２６．０２１６０７．０９０３３１。Ｍｅｒｃｋ（ＭＫ−３４７５）、またはラムブロリズマブ；ＢＭＳ（ＭＢＳ−９３６５５８）、またはニボルマブ；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ（ＭＥＤＩ４７３６）；Ｇｌａｘｏ（ＡＭＰ−２２４）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）の、開発中の少なくとも５つのＰＤ−１化合物が知られている。
【０１２０】
４−１ＢＢ．  ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、活性化誘発性Ｔ細胞共刺激分子である。４−１ＢＢを介したシグナル伝達は、生存遺伝子を上方調節し、細胞分裂を促進し、サイトカイン産生を誘発し、Ｔ細胞における活性誘発性細胞死を防止する。４−１ＢＢ経路の重要性は、がんを含む多くの疾患において強調されている。ますます多くの証拠が、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体が強い抗腫瘍特性を有することを示しており、これは一方で、その強力なＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＩＦＮ−γ産生、および細胞溶解マーカー誘発能力の結果である。さらに、抗４−１ＢＢと他の抗がん剤、例えば放射線との併用療法は、非免疫原性または低免疫原性腫瘍に対する確実な腫瘍退行能力を有する。Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；  １１（５）；  １０６２−７０，  ２０１２  ＡＡＣＲ。４−１ＢＢ化合物の２つの例が、Ｐｆｉｚｅｒ（ＰＦ−０５０８２５６６）およびＢＭＳ（ＢＭＳ−６６３５１３）により開発されている。
【０１２１】
ＣＤ４０．  ＣＤ４０（ＣＤ１５４）は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、その活性化に必要である。ＴＨ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）のＣＤ４０への結合は、抗原提示細胞を活性化し、様々な下流効果を誘発する。この遺伝子によりコードされるタンパク質受容体は、ＴＮＦ−受容体スーパーファミリーのメンバーである。この受容体は、Ｔ細胞依存的免疫グロブリンクラス切り替え、記憶Ｂ細胞発生、および胚中心形成を含む、多種多様な免疫および炎症反応を媒介する上で不可欠であることが判明している。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５；Ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＣＤ４０＿（ｐｒｏｔｅｉｎ）。例示的なＣＤ４０化合物は、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（ダセツズマブ）およびＮｏｖａｒｔｉｓ（ルカツムマブ）により開発されたものを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
ＬＡＧ−３．  ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３）は、活性化Ｔ細胞（Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：２１３−２１７，  １９９４）、ＮＫ細胞（Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７１：１３９３−１４０５，  １９９０）、Ｂ細胞（Ｋｉｓｉｅｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：２０８１−２０８８，  ２００５）、および形質細胞様樹状細胞（Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２：１８８５−１８９１，  ２００９）上に発現し、これらのリンパ球サブセットの機能において重要であるが完全には理解されていない役割を果たす、細胞表面分子である。さらに、ＬＡＧ−３とその主要なリガンド、クラスＩＩ  ＭＨＣとの間の相互作用は、樹状細胞機能の調整において役割を果たすと考えられている（Ａｎｄｒｅａｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：３８７４−３８８０，  ２００２）。最近の臨床前試験では、ＣＤ８  Ｔ細胞枯渇におけるＬＡＧ−３の役割が実証されており（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：２９−３７，  ２００９）、ＬＡＧ−３  Ｉｇ融合タンパク質を使用したＬＡＧ−３／クラスＩＩ相互作用の遮断が、がん患者における多くの臨床試験において評価されている。Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１；３４４：２６９−７８．  ｄｏｉ：  １０．１００７／８２＿２０１０＿１１４。ＬＡＧ−３は、ＢＭＳ等の企業により、標的として開発されている。
【０１２３】
免疫カスケードに沿った標的の幅。免疫調整はまた、（特異的標的に対する）化合物ファミリーにより、免疫グロブリンファミリーまたはＴＮＦファミリーのメンバーに分類され得る。Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２，  １３０−１４６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３８７７）を参照されたい。この分類は、これらの標的が該当し得る、および免疫能力の尺度が等しく関連し得るがん以外の治療カテゴリーの幅を強調するのに有用である。
免疫治療の標的の例示的リスト
【表１】
0006449160.tif 000002
0006449160.tif 000003
0006449160.tif 000004
【０１２４】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２，  １３０−１４６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３）（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３８７７）。
【０１２５】
試料および対象。試験生体試料を得ることができる対象または生物学的源は、ヒトもしくは非ヒト動物、または、トランスジェニックもしくはクローン化もしくは組織工学的に作製された（幹細胞の使用によるものを含む）生物であってもよい。本発明のある特定の好ましい実施形態において、対象または生物学的源は、がんもしくは別の悪性状態、または自己免疫疾患、または炎症状態、または細菌、ウイルス、真菌もしくは他の微生物感染を有することが既知であってもよく、またはそれらを有する、もしくは有するリスクがある疑いがあってもよく、あるいは、対象または生物学的源は、固形臓器移植受容者（例えば、移植肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、心臓、または皮膚の全てまたは一部の受容者）であってもよい。いくつかの実施形態において、対象または生物学的源は、造血細胞移植受容者（例えば、骨髄移植、臍帯血移植、自家Ｔ細胞移植等の受容者）であってもよい。本発明のある特定の実施形態において、対象または生物学的源は、そのような疾患のリスクまたは存在を有さないことが既知であってもよい。試験生体試料は、１つまたは複数の時点で、例えば、対象または生物学的源に処置または治療（例えば、免疫治療）を施す前の１つまたは複数の時点で、および対照または生物学的源に処置または治療（例えば、免疫治療）を施している間またはその後の１つまたは複数の時点で、対象または生物学的源から得られてもよい。
【０１２６】
ある特定の好ましい実施形態は、ヒト対象である対象または生物学的源、例えば、当該技術分野において認められている臨床診断基準、例えば米国国立がん研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）の基準、またはＤｅＶｉｔａ，  Ｈｅｌｌｍａｎ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２００８，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／  Ｏｖｉｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／  Ｏｖｉｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００２，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｄａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３６  Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ４６）に記載のような基準に従い、がんを有する、またはがんを発症もしくは獲得するリスクがあると診断された患者を企図する。ある特定の実施形態は、そのような基準により、がんを有する、発症する、または獲得するリスクを有さないことが既知であるヒト対象を企図する。ある特定の本発明の実施形態に従い企図される悪性状態の例は、黒色腫、肉腫、およびがん腫等の固形腫瘍を含み得る。その他の悪性状態の例は、悪性黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんを含み得る。
【０１２７】
ある特定の他の実施形態は、非ヒト対象または生物学的源、例えば非ヒト霊長類、例えばマカク、チンパンジー、ゴリラ、ミドリザル、オランウータン、ヒヒ、または他の非ヒト霊長類を企図し、当該技術分野において固形腫瘍および／または他のがんの前臨床モデルを含む前臨床モデルとして知られていてもよいそのような非ヒト対象を含む。ある特定の他の実施形態は、哺乳動物である非ヒト対象、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたは他の哺乳動物を企図し、多くのそのような哺乳動物は、当該技術分野においてリンパ系造血器悪性腫瘍および／または他のがんを含むある特定の疾患または障害の前臨床モデルとして知られている対象であってもよい（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｄｉｓ．  Ｍｏｄｅｌ．Ｍｅｃｈ．４：３１１、ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｖｅｔ．Ｃｏｍｐ．Ｏｎｃｏｌ．９：１、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．３：３０１、Ｄｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．２４：１１５０、Ｍａｃｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１４：２０２３、Ｔａｌｍａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １７０：７９３、Ｋｅｒｂｅｌ，  ２００３  Ｃａｎｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４、Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｃａｎｃ．  Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７、Ｃｅｓｐｅｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。実施形態の範囲は限定されることを意図しないが、対象または生物学的源が、非哺乳動物脊椎動物、例えば、別の高等脊椎動物、もしくは鳥類、両生類もしくは爬虫類種、または別の対象もしくは生物学的源であってもよい他の実施形態もまた企図される。
【０１２８】
本明細書の別の箇所にも記載されるように、これらの、および他のがんの種類に対して、当該技術分野において認められている臨床診断基準、例えば米国国立がん研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により公表されている基準、またはＤｅＶｉｔａ，  Ｈｅｌｌｍａｎ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２００８，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／  Ｏｖｉｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／  Ｏｖｉｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００２，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載のような基準が確立されている。特定のがんの分類および特性決定の他の限定されない例は、例えば、Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．７５：１０４）；  Ｋｕｎｚ  （２００８  Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：９）、およびＡｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．４０：３０３）に記載されている。
【０１２９】
生体試料は、対象または生物学的源から、血液試料、生検標本、固形腫瘍標本等の切除腫瘍標本、組織外植片、器官培養物、生体液または任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることにより提供され得る。したがって、Ｂ細胞およびＴ細胞は、生体試料から、例えば、骨髄、胸腺、リンパ腺、リンパ節、末梢組織および血液を含む様々な組織および生体液試料から、ならびに腫瘍組織（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）からも得ることができるが、末梢血が最も容易に利用可能である。任意の末梢組織がＢおよびＴ細胞の存在について採取され得、したがって、本明細書に記載の方法における使用に企図される。適応免疫細胞を得ることができる組織および生体液は、皮膚、上皮組織、結腸、脾臓、粘膜分泌物、口腔粘膜、腸粘膜、膣粘膜もしくは膣分泌物、頸部組織、神経節、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、臍帯血、血清、漿液、血漿、リンパ液、尿、腹水、胸膜液、心膜液、腹膜液、腹腔液、培養培地、調整培養培地、または洗浄液を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、適応免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞等のリンパ系の造血細胞）は、アフェレーシス試料から単離され得る。末梢血試料は、瀉血により対象から得ることができる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、当業者に知られている技術により、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離により単離される。ある特定の実施形態において、全ＰＢＭＣが分析に使用される。
