(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変ドメイン配列は配列番号１、２、３、７、８または９を含み、前記抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変ドメイン配列は配列番号４、５または１０を含み、前記抗体は、
３Ｆ８抗体と比較して、ＧＤ２への親和性を増大させる軽鎖の特性により特徴付けられ、前記３Ｆ８抗体は前記特性を欠き、前記特性は、
Ｄ３２Ｈ突然変異；
Ｅ１Ｋ突然変異；および
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号１または２として同定され、前記重鎖可変ドメイン配列が、配列番号４として同定される、請求項１に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号７または８として同定され、前記重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１０として同定される、請求項１に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号３として同定され、前記重鎖可変ドメイン配列が、配列番号４として同定される、請求項１に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号９として同定され、前記重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１０として同定される、請求項１に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号１１〜１６、１９および２１〜２５のいずれか１つとして同定された配列を含む、高親和性抗ＧＤ２一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１１または１３として同定される配列を含む、請求項６に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１９または２２として同定される配列を含む、請求項６に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項９】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１２、１４または１５として同定される配列を含む、請求項６に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２１、２３、または２４として同定される配列を含む、請求項６に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項１１】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１６または２５として同定される配列を含む、請求項６に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項１２】
配列番号１１〜１６、１９および２１〜２５のいずれか１つとして同定された配列を含むｓｃＦｖを含む第１の結合部位と、第２の結合部位とを含む二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記第２の結合部位が、配列番号２６または２７として同定された配列を含むｈｕＯＫＴ３ ｓｃＦｖを含む請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
前記第２の結合部位が、配列番号２８として同定された配列を含むＣ８２５  ｓｃＦｖを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の高親和性抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項６〜１１のいずれか１項に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖをコードする単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗体またはその断片あるいはｓｃＦｖを発現させる条件下で、請求項１７に記載の宿主細胞を培地中で培養する工程と、
前記抗体またはその断片あるいは前記ｓｃＦｖを前記培地から分離する工程と
を含む、抗体またはその断片あるいはｓｃＦｖの生産方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項６〜１１のいずれか１項に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖを含む組成物。
【請求項２０】
前記抗体またはその抗原結合断片、あるいはｓｃＦｖが、細胞毒性剤にコンジュゲートしている請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
医薬的に許容し得る担体または希釈剤をさらに含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
対象内の病状の治療または予防のための組成物であって、
前記病状は、ＧＤ２発現により特徴付けられ、
前記組成物は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片あるいは請求項６〜１１のいずれか１項に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖの治療有効量を含み、前記組成物は、前記対象に投与されることを特徴とする前記組成物。
【請求項２３】
前記病状が、神経芽細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍または癌腫である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記病状が、骨肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、紡錘細胞肉腫、脳腫瘍、小細胞肺癌、網膜芽腫、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞白血病、及び他のＧＤ２陽性腫瘍から成る群から選択される請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第２の結合部位が、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、神経幹細胞から成る群から選択される免疫細胞に関連する請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
前記第２の結合部位が、ＣＤ３に対して特異的である請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
前記第２の結合部位が、ハプテンに結合する請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２８】
前記ハプテンが、診断検出標識で標識される請求項２７に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
前記第２の結合部位が、サイトカインまたは細胞増殖抑制剤に結合する請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
対象内でＧＤ２を発現する細胞へのサイトカインまたは細胞増殖抑制剤の送達のための組成物であって、
前記組成物は、請求項２９に記載の二重特異性抗体を含み、前記組成物は、前記二重特異性抗体が前記細胞上で前記ＧＤ２に結合することで、前記サイトカインまたは細胞毒性剤が前記細胞に送達されるように、前記対象に投与されることを特徴とする前記組成物。
【請求項３１】
放射活性によって標識されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項６〜１１のいずれか１項に記載の高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ。
【請求項３２】
請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖを含む治療用組成物。
【請求項３３】
請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは高親和性抗ＧＤ２  ｓｃＦｖを含む診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８０１，２８７号に対する３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  １１９（ｅ）の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列リスト
本願明細書は、「２００３０８０−０６３８＿ＳＴ２５」と命名されたａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子媒体で２０１４年３月１４日に提出された配列リストについて言及する。この．ｔｘｔファイルは２０１４年３月１２日に作成され、９４ｋｂサイズである。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）療法は、癌についての認められた治療形式であり、５種のＭｏＡｂは、結直腸及び乳癌、非小細胞肺癌、扁平細胞癌腫、及び黒色腫を含めた、成人における固形腫瘍に対してＦＤＡの承認を受けている（Ｂｏｙｉａｄｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８，１１５１−８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １４，１７８−８３）。
特に、本発明は、小児癌の治療には不適切に開発されたままのＭｏＡｂ治療についての見識を提供する。化学療法または放射線照射とは異なり、ＭｏＡｂ療法は、一般的には、少ない長期毒性を伴う、骨髄抑制性かつ遺伝毒性ではない。これらは、若い子供にとっては重要な考慮である。より重要なことは、ＭｏＡｂは、典型的には、高リスクの神経芽細胞腫（ＮＢ）で見出される、血液、骨髄、及び骨における転移性癌に対して効果的である。薬剤のクラスとして、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体の薬物動態及び毒性は、広範囲に研究されてきた。加えて、抗体は、免疫ベースであるか否かにかかわらず、細胞毒性ペイロード、放射性同位体、毒素、または酵素を運ぶことができ、それにより、標的療法に対する選択肢を増大させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｏｙｉａｄｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８，１１５１−８
【非特許文献２】Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １４，１７８−８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＧＤ２に結合し、かつ、参照３Ｆ８抗体の変異体である抗体剤を提供する。該抗体剤は、参照３Ｆ８抗体で見出されない１つまたは複数の特定の構造特性を含み、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の１つまたは複数の構造特性を欠く以外は同一の３Ｆ８抗体に対して安定性が改善し、及び／または免疫原性が減少した抗体剤を提供する。いくつかの実施形態において、医薬上、例えば、ＮＢの診断及び／または治療に有用な抗体剤を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のペイロード（例えば、検出可能なペイロード及び／または治療ペイロード）に関連し、該ペイロードを含み、及び／または該ペイロードを送達する抗体剤を提供する。そのような抗体剤を同定し、特徴付け、調製し、及び／または使用する種々の方法についても、本発明によって提供される。
【０００６】
本出願において、免疫原性を減少させるが安定性を増強させるように設計される新規のｈｕ３Ｆ８フレームワークであるｈｕ３Ｆ８Ｖ５を持つ高親和性抗ＧＤ２抗体について具体的に説明する。ｈｕ３Ｆ８Ｖ５抗体は、計算方法に基づいて免疫原性を減少させるために、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１（ＷＯ２０１１／１６０１１９及びＣｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：４７７−４８６に記載）のフレームワーク構造を最適化することで設計された。まず、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１重鎖及び軽鎖配列をヒト生殖細胞株配列であるｈｕｍＩＧＨＶ１９９及びｈｕｍＩＧＫＶ０２５とそれぞれ比較した（ＥＭＢＬデータベース）。ネズミ３Ｆ８（タンパク質データバンク登録番号３ＶＦＧ）の結晶構造に基づいて、ＣＨＡＲＭｍ（ＣＨｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場（Ｂ．Ｒ．Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．３０，１５４５−１６１５（２００９））を用いた分子シミュレーションを各々の潜在的なヒト化突然変異に行い、突然変異が構造的に許容できるか判断した。さらに、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１中のＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープを、ＮＮアラインメント方法を用いて、免疫エピトープデータベース上で同定し、構造的に許容できる突然変異に基づいて最小化した。３Ｆ８結晶構造にドッキングさせたＧＤ２の計算モデル（ＣＤＯＣＫＥＲ及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて構築、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）に基づいて、ＧＤ２抗原と直接相互作用するようにモデリングされていないＣＤＲ残基は、ヒト化突然変異と見なした。
【０００７】
潜在的な免疫原性を減少させる目的で、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１中に９点の突然変異を起こさせて、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５（表２を参照）を作製した。９つ全ての突然変異は、その抗原であるＧＤ２に結合した３Ｆ８の計算モデルに構造的に許容できることが分かった。全ての突然変異は、ヒト化３Ｆ８上に残されたネズミ残基をヒト生殖細胞株配列に変更することを伴う。（ＬＣ：Ｋ２４Ｒ、ＬＣ：Ｓ５６Ｔ、ＬＣ：Ｖ５８Ｉ、ＨＣ：Ｉ２０Ｌ、ＨＣ：Ｍ９２Ｖ）は、フレームワーク残基を伴う。ＣＤＲ  Ｈ２中の４つの突然変異（ＨＣ：Ａ６２Ｓ、ＨＣ：Ｆ６３Ｖ、ＨＣ：Ｍ６４Ｋ、ＨＣ：Ｓ５６Ｇ）により、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法によって同定された際に、強力なＴ細胞エピトープが除去されたことがさらに分かった。グラフト法による抗体ヒト化の当業者には、ＣＤＲ残基を変化させることは一般的ではないため、ＧＤ２に結合した３Ｆ８の計算モデルによってＣＤＲ領域中に提案された突然変異がもたらされたことは驚くべきことであった。
【０００８】
酵母提示法に基づいて親和性成熟を行うため、まず、選択用に用いる新規のビオチン化ＧＤ２誘導体を合成した。標準的なビオチン化ＧＤ２抗原（糖鎖機能研究コンソーシアムから得られる）を用いてでは、これまで失敗に終わっていた。フローサイトメトリーでＧＤ２を観察するために、ＰＥＧスペーサーを融合することで新規の合成ＧＤ２−アジド誘導体（図２）を作製した。この新規のアナログを用いて、合成ＧＤ２アナログへの結合を増強させた酵母の表面上に提示されたｈｕ３Ｆ８  ＳｃＦｖのランダムライブラリーから２つの突然変異を選択した。１つ目は、ＣＤＲ  Ｌ１上に位置するＬＣ：Ｄ３２Ｈであり、２つ目は、フレームワーク残基であるＬＣ：Ｅ１Ｋであった。組換え発現ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＳｃＦｖ及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＳｃＦｖ構築体中で２つの突然変異（ＬＣ：Ｅ１Ｋ及びＬＣ：Ｄ３２Ｈ）を試験し、天然のＧＤ２に対する結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて測定した。構造モデリングに基づいて、全てのｈｕ３Ｆ８  ＳｃＦｖは、抗原結合ポケットへのアクセスがそれほど制限されないため、ＶＬ−ＶＨ形式で作製した。これは、ＶＨ−ＶＬ形式で構築されるほとんどの従来のＳｃＦｖと対照的である。いくつかの変異体についても、完全ＩｇＧ１形式で試験した。
【０００９】
従って、本発明は、免疫原性を減少させ、ＧＤ２に対する抗体の親和性を増大させる特定の構造特性（３Ｆ８及び／またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１に対する突然変異）を含有する無傷抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び他の形式を含む新規の高親和性抗ＧＤ２抗体剤を提供する。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、免疫原性を減少させ、Ｔ細胞エピトープを除去する特定の構造特性（３Ｆ８及び／またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１に対する突然変異）を有する抗ＧＤ２  ３Ｆ８抗体の新規のフレームワーク、すなわち、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ＧＤ２への親和性が増大した抗ＧＤ２抗体剤を提供する。該抗体剤は、ＣＤＲ  Ｌ１上に位置した軽鎖（ＬＣ）Ｄ３２Ｈ、及びフレームワーク残基である軽鎖（ＬＣ）Ｅ１Ｋに特定の構造特性を有する。
【００１２】
重鎖（ＨＶ）Ｇ５４Ｉに特定の構造特性を持つ抗ＧＤ２抗体剤も提供する。
【００１３】
本発明の抗体剤は、上述した１つの構造特性、または２つの特徴として任意の組み合わせの２つの構造特性、あるいは３つの特徴として任意の組み合わせの３つ以上の構造特性を有することができる。いくつかの実施形態において、これらの構造特性は、任意の形態の３Ｆ８抗体、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１に導入してもよいし、同様あるいは別の目的の３Ｆ８分子、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５に既に存在する他の構造特性と組み合わせてもよい。ｈｕ３Ｆ８Ｖ１及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５の双方においてこれらの構造特性を内部に持つ抗体及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）について本明細書中に記載するが、親和性を増強させるために、突然変異を任意の３Ｆ８抗体配列に組み込むことができることを理解されたい。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、１つの構造特性を持つ軽鎖（ＬＣ）、Ｅ１ＫまたはＤ３２Ｈのいずれか、または２つの構造特性、Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈ、及び／またはＧ５４Ｉ構造特性を持つ重鎖（ＨＣ）有する３Ｆ８抗ＧＤ２抗体、ならびに抗体組成物、該抗体の糖型、増強された安定性を持つ抗体、Ｆｃ受容体への増強された結合を持つ抗体、ＧＤ２に対して増強された親和性を持つ抗体、第２の区別される結合部位または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを発現するように操作された二重特異性抗体、または二重特異性についてのモジュールのＩｇＧ構築における本発明の抗体のいずれかのＦｖ断片の使用、Ｔ細胞（ＢｉＴＥ）抗体を係合するタンデム型のｓｃＦｖ二重特異性抗体、三重特異性または多重特異性抗体を提供する。そのような抗体及びコーディングまたは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、それに関連するトランスジェニック植物、及び当該技術分野で知られているものと組み合わせた、本明細書中に記載されかつ実施可能とされた、その製造及び使用方法は、本発明の一部である。驚くべきことに、構造特性Ｅ１Ｋ、Ｄ３２Ｈ、及びＧ５４Ｉの任意の組み合わせを内部に持つｈｕ３Ｆ８は、補体媒介細胞毒性（ＣＭＣ）が低く、親ｈｕ３Ｆ８Ｖ１よりも有意に大きなＧＤ２への親和性とＰＭＮ−ＡＤＣＣ及びＰＢＭＣ−ＡＤＣＣ活性とを有する。ＣＭＣが抗ＧＤ２免疫療法に関連する疼痛の副作用を媒介すると考えられるため、ＣＭＣは低いことが望ましい。この優秀性は、ドナーにかかわらず、またはヒトＣＤ１６またはＣＤ３２で形質導入されたＮＫ９２をキラーとして用いれば、ＡＤＣＣアッセイで一貫して観察された。ＡＤＣＣは、一般に、患者においてＭｏＡｂの抗腫瘍効果についての証明されたメカニズムであるため、これは重要であった。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１またはｈｕ３Ｆ８Ｖ５に基づくが、本明細書中に記載された１つまたは複数の構造特性の存在下において異なる軽鎖及び重鎖を含む３Ｆ８抗体剤に関する。前記抗体剤は、ＧＤ２と高い親和性で結合し、所望の効果を仲介する、例えば、数例を挙げると、細胞増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害し、抗ＧＤ２抗体治療による疼痛の副作用をブロックする。
【００１６】
１つの態様において、本発明の抗体剤には、本明細書中に記載された１つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ；本明細書中に記載された２つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；本明細書中に記載された３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ；本明細書中に記載された１つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ；本明細書中に記載された２つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；及び本明細書中に記載された３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉが含まれる。
【００１７】
また、本発明は、重鎖定常、連結、多様性または可変領域、または軽鎖定常、連結または可変領域のような、抗体鎖の１つまたは複数の部分などの、そのような抗体の断片または誘導体を含む。該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡのようないずれかのクラス、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ４のようないずれかのサブクラス、及び当該技術分野で知られた他のサブクラスのものであってよい。本発明で有用な抗体は、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結またはジスルフィド安定化Ｆｖ（ｓｄＦｖまたはｄｓＦｖ）を含む、本発明の抗体の抗原結合抗体断片を含む。
【００１８】
本発明の一本鎖可変断片には、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；本明細書中に記載された２つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；本明細書中に記載された３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ；本明細書中に記載された１つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；本明細書中に記載された２つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；本明細書中に記載された３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びその組み合わせが含まれる。
【００１９】
本発明は、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む単一ドメイン抗体も含む。さらに、該抗体は、ファージ提示のような任意の方法によって生産することができ、または細菌、昆虫、酵母（真菌）、哺乳動物、またはヒト化抗体のような所望の特徴を持つ抗体を生産する他のタイプの細胞または細胞株を含む、いずれかの生物、卵、または細胞株において生産することができる。該抗体は、Ｆａｂ部分、及び異なる種からのＦｃ領域を組み合わせることによって、または相補性決定領域を保持し、かつもう１つの種のそれに対するフレームワーク領域を改変することによって形成することもできる。
【００２０】
本発明の好ましい抗ＧＤ２抗体には、以下のペプチド配列のいずれかが含まれる：
配列番号１として同定されたＤ３２Ｈの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１軽鎖、
配列番号２として同定されたＥ１Ｋの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１軽鎖、
配列番号３として同定された２つの構造特性、Ｄ３２Ｈ及びＥ１Ｋを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１軽鎖、
配列番号４として同定されたＧ５４Ｉの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１重鎖、
配列番号５として同定されたｈｕ３Ｆ８Ｖ５重鎖ガンマ１
配列番号６として同定されたｈｕ３Ｆ８Ｖ５軽鎖カッパ、
配列番号７として同定されたＤ３２Ｈの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５軽鎖、
配列番号８として同定されたＥ１Ｋの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５軽鎖、
配列番号９として同定された２つの構造特性、Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５軽鎖、
配列番号１０として同定されたＧ５４Ｉの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５重鎖、
配列番号１１で同定されたＤ３２Ｈの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、
配列番号１２として同定された、Ｄ３２Ｈの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ
配列番号１３として同定されたＥ１Ｋの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、
配列番号１４として同定された、Ｅ１Ｋの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ
配列番号１５として同定されたＥ１Ｋ及びＤ３２Ｈの２つの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、
配列番号１６として同定された、Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈの２つの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ
配列番号１７として同定されたＧ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ
配列番号１８として同定されたｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、
配列番号１９として同定されたＤ３２Ｈの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、
配列番号２０として同定されたＧ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、
配列番号２１として同定された、Ｄ３２Ｈの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ
配列番号２２として同定されたＥ１Ｋの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ
配列番号２３として同定された、Ｅ１Ｋの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ
配列番号２４として同定されたＥ１Ｋ及びＤ３２Ｈの２つの構造特性を持つ軽鎖可変領域を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、及び
配列番号２５として同定された、Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈの２つの構造特性を持つ軽鎖可変領域と、Ｇ５４Ｉの構造特性を持つ重鎖可変領域とを有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ。
【００２１】
別の実施形態において、上述した一本鎖可変断片は、リンカーまたはスペーサーを持っていようがいまいが、別の抗原に特異性を持つ他のｓｃＦｖに連結して、二価または二重特異性の抗ＧＤ２抗体を生産することができる。例えば、配列番号２６として同定されたリンカー及びスペーサーを持つ、または配列番号２７として同定されたスペーサーを持たないｈｕＯＫＴ３のｓｃＦｖ配列は、配列番号１１〜２５に記載のｓｃＦｖのいずれかに従い得る。あるいは、Ｃ８２５のｓｃＦｖ配列、配列番号２８として同定された抗ＤＯＴＡは、配列番号１１〜２５で同定されたｓｃＦｖ配列のいずれかに従い得る。二重特異性抗体のいくつかの例としては：
配列番号２９として同定されたＡＤＴＫＧＰスペーサーを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ−リンカー−ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、
配列番号３０として同定されたスペーサーを持たないｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ−リンカー−ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、及び
配列番号３１で同定されたｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ−Ｃ８２５  ｓｃＦｖが挙げられる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明で提供される抗体剤は、例えば、エフェクター機能を増大させるために、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１の重鎖に特定の三重残基特性ＤＥＬ（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）を持つ、重鎖及び／または安定性を増強させるためのＶＨ−ＶＬ  Ａｌａ４３Ｓｅｒインタフェースに１つまたは複数の構造特性を持つ、及び／またはその組み合わせを持つ炭水化物組成物でさらに改変することができる。
【００２３】
本発明の好ましい抗体剤は、ヒトＧＤ２に結合し、所望の機能、すなわち、エフェクター機能、疼痛のブロック、または細胞増殖の阻害を行うものである。競合阻害によるモノクローナル抗体の特異性及び親和性を決定するためのある代表的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）に見出すことができる。本発明の少なくとも１つの抗体は、ヒトＧＤ２に対して特異的な少なくとも１つの特定のエピトープ、そのサブユニット、断片、部分、または任意の組み合わせに結合する。エピトープは、少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、そのエピトープは、好ましくは、少なくとも１〜５の糖残基、またはＧＤ２の少なくとも１つの部分のセラミドから成る。
【００２４】
１つの態様において、本発明は、本明細書において定義する構造特性のいずれかを任意の組み合わせで内部に持つＬＣまたはＨＶ、該ＬＣまたはＨＶをコードする核酸配列のいずれかを含む本発明の少なくとも１つの単離されたｈｕ３Ｆ８抗ＧＤ２抗体を提供し、
１つの構造特性Ｄ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１軽鎖は、配列番号３２で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
２つの構造特性Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１軽鎖は、配列番号３３で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
ｈｕ３Ｆ８Ｖ５重鎖は、配列番号３４で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
ｈｕ３Ｆ８Ｖ５軽鎖は、配列番号３５で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
１つの構造特性Ｄ３２Ｈ軽鎖を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５は、配列番号３６で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
２つの構造特性Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈ軽鎖を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５は、配列番号３７で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
１つの構造特性Ｇ５４Ｉ重鎖を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５は、配列番号３８で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
軽鎖領域において１つの構造特性Ｄ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖは、配列番号３９で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
軽鎖領域において２つの構造特性Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖは、配列番号４０で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
軽鎖領域におけるＥ１Ｋ及びＤ３２Ｈの構造特性と重鎖領域におけるＧ５４Ｉの構造特性との３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖは、配列番号４１で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖは、配列番号４２で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
軽鎖領域において１つの構造特性Ｄ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖは、配列番号４３で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、
軽鎖領域において２つの構造特性Ｅ１Ｋ及びＤ３２Ｈを持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖは、配列番号４４で同定されたポリヌクレオチドによりコードされ、ならびに
軽鎖領域におけるＥ１Ｋ及びＤ３２Ｈと重鎖領域におけるＧ５４Ｉとの３つの構造特性を持つｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖは、配列番号４５で同定されたポリヌクレオチドによりコードされる。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明は、本発明の３Ｆ８  ＭｏＡｂのいずれかまたはその断片を含む抗体成分、または本発明の３Ｆ８抗体のいずれかまたはその断片を有する抗体融合タンパク質またはその断片を有する診断／検出または治療免疫コンジュゲートを提供し、該抗体成分は、少なくとも１つの診断／検出剤または少なくとも１つの治療剤に結合する。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、放射性核種、ホウ素、ガドリニウムまたはウラン原子、サイトカイン、幹細胞増殖因子のような免疫モジュレーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、−ベータまたは−ガンマのようなインターフェロン（ＩＦＮ）、及び幹細胞増殖因子、造血因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、抗体、ホルモン、ホルモン拮抗剤、酵素、酵素阻害剤、光活性治療剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、血管形成−阻害剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２阻害剤及び抗生物質剤のような細胞毒性剤、植物、微生物、及び動物性毒素のような細胞毒性毒素、及びその合成変種、血管形成阻害剤、異なる抗体、及びその組み合わせから成る群から選択される治療剤を含む治療免疫コンジュゲートを提供する。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、３Ｆ８抗体によって認識される抗原に向けられた親和性を有する１つまたは複数の抗原結合部位、及びＧＤ２以外にエピトープまたはハプテンに向けられた親和性を有する１つまたは複数のハプテン結合部位を有する多価、多重特異性抗体またはその断片も提供する。１つの実施形態において、多価、多重特異性抗体またはその断片は、診断／検出または治療剤を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明は、（ｉ）対象に、本発明の多価、多重特異性抗体またはその断片を投与し；（ｉｉ）対象の血流を除去するために非結合タンパク質の量についての十分な量の時間を待ち；及び（ｉｉｉ）前記対象に、前記抗体の結合部位に結合する、診断／検出剤、治療剤、またはその組み合わせを含む分子担体を投与することを含む、診断／検出剤、治療剤、またはその組み合わせを標的に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、診断／検出剤または治療剤は、同位体、色素、クロマゲン、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、成長因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びその組み合わせを含む群から選択される。第２の特異性は、記載された薬剤の群からのいずれかにコンジュゲートされたハプテンも含む。これらのハプテンは、これに限定されるものではないが、ビオチン及びその誘導体、ＤＯＴＡ及びその誘導体、ＤＴＰＡ及びその誘導体、フルオレセイン及びその誘導体、ヒスタミン及びその誘導体、デフェロキサミン及びその誘導体を含む。
【００２９】
本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、好ましくは、ヒトまたは家庭用ペットのような哺乳動物である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、（Ａ）対象に、病気となった組織関連マーカーに特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する二重特異性抗体または抗体断片を投与し、前記病気となった組織関連マーカーは、３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原であり；（Ｂ）必要に応じて、前記対象に除去組成物を投与し、前記組成物が非局所化抗体または抗体断片を循環から除去するのを可能とし；次いで、（Ｃ）前記対象に、前記二重特異性抗体または抗体断片の前記少なくとも１つの他のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含む、または担持する担体部分、及び１つまたは複数のコンジュゲートされた治療剤または診断剤を含む第１の標的化可能コンジュゲートを投与することを含む、前記対象において病気となった組織を治療し、または同定する方法である。好ましくは、標的化組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームは、本発明の抗ＧＤ２抗体または抗ＧＤ２抗体の断片である。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明は、（Ａ）標的化組織に特異的に結合する少なくとも１つのアーム及び標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを含む有効量の二重特異性抗体または抗体断片を投与し、標的化組織に特異的に結合する前記１つのアームは、本発明の３Ｆ８抗体またはその断片であり；次いで（Ｂ）標的化可能なコンジュゲートを投与することを含む、哺乳動物において３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原を発現する腫瘍を検出し、または治療する方法を提供する。標的化可能なコンジュゲートは、（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２；（ｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｉｉ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２；（ｘｉｖ）Ｔｓｃｇ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｘｖ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｘｖｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｃｙｓ−ＮＨ２；（ｘｖｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；フルオレセイン及びその誘導体；デスフェリオキサミン、及びその誘導体から成る群から選択することができる。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明は、（Ａ）そのような手順を受けることになっている対象に二重特異性抗体Ｆ（ａｂ）２またはＦ（ａｂ’）２断片、または一本鎖Ｆｖ断片を注射し、二重特異性抗体または断片は、本発明の３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原に特異的に結合する第１の抗体結合部位を有し、ハプテンに特異的に結合する第２の抗体結合部位を有し、抗体断片が標的部位において融合するのを可能とし；（Ｂ）二重特異性断片が注射から約２４時間以内に循環からかなり除去されているのでなければ、必要に応じて、除去剤を用いて非標的化抗体断片を除去し、次いで、非標的化抗体または断片を素早く除去するハプテン修飾デキストラン、またはデンドリマー、またはポリマーを、分解するための肝臓に注射し、（Ｃ）最初の注射から数時間以内に、スキャナーまたはプローブを用いて標的部位における融合した標識の上昇したレベルの核イメージングまたは近い範囲の検出によってハプテンの存在を検出し、次いで、前記手順を行うことを含み、前記検出は、造影剤または減剤の使用無くして行われる、標的化方法を提供する。好ましい実施形態において、ハプテンは、診断／検出放射性同位体、ＭＲＩイメージ増強剤、蛍光標識、または化学発光標識で標識される。蛍光標識は、ローダミン、フルオレセイン、レノグラフィン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド及びフルオレスカミンを含むことができる。化学発光標識は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルを含むことができる。ＭＲＩイメージ増強剤は、ガドリニウム及び強磁性物質を含む。抗体ハプテン局所化のイメージングは、腫瘍ステージング、治療に対する腫瘍応答の測定、早期再発及び腫瘍監視の検出にとって重要な、ＧＤ２を運ぶ無傷腫瘍細胞を検出する。抗体ハプテン局所化の手術中の検出は、腫瘍の正確な位置を与え、病気の肉眼で見えない部位を暴露して、癌に対する治癒的療法の一部としての完全な外科的摘出を可能にする。
【００３３】
また、本発明で考えられるのは、３Ｆ８抗体によって認識される抗原に向けられた親和性を有する１つまたは複数の抗原結合部位、及び細胞（リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、骨髄細胞、幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、白血病細胞、細胞毒性リンパ球、及びＢリンパ球）上のエピトープまたはハプテンに向けての親和性を有する１つまたは複数のハプテン結合部位を含む多価、多重特異性抗体またはその断片である。これらの二重特異性抗体または断片は、静脈内、髄腔内、及び腫瘍内を含めた種々の経路を介して、ヒトを含めた哺乳動物に投与して、内因性細胞または外因的に注入された細胞を、抗原ＧＤ２を運ぶ部位または組織または細胞に標的化することができる。あるいは、細胞は、ヒトを含めた哺乳動物への投与の前に、これらの二重特異性抗体または断片を用いてｅｘ  ｖｉｖｏにてアーム化することができる。
【００３４】
また、本発明で考えられるのは、遺伝学的方法を用いてＧＤ２に対して特異的なキメラ表面受容体を作り出して、診断及び治療用途の双方のために、細胞（リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、骨髄細胞、幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、白血病細胞、細胞毒性リンパ球、及びＢリンパ球）をＧＤ２を担持する組織、臓器、または腫瘍に再度向ける、３Ｆ８またはその断片の配列の使用である。
【００３５】
本発明は、１つの態様において、少なくとも１つの特異的な配列、ドメイン、部分またはその変異体を含む、前記した特異的抗ＧＤ２抗体をコードするポリヌクレオチドに相補的な、またはそれにハイブリダイズさせることを含む単離された核酸分子を提供する。
【００３６】
