(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸を製造する生物変換方法であって、以下のステップ：
混合物中でVaoA遺伝子を発現させること；
混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること；
混合物にオイゲノールを供給すること；ならびに
フェルラ酸を収集すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
フェルラ酸を製造する生物変換方法であって、以下のステップ：
混合物中でVaoA遺伝子を発現させること；
混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること、ここで発現された遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する；
混合物にオイゲノールを供給すること；ならびに
フェルラ酸を収集すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
発現されたMtSAD1が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発現されたVaoAが、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ADH遺伝子を発現させることをさらに含み、発現されたADHが、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子のいずれかを発現させることが、in vitro翻訳により遺伝子を発現させること；細胞系において遺伝子を発現させること；細菌または酵母において遺伝子を発現させること；からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
バニリンを製造する生物変換方法であって、以下：
混合物中でVaoA遺伝子を発現させること；
混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること；
混合物にオイゲノールを供給すること；ならびに
フェルラ酸をバニリンに変換すること
を含む、前記方法。
【請求項８】
バニリンを製造する生物変換方法であって、以下：
混合物中でVaoA遺伝子を発現させること；
混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること、ここで発現された遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する；
混合物にオイゲノールを供給すること；ならびに
フェルラ酸をバニリンに変換すること
を含む、前記方法。
【請求項９】
発現されたMtSAD1が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
発現されたVaoAが、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ADH遺伝子を発現させることをさらに含み、発現されたADHが、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子のいずれかを発現させることが、in vitro翻訳により遺伝子を発現させること；細胞系において遺伝子を発現させること；細菌または酵母において遺伝子を発現させること；からなる群より選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子のいずれかからの発現産物を組み換えタンパク質として精製する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
フェルラ酸をバニリンに変換することが、フェルラ酸を、Pseudomonas sp. HR 199、Amycolatopsis sp. ATCC 39116、Amycolatopsis sp. HR167、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Pseudomonas fluorescens AN103、Streptomyces seotonii、Streptomyces sannanensis、Amycolalopsis sp.株（Zhp06）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物と共にインキュベートすることをさらに含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バニリンを製造する方法であって、以下：
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法に基づいてフェルラ酸を製造すること；
混合物中でフェルラ酸を提供すること；
混合物中でフェルロイル−ＣｏＡシンテターゼを発現させること；
混合物中でエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼを発現させること；ならびに
バニリンを収集すること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
Pseudomonas、Amycolatopsis、Sphingomonas paucimobilis、Rhodococcus、Streptomycesおよびそれらの組み合わせからなる属より選択される種において、シンテターゼおよびヒドラターゼ／アルドラーゼを発現させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Pseudomonas sp. HR 199、Amycolatopsis sp. ATCC 39116、Amycolatopsis sp. HR167、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Pseudomonas fluorescens AN103、Streptomyces seotonii、Streptomyces sannanensis、Amycolalopsis sp.株（Zhp06）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微生物種において、シンテターゼおよびヒドラターゼ／アルドラーゼを発現させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
