(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子が、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する肺癌を有する対象に投与されるように用いられることを特徴とする、該ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を含む肺癌治療剤：
ここで、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する前記肺癌の細胞の少なくとも一部は、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも１．５である。
【請求項２】
該対象が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、該肺癌の細胞の少なくとも一部が、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも１．５であるＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有することが決定された対象である、請求項１記載の肺癌治療剤。
【請求項３】
第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２である、請求項１または２に記載の肺癌治療剤。
【請求項４】
第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２．５である、請求項３に記載の肺癌治療剤。
【請求項５】
第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも３である、請求項４に記載の肺癌治療剤。
【請求項６】
第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも３．５である、請求項５に記載の肺癌治療剤。
【請求項７】
第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも４である、請求項６に記載の肺癌治療剤。
【請求項８】
ＦＧＦＲ１遺伝子増幅が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、スペクトル核型決定、定量ＰＣＲ、サザンブロット法、または配列決定から選択される方法によって決定される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項９】
前記肺癌が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種のマーカーを過剰発現している、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項１０】
前記過剰発現が、タンパク質の過剰発現である、請求項９に記載の肺癌治療剤。
【請求項１１】
前記タンパク質の過剰発現が、免疫組織化学を用いて決定される、請求項１０に記載の肺癌治療剤。
【請求項１２】
前記過剰発現が、ｍＲＮＡの過剰発現である、請求項９に記載の肺癌治療剤。
【請求項１３】
前記ｍＲＮＡの過剰発現が、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定される、請求項１２に記載の肺癌治療剤。
【請求項１４】
前記肺癌が、ＦＧＦＲ１を過剰発現している、請求項９乃至１３のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項１５】
前記肺癌が、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃを過剰発現している、請求項１４に記載の肺癌治療剤。
【請求項１６】
少なくとも１種のさらなる治療剤と組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項１７】
少なくとも１種のさらなる治療剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、エトポシド、トポテカン、ソラフェニブ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、およびベバシズマブからなる群から選択される、請求項１６に記載の肺癌治療剤。
【請求項１８】
少なくとも１種のさらなる治療剤が、パクリタキセルおよびカルボプラチンを含む、請求項１７に記載の肺癌治療剤。
【請求項１９】
前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項２０】
前記肺癌が、小細胞肺癌である、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項２１】
前記ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子が、配列番号１乃至４から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項２２】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を含む、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の肺癌治療剤。
【請求項２３】
前記ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび融合パートナーを含み、該融合パートナーがＦｃである、請求項２２に記載の肺癌治療剤。
【請求項２４】
前記ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、請求項２３に記載の肺癌治療剤。
【請求項２５】
前記ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子が、配列番号６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、請求項２３に記載の肺癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５５９，２５９号および２０１２年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／６１６，７６１号の利益を主張するものであり、これらは、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
可溶型の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている。例えば、米国特許第７，６７８，８９０号（特許文献1）に見出すことができる。抗癌治療の有効性は、場合によっては、標的とされる癌の遺伝子構造に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７，６７８，８９０号
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含む特定の癌が、いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含まない癌よりも、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高いことを証明した。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現を有する癌は、ＦＧＦＲ１の過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかの実施形態において、線維芽細胞増殖因子受容体３アイソフォームＩＩＩｃ（ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ）の過剰発現を有する癌は、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。いくつかの実施形態において、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）の過剰発現を有する癌は、ＦＧＦ２の過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。いくつかの実施形態において、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３（ＤＫＫ３）の過剰発現を有する癌は、ＤＫＫ３の過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。いくつかの実施形態において、ＥＴＳ転座変異体４（ＥＴＶ４）の過剰発現を有する癌は、ＥＴＶ４の過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８の過剰発現を有する癌は、ＦＧＦ１８の過剰発現を有しない癌よりも、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を含む治療に対する反応性が高い。
【０００５】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有することが決定され、癌におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する肺癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における肺癌を治療する方法は、治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、肺癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有することが決定され、癌におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、癌の細胞の少なくとも一部は、ＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも８コピー、または少なくとも１０コピー含む。いくつかの実施形態において、癌の細胞の少なくとも一部は、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、または少なくとも４である。
【０００８】
上記実施形態のうちのいずれかを含むいくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種のマーカーを過剰発現し得る。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、およびＦＧＦ１８から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または５種のマーカーを過剰発現し得る。いくつかの実施形態において、癌はＥＴＶ４を過剰発現し得る。上記実施形態のうちのいずれかを含むいくつかの実施形態において、癌は、後述する表１０の任意の列からの遺伝子１および遺伝子２、またはそれらの任意の組み合わせを過剰発現し得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。上記実施形態のうちのいずれかを含むいくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子が増幅され得る。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーの過剰発現は、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、当該方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌に罹患している対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現していることが決定され、癌におけるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーの過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅も有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌の細胞の少なくとも一部は、ＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、または少なくとも８コピー含む。いくつかの実施形態において、過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、過剰発現は、タンパク質の過剰発現であるいくつかの実施形態において、タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦＲ１の過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦＲ１の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量の  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃタンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を有する癌は、膀胱癌、腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、および結腸直腸癌から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦ２の過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦ２の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦ２の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現を有する癌は、神経膠芽腫、腎細胞癌、および肝細胞癌から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＤＫＫ３の過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＤＫＫ３の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＤＫＫ３の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３の過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３の過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３の過剰発現を有する癌は、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、肺腺癌、肝細胞癌、および結腸直腸癌から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦ１８の過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量の  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦ１８の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦ１８の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８の過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８の過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である、ＥＴＶ４の過剰発現を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量の  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＥＴＶ４の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＥＴＶ４の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４の過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４  ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４の過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦＲ１の過剰発現を有する肺癌を治療する方法は、治療有効量の  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における肺癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、肺癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦＲ１の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である、ＦＧＦ２の過剰発現を有する肺癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における肺癌を治療する方法は、治療有効量の  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、肺癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦ２の過剰発現を有することが決定され、癌におけるＦＧＦ２の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する肺癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも１種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも１種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、エトポシド、トポテカン、ソラフェニブ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、およびベバシズマブから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療剤は、ドセタキセルである。いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも２種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも２種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２種のさらなる治療剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、エトポシド、トポテカン、ソラフェニブ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、およびベバシズマブから選択される。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、パクリタキセルおよびカルボプラチンである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、ドキソルビシンおよびパクリタキセルである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、シスプラチンおよびエトポシドである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、オキサリプラチンおよび５−ＦＵである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、５−ＦＵおよびロイコボリンである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、５−ＦＵおよびベバシズマブである。いくつかの実施形態において、２種のさらなる治療剤は、パクリタキセルおよびベバシズマブである。いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも３種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、少なくとも３種のさらなる治療剤とを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも３種のさらなる治療剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、エトポシド、トポテカン、ソラフェニブ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、およびベバシズマブから選択される。いくつかの実施形態において、３種のさらなる治療剤は、オキサリプラチン、５−ＦＵ、およびロイコボリンである。いくつかの実施形態において、３種のさらなる治療剤は、ベバシズマブ、５−ＦＵ、およびロイコボリンである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有し、および／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを有する癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤを投与する工程を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１〜４から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅および／またはＦＧＦＲ１の過剰発現および／またはＦＧＦ２の過剰発現および／またはＤＫＫ３の過剰発現および／またはＦＧＦ１８の過剰発現および／またはＥＴＶ４の過剰発現を有する癌を治療する方法は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと、少なくとも１つの融合パートナーとを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの融合パートナーは、Ｆｃ、アルブミン、およびポリエチレングリコールから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの融合パートナーは、Ｆｃである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、配列番号８〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、配列番号５および配列番号６から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの融合パートナーは、Ｆｃおよびポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの融合パートナーは、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、融合分子は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと１つまたは複数の融合パートナーとの間にリンカーを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ．３３９−Ｆｃである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、グリコシル化および／またはシアル酸付加される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のポリペプチド部分は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１および配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、約０．５ｍｇ／体重１ｋｇ〜約３０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の量、例えば、約８〜約１６ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の量である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の治療有効量は、約８ｍｇ／体重１ｋｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の治療有効量は、約１６ｍｇ／体重１ｋｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の治療有効量は、約２０ｍｇ／体重１ｋｇである。いくつかの実施形態において、投与量は、週２回、毎週、隔週、毎週と隔週の間の頻度で、３週毎、４週毎、または毎月投与されてもよい。
【００２４】
特定の実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、喉頭癌、肝癌、腎癌、神経膠芽腫、または膵癌である。特定の実施形態において、癌は、乳癌、食道癌、腎癌、頭頸部癌、または肺癌である。特定の実施形態において、癌は、肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、扁平上皮癌である。いくつかの実施形態において、癌は、頭頸部癌である。いくつかの実施形態において、頭頸部癌は、頭頸部の扁平上皮癌である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含むかどうかを決定する工程を含み、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、スペクトル核型決定、定量ＰＣＲ、サザンブロット法、または配列決定によって決定される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種のマーカーを過剰発現しているかどうかを決定する工程を含み、過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、およびＦＧＦ１８から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現しているかどうかを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部がＥＴＶ４を過剰発現しているかどうかを決定する工程を含む。上記実施形態のうちのいずれかを含むいくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部が、後述する表１０の任意の列からの遺伝子１および遺伝子２、またはそれらの任意の組み合わせを過剰発現しているかどうかを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかの実施形態において、過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。上記実施形態のうちのいずれかを含むいくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有するかどうかを決定する工程を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦ２を過剰発現しているかどうかを決定する工程を含み、過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの過剰発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態において、過剰発現は、タンパク質の過剰発現である。いくつかの実施形態において、タンパク質の過剰発現は、免疫組織化学によって決定される。いくつかの実施形態において、癌は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しないことが決定される。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌である。いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌または小細胞肺癌である。
【００２８】
本明細書に記載されるいずれの実施形態またはそれらのいずれの組み合わせも、本明細書に記載される本発明のあらゆる方法に適用される。
[本発明1001]
対象における、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する癌を治療する方法であって、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標であり、
該方法が、治療有効量のＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
対象における癌を治療する方法であって、
治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含み、
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与前に、該癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有することが決定され、かつ
癌におけるＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1003]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも3コピー含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも4コピー含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも5コピー含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも6コピー含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも8コピー含む、本発明1003の方法。
[本発明1008]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の前記細胞の少なくとも一部は、第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも1．5である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1009]
第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも2である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも2．5である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも3である、本発明1008の方法。
[本発明1012]
第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも3．5である、本発明1008の方法。
[本発明1013]
第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が少なくとも4である、本発明1008の方法。
[本発明1014]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、スペクトル核型決定、定量ＰＣＲ、サザンブロット法、または配列決定から選択される方法によって決定される、本発明1002の方法。
[本発明1015]
前記癌が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のマーカーを過剰発現している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記癌が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、およびＦＧＦ18から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種のマーカーを過剰発現している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記癌がＥＴＶ4を過剰発現している、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記癌が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のマーカーを過剰発現している、本発明1015の方法。
[本発明1019]
ＦＧＦＲ1がＦＧＦＲ1ＩＩＩｃである、本発明1015、1016、および1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
対象における、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のマーカーを過剰発現している癌を治療する方法であって、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種のマーカーの過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標であり、
該方法が、治療有効量のＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1021]
対象における癌を治療する方法であって、
治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含み、
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与前に、該癌の細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のマーカーを過剰発現していることが決定され、かつ
癌におけるＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種のマーカーの過剰発現が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1022]
前記癌が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のマーカーを過剰発現している、本発明1020または本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記癌がＥＴＶ4を過剰発現している、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記癌が、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、およびＦＧＦ18から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種のマーカーを過剰発現している、本発明1020または本発明1021の方法。
[本発明1025]
ＦＧＦ2を過剰発現している癌を治療する方法であって、ＦＧＦ2の過剰発現が、線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標であり、
該方法が、治療有効量のＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1026]
対象における癌を治療する方法であって、
治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体1（ＦＧＦＲ1）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を該対象に投与する工程を含み、
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与前に、該癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦ2を過剰発現していることが決定され、かつ
ＦＧＦ2の過剰発現が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1027]
前記癌がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有しない、本発明1025または本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記過剰発現がタンパク質の過剰発現である、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
タンパク質の過剰発現が免疫組織化学を用いて決定される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記過剰発現がｍＲＮＡの過剰発現である、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1031]
ｍＲＮＡの過剰発現が定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記癌がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する、本発明1020〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
ＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有する前記癌の細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ1遺伝子を少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、または少なくとも8コピー含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
少なくとも1種のさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1035]
少なくとも1種のさらなる治療剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、5−フルオロウラシル（5−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、エトポシド、トポテカン、ソラフェニブ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、およびベバシズマブから選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤを投与する工程を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤが、配列番号1〜4から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子を投与する工程を含む、本発明1001〜1035のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤおよび融合パートナーを含み、該融合パートナーがＦｃである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子が、配列番号5および配列番号6から選択される配列を含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記癌が、肺癌、腎癌、結腸癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、および前立腺癌から選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記癌が、肺癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、または食道癌である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記癌が肺癌である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記肺癌が非小細胞肺癌である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記肺癌が小細胞肺癌である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法であって、該対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ1遺伝子のコピー数を決定する工程を含み、細胞におけるＦＧＦＲ1遺伝子が2コピーより多いことが、該細胞がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有することを示し、かつ、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1047]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法であって、該対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部における第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率を決定する工程を含み、細胞における比率が1より大きいことが、該細胞がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有することを示し、かつ、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1048]
ＦＧＦＲ1遺伝子のコピー数、または第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、スペクトル核型決定、定量ＰＣＲ、サザンブロット法、または配列決定から選択される方法によって決定される、本発明1046または本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部における、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定する工程をさらに含み、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種のタンパク質またはｍＲＮＡの過剰発現が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する前記癌の治療反応性の指標である、本発明1046〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、およびＦＧＦ18から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定する工程をさらに含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
ＥＴＶ4のレベルを決定する工程をさらに含む、本発明1049の方法。
[本発明1052]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法であって、該対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部における、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、または少なくとも5種のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定する工程を含み、ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、ＦＧＦ18、およびＥＴＶ4から選択される少なくとも1種のタンパク質またはｍＲＮＡの過剰発現が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1053]
ＦＧＦＲ1、ＦＧＦＲ3ＩＩＩｃ、ＦＧＦ2、ＤＫＫ3、およびＦＧＦ18から選択される少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定する工程を含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
ＥＴＶ4のレベルを決定する工程を含む、本発明1052の方法。
[本発明1055]
ＦＧＦＲ1がＦＧＦＲ1ＩＩＩｃである、本発明1052または本発明1053の方法。
[本発明1056]
ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る、癌を有する対象を特定する方法であって、該対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦ2のレベルを決定する工程を含み、ＦＧＦ2の過剰発現が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する該癌の治療反応性の指標である、方法。
[本発明1057]
前記癌がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有しないことを決定する工程をさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1058]
1種または複数種のタンパク質のレベルが決定される、本発明1049〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
タンパク質のレベルが免疫組織化学を用いて決定される、本発明1058の方法。
[本発明1060]
1種または複数種のｍＲＮＡのレベルが決定される、本発明1049〜1057のいずれかの方法。
[本発明1061]
ｍＲＮＡのレベルが定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定される、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ1遺伝子のコピー数を決定する工程をさらに含み、細胞におけるＦＧＦＲ1遺伝子が2コピーより多いことが、該細胞がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有することを示し、かつ、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する前記癌の治療反応性の指標である、本発明1049〜1056のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部における第8染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ1遺伝子の比率を決定する工程をさらに含み、細胞における比率が1より大きいことが、該細胞がＦＧＦＲ1遺伝子増幅を有することを示し、かつ、ＦＧＦＲ1遺伝子増幅が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子に対する前記癌の治療反応性の指標である、本発明1049〜1056のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤが、配列番号1〜4から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1046〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子が、ＦＧＦＲ1  ＥＣＤおよび融合パートナーを含み、該融合パートナーがＦｃである、本発明1046〜1063のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記ＦＧＦＲ1  ＥＣＤ融合分子が、配列番号5および配列番号6から選択される配列を含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記癌が、肺癌、腎癌、結腸癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、および前立腺癌から選択される、本発明1046〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記癌が、肺癌、乳癌、腎癌、頭頸部癌、または食道癌である、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記癌が肺癌である、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記肺癌が非小細胞肺癌である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記肺癌が小細胞肺癌である、本発明1069の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＮＣＩ−Ｈ１５８１腫瘍細胞の培養物中の細胞数を示す。
【図１Ｂ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＮＣＩ−Ｈ５２０腫瘍細胞の培養物中の細胞数を示す。
【図１Ｃ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＤＭＳ５３腫瘍細胞の培養物中の細胞数を示す。
【図１Ｄ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＤＭＳ１１４腫瘍細胞の培養物中の細胞数を示す。
【図２Ａ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＮＣＩ−Ｈ１５８１腫瘍細胞によるチミジンの取り込みを示す。
【図２Ｂ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＮＣＩ−Ｈ５２０腫瘍細胞によるチミジンの取り込みを示す。
【図２Ｃ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＤＭＳ５３腫瘍細胞によるチミジンの取り込みを示す。
【図２Ｄ】実施例１に記載されるように、様々な量の血清を用いて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させた、ＤＭＳ１１４腫瘍細胞によるチミジンの取り込みを示す。
【図３】実施例１に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下で増殖させた種々のＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株および種々のＦＧＦＲ１遺伝子非増幅肺癌細胞株における細胞数の平均減少率（％）のプロットを示す。
【図４】実施例１に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下で増殖させた種々のＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株および種々のＦＧＦＲ１遺伝子非増幅肺癌細胞株における３Ｈ−チミジン取り込みの平均減少率（％）のプロットを示す。
【図５】実施例２に記載されるように、ＤＭＳ５３細胞を移植し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンで処理したマウスにおける、種々の時点での平均腫瘍体積を示す。
【図６】実施例３に記載されるように、ＤＭＳ１１４細胞を移植し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンで処理したマウスにおける、種々の時点での平均腫瘍体積を示す。
【図７】実施例４に記載されるように、ＮＣＩ−Ｈ１５８１細胞を移植し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンで処理したマウスにおける、種々の時点での平均腫瘍体積を示す。
【図８】実施例５に記載されるように、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞を移植し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンで処理したマウスにおける、種々の時点での平均腫瘍体積を示す。
【図９】実施例６に記載されるように、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する腫瘍細胞および非増幅ＦＧＦＲ１遺伝子を有する腫瘍細胞のマウス異種移植片における、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる腫瘍増殖阻害率（％）を示す。
【図１０】実施例７に記載されるように、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有するおよび有しない肺癌細胞株におけるＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現の散布図を示す。
【図１１】実施例７に記載されるように、様々な量の血清を用いてＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下で増殖させたＮＣＩ−Ｈ２２６細胞において実行された、（Ａ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）アッセイにおける平均発光量、および（Ｂ）トリチウム標識チミジン取り込みアッセイにおける１分当たりのカウントのグラフを示す。
【図１２】実施例７に記載されるように、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有するおよび有しない肺癌異種移植片におけるＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現の散布図を示す。
【図１３】実施例７に記載されるように、ＰＤＸ  Ｄ３５０８７細胞を移植し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンで処理したマウスにおける、種々の時点での平均腫瘍体積を示す。
【図１４】実施例８に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者および非応答者の異種移植片における、（Ａ）ＦＧＦ２  ｍＲＮＡ（ＧＵＳＢに対して正規化）および（Ｂ）ＦＧＦ２タンパク質の発現（総タンパク質量に対して正規化）を示す。
【図１５】実施例９に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者および非応答者の異種移植片における、ＤＫＫ３  ｍＲＮＡの発現（ＧＵＳＢに対して正規化）を示す。
【図１６】実施例８に記載されるように、（Ａ）Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片モデルおよび（Ｂ）ＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫異種移植片モデルにおける、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの抗腫瘍活性を示す。
【図１７】実施例８に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ反応性および非反応性異種移植片モデルにおける、（Ａ）ＦＧＦＲ１および（Ｂ）ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１８】実施例１０に記載されるように、（Ａ）ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを週に１回投与したラットにおける経時的な血漿ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃレベル、ならびに（Ｂ）ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦｃまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤ＰＤ１７３０７４を投与したラットにおける２４時間後および１６８時間後の血清リン酸塩レベルを示す。
【図１９】実施例１１に記載されるように、マトリゲルプラグアッセイにおける、ＦＧＦ−２およびＶＥＧＦ−Ａによって誘導された血管新生のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性阻害を示す。
【図２０】実施例１１に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害しないことを示す。
【図２１】実施例１２に記載されるように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたＣａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片モデルマウスにおける腫瘍血管新生の阻害（ＣＤ３１の免疫染色によって評価される）を示す。
【図２２】実施例１３に記載されるように、ＪＩＭＴ−１乳癌異種移植片におけるＦＧＦＲ１シグナル伝達のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本明細書において使用される項目の見出しは、構成上の目的のために過ぎず、記載される主題を限定すると解釈されるべではない。
【００３１】
定義
別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００３２】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）、酵素反応、ならびに精製技術に関連して使用される特定の技術は、当該技術分野において既知である。多くのそのような技術および手順は、とりわけ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載されている。さらに、化学合成、化学分析、医薬品、処方、および送達、ならびに患者の治療に関する特定の技術も当該技術分野において既知である。
【００３３】
本出願において、別途記載のない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。複数の従属請求項の文脈において「または」の使用は、選択肢においてのみ、複数の先行する独立請求項または従属請求項を参照することを意味する。また、「要素」または「成分」等の用語は、特に別途指定のない限り、１つのユニットを含む要素および成分と、複数のサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、全ての数字は、近似値であり、測定誤差および有効数字の丸めを考慮して変動し得る。特定の測定量の前の「約」の使用は、試料の不純物、測定誤差、人的ミス、および統計的変動、ならびに有効数字の丸めによる変動を含む。
【００３５】
本発明の開示に従って用いられる場合、別途指定のない限り、以下の用語は以下の意味を有すると理解されたい。
【００３６】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同義で使用されてもよく、ヌクレオチドのポリマーを指す。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然および／または非天然のヌクレオチドを含んでもよく、また限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチドを含むヌクレオチドの直鎖配列を指す。
【００３７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義で使用され、最小長に限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含んでもよく、また限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体を含む。完全長タンパク質およびその断片の両方が、この定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等も含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する修飾、例えば、欠失、付加、および置換（通常、本質的に保存的である）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘発のように計画的であってもよいか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因する誤差のように偶発的であってもよい。ポリペプチドが、特定のアミノ酸配列「からなる」場合、それは翻訳後修飾、例えば、グリコシル化およびシアリル化等をなおも含むことができる。
【００３８】
「ＦＧＦＲ１細胞外ドメイン」（「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ」）という用語は、完全長  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片、およびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ変異体を含む。本明細書において使用される場合、「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ」という用語は、シグナルペプチドを有するかまたは有しない、細胞内および膜貫通ドメインを欠くＦＧＦＲ１ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１および２から選択されるアミノ酸配列を有するヒト完全長ＦＧＦＲ１  ＥＣＤである。本明細書において使用される場合、「完全長ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ」という用語は、細胞外ドメインの最後のアミノ酸まで延在するＦＧＦＲ１  ＥＣＤを意味し、Ｎ末端シグナルペプチドを含んでもまたは含まなくてもよい。本明細書において定義される場合、完全長ＦＧＦＲ１  ＥＣＤの最後のアミノ酸は、３５３位にある。したがって、ヒト完全長ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号２（成熟型）または配列番号１（シグナルペプチドを有する）に対応するアミノ酸配列から構成されてもよい。本明細書において使用される場合、「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片」という用語は、完全長ＥＣＤのＮおよび／またはＣ末端から１つまたは複数の残基が欠失した、ＦＧＦ−２に結合する能力を保持するＦＧＦＲ１  ＥＣＤを指す。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片は、Ｎ末端シグナルペプチドを含んでもまたは含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片は、配列番号４（成熟型）または配列番号３（シグナルペプチドを有する）に対応するアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片である。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ変異体」という用語は、アミノ酸付加、欠失、および置換を含み、ＦＧＦ−２に結合し続けることができるＦＧＦＲ１  ＥＣＤを指す。そのような変異体は、親ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。２つのポリペプチドの％同一性は、類似性を決定するためのデフォルト設定でＢｅｓｔｆｉｔプログラムを使用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される類似度スコアを用いて測定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  ＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の最良の相同性セグメントを見つけ出す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ変異体は、配列番号４の配列と少なくとも９５％同一である。
【００４０】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも、例えば９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が、参照ポリペプチドの各１００個のアミノ酸当たり最高５つのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一なポリペプチドである。換言すると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失していても、もしくは別のアミノ酸で置換されてもよいか、または参照配列中の合計アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列に挿入されてもよい。これらの参照配列の変化は、参照配列中の残基間に個々に散在するか、または参照配列中の１つまたは複数の近接するグループとして散在する、参照アミノ酸配列のＮもしくはＣ末端の位置、またはこれらの末端の位置の間のどこで起こってもよい。
【００４１】
実際に、いずれか特定のポリペプチドが、例えば、配列表に記載される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列またはポリペプチド配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム等の既知のコンピュータプログラムを使用して従来通りに決定することができる。特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アライメントプログラムを使用する場合、当然、参照アミノ酸配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるパラメータが設定される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ｈＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３５３」および「ｈＦＧＦＲ１．３５３」という用語は、配列番号１（シグナルペプチドを有する）または配列番号２（シグナルペプチドを有しない、成熟型）に対応する完全長ヒトＦＧＦＲ１  ＥＣＤを指すために同義で使用されてもよい。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「ｈＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９」および「ｈＦＧＦＲ１．３３９」という用語は、配列番号３（シグナルペプチドを有する）または配列番号４（シグナルペプチドを有しない、成熟型）に対応するヒトＦＧＦＲ１  ＥＣＤを指すために同義に使用されてもよい。
【００４４】
さらなるｈＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に記載され、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【００４５】
「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子」という用語は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと、１つまたは複数の「融合パートナー」とを含む分子を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと融合パートナーとは共有結合（「融合」）している。融合パートナーもポリペプチド（「融合パートナーポリペプチド」）である場合、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび融合パートナーポリペプチドは、連続するアミノ酸配列の一部であってもよく、融合パートナーポリペプチドは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合してもよい。そのような場合、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび融合パートナーポリペプチドは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび融合パートナーポリペプチドの両方をコードするコード配列から単一ポリペプチドとして翻訳されてもよい（「ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合タンパク質」）。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと融合パートナーとは、例えば、ペプチド結合以外の化学結合等の他の手段によって共有結合される。ポリペプチドを他の分子に共有結合させる多くの既知の方法（例えば、融合パートナー）が使用されてもよい。他の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと融合パートナーとは、少なくとも１つのアミノ酸または化学部分から構成される「リンカー」を介して融合されてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤポリペプチドと融合パートナーとは、非共有結合している。いくつかのそのような実施形態において、それらは、例えば、結合対を使用して結合することができる。例示的な結合対は、限定されないが、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、抗体およびその抗原等を含む。
【００４７】
例示的な融合パートナーは、限定されないが、免疫グロブリンＦｃドメイン、アルブミン、およびポリエチレングリコールを含む。いくつかの例示的なＦｃドメインのアミノ酸配列を配列番号８〜１０に示す。いくつかの実施形態において、Ｆｃと融合したＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、「ｈＦＧＦＲ１  ＥＣＤ−Ｆｃ」と称される。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、およびＩｇＧ４  Ｆｃから選択される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「ｈＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ」および「ｈＦＧＦＲ１．３３９−Ｆｃ」という用語は、配列番号６（シグナルペプチドを有しない、成熟型）および配列番号５（シグナルペプチドを有する）から選択されるアミノ酸配列を指すために同義で使用されてもよい。ｈＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを用いて治療することができる非限定的な例示的癌は、限定されないが、肺癌、結腸癌、乳癌、胃癌、頭頸部癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肉腫、小細胞肺癌、卵巣癌、カポジ肉腫、ホジキン病、白血病、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫（脳癌）、横紋筋肉腫、ウイルムス腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、膀胱癌、精巣癌、リンパ腫、胚細胞性腫瘍、結腸と直腸の癌、消化管癌、甲状腺癌、多発性骨髄腫、膵癌、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、血液／リンパ腺癌、悪性腹膜中皮腫、食道癌、腎細胞癌、多形神経膠芽腫、および肝癌を含む。
【００４９】
「シグナルペプチド」という用語は、哺乳動物細胞からポリペプチドの分泌を促進する、ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基の配列を指す。シグナルペプチドは、哺乳動物細胞からポリペプチドを排出する際に切断され得、成熟タンパク質を形成する。シグナルペプチドは、天然または合成であってもよく、それらが付着するタンパク質に対して異種または相同であってもよい。例示的なシグナルペプチドは、限定されないが、ＦＧＦＲ１シグナルペプチド、例えば、配列番号７のアミノ酸配列等を含む。例示的なシグナルペプチドはまた、異種タンパク質由来のシグナルペプチドも含む。「シグナル配列」は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、シグナルペプチドを欠く。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、天然ＦＧＦＲ１シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであり得る少なくとも１つのシグナルペプチドを含む。
【００５０】
「ベクター」という用語は、宿主細胞中で増殖され得る１つまたは複数のクローン化ポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作され得るポリヌクレオチドを説明するために使用される。ベクターは、次の要素のうちの１つまたは複数を含んでもよい：複製起点、対象とするポリペプチドの発現を調節する１つまたは複数の制御配列（例えば、プロモーターおよび／もしくはエンハンサー等）、ならびに／または１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、および比色分析法で使用され得る遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼ）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において対象とするポリペプチドを発現させるために使用されるベクターを指す。
【００５１】
「宿主細胞」は、ベクターまたは単離ポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るか、またはレシピエントとなった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。例示的な真核細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類または非霊長類動物細胞、真菌細胞、植物細胞；および昆虫細胞等を含む。例示的な哺乳動物細胞は、限定されないが、２９３およびＣＨＯ細胞、ならびにそれらの誘導体、例えば、それぞれ２９３−６ＥおよびＤＧ４４を含む。
【００５２】