【０１３０】
ある特定の関連した実施形態において、主にリンパ球（例えば、ＴおよびＢ細胞）を含む、または主にＴ細胞または主にＢ細胞を含む調製物が、確立された当該技術分野において認められた方法に従って、本明細書において提供されるような生体試料としての使用のために調製されてもよい。他の関連した実施形態において、ＴまたはＢ細胞の特定の亜集団が、本明細書に記載の方法を使用した分析前に単離されてもよい。ＴおよびＢ細胞の異なる亜集団を単離するための様々な方法および市販のキットは、当該技術分野において知られており、サブセット選択免疫磁性ビーズ分離または様々な既知のＴおよびＢ細胞表面マーカーのいずれかの１つ以上に特異的な抗体を使用したフロー免疫サイトメトリー細胞分類を含むが、これらに限定されない。例示的なマーカーは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５４、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ５４、およびＣＤ２８の１つまたは組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、当業者に知られているように、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯ等の細胞表面マーカーを使用して、Ｔ、Ｂ、および単球系ならびに亜集団をフローサイトメトリーにおいて決定することができる。同様に、前方光散乱、側方散乱、および／または細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４を使用して、細胞の活性状態および機能的特性を決定することができる。
【０１３１】
本明細書に記載の方法のいくつかにおいて有用な例示的組み合わせは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋（記憶細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋（記憶Ｔヘルパー）、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ−（ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ様細胞毒性Ｔ細胞）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２ＬｈｉＧＩＴＲ＋ＦｏｘＰ３＋（調節性Ｔ細胞）を含み得る。免疫磁性細胞分離またはフロー免疫サイトメトリー細胞分類における使用のための例示的な抗体は、蛍光標識抗ヒト抗体、例えば、ＣＤ４  ＦＩＴＣ（クローンＭ−Ｔ４６６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ８  ＰＥ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５ＲＯ  ＥＣＤ（クローンＵＣＨＬ−１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、およびＣＤ４５ＲＯ  ＡＰＣ（クローンＵＣＨＬ−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。抗体の適切な組み合わせを用いて全ＰＢＭＣの染色を行い、続いて細胞を洗浄してから分析を行うことができる。リンパ球サブセットは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により、例えば、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩ（登録商標）細胞分類システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、およびＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）による結果の分析により、またさらに、表面またはビーズに固定された特異的抗体を含む概念的に同様の方法により単離され得る。
【０１３２】
核酸抽出のために、当該技術分野において知られた方法および／または市販のキットを使用して、例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用することにより、全ゲノムＤＮＡを細胞から抽出することができる。単一１倍体ゲノムの近似的質量は、３ｐｇである。好ましくは、少なくとも２５，０００から２５０，０００の細胞、例えば少なくとも５０，０００から１２５，０００の細胞、または少なくとも７５，０００から１５０，０００の細胞、または少なくとも１００，０００から２００，０００の細胞、すなわち、２倍体ＴまたはＢ細胞からの約０．１５から１．５μｇ、または例えば０．６から１．２μｇのＤＮＡが、分析に使用される。急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）等のリンパ系血液悪性腫瘍を有する患者から試料が得られた場合、試料中に存在するＴまたはＢ細胞の数は、顕著に変動し得る。源として正常な健康ヒト成人から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用すると、Ｔ細胞の数は変動し得、全細胞の約３０％であると推定され得、Ｂ細胞の数は変動し得、ＰＢＭＣ調製物中の全細胞の約５〜１５％であると推定され得る。
５．適応免疫受容体（ＡＩＲ）
【０１３３】
天然ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介するＣＤ３複合体の不変タンパク質と関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、αβおよびγδ形態で存在し、これらは構造的に類似しているが、極めて異なる解剖学的位置およびおそらくは機能を有する。ＴＣＲに結合するＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩリガンドはまた、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であるが、抗原提示に特化しており、それらがＡＰＣ細胞表面に短鎖ペプチド断片の多様なアレイを提示することを可能とする極めて多形のペプチド結合部位を有する。
【０１３４】
天然ヘテロ二量体αβおよびγδ  ＴＣＲの細胞外部分は、２つのポリペプチからなり、そのそれぞれは、膜近位定常ドメイン、および膜遠位可変ドメインを有する。定常および可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した極めて多形のループを含有する。αβ  ＴＣＲのＣＤＲ３は、ＭＨＣにより提示されたペプチドと相互作用し、αβ  ＴＣＲのＣＤＲ１および２は、ペプチドおよびＭＨＣと相互作用する。ＴＣＲ配列の多様性は、結合した可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）、および定常遺伝子の体細胞再配列により生成される。
【０１３５】
ＩｇおよびＴＣＲ遺伝子座は、多くの異なる可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、および連結（Ｊ）遺伝子断片を含有し、これらは、初期リンパ系分化中の再配列プロセスに供される。ＩｇおよびＴＣＲ  Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子断片配列は、当該技術分野において知られており、ＧＥＮＢＡＮＫ等の公共データベースにおいて利用可能である。
【０１３６】
Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列は、リコンビナーゼ酵素複合体により媒介され、ＲＡＧ１およびＲＡＧ２タンパク質は、ＤＮＡを認識してそれをＶ遺伝子断片の下流側、Ｄ遺伝子断片の両側、およびＪ遺伝子断片の上流側に位置する組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）で切断することにより、重要な役割を果たす。不適切なＲＳＳは、再配列を低減またはさらに完全に防止する。組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、１２＋／−１ｂｐ（「１２−シグナル」）または２３＋／−１ｂｐ（「２３−シグナル」）のいずれかのスペーサにより隔てられた、２つの保存配列（七量体、５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’、および九量体、５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’）からなる。いくつかのヌクレオチド位置が、七量体の１位および２位のＣＡジヌクレオチドを含む組み換えに重要であると特定されており、七量体の３位のＣはまた、九量体の５位、６位、７位のＡヌクレオチドと共に極めて好ましいことが示されている。（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：１７８５、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：４５２０、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１０５３）。他のヌクレオチドの突然変異は、最小限または一貫性のない効果を有する。より変動性ではあるが、スペーサもまた組み換えに影響し、単一ヌクレオチド置換は、組み換え効率に大きく影響することが示されている（Ｆａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｍｎｏｐａｔｈ．７９：１，  Ｌａｒｉｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２７：２３０４、Ｎａｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：６０６８、Ｎａｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８７：１４９５）。大きく異なる組み換え効率を有するＲＳＳポリヌクレオチド配列を特定するための基準が説明されている（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：１７８５、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：４５２０、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ．  ａｌ．  １９８９  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１０５３、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  ＰＬｏＳ  １（１）：Ｅ１）。
【０１３７】
再配列プロセスは、一般に、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）、ＴＣＲベータ（ＴＣＲＢ）、およびＴＣＲデルタ（ＴＣＲＤ）遺伝子の場合、ＤからＪの再配列から開始してＶからＤ−Ｊの再配列が続き、またＩｇカッパ（ＩｇＫ）、Ｉｇラムダ（ＩｇＬ）、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲＡ）、およびＴＣＲガンマ（ＴＣＲＧ）遺伝子の場合、直接的なＶからＪの再配列が関連する。再配列遺伝子断片の間の配列は、一般に、ＴＣＲ切断円（ＴＲＥＣ）またはＢ細胞受容体切断円（ＢＲＥＣ）とも呼ばれる円形切断産物の形態で削除される。
【０１３８】
Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子断片の多くの異なる組合せが、いわゆるコンビナトリアルレパートリーを表し、これは、Ｉｇ分子の場合約２×１０６、ＴＣＲαβの場合約３×１０６、およびＴＣＲγδ分子の場合約５×１０３であると推定される。Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子断片の連結部位において、ヌクレオチドの削除およびランダム挿入が再配列プロセス中に生じ、極めて多様性の連結領域をもたらし、これは、＞１０１２であると推定されるＩｇおよびＴＣＲ分子の全レパートリーに大きく寄与する。
【０１３９】
成熟Ｂリンパ球は、Ｉｇ分子の親和性成熟をもたらすプロセスである体細胞超変異を介して、濾胞中心において抗原認識後にそのＩｇレパートリーをさらに拡張する。体細胞超変異プロセスは、ＩｇＨおよびＩｇ軽鎖遺伝子のＶ−（Ｄ−）Ｊエクソンに集中し、単一ヌクレオチド突然変異に、時にはまたヌクレオチドの挿入または削除に関連する。体細胞突然変異Ｉｇ遺伝子はまた、濾胞または濾胞後の源の成熟Ｂ細胞悪性腫瘍において見出される。
６．増幅プライマーおよび多重ＰＣＲ
【０１４０】
本明細書に記載のある特定の好ましい実施形態において、Ｖ断片およびＪ断片プライマーは、試験生体試料における再配列されたＴＣＲまたはＩｇ  ＣＤＲ３コードＤＮＡ領域を増幅するために、ＰＣＲ反応において使用され得、各機能的ＴＣＲまたはＩｇ  Ｖコード遺伝子断片は、Ｖ遺伝子組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含み、各機能的ＴＣＲまたはＩｇ  Ｊコード遺伝子断片は、Ｊ遺伝子ＲＳＳを含む。これらの、および関連した実施形態において、各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも約１０、２０、３０もしくは４０の連続ヌクレオチドのＴＣＲもしくはＩｇ  Ｖコード遺伝子断片のセンス鎖を含んでもよく、少なくとも約１０、２０、３０もしくは４０の連続ヌクレオチドは、Ｖ遺伝子ＲＳＳに対して５’に位置し、および／または、各増幅された再配列ＤＮＡ分子は、（ｉｉ）少なくとも約１０、２０または３０の連続ヌクレオチドのＴＣＲもしくはＩｇ  Ｊコード遺伝子断片のセンス鎖を含んでもよく、少なくとも約１０、２０または３０の連続ヌクレオチドは、Ｊ遺伝子ＲＳＳに対して３’に位置する。ある特定の好ましい実施形態において、各増幅されたＴＣＲまたはＩｇ  ＣＤＲ３コード領域は、６００ヌクレオチド未満の長さの増幅された再配列ＤＮＡ分子内に存在する。理論に束縛されることを望まないが、ＣＤＲ３コードＶ−Ｊ連結領域を増幅するためのこれらの設計機能は、実質的に全ての機能的ＴＣＲまたはＩｇ  Ｖコード遺伝子断片に対するＶ断片プライマーハイブリダイゼーションを可能とし、また、実質的に全ての機能的ＴＣＲまたはＩｇ  Ｊコード断片へのＪ断片プライマーハイブリダイゼーションを可能とし、また、本明細書に記載のハイスループット配列決定（ＨＴＳ）プラットフォームによる配列決定に適したＣＤＲ３コード領域の増幅を可能とする一方で、全ての可能なＶ−Ｄ−ＪおよびＶ−Ｊの組み合わせを特定するための十分な配列情報を含む。
