(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法であって、以下の連続的ステップ：
ａ．少なくとも１種の組成物を表面上に計量分配するステップであって、ここで、前記組成物は、以下：
ｉ．少なくとも１種の生体分子、ここで、前記生体分子は、核酸の増幅反応のための酵素であり、
ｉｉ．少なくとも１種の液体揮発性成分、
ｉｉｉ．２〜１０個の単糖単位から構成される少なくとも１種の多糖類であって、前記少なくとも１種の生体分子及び前記少なくとも１種の液体揮発性成分の一部と共に、ガラス転移温度Ｔgを示すマトリックスを形成するように設計されているものとする前記多糖類
を含むものとする、前記ステップ、
ｂ．前記マトリックスの形成が可能となるように前記組成物の温度を調整することによって、前記少なくとも１種の液体揮発性成分の少なくとも一部を蒸発させるステップ
を含む前記方法において、前記ステップｂ）を３０℃〜５０℃の間の初期温度Ｔ１で開始し、かつ８０℃を上回る最終温度Ｔ２で完了し、かつ、ステップｂ）を、初期温度Ｔ１で、前記組成物の液体揮発性成分の割合が１０％に達するまで行うことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記初期温度Ｔ１及び最終温度Ｔ２が前記ガラス転移温度Ｔgを上回る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記初期温度Ｔ１と前記ガラス転移温度Ｔgとの差、及び前記最終温度Ｔ２と前記ガラス転移温度Ｔgとの差が、一定のままでありかつ正である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記初期温度Ｔ１が３０℃〜５０℃であり３０分間保持し、かつ前記最終温度Ｔ２が８０℃を上回り、かつ９０℃までであり３０分間保持する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）を、前記組成物の液体揮発性成分の割合が３％に達するまで行う、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）を、前記組成物の液体揮発性成分の割合が２％に達するまで行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記初期温度Ｔ１が４０℃未満である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）でさらにガス流を使用する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記液体揮発性成分が、水又はアルコール又はそれらの混合物から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、少なくとも０．１Ｍ〜０．６Ｍのトレハロースを含有する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、少なくとも０．１５Ｍ〜０．３Ｍのトレハロースを含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、少なくとも４．０μｇ／μＬ〜８．０μｇ／μＬのウシ血清アルブミンを含有する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、少なくとも５．５μｇ／μＬ〜６．５μｇ／μＬのウシ血清アルブミンを含有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、少なくとも１．０％〜３０．０％のグリセリンを含有する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、少なくとも５．０％〜１５．０％のグリセリンを含有する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の長期貯蔵能力を高めるための該生体分子の乾燥組成物の分野に関する。
【０００２】
