(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
0006449632.tif 000011
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子または、ベンゼン環に結合する１〜３個の同一もしくは異なる、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、アルキル基で置換されたモノ置換アミノ基、アルキル基で置換されたジ置換アミノ基、アルキル基で置換された置換シリル基およびアシル基からなる群から選択される置換基を表し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基またはハロゲン原子を表し；Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、フッ素原子または塩素原子を表す、
で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩。
【請求項２】
ｌｏｇＰ値が５．２以下である、請求項１に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素原子であり、Ｘ１およびＸ２が塩素原子である、請求項１または２に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブ。
【請求項５】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性の測定方法であって、下記の工程：
（１）請求項１〜３のいずれか１項に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩を、還元型グルタチオンの存在下でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと反応させる工程；および、
（２）反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含む、測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルオレセイン誘導体またはその塩、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブ、およびこれを用いたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（本明細書中、「ＧＳＴ」とも称する）は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（本明細書中、「ＧＳＨ」とも称する）との抱合体の生成反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として薬物や内在性活性代謝物のグルタチオン抱合に関与していることが知られている。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化したり、排出したりする役割を担っている。また、ＧＳＴはこれ以外にも、ステロイドホルモンの生合成・アミノ酸の分解・プロスタグランジンの生合成など、多岐にわたる機能をもつ。また、ＧＳＴのいくつかのサブタイプはがん細胞において過剰発現しており、阻害剤処理やノックダウンが細胞死を誘導することから、創薬における重要な標的と考えられている。
【０００３】
このため、ＧＳＴの活性を測定して特定疾患の診断に役立てるニーズもある。さらに、生化学の研究分野では、ＧＳＴを利用したキットが多数開発されており、ＧＳＴの活性を正確に測定するという要求は非常に高い。
【０００４】
ここで、従来提案されているＧＳＴ活性の測定方法としては、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがある。
【０００５】
吸光法（比色法）によるＧＳＴ活性の測定方法として、例えば、２，４−ジニトロクロロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて、グルタチオン化生成物の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を検出する方法が知られている。しかしながら、この方法では吸光法によるという性質上、生成物の波長に吸収を有する化合物を含む化合物スクリーニングなどにおいては、偽陽性または偽陰性を生じる可能性が非常に高く、また、感度が低いという問題もあった。
【０００６】
続いて、生物発光法によるＧＳＴ活性の測定方法として、例えば非特許文献１には、ケージドルシフェリンのニトロベンゼンスルホン酸エステルがＧＳＴによる芳香族求核置換反応（脱保護反応）を受けて生成するルシフェリンを、ＡＴＰおよびルシフェラーゼの存在下において発光させて、その発光強度からＧＳＴ活性を測定する方法が開示されている。この方法は生物発光法であることから、励起光照射の必要がなく、極めて大きなシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を達成可能であるという利点がある。しかしながら、ルシフェラーゼが必要であることから、ＧＳＴ阻害剤のスクリーニングなどにおいては、ルシフェラーゼ活性の阻害により偽陽性が生じる可能性が高く、また、活性測定の対象となりうるＧＳＴ種も限られるという問題を抱えている。
【０００７】
さらに、蛍光法によるＧＳＴ活性の測定方法として、いくつかの蛍光プローブが開発されている。例えば非特許文献２には、クレシルバイオレットのジニトロベンゼンスルホニルアミド体（ＤＮｓ−ＣＶ）からなる蛍光プローブが開示されている。このＤＮｓ−ＣＶがＧＳＴによるグルタチオン抱合反応を受けると、ジニトロベンゼンスルホン部位が脱保護され、蛍光性クレシルバイオレットが遊離する。しかしながら、In vitroにおける酵素アッセイ・細胞内ＧＳＴ活性の検出には数十μＭと高濃度のプローブが必要であり、反応性の面で他の蛍光プローブに劣る。また、脂溶性が極めて高いため、阻害剤スクリーニングなどのような実験系においては、偽陽性または偽陰性を生じる可能性が高いという問題もある。
