(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−ソルビトールへの酵素触媒還元であって、この第１の酵素触媒生成物形成反応の結果として２つの酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの一方がその酸化型として得られる還元と、
それに続くＤ−ソルビトールのＤ−フルクトースへの酵素触媒酸化であって、この第２の酵素触媒生成物形成反応の結果として２つの酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの他方が還元型として得られる酸化と、によるＤ−グルコースの異性化のための方法であって、
酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨが、生成物形成反応と同じ反応バッチで起こる２つの追加の酵素触媒酸化還元反応を含むワンポット反応で再生され、
ａ）還元された前記補因子を元の酸化型に戻す再生反応において、酸素または一般式
【化１】
0006480416.tif 000012
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分枝状の（Ｃ１〜４）−アルキル基、もしくは（Ｃ１〜４）−カルボキシアルキル基である）
の化合物が還元され、
ｂ）酸化された前記補因子を元の還元型に戻す再生反応において、（Ｃ４〜８）シクロアルカノールまたは一般式
【化２】
0006480416.tif 000013
（式中、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、アルキルがＨ、直鎖もしくは分枝状である（Ｃ１〜６）アルキル、アルケニルが直鎖もしくは分枝状でありかつ１〜３個の二重結合を含有する（Ｃ２〜６）アルケニル、アリール、カルボキシルもしくは（Ｃ１〜４）カルボキシアルキル、シクロアルキルからなる群から選択される）
の化合物が酸化される
方法において、Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物が出発原料として使用されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ａ）において、一般式Ｉ（式中、Ｒ１は置換または非置換の（Ｃ１〜４）アルキル基である）の化合物が還元され、ｂ）において、一般式ＩＩ（式中、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキルが直鎖または分枝状である（Ｃ１〜６）アルキル、アルケニルが直鎖または分枝状でありかつ最大３個の二重結合を含有する（Ｃ２〜６）アルケニル、シクロアルキル、アリール、（Ｃ１〜４）カルボキシアルキル、化合物Ｉがピルベートの場合は更にカルボキシルからなる群から選択される）の化合物が酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｂ）において、式ＩＩ（式中、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキルが直鎖もしくは分枝状である（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルケニルが直鎖もしくは分枝状でありかつ１〜３個の二重結合を含有する（Ｃ２〜６）アルケニル、アリール、カルボキシルまたは（Ｃ１〜４）カルボキシアルキルからなる群から選択される）の化合物が酸化される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アリールが（Ｃ６〜１２）アリールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
シクロアルキルがＣ３〜８シクロアルキルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
アリールが（Ｃ６〜１２）アリールである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記反応が下記の反応スキーム１
【化３】
0006480416.tif 000014
に従うことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生成物形成酸化反応および生成物形成還元反応が時間的に並行して起こることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生成物形成酸化反応および生成物形成還元反応が時間的に並行して起こらないことを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１０】
酸化された前記補因子ＮＡＤＰ＋を元の還元型ＮＡＤＰＨに戻す再生反応において、アルコールデヒドロゲナーゼにより、２−プロパノールがアセトンに酸化されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
還元された前記補因子ＮＡＤＨを元の酸化型ＮＡＤ＋に戻す再生反応において、ＮＡＤＨオキシダーゼにより、酸素が水に還元されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生成物形成に関与する前記酸化反応の基質が、反応バッチ中に濃度５％（ｗ／ｖ）以上で存在することを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成物形成に関与する前記酸化反応の基質が、反応バッチ中に濃度７％（ｗ／ｖ）以上で存在することを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１４】
前記生成物形成に関与する前記酸化反応の基質が、反応バッチ中に濃度９％（ｗ／ｖ）以上で存在することを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１５】
得られるＤ−フルクトースが単離されることを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１６】
得られるＤ−フルクトースが、結晶化した形態で単離されることを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物からフラン誘導体を得る方法であって、
Ａ）Ｄ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物が、酵素法で、酸化還元補因子の使用および再生によりＤ−フルクトースに変換されることであって、同じ反応バッチで起こる少なくとも２つの追加の酵素触媒酸化還元反応の結果、前記２つの酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨのうちの一方の酸化還元補因子が、還元型として得られ、他方の酸化還元補因子が酸化型として得られ、Ｄ−グルコースは２つ以上の酸化還元酵素が関与することでＤ−フルクトースに変換され、前記２つ以上の酸化還元酵素は、
- Ｄ−グルコースのＤ−ソルビトールへの還元であって、この第１の酵素触媒生成物形成反応の結果として２つの酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの一方が酸化型として得られる還元と、
