(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットの融合タンパク質を含む大腸菌症防除剤であって、前記大腸菌症がブタ浮腫病及びLTを原因とする大腸菌性下痢症の両方であり、前記LTのBサブユニットの９０位のＡｓｎ残基にＮ−結合型の糖鎖が付加されていることを特徴とする、大腸菌症防除剤。
【請求項２】
志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、請求項１に記載の防除剤。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーが配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項２に記載の防除剤。
【請求項４】
前記ペプチドリンカーが配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項２に記載の防除剤。
【請求項５】
志賀毒素Stx2eのBサブユニットのＣ末端側に大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットが融合されている、請求項１または２に記載の防除剤。
【請求項６】
志賀毒素Stx2eのBサブユニットのＮ末端側に大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットが融合されている、請求項１または２に記載の防除剤。
【請求項７】
大腸菌易熱性毒素LTに対する抗体を誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の防除剤。
【請求項８】
ＩｇＡを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項７に記載の防除剤。
【請求項９】
ＩｇＧを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項７に記載の防除剤。
【請求項１０】
志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む組み換えベクターで形質転換した可食植物であって、LTのBサブユニットの９０位のＡｓｎ残基にＮ−結合型の糖鎖が付加されている前記融合タンパク質を産生する可食植物を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物のブタ浮腫病及びLTを原因とする大腸菌性下痢症を防除する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌症に対して予防および治療効果を有する防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物病原体は、幾つかのメカニズムの中の１つのメカニズムによって宿主に感染することがある。それらの微生物病原体は、皮膚の外傷を通じて侵入することもあるし、粘膜表面と相互作用することもある。このメカニズムを通じて作用する細菌病原体とウイルス病原体は、最初に粘膜表面と接触し、粘膜表面に付着し、次いで集落化したり、或いは、パイエル板(Peyer's patches)及びその他のリンパ濾胞の上にある上皮の中の特殊化された吸収細胞(Ｍ細胞)により吸収(take up)される。
感染有機体の特異的ビルレンス決定子に抗する分泌型IgA(sIgA)抗体は、粘膜免疫性において重要な役割を果たす。多くの場合、感染有機体の関連ビルレンス決定子に抗する粘膜sIgAレベルの生産を刺激することにより、粘膜表面の初期感染を防止することができる。分泌型IgAは、付着及び／又は集落化をブロックし、表面作用毒素を中和し、又は宿主細胞の侵入を防止することにより、病原体の粘膜表面との初期相互作用を防止できる。【０００３】
ブタ浮腫病は離乳後に高発し、大腸菌の感染により引き起こされる。ブタ浮腫病の予防・治療には、抗生物質が使用されるが、食の安全及び耐性菌出現の懸念から、抗生物質に代わる予防法の確立が急務である。しかしながら、現在、浮腫病用の効果的なワクチンは無い。大腸菌性下痢症は、哺乳期および離乳直後に発症する。母豚投与型の哺乳期用ワクチンは市販されているが、移行抗体が切れ始める離乳期の下痢症をカバーすることはできず、また離乳期下痢症用のワクチンは市販されていない。これらの疾病を同時予防可能な経口投与型ワクチンができれば非常に有用だと考えられる。【０００４】
特許文献１には、シロイヌナズナ培養細胞及びレタス子葉断片を、糖鎖修飾が抑制された改変された浮腫病毒素Ｂサブユニット(Stx2eB)を一過的に発現するように形質転換することが記載されている。しかしながら、形質転換体において産生されたStx2eBを実際にワクチンとして用いたときの性能は確認されていない。
特許文献２には、遺伝子組換え植物に、ブタ浮腫病ワクチン抗原と大腸菌性下痢症抗原を連結して高蓄積させるための技術が開示されている。しかしながら、特許文献２では、当該組換え植物が実際にワクチンとして利用可能かどうかを確認する課題が残されていた。また、特許文献２では、（１）大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB)とStx2eBの融合順序、及び（２）LTBに付加されるN-結合型糖鎖が、それぞれ、植物細胞内での抗原蓄積やワクチン性能に対する影響については検討されていない。
非特許文献１では、遺伝子組換え大腸菌を用いてStx2eB-LTB融合抗原を発現・精製し、その性能評価がなされている。しかしながら、宿主として、イチゴやレタス等の植物を用いた性能評価はなされていない。また、LTBとStx2eBの融合順序が、植物細胞内での抗原蓄積・ワクチン性能に対して及ぼす影響について検討されていない。さらに、Stx2eB-LTB融合抗原について、Stx2e毒素予防効果は確認しているが、LT毒素予防の観点からの評価はなされていない。また、動物への投与は注射(アジュバント添加有)で行われており、より簡便かつ低コストな手法である経口投与(アジュバント添加無し)での免疫誘導有無は確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１９７１９号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ran et al., Veterinary Microbiology 127 (2008) 209-15
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、大腸菌易熱性毒素サブユニット(LT)と浮腫病毒素サブユニット(Stx2e)を含む大腸菌症防除剤について、植物細胞内での抗原蓄積と、防除（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）性能を最適化することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB)と浮腫病毒素Ｂサブユニット(Stx2eB)を含む大腸菌症防除剤が、それぞれのサブユニットを単独で使用した場合と比較して、ブタ浮腫病と大腸菌性下痢の両方の予防において、より高い効果があることを見出した。
また、本発明者らは、大腸菌易熱性毒素Ｂサブユニット(LTB)の９０位のＡｓｎ残基にＮ−結合型の糖鎖が付加されていることにより、植物細胞内での高生産でき、かつ、防除剤（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）として有効であることを見出した。
本発明者らは、このようにして本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質を含む大腸菌症防除剤。
（２）志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、（１）に記載の防除剤。
（３）志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットが共にＢサブユニットである、（１）または（２）に記載の防除剤。
（４）志賀毒素サブユニットのＢサブユニットの７３位のＡｓｎ残基がＳｅｒに変更されている、（３）に記載の防除剤。
（５）大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットに糖鎖が付加されている、（３）または（４）に記載の防除剤。
（６）大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットの９０位のＡｓｎ残基にＮ−結合型の糖鎖が付加されている、（５）に記載の防除剤。