７．多重定量ＰＣＲ
【０１４１】
本明細書に記載のように、およびＲｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５５０，３１１、およびＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５６９，１１８を考慮して、ある特定の好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｖ断片に特異的にハイブリダイズする順方向プライマーのセット、およびＪ断片に特異的にハイブリダイズする逆方向プライマーのセットを使用した多重ＰＣＲ法を含み、多重ＰＣＲ反応は、ＴまたはＢ細胞の所与の集団内の全ての可能なＶＪ（およびＶＤＪ）の組み合わせの増幅を可能とする。
【０１４２】
ＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術分野における標準的方法または市販のキットを使用して、血液もしくはリンパ液の試料、またはリンパ系細胞を含有することが既知である対象からの他の試料等の試料中の細胞から抽出されてもよい。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡが使用される。他の実施形態において、ｃＤＮＡは、細胞から得られたｍＲＮＡから転写され、次いで多重ＰＣＲに使用される。
【０１４３】
多重ＰＣＲシステムは、ゲノムＤＮＡから、好ましくはＣＤＲ３領域から再配列された適応免疫細胞受容体遺伝子座を増幅するために使用され得る。ある特定の実施形態において、ＣＤＲ３領域は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδ  ＣＤＲ３領域から、または同様にＩｇＨもしくはＩｇＬ（ラムダもしくはカッパ）遺伝子座から増幅される。試料中のＴ細胞（ＴＣＲの場合）またはＢ細胞（Ｉｇの場合）の集団から複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子を生成するために、そのような受容体の所与のクラス（例えば、ＴＣＲγ、ＴＣＲβ、ＩｇＨ等）に関して、試料中の実質的に全ての生産的に再配列された適応免疫受容体ＣＤＲ３コード領域の多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において増幅を促進することができる複数のＶ断片およびＪ断片プライマーを含む組成物が提供される。好ましくは、ある特定の実施形態において、プライマーは、複数の増幅された再配列ＤＮＡ分子における各増幅された再配列ＤＮＡ分子が６００ヌクレオチド未満の長さであり、それにより非再配列適応免疫受容体遺伝子座から増幅生成物を除外するように設計される。
【０１４４】
ヒトゲノムにおいて、現在、約７０のＴＣＲ  Ｖαおよび約６１のＪα遺伝子断片、約５２のＴＣＲ  Ｖβ、約２のＤβおよび約１３のＪβ遺伝子断片、約９のＴＣＲ  Ｖγおよび約５のＪγ遺伝子断片、ならびに約４６の免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）ＶＨ、約２３のＤＨおよび約６のＪＨ遺伝子断片があると考えられている。したがって、これらの遺伝子座のゲノム配列が、それらのそれぞれの特異的分子プローブが容易に生成され得るように知られている場合、限定されない理論に従い、本発明の組成物および方法は、これらの既知の容易に検出可能な適応免疫受容体Ｖ、ＤおよびＪ領域コード遺伝子断片の実質的に全て（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）に関連すると考えられる。
【０１４５】
ＴＣＲおよびＩｇ遺伝子は、体細胞突然変異を介して何百万もの異なるタンパク質を生成し得る。この多様性生成機構のために、これらの遺伝子の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）は、数百万ものリガンドと相互作用し得る配列をコードすることができ、これらの領域は、タンパク質の同種リガンドの結合を示すシグナルを細胞に伝達し得る定常領域に結合する。適応免疫系は、多くの潜在的病原体を認識するための十分な多様性を有するＴ細胞およびＢ細胞抗原受容体のレパートリーを生成するために、いくつかの戦略を使用する。ＭＨＣ分子により提示されるペプチド抗原を主に認識するαβおよびγδ  Ｔ細胞において、この受容体多様性のほとんどは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ鎖（またはγおよびδ鎖）の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）内に含有される。
【０１４６】
アッセイ技術は、高度多重ＰＣＲ反応を提供するために、プライマーの２つのプールを使用する。まず、「順方向」プール（例えば、限定ではなく例示として、本明細書に記載のＶ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、ある特定の好ましい実施形態において、一般的に使用されるＰＣＲ用語に従い、Ｊ断片オリゴヌクレオチドプライマーが「逆方向」プライマーとして使用される場合、「順方向」プライマーとして使用され得るが、当業者には、ある特定の他の実施形態において、Ｊ断片プライマーが、Ｖ断片「逆方向」プライマーと共に使用される場合、「順方向」プライマーとみなされ得ることが理解される）は、それぞれのＴＣＲまたはＩｇ遺伝子座における各Ｖ領域コード断片（「Ｖ断片」）に特異的である（例えば、その一意の配列領域に相補的なヌクレオチド配列を有する）オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ある特定の実施形態において、多くのＶ断片を同時に捕捉し、それにより多重ＰＣＲにおいて必要とされるプライマーの数を低減するために、高度に保存された領域を標的化するプライマーが使用される。同様に、ある特定の実施形態において、「逆方向」プールプライマーは、連結（「Ｊ」）断片における保存配列にアニールする。
【０１４７】
各プライマーは、ヒトゲノムデータベースにおける既知のＪ領域コード遺伝子断片の中での配列差に基づいて各Ｊ断片を一義的に特定するために、またさらにＪ断片特異的プライマーが再配列決定のためにアニールし得る配列部分を含むために、十分な長さの配列部分を含むそれぞれの増幅されたＤＮＡ断片が得られるように設計され得る。ＶおよびＪ断片特異的プライマーのこの設計は、個人における適応免疫受容体遺伝子レパートリーに存在する体細胞再配列の大部分の直接的観察を可能にする。この特徴は、一方で、（ｉ）関心ある特定の疾患、障害、状態または他の兆候（例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害または他の状態）を有する個人におけるＴＣＲおよび／またはＩｇレパートリーの、（ｉｉ）そのような疾患、障害状態または兆候を有さない対照対象のＴＣＲおよび／またはＩｇレパートリーとの迅速な比較を可能とする。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、ＴＣＲまたはＩｇポリペプチド（例えば、ＣＤＲ３含有ポリペプチド）の全てまたは一部等のポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの断片を指し、コード領域「リーダーおよびトレーラー」の前および後の領域、ならびに、個々のコード断片（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含み、また調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合部位等）を含んでもよく、また本明細書に記載のような組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含んでもよい。
【０１４９】
本明細書においてポリヌクレオチドとも呼ばれ、またオリゴヌクレオチドを含む本実施形態の核酸は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってもよく、このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。本実施形態による使用のためのＴＣＲまたは免疫グロブリンまたはその領域（例えば、Ｖ領域、Ｄ断片、Ｊ領域、Ｃ領域等）をコードするコード配列は、任意の所与のＴＣＲまたは免疫グロブリン遺伝子領域またはポリペプチドドメイン（例えば、Ｖ領域ドメイン、ＣＤＲ３ドメイン等）の当該技術分野において知られたコード配列と同一であってもよく、または、遺伝子コードの冗長性または縮重の結果、同じＴＣＲまたは免疫グロブリン領域またはポリペプチドをコードする、異なるコード配列であってもよい。
【０１５０】
一実施形態において、本開示は、複数のＶ断片プライマーおよび複数のＪ断片プライマーを提供し、複数のＶ断片プライマーおよび複数のＪ断片プライマーは、再配列された免疫受容体遺伝子座のＶおよびＪ断片の実質的に全ての組み合わせを増幅する。いくつかの実施形態において、方法は、リンパ系細胞における再配列されたＡＩＲ配列の実質的に全ての増幅を提供し、試料中の少なくとも１０６、１０５、１０４、または１０３の一意の再配列されたＡＩＲ配列のＴＣＲまたはＩＧレパートリーの多様性を定量することができる。「実質的に全ての組み合わせ」は、再配列された免疫受容体遺伝子座のＶおよびＪ断片の全ての組み合わせの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を指す。ある特定の実施形態において、複数のＶ断片プライマーおよび複数のＪ断片プライマーは、再配列された免疫受容体遺伝子座のＶおよびＪ断片の組み合わせの全てを増幅する。
【０１５１】
一般に、多重ＰＣＲシステムは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の、またある特定の実施形態において、少なくとも２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９の、また他の実施形態において、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、またはそれ以上の順方向プライマーを使用することができ、各順方向プライマーは、１つ以上のＶ領域セグメントに対応する配列に特異的にハイブリダイズする、またはそれと相補的である。また、多重ＰＣＲシステムは、少なくとも３、４、５、６、または７の、またある特定の実施形態において、８、９、１０、１１、１２または１３の逆方向プライマーを使用し、各逆方向プライマーは、１つ以上のＪ領域断片に対応する配列に特異的にハイブリダイズする、またはそれと相補的である。レパートリーにおけるＴＣＲおよびＩＧ配列の完全多様性を増幅するために、ＶおよびＪ断片プライマーの様々な組み合わせを使用することができる。ＴＣＲおよびＩＧ配列の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチド配列を含む、多重ＰＣＲシステムに関する詳細については、例えば、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５５０，３１１、およびＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  ６１／５６９，１１８に記載されている。
【０１５２】
ヌクレオチド塩基相補性により標的核酸に特異的にハイブリダイズまたはアニールすることができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、中程度から高いストリンジェンシー条件下でそれを行うことができる。例示を目的として、標的核酸配列の特異的ＰＣＲ増幅のための好適な中程度から高いストリンジェンシー条件は、２５から８０ＰＣＲサイクルの間であり、各サイクルは、変性ステップ（例えば、約９５℃超で約１０〜３０秒（ｓ）、アニールステップ（例えば、約６０〜６８℃で約１０〜３０ｓ）、および伸長ステップ（例えば、約６０〜７２℃で約１０〜６０ｓ）からなり、任意選択で、ある特定の実施形態によれば、アニールおよび伸長ステップは、２ステップＰＣＲを提供するために組み合わされる。当業者により認識されるように、プライマーのアニールおよび増幅の特異性を増加させるために、ＰＣＲ反応において他のＰＣＲ試薬を添加する、または変更する、例えばマグネシウム濃度を改変する、任意選択でＤＭＳＯを添加する、および／または、ブロックされたプライマー、修飾されたヌクレオチド、ペプチド−核酸等を使用することができる。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、本明細書に記載のプライマーのハイブリダイゼーション特異性を評価することができる。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の技術分野において周知である。例示を目的として、本明細書に記載のようなポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための好適な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での事前洗浄、５×ＳＳＣによる５０℃〜６０℃で一晩のハイブリダイゼーション、続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれによる６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者には、例えばハイブリダイゼーション溶液の塩含量、および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を改変することにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが容易に操作され得ることが理解される。例えば、別の実施形態において、好適な高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、上述のものを含むが、但し、ハイブリダイゼーションの温度は、例えば、６０℃〜６５℃、または６５℃〜７０℃に増加される。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、プライマーは、イントロン／エクソン境界を交差しないように設計される。順方向プライマーは、ある特定の実施形態において、これらのプライマーの間の配列の保存を最大化するように、Ｖ断片間の比較的強い配列保存の領域内のＶ断片にアニールする。したがって、これにより、各プライマーのアニール特性の差の可能性が最小限化され、ＶプライマーとＪプライマーとの間の増幅領域は、使用された特定のＶ遺伝子断片を特定するための十分なＴＣＲまたはＩｇ  Ｖ配列情報を含有するようになる。一実施形態において、Ｊ断片プライマーは、Ｊ断片の保存された要素にハイブリダイズし、同様のアニール強度を有する。１つの具体的実施形態において、Ｊ断片プライマーは、同じ保存されたフレームワーク領域モチーフにアニールする。
【０１５５】
オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホロアミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法等の方法による直接的化学合成を含む、任意の好適な方法により調製され得る。オリゴヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのコンジュゲートの合成法に関する検討は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  １９９０，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：  １６５−１８７に記載されている。
【０１５６】
プライマーは、好ましくは、一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存するが、典型的には、６から５０ヌクレオチド、またはある特定の実施形態においては１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短鎖プライマー分子は、一般に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするのに十分相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のための好適なプライマーの設計は、当該技術分野において周知であり、本明細書において引用される文献において説明されている。
【０１５７】
本明細書に記載のように、プライマーは、プライマーの検出または固定化を可能とするが、ＤＮＡ合成の起点として機能するというプライマーの基本的特性を改変しない追加的特徴を組み込むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、増幅産物のクローン化、検出、または配列決定を容易化する追加的核酸配列を、５’末端に含有してもよい。ハイブリダイズするのに十分テンプレートに相補的であるプライマーの領域は、本明細書において、ハイブリダイズ領域と呼ばれる。
【０１５８】
本明細書において使用されるように、プライマーが、十分ストリンジェントな条件下で増幅反応に使用される際に、主に標的核酸にハイブリダイズする場合、プライマーは標的配列に「特異的」である。典型的には、プライマー−標的二本鎖安定性が、プライマーと試料中に見られる任意の他の配列との間に形成される二本鎖の安定性よりも大きい場合、プライマーは、標的配列に特異的である。当業者には、塩条件ならびにプライマーの塩基組成およびミスマッチの場所等の様々な因子が、プライマーの特異性に影響すること、また多くの場合、プライマー特異性の日常的な実験による確認が必要であることが認識される。プライマーが標的配列のみと安定な二本鎖を形成し得るハイブリダイゼーション条件が選択され得る。したがって、好適にストリンジェントな増幅条件下で標的特異的プライマーを使用することにより、標的プライマー結合部位を含有するそれらの標的配列の選択的増幅が可能となる。
【０１５９】
具体的実施形態において、本明細書に記載の方法における使用のためのプライマーは、標的ＶまたはＪ断片の連続核酸配列と同じ配列を有する、またはそれと実質的に相補的である、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さの核酸を含む、またはその核酸からなる。標的ＶまたはＪ断片の連続配列と同じ配列を有する、またはそれと実質的に相補的である、より長いプライマー、例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、または５０ヌクレオチドの長さのプライマーもまた、ある特定の実施形態において使用される。プライマーにおいて、標的ＶまたはＪ断片に対する相補性を保持しながら、標的配列に対する様々なミスマッチ（１、２、３、またはそれ以上）が企図され得る。上述のプライマーの全ての中間的長さが、本明細書における使用に企図される。当業者に認識されるように、プライマーは、加えられた追加的配列（例えば、標的ＶまたはＪ断片と同じまたは相補的となり得ないヌクレオチド）、例えば制限酵素認識部位、配列決定のためのアダプタ配列、バーコード配列等を有し得る（例えば、本明細書および配列リストに記載のプライマー配列）。したがって、プライマーの長さは、特定の用途または必要性に依存して、より長くてもよく、例えば５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、もしくは８０ヌクレオチドの長さまたはそれ以上であってもよい。例えば、一実施形態において、順方向および逆方向プライマーは、共に、５’末端において、ＤＮＡ配列決定核酸配列と適合性のユニバーサル順方向プライマー配列で修飾されている。
【０１６０】
オリゴヌクレオチドプライマーと高度の配列同一性を共有し得る、適応免疫受容体Ｖ断片またはＪ断片オリゴヌクレオチドプライマー変異体もまた、ある特定の実施形態における使用に企図される。したがって、これらの、および関連した実施形態において、適応免疫受容体Ｖ断片またはＪ断片オリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書に開示される適応免疫受容体Ｖ断片またはＪ断片オリゴヌクレオチドプライマー配列に対する実質的な同一性を有し得、例えば、そのようなオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書に記載の方法（例えば、標準的パラメータを使用したＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドプライマー配列等の参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。当業者には、これらの値が、適応免疫受容体断片コードポリヌクレオチドにアニールするオリゴヌクレオチドプライマー変異体の対応する能力を決定するために、コドン変性、リーディングフレーム位置等を考慮することにより、適切に調節され得ることが認識される。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー変異体は、好ましくは変異体オリゴヌクレオチドのアニール能力が、本明細書において具体的に記載される適応免疫受容体Ｖ断片またはＪ断片オリゴヌクレオチドプライマー配列のアニール能力に比べて実質的に消失しないように、１つ以上の置換、付加、削除および／または挿入を含有する。本明細書のいずれかの箇所にも記載のように、好ましい実施形態において、適応免疫受容体Ｖ断片およびＪ断片オリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＤＲ３のコード領域を含む再配列されたＴＣＲまたはＩＧＨ配列を増幅することができるように設計される。
【０１６１】
本明細書において企図されるある特定の実施形態によれば、本開示の多重ＰＣＲ法における使用のためのプライマーは、非ＴまたはＢ細胞配列の非特異的プライミングを防止するために、機能的にブロックされてもよい。例えば、プライマーは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０１６７３５３号に記載のような化学修飾によりブロックされてもよい。本明細書に開示されるある特定の実施形態によれば、本多重ＰＣＲ反応におけるそのようなブロックされたプライマーの使用は、ＤＮＡ複製（すなわち、プライマー伸長）がブロックされる不活性な構成、およびＤＮＡ複製が進行する活性化構成を有し得るプライマーを含む。プライマーの不活性構成は、プライマーが一本鎖である場合、またはプライマーが関心のある標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするが、プライマーの３’末端もしくはその近くに結合した化学部分によりプライマー伸長がブロックされたままである場合に存在する。
【０１６２】
プライマーの活性化構成は、プライマーが関心のある標的核酸配列にハイブリダイズし、その後ＲＮａｓｅ  Ｈまたは別の切断剤が作用して３’ブロック基を除去し、それにより酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が増幅反応においてプライマー伸長を触媒し得る場合に存在する。理論に束縛されることを望まないが、そのようなプライマーのハイブリダイゼーションの反応速度論は、二次反応と類似しており、したがって、混合物中のＴ細胞またはＢ細胞遺伝子配列濃度の関数であると考えられる。ブロックされたプライマーは、プライマー伸長が進行し得る前に、標的へのハイブリダイゼーションに続く切断を必要とすることにより、非特異的反応を最小限化する。プライマーが、所望の標的配列に関連するが、塩基対形成ミスマッチをもたらす１つ以上の非相補的ヌクレオチドを有することにより異なる配列に誤ってハイブリダイズした場合は、特に切断部位またはその近くに存在するミスマッチがある場合、プライマーの切断が阻害される。増幅の忠実度を改善するためのこの戦略は、そのような場所での誤ったプライミングの頻度を低減し、それにより反応の特異性を増加させる。当業者により認識されるように、反応条件、特にＲＮａｓｅ  Ｈの濃度、ならびに各サイクルにおいてハイブリダイゼーションおよび伸長が行われる時間は、その本当の標的配列に正しくハイブリダイズした場合のプライマーの極めて効率的な切断と、プライマーおよび不完全にアニールされ得るテンプレート配列の間のミスマッチがある場合のプライマーの不良な切断との間の切断効率の差を最大化するように最適化され得る。
【０１６３】
参照により全体が組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０１６７３５３号に記載のように、伸長を防止するためにオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’末端またはその近くに配置され得るいくつかのブロック基が、当該技術分野において知られている。プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド残基、非ヌクレオチド結合またはアルカン−ジオール修飾（米国特許第５，５５４，５１６号）の付加により、ＤＮＡ合成の開始を防止または阻害するために３’末端ヌクレオチドで修飾されてもよい。プライマー伸長を阻害またはブロックするために使用され得るアルカンジオール修飾はまた、Ｗｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８  （８）：２０６５）、およびＡｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０３１，０９１号）により説明されている。好適なブロック基の追加的な例は、３’ヒドロキシル置換（例えば、３−ヒドロキシプロピル等のアルコールとの３’−ホスフェート、３’−トリホスフェートまたは３’−ホスフェートジエステル）、２’，３’−環式ホスフェート、末端ＲＮＡ塩基の２’ヒドロキシル置換（例えば、ホスフェートまたは立体的にかさ高い基、例えばトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）を含む。オリゴヌクレオチドの３’端で置換されたＴＩＰＳおよびＴＢＤＭＳ等の２’−アルキルシリル基は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｉｋｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願第１１／６８６，８９４号により説明されている。かさ高い置換基はまた、プライマー伸長をブロックするために、オリゴヌクレオチドの３’末端残基の基部に組み込まれてもよい。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を阻害するために使用されるブロック基の上流側（例えば、５’）に位置する切断ドメインを含んでもよい。例として、切断ドメインは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインであってもよく、または、切断ドメインは、単一ＲＮＡ残基を含むＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインであってもよく、または、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の代替のヌクレオチドによるＲＮＡ塩基の置換を含んでもよい。追加の例示的な切断ドメインは、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０１６７３５３号に記載されている。
【０１６５】
したがって、多重ＰＣＲシステムは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、またはそれ以上の順方向プライマー（各順方向プライマーは、単一の機能的ＴＣＲもしくはＩｇ  Ｖ断片、または機能的ＴＣＲもしくはＩｇ  Ｖ断片の小ファミリー、例えば、ＴＣＲ  Ｖβ断片（または例えば配列リストに記載のＴＣＲプライマーを参照されたい）に相補的である）、および、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の逆方向プライマー（それぞれ、ＴＣＲまたはＩｇ  Ｊ断片、例えばＴＣＲ  Ｊβ断片（例えば、配列リストを参照されたい）に特異的である）を使用してもよい。別の実施形態において、多重ＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的ＴＣＲγ  Ｖ  断片に特異的である４つの順方向プライマー、およびそれぞれ１つ以上のＴＣＲγ  Ｊ断片に特異的である４つの逆方向プライマーを使用してもよい。別の実施形態において、多重ＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的Ｖ断片に特異的である８４の順方向プライマー、およびそれぞれ１つ以上のＪ断片に特異的である６つの逆方向プライマーを使用してもよい。したがって、ＶおよびＪプライマーの様々な組み合わせを、多重ＰＣＲ反応において使用することができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＶおよびＪ断片プライマーは、多重ＰＣＲ反応から複数の単位複製配列を生成するために使用される。ある特定の実施形態において、単位複製配列は、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００から１６００ヌクレオチドの長さのサイズ範囲である。好ましい実施形態において、単位複製配列は、５０〜６００ヌクレオチドの長さのサイズを有する。
【０１６７】
限定されない理論によれば、これらの実施形態は、適応免疫細胞（例えば、ＴまたはＢリンパ球）がその適応免疫受容体コード（例えば、ＴＣＲまたはＩｇ）遺伝子を再配列したら、その子孫細胞は同じ適応免疫受容体コード遺伝子再配列を有し、したがって、その中における、本明細書で開示されるようなＶおよびＪ特異的オリゴヌクレオチドプライマーの特定の対の組み合わせにより増幅され得る再配列された（例えば、ＣＤＲ３コード）ＶおよびＪ遺伝子断片の存在により一意に特定され得るクローン集団を生じるという、当該技術分野における現在の理解（上でも説明されている）を利用している。
【０１６８】