in vitro翻訳によりまたは細胞系において、バニリンシンターゼを発現させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
組み換えE.coli株を用いてフェルラ酸を生成する方法であって、以下：（ｉ）培地中で組み換えE.coli株を培養すること；（ｉｉ）オイゲノールを（ｉ）の培養物に添加してオイゲノールの生体内変換を開始させること；（ｉｉｉ）生体内変換を進行させること；ならびに（ｉｖ）培養物からフェルラ酸を抽出することを含み、ここで、組み換えE.coli株は、MtSAD1を発現するプラスミドおよびVaoAを発現するプラスミドを含むか、またはMtSAD1およびVaoAを発現するプラスミドを含む、前記方法。
【請求項２０】
組み換えE.coli株を用いてフェルラ酸を生成する方法であって、以下：（ｉ）培地中で組み換えE.coli株を培養すること；（ｉｉ）オイゲノールを（ｉ）の培養物に添加してオイゲノールの生体内変換を開始させること；（ｉｉｉ）生体内変換を進行させること；ならびに（ｉｖ）培養物からフェルラ酸を抽出することを含み、ここで、組み換えE.coli株は、MtSAD1を発現するプラスミドおよびVaoAを発現するプラスミドを含むか、またはMtSAD1およびVaoAを発現するプラスミドを含み、発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項２１】
組み換えE.coli株が、AtADH、fcsおよびechからなる群より選択される１以上の遺伝子をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
発現されたMtSAD1が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
発現されたMtSAD1が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
以下のステップ：請求項８または１５に記載の方法に基づいてバニリンを製造すること；バニリンを収集すること；およびバニリンを消耗品に組み込むこと；を含む、消耗品を製造する方法。
【請求項２５】
バニリンを消耗品と混合するステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
バニリンが、フレーバーノートを付与するのに十分な量で、消耗品に組み込まれる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
消耗品が、香味付けされた消耗品、食品、食品前駆体製品、食糧の産生において用いられる添加物、医薬組成物、栄養補助食品、栄養補給食品、および化粧品からなる群より選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
消耗品が、香味付けされた消耗品である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
消耗品が、食品、食品前駆体製品、または、食糧の産生において用いられる添加物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
オイゲノールをフェルラ酸に変換する、１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子を含む、組み換えE.coli株。
【請求項３１】
オイゲノールをフェルラ酸に変換する、VaoAおよびMtSAD1遺伝子を含み、ここで発現されたMtSAD1遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、組み換えE.coli株。
【請求項３２】
VaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子の１以上、ならびにフェルラ酸をバニリンに変換する１以上のfcsおよびech遺伝子を含む、組み換えE.coli株。
【請求項３３】
VaoAおよびMtSAD1遺伝子、ならびにフェルラ酸をバニリンに変換する１以上のfcsおよびech遺伝子を含み、ここで発現されたMtSAD1遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、組み換えE.coli株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１３年１１月４日に出願された米国仮出願番号61/899,456の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願の内容は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０００２】
開示の分野
本開示は、一般に、細菌、酵母または他の細胞系におけるオイゲノールのフェルラ酸への生物変換（bioconversion）を触媒するために植物デヒドロゲナーゼを利用するための方法および／または材料に関する。それはまた、バニリンの製造、かかる方法を用いて製造されたバニリンおよび材料、ならびに天然バニラ製品としてのバニラ製品の真偽の確認に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
バニラ香味剤は、世界中で最も頻繁に用いられる香味剤のいくつかのうちの一つである。それらは、アイスクリーム、乳製品、デザート類、菓子類、ベーカリー製品および蒸留酒などの多くの食品の香味付けのために用いられる。それらはまた、香水、医薬品および個人衛生用品においても用いられる。
【０００４】
天然バニラ香味剤は、伝統的に、バニラ属のランの発酵させた莢から得られてきた。それは主に、豆の収穫の後であって数週間の乾燥および発酵のプロセスの間に、豆の中に存在するバニリングルコシドの加水分解により形成される。バニラ香味剤の必須の芳香性物質は、バニリン（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド）である。
