(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下で該乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間での培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を含む、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件下で該乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間での培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が、乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記乳酸菌は、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌及びテトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下で該乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間での培養に供することにより、該乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する工程を含む、乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する方法。
【請求項７】
複数の乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下で該乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間での培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌をスクリーニングする工程を含む、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上である、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌（ただし、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を除く。）。
【請求項９】
二本鎖ＲＮＡの含有量が、乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上である、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌（ただし、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を除く。）。
【請求項１０】
前記乳酸菌は、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌及びテトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも１である、請求項８または９に記載の乳酸菌。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の乳酸菌を含有する組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、飲食品用組成物、飲食品原料用組成物、飼料用組成物及び飼料原料用組成物からなる群から選ばれる１種の組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡの含有量が大きい乳酸菌の製造方法及び該乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫系細胞応答では、樹状細胞やマクロファージといった免疫細胞が細菌やウイルスに由来する自然免疫活性化物質に応答してインターフェロンやサイトカインを産生し、その後の免疫反応が起こることが知られている。自然免疫系細胞応答は、生物が共通に有する感染防御機構であり、非特異的であるために反応が素早く、多くの感染源に対して有効に機能することに特徴がある。【０００３】
自然免疫系細胞応答に関与する免疫細胞は、一般的にはトル様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）を介して免疫反応を惹起する。ＴＬＲは、細胞膜やエンドソームに存在するタンパク質の一種であり、細胞外の自然免疫活性化物質を認識して、細胞内にその情報を伝えることにより、インターフェロンやサイトカインなどの生理活性物質の産生を導く。【０００４】
ＴＬＲの一種であるＴＬＲ３は、ウイルスの二本鎖ＲＮＡを認識し、ＭｙＤ８８非依存的にインターフェロンβプロモーターの活性化及びインターフェロンβの産生を誘導することが知られている。インターフェロンβは、樹状細胞を活性化させて、インターロイキン１２などの炎症性サイトカインの産生を誘導する。さらに、インターロイキン１２は、ナイーブＴ細胞を１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞へと分化誘導し、これにより自然免疫系細胞応答が確立することになる。【０００５】
ウイルスの二本鎖ＲＮＡによるＴＬＲ３を介した自然免疫系細胞応答は、免疫反応の活性化又は抑制をもたらし、自然免疫を正常に調整し得る。しかし、自然免疫の調整のためにウイルスそのものを二本鎖ＲＮＡとして利用することは、安全性の面で現実的ではない。【０００６】
そこで、ウイルスの二本鎖ＲＮＡの代わりに、人体に対して悪影響を及ぼさない微生物を二本鎖ＲＮＡ含有物として利用すること、又は該微生物から単離した二本鎖ＲＮＡを利用することが考えられる。特に、人体に対して悪影響を及ぼさない微生物として、食経験のある乳酸菌などを用いれば、日常的に自然免疫を良好に保ち得る。例えば、特許文献１には、塩分によるストレス条件下で菌体内に二本鎖ＲＮＡを生産させた乳酸菌及びその製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特許第５０９９６４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、本発明者らが調べたところによれば、乳酸菌の中には塩分によるストレス条件によって増殖阻害が顕著に発現し、結果として二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌を大量に得ることが困難である場合がある。このように、乳酸菌によっては、ストレス条件の種類によって顕著な増殖阻害が起こり、結果として効率良く二本鎖ＲＮＡを含有させることができない。【０００９】
