(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列またはその二量体化変異体、ここで該二量体化変異体は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、を含むＩｇＥ由来の重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)および少なくとも１個の薬学的活性部分を含むポリペプチドであって、該薬学的活性部分がＩｇＥ由来のＦａｂまたはＦｃフラグメントではなく、該ポリペプチドが、ＩｇＥの重鎖定常ドメインＣＨ３および／またはＣＨ４を含まない、ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも１個の薬学的活性部分がＥＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端に連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１個の薬学的活性部分がＥＨＤ２に直接的にまたは１個以上のリンカーを介して間接的に連結している、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
１個以上のリンカーがペプチドリンカーまたは可動性ペプチドリンカーを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
１個以上のリンカーが１箇所以上の開裂部位を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
１個以上のリンカーが１箇所以上のエンドペプチダーゼ開裂部位を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも２個の同一のまたは少なくとも２個の異なる薬学的活性部分がＥＨＤ２に連結している、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１個の薬学的活性部分がリガンド、エフェクター分子および半減期延長モジュールから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
さらに造影分子が連結した、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
リガンドが抗原結合分子、足場タンパク質、天然リガンド、リガンド結合受容体フラグメントおよびアプタマーから成る群から選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
抗原結合分子が抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、重鎖抗体、シングルドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、重鎖抗体の可変ドメイン、ＶＨＨ、ナノボディ、単一鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)、直列型ｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥｓ)、二重特異性抗体、単一鎖二重特異性抗体、ＤＡＲＴ、トリプルボディ、ナノ抗体、代替足場タンパク質およびその融合タンパク質から成る群から選択される、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ｓｃＦｖが抗ＨＥＲ２または抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ｓｃＦｖが配列番号３または４に従うものまたはその変異体である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
エフェクター分子がサイトカイン、ケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質、キナーゼ、プロドラッグ変換酵素、ＲＮａｓｅ、アゴニスト抗体または抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメント、融合タンパク質または誘導体から成る群から選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
サイトカインが腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
サイトカインが配列番号５に従うものまたはその変異体である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
サイトカインがＴＮＦ関連アポトーシス誘発因子(ＴＲＡＩＬ)である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
サイトカインが配列番号６に従うものまたはその変異体である、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
半減期延長モジュールが免疫グロブリン結合ドメイン(ＩｇＢＤ)、アルブミン、アルブミン結合ドメイン(ＡＢＤ)、ペプチド、小分子、脂肪酸、抗体フラグメント、シングルドメイン抗体、ＶＨＨ、足場タンパク質および長期循環血漿タンパク質に対する親和性を示す天然リガンドからなる群から選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
半減期延長モジュールがペグ化、ヘシル化、ポリシアル化、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化またはＰＥＧ模倣ポリペプチドである、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
造影分子が生物発光試薬、化学発光試薬、蛍光造影剤、光増感剤、キレート試薬および放射性部分から成る群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のポリペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれかに記載の少なくとも２個のポリペプチドを含む、複合体。
【請求項２５】
少なくとも２個のポリペプチドがそれらのＥＨＤ２ドメインを介して連結している、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
少なくとも２個のポリペプチドが共有結合性または非共有結合性結合を介して連結している、請求項２４または２５に記載の複合体。
【請求項２７】
共有結合性結合がジスルフィド結合である、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
少なくとも２個のポリペプチドが同一または異なる、請求項２４〜２７のいずれかに記載の複合体。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２２に記載のポリヌクレオチド、請求項２３に記載のベクターまたは請求項２４〜２８のいずれかに記載の複合体を含む、細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２２に記載のポリヌクレオチド、請求項２３に記載のベクター、請求項２４〜２８のいずれかに記載の複合体または請求項２９に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
さらに薬学的に許容される担体および／または添加物および所望により１種以上の付加的活性物質を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来の重鎖ドメイン２(ＨＤ２)および少なくとも１個の薬学的活性部分を含むポリペプチド、それらの複合体および治療および予防におけるそれらの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
抗体、サイトカインおよび増殖因子のような治療用タンパク質のホモ二量体化モジュールへの融合は、一般的に、結合価の増加による効果の改善だけでなく、薬物動態特性の改善も示す二価分子を産生する(Deyev & Lebedenkov, 2008; Cuesta et al., 2010; Kontermann, 2010)。さらに、２個の異なるエフェクター分子の組み合わせは、二重特異性を有する分子の産生を可能にする。このような多価分子は、二重特異性抗体を使用するまたはエフェクター分子と抗体部分から成る二機能性分子を使用する二重標的化手法に適用できる(Mueller & Kontermann, 2010; Schrama et al., 2006; Deckert, 2009)。種々のホモ二量体化および多量体化モジュールが確立されており、免疫グロブリンのＦｃ領域ならびにＣＨ３およびＣκドメインだけでなく(Jazayeri & Carroll, 2008; Hu et al., 1996; Giersberg et al., 2011)、例えばストレプトアビジン、ｐ５３、ウテログロビン、テネイシンおよびコラーゲン由来の、他のタンパク質ドメインおよびペプチドも含む(Ventura et al., 2009; Duebel et al., 1995; Pack & Plueckthun, 1992; Rheinnecker et al., 1996; Wueest et al., 2002; Fan et al., 2008)。しかしながら、これらのモジュールの多くは非ヒトであり、それゆえに免疫応答を誘発し得る。さらに、これらのモジュールの多くはジスルフィド結合により共有結合しておらず、それゆえに安定性が低く、製造が困難である。最後に、これらの多量体化ドメインのいくつか、例えばＩｇＧのＦｃ領域は望まないＡＤＣＣ(抗体依存性細胞傷害)またはＣＤＣ(補体依存性細胞傷害)エフェクター機能を誘発し、望まない副作用の原因となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N, & Nagamune, T.  (2001); Design of linkers which effectively seperate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14, 8, 529-532.
【非特許文献２】Carter, P., Presta, L., Gorman, C.M., Ridgway, J.B.B., Henner, D., Wong, W.L.T., Rowland, A.M., Kotts, C., Carver, M.E. & Shepard, H.M. (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289.
【非特許文献３】Cuesta, A.M., Sainz-Pastor, N., Bonet, J., Oliva, B. & Alvarez-Vallina, L. (2010) Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. Trends Biotechnol. 28, 355-362.
【非特許文献４】Deckert, P.M. (2009) Current constructs and targets in clinical development for antibody-based cancer therapy. Curr. Drug Targets 10, 158-175.
【非特許文献５】Deyev, S.M. & Lebedenko, E.N. (2008) Multivalency: the hallmark of antibodies used for optimiziation of tumor targeting by design. BioEssays 30, 904-918.
【非特許文献６】Duebel, S., Breitling, F., Kontermann, R., Schmidt, T., Skerra, A. & Little, M. (1995)  Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single chain antibodies (scFv). J. Immunol. Methods 178, 201-209.
【非特許文献７】George, R.A., & Heringa, J. (2003), An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Engineering. 15, 11, 871879.
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【非特許文献１５】Mueller, D. & Kontermann, R.E. (2010) Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: current perspectives. BioDrugs 24, 89-98.
【非特許文献１６】Pack, P. & Plueckthun, A. (1992) Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry 31, 1579-1584.
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【非特許文献１８】Robinson, C.R., & Sauer, R.T. (1998) Optimizing the stability of single-chain proteins by linker length and composition mutagenesis. PNAS USA, 95, 59295934.
【非特許文献１９】Schrama, D., Reisfeld, R.A. & Becker, J.C. (2006) Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 147-159.
【非特許文献２０】Tanaka, T., Yokoyama, S., & Kuroda, Y. (2005) Improvement of Domain Linker Prediction by Incorporating Loop-Length-Dependent Characteristics. Biopolymers (Peptide Science), 84, 161168.
【非特許文献２１】Ventura, E., Sassi, F., Fossati, s., Parodi, A., Blalock W., Balza, E., Castellani, P., Borsi, L., Carnemolla, B. & Zardi, L. (2009) Use of uteroglobin for the engineering of polyvalent, polyspecific fusion proteins. J. Biol. Chem. 284, 26646-26654.
【非特許文献２２】Voelkel T., Korn, T., Bach, M., Mueller, R., & Kontermann, R.E. (2001) Optimized linker sequences for the expression of monomeric and dimeric bispecific single-chain diabodies. Protein Engineering, 14, 10, 815-823.
【非特許文献２３】Watanabe, H., Kanazaki, K., Nakanishi, T., Shiotsuka, H., Hatakeyama, S., Kaieda, M., Imamura, T., Umetsu, M., & Kumagai, I. (2011) Biomimetic Engineering of Modular Bispecific Antibodies for Biomolecule Immobilization. ACS Langmuir, 27, 96569661.
【非特許文献２４】Wriggers W., Chakravarty, S., Jennings, P.A., (2005) Control of Protein Functional Dynamics by Peptide Linkers. Biopolymers (Peptide Science), 80, 736746.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
先行技術のこのような欠点を克服するために、本発明者らは、代替多量体化モジュールの使用を検討した。驚くべきことに、本発明により、２個の重鎖を連結するヒンジ領域を他のＩｇ分子に置き換えたＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン(ＭＨＤ２)およびＩｇＥ  ＣＨ２ドメイン(ＥＨＤ２)が、２個のＭＨＤ２間または２個のＥＨＤ２間のジスルフィド結合形成により、安定な二量体の産生を可能にすることが判明した。ＭＨＤ２およびＥＨＤ２がそれぞれＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖内でさらなる重鎖配列を両端に含み中心に位置することにより、両ドメインは、いずれかのＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端に融合したタンパク質から成る二量体融合タンパク質の産生に理想的に適していることが判明した。それゆえに、ＭＨＤ２またはＥＨＤ２ドメインの使用は、共有結合した二量体化ドメインＭＨＤ２またはＥＨＤ２によりまとめられた多価および二機能性分子の産生を可能にする。このような二量体は、その可動性を維持しながら特に安定であることが証明された。さらに、二量体化モジュールとしてのその使用はＡＤＣＣまたはＣＤＣエフェクター機能と関連しない。それらは天然血漿タンパク質由来であるため、高収量での産生が容易である。これらのドメインの天然に生じるＮ−グリコシル化は、さらに生理学的条件下で安定性および溶解度を改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
第一の面において、本発明は、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来の重鎖ドメイン２(ＨＤ２)および少なくとも１個の薬学的活性部分を含むが、該薬学的活性部分がＩｇＭまたはＩｇＥ由来のＦａｂまたはＦｃフラグメントではない、ポリペプチドを提供する。
【０００６】
第二の面において、本発明は、第一の面のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子を提供する。
【０００７】
第三の面において、本発明は、第二の面の核酸分子を含む、ベクターを提供する。
【０００８】
第四の面において、本発明は、第一の面の少なくとも２個のポリペプチドを含む、複合体を提供する。
【０００９】
第五の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクターまたは第四の面の複合体を含む、細胞を提供する。
【００１０】
第六の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を含む、組成物を提供する。
【００１１】
第七の面において、本発明は、医薬として使用するための、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩｇＭ重鎖ドメイン２(ＭＨＤ２)およびＩｇＥ重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)を共有結合したホモ二量体化モジュールとして使用する。さらなるモジュールをＮ末端もしくはＣ末端または両端に融合できる。モジュールＸ１、Ｘ２...ＸｍならびにＹ１、Ｙ２...Ｙｎのいずれも同一でも異なってもよい。融合モジュールの数は１〜ｎの間であり、Ｎ末端およびＣ末端融合で同一である必要はない。
【００１３】
【図２】ヒトＭＨＤ２およびＥＨＤ２の配列解析ならびに２個の配列のアライメント。ドメイン間およびドメイン内システイン結合ならびに潜在的Ｎ−グリコシル化部位(ＮＩＴ、ＮＡＳ)に印を付す。
【００１４】
【図３】ａ)二価または四価ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質のアセンブリ。二価の単一特異性ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質を、ｓｃＦｖを、それぞれＭＨＤ２のＮ末端またはＣ末端に融合することにより産生する。四価の二重特異性ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質を、抗原Ａに対するｓｃＦｖをＭＨＤ２のＮ末端におよび抗原Ｂに対する他のｓｃＦｖをＭＨＤ２のＣ末端に融合することにより産生する。ｂ)ｓｃＦｖの可変ドメインおよびＭＨＤ２の概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はＮ末端リーダー配列(Ｌ)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにＣ末端ヘキサヒスチジンタグ(Ｈｉｓ６)を含む。ｃ)ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２または両抗原に対する精製ＭＨＤ２融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。タンパク質は還元(１〜３)または非還元(４〜６)条件下で分析した(１および３、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２；２および５、ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２；３および６、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２)。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ２５０で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で見られる上部バンドにより示される。
【００１５】
【図４】ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質の生理活性。ａ)ＥＬＩＳＡにおける抗体−ＭＨＤ２融合タンパク質の固定化受容体−Ｆｃ融合タンパク質への結合。３個のｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質が、各ＥＧＦＲ−およびまたはＨＥＲ２−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示した。ネガティブコントロールとして含ませたＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質での結合は見られなかった。ｂ)ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質の示す種々の細胞株への結合は、フローサイトメトリーにより分析した。結合したタンパク質は、ＦＩＴＣ標識抗Ｈｉｓタグ抗体で検出した。
【００１６】
【図５】ａ)ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ、ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質のアセンブリ。二価ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質を、ｓｃＴＮＦのＭＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質を、ｓｃＦｖのＭＨＤ２のＮ末端へのおよびｓｃＴＮＦのＭＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｂ)融合タンパク質におけるｓｃＦｖの可変ドメイン、ＭＨＤ２およびｓｃＴＮＦの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はＮ末端リーダー配列(Ｌ)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにＣ末端ヘキサヒスチジンタグ(Ｈｉｓ６)を含む。ｃ)精製融合タンパク質の還元(１〜４)または非還元(５〜８)条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(１および５、ｓｃＴＮＦ；２および６、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２；３および７、ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ；４および８、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ)。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ２５０で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン６〜８)。ｃ)ｓｃＴＮＦの分子ふるいクロマトグラフィー(ＳＥＣ)。ｄ)ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦのＳＥＣ。ｅ)ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦのＳＥＣ。この分析は、さらに融合タンパク質の二量体アセンブリを証明する。ｆ)動的光散乱によるｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの融解温度の決定。
【００１７】
【図６】ａ)ＥＬＩＳＡにおけるｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ、ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよびｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２のＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質への結合。ＨＥＲ２−ＦｃおよびＨＥＲ３−Ｆｃはネガティブコントロールとして含ませた。抗ヒトＦｃ抗体をコーティングコントロールとして使用した。ｂ)フローサイトメトリーにより分析した、モノクローナル抗体(抗ＥＧＦＲセツキシマブ、抗ＨＥＲトラスツマブ)存在下または非存在下のｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質の種々の細胞株(Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ４６０)への結合(灰色、細胞のみ、太線；ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦとインキュベートした細胞；細線、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよび過剰量のセツキシマブまたはトラスツマブとインキュベートした細胞)。ｃ)ＭＥＦ−ＴＮＦＲ１細胞の死滅に対する融合タンパク質の効果。ｄ)ＭＥＦ−ＴＮＦＲ２細胞の死滅に対する融合タンパク質の効果。ここで、二量体ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質のみがＴＮＦＲ２介在細胞死滅を誘発できる。ｅ)ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ−ｓｃＴＮＦ、ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよびｓｃＴＮＦの濃度上昇により誘発されたＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８遊離(ｎ＝４、＋／−ＳＤ)。ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤをネガティブコントロールとして含ませた。ｆ)過剰量の抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ(６６０nM)によるｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ(２０pM)誘発ＩＬ−８分泌の阻害。ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよびｓｃＴＮＦ各々でＩＬ−８遊離誘発に対する効果は見られなかった。トラスツマブ(抗ＨＥＲ２)をネガティブコントロールとして含ませた。
【００１８】
【図７】ａ)ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のアセンブリ。二価ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質をｓｃＴＲＡＩＬのＭＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、ｓｃＦｖのＭＨＤ２のＮ末端へのおよびｓｃＴＲＡＩＬのＭＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｂ)融合タンパク質におけるｓｃＦｖの可変ドメイン、ＭＨＤ２およびｓｃＴＲＡＩＬの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はＮ末端リーダー配列(Ｌ)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにＮ末端ＦＬＡＧタグ(ＦＬＡＧタグ)を含む。ｃ)精製融合タンパク質の還元(１〜４)または非還元(５〜８)条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(１および４、ｓｃＴＲＡＩＬ；２および５、ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ；３および６、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ)。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ２５０で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン４〜６)。
【００１９】
【図８】２５０ng／ml  ボルテゾミブ存在下のＮＣＩ−Ｈ４６０(ａ)およびＣｏｌｏ２０５(ｂ)細胞に対するｓｃＴＲＡＩＬおよびＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性活性。細胞を該タンパク質と２４時間インキュベートし、細胞傷害性を残存細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは、ｓｃＴＲＡＩＬと比較して、１０〜５０倍高い細胞傷害性活性を示した。
【００２０】
【図９】ａ)ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質のアセンブリ。二価ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質を、ＥＧＦＲに対するｓｃＦｖのＥＨＤ２のＮ末端への融合により産生する。二価ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、ｓｃＴＲＡＩＬのＥＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのＥＨＤ２のＮ末端へのおよびｓｃＴＲＡＩＬのＥＨＤ２のＣ末端への融合により産生する。ｂ)融合タンパク質におけるｓｃＦｖの可変ドメイン、ＥＨＤ２およびｓｃＴＲＡＩＬの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はＮ末端リーダー配列(Ｌ)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにＮ末端ＦＬＡＧタグ(ＦＬＡＧタグ)を含む。ｃ)非還元(１)または還元(２)条件下にｓｃＦｖ−ＥＨＤ２について発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗ＦＬＡＧタグ抗体または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン１)。ｄ)非還元(１)または還元(２)条件下でＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬについて発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン１)。ｅ)非還元(１)または還元(２)条件下でｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬについて発現プラスミドで一過性のトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン１)。
【００２１】
【図１０】ヒトＩｇＧ１(ＧＨＤ３)(ａ)、ヒトＭＨＤ２ドメイン(ｂ)およびヒトＥＨＤ２ドメイン(ｃ)の組み換えＣＨ３ドメインの比較。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を還元(１)および非還元(２)条件下で実施した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ２５０で染色した。二量体アセンブリおよびジスルフィド結合による結合がＭＨＤ２およびＥＨＤ２について証明された。還元および非還元条件下それぞれで２〜３バンドにより示されるＮ−グリコシル化に関する不均一性も、ＭＨＤ２およびＥＨＤ２で観察された。分子ふるいクロマトグラフィーは、ＧＨＤ３ドメインより大きい見かけの大きさで移動する２個のＮ−グリコシル化ドメイン(ＭＨＤ２、ＥＨＤ２)と共に、これらドメインの二量体アセンブリを確認した。動的光散乱による融解温度の決定は、ＩｇＧ１のＣＨ３について、約５０℃の最初の融解温度(おそらくドメイン解離による)および７５℃での第二の主要な融解温度(おそらく完全な変性による)を確認したが、ＭＨＤ２についてシグナルの鋭い増加はなく、約５６℃から開始する漸増が観察され、本タンパク質は９２℃の温度までむしろ安定であることが示された。ＥＨＤ２について、約８０〜８２℃の単一変性中点が決定された。
【００２２】
【図１１】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ(４Ｄ５)の核酸およびアミノ酸配列。リーダーペプチドに下線を付す。
【００２３】
【図１２】抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ(ｈｕ２２５)の核酸およびアミノ酸配列。リーダーペプチドに下線を付す。
【００２４】
【図１３】ｓｃＴＮＦの核酸およびアミノ酸配列。個別のＴＲＡＩＬ単量体を連結するリンカーに下線を付す。
【００２５】
【図１４】ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。個別のＴＲＡＩＬ単量体を連結するリンカーに下線を付す。
【００２６】
【図１５】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００２７】
【図１６】ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２の核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００２８】
【図１７】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２の核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００２９】
【図１８】ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３０】
【図１９】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３１】
【図２０】ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３２】
【図２１】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３３】
【図２２】ｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３４】
【図２３】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。ＥＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３５】
【図２４】ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３６】
【図２５】ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの核酸およびアミノ酸配列。ＭＨＤ２を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。
【００３７】
【図２６】ａ)ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質の概略図(Ｌ＝リーダーペプチド；Ｈｉｓ６＝ヘキサヒスチジンタグ)。ｂ)ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質の概略構造(ＥＨＤ２ドメインを白色で示す)。ｃ)抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質の発現を示す免疫ブロッティング実験(レーン１)。タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に分離し、ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体で検出した。融合タンパク質は約４０〜４５kDaの予測したサイズを有した。検出した二重バンドはグリコシル化および非グリコシル化タンパク質を示す。
【００３８】
【図２７】ａ)二重特異性ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２融合タンパク質の概略図(Ｌ＝リーダーペプチド；Ｈｉｓ６＝ヘキサヒスチジンタグ)。ｂ)ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２融合タンパク質の概略構造(ＥＨＤ２ドメインを白色で示す)。ｃ)還元または非還元条件下の精製融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ゲルをクーマシーで染色した。ｄ)固定化ＣＥＡに対するｓｃＦｖ−ＥＨＤ２およびｓｃＤｂ−ＥＨＤ２のＥＬＩＳＡ(３μg／ml)。結合抗体をＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した。
【００３９】
【図２８】ａ)リンカー配列の３位としてシステインを有するｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２融合タンパク質の産生のために使用したｓｃＦｖ−Ｌ３フラグメントの模式的組成。ｂ)ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２およびｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖ融合タンパク質の概略構造(ＥＨＤ２ドメインを白色で示す)。ｃ)一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清における抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖ−Ｌ３(レーン１)、二重特異性抗体Ｄｂ−Ｃｙｓ(レーン２)、ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２(レーン３)およびｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ３−ｓｃＦｖの発現を示す免疫ブロッティング実験。タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に分離し、ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体で検出した。全てのタンパク質は予測したサイズを有した。
【００４０】
【図２９】ａ)種々のＥＨＤ２融合タンパク質の略図。ｂ)還元(レーン１〜３)または非還元(レーン４〜６)条件下の精製融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２、レーン１、４；ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ、レーン２、５；ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ、レーン３、６)。ｃ)精製融合タンパク質のＳＥＣ分析。ｄ)組み換え受容体−Ｆｃ融合タンパク質を使用したＥＧＦＲおよびＴＲＡＩＬ受容体１および２に対する融合タンパク質の結合についてのＥＬＩＳＡ。ＨＥＲ２−Ｆｃをネガティブコントロールとして含ませた。ｅ)固定化ＥＧＦＲに対する結合についてのＥＬＩＳＡにおけるＥＧＦＲに対するｓｃＦｖ−ＥＨＤ２およびｓｃＦｖの抗体価測定。
【００４１】
【図３０】フローサイトメトリーにより分析したＥＧＦＲ発現細胞株に対するＥＨＤ２融合タンパク質の結合。ａ)検出に抗ＦＬＡＧタグ抗体を使用した、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのＣｏｌｏ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＨＥＫ２９３への結合。ｂ)検出に抗Ｈｉｓタグ抗体を使用した、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２のＣｏｌｏ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＨＥＫ２９３への結合。
【００４２】
【図３１】ｓｃＴＲＡＩＬと比較したＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、ボルテゾミブ(２５０ng／ml)非存在下または存在下、２種の細胞株(ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｃｏｌｏ２０５)で分析した。細胞を、融合タンパク質と１６時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。
【００４３】
【図３２】セツキシマブ非存在下または存在下のＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの細胞への結合を遮断する１００倍モル濃度過剰のセツキシマブ(Ｃｅｔ.)の存在下または非存在下、ボルテゾミブ(２５０ng／ml)の存在下に、２種の細胞株(ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｃｏｌｏ２０５)で分析した。細胞を、融合タンパク質と１６時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。
【００４４】
【図３３】ｓｃＦｖ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較したｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、ボルテゾミブ(２５０ng／ml)非存在下または存在下、２種の細胞株(ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｃｏｌｏ２０５)で分析した。細胞を、融合タンパク質と１６時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。
【００４５】
【図３４】マウスにおけるＥＨＤ２融合タンパク質の薬物動態。ｓｃＴＲＡＩＬおよびＥＨＤ２融合タンパク質(２５μg／動物)を、ＣＤ１マウス(ｎ＝３)に静脈内注射し、血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【００４６】
【図３５】ａ)ｓｃＴＲＡＩＬと比較したＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのインビボ抗腫瘍活性。皮下Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍担持ＮＭＲＩヌードマウスは、４日毎にタンパク質(０.３５nmolの融合タンパク質および０.７nmolのｓｃＴＲＡＩＬ)の静脈注射４回ならびに２日毎にボルテゾミブ(Ｂｒｔ、５μg／注射)の腹腔内注射８回を受けた。ａ)腫瘍増殖。ｂ)１３日目の腫瘍体積。ｃ)ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２およびボルテゾミブ処置と比較したｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのインビボ抗腫瘍活性。皮下Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍担持ＮＭＲＩヌードマウスはタンパク質(１nmolの融合タンパク質)の静脈注射４回ならびに２日毎にボルテゾミブ(Ｂｒｔ、５μg／注射)の腹腔内注射８回を受けた。ｂ)２１日目の腫瘍体積。ｅ)ＡＬＴ−アッセイを、ＣＤ１マウスへのｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ(１nmol、ｉ.ｖ.)とボルテゾミブ(５μg、ｉ.ｐ.)の同時の注射４時間または２４時間後に行った。ＰＢＳコントロールと比較して、統計学的有意差は観察されなかった。全値は５０Ｕ／Ｌの閾値より低かった。
【００４７】
【図３６】ａ〜ｃ)精製ＴＮＦ変異体(ａ：ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２、ｂ：ＥＨＤ２とｓｃＴＮＦＲ２の間に１６ａａリンカーを有するＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２ならびにｃ：ＥＨＤ２とｓｃＴＮＦＲ２の間に２８ａａリンカーを有するＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２)を、還元(＋２−ＭＥ)または非還元(−２−ＭＥ)条件下、クーマシーで染色して、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｄ)ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質との結合試験。プレートを１μg／ml  ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質(エンブレル)で被覆した。ＴＮＦ融合タンパク質を１時間、ＲＴでインキュベートし、結合ＴＮＦ融合タンパク質をＨＲＰ結合抗ＴＮＦ抗体およびＴＭＢ基質を使用して検出した(ｎ＝２)。
【００４８】
【図３７】抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００４９】
【図３８】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００５０】
【図３９】抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００５１】
【図４０】抗ＣＥＡｘＣＤ３  ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００５２】
【図４１】抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００５３】
【図４２】抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖの核酸およびアミノ酸配列。
【００５４】
【図４３】ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２の核酸およびアミノ酸配列。
【００５５】
【図４４】ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２−Ｌ１６ａａの核酸およびアミノ酸配列。
【００５６】
【図４５】ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２−Ｌ２８ａａの核酸およびアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な記載
下に本発明を詳細に記載する前に、本発明は、ここに記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬が、変わり得るものであるために、これらに限定されるべきではないことが理解されるべきである。ここで使用する用語は特定の態様を記載することのみを目的とし、添付する特許請求の範囲でのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。特に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００５８】
好ましくは、ここで使用する用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のとおりに定義される。
【００５９】
いくつかの文献が本明細書の本文中で引用されている。ここに定義する文献の各々(全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、指示、GenBank配列寄託受入番号などを含む)は、本明細書中における引用によりその全体を本明細書に包含させる。本明細書の如何なる記載も、先行発明の開示により本発明が先行されていることを認めるものと解釈してはならない。
【００６０】
定義
明細書および添付する特許請求の範囲を通して、文脈上他の解釈が必要でない限り、用語“含む”および“含み”および“含んで”のようなその変形は、それぞれの整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を包含することを意図するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群のいずれも排除しないと理解されるべきである。
【００６１】
用語“タンパク質”および“ポリペプチド”はここでは交換可能に使用し、鎖長または翻訳後修飾に拘わらず、あらゆるペプチド結合により結合したアミノ酸の鎖をいう。本発明で使用可能なタンパク質(タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む)を、化学修飾によりさらに修飾できる。これは、このような化学修飾したポリペプチドが、２０種の天然起源アミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。このような他の化学基の例は、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドの化学修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば安定性増加、生物学的半減期延長または水溶性増加の一つ以上を提供し得る。
【００６２】
用語“ポリヌクレオチド”および“核酸”はここでは交換可能に使用し、ヌクレオチド単量体から成る重合体またはオリゴマー高分子として理解される。ヌクレオチド単量体は、核酸塩基、５炭素糖(例えばリボースまたは２’−デオキシリボースであるが、これらに限定されない)および１〜３個のリン酸基から成る。典型的に、ポリヌクレオチドは、個別のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合により形成される。核酸は、例えば化学的に、例えばホスホトリエステル法によって製造できる(例えば、Uhlmann & Peyman (1990) Chemical Reviews 90:543-584参照)。
【００６３】