- Ｄ−ソルビトールのＤ−フルクトースへの酸化であって、この第２の酵素触媒生成物形成反応の結果として２つの酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの他方が還元型として得られる酸化と、を触媒することと、
Ｂ）Ａ）で得られた前記Ｄ−フルクトースがフラン誘導体に変換されることと
を特徴とする、方法。
【請求項１８】
段階Ｂ）において、酸性触媒と溶媒が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
次式のＮ−メチル−２−ピロリドン
【化４】
0006480416.tif 000015
が反応溶媒または共溶媒のいずれかとして使用されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への前記変換が、バッチプロセスまたは連続プロセスとして実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への前記変換が、バッチプロセスまたは連続プロセスとして実施されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への前記変換が、マイクロ波加熱下で実施されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される酸性触媒が、
−  均一酸性触媒、
−  不均一酸性触媒、
−  ルイス酸触媒、または
−  ＳＩＬＰ触媒
であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される前記酸性触媒が、硫酸または塩酸から選ばれる均一酸性触媒であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される前記酸性触媒が、イオン交換体である不均一酸性触媒であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される前記酸性触媒が、モンモリロナイトまたはアンバーライトから選ばれる不均一酸性触媒であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される前記酸性触媒が、ＣｒＣｌ２、ＡｌＣｌ３またはＳｉＯ２−ＭｇＣｌ２から選ばれるルイス酸触媒であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記フラン誘導体が、次式のヒドロキシメチルフルフラル
【化５】
0006480416.tif 000016
であることを特徴とする、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースの異性化ならびにフルクトースおよびグルコースの混合物中のフルクトースの富化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−グルコースは、再生可能原料の一部である様々なバイオポリマー中に大量に存在している。その例は、デンプン（例えばコーンスターチ）またはセルロース（例えばリグノセルロースバイオマス）である。
【０００３】
Ｄ−グルコースをＤ−フルクトースに変換する一般的な可能性は、Ｄ−グルコースを基質として受け取る、適切なＤ−グルコースイソメラーゼ、例えばＤ−キシロースイソメラーゼの使用により始まる。このような方法は、例えばＵＳ２９５０２２８から長い間知られており、また、例えばＵＳ３６１６２２１またはＵＳ３８６８３０４に記載されるように、産業上の使用に適している。
【発明の概要】
【０００４】
この場合の１つの課題は、一般に、最高でおおよそ４２％のＤ−グルコースがＤ−フルクトースに変換される可能性があることである。Ｄ−グルコースに対してＤ−フルクトースを更に富化することは、分離方法を通じてのみ達成可能である。従来、１つの可能性は、例えばＵＳ５２２１４７８に記載されるように、クロマトグラフィ法の使用である。食物部門はしばしば、部分的なＤ−フルクトースの富化のみを求める。特に、比較的純粋〜非常に純粋なＤ−フルクトースを製造するクロマトグラフィ法は、幾分手間が掛かる。
【０００５】
イソメラーゼの使用に加えて、文献は炭水化物での酵素の酸化還元反応も記載する。
【０００６】
例えばＤＥ６９８３９３８１は、Ｄ−ソルビトールをＬ−ソルビトールに変換するために使用され、アスコルビン酸の製造のために使用できるソルビトールデヒドロゲナーゼを記載している。
【０００７】
ＤＥ１０２４７１４７は、Ｄ−マンニトール−２−デヒドロゲナーゼの使用により、Ｄ−フルクトースをＤ−マンニトールに還元する方法を記載する。
【０００８】
ＵＳ４４６７０３３は、Ｌ−ソルビトールからＬ−フルクトースへの酵素酸化を記載している。
【０００９】
Ｄ−キシロースからキシリトールへの還元の例は、例えば、ＵＳ２００６００３５３５３、またはＷｏｏｄｙｅｒ  Ｒ．ら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２００５年、２７２巻、３８１６〜３８２７ページに開示されている。
【００１０】
適切なキシロースレダクターゼを使用して、Ｄ−グルコースをＤ−ソルビトールに還元できることが示されている（例えば、Ｗａｎｇ  Ｘ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２００７年、２９巻、１４０９〜１４１２頁）。
【００１１】
ソルビトールデヒドロゲナーゼなどの糖酸化還元酵素は、診断目的のためにも使用される（例えば、ＤＥ６０００６３３０）。
【００１２】
これらの方法は、それぞれの生成物の形成のために、還元または酸化のいずれかが起こる、個別の酸化還元反応である。産業プロセスでは、酵素触媒酸化還元反応は、例えばキラルアルコール、α−アミノ酸、およびα−ヒドロキシ酸の製造で使用される。これまでに既知の産業プロセスは通常、生成物の合成のために酸化還元酵素を使用しており、また、補因子の再生のため、任意で別の酵素も使用している。これと対照的なのが、生成物の形成、および補因子再生に必要な任意の酵素反応に関与する２つ以上の酵素の酸化還元反応が、（同時にまたは順次）１つの反応バッチで、いずれの中間体も単離することなく実施される方法である。最近では、このような酵素カスケード反応−本明細書ではワンポット反応と呼ぶ−は、著しい注目を集めている。なぜなら、ワンポット反応が効果的に作業コスト、作業時間および環境影響を減少するためである。加えて、酵素の酸化還元反応のカスケードは、古典的な化学的方法によっては簡単に実行できない転換を可能にする。
【００１３】
第二級アルコールのラセミ体の脱ラセミ化を、中間体としてプロキラルケトンを経由して、ワンポットシステムを使用して達成する試みが記載された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００８年、１３０年、１３９６９〜１３９７２頁）。第二級アルコールの脱ラセミ化は、異なる補因子特異性を有する２つのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓ−およびＲ−特異的）によって達成された。この方法の不利益は、使用される基質の濃度が、０．２〜０．５％と非常に低いことであり、これは産業目的には適さない。
【００１４】