本明細書において使用される「単離された」という用語は、天然において典型的に見出される成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、ポリペプチドは「単離されている」と称される。発現後の細胞によってポリペプチドが分泌される場合、それを産生した細胞からポリペプチドを含む上清を物理的に分離することは、ポリペプチドの「単離」であると見なされる。同様に、ポリヌクレオチドが、天然において典型的に見出されるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）の一部ではない場合、またはそれが産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドは、「単離された」と称される。よって、宿主細胞中のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが天然においてベクター中に見出されない限り、「単離された」と称されてもよい。
【００５３】
「抗悪性腫瘍組成物」という用語は、少なくとも１つの活性治療剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤（抗癌剤）の例は、限定されないが、例えば、化学療法剤、増殖抑制剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法に使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス性薬剤、抗チュブリン剤、および他の癌を治療するための薬剤、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、抗ＨＥＲ−２抗体（例えば、トラスツズマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに他の生理活性および有機の化学薬剤を含む。これらの組み合わせもまた、本発明に含まれる。
【００５４】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物を指す。化学療法剤の例は、以下を含む：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；Δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；βラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体ポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビセレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン  １およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．（ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシン  ＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシン  ＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標）、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物、例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））；テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２'，２'−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２  毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥTM）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金薬剤、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、およびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮ��（登録商標））を含む、チューブリン重合による微小管形成を防止するビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイド、例えばレチノイン酸；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１  阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ−２  阻害剤、例えば、オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（後述する定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（後述する定義を参照）；セリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ロナファルニブ（ＳＣＨ  ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲTM）；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；またＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略称）ならびにＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））を用いた治療計画の略称）等の、上記のうちの２つ以上の組み合わせ。
【００５５】
本明細書において定義される化学療法剤は、「抗ホルモン剤」または「内分泌治療薬」を含み、これらは、癌の増殖を促進する可能性のあるホルモンの影響を、調節、低下、遮断、または阻害するように作用する。これらは、それら自体がホルモンであってもよく、限定されないが、以下を含む：タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、およびＳＥＲＭ３等の選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン剤；アゴニスト特性を有しない純粋な抗エストロゲン、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（このような薬剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、かつ／またはＥＲレベルを抑制し得る）；アロマターゼ阻害剤（ホルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））等のステロイドアロマターゼ阻害剤性、ならびに例えば、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミ等の非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、ならびにボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、メゲストロール酢酸塩（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）−イミダゾール等の他のアロマターゼ阻害剤を含む）；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプトレリンを含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；プロゲスチン、例えば、メゲストロール酢酸塩およびメドロキシプロゲステロン酢酸塩、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、ならびにアンドロゲン／レチノイド、例えば、フルオキシメステロン、全てのトランス−レチノイン酸およびフェンレチニドを含む、性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ。
【００５６】
「血管新生因子または血管新生剤」は、例えば、血管新生、内皮細胞増殖、血管の安定性、および／または脈管形成等を促進する、血管の発生を刺激する成長因子を指す。例えば、血管新生因子は、限定されないが、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ）、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、ニューロピリン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−β、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）等を含む。また、創傷治癒を加速する因子、例えば、成長ホルモン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βも含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ'Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、既知の血管新生因子を列挙する表１）；およびＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６を参照のこと。
【００５７】
「抗血管新生剤」または「血管新生阻害剤」は、血管新生、脈管形成、または望ましくない血管透過性を直接的または間接的のいずれかで阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド（例えば、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）を含む）、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはそれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を指す。抗血管新生剤は、血管新生因子またはその受容体に結合し、その血管新生活性を遮断する薬剤を含むことを理解されたい。例えば、抗血管新生剤は、例えば、上に定義したような血管新生薬に対する抗体または他のアンタゴニストであり、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに結合する融合タンパク質、例えば、ＺＡＬＴＲＡＰTM（アフリベルセプト）、ＶＥＧＦ−Ａ  に対する抗体、例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体もしくはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体、抗ＰＤＧＦＲ阻害剤、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を遮断する小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（スニチニブリンゴ酸塩）、ＡＭＧ７０６、または例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／１１３３０４号に記載されるもの）である。抗血管新生剤はまた、天然の血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン等も含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ'Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９（例えば、悪性黒色腫の抗血管新生療法剤を列挙する表３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、既知の抗血管新生因子を列挙する表２）；およびＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｄＯｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば、臨床試験で使用される抗血管新生剤を列挙する表１を参照のこと）。
【００５８】
本明細書において使用される「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、１６５−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子ならびに関連する１２１−、１８９−、および２０６−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を指し、これは、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６およびＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ，５：１８０６によって、天然の対立遺伝子およびそのプロセシング型と一緒に記載されている。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、マウス、ラット、または霊長類等の非ヒト種に由来するＶＥＧＦも指す。特定の種に由来するＶＥＧＦは、例えば、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦ等の用語によって示される場合もある。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、１６５−アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を指すためにも使用される。いずれかのそのような形態のＶＥＧＦへの言及は、例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」、「ＶＥＧＦ−Ａ１０９」、または「ＶＥＧＦ１６５」によって本出願において特定することができる。「切断型」の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列において示されるように番号付けされる。例えば、切断型天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦの位置１７（メチオニン）でもある。切断型天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１受容体に対して天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。
【００５９】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、限定されないが、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体に対するその結合を含む、ＶＥＧＦの活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストは、限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それによって１つまたは複数の受容体に対するその結合を封鎖する受容体分子および誘導体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤（例えば、パゾパニブ）、およびＶＥＧＦに結合するイムノアドヘシン、例えば、ＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト）を含む。「ＶＥＧＦアンタゴニスト」という用語は、本明細書において使用される場合、特に、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる、抗体、抗体断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、および非ペプチド小分子を含む分子を含む。従って、「ＶＥＧＦの活性」という用語は、特に、ＶＥＧＦによって媒介されるＶＥＧＦの生物活性を含む。
【００６０】
本明細書において使用される「ＶＥＧＦトラップ」という用語は、タンパク質、例えば、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる融合分子を意味する。ＶＥＧＦトラップの一例は、アフリベルセプトである。
【００６１】
「抗ＶＥＧＦ抗体」または「ＶＥＧＦに結合する抗体」という用語は、十分な親和性および特異性を伴ってＶＥＧＦに結合できる抗体を意味し、該抗体は、標的ＶＥＧＦにおける診断剤および／または治療薬として有用である。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１７８９−１７９７（１９９５）；Ｂｏｒｇｓｔｒoｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）；Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１−９２４（１９９６））、また、虚血性網膜障害のモデルにおいて眼内血管新生を阻害する。Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６）。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦの活性が関与する疾患または状態の標的化および介入における治療剤として使用することができる。例えば、米国特許第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０２０号；国際公開第ＷＯ９８／４５３３２号；同第ＷＯ９６／３００４６号；同第ＷＯ９４／１０２０２号、同第ＷＯ２００５／０４４８５３号；欧州特許第ＥＰ０６６６８６８Ｂ１号；米国特許出願第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号、および同第２００５０１１２１２６；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）；ならびに国際公開第ＷＯ２００５０１２３５９号を参照のこと。選択された抗体は、通常、ＶＥＧＦに対して十分に強力な結合親和性を有する。例えば、抗体は、１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願公開２００５／０１２３５９号に記載されるようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ等）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）によって決定されてもよい。抗体は、例えば、治療薬としての有効性を評価するために、他の生物活性アッセイに供されてもよい。そのようなアッセイは、当該技術分野において既知であり、標的抗原および意図する抗体の用途に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ抑制アッセイ、腫瘍細胞増殖抑制アッセイ（例えば、国際公開第ＷＯ８９／０６６９２号に記載されるような）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）、ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（国際公開第ＷＯ９５／２７０６２号を参照）が挙げられる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｅ等の他のＶＥＧＦ相同体にも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦ等の他の増殖因子にも結合しない。
【００６２】
一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；限定されないが、「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる、「ベバシズマブ」として知られる抗体を含む、組換え型ヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７４５９３−４５９９を参照のこと）。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、現在市販されている。ベバシズマブを用いて治療することができる非限定的な例示的癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腎癌、卵巣癌、多形神経膠芽腫、小児骨肉腫、胃癌、および膵癌を含む。ベバシズマブは、その受容体に対するヒトＶＥＧＦの結合を遮断するマウス抗体Ａ．４．６．１に由来する、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域と、抗原結合相補性決定領域とを含む。ベバシズマブおよび他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、米国特許第６，８８４，８７９号および同第７，１６９，９０１号にさらに記載される。さらなる抗ＶＥＧＦ抗体は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号および同第ＷＯ２００９／０７３１６０号；米国Ｐａｔ．第７，０６０，２６９号、同第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０２０号；同第６，０５４，２９７号；国際公開第ＷＯ９８／４５３３２号；同第ＷＯ９６／３００４６号；同第ＷＯ９４／１０２０２号；欧州特許第ＥＰ０６６６８６８Ｂ１号；米国特許出願公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、および同第２００５０１１２１２６；ならびにＰｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）に記載されている。
【００６３】
「対象」  および「患者」という用語は、哺乳動物を指すために本明細書において同義で使用される。いくつかの実施形態において、対象または患者はヒトである。他の実施形態において、限定されないが、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳類実験動物、哺乳類家畜、哺乳類競技動物、および哺乳類ペットを含む、他の哺乳動物を治療する方法も提供される。
【００６４】
「試料」または「患者試料」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、物理的、生化学的、化学的、および／または生理学的な特徴に基づいて特徴付けられるおよび／または特定される、細胞実体および／または他の分子実体を含む対象とする対象から得られるかまたは対象に由来する組成物を指す。例えば、「疾患試料」という句およびこの変形は、特徴付けられる細胞実体および／または分子実体を含むことが予測されるかまたは分かっている、対象とする対象から得られる任意の試料を指す。「組織または細胞試料」とは、対象または患者の組織から得られた類似する細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の源は、新鮮な、凍結された、および／または保存された、臓器もしくは組織試料または生検組織または吸引液由来の固形組織；血液または任意の血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液等の体液；対象の妊娠または発達における任意の時期かの細胞であってもよい。組織試料はまた、初代培養細胞または培養細胞または細胞株であってもよい。任意選択的に、組織または細胞試料は、疾患組織／臓器から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血剤、緩衝液、固定液、栄養剤、抗生物質等の、本来の組織には自然に混合されない化合物を含み得る。
【００６５】
「参照試料」、「参照細胞」、または「参照組織」は、本明細書において使用される場合、特定するために本発明の方法または組成物が使用される疾患または状態に罹患していないと分かっているかまたは考えられる源から得られた試料、細胞、または組織を指す。いくつかの実施形態において、参照試料、参照細胞、または参照組織は、本発明の組成物または方法を使用して疾患または状態が特定される同じ対象または患者の正常な身体部分から得られる。いくつかの実施形態において、参照試料、参照細胞、または参照組織は、本発明の組成物または方法を使用して疾患または状態が特定される対象または患者ではない１人以上の個体の正常な身体部分から得られる。
【００６６】
「癌」および「腫瘍」は、本明細書において使用される場合、動物における任意の異常な細胞または組織の成長または増殖を指す同義の用語である。本明細書において使用される場合、「癌」および「腫瘍」という用語は、固形癌および血液癌／リンパ腺癌を包含し、また悪性、前癌性、および良性の増殖、例えば異形成等も包含する。癌の例として、限定されないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な非限定的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、下垂体癌、食道癌、星状細胞腫、軟部肉腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管細胞癌、胆嚢癌、胃癌、黒色腫、および種々の種類の頭頸部癌が挙げられる。
【００６７】
「肺癌」という用語は、本明細書において使用される場合、小細胞肺癌と非小細胞肺癌の両方を指す。非小細胞肺癌は、限定されないが、肺扁平上皮癌、腺癌、肺大細胞癌、肉腫様細胞癌、カルチノイド腫瘍、肺多形癌、ならびに腺扁平上皮癌および細気管支肺胞上皮癌を含む。小細胞肺癌は、いくつかの実施形態において、「燕麦細胞癌」と称される場合があり、限定されないが、小細胞癌と非小細胞癌とが混在する混合型小細胞癌を含む。
【００６８】
「ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞」は、ＦＧＦＲ１遺伝子を２コピーより多く含む細胞を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が１より大きい細胞を指す。いくつかの実施形態において、比率は、蛍光インサイツハイブリダイゼーションによって決定される。「ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌」は、本明細書において使用される場合、癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌は、癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも４コピー含む癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌は、癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ１遺伝子：第８染色体セントロメア比が１より大きい、癌を指す。例示的なＦＧＦＲ１遺伝子配列は、例えば、２０１２年３月２５日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７７２９．１に見出すことができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、ＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも８コピー、または少なくとも１０コピー含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、少なくとも４コピーを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、ＦＧＦＲ１遺伝子：第８染色体セントロメア比が、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、または少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、ＦＧＦＲ１遺伝子：第８染色体セントロメア比が少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞中のＦＧＦＲ１遺伝子の各コピーは、ＦＧＦＲ１遺伝子の完全なコピーである必要はない。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う細胞は、高いレベルのＦＧＦＲ１を有する（すなわち、いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する細胞は、ＦＧＦＲ１の過剰発現を伴う細胞でもある）。
【００７０】
「ＦＧＦＲ１の過剰発現を伴う細胞」または「ＦＧＦＲ１を過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＦＧＦＲ１の過剰発現を伴う癌」または「ＦＧＦＲ１を過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１の過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍高いレベルのＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。例示的なヒトＦＧＦＲ１タンパク質配列は、例えば、２０１２年３月２１日付のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ参照配列：Ｐ１１３６２（ＦＧＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ）に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年３月２４日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２３１１０．２に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｃタンパク質配列は、例えば、２０１２年３月２４日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０７５５９８．２に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年３月２４日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２３１１０．２に見出すことができる。
【００７１】
「ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を伴う細胞」または「ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を伴う癌」または「ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃを過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍高いレベルのＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。例示的なヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃタンパク質配列は、例えば、２０１２年２月１２日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００１３３．１に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年２月１２日付ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００１４２．４に見出すことができる。
【００７２】
「ＦＧＦ２の過剰発現を伴う細胞」または「ＦＧＦ２を過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＦＧＦ２の過剰発現を伴う癌」または「ＦＧＦ２を過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ２の過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍高いレベルのＦＧＦ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＦＧＦ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。例示的なヒトＦＧＦ２タンパク質配列は、例えば、２０１２年２月１２日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１９９７．５に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦ２  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年２月１２日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２００６．４に見出すことができる。
【００７３】
「ＤＫＫ３の過剰発現を伴う細胞」または「ＤＫＫ３を過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＤＫＫ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＤＫＫ３の過剰発現を伴う癌」または「ＤＫＫ３を過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＤＫＫ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＤＫＫ３の過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍高いレベルのＤＫＫ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＤＫＫ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。例示的なヒトＤＫＫ３タンパク質配列は、例えば、２０１２年１月２２日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０１８０６７．１に見出すことができる。例示的なヒトＤＫＫ３  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年１月２２日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０１８０５７．１に見出すことができる。
【００７４】
「ＦＧＦ１８の過剰発現を伴う細胞」または「ＦＧＦ１８を過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦ１８  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＦＧＦ１８の過剰発現を伴う癌」または「ＦＧＦ１８を過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＦＧＦ１８  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１８の過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍高いレベルのＦＧＦ１８  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＦＧＦ１８  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。例示的なヒトＦＧＦ１８タンパク質配列は、例えば、２０１２年６月２７日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３８５３に見出すことができる。例示的なヒトＦＧＦ１８  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年６月２７日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３８６２．２に見出すことができる。
【００７５】
「ＥＴＶ４の過剰発現を伴う細胞」または「ＥＴＶ４を過剰発現している細胞」は、参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＥＴＶ４  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する細胞を指す。「ＥＴＶ４の過剰発現を伴う癌」または「ＥＴＶ４を過剰発現している癌」は、細胞の少なくとも一部が参照細胞よりも少なくとも２倍高いレベルのＥＴＶ４  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する癌を指す。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ４の過剰発現を伴う細胞は、参照細胞よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、または少なくとも１０倍高いレベルのＥＴＶ４  ｍＲＮＡまたはタンパク質を有する。ＥＴＶ４  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、限定されないが、本明細書に記載される方法を含む任意の好適な方法によって決定することができる。例示的なヒトＥＴＶ４タンパク質配列は、例えば、２０１２年９月０８日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１９７７．１に見出すことができる。例示的なヒトＥＴＶ４  ｍＲＮＡ配列は、例えば、２０１２年９月０８日付のＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１９８６．２に見出すことができる。