そこで、本発明は、大量の二本鎖ＲＮＡを含有せしめる乳酸菌を効率良く得るための方法及び該方法によって得られる二本鎖ＲＮＡの含有量が大きい乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、驚くべきことに、通常は非通気条件下で培養する乳酸菌を通気条件下で培養することにより、乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量を増加させることに成功した。しかし、本発明者らは、乳酸菌の菌体内の二本鎖ＲＮＡ量を維持することが難しく、特に培養時間の経過によって容易に二本鎖ＲＮＡ量が減少することを見出した。【００１１】
そこで、さらなる試行錯誤を経ることによって、通気条件に加えて、低温度条件下で乳酸菌を培養することにより、乳酸菌の増殖速度を低下することができ、それに伴い菌体内の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を緩和することができることを見出した。そして、驚くべきことに、通気条件及び低温度条件を組み合わせることにより、工業的規模での二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得ることに成功した。これらの知見や成功例は、本発明者らによって初めてもたらされたものである。そして、本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。【００１２】
したがって、本発明の一態様によれば、以下の（１）〜（１２）に示す態様の乳酸菌、組成物及び方法が提供される。
（１）乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を含む、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法。
（２）乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件下の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を含む、（１）に記載の二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法。
（３）二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上である、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が、乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の製造方法。
（５）前記乳酸菌は、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌及びテトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも１である、（１）〜（４）のいずれか１に記載の製造方法。
（６）乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、該乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する工程を含む、乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する方法。
（７）複数の乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌をスクリーニングする工程を含む、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌のスクリーニング方法。
（８）二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上である、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌。
（９）二本鎖ＲＮＡの含有量が、乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上である、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌。
（１０）前記乳酸菌は、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌及びテトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも１である、（８）または（９）に記載の乳酸菌。
（１１）（８）〜（１０）のいずれか１に記載の乳酸菌を含有する組成物。
（１２）前記組成物は、飲食品用組成物、飲食品原料用組成物、飼料用組成物及び飼料原料用組成物からなる群から選ばれる１である、（１１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一態様の方法及び乳酸菌によれば、二本鎖ＲＮＡの含有量が高い乳酸菌を効率良く得ることができる。特に、本発明の一態様の方法は、二本鎖ＲＮＡの含有量が高い乳酸菌を工業的規模で製造するための格別顕著に優れた方法である。また、本発明の一態様の組成物によれば、含有する二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の作用によって、摂取個体は自然免疫を獲得することが期待でき、具体的には抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抵抗性抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果、抗癌効果などを得ることが期待できる。【００１４】
