(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)  前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号:4、2、3又は6と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)  病原体の抗原又は腫瘍関連抗原と、
(d)  C末端アミノ酸がアラニンである配列番号:13のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)  前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
前記核外移行シグナルは、前記抗原と前記小胞体リテンション配列との間、又は、前記トランスロケーションペプチドと前記抗原との間に位置し、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-１)、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、ブタコレラウイルス(CSFV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、伝染性気管支炎ウイルス及び伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
更に、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん及び肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも１つである、融合タンパク質。
【請求項２】
前記病原体の抗原は、PCV2 ORF2、CSFV E2及びヒトパピローマウイルス（HPV）E7タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記PCV2 ORF2タンパク質は、配列番号20のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記病原体の抗原は、配列番号20と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記CSFV E2タンパク質は、配列番号21のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記病原体の抗原は、配列番号21と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗原は、口蹄疫ウイルスタンパク質VP1（FMDV VP1）及び口蹄疫ウイルスタンパク質3A（FMDV 3A）の融合抗原である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合抗原は、配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合抗原は、配列番号24と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗原は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）Fペプチドとニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（NDV HN）タンパク質との融合抗原である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合抗原は、配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合抗原は、配列番号27と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記HPV E7タンパク質は、配列番号28のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記病原体の抗原は、配列番号28と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原は、病原体由来の2以上の抗原ペプチドの融合抗原である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)  前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する配列番号:4、2又は3と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する長さ34-61のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)  病原体の抗原又は腫瘍関連抗原と、
(d)  配列番号:13のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)  前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を含み、
前記核外移行シグナルは、前記抗原と前記小胞体リテンション配列との間、又は、前記トランスロケーションペプチドと前記抗原との間に位置し、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-１)、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、ブタコレラウイルス(CSFV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、伝染性気管支炎ウイルス及び伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
更に、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん及び肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも１つである、融合タンパク質。