生物学的反応、例えばＰＣＲ又は酵素触媒反応に関与する生体分子のうち、可溶化形で安定であるものはほとんど無い。溶液中で貯蔵された場合、そのような生体分子は分解反応を生じやすく、この分解反応によって、そのような生体分子はいかなる生物学的反応にも適さない形態となる。従って、そのような液体に弱い生体分子は、その溶液中での分解を防ぐために長期貯蔵用に乾燥される必要がある。
【０００３】
しかしながら、他の成分に混じって生体分子を含有する溶液が乾燥される間に、不揮発性成分が該生体分子の安定性に極めて大きな影響を及ぼしうる。実際に、初期溶液中に極めて低濃度で存在する成分、例えば無機塩は、揮発性成分の除去中にその濃度が上昇するため、極めて高い不安定化効果を有しうる。
【０００４】
それに加えて、溶液の乾燥に使用される方法も同様に、生体分子の活性に関してクリティカルである。高温で、酵素は変性又は分解によりその活性を失いうる。
【０００５】
長期安定性に必要な乾燥状態に達するためには、米国特許第２０１０／０１５９５２９号明細書において言及されているように、液体成分を長時間（例えば１６時間）にわたって低圧（例えば２００ミリバール）下で乾燥させることによって組成物から除去することができる。このプロセスは、バッチスケールでの製造には効率的であるが、大規模製造用の製造ラインへの適用は依然として困難である。
【０００６】
用いられている他の急速乾燥のための方法は、組成物をより短時間で高温に曝す方法である。しかしながら、組成物を高温空気に直接曝すことは、生体分子の望ましくない分解につながりうる。本発明は、上記で述べた欠点の全て又は一部を改善することを目的とする。
【０００７】
本発明は、１種以上の生体分子の分解を防ぐ、前記１種以上の生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法を提供することによって、前記目的を達成するものである。本発明は、生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法であって、以下の連続的ステップ：
ａ．少なくとも１種の組成物を表面上に計量分配するステップであって、ここで、前記組成物は、以下：
ｉ．少なくとも１種の生体分子、
ｉｉ．少なくとも１種の液体揮発性成分、
ｉｉｉ．少なくとも１種の多糖類であって、前記少なくとも１種の生体分子及び前記少なくとも１種の液体揮発性成分の一部と共に、ガラス転移温度Ｔgを示すマトリックスを形成するように設計されているものとする前記多糖類、
を含むものとする、前記ステップ、
ｂ．前記マトリックスの形成が可能となるように前記組成物の温度を調整することによって、前記少なくとも１種の液体揮発性成分の少なくとも一部を蒸発させるステップ
を含む前記方法において、前記ステップｂ）を初期温度Ｔ１で開始し、かつ最終温度Ｔ２で完了し、ここで、前記最終温度Ｔ２は前記初期温度Ｔ１を上回るものとすることを特徴とする前記方法を記載するものである。
【０００８】
従って、本発明は、前記乾燥プロセスを初期温度Ｔ１で開始し、かつ前記乾燥プロセスを最終温度Ｔ２で完了することによって、上記課題を解決するものである。前記初期温度Ｔ１の目的は、温度が比較的低い間に前記液体揮発性成分の大部分をできるだけ早急に除去し、それによって前記生体分子の分解を最小限に抑えることである。前記液体揮発性成分の部分を除去することによって、前記組成物の粘度が上昇する。それにより前記生体分子の移動度が著しく低下し、これによって該生体分子の分解速度が最小化される。より高い最終温度Ｔ２によって、残留する液体揮発性成分をできるだけ多く前記組成物から除去することができ、それによって最終的には、比較的低含分の残留液体揮発性成分が存在するガラス状態とすることができる。前記生体分子の移動度は前記初期温度Ｔ１での加熱の間にすでに低下しているため、より高い温度が該生体分子の反応性に及ぼす影響はそれほど重大でないものと考えられる。
【０００９】
「多糖類」という用語は、本発明の明細書において、２〜１５個の単糖単位、好ましくは２〜１０個の単糖単位から構成される高分子量炭水化物分子として用いられる。
【００１０】
一実施形態によれば、前記初期温度Ｔ１及び最終温度Ｔ２は前記ガラス転移温度Ｔgを上回る。従って、前記プロセスの間に前記マトリックスは液状のままであり、これによって均一な分配及び前記液体揮発性成分の少なくとも一部の最適化された蒸発が可能となる。
【００１１】
