(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え真核微細藻類を含む食用ワクチンであって、
前記遺伝子組換え微細藻類は、外因性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセットを含む、
食用ワクチン。
【請求項２】
前記液胞標的化ペプチドは、配列番号１および配列番号９のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の食用ワクチン。
【請求項３】
前記コードされる外因性抗原は、前記ワクチンを摂取する標的対象において、病原体によって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘導する、請求項１または２に記載の食用ワクチン。
【請求項４】
前記ワクチンは、前記遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食用ワクチン。
【請求項５】
前記標的対象は魚である、請求項３または４に記載の食用ワクチン。
【請求項６】
前記病原体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ベータノダウイルス、および伝染性サケ貧血ウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の食用ワクチン。
【請求項７】
前記病原体はベータノダウイルスであり、前記外因性抗原は配列番号３に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の食用ワクチン。
【請求項８】
前記標的対象は家禽対象である、請求項３に記載の食用ワクチン。
【請求項９】
前記病原体はｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである、請求項８に記載の食用ワクチン。
【請求項１０】
前記外因性抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の食用ワクチン。
【請求項１１】
前記微細藻類は海生藻類である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の食用ワクチン。
【請求項１２】
前記微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の食用ワクチン。
【請求項１３】
前記微細藻類はＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである、請求項１２に記載の食用ワクチン。
【請求項１４】
前記外因性抗原は、１００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の食用ワクチン。
【請求項１５】
請求項１に記載の食用ワクチンを含む、食用組成物。
【請求項１６】
前記食用組成物は、水生動物に給餌するための食用組成物および陸生家畜に給餌するための食用組成物からなる群から選択される動物用食物組成物である、請求項１５に記載の食用組成物。
【請求項１７】
請求項４に記載の食用ワクチンを含む、食用組成物。
【請求項１８】
前記介在生物は、アルテミアおよびワムシからなる群から選択される、請求項１７に記載の食用組成物。
【請求項１９】
外因性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を含むワクチンであって、
それを必要とする対象に対する前記コードされる抗原の経口送達に使用するためのワクチン。
【請求項２０】
前記液胞標的化ペプチドは、配列番号１および配列番号９のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記コードされる外因性抗原は、前記対象において、病原体によって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘発する、請求項１９または２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記コードされる外因性抗原は、病原体に対する前記対象の抵抗性を向上させる、請求項１９または２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記対象は、水生動物、陸生家畜およびヒトからなる群から選択される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記対象は魚である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記病原体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ベータノダウイルス、および伝染性サケ貧血ウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記病原体はベータノダウイルスであり、前記外因性抗原は配列番号３に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記対象は家禽対象である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記病原体はｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記外因性抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記微細藻類は海生藻類である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓからなる群から選択される、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記微細藻類はＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記コードされる外因性抗原は、１００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１９〜３２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３４】
前記ワクチンは、食用の希釈剤、賦形剤または運搬体をさらに含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項３５】
前記ワクチンは、水生動物に給餌するための組成物および陸生家畜に給餌するための組成物からなる群から選択される動物用食物組成物として製剤化されている、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
前記ワクチンは、前記遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を含む、請求項１９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、食用ワクチンの分野に関する。特に、本発明は、組換え抗原を発現する遺伝子組換え微細藻類を含むワクチンに関し、上記組換え抗原は、上記ワクチンを直接摂取するか、あるいは介在生物（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）を介して摂取する動物において病原体に対する免疫応答を誘発する。
【背景技術】
【０００２】
疾患を抑制するための安全且つ効果的なワクチンの開発が世界的に必要とされている。ワクチンは、特定の疾患に対抗することになる抗体の産生（体液性免疫）または細胞媒介性応答を導く免疫応答を誘起することを目的とする。理想的なワクチンとは、免疫が適切な期間持続する効果的な免疫原性応答を誘発し、有害な副作用が最小限であり、経済的に実現可能であり、生産および使用が比較的簡単なものである。
【０００３】
ワクチネーション分野では、種々のタイプのワクチンおよび効果的な送達手段に焦点が置かれている。不活化ワクチン、弱毒生ワクチン、ウイルスベクターおよび細菌ベクターなどの組換えワクチン、トキソイド、ＤＮＡワクチンおよび合成ポリペプチド混合ワクチンを含め、ワクチンのタイプは多数存在する。ワクチンは、経口的または非経口的に送達可能である。関連するリスクを理由として、さらにはレシピエントの苦痛および恐怖を理由として、ワクチンの非経口投与は不便である。さらに、標的生物が水生動物あるいは多数の陸生動物である場合、非経口投与は、実用的には不可能である。
【０００４】
水産養殖は、常に成長している食料生産分野である。疾患の予防は、水産養殖の持続可能な発展を維持するための重要課題である。バイオセキュリティ（感染因子からの防護）、栄養、遺伝学、システム管理および水質を含め、最適な飼育および総合管理の実施が、水生動物の健康状態を最良にするためには重要である。しかし、病原生物の多くが日和見性であり、環境中に存在するため、全ての施設は、疾患の集団発生に対して脆弱である。さらに、種が高密度で飼育される場合、感染性疾患の因子は個体間で容易に伝染する。これまでの治療は主に、抗生物質およびワクチンの投与を含む。消費者の健康、食品の安全性の問題および耐性菌の発生に関する懸念が、水産養殖における抗生物質の使用を減少させる。さらに、ウイルス性疾患は、利用可能な抗生物質では治療できない。さらなる魚用ワクチンおよび効果的な送達手段の開発によって、水産養殖における抗生物質の使用が著しく減少することになるであろう。
【０００５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅは、世界中の水産養殖事業における主要な魚の病原体であるグラム陽性細菌の種である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅは、様々な養殖魚および野生魚に感染し、深刻な経済的損失をもたらす。ワクチネーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅの抑制については成功が限られており、従って、抗生物質の使用が、死亡率ならびにその結果としての経済的損失を減少させるための現在の主な慣行である。
【０００６】
米国特許第６，３７９，６７７号は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅのホルマリンで死滅させた細胞および濃縮された細胞外生産物から調製されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅに対する多価ワクチンを開示する。
【０００７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、水生の種ならびに動物およびヒトを冒す別の重要な病原体である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは世界中で、様々な魚種において、特に温水に生息する魚種において、見出されている。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、中国四川省のｙａ−ｆｉｓｈ（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｏｒａｘ  ｐｒｅｎａｎｔｉ）の養魚場で見出された（Ｇｅｎｇ  Ｙ．Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄａｒｙ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５９（４）：３６９−３７５，２０１２，Ａｂｓｔｒａｃｔ）。米国特許第７，２０４，９９３号は、魚用のワクチンとして、単離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅの死滅細胞を含む組成物を開示する。上記組成物は、腹腔内注射もしくは筋肉内注射、槽浸漬（ｂａｔｈ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）、経口投与、または経鼻投与によって投与されることが示唆されている。
