(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス外毒素A(Pseudomonas exotoxin A、PE)のアミノ酸配列を含むPEであって、ここで配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸R456が、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンで置換されており、ここで、該PEが、細胞傷害活性を有し、且つ、該PEが、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基R456が置換されていないPEと比較して、低下した免疫原性を有し、ここで、該PEが、任意に以下を有する、前記シュードモナス外毒素A:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、該1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、K590、Q592及びL597の1又は複数の位置における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンでの置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、該1又は複数のT細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-480、482-519、R551、L552、T554、I555、L556、及びW558の1又は複数の位置における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンでの置換である、置換、
(iii)配列番号:1により定義される残基1-273及び残基285-394の1又は複数の連続するアミノ酸残基の欠失、
(iv)アミノ酸残基F443のアラニンでの置換、L477のヒスチジンでの置換、R494のアラニンでの置換、およびL552のグルタミン酸又はアスパラギンでの置換の1又は複数の更なる置換、又は、
(v)(i)から(iv)のいずれか1つ、2つ、3つ、又は4つの組み合わせ。
【請求項２】
以下の式の配列を含む、単離された変異シュードモナス外毒素A(PE):
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、ここで、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸R456がアラニン、グリシン、セリン又はグルタミンで置換されており、ここで、該PEが、細胞傷害活性を有し、且つ、該PEが、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基R456が置換されていないPEと比較して、低下した免疫原性を有し、ここで、該PEが任意に以下を有する:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、該1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、K590、Q592及びL597の1又は複数の位置における、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンでの置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、該1又は複数のT細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-480、482-519、R551、L552、T554、I555、L556、及びW558の1又は複数の位置における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンでの置換である、置換、
(iii)アミノ酸残基F443のアラニンでの置換、L477のヒスチジンでの置換、R494のアラニンでの置換、およびL552グルタミン酸又はアスパラギンでの置換の1又は複数の更なる置換、又は、
(iv)(i)−(iii)のいずれか1つ、2つ、又は3つの組み合わせ。
【請求項３】
さらに前記FCSが、式P4-P3-P2-P1によって表され、ここで、P4はアミノ末端のアミノ酸残基であり、P1はカルボキシル末端のアミノ酸残基であり、P1はアルギニン又はリジン残基であり、当該配列はP1のカルボキシル末端でフューリンにより切断可能である、請求項2記載の変異PE。
【請求項４】
さらに前記FCSが、(i)P6-P5によって表されるアミノ酸残基をアミノ末端にさらに含み、(ii)P1’-P2’によって表されるアミノ酸残基をカルボキシル末端にさらに含み、(iii)ここで、P1がアルギニン又はリジン残基であり、P2’がトリプトファンであり、かつP4がアルギニン、バリン又はリジンである場合、P4がアルギニンでないという条件で、P6及びP2は塩基性残基であり、及び(iv)当該配列がP1のカルボキシル末端でフューリンにより切断可能である、請求項3記載の変異PE。
【請求項５】
さらに前記PE機能性ドメインIIIが、配列番号:1の残基395-613の配列からなる、請求項2〜4のいずれか一項記載の変異PEであって、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基R456が、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンで置換されている、変異PE。
【請求項６】
前記変異PEが、FCS及びPEドメインIIIの間に配列番号:1の残基365-394の1又は複数の連続する残基を含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項７】
R1及びR2についてnが1である、請求項2〜6のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項８】
前記FCSが配列番号:8である、請求項2〜7のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項９】
R1=配列番号:282のアミノ酸配列のリンカーであり、R2=配列番号:284のアミノ酸配列のリンカーであり、及び、前記FCS=配列番号:8である、請求項2〜8のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項１０】
R3についてnが0である、請求項2〜9のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項１１】
PE機能的ドメインIIIが配列番号:37のアミノ酸配列を含む、請求項2〜10のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項１２】
R1n-FCS-R2n=配列番号:36である、請求項2〜11のいずれか一項記載の変異PE。
【請求項１３】
前記PEが、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及び、アミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換を有し、前記PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が以下である、請求項1〜12のいずれか一項記載のPE:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換; 
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【請求項１４】
前記PEが、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換を有し、前記PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が以下である、請求項1〜12のいずれか一項記載のPE:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換; 
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【請求項１５】
前記PEが、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及び、アミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換を有し、前記PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が以下である、請求項1〜12のいずれか一項記載のPE:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【請求項１６】
配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数が独立に置換されている、請求項2記載の変異PE。
【請求項１７】
前記PEが、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換、アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換、アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換を有する、請求項16記載の変異PE。
【請求項１８】
(b)請求項1〜17のいずれか一項記載のPEに結合又は融合された(a)標的指向化部分を含む、キメラ分子。
【請求項１９】
前記標的指向化部分が、モノクローナル抗体又は該モノクローナル抗体の抗原結合部分である、請求項18記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体又は前記モノクローナル抗体の抗原結合部分が、以下からなる群から選択される細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項19記載のキメラ分子:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD79b、トランスフェリンレセプター、上皮成長因子(EGF)レセプター、メソテリン、カドヘリン、ルイスY、グリピカン-3、FAP(繊維芽細胞活性化タンパク質α)、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、CA9 = CAIX(炭酸脱水酵素IX)、L1CAM(神経細胞接着分子L1)、エンドシアリン、HER3(上皮成長因子レセプターファミリーメンバー3の活性化形態)、Alkl/BMP9複合体(未分化リンパ腫キナーゼ1/骨形成タンパク質9)、TPBG = 5T4(栄養芽層糖タンパク質)、CD33(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン3、骨髄系細胞表面抗原)、CD123(インターロイキン3レセプターα)、MUC1(腫瘍関連上皮性ムチン)、ROR1(レセプターチロシンキナーゼ様表面抗原)、HER1(上皮成長因子レセプターの活性化形態)、及びCLL1(C型レクチンドメインファミリー12、メンバーA)。
【請求項２１】
前記標的指向化部分が、B3、RFB4、SS、SS1、MN、MB、HN1、HN2、HB21、MORAb-009、それらの抗原結合部分及びHA22の抗原結合部分からなる群から選択される、請求項18記載のキメラ分子。
【請求項２２】
標的指向化部分が、ヒト化SS1又は該ヒト化SS1の抗原結合部分である、請求項18記載のキメラ分子。
【請求項２３】
前記標的指向化部分が以下を含む、請求項18記載のキメラ分子:
(a)配列番号:31及び34;
(b)配列番号:45及び46;
(c)配列番号:61及び62;
(d)配列番号:77及び78;
(e)配列番号:93及び94;
(f)配列番号:109及び110;
(g)配列番号:125及び126;
(h)配列番号:141及び142;
(i)配列番号:157及び158;
(j)配列番号:173及び174;
(k)配列番号:49、50、53、54、57及び58;
(l)配列番号:65、66、69、70、73及び74;
(m)配列番号:81、82、85、86、89及び90;
(n)配列番号:97、98、101、102、105及び106;
(o)配列番号:113、114、117、118、121及び122;
(p)配列番号:129、130、133、134、137及び138;
(q)配列番号:145、146、149、150、153及び154;
(r)配列番号:161、162、165、166、169及び170;
(s)配列番号:177、178、181、182、185及び186;
(t)配列番号:31-32及び34-36;
(u)配列番号:33及び38;又は、
(v)配列番号:93及び290。
【請求項２４】
前記キメラ分子が、配列番号:36を含むリンカーを含む、請求項18〜23のいずれか一項記載のキメラ分子。
【請求項２５】
以下を含む、請求項18〜23のいずれか一項記載のキメラ分子:
(a)配列番号:39及び40;
(b)配列番号:41及び42;
(c)配列番号:43及び44;
(d)配列番号:291及び293;
(e)配列番号:291及び294;
(f)配列番号:292及び294;
(g)配列番号:295及び297;又は
(h)配列番号:296及び297。
【請求項２６】
請求項1〜17のいずれか一項記載のPE又は請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２７】
請求項26記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項２８】
請求項27記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項28記載の宿主細胞の少なくとも1つを含む、細胞集団。
【請求項３０】
(a)請求項1〜17のいずれか一項記載のPE、請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子、請求項26記載の核酸、請求項27記載の組換え発現ベクター、請求項28記載の宿主細胞又は請求項29記載の細胞集団、及び（b）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項1〜17のいずれか一項記載のPE、請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子、請求項26記載の核酸、請求項27記載の組換え発現ベクター、請求項28記載の宿主細胞、請求項29記載の細胞集団又は請求項30記載の薬学的組成物を含む、哺乳動物における癌を治療又は予防するための組成物。
【請求項３２】
請求項1〜17のいずれか一項記載のPE、請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子、請求項26記載の核酸、請求項27記載の組換え発現ベクター、請求項28記載の宿主細胞、請求項29記載の細胞集団又は請求項30記載の薬学的組成物を含む、標的細胞の成長を阻害するための組成物。
【請求項３３】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
標的細胞が、以下からなる群から選択される細胞表面マーカーを発現する、請求項32記載の組成物:CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD79b、トランスフェリンレセプター、EGFレセプター、メソテリン、カドヘリン、ルイスY、グリピカン-3、FAP(繊維芽細胞活性化タンパク質α)、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、CA9 = CAIX(炭酸脱水酵素IX)、L1CAM(神経細胞接着分子L1)、エンドシアリン、HER3(上皮成長因子レセプターファミリーメンバー3の活性化形態)、Alkl/BMP9複合体(未分化リンパ腫キナーゼ1/骨形成タンパク質9)、TPBG = 5T4(栄養芽層糖タンパク質)、CD33(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン3、骨髄系細胞表面抗原)、CD123(インターロイキン3レセプターα)、MUC1(腫瘍関連上皮性ムチン)、ROR1(レセプターチロシンキナーゼ様表面抗原)、HER1(上皮成長因子レセプターの活性化形態)、及びCLL1(C型レクチンドメインファミリー12、メンバーA)。
【請求項３５】
(a)前記PEを組換え発現させる工程、及び(b)前記PEを精製する工程を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載のPEを製造する方法。
【請求項３６】
(a)前記キメラ分子を組換え発現させる工程、及び(b)前記キメラ分子を精製する工程を含む、請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子を製造する方法。
【請求項３７】
(a)請求項1〜17のいずれか一項記載のPEを組換え的に発現させる工程、(b)前記PEを精製する工程、及び(c)該精製されたPEに対して標的指向化部分を共有結合させる工程を含む、請求項18〜25のいずれか一項記載のキメラ分子を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
本特許出願は、2013年10月6日に出願された米国仮出願番号:61/887,418号、2013年11月25日に出願された米国仮出願番号:61/908,464号、2014年4月21日に出願された米国仮出願番号:61/982,051号及び2014年9月19日に出願された米国仮出願番号:62/052,665号の優先権の利益を主張するものであり、これらそれぞれの全ての内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
[電子的に提出する物件の参照による組み込み]
本明細書と同時に提出され、2014年10月1日付の、ファイル名を「718581_ST25.txt」とする144,505バイトのASCII（テキスト）ファイルとして同定されるコンピュータ可読性の核酸/アミノ酸配列表は、その全ての内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
シュードモナス外毒素A(PE)は、例えば癌細胞などの有害な細胞を破壊又はその成長を阻害するのに有用であり得る細胞毒性を有する細菌性毒素である。従って、PEは、例えば癌などの疾患を治療又は予防するのに有用であり得る。しかしながら、PEは、極めて免疫原性であり得る。そのため、PEを投与しても、例えば、PEの細胞毒性を中和する抗PE抗体及び／又はT細胞の産生といった抗PE免疫応答を刺激してしまう。そのような免疫原性のため、患者へ投与できるPEの量を減少させることとなり、これにより例えば癌などの疾患を治療するためのPEの効能が低減されてしまう。従って、改良されたPEが必要である。
【０００４】
いくつかの脱免疫化シュードモナス外毒素（PE）が当技術分野において周知である。ドメインII欠失型（例えば、PE24）は、比較的免疫原性が小さく、ドメインIIを有するPE38と比較して、（例えば、毛細血管漏出症候群や肝毒性といった）副作用が低減され得る。特定の理論に拘束されるものではないが、PE24が比較的免疫原性が低減しており、副作用が少ないのは、少なくとも部分的には、PE24のサイズが減少し、血清半減期が短くなる不利が生じていることに起因していると考えられている。様々なフューリン切断性リンカーがPE24バリアントにおいて利用され得る。PE免疫複合体は、多くの場合、標的指向化部分としてdsFvフラグメントが用いられてきた。そのような脱免疫化されたシュードモナス外毒素（PE）は、例えば、国際特許出願公開公報WO2005/052006、WO2007/016150、WO2007/014743、WO2007/031741、WO2009/32954、WO2011/32022、WO2012/154530、及びWO2012/170617に記載されている。
【０００５】
従前の免疫毒素は多数の不利を有している。例えば、従前の免疫毒素の脱免疫化は、免疫反応が依然として生じたことから、ヒトB細胞エピトープに関して不完全であった。加えて、従前の免疫毒素の脱免疫化は、細胞毒性作用強度の低減を伴うものであった。例えば、WO2012/170617に開示されるLO10脱免疫化PEバリアントは、野生型（WT）PEや他のPEバリアントに比較して、少なくとも40%の作用強度の減損を呈した。国際特許出願公開公報WO2013/040141には、低減されたB細胞エピトープを有するシュードモナス外毒素が開示されている。開示されるPEバリアントLRO10では、全てのB細胞エピトープが除去された。これはしかし、腫瘍細胞に対する細胞毒性の低減をももたらした。
【０００６】
加えて、ドメインII欠失型のPE(PE24)とdsFvの融合は、その全体サイズの低減により、PE38とのdsFv融合体と比較して短い血清半減期を有する。従前の免疫毒素のリンカーもT細胞エピトープを含有し、かつ、例えば37℃での安定性に欠けるなど開発性に乏しいものであった。加えて、従前の抗メソテリン（MSLN）免疫毒素は、免疫原性の更なる原因ともなり得るマウス由来のdsFvフラグメントをPEへの融合に用いるのみであった。国際特許出願公開公報WO2012/154530は、腫瘍細胞に対する細胞毒性を改良した、短いフレキシブルリンカーを有するシュードモナス外毒素バリアントのキメラ分子に言及している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、脱免疫化されたシュードモナス外毒素及びそのFab融合体（例えば、ヒト化抗MSLN）、癌の治療方法、安定化された薬学的製剤、副作用を低減する方法、及び血清半減期を延長し、治療スケジュールを最適化する方法に関する。
【０００８】
本発明の一態様は、シュードモナス外毒素(PE)のアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Aであって、ここで配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立に置換されており、ここで、前記PEが、任意に以下を有する、シュードモナス外毒素Aを提供する:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、前記1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、Q592及びL597の1又は複数の置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換、
(iii)配列番号:1により定義される残基1-273及び残基285-394の1又は複数の連続するアミノ酸残基の欠失、又は、
(iv)(i)から(iii)のいずれか1つ、2つ、又は3つの組み合わせ。
【０００９】
本発明の別態様は、以下の式の配列を含む、単離された変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、
ここで、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立に置換されており、ここで、前記PEは任意に以下を有する:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、前記1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸残基のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、Q592及びL597の1又は複数の置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
【００１０】
本発明の別態様は、以下の式の配列を含む、単離された、変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365〜394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395〜613であり、ここで、前記PEが配列番号:1の参照により定義される位置458でアルギニンを含み、及び、
ここで、前記PEが、以下を有する:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【００１１】
本発明の追加的な態様は、関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び薬学的組成物並びに関連するキメラ分子を提供する。
【００１２】
さらに本発明の別態様は、哺乳動物における癌を治療又は予防するのに有効な量において本発明のPE、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における癌を治療又は予防するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の別態様は、標的細胞の成長を阻害するのに有効な量において、本発明のPE、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は薬学的組成物を前記細胞と接触させる工程を含む、標的細胞の成長を阻害する方法を提供する。
【００１４】
本発明の追加的な態様は、本発明のPEを製造する方法及び本発明のキメラ分子を製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1A及び1Bは、未処理のドナー(n=50)(A)及び予め処理された患者(n=16)(B)に対する、最も強い反応(>20%、黒い四角形)、中程度の反応(10-20%、暗灰色の四角形)、弱い反応(3%-10%、明灰色の四角形)及び陰性(反応なし;<3%、白い四角形)を示すT細胞エピトープヒートマップである。反応は、各ドナーの反応スポットの割合として示される。反応は、プールの反応性に基づき自動選別を用いてクラスタ化した。
【図２】図2A-2Dは、10x106細胞ごとにスポットを形成する細胞(SFC)によって測定した、HA22（斜線のバー）又はLR-R494A（斜線なしのバー）で刺激した後の3人のドナー試料(A-C)及び1人のHCL患者試料(D)の、22のペプチドプールの一つ、対照プール(CEFT)、又はペプチドなしに対する反応を示したグラフである。＊は、HA22及びLR-R494Aの間で統計学的に有意であることを示す(p<0.01)。
【図３】図3A-3Cは、10x106細胞ごとにSFCによって測定した、HA22（斜線のバー）又はLR-R505A（斜線なしのバー）で刺激した後の2人のドナー試料(A-B)及び1人のHCL患者試料(C)の、22のペプチドプールの一つ、CEFT、又はペプチドなしに対する反応を示したグラフである。＊は、統計学的に有意であることを示す(p<0.01)。
【図４】図4A-4Bは、10x106細胞ごとにSFCによって測定した、HA22（斜線のバー）又はLR-R551A（斜線なしのバー）で刺激した後の2人のドナー試料(A-B)の、22のペプチドプールの一つ、CEFT、又はペプチドなしに対する反応を示したグラフである。＊は、スチューデントT検定において統計学的に有意であることを示す(p<0.01)。
【図５】図5A-5Dは、組換え免疫毒素(RIT)で刺激し、かつ、野生型(WT)アミノ酸配列を有する（黒いバー）、L552Nを有する(暗灰色のバー）若しくはL552Eを有するペプチド93若しくは94(斜線なしのバー）のいずれかで再刺激後、又はペプチドなしでの処理(明灰色のバー)後の、2人のドナーの試料(C-D)及び2人の中皮腫患者の試料(A-B)の反応を示したグラフである。＊は、スチューデントT検定において統計学的に有意であることを示す(p<0.05)。
【図６】図6A-6Cは、10x106細胞ごとにSFCによって測定した、HA22-LR(WT)(斜線のバー)又はLR-R427A(斜線なしのバー)のいずれかで刺激し、かつ、適切なペプチドで再刺激した後の3人のドナー試料の、22のペプチドプールに対する反応を示したグラフである。＊は、統計学的に有意であることを示す(p<0.05)。
【図７】図7A-7Cは、10x106細胞ごとにSFCによって測定した、HA22-LR(WT)(斜線のバー)又はLR-F443A(斜線なしのバー)のいずれかで刺激し、かつ、適切なペプチドで再刺激した後の2人の患者試料(A-B)及び1人のドナー試料(C)の、プール8-22の一つに対する反応を示したグラフである。＊は、統計学的に有意であることを示す(p<0.05)。
【図８】図8は、さまざまな温度での、HA22-LR-GGS(円)、HA22(縦線)、又はHA22-LR-T18(三角形)のEC50における倍差(fold change)を示すグラフである。
【図９】図9A-9Dは、10x106細胞ごとにSFCによって測定した、RITで刺激し、及び、ペプチドなし、WTのペプチド67、又は位置471をバリン又はアラニンで置換したペプチド67を用いて再刺激した後の4人のドナー試料の反応を示すグラフである。
【図１０】図10A-10Eは、位置477にアラニン変異を含む（白いバー）、又は位置477にヒスチジン変異を含む（灰色のバー）、又は変異を含まない（WT）（黒いバー）ペプチド67又はペプチド68を用いて刺激した後の、3人のドナー試料(A-C)、HCL患者試料(D)、及び中皮腫患者試料(E)の反応を示すグラフである。
【図１１】図11A及び11Bは、RITで刺激し、かつ、ペプチドなし、WTアミノ酸配列を有するペプチド93、94若しくは95(斜線のバー)、又はL556Vを有するペプチド93、94又は95(斜線なしのバー)のいずれかで再刺激した後の中皮腫患者(A)及び有毛細胞白血病(HCL)患者(B)由来の試料の反応を示すグラフである。
【図１２】図12は、33℃でインキュベーションした後、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって測定された、HMW cFP-0170(Fab-LO10R-456A ショートリンカー;斜線のバー）又はHMW cFP-0171(Fab-LO10R-456A 伸長されたリンカー；水平の斜線)の凝集（％ 面積）を示すグラフである。
【図１３】図13は、33℃でインキュベーションした後、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって測定された、HMW cFP-0170(Fab-LO10R-456A ショートリンカー;菱形)又はHMW cFP-0171(Fab-LO10R-456A 伸長されたリンカー;四角形)の凝集（%、面積）を示すグラフである。
【図１４】図14は、25℃から50℃の範囲におけるさまざまな温度で、動的光散乱(DLS)により測定したcFP-0166(Fab-LO10Rショートリンカー;菱形)又はcFP-0174(Fab-LO10R 伸長されたリンカー;円)の凝集（半径(nm)）を示すグラフである。
【図１５】図15は、25℃から50℃の範囲におけるさまざまな温度で、DLSにより測定したcFP-0170(Fab-LO10R-456A ショートリンカー;菱形)又はcFP-0171(Fab-LO10R-456A 伸長されたリンカー;円)の凝集（半径(nm)）を示すグラフである。
【図１６】図16は、25℃から50℃の範囲におけるさまざまな温度で、DLSにより測定したcFP-0172(Fab-LO10R-456A-551A ショートリンカー；菱形)又はcFP-0173(Fab-LO10R-456A-551A 伸長されたリンカー;円)の凝集（半径(nm)）を示すグラフである。
【図１７】図17は、450 nmの光学濃度で測定した患者の血清クローン9H3の、(107)若しくは(108)ファージ/ウェル又はhuSS1Fab-PE24LRO10(458A変異を有する) (左上がりの斜線のバー)、huSS1Fab-PE24LRO10R(458R復帰突然変異を有する) (水平の斜線のバー)、若しくはhuSS1Fab-PE24LRO10R-456A(458R復帰突然変異及び456A変異を有する) (右上がりの斜線のバー)とともにインキュベートされた抗原プレインキュベーションを有する(107)若しくは(108)ファージ/ウェルに対する反応を示すグラフである。
【図１８】図18A及び18Bは、20人の患者の血清に関して、キメラ分子SS1P(T1)、SS1-dsFv-LR-LO10R(T2)、SS1-dsFv-LR-LO10R456A(T3)、SS1-FABLO10R(Roche116、T4)、SS1-FABLO10R456Aロングリンカー(Roche171、T5)及びSS1-FABLO10Rロングリンカー(Roche174、T6)の抗原性を示すグラフである。2つの典型的な例(A及びB)が示される。Y軸は、相対的なIC50(%)である。
【図１９】図19は、ある期間(時間(h))にわたってマウスに投与されたキメラ分子SS1P38 (0.4 mg/kg（菱形）、SS1P38 (0.2 mg/kg（四角形））、Fab-PE24 (0.231 mg/kg（三角形））、(dsFv-PE24 (0.16 mg/kg (x))の血漿濃度(ng/ml)を示すグラフである。
【図２０】図20は、経時的に(時間)、カニクイザルにおける、0.3 mg/kg cFP_0205(四角形)、0.3 mg/kg SS1P（円）、又は0.3 mg/kg cFP_0205（破線)の血清半減期cFP(ng/ml)を示すグラフである。
【図２１】図21は、経時的に（細胞の播種後の日数）、対照（ビヒクル;円); cFP 0205 3 mg/kg i.v. 3q7d（実線上の四角形）;cFP 0205 2 mg/kg i.v. 3q7d(より広い破線上の四角形);cFP 0205 1 mg/kg i.v. 3q7d（狭い破線上の四角形）;cFP 0205 0.5 mg/kg i.v. 3q7d（点線上の四角形）で処理したマウスの体重変化を示すグラフである。
【図２２】図22A-Fは、10倍(A、C、E)又は40倍(B、D、F)拡大された、標識されたcFP0205で処理されたマウスの肺(A-B)、脾臓(C-D)又は肝臓(E-F)の薄片の蛍光イメージである。図22G-Lは、10倍（G、I、K）又は40倍（H、J、L）拡大された、標識されたSS1Pで処理されたマウスの肺(G-H)、脾臓(I-J)又は肝臓(K-L)の切片の蛍光イメージである。
【図２３】図23は、経時的に日単位で測定した、未治療（白い菱形）又はパクリタキセル単独（灰色の菱形）、RG7787(R205又はcFP0205としても言及される)単独（黒い菱形）、若しくはRG7787及びパクリタキセルの組み合わせ（黒及び白の菱形）で治療したマウスの腫瘍サイズを示すグラフである。
【図２４】図24は、経時的に日単位で測定した、未処理（ビヒクル）（円）又はRG7787（四角形）で治療したマウスの腫瘍サイズを示すグラフである。各データポイントは、RG7787で治療されたn=9の動物とn=8の対照動物の平均腫瘍体積の平均値を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２５】図25は、経時的に日単位で測定した、ビヒクル（対照）（円）、RG7787単独（四角形）、パクリタキセル単独（三角形）又はRG7787とパクリタキセルの組合せ（菱形）で治療したマウスの腫瘍サイズを示すグラフである。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２６】図26は、経時的に日単位で測定した、未治療(UT)（×）マウス、又はR205単独（菱形）、R205及びタキソールの組合せ（四角形）若しくはタキソール単独（三角形）で治療したマウスの腫瘍サイズを示すグラフである。
【図２７】図27Aは、さまざまな濃度のT18又はMP RIT(ng/ml)で処理したCD22発現細胞株の細胞生存率(%)を示すグラフである。図27Bは、さまざまな温度（℃）の一つへと加熱されたT18又はMP RITの相対的な細胞毒性（％）を示すグラフである。図27C-Dは、有毛細胞白血病(HCL)(C)又は慢性リンパ球性白血病(CLL)(D)患者由来の細胞に対するMP又はT18 RITの細胞毒性(IC50(ng/ml))を示すグラフである。図27Eは、5 mg／kgのLMB-T18の4回の投与後（四角形）、7.5 mg/kgのLMB-T18の3回の投与後（三角形）又はPBS-0.2%ヒト血清アルブミン投与後（円）の、異種移植マウスモデルにおける腫瘍サイズへのLMB-T18の効果を示すグラフである。矢印は、全ての用量群に対して投与日を表す。破線の矢印は、5 mg/ml群の追加投与を示す。（＊）一元配置分散分析におけるP>0.01。エラーバーはSDを示す。図27Fは、MPに対する中和抗体を有する患者由来の血清に対するMP、HA22-LR及びLMB-T18の%結合を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
シュードモナス外毒素A（「PA」）は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa）によって分泌される細菌性毒素(分子量66kD）である。天然の野生型PE配列（配列番号:1）は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,602,095号に記載されている。天然の野生型PEは細胞毒性をもたらす3つの構造ドメインを含む。ドメインIa(アミノ酸1-252)は、細胞結合を仲介し、ドメインII(アミノ酸253-364)は、サイトゾルへの移行を仲介し、ドメインIII(アミノ酸400-613)は、伸長因子2のADPリボシル化を仲介する。PEのドメインIIIの構造的境界は、残基400から開始されると考えられるが、ドメインIIIがADPリボシル化活性を保持するためにはドメインIbのセグメントが必要とされ得ると考えられる。従って、機能的ドメインIIIはPEの残基395-613と定義される。ドメインIb(アミノ酸365-399)の機能は不明である。特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、PEの細胞毒性は、例えば、伸長因子2(EF-2)のADPリボシル化の不活性化といった真核生物細胞におけるタンパク質合成の阻害を通して生じるものと考えられている。
【００１７】
PEの置換体は、本明細書において、PEのアミノ酸配列を参照して定義される。従って、PEの置換体は、本明細書において、特定の位置に存在するアミノ酸残基を参照することにより説明され、議論される特定の置換体において当該残基がそれによって置換されたアミノ酸によって説明される。この点において、PEの特定の態様のアミノ酸配列の位置は、本明細書において、当該特定の態様のアミノ酸配列の位置又は配列番号:1によって定義される位置として言及される。位置は、配列番号:1によって定義されるが、その結果、PEの特定の態様のアミノ酸配列の実際の位置は、配列番号:1の対応する位置に応じて定義され、配列番号:1の残基位置数とは異なる残基位置数を表すことがある。このように、例えば、置換体は、個々のアミノ酸配列における実際の位置が異なり得るとの理解のもとで、配列番号:1の613アミノ酸配列の指示された位置に対応する、PEの特定の態様のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の置換を指す。例えば、位置が、配列番号:1によって定義される場合、用語「R490」は、配列番号:1の位置490に本来存在するアルギニンを指し、「R490A」は、配列番号:1の位置490に本来存在するアルギニンがアラニンで置換されていることを示し、「K590Q」は、配列番号:1の位置590に本来存在するリジンがグルタミンにより置換されていることを示す。2又はそれ以上の位置での複数の置換の場合においては、2又はそれ以上の置換は同一又は異なってよく、すなわち、置換される2又はそれ以上のアミノ酸残基の各アミノ酸残基は、他に明示的に示されない限り、同一又は異なったアミノ酸残基で置換され得る。
【００１８】
本明細書において用いられる用語「シュードモナス外毒素」及び「PE」は、天然のタンパク質から免疫原性を減少または除外するために改変されたPEを含む。そのような改変は、ドメインIaの除外、ドメインIb、II及びIIIにおけるさまざまなアミノ酸の欠失、1アミノ酸置換及びカルボキシル末端へのDELやREDL(配列番号:7)などの1又は複数の配列の追加が含まれ得るが、これらに限定されない。Siegall et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989)を参照されたい。そのような改変されたPEは、本明細書に記載される1又は複数のT細胞及び／又はB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基に対しての本発明のいずれかの置換を含むよう、さらに改変されてもよい。ある態様において、改変されたPEは、天然の野生型PEの細胞毒性フラグメントであってもよい。PEの細胞毒性フラグメントは、（例えば、プロテイン又はプレプロテイン(pre-protein)として）標的細胞におけるその後のタンパク質分解プロセシング又は他のプロセシングに対して細胞毒性を有する、又は有さないものを含んでもよい。好ましい態様において、PEの細胞毒性フラグメントは天然のPEの細胞毒性の少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約40%、さらに好ましくは少なくとも約50%、よりさらに好ましくは少なくとも約75%、さらに好ましくは少なくとも約90%、及び、なおさらに好ましくは少なくとも約95%を保持する。特に好ましい態様において、細胞毒性フラグメントは、少なくとも天然のPEの細胞毒性を有し、好ましくは、天然のPEと比較してさらに高い細胞毒性を有する。