【００７６】
「治療」は、本明細書において使用される場合、ヒトを含む哺乳動物の状態に対する治療薬の任意の投与または適用を含み、例えば、退縮を引き起こすことによって、または機能の損失、不足、もしくは低下を回復もしくは修復することによって、または非効率的なプロセスを刺激することによって、状態もしくは状態の進行を阻害すること、状態もしくはその進行を阻害することもしくは遅延させること、その発達を停止すること、状態を部分的もしくは完全に軽減すること、または状態を治癒することを含む。いくつかの実施形態において、「治療」は、治療される個体または細胞の自然の経過を変更するための臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理学的過程の間に行うことができる。望ましい治療の効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患のいずれの直接的または間接的な病理学的帰結の低減、転移の予防、疾患進行の速度の減速、病態の回復または緩和、および寛解または予後の改善を含む。
【００７７】
分子または分子の組み合わせの「有効量」または「治療有効量」は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与された時に、状態を治療するのに十分な量、および／または、少なくとも対象のサブセットにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量を意味する。特定の実施形態において、治療有効量は、投与時および必要な期間の間、所望の治療結果または予防的結果を達成するために有効な量を指す。本発明のＦＧＦＲ１融合タンパク質の治療有効量は、例えば、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体においてＦＧＦＲ１融合タンパク質が所望の応答を誘発する能力等の要因に従って変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、ＦＧＦＲ１融合タンパク質のいずれかの毒性または有害作用を上回る量である。癌の場合、薬物の有効量は、癌細胞の数を減少させる；腫瘍サイズを縮小する；癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで遅らせ、典型的には停止する）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで遅らせ、典型的には停止する）；腫瘍増殖をある程度まで阻害する；腫瘍の治療を可能にする、および／または障害に関連する１つより多くの症状をある程度まで軽減し得る。薬物は、増殖を予防し得るおよび／または既存の癌細胞を死滅させ得る範囲で、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であってもよい。
【００７８】
「予防的有効量」は、投与時および必要な期間の間、所望の予防的結果を達成するために有効な量を指す。必ずではないが典型的には、予防投与は、疾患の前または早期段階で対象に行われるため、予防的有効量は治療有効量よりも少ない。
【００７９】
「阻害」または「阻害する」という用語は、任意の表現型特性の減少もしくは停止、またはその特性の発生頻度、程度、もしくは可能性の減少もしくは停止を指す。非限定的な例示的阻害は、腫瘍増殖の阻害を含む。
【００８０】
治療剤の投与の恩恵または治療剤の投与に対する反応の文脈において本明細書において使用される「恩恵」、「治療上の恩恵」、「反応性」、および「治療反応性」という用語は、例えば、疾患進行のある程度の阻害（遅延および完全な停止を含む）；疾患のエピソードおよび／もしくは症状の数の減少；病変サイズの縮小；疾患細胞の隣接する末梢器官および／もしくは組織への浸潤の阻害（すなわち、低減、遅延、および完全な停止）；疾患転移の阻害（すなわち、低減、遅延、および完全な停止）；疾患病変の退縮または消失を必ずではないがもたらし得る自己免疫応答の低下；疾患に関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減；治療後の無病期間の長さ、例えば、無進行生存の増加；全体的な生存期間の増加；より高い奏効率；ならびに／または治療後の所与の時点での死亡率の減少等の種々のエンドポイントを評価することによって、測定することができる。
【００８１】
１つまたは複数のさらなる治療剤と「組み合わせた」投与は、共投与（同時投与を含む）および任意の順序の連続投与（すなわち、逐次投与）を含む。
【００８２】
「薬学的に許容される担体」は、対象に投与するための「薬学的組成物」を一緒に含む治療剤とともに使用される、当該技術分野において従来的である無毒性の固体、半固体、もしくは液体の増量剤、希釈剤、封入材料、製剤補助剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントに非毒性であり、製剤の他の成分と適合する。薬学的に許容される担体は、用いられる製剤に適している。例えば、治療剤が経口投与される場合、担体はゲルカプセルであってもよい。治療薬剤が皮下投与される場合、担体は、理想的には、皮膚に刺激性を示さず、注射部位反応を引き起こさない。
【００８３】
治療組成物および方法
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を使用してＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法を提供する。そのような癌は、いくつかの実施形態において、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を用いた治療に特に反応することが分かっている。したがって、いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有する癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有することが決定される。そのような方法において、癌におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーの過剰発現を有する癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかの実施形態において、過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、過剰発現は、タンパク質の過剰発現であるいくつかの実施形態において、少なくとも、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択されるマーカーを過剰発現している癌を治療する方法は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象における癌を治療する方法は、治療有効量の線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を対象に投与する工程を含み、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与前に、癌の細胞の少なくとも一部が、少なくとも、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択されるマーカーの過剰発現を有することが決定される。そのような方法において、癌におけるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、および／またはＥＴＶ４の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌において、癌細胞の少なくとも一部は、ＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも４コピー含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌において、癌細胞の少なくとも一部は、ＦＧＦＲ１遺伝子を少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも８コピー、または少なくとも１０コピー含む。ＦＧＦＲ１遺伝子のコピー数の決定は、当該技術分野における任意の好適な方法によって実行することができる。特定の非限定的な例示的方法を本明細書で論じる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌において、癌細胞の少なくとも一部は、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う癌において、癌細胞の少なくとも一部は、第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、または少なくとも４である。そのような比率の決定は、当該技術分野における任意の好適な方法によって実行することができる。特定の非限定的な例示的方法を本明細書で論じる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、喉頭癌、肝癌、腎癌、神経膠芽腫、および膵癌から選択される。特定の実施形態において、癌は、乳癌、食道癌、および肺癌から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌である。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌から選択される。いくつかの実施形態において、肺癌は、扁平上皮癌である。いくつかの実施形態において、癌は、頭頸部癌である。いくつかの実施形態において、頭頸部癌は、頭頸部の扁平上皮癌である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１〜４から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号２および４から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、配列番号５および６から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１  ＥＣＤ．３３９−Ｆｃである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、１つまたは複数のさらなる抗癌治療とともに投与される。さらなる抗癌治療の例として、限定されないが、手術、放射線療法（照射療法）、生物学的療法、免疫療法、および化学療法、またはこれらの治療の組み合わせが挙げられる。さらに、細胞傷害性薬剤、抗血管新生剤、および抗増殖性薬剤を、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と組み合わせて使用することができる。任意の方法および使用法の特定の態様において、本発明は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、１つまたは複数の化学療法剤とを対象に投与することにより、癌細胞の少なくとも一部が、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含み、かつ／または、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療することを提供する。いくつかの実施形態において、対象の癌は、以前に治療されていない。様々な化学療法剤が、本発明の併用治療の方法および用途に使用され得る。企図される化学療法剤の例示的かつ非限定的なリストは、本発明の「定義」および「発明の概要」に提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、１つまたは複数の抗血管新生剤とを対象に投与することにより、癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、１つまたは複数のＶＥＧＦアンタゴニストとを対象に投与することにより、癌を治療することを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、１つまたは複数のＶＥＧＦアンタゴニストとを、１つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することにより、癌を治療することを提供する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体および／またはＶＥＧＦトラップである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、ソラフェニブ、エトポシド、トポテカン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦトラップ、およびベバシズマブから選択される少なくとも１種のさらなる治療剤と組み合わせて対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法が提供される。別の例において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、ソラフェニブ、エトポシド、トポテカン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦトラップ、およびベバシズマブから選択される少なくとも１種のさらなる治療剤と組み合わせて対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃおよびドセタキセルを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法が提供される。
【００９０】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）を含む薬学的組成物が、特定の適応症のための治療有効量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療を受ける対象の体重、対象の身体的状態もしくは健康状態、治療される状態の広範さ、および／または治療を受ける対象の年齢に依存する。一般に、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、１用量当たり約５０μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の量で投与されるべきである。任意選択的に、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、１用量当たり約１００μｇ／体重１ｋｇ〜約３０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の量で投与することができる。さらに任意選択的に、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、１用量当たり約０．５ｍｇ／体重１ｋｇ〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の量で投与することができる。特定の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、約８ｍｇ／体重１ｋｇ〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、約８ｍｇ／体重１ｋｇ〜約１６ｍｇ／体重１ｋｇ（または減衰係数１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍを用いて計算した場合、約１０ｍｇ／体重１ｋｇ〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇ）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、約８ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１１ｍｇ／体重１ｋｇ、約１２ｍｇ／体重１ｋｇ、約１３ｍｇ／体重１ｋｇ、約１４ｍｇ／体重１ｋｇ、約１５ｍｇ／体重１ｋｇ、約１６ｍｇ／体重１ｋｇ、約１７ｍｇ／体重１ｋｇ、約１８ｍｇ／体重１ｋｇ、約１９ｍｇ／体重１ｋｇ、または約２０ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１融合タンパク質は、減衰係数１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍを用いて計算された約１０ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与される。 他の実施形態において、ＦＧＦＲ１融合タンパク質は、減衰係数１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍを用いて計算された約２０ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与される。 ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子はまた、上記用量のうちの１つから別の用量の範囲で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、投与量は、週２回、毎週、隔週、毎週と隔週の間の頻度で、３週毎、４週毎、または毎月投与されてもよい。
【００９１】
特定の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与量は、用いられる減衰係数（ＥＣ）に依存して二通りに計算することができる。減衰係数は、タンパク質のグリコシル化が考慮されているかどうかに依存して異なる。一実施形態において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのアミノ酸組成に基づく減衰係数は、例えば、１．４２ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍである。別の実施形態において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのアミノ酸部分に基づく減衰係数は、例えば、１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍである。表１に示すように、１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍのＥＣを用いたＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの用量の計算は、計算用量を２８％増加させる。２つの減衰係数を用いて計算される用量は異なるが、モル濃度、または投与される薬物の実際の量は同一である。別途記載のない限り、本明細書において開示される用量は、それぞれ、グリコシル化を考慮に入れない減衰係数を用いて計算される。これらの投与量を、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのグリコシル化を考慮に入れた減衰係数を用いて計算された投与量と比較したものを表１に示す。表１から分かるように、ここで１．４２ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍのＥＣを用いた約８ｍｇ／ｋｇ（例えば、７．８および８．０）の投与量は、１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍのＥＣを用いて計算した場合の約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、１０．０および１０．２）の投与量に相当する。ここで１．４２  ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍのＥＣを用いた約１６  ｍｇ／ｋｇ（例えば、１５．６および１６．０ｍｇ／ｋｇ）投与量は、１．１１ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍのＥＣを用いて計算した場合の約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、２０．０および２０．５）投与量に相当する。上記「定義」の項目で述べたように、本明細書において提供される測定された数値は近似値であり、丸められたさらなる有効数字を有する値を包含する。例えば、８ｍｇ／ｋｇは、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、および８．４５等の有効桁数が２桁の値を包含し、これらの各々は８に丸められる。同様に、１６ｍｇ／ｋｇ等の値は、例えば、１５．６および１６．０等の、１６に丸められる有効桁数が３桁の値を包含する。
【００９２】
（表1）ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦＣ用量の変換
0006578318.tif 000002
a用量は、mg/kgで示されている。
【００９３】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子、および／または少なくとも１種のさらなる治療剤を含む薬学的組成物は、必要に応じて対象に投与することができる。特定の実施形態において、有効量の治療用分子は、１回以上対象に投与される。種々の実施形態において、有効量の治療用分子は、少なくとも２ヶ月に１回、少なくとも１ヶ月に１回、少なくとも１ヶ月に２回、週１回、週２回、または週３回、対象に投与される。種々の実施形態において、  有効量の治療用分子は、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間、対象に投与される。
【００９４】
特定の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子、および少なくとも１種のさらなる治療剤の併用投与は、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いた同時投与を含む共投与、および任意の順序の連続投与を含む。任意選択的に、両方の（または全ての）活性薬剤が、同時にそれらの生物活性を発揮する時期が存在する。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）と組み合わせて投与される治療剤の治療有効量は、医師または獣医師の判断に委ねられる。投与量の投与および調整は、治療される状態の最大管理を達成するために行われる。用量は、使用される治療剤の種類、治療を受ける特定の患者、疾患の段階、および治療計画の所望の積極性等の要因にさらに依存する。
【００９５】
特定の実施形態において、患者は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）とＶＥＧＦアンタゴニストとの組み合わせを用いて治療される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト）である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストはチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、パゾパニブ）である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。ベバシズマブの例示的な１つの投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは１５ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つまたは複数の用量が患者に投与されてもよい。そのような量は、間欠的に、例えば、毎週、２週毎、または３週毎に投与されてもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ）は、化学療法剤または抗血管新生剤等の別の治療剤と組み合わせて、該治療剤の推奨または処方される投与量および／または頻度で投与される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、さらなる治療剤は、食品医薬品局等の治療処置の認可に責任のある機関によって承認された投与量で、または製造者の推奨する投与量で投与される。
【００９８】
投与経路および担体
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、静脈内および／または皮下に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、別の経路、例えば、動脈内、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、心室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内、皮内、局所的、経皮的、もしくはくも膜下腔内経路により、またはさもなければ移植もしくは吸入により、投与することができる。種々の実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療剤を、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、心室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内の、皮内、局所的、経皮的、およびくも膜下腔内を含む種々の経路により、またはさもなければ移植もしくは吸入によりインビボで投与することができる。 対象組成物の各々は、単独で、または組み合わせて、錠剤、カプセル剤、散剤、粒剤、軟膏、溶剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤等の、固体、半固形、液体、または気体形態の調製物に処方することができる。
【００９９】
種々の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子、および／または少なくとも１種のさらなる治療剤を含む組成物は、薬学的に許容される担体とともに製剤中に提供され、多種多様な担体が当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２００３）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。ビヒクル、アジュバント、担体、および希釈剤を含む種々の薬学的に許容される担体が公的に利用可能である。さらに、種々の薬学的に供される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤等も、公的に利用可能である。特定の非限定的な例示的担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、定義の項目において上に示したブランド薬として、またはジェネリックの均等物として処方される。いくつかの実施形態において、ドセタキセルは、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）、またはジェネリックの均等物として処方される。
【０１００】
種々の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子および／または少なくとも１種のさらなる治療剤を含む組成物は、植物油もしくは他の油、合成脂肪族酸グリセリド、より高級な脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性または非水性溶媒中に、溶解、懸濁、または乳化することによって、あるいは所望の場合、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の従来の添加物とともに、注射用に処方することができる。種々の実施形態において、組成物は、例えば、加圧された許容される噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等を使用して、吸入用に処方されてもよい。組成物はまた、種々の実施形態において、生分解性または非生分解性のポリマーととともに徐放性マイクロカプセルに処方されてもよい。非限定的な例示的生分解性製剤は、ポリ乳酸−グリコール酸ポリマーを含む。非限定的な例示的非生分解性製剤は、ポリグリセリン脂肪酸エステルを含む。そのような製剤を作製する方法は、例えば、欧州特許第ＥＰ１  １２５  ５８４  Ａ１号に記載されている。
【０１０１】
各々が１つまたは複数の用量のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子および／または少なくとも１種のさらなる治療剤を収容する１つまたは複数の容器を含む薬学的投薬パックも提供される。特定の実施形態において、単位投与量が提供され、単位投与量は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子、および／または１種または複数種のさらなる薬剤を含むかもしくは含まない少なくとも１種のさらなる治療剤を含む、所定量の組成物を含む。特定の実施形態において、そのような単位投与量は、単回使用の注射用プレフィルドシリンジ内に供給される。種々の実施形態において、単位投与量に含まれる組成物は、生理食塩水、ショ糖等、緩衝液、例えば、リン酸塩等を含み得、かつ／または安定した有効なｐＨ範囲内で処方することができる。代替として、特定の実施形態において、組成物は、適切な液体、例えば滅菌水の添加によって再構成することができる凍結乾燥粉末として提供されてもよい。特定の実施形態において、組成物は、限定されないが、ショ糖およびアルギニンを含む、タンパク質凝集を阻害する１種または複数種の物質を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはプロテオグリカンを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、投薬パックは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を投与する前に、癌が、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含むかどうか、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーを過剰発現しているかどうかを決定するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかのそのような実施形態において、説明書は、癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅の存在、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーの過剰発現が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、癌細胞の少なくとも一部においてＦＧＦＲ１遺伝子が少なくとも４コピー存在することが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、癌細胞の少なくとも一部においてＦＧＦＲ１遺伝子が少なくとも４コピー、少なくとも６コピー、少なくとも８コピー、または少なくとも１０コピー存在することが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、癌細胞の少なくとも一部における第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２であることが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部における第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、または少なくとも４であることが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、投与量パックは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を投与する前に、肺癌が、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含むかどうか、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーを過剰発現しているかどうかを決定するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかのそのような実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部における  ＦＧＦＲ１遺伝子増幅の存在、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーの過剰発現が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部においてＦＧＦＲ１遺伝子が少なくとも４コピー存在することが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部においてＦＧＦＲ１遺伝子が少なくとも４コピー、少なくとも６コピー、少なくとも８コピー、または少なくとも１０コピー存在することが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部における第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２であることが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。いくつかの実施形態において、説明書は、肺癌細胞の少なくとも一部における第８染色体セントロメアに対するＦＧＦＲ１遺伝子の比率が少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、または少なくとも４であることが、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する治療反応性の指標であることを示す。
【０１０４】
「説明書」という用語は、本明細書において使用される場合、限定されないが、ラベル、添付文書、コンピュータ可読媒体（例えば、ディスケット、コンパクトディスク、またはＤＶＤ）等の電子形態で利用可能な説明書、インターネット等を経由して遠隔で利用可能な説明書を含む。投薬パックが、説明書へのアクセス、説明書へのリンク（例えば、ユニフォームリソースロケータ、つまりｕｒｌ）、または説明書のコピーを入手するための他の機構（例えば、返信はがき、そこから説明書を要求することができる物理的住所、そこから説明書を要求することができる電子メールアドレス、説明書を入手するためにかけることができる電話番号等）を提供する場合、投薬パックは説明書を含むと見なされる。
【０１０５】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子
非限定的な例示的ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、完全長ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片、およびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ変異体を含む。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、シグナルペプチドを含んでもよいか、または欠いてもよい。例示的なＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、限定されないが、配列番号１、２、３、および４から選択されるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１  ＥＣＤを含む。
【０１０６】