【請求項１７】
前記病原体の抗原は、PCV2 ORF2、CSFV E2及びヒトパピローマウイルス（HPV）E7タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項16に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗原は、口蹄疫ウイルスタンパク質VP1（FMDV VP1）と口蹄疫ウイルスタンパク質3A（FMDV 3A）の融合抗原又はニューカッスル病ウイルス（NDV）Fペプチドとニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（NDV HN）タンパク質との融合抗原である、請求項16に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項1に記載の融合タンパク質とアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項２０】
請求項16に記載の融合タンパク質とアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項２１】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)  前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する配列番号:4、2又は3と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する長さ34-61のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)  病原体の抗原と、
(d)  配列番号:13のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)  前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
前記核外移行シグナルは、前記抗原と前記小胞体リテンション配列との間、又は、前記トランスロケーションペプチドと前記抗原との間に位置する、
融合タンパク質。
【請求項２２】
病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導させるために使用する、請求項21に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、融合タンパク質及び免疫学に関する。
【０００２】
発明の背景
分子生物学は、サブユニットワクチンの生産を可能にした。免疫原は、親タンパク質又は複合体の断片又はサブユニットである。T細胞感作反応を誘導することができ、病原菌の多くの株由来の配列を組み込むのに十分な柔軟性がある安定ワクチンの開発が望まれている。
【０００３】
一つの態様では、本発明は、融合タンパク質であって、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)  上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号:4、2、3又は6と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)  上記トランスロケーションペプチドのC末端に位置する病原体の抗原と、
(d)  配列番号:13のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)  上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含む融合タンパク質に関する。
【０００４】
本発明の一実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、配列番号:1及び8-11からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペチドである。
【０００５】
本発明の別の実施形態において、核外移行シグナルは、配列番号:14のアミノ酸配列を含む。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、小胞体リテンション配列は、配列番号:15のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、核外移行シグナルは、トランスロケーションペプチドと抗原との間に位置する。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、核外移行シグナルは、抗原と小胞体リテンション配列との間に位置する。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、核外移行シグナル及びERリテンション配列は、配列番号:12と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む融合ペプチドを形成する。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドは、長さ34-61のアミノ酸残基を有する。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドは、長さ34-46のアミノ酸残基を有する。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を有していない。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、配列番号:8のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号:1である。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、抗原は、病原体由来の2又は3以上の抗原ペプチドの融合抗原である。