【００１９】
免疫原性を減少または除外した改変されたPEは、例えば、PE4E、PE40、PE38、PE25、PE38QQR、PE38KDEL、およびPE35を含む。一態様において、PEは、PE4E、PE40、PE38、PE25、PE38QQR(PE38がC末端に追加配列QQRを有する）、PE38KDEL(PE38がC末端に追加配列KDEL（配列番号:5）を有する)、PE-LR(リソソーム分解に耐性)(PE24とも称される)、PE24-LO10、及びPE35のいずれかであってよい。
【００２０】
ある態様において、PEは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許4,892,827号に記載されるように、ドメインIaを欠失することによって免疫原性を減少させるように改変されている。PEはまた、ドメインIaのある特定の残基を置換することによって改変されてもよい。ある態様において、PEは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,512,658号に記載されるように、ドメインIaは存在するものの、ドメインIaの位置57、246、247及び249の塩基性残基が酸性残基（例えば、グルタミン酸）へと置換された置換体PEである、PE4Eであってもよい。
【００２１】
PE40は、PEの切断型誘導体である(Pai et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 88: 3358-62(1991)及びKondo et al., Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988))。PE35は、PEの35kDのカルボキシル末端フラグメントであって、アミノ酸残基1-279が欠失されており、当該分子は位置280で、メチオニンで開始し、天然のPEのアミノ酸281-364及び381-613がその後に続いている。PE35及びPE40は、例えば、いずれもが参照により本明細書に組み入れられる米国特許5,602,095号及び4,892,827号に開示されている。PE25は、ドメインII由来の11残基のフラグメント及びドメインIIIの全てを含有する。いくつかの態様において、PEはドメインIIIのみを含有する。
【００２２】
好ましい態様において、PEはPE38である。PE38は、PEの移行ドメイン及びADPリボシル化ドメインを含有するが、細胞結合部分は含有しない(Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987))。PE38は、細胞内でのプロセシングにより細胞毒性形態へと活性化された、アミノ酸253-364及び381-613からなる切断型PEプロタンパク質である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,608,039号及びPastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6(1997)を参照されたい）。
【００２３】
別の好ましい態様において、PEはPE-LRである。PE-LRは、配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8))に対応するフューリン切断配列(FCS)以外のドメインIIの欠失及びドメインIbのアミノ酸残基365-394の欠失を含む。従って、PE-LRは、配列番号:1のアミノ酸残基274-284及び395-613を含む。PE-LRは、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願公開公報WO2009/032954に記載されている。PE-LRは、任意に、FCSと配列番号:1のアミノ酸残基395-613との間にGGS(配列番号:283）連結ペプチドを追加的に含んでもよい。
【００２４】
上述の通り、選択的又は追加的に、ドメインIbのいくつか又は全ては、架橋、又はペプチド結合によって直接的に連結された残存部分を有して、欠失されていてもよい。選択的又は追加的に、ドメインIIのアミノ部分のいくつかは欠失されていてもよい。選択的又は追加的に、C末端は天然の配列である残基609-613(REDLK)(配列番号:6)を含んでもよく、又は、KDEL(配列番号:5)又はREDL(配列番号:7)及びこれらの配列の繰り返しなどの、PEがサイトゾルへ移行する活性を維持する変種を含んでもよい。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,854,044号;第5,821,238号;及び第5,602,095号並びに国際特許出願公開公報WO1999/051643を参照されたい。免疫原性が除外又は減少しているあらゆる形態のPEは、例えば、標的細胞における移行及びEF-2リボシル化といった、標的細胞に対する細胞毒性能を維持し得る限り、本明細書に記載される1又は複数のT細胞及び/又はB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基に対しての本発明のいずれかの置換と組み合わせて用いることができる。
【００２５】
本発明の一態様は、シュードモナス外毒素(PE)のアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Aであって、ここで配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立に置換されており、ここで、前記PEが、任意に以下を有する、シュードモナス外毒素Aを提供する:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、前記1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、Q592及びL597の1又は複数の置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換、
(iii)配列番号:1により定義される残基1-273及び残基285-394の1又は複数の連続するアミノ酸残基の欠失、又は、
(iv)(i)から(iii)のいずれか1つ、2つ、又は3つの組み合わせ。
【００２６】
アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552は、PEの1又は複数のT細胞エピトープに位置していることが見いだされている。それゆえ、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、1又は複数のT細胞エピトープを有効に除去してもよい。従って、本発明のPEは、置換されていない（例えば、野生型の）PEよりも有効に免疫原性が低減されていてもよい。
【００２７】
本発明の好ましい態様は、以下の式の配列を含む、単離された変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、
ここで、配列番号:1を参照して定義されるアミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立して置換され、かつ、前記PEが任意に1又は複数のB細胞エピトープにおいてアミノ酸のさらなる置換を含む。
【００２８】
アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数のあらゆるアミノ酸残基への置換であってよい。本発明の一態様において、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、独立に、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数における、アラニン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンへの置換である。本発明の一態様において、L552の置換は、L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換であり、L477の置換は、L477におけるヒスチジンへの置換である。
【００２９】
本発明の一態様において、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及び、アミノ酸残基L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換である。
【００３０】
本明細書に記載される1又は複数のPEのT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基の置換に加えて、本発明のPEは、任意で、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基の追加的な置換も含んでもよい。この点において、本発明の一態様において、PEは、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸の置換を有する。本発明の好ましい態様において、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基の置換は、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンへの置換を含む。1又は複数のB細胞エピトープにおける置換は、有効には、1又は複数のB細胞エピトープの除去によって、免疫原性をさらに低減してもよい。置換は、あらゆる適切なPEのB細胞エピトープに位置してもよい。典型的なB細胞エピトープは、例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願公開公報WO2007/016150、WO2009/032954、及びWO2011/032022に開示されている。好ましい態様において、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸の置換は、独立に、アミノ酸残基E282、E285、P290、R313、N314、P319、D324、E327、E331、Q332、D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、Y481、R490、R505、R513、L516、E522、R538、E548、R551、R576、K590、Q592及びL597の1又は複数における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンへの置換であり、ここで、アミノ酸残基E282、E285、P290、R313、N314、P319、D324、E327、E331、Q332、D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、Y481、R490、R505、R513、L516、E522、R538、E548、R551、R576、K590、Q592及びL597は、配列番号:1を参照して定義される。
【００３１】
本発明の一態様において、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換は、独立に、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基E282、E285、P290、R313、N314、P319、D324、E327、E331、Q332、D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、K590、Q592及びL597の1又は複数における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンへの置換である。好ましくは、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換は、独立に、アミノ酸残基R427、R505及びR551の1又は複数におけるアラニン、グリシン又はセリンへの置換である。特に好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換、L477におけるヒスチジンへの置換、R494におけるアラニンへの置換及びL552におけるグルタミン酸への置換であり、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換は:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;及び(b)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換である。
【００３２】
本発明の一態様において、本明細書に記載されるいずれかのPEは、配列番号:1を参照し、位置458のアルギニンを有していてもよい。特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、位置458のアルギニンは、細胞毒性の向上をもたらすと考えられている。
【００３３】
本発明の一態様において、PEは配列番号:1の参照により定義される位置458のアルギニン残基を有する。より好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換であり、かつ、PEは位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換は:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;及び(e)アミノ酸残基R505におけるアラニンへの置換;(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。
【００３４】
本発明の一態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及び、アミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、かつ、PEが位置458にアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。
【００３５】
本発明の一態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【００３６】
本発明の別態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基R456におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及びアミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。
【００３７】
本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換、(c)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基D467に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(f)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(g)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様は、配列番号:285(T14-L010R+456A)を含むPEである。
【００３８】
本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及びアミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換、(c)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(f)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(g)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様は、配列番号:286(T15-L010R+456A)を含むPEである。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様は、配列番号:287(T14-L010R)を含むPEである。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換;アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換;アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換;及びアミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換であり、かつ、PEが位置458でアルギニン残基を有し、かつ、1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び、(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様は、配列番号:288(T15-L010R)を含むPEである。
【００４１】
好ましい態様において、FCSは、配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8))に対応するフューリン切断配列(FCS)である。
【００４２】
好ましい態様において、
R1及びR2についてn=1、
R1=配列番号:282のアミノ酸配列のリンカー(DKTHKASGG)、
R2=配列番号:284のアミノ酸配列のリンカー(GGGGGS)、及び、
FCS=配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8))に対応するフューリン切断配列(FCS)である。特に好ましい態様において、R3についてnが0である。
【００４３】
本発明の一態様において、PEは1又は複数のT細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換を有する。この点において、PEは、配列番号:1の参照により定義される、位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基における、あらゆるアミノ酸のさらなる置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本発明の一態様において、位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基におけるあらゆるアミノ酸へのさらなる置換は、位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、Y470、I471、A472、P475、A476、L477、I493、R494、N495、L498、L499、R500、V501、Y502、V503、R505、L508、P509、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の１又は複数のアミノ酸残基の置換である。
【００４４】
配列番号:1の位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基の置換は、配列番号:1の位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558のいずれか1つ又は複数のアミノ酸残基における、あらゆるアミノ酸残基への置換であってよい。配列番号:1の位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基の置換は、例えば、配列番号:1の位置421、422、423、425、427、429、439、440、443、444、446、447、450、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、551、552、554、555、556、及び558の1又は複数のアミノ酸残基における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンへの置換が含まれていてもよい。好ましい態様において、配列番号:1の位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基の置換は、R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、Y470、I471、A472、P475、A476、L477、I493、R494、N495、L498、L499、R500、V501、Y502、V503、R505、L508、P509、R551、L552、T554、I555、L556及びW558の1又は複数のアミノ酸残基における、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンへの置換である。配列番号:1の参照により定義される位置R421、L422、L423、A425、R427、L429、Y439、H440、F443、L444、A446、A447、I450、463-519、R551、L552、T554、I555、L556及びW558に位置する1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数の置換は、PEの免疫原性をさらに減少させてもよい。一態様において、当該アミノ酸配列は、位置427、467、485、490、505、513、516および551の1又は複数のアミノ酸残基の置換を有さない。
【００４５】
好ましくは、PEは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願公開公報WO2007/016150に開示される、細胞毒性を増強する1又は複数の置換を含む。この点において、本発明の一態様は、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸残基の置換を有するPEを提供し、当該配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基R490におけるバリン、ロイシン又はイソロイシンへの置換であり、ここでアミノ酸残基R490は、配列番号:1の参照により定義されるものである。本発明の一態様において、配列番号:1の参照により定義される位置313、327、331、332、431、432、505、516、538及び590の1又は複数のアミノ酸残基のアラニン又はグルタミンでの置換は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願公開公報WO2007/016150に開示される、増強された細胞毒性を有するPEを提供してもよい。増強された細胞毒性及び低減された免疫原性は同時に生じ得、これらは相互排他的ではない。R490のグリシン、又はより好ましくはアラニンへの置換といった細胞毒性を増強し免疫原性を減少させる置換は特に好ましい。
【００４６】
本発明の一態様において、本発明の別態様は、以下の式の配列を含む、単離された変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、
ここで、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立に置換されており、ここで、前記PEは任意に以下を有する:
(i)1又は複数のB細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換であって、前記1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸残基のさらなる置換が、独立に、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基D403、D406、R412、R427、E431、R432、D461、D463、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、Q592及びL597の1又は複数の置換である、置換、
(ii)1又は複数のT細胞エピトープにおける1又は複数のアミノ酸残基のさらなる置換、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
【００４７】
本発明の別態様は、以下の式の配列を含む、単離された、変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについてn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、ここで、前記PEが配列番号:1の参照により定義される位置458でアルギニン残基を含み、及び、
ここで、前記PEが、以下を有する:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;及び
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換。
【００４８】
本発明の一態様において、式IのR1及びR2について、nは0である。本発明の別態様において、R1及びR2について、nは1である。本発明の一態様において、R1及びR2についてnが0のとき、式IのPEは、フューリン切断配列(FCS)とPE機能性ドメインIIIとの間にGGS(配列番号:283)連結ペプチドをさらに含んでもよい。
【００４９】
特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、FCSを含有するPEは、標的細胞内でタンパク質分解処理を受け、それによって毒素の細胞毒性が活性化されると考えられている。本発明のPEのFCSは、フューリンによって切断可能な、あらゆる適切なフューリン切断配列を含んでいてもよい。典型的なフューリン切断配列は、いずれもが参照により本明細書に組み入れられるDuckert et al.,Protein Engineering, Design & Selection,17(1):107-112(2004)および国際特許出願公開公報WO 2009/032954に記載されている。本発明の一態様において、FCSは、配列番号:1の残基274-284（すなわち、RHRQPRGWEQL(配列番号:8)）を含み、ここで、配列番号:1の1又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸の置換は、配列番号:1のアミノ酸残基E282のアラニン、グリシン、セリン又はグルタミンへの置換である。他の適切なFCSアミノ酸配列は、R-X1-X2-Rであって、ここでX1が、あらゆる天然に存在するアミノ酸かつX2があらゆる天然に存在するアミノ酸(配列番号:9)、RKKR(配列番号:10)、RRRR(配列番号:11)、RKAR(配列番号:12)、SRVARS(配列番号:13)、TSSRKRRFW(配列番号:14)、ASRRKARSW(配列番号:15)、RRVKKRFW(配列番号:16)、RNVVRRDW(配列番号:17)、TRAVRRRSW(配列番号:18)、RQPR(配列番号:19)、RHRQPRGW(配列番号:20)、RHRQPRGWE(配列番号:21)、HRQPRGWEQ(配列番号:22)、RQPRGWE(配列番号:23)、RHRSKRGWEQL(配列番号:24)、RSKR(配列番号:25)、RHRSKRGW(配列番号:26)、HRSKRGWE(配列番号:27)、RSKRGWEQL(配列番号:28)、HRSKRGWEQL(配列番号:29)、RHRSKR(配列番号:30)及びR-X1-X2-Rであって、ここでX1が、あらゆる天然に存在するアミノ酸かつX2がアルギニン又はリジン（配列番号:4）を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明のなお別の態様において、PE機能性ドメインIIIは、配列番号:1の残基395-613を含み、ここで、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552の1又は複数は、独立に置換される。アミノ酸残基F443、R456、L477、R494及びL552は、本発明の他の側面に関して、本明細書に記載されるように置換されてもよい。
【００５１】
本発明の一態様において、FCSは、式P4-P3-P2-P1によって表され、ここで、P4はアミノ末端のアミノ酸残基であり、P1はカルボキシル末端のアミノ酸残基であり、P1はアルギニン又はリジン残基であり、当該配列はP1のカルボキシル末端でフューリンにより切断可能である。
【００５２】
本発明の別態様において、FCSは、(i)P6-P5によって表されるアミノ酸残基をアミノ末端にさらに含み、(ii)P1’-P2’によって表されるアミノ酸残基をカルボキシル末端にさらに含み、(iii)ここで、P1がアルギニン又はリジン残基であり、P2’がトリプトファンであり、かつP4がアルギニン、バリン又はリジンである場合、P4がアルギニンでないという条件で、P6及びP2は塩基性残基であり、及び(iv)当該配列は、P1のカルボキシル末端でフューリンにより切断可能である。
【００５３】
本発明のなお別態様において、PE機能性ドメインIIIは、配列番号:1の残基395-613の配列からなる。
【００５４】
本発明のなお別態様において、変異PEは、FCSとPEドメインIIIとの間に配列番号:1の残基365-394の1又は複数の連続する残基を含む。
【００５５】
抗癌剤としてのシュードモナス外毒素キメラ分子の開発の側面には、腫瘍細胞に対する細胞毒性、ヒトB細胞及びヒトT細胞に対する免疫原性、及び熱安定性が含まれる。熱安定性は、薬学的製剤又は組成物の開発に有用であり得る。
【００５６】
それゆえ、本発明の一側面において、R458Aの代わりに変異R456Aを導入することによって、（さらなる置換によって、さらなるT細胞エピトープが除去されない場合、）腫瘍細胞に対する細胞毒性を実質的に減少させることなくPEからB細胞エピトープを除去することが可能となり得ることが見いだされた。従って、すべてのB細胞エピトープが完全に除去され、かつ、その細胞毒性が維持されているPEが初めて提供される。
【００５７】
本発明の態様は、以下の式の配列を含む、単離された、変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、ここで、前記PEが配列番号:1の参照により定義される位置458でアルギニンを含み、及び、
ここで、前記PEが、以下を有する:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換;
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換;
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換;
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換;
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換;
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換;及び
(g)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換。
【００５８】
好ましい態様において、FCSは配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8))に対応するフューリン切断配列(FCS)である。
【００５９】
好ましい態様において、
R1及びR2についてn=1、
R1=配列番号:282のアミノ酸配列のリンカー(DKTHKASGG)、
R2=配列番号:284のアミノ酸配列のリンカー(GGGGGS)、及び、
FCS=配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8))に対応するフューリン切断配列(FCS)である。特に好ましい態様において、R3についてnが0である。
【００６０】
好ましい態様において、PE機能性ドメインIIIは、配列番号:37のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本発明の態様は、以下の式の配列を含む、単離された変異シュードモナス外毒素A(PE)を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS=フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365-394の、1又は複数の連続した残基であり、及び
PE機能性ドメインIII=配列番号:1の残基395-613であり、
ここで、PEは、配列番号:1の参照により定義される位置458のアルギニンを含む。
【００６２】
本発明のPEに対しての免疫応答が、置換していないPEに対しての免疫応答に対して量的又は質的に減少している場合は、本発明に従い、本発明のPEは、置換していないPEよりも免疫原性が低減され得る。免疫原性の量的な減少には、免疫応答の大きさ又は程度における減少が包含される。免疫原性の大きさ又は程度は、サイトカイン（例えば、抗原特異的サイトカイン）の産生レベル（サイトカイン濃度）における減少、活性化されたリンパ球（例えば、リンパ球の増殖（例えば、抗原特異的リンパ球）)又は動員されたリンパ球の数における減少、及び/又は、抗体(抗原特異的抗体)の産生における減少などの、あらゆる公知のパラメータに基づいた測定が可能である。免疫原性における質的減少には、免疫応答がPEの細胞毒性の低減を媒介するに際しその効果が弱まるような免疫応答の性質におけるあらゆる変化を包含する。免疫原性を測定する方法は当技術分野において公知である。例えば、産生されるサイトカインの型やレベルを測定することにより、免疫原性を測定することができる。選択的又は追加的に、PEの抗体（例えば、予めPEへ暴露された抗体）への結合を測定すること、及び/又は、動物（例えば、ヒト、マウス、及び/又は、マウス免疫系がヒト免疫系へ置換されているマウス）へ投与された時のPEの抗体誘導能を測定することにより、免疫原性を測定することができる。免疫原性の低いPEは、IFN-γ、TNF-α及びグランザイムBのいずれか一つ又は複数のサイトカインの産生における減少、及び/又は、PEに特異的なT細胞及び/又はマクロファージの増殖及び活性化が、置換されていないPEによって得られる場合に比較して減少しているなどの、細胞が仲介する免疫応答の減少した刺激によって特徴づけてもよい。選択的又は追加的に、免疫原性の低いPEは、置換されていないPEによって得られる場合に比較して、TGF-β及び/又はIL-10の生産における増加によって特徴づけてもよい。好ましい態様において、減少された免疫原性は、T細胞刺激における減少、T細胞増殖における減少、並びにT細胞のIFNγ及び/又はグランザイムBの分泌における減少のいずれか一つ又は複数によって特徴づけられる。選択的又は追加的に、免疫原性の低いPEは、置換されていないPEによって得られる場合に比較して、PEに特異的なB細胞の刺激及び/又は活性化における減少によって特徴づけてもよい。例えば、免疫原性の低いPEは、置換していないPEによって得られる場合に比較して、抗体を分泌するプラズマ細胞及び/又はメモリー細胞へのB細胞の分化における減少によって特徴づけてもよい。減少された免疫原性は、B細胞刺激における減少、B細胞増殖における減少、及び抗PE抗体分泌における減少のいずれか1つ又は複数によって特徴づけてもよい。免疫原性の質的及び量的な減少は同時に生じ得、これらは相互排他的ではない。
【００６３】
当業者であれば、改変を通して本発明のPEの治療的又は予防的有効性が増加するように、あらゆる方法において本発明のPEが改変され得ることを容易に理解し得る。例えば、本発明のPEは、リンカーを通して直接的か間接的かのいずれかにより標的指向化部分へと結合又は融合させることができる。この点において、本発明の一態様は、(b)本明細書に記載される本発明のいずれかのPEに(a)結合又は融合された標的指向化部分を含む、キメラ分子を提供する。例えば、本発明のPEなどの化合物の標的指向化部分への結合の実践は、当技術分野において公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting,3:111(1995)、及び米国特許5,087,616号を参照されたい。一態様において、本明細書に記載される本発明のいずれかのPEは、標的指向化部分を欠いていてもよい。一態様において、本明細書に記載される本発明のいずれかのPEは、本明細書に記載されるいずれかの配列を有するいずれかの標的指向化部分を有していてもよい。
【００６４】
本明細書に用いられる用語「標的指向化部分」は、その表面上にレセプターが発現している細胞集団へ標的指向化部分が本発明のPEを送達させることができるように、細胞表面マーカーを特異的に認識し及び結合するあらゆる分子又は作用因子を指す。標的指向化部分には、抗体(例えば、モノクローナル抗体)又はそのフラグメント、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、及び、例えばスキャフォールド抗原結合タンパク質(scaffold antigen binding proteins)などの他のあらゆる天然又は非天然のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
スキャフォールド抗原結合タンパク質は当技術分野において公知である。例えば、フィブロネクチン及びアンキリンリピートタンパク質(DARPins)は、抗原結合ドメインに対して代替スキャフォールドとして使用されており、例えば、いずれも全体として参照により本明細書に組み入れられるGebauer and Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009)及びStumpp et al., Drug Discov. Today, 13:695-701 (2008)を参照されたい。
【００６６】
一態様において、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、天然のリガンド以外のリガンドと結合するようタンパク質操作を受けている、CTLA-4(Evibody);リポカリン;プロテインAのZドメイン（アフィボディ(Affibody)、SpA）、Aドメイン（アビマー(Avimer)/Maxibody）などのプロテインA由来分子;GroEI及びGroESなどのヒートショックタンパク質;トランスフェリン(trans-body);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(テトラネクチン);ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン(アフィリン(affilins)）;PDZドメイン; ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ型(scorpion toxinkunitz-type)ドメイン;及びフィブロネクチン（アドネクチン)からなる群から選択される。
【００６７】
CTLA-4(Cytotoxic T Lymphocyte-associated Antigen 4)は、CD4+T細胞によって主に発現されるCD28ファミリーレセプターである。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様免疫グロブリンフォールドを有する。抗体のCDRに対応するループは、さまざまな結合特性を付与するために異種配列で置換することができる。異なった結合特異性を有するように改変されたCTLA-4分子は、エビボディ(Evibody)とも称される。さらなる詳細は、J.Immunol. Methods,248(1-2):31-45(2001)を参照されたい。
【００６８】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの疎水性低分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するよう改変され得る円錐状構造の開口端における多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリン(Anticalin)は、160-180アミノ酸のサイズであり、リポカリンから生じる。さらなる詳細は、Biochim. Biophys. Acta., 1482:337-350(2000)、米国特許7250297B1及び米国特許出願公開公報20070224633を参照されたい。
【００６９】