（７）志賀毒素のＣ末端側に大腸菌易熱性毒素が融合されている、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の防除剤。
（８）志賀毒素のＮ末端側に大腸菌易熱性毒素が融合されている、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の防除剤。
（９）大腸菌易熱毒素に対する抗体を誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の防除剤。
（１０）ＩｇＡを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、（９）に記載の防除剤。
（１１）ＩｇＧを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、（９）に記載の防除剤。
（１２）大腸菌症が大腸菌性下痢症である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の防除剤。
（１３）大腸菌症がブタ浮腫病及び大腸菌性下痢症の両方である、（１２）に記載の防除剤。
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の防除剤を含む飼料。
（１５）志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む組み換えベクターで形質転換した可食植物を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の大腸菌症を防除する方法。
（１６）大腸菌症の防除に用いるための志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質。
（１７）大腸菌症防除剤の製造のための志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の大腸菌症防除剤は、先行技術文献に記載されるワクチンと比べて、植物細胞内での抗原蓄積・防除（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）性能性能が著しく改善されている。
本発明の大腸菌症防除剤により、ブタ浮腫病と大腸菌性下痢を同時に予防することができる。
本発明では、可食植物にタンパク抗原を蓄積させ経口投与するため、省コスト化、省力化、家畜のストレス軽減による生産性の向上が期待できる。
本発明の大腸菌症防除剤は、大腸菌症の症状を予防することができる、または治療することができる。健康な状態の非ヒト動物に本発明の大腸菌症防除剤を与えると、ワクチン効果や免疫賦活剤としての効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の大腸菌症防除剤発現用構築物を示す。
【図２】ガラクトースカラムを用いた融合タンパク質の精製を示す（電気泳動写真）。
【図３】レタスにおける融合タンパク質の蓄積を示す（電気泳動写真）。
【図４】形質転換植物を経口投与した場合のマウス血清の抗IgG抗体価を示す。
【図５】形質転換植物を経口投与した場合のマウス血清の抗IgA抗体価を示す。
【図６】形質転換植物を経口投与した場合のマウス腸管洗浄液の抗IgA抗体価を示す。
【図７】形質転換植物を経口投与した場合のウサギ血清の抗IgG抗体価推移を示す。
【図８】形質転換植物の経口投与によるブタ浮腫病の予防効果を示す。（Ａ）タイムテーブルを示す。各群ブタ3頭を供試した。陰性対照には空ベクターレタスを投与した。（Ｂ）臨床スコアを示す。攻撃初日（25日齢）から剖検日（34日齢）までを積算した。データは３頭の平均と標準偏差を示す。（Ｃ）攻撃初日から剖検日までの増体重割合（攻撃初日を基準とした）を示す。データは3頭の平均と標準偏差を示す。健常ブタは、レタス投与と攻撃無し。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の大腸菌症防除剤は、志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質を有効成分とする。
志賀毒素（Ｓｔｘ）は、腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、１型（Ｓｔｘ１）及び２型（Ｓｔｘ２）に分けられる。Ｓｔｘ１は、ａ〜ｄのサブクラスに、Ｓｔｘ２はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。腸管出血性大腸菌や赤痢菌の感染時に見られる出血性の下痢や、溶血性尿毒症症候群(HUS)、急性脳症などのさまざまな病態の直接の原因となる病原因子である。アフリカミドリザルの腎臓上皮由来培養細胞（ベロ細胞）に対して細胞毒性を示すことから、ベロ毒素とも呼ばれる。
ブタ浮腫病は、Ｓｔｘ２ｅを産生する腸管出血性大腸菌が経口感染し、小腸内で産生された該毒素が体内に吸収されることにより発病する。全身に浮腫が出現し、急性経過をとって高い死亡率を示す。
本明細書中において、Ｓｔｘ２ｅのＡサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＡ）は配列番号６のアミノ酸配列で表され、Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）は配列番号８のアミノ酸配列で表される。また、配列番号８は、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（GenBank Accession No. AAQ63639）の成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ａｌａ１９〜Ａｓｎ８７）のアミノ酸配列を示す。本明細書において、単に「Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質」、「Stx2eB」という場合には、上記成熟領域のアミノ酸配列からなるＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を指す。
本発明において、Ｓｔｘ２ｅのＢサブユニットは、例えば、Ａｓｎ７３（すなわち、配列番号８のアミノ酸配列の５５位のＡｓｎ残基）がＳｅｒに置換されている。配列番号８のアミノ酸配列の５５位のＡｓｎ残基がＳｅｒに置換されているアミノ酸配列（Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）を配列番号１０で示す。
【００１３】
Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、それぞれ、配列番号６又は配列番号８もしくは１０で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Ｓｔｘ２ｅＡにおいて、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり、Ｓｔｘ２ｅＢにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、それぞれ、配列番号６又は配列番号８もしくは１０で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
ただし、配列番号１０において上記置換等を含む配列、または、配列番号１０と上記同一性を有する配列は、配列番号１０の５５位の残基はＳｅｒに置換されたままである。
なお、本発明で使用されるＳｔｘ２ｅは、ＡサブユニットまたはＢサブユニットのいずれでもよいが、Ｂサブユニットが好ましい。
【００１４】
大腸菌性下痢症は、毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性の大腸菌易熱性毒素（LT）が原因である。LTは、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット（LTA）は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット（LTB）は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与する。
LTBとして配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、配列番号１２で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、ＬＴＢにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、Gen Bank Accession No. AAL55672として登録されている。