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、ERリテンション配列は、長さが4つを超えるアミノ酸残基を有する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドは、配列番号:4、2、3又は6と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、樹状細胞、単核細胞、B細胞及びリンパ球からなる群より選択される抗原提示細胞(APC)上の受容体を認識及び結合するする特性を示す。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、病原体は、PRRSV、PCV、FMDV、CSFV、NDV、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス(Prvovirus)、仮性狂犬病ウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、感染性気管支炎及び感染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、融合タンパク質であって、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)  上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する配列番号:4、2、3又は6と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)  上記トランスロケーションペプチドのC末端に位置する病原体の抗原と、
(d)  配列番号:13のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)  上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列、からなる又はから実質的になる。
【００２１】
更に別の態様においては、本発明は、上記融合タンパク質とアジュバントを含むワクチン組成物に関する。
【００２２】
更に別の態様においては、本発明は、治療的有効量の前記融合タンパク質を含むワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するステップを含む、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導する方法に関する。
【００２３】
本発明は、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するために使用する、又は、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導する医薬品の製造において上記融合タンパク質を使用する、上記融合タンパク質又はワクチンの組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1Aは、全長シュードモナス‐アエルギノーザエキソトキシンA(PE)及びPEの部分的な断片を示している概略図である。図1B-Cは、ベクター図を示している。
【図２−５】図2-5は、高められたCD8+/IFN-γ + T細胞性(図2A-5A)及びをCD4+/IFN-γ + T細胞性(図2B-5B)免疫原性の向上をそれぞれ誘導する本発明の融合タンパク質を示しているグラフである。
【図６−８】図6は、動物を免疫化するために使用する動物群、ワクチン及び用量、並びに、免疫化スケジュールを示す。図7-8は、それぞれ、様々な融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた動物の群における腫瘍サイズ曲線及び腫瘍がないマウスのパーセンテージを示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の実施例に特に記載されている。多数の変更形態及びバリエーションが当業者にとって明らかであるため、実施例は、説明のためであることを意図している。以下、本発明の様々な実施形態の詳細について説明する。図面に関して、同じ番号は、図全体にわたって、同じ構成要素を示す。本願明細書及び添付の請求項全体に渡る記述において使用している通り、「a」、「an」及び「the」の意味は、文脈において別途明確に示していない限り、複数を含む。また、本願明細書及び添付の請求項全体に渡る記述において使用している通り、「in」の意味は、文脈において別途明確に示していない限り、「in」及び「on」を含む。更に、表題又は副題は、読者の便宜のために明細書において使用されているが、本発明の範囲に対する影響を及ぼすものではない。加えて、この明細書において使用するある種の用語は、下でより詳しくは規定される。
【００２６】
定義
この明細書において使用する用語は、一般的に、本発明の背景内の技術分野、及び、各用語が使用されている特定の文脈における通常の意味を有する。本発明を説明するために用いるある種の用語は、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供するために、以下、又は、別途明細書中にて説明する。便宜上、ある種の用語は、例えば、イタリック及び/又は引用符を使用して、強調されているだろう。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に対する影響を与えない。用語の範囲及び意味は、それが強調されていようといまいと、同じ文脈において同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、代替の言葉及び同義語を、本願明細書において述べられる任意の1又は複数の用語のために用いることができるが、本願明細書において詳しく述べている又は議論されているか否かによって与えられる任意の特別は用語はない。ある種の用語の同義語は、提供される。1又は複数の同義語の記載は、他の同義語の使用を排除しない。この明細書における例示(本願明細書に記載の任意の用語の例示を含む)の使用は、解説のためだけにあり、本発明又は任意の例示用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書が提供する様々な実施形態に限定されない。
