(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列からなる、微生物結合性ペプチド。
【請求項２】
前記微生物がべん毛を有する微生物である、請求項１に記載の微生物結合性ペプチド。
【請求項３】
前記微生物がグラム陰性細菌である、請求項１又は２に記載の微生物結合性ペプチド。
【請求項４】
前記微生物が大腸菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物結合性ペプチド。
【請求項５】
基板と、前記基板上に配置された請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物結合性ペプチドと、を備える、微生物検出用センサー。
【請求項６】
前記微生物がべん毛を有する微生物である、請求項５に記載の微生物検出用センサー。
【請求項７】
前記微生物がグラム陰性細菌である、請求項５又は６に記載の微生物検出用センサー。
【請求項８】
前記微生物が大腸菌である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の微生物検出用センサー。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、
前記微生物結合性ペプチドへの微生物の結合量を測定する工程と、
を備える、被検試料中の微生物の存在量を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物結合性ペプチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
身の回りには様々な病原菌が存在し、病原菌が原因で様々な疾病を発症するリスクがある。例えば結核菌が起こす結核やコレラ菌が起こすコレラに加え、大腸菌やサルモネラ菌は下痢や腹痛の原因となることが知られている。このような感染症を防ぐため、先進国、発展途上国を問わず、様々な病原菌に対する簡便な検出システムの開発が求められている。
【０００３】
ところで、ヒトを含む動物の細胞では、Ｔｏｌｌ様受容体が病原性微生物を認識することで免疫防御機構が働くことが知られている。Ｔｏｌｌ様受容体の１つであるＴｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ＴＬＲ４）は、グラム陰性菌の細胞壁にある内毒素のリポ多糖（ＬＰＳ）を認識することが知られている（例えば、非特許文献１を参照。）。また、Ｔｏｌｌ様受容体の１つであるＴｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ５（ＴＬＲ５）は、細菌のべん毛構成タンパク質であるフラジェリンを認識することが知られている（例えば、非特許文献２を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Park B.S. and Lee J.O., Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes., Exp. Mol. Med., 45 (12), e66, 2013.
【非特許文献２】Hayashi F., et al., The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5, Nature, 410, 1099-1103, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
病原菌を含めた標的分子を認識できる一般的な分子として、抗体、アプタマー、ペプチド等が知られている。しかしながら、抗体は開発に時間を要する場合が多く、製造に要するコストが高価な傾向にあり、保存安定性が十分でない場合がある。また、核酸アプタマーは、抗体よりも開発期間が短い傾向にあるが、熱やｐＨの影響を受けやすく、保存安定性が十分でない場合がある。これに対し、ペプチドは、化学合成が可能であり、保存安定性も高い傾向にある。そこで、本発明は、微生物結合性ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
（１）アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、微生物結合性ペプチド。
（２）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、（１）に記載の微生物結合性ペプチド。
（３）前記微生物がべん毛を有する微生物である、（１）又は（２）に記載の微生物結合性ペプチド。
（４）前記微生物がグラム陰性細菌である、（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物結合性ペプチド。
（５）前記微生物が大腸菌である、（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物結合性ペプチド。
（６）基板と、前記基板上に配置された（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物結合性ペプチドと、を備える、微生物検出用センサー。
（７）前記微生物がべん毛を有する微生物である、（６）に記載の微生物検出用センサー。
（８）前記微生物がグラム陰性細菌である、（６）又は（７）に記載の微生物検出用センサー。
（９）前記微生物が大腸菌である、（６）〜（８）のいずれかに記載の微生物検出用センサー。