【０００８】
非特許文献３には、極大吸収波長３９４ｎｍ／極大蛍光波長４９０ｎｍを有する市販の化合物であるモノクロロバイマン（Monochlorobimane；mBCl〉を蛍光プローブとして用いる技術が開示されている。また、非特許文献４には、極大吸収波長３９４ｎｍ／極大蛍光波長４９０ｎｍを有する化合物である６−クロロアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＣＡＤＡＮ）を蛍光プローブとして用いる技術が開示されている。これらの蛍光プローブはともに、ＧＳＴ活性によるクロロ基のＧＳＨへの置換反応によって、強蛍光性であるグルタチオン抱合体を生成する。しかしながら、両者に共通する欠点として、ＵＶ領域の励起は実験などに用いるプレートなどから強い自家蛍光を生じるため、Ｓ／Ｎ比を大きく損ねてしまうという問題がある。阻害剤のスクリーニングなどへの応用例については報告がないが、同じ波長領域に吸収・蛍光を有する化合物の割合は少なくないことから、偽陰性を生じる可能性が非常に高いと考えられる。
【０００９】
さらに、非特許文献５には、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている。これらの蛍光プローブはＧＳＴ活性によるグルタチオン化と、これに伴う脱ニトロ化反応によって大きな蛍光強度上昇を示す。このように、非特許文献５に開示された蛍光プローブは、ＧＳＴ存在下での反応性が極めて高く、比較的有用な蛍光プローブではあるということができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chem Commun (Camb). 2006 (44):4620-4622
【非特許文献２】J Am Chem Soc. 2011, 133(35):14109-14119
【非特許文献３】J. Pharm. Pharmacol. 1983, 35, 384-386
【非特許文献４】Anal. Biochem. 2002, 311, 171-178
【非特許文献５】J Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、非特許文献５に開示された蛍光プローブ（ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅ）は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が高いことから、十分なＳ／Ｎ比が得られないという問題がある。また、反応後の蛍光量子収率が０．１程度（０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中でのフルオレセインの量子収率を０．８５とした場合〉と低い。さらに、本発明者らの検討によれば、ＤＮＡＦ類を蛍光プローブとして用いると、弱酸性領域のｐＨ条件下では生成物の蛍光強度が大幅に減少するという問題もあることが判明した。
【００１２】
そこで本発明は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が低く十分に高いＳ／Ｎ比を達成可能で、かつ、弱酸性領域のｐＨ条件下における生成物の蛍光強度の減少が最小限に抑制されうるような蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、特定部位にフッ素原子または塩素原子が導入されたフルオレセイン誘導体が、上記課題を解決可能な蛍光プローブとして有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の一形態によれば、下記一般式（１）：
【００１５】
【化１】
0006449632.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはベンゼン環に結合する１〜３個の同一または異なる置換基を表し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基またはハロゲン原子を表し；Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、フッ素原子または塩素原子を表す、
で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩が提供される。
【００１７】
また、本発明の他の形態によれば、上記フルオレセイン誘導体またはその塩を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブが提供される。
【００１８】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性の測定方法であって、下記の工程：
（１）上記フルオレセイン誘導体またはその塩を、還元型グルタチオンの存在下でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと反応させる工程；および、
（２）反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含む、測定方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が低く十分に高いＳ／Ｎ比を達成可能で、かつ、弱酸性領域のｐＨ条件下における生成物の蛍光強度の減少が最小限に抑制されうるような蛍光プローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦおよびＤＮＡＦ１について、ＧＳＴによる反応前後での吸収スペクトルおよび（反応生成物の）蛍光スペクトルのｐＨ依存性を比較した結果を示すグラフである。