ここで使用する用語“変異体”は、その鎖長または配列の１個以上の変化により、元のポリヌクレオチドまたはタンパク質と比較して異なっている、ポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。タンパク質または核酸変異体が由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親または親のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしても知られる。ここでいう“二量体化変異体”は、上記のとおりその鎖長または配列の１個以上の変化により、該親の二量体化ドメインと異なる、親の二量体化ドメインの変異体である。用語“変異体”または“二量体化変異体”は、親分子の“フラグメント”または“誘導体”を含む。典型的に、“フラグメント”は、親分子より長さが短くまたはサイズが小さく、一方“誘導体”は、親分子と比較してその配列に１個以上の違いがある。またここに包含されるのは、翻訳後修飾タンパク質(例えばグリコシル化、ビオチニル化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化されたまたはタンパク分解により切断されたタンパク質)のような、しかしこれらに限定されない修飾分子およびメチル化ＤＮＡのような修飾核酸である。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのような、しかしこれに限定されない異なる分子の混合物も用語“変異体”または“二量体化変異体”に包含される。典型的に、変異体または二量体化変異体は人為的に、好ましくは遺伝子工学的手段により構築されるが、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは野生型タンパク質またはポリヌクレオチドである。しかしながら、天然起源変異体も、ここで使用する用語“変異体”または“二量体化変異体”に包含されると理解すべきである。さらに、本発明で使用可能な変異体または二量体化変異体はまた、変異体または二量体化変異体が親分子の少なくとも１個の生物活性を示す限り、すなわち機能的活性である限り、親分子のホモログ、オルソログまたはパラログまたは人為的に構築された変異体に由来してもよい。
【００６４】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化は、ヌクレオチドまたはアミノ酸交換、挿入、欠失、５’または３’短縮化、Ｎ末端またはＣ末端短縮化またはこれらの変化の任意の組み合わせであってよく、これは、１箇所または数箇所で起こってよい。好ましい態様において、本発明で使用可能な変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に合計で１５０個まで(１個まで、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで、１５個まで、２０個まで、２５個まで、３０個まで、３５個まで、４０個まで、４５個まで、５０個まで、５５個まで、６０個まで、６５個まで、７０個まで、７５個まで、８０個まで、８５個まで、９０個まで、９５個まで、１００個まで、１１０個まで、１２０個まで、１３０個まで、１４０個までまたは１５０個まで)の変化(すなわち交換、挿入、欠失および／または短縮化)を有してよい。アミノ酸交換は保存的および／または非保存的であり得る。典型的置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間または芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的な半保存的および保存的置換は次のとおりである。
【表１】
0006449143.tif 000002
【００６５】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変換は、新しいシステインが遊離チオールとして残存するならば、半保存的である。さらに、当業者が理解しているように、立体的に厳しい位置のグリシンは置換されるべきでなく、Ｐはアルファらせんまたはベータシート構造を有するタンパク質の部分に導入されるべきでない。
【００６６】
これとは別にまたはこれに加えて、ここで使用する“変異体”または“二量体化変異体”は、それが由来する親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドとのある程度の配列同一性により特徴づけられ得る。より正確にいうと、本発明におけるタンパク質変異体は、親ポリペプチドに少なくとも７０％配列同一性を示す。本発明におけるポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチドに少なくとも７０％配列同一性を示す。好ましくは、タンパク質変異体の配列同一性は、連続する２０個、３０個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個以上のアミノ酸に係る。好ましくは、ポリヌクレオチド変異体の配列同一性は、連続する６０個、９０個、１２０個、１３５個、１５０個、１８０個、２１０個、２４０個、２７０個、３００個以上のヌクレオチドに係る。
【００６７】
用語“少なくとも７０％配列同一性”は、本明細書をとおして、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列比較に関して使用する。この表現は、好ましくは各対照ポリペプチドまたは各対照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性をいう。
【００６８】
２個の配列を比較し、配列同一性パーセンテージの計算の基準である対照配列が比較対照として特定されていないときは、配列同一性は、他に特定して指示されていない限り、比較する２個の配列の長い方を対照として計算されるべきである。対照配列が示されているときは、配列同一性は、他に特定して指示されていない限り、配列番号により示す対照配列の完全長に基づき決定する。例えば、ヒトＭＨＤ２ドメインのアミノ酸配列と比較して、９０アミノ酸から成るペプチド配列は、８１.０８％(９０／１１１)の最大配列同一性パーセンテージ示す可能性があり、一方７８アミノ酸長の配列は、７０.０３％(７８／１１１)の最大配列同一性パーセンテージを示す可能性がある。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは配列アライメントを介して決定できる。このようなアライメントは、数種の当業者に知られたアルゴリズム、好ましくはKarlinおよびAltschulの数学アルゴリズム(Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)、hmmalign(ＨＭＭＥＲパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/)またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ or on http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlまたはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlから入手可能なCLUSTALアルゴリズム(Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)を用いて実施できる。使用する好ましいパラメータは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlに設定されているような、デフォルトパラメータである。配列同一性(配列整合)の程度を、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ(またはＢｌａｓｔＸ)を使用して計算できる。類似のアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに取り込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド探索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実施する。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施する。比較目的のギャップドアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおり使用する。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列整合分析は、Shuffle-LAGAN(Brudno M. (2003b) Bioinformatics 19 Suppl 1:I54-I62)またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術を補ってよい。配列同一性パーセンテージを本明細書中で言及するとき、これらのパーセンテージは、他に具体的指示が無い限り、長い配列の完全長に対して計算する。
【００６９】
“ハイブリダイゼーション”も、２個の核酸配列の配列同一性または相同性の指標として使用できる。ハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991に見られる。“中程度ハイブリダイゼーション条件”は、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)中で３０℃においてハイブリダイゼーションさせ、次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃において洗浄するのに相当すると定義されている。“高ストリンジェントな条件”は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)中で４５℃においてハイブリダイゼーションさせ、次いで０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃において洗浄するのに相当すると定義されている。
【００７０】
ここで使用する用語“免疫グロブリン(Ｉｇ)”は、免疫グロブリンスーパーファミリーの糖タンパク質がもたらす免疫をいう。“表面免疫グロブリン”は、膜貫通型領域によりエフェクター細胞の膜に結合しており、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびII主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)タンパク質、ベータ−２ミクログロブリン(β２Ｍ)、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８のような、しかしこれらに限定されない分子を含む。典型的に、ここで使用する用語“抗体”は、膜貫通型領域を欠き、それゆえに、血流および体腔に放出され得る、分泌免疫グロブリンをいう。ヒト抗体は、その重鎖によって、異なるアイソタイプに分類できる。ギリシャ文字α、δ、ε、γおよびμで表示される５タイプのヒトＩｇ重鎖がある。重鎖のタイプは抗体のクラスを規定し、これらの鎖がそれぞれＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に存在し、それぞれ異なる役割を有し、異なるタイプの抗原に対して適切な免疫応答を指示する。それぞれの重鎖はサイズおよび組成が異なり、αおよびγは約４５０アミノ酸を有し、μおよびεは約５５０アミノ酸を有する(Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science)。ＩｇＡは、消化管、気道および尿生殖路のような粘膜領域ならびに唾液、涙液および母乳に存在し、病原体によるコロニー形成を阻止する(Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417)。ＩｇＤは、主に抗原に曝されていないＢ細胞上の抗原受容体として機能し、抗微生物因子を産生させるために好塩基球および肥満細胞の活性化に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898)。ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミン遊離を誘発するアレルゲンへの結合を介して、アレルギー反応に関与する。ＩｇＥはまた寄生虫に対する防御にも関与する(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ＩｇＧは、侵入してきた病原体に対する抗体ベースの免疫の大部分を提供し、胎児に受動免疫を与えるために胎盤を通過できる唯一の抗体アイソタイプである(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ヒトでは、４種のＩｇＧサブクラス(ＩｇＧ１、２、３および４)があり、血清中のその存在量の順に命名され、ＩｇＧ１が最も豊富であり(〜６６％)、続いてＩｇＧ２(〜２３％)、ＩｇＧ３(〜７％)、そしてＩｇＧ(〜４％)である。異なるＩｇＧクラスの生物学的プロファイルは、各ヒンジ領域の構造により決定される。ＩｇＭは、極めて強い抗原親和性を有していて、単量体型でＢ細胞表面に発現し、五量体型で分泌される。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前の、Ｂ細胞介在(液性)免疫の初期段階での病原体排除に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437)。
【００７１】
抗体は単量体として存在するだけでなく、２個のＩｇ単位(例えばＩｇＡ)の二量体、４個のＩｇ単位の四量体(例えば硬骨魚のＩｇＭ)または５個のＩｇ単位の五量体(例えば哺乳動物ＩｇＭ)を形成することも知られている。抗体は、典型的にジスルフィド結合を介して連結された２個の同一重鎖および２個の同一軽鎖を含む４ポリペプチド鎖から成り、“Ｙ字”型高分子のように見える。鎖の各々は、数個の免疫グロブリンドメインを含み、そのうちの幾つかは定常ドメインであり、残りは可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、２個のβシートの間に７〜９個の逆平行β鎖が配置された２層サンドイッチから成っている。典型的に、抗体の“重鎖”は、４個のＩｇドメインを有し、そのうち３個は定常領域(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３)であり、１個は可変領域(ＶＨ)である。ＩｇＭおよびＩｇＥは例外であって、１個の可変領域(ＶＨ)および４個の定常領域(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４)を含んでいる。ＩｇＭ分子およびＩｇＥ分子の重鎖の付加的ドメイン(ＣＨ２：Ｃμ２、Ｃε２)は、他のＩｇ分子に含まれるヒンジ領域に代って、２個の重鎖を連結している(Perkins et al., 1991; Beavil et al., 1995;Wan et al., 2002)。“軽鎖”は、典型的に１個の定常Ｉｇドメイン(ＣＬ)と１個の可変Ｉｇドメイン(ＶＬ)を含む。ヒトＩｇＭ重鎖の場合は、Ｎ末端からＣ末端にかけてＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４(ＶＨ−Ｃμ１−Ｃμ２−Ｃμ３−Ｃμ４ともいう)の順で結合した４個のＩｇドメインから成り、一方ヒトＩｇＭ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけてＶＬ−ＣＬの順で結合した２個の免疫グロブリンドメインから成り、カッパタイプまたはラムダタイプ(Ｖκ−ＣκまたはＶλ−Ｃλ)のいずれかである。
【００７２】
例えば、ヒトＩｇＭの定常鎖は、４５２個のアミノ酸を含む。本明細書および特許請求の範囲を通じて、免疫グロブリンのアミノ酸の位置番号はKabat, E. A., Wu, T.T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed. U.S. Department of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDの“ＥＵ指標”によるものである。“KabatにおけるＥＵ指標”は、ヒトＩｇＭ  ＥＵ抗体の残基番号付けをいう。したがって、ＩｇＭにおけるＣＨドメインは次のとおりである：“ＣＨ１”はKabatによるＥＵ指標でアミノ酸位１１８〜２１５を意味し、“ＣＨ２”はKabatによるＥＵ指標でアミノ酸位２３１〜３４０を意味し、“ＣＨ３”はKabatによるＥＵ指標でアミノ酸位３４１〜４４６を意味する。“ＣＨ４”は、KabatによるＥＵ指標でアミノ酸位４４７〜５５８を意味する。
【００７３】
ヒトＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＤ分子においては２個の重鎖がヒンジ領域を介して結合するが、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体はこのようなヒンジ領域を含まない。その代わり、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、２個の重鎖間の二量体化ドメインとして機能する付加的ＩｇドメインであるＣＨ２ドメインを有している。他の抗体のかなり可動性で線形のヒンジ領域とは対照的に、ＩｇＥおよびＩｇＭのＣＨ２ドメインは、ｃタイプ免疫グロブリン折りたたみを形成するドメイン内ジスルフィド結合により安定化される２個のベータシートから成る(Bork et al., 1994; Wan et al., 2002)。さらに、ＭＨＤ２およびＥＨＤ２ドメインは２個のＮ−グリコシル化部位を含む。
【００７４】
“ヒトＩｇＥ重鎖ドメイン２”(“ＥＨＤ２”)は１０６個のアミノ酸残基から成る。本ドメインは、Ｃｙｓ２６１とＣｙｓ３２１(KabatによるＥＵ番号付け)の間に形成されたドメイン内ジスルフィド結合を含む。典型的に、２個のＥＨＤ２ドメインは、Ｃｙｓ２４７とＣｙｓ３３７の間の２個のドメイン間ジスルフィド結合により共有結合する。ＥＨＤ２はＡｓｎ２７５にＮ−グリコシル化部位を有する(図２)。
ヒトＥＨＤ２のアミノ酸配列は配列番号２に示す。
【００７５】
“ＩｇＭ重鎖ドメイン２”(“ＭＨＤ２”)は、２個のドメインのシステイン残基３３７間に形成されたジスルフィド結合により共有結合で相互に結合されたホモ二量体を形成する１１１個のアミノ酸残基(１２.２kDa)から成っている(Davis et al., 1989;Davis & Shulman, 1989)。本ドメインは、Ｃｙｓ２６１とＣｙｓ３２１の間に形成されたドメイン内ジスルフィド結合によりさらに安定化される。典型的に、２個のＭＨＤ２ドメインは、両者のＣｙｓ３３７間のドメイン間ジスルフィド結合により共有結合する。ＭＨＤ２はＡｓｎ３３３にＮ−グリコシル化部位を有する(図２)。
ヒトＭＨＤ２のアミノ酸配列を配列番号１に提供する。
ヒトＭＨＤ２およびＥＨＤ２は約２５％配列同一性を有する(図２)。
【００７６】
抗体のパパイン消化は、各々１個の抗原結合部位を有する“Ｆａｂフラグメント”(“Ｆａｂ部分”または“Ｆａｂ領域”ともいう)と呼ばれる２個の同一抗原結合フラグメントならびに容易に結晶化できる能力を反映した名称を有する残存“Ｆｃフラグメント”(“Ｆｃ部分”または“Ｆｃ領域”とも呼ばれる)を産生する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の結晶構造は決定されている(Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370)。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに由来する２個の同一タンパク質フラグメントから成り、ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は各ポリペプチド鎖における３個の重鎖定常ドメイン(ＣＨ２−４)を含む。さらに、小さい免疫グロブリン分子が天然に存在し、または人工的に構築されている。用語“Ｆａｂ’フラグメント”は、Ｉｇ分子のヒンジ領域をさらに含むＦａｂフラグメントをいい、一方“Ｆ(ａｂ’)２フラグメント”は、化学的に結合したまたはジスルフィド結合を介して連結した２個のＦａｂ’フラグメントを含むと理解される。“単一ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)”(Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811)および“ナノボディ”は単一ＶＨドメインのみを含み、“単一鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)”フラグメントは、短リンカーペプチドを介して軽鎖可変ドメインに結合した重鎖可変ドメインを含む(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)。二価単一鎖可変フラグメント(ジ−ｓｃＦｖ)は、２個のｓｃＦｖの結合(ｓｃＦｖＡ−ｓｃＦｖＢ)により製造され得る。これは、２個のＶＨ領域および２個のＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を製造し、“直列型ｓｃＦｖ”(ＶＨＡ−ＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ)を産生することにより実施できる。今ひとつの可能性は、２個の可変領域が一緒に折りたたまれるには短すぎ、ｓｃＦｖを二量体化させる、リンカーを有するｓｃＦｖの生成である。通常５残基長のリンカーがこれらの二量体の産生に使用される。このタイプは“ディアボディ”として知られる。ＶＨドメインとＶＬドメイン間のさらに短いリンカー(１個または２個のアミノ酸)は、単一特異性三量体、いわゆる“トリアボディ”または“トリボディ”の形成に至る。二重特異性ディアボディは、それぞれＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡまたはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡの配置を有する２個の鎖の発現により形成される。単一鎖二重特異性抗体(ｓｃＤｂ)は、１２〜２０個のアミノ酸、好ましくは１４個のアミノ酸のリンカーペプチド(Ｐ)により結合したＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡフラグメントを含む(ＶＨＡ−ＶＬＢ−Ｐ−ＶＨＢ−ＶＬＡ)。“二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＢｉＴＥ)”は、異なる抗体の２個のｓｃＦｖから成る融合タンパク質であり、ここで、ｓｃＦｖの一方がＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方が腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する(Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244)。二重親和性再標的化分子(“ＤＡＲＴ”分子)は、Ｃ末端ジスルフィド架橋を介してさらに安定化された二重特異性抗体である。
【００７７】
ここで使用する用語“薬学的活性部分”は、予防、治療および／または診断効果を含むが、これらに限定されない薬理効果を仲介する、高分子または複合体、すなわちポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその複合体の一部または部分をいうと理解される。
【００７８】
ここで使用する疾患または障害の“予防”、“予防する”、“予防の”または“予防法”は、このような疾患または障害が患者で生じるのを阻止することを意味する。したがって、予防効果を有する部分は、患者における疾患または障害の発症を阻止する。
【００７９】
ここで使用する疾患または障害の“処置”、“処置する”、“処置法”または“治療”は、次の１個以上の達成を意味する：(ａ)障害の重症度の軽減；(ｂ)処置中の障害の特徴である症状の発症の制限または阻止；(ｃ)処置中の障害の特徴である症状の悪化の阻止；(ｄ)以前障害を有していた個体における障害の再発の制限または阻止；および(ｅ)先に障害が症候性であった個体における症状の再発の制限または阻止。したがって、治療効果を有する部分は、上記効果(ａ)〜(ｅ)の１個以上の達成により、疾患または障害の症状を処置する。
【００８０】
用語疾患または障害の“同定”、“同定する”、“鑑別”または“診断”は、ここでは、疾患または障害の性質および原因の決定をいう。したがって、診断効果を有する部分は、疾患または障害の性質および原因の決定を可能にする。
【００８１】