【００２７】
別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、一般的に、本発明が関係する当業者が理解するのと同じ意味を有する。不一致の場合は、定義を含む本書が支配的である。
【００２８】
「抗原提示細胞(APC)又は補助細胞」という用語は、それらの表面上の主要組織適合性複合体(MHC)と複合体を形成した外来抗原を提示する細胞を指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用しているこれらの複合体を認識することができる。これらの細胞は、抗原を処理して、それらをT細胞に提示する。主要なタイプの成熟抗原提示細胞は、樹状細胞(DC)、マクロファージ(これらは、CD4+でもあるため、HIVによる感染にも影響されやすい)、単核細胞及びある種のB細胞である。
【００２９】
「抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン」という用語は、抗原提示細胞(APC)に結合することができるドメイン(ポリペプチド)をいう。APC-結合ドメインは、配列番号:1及び8-11からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペチドであってもよい。APC-結合ドメインは、APC上の受容体を認識して結合するリガンドである。
【００３０】
分化抗原群91(CD91)は、細胞膜の受容体を形成し、受容体依存性エンドサイトーシスに関連するタンパク質である。
【００３１】
「PEt」という用語は、長さ34-112のアミノ酸残基を有するトランスロケーションペプチド(又は、トランスロケーションドメイン)をいう。PEtは、配列番号:2-4及び6と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、PEtのアミノ酸配列は、PEのa.a.280-a.a.313(配列番号:4)、a.a.268-a.a.313(配列番号:3)、a.a.253-a.a.313(配列番号:2)又はa.a.253-a.a.364(配列番号:6)の断片であってもよい。即ち、これが、a.a.280-a.a.313(配列番号:4)必須配列(即ち、必須断片)を含む限り、PEtのアミノ酸配列は、PEドメインII(a.a.253〜a.a.364;配列番号:6)の任意の領域を含むことができる。
【００３２】
PE407(配列番号7)は、PE(ΔIII)として、先行特許(US7,335,361B2)に記載されている。
【００３３】
「ミニマムトランスロケーションペプチド」という用語は、PE253-313(配列番号2)を指すものであり、標的細胞の細胞質に抗原を転位させることができる。
【００３４】
「小胞体(ER)リテンション配列」という用語は、細胞質からERへの抗原のトランスロケーションを促進し、ERのルーメンの抗原を保持する機能のペプチドを指す。ERリテンション配列は、Lys Asp Glu Leu(KDEL;配列番号:15)又はRDEL配列を含む。ERリテンション配列には、配列KDEL、RDEL、KDELKDELKDEL(K3;配列番号:16)、KKDLRDELKDEL(K3;配列番号:17)、KKDELRDELKDEL(K3;配列番号:18)又はKKDELRVELKDEL(K3;配列番号:19)を挙げることができる。
【００３５】
核外移行シグナル(NES)は、核輸送を使用して、核孔複合体を通じ、細胞核から細胞質に輸送するための目標とするタンパク質中の4つの疎水性残基の短いアミノ酸配列を指す。NESは、エクスポーチンによって認識され、結合する。疎水性残基で最も一般的なスペーサーは、LxxKLxxLxLx(配列番号13)(「L」はロイシン、「K」はリシン及び「x」は天然アミノ酸)である。例えば、人工NESには、配列Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala(LQKKLEELELA;配列番号:14)を挙げることができる。
【００３６】
「NESK」という用語は、NES及びERリテンションシグナルの融合ペプチド(即ち、ERリテンションシグナルに融合したNES)を指す。これは、核外移行シグナル(NES)とERリテンション配列の機能を有する人工ペプチドである。従って、これは、核孔複合体を通じて細胞核から細胞質に抗原を輸送して、細胞質からERへの抗原のトランスロケーションを促進し、ERのルーメン中に抗原を保持することができる。例えば、NESKのアミノ酸配列は、LQKKLEELELAKDEL(配列番号:12)であってもよい。
【００３７】
抗原は、病原体によって引き起こされる疾患の原因となる、又は、病原体によって感染している宿主の免疫学的反応を誘導することができる病原性タンパク質、ポリペプチド又はペプチド、又は、具体的には、腫瘍細胞において特異的に発現したポリペプチドである腫瘍関連抗原(TAA)であってもよい。抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-１)、デング(Dangue)ウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、ブタコレラウイルス(CSFV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、伝染性気管支炎又は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がん及び任意のそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない病原体又はがん細胞から選択することができる。例えばHPV E7タンパク質(E7)、HCVコアタンパク質(HCV核)で、ある、HBV Xタンパク質(HBx)を、ワクチン開発のための抗原として選択した。抗原は、1又は複数の病原性タンパク質から選択される2以上の抗原の融合由来の融合抗原でもよい。例えば、PRRSV ORF6及びORF5断片の融合抗原又はPRRSV及びPCV2病原体由来の抗原タンパク質の融合が挙げられる。