本発明は、さらに、前記抗ＧＤ２抗体核酸分子、そのような核酸を含有する宿主細胞及び／または組換えベクター、ならびにそのような抗体核酸、ベクター及び／または宿主細胞を製造し、及び／または使用する方法も提供する。従って、本発明は、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体またはその断片をコードする単離された核酸を含み；単離された核酸ベクターは、単離された核酸を含み、及び／または原核生物または真核生物宿主細胞は、単離された核酸を含む。宿主細胞は、必要に応じて、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＤＧ４４、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、またはリンパ腫細胞、またはそのいずれかの誘導体、不死化または形質転換細胞から選択される少なくとも１つであり得る。また、抗体が検出可能なまたは回収可能な量で発現されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕでの条件下で核酸をコードする抗体を翻訳することを含む、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を生産させる方法、例えば、代謝経路の制御下で成長及び生存選択を用いてタンパク質発現が増幅されるのを可能とするベクター、またはこれに限定されるものではないが、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）またはＧＳ（グルタミン合成酵素）を含む酵素を用いる方法も提供する。
【００３７】
また、本発明は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体が検出可能な、及び／または回収可能な量で発現される条件下で、本明細書中に記載された宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞において少なくとも１つの前述した抗ＧＤ２抗体を発現するための少なくとも１つの方法を提供する。
【００３８】
本発明は、（ａ）単離された抗ＧＤ２抗体をコードする核酸、及び／または本明細書中に記載された抗体と；及び（ｂ）適当な担体または希釈剤とを含む少なくとも１つの組成物も提供する。担体または希釈剤は、必要に応じて、公知の担体または希釈剤に従って、医薬的に許容し得るものであってよい。組成物は、必要に応じて、さらに、少なくとも１つのさらなる化合物、タンパク質、または組成物を含むことができる。これらの組成物のいくつかにおいて、キメラまたはヒト化抗体は、細胞毒性剤、トキシン、または放射性核種のような、細胞毒性剤（すなわち、細胞の生存能力及び／または機能を損なう薬剤）にコンジュゲートしている。
【００３９】
本発明は、さらに、当該技術分野で知られているように、及び／または本明細書中に記載されているように、細胞、組織、臓器、動物、または患者において、及び／または関連条件に先立って、それに引き続いて、またはその間に、少なくとも１つのＧＤ２関連疾患を変調するかまたは治療するのに治療有効量を投与するための、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体方法または組成物を提供する。従って、本発明は、本発明の少なくとも１つの単離された抗ＧＤ２抗体またはその断片の有効量を含む組成物を、細胞、組織、臓器、または動物と接触させて、またはそれらに投与することを含む、細胞、組織、臓器、または動物においてＧＤ２関連疾患を診断するかまたは治療する方法を提供する。本方法は、必要に応じて、さらに、細胞、組織、臓器、または動物に対して本発明の抗ＧＤ２抗体の０．００１〜５０ｍｇ／キログラムの有効量を用いることを含んでもよい。本方法は、必要に応じて、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、髄腔内、オマヤ内、硝子体内、眼内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮から選択される少なくとも１つの形態による接触または投与を含んでもよい。本方法は、必要に応じて、さらに、抗体の接触または投与に先立って、それと同時に、またはその後に、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦ拮抗剤、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤、乾癬治療剤、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、抗体または抗体由来コンジュゲート、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、興奮剤、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたはそのアナログ、細胞毒性または他の抗ガン剤、メトトレキサートのような代謝拮抗物質、抗増殖剤、サイトカイン、インターロイキン、成長因子、サイトカイン拮抗剤、及び抗ＴＮＦα、白血球、Ｔ細胞、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、ＮＫＴ細胞、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞または単球または顆粒球の少なくとも１つから選択される化合物またはタンパク質または細胞の有効量を含む少なくとも１つの組成物を投与することを含む。
【００４０】
本発明は、さらに、当該技術分野で知られているように、及び／または本明細書中に記載されているように、細胞、組織、臓器、動物、または患者において及び／または関連疾患に先立って、それに引き続いて、またはその間に、少なくとも１つのＧＤ２関連疾患を診断するための少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を提供する。
【００４１】
本発明は、本発明による、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体疾患の診断のための少なくとも１つの組成物、装置及び／または該診断のための送達の方法も提供する。
【００４２】
また、本発明の少なくとも１つの単離されたヒト化抗ＧＤ２抗体または少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む組成物が提供される。組成物は、必要に応じて、さらに、検出可能な標識またはレポーター、細胞毒性または他の抗ガン剤、メトトレキサートのような代謝拮抗物質、抗増殖剤、サイトカイン、またはサイトカイン拮抗剤、ＴＮＦ拮抗剤、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＴＨＥ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤、乾癬治療剤、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品；抗鬱剤、抗精神病剤、興奮剤、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたはアナログの少なくとも１つから選択された少なくとも１つの化合物またはタンパク質の有効量を含んでもよい。
【００４３】
また、本発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体を含む医療機器が提供され、該機器は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オマヤ内、硝子体内、眼内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮から選択された少なくとも１つの形態によって少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を接触させ、または投与するのに適している。
【００４４】
さらなる態様において、本開示は、第１の容器中の凍結乾燥された形態の本開示の少なくとも１つのキメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体または断片、及び水性希釈剤中の、滅菌水、滅菌緩衝化水、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、マンニトール、スクロース、マンノース、他の糖、ｔｗｅｅｎ８０、またはその混合物から成る群から選択される少なくとも１つの保存剤の選択的な第２の容器を含むキットを提供する。１つの態様において、該キットでは、第１の容器中の抗ＧＤ２抗体または特定の部分または変異体の濃度は、第２の容器の内容物で、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度まで再構成される。別の態様において、第２の容器は、さらに、等張剤を含む。別の態様において、第２の容器は、さらに、生理学的に許容し得る緩衝剤を含む。１つの態様において、本開示は、それを必要とする患者に、キット中で提供され、かつ投与に先立って再構成される製剤を投与することを含む、少なくとも１つのＧＤ２で特徴付けられる疾患を治療する方法を提供する。
【００４５】
また、包装材料、及び本発明の少なくとも１つの単離されたキメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体の溶液または凍結乾燥された形態を含む容器を含む、ヒト医薬または診断用途のための製品も提供される。該製品は、必要に応じて、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オマヤ内、硝子体内、眼内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮送達機器またはシステムの成分としての容器を有することを含むこともできる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
適切な参照抗ＧＤ２抗体と比較して、免疫原性を減少させ、かつ、ＧＤ２への親和性を増大させる特性により特徴付けられる構造の高親和性抗ＧＤ２抗体。
（項目２）
前記抗体が、配列番号１、２、７、または８として同定された軽鎖配列を含む１つの構造特性を持つ項目１に記載の高親和性抗ＧＤ２抗体。
（項目３）
前記構造特性が、配列番号４または１０として同定された重鎖配列を含む１つの構造特性を持つ項目１に記載の高親和性抗体。
（項目４）
免疫原性を減少させ、かつ、ＧＤ２への親和性を増大させる２つの構造特性を持つ高親和性抗ＧＤ２抗体。
（項目５）
配列番号３または９として同定された軽鎖配列を含む項目４に記載の高親和性抗体。
（項目６）
免疫原性を減少させ、かつ、ＧＤ２への親和性を増大させる３つの構造特性を持つ高親和性抗ＧＤ２抗体。
（項目７）
項目５に記載の軽鎖配列と、項目３に記載の重鎖配列とを含む項目６に記載の高親和性抗体。
（項目８）
配列番号６として同定された軽鎖配列を含む項目１に記載の高親和性抗体。
（項目９）
配列番号５として同定された重鎖配列を含む項目１に記載の高親和性抗体
（項目１０）
前記抗体が、免疫原性を減少させ、かつ、ＧＤ２への親和性を増大させる１つまたは複数の構造特性を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である項目１に記載の高親和性抗体。
（項目１１）
前記ｓｃＦｖが、１つの突然変異を含有し、かつ、配列番号１１、１３、１７、１９、２０、または２２として同定される項目１０に記載の抗体。
（項目１２）
前記ｓｃＦｖが、２つの構造特性を有し、かつ、配列番号１２、１４、１５、２１、２３、または２４として同定される項目１０に記載の抗体。
（項目１４）
前記ｓｃＦｖが、３つの構造特性を有し、かつ、配列番号１６または２０として同定される項目１０に記載の抗体。
（項目１６）
前記ｓｃＦｖが、配列番号１６または２５として同定される３つの構造特性を持つ項目１に記載の抗体。
（項目１７）
配列番号１８として同定されたｈｕＦ８Ｖ５  ｓｃＦｖ。
（項目１８）
配列番号１１〜２５として同定された前記ｓｃＦｖのいずれかを含む第１の結合部位と、第２の結合部位とを含む二重特異性抗体。
（項目１９）
前記第２の結合部位が、配列番号２６または２７として同定されたｈｕＯＫＴ３のｓｃＦｖを含む項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目２０）
配列番号２９または３０として同定された項目１９に記載の二重特異性抗体。
（項目２１）
前記第２の結合部位が、配列番号２８として同定されたｓｃＦｖ  Ｃ８２５を含む項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目２２）
配列番号３１として同定された項目２１に記載の二重特異性抗体。
（項目２３）
前記抗体が、前記抗体をコードする核酸を含む組換えベクターによって生産される項目２、３、５、７、８、９、１１〜２２に記載の抗体。
（項目２４）
配列番号３３〜４５として同定された、高親和性抗体軽鎖をコードする単離された核酸分子。
（項目２５）
項目２４に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
（項目２６）
項目２５に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（項目２７）
抗体またはその断片を発現させて、前記抗体またはその断片を培地から分離させる条件下で、項目２６に記載の宿主細胞を前記培地中で培養する工程、
を含む項目１〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片の生産方法。
（項目２８）
項目１〜２２のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む組成物。
（項目２９）
前記抗体が、細胞毒性剤にコンジュゲートしている項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
項目２８または２９に記載の抗体またはその断片または組成物を含み、かつ、医薬的に許容し得る担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
（項目３１）
対象内の病状の治療または予防方法であって、
前記病状は、ＧＤ２発現により特徴付けられ、
項目１〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を治療有効量で前記対象に投与することを含む前記方法。
（項目３２）
前記病状が、神経芽細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍または癌腫である項目３１に記載の対象内の病状の治療または予防方法。
（項目３３）
前記病気が、骨肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、紡錘細胞肉腫、脳腫瘍、小細胞肺癌、網膜芽腫、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞白血病、及び他のＧＤ２陽性腫瘍から成る群から選択される項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記第２の抗原結合部位が、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、神経幹細胞から成る群から選択される免疫細胞に関連する項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目３５）
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤ３に対して特異的である項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目３６）
ビオチン−ＰＥＧ−アルキンと反応したアジド−ＧＤ２−オリゴ糖を含む分子。
（項目３７）
項目３６に記載の分子を含む組成物。
（項目３８）
３Ｆ８抗体のＡＤＣＣの増強方法であって、
Ｇ５４Ｉ構造特性を前記抗体の重鎖に導入することを含む前記方法。
（項目３９）
項目３８に記載の方法によって生産される３Ｆ８抗体を含む治療用組成物。
（項目４０）
前記第２の抗原結合部位が、ハプテンに結合する項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目４１）
前記ハプテンが、診断検出標識で標識される項目４０に記載の二重特異性抗体。
（項目４２）
前記第２の抗原結合部位が、サイトカインまたは細胞増殖抑制剤に結合する項目１８に記載の二重特異性抗体。
（項目４３）
対象内でＧＤ２を発現する細胞へのサイトカインまたは細胞増殖抑制剤の送達方法であって、
項目４２に記載の二重特異性抗体が、前記細胞内で前記ＧＤ２に結合することで、前記サイトカインまたは細胞毒性剤が前記細胞に送達されるように、前記対象に前記抗体を投与することを含む前記方法。
（項目４４）
放射活性によって標識されている項目１〜２２のいずれか１項に記載の高親和性抗体。
（項目４５）
項目４４に記載の抗体を含む治療用組成物。
（項目４６）
項目４４に記載の抗体を含む診断用組成物。
【００４６】
以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、説明のために示されているに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖを持つ異なる腫瘍タイプの染色強度の強さを示す。
【図２】クリック化学を用いてビオチン−（ＰＥＧ）４−アルキンと反応させたアジド−ＧＤ２−オリゴ糖から作製されたビオチン−ＰＥＧ−ＧＤ２の化学的構造を示す。
【図３】典型的なｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧの解離速度のＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
特定の定義
以下の記載において、組換えＤＮＡ及び免疫学で用いる多数の用語が広範に利用される。そのような用語が与えられる範囲を含めた、明細書及び特許請求の範囲のより明瞭かつ一貫性のある理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００４９】
成人：本明細書中で用いられるように、用語「成人」は、１８歳またはそれ以上の年齢のヒトのことを言う。成人間の体重は、通常、９０ポンド〜２５０ポンドの範囲で大きく変化し得る。
【００５０】
親和性：当該技術分野で知られているように、「親和性」は、特定のリガンド（例えば、抗体）がそのパートナー（例えば、エピトープ）に結合する強度の尺度のことである。親和性は、様々な方法で測定することができる。
【００５１】
アミノ酸：本明細書中で用いられるように、用語「アミノ酸」は、その広い意味において、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質のことを言う。いくつかの実施形態において、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は合成アミノ酸である；いくつかの実施形態において、アミノ酸はｄ−アミノ酸である；いくつかの実施形態において、アミノ酸はｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般に見られる２０種類の標準的なｌ−アミノ酸のうちのいずれかのことを言う。「非標準アミノ酸」は、合成により作製されたものであろうと、または天然供給源から得られたものであろうと関係なく、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸のことを言う。本明細書中で用いられるように、「合成アミノ酸」は、化学的に改変されたアミノ酸であって、限定されるものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換体を包含する。アミノ酸、例えば、ペプチド内のカルボキシ−及び／またはアミノ−末端のアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／または該アミノ酸の活性に有害な影響を及ぼすこと無くペプチドの循環半減期を変更させ得る他の化学基による置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与するものであってもよい。アミノ酸は、１つまたは複数の化学的実体（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、ホスフェート基、ホルミル部分、イソプレノイド基、サルフェート基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合のような１つまたは翻訳後修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。該用語が遊離アミノ酸を指すのか、ペプチドの残基を指すのかは、それが使用されている文脈から明らかであろう。
【００５２】
動物：本明細書中で用いられるように、用語「動物」は動物界の任意のメンバーのことを言う。いくつかの実施形態において、「動物」はいずれかの性の任意の発生段階のヒトのことを言う。いくつかの実施形態において、「動物」は任意の発生段階の非ヒト動物のことを言う。ある実施形態において、非ヒト動物は哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物としては、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫及び／または蠕虫が挙げられる。ある実施形態において、動物は、ＤＶによって感染しやすい。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、及び／またはクローンであり得る。
【００５３】
抗体：用語「抗体」は、当該技術分野で認識された用語であり、公知の抗原に結合する分子または分子の活性断片を含むものとする。公知の抗原に結合する分子の活性断片の例は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含む。これらの活性断片は、多数の技術による本発明の抗体に由来してもよい。例えば、精製されたモノクローナル抗体は、ペプシン等の酵素で開裂させて、ＨＰＬＣゲルろ過に付すことができる。Ｆａｂ断片を含む適切な画分はその後、メンブレンろ過法等により集めて濃縮することができる。抗体の活性断片を単離する一般的な技術のさらなる記載については、例えば、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３：１０１１−１０１９（１９８２）を参照されたい。用語「抗体」は、二重特異性抗体、キメラ抗体、及び他の利用可能な形式も含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された抗体は、全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）もしくは免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的結合）部分、例えば、抗体断片であるかまたはこれを含む。
【００５５】
抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等のような抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷抗体によって認識される同一の抗原と結合する。例えば、３Ｆ８モノクローナル抗体断片は、３Ｆ８によって認識されたエピトープに結合する。用語「抗体断片」は、特異的抗原に結合して、複合体を形成することによって、抗原結合構造を含み、かつ、抗体のように作用するいずれの合成または遺伝子操作されたタンパク質も含む。例えば、抗体断片は、重鎖または軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片のような、可変領域から成る単離された断片、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、及び超可変領域であるかまたは超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を含む。
【００５６】
例えば、いくつかの実施形態において、抗体断片は、いくつかの実施形態のいずれかにおいて、親抗体の重鎖または軽鎖で見出される相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、抗体断片は、ＣＤＲに隣接する配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、抗体断片は、親無傷抗体の部分に同一な配列を含み；いくつかの実施形態において、部分は、１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含み；いくつかの実施形態において、部分は、全長鎖に対応する。いくつかの実施形態において、部分は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸の長さである。
【００５７】
文言「モノクローナル抗体」は、当該技術分野で認識された用語である。モノクローナル抗体は、全てがユニークな親細胞クローンである免疫細胞の１つのタイプによって作製されるため、同一の単一特異性抗体である。
【００５８】
種々の方法が、モノクローナル抗体の生産のために当該技術分野で存在する。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作製されてもよい。この関係で、用語「モノクローナル抗体」は、単一の真核生物、ファージ、または原核生物クローンに由来する抗体のことを言う。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖、またはヒト、ヒト化、または他の源からのそのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、及び配列決定することができる。一旦単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクターに入れてよく、次いで、これは、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しないＮＳ０細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、海藻細胞、卵、または骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質転換されて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡは、例えば、均一ヒト配列の代わりに所望の種のヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，上記）、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合により接合させることによって修飾することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに代えて置換することができるか、または本発明の抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変ドメインに代えて置換して、キメラ二価抗体を作り出すことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、「抗体剤」は、抗体またはその断片、もしくはそのような抗体またはその断片を含むかまたはからなる作用物質であるかまたはこれを含む。
【００６０】
同等：用語「同等」は、得られた結果または観察された現象を比較できるほど十分に互いに類似している２つ（またはそれ以上）の条件または環境のセットを説明するのに本明細書において使用される。いくつかの実施形態において、条件または環境の同等なセットは、複数の実質的に同一の特性及び１つまたは少数の異なる特性により特徴付けられる。当業者であれば、条件または環境の異なるセットの下で得られた結果または観察された現象の違いは、変化するそれらの特性の変動によって引き起こされるか、または前記変動を示すものであるという合理的な結論を支持するのに十分な数及び種類の実質的に同一の特性により特徴付けられる場合に、条件のセットが互いに同等であることを認識するであろう。
【００６１】
に対応する：本明細書中で用いられるように、「に対応する」という用語は、多くの場合、注目するポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を示すために使用される。当業者であれば、分かりやすくするために、ポリペプチドの残基は、参照関連ポリペプチドに基づいた標準的な番号付けシステムを用いて指定することが多いことが、理解できるであろう。そのため、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸は、実際に特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要は無く、参照ポリペプチドの１９０位に見出される残基に対応することが理解されよう；当業者には、「対応する」アミノ酸をどのように同定するかは容易に理解されるであろう。
【００６２】
剤形：本明細書中で用いられるように、用語「剤形」及び「単位剤形」は、治療されるべき患者のための治療用タンパク質（例えば、抗体）の物理的に離散した単位のことを言う。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定されると理解されるであろう。
【００６３】
投与レジメン：本明細書において使用される用語「投与レジメン」（または「治療レジメン」）は、典型的には、一定期間を空けて対象に個別に投与される一連の単位用量（典型的には、２つ以上）のことである。いくつかの実施形態において、所与の治療剤は、１つまたは複数の投与を含み得る推奨投与レジメンを有する。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、それぞれが同じ長さの一定期間で互いに分けられている複数の投与を含む；いくつかの実施形態において、投与レジメンは、複数の投与と、個々の投与を分けている少なくとも２つの異なる期間とを含む。いくつかの実施形態において、投与レジメン内の全ての投与は、同じ単位投与量によるものである。いくつかの実施形態において、投与レジメン内の異なる投与は、異なる量によるものである。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、第１の投与量での第１の投与、続いて第１の投与量とは異なる第２の投与量での１つまたは複数の追加の投与を含む。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、第１の投与量での第１の投与、続いて第１の投与量と同じ第２の投与量での１つまたは複数の追加の投与を含む。
【００６４】
エピトープ：用語「エピトープ」は当該分野で認識されている。一般に、抗体と相互作用する抗原または複数抗原の領域のことを言うのは当業者に理解される。ペプチドまたはタンパク質または糖抗原のエピトープは線状または立体配座とすることができるか、または抗原の連続的なまたは非連続的なアミノ酸及び／または糖配列によって形成することができる。ＧＤ２分子は、多くの炭水化物のように、多くのエピトープを含有する。当業者であれば、いくつかの実施形態において、提供される抗体剤が、例えば、１つまたは複数のアミノ酸もしくは糖残基の置換、修飾、付加、欠失、または化学的ミメティックスを含有し得るそれらの標的エピトープの変異体と結合し得る（例えば、架橋し得る）ことが理解されるであろう。本発明の抗体によって認識されるエピトープまたは糖、及び抗体、ＧＤ２抗原の化学的ミメティックスのペプチド及び抗イディオタイプ抗体によって依然として認識されるこれらの糖の保存的置換は、本発明の実施形態である。そのような変異体エピトープ、及び提供される抗体剤に従ったそれらの使用は、本発明の範囲内である。抗イディオタイプ抗体は、本発明の実施形態である。いくつかの実施形態において、アミノ酸または糖エピトープ、またはミメティックスのペプチド／化学物質、または抗イディオタイプ抗体は、免疫親和性カラム上でＧＤ２をＭｏＡｂに、またはＧＤ２からＭｏＡｂを溶出させるための慣用的な方法を提供する。これらのエピトープのさらなる切形も可能である。
【００６５】
同一性：本明細書中で用いられるように、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全長における関係性のことを言う。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、２つの配列を、最適な比較目的のためアラインメントすることにより行われ得る（例えば、最適なアラインメントのために、第１と第２の核酸配列の一方または両方にギャップが導入され得、比較目的のため同一でない配列は無視され得る）。ある実施形態において、比較目的のためにアラインメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列内のある位置が第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドで占められているならば、両分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数及び各ギャップの長さ（これは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある）を考慮し、両配列が共有する同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行われ得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定され得る。このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用いて決定され得る。
【００６６】
単離された：本明細書中で用いられるように、用語「単離された」は、（１）それが最初に生産された（自然状態であろうが実験的環境であろうが）際に付随していた成分の少なくとも一部から分離されたか、または（２）人間の手によって生産された、調製された、及び／または製造された物質及び／または実体のことを言う。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に付随していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上から分離することができる。いくつかの実施形態において、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％以上純粋である。本明細書中で用いられるように、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書中で用いられるように、単離された物質及び／または実体の純度パーセントの算出には、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００６７】
裸：いくつかの実施形態において、抗体剤は、ペイロード（例えば、診断剤または治療剤）にコンジュゲートされていない場合、「裸」と呼ばれる。そのような裸の抗体剤は、抗体分子のＦｃ部分が、補体結合及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞の細胞毒性）のようなエフェクター機能を提供し、細胞溶解をもたらし得る作用にメカニズムを設定するため、様々な状況で有用である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、ならびにキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体の双方を含む。しかしながら、Ｆｃ部分は治療的機能に要求されず、むしろ、抗体は細胞周期の休止及びアポトーシスの誘導のような他のメカニズムを介してその治療効果を発揮するのが可能である。この場合において、裸の抗体は、先に定義されたコンジュゲートされていない抗体断片も含む。
【００６８】
キメラ：「キメラ」抗体は、１つの種、好ましくは齧歯類に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた可変ドメインを含有する組換えタンパク質であり、他方、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のそれに由来する。動物適用では、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種のそれに由来してもよい。
【００６９】
ヒト化：「ヒト化」抗体は、１つの種からの抗体；例えば、齧歯類抗体からのＣＤＲが齧歯類抗体の重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインに移される組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のそれに由来する。
【００７０】
ヒト：用語「ヒト」は、抗原攻撃に応答して、特異的なヒト抗体を生産させるように「操作された」トランスジェニックマウスから得られた抗体のことを言うために使用されることが多い。この技術において、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素は、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された崩壊を含有する胚幹細胞株に由来するマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを生産することができる。トランスジェニックマウスからのヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。十分にヒト型の抗体は、その全てが当該技術分野で知られている、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージ提示技術によって構築することもできる。例えば、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト抗体及びその断片の生産については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術において、抗体可変ドメイン遺伝子は、フィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たる外皮タンパク質遺伝子いずれかにインフレームにてクローン化させ、及びファージ粒子の表面に機能的抗体断片として提示される。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有する故に、抗体の機能的性質に基づく選択の結果、それらの性質を呈する抗体をコードする遺伝子が選択される。このようにして、ファージはＢ細胞の性質のいくつかを模倣する。ファージ提示は、種々の形式で行うことができ、それらのレビューについては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。
【００７１】
ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって生じさせることもできる。この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照されたい。
【００７２】
治療剤：治療剤は、特定のレジメンに従って投与された際に、所望の治療利益を得やすい実体のことである。いくつかの実施形態において、治療剤は、抗体部位とは別々に、同時に、または順次に投与され、または抗体部位、すなわち、抗体または抗体断片、またはサブ断片にコンジュゲートされており、病気の治療で有用である。治療剤の例としては、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫モジュレーター、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、または色素及び放射性同位体が挙げられる。
【００７３】
診断剤：診断剤は、投与した際に検出可能な実体のことである。いくつかの実施形態において、診断剤は、抗体部位、すなわち、抗体または抗体断片またはサブ断片にコンジュゲートされて投与され、抗原を含有する細胞を突き止めることによって病気を診断し、または検出するのに有用である。有用な診断剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体、（ビオチン−ストレプトアビジン複合体を持つような）色素、造影剤、蛍光化合物、または分子、及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。米国特許第６，３３１，１７５号は、ＭＲＩ技術、及びＭＲＩ増強剤にコンジュゲートされた抗体製剤を記載し、参照によりその全体が組み込まれる。好ましくは、診断剤は、放射性同位体、磁気共鳴イメージングで用いられる増強剤、及び蛍光化合物から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、診断剤は、放射活性または非放射活性標識、（磁気共鳴イメージングについては、計算されたトモグラフィー、または超音波のような）造影剤を含むことができ、及び放射活性標識はガンマ−、ベータ−、アルファ−、オージェ電子−、または陽電子放出同位体であり得る。放射活性金属または常磁性イオンを持つ抗体成分を負荷するために、イオンを結合させるための多様なキレート化基が結合される長いテイルを有する試薬とそれを反応させる必要があろう。そのようなテイルは、ポリリシン、多糖、または例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的で有用であることが知られている同様な基のようなキレート化基を結合させることができるペンダント基を有する他の誘導体化されて、または誘導体化可能な鎖のようなポリマーであり得る。キレートは、標準的な化学を用いて抗体に連結させる。該キレートは、通常、免疫反応性の最小の喪失及び最小の凝集でもって分子への結合の形成を可能とする基によって抗体に連結されており、及び／または内部架橋の他のより通常でない方法、及びキレートを抗体にコンジュゲートさせるための試薬は、この参照によりその全体が本明細書ら組み込まれる、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」と題された、１９８９年４月２５日に発行されたＨａｗｔｈｏｒｎｅに対する米国特許第４，８２４，６５９号に開示されている。特に有用な金属−キレート組み合わせは、放射性イメージング用の診断同位体と共に用いられる、２−ベンジル−ＤＴＰＡ及びそのモノメチル及びシクロヘキシルアナログを含む。同一のキレートは、マンガン、鉄、及びガドリニウムのような非放射性金属と複合体化された場合、本発明の抗体と共に用いる場合に、ＭＲＩで有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡのような大環キレートは、種々の金属及び放射性金属と、最も好ましくは、各々、ガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共に使用されるものである。そのような金属−キレート複合体は、環のサイズを注目する金属に対して仕立てることによって、非常に安定とすることができる。ＲＡＩＴについての２２３Ｒａのような、安定に結���する核種のための注目する大環状ポリエーテルのような他の環タイプのキレートは本発明によって含まれる。
【００７４】
免疫コンジュゲート：「免疫コンジュゲート」は、抗体成分とペイロード（例えば、治療剤または診断剤）とのコンジュゲート（すなわち、共有結合）である。
【００７５】
免疫モジュレーター：「免疫モジュレーター」は、存在する場合、典型的には免疫細胞を増殖させるか、またはマクロファージ、Ｂ細胞、及び／またはＴ細胞のような免疫応答カスケードにおいて活性化されるように刺激する薬剤である。本明細書中に記載された免疫モジュレーターの例は、サイトカインである。当業者が理解するように、ある種のインターロイキン及びインターフェロンはＴ細胞または他の免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００７６】
発現ベクター：「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。典型的には、遺伝子の発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節要素、及びエンハンサーを含めた、ある種の調節要素の制御下に置かれる。そのような遺伝子は、調節要素に「操作可能に連結している」と言われる。
【００７７】
宿主細胞：組換え「宿主細胞」は、クローニングベクターまたは発現ベクターいずれかを含有するいずれの原核生物または真核生物細胞であってもよい。この用語は、原核生物または真核生物細胞のみならず、宿主細胞の染色体またはゲノム、または宿主細胞の細胞においてクローン化遺伝子（類）を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物も含む。
【００７８】
突然変異体：本明細書中で用いられるように、用語「突然変異体」は、参照実体と顕著な構造同一性を示すが、参照実体と比較して１つまたは複数の化学的部分の存在またはレベルで参照実体と構造的に異なる実体のことを言う。多くの実施形態において、突然変異体は、その参照実体と機能的にも異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「突然変異体」であると適切に考えられるかは、参照実体との構造同一性の度合に基づいている。当業者によって認識されているように、任意の生物学的または化学的な参照実体は、ある種の特徴的な構造的要素を有する。定義によれば、突然変異体は、１つまたは複数のこのような特徴的な構造的要素を共有する異なる化学的実体である。少数だが例を挙げれば、小分子は、小分子の突然変異体が、コア構造的要素及び特徴的なペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分の点で及び／またはコア内に存在する結合の種類（例えば、単一対二重、Ｅ対Ｚなど）の点で異なるものであるように、特徴的なコア構造的要素（例えば、大環状のコア）及び／または１つもしくは複数の特徴的なペンダント部分を有してもよく、ポリペプチドは、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有し、及び／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から成る特徴的な配列要素を有してもよく、核酸は、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有する複数のヌクレオチド残基から成る特徴的な配列要素を有してもよい。例えば、突然変異ポリペプチドは、アミノ酸配列の１つまたは複数の違い、及び／またはポリペプチド骨格に共有結合している化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つまたは複数の違いの結果として参照ポリペプチドと異なってもよい。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９９％の全体的な配列同一性を示す。あるいはもしくはさらに、いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。いくつかの実施形態において、参照ポリペプチドは、１つまたは複数の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の１つまたは複数を共有する。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の１つまたは複数を欠く。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して減少したレベルの１つまたは複数の生物学的活性を示す。
【００７９】