疾患または障害の“症状”は、このような疾患または障害を有する組織、臓器または生物に顕著な疾患または障害の影響であり、組織、臓器または個体の疼痛、脱力、圧痛、過労、硬直および攣縮ならびにバイオマーカーまたは分子マーカーのような特異的指標の存在、不在、上昇、低下を含むが、これらに限定されない。ここで使用する用語“疾患”および“障害”は、病気または傷害のような異常状態、特に医学的異常状態をいい、ここで、組織、臓器または個体はその機能をもはや効率的に全うできない。典型的に、しかし必定ではなく、疾患または障害は、このような疾患または障害の存在を示す特異的症状または徴候と関連する。疾患または障害は、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、癌タイプ疾患、皮膚状態、内分泌疾患、血液疾患および障害、眼疾患および障害、遺伝性障害、炎症性疾患、感染症、消化器系疾患、神経障害および精神疾患を含むが、これらに限定されない。自己免疫性疾患の例は、Ｉ型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、クローン病、自己免疫性心筋症、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎およびシェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。アレルギー性疾患の例は、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性湿疹、アナフィラキシー、昆虫毒アレルギー、薬物アレルギーおよび食物アレルギーを含むが、これらに限定されない。癌タイプ疾患の例は、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、網膜芽細胞腫、胃癌、消化器間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、胸膜肺芽腫、前立腺癌、咽頭癌、甲状腺癌および尿道癌を含むが、これらに限定されない。皮膚状態の例は、アクネ、皮膚炎、湿疹、皮膚付属器の状態、皮下脂肪の状態、色素沈着障害、上皮母斑、上皮新生物、上皮嚢腫、紅斑、凍傷、遺伝性皮膚症、ムチン沈着症、神経皮膚状態(例えばウィスコット・アルドリッチ症候群)および乾癬を含むが、これらに限定されない。内分泌疾患の例は、Ｉ型およびII型糖尿病、骨粗鬆症およびクッシング病を含むが、これらに限定されない。血液疾患および障害の例は、凝固障害(血友病Ａ、血友病Ｂなど)、線維素溶解性障害、補体欠損症、免疫グロブリン欠損症および貧血を含むが、これらに限定されない。遺伝性障害の例は、色覚異常、嚢胞性線維症、ダウン症候群、鎌状赤血球疾患およびターナー症候群を含むが、これらに限定されない。炎症性疾患の例は、リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、粥状動脈硬化、変形性関節症および喘息を含むが、これらに限定されない。感染症の例は、アフリカ睡眠病、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ感染、炭疽、ボレリア症、カリシウイルス感染(ノロウイルスおよびサポウイルス)、水痘、クラミジア感染、コレラ、クロストリジウム感染、コロラドダニ熱(ＣＴＦ)、感冒、クロイツフェルト・ヤコブ病、デング熱(ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４)、エボラ、エンテロウイルス感染、ヒトヘルペスウイルス６(ＨＨＶ−６)およびヒトヘルペスウイルス７(ＨＨＶ−７)の感染、淋病、連鎖球菌感染(Ａ群およびＢ群)、手足口病(ＨＦＭＤ)、ヘリコバクター・ピロリ感染、肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型)、ヘルペス感染、パピローマウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザ、ラッサ熱、マールブルグ熱、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、パスツレラ症、シラミ属感染、ペスト、肺炎球菌感染、呼吸器多核体ウイルス感染、ロタウイルス感染、風疹ウイルス感染、サルモネラ食中毒および感染、ＳＡＲＳ、疥癬感染、住血吸虫症、天然痘、ブドウ球菌食中毒および感染、梅毒、破傷風、白癬菌感染、結核、チフス、ベネズエラウマ脳炎および黄色熱のようなウイルス、細菌、寄生虫、プリオンまたは他の病原体または寄生生物が原因の感染疾患を含むが、これらに限定されない。消化器系疾患の疾患は、胃腸炎、イレウス、回腸炎、大腸炎、虫垂炎、セリアック病、過敏性腸症候群、憩室性疾患、下痢、ポリープおよび潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。神経障害の例は、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、アルツハイマー病、脳損傷、クロイツフェルト・ヤコブ病、クッシング症候群、失読症、脳炎、癲癇、頭痛、ハンチントン病、片頭痛、多発性硬化症、パーキンソン病、ポリオ、狂犬病、統合失調症および卒中を含むが、これらに限定されない。精神疾患の例は、急性ストレス障害、注意欠損過活動障害(ＡＤＨＤ)、自閉症性障害、境界性人格障害、神経性過食症、燃え尽き症候群、統合失調症、鬱病、認知障害、コミュニケーション障害、摂食障害、窃盗癖、学習障害、男性勃起障害、抑欝、強迫性障害(ＯＣＤ)、妄想性障害、病的賭博、外傷後ストレス障害(ＰＴＳＤ)、精神病性障害、過眠症、不眠症およびトゥレット症候群を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
“薬学的活性部分”は、典型的に生物製剤および／または合成医薬、例えばリガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子を含む。用語“リガンド”は、特異的生物学的機能を発揮するために他の分子と複合体を形成する化学物質または生物学的物質をいう。リガンドは、抗原結合分子、足場タンパク質、天然リガンド、リガンド結合受容体フラグメントおよびアプタマーのような基質、阻害剤およびアクティベーターを含むが、これらに限定されない。用語“エフェクター分子”は、典型的にタンパク質と結合し、それによりそのタンパク質の活性を変える小分子、ペプチドまたはポリペプチドをいう。これはサイトカイン、ケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質、キナーゼ、プロドラッグ変換酵素、ＲＮａｓｅ、アゴニスト抗体または抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメント、融合タンパク質または誘導体を含むが、これらに限定されない。“半減期延長モジュール”は、化学物質または生物学的物質の半減期、例えば“血漿半減期”または“血清半減期”を延長する。造影分子は、特異的標的分子に結合し、それにより、その分子の位置を可視化できるものである。
【００８３】
“合成医薬”は、典型的に障害または疾患の予防、処置または診断に有効な人為的に合成された化合物をいうと理解される。
【００８４】
“生物製剤”は、典型的に生物工学的手段を使用して製造され、予防、治療および／またはインビボ診断目的で使用される医薬をいうと理解される。生物製剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および核酸(例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッド)を含むが、これらに限定されない。承認された治療用生物製剤は、ホルモン(例えばインスリン、ｈＧＨ、ＦＳＨ、グルカゴン様ペプチド１、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン)、増殖因子(例えばエリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１)、インターフェロン(例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ)、インターロイキン(例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１Ｒａ)、凝固因子(例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIａ因子、トロンビン)、血栓溶解剤および抗凝固剤(例えばｔ−ＰＡ、ヒルジン、活性化プロテインＣ)、酵素(例えばα−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ＤＮａｓｅ)、抗体および抗体フラグメント(例えばＩｇＧ、Ｆａｂ)のような抗原結合分子およびその融合タンパク質(例えばＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＴＭＰ−Ｆｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ、ＬＦＡ−３−Ｆｃ、ＩＬ−２−ＤＴ)を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明における“ペプチドリンカー”は、複合体の２個の部分または成分、例えば２個のペプチドまたはタンパク質を立体的に分けるアミノ酸配列をいう。典型的にこのようなリンカーは、最小で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長および最大で少なくとも１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長またはそれ未満を有する１〜１００アミノ酸から成る。本発明によるペプチドリンカーの示される好ましい最小および最大長は、組み合わせが数学的意味をなすならば組み合わせてよく、例えばこのようなリンカーは１〜１５または１２〜４０または２５〜７５または１〜１００アミノ酸を有し得る。ペプチドリンカーはまた一緒に結合する２個の部分の間に可動性も提供し得る。このような可動性は、アミノ酸が小さければ一般的に増加する。したがって、可動性ペプチドリンカーは、小アミノ酸、特にグリシンおよび／またはアラニンおよび／またはセリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンのような親水性アミノ酸含量が多い。好ましくは、ペプチドリンカーの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上のアミノ酸が小アミノ酸である。
【００８６】
ここで使用する用語“開裂部位”は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列をいい、ここで、この配列は、例えば、開裂酵素により認識され、または開裂できるために、複合体または高分子(例えば核酸またはタンパク質)の開裂を指示される。典型的に、ポリペプチド鎖はアミノ酸を結合する１個以上のペプチド結合の加水分解により開裂され、ポリヌクレオチド鎖はヌクレオチド間の１個以上のホスホジエステル結合の加水分解により開裂される。ペプチド結合またはホスホジエステル結合の開裂は、化学または酵素開裂により生じ得る。酵素開裂は、制限エンドヌクレアーゼ(例えばＩ型、II型、III型、IV型または人工的制限酵素)およびエンドまたはエキソペプチダーゼまたはプロテアーゼ(例えばセリン−プロテアーゼ、システイン−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ)を含むが、これらに限定されないタンパク分解性酵素により達成されるような開裂をいう。典型的に、酵素開裂は、自己開裂により起こるかまたは独立したタンパク分解酵素により実行される。タンパク質またはポリペプチドの酵素開裂は、翻訳時または翻訳後に起こり得る。したがって、ここで使用する用語“エンドペプチダーゼ開裂部位”は、アミノ酸またはヌクレオチド配列内の開裂部位をいい、ここで、この配列はエンドペプチダーゼ(例えばトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼＶ８、カテプシン)により開裂されまたは開裂可能である。
【００８７】
ここで使用する用語“自己開裂部位”は、アミノ酸配列内の開裂部位をいい、ここで、この配列は、何らかの付加的分子が関与するような開裂を行わずに開裂されまたは開裂可能である。開裂部位は、典型的に数アミノ酸を含むと理解される。それゆえに、開裂部位はまたペプチドリンカーとして、すなわち２個のペプチドまたはタンパク質を立体的に分離する目的でも役立ち得る。
【００８８】
ここで使用する用語“ベクター”は、細胞に導入され得るまたはその中に含まれるタンパク質および／または核酸を細胞に導入できるタンパク質またはポリヌクレオチドまたはその混合物をいう。本発明において、導入されたポリヌクレオチドによりコードされる目的の遺伝子が、１種以上のベクターの導入により細胞内で発現されるのが好ましい。適切なベクターの例は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
ここで使用する用語“複合体”は、互いに極めて接近しており、共通のまたは相互に関連する機能を発揮する、数個の個別の成分、部分または一部分を含む全体をいう。複合体の個別の部分は性質が同一でも異なってもよく、すなわちそれらはヌクレオチド、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物および／または脂質のような、しかしこれらに限定されない同一の、類似のまたは異なる化学物質から成ってよい。複合体の例は、数個の関連タンパク質または１種以上のタンパク質および１種以上の核酸の混合物または１種以上のタンパク質および１種以上の脂質および／または炭水化物の混合物から成り得る。同一の、類似のまたは異なる化学物質の任意の組み合わせも包含されると理解される。複合体の個別の部分は相互連結していても、していなくてもよい。典型的に、複合体の個別の部分は共有結合性または非共有結合性結合を介して連結する。
【００９０】
ここで使用する用語“多量体化”は、２個以上の分子、例えばタンパク質または核酸の高分子複合体(すなわち２個、３個、４個、５個またはそれ以上の分子)の形成をいい、一方ここで使用する用語“二量体化”は、２個の分子、例えばタンパク質または核酸の高分子複合体化を特にいう。ホモ二量体は２個の同一分子(いわゆる“ホモ二量体化”)により形成され、一方ヘテロ二量体は２個の異なる高分子(いわゆる“ヘテロ二量体化”)により形成される。典型的に、“二量体”において、２個の高分子は、非共有結合性または共有結合性結合、例えばジスルフィド結合(Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ)を介して結合する。本発明において、ＭＨＤ２またはＥＨＤ２は、それぞれ、２個のＭＨＤ２ドメインの２個のＣｙｓ３３７間のジスルフィド結合または２個のＥＨＤ２ドメインの２個のＣｙｓ２４７およびＣｙｓ３３７間のジスルフィド結合(一方のドメインのＣｙｓ２４７は他方のドメインのＣｙｓ３３７と対形成する)を介して２個のＭＨＤ２ドメイン間または２個のＥＨＤ２ドメイン間でホモ二量体が形成される点で、“二量体化ツール”として役立ち得る。ＩｇＭ分子またはＩｇＥ分子の重鎖内のＭＨＤ２またはＥＨＤ２の中心の位置のために、これらのＨＤ２ドメインのＮ末端および／またはＣ末端にさらにモジュールを融合できる。これらのモジュールは、上におよび／または下に定義する１種以上の薬学的活性部分を含み得る。したがって、ＭＨＤ２およびＥＨＤ２は、共有結合した二量体化ドメインによりまとめられた多価および二機能性分子の産生を可能にする共有結合した“ホモ二量体化モジュール”として使用される。
【００９１】
ここで使用する用語“モジュラーシステム”は、個々に創製でき、その後複数機能性を駆動するように異なるシステムで使用される、小さい部分(“モジュール”)に細分されるシステムをいう。典型的に、個々のモジュールは孤立した、自己完結型機能要素であり、これは個別の拡張性のある、再利用可能なモジュールに機能的に分割できる。本発明において、用語“モジュール”は、特に高分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは複合体の自給自足部分または分離可能成分をいう。典型的に、モジュールは高分子または複合体の残りと無関係に進化でき、機能できおよび／または存在でき、１個〜数ドメインから成り、その各々は安定かつ独立的に折りたたまれている３次元構造である。このようなモジュールは、典型的に高分子または複合体内に独立した機能単位を形成する。
【００９２】
用語“薬剤”、“医薬”および“薬物”はここでは交換可能に使用し、疾患または障害の鑑別、予防または処置に使用される物質および／または物質の組み合わせをいう。
【００９３】
用語“製剤”および“組成物”は、活性成分が他の担体を伴わずまたは伴って、担体により囲まれた封入体を提供する担体として、すなわち、活性化合物と関連している、封入材料を伴う、活性化合物の製剤を含むことを意図する。
【００９４】
“薬学的に許容される”は、動物およびより具体的にヒトにおける使用について、連邦政府または州政府の規制当局により承認されたまたは米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。
【００９５】
用語“活性成分”は、生物学的に活性である、すなわち薬剤価値を提供する医薬組成物または製剤中の物質をいう。医薬組成物は、互いに関連して作用しても独立して作用してもよい１種以上の活性成分を含み得る。活性成分は、中性または塩形態として製剤できる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものを含むが、これらに限定されない遊離アミノ基と形成されるものおよびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、三価鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものを含むが、これらに限定されない遊離カルボキシル基と形成されるものを含む。
【００９６】
ここで使用する用語“担体”は、治療的活性成分と一緒に投与する希釈剤、添加物、界面活性剤、安定化剤、生理学的緩衝液または媒体のようなしかしこれらに限定されない薬理学的不活性物質をいう。このような医薬担体は液体または固体であり得る。液体担体は、水中およびピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などのような石油、動物、植物または合成起源のものを含むが、これらに限定されない油中の塩類溶液(saline solution)のような無菌液体を含むが、これらに限定されない。塩類溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射溶液のために、液体担体として使用できる。医薬組成物を静脈内投与するとき、塩類溶液が好ましい担体である。適切な医薬担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。
【００９７】
適切な医薬“添加物”は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。
【００９８】
“界面活性剤”はデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０のようなポリソルベート類のような、しかしこれらに限定されないアニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤を含む。
【００９９】
“安定化剤”は、マンニトール、スクロース、トレハロース、アルブミンならびにプロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
“生理学的緩衝液”は、塩化ナトリウム溶液、脱塩水ならびにリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、ＨＥＰＥＳ緩衝液([４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはＭＯＰＳ緩衝液(３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸)のようなしかしこれらに限定されない適切な有機または無機緩衝液を含むが、これらに限定されない。各緩衝液の選択は、一般に所望の緩衝液モル濃度による。リン酸緩衝液は、例えば、注射および点滴溶液に適切である。
【０１０１】
用語“アジュバント”は、細胞レベルまたは液性レベルで組成物の活性成分に対する免疫応答を増大、刺激、活性化、増強または調節する薬剤をいい、例えば免疫性アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体免疫学的効果はない。このようなアジュバントの例は、無機アジュバント(例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムのような無機金属塩)、有機アジュバント(例えばサポニンまたはスクアレン)、油性アジュバント(例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント)、サイトカイン(例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＮＦ−γ)、粒子アジュバント(例えば免疫賦活性複合体(ＩＳＣＯＭＳ)、リポソームまたは生分解性マイクロスフェア)、ビロソーム、細菌アジュバント(例えばモノホスホリルリピドＡまたはムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログまたは合成リピドＡ)または合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えばポリアルギニンまたはポリリシン)を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
“有効量”または“治療有効量”は、意図する目的を達成するのに十分な治療剤の量である。ある治療剤の有効量は薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物の大きさおよび種および投与目的のような因子により変わる。各個別の例における有効量は、当分野で確立された方法に従い、当業者により経験的に決定され得る。
【０１０３】
態様
第一の面において、本発明は、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来の重鎖ドメイン２(ＨＤ２)および少なくとも１個の薬学的活性部分を含むポリペプチドを提供する。該薬学的活性部分が、ＩｇＭまたはＩｇＥのＦａｂまたはＦｃフラグメントまたはその一部であることは想定されておらず、すなわち本発明は天然起源ＩｇＭまたはＩｇＥを含まない。
【０１０４】
好ましい態様において、このようなポリペプチドはＩｇＭまたはＩｇＥアイソタイプの重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ３および／またはＣＨ４の１個以上を含まず、すなわちポリペプチドはＣＨ１、ＣＨ３、ＣＨ４、ＣＨ１およびＣＨ３、ＣＨ１およびＣＨ４、ＣＨ３およびＣＨ４またはＣＨ１、ＣＨ３およびＣＨ４を含まない。
【０１０５】
該ポリペプチドがＩｇＥまたはＩｇＭの重鎖ドメイン２  ＣＨ２(ＨＤ２)のみを含むのが特に好ましい。好ましくは、ＩｇＥまたはＩｇＭのさらなる部分は含まない。したがって、該ポリペプチドがＩｇＥまたはＩｇＭの唯一のドメインとしてＩｇＥまたはＩｇＭのＨＤ２ドメインを含むことが想定される。
【０１０６】
好ましくは、このようなポリペプチドは、ペプチド結合により結合されたアミノ酸鎖を模倣し、これは所望により化学修飾されていてよく、例えばグリコシル化アミノ酸および／またはリン酸化アミノ酸を含んでよくおよび／またはペグ化、ヘシル化および／またはポリシアル化されていてよい。好ましい態様において、ＩｇＭまたはＩｇＥからのＨＤ２は１個以上のシステイン残基を含む。ＩｇＭのＨＤ２(ＭＨＤ２)が少なくとも３個のシステイン残基を含み、好ましくは２個のシステイン残基がドメイン内ジスルフィド結合を形成し、３番目のものがドメイン間ジスルフィド結合の形成を可能にするのが特に好ましい。好ましい態様において、これらのジスルフィド結合は、ＭＨＤ２のドメイン内および／またはドメイン間安定性を改善する。好ましくは、これらのシステイン残基は、ＭＨＤ２の２６１位、３２１位および３３７位(KabatによるＥＵ番号)に位置する。さらなる態様において、ＩｇＥのＨＤ２(ＥＨＤ２)が少なくとも４個のシステイン残基を含み、好ましくは２個のシステイン残基がドメイン内ジスルフィド結合を形成し、２個のシステイン残基がドメイン間ジスルフィド結合の形成を可能にするのが好ましい。好ましい態様において、これらのジスルフィド結合は、ＥＨＤ２のドメイン内および／またはドメイン間安定性を改善する。好ましくは、これらのシステイン残基は、それぞれＥＨＤ２の２６１位および３２１位および２４７位および３３７位(KabatによるＥＵ番号)に位置する。
【０１０７】
好ましい態様において、ＨＤ２ドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列またはその二量体化変異体を含む。
【０１０８】
好ましくは、ＭＨＤ２は配列番号１に示すアミノ酸配列：AELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDまたはその変異体を含む。
【０１０９】
好ましくは、ＥＨＤ２は配列番号２に示すアミノ酸配列：DFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNまたはその二量体化変異体を含む。
【０１１０】
好ましい態様において、二量体化変異体は、それぞれ配列番号１または配列番号２のＭＨＤ２またはＥＨＤ２に少なくとも７０％配列同一性を有する。変異体がそれぞれ配列番号１または配列番号２のＭＨＤ２またはＥＨＤ２に少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有するのが特に好ましい。特に好ましい態様において、変異体はそれぞれ配列番号１または配列番号２のＭＨＤ２またはＥＨＤ２に少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を有する。該二量体化変異体が親ＭＨＤ２またはＥＨＤ２の少なくとも１種の生物活性を示す、すなわち機能的活性であるのが好ましい。該二量体化変異体が、第二のＭＨＤ２またはＥＨＤ２またはその二量体化変異体と二量体化できることにより機能的活性であるのが特に好ましい。
【０１１１】
好ましい態様において、該二量体化変異体はアミノ酸交換、好ましくは保存的および／または非保存的アミノ酸交換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸付加を示し得る。好ましくは、これらのアミノ酸交換、欠失および／または付加は、オルソロガスまたはパラロガス配列にほとんどまたはまったく保存されない配列領域内である。好ましくは、保存されたおよび／または高度に保存された配列領域は変更されない。それぞれＭＨＤ２およびＥＨＤ２のシステイン残基が維持されるのが特に好ましい。
【０１１２】
ＩｇＭ分子またはＩｇＥ分子において、ＨＤ２は重鎖内の中央部分を占拠し、さらなる重鎖配列が、ＨＤ２ドメインのＣ末端およびＮ末端で連結されている。これらの連結された重鎖配列は、ＨＤ２がその二量体化への機能を発揮する能力に影響しない、変えないまたは阻害しない。したがって、ＨＤ２が二量体化する能力に影響せず、変更せずまたは阻害せず、ＨＤ２ドメインのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるモジュールを融合し得ることが想定される。それゆえに、両ドメインとも、化学および生物学的分子(例えば小化学物質、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質フラグメント、核酸またはそのハイブリッド)のような、しかしこれらに限定されない、さらなる個別のまたは複数の機能的に異なるモジュールを含むモジュラーシステムにおけるアンカー点として適切である。好ましくは、該モジュールは、ＨＤ２の二量体化における機能に影響しない、変えないまたは阻害しないようなサイズ、表面電荷および機能を有する。ＨＤ２の機能を妨害するモジュールは、干渉効果を最小化および／または消滅させるためにリンカーペプチドを介して融合させ得る。好ましい態様において、ＩｇＭまたはＩｇＥのＨＤ２のＣ末端および／またはＮ末端に融合したモジュールは、少なくとも１個の薬学的活性部分を含む。それゆえに、好ましい態様において、少なくとも１個の薬学的活性部分は、ＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端に連結している。
【０１１３】
