(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーと、
配列番号５で表される３’末端をフルオレセインでラベルされたドナー色素プローブと、
配列番号６で表される５’末端をLCREDでラベルされているアクセプター色素プローブと、を有する、
HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)を検出する免疫介在性てんかんの診断キット。
【請求項２】
配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーと、
配列番号８で表される３’末端をフルオレセインでラベルされたドナー色素プローブと、
配列番号７で表される５’末端をLCREDでラベルされているアクセプター色素プローブと、を有する、
HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて、PDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)を検出する免疫介在性てんかんの診断キット。
【請求項３】
前記免疫介在性てんかんは、Rasmussen症候群、脳炎後てんかん、ランドウ−クレフナー症候群（Landau-Kleffner-syndrome）、又は、West症候群（点頭てんかん）の何れかである請求項１又は２に記載の免疫介在性てんかんの診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫介在性てんかんの診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の中には、感染症・ワクチン接種などを契機に自己免疫的機序が駆動され、自己抗体、自己分子をターゲットとする細胞傷害性T細胞、炎症性サイトカイン産生T細胞などが働いて発病する疾患が存在する。これらの疾患の多くは難治で進行性であり、年余にわたり患者QOLを大きく損なうため、早期診断法の確立、治療法の確立、素因保有者における感染・ワクチン後の発病予防の確立が望まれている。
【０００３】
免疫は免疫調節遺伝子と呼ばれる遺伝子によりコントロールされ、自己を攻撃する免疫（自己免疫）が抑制されている。免疫調節遺伝子のひとつであるCTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) はCD152 (Cluster of differentiation 152)とも呼ばれ、T細胞免疫を抑制的に制御する細胞表面蛋白として知られている。その重要性はCTLA4を欠損したマウスが致死的な炎症細胞浸潤を認めること、CTLA4遺伝子の多型性が糖尿病１型・橋本病などの自己免疫疾患と関連があること、CTLA4を阻害する抗体が悪性腫瘍に有効なことから示されている。Rasmussen症候群の研究では、CTLA4遺伝子全長の遺伝子解析の結果、exon 1 +49のSNP（rs231775）が有意に多く、CTLA4の転写・翻訳に影響し、CTLA4蛋白の発現量を低下させ、T細胞免疫の抑制的制御が低下している可能性を報告した（非特許文献１）。
【０００４】
exon 1 +49のSNP がA/AのT細胞とG/GのT細胞を比較すると、G/GではT細胞活性化刺激に対するCTLA4蛋白の増加反応が弱く、細胞内での分布もA/AのT細胞が均一であるのに対し、G/G は不均一であるという報告がある（非特許文献２）。よって、G/GではCTLA4活性が上昇しにくく、感染後のT細胞活性化状態が終息しないことにつながり得る。このデータをもとに、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)を含む免疫介在性てんかんの診断のためのSNPマーカーが出願されている（特許文献１）。
【０００５】
免疫調節遺伝子のひとつであるPDCD1 (programmed cell-death 1)はCD279(Cluster of differentiation 279)とも呼ばれ、T細胞免疫を抑制的に制御する細胞表面蛋白として知られている。その重要性はPDCD1を欠損したマウスが実験アレルギー脊髄炎という自己免疫性疾患を起こしやすいという報告、PDCD1を強制発現すると糖尿病１型が起こりにくくなるという報告に示されている。Rasmussen症候群の研究では、PDCD1遺伝子全長の遺伝子解析の結果、Exon5のAla215Val変異SNP(rs2227982)が有意に多く、このSNPがPDCD1の細胞内ITIM、ITSM近傍にあって、チロシンとSHP-2との会合に影響し、PI3Kの脱リン酸を低下させ、T細胞機能抑制を低下させている可能性がある。このデータをもとに、PDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)を含む免疫介在性てんかんの診断のためのSNPマーカーが出願されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５５４号公報
【特許文献２】特開２０１４−０１８１３７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yukitoshi Takahashi, et al., Genetic variations of immunoregulatory genes associated with Rasmussen syndrome. Epilepsy Research, 2013; 107: 238-243.