【００３８】
「治療」又は「処置」という用語は、疾患、その症状又はその素因の治癒、緩和、軽減、救済、寛解又は予防の目的で、有効量の融合タンパク質を、それを必要とする対象(上記対象はがん又は感染、又はかかる疾患に対する症状又は素因を有する)に投与することを指す。かかる対象は、任意の適切な診断法からの結果に基づいて健康ケアの専門家によって同定することができる。
【００３９】
「有効量」という用語は、治療対象に治療効果を与える必要がある有効化合物の含量を指す。有効量は、当業者が認識しているとおり、他の治療薬との共同使用の可能性に応じて変化するだろう。
【００４０】
本発明は、抗原デリバリーを向上させて、細胞性免疫応答を調節するための融合タンパク質に関する。上記融合タンパク質は、(a) 融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、(b) APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置し、配列番号:2-4及び6と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、(c) トランスロケーションペプチドのC末端に位置する病原体の抗原と、(d) 核外移行シグナル(NES)と、(e) 融合タンパク質のC末端に位置する小胞体(ER)リテンション配列と、を有し、NESは、配列番号:13のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
一例として融合タンパク質PE313-ORF2-NESKを用いた方針は、本発明の融合タンパク質が抗原ブタサーコウイルスタイプ2(PCV2)カプシドタンパク質ORF2を認識することができるT細胞の生成と活性化を刺激するということである。融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、PEドメインI(APC-結合ドメイン)、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド(例えば、PEドメインIIのa.a.253-313)、(N末端核移行シグナルを除いて)切り詰めたPCV2 ORF2タンパク質、NESシグナル及びERリテンション配列(KDEL)を含む。PE313-ORF2-NESKによるORF2特異的T細胞免疫反応の向上を誘導する基礎メカニズムは、以下のステップを伴う:a) 樹状細胞(又は、抗原提示細胞)表面受容体(CD91)に結合するステップと、b) エンドサイトーシスによって内在化するステップと、c) ERに輸送して、トランスロケーションペプチドの前のフーリンによってタンパク質加水分解が生じるステップと、d) MHC I複合体によって加工されて提示されるステップと、e) 抗原特異的CD4+及びCD8+ T細胞を活性化するステップ。CD4+ Th1細胞は、細胞毒性CD8+ T細胞免疫反応を効率的に刺激して向上させることが可能である。共に、適応免疫系のこれらの2つのアームは、PCV2及びPCV2-感染細胞を殺す特異性及び力価を有する。
【００４２】
本願明細書における融合タンパク質PE313-ORF2-NESKは、いくつかの態様において、LaiのUS 7,335,361に開示される融合タンパク質ワクチンPE407-Ag-K3から識別可能である。第１に、PE313(配列番号:5)の長さは、PE407(配列番号:7)より短い94のアミノ酸残基であり、PEの余分な断片の存在によって誘導される不必要な体液性応答を最小限にするか無くす利点がある。第２に、ERリテンション配列が短い。K3(即ち、3つのKDER)の代わりに、1つのKDERだけ又はRDERは必要である。第３に、細胞内抗原だけが、MHC I型経路によって処理されて提示され得る。融合タンパク質へのNESシグナルの追加は、サイトゾルへの抗原のトランスロケーションの機会を増加させるため、病原体抗原特異的T細胞反応を向上させるのに有益である。病原体の抗原は、細胞核に輸送することができる。NESシグナルを組み込むことによって、細胞核に輸送される抗原は、融合タンパク質のNESシグナルによって細胞質に輸送することができる。
【実施例】
【００４３】
本発明の範囲を制限する意図なしに、本発明の実施形態による例示的な機器、装置、方法及びそれらの関連結果を以下に示す。表題又は副題は、読者の便宜のために実施例に使用しているが、本発明の範囲を決して制限してはならないことに注意されたい。更に、ある種の理論が提唱されており、本願明細書に開示している。しかしながら、正しいか間違っているかどうかに関係なく、任意の特定の理論又は作用のスキームに関係なく本発明によって実施される限り、本発明の範囲を決して制限してはならない。
【００４４】
実施例1
発現ベクターの構造
図1Aは、PEが3つのドメイン(I、II及びIII)を含むことを示している。PE407は、PEのa.a.1からa.a.407までの領域である。PE407は、細胞毒性ドメインIIIを含んでいないため、ドメインI及びIIを含む。PE313は、PEのa.a.1からa.a.313までの領域である。従って、PE313は、PEのドメインIa及びドメインIIの部分的なN末端領域だけを含む。
【００４５】