多重特異的：「多重特異的」抗体は、異なる構造のものである少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同一抗原上の２つの異なるエピトープ、またはハプテン及び抗原またはエピトープに対して同時に結合することができる抗体である。１つの特異性は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄−、血漿−、または肥満細胞抗原またはエピトープに対するものであろう。もう１つの特異性は、Ｂ細胞上の、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、またはＣＤ２２のような同一の細胞型上での異なる抗原に対することができよう。多重特異的な多価抗体は、２つ以上の結合部位を有する構築体であって、及び結合部位は異なる特異性のものである。例えば、１つの結合部位が１つの抗原と反応し、及び他の結合部位がもう１つの抗原と反応する二重特異性ダイアボディー。
【００８０】
二重特異性：「二重特異性」抗体は、異なる構造のものである２つの標的に同時に結合することができる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）及び二重特異性抗体断片（ｂｓＦａｂ）は、例えば、ＧＤ２に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び治療剤または診断剤を担持する標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する。種々の二重特異性融合タンパク質は、分子工学を用いて生産することができる。１つの形態において、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原のための単一の結合部位を持つｓｃＦｖ、及び第２の抗原のための単一の結合部位を持つＦａｂ断片から成る。もう１つの形態において、二重特異性融合タンパク質は四価であり、例えば、１つの抗原のための２つの結合部位を持つＩｇＧ、及び第２の抗原のための２つの同一のｓｃＦｖから成る。
【００８１】
二重特異性ＭｏＡｂを生産するための最近の方法は、それらがより通常の免疫グロブリンアイソタイプよりも強く架橋するように、さらなるシステイン残基を有する操作された組換えＭｏＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（１０）：１２２１−１２２５、１９９７を参照されたい。もう１つのアプローチは、２つ以上の異なる一本鎖抗体、または必要な二重特異性を持つ抗体断片セグメントを連結させる組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９−１６３，１９９７を参照されたい。種々の二重特異性融合タンパク質は分子工学を用いて生産することができる。
【００８２】
２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体断片を連結する二重特異性融合タンパク質は、同様な手法で生産される。組換え方法を用いて、種々の融合タンパク質を生産することができる。いくつかの実施形態において、柔軟なリンカーはｓｃＦｖを、３Ｆ８抗体の重鎖の定常領域に連結させる。あるいは、ｓｃＦｖはもう１つのヒト化抗体の軽鎖の定常領域に連結させることができる。重鎖ＦｄのｓｃＦｖへのインフレーム連結に必要な適切なリンカー配列は、ＰＣＲ反応を通じてＶＬ及びＶカッパドメインに導入される。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するステージングベクターに連結される。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築体を切り出し、ｈｕ３Ｆ８抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターに連結させる。得られたベクターを用いて、二重特異性融合タンパク質の発現のために、哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞を形質導入することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明のｈｕ３Ｆ８抗体及びその断片を用いて、ダイアボディーとも呼ばれる機能的二重特異性一本鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）を調製することもでき、組換え方法を用いて哺乳動物細胞において生産することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７０２１−７０２５、１９９５を参照されたい。例えば、ｂｓｃＡｂは、２つの一本鎖Ｆｖ断片を、組換え方法を用いてグリシン−セリンリンカーを介して接合させることによって生産される。注目する２つの抗体のＶ軽鎖及びＶ重鎖ドメインは、当該技術分野で知られた標準的なＰＣＲ方法を用いて単離される。二重特異性一本鎖抗体及び二重特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された二重特異性ダイアボディーの最終の使用は、診断／検出または治療剤の引き続いての特異的送達用のＧＤ２陽性細胞を予め標的化するためである。これらのダイアボディーは標的化された抗原に必要に応じて結合し、増大した親和性及び所望の位置におけるより長い滞留時間を可能とする。さらに、非抗原結合ダイアボディーは素早く身体から除去され、正常組織の暴露は最小化される。ある特定の実施形態において、本明細書で使用されるダイアボディーは、診断／検出及び治療剤、例えば、同位体、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、コンジュゲート、放射性核種、及び金属の１つ以上を含むかまたはそれにコンジュゲートされていてもよい。例えば、ガドリニウム金属は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のために用いられる。放射性核種は、診断剤及び治療剤（ダイアボディーの有無を問わず）、特に、６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲のそれとしても入手可能である。
【００８５】
標的化可能な構築体は、多様な構造のものとすることができるが、免疫応答の惹起を回避するのみならず、ｂｓＡｂ標的化方法内で用いる場合に迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスのために選択される。疎水性剤は強力な免疫応答を惹起するにおいて最良であり、他方、親水性剤は迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスで好ましく；従って、疎水性と親水性間のバランスが確立される必要がある。これは、部分的には、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺するために親水性キレート剤の使用に依拠することによって達成される。また、標的化可能な構築体のサブユニットを選択することができ、それは反対の溶液性質を有する。例えば、そのいくつかが疎水性であるアミノ酸、及びそのいくつかが親水性であるアミノ酸を含有するペプチド。ペプチドとは別に、炭水化物を使用することもできる。
【００８６】
ペプチド：２つ程度と少数のアミノ酸残基を有するペプチドを使用してもよく、いくつかの実施形態において、キレート剤のような他の部分にもカップリングされるならば、好ましくは２〜１０の残基を用いてよい。
【００８７】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書中においては、天然タンパク質、断片、またはポリペプチド配列のアナログのことを言うように総称として用いられる。よって、天然タンパク質、断片、及びアナログは、ポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは、配列番号：４、５、１０で表わされた重鎖免疫グロブリン分子、配列番号：１、２、３、６、７、８、９で表わされた軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に重鎖免疫グロブリン分子、及びその逆、ならびにその断片及びアナログを含む組み合わせによって形成された抗体分子を含む。
【００８８】
リンカー：いくつかの実施形態において、コンジュゲートに利用される「リンカー」は、キレート中に金属イオンを含む、好ましくは、５０，０００ダルトン未満の分子量、有利には約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、または５，０００ダルトン未満の分子量を有するコンジュゲートと比較して低分子量とすべきである。いくつかの実施形態において、リンカー部分上の親水性キレート部分の存在は、迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを確実とするのを助ける。親水性に加えて、キレート剤は、それらの金属結合性質について選択され、及び任意に変化させる。というのは、少なくとも、そのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるか、または非キレート化学的ハプテンであるリンカーについて、金属−キレート複合体の認識はもはや論点ではないからである。
【００８９】
突然変異体：本明細書中で用いられるように、用語「突然変異体」は、参照実体と顕著な構造同一性を示すが、参照実体と比較して１つまたは複数の化学的部分の存在またはレベルで参照実体と構造的に異なる実体のことを言う。多くの実施形態において、突然変異体は、その参照実体と機能的にも異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「突然変異体」であると適切に考えられるかは、参照実体との構造同一性の度合に基づいている。当業者によって認識されているように、任意の生物学的または化学的な参照実体は、ある種の特徴的な構造的要素を有する。定義によれば、突然変異体は、１つまたは複数のこのような特徴的な構造的要素を共有する異なる化学的実体である。少数だが例を挙げれば、小分子は、小分子の突然変異体が、コア構造的要素及び特徴的なペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分の点で及び／またはコア内に存在する結合の種類（例えば、単一対二重、Ｅ対Ｚなど）の点で異なるものであるように、特徴的なコア構造的要素（例えば、大環状のコア）及び／または１つもしくは複数の特徴的なペンダント部分を有してもよく、ポリペプチドは、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有し、及び／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から成る特徴的な配列要素を有してもよく、核酸は、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有する複数のヌクレオチド残基から成る特徴的な配列要素を有してもよい。例えば、突然変異ポリペプチドは、アミノ酸配列の１つまたは複数の違い、及び／またはポリペプチド骨格に共有結合している化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つまたは複数の違いの結果として参照ポリペプチドと異なってもよい。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９９％の全体的な配列同一性を示す。あるいはもしくはさらに、いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。いくつかの実施形態において、参照ポリペプチドは、１つまたは複数の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の１つまたは複数を共有する。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の１つまたは複数を欠く。いくつかの実施形態において、突然変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して減少したレベルの１つまたは複数の生物学的活性を示す。
【００９０】
キレート剤：ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、またはＮＯＴＡなどのキレート剤は、コンジュゲート中を含む種々の状況のいずれかで利用することができる。同一のキレート剤は、Ｍｎ、Ｆｅ及びＧｄなどの非放射性金属と複合体化させた場合、本発明のｂｓＡｂと共に用いると、ＭＲＩで用いることができる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸）、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸）のような大環キレート剤は、種々の金属及び放射性金属と共に、最も好ましくは、各々、Ｇａ、Ｙ、及びＣｕの放射性核種と共に用いられるものである。
【００９１】
コンジュゲート：いくつかの実施形態において、コンジュゲート中で利用される抗体剤を提供する。いくつかの特定の実施形態において、蛍光分子のような検出可能な標識、または重金属または放射性核種のような細胞毒性剤をコンジュゲートさせることができる、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、またはＮＯＴＡまたは適当なペプチドのようなキレート剤。例えば、治療的に有用な免疫コンジュゲートは、光活性剤または色素を抗体融合タンパク質にコンジュゲートさせることによって得ることができる。蛍光色素のような蛍光組成物、及び可視光に対して感受性があるポルフィリンのような他の色原体または色素が、適当な光を病巣に向けることによって病巣を検出し、治療するのに用いられてきた。療法において、これは光照射、光療法、または光力学的療法と言われてきた（Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ  ２２：４３０（１９８６））。さらに、モノクローナル抗体は、光療法を達成するために光活性化色素とカップリングされてきた。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３（１９８３）；ｉｄｅｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８７４４（１９８６）；ｉｄｅｍ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２５２９（１９９１）。しかしながら、これらのより早い研究は、特に、抗体断片またはサブ断片を使用した、内視鏡療法適用の使用を含まなかった。従って、本発明では、光活性剤または色素を含む免疫コンジュゲートの治療的使用が考えられる。
【００９２】
予防する：本明細書中で用いられるように、用語「予防する」、「予防している」及び「予防」は、予防剤または治療剤の投与から得られる、対象における障害の１つまたは複数の症状の再発または発症の予防のことを言う。
【００９３】
組み合わせ：本明細書中で用いられるように、用語「組み合わせて」は、２つ以上の予防剤及び／または治療剤の使用のことを言う。用語「組み合わせて」の使用は、予防剤及び／または治療剤を、障害のある対象に投与する順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤は、障害のある対象に第２の予防剤または治療剤を投与する前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前）に、または第２の予防剤または治療剤を投与すると同時に、または第２の予防剤または治療剤を投与した後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週後）に、投与することができる。
【００９４】
エフェクター機能：本明細書において用いられる「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体またはリガンドとの相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能としては、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体媒介細胞毒性（ＣＭＣ）があるが、これに限定されるものではない。エフェクター機能は、抗原結合後に作用するエフェクター機能と、抗原結合とは無関係に作用するエフェクター機能の両方を含む。
【００９５】
エフェクター細胞：本明細書において用いられる「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃ受容体を発現し、１つまたは複数のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球があるが、これに限定されるものではなく、またエフェクター細胞は任意の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルに由来し得るが、これに限定されるものではない。
【００９６】
Ｆｃリガンド：本明細書において用いられる「Ｆｃリガンド」は、任意の生物に由来する、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドとしては、限定されるものではないがＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、ブドウ球菌タンパク質Ａ、レンサ球菌タンパク質Ｇ、及びウイルスＦｃγＲがあるが、これに限定されるものではない。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未知の分子を含み得る。
【００９７】
誘導体：本明細書中で用いられるように、ポリペプチドまたはタンパク質との関係での用語「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質のことを言う。用語「誘導体」とは、本明細書中で用いられるように、すなわち、いずれかのタイプの分子のポリペプチドまたはタンパク質への共有結合によって修飾されているポリペプチドまたはタンパク質のことも言う。例えば、これに限定されるものではないが、抗体は、公知の保護／ブロック基、タンパク質分解開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等により、例えば、グリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、ホスホリル化、アミド化、誘導体化によって修飾されてもよい。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、これに限定されるものではないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含めた、当業者に知られた技術を用いて化学的修飾によって生産されてもよい。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質としての同様なまたは同一の機能を保持する。
【００９８】
断片：本明細書中で用いられるように、用語「断片」は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドのことを言う。特定の実施形態において、ポリペプチドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【００９９】
有効量：本明細書中で用いられるように、用語「有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な所与の化合物、コンジュゲートまたは組成物の量のことを言う。本発明の方法による所与の化合物、コンジュゲートまたは組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当該技術分野で知られた、及び／または本明細書中に記載されたアッセイを用い、過度な実験の必要性無くして、当業者によってルーチンの事項として決定することができる。例えば、癌の転移を治療または予防するための有効量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの基底膜を横切っての、または内皮層を横切っての腫瘍細胞の移動及び侵入を予防するのに必要な量であり得るであろう。該用語は「十分な量」とも同義である。いずれかの特定の適用のための有効量は、処置される病気、障害または疾患、投与すべき特定の組成物、投与経路、対象のサイズ、及び／または病気または疾患の重症度のような因子に依存して変化し得る。当業者であれば、過度の実験を必要とすること無く、本明細書中で提供されたガイダンスに従って、本発明の特定の化合物、コンジュゲートまたは組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【０１００】
約：測定された量との関係で本明細書中で用いられるように、用語「約」とは、測定を行い、測定の対象と同様なケアのレベル、及び用いる測定機器の精度を行使する当業者によって予測されるであろう測定された量における通常の変動のことを言う。そうでないことが示されているのでなければ、「約」とは、提供された値の＋／−１０％の変動のことを言う。
【０１０１】
単離された：「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、または誘導体とは、その天然の環境には無いポリペプチドを意図する。精製の特別なレベルは要求されない。例えば、単離されたポリペプチドは、その生来のまたは天然の環境から除去することができる。宿主細胞で発現された組換えにより生産されたポリペプチド及びタンパク質は、いずれかの適当な技術によって分離され、分画され、または部分的にまたは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的では単離されていると考えられる。
【０１０２】
小分子：一般に、「小分子」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、または約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態において、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態において、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態において、小分子は、ポリマーではない。いくつかの実施形態において、本発明によれば、小分子は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、糖タンパク質、プロテオグリカンなどではない。
【０１０３】
実質的に：本明細書中で用いられるように、用語「実質的に」は、注目する特徴または特性の完全なまたは完全に近い程度あるいは度合を示す定性的条件のことを言う。生物学的技術分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が完了し、及び／または完結まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することは極めてまれであることを理解するであろう。従って、用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象において固有の完全さの潜在的欠如を捉えるために本明細書において使用される。
【０１０４】
治療有効量：本明細書中で用いられるように、用語「治療有効量」は、いずれの医療処置にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、治療対象に治療効果をもたらす治療用タンパク質の量のことを言う。治療効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能である）でもよいし、主観的（すなわち、対象が効果を示すか、または効果を感知する）でもよい。特に、「治療有効量」とは、所望の病気または疾患を治療する、改善する、または予防するのに効果的な、あるいは、病気に関連する症状を改善する、病気の発症を予防するかまたは遅らせる、及び／または病気の症状の重症度もしくは頻度を低下させることによって検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すのに効果的な治療用タンパク質または組成物の量のことを言う。治療有効量は、一般的には、複数の単位用量を含んでもよい投与レジメンで投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療有効量（及び／または有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬剤との組み合わせに応じて変化し得る。また、任意の特定の患者のための具体的な治療有効量（及び／または単位用量）は、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な薬剤の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び／または用いられる具体的な融合タンパク質の排出もしくは代謝の速度；治療の継続期間；ならびに医療分野において周知であるような要因を含む種々の要因に依存し得る。
【０１０５】
治療：本明細書中で用いられるように、用語「治療」、「治療する」、「治療された」、または「治療している」とは、特に、対象が多発性硬化症の進行のような望まれない生理学的変化または障害を予防し、または遅らせる（少なくする）ことにある予防及び／または治療のことを言う。有益なまたは所望の臨床的結果は、これに限定されるものではないが、症状の軽減、病気の程度の低下、病気の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、病気の進行の遅延または遅れ、病気状態の緩和または寛解、及び（部分的または全体的を問わず）緩解を、検出可能であるかまたは検出できないかを問わず、含む。「治療」は、治療を受けるのでなければ、予測された生存と比較して延長される生存を意味することもできる。治療を必要とする者は、疾患または障害を既に持つ者、ならびに疾患または障害を有する傾向がある者、または疾患または障害が予防されるべき者を含む。「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療が望まれるいずれかの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ等のような、ヒト及び他の霊長類、家畜動物、農場動物、及び動物園、スポーツ、またはペット動物を含む。
【０１０６】
単位用量：本明細書において用いられる「単位用量」という表現は、単回投与として、及び／または物理的に離散した単位で投与される医薬組成物の量のことを言う。多くの実施形態において、単位用量は、所定分量の活性剤を含有する。いくつかの実施形態において、単位用量は、単回投与全体の剤を含有する。いくつかの実施形態において、全ての単回投与を達成するために、２つ以上の単位用量が投与される。いくつかの実施形態において、目的の効果を達成するために、複数の単位用量の投与が必要であるか、または前記投与が必要であると予想される。単位用量は、例えば、所定分量の１つまたは複数の治療剤を含有する液体（例えば、許容される担体）、所定量の１つまたは複数の固体形態の治療剤、所定量の１つまたは複数の治療剤を含有する持続放出製剤または薬物送達装置などの容量でもよい。単位用量は、治療剤に加えて種々の成分のいずれかを含む製剤中に存在してもよいと理解されるであろう。例えば、許容される担体（例えば、医薬的に許容し得る担体）、希釈剤、安定剤、緩衝剤、保存剤などが、下記のように含まれていてもよい。当業者であれば、多くの実施形態において、特定の治療剤の適切な１日総投与量は単位用量の一部または大部分を含んでもよく、例えば、正当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定されてもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、任意の特定の対象または生物のための具体的な有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な活性化合物の活性；用いられる具体的な組成物；対象の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与時間、及び用いられる具体的な活性化合物の排出速度；治療の継続期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物及び／またはさらなる治療薬、ならびに医療分野において周知であるような要因を含む種々の要因に依存し得る。
【０１０７】
神経芽細胞腫
神経芽細胞腫（ＮＢ）は子供時代の最も普通の頭蓋外固形腫瘍である。症例の〜５０％においては、治癒的戦略は骨髄（ＢＭ）における柔軟な組織の質量及び転移の双方に取り組まなければならない。用量集中的化学療法は腫瘍の切除可能性を改善し、及び外科的処置後照射は原発部位における再発の危険性を＜１０％まで低下させる（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９，２８２１−８）。しかしながら、ＢＭ病は、組織学またはメタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）スキャンによって証明されるように、しばしば持続し、致死的な結果を予知する（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１，２４８６−９１；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４，１５５２−８）。加えて、誘導療法後におけるほとんど完全な緩解の達成にかかわらず、骨延髄再発は共通している。治療強化における試みは急性及び長期の副作用双方に遭遇しており、双方は若い患者について重大な関心事である。有望な新しい薬剤の不足があり、今日、いずれかの標的／経路特異的小分子がＮＢを持つ患者において主な臨床的利益を示したならば少数であるが、多くの有望な先例は継続して蓄積されている。＞１８月齢において診断されたステージ４の患者の中の毒性制限における＜３０％の治癒率にて、改良の実質的な予知がある（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ９，２４７−５６）。
【０１０８】
本発明は、いくつかの因子が、ＮＢを、ＭｏＡｂ標的化免疫療法によく適したものとする認識を包含する。まず、ＭｏＡｂは、ヒト白血球の存在下においてＮＢの高度に効果的な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。第二に、ＭｏＡｂは、減衰加速因子ＣＤ５５（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１，１１２２−８）及び相同制限因子ＣＤ５９（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，３０１３−８）を欠如する、ＮＢ細胞の補体媒介細胞毒性（ＣＭＣ）を誘導する。ＮＢ細胞上への補体沈積は、コロニー刺激因子が与えられれば（Ｍａｃｋａｌｌ，ＣＬ，２０００，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８，１０−８）、用量集中的または骨髄破壊的化学療法＋幹細胞移植の後においてさえ利用可能な、好中球に対するｉＣ３Ｂ受容体の活性化を通じてＡＤＣＣを増強させる（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，１９９２，Ｂｌｏｏｄ  ７９，１４８４−９０，Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，４１６６−７３）。第三に、臨床的緩和を達成するための集中的化学療法（ＮＢについての看護の標準）の使用は、患者がネズミ、キメラ、またはヒト化ＭｏＡｂ（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ４８，４３０−４）をあまり拒絶しないようであるように、延長されたリンパ球減少症及び免疫抑制（Ｍａｃｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ  ９６，７５４−７６２）を引き起こす。
【０１０９】
参照抗ＧＤ２抗体
ＧＤ２は、正常組織においてはかなり制限された発現を持つ神経芽細胞腫及び黒色腫を含めた、神経外胚葉性起源の腫瘍について豊富なジシアロガングリオシドである。少なくとも２つの抗ＧＤ２抗体ファミリーが、ＮＢの治療用に臨床的に試験されている。すなわち、３Ｆ８（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２６４２−９）及び１４．１８（Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９，２８５７−６１）。
【０１１０】
キメラｃｈ１４．１８は、ネズミＭｏＡｂ  １４．１８の可変領域、及びヒトＩｇＧ１−Ｋの定常領域（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｓ  １２５，１９１−２０２）からなる。それは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＢ及び黒色腫細胞のＡＤＣＣ及びＣＭＣを示している（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１，１４４−９；Ｂａｒｋｅｒ及びＲｅｉｓｆｅｌｄ，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，３６２−７；Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７，５７０２−０５）。フェーズＩ研究における臨床的応答の促進に基づき、ｃｈ１４．１８はステージ４のＮＢについての地固め療法として大きなフェーズＩＩ研究で試験された（Ｇｅｒｍａｎ  ＮＢ９０及びＮＢ９７研究）。診断における＞１２ヶ月の１６６人の患者では、イベントフリー生存（ＥＦＳ）は、維持化学療法に対する患者と比較した場合にｃｈ１４．１８を受ける患者において同様であるが、全生存（ＯＳ）は改善され、ＢＭ再発率はｃｈ１４．１８で治療された患者において低下した（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２，３５４９−５７）。
【０１１１】
２００１年において、子供の腫瘍学グループ（ＣＯＧ）は、無作為化されたフェーズＩＩＩ試験を開始して、自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）後の完全緩解（ＣＲ）における患者でのＮＢ再発を予防するにおけるｃｈ１４．１８とＧＭＣＳＦ及びＩＬ−２の組み合わせの効力を実験し（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖＮＣＴ０００２６３１２）（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：８５−９１，２００９）、ここに、２年における進行フリー生存（ＰＦＳ）及びＯＳの有意な改良が見出された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：１３２４−１３３４，２０１０）。
【０１１２】
ＧＤ２に対して特異的なネズミＩｇＧ３  ＭｏＡｂである３Ｆ８は細胞の死滅を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＮＢに対する有効なＡＤＣＣ及びＣＭＣを媒介する（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，上記）。用量集中誘導＋攻撃的サルベージレジメンにかかわらず化学療法抵抗性骨髄病を持つ患者の中で、８０％は、５日抗体＋ＧＭ−ＣＳＦ療法の１〜２サイクル後に通常ＢＭ緩解を達成した（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５，５２６ｓ）。化学療法抵抗性骨髄病に対するｍ３Ｆ８の活性を考えれば、ｍ３Ｆ８の使用は、有望な結果を伴うそれらの最初の緩解において患者に拡大した。子供におけるこれらの好都合な臨床的結果は、再発危険性が最も高い最初の３〜５年にわたっての維持療法としてｍ３Ｆ８が与えられるならば、改良をすることができよう。しかしながら、ヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）が、化学療法が終了したときに免疫系が回復される場合の制限因子である。ＨＡＭＡを低下させる１つの戦略は、３Ｆ８をキメラ化し、またはヒト化することである。
【０１１３】
本発明者らは、ヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１  Ｈ１Ｌ１、以下では、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１）の工学及び単離について前述した（ＷＯ２０１１／１６０１１９及びＣｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１：４７７−４８６に記載、その両方が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。これらの抗体は、標準的な組換え方法を用いて作製され、無血清培地中でのＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株による高い発現について選択された。Ｂｉａｃｏｒｅ系、ヒト化３Ｆ８によって用いられた表面プラズモン共鳴を用いての測定は、ｍ３Ｆ８のそれと同様なＫＤを維持した。他の抗ＧＤ２抗体とは対照的に、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてより遅い洗浄除去に移される、実質的により低いｋｏｆｆを有した。ｍ３Ｆ８と同様に、ヒト化３Ｆ８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞増殖を阻害し、他の抗ＧＤ２抗体については典型的でない。ｈｕ３Ｆ８Ｖ１の血液単核細胞（ＰＢＭＣ）−ＡＤＣＣ及び好中球（ＰＭＮ）−ＡＤＣＣの双方はｍ３Ｆ８のそれよりも優れており（１０〜＞１０００倍）、他方、ＣＭＣは劣っていた。この優秀性は、ドナーにかかわらず、またはヒトＣＤ１６またはＣＤ３２で形質導入されたＮＫ９２をキラーとして用いれば、ＡＤＣＣアッセイにおいて一貫して観察された。Ｈｕ３Ｆ８Ｖ１は、ｍ３Ｆ８と比較した場合に、ＮＢ異種移植に対する優れた抗腫瘍効果を示した。
【０１１４】
提供される抗体剤
本発明は、治療効果を増強させるために、増強させた親和性を持つ抗体の新規のヒト化形態が必要であるという認識を包含する。本発明は、３Ｆ８及び／またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１の変異体である抗体（または他の抗体剤）を開発することが望ましいという認識を包含する。本発明は、特に、そのような抗体及び抗体剤を提供する。すなわち、本発明は、３Ｆ８及び／またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１で観察されるものと比較して、３Ｆ８及び／またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１と著しい構造同一性を示し、さらに、改善された機能的特徴（例えば、安定性及び／または親和性もしくは特異性）を示す種々の抗体剤を提供する。好ましい特定の実施形態において、本発明は、変異Ｆｃ領域を含む分子を包含し、該変異Ｆｃ領域は、該分子がＦｃγＲに対する改変された親和性を有するように、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、但し、該変異Ｆｃ領域は、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７−２７３）によって開示されたもののようなＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結晶学的及び構造解析に基づいてＦｃγＲとの直接的接触をなす位置に置換を有しない。ＦｃγＲとの直接的接触を行うＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）、及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ領域を含む本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいて、ＦｃγＲとの直接的接触をなす少なくとも１つの残基の修飾を含む。
【０１１５】
本発明の１つの態様は、１つまたは複数のアミノ酸修飾を持つ変異Ｆｃ領域を有する、活性化及び／または阻害性受容体に対する改変された親和性を持つｈｕ３Ｆ８抗体を含み、該１つまたは複数のアミノ酸修飾は、位置２３９におけるアスパラギン酸での、位置３３０におけるロイシンでの、及び位置３３２におけるグルタミン酸での置換である。
【０１１６】
本発明は、例えば、エフェクター機能を改変するか、または提供されるＦｃのＦｃＲへの親和性を増強させるかもしくは減少させるために、参照抗体（例えば、参照３Ｆ８抗体）Ｆｃ領域に対する本発明の抗体のＦｃ領域における１つまたは複数のアミノ酸に対する付加、欠失、及び／または置換を持つ変異Ｆｃ領域を含む分子を包含する。そのような変異Ｆｃ領域を調製し使用することは、本明細書中で提供されたガイダンスがあれば、当業者の技量内のものである。従って、本発明は、１つまたは複数のＦｃγＲに対するより大きな親和性でもって結合する変異Ｆｃ領域を含む分子を包含する。そのような分子は、好ましくは、後記で議論されたエフェクター機能をより効果的に媒介する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、参照抗体（例えば、参照３Ｆ８抗体）Ｆｃ領域よりも１つまたは複数のＦｃγＲに対する親和性がより弱く結合する変異Ｆｃ領域を含む分子を包含する。エフェクター機能の低下または排除は、ある場合には、例えば、その作用メカニズムがブロッキングまたは拮抗作用を伴うが、標的抗原を担持する細胞の殺傷は伴わない抗体の場合に望ましい。エフェクター機能の低下または排除は、エフェクター細胞においてＦｃγＲ活性化受容体をブロックしようとする自己免疫疾患の場合において望ましいであろう（このタイプの機能は宿主細胞に存在するであろう）。一般に、増大したエフェクター機能は、腫瘍及び異質細胞に向けられるであろう。
【０１１８】
ある実施形態において、本発明のＦｃ変異体は、これに限定されるものではないが、エフェクター機能を改変する修飾を含めた、他のＦｃ修飾と組み合わせてもよい。本発明は、本発明のＦｃ変異体を他のＦｃ修飾と組み合わせて、抗体またはＦｃ融合において付加的、相乗的、または新規な性質を提供することを包含する。好ましくは、本発明のＦｃ変異体は、それらが組み合わされる修飾の表現型を増強させる。例えば、本発明のＦｃ変異体が、野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子よりも高い親和性でもってＦｃγＲＩＩＩＡに結合することが知られた突然変異体と組み合わせるならば、本発明の突然変異体との組み合わせの結果、ＦｃγＲＩＩＩＡ親和性におけるより大きな倍増強がもたらされる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ変異体は、１つまたは複数の操作された糖型、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合している炭水化物組成物を含む抗体剤（例えば、抗体またはＦｃ融合）に組み込まれ、炭水化物組成物は、Ｆｃ領域を含む親分子のそれとは化学的に異なる。
【０１２０】
本発明は、好ましくは、抗体の機能性、例えば、結合活性ＧＤ２を改変すること無く、改変されたグリコシル化部位を持つ抗体を包含する。本明細書中で用いられるように、「グリコシル化部位」は、それにオリゴ糖（すなわち、一緒に連結した２つ以上の単純な糖を含有する炭水化物）が特異的かつ共有結合的に付着した抗体におけるいずれの特異的アミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ−またはＯ−連結いずれかを介して抗体の骨格に連結されている。Ｎ−連結グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着のことを言う。Ｏ−連結グリコシル化とは、オリゴ糖部分のヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、スレオニンへの付着のことを言う。フコース及び末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含めたある種のオリゴ糖を欠如するＦｃ糖型、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧｌｎは、特殊なＣＨＯ細胞において生産され、増強されたＡＤＣＣエフェクター機能を示した。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。抗体の炭水化物含有量を改変する方法は、当該技術分野でよく知られており、本発明内に含まれる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６号Ｂ１；米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／００２８４８６；ＷＯ０３／０３５８３５；米国特許出願公開番号２００３／０１１５６１４；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号を参照されたい。他の実施形態において、本発明は、抗体の１つまたは複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。特定の実施形態において、本発明は、位置２９７をアスパラギンからアラニンに修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失することを包含する。
【０１２２】
操作された糖型は、これに限定されるものではないが、エフェクター機能の増強または低下を含めた、種々の目的で有用であろう。操作された糖型は、当業者に知られた任意の方法によって、例えば、操作されたまたは変異発現株によって、１つまたは複数の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）での共発現によって、種々の生物におけるＦｃ領域を含む分子、または種々の生物からの細胞株を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を改変することによって生成させることができる。操作された糖型を生成させるための方法は、当該技術分野で知られており、これに限定されるものではないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）テクノロジー（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化エンジニアリングテクノロジー（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）に記載されたものを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照されたい。
【０１２３】
また、本発明のポリペプチドとして含まれるのは、上述したポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、または変異体、及びその任意の組み合わせである。抗ＧＤ２抗体または抗体ポリペプチドのことを言う場合の用語「断片」、「変異体」、「誘導体」、及び「アナログ」は、対応する天然の抗体またはポリペプチド、すなわち、ＧＤ２上の１つまたは複数のエピトープに結合する能力を保持するポリペプチドの抗原結合性質の少なくともいくつかを保持するいずれかのポリペプチドを含む。