【０００８】
伝染性サケ貧血（ＩＳＡ）ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓａｌｍｏｎ  ａｎｅｍｉａ  （ＩＳＡ）  ｖｉｒｕｓ）は、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、イサウイルス（Ｉｓａｖｉｒｕｓ）属のウイルスである。ＩＳＡは、養殖されるタイセイヨウサケの重篤な疾患である。ＩＳＡはノルウェーで１９８４年に初めて検出され、重度の貧血および循環障害によって特徴付けられた。魚用の他のウイルスワクチンと同様、不活化全ウイルスをベースとしたＩＳＡに対する市販ワクチンの実地における有効性は疑わしい。
【０００９】
ウイルス性神経壊死症（ｖｉｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）（ＶＮＮ）は、世界中で経済的に重要ないくつかの魚種の主要な病原体である神経壊死症ウイルス（ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＮＮＶ）によって引き起こされる。ＮＮＶは、非エンベロープ型低分子一本鎖センスＲＮＡウイルスである。ベータノダウイルス（Ｂｅｔａｎｏｄａｖｉｒｕｓｅｓ）は、ウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）またはウイルス性の脳症および網膜症（ｖｉｒａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）（ＶＥＲ）を引き起こす。４０種超の魚種（その大半は海生である）がベータノダウイルスに感染しやすいと報告されていた（Ｎａｋａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌｉ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，６１（３）：１９８−２０７  ２００９）。不活化ベータノダウイルスを用いた免疫化が、ハタ（ｇｒｏｕｐｅｒ）の仔魚をＶＮＮから防護するための効果的な戦略として提案されていた。効果的なＮＮＶワクチンは、ＮＮＶへの感染が生じてしまう前の初期仔魚期に投与されなければならない。仔魚のサイズが小さいため、ならびに仔魚はストレスに対して敏感であるため、注射または浸漬よりも経口ワクチン接種の方が、より好適な免疫化手段である。
【００１０】
サルモネラ感染症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は世界中で、ヒトにおける胃腸炎の主要な原因であり、生または調理されていない家禽肉製品の消費と関連していることが多い。腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）で汚染された卵は、非常に多くのヒトの病気に関連しており、公衆衛生上の懸念であり続けている。腸内の腸炎菌の数を大幅に減少させることが、ワクチネーションの所望の目的である。弱毒生ワクチンは、家禽産業、家禽の繁殖および産卵家禽において広く使用される。このタイプのワクチンの使用には幾つかの欠点があり、これは主に、弱毒化された形態の病原体が危険な形態に戻り得る、および、さらにはその病原体が他の動物に感染する可能性があるというリスクが僅かに存在するためである。腸管免疫応答を刺激するであろう如何なる生きた形態の病原体も含まないワクチンは、家禽産業にとって非常に有利なものとなり得る。
【００１１】
コストがかからず、且つ、骨の折れる努力を必要としない、水産養殖場ならびに陸生動物にワクチンを投与するための経路が必要とされている。これらの目的には、ワクチンの経口投与が理想的であろう。ヒトに対するワクチンの経口送達も望ましく、これは、この投与様式が専門の人材を必要とせず、非経口投与に伴う不快感を防ぐためである。経口送達を成功させるには、食品または飼料組成物へと抗原を処理する間に生じる可能性がある、および動物またはヒトの消化管を介した送達中に生じる可能性がある化学的分解および酵素的分解から抗原が保護されるべきである。さらに、抗原は、動物への侵入または標的となる到達場所への接近を妨げる構造的障壁を克服するべきである。
【００１２】
微細藻類（単細胞藻類または植物プランクトン）は、地球上で最大の、しかし最も解明されていない微生物の界である。陸生動物に対する植物のように、微細藻類は、水中の食物連鎖において、全ての植物栄養素の天然の栄養基盤および一次供給源となる。ワクチン生産のために藻類を使用することで、低コスト、安全性および容易なスケールアップなどのいくつかの利点が提供される。
【００１３】
藻類における組換えタンパク質の発現が報告されており、藻類細胞内で、特に細胞プラスチド内で、外因性タンパク質を生産するために、様々な方法が利用可能である。国際（ＰＣＴ）出願公開第ＷＯ２０１１／０６３２８４号は、ラン藻などの原核生物ならびに藻類および植物などの真核生物を含む、光合成生物において治療タンパク質を発現する方法を開示する。真核生物の形質転換は、好ましくはプラスチドゲノムに対して、通常はクロロプラストゲノムに対して、行われる。
【００１４】
米国特許第７，４１０，６３７号および第８，２８２，９１５号は、宿主動物への生物活性タンパク質の送達のための送達システムおよび方法を開示する。提供されるシステムおよび方法は、プロモーターに機能可能に連結された生物活性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された藻類細胞を得ることを含む。説明される一実施形態では、生物活性タンパク質は抗原エピトープであり、動物への投与後、藻類細胞は、宿主動物において免疫応答を誘導する。
【００１５】
国際（ＰＣＴ）出願公開第ＷＯ２００２／０７６３９１号は、水産養殖または農業において飼料成分として使用される微生物細胞であって、外因性のペプチド、タンパク質、および／または抗体も含有する微生物細胞の使用を開示し、上記外因性のペプチド、タンパク質、および／または抗体が、ウイルス性病原体または細菌性病原体に対する抵抗性または免疫をもたらすか、さもなければ、上記微生物細胞を摂取する種の健康状態およびパフォーマンスを改善する。微生物細胞は、酵母、真菌、細菌、または藻類であってよい。タンパク質および／または抗体は、微生物それ自体に対する直接的な遺伝子改変によって、または目的のタンパク質を発現するよう改変されたウイルスで微生物を感染させることによって、微生物細胞内で発現されてよい。
【００１６】
国際（ＰＣＴ）出願公開第ＷＯ２００８／０２７２３５号は、水生動物に感染する病原体の１種以上の重要なエピトープを特異的に標的とする組換え分子を発現する遺伝子改変された微細藻類を水生動物に直接的または間接的に給餌することによる、水生動物における疾患または障害の予防、改善または治療のための方法を開示する。
【００１７】
米国特許出願公開第２０１１／００１４７０８号は、遺伝子導入を促進するためにタンパク質酵素溶液によって藻類の細胞壁を弱体化または除去することを含む、外来の所望の遺伝子産物を藻類において生産する方法、および、遺伝子組換え藻類またはその後代を含む飼料組成物を開示する。またこの発明は、藻類におけるウシラクトフェリシン（ＬＦＢ）の発現のための修飾核酸も提供する。
【００１８】
本発明の優先日より後に公開された、本発明の発明者に属する国際（ＰＣＴ）出願公開第ＷＯ２０１４／０３０１６５号は、外因性の生物活性タンパク質を発現する遺伝子組換え微細藻類、ならびに上記生物活性タンパク質の動物およびヒトへの経口送達のための上記遺伝子組換え微細藻類の使用を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかし、生産および使用が容易で、抗原の免疫原性活性を維持し、且つ生物による抗原の吸収を促進する、ワクチネーションのための効果的な経口送達システムの必要性が未だ満たされずに存在し、このような経口送達システムを有することは非常に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、病原体に対する標的生物の効果的な免疫をもたらす、藻類をベースとした食用ワクチンを提供する。本発明は、免疫原性形態で所定の細胞内コンパートメント内に局在する少なくとも１種の外因性抗原を発現する遺伝子組換え微細藻類を含むワクチンを提供する。抗原を発現する微細藻類は、水生動物および陸生動物ならびにヒトへの給餌に適用可能な、食物または食物添加物として使用される。食用ワクチンは、免疫原性活性があることによって特徴付けられ、病原体に対する標的生物の抵抗性を増加させることになる少なくとも１つの免疫応答を誘起する。標的生物は遺伝子組換え微細藻類を直接摂取できるか、あるいは、介在生物を介して間接的に摂取できる。
【００２１】
本発明は、遺伝子組換え藻類を経口摂取する動物あるいは遺伝子組換え微細藻類を給餌された生物を摂取する動物において、発現された抗原が活性のあるままであり、その免疫原性活性を発現するということを開示する。通常、抗原は、その完全な形態のままである。予想外なことに、介在生物を介して間接的に遺伝子組換え微細藻類が摂取される場合にも、抗原は標的生物において免疫原性応答を誘発する。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、維持される抗原の免疫原性活性は、完全体の微細藻類内でのその局在に起因する可能性があり、そのため、微細藻類細胞は、動物の消化管および／または胃における分解から抗原を保護する天然の封入材料としてはたらく。ある典型的な本発明の実施形態によれば、抗原は微細藻類の細胞内コンパートメントに、特に液胞に局在する。藻類の液胞に局在することで、プロテアーゼ分解からのさらなる保護、および免疫原性応答が誘発される標的動物の腸から血流への抗原の効率的な移動がもたらされる。
【００２２】
従って、一態様によれば、本発明は、外因性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を含む食用ワクチンを提供し、コードされる外因性抗原は、微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内に局在する。
【００２３】
抗原が局在する遺伝子組換え微細藻類の細胞内コンパートメントは、微細藻類の種類、発現される抗原のタイプおよび給餌される動物の種類に依存する。ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００２４】
ある例示的実施形態によれば、外因性抗原は微細藻類細胞の液胞内に局在する。これらの実施形態によれば、発現カセットは、液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を有する液胞標的化ペプチドをコードする。ある実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする。ある例示的実施形態によれば、液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６および配列番号１０のうちのいずれか１つに示される核酸配列を有する。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００２５】
ある他の例示的実施形態によれば、外因性抗原は、微細藻類細胞の小胞体（ＥＲ）内に局在する。これらの実施形態によれば、発現カセットは、ＥＲ標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ小胞体（Ｂｉｐ）リーダー配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を有するＥＲ標的化ペプチドをコードする。ある実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ小胞体（Ｂｉｐ）リーダー配列をコードする。ある例示的実施形態によれば、ＥＲ標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５に示される核酸配列を有する。
【００２６】