（１０）（６）〜（９）のいずれか一項に記載の微生物検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、前記微生物結合性ペプチドへの微生物の結合量を測定する工程と、を備える、被検試料中の微生物の存在量を測定する方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、微生物結合性ペプチドを提供することができる。当該微生物結合性ペプチドは、例えば、微生物検出用センサーに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２のペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、実験例３のペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。（ａ）は野生株の大腸菌の結果であり、（ｂ）はべん毛欠損株の大腸菌の結果であり、（ｃ）は対照である。
【図３】実験例３の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図５】実験例６の結果を示す顕微鏡写真である。（ａ）は野生株の大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。（ｂ）はべん毛欠損株の大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。（ｃ）は野生株の大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。（ｄ）はべん毛欠損株の大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【図６】実験例７の電子顕微鏡像を示す写真である。
【図７】実験例８の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図８】実験例１０のペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。
【図９】実験例１０の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｄ）は実験例１１のペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。（ａ）〜（ｃ）は独立した３つのペプチドアレイの蛍光画像を示す写真であり、図１０（ｄ）は対照である。
【図１１】実験例１１の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）は実験例１２の顕微鏡観察の結果を示す写真である。（ａ）は大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。（ｂ）は大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【図１３】実験例１３の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号１４のペプチドの変異体の結果を示す。
【図１５】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号１５のペプチドの変異体の結果を示す。
【図１６】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号１７のペプチドの変異体の結果を示す。
【図１７】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号１８のペプチドの変異体の結果を示す。
【図１８】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号１９のペプチドの変異体の結果を示す。
【図１９】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号２２のペプチドの変異体の結果を示す。
【図２０】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号２３のペプチドの変異体の結果を示す。
【図２１】実験例１４の結果を示すグラフである。配列番号２４のペプチドの変異体の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［微生物結合性ペプチド］
１実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、微生物結合性ペプチドを提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、本実施形態の微生物結合性ペプチドは微生物に対する高い結合性を有する。このため、微生物を簡便に検出するセンサー等に利用することができる。
【００１１】
本明細書において、１若しくは数個とは、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜４個であってもよく、例えば１〜３個であってもよく、例えば１〜２個であってもよい。以下、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のことを「変異配列」という場合がある。また、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのことを「ペプチド変異体」等という場合がある。
【００１２】