【０１２４】
本発明のポリペプチドの断片は、本明細書中の他の個所で議論された特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含む。
【０１２５】
本発明による有用な抗ＧＤ２抗体及び抗体ポリペプチドの変異体は、上記のような断片、及びアミノ酸の置換、欠失、または挿入のため改変されたアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。変異体は、天然に存在し得るか、または非天然に存在し得る。非天然に存在する変異体は、当該技術分野で知られた突然変異誘発技術または非天然アミノ酸を用いて生産することができる。突然変異ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。
【０１２６】
本発明による有用な抗ＧＤ２抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドで見出されないさらなる特徴を呈するように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。突然変異ポリペプチドは、本明細書中においては、「ポリペプチドアナログ」とも言われる。本明細書中で用いられるように、抗ＧＤ２抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、機能的側基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する主題のポリペプチドのことを言う。また、「誘導体」として含まれるのは、２０個の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに代えて置換してもよく；５−ヒドロキシリシンはリシンに代えて置換してもよく；３−メチルヒスチジンはヒスチジンに代えて置換してよく；ホモセリンはセリンに代えて置換してよく；及びオルニチンはリシンに代えて置換してよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、本明細書の実施例に記載される機能的性質を示す。例えば、いくつかの実施形態において、提供される作用物質には、親３Ｆ８抗体及び／またはそのヒト化バージョン（例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１）に対して改善された結合を示す。典型的なヒト化バージョンは、本明細書中に記載された１つまたは複数の構造特性を有するものが含まれる。いくつかの特定の実施形態において、構造特性には、免疫グロブリン可変領域配列のヒトフレームワーク領域に現れる配列に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの特定の実施形態において、構造特性には、免疫グロブリン可変領域配列のヒトＣＤＲ領域に現れる配列に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの特定の実施形態において、構造特性には、親抗体に対して提供される作用物質の免疫原性を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの特定の実施形態において、構造特性には、親抗体に対して提供される作用物質のＴ細胞エピトープを減少させる、改善させるかまたは排除する１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの実施形態において、提供される作用物質は、表２に示すものを含む構造特性を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、ＧＤ２に結合する異なる抗体の親和性よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上の親和性でＧＤ２に結合する。いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、ＧＤ２に結合する異なる抗体の親和性よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍の親和性でＧＤ２に結合する。いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、ＧＤ２に結合する異なる抗体の親和性よりも２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、または１００倍以上の親和性でＧＤ２に結合する。いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、例えば、ＧＤ１ｂなどの異なるガングリオシドに対して、互いに２倍以内、３倍以内、４倍以内、５倍以内、６倍以内、７倍以内、８倍以内、９倍以内、または１０倍以内の結合親和性を示す。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、本明細書中に記載及び／または例示されるような範囲内で、ＡＤＣＣまたはＣＭＣアッセイにおいて相対的効力（例えば、３Ｆ８  ＥＣ５０／抗体ＥＣ５０またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＥＣ５０／抗体ＥＣ５０の比率）を示す。いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、ＧＤ２に結合する親抗体と比較して少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、少なくとも４．５、少なくとも５．０、少なくとも５．５、少なくとも６．０、少なくとも６．５、少なくとも７．０、少なくとも７．５、少なくとも８．０、少なくとも８．５、少なくとも９．０、少なくとも９．５、少なくとも１０．０、少なくとも１０．５、少なくとも１１．０、少なくとも１１．５、少なくとも１２．０、少なくとも１２．５、少なくとも１３．０、少なくとも１３．５、少なくとも１４．０、少なくとも１４．５、少なくとも１５．０、少なくとも１５．５、少なくとも１６．０、少なくとも１６．５、少なくとも１７．０、少なくとも１７．５、少なくとも１８．０、少なくとも１８．５、少なくとも１９．０、少なくとも１９．５、少なくとも２０．０、少なくとも２０．５、少なくとも２１．０、少なくとも２１．５、少なくとも２２．０、少なくとも２２．５、少なくとも２３．０、少なくとも２３．５、少なくとも２４．０、少なくとも２４．５、少なくとも２５．０、少なくとも２５．５、少なくとも２６．０、少なくとも２６．５、少なくとも２７．０、少なくとも２７．５、少なくとも２８．０、少なくとも２８．５、少なくとも２９．０、少なくとも２９．５、または少なくとも３０．０の相対的効力を示す。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０Ｍ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＫＤ（ｎＭ）でＧＤ２への結合を示す。いくつかの特定の実施形態において、提供される抗体剤は、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫＤ（ｎＭ）でＧＤ２への結合を示す。いくつかの特定の実施形態において、提供される抗体剤は、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１．０ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、約２．０ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．２ｎＭ、約２．３ｎＭ、約２．４ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．６ｎＭ、約２．７ｎＭ、約２．８ｎＭ、約２．９ｎＭ、または約３．０ｎＭのＫＤ（ｎＭ）でＧＤ２への結合を示す。いくつかの特定の実施形態において、提供される抗体剤は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、または約９ｎＭのＫＤ（ｎＭ）でＧＤ２への結合を示す。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、下限が約２．０ｘ１０−４ｓ−１で、上限が約２０．０ｘ１０−４ｓ−１であるＫｏｆｆ（ｓ−１）でＧＤ２への結合を示す。いくつかの実施形態において、提供される抗体剤は、下限が２ｘ１０−４ｓ−１、３ｘ１０−４ｓ−１、４ｘ１０−４ｓ−１、５ｘ１０−４ｓ−１、６ｘ１０−４ｓ−１、７ｘ１０−４ｓ−１、８ｘ１０−４ｓ−１、９ｘ１０−４ｓ−１、またはそれ以上から成る群から選択され、上限が下限よりも高く、かつ、１０ｘ１０−４ｓ−１、１１ｘ１０−４ｓ−１、１２ｘ１０−４ｓ−１、１３ｘ１０−４ｓ−１、１４ｘ１０−４ｓ−１、１５ｘ１０−４ｓ−１、１６ｘ１０−４ｓ−１、１７ｘ１０−４ｓ−１、１８ｘ１０−４ｓ−１、１９ｘ１０−４ｓ−１、２０ｘ１０−４ｓ−１、またはそれ以上から成る群から選択されるＫｏｆｆ（ｓ−１）でＧＤ２への結合を示す。いくつかの特定の実施形態において、提供される抗体剤は、約２．９ｘ１０−４ｓ−１、５．１ｘ１０−４ｓ−１、６．９ｘ１０−４ｓ−１、８．８ｘ１０−４ｓ−１、または１８．５ｘ１０−４ｓ−１のＫｏｆｆ（ｓ−１）でＧＤ２への結合を示す。
【０１３２】
ヒト化抗体剤
１つの実施形態において、本発明によって提供される抗体は、好ましい実施形態においては、他の種に由来する同種抗ＧＤ２抗体ヒト化バージョンであるモノクローナル抗体である。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって生産された抗体であり、そこでは、抗原結合で必要とされないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域）のアミノ酸のいくつかまたは全てを用いて、同種の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖からの対応するアミノ酸に代えて置換する。その例として、所与の抗原に対するネズミ抗体ヒト化バージョンは、その重鎖及び軽鎖の双方の上に、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメインからのフレームワーク領域；及び（３）ネズミ抗体からのＣＤＲを有する。必要であれば、ヒトフレームワーク領域における１つまたは複数の残基を、ネズミ抗体における対応する位置での残基に変化させて、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保持することができる。この変化は、時々、「復帰突然変異」と呼ばれる。同様に、正突然変異を行って、所望の理由、例えば、抗原に対する安定性または親和性のためにネズミ配列に戻してもよい。例えば、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１（またはｈｕ３Ｆ８Ｖ１）復帰突然変異が重鎖配列における１９位置、及び軽鎖における１７位置において、結合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性を維持するために必要であった。ヒト化抗体は、一般に、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答をあまり惹起しない。なぜならば、前者はかなり少数の非ヒト成分を含有するからである。
【０１３３】
本発明のヒト化抗体を作製するための適当な方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ  ＥＰ０２３９４００；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ８６：１００２９（１９８９）；米国特許第６，１８０，３７０号；及びＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）に記載されている。一般に、ヒト抗体へのネズミ（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は以下のように達成される。重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡをハイブリドーマから単離する。ＣＤＲを含めた可変ドメインのＤＮＡ配列は配列決定によって決定される。ＣＤＲをコードするＤＮＡは、所望のイソタイプ（例えば、ＣＨに代えてγ１及びＣＬに代えてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントに付着された、ヒト抗体重鎖または軽鎖可変ドメインコーディング配列の対応する領域に挿入され、遺伝子合成される。ヒト化重鎖及び軽鎖遺伝子は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞）において共発現されて、可溶性ヒト化抗体を生産する。抗体の大規模な生産を促進するためには、しばしば、生産株においてＤＨＦＲ遺伝子またはＧＳ遺伝子を用いて高エクスプレッサーについて選択するのが望ましい。これらの生産細胞株は、バイオリアクター、または中空線維培養システム、またはＷＡＶＥ技術において培養して、可溶性抗体のバルク培養を生産させ、または乳中で抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生産させる（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照されたい）。
【０１３４】
上述したアプローチを用い、３Ｆ８抗体ヒト化及びキメラバージョンを生成させた。軽鎖及び重鎖のネズミ３Ｆ８可変領域をコードするｃＤＮＡを用いて、上述したように、ネズミ３Ｆ８可変領域が（重鎖では）ヒトＩｇＧ１及び（軽鎖では）ヒトカッパー定常領域に連結したネズミ−ヒトキメラの発現用のベクターを構築した。加えて、Ｆｃ受容体への結合を増強させ、抗原親和性を増強させるために、変異体グリコシル化を持つｈｕ３Ｆ８の新規な形態を作り出した。
【０１３５】
ヒト化３Ｆ８抗体を生産するために、ヒトアクセプターフレームワークドメインを、ヒト生殖細胞株配列への相同性マッチングによって選択した。これらの選択されたヒトアクセプターフレームワークを用い、軽鎖及び重鎖可変ドメインを設計し、実施例にて後述するように、各々の多数の変異体／バージョンを生成し、発現させた。
【０１３６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置で特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて上述したファージ提示方法を含めた、当該技術分野で知られた種々の方法によって作製することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／６０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６６４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｏｅｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製でやはり入手可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｒｉｓｓ，（１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５、（１９９１））。
【０１３７】
他の技術を用いて生産されるが、本発明の抗ＧＤ２抗体の可変領域を保持するヒト抗体は本発明の一部である。ヒト抗体は、機能的内因性マウス免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚幹細胞に導入してもよい。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々に、または相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と同時に非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体の生産を妨げる。改変された胚幹細胞は拡大され、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生産する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生産させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または部分で通常の形式で免疫化する。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化の間に再編成され、引き続いて、クラススイッチング及び体細胞突然変異を受ける。従って、そのような技術を用い、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥ抗体を生産させることが可能である。ヒト抗体を生産させるためのこの技術の概観については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト型モノクローナル抗体を生産するためのこの技術、及びそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な議論については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８６，７９３号；第５，９１６，７７１号；及び第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のような会社は、上述したのと同様な技術を用いて選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供するのに従事できる。
【０１３８】
また、ヒトＭｏＡｂは、ヒト末梢血液白血球、脾臓細胞、または骨髄を移植したマウスを免疫化することによって作製できよう（例えば、ＸＴＬのＴｒｉｏｍａ技術）。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドされた選択」という技術を用いて生成させることができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１３９】
本明細書中で用いられるように、「抗ＧＤ２抗体」、「抗ＧＤ２抗体部分」、または「抗ＧＤ２抗体断片」及び／または「抗ＧＤ２抗体変異体」等は、本発明の抗体に組み込むことができる、非ネズミ起源の、好ましくはヒト起源の、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはそのいずれかの部分と組み合わせた、本明細書中に記載されたモノクローナル抗体のいずれかに由来する重鎖または軽鎖またはそのリガンド結合部分の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する、免疫グロブリン分子の少なくとも部分を含む分子を含有するいずれのタンパク質またはペプチドを含む。あるいは、用語「抗ＧＤ２抗体」は、集合的に、または個々に、単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ；単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ抗体、及びその組み合わせ、ならびにその断片及び領域、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ  ｓｃＦｖを含む本発明の一本鎖可変断片；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ；単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ  ｓｃＦｖ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ  ｓｃＦｖ、及びその組み合わせを言うべきである。そのような抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏにて、少なくとも１つの細胞機能を変調し、減少させ、拮抗し、軽減し、緩和し、ブロックし、阻害し、無くする、及び／または干渉することができ、該細胞はＧＤ２を発現する。非限定例として、本発明の適当な抗ＧＤ２抗体、特定の部分または変異体は、ヒトＧＤ２のエピトープに高い親和性を持って結合することができる。
【０１４０】
用語「抗体」は、さらに、抗体ミメティックスを含めた、または各々が抗ＧＤ２抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含有する、一本鎖抗体及びその断片を含めた、抗体またはその特定の断片または部分の構造及び／または機能を模倣する抗体の部分を含む、抗体、消化断片、その特定の部分及び変異体を包含することを意図する。機能的な断片は、哺乳動物ＧＤ２に結合する抗原結合断片を含む。例えば、これに限定されるものではないが、（例えば、パパイン消化による）Ｆａｂ、（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）Ｆａｂ’、及び（例えば、ペプシン消化による）Ｆ（ａｂ’）２、（例えば、プラスミン消化による）ｆａｃｂ、（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）ｐＦｃ’、（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再凝集による）Ｆｄ、（例えば、分子生物学技術による）ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を含む、ＧＤ２に結合することができる抗体断片またはその部分は、本発明によって含まれる（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい，上記）。
【０１４１】
抗体断片は、当該技術分野で知られているように、及び／または本明細書中に記載されているように、酵素開裂、合成、または組換え技術によって生産することができる。抗体は、１つまたは複数の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて種々の切形形態で生産することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を設計して、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含ませることができる。抗体の種々の部分を、従来の技術によって化学的に一緒に連結することができるか、または遺伝子工学技術を用いて連続したタンパク質として調製することができる。
【０１４２】
本明細書中で用いられるように、「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体または「ＣＤＲグラフト化」は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２  Ａｂ、または非ネズミ、好ましくはヒト抗体に由来する１つまたは複数のタンパク質またはペプチドと組み合わせたそれから由来するいずれかのＣＤＲの任意の組み合わせを含む。本発明によれば、キメラまたはヒト化抗体は、ＣＤＲが本明細書中に記載された抗ＧＤ２  Ａｂの１つ以上から由来するものを含み、及び抗体の少なくとも一部または残りは、１つまたは複数のヒト抗体に由来する。従って、抗体のヒト部分は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であるフレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ）領域を含むことができる。ヒト抗体に由来する抗体の領域は、ヒト抗体に対して１００％同一性を有する必要が無い。好ましい実施形態において、できる限り多くのヒトアミノ酸残基が、免疫原性が無視できるように保持されるが、ヒト残基を必要に応じて修飾して、同時に抗体ヒト化を最大化しつつ、ＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持することができる。そのような変化または変動は、必要に応じてかつ好ましくは、非修飾抗体に対してヒトまたは他の種における免疫原性を保持するかまたは低下させてよい。ヒト化抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核生物または真核生物細胞によって生産することができることを指摘する。さらに、抗体が一本鎖抗体である場合、それは、天然ヒト抗体で見出されないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を連結させる、２〜約２０のグリシンまたは他のアミノ酸残基、好ましくは８〜１５のグリシンまたは他のアミノ酸残基のようなリンカーペプチドを含むことができる。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものであると考えられる。
【０１４３】
抗体ヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにインフレームにて融合させた非ヒト標的モノクローナル抗体の６つのＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリーを合成することによって行うことができる。全ての公知の重鎖及び軽鎖のヒト生殖系列遺伝子の遺伝子代表を含有するヒトフレームワークライブラリーを利用することができる。次いで、注目する抗原への結合について、得られたコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることができる。このアプローチにより、親抗体への結合活性を維持する関係で完全にヒトフレームワークの最も好都合な組み合わせの選択を可能とすることができる。次いで、ヒト化抗体は、さらに、種々の技術によって最適化することができる。
【０１４４】
抗体ヒト化を用いて、マウスまたは他の非ヒト抗体を「完全ヒト」抗体に発展させることができる。得られた抗体は、出発抗体として同様な結合親和性及び特異性を維持しつつ、ヒト配列のみを含有し、マウスまたは非ヒト抗体配列は含有しない。
【０１４５】
全長抗体分子では、免疫グロブリン遺伝子は、ハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから得ることができる。抗体の重鎖及び軽鎖を哺乳動物ベクター系にクローン化する。アセンブリは、二本鎖配列分析で実証されている。抗体構築体は、他のヒトまたは哺乳動物宿主細胞株において発現させることができる。次いで、該構築体は、注目する発現された抗体の一過性トランスフェクションアッセイ及びウエスタンブロット分析によって確証することができる。最高の生産性を持つ安定な細胞株は、迅速なアッセイ方法を用いて単離し、スクリーニングすることができる。
【０１４６】
本発明の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、必要に応じて、当該技術分野でよく知られているように、細胞株、混合細胞株、不滅化細胞または不滅化細胞のクローン集団によって生産することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）。Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）を参照されたい。
【０１４７】
１つのアプローチにおいて、ハイブリドーマは、適当な不滅細胞株（例えば、これに限定されるものではないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ＳＡ３、Ｓｐ２  ＭＡＩ、Ｓｐ２  ＳＳ１、Ｓｐ２  ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ  １４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａのような骨髄腫細胞株）等、またはヘテロ骨髄腫、その融合生成物、またはそれから由来するいずれかの細胞または融合細胞、または当該技術分野で知られたいずれかの他の適当な細胞株（例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ，ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．等を参照されたい）を、これに限定されるものではないが、単離されたかまたはクローン化された脾臓、末梢血液、リンパ、扁桃、または他の免疫またはＢ細胞含有細胞などの抗体生産細胞と、または内因性または異種核酸いずれかとしての、組換えまたは内因性としての、ウイルス、細菌、海藻、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、齧歯類、ウマ、めん羊、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または三本鎖のハイブリダイズされた、またはその任意の組み合わせのような、重鎖または軽鎖定常または可変またはフレームワークまたはＣＤＲ配列を発現するいずれかの他の細胞と融合させることによって生産される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，及びＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２を参照されたい。
【０１４８】
いずれかの他の適当な宿主細胞は、本発明の抗体、特定の断片またはその変異体をコードする異種または内因性核酸を発現するために用いることもできる。融合された細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件または他の適当な公知の方法を用いて単離し、限界希釈法または細胞分類、または他の公知の方法によってクローン化することができる。所望の特異性を持つ抗体を生産する細胞は、適当なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。
【０１４９】
本発明の抗体は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をコードする核酸を用いて調製して、それらの乳中にそのような抗体を生産する、トランスジェニック動物、またはヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等のような哺乳動物を提供することもできる。そのような動物は、公知の方法を用いて提供することができる。例えば、これに限定されるものではないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，６９０号；第５，８４９，９９２号；第４，８７３，３１６号；第５，８４９，９９２号；第５，９９４，６１６号、第５，５６５，３６２号；第５，３０４，４８９号を参照されたい。
【０１５０】
本発明の抗体は、さらに、そのような抗体、特定の部分または変異体を植物の部分またはそれから培養する細胞において生産するトランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば、これに限定されるものではないが、タバコ及びトウモロコシ）を提供するように少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をコードする核酸を用いて調製することができる。非限定例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉は、例えば、誘導性プロモーターを用いて、大量の組換えタンパク質を提供するために成功裡に用いられている。例えば、Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８（１９９９）及びその中に引用される参考文献を参照されたい。また、トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において生産されるかもしくは天然源から精製されるものと同等の生物学的活性を有して、商業生産レベルで哺乳動物タンパク質を発現するために用いられている。例えば、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７（１９９９）及びその中に引用される参考文献を参照されたい。抗体はまた、タバコ種子及びジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）のような抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に生産されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９（１９９８）及びその中に引用される参考文献を参照されたい。従って、本発明の抗体は、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いて生産することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０８（Ｏｃｔ．，１９９９），Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２−７（１９９５）；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４（１９９４）；及びその中に引用される参考文献も参照されたい。上記の参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
抗ＧＤ２抗体は、これに限定されるものではないが、タンパク質Ａ精製、タンパク質Ｇ精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いることができる。例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）、例えば、１、４、６、８、９及び１０章を参照されたい。
【０１５２】
本発明の抗体には、天然で精製される生成物、化学合成法の生成物、ならびに例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から組換え技術により生産される生成物が含まれる。組換え生産手順に用いられる宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化されていてもよくまたはグリコシル化されていなくてもよいが、グリコシル化されているのが好ましい。そのような方法は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記、１７．３７−１７．４２節；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記、１０、１２、１３、１６、１８及び２０章、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，上記、１２−１４章のような、多数の標準的な実験室マニュアルに記述されている。
【０１５３】
精製抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、免疫細胞学、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析、ＳＡＰＩＤＹＮＥ  ＫＩＮＥＸＡ（商標）反応速度排除分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって、またはＨＰＬＣ分析ならびに本明細書で開示する多くの他の機能的アッセイによって特徴付けることができる。
【０１５４】
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモーター要素、抗体コーディング配列、ならびに転写の終結及び転写生成物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。追加の要素には、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列ならびにＲＮＡスプライシングの供与及び受容部位が隣接する介在配列が含まれる。非常に効率のよい転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長い末端反復（ＬＴＲＳ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで得ることができる。しかしながら、細胞要素を用いることもできる（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明を実施するために使用する適当な発現ベクターには、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、またはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）もしくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ  ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）及びｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ  ６７１０９）のようなベクターが挙げられる。用いることができる哺乳動物宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ  ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０１５５】
あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細胞株において発現することができる。ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ネオマイシン、またはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、形質導入した細胞の同定及び単離を可能にする。
【０１５６】
形質導入した遺伝子は、大量のコードされた抗体を発現するために増幅することもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百もしくは数千コピーさえの注目する遺伝子を運ぶ細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子（１つもしくは複数）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞は、抗体の生産に使用されることが多い。
【０１５７】
本発明によれば、抗ＧＤ２抗体は、該抗体がＧＤ２に結合する能力を維持する限りは、天然の突然変異もしくはヒト操作のいずれかからの置換、挿入及び欠失を含むありとあらゆる改変が意図されるが、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ；単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；及び三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ抗体、または、可変領域またはＣＤＲが、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉのいずれか１つに由来する抗体；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＩｇＧ；単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；ならびに三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ抗体のいずれか１つを含み、該抗体のフレームワーク及び定常領域は、１つまたは複数のヒト抗体から得られる。抗体から得られる可変領域またはＣＤＲは、好ましくは、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ１、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉ；ｈｕ３Ｆ８Ｖ５；単一突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１Ｋ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｇ５４Ｉ；二重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２Ｈ、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＧ５４Ｉ、及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｄ３２ＨＧ５４Ｉ；ならびに三重突然変異を有するｈｕ３Ｆ８Ｖ５、例えば、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５−Ｅ１ＫＤ３２ＨＧ５４Ｉのいずれか１つの可変領域またはＣＤＲと約９０％〜約１００％の同一性を有する。ヒト抗体から得られるキメラ、ヒト化またはＣＤＲグラフト化抗体の領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要は無い。好ましい実施形態において、免疫原性が無視し得る程度であるようにできるだけ多くのヒトアミノ酸残基が保持されるが、ヒト残基、特にフレームワーク領域の残基は、必要に応じて、かつ、本発明に従って以下に教示するように置換される。本明細書に開示されているそのような改変は、同時に抗体のヒト化を最大にしながらＣＤＲにより形成される抗原結合部位をサポートするのに必要である。
【０１５８】
本明細書中に記載された配列と実質的に同じであるアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸欠失及び／または挿入を含む配列が含まれる。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸のものと同様である化学的及び／または物理的性質（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸による第１のアミノ酸の置換のことを言う。保存的置換には、あるアミノ酸の以下の群内の別のものによる置換が含まれる：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパルテート（Ｄ）及びグルタメート（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ。
【０１５９】
もちろん、当業者が行うアミノ酸置換の数は、上記のものを含む多数の因子によって決まる。一般的に言えば、任意の所与の抗ＧＤ２抗体断片または変異体のアミノ酸置換、挿入または欠失の数は、本明細書において特定するように、１〜３０またはその中の任意の範囲もしくは値のような、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１より多くない。
【０１６０】
機能にとって必須である本発明の抗ＧＤ２抗体におけるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニンスキャニング突然変異誘発（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，８，１５章；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような、当該技術分野で知られた方法により同定することができる。後者の手順は、分子におけるあらゆる残基で単一のアラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異体分子を、これに限定されるものではないが、少なくともＧＤ２に結合するような生物学的活性について試験する。抗体結合にとって重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性ラベリングのような構造解析により同定することもできる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）及びｄｅ  Ｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１６１】
抗ＧＤ２抗体は、さらに、必要に応じて、本明細書中に記載された配列番号の少なくとも１つに由来するＣＤＲの連続するアミノ酸の７０〜１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。
【０１６２】
１つの実施形態において、免疫グロブリン鎖またはその一部（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、表１〜４における配列の少なくとも１つのアミノ酸配列に対して約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中の任意の範囲もしくは値）を有する。
【０１６３】
典型的な重鎖及び軽鎖可変領域配列を本明細書中で提供する。本発明の抗体、またはその特定の変異体は、本発明の抗体からの任意の数の連続するアミノ酸残基を含むことができ、この数は、抗ＧＤ２抗体における連続する残基の数の１０〜１００％から成る整数の群から選択される。必要に応じて、連続するアミノ酸のこのサブ配列は、長さが少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸、またはその中の任意の範囲もしくは値である。さらに、そのようなサブ配列の数は、少なくとも２、３、４、または５のような、１〜２０から成る群から選択される任意の整数であってもよい。
【０１６４】
本発明によれば、核酸配列は、配列番号３２〜４５に記載され、抗ＧＤ２抗体の推定アミノ酸配列は、配列番号１〜３１に記載される。重鎖及び軽鎖可変領域の各々は、結合して抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲを含有する。３つのＣＤＲは、ＣＤＲをサポートするために主に機能する４つのフレームワーク領域により囲まれている。重鎖及び軽鎖の可変領域の配列内のＣＤＲの配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．におけるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）によるコンピューターを使ったアラインメントにより、または、例えば、Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５により記載されているようなＥＮＣＡＤプログラムを利用する、可変領域の分子モデリングによって同定することができる。
【０１６５】
本発明のヒト化抗体、断片及び領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、公知の方法により、ヒト胎児肝臓ライブラリーから得ることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し生産するものを含む任意のヒト細胞から得ることができる。ヒトＣＨ領域は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、イプシロン、及びＧ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４のような、そのサブタイプを含む、ヒトＨ鎖の公知のクラスもしくはアイソタイプのいずれかから得ることができる。Ｈ鎖アイソタイプは、抗体の種々のエフェクター機能をもたらすので、ＣＨ領域の選択は、補体結合、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における活性のような、所望のエフェクター機能により導かれる。好ましくは、ＣＨ領域はガンマ１（ＩｇＧ１）またはガンマ４（ＩｇＧ４）から得られる。