【非特許文献２】Mathias Maurer, et al., Immunogenetics(2002) 54:1-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
免疫調節遺伝子のCTLA4およびPDCD1の二つの発明を臨床に更に役立てるには、免疫介在疾患発症に影響するCTLA4のSNP(rs231775)およびPDCD1のSNP(rs2227982)の迅速診断法を開発し、遺伝子全長の遺伝子配列解析よりも迅速に、外来で待ち時間なく、疾患感受性を診断する必要がある。
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、免疫介在疾患発症に影響するCTLA4のSNP(rs231775)およびPDCD1のSNP(rs2227982)の迅速診断を可能とする免疫介在性てんかんの診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかる免疫介在性てんかんの診断キットは、
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーと、
配列番号５で表される３’末端をフルオレセインでラベルされたドナー色素プローブと、
配列番号６で表される５’末端をLCREDでラベルされているアクセプター色素プローブと、を有して、
HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)を検出することを特徴とする。
【００１１】
本発明にかかる免疫介在性てんかんの診断キットは、
配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーと、
配列番号８で表される３’末端をフルオレセインでラベルされたドナー色素プローブと、
配列番号７で表される５’末端をLCREDでラベルされているアクセプター色素プローブと、を有する、
HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて、PDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、免疫介在疾患発症に影響するCTLA4のSNP(rs231775)およびPDCD1のSNP(rs2227982)の迅速診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】検出対象がSNP(rs231775)の場合のリアルタイムPCRアッセイの結果を示す図である。
【図２】検出対象がSNP(rs2227982)の場合のリアルタイムPCRアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明にかかる１対のプライマーセットは、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、からなるフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、からなるリバースプライマーと、からなることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる１対のプライマーセットは、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、からなるフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、からなるリバースプライマーと、からなることを特徴とする。
【００１７】
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーは、下記表１で示される。このプライマーセットを使用して、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)の迅速な検出が可能となる。
【００１８】
また、配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーも、下記表１で示される。このプライマーセットを使用して、PDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)の迅速な検出が可能となる。
【００１９】
【表１】
0006480704.tif 000002
【００２０】
ストリンジェントな条件下とは、例えば、Molecular Cloning:ALABORATORY MANUAL 3rd EDITION(J.F. Sambrook and D.W. Russell, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に記載の方法が挙げられる。
【００２１】
迅速診断可能となる免疫介在性てんかんは、特に限定されるものではないが、例えば、Rasmussen症候群、脳炎後てんかん、ランドウ−クレフナー症候群（Landau-Kleffner-syndrome）、又は、West症候群（点頭てんかん）である。
【００２２】
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーは、HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて使用される。また、配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーも、HybProbeフォーマットのリアルタイムPCRにて使用される
HybProbeフォーマットは蛍光共鳴エネルギー転移の原理に基づいた蛍光フォーマットであり、３’末端をフルオレセインでラベルされたドナー色素プローブと、５’末端をLCREDでラベルされているアクセプター色素プローブとを用いる。PCRにおいてアニーリング期に、２本のプローブが増幅されたPCR産物上のターゲット配列にハイブリダイズするとドナー色素により励起されたアクセプター色素が蛍光を発する。蛍光強度はPCRプロセス中に増幅されたターゲットDNA量に比例する。