【０００５】
発酵させたバニラ莢から得られる天然バニラ香味の他に、これもまた食品の香味付けのために用いられる、生物工学および合成により製造されたバニリンを製造する生物工学的および化学的合成方法もまた、開発されてきた。天然バニリンの製造のためのいくつかの潜在的な原材料が示唆されてきた。例として、フェルラ酸、リグニン、バニリン酸、オイゲノールおよびイソオイゲノールなどの多くの物質が、多くの異なる微生物を用いてバニリンに変換（transform）され得ることが見出されてきた。バニリンの最高収率のいくつかは、フェルラ酸を天然バニリンに変換（convert）することができるStreptomyces setonii株を用いて得られる（例えば、EP0885968B、ならびにMuheimおよびLerch（1999）Appl Microbiol Biotechnol 51: 456-461を参照）。しかしながら、フェルラ酸（コメ殻の出発材料からのもの）は、高価な出発材料であるため、芳香品質が高い天然バニリンの調製において有用なフェルラ酸を製造するために、より安価なフェルラ酸前駆体出発材料および効率的な生物変換方法を同定する必要性が存在する。
【０００６】
天然食品の販売を規制する法律によれば、植物および動物材料から得られる、または微生物の酵素による生体内変換／生体触媒から得られる製品のみが、天然として同定され得る。この規制法は、国ごとに異なり得る。例として、ＵＳの天然バニリンは、オイゲノールから、ＥＵにおいては天然としては受け入れられない方法により誘導される。ＥＵにおける新たな出発材料から製造される天然バニリン製品／食品成分の立ち上げは、その地域の規制法を順守することを確実にするため、および規制により受け入れ可能な方法を用いて製造されていないバニリン成分から消費者を保護するための、緊密な監視を受ける。
【０００７】
バニラ豆から単離された天然バニラ香味剤またはバニリンに対する顧客主導の要求が非常に高く、合成バニリンを製造するための方法が伝統的な方法よりもはるかに安価であることを考慮すると、偽造および虚偽情報の問題が、特に大きなものとなる。消費者組織は、定期的に、食品中の天然であると謳われるバニラ香味剤の真性についての研究の結果を公開する。これらの評価は、典型的には、分析結果に基づく。しかしながら、特定のケースにおける製造条件または影響要因の知識を伴わない分析結果の解釈は、誤った評価、および、実際にはそれは植物および動物材料から製造されたか、または微生物酵素による生体内変換／生体触媒から得られたものであり、したがって天然生成物であるとみなされるべき資格を有する場合に、製品を合成とする誤った指摘をもたらし得ることが、明らかとなってきた。
【０００８】
天然バニリンなどの天然生成物に対する消費者主導の要求のために、（ｉ）天然起源の原材料を用いる；ならびに（ｉｉ）工業および規制の当局により認識される天然香味剤のための必要条件に適合する方法ステップを用いる、生体内変換／生物変換方法による天然バニリンの効率的な製造についての要求は増加している。また、最終生成物が真の天然バニリン生成物であることを証明するための好適な方法の評価についての必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００９】
要旨
本開示の目的は、天然バニリンの製造のために次々に用いることができるフェルラ酸へのオイゲノールの生物変換のための、工業レベルにスケールアップすることができる方法を提供することである。
【００１０】
本開示は、VaoAおよびMtSAD1の遺伝子産物を使用する細菌または他の細胞系を利用する、オイゲノールのフェルラ酸への高収率の生物変換のための方法である。さらに、ADH遺伝子により発現されるアルデヒドデヒドロゲナーゼであるAtADHを、細菌において、生物変換反応における効率を増大させるために用いる。AtADHは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）からクローニングする。
【００１１】
出願人らは、植物タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）から誘導されるMtSAD1の遺伝子産物が二機能性であることを発見した。本質的には、MtSAD1は、calAおよびcalBの遺伝子産物の両方の活性を有する。したがって、MtSAD1は、calAおよびcalBの発現産物を置換することができ、それにより、フェルラ酸の製造のためのより効率的な生合成経路が可能となる。やはり、VaoAおよびMtSAD1からの遺伝子産物は、オイゲノールをフェルラ酸に変換することができる。
【００１２】
別の開示は、フェルラ酸を製造する生物変換／生合成方法であって、該方法は、細菌中でVaoA遺伝子を発現させ、細菌中でMtSAD1遺伝子を発現させること；細菌を培地中で増殖させ、オイゲノールを細菌に供給し、細菌をインキュベートし、フェルラ酸を収集することを含む。
【００１３】
一態様は、フェルラ酸を製造する生合成／生物変換方法であって、該方法は、細菌中でVaoA遺伝子を発現させ、細菌中でMtSAD1遺伝子を発現させること；細菌を培地中で増殖させ、オイゲノールを細菌に供給し、細菌をインキュベートし、フェルラ酸をバニリンに変換することを含む。
【００１４】
一態様は、バニリンを製造する生物変換方法であって、該方法は、混合物中でVaoA遺伝子を発現させ、混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること；混合物にオイゲノールを供給すること；ならびにフェルラ酸をバニリンに変換することを含む。
【００１５】
本開示の別の態様によれば、フェルラ酸のバニリンへの生物変換は、酵素的および／もしくは生化学的な経路ならびに／または発酵経路により行う。酵素的および／もしくは生化学的な経路は、in vitroで、またはin vivoで、発酵経路の一部として行うことができる。
【００１６】
本開示のさらなる態様によれば、（約−２５〜約−３２‰の）δ１３Ｃ値の範囲を有するフェルラ酸材料が得られ、これは、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンから選択される天然植物ソースから得られたフェルラ酸についてのδ１３Ｃ値とは異なる（Cochennec C Perfumer & Flavourist (2013) 38; 20-27によれば、トウモロコシからのフェルラ酸についてのδ１３Ｃ値の範囲は、約−１６〜−１９‰である）。