好ましくは少なくとも１個の薬学的活性部分を含む融合モジュールの数は、ＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端で１個以上、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上であり得る。融合モジュールの数は、主に得られたポリペプチドの所望の機能ならびに得られたポリペプチドのサイズまたは表面電荷による機能的または立体的制限により制限されることは当業者により理解される。典型的にこのような得られたポリペプチドは最大サイズ１０００kDa、すなわち５kDa、１０kDa、２０kDa、３０kDa、４０kDa、５０kDa、１００kDa、１５０kDa、２００kDa、２５０kDa、３００kDa、３５０kDa、４００kDa、４５０kDa、５００kDa、５５０kDa、６００kDa、６５０kDa、７００kDa、７５０kDa、８００kDa、８５０kDa、９００kDa、９５０kDaまたは１０００kDaであるが、各状況で適切であるならば、さらに大きくてもよい。
【０１１４】
さらなる態様において、好ましくは少なくとも２個の薬学的活性部分を含む、少なくとも２個のモジュールは、ＩｇＭまたはＩｇＥのＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかまたは両者に連結している。各ＸおよびＹモジュールは、それぞれ同一または異なるモジュール、好ましくは同一または異なる薬学的活性部分であり得る。それゆえに、ＸｍモジュールがＭＨＤ２またはＥＨＤ２ドメインのＮ末端に連結し、ＹｎモジュールがＭＨＤ２またはＥＨＤ２ドメインのＣ末端に連結していることが想定される(ここで、ｍは好ましくは０〜１０、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、ｎは好ましくは０〜１０、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であるが、ｍおよびｎの少なくとも１個が１以上である)。ｍおよびｎは同一でも異なってもよい。
【０１１５】
したがって、このようなポリペプチドは次の構造の一つを有し得る：Ｘｍ−ＭＨＤ２−Ｙｎ、より好ましくはＸ１−ＭＨＤ２、ＭＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２、ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、ＭＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＭＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−ＭＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｙ１またはＸ１−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｙ１；Ｘｍ−ＥＨＤ２−Ｙｎ、より好ましくはＸ１−ＥＨＤ２、ＥＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＥＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２、ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、ＥＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＥＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−ＥＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｙ１またはＸ１−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｙ１(ここで、ｍは好ましくは０〜１０、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、ｎは好ましくは０〜１０、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であるが、ただし、ｍおよびｎの少なくとも１個が１以上である)。Ｍおよびｎは同一でも異なってもよい。ｍおよびｎの特に好ましい組み合わせは次のものである：ｍ＝１およびｎ＝０；ｍ＝０およびｎ＝１、ｍ＝１およびｎ＝１；ｍ＝１およびｎ＝２；ｍ＝１およびｎ＝３；ｍ＝１およびｎ＝４；ｍ＝１およびｎ＝５；ｍ＝１およびｎ＝６；ｍ＝１およびｎ＝７；ｍ＝１およびｎ＝８；ｍ＝１およびｎ＝９；ｍ＝１およびｎ＝１０；ｍ＝２およびｎ＝１；ｍ＝２およびｎ＝２；ｍ＝２およびｎ＝３；ｍ＝２およびｎ＝４；ｍ＝２およびｎ＝５；ｍ＝２およびｎ＝６；ｍ＝２およびｎ＝７；ｍ＝２およびｎ＝８；ｍ＝２およびｎ＝９；ｍ＝２およびｎ＝１０；ｍ＝３およびｎ＝１；ｍ＝３およびｎ＝２；ｍ＝３およびｎ＝３；ｍ＝３およびｎ＝４；ｍ＝３およびｎ＝５；ｍ＝３およびｎ＝６；ｍ＝３およびｎ＝７；ｍ＝３およびｎ＝８；ｍ＝３およびｎ＝９；ｍ＝３およびｎ＝１０；ｍ＝４およびｎ＝１；ｍ＝４およびｎ＝２；ｍ＝４およびｎ＝３；ｍ＝４およびｎ＝４；ｍ＝４およびｎ＝５；ｍ＝４およびｎ＝６；ｍ＝４およびｎ＝７；ｍ＝４およびｎ＝８；ｍ＝４およびｎ＝９；ｍ＝４およびｎ＝１０；ｍ＝５およびｎ＝１；ｍ＝５およびｎ＝２；ｍ＝５およびｎ＝３；ｍ＝５およびｎ＝４；ｍ＝５およびｎ＝５；ｍ＝５およびｎ＝６；ｍ＝５およびｎ＝７；ｍ＝５およびｎ＝８；ｍ＝５およびｎ＝９；ｍ＝５およびｎ＝１０；ｍ＝６およびｎ＝１；ｍ＝６およびｎ＝２；ｍ＝６およびｎ＝３；ｍ＝６およびｎ＝４；ｍ＝６およびｎ＝５；ｍ＝６およびｎ＝６；ｍ＝６およびｎ＝７；ｍ＝６およびｎ＝８；ｍ＝６およびｎ＝９；ｍ＝６およびｎ＝１０；ｍ＝７およびｎ＝１；ｍ＝７およびｎ＝２；ｍ＝７およびｎ＝３；ｍ＝７およびｎ＝４；ｍ＝７およびｎ＝５；ｍ＝７およびｎ＝６；ｍ＝７およびｎ＝７；ｍ＝７およびｎ＝８；ｍ＝７およびｎ＝９；ｍ＝７およびｎ＝１０；ｍ＝８およびｎ＝１；ｍ＝８およびｎ＝２；ｍ＝８およびｎ＝３；ｍ＝８およびｎ＝４；ｍ＝８およびｎ＝５；ｍ���８およびｎ＝６；ｍ＝８およびｎ＝７；ｍ＝８およびｎ＝８；ｍ＝８およびｎ＝９；ｍ＝８およびｎ＝１０；ｍ＝９およびｎ＝１；ｍ＝９およびｎ＝２；ｍ＝９およびｎ＝３；ｍ＝９およびｎ＝４；ｍ＝９およびｎ＝５；ｍ＝９およびｎ＝６；ｍ＝９およびｎ＝７；ｍ＝９およびｎ＝８；ｍ＝９およびｎ＝９；ｍ＝９およびｎ＝１０；ｍ＝１０およびｎ＝１；ｍ＝１０およびｎ＝２；ｍ＝１０およびｎ＝３；ｍ＝１０およびｎ＝４；ｍ＝１０およびｎ＝５；ｍ＝１０およびｎ＝６；ｍ＝１０およびｎ＝７；ｍ＝１０およびｎ＝８；ｍ＝１０およびｎ＝９；ｍ＝１０およびｎ＝１０。
【０１１６】
モジュール、好ましくは薬学的活性部分は、ＭＨＤ２またはＥＨＤ２に直接連結してよくまたは１個以上のリンカー(Ｌ)を介して間接的に連結してよい。１個を超えるモジュールがＨＤ２ドメインに連結している態様において、個々のモジュールは互いに直接的に連結してよくまたは１個以上のリンカー(Ｌ)を介して間接的に連結してよい。ＭＨＤ２およびＥＨＤ２それぞれの二量体化またはさらに連結したモジュールの機能を妨害するモジュールは、好ましくはリンカーを介して間接的に連結する。同様に、ＭＨＤ２およびＥＨＤ２の二量体化が薬学的活性部分の薬剤活性を妨害するならば、リンカーを介して連結する間接的連結の使用が好ましい。それゆえに、好ましい態様において、少なくとも１個の薬学的活性部分をＨＤ２に直接的にまたは１個以上のリンカーを介して間接的に連結している。
【０１１７】
好ましくは、１個以上のリンカーは、連結したモジュール、好ましくは薬学的活性部分をＨＤ２ドメインと立体的に分離するペプチドリンカーを含む。１個を超えるモジュール、好ましくは薬学的活性部分がＨＤ２ドメインに連結している態様において、リンカーは、異なる連結しているモジュールを互いに立体的に分離するペプチドリンカーを含む。
【０１１８】
好ましくは、ペプチドリンカーは５〜４０アミノ酸長(すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０アミノ酸長)、より好ましくは５〜２０アミノ酸長(すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長)、最も好ましくは８〜１５アミノ酸長(すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５アミノ酸長)を有する。融合モジュールとＨＤ２ドメインまたはさらに連結したモジュールの立体的分離を可能にする適切な長さのリンカーは、当分野で周知の慣用法を使用して当業者が選択できる(Arai et al., 2001;George & Heringa et al., 2003; Wriggers et al., 2005;Tanaka et al., 2005)。
【０１１９】
特に好ましいのは可動性ペプチドリンカーである。可動性リンカーは、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨害する嵩高い側鎖を有しないアミノ酸から成る。可動性リンカーは、好ましくはＧ残基、Ｓ残基、Ｔ残基およびＡ残基を含む。好ましくは可動性リンカーペプチドの少なくとも５０％のアミノ酸が、Ｇ、Ｓ、ＴおよびＡから成る群から選択されるアミノ酸から成る。より好ましくはリンカーの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸がＧ、Ｓ、ＴおよびＡから成る群から選択されるアミノ酸から成る。
【０１２０】
ＨＤ２ドメインとモジュール、好ましくは薬学的活性部分を立体的に分離するのに適する数多くのペプチドリンカーが文献に記載されている(Robinson & Sauer, 1998; Voelkel et al., 2001; Kavoosi et al., 2007; Watanabe et al., 2011)。好ましいペプチドリンカーは、リンカーペプチド１：GGGGS(配列番号１８)、リンカーペプチド２：GGGGSGGGGS(配列番号１９)、リンカーペプチド３：GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号２０)、リンカーペプチド４：GSLGGSGG(配列番号２１)、リンカーペプチド５：GGGSGGGT(配列番号２２)、リンカーペプチド６：GGGSGGGTGS(配列番号２３)、リンカーペプチド７：GGGSGGGTGSGG(配列番号２４)、リンカーペプチド８：GGGSGGGS(配列番号２５)、リンカーペプチド９：EFTRG(配列番号２６)およびリンカーペプチド１０：AAA(配列番号２７)またはその多量体、誘導体およびフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
さらに好ましい態様において、１個以上のリンカーは１箇所以上の開裂部位、すなわちリンカー配列が１個以上のペプチド結合の分割により化学的または酵素的に開裂し得る１個以上の配列領域を含む。開裂部位が、意図する目的地に到達したら、薬学的活性部分の遊離を可能にするのが好ましい。酵素開裂は、制限エンドヌクレアーゼ(例えばＩ型、II型、III型、IV型または人工的制限酵素)およびエンドまたはエキソペプチダーゼまたはプロテアーゼ(例えばセリン−プロテアーゼ、システイン−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ)を含むが、これらに限定されないタンパク分解性酵素により達成され得る。特に好ましい態様において、一箇所以上の開裂部位は、一箇所以上のエンドペプチダーゼ開裂部位、すなわち配列がトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼＶ８および／またはカテプシンのような、しかしこれらに限定されないエンドペプチダーゼにより開裂されるまたは開裂可能である場所を含む。
【０１２２】
何個のモジュールがＨＤ２に結合するかによって、ペプチドリンカーはＨＤ２ドメインのＣ末端および／またはＮ末端の間ならびに異なるモジュール間に位置し得ることも想定される。１個を超えるリンカーが異なるモジュールおよび／またはＨＤ２ドメイン間に存在する態様において、これらのリンカーは同一でも互いに異なってもよい。したがって、このようなポリペプチドは次の構造の１個を有し得る：
Ｘ１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＭＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−ＭＨＤ２、Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＭＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−ＭＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｎ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＭＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１またはＸ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＭＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｍ−１；
Ｘ１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＥＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−ＥＨＤ２、Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＥＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−ＥＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＥＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１またはＸ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＥＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１。ｍおよびｎは各場合上記の好ましいおよび特にこのまし意味を有する。
【０１２３】
好ましい態様において、少なくとも１個の薬学的活性部分は合成医薬または生物製剤である。少なくとも１個の薬学的活性部分が生物製剤である態様において、このような生物製剤がペプチド、ポリペプチド、タンパク質および／または核酸(例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッド)であるのが好ましい。特に好ましい態様において、このような生物製剤はホルモン(例えばインスリン、ｈＧＨ、ＦＳＨ、グルカゴン様ペプチド１、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン)；増殖因子(例えばエリスロポエチン、トロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１)；インターフェロン(例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ)およびインターロイキン(例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１Ｒａ)のようなサイトカイン(例えばＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＴＧＦ−β)；凝固因子(例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIａ因子、トロンビン)；血栓溶解剤および抗凝固剤(例えばｔ−ＰＡ、ヒルジン、活性化プロテインＣ)；酵素(例えばα−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ＤＮａｓｅ)；抗体および抗体フラグメント(例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆｃ)のような抗原結合分子；およびその融合タンパク質(例えばＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＴＭＰ−Ｆｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ、ＬＦＡ−３−Ｆｃ、ＩＬ−２−ＤＴ)から成る群から選択される。
【０１２４】
さらに好ましい態様において、少なくとも１個の薬学的活性部分はリガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子から成る群から選択される。好ましくは、リガンドは、基質、阻害剤およびアクティベーターのような特異的生物学的機能を発揮するために他の分子と複合体を形成する任意の化学的または生物学的物質である。より好ましくは、リガンドは抗原結合分子、足場タンパク質(Scaffold proteins)、天然リガンド(例えばＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ)、リガンド結合受容体フラグメント(例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−３、ＢＲ３、ＣＤ９５Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１)およびアプタマー(例えば抗トロンビン、抗ＦIXａ、抗Ｃ３ｂ、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０Ｌ)を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
好ましくは、足場タンパク質は、ＫＳＲ、ＭＥＫＫ１、ＢＣＬ−１０、ＭＡＰＫ、ＡＨＮＡＫ−１、ＨＯＭＥＲ、Pellino、ＮＬＲＰ、ＤＬＧ１、スピノフィリン、植物ＦＬＵ調節タンパク質を含むが、これらに限定されない重要なシグナル伝達経路の制御因子である。
【０１２６】
好ましくは、抗原結合分子は、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント(ＩｇＭまたはＩｇＥのものを除く)、Ｆａｂ’フラグメント(ＩｇＭまたはＩｇＥのものを除く)、重鎖抗体、シングルドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、重鎖抗体の可変ドメイン、ＶＨＨ、ナノボディ、単一鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)、直列型ｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＢＩＴＥ)、二重特異性抗体、単一鎖二重特異性抗体、ＤＡＲＴ分子、トリプルボディ、ナノ抗体、代替足場タンパク質(例えばダルピン、アンチカリン、アフィボディ分子、ミクロボディ、モノボディ、フィノマー、アドネクチン(Adnetins)、テトラネクチン、クニッツドメイン、アフィリン、アビマー)およびその融合タンパク質から成る群から選択される。抗原結合分子が薬学的に関連する、すなわち疾患または疾患または障害の症状の予防、診断および／または処置に適切である抗原に結合するのが好ましい。好ましい態様において、疾患は癌タイプ疾患である。好ましくは、抗原結合分子は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、アルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)、ＣＡ−１２５、上皮性腫瘍抗原(ＥＴＡ)、about:blank、黒色腫関連抗原(ＭＡＧＥ)およびｒａｓおよびｐ５３の異常産物、エストロゲン受容体、５−アルファ−レダクターゼ、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２、ＶＥＧＦＲｓ、インテグリン受容体ファミリー、線維芽細胞活性化タンパク質、ガレクチン、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ｃｌａｕｄｉｎｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、葉酸受容体、Ｌｅｙ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびｕＰＡＲのような、しかしこれらに限定されない腫瘍関連抗原を認識する。好ましい態様において、抗原結合分子は、ＩｇＭまたはＩｇＥからのＦａｂまたはＦｃフラグメントではないことが想定される。
【０１２７】
特に好ましい態様において、抗原結合分子はｓｃＦｖ、好ましくは抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖまたは抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、より好ましくは配列番号３または４に従うものまたはその変異体である。
【０１２８】
好ましい態様において、タンパク質と結合し、それによりそのタンパク質の活性を変えるエフェクター分子、すなわち小分子、ペプチドまたはポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質、酵素(例えばキナーゼ)プロドラッグ変換酵素、ＲＮａｓｅ、アゴニスト抗体または抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメント、融合タンパク質または誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
好ましい態様において、サイトカインはインターロイキンおよび／またはインターフェロンである。インターロイキン(ＩＬ)は、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、インターロイキン−３０、インターロイキン−３１、インターロイキン−３２、インターロイキン−３３、インターロイキン−３４およびインターロイキン−３５を含むが、これらに限定されない。インターフェロン(ＩＦＮ)は、インターフェロンＩ型(例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ω)、インターフェロンII型(例えばＩＦＮ−γ)およびインターフェロンIII型を含むが、これらに限定されない。特に包含されるのは、インターフェロンＡ１、インターフェロンＡ２、インターフェロンＡ４、インターフェロンＡ５、インターフェロンＡ６、インターフェロンＡ７、インターフェロンＡ８、インターフェロンＡ１０、インターフェロンＡ１３、インターフェロンＡ１４、インターフェロンＡ１６、インターフェロンＡ１７、インターフェロンＡ２１、インターフェロンＢ１、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬである。
【０１３０】
好ましい態様において、ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインおよびＣＸ３Ｃケモカインを含むが、これらに限定されない。特にケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２およびＣＸ３ＣＬ１を含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
好ましい態様において、免疫(共)刺激性タンパク質は、Ｂ７.１、Ｂ７.２、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ７０を含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
免疫抑制性タンパク質は、好ましくはＩＬ１−Ｒａ、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２および、好ましくはシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素およびリシンを含むが、これらに限定されない毒素を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
好ましい態様において、アポトーシス誘発タンパク質は、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、ＰｕｍａおよびＢｉｍならびにＴＮＦ、ｓｃＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ｓｃＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬのようなしかしこれらに限定されないアポトーシス促進性サイトカイン(デスリガンド)を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
好ましい態様において、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼを含むが、これらに限定されない。キナーゼは、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＰＫＧのようなＡＧＣキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼおよびセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ(例えばＤＡＰＫ２)のようなＣａＭキナーゼ、カゼインキナーゼ１群のようなＣＫ１、ＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３およびＣＬＫキナーゼのようなＣＭＧＣ、酵母ステリル(Sterile)７、ステリル１１およびステリル２０キナーゼのホモログのようなＳＴＥ、チロシンキナーゼ(ＴＫ)、チロシン−キナーゼ様群のキナーゼ(ＴＫＬ)、受容体関連チロシンキナーゼ、ＭＡＰキナーゼおよびヒスチジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