【図２】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＨとの酵素非依存的な反応性の指標である二分子反応速度定数ｋ２のｐＨ依存性を比較した結果を示すグラフである。
【図３】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＴによる反応前後における吸収ピーク強度および（反応生成物の）蛍光強度のｐＨ依存性を比較した結果を示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）は、実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、異なるｐＨ条件下でのＧＳＴとの反応による蛍光強度の経時的な変化を測定した結果を示すグラフである。図４（Ｂ）は、実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＴＰ１−１の存在下における反応速度（ＶＧＳＴＰ１＋ＧＳＨ）のＧＳＴＰ１−１の非存在下における反応速度（ＶＧＳＨ）に対する比（ＶＧＳＴＰ１＋ＧＳＨ／ＶＧＳＨ）を算出した結果を示すグラフである。
【図５】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＴおよび還元型グルタチオンの存在下における反応液組成の経時的な変化をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法により測定した結果を示すチャートである。
【図６】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、反応開始２７０秒後における反応液をＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）法により解析した結果を示す図である。
【図７】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、種々の種類および濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定した結果を示すグラフである。
【図８】実施例において、３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、（Ａ）ＧＳＴＡ１−１、（Ｂ）ＧＳＴＭ１−１、（Ｃ）ＧＳＴＰ１−１、および（Ｄ）ＧＳＴｎｏｂｏの４種の異なるＧＳＴを用いて酵素反応速度論を比較した結果を示すミカエリスメンテンプロットのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態を説明する。
【００２２】
本発明の一形態は、下記一般式（１）：
【００２３】
【化２】
0006449632.tif 000003
【００２４】
で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩である。
【００２５】
一般式（１）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはベンゼン環に結合する１〜３個の同一または異なる置換基を表す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。また、それぞれのベンゼン環上に２個以上の置換基が存在する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。なお、Ｒ１およびＲ２としてはともに水素原子が好ましい。
【００２６】
一般式（１）において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基またはハロゲン原子を表す。好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素原子またはフッ素原子または塩素原子であり、より好ましくは、いずれも水素原子である。
【００２７】
一般式（１）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、フッ素原子または塩素原子を表す。好ましい実施形態において、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方が塩素原子であり、特に好ましくはＸ１およびＸ２がともに塩素原子である。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、一般式（１）で表される化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素原子であり、Ｘ１およびＸ２が塩素原子である化合物またはその塩である（後述する実施例において合成されている３，４−ＤＮＡＤＣＦ）。
【００２９】
本明細書において、「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１〜６個程度、好ましくは炭素数１〜４個程度である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００３０】
本明細書において、「アルコキシ基」は、−Ｏ−アルキル基を意味し、ここで「アルキル基」は上述した定義を有する基である。
【００３１】
本明細書において、「アミノ基」は−ＮＨ２基を意味し、「モノもしくはジ置換アミノ基」は、アミノ基の水素原子の一方または双方が置換基によって置換されてなる基を意味する。前記置換基としては、例えば、アルキル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３２】
本明細書において、「置換シリル基」は、シリル基（−ＳｉＨ３基）の少なくとも１つの水素原子が置換基によって置換されてなる基を意味する。前記置換基としては、例えば、アルキル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３３】