アフィボディは、抗原と結合するように改変され得る、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインA由来のスキャフォールドである。そのドメインは、約58アミノ酸の3ヘリックスバンドルを含む。表面残基のランダム化によってライブラリが作製されている。さらなる詳細は、Protein Eng.Des.Sel.,17:455-462(2004)及び欧州特許出願公開公報1641818A1を参照されたい。アビマーは、Aドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約35アミノ酸の天然のドメインは、規定されたジスルフィド結合構造を採用している。多様性は、Aドメインのファミリーによって表された自然変異のシャッフリングにより生じる。さらなる詳細は、Nature Biotechnology, 23(12): 1556-1561 (2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs, 16(6): 909-917 (2007)を参照されたい。
【００７０】
トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパクである。トランスフェリンは、許容される表面のループにおけるペプチド配列の挿入により、異なった標的抗原に結合するよう改変することができる。改変されたトランスフェリンスキャフォールドの例にはトランスボディ(Trans-body）が含まれる。さらなる詳細は、J. Biol. Chem., 274: 24066-24073 (1999)を参照されたい。
【００７１】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（DARPin）は、内在膜タンパク質の細胞骨格との結合を介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンから生じる。単一のアンキリンリピートは、2つのαヘリックスと1つのβターンからなる33残基のモチーフである。それらは、各リピートの第一番目のαヘリックスとβターンにおいて残基をランダム化することにより、異なる標的抗原へ結合するよう改変することができる。これらの結合界面は、モジュール数を増加させることにより、増加させることができる（アフィニティマチュレーション法）。さらなる詳細は、J. MoI. Biol., 332: 489-503 (2003); PNAS, 100(4): 1700-1705 (2003); J. Mol. Biol., 369, 1015-1028 (2007);及び米国特許出願公開公報20040132028A1を参照されたい。
【００７２】
フィブロネクチンは、抗原と結合するように改変することができるスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンIII型（FN3）の15反復ユニットの10番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格を含有する。βサンドイッチの一端の3つのループを改変することにより、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel., 18: 435- 444 (2005)、米国特許出願公開20080139791、国際特許出願公開公報WO2005056764及び米国特許6,818,418B1を参照されたい。
【００７３】
ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的にはチオレドキシン（TrxA）、を含むコンビナトリアル認識分子であり、この分子はその活性部位に挿入された束縛された可変ペプチドループを含有する。さらなる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther., 5: 783-797 (2005)を参照されたい。
【００７４】
ミクロボディは、25-50アミノ酸長の、3-4のシステイン架橋を含有する天然に存在するミクロタンパク質から生じる。ミクロタンパク質の例には、KalataBI、コノトキシン及びノッチンが含まれる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体フォールドに影響を与えずに、最大25アミノ酸を含めるよう改変可能なループを有する。改変されたノッチンドメインの詳細については、国際特許出願公開公報WO2008098796を参照されたい。
【００７５】
他の抗原結合タンパク質には、ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼインヒビターのクニッツ型ドメイン、Ras結合タンパク質AF-6のPDZドメイン、スコーピオントキシン（カリブドトキシン）及びC型レクチンドメイン（テトラネクチン）を含む、さまざまな標的抗原結合特性を設計するためにスキャフォールドとして用いられてきたタンパク質が含まれる。Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)の第7章「非抗体スキャフォールド」及びProtein Science, 15:14-27 (2006)を参照されたい。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインのいずれかから生じさせてもよい。
【００７６】
本明細書に用いられる用語「抗体」は、全（又は「完全」としても知られる）抗体、又は抗原認識能及び結合能を維持しているその抗原結合部分を指す。抗体又はその抗原結合部分は、例えば、哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、チキン、ハムスター、ヒトなどから単離及び/又は精製した抗体又はその抗原結合部分などの、天然に存在する抗体又はその抗原結合部分であり得る。抗体又はその抗原結合部分は、単量体型又は多量体型であり得る。また、抗体又はその抗原結合部分は、細胞表面マーカーに対してあらゆるレベルの親和性又は結合活性を有し得る。望ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、その他のペプチドやタンパク質との交差反応が最小となるよう、細胞表面マーカーに対して特異的である。
【００７７】
抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよく、例えばIgM、IgG、(例えばIgG、IgG2、IgG3若しくはIgG4)、IgD、IgA又はIgEなどのいずれのアイソタイプであってもよい。標的細胞表面マーカーに対する抗体又は抗体の単鎖可変領域フラグメント（Fv）の相補性決定領域（CDR）は、標的細胞表面マーカーに対する特異性を抗体に付与するために、選択された抗体へグラフト又は改変され得る。例えば、標的細胞表面マーカーに対する抗体のCDRは、ヒトへ投与されたとき免疫原性の応答をほとんど又は全く惹起しないような抗体を形成するために、公知の三次元構造のヒト抗体フレームワーク上へグラフトされ得る（国際特許出願公開公報WO1998/045322及びWO1987/002671; 米国特許5,859,205; 5,585,089;及び4,816,567; 欧州特許出願公開公報0173494; Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988), Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988);及びWinter & Milstein, Nature, 349: 293 (1991)を参照されたい。）好ましい態様において、標的指向化部分はモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合部分である。
【００７８】
抗原結合部分は、例えば、完全抗体の可変領域又はCDRといった少なくとも１つの抗原結合サイトを有するあらゆる部分であり得る。抗体の抗原結合部分の例には、重鎖、軽鎖、重鎖又は軽鎖の可変又は定常領域、単鎖可変領域フラグメント（scFv）、又はFc、Fab、Fab’、Fv若しくはF(ab)2’フラグメント；シングルドメイン抗体（例えば、Wesolowski, Med Microbiol Immunol., 198(3): 157-74 (2009); Saerens et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8(5):600-8 (2008); Harmsen and de Haard, Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(1): 13-22 (2007)を参照されたい）、ヘリックス安定化抗体（例えば、Arndt et al., J. Mol. Biol., 312: 221-228 (2001)）；トリアボディ；ダイアボディ（欧州特許出願公開公報0404097;国際特許出願公開公報WO1993/011161; 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993));単鎖抗体分子（「scFv」、例えば、米国特許5,888,773を参照されたい。）；ジスルフィド安定化抗体（「dsFv」、例えば、米国特許5,747,654及び6,558,672を参照されたい)、及びドメイン抗体（「dAb」、例えば、Holt et al., Trends Biotech, 21(11):484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett., 414:521 -526 (1997), Lauwereys et al., EMBO J 17:3512- 3520 (1998), Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999);及びDavies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
あらゆる細胞表面マーカーへの結合活性に関して抗体又はその抗原結合部分を試験する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降及び競合阻害アッセイ（例えば、Janeway et al., infra,及び米国特許出願公開公報2002/0197266 A1を参照されたい)などの、あらゆる抗体抗原結合アッセイが含まれる。
【００８０】
抗体作製の適切な方法は、当技術分野において公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976)、Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988)及びC.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)に記載されている。また、EBVハイブリドーマ法（Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984)及びRoder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)）及びバクテリオファージベクター発現システム（例えば、Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)を参照されたい）などのその他の方法も当技術分野において公知である。さらに、非ヒト動物における抗体の製造方法は、例えば、米国特許 5,545,806、5,569,825及び5,714,352並びに米国特許出願公開公報2002/0197266 A1に記載されている。
【００８１】
ファージディスプレイもまた、本発明のキメラ分子に用いてもよい抗体の作製に用いることができる。この点において、抗体の抗原結合可変（V）ドメインをコードするファージライブラリは、標準的な分子生物学及び組換えDNA技術を用いて製造することができる（例えば、Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照されたい）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージは、所望の抗原への特異的結合により選択され、選択された可変ドメインを含む完全又は部分抗体が再構築される。再構築された抗体をコードする核酸配列は、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞により分泌されるように、ハイブリドーマ生産に用いられるミエローマ細胞などの適切な細胞系へ導入される（例えば、上述のJaneway et al.,上述のHuse et al.及び米国特許6,265,150を参照されたい）。
【００８２】
また、抗体は、特異的な重鎖及び軽鎖イムノグロブリン遺伝子が遺伝子組み換えされている形質転換マウスによって製造することができる。そのような方法は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許5,545,806及び5,569,825並びに上述のJaneway et al.に記載されている。
【００８３】
また、抗体は、例えばヒト化抗体やキメラ抗体といった遺伝子改変抗体であり得る。ヒト化抗体は、副作用のリスクを低減するのに有効であり、血液循環においてより長期間維持され得る。ヒト化抗体を製造するための方法は当技術分野において公知であり、詳細は、例えば、上述のJaneway et al.,米国特許5,225,539、5,585,089及び5,693,761、欧州特許0239400 B1及び英国特許2188638に記載されている。ヒト化抗体は、例えば米国特許5,639,641及びPedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994)に記載される抗体リサーフェイシング（resurfacing）技術を用いて製造することもできる。
【００８４】
標的指向化部分は、あらゆる適切な細胞表面マーカーに特異的に結合してもよい。特定の標的指向化部分及び／又は細胞表面マーカーの選択は、標的となる特定の細胞集団に依存して選択してもよい。細胞表面マーカーは当技術分野において公知であり（例えば、Mufson et al., Front. Biosci., 11:337-43 (2006); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6:326-334 (2000);及びKreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)を参照されたい）、例えば、タンパク質又は糖であってよい。本発明の一態様において、標的指向化部分は細胞表面上のレセプターに特異的に結合するリガンドである。典型的なリガンドには、血管内皮増殖因子（VEGF）、Fas、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、サイトカイン（例えば、IL-2、IL-15、IL-4、IL-13）、リンホカイン、ホルモン及び成長因子（例えば、トランスフォーミング成長因子（TGFa）、神経細胞成長因子（neuronal growth factor）、上皮成長因子）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
細胞表面マーカーは、例えば、癌抗原であり得る。本明細書において用いられる用語「癌抗原」は、抗原が腫瘍又は癌と関連付けられる、腫瘍細胞又は癌細胞によって唯一又は大部分に発現又は過剰発現されているあらゆる分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、糖など）を指す。癌抗原は、追加的に、正常な、非腫瘍又は非癌性細胞によって発現され得る。しかしながら、そのような場合、正常な、非腫瘍又は非癌性細胞による癌抗原の発現は、腫瘍又は癌細胞による発現ほど頑強ではない。この点において、腫瘍又は癌細胞は、抗原を過剰発現しているか、又は、正常な、非腫瘍又は非癌性細胞による抗原の発現に比較して、極めて高いレベルで抗原を発現し得る。また、癌抗原は、追加的に、発生又は成熟のさまざまな状態の細胞によって発現され得る。例えば、癌抗原は、追加的に、成体宿主においては通常見られない細胞である胚期又は胎生期の細胞によって発現され得る。また、癌抗原は、追加的に、成体宿主においては通常見られない細胞である幹細胞又は前駆細胞によって発現され得る。
【００８６】
癌抗原は、本明細書に記載される癌および腫瘍を含む、あらゆる癌又は腫瘍のあらゆる細胞によって発現される抗原であり得る。癌抗原は、癌抗原が1種類のみの癌又は腫瘍に関連付けられる又は特徴づけられる、1種類のみの癌又は腫瘍の癌抗原であってよい。また、癌抗原は、2種類以上の癌又は腫瘍（に例えば特徴付けられるてよい）の癌抗原であってよい。例えば、癌抗原は、乳癌及び前立腺癌細胞の両方によって発現され、かつ、正常な、非腫瘍又は非癌細胞によっては全く発現されていなくてもよい。
【００８７】
標的指向化部分が特異的に結合する典型的な癌抗原には、ムチン１（MUC1；腫瘍関連上皮性ムチン）、メラノーマ関連抗原（MAGE）、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、癌胎児性抗原（CEA）、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSFR）、CD56、ヒト上皮成長因子レセプター2（HER2/neu）（erbB-2としても知られる）、CD5、CD7、チロシナーゼ腫瘍抗原、チロシナーゼ関連タンパク質（TRP）1、TRP2、NY-ESO-1、テロメラーゼ及びp53が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、標的指向化部分が特異的に結合する細胞表面マーカーは、表面抗原分類(CD)19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン3、骨髄系細胞表面抗原)、CD79b、CD123(インターロイキン3レセプターα)、トランスフェリンレセプター、EGFレセプター、メソテリン、カドへリン、ルイスY、グリピカン3、FAP(繊維芽細胞活性化タンパク質α)、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、CA9 = CAIX(炭酸脱水酵素IX)、L1CAM(神経細胞接着分子L1)、エンドシアリン、HER3(上皮成長因子レセプターファミリーメンバー3の活性化形態)、Alkl/BMP9複合体(未分化リンパ腫キナーゼ1/骨形成タンパク質9)、TPBG = 5T4(栄養芽層糖タンパク質)、ROR1(レセプターチロシンキナーゼ様表面抗原)、HER1(上皮成長因子レセプターの活性化形態)、及びCLL1(C型レクチンドメインファミリー12、メンバーA)からなる群から選択される。メソテリンは、例えば、卵巣癌、中皮腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、卵管癌、頭頸部癌、子宮頸癌及び膵臓癌において発現される。CD22は、例えば、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（SLL）及び急性リンパ球性白血病（ALL）において発現される。CD25は、例えば、有毛細胞白血病及びホジキンリンパ腫を含む、白血病及びリンパ腫において発現される。ルイスY抗原は、例えば、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺癌及び膵臓癌において発現している。CD33は、例えば、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄単球性白血病（CML）及び骨髄増殖性疾患において発現される。
【００８８】
本発明の一態様において、標的指向化部分は、癌抗原に特異的に結合する抗体である。癌抗原に特異的に結合する典型的な抗体には、トランスフェリンレセプターに対する抗体（例えば、HB21及びそのバリアント）、CD22に対する抗体（例えば、RFB4及びそのバリアント）、CD25に対する抗体（例えば、抗Tac及びそのバリアント）、メソテリンに対する抗体（例えば、SS1、MORAb-009、SS、HN1、HN2、MN、MB及びそのバリアント）及びルイスY抗原に対する抗体（例えば、B3及びそのバリアント）並びにその抗原結合部分が含まれるが、これらに限定されない。この点において、標的指向化部分はB3、RFB4、SS、SS1、MN、MB、HN1、HN2、HB21及びMORAb-009並びにその抗原結合部分からなる群から選択される抗体であってよい。本発明のキメラ分子に用いるための適切なさらなる典型的な標的指向化部分は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、米国特許5,242,824(抗トランスフェリンレセプター); 5,846,535(抗CD25); 5,889,157(抗ルイスY); 5,981,726 (抗ルイスY); 5,990,296(抗ルイスY); 7,081,518(抗メソテリン); 7,355,012 (抗CD22及び抗CD25); 7,368,110(抗メソテリン); 7,470,775 (抗CD30); 7,521,054(抗CD25);及び7,541,034(抗CD22); 米国特許出願公開公報2007/0189962(抗CD22); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000)及びKreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)に開示されている。別態様において、標的指向化部分は当技術分野で公知である免疫毒素の標的指向化部分を含んでもよい。典型的な免疫毒素には、LMB-2(抗Tac(Fv)-PE38)、BL22及びHA22(RFB4(dsFv)-PE38)、SS1P(SS l (dsFv)-PE38)、HB21-PE40及びそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、標的指向化部分はHA22の抗原結合部分である。HA22は、PE38に接合したジスルフィド結合Fv抗CD22抗体フラグメントを含む。HA22及びそのバリアントは、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願公開公報WO2003/027135及びWO2009/032954に開示されている。
【００８９】
標的指向化部分の抗原結合部分は、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含んでいてよい。本発明の一態様において、重鎖可変領域は、重鎖CDR1領域、重鎖CDR2領域及び重鎖CDR3領域を含む。この点において、抗原結合ドメインは、配列番号:49、65、81、97、113、129、145、161又は177を含む重鎖CDR1領域；配列番号:53、69、85、101、117、133、149、165又は181を含む重鎖CDR2領域；及び、配列番号:57、73、89、105、121、137、153、169又は185を含む重鎖CDR3領域の１又は複数を含んでいてよい。好ましくは、重鎖は、配列番号:(a)49、53及び57のすべて(それぞれ、抗メソテリン重鎖CDR1-CDR3);(b)配列番号:65、69及び73のすべて(それぞれ、抗グリピカン3 gc33 重鎖CDR1-CDR3);(c)配列番号:81、85及び89のすべて(それぞれ、抗グリピカン3 ab 酸性 重鎖CDR1-CDR3);(d)配列番号:97、101及び105のすべて(それぞれ、抗Fap 重鎖CDR1-CDR3);(e)配列番号:113、117、121のすべて(それぞれ、抗PSMA重鎖CDR1-CDR3);(f)配列番号:129、133及び137のすべて(それぞれ、抗CAIX重鎖CDR1-CDR3);(g)配列番号:145、149及び153のすべて(それぞれ、抗L1CAM-(1)重鎖CDR1-CDR3);(h)配列番号:161、165及び169のすべて(それぞれ、抗L1CAM(2)重鎖CDR1-CDR3);又は(i)配列番号:177、181及び 185のすべて(それぞれ、抗L1CAM(3)重鎖CDR1-CDR3)を含む。
【００９０】
本発明の一態様において、軽鎖可変領域は、軽鎖CDR1領域、軽鎖CDR2領域及び軽鎖CDR3領域を含んでいてよい。この点において、抗原結合ドメインは、配列番号:50、66、82、98、114、130、146、162又は178を含む軽鎖CDR1領域；配列番号:54、70、86、102、118、134、150、166又は182を含む軽鎖CDR2領域；配列番号:58、74、90、106、122、138、154、170又は186を含む軽鎖CDR3領域の一又は複数を含んでいてよい。好ましくは、軽鎖は、(a)配列番号:50、54及び58のすべて(それぞれ、抗メソテリン軽鎖CDR1-CDR3);(b)配列番号:66、70及び74のすべて(それぞれ、抗グリピカン3 ab gc33軽鎖CDR1-CDR3);(c)配列番号:82、86及び90のすべて(それぞれ、抗グリピカン3 ab 酸性 軽鎖CDR1-CDR3);(d)配列番号:98、102及び106のすべて(それぞれ、抗FAP軽鎖CDR1-CDR3);(e)配列番号:114、118及び122のすべて(それぞれ、抗PSMA軽鎖CDR1-3);(f)配列番号:130、134及び138のすべて(それぞれ、抗CAIX軽鎖CDR1-CDR3);(g)配列番号:146、150及び154のすべて(それぞれ、抗L1CAM-(1)軽鎖CDR1-CDR3);(h)配列番号:162、166及び170のすべて(それぞれ、抗L1CAM-(2)軽鎖CDR1-CDR3);又は(i)配列番号:178、182及び186のすべて(それぞれ、抗L1CAM-(3)軽鎖CDR1-CDR3)を含む。
【００９１】
特に好ましい態様において、抗原結合部分は、軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3領域及び重鎖のCDR1、CDR2、CDR3領域を含む。この点において、抗原結合部分は、(a)配列番号:49、50、53、54、57及び58;(b)配列番号:65、66、69、70、73及び74;(c)配列番号:81、82、85、86、89、及び90;(d)配列番号:97、98、101、102、105及び106;(e)配列番号:113、114、117、118、121及び122;(f)配列番号:129、130、133、134、137及び138;(g)配列番号:145、146、149、150、153及び154;(h)配列番号:161、162、165、166、169及び170;又は(i)配列番号:177、178、181、182、185及び186を含む。
【００９２】
一態様において、抗原結合部分は、上述のCDR領域に加えて、重鎖のフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、FR4及び軽鎖のフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、FR4を含む。この点において、抗体結合部分は、配列番号:47、63、79、95、111、127、143、159又は175を含む重鎖FR1領域；配列番号:51、67、83、99、115、131、147、163又は179を含む重鎖FR2領域；配列番号:55、71、87、103、119、135、151、167又は183を含む重鎖FR3領域；及び配列番号:59、75、91、107、123、139、155、171又は187を含む重鎖FR4領域を含んでいてよい。抗原結合部分は、配列番号:48、64、80、96、112、128、144、160又は176を含む軽鎖FR1領域；配列番号:52、68、84、100、116、132、148、164又は180を含む軽鎖FR2領域；配列番号:56、72、88、104、120、136、152、168又は184を含むFR3領域；及び配列番号:60、76、92、108、124、140、156、172又は188を含むFR4領域を含んでいてよい。好ましくは、抗原結合部分は、軽鎖のFR1、FR2、FR3、F4、CDR1、CDR2及びCDR3領域並びに重鎖のFR1、FR2、FR3、F4、CDR1、CDR2及びCDR3領域を含んでいる。この点において、抗原結合部分は、(a)配列番号:47-60(抗メソテリン);(b)配列番号:63-76(抗グリピカン3 ab gc33);(c)配列番号:79-92(抗グリピカン3 ab 酸性);(d)配列番号:95-108(抗FAP);(e)配列番号:111-124(抗PSMA);(f)配列番号:127-140(抗CAIX);(g)配列番号:143-156(抗L1CAM(1));(h)配列番号:159-172(抗L1CAM(2));又は(i)配列番号:175-188(抗L1CAM(3))を含む。
【００９３】
一態様において、抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、配列番号:46、62、78、94、110、126、142、158又は174を含んでいてよい。一態様において、抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、配列番号:45、61、77、93、109、125、141、157又は173を含んでいてよい。好ましい態様において、抗原結合ドメインは、(a)配列番号:45及び46の両方(抗メソテリン);(b)配列番号:61及び62の両方(抗グリピカン3 ab gc33);(c)配列番号:77及び78の両方(抗gc33 酸性);(d)配列番号:93及び94の両方(抗FAP);(e)配列番号:109及び110の両方(抗PSMA);(f)配列番号:125及び126の両方(抗CAIX);(g)配列番号:141及び142の両方(抗L1CAM(1));(h)配列番号:157及び158の両方(抗L1CAM(2));(i)配列番号:173及び174の両方(抗L1CAM(3));又は(j)配列番号:93及び290の両方(抗FAP)を含む。
【００９４】
本発明の他の側面は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含むヒト化抗メソテリン抗体である。当該ヒト化抗体は、出発物質としてマウス抗メソテリン抗体SS1を用いて、特定の組合せのマウスSS1抗体のCDR領域を有するある一定のフレームワーク領域を作製することによって作製した。当該ヒト化抗体は、優れた結合特性、安定性及び開発性（developability）を有利に提供する。
【００９５】
本発明の一態様において、標的指向化部分はヒト化されていてよい。本発明の一態様において、標的指向化部分はヒト化SS1又はヒト化SS1の抗原結合部分である。この点において、標的指向化部分は、配列番号:33（cFp-0199）を含む軽鎖及び配列番号:38(cFp-0200)を含む重鎖を含んでいてよい。別態様において、標的指向化部分は、配列番号:31(cFp-0199ヒト化可変軽鎖ドメインVL)及び配列番号:32（cFp-0199カッパ定常軽鎖ドメイン）を含んでいてよい。一態様において、標的指向化部分は配列番号:34（cFp-0200ヒト化可変重鎖ドメインVH）及び配列番号:35（cFp-0200定常重鎖ドメインCH1）を含む重鎖を含んでいてよい。一態様において、標的指向化部分は、配列番号:31、32、34及び35を含む。
【００９６】
本発明の一態様において、キメラ分子はリンカーを含む。本明細書において用いられる用語「リンカー」は、本発明のPEと標的指向化部分を接続するあらゆる作用因子又は分子を指す。当技術分野の当業者は、リンカー及び／又は標的指向化部分が、本発明のPEに一旦結合させられたのちに、本発明のPEの機能、すなわち、細胞毒性、標的細胞の成長阻害、又は癌の治療又は予防といった機能を阻害しないという条件において、本発明のPEの機能に対し必要ではない本発明のPE上のサイトが、リンカー及び／又は標的指向化部分を結合させるための理想的なサイトであることを認識する。リンカーは、PE及び標的指向化部分の両方に対して共有結合を形成することができてよい。適切なリンカーは、当技術分野において公知であり、直鎖又は分岐状炭素リンカー、複素環炭素リンカー及びペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。PE及び標的指向化部分がポリペプチドの場合、側鎖を介して（例えば、システインへのジスルフィド結合を介して）アミノ酸へ結合していてもよい。好ましくは、リンカーは、末端アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基のα炭素へ結合している。
【００９７】
本発明の別側面において、フューリン切断配列（FCS）の両端に特定のアミノ酸を導入することによって、標的指向化部分を有するシュードモナス外毒素のより安定なキメラ分子が提供されることが見いだされている。加えて、さらに、リンカー領域における潜在的なT細胞エピトープが除去されることが見いだされており、これは標的指向化部分として抗体のFabフラグメントを使用する場合に特に有利であり得る。これらのキメラ分子は、これらの伸長されたリンカーを有さないキメラ分子に比べて改良された熱力学的安定性を提供するとともに腫瘍細胞に対する細胞毒性を維持している。したがって、本発明の一態様において、リンカーは伸長されたリンカーである。伸長されたリンカーは、配列番号:３６を含んでいてよい。
【００９８】
好ましい態様において、R1n-FCS-R2nは配列番号:36のアミノ酸配列のリンカーである。フューリン切断サイトは配列番号:36のアミノ酸残基15と16の間に位置している。
【００９９】
本発明の一態様は、(b)本明細書に記載されるいずれかのPEに対して（a）結合又は融合された標的指向化部分を含むキメラ分子を提供する。
【０１００】
本発明の一態様は、以下の式の配列を含む、(b)変異シュードモナス外毒素A（PE）に対して(a)結合又は融合された標的指向化部分を含む、単離されたキメラ分子を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS＝フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365〜394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII＝配列番号:1の残基395〜613であり、ここで、前記PEが配列番号:1の参照により定義される位置458でアルギニンを含み、及び、
ここで、前記PEが、以下を有する:
(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換；
(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換:
(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換；
(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換；
(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換；
(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換；及び
(g)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換。
【０１０１】
キメラ分子の好ましい態様において、FCSは配列番号:1のアミノ酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(配列番号:8)に対応するフューリン切断配列（FCS）である。
【０１０２】
キメラ分子の好ましい態様において、
R1及びR2についてn=1、
R1=配列番号:282のアミノ酸配列のリンカー（DKTHKASGG）、
R2=配列番号:284のアミノ酸配列のリンカー（GGGGGS）、及び、
FCS=配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）である。特に好ましい態様において、R3についてnが0である。
【０１０３】
キメラ分子の好ましい態様において、R1n-FCS-R2nは配列番号:36のアミノ酸配列のリンカーであり、かつ、標的指向化部分は抗体のFabフラグメントを含む。
【０１０４】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗メソテリン抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい一態様において、抗原結合部分は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含む抗メソテリン抗体のFabフラグメントである。この点において、キメラ分子は、(a)配列番号:39及び40;(b)配列番号:41及び42;又は(c)配列番号:43及び44を含んでいてよい。
【０１０５】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１０６】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１０７】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するFCS及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2、CDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2、CDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい一態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインVLを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。この点において、キメラ分子は(a)配列番号:291及び293;(b)配列番号:291及び294;又は(c)配列番号:292及び294を含んでいてよい。
【０１０８】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するFCS及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）並びに配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１０９】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するFCS及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）並びに配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。この点において、キメラ分子は(a)配列番号:295及び297;又は(b)配列番号:296及び297;を含んでいてよい。
【０１１０】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するFCS及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:37を含むPE（LO10R-456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）並びに配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。
【０１１１】
好ましい態様において、本発明は、以下の式の配列を含む、（b）変異シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）に対して（a）結合又は融合された標的指向化部分を含む単離されたキメラ分子を提供する:
R1n-FCS-R2n-R3n-PE機能性ドメインIII
ここで、
R1、R2及びR3のそれぞれについて独立にn=0又は1であり、
R1=1から10アミノ酸残基であり、
FCS＝フューリンによって切断可能で、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する配列である、フューリン切断配列のアミノ酸残基であり、
R2=1から10アミノ酸残基であり、
R3=配列番号:1の残基365〜394の、1又は複数の連続した残基であり、及び、
PE機能性ドメインIII＝配列番号:1の残基395〜613であり、
ここで、配列番号:1の参照により定義されるアミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数が、独立に置換されており；
及び、前記PEは、任意に、１又は複数のB細胞エピトープにおいてアミノ酸のさらなる置換を含む。
【０１１２】
アミノ酸残基L477におけるヒスチジンでの置換は、他のアミノ酸での置換に比較して、T細胞応答の強力な減少をもたらすとともに（例えば、実施例4を参照されたい）、同時に、他のアミノ酸での置換に比較して、PEの細胞毒性効果の向上をももたらす（例えば、実施例3、5及び6を参照されたい）ことが見いだされている。したがって、キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換である。アミノ酸残基L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換もまた、さらなる毒性の向上をもたらし、一方でT細胞応答の低減をもたらす。キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換である。キメラ分子に関する本発明の一態様において、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及び、アミノ酸残基L552におけるグルタミン酸又はアスパラギンへの置換である。