図1B-Cは発現ベクターの構造を示す。それぞれは、核外移行シグナル(NES)を有する(下側パネル)又は有さない(上側パネル)、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン、トランスロケーションペプチド、抗原；及び、融合タンパク質のC末端に位置する小胞体(ER)リテンション配列(上側パネル、K3又は下側パネル、K)を含む。プラスミドpTac-2-PE313-NESK、pTac-2-PE407-K3、pTac-2-RAP1-PE268-313-NESK及びpTac-2-RAP1-PE268-313-K3は、以下の通りに生成した：NdeIPE313-(EcoRI, XhoI)-NESK XhoI, NdeIPE407-(EcoRI, XhoI)-K3XhoI, NdeIRAP1-(EcoRI)-PE268-313-(EcoRI, XhoI)-NESKXhoI及びNdeIRAP1-(EcoRI)-PE268-313-(EcoRI, XhoI)-K3XhoI断片を、PCR法によって合成して、カナマイシン耐性遺伝子を有するpUC18主鎖に結合し、それぞれのプラスミドを得た。
【００４６】
次に、関心がある病原体の抗原又は融合抗原をエンコードしている標的DNAを上述したプラスミドに挿入すると、融合タンパク質の発現のための発現ベクターを生成することができる。例えば、それぞれ、ブタサーコウイルスタイプ 2(PCV2) ORF2(配列番号:20)、ブタコレラウイルス(CSFV) E2(配列番号:21)、口蹄疫ウイルス(FMDV) VP1-3A(配列番号:24)及びニューカッスル病ウイルス(NDV) FHN(配列番号:27)の抗原をエンコードしているDNA断片を合成してそれぞれプラスミドpTac-2-PE313-NESK及びpTac-2-PE407-K3に挿入して、以下の発現ベクターを生成した：(1) PE313-ORF2-NESK;(2) PE407-ORF2-K3;(3) PE313-E2-NESK;(4) PE407-E2-K3;(5) PE313-VP1-3A-NESK;(6) PE407-VP1-3A-K3;(7) PE313-FHN-NESK;及び(8) PE407-FHN-K3。ヒトパピローマウイルスタイプ16 E7(配列番号:28)の抗原をエンコードしているDNA断片を合成してそれぞれプラスミドpTac-2-PE407-K3、pTac-2-RAP1-PE268-313-NESK及びpTac-2-RAP1-PE268-313-K3に挿入して、以下の発現ベクターを生成した：(9) PE407-E7-K3、(10) RAP1-PE268-313-E7-NESK及び(11) RAP1-PE268-313-E7-K3。
【００４７】
実施例2
タンパク質発現
融合タンパク質の発現のためのプラスミド(1) PE313-ORF2-NESK;(2) PE407-ORF2-K3;(3) PE313-E2-NESK;(4) PE407-E2-K3;(5) PE313-VP1-3A-NESK;(6) PE407-VP1-3A-K3;(7) PE313-FHN-NESK;(8) PE407-FHN-K3;(9) PE407-E7-K3;(10) RAP1-PE268-313-E7-NESK及び(11) RAP1-PE268-313-E7-K3を含む大腸菌BL21細胞を、37℃で25ppmのカナマイシンを含有するルーリアベルターニブロスにてそれぞれ培養した。培養が初期対数期(A600=0.1から0.4)に達すると、誘導のためにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)を、0.5〜2mMの終濃度で加えた。細胞を、誘導の4時間後に回収して、-70℃で直ちに保存した。融合タンパク質を、既に述べられている尿素抽出によって精製し(Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507)、そして、4℃で一晩、50X体積のTNE緩衝液(50mMのトリス、50mMのNaCl及び1mMのEDTA)において透析方法によってリフォールディングした。リフォールディングタンパク質を、SDS-PAGE分析して、定量分析はブラッドフォードタンパク質アッセイキット(Pierce)を使用して行った。この結果から、ほとんどのリフォールディングタンパク質は還元条件下で単量体であることが示されたことから、融合タンパク質は容易にリフォールディングされ、凝集されなかったことが示された。
【００４８】
実施例3
PCV2サブユニットワクチン免疫原性アッセイ
マウスは、1週1回を3週間、リン酸アルミニウム(融合タンパク質の徐放のためのタンパク質吸着剤; 10%v/v)及び10μgのサポニン(キラヤサボンソウから抽出されるアジュバント)と共に40μgのPE313-ORF2-NESK又はPE407-ORF2-K3を含む0.1mlのPCV2サブユニットワクチンをs.c.注射を介してワクチン接種を受けた。コントロール群(プラセボ)は、融合タンパク質だけを含まず、アジュバントと共に注射した。全てのマウスは、最後の免疫の14日後に屠殺して、脾臓は回収した。脾細胞を単離して、16時間37℃、1μg/ml GolgiPlug(BD Pharmingen、サンディエゴ、CA)の存在下において組換え型ORF2タンパク質の有り無しで6ウェルプレート(108細胞/2ml/ウェル)で培養した。刺激した脾細胞を、FACScan緩衝液にて洗浄して、フィコエリトリン共役モノクローナルラット抗マウスCD8a及びAF700共役モノクローナルラット抗マウスCD4抗体で染色した。細胞を、製造業者(BD Pharmingen)の指示に従ってCytofix/Cytopermキットを用いて細胞内サイトカインを染色した。細胞内のIFN-γは、AF488共役ラット抗マウスIFN-γで着色して、免疫反応及びサイトカインレベルを測定した。Kaluza分析ソフトウェア(ベックマン・コールター製)を用いたガリオフローサイトメトリーを使用してフローサイトメトリー分析を実施した。
【００４９】