【０１６６】
ヒトＣＬ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプ、カッパまたはラムダのいずれか、好ましくはカッパから得ることができる。
【０１６７】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７−１９９３））によりヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、Ｌ鎖の２つのクラス、Ｈ鎖の５つのクラス及びそのサブクラスに相当する遺伝子を含有する公知のクローンから容易に入手可能である。
【０１６８】
抗体の可変領域の配列は、キメラ抗体がヒトＧＤ２に結合する能力を維持する範囲で挿入、置換及び欠失により改変することができる。当業者は、以下に説明する機能的アッセイを行うことによって、この活性の維持を確かめることができる。可変領域は、例えば、以下で同定された可変領域に約５０％〜約１００％の相同性を有することができる。抗体の可変領域は、以下で同定された可変領域に約８０％〜約１００％の相同性を有する。より好ましい実施形態において、可変領域は、以下で同定された可変領域に約９０％〜約１００％の相同性を有する。
【０１６９】
１つの特定の態様において、本開示の好ましい抗ＧＤ２  Ｍａｂは、本明細書で同定された配列に９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列相同性を有する可変軽鎖領域を含み、本明細書で同定された配列に９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列相同性を有する可変重鎖領域をさらに含む。
【０１７０】
好ましくは、本発明の抗体、または抗体の抗原結合断片、またはその特定の部分もしくは変異体は、ヒトＧＤ２に結合するため、１つのＧＤ２タンパク質または断片を部分的にまたは実質的に中和し、ＧＤ２を介して媒介される活性を阻害する。本明細書中で用いられるように、用語「中和抗体」とは、ＧＤ２依存性活性をアッセイに応じて約２０〜１２０％、好ましくは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれ以上阻害することができる抗体のことを言う。ＧＤ２依存性活性を阻害する抗ＧＤ２抗体の能力は、好ましくは、本明細書中に記載されているように、及び／または当該技術分野で知られているように、少なくとも１つの適当なアッセイにより評価する。
【０１７１】
記述するように、本発明は、本明細書中に記載されたアミノ酸配列と実質的に同じである配列中のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲにも関する。そのような抗ＧＤ２抗体は、本明細書において特定するように、天然の突然変異またはヒト操作のいずれかから、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含むことができる。好ましくは、そのような抗体または抗原結合断片及びそのような鎖もしくはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性でヒトＧＤ２に結合することができる。
【０１７２】
当業者であれば、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物学的に活性な抗体が含まれることが理解されるであろう。生物学的に活性な抗体は、天然の（非合成の）、内因性または関連している公知の抗体のものの少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、または７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％、９０％、または９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の指標をアッセイ及び定量する方法は、当業者に周知である。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、有機部分の共有結合により改変される、本明細書中に記載されたようなヒト抗体及び抗原結合断片に関する。そのような改変は、改善された薬物動態性質（例えば、増大したｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期）を有する抗体または抗原結合断片を生産することができる。有機部分は、線状または分枝状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であってもよい。特定の実施形態において、親水性ポリマー基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーまたはポリビニルピロリドンであってもよく、脂肪酸または脂肪酸エステル基は、約８〜約４０個の炭素原子を含んでいてもよい。
【０１７４】
本発明の修飾抗体及び抗原結合断片は、抗体に直接的もしくは間接的に共有結合している１つまたは複数の有機部分を含むことができる。本発明の抗体または抗原結合断片に結合している各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であってもよい。本明細書中で用いられるように、用語「脂肪酸」とは、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、該用語を本明細書において用いる場合、オクタンよりも水に可溶性である有機ポリマー、例えば、ポリリシンのことを言う。従って、ポリリシンの共有結合により改変された抗体は、本発明に包含される。本発明の抗体を改変するのに適当な親水性ポリマーは、線状もしくは分枝状であってもよく、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧ等）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパルテートなど）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）及びポリビニルピロリドンが挙げられる。好ましくは、本発明の抗体を改変する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００（下付き文字は、ダルトン単位のポリマーの平均分子量である）を用いることができる。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル、脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いることにより調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートに連結させることができ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化する）は、ポリマー上のヒドロキシル基に連結させることができる。
【０１７５】
本発明の抗体を改変するのに適当な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和していてもよく、または１つまたは複数の単位の不飽和を含有していてもよい。本発明の抗体を改変するのに適当な脂肪酸としては、例えば、ｎ−ドデカノエート、ｎ−テトラデカノエート、ｎ−オクタデカノエート、ｎ−エイコサノエート、ｎ−ドコサノエート、ｎ−トリアコンタノエート、ｎ−テトラコンタノエート、シス−Δ９−オクタデカノエート、全てのシス−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。適当な脂肪酸エステルには、線状または分枝状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは、１〜約６個の炭素原子を含むことができる。
【０１７６】
改変されたヒト抗体及び抗原結合断片は、１つまたは複数の改変剤との反応によるなど、適当な方法を用いて製造することができる。「改変剤」は、該用語を本明細書において用いる場合、活性化基を含む適当な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）のことを言う。「活性化基」は、適切な条件下で、第２の化学基と反応し、それにより改変剤と第２の化学基との間で共有結合を形成することができる化学的部分もしくは官能基である。例えば、アミン反応性活性化基としては、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような求電子基が挙げられる。チオールと反応することができる活性化基には、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミンもしくはヒドラジドを含有する分子に連結することができ、アジド基は３価のリン基と反応してホスホルアミデートもしくはホスホルイミド結合を形成することができる。分子に活性化基を導入する適当な方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｈｅｒｎａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、もしくはリンカー部分、例えば２価のＣ１〜Ｃ１２基（ここで、１つまたは複数の炭素原子は、酸素、窒素もしくは硫黄のようなヘテロ原子で置換することができる）を介して結合することができる。適当なリンカー部分には、数例を挙げると、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−が含まれる。リンカー部分を含む改変剤は、例えば、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間でアミド結合を生成させることにより調製することができる。Ｂｏｃ保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することで生成物から除去して第１級アミンを露出することができ、それを記述されているように別のカルボキシレートに連結することができ、もしくは無水マレイン酸と反応させて得られた生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／１６２２１を参照されたい、この全教示は、引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１７７】
本発明の改変された抗体は、ヒト抗体もしくは抗原結合断片を改変剤と反応させることにより調製することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性改変剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることにより非部位特異的に抗体に結合することができる。改変されたヒト抗体もしくは抗原結合断片は、抗体もしくは抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することにより調製することもできる。次いで、還元した抗体もしくは抗原結合断片は、チオール反応性改変剤と反応させて本発明の改変された抗体を生産することができる。本発明の抗体の特定の部位に結合している有機部分を含む改変されたヒト抗体及び抗原結合断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６−４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記述されている方法のような適当な方法を用いて製造することができる。
【０１７８】
本発明の抗体は、以下に示すように、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒトＧＤ２に結合することができる。
【０１７９】
抗原に対する抗体の親和性もしくはアビディティーは、任意の適当な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書中に記載された方法を参照されたい。）特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定する場合に異なり得る。従って、親和性及び他の抗原結合パラメータの測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、ならびに本明細書中に記載された緩衝剤のような標準化緩衝剤で行う。
【０１８０】
本発明の方法及び組成物において有用な抗ＧＤ２抗体は、ＧＤ２への結合、及び好ましくは、低い毒性を有することにより特徴付けられる。特に、可変領域、定常領域及びフレームワークのような個々の成分が、個々に及び／または集合的に、必要に応じて、好ましくは低い免疫原性を有する、本発明の抗体、特定の断片もしくは変異体は、本発明において有用である。本発明に用いることができる抗体は、必要に応じて、症状の測定可能な軽減及び低い及び／または許容し得る毒性で長期間にわたって患者を治療する能力により特徴付けられる。低いもしくは許容し得る免疫原性及び／または高い親和性、ならびに他の適当な性質は、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、処置する患者の約７５％未満、もしくは好ましくは、約５０％未満において有意なＨＡＨＡ、ＨＡＣＡもしくはＨＡＭＡ応答を引き起こすこと、及び／または処置する患者において低い力価をもたらすこと（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５−１１２７（１９９４）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）と本明細書において定義する。
【０１８１】
少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、ヒト化、抗体である二重特異性、ヘテロ特異性、ヘテロコンジュゲートもしくは同様の抗体もまた用いることができる。本発明の場合、結合特異性の一方は、少なくとも１つのＧＤ２タンパク質に対してであり、もう一方は、任意の他の抗原に対してである。二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え生産は、２本の重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意の組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、これらのうち１種のみが、正しい二重特異性構造を有する。通常は親和性クロマトグラフィー工程によって行われる、正しい分子の精製は、かなり面倒であり、生成物収量は低い。同様の方法は、例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ９３／０８８２９、米国特許第６，２１０，６６８号、第６，１９３，９６７号、第６，１３２，９９２号、第６，１０６，８３３号、第６，０６０，２８５号、第６，０３７，４５３号、第６，０１０，９０２号、第５，９８９，５３０号、第５，９５９，０８４号、第５，９５９，０８３号、第５，９３２，４４８号、第５，８３３，９８５号、第５，８２１，３３３号、第５，８０７，７０６号、第５，６４３，７５９号、第５，６０１，８１９号、第５，５８２，９９６号、第５，４９６，５４９号、第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、ＥＰ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）；Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．１０，３０１−３１６；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．１０，３１７−３２７に開示されている。
【０１８２】
ある実施形態において、ＧＤ２に結合する抗体は、コンジュゲートされていない形態で用いることができる。ＧＤ２に結合する抗体は、例えば、検出可能な標識、ドラッグ、プロドラッグもしくはアイソトープにコンジュゲートしていてもよい。
【０１８３】
以下により詳細に説明する本発明の特定の方法、例えば、腫瘍細胞の転移能の尺度として、もしくは組織中のｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（例えば、ＤＣＩＳまたはＬＣＩＳ）を同定する手段として細胞または組織中のＧＤ２発現を検出する方法において、抗ＧＤ２抗体を１つまたは複数の検出可能な標識にコンジュゲートする。そのような使用において、抗体は、発色性、酵素、放射性同位体、同位体、蛍光、毒素、化学発光、核磁気共鳴造影剤または他の標識の共有結合または非共有結合で検出可能に標識してよい。
【０１８４】
適当な発色標識の例としては、ジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾ−ベンゼン−２−カルボン酸が挙げられる。
【０１８５】
適当な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０１８６】
適当な放射性同位体標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１１、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。１１１Ｉｎは、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識したＧＤ２−結合抗体の肝臓による脱ハロゲン化を回避するので、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化を使用する場合に好ましいアイソトープである。加えて、この放射性ヌクレオチドは、画像化のためにより好ましいガンマ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．７０：２９６−３０１，１９８５）、Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７，１９８７）。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体に連結した１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に肝臓における取り込みをほとんど示さず、従って、腫瘍局在化の特異性を増強させる（Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０，１９８７））。
【０１８７】
適当な非放射性同位体標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、及び５６Ｆｅが挙げられる。
【０１８８】
適当な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、及びフルオレサミン標識が挙げられる。
【０１８９】
適当な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、及びコレラ毒素が挙げられる。
【０１９０】
化学発光標識の例としては、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識が挙げられる。
【０１９１】
核磁気共鳴造影剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ、及びＦｅなどの重金属核が挙げられる。
【０１９２】
上述の標識を抗体に結合するための典型的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣＭｍ．Ａｃｔａ  ７０：１−３１，１９７６，及びＳｃｈｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣＭｍ．Ａｃｔａ  ８１：１−４０，１９７７により提供される。後者において言及される連結技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法である。それらの方法は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
手術後の残存腫瘍細胞の焼灼、または転移の防止のような本発明の特定の治療アプローチにおいて使用するために、抗ＧＤ２抗体は、１つまたは複数の薬物、プロドラッグまたは同位体にコンジュゲートすることができる。好ましいそのようなコンジュゲートは、１つまたは複数の細胞毒性剤にコンジュゲートした、ＧＤ２に結合する１つまたは複数のリガンド、例えば、１つまたは複数の抗体または断片、誘導体または変異体を含み；そのようなコンジュゲートは、本発明によって提供される腫瘍の転移の治療及び防止の方法において有用である。本発明の特定のそのような実施形態によれば、抗ＧＤ２抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートされる。抗ＧＤ２抗体−細胞毒性剤コンジュゲートの生成において有用な細胞毒性剤、例えば、化学療法剤は、当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、微小管毒物、及びアノナセオスアセトゲニンが挙げられる。本発明のこの態様による使用に適当な他の化学療法剤は、周知であり、当業者の知る通りである。
【０１９４】
１つまたは複数の抗ＧＤ２抗体と、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン及びＣＣ１０６５などの１つまたは複数の低分子毒素のコンジュゲートの使用も本明細書において意図される。本発明の１つの実施形態において、抗ＧＤ２抗体は、１つまたは複数のメイタンシン分子にコンジュゲートしている（例えば、抗ＧＤ２抗体当たり約１〜約１０メイタンシン分子）。メイタンシンは、例えば、メイタンシノイド−抗ＧＤ２抗体コンジュゲートを生成するために、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元されて改変された抗ＧＤ２抗体（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））と反応し得る、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換され得る。
【０１９５】
あるいは、抗ＧＤ２抗体は、１つまたは複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートしていてもよい。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度未満の濃度において二本鎖ＤＮＡ開裂を生じることができる。使用され得るカリケアマイシンの構造的類似体は、（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
【０１９６】
１つまたは複数の抗ＧＤ２抗体とのコンジュゲートを生成するのに使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤー阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に英語で公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。メイタンシノイドは、１つまたは複数の抗ＧＤ２抗体にコンジュゲートしていてもよい。
【０１９７】
本発明は、さらに、核酸分解活性を有する化合物{例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）でコンジュゲートされた抗ＧＤ２抗体についても意図する。
【０１９８】
例示代替形式
いくつか特定の実施形態において、本発明の抗ＧＤ２抗体剤、またはその配列は、多重特異性（例えば、二重特異性）形式で利用される。いくつかの実施形態において、二重特異性ＭｏＡｂは、二重可変ドメインから成り、一方のドメインは、抗３Ｆ８可変ドメインを有し、他方のドメインは、腫瘍細胞傷害性のＴ細胞を再標的化する抗ＯＫＴ３、またはＤＯＴＡ−金属、多段階プレ標的化用Ｃ８．２．５、またはアゴニストとして抗４１ＢＢ−ｓｃＦｖまたはＣＤ１３７を持つＡＤＣＣのクローン３５、ＣＤ１３７、またはアゴニストとして４１ＢＢＬを持つＡＤＣの４１ＢＢＬから成る群から選択される。ＣＨ２ドメインにおけるＮ２９７Ａ突然変異は、非グリコシル化をもたらし、ＦｃＲまたはＣ１ｑ非結合につながる。リンカー及びスペーサーを持つ（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−ｓｃＦｖ）−（ｈｕＯＫＴ３−ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は、配列番号２９に示し、スペーサーを持たない（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１−ｓｃＦｖ）−（ｈｕＯＫＴ３−ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は、配列番号３０に示す。（Ｏｒｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３，２２１に基づく）（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ）−（Ｃ８．２．５−ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は、配列番号３１に示す。
【０１９９】
二重特異性抗体（抗ＧＤ２及び抗ＤＯＴＡ）は、多段階プレ標的化の第１段階で使用することができ、除去剤としてＤＯＴＡ（金属）−デキストランを用いた血液クリアランスの後、第３段階で、ＤＯＴＡ（金属）−放射活性金属、ＤＯＴＡ（金属）−ナノ粒子、ＤＯＴＡ（金属）−リポソーム、ＤＯＴＡ（金属）−薬物、ＤＯＴＡ（金属）−ＤＮＡ、ＤＯＴＡ（金属）−ＲＮＡ、及びＤＯＴＡ（金属）−毒素などのＤＯＴＡ（金属）−コンジュゲート治療を導入する。
【０２００】
Ｃ８．２．５は、各タイプのＤＯＴＡ−金属複合体に対して異なる親和性を持つため、除去剤用にプレ標的化されたＣ８．２．５とＤＯＴＡ−リガンドとの親和性は正確に制御することができる。
【０２０１】
本明細書に示されるｈｕ３Ｆ８のアミノ酸配列及びその変異体は、他の抗ＧＤ２抗体に対して先に示したように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築に用いることができる（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８，６１９−６２６）。免疫エフェクター細胞を再標的化するＣＡＲ戦略は、ＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ相互作用と無関係であるため、多種多様の細胞表面抗原に対して細胞を反応させることができる（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｈｅｒ，２０１０，Ａｃｈｉｖｕｍ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  ｔｈｅｒａｐｉａｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ５８，１６５−１７８）。ＣＡＲの設計にはいくつかの方法が用いられており、そのほとんどが、抗原認識用の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態でモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを用いる。初期Ｔ細胞活性化受容体は、研究から生じたため、研究者らは、ＣＤ３ζ鎖の役割を解明することができた（Ｉｒｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６４，８９１−９０１；Ｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８，８８９−８９７）。その後の研究で、注目するｓｃＦｖをＣＤ３ζ鎖（Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０，７２０−７２４）またはＦｃεＲＩγ（Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７，８３６−８４３）に融合させ、両方ともＴ細胞活性化に十分であることが分かった。これは、ＣＡＲ構築物の青写真であったが、第１世代ＣＡＲが、２〜３回の細胞分裂でＴ細胞増殖を誘導した後、迅速な細胞の死滅をもたらすことが可能だと分かった後、共刺激分子の取り込みが起こった（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １，１２３−１２７）。標的腫瘍細胞上にＣＤ８０を発現させることで、研究者らは、ＣＡＲ発現細胞を再刺激してＴ細胞数をさらに増加させることができることを示した。ＣＤ３ζ鎖と平行してＣＤ２８共刺激分子を取り込んだ最初のＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖のみを発現したものよりも大幅な改善を示した（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，上記；Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  １００，３１５５−３１６３；Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０，７０−７５）；これは、Ｔ細胞数の絶対的増加ならびにＩＬ−２産生の増加を含んだ。次いで、いくつかの他の群が、ＣＤ３ζのみと組み合わせかもしくはＣＤ３ζ及びＣＤ２８両方との組み合わせのいずれかで他の共刺激分子を使用し始めた。これらの追加のシグナル伝達分子には、４−１ＢＢ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８，７１２−７２５；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｃｌｉｎ  Ｃｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，５４２６−５４３２；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８，６７６−６８４；Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，１０４−１１３）、ＤＡＰ１０（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，上記）、ＯＸ４０（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，上記；Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，上記；Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０，４９０１−４９０９；Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０，５９４−６０４；Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，９３３−９４１）及びＩＣＯＳ（Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，上記）、ならびにＴ細胞及びＮＫ細胞との関係での適用されたもの（Ｄａｌｄｒｕｐ−Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｒｏｐｅａｎ  ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １５，４−１３；Ｉｍａｉ  ａｎｄ  Ｃａｍｐａｎａ，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇ  １８，６２−７１；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７５−３８４；Ｋｒｕｓｃｈｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０５，１７４８１−１７４８６；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，３４４９−３４５５）が含まれる。第１世代ＣＡＲが、現時点で臨床試験されている唯一のものであるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ比較及びｉｎ  ｖｉｖｏ比較により、第２及び第３世代ＣＡＲよりも明確な優秀性が実証されている（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上記；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，上記；Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５，６９９−７０８；Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，５７８０−５７８６；Ｋｏｗｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，１０９９５−１１００４；Ｌｏｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０，１８１９−１９２８；Ｍｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１，３７１−３７９；Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８，３８９０−３８９７）。
【０２０２】
現在、ほとんどの研究者らは、バルクヒト末梢Ｔ細胞を用いるが、他の研究者らは、近年、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞（Ｒｏｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，２００９−２０１６）、リンパ前駆細胞（Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １２，１０３９−１０４７；Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２６，４５３−４６１）、及び非分画骨髄細胞（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９，１５７−１６８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４，１６８−１７２）を使用し始めている。細胞溶解性でありかつ培養しやすいキラー白血病細胞株（例えば、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩ、ＫＨＹＧ−１）により、ＣＡＲ発現エフェクター細胞を臨床前試験及び臨床試験用に継続的に供給することもできる。ＮＫ９２ＭＩは、非ホジキンリンパ腫由来かつヒトＩＬ−２  ｃＤＮＡで形質導入したヒトＮＫ細胞株であり；マウスモデルにおける強力な細胞毒性能力が先の研究により実証されている（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８，２８１−２９０；Ｋｏｒｂｅｌｉｋ  ａｎｄ  Ｓｕｎ，２００１，Ｉｎｔｅｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９３，２６９−２７４）。加えて、ＮＫ９２細胞は、臨床設定においても使用されており、多数のフェーズＩ研究により腎細胞癌腫及び黒色腫を有する患者にとって安全だと証明されている（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １０，６２５−６３２）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメンテナンスがしやすいことや倍増時間が比較的短いため、これらの細胞は、種々の標的アプローチを試験するための種々の細胞毒性アッセイの理想的なエフェクターである。起源ＩＬ−２依存性ＮＫ９２細胞株を用いた研究では、マウス及びヒトの双方において最小の毒性を示したが、ＩＬ−２形質導入ＮＫ９２ＭＩ細胞は、白血病誘発の可能性が高い場合がある。研究者らがＮＫ９２細胞を用いてＳＣＩＤマウスにおける白血病誘発を回避しようとしている１つの方法は、接種前にエフェクターに３０００ｃＧｙを照射することである。フェーズＩ臨床試験では、これは、免疫不全の患者内でＮＫ９２ＭＩ細胞が無制限に増殖することを防止するのに十分である。別の安全なメカニズムは、自殺遺伝子の使用を伴うものである。１つの一般的な例は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を使用することであり、アシクロビルまたはガンシクロビルの投与により該遺伝子を発現する細胞を殺傷することによって作用する（Ｈｅｌｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５０７９−５０８２）。
【０２０３】
核酸
本発明のＭｏＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列について本出願に記載する。本発明は、さらに、本発明の抗体及びその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ストリンジェント条件下または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０２０４】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列は公知であるため、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）組み立てることができ、それは、簡潔に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、該オリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、及び連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０２０５】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、適当な供給源由来の核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成してもよいし、あるいは適当な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織または細胞、例えば、本発明の抗体を発現するように選択されるハイブリドーマ細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれらから単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得てもよい。ＰＣＲによって作製された増幅核酸は、当技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２０６】
抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されるため、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（該文献はともに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の技術を参照されたい）を使用して抗体のヌクレオチド配列を操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を創出してもよい。
【０２０７】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは任意の他の形態のようなＲＮＡの形態、または、これに限定されるものではないが、クローニングにより得られるかもしくは合成的に製造されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態、またはその任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖もしくは一本鎖、またはその任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られているコーディング鎖であってもよく、またはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コーディング鎖であってもよい。
【０２０８】
本発明の単離された核酸分子には、必要に応じて、１つまたは複数のイントロンを有する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、これに限定されるものではないが、少なくとも１つの重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３のような少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定の部分を含む核酸分子；抗ＧＤ２抗体または可変領域のコーディング配列を含む核酸分子；及び上記したものと実質的に異なるが、本明細書中に記載されているように、及び／または当該技術分野で知られているように、遺伝暗号の縮退により、少なくとも抗ＧＤ２抗体をなおコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み得る。
【０２０９】
本発明は、本明細書で開示するポリヌクレオチドに選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。従って、本実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／または定量するのに用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託ライブラリーにおける部分もしくは全長クローンを同定、単離、もしくは増幅するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された、またはそうでなければヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーからのｃＤＮＡに相補的なゲノムもしくはｃＤＮＡ配列である。
【０２１０】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を都合よく含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入することができる。また、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立つように、翻訳可能な配列を挿入してもよい。例えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するために都合の良い手段を提供する。コーディング配列を除く本発明の核酸は、必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／または発現用のベクター、アダプター、もしくはリンカーである。
【０２１１】
追加の配列をそのようなクローニング及び／または発現配列に加えて、クローニング及び／または発現におけるそれらの機能を最適化する、ポリヌクレオチドの単離に役立たせる、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を高めることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，上記を参照されたい）。
【０２１２】
本発明は、さらに、上記の単離されたまたは精製された核酸分子のいずれかを含むベクターを提供する。上記の核酸分子またはその断片のいずれかを任意の適当なベクターにクローン化することができ、かつ、それを使用して、任意の適当な宿主を形質転換または形質導入することができる。ベクターの選択及びそれらを構築するための方法は、一般に、当業者に知られており、一般的な技術文献に記載されている（一般的には、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５３，Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照されたい）。望ましくは、ベクターは、適切にかつベクターがＤＮＡまたはＲＮＡであるか否かを考慮して、該ベクターが導入される宿主（例えば、細菌、真菌、または植物）のタイプに対して特異的な転写及び翻訳開始及び終了コドンのような制御配列を含む。好ましくは、該ベクターは、宿主の属に対して特異的な制御配列を含む。最も好ましくは、該ベクターは、宿主の種に対して特異的な制御配列を含む。
【０２１３】
複製システム及び挿入された核酸に加えて、構築体は、形質転換されたまたは形質導入された宿主の選択を可能にする１つまたは複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質、重金属などへの抵抗性といった殺生剤抵抗性、栄養要求性宿主における相補性を含んで、原栄養体などを提供する。
【０２１４】
適当なベクターは、増殖及び拡張または発現あるいは両方に設計されたものを含む。例えば、クローニングベクターは、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から成る群から選択される。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９のようなバクテリオファージベクターを使用することもできる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。ＴＯＰＯクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、製造者の推奨に従って用いることもできる。
【０２１５】
発現ベクターは、上記のような単離されたまたは精製された核酸分子に操作可能に連結している天然または非天然のプロモーターを含み得る。プロモーター（例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的）の選択は、当業者の技術範囲内である。同様に、上記のような核酸分子またはその断片とプロモーターとの組み合わせもまた、当業者の技術範囲内である。
【０２１６】
適当なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、パルボウイルスベースベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスベースベクター、ならびにレンチウイルスベクター、例えば、単純ヘルペス（ＨＳＶ）ベースベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０２１７】