本発明のある特定の実施形態の実践は、異なるように具体的に指定されない限り、当業者の技術の範囲内である、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学技術における従来の方法を使用し、例示を目的として以下でそのいくつかが言及される。そのような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  １  ＆  ２  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，  １９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＮＹ）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，  Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  ２００９，  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｏｒｆｏｌｋ，  ＵＫ、Ａｎａｎｄ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ， Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｎ．Ｇａｉｔ，  Ｅｄ．，  １９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．，  １９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．，  １９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｅｄ��，  １９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）、Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  （Ｊａｎｉｔｚ，  ２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｐａｒｋ，  Ｅｄ．，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）、ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）、 Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．  Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  １９８７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６）、Ｒｉｏｔｔ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８８）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，  Ｅｄ．，  ２００２）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，  Ｅｄ．，  ２００６）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，  Ｅｄ．，  ２００６）、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ  Ｅｄ．，  ２００６）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ  Ｅｄｓ．，  ２００８）��Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）  （Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｋｌｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ  Ｅｄｓ．，  ２００１）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｅｄ．，  ２００８）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ  Ｅｄ．，  ２００８）を参照されたい。
８．コンピュータシステム
【０１６９】
図１２は、一実施形態による、分子検体の分析に使用するためのコンピュータ１２００の一例を示すハイレベルブロック図である。チップセット１２０４に連結された少なくとも１つのプロセッサ１２０２が示されている。チップセット１２０４は、メモリコントローラハブ１２２０と、入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラハブ１２２２とを含む。メモリ１２０６およびグラフィックスアダプタ１２１２は、メモリコントローラハブ１２２０に連結され、ディスプレイデバイス１２１８は、グラフィックスアダプタ１２１２に連結される。記憶デバイス１２０８、キーボード１２１０、ポインティングデバイス１２１４、およびネットワークアダプタ１２１６は、Ｉ／Ｏコントローラハブ１２２に連結される。コンピュータ１２００の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。例えば、いくつかの実施形態において、メモリ１２０６は、プロセッサ１２０２に直接連結される。
【０１７０】
記憶デバイス１２０８は、ハードドライブ、コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、ＤＶＤ、または固体メモリデバイス等の、非一時的なコンピュータ読み出し可能な記憶媒体である。メモリ１２０６は、プロセッサ１２０２によって使用される命令およびデータを保持する。ポインティングデバイス１２１４は、コンピュータシステム１２００にデータを入力するために、キーボード１２１０と組み合わせて使用される。グラフィックスアダプタ１２１２は、画像および他の情報をディスプレイデバイス１２１８上に表示する。いくつかの実施形態において、ディスプレイデバイス１２１８は、ユーザによる入力および選択を受容するためのタッチスクリーン機能を含む。ネットワークアダプタ１２１６は、コンピュータシステム１２００をネットワークに連結する。コンピュータ１０２０のいくつかの実施形態は、図１２に示されるものとは異なる、および／または他のコンポーネントを有する。例えば、サーバーは、複数のブレードサーバーで形成され、ディスプレイデバイス、キーボード、および他のコンポーネントを有さなくてもよい。
【０１７１】
コンピュータ１２００は、本明細書で説明される機能を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを実行するように適合される。本明細書において使用される場合、「モジュール」という用語は、指定された機能を提供するために使用されるコンピュータプログラム命令および他の論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアに実装することができる。一実施形態において、実行可能なコンピュータプログラム命令で形成されるプログラムモジュールは、記憶デバイス１２０８上に記憶され、メモリ１２０６内にロードされ、プロセッサ１２０２により実行される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、コンピュータ１２００は、試験対象の免疫反応を予測するための機械学習アルゴリズムを実行するように設計される。システム１２００は、ソフトウェアが試験対象の免疫学的状態を決定するためのコンピュータ実装方法の動作を実行することを可能にする。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、様々な時点において複数の試料から得られた対照対象のデータを保存するステップであって、前記データは、各試料に対して、前記試料中の複数の一意の再配列された核酸配列の核酸配列情報、前記試料のＡＩＲ配列多様性スコア、前記試料中の各一意の再配列された核酸配列の発生頻度、および前記対象の決定された免疫学的状態を含むステップを含む。
【０１７４】
コンピュータ実装方法は、プロセッサにより、前記対照対象の前記データに基づいて、試験対象の免疫学的状態を評価するための規則を決定するステップと、免疫治療前および免疫治療後の様々な時点において得られた複数の試料に関する試験対象のデータを入力するステップであって、前記データは、各試料に対して、前記試料中の複数の一意の再配列された核酸配列の核酸配列情報、前記試料のＡＩＲ配列多様性スコア、および前記試料中の各一意の再配列された核酸配列の発生頻度を含むステップと、前記試験対象の免疫学的状態の決定を受信するステップとを含む。
【０１７５】
コンピュータ実装方法は、前記試験対象の免疫治療に対する予測される反応を決定することを含む。一実施形態において、前記対照対象のデータは、免疫治療処置前の時点において前記対照対象から得られた核酸配列情報を含む。別の実施形態において、前記対照対象のデータは、免疫治療処置後の時点において前記対照対象から得られた核酸配列情報を含む。
【０１７６】
（第１実施形態）
実施例１：感染による死亡率の予測因子としての臍帯血移植後のＴ細胞受容体多様性
本実施例は、高リスクの血液悪性腫瘍を有する３４名の患者が骨髄除去され、次いでダブル臍帯血（ＣＢ）単位で移植された臨床試験を説明する。移植後０、２８、５６、１００、１８０、および３６０日目に血液試料を回収した。各時点において、Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ（商標）ハイスループットＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定アッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を全ての使用に適用した。Ｔ細胞クローン性増殖および何十万ものＴ細胞クローンの収縮が経時的に追跡され、ＴＣＲレパートリー多様性が直接的に測定されるように、Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ（商標）データを使用して、前例のない深さで適応免疫系をアッセイした。クローンを追跡する能力を使用して、適応免疫系再構成は激しく振動することが示され、ほぼ完全に新しいレパートリーがＣＢ移植後少なくとも毎月出現した。以前の採血からの最大クローンは、数週間以内に検出可能レベル未満に下降し、健康な患者における最も高いクローンはその後の時点において全て観察されたわけではないが、最高頻度クローンを維持した対照データとは対照的であった。また、本明細書において、ハイスループット配列決定の臨床的応用として、Ｔ細胞レパートリーの多様性が免疫能力の尺度であることの実証が説明される。３４名の患者のうち、６名の患者は、感染症を原因として１００日目から３６０日目の間に死亡した。５６日目および１００日目の両方において、これらの６名の患者のそれぞれのＴ細胞レパートリーの多様性は、残りの患者の平均よりもはるかに低かった（Ｐ値＝０．０１５）。移植後２ヶ月までに、ＴＣＲ多様性は、感染による死亡のリスクを正確に予測した。
【０１７７】
造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている患者は、調整計画から生じる長期間の汎血球減少症および免疫調節異常に続発する感染性合併症による、早期移植後疾患率および死亡率のリスクが増加する。臍帯血移植（ＣＢＴ）受容者は、早期移植関連死亡率のさらにより高いリスクを有すると考えられ、実際に、最近の研究では、マッチおよびミスマッチ非関連ドナー受容者と比較して、非再発死亡率（ＮＲＭ）がダブルＣＢＴ（ｄＣＢＴ）受容者において最も高いことが示されている。また、いくつかの研究では、ＣＢＴ後の免疫再構成が、従来のドナー幹細胞源（ＰＢおよびＢＭ）と比べて大幅に遅延され、この患者集団における致命的な感染合併症のリスクの増加にさらに寄与し、また結果として、ＣＢＴ受容者は、移植後１年目における日和見感染（ＯＩ）のより高い発生率を有することが示されている［６〜８］。さらに複雑としている問題は、適応免疫系の再構成を適正に測定することができるアッセイの不足であり、これによって、他の多くの寄与する変数（例えば、年齢、ＨＬＡマッチ、投薬計画の強度、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防および処置のための併用免疫抑制治療）の設定における、ＣＢＴ転帰に対する遅延免疫の役割に直接取り組むことが困難となっている。本実施例は、ＨＣＴを受けている患者において機能的免疫再構成をより正確に測定し、したがって感染性合併症による死亡の最終的なリスクを決定する能力を実証しており、これは、特にＧＶＨＤの予防および処置のための免疫抑制治療の状況において、このリスクの低減を目指した直接的な医学的意思決定に肯定的に影響する。
【０１７８】
健康な成人の血液にいて、個々のＴ細胞は、主に、何百万もの異なるＴＣＲの１つを発現し、クローンは、同じＴＣＲを発現するＴ細胞の組である１，２。ＴＣＲレパートリーの多様性は、外来病原体に対する十分な保護に必要であることが知られている。これは、原発性または後天性免疫不全疾患（例えば、ＳＣＩＤＳ、ＣＶＩＤ、およびＨＩＶ）を有する高齢の、ならびに造血細胞移植後のヒトにおいて明らかであり、ＴＣＲ多様性の喪失は、これらの患者において観察される感染症による罹患率および死亡率の増加に関与している。
【０１７９】
ヒトの体内における多数の異なるＴ細胞クローンに起因して、ＴＣＲレパートリーの多様性の推定は、一般に、間接的に、および低い感度で外挿されるのみであった。したがって、従来の多様性の推定は、臨床上の意思決定において、または、例えば免疫能力のレベルに関連した感染性合併症に対する患者のリスクの指針としての細胞適応免疫系の健康の評価において、または、免疫能力のレベル自体の決定において不十分である。以前のアプローチのこれらの欠点に対応するために、細胞適応免疫系の健康の直接的評価において使用するためのＴ細胞レパートリーの多様性の直接的決定を可能とする、単一試料から数百万ものＴＣＲを配列決定するためのハイスループット方法の適用が、本明細書において説明されている。この情報は、後天的または先天的な免疫抑制の状況における臨床的意思決定の指針を提供する。
【０１８０】
本明細書において説明されるように、Ｔ細胞レパートリー多様性は、骨髄破壊的ＣＢＴ後の免疫再構成の直接的測定を提供する。ＴＣＲ多様性は、ＣＢＴ受容者において、移植から２８、５６、および１００日後の時点で測定され、非再発死亡率（ＮＲＭ）を予測するものであることが示された。さらに、免疫再構成の動力学をより良く理解するために、定量的ＴＣＲ配列多様性および分布データが各時点において得られ、何十万ものＴ細胞クローンの増殖および収縮を同時に追跡するために使用された。
【０１８１】
方法
【０１８２】
試験デザイン。骨髄破壊的単一またはダブルＣＢＴを受けている患者が、この（予め収集されたデータの）レトロスペクティブ分析に適合する。全ての患者は、試験の施設内倫理委員会により承認された試験への参加に対する署名入りの同意書を提出した。
【０１８３】