【０１１３】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、PEは位置458にアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換及び(b)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換である。本発明の好ましい態様において、キメラ分子のPEは、配列番号:289のアミノ酸配列（T18/T20）を含む。
【０１１４】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、PEは位置458にアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換；(b)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換；(c)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換；(d)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換；(e)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換；(f)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換；及び(g)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様において、キメラ分子のPEは、配列番号:285のアミノ酸配列（T14-L010R+456A）を含む。
【０１１５】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換であり、PEは位置458にアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換；(b)アミノ酸残基R456に対するアラニンへの置換；(c)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換；(d)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換；(e)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換；(f)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換；及び(g)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様において、キメラ分子のPEは、配列番号:286のアミノ酸配列（T15-L010R+456A）を含む。
【０１１６】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるグルタミン酸への置換であり、PEは位置458にアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換；(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換；(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換；(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換；(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換；及び(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様において、キメラ分子のPEは、配列番号:287のアミノ酸配列（T14-L010R）を含む。
【０１１７】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、配列番号:1の参照により定義される、アミノ酸残基F443、L477、R494及びL552の1又は複数の置換は、アミノ酸残基F443におけるアラニンへの置換；アミノ酸残基L477におけるヒスチジンへの置換；アミノ酸残基R494におけるアラニンへの置換；及びアミノ酸残基L552におけるアスパラギンへの置換であり、PEは位置458にアルギニン残基を有し、かつ、１又は複数のB細胞エピトープにおけるアミノ酸のさらなる置換が:(a)アミノ酸残基R427に対するアラニンへの置換；(b)アミノ酸残基D463に対するアラニンへの置換；(c)アミノ酸残基R467に対するアラニンへの置換；(d)アミノ酸残基R490に対するアラニンへの置換；(e)アミノ酸残基R505に対するアラニンへの置換；及び(f)アミノ酸残基R538に対するアラニンへの置換である。好ましい態様において、キメラ分子のPEは、配列番号:288のアミノ酸配列（T15-L010R）を含む。
【０１１８】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、FCSは配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）である。
【０１１９】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、
R1及びR2についてn=1、
R1=配列番号:282のアミノ酸配列のリンカー（DKTHKASGG）、
R2=配列番号:284のアミノ酸配列のリンカー（GGGGGS）、及び、
FCS=配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）である。特に好ましい態様において、R3についてnが0である。
【０１２０】
キメラ分子に関する本発明の好ましい態様において、R1n-FCS-R2nは配列番号:36のアミノ酸配列のリンカーであり、かつ、標的指向化部分は抗体のFabフラグメントを含む。
【０１２１】
好ましい態様において、キメラ分子は抗メソテリン抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（T14-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含む抗メソテリン抗体のFabフラグメントである。
【０１２２】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗メソテリン抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含む抗メソテリン抗体のFabフラグメントである。
【０１２３】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗メソテリン抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含む抗メソテリン抗体のFabフラグメントである。
【０１２４】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗メソテリン抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:45の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:46の可変軽鎖ドメインを含む抗メソテリン抗体のFabフラグメントである。
【０１２５】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:65、69及び73）及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:66、70及び74）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:81、85及び89）及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:82、86及び90）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１２６】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:285を含むPE（T14-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（T14-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:65、69及び73）及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:66、70及び74）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:81、85及び89）及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:82、86及び90）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１２７】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:65、69及び73）及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:66、70及び74）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:81、85及び89）及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:82、86及び90）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１２８】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-LO-1OR）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:65、69及び73）及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:66、70及び74）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:81、85及び89）及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:82、86及び90）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。
【０１２９】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗グリピカン3抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:65、69及び73）及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:66、70及び74）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:81、85及び89）及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:82、86及び90）を含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。
【０１３０】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:285を含むPE（T14-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（T14-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。
【０１３１】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。
【０１３２】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。
【０１３３】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗FAP抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:97、101及び105）及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:98、102及び106）を含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:94の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい別態様において、抗原結合部分は、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:290の可変軽鎖ドメインを含む抗FAP抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）及び配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１３４】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:285を含むPE（Tl4-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（T14-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）及び配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１３５】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-L010R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）及び配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１３６】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）及び配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１３７】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗PSMA抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:109の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:113、117及び121）及び配列番号:110の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:114、118及び122）を含む抗PSMA抗体のFabフラグメントである。
【０１３８】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）及び配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。
【０１３９】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:285を含むPE（Tl4-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（Tl4-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）及び配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。
【０１４０】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）及び配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。
【０１４１】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）及び配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。
【０１４２】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗CAIX抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:125の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:129、133及び137）及び配列番号:126の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:130、134及び138）を含む抗CAIX抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:289を含むPE（T18/T20）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び含むPEを含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）及び配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。
【０１４３】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:285を含むPE（Tl4-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:285を含むPE（Tl4-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）及び配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。
【０１４４】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:286を含むPE（T15-LO10R+456A）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）及び配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。
【０１４５】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:287を含むPE（T14-LO10R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）及び配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。
【０１４６】
好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:1のアミノ酸残基274-284（RHRQPRGWEQL（配列番号:8））に対応するフューリン切断配列（FCS）及び配列番号:288を含むPE（T15-LO10R）を含む。好ましい態様において、キメラ分子は、抗L1CAM抗体の抗原結合部分、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー及び配列番号:288を含むPE（T15-L010R）を含む。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:141の可変重鎖ドメインVHのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:145、149及び153）及び配列番号:142の可変軽鎖ドメインのCDR1、CDR2及びCDR3（それぞれ、配列番号:146、150及び154）を含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:157の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:158の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、配列番号:173の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:174の可変軽鎖ドメインを含む抗L1CAM抗体のFabフラグメントである。本発明の範囲において、本明細書に記載される本発明のPE及びキメラ分子の機能的部分が含まれる。PE又はキメラ分子に関して用いられる場合、用語「機能的部分」は、その部分又はフラグメントが一部を構成するPE又はキメラ分子（すなわち親PE又はキメラ分子）の生物学的活性を維持している、本発明のPE又はキメラ分子のあらゆる部分又はフラグメントを指す。機能的部分は、例えば、親PE又はキメラ分子に対して類似する程度、同程度、又はより高い程度において、標的細胞へ特異的に結合し標的細胞を破壊若しくはその成長を阻害する、又は癌を治療若しくは予防する能力を維持するPE又はキメラ分子の部分を包含する。親PE又はキメラ分子に関して、機能的部分は、例えば、親PE又はキメラ分子の、約10％若しくはそれ以上、約25％若しくはそれ以上、約30％若しくはそれ以上、約50％若しくはそれ以上、約68％若しくはそれ以上、約80％若しくはそれ以上、約90％若しくはそれ以上、又は、約95％若しくはそれ以上を含み得る。
【０１４７】
機能的部分は、そのアミノ末端若しくはカルボキシル末端又は両末端において、親PE又はキメラ分子のアミノ酸配列においては見いだされない、さらなるアミノ酸を含むことができる。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞に特異的に結合し、標的細胞を破壊又はその成長を阻害し、癌を治療又は予防する能力を有するなどの機能的部分の生物学的機能を干渉しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親PE又はキメラ分子の生物学的活性と比較して、生物学的活性を向上させる。
【０１４８】
本発明の範囲において、本明細書に記載される本発明のPE及びキメラ分子の機能的バリアントが含まれる。本明細書に記載される用語「機能的バリアント」は、親PE又はキメラ分子に対して相当な又はかなりの配列同一性又は相同性を有するPE又はキメラ分子を指し、当該機能的バリアントは、バリアントの由来となるPE又はキメラ分子の生物学的活性を維持している。機能的バリアントは、例えば、親PE又はキメラ分子に対して、類似する程度、同程度、又はより高い程度で、標的細胞へ特異的に結合し標的細胞を破壊又はその成長を阻害する能力を維持している、本明細書に記載のPE又はキメラ分子（親PE又はキメラ分子）のバリアントを包含する。親PE又はキメラ分子に関して、機能的バリアントは、例えば、約30％若しくはそれ以上、約50％若しくはそれ以上、約75％若しくはそれ以上、約80％若しくはそれ以上、約90％若しくはそれ以上、約95％若しくはそれ以上、約96％若しくはそれ以上、約97％若しくはそれ以上、約98％若しくはそれ以上、又は、約99％若しくはそれ以上、親PE又はキメラ分子に対するアミノ酸配列において同一であり得る。
【０１４９】
機能的バリアントは、例えば、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する親PE又はキメラ分子のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は当技術分野において公知であり、ある化学的及び／又は物理的特性を有する１つのアミノ酸が、同一の化学的又は物理的特性を有する他のアミノ酸へ交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の、他の酸性アミノ酸（例えば、Asp又はGlu）への置換、非極性側鎖を有するアミノ酸の、他の非極性側鎖を有するアミノ酸への置換（例えば、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Valなど）、塩基性アミノ酸の、他の塩基性アミノ酸への置換（Lys、Argなど）、極性側鎖を有するアミノ酸の、他の極性側鎖を有するアミノ酸への置換（Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyrなど）などであり得る。
【０１５０】
選択的又は追加的に、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親PE又はキメラ分子のアミノ酸配列を含み得る。この場合において、非保存的アミノ酸置換が当該機能的バリアントの生物学的活性を干渉又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を向上させ、親PE又はキメラ分子に対して、機能的バリアントの生物学的活性を増加させる。
【０１５１】
本発明のPE又はキメラ分子は、本質的に、本明細書に記載された特定のアミノ酸配列からなり、例えば、その他のアミノ酸などの機能的バリアントのその他の構成要素は、機能的バリアントの生物学的活性を実質的に変化させない。
【０１５２】
本発明のPE又はキメラ分子（本発明の機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、1又は複数の天然に存在するアミノ酸に代えて合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジル‐リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα-tert-ブチルグリシンが含まれる。
【０１５３】
本発明のPE又はキメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N‐アシル化、例えばジスルフィド架橋を介しての環状化、若しくは酸付加塩に変換、及び／又は、任意にダイマー化若しくは重合化若しくは結合され得る。
【０１５４】
本発明の一態様は、(a)組換えによりPEを発現させる工程及び(b)PEを精製する工程を含む、本発明のPEを製造する方法を提供する。本発明のPE及びキメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、当技術分野において公知のタンパク質及びポリペプチドの製造方法によって獲得することができる。ポリペプチド及びタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、例えば、Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000;及び米国特許5,449,752に参照として記載されている。また、本発明のPE及びキメラ分子は、標準的な組換え法を用いることにより、本明細書に記載される核酸を用いて組換え的に発現させることができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001;及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照されたい。
【０１５５】
本方法は、PEを精製する工程をさらに含む。発現後、本発明のPEは当技術分野に公知の精製技術によって精製されてもよい。典型的な精製技術には、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティカラム及びカラムクロマトグラフィ、又は、例えば、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)に記載される手順によるものなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５６】
本発明の別態様は、(a)キメラ分子を組換えにより発現させる工程及び(b)キメラ分子を精製する工程を含む、本発明のキメラ分子を製造する方法を提供する。キメラ分子は、本発明の他の側面に関して本明細書に記載されるように、組換えにより発現させ、精製されてもよい。本発明の一態様において、キメラ分子を組換えにより発現する工程は、標的指向化部分をコードするヌクレオチド配列及びPEをコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入する工程を含む。本方法は、機能的な標的指向化部分領域と機能的なPE領域とを含む１つの連続したポリペプチドがコードされるように、標的指向化部分をコードするヌクレオチド配列及びPEをコードするヌクレオチド配列をインフレームで挿入する工程を含んでもよい。本発明の一態様において、本方法は、発現の際に、PEが標的指向化部分のカルボキシル末端に位置するように、PEをコードするヌクレオチド配列を、標的指向化部分をコードするヌクレオチド配列へ連結する工程を含む。他の態様において、本方法は、発現の際に、PEが標的指向化部分のアミノ末端に位置するように、PEをコードするヌクレオチド配列を、標的指向化部分をコードするヌクレオチド配列へ連結する工程を含む。
【０１５７】
本発明のなお別態様は、(a)本発明のPEを組換えにより発現させる工程、(b)PEを精製する工程、及び(c)標的指向化部分を精製されたPEへ共有結合的に結合させる工程を含む、本発明のキメラ分子を製造する方法を提供する。本発明のPEは、本発明の他の側面に関して本明細書に記載されるように、組換えにより発現されてもよい。本方法は、標的指向化部分を精製されたPEへ共有結合的に結合する工程をさらに含む。PEを標的指向化部分へ結合させる方法は、標的指向化部分の化学構造に従って異なってもよい。例えば、本方法は、例えばカルボン酸（COOH）基、遊離アミン（-NH2）基又はスルフヒドリル(-SH)基などの、PE上に存在するいずれか１又は複数のさまざまな官能基と標的指向化部分上の適切な官能基とを反応させ、それによってPEと標的指向化部分との間に共有結合を形成する工程を含んでいてよい。選択的又は追加的に、本方法は、さらなる反応性官能基を露呈させるため又はさらなる反応性官能基を結合させるために、標的指向化部分又はPEを誘導体化する工程を含んでいてよい。誘導体化する工程は、標的指向化部分又はPEへ1又は複数のリンカーを結合する工程をも含んでいてよい。
【０１５８】
本発明の別態様において、本発明のPE及びキメラ分子は、非組換え的な方法を用いて製造されてもよい。例えば、本明細書に記載される本発明のPE及びキメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、Synpep社(Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. 社(Gaithersburg, MD)及びMultiple Peptide Systems社(San Diego, CA)などの企業によって商業的に合成され得る。この点において、本発明のPE及びキメラ分子は、合成されたもの、組換えられたもの、単離されたもの及び／又は精製されたものであり得る。
【０１５９】
いくつかの状況において、キメラ分子が1又は複数の標的細胞へ到達しているときに、標的指向化部分からPEを遊離させることが望ましい場合があり得る。この点において、本発明のキメラ分子は切断可能なリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、例えば酵素的に切断可能であるなど、あらゆる適切な手段により切断可能であってよい。例えば、標的細胞が癌（例えば腫瘍）細胞である場合に、キメラ分子は、腫瘍部位に存在する状況下（例えば、腫瘍関連酵素又は酸性pHにさらされたときなど）において切断可能なリンカーを含んでいてもよい。
【０１６０】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるいずれかの本発明のPE又は本発明のキメラ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書において用いられる用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、かつ、一本鎖又は二本鎖であり得、天然源から（例えば単離及び／又は精製により）合成又は獲得し得、天然、非天然又は変更されたヌクレオチドを含有し得、及び、非改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、例えばホスホロアミダイト結合又はホスホロチエート結合などの天然、非天然又は変更されたヌクレオチド間結合を含有し得る、DNA又はRNAのポリマーを一般的に意味する。一般的に好ましくは、核酸はいかなる挿入、欠失、逆位及び／又は置換も含まない。しかしながら、いくつかの例において、本明細書において議論されるように、核酸が1又は複数の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが適切であってもよい。
【０１６１】
好ましくは、本発明の核酸は、組換え体である。本明細書に用いられるように、用語「組換え体」は、(i)天然又は合成核酸セグメントを連結することにより生細胞外で作出された分子、又は(ii)上記(i)において記載された分子の複製により生じる分子を指す。本目的において、複製はインビトロでの複製又はインビボでの複製であり得る。
【０１６２】
核酸は、当技術分野において公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的結合反応に基づき作出できる。例えば、上述のSambrook et al.及び上述のAusubel et al.を参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を増加させるためや、ハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように、さまざまに改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学的に合成することができる。核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-置換アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル及び2,6-ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。選択的に、本発明の核酸の1又は複数は、例えばMacromolecular Resources社(Fort Collins, CO)及びSynthegen社(Houston, TX)などの企業から購入することもできる。
【０１６３】
本発明はまた、本明細書に記載されるいずれかの核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載されるいずれかの核酸のヌクレオチド配列にストリンジェントな状況下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０１６４】
ストリンジェントな状況下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェント条件」は、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能に強固な程度において、ヌクレオチド配列が標的配列（本明細書に記載されるいずれかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェント条件には、完全な相補的配列を有するポリヌクレオチド又はわずかに散在しているミスマッチを含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列がマッチしたわずかな短領域（例えば、3-10塩基）を偶然に有するランダム配列から区別する条件が含まれる。そのような相補的な短領域は、14-17又はそれ以上の塩基の全長の相補体よりも容易に融解するので、高ストリンジェントハイブリダイゼーションによりそれらを容易に区別することができる。比較的高いストリンジェント条件には、例えば、約0.02-0.1 M NaCl又はそれ相当、約50℃-70℃の温度によって与えられる、低塩及び／又は高温条件が含まれる。そのような高いストリンジェント条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のあるとしてもわずかなミスマッチを許容し、本発明のいずれかのPE又はキメラ分子の発現の検出に特に適切である。条件は、ホルムアルデヒド量を増量して追加することより、さらにストリンジェントにすることができることが一般的に認識されている。
【０１６５】
本発明はまた、本明細書に記載されるいずれかの核酸に対して約70％若しくはそれ以上、例えば、約80％若しくはそれ以上、約90％若しくはそれ以上、約91％若しくはそれ以上、約92％若しくはそれ以上、約93％若しくはそれ以上、約94％若しくはそれ以上、約95％若しくはそれ以上、約96％若しくはそれ以上、約97％若しくはそれ以上、約98％若しくはそれ以上、又は約99％若しくはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０１６６】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターへ組み入れることができる。この点において、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本目的に対して、用語「組換え発現ベクター」は、構築物がmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内においてmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるのに十分な条件下においてベクターが細胞に接触したとき、宿主細胞によってmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を意味する。本発明のベクターは、全体としては天然に生じるものではない。しかしながら、ベクターは、部分的には天然に生じ得る。本発明の組換え発現ベクターは、あらゆるタイプのヌクレオチドを含み得、これには一本鎖又は二本鎖であり得、天然源より一部において合成又は獲得され得、及び、天然、非天然又は変更されたヌクレオチドを含有し得るDNA及びRNAが含まれるが、これらに限定されない。組換え発現ベクターは、天然に生じるヌクレオチド間結合、天然には生じないヌクレオチド間結合、又はその両方のタイプの結合が含まれ得る。好ましくは、天然には生じないヌクレオチド若しくは変更されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合はベクターの転写及び複製を妨げない。
【０１６７】
本発明の組換え発現ベクターは、あらゆる適切な組換え発現ベクターであり得、かつ、あらゆる適切な宿主細胞を形質転換又は遺伝子導入するために用いられ得る。適切なベクターには、プラスミドやウイルスのような、増殖及び増大用若しくは発現用又はその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、pUCシリーズ(Fermentas Life Sciences社)、pBluescriptシリーズ(Stratagene社、LaJolla、CA)、pETシリーズ(Novagen社、Madison、WI)、pGEXシリーズ(Pharmacia Biotech社、Uppsala、Sweden)及びpEXシリーズ(Clontech社、Palo Alto, CA)からなる群から選択され得る。λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene社)、λEMBL4及びλNM1149などのバクテリオファージベクターもまた用いることができる。植物発現ベクターの例には、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及びpBIN19(Clontech社)が含まれる。動物発現ベクターの例には、pEUK-Cl、pMAM及びpMAMneo(Clontech社)が含まれる。好ましくは、組換え発現ベクターは、例えばレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【０１６８】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば上述のSambrook et al.及び上述のAusubel et al.において記載される標準的な組換えDNA技術を用いて調製し得る。環状又は線状である発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製し得る。複製系は、例えばColEl、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