本明細書において、「アシル基」は脂肪族アシル基または芳香族アシル基のいずれであってもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アシル基としてアルキルカルボニル基（アセチル基など）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基など）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基など）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基など）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基など）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基など）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基など）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基など）、又はアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基など）などのアシル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。これらのアシル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３４】
上記一般式（１）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、またはトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などが例示されうる。ただし、本発明に係る化合物の塩はこれらに限定されることはない。
【００３５】
一般式（１）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３６】
一般式（１）で表される本発明の化合物またはその塩は、水和物または溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒が挙げられる。
【００３７】
一般式（１）で表される本発明の化合物は、親水性の化合物であることが好ましい。本明細書では、化合物の親水性の指標として「ｌｏｇＰ値」を用いることができる。ここで、「ｌｏｇＰ値」とは、「オクタノール−水分配係数」や「ｌｏｇＰｏｗ」とも称され、ｎ−オクタノールおよび水からなる二相溶媒系の各相へのある物質の分配濃度の比の値の常用対数として定義され、値が大きいほど親油性が高い（親水性が低い）ことを意味する。なお、本明細書において、ｌｏｇＰ値の値としては、ＪＩＳ Ｚ−７２６０−１０７：２０００に記載のフラスコ振盪法により測定が可能である。また、ｌｏｇＰ値については、実測に代わって、計算化学的手法または経験的方法により見積もることも可能である。
【００３８】
計算方法としては、Ｃｒｉｐｐｅｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２７巻、ｐ２１（１９８７年））、Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２９巻、ｐ１６３（１９８９年））、Ｂｒｏｔｏ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｏｒ．”，１９巻、ｐ７１（１９８４年））、ＣＬｏｇＰ法（参考文献Ｌｅｏ，Ａ．，Ｊｏｗ，Ｐ．Ｙ．Ｃ．，Ｓｉｌｉｐｏ，Ｃ．，Ｈａｎｓｃｈ，Ｃ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１８，８６５  １９７５年）などが好ましく用いられるが、Ｃｒｉｐｐｅｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２７巻、ｐ２１（１９８７年））がより好ましい。ただし、上述したフラスコ振盪法による測定値と計算化学的手法または経験的方法によって見積もられた値とが有意に異なる場合には、フラスコ振盪法による測定値が優先するものとする。
【００３９】
本発明において一般式（１）で表される化合物のｌｏｇＰ値は、好ましくは５．２以下であり、より好ましくは５．０以下であり、さらに好ましくは４．８以下であり、いっそう好ましくは４．６以下であり、特に好ましくは４．４以下であり、最も好ましくは４．２以下である。本発明に係る化合物が、かような範囲内のｌｏｇＰ値を示す程度に親水性であると、ＧＳＴ阻害剤のスクリーニングなどの際に、一般式（１）で表される化合物と親油性が高い阻害剤との相互作用を低減することができる。このような相互作用を低減できると、偽陰性または偽陽性に基づく判定の誤りを低減することが可能となるため、好ましい。一方、一般式（１）の化合物のｌｏｇＰ値の下限値について特に制限はないが、通常は１．５以上程度のｌｏｇＰ値であれば、上述したような効果を十分に得ることができる。なお、後述する実施例において合成されている本発明に係る化合物である３，４−ＤＮＡＤＣＦのｌｏｇＰ値は４．１６である。
【００４０】
一般式（１）で表される本発明の化合物は、例えば、従来公知の文献（Synthesis 2009, 7; 1224-1226（非特許文献６）およびJ Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543（非特許文献５））に記載の手法を参照しつつ、合成することが可能である。本明細書の実施例の欄には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されており、当業者は本明細書の開示を参照することにより、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００４１】