ある実施形態によれば、抗原は、遺伝子組換え微細藻類を含むワクチンを摂取する標的対象において、病原体によって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘導する。
【００２７】
ある実施形態によれば、ワクチンは、遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を含む。これらの実施形態によれば、抗原は、介在生物を含むワクチンを摂取する標的対象において免疫応答を誘導する。ある例示的実施形態によれば、介在生物は微細藻類を給餌される。さらなる実施形態によれば、介在生物は、標的動物対象用の食物源として使用されることが知られている。一部の実施形態によれば、標的動物は魚である。ある例示的実施形態によれば、魚は、その仔魚形態または後期仔魚形態である。一部の実施形態によれば、遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物は、アルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）およびワムシ（ｒｏｔｉｆｅｒ）からなる群から選択される。
【００２８】
一部の実施形態によれば、誘導される免疫応答は、病原体に対する標的対象の抵抗性を付与するか、増大させる。
【００２９】
ある実施形態によれば、標的対象は、水生動物、陸生動物およびヒトからなる群から選択される。
【００３０】
ある例示的実施形態によれば、標的水生動物は魚である。
【００３１】
一部の実施形態によれば、発現される抗原は、病原体によって引き起こされる疾患に対して、上記ワクチンを摂取する魚をワクチネーション（ｖａｃｃｉｎａｔｅ）する。ある実施形態によれば、病原体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ベータノダウイルスおよび伝染性サケ貧血ウイルスからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００３２】
一部の例示的実施形態によれば、抗原は、ベータノダウイルス属（神経壊死症ウイルス、ＮＮＶ）のカプシドタンパク質またはそのフラグメントである。さらなる実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、神経壊死症ウイルス（ＮＮＶ）カプシドタンパク質の配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を含むアミノ酸配列をコードする。ある例示的実施形態によれば、ＮＮＶカプシドタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。ある例示的実施形態によれば、ＮＮＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示される核酸配列を含む。
【００３３】
一部の実施形態によれば、発現される抗原は、病原体によって引き起こされる疾患に対して、上記ワクチンを摂取する家禽をワクチネーションする。ある他の実施形態によれば、病原体は、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである。
【００３４】
さらなる追加的な実施形態によれば、発現される抗原は、病原体によって引き起こされる疾患に対して、上記ワクチンを摂取するヒト対象をワクチネーションする。ある実施形態によれば、病原体は、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからなる群から選択される。
【００３５】
他の例示的実施形態によれば、抗原は、フラジェリンタンパク質またはそのフラグメントである。さらなる実施形態では、フラジェリンは、腸炎菌のものである。ある実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、腸炎菌フラジェリンの配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を含むアミノ酸配列をコードする。例示的実施形態によれば、フラジェリンは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。ある例示的実施形態によれば、フラジェリンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に示される核酸配列を含む。
【００３６】
様々な種類の微細藻類が、本発明の教示に従って使用可能である。ある実施形態によれば、本発明の教示に従って使用される微細藻類は、海生微細藻類である。ある実施形態によれば、微細藻類は、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ；Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａを含むＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．；Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉを含むＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．；Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ；Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．；Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ；Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ；およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００３７】
ある特定の実施形態によれば、微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．およびＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．からなる群から選択される。
【００３８】
他の特定の実施形態によれば、微細藻類はＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである。
【００３９】
本発明の遺伝子組換え微細藻類は、これを摂取する標的対象において免疫原性応答を誘起する任意の抗原を発現するように形質転換され得る。
【００４０】
ある実施形態によれば、発現される抗原の分子量は、１００ｋＤａ以下である。他の実施形態によれば、発現される抗原の分子量は、９０ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、７０ｋＤａ以下または６０ｋＤａ以下である。他の実施形態によれば、発現される抗原の分子量は、１〜５０ｋＤａの範囲である。
【００４１】
さらなる実施形態によれば、本発明は、本発明のワクチンを含む食用組成物を提供する。一部の実施形態によれば、食用組成物は動物用食物組成物である。例示的実施形態によれば、動物用食物組成物は、水生動物への給餌用である。一部の実施形態によれば、動物用食物組成物は、陸生家畜への給餌用である。他の実施形態によれば、動物用食物組成物は、家禽への給餌用である。上述したように、食用組成物は、ワクチンの経口送達のために使用される。
【００４２】
さらなる態様によれば、本発明は、それを必要とする対象への抗原の経口送達のための方法を提供し、上記方法は、外因性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を含むワクチンの有効量を対象に経口投与することを含み、コードされる外因性抗原は、微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内に局在する。ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００４３】
ある特定の実施形態によれば、コードされる外因性抗原は、微細藻類細胞の液胞内に局在する。他の特定の実施形態によれば、外因性抗原は、微細藻類細胞の小胞体内に局在する。
【００４４】
ある実施形態によれば、ワクチンは、食物組成物中において投与される。上記組成物は、本明細書において上述される食物組成物のいずれかである。微細藻類は、本明細書において上述される微細藻類のいずれかである。
【００４５】
ある実施形態によれば、外因性抗原は、ワクチンを摂取する対象において免疫応答を誘発する。一部の実施形態によれば、外因性抗原は、病原体によって引き起こされる疾患に対して対象をワクチネーションする。
【００４６】
ある実施形態によれば、対象は、水生動物、陸生動物およびヒトからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。一部の実施形態によれば、対象は魚である。
【００４７】
ある実施形態によれば、動物対象は、水生動物または陸生動物である。任意選択で陸生動物は、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、家禽等を含む、食用目的または非食用目的（後者は、限定されるものではないが、労働用動物、ペット等を含む）で育成される任意の動物であってよい。任意選択で水生動物は、食用目的または非食用目的（後者は、限定されるものではないが、観賞用等を含む）で育成される任意の動物であってよい。
【００４８】
さらなる態様によれば、本発明は、動物対象への抗原の経口送達のための方法を提供し、上記方法は、
（ａ）外因性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え微細藻類の有効量を介在生物に経口投与するステップであって、コードされる外因性抗原が微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内に局在し、それにより遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を得る、ステップと、
（ｂ）遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物の有効量を動物対象に経口投与するステップと、
を含む。
【００４９】
ある実施形態によれば、動物対象は、水生動物および陸生動物からなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００５０】
ある実施形態によれば、抗原は、対象において免疫原性応答を誘起し、上記免疫原性応答は、病原体によって引き起こされる疾患に対して有効である。
【００５１】
一部の実施形態によれば、対象は魚である。ある実施形態によれば、介在生物は、アルテミアおよびワムシからなる群から選択される。
【００５２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、藻類細胞におけるＮＮＶカプシドタンパク質の発現を示す。ＨＡをタグ付けされた液胞標的化ＮＮＶカプシドタンパク質（６４２と命名）、およびＨＡをタグ付けされ、さらに膜移行配列（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＭＴＳ）を含む液胞標的化ＮＮＶカプシドタンパク質（６４３と命名）を発現する形質転換された藻類の抽出物において発現を検出した。総タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。陰性対照は、野生型の藻類（形質転換されていない藻類）から得られた抽出物である。
【図２】図２は、藻類において発現される液胞標的化タンパク質が、藻類を摂取するアルテミアに、その完全なままのサイズで送達されることを示す。ＷＴ、または、液胞標的化ＧＦＰを発現する藻類（図２Ａ）、または、ヘマグルチニンエピトープタグ（ＨＡ）をタグ付けされた液胞標的化魚類成長ホルモンをそれぞれ発現する２つの藻類系列（図２Ｂ；ＡおよびＢ）を、表示される幾通りかの時間、アルテミアに給餌した。その後、アルテミアを洗浄して、総タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして、ウェスタンブロット分析に供した。メンブレンを抗ＧＦＰ（図２Ａ）または抗ＨＡ抗体（図２Ｂ）のいずれかと反応させた。