レトロウイルスベクターは、レトロウイルス由来である。レトロウイルスは、多種多様の宿主細胞に感染することが可能なＲＮＡウイルスである。感染する際、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞ＤＮＡに沿って複製されるため、ウイルスＲＮＡと、レトロウイルスゲノムに組み込まれた任意の核酸配列とが持続的に生産される。そのようなものとして、レトロウイルスを用いた際に、治療因子（複数）の長期発現が達成可能である。遺伝子治療での使用が考えられるレトロウイルスは、病原性レトロウイルスが存在しているが、比較的非病原性である。病原性レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）を用いる場合、ウイルスゲノムが改変されて、宿主に対する毒性を排除することに注意を注がなければならない。レトロウイルスベクターをさらに操作して、ウイルスを複製欠損にさせることができる。そのようなものとして、レトロウイルスベクターは、安定的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に特に有用であると考えられる。ＨＩＶベースベクターなどのレンチウイルスベクターは、遺伝子送達に用いられる典型的なレトロウイルスベクターである。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶベースベクターは、それらのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、従って、病気の執拗な形態を治療するにおいて用いることができる。
【０２１８】
必要に応じて、単離されたまたは精製された核酸分子、またはその断片は、もう１つの核酸分子との連結に際して、融合タンパク質をコードすることができる。融合タンパク質の生成は、当該技術分野における通常の技量内のものであり、制限酵素または組換えクローニング技術の使用を含むことができる（例えば、Ｇａｔｅｗａｙ．ＴＭ．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を参照されたい）。また、米国特許第５，３１４，９９５号を参照されたい。
【０２１９】
これまでを考慮すると、本発明は、必要に応じて、ベクターの形態で上述された単離されたまたは精製された核酸分子を含む組成物も提供する。組成物は、本明細書中でさらに記載されるような他の成分を含むことができる。
【０２２０】
本発明の治療方法における使用のための放射コンジュゲートされた抗ＧＤ２抗体の製造のために同位体も使用される。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【０２２１】
抗ＧＤ２抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、種々の２官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（例えば、アジピミド酸ジメチルＨＣＩ）の２官能性誘導体、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ヒス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造してもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。１４炭素標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗ＧＤ２抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内の細胞毒性剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性のリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））を使用してもよい。
【０２２２】
あるいは、抗ＧＤ２抗体リガンド及び細胞毒性剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成により製造してもよい。
【０２２３】
組成物
本発明の抗ＧＤ２抗体組成物は、そのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物もしくは患者に提供される抗体剤の送達に用いるための、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体剤を含む任意の適当かつ有効量の組成物もしくは医薬組成物を含む。
【０２２４】
本発明は、天然に存在しない組成物、混合物もしくは形態で提供される本明細書中に記載されたような、及び／または当該技術分野で知られているような少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つもしくはそれ以上の抗ＧＤ２抗体を含む少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物も提供する。そのような組成物は、本明細書中に記載された抗体、またはその特定の断片、ドメインもしくは変異体のＣＤＲ領域の連続するアミノ酸の７０〜１００％から成る群から選択される抗ＧＤ２抗体アミノ酸配列の少なくとも１つもしくは２つの完全長、Ｃ末端及び／またはＮ末端欠失変異体、ドメイン、断片、または特定の変異体、を含む天然に存在しない組成物を含む。好ましい抗ＧＤ２抗体組成物は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２抗体配列の少なくとも１つのＣＤＲまたはＬＢＲ含有部分として少なくとも１もしくは２つの完全長、断片、ドメインもしくは変異体を含む。さらに好ましい組成物は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２  ＡｂのＣＤＲ領域の７０〜１００％の少なくとも１つの４０〜９９％を含む。そのような組成物のパーセントは、当該技術分野で知られているように、または本明細書中に記載されているように液体もしくは乾燥溶液、混合物、懸濁剤、乳剤もしくはコロイド剤として重量、容量、濃度、容積モル濃度もしくは重量モル濃度である。
【０２２５】
本発明の抗ＧＤ２抗体化合物、組成物もしくは組み合わせは、さらに、これに限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、脂肪親和性溶媒、保存剤、アジュバントなどのような任意の適当な助剤の少なくとも１つを含むことができる。医薬的に許容し得る助剤が好ましい。そのような滅菌溶液を調製する非限定例及び方法は、これに限定されるものではないが、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）１９９０のような、当該技術分野でよく知られている。当該技術分野でよく知られているように、または本明細書中に記載されているように、抗ＧＤ２抗体、断片もしくは変異体組成物の投与の形態、可溶性及び／または安定性に適当な医薬的に許容し得る担体を日常的に選択することができる。
【０２２６】
本発明の組成物において有用な医薬賦形剤及び添加剤には、限定されるものではないが、単独でまたは１〜９９．９９重量もしくは容量％での組み合わせを含む、単独でもしくは組み合わせで存在することができる、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖及びオリゴ糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などのような誘導化糖；ならびに多糖もしくは糖ポリマーを含む糖）が含まれる。典型的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）のような血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能力においても機能することができる代表的なアミノ酸／抗体成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。
【０２２７】
本発明における使用に適当な炭水化物賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどのような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉などのような多糖；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのようなアルジトールが挙げられる。本発明における使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
【０２２８】
抗ＧＤ２抗体組成物は、緩衝剤もしくはｐＨ調整剤を含むこともでき；典型的には、緩衝剤は、有機酸もしくは塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、もしくはフタル酸の塩のような有機酸塩；トリス、トロメタミン塩酸塩、もしくはリン酸緩衝剤が含まれる。本発明の組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩のような有機酸塩である。
【０２２９】
さらに、本発明の抗ＧＤ２抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香料、抗菌剤、甘味料、酸化防止剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ  ２０」及び「ＴＷＥＥＮ  ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）のようなポリマー賦形剤／添加剤を含むことができる。
【０２３０】
本発明の抗ＧＤ２抗体、部分もしくは変異体組成物における使用に適当なこれら追加かつ公知の医薬賦形剤及び／または添加剤は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）（本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、当該技術分野で知られている。好ましい担体もしくは賦形剤材料は、炭水化物（例えば、糖類及びアルジトール）及び緩衝剤（例えば、クエン酸塩）もしくはポリマー剤である。
【０２３１】
上記のように、本発明は、医薬的に許容し得る製剤において少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む、好ましくは、食塩水もしくは選択された塩を有するリン酸緩衝剤である安定製剤、ならびに保存剤を含有する保存溶液及び製剤ならびに医薬的もしくは獣医学的用途に適当な複用保存製剤を提供する。保存製剤は、水性希釈剤中に少なくとも１つの公知のもしくは必要に応じて少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、６水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、もしくはその混合物から成る群から選択される保存剤を含有する。０．００１〜５％、または、これに限定されるものではないが、０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８，０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６，１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９のようなその中の任意の範囲もしくは値、またはその中の任意の範囲もしくは値のような、任意の適当な濃度もしくは混合物を当該技術分野で知られているように用いることができる。非限定例としては、保存剤なし、０．１〜２％のｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％のベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％のチメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％のフェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％のアルキルパラベン（１つもしくは複数）（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが挙げられる。
【０２３２】
上記のように、本発明は、包装材料ならびに必要に応じて水性希釈剤中に、所定の緩衝剤及び／または保存剤を有する少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルを含む製品を提供し、該包装材料は、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間もしくはそれ以上の期間にわたって保持できることを示すラベルを含む。本発明は、さらに、包装材料、凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む第１のバイアル、及び所定の緩衝剤もしくは保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルを含む製品を含み、該包装材料は、２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって保持することができる溶液を形成するために水性希釈剤において少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を再構成するように患者に指示するラベルを含む。
【０２３３】
本発明の製品における少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の範囲は、より低い及びより高い濃度が実施可能であるが、再構成の際に、湿潤／乾燥系における場合、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす量を含み、意図する送達媒体に依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、肺、経粘膜、または浸透もしくはマイクロポンプ法と異なる。
【０２３４】
好ましくは、水性希釈剤は、必要に応じて、医薬的に許容し得る保存剤をさらに含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、もしくはその混合物から成る群から選択されるものが含まれる。製剤に用いる保存剤の濃度は、抗菌効果をもたらすのに十分な濃度である。そのような濃度は、選択する保存剤に依存しており、当業者により容易に決定される。
【０２３５】
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、酸化防止剤、保存剤エンハンサーを必要に応じてかつ好ましくは希釈剤に加えることができる。グリセリンのような等張剤は、公知の濃度で一般的に用いられる。好ましくは、生理的に許容し得る緩衝剤を、より一層のｐＨ制御を与えるために加える。製剤は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０のような広範囲のｐＨ、約ｐＨ５〜約ｐＨ９の好ましい範囲、及び約６．０〜約８．０の最も好ましい範囲に及ぶことができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８〜約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝剤には、リン酸緩衝剤、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
【０２３６】
必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）あるいはポリソルベート２０もしくは８０またはポロキサマー１８４もしくは１８８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリル、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤のような医薬的に許容し得る可溶化剤、ならびにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのようなキレート剤のような他の添加剤を、凝集を減らすために製剤もしくは組成物に加えることができる。これらの添加剤は、製剤を投与するためにポンプもしくはプラスチック容器を用いる場合に特に有用である。医薬的に許容し得る界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。
【０２３７】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体及びフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサールもしくはその混合物から成る群から選択される保存剤を水性希釈剤において混合することを含む方法により調製することができる。水性希釈剤において少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体及び保存剤を混合することは、従来の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な製剤を製造するために、例えば、緩衝溶液中の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の測定量を、所望の濃度のタンパク質及び保存剤を与えるのに十分な量で緩衝溶液中の所望の保存剤と組み合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を用いるかどうか、製剤を調製する温度及びｐＨは全て、使用する投与の濃度及び手段に対して最適化することができる因子である。
【０２３８】
請求する製剤は、清澄溶液として、もしくは水性希釈剤中に、水、保存剤及び／または賦形剤、好ましくは、リン酸緩衝剤及び／または食塩水及び選択された塩を含有する第２のバイアルで再構成する凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含む二重バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする二重バイアルのいずれも複数回再使用することができ、単一もしくは複数サイクルの患者処置に十分であることができるため、現在利用できるよりもさらに便利な治療レジメンを提供することができる。
【０２３９】
本発明のこの特許請求する製品は、即時〜２４時間もしくはそれ以上の期間にわたる投与に有用である。従って、現在この特許請求する製品は、患者に有意な利点を与える。本発明の製剤は、必要に応じて、約２℃〜約４０℃の温度で安全に保存し、長期間にわたってタンパク質の生物学的活性を保持することができ、従って、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、もしくは９６時間またはそれ以上の期間にわたって保持し及び／または使用できることを示す包装ラベルを可能にする。保存希釈剤を用いる場合、そのようなラベルは、１〜１２ヶ月、半年、１年半、及び／または２年までの使用を含むことができる。
【０２４０】
本発明における少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の溶液は、少なくとも１つの抗体を水性希釈剤において混合することを含む方法により調製することができる。混合は、従来の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な希釈液を調製するために、例えば、水もしくは緩衝剤中の少なくとも１つの抗体の測定量を、所望の濃度のタンパク質、必要に応じて、保存剤もしくは緩衝剤を与えるのに十分な量で組み合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度及びｐＨは、用いる投与の濃度及び手段に対して全て最適化することができる因子である。
【０２４１】
この特許請求する製品は、清澄溶液として、もしくは水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成する凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含む二重バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする二重バイアルのいずれも複数回再使用することができ、単一もしくは複数サイクルの患者処置に十分であることができるため、現在利用できるよりもさらに便利な治療レジメンを提供する。
【０２４２】
この特許請求する製品は、清澄溶液もしくは水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成する凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含む二重バイアルを薬局、診療所、もしくは他のそのような機関及び設備に提供することにより患者に間接的に提供することができる。この場合の清澄溶液は、１リットルまでもしくはさらに大きいサイズであってもよく、大きい容器を提供してもよく、それから少なくとも１つの抗体溶液のより少ない量をより小さいバイアルに移すために１回もしくは複数回取り出し、薬局もしくは診療所によってそれらの顧客及び／または患者に提供することができる。
【０２４３】
これらの単一バイアルシステムを含む承認された装置には、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ），Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ）により製造もしくは開発されるような、ＢＤ  Ｐｅｎｓ，ＢＤ  ＡＵＴＯＪＥＣＴＯＲ（登録商標），ＨＵＭＡＪＥＣＴ（登録商標）のような溶液の送達用のペンインジェクター装置が含まれる。二重バイアルシステムを含む承認された装置は、再構成された溶液を送達するためのカートリッジ中で凍結乾燥薬を再構成するためのペン−インジェクターシステム、例えば、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥＮ（登録商標）を含む。
【０２４４】
現在この特許請求する製品には、包装材料が含まれる。包装材料は、規制当局により要求される情報に加えて、製品が使用できる条件を提供する。本発明の包装材料は、２バイアルの湿潤／乾燥製品では少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を水性希釈剤において再構成して溶液を形成し、該溶液を２〜２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって使用する使用説明書を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品では、ラベルはそのような溶液を２〜２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって使用できることを示す。現在この特許請求する製品は、ヒト医薬的製品用途に有用である。
【０２４５】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体及び選択された緩衝剤、好ましくは食塩水もしくは選択された塩を含有するリン酸緩衝剤を混合することを含む方法により調製することができる。少なくとも１つの抗体及び緩衝剤を水性希釈剤において混合することは、従来の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な製剤を調製するために、例えば、水もしくは緩衝剤中の少なくとも１つの抗体の測定量を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を与えるのに十分な量で水中の所望の緩衝剤と組み合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度及びｐＨは、用いる投与の濃度及び手段に対して全て最適化することができる因子である。
【０２４６】
請求する安定もしくは保存された製剤は、清澄溶液として、もしくは水性希釈剤中に保存剤もしくは緩衝剤及び賦形剤を含有する第２のバイアルで再構成する凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含む二重バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする二重バイアルのいずれも複数回再使用することができ、単一もしくは複数サイクルの患者処置に十分であることができるため、現在利用できるよりもさらに便利な治療レジメンを提供する。
【０２４７】
本明細書中に記載された安定もしくは保存された製剤または溶液のいずれかにおける少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、当該技術分野において周知であるように、ＳＣもしくはＩＭ注射；経皮、肺、経粘膜、埋め込み、浸透ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、もしくは当業者により認識される他の手段を含む種々の送達方法を介して本発明に従って患者に投与することができる。
【０２４８】
本発明の１つの実施形態において、本開示の抗ＧＤ２抗体を含む医薬組成物により、生物、好ましくは、動物、好ましくは、哺乳動物へのヒト化抗体の投与が容易になる。特定の哺乳動物としては、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ動物、非ヒト霊長類、及びヒトが含まれる。ヒトが特に好ましい。
【０２４９】
内部投与に適当な剤形（組成物）は、一般に、ユニットもしくは容器当たり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの有効成分を含有する。これらの医薬組成物において、有効成分は、通常、組成物の総重量に基づいて約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在する。
【０２５０】
非経口投与には、抗体は、医薬的に許容し得る非経口賦形剤と会合した、もしくは別個に提供する液剤、懸濁剤、乳剤もしくは凍結乾燥した散剤として調合することができる。そのような賦形剤の例として、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び１〜１０％のヒト血清アルブミンである。リポソーム及び不揮発性油のような非水性の賦形剤もまた用いることができる。賦形剤もしくは凍結乾燥した散剤は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝剤及び保存剤）を維持する添加剤を含有することができる。製剤は、公知のもしくは適当な技術により滅菌する。
【０２５１】
適当な医薬担体は、この分野の標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記述されている。
【０２５２】
非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として滅菌水もしくは食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有することができる。注入用の水性もしくは油性懸濁剤は、公知の方法に従って、適切な乳化剤もしくは加湿剤及び懸濁化剤を用いることにより調製することができる。注入剤は、水溶液または溶媒中の滅菌した注入可能な溶液もしくは懸濁液のような無毒の非経口的に投与可能な希釈剤であることができる。使用可能な賦形剤もしくは溶媒として、水、リンガー溶液、等張食塩水などが認められ；通常の溶媒、もしくは懸濁溶媒として、滅菌した不揮発性油を用いることができる。これらの目的のために、天然もしくは合成もしくは半合成の脂肪油もしくは脂肪酸；天然もしくは合成もしくは半合成のモノ−もしくはジ−もしくはトリグリセリドを含む、任意の種類の不揮発性油及び脂肪酸を用いることができる。非経口投与は、当該技術分野において知られており、これに限定されるものではないが、通常の注入手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記述されているようなガス加圧無針注入装置、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３９，４４６号に記述されているようなレーザー穿孔器装置が含まれる。
【０２５３】
併用療法
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗剤（例えば、これに限定されるものではないが、ＴＮＦ抗体もしくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体もしくは断片、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦ拮抗剤）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌剤）、乾癬治療剤、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養剤、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止痢薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ，Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗鬱剤、抗躁病薬、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠薬、交感神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくはアナログ、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカイン拮抗剤、及び細胞療法から選択される少なくとも１つをさらに含む本発明の抗ＧＤ２抗体は、さらに、必要に応じて、投与する。そのようなサイトカインの非限定例としては、限定されるものではないが、ＩＬ−１〜ＩＬ−３４のいずれかが含まれる。適当な投与量は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照、これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５４】
そのような抗癌もしくは抗感染薬はまた、本発明の少なくとも１つの抗体と会合、結合、共調合もしくは共投与する毒素分子を含むこともできる。毒素は、必要に応じて、病的細胞もしくは組織を選択的に殺すように作用することができる。病的細胞は、癌もしくは他の細胞であってもよい。そのような毒素は、限定されるものではないが、例えば、リシン、ジフテリア毒素、毒液毒素、もしくは細菌毒素の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能性細胞毒性ドメインを含む精製されたもしくは組換えの毒素もしくは毒素断片であってもよい。毒素という用語にはまた、死をもたらすことができる、毒素ショックを含む、ヒト及び他の哺乳動物における任意の病的症状を引き起こすことができる任意の天然に存在するか、突然変異体もしくは組換えの細菌もしくはウイルスにより生産される内毒素及び外毒素の両方も含まれる。そのような毒素には、限定されるものではないが、腸管毒素原性大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、耐熱性エンテロトキシン（ＳＴ）、シゲラ細胞毒素、アエロモナスエンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、スタヒロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、もしくはＣ（ＳＥＣ）、ストレプトコッカスエンテロトキシンなどが含まれる。そのような細菌には、限定されるものではないが、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌の種の株（例えば、血清型Ｏ１５７：Ｈ７の株）、スタヒロコッカス種（例えば、スタヒロコッカス・アウレウス、スタヒロコッカス・ピオゲネス）、シゲラ種（例えば、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ、及びシゲラ・ソンネイ）、サルモネラ種（例えば、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・エンテリティディス）、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ジフィシール、クロストリジウム・ボツリヌム）、カンピロバクター種（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・フィタス）、ヘリコバクター種（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）、アエロモナス種（例えば、アエロモナス・ソブリア、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・キャビエ）、プレイソモナス・シゲロイデス、エルジニア・エンテロコリチカ、ビブリオ種（例えば、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリチカス、クレブシエラ種、シュードモナス・アエルギノーザ、及びストレプトコッカスが含まれる。例えば、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｐｐ１−１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ２３９−２５４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎ．��．（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１−１３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５−７１１（１９９０）を参照されたい、これらの参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
生産
本発明により使用される少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、哺乳動物細胞からを含む組換え手段もしくはトランスジェニック調製によって生産することができ、あるいは本明細書中に記載されるように、または当該技術分野で知られているように、他の生物学的供給源から精製することができる。
【０２５６】
そこで、本発明は、上述の単離されたまたは精製された核酸分子を、必要に応じて、ベクターの形態で含む宿主細胞も提供する。オリゴヌクレオチドまたはその断片が、細胞によって効率的に転写、翻訳されるように、本発明の細胞がベクターを発現するのが最も好ましい。細胞の例としては、限定されるものではないが、ヒト細胞、ヒト細胞株、大腸菌（例えば、大腸菌ＴＢ−１、ＴＧ−２、ＤＨ５α、ＸＬ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＳＡ２８２１及びＹ１０９０）、バシルス・スブチリス、シュードモナス・アエルギノーザ、サッカロマイセス・セレビシエ、ニューロスポラ・クラッサ、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｅａ４）、及び以下の本明細書中に記載の他のものが挙げられる。宿主細胞は、宿主内に存在することができる。該宿主は、哺乳動物などの動物であり、特に、ヒトである。
【０２５７】
特定の実施形態において、ルーチン組換えＤＮＡ技術を用いて、本明細書で同定されたＣＤＲの１つまたは複数をフレームワーク領域内に挿入してもよい。フレームワーク領域は、天然に存在するかまたはコンセンサスフレームワーク領域でもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストに関しては、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）である。フレームワーク領域とＣＤＲとの組み合わせによって生成させるポリヌクレオチドは、ＧＤ２に特異的に結合する抗体をコードするのが好ましい。１つまたは複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で行ってもよく、アミノ酸置換により抗体の抗原への結合が改善されるのが好ましい。さらに、そのような方法を用いて、アミノ酸を置換させ、もしくは鎖内ジスルフィド結合に関与している１つまたは複数の可変領域システイン残基を欠失させて、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成してもよい。ポリヌクレオチドの他の改変は、本発明に包含され、かつ当業者の技術の範囲内である。
【０２５８】
用途
高い親和性で、ＧＤ２への中和キメラ抗体またはヒト抗体を、ＧＤ２が発現される病気で用いるのが望ましい。例えば、ＧＤ２は、黒色腫の＞５０％（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３、４２−４９）、骨肉腫の８８％（Ｈｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７，５３７７−５３８８）、及び脂肪肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、及び紡錘細胞肉腫（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  ７０，６３３−６３８）、ならびに脳腫瘍（Ｌｏｎｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８２，４５−５４）を含む柔軟組織の肉腫の９３％において発現される。抗ＧＤ２抗体は、黒色腫（Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｉｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３，１９−２４；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５，１４３０−１４４０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５，７６１−７７４）、肉腫（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上記；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｈｅ  ｆｉｆｔｈ  Ａｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｃｅａｎｉａ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ｐ．１０４）、小細胞肺癌（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３，１４５−１４９）、脳腫瘍（Ａｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２２，４１９−４２６）を有する患者に、静脈注射ならびにＯｍｍａｙａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，５４６５−５４７０）を用いたコンパートメント治療によって試験されている。ＧＤ２は、網膜芽腫（Ｃｈａｎｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２８，３６９−３７３）及びＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞白血病細胞（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０，１９７２−１９７６）の腫瘍標的でもある。１つの好ましい態様において、本開示の抗ＧＤ２抗体を用いて、神経芽細胞腫を治療することができる。抗ＧＤ２抗体もしくはその誘導体は、単剤として用いてもよいし、あるいは他の治療剤と組み合わせて用いてもよい。加えて、これらのＭａｂを化学療法増強剤として用いてもよく、それらの使用により、細胞毒性剤の治療効果を増すことができる。これらの抗体を放射線増感剤として用いてもよく、それらの使用により放射効果を増すことができる。これらは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及び／またはＩＦＮアルファなどの他の腫瘍免疫抑制剤と組み合わせて用いてもよい。さらに、抗ＧＤ２抗体は、抗ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ−２、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＲＳＶタンパク質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体などの他のモノクローナル抗体；ならびにリツキサン、ハーセプチン、ミロターグ、カンパス、ゼバリン、ベクサール、エルビタックス、アバスチン及びベクチビックスを含む市販の認可された抗体と組み合わせて用いてもよい。
【０２５９】
従って、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を用いて、当該技術分野で知られているように、または本明細書中に記載されているように、細胞、組織、臓器、動物もしくは患者における少なくとも１つのＧＤ２関連疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０２６０】
リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いて１９８６年に行われた養子免疫療法試験により、患者内に腫瘍応答が時折起こることが報告された。ドナーリンパ球注入は、同種幹細胞移植後の慢性骨髄性白血病を持つ患者もしくは移植後ＥＢＶ関連リンパ増殖異常症（ＰＴＬＤ）を持つ患者においてもさらに成功を示している。固形腫瘍では、ＣＴＬは、高用量化学療法により作製したリンパ球減少フェーズ中に悪性黒色腫の治療に成功した。２つのハイブリドーマを融合することで二重特異性抗体を作製し、２つの結合部位を持つハイブリッド免疫グロブリン分子を作製した。抗体は、腫瘍をＴ細胞に「手錠を掛け」させるだけでなく；Ｔ細胞上でＣＤ３と架橋し、活性化カスケードを開始させる。このように、ＭＨＣ制限をバイパスすることで、ＴＣＲベース細胞毒性を所望の腫瘍標的に再度向ける。ポリクローナル的活性化されたＴ細胞（ＡＴＣ）を抗ＣＤ３×抗ＴＡＡ（ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥ抗体）にアーム化させることにより、ＭｏＡｂ（例えば、ＴＡＡがＧＤ２であるｈｕ３Ｆ８）の標的特異性を、Ｔ細胞の細胞毒性を媒介したＭＨＣ非制限パーフォリン／グランザイムと組み合わせる。ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥは、患者に注入する前に、ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大された活性化Ｔ細胞にアーム化することができる。この戦略により、全てのＡＴＣを特異的ＣＴＬに変換する（Ｔｈａｋｕｒ  ａｎｄ  Ｌｕｍ，２０１０，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，３４０−３４９；Ｇｒａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，５６９−５７６）。
【０２６１】
腫瘍は、ＭＨＣ（例えば、ＮＢ内において）の低発現または無発現、Ｔ細胞シグナル伝達を脱線させる、ＭＨＣ上の腫瘍ペプチドの提示を減少させる、共刺激分子の欠損、及びＣＴＬ及び体液性応答を阻害する制御性Ｔ細胞の誘導などの多数のメカニズムによってＴ細胞を回避する。ＡＴＣにアーム化したＢｓＡｂまたはＢｉＴＥにより行われる殺傷はＭＨＣ非制限であるため、この戦略は、これらの腫瘍回避メカニズムのいくつかを克服しなければならない。腫瘍は、ＴＧＦ−βを分泌することで、Ｔｈ２タイプへのＴ細胞免疫応答をシフトさせ、インターロイキン２（ＩＬ−２）及びＩＦＮ−γ分泌を下方制御しながら、ＩＬ−１０及びＩＬ−６を上方制御することで、免疫抑制を引き起こす。アーム化されたＡＴＣが、ＩＬ−２に独立した方法で腫瘍標的を溶解させるため、ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥによって再度向けられたＴ細胞は、制御性サイトカインのこれらの悪影響を迂回し得る。これらの腫瘍に向けられたＴ細胞にアーム化されたＢｓＡｂまたはＢｉＴＥで治療された患者は、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのレベルが増大したため、Ｔ細胞をＴｈ１応答にシフトさせなければならない。加えて、細胞毒性Ｔ細胞は、腫瘍細胞上のＦａｓ受容体（ＣＤ９５）を係合するＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を介して殺傷する。残念なことに、腫瘍細胞上のＦａｓＬは、Ｔ細胞のアポトーシスも誘導し得る。ＣＤ３カスケードを介したＴＣＲ刺激により、ＣＤ８＋細胞をＣＤ９５媒介自殺から防御する。アーム化されたＡＴＣは、ＴＣＲをＢｓＡｂまたはＢｉＴＥに架橋させることでＣＤ９５−誘導細胞死滅に抵抗する。連続的に殺傷するＴ細胞、すなわち、処置中に増殖し、リンパ管及び柔軟な組織内に移動する腫瘍標的を連続的に殺傷するＴ細胞の能力により、ＮＢ細胞が骨髄腔外に転移し腫瘤を形成している間にＮＢ細胞を捕捉する確率が増大した。ヒト癌を標的化するＢｓＡｂまたはＢｉＴＥを用いることは有望であることが、最近の研究により示されている。
【０２６２】