本発明の一態様の組成物で用いられる有効成分は飲食品の添加物などの使用実績のあるものである。したがって、本発明の一態様の組成物は、安全性が高いものであり、抗ウイルス用組成物、免疫賦活用組成物、抗感染症用組成物、抗Ｂ型肝炎用組成物、抗Ｃ型肝炎用組成物、腸管免疫賦活用組成物、気道免疫賦活用組成物、抗腫瘍用組成物、抗癌用組成物などとして有用であり、経口的又は非経口的な形態で提供することが期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１（ａ）及び（ｂ）は、後述する実施例に記載されている、非通気条件又は通気条件下で培養した場合の各種乳酸菌のＯＤ６００値を測定した結果を示す図である。図１（ｃ）及び（ｄ）は、後述する実施例に記載されている、非通気条件又は通気条件下で培養した場合の各種乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。図中の（−）は通気を行わずに培養したときの結果を示し、（＋）は通気条件下で培養したときの結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、後述する実施例に記載されている、種々の温度で培養した場合のＫ１５株のＯＤ６００値を測定した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、後述する実施例に記載されている、種々の温度で培養した場合のＫ１５株の二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。
【図３】図３は、後述する実施例に記載されている、通気かつ低温度条件下で培養した場合のＫ１５株の二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。
【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、後述する実施例に記載されている、非通気条件又は通気条件下で培養した場合の各種乳酸菌のＯＤ６００値を測定した結果を示す図である。図４（ｃ）及び（ｄ）は、後述する実施例に記載されている、非通気条件又は通気条件下で培養した場合の各種乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。図中の（−）は通気を行わずに培養したときの結果を示し、（＋）は通気条件下で培養したときの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の一態様である乳酸菌、組成物及び方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【００１７】
本発明の一態様の乳酸菌は、二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌である。本発明の一態様の乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量は、同一の菌株を至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で培養したときの該菌株の二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上であり、好ましくは３．０倍以上であり、より好ましくは５．０倍以上であり、さらに好ましくは１０倍以上であり、なおさらに好ましくは３０倍以上である。また、上限は特に制限されないが、典型的には１０００倍以下である。
【００１８】
また、本発明の一態様の乳酸菌は、後述する実施例に記載があるとおりの二本鎖ＲＮＡの評価方法を採用した場合に、二本鎖ＲＮＡの含有量が乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上であることが好ましく、より好ましくは乾燥菌体１ｍｇあたり５０ｎｇ以上、さらに好ましくは乾燥菌体１ｍｇあたり１００ｎｇ以上である。また、上限は特に制限されないが、典型的には乾燥菌体１ｍｇあたり２００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００１９】
本発明の一態様の乳酸菌は、乳酸菌を所定の条件下の培養に供することにより得ることができる。この際に使用する乳酸菌は通常知られているとおりの乳酸を生成する微生物のことを意味する。
【００２０】
乳酸菌としては、例えば、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌、テトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌などに属する乳酸菌が挙げられる。
【００２１】
具体的には、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｌａｃｔｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
乳酸菌のより具体的な非限定的な例としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ  Ｋ１５株、ラクトコッカス・ラクティス  ＡＴＣＣ１９４３５株、ラクトバチルス・プランタラム  ＡＴＣＣ１４９１７株、ラクトバチルス・ペントーサス  ＡＴＣＣ８０４１株、ラクトバチルス・サケイ  Ｋ４１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラス  ＫＫ２２１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラス  ＮＢＲＣ１２１７２株、ペディオコッカス・ペントサセウス  ＯＳ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウス  ＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウス  ＮＲＩＣ００９９株、ペディオコッカス・ペントサセウス  ＮＲＩＣ０１２２株、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＲＩＣ１９３０株、ラクトバチルス・プランタラム  ＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス  ＮＲＩＣ１６８８株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ブレビス  ＮＲＩＣ１７１３株、ラクトバチルス・ペントーサス  ＮＲＩＣ０３９１株、ラクトバチルス・ペントーサス  ＮＲＩＣ０３９６株、ラクトバチルス・ペントーサス  ＮＲＩＣ１８３６株、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ  ＮＲＩＣ０６４４株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ  ＮＲＩＣ１９３６、ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＮＲＩＣ０２５６株、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス  ＮＲＩＣ１９８２株、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス  ＡＴＣＣ１２２９１株、ロイコノストック・ラクティス  ＮＲＩＣ１５８２株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス  ＡＴＣＣ１１８４２株、ラクトバチルス・ラムノサス  ＡＴＣＣ５３１０３株などが挙げられる。