プロドラッグ変換酵素は、アセチルエステラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、一リン酸ジエステルヒドロラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ(スルファターゼ)、二リン酸モノエステルヒドロラーゼおよびリン酸トリエステルヒドロラーゼのような、しかしこれらに限定されないエステラーゼ；チロシン特異的ホスファターゼ、セリン／スレオニン特異的ホスファターゼ、二重特異性ホスファターゼ、ヒスチジンホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、しかしこれらに限定されないホスファターゼ；および５−アルファレダクターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メトヘモグロビンレダクターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、大腸菌ニトロレダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＧ２、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼのような、しかしこれらに限定されないレダクターゼを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  Ｌ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、ＲＮａｓｅ  Ｕ２、ＲＮａｓｅ  Ｖ１およびＲＮａｓｅ  Ｖのような、しかしこれらに限定されないエンドリボヌクレアーゼならびにポリヌクレオチドホスホリラーゼ(ＰＮＰａｓｅ)、ＲＮａｓｅ  ＰＨ、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  Ｄ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩおよびエキソリボヌクレアーゼIIのような、しかしこれらに限定されないエキソリボヌクレアーゼを含む。
【０１３７】
アゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質合成およびタンパク質分解、例えばＴＲＡＩＬ受容体、抗グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子ファミリー受容体(ＧＩＴＲ)およびＣＤ４０に対するような、しかしこれらに限定されない組織、臓器または個体で作用を起こすものを含む。典型的に、アゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体分子の活性部位またはアロステリック部位と結合し、それにより特異的反応を誘発する。
【０１３８】
アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、アゴニストの作用を遮断するものを含む。典型的に、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体分子の活性部位またはアロステリック部位と結合することによりまたは受容体活性制御に通常関与しない独特の結合部位と結合することにより作用し、例えば抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＮＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２である。典型的に、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、構造的に明確な結合部位でアゴニストと競合するかまたはアゴニストがその結合による通常発揮する作用を起こすことができないような方法でアゴニストの結合部位を変える。
【０１３９】
好ましい態様において、増殖因子は、アドレノメデュリン(ＡＭ)、アンギオポエチン(Ａｎｇ)、自己分泌運動性因子、骨形成タンパク質(ＢＭＰｓ)、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、グリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、増殖分化因子−９(ＧＤＦ９)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、Ｈｅｐ原子ａ由来増殖因子(ＨＤＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、遊走刺激因子ミオスタチン(ＧＤＦ−８)、神経増殖因子(ＮＧＦ)および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ−α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ−β)、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、Ｗｎｔシグナル伝達経路および胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)を含むが、これらに限定されない。
【０１４０】
好ましい態様において、凝固因子は、トロンビン、第Ｖ因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第Ｘ因子、第XI因子、第XII因子および第XIII因子およびその活性フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
好ましい態様において、線維素溶解性タンパク質は、プラスミン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織−プラスミノーゲンアクティベーター(ｔ−ＰＡ)およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１(ＰＡＩ−１)を含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
特に好ましい態様において、サイトカインは腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、より好ましくは配列番号５に従うものまたはその変異体である。さらに好ましい態様において、サイトカインはＴＮＦ関連アポトーシス誘発因子(ＴＲＡＩＬ)、より好ましくは配列番号６に従うものまたはその変異体である。
【０１４３】
模倣ペプチドおよびタンパク質は、トロンボポエチン模倣ペプチド、エリスロポエチン模倣ペプチドのような、しかしこれらに限定されない、他のペプチドまたはタンパク質、特に上記または下記のペプチドまたはタンパク質の活性を模倣するペプチドおよびタンパク質を含む。
【０１４４】
さらなる態様において、半減期延長モジュールは、本発明のポリペプチドの半減期、例えば“血漿半減期”または“血清半減期”を変える化学的または生物学的物質である。好ましくは、半減期延長モジュールは、免疫グロブリン結合ドメイン(ＩｇＢＤ)、アルブミン、アルブミン結合ドメイン(ＡＢＤ)、ペプチド、小分子、脂肪酸、抗体フラグメント、シングルドメイン抗体、ＶＨＨ、足場タンパク質および長期循環血漿タンパク質に対する親和性を示す天然リガンドからなる群から選択され、このいずれも所望によりペグ化、ヘシル化、ポリシアル化、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化されたまたはＰＥＧ模倣ポリペプチドであってよい。好ましくは、ＩｇＢＤはＩｇ分子のドメインのいずれか、すなわちＩｇ分子の可変ドメインＶＨまたはＶＬおよび／または定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３  ＣＨ４および／またはＣＬに結合し得る。ＩＧＢＤは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ(ＳｐＡ)、連鎖球菌プロテインＧ(ＳｐＧ)、ペプトストレプトコッカス・マグヌスのプロテインＬ(ＰｐＬ)、大腸菌のプロテインＥｉｂ、ブドウ球菌のプロテインＳｂｉおよび連鎖球菌プロテインＭＡＧ、ＭＩＧ、Ｈ、ＭおよびＺＡＧ由来のドメインを含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
さらなる態様において、造影分子は、特異的標的分子と結合し、それにより、その分子の位置を可視化するものである。好ましくは、造影分子は、生物発光試薬、化学発光試薬、蛍光造影剤、光増感剤、キレート試薬および放射性部分から成る群から選択される。
【０１４６】
造影分子は、レニラ・レニフォルミスおよび／またはメトリディア・ロンガからのルシフェラーゼ、過シュウ酸、ポリメチン(例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７のようなシアニン色素)、スクアライン誘導体、フタロシアニン、ポルフィリン誘導体およびＢＯＤＩＰＹアナログ(ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５)ならびにＧＦＰ、ＥＧＰＦ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲＥＤのような、しかしこれらに限定されない蛍光タンパク質のような、しかしこれらに限定されない生物発光、化学発光および蛍光造影剤を含む(Chudakov et al. (2010) Physiol. Rev. 90:1103-1163)。
【０１４７】
キレート試薬は、カルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウム、亜鉛、銅、ヒ素、鉛、タリウムおよび水銀イオンのような、しかしこれらに限定されない少なくとも１種の金属イオンを、キレート化により結合できる。このようなキレート試薬は、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、エチレンジアミンテトラ酢酸(カルシウム二ナトリウムベルサント)(ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ)、ジメルカプロール(ＢＡＬ)、ジメルカプトコハク酸(ＤＭＳＡ)、ジメルカプト−プロパンスルホネート(ＤＭＰＳ)、フェリチン、デフェロキサミンおよびデフェラシロクス、デフェリプロン(１,２−ジメチル−３−ヒドロキシル−４−ピリジノン)、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＡＤＴ、ＤＡＤＳ、ＤＯ３Ａ、Ｎ２Ｓ２ＭＡＭＡ、トリアミドチオール、ホスホネート、有機ガドリニウム錯体、ペニシラミンおよびテトラサイクリン系抗生物質を含み得る。
【０１４８】
好ましい態様において、放射性部分は、放射性核種を含み得る。放射性部分は、Ｆ、Ｂｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｇａ、Ａｓ、Ｚｒ、Ｐ、Ｃ、Ｓ、Ｈ、Ｉ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｂｉ、Ａｔ、Ｙ、Ｒｅ、Ａｃ、ＴｃまたはＨｇ原子の同位体であり得る。放射性部分は、本発明のポリペプチドを放射性に標識し、例えばヒト体内での、その検出を可能にし、診断的手法(放射免疫検出法：ＲＡＩＤ)と有用となるだけでなく、治療適用(放射免疫治療：ＲＡＩＴ)にも適するものとする。
【０１４９】
光増感剤は、特異的波長の光で励起後、発光またはフリーラジカルおよび一重項酸素形成が可能な化学化合物である。光増感剤は、例えば光線力学的治療のために使用される。好ましい態様において、光増感剤は、特にＨｐＤ、ＡＬＡ、Ｍ−ＡＬＡ、ベルテポルフィン、ルテキサフィリン(Lutexaphyrin)、テモポルフィン、タラポルフィン、ＨＰＰＨ、フタロシアニンおよびナフタロシアニンを含む、ポルフィリンファミリー、テキサフィリンファミリー、クロリンファミリーおよびフタロシアニンファミリーの化合物を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
特に好ましい態様において、ポリペプチドは、Ｃ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合および／またはＮ末端にｓｃＦＶＨＥＲ２が融合したＭＨＤ２ドメインを含む。さらに好ましい態様において、ｓｃＴＲＡＩＬまたはｓｃＴＮＦは、ＭＨＤ２ドメインのＣ末端および／またはＮ末端に融合している。特に好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＭＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＦｖＨＥＲ２はＭＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＭＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＮＦはＭＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＭＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＲＡＩＬはＭＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲはＭＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＲＡＩＬはＭＨＤ２のＣ末端に融合している。極めて好ましいのは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４に従うポリペプチドである。
【０１５１】
特に好ましい態様において、ポリペプチドは、Ｃ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合および／またはＮ末端にｓｃＦＶＨＥＲ２が融合しているＥＨＤ２ドメインである。さらに好ましい態様において、ｓｃＴＲＡＩＬまたはｓｃＴＮＦは、ＥＨＤ２ドメインのＣ末端および／またはＮ末端に融合している。特に好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＥＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＦｖＨＥＲ２はＥＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＥＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＮＦはＥＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＦｖＥＧＦＲはＥＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＲＡＩＬはＥＨＤ２のＣ末端に融合している。さらに好ましい態様において、ｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲはＥＨＤ２のＮ末端に融合し、ｓｃＴＲＡＩＬはＥＨＤ２のＣ末端に融合している。極めて好ましいのは、配列番号１５、１６または１７に従うポリペプチドである。
【０１５２】
第二の面において、本発明は、本発明の第一の面のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子を提供する。好ましくは、このような核酸分子はＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を含む。
【０１５３】
第三の面において、本発明は、本発明の第二の面のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。適切なベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスおよび／または人工染色体を含むが、これらに限定されないことが理解される。
【０１５４】
第四の面において、本発明は、本発明の第一の面の少なくとも２個のポリペプチドを含む複合体を提供する。好ましい態様において、少なくとも２個のポリペプチドは、ＨＤ２ドメインを介して、好ましくは共有結合性または非共有結合性結合を介して連結している。共有結合性結合が、好ましくは各々各ポリペプチドのＨＤ２ドメイン内に存在する２個のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合であるのが特に好ましい。複合体を形成する少なくとも２個のポリペプチドは同一または異なるＨＤ２ドメインを含み得る。複合体を形成する少なくとも２個のポリペプチドが同一ＨＤ２を含む、すなわち複合体を形成する少なくとも２個のポリペプチドがＭＨＤ２を含むまたは複合体を形成する少なくとも２個のポリペプチドがＥＨＤ２を含むのが、特に好ましい。
【０１５５】
少なくとも２個のポリペプチドは、ＨＤ２のＮ末端および／またはＣ末端ドメインに融合するモジュールに関してまたはＨＤ２ドメインと融合モジュールを連結するリンカーペプチドに関して同一でも異なってもよく、すなわちそれらは上に詳述したとおり、ＨＤ２ドメインに連結した同一または異なるモジュール、好ましくは薬学的活性部分を含んでよく、異なるモジュールを連結する異なるペプチドリンカーを含んでよい。それゆえに、好ましい態様において、複合体は、次の構造の少なくとも２個のポリペプチドを含み、ここで、少なくとも２個のポリペプチドは同一または異なる：
Ｘ１−ＨＤ２、ＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２、ＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、ＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−ＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−ＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−ＨＤ２−Ｙ１−Ｙｎ、Ｘ１−Ｘ２−ＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｌ−ＨＤ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＨＤ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−ＨＤ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｌ−ＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−Ｌ−ＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−Ｙ２−ＨＤ２、Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−Ｌ−ＨＤ２、Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１−ＨＤ２、Ｘ１−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１、Ｘ１−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−ＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−Ｙ２、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｍ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１、Ｘ１−[Ｘ]ｍ−１−ＨＤ２−Ｌ−Ｙ１−Ｌ−[Ｙ]ｎ−１またはＸ１−Ｌ−[Ｘ]ｍ−１−Ｌ−ＨＤ２−Ｙ１−[Ｙ]ｎ−１。ｍおよびｎは各場合上記の好ましいおよび特にこのまし意味を有する。
【０１５６】
特に好ましい態様において、複合体は、２個のポリペプチド間で形成され、その各々は、Ｃ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合および／またはＮ末端にｓｃＦＶＨＥＲ２が融合したＭＨＤ２ドメイン；Ｃ末端および／またはＮ末端にｓｃＴＲＡＩＬまたはｓｃＴＮＦが融合したＭＨＤ２ドメイン；Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｃＦｖＨＥＲ２が融合したＭＨＤ２、Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＮＦが融合したＭＨＤ２ドメイン；Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＲＡＩＬが融合したＭＨＤ２；およびＮ末端にｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＲＡＩＬが融合したＭＨＤ２を含む。極めて好ましいのは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４に従う２個のポリペプチド間で形成された複合体である。
【０１５７】
特に好ましい態様において、複合体は２個のポリペプチド間で形成され、その各々は、Ｃ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合および／またはＮ末端にｓｃＦＶＨＥＲ２が融合したＥＨＤ２ドメイン；Ｃ末端および／またはＮ末端にｓｃＴＲＡＩＬまたはｓｃＴＮＦが融合したＥＨＤ２ドメイン；Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＦｖＨＥＲ２が融合したＥＨＤ２、Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＮＦが融合したＥＨＤ２ドメイン；Ｎ末端にｓｃＦｖＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＲＡＩＬが融合したＥＨＤ２；およびＮ末端にｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲが融合し、Ｃ末端にｓｃＴＲＡＩＬが融合したＥＨＤ２を含む。極めて好ましいのは、配列番号１５、１６または１７に従う２個のポリペプチド間で形成された複合体である。
【０１５８】
第五の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクターまたは第四の面の複合体を含む、細胞を提供する。このような細胞は原核細胞(例えば細菌細胞)または真核細胞(例えば真菌、植物または動物細胞)を含むが、これらに限定されないことは理解される。
【０１５９】
第六の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞および薬学的に許容される担体および／または添加物を含む、組成物を提供する。好ましくは、このような組成物は医薬組成物である。
【０１６０】
好ましい態様において、医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体および／または添加物および所望により１種以上の付加的活性物質を含む。好ましくは、第六の面の組成物は、患者への投与に適する形態を提供するために、治療有効量の化合物を、好ましくは精製形で、適切な量の担体および／または添加物と共に含む。製剤は投与方法に適さなければならない。
【０１６１】
医薬組成物は溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形を取り得る。医薬組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担体と坐剤に製剤できる。
【０１６２】
本発明の医薬組成物の製造のために、薬学的に許容される担体は固体または液体であり得る。固形組成物は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、カシェー剤、坐剤および分散性顆粒剤を含む。固形添加物は１種以上の物質であってよく、これはまた希釈剤、風味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても働き得る。散剤において、添加物は、好ましくは微粉砕固体であり、これは、本発明の微粉砕した阻害剤と混合される。錠剤において、活性成分を、適切な比率で必要な結合特性を有する担体と混合し、所望の形およびサイズに圧縮する。適切な添加物は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点蝋、カカオバターなどである。坐剤製剤のために、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物のような低融点蝋を最初に融解し、活性成分を撹拌によるようにその中に均一に分配する。その後溶融均質混合物を好都合なサイズの鋳型に注加し、冷却し、それにより固化させる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェー剤およびロゼンジ剤を、経口投与に適する固体投与形態として使用できる。
【０１６３】
液体形態組成物は、溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、水、塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール溶液または水／プロピレングリコール溶液を含む。非経腸注射(例えば静脈内、動脈内、骨内注入、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内および髄腔内注射)のために、液体製剤を、例えばポリエチレングリコール水溶液中の、溶液として製剤できる。塩類溶液は、医薬組成物が静脈内されるとき、好ましい担体である。
【０１６４】
好ましくは、医薬組成物は単位投与量形態である。このような形態で、組成物は、適当な量の活性成分を含む単位投与量に細分し得る。単位投与量形態は、包装錠剤、バイアルまたはアンプル中のカプセル剤および粉末のような、包装組成物、個別の量の組成物を含む包装物であり得る。また、単位投与量形態はカプセル、注射バイアル、錠剤、カシェー剤またはロゼンジ剤自体であってよくまたは包装された形態のこれらの任意の適当な数であってよい。
【０１６５】
組成物は、望むならば、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０１６６】
さらに、このような医薬組成物は、アジュバントおよび／または付加的活性成分を含むが、これらに限定されない他の薬理学的活性物質も含み得る。アジュバントは、本発明において無機アジュバント、有機アジュバント、油性アジュバント、サイトカイン、粒子アジュバント、ビロソーム、細菌アジュバント、合成アジュバントまたは合成ポリヌクレオチドアジュバントを含むが、これらに限定されない。
【０１６７】