別のワンポットシステムがＷＯ２００９／１２１７８５に記載されており、ここでは光学活性な第二級アルコールの立体異性体がケトンに酸化された後、対応する光学対掌体に還元され、また逆の立体選択性および異なる補因子特異性を有する２つのアルコールデヒドロゲナーゼが使用された。補因子は、いわゆる「ハイブリッド転移システム」により、追加の酵素を１つだけ使用して再生された。補因子を再生するために、異なる酵素、例えばホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼなどが使用された。この方法の不利益は、使用される基質の濃度が低いことである。
【００１５】
これとは対照的に、多数の個別の酵素の酸化還元反応が知られている。キラルなヒドロキシ化合物の製造の１つの代表的な適用は、対応するプロキラルケト化合物に基づく。この方法では、補因子は追加の酵素によって再生される。これらの方法は全て共通して、独立した還元反応を表し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生する（例えば、ＥＰ１１５２０５４参照）。
【００１６】
キラルでエナンチオマー富化した有機化合物、例えばアルコールまたはアミノ酸の酵素製造の更なる例が記載されている（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００３年、５巻、３６４９〜３６５０頁；ＵＳ７１６３８１５；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．、２００８年、３９巻（２号）３１９〜３２７頁；ＥＰ１２８５９６２）。これらのシステムでは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓからのＮＡＤ（Ｐ）Ｈに依存するオキシダーゼが、補因子再生酵素として使用された。これらの試みは、生成物の形成のための個別の反応も表す。
【００１７】
上述のように、別々に進行する酸化または還元反応は、ワンポット反応の利点、例えば時間および材料の減少による効率性を欠く。
【００１８】
水溶液からフルクトースを単離することは、例えば、ＵＳ４８９５６０１またはＵＳ５０４７０８８に記載される方法により可能である。
【００１９】
今日までに既知の全てのプロセスは、異なる不利益を有する。例えば、基質の初期濃度が低いこと、全体としての収率が低いことである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
驚くべきことに、グルコースからフルクトースへの異性化中に、より高いフルクトースの富化の達成の可能性が、今回見出だされた。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、ソルビトールへの還元とそれに続くフルクトースへの酸化によるグルコースの異性化のための方法であって、酸化還元補因子ＮＡＤ+／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ+／ＮＡＤＰＨがワンポット反応で再生され、同じ反応バッチで起こる少なくとも２つの追加の酵素触媒酸化還元反応（生成物形成反応）の結果、２つの酸化還元補因子のうちの一方が還元型として得られ、他方が酸化型として得られ、
ａ）還元された補因子を元の酸化型に戻す再生反応において、酸素または一般式
【００２２】
【化１】
0006480416.tif 000002
（式中、Ｒ1は直鎖もしくは分枝状の（Ｃ1〜4）−アルキル基、もしくは（Ｃ1〜4）−カルボキシアルキル基である）
の化合物が還元され、
ｂ）酸化された補因子を元の還元型に戻す再生反応において、（Ｃ4〜8）シクロアルカノールまたは一般式
【００２３】
【化２】
0006480416.tif 000003
（式中、Ｒ2およびＲ3がそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルが直鎖もしくは分枝状である（Ｃ1〜6）アルキル、アルケニルが直鎖もしくは分枝状でありかつ１〜３個の二重結合を含有する（Ｃ2〜6）アルケニル、アリール、特に（Ｃ6〜12）アリール、カルボキシルもしくは（Ｃ1〜4）カルボキシアルキル、特にまたシクロアルキル、例えば、（Ｃ3〜8）シクロアルキルからなる群から選択される）
の化合物が酸化される
方法において、グルコースおよびフルクトースの混合物が出発原料として使用されることを特徴とする、方法を提供する。
【００２４】
本発明により提供される方法は、本明細書中において「本発明による（の）方法」とも呼ばれる。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、本発明による方法であって、ａ）において、一般式Ｉ（式中、Ｒ1は置換または非置換の（Ｃ1〜4）アルキル基である）の化合物が還元され、ｂ）において、一般式ＩＩ（式中、Ｒ2およびＲ3は独立して、Ｈ、アルキルが直鎖または分枝状である（Ｃ1〜6）アルキル、アルキルが直鎖または分枝状でありかつ任意で最大３個の二重結合を含有する（Ｃ2〜6）アルケニル、シクロアルキル、特に（Ｃ3〜8）シクロアルキル、アリール、特に（Ｃ6〜12）アリール、（Ｃ1〜4）カルボキシアルキル、化合物Ｉがピルベートの場合は任意で更にカルボキシルからなる群から選択される）の化合物が酸化される、方法を提供する。
【００２６】
更なる態様では、本発明による方法において、Ｒ2およびＲ3が独立して、Ｈ、アルキルが直鎖もしくは分枝状である（Ｃ1〜6）アルキル、アルケニルが直鎖もしくは分枝状でありかつ１〜３個の二重結合を含有する（Ｃ2〜6）アルケニル、アリール、特に（Ｃ6〜12）アリール、カルボキシルまたは（Ｃ1〜4）カルボキシアルキルからなる群から選択される。
【００２７】
特定の態様では、本発明による反応は、以下の反応スキーム１に従って進行する。
【００２８】
【化３】
0006480416.tif 000004
【００２９】
最新技術と比較して、本発明による方法は、化合物が酵素により酸化および還元される方法の大幅な改善といえる。その理由は、この方法が、１つの反応バッチで同時になされる必要な酸化および還元反応、ならびに対応する補因子再生反応で、最新技術による基質濃度よりも大幅に高い基質濃度の使用を可能にするからである。
【００３０】
本発明による方法では、補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨが使用される。ここで、ＮＡＤ+はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型を意味し、ＮＡＤＨはその還元型を意味するのに対し、ＮＡＤＰ+はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型を意味し、ＮＡＤＰＨはその還元型を意味する。
【００３１】
本明細書で、用語「酸化反応」および「還元反応」は、補因子再生の一部でなく、本発明による方法で、生成物の形成に関与する酵素触媒酸化還元反応を意味する。「酸化反応」および「還元反応」は、まとめて「生成物形成反応」と呼ばれる。本発明による方法での生成物形成反応はそれぞれ、少なくとも１つの酸化反応および少なくとも１つの還元反応を含む。
【００３２】
ＮＡＤ+が酸化反応のための補因子として使用される場合、ＮＡＤＰＨが還元反応のための補因子である。ＮＡＤＰ+が酸化反応のための補因子として使用される場合、ＮＡＤＨが還元反応のための補因子である。
【００３３】