本実施形態の微生物結合性ペプチドは、その部分ペプチドが、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体であってもよい。いい換えると、本実施形態の微生物結合性ペプチドは、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体を部分ペプチドとし、そのＮ末端側又はＣ末端側に、更に他のアミノ酸配列からなるペプチドが連結されていてもよい。このような微生物結合性ペプチドであっても、微生物に対する高い結合性を有する。
【００１３】
また、本実施形態の微生物結合性ペプチドは、その部分ペプチドとして、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドを１つ含んでいてもよいし、２個以上含んでいてもよい。ここで、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドは、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、微生物結合性ペプチドに、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドが２種以上含まれている場合、それらのペプチドは任意の順序で並んでいてもよい。ここで、上記の２種以上のペプチドは、互いに直接連結されていてもよいし、上記の２種以上のペプチドの間に他のペプチドを挟んで連結されていてもよい。
【００１４】
本実施形態の微生物結合性ペプチドの長さは、例えば５〜１００アミノ酸であってもよく、例えば５〜５０アミノ酸であってもよく、例えば５〜４０アミノ酸であってもよく、例えば５〜３０アミノ酸であってもよく、例えば５〜２０アミノ酸であってもよく、例えば５〜１０アミノ酸であってもよい。
【００１５】
１実施形態において、本実施形態の微生物結合性ペプチドは、配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００１６】
１実施形態において、本実施形態の微生物結合性ペプチドが結合する微生物は、べん毛を有する微生物であってもよい。実施例において後述するように、例えば、配列番号１、２、４、５、７〜１１のアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体は、べん毛に対する結合性が特に良好である。
【００１７】
本明細書において、「ペプチドが微生物と結合する」とは、「ペプチドが微生物と反応する」、「ペプチドが微生物を認識する」、「ペプチドが微生物を結合対象とする」等といい換えることもできる。
【００１８】
１実施形態において、本実施形態の微生物結合性ペプチドが結合する微生物は、グラム陰性細菌であってもよい。実施例において後述するように、例えば、配列番号１３〜２５のアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体は、グラム陰性細菌に対する結合性が特に良好である。
【００１９】
１実施形態において、本実施形態の微生物結合性ペプチドが結合する微生物は、大腸菌であってもよい。実施例において後述するように、例えば、配列番号１〜２５のアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体は、大腸菌に対する結合性を指標に選択されたものであるため、大腸菌に対する結合性が良好である。
【００２０】
［微生物検出用センサー］
１実施形態において、本発明は、基板と、前記基板上に配置された上記の微生物結合性ペプチドと、を備える、微生物検出用センサーを提供する。
【００２１】
本実施形態の微生物検出用センサーにおいて、上記の微生物結合性ペプチドは、１種が単独で基板上に配置されていてもよく、２種以上が混合して基板上に配置されていてもよい。また、複数の微生物結合性ペプチドが基板上に配置される場合、１つの基板上に複数の微生物結合性ペプチドが配置されていてもよく、１種の微生物結合性ペプチドが配置された基板が複数備えられていてもよい。
【００２２】
また、１つの基板上に複数の微生物結合性ペプチドが配置される場合、各微生物結合性ペプチドは、同一の領域に混合して配置されていてもよく、それぞれ独立した領域にアレイ状に配置されていてもよい。
【００２３】
本実施形態の微生物検出用センサーは、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）センサー、水晶振動子マイクロバランス（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＱＣＭ）センサー、電気化学計測（インピーダンス、電位計測等）や分光電気化学計測を原理とするセンサー等であってもよい。本実施形態の微生物検出用センサーにより、被検試料中の微生物の存在を高感度に検出することができる。
【００２４】
ＳＰＲセンサーとは、金属薄膜上の質量変化を高感度に検出するセンサーである。まず、ＳＰＲ現象について説明する。ガラス板上に蒸着された金属薄膜の裏面等に対して光源からレーザー等で光を照射すると、金属薄膜裏面で光が全反射すると同時に金属薄膜でエバネッセント波が発生する。このとき、金属薄膜表面側では表面プラズモンが発生する。このエバネッセント波と表面プラズモンのそれぞれの波数・周波数が一致した際、共鳴により光子エネルギーが表面プラズモンの電子を励起するために消費される。そのため、ある入射角で光を入射すると反射光が減衰する現象が生じる。これがＳＰＲ現象であり、このときの入射角を共鳴角と呼ぶ。
【００２５】
上記の共鳴角は金属薄膜表面近傍の状態によって変化し、この変化は質量変化に対応している。ＳＰＲ測定法は、質量変化による共鳴角の変化を利用して金属薄膜表面上の吸着物を測定するものである。これにより、金属薄膜がその表面にどれほどの分子を吸着したのかを測定することが可能となる。
【００２６】