図2A-Bは、CD8及びCD４ポジティブIFN-γの数を示している。マウス由来の脾細胞中のT細胞は、それぞれ、プラセボ(融合タンパク質だけのないアジュバント)又は融合タンパク質によってワクチン接種した。ORF2によって刺激された脾細胞中のCD4+及びCD8+ T細胞によるIFN-γ生成は、細胞内染色によってフローサイトメトリーを介して検出した。棒グラフは、ORF2ペプチドによる刺激が有り(灰色の棒)無し(黒色の棒)で、各群由来のORF2特異的IFN-γ+ CD4+ T細胞(図2B)及びIFN-γ+ CD8+ T細胞(図2A)の数を示している。この結果から、PE313-ORF2-NESKによってワクチン接種を受けたマウスがPE407-ORF2-K3群によってワクチン接種を受けたマウスよりもORF2特異的CD4+ IFN-γ+及びCD8+ IFN-γ+Tの細胞がORF2ペプチドによって刺激されたことが示された。
【００５０】
実施例4
CSFVサブユニットワクチン免疫原性アッセイ
同じ免疫化スケジュール及び用量を用いて、マウスを、PE313-E2-NESK又はPE407-E2-K3を含むCSFVサブユニットワクチンを用いてワクチン接種をして、脾細胞を単離し、培養し、上述したフローサイトメトリー法によってアッセイした。但し、組換え型E2タンパク質を培地中に加えて脾細胞を刺激したことは除いた。
【００５１】
図3A-Bは、CD8及びCD４ポジティブIFN-γの数を示す。マウス由来の脾細胞におけるT細胞は、それぞれ、プラセボ(融合タンパク質だけのないアジュバント)又は融合タンパク質によってワクチン接種した。E2によって刺激された脾細胞中のCD4+及びCD8+ T細胞によるIFN-γ生成は、細胞内染色によってフローサイトメトリーを介して検出した。棒グラフは、E2ペプチドによる刺激が有り(灰色の棒)無し(黒色の棒)で、各群由来のE2特異的IFN-γ+ CD4+ T細胞(図3B)及びIFN-γ+ CD8+ T細胞(図3A)の数を示している。この結果から、PE313-E2-NESKによってワクチン接種を受けたマウスがPE407-E2-K3群によってワクチン接種を受けたマウスよりもE2特異的CD4+ IFN-γ+及びCD8+ IFN-γ+Tの細胞がE2ペプチドによって刺激されたことが示された。
【００５２】
実施例5
FMDVサブユニットワクチン免疫原性アッセイ
同じ免疫化スケジュール及び用量を用いて、マウスを、PE313-VP1-3A-NESK又はPE407-VP1-3A-K3を含むFMDVサブユニットワクチンを用いてワクチン接種をして、脾細胞を単離し、培養し、（組換え型VP1-3Aタンパク質を培地中に加えて脾細胞を刺激した点以外は、）上述したフローサイトメトリー法によってアッセイした。
【００５３】
図4A-Bは、CD8及びCD４ポジティブIFN-γの数を示す。マウス由来の脾細胞におけるT細胞は、プラセボ又は融合タンパク質によってワクチン接種した。VP1-3Aによって刺激された脾細胞中のCD4+及びCD8+ T細胞によるIFN-γ生成は、細胞内染色によってフローサイトメトリーを介して検出した。棒グラフは、VP1-3Aペプチドによる刺激が有り(灰色の棒)無し(黒色の棒)で、各群由来のVP1-3A特異的IFN-γ+ CD4+ T細胞(図4B)及びIFN-γ+ CD8+ T細胞(図4A)の数を示している。この結果から、PE313-VP1-3A-NESKによってワクチン接種を受けたマウスは、PE407-VP1-3A-K3群によってワクチン接種を受けたマウスよりもVP1-3Aペプチドによって刺激されたVP1-3A特異的CD4+ IFN-γ+及びCD8+ IFN-γ+Tの細胞を有していることが示された。
【００５４】
実施例6
NDVサブユニットワクチン免疫原性アッセイ
同じ免疫化スケジュール及び用量を用いて、マウスを、PE313-FHN-NESK又はPE407-FHN-K3を含むFMDVサブユニットワクチンを用いてワクチン接種をして、脾細胞を単離し、培養し、上述したフローサイトメトリー法によってアッセイした。但し、組換え型FHNタンパク質を培地中に加えて脾細胞を刺激したことは除いた。
【００５５】
図5A-Bは、CD8及びCD４ポジティブIFN-γの数を示す。マウス由来の脾細胞におけるT細胞は、プラセボ又は融合タンパク質によってワクチン接種した。FHNによって刺激された脾細胞中のCD4+及びCD8+ T細胞によるIFN-γ生成は、細胞内染色によってフローサイトメトリーを介して検出した。棒グラフは、FHNペプチドによる刺激が有り(灰色の棒)無し(黒色の棒)で、各群由来のFHN特異的IFN-γ+ CD4+ T細胞(図5B)及びIFN-γ+ CD8+ T細胞(図5A)の数を示している。この結果から、PE313-FHN-NESKによってワクチン接種を受けたマウスは、PE407-FHN-K3群によってワクチン接種を受けたマウスよりもFHNペプチドによって刺激されたFHN特異的CD4+ IFN-γ+及びCD8+ IFN-γ+Tの細胞を有することが示された。
【００５６】
実施例7
ヒトパピローマウイルスタイプ16E7タンパク質によって誘導された腫瘍成長の阻害の向上
融合タンパク質PE407-E7-K3、RAP1-PE268-313-E7-K3及びRAP1-PE268-313-E7-NESKは、上記方法と類似の方法を使用して発現させてリフォールディングさせた。s.c.注射を介して2×103のTC-01細胞(HPVタイプ16 E7遺伝子を含むマウス肺上皮細胞)をマウスに投与して、HPV-16タイプ上皮性悪性腫瘍を誘導した。TC-01細胞投与の12日後、1週1回を3週間、アジュバントとしてのAS04C(グラクソスミスクライン)と共に、プラセボ(PBS)、PE407-E7-K3(100mg/投与)、RAP1-PE268-313-E7-K3(100μg/投与)又はRAP1-PE268-313-E7-NESK(100μg/投与)をs.c.にてマウスにワクチン接種した(図6)。AS04Cは、細胞毒性Tリンパ球活性化アジュバントであり、MPL(モノホスホリルリピドA、免疫強化剤)及びリン酸アルミニウム(抗原デリバリーのためのタンパク質吸着剤)を含む。「K3」という用語は、KDELを含むERリテンション配列をいう。例えば、K3は、アミノ酸配列KDELKDELKDEL(配列番号:16)であってもよい。「NESK」という用語は、核外移行シグナル及びERリテンション配列を含む融合ペプチドをいう。本発明の一実施形態において、NESKは、アミノ酸配列LQKKLEELELAKDEL(配列番号:12)である。各群における腫瘍のサイズ及び腫瘍がない動物の数を記録した(図7及び8)。腫瘍成長は、アジュバントとしてのAS04Cを有するワクチンPE407-E7-K3、RAP1-PE268-313-E7-K3及びRAP1-PE268-313-E7-NESKによって著しく抑制された。しかしながら、ワクチンのRAP1-PE268-313-E7-NESKは、腫瘍成長を抑制して、腫瘍がない動物のパーセンテージを増加させることについて、PE407-E7-K3よりも優れており、RAP1-PE268-313-E7-K3よりも良好だった。