【００２３】
本発明の一態様の乳酸菌を得るために使用する乳酸菌としては、上記したものの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。また、上記したもののうち、二本鎖ＲＮＡの含有量の観点から、ペディオコッカス・アシディラクティシ  Ｋ１５株、ラクトコッカス・ラクティス  ＡＴＣＣ１９４３５株、ラクトバチルス・プランタラム  ＡＴＣＣ１４９１７株、ラクトバチルス・ペントーサス  ＡＴＣＣ８０４１株及びラクトバチルス・サケイ  Ｋ４１株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス  ＡＴＣＣ１１８４２株、ラクトバチルス・ラムノサス  ＡＴＣＣ５３１０３株が好ましく、ペディオコッカス・アシディラクティシ  Ｋ１５株がより好ましい。
【００２４】
乳酸菌を入手する方法は特に限定されないが、例えば、市販や寄託されている乳酸菌を利用する方法、醤油諸味、漬物、市販の乳酸菌飲料などの乳酸菌含有物から分離して利用する方法などが挙げられる。一般的な乳酸菌の至適温度は３０℃〜４０℃程度であり、例えば、糠床から単離した乳酸菌株であるペディオコッカス・アシディラクティシ  Ｋ１５株の至適温度は４０℃前後であり、人参の押し漬けから単離した乳酸菌株であるラクトバチルス・サケイ  Ｋ４１株の至適温度は３０℃前後である。
【００２５】
本発明の一態様の方法は、本発明の一態様の乳酸菌のような二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を製造する方法である。本発明の一態様の二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法は、乳酸菌を、通気条件下、至適温度より低温度条件下又は至適温度より低温度かつ通気条件下（以下、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下、と略す）の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を少なくとも含む。
【００２６】
本発明の別の一態様の方法は、乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する方法である。本発明の一態様の乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下抑制方法は、乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、該乳酸菌の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下を抑制する工程を少なくとも含む。
【００２７】
本発明の別の一態様の方法は、複数の乳酸菌から二本鎖ＲＮＡを大量に含有し得る乳酸菌を選別する方法である。本発明の一態様の二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌のスクリーニング方法は、複数の乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌をスクリーニングする工程を少なくとも含む。
【００２８】
前記複数の乳酸菌とは、例えば、複数菌株の乳酸菌を示し、具体的には例えば、同一種の範囲における異なる複数菌株の乳酸菌であってもよいし、異なる菌種からなる複数菌株の乳酸菌であってもよい。前記スクリーニングする工程としては、具体的には例えば、複数の乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供し、同一の菌株を至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で培養したときの該菌株の二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて２．０倍以上であるもの、または二本鎖ＲＮＡの含有量が乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上であるものをスクリーニングする工程が挙げられる。
【００２９】
本発明の一態様の方法は、乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下といった、乳酸菌を通常培養する条件とは異なる条件下で培養することに特徴がある。
【００３０】
通気条件下での培養とは、例えば、空気を供給して、撹拌などすることにより溶存酸素濃度を高めるような条件下で培養することなどが挙げられる。この際、空気に代えて酸素ガスを用いてもよく、溶存酸素濃度が高められるのであれば撹拌以外に振盪などの手段を採用してもよい。なお、撹拌数は、培養槽の大きさなどによって適宜設定し得る。
【００３１】
空気の供給量（通気量）は特に限定されないが、例えば、単位体積当たり０．０１〜１０ＶＶＭ程度であり、好ましくは０．１〜１ＶＶＭ程度である。通気量が０．０１ＶＶＭより小さい場合は溶存酸素濃度が高められない可能性があり、通気量が１０ＶＶＭより大きい場合は大量の気泡によって乳酸菌が物理的にダメージを受ける可能性があることから、これらの場合は好ましくない。
【００３２】
至適温度より低温度条件下での培養とは、例えば、使用する乳酸菌の増殖に適した温度よりも低い温度の条件下で培養することなどが挙げられる。至適温度より低温度とは、例えば、至適温度より１℃〜３０℃低い温度であり、好ましくは至適温度より５℃〜２０℃低い温度であり、より好ましくは至適温度より５℃〜１５℃低い温度である。
【００３３】
乳酸菌を培養する温度が至適温度より低く、その差が１℃以上であると、乳酸菌の恒常性の影響を抑え、二本鎖ＲＮＡの含有量を効率良く維持又はその低下を抑制できる。乳酸菌を培養する温度が至適温度より低く、その差が３０℃以下であると、乳酸菌の生存又は代謝機能の著しい低下を抑制し、乳酸菌の収量が低下するのを抑制できる。
【００３４】
なお、具体的には例えば、至適温度より１℃〜３０℃低い温度とは、乳酸菌の至適温度が４０℃である場合は、４０℃より１℃〜３０℃低い温度、すなわち、１０℃〜３９℃を意味する。
【００３５】
