(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）バルプロ酸を添加した培地中で体細胞を培養する段階、
b）段階（a）で得られた細胞を、N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミド、BMPの阻害剤ノギン、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）の低分子阻害剤SB431542、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3β）の低分子阻害剤3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンを添加した無血清培地中で培養する段階
を含む、体細胞から神経堤細胞を産生する方法であって、体細胞または段階（a）で得られた細胞を遺伝子の導入によって遺伝子改変する段階を含まない、方法。
【請求項２】
段階b）が浮遊培養で細胞を培養する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階a）が、細胞を2日間培養する段階を含む、請求項1または２のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
段階b）が、細胞を7日間培養する段階を含む、請求項1から３のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
体細胞が線維芽細胞である、請求項1から４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
体細胞がヒト細胞である、請求項1から５のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
体細胞が、神経疾患に罹患した対象から得られたものである、請求項1から６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
c）シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞の群から選択される分化した細胞への神経堤細胞の分化に適した条件下で、段階b）の産物をインキュベートする段階
をさらに含む、請求項1から７のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、化学的に規定された培地による誘導段階の組み合わせに基づいて体細胞をマルチコンピテント神経堤細胞に分化させる方法に関する。神経堤細胞は、シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞などの多数の細胞タイプに分化することができる。
【背景技術】
【０００２】
背景
4つの重要な発生遺伝子、c-myc、Sox2、Oct4、およびKlf4の異所性発現によって体細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラムするノーベル賞受賞方法は、任意の細胞タイプへと分化することができる患者特異的多能性細胞を得るための強力なツールである（Takahashi and Yamanaka, 2006）。より最近では、異なる研究により、細胞タイプ特異的遺伝子もまた、1つの体細胞タイプを別の細胞タイプへと直接変換することができることが報告されており、このプロセスは細胞変換または分化転換として報告されている（Vierbuchen and Wernig, 2011）。このアプローチは、潜在的に腫瘍形成性の多能性細胞期を回避しながら、臨床および研究用の様々な定義された細胞を得るための有望な戦略である。
【０００３】
公知の細胞変換またはリプログラミング戦略の主要な欠点は、変換された細胞の後の応用において望ましくない効果を有しうる異所性遺伝子を導入する必要があることである。持続的で安定な発現を可能にするためには、異所性遺伝子はしばしば、ゲノムに安定に組み入れられなければならない。異所性遺伝子発現を厳密に制御することができるにもかかわらず、組み入れられた遺伝子は望ましくない効果を有しうる。例えば、がん原遺伝子c-mycを導入すると、c-mycの再活性化によりキメラ動物において腫瘍形成のリスクが増加した（Okita et al, 2007）。一般的に、ゲノムの複雑な調節機構により、遺伝子改変の長期効果を予測するのはかなり難しくなっている。
【０００４】
リプログラミングアプローチにおける遺伝子組み込みの短所を回避するために、新規方法は、重要なリプログラミング遺伝子を低分子に置き換える。Liらは、特定の遺伝子を、WntまたはTGF-β（Li et al, 2012）などの特異的シグナル伝達経路を改変する低分子に置き換えることによってiPS細胞を生成した。線維芽細胞のニューロンへの遺伝子媒介性の変換の収率および効率は、低分子によってBMP、TGFβ、およびGSK3bシグナル伝達を阻害すると大きく増加した（Ladewig et al, 2012）。これらの結果と一致して、低分子はまた、幹細胞分化の方向を決定するための貴重なツールであることも証明されている。例えば、骨形成タンパク質（BMP）およびTGF-βシグナル伝達の阻害によって、幹細胞の非常に効率的な神経誘導が起こる（Chambers et al, 2009）。
【０００５】
低分子が細胞運命の決定に影響を及ぼす機序は、完全には理解されていない。低分子は分化を誘導するためには十分であり得るが、多能性または別の体細胞タイプへの細胞変換を誘導する場合にはなおも、異所性遺伝子発現を必要とする。これは、幹細胞を体細胞に分化させる場合と比較すると、最終分化細胞の表現型を異なる細胞タイプに変化させることが、非生理的技法であるという事実による可能性がある。
【０００６】
本明細書において、体細胞を多能性神経堤細胞に変換する新規方法が提供され、本方法は、低分子処置および規定の培養条件のみに基づいており、細胞を遺伝子の導入によって遺伝子改変する必要はない。
【０００７】
本発明の新規方法は、体細胞を増殖性の神経堤様細胞期へと分化転換するために新規マルチキナーゼ阻害剤を使用する。神経堤細胞は、シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞などの多数の細胞タイプに分化することができる。
【０００８】
例えば、神経堤細胞のシュワン細胞への分化は、特異的培地と、規定のシグナル伝達経路の低分子による阻害とを組み合わせることによって誘導することができる。神経成熟シュワン細胞は、末梢神経系（PNS）の神経膠細胞である。シュワン細胞は、免疫保護、栄養供給、およびニューロンの髄鞘形成などの多数の機能を実行する。シュワン細胞の機能障害は、末梢神経系の多くの神経障害、例えば多発性硬化症または髄鞘形成疾患の原因である。
【０００９】
重要なことに、この新規細胞変換法は、いかなる異所性遺伝子の発現も必要とせず、化学的処置のみに基づく。それゆえ、新規細胞変換法は、患者特異的神経堤細胞、またはシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞などの分化した細胞を生成するための有望なアプローチとなる。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において、
a）バルプロ酸を添加した培地中で体細胞を培養する段階、
b）段階（a）で得られた細胞を、N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドを添加した無血清培地中で培養する段階、を含む、体細胞から神経堤細胞の方法が提供される。
【００１１】
1つの態様において、方法は、体細胞または段階（a）で得られた細胞を、遺伝子の導入によって遺伝子改変する段階を含まない。
【００１２】
1つの態様において、段階b）は、浮遊培養で細胞を培養する段階を含む。
【００１３】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、骨形成タンパク質（BMP）の阻害剤が添加されている。1つの態様において、BMPの阻害剤は、ノギンである。
【００１４】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）の低分子阻害剤が添加されている。
【００１５】
1つの態様において、TGFβの低分子阻害剤は、SB431542である。
【００１６】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3β）の低分子阻害剤が添加されている。
【００１７】
1つの態様において、GSK3βの阻害剤は、3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンである。
【００１８】
1つの態様において、段階a）は、細胞を2日間培養する段階を含む。
【００１９】
1つの態様において、段階b）は、細胞を7日間培養する段階を含む。
【００２０】
1つの態様において、体細胞は線維芽細胞である。
【００２１】
1つの態様において、体細胞はヒト細胞である。
【００２２】
1つの態様において、体細胞は、神経疾患に罹患した対象から得られる。
【００２３】
1つの態様において、上記の態様のいずれかに従う方法によって得られた神経堤細胞が提供される。
【００２４】
1つの態様において、方法は、c）シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞からなる群より選択される分化した細胞への神経堤細胞の分化に適した条件下で、段階b）の産物をインキュベートする段階をさらに含む。
【００２５】
1つの態様において、上記の態様のいずれかに従う方法によって得られたシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞が提供される。