一般式（１）で表される本発明の化合物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）測定用の蛍光プローブとして使用することができる。本発明の化合物は、中性領域（例えばｐＨ５〜９の範囲）では実質的に無蛍光である。一方、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の存在下では、本発明の化合物におけるベンゼン環のパラ位（４位）に結合しているニトロ基（−ＮＯ２基）が脱離するとともにこのパラ位（４位）がグルタチオン化され、強蛍光性の化合物となる。例えば、一般式（１）で表される化合物またはその塩は、中性領域において例えば５０５ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記のようにグルタチオン化された化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えば、蛍光波長５２５ｎｍ）を発する性質を有している。従って、本発明の化合物をＧＳＴ測定用の蛍光プローブとして使用することにより、ＧＳＴの存在を蛍光強度の変化により測定することが可能になる。
【００４２】
このことを利用して、本発明の他の形態によれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の測定方法もまた、提供される。当該測定方法は、下記の工程：
（１）本発明により提供されるフルオレセイン誘導体（一般式（１）で表される化合物）またはその塩を、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と反応させる工程；および、
（２）反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含むものである。一般式（１）で表される化合物を各種試料中のＧＳＴと反応させることで強蛍光性の化合物（グルタチオン化体）を生成させ、この化合物（グルタチオン化体）の蛍光を測定することにより、試料中のＧＳＴ活性を測定することができる。
【００４３】
上記測定方法によって活性を測定する対象であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の種類は特に制限されず、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で、一般式（１）で表される化合物のベンゼン環におけるパラ位（４位）に結合しているニトロ基を脱離させてこのパラ位（４位）をグルタチオン化できるものであればよい。例えば、図５（Ａ）および図５（Ｂ）に記載の各種ＧＳＴが例示されるが、これらに限定されることはない。
【００４４】
なお、本明細書において「測定」という用語は、検出、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。本発明の方法によるＧＳＴ活性の測定は中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で行うことができる。ここで、非特許文献５に開示されている蛍光プローブであるＤＮＡＦ１をｐＨ６．５などの弱酸性条件下で用いてＧＳＴの活性を測定すると、反応生成物の蛍光強度の低下が見られることが判明した。これに対し、本発明に係るフルオレセイン誘導体またはその塩を蛍光プローブとして用いることで、ｐＨ６．５などの酸性条件下での測定であってもかような蛍光強度の低下はほとんど見られない。したがって、本発明に係るＧＳＴ活性の測定方法の好ましい実施形態では、ｐＨ６．３〜８．５の範囲で測定が行われ、より好ましくはｐＨ６．４〜６．６の範囲で測定が行われる。
【００４５】
ＧＳＴ活性の測定方法の対象である試料の由来は特に制限されず、生体由来の試料であってもよいし、非生体由来の試料であってもよい。生体由来の試料の種類は特に制限されないが、例えば、血液、リンパ液、髄液その他の体液；細胞抽出物（ホモジネート）などが挙げられる。
【００４６】
本発明に係るＧＳＴ測定用蛍光プローブとしては、上記一般式（１）で表される化合物またはその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。
【００４８】
［合成例］
従来公知の文献（Synthesis 2009, 7; 1224-1226（非特許文献６）およびJ Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543（非特許文献５））に記載の手法を参照し、下記の合成スキームに従って本発明に係るフルオレセイン誘導体（下記の合成スキームに記載の化合物（５）（「３，４−ＤＮＡＤＣＦ」とも称する））を合成した。
【００４９】
【化３】
0006449632.tif 000004
【００５０】
上記合成スキームに記載の化合物（３）〜（５）の機器データは以下の通りである。
【００５１】
（化合物（３）の機器データ）
【００５２】
【化４】
0006449632.tif 000005
【００５３】
（化合物（４）の機器データ）
【００５４】
【化５】
0006449632.tif 000006
【００５５】
（化合物（５）の機器データ）
【００５６】
【化６】
0006449632.tif 000007
【００５７】
［ＧＳＴによる反応前後における吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルのｐＨ依存性］
上記で合成した化合物（５）（３，４−ＤＮＡＤＣＦ）および従来公知（非特許文献５に記載）の蛍光プローブであるＤＮＡＦ１（化合物（５）（３，４−ＤＮＡＤＣＦ）における２つの塩素原子がともに水素原子で置換された構造を有する化合物）について、ＧＳＴによる反応前後での吸収スペクトルおよび（反応生成物の）蛍光スペクトルのｐＨ依存性を比較した。
【００５８】