【図３】図３は、藻類において発現される液胞標的化ＧＦＰが、その機能的形態でアルテミアに送達されることを示す。ＷＴ（図３Ａ）、またはＧＦＰを発現する藻類（図３Ｂ）をアルテミアに給餌し、次に、給餌から４時間後に蛍光双眼鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｎｏｃｕｌａｒ）下でＧＦＰの蛍光についてアルテミアを分析した。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、それを必要とする生物へのワクチンの経口送達のための組成物および方法を提供する。とくに、本発明は、抗原を発現する遺伝子組換え微細藻類、および、それを含む食用組成物を提供する。本発明は、抗原を微細藻類から、それを摂取する対象へと直接転換するか、あるいは介在生物を介して転換して、さらに、その活性を維持し、上記対象の細胞または組織において免疫原性応答を誘起させることができるということを開示する。本発明のある典型的実施形態によれば、抗原は微細藻類の細胞内コンパートメントに、特に液胞に、局在する。
【００５５】
本明細書において上述され、および世界中で使用される、動物の疾患に対するワクチンの大半は、弱毒生形態または死滅形態のいずれかの全生物ワクチンである。しかし、弱毒化された形態の病原体は危険な形態に戻り得る、および弱毒化された形態の病原体はそれでも免疫不全のワクチンレシピエント（ＡＩＤＳを有するレシピエントなど）において疾患を引き起こすことができる可能性がある他、環境中に漏れ出す可能性もあるというリスクが僅かに存在する。本発明の原理に従って利用されるように、ワクチンが単一抗原またはいくつかの特異抗原エピトープをベースとする場合には、このリスクは存在しない。さらに、これらのタイプのワクチンに副作用がある可能性は、より低い。
【００５６】
定義
用語「微細藻類」または「微細藻類（複数）」は、本明細書において、その最も広い範囲において使用され、淡水系および海洋系において通常見出される単細胞微小真核藻類を指す。微細藻類のサイズは、その種類に応じて、数マイクロメートル（μｍ）から数百マイクロメートルの範囲にわたることがある。ある現在の特定の実施形態によれば、上記用語は海生真核微細藻類または海生真核微細藻類（複数）を指す。
【００５７】
用語「ワクチン」は、対象において特定の疾患に対する免疫を向上させるか、誘導する免疫原性組成物を指す。ワクチンは通常、疾患を引き起こす生物の少なくとも１種の構成要素（抗原）に類似するか、それを構成する、免疫原性因子を含む。上記因子は免疫系を刺激し、その結果、免疫系は、それが後に遭遇する、対応する病原体をより容易に特定できる。抗原が由来する病原生物による宿主動物の後の感染が、防がれるか、疾患を引き起こさないか、または、疾患が生じた場合には疾患もしくは疾患に関連する症状が改善されることになるという意味で、抗原によって誘発される免疫応答または防御応答は、宿主動物において保護性である。好ましくは、抗原自体は、標的動物において疾患もしくはその他の如何なる有害な症状も引き起こさない。有利なことに、本発明のワクチンは、遺伝子組換え微細藻類の細胞内コンパートメント内に外因性抗原を含む。
【００５８】
用語「免疫原性」または「免疫原性の」は、物質の、免疫応答を刺激または誘発する能力に関する。免疫原性は、例えば、その物質に特異的な抗体の存在を判定することによって測定される。抗体の存在は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、検出される。
【００５９】
用語「抗原」は、本明細書において使用される場合、宿主動物の免疫原性応答系の標的である因子であって、宿主動物において免疫応答または防御応答を誘発できる因子を指す。本発明によれば、抗原はタンパク質またはペプチドである。ある実施形態によれば、タンパク質またはペプチドは、追加の修飾を受ける。本発明のある実施形態によれば、抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物（例えば、原生動物または蠕虫）からなる群から選択される病原微生物に少なくとも部分的に由来する。さらなる実施形態によれば、抗原は、プリオンに少なくとも部分的に由来する。
【００６０】
用語「ペプチド」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸残基のポリマーを指す。「ペプチド」とは、２〜５０アミノ酸からなるアミノ酸配列を意味する。「タンパク質」とは、５０以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を意味する。ペプチドおよびタンパク質なる用語は、本明細書の全体にわたって交換可能に使用される。
【００６１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直線状または分枝状であり、および任意選択で、合成のヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基または変更されたヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの混成物のポリマーであってよい。また、上記用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成物も包含する。ある現在の例示的実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、形質転換される特定の微細藻類種のコドン使用頻度を用いて、目的のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計される。
【００６２】
用語「発現カセット」および「コンストラクト」または「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において交換可能に使用され、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、且つ上記タンパク質が発現されるように構築されている、人工的に構築または単離された核酸分子を指す。コンストラクトは、一部の場合において目的のタンパク質をコードする可能性もあるマーカー遺伝子をさらに含んでよい。本発明のある実施形態によれば、目的のタンパク質は、細胞内局在化ペプチドに機能可能に連結された抗原である。発現カセットは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結された適切な調節配列をさらに含む。コンストラクトへの調節配列の包含は任意であることが理解されるべきであり、例えば、宿主細胞の調節配列が使用されるべき状況においては、このような配列は必要でないことがある。
【００６３】
ある実施形態によれば、微細藻類は、プロモーター配列と、抗原および液胞標的化配列をコードするポリヌクレオチドと、終結配列と、を包含する機能可能に連結された複数の要素を含む発現カセットを含む。
【００６４】
用語「機能可能に連結された」は、一方の機能が他方により調節されるように、単一の核酸フラグメント上で核酸配列同士が結合していることを指す。例えば、そのコード配列の発現をプロモーターが調節可能である場合（すなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターはコード配列に機能可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで、調節配列に機能可能に連結され得る。
【００６５】
用語「プロモーターエレメント」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」は、本明細書において使用される場合、ＤＮＡポリマーのタンパク質コード領域の５’端の上流に位置する（すなわち、先行する）ＤＮＡ配列を指す。天然の既知のプロモーターの大部分の位置は、転写領域に先行する。プロモーターはスイッチとして機能し、遺伝子またはその一部の発現を活性化する。遺伝子が活性化される場合、遺伝子が転写される、または転写に参加していると言われる。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成を伴う。従って、プロモーターは、転写調節エレメントとしてはたらき、また、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写の開始のための場所も提供する。プロモーターは、天然の遺伝子からその全体が由来してよく、または、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、または、合成ＤＮＡ部分を含んでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、発生の異なる段階において、および／または異なる環境条件に応答して、遺伝子またはその一部の発現を導いてよいことが当業者には理解される。大抵の場合、調節配列の正確な境界は完全には画定されていないため、複数のバリエーションのＤＮＡフラグメントが、同一のプロモーター活性を有してよいことがさらに認識される。大部分の細胞型で大部分の期間において遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「恒常的プロモーター」と呼ばれる。
【００６６】
一部の実施形態によれば、プロモーターは、その生物本来のプロモーターまたは異種プロモーターである。さらなる実施形態によれば、プロモーターは、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【００６７】
微細藻類において活性があることが当技術分野において公知である任意のプロモーターが、本発明の教示に従って使用され得る。非限定的な例としては、フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ａ（ｆｃｐＡ）、Ｂ（ｆｃｐＢ）、Ｃ（ｆｃｐＣ）およびＥ（ｆｃｐＥ）のプロモーター、ならびに、任意の光収穫複合体（Ｌｈｃ）プロモーターが挙げられる。また、限定されるものではないが、ノパリンシンターゼプロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来ポリアデニル化配列、ｔｕｂＢ２のプロモーター領域、バクテリオファージλ由来ＰＬプロモーター、サイトメガロウイルス（ＰＣＭＶ）のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＰＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス  ３５ｓ（ＰＣａＭＶ３５ｓ）プロモーター、細菌のｔφプロモーター、熱ショックタンパク質７０Ａプロモーター（ＨＳＰ７０Ａ）、葉緑体炭酸脱水酵素（Ｐｐｔｃａ１）のＣＯ２応答性プロモーター配列、およびルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット２（ＲＢＣＳ２）のプロモーターを含む、非光収穫関連プロモーター（ｎｏｎ−ｌｉｇｈｔ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）も使用され得る。
【００６８】
本明細書において使用される場合、用語「食物（ｆｏｏｄ）」は、陸生動物および水生動物を含む動物用の食物を指す。
【００６９】
本明細書において使用される場合、用語「水産養殖」は、制御された条件下で養殖される水生生物を指す。「水生生物」または「水生動物」は、本明細書において交換可能に使用され、淡水または海水のいずれかの水中で育成される生物を指す。水生生物には、限定されるものではないが、魚類、例えば、ティラピア、シーバス、ハタ、サケ、シマスズキ、ナマズ、タイ、ニジマス、バラマンディ、レッドドラム、キンギョ、ニシキゴイ、エンゼルフィッシュ、およびコイ、が包含される。用語「魚」には、仔魚および後期仔魚の形態を含め、魚の発育の全ての段階が包含される。