【００２６】
1つの態様において、神経堤細胞、または分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞のバイオバンクが提供される。
【００２７】
1つの態様において、神経堤細胞、または分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞は、インビトロ神経疾患モデルとして用いられる。
【００２８】
1つの態様は、神経堤細胞または分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞を含む治療組成物、またはこれらの細胞を含むバイオバンクを含む。
【００２９】
1つの態様は、体細胞から神経堤細胞を産生する方法におけるN-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドの使用を含む。
【００３０】
1つの態様は、体細胞から神経堤細胞を産生する方法における3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンの使用を含む。
【００３１】
上記の態様のいずれも、単独または組み合わせで存在しうる。
[本発明1001]
a）バルプロ酸を添加した培地中で体細胞を培養する段階、
b）段階（a）で得られた細胞を、N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドを添加した無血清培地中で培養する段階
を含む、体細胞から神経堤細胞を産生する方法。
[本発明1002]
体細胞または段階（a）で得られた細胞を遺伝子の導入によって遺伝子改変する段階を含まない、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階b）が浮遊培養で細胞を培養する段階を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
段階b）の無血清培地に、骨形成タンパク質（BMP）の阻害剤が添加される、本発明1001から1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
BMPの阻害剤がノギンである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
段階b）の無血清培地に、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）の低分子阻害剤が添加される、本発明1001から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
TGFβの低分子阻害剤がSB431542である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
段階b）の無血清培地に、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3β）の低分子阻害剤が添加される、本発明1001から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
GSK3βの阻害剤が、3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンである、本発明1008の方法。
[本発明1010]
段階a）が、細胞を2日間培養する段階を含む、本発明1001から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階b）が、細胞を7日間培養する段階を含む、本発明1001から1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
体細胞が線維芽細胞である、本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
体細胞がヒト細胞である、本発明1001から1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
体細胞が、神経疾患に罹患した対象から得られる、本発明1001から1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記本発明のいずれかの方法によって得られる神経堤細胞。
[本発明1016]
c）シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞の群から選択される分化した細胞への神経堤細胞の分化に適した条件下で、段階b）の産物をインキュベートする段階
をさらに含む、本発明1001から1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
本発明1016の方法によって得られたシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞。
[本発明1018]
本発明1015の神経堤細胞、または本発明1017の分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞のバイオバンク。
[本発明1019]
神経疾患のインビトロモデルとしての、本発明1015もしくは1017の細胞または本発明1018のバイオバンクの使用。
[本発明1020]
本発明1015もしくは1017の細胞または本発明1018のバイオバンクを含む治療組成物。
[本発明1021]
体細胞から神経堤細胞を産生する方法におけるN-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドの使用。
[本発明1022]
体細胞から神経堤細胞を産生する方法における3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンの使用。
[本発明1023]
本明細書において本質的に記述される方法および使用。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】神経幹細胞（NSC）の増殖を増強して、線維芽細胞をニューロスフェア様構造に変換させることができる低分子の同定。A：化合物Bは、ESC-NSCの増殖を用量依存的に促進した。増殖をATPアッセイによって分析して、2回の実験の平均値を示す。B：化合物Bで処置した線維芽細胞は、浮遊培養中でスフェア様構造を形成した。スケールバー：200μm。C：化合物Bのキナーゼ選択性プロファイリング。オレンジ色のバーは、80％より多く阻害されたキナーゼを表す。D：他の化合物の単独または併用によって化合物B標的（化合物標的を説明文の括弧内に示した）を阻害しても、線維芽細胞のスフェア形成に対して全くまたはわずかな効果しか示さなかった。グラフは、浮遊培養3日目での、初回細胞数の変化倍率としての増殖率（左）およびスフェアの平均直径（右）を示す。棒グラフは3回の独立した実験の平均値±SDを示す。データは、Studentのt-検定を使用して評価した。*：DMSO対照と比較してp＜0.05。+：単一阻害剤と比較して化合物Bに関してp＜0.05。E：ヒト線維芽細胞を人工シュワン細胞（iSC）に変換するための実験装備の略図である。
【図２】神経堤様細胞期へのヒト線維芽細胞の変換。A〜D：スフェアから外に向かって伸びて、初期神経板マーカーSox1およびネスチンを発現する双極性細胞を有する変換11日目の二次スフェア。スケールバー：50μm。E：変換した神経堤細胞（18日目）および線維芽細胞（0日目）のフローサイトメトリーにより、線維芽細胞マーカーCD29のダウンレギュレーションおよび神経堤マーカーCD271のアップレギュレーションが明らかとなった。下のパネルは、平均蛍光強度（MFI）の定量を示す。棒グラフは、3回の独立した実験の平均値±SDを示し、データは、Studentのt-検定を用いて評価した。F〜I：変換の18日目、細胞はスフェアから外に遊走して、神経堤マーカーであるSnail、Sox10、FoxD3、およびAN2を発現した。スケールバー：100μm。J〜M：神経堤様細胞の非神経分化。特異的分化培地での培養により、脂肪細胞（J）、平滑筋細胞（K）および軟骨細胞（L、M）が形成された。スケールバー：50μm（J）、100μm（K）。
【図３】一過性前駆細胞の人工シュワン細胞（iSC）への分化。（A〜D）：iSCは、シュワン細胞マーカータンパク質を発現する。スケールバー：50μm。（E）変換効率。31日目でのPLP陽性細胞の定量。少数のPLP陽性線維芽細胞は、バックグラウンドシグナルが原因である。棒グラフは、平均値±SD（n＝3）を示す。データはStudentのt-検定を用いて分析した。（F）0日目（線維芽細胞）、7日目（初期tP）、11日目（初期tP）、18日目（後期tP）、39日目（iSC）の細胞、および一次シュワン細胞（pSC）からの全トランスクリプトーム発現プロファイルの主成分分析。主成分1（x-軸）は、データセットの変動の27.4％を占め、主成分2（y-軸）は、16.5％を占める。各細胞期は、独立した実験に由来する少なくとも2つのデータポイントによって表される。39日目でのクラスタ化したトランスクリプトームプロファイルから、プロトコールのロバストネスが示唆される。（G）39日目（iSC）対0日目（線維芽細胞）の細胞における遺伝子セット（Reactome/RONET）の濃縮マップ。赤色のノードは、iSCにおいて濃縮された遺伝子セットを表し、青色のノードは、線維芽細胞において濃縮された遺伝子セットを表す。ノードを群分けして、関連する遺伝子セットに従うその類似性によって注釈する：共有された遺伝子は、ノード間の緑色の線として表される。機能的に関連するノードのクラスタを、WordCloudを用いて要約および注釈した。少なくとも2つの独立したアッセイからのデータを分析した。（H）iSCの全パッチクランプ分析。保持電位Vh＝-80 mVから10 mV刻みの増加プロトコールで-70 mVから+40 mVまで得られた電位依存的電流。初期内向き電流が存在しないことから、電位依存的Na+チャンネルの欠如が確認されるが、外向き成分は、電位依存的K+チャンネルの存在と一貫する。（I）最大電位依存的K+電流は、線維芽細胞よりiSCにおいて有意に高い。棒グラフは、2回の独立した実験で測定した異なる細胞の平均値±SDを示す（FB：n＝12；iSC：n＝7）。データをStudentのt-検定を用いて分析した。