至適温度より低温度かつ通気条件下での培養とは、通気条件下での培養と、至適温度より低温度条件下での培養とを組み合わせた培養をいう。具体的には例えば、至適温度より１℃〜３０℃低い温度であり、かつ、通気量が単位体積当たり０．０１〜１０ＶＶＭ程度である条件下での培養などが挙げられ、至適温度より５℃〜１５℃低い温度であり、かつ、通気量が単位体積当たり０．１〜１ＶＶＭ程度である条件下での培養が好ましい。
【００３６】
乳酸菌の培養は、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下で培養する限りにおいて、その他の条件として、使用する乳酸菌の増殖に適した条件で培養すればよい。例えば、使用する培地は、乳酸菌の培養に通常使用する培地を採用することができる。そのような培地としては、例えば、ＭＲＳ培地及びＭ１７培地などを挙げることができるが、これに限定されない。
【００３７】
本発明の一態様の具体的な方法としては、例えば、ペディオコッカス属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、ラクトバチルス属乳酸菌、ストレプトコッカス属乳酸菌、ロイコノストック属乳酸菌及びテトラジェノコッカス属乳酸菌からなる群から選ばれる乳酸菌のいずれか１種又は２種以上の乳酸菌を、通気量が単位体積当たり０．１〜１ＶＶＭ程度である条件および至適温度より５℃〜１５℃低い温度条件の少なくとも一方の条件下で、ＭＲＳ培地を用いて、１０〜３０時間で培養することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を含む培養物を得る工程を含む方法などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
本発明の一態様の方法において、培養時間は乳酸菌の増殖が認められる時間であれば特に限定されないが、例えば、乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間であることが好ましい。例えば、乳酸菌の培養物のＯＤ６００値を経時的に測定し、次いで測定したＯＤ６００値を培養時間に対してプロットすることにより得られる増殖曲線の傾きが小さくなる前の時間を、乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間ということができる。
【００３９】
本発明の一態様の方法において、乳酸菌を、乳酸菌の増殖速度が低下する時間まで培養することにより、乳酸菌内の二本鎖ＲＮＡの含有量が低下する傾向にあることから、培養時間を乳酸菌の増殖速度が低下する時間より前に設定することが好ましい。乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間の具体例は、図２Ａの４０℃の増殖曲線を参照すれば、培養後６時間より前の時間ということができ、より具体的には培養後４〜６時間の間の時間や培養後５時間に相当する時間ということができるが、これに限定されない。
【００４０】
本発明の一態様の方法では、乳酸菌を通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、乳酸菌の増殖速度を減じることができ、これにより培養時間を乳酸菌の増殖速度が低下する前の時間に制御することが容易になることから、最終的には大量の二本鎖ＲＮＡを含有せしめる乳酸菌を効率良く得ることができる。
【００４１】
本発明の一態様の方法は、得られた培養物を殺菌し、培地を限外ろ過膜や遠心濃縮機などの通常知られている固液分離手段によって培地を除去して菌体を回収し、次いで得られた菌体を水や食塩水などで洗浄することにより、乳酸菌の菌体を得る工程を含む方法であってもよい。
【００４２】
このようにして得られた菌体、該菌体を水や食塩水などに懸濁した菌体懸濁液、該菌体を乾燥処理に供して得られる乾燥粉末などを、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌として使用可能である。乾燥処理の方法は特に限定されず、例えば、自然乾燥、風乾、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。
【００４３】
本発明の一態様の方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【００４４】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌は、二本鎖ＲＮＡを含有せしめた乳酸菌それ自体、すなわち、該乳酸菌の菌体に加えて、該乳酸菌の菌体成分及び該乳酸菌の培養物などであり得る。二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物は、これらに含まれる二本鎖ＲＮＡが有する免疫を調節、賦活、抑制及び適正化する作用によって、免疫調節物、免疫賦活物及び抗アレルギー物であるともいえる。
【００４５】
乳酸菌の菌体は、例えば、乳酸菌の培養物を遠心分離などの通常知られている固液分離手段を用いて培地を除去することにより得られる菌体などが挙げられる。菌体成分は、例えば、乳酸菌の菌体内に存在する、又は菌体外に分泌する精製又は非精製の成分が挙げられる。具体的には例えば、二本鎖ＲＮＡに加えて、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡなどを含む成分などが挙げられる。乳酸菌の培養物は、例えば、乳酸菌を培養して得た培養液そのものなどが挙げられる。
【００４６】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌としての菌体、菌体成分及び培養物は、それらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせてなるものとすることができる。例えば、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物から二本鎖ＲＮＡを単離してなるものであってもよい。二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物から二本鎖ＲＮＡを単離する方法は特に限定されないが、例えば、日本国特許第５３１２３２２号公報に記載の方法などが挙げられる。
【００４７】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌から二本鎖ＲＮＡを単離する方法の具体例としては、例えば、以下の方法などが挙げられる。すなわち、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を９０〜１００℃で５〜２０分間の加熱殺菌処理に供して加熱殺菌処理液を得る。
【００４８】