ＱＣＭセンサーとは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に検出するものである。
【００２７】
基板の材質は、センサーの原理等に応じて適宜選択すればよい。例えば、ＳＰＲセンサーやＱＣＭセンサーの場合、基板は金属薄膜で構成される。金属種は特に限定されないが、化学的に不活性であり、信号の発生効率がよい等の理由から金（Ａｕ）が好ましい。
【００２８】
基板上に微生物結合性ペプチドを配置（固定化）する方法としては、物理的吸着法、化学的吸着法等が挙げられる。物理的吸着法の場合、基板表面の材質が金属の場合には金属と微生物結合性ペプチドとの親和性によって固定化することができる。化学的吸着法の場合、基板表面上に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ；ＳＡＭｓ）を予め形成させておくと便利である。自己組織化単分子膜は基板表面上に種々の分子を自発的に配向させ、また集積させることが可能なため、微生物結合性ペプチドを簡便に、高密度に、高配向で基板上に固定化することができる。
【００２９】
例えば、自己組織化単分子膜は、チオール溶液中に基板を浸漬すること等により形成することができる。微生物結合性ペプチドは、例えば、分子中のアミノ基を介してアミノカップリング法によって基板表面上に修飾されたチオール化合物のカルボキシル基に固定化してもよい。
【００３０】
あるいは、微生物結合性ペプチドに予めシステイン残基を導入しておき、当該システイン残基のチオール基を介した架橋反応により、基板表面上に修飾された自己組織化単分子膜に固定化してもよい。システイン残基は微生物結合性ペプチドのＮ末端に導入してもよいし、Ｃ末端に導入してもよいし、ペプチドの内部に導入してもよいが、微生物に対する良好な反応性を確保する観点からは、Ｎ末端又はＣ末端に導入することが好ましい。
【００３１】
あるいは、微生物結合性ペプチドに化学リンカーを付加した上で基板上に固定化してもよい。あるいは、ビオチン、アビジン等の互いに結合する分子を利用して、微生物結合性ペプチドを基板上に固定化してもよい。
【００３２】
本実施形態の微生物検出用センサーにおいて、微生物結合性ペプチドが結合する微生物は、べん毛を有する微生物であってもよいし、グラム陰性細菌であってもよいし、大腸菌であってもよい。
【００３３】
［被検試料中の微生物の存在量を測定する方法］
１実施形態において、本発明は、上述した微生物検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、前記微生物結合性ペプチドへの微生物の結合量を測定する工程と、を備える、被検試料中の微生物の存在量を測定する方法を提供する。本実施形態の方法により、被検試料中の微生物の存在量を、簡便に、高い信頼性で測定することができる。
【００３４】
被検試料は、微生物の存在量を測定する対象の試料であり、例えば、飲料、食品、環境中から採取した試料等が挙げられる。環境中から採取した試料としては、例えば、屋内の壁や床を拭き取ったろ紙等を緩衝液で懸濁したもの等が挙げられる。
【００３５】
微生物検出用センサーと被検試料とを接触させる工程は、センサーの原理等に応じて適宜行えばよい。例えば、微生物検出用センサーがＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーである場合、被検試料を緩衝液中に溶解させてセンサー部に導入するとよい。ここで、ＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーが、フローシステムを採用したものであると簡便である。ここで、フローシステムとは、固定化した固相の分子に液相の分子を一定の条件（濃度、速度、供給量）で供給する続けるシステムをいう。
【００３６】
これにより、微生物検出用センサーにおける、微生物結合性ペプチドが配置された基板と、被検試料とを接触させることができる。
【００３７】
微生物結合性ペプチドに微生物が結合したか否かを検出する工程は、センサーの原理等に応じて適宜行えばよい。例えば、ＳＰＲセンサーの場合には、共鳴角の質量変化による変化を測定することにより、基板上に配置した微生物結合性ペプチドへの微生物の結合量を測定するとよい。
【００３８】
また、ＱＣＭセンサーの場合には、水晶振動子に取り付けた電極表面上に配置した微生物結合性ペプチドに、微生物が結合すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、微生物の結合量を測定するとよい。
【００３９】
測定された微生物結合性ペプチドへの微生物の結合量は、被検試料中の微生物の存在量に対応する。ここで、既知濃度の微生物の懸濁液等をスタンダードとして用いて、被検試料と同じ条件で微生物の存在量を測定し、その測定値を被検試料の測定値と対比することにより、被検試料中の微生物の存在量を定量することもできる。
【実施例】
【００４０】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４１】
［実験例１］
（ペプチドアレイの作製１）
ヒトＴＬＲ５の細胞外領域のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドアレイを作製した。ＴＬＲ５は、細菌のべん毛構成タンパク質であるフラジェリンを認識することが知られている。ヒトＴＬＲ５のアミノ酸配列を配列番号２６に示す。配列番号２６の第２１〜６３９番目のアミノ酸からなる配列がＴＬＲ５の細胞外領域のアミノ酸配列である。
【００４２】
ペプチドアレイを構成する部分配列は全て８アミノ酸からなるペプチドとした。配列番号２６の第２１〜６３９番目のアミノ酸からなる配列において、Ｎ末端から８アミノ酸からなるペプチドを１ペプチドとし、そこから２残基ずつＣ末端方向にずらし、長さがそれぞれ８アミノ酸である全３０７種類のペプチドから構成されるペプチドアレイを作製した。