【図４】神経細胞と共培養したiSCの機能性。（A〜C）それぞれ、POL（A）、細胞トラッキング剤標識線維芽細胞（B）およびiSC（C）上でのNSC由来ニューロンの培養。スケールバー：100μm。iSCと共に培養したNSCニューロンは、MAP2染色面積（D）、神経突起数（E）および総神経突起長（F）によって分析したところ、より密度が高く、分岐のあるネットワークを形成する。棒グラフは、平均値±SD（n＝3）を示す。データは、Studentのt-検定を用いて分析した。*：p＜0.05。（G）iSCとラット一次DRGニューロンとの共培養。いくつかのiSCは、1つの髄鞘形成断片（矢印の先）を形成し、これはMBP染色（黄色）とニューロフィラメント（NF）染色（マゼンタ）の同時局在によって検出される。スケールバー：20μm。
【図５】iSC生成のために用いられるヒト線維芽細胞の特徴付け。（A〜C）ヒト線維芽細胞は、神経堤細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカーを発現しない。（A）線維芽細胞の位相差顕微鏡画像。スケールバー：50μm。（B）初回線維芽細胞集団が神経堤マーカーCD271を発現する細胞を含まないことを示す、線維芽細胞のフローサイトメトリー分析。（C）神経堤細胞マーカーとシュワン細胞マーカーの免疫染色。ヘキスト染色によって核を可視化した。スケールバー：50μm。（D、E）線維芽細胞培養物および誘導一過性前駆細胞は、間葉幹細胞（MSC）を含まない。免疫染色（D）およびフローサイトメトリー（E）によるMSCマーカーCD146の分析。胚幹細胞に由来するMSCを陽性対照として用いた。Dのスケールバー：50μm。
【図６】ラミニン基質に対するスフェアの接着は、化合物B処置によって媒介された。二次スフェアは、POL上で播種した2時間後に化合物Bまたは化合物B標的の単一阻害剤によって生成された。化合物B処置スフェア（上中央）のみが、接着して遊走を開始した。対照（DMSO）および単一阻害剤条件では、浮遊しているスフェアは、ウェルの中央に凝集する。スケールバー：200μm。
【図７】（A、B）31日目のMap2染色陰性によって示されるように、変換プロトコールによってニューロンは生成されなかった。核をヘキスト染色によって可視化した。スケールバー：100μｍ。（C、D）変換プロセスのあいだの全遺伝子発現プロファイル。（C）0日目（線維芽細胞）と比較して、11日目（初期tP）、18日目（後期tP）、および39日目（iSC）で差次的に発現された遺伝子（少なくとも1つの時点のあいだで＞10倍の変化）のヒートマップ。平均連結法およびユークリッド距離を用いて、全体的にダウンレギュレートされた遺伝子（青色）とアップレギュレートされた遺伝子（赤色）のクラスタを生成した。生物学的プロセスGOタームを、クラスタの注釈に使用した。各細胞期に関して、少なくとも2つの独立したアッセイからのデータを分析した。（D）神経栄養因子の差次的発現を示すヒートマップ。Log2発現比は、青色でダウンレギュレーションおよび赤色でアップレギュレーションを示す。少なくとも2つの独立した実験からのデータを示す。
【図８】POL、細胞トラッキング剤標識線維芽細胞、または細胞トラッキング剤標識iSC上でのNSC由来ニューロンの共培養の経時的変化。位相差顕微鏡画像と細胞トラッキング剤シグナル（赤色）の重ね合わせ。NSC-ニューロンは、特徴的な小さい暗い細胞体によって同定することができる。1日目、NSCニューロンは、3種類全ての表面（A〜C）に接着した。線維芽細胞と長期間共培養すると、ニューロンの凝集および不良な神経突起の伸長が起こった（E、H）。iSCとの共培養では、増殖および多細胞ネットワークの形成が起こった（F、I）。スケールバー：100μm。J：iSCとの共培養では、POL上で生育させたNSCニューロンと比較してNSCニューロン数が増加した。ニューロンは、共培養の13日目で細胞トラッキング剤陰性細胞として同定された。棒グラフは、3回の独立した実験の平均値±SDを示す。データは、Studentのt-検定を用いて評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
現行の1つの細胞タイプからもう1つの細胞タイプへの直接変換プロトコールの効率は低い。これは、多くのプロトコールが、分裂が終了した細胞タイプ、例えば心筋細胞またはニューロンを得ることを試みているという事実に部分的による可能性がある。このため変換技法は、増殖の停止を含み、それによって収率および効率がいずれも減少する。加えて、非分裂細胞は、おそらく可塑性がより低いエピジェネティックランドスケープにより、リプログラミングなどの強制的な表現型の変化を受けにくいように思われる。本明細書において、細胞を遺伝子の導入によって遺伝子改変する必要なく、線維芽細胞などの体細胞をシュワン細胞（SC）に効率よく変換する新規2段階アプローチが提供される。第1の段階において、線維芽細胞は、分裂するSC前駆細胞集団である神経堤細胞（NCC）へとリプログラムされる。NCCを増殖させて、次に第2段階において、成熟SCへと分化させることができる。シュワン細胞のほかに、NCCは、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞も生じることができる。
【００３４】
神経堤細胞は、胚形成の際に神経板の境界および非神経外胚葉を起源として、様々な細胞タイプ、例えばシュワン細胞、末梢ニューロン、メラノサイト、平滑筋細胞、および軟骨を生じる多能性細胞である。神経堤の特異化は、例えば骨形成タンパク質（BMP）、Sonic Hedgehog（Shh）、Wnt、線維芽細胞増殖因子（Fgf）、およびNotch（Stuhlmiller and Garcia-Castro, 2012）などの多数のシグナル伝達のキューによって調節される非常に複雑なプロセスである。その上、神経堤の特異化は、神経上皮運命の決定に密接に関連している。インビトロで多能性幹細胞を神経細胞に分化させても、生じるNCCはごく一部であることが多い（Chambers et al, 2009）。
【００３５】
本発明の発明者らは、神経誘導のキューとNCC特異化剤とを組み合わせると、線維芽細胞においてNCCの運命を誘導することを見出した。意外にも、本発明者らは、化合物B（N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミド、3,5-ジメチル-4-ヒドロキシ安息香酸{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-アミド塩酸塩とも呼ばれる、例えばWO03/076429を参照されたい）が体細胞の神経堤細胞へのリプログラミングを誘導できることを見出した。本発明の発明者らは、この化合物が、間葉幹細胞には影響を及ぼすことなく、神経幹細胞の増殖を選択的に促進することを示す（図1A）。
【００３６】
本明細書において、
a）バルプロ酸を添加した培地中で体細胞を培養する段階、
b）段階（a）で得られた細胞を、N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドを添加した無血清培地中で培養する段階
を含む、体細胞から神経堤細胞の方法が提供される。
【００３７】
1つの態様において、方法は、体細胞または段階（a）で得られた細胞を遺伝子の導入によって遺伝子改変する段階を含まない。
【００３８】
段階a）において体細胞を培養するために適した培地は、培養皿において特定の体細胞タイプを生育させるために適した任意の公知の培地である。例えば、線維芽細胞は、低血清の線維芽細胞培地（例えば、FibroGro、Millipore）中で生育する。
【００３９】
段階b）において細胞を培養するために適した培地は、好ましくは、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ヘパリン、デルタ様タンパク質4（Dll4）、Jagged1、Sonic Hedgehog（SHH）、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）の群から選択される1つまたは複数の増殖因子を添加した任意の無血清培地である。
【００４０】
本明細書において用いられる「体細胞」という用語は、生殖系列細胞（例えば、精子および卵子、ならびにそれらが作られる細胞（生殖母細胞））ではなく、未分化幹細胞でもない、生物の体を形成する任意の細胞を意味する。内部臓器、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て体細胞で構成される。本明細書において記述される方法において用いられる好ましい体細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチノサイトであり、好ましくは皮膚生検から得られる。
【００４１】
1つの態様において、体細胞は線維芽細胞である。本明細書において有用な線維芽細胞は、例えば肺線維芽細胞および包皮線維芽細胞である。
【００４２】