また、ＬＴＢは、それぞれ、配列番号１２で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットに糖鎖が付加されている。より好ましくは、大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットの９０位（すなわち、配列番号８の９０位）のＡｓｎ残基にＮ−結合型の糖鎖が付加されている。９０位がＡｓｎ残基であるＬＴＢサブユニットタンパク質の説明において、「数個」とは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列の第９０位のＡｓｎ残基以外の位置で、好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。
また、９０位がＡｓｎ残基であるＬＴＢサブユニットタンパク質は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列の９０位に対応する位置がＡｓｎである以外は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
なお、配列番号８の９０位がＳｅｒ残基に置換されたＬＴＢサブユニットタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４で表す。配列番号１４において上記置換等を含む配列、または、配列番号１４と上記同一性を有する配列を使用するこができるが、配列番号１４において上記置換等を含む配列、または、配列番号１４と上記同一性を有する配列は、配列番号１４の９０位の残基はＳｅｒに置換されたままである。
【００１６】
本発明の大腸菌症防除剤は、上記のような志賀毒素と大腸菌易熱性毒素との融合タンパク質を有効成分とするため、好ましくは、大腸菌易熱性毒素に対する抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧを誘導するワクチンまたは免疫賦活剤として機能することができる。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の大腸菌症防除剤によって誘導される抗体は、易熱性毒素エンテロトキシン(LTp)の毒素中和活性を有する。
本発明の大腸菌症防除剤は、大腸菌症の症状の防除（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）効果を有する。本発明でいう大腸菌症とは、ブタ浮腫病（毒素原性大腸菌）、大腸菌下痢症（腸管出血性大腸菌）、腸管侵入性大腸菌、腸管凝集性大腸菌、腸管病原性大腸菌を含む。
本発明の大腸菌症防除剤の有効成分である融合タンパク質とは、遺伝子組換え技術によって作られたタンパク質で、２種類以上のタンパク質遺伝子(コード領域)が連結され、連続的に転写・翻訳されることにより、１つのタンパク質を形成したものである。本発明に用いる融合タンパク質は、タンパク質同士が直接融合していても良いし、ペプチドリンカーを介して結合していても良い。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明の大腸菌症防除剤は、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットと大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結された融合タンパク質である。
本発明において、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットと大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットとが融合される順序は、いずれが先であってもよい。なお、植物における発現では、融合順序はStx2eBをN末端側に配置した方が、組換えタンパク質が高蓄積となる傾向がある。
本願明細書中において、志賀毒素のサブユニット及び大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質を有効成分とする大腸菌症防除剤、並びに、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットと大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結された融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物、該融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含むベクターで形質転換された植物等を総称して、大腸菌症防除剤ということがある。なお、本発明の大腸菌症防除剤は、上記融合タンパク質を含む限り、ワクチンまたは免疫賦活剤などの医薬及び飼料のいずれの形態であってもよい。本発明において、防除とは、予防及び治療のいずれも含むものである。
【００１８】
本発明で用いるペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、好ましくは１２〜２５個、さらに好ましくは１２〜２２個である。また、本発明で用いるペプチドリンカーにおいて、好ましくは、プロリンの含有率が２０〜２７％、より好ましくは、２０〜２５％である。
ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１２）や配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１２ｖ２）である。これらの配列と９０％以上、好ましくは９５％以上同一性を有するペプチドリンカーでもよい。
【００１９】
本発明で用いる融合タンパク質は、志賀毒素のＢサブユニット及び大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。本発明で用いる融合タンパク質は、各々のＢサブユニットが、ＰＧ１２（配列番号２）もしくはＰＧ１２ｖ２（配列番号４）を介してタンデムに連結されていることがより好ましい。本発明で用いる融合タンパク質は、Ａサブユニットを含んでいてもよいが、Ａサブユニットを含む場合には、Ａサブユニットは無毒化されていることが好ましい。
また、本発明で用いる融合タンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドリンカーが付加されていることが好ましい。特に、本発明で用いる融合タンパク質は、そのＣ末端にＰＧ１２もしくはＰＧ１２ｖ２が付加されていることが好ましい。
本発明で用いる融合タンパク質は、例えば、配列番号１５〜１８で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号１５〜１８で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、志賀毒素のＢサブユニット及び大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットが、ＰＧ１２もしくはＰＧ１２ｖ２を介してタンデムに連結され、そのＣ末端にはＰＧ１２もしくはＰＧ１２ｖ２がさらに付加されている。
前記ＰＧ１２もしくはＰＧ１２ｖ２などのペプチドを、前記融合タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該融合タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
【００２０】
本発明で用いる融合タンパク質は、好ましくは、そのアミノ末端に、植物由来の分泌シグナルペプチド又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されている。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した融合タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ-Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ-Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ-ＤグルカンエキソヒドロラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号２７で表される。