患者、処置計画および移植後の支持療法。４５歳以下の年齢の血液悪性腫瘍を有する患者が、好適なＨＬＡマッチ関連または非関連ドナーを有さない場合、骨髄破壊的ＣＢＴを受けた。患者の基礎疾患は、以前に説明された基準［１７］に基づいて、標準またはハイリスクとして分類された。患者は、施設の優先性基準により決定されるように、単一またはダブルＣＢ移植を受けた。全てのＣＢ単位は、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂの中間的分解能レベル、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１の対立遺伝子レベル（高分解能）でＨＬＡ分類され、また全てのＣＢ単位は、６ＨＬＡ遺伝子座の４以上で受容者にマッチする必要があった。ＴＣＲ分析用に移植前血液試料が保存されていない、または２８日目以前に死亡した患者は除外した。
【０１８４】
骨髄破壊的調整は、シクロホスファミド（Ｃｙ）（全１２０ｍｇ／ｋｇ）、４日間にわたる多分割全身照射（ＴＢＩ）（全部で１３．２Ｇｙ）、およびフルダラビン（Ｆｌｕ）（全７５ｍｇ／ｍ２）、またはトレオスルファン（Ｔｒｅｏ）（全４２ｇｍ／ｍ２）、Ｆｌｕ（全１５０ｍｇ／ｍ２）、および単回の２Ｇｙ  ＴＢＩからなっていた。全ての患者は、−３日目に開始するシクロスポリン−Ａ（ＣＳＡ）およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）によるＧＶＨＤ免疫学的予防を受けた。全ての患者は、経過観察中に標準的な予防的抗菌剤および抗真菌剤を受け［１８］、移植後最低１００日間、施設に留まった。患者は、少なくとも週１回、臨床評価および経過観察のために診察された。臓器病変の段階に基づく標準的基準を使用して、急性ＧＶＨＤが等級付けされ、急性ＧＶＨＤグレード０〜ＩＶと分類された［１６］。
【０１８５】
ＩｍｍｕｎｏＳｅｑ（商標）アッセイおよび移植後免疫再構成の評価末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出されたゲノムＤＮＡからのＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）のハイスループット配列決定のためのＩｍｍｕｎｏＳｅｑ（商標）アッセイを使用した免疫回復のレトロスペクティブ分析のために、移植後２８、５６、８０〜１００、１８０日目、ならびに１年および２年目、さらに移植前に、末梢血を採取した。試験に参加した生存患者における各時点からの約２５０，０００のＰＢＭＣから、ＴＣＲβ遺伝子のＣＤＲ３領域の配列決定を行った。ＴＣＲβ  ＣＤＲ３領域は、ＩＭＧＴコラボレーション３に従い定義され、Ｖβ遺伝子断片の３′部分によりコードされた第２の保存システインで開始し、Ｊβ遺伝子断片の５′部分によりコードされた保存フェニルアラニンで終了する。これらのコドンの間のヌクレオチドの数が長さを規定し、したがってＣＤＲ３領域のフレームを規定した。ＴＣＲβ  ＣＤＲ３領域は、以前に説明されたプロトコル（Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．  ３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．  １２／７９４，５０７、国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１４１６号、国際公開第ＷＯ／２０１１／１０６７３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６３７３）、国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５０３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９０１２）を使用して、増幅および配列決定された。簡潔に説明すると、それぞれＴＣＲ  Ｖβ断片に特異的な５２の順方向プライマー、およびそれぞれＴＣＲ  Ｊβ断片に特異的な１３の逆方向プライマーを使用して、全ての可能な再配列されたゲノムＴＣＲβ配列を増幅するために、多重ＰＣＲ法が使用された。長さ６０ｂｐの配列リードは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた。Ｒａｗ  ＨｉＳｅｑ（商標）配列データを前処理して、各リードの一次配列におけるエラーを除去し、データを圧縮した。最近傍アルゴリズムを使用して、密接に関連した配列をマージすることによりデータを一意の配列に折り畳み、ＰＣＲおよび配列決定のエラーの両方を除去した。
【０１８６】
統計的考察。試料サイズの制限に起因して（５６日目以降の６つのＮＲＭを含む３４名の患者）、標準的Ｃｏｘ比例ハザードモデルは、情報を提供しなかった。試料サイズを考慮して、骨髄破壊的単一またはダブルＣＢＴを受けている患者からの血液試料において、５６日目（または１００日目）における患者のＴ細胞レパートリーのより低い多様性は、ＮＲＭによる死亡を予測するものであるという仮説を確実に試験するために、試験を強化した。患者間のＴＣＲレパートリーサイズの分布は、十分に特性決定されなかったため、片側ノンパラメトリックマン−ホイットニーＵ検定を使用して、最終的にＮＲＭに罹患した患者がより低い値のＴＣＲレパートリー多様性を有するかどうかを決定した。多変数モデルにおいて全ての可能な交絡因子を評価することはできなかったが、それぞれの可能な交絡因子を別個に分析した。バイナリデータに対しては両側のフィッシャーの正確確率検定を使用し、連続データに対しては両側マン−ホイットニーＵ検定を使用した。
【０１８７】
結果
【０１８８】
試験コホート患者（Ｎ＝３４）およびドナーの特性は、表２に概説される。患者は、高リスク血液悪性腫瘍、原発性急性リンパ芽球性または骨髄芽球性白血病（Ｎ＝２６）の処置のために移植を受けたが、１２名の患者はＣＲ１、および１４名はＣＲ２以上であった。表２は、患者の人口統計、診断、および臨床経過を要約している。全ての患者に対する処置計画は、移植後の最初の５６日間は同様であった。３４名の患者のうち、３１名はＧＶＨＤを有し、そのうち６名がグレードＩＩＩ〜ＩＶであり、したがって、全ての患者がコルチコステロイドで予防的に処置された。
分析に含まれる３４名の患者のコホート特性
【表２】
0006449160.tif 000005
0006449160.tif 000006
【０１８９】
表２中、ＡＬＬ＝急性リンパ性白血病、ＡＭＬ＝急性骨髄性白血病、ＭＤＳ／ＭＰＤ＝骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、ＦＬＵ＝フルダラビン、ＣＹ＝シトキサン、ＴＢＩ＝全身照射、ＴＲＥＯ＝トレオスルファン、ＧＶＨＤ＝移植片対宿主病、ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス、ＣＢ＝臍帯血、ＣＲ＝完全寛解、ＭＲＤ＝微小残存病変である。†＝フルダラビン７５ｍｇ／ｍ２、シトキサン１２０ｍｇ／ｋｇ、ＴＢＩ  １３２０  ｃＧｙ。††＝トレオスルファン４２ｇｍ／ｍ２、フルダラビン１５０ｍｇ／ｍ２、ＴＢＩ  ２００  ｃＧｙ。§＝ＨＬＡマッチングは、２単位の最低ＨＬＡマッチを反映する。
【０１９０】
試料採取。本試験に含まれる全ての患者は、移植前、ならびに移植後＋２８、５６、８０〜１００、１８０日目、および生存した者に対しては１年後に採血された。各血液からの百万を超えるＰＢＭＣのアリコートを、ＩｍｍｕｎｏＳｅｑ（商標）アッセイを使用したＴＣＲ  ＤＮＡの大規模配列決定のために、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）に送付した。試料間の直接比較を可能とするために、一定量のＤＮＡをＩｍｍｕｎｏｓｅｑ（商標）アッセイに入力した。さらに、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞のパーセントおよび絶対数、ならびに免疫グロブリンレベルを、各試料に対して評価した。
【０１９１】
細胞適応免疫系の免疫再構成の動力学。ＴＣＲ遺伝子の膨大な数の潜在的再配列を考慮して、各クローンは事実上一意のＴＣＲ配列を有することが示唆された。これらの配列は、それぞれの固定された時点でのクローン分布の特性を決定することに加え、クローン性増殖および収縮が経時的に追跡され得るような、各クローンの分子識別子であった。
【０１９２】
処置前レパートリーとの重複。ＴＣＲ配列を分子タグとして使用して、何十万ものＴ細胞クローンを時間にわたり追跡した。３４名の患者の全てが、移植前に骨髄破壊的手順を受けたため、処置前レパートリーの非常に限定されたサブセットが、骨髄破壊後に持続すると推定された。驚くべきことに、骨髄破壊的処置後に残ったクローンの割合は幅広く変動し、３４名の患者のうち３名において、１８０日目におけるＴＣＲレパートリーの１０％以上が、処置前（宿主）免疫系から得られた。
【０１９３】
しかしながら、ほとんどの患者において、事前に存在するクローンは、移植後にほとんど、または全く残留しなかった。図１は、患者および時点にわたる移植後に持ち越されたＴＣＲレパートリーの割合を示す。移植後に持続する移植前クローンの割合は、移植後の各時点で観察された移植前クローンの割合の間の強い相関により明らかなように経時的に安定しており（例えば、２８日目および１００日目における残留物の割合の間でｒ＝０．９）、ほとんどの患者において約０．００１であり、平均して１０００のうち約１つのＴ細胞が、移植前に観察されたクローンの一部であることを示していた。Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ（商標）ハイスループットＴＣＲ配列決定アッセイを使用したクローンの分析は、以前の方法により測定されるようなマイクロキメリズムとは異なる結果をもたらした。ＴＣＲ再配列のプロセスは、ＤＮＡレベルでの実質的なクローン同一性が、生存宿主Ｔ細胞の非存在下で偶然観察され得る可能性を低下させた。したがって、これらの結果は、Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ（商標）高品質ＴＣＲ配列決定法が、以前はいかなる宿主Ｔ細胞も保有しないと考えられていた一部の患者において、マイクロキメリズムを検出したことを示した。
【０１９４】
移植後のクローンの追跡。再構成適応免疫系の経時的安定性を評価するために、早期時点において見出されたＴＣＲクローンの持続性を、後の試料において調査した。移植後２８、５６、１００、１８０、および３６５日目で試料が採取および配列決定された患者のみを使用して、上位１０のＴＣＲクローンを、２８、５６、１００および１８０日の時点での各患者における頻度により決定し、これらのクローンのそれぞれの配列を、持続的または一時的なものとして分類した。後の時点において（任意の頻度で）観察された上位１０のＴＣＲクローンは、持続的であるとみなされ、同じ患者からの試料において二度と観察されなかったクローンは、一時的であるとみなされた。
【０１９５】
図２は、移植後の各時点での、上位１０における一時的ＴＣＲクローンの平均数を示す。移植後２８および５６日目において、動的で極めて不安定なＴＣＲレパートリーが観察され、初期試料において高頻度で存在した多くのＴＣＲクローンは、その後再び観察されることはなかった。移植後１００日目以降、このパターンは消失し始め、患者のＴＣＲレパートリーはより安定化した。このパターンが極めて異常であることを確認するために、同じ期間にわたり、４名の健康な対照対象からＰＢＭＣ試料を配列決定した。上位１０の一時的ＴＣＲクローンの平均数は、これらの健康対照に対して各時点において０であり、移植後の一時的ＴＣＲクローンの高い発生率が、異常に不安定なＴＣＲレパートリーを示すという仮定が確認された。以前には、幹細胞移植後のＴ細胞において高い割合のアポトーシス広がったことが示されている。４ここで、このアポトーシスプロセスが、クローンを構成するＴ細胞に関して無作為ではないが、クローン全体の急速な増殖および収縮として生じることが示された。
【０１９６】
移植後のＴ細胞クローン多様性の変化。未発見種分析（Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ４０９９）を使用して全血における多様性の下限を推定するために、Ｔ細胞クローンの分布を使用した。多様性の推定は、各時点に対して計算された。
【０１９７】
図３は、このコホートにおける、移植後１年目の間のＴＣＲレパートリーにより測定されるような免疫再構成の概要を示す。多様性メトリクスの幾何平均が各時点において示され、再構成の一般的経過を示している。骨髄破壊的調整計画は、移植前の値からのＴＣＲ多様性の大幅な低下をもたらした。多様性は、移植前の値から２８日目まで低下したが、これは、ほとんどの患者における生着までの平均時間に近かった（生着時間は、７から４５日の範囲であり、平均は２４であった）。患者のこのコホートにおいて、ＴＣＲ多様性は、移植後５６日でその最低値に達し、それから移植後１年までに、ＴＣＲレパートリー多様性の実質的増加まで徐々に回復し始めた。しかしながら、この回復にもかかわらず、患者ＴＣＲレパートリーは、１年間の試験の終わりまでに、健康なレパートリーよりもまだはるかに低い多様性を有していた。
【０１９８】
ＴＣＲ多様性の観察される変化のいくつかは、絶対的Ｔ細胞カウントの変動により説明され得る。極端には、患者が非常に少ないＴ細胞を有する場合、そのような患者のＴＣＲ多様性は制限された。５６日目において、患者の一部は、非常に低いＣＤ３カウントを有し、したがって、低い多様性を有していた。しかしながら、多様性と絶対的ＣＤ３カウントとの間の相関は、残りのコホートにおいては弱かった（ｒ＝０．０５、図５）。例えば、このコホートにおいて、極めてオリゴクローン性のＴＣＲレパートリー（少数の極めて増殖したクローン）に伴って、より高い絶対的ＣＤ３カウントを有するが多様性をほとんど有さない患者が存在した。
【０１９９】
感染による死亡の予測因子としてのＴＣＲ多様性。本試験における３４名の患者のうち、１５名は、移植後１年目に死亡した。これらの患者のうち６名における唯一の死因は疾患の再発であり、残りの９名の患者においては、死亡は主に感染を原因とした。移植後の感染性合併症は、予想外または珍しいことではなかった。しかしながら、本開示の前には、移植後にどの患者が致死的な感染症により死亡する増加したリスクを有するかを評価するための強力な予測値を有する具体的測定法がなかった。そのような予測能力は、幹細胞移植後の患者の医学的管理を変更し得る。したがって、ＴＣＲ多様性のこの直接的測定法を、感染症と闘う適応免疫系の能力の情報を提供する予測因子としてのその可能性について分析した。移植後の早期時点（５６日目および１００日目）におけるＴ細胞レパートリーの多様性は、確かに、再発以外の原因による死亡の強力な予測因子であった。移植前のＴ細胞多様性の測定は、予測値への傾向を示したが、このコホートにおいて統計的有意性に達しなかった。また、２８日目のデータは、おそらくはこの時点でのＴＣＲレパートリー多様性が、注入前に分化した移植片からのＴ細胞により支配的であった可能性があり、したがって本当の免疫再構成を反映しなかったことに起因して、有意な予測値を有していない。しかしながら、１００日目以降に最終的に再発以外の原因で死亡した患者は、早くも移植後５６日目に大幅に低減されたＴＣＲ多様性を示した（図４を参照されたい）。ＮＲＭ（再発以外による死亡）により死亡した患者からのデータは、測定された各時点においてＴＣＲ多様性のより低い推定を一貫してもたらしたが、この関係は、患者の免疫再構成が生着後に本格的に開始した５６日目においてのみ、統計的有意性に到達した（片側マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算、ｐ＝０．０１５３）。引き続いてＮＲＭにより死亡した患者のＴＣＲ多様性における大きな差異は、移植後１００日目も持続した（ｐ＝０．０１５３）。５６日目には生存していたが、最終的には感染症を原因として死亡した６名の患者のうち５名は、１８０日を通して生存し、これは、２８日から５６日の間の高リスク状態の臨床的特定が、予防的な臨床的介入のための十分な時間を可能とすることを示していることに注目すべきである。