好ましくは、神経堤細胞に変換するために用いられる体細胞は、哺乳動物起源の細胞、最も好ましくはヒト起源の細胞である。前記ヒト体細胞は、健康な個体から、または患者から得ることができる。好ましくは、前記体細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチノサイトの群から選択される。これらのドナー細胞は、任意の適した供給源から容易に得ることができる。本明細書において、ヒトの体に侵襲性の技法を行うことなくドナー細胞を単離することができる供給源が好ましい。線維芽細胞を単離する方法は、当技術分野において周知である。線維芽細胞は、任意の適した供給源、例えば様々な臓器組織または皮膚組織から得られうる。好ましい線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞、および成人皮膚線維芽細胞である。本発明の特定の態様において、前記ヒト線維芽細胞は、患者から、例えば皮膚生検によって得られる（例えば、Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. George Q. Daley et al. Nature 2008; A method for the isolation and serial propagation of keratinocytes, endothelial cells, and fibroblasts from a single punch biopsy of human skin, Normand et al. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 1995）。脂肪細胞およびケラチノサイトはまた、皮膚生検または抜いた毛から容易に誘導することができ（Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells, Belmonte et al. Nature Protocols 2010）、これらもまた本発明の方法にとって好ましいドナー細胞である。神経堤細胞に変換するために適した他の体細胞は、血液試料から得た白血球細胞、または上皮細胞、または尿試料から得た他の細胞である。
【００４３】
本明細書において用いられる「神経堤細胞」は、Sox10、Snail、Twist1、Krox20、CD271、FoxD3、AN2の群から選択される神経マーカーの少なくとも1つを発現する多能性細胞のサブセットを意味する。1つの態様において、本明細書に開示される方法によって得られる神経堤細胞は、神経マーカーSox10、Snail、Twist1、Krox20、CD271、FoxD3、AN2の全てを発現する。本明細書に記述される方法によって得られる神経堤細胞はまた、「iNCC」、すなわち人工神経堤細胞とも呼ばれる。神経堤細胞は、無限に増殖することができ、シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、および脂肪細胞に分化しうる。
【００４４】
本明細書において用いられる、「リプログラミング」という用語は、体細胞をより未分化の細胞に変換するために、例えば線維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチノサイトを神経堤細胞に変換させるために必要な1つまたは複数の段階を意味する。体細胞の神経堤細胞へのリプログラミングは、本明細書に開示される方法によって達成される。
【００４５】
1つの態様において、段階b）は、浮遊培養中で細胞を培養する段階を含む。浮遊培養は、スフェア様構造の形成を促進して、それゆえ、リプログラミングを受ける細胞を選択する。本明細書において用いられる「浮遊培養」という用語は、固相支持体または培養容器に細胞が接着しない細胞の培養を意味する。細胞を浮遊培養に移すために、細胞を、例えばセルスクレイパーによって培養容器から取り出して、培養培地を含み、プレートの表面に細胞を接着させない滅菌低接着プレートに移す。このようにして、細胞を、培養皿の基質または底面に接着させることなく、浮遊させて培養する。
【００４６】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、骨形成タンパク質（BMP）の阻害剤が添加されている。1つの態様において、BMPの阻害剤は、ノギン（同義語：NOG、SYM1、SYNS1）である。
【００４７】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）の低分子阻害剤が添加されている。1つの態様において、TGFβの阻害剤は、SB431542（例えば、Laping, NJ; Grygielko E, Mathur A, Butter S, Bomberger J, Tweed C, Martin W, Fornwald J, Lehr R, Harling J, Gaster L, Callahan JF, Olson BA (2002). "Inhibition of transforming growth factor (TGF)-betal -induced extracellular matrix with a novel inhibitor of the TGF-beta type I receptor kinase activity: SB-431542". Molecular Pharmacology 62 (1): 58-64を参照されたく、例えばSigma製品番号S 4317により購入可能）である。
【００４８】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3β）の低分子阻害剤が添加されている。1つの態様において、GSK3βの阻害剤は、本明細書において「化合物21」または「CP21」とも呼ばれている3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンである；例えば、L. Gong et al; Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696を参照されたい。
【００４９】
これらの阻害剤は、単独で、または任意の組み合わせで使用されうる。これらの阻害剤の1つまたは複数の添加は、任意であり、プロセスを改善する。線維芽細胞のリプログラミング／変換は、化合物B単独によっても進行する。
【００５０】
1つの態様において、段階b）の無血清培地には、BMP、TGFβ、およびGSK3βの阻害剤が添加されている。1つの態様において、段階b）の無血清培地には、ノギン、CP21、およびSB431542が添加されている。1つの態様において、段階b）の無血清培地には、0.1〜1μg/mlノギン、0.1〜5μM CP21、および1〜50μM SB431542が添加されている。1つの態様において、段階b）の無血清培地には、0.5μg/mlノギン、1μM CP21および10μM SB431542が添加されている。
【００５１】
1つの態様は、体細胞から神経堤細胞を産生する方法における、N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドの使用を含む。
【００５２】
1つの態様は、体細胞から神経堤細胞を産生する方法における、3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンの使用を含む。
【００５３】
1つの態様において、段階a）は、細胞を2日間培養する段階を含む。
【００５４】
1つの態様において、段階b）は、細胞を7から14日間培養する段階を含む。1つの態様において、段階b）は、細胞を7日間培養する段階を含む。1つの態様において、段階b）は、細胞を14日間培養する段階を含む。
【００５５】
1つの態様において、体細胞はヒト細胞である。
【００５６】
本発明の1つの好ましい局面は、患者特異的神経堤細胞を生成する方法である。したがって、1つの態様において、体細胞は神経疾患に罹患した対象から得られる。
【００５７】
本明細書において用いられる「神経疾患」は、神経系の障害として定義され、中枢神経系（脳、脳幹、および小脳）、末梢神経系（頭蓋神経を含む）、および自律神経系（その一部が、中枢神経系および末梢神経系の両方に存在する）に関係する障害を含む。特に神経疾患は、神経堤細胞またはシュワン細胞の機能が障害される、変化する、または破壊される任意の疾患を含む。シュワン細胞に関連する神経疾患の例は、脱髄疾患、多発性硬化症、ミエロパチー、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、感染後またはワクチン接種後脳脊髄炎、末梢ニューロパチー、シュワン細胞症、シャルコーマリートゥース病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（CIDP）である。
【００５８】
本発明のもう1つの局面は、健康な個体から得た体細胞から神経堤細胞を生成する方法である。
【００５９】
「患者特異的神経堤細胞」という用語は、患者の体細胞から得られた神経堤細胞を意味し、自己神経堤細胞とも呼ばれる。本明細書において用いられる「健康な個体から得られた神経堤細胞」は、いかなる障害または疾患も有することが疑われていない個体の体細胞から得られた神経堤細胞を意味する。
【００６０】
本発明のもう1つの局面において、前述の方法のいずれかによって産生される神経堤細胞集団が提供される。好ましくは、神経堤細胞集団は患者特異的であり、すなわち疾患を有する個体から得られた体細胞に由来する。もう1つの態様において、前記細胞集団は、健康な個体から得られる。神経堤細胞は、無限に増殖することができる。培養は容易であり、十分に特徴付けられている。神経堤細胞のアリコートは、再現性よく凍結融解することが可能である。患者由来の神経堤細胞は、神経疾患の病理生理学を研究するためのインビトロ疾患関連モデルである。患者特異的体細胞の神経堤細胞への直接変換は、患者特異的神経堤細胞のバイオバンクを生成するための容易に利用可能で再現性のある技術である。したがって、本発明のさらに好ましい局面において、患者特異的神経堤細胞を含むバイオバンクが想定される。もう1つの態様において、健康な個体から得られた異なる神経堤細胞集団を含むバイオバンクが生成される。本明細書において用いられる「バイオバンク」という用語は、様々な個体または種から採取した生物試料のライブラリを意味する。保管された標本および関連データのコレクションは、脱髄疾患、多発性硬化症、ミエロパチー、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、感染後またはワクチン接種後脳脊髄炎、末梢ニューロパチー、シュワン細胞症、シャルコーマリートゥース病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（CIDP）などの神経疾患に取り組むことをねらいとする研究目的を対象とする。