一実施形態においては、前記初期温度Ｔ１と前記ガラス転移温度Ｔgとの差、及び前記最終温度Ｔ２と前記ガラス転移温度Ｔgとの差は、一定のままでありかつ正である。前記ガラス転移温度Ｔgは、前記組成物中に残留する前記液体揮発性溶剤の割合に応じて変化する。
【００１２】
一実施形態においては、前記初期温度Ｔ１は約３０℃〜約５０℃で３０分間保持され、かつ前記最終温度Ｔ２は約６０℃〜約９０℃で３０分間保持される。
【００１３】
一実施形態によれば、ステップｂ）は、前記組成物の液体揮発性成分の割合が約３％、好ましくは２％に達するまで行われる。前記生体分子は、長期間にわたる貯蔵用に設計された組成物中で、活性でかつ安定化された乾燥形のままである。従って、液体に弱い生体分子は分解しにくい。
【００１４】
本発明の一実施形態においては、ステップｂ）は、初期温度Ｔ１で、前記組成物の液体揮発性成分の割合が約１０％に達するまで行われる。前記液体揮発性成分の割合が約１０％に達すると、前記組成物は前記生体分子の移動度を著しく低下させる粘度を示す。その後、前記組成物はすぐに最終温度Ｔ２で乾燥されることができる。
【００１５】
一実施形態によれば、前記初期温度Ｔ１は４０℃未満である。
【００１６】
一実施形態においては、前記最終温度Ｔ２は８０℃を上回る。
【００１７】
一実施形態によれば、ステップｂ）でさらにガス流が使用される。本発明による前記乾燥プロセスの間の前記液体揮発性成分の蒸発によって、前記組成物の上方の蒸気圧が低下される。このようにして、前記ガス流は前記乾燥プロセスに寄与する。
【００１８】
一実施形態においては、前記液体揮発性成分は、水又はアルコール又はそれらの混合物から選択される。そのような液体揮発性成分又はその混合物は、本発明による方法に適した特性を示す。実際に、生体分子は一般に、水及び／又はアルコールを含有する溶剤に可溶である。さらに、そのような液体揮発性成分は、本発明による方法によって容易に蒸発される。
【００１９】
一実施形態によれば、前記生体分子は、核酸の増幅反応（ＰＣＲ）のための酵素である。そのような生体分子は溶液中で不安定であることが知られている。一実施形態においては、本発明による組成物は、ＰＣＲ反応を安定化させるための安定剤を含有する。
【００２０】
一実施形態においては、前記組成物は、少なくとも０．１Ｍ〜０．６Ｍ、好ましくは０．１５Ｍ〜０．３Ｍのトレハロースを含有する。
【００２１】
一実施形態によれば、前記組成物は、少なくとも４．０ｕｇ／ｕＬ〜８．０ｕｇ／ｕｌ、好ましくは５．５ｕｇ／ｕＬ〜６．５ｕｇ／ｕｌのウシ血清アルブミンを含有する。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、前記組成物は、少なくとも１．０％〜３０．０％、好ましくは５．０％〜１５．０％のグリセリンを含有する。
【００２３】
一実施形態においては、前記組成物の温度を適合させるために、本発明による方法においてラマン分光法が用いられることができる。
【００２４】
一実施形態においては、前記生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法は、以下の連続的ステップ：
ａ．少なくとも１種の組成物を表面上に計量分配するステップであって、ここで、前記組成物は、以下：
ｉ．少なくとも１種の生体分子、
ｉｉ．ガラス転移温度Ｔgを示すマトリックスの少なくとも一部を形成するように設計された、少なくとも１種のポリマー、
ｉｉｉ．少なくとも１種の液体揮発性成分
を含むものとする、前記ステップ、
ｂ．前記ポリマーが前記生体分子を含む前記マトリックスを形成しうるように前記組成物の温度を調整することによって、前記液体揮発性成分の少なくとも一部を蒸発させるステップ
を含み、ここで、前記方法は、前記ステップｂ）を初期温度Ｔ１で開始し、かつ最終温度Ｔ２で完了し、ここで、前記最終温度Ｔ２は前記初期温度Ｔ１を上回るものとすることを特徴とする。
【００２５】
本発明は、生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法の例示的かつ説明のための一実施形態を示す以下の詳細な記載によってさらに説明される。
【００２６】
本発明による生体分子の貯蔵可能な乾燥組成物を製造するための方法は、２つのステップを含む：
−  最初に、乾燥されるべき組成物を表面上に計量分配するステップ、