本発明による方法では、酸化反応および還元反応は、時間的に並行して、または時間的に並行せずに、すなわち順次、同じ反応バッチで実施され得る。
【００３４】
本明細書では、基質は、生成物の形成を目的として使用される化合物を指す。本明細書では、補基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、補因子再生中に変換される化合物を指す。
【００３５】
本発明による方法では、いくつかの基質、すなわちグルコースおよびソルビトールが使用される。ここで、還元および／または酸化反応は、同じ基質（分子骨格）で起こる。加えて、本発明による方法では、還元および酸化反応は、２つの異なる官能基で、分子骨格の異なる位置で起こる。
【００３６】
本明細書では、「ワンポット反応」は、生成物の形成、および補因子再生のための２つの酵素のシステムに関与する２つ以上の酸化還元反応が、中間体を単離せずに、１つの反応バッチで起こる方法を指す。
【００３７】
本明細書での酸または酸の塩の記述は、記述されないそれぞれの他の用語を含む。また、本明細書での酸の記述は、酸から誘導される全てのエステルを含む。加えて、（部分的に）保護基が設けられた化合物は、元となる物質の記述に含まれる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による方法は、酸化反応および還元反応が、時間的に並行して起こることを特徴とする。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による方法は、酸化反応および還元反応が、同じ分子骨格で起こることを特徴とする。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による方法は、（第二級アルコール）２−プロパノール（イソプロピルアルコール、ＩＰＡ）（補基質）が式ＩＩの化合物として使用され、アルコールデヒドロゲナーゼによりアセトンに酸化され、これは酸化された補因子ＮＡＤ（Ｐ）+を元の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻す再生反応で、アルコールデヒドロゲナーゼにより、２−プロパノールがアセトンに酸化されることを意味することを特徴とする。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による方法は、還元された補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを元の酸化型ＮＡＤ（Ｐ）+に戻す再生反応で、ＮＡＤＨオキシダーゼにより、酸素が水に還元されることを特徴とする。
【００４２】
本発明による方法は、好ましくは水性システムで実施される。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明による方法は、フルクトースが反応バッチに基質として濃度少なくとも５％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは７％（ｗ／ｖ）以上、最も好ましくは９％（ｗ／ｖ）以上、例えば５％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、例えば５％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）、例えば５％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）、例えば５％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）で存在することを特徴とする。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明による方法は、生成物形成反応中に、７０％以上、特に９０％以上の全ターンオーバーが達成されることを特徴とする。
【００４５】
本発明による方法では、緩衝液を水性システムに添加してもよい。適切な緩衝液は、例えば、ｐＨ値が５〜１０、好ましくは６〜９のリン酸カリウム、トリスＨＣｌ、およびグリシンである。加えて、または代わりに、酵素を安定化するために、Ｍｇ2+などのイオンをシステムに添加してもよく、またはグリセロールなどの他の添加剤を添加してもよい。本発明による方法では、添加される補因子ＮＡＤ（Ｐ）+およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は通常、０．００１ｍＭ〜１０ｍＭの間の範囲であり、好ましくは０．０１ｍＭ〜１ｍＭの間の範囲である。
【００４６】
使用される酵素によって、本発明による方法は、温度１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜４５℃で行ってもよい。
【００４７】
本発明による方法では、酵素は、任意で細胞溶解物の形態で、任意で組換え過剰発現蛋白質として、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換えにより過剰発現された蛋白質として使用してもよく、対応する細胞溶解物液は、好ましくは更に精製せずに使用してもよい。製造されるべき酵素によって、発現のために他の微生物、例えば当業者に既知の微生物も使用してもよい。それぞれの微生物の一体部分は、本発明による方法で、分離されてもよく、または同様に反応で使用してもよい（例えば、細胞全体の生体触媒（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ））。微生物の培養上清または溶解液であって、ＤＮＡ組換え技術なしに十分な酵素活性を既に有するものも、使用してもよい。本発明による方法では、酵素および酸化還元補因子は、可溶形態で使用してもよく、または固体に固定化してもよい。ここで、酵素単位１Ｕは、１分当たり１μｍｏｌの基質を変換するために必要な酵素の量に対応する。
【００４８】
本発明による方法では、酵素は好ましくは、大腸菌で組換えにより過剰発現された蛋白質として使用され、対応する細胞溶解物は、より好ましくは更に精製せずに使用される。
【００４９】
可能性のある酵素は、特にグルコースをソルビトールに還元する酵素、ソルビトールをフルクトースに還元する酵素、およびＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを還元できるか、またはＮＡＤ+もしくはＮＡＤＰ+を酸化できる酵素である。
【００５０】
グルコースをソルビトールに変換できる酵素としては、例えば、キシロースレダクターゼなどのアルドースレダクターゼが挙げられる。適切なキシロースレダクターゼは、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから得ることができる。
【００５１】
ソルビトールをフルクトースに変換できる酵素としては、例えば、ソルビトールデヒドロゲナーゼが挙げられる。適切なソルビトールデヒドロゲナーゼは、例えば、羊の肝臓、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａから得ることができる。
【００５２】