【００６１】
1つの態様において、方法は、c）神経堤細胞を、シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞の群から選択される分化した細胞へと分化させるために適した条件下で段階b）の産物をインキュベートする段階をさらに含む。
【００６２】
本明細書において用いられる用語「分化する」、「分化」は、より未分化の細胞を体細胞に変換させるための、例えば神経堤細胞をシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、および脂肪細胞に変換するための1つまたは複数の段階を意味する。
【００６３】
1つの態様において、上記の態様のいずれかに従う方法によって得られたシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞が提供される。好ましくは、シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、患者特異的、すなわち疾患を有する個体から得られた体細胞に由来する。もう1つの態様において、前記細胞集団は、健康な個体から得られる。例えば、患者由来シュワン細胞は、神経疾患の病理生理学を研究するためのインビトロ疾患関連モデルである。患者特異的体細胞のシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞への変換は、患者特異的シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞のバイオバンクを生成するための容易に利用可能で再現性のよい技術である。したがって、本発明のさらに好ましい局面において、患者特異的シュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞を含むバイオバンクが想定される。もう1つの態様において、健康な個体から得られた異なるシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞集団を含むバイオバンクが生成される。本明細書において用いられる「バイオバンク」という用語は、様々な個体または種から採取した生物試料のライブラリを意味する。保管された標本および関連データのコレクションは、疾患、例えば脱髄疾患、多発性硬化症、ミエロパチー、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、感染後またはワクチン接種後脳脊髄炎、末梢ニューロパチー、シュワン細胞症、シャルコーマリートゥース病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（CIDP）などの神経疾患に取り組むことをねらいとする研究目的のために意図される。
【００６４】
好ましい態様において、この方法によって得られた神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、神経疾患の病理生理学を研究するためのインビトロモデルとして使用される。例えば、本発明の方法によって得られた神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、神経疾患を逆転させる、阻害する、または予防する化合物をスクリーニングするために用いることができる。加えて、それらは、薬剤、例えば糖尿病治療薬の神経副作用を逆転、阻害、または予防する化合物をスクリーニングするために用いることができる。好ましくは、本明細書に記述される本発明の方法によって得られた前記神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、疾患を有する対象に由来する。
【００６５】
もう1つの態様において、この方法によって得られた神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、神経疾患を処置するための新規標的および化合物をスクリーニングおよび評価するために用いられる。好ましくは、この方法によって得られた神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、神経疾患に罹患している個体に由来する。疾患を有する対象からの分化しつつある神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、ヒトバックグラウンドの模範例において薬物の安全性を早期に評価する独自の機会である。もう1つの態様において、この方法によって得られた分化したシュワン細胞は、インビトロ末梢神経系モデルとして用いられる。
【００６６】
もう1つの局面において、本発明は、前述の任意の方法によって産生された細胞を含む、または前述の任意の細胞集団を含む治療組成物を提供する。好ましくは、治療組成物はさらに、例えば人工脳脊髄液、またはリン酸緩衝食塩水を含む生理的に適合性の溶液を含む。前記治療組成物は、例えば、脱髄疾患、多発性硬化症、ミエロパチー、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、感染後またはワクチン接種後脳脊髄炎、末梢ニューロパチー、シュワン細胞症、シャルコーマリートゥース病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（CIDP）などの神経疾患を処置、予防、または安定化するために用いることができる。例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、または脂肪細胞は、処置を必要とする個体、または健康な個体からの皮膚生検によって得られ、本発明の方法によって神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞へとリプログラムされうる。本発明の1つの態様において、この方法によって得られた神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞を収集して、状態を処置するために個体に導入する。もう1つの態様において、この方法によって得られた神経堤細胞を、個体に導入する前に、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞へと分化させるために適した条件下で培養して、疾患または損傷した組織の正常な機能を交換または補助するために用いてもよい。本発明の大きい利点は、本発明が、患者特異的ヒト神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞、または移植に適した同じHLAタイプの健康な個体からの適合性の神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、もしくは脂肪細胞の本質的に無限の供給をもたらす点である。細胞治療における自己および／または適合性の細胞の使用は、免疫学的拒絶を受ける可能性がある非自己細胞の使用と比較して大きい利点を提供する。これに対し、自己細胞は、有意な免疫応答を誘発する可能性が低い。
【００６７】
本発明のもう1つの態様は、神経疾患の治療のための、ヒト神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞のバイオバンクの使用である。バイオバンクは、好ましくは、患者またはいくつかのHLAタイプを有する健康な個体から得たヒト神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞を含む。健康なドナーから得た細胞を、処置を必要とする適合性のHLAタイプの個体に移植することは、異種細胞移植片に通常関連する重要な拒絶反応の問題を回避する。通常、拒絶は免疫抑制剤またはシクロスポリンなどの抗拒絶薬の投与によって予防または低減される。しかし、そのような薬物は、有意な有害な副作用、例えば免疫抑制、発癌特性、腎毒性を有するのみならず、非常に高価である。本発明は、シクロスポリン、イムラン、FK-506、グルココルチコイド、およびラパマイシン、ならびにそれらの誘導体などの抗拒絶薬の必要性をなくすか、または少なくとも大きく低減させるはずである。
【００６８】
本発明の治療的方法に関して、神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞の哺乳動物への投与は、特定の投与様式、用量、または投与回数に限定されないと意図され；本発明は、筋肉内、静脈内、関節内、病変内、皮下、または疾患を予防もしくは処置するために適切な用量を提供するために十分な他の任意の経路を含む全ての投与様式を企図する。ヒト神経堤細胞、分化したシュワン細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、または脂肪細胞は、哺乳動物に1回または複数回投与されうる。複数回の用量を投与する場合、用量は互いに例えば1週間、1ヶ月、1年、または10年の間隔をあけてもよい。細胞を特定の細胞タイプへとさらに向かわせるために、1つまたは複数の増殖因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、低分子、または他の細胞もまた、細胞の投与前、投与時、または投与後に投与してもよい。