【００４３】
まず、活性化メンブレンを作製した。３７℃で１日乾燥させたセルロースメンブレン（フィルターペーパー５４２、ＧＥヘルスケア社）を、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）に１日浸漬した。続いて、メンブレンをメタノールで２回洗浄した後乾燥させた。続いて、ＤＭＦ  ３００ｍＬ、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下、「Ｆｍｏｃ」という。）−β−アラニン２４ｍＬ（１．０Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＰＣＩ」という。）５００μＬ、１−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）４００μＬを混合して調製した活性化試薬に、上記のメンブレンを２日間浸漬した。最後に、メンブレンを、ＤＭＦ及びメタノールでそれぞれ３回ずつ洗浄し、冷風をあてて乾燥させた。完成した活性化メンブレンは−２０℃の冷凍庫中に保存した。
【００４４】
続いて、ペプチドアレイを作製した。ペプチド合成機（型式「ＲｅｓＰｅｐ  ＳＬ、ＫＩＦＵ２０１４００４７−００００」、Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いて、上述した活性化メンブレン上の決められた位置にアミノ酸のスポッティングを繰り返すことにより、Ｆｍｏｃ固相合成反応によるペプチドの伸長反応を行った。スポットするアミノ酸溶液としては、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（以下、「ＮＭＰ」という。）に溶解した０．５Ｍ  Ｆｍｏｃアミノ酸溶液、及び、ＤＩＰＣＩとヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨｏＢｔ」という。）をモル比で１：４に混合して調製した活性化剤を、１７：１００の容量比で混合させたものを使用した。Ｆｍｏｃ基の脱保護には、２０％ピペリジン（渡辺化学社）を用いた。キャッピングには、無水酢酸とＤＭＦとを容量比で２：１００に混合した溶液を使用した。また、メンブレンの洗浄には、ＤＭＦ及びエタノールを使用した。
【００４５】
［実験例２］
（微生物結合ペプチドのスクリーニング１）
実験例１で作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）とを反応させ、大腸菌結合ペプチドをスクリーニングした。
【００４６】
大腸菌の培養には、Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ培地（日本ベクトン社）を用いた。固体培地で形成したコロニーをピックアップし、１００ｍＬ程度の液体培地中、３７℃で一晩、ＯＤ６６０が２．０を超えるように培養を行った後に結合試験を行った。
【００４７】
培養した大腸菌を５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して回収し、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）（ｐＨ７．４）に再懸濁した。分光光度計（型式「ＵＶ−２６００」、島津製作所社）で濁度を測定し、菌液がＯＤ６６０＝２．０となるようにＰＢＳで希釈した。懸濁液にペプチドアレイを浸し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４８】
その後、ペプチドアレイを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社）−ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔ」という。）で３回洗浄し、蛍光試薬ＳＹＴＯ９（終濃度１μＭ、インビトロジェン社）で３７℃、３０分間染色した。その後ペプチドアレイをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、画像解析システム（型式「Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００ＢＧＲ」、ＧＥヘルスケア社）を用いて蛍光画像を取得した。続いて、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ（ＧＥヘルスケア社）を用い、測定された蛍光強度を数値化した。
【００４９】
図１（ａ）及び（ｂ）は、ペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。図１（ａ）はペプチドアレイに大腸菌を反応させた結果であり、図１（ｂ）は対照である。その結果、大腸菌に対する結合性を有するペプチドが多数同定された。
【００５０】
［実験例３］
（微生物結合ペプチドのスクリーニング２）
実験例１と同様にして作製したペプチドアレイを用いて、大腸菌のべん毛に特異的に結合するペプチドをスクリーニングした。
【００５１】
より具体的には、ペプチドアレイと野生株の大腸菌との結合性、及びペプチドアレイとべん毛欠損株の大腸菌との結合性を実験例２と同様にしてそれぞれ測定した。べん毛欠損株としては、べん毛タンパク質をコードするｆｌｉＣ遺伝子を欠損した大腸菌を使用した。また、対照として、大腸菌を反応させずにＳＹＴＯ９で染色したペプチドアレイを用いた。
【００５２】