好ましい葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００２１】
さらに、本発明で用いる融合タンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、小胞体型（ER）のハイブリッドタンパク質ともいい、該小胞体型の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、小胞体型のＤＮＡ構築物ともいう。小胞体型の融合タンパク質は、真核生物で効率良く蓄積する報告例が多数ある。
本発明で用いる融合タンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されているが、ＨＤＥＬ配列（配列番号２９）を利用することができる。
他の好ましい液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００２２】
本発明で用いる融合タンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。遺伝子工学的に生産する方法については、後述する。
【００２３】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。
すなわち、本発明で用いるＤＮＡ構築物は、志賀毒素のサブユニットをコードするＤＮＡ及び大腸菌易熱性毒素のサブユニットをコードするＤＮＡ、好ましくは、志賀毒素のＢサブユニットをコードするＤＮＡ及び大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットをコードするＤＮＡが、前記ペプチドをコードするＤＮＡを介してタンデムに連結されているＤＮＡを含む。前記ペプチドリンカーをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１（ＰＧ１２）や配列番号３（ＰＧ１２ｖ２）で表される。志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡとして、例えばＳｔｘ２ｅＡをコードするＤＮＡ（配列番号５）、Ｓｔｘ２ｅＢ（Ａｓｎ７３）をコードするＤＮＡ（配列番号７）、Ｓｔｘ２ｅＢ（Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ（配列番号９）が挙げられる。大腸菌易熱性毒素をコードするＤＮＡとして、例えばＢサブユニット（Ａｓｎ９０）をコードするＤＮＡ（配列番号１１）、Ｂサブユニット（Ａｓｎ９０Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ（配列番号１３）が挙げられる。前記ペプチドをコードするＤＮＡ、志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡ、及び大腸菌易熱性毒素をコードするＤＮＡは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
【００２４】
志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡ及び大腸菌易熱性毒素をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９，１１，１３の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各志賀毒素を生産する細菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。
本発明で用いる融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１９〜２２で表される。
【００２５】
融合タンパク質をコードするＤＮＡは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００２６】
また、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１９〜２２の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸）、６０℃が挙げられる。
【００２７】
本発明で用いるＤＮＡ構築物において、好ましくは、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明で用いるＤＮＡ構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記融合タンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのＤＮＡが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域に発現可能に連結されている。
【００２８】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ＡＴＧ、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域（NtADH5'UTR）（配列番号３０）を用いることができ、翻訳開始点上流３塩基を改変したNtADH5'UTR領域（NtADHmod 5'UTR）（配列番号３１）を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開２０１２−１９７１９号公報および国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００２９】
また、配列番号３１の塩基配列で表されるような前記NtADHmod 5'UTRは、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記NtADHmod 5'UTRと好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
【００３０】
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてＧＵＳ（β-グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
【００３１】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、例えば、配列番号２３〜２６で表される塩基配列を有する。
配列番号２３(L+E-)で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号３１）に、１つのＬＴＢタンパク質（野生型Ａｓｎ９０）および１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質（変異型Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２４(L-E-)で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号３１）に、１つのＬＴＢタンパク質（変異型Ａｓｎ９０Ｓｅｒ）および１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質（変異型Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２５（E-L+）で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号３１）に、１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質（変異型Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）および１つのＬＴＢタンパク質（野生型Ａｓｐ９０）を、ＰＧ１２ｖ２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２６(E-L-)で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号３１）に、１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質（変異型Ａｓｎ７３Ｓｅｒ）および１つのＬＴＢタンパク質（変異型Ａｓｐ９０Ｓｅｒ）を、ＰＧ１２ｖ２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