非限定的な例示的ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片は、（シグナルペプチドを有しない成熟型の第１のアミノ酸から数えて）アミノ酸３３９で終端するヒトＦＧＦＲ１  ＥＣＤを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片は、（シグナルペプチドを有しない成熟型の第１のアミノ酸から数えて）アミノ酸３３９とアミノ酸３６０の間で終端する。例示的なＦＧＦＲ１  ＥＣＤ断片は、限定されないが、配列番号３および４から選択されるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１  ＥＣＤを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１〜４から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、配列番号１〜４から選択される配列からなる。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤが、配列番号１〜４から選択される配列「からなる」場合、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、グリコシル化およびシアリル化等の種々の翻訳後修飾を含んでもまたは含まなくてもよい。換言すると、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤが特定のアミノ酸配列からなる場合、近接するアミノ酸配列中にさらなるアミノ酸を含まないが、アミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基、および／またはＣ末端カルボキシ基に対する修飾を含み得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、シグナルペプチドを欠く。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ部分は、配列番号１〜４から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ部分は、配列番号１〜４から選択される配列からなる。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ部分が、配列番号１〜４から選択される配列「からなる」場合、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ部分は、グリコシル化およびシアリル化等の種々の翻訳後修飾を含んでもまたは含まなくてもよい。換言すると、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ部分が特定のアミノ酸配列からなる場合、近接するアミノ酸配列中にＦＧＦＲ１由来のさらなるアミノ酸を含まないが、アミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基、および／またはＣ末端カルボキシ基に対する修飾を含み得る。さらに、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは融合分子に結合しているため、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸が存在し得るが、それらのアミノ酸はＦＧＦＲ１配列に由来するものではなく、例えば、リンカー配列または融合パートナー配列に由来し得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の融合パートナー部分は、Ｆｃ、アルブミン、およびポリエチレングリコールから選択される。非限定的な例示的融合パートナーを本明細書で論じる。
【０１１０】
本発明者らは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子と、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ペメトレキセド、ソラフェニブ、エトポシド、トポテカン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、パゾパニブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦトラップ、およびベバシズマブから選択される少なくとも１種のさらなる治療剤との投与が、癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有し、かつ／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーを過剰発現している癌を治療するのに有用であることを発見した。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、ドセタキセルとともに投与される。
【０１１１】
融合パートナーおよびコンジュゲート
本明細書で論じられるように、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、少なくとも１つの融合パートナーと組み合わされてもよく、その結果としてＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を生じる。これらの融合パートナーは、精製を促進し得、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、インビボ半減期の増加を示し得る。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤの好適な融合パートナーは、例えば、水溶性ポリマー等のポリマー、免疫グロブリンの定常ドメイン；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の全部または一部；フェチュインＡ；フェチュインＢ；ロイシンジッパードメイン；テトラネクチン三量体形成ドメイン；マンノース結合タンパク質（マンノース結合レクチンとしても知られる）、例えば、マンノース結合タンパク質１；および本明細書に記載され、また米国特許第６，６８６，１７９号に記載されているＦｃ領域を含む。非限定的な例示的ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に見出すことができる。
【０１１２】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、ポリアミノ酸または分岐点アミノ酸をＦＧＦＲ１  ＥＣＤに付着させることによって調製することができる。例えば、ポリアミノ酸は、（融合分子によって達成される利点に加えて）ＦＧＦＲ１  ＥＣＤの循環半減期を延長する役割を果たす担体タンパク質であってもよい。本発明の治療目的のために、このようなポリアミノ酸は、理想的には、中和抗原反応または他の有害な反応を有しないまたは生じないものであるべきである。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ＨＳＡ等）、さらなる抗体もしくはその一部、例えば、Ｆｃ領域、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパー核因子赤血球誘導体−２（ＮＦＥ２）、神経網膜ロイシンジッパー、テトラネクチン、または他のポリアミノ酸、例えば、リジンから選択されてもよい。本明細書に記載されるように、ポリアミノ酸の付着位置は、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその間の他の場所であってもよく、選択された分子に化学リンカー部分を介して接続されてもよい。
【０１１３】
ポリマー
ポリマー、例えば、水溶性ポリマーは、生理学的環境において典型的に見られるような水性環境において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の沈殿を減少させるための融合パートナーとして有用であり得る。本発明において用いられるポリマーは、治療用の生成物または組成物の調製に薬学的に許容される。
【０１１４】
好適な、臨床的に許容される水溶性ポリマーは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレインコポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コラン酸または他の炭水化物ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、またはデキストラン、ならびにこれらの混合物を含む。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきた形態のいずれか、例えば、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−アリールオキシ−ポリエチレングリコール等を包含することが意図される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のために、製造における利点を有し得る。
【０１１６】
本明細書で用いられるポリマー、例えば、水溶性ポリマーは、いずれの分子量であってもよく、分岐もしくは非分岐であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーは、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」という用語は、ポリマーの調製中に、ある分子は所定の分子量よりも多く計量され、ある分子は少なく計量されることを示す）。各ポリマーの平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａであってもよい。一般に、分子量が高いほど、または分岐が多いほど、ポリマー：タンパク質の比率が大きい。所望の治療プロファイル、例えば、持続放出の期間、もしある場合には、生物活性に及ぼす影響、取り扱い易さ、抗原性の程度または欠如、およびポリマーがＦＧＦＲ１  ＥＣＤに与える他の既知の影響に依存して、他のサイズが用いられてもよい。
【０１１７】
本発明において用いられるポリマーは、典型的には、ポリペプチドの機能的ドメインまたは抗原ドメインに与える影響を考慮してＦＧＦＲ１  ＥＣＤに付着される。一般に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の好適な条件下で行われ得る。ポリマーを活性成分に結合させるために使用できる活性化基は、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、および５−ピリジルを含む。
【０１１８】
本発明のポリマーは、典型的には、アミノ酸のアルファ（α）もしくはイプシロン（ε）アミノ基または反応性チオール基で異種ポリペプチドに付着されるが、好適な反応条件下でポリマー基に付着するのに充分に反応性であるタンパク質のいずれかの反応基にポリマー基が付着され得ることも企図される。したがって、ポリマーは、遊離アミノ基またはカルボキシル基等の反応基を介してＦＧＦＲ１  ＥＣＤに共有結合されてもよい。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含んでもよい。遊離カルボキシル基を有する残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含んでもよい。反応性チオール基を有する残基は、システイン残基を含む。
【０１１９】
ポリマー、例えば、水溶性ポリマーとコンジュゲートされた融合分子を調製するための方法は、通常、（ａ）ポリペプチドが１つまたは複数のポリマーに付着する条件下でＦＧＦＲ１  ＥＣＤをポリマーと反応させることと、（ｂ）反応生成物を得ることとを含む。各コンジュゲーションの反応条件は、現在既知である条件または後に開発される条件のいずれから選択されてもよいが、修飾されるべきタンパク質を不活性化させる温度、溶媒、およびｐＨ等の条件は回避するべきである。一般に、反応に最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて臨機応変に決定される。例えば、ポリマー：ポリペプチドコンジュゲートの比率が大きいほど、コンジュゲートされた生成物の割合が大きい。（過剰な未反応ポリペプチドまたはポリマーが存在しない反応の効率という観点において）最適な比率は、例えば、所望の誘導体化の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−等）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分岐または非分岐であるかどうか、および用いられる反応条件等の要因によって決定されてもよい。ポリペプチドに対するポリマー（例えば、ＰＥＧ）の比率は、通常、１：１〜１００：１の範囲である。１つまたは複数の精製されたコンジュゲートが、とりわけ、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む標準的な精製技術によって、各混合物から調製されてもよい。
【０１２０】
Ｎ末端を化学修飾したＦＧＦＲ１  ＥＣＤが特に所望されてもよい。分子量、分岐等、反応混合物中のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ分子に対するポリマーの割合、行われる反応の種類、および選択されたＮ末端を化学修飾したＦＧＦＲ１  ＥＣＤを得る方法によって、ポリマーが選択されてもよい。Ｎ末端を化学修飾したＦＧＦＲ１  ＥＣＤ調製物を得る方法（必要に応じて、他のモノ誘導体化部分からこの部分を分離する）は、化学修飾したタンパク質分子の集団からの、Ｎ末端を化学修飾したＦＧＦＲ１  ＥＣＤ材料の精製によるものであってもよい。
【０１２１】
選択的なＮ末端化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる種類の１級アミノ基の異なる反応性（リジン対Ｎ末端）を利用した還元的アルキル化によって達成することができる。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーを用いて、Ｎ末端のタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基とＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａの差を利用することを可能にするｐＨで反応を行うことによって、タンパク質のＮ末端にポリマーを選択的に付着させることができる。このような選択的誘導体化によって、タンパク質へのポリマーの付着が制御される：タンパク質のＮ末端でポリマーとのコンジュゲーションが優勢的に起こり、リジン側鎖アミノ基等の他の反応基の著しい修飾が起こらない。還元的アルキル化を用いると、ポリマーは、上述の種類のものであってもよく、タンパク質へのカップリングのために単一の反応性アルデヒド有するべきである。単一の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドも使用され得る。
【０１２２】
一実施形態において、本発明は、化学的に誘導体化したＦＧＦＲ１  ＥＣＤがモノ−またはポリ−（例えば、２〜４個の）ＰＥＧ部分を含むことを企図する。ペグ化は、利用可能なペグ化反応のいずれかによって実行することができる。ペグ化したタンパク質生成物を調製する方法は、通常、（ａ）タンパク質が１つまたは複数のＰＥＧ基に付着する条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と反応させることと、（ｂ）反応生成物を得ることとを含む。一般に、最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて臨機応変に決定される。
【０１２３】
当該技術分野において既知の多くのＰＥＧ付着方法が存在する。例えば、欧州特許第ＥＰ０４０１  ３８４号；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：１０２８−１０３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０（１９９２）；欧州特許第ＥＰ０  １５４  ３１６号；欧州特許第ＥＰ０４０１  ３８４号；国際公開第ＷＯ９２／１６２２１号；国際公開第ＷＯ９５／３４３２６号；および本明細書に列挙されるペグ化に関連する他の刊行物を参照のこと。
【０１２４】
ペグ化は、例えば、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行されてもよい。したがって、本発明によるタンパク質生成物は、アシル基またはアルキル基を介してＰＥＧ基を付着させたペグ化タンパク質を含む。このような生成物は、モノペグ化またはポリペグ化されてもよい（例えば、２〜６もしくは２〜５個のＰＥＧ基を含むもの）。ＰＥＧ基は、通常、アミノ酸のα−またはε−アミノ基でタンパク質に付着されるが、好適な反応条件下でＰＥＧ基に付着するのに充分に反応性であるタンパク質に付着したいずれかのアミノ基にＰＥＧ基が付着され得ることも企図される。
【０１２５】
アシル化によるペグ化は、通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エステル誘導体を、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤと反応させることを含む。アシル化反応の場合、選択されたポリマーは、典型的には単一の反応性エステル基を有する。いずれの既知のまたは後に発見される反応性ＰＥＧ分子が、ペグ化反応を実行するために使用されてもよい。好適な活性化ＰＥＧエステルの一例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化したＰＥＧである。本明細書において使用される場合、アシル化は、限定されないが、治療用タンパク質と、ポリマー、例えば、ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタン等との間に以下の種類の結合を含むことが意図される（例えば、Ｃｈａｍｏｗ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：１３３−１４０（１９９４）を参照のこと）。反応条件は、現在既知である条件または後に開発される条件のいずれから選択されてもよいが、修飾されるべきポリペプチドを不活性化させる温度、溶媒、およびｐＨ等の条件は回避するべきである。
【０１２６】
アシル化によるペグ化は、通常、ポリ−ペグ化タンパク質を生じる。接続する結合部はアミドであってもよい。結果として得られる生成物は、実質的に（例えば、＞９５％）モノ−、ジ−、またはトリ−ペグ化のみであり得る。しかしながら、ペグ化の程度がより高い特定の種が、用いられる特定の反応条件に応じた量で形成される場合がある。所望の場合、さらに精製されたペグ化種が、とりわけ、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む標準的な精製技術によって、混合物（特に未反応種）から分離されてもよい。
【０１２７】
アルキル化によるペグ化は、通常、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をポリペプチドと反応させることを含む。還元的アルキル化反応の場合、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１２８】
マーカー
さらに、本発明のＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチド等のマーカー配列に融合されてもよい。マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）中に提供されるタグ等のヘキサヒスチジンペプチドであってもよく、これらの多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである赤血球凝集素（ＨＡ）タグは、インフルエンザＨＡタンパク質由来のエピトープに対応する。（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））。これらの上記融合体のいずれも、本明細書に記載されるＦＧＦＲ１  ＥＣＤを用いて遺伝子操作することができる。
【０１２９】
オリゴマー化ドメイン融合パートナー
種々の実施形態において、オリゴマー化は、限定されないが、多価性、結合強度の増加、および異なるドメインの組み合わせた機能を含む、いくつかの機能的利点を融合タンパク質に供給する。したがって、いくつかの実施形態において、融合パートナーは、オリゴマー化ドメイン、例えば、二量体化ドメインを含む。例示的なオリゴマー化ドメインは、限定されないが、α−ヘリックスコイルドコイルドメインを含むコイルドコイルドメイン、コラーゲンドメイン、コラーゲン様ドメイン、および特定の免疫グロブリンドメインを含む。例示的なコイルドコイルポリペプチド融合パートナーは、限定されないが、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質のコイルドコイルドメイン、アンジオポエチンコイルドコイルドメイン、およびロイシンジッパードメインを含む。例示的なコラーゲンまたはコラーゲン様オリゴマー化ドメインは、限定されないが、コラーゲン中に見出されるもの、マンノース結合レクチン、肺界面活性剤タンパク質ＡおよびＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャー受容体、ならびにエミリン（ｅｍｉｌｉｎ）を含む。
【０１３０】
抗体Fc免疫グロブリンドメイン融合パートナー
融合パートナーとして使用されてもよい多くのＦｃドメインが、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、融合パートナーは、Ｆｃ免疫グロブリンドメインである。Ｆｃ融合パートナーは、天然に存在する抗体に見出される野生型Ｆｃ、その変異体、またはその断片であってもよい。非限定的な例示的Ｆｃ融合パートナーは、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の、ヒンジならびにＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含むＦｃを含む。さらなる例示的Ｆｃ融合パートナーは、限定されないが、ヒトＩｇＡおよびＩｇＭを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合パートナーは、例えば、ＩｇＧ１中にＣ２３７Ｓ突然変異を含む（例えば、配列番号８を参照）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合パートナーは、米国特許第６，９００，２９２号に記載されるように、Ｐ３３１Ｓ突然変異を有するヒトＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の例示的なＦｃドメイン融合パートナーは、配列番号８〜１０に示される。
【０１３１】
アルブミン融合パートナーおよびアルブミン結合分子融合パートナー
いくつかの実施形態において、融合パートナーはアルブミンである。例示的なアルブミンは、限定されないが、それらが融合するポリペプチドの血清半減期またはバイオアベイラビリティを増加させることができるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびＨＳＡの断片を含む。いくつかの実施形態において、融合パートナーは、アルブミン結合分子、例えば、脂質、またはアルブミンに結合する他の分子とコンジュゲートするアルブミンまたは分子に結合するペプチドである。いくつかの実施形態において、ＨＳＡを含む融合分子は、例えば、米国特許第６，６８６，１７９号に記載されている。
【０１３２】
融合パートナーの例示的な付着
融合パートナーは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤのＮ末端またはＣ末端に共有結合的にまたは非共有結合的に付着させることができる。付着は、例えば、アミノ酸側鎖（例えば、システイン、リジン、セリン、またはスレオニンの側鎖等）を介して、Ｎ末端またはＣ末端以外のＦＧＦＲ１  ＥＣＤ内の場所でも起こり得る。
【０１３３】
共有結合的な付着または非共有結合的な付着のいずれかの実施形態において、融合パートナーとＦＧＦＲ１  ＥＣＤとの間にリンカーが含まれてもよい。そのようなリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸または化学部分から構成されてもよい。融合パートナーをＦＧＦＲ１  ＥＣＤに共有結合的に付着させる例示的な方法は、限定されないが、融合パートナとＦＧＦＲ１  ＥＣＤを単一のアミノ酸配列として翻訳すること、および融合パートナーをＦＧＦＲ１  ＥＣＤに化学付加することを含む。融合パートナーとＦＧＦＲ１  ＥＣＤが単一のアミノ酸配列として翻訳される場合、さらなるアミノ酸が、融合パートナーとＦＧＦＲ１  ＥＣＤとの間にリンカーとして含まれてもよい。いくつかの実施形態において、融合パートナーおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤの単一発現構築物へのクローニングを促進するために、リンカーは、それをコードするポリヌクレオチド配列に基づいて選択される（例えば、特定の制限酵素部位を含むポリヌクレオチドが、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドとＦＧＦＲ１  ＥＣＤをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されてもよく、制限酵素部位を含むポリヌクレオチドが、短いアミノ酸リンカー配列をコードする）。融合パートナーとＦＧＦＲ１  ＥＣＤとが、化学的手段によって共有結合的にカップリングされる場合、典型的には、カップリング反応の間に種々のサイズのリンカーが含まれてもよい。
【０１３４】
融合パートナーをＦＧＦＲ１  ＥＣＤに非共有結合的に付着させる例示的な方法は、限定されないが、結合対を介した付着を含む。例示的な結合対は、限定されないが、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、抗体およびその抗原等を含む。
【０１３５】
共翻訳修飾および翻訳後修飾
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または抗体分子もしくは他の細胞リガンドへの結合によって、翻訳の間または後に特異的に修飾されるＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与を包含する。多くの化学的修飾のいずれも、限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８  プロテアーゼによる特異的な化学切断；ＮＡＢＨ４；アセチル化；ホルミル化；酸化；還元；および／またはチュニカマイシンの存在下における代謝合成を含む既知の技術によって実行することができる。
【０１３６】
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾は、例えば、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端終端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学部分の付着、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞の発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の種々の翻訳後修飾の非限定的な考察は、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に見出すことができる。
【０１３７】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよびＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の発現と産生ベクター
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。また、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。そのようなベクターは、限定されないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＣＨＯまたはＣＨＯ由来細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されるベクターが選択される。例示的なこのようなベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０−８８９（２００４）に記載されている。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ヒトを含む動物における  ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子のインビボ発現のために選択される。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドの発現は、組織特異的な様式で機能するプロモーターの制御下にある。例えば、肝臓特異的プロモーターは、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０７６２８８号に記載されている。種々の発現ベクターの非限定的な考察は、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に見出すことができる。
【０１４０】
宿主細胞
種々の実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、原核細胞、例えば、細菌細胞中で、または真核細胞、例えば、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞中で発現させることができる。そのような発現は、例えば、当該技術分野において既知の手順に従って実行されてもよい。ポリペプチドを発現させるために使用することができる例示的な真核細胞は、限定されないが、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３−６Ｅ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ−ＳおよびＤＧ４４細胞を含むＣＨＯ細胞、ならびにＮＳＯ細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対して特定の所望の翻訳後修飾を行う能力に基づいて、特定の真核生物宿主細胞が選択される。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりもより高いレベルのシアリル化を有するＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を産生する。
【０１４１】
所望の宿主細胞への核酸の導入は、限定されないが、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、カチオン性脂質媒介形質移入、電気穿孔、形質導入、感染等を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成することができる。非限定的な例示的方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載されている。核酸は、当該技術分野において既知の方法に従って、所望の宿主細胞中に過渡的にまたは安定に形質移入することができる。宿主細胞および宿主細胞中のポリペプチドの方法に関する非限定的な考察は、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に見出すことができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法に従って、遺伝子操作したかまたはポリペプチドをコードする核酸分子で形質移入した動物においてインビボで産生させることができる。
【０１４３】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤポリペプチドの精製
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子は、当該技術分野において既知の種々の方法によって精製することができる。そのような方法は、限定されないが、親和性マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用を含む。好適な親和性リガンドは、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたは融合パートナーの任意のリガンドを含む。ＦＧＦＲ１に結合する抗体の場合の好適な親和性リガンドは、限定されないが、ＦＧＦＲ１自体およびその断片を含む。さらに、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体親和性カラムを用いてＦｃ融合パートナーに結合させ、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を精製することもできる。また、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤに対する抗体を用いてＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子を精製してもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムも、特定のポリペプチドを精製するのに好適であるかもしれない。ポリペプチドを精製する多くの方法が、当該技術分野において既知である。ポリペプチドを精製する種々の方法の非限定的な考察は、例えば、米国特許第７，６７８，８９０号に見出すことができる。
【０１４４】
ＦＧＦＲ１  ＥＣＤおよび／またはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の恩恵を受ける患者を特定する方法
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子の投与から恩恵を受け得る癌に罹患している患者を特定する方法が提供される。いくつかのそのような実施形態において、当該方法は、対象から採取された試料中の癌細胞の少なくとも一部がＦＧＦＲ１遺伝子増幅を含むかどうかを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、試料は、癌を有するかまたは有することが疑われる患者から採取される。癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅の発見は、癌を有するかまたは有することが疑われる患者が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子療法の恩恵を受け得ることを示唆する。いくつかの実施形態において、患者は、肺癌を有するかまたは有することが疑われる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、方法は、癌細胞の少なくとも一部が、対象から採取された試料中に、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のマーカーの過剰発現を含むかどうかを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、過剰発現は、ｍＲＮＡの過剰発現である。いくつかの実施形態において、過剰発現は、タンパク質の過剰発現であるいくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、および／またはＥＴＶ４の過剰発現は、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子に対する癌の治療反応性の指標である。いくつかの実施形態において、試料は、癌を有するかまたは有することが疑われる患者から採取される。癌細胞の少なくとも一部におけるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、および／またはＥＴＶ４の過剰発現の発見は、癌を有するかまたは有することが疑われる患者が、ＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子療法の恩恵を受け得ることを示唆する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。いくつかの実施形態において、患者は、肺癌を有するかまたは有することが疑われる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーの過剰発現は、研究施設によって決定される。研究施設は、病院の研究室または病院とは独立した研究室であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅、ならびに／またはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、およびＥＴＶ４から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、もしくは少なくとも４種のマーカーの過剰発現の決定後、決定の結果が医療従事者に伝えられる。いくつかのそのような実施形態において、患者がＦＧＦＲ１  ＥＣＤまたはＦＧＦＲ１  ＥＣＤ融合分子療法の恩恵を受けるかどうか、または該療法に反応を示すかどうかを判定する目的のために結果が伝えられる。いくつかの実施形態において、医療従事者は、限定されないが、医師、看護師、病院の運営者およびスタッフ等を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃである。
【０１４７】
ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を決定する任意の好適な方法が使用され得る。非限定的な例示的なそのような方法は、蛍光インサイツ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；例えば、Ｍｏｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：５７１１−５７１６を参照）、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：Ｓ１６−２１を参照）、スペクトル核型決定、（ＳＫＹ；例えば、Ｌｉｙａｎａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３１２−５を参照）、リアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、Ｄｈａｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：２６２-２７０を参照）、サザンブロット法、ならびに、限定されないが、ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ；例えば、Ｍｅｄｖｅｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０：１６１３−２２を参照）および次世代シーケンシング技術、例えば、「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」（「ＷＴＳＳ」）とも称されるＲＮＡシーケンス、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤTMＳｙｓｔｅｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（ＴＭ）単一分子シーケンシング、単一分子ＳＭＲＴ（ＴＭ）シーケンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）シーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、ＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの手法、および４５４  ピロシーケンシングを含む配列決定を含む。