【０１６９】
望ましくは、組換え発現ベクターは、必要に応じてそのベクターがDNAベースであるかRNAベースであるかを考慮して、ベクターが組み込まれる宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な、転写及び翻訳開始及び終止コドンなどの調節配列を含む。
【０１７０】
組換え発現ベクターは、形質転換又は遺伝子導入された宿主の選択を可能とする1又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質、重金属などの殺生物剤耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【０１７１】
組換え発現ベクターは、本発明のPE又はキメラ分子（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、又は、PE又はキメラ分子をコードするヌクレオチド配列と相補的であるか若しくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、天然又は非天然のプロモーターを含み得る。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、例えば、非ウイルスプロモーター、又は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター若しくはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列中に見出されるプロモーターなどの、ウイルスプロモーターであり得る。
【０１７２】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために製造され得る。
【０１７３】
本発明の別態様は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含有し得るあらゆるタイプの細胞を指す。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌又は藻類などの真核生物細胞であり得、又は、例えば、細菌又は原生生物などの原核生物細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞、接着細胞又は浮遊細胞、即ち、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。本発明のPE又はキメラ分子を製造する目的に対して、宿主細胞は、好ましくは例えば大腸菌細胞などの原核生物細胞である。
【０１７４】
本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も本発明によって提供される。細胞集団は、例えば、いずれの組換え発現ベクターも含まない宿主細胞などの、少なくとも1つの他の細胞に加えて、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均質な細胞集団であり得る。選択的に、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、このとき、集団は集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、組換え発現ベクターを含む宿主細胞から本質的に構成される）。集団は、細胞のクローン集団でもあり得、このとき、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む。本発明の一態様において、細胞集団は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞のクローン集団である。
【０１７５】
本発明のPE、キメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び細胞集団は、単離及び/又は精製され得る。本明細書において用いられる用語「単離された」は、その天然の環境から取り出されたことを意味する。本明細書において用いられる用語「精製された」は、純度において向上したことを意味し、ここで「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度として解釈されない。例えば、純度は、約50%若しくはそれ以上、約60%若しくはそれ以上、約70%若しくはそれ以上、約80%若しくはそれ以上、約90%若しくはそれ以上又は約100%であり得る。純度は、好ましくは、約90%又はそれ以上（例えば、約90%〜約95%）であり、より好ましくは約98%又はそれ以上（例えば、約98%〜約99%）である。
【０１７６】
本発明のPE、キメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び細胞集団（これらすべてを、これ以降集合的に「本発明のPE材料」と称する）は、例えば薬学的組成物といった組成物へ製剤化され得る。この点において、本発明は、PE、キメラ分子（機能的部分及び機能的バリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び細胞集団のいずれか及び薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明のPE材料のいずれかを含有する本発明の薬学的組成物は、本発明のPE材料のほか、例えば、ポリペプチド及び核酸又は2又はそれ以上の異なったPEを含み得る。選択的に、薬学的組成物は、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤などの、1又は複数の他の薬学的に活性な作用物質又は薬剤と組み合わせて本発明のPE材料を含み得る。
【０１７７】
好ましくは、担体は薬学的に許容される担体である。薬学的組成物に関して、担体は慣習的に用いられるもののいずれかであってよく、例えば溶解度や活性化合物との反応性の欠如、並びに投与経路などの物理化学的な考慮によってのみ制限される。例えば、ビヒクル、アジュバンド、賦形剤及び希釈剤などの本明細書に記載される薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、一般に容易に利用可能である。薬学的に許容される担体は、活性薬剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下において有害な副作用又は毒性がないものが好ましい。
【０１７８】
担体の選択は、本発明の特定のPE材料によって、並びに、本発明のPE材料の投与に用いられる特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の適切な製剤は多様である。非経口投与（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋内、皮内、腹腔内（interperitoneal）及び髄腔内）、経口投与及びエアロゾル投与のための以下の製剤は典型例であり、何ら限定ではない。複数の経路が本発明のPE材料の投与に用いられ得、ある場合において、特定の経路が他の経路よりも、より即時かつより効果的な反応を提供し得る。
【０１７９】
局所的な製剤は当業者にとって周知である。そのような製剤は、本発明との関連において皮膚への適用が特に適切である。
【０１８０】
経口投与に適した製剤は、以下を含み得る:（ａ）例えば、水、生理食塩水又はオレンジジュースなどの希釈剤中に溶解させた有効量の本発明のPE材料などの、液体溶液；（ｂ）それぞれ、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む、カプセル、サシェ剤（sachet）、錠剤、ロゼンジ及びトローチ（troche）；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁物；及び（ｅ）適切な乳濁物。液体製剤は、薬学的に許容される界面活性剤の添加あり又はなしのいずれかの、水及び、例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールといったアルコールなどの希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤及び、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチといった不活性フィラーを含む、通常の硬ゼラチン型又は軟ゼラチン型のものであり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、加湿剤、保存剤、香味料及び他の薬理学的に適合性の賦形剤の１又は複数を含み得る。ロゼンジ形態は、通常はスクロース及びアラビアゴム又はトラガントである香料中に、本発明のPE材料を含み得、トローチ（pastille）は、当技術分野において公知のそのような賦形剤を含有するに加えて、例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴムといった不活性基剤、乳濁物、ゲルなどの中に、本発明のPE材料を含み得る。
【０１８１】
本発明のPE材料は、単独又は他の適切な構成要素と組み合わせて、吸入を介して投与するために、エアロゾル製剤化され得る。これらのエアロゾル製剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴霧剤中に入れられ得る。エアゾール製剤はまた、例えばネブライザー又はアトマイザー中などの、非加圧製剤の医薬品として製剤化されてもよい。そのようなスプレー製剤は、粘膜にスプレーするためにも使用されてよい。
【０１８２】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤と意図したレシピエントの血液とを等張にする溶質を含み得る水性又は非水性の等張無菌注射溶液、並びに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁物が含まれる。本発明のPE材料は、薬学的に許容される界面活性剤（例えば、石鹸又は洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロース）、又は乳化剤及び他の薬学的アジュバントの添加あり又はなしの、薬学的担体（例えば、無菌の液体又は液体混合物（水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連の糖溶液、アルコール（例えば、エタノール又はヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール（例えば、2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノール）、エーテル、ポリ（エチレングリコール）400、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む））中の生理学的に許容される希釈剤中で投与され得る。
【０１８３】
非経口製剤で使用され得る油には、石油、動物油、植物油又は合成油が含まれる。油の具体的な例には、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油が含まれる。非経口製剤における使用に適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０１８４】
非経口製剤における使用に適した石鹸には、脂肪酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が含まれ、適切な洗剤には以下が含まれる:(a)例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライドなどのカチオン性洗剤、(b)例えば、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、オレフィン硫酸塩、エーテル硫酸塩及びモノグリセリド硫酸塩、並びにスルホコハク酸塩などのアニオン性洗剤、(c)例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン性洗剤、(d)例えば、アルキル-β-アミノプロピオン酸塩及び2-アルキル-イミダゾリン第4級アンモニウム塩などの両性洗剤、並びに(e)それらの混合物。
【０１８５】
非経口製剤は、典型的には、約0.5重量%から約25重量%の本発明のPE材料を溶液中に包含する。保存剤及び緩衝剤が使用されてもよい。注射部位での刺激を最小化又は排除するために、そのような組成物は、約12から約17までの親水性・親油性バランス(HLB)を有する1又は複数の非イオン性界面活性剤を含有してもよい。そのような製剤における界面活性剤の量は、典型的には、約5重量%から約15重量%の範囲である。適切な界面活性剤には、ソルビタンオレイン酸モノエステルなどのポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、及び、酸化プロピレンとプロピレングリコールの縮合により形成される、疎水性塩基とエチレンオキシドとの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、例えば、単一用量又は複数用量の、アンプル及びバイアルなどの密封容器中に提示され得、使用直前の、例えば注射用水などの無菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時の注射溶液及び懸濁物は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製し得る。非経口組成物のための有効な薬学的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B.Lippincott Company, Philadelphia,PA,Banker及びChalmers編、頁238-250(1982)、及びASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 第４版、頁622-630(1986)を参照されたい）。
【０１８６】
上述された薬学的組成物に加えて、本発明のPE材料が、例えばシクロデキストリン包接錯体などの包接錯体又はリポソームとして製剤化することができることは、当業者に理解される。
【０１８７】
本発明の目的に対して、投与される本発明のPE材料の量又は容量は、例えば、合理的な期間に渡って、哺乳動物において治療的又は予防的な反応といった所望の反応を生じさせるのに充分なものであるべきである。例えば、本発明のPE材料の用量は、例えば、投与時点から12〜24時間又はそれ以上といった、約2時間又はそれ以上よりの期間において、標的細胞の成長を阻害し、又は癌を治療若しくは予防するのに充分であるべきである。ある特定の態様において、期間はさらに長期間であり得る。用量は、本発明の特定のPE材料の有効性、及び哺乳動物（例えば、ヒト）の状態、並びに、治療される哺乳動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【０１８８】
投与される用量を決定するための多数のアッセイが当技術分野において公知である。投与される用量は、インビトロ(例えば、細胞培養)又はインビボ（例えば、動物実験）で決定されてもよい。例えば、投与される用量は、IC50（徴候の半数阻害を達成する用量）、LD50（集団の50%が致死となる用量）、ED50（集団の50%において治療的に有効である用量）、及び、細胞培養及び／又は動物実験における治療指数を決定することにより決定してもよい。治療指数は、ED50に対するLD50の比（すなわち、LD50／ED50）である。
【０１８９】
本発明のPE材料の用量は、本発明の特定のPE材料の投与に伴い得るあらゆる有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。典型的には、担当医は、個々の患者を治療するに際して用いる本発明のPE材料の用量を、例えば、年齢、体重、全体的健康、食習慣、性別、投与される本発明のPE材料、投与経路及び治療される状態の重症度などのさまざまな因子を考慮して決定する。例示であって、本発明の限定を意図するものではないが、本発明のPE材料の用量は、約0.001〜約1000 mg/ kg治療対象の体重/日、約0.01〜約10 mg/kg体重/日、約0.01〜約1 mg/kg体重/日、約1〜約1000 mg/kg体重/日、約5〜約500 mg/kg体重/日、約10〜約250 mg/kg体重/日、約25〜約150 mg/kg体重/日又は、約10 mg/kg体重/日であり得る。
【０１９０】
選択的に、本発明のPE材料はデポー形態へ改変され得、この結果、体内での時間及び部位の観点で、投与される体への本発明のPE材料の放出様式が制御される（例えば、米国特許4,450,150を参照されたい）。本発明のPE材料のデポー形態は、例えば、本発明のPE材料及び、例えば、ポリマーなどの多孔性又は非多孔性の材料を含む埋め込み可能な組成物であり得、ここで、本発明のPE材料は、当該材料によりカプセル化され、又は当該物質を通して拡散し、及び／又は、非多孔性材料の分解を通して拡散する。デポーは、その後体内における所望の部位に埋め込まれ、本発明のPE材料が所定の比率で当該埋没物から放出される。
【０１９１】
本発明のPE材料は、当技術分野に公知のアッセイによって細胞毒性をアッセイされてもよい。細胞毒性アッセイの例には、国際特許出願公開WO2011/032022に記載されるように、テトラゾリウム塩WST-1を用いて細胞増殖を測定するWSTアッセイ(Roche Applied Sciences社より入手可能な試薬及びキット)が含まれる。
【０１９２】
本発明の薬学的組成物、PE、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、癌を治療又は予防する方法において使用し得ると考えられている。特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、本発明のPEは、例えば、伸長因子2（EF-2）のADPリボシル化の不活性化によって、真核生物細胞におけるタンパク質合成の阻害を通して、細胞の破壊又は細胞増殖を阻害すると考えられている。特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、本発明のキメラ分子は、細胞表面マーカーを認識し、それに特異的に結合することによって、当該細胞表面マーカーを発現していない細胞には最小限の交差反応又は交差反応することなしに、細胞毒性のあるPEを、細胞表面マーカーを発現している細胞集団へ送達する。この様式において、PEの細胞毒性は、例えば癌細胞などの特定の細胞集団の破壊又はその成長を阻害するために標的化し得る。この点において、本発明は、本明細書に記載されるPE、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は薬学的組成物のいずれかを、哺乳動物において癌を治療又は予防するのに有効な量で投与する工程を含む、哺乳動物における癌を治療又は予防する方法を提供する。
【０１９３】
本明細書で用いられる用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれらに起因する語は、必ずしも100%又は完全な治療若しくは予防を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の治療及び予防が存在する。この点において、本発明の方法は、あらゆる量の、あらゆるレベルでの哺乳動物における癌の治療又は予防を提供し得る。なお、本発明の方法によって提供される治療又は予防には、例えば、癌などの、治療又は予防される疾患の1又は複数の状態又は症状の治療又は予防が含まれ得る。また、本発明の目的に対して、「予防」は、疾患又はその症状若しくは状態の発生を遅らせることを包含し得る。
【０１９４】
本発明の方法の目的に対して、宿主細胞又は細胞集団が投与される場合、細胞は宿主に対して同種又は自家性の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、宿主に対して自家性である。
【０１９５】
本発明の方法に関して、癌は、以下のいずれかを含むあらゆる癌であり得る:副腎癌、肉腫(例えば、滑膜肉腫、骨肉腫、子宮平滑筋肉腫(leiomyosarcoma uteri)、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫)、リンパ腫(例えば小リンパ球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、肝細胞癌、神経膠腫、頭部癌(例えば、扁平上皮癌)、頸部癌(例えば、扁平上皮癌)、急性リンパ球性癌、白血病(例えば、有毛細胞白血病、骨髄性白血病（急性及び慢性）、リンパ性白血病（急性及び慢性）、前リンパ球性白血病(PLL)、骨髄単球性白血病（急性及び慢性）、及びリンパ性白血病（急性及び慢性）、骨癌（骨肉腫、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫(骨軟骨腫(osteocartilaginous exostoses))、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、及び巨細胞腫）、脳癌（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫及び網膜芽細胞腫）、卵管癌、乳癌、肛門、肛門管又は肛門直腸の癌、目の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢又は胸膜の癌、鼻、鼻腔又は中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌(例えば、扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌及び線維肉腫)、骨髄増殖性疾患(例えば、慢性骨髄性癌)、大腸癌（例えば、結腸癌）、食道癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫及びリンパ腫）、子宮頸癌（子宮頸癌及び浸潤前子宮頸部異形成）、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、下咽頭癌、喉頭癌、肝癌（例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫及び血管腫）、肺癌（例えば、気管支原性肺癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞及び腺癌)、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌及び肺腺癌）、中皮腫、皮膚癌（例えば、メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫及びケロイド）、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、卵巣癌（例えば、卵巣癌(漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜癌及び明細胞腺癌)、顆粒膜-卵胞膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫及び悪性奇形腫）、膵臓癌（例えば、管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍及びVIP産生腫瘍）、腹膜癌、網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌（例えば、腺癌及び肉腫）、直腸癌、腎臓癌（例えば、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）及び、腎細胞癌）、小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫及び線維腫）、軟部組織癌、胃癌（例えば、細胞腫、リンパ腫及び平滑筋肉腫）、精巣癌（例えば、セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、ライディッヒ細胞腫、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍及び脂肪腫）、子宮癌（例えば、子宮内膜癌）、甲状腺癌及び尿路上皮癌（例えば、扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、尿管癌及び膀胱癌）。
【０１９６】
本明細書において用いられる用語「哺乳動物」はあらゆる哺乳動物を指し、これにはマウス及びハムスターなどのネズミ目の哺乳動物、及びウサギなどのウサギ目の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含むネコ目であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ亜科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目、又はウマ科（ウマ）を含む奇蹄目であることがより好ましい。哺乳動物は、サル目、セボイド（Ceboids）目、若しくはシモイド（Simoids）目（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【０１９７】
また、標的細胞の成長を阻害するのに有効な量で本明細書に記載されるPE、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は薬学的組成物のいずれかのPEを細胞へ接触させる工程を含む、標的細胞の成長を阻害する方法も提供される。標的細胞の成長は、あらゆる量で阻害され得、例えば、約10%若しくはそれ以上、約15%若しくはそれ以上、約20%若しくはそれ以上、約25%若しくはそれ以上、約30%若しくはそれ以上、約35%若しくはそれ以上、約40%若しくはそれ以上、約45%若しくはそれ以上、約50%若しくはそれ以上、約55%若しくはそれ以上、約60%若しくはそれ以上、約65%若しくはそれ以上、約70%若しくはそれ以上、約75%若しくはそれ以上、約80%若しくはそれ以上、約85%若しくはそれ以上、約90%若しくはそれ以上、約95%若しくはそれ以上、又は約100％で阻害されてよい。標的細胞は、生物学的試料において提供されてもよい。生物学的試料は、哺乳動物から、あらゆる適切な様式及びソースより獲得されてもよい。生物学的試料は、例えば、採血、白血球除去輸血及び／又は腫瘍生検若しくは死体解剖により獲得されてもよい。接触させる工程は哺乳動物に関してインビロト又はインビボで行われ得る。好ましくは、接触させる工程はインビトロで行われる。
【０１９８】
本発明の一態様において、標的細胞は癌細胞である。標的細胞は、本明細書に記載される癌のいずれかの癌細胞であってもよい。本発明の一態様において、標的細胞は細胞表面マーカーを発現してもよい。細胞表面マーカーは、本発明の他の側面に関して、本明細書に記載されるあらゆる細胞表面マーカーであってよい。細胞表面マーカーは、例えば、CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、トランスフェリンレセプター、EGFレセプター、メソテリン、カドヘリン及びルイスYからなる群から選択されてもよい。
【０１９９】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、それらは当然に何ら本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２００】
[実施例1]
本実施例は、PE38のドメインIIIにおけるT細胞エピトープの同定を説明する。
【０２０１】
PE38におけるT細胞エピトープを同定するために、末梢血単核球（PBMC）を組換え免疫毒素（RIT）とともに14日間インキュベートし、T細胞に提示される関連するペプチドに対するドナーAPCによってRITを処理させた。濃縮されたPBMCは、その後、PE38の配列にまたがる111の部分的に重複するペプチドからなるペプチドライブラリーへ暴露され、T細胞活性化をインターロイキン-2(IL-2)に対するELISpotアッセイを用いて測定した。
【０２０２】
以前にPE38へ暴露された記録のない50人の正常ドナー由来の試料及びヒト白血球抗原（HLA）遺伝子座の広域分布を有する試料を解析した。本集団の細胞は、ナイーブT細胞エピトープを含有した。以前にPEベースのRITで治療され、高いレベルの中和抗体を生じた9人の中皮腫及び7人の有毛細胞白血病（HCL）患者由来の試料も解析した。本集団の細胞は、メモリーT細胞エピトープを含有した。未処理のドナー及び予め処理された患者の反応は、図1A-1Bにおいてヒートマップ形式で示される。
【０２０３】
図1Aは50人の未処理のドナーの陽性及び陰性反応を表す。反応は、各ドナーの反応スポットの割合として示される。最も強い陽性反応は、>20%と示され、中程度の反応は、10%-20%と示され、弱い反応は、3%-10%と示され、無反応（陰性）は、<3%と示される。結果には全258の陽性反応が含まれ、このうち201が弱く(3%-10%)、44が中程度（10%-20%）及び13が強く(>20%)、残りの全5292が陰性反応（<3%）であった。ドメインII（ペプチド1-38）においては122の反応があり、11の強い反応、24の中程度の反応、87の弱い反応が含まれた。ドメインIII(ペプチド39-111)においては136の反応があり、2の強い反応、20の中程度の反応及び114の弱い反応が含まれた。
【０２０４】
ペプチド15及び14（プール3）が、本研究において最も強く、かつ最も高頻度の反応を与え、それぞれ21及び18の陽性反応を示した。全体で36のペプチドは、全く反応を呈しなかった。50人の未処理のドナーのうちの16人は、重複する連続したペプチドにおける1つ、2つ又は3つの反応によって示される、反応する単一のエピトープを有した。15人のドナーは、2つの区別されるエピトープを有し、14人は3つのエピトープを有し、及び、5人は4つのエピトープを有した。22の機会のうち、陽性プールの詳細な評価は特定のペプチド反応を与えず、又は評価は行われず、結果としてヒートマップにおける5つの連続した陽性反応が得られた。
【０２０５】
図1Bは、9人の中皮腫患者及び7人のHCL患者の陽性反応及び陰性反応を示す。中皮腫患者は919の陰性反応及び80の陽性反応を与え、陽性反応の内訳は、2の強い反応(>20%)、4の中程度の反応(10-20%)及び74の弱い反応(3-10%)であった。2つの強い反応は、ペプチド13及び14におけるものであり、中程度の反応は、ペプチド15、35、57及び74におけるものであった。35の反応がドメインII（ペプチド1-38）におけるものであり、45の反応がドメインIII(ペプチド38-111)におけるものであった。マップに生じたホットスポットパターンは、未処理のドナーのマップにおけるホットスポットパターンと類似している。反応性（いくつのエピトープが各患者において見いだされるかを意味する）は、ドナーのパターンよりも高く、1人の患者は2つのエピトープを有し、4人の患者は3つのエピトープを有し、2人の患者は4つのエピトープを有し、さらに2人の患者は5つのエピトープを有していた。
【０２０６】
さらに、7人のHCL患者は、3の強い反応(>20%)、9の中程度の反応(10-20%)、37の弱い反応(3-10%)、及び728の陰性反応(<3%)を与えることが分かった。強い反応は全て連続するペプチド75、76及び77におけるものであった。22の反応がドメインIIにおけるものであり、37の反応がドメインIIIにおけるものであった。興味深いことに、40%以上の未処理のドナー及び55%以上の中皮腫患者（9試料中、5試料）において同定されたペプチド14及び15における免疫優勢エピトープは、HCL患者において単独の反応を有さなかった。1人の患者が、ペプチド14及び15と共通するアミノ酸を有するペプチド12及び13に対して反応した。しかしながら、ペプチド14及び15に対して直接的な反応は見られなかった。これは、これらの患者の試料の偏りのあるHLA分布、又は当該疾患の性質に起因するものであり得る。
【０２０７】
全体として、反応の93%を占める8つの主要なエピトープがPE38において同定された。ドメインIIにおけるすべてのT細胞エピトープはLR欠失を用いることにより排除できるため、ドメインIIIに残存する5つのエピトープを以降の研究において重点的に取り組んだ。表1Aは、エピトープの位置、配列、反応率及び細胞毒性に影響を与えずにそれらを減弱させる変異をまとめたものである。エピトープランキングを、エピトープに反応する未処理のドナー数、反応の相対的な強さ、反応した中皮腫患者数、及び、より少ない程度において、HCL患者の反応数を含めた多数の因子から構成した。HCL患者由来のエピトープは、患者コホートのHLAバイアス、及びHCL患者集団においては、HCL患者はBRB_11の濃縮を有する(Annino et al., Leuk. Lymphoma, 14 (Suppl.) 1:63-5 (1994))との理由から、本研究においてはより少ない程度に評価した。エピトープ2は5つのペプチドにわたっている。解析を単純化するために、それを、2つのサブエピトープ:ペプチド77-78(2A)及びペプチド75-76(2B)へと分割した。何人かのドナーは2A及び2Bエピトープ両方に対して反応したが、他の患者は一方にのみ反応した。エピトープ6(ペプチド93-96)及びエピトープ8（ペプチド56-59）もまた2つのサブエピトープへ分割した。
【０２０８】
【表１Ａ】
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【０２０９】
未処理のドナーから免疫毒素で処理された患者までの結果を比較するため、RITに対する中和抗体を産生した2つの患者コホートを調査した。患者のDRB1 HLA対立遺伝子は表1Bに示される。ドナーコホートにおいて同定された同一エピトープは、当該患者コホートにも存在した。1つのコホートは、SS1P(P38に融合した抗メソテリンFv) (Chowdhury et al., Nat. Biotechnol., 17: 568-572 (1999))で処理された中皮腫患者からなり;もう一方は、モキセツモマブシュードトクス(moxetumomab pasudotox)(MP)、抗CD22Fvに融合したPE38を含むRIT(Kreitman et al., Clin. Cancer Res., 17: 6398-6405 (2011))で処理された白血病患者からなった。未処理のドナーのエピトープ反応はドナー当たり1-4エピトープの範囲で、平均は2.1であったが、患者の反応は、患者当たり1-7の範囲にあり、平均は3.4とより高かった(スチューデントT検定でP<0.001)。これにより、未処理のドナーにおける一部の反応は、本方法によって検出するには弱すぎたこと及び免疫毒素への暴露後に増幅されたことが示唆される。患者試料は、ドナーのコホートを用いて同定されなかったあらゆる主要なエピトープを同定しなかった。
【０２１０】
【表１Ｂ】
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【０２１１】
[実施例２]
本実施例は、ドメインIIIにおけるT細胞エピトープの排除を説明する。
【０２１２】
表1に記載されるドメインIIIにおける各エピトープに対して、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施した。アラニン変異体を、以下の11の工程に基づいて、RITへ組み込んだ:(1)各エピトープに対するすべてのアラニンペプチドバリアントのリストを作成し;(2)インシリコ予測を実施し、13の主要なHLAグループへの結合能を測定するHLA結合アルゴリズム（Immune Epitope Database、IEDB）(Wang et al., PLoS Comput. Biol., 4:e1000048 (2008))を用いて、少なくとも6つのHLA対立遺伝子に対して増加した結合を有するアラニンバリアントを除外し;(3)8-15のドナー及び患者試料を用いて、インビトロでの増殖及びELIspotによってアラニンバリアントをアッセイし;(4)T細胞活性化が減少したアラニン変異体を同定し;(5)前記アラニン変異体をHA22-LRプラスミドへクローニングし、単一点突然変異を有するようにRITを構築し;(6)WST8アッセイを用いて活性を調査した。
【０２１３】
タンパク質が凝集した、又は低い細胞毒性を有する場合は、(7)インシリコでの予測及び結晶構造を用いて、アラニンに対する別のアミノ酸を同定し、(8)新規変異体をHA22-LRプラスミドへクローニングし、単一点突然変異を有するRITを構築し、活性を調査した。タンパク質が凝集した、又は低い細胞毒性を有した場合は、工程(4)及び(5)を実行し、次善のアラニン変異体を同定した。タンパク質が活性を有する場合は工程(10)を実行した。
【０２１４】
タンパク質が活性を有する場合、(10)エピトープが減弱しているかどうか、及び当該変異に起因して新たなエピトープが創出されていないことを決定するために検証を実行し、(11)良好な点突然変異体を単一のRITへ結合させた。
【０２１５】
すべてのエピトープに対する結果は、表2-表7に示される。表2-表7において、下線が付された値は<10%であることを示し、D=ドナーであり、Pt=患者であり、「Meso」=中皮腫である。アラニンバリアントは、8-15のドナー及び患者試料を用いて、インビトロでの増殖及びELIspotによってアッセイした。
【０２１６】
【表２】
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【０２１７】
【表３】
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【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
【表５】
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【０２２０】
【表６】
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【０２２１】
【表７】
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【０２２２】
エピトープ2A及び2Bは、応答を与えるすべての5つのぺプチドの9merのコアをカバーするために、別々にスキャンした。Y502Aは両方のエピトープの反応を減弱させた(表2及び表3)。エピトープ5及び7に対して、アラニン変異体は、それぞれペプチド67及び51と比較され、I471A及びL423Aが最も低いT細胞応答を有した（表4及び表6）。4つの陽性ペプチドを含有するエピトープ6及び8におけるすべての9merのコアをカバーするために、18merの野生型及びアラニンバリアントを合成した。L552Aが、エピトープ6における応答を低減するにおいて最も有効であること（表5）及びF443Aがエピトープ8に対して最良であること(表7)が分かった。
【０２２３】
[実施例3]
本実施例は、HA22-LRにおける点突然変異タンパク質の細胞毒性について説明する。
【０２２４】
実施例2の工程4を実行した。アラニンスキャンにおいて同定された又はさらなるインシリコでの予測を用いて同定された最良のバリアントが表1Aに記載される。
【０２２５】
40の変異RITを構築した。HA22-LRにおける点突然変異タンパク質の細胞毒性を、CA46細胞、Raji細胞及びDaudi細胞に関して測定した。精製タンパク質の収量、野生型アミノ酸残基の計算接触面積（Lee et al., J. Mol. Biol., 55:379-400 (1971); Roscoe et al., Infect. Immunity, 62:5055-5065 (1994)）及び各RITの細胞毒性が、表8に示される。
【０２２６】
【表８】
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【０２２７】
[実施例４]
本実施例は、PEドメインIIIにおける置換がエピトープを減弱すること、及び当該変異に起因して新たなエピトープを創出しないことを説明する。
【０２２８】
HA22(野生型)又はLR-R494Aのいずれかによる刺激後の、3人のドナー試料及び1人の患者試料の22のペプチドプールに対する反応を測定した。「LR」は、フューリン切断配列を除くドメインIIの全ての欠失を意味する。結果は、図2A-2Dに示される。図2A-2Dに示されるように、ペプチド76におけるエピトープがR494A変異によって減弱された。
【０２２９】
HA22(野生型)又はLR-R505Aのいずれかによる刺激後の、2人のドナー試料及び1人の患者試料の22のペプチドプールに対する反応を測定した。結果は、図3A-3Cに示される。図3A-3Cに示されるように、ペプチド77におけるエピトープがR505A変異によって減弱された。
【０２３０】
HA22-LR(野生型)又はHA22-R551Aのいずれかにより刺激し、適切なペプチドにより再刺激後の、2人のドナーの22のペプチドプールに対する反応もまた測定した。結果は、図4A-4Bに示される。図4A-4Bに示されるように、変異R551Aは、ペプチド93におけるエピトープを減弱した。