【００３２】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及び融合タンパク質をコードするＤＮＡ、小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡなどの各ＤＮＡを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
【００３３】
本発明で用いる組換えベクターは、前記ＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする。本発明で用いる組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等を用いることもできる。ウイルスＤＮＡとしては、例えばpTB2等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
【００３４】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター(HSP-T)等が好ましく用いられる。本発明で使用される好ましいターミネーターは、例えば、配列番号３２で表されるHSP-Tである。
【００３５】
本発明で用いる組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、前記ＤＮＡ構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
【００３６】
本発明で用いる形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
【００３７】
本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
【００３８】
本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって前記形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記志賀毒素タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記志賀毒素タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
【００３９】
レタスの場合は、例えば0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
また、本発明で用いる種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明で用いる種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、前記形質転換体に含まれる。
【００４０】
アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)は植物の傷口で感染させるもので、腫瘍誘発性のTi(tumor-inducing)プラスミドと呼ばれる大きな染色体外因子を運搬する。多くの研究所において、数年に亘る鋭意研究の後、アグロバクテリウム系の開発により、様々な植物組織を型通りに形質転換することが可能となった。この技術により転換された代表的な植物として、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、ナタネ、ジャガイモ、ポプラ、及びダイズ、イチゴ、イネなどがある。
様々な種の植物について、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換された組織から植物を再生することが実証されている。この植物として、ヒマワリ、トマト、シロツメクサ、アブラナ、コットン、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、イチゴ、イネ、その他多数の野菜作物を挙げることができる。
本発明においては、アグロバクテリウムＴｉベクターにより上記レタスをはじめとした可食植物を形質転換することが好ましい。
【００４１】
本発明の大腸菌症防除剤は、前記形質転換体を含んでいてもよい。本発明の大腸菌症防除剤は、前記融合タンパク質を含む形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。また、本発明の大腸菌症防除剤には、融合タンパク質の免疫原性を高めるアジュバントを配合することもできる。一般的には、水酸化アルミニウム、コレラ毒素（ＣＴＢ）、易熱性エンテロトキシン（ＬＴＢ）、細菌の鞭毛、例えばサルモネラのフラジェリンなどがアジュバントとして用いられる。
【００４２】
本発明の大腸菌症の防除方法は、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を動物に投与することを特徴とする。本発明の大腸菌症の防除対象としては、ブタ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられるが、ブタに投与することが好ましい。本発明の大腸菌症防除剤による免疫は、哺乳期〜１２０日齢のブタに、好ましくは哺乳期〜９０日齢のブタに対して行うことが好ましい、また繁殖期前後の母豚に対して行うことが好ましい。免疫の方法としては、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体を母豚に投与して、母豚が産生した抗体を、乳汁により子豚に与える方法、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体を哺乳期〜９０日齢の子豚に投与し、子豚を直接免疫する方法等が挙げられる。
本発明の大腸菌症防除剤をブタに投与する方法としては、ブタの飼料に、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。本発明の大腸菌症防除剤は、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１．大腸菌発現用タンパク遺伝子の構築
タンパク抗原候補として、1) 毒素原生大腸菌が生産する易熱性毒素の無毒Bサブユニット(LTB)と2) 腸管出血性大腸菌が生産するベロ毒素の無毒Bサブユニット(Stx2eB)を用いた。
またLTBはレタス小胞体で生産した場合に90番目Asn残基にN-結合型糖鎖が付加されるが、このAsnをSerに置換した変異体も作製した(以下、野生型をL+、変異型をL-と表記する)。Stx2eBは糖鎖付加部位変異体（Asn73Ser、以下E-と表記する）を用い、L+もしくはL-と二通りの融合順序で連結し、4通りの融合抗原を作製した(L+E-, L-E-, E-L+, E-L-)。得られた断片(L+E-, L-E-, E-L+, E-L-)をそれぞれ配列番号１９〜２２の塩基配列で示す。各抗原はStx2eBのシグナルペプチドに融合し、IPTG誘導性プロモーターに連結し、pET１０１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した(図1)。
具体的には、Ｓｔｘ２ｅＢのリボソーム結合サイト（ＳＤ配列）とシグナルペプチドを含む領域を、Ｓｔｘ２ｅＢ−ＳＤＳＰ−Ｆプライマー（aaatctagaaataataaggagttaagaatgaagaa（配列番号３３）、下線はＸｂａＩサイト）とＳｔｘ２ｅＢ−ＳＰ−Ｒプライマー（aaaggatcctgcattaacagaaaccaatgcaaa（配列番号３４）、下線はＢａｍＨＩサイト）を用いて増幅した。
得られた断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで処理し、以下に示すｐＲＩ９０９Ｌ＋，Ｌ−，Ｌ＋Ｅ−，Ｌ−Ｅ−，Ｅ−Ｌ＋，Ｅ−Ｌ−のＸｂａＩ―ＢａｍＨＩに挿入した。ＸｂａＩとＳａｃＩを用いてＳＤ配列−Ｓｔｘ２ｅＢＳＰ−抗原領域−ＨＤＥＬ断片を切り出し、ｐＥＴ１０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ−ＳａｃＩギャップに挿入した（図１）。【００４４】
実施例２．大腸菌を用いた抗原の生産
各発現ベクターを組換えタンパク質生産用大腸菌(BL21 DE3)に導入した。得られた組換え大腸菌のシングルコロニーをピックアップし、100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地(LB+Amp培地)で一晩培養した後、50%グリセロールと等量混合して-80℃でストックした。