アルドースレダクターゼは、グルコースの還元と同時に、酸化還元補因子ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）+に酸化する。ソルビトールデヒドロゲナーゼは、ソルビトールの酸化と同時に、酸化還元補因子ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する。
【００５３】
酸化還元補因子ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＮＡＤ（Ｐ）+を再生するために、デヒドロゲナーゼ、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、特にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを使用してもよい。
【００５４】
適切なアルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒから得ることができる。適切なラクテートデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓから得ることができる。適切なＮＡＤＨオキシダーゼは、例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍから得ることができる。
【００５５】
本発明による方法の出発原料は、グルコースおよびフルクトース、好ましくはＤ−グルコースおよびＤ−フルクトースの混合物である。このような混合物は、異なる方法で製造してもよい。
【００５６】
例えば、出発原料としてグルコースを使用してもよく、グルコースを部分的にフルクトースに異性化してもよい。異性化は既知の方法、例えば、イオン交換樹脂を均一酸性触媒として使用することにより、または酵素により、例えば、グルコースイソメラーゼなどの固定化されたイソメラーゼの助けにより達成でき、グルコースイソメラーゼは例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓからのキシロースイソメラーゼである。
【００５７】
好ましくは、グルコースおよびフルクトースの混合物は、固定化されたグルコースイソメラーゼの使用により、グルコースから製造される。
【００５８】
グルコースの異性化は平衡反応であり、酵素反応中のグルコースとフルクトースとの間の化学平衡は、温度に依存する。これまで文献で見出だされた最大値は、出典によって、混合物中５５％〜５８．９％のフルクトースである。しかし今のところ、最適化された技術的プロセスは、酵素量が少なく、かつ反応時間が短いために、おおよそ４２％の値を使用する。より高い値は、今まで、より高い温度でのみ可能である。しかし、アセトンの９０％の異性化も記載されている。ここで、フルクトースの最大６０％の変換が達成され得る。しかし、ここで必要な酵素は、これらの反応条件下で、あまり安定ではない。
【００５９】
対照的に、本発明による、フルクトースをソルビトール経由でグルコースに変換するための２つの酸化還元反応は、適切な補因子リサイクルシステムにより、大いに生成物へと押し進められる。
【００６０】
本発明による方法の出発混合物は、好ましくは、フルクトース部分が最大５５重量％、例えば１０重量％〜５５重量％、例えば２０重量％〜５０重量％、例えば２３重量％〜４５重量％、例えば２５重量％〜４３重量％に達する混合物である。
【００６１】
本発明による方法の段階ａ）、すなわちグルコースからソルビトールへの変換では、存在するグルコースの少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、特に、少なくとも９５％が、ソルビトールに還元され得ることが示された。例えば、出発混合物中に存在するグルコースの８０％〜９９．９９％、例えば９０％〜９９．９５％、例えば９５％〜９９．９％が変換され得る。
【００６２】
加えて、本発明による方法の段階ｂ）の実行後、すなわちソルビトールからフルクトースへの変換後、混合物中の全ての糖の全フルクトース比率が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または更に最大９９．９％を達成でき、例えば混合物中の全ての糖の全フルクトース比率が６０％〜９９．９９％、例えば７０％〜９９．９５％、例えば８０％〜９９．９％、９０％〜９９．８％、更に９５％〜９９．５％が達成できることが示された。加えて、本発明による方法の段階ｂ）から得られる混合物であって、フルクトースが例えば既に６０％に富化された混合物を、本発明による方法で再使用してもよい。
【００６３】
フルクトースは、グルコースよりも高い甘味を有し、特に米国では、グルコースおよびフルクトースの混合物である甘味料が、ほとんど純粋なグルコースであるコーンスターチから、酵素により製造される。このようなグルコース−フルクトース混合物としては、グルコース−フルクトースシロップ（高フルクトースコーンシロップ−ＨＦＣＳ（：ｈｉｇｈ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｃｏｒｎ  ｓｙｒｕｐ））が挙げられる。コーンシロップは例えば、ドイツ食品で含有量が５％のフルクトースから始まる成分のグルコース−フルクトースシロップとして列挙され、糖濃縮物として使用される。シロップが５０％よりも高い割合のフルクトースを含有する場合、対応して「フルクトース−グルコースシロップ」として列挙される。
【００６４】
本発明による方法により、所望のフルクトース含有量、例えば６０％以上の当該グルコース−フルクトースシロップを、面倒な分離方法なしに製造できる。
【００６５】
更なる態様では、本発明は、所望のフルクトース含有量、特に６０％以上のフルクトース−グルコースシロップを製造するための本発明による方法の使用を提供する。
【００６６】
本発明の段階ａ）により得ることのできるＤ−フルクトースは、例えば、結晶化により単離できる。
【００６７】
全糖含有量中のＤ−フルクトースの割合が非常に高い材料は、例えば、フラン誘導体への更なる変換のための適切な出発原料である。
【００６８】
本発明による段階Ｂ）で、Ｄ−フルクトースをフラン誘導体に変換することは、例えば従来の方法などの適切な方法により、または本明細書で記載されるように、実施してもよい。
【００６９】
本発明の方法により製造されるフルクトースを、更にフラン誘導体に変換してもよい。
【００７０】
更なる態様では、本発明は、グルコースおよびフルクトースの混合物からフラン誘導体を得る方法において、
Ａ）グルコースおよびフルクトースの混合物が、酵素法で、酸化還元補因子の使用および再生によりフルクトースに変換されることであって、同じ反応バッチで起こる少なくとも２つの追加の酵素触媒酸化還元反応の結果、２つの酸化還元補因子のうちの一方の酸化還元補因子が還元型として得られ、他方の酸化還元補因子が酸化型として得られ、２つ以上のオキシドレダクターゼが関与することでＤ−グルコースがＤ−フルクトースに変換されることと、
Ｂ）Ａ）で得られるフルクトースがフラン誘導体に変換されることと
を特徴とする、方法を提供する。
【００７１】
本明細書では、本発明により提供されるグルコースおよびフルクトースの混合物からフラン誘導体を得る方法は、「本発明による（の）フラン方法」とも呼ばれる。
【００７２】
従来の方法によると、Ｄ−フルクトースから本発明によるフラン方法のフラン誘導体への変換は、触媒、例えば酸性触媒、例えば無機酸、有機酸、例えばシュウ酸、遷移金属イオンのゼオライト（Ｈ体）、不均一溶解金属リン酸塩、強酸性カチオン交換体の存在下で起こり得る。