【０２３１】
RITにより刺激し、かつ、野生型アミノ酸配列、L552E又はL552Nのいずれかを有するペプチド93、94により再刺激後の2人のドナー及び2人の患者由来の細胞の反応を測定した。結果は、図5A-5Dに示される。図5A-5Dに示されるように、ペプチド93及び94におけるエピトープは、L552N及びL552E変異によって減弱された。
【０２３２】
HA22-LR(野生型)又はLR-A427Aのいずれかにより刺激し、かつ適切なペプチドで再刺激後の3人のドナーの22のペプチドプールに対する反応もまた測定した。結果は、図6A-6Cに示される。図6A-6Cに示されるように、ペプチド51におけるエピトープがR427A変異によって減弱された。
【０２３３】
HA22-LR(野生型)又はLR-F443Aのいずれかにより刺激し、かつ適切なペプチドで再刺激後の2人の患者及び1人のドナーのプール8-22に対する反応を測定した。結果は、図7A-7Cに示される。図7A-7Cに示されるように、プール11及び12におけるエピトープがF443A変異によって減弱された。
【０２３４】
4人のドナー試料を、RITにより刺激し、かつ位置I471でバリン又はアラニン変異を含有するペプチド67により再刺激した。反応は、スポット形成細胞（SFC）/106細胞において図9A-9Dに示される。図9A-9Dに示されるように、変異I471Vは、ペプチド67におけるエピトープを減弱しなかった。
【０２３５】
位置L477でアラニン又はヒスチジン変異を含有する、又は変異を含有しない（野生型）のペプチド67又は68による刺激に対する反応として、T細胞活性化もまた測定した。結果（SFC/106細胞）は、表9及び図10A-10Dに示される。図10A-10D及び表9に示されるように、変異L477Hは、ペプチド67及び68におけるエピトープを減弱した。
【０２３６】
【表９】
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【０２３７】
2人の患者からの細胞をRITにより刺激し、かつ野生型のアミノ酸配列又はL556Vのいずれかを有するペプチド93、94又は95により再刺激した。結果は、図11A及びBに示される。変異L477Vは、ペプチド94におけるエピトープを減弱しなかった。
【０２３８】
[実施例5]
本実施例は、HA22-LRにおける変異の組合せの活性を説明する。
【０２３９】
T細胞エピトープを減弱するにおいて有効であった点突然変異を組み合わせ、かつ良好な細胞毒性を維持させるために、さまざまな点突然変異の組合せを含む遺伝子を設計した。遺伝子は、HA22-LR RITプラスミドへクローニングした。表10は構築された7つのRIT及び野生型のHA22-LRも示す。表10はまた2つの細胞株における細胞毒性及び計算維持T細胞応答を示す。計算維持T細胞応答は、変異がエピトープにおける応答を完全に排除すると仮定した場合に、各エピトープに対するエピトープヒートマップに示された反応の総和である。この計算は、応答強度を考慮していない。
【０２４０】
表10に示されるように、PE38のドナー評価において同定された258の反応のうち、136の反応がドメインIIIにおけるものであり、HA22-LRにおいても存在するものである。変異R505A、R427A及びF443A(HA22-LR-T2)によるペプチド(77-78)、(51-52)及び(57-58)におけるエピトープの排除により、計算応答は82反応へ減少し、野生型に比較して、CA46及びRaji細胞においてそれぞれ280％及び135％の相対活性を有する非常に活性の高いタンパク質を維持した。HA22-LR-T3は4つの変異:R505A、R427A、F443A及びR494Aを含有し、55%及び50%の減弱された活性を有した。HA22-LR-T7も4つの変異(R505A、R427A、F443A及びR551A)を有し、CA46及びRaji細胞において113%及び100%の相対活性との良好な細胞毒性を有した。HA22-LR-T5の構築に対して、5つの変異R505A、R494A、L427A、R551A及びF443Aが挿入され、それにより計算維持応答が39反応へと減少した。しかしながら、当該タンパク質の細胞毒性は24%及び19%の相対活性へと大幅に減少し、EC50も>1 ng/mlであった。HA22-LR-T9も5つの点突然変異（R505A、R427A、F443A、R494A及びL477A)を有した。T9は、46の計算維持応答を有し；すべての46の維持応答は弱い、又は中程度のものであった。当該タンパク質は、EC50<1 ng/mlの細胞毒性を維持し、CA46及びRaji細胞におけるそれぞれ36%及び26%の相対活性を有した。HA22-LR-T11は、T9におけるL477AをL477Hへ置換するもので、CA46における相対活性は85%で、その活性を0.2 ng/mlへ改善した。最後に、T18（「LMB-T18」とも称される）は6つの変異を含有する最初のRITであり、同定されたすべての主要なエピトープを減弱した。当該タンパク質は、IC50<0.3 ng/mlとの良好な相対活性を有し、かつ、HA22-LRに比較して、CA46及びRaji細胞において63%及び104%の相対活性を有した。細胞毒性を改善するために、Gly-Gly-Serペプチドリンカーをフューリン切断サイト後に挿入した。
【０２４１】
【表１０】
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【０２４２】
T3及びT18の細胞毒性の特性を特徴づけるために、CD22を発現する4つの細胞株: ca46、Raji、Daudi及びHAL-01において、WST-8アッセイを行った。各アッセイは、3回行った。表11Aは、各細胞株の平均EC50値を示す。HA22-LR-T3及びHA22-LR-T18は、親分子のHA22-LR-GGSよりも幾分弱いものの、非常に細胞毒性が強かった。HA22-LR-GGSに比較して、HA22-LR-T18は、4つの細胞株において、28%-55%にわたる相対活性とIC50<1 ng/mlを示した。HA22-LR-T3もまた非常に活性が強いものの、T18よりは活性が弱い。
【０２４３】
【表１１Ａ】
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【０２４４】
LMB-T18の細胞毒性アッセイは、4つのCD22発現細胞株において実施し、MPの細胞毒性と比較した（図27A、表11B）。LMB-T18は、すべての細胞株においてEC50<10 pMであり、非常に強力だった。MPと比較して、LMB-T18はCA46細胞における活性において53%、Daudi細胞において54%及びHAL-01細胞において>200%のわずかな増加を有した(スチューデントT検定において、それぞれp=0.2、0.06及び0.01);しかしながら、Raji細胞においては、LMB-T18は、52%の活性の減少を有した(スチューデントT検定においてP=0.3)。特定の理論や作用機序に拘束されるものではないが、Raji細胞における活性の減少は、おそらくドメインIIの欠損に起因するものであると考えられる(Weldon et al., Blood, 113: 3792-3800 (2009))。LMB-T18の安定性は、さまざまな温度で15分間加熱し、その後冷却した試料でMPと比較し、Raji細胞への残存する細胞毒性を測定した(図27B)。MPは、56℃で15分のインキュベーション後に、その活性の50%を喪失した。予想外にも、LMB-T18は、より熱耐性であり（スチューデントT検定においてp<0.05）;その活性の50%を喪失したのは、70℃で15分のインキュベーション後であった。7人のHCL患者及び6人の慢性リンパ性白血病(CLL)患者由来の細胞が、患者細胞に対する活性を決定するために用いられた。図27C-Dは、LMB-T18がCLL細胞に対してMPよりも活性が高いが、HCL細胞に関しては、この違いは見られないことを示す。
【０２４５】
【表１１Ｂ】
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【０２４６】
[実施例6]
本実施例は、B及びT細胞エピトープ改変RITの相対活性を説明する。
【０２４７】
PE38におけるB細胞エピトープが以前に同定されており、抗原性を減少させるためにバルキーな表面残基をアラニン又はセリンによって変異させた(Liu et al., Protein Eng. Dec. Sel., (25)(1): 1-6 (2012))。低い抗原性を有する以前に同定された変異体RITはSS1LO10Rと名付けられ、それは次の変異を含有した:R505A、R427A、R490A、D463A、R467A、R538A。
【０２４８】
メソテリンを標的とする最小限の免疫原性RITを作製するために、LO10改変をSS1Pへ組み込み、その後T細胞エピトープ点突然変異を1つずつ組み込んだ。細胞毒性を、メソテリン発現細胞株（A9/431及びHAY）を用いて、各バリアントに対して試験した。2つの変異R505A及びR427Aが、B及びT細胞エピトープの両方を減弱するのに有効であることが分かった。
【０２４９】
表12は、2つの細胞株における変異PEの細胞毒性及び構築された組み合わせRITの計算維持応答をまとめたものである。SS1-LO10と単一点突然変異F443A(SS1-LO10-T2)の組合せは、HA22-LRにおけるこれらの点突然変異の活性に対応した高い(100%-115%)相対活性を有した。SS1-LO10-T1におけるR494A及びR551Aの組合せは、非常に低い活性を与え、これはR551A及びR494Aの組合せがHA22及びSS1-LO10の両方においてタンパク質活性を減弱することを意味する。
【０２５０】
【表１２】
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【０２５１】
SS1 LO10R-T11は、R505A、R427A、R494A、F443A及びL477Hを含有し、H9細胞において71%の活性を有したが、HAY細胞においては7%のみであった(HAYにおけるアッセイは1回実施)。T14及びT15は、R505A、R427A、R494A、F443A及びL477Hを含有するほか、追加の変異（それぞれL552E及びL552N）を含有し、H9細胞における>100%の相対活性及び>1ng/mlのIC50を有した。これら2つの変異体は、これまでに本計画においてなされた最大のT細胞脱免疫化(deimmunization)を示した。
【０２５２】
変異体T14は、B細胞エピトープ及び多くのTエピトープが除去されているにもかかわらず依然としてメソテリン発現細胞株への良好な細胞毒性を与えることから、臨床開発のための最良の候補として選択した。
【０２５３】
[実施例７]
本実施例は、T14の抗腫瘍活性を説明する。
【０２５４】
抗腫瘍実験は、生理食塩水(対照)又はT14をA431/H9異種移植片を有するヌードマウスに注射することによって実施した。腫瘍サイズは一日おきに測定し、ミリメートル（mm）で記録された。同時に、動物は体重を測定され、グラム(g)で記録された。結果は、以下の表13に示される。表13において、矢印は免疫毒素が注射された日を示す。表13に示されるように、7 mg/kg x3までの用量では、マウスにおける毒性徴候がなく許容的であった。加えて、大幅な腫瘍退縮がT14の全ての用量レベルにおいて見られた。
【０２５５】
【表１３】
0006584012.tif 000016
【０２５６】
[実施例8]
本実施例は、T18の熱安定性を説明する。
【０２５７】
T18の安定性は、さまざまな温度で15分間当該RITを熱することにより調べた。細胞毒性アッセイをその後実施した。さまざまに加熱した後のタンパク質のEC50を計算した。結果は図8に示される。EC50におけるフォールド増加（fold increase）が示される。図8に示されるように、T18は60℃において細胞毒性を維持し、68℃においてその活性の50%を喪失することが分かった。Leaver et al., Methods in Enzymology, 487: 545-74 (2011) 。
【０２５８】
[実施例9.1]
本実施例は、抗メソテリンFabフラグメント重鎖とPE24ドメインとの間に伸長されたリンカーを有する抗メソテリン脱免疫化PEキメラ分子の構築、発現及び精製、並びに当該リンカーにおける予想されたT細胞エピトープの除去について説明する。
【０２５９】
WO2012/154530及びWeldon et al., Mol. Cancer Ther., 12: 48-57 (2013)において用いられた、脱免疫化PEへ(VHドメインのC末端を介して)dsFVフラグメントを融合させるためのリンカー配列が、脱免疫化PEへ(CH1ドメインのC末端を介して)Fabフラグメントを融合するためにも用いられた。CH1ドメイン部分、リンカー及び部分的な脱免疫化PEの部分を含む、結果として生じたペプチド領域(配列番号:273)を、TEPITOPE解析(Bian et al., Methods, 34: 468-475 (2004))によって調べた。欧州（EU）及び米国の集団に対して関連のある潜在的なT細胞エピトープが、CH1ドメインとリンカーとの間の領域及びリンカーとPE24ドメインとの間の領域において同定された。潜在的なT細胞エピトープは、3又はそれ以下の信頼数(confidence number)によって特徴づけた。結果は、表14に示される。表14に示されるように、特定の伸長（配列番号:273）を有さないリンカー領域は、7つの潜在的なT細胞エピトープを示した。一つの潜在的なT細胞エピトープは移行領域WEQLGGSPT(配列番号:274)に位置し、その他の6つのT細胞エピトープは移行領域VEPKSCKAS(配列番号:275)に位置していた。これらの領域の両方とも欧州（EU）及びアジア集団に主に関連している。
【０２６０】
潜在的なT細胞エピトープは、各移行領域においてアミノ酸配列（インサート）を挿入することによって無効化されたが、それによりフューリン切断サイトの両端のいずれかにインサートが与えられた。配列DKTH（配列番号:276）は、フューリン切断配列（FCS）に直接的には隣接しない位置でリンカーへ挿入し、配列GGG（配列番号:277）は、潜在的なT細胞エピトープを有さないFCSへ直接的に隣接する位置でリンカーへ挿入した。結果として生じる伸長ペプチド領域は、a)CH1ドメインの部分、b)Fab融合エリアで伸長されたリンカー及びPE融合エリアで伸長されたリンカー、並びにc)配列番号:278のアミノ酸を含む脱免疫化PEの部分を含んでいた。伸長されたペプチド領域は、TEPITOPE解析を用いて検討し、その結果が表15Aに示される。表15Aに示されるように、伸長されたリンカーはTEPITOPE解析においてアラート(6又はそれ以上の信頼数)を発生させず、同時に、改善された安定性をもたらした(以下の実施例9.2を参照されたい)。
【０２６１】
【表１４】
0006584012.tif 000017
【０２６２】
【表１５Ａ】
0006584012.tif 000018
【０２６３】
[実施例9.2]
本実施例は、脱免疫化PE融合タンパク質及び配列番号:36の伸長されたリンカーを有する結合体の安定性を説明する。
【０２６４】
6つのFab-リンカー-PEバリアントを製造し、温度安定性及び凝集傾向の観点において比較した。6つのバリアントすべてが同一のSS1抗体のヒト化FabバリアントH1/L1を含有していたが、リンカー及びPE24変異体に関して異なっていた。リンカーに関しては、国際特許出願公開公報WO2012/154530(kasggrhrqprgweqlggs(配列番号:281))に記載されたリンカー又は追加されたアミノ酸(「ロングリンカー」;配列番号:36（dkthkasggrhrqprgweqlgggggs）)を有する伸長されたリンカーのいずれかが用られた。PE24バリアントとして、LRO10R、LRO10R-456A(配列番号:37)又はLRO10R-456A-551Aが構築物に使用された。
【０２６５】
図12-13は、33℃でインキュベートした後に、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって凝集ピーク下の期間面積を測定した、PE24バリアントLRO10R-456Aを有する2つの構築物の凝集のレベルを示す。図12-13における2つの構築物は、使用されるリンカーの点においてのみ異なっていた。配列番号:281のショートリンカーは構築物cFP-0170において用い、配列番号:36の伸長されたリンカーは構築物cFP-0171において用いた。
【０２６６】
図14-16は、動的光散乱（DLS）を用いて測定した構築物の熱安定性を示す。動的光散乱に関し、試料を20 mMヒスチジン／ヒスチジン塩化物、140 mM NaCl、pH 6.0において1 mg/mLの濃度で調製し、0.4 μmフィルタープレートを通して遠心分離によってオプティカル384ウェルプレートへ移し、パラフィンオイルで覆った。試料が25℃から80℃まで0.05℃/分の比率で加熱される間に、WYATT DYNAPROプレートリーダーIIにおいて、流体力学半径を動的光散乱によって繰り返し測定した。凝集開始温度は、流体力学半径が増加し始める温度として定義した。結果は図14-16に示される。6つの構築物のDLSカーブは、LRO10Rバリアントにおいてより高い凝集温度へと強くシフトしており、公開されている短いリンカーと比較して、伸長されたリンカーはより高い凝集温度を有することを示した。
【０２６７】
表15Bは、示差走査熱量測定(DSC)で測定された、構築物cFP-0170及びcFP-0171の熱安定性を示す。示差走査熱量測定は、MicroCal DSCシステム(GE Healthcare社)を用いて実施された。試料を20 mMヒスチジン/HCl、140 mM塩化ナトリウム、pH 6.0中に約1 mg/mlのタンパク質濃度へ調整した。参照セルを試料バッファーと対応するバッファーで充填した。試料を試料セルに入れ、60℃/時間の比率で4℃から110℃まで加熱した。プレスキャンは15分であり、フィルター時間は10秒であり、フィードバックモード／ゲイン(feedback mode/gain)は、パッシブ(passive)に設定した。熱転移温度(thermal transition temperature)の中間点(Tm又は熱転移温度)は、MicroCal DSC解析ソフトウェアを用いてデータを解析することによって得た。
【０２６８】
【表１５Ｂ】
0006584012.tif 000019
【０２６９】
図12-16及び表15Bにおいて示されるように、伸長されていないショートリンカーを有するキメラFab-PE分子と比較して、伸長されたリンカーを有するすべてのキメラFab-PE分子は、凝集に対する傾向が減少し、より高い凝集温度を呈した。
【０２７０】
[実施例10]
本実施例は、伸長されたリンカーを有する脱免疫化PE融合タンパク質の腫瘍細胞を死滅させる能力、及び細胞のタンパク質合成を阻害する能力を説明する。本実施例はまた、伸長された脱免疫化PE融合タンパク質の抗原性も説明する。
【０２７１】
タンパク質合成の阻害能に関し、さまざまなFab-PE24バリアントの作用強度を比較した。ルシフェラーゼを安定に遺伝子導入した膵臓癌細胞株ASPC-1(ASPC-1 Luc)のクローンを用いた。これらの細胞中のルシフェラーゼタンパク質は、その再合成の阻害から24時間以内に、測定可能な活性が顕著に低下するように高いターンオーバーを起こす。一時的に、細胞を96ウェルプレートに播種した。オーバーナイトでの培養後、さまざまな濃度のcFPバリアントを培地に加え、さらに72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、細胞を溶解し、製造業者の取扱説明書に従ってSTEADY-GLOWアッセイによりルシフェラーゼ活性を決定した。典型的な実験結果において、未処理の対照細胞からの溶解物に比較して、処理した細胞由来の溶解物ではルシフェラーゼ活性の80%-90%の減少が観察された。EC50値すなわち半数の有効を達成する濃度を、フリーの4パラメータフィット(a free four parameter fit)に基づき決定した。表16は、huFabLRO10RのIC50を1として、代表的な実験結果における相対作用強度を比較する。
【０２７２】
非標的化PE24(バリアントLR8M)は、>3.5 μg/mlの濃度でしか阻害せず、前述のヒト化SS1Fabフラグメントへ融合されたLRO10バリアントは、モルベースで〜500倍強力であった。LRO10R逆突然変異は、10から20倍作用強度を増加させた(EC50値1-2 ng/ml対18 ng/ml)。456A変異は作用強度において有害な効果を有さなかったが、551A変異はLRO10のレベルまで活性を減少させた(EC50 10-23 ng/ml)。伸長されたリンカーを有する構築物と前述の短いリンカーを有する構築物の3組のいずれの比較においても、新規の伸長されたリンカーもまた、当該分子の細胞への作用強度における悪影響を有さなかった。
【０２７３】
同一のヒト化SS1標的化バリアントを用いたさまざまなFab-PE24バリアントの、2つの異なった腫瘍細胞株(A431 H9及びH596)に対する細胞毒性強度を、CELLTITERGLOWアッセイによって評価した細胞生存率を用いて比較した。一時的に、細胞を96ウェルプレートへ播種した。オーバーナイトでの培養後、さまざまな濃度のcFPを培地に加え、細胞を72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、CELLTITERGLOWアッセイを用いて細胞生存率を決定した。表16は、huFabLRO10RのIC50を1として相対作用強度を比較する。
【０２７４】
【表１６】
0006584012.tif 000020
【０２７５】
表16における結果に類似する結果が、さまざまな細胞株における3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-yl]-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)-ベースの読み出し(read-out)を用いても得られた(表17)。
【０２７６】
【表１７】
0006584012.tif 000021
【０２７７】
[実施例11]
本実施例は、456A変異による、PEのB細胞エピトープの除去を説明する。
【０２７８】
Liu et al., PNAS, 109: 11782-11787 (2012)に記載されるpCANTABベクター中にscFv9H3を含有するファージミドを、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される標準的な方法によって調製した。分子生物学的な試薬は、製造業者の取扱説明書に従って用いた。ファージミドをエレクトロコンピテントTG1細胞へ形質転換した。単一コロニーから前培養をオーバーナイトで増殖させ、適切な選択用抗生物質であるアンピシリンを追加した2xYT/1%グルコース培養液4ml中へこれを播種した。OD600が0.3-0.8となった時点で、1010 cfu VCSM13ヘルパーファージ及びIPTGを終濃度1mMとなるように追加した。37℃、15分のインキュベーション後、培養液は37℃、オーバーナイトで増殖させた。ヘルパーファージ追加の2時間後、カナマイシンを終濃度30 μg/mlとなるよう追加した。ファージを含有する上清はオーバーナイトした培養液から遠心分離により回収し、scFVを提示したファージは、1/5 v/v 20% PEG-6000/ 2.5 M NaClの追加によって上清より沈殿させ、遠心分離によって単離した。ファージのペレットを0.5 ml PBS/1% BSAに溶解し、ファージ溶液を遠心分離及び滅菌フィルトレーションによって除去した。ファージ溶液のタイターは、Barbas, C. et al., Phage Display - A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001に記載される標準的な方法によって決定した。
【０２７９】
96ウェルMaxiSorpマイクロタイタープレートを100μg/ml Fab-PE24バリアントによってコートした。2%BSAを追加したPBSバッファーでブロッキングした後、107及び108のscFvを提示するファージを1時間プレート上で捕獲した。特定の陰性対照として、プレート上でそれらを捕獲する前に、scFvを提示するファージを、50 μg/mのFab-PE24バリアントとともに室温（RT）で1時間前培養した。プレートは、PBSTバッファー(PBS + 0.5% Tween 20)を用いて洗浄した。scFvを提示するファージの結合は、POD結合抗m13抗体(Progen)で検出した。最終洗浄後、プレートをPOD基質とともにインキュベートした。吸光度は、405 nmで測定した。結果は図17に示され、scFv 9H3を含有するファージミドに含有されるB細胞エピトープは、(458R逆突然変異を有する)LRO10Rにおいては除去されない一方で、変異458A及び456Aのいずれの変異によっても除去されたが、456A変異の方が若干強い効果がみられた。
【０２８０】
抗原性試験はWeldon et al., Mol. Cancer Ther., 12: 48-57 (2013)に記載されるように実施した。図18に示されるように、SS1P(T1)に比較して、脱免疫化バリアントLRO10R（T2）は、マウスdsFv融合フォーマット及びヒト化Fab融合フォーマットの両方を有するPEベースの治療用融合タンパク質に対して予め暴露されていた患者からの大部分の血清に関して100-10,000倍減少した反応性を有した。また、456A変異(T3及びT5)又は新規の伸長されたリンカー(T5及びT6)の導入は、PEベースの治療用融合タンパク質に対して予め暴露されていた患者からの大部分の血清に関して100-10,000倍減少した反応性を示した。
【０２８１】
[実施例12]
本実施例は、脱免疫化PEバリアント及びそのFab融合物並びに、比較のためのdsFv融合物の構築、発現及び精製を説明する。
実施例12.1:抗メソテリン脱免疫化PEキメラ分子cFP-0077(配列番号:41及び42)及びcFP-0078(配列番号:43及び44)のクローニング
【０２８２】
cFP-0077及びcFP-0078の発現に対し、大腸菌の栄養要求性(PyrF)の補完による抗生物質フリーのプラスミド選抜が可能な大腸菌宿主／ベクターシステムを使用した(欧州特許出願公開公報0972838及び米国特許6,291,245)。上述のSambrook, J. et al.において記載される標準的な方法をDNA操作に用いた。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。所望の遺伝子セグメントは商用的な遺伝子合成によって作製した。合成された遺伝子フラグメントは特定の発現ベクターへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列は、DNA配列決定により確認した。
【０２８３】
軽鎖及び重鎖の製造のための発現プラスミドは、それぞれ以下のように調製した:軽鎖（LC）プラスミド15478（cFP-0077のアミノ酸配列に基づき、配列番号:41をコードする）及びプラスミド15479(cFP-0078のアミノ酸配列に基づき、配列番号:43をコードする)は、大腸菌における抗体軽鎖フラグメントの発現のための発現ベクターである。それらは、15478のXhoI/BsiWI制限サイト及び15479のXhoI/BlpIを用いて、抗体VLドメインフラグメントをベクターへ連結することによって作製した。
【０２８４】
軽鎖大腸菌発現プラスミドは以下の要素を含む:
・大腸菌中での複製のためのベクターpBR322由来の複製起点（Sutcliffe et al., Quant. Biol., 43: 77-90(1979)による位置2517-3160に対応する）、
・大腸菌pyrF突然変異系統(ウラシル要求性)の補完によりプラスミド選抜を可能とする、オロチジン5’-リン酸脱炭酸酵素をコードする出芽酵母のURA3遺伝子(Rose et al., Gene, 29: 113-124 (1984))、
・以下を含む、抗体軽鎖発現カセット:
・T5ハイブリッドプロモーター(Bujard et al., Methods. Enzymol., 155: 416-433 (1987)及びStueber, et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990))によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)で、Stueber et al.(上述)による合成リボソーム結合サイトを含むプロモーター、
・SS1のCDRを含む抗体軽鎖可変ドメイン、及び、
・15478にはヒトCkドメインを含み、15479には含まない、
・2つのバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター(Schwarz et al., Nature, 272: 410-414 (1978))及びfdターミネーター(Beck et al., Gene, 1-3: 35-58 (1981))、及び、
・大腸菌からのladリプレッサー遺伝子(Farabaugh, Nature, 274: 765-769 (1978))。
【０２８５】
重鎖（HC）プラスミド15476(cFP-0077のアミノ酸配列に基づき、配列番号:42をコードする)及びプラスミド15477(cFP-0078のアミノ酸配列に基づき、配列番号:44をコードする)は、抗体重鎖フラグメント、フューリン切断サイトを含有するリンカー及び緑膿菌の外毒素A(PE)のドメインIIIの変異体を含む融合タンパク質を大腸菌内で発現するための発現プラスミドである。それは、15476のXhoI/BsrGI制限サイト及び15477のXhoI/HindIII制限サイトを用いて、VHドメインフラグメントをベクターへ連結することにより作製した。
【０２８６】
細胞溶解性の融合タンパク質重鎖大腸菌発現プラスミドは、以下の要素を含む:
・大腸菌中での複製のためのベクターpBR322由来の複製起点（Sutcliffe et al., Quant. Biol., 43: 77-90(1979)による位置2517-3160に対応する）、
・大腸菌pyrF突然変異系統(ウラシル要求性)の補完によりプラスミド選抜を可能とする、オロチジン5’-リン酸脱炭酸酵素をコードする出芽酵母のURA3遺伝子(Rose et al., Gene, 29: 113-124 (1984))、
・以下を含む、重鎖-PEドメインIII融合タンパク質発現カセット:
・T5ハイブリッドプロモーター(Bujard et al., Methods. Enzymol., 155: 416-433 (1987)及びStueber, et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990))によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)で、Stueber et al.(上述)による合成リボソーム結合サイトを含むプロモーター、
・SS1のCDRを含む抗体重鎖可変ドメイン、
・15476にはヒトCH1ドメインを含み、15477には含まない、
・フューリン切断サイトを含むリンカー
・緑膿菌外毒素AドメインIIIの変異体バリアント
・2つのバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター(Schwarz et al., Nature, 272: 410-414 (1978))及びfdターミネーター(Beck et al., Gene, 1-3: 35-58 (1981))、及び、
・大腸菌からのladリプレッサー遺伝子(Farabaugh, Nature, 274: 765-769 (1978))。
【０２８７】
実施例12.2:抗メソテリン脱免疫化PEキメラ分子cFP-0077及びcFP-0078の大腸菌における発現。
【０２８８】
すべてのポリペプチド鎖は、大腸菌系統CSPZ-6において別々に発現された。
【０２８９】
大腸菌K12系統CSPZ-6(thi-1、△pyrF)は、エレクトロポレーションにより、発現プラスミド15476、15477、15478及び15479で形質転換され、結果として4系統cFP-0019(プラスミド15476に基づく)、cFP-0020(プラスミド15477に基づく)、cFP-0040(プラスミド15478に基づく)及びcFP-0041(プラスミド15479に基づく)を生じた。4系統のそれぞれに対し、形質転換された大腸菌細胞をまず37℃においてアガープレート上で生育させた。一つのコロニーをこのプレートから選択し、3 mLのローラー培養へ移し、37℃で光学濃度が1-2(578nmで測定)となるまで生育した。その後、1000 μlの培養液を1000 μlの滅菌された86％グリセロールと混合し、長期保存のために即座に-80℃で凍結した。このクローンの正しい生産物の発現は、10L発酵槽に移す前にまず小スケールの振とうフラスコ実験により検証し、SDS-Pageにより解析した。
【０２９０】
前培養
前発酵のために、化学的に規定された培地(CD-PCMv2.20)を用いた:
NH4Cl 1.0 g/l、K2HPO4*3H2O 18.3 g/l、クエン酸 1.6 g/l、グリシン 0.78 g/l、L-アラニン0.29 g/l、L-アルギニン 0.41 g/l、L-アスパラギン*H2O 0.37 g/l、L-アスパラギン酸 0.05 g/l、L-システイン*HCl*H2O 0.05 g/l、L-ヒスチジン0.05 g/l、L-イソロイシン 0.31 g/l、L-ロイシン0.38 g/l、L-リジン*HCl 0.40 g/l、L-メチオニン0.27 g/l、L-フェニルアラニン0.43 g/l、L-プロリン0.36 g/l、L-セリン0.15 g/l、L-トレオニン0.40 g/l、L-トリプトファン 0.07 g/l、L-バリン0.33 g/l、L-チロシン0.51 g/l、L-グルタミン0.12 g/l、Na-L-グルタミン酸*H2O 0.82 g/l、グルコース*H2O 6.0 g/l、微量元素溶液 0.5 ml/l、MgSO4*7H2O 0.86 g/l、及びチアミン*HCl 17.5 mg/l。微量元素溶液は、0.5M HClに溶解させた、FeSO4*7H2O 10.0 g/l、ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/l、MnSO4 * H2O 2.13 g/l、H3BO30.50 g/l、(NH4)6Mo7O24* 4H2O 0.3 g/l、CoCl2*6H2O 0.42 g/l、及びCuSO4 * 5H2O 1.0 g/lを含有した。
【０２９１】
前発酵のため、4つの整流装置を備えた1000 mlエルレンマイヤーフラスコ中に220 mlのCD-PCMv2.20培地を、リサーチシードバンクアンプル(a research seed bank ampoule)の1.0 mlとともに播種した。培養は、ロータリーシェイカー上で8時間、32℃及び170 rpmで、光学濃度(578 nm)が2.9となるまで行った。100 mlの前培養物を10 Lのバイオリアクターのバッチ培養液（batch medium）へ播種するために用いた。
【０２９２】
cFP-0019及びcFP-0020の発酵
10L Biostat C、DCU3発酵槽(Sartorius社、メルズンゲン、ドイツ)における発酵のために、次の化学的に規定されたバッチ培養液を用いた:
KH2PO41.59 g/l、(NH4)2HPO4 7.45 g/l、K2HPO4*3H2O 13.32 g/l、クエン酸 2.07 g/l、L-メチオニン1.22 g/l、NaHCO3 0.82 g/l、微量元素溶液 7.3 ml/l、MgSO4*7 H2O 0.99 g/l、チアミン*HCl 20.9 mg/l、グルコース*H2O 29.3 g/l、ビオチン 0.2 mg/l及び1.2 ml/l シンペロニック(Synperonic)10 %消泡剤。微量元素溶液は、0.5M HCl溶液に溶解させた、FeSO4*7H2O 10 g/l、ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/l、MnSO4 * H2O 2.13 g/l、CuSO4* 5H2O 1.0 g/l、CoCl2*6H2O 0.42 g/l、(NH4)6Mo7O24* 4H2O 0.3 g/l及びH3BO30.50 g/lを含有した。
【０２９３】
フィード１溶液は、700 g/lグルコース*H2O、7.4 g/l MgSO4*7 H2O及び0.1 g/l FeSO4*7H2Oを含有した。フィード2は、KH2PO4 52.7 g/l、K2HPO4*3H2O 139.9 g/l及び(NH4)2HPO466.0 g/lを含む。すべての成分は、脱イオン水に溶解させた。pH調節のためのアルカリ性溶液は、11.25 g/l L-メチオニンを追加された水性12.5 %(w/v)NH3溶液であった。
【０２９４】
4.2 Lの滅菌されたバッチ培養液と前培養からの100 ml播種菌液から開始し、バッチ発酵は31℃、pH6.9±0.2、背圧800 mbar及び初期通気速度10 l/分で実施した。溶解酸素の相対値(pO2)は、攪拌機速度を1500 rpmまで増加させることによって、発酵を通して50％で維持された。溶解酸素値の急増によって示される、最初に追加されたグルコースの枯渇後に、温度を25℃へ移行させ、15分後、発酵は両フィードの開始に伴いフェドバッチモードへ入った(それぞれ、60及び14 g/h)。フィード2の速度は一定に維持された一方で、フィード1の速度は、所定のフィードプロファイルによって、7時間で60から最終的に160 g/hまで段階的に増加させた。二酸化炭素排気濃度が2％を超えるレベルとなった場合は、通気速度が5時間で10から20 l/分まで一定に増加させた。組換えタンパク質の発現は、光学濃度およそ120において、2.4 gのIPTGを追加することによって誘導した。標的タンパク質は細胞質中に封入体として発現させた。
【０２９５】
24時間培養後、光学濃度は209に達し、全培養液を4℃-8℃へ冷却した。細菌は、フロースルー遠心分離機を用いて遠心分離を介して回収し(13,000 rpm、13 l/時間)、得られたバイオマスはさらなる処理(細胞破砕)まで-20℃で保存した。
【０２９６】
cFP-0040及びcFP-0041の発酵:
10L Biostat C, DCU3発酵槽(Sartorius社、メルズンゲン、ドイツ)における発酵のために、次の化学的に規定されたバッチ培養液を用いた:バクト-トリプトン 20g/l、酵母エキス15g/l、KH2PO4 1.5 g/l、K2HPO4*3H2O 6.6 g/l、NaCl 1.0 g/l、MgSO4*7 H2O 0.74g/l、グルコース*H2O 3.0 g/l及び0.2 ml/l シンペロニック10 %消泡剤。
【０２９７】
フィード1溶液はバクト-トリプトン250 g/l及び酵母エキス175 g/lを含有した。pHは、75%グルコース*H2Oを用いて調節した。すべての成分は脱イオン水に溶解させた。
【０２９８】
7.6 lの滅菌されたバッチ培養液と前培養からの100 ml播種菌液から開始し、バッチ発酵は37℃、pH 7.0±0.3、背圧500 mbar及び初期通気速度10 l/分で実施した。溶解酸素の相対値(pO2)は、攪拌機速度を1500 rpmまで増加させることによって、発酵を通して50％で維持した。フィード1の供給は、培養物が光学濃度15に到達した後に開始した。二酸化炭素排気濃度が2％を超えるレベルとなった場合は、通気速度を5時間で10から20 l/分まで一定に増加させた。組換えタンパク質の発現は、光学濃度およそ20において、2.4 gのIPTGを追加することによって誘導させた。標的タンパク質は不溶性で、細胞質中において封入体で発現させた。
【０２９９】
13時間培養し、光学濃度が100-115となった後、全培養液を4℃-8℃へ冷却した。細菌は、フロースルー遠心分離機を用いて遠心分離を介して回収し(13,000 rpm、13 l/時間)、得られたバイオマスはさらなる処理(細胞破砕及び封入体調製)まで-20℃で保存した。
【０３００】
産物形成の解析(cFP-0019、-0020、-0040及び-0041):
試料は、一つは誘導前に、その他はタンパク質発現誘導後の複数の誘導中の時点で発酵槽から採取し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。すべての試料から、当量の細胞（OD標的=10）を5 mL PBSバッファー中に懸濁し、氷上の超音波処理を介して破砕した。その後、100 μLの各懸濁液を遠心分離し(15,000 rpm、5分)、各上清を取り出し、別々のバイアルへ移した。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質を区別するために行った。各上清(=可溶性タンパク質画分)100 μLに対して、及び、各ペレット(不溶性タンパク質画分)に対して、200 μLのSDSサンプルバッファー(Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970))を加えた。試料は、試料中のすべてのタンパク質を可溶化及び還元するために激しい攪拌下において、15分間、95℃で加熱した。室温へ冷却した後、5 μLの各試料を4-20 % TGX Criterionステインフリーポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad社)へ移した。加えて、5 μlの分子量標準(プレシジョンプラスプロテインスタンダード、Bio-Rad社)が用いた。