【００１７】
本開示のさらなる態様によれば、（約−２５〜約−３２‰の）δ１３Ｃ値の範囲を有するバニリン材料が得られ、これは、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンから選択される天然植物ソースから得られたバニリンについてのδ１３Ｃ値とは異なる（Cochennec C Perfumer &Flavourist (2013) 38; 20-27によれば、コメからのバニリンについてのδ１３Ｃ値の範囲は、約−３８〜−３５‰である）。
【００１８】
また、生物変換されたオイゲノールから得ることができるフェルラ酸生成物が提供され、これは、その（約−２５〜約−３２‰の）δ１３Ｃ値の範囲に関して既知のフェルラ酸生成物（例えば、限定されないが、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンを含むＣ３、Ｃ４およびＣＡＭ植物からのもの）とは異なり、そのδ１３Ｃ値の範囲がさらなるＤ−ＮＭＲ値測定に関して考慮される場合（例えばそのδ１３Ｃ値が単独でまたはＤ−ＮＭＲ値測定と組み合わせて測定される場合など）に、既知の人工的におよび／または合成により誘導されたフェルラ酸生成物（例えばリグニンおよび／またはグアヤコールからのもの）と異なる。
【００１９】
また、生物変換されたオイゲノールから得ることができるバニリン生成物が提供され、これは、その（約−２５〜約−３２‰の）δ１３Ｃ値の範囲に関して既知のバニリン生成物（例えば、限定されないが、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンを含むＣ３、Ｃ４およびＣＡＭ植物からのもの）とは異なり、そのδ１３Ｃ値の範囲がさらなるＤ−ＮＭＲ値測定に関して考慮される場合（例えばそのδ１３Ｃ値が単独でまたはＤ−ＮＭＲ値測定と組み合わせて測定される場合など）に、既知の人工的におよび／または合成により誘導されたフェルラ酸生成物（例えばリグニンおよび／またはグアヤコールからのもの）と異なる。
【００２０】
図面の簡単な説明
本開示のよりよい理解のために、添付の図面を参照することができ、図面においては以下のとおりである：
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、オイゲノールからフェルラ酸へ、そしてバニリンへの既知のおよび新規の酵素経路を説明する模式図である；
【００２２】
【図２】図２は、CgVaoA-pETDuetコンストラクトの模式図を提供する；
【００２３】
【図３】図３は、MtSADrbsAtADH-pRSFDuetコンストラクトの模式図を提供する；
【００２４】
【図４】図４は、E. coliにおけるMtSAD1のタンパク質発現を示すゲルの写真である。矢印はMtSAD1タンパク質を示す；
【００２５】
【図５Ａ】図５Ａは、MtSAD1の遺伝子産物によるコニフェリルアルコールの生物変換を示すクロマトグラムである；
【図５Ｂ】図５Ｂは、MtSAD1の遺伝子産物によるコニフェリルアルコールの生物変換を示すクロマトグラムである；
【００２６】
【図６】図６は、MtSAD1およびAtADHの遺伝子産物を含むE. coliにおけるコニフェリルアルコールのフェルラ酸への生物変換を示すクロマトグラムである；
【００２７】
【図７】図７は、M9A培地中でのE. coliにおけるオイゲノールによるフェルラ酸のin vivo生成を示す線グラフである；
【００２８】
【図８】図８は、オイゲノールから調製されたフェルラ酸によるバニリンの生成を示す線グラフである；
【００２９】
【図９】図９は、LB培地中では低効率であるがM9A培地中では相対的により高い効率で（なぜならば、全ての添加されたフェルラ酸が、生物変換条件を用いて１１時間内にバニリンへと生物変換されたので）フェルラ酸（青色（上）矢印）をバニリン（赤色（下）矢印）へと生物変換するechおよびfcs遺伝子を含む組み換えE. coli株を示すクロマトグラムである；
【００３０】
【図１０】図１０は、M9A培地中でのバニリン生成のHPLC分析を示すクロマトグラムであり、ここで、全ての添加されたフェルラ酸が、生物変換条件を用いて１１時間以内にバニリンに変換される；
【００３１】
【図１１】図１１は、多様なバニリン試料：合成バニリン（橙色のｘのもの）、ex-フェノール／グアヤコール、（緑色のｘのもの）、ex-フェルラ酸（紫色の塗りつぶした三角形）、ex-クローブ（青色の塗りつぶしていない三角形）、ex-マダガスカルビーン（青色の塗りつぶしていない正方形）、ex-リグニン（紫色の塗りつぶしていない円）のＤ−ＮＭＲの結果を示すデータグラフである；ならびに
【００３２】
【図１２】図１２は、オイゲノールのバニリンへの生体内変換、ならびにバニリンのバニリン酸およびプロトカテク酸アルデヒドへのさらなる変換のための模式的経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示の詳細な説明
本開示は、オイゲノールのフェルラ酸への生物変換、およびその後のバニリンへのさらなる変換を通してフェルラ酸を製造するための方法を提供する。生物変換は、Escherichia coli細菌などの細胞系において媒介することができる。
【００３４】