特に、同種造血幹細胞移植を受けた患者の分析から、リンパ腫及び特定の種類の白血病を抑制もしくは根絶するＴ細胞の可能性を支持するという証拠が山のように存在する（Ｏ’ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２，１６２−１７２）。しかしながら、子供における固形腫瘍の制御においてＴ細胞の役割を支持するという確たるデータは存在しない。これは、これらの腫瘍のいくつかが、遺伝性クラスＩまたはＩＩのＨＬＡ対立遺伝子（例えば、神経芽細胞腫）を発現しない（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，４６３４−４６４４；Ｗｏｌｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４，４００−４０６）かもしくはクラスＩ対立遺伝子のみを低レベル（例えば、横紋筋肉腫）で発現する（Ｐｒａｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ５３，２２６−２３１）という事実と一致している。さらに、Ｂ７．１及びＩＣＡＭ−１などの重要な共刺激分子の発現は、低いかまたは検出不能であることが多い。その結果、これらの腫瘍がＴ細胞応答を惹起する能力は低く、ＨＬＡ対立遺伝子によって提示される腫瘍抗原に結合することでＴ細胞受容体を介して腫瘍に係合するエフェクターＴ細胞の潜在力は限定される。さらに、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫及び線維形成性小円形細胞腫瘍に対して現時点で利用可能な最も効果的な治療では、免疫抑制アルキル化剤、特に、シクロホスファミドを、重度のＴ−リンパ球減少症を誘発する用量で用いる。二官能性抗体により、Ｔ細胞の標的係合、及び抗原特異的ＨＬＡ−制限ＴＣＲよりもＨＬＡ−非制限ＣＤ３媒介性の活性化を介したエフェクター機能を引き出すことが可能になる。ＣＤ３及び腫瘍抗原、例えば、ＣＤ−１９、ＨＥＲ−２  ＮＥＵ、またはＣＥＡに対して特異的な特定の二官能性モノクローナル抗体の研究により、これらの抗体が、他の標的抗原を発現する腫瘍細胞に細胞毒性Ｔ細胞を連結させるという能力が実証されている（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９７４−９７７；Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）１１４，８４０；Ｋｉｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，３０８５−３０９１；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ  ３２，３４１−３５２）。両方の抗体受容体が係合すると、細胞毒性Ｔ細胞応答が、腫瘍細胞に対して開始される。Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞受容体及び腫瘍細胞間の細胞毒性シナプスの形成、ならびに腫瘍細胞アポトーシスのパーフォリン及びグランザイム媒介誘導を伴う（Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３，７６３−７７１；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３，１１２９−１１４３）。ＣＤ３の係合によりＴ細胞も活性化され、抗腫瘍効果を増強するエフェクターサイトカインの増殖及び生成を誘発する（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上記；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  ���ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０，７９８−８０７）。驚くべきことに、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化中に生成されたＴＮＦ及びＦａｓリガンドの細胞毒性効果から活性化Ｔ細胞を防御する抗アポトーシスタンパク質ｃ−ＦＬＩＰを上方制御する（Ｄｒｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００，６９０−６９７）。その結果、Ｔ細胞応答は倍増される。しかして、ピコグラムレベルの二官能性抗体は、前臨床動物モデル、特に、Ｂ細胞リンパ腫及びＡＬＬの治療におけるＣＤ３／ＣＤ１９二重特異性の初期臨床試験の結果で示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，上記；Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６，１５５１−１５６３）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，上記；Ｋｉｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，上記）で著しい抗腫瘍効果を及ぼし得る。誘発されたＴ細胞応答により、未感作Ｔ細胞が形成され、腫瘍部位での腫瘍特異的Ｔ細胞の生成を刺激することができるとの仮説が立てられている（Ｋｏｅｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，１７３０−１７４０）。二重特異性抗体を用いて、Ｔリンパ球に加えて他のエフェクター細胞を再標的化することもできる。これらのエフェクター細胞には、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、神経幹細胞、及びＧＤ２を発現する細胞、組織または臓器の他の幹細胞が含まれる。組織が腫瘍である場合、これらのエフェクター細胞を活用して、タンパク質（例えば、サイトカイン、抗体、酵素、または毒素）もしくは診断用または治療用の放射性同位体を殺傷もしくは沈着することができる。組織が正常臓器である場合、エフェクター細胞を同様に活用して、タンパク質もしくは診断用または治療用の同位体を送達することができる。
【０２６３】
本発明は、これに限定されるものではないが、多発性骨髄腫、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞もしくはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、前立腺細胞癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛；癌転移の抑制；癌悪液質の改善；及びメサンギウム増殖性糸球体腎炎などのような炎症性疾患の治療の少なくとも１つが含まれる、細胞、組織、臓器、動物もしくは患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節もしくは処置する方法を提供する。そのような方法は、必要に応じて、そのようなＧＤ２抗体の投与の前に、同時にもしくは後に投与することにより、放射線療法、抗血管新生剤、化学療法剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤などと組み合わせて用いることができる。
【０２６４】
本発明は、これに限定されるものではないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除術を戻す処置、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線の暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病状、サルコイドーシス、クローン病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、超過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の臓器もしくは組織の移植片拒絶反応、腎臓移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植片拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植片拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、任意の臓器もしくは組織の異種移植片拒絶反応、同種移植片拒絶反応、抗受容体超過敏反応、グレーブス病、レーノー病、Ｂ型インシュリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞傷害、ＩＩＩ型超過敏反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、及び皮膚変化症候群）、多発性神経障害、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織病、特発性アジソン病、糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、心筋梗塞心術後症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶反応、細胞内生物体による肉芽腫、薬物過敏、代謝性／特発性、ウィルソン病、ヘマクロマトーシス、アルファ−１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗しょう症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球増多症、皮膚病変、乾癬、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ＯＫＴ３療法、抗ＣＤ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、限定されるものではないが、無力症、貧血、悪液質などが含まれる）、慢性サリチル酸中毒、睡眠時無呼吸、肥満症、心不全、副鼻腔炎、炎症性腸疾患などの少なくとも１つを含む、細胞、組織、臓器、動物、もしくは患者における少なくとも１つのＧＤ２媒介免疫関連疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。例えば、各々を参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ−１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照されたい。
【０２６５】
本発明は、これに限定されるものではないが、急性もしくは慢性の細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む急性及び慢性の寄生性もしくは感染性プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、ＢもしくはＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、エシェリキア・コリＯ１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解性血小板減少性紫斑症、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、毒素性ショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疽、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ菌、ライム病、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食性症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などの少なくとも１つを含む、細胞、組織、臓器、動物もしくは患者における少なくとも１つの感染症を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０２６６】
そのような方法のいずれも、必要に応じて、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む少なくとも１つの組成物もしくは医薬組成物の有効量をそのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物もしくは患者に投与することを含むことができる。
【０２６７】
本発明の任意の方法は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物もしくは医薬組成物の有効量をそのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物もしくは患者に投与することを含むことができる。そのような方法は、必要に応じて、そのような免疫疾患もしくは悪性疾患を治療するための共投与もしくは併用療法をさらに含むことができ、前記少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、その特定の部分もしくは変異体の投与は、前に、同時に、及び／または後に、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗剤（例えば、これに限定されるものではないが、ＴＮＦ抗体もしくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体もしくは断片、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦ拮抗剤）、ＩＬ−１８抗体もしくは断片、小分子ＩＬ−１８拮抗剤またはＩＬ−１８受容体結合タンパク質、ＩＬ−１抗体（ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータの両方を含む）もしくは断片、可溶性ＩＬ−１受容体拮抗剤、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、放射線療法、抗血管新生剤、化学療法剤、サリドマイド、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌剤）、乾癬治療剤、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ，Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗鬱剤、抗躁病薬、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠薬、交感神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくはアナログ、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカイン拮抗剤から選択される少なくとも１つを投与することをさらに含む。適当な投与量は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照されたい、これらの参考文献の各々は、参照によりその全体���本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
（本発明の少なくとも１つの抗体、その特定の部分及び変異体をさらに含む）本発明の組成物、併用療法、共投与、装置及び／または方法に適当なＴＮＦ拮抗剤には、限定されるものではないが、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦに特異的に結合する受容体分子；サリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体アゴニスト及びＡ２ｂアデノシン受容体エンハンサーのような、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出もしくは標的細胞へのその作用を阻止及び／または阻害する化合物；マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤のような、ＴＮＦ受容体シグナル伝達を阻止及び／または阻害する化合物；メタロプロテイナーゼ阻害剤のような、膜ＴＮＦ切断を阻止及び／または阻害する化合物；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル）のような、ＴＮＦ活性を阻止及び／または阻害する化合物；ならびにＭＡＰキナーゼ阻害剤のような、ＴＮＦ生産及び／または合成を阻止及び／または阻害する化合物が含まれる。
【０２６９】
本発明の任意の方法は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物もしくは医薬組成物の有効量をそのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物もしくは患者に投与することを含む、ＧＤ２発現により特徴付けられるＧＤ２媒介疾患もしくは障害を治療する方法を含むことができる。そのような方法は、必要に応じて、そのような免疫疾患を治療するための共投与もしくは併用療法をさらに含むことができ、前記少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、その特定の部分もしくは変異体の投与は、前に、同時に、及び／または後に、上記のような少なくとも１つの薬剤を投与することをさらに含む。
【０２７０】
典型的には、病的症状の治療は、組成物に含まれるものの比活性により、平均して、用量につき患者のキログラム当たり少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、好ましくは単回もしくは複数回投与につき患者のキログラム当たり少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの抗体の範囲に合計でなる少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物の有効量もしくは投与量を投与することによりもたらされる。あるいは、有効血清濃度は、単回もしくは複数回投与につき０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含むことができる。適当な投与量は、医師に既知であり、もちろん特定の疾患状態、投与する組成物の比活性、及び治療を受けている特定の患者により決まる。いくつかの例として、所望の治療量を得るために、反復投与、すなわち、特定のモニター量もしくは定量の反復個別投与を与えることが必要である可能性があり、該個別投与は、所望の日量もしくは効果が得られるまで繰り返される。
【０２７１】
好ましい用量には、必要に応じて、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／または１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはその任意の範囲、値もしくは割合、あるいは単回もしくは複数回投与当たり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、１４．９、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、及び／または５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、またはその任意の範囲、値もしくは割合を得ることを含むことができる。
【０２７２】
あるいは、投与する投与量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびにその投与形態及び経路；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の性質及び程度、併用療法の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果のような公知の因子により異なることができる。通常、有効成分の投与量は、体重のキログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムであることができる。通常は、投与につきもしくは持続放出形態においてキログラム当たり０．１〜５０、好ましくは０．１〜１０ミリグラムが、所望の結果を得るために有効である。
【０２７３】
非限定例として、ヒトもしくは動物の治療は、単回の、注入もしくは反復用量を用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日の少なくとも１つ、あるいはもしくはさらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、もしくは５２週の少なくとも１つ、あるいはもしくはさらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０年の少なくとも１つ、またはその任意の組み合わせに、１日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｋｇのような、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの本発明の少なくとも１つの抗体の１回限りのもしくは定期的投与量として提供することができる。
【０２７４】
本発明は、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オマヤ内、眼内、硝子体内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、もしくは経皮手段による少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物は、特に液体溶液もしくは懸濁剤の形態で非経口（皮下、筋肉内もしくは静脈内）または任意の他の投与の使用のために；これに限定されるものではないが、クリーム及び座薬のような、特に半固体形態で膣内もしくは直腸投与における使用のために；これに限定されるものではないが、錠剤もしくはカプセル剤の形態のような口腔内、もしくは舌下投与のために；あるいはこれに限定されるものではないが、散剤、点鼻薬もしくはエアロゾルまたはある種の薬剤の形態のような鼻腔内に；あるいはこれに限定されるものではないが、皮膚構造を改変するためもしくは経皮パッチにおける薬剤濃度を上げるために（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．“Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ”；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９−９０（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）ジメチルスルホキシドのような化学エンハンサーを有する、あるいは皮膚上へのタンパク質及びペプチドを含有する製剤の適用（ＷＯ９８／５３８４７）、または電気穿孔のような一時的輸送経路を作り出すためもしくはイオン導入のような皮膚を通した荷電薬剤の移動性を上げるための電場の適用、または超音波導入（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）のような超音波の適用を可能にする酸化剤を有するゲル、軟膏、ローション、懸濁剤もしくはパッチ送達系のような経皮に調製することができる（上記の公開及び特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２７５】
肺投与には、好ましくは、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物を肺もしくは洞の下気道に到達するのに有効な粒子サイズで送達する。本発明によれば、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、吸入による治療剤の投与用に当該技術分野で知られた種々の吸入もしくは点鼻装置のいずれかにより送達することができる。患者の洞腔もしくは肺胞にエアロゾル化した製剤を置くことができるこれらの装置には、定量吸入器、ネブライザー、ドライパウダー発生器、スプレーなどが含まれる。抗体の肺もしくは鼻腔投与を導くのに適当な他の装置も、当該技術分野において既知である。全てのそのような装置は、エアロゾルで抗体を施薬する投与に適当な製剤のものを用いることができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）もしくは固体粒子のいずれかから成ることができる。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器のような定量吸入器は、典型的には、噴射ガスを使用し、吸気中の作動を必要とする（例えば、ＷＯ９４／１６９７０、ＷＯ９８／３５８８８を参照されたい）。数例を挙げると、ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ（商標）（Ａｓｔｒａ）、ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、ＤＩＳＫＵＳ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販される装置のようなドライパウダー吸入器は、混合パウダーの呼吸作動を用いる（米国特許第４，６６８，２１８号  Ａｓｔｒａ，ＥＰ２３７５０７  Ａｓｔｒａ，ＷＯ９７／２５０８６  Ｇｌａｘｏ，ＷＯ９４／０８５５２  Ｄｕｒａ，米国特許第５，４５８，１３５号  Ｉｎｈａｌｅ，ＷＯ９４／０６４９８  Ｆｉｓｏｎｓ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、及びＡＣＯＲＮ  ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５，４０４，８７１号  Ａｒａｄｉｇｍ，ＷＯ９７／２２３７６）（上記の参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のようなネブライザーは、溶液からエアロゾルを生成し、一方、定量吸入器、ドライパウダー吸入器などは、小粒子エアロゾルを生成する。市販されている吸入装置のこれらの特定の例は、本発明の実施に適当な特定の装置の代表であるものとし、本発明の範囲を限定するものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物は、ドライパウダー吸入器もしくはスプレーにより送達する。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入装置のいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、好都合なことに信頼性があり、再現可能であり、なおかつ正確である。吸入装置は、必要に応じて、十分に呼吸が可能であるように、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの小乾燥粒子を送達することができる。
【０２７６】
ＧＤ２抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の懸濁液もしくは溶液を圧力下でノズルを通して押し出すことにより製造することができる。ノズルのサイズ及び構造、適用圧力、ならびに液体供給速度は、所望の出力及び粒子サイズを得るために選択することができる。例えば、毛細管もしくはノズル送りと接続した電場によりエレクトロスプレーを製造することができる。好都合なことに、スプレーにより送達する少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、そして最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒子サイズを有する。
【０２７７】
スプレーでの使用に適当な少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物タンパク質の製剤は、典型的には、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物タンパク質／ｍｌ溶液もしくはｍｇ／ｇｍ、またはその中の任意の範囲もしくは値、例えば、これに限定されるものではないが、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍｌもしくはｍｇ／ｇｍの濃度で水溶液中に抗体組成物タンパク質を含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、好ましくは亜鉛のような作用物質を含むことができる。製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、もしくは炭水化物のような、抗体組成物タンパク質の安定化のための賦形剤もしくは作用物質を含むこともできる。抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。抗体組成物タンパク質製剤は、界面活性剤を含むこともでき、これはエアロゾルを形成する際に溶液の噴霧化により引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面誘起凝集を減らすかもしくは防ぐことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような種々の従来の界面活性剤を用いることができる。量は一般に、製剤の０．００１〜１４重量％の間である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。ＧＤ２抗体、または特定の部分もしくは変異体のようなタンパク質の調合用に当該技術分野で知られた追加の作用物質も、製剤に含むことができる。
【０２７８】
抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザーもしくは超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与することができる。典型的には、ジェットネブライザーでは、開口部を通して高速空気ジェットを作り出すために圧縮空気源を用いる。気体がノズルを越えて広がるにつれて、低圧領域が生み出され、それは液体リザーバに接続されている毛細管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体の流れは、それが管から抜け出るにつれて不安定なフィラメント及び小滴に剪断され、エアロゾルを生み出す。所与のジェットネブライザーから所望の性能特性を得るために、一連の構成、流速、及びバッフルタイプを用いることができる。超音波ネブライザーでは、典型的には圧電変換器を使用して、振動の、機械的エネルギーを生み出すために高周波電気エネルギーを用いる。このエネルギーは、直接もしくはカップリング流動体を通して抗体組成物タンパク質の製剤に伝達され、抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを生み出す。好都合なことに、ネブライザーにより送達する抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒子サイズを有する。
【０２７９】
ジェットもしくは超音波のいずれかのネブライザーでの使用に適当な少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の製剤は、典型的に、溶液のｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体タンパク質の濃度を含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛のような作用物質を含むことができる。製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、もしくは炭水化物のような、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物タンパク質の安定化のための賦形剤もしくは作用物質を含むこともできる。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を調合することにおいて有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体製剤は、界面活性剤を含むこともでき、これはエアロゾルを形成する際に溶液の噴霧化により引き起こされる少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の表面誘起凝集を減らすかもしくは防ぐことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような種々の従来の界面活性剤を用いることができる。量は、一般に、製剤の０．００１〜４重量％の間である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。抗体タンパク質のようなタンパク質の調合用に当該技術分野で知られた追加の作用物質も製剤に含むことができる。
【０２８０】
定量吸入器（ＭＤＩ）において、噴射剤、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、及び任意の賦形剤もしくは他の添加剤を、液化圧縮ガスを含む混合物として容器に含有する。絞り弁の作動により、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍのサイズ範囲の粒子を含有する、エアロゾルとして混合物が放出される。所望のエアロゾル粒子サイズは、ジェット切削、噴霧乾燥、臨界点凝縮などを含む、当業者に知られた種々の方法により製造される抗体組成物タンパク質の製剤を用いることにより得ることができる。好ましい定量吸入器には、３ＭもしくはＧｌａｘｏにより製造され、ヒドロフルオロカーボン噴射剤を用いるものが含まれる。
【０２８１】
定量吸入器装置での使用のための少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の製剤には、一般に、非水性媒質中の懸濁液として、例えば、界面活性剤を用いて噴射剤に懸濁した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含有する微粉化散剤が含まれる。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）などを含む、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、もしくは炭水化物のような、この目的のために用いる任意の従来の物質であってもよい。好ましくは、噴射剤は、ヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、噴射剤における懸濁液として少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を安定させるため、化学分解から有効成分を守るためなどに選択することができる。適当な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが含まれる。場合によっては、エタノールのような溶媒を用いる溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の調合用に当該技術分野で知られた追加の作用物質も製剤に含むことができる。
【０２８２】
当業者であれば、本発明の方法は、本明細書中に記載されていない装置を介して少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物の肺投与により達成できることが分かるであろう。
【０２８３】
経口投与用の製剤は、腸壁の透過性を人工的に上げるためにアジュバント（例えば、レゾルシノールならびにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤）の共投与、ならびに酵素分解を阻止するために酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＦ）及びトラシロール）の共投与に依存する。経口投与用の固体タイプ剤形の有効成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成のポリマー、及びグリセリドを含む、少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は、他のタイプ（１つもしくは複数）の添加剤、例えば、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、パラベンのような潤滑剤、ソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロールのような保存剤、システインのような酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、着香料、香料などを含有することもできる。
【０２８４】
錠剤及び丸剤は、腸溶性製剤にさらに加工することができる。経口投与用の液体製剤には、医療用に許容される乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤及び液剤製剤が含まれる。これらの製剤は、該分野において通常用いられる不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームもまた、インシュリン及びヘパリンの薬剤送達系として記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。さらに最近では、混合アミノ酸の人工ポリマーの小球体（プロテイノイド）が医薬品を送達するために用いられている（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，５，８７１，５７３号に記述されている担体化合物は、生物学的に活性な作用物質を経口的に送達するために用いられ、当該技術分野で知られている。
【０２８５】
粘膜面を通した吸収には、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を投与する組成物及び方法は、乳剤粒子の粘膜接着を成し遂げることにより粘膜面を通した吸収を促進する、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチド、及び水性連続相を含む乳剤を含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明の乳剤の使用に適当な粘膜面には、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻腔内、膣内、肺、胃、腸、及び直腸投与経路を含むことができる。膣内もしくは直腸投与用の製剤、例えば座薬は、賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含有することができる。鼻腔内投与用の製剤は固体であってもよく、賦形剤として例えばラクトースを含有してもよく、または点鼻薬の水性もしくは油性溶液であってもよい。口腔内投与では、賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糊化済澱粉などが含まれる（米国特許第５，８４９，６９５号）。
【０２８６】
経皮投与には、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をリポソームもしくはポリマーナノ粒子、微粒子、マイクロカプセル、または小球体（他に記載されない限り、まとめて微粒子と称する）に封入する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼンのような合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及び他のタンパク質、アルギネート及び他の多糖のような天然ポリマー、ならびにその組み合わせでできている微粒子を含む、多数の適当な装置が公知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。
【０２８７】
本発明の化合物を対象に長期間にわたって、例えば、単回投与から１週〜１年以上の期間にわたって送達することが望ましいことがあり得る。種々の持続放出、持続性薬剤もしくは埋め込み剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液において低い程度の溶解性を有する化合物の医薬的に許容し得る無毒の塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノもしくはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような多塩基酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどのような多価金属陽イオン、または、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンとの塩；あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有することができる。さらに、本発明の化合物もしくは好ましくは今記述したもののような比較的不溶性の塩は、ゲル、例えば、注入用に適当な、例えば、ゴマ油を有するモノステアリン酸アルミニウムゲルに調合することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモン酸塩などである。注入用の持続放出持続性製剤の別のタイプは、例えば、米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのようなゆっくり分解する無毒の非抗原性ポリマーに分散もしくは封入した化合物もしくは塩を含有する。化合物、もしくは好ましくは、上述したものなどの比較的不溶性の塩は、特に動物における使用のために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに調合することもできる。追加の持続放出、持続性製剤もしくは埋め込み製剤、例えば、気体もしくは液体リポソームは、文献において既知である（米国特許第５，７７０，２２２号及び“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）。
【０２８８】
本出願を通して引用された全ての引用参照文献（参照文献、発行特許、公開特許出願、同時係属特許出願を含む）の内容は、ここに参照によって明白に組み入れられる。
【０２８９】
本発明の他の特徴は、本発明の例示について述べるものであり、かつ、本発明を限定するためではない以下の例示的な実施形態の記載により明らかになるだろう。
【実施例】
【０２９０】
実施例
本発明について、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明の理解のために記載されるが、本発明の範囲をいかなる意味でも限定することを意図せず、またそう解釈すべきではない。実施例には、当業者に周知の従来の方法（分子クローニング技術など）の詳細な説明は含まれない。別段の指示が無い限り、分率は重量分率であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の温度であり、かつ圧力は大気圧であるかまたはそれに近い。
【０２９１】
ネズミ３Ｆ８の抗体精製及びＦａｂ断片製剤
前述のように、濃縮されたハイブリドーマ上清からネズミ抗ＧＤ２  ＭｏＡｂ  ３Ｆ８（ＩｇＧ３）を精製した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２６４２−２６４９）。標準的Ｆａｂ製剤キットを用いて、パパイン消化によりｍ３Ｆ８のＦａｂ断片を生成した（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【０２９２】
結晶化及びデータ収集
精製された３Ｆ８  Ｆａｂ断片を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）中で１２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．１Ｍ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ６．５、２５％ＰＥＧ  ３３５０を含有するＨａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ試薬Ｄ７を含有するリザーバに対して、１６℃で蒸気拡散により懸滴で結晶化した（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州アリソ・ビエホ）。１μｌのタンパク質溶液と１μｌのリザーバ溶液とを混合して液滴を形成した。２５％グリセロール、０．１Ｍ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ６．５、２５％ＰＥＧ  ３３５０を含有する抗凍結剤により結晶を保護した。Ａｒｇｏｎｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅビームライン２４ＩＤＣでデータを収集した。結晶は、空間群Ｃ２に属し、１．６５Åの分解能に回折した。
【０２９３】
構造決定及び精製
フェーザー（ＣＣＰ４スーツ）を用いて、検索モデルＰＤＢエントリー２ＡＪＵを持つ分子置換によりＦａｂ構造を解決した（Ｍｃｃｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４）。Ｒｅｆｍａｃ５を用いて、最良の分子置換モデルを精製し（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ５３，２４０−２５５）、マニュアルフィッティングをＯで行い（Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．，１９９４，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ５０，７６０−７６３）、Ａｒｐ−Ｗａｒｐで溶媒付加した（Ｌａｍｚｉｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｏｎ，１９９３，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ４９，１２９−１４７）。最終モデルは、ｍ３Ｆ８  Ｆａｂ及び５８５溶媒分子の２つのポリペプチド鎖を含有していた。最終モデルは、タンパク質構造データバンク（アクセスコード３ＶＦＧ）に寄託した。
【０２９４】
分子ドッキングシミュレーション及びｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発
Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｓｕｉｔｅ２００９プラットフォーム（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）を用いて、ＧＬＩＤＥドッキングを行った。ＯＰＬＳ力場を用いて、タンパク質及びリガンドをパラメータ化した。トップリガンドポーズを２．０Åの標準偏差内でクラスタ化し、ＧｌｉｄｅＳｃｏｒｅで採点した。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、ＣＤＯＣＫＥＲドッキング及び相互作用エネルギー測定を行った。ＣＨＡＲＭｍ力場を用いて、タンパク質及びリガンドをパラメータ化した。トップリガンドポーズを２．０Åの標準偏差内でクラスタ化し、ＣＤＯＣＫＥＲ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙで採点した。ＧＤ２を伴う全てのドッキング研究では、セラミドテイルをメチル基で置換した（データ不図示）。剛直側鎖を持つタンパク質／抗体上にリガンド配座をドッキングする剛体条件下でドッキングシミュレーションを行った。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）のＳｍａｒｔ  Ｍｉｎｉｍｉｚｅｒアルゴリズムを用いたＣＨＡＲＭｍで、最終のドッキング複合体のエネルギーを最小限にした。ドッキング抗体の結合の自由エネルギーを算出することで、Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発を行った：抗原モデルは、ＣＨＡＲＭｍ力場及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の「Ｃａｌｃｕｌａｔｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ」プロトコルを用いた。
【０２９５】
画像レンダリング
ドッキング研究用のＰｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）もしくは静電ポテンシャル表面用のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で分子構造画像をレンダリングした。
【０２９６】
露出した疎水性表面積のモデリング
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）でＭｏＡｂ  ３Ｆ８及びＭｏＡｂ  ３Ｆ８  Ｈの抗原結合部位：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅをモデリングした。Ｃｈｅｎｎａｍｓｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｎｎａｍｓｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，１１９３７−９９８４２）により開発されたＳｐａｔｉａｌ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙアルゴリズムを用いて、露出した疎水性表面をレンダリングした。ここで、タンパク質表面上の効果的かつ動的に露出した疎水性のパッチを定量化し、赤色に着色する。
【０２９７】
細胞培養物
ヒト神経芽細胞腫細胞株ＬＡＮ−１は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓｅｅｇｅｒ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）によって提供された。黒色腫細胞株Ｍ１４及びＯＣＭ−１は、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｃｏｂｒｉｎｉｋ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）から入手した。全ての細胞株は、５％のＣＯ２インキュベーター内３７℃で、１０％子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＦ１０  ＲＰＭＩ  １６４０培地で成長させた。