【００７０】
本発明の少なくとも一部の態様の実施の非限定的な例として、動物、特に水産養殖で育成される動物およびモデルとなる陸生動物に関して、本発明の教示が以下に説明される。
【００７１】
現在利用可能な水産養殖システムは一般に、開放型または閉鎖型に分類される。開放型システムは通常、湖または川などの水域において網囲いを築くことにより設けられる。閉鎖型システムは一般に、密閉タンク内において水を再循環させ、水はタンクから処理サイクルを介してタンクに再度注入される。
【００７２】
水産養殖システムは、異なる用途（主に食品としての用途だけでなく観賞用としての用途）のために販売可能なサイズになるまで、魚類、甲殻類および軟体動物などの水生動物を育成するために使用される。一部の実施形態によれば、本発明は、魚用または他の水生動物用の改良されたワクチンを提供する。
【００７３】
抗原を含む食用組成物の経口投与は、水産養殖ならびに農業において非常に経済的価値のあるものであり、各動物に組成物を個別に投与する必要性を排除する。
【００７４】
別の態様によれば、本発明は、外因性抗原をコードする少なくとも１つの転写可能なポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を提供し、発現される外因性抗原は微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内に局在する。
【００７５】
様々な藻類種が本発明の教示に従って使用され得る。ある実施形態によれば、藻類は海生微細藻類である。本発明の教示に従って使用され得る海生微細藻類の例示的なリストには、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ；Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａを含むＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．；Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．；Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉを含むＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐｐ．；Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ；Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．；Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ；Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ；およびＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓが含まれる。藻類は、種の分類学的大断面（表１）に由来し、かつ、これを代表する。
【００７６】
【表１】
0006578283.tif 000002
【００７７】
ある特定の実施形態によれば、本発明の教示に従って使用される遺伝子組換え微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍである。藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、植物プランクトンの一部を形成し温暖な地方に由来する珪藻類の単細胞藻類である。この藻類は容易に形質転換され、形質転換された藻類は水産養殖において良く増殖する。さらに、この藻類は非毒性かつ非病原性であり、動物用の、特に魚用および海生無脊椎動物用だけでなく陸生動物用の、食物源として使用できる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは海生藻類であり、従って、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような淡水で増殖される微細藻類とは対照的に、病原体の感染を遥かに受けにくい海水培地（ｍａｒｉｎｅ  ｍｅｄｉａ）中で増殖される。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、非常に重要なオメガ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を高度に蓄積するその能力で知られている（Ｐａｔｉｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔ  Ｉｎｔ．，２００７，１５：１−９）。単胃動物用飼料における潜在的栄養源として３種の微細藻類を評価するために行われた研究では、調査された藻類の中で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍが、消化可能な栄養分の好ましい供給源であると結論付けられた（Ｓｋｒｅｄｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．，２０１１，２０：１３１−１４２）。従って、本発明の教示による遺伝子組換えＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを含むワクチンは、経口投与に非常に適している。
【００７８】
本発明の遺伝子組換え微細藻類の主な用途は、食用組成物として組成されたワクチン媒介体としての用途である。藻類細胞中で発現される外因性抗原は、組成物を摂取する対象の標的細胞または標的組織に、その免疫原性形態で到達するべきであり、ここで、対象は水生動物または陸生動物である。抗原の経口送達における主な障害の一つは、経口送達製品の調製過程およびその保存の全体にわたる環境条件ならびにその後の標的対象体内の消化管における環境条件に対する抗原の感受性である。
【００７９】
本発明は本明細書において、微細藻類の細胞内コンパートメント内に局在する外因性抗原が、水生動物ならびに陸生動物に摂取された場合に、その免疫原性活性を維持することを開示する。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、抗原の活性は、藻類バイオマスの増殖および処理の全体にわたる外部の過酷な環境から、およびさらには、藻類を摂取する対象動物の消化管の環境から、抗原を保護する封入形態としてはたらく可能性がある完全体の藻類細胞によって、特に細胞壁によって、維持されるのかもしれない。さらに、本発明は、まず遺伝子組換え微細藻類を給餌された後に標的動物用の食物となる、介在生物を介して送達された場合に、外因性抗原がその免疫原性活性を維持することを開示する。
【００８０】
本発明に従って、様々な外因性抗原を使用できる。抗原は、本発明による微細藻類を摂取する生物において、または上記微細藻類を摂取する生物（介在生物）を給餌される生物において、免疫応答を誘発するために使用される。
【００８１】
一部の例示的実施形態によれば、標的生物は魚であり、抗原は神経壊死症ウイルス（ＮＮＶ）カプシドタンパク質またはそのフラグメントである。さらなる実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、神経壊死症ウイルス（ＮＮＶ）カプシドタンパク質の配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を含むアミノ酸配列をコードする。ある例示的実施形態によれば、ＮＮＶカプシドタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。ある例示的実施形態によれば、ＮＮＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示される核酸配列を含む。ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する微細藻類を用いた魚のワクチネーションは、前記魚においてウイルス抵抗性を付与する。ＮＮＶカプシドタンパク質は微細藻類内で発現され、微細藻類の液胞に局在する。いかなる特定の理論または作用機構に束縛されることを望むものではないが、ＮＮＶタンパク質の液胞への貯蔵は、免疫応答を誘発するように、魚の消化系による分解からＮＮＶタンパク質を保護してＮＮＶタンパク質の魚への送達を促進することが規定されている。
【００８２】
他の例示的実施形態によれば、抗原は、フラジェリンタンパク質またはそのフラグメントである。さらなる実施形態では、フラジェリンは、腸炎菌のものである。ある実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、腸炎菌フラジェリンの配列に対して少なくとも８０％の相同性、典型的には少なくとも９０％の相同性、より典型的には少なくとも９８％の相同性を含むアミノ酸配列をコードする。例示的実施形態によれば、フラジェリンは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。ある例示的実施形態によれば、フラジェリンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に示される核酸配列を含む。ある実施形態によれば、フラジェリンタンパク質を発現する微細藻類を用いた家禽のワクチネーションは、前記家禽においてサルモネラに対する抵抗性を付与する。
【００８３】
ある実施形態によれば、細胞内コンパートメントは、液胞、小胞体、ゴルジ系、リソソームおよびペルオキシソームからなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。ある現在の特定の実施形態によれば、外因性抗原は微細藻類の液胞内に局在する。
【００８４】
ワクチンの経口送達において解決するべき別の問題は、抗原の侵入を厳しく制限する標的動物対象の胃腸上皮細胞の膜を通じた抗原の侵入である。抗原が経細胞吸収のために上皮細胞の膜に分配されるには最小限レベルの親油性が必要である。予想外にも、本発明は、抗原を微細藻類の液胞内に標的化することが、遺伝子組換え微細藻類を摂取する動物の消化管から血流中への、発現される抗原の効率的な吸収をもたらすことを開示する。液胞は細胞内膜系の一部であり、従って、単一の仮説または作用機構に制限されることを望むものではないが、内膜系の一部である微細藻類細胞の液胞に抗原を標的化することは、藻類が摂取されてその壁が動物の対象によって分解された場合に動物の消化管を介した吸収を増加させる可能性がある。このような吸収の増加は、上皮細胞の膜による抗原分子の親油性の「感知」が増加して、腸を介した効率的な吸収が生じることに起因するのかもしれない。さらに、液胞を通じた抗原の供与が抗原の保存安定性を増加させる可能性もある。また、上記の様々な組み合わせも役割を果たすのかもしれない。いずれにせよ、抗原を液胞に標的化することは、経口投与されるワクチンの機能的効力を明らかに増大させる。
【００８５】
さらに、微細藻類により発現される外因性抗原は、遺伝子組換え藻類を摂取する動物対象の上皮細胞の膜によるその取り込みを促進するように設計され得る。一部の実施形態によれば、本発明の発現カセットは、異種細胞または異種組織による、発現される外因性抗原の取り込みを促進するタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００８６】
特定の取り込み促進ドメインは、遺伝子組換え微細藻類を摂取する対象動物の種類に依存する異種細胞の種類に応じて選択される。ある実施形態によれば、発現カセットは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態によれば、ＣＰＰは、限定されるものではないが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成されるヒト免疫不全ウイルス１由来トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）またはその一部、およびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成される繊維芽細胞成長因子の膜移行配列（ＭＴＳ）またはその一部からなる群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態となる。