本開示の一態様は、フェルラ酸を製造する生物変換方法であって、該方法は、細胞系においてVaoA遺伝子を発現させること、細胞系においてMtSAD1遺伝子を発現させること、細胞を培地中で増殖させること、細菌にオイゲノールを供給すること、細菌をインキュベートすること、ならびにフェルラ酸を収集することを含む。２つの前述の遺伝子の発現は、フェルラ酸を製造する方法を提供する。他の遺伝子の発現は、当該方法を増強するためにのみ役立つ。生物変換方法は、細胞系におけるAtADH遺伝子のさらなる発現を含んでもよい。AtADHの発現は、フェルラ酸を製造するための生物変換経路を増強する。生物変換経路を増強するために、細胞系においてcalA遺伝子をさらに発現させてもよい。同様に、同じまたは類似の生合成経路を増強する目的のために、細胞系においてcalB遺伝子をさらに発現させてもよい。細胞系は、フェルラ酸の蓄積を促進することができる任意の数の細胞系であってよい。一態様は、E. coliなどの細菌に基づく細胞系を用いる。別の態様は、Amycolatopsisに基づく細胞系を利用する。さらなる態様は、酵母に基づく細胞系を利用する。発現されたMtSAD1は、アミノ酸配列番号１またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントに基づく。代替的態様において、発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸に基づく。あるいは、発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸に基づく。さらに、一態様において、発現されたMtSAD1は、E. coliから発現されるアミノ酸配列に基づく。
【００３５】
用語「生物変換」は、本明細書において用いられる場合、例えば細胞培養中の宿主細胞（特に微生物宿主細胞）中でのin vivo生成による、生成物の生成であって、この細胞による生成が、任意に、さらなる生合成生成ステップ（例えば先のものとは異なる宿主細胞中での）と、および／または、例えばin vitro反応による、化学合成の反応と組み合わせることができるものを、特に指すであろう。用語「生物変換」は、明細書を通して、用語「生体内変換」および／または「生合成」または「生合成的な」と、交換可能に用いられる。
【００３６】
用語「バニリル−アルコールオキシダーゼ（VaoA）」とは、本明細書において用いられる場合、Penicillium simplicissimumからの、広範なパラ置換化合物に対して活性な共有結合性フラボタンパク質を指す。VaoAは、オイゲノールを含む４−アルキルフェノール類の酸化を触媒する。VaoA酵素（EC 1.1.3.38）はまた、宿主細胞において発現されて、任意の形態のバニリルアルコールをバニリンへと酸化することができる。VaoA酵素は、当該分野において公知であり、限定されないが、Fusarium onilifomis（GENBANK受入番号AFJ11909）およびPenicillium simplicissium（GENBANK受入番号P56216; Benen, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:7865-72）などの糸状菌、ならびにModestobacter marinus（GENBANK受入番号YP_006366868）、Rhodococcus jostii（GENBANK受入番号YPJ703243.1）およびR. opacus（GENBANK受入番号EHI39392）などの細菌からの酵素が挙げられる。Penicillium simplicissimumからのVaoAのcDNAはまた、国立生物工学情報センター（GenBank）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、参照Y15627により入手可能である。VaoA ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号６および配列番号５として提供される。
【００３７】
本開示の方法は、二機能性であることが発見された、植物であるタルウマゴヤシから誘導されたMtSAD1のデヒドロゲナーゼ遺伝子産物を利用する。本質的には、MtSAD1は、calAおよびcalBの遺伝子産物の両方の活性を有する。したがって、MtSAD1は、calAおよびcalBの発現産物を置換することができ、それにより、潜在的に、オイゲノールからのフェルラ酸の生成のためのより効率的な生物変換／生合成経路が可能となる。したがって、VaoAおよびMtSAD1からの遺伝子産物は、オイゲノールをフェルラ酸に生物変換することができる。MtSAD1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、は、本明細書において、それぞれ配列番号２および配列番号１として提供される。
【００３８】
オイゲノールは、そのIUPAC名：４−アリル−２−メトキシフェノールにより知られる。それはフェニルプロペン、アリル鎖で置換されたグアヤコールである。オイゲノールは、クローブ樹木であるSyzygium aromaticumのエッセンシャルオイルから工業スケールで単離することができる、相対的に安価な天然基質である。オイゲノールおよびイソオイゲノールは、フェニルプロペン、アリル鎖で置換されたグアヤコールである。オイゲノールは、フェニルプロパノイドのクラスの化学化合物のメンバーである。それは、特定のエッセンシャルオイルから、特にクローブ油、ナツメグ、シナモン、バジルおよび月桂樹から抽出される、透明から淡黄色の油性の液体である。それは、僅かに水溶性であり、有機溶媒中で可溶性である。それは、ピリッとしたクローブ様の芳香を有する。それは、クローブ芽油中に８０〜９０％、クローブ葉油中に８２〜８８％の濃度で存在する。
【００３９】
フェルラ酸は、化学的にはそのIUPAC名（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）プロプ−２−エン酸により知られる。それはまた、フェルラート（Ferulate）、コニフェル酸（Coniferic acid）およびトランス−フェルラ酸（Ｅ）−フェルラ酸としても知られる。フェルラ酸は、有機化合物の一種であるヒドロキシ桂皮酸である。それは、共有結合性側鎖としてアラビノキシランなどの植物細胞壁成分中に見出される豊富なフェノール性植物化学物質である。それは、トランス−桂皮酸に関連する。リグニンの成分として、フェルラ酸は、他の芳香族化合物の製造における前駆体である。
【００４０】
AtADHは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH2C4）である。AtADHのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（GenBank）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）において、参照NM_113359.3により入手可能である。AtADHのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書において、それぞれ配列番号４および配列番号３として提供される。