第七の面において、本発明は、医薬として使用するための、上に詳述した第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を提供する。好ましい態様において、複合体は医薬で使用するため、すなわち自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、癌タイプ疾患、皮膚状態、内分泌疾患、眼疾患および障害、遺伝性障害、感染症、消化器系疾患、神経障害および精神疾患を含むが、これらに限定されない障害または疾患の予防、処置または診断に使用するためである。自己免疫性疾患の例は、Ｉ型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、クローン病、自己免疫性心筋症、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎およびシェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。アレルギー性疾患の例は、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性湿疹、アナフィラキシー、昆虫毒アレルギー、薬物アレルギーおよび食物アレルギーを含むが、これらに限定されない。癌タイプ疾患の例は、基底細胞癌、膀胱癌、骨の癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、網膜芽細胞腫、胃癌、消化器間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、胸膜肺芽腫、前立腺癌、咽頭癌、甲状腺癌および尿道癌を含むが、これらに限定されない。皮膚状態の例は、アクネ、皮膚炎、湿疹、皮膚付属器の状態、皮下脂肪の状態、色素沈着障害、上皮母斑、上皮新生物、上皮嚢腫、紅斑、凍傷、遺伝性皮膚症、ムチン沈着症、神経皮膚状態(例えばウィスコット・アルドリッチ症候群)および乾癬を含むが、これらに限定されない。内分泌疾患の例は、Ｉ型およびII型糖尿病、骨粗鬆症およびクッシング病を含むが、これらに限定されない。遺伝性障害の例は、色覚異常、嚢胞性線維症、ダウン症候群、鎌状赤血球疾患およびターナー症候群を含むが、これらに限定されない。感染症の例は、アフリカ睡眠病、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ感染、炭疽、ボレリア症、カリシウイルス感染(ノロウイルスおよびサポウイルス)、水痘、クラミジア感染、コレラ、クロストリジウム感染、コロラドダニ熱(ＣＴＦ)、感冒、クロイツフェルト・ヤコブ病、デング熱(ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４)、エボラ、エンテロウイルス感染、ヒトヘルペスウイルス６(ＨＨＶ−６)およびヒトヘルペスウイルス７(ＨＨＶ−７)の感染、淋病、連鎖球菌感染(Ａ群およびＢ群)、手足口病(ＨＦＭＤ)、ヘリコバクター・ピロリ感染、肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型)、ヘルペス感染、パピローマウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザ、ラッサ熱、マールブルグ熱、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、パスツレラ症、シラミ属感染、ペスト、肺炎球菌感染、呼吸器多核体ウイルス感染、ロタウイルス感染、風疹ウイルス感染、サルモネラ食中毒および感染、ＳＡＲＳ、疥癬感染、住血吸虫症、天然痘、ブドウ球菌食中毒および感染、梅毒、破傷風、白癬菌感染、結核、チフス、ベネズエラウマ脳炎および黄色熱のような、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンまたは他の病原体または寄生生物が原因の感染疾患を含むが、これらに限定されない。消化器系疾患の例は、胃腸炎、イレウス、回腸炎、大腸炎、虫垂���、セリアック病、過敏性腸症候群、憩室性疾患、下痢、ポリープおよび潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。神経障害の例は、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、アルツハイマー病、脳損傷、クロイツフェルト・ヤコブ病、クッシング症候群、失読症、脳炎、癲癇、頭痛、ハンチントン病、片頭痛、多発性硬化症、パーキンソン病、ポリオ、狂犬病、統合失調症および卒中を含むが、これらに限定されない。精神疾患の例は、急性ストレス障害、注意欠損過活動障害(ＡＤＨＤ)、自閉症性障害、境界性人格障害、神経性過食症、燃え尽き症候群、統合失調症、鬱病、認知障害、コミュニケーション障害、摂食障害、窃盗癖、学習障害、男性勃起障害、抑欝、強迫性障害(ＯＣＤ)、妄想性障害、病的賭博、外傷後ストレス障害(ＰＴＳＤ)、精神病性障害、過眠症、不眠症およびトゥレット症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１６８】
次の実施例は本発明の単なる説明であり、添付する特許請求の範囲により示される本発明の範囲をいかなる方法でも限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【０１６９】
実施例１：ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質の産生
ヒト化抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ(ｈｕ２２５)を、ＣＤＲ移植により抗体Ｃ２２５(Goldstein et al., 1995)から産生した。抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ  ４Ｄ５を、公開された配列(Carter et al., 1992)から再現した。ｓｃＦｖならびにヒトＩｇＭ重鎖ドメイン２(ＭＨＤ２)の配列のいずれも、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されており、現在Life Technologies子会社(Darmstadt, Germany)であるGeneartにより、適当なクローニング部位を添加されて合成された。２個の二価抗体−ＭＨＤ２融合タンパク質を、ヒト化抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖをＭＨＤ２のＮ末端に(ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２；ｓｃＦｖＡ−ＭＨＤ２)または抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖをＭＨＤ２のＣ末端に(ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２；ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＢ)それぞれ融合させることにより産生した。さらに、四価の二重特異性融合タンパク質を、ｓｃＦｖＡをＭＨＤ２のＮ末端およびｓｃＦｖＢをＭＨＤ２のＣ末端に融合して産生した(ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２；ｓｃＦｖＡ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＢ)(図３ａ、ｂ)。全ての構築物を真核発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡにクローン化し、安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で、１.５〜２.５mg／Ｌ上清の収量で産生した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＨＤ２における１個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を考慮して、還元条件下で、予想される分子質量の単量体ポリペプチド鎖を明らかにした(単一特異性ＭＨＤ２融合タンパク質で約５０kDaおよび二重特異性ＭＨＤ２融合タンパク質で７５kDa)(図３ｃ参照)。非還元条件下で、全構築物は、二量体分子に対応するバンドを示したが、単量体サイズの第二のバンドが観察された。単一特異性ＭＨＤ２融合タンパク質について、分子の約８０〜９０％がジスルフィド結合した二量体として存在したが、二重特異性ＭＨＤ２融合タンパク質について、約５０％がジスルフィド結合していた。
【０１７０】
実施例２：ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質の生理活性
抗体−ＭＨＤ２融合タンパク質の選択性を、それぞれＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の細胞外領域のＦｃ融合タンパク質を使用してＥＬＩＳＡにより分析した(図４ａ)。ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２はＥＧＦＲへのおよびＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２はＨＥＲ２への特異的結合を示し、一方ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２融合タンパク質は両受容体への結合を示した。ネガティブコントロールとして含ませたＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質への結合は観察されなかった。さらに、抗体−ＭＨＤ２融合タンパク質を、種々の量のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を発現する種々の腫瘍細胞株に対する結合について、フローサイトメトリーにより分析した(図４ｂ)。ＥＧＦＲ発現細胞株Ａ４３１はｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２およびｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２に強い結合を示し、一方ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２では結合は検出されないかまたは検出されても極わずかであった(図４ｂ)。対照的に、ＨＥＲ２陽性細胞株ＳＫＢＲ３はＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２およびｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２に強い結合を示し、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２には弱い結合のみであった(図４ｂ)。少量のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を発現する肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０は、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２およびＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２の弱い結合を示したが、ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２では結合は増加した(図４ｂ)。同様の結果が結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５で見られた(図４ｂ)。ＳＫＢＲ３以外、２個の単一特異性ＭＨＤ２融合タンパク質と比較して、観察された二重特異性ＭＨＤ２融合タンパク質の結合は増加した。
【０１７１】
実施例３：ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質の産生
抗体−ＴＮＦＭＨＤ２融合タンパク質を、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖをＭＨＤ２のＮ末端におよび単一鎖ＴＮＦ誘導体(ｓｃＴＮＦ；Krippner-Heidenreich et al., 2008)をＭＨＤ２のＣ末端に融合することにより産生した(ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ)。さらに、ｓｃＦｖを欠く二価サイトカイン−ＭＨＤ２分子を産生した(ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ)(図５ａ、ｂ)。２個の構築物を、ＨＥＫ２９３細胞で５〜１２mg／Ｌ上清の収量で産生した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元条件下で、単量体ポリペプチドの予想される分子質量に対応する単一バンドを示した(ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦで７０kDaおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦで１００kDa)。二量体アセンブリは、非還元条件下で見られ、ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの約４０％およびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの約９５％が二量体として存在した(図５ｃ)。二量体アセンブリを、分子ふるいクロマトグラフィー(ＳＥＣ)により確認した(図５ｄ−ｆ)。約５０kDaのみかけの分子量で主ピークで溶出されるＳｃＴＮＦを、比較のために含ませた。ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ分子は、約２００kDaの主ピークを示し、ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦは約３００kDaに対する主ピークを示した。融解温度もｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦで測定し、約７７℃の主要な融解温度を示した(図５ｇ)。
【０１７２】
実施例４：ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質の生理活性
ＥＬＩＳＡにおいて、ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質はＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質に特異的結合を示し、一方ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦに対する結合は観察されなかった(図６ａ)。ＥＧＦＲへの結合を、ＥＧＦＲ発現細胞株Ａ４３１およびＨＴ１０８０を用いるフローサイトメトリーでさらに確認した(図６ｂ)。ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの両細胞株への結合はセツキシマブとのプレインキュベーションにより遮断できた。トラスツマブ(抗ＨＥＲ２)で観察される効果はないか極わずかであった。
【０１７３】
次に、融合タンパク質を、Ｆａｓの膜貫通型および細胞質領域に融合したヒトＴＮＦＲ１(ＭＥＦ−ＴＮＦＲ１)またはＴＮＦＲ２(ＭＥＦ−ＴＮＦＲ２)のいずれかの細胞外領域を発現するように安定に遺伝子導入したマウス胎仔線維芽細胞(ＭＥＦ)での細胞死誘発について試験した(Krippner-Heidenreich et al., 2002)。これらの細胞株は、可溶性ＴＮＦと膜結合ＴＮＦ(ｍＴＮＦ)の作用の区別が可能であり、ｍＴＮＦまたは多量体ＴＮＦがＭＥＦ−ＴＮＦＲ２活性に必要である。ｓｃＴＮＦ、ＭＨＤ２−ＴＮＦおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２の抗体価測定は、ＭＥＦ−ＴＮＦＲ１に対するｓｃＴＮＦおよびＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦの強細胞傷害性活性を示し、一方ＭＥＦ−ＴＮＦＲ２細胞に対する死滅は二量体ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ構築物によってのみ誘発された(図６ｃ、ｄ)。ＳｃＦｖ−ＭＨＤ２は両細胞株に対して不活性であった。
【０１７４】
ｓｃＴＮＦ融合タンパク質の生理活性を、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８のＴＮＦ介在分泌の測定によりさらい分析した。ＳｃＴＮＦならびにＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質は、濃度依存的方法でＩＬ−８分泌を誘発し、ＥＣ５０値は約１〜１０nMであった(図６ｅ)。強度に増加した刺激活性がｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦで見られ、約１０pMが最適であった。高濃度で、ＩＬ−８遊離は最高値の約２５％まで減少した。ネガティブコントロールとして含ませたｓｃＴＮＦ部分を欠くｓｃＦｖ−ＭＨＤ２融合タンパク質は刺激活性を示さなかった。ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦによるＩＬ−８分泌誘発は、同一エピトープを指向する過剰量のセツキシマブ(６６０nM)で非標的化ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質およびｓｃＴＮＦにより誘発されるレベルまで完全に遮断されたが、トラスツマブは効果を有しなかった。両抗体とも、それぞれＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦおよびｓｃＴＮＦにより誘発されるＩＬ−８分泌に影響しなかった(図６ｆ)。
【０１７５】
実施例５：ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の産生
二価ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ分子を、ＴＲＡＩＬの単一鎖誘導体(ｓｃＴＲＡＩＬ；Schneider et al., 2010)をＭＨＤ２のＣ末端ドメインに融合することにより産生した(図７ａ、ｂ)。さらに、抗体−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖをＭＨＤ２のＮ末端におよび単一鎖ＴＲＡＩＬ誘導体をＭＨＤ２のＣ末端に融合することにより産生した(ｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ)。構築物をＨＥＫ２９３細胞で産生し、０.３〜０.５mg／Ｌ上清の収量であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元条件下で、単量体ポリペプチドの分子質量に対応する単一バンドを示した(ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで１００kDaおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで１１５kDa)。二量体アセンブリが、非還元条件下、ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで見られた(図７ｃ)。
【０１７６】
実施例６：ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の生理活性
ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の生理活性を、ＥＧＦＲ発現細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０(ａ)およびＣｏｌｏ２０５(ｂ)を使用する細胞傷害性アッセイを使用してさらに分析した。これらの細胞をＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスに対して感作するために、臨床的に承認されたプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブを２５０ng／ml濃度で添加した。ＳｃＴＲＡＩＬならびにＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、濃度依存的方法でこれらの細胞株の死滅を誘発した(図８ａ、ｂ)。ｓｃＴＲＡＩＬのＥＣ５０値はＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対して４５０pMおよびＣｏｌｏ２０５細胞に対して９.８nMであった。ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、顕著に増加した細胞傷害性能を示し、ＥＣ５０値はＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対して４７pMおよびＣｏｌｏ２０５細胞に対して１８０pMであり、使用する細胞株によって生理活性の９.６倍および５４倍増加に相当した。
【０１７７】
実施例７：ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の産生
二価ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２を、ＥＧＦＲに対するｓｃＦｖをＥＨＤ２のＮ末端ドメインに融合することにより産生した。二価ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ分子を、ＴＲＡＩＬの単一鎖誘導体(ｓｃＴＲＡＩＬ)をＥＨＤ２のＣ末端ドメインに融合することにより産生した。さらに、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖをＥＨＤ２のＮ末端におよび単一鎖ＴＲＡＩＬ誘導体をＥＨＤ２のＣ末端に融合することにより産生した(ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦ)(図９ａ、ｂ)。融合タンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇにクローン化し、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で産生させた。可溶性ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２(図９ｃ)、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ(図９ｄ)およびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ(図９ｅ)の細胞培養上清への分泌を免疫ブロッティングにより確認した(図９ｃ〜ｅ)。還元条件下、単量体ポリペプチドに対応するバンドが検出され(レーン２)、一方、非還元条件下(レーン１)、ジスルフィド結合二量体に対応する二量体分子(上部バンド)が同定された。
【０１７８】
実施例８：ＭＨＤ２およびＥＨＤ２とＩｇＧ１−ＣＨ３の比較
ヒトＩｇＧ１重鎖からの個別のＭＨＤ２、ＥＨＤ２ならびにＣＨ３ドメインを、安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３から産生させ、ＩＭＡＣで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＣＨ３(ＧＨＤ３)ドメインは、還元条件(図１０ａ、レーン１)ならびに非還元条件(図１０ａ、レーン２)した、単量体ポリペプチドに対応する単一バンドを示し、これらドメインが共有結合性に結合していないことが確認された。分子ふるいクロマトグラフィーは、これらドメインの二量体アセンブリを確認した。動的光散乱により、約５０℃の最初の融解温度(おそらくドメイン解離による)および７５℃の第二の主要な融解温度(おそらく完全な変性による)が観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＩｇＭのＣＨ２ドメイン(ＭＨＤ２)は、還元条件下(図１０ｂ、レーン１)、単量体ポリペプチドに対応するバンドを示し、一方、非還元条件下(図１０ｂ、レーン２)、二量体分子に対応するバンドが検出され、これらドメインが共有結合性に結合していることが確認された。この分析はまた還元条件下の２バンドにより明らかな部分的Ｎ−グリコシル化を証明し、これは、ＰＮＧａｓｅＦでの脱グリコシル化により確認された(示していない)。分子ふるいクロマトグラフィーは、さらにこれらドメインの二量体アセンブリを確認した。動的光散乱により、明らかな転移は観察されなかったが、おそらく、調製物の不均一性が原因の約５６℃から出発する凝集物形成の連続的増加が観察され、また、このドメインが高温ですら安定であることを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＩｇＥのＣＨ２ドメイン(ＥＨＤ２)は、還元条件下(図１０ｃ、レーン１)、単量体ポリペプチドに対応するバンドを示し、一方、非還元条件下(図１０ｃ、レーン２)、二量体分子に対応するバンドが検出され、これらドメインがまた共有結合性に結合していることを確認する。ＭＨＤ２と同様、この分析はまた還元条件下の２バンドにより明らかな部分的Ｎ−グリコシル化も証明した。分子ふるいクロマトグラフィーは、さらにこれらドメインの二量体アセンブリを確認した。動的光散乱により、約８０〜８２℃の単一変性中点が決定された。
【０１７９】
実施例９：ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質
種々のｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質を、ＣＥＡ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３に対するｓｃＦｖをＥＨＤ２のＮ末端に融合することにより産生した(図２６)。全ての構築物を哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡにクローン化し、一過性にまたは安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で産生した。抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質は、一過性にトランスフェクトした細胞の上清において抗Ｈｉｓタグ抗体を用いる免疫ブロッティングで検出できた(図２６ｃ)。抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２は、固定化金属親和性クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。精製抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、融合タンパク質の二量体アセンブリを確認した(図２７ｃ参照)。固定化ＣＥＡでのＥＬＩＳＡは、抗原結合部位の正しいアセンブリをさらに確認した(図２７ｄ)。