【０１４８】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、染色体上の特定のＤＮＡ配列の有無を検出して位置を特定するための細胞遺伝学的技術である。いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨは、蛍光プローブを使用して、配列特異的な様式で染色体上の特定の領域を検出する。したがって、いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨを用いて癌における遺伝子増幅を検出するために、いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ１遺伝子等の対象とする遺伝子に特異的に結合する蛍光プローブが開発される。いくつかのそのような実施形態において、この遺伝子特異的プローブを癌試料とハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡を使用して細胞当たりに存在する蛍光シグナルの数を数えることによりコピー数を決定する。通常の二倍体細胞の場合、遺伝子の大半はコピー数が２である（遺伝子が常染色体ではなく性染色体のうちの１つに存在する場合、または細胞が分裂中でありゲノムが複製中される場合を除く）。１つの細胞に２つより多いシグナルが検出された場合、特定の場合において、遺伝子が増幅している可能性がある。
【０１４９】
癌における遺伝子増幅を評価するために、二色ＦＩＳＨも用いることができる。いくつかの実施形態において、対象とする遺伝子が位置する染色体のセントロメア領域に結合する参照プローブを、対照として使用することができる。場合によっては、染色体のセントロメア（ＣＥＮ）領域はゲノム的に安定であると見なされ、したがって染色体全体を代表するものであると考えられる。したがって、ＣＥＮのコピー数は、いくつかの実施形態において、染色体の多染色体性（染色体のセントロメアが３コピー以上）に起因する遺伝子コピー数の増加と局所的な遺伝子増幅を区別するのに役立つ。いくつかの実施形態において、対象とする遺伝子プローブからのシグナル／セントロメアプローブからのシグナルの比率を計算することによって、遺伝子増幅を多染色体性と区別することができる。対象とする遺伝子が常染色体に位置する通常の二倍体細胞の場合、この比率は典型的には１である。いくつかの実施形態において、この比率が１より大きいことが遺伝子増幅の指標である。いくつかの実施形態において、セントロメアプローブの代わりに、またはそれに加えて、染色体の参照遺伝子に対するプローブを使用することができる（例えば、Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：４１６８−７４を参照）。いくつかの実施形態において、選択される参照遺伝子も第８染色体上に存在する。いくつかの実施形態において、参照遺伝子は、第８染色体のセントロメアの近くに位置する。いくつかの実施形態において、参照配列は、第８染色体上に非コードＤＮＡを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨは、限定されないが、増幅された遺伝子を含む細胞の画分、細胞の種々の亜集団内の増幅レベル、および細胞内の増幅パターン（例えば、密集シグナル対複数の散乱シグナル）を含む、遺伝子増幅の複数のパラメータの決定を可能にする。いくつかの実施形態において、各癌細胞ごとに、セントロメア参照に対する対照となる遺伝子のコピー数の比率が決定される。いくつかのそのような実施形態において、特定の試料または試料中の細胞のサブセットの平均比率が次いで計算される。一般に、平均比率が２より大きいことが遺伝子増幅を示唆すると見なされるのに対し、１．５〜２のシグナルは、低レベルの増幅を示唆し得る。いくつかの実施形態において、参照対照プローブよりも多い対象とする遺伝子のコピー数を有する細胞は、増幅したと見なされる（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３３：２１−８；ａｎｄ  Ｋｕｎｉｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．５２：４５１−７を参照）。いくつかの実施形態において、染色体参照プローブ対照を用いずに、単色ＦＩＳＨを用いて対象とする遺伝子のコピー数を決定する。いくつかのそのような実施形態において、１つの核当たりの遺伝子が４コピー以上であることは、遺伝子増幅であると見なされる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１２３８−４３；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１９７４−８２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５３：３７４−８１を参照）。
【０１５１】
タンパク質の過剰発現（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、および／またはＥＴＶ４の過剰発現）を決定する任意の好適な方法が使用され得る。特定の実施形態において、試料中のタンパク質の発現は、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）および染色プロトコルを使用して調べられる。組織片の免疫組織化学的染色は、試料中のタンパク質の存在を評価または検出する信頼性のある方法であることが示されている。免疫組織化学技術は、通常、発色法または蛍光法によって、細胞抗原をインサイツでプローブおよび可視化するための抗体を用いる。
【０１５２】
組織試料は、従来の方法によって固定する（すなわち保存する）ことができる（例えば、"Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，"  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９６０）Ｌｅｅ  Ｇ．Ｌｕｎａ，ＨＴ（ＡＳＣＰ）Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｔｈｅ  Ｂｌａｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．Ｍｉｋｅｌ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照）。当業者は、固定液の選択が、試料を組織学的に染色する目的または別様に分析する目的によって決定されることを理解するであろう。当業者はまた、固定の長さは、組織試料のサイズおよび使用される固定液に依存することも理解するであろう。例として、試料を固定するために、中性緩衝ホルマリン、Ｂｏｕｉｎ固定液、またはパラホルムアルデヒドが使用され得る。
【０１５３】
通常、試料を最初に固定し、次いで、上昇アルコール系列で脱水し、組織試料が切断され得るようにパラフィンまたは他の切片化媒体に浸潤させ、包埋する。代替として、組織を切片化し、得られた切片を固定してもよい。例として、従来の方法によって組織試料をパラフィンに包埋して処理してもよい（例えば、"Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ"，ｓｕｐｒａを参照）。使用され得るパラフィンの例は、限定されないが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｂｒｏｌｏｉｄ、およびＴｉｓｓｕｅｍａｙを含む。組織試料を包埋してから、該試料をミクロトーム等により切片化することができる（例えば、．，"Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ"，ｓｕｐｒａを参照）。この手順の例として、切片は、約３ミクロン〜約５ミクロンの範囲の厚さを有し得る。切片化してから、いくつかの標準的な方法により切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例は、限定されないが、シラン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン等を含む。例として、パラフィン包埋切片は、正電荷を帯びたスライドおよび／またはポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライドに付着させることができる。
【０１５４】
パラフィンが包埋材料として使用される場合、組織片は、通常、脱パラフィンして水に再水和させる。組織片は、いくつかの標準的な従来方法によって脱パラフィンすることができる。例えば、キシレンおよび段階的な下降アルコール系列が使用されてもよい（例えば、"Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ"，ｓｕｐｒａを参照）。代替として、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ７（ＣＭＳ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）等の市販の脱パラフィン化非有機剤が使用されてもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、試料の調製後、ＩＨＣを用いて組織片を分析することができる。ＩＨＣは、形態学的染色および／または蛍光インサイツハイブリダイゼーション等のさらなる技術と組み合わせて行われてもよい。直接法および間接法の２つの一般的なＩＨＣの方法が利用可能である。第１のアッセイによると、標的抗原に対する抗体の結合が直接決定される。この直接法は、抗体をさらに相互作用させることなく可視化することができる蛍光タグまたは酵素標識一次抗体等の標識化試薬を使用する。典型的な間接法では、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原に結合し、次いで、標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原の可視化を提供するために発色性基質または蛍光発生基質が加えられる。いくつかの二次抗体が一次抗体上の異なるエピトープと反応し得るため、シグナルの増幅が起こる。
【０１５６】
免疫組織化学に使用される一次および／または二次抗体は、典型的には、検出可能な部分で標識される。多数の標識が利用可能であり、それらは通常、次のカテゴリーに分類することができる：（ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載される技術を用いて放射性同位体で標識することができ、放射活性は、シンチレーション測定を用いて測定することができる。（ｂ）コロイド金粒子。（ｃ）限定されないが、希土類キレート（ユウロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン、フィコシアニン、または市販の蛍光団、例えば、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ７およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ７、ならびに／または上記のうちのいずれか１つまたは複数の誘導体を含む、蛍光標識。蛍光標識は、例えば、上記の  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は、蛍光光度計を使用して定量化することができる。（ｄ）種々の酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのうちのいくつかに関する考察を提供している。酵素は、通常、種々の技術を用いて測定することができる、発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒することができ、それは、分光測光法で測定することができる。代替として、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量化するための技術は上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、次いで、（例えば、ケミルミノメーターを用いて）測定することができる光を放出し得るか、または蛍光受容体にエネルギーを付与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体にコンジュゲートさせる技術は、Ｏ'Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ．  Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ��ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）に記載されている。
【０１５７】
酵素−基質の組み合わせの例は、例えば、以下を含む：（ｉ）色素前駆体（例えば、オルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン塩酸（ＴＭＢ））を酸化する、水素ペルオキシダーゼを基質とする西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、（ｉｉ）パラ−ニトロフェニルリン酸を発色性基質とするアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、および（ｉｉｉ）発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０１５８】
多数の他の酵素−基質の組み合わせが当業者に利用可能である。これらの概説については、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照のこと。時として、標識は、抗体と間接的にコンジュゲートする。当業者は、これを達成するための種々の技術を認識するであろう。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、上述した４つの広義のカテゴリーの標識のいずれもアビジンとコンジュゲートさせることができるか、またはその逆の場合も同じである。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって、この間接的な様式で標識を抗体とコンジュゲートさせることができる。代替として、抗体と標識との間接的なコンジュゲーションを達成するために、抗体を小さなハプテンとコンジュゲートさせ、上述の異なる種類の標識のうちの１つを抗ハプテン抗体とコンジュゲートさせる。このように、抗体と標識との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【０１５９】
上述の試料調製手順とは別に、ＩＨＣの前、間、または後の、さらなる組織片の処理が望ましい場合がある。例えば、クエン酸緩衝液中で組織試料を加熱する等のエピトープ回収方法が実行され得る（例えば、Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．４（３）：２０１（１９９６）を参照）。
【０１６０】
任意選択的なブロッキングステップの後、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原に結合するように、十分な時間および好適な条件下で組織片を一次抗体に曝露する。これを達成するための適切な条件は、日常的実験により決定することができる。試料に対する抗体の結合の程度は、上述の検出可能な標識のうちのいずれか１つを用いて決定される。いくつかの実施形態において、標識は、３，３'−ジアミノベンジジン発色体等の発色性基質の化学的変化を触媒する酵素標識（例えば、ＨＲＰＯ）である。一実施形態において、酵素標識は、一次抗体に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされる（例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である）。
【０１６１】
このように調製された検体を、マウントしてカバースリップで覆ってもよい。次いで、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当該技術分野で日常的に使用される染色強度基準を用いてもよい。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＩＨＣが用いられる場合、細胞または細胞の集合がＦＧＦＲ１タンパク質を過剰発現しているかどうかを判定するために段階的染色システムが使用される。例えば、いくつかの実施形態において、無染色、１＋、２＋、および３＋の４段階システムが使用され、１＋、２＋、および３＋は、それぞれ増加する染色レベルを示唆する。いくつかのそのような実施形態において、ＦＧＦＲ１タンパク質の過剰発現を示唆するために１＋超、２＋超、または３＋超を用いてもよい。非限定的な例として、ＩＨＣアッセイにおいて特定の細胞型が典型的にＦＧＦＲ１に対する染色を示さない場合、そのＩＨＣアッセイにおけるいずれの染色（すなわち、１＋、２＋、または３＋）も、タンパク質の過剰発現を示唆し得る。さらなる非限定的な例として、ＩＨＣアッセイにおいて特定の細胞型が典型的にＦＧＦＲ１に対する染色をほとんどまたは全く示さない場合、そのＩＨＣアッセイにおける１＋より高いいずれの染色（すなわち、２＋または３＋）も、タンパク質の過剰発現を示唆し得る。当業者は、特定のＩＨＣアッセイ（特定の抗体を含む）、細胞型等に応じて、タンパク質の過剰発現を示唆する染色レベルを決定することができる。
【０１６３】
ｍＲＮＡの過剰発現（ＦＧＦＲ１の過剰発現、および／またはＦＧＦ２の過剰発現、および／またはＤＫＫ３の過剰発現、および／またはＦＧＦ１８の過剰発現、および／またはＥＴＶ４の過剰発現等）を決定する任意の好適な方法が使用され得る。細胞中のｍＲＮＡを評価するための方法は周知であり、例えば、相補的なＤＮＡプローブ（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、またはＥＴＶ４に特異的な標識リボプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、および関連する技術等）を使用するハイブリダイゼーションアッセイ、ならびに種々の核酸増幅アッセイ（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、ＤＫＫ３、ＦＧＦ１８、またはＥＴＶ４に特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出法、例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等）を含む。
【０１６４】
哺乳動物からの組織または細胞試料は、ノーザン、ドットブロット法、またはＰＣＲ分析を用いて、ｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量ＰＣＲアッセイ等のＲＴ−ＰＣＲアッセイが、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの発現レベルは、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを用いて定量化されるレベルである。本発明のいくつかの実施形態において、生体試料中の標的ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを用いて、逆転写により試料からｃＤＮＡを生成することと、標的ポリヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて、そのように生成されたｃＤＮＡを増幅し、その中の標的ｃＤＮＡを増幅することと、増幅された標的ｃＤＮＡの存在を検出することとを含む。さらに、そのような方法は、生体試料中の標的ｍＲＮＡのレベルの決定を可能にする１つまたは複数のステップを含むことができる（例えば、アクチンファミリーのメンバー等の「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによる）。任意選択的に、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【０１６５】
本発明の任意選択的な方法は、マイクロアレイ技術によって組織または細胞試料中の標的ｍＲＮＡ等のｍＲＮＡを検査または検出するプロトコルを含む。核酸マイクロアレイを使用して、試験および対照組織試料からの試験および対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを作製する。次いで、固体支持体に固定された核酸のアレイにプローブをハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列および位置が分かるように構成される。特定のアレイメンバーを有する標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示唆する。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供することができる。マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリダイゼーション技術およびコンピューティング技術を用いて、単一の実験において数千個の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価する。（例えば、２００１年１０月１１日に公開された国際公開第ＷＯ０１／７５１６６を参照；（アレイの製造に関する考察については、例えば、米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，４４５，９３４号および米国特許第５，８０７，５２２号、Ｌｏｃｋａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１（Ｓｕｐｐｌ）：１５−１９（１９９９）を参照）。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスもしくは他の基板上に直接合成されたまたはスポットされた遺伝子断片を含む小型アレイである。通常、数千個の遺伝子が単一のアレイ内に提示される。典型的なマイクロアレイ実験は以下のステップを含む：１）試料から単離されたＲＮＡ由来の蛍光標識標的の調製、２）標識標的のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、３）アレイの洗浄、染色、および走査、４）走査画像の分析、ならびに５）遺伝子発現プロファイルの作成。現在、オリゴヌクレオチド（通常、２５塩基長〜７０塩基長）アレイと、ｃＤＮＡから調製されるＰＣＲ産物を含む遺伝子発現アレイの、２つの主な種類のＤＮＡマイクロアレイが用いられている。アレイを形成する際には、オリゴヌクレオチドを事前に作製して表面にスポットするか、または表面上で直接合成する（インサイツ）ことができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡマイクロアレイは、一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ６．０である。
【０１６６】
Ｔｈｅ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）システムは、ガラス表面上のオリゴヌクレオチドの直接合成によって製造されたアレイを含む市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド（通常、２５塩基長）は、半導体ベースのフォトリソグラフィーおよび固相化学合成技術の組合せによって、ガラスウエハ上に直接合成される。各アレイは、最高で４００，０００個の異なるオリゴを含み、各オリゴは数百万個のコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の場所で合成されるため、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを用いて、ハイブリダイゼーションパターンおよびシグナル強度を遺伝子同一性および相対発現レベルの観点で解釈することができる。各遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによってアレイ上に提示される。各プローブ対は、完全にマッチしたオリゴヌクレオチドおよびミスマッチしたオリゴヌクレオチドからなる。完全マッチプローブは、特定の遺伝子に正確に相補的な配列を有し、したがって遺伝子の発現の尺度となる。ミスマッチプローブは、中心の塩基位置の単一の塩基置換によって完全マッチプローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これは、バックグラウンド、および完全マッチオリゴについて測定されるシグナルに寄与する非特異的なハイブリダイゼーションを決定するのに役立つ。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、ミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を完全マッチプローブのそれらから差し引いて、各プローブセットの絶対的または特異的強度値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋおよび他のヌクレオチドリポジトリからの最新情報に基づいて選択される。配列は、遺伝子の３'末端の特有の領域を認識すると考えられる。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ（「回転式」オーブン）は、一度に最高６４個のアレイのハイブリダイゼーションを実行するために使用される。流体工学ステーションは、プローブアレイの洗浄および染色を行う。これは、完全に自動化されており、各モジュールが１つのプローブアレイを保持する４つのモジュールを含む。各モジュールは、プログラムされた流体工学プロトコルを使用して、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアによって独立して制御される。スキャナは、プローブアレイに結合した標識ｃＲＮＡによって放射される蛍光強度を測定する、共焦点レーザー蛍光スキャナである。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを備えたコンピュータワークステーションは、流体工学ステーションおよびスキャナを制御する。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、プログラムされたプローブアレイに関するハイブリダイゼーション、洗浄、染色プロトコルを使用して、最高で８つの流体工学ステーションを制御することができる。このソフトウェアはまた、ハイブリダイゼーション強度データを取得し、適切なアルゴリズムを使用してデータを各遺伝子の存在／非存在コールに変換する。最後に、このソフトウェアは、比較分析によって実験間の遺伝子発現の変化を検出し、出力をテキストファイルにフォーマット化する：それは、さらなるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムとともに用いることができる。
【実施例】
【０１６７】
以下に論じる実施例は、純粋に本発明の例示であることを意図するものであって、決して本明細書を限定するものであると見なされるべきではない。実施例は、以下の実験が、行われた全てのまたは唯一の実験であることを意味することを意図するものではない。上に提供した概要を前提として、種々の他の実施形態が実施され得ることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１６８】
実施例１：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、組織培養中のＦＧＦＲ１増幅肺癌細胞株の増殖を阻害する
ＦＧＦＲ１遺伝子の潜在的な増幅を示す肺癌細胞株のパネルを、ＣＯＮＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｎａｎ／ｓｅａｒｃｈ．ｃｇｉ）およびＴｕｍｏｒｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｔｕｍｏｒｓｃａｐｅ／ｐａｇｅｓ／ｐｏｒｔａｌＨｏｍｅ．ｊｓｆ）を用いて同定した。ＣＯＮＡＮおよびＴｕｍｏｒｓｃａｐｅは、癌のＳＮＰ６．０データセットにわたって所定のまたはユーザ定義の遺伝子座に関する遺伝子コピー数情報を抽出するための公的なデータマイニングツールを意味する。肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、およびＮＣＩ−Ｈ５２０が、ＦＧＦＲ１遺伝子の潜在的な増幅（＞４コピー／細胞）を有すると同定され、さらなる分析のために選択された。ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株ＤＭＳ５３およびＤＭＳ１１４は、ＡＴＣＣから購入した（マナサス、ヴァージニア州、それぞれ、カタログ番号ＣＲＬ−２０６２、カタログ番号ＣＲＬ−２０６６）。５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ  ７５２／１培地＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で細胞を培養した。ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ１５８１は、ＡＴＣＣから購入し（マナサス、ヴァージニア州、カタログ番号ＣＲＬ−５８７８）、ＡＣＬ−４培地（無血清）で培養した。ＮＣＩ−Ｈ１５８１の基本培地はＤＭＥＭ：Ｆ１２（５０／５０で混合）であり、以下の成分を基本培地に加えた：０．０２ｍｇ／ｍｌインスリン、０．０１ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（最終濃度）、５０ｎＭヒドロコルチゾン（最終濃度）、１ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（最終濃度）、０．０１ｍＭエタノールアミン（最終濃度）、０．０１ｍＭホスホリルエタノールアミン（最終濃度）、１００ｐＭトリヨードチロニン（最終濃度）、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（最終濃度）、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム（最終濃度）、および４．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン。５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で細胞を増殖させた。ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０は、ＡＴＣＣ（マナサス、ヴァージニア州、カタログ番号ＨＴＢ−１８２）。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で、ＲＰＭＩ−１６４０  培地＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で細胞を培養した。
【０１６９】
細胞株中のＦＧＦＲ１遺伝子の増幅状態を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）Ｐｌｅｘ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）により確認した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙは、ｘＭＡＰ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）磁気ビーズを使用するハイブリダイゼーションに基づくアッセイである。ＦＧＦＲ１（ＮＭ＿０２３１１０）、ＡＬＢ（ＮＭ＿０００４７７）、およびＤＣＫ（ＮＭ＿０００７８８）遺伝子に特異的な個々のビーズに基づくオリゴヌクレオチドプローブセット（キャプチャー、キャプチャーエクステンダー、ブロッカー、および標識プローブを含む）を、交差反応を回避するように設計した（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。ＡＬＢおよびＤＣＫを、ＦＧＦＲ１のコピー数を正規化するための参照遺伝子として用いた。細胞試料を溶解してＤＮＡを放出させ、ＦＧＦＲ１標的特異的プローブセットとともに一晩インキュベートした。２日目に、前置増幅器（ＰｒｅＡｍｐ）、増幅器（Ａｍｐ）、およびビオチン標識プローブ（ＬＰ）の連続的ハイブリダイゼーションによってシグナル増幅ツリーを構築した。フィコエリトリンストレプトアビジン（ＳＡＰＥ）基質を加えることによりシグナルを検出した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００フローサイトメーター機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ、オースチン、テキサス州）を使用して、各キャプチャビーズごとに５７５ｎｍでＳＡＰＥ蛍光を検出した。全てのデータを参照遺伝子に対して正規化し、比率（ＦＧＦＲ１／ＡＬＢ）として表した。４種の細胞株のデータを表２に示す。
【０１７０】
（表2）肺癌細胞株におけるＦＧＦＲ１遺伝子増幅
0006578318.tif 000003
＊ＴＧＩ＝腫瘍増殖の阻害
【０１７１】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが組織培養中の肺癌細胞株に与える影響を決定するために、１５μｇ／ｍｌ  ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ（配列番号６）または無関係なＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（陰性対照として）の存在下または非存在下で、１０％、１％、または  ０．１％  ＦＢＳを含む培地中５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で、Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）９６−ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、フランクリンレイク、ニュージャージー州）に細胞を播種した。３７℃、５％  ＣＯ２で４日間プレートをインキュベートし、次いで、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが細胞数および増殖に与える影響を決定するためにアッセイした。
【０１７２】
細胞数を決定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を用いた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）は、代謝的に活性な細胞の指標であるＡＴＰの存在の定量化に基づいて、培養中の生細胞の数を決定する均質な方法である。端的に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔを、各ウェルに存在する細胞培養培地の体積（１００μｌ）と等しい体積で組織培養プレートの各ウェルに加え、内容物をオービタルシェーカー上で２分間混合して細胞溶解を誘導し、次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＥｎＶｉｓｉｏｎTM Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州）で、０．２秒の積分時間で蛍光を測定した。結果を、相対発光量（ＲＬＵ）／ウェルとして表した。
【０１７３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイの結果から、ＦＧＦＲ１増幅を伴う４種全ての細胞株において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのインキュベーションにより細胞数が有意（Ｐ＝＞０．０１）に減少したことが実証された（図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、およびＤＭＳ１１４を示す）。Ｐ値は、独立ｔ検定を用いて決定した。Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニア州を参照のこと。