【００６９】
上記の態様のいずれも、単独または組み合わせて存在しうる。
【００７０】
本明細書において用いられる「幹細胞」という用語は、自己再生能を有する細胞を意味する。本明細書において用いられる「未分化幹細胞」とは、多様な範囲の細胞タイプへの分化能を有する幹細胞を意味する。本明細書において用いられるように、本明細書において用いられる「多能性幹細胞」は、多数の細胞タイプの細胞を生じることができる幹細胞を意味する。多能性幹細胞（PSC）には、ヒト胚幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）が挙げられる。ヒト人工多能性幹細胞は、例えば、当技術分野において公知の方法によって4つの規定の因子（Sox2、Oct4、Klf、c-Myc）の形質導入によって、リプログラムされた体細胞から誘導することができる。
【実施例】
【００７１】
線維芽細胞の培養およびiSC変換
SCC058包皮線維芽細胞（Millipore）を、低血清FibroGro（Millipore）中で37℃および5％CO2で培養した。変換のために、細胞7300個/cm2を1 mMバルプロ酸（VPA, Sigma）を含む線維芽細胞培地に播種した。次に、細胞を1 mM VPA、および6μg/mlポリブレン（Millipore）によって2日間処置した後、スフェア形成のためにNSC培地中で低接着プレートに移した。NSC培地は、ペニシリン/ストレプトマイシン、bFGF（20 ng/ml）、EGF（20 ng/ml）、BDNF（20 ng/ml）、ヘパリン（2 μg/ml）、Dll4（500 ng/ml）、Jagged1（500 ng/ml）、SHH（500 ng/ml、peprotech）、アスコルビン酸（0.2 mM、Sigma）、FGF8a（100 ng/ml）、10％NSC-CM（ESC-NSCsによる条件培地）、および化合物B（2μM、Roche）を添加したNeuroCult NS-A増殖培地（StemCell Technologies）からなった。
【００７２】
化合物Bは、例えばWO03/076429に記述されており、以下の構造を有する：
0006474806.tif 000002
融点PT（℃）：180〜183℃
組織名:
[3R,4R]-N-{4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼプ+アン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミド塩酸塩
【００７３】
増殖因子は全て、特に指定のない限り、R & D systemsから得た。他の阻害剤の効果を比較するために、化合物Bをそれぞれ、2μMドルソモルフィン、10μM H89（Tocris）、10μM Y27632、または10μM GSK650394（Tocris）に交換した。4日後、Accutaseによってスフェアを解離させて、500ng/mlノギン（peprotech）、10μM SB431452（Tocris）、および1μM CP21（Roche）を含む阻害剤ミクスを添加したNSC培地中で、単一細胞を低接着プレートに播種した。
【００７４】
CP21は、新規の非常に選択的なGSK3β阻害剤である：組織名3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン;L. Gong et al; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696に記述される。
0006474806.tif 000003
【００７５】
3日後、二次スフェアをポリオルニチン-ラミニン（POL）コーティング皿に播種した。接着後（24時間）、培地を、抗生物質、BDNF（20 ng/ml）、GDNF（20 ng/ml）、ラミニン（1μg/ml）、アスコルビン酸（0.2 mM）、およびジブチリル-cAMP（0.5 mM、Sigma）を添加したN2B27 (β-メルカプトエタノール（50μM）、ビタミンA不含B27サプリメント（1 :50、Invitrogen）、およびN2サプリメント（1 : 100、Invitrogen）を含む1 : 1 DMEM/F12およびNeurobasal）を含む分化培地に交換した。１日おきに培地の50％を交換した。分化の最初の7日間、培地に阻害剤ミクスを添加した。
【００７６】
神経堤様細胞を脂肪細胞および平滑筋細胞に分化させる場合、二次スフェアを、スフェアまたは単一細胞のいずれかとして増殖因子低減マトリゲル上に播種した。24時間後、培地を、DMEM、7.5％ノックアウト血清代替物（KOSR、Invitrogen）、0.5％非必須アミノ酸、1％ペニシリン＆ストレプトマイシン、0.1 μMデキサメタゾン、10μg/mlインスリン（Sigma）、および0.5μMロシグリタゾンを含む脂肪細胞形成分化培地に交換した。培地を１日おきに交換した。4週間後、細胞を4％PFAによって固定して、それぞれ、オイルレッドまたは抗SMAによって染色した。軟骨形成の場合、二次スフェアを遠心分離によって収集して、グルタミン、ピルビン酸塩、抗生物質、NEAA、10％FCS、および10 ng/ml TGFβを添加したDMEM高グルコース中でペレットとして培養した。4週間後、ペレットを4％PFAによって固定して、アリューシャンブルー染色によって分析した。
【００７７】
胚幹細胞由来神経幹細胞（ESC-NSC）を、SMAD二重阻害プロトコールを用いて既に記述されているように（Chambers et al, 2009）生成した。NSCを、bFGF（10 ng/ml）、EGF（10 ng/ml）、BDNF（20 ng/ml）を添加したN2B27中で37℃、5％CO2中でPOLコーティングプレート上で培養した。
【００７８】
化合物Bの同定に関して、NSCをPOLコーティングプレート上のN2B27中に細胞21000個/cm2で播種した。細胞の接着後（4時間）、化合物を表記の濃度で加えた。陰性対照細胞をDMSOによって処置した。細胞を4日間インキュベートした後、ATPの量を、CellTiterGlo（登録商標）キット（Promega）を用いて製造元の説明書に従って決定した。
【００７９】
iSC/NSCニューロンの共培養に関して、NSCを分化培地中で13日間培養した。NSCニューロンをAccutaseによって剥離させた後、POLのみ、線維芽細胞、またはiSC上で、NSC-ニューロン120000個/12ウェルで分化培地中に播種した。線維芽細胞およびiSCは、CFSE細胞トラッキング剤（Invitrogen、10μMで20分間）によって予め標識されていた。１日おきに、培地の50％を交換した。共培養の13日目に細胞を4％PFAによって固定した。
【００８０】
キナーゼ選択性プロファイリング
キナーゼ選択性プロファイリングは、Caliper（Perkin Elmer）のProfilerProキナーゼキットを用いて製造元の説明書に従って行った。
【００８１】
染色
全ての免疫蛍光染色に関して、細胞を4％PFAで15分間固定した。10％ロバ血清によってブロックした後、細胞を一次抗体によって終夜染色した。次に、細胞を洗浄して、Alexa 488、555、および647（Molecular Probes）にコンジュゲートした二次抗体によって染色した。核をヘキスト（Molecular Probes）によって染色した。一次抗体は、抗-Sox1（Santacruz, 1:250)、抗-ネスチン（Millipore、1：500）、抗-Sox10（Santacruz、1：200）、抗-Snail（Santacruz、1：100）、抗-FoxD3（Santacruz、1：100）、抗-AN2（Miltenyi、1：20）、抗- Plp（abcam、1：75）、抗-GalC（Millipore、1：100）、抗-S100B（abcam、1：20）、抗-MBP（Sigma、1：100）、抗-ABCA2（santacruz、1：200）、抗-Map2ab（Sigma、1：800）、抗-GFAP（DAKO、1：500)、ミエリン染色（Molecular probes）、および抗-SMA（Dako、1:100）であった。細胞を、Zeiss倒立顕微鏡を用いて撮像して、画像を、ImageJソフトウェアを用いて分析した。PlpおよびMap2染色の定量は、OperettaイメージングシステムおよびHarmony画像分析ソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて行った。
【００８２】
オイルレッド染色に関して、細胞を4％PFAで15分間固定した。PBSで洗浄後、細胞をオイルレッド染色液（0.21％オイルレッドの60％イソプロパノール溶液）中で室温で1時間インキュベートした。次いで細胞をPBSによって3〜5回洗浄して、分析した。軟骨形成に関するアリューシャンブルー染色の場合、細胞ペレットを4％PFAによって30分間固定した。ペレットをPBSで3回洗浄した後、アリューシャンブルー染色液中で室温で終夜インキュベートした。ペレットを脱染して（室温で20分間、3回）、PBSに移して分析した。
【００８３】
フローサイトメトリー
18日目に、細胞をAccutaseによって剥離させた後、条件培地中で37℃、5％CO2で2時間インキュベートして、表面抗原を再度発現させた。細胞を、一次抗体抗CD29-PE（BD Bioscience）、抗CD271-APC（Miltenyi）、または対応するアイソタイプ対照（BD Bioscience）を含むMACSランニング緩衝液（Miltenyi）中で4℃で10分間染色した後、PBSで洗浄した後、2％PFAによって1時間固定した後、PBS中で4℃で保存した。フローサイトメトリーは、BD FACS Cantorを用いて行い、データをFlowJoソフトウェアによって分析した。