【００４１】
CalA（EC 1.1.1.194）として知られるコニフェリル−アルコールデヒドロゲナーゼは、化学反応：
【化１】
0006596009.tif 000002
を触媒する酵素である。したがって、この酵素の２つの基質は、コニフェリルアルコールおよびＮＡＤＰ＋であり、一方、その３つの生成物は、コニフェリルアルデヒド、ＮＡＤＰＨおよびＨ＋である。この酵素は、酸化還元酵素のファミリー、特にドナーのＣＨ−ＯＨ基に対してＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をアクセプターとして作用するものに属する。この酵素クラスの系統名は、コニフェリル−アルコール：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素である。この酵素はまたＣＡＤとも称される。コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、国立生物工学情報センター（GenBank）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）において参照A92130により入手可能である。コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（CalA）についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はまた、EP0845532, US2002/0182697A1およびUS6524831B2においても開示される。
【００４２】
CalB（EC 1.2.1.68）として知られるコニフェリル−アルデヒドデヒドロゲナーゼは、化学反応：
【化２】
0006596009.tif 000003
を触媒する酵素である。この酵素の４つの基質は、コニフェリルアルデヒド、Ｈ２Ｏ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋であり、一方、その４つの生成物は、フェルラート、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびＨ＋である。この酵素は、酸化還元酵素のファミリー、特にドナーのアルデヒドまたはオキソ基に対してＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をアクセプターとして作用するものに属する。この酵素クラスの系統名は、コニフェリルアルデヒド：ＮＡＤ（Ｐ）＋酸化還元酵素である（Achterholt S, Priefert H, Steinbuchel A (1998).「Purification and characterization of the coniferyl aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas sp.Strain HR199 and molecular characterization of the gene」、J. Bacteriol. 180 (17): 4387-91. PMC 107445. PMID 9721273を参照）。コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（GenBank）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）において参照AJ006231により入手可能である。コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（CalB）についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はまた、EP0845532, US2002/0182697A1およびUS6524831B2においても開示される。
【００４３】
用語「遺伝子」とは、本明細書において用いられる場合、特に本開示の核酸分子またはポリヌクレオチドを指すであろう。これは、DNA、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、またはRNAであってよく、二本鎖または一本鎖であってよく、センスおよび／またはアンチセンス鎖であってよい。用語「遺伝子」は、特に、本明細書において用いられる場合、例えば全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは部分としてのポリヌクレオチドであって、酵素（例えば代謝経路の酵素）活性を有するポリペプチドをコードするもの、またはそれぞれそのフラグメントもしくは部分に適用される。
【００４４】
用語はまた、対応するゲノムDNAがイントロンを有し、したがって異なる配列を有する、cDNA；フランキング遺伝子の少なくとも一方を欠失するゲノムフラグメント；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生成され、フランキング遺伝子の少なくとも一方を欠失するｃDNAまたはゲノムDNAのフラグメント；フランキング遺伝子の少なくとも一方を欠失する制限酵素切断フラグメント；融合タンパク質、ムテイン、または所与のタンパク質のフラグメントなどの天然に存在しないタンパク質をコードするDNA；ならびにcDNAまたは天然に存在する核酸の縮重バリアントである核酸などの別個の分子を含む。さらに、それは、ハイブリッド遺伝子、すなわち、天然に存在しない融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