【０１７４】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが細胞増殖に与える影響を決定するために、トリチウム標識チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ）取り込みアッセイを用いた。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたは無関係なＥＣＤ−Ｆｃ陰性対照とともに肺癌細胞株をインキュベーションした後、トリチウム標識チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州）を１μＣｉ／ウェルの活性で加えた。１６−時間曝露した後、トリチウム標識チミジンの取り込みを評価した。細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）とのインキュベーションにより細胞培養表面から除去した。次いで、ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して細胞懸濁液（２００μｌ）を組織培養プレートから除去し、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｂ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）プレートを通して濾過した。９５％エタノールを用いて細胞を溶解し、ウェル当たり４０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ４０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）液体シンチラントを加えた。チミジンの取り込みは、（ｃｐｍ）Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）シンチレーションカウンターで１分当たりのカウントとして測定した。結果をｃｐｍ／ウェルとして表した。
【０１７５】
トリチウム標識チミジン取り込みアッセイにおいて、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、およびＤＭＳ１１４細胞の増殖を、それぞれ８５、３３、５２、および８１％減少させた（それぞれ、図２Ａ〜Ｄ）。対照ＥＣＤ−Ｆｃは、いずれの細胞株においても細胞増殖に影響を与えないことが実証された。追加の胚腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３（ＮＳＣＬＣ；ＦＧＦＲ１遺伝子コピー数：６コピー／細胞）についても、上述のように、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃとのインキュベーション後にトリチウム標識チミジン取り込みアッセイにおいて調べた。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＮＣＩ−Ｈ１７０３の増殖を１５％減少させた。
【０１７６】
トリチウム標識チミジン取り込みアッセイの結果から、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う４種全ての細胞株において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのインキュベーションにより細胞増殖が有意に減少したことが実証された（＊はＰ＝＞０．０５を示す）。（図２）．Ｐ値は、独立ｔ検定を用いて決定した。Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニア州を参照のこと。対照ＥＣＤ  Ｆｃは、いずれの細胞株においても細胞増殖にほとんどまたは全く影響を与えなかった。
【０１７７】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下におけるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ相対発光量（ＲＬＵ）の減少率を、４種のＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株の各々について調べた全てのＦＢＳ濃度にわたって平均化し、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌細胞株のパネルと比較した（図３）。この実験で調べたＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌細胞株は、ＮＣＩ−Ｈ８３８、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、およびＮＣＩ−Ｈ２１２６を含んでいた。非増幅細胞株をＡＴＴＣ（マナサス、ヴァージニア州）から購入し、供給者の指示に従って培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって評価したところ、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う肺癌細胞株は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを付加した場合、対照ＥＣＤ−Ｆｃの付加と比較して平均で４６．２５％の細胞数の減少を示した。比較すると、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌細胞株は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって評価したところ、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを付加した場合、対照ＥＣＤ−Ｆｃの付加と比較して平均で９．３３％の細胞数の減少を示した。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株と非増幅肺癌細胞株との間に見られた、このＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが細胞数に与えた影響の差は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．００３９）。
【０１７８】
トリチウム標識チミジンの取り込みによって評価されるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが細胞増殖に与える影響についても、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株と非増幅肺癌細胞株との間で比較した（図４）。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを付加した場合の細胞増殖における平均減少率を、各ＦＧＦＲ１遺伝子増幅細胞株について調べた全てのＦＢＳ濃度にわたって決定し、非ＦＧＦＲ１遺伝子増幅細胞株のパネルを上に示した。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う肺癌細胞株は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを付加した場合、対照ＥＣＤ−Ｆｃの負荷と比較して平均で６２．７５％のＣＰＭの減少を示した。比較すると、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌細胞株は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを付加した場合、対照ＥＣＤ−Ｆｃの付加と比較して平均で１７．０％のＣＰＭの減少を示した。このＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株と非増幅肺癌細胞株との間の差は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．００８８）。
【０１７９】
実施例２：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与は、DMS53小細胞肺癌 (SCLC) 異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
６週齢のメスＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、試験の開始前に１週間順化させた。ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株ＤＭＳ５３を腫瘍モデルとして使用し、ＡＴＣＣから購入した（マナサス、ヴァージニア州；カタログ番号ＣＲＬ−２０６２）。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ  ７５２／１培地＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で細胞を３世代継代培養した。培養細胞が８５〜９０％コンフルエンスに達した時に細胞を採取し、５０％マトリゲルを含む、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ミリリットル当たり５ｘ１０７細胞で再懸濁した。マウスの右側腹部に、５ｘ１０６細胞／１００μｌ／マウスで細胞を皮下移植した。細胞移植後１日目に、マウスを分別および無作為化し（ｎ＝１０）、下の表３に従って処理を開始した。
【０１８０】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦｃをＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌで配合し、１５ｍｇ／ｋｇ（３００μｇ／１００μｌ／マウス）を週２回、４週間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ヒトアルブミンをＧｒｉｆｏｌｓ  ＵＳＡ（ロサンゼルス、カリフォルニア州；カタログ番号ＮＤＣ  ６１９５３−０００２−１）から購入し、０．９％塩化ナトリウムで作業溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、３００μｇ／１００μｌ／マウス（１５ｍｇ／ｋｇ）で陰性対照として使用し、週２回、４週間投与した。
【０１８１】
(表3)投与群
0006578318.tif 000004
【０１８２】
腫瘍細胞接種の日から７、１４、２１、２８、３５、および３９日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
皮下腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍が過剰に壊死性になった時に、「癌による死亡」としてマウスを安楽死させた。
【０１８３】
図５は、この実験の結果を示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して６４％の腫瘍増殖の減少を示した。３７日目のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理群とビヒクル処理群とのＤＭＳ  ５３腫瘍体積の比較から、この結果が統計的に有意であることが示唆された（Ｐ＝０．００３）。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡ分析を用いて算出した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニア州を参照のこと。この分析により、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦＲ１受容体をコードする遺伝子の増幅を有する肺癌細胞株ＤＭＳ５３において腫瘍増殖を有意に減少させたことが実証された。
【０１８４】
実施例３：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与は、ＤＭＳ１１４小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
６週齢のメスＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、試験の開始前に１週間順化させた。ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株ＤＭＳ１１４を腫瘍モデルとして使用し、ＡＴＣＣから購入した（マナサス、ヴァージニア州；カタログ番号ＣＲＬ−２０６６）。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ  ７５２／１培地＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で細胞を３世代継代培養した。培養細胞が８５〜９０％コンフルエンスに達した時に細胞を採取し、５０％マトリゲルを含む、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ミリリットル当たり５ｘ１０７細胞で再懸濁した。マウスの右側腹部に、５ｘ１０６細胞／１００μｌ／マウスで細胞を皮下移植した。細胞移植後１日目に、マウスを分別および無作為化し（ｎ＝１０）、上記実施例２に記載されるように処理を開始した。
【０１８５】
腫瘍細胞接種の日から３、１０、１６、１９、２４、２７、および３１日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
皮下腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍が過剰に壊死性になった時に、「癌による死亡」としてマウスを安楽死させた。
【０１８６】
図６は、この実験の結果を示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して６４％の腫瘍増殖の減少を示した。３１日目のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理群とビヒクル処理群とのＤＭＳ１１４腫瘍体積の比較から、この結果が統計的に有意であることが示唆された（Ｐ＝０．００２）。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡ分析を用いて算出した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニア州を参照のこと。この分析により、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦＲ１受容体をコードする遺伝子の増幅を有する肺癌細胞株ＤＭＳ１１４において腫瘍増殖を有意に減少させたことが実証された。
【０１８７】
実施例４：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与は、ＮＣＩ−Ｈ１５８１非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
６週齢のメスＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、試験の開始前に１週間順化させた。ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ１５８１を腫瘍モデルとして使用し、ＡＴＣＣから購入した（マナサス、ヴァージニア州；カタログ番号ＣＲＬ−５８７８）。ＡＣＬ−４培地（無血清）中で細胞を３世代継代培養した。この細胞株の基本培地はＤＭＥＭ：Ｆ１２（５０／５０で混合）であり、以下の成分を基本培地に加えた：０．０２ｍｇ／ｍｌインスリン、０．０１ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（最終濃度）、５０ｎＭヒドロコルチゾン（最終濃度）、１ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（最終濃度）、０．０１ｍＭエタノールアミン（最終濃度）、０．０１ｍＭホスホリルエタノールアミン（最終濃度）、１００ｐＭトリヨードチロニン（最終濃度）、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（最終濃度）、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム（最終濃度）、および４．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン。５％ＣＯ２を含む加湿 雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。培養細胞が８５〜９０％コンフルエンスに達した時に細胞を採取し、５０％マトリゲルを含む、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ミリリットル当たり５ｘ１０７細胞で再懸濁した。マウスの右側腹部に、５ｘ１０６細胞／１００μｌ／マウスで細胞を皮下移植した。細胞移植後１日目に、マウスを分別および無作為化し（ｎ＝１０）、上記実施例２に記載されるように処理を開始した。
【０１８８】
腫瘍細胞接種の日から７、１０、１４、１７、２１、２５、および３１日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
皮下腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍が過剰に壊死性になった時に、「癌による死亡」としてマウスを安楽死させた。
【０１８９】
図７は、この実験の結果を示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して７４％の腫瘍増殖の減少を示した。３１日目のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理群とビヒクル処理群とのＮＣＩ−Ｈ１５８１腫瘍体積の比較から、この結果が統計的に有意であることが示唆された（Ｐ＜０．００１）。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡ分析を用いて算出した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ＆Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｏｖｅ，ＣＡを参照のこと。この分析により、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦＲ１受容体をコードする遺伝子の増幅を有する肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１５８１において腫瘍増殖を有意に減少させたことが実証された。
【０１９０】
実施例５：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与は、ＮＣＩ−Ｈ５２０  非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
６週齢のメスＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、試験の開始前に１週間順化させた。ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０を腫瘍モデルとして使用し、ＡＴＣＣから購入した（マナサス、ヴァージニア州；カタログ番号ＨＴＢ−１８２）。５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で、ＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で細胞を３世代継代培養した。培養細胞が８５〜９０％コンフルエンスに達した時に細胞を採取し、５０％マトリゲルを含む、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ミリリットル当たり５ｘ１０７細胞で再懸濁した。マウスの右側腹部に、５ｘ１０６細胞／１００μｌ／マウスで細胞を皮下移植した。細胞移植後１日目に、マウスを分別および無作為化し（ｎ＝１０）、後に記載されるように処理を開始した。
【０１９１】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦｃをＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌで配合し、２０ｍｇ／ｋｇ（４００μｇ／１２５μｌ／マウス）を週２回、４週間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ヒトアルブミンをＧｒｉｆｏｌｓ  ＵＳＡ（ロサンゼルス、カリフォルニア州；カタログ番号ＮＤＣ  ６１９５３−０００２−１）から購入し、０．９％塩化ナトリウムで作業溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、４００μｇ／１２５μｌ／マウス（２０ｍｇ／ｋｇ）で陰性対照として使用し、週２回、６週間投与した。
【０１９２】
腫瘍細胞接種の日から１１、１８、２５、３２、３９、および４６日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
皮下腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍が過剰に壊死性になった時に、「癌による死亡」としてマウスを安楽死させた。
【０１９３】
図８は、この実験の結果を示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して４７％の腫瘍増殖の減少を示した。４６日目の  ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理群とビヒクル処理群とのＮＣＩ−Ｈ５２０腫瘍体積の比較から、この結果が統計的に有意であることが示唆された（Ｐ＜０．０１）。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡ分析を用いて算出した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ＆Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニア州を参照のこと。この分析により、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦＲ１受容体をコードする遺伝子の増幅を有する肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０において腫瘍増殖を有意に減少させたことが実証された。
【０１９４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３を使用したもう１つの異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理の有効性を、上述のＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株と同様の様式で調べた。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して３１％の腫瘍増殖の減少を示した。ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞株は、ＦＧＦＲ１増幅に加えて、薬剤感受性ＰＤＧＦＲＡ／ＰＤＧＦＣゲノム増幅を含んでおり、それが低い有効性が観察される原因であり得ることに留意されたい。
【０１９５】
実施例６：ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う特定の肺癌異種移植片モデルは、特定の非ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌異種移植片モデルよりも、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性阻害に対する感受性が高い
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが腫瘍増殖に与える影響を、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌異種移植片モデルと非増幅肺癌異種移植片モデルとの間で比較した。この実験で調べたＦＧＦＲ１増幅を伴わない肺細胞株は次の通りであった：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ５２２、およびＣｏｌｏ６９９。非増幅細胞株をＡＴＴＣ（マナサス、ヴァージニア州）から購入し、供給者の指示に従って培養した。非ＦＧＦＲ１遺伝子増幅細胞株を使用した肺癌異種移植片モデルを、実質的に実施例２に記載されるように実行した。
【０１９６】
ＦＧＦＲ１増幅を伴わない肺癌の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルのパネルも、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃに対する感受性について調べた。ＰＤＸ異種移植片は、インビトロ組織培養を行わずに、癌患者からヌードマウスに直接移植した。腫瘍異種移植片は、組織構造および抗癌剤に対する感受性を含む患者の親腫瘍の特徴のほとんどを保持する。調べた肺ＰＤＸモデルは次の通りであった：ＰＤＸ  Ｄ３５０８７、ＰＤＸ  Ｄ３７６３８、ＰＤＸ  Ｄ３５３７６、ＬＸＦＬ−４３０、ＬＸＦＥ−９３７、ＬＸＦＥ−３９７、ＬＸＦＡ−７３７、およびＬＸＦＡ−６２９。調べた肺ＰＤＸに関する予備的な病理および患者の特徴を表４に要約する。
【０１９７】
（表4）肺癌患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルの特徴
0006578318.tif 000005
【０１９８】
６週齢のメスＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、試験の開始前に１週間順化させた。ＰＤＸ腫瘍断片は、ドナーＳＣＩＤマウスの連続継代における異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を除去した後、それらを断片（直径１〜２ｍｍ、約２５ｍｇｓ）に切断し、皮下移植までＲＰＭＩ  １６４０培養培地に置いた。イソフルランの吸入によりレシピエントマウスを麻酔した。鈍鉗子を用いて小さなポケットを形成し、一塊の腫瘍ＰＤＸをそのポケットに入れた。Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ接着剤を使用して創傷を閉鎖し、切開部に一滴のブピバカインを用いた。ＰＤＸ移植後１日目に、マウスを分別および無作為化し（ｎ＝１０）、後に記載されるように処理を開始した。
【０１９９】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦｃをＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌで配合し、移植したＰＤＸ腫瘍の増殖速度に応じて、１５ｍｇ／ｋｇ（３００μｇ／１００μｌマウス）を週２回、４〜８週間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ヒトアルブミンをＧｒｉｆｏｌｓ  ＵＳＡ（ロサンゼルス、カリフォルニア州；カタログ番号ＮＤＣ  ６１９５３−０００２−１）から購入し、０．９％塩化ナトリウムで作業溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、３００μｇ／１００μｌ／マウス（１５ｍｇ／ｋｇ）で陰性対照として使用し、移植したＰＤＸ腫瘍の増殖速度に応じて週２回、４〜８週間投与した。
【０２００】
腫瘍細胞接種の日から１１、１８、２５、３２、３９、および４６日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
皮下腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍が過剰に壊死性になった時に、「癌による死亡」としてマウスを安楽死させた。
【０２０１】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる腫瘍増殖阻害率は、アルブミン対照と比較した、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで処理した異種移植片増殖曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）分析によって決定した。図９は、この分析の結果の散布図を示す。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う肺癌異種移植片は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで処理した場合、平均で５６％の腫瘍増殖の減少を示した。比較すると、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌異種移植片は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで処理した場合、対象と比較して平均で２２％の異種移植片増殖の減少を示した。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌異種移植片モデルと非増幅肺癌異種移植片モデルとの間に見られた、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性の異種移植片の阻害における差は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．０３３３）。
【０２０２】
したがって、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅腫瘍細胞は、非増幅ＦＧＦＲ１遺伝子を伴う腫瘍細胞よりもＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与に対する感受性が高いことが分かった。
【０２０３】
実施例７：ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌細胞株および非増幅肺癌細胞株ならびに異種移植片におけるＦＧＦＲ１の過剰発現
ＲＮＡレベルでのＦＧＦＲ１の発現を、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅および非増幅肺癌細胞株、異種移植片モデル、およびＰＤＸモデル間で比較した。この実験で調べたＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌細胞株は次の通りであった：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、およびＣｏｌｏ６９９。非増幅細胞株をＡＴＴＣ（マナサス、ヴァージニア州）から購入し、供給者の指示に従って培養した。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない肺癌の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルのパネルも、ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現について調べた。調べた肺ＰＤＸモデルは次の通りであった：ＰＤＸ  Ｄ３５０８７、ＰＤＸ  Ｄ３７６３８、ＰＤＸ  Ｄ３５３７６、ＬＸＦＬ−４３０、ＬＸＦＥ−９３７、ＬＸＦＥ−３９７、ＬＸＦＡ−７３７、およびＬＸＦＡ−６２９。調べた肺ＰＤＸに関する予備的な病理および患者の特徴は、上の表４に要約されている。
【０２０４】
ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、インビトロで増殖させた細胞株、またはインビボで増殖させた腫瘍異種移植片からＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号２０５３１１、キアゲン、ドイツ）を使用したランダム６量体プライミングおよび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製する前に、抽出したＲＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉで処理した。ヒトＦＧＦＲ１  ＲＮＡの発現は、ＦＧＦＲ１  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｈｓ＿ＦＧＦＲ１＿１＿ＳＧ、カタログ番号ＱＴ００１０２８３７，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびヒトＧＵＳＢ対照参照ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｈｓ＿ＧＵＳＢ＿１＿ＳＧ、カタログ番号ＱＴ０００４６０４６、Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔｓ（カタログ番号２０４１４５、キアゲン、ドイツ）は、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＶｉｉＡTM ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いてｍＲＮＡ発現レベルを定量化するために使用した。遺伝子発現の相対定量は、基準物質としてのヒトＧＵＳＢおよび市販のＲＮＡ対照（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カリフォルニア）を使用して、比較Ｃｔ法に従って算出した。相対定量は、次の式に従って決定した：２−（ΔＣｔ  ｓａｍｐｌｅ−ΔＣｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）。
【０２０５】
ＧＵＳＢに対して正規化したＦＧＦＲ１  ＲＮＡの発現を、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴うおよび伴わない肺癌細胞株（図１０）と異種移植片モデル（図１２）との間で比較した。
【０２０６】
図１０は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴うおよび伴わない細胞株におけるＦＧＦＲ１  ＲＮＡの発現の散布図を示す。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う肺癌細胞株は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴わない細胞株と比較して、ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現に統計的に有意な増加（Ｐ  ＝  ０．０１１４）を示す。図１０はまた、肺癌細胞株の亜集団が、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅の非存在下で高いＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現を有することも示している。ＧＵＳＢに対して正規化した１．４８のＦＧＦＲ１の遺伝子発現を有するＮＣＩ−Ｈ２２６、およびＧＵＳＢに対して正規化した１．２６のＦＧＦＲ１の遺伝子発現を有するＮＣＩ−Ｈ５２２は、非増幅肺癌細胞株集団における最も高い２つの外れ値の点を表す。
【０２０７】
ＮＣＩ−Ｈ２２６およびＮＣＩ−Ｈ５２２はまた、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃに対してインビトロ感受性を示し、それぞれ、トリチウム標識チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ）取り込みアッセイおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を用いると細胞増殖および細胞数の減少を示した。図１１Ａは、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイの結果を示しており、ＦＧＦＲ１増幅を有しないＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株におけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのインキュベーションにより細胞数が有意に減少したことを示している（＊はＰ＝＞０．０５を示す）。Ｐ値は、独立ｔ検定を用いて決定した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｒｏｏｋｓ，パシフィックグローブ，カリフォルニアを参照のこと。
【０２０８】
図１１Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株のトリチウム標識チミジン取り込みアッセイの結果を示しており、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を有しないＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株におけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのインキュベーションにより細胞数が有意に減少したことを示している（＊はＰ＝＞０．０５を示す）。Ｐ値は、独立ｔ検定を用いて決定した。対照ＥＣＤ  Ｆｃは、ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞増殖にほとんどまたは全く影響を与えなかった。
【０２０９】
したがって、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅は有しないがＦＧＦＲ１の過剰発現を有する特定の肺癌細胞株は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理に対して感受性を示す。
【０２１０】