【００５７】
実施例8
以下の融合タンパク質を生成した：PE313-NES-抗原-K、PE1-252-PE268-313-NES-抗原-K、PE1-252-PE280-313-NES-抗原-K。加えて、融合タンパク質PE313-抗原-NESKのPEドメインIa(PE1-252)の断片は、RAP1ドメイン3(配列番号:8)A2Mミニマム(配列番号:9)、HIV-Tatミニマム(配列番号:10)又はHSPミニマム(配列番号:11)によって取り替えて、融合タンパク質RAP1ドメイン3-PE253-313-抗原-NESK、A2M-PE253-313-抗原-NESK、Tat-PE253-313-抗原-NESK及びHSP-PE253-313-抗原-NESK、RAP1ドメイン3-PE268-313-抗原-NESK、A2M-PE268-313-抗原-NESK、Tat-PE268-313-抗原-NESK及びHSP-PE268-313-抗原-NESKワクチン、RAP1ドメイン3-PE280-313-抗原-NESK、A2M-PE280-313-抗原-NESK、Tat-PE280-313-抗原-NESK及びHSP-PE280-313-抗原-NESK、RAP1ドメイン3-PE253-313-NES-抗原-K、A2M-PE253-313-NES-抗原-K、Tat-PE253-313-NES-抗原-K及びHSP-PE253-313-NES-抗原-K、RAP1ドメイン3-PE268-313-NES-抗原-K、A2M-PE268-313-NES-抗原-K、Tat-PE268-313-NES-抗原-K及びHSP-PE268-313-NES-抗原-Kワクチン、RAP1ドメイン3-PE280-313-NES-抗原-K、A2M-PE280-313-NES-抗原-K、Tat-PE280-313-NES-抗原-K及びHSP-PE280-313-NES-抗原-Kを生成する。これらのワクチンによって向上した細胞性免疫反応は、上記方法に類似の方法を使用して検討した。
【００５８】
表1は、様々な融合タンパク質を作るための使用するペプチドの配列番号を示す。
【表１】
0006449384.tif 000002
0006449384.tif 000003
*:太字は、人工核移行シグナルのアミノ酸配列を表す;下線文字は、小胞体リテンションシグナルのアミノ酸配列を表す。
**:VP1-3Aペプチドは、VP1のa.a.127 - a.a.176及び3Aのa.a.21-a.a.35、即ち、FMDV VP1ペプチド(配列番号: 22)及びFMDV 3Aペプチド(配列番号: 23)の融合で構成される融合抗原である。
***:FHNペプチドは、融合タンパク質のa.a.65-a.a.8及びヘマグルチニン-ノイラミニダーゼのa.a.101-a.a.111、即ち、NDV Fペプチド(配列番号: 25)及びNDV HNペプチド(配列番号: 26)の融合で構成される融合抗原である。
【００５９】
要約すると、この結果は、APC-結合ドメイン、トランスロケーションドメイン、その後の病原体の抗原、そして次に、C末端のNESKの融合ペプチドを含む融合タンパク質は、細胞性免疫応答を向上させる、腫瘍成長を抑制する、及び/又は、腫瘍がない動物のパーセンテージを増加させる観点から、カルボキシル末端のNESKの融合ペプチドがないPE-融合タンパク質に対して改良された設計である。
【００６０】
本発明の実施形態が図示及び記載されている一方、様々な変更及び改善については当業者がなすことができる。これは、本発明は、図示する特定の形態に限定されず、そして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱していない全ての変更は、添付の特許請求の範囲に記載の範囲にあることを意図している。
【００６１】
実施形態及び実施例は、本発明及びそれらの実用的な応用の原理を説明する目的で選択し記載しており、他の当業者が本発明及び各種実施形態を、予想される特定の用途に適している各種変更形態を伴って利用することができるようにしている。代わりの実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、関係する当業者にとって明らかになるだろう。従って、本発明の範囲は、ここで記載されている前述の記述及び例示的な実施形態よりは、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００６２】
特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得るいくつかの参考文献は、本発明の記述に引用され論じられている参考文献の引用又は議論は、単に本発明の記述を明確にするためだけに提供されているものであり、かかる任意の参考文献が本願明細書に記載の本発明に対する「先行技術」であるという自認でない。この明細書中で引用され議論されている全ての文献は、それらの全体が本願明細書に引用によって組み込まれており、各文献が引用によって個々に組み込まれているのと同程度に組込まれている。
【図１】
0006449384.tif 000004
【図２−５】
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【図６−８】
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【配列表】
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