リボ核酸（RNA）分子は、in vitroでの転写により生成することができる。これらの分子のセグメントもまた、本開示の範囲内と考えられ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生成するか、または１もしくは２以上の制限エンドヌクレアーゼによる処理により生成することができる。核酸分子のセグメントは、遺伝子のDNAフラグメント、特に部分的な遺伝子のものとして言及されてもよい。フラグメントはまた、いくつかのオープンリーディングフレーム（ORF）、同じORFまたは異なるORFのいずれかの繰り返し、を含んでもよい。当該用語は特にコードヌクレオチド配列を指すであろうが、また、非コードである、例えば転写されないかもしくは翻訳されない配列、またはポリペプチドを完全にまたは部分的にコードするヌクレオチド配列をも含むであろう。本明細書において、例えば会合、多様化または組み換えのために用いられる遺伝子は、非コード配列、またはポリペプチドをコードする配列もしくはタンパク質をコードする配列、または首尾よい組み換えイベントのために十分な配列長さを有するそれらの部分もしくはフラグメントであってよい。より具体的には、前記遺伝子は、３ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐの最少の長さを有する。
【００４６】
単離されたDNAへの言及は、例えばcDNAまたはゲノムDNAのライブラリーまたはゲノムDNA制限酵素消化物中の、例えば制限酵素消化反応混合物または電気泳動ゲルスライス中の、何百から何百万もの他のDNA分子中に存在するDNAを意味しないことは、前記から明らかであろう。用語「単離された」ポリペプチドまたはペプチドフラグメントとは、本明細書において用いられる場合、天然に存在するカウンターパートを有しないか、または天然で（例えば植物中で）それに付随する成分から分離もしくは精製されているポリペプチドまたはペプチドフラグメントを指す。さらに、本開示の単離された核酸分子は、天然の状態においてはそれ自体としては見出されないセグメントを包含する。
【００４７】
本開示の単離されたポリペプチド（またはペプチドフラグメント）は、例えば天然のソースから（例えば植物ソースから）の抽出により；ポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により；または化学合成により、得ることができる。それが天然で起源とするソースとは異なる細胞系において生成されるポリペプチドは、天然ではそれに付随する成分を必然的に含まないであろうことから、「単離され」ている。単離の程度または純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析により、測定することができる。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、用語「組み換えDNA」とは、以下のいずれかである：（１）いかなる天然に存在する配列とも同一でない配列を含むDNA、天然に存在しない（例えば、２つの本来では分離された配列のセグメントの、ヒトの介入を通しての人工の組み合わせ（例えば単離された核酸のセグメントの、例えば遺伝子工学技術による、人工の操作）により作成された）ポリヌクレオチドまたは核酸の配列、または（２）天然に存在する配列を有するDNA（例えばcDNAまたはゲノムDNA）に関して、生物のゲノム中の目的のDNAを含む遺伝子を挟む遺伝子のうちの少なくとも１つを含まないDNAであって、ここで、目的のDNAを含む遺伝子は天然に存在する。
【００４９】
用語「組み換えDNA」とは、本明細書において、特に核酸配列に関して用いられる場合はまた、組み換えDNA技術により生成された核酸またはポリヌクレオチド、例えば、任意に宿主細胞中に組み込まれる宿主細胞にとって異種のポリヌクレオチドを含むDNAコンストラクトを指すであろう。キメラヌクレオチド配列は、特に、組み換え分子として生成することができる。用語「組み換え」は、特に、交差または遺伝子モザイクを達成するための組み換えにより、またはこれによらずに、ポリヌクレオチドまたはその部分を一緒に結合する、ポリヌクレオチドの会合に適用されるであろう。例えば、それは、所望される機能の核酸セグメントを一緒に結合して所望される機能の組み合わせを作製するために行われる。本明細書において記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、当該ポリペプチドを発現させるために好適な１以上の調節領域にセンス方向において作動的に連結された、そのポリペプチドについてのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロン性mRNAから複数の遺伝子産物を発現することができるので、所望される場合は、それらの微生物のための単一の調節領域の制御下において、複数のポリペプチドを発現させることができる。コード配列と調節領域とは、調節領域とコード配列とが、当該調節領域が、配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように配置される場合に、作動的に連結されると考えられる。
【００５０】
用語「組み換え」とは、本明細書において、特に酵素に関して用いられる場合、組み換えDNA技術により生成された、すなわち、所望される酵素をコードする外来DNAコンストラクトにより形質転換された細胞から生成された酵素を指すであろう。「合成」酵素とは、化学合成により調製されたものである。キメラ酵素は、特に、組み換え分子として生成することができる。用語「組み換えDNA」は、したがって、ベクター中に、自己複製プラスミドまたはウイルス中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に（または類似の細胞のゲノムに、天然の染色体位置とは異なる位置において）組み込まれた組み換えDNAを含む。
【００５１】
本開示のさらなる側面は、本開示のポリヌクレオチドまたは本開示のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含むベクターである。用語「ベクター」とは、細胞中に導入されることができるか、または、細胞中に含まれるタンパク質および／または核酸に導入することができる、タンパク質またはポリヌクレオチドまたはそれらの混合物を指す。導入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、ベクターの導入の後で、細胞内で発現されることが好ましい。多様な遺伝子基質をプラスミド中に導入することができる。プラスミドは、しばしば、標準的なクローニングベクター、例えば細菌のマルチコピープラスミドである。基質は、同じプラスミド中に導入しても、異なるプラスミド中に導入してもよい。しばしば、少なくとも２つの型のベクターを含む細胞の選択を可能にするために、異なる型の選択可能なマーカーを有する少なくとも２つの異なる型のプラスミドを用いる。