図２（ａ）〜（ｃ）は、ペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。図２（ａ）はペプチドアレイに野生株の大腸菌を反応させた結果であり、図２（ｂ）はペプチドアレイにべん毛欠損株の大腸菌を反応させた結果であり、図２（ｃ）は対照である。
【００５３】
図３は、べん毛特異的な結合による蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図３の縦軸は蛍光強度（相対値）を示し、横軸はペプチド番号を示す。べん毛特異的な結合による蛍光強度は、図２（ａ）〜（ｃ）の各スポットの蛍光強度（相対値）を数値化した値を用いて、下記式（１）により計算した。
べん毛特異的な結合による蛍光強度＝（野生株との結合による蛍光強度−対照の蛍光強度）−（べん毛欠損株との結合による蛍光強度−対照の蛍光強度）  …（１）
【００５４】
その結果、図３中、領域１、領域２、領域３と示す領域のペプチドは、べん毛特異的な結合性が特に高いことが明らかとなった。表１にべん毛特異的な結合性が特に高かったペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
【表１】
0006587133.tif 000002
【００５６】
［実験例４］
（蛍光標識ペプチド及び金コロイド標識ペプチドの作製）
配列番号１、５及び８のアミノ酸配列からなるペプチドをＦｍｏｃ固相合成により合成し、蛍光標識又は金コロイド標識した。蛍光色素としてはフルオレセインを用いた。
【００５７】
ペプチドの金コロイド標識は次のようにして行った。５ｎｍ金コロイド（型式「ＥＭ．ＧＣ５」、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）５００μＬに、１０ｍＭのペプチド２０μＬを添加し、ローテーターを用いて室温で２時間混合した。その後、８０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。続いて、５００μＬのＰＢＳを加え、軽くピペッティング後に、軽く超音波処理した。
【００５８】
［実験例５］
（蛍光標識ペプチドと大腸菌との反応性の検討１）
実験例４で作製した蛍光標識ペプチドを、野生株の大腸菌及びべん毛欠損株の大腸菌と反応させ、結合性を検討した。
【００５９】
まず、１０μＭの各蛍光標識ペプチド５００μＬと大腸菌（１．０×１０９個）とをローテーターを用いて室温で混合した。混合時間は、０分、１０分、３０分及び６０分とした。その後、６５００×ｇ、５分間遠心分離した。続いて上清を廃棄し、沈殿にＰＢＳ（５００μＬ）を添加し、ピペッティングにより懸濁した。再び遠心分離し、上清を廃棄し、ＰＢＳ（５００μＬ）を添加し、ピペッティングにより懸濁した。この懸濁液の波長５２１ｎｍの蛍光強度を蛍光分光光度計により測定した。
【００６０】
図４（ａ）及び（ｂ）は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。その結果、配列番号１、５及び８のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドは、いずれも大腸菌に対する結合性を示した。また、特に、配列番号８のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドは、べん毛欠損株の大腸菌と比較して野生株の大腸菌と高い結合性を示した。この結果は、配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチドが、べん毛に対する特異的な結合性を有することを示す。
【００６１】
［実験例６］
（蛍光標識ペプチドと大腸菌との反応性の検討２）
実験例５で作製したサンプルのうち、配列番号８のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドと野生株の大腸菌及びべん毛欠損株の大腸菌とを３０分混合したサンプルをそれぞれ位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡により観察した。
【００６２】
図５（ａ）〜（ｄ）は顕微鏡観察の結果を示す写真である。図５（ａ）は野生株の大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。図５（ｂ）はべん毛欠損株の大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。図５（ｃ）は野生株の大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。図５（ｄ）はべん毛欠損株の大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【００６３】
その結果、配列番号８のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドは、野生株の大腸菌に対する高い結合性を有することが明らかとなった。
【００６４】
［実験例７］
（蛍光標識ペプチドと大腸菌との反応性の検討３）
実験例４で作製した、配列番号８のアミノ酸配列からなる金コロイド標識ペプチドを用いて野生株の大腸菌を染色し、電子顕微鏡で観察した。
【００６５】
まず、ＬＢ培地を用いて大腸菌を一晩前培養した。続いて、３７℃でＯＤ６６０が１．０となるまで本培養した。その後、大腸菌の培養液５００μＬを１０００×ｇで５分間遠心分離して上清を廃棄し、沈殿をＰＢＳ１０００μＬでピペッティングにより懸濁し、大腸菌液を得た。
【００６６】