具体的には、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦおよびＤＮＡＦ１をそれぞれ１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、反応前の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。なお、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定には、それぞれ紫外・可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光株式会社製）および蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、蛍光スペクトル測定時の励起波長は４９０ｎｍとした。
【００５９】
一方、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦおよびＤＮＡＦ１をそれぞれ、１００μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および１．２μｇ／ｍｌのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら１０分間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。
【００６０】
３，４−ＤＮＡＤＣＦについての測定結果を図１の（Ａ）および（Ｂ）に示し、ＤＮＡＦ１についての測定結果を図１の（Ｃ）および（Ｄ）に示す。これらの結果から明らかなように、ｐＨ７．４の条件下では、３，４−ＤＮＡＤＣＦとＤＮＡＦ１との間で、蛍光スペクトルに違いは見られなかった。これに対し、ｐＨ６．５の条件下では、ＤＮＡＦ１の蛍光スペクトルの発光強度が３，４−ＤＮＡＤＣＦと比較して大幅に減少していることがわかる。このことから、本発明に係る蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦは、従来公知の蛍光プローブであるＤＮＡＦ１よりも、ＧＳＴ活性測定を行う際のｐＨ領域におけるｐＨ変化に対して安定であることが示された。
【００６１】
なお、図１（Ａ）（Ｃ）に示す吸収スペクトル（ｐＨ７．４）から得られる極大吸収波長（λｅｘ）および図１（Ｂ）（Ｄ）に示す蛍光スペクトル（ｐＨ７．４）から得られる極大蛍光波長（λｅｍ）を下記の表１に示す。また、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中におけるフルオレセインの量子収率を０．８４とし、これに対する相対蛍光量子収率（apparent Q. E.）を算出した結果も併せて下記の表１に示す。
【００６２】
【表１】
0006449632.tif 000008
【００６３】
［ＧＳＨとの二分子反応速度定数ｋ２のｐＨ依存性］
上記で合成した３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＨとの酵素非依存的な反応性の指標である二分子反応速度定数ｋ２のｐＨ依存性を比較した。
【００６４】
具体的には、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を終濃度２〜５ｍＭとなるように加え、室温（２５℃）で撹拌しながら時間に伴う蛍光強度変化を５分間記録した。なお、測定条件としては以下の条件を用いた：測定モード：タイムコース、パラメータは、励起／蛍光波長５０５／５２５ｎｍ、バンド幅：励起／蛍光１．５／１．５ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ。
【００６５】
測定終了後、測定により得られた単位時間当たりの蛍光強度上昇を、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００μＭ ＧＳＨおよびＧＳＴＰ１−１の存在下で反応させた際の反応生成物の蛍光強度に基づいて、単位時間当たりの濃度変化に換算した。換算された速度、使用したＧＳＨ濃度、および３，４−ＤＮＡＤＣＦ濃度から、二分子反応速度定数ｋ２を算出した。
【００６６】
上記の測定結果を図２に示す。図２に示す結果から明らかなように、本発明に係る蛍光プローブを構成する３，４−ＤＮＡＤＣＦの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との酵素非依存的な反応性を示す二分子反応速度定数ｋ２は、ｐＨ７．４の条件下よりもｐＨ６．５の条件下の方がより小さい値を示すことがわかる。つまり、３，４−ＤＮＡＤＣＦを蛍光プローブとしてＧＳＴ活性を測定するときには、ｐＨ６．５の条件下で測定を行うことで、ｐＨ７．４の条件下よりも酵素非依存的な反応の進行に起因するＳ／Ｎ比の低下が抑制されることが示された。
【００６７】
［ＧＳＴによる反応前後における吸収強度および蛍光強度のｐＨ依存性］
上記で合成した３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＴによる反応前後における吸収強度および（反応生成物の）蛍光強度のｐＨ依存性を比較した。
【００６８】
具体的には、まず、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（図３（Ａ）に示すｐＨ；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、紫外・可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光株式会社製）を用いて、各ｐＨにおける反応前の吸収強度（５０５ｎｍにおける吸光度）を測定した。結果を図３（Ａ）に示す。
【００６９】