【０２００】
感染症による死亡の予測因子としての他の因子。移植後の免疫回復は、多くの因子により影響され、最も有意には、ＧＶＨＤの予防および処置のための免疫抑制治療（ＩＳＴ）の使用、特にステロイドの使用により影響される。感染のリスクの予測におけるＴＣＲ多様性の直接的測定の実用性を決定するために、ＩＳＴによる処置の差および全絶対的ＣＤ３カウントを中心として、可能な交絡因子の役割を評価した。処置後平均２３日目にＧＶＨＤを発症した２７名の患者がいた。これらの患者を、まずプレドニゾンで処置した。
【０２０１】
ＴＣＲ多様性測定の臨床転帰との相関における別の主要な交絡因子は、全ＣＤ３＋細胞の回復であった。ＴＣＲ多様性の臨床転帰との相関は、それが末梢血中の全Ｔ細胞の計数により得られた結果を単純に反復する場合、実用性が限られる。絶対的ＣＤ３＋細胞／μｌにより測定されるようなＴ細胞回復の反応速度を、ＴＣＲ多様性の測定と同時に末梢血において測定した。図５は、絶対的ＣＤ３＋カウントが、推定ＴＣＲレパートリー多様性と非常に弱く相関したことを示し、これらの２つのメトリクスが、本質的に独立していたことを示している。実質的に低下した絶対的Ｔ細胞カウントは、必然的に、低い多様性を有するＴＣＲレパートリーの決定をもたらすため、この相関は、ほとんどの場合、絶対的ＣＤ３＋細胞カウントの下限近くの試料により引き起こされた。しかしながら、それにもかかわらず、より高い絶対的ＣＤ３＋カウントにおいては、オリゴクローン性Ｔ細胞集団は非常に低いＴＣＲ多様性を有し、したがって日和見病原体に対する保護を提供しなかった可能性が依然としてあった。
【０２０２】
表３は、移植後５６日目および１００日目からのデータを使用して、ＴＣＲ多様性メトリクスと共にＣＤ３＋カウントを分析した際に得られた結果を要約している。表３中、各試料には、両方のメトリクスに対して高い（平均以上の）群または低い（平均未満の）群が割り当てられ、各カテゴリーに含まれるＮＲＭによる最終的な死亡数が比較された（５６日目まで生存した６名の中から）。さらに、表３は、ＮＲＭにより死亡する患者がより低い値の絶対的ＣＤ３＋カウントまたはＴＣＲ多様性を有する傾向があったという仮説の、マン−ホイットニーＵ検定の片側ｐ値の結果を示している。ＴＣＲ多様性メトリクスは、早くも移植後５６日目には臨床転帰の予測因子であったが、一方絶対的ＣＤ３＋カウントは、その時点では情報を提供しなかった。さらに、移植後１００日目では、多様性は、ＣＤ３＋カウントよりも有意に臨床転帰に相関した。再発のみにより死亡した６名の患者のレパートリーもまた分析した。絶対的ＣＤ３カウントもＴＣＲレパートリー多様性も、このコホートにおける再発による死亡を予測しなかった。
移植後５６日目および１００日目における、ＣＤ３＋（全Ｔ細胞）カウントおよび推定ＴＣＲレパートリーサイズの比較。
【表３】
0006449160.tif 000007
【０２０３】
各メトリクスの数は、高い（平均以上の）カテゴリーまたは低い（平均未満の）カテゴリーに含まれる非再発死亡の数（ｎ＝６）を表す。右側には、片側マン−ホイットニーＵ検定のｐ値が示されている。全Ｔ細胞カウントは、移植後５６日目では臨床転帰を予測せず、移植後１００日目では、推定ＴＣＲレパートリーサイズよりも弱い臨床転帰の予測因子であった。
【０２０４】
ＧＶＨＤ処置および全ＣＤ３＋カウントに加えて、ＴＣＲ多様性測定の臨床転帰との相関はまた、任意の数の他の変数により引き起こされた可能性がある。表３は、５６日目まで生存したが、最終的に再発以外の原因により死亡した６名の患者の、５６日目において生存していた２５名の他の患者に対する比較を示す。ＴＣＲ多様性メトリクスと同様の様式で、これらの群の間でいくつかのメトリクスを評価した（カテゴリーデータに対してはフィッシャーの正確確率検定を使用し、連続データに対してはマン−ホイットニーＵ検定を使用した）。いずれも、このコホートにおいて統計的有意性に到達せず、多くはＮＲＭと全く関連しないようであった。６名のＮＲＭ患者は、他の患者よりも幾分高齢であり（ｐ＝０．０５１）、これは、媒介として機能するＴＣＲ多様性を有する、または有さない、ＮＲＭとの弱い相関を示し得る。これらの結果は、ＴＣＲレパートリー多様性が非再発死亡率の統計的に有意な予測因子であるこのコホートにおいて、非再発死亡率が、我々が試験した他の変数のいずれによっても容易に予測され得なかったことを示している。
【０２０５】
本試験は、有害な臨床転帰、特に骨髄破壊的臍帯血移植を受けている患者における感染性合併症の増加したリスクに関連する、免疫再構成の直接的なＴＣＲ配列ベースの尺度を使用した。ＣＢＴの受容者は、造血および免疫回復の遅延の増加したリスクを有し、これらの患者の全生存率の改善は、好中球および免疫系回復の反応速度を向上させ得る戦略に依存していた。造血回復の直接的尺度は、単純であり、完全血球カウントを得ることにより十分確立されている。しかしながら、特に、Ｔ細胞数と対照的に、Ｔ細胞機能に関する免疫系回復の直接的な尺度は、本開示以前にはなかった。したがって、ＧＶＨＤの予防および処置のための医薬に関して、標準治療がある。しかしながら、全ての患者が等しく移植後に合併症を発症するリスクを有するわけではなく、全ての患者が等しく医学的介入に反応するわけではない。ＩｍｍｕｎｏＳｅｑ（商標）アッセイを使用した本明細書に記載のような免疫回復の新規な測定は、患者が感染によるＮＲＭのより高いリスクを有すると特定された場合、抗菌的予防に関してだけでなくＩＳＴの管理に関しても、個々の患者の医学的管理の調整を可能にする。このリスクの直接的な尺度は、医学的管理を劇的に変化させる。
【０２０６】
ここで、３４名の患者のコホートにおいて、ハイスループットＴ細胞受容体配列決定を使用した免疫再構成の測定と非再発死亡率との間に有意な相関が実証された。循環Ｔ細胞におけるＴＣＲ再配列の低い多様性により測定されるような免疫再構成の遅延が、患者を感染性疾患による合併症の高いリスクにさらすという理解は、この結果と一致している。これらの結果は、ＣＤ３＋細胞カウントにより、または小コホートにおいて測定されたいくつかの他の変数のいずれかにより自明には再現され得ない。この結果は、全Ｔ細胞内コンパートメントを分析することにより得られたが、免疫再構成の反応速度論および臨床的意義は、Ｔ細胞サブセット間（例えば、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞）で異なることが知られている５。したがって、ＨＴＳを使用したＴ細胞サブセットの再構成の調査は、追加的な洞察を提供し得る。
【０２０７】
この結果は、高いＴＣＲ多様性が、骨髄破壊的臍帯血移植を受けている患者から採取された血液試料においてより良好な転帰と関連することを示した。したがって、ＴＣＲ多様性は、将来の感染性合併症のリスクに基づいて、移植後すぐに患者を階層化するための極めて有用な尺度である。したがって、患者が移植後２ヶ月から３ヶ月までにＴＣＲ多様性の閾値に達しなかった場合、その患者は、耐容可能なようにＩＳＴをより速く中止することから恩恵を受けることができ、および／または、抗菌予防によってより積極的に処置され得、および／または、免疫再構成が十分なレベルに到達するまでより長期間観察下に維持され得る。本試験において、低下したＴＣＲ多様性は、数ヶ月非再発死亡に先行することを考慮して、この目安は、そのような予防的対策のための十分な時間を可能とするはずである。しかしながら、高リスク患者の特定に加えて、ここで説明される免疫再構成の確実な測定は、各患者に対し同じ期間の投薬計画を施すのではなく、患者が予防的処置を中止するのに十分な免疫再構成を達成した時期を決定するのを助けることができる。
【０２０８】
（第２実施形態）
実施例２：免疫治療反応者の予測因子としてのＴ細胞受容体レパートリー分布
免疫治療の開始前および開始後にＣＴＬＡ−４阻害剤またはＰＤ−１阻害剤を受容する候補であるがん患者から得られた血液および固形腫瘍試料において、Ｔ細胞受容体多様性および分布を上述のように決定した。各免疫治療薬剤の効能は、標準的な腫瘍学的臨床基準（対象を反応者または非反応者として分類する）により独立して評価され、各患者の適応免疫系の免疫治療に有益に反応する相対的能力は、免疫治療前のＴＣＲレパートリーの分布の修正されたエントロピー計算により予測されることが示された。
【０２０９】
免疫治療（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）の開始前、反応者は、非反応者に比べて、血液および腫瘍試料中に存在するリンパ球における比較的より高いＴＣＲ配列多様性、およびより平坦なＴＣＲ分布プロファイルとして観察されるより高いＴＣＲ配列分布エントロピーを示した。
【０２１０】
図６に示されるように、血液試料からのＴＣＲコードＤＮＡの定量的配列決定の結果は、より高いＴＣＲ配列多様性およびより高いＴＣＲ配列分布エントロピーを示す低いＴＣＲレパートリークローン性が、免疫治療（抗−ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）反応者状態の予測因子であったことを示している。図６はまた、より低いＴＣＲ配列多様性およびより低いＴＣＲ配列分布エントロピーを示す高いＴＣＲレパートリークローン性が、免疫治療非反応者状態の予測因子であったことを示している。
【０２１１】
図７は、腫瘍組織試料からのＴＣＲコードＤＮＡの定量的配列決定からの結果を示す。図７は、免疫治療（ＡＴ）前に得られた腫瘍試料において検出されたＴＣＲクローン性のレベルと比較した、免疫治療（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）（ＤＴ）を施した後に得られた固形腫瘍組織試料中に存在するリンパ球におけるＴＣＲクローン性の増加を示している。試料は、反応者対象から得られた。図７は、免疫治療処置が、対象のＴ細胞レパートリーに顕著な影響を与えたことを示している。
【０２１２】
図８において、個々のＴＣＲクローン提示の動力学が、免疫治療（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）による処置）前および免疫治療後に得られた血液試料および腫瘍試料において、時間の関数として調査されている。時点Ａ、Ｂ、およびＣは、血液試料から採取された時点である。時点Ａは、免疫治療前であり、時点ＢおよびＣは、免疫治療計画開始後の２つの時点である。時点ＡＴ、ＢＴ、ＣＴは、対化腫瘍試料である（ＡＴは免疫治療前であり、時点ＢＴおよびＣＴは、免疫治療計画開始後の２つの時点である）。データ点の各線は、単一クローンに従う。時点ＣＴにおける矢印は、治療前はその相対的存在度において顕著ではなかったが、治療後に腫瘍試料において相対的頻度が増加し、時点ＣＴにおいてレパートリーの１０％を占めた単一クローンを示す。時点ＡおよびＢにおいて血液中でそれぞれＴＣＲ配列の７〜９％を占めた２つのクローン（Ｘ１およびＸ２）は、その後、相対的存在度において有意に低下し、一方、血液中で始めは非常に低い頻度を有していたいくつかのＴ細胞受容体配列は、時点Ｃまでに有意に増加した。時点Ａにおける腫瘍試料中の３つの最も多数のクローンは、後の時点において決定されるように、その後の相対的提示において有意に減少した。
【０２１３】
図６〜８で使用されたのと同じ免疫治療薬剤を使用した別個の試験において、ＴＣＲ配列多様性および分布エントロピーを、免疫治療の開始前（時点Ａ）ならびに開始後（時点ＢおよびＣ）に得られた血液試料において決定した。結果は、経時的な個々のＴＣＲクローン提示の動力学を示す図９に要約される。矢印は、免疫治療前は高度に提示されなかったが、治療後に有意性が増加し、時点Ｃにおいてレパートリーの１０％超を占めた単一クローンを示す。
【０２１４】
図８および９において示されるように、免疫治療の副作用は、単一またはいくつかのクローンの発生頻度が、レパートリーにおける他のクローンの発生頻度よりも統計的に有意に高くなるような、対象の血液中の単一またはいくつかのクローンの増殖となり得る。いくつかの実施形態において、単一クローンの発生頻度は、所定の閾値よりも高く、例えばレパートリーにおけるクローンの発生頻度の上位４分の１より高く決定される。図８および９において、免疫治療処置後のレパートリーの１０％超を占める単一クローンは、統計的に有意に異なり、対象による不良な反応の指標である。例えば、免疫治療前の発生頻度における１％未満のクローン頻度、およびレパートリーにおける発生頻度の１％超までの頻度のスパイクは、対象における不良な転帰の指標である。これは、単一クローンの増殖（高いクローン性）およびレパートリーの低い多様性の状況を与え、不良な反応および転帰をもたらす。単一またはいくつかのクローンがレパートリーと比較して統計的に有意により高い発生頻度を示す状況においては、免疫反応（例えば炎症等）を低下させるためのコルチコステロイドまたは免疫抑制剤の使用を含む、対象の処置の調節を行うことができる。
【０２１５】
（第３実施形態）
実施例３：免疫治療反応の予測因子としてのＴ細胞受容体クローン性。
別の例において、免疫治療（抗ＰＤ−１抗体による処置）を受けている末期転移黒色腫患者において、ＴＣＲＢ遺伝子座のハイスループット配列決定を使用して試験を行い、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のレパートリーを特性決定した。この試験の目標は、処置前腫瘍生検の（ＴＣＲＢ配列決定による）免疫学的プロファイリングを使用して、ハイスループット配列決定による腫瘍内Ｔ細胞レパートリーの特性決定が、臨床的転帰（すなわち、薬物反応）を予測するのに十分であるかどうかを決定することであった。
【０２１６】
免疫治療の開始前にＰＤ−１阻害剤（ラムブロリズマブ）を受容する候補である転移黒色腫患者から得られた固形腫瘍試料において、Ｔ細胞受容体多様性および分布を決定した。ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである１型膜タンパク質であり、Ｂ細胞分化において役割を果たすと考えられている。
【０２１７】
免疫治療処置の効力は、標準的な腫瘍学的臨床基準により独立して評価された。対象は次のように特性決定された：反応者（患者腫瘍負荷の低減を示す「部分的反応」および腫瘍負荷の低下のない進行の喪失を示す「安定な疾患」に分類される）または非反応者（継続的な疾患の進行）。免疫治療に対して有益に反応する各患者の適応免疫系の相対的能力は、免疫治療前のＴＣＲレパートリーの分布の修正されたエントロピー計算により予測されることが示された。
【０２１８】
修正されたエントロピー計算（「クローン性」）が使用され、各腫瘍試料において観察された一意のＴＣＲ再配列の数を考慮することにより、その腫瘍試料のＴＣＲ配列分布エントロピーが範囲（０〜１）に正規化され、高い正規化エントロピーが低いクローン性となるように、またその逆となるように反転された。免疫治療の開始前、免疫治療に反応する患者は、非反応者に比べて、腫瘍生検試料中に存在するリンパ球において比較的より高いＴＣＲ配列分布クローン性を示した。