【００８４】
ゲノムワイド遺伝子発現分析
総RNA抽出に関して、1.4 mmセラミックビーズおよびQIAzol溶解試薬を予め充填したチューブ中で、FastPrep-24機器（MP Biomedicals）およびDNアーゼ処理を行うQiagen miRNeasyミニキット（Qiagen）を用いて細胞をホモジナイズした。RNAの品質評価および定量は、Agilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies）においてマイクロフルイディックチップ分析を用いて行った。Biomek FXpワークステーション（Beckman Coulter）において、総RNA 10 ngを、NuGen Ovation Pico WTA Systems V2を用いて逆転写した後に断片化して、NuGen Encore Biotinモジュール（NuGEN Technologies）によって3'-ビオチン標識を行った。断片化したcDNA 4.4 μgを、Affymetrix HG-U133_plus_2マイクロアレイにおいて45℃および65 rpmで16時間ハイブリダイズさせた後、洗浄して、染色し、GeneChip Fluidics 450ステーションおよびGeneChip Scanner 3000（Affymetrix）で走査した。Affymetrixのプローブ強度を、ロバストなマルチアレイ分析（RMA）、分位数正規化によるバックグラウンド補正、およびPartek Genomics Suite 6.6ソフトウェア（Partek）において実行されるメディアンポリッシュプローブセット要約に供した。プローブセットの遺伝子名を、PartekおよびNetAffyx（Affymetrix）を用いて同定した。BROAD Instituteのアルゴリズムに基づいて、遺伝子セット濃縮分析をデータに適用した。生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を、GOタームおよびReactome/RONETに基づく遺伝子セットを用いて同定した。Cytoscapeプラグイン濃縮マップを用いて、有意性閾値を超えるGSEA結果を可視化した（p値＜0.005、偽発見率＜0.1）。遺伝子発現ヒートマップを、Tibco Spotfire 3.1.0（Tibco Software）を用いて作製した。
【００８５】
結果
化合物Bは、神経幹細胞の増殖を選択的に促進するが、間葉幹細胞に対して効果を示さないことが示された（図1A）。化合物Bが線維芽細胞においてNC前駆細胞期を誘導することができるか否かを分析するために、スフェア形成アッセイを行った。このアッセイは、多数の研究において、様々な組織から幹細胞特徴を有する細胞を同定および選択するために用いられている（Dontu et al, 2003; Seaberg et al, 2004; Toma et al, 2001; Tropepe, 2000）。化合物B処置によって、スフェアサイズおよび総細胞数がいずれも有意に増加した（図1B）。キナーゼプロファイリング（図1C）により、主要な標的AMPK、PKA、MSK1、SGK1、ROCK2、およびPKGaに対する効率的なマルチキナーゼ阻害剤（80％を超える阻害）として化合物Bが同定された。化合物B処置により増加したスフェア形成能が、これらの標的の1つまたは組み合わせの阻害によって媒介されたか否かを試験するために、スフェア形成に及ぼす特異的な単一キナーゼ阻害剤の効果を試験した。化合物B処置のみが、浮遊培養中の総細胞数を有意に増加させた。その上、平均スフェアサイズもまた、化合物B処置で最大であった（図1D）。興味深いことに、単一キナーゼ阻害剤を組み合わせても、化合物Bほど細胞数を増加させず、スフェアサイズは対照と比較してわずかに減少すら起こった。
【００８６】
初回段階としてのスフェア形成に基づいて、線維芽細胞においてNCC表現型を誘導するための最適なプロトコールを確立した（図1E）。簡単に説明すると、HDAC阻害剤であるVPAによる処置の後に、規定の神経幹細胞培地中での化合物Bによる処置によってNCC運命の誘導を行った。得られた細胞を増殖させて、浮遊培養で1回継代して、線維芽細胞の神経変換を増強して多能性幹細胞を神経堤に向かって分化させることが知られている阻害剤ミクスであるBMP、TGF-β、およびGSK3βシグナル伝達の阻害剤（Ladewig et al, 2012; Menendez et al, 2011）によってさらに処置した。次に、NCCスフェアをポリオルニチン-ラミニンコーティングプレートに播種して、分化培地に移した。スフェアの接着が播種後2時間以内に観察され、細胞はまもなく、スフェアから遊走し始めた。これに対し、スフェアが特異的単一キナーゼ阻害剤を用いて作製されている場合、スフェアの接着は大きく損なわれ、細胞の遊走は全くないか、またはごくわずか観察されたに過ぎなかった（図6）。ラミニンは、生理的なNC発生の際に、NC細胞の遊走および生存を媒介する重要なECM成分の1つである（Bronner-Fraser, 1986; Desban et al, 2006）。このように、ラミニン基質上で迅速に接着および遊走できることは、化合物B処置細胞が一定のNCC特徴を有したことを示している。
【００８７】
スフェアの接着後24時間では、細胞は、神経上皮および神経堤の両方のマーカーであるSox1およびネスチンに関して染色陽性であった。1週間後（18日目）、神経堤特異的マーカーp75、Sox10、FoxD3、Snail、およびAn2が検出され、NCC表現型へとさらに変換したことを示している。その上、線維芽細胞同一性の喪失は、線維芽細胞表面マーカーCD29のダウンレギュレーションによって示された。NCCは、様々な異なる細胞タイプを生じることができることを特徴とすることから、本発明者らは、変換された細胞がNCを起源とする非神経細胞タイプを生じることができるか否かを試験した。特異的培養培地中で培養すると、変換された細胞は、脂肪細胞（オイルレッド染色によって同定）、軟骨（アリューシャンブルーによって同定）、およびSMA陽性平滑筋細胞を生じ、その多能性分化能が確認された。要約すると、これらの結果は、化合物B処置と規定の培養条件との組み合わせが、ヒト線維芽細胞において神経堤細胞様運命を誘導するために十分であることを示唆している。本発明者らは、これらの細胞を人工神経堤細胞またはiNCCと命名した。
【００８８】
次に、本発明者らは、iNCCの成熟シュワン細胞への分化誘導を所望した。それゆえ、細胞を標準的な神経分化培地中で3〜4週間培養した。iNCCとしての初代継代における初期増殖相の後、細胞数は約50％減少して、実験終了まで同じレベルであった（図3）。3〜4週間後、細胞は、大きい星状の細胞体と多数の長い突起を有する神経膠細胞の典型的な形態を示した。60％を超える細胞がシュワン細胞マーカーPlpの染色陽性であった（図3）。加えて、細胞はシュワン細胞マーカータンパク質Krox20、S100b、GFAP、およびGalCを発現した（図3）。Map2陽性細胞は検出できず、このことは培養中にニューロンが存在しないことを示した（図7）。無処置線維芽細胞は、全てのマーカーに関して染色陰性であった（図5）。このため、iNCCはシュワン細胞へとさらに分化したと結論することができる。本発明者らは、これらの細胞を人工シュワン細胞またはiSCと命名した。
【００８９】
iSCの電気生理学的特徴を分析するために、全細胞パッチクランプ記録を行った。ISCは、活動電位を発生させることができなかったが、脱分極時に非常に高いK+電流を示し、神経膠細胞に共通の特徴である電位依存性K+チャンネルの存在を示している。線維芽細胞と比較するとK+電流は有意に高く、変換プロセスを確認した（図3）。
【００９０】
インビボで、シュワン細胞は、ニューロン前駆体およびニューロンの生育、分化、および生存を支持するために多数の機能を果たしている。さらに、その突起は、1つの軸索を別の軸索と絶縁するミエリン鞘を形成する。iSCがニューロンの分化および生存を支持することができるか否かを試験するために、共培養実験を行った。胚幹細胞に由来するヒト神経幹細胞をニューロンへと分化誘導した（NSC-ニューロン）。13日後、NSC-ニューロンを剥離させて、ポリオルニチン、細胞トラッキング剤標識線維芽細胞、またはiSCのいずれかの上に播種した。NSC-ニューロンは、3つ全ての条件で良好に接着した。POL上に播種したNSC-ニューロンは、分化し続けて、神経突起のネットワークを形成し続けた。しかし、iSCとの共培養では最初の週に、NSC-ニューロンの大量の増加が観察され、このことはNSCニューロンの増殖の増加または細胞死の減少のいずれかを示している。共培養を進行させると、iSCおよびNSCニューロンは、密度の濃い多細胞ネットワークを形成した。これに対し、線維芽細胞上に播種したNSC-ニューロンは、増殖せず、密度の濃いクラスタに凝集して、ごくわずかな神経突起が目に見える程度であった（図8）。共培養の13日目でのMap2染色により、iSCと共に培養したNSC-ニューロンが、単独または線維芽細胞と共に生育させたNSC-ニューロンより大きくより分岐のある神経突起ネットワークを形成することが確認された（図4）。画像の定量により、Map2陽性面積のみならず、神経突起の数および全長は、単独で生育させたNSC-ニューロンと比較してiSC/NSC-ニューロン共培養では有意に増加することが判明した（図4）。その上、細胞をiSCと共培養すると、ニューロンの総数もまた増加した（図8J）。このことは、iSCがニューロンの生存および分化に正の影響を及ぼしたことを示唆している。その上、線維芽細胞との共培養では、神経突起の数および長さの有意な減少が起こり、iSCの有益な効果が真にその細胞表現型によるものであり、その起源細胞タイプによるものではないことが確認された。
【００９１】