グリセロールストックをチップでかきとりLB+Amp培地に植菌し、37℃、180 rpmにて一晩前培養を行った。培養液1 mlを250 mlのLB+Amp培地が入った2 Lバッフル付きフラスコに植え継ぎ、37℃ 、180 rpmにて培養を行った。O.D.が0.4-0.6になったタイミングでIPTG(終濃度1 mM)を添加し、25℃、120 rpmで4時間培養を行った。培養液を50 mlの遠沈管に移し、8,000 rpm、室温で5分間遠心を行って集菌した。培地を除き、さらに50 mlの培養液を追加して8,000 rpm、室温で5分間遠心を行った。菌体は-80℃で保存した。【００４５】
実施例３．組換えLTBを発現する大腸菌からの可溶性タンパク質の調製
実施例２で得られた菌体に、培養液125 ml分あたり20 mlの溶解バッファー（BugBuster（メルクミリポア）、0.2 mg/ml lysozyme、1 mM PMSF、30U/ml DNase Iを含むPBS pH 7.4）を添加し、室温で30 分間、ローテーターで撹拌した。8,000 rpm、4℃で20分間遠心し、上清を回収し新しい遠沈管に移した。この遠心操作をあと２回繰り返した。【００４６】
実施例４．ガラクトースカラムを用いた組換え抗原の精製
PBST(0.05% Tween-20 を含むPBS pH 7.4)で平衡化したガラクトースビーズ(Immobilized D-Galactose Gel、Thermo SCIENTIFIC社、No. 20372) 5 mlを、実施例３で得られた菌体破砕液に添加し、ローテーターで2時間撹拌した。懸濁液をクロマトグラフィー用カラム(エコノパッククロマトグラフィー用カラム、BIO-RAD社、#732-1010)にロードし、溶液を排出した。120 mlのPBSTをカラムに添加し、カラムを洗浄した。ナノドロップを用いてカラム滴下溶液の280 nm吸光度を測定し、O.D.がベースラインになっていることを確認した。洗浄が不十分な場合は、PBSTを適宜追加し、洗浄した。0.5 M ガラクトースを含むPBSTを１フラクションあたり1 ml添加して、LTBを溶出した。280 nm吸光度を測定して溶出タンパク質が無くなったことを確認した後、6 Mグアニジン塩酸を50 ml添加してカラムを洗浄した。20% エタノールで置換し、4℃でカラムを保存した。【００４７】
実施例５．精製抗原の免疫原性評価
LTBのガラクトースに対する親和性を利用してアフィニティー精製を行った結果を図2Aに示す。また、0.5Mガラクトースを用いて競合溶出し、小動物免疫に用いた。
熱変性無しの条件下でSDS-PAGEを行ったところ、精製LTBは約70 kDaの位置に検出され(図2B)、５量体を形成していると思われる。L-およびL+E-についても同様に精製抗原を調製した。なお、E-L+は大腸菌内で不溶化したため精製抗原調製は実施しなかった。【００４８】
実施例６．ウサギを用いた免疫原性の確認
実施例４，５で調製した精製抗原を用い、ウサギに注射免疫を行い、抗体価を測定した。抗LTp抗体価は、L+, L-, L+E-のいずれでも上昇が確認された、LTp毒素中和活性も検出された(表１)。表１の結果より、（１）LTB糖鎖付加部位への変異導入は中和抗体誘導に影響がないこと、（２）本発明の大腸菌症防除剤でもLTp中和抗体誘導可能であることが分かった。抗Stx2e抗体価の上昇は弱く、Stx2e毒素中和活性は検出されなかった。【００４９】
【表１】
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【００５０】
実施例７．植物発現用タンパク質遺伝子の構築
LTBとStx2eBのコンビネーション化は、Stx2eBのC末端にLTB（糖鎖付加有/無）を融合したものと、N末端にLTB（糖鎖付加有/無）を融合させた計4通りを作成した。この際、Stx2eBは糖鎖無Stx2eB（N末端から73番目のアスパラギンをセリンに置換）を使用し、糖鎖無LTBはN末端から90番目のアスパラギンをセリンに置換したものを用いた。またこれらのタンパク抗原遺伝子は、蓄積量を高めることが報告されているPG12スペーサー（Matsui et al, Transgenic Res, 2011, 20:735-48）もしくは類似のＰＧ１２ｖ２を介して連結し、近傍配列改変型NtADH 5’-UTRとAtHSPターミネーターを使用した。さらにタバコ由来β-D-glucan exohydrolase分泌シグナルペプチドコード配列および小胞体残留シグナル（HDEL）を用いることで融合タンパク質抗原候補タンパク質の高蓄積化をはかった。【００５１】
植物発現用プラスミドの構築は、具体的には、以下の通り行った。
ＬＴＢ（野生型Ａｓｎ９０）断片（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除くＡｌａ２２からＡｓｎ１２４までの領域）を以下の要領で作製した。以下の二本のオリゴヌクレオチドを、3’相補末端を介してアニールした後、T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan)を用いて伸長反応を行った。一段階目はＬＴＢ-ＡとＬＴＢ-Ｂ、ＬＴＢ-ＣとＬＴＢ-Ｄ、ＬＴＢ-ＥとＬＴＢ-Ｆ、ＬＴＢ-ＧとＬＴＢ-Ｈ、ＬＴＢ-ＩとＬＴＢ-Ｊを用い、それぞれＡ＋Ｂ、Ｃ＋Ｄ、Ｅ＋Ｆ、Ｇ＋Ｈ、Ｉ＋Ｊ断片を作製した。二段階目の反応には、Ａ＋ＢとＣ＋Ｄ、Ｅ＋ＦとＧ＋Ｈを用いＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤとＥ＋Ｆ＋Ｇ＋Ｈ断片を作製した。最後にＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤとＥ＋Ｆ＋Ｇ＋ＨとＩ＋Ｊを用い、全長のＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ＋Ｇ＋Ｈ＋Ｉ＋Ｊ断片を作製した。ＬＴＢ（Ａｓｎ９０Ｓｅｒ）変異体の作製は、LTB-ＩのかわりにＬＴＢ-ＩＮ９０Ｓを用いて、上記と同様に作製した。
ＬＴＢ-Ａ: ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac（配列番号３５）
ＬＴＢ-Ｂ: cgttgatggtgtagatttgggtgttgcggtactcgctgc（配列番号３６）
ＬＴＢ-Ｃ: ccatcaacgacaagatcctcagctacaccgagagcatgg（配列番号３７）
ＬＴＢ-Ｄ: cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc（配列番号３８）
ＬＴＢ-Ｅ: atcaccttcaagagcggcgagaccttccaggtcgaggtc（配列番号３９）
ＬＴＢ-Ｆ: cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa（配列番号４０）
ＬＴＢ-Ｇ: gacagccagaagaaggccatcgagaggatgaaggacaccctcaggatc（配列番号４１）
ＬＴＢ-Ｈ: gcagagcttgtcgatcttggtctcggtgaggtaggtgatcctga（配列番号４２）
ＬＴＢ-Ｉ: aagctctgcgtctggaacaacaagaccccc（配列番号４３）
ＬＴＢ-Ｊ: aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt（配列番号４４）
ＬＴＢ-ＩＮ９０Ｓ: aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc（配列番号４５）【００５２】
得られたＬＴＢ（野生型Ａｓｎ９０）とＬＴＢ（Ａｓｎ９０Ｓｅｒ）の各断片をBamHIとBglIIで切断した後、Plasmid14(Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)の脱リン酸化したBamHI-BglIIギャップへ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれBglIIで処理した後、脱リン酸化し、リン酸化したPG12断片を挿入した。なおＰＧ１２断片は、ＰＧ１２−Ｆプライマー（gatcccctggttctggtcctggttctccta）（配列番号４６）とＰＧ１２−Ｒプライマー（gatctaggagaaccaggaccagaaccaggg）（配列番号４７）をアニーリングした後T4 polynucleotide kinase (PNK) (New England Biolabs, Hitchin, UK)でリン酸化し作製した。得られたプラスミドからBamHIとSacIを用いてLTB-PG12-HDEL断片を切り出し、2BHプラスミド（Matsui et al., Transgenic Res., 2011,20;735-48）のBamHI-SacIギャップへ挿入した。これにより、ｐＲＩ９０９Ｌ＋およびｐＲＩ９０９Ｌ−発現用プラスミドを作製した。【００５３】