【０１８０】
実施例１０：Ｔ細胞再標的化のための二重特異性ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２融合タンパク質
二重特異性単一鎖二重特異性抗体(ｓｃＤｂ)−ＥＨＤ２融合タンパク質を、ＣＥＡおよびヒトＣＤ３に対するｓｃＤｂをＥＨＤ２のＮ末端に融合することにより産生した(図２７ａ、ｂ)。構築物を哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡにクローン化し、安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で産生させた。タンパク質を固定化金属親和性クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。比較のために、ＣＥＡに対するｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質を含ませた(実施例９参照)。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、還元条件下、それぞれ単一ポリペプチドサイズに対応する８０kDa(ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２)および４５kDa(ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２)の分子質量で移動した。非還元条件下、タンパク質は、二量体分子に対応するみかけの分子量で移動し、ジスルフィド結合形成を証明した。両タンパク質とも、ＥＬＩＳＡで固定化ＣＥＡに対する類似の結合を示し(図２７ｄ)、抗原結合部位の機能性を確認した。
【０１８１】
実施例１１：化学カップリングのための二価ｓｃＦｖ−Ｃｙｓ−ＥＨＤ２および四価ｓｃＦｖ−Ｃｙｓ−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖ融合タンパク質
抗体を、診断および治療用分子、例えば薬物、毒素および造影剤の担体として使用できる。これらの分子のコンジュゲーションを促進するために、タンパク質配列に、例えば、１個以上のシステイン残基を、理想的には抗原結合を妨害しない位置で導入することにより、抗体分子にチオール基を導入できる。我々は、ｓｃＦｖ分子のＣ末端にまたはＶＨドメインとＶＬドメインを連結するリンカー配列に付加的システイン残基を含む修飾ｓｃＦｖ分子を最近発表した(Messerschmidt et al., 2008, Bioconjug. Chem. 19, 362-369)。１４残基長リンカー(ＧＧＣＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＡ)の３位にステイン残基を含む抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖ(ｓｃＦｖ−Ｌ３)を使用して、二価ｓｃＦｖ−Ｃｙｓ−ＥＨＤ２を、ｓｃＦｖ−Ｌ３をＥＨＤ２のＮ末端に融合することにより産生した(図２８)。さらに、四価ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖ融合タンパク質を、非修飾抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖをＥＨＤ２のＣ末端ドメインに融合することにより産生した(図２８)。コード化ＤＮＡ配列を哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡにクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞に安定に遺伝子導入した。発現されるタンパク質を、抗Ｈｉｓタグ抗体を使用して上清で検出し、哺乳動物細胞における完全長ポリペプチドの産生および分泌を証明した(図２８ｃ)。
【０１８２】
実施例１２：ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞を標的とするＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質
種々の融合タンパク質を、ＥＨＤ２において抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖをＮ末端に(ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２)、ＴＲＡＩＬの一本鎖誘導体(ｓｃＴＲＡＩＬ)をＣ末端に(ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ)またはｓｃＦｖをＮ末端におよびｓｃＴＲＡＩＬをＣ末端に(ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ)融合することにより産生した(図２９ａ)。全融合タンパク質を安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で産生させ、親和性クロマトグラフィーで精製し、ヘキサヒスチジン標識ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２について７.９mg／Ｌ上清およびＦＬＡＧ標識ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質についてそれぞれ２.８mg／Ｌ上清および７.９mg／Ｌ上清の収量であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は融合タンパク質の純度および完全性ならびにジスルフィド結合した二量体の形成を確認したが、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ分子のフラクションのみが共有結合性結合を示した(図２９ｂ)。それにも関わらず、二量体分子への正確なアセンブリがＳＥＣにより証明され、鎖間ジスルフィド結合の非存在下でさえ、二量体分子の存在を示した(図２９ｃ)。ＥＨＤ２のＮ−グリコシル化は、ＰＮＧａｓｅ  ＦでのｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質の脱グリコシル化により確認された。脱グリコシル化後、未処置融合タンパク質で見られる速く移動するバンドに対応するサイズの単一バンドのみが、非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出された(示していない)。融合タンパク質の機能性はＥＬＩＳＡにより示された(図２９ｄ、ｅ)。ここで、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２およびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは固定化ＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質に結合したが、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで結合は見られなかった。融合タンパク質のいずれも、ネガティブコントロールとして含ませたＨＥＲ２−Ｆｃに結合できなかった。さらに、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬはまたＥＬＩＳＡにおいて組み換えＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２への結合を示した(図２９ｄ)。ＥＬＩＳＡにおける一価抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖと比較した二価ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２の抗体価測定は、二価融合タンパク質の結合増加を証明した(図２９ｅ)。さらに、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２およびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは、ＥＧＦＲを発現する細胞株(Ｃｏｌｏ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０)への結合を示したが、ＥＧＦＲの顕著な発現がないＨＥＫ２９３細胞では極わずかな結合しか観察されなかった(図３０ａ、ｂ)。これらの細胞株に対してＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬでは弱い結合しか観察されず、ＴＲＡＩＬ受容体のむしろ低い発現が証明された。これは、ＴＲＡＩＬ受容体１〜４に対するモノクローナル抗体を用いた細胞株のフローサイトメトリー分析により確認された。
【０１８３】
実施例１３：抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質はインビトロで強力な腫瘍細胞死滅を示す
融合タンパク質の細胞傷害性活性を、ＴＲＡＩＬ作用に対して腫瘍細胞を感作することが知られているプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ(ベルケイド)の非存在下または存在下、融合タンパク質と１日インキュベートしたＮＣＩ−Ｈ４６０およびＣｏｌｏ２０５細胞で測定した(図３１)。ボルテゾミブ非存在下、ｓｃＴＲＡＩＬは、分析濃度範囲(１pM〜１０nM)で細胞死を誘発しなかった。対照的に、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは細胞死を起こし、それぞれ７.２nM(ＮＣＩ−Ｈ４６０)および１０nM(Ｃｏｌｏ２０５)のＩＣ５０であった(表１)。ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬと比較して、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質で細胞傷害性活性は約２０倍増加し、標的化送達の貢献を支持した。細胞傷害性は、２５０mg／ml  ボルテゾミブ存在下で、全タンパク質で改善した。同様に、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは、ｓｃＴＲＡＩＬより強力であり、最強の効果はｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで見られた(表１)。ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質は分析濃度範囲で細胞傷害性活性を示さなかった(示していない)。細胞傷害性に対するｓｃＦｖ介在標的化の貢献を試験するために、ｓｃＦｖ  ｈｕ２２５と同じエピトープを認識する過剰量のセツキシマブの非存在下または存在下で実験を繰り返した。セツキシマブ存在下のｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性活性はＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで見られる程度に減少し、一方セツキシマブは、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性に対する効果に影響しなかった(図３２；表１)。さらに、我々は、二価ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬと一価ｓｃＦｖ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のＮＣＩ−４６０およびＣｏｌｏ２０５細胞に対する細胞傷害性を比較した(図３３)。両細胞株に対して高度に増加した細胞傷害性活性が二量体ｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質で、ボルテゾミブ非存在下および存在下で見られた。ボルテゾミブ非存在下、最高濃度の融合タンパク質でｓｃＦｖ−ｓｃＴＲＡＩＬは約５０〜６０％の細胞死滅に達した。対照的に、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、両細胞株で強力な死滅を仲介した。ボルテゾミブ存在下、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性活性はｓｃＦｖ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較して約３〜４倍増加した(図３３)。
【０１８４】
【表２】
0006449143.tif 000003
【０１８５】
実施例１４：ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の薬物動態
融合タンパク質の薬物動態特性を、２５μgタンパク質を１回静脈内注射したＣＤ１マウスで決定した(図３４)。全３種のＥＨＤ２融合タンパク質は、ｓｃＴＲＡＩＬと比較して、長時間の循環時間を示した。終末相半減期はｓｃＴＲＡＩＬの３.３時間から、ＥＨＤ２融合タンパク質では７.４〜１０.８時間に延長され、ＡＵＣ０−２４ｈの３〜４倍の増加ももたらした(表２)。ｓｃＴＲＡＩＬおよび種々の融合タンパク質の間の終末半減期およびＡＵＣの差は統計学的に有意であり(ｐ＜０.０５)、一方ＥＨＤ２融合タンパク質のＡＵＣは互いに統計学的有意差はなかった(ｐ＞０.０５)。
【０１８６】
【表３】
0006449143.tif 000004
分子質量は二量体分子として計算した
【０１８７】
実施例１５：抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は強力な抗腫瘍活性を示す
次いで、ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、皮下Ｃｏｌｏ２０５腫瘍担持ヌードマウスで抗腫瘍活性について試験した。マウスはそれぞれｓｃＴＲＡＩＬ、ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬまたはｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの４回の静脈注射を１６日間にわたり受けた。０.７nmol  ｓｃＴＲＡＩＬおよび０.３５nmol  ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬの投与量を使用し、ゆえに、マウスはｓｃＴＲＡＩＬに関して当モル量を受けた。対照群を含む全マウスにさらにボルテゾミブ(ｉ.ｐ.)を２日毎に１４日間の期間投与した(図３５ａ)。この投与量のボルテゾミブは、この異種移植腫瘍モデルでなんらの抗腫瘍効果も発揮しない。腫瘍増殖の統計学的に有意な減少がｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬで見られ、一方ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬは腫瘍増殖に対してわずかな効果しか示さなかった(図３５ｂ)。適用量で、ｓｃＴＲＡＩＬはボルテゾミブ対象群と比較して効果がなかった。さらなる実験において、我々は、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の１nmol投与量の抗腫瘍活性を、ｓｃＴＲＡＩＬ部分を欠くｓｃＦｖ−ＥＨＤ２融合タンパク質と比較した(図３５ｃ、ｄ)。マウスは、２日毎に融合タンパク質の静脈内注射を受けた。上記のとおり、ボルテゾミブを含ませた(５μg／ｉ.ｐ.注射)。強い抗腫瘍活性がｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質で見られたが、ボルテゾミブ処置単独と比較してｓｃＦｖ−ＥＨＤ２は効果を有しなかった(図３５ｄ)。最後に、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の肝毒性の可能性を、１回注射後ボルテゾミブ存在下で分析した。ＡＬＴの上昇は、処置４時間または２４時間後に見られず、値はＰＢＳ処置マウスと同等であった(図３５ｅ)。
【０１８８】
実施例１６：ＴＮＦＲ２−選択的ＭＨＤ２−およびＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２融合タンパク質
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)は、その生物学的機能を２個の異なる受容体を介して発揮する。ＴＮＦ受容体(ＴＮＦＲ)１は主に炎症性応答を仲介するが、ＴＮＦＲ２は組織保護および再生に関与する。特に、ＴＮＦＲ２がインビトロで興奮毒性侵襲に対して神経を保護でき、虚血性および神経毒性侵襲後の神経生存ならびにオリゴデンドロサイト再生を促進することが証明されている。したがって、選択的にＴＮＦＲ２を活性化するＴＮＦ変異体は、多様な疾患の治療レジメンとして有用である可能性がある。可溶性組み換えＴＮＦは、可溶性ＴＮＦがＴＮＦＲ２を活性化するのに十分にではないため、主にＴＮＦＲ１活性化を介する、炎症の強力なメディエーターである。対照的に、ＴＮＦの膜結合形態(ｍｅｍＴＮＦ)は、両者のＴＮＦＲを十分に活性化する。それゆえに、ＴＮＦＲ２特異的治療はｍｅｍＴＮＦの模倣と、用量依存的な重度炎症性応答を避けるために、受容体選択性の２つの基本的要求を満たす必要がある。ＴＮＦＲ２選択性は、ＴＮＦ分子に既知ＴＮＦＲ識別変異(Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ)を導入することにより保証された。ＴＮＦＲ２選択的変異体を、短ペプチドリンカーに連結した３個のＴＮＦ単量体から成る単一鎖ＴＮＦ形式(ｓｃＴＮＦＲ２)で使用した。多量体化は、ＭＨＤ２(ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２)またはＥＨＤ２(ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２)それぞれへのｓｃＴＮＦＲ２の融合により達成した。全てのタンパク質は、安定に遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞で産生させ、細胞培養上清からＩＭＡＣにより精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は融合タンパク質の二量体アセンブリを証明した(図３６ａ−ｃ)。ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２およびＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質への選択的結合を示し、一方本実験に含ませた組み換えヒトＴＮＦ(ｒｈＴＮＦ)は、ＴＮＦＲ２−Ｆｃへの弱い結合しか示さず、二価ＭＨＤ２−およびＥＨＤ２融合タンパク質の結合活性増加が証明された。
【配列表フリーテキスト】
【０１８９】
配列番号１  ヒトＭＨＤ２のアミノ酸配列：AELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPD
配列番号２  ヒトＥＨＤ２のアミノ酸配列：DFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSN
配列番号３  抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ(４Ｄ５)のアミノ酸配列
配列番号４  抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ(ｈｕ２２５)のアミノ酸配列
配列番号５  ｓｃＴＮＦのアミノ酸配列
配列番号６  ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号７  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号８  ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号９  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＦｖＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０  ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦのアミノ酸配列
配列番号１１  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦのアミノ酸配列
配列番号１２  ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１３  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１４  ｓｃＤｂＥｐＣＡＭｘＥＧＦＲ−ＭＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１５  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号１６  ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１７  ｓｃＦｖＥＧＦＲ−ＥＨＤ２−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１８  リンカーペプチド１：GGGGS
配列番号１９  リンカーペプチド２：GGGGSGGGGS
配列番号２０  リンカーペプチド３：GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２１  リンカーペプチド４：GSLGGSGG
配列番号２２  リンカーペプチド５：GGGSGGGT
配列番号２３  リンカーペプチド６：GGGSGGGTGS
配列番号２４  リンカーペプチド７：GGGSGGGTGSGG
配列番号２５  リンカーペプチド８：GGGSGGGS
配列番号２６  リンカーペプチド９：EFTRG
配列番号２７  リンカーペプチド１０：AAA
配列番号２８  抗ＣＥＡ  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号２９  抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号３０  抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号３１  抗ＣＥＡｘＣＤ３  ｓｃＤｂ−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号３２  抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２のアミノ酸配列
配列番号３３  抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−Ｌ３−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖのアミノ酸配列
配列番号３４  ＭＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２のアミノ酸配列
配列番号３５  ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２−Ｌ１６ａａのアミノ酸配列
配列番号３６  ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２−Ｌ２８ａａのアミノ酸配列
【図１】
0006449143.tif 000005
【図２】
0006449143.tif 000006
【図３ａ）】
0006449143.tif 000007
【図３ｂ）】
0006449143.tif 000008
【図３ｃ）】
0006449143.tif 000009
【図４】
0006449143.tif 000010
【図５−１】
0006449143.tif 000011
【図５−２】
0006449143.tif 000012
【図６−１】
0006449143.tif 000013
【図６−２】
0006449143.tif 000014
【図７】
0006449143.tif 000015
【図８】
0006449143.tif 000016
【図９】
0006449143.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
0006449143.tif 000019
【図１２】
0006449143.tif 000020
【図１３】
0006449143.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006449143.tif 000028
【図２１】
0006449143.tif 000029
【図２２】
0006449143.tif 000030
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ）】
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【図２６ｂ）】
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【図２６ｃ）】
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【図２７】
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【図２８ａ）】
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【図２８ｂ）】
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【図２８ｃ）】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６ａ）】
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【図３６ｂ）】
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【図３６ｃ）】
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【図３６ｄ）】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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