【００７３】
本発明によるフラン方法での溶媒は、水または有機溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドンであってもよく、本発明による段階Ｂ）でのＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換は、好ましくは酸性触媒の存在下で、かつ下記の式のＮ−メチルピロリドン（Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＮＭＰ）の存在下で起こる。
【００７４】
【化４】
0006480416.tif 000005
【００７５】
本発明によるフラン方法の段階Ｂ）でのＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換は、バッチプロセスまたは連続プロセスのいずれかとして実施してもよく、好ましい実施形態では、本発明による段階Ｂ）は、マイクロ波加熱下で実施される。
【００７６】
本発明のフラン方法の特定の実施形態は、Ｄ−フルクトースからフラン誘導体への変換が、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を、反応溶媒または共溶媒、すなわち別の溶媒への添加剤のいずれかとして使用することを特徴とする。
【００７７】
本発明によるフラン方法の特定の実施形態では、段階Ｂ）は、ＮＭＰを（共）溶媒として、例えば反応溶媒として、または別の溶媒への添加剤として使用する。
【００７８】
本発明によるフラン方法では、ＮＭＰが溶媒として使用される場合、ＮＭＰは唯一の溶媒として使用されてもよく、またはＮＭＰは別の共溶媒と一緒に使用されてもよい。共溶媒が使用される場合、全溶媒量に対してＮＭＰ濃度は最大７０％（ｖ／ｖ）、例えば最大６０％（ｖ／ｖ）を使用してもよい。可能性のある共溶媒は、例えば水または有機溶媒、例えば最新技術から既知の有機溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。
【００７９】
本発明の段階Ｂ）によるフラン方法では、Ｄ−フルクトースは、最大４０％（ｗ／ｖ）の量で使用されてもよく、一般に５〜２０％の量で使用される。ただし反応は、より低い濃度、例えばＤ−フルクトース濃度（おおよそ）１％（ｗ／ｖ）でも起こる。最小値はむしろコスト効果により規定され、化学的には規定されない。
【００８０】
本発明によるフラン方法の段階Ｂ）の酸性触媒は通常、フルクトースからフラン誘導体への変換に使用できる酸性触媒を含む。好ましくは、触媒はブレンステッド酸である。
【００８１】
ここで、均一酸性触媒、例えば硫酸もしくは塩酸、または不均一酸性触媒、例えばカチオン交換樹脂、例えばモンモリロナイト、好ましくはモンモリロナイトＫＳＦ（登録商標）、もしくはアンバーライト、例えばアンバーライト（登録商標）、好ましくはアンバーライト１５（登録商標）を使用してもよい。加えて、ルイス酸触媒、例えばＣｒＣｌ2、ＡｌＣｌ3、ＳｉＯ2−ＭｇＣｌ2、またはＳＩＬＰ（シリカ担持イオン性液体相：ｓｉｌｉｃａ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ）触媒を、本発明の方法で使用してもよい。しかし、一般に、その結果は上記の触媒の結果ほど良くはない。
【００８２】
更なる態様では、本発明のフラン方法は、段階Ｂ）におけるＤ−フルクトースからフラン誘導体への変換中に使用される酸性触媒が、
−  均一酸性触媒、好ましくは硫酸または塩酸、
−  不均一酸性触媒、好ましくはイオン交換体、例えばモンモリロナイト、例えばモンモリロナイトＫＳＦ（登録商標）、またはアンバーライト、例えばアンバーライト（登録商標）、好ましくはアンバーライト１５（登録商標）、
−  ルイス酸触媒、例えばＣｒＣｌ2、ＡｌＣｌ3またはＳｉＯ2−ＭｇＣｌ2、
−  ＳＩＬＰ触媒、
であり、好ましくは均一または不均一酸性触媒であることを特徴とする。
【００８３】
当業者は、段階Ｂ）での触媒の必要量を、単純な予備テストによって簡単に決定できる。量は、使用される触媒の種類に依存する。
【００８４】
使用されるフルクトース量に基づく下記の触媒量は、特にＮＭＰが溶媒として使用される場合の例として示す。
【００８５】
触媒                                    量
１Ｎ  ＨＣｌ                            ２０〜２００％（ｖ／ｗ）
ＨＣｌ（３７％）                        ２〜２５％（ｖ／ｗ）
１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4                          ２０〜２００％（ｖ／ｗ）
濃縮Ｈ2ＳＯ4                            ２〜２５％（ｖ／ｗ）
モンモリロナイトＫＳＦ（登録商標）      １〜５０％（ｗ／ｗ）
アンバーライト１５（登録商標）          １〜５０％（ｗ／ｗ）
ＣｒＣｌ2、ＡｌＣｌ3                    １〜２０％（ｗ／ｗ）
ＳｉＯ2−ＭｇＣｌ2                      ２０〜２００％（ｗ／ｗ）
ＳＩＬＰ                                １０〜２００％（ｗ／ｗ）
【００８６】
おおよそ１０％（ｗ／ｖ）のＤ−フルクトースの濃度では、記述された値は問題が無く、より高いフルクトース濃度では、フルクトースが残りの溶媒量になお溶解できるように、触媒の量が制限されるべきである。
【００８７】
本発明によるフラン方法の段階Ｂ）は、適切な温度で実施される。適切な温度としては、特にＮＭＰが溶媒として使用される場合、温度１００〜２２０℃、好ましくは１１５〜２００℃、最も好ましくは１３５〜１８５℃が挙げられる。
【００８８】
溶媒としてＮＭＰを使用する際の段階Ｂ）での反応は、実験全体に亘って、積極的に圧力制御せずに、密閉容器（バッチ、マイクロ波）内で実施した。マイクロ波の実行から、ＮＭＰのための最大圧力は、添加剤によって、２〜４ｂａｒと推測してもよい。例えばＨＣｌが触媒として使用される場合、展開圧力（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は、最大１５ｂａｒまで上昇する。連続作業時、溶媒の沸騰を防ぐために、最大４０ｂａｒの一定の背圧を加えた。圧力は、溶媒もしくは添加剤のいずれかからの蒸気圧として生じるか、またはシステム関連の（ポンプ）圧力が加えられる。しかし、圧力は反応機構に対して決定的であるとは思われない。
【００８９】
本発明によるフラン方法で生じる主なフラン誘導体は、下記の式のヒドロキシメチルフルフラル（ＨＭＦ）であることが見出だされた。
【００９０】
【化５】
0006480416.tif 000006
【００９１】
更なる態様では、本発明によるフラン方法は、フラン誘導体がヒドロキシルメチルフルフラルであることを特徴とする。
【００９２】
本発明のフラン方法では、「ＨＭＦ選択性」は、ＨＭＦに変換された、消費されたＤ−フルクトースの部分を表すと理解されるべきである。
【００９３】