次いで加熱殺菌処理液を遠心分離等の固液分離手段に供して固形分を回収する。次いで固形分を洗浄して緩衝液に懸濁して懸濁液を得る。次いで懸濁液にリゾチームを添加して３５〜４０℃で加温してリゾチーム処理液を得る。
【００４９】
次いでリゾチーム処理液にＳＤＳ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加して３５〜４０℃で加温してプロテナーゼ処理液を得る。次いでプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理に供し、遠心分離等の固液分離手段により上清として粗核酸抽出液を得る。粗核酸抽出液とは、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどを含有する核酸混合物である。
【００５０】
次いで、粗核酸抽出液を、セルロースカラムクロマトグラフィーに供することによって、精製された二本鎖ＲＮＡを得ることができる。セルロースカラムクロマトグラフィー及びその後の高度な精製手段は、日本国特許第５３１２３２２号明細書の記載に準じて実施することができる。
【００５１】
本発明の一態様の方法では、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、好ましくは２．０倍以上であり、より好ましくは３．０倍以上であり、さらに好ましくは５．０倍以上であり、特に好ましくは１０倍以上であり、最も好ましくは３０倍以上である。また、上限は特に制限されないが、典型的には１０００倍以下である。
【００５２】
本発明の一態様の方法では、後述する実施例に記載があるとおりの二本鎖ＲＮＡの評価方法を採用した場合に、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量が乾燥菌体１ｍｇあたり２０ｎｇ以上であることが好ましく、より好ましくは乾燥菌体１ｍｇあたり５０ｎｇ以上、さらに好ましくは乾燥菌体１ｍｇあたり１００ｎｇ以上である。また、上限は特に制限されないが、典型的には乾燥菌体１ｍｇあたり２００ｎｇ以下である。
【００５３】
本発明の一態様の組成物は、本発明の一態様の二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を少なくとも含有する。二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌は、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果及び抗癌効果などを奏することが期待されるものである。このことから、本発明の一態様の組成物は、抗ウイルス用組成物、免疫賦活用組成物、抗感染症用組成物、抗Ｂ型肝炎用組成物、抗Ｃ型肝炎用組成物、腸管免疫賦活用組成物、気道免疫賦活用組成物、抗腫瘍用組成物、抗癌用組成物といった態様を採り得る。
【００５４】
本発明の一態様の組成物が奏し得る抗疾患効果とは、例えば、抗ウイルス効果の場合は、摂取個体における現在又は将来のウイルス性疾患若しくはウイルス性疾患に罹患しているとされる状態になることを抑制、遅滞又はその状態を改善することをいう。本発明の一態様の組成物が奏する免疫賦活効果とは、例えば、摂取個体における現在又は将来の免疫系を活性化して、種々の疾患や異常を正常な状態になるようにすることをいう。
【００５５】
二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌は、長期にわたりヒトや動物に摂取されてきた実績のある天然物やその由来物であって、安全性が高いことから、本発明の一態様の組成物は、実用性が高く、それ自体単独で、又は他の組成物とともに加工し、若しくは他の組成物に添加することにより、経口的又は非経口的な形態で種々の用途に適用可能である。
【００５６】
本発明の一態様の組成物の具体的態様は特に限定されず、例えば、飲食品、動物用飼料、化粧品、医薬品、医薬部外品及びこれらを製造するための原料若しくは原料用組成物などが挙げられるが、摂取個体にとって日常的に摂取し易いという観点から、飲食品用組成物、飲食品原料用組成物、飼料用組成物及び飼料原料用組成物であることが好ましく、機能性飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品及びこれらを製造するための原料若しくは原料用組成物であることがより好ましい。
【００５７】
本発明の一態様の組成物は、用途に応じて、例えば、他の成分と混合して使用することができる。このように、本発明の一態様の組成物は、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌に追加して、本発明の目的を達成し得る限り、種々のものを配合できる。
【００５８】
本発明の一態様の組成物には、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物をさらに含有することができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。
【００５９】
本発明の一態様の組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。
【００６０】
本発明の一態様の組成物は、例えば、経口用組成物である場合に、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌から単離した二本鎖ＲＮＡを、食道及び胃を経由して小腸へ送達し得るものとして、腸溶性組成物とすることが好ましい。腸溶性組成物は、胃酸では溶けずに小腸において溶解する形態の組成物であれば特に限定されず、例えば、耐酸性マイクロカプセルやリポソームの形態の組成物などが挙げられる。
【００６１】
本発明の一態様の組成物に含有される二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の含有量は、期待する効果が認められる量であれば特に限定されない。経口用組成物としては、例えば、組成物全体に対して、０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上である。非経口用組成物としては、例えば、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上である。本発明の一態様の組成物の摂取量は特に限定されず、摂取個体の症状や体格に合わせて適宜設定すればよいが、例えば、１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日などである。