−  次に、前記組成物を２つの温度の間で乾燥させるための乾燥ステップ。
【００２７】
本発明による組成物は、少なくとも１種の生体分子を含有する。本発明による生体分子は、脆弱であり従って溶液中で損傷を受け易いという特性を共通に有する。そのような生体分子は、その分解を防ぐために、長期貯蔵のための極度に乾燥した状態を必要とする。本実施形態においては、前記生体分子はＰＣＲ酵素である。
【００２８】
本発明による組成物はさらに、少なくとも１種の多糖類を含有し、ここで、この多糖類は、前記少なくとも１種の生体分子及び前記少なくとも１種の液体揮発性成分の一部と共に、ガラス転移温度Ｔgを示すマトリックスを形成するように設計されている。本ケースでは、前記組成物は前記多糖類としてトレハロースを溶液中で０．２Ｍで含有する。
【００２９】
その上、本発明による組成物はさらに、前記生体分子及び前記多糖類を溶解させるための少なくとも１種の液体揮発性成分を含有し、ここで、前記液体揮発性成分は蒸発されるように設計されている。本実施形態においては、前記液体揮発性成分は水である。
【００３０】
本発明による組成物は、好ましくは、該組成物の前記生体分子の用途に適合された他の試薬を含有することができる。例えば、前記生体分子がＰＣＲ酵素である場合には、前記組成物は、ＰＣＲ増幅反応の達成に必要なプライマー又はヌクレオチド又は塩を含むことができる。好ましくは、増幅ＰＣＲ反応を安定化させるために、６．２５μｇ／μｌのウシ血清アルブミンが前記組成物に配合される。さらに、前記組成物は、前記反応において使用されるＰＣＲ酵素の市販溶液中に存在する１〜２％のグリセリンを含有する。
【００３１】
本発明による方法の第一のステップは、上記組成物を表面上に計量分配するステップである。例えば、前記組成物はノズルで計量分配され、それによりスポットが生成される。示される実施形態においては、前記表面は、ＩＶＤ装置のＰＣＲ反応チャンバーの一部である箔である。
【００３２】
前記組成物が前記表面上に計量分配された後に、本発明による方法は乾燥ステップを含む。本発明による方法は、前記マトリックスの形成が可能となるように前記組成物の温度を調整することによって、前記液体揮発性成分の少なくとも一部を蒸発させるステップを含む。前記ステップは初期温度Ｔ１で開始され、かつ最終温度Ｔ２で完了され、ここで、前記最終温度Ｔ２は前記初期温度Ｔ１を上回るものとする。
【００３３】
本実施形態においては、前記組成物は約４０℃の温度Ｔ１で３０分間保持される。他の実施形態においては、前記ステップは、前記組成物の前記液体揮発性成分の割合が約１０％に達するまで行うことができる。目標は、液体揮発性成分の割合を低下させることによって前記生体分子の移動度を低下させ、それにより該生体分子を分解しにくくすることである。その後、温度が最終温度Ｔ２へと上昇されることによって、所定の時間にわたって前記組成物が乾燥される。本ケースでは、前記組成物は約８０℃の温度Ｔ２で３０分間保持される。他の実施形態においては、前記最終温度Ｔ２は、前記組成物の液体揮発性成分の割合が約２％に達するまで保持される。
【００３４】
他の実施形態においては、前記最終温度Ｔ２は、温度を前記初期温度Ｔ１から段階的かつ連続的に上昇させることにより達成される。
【００３５】
実際には、前記組成物を含む前記表面が乾燥トンネルに挿入され、該トンネル中でかつこの表面の上方で空気流が循環されることによって、前記液体揮発性成分の蒸気の除去による乾燥が支援される。
【００３６】
好ましくは、前記初期温度Ｔ１及び前記最終温度Ｔ２は、前記ガラス転移温度Ｔgに応じて選択される。本ケースにおいては、前記初期温度Ｔ１及び最終温度Ｔ２は前記ガラス転移温度Ｔgを上回る。さらに、前記初期温度Ｔ１と前記ガラス転移温度Ｔgとの差、及び前記最終温度Ｔ２と前記ガラス転移温度Ｔgとの差は、一定のままでありかつ正である。
【００３７】
本発明の他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示された本発明の実施の参酌によって当業者には自明である。本明細書及び実施例は単に例示的なものと考えられるべきであり、本発明の真の範囲及び要旨は以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。