本発明のフラン方法で製造されるフラン誘導体は、直接使用されてもよく、または更なる化学反応で二次生成物に変換してもよい。例えば、ヒドロキシルメチルフルフラルは、下記の式の２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ：２，５−ｆｕｒａｎ  ｄｉｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）に更に酸化されてもよい。
【００９４】
【化６】
0006480416.tif 000007
【００９５】
既知の通り、ＦＤＣＡは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）と同様に、例えば中空体、特にボトル、例えば飲料ボトル、化粧品用ボトル、または洗浄剤用ボトルに使用され得るポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）などのポリマーの製造のためのモノマーとして使用できる。再生源からのエチレングリコール、および本発明による方法で製造されるＨＭＦから入手可能なＦＤＣＡの同時使用で、ほとんど完全に再生可能原料からなるＰＥＦを得ることができる。
【００９６】
更なる態様では、本発明は、製造されるフラン誘導体が更に変換されること、例えばヒドロキシルメチルフルフラルが２，５−フランジカルボン酸に更に酸化されることを特徴とし、この２，５−フランジカルボン酸は、例えば、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）などのポリマーを製造するために、任意で重合されることを特徴とする。
【実施例１】
【００９７】
グルコースイソメラーゼおよびそれに続く２段階酸化還元プロセスによるグルコース−フルクトースシロップからのフルクトースの製造
７５０ｍｇのＤ−グルコースを５０ｍＭのトリス緩衝液（２５℃でｐＨ＝８．０）に溶解させ、全体積５ｍＬとした。この混合物に、２５０ｍｇのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓからの固定化されたグルコースイソメラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ  ＩＴ（登録商標））を加え、懸濁液を５０℃で６時間、穏やかに振とうした。これにより、グルコースのおおよそ３３％がフルクトースに変換された。グルコースイソメラーゼを、遠心分離（５０００ｇ、１分間）により除去した。その後、２ｍＬのガラス容器で、４００μＬの溶液を、１０μＬのトリスＨＣｌ（０．５Ｍ、ｐＨ＝８．０）、２０μＬのＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのキシロースレダクターゼ（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現、２８０Ｕ／ｍＬ）、３０μＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒからのアルコールデヒドロゲナーゼ（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現、１３０Ｕ／ｍＬ）、および３５μＬの２−プロパノールで処理した。反応は開放系で実施し、ガラス容器を２４時間４０℃で振とうした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ（登録商標）、８５０ｒｐｍ）。開放系では反応生成物のアセトンの蒸発が可能であるため、反応はソルビトール形成の方へと駆動される。４時間後に１５μＬの２−プロパノール、１８時間後に２５μＬの２−プロパノール、および１８時間後に５０μＬの水を補充した。存在していたグルコースの９８．５％がソルビトールに変換された。混合物は、合計でおおよそ７１％のソルビトール、２８％のフルクトース、および１％のグルコースを含有した。更なる反応工程では、６０μＬのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからのＮＡＤＨオキシダーゼ（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現、３５０Ｕ／ｍＬ）、および４０μＬのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのソルビトールデヒドロゲナーゼ（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現、５０Ｕ／ｍＬ）が添加された。ＮＡＤＨオキシダーゼ反応への酸素供給を保証するため、開放系で再度反応させた。反応容器を４８時間、２５℃で振とうした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ（登録商標）、８５０ｒｐｍ）。６０％のＤ−フルクトース、３５．２％のＤ−ソルビトール、および４．７％のＤ−グルコースの混合物が得られた。
【実施例２】
【００９８】
Ｄ−フルクトースからフラン誘導体への変換のための材料および方法
Ｄ−フルクトースからＨＭＦへの脱水反応は、異なる反応条件下で、任意でマイクロ波に補助された加熱下で標準バッチプロセスとして、または連続フロー条件により、実施した。驚くべきことに、既知のシステムと比較して、反応でＮＭＰを溶媒として使用し、均一または不均一触媒を併用することにより、マイクロ波に補助された方法と、連続フロー条件下とで、より高い収率が得られることが見出だされた。
【００９９】
ＳｉＯ2−ＭｇＣｌ2の合成
ＳｉＯ2−ＭｇＣｌ2は、Ｙａｓｕｄａら（Ｙａｓｕｄａ，Ｍ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｊ．；Ｙｏｋｏｉ，Ｈ．Ｓｈｉｒａｇａｍｉ，Ｔ．Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．２０１１、８４、４１６〜４１８）によるプロトコルと同様に製造した。
【０１００】
ＳＩＬＰの合成
ＳＩＬＰ触媒は、既知のプロトコルにより（Ｆｕ，Ｓ．−Ｋ．；Ｌｉｕ，Ｓ．−Ｔ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６、３６、２０５９〜２０６７）、Ｎ−メチル−イミダゾールを使用して製造した。固定化のために、得られたイオン液体を、乾燥クロロホルム中の２００重量％のシリカゲル（１０ｇのＳｉＯ2当たりクロロホルム１００ｍＬ）と混合し、２４時間７０℃まで加熱した。得られた固体を濾過し、クロロホルムで洗浄して、減圧下で乾燥させた。この得られたシリカゲルは、触媒充填量がおおよそ１６重量％であった。
【０１０１】
バッチ反応の一般条件
特に記述しない場合、全てのバッチ反応は、４ｍＬのねじ蓋ガラス広口瓶で実施した。加熱は、適切なアルミニウムブロックで、所望の温度まで実施した。
【０１０２】
バッチプロセスでのマイクロ波反応
バッチプロセスでのマイクロ波反応は、反応を順次可能にするために、オートサンプラを取り付けたＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  Ｓｉｘｔｙ実験用マイクロ波（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）で実施した。吸収レベルは最大値に設定し、自動的に最大エネルギー入力４００Ｗに制御させた。
【０１０３】
ストップフローマイクロ波反応および連続フロー反応