続いて、大腸菌液１０００μＬに金コロイド標識ペプチドを５０μＬ添加し、ローテーターを用いて室温で１時間混合した。続いて、大腸菌液と金コロイド標識ペプチドとの混合液を６５００×ｇで５分間遠心分離した。続いて、上清を廃棄し、ＰＢＳ２００μＬを添加し、ピペッティングにより懸濁した。その後、金コロイド標識ペプチドで染色した大腸菌を電子顕微鏡で観察した。
【００６７】
図６は電子顕微鏡像を示す写真である。その結果、点線で囲んだ部分に金コロイドが検出された。配列番号８のアミノ酸配列からなる金コロイド標識ペプチドは、大腸菌のべん毛又は繊毛に特異的に結合することが確認された。
【００６８】
［実験例８］
（微生物結合性ペプチドの検討１）
配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、どのアミノ酸が大腸菌との結合に重要であるかを検討した。
【００６９】
具体的には、まず、実験例１と同様にして、配列番号８のアミノ酸配列をＮ末端から順に１アミノ酸ずつアラニンに置換したペプチドからなるペプチドアレイを作製した。続いて、実験例２と同様にして、作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）との結合アッセイを行い、蛍光強度を測定した。図７は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【００７０】
その結果、配列番号８のアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換すると、ペプチドの大腸菌との結合性が低下することが示された。この結果は、これらのアミノ酸が大腸菌との結合に重要な役割を果たしていることを示す。
【００７１】
［実験例９］
（ペプチドアレイの作製２）
ヒトＴＬＲ４のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドアレイを作製した。ＴＬＲ４は、グラム陰性菌の細胞壁に存在する内毒素のリポ多糖（ＬＰＳ）を認識することが知られている。ヒトＴＬＲ４のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【００７２】
ペプチドアレイを構成する部分配列は全て８アミノ酸からなるペプチドとした。配列番号２７のアミノ酸配列において、Ｎ末端から８アミノ酸からなるペプチドを１ペプチドとし、そこから２残基ずつＣ末端方向にずらし、長さがそれぞれ８アミノ酸である全４２０種類のペプチドから構成されるペプチドアレイを、実験例１と同様にして作製した。
【００７３】
［実験例１０］
（微生物結合ペプチドのスクリーニング３）
実験例９で作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）とを反応させ、実験例２と同様にして大腸菌結合ペプチドをスクリーニングした。
【００７４】
図８は、ペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。また、図９は、各ペプチドの蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図９の縦軸は蛍光強度（相対値）を示し、横軸はペプチド番号を示す。
【００７５】
図９には、全ペプチドの蛍光強度の平均値（図中、「平均」と示す。）、全ペプチドの蛍光強度の平均値＋標準偏差（図中、「平均＋標準偏差」と示す。）、蛍光強度の高さが上位６０位であったペプチドの蛍光強度の平均値（図中、「上位６０ペプチドの平均」と示す。）も示す。その結果、大腸菌に対する結合性を有するペプチドが多数同定された。
【００７６】
［実験例１１］
（微生物結合ペプチドのスクリーニング４）
実験例１０において、大腸菌との反応性が高かった上位６０個のペプチドからなるペプチドアレイを、実験例１と同様にして作製した。
【００７７】
続いて、作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）とを、実験例２と同様にして反応させた。実験は３個のペプチドアレイを用いて３回行った。また、対照として、大腸菌を反応させずにＳＹＴＯ９で染色したペプチドアレイを用いた。
【００７８】
図１０（ａ）〜（ｄ）はペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。図１０（ａ）〜（ｃ）は独立した３つのペプチドアレイに大腸菌を反応させた結果であり、図１０（ｄ）は対照である。その結果、大腸菌に対する結合性を示すペプチドが多数同定された。図１０（ａ）〜（ｄ）中の四角で囲んだ領域１〜３は、大腸菌との結合性が特に高かったペプチドの領域を示す。
【００７９】
図１１は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図１１の縦軸は蛍光強度（相対値）を示し、横軸はペプチド番号を示す。図１１中の四角で囲んだ領域１〜３は、大腸菌との結合性が特に高かった領域を示し、図１０（ａ）〜（ｄ）中の四角で囲んだ領域１〜３と対応する。表２に大腸菌との結合性が特に高かったペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００８０】
【表２】
0006587133.tif 000003
【００８１】
［実験例１２］
（蛍光標識ペプチドと大腸菌との反応性の検討４）
実験例４と同様にして、配列番号２４のアミノ酸配列からなるペプチドを蛍光標識した。蛍光色素にはフルオレセインを用いた。
【００８２】
作製した配列番号２４のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドを、実験例６と同様にして野生株の大腸菌と反応させ、位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察し、結合性を検討した。