【０２１９】
簡潔に説明すると、悪性病変生検からの凍結組織試料が、抗ＰＤ−１抗体（転移黒色腫に罹患した患者に対し免疫治療薬剤として投与される）の投与前の１２名の患者に対して調製された。組織試料（黒色腫病変からの生検）はまた、抗ＰＤ−１免疫治療中および治療後に採取された。その後、ゲノムＤＮＡがこれらの組織試料から抽出された。ハイスループットＴＣＲＢ配列決定のためのＩｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォームを使用して、各試料におけるＴＩＬのレパートリーを特性決定し、（１）腫瘍内リンパ球浸潤の程度、および（２）腫瘍内リンパ球レパートリーのクローン構造を決定した。
【０２２０】
試験した１２名の患者のうち、８名が処置に反応し（疾患の安定化または部分的反応）、一方４名は反応しなかった（疾患の進行）。凍結腫瘍組織生検からのＴＣＲコードＤＮＡの定量的配列決定の結果は、図１０Ａに示される。
【０２２１】
図１０Ａは、少数の高度増殖Ｔ細胞クローンにより特徴付けられるＴＣＲレパートリーを示す、高い腫瘍内ＴＣＲレパートリークローン性（低いＡＩＲ配列多様性）が、この１２名の患者のコホートのレトロスペクティブ試験における免疫治療反応者状態の統計的に優位な予測因子であったことを示している。ＴＣＲレパートリークローン性の平均および標準偏差（各試料中に存在する一意のＴＣＲ配列の数を考慮することにより範囲（０〜１）に正規化されたＴＣＲ配列分布エントロピーに基づく修正されたメトリクス）が、免疫治療に対する反応に従い示されている。ＴＣＲ配列分布クローン性は、反応しなかった４名の患者と比較して、反応した８名の患者において有意により高かった（両側の対応のないｔ検定によりｐ＝０．０１５）。
【０２２２】
図１０Ｂにおいて、Ｔ細胞浸潤が１２名の患者のコホートにおいて評価された。Ｔ細胞浸潤の平均および標準偏差（２倍体ゲノム当たりのＴ細胞受容体再配列として測定される）は、免疫治療に対する反応に従い示されている。Ｔリンパ球浸潤のレベルは、反応しなかった４名の患者と比較して、反応した８名の患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定によりｐ＝０．０５６）。
【０２２３】
第１のコホート（処置前および処置後腫瘍生検のない１２名の患者）からのデータは、処置前腫瘍生検からの２つの因子（低レベルのＴ細胞浸潤および極めて多様性の浸潤Ｔ細胞レパートリー）が、処置に反応しないこと（すなわち、安定または改善している疾患状態とは対照的に進行すること、図１０Ａ、１０Ｂ）に関連することを示唆していた。
【０２２４】
第２の試験において、１３名の追加的患者の確認コホートが評価され、処置前腫瘍生検のみが配列決定された。図１１Ａにおいて、ＴＣＲレパートリークローン性および免疫治療への反応が、コホート１、２、および組み合わされたコホートに対して評価された。ＴＣＲレパートリークローン性の平均および標準偏差（各試料中に存在する一意のＴＣＲ配列の数を考慮することにより範囲（０〜１）に正規化されたＴＣＲ配列分布エントロピーに基づく修正されたメトリクス）が、コホート１（無地の四角）、コホート２（斜線縞模様の四角）および組み合わされたデータ（水平線縞模様の四角）における免疫治療に対する反応に従い示されている。ＴＣＲ配列分布クローン性は、反応しなかった患者と比較して、反応した患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定により、組み合わされたデータにおいてｐ＝０．０００６５）。
【０２２５】
図１１Ｂにおいて、Ｔ細胞浸潤は、患者群において評価された。コホート１（無地の四角）、コホート２（斜線縞模様の四角）および組み合わされたデータ（水平線縞模様の四角）における免疫治療に対する反応に従い、Ｔ細胞浸潤の平均および標準偏差（２倍体ゲノム当たりのＴ細胞受容体再配列として測定）が示されている。Ｔリンパ球浸潤のレベルは、反応しなかった患者と比較して、反応した患者においてより高かった（両側の対応のないｔ検定により、組み合わされたデータにおいてｐ＝０．００１５）。
【０２２６】
図１１Ｃは、Ｔ細胞浸潤およびＴＣＲレパートリークローン性のレベルに関する、（全２５名の患者のうちの）各患者のランクの比較を示す。反応者（菱形）と比較して、非反応者（丸）は、低いＴＣＲレパートリークローン性および低レベルの浸潤Ｔリンパ球への傾向を同時に示す。
【０２２７】
１３名の患者の第２のコホートからのデータは、１２名の患者のコホートからの最初のデータと完璧に近い一致を見せた（図１１Ａ〜Ｃ）。しかしながら、これらのデータは共に、免疫治療前の黒色腫生検におけるＴ細胞浸潤物の配列決定の結果が、免疫治療に対する患者の反応に極めて相関しており、患者毎に免疫治療の効果を予測するための潜在的バイオマーカーを提供することを示している。
【０２２８】
上述の様々な実施形態は、組み合わされてさらなる実施形態を提供し得る。本明細書において参照される、および／または出願データシートにおいて列挙される、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献は全て、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、様々な特許、出願および出版物の概念を使用してさらなる実施形態を提供するために、必要に応じて修正され得る。これらの、および他の変更は、上で詳述された説明に照らして実施形態に対し行うことができる。
【０２２９】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に制限するものとして解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の対象となる全範囲の均等物と共に、全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。
参考文献
１．  Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ＭＪ，  Ｅａｐｅｎ  Ｍ，  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｐ．  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｒｏｍ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００４；３５１：２２６５−２２７５．
２．  Ｗａｇｎｅｒ  ＪＥ，  Ｂａｒｋｅｒ  ＪＮ，  Ｄｅｆｏｒ  ＴＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｉｎ  １０２  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３４  ｃｅｌｌ  ｄｏｓｅ  ａｎｄ  ＨＬＡ  ｄｉｓｐａｒｉｔｙ  ｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ−ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００１；１００：１６１１−１６１８．
３．  Ｒｏｃｈａ  Ｖ，  Ｃｏｒｎｉｓｈ  Ｊ，  Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＥＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：２９６２−２９７１．
４．  Ｇｒｅｗａｌ  ＳＳ，  Ｂａｒｋｅｒ  ＪＮ，  Ｗａｇｎｅｒ  ＪＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ｍａｒｒｏｗ  ｏｒ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ？  Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０１：４２３３−４２４４．
５．  Ｒｏｃｈａ  Ｖ，  Ｌａｂｏｐｉｎ  Ｍ，  Ｓａｎｚ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ−ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｒｏｍ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００４；３５１：２２７６−２２８５．
６．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＢＧ，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＫＡ，  Ｇｏｗａｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ，  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ−ｄｉｓｅａｓｅ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ    ２０００；９６：２７０３−２７１１．  
７．  Ｂａｒｋｅｒ  ＪＮ，  Ｈｏｕｇｈ  ＲＥ，  ｖａｎ  Ｂｕｒｉｋ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｒｉｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  １３６  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００５；１１：３６２−３７．
８．  Ｍｅｒｉｎｄｏｌ  Ｎ，  Ｃｈａｒｒｉｅｒ  Ｅ，  Ｄｕｖａｌ  Ｍ，  Ｓｏｕｄｅｙｎｓ  Ｈ．  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．  Ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｍａｒｃｈ  ２ｎｄ，  ２０１１．
９．  Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ＣＧ，  Ｂａｒｋｅｒ  ＪＮ，  Ｗｅｉｓｄｏｒｆ  ＤＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  １１０  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００７；１１０（８）：３０６４−３０７０．
１０．  Ｃｏｒｎｅｔｔａ  Ｋ，  Ｌａｕｇｈｌｉｎ  Ｍ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （ＣＯＢＬＴ）．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  ２００５；１１：１４９−１６０．
１１．  Ｌｏｎｇ  ＧＤ，  Ｌａｕｇｈｌｉｎ  Ｍ，  Ｍａｄａｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  ２００３；９：７７２−７８０．
１２．  Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ，  Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ  ＶＡ．  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ｂａｓｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２００８；１２７：２８６−２９７．
１３．  Ｓａｕｔｅｒ  Ｃ，  Ａｂｂｏｕｄ  Ｍ，  Ｂａｒｋｅｒ  ＪＮ，  ｅｙ  ａｌ．  Ｓｅｒｉｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｕｎｉｔ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  ２０１１；１７：１４６０−７１．
１４．  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｅｌ  Ｋｈｏｕｒｏｕｊ  Ｖ，  Ｄａｌｌｅ  ＪＨ，  Ｐｅｄｒｏｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡｅｍｉａ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１１；１７：４７６−８５．
１５．  Ｔｏｒｍｏ  Ｎ，  Ｓｏｌａｎｏ  Ｃ，  Ｂｅｎｅｔ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ａｎｄ  ＩＥ−１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩＦＮ−γ  ＣＤ８（＋）  ａｎｄ  ＣＤ４（＋）  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｆｏｒｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＣＭＶ  ＤＮＡｅｍｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ＳＣＴ．  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，  ２０１１．
１６．  Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  Ｄ，  Ｓｍｉｔｈ  ＴＬ，  Ｆｏｌｌｏｄｅｒ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９９；９４：１４６５−１４７０．
１７．  Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ  Ｍ，  Ｓｔｏｒｅｒ  ＢＥ，  Ｂｏｅｃｋｈ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｉｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１３：２８８８−２８９４．
１８．  Ｎａｋａｍａｅ  Ｈ，  Ｋｉｒｂｙ  ＫＡ，  Ｓａｎｄｍａｉｅｒ  ＢＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｏｎ  ＣＭＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００９；１５：６９４−７０３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006449160.tif 000018
【図１１Ａ】
0006449160.tif 000019
【図１１Ｂ】
0006449160.tif 000020
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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