興味深いことに、本発明者らは、時に、Map2陽性神経突起および細胞トラッキング剤標識iSC突起が同時局在する領域を検出したが、これは髄鞘形成プロセスが進行していることを示している（図4）。
【００９２】
要約すると、iSCは、ニューロンの分化および生存を有意に支持し、頻度は低いもののミエリン鞘を形成することができる。このため、iSCへの変換プロセスもまた、生理的シュワン細胞の機能的特徴の採用を含むと結論することができる。
【００９３】
考察
近年、体細胞のリプログラミングまたは分化転換を報告する多数の試験から、たとえ最終分化細胞においても一定の可塑性を誘発することができること、および他の無関係な細胞タイプへの移行がなおも起こりうることが示されている。このことは、例えば神経細胞タイプのようにアクセスすることができない、またはアクセスすることが非常に難しい臨床または研究に関連する細胞を得る新しい機会を与える。しかし、現在の細胞変換プロトコールは、一般的に、規定の遺伝子の異所性発現を必要とする。これによって、望ましくないまたは予想されない様式で後の応用に影響を及ぼしうるリプログラム細胞の遺伝子改変が起こる。
【００９４】
本明細書において、本発明者らは、神経堤細胞期を経由して成熟シュワン細胞へとヒト線維芽細胞を分化転換させる新規アプローチを提示する。重要なことに、この戦略は、異所性遺伝子発現に依存せず、規定のシグナル伝達経路の単なる化学的改変に基づいている。本発明者らは、合成培地条件ならびにBMP、TGF-β、およびGSK3βの阻害剤を組み合わせると、線維芽細胞を神経堤細胞期に変換させることができる新規マルチキナーゼ阻害剤である化合物Bを導入する。これらのNCCは、さらに成熟シュワン細胞へと分化させることができる。
【００９５】
化合物Bは、スフェア形成能、浮遊培養での増殖能、およびラミニンに対するスフェアの接着によって評価した場合に、NCC表現型へと向かう第１の変換段階を誘導した。キナーゼプロファイリングにより、化合物Bの主要な標的としてAMPK、MSK1、PKA、ROCK2、PKGa、およびSGK1が同定された。これらのシグナル伝達経路のいくつかの研究から、変換プロセスの作用機序の調節に関する仮定が可能となる。たとえば、SGK1は、細胞ストレス応答に関係して、そのアップレギュレーションは、神経変性疾患における細胞死の発生と相関する（Schoenebeck et al, 2005）。それゆえ、本発明者らのアプローチにおいて、SGK1阻害は、神経の運命に向けて変換した細胞の生存を増強しうる。AMPKは、細胞の重要なエネルギーセンサーとして機能する。AMPK活性化は、リプログラミングにとって必要な糖分解代謝への移行を防止することによってIPS生成を阻害する（Vazquez-Martin et al, 2012）。そのような代謝障壁はまた、細胞を血清含有線維芽細胞培地から無血清神経培地に移す現在の変換プロトコールにおいても非常に重要でありうる。化合物Bによって媒介されるAMPK阻害は、おそらく、代謝的ストレスに対する細胞の応答を防止して、これにより継続的な糖分解を可能にして、変換プロセスにとって必要なエネルギーを提供する。
【００９６】
もう1つの化合物B標的は、Rho関連キナーゼROCK2である。いくつかの研究により、このキナーゼは解離による細胞死に関係することが示されている。このキナーゼの阻害は、ヒト胚幹細胞をサブクローニングの際にアポトーシスから保護するか、またはヒトiPS細胞の生成を改善する（Watanabe et al, 2007; Yu et al, 2011）。この変換戦略において、Rock阻害は、おそらく浮遊培養時の細胞死を防止して、スフェアを形成させるために必要である。この考え方は、Rock2阻害剤であるH89およびY27142がまた、化合物Bと同じ程度ではないものの、スフェアサイズの増加を誘導したという事実によって支持される。加えて、化合物B処置の際に限って総細胞数が増加したことは、Rock阻害がスフェアを形成させるために十分であるが、細胞を増殖させるためには十分でないことを示唆している。興味深いことに、Rock阻害は、様々な組織の正常および腫瘍細胞において増殖性の幹細胞様表現型を誘発する（Liu et al, 2012b; Terunuma et al, 2010）。さらに、Rockシグナル伝達の阻害は、神経堤細胞の遊走を促進して（Groysman et al, 2008）、神経保護作用を有する（Ding et al, 2009）。このように、スフェア形成に及ぼすその効果に加えて、Rock阻害はおそらく、遊走性の神経堤細胞の特徴を持つことを増強して、これらの細胞の生存を促進する。
【００９７】
要約すると、化合物Bは2つの方法で線維芽細胞の変換に影響を及ぼす。第一に、化合物Bは、ストレス誘導細胞死を防止して、スフェア形成を可能にすることによって、および必要な代謝状態を提供することによって、リプログラム可能な状態への移行を可能にする。第二に、化合物Bは、Shh、FGF、ならびにNotch-リガンドJaggedおよびDll4などの公知のNC特異化増殖因子の存在によっておそらく媒介される神経堤特徴を持つことを増強する。
【００９８】
化合物B処置に加えて、本明細書において提供されるアプローチは、TGFβ、BMP、およびGSK3βシグナル伝達の低分子による阻害を含む。これらの経路の改変は、胚幹細胞の分化を神経上皮および／または神経堤運命へと向けることが知られている（Chambers et al, 2009; Menendez et al, 2011）。そのため、化合物Bの処置と併用すると、Tgf-β、BMP、およびGSK3βは、神経堤に向かう変換を増強するはずである。インビボでの神経堤の特異化後、BMPおよびTGF-βシグナル伝達は、神経堤細胞の間葉細胞タイプへの非神経型分化を促進する（Chung et al, 2009; John et al, 2011; Shah et al, 1996）。このように、本発明者らのプロトコールにおけるこれらの経路の阻害は、シュワン細胞形成にとって好都合となるようにこれらの非神経細胞の形成を抑制する目的を果たす。
【００９９】
それにもかかわらず、化学的処置によって誘導され、シュワン細胞への変換の原因となる正確な機序は、なおも解明されなければならない。細胞の強制的分化転換は、人為的に誘発されて、このため、非生理的プロセスであることから、分化などの細胞運命決定の生理的なインビボプロセスのデータと比較することはかなり難しい。このことは、本明細書において提供された低分子に基づく変換のみならず、分化転換、または異所性遺伝子の過剰発現によって達成されるリプログラミングについても当てはまる。強制的な遺伝子発現および低分子処置はいずれも、重要なシグナル伝達経路の活性化または抑制を引き起こし、それらが組み合わさって、細胞同一性の変化が起こる。遺伝子に基づくアプローチとは対照的に、低分子処置では、細胞の遺伝子改変は起こらない。その上、およびおそらく、さらにより重要なことは、化学化合物による処置は、例えば化合物の濃度を変化させることによって、経路の改変をより厳密に制御することができるが、遺伝子発現レベルは制御することがかなり難しい。
【０１００】
シュワン細胞は、末梢神経系の発生、恒常性、および疾患において重要な役割を果たす（Bhatheja and Field, 2006）。これまで、ヒトシュワン細胞は、多能性幹細胞から（Liu et al., 2012a）、または末梢神経組織からの一次細胞として誘導することができる（Casella et al, 1996）。後者のアプローチは、ごく限定的な量の細胞を生じるに過ぎず、多能性幹細胞の使用は、倫理的制限、起こりうる腫瘍形成性、およびIPS細胞の場合には、異所性遺伝子の導入に関連する。線維芽細胞のiSCへの化学的変換は、多能性細胞期または遺伝子改変を伴うことなくシュワン細胞の新規供給源である。iSCは、真の変換プロセスを起源とするのではなくて、線維芽細胞培養中のまれな幹細胞集団の分化から生じるという仮説を立てることができる。実際に、いわゆる皮膚由来前駆細胞を齧歯類およびヒトから得ることができることが示されている（Toma et al, 2001; Toma et al, 2005）。これらの前駆細胞は、NC幹細胞特性を示し、同様にシュワン細胞へと分化することができる（Fernandes et al, 2004; McKenzie et al, 2006）。しかし、変換プロセスの初期では、細胞数は4日以内に2.5倍超増加した。この増殖率に達するには、初回培養中の幹細胞の割合は、皮膚におけるこの集団の報告された頻度（約１パーセント）よりはるか上のおよそ30％でなければならないであろう（Hunt et al, 2008）。このため、iSCは実際には、別の細胞表現型に向かって変換した線維芽細胞を起源としたと結論することができる。変換した細胞のシュワン細胞同一性を、神経膠の形態、多数のシュワン細胞マーカーの発現、電気生理学、ならびにインビトロでニューロンの分化および生存を効率的に支持する能力によって確認した。その上、iSCは、頻度は低いものの、インビトロでニューロンの髄鞘を形成することができるように思われた。しかし、これは、NSC由来ニューロンのサブタイプによる可能性があり、インビトロで同じ結果を達成するためには、インビボでの髄鞘形成の際に存在する追加のキューが必要でありうる。
【０１０１】
まとめると、本発明者らの研究は、遺伝子改変を行わない純粋な化学的処置によって、患者特異的ヒトシュワン細胞を生成するための有望な新しい系を提供する。これらの細胞は、インビトロでシュワン細胞の機能もしくは病理生理学を分析するための、またはニューロン-シュワン細胞共培養系における細胞相互作用モデルを開発するための有用なツールとなりうる。
【０１０２】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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