一方、１０μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として用いた）に溶解し、１００μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および１．２μｇ／ｍｌのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）の存在下、室温（２５℃）にて撹拌しながら１０分間反応させた。これを１００ｍＭリン酸バッファー（図３（Ｂ）に示すｐＨ；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に体積の１０％となるように加え、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いて、各ｐＨにおける反応後の蛍光強度を測定した（反応生成物の最終濃度は１μＭ、励起／蛍光波長５０５／５２５ｎｍ）。結果を図３（Ｂ）に示す。
【００７０】
［異なるｐＨにおける反応性］
上記で合成した３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、異なるｐＨ条件下でのＧＳＴとの反応による蛍光強度の経時的な変化を測定した。
【００７１】
具体的には、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、７３．５ｎｇ／ｍｌのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）の存在下または非存在下、１００μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させ、蛍光強度を経時的に３０分間記録した。なお、測定条件としては以下の条件を用いた：測定モード：タイムコース、パラメータは、励起／蛍光波長５０５／５２５ｎｍ、バンド幅：励起／蛍光１．５／１．５ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ。
【００７２】
上記の測定結果を図４（Ａ）に示す。図４（Ａ）に示す結果から明らかなように、本発明に係る蛍光プローブを構成する３，４−ＤＮＡＤＣＦの酵素依存的なグルタチオン化に伴う蛍光強度の上昇は、ｐＨ６．５の酸性領域においてもｐＨ７．４の場合と同様に維持されることが確認された。またその一方で、ｐＨ６．５の酸性領域においても、酵素非依存的なグルタチオン化による蛍光強度の上昇はｐＨ７．４の場合と同程度に著しく抑制されることが示され、上述した「ＧＳＨとの二分子反応速度定数ｋ２のｐＨ依存性」の項における結果が裏付けられた。
【００７３】
さらに、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、２３．８ｎｇ／ｍｌのＧＳＴＰ１−１の存在下または非存在下、０．１μＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて反応させ、蛍光分光光度計にて蛍光強度変化を１０分間測定した。時間に対する蛍光強度変化のグラフにおける初速度（蛍光強度変化が線形）の領域を反応速度として、ＧＳＴＰ１−１の存在下における反応速度（ＶＧＳＴＰ１＋ＧＳＨ）およびＧＳＴＰ１−１の非存在下における反応速度（ＶＧＳＨ）をそれぞれ計算し、その比（ＶＧＳＴＰ１＋ＧＳＨ／ＶＧＳＨ）を求めた。ｐＨ６．５およびｐＨ７．４のそれぞれにおける実験結果を図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）に示す結果から明らかなように、ｐＨ６．５の条件下の方がＧＳＴ依存的な反応を選択的に進行させることができる。
【００７４】
［ＨＰＬＣによる酵素反応の解析］
上記で合成した３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、ＧＳＴおよび還元型グルタチオンの存在下における反応液組成の経時的な変化をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法により測定した。
【００７５】
具体的には、２０μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解し、ＧＳＴＰ１−１の存在下で、０．１μＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）で反応させ、蛍光分光光度計を用いて、時間に伴う蛍光強度の変化を測定した。反応開始後、７０秒および２７０秒後において、１００μｌの反応液に２μｌの酢酸を加えて反応を停止させ、そのうち２０μｌを用いてＨＰＬＣ解析を行った。この際、反応前、反応開始から７０秒後および２７０秒後、並びに反応終了後（反応開始から１８００秒後）の反応液をＨＰＬＣ測定に供し、波長５０５ｎｍにおける吸収による検出と、波長５２５ｎｍの蛍光（励起波長は５０５ｎｍ）による検出とをそれぞれ行った。ここで、ＨＰＬＣ解析は、ポンプ（ＰＵ−９８０）および検出器（ＭＤ−２０１５およびＦＰ−２０２５）からなるＨＰＬＣ装置（日本分光株式会社）を用い、データ取り込みおよび解析はＣｈｒｏｍＮａＶソフトウェア（日本分光株式会社）を用いて行った。また、分離カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；ジーエルサイエンス株式会社）を用いた。Ａ液：１００ｍＭ トリエチルアミン酢酸、Ｂ液：８０％アセトニトリル水溶液を用い、組成比Ａ：Ｂ＝８０：２０→０：１００（２０分間）の条件で組成比を変化させて分析を行った。
【００７６】
上記ＨＰＬＣ解析について、吸収による検出結果を図５（Ａ）に示し、蛍光による検出結果を図５（Ｂ）に示す。なお、図５（Ａ）（Ｂ）中の「Before」は反応前の結果を示し、「After」は反応終了後の結果を示す。これらの結果から明らかなように、反応前には図５（Ａ）における１５ｍｉｎのピークに相当する蛍光は図５（Ｂ）においては観察されないが、反応の進行に伴って生じる１０ｍｉｎ弱の保持時間を与える反応生成物は強蛍光性を示す。
【００７７】