【００８７】
当技術分野において公知である、微細藻類を形質転換するための任意の方法が、本発明の教示に従って使用され得る。形質転換方法は、微粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロポレーション、外因性ＤＮＡの存在下で細胞をボルテックスすること、酸洗浄ビーズおよびポリエチレングリコールを介した形質転換を包含する。真核藻類の形質転換のための方法および手段を、例えば、国際（ＰＣＴ）出願公開第ＷＯ１９９７／０３９１０６号に見出すことができる。
【００８８】
典型的には、遺伝子組換え藻類を作製するためのベクターを調製するために、藻類のゲノムに組み込まれることが可能なプラスミドである発現ベクターに、外因性抗原をコードするポリヌクレオチドがまずクローニングされる。このような発現ベクターにおいて、外因性抗原をコードするＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を導く発現制御配列、すなわちプロモーター、に機能可能に連結されている。本明細書において上述されたように、プロモーターは、内因性プロモーター、すなわち藻類に通常存在する遺伝子の転写を導くプロモーター、であってよい。ある実施形態によれば、ベクターは、形質転換された藻類の選択を可能にする耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある現在の例示的な実施形態によれば、ベクターは、ゼオシンおよびフレオマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８９】
当業者には公知のように、および本明細書において以下に例示するように、形質転換された藻類の培養条件は、使用される藻類の種類に依存する。典型的には、藻類は、光合成が可能な条件下で増殖される。光合成には日光およびＣＯ２が必要であり、さらに微細藻類が、適切な肥料を混合した淡水、汽水または海水のいずれかを増殖に必要とするため、微細藻類は、例えば、開放された池および湖で培養され得る。しかし、開放型システムは、閉鎖型システムよりも汚染に対して脆弱であり、さらには、開放された貯水池において増殖された遺伝子改変微細藻類は環境に対して危険であるとみなされる可能性がある。さらに、開放型システムにおいては、水温、ＣＯ２濃度、および照明条件を制御しにくい。増殖時季は、場所に大きく依存し、熱帯は別として、１年の内の温暖な月に限定される。しかし、開放型システムでは、閉鎖型システムよりも構築および／または維持が安価である。
【００９０】
従って、微細藻類を増殖させる別の方法は、池またはプールを構造体で、例えば「温室型」構造体で覆うような、半閉鎖型システムの使用である。これは、より小さなシステムになる可能性があるが、開放型システムに伴う多くの問題に対処する。半閉鎖型システムの利点は、目的の微細藻類を、その増殖に必要な栄養素について、侵入生物との競合に勝たせることによって、所望の微細藻類を、侵入生物に対して優占的であるようにすることが可能である点、および増殖時季を延ばすことが可能である点である。例えば、システムが加熱または冷却される場合、微細藻類は、一年を通して増殖できる。
【００９１】
あるいは、微細藻類を、開放型システムまたは半閉鎖型システムに比べてより厳密に環境が制御される光バイオリアクタなどの閉鎖型構造内で増殖させることができる。光バイオリアクタは、リアクタに光子エネルギーの投入を提供するために、ある種の光源を組み入れたバイオリアクタである。用語光バイオリアクタは、環境に対して閉鎖されているシステムであって、環境との間で気体および汚染物質を直接的に交換しないシステムを指し得る。光バイオリアクタは、光栄養液体細胞懸濁培養液の、管理されたバイオマス生産のために設計された、閉じられた照明される培養容器として説明され得る。光バイオリアクタの例としては、例えば、ガラス容器、プラスチック／ガラス管、タンク、プラスチックスリーブ、および袋が挙げられる。光合成の維持に必要なエネルギーを供給するために使用され得る光源の例としては、例えば、蛍光電球、ＬＥＤ、および自然光が挙げられる。これらのシステムは閉鎖されているため、生物の増殖に必要な全てのもの（例えば、二酸化酸素、栄養素、水、および光）がバイオリアクタに導入されなければならない。その構築および維持のコストにもかかわらず、光バイオリアクタは、開放型システムに対して有利な点をいくつか有する。例えば、光バイオリアクタは、汚染を防止または最小化すること、培養条件（例えば、ｐＨ、光、二酸化酸素、および温度）をより制御しやすくすること、水の蒸発を防ぐこと、脱気による二酸化酸素の喪失を低減すること、および、より高い細胞濃度を許容することが可能である。一方で、冷却、撹拌、酸素の蓄積ならびに生物付着の制御などの光バイオリアクタの一定の必要条件のために、これらのシステムの構築および稼働は、開放型システムまたは半閉鎖型システムよりも高価となる。光バイオリアクタは、（より大容量の培養システムの大部分のように）継続的に回収されるように、または（例えば、ポリエチレンの袋での培養のように）一度に１バッチを回収するように構築され得る。バッチ光バイオリアクタは、例えば、栄養素、微細藻類、および水で構築され、微細藻類は、バッチが回収されるまで増殖させられる。継続的光バイオリアクタは、例えば、継続的に、毎日、または一定の時間間隔で、回収され得る。
【００９２】
例えば、微細藻類を含む液体の表面下からＣＯ２でバブリングすることによって、ＣＯ２は本明細書に記載のシステムのいずれかに送達され得る。また、スパージ（ｓｐａｒｇｅ）も液体へのＣＯ２の注入に使用され得る。スパージャは、例えば、バブラ（Ｂｕｂｂｌｅｒ）、カーボネータ（Ｃａｒｂｏｎａｔｏｒ）、エアレータ（Ａｅｒａｔｏｒｓ）、ポーラスストーン（Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｔｏｎｅ）およびディフューザ（Ｄｉｆｆｕｓｅｒ）とも呼ばれる多孔性の円盤状アセンブリまたは管状アセンブリである。
【００９３】
本明細書に記載のシステムにおいて使用され得る栄養素には、例えば、窒素（ＮＯ３−またはＮＨ４の形態）、リン、および微量金属（Ｆｅ、Ｍｇ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｖ、およびＢ）が包含される。栄養素は、例えば、固体形態または液体形態で入れることができる。栄養素が固体形態の場合、それらは、微細藻類を含む液体に送達される前に、または光バイオリアクタに送達される前に、例えば、淡水または海水と混合され得る。
【００９４】
微細藻類は、大スケール培養で増殖され得る。ここで、大スケール培養とは、約６リットル超、または約１０リットル超、または約２０リットル超の体積での培養増殖を指す。また、大スケール増殖は、１００リットル以上、５００リットル以上、または１０００リットル以上の体積での培養増殖であってもよい。
【００９５】
最適増殖温度は通常、約２０℃〜約２５℃であるが、これは種類に依存する。ある実施形態によれば、微細藻類細胞の密度は、回収前に１０６〜１０８細胞／ｍｌに達する。
【００９６】
経口摂取のための材料を調製するために、または食物組成物として調製するために、何らかの回収後処理が用いられてよい。従来の処理は通常、藻類が増殖された液体培養物からの、少なくとも部分的な藻類バイオマスの分離を含む。任意選択で、標的対象および用途の態様に応じて多様なサイズのペレットを形成するために、藻類バイオマスはホモジナイズされ、および／または乾燥され得る。調製の他の態様は、スプレー乾燥、流動床乾燥、あるいは、液体懸濁液として材料を提供することを包含する。
【００９７】
回収された本発明の遺伝子組換え微細藻類それ自体がワクチンを形成し得るか、ワクチンが、食用の希釈剤、賦形剤または運搬体をさらに含む食用組成物へとさらに製剤化され得る。
【００９８】
本発明のある例示的実施形態によれば、回収された微細藻類は、介在生物への食物となる。これらの実施形態によれば、遺伝子組換え微細藻類を給餌された介在生物は、ワクチンを形成する。ある例示的実施形態によれば、介在生物は、限定されるものではないが、アルテミアおよびワムシを含む、魚用飼料である。遺伝子組換え微細藻類を含む介在生物は、その生物種に応じて、当技術分野において公知の任意の方法により回収できる。回収された介在生物は、例えば乾燥によって、さらに処理されて食用ワクチンの材料を形成できる。ある実施形態によれば、介在生物を含むワクチンは、食用の希釈剤、賦形剤または運搬体をさらに含む。
【００９９】
微細藻類またはこれを含むワクチンは、さらに製剤化されて食物組成物を形成できるか、または食物添加物として使用され得る。一部の実施形態によれば、食用組成物は、動物用食物組成物である。ある現在の特定の実施形態によれば、動物用食物組成物は、水生動物および／または陸生動物への給餌用である。以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、これらは決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理に対する多くの変更および改変を容易に考案することができる。
【０１００】
実施例
これらの実施例は、本発明の実施形態の少なくとも一部の態様の特定の実施に関する。実施例は例示に過ぎず、決して限定することを意図するものではない。
【０１０１】
方法
ＮＮＶカプシドタンパク質発現ベクターの調製
ＮＮＶカプシドタンパク質（配列番号３）をコードする遺伝子を藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成し、配列番号７に示される核酸配列を得た。
【０１０２】
液胞標的化タンパク質をコードする配列（核酸配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号１）、ＨＡタグコード配列（核酸配列：配列番号１４、アミノ酸配列：配列番号１３）および任意選択でＭＴＳコード配列（核酸配列：配列番号１２、アミノ酸配列：配列番号１１）が予めクローニングされたｐＰｈａＴ１ベクターに、ＮＮＶウイルスの３７ｋＤａのカプシドタンパク質（抗原）をコードする１０１４ヌクレオチドに対応する合成配列をクローニングした。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを用いてＮＮＶ抗原をクローニングした。ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを用いて液胞標的化配列をｐＰｈａＴ１にクローニングした（ｐＰｈａＴ１−Ｖａｃの作製）。ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いてｐＰｈａＴ１−ＶａｃにＨＡタグコード配列をクローニングした。ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＰｈａＴ１−ＶａｃにＭＴＳコード配列をクローニングした。
【０１０３】
フラジェリンの調製
腸炎菌の細菌フラジェリン（配列番号４）をコードする遺伝子を藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのコドン使用頻度に従って合成し、配列番号８に示される核酸配列を得る。液胞標的化配列およびＨＡタグが予めサブクローニングされたｐＰｈａＴ１ベクターに、細菌フラジェリンに対応する合成配列をクローニングする。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを用いて細菌フラジェリンをクローニングする。
【０１０４】
プラスミドｐＰｈａＴ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２１９９４２）においてｆｃｐＡプロモーターおよびｆｃｐＡターミネーターの制御下に、本発明の様々なポリヌクレオチドおよびコンストラクトをさらにクローニングした。