【００８３】
図１２（ａ）及び（ｂ）は顕微鏡観察の結果を示す写真である。図１２（ａ）は大腸菌の位相差顕微鏡像を示す写真である。図１２（ｂ）は大腸菌の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【００８４】
その結果、配列番号２４のアミノ酸配列からなる蛍光標識ペプチドは、野生株の大腸菌に対する高い結合性を有することが明らかとなった。
【００８５】
また、得られた蛍光顕微鏡像からは、大腸菌の細胞膜付近だけでなく、細胞内の特定の領域から高い蛍光強度を示している菌体も数多く観察された。この結果から、配列番号２４のアミノ酸配列からなるペプチドが認識する分子が細胞内にも存在することが示唆される。
【００８６】
［実験例１３］
（微生物結合性ペプチドの検討２）
表２に示す各ペプチドにおいて、どのアミノ酸が大腸菌との結合に重要であるかを検討した。具体的には、まず、実験例１と同様にして、表２に示す各ペプチドのアミノ酸配列をＮ末端から順にアラニンに置換したペプチドからなるペプチドアレイを作製した。
【００８７】
続いて、実験例２と同様にして、作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）との結合アッセイを行い、蛍光強度を測定した。図１３は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【００８８】
その結果、アルギニン（Ｒ）やヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）等の正電荷を有するアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換すると、ペプチドの大腸菌との結合性が特に低下することが示された。この結果は、これらのアミノ酸が大腸菌との結合に重要な役割を果たしていることを示す。
【００８９】
［実験例１４］
（微生物結合性ペプチドの改変）
表３に示す各ペプチドにアミノ酸変異を導入し、大腸菌との結合性の変化を検討した。具体的には、まず、実験例１と同様にして、表３に示す各ペプチドの太字で示すアミノ酸を様々なアミノ酸に置換したペプチドからなるペプチドアレイを作製した。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
続いて、実験例２と同様にして、作製したペプチドアレイと大腸菌（野生株）との結合アッセイを行い、蛍光強度を測定した。図１４〜２１は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図１４は配列番号１４のペプチドの変異体の結果であり、図１５は配列番号１５のペプチドの変異体の結果であり、図１６は配列番号１７のペプチドの変異体の結果であり、図１７は配列番号１８のペプチドの変異体の結果であり、図１８は配列番号１９のペプチドの変異体の結果であり、図１９は配列番号２２のペプチドの変異体の結果であり、図２０は配列番号２３のペプチドの変異体の結果であり、図２１は配列番号２４のペプチドの変異体の結果である。図１４〜２１において、縦軸は、表３に示す各ペプチドの太字で示すアミノ酸をいずれのアミノ酸に置換したかを示す。また、横軸は、各ペプチドの蛍光強度（相対値）を示す。
【００９２】
その結果、アミノ酸置換により、アミノ酸置換前のペプチドよりも大腸菌に対する結合性が低下したペプチドだけでなく、大腸菌に対する結合性が向上したペプチドが得られた。より具体的には、配列番号１４のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号２８〜４２のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号４３及び４４のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号４５〜４７のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号４８〜５１のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号１９のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号５２〜５５のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号２２のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号５６のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号５７のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。また、配列番号２４のアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である、配列番号５８〜６３のアミノ酸配列からなるペプチドは、大腸菌に対する結合性が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、微生物結合性ペプチドを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006587133.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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