【０３０１】
電気泳動を60分間、200 Vで行い、その後ゲルをGELDOC EZ Imager(Bio-Rad社)へ移し、5分間UV照射を用いて処理した。ゲルイメージは、IMAGE LAB解析ソフトウェア(Bio-Rad社)を用いて解析した。タンパク質発現の相対的定量化は、産物のバンドのボリュームを25 kDaの分子量標準のバンドのボリュームに対して比較することによって行った。
【０３０２】
封入体調製
10L発酵の封入体調製(IBP)は、細菌を回収した直後に、バッファー1(12.1g/l Tris、0.246g/l MgSO4*7H2O、12ml/l 25%-HCl)中に、回収された細菌細胞を再懸濁することにより開始した。バッファーの容量はバイオマスの乾物含量に依存して計算した。リゾチーム(100 kU/mg、0.12 mg/g DCW)及び少量のベンゾナーゼ(5U/g DCW)を追加した。その後懸濁液は、細菌細胞を破砕するために900 bar（APV Rannie 5、1パス）でホモジナイズし、続いて、さらなるベンゾナーゼ(30 U/g DCW)を追加した上で30-37℃で30分間インキュベートした。その後、第1洗浄バッファー(60 g/l Brij、87.6 g/l NaCl、22.5 g/l EDTA、6 ml/l 10N NaOH)を加え、再度、懸濁液を30分間インキュベートした。続く遠心分離工程(BP12、ソーバル（Sorvall）)により封入体スラリーがもたらされ、それは第2洗浄バッファー(12.1 g/l Tris、7.4 g/l EDTA、11 ml/l 25%-HCl)に再懸濁し、20分間インキュベートした。さらなる分離工程により封入体を回収し、回収された封入体を-20℃で凍結して保存するか又はリフォールディング及び精製のために即座に可溶化した。
【０３０３】
実施例12.3:抗メソテリン脱免疫化PEキメラ分子cFP-0077及びcFP-0078のリフォールディング及び精製
cFP-0077及びcFP-0078がリフォールディング及び精製によって共に得られた。
【０３０４】
Fab-PE24(cFP-0077)の再生及び精製:HC-PE24及びLCの封入体は、室温、オーバーナイトで、8 Mグアニジン塩酸塩、100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、pH 8.0 + 100 mMジチオスレイトール(DTT)中に別々に溶解した(5 mL中に1gの封入体)。ソルビリゼート(Solubilizate)をpH 3へ調整し、遠心分離してペレットを廃棄した。DTTを除去するために、8 Mグアニジン塩酸塩、10 mM EDTA、pH 3.0に対して大規模透析を行った後、全タンパク質濃度をビウレット法により決定した。HC及びLC内容物の純度はSDS-PAGEを介して推定した。
【０３０５】
ソルビリゼートは、0.5 Mアルギニン、2 mM EDTA、pH 10 + 0.9 mM GSH/GSSG、それぞれを含有する再生バッファーで、モル比1:1で、2℃-10℃で希釈した。標的タンパク質濃度は、2つの用量の間に4時間のインキュベーション時間で、2工程において0.22 g/Lまで増加させた。その後、再生溶液を、オーバーナイトで2℃-10℃で保持した。
【０３０６】
再生されたタンパク質はH2Oを用いて<3 mS/cmへ希釈し、20 mM Tris/HCl、pH 7.4で平衡化された陰イオン交換カラム(AIEX)へポンプにより送り込んだ。平衡化バッファーでカラムを洗浄の後、タンパク質を20 mM Tris/HCl、400 mM NaCl、pH 7.4に至る勾配で溶出させた。Fab-PE24を含有するピーク画分をプールし、濃縮し、及び凝集体、断片、及び大腸菌タンパク質を除去するために20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4において調製用サイズ排除カラム(SEC)へ適用した。最終タンパク質プールは所要のタンパク質濃度へと調整し、SDS-PAGE、解析的SEC及びUV280を介して解析され、同一性を質量分析によって確認した。
【０３０７】
dsFv-PE24(cFP-0078)の再生及び精製:HC-PE24及びLCの封入体は、室温、オーバーナイトで、8 Mグアニジン塩酸塩、100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、pH 8.5 + 100 mM DTT中に別々に溶解した(5 mL中に1gの封入体)。ソルビリゼートをpH 3へ調整し、遠心分離してペレットを廃棄した。DTTを除去するために、7.2 Mグアニジン塩酸塩、10 mM EDTA、pH 3.0に対して大規模透析を行った後、全タンパク質濃度をビウレット法により決定し、HC及びLC内容物の純度をSDS-PAGEを介して推定した。
【０３０８】
ソルビリゼートは、0.5 Mアルギニン、2 mM EDTA、pH 10 + 0.9 mM GSH/GSSG(それぞれ、モル比1:1)を含有する再生バッファーで1:100に希釈し、オーバーナイトで2-10℃で保持した。
【０３０９】
再生されたタンパク質をH2Oを用いて<3 mS/cmへ希釈し、20 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、pH 7.4で平衡化された陰イオン交換カラム(AIEX)へポンプにより送り込んだ。平衡化バッファーでカラムを洗浄の後、タンパク質を20 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、400 mM NaCl、pH 7.4に至る勾配で溶出させた。dsFv-PE24を含有するピーク画分をプールし、濃縮し、及び凝集体、断片、及び大腸菌タンパク質を除去するために20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4において調製用サイズ排除カラム(SEC)へ適用した。最終タンパク質プールは所要のタンパク質濃度へと調整し、CE-SDS、解析的SEC及びUV280を介して解析した。同一性は質量分析によって確認した。
【０３１０】
実施例12.4:cFP-0077及びcFP-0078のタンパク質解析
試料は、溶液中のタンパク質の濃度を決定するために、UV分光光度計を用いてOD280 nmによって解析した。これに対して求められる吸光係数は、Pace et al., Protein Science, 4: 2411-2423 (1995)に従い、アミノ酸配列から計算した。試料中における単量体種、凝集体種及び分解体種の含有量を決定するために、移動相として0.25 M KCl、pH 7.0を含む0.2 Mリン酸カリウムバッファーを用いて、TSK-Gel300SWXL又はSuperdex 200カラムでサイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)を実施した。産物に関係する分解産物及び無関係の不純物に関する複合体調製物の純度を解析するために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元及び非還元）を実施した(詳細は以下を参照されたい)。各鎖の正確な質量／同一性の確認及び化学的修飾を決定するために、還元された(TCEP)試料を用いてエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)を実施した。完全に会合したタンパク質の性質及び品質を解析するため、及び潜在的な産物に関係する副生物を決定するために、非還元試料のESI-MSを実行した。
SDS-PAGE及びクマシー染色の方法
装置:Invitrogen XCELL SURE LOCK Mini-Cell
ゲル:4-20%トリス-グリシンゲル、Invitrogen EC6025BOX
バッファー:トリス-グリシンSDSランニングバッファー(10x)、Invitrogen LC2675-5
サンプルバッファー:トリス-グリシンSDSサンプルバッファー(2x)、Invitrogen LC2676
還元バッファー:ニューページサンプル還元剤(10x)、Invitrogen NP0004  
分子量マーカー: Mark 12、MW標準、Invitrogen LC5677
【０３１１】
試料は、バッファーを用いて1 mg/mlのタンパク質濃度へと調整した。試料の還元に関しては、以下の手順を実行した:4 mlのサンプルバッファー(2x)及び1 ml還元バッファー(10x)を含む還元バッファーを調製した。試料は、還元バッファーで1:1に希釈し、5分間、70℃でインキュベートした。
【０３１２】
ゲル電気泳動を125V、90分で実行した。ゲルは、SIMPLY BLUE Safe Stain (Invitrogen社、Cat. No. LC6065)で染色した。
【０３１３】
実施例12.5:Fab対dsFv融合タンパク質の比較-細胞毒性特性
dsFv-PE24融合タンパク質フォーマット及びFab-PE24フォーマットの細胞毒性強度を、3つの異なる腫瘍細胞株(MKN45、H596及びA431H9)において、同一のヒト化SS1標的指向化部分を用いて比較した。一時的に、細胞を96ウェルプレートへ播種した。オーバーナイトで培養後、さまざまな濃度のcFPを培地に追加し、細胞を72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、CELLTITERGLOWアッセイを用いて細胞生存率を決定した。
【０３１４】
各ケースにおいて、細胞生存率の阻害に対する用量反応曲線及びIC50値はdsFv-PE24及びFab-PE24フォーマットに対して同様であった。IC50値のモル比が表18に記載される。試験された細胞株に依存して、標的化PE24融合タンパク質は、非標的化PE24よりも数百倍から1千倍強力であった。
【０３１５】
【表１８】
0006584012.tif 000022
【０３１６】
実施例12.6:Fab対dsFv融合タンパク質の比較:血清動態
SCID beigeマウスにおける以下の3つのシュードモナス外毒素A(PE)ベースの抗メソテリン免疫毒素の血清動態を比較した:SS1dsFv-PE38(MW:62.5 kDa)、SS1dsFv-PE24(MW:49.9 kDa)及びSS1Fab-PE24(MW:72.2 kDa)。マウスSS1抗体分子をすべての構築物に用いた。動態は、SS1Fab-PE24に対し0.231 mg/kg及びSS1dsFv-PE24に対し0.160 mg/kgに対応する0.2 mg/kg(3.2 nmol/kg) SS1P)で、等モルの用量で比較した。
【０３１７】
構築物は、単一の静注投与量として投与し、それらの血清レベルを投与後0.08、0.5、1、1.5、2、3、4、5及び7時間の時点で解析した。グループあたり9匹のマウスに本研究の薬物を投与し、及び後眼窩穿刺により動物あたり3回、時差的な様式において血液を採取し、結果としてn=3の試料を有する9つの時点がもたらされた。血清試料は抗体フラグメントとPE部分を有する完全な試験化合物のみを検出するELISAによって解析した。本アッセイフォーマットにおいてcFPはMSLN被覆表面上で捕捉され、PE分子はウサギポリクローナル抗PE抗体及びビオチン標識された抗ウサギ二次抗体を用いて検出される。
【０３１８】
各時点に対し、CD2F1マウスからの過去データと共に、3匹の動物からの平均血清値を処理群に対してプロットした。SS1dsFv-PE24構築物は、わずか〜12分の血清半減期であり、非常に急速に除去された。過去データと一致して、SS1Pのクリアランスはかなりゆっくりしたものであり、35分及び44分の間の血清半減期をもたらした（それぞれ、測定されたデータ及び過去データ由来の値）。SS1Fab-PE24構築物の薬物動態特性は、43分の血清半減期を有するSS1dsFv-PE38と非常に類似しており、またクリアランス速度、分布容積、Cmax及び曲線下面積に対しても類似する値が得られた(表19及び図19)。
【０３１９】
【表１９】
0006584012.tif 000023
【０３２０】
[実施例13]
本実施例は、抗メソテリン抗体SS1のヒト化を説明する。
【０３２１】
実施例13.1:ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域の設計。
SS1抗体のVH及びVLドメインの構造をインシリコでモデル化し、そのモデルをヒトVH及びVLドメインの構造データベースに対して比較した。最も構造的に類似するVドメインのパネルが、SS1のCDRをヒトVH及びVLドメイン上へのグラフトに対し選択された。加えて、SS1のVH及びVLドメインの一次配列をヒトVドメインレパートリーに対して整列させることによってヒトVドメインの選択肢の範囲を限定するために、一次配列における類似性を考慮した。ヒトフレームワーク領域におけるマウス親残基への逆突然変異を、幾つかのヒト化バリアントにおいて導入した。同様に、適切な場合に抗原に対する親和性を潜在的に増加させるため、又はCDRの3次構造を維持するために、CDRにおける突然変異をいくつかのバリアントにおいて導入した。
【０３２２】
設計されたVドメインバリアントを、ヒトIgG軽鎖及び重鎖を生成するために、ユニークなクローニングサイトを介して重鎖及び軽鎖ベクター6318及び6319へクローニングした。起こり得るすべての軽鎖／重鎖の組合せを有する完全サイズのIgGを発現する細胞培養物を得るために、重鎖及び軽鎖ベクターを、マトリクス様式において、マイクロタイター培養プレート中のHEK293浮遊細胞へ同時導入した。5日間、37℃で培養後に上清を回収し、マイクロタイタースケールにおいてプロテインAアフィニティクロマトグラフィによって精製した。
【０３２３】
実施例13.2:ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域のクローニング
上述のSambrook, J. et al.において記載される標準的な方法をDNA操作に用いた。分子生物学的な試薬は、製造業者の取扱説明書に従って用いた。所望の遺伝子フラグメントは、商用の遺伝子合成によって調製した。合成された遺伝子フラグメントは、特定の発現ベクターへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列は、DNA配列決定により確認した。
【０３２４】
抗体重鎖に対する発現ベクター:設計されたヒト化抗体重鎖可変ドメインの遺伝子セグメントを、ユニークな制限酵素サイトであるHindIII及びXhoIを介して、特定の発現ベクターへクローニングした。発現ベクターは、HEK293細胞において、ヒト抗体ドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3と融合した抗体重鎖可変ドメインを発現するように設計し、この結果、通常の抗体重鎖がもたらされた。すべてのドメインはイントロンによって分離された。抗体重鎖に対する発現カセット以外に、ベクターは以下を含有した:
・大腸菌における本プラスミドの複製を可能とするベクターpUC18由来の複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、
・SV40プロモーター及びDHFR選択マーカーの発現の起点、
・抗体発現の選択マーカーとしてのマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、及び、
・SV40の早期ポリアデニル化(「早期ポリA」)シグナル配列。
【０３２５】
抗体重鎖の転写ユニットは以下の要素から構成される:
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
・ヒト抗体生殖系列遺伝子の5’非翻訳領域、
・シグナル配列イントロン(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2、[L1-イントロン-L2])を含むマウスイムノグロブリン重鎖シグナル配列、
・イントロンが後に続くVH配列、
・イントロンによって分離されるヒトCH1、ヒンジ、CH2、CH3ドメイン、
・ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
・ヒトガストリン転写ターミネーター(HGT)。
【０３２６】
抗体軽鎖に対する発現ベクター:設計されたヒト化抗体軽鎖可変ドメインの遺伝子セグメントは、ユニークな制限酵素サイトであるBsmI及びCelIを介して特定の発現ベクターへクローニングした。発現ベクターは、HEK293細胞において、ヒト抗体ドメインCkと融合した抗体軽鎖可変ドメインを生ずる(place)ように設計した。両ドメインは、イントロンによって分離された。抗体軽鎖の発現カセット以外に、ベクターは以下を含む:
・大腸菌における本プラスミドの複製を可能とするベクターpUC18由来の複製起点、及び、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
【０３２７】
抗体軽鎖の転写ユニットは、以下の要素から構成される:
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
・ヒトサイトメガロウイルスからの5’非翻訳領域、
・ヒトサイトメガロウイルスのイントロンA配列
・ヒト抗体生殖系列遺伝子の5’非翻訳領域、
・シグナル配列イントロン(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1-イントロン-L2])及びユニークな制限酵素サイトであるBsmIをL2の3’末端に含むマウスイムノグロブリン重鎖シグナル配列、
・イントロンが後に続くVL配列、
・ヒトCkドメイン
・ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
・ヒトガストリン転写ターミネーター(HGT)。
【０３２８】
実施例13.3:ヒト化抗体の発現。
ヒト化抗体軽鎖及び重鎖の一過性導入:組換えヒト化抗体バリアントは、懸濁液中で成長させたHEK293フリースタイルセル(ヒト胎児腎臓細胞株293、Invitrogen社)の一過性導入によって生成させた。遺伝子導入された細胞は、6 mMグルタミン、ウルトラグルタミン(Biowhittake/Lonza社)又はL-グルタミン(Sigma社)のいずれかを追加したF17培地(Gibco社)又はFreestyle293培地(Invitrogen社)で、振とうフラスコ中8 %CO2、37℃の条件で、48ディープウェルプレート中の2 ml培地のスケールから振とうフラスコ中の１L培地までのスケールにおいて培養した。293フリー遺伝子導入試薬(Novagen/Merck社)は、試薬(μl)とDNA(μg)が4:3の比率において用いた。軽鎖及び重鎖は、重鎖をコードするプラスミドに対する軽鎖をコードするプラスミドのモル比をそれぞれ1:2から2:1までの範囲で用いて2つの異なるプラスミドから発現させた。ヒト化抗体を含有する細胞培養上清は、遺伝子導入後6日から8日で回収した。例えば、HEK293細胞におけるヒトイムノグロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、次に与えられる:Meissner et al., Biotechnol. Bioeng., 75: 197-203 (2001)。上清は、PBSで平衡化されたMabSelect Sure(GE社 プロテインA)で、アフィニティクロマトグラフィによって精製した。濾過された上清を適用後、抗体は50 mM酢酸ナトリウム、pH 3.2で溶出させた。溶出液のpHは、2 M Tris/HCl、pH 9.0を用いて即座にpH > 6へ調整され、その後、20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で透析した。抗体は、UV280、SDS-PAGE及び解析的SECによって解析した。配列は、質量分析によって確認した。
【０３２９】
実施例13.4:ヒト化SS1バリアントの性質決定
ヒト化SS1バリアントのELISAスクリーニング:IgGフォーマットにおけるすべてのSS1ヒト化バリアントをELISAによって親和性に対しスクリーニングした。384ウェルMaxiSorpマイクロタイタープレートを0.5 μg/ml抗His抗体(Novagen社)で被覆した。2% BSA、0.1% Tween 20及び0.2 μg/ml ヒト/カニクイザル/マウスメソテリン(社内/R&D Systems)が追加されたPBSバッファーでブロッキングした後、Hisタグを有するすべてのタンパク質をプレート上で1時間捕捉した。プレートは、PBSTバッファー(PBS + 0.1% Tween 20)で洗浄し、PBS中のヒト化抗メソテリン抗体の希釈物を1時間室温においてインキュベートした。抗体の結合は、抗ヒトFc抗体を結合させたHRP(GE Healthcare社)を用いて検出した。最終洗浄の後、プレートをHRP基質とともにインキュベートした。吸光度は、ENVISIONプレートリーダー上で370 nmで測定した。EC50曲線適合解析は、EXCELソフトウェア(モデル205)のXLfit4解析プラグインを用いて実施した。
【０３３０】
IgGタイターに対して得られた値を標準化するために、ヒトIgGの定量を、ストレプトアビジン被覆プレートを用いてサンドイッチELISAによって実施した。ストレプトアビジン被膜384ウェルマイクロタイタープレート(Microcoat社)を、0.25 μg/mlビオチン標識された抗ヒトIgG抗体(Jackson Imm. Res.社)、0.05 μg/ml抗ヒトIgG-HRP結合体(Jackson Imm. Res.社)及びヒト化抗メソテリン抗体の希釈液の混合物とともにインキュベートした。室温(RT)での1.5時間のインキュベーション後、プレートを0.1% Tween 20が追加されたPBSバッファーで洗浄した。HRP基質が加えられ、吸光度をENVISIONプレートリーダー上で、370 nmで測定した。データの計算は、較正に対してはヒトIgG参照を標準(社内)として用い、曲線適合解析に対してはEXCELソフトウェア(モデル205)のXLfit4解析プラグインを用いて実施した。
【０３３１】
以下の表20-21において、すべてのヒト化バリアントのELISAデータが示される。ヒトメソテリン(huMesothelin)へのELISA/BIACORE結合(EC50 ng/ml)が測定され、結果は表20(社内)及び表21(R&D)において示される。IgGタイターが標準化され、この1次スクリーニングではバリアントVL001/VH001が最も良いEC50値を有する組合せの一つとして同定された。
【０３３２】
ヒト化SS1バリアントのビアコアスクリーニング:SS1に最も類似するCDRを含有する最良のバリアントを、表面プラズモン共鳴(SPR)による動態解析に対して選択した。SPRベースのアッセイは、幾つかのMSLN PE cFPヒト化バリアント及びヒトメソテリン間の結合の動態学的パラメータを決定するために用いられている。したがって、プロテインAをCM5バイオセンサーチップの表面へアミンカップリングを用いて固定化した。試料がその後捕捉され、ヒトメソテリンが注入されたセンサーチップ表面を、各解析サイクル間で再生した。データを1:1ラングミュア相互作用モデルにフィッティングさせることにより、最終的に速度定数kd及びka並びに平衡定数KDを得た。約175反応単位(RU)のプロテインA(10 μg/ml)を、GE Healthcare社により提供されるアミンカップリングキットを用いて、pH 4.0でCM5センサーチップ上へカップリングした。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、HBS-P+(0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、滅菌、濾過済の0.005%サーファクタントP20、pH 7.4)であった。フローセル温度は25℃に設定し、試料区画温度は12℃に設定した。本システムは、ランニングバッファーを用いて準備した。各試料に対して同様の補足レベルを作り出すために、プロテインA結合サイトはIgG(約0.03 μg/mL)を40秒間、10 μl/分の流速で注入することによって飽和させた。その後、単一の50 nMヒトメソテリン溶液を120秒間、30 μl/分の流速で注入し、その後に180秒の解離期が続いた。これによる相対的なKDの決定により、さまざまなMSLN結合物の順位付けが可能となった。各サイクルは、グリシン-HCL pH 1.5(30秒、30 μl/分)の2回の注入によって再生した。
【０３３３】
以下の表22は、12の選択されたヒト化バリアントのビアコアデータを記載する。最終的なヒト化バリアントVL01/VH01は、すべてのヒト化バリアント中で最も低いKd値の一つを示す。表22は、cFP.15438-15457及びcFP.15438-15459(すべてがヒト化VH1を含む)のビアコアの結果を示す。配列番号:45のアミノ酸配列を含む、cFP.15438は、SS1抗体のヒト化バリアントで最も高い親和性を呈する。従って、cFP.15438のVHは、有利な結合特性を提供する。
【０３３４】
5つの最良のバリアントを、PE24バリアントとして、公開されているリンカー及びLRO10を含有するFab-リンカー-PEフォーマットへクローニングし、発現、リフォールド及び精製した。クローニング、発現、リフォールディング及び精製は、cFP-0205に関して以下に記載されるように実行した。細胞融解性の融合フォーマットにおける5つのヒト化バリアントは、異なった時点において、実施例9.2に記載の動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、SDS-PAGE及び質量分析といった方法により、37℃で7日間、安定性に対して解析した。
【０３３５】
試料中における単量体種、凝集体種及び分解体種の含有量を決定するために、移動相として0.25 M KCl(pH 7.0)を含む0.2 Mリン酸カリウムバッファーを用いて、TSK-Gel300SWXL又はSuperdex 200カラムでサイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)を実施した。産物に関係する分解産物及び無関係の不純物に関する複合体調製物の純度を解析するために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元及び非還元）を実施した(詳細は以下を参照されたい)。各鎖の正確な質量／同一性の確認及び化学的修飾を決定するために、還元された(TCEP)試料を用いてエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)を実施した。完全に会合したタンパク質の性質及び品質を解析するため、及び潜在的な産物に関係する副生物を決定するために、非還元試料のESI-MSを実行した。
【０３３６】
37℃で7日間の温度ストレス後、細胞溶解性の融合フォーマット内におけるFabフラグメントの活性濃度を、表面プラズモン共鳴（SPR）によりモニターした。メソテリンを、SPRバイオセンサーの表面上へ固定化した。SPR分光計のフローセルへ試料を注入することによって、試料は固定化されたメソテリンと複合体を形成し、その結果、センサーチップ表面上の質量が増加し、それによってより高い反応（1 RUは1 pg/mm2で定義される）がもたらされる。その後、センサーチップは、試料-メソテリン複合体を解離させることにより回復される。得られた反応は、(100%の活性と想定される)標準試料によって呈される反応と比較することによりその後評価される。まず、約50反応単位（RU）のヒトMSLN(0.75 μg/ml)を、GE Healthcare社のアミノカップリングキットを用いることによって、pH 4.5でC1チップ(GE Healthcare社)上へカップリングした。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、HBS-P+(0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、滅菌、濾過された0.005%サーファクタントP20、pH 7.4)であった。フローセル温度は、25℃に設定し、試料区画温度は12℃に設定した。本システムは、ランニングバッファーを用いて準備した。その後、MSLN PE cFP構築物の5 nM溶液を、流速30 μl/分で60秒間注入し、その後に60秒の解離期が続いた。その後、センサーチップ表面は、流速30 μl/分で再生溶液(0.31M KSCN、1.22M MgCl2、0.61M尿素、1.22M グアニンHCl、6.7mM EDTA)を20秒の長時間注入2回によって再生し、その後にバッファーにより追加洗浄し、さらに5秒の安定化期間が続いた。
【０３３７】
安定性データは、Fab-リンカー-PE24LRO10フォーマットにおいて最も良い5つのヒト化バリアントを37℃で7日間インキュベートすることによって得られた。結果を表23に示す。表23において示されるように、バリアントVH01/VL01が温度ストレス後に断片化を示さない唯一のバリアントであった。すべてのVL01の組合せが温度ストレス後に凝集体のみを形成するも沈殿はせず、VL01はリカバリーを促進した。温度ストレス後の親和性測定の結果が芳しくなかったのは、これら凝集体によるものであった。よって、ヒト化バリアントVH1/VL1(配列番号:45)/(配列番号:46)を、さらなる開発のために選択した。VH1(配列番号:45）は、好ましい機能性及び結合特性を与えた。VH1(配列番号:45)/VL（配列番号:46）の組合せは、好ましい開発性を与えた。
【０３３８】
【表２０−１】
0006584012.tif 000024
【０３３９】
【表２０−２】
0006584012.tif 000025
【０３４０】
【表２１】
0006584012.tif 000026
【０３４１】
【表２１−２】
0006584012.tif 000027
【０３４２】
【表２２】
0006584012.tif 000028
【０３４３】
【表２３】
0006584012.tif 000029
【０３４４】
[実施例14]
本実施例は、ヒト化抗メソテリンSS1とのFab融合物(cFP-0205)としての、キメラ脱免疫化PE LOR10-456Aのクローニング、発現、リフォールディング及び精製を説明する。
【０３４５】
キメラPE抗メソテリン分子cFP-0205は、クローニング、発現、リフォールディング及び精製の後に得られた。cFP-0205(R205又はRG7787とも称される)は、配列番号:39及び40のアミノ酸配列を含む。
【０３４６】
cFP-0205のクローニング:cFP-0205の発現に対し、大腸菌の栄養要求性(PyrF)の補完による抗生物質フリーのプラスミド選抜が可能な大腸菌宿主／ベクターシステムを使用した(欧州特許出願公開公報0972838及び米国特許6,291,245)。上述のSambrook, J. et al.において記載される標準的な方法をDNA操作に用いた。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。所望の遺伝子セグメントは商用的な遺伝子合成によって作製した。合成された遺伝子フラグメントは特定の発現ベクターへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列は、DNA配列決定により確認した。
【０３４７】
軽鎖(LC)及び重鎖(HC)の製造のための発現プラスミドは、それぞれ以下のように調製した:LCプラスミド15496は、大腸菌における抗体軽鎖の発現のための発現ベクターである。それは、NdeI/BsiWI制限サイトを用いて、抗体VLドメインフラグメントをベクターへ連結することによって作製した。
【０３４８】
軽鎖大腸菌発現プラスミドは以下の要素を含む:
・大腸菌中での複製のためのベクターpBR322由来の複製起点（Sutcliffe et al., Quant. Biol., 43: 77-90(1979)による位置2517-3160に対応する）、
・大腸菌pyrF突然変異系統(ウラシル要求性)の補完によりプラスミド選抜を可能とする、オロチジン5’-リン酸脱炭酸酵素をコードする出芽酵母のURA3遺伝子(Rose et al., Gene, 29: 113-124 (1984))、
・以下を含む、抗体軽鎖発現カセット:
・T5ハイブリッドプロモーター(Bujard et al., Methods. Enzymol., 155: 416-433 (1987)及びStueber, et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990))によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)で、Stueber et al.(上述)による合成リボソーム結合サイトを含むプロモーター、
・SS1のCDRを含む抗体軽鎖可変ドメイン、
・ヒトCkドメイン
・2つのバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター(Schwarz et al., Nature, 272: 410-414 (1978))及びfdターミネーター(Beck et al., Gene, 1-3: 35-58 (1981))、及び、
・大腸菌からのladリプレッサー遺伝子(Farabaugh, P. J., Nature, 274 (1978) 765-769)。
【０３４９】
HCプラスミド18023は、抗体重鎖、フューリン切断サイトを含有するリンカー及びシュードモナス外毒素AのドメインIIIの変異体を含む融合タンパク質を大腸菌内で発現するための発現プラスミドである。それは、NdeI/BsrGI制限サイトを用いて、VHドメインフラグメントをベクターへ連結することにより作製した。特定のPEバリアントフラグメントは、BsrGI/BsiWI制限サイトを用いて交換した。
【０３５０】
細胞溶解性の融合タンパク質重鎖大腸菌発現プラスミドは、以下の要素を含む:
・大腸菌中での複製のためのベクターpBR322由来の複製起点（Sutcliffe et al., Quant. Biol., 43: 77-90(1979)による位置2517-3160に対応する）、
・大腸菌pyrF突然変異系統(ウラシル要求性)の補完によりプラスミド選抜を可能とする、オロチジン5’-リン酸脱炭酸酵素をコードする出芽酵母のURA3遺伝子(Rose et al., Gene, 29: 113-124 (1984))、
・以下を含む、重鎖-PEドメインIII融合タンパク質発現カセット:
・T5ハイブリッドプロモーター(Bujard et al., Methods. Enzymol., 155: 416-433 (1987)及びStueber, et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990))によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)で、Stueber et al.(上述)による合成リボソーム結合サイトを含むプロモーター、
・SS1のCDRを含む抗体重鎖可変ドメイン、
・ヒトCH1ドメイン、
・フューリン切断サイトを含むリンカー
・シュードモナス外毒素AドメインIIIの変異体バリアント、
・2つのバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター(Schwarz et al., Nature, 272: 410-414 (1978))及びfdターミネーター(Beck et al., Gene, 1-3: 35-58 (1981))、及び、
・大腸菌からのladリプレッサー遺伝子(Farabaugh, Nature, 274: 765-769 (1978))。
【０３５１】
大腸菌におけるcFP-0205の発現:大腸菌K12系統CSPZ-6(thi-1、△pyrF)及びCSPZ-13(thi-1、△ompT、△pyrF)は、エレクトロポレーションにより、それぞれ発現プラスミド番号15496及び18023で形質転換した。形質転換された大腸菌細胞は、まず37℃においてアガープレート上で生育させた。各形質転換に対して、一つのコロニーをこのプレートから選択し、3 mLのローラー培養へ移し、37℃で光学濃度が1-2(578nmで測定)となるまで生育させた。その後、1000 μlの培養液を1000 μlの滅菌された86％グリセロールと混合し、長期保存のために即座に-80℃で凍結した。これらのクローンの正しい生産物の発現は、10L発酵槽に移す前にまず小スケールの振とうフラスコ実験により検証し、SDS-Pageにより解析した。
【０３５２】
前培養:
前発酵のために、化学的に規定された培地(CD-PCMv2.60)を用いた:NH4Cl 1.25 g/l、K2HPO4*3H2O 18.3 g/l、クエン酸 1.6 g/l、L-メチオニン0.20 g/l、グルコース*H2O 8.0 g/l、微量元素溶液0.5 ml/l、MgSO4*7H2O 0.86 g/l及びチアミン*HCl 17.5 mg/l。微量元素溶液は、0.5M HCl溶液に溶解させた、FeSO4*7H2O 10.0 g/l、ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/l、MnSO4 * H2O 2.13 g/l、H3BO30.50 g/l、(NH4)6Mo7O24* 4H2O 0.3 g/l、CoCl2*6H2O 0.42 g/l、CuSO4 * 5H2O 1.0 g/lを含有した。
【０３５３】
前発酵のため、220 mLの培地を有する4つの整流装置を備えた5つの1000 mL振とうフラスコに、1.0 mlの各プライマリーシードバンクアンプル(a primary seed bank ampoule)を播種した。培養は、ロータリーシェイカー上で11-12時間、37℃及び170 rpmで、光学濃度(578 nm)が7から9となるまで行った。振とうフラスコをプールし、光学濃度を決定した。播種菌液容量はVinoc. = 1000 mL * 5 / ODPCで計算し、これは、等量の細胞で実施された各100Lのバイオリアクターのバッチ培養液に播種する前培養の光学濃度に依存する。
【０３５４】
100Lスケール発酵
100 Lの発酵槽(Sartorius社、メルズンゲン、ドイツ)における発酵に対し、以下の化学的に規定されたバッチ培養液を使用した:KH2PO41.59 g/l、(NH4)2HPO47.45 g/l、K2HPO4*3H2O 13.32 g/l、クエン酸2.07 g/l、L-メチオニン1.22 g/l、NaHCO3 0.82 g/l、微量元素溶液7.3 ml/l、MgSO4*7 H2O 0.99 g/l、チアミン*HCl 20.9 mg/l、グルコース*H2O 29.3 g/l、ビオチン0.2 mg/l、1.2 ml/l シンペロニック10 % 消泡剤。微量元素溶液は、0.5M HCl溶液中に溶解させた、FeSO4*7H2O 10 g/l、ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/l、MnSO4 * H2O 2.13 g/l、CuSO4* 5H2O 1.0 g/l、CoCl2*6H2O 0.42 g/l、(NH4)6Mo7O24* 4H2O 0.3 g/l、H3BO30.50 g/lを含有した。
【０３５５】
フィード１溶液は、700 g/lグルコース*H2O、7.4 g/l MgSO4*7 H2O及び0.1 g/l FeSO4*7H2Oを含有した。フィード2は、KH2PO4 52.7 g/l、K2HPO4*3H2O 139.9 g/l及び(NH4)2HPO466.0 g/lを含んだ。すべての成分は、脱イオン水に溶解させた。pH調節のためのアルカリ性溶液は、11.25 g/l L-メチオニンを追加された水性12.5 %(w/v)NH3溶液であった。
【０３５６】
42 Lの滅菌されたバッチ培養液と前培養の計算された播種菌液から開始し、バッチ発酵は31℃、pH 6.9±0.2、背圧800 mbar及び初期通気速度50 l/分で実施した。溶解酸素の相対値(pO2)を、攪拌機速度を1000 rpmまで増加させることによって、発酵を通して50％で維持した。溶解酸素値の急増によって示される、最初に追加されたグルコースの枯渇後に、軽鎖を製造する場合は温度を37℃へ移行させ、又、重鎖構築物を製造する場合は温度を一定に保ち、15分後、発酵は両フィードの開始に伴いフェドバッチモードへ入った(それぞれ、600及び140 g/h)。フィード2の速度は一定に維持された一方で、フィード1の速度は、所定のフィードプロファイルによって、6-7時間で、軽鎖を製造する場合は600から最終的に1400 g/hまで、重鎖構築物を製造する場合は600から最終的に1600 g/hまで段階的に増加させた。二酸化炭素排気濃度が2％を超えるレベルとなった場合は、通気速度を5時間で50から100 L/分まで10 L/分の割合で増加させた。細胞質中の不溶性封入体としての組換え標的タンパク質の発現は、可変軽鎖Fab鎖に対しては光学濃度およそ40において、可変重鎖Fab鎖に対しては光学濃度およそ120において、24 gのIPTGを追加することによって誘導させた。
【０３５７】
24時間培養後、全培養液を4℃-8℃へ冷却し、発酵槽容器においてオーバーナイトで保存した。細菌を、フロースルー遠心分離機を用いた遠心分離(13,000 rpm、13 l/時間)又は分離器を介して回収し、得られたバイオマスはさらなる処理(細胞破砕)まで-20℃で保存するか又は封入体の単離のために即座に処理した。