【０２９８】
ｈｕ３Ｆ８及び変異体の構築
前述のように、ＣＨＯ細胞（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）でヒト化３Ｆ８遺伝子を合成した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １，４７７−４８６）。ブルースクリプトベクター（Ｅｕｒｅｋａ、ＣＡ）を用いて、ｈｕ３Ｆ８のこれらの重鎖及び軽鎖遺伝子をＤＧ４４細胞に形質導入し、Ｇ４１８で選択した（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）。
【０２９９】
抗体の精製
Ｈｕ３Ｆ８及びキメラ３Ｆ８生産株をＯｐｔｉｃｈｏ無血清培地（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、成熟上清を前述のように採取した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２を持つ２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤でタンパク質Ａ親和性カラムを前平衡化した。結合ｈｕ３Ｆ８を０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ３．９）で溶出させ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中でアルカリ化した（１：１０ｖ／ｖ比率）。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜を通過させて、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２の２５ｍＭクエン酸ナトリウム中で５〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０３００】
ＥＬＩＳＡによるＧＤ２結合の定量化及びフローサイトメトリー
前述のようにＥＬＩＳＡを行った（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。１ウエル当たり２０ｎｇのＧＤ２でマイクロタイタープレートをコートした。１ウエル当たり、ＰＢＳ（希釈剤）中０．５％ＢＳＡ１５０μｌを周囲温度で少なくとも３０分間各プレートに加え、過剰な結合部位をブロックした。１００μｌの標準及び試料（２倍に希釈）を各ウエルに加え、３７℃で２．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄後、希釈剤中で１：３５００に希釈した１００μＬのヤギ抗ヒト−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を各ウエルに加え、４℃で１時間インキュベートした。基質過酸化水素と色原体ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）とのＥＬＩＳＡにおける呈色反応を、周囲温度で暗闇にて３０分間生じさせた。反応を５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、光学濃度（ＯＤ）をＥＬＩＳＡプレートリーダーＭＲＸ（Ｄｙｎｅｘ）で４９０ｎｍにて読んだ。
【０３０１】
抗原含有細胞へのＭｏＡｂの結合保持を測定するため、抗体を黒色腫Ｍ１４細胞でインキュベートし、連続的に洗い落した。最初に、丸底チューブ当たり１ｘ１０６細胞で細胞を集め、遠心分離し、ＰＢＳで洗い流し、アッセイチューブ当たり１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁した。細胞をＭｏＡｂ  ｈｕ３Ｆ８またはｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ（（１μｇ  ＭｏＡｂ／１ｘ１０６細胞）で４℃にて３０分間インキュベートした。次いで、３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有５ｍｌ  ＰＢＳを用いて細胞を何回も連続的に洗浄した後、ペレット化し、上清を廃棄し、再懸濁させた。連続的な各洗浄で、試料をＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異性二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で暗闇で４℃にて３０分間インキュベートし、洗浄した後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ機器を用いてフローサイトメトリーにより分析した。試料を３通りで調製した。
【０３０２】
５１クロム遊離による抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）
前述のように、ヒトＣＤ１６  Ｆｃ受容体で安定的に形質導入されたＮＫ−９２ＭＩ細胞を用いて、ＡＤＣＣアッセイを行った（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。ＬＡＮ１−１、Ｍ１４、ＯＣＭ−１、Ｕ２ＯＳ、ＣＲＬ１４２７、ＮＣＩ−Ｈ３４５標的細胞をＣａ２＋Ｍｇ２＋遊離ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで分離し、Ｆ１０で洗浄し、ＡＤＣＣアッセイのために５１Ｃｒで放射性標識した。
【０３０３】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を用いて、カーブフィッティング及び統計分析を行った。有意の計算には、スチューデントｔ検定を用いた。
【０３０４】
実施例１
３Ｆ８：ＧＤ２モデルのＩｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発
ドッキング３Ｆ８：ＧＤ２モデル（Ｌ：Ｔｙｒ３７、Ｌ：Ｌｙｓ５５、Ｌ：Ｖａｌ９９、Ｌ：Ｌｅｕ１０２、Ｈ：Ｇｌｙ４０、Ｈ：Ｔｙｒ３１、Ｈ：Ａｓｎ３２、Ｈ：Ａｓｎ３４、Ｈ：Ｓｅｒ５６、Ｈ：Ｓｅｒ５８、Ｈ：Ｇｌｙ９７、及びＨ：Ｍｅｔ９８）中のＧＤ２と直接相互作用した１２個の残基を取ってＩｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発を行い、各部位での全ての可能性に対する単一点突然変異の効果を分析した。ＣＨＡＲＭｍ力場を用いて、モデルのエネルギーを最小限にした後、相互作用エネルギー（静電、ファン・デル・ワールス、エントロピー）の変化を分析した。トップ突然変異を表１に示す。４つの突然変異のみが、結合複合体の相互作用エネルギーを１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上増加させることが分かった（表１）。１点の突然変異のみが、−８ｋｃａｌ／ｍｏｌの加重突然変異エネルギーによって実質的に高い相互作用エネルギー（Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ）を有することが予測された。この相互作用エネルギーの増加の大部分は、抗原とのファン・デル・ワールス接触による増加のためであった。１２個の相互作用残基を伴う二重点及び三重点突然変異の効果についても算出したが、相互作用エネルギーを増加させる突然変異のさらなる組み合わせは見つからなかった。表１は、ドッキングＧＤ２抗原と直接相互作用するＣＤＲ残基のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発の結果を示す。エネルギーは、ｋｃａｌ／ｍｏｌの単位で示す。
【表１】
0006482525.tif 000002
【０３０５】
３Ｆ８及び３Ｆ８−Ｉｌｅ（Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ）の抗原結合部位の分析
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発シミュレーションに由来する単一点突然変異（Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ、３Ｆ８−Ｉｌｅと呼ばれる）を３Ｆ８の抗原結合部位にモデリングした（データ不図示）。Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ突然変異の疎水性のため、疎水性溶媒に露出したパッチの測度を提供するＳｐａｔｉａｌ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙアルゴリズム（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いて、抗原結合部位の疎水性の分析を行った。ＭｏＡｂ  ３Ｆ８は、Ｈ：Ｉｌｅ５６を中心にしたＧＤ２結合部位で疎水性パッチを有する（データ不図示）。Ｈ：Ｉｌｅ５６は、結合窩洞から突出しており、抗体が、ＧＤ２頭部基を取り囲む膜表面と相互作用するのに役立つ。Ｈ：Ｇｌｙ５４をＩｌｅに置換することにより、抗原結合部位の露出した疎水性表面積が増し、ドッキングモデルにおけるＧＤ２とのファン・デル・ワールス接触も増す（データ不図示）。
【０３０６】
ｈｕ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ  Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅの結合特性及び腫瘍細胞殺傷特性
Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ突然変異が、ＧＤ２及び腫瘍細胞のＡＤＣＣへの親和性を増大させるかどうか試験するため、突然変異を最近記載されたヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）に操作した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。Ｈｕ３Ｆ８は、ネズミ３Ｆ８よりも免疫原性が低く、この研究で見出されたネズミ３Ｆ８の構造特性を保持し、現在、フェーズＩ臨床試験中である。Ｈｕ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８  Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ（ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ）を構築し、発現し、精製し、ＧＤ２結合及びＡＤＣＣについて試験した。ＧＤ２のＥＬＩＳＡアッセイにより、ｈｕ３Ｆ８（ＧＤ２結合のＥＣ５０：ｈｕ３Ｆ８  ４８±１３ｎｇ／ｍＬ、ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ  ３８±１１ｎｇ／ｍＬ）に対するｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅの結合効率の増加は無視できるものであったことが示された（データ不図示）。天然の環境において腫瘍細胞の表面のＧＤ２にこれらの抗体が結合するアビディティーを試験するため、洗浄実験を行った。ここで、Ｍ１４の表面、ＧＤ２（＋）黒色腫細胞株に結合した抗体に、ＰＢＳ−ＥＤＴＡで連続的な洗浄サイクルを施した（Ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓを参照）。Ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅは、腫瘍細胞の洗い落しに抵抗する能力がより大きいことを示した（ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅのｔ１／２＝３回洗浄、ｈｕ３Ｆ８のｔ１／２＝２回洗浄）（データ不図示）。抗原結合を増強させる他の突然変異は見つからなかった。
【０３０７】
次いで、ヒトＣＤ１６  Ｆｃ受容体で形質導入されたナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２ＭＩの存在下において神経芽細胞腫ＬＡＮ−１のＡＤＣＣを媒介する効率について、Ｈｕ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅをアッセイした（データ不図示）。Ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅは、ｈｕ３Ｆ８に比べて一貫して〜９倍の細胞毒性能の増加を示した（ＩＣ５０細胞殺傷：ｈｕ３Ｆ８  １．３５±０．１５ｎｇ／ｍＬ、ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ  ０．１５±０．０１ｎｇ／ｍＬ）。黒色腫Ｍ１４及びＯＣＭ−１細胞に対するＡＤＣＣ能の６〜７倍の増加も観察された（Ｍ１４細胞のＩＣ５０細胞殺傷：ｈｕ３Ｆ８  ２５±２．２ｎｇ／ｍＬ、ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ  ３．７±１．１ｎｇ／ｍＬ；ＯＣＭ−１細胞のＩＣ５０細胞殺傷：ｈｕ３Ｆ８  ８．５±０．８ｎｇ／ｍＬ、ｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅ  １．５±０．１ｎｇ／ｍＬ）。ｈｕ３Ｆ８に対するｈｕ３Ｆ８−ＩｌｅのＡＤＣＣ能の増加は、非常に有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０３０８】
ヒト化３Ｆ８の潜在的な臨床効果をさらに最適にするため、３Ｆ８：ＧＤ２ドッキングモデル中の重要な相互作用残基上でハイスループットｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発を用いた。ＧＤ２−ＥＬＩＳＡアッセイにおける結合親和性の穏やかな上昇及び細胞表面のＧＤ２への結合を保持するｈｕ３Ｆ８−Ｉｌｅの能力の増加を示した単一点突然変異（Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ）を同定した。さらに驚くべきことに、ｈｕ３Ｆ８は、神経芽細胞腫、黒色腫、骨肉腫、及び小細胞肺癌を含むＧＤ２陽性腫瘍細胞株のＡＤＣＣにおいて〜６〜９倍の増加を示した。Ｈ：Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ突然変異の性質は、抗原結合部位で露出した疎水性表面積を増加させることである。ＧＤ２は、セラミド部分により膜表面に組み込まれるため、抗原結合部位でのＩｌｅの追加により、細胞洗浄実験にて観察されたように、ＭｏＡｂ  ３Ｆ８が膜表面に結合し続ける能力を増強させることで、ＡＤＣＣを増強し得る。
【０３０９】
糖鎖抗原は、いくつかの生物学的経路において重要な役割を果たす。糖鎖を標的にする抗体の開発は、細菌、腫瘍、血液型、細胞間接着相互作用；ウイルス、ホルモン、及びキシン受容体；ならびに組換えタンパク質のグリコシル化を調査するために重要である（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ−Ｍｏｌｉｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ−Ｏｌｓｏｎ，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３４，３４１−３５７）。サッカリドへの免疫応答は、Ｔ細胞非依存性であるため、糖鎖抗原に向かって生成された抗体は、低親和性ＩｇＭ抗体として生産されることが多い（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ−Ｍｏｌｉｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ−Ｏｌｓｏｎ，２００９，上記）。癌免疫療法の場合と同様に治療用途用の高親和性抗体を生成するために、親和性成熟技術は、治療効果を増強させるために用いる必要があることが多い。酵母／ファージ／リボソームディスプレイなどの従来の抗体親和性成熟法は、抗体のＣＤＲにおけるアミノ酸の各々で全種類の多様性を提供するわけではない変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に依存する。この調査において、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニング突然変異誘発は、高分解能の共複合体構造が使用できない場合でも用いることが可能であることを示す。さらに、親和性の穏やかな上昇により、腫瘍抗原ＧＤ２に治療的に標的化するＭｏＡｂ  ３Ｆ８の機能的性質を増強することができることも示す。ＡＤＣＣの増強が効果の改善につながると思われるが、これについては、患者において将来の臨床試験で証明する必要がある。これらのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術を用いることで、癌だけでなく、炭水化物エピトープがドラッガブルターゲットである他のヒト障害の診断もしくは治療用の次世代のＭｏＡｂの開発における従来の実験的方法に有益な付加をもたらし得る。
【０３１０】
新規フレームワークｈｕ３Ｆ８  ｖｅｒ５の設計
計算方法に基づいて免疫原性を減少させるために、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１（ＷＯ２０１１／１６０１１９，Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）のフレームワーク構造を最適化した。まず、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１重鎖及び軽鎖配列をヒト生殖細胞株配列であるｈｕｍＩＧＨＶ１９９及びｈｕｍＩＧＫＶ０２５とそれぞれ比較した（ＥＭＢＬデータベース、ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）。ネズミ３Ｆ８（タンパク質データバンク登録番号３ＶＦＧ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）の結晶構造に基づいて、ＣＨＡＲＭｍ（ＣＨｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．３０，１５４５−１６１５）を用いた分子シミュレーションを各々の潜在的なヒト化突然変異に行い、突然変異が構造的に許容できるか判断した。さらに、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１中のＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープを、ＮＮアラインメント方法を用いて、免疫エピトープデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）上で同定し、構造的に許容できる突然変異に基づいて最小化した。３Ｆ８結晶構造にドッキングさせたＧＤ２の計算モデル（ＣＤＯＣＫＥＲ及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて構築、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）に基づいて、ＧＤ２抗原と直接相互作用するようにモデリングされていないＣＤＲ残基は、ヒト化突然変異と見なした。
【０３１１】
酵母ライブラリーからのｈｕ３Ｆ８突然変異体の選択
高親和性突然変異体を生成し、単離する方法は、参照文献（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１１，１０，１６７７−１６８５）に記載されている通りであった。ＦＡＣＳの選択前に、酵母細胞（１×１０９）をＰＢＳＡ緩衝剤（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）中の１０μｇ  ＧＤ２−コンジュゲート磁気ビーズで室温にて１時間インキュベートした後、磁気スタンドで分離した。単離されたビーズをＰＢＳＡ緩衝剤で３回洗浄し、１０ｍｌのＳＤＣＡＡ（合成デキストロースカザミノ酸）培地に置き、２５０ｒｐｍの攪拌器中で３０℃にて一晩増殖させた。磁気ビーズから回収した酵母細胞を、２０℃にて１８時間２５０ｒｐｍで攪拌しながらＳＧ／ＲＣＡＡ（合成ガラクトースラフィノースカザミノ酸）培地中で誘導した。およそ１×１０８酵母細胞をペレット化し、ＰＢＳＡ緩衝剤で２回洗浄し、ビオチン化ＧＤ２を含む１ｍｌのＰＢＳＡ緩衝剤及びマウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１００希釈物中で再懸濁した。インキュベーション後、酵母細胞を３回洗浄し、次いで、１ｍｌのＰＢＳＡ緩衝剤中で再懸濁した。Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方の１：１００希釈物に酵母細胞を加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＡ緩衝剤で再度３回洗浄し、次いで、ソーティングのためにＰＢＳＡ緩衝剤中で再懸濁した。ソーティングゲートを決定し、より高い抗原結合シグナルを持つ個体群のみを選択した。収集した細胞をＳＤＣＡＡ培地中で３０℃にて一晩増殖させ、次回のソーティングのためにＳＧ／ＲＣＡＡ中で誘導させた。次の３択では、およそ１〜２×１０７酵母細胞をそれぞれ用いて、ビオチン化ＩＧＦ−１で染色した。製造者の指示に従って、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、酵母プラスミドを単離し、ライブラリー構築のテンプレートに用いた。４回目のプラスミドを調製して、配列を決定し、特徴付けた。
【０３１２】
ｈｕ３Ｆ８  ｓｃＦｖ及びＩｇＧ１の発現
前述のように、ＳｃＦｖを発現し、精製した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，上記）。ｓｃＦｖ配列を含有するｐＣｏｍｂ３ｘプラスミドでＨＢ２１５１細胞を形質転換した。単一の新鮮なコロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．２％グルコースを含有する２ＹＴ培地に接種した。イソプロピル−Ｌ−チオ−ｈ−Ｄ−ガラクトピラノシド（最終濃度０．５ｍＭ）によって培養を誘導した。３０℃にて一晩増殖後、細菌を５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。３０℃で３０分間インキュベートすることで、可溶性ｓｃＦｖをペリプラズムから放出した。透明な上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上で精製した。組換えｓｃＦｖは、ＦＬＡＧ及びＨｉｓタグを有する。前述のように、ＩｇＧをＣＨＯ懸濁剤細胞中で発現した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記）。ＨＥＫ２９３細胞を用いて、Ｈｕ３Ｆ８  Ｖ５  ＩｇＧを過渡的に発現した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎフリースタイル発現システム）。ＩｇＧをタンパク質Ｇカラム上で精製した。
【０３１３】
ＥＬＩＳＡ
他のガングリオシドとの交差反応では、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、及びＧＤ１ｂを９０％エタノール中で１ウエル当たり２０ｎｇでポリビニルマイクロタイタープレート上にコートした。空気乾燥後、１ウエル当たり１５０μｌのＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでウエルを室温で１時間ブロックした。０．５％ＢＳＡ中に１ｍｇ／ｍｌ（１ウエル当たり１００ｍｌ）で抗体を３通りで加えた。室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄後、ＩｇＧ抗体のために１：５０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ、もしくはｓｃＦｖ抗体のために１：５０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗Ｆｌａｇ  ＩｇＧを加えた。４℃で１時間インキュベーションし、さらに洗浄後、呈色反応を行い、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９０ｎｍでＯＤを読んだ。
【０３１４】
表面プラズモン共鳴による親和性決定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて親和性を測定した。要するに、疎水性相互作用を介してＣＭ５センサーチップ上にガングリオシドを直接固定化した。参照表面をＧＭ１で固定化した。活性表面を１：１比率のＧＤ２及びＧＭ１もしくはＧＤ１ｂのみで固定化した。ＧＤ２及びＧＭ１の希釈混合物（５０ｕｇ／ｍｌ）もしくはＧＤ１ｂを１５μｌ／分の流量で２０分かけて注入した（３００μｌ）。安定なベースラインが得られるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＨで広範囲にわたる洗浄を行った（典型的には、５μｌ／分の流量で２０μｌの５回洗浄）。
【０３１５】
補体媒介細胞毒性（ＣＭＣ）アッセイ
ヒト血清もしくはヒトエフェクター細胞の非存在下で腫瘍細胞増殖及び生存への直接効果について抗体を試験した。腫瘍標的を２ｍＭ  ＥＤＴＡもしくはトリプシン−ＥＤＴＡで解離させ、洗浄し、ヒト血清を含む９６ウエル平底プレート上にプレートした。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２４時間インキュベーション後、Ｆ１０中の濃度を増加させた抗体を各ウエルに加えた。対照ウエルはＦ１０のみを受けた。５％ＣＯ２中で３７℃にて４時間インキュベーション後、ＷＳＴ−８試薬（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を各ウエルに加え、ＣＯ２インキュベーター中で暗闇で３７℃にて２〜６時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ及び６９０ｎｍでＯＤを読んだ。Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）もしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、直接細胞計数によってＷＳＴ−８アッセイを確認した。
【０３１６】
５１クロム遊離による抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）
標的細胞をＣａ２＋Ｍｇ２＋遊離ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで分離し、Ｆ１０で洗浄した。製造者の指示に従って、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて、抗原密度を推定した。細胞毒性アッセイでは、５１Ｃｒの１００ｕＣｉを２５０μｌの最終容量で１０６標的細胞でインキュベートし、１５分間隔でペレットを穏やかに再懸濁させて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２５０μｌのＦ１０中で再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を計数し、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅで生存能力を決定し、９６ウエルＵ底プレートの上に素早くプレートした。正常ボランティアからの末梢血を、ヘパリン化チューブに集めた。血液を３％デキストラン／ＰＢＳと混合し、室温で２０分間保持し、赤血球を沈降させた。次いで、白血球をフィコールし、ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣ用に末梢血中単核細胞（ＰＢＭＣ）に分離した。細胞をＦ１０中で洗浄し、計数し、生存能力を決定した。１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下においてＰＢＭＣ−ＡＤＣＣを行った。Ｆ１０中で１μｇ／ｍｌから１０倍希釈で抗体を希釈した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて４時間インキュベートした。ＡＤＣＣ上清中の放出された５１Ｃｒをガンマ計数用に集めた。１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて総放出を決定し、エフェクターを持たないＦ１０のみで、バックグラウンド自然放出を決定した。一般に、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率が５０：１のものを用いた。同様に、ヒトＣＤ１６もしくはヒトＣＤ３２  Ｆｃ受容体で安定的に形質導入されたＮＫ−９２ＭＩ細胞を用いて、ＡＤＣＣアッセイを行った。ＰＢＭＣと異なり、サイトカインはアッセイに必要としなかった。Ｅ：Ｔ比率は、２０：１に保持した。
【０３１７】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
腫瘍及び正常組織を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにて施設内倫理委員会の承認の元で得た。スナップ冷凍組織の５〜７マイクロメータ切片をアセトン中で３０分間−２０℃にて固定した。内因性ビオチン結合活性は、アビジン及びビオチン（ベクターアビジン−ビオチンブロックキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で各々２０分間連続処理することでブロックした。切片を３ｕｇ／ｍｌ  ｓｃＦｖ−Ｆｌａｇで室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、切片をＨＲＰ抗Ｆｌａｇ抗体で室温にて３０分間インキュベートした後、３，３−ジアミノベンジジンで５分間インキュベートした。Ｈ＆Ｅ染色も行った。
【０３１８】
実施例２
ｈｕ３Ｆ８Ｖ５の構築
潜在的な免疫原性を減少させる目的で、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１中に９点の突然変異を起こさせて、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５（表２を参照）を作製した。９つ全ての突然変異は、その抗原であるＧＤ２に結合した３Ｆ８の計算モデルに構造的に許容できることが分かった。全ての突然変異は、ヒト化３Ｆ８上に残されたネズミ残基をヒト生殖細胞株配列に変更することを伴う。５つの突然変異（ＬＣ：Ｋ２４Ｒ、ＬＣ：Ｓ５６Ｔ、ＬＣ：Ｖ５８Ｉ、ＨＣ：Ｉ２０Ｌ、ＨＣ：Ｍ９２Ｖ）は、フレームワーク残基を伴う。ＣＤＲ  Ｈ２中の４つの突然変異（ＨＣ：Ａ６２Ｓ、ＨＣ：Ｆ６３Ｖ、ＨＣ：Ｍ６４Ｋ、ＨＣ：Ｓ５６Ｇ）により、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法によって同定された際に、強力なＴ細胞エピトープが除去されたことがさらに分かった。グラフト法による抗体ヒト化の当業者には、ＣＤＲ残基を変化させることは一般的ではないが、ＧＤ２に結合した３Ｆ８の計算モデルにより、これらのさらなるヒト化突然変異を操作することができた。
【０３１９】
ｈｕ３Ｆ８の親和性成熟
酵母提示法に基づいて親和性成熟を行うため、選択用に用いる新規のビオチン化ＧＤ２誘導体を合成した。標準的なビオチン化ＧＤ２抗原を用いてでは、これまで失敗に終わっていた。合成ＧＤ２−アジド誘導体（図２）を用いて、それをＰＥＧスペーサーに融合させた（以下の実施例７を参照）。この新規のアナログを用いて、合成ＧＤ２アナログへの結合を増強させた酵母の表面上に提示されたｈｕ３Ｆ８  ＳｃＦｖのランダムライブラリーから２つの突然変異を選択した。１つ目は、ＣＤＲ  Ｌ１上に位置するＬＣ：Ｄ３２Ｈであり、２つ目は、フレームワーク残基であるＬＣ：Ｅ１Ｋであった。
【０３２０】
組換え発現ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＳｃＦｖ及びｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ＳｃＦｖ構築体中で２つの突然変異（ＬＣ：Ｅ１Ｋ及びＬＣ：Ｄ３２Ｈ）を試験し、天然のＧＤ２に対する結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて測定した。構造モデリングに基づいて、全てのｈｕ３Ｆ８  ＳｃＦｖは、抗原結合ポケットへのアクセスがそれほど制限されないため、ＶＬ−ＶＨ形式で作製した。これは、ＶＨ−ＶＬ形式で構築されるほとんどの従来のＳｃＦｖと対照的である。いくつかの変異体についても、完全ＩｇＧ１形式で試験した。表２は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ５の設計を示す。
【表２】
0006482525.tif 000003
【０３２１】
実施例３
結合親和性
ＳｃＦｖ形式で試験したｈｕ３Ｆ８変異体の結合親和性（表３を参照）は、多くの興味深い所見を示す。まず、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１よりも免疫原性が低くなるようにのみ設計されたｈｕ３Ｆ８Ｖ５は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１よりもＧＤ２への結合親和性がわずかに強かった。別々に発現した場合、２つの親和性成熟突然変異（ＬＣ：Ｅ１Ｋ及びＬＣ：Ｄ３２Ｈ）は、ＧＤ２への結合の増強を示す。ｈｕ３Ｆ８Ｖ１形式もしくはｈｕ３Ｆ８Ｖ５  ｓｃＦｖ形式のいずれかで一緒に発現した場合、より著しい結合親和性の増強が観察される（７〜１２倍低いＫＤ）。二重突然変異（ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）をＨＣ：Ｇ５４Ｉと組み合わせた場合（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングに基づく、参照原特許）、結合親和性は、二重突然変異のみの場合ほど強くはないが、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１よりも高い親和性である。ｈｕ３Ｆ８  Ｇ５４Ｉは、ＧＤ２陽性腫瘍細胞株に対してＡＤＣＣで７〜１０倍の増加を持つことが示された。
【０３２２】
完全ＩｇＧ１形式におけるｈｕ３Ｆ８変異体の結合親和性を表４に示す。ＳｃＦｖデータと同様、二重突然変異ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈは、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１形式及びｈｕ３Ｆ８  Ｖ５形式の双方において、単一突然変異ＬＣ：Ｄ３２Ｈよりも強い親和性を示す。ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈ二重突然変異体対親の全体的な増強は、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１形式及びｈｕ３Ｆ８  Ｖ５形式の双方において８〜１０倍である。ＬＣ：Ｅ１Ｋは、正準的なＣＤＲ残基でないため、結合の増強に対するＬＣ：Ｅ１Ｋの寄与は予想外である。ｈｕ３Ｆ８  Ｖ５構築体は、ＨＥＫ２９３細胞において過渡的に発現され、結合に影響を与え得る構造的性質が改変されている場合があるため、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１構築体とｈｕ３Ｆ８  Ｖ５  ＩｇＧ構築体の結合親和性は、直接比較することはできない。表３は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定された、ＧＤ２に対するｈｕ３Ｆ８  ｓｃＦｖの結合親和性を示す。表４は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定された、ＧＤ２に対するｈｕ３Ｆ８  ＩｇＧの結合親和性を示す。
【表３】
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【表４】
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【０３２３】
実施例４
他のガングリオシドとの交差反応
交差反応研究（表５、データ不図示）では、全てのｈｕ３Ｆ８変異体は、ＧＤ１ｂと同等の交差反応を示し（神経芽細胞腫瘍細胞上にガングリオシドも存在）、試験した他のガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３）には著しい交差反応を示さず、これは、ｈｕ３Ｆ８変異体が、親ｈｕ３Ｆ８Ｖ１と同じ特異性を保持することを実証するものである。表５は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定された、ＧＤ１ｂに対するｈｕ３Ｆ８  ＩｇＧの結合親和性を示す。
【表５】
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【０３２４】
実施例５
ＡＤＣＣ及びＣＭＣにおける抗体効力
ＰＢＭＣ（末梢血中単核細胞）もしくはＮＫ９２−ＣＤ１６（ＣＤ１６陽性培養ＮＫ細胞）をエフェクターとして、かつ、神経芽細胞腫ＬＡＮ−１細胞を標的として用いて、抗ＧＤ２  ＩｇＧ１抗体をＡＤＣＣアッセイで比較した（データ不図示）。これらの抗体のＡＤＣＣ効力は、（３Ｆ８のＥＣ５０）／（ＭｏＡｂのＥＣ５０）比率として計算した。親のｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＩｇＧに対して、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ及びｈｕ  ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈは、ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣでは〜２０倍強く、ＮＫ９２−ＣＤ１６−ＡＤＣＣでは７倍強かった（表６を参照）。表６は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧを用いたＡＤＣＣアッセイの概要を示す。
【表６】
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【０３２５】
ヒト血清をエフェクターとして、かつ、ＬＡＮ−１細胞を標的として用いて、同じ抗体を、ＣＭＣを誘導する能力について試験した（表７、データ不図示）。ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈは、ＣＭＣの増強は少しであったが、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈは、親のｈｕ３Ｆ８  Ｖ１と比較的同じ量のＣＭＣを示した。補体活性化は、抗ＧＤ２免疫療法に関連する疼痛の副作用を媒介すると考えられるため、補体活性化は、比較的低いことが望ましい。表７は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＩｇＧによるＣＭＣアッセイの概要を示す。
【表７】
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【０３２６】
実施例６
正常組織及び腫瘍上の免疫組織化学
ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１、ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ、及びｈｕ３Ｆ８  ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２ＨのＳｃＦｖバージョンを、ヒト神経芽細胞腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍及び正常ヒト組織上のＩＨＣによる組織特異性について試験した（図１を参照）。１２個の正常組織も試験した（表８を参照）。ＧＤ２は神経組織上に存在することが知られているため、前頭葉、橋、小脳、及び脊髄は全て、両方の親和性成熟クローン（ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ及びｈｕ３Ｆ８  ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）では陽性に染色されたが、親のクローン（ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１）では予想通り陽性に染色されなかった。異なる腫瘍試料のＩＨＣを見ると、親和性成熟クローン（ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ、及びｈｕ３Ｆ８  ＬＣ：Ｅ１Ｋ＋ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）は、親抗体（ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１）に対して、ＧＤ２陽性腫瘍の染色レベルが高かった。表８は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ｓｃＦｖ組織染色の強度を示す。
【表８】
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【０３２７】
実施例７
ＧＤ２ビオチン化
小規模な反応において、２５μｌの水中で１００μｇのＧＤ２−アジドと５０μｇのＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）とを穏やかに回転させながら４℃で一晩反応させた。次の日に、３０μｇのアジド−ＰＥＧ−アジド（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）を追加することで過剰なＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチンを不活性化させて、室温で１時間インキュベートした。生成物を希釈して、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させて、−８０℃で保存した。
【０３２８】
ＦＡＣＳ分析
Ｈｕ３Ｆ８  ｓｃＦｖを提示する酵母細胞を成長させ、ＦＡＣＳ分析用として誘導した。酵母細胞（１×１０６）をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ緩衝剤中でマウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体の１：１００希釈物である２μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＤ２−アジド−ＰＥＧ４−ビオチンもしくはＧＤ２−ビオチンで氷上にて３０分間インキュベートした。１回洗浄後、細胞を、ヤギ抗マウス抗体にコンジュゲートしたＲ−フィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）の１：５０希釈物で氷上にて３０分間インキュベートした後、再び洗浄し、０．５ｍｌ  ＰＢＳＡ緩衝剤中で再懸濁させた。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦＡＣＳを用いて、分析を行った。
【０３２９】
結果
細胞表面上でｃｍｙｃタグ付きのＨｕ３Ｆ８  ｓｃＦｖを提示した酵母細胞を用いて、ＰＥＧスペーサーを持つまたは持たないＧＤ２ビオチンコンジュゲートに結合させた。フローサイトメトリー分析では、Ｈｕ３Ｆ８  ｓｃＦｖの発現及びＧＤ２結合は、それぞれ、Ｘ軸及びＹ軸として検出した。スペーサーを持たないＧＤ２と比較することで、フローサイトメトリー分析におけるＧＤ２観察にＰＥＧ４スペーサーの存在が必要であることが分かった（データ不図示）。ビオチン−ＰＥＧ−ＧＤ２化学的構造については図２を参照されたい。
【０３３０】
実施例８
表面プラズモン共鳴によるＭｏＡｂ解離速度の測定
親和性を増強させる突然変異を持つｈｕ３Ｆ８  ＩｇＧの解離速度は、高密度ＧＤ２モデルを用いて、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００）により測定した。
【０３３１】
要するに、疎水性相互作用を介してＣＭ５センサーチップの上にガングリオシドを直接固定化した。参照表面をＧＭ１で固定化した。活性表面を純粋ＧＤ２で固定化した。ＧＤ２（５０μｇ／ｍＬ）を１５μｌ／分の流量で２０分かけて注入した（３００μｌ）。安定なベースラインが得られるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＨで広範囲にわたる洗浄を行った（典型的には、５μｌ／分の流量で２０μｌの５回洗浄）。結果を表９及び図３に示す。
【表９】
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【０３３２】
表９及び図３に示すように、ｈｕ３Ｆ８二重突然変異体（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ  ＨＣ：Ｇ５４Ｉ及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）は、解離速度が最も遅いことが実証されており、解離速度は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１よりも３．６〜６．４倍遅かった。単一突然変異体（ｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）及び三重突然変異体（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ  ＨＣ：Ｇ５４Ｉ）は、それぞれ、２．７倍及び２．１倍遅いことが実証された。
【０３３３】
追加の腫瘍細胞株によるＡＤＣＣにおける抗体効力
ＮＫ９２−ＣＤ１６（ＣＤ１６陽性培養ＮＫ細胞）をエフェクターとして、かつ、神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２もしくは黒色腫Ｍ１４のいずれかを標的として用いて、抗ＧＤ２  ＩｇＧ１抗体をＡＤＣＣアッセイで比較した（上記のように）。ＡＤＣＣ効力は、ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＥＣ５０／抗体ＥＣ５０の比率として計算した。結果を表１０に示す。
【表１０】
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【０３３４】
これらの結果から、親のｈｕ３Ｆ８  Ｖ１  ＩｇＧに対して、二重突然変異体（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ  ＨＣ：Ｇ５４Ｉ及びｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ）は、ＩＭＲ−３２細胞のＡＤＣＣを１００〜１４０倍に増加し、Ｍ１４細胞のＡＤＣＣを２２〜２５倍に増加することが実証されたこと示す。単一突然変異体（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ）は、ＩＭＲ−３２細胞のＡＤＣＣを２５倍に増加し、Ｍ１４細胞のＡＤＣＣを５倍に増加することが実証された。三重突然変異体（ｈｕ３Ｆ８Ｖ１  ＬＣ：Ｅ１Ｋ  ＬＣ：Ｄ３２Ｈ  ＨＣ：Ｇ５４Ｉ）は、ＩＭＲ−３２細胞のＡＤＣＣを１５．６倍に増加し、Ｍ１４細胞のＡＤＣＣを３．６倍に増加することが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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