Stx2eBN73S-PG12v2融合断片は以下のように構築した。2BHプラスミドを鋳型として用い、mStx2eB5-Ａプライマー（aaggatccgcggcggactgcgcgaagggcaagatcgagttctcgaagtacaacgaggac（配列番号４８）、下線はBamHIサイト）とPG12v2-Rプライマー（aaagatctaggagaaccaggaccagaaccaggtcctct（配列番号４９）、下線はBglIIサイト）を用いてPCRを行い、Stx2eBN73S-PG12v2断片を増幅した。得られた断片をBamHIとBglIIで切断した後、Plasmid14(Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1628-34)の脱リン酸化したBamHI-BglIIギャップへ挿入した。得られたプラスミドからBamHIとSacIを用いてStx2eBN73S-PG12v2-HDEL断片を切り出し、2BHプラスミドのBamHI-SacIギャップへ挿入した（ｐＲＩ９０９Ｅ−プラスミド）。【００５４】
本発明の大腸菌症防除剤発現カセットは以下の要領で構築した。ｐＲＩ９０９Ｅ−プラスミドからＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを用いてＳｔｘ２ｅＢＡｓｎ７３Ｓｅｒ−ＰＧ１２ｖ２−ＨＤＥＬ−ＨＳＰＴ断片を切り出した。ｐＲＩ９０９Ｌ＋もしくはｐＲＩ９０９Ｌ−プラスミドからＸｂａＩとＢｇｌＩＩを用いて３５Ｓプロモーター−ＮｔＡＤＨｍｏｄ５’ＵＴＲ−分泌シグナルペプチド−ＬＴＢ−ＰＧ１２断片を切り出した。両断片をライゲーションし、２ＢＨプラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩギャップに挿入し、植物発現用のｐＲＩ９０９Ｌ＋Ｅ−（配列番号２３）プラスミドおよびｐＲＩ９０９Ｌ−Ｅ−（配列番号２４）プラスミドを作製した。
ｐＲＩ９０９Ｌ＋プラスミドもしくはｐＲＩ９０９Ｌ−プラスミドからＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを用いてＬＴＢ−ＰＧ１２−ＨＤＥＬ−ＨＳＰＴ断片を切り出した。ｐＲＩ９０９Ｅ−プラスミドからＸｂａＩとＢｇｌＩＩを用いて３５Ｓプロモーター−ＮｔＡＤＨｍｏｄ５’ＵＴＲ−分泌シグナルペプチド−Ｓｔｘ２ｅＢＡｓｎ７３Ｓｅｒ−ＰＧ１２ｖ２断片を切り出した。両断片をライゲーションし、２ＢＨプラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩギャップに挿入し、植物発現用のｐＲＩ９０９Ｅ−Ｌ＋（配列番号２５）プラスミドおよびｐＲＩ９０９Ｅ−Ｌ−（配列番号２６）プラスミドを作製した（図１）。【００５５】
実施例８．アグロバクテリウムによるレタスへの遺伝子導入
レタス(Lactuca sativa L.)品種グリーンウェーブ(タキイ種苗)をMS培地 [1/2×ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（MS塩、和光純薬工業）、1×Murashige and Skoog vitamin solution（MSビタミン、Sigma-Aldrich）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に無菌播種後、10-16日目の本葉を5 mm角程度に切断し、本切片を、ベクターコンストラクトを有すバイナリープラスミド（pRI909）を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA105）懸濁液に10分間浸漬後、共存培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l 6-ベンジルアミノプリン（BA）、0.1 mg/l 1-ナフチル酢酸（NAA）、0.1 M アセトシリンゴン、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、暗所で2日間培養した。切片を滅菌水で洗浄後、選抜培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l BA、0.1 mg/l NAA、0.5 g/l ポリビニルピロリドン（PVP）、50 mg/lカナマイシン（Km）、250 mg セフォタキシム（Cef）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、蛍光灯下（2000-3000 lux）で培養を行った。以降、不定芽が得られるまで3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい選抜培地への移植を行った。不定芽から形成された再分化個体は発根培地[1/2× MS塩、1× MSビタミン、0.5 g/l PVP、250 mg Cef、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に移植し、同条件で培養を行った。以降、3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい発根培地への移植を行った。発根した再分化個体は鉢植えにし、同条件で栽培を行った。【００５６】
実施例９．レタスからのタンパク質抽出
タンパク質抽出はTCA-acetone法（Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23:405）に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入レタス本葉を用いて行った。100-200 mgのサンプルをTissueLyzerＩＩ（QIAGEN）を用い破砕後、サンプルの5倍量の TCA-acetone（10% トリクロロ酢酸、90% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、-20℃で1時間静置後、16,000×g、4℃、30分間遠心操作を行い、上清を除去し、タンパク質を含む沈殿を得た。さらに夾雑物を除去するために、サンプルの5倍量の acetone/BME（100% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を除去した。本夾雑物除去操作はさらに2回行った。沈殿は減圧乾燥後、サンプルの2倍量の 抽出Iバッファー [0.5 M 塩化ナトリウム、5 mM イミダゾール、6 M 尿素、20 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）-HCl、pH 7.9] に懸濁し、16,000×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収、タンパク質溶液を得た。タンパク質濃度の測定は、Protein Assay Kit ＩＩ（Bio-Rad）を用いて行った。【００５７】
実施例１０．ウエスタン解析
得られたタンパク質溶液をマイクロチューブに適量入れ、同量のサンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え混合し、沸騰水中で5分間加温し、サンプルのSDS化を行った。タンパク質定量時の標準物質には精製LTB+を用いた。これを抽出Iバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これら希釈系列をスタンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（ミニプロティアンTetraセル）およびミニプロティアンTGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動バッファー（EZ Run、ATTO製）を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを5 μlアプライし、200 V定電圧で40分間行った。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液（TBS系, pH7.2、ナカライテスク）に浸し、室温で1時間振とうまたは4℃で16時間静置後、TBS-T（137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。LTBタンパク質の検出には、抗血清Rabbit-Antiserum Anti-LTp 991109(inactive)(0.1% NaN3)AO をTBS-Tで10,000倍希釈して使用した。当該希釈液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。二次抗体にはTBS-Tで10,000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody（Cell Signaling TECHNOLOGY）を使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液（0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5）中にメンブレンを浸し、室温で7分間振とうすることにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。