【００２３】
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーは、上記表１で示されるドナー色素プローブ（配列番号５）及びアクセプター色素プローブ（配列番号６）と組み合わせて使用される。
【００２４】
配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーは、上記表１で示されるドナー色素プローブ（配列番号７）及びアクセプター色素プローブ（配列番号８）と組み合わせて使用される。
【００２５】
本発明は、免疫介在性てんかんの検査キットとして構成することも可能であり、免疫介在性てんかんの検査キットとしては、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)からなるSNPマーカーのSNPをタイピングするためのポリヌクレオチド、表１記載のプライマーセット（配列番号１，２）、表１記載のプローブセット（配列番号５，６）、及びDNAマイクロアレイを含む。
【００２６】
また、免疫介在性てんかんの検査キットとしては、PDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)からなるSNPマーカーのSNPをタイピングするためのポリヌクレオチド、表１記載のプライマーセット（配列番号３，４）、表１記載のプローブセット（配列番号７，８）、及びDNAマイクロアレイを含む。
【００２７】
本実施形態にかかるプローブセットを用いることにより、CTLA4のSNP（rs231775）およびPDCD1のSNP(rs2227982)の検出が90分以内に可能となり、迅速な外来でも利用できる診断法が確立できる。
【００２８】
また、免疫介在性疾患の早期診断により、早期治療が可能となり、疾患予後が改善できる。
【００２９】
更には、CTLA4機能阻害剤（イピリムマブなど）、PDCD1機能阻害剤（ニボルマブなど）を用いた悪性黒色腫などの免疫修飾治療を行う場合に、CTLA4のSNP（rs231775）およびPDCD1のSNP(rs2227982)を有する症例では機能阻害作用がより強く出て、副作用が出現する可能性があるが、それらの副作用予測のためにもCTLA4・PDCD1遺伝子マーカー迅速診断法のデータが有用で、パニツムマブ、セツキシマブのK-ras遺伝子検査、イリノテカンのUGT1A1遺伝子検査と同様にオーダーメイド治療に貢献できる。
【実施例】
【００３０】
リアルタイムPCRは、LightCycler(登録商標)FastStartDNA Master HybProbe
ライトサイクラーインスツルメントキットを使用した。検出対象となるSNPは、CTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)及びPDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)であった。
【００３１】
上記キットは、ライトサイクラーインスツルメントでDNAを増幅、検出するためのeasy-to-useの10×ホットスタート反応ミックスとMgCl2、PCRグレード蒸留水から構成された。
【００３２】
プライマー配列は、表１記載のものを使用した。
【００３３】
反応組成は、下記表２に示すものであった。
【００３４】
【表２】
0006480704.tif 000003
【００３５】
検出対象となるSNPがCTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)の場合の反応プログラムは、下記表３に示すものであった。
【００３６】
【表３】
0006480704.tif 000004
【００３７】
検出対象となるSNPがPDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)の場合の反応プログラムは、下記表４に示すものであった。
【００３８】
【表４】
0006480704.tif 000005
【００３９】
検出対象となるSNPがCTLA4遺伝子エクソン１におけるSNP(rs231775)の場合の結果を図１に示す。なお、SNP(rs231775)のReferenceゲノムはＡＡであるが、Rasmussen症候群患者と日本人とのゲノムを比較すると有意差があり、ゲノム頻度傾向で見るとRasmussen症候群は日本人に比べて有意にＧを含むゲノムが多く(p=0.01)、アレル頻度を比較するとRasmussen症候群は日本人に比べて有意にＧが多いことが判明している(p<0.01)。
【００４０】
また、検出対象となるSNPがPDCD1遺伝子エクソン５におけるSNP(rs2227982)の場合の結果を図２に示す。なお、SNP(rs2227982)のReferenceゲノムはＣＣであるが、Rasmussen症候群患者と日本人とのゲノムを比較すると有意差があり、ゲノム頻度傾向で見るとRasmussen症候群は日本人に比べて有意にＴを含むゲノムが多く(p=0.0369)、アレル頻度を比較するとRasmussen症候群は日本人に比べて有意にＧが多いことが判明している(p<0.0073)。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
免疫介在疾患発症に影響するSNPの迅速診断に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号１〜４：プライマー
配列番号５〜８：プローブ
【図１】
0006480704.tif 000006
【図２】
0006480704.tif 000007
【配列表】
0006480704000001.app