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【００６３】
［例１．通気条件下での乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量の評価］
乳酸菌を通気条件下で培養した際の二本鎖ＲＮＡ量を評価した。【００６４】
ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）  Ｋ１５株［以下、Ｋ１５株ともよぶ。Front Immunol. 2018 Jan 23;9:27. doi: 10.3389/fimmu.2018.00027. eCollection 2018.、及びSci Rep. 2018 Mar 22;8(1):5065. doi: 10.1038/s41598-018-23404-4.］又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）  ＡＴＣＣ１９４３５株（以下、ＡＴＣＣ１９４３５株ともよぶ。）を１×１０７個／ｍＬとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。得られた乳酸菌原液  １００ｍＬを、２００ｍＬ容培養槽を用いて、単位体積当たりの通気量  ０．５ＶＶＭとした通気条件下において３１℃にて１３時間培養した。このとき、５００ｒｐｍで撹拌する試験群と、コントロールとして通気を行わずに１００ｒｐｍで撹拌しながら３１℃にて培養する試験群を設けた。【００６５】
培養開始から１３時間後に培養液を回収し、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理に供することにより、殺菌処理液を調製した。調製した殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、再度遠心分離して得た菌体を凍結乾燥させた。【００６６】
得られた凍結乾燥粉末  ５ｍｇをＳＴＥ緩衝液に懸濁して懸濁液を得た。得られた懸濁液に、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＳＴＥ緩衝液に懸濁して調製したリゾチーム溶液（終濃度  ５ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃にて３０分間、加温することによってリゾチーム処理液を得た。【００６７】
得られたリゾチーム処理液に１０％ＳＤＳ（和光純薬工業株式会社）及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（タカラバイオ株式会社）を添加して３７℃で１時間加温してプロテナーゼ処理液を得た。得られたプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（和光純薬工業株式会社）で処理し、８５００×ｇで１５分間遠心分離して、上清として粗核酸抽出液を得た。【００６８】
得られた粗核酸抽出液から、ＥＬＩＳＡ法で二本鎖ＲＮＡを定量した。測定して得られた二本鎖ＲＮＡ量を図１（ｃ）および（ｄ）に示す。また、各培養液のＯＤを測定した結果を図１（ａ）および（ｂ）に示す。なお、ＯＤ６００は、６００ｎｍの吸光度であり、培養液の濁度である。ＯＤ６００が高くなる条件が、乳酸菌の増殖に適した条件であるといえる。【００６９】
図１（ｃ）および（ｄ）に示すとおり、通気条件下で培養した場合に、非通気条件下で培養した場合と比較して、Ｋ１５株及びＡＴＣＣ１９４３５株の二本鎖ＲＮＡ量が多くなったことを確認した。【００７０】
なお、撹拌数を３００ｒｐｍにし、培養時間を１８時間にして、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の収量を高めようとしたところ、菌体内の二本鎖ＲＮＡ含有量が極端に減少することを確認した。したがって、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の収量を高めるためには、培養時間などの培養条件をコントロールして、菌体内の二本鎖ＲＮＡ含有量を高めた状態の乳酸菌を得ることが肝要であることがわかった。【００７１】
［例２．種々の培養温度条件下でのペディオコッカス属乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量の評価］
ペディオコッカス属に属する乳酸菌を種々の培養温度により培養した際の二本鎖ＲＮＡ量を評価した。【００７２】
ＭＲＳ培地に、Ｋ１５株を１×１０７個／ｍＬとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。なお、上述したように、Ｋ１５株の至適温度は４０℃前後である。【００７３】
調製した乳酸菌原液を、２５℃、３１℃又は４０℃にて、２２時間、静置培養して、複数のタイムポイントにおいてＯＤ６００を測定した。測定して得られたＯＤ６００の値を図２Ａに示す。【００７４】
２５℃で培養した際は１０、１４及び２２時間目に、３１℃にて培養した際は８、１３及び１４時間目に、並びに４０℃にて培養した際は４、６及び１４時間目に培養液を回収し、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理に供することにより、殺菌処理液を調製した。調製した殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、再度遠心分離して得た菌体を凍結乾燥させた。【００７５】
得られた凍結乾燥粉末  ５ｍｇから、例１と同様にして粗核酸抽出及び二本鎖ＲＮＡ量を測定した。測定して得られた二本鎖ＲＮＡ量を図２Ｂに示す。【００７６】
図２Ａ及び図２Ｂに示すとおり、培養温度による二本鎖ＲＮＡの含有量の最大値に大きな変動はみられなかったが、至適温度より低温度条件である２５℃および３１℃にて培養した場合に、至適温度である４０℃にて培養した場合と比較して、菌体増殖速度を低下させることができ、それに伴い菌体内の二本鎖ＲＮＡの含有量の低下速度を緩和できることがわかった。これらの結果より、工業的規模で二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得るためには、乳酸菌を至適温度より低温度条件下で培養することが好ましいことがわかった。【００７７】
［例３．至適温度より低温度条件かつ通気条件下でのペディオコッカス属乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量の評価］
ペディオコッカス属に属する乳酸菌を至適温度より低温度条件かつ通気条件下で培養した際の二本鎖ＲＮＡ量を評価した。【００７８】