発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、LTBタンパク質の定量を行った。
図１に示すコンストラクトを用いて作成した遺伝子組換えレタスにおいて発現された融合タンパク質の発現解析の結果を図３に示す。N-結合型糖鎖付加部位に変異を導入したL-E-とE-L-では推定分子量(約20 kDa)の位置に一本のバンドが検出された(図3A)。L+E-とE-L+では20 kDaのバンドに加えてN-結合型糖鎖が付加されたと推定される高分子量のバンドも検出された。図3Bに各融合タンパク質抗原の蓄積量を示す。N-結合型糖鎖有のLTB(L+)を用いた方が無し(L-)よりも高蓄積する傾向があり、融合順序はStx2eBをN末端側に配置した方が、高蓄積傾向が認められた。【００５８】
実施例１１．遺伝子組換えタンパクの抗原性（抗体誘導）の確認
大腸菌易熱性毒素Bサブユニット（L+）、LTB糖鎖修飾部位変異体（L-）、L+と浮腫病毒素Bサブユニット（Stx2eB）の糖鎖修飾部位変異体の融合タンパク（L+E-）、の抗原性（抗体誘導）を確認するため、精製したそれぞれのタンパク質をフロイント完全（あるいは不完全）アジュバントでエマルジョン化し、ウサギに皮下免疫した。1回目に50 μg、以後2週間間隔で4回(100 μg/回)の追加免疫を行った。抗原に対する抗体価がELISAで十分に上昇したことを確認した後、全採血を行い、遠心分離により血清を調製した。【００５９】
実施例１２．組換えレタスのマウス経口免疫
6週齢のBalb/c雌マウスを導入し、馴化、免疫前採血を行い、8週齢から免疫を開始した。90 μg相当のLTBが含まれる組換えレタス末を生理食塩水で懸濁後、胃ゾンデを用いて経口投与した。投与粉末量はLTB等量で揃えた。経口投与は7日毎に4回行った。初回投与後10日目と28日目に採血を行い、血清を分離した。血清は56℃、30分処理し非働化した。組換えレタス末の経口投与についても同様に65 μg相当組換えレタス末を経口投与した。定期的に採血を行い、血清を分離、非働化した。腸管洗浄液の採取は大腸ではその全長を、小腸は回盲部から5 cmを切り取り5 mLのPBSで洗浄した。使用時まで-80℃で保存し、抗体価測定時にはプロテアーゼ阻害剤を添加した。【００６０】
実施例１３．組換えレタスのウサギ経口免疫
体重2.5 kgの日本白色種ウサギを導入し、馴化、免疫前採血を行った後、7日毎に6回、2 mg相当のLTBが含まれる組換えレタス末を生理食塩水で懸濁し、経口投与した。一回当たりの投与量はL+E-とL+は2 mg LTB等量/回(L+E-;0.85 gレタス末, L+;1.5gレタス末)、陰性対照の空ベクターレタスは1.0 gレタス末/回とした。初回投与後10日、28日、44日目に採血を行い、血清を分離した。血清は56℃、30分処理し非働化した。プロテインGカラムを用いてIgGを精製し中和活性測定に用いた。【００６１】
実施例１４．Stx2eの毒素中和活性の測定
血清中の抗Stx2e毒素抗体の中和活性の測定はベロ細胞アッセイで行った。96-well細胞培養用プレートに1×104/wellのベロ細胞（アフリカミドリザルの腎上皮由来の培養細胞）を播種し、2日間の前培養の後、半数細胞致死量の4倍のStx2eを加えて３日間、炭酸ガスインキュベーター（5% CO2、37℃）で培養した。ベロ細胞の生死判定はセルカウンティングキット（同仁化学）を用いて細胞内脱水素酵素活性を測定することで行った。【００６２】
実施例１５．ブタ下痢原性易熱性エンテロトキシン（LTp）の毒素中和活性の測定
血清中の抗LTp毒素抗体の中和活性の測定はCHO細胞アッセイで行った。8-well チャンバースライドに被験血清と、最終濃度が20 ng/mLとなるようにLTpを加え、2.5×103/wellのCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を播種し24時間、炭酸ガスインキュベーター（5% CO2、37℃）で培養した。培養後、CHO細胞の形体観察を行い、細胞の長径が短径の２倍以上の細胞を異型細胞とした。総細胞数に対する異型細胞の率を計算し、自然発生する異型細胞の発生率との比が50％を超えないものを中和活性陽性とした。中和活性が陽性となる最小の血清量を中和活性の力価とした。【００６３】
実施例１６．抗体価の測定
抗体価の測定は、2.5 μg/mLの抗原を100 μL/wellで固相化したELISAプレート（Maxisorp、Nunc）を用いて行った。抗原は、抗Stx2e抗体に関しては精製した無毒化Stx2eを、抗LTp抗体に関しては精製したLTpをそれぞれ用いた。被験血清は0.1%（w/v）牛血清アルブミンを含む希釈液で2倍希釈列を作製し、ELISAプレートにアプライした。２次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体を用い、基質に過酸化水素、発色剤にABTS（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)）を用いた発色法にて検出した。陰性コントロールである希釈液に対する吸光度の平均の2倍の値以上の吸光度を抗体価陽性とし、陽性となる最大希釈率をその血清の抗体価とした。免疫前血清について抗体価が検出された場合は免疫前血清の抗体価値を除した値を当該血清の抗体価とした。結果を図４〜７に示す。
血清IgGとIgA(図4、5)、腸管洗浄液のIgA(図6)についてタンパク抗原レタス投与マウスで抗体価の上昇が確認された。これらの結果から、融合タンパク質抗原生産植物の経口投与によって抗LTp抗体の誘導が可能であることが確認された。コンストラクト間での抗体誘導能の顕著な差は見られなかった。
タンパク抗原レタス投与群では抗LTp抗体価の上昇が確認された(図7)。抗体価が十分に上昇した44日目の血清からIgGを精製し、LTp毒素中和活性評価を行った。L+E-免疫ウサギの全2羽、L+免疫ウサギの2羽中1羽で中和活性が確認された(表2)。【００６４】
【表２】
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【００６５】
実施例１７．浮腫病菌攻撃試験
タンパク抗原レタスの経口投与による浮腫病予防効果確認試験を行った。試験に供試した子ブタは分娩後24時間目までは初乳を与えず人工乳を与え、以降は母豚哺乳に戻した。各試験群につき3頭のブタを供試した。分娩後6、12、18日目にタンパク抗原レタス（Stx2eB 2.3 mg相当量）もしくは空ベクターレタスの凍結乾燥粉末を水に懸濁し、チューブを接続したシリンジで強制投与した。ブタ由来志賀毒素産生大腸菌（STEC、帯広株、ST-、LT-）を腸溶性カプセルに充填して25、26、27日目に投与し攻撃した。体重、飼料摂取量を測定するとともに、臨床症状を毎日観察し、ブタ浮腫病に典型的な症状である元気（0:正常、1:減退、2:消失）、眼周囲の浮腫（0:なし、1:軽度、2:中度、3:重度）、神経症状（0:なし、1:軽度、2:中度、3:重度）について観察しスコア化した。また定期的に採血、採便し、ELISAによりStx2eB特異的抗体価を測定した。STECによる攻撃７日目に安楽死後、剖検を行い、各臓器及び組織の異常を肉眼的に観察した。主要臓器の病理標本を作製し、病理組織学的所見を観察した。結果を図８に示す。
E-L+とL+E-ともに、臨床症状と増体重の両指標において浮腫病予防効果が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、畜産の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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