半連続プロセスを最適化するためのストップフロー反応を、ＣＥＭ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍで、ＣＥＭ（登録商標）Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｕｐｇｒａｄｅと共に、かつ外部圧力センサーによって実施した。連続プロセスでの反応のために、自動的な生成物回収のため、Ｇｉｌｓｏｎ（登録商標）ＧＸ−２７１オートサンプラを取り付けた、ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ（登録商標）のカートリッジ系反応器システムＸ−Ｃｕｂｅを使用した。ここで、２つのケイ砂カートリッジ（ＣａｔＣａｒｔ（登録商標）、７０×４ｍｍ）を反応ゾーンに導入した。
【０１０４】
あるいは、ペルフルオロアルコキシアルカンキャピラリ（ＰＦＡキャピラリ、内径０．８ｍｍ、外径１．６ｍｍ）を使用し、加熱可能なアルミニウムシリンダに巻き付けた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＤ  ＨＰＬＣポンプによって、所望の流速で基質を添加した。正確な容積（カラム１６．０ｍＬ；カラムの前および後のデッドボリュームそれぞれ１．０ｍＬ）は、純粋な溶媒の規定された流速を、デジタルストップウォッチにより監視することにより決定した。
【０１０５】
Ｄ−フルクトースからフラン誘導体への変換の反応の分析
定量ＨＰＬＣ分析のため、反応試料（特に記述しない場合、２２μＬ）を脱イオン水で希釈して１ｍＬとした。異なる濃度を有する反応試料では、最高濃度が２ｍｇ／ｍＬを超えないように希釈した。この溶液に、１００μＬの３−ヒドロキシベンジルアルコールを内部標準として添加した後、試料を完全に混合した。固体残留物を遠心分離（５分、２００００Ｇ）、または濾過（Ｐｈｅｎｅｘ  ＰＴＦＥ、４ｍｍ、０．２μｍ）により分離した。定量は、内部標準と比較したＲＩスペクトルのピークの面積に基づいた。
【０１０６】
試料をＨＰＬＣにより、それぞれＰＤＡ  ＰｌｕｓおよびＲＩ検出器を取り付けたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｐｌｕｓ  ＳｙｓｔｅｍまたはＳｈｉｍａｄｚｕ（登録商標）Ｎｅｘｅｒａ  Ｓｙｓｔｅｍで分析した。分離のため、固定相はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）からのイオン交換カラム（Ｒｅｚｅｘ  ＲＨＭ−Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｈ＋（８％）、１５０×７．８ｍｍ、スルホン化スチレンおよびジビニルベンゼンの架橋マトリックスから構成される、Ｈ+体）であり、溶離液は水（ＨＰＬＣグレード）および０．１％のＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）から構成した。カラム温度を８５℃で一定に保ち、実行時間を２５分で最適化した。生成物の定量は、内部標準により、ＲＩ信号の積分によって実施した。加えて、更なる反応分析のために、波長２００ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍをＰＤＡにより記録した。
【０１０７】
ＧＰ１−バッチプロセスでのＤ−フルクトースの脱水
標準反応では、反応の最適化のため、１００ｍｇのＤ−フルクトース（０．５６ｍｍｏｌ）および所望の量のそれぞれの触媒をガラスバイアル瓶に入れ、１ｍＬの新しく蒸留したＮＭＰで処理した。得られた溶液／懸濁液を選択した温度まで加熱し、所望の時間反応させた。
【０１０８】
ＧＰ２−マイクロ波バッチプロセスでのＤ−フルクトースの脱水
標準反応では、反応の最適化のため、１００ｍｇのＤ−フルクトース（０．５６ｍｍｏｌ）および所望の量のそれぞれの触媒をマイクロ波容器に加えた（０．５〜２．０ｍＬ）。容器に磁気撹拌子を設け、１ｍＬのＮＭＰを添加した。マイクロ波の放射強度は、所望の温度を達成するために、企業内の調整アルゴリズムにより自動的に設定した。反応容器の急速冷却は、少なくとも６ｂａｒの加圧空気を吹きつけることにより達成した。
【０１０９】
ＧＰ３−マイクロ波ストップフロープロセスでのＤ−フルクトースの脱水
標準反応では、反応の最適化のため、Ｄ−フルクトース標準溶液（１ｍＬ；ｃ＝１００ｍｇ／ｍＬ（ＮＭＰ中））および塩酸（１００μＬ；ｃ＝１ｍｏｌ／Ｌ）を、磁気撹拌子を備えたマイクロ波容器に添加した。バイアル瓶をスナップキャップで封止した後、溶液を所望の時間、所望の温度まで加熱した。可能な最速加熱を達成するために、加えるエネルギーは下記の表１により設定した。
【０１１０】
【数１】
0006480416.tif 000008
【０１１１】
反応容器の急速冷却は、少なくとも６ｂａｒの加圧空気を吹きつけることにより達成した。
【０１１２】
ＧＰ４−カートリッジ系反応器システムでのＤ−フルクトースの脱水
標準反応では、反応の最適化のため、Ｄ−フルクトース標準溶液（１ｍＬ；ｃ＝１００ｍｇ／ｍＬ（ＮＭＰ中））を塩酸（ｃ＝１ｍｏｌ／Ｌ）と混合し、試薬ポンプにより反応システム内へと注入した。加熱プロセス中、安定な温度および安定な流速を監視するために、いくつかの予備試料を取った。選択した反応温度は１５０℃、１８０℃および２００℃であり、反応圧力は４０ｂａｒに調整した。流速は０．２〜０．６ｍＬ／分の間を選択した。反応試料は２．５ｍＬの量で取り、分析した。
【実施例３】
【０１１３】
Ｄ−フルクトースの脱水のための触媒としての硫酸の使用
異なる温度、反応時間、および酸濃度を比較した。反応は「ＧＰ１」により実施した（実施例４）。使用した触媒は、１００μＬの１Ｎ硫酸または１０μＬの濃縮硫酸のいずれかであった。結果を表１に要約する。
【０１１４】
【数２】
0006480416.tif 000009
【０１１５】
黒い不溶性ポリマーおよびフミンの形成は、使用された最適条件下で観測されなかった。
【実施例４】
【０１１６】
Ｄ−フルクトースからフラン誘導体への変換を触媒するための硫酸の使用（連続プロセス）
Ｄ−フルクトース（１０％ｗ／ｖ）および濃縮硫酸（１％ｖ／ｖ）をＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解させた。ＰＦＡキャピラリにより、連続フローで、混合物を反応器にポンプで通した（反応温度１５０℃）。最初の１８ｍＬを廃棄した後、更に１０ｍＬを分析のために回収した。様々な流速で、反応器内での異なる滞留時間の効果をテストした（表１０）。
【０１１７】
【数３】
0006480416.tif 000010
【０１１８】
黒い不溶性ポリマーおよびフミンの形成は、分析された条件下で観測されなかった。
【実施例５】
【０１１９】
Ｄ−フルクトースの脱水のための触媒としてのアンバーライト１５（登録商標）の使用
この実施例は、マクロ架橋樹脂に基づくスルホン酸残基を有する強いイオン交換体の使用を示す。１００ｍｇのＤ−フルクトースを、１ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドンの存在下で３時間、１００℃で撹拌しながらインキュベートした（プロトコルＧＰ１、実施例２）。アンバーライト１５（登録商標）を触媒として添加した。表２は、この実験の結果を示す。比較的低温で、高い収率が達成された。タール状化合物の形成は回避された。
【０１２０】
【数４】
0006480416.tif 000011