【０３５８】
産物形成の解析
試料は、一つは誘導前に、その他はタンパク質発現誘導後の複数の誘導中の時点で発酵槽から採取した。試料は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。すべての試料に対して、当量の細胞（OD標的=10）を5 mL PBSバッファー中に懸濁し、氷上の超音波処理を介して破砕した。その後、100 μLの各懸濁液を遠心分離し(15,000 rpm、5分)、各上清を取り出し、別々のバイアルへ移した。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質を区別するために行った。各上清(=可溶性タンパク質画分)100 μLに対して、及び、各ペレット(不溶性タンパク質画分)に対して、200 μLのSDSサンプルバッファー(Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970))を加えた。試料は、試料中のすべてのタンパク質を可溶化及び還元するために激しい攪拌下において、15分間、95℃で加熱した。室温へ冷却した後、5 μLの各試料を4-20 % TGX Criterionステインフリーポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad社)へ移した。加えて、5 μlの分子量標準(プレシジョンプラスプロテインスタンダード、Bio-Rad社)及び3つの量(0.3 μl、0.6 μl及び0.9 μl)の、公知の標的タンパク質濃度(0.1 μg/μl)を有する定量化標準を用いた。
【０３５９】
電気泳動は60分間、200 Vで行い、その後ゲルをGELDOC EZ Imager(Bio-Rad社)へ移し、5分間UV照射を用いて処理した。ゲルイメージは、IMAGE LAB解析ソフトウェア(Bio-Rad社)を用いて解析した。3つの標準を用いて、線形回帰曲線を係数>0.99で計算し、オリジナルの試料中の標的タンパク質の濃度を計算した。収量は、Fab軽鎖が最大で3-4 g/L及びFab重鎖PE融合体が最大で10-12g/Lであった。
【０３６０】
封入体調製:
100 L発酵の封入体調製(IBP)は、細菌を回収した直後に、バッファー1(12.1 g/L Tris、0.246g/L MgSO4*7H2O、12 mL/L 25%-HCl)中に、回収された細菌細胞を再懸濁することにより開始した。バッファーの容量はバイオマスの乾物含量に依存して計算した。リゾチーム(100 kU/mg、0.12 mg/g DCW)及び少量のベンゾナーゼ(5 U/g DCW)を追加した。その後懸濁液を、細菌細胞を破砕するために900 bar（APV Rannie 5、1パス）でホモジナイズし、続いて、さらなるベンゾナーゼ(30 U/g DCW)を追加した上で30-37℃で30分間インキュベートした。その後第1洗浄バッファー(60 g/L Brij、87.6 g/L NaCl、22.5g/L EDTA、6 mL/L 10N NaOH)を加え、再度、懸濁液を30分間インキュベートした。続く分離工程(CSC6、Westfalia社)により封入体スラリーがもたらされ、それは第2洗浄バッファー(12.1 g/L Tris、7.4 g/L EDTA、11 mL/L 25%-HCl)に再懸濁し、20分間インキュベートした。さらなる分離工程により、封入体を使い捨ての滅菌されたプラスチックバッグへ回収し、即座にDSP部門へ移した。
【０３６１】
結果
軽鎖の発酵では、578 nmで測定した光学濃度で170-190の収量が得られ、最終産物の収量は10-12 g/Lであった。重鎖毒素融合体の発酵では、578 nmで測定した光学濃度で210-230の収量が得られ、最終産物の収量は3-4.5 g/Lであった。
【０３６２】
cFP-0205のリフォールディング及び精製:HC-PE24及びLCの封入体を、室温、オーバーナイトで、8 Mグアニジン塩酸塩、100 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、pH 8.0 + 100 mMジチオスレイトール(DTT)中に別々に溶解した(5 mL中に1gの封入体)。ソルビリゼートをpH 3へ調整し、遠心分離しペレットを廃棄した。DTTを除去するために、8 Mグアニジン塩酸塩、10 mM EDTA、pH 3.0に対して大規模透析を行った後、全タンパク質濃度をビウレット法により決定した。HC及びLC内容物の純度はSDS-PAGEを介して推定した。
【０３６３】
ソルビリゼートを、0.5 Mアルギニン、2 mM EDTA、pH 10 + 1 mM GSH/GSSG、それぞれを含有する再生バッファーで、モル比1:1で、2℃-10℃で希釈した。標的タンパク質濃度は、各用量の間で2時間のインキュベーション時間で、0.1 g/Lから0.5 g/Lまで段階的に増加させた。5パルス後に、再生溶液を、オーバーナイトで2℃-10℃で保持した。
【０３６４】
再生されたタンパク質を、H2Oを用いて<3 mS/cmへ希釈し、20 mM Tris/HCl、pH 7.4で平衡化された陰イオン交換カラム(AIEX)へポンプにより送り込んだ。平衡化バッファーでカラムを洗浄の後、タンパク質を20 mM Tris/HCl、400 mM NaCl、pH 7.4に至る勾配で溶出させた。Fab-PE24を含有するピーク画分をプールし、濃縮し、及び凝集体、断片、及び大腸菌タンパク質を除去するために20 mM Tris、140 mM NaCl、pH 5.5又は6.0において調製用サイズ排除カラム(SEC)へ適用した。最終タンパク質プールを所要のタンパク質濃度へと調整し、SDS-PAGE又はCE-SDS、解析的SEC及びUV280を介して解析した。同一性は質量分析によって確認した。
【０３６５】
cFP-0205のタンパク質解析:試料解析は、上記の通り実行した。
【０３６６】
ヒト化抗メソテリンSS1とのFab融合体としての最終的な脱免疫化PEバリアント(cFP0205)の性質決定。
細胞毒性及びインビトロ腫瘍細胞死滅:cFP0205の細胞毒性強度を、さまざまな癌細胞株及び原発性中皮腫細胞を用いた細胞生存率アッセイにおいて、SS1Pの細胞毒性強度と比較した。結果は表24に示される。表24に示されるように、多くの癌細胞株に対して、SS1P及びcFP0205は同程度の作用強度を有した(IC50値における相違≦3)。しかしながら、幾つかの細胞株(例えば、Hu-1及びHu-2)及び原発性中皮腫細胞(RH19、RH21)は、SS1PよりもcFP0205に対して有意に感受性が高かった(6-10倍低いIC50値)。
【０３６７】
【表２４】
0006584012.tif 000030
【０３６８】
ヒト化抗メソテリンSS1とのFab融合体としての最終的な脱免疫化PEバリアント(cFP0205)の性質決定。
血清半減期:単一用量の薬物動態を評価するために、カニクイザル(1匹の雄及び1匹の雌)においてcFP0205を用いた予備研究を実施した。動物に0.3 mg/kgのcFP0205を静脈内に投与した。薬学動態に関し、血液試料を、投与前、投与後0.083時間(5分、注入終了)、1時間、2時間、3時間、5時間、8時間、24時間、48時間及び168時間で採取した。遊離薬物(破線)並びに全薬物(黒四角形及び実線)の濃度を、さまざまなELISAフォーマットによって決定した(図20)。全薬物濃度を決定するために、メソテリン被覆プレート上での捕捉工程前に、ワンステップの酸解離を実施した。遊離薬物濃度及び全薬物濃度は経時的にプロットした。比較として、SS1Pによる過去データもまた図20へ挿入した(黒円及び実線)。これらの過去のデータは、SS1Pの血清濃度に対する読み出しとして、細胞毒性のアッセイを用いて作成した。細胞毒性アッセイは遊離薬物を検出するが、それのみならず、観察された活性に寄与し得る可溶性メソテリンへ結合した薬剤も少なくとも部分的に検出する。cFP0205に対して測定された遊離薬物濃度は、SS1Pの過去のデータの第一期と同等であった。cFP0205に対して測定された全薬物濃度は、SS1Pに対して観察された動態の第二期と同等であった。要するに、マウスのみならずカニクイザルにおいても、SS1P及びcFP0205の血清濃度の動態は非常に類似していた。
【０３６９】
ヒト化抗メソテリンSS1とのFab融合体としての、最終的な脱免疫化PEバリアント(cFP0205)の性質決定
標的毒性の低減:H596肺癌細胞の小さな皮下腫瘍(平均腫瘍体積100 mm3)を有するSCID beigeマウスに、0.5、1、2及び3 mg/kgのcFP0205を3x/w、1日おき(qod)で投与し、体重減少を1ヶ月にわたってモニターした。結果は図21に示される。
【０３７０】
図21に示されるように、3x/w、1日おきで静脈投与されたマウスにおけるSS1Pの最大耐量は0.4 mg/kgであった。この同一の投与計画で投与されたcFP0205は、SCID beigeマウスにおいては最大3 mg/kgの用量で許容された。幾らかの体重減少が、全ての処理グループにおいて観察された。しかしながら、0.5 mg/kgの用量のcFP0205の影響は、ビヒクル対照とは区別不能であった。容量依存的に、1、2及び3 mg/kgで増加的に体重減少が生じた。3 mg/kgグループにおいて、最大の体重減少は15%であり、これはcFP0205の最後の適用後4日目に観察された。2及び3 mg/kg処理グループにおいては、最後の適用後にさらなる体重の減少は観察されなかった。すべての動物は、最後の処理後5日目以降から体重の回復が始まった。最初の体重回復は、3 mg/kgグループで最も明白だった。要するに、マウスにおける両分子の同様な薬物動態的特性にもかかわらず、cFP0205は、SS1Pと比較してほぼ10倍高い用量で許容された。
【０３７１】
SS1P及びcFP0205の非特異的な毒性を評価及び比較するために、単回静脈内投与(短時間注入)毒性試験を、8週齢の雌のWistar-Furthラット(体重150-175 g)において実施した。特に、試験物によって引き起こされる肺における血液漏出(浮腫)を誘導するリスクを調査した。グループあたり3匹の動物は、0.3 ml/分の注入速度で静脈内短時間注入により活性物質又はビヒクルを与えられた。動物は、投与後24時間で死体解剖を受けた。主気管支を有する肺及び肝臓を肉眼で評価し、肺における液貯留を評価し、臨床的化学アッセイを血液試料に対して実施した。結果が表25に示される。
【０３７２】
【表２５】
0006584012.tif 000031
SS1P及びcFP0205の血清半減期は、マウスにおいて示されたように、ラットにおいても非常に類似すると思われる。
【０３７３】
表25において示されるように、2 mg/kgのSS1Pを静脈投与された3匹のラットのうちの2匹は、肺における液体貯留を示した。このグループのすべての動物は毒性に関する明らかな臨床徴候を示し、かつ、全ての動物に対して、臨床的化学の値は重度の肝臓障害を示していた。これとは対照的に、10 mg/kgのcFP0205で処理された3匹の動物はすべて、毒性に関する徴候を示さなかった。1匹の動物においてのみ、肝臓の酵素の一つに対する値がわずかに上昇していた。これらの知見はcFP0205分子が、SS1Pという旧知の免疫毒素フォーマットよりも肝毒性及び血管漏出症候群をかなり引き起こし難いということを実証する。
【０３７４】
静脈内投与後の試験物の反復1日用量の許容度を決定するため及び潜在的な遅発性の毒性(最後の反復投与後最大72時間)を確認するために、カニクイザル(1匹の雄及び1匹の雌)においてcFP0205を用いた予備毒性学試験を実施した。動物の投与後の観察は、投与終了後すぐ、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間及び4時間で実施した。投与期の間、動物の一般行動及び全身外観を一日2回観察し、一方、体重、摂餌量及び排泄物は一日1回解析した。
【０３７５】
cFP0205の、毎日、1 mg/kgで5日連続の投与は、2匹の動物によって十分に許容された。投与部位での大量出血、急性炎症又は潰瘍形成は観察されなかった。SS1Pによって代表される旧知の免疫毒素フォーマットは、0.3 mg/kg/d 5xでの投与で非許容的であり、動物が、震えを伴う円背位の姿勢、活動性低下及び食欲不振などの毒物による持続的な臨床徴候を示すことがこれまでに示されている一方で、動物が毒性の臨床徴候や非許容性を示さなかったことは、1 mg/kg/d 5xが重度の中毒を起こさない投与量であることを確固として証明した。要するに、マウスのみならず、これらの免疫複合体の標的指向化部分に対して完全に交差反応性の種であるカニクイザルにおいても、cFP0205はSS1Pよりも非常に許容的である。
【０３７６】
ヒト化SS1とのFab融合体としての最終的な脱免疫化PEバリアント(cFP0205)の性質決定
cFP0205及びSS1Pを、遊離アミノ基においてCy5で標識化した。皮下H596腫瘍を有するアウトステージSCID beigeマウス(Outstaged SCID beige mice)に、2つの蛍光標識化された分子を有する2 mg/kgを静脈内投与した(4匹のマウス／グループ)。6時間後、動物を屠殺した。肺、肝臓及び脾臓をホルマリンで固定し、包埋し、切片化した。これらの器官の代表的な切片の蛍光イメージをさまざまな拡大率で撮影した。結果は、図22A-22Lにおいて示される。
【０３７７】
図22A-22Lに示されるように、SS1P処理により肺及び脾臓組織の明白な蛍光染色及び肝臓における細網内皮系と思われるものの大規模な染色がもたらされた。これに対して、cFP0205を適用した肺組織には染色が見られなかった。また、脾臓の染色もそれほど明白ではなく、染色模様はSS1P処理動物のそれとは異なっていた。肝臓においても、cFP0205での染色は、SS1Pに比較して大幅に減少した。クッパー細胞と思われる孤立した単一の細胞のみが蛍光染色された。これより、dsFv-PE38と比較したFab-PE24のより低い非特異的毒性が、正常組織における両分子の分布の異なりに起因していることが示唆される。
【０３７８】
[実施例15]
本実施例は、抗グリピカン3-PEバリアントキメラ分子の製造を説明する。
【０３７９】
配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(L010R-456A)、配列番号:61の可変重鎖ドメインVH、及び配列番号:62の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3-PEバリアントキメラ分子(GPC3-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー)は、実施例12に記載された抗メソテリンPEバリアントキメラ分子cFP-077を調製する方法(クローニングから精製まで)と類似する方法によって調製した。
【０３８０】
配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(L010R-456A)、配列番号:77の可変重鎖ドメインVH、及び配列番号:78の可変軽鎖ドメインを含む抗グリピカン3-PEバリアントキメラ分子も、実施例12に記載された抗メソテリンPEバリアントキメラ分子cFP-077を調製する方法(クローニングから精製まで)と類似する方法によって調製した。
【０３８１】
[実施例16]
本実施例は、GPC3-PE24-LR-LO10Rと比較した抗グリピカン3-PEバリアントキメラ分子GPC3-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーの細胞毒性特性を説明する。
【０３８２】
グリピカン3陽性肝臓癌細胞株HepG2において、GPC3-PE24-LR-LO10Rの細胞毒性強度を、GPC3-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーのそれと比較した。一時的に、HepG2細胞を6000細胞／ウェルの密度で96ウェルプレートへ播種した。オーバーナイトで培養後、さまざまな濃度のcFPを培地に加え、細胞を72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、CELLTITERGLOWアッセイを用いて細胞生存率を決定した。結果は表26に示される。
【０３８３】
表26に示されるように、両分子について、HepG2の細胞生存率の阻害に対する同等の用量反応曲線が観察された。456A変異及びロングリンカーを有する、より完全に脱免疫化されたPEバリアントのIC50値は、ショートリンカーを有するLR-LO10Rバリアントのそれよりもほんのわずかに低かった。非標的(「フリーPE24」)又は誤標的化PE24(mistargeted PE24)(「CD33-Fab-PE」；HepG2細胞はCD33を発現していない)は、＜30 μMの濃度では細胞生存率のいかなる有意な減少も示さなかった。要するに、より完全に脱免疫化されたGPC3標的化LR-LO10R-456A-ロング-リンカーバリアントは、ショートリンカーを有するGPC3標的化LR-LO10Rバリアントに比較して同じか又はほんのわずかに良好な細胞毒性強度を有した。PEにおける追加的な456A変異によって、全てのB細胞エピトープが除去された。
【０３８４】
【表２６】
0006584012.tif 000032
【０３８５】
[実施例17]
本実施例は、A458R変異を有する脱免疫化PE融合タンパク質の細胞毒性を説明する。
【０３８６】
SS1P、SS1-LR-GGS、SS1-LR-GGS-LO10、SS1-LR-GGS-LO10-A458R及びSS1-LR-GGS-LO10-A458-456Aの細胞毒性をWST法を用いて測定した。結果は、表27に示される。
【０３８７】
【表２７】
0006584012.tif 000033
【０３８８】
表27に示されるように、A458R変異は、幾つかの細胞株におけるSS1-LR-GGS-L010の活性を増加させた。456A変異の追加は、さらに幾つかの細胞株における活性を増加させた。A431/H9はメソテリンを発現する類表皮癌であり、Hayは中皮腫の株である。M30もまた中皮腫細胞株であり、AGSは胃癌細胞株である。Hu-Mesoは、数か月間培養に置かれた、中皮腫患者由来の細胞である。
【０３８９】
[実施例18]
本実施例は、RG7787を用いたHCC70腫瘍の治療を説明する。
【０３９０】
雌のヌードマウスに、時間0において、HCC70細胞を乳房脂肪パッドへ接種した。HCC70は乳癌細胞株である。RG7787(2.5 mg/kg IV)又はビヒクルでの静脈内治療を6日目から開始し、1日おきに、全5回の投与(矢印)を続けた。腫瘍のサイズを測定した。結果は、図24に示される。
【０３９１】
図24に示されるように、RG7787で治療されたマウスの腫瘍サイズは、対照マウス(ビヒクル)のそれと比較して減少した。2つのグループ間で10日目に統計的に有意な差が生じ始め、14日目までにp<0.00001となった。
【０３９２】
[実施例19]
本実施例は、パクリタキセル及びRG7787の組合せを用いた、マウスにおけるKLM1腫瘍の治療を説明する。
【０３９３】
4週4日齢のマウスに4 x 106 KLM1細胞を注入した。KLM1は、メソテリンを発現する膵臓癌細胞株である。13日後、マウスは、治療されないか又はパクリタキセル(50 mg/kg)、RG7787(2.5 mg/kg)又はRG7787(2.5 mg/kg)及びパクリタキセル(50 mg/kg)の組合せにより治療した。腫瘍サイズを治療後89日まで測定した。結果は、図23に示される。
【０３９４】
図23に示されるように、パクリタキセル及びRG7787の組合せで治療されたマウスの腫瘍サイズは、対照マウス（未治療）の腫瘍サイズ又はパクリタキセル単独若しくはRG7787単独で治療されたマウスの腫瘍サイズと比較して減少した。
【０３９５】
[実施例20]
本実施例は、パクリタキセル及びRG7787の組合せを用いた、マウスにおけるHCC70腫瘍の治療を説明する。
【０３９６】
雌の胸腺欠損ヌードマウスに、時間0において、HCC70細胞を接種した。動物を、ビヒクル、腹腔内(IP)ビヒクル注射でのRG7787、静脈内(IV)ビヒクル注射でのパクリタキセル又はパクリタキセル及びRG7787の組合せにより治療した。パクリタキセル(50 mg/kg)は腹腔内注射により、長い矢印で示された日において投与した。RG7787(2.5 mg/kg)は、短い矢印で指し示された日において静脈内投与した。ビヒクルを投与されたn=5のマウス及びRG7787、パクリタキセル又はその組み合わせで治療されたn=6のマウスの平均腫瘍体積が標識によって示される。結果は、図25に示される。
【０３９７】
図25に示されるように、パクリタキセル及びRG7787の組合せで治療されたマウスの腫瘍サイズは、対照マウス（ビヒクル）の腫瘍サイズ又はパクリタキセル単独若しくはRG7787単独で治療されたマウスの腫瘍サイズと比較して減少した。
【０３９８】
[実施例21]
本実施例は、パクリタキセル及びR205の組合せを用いた、マウスにおけるMKN-28腫瘍の治療を説明する。
【０３９９】
胸腺欠損ヌードマウスに、時間0で、MKN-28細胞を接種した。MKN-28は、メソテリンを発現する胃癌細胞株である。動物は、治療なし（UT）又はRoche 205(R205又は205)単独、パクリタキセル(タキソール)単独又はR205及びパクリタキセルの組合せで治療した。腫瘍サイズが測定された。結果は、図26に示される。図26に示されるように、パクリタキセル及びR205の組合せで治療されたマウスの腫瘍サイズは、対照マウス(未治療)の腫瘍サイズ又はパクリタキセル単独若しくはR205単独で治療されたマウスの腫瘍サイズと比較して減少した。
【０４００】
[実施例22]
本実施例は、LMB-T18のインビボにおける抗腫瘍活性を説明する。重症複合免疫不全(SCID)マウスにCA46細胞を移植した。数日後、腫瘍がサイズにおいて100 mm3へ到達したときに、マウスを、静脈内投与によるPBS(対照)又はLMB-T18(5 mg/kg x 4又は7.5 mg/kg x 3)で治療した。5.0 mg/kgを与えられたマウスは、7日目、9日目、11日目及び16日目の4回治療し、より高い用量グループでは、7.5 mg/kgで、7日目、9日目及び11日目の3回治療した。若干の体重減少(平均6%)と共に、著しい腫瘍退縮がすべてのマウスにおいて観察された(図27E)。5.0 mg/kgで治療された7匹中5匹のマウスが、33日目における完全な腫瘍退縮を維持し、7.5 mg/kgグループにおいては、7匹中3匹のマウスが完全な腫瘍退縮を維持した。LMB-T18の非特異的な毒性を評価するために、6匹の腫瘍を持つマウスを静脈内投与での10 mg/kg QODの2回の投与により治療した。1匹のマウスは急激な体重減少を示し、安楽死させた。
【０４０１】
[実施例23]
本実施例は、LMB-T18が、大幅に減少したT細胞活性化を有することを説明する。
【０４０２】
LMB-T18がT細胞刺激における減少を有するか、又は新たなT細胞エピトープが変異によって創出されたかを決定するために、最も高い応答を行うドナー(n=13)並びにHCL及び中皮腫患者(n=7)由来のPBMCを、MP又はLMB-T18を用いて刺激した。細胞は、MP及びLMB-T18の間の相違を提示する39の新規ペプチドを用いて再刺激した。ドナーT細胞活性における90 %の減少(スチューデントT検定におけるp<0.0001)が観察された。活性化T細胞を有する患者においてさえ、83 %の減少(スチューデントT検定におけるp<0.0001)があった。なお、新規のエピトープは変異によっては創出されなかった。
【０４０３】
[実施例24]
本実施例は、LMB-T18が患者由来の抗血清に対し減少した結合を有することを説明する。
【０４０４】
LMB-T18の抗原性を、MPに対する中和抗体を有する患者由来の血清を用いて、MP、HA22-LR及びLMB-T18の反応性を比較することにより評価した。結合は、13人のMP処理患者由来の血清を用いてICC-ELISAで測定され、図27Fに示される。HA22-LRのように、LMB-T18は、MPと比較して、血清に対して有意に減少した結合(p<0.001 一元配置分散分析)を有することが分かった。また、LMB-T18がHA22-LRと比較して、有意にさらに低い結合(p<0.001 一元配置分散分析)を有していることも判明し、これはLMB-T18における変異が、抗血清に対する結合を減少させていることを示している。
【０４０５】
[実施例25]
本実施例は、抗FAP-PEバリアントキメラ分子の製造を説明する。
【０４０６】
以下を含む、3つの抗FAP-PEバリアントキメラ分子は、後述されるものを除き、実施例12に記載された抗メソテリンPEバリアントキメラ分子cFP-077を調製する方法(クローニングから精製まで)と類似する方法によって調製した:
(a)配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(L010R-456A)、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH、及び配列番号:94の可変軽鎖ドメイン(iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー)
(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(L010R-456A)、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH、及び配列番号:294の可変軽鎖ドメイン(LCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー)(これは配列番号:290のVLバリアントを含んでいる)、及び、
(c)配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(T-20)、配列番号:93の可変重鎖ドメインVH、及び配列番号:290の可変軽鎖ドメイン(LCL4-T20)。
【０４０７】
抗FAP-PEバリアントキメラ分子(b)及び(c)は、改変された可変軽鎖ドメイン(VL)を含んだが、これは配列番号:94のオリジナルのVL配列の4位のメチオニンがロイシンで置換されたものであり、これにより配列番号:290の改変VL配列(「LCL4」)が提供された。配列番号:290の改変された可変軽鎖ドメインは、N末端改変に関係した不純物の生成を減少させることが分かった。これらのN末端の改変は、さまざまな軽鎖長を有するバリアントの混合物を与えたが、これは配列番号:94のN末端のメチオニン又は4位のメチオニンのいずれかで未改変の配列が発現を開始することに起因していた。
【０４０８】
前培養
前発酵に対して、実施例12に記載されたものと同一の化学的に規定された培地(CD-PCMv2.20)を使用した。
【０４０９】
培養は、ロータリーシェイカー上で8時間、37℃及び170 rpmで、光学濃度(578 nm)が13.3又は14.4となるまで行った。150 mlの前培養液を、10 Lのバイオリアクターのバッチ培養液へ播種するために用いた。
【０４１０】
発酵
10L Biostat C、DCU3発酵槽(Sartorius社、メルズンゲン、ドイツ)における発酵のために、実施例12に記載されたものと同一の化学的に規定されたバッチ培養液を用いた。
【０４１１】
使用された一つのフィード溶液は、700 g/lグルコース*H2O、7.4 g/l MgSO4*7H2O及び0.1 g/l FeSO4*7H2Oを含有した。すべての成分は、脱イオン水に溶解させた。pH調節のためのアルカリ性溶液は、11.25 g/l L-メチオニン及び10 g/Lロイシン及び10 g/Lトレオニンを追加された水性12.5 %(w/v)NH3溶液であった。
【０４１２】
6.24 Lの滅菌されたバッチ培養液と前培養からの150 ml播種菌液から開始し、バッチ発酵は32℃、pH6.9±0.2、背圧800 mbar及び初期通気速度10 l/分で実施した。溶解酸素の相対値(pO2)を、攪拌機速度を1500 rpmまで増加させることによって、発酵を通して50％で維持した。溶解酸素値の急増によって示される、最初に追加されたグルコースの枯渇後に、温度を32 ℃又は37 ℃へ移行させ、15分後、発酵は両フィードの開始に伴いフェドバッチモードへ入った(それぞれ、60及び14 g/h)。フィードの速度は、所定のフィードプロファイルによって、5.5時間又は6.5時間で90から最終的に210又は240 g/hまで段階的に増加させた。二酸化炭素排気濃度が2％を超えるレベルとなった場合は、通気速度を5時間で10から20 l/分まで一定に増加させた。組換えタンパク質の発現は、光学濃度およそ40又は120において、3.6 gのIPTGを追加することによって誘導した。標的タンパク質を細胞質中に封入体として発現させた。
【０４１３】
24時間培養後、光学濃度は179又は171に達し、全培養液を4 ℃-8 ℃へ冷却した。細菌を、実験用遠心分離機を用いて遠心分離を介して回収し(4500 rpm、4 ℃で冷却)、得られたバイオマスはさらなる処理(細胞破砕)まで-20 ℃で保存した。
【０４１４】
産物形成の解析
実施例12の方法との比較における特定の相違を以下に記載する:
【０４１５】
すべての試料からの等量の細胞(OD標的=10)を、5 mL PBSバッファーに懸濁し、氷上の超音波処理を介して破砕した。その後、100 μLの各懸濁液を遠心分離し(8,000 rpm、5分)、各上清を取り出し、別々のバイアルへ移した。
【０４１６】
Laemmliバッファーを加えた後、試料を、試料中のすべてのタンパク質を可溶化及び還元するために激しい攪拌下において、45分間、40℃で加熱した。
【０４１７】
封入体調製:
10 L発酵の封入体調製(IBP)は、細菌細胞の破砕後にさらなるベンゾナーゼ(30 U/g DCW)が追加され、60分間、25 ℃でインキュベートされたことを除き、実施例12に記載の方法と類似する様式において処理した。
【０４１８】
可溶化、再生及び精製は、実施例12に記載されたものと同様の様式において実施した。以下の配列を用いた:
・配列番号:93の可変ドメインVH、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、及び配列番号:37を含むPEを含む、iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びLCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーキメラ完全長重鎖配列(配列番号:291);
・配列番号:93の可変ドメインVH、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、及び、配列番号:289を含むPE(T18/T20)を含む、完全長重鎖を含むLCL4-T20キメラ重鎖構築物の配列(配列番号:292);
・配列番号:94の可変軽鎖ドメイン及び定常領域の配列を含む、完全長のiFAP軽鎖(配列番号:293)の配列;
・配列番号:290の可変軽鎖ドメイン及び定常領域の配列を含む、完全長のLCL4軽鎖(配列番号:294)の配列;並びに、
・配列番号:290の可変軽鎖ドメイン((配列番号:94と比較して)位置4に変異M4Lを有する)配列。
【０４１９】
[実施例26]
本実施例は、抗FAP-PEバリアントキメラ分子iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー、LCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びLCL4-T20の細胞毒性を説明する。
【０４２０】
FAP陽性繊維芽細胞株MRC-5、FAP陽性繊維形成性メラノーマ細胞株LOX-IMVI及びFAP陽性肉腫細胞株OsA-CLに関して、iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーの細胞毒性を、LCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びLCL4-T20(「cFP」)の細胞毒性と比較した。一時的に、細胞を10,000細胞／ウェルの密度で96ウェルプレートへ播種した。オーバーナイトで培養後、さまざまな濃度のcFPを培地に加え、細胞を72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、CELLTITER GLOアッセイを用いて細胞生存率を決定した。結果は、表28及び表29に示される。
【０４２１】
表28に示されるように、iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー(3つの異なるバッチ)及びLCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーに対して試験された3種すべての細胞株において、細胞生存率の阻害について同等のIC50値が観察された。表29に示されるように、LCL4-T20も細胞生存率の強力な阻害を示した。要するに、iFAP-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー、LCL4-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びLCL4-T20は、FAP陽性腫瘍細胞株及び繊維芽細胞に対し、強力な細胞毒性効果を示した。
【０４２２】
【表２８】
0006584012.tif 000034
【０４２３】
【表２９】
0006584012.tif 000035
【０４２４】
[実施例27]
本実施例は、抗CAIX-PEバリアントキメラ分子の製造を説明する。
【０４２５】
以下を含む、2つの抗CAIX-PEバリアントキメラ分子は、後述されるものを除き、実施例12に記載された抗メソテリンPEバリアントキメラ分子cFP-077を調製する方法(クローニングから精製まで)と類似する方法によって調製された:
(a)配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:37を含むPE(L010R-456A)、配列番号:125の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:126の可変軽鎖ドメイン;又は、
(b)配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、配列番号:289を含むPE(T-20)、配列番号:125の可変重鎖ドメインVH及び配列番号:126の可変軽鎖ドメイン。
【０４２６】
試料は、溶液中のタンパク質濃度を決定するために、OD 280 nmでUV分光光度計を用いて解析した。SDS-PAGE及びクマシー染色装置の材料は、以下の表30において説明される。
【０４２７】
【表３０】
0006584012.tif 000036
【０４２８】
Laemmliバッファーを加えた後、試料を、試料中のすべてのタンパク質を可溶化及び還元するために激しい攪拌下において、45分間、40℃で加熱した。
【０４２９】
試料は、バッファーで1 mg/mlのタンパク質濃度へ調整した。試料の還元は、4 mlのサンプルバッファー(2x)及び1 mlの還元バッファー(10x)を含む還元バッファーを用いた。試料は、還元バッファーで試料を1:1に希釈し、10分間、70℃で試料をインキュベートすることにより還元した。
【０４３０】
ゲル電気泳動を、200 V、40分間で実行した。ゲルはSIMPLY BLUE Safe Stain(Invitrogen社、Cat. No. LC6065)で染色した。
【０４３１】
封入体調製
10 L発酵の封入体調製(IBP)は、細菌細胞の破砕後にさらなるベンゾナーゼ(30 U/g DCW)が追加され、60分間、25 ℃でインキュベートされたことを除き、実施例12に記載の方法と類似する様式において処理した。
【０４３２】
可溶化、再生及び精製は、実施例12に記載されたものと同様の様式において実施した。
【０４３３】
以下の配列が用いられた:
・配列番号:125の可変重鎖ドメインVH、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、及び配列番号:37を含むPEを含む、CAIX-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカーキメラ重鎖構築物(配列番号:295)の配列;
・配列番号:125の可変重鎖ドメインVH、配列番号:36のアミノ酸配列を含むリンカー、及び配列番号:289を含むPE(T18/T20)を含む、CAIX-T20キメラ重鎖構築物(配列番号:296)の配列;及び、
・配列番号:126の可変軽鎖ドメイン及び定常領域を含む、完全長の軽鎖(配列番号:297)の配列。
【０４３４】
[実施例28]
本実施例は、抗CAIX-PEバリアントキメラ分子CAIX-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びCAIX-T20の細胞毒性(インビトロ腫瘍細胞死滅)を説明する。
【０４３５】
CAIX-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びCAIX-T20(「cFP」)の細胞毒性を、CAIX発現RCC-MF細胞を用いた細胞生存率アッセイにおいて比較した。一時的に、細胞を7,500 細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。オーバーナイトで培養後、さまざまな濃度のcFPを培地に加え、細胞を72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後にCELLTITER GLOアッセイを用いて細胞生存率を決定した。結果は、表31に示される。
【０４３６】
要するに、CAIX-PE24-LR-LO10R-456A-ロング-リンカー及びCAIX-T20は、CAIX陽性腫瘍細胞株に強力な細胞毒性効果を示した。
【０４３７】
【表３１】
0006584012.tif 000037
【０４３８】
本明細書に引用される、出版物、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることを個々に及び特に示され本明細書にその全体において説明されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０４３９】
本発明を記載する文脈（特に以下の請求項の文脈）における、用語「ひとつの(a)」及び「ひとつの(an）」及び「その(the)」及び「少なくとも1つの」並びに類似の指示対象物の使用は、本明細書において別に指示するか又は明確に文脈に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を含むものと解釈される。1又は複数の項目のリストが後に続く用語「少なくとも1つ」の使用（例えば、「A及びBの少なくとも1つ」）は、本明細書において別に指示するか又は明確に文脈に矛盾しない限り、リストされた項目(A又はB)から選択される一つの項目又はリストされた項目(A及びB)の2又はそれ以上のあらゆる組合せを意味すると解釈される。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」及び「含有する(containing)」は、特に断りのない限り、オープンエンドな用語(つまり、「含むが、それに限定されない」ことを意味する)として解釈される。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書において別に指示しない限り、その範囲内に含まれる各々独立した値を個々に言及する簡便な方法として役立てることを単に意図され、各々独立した値は、それらが本明細書に個々に引用されているものとして、本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別に指示するか又は明確に文脈に矛盾しない限り、あらゆる適切な順序において達成することができる。本明細書において与えられるあらゆるすべての実施例又は例示的な文言（例えば「など(such as)」）は、本発明をより良く明らかにするためにのみ意図され、特に請求されないかぎり、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の文言は、本発明の実施に対して必須の、あらゆる請求されない構成要素を意味すると解釈すべきではない。
【０４４０】
本発明の好ましい態様は、本発明を実行するために本発明者らが知る最良の様式を含め、本明細書に記載される。それらの好ましい態様のバリエーションは、前述の記載を読むことにより、当業者に対して明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がそのようなバリエーションを適切に使用することを期待するとともに、本発明者らは本発明が本明細書に特に記載されたものとは異なったやり方で実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に添付される請求の範囲において請求される主題のあらゆる改変物及び均等物を含んでいる。さらに、本明細書において別に指示するか又は明確に文脈に矛盾しない限り、それらのあらゆる潜在的なバリエーションにおいて、上述された構成要素のあらゆる組合せは本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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