【０１０５】
ｆｃｐＡプロモーターは、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて機能することが知られている。しかし、他のプロモーターがＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍならびに他の藻類において使用され得ることが明白に理解されるべきである。
【０１０６】
ベクターは、
・目的の遺伝子のクローニングサイトの上流にｆｃｐＡ（フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ａ）プロモーター、
・ＭＣＰ−マルチクローニングサイト、
・ゼオシン耐性およびフレオマイシン耐性を付与するタンパク質をコードするＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子の転写を制御するｆｃｐＢ（フコキサンチンクロロフィルタンパク質Ｂ）プロモーター、
・目的の遺伝子の後ろ（下流）およびゼオシン（ｚｅｕｃｉｎｅ）耐性遺伝子の後ろにあるｆｃｐＡターミネーター、
・アンピシリン耐性遺伝子、
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来複製開始点
を含む。
【０１０７】
藻類の培養および回収
藻類の培養および回収を、本発明の出願人に属する米国特許出願公開第２０１１／００８１７０６号に記載されるように行った。簡潔に説明すると、珪藻を増殖させるためのＦ／２栄養素で強化した濾過海水中で藻類を培養した（「Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｆｏｒ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｅａｗａｔｅｒ  ｍｅｄｉａ．：Ａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｒ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｅｄｓ．），ｐｐ．４２９−５３８．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ」から改変）。７２時間ごとに最終培養体積に対して１：１０００の用量でＦ／２を加えた。温度状況を２１℃で一定に維持した。１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２ｓ１の光強度で、明：暗を１６時間：８時間に設定した。ＣＯ２を空気と混合し、エアレーションシステムによって、制御された比率で培養液に送達した。実験で使用する藻類を、その最大培養密度付近にて回収した。藻類の凝集を促進するために水酸化カルシウムを、０．１５ｇ／ｍｌでＣａ（ＯＨ）２を含む水中での粒子の微細懸濁液として培養液に加え、その後、培養液を濾過するか、または遠心分離した。得られた藻類沈殿物を凍結乾燥した。
【０１０８】
微粒子銃による藻類の形質転換
（Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５２：５７２−５７９に従って実施した）
上述の通りに、新鮮な藻類培養液を人工海水（ＡＳＷ）Ｆ／２培地において対数期半ば（２〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで増殖させた。射出の２４時間前に細胞を回収し、新鮮なＡＳＷ＋Ｆ２で２回洗浄して、元の細胞体積の１／１０となるようにＡＳＷ＋Ｆ／２に再懸濁した。細胞懸濁液０．５ｍｌを、凝固させたＡＳＷ＋Ｆ／２培地を含む５５ｍｍのペトリ皿の中央にスポットする。プレートを放置して、通常の増殖条件下で乾燥させる。直径が２ミクロンより大きい細胞についてはＭ１７タングステンパウダー（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、および、より小さい細胞については０．６ミクロン未満の粒子からなるタングステンパウダー（ＦＷ０６，Ｃａｎａｄａ  Ｆｕｊｉａｎ  Ｊｉｎｘｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｙ  Ｃｏ．，Ｍａｒｋｈａｍ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、ＰＤＳ  １０００／Ｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ＵＳＡ）を製造業者の指示書に従い使用して射出を行った。タングステンを直鎖状ＤＮＡで被覆した。１１００または１３５０ｐｓｉのラプチャーディスクを使用した。使い捨て用品は全てＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃから購入した。射出後に、プレートを通常の増殖条件下で２４時間インキュベートし、その後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
【０１０９】
エレクトロポレーションによる形質転換
上述の通りに、藻類培養液を人工海水（ＡＳＷ）＋Ｆ／２培地において対数期半ばまで増殖させた。その後、細胞を回収し、新鮮な培地で２回洗浄した。元の体積の１／５０となるように細胞を再懸濁した後、ＡＳＷ中４％のヘミセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ）および２％のドリセラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を等体積で加えることによりプロトプラストを調製し、３７℃で４時間インキュベートした。カルコフロールホワイトで染色されないことをもってプロトプラストの形成を試験した。０．６ＭのＤ−マンニトールおよび０．６ＭのＤ−ソルビトールを含むＡＳＷでプロトプラストを２回洗浄し、同じ培地に再懸濁した。その後、ＤＮＡを加えた（プロトプラスト１００μｌごとに１０μｇの直鎖状ＤＮＡ）。冷えたエレクトロポレーションのキュベットにプロトプラストを移して、氷上で７分間インキュベートし、その後、ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）においてパルスした。１０００〜１５００ボルト、１パルスあたり１０〜２０ｍｓｅｃの範囲にわたる様々なパルスが通常使用される。各キュベットを５〜１０回パルスした。パルス後直ちにキュベットを氷上に５分間置き、その後、プロトプラストを２５０μｌの新鮮な増殖培地（非選択的）に加えた。２５℃にて低光量で２４時間プロトプラストをインキュベートした後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
【０１１０】
マイクロポレーションによる形質転換
新鮮な藻類培養液をＡＳＷ＋Ｆ／２培地において対数期半ばまで増殖させた。培養液サンプル１０ｍｌを回収し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２回洗浄して、２５０μｌのバッファＲ（マイクロポレーション装置およびキットの製造者であるＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ，ＮａｎｏＥｎＴｅｋ  Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）により供給）中に再懸濁した。細胞１００μｌごとに直鎖状ＤＮＡを８μｇ加えた後、細胞をパルスした。細胞の種類に応じて、７００〜１７００ボルト、パルス長さ１０〜４０ｍｓｅｃの範囲にわたる様々なパルスが一般に必要である。各サンプルを１〜５回パルスした。パルス後直ちに細胞を２００μｌの新鮮な培地（非選択的）に移した。２５℃にて低光量で２４時間インキュベートした後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の培養条件下でインキュベートした。
【０１１１】
タンパク質発現解析
タンパク質発現の解析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により以下のように行った。プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃  Ｐ９５９９）および１００μｌの酸洗浄ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ｇ８７７２）を加えた５００μｌの溶解バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４ｍＭ  ＣＨＡＰＳ）中で、２０ｍｇの藻類の粉末を溶解した。製造業者の指示書に従いＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ＃２３２２５）を使用してタンパク質濃度を決定し、製造業者の指示書に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％；Ｔｒｉｓ−グリシン，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｔ＃４５６−１０９５）によって各サンプル２０μｌを分析した。製造業者の指示書に従いＴｒａｎｓＢｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  ＲＴＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｃａｔ＃１７０−４２３７）を使用してゲルをＰＶＤＦメンブレンに移した。メンブレンを環境温度にて１時間、ブロッキングバッファ（５％スキムミルク）でブロッキングし、環境温度にて２時間、マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ；Ｃａｔ＃ＭＭＳ−１０１Ｐ−１０００）とインキュベートしてから、ＴＢＳ−Ｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｃａｔ＃１７０−６４３５）＋０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ｐ１３７９）で３回洗浄した。次に、メンブレンを１時間、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃａｔ＃１１５−０３５−００３）とインキュベートし、環境温度にて５分間、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。製造業者の指示書に従いＥＺ−ＥＣＬ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；Ｃａｔ＃２０−５００−１２０）を用いてメンブレンを化学発光させ、フジ医療用Ｘ線フィルムに露光させた。
【０１１２】
魚用飼料−藻類混合物
魚用飼料を、乾燥させた藻類（野生型または遺伝子組換え）の粉末と混合する。５％ゼラチン溶液１００ｍｌを藻類−魚用飼料混合物に注ぎ、その後、風乾させる。
【０１１３】