ＭＲＳ培地に、Ｋ１５株を１×１０７個／ｍＬとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。調製した乳酸菌原液  １００ｍｌを、２００ｍＬ容培養槽を用いて、至適温度である４０℃にて、１４時間静置培養する試験群を設けた。また、乳酸菌原液  １００ｍＬを、２００ｍＬ容培養槽を用いて、単位体積当たりの通気量  ０．５ＶＶＭとした通気条件下において２５℃にて１６時間、３００ｒｐｍで撹拌して培養する試験群を設けた。【００７９】
培養後に培養液を回収し、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理に供することにより、殺菌処理液を調製した。調製した殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、再度遠心分離して得た菌体を凍結乾燥させた。【００８０】
得られた凍結乾燥粉末  ５ｍｇから、例１と同様にして粗核酸抽出及び二本鎖ＲＮＡ量の測定を行った。測定して得られた二本鎖ＲＮＡ量を図３に示す。【００８１】
図３に示すとおり、通気条件かつ至適温度より低温度条件下で培養した場合に、非通気条件かつ至適温度条件下で培養した場合と比較して、菌体内の二本鎖ＲＮＡ量が高い値となることが確認された。【００８２】
［例４．通気条件下でのラクトバチルス属乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ量の評価］
乳酸菌を通気条件下で培養した際の二本鎖ＲＮＡ量を評価した。【００８３】
ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス  ＡＴＣＣ１１８４２株（以下、ＡＴＣＣ１１８４２株ともよぶ。）又はラクトバチルス・ラムノサス  ＡＴＣＣ５３１０３株（以下、ＬＧＧ株ともよぶ。ＬＧＧは登録商標。）を１×１０７個／ｍＬとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。得られた乳酸菌原液  １００ｍＬを、２００ｍＬ容培養槽を用いて、単位体積当たりの通気量  ０．５ＶＶＭとした通気条件下において、ＡＴＣＣ１１８４２株については３７℃にて１０時間、ＬＧＧ株については３７℃にて９時間培養した。このとき、５００ｒｐｍで撹拌する試験群と、コントロールとして通気を行わずに１００ｒｐｍで撹拌しながら培養する試験群を設けた。【００８４】
培養終了後、培養液を回収し、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理に供することにより、殺菌処理液を調製した。調製した殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、再度遠心分離して得た菌体を凍結乾燥させた。【００８５】
得られた凍結乾燥粉末  ５ｍｇをＳＴＥ緩衝液に懸濁して懸濁液を得た。得られた懸濁液に、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＳＴＥ緩衝液に懸濁して調製したリゾチーム溶液（終濃度  ５ｍｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃にて３０分間、加温することによってリゾチーム処理液を得た。【００８６】
得られたリゾチーム処理液に１０％ＳＤＳ（和光純薬工業株式会社）及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（タカラバイオ株式会社）を添加して３７℃で１時間加温してプロテナーゼ処理液を得た。得られたプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（和光純薬工業株式会社）で処理し、８５００×ｇで１５分間遠心分離して、上清として粗核酸抽出液を得た。【００８７】
得られた粗核酸抽出液から、ＥＬＩＳＡ法で二本鎖ＲＮＡを定量した。測定して得られた二本鎖ＲＮＡ量を図４（ｃ）および（ｄ）に示す。また、各培養液のＯＤを測定した結果を図４（ａ）および（ｂ）に示す。【００８８】
図４（ｃ）および（ｄ）に示すとおり、通気条件下で培養した場合に、非通気条件下で培養した場合と比較して、ＡＴＣＣ１１８４２株及びＬＧＧ株の二本鎖ＲＮＡ量が多くなったことを確認した。【００８９】
以上の結果より、各種乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下で培養することにより、二本鎖ＲＮＡの含有量が大きい乳酸菌を効率良く得られることが確認できた。【００９０】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年５月１２日付で出願された日本特許出願（特願２０１７−０９５９４７）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の一態様の乳酸菌及び組成物並びに本発明の一態様の方法によって得られる乳酸菌及び組成物は、二本鎖ＲＮＡを含有するものであり、自然免疫系細胞応答に貢献するものであることから、抗ウイルス活性、免疫賦活活性、抗感染症活性、抗Ｂ型肝炎活性、抗Ｃ型肝炎活性、抗増殖活性、抗腫瘍活性、抗癌活性を期待する摂取個体にとって有用なものであり、このような摂取個体の健康及び福祉に資する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、サプリメントなどとして利用可能なものである。
【要約】
本発明の目的は、大量の二本鎖ＲＮＡを含有せしめる乳酸菌を効率良く得るための方法及び該方法によって得られる二本鎖ＲＮＡの含有量が大きい乳酸菌を提供することにある。上記目的は、（１）乳酸菌を、通気条件および至適温度より低温度条件の少なくとも一方の条件下の培養に供することにより、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌を得る工程を含む、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌の製造方法、及び（２）二本鎖ＲＮＡの含有量が、至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で同一の菌株を培養したときの二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上である、二本鎖ＲＮＡ含有乳酸菌などにより解決される。【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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