図１２は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅肺癌異種移植片を非増幅肺癌異種移植片と比較した、ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現の散布図を示す。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅を伴う異種移植片モデルは、非増幅細胞株と比較して、ＦＧＦＲ１  ＲＮＡレベルに統計的に有意な増加（Ｐ＝０．０１４６）を示した。さらに、インビトロのデータと一致して、肺癌異種移植片モデルの亜集団は、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅の非存在下で高いＦＧＦＲ１  ＲＮＡの発現を有する。異種移植片モデルＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、およびＰＤＸ  Ｄ３５０８７は、非増幅肺モデルにおけるＦＧＦＲ１  ＲＮＡ発現の３つの外れ値の点を表し（図１２）、ＧＵＳＢに対して正規化した遺伝子発現レベルは、それぞれ、３．７０、３．７５、および４．３０であった。
【０２１１】
ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、およびＰＤＸ  Ｄ３５０８７はまた、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃに対してインビボ感受性を示し、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで処理すると、腫瘍増殖においてそれぞれ、５５、４２、および５７％の統計的に有意な減少を示した（Ｐ＜０．０５）。ＰＤＸ  Ｄ３５０８７の場合、実質的に実施例６に記載されるように実験を行った。
【０２１２】
ＰＤＸ  Ｄ３５０８７移植の日から２６、３５、４１、および４５日目に、各マウスにおいて腫瘍サイズを測定した。ノギスを使用して各腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の式に従って腫瘍サイズを算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）ｘ長さ（ｍｍ））２／２
【０２１３】
図１３は、この実験の結果を示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与されたマウスは、アルブミン処理動物と比較して腫瘍増殖の阻害を示した。４５日目のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理群とビヒクル処理群とのＰＤＸ  ３５０８７腫瘍体積の比較から、この結果が統計的に有意であることが示唆された（Ｐ＜０．０１）。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡ分析を用いて算出した。例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８８，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ＆Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｏｖｅ，ＣＡを参照のこと。この分析により、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦＲ１遺伝子の増幅は有しないが比較的高いレベルのＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡを発現するＰＤＸ肺腫瘍モデルＤ３５０８７において腫瘍増殖を有意に減少させたことが実証された。
【０２１４】
したがって、ＦＧＦＲ１遺伝子増幅は有しないがＦＧＦＲ１の過剰発現を有する特定の肺癌異種移植片モデルは、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ処理に対して感受性を示す。
【０２１５】
実施例８：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応の予測因子
ＦＧＦリガンド、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ結合タンパク質、ＦＧＦシグナル伝達分子、および一群の血管新生関連標的を含むＦＧＦＲ１関連遺伝子のパネルのＲＮＡ発現を、一組の３５個の腫瘍細胞株および異種移植片においてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）を使用して、インビトロで増殖させた細胞株またはインビボで増殖させた腫瘍異種移植片からＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）を使用したランダム６量体プライミングおよび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製する前に、抽出したＲＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉで処理した。ヒトおよびマウスＲＮＡの発現は、ヒトＧＵＳＢ対照参照ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（キアゲン、ドイツ）を利用して、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙｓ（キアゲン、ドイツ）を用いて決定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）は、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＶｉｉＡTM ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてｍＲＮＡ発現レベルを定量化するために使用した。遺伝子発現の相対定量は、基準物質としてのヒトＧＵＳＢおよび市販のＲＮＡ対照（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ラホヤ，カリフォルニア州）を使用して、比較Ｃｔ法に従って算出した。相対定量は、次の式に従って決定した：２−（ΔＣｔ  ｓａｍｐｌｅ−ΔＣｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）。
【０２１６】
この実験で使用した腫瘍細胞株および異種移植片を表５に示す。また、マウス異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与計画、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ（％））、および腫瘍増殖阻害の統計的有意性（Ｐ値）、ならびに細胞株においてＦＧＦＲ１遺伝子が増幅しているかどうかも表５に示す。
【０２１７】
（表5）異種移植片モデルのパネルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの抗腫瘍活性
0006578318.tif 000006
0006578318.tif 000007
【０２１８】
例示的な異種移植片実験は次の通りである。Ｃａｋｉ−１およびＭＳＴＯ−２１１Ｈの場合、ＳＣＩＤマウス（群当たりＮ＝１０）の右側腹部に５００万個の細胞を皮下移植した。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃまたはアルブミンを表５に示される用量で週２回腹腔内投与した。図１６は、選択された異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの抗腫瘍活性を示す。腎癌Ｃａｋｉ−１（Ａ）および中皮腫ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（Ｂ）の異種移植片癌モデルの代表的な腫瘍増殖曲線を示す。腎細胞癌（ＲＣＣ）Ｃａｋｉ−１モデルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを週２回、６週間投与した結果、８１％（Ｐ＜０．００１）の腫瘍増殖阻害が生じた（ＴＧＩ、図１６ａ）。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫モデルでは、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与により腫瘍増殖が６４％（Ｐ＜０．０００１）減少した（図１６ｂ）。対応する腫瘍において、曲線下面積（ＡＵＣ）分析によって評価したところ、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは腫瘍体積を有意に減少させた。調べたモデルの１９／３５（５４％）に、２５〜９６％の範囲の阻害を伴う反応が観察された（表５を参照）。
【０２１９】
異種移植片モデルをＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる処理に対して感受性にする潜在的な分子決定因子をさらに理解するために、表５中の特定の異種移植片モデルにおいて、ＦＧＦリガンド、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ結合タンパク質、およびＦＧＦシグナル伝達分子を含む遺伝子のパネルのＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。その結果を下の表７に示す。
【０２２０】
次いで、遺伝子発現をＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と相関させ、抗腫瘍活性と正におよび負に相関するＲＮＡの発現特性を決定した。表８は、その分析の結果を示す。ＦＧＦ２に加えて、ＦＧＦ１８のＲＮＡ発現（Ｐ＝０．０２２２７）も、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの抗腫瘍活性と正に相関（６．９倍）していた。ＦＧＦの下流標的遺伝子であるｅｔｓ変異体４（ＥＴＶ４）は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの活性との正の関連（２．８９７倍）に関する最も有意な遺伝子（Ｐ＝０．０１６３９）であった。ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃスプライス変異体（Ｐ＝０．０１６０３）を含む  ＦＧＦＲ１の発現（Ｐ＝０．０１２７６）は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応の正の予測因子であった。ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂスプライス変異体の発現は、その実験ではＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と相関していなかった。ＦＧＦＲ１に加えてＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ受容体の発現（Ｐ＝０．０２４８８）も、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と正に相関しており、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３受容体のＩＩＩｃ−スプライシングアイソフォーム間のＦＧＦリガンド結合親和性における潜在的な重複を反映している。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの活性と負の関連を有する有意な遺伝子は、この分析では見つからなかった。
【０２２１】
（表8）異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる抗腫瘍反応との関連におけるＦＧＦ関連遺伝子発現の統計分析
0006578318.tif 000008
§ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者／非応答者における遺伝子発現の中央値によって決定される遺伝子発現の比率
†Ｐ値は、表５の全てのモデルを使用して、各遺伝子の応答者対非応答者においてＰＣＲによる遺伝子発現のマンホイットニーの検定によって決定される。
【０２２２】
ＦＧＦＲ１−遺伝子増幅の非存在下で何のＲＮＡ要因が肺異種移植片の反応を決定し得るかを決定するために、肺モデルの非ＦＧＦＲ１増幅サブセットにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応の相関を調べた（Ｎ＝１３）。その分析の結果を表９に示す。ＦＧＦ２の発現は、反応性対非反応性のＦＧＦＲ１非増幅肺モデルにおいて、３，０００倍を超えて上方制御された（Ｐ＝０．０２９）。ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃおよびＦＧＦＲ３ＩＩＩｃの発現も、この実験の非ＦＧＦＲ１増幅肺サブセットにおいてＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応を伴う正の傾向を示した。
【０２２３】
（表9）非ＦＧＦＲ１増幅肺異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる抗腫瘍反応との関連におけるＦＧＦ関連遺伝子発現の統計分析
0006578318.tif 000009
§ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者における遺伝子発現の中央値／非応答者における遺伝子発現の中央値によって決定される遺伝子発現の比率
†Ｐ値は、表５の非ＦＧＦＲ１増幅肺モデルを使用して、各遺伝子の応答者対非応答者においてＰＣＲによる遺伝子発現のマンホイットニーの検定によって決定される。
【０２２４】
全てのモデルにおいてＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と関連すると同定された重要な遺伝子マーカー間に遺伝子発現における相関が存在するかどうかを調べた。その分析の結果を表１０に示す。この実験では、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ異種移植片反応の予測因子として同定された大部分の個々のＲＮＡマーカー間に、有意な正の相関が存在した。例えば、異種移植片ＦＧＦ２のＲＮＡ発現は、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ１の発現と正に相関しており（Ｐ＜０．０５）、ＦＧＦＲ１のＲＮＡ発現は、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ＦＧＦ２、およびＦＧＦ１８と正に相関している。ＥＴＶ４の発現は、他のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ反応性遺伝子と関連していなかった。
【０２２５】
（表10）異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの有効性を予測する遺伝子発現マーカーのスピアマンの相関
0006578318.tif 000010
§２−モンテカルロシミュレーションを用いた両側ｐ値
【０２２６】
図１４は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者および非応答者の異種移植片における（Ａ）ＦＧＦ２  ｍＲＮＡ（ＧＵＳＢに対して正規化）および（Ｂ）ＦＧＦ２タンパク質の発現を示す。ＦＧＦ２の発現（Ｐ＝０．０３５６９）は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と正に関連していた。ＦＧＦ２は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ  応答者の異種移植片と非応答者の異種移植片との間で高い比率（２４７．７倍）のｍＲＮＡ遺伝子発現を示した。ＦＧＦ２タンパク質レベルも、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と相関していることが確認された。
【０２２７】
図１７は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者および非応答者の異種移植片における、（Ａ）ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現（ＧＵＳＢに対して正規化）および（Ｂ）ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ  ｍＲＮＡの発現（ＧＵＳＢに対して正規化）を示す。ＦＧＦＲ１（Ｐ＝０．０１６６９、図１７ａ）、およびＦＧＦＲ１ＩＩＩｃスプライス変異体（Ｐ＝０．０４３１、表８）の発現は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの抗腫瘍活性と正に相関していた。ＦＧＦＲ１に加えて、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ受容体の発現（Ｐ＝０．０１９４４、表８）も、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる抗腫瘍反応と正に相関しており（図５ｂ）、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３受容体のＣスプライシングアイソフォーム間のＦＧＦリガンド結合特異性における重複を反映している。（例えば、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１５６９４−１５７００（２００６）；Ｏｒｎｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５２９２−１５２９７（１９９６）を参照のこと）。
【０２２８】
実施例９：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応の予測因子
ＤＫＫ３  ｍＲＮＡの発現を、一組の２５個の異種移植片においてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）を使用して、インビボで増殖させた腫瘍異種移植片からＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）を使用したランダム６量体プライミングおよび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製する前に、抽出したＲＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉで処理した。ヒトＤＫＫ３  ＲＮＡの発現は、ヒトＧＵＳＢ対照参照ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（キアゲン、ドイツ）を利用して、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙｓ（キアゲン、ドイツ）を用いて決定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）は、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＶｉｉＡTM ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてｍＲＮＡ発現レベルを定量化するために使用した。遺伝子発現の相対定量は、基準物質としてのヒトＧＵＳＢおよび市販のＲＮＡ対照（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カリフォルニア州）を使用して、比較Ｃｔ法に従って算出した。相対定量は、次の式に従って決定した：２−（ΔＣｔ  ｓａｍｐｌｅ−ΔＣｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）。
【０２２９】
この実験で使用した腫瘍異種移植片を表１１に示す。また、マウス異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与計画、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ（％））、および腫瘍増殖阻害の統計的有意性（Ｐ値）も表１１に示す。
【０２３０】
（表11）マイクロアレイデータを含む異種移植片モデルのパネル
0006578318.tif 000011
【０２３１】
次いで、遺伝子発現をＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる反応と相関させ、抗腫瘍活性と正におよび負に相関するＲＮＡの発現特性を決定した。ＤＫＫ３  ｍＲＮＡの発現は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃに感受性を示さない腫瘍においてよりも、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃに対して感受性を示す腫瘍において高かった（Ｐ＝０．００６９）。
【０２３２】
図１５は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ応答者および非応答者の異種移植片におけるＤＫＫ３  ｍＲＮＡレベル（ＧＵＳＢに対して正規化）を示す。水平線は、その群の発現レベルの中央値を示す。
【０２３３】
実施例１０：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ラットにおける高用量投与後に血清リン酸塩を増加させない
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＦＧＦ−２３に対してよりも１０〜１００倍高い親和性で分裂促進性ＦＧＦに結合する。ＳＰＲ分析によると、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃのげっ歯類ＦＧＦ−２３に対する結合親和性は、ヒトＦＧＦ−２３のそれに匹敵する（６．０ｘ１０−８対６．７ｘ１０−８Ｍ）。この比較的弱いＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ／ＦＧＦ−２３の結合の潜在的な生物学的影響を、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを１０〜２００ｍｇ／ｋｇ／ｑｗｋの用量範囲で週１回、４週間投与した後、ラットにおいて調査した。
【０２３４】
最初の実験では、スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｎ＝５／群）に、ビヒクル、１０、５０、または２００ｍｇ／ｋｇ／ｑｗｋのＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを週１回、４週間投与し、試験を通してＥＬＩＳＡベースの検出方法により  ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの血漿濃度を決定した。
【０２３５】
定量ＥＬＩＳＡを用いてＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの血漿中濃度を決定した。端的に述べると、組換えヒトＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ハーフウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上に固定し、ブロッキングし、試験試料とともにインキュベートした（ブロッキング緩衝液／２０μｇ／ｍＬヘパリンで１：１０に希釈）。続いてプレートを洗浄し、希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ  ＨＲＰ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ）を加え、インキュベートした。最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質溶液を加え、穏かに振盪しながら周囲温度でインキュベートした。リン酸溶液で反応を停止した。プレートリーダー上でプレートを読み取った（４５０ｎｍ）。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ濃度は、光学密度（ＯＤ）を濃度に対してプロットすることにより得られた標準曲線上で決定した。
【０２３６】
第２の実験では、スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｎ＝５／群）に、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤ＰＤ１７３０７４（Ｃｈｅｍｄｅａ、リッジウッド、ニュージャージー州；５０ｍｇ／ｋｇ／日）もしくはビヒクル対照を経口胃管栄養により７日間投与するか、またはＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ（２００  ｍｇ／ｋｇ）もしくは適切なビヒクルを静脈内投与により投与した。指示された時点で血液試料を採取し、投薬開始後２４および１６８時間目に血清リン酸塩を測定した（Ｉｄｅｘｘ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストブルック、マサチューセッツ州）。
【０２３７】
これらの実験の結果を図１８に示す。２００ｍｇ／ｋｇ／ｑｗｋの用量では、薬物の最大血漿濃度は、メスおよびオスのラットでそれぞれ３．６および４．２ｍｇ／ｍｌであった（図１８Ａ）。これらの持続的高レベルの薬物にもかかわらず、ビヒクルを投与された動物と比較して、いずれの用量のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃでも血漿リン酸塩に有意な変化は観察されなかった（ビヒクルおよび２００ｍｇ／ｋｇ／ｑｗｋのＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで、それぞれ９．６１対１０．１９ｍｇ／ｄＬ）。対照的に、ラットに小分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤ＰＤ１７３０４３を毎日投薬することにより、毎日投薬の２４時間または１週間目のいずれかに、著しい血漿リン酸塩の上昇がもたらされた（図１８Ｂ）。さらに、高用量ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃで処理した動物における５５個の組織の組織学的分析は、ＦＧＦＲ１キナーゼ活性の小分子阻害剤の投与後に高リン血症および種々の臓器におけるカルシウム−リンの沈着を観察したＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３３，４４９−４５５（２００５））によって報告されたものに一致するいずれの変化も明らかにすることはできなかった。
【０２３８】
さらに、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃにより、固形腫瘍を有する患者において最高１６ｍｇ／ｋｇ／ｑｗｋの第１相用量漸増試験（Ｎ＝３９）を完了した。調べた用量レベルのいずれにおいても、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが血清リン酸塩に与える影響は観察されなかった（例えば、Ｔｏｌｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２２ｎｄ  ＥＯＲＴＣ−ＮＣＩ−ＡＡＣＲ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１０）を参照のこと）。要約すると、これらの結果は、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが、ＦＧＦ−２３に高い親和性で結合せず、ＦＧＦＲ経路の他の広範な阻害剤について示されるような高リン血症を誘発しないという生物物理学的データを支持するものである。
【０２３９】
実施例１１：マトリゲルプラグアッセイにおけるＦＧＦ−２およびＶＥＧＦ−Ａによって誘導される血管新生のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性阻害
組換えヒトＦＧＦ−２（最終濃度２５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および／または組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ヘパリンナトリウム（２ユニット／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を含むマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイク、ニュージャージー州）に加えた。マトリゲルプラグ（動物１匹当たり１つ）を含むＦＧＦ−２および／またはＶＥＧＦ−Ａを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）の腹部領域に皮下移植した。マトリゲル移植後１、４、および７日目に、尾静脈注射によりＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを投与した。９日目に、プラグを切除し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理した。Ｒｅｔｉｇａ  ２０００Ｒデジタルカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、バーナビー、ブリティッシュコロンビア州）を使用して、染色したマトリゲル切片のデジタル画像を作成した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５．１（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、シルバースプリング、メリーランド州）を使用して画像分析を行った。脈絡膜新生血管を、新たに形成された血管および遊走細胞からなる、マトリゲルにおける細胞応答として定義した。
【０２４０】
その実験の結果を図１９に示す。５ｍｇ／ｋｇ以上のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与は、ＦＧＦ−２を含浸させたマトリゲルプラグによって誘導されたインビボ  血管新生を完全にブロックした。１５または４５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与も、ＶＥＧＦ−ＡのみまたはＦＧＦ−２およびＶＥＧＦ−Ａを含浸させたマトリゲルプラグに反応したインビボ血管新生を完全にブロックした。ＳＰＲ分析によって、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−ＦｃはＶＥＧＦ−Ａと直接相互作用しないことが示されているため、このモデル系においてＶＥＧＦによって誘導される血管新生に対する抗血管新生活性は、プラグ中のＶＥＧＦとマウス由来間質ＦＧＦとの間の相乗活性の阻害を反映している可能性がある。
【０２４１】
ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃが内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖をブロックするかどうかを決定するために、ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を４Ｘ１０３細胞／ウェルの密度で基本培地（Ｍｅｄｉｕｍ  ２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２％の熱失活したＦＢＳと共に）に播種し、１０μｇ／ｍｌ  ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの存在下または非存在下のいずれかで、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）または１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）のいずれかで刺激した。刺激後３日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いてＨＵＶＥＣ細胞の増殖を測定した。
【０２４２】
その実験の結果を図２０に示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性増殖をブロックしなかったが、ＦＧＦ−２によって誘導されるＨＵＶＥＣの増殖をブロックすることができる。
【０２４３】
実施例１２：ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片モデルにおいて腫瘍血管新生を阻害する
ヒト腎癌Ｃａｋｉ−１細胞（１．５ｘ１０７細胞／マウス）細胞をＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍移植後１日目に、マウスを無作為化し、ビヒクルまたはＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで週２回皮下処理した。試験終了時（５７日目）に、腫瘍を切除し（Ｎ＝３／ｇｐ）、組織学的分析に使用した。凍結切片を抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイク、ニュージャージー州）でプローブし、ＨＲＰコンジュゲートコンジュゲート二次抗体をジアミノベンジジン染色（褐色）と併せて使用して可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、細胞核を同定した（青色）。代表的な切片を示す（５ｘ倍率）。
【０２４４】
その実験の結果を図２１に示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃによる処理後にＣＤ３１染色の低下が観察されることから、この実験において、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃの投与により腫瘍血管新生が阻害されたことが示唆される。
【０２４５】
実施例１３：ＪＩＭＴ−１乳癌異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ１シグナル伝達のＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃ媒介性阻害
確立された（２００ｍｍ３）ヒト乳癌ＪＩＭＴ−１腫瘍を有する動物に、単回（２４および７２時間の時点）または週３回（複数回投与）のいずれかで、１５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを腹腔内投与した。単回投与群の場合は投与後２４および７２時間目に、複数回投与群では最終投与後４８時間目に腫瘍試料を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）に溶解した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより腫瘍溶解物を分離し、モノクローナル抗体ＦＧＦＲ１、ｐＦＧＦＲ１、ＦＲＳ２α、ｐＦＲＳ２α、Ａｋｔ、ｐＡｋｔ、およびβＡｃｔｉｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用してウエスタンブロットを行った。抗ヒトＦｃモノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃを検出した。
【０２４６】
その実験の結果を図２２に示す。ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、投与後２４時間までにリン酸化されたＦＧＦＲ１のレベルを減少させ、投与後７２時間目までにはＦＧＦＲ１のリン酸化が完全に消失した。投与後２４時間目には、リン酸化されたＦＲＳおよびＡｋｔのレベルが減少し、２日後にはさらに減少した。したがって、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤ．３３９−Ｆｃは、ＪＩＭＴ−１乳癌異種移植片モデルにおいてＦＧＦＲ１のシグナル伝達を阻害した。
【０２４７】
表６には、本明細書で論じられる特定の配列が記載される。別途指定のない限り、ＦＧＦＲ１配列はシグナルペプチドを含まずに示される。
【０２４８】
（表6）配列および説明
0006578318.tif 000012
0006578318.tif 000013
【０２４９】
（表7）表5の特定の異種移植片モデルの遺伝子発現値
0006578318.tif 000014
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【図１Ａ】
0006578318.tif 000024
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0006578318.tif 000026
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
0006578318.tif 000033
【図５】
0006578318.tif 000034
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006578318.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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