魚ＩｇＭ力価ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃４４２４０４）を、コーティングバッファ（０．０３Ｍ  ｇ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０７Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中に溶解させた５μｇ／ｍｌの精製ＮＮＶカプシドタンパク質１００μｌでコーティングする。４℃にて一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；Ｃａｔ＃０．２−０．２３−５Ａ）＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ｐ１３７９）で３回洗浄し、環境温度にて１時間、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ａ７８８８））でブロッキングする。魚の血清をＰＢＳ中で段階希釈して、各サンプル１００μｌを各ウェルに加え、４℃にて一晩インキュベートする。プレートを室温にて洗浄バッファで３回洗浄する。次に、プレートを４℃にて一晩、マウス抗魚ＩｇＭ抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ＃ＬＳ−Ｃ５８９８９）とインキュベートする。プレートを洗浄バッファで３回洗浄し、環境温度にて１時間、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｃａｔ＃１１５−０３５−００３）とインキュベートする。次に、プレートを室温にて洗浄バッファで３回洗浄し、環境温度にてペルオキシダーゼの基質（ＴＭＢＥ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃａｔ＃ＥＳ００１）とインキュベートする。発色後に、停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）で反応を終結させる。４５０ｎｍにて光学密度解析を行う。アッセイは二連で行う。
【０１１４】
ベータノダウイルスへの感染後のサイトカイン誘導
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してインターフェロン誘導性Ｍｘタンパク質の発現レベルをベータノダウイルス接種後に検定する。魚を屠殺し、脳、頭部および腎臓を無菌的に取り出してＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製のために凍結する。Ｐｏｉｓａ−Ｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，４５：２１８−２２５）において以前に説明された通りにｑＰＣＲを行う。
【０１１５】
ニワトリＩｇＧ力価ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃４４２４０４）を、コーティングバッファ（０．０３Ｍ  ｇ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０７Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中に溶解させた５μｇ／ｍｌの精製ＮＮＶフラジェリン１００μｌでコーティングする。４℃にて一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；Ｃａｔ＃０．２−０．２３−５Ａ）＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ｐ１３７９）で３回洗浄し、環境温度にて１時間、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ａ７８８８））でブロッキングする。ニワトリの血清をＰＢＳ中で段階希釈して、各サンプル１００μｌを各ウェルに加え、４℃にて一晩インキュベートする。プレートを室温にて洗浄バッファで３回洗浄する。次に、プレートを４℃にて一晩、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃Ａ９０４６）とインキュベートする。プレートを洗浄バッファで３回洗浄し、環境温度にてペルオキシダーゼの基質（ＴＭＢＥ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃａｔ＃ＥＳ００１）とインキュベートする。発色後に、停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）で反応を終結させる。４５０ｎｍにて光学密度解析を行う。アッセイは二連で行う。
【０１１６】
実施例１：藻類細胞におけるＮＮＶカプシドタンパク質の発現
ＮＮＶカプシドタンパク質を液胞標的化配列に融合させ、さらなる分析において特定のタンパク質の検出を容易にするためにＨＡタグに融合させた。必要に応じて、カプシドタンパク質を、液胞リーダー配列およびＨＡタグに加えて膜移行配列（ＭＴＳ）に融合させた。ＭＴＳは、魚の腸からその血液循環系へと魚によって摂取された藻類において発現されたタンパク質の吸収を促進することが本発明の発明者によって以前に示された。ＮＮＶ組換えタンパク質の発現について藻類の形質転換体をスクリーニングした（図１）。陽性の藻類クローンを上述の通りにさらに培養し、ワクチネーション試験に使用するために藻類材料を回収した。
【０１１７】
実施例２：ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する藻類を用いたホワイトグルーパーＥｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ  ａｅｎｅｕｓまたはヨーロピアンシーバスＤｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘの仔魚のワクチネーション
孵化した仔魚の３つの反復試験群をワクチネーション実験に使用し（アッセイ群）、３つの反復試験群を対照として使用する。開放循環で濾過およびＵＶ処理された海水を供給されるタンクにおいて仔魚を飼育した（環境温度および環境塩分濃度）。ワムシを含む生の稚魚スターター飼料（ｌｉｖｅ  ｆｒｙ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｆｅｅｄ）を１０日間、仔魚に給餌し、その後、さらなる２０日間については、以下のように餌をＡｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉに変更した。
（１）液胞標的化カプシドタンパク質を発現する遺伝子組換え藻類を給餌したアルテミアをアッセイ群の仔魚への給餌に使用した。
（２）野生型の藻類を給餌したアルテミアを対照群の仔魚への給餌に使用した。
【０１１８】
図２および図３に示されるように、遺伝子組換え藻類において発現された液胞標的化タンパク質をアルテミアの体内においてその完全形態および機能的形態で、給餌後の少なくとも６時間、検出することができる。従って、アルテミアは、液胞標的化ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する遺伝子組換え藻類または野生型の藻類を２時間給餌された後、上述の通りにアッセイ群および対照群の仔魚に給餌するために直ちに使用された。魚が体重約１グラムに達し、依然としてＮＮＶに対して脆弱である時に、追跡検証のために魚を実験室の水槽に移す。各群（アッセイ群および対照群）の仔魚の約５０％を浸漬により所定のＬＤ６０用量にてウイルスに曝露させ、残りの５０％をＬ−１５培地で偽曝露させる。曝露は、本明細書の以下の実施例４において説明される通りに行う。
【０１１９】
実施例３：ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する藻類を用いたホワイトグルーパーＥｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ  ａｅｎｅｕｓまたはヨーロピアンシーバスＤｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘの稚魚（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｆｉｓｈ）のワクチネーション
開放循環で濾過およびＵＶ処理された海水を供給されるタンクにおいて仔魚を飼育する（環境温度および環境塩分濃度）。孵化した仔魚の３つの反復試験群をワクチネーション実験に使用し、３つの反復試験群（いずれもワクチネーション処理なし）を対照として使用する。ワムシを含む生の稚魚スターター飼料を仔魚に給餌した。１０日間の後、ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する遺伝子組換え微細藻類を給餌されたＡｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉを、さらなる２０日間、仔魚への給餌に使用した（ワクチネーション実験、アッセイ群）。野生型の藻類を給餌されたＡｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉを給餌された仔魚が対照群となる。
【０１２０】
仔魚が育つ（魚用乾燥飼料を給餌できる）と、ＮＮＶカプシドタンパク質を発現する藻類または野生型の藻類が魚用飼料に埋め込まれ、幼魚（ｆｉｎｇｅｒｌｉｎｇ）が１０グラムのサイズに達するまで、その飼料ペレットが後期仔魚段階に給餌するために使用される。ワクチネーションから１カ月後、ワクチネーションされた魚の約５０％を所定のＬＤ６０用量にて腹腔内注射によりウイルスに曝露させ、残りの５０％をＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で偽曝露させる。また、対照群（野生型の藻類を給餌）も、ワクチネーションされた群のように２つの群に分けてウイルスまたはＬ−１５培地に曝露させる。曝露は、本明細書の以下の実施例４において説明される通りに行う。
【０１２１】
実施例４：ワクチネーションされた仔魚および稚魚のＮＮＶへの曝露
ワクチネーション群（遺伝子組換え微細藻類を給餌）および非ワクチネーション群（野生型の微細藻類を給餌）の１０匹の幼魚または稚魚の３つの反復試験群を浸漬または腹腔内（ＩＰ）注射のいずれかによって１０７、１０５、１０３または１０１のＴＣＩＤ５０で曝露させる。陰性対照は、５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＬ−１５培地で偽曝露させる。６０％の死亡率を生じさせる用量（ＬＤ６０）を、その後の曝露に使用する。曝露から０日、１５日および３０日後に、各反復試験群から３匹の魚のサンプリングを行う。ウイルス曝露後の魚の生存率、血清中のＩｇＭ力価のレベルおよびサイトカインＭｘのＲＮＡの発現レベルによってワクチンの有効性を決定する。
【０１２２】
実施例５：腸炎菌フラジェリンを発現する藻類を用いたニワトリのワクチネーションおよび曝露試験
３７日齢の健康な２０匹のヒヨコを２つの群に割り当てる。一方の群にはフラジェリンを発現する藻類を給餌し、対照群には野生型の藻類を給餌する。３つの独立した反復試験を並行して行う。免疫化から２６日後に、ニワトリの群を１０９ＣＦＵのＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに経口的に曝露させる。曝露から３日、７日、および１４日後に、盲腸糞を採取し、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９１：２４４４−２４４９，２０１２）において以前に説明された通りに細菌の排泄を調べる。曝露から１８日後に、ニワトリを剖検に供し、サルモネラについて肝臓、脾臓、および盲腸の内容物を調べる。また、特異的抗腸炎菌フラジェリン抗体力価分析のために、ワクチネーション前およびワクチネーション後に血清も採取する。
【０１２３】
上記の特定の実施形態の説明は、他者が、現在の知識を適用することにより、過度に実験を行うことなく、および一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途のために容易に変更および／または適合できるように、本発明の一般的特徴を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適合および変更は、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、および、包含されることが意図される。本明細書で使用される語法または用語は説明を目的とするものであり、限定を目的としないことが理解されるべきである。開示される様々な機能を実施するための手段、材料、および工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替の形態をとってよい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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