続いて、反応開始２７０秒後における反応液をＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）法により解析した。具体的に、ＬＣ−ＭＳ解析は、四重極型ＬＣ−ＭＳ（Ａｌｉｇｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ／６１３０）を用いて行った。また、分離カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム（２５０ｍｍ×２．１ｍｍ；ジーエルサイエンス株式会社）を用いた。Ａ液：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ液：０．１％ギ酸 ８０％アセトニトリル水溶液を用い、組成比Ａ：Ｂ＝９５：５→５：９５（３０分間）の条件で組成比を変化させて分析を行った。ＬＣ−ＭＳ解析の結果を図６（Ａ）〜（Ｃ）に示す。ここで、図６（Ａ）は、波長４９０ｎｍの吸収による検出結果を示す液体クロマトグラフである。図６（Ｂ）は、質量分析の結果から推定されたｍ／ｚ＝８７０に対応するピークおよびこれに対応する反応生成物の化学構造を示し、また、図６（Ｃ）は、ｍ／ｚ＝６１０に対応するピークおよびこれに対応する３，４−ＤＮＡＤＣＦ（オニウムカチオン型）の化学構造を示す。
【００７８】
［種々の種類・濃度のＧＳＴを用いた場合の蛍光強度の比較］
上記で合成した３，４−ＤＮＡＤＣＦについて、種々の種類および濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定した。
【００７９】
具体的には、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの、図７（Ａ）および図７（Ｂ）に示す各種グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの存在下、１００μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させ、蛍光強度を５分ごとに３０分間記録した（励起／蛍光波長５０５／５２５ｎｍ）。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。３０分後における蛍光強度をＦ、０分におけるＧＳＴ非存在下での蛍光強度をＦ０とし、蛍光強度の上昇率（Ｆ／Ｆ０）を算出した。結果を図７（Ａ）（ＧＳＴ濃度：０．１μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌ）および図７（Ｂ）（ＧＳＴ濃度：１０μｇ／ｍｌ）に示す。図７に示す結果から、本発明に係る化合物である３，４−ＤＮＡＤＣＦを蛍光プローブとして用いることで、種々のＧＳＴの活性を極めて高感度で測定することが可能であることが示される。
【００８０】
［種々の種類のＧＳＴを用いた場合の酵素反応速度論の比較］
（Ａ）ＧＳＴＡ１−１、（Ｂ）ＧＳＴＭ１−１、（Ｃ）ＧＳＴＰ１−１、および（Ｄ）ＧＳＴｎｏｂｏの４種の異なるＧＳＴを用いて、３，４−ＤＮＡＤＣＦの酵素反応速度論を比較した。具体的には、種々の濃度の３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、１ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下、所定の濃度（ＧＳＴＡ１−１：１３ｎｇ／ｍｌ、ＧＳＴＭ１−１：３３ｎｇ／ｍｌ、ＧＳＴＰ１−１：７．９ｎｇ／ｍｌ、ＧＳＴｎｏｂｏ：５０ｎｇ／ｍｌ）になるように各酵素を加え、室温（２５℃）で５分間蛍光強度を測定した。それぞれの濃度における初速度（蛍光強度上昇が線形）を算出し、ミカエリスメンテン式Ｖ＝Ｖｍａｘ／（［Ｓ］＋ＫＭ）（Ｖｍａｘは最大反応速度、［Ｓ］は基質濃度、ＫＭはＶｍａｘ／２の速度を与える基質濃度）を用いて回帰曲線を作成した。得られたミカエリスメンテンプロットを図８（Ａ）〜（Ｄ）に示す。また、図８に示す結果から算出された各ＧＳＴにおける酵素反応速度論的パラメータを下記の表２に示す。
【００８１】
【表２】
0006449632.tif 000009
【００８２】
［種々の種類のＧＳＴを用いた場合の比活性の比較］
１０種のヒトＧＳＴ（ｈＧＳＴ）およびキイロショウジョウバエ由来ＧＳＴｎｏｂｏ（ＤｍＧＳＴｎｏｂｏ）について、比活性（タンパク質１ｍｇ当たりの活性）を比較した。具体的には、１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として用いた）に溶解し、１００μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下、室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させた。この際、酵素濃度の変化に対して反応速度が線形性を示す領域の酵素濃度を用いた。そして、マルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社）を用い、蛍光強度を１０秒ごとに１０００秒間測定した（励起／蛍光波長 ５０５／５２５ｎｍ）。それぞれの酵素濃度から得られた反応速度から、比活性（１分間当たり１ｍｇのＧＳＴが触媒する３，４−ＤＮＡＤＣＦのナノモル数）を算出した。結果を下記の表３に示す。
【００８３】
【表３】
0006449632.tif 000010
【００８４】
表３に示す結果から明らかなように、本発明に係るＧＳＴ測定用蛍光プローブは、ＧＳＴの種々のアイソザイムに対して活性を示すことがわかる。
【図１】
0006449632.tif 000012
【図２】
0006449632.tif 000013
【図３】
0006449632.tif 000014
【図４】
0006449632.tif 000015
【図５】
0006449632.tif 000016
【図６】
0006449632.tif 000017
【図７】
0006449632.tif 000018
【図８】
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