好ましい態様において、本開示のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工哺乳動物染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、合成核酸配列またはカセットを含み、サブセットは、直鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミド、合成または人工の染色体、例えば植物、細菌、哺乳動物または酵母の人工染色体の形態において生成することができる。
【００５２】
用語「組み換え宿主」はまた、「遺伝子改変された宿主細胞」としても言及され、異種核酸を含む宿主細胞を表す。
【００５３】
さらなる側面において、本開示の核酸分子は、発現制御配列に作動的に連結され、これが原核生物および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする。上で言及される転写／翻訳調節エレメントとして、限定されないが、誘導性または非誘導性の、構成的な、細胞周期により調節されるか、代謝的に調節される、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー、および当業者に公知であり、遺伝子発現を駆動するかまたは他に調節する他のエレメントが挙げられる。かかる調節エレメントとして、限定されないが、例えばtet-onまたはtet-off系、lac系、trp系の調節エレメントにおいて使用される、例えばCUP-1プロモーター、tet-リプレッサーのような、構成的発現を指揮するかまたは誘導性発現を可能にする調節エレメントが挙げられる。例として、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（IPTG）は１００μＭ〜１．０ｍＭの濃度範囲においてタンパク質発現の効果的な誘導因子である。この化合物は、lacオペロンの転写を引き起こすラクトース代謝物であるアロラクトース（allolactose）の分子模倣物であり、したがって、遺伝子がlacオペレーターの制御下にある場合に、タンパク質発現を誘導するために用いられる。タンパク質発現を誘導する調節エレメントの別の例は、ラクトースである。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、「作動的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子コンストラクト中に組み込まれることを意味する。
【００５５】
同様に、本開示の核酸分子は、さらなるポリペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分を形成することができる。マーカーおよびレポーター遺伝子の例として、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deammase：ADA）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、lacZ（ベータ−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）が挙げられる。本開示の実施に関連する標準的な手順の多くと同様に、当業者は、さらなる有用な試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列を知っているであろう。
【００５６】
本開示の別の側面は、上で概略されるポリヌクレオチドまたはベクターにより遺伝子操作された宿主細胞である。本開示の目的のために用いることができる宿主細胞として、限定されないが、細菌（例えば、E. coliおよびB. subtilis）などの原核生物細胞であって、例えば本開示のポリヌクレオチド分子を含む組み換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換することができるもの；酵母（例えば、SaccharomycesおよびPichia）のような簡単な真核生物細胞であって、例えば本開示のポリヌクレオチド分子を含む組み換え酵母発現ベクターにより形質転換することができるものが挙げられる。本開示のポリヌクレオチドを導入するために用いられる宿主細胞およびそれぞれのベクターに依存して、ポリヌクレオチドは、例えば染色体またはミトコンドリアDNA中に組み込まれても、例えばエピソームなどの染色体外に維持されても、または一過性のみで細胞中に含まれてもよい。
【００５７】
当該分野において周知であるように、以下のヌクレオチド配列の任意の１以上により、細胞をトランスフェクトすることができる。in vivoでの組み換えのために、ゲノムまたは他の遺伝子と組み換えされるべき遺伝子を、標準的なトランスフェクション技術を用いて宿主をトランスフェクトするために用いる。好適な態様において、複製起点を提供するDNAをコンストラクト中に含める。複製起点は、当業者により好適に選択され得る。遺伝子の性質に依存して、配列が、それら自体が複製起点として作動可能である遺伝子またはゲノムと共に既に存在する場合は、追加の複製起点がを必要としない場合がある。
【００５８】
外来性または異種性のDNAにより、かかるDNAが細胞内に導入された場合に、細胞を形質転換することができる。形質転換DNAは、組み込まれても組み込まれなくても、すなわち細胞のゲノム中に共有結合してもしなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞においては、形質転換DNAは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、形質転換DNAが、それが染色体の複製を通して娘細胞により受け継がれるように、染色体中に組み込まれたものである。この安定性は、真核生物細胞が形質転換DNAを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを確立することができる能力により、実証される。
【００５９】
本開示はまた、組み換え宿主に注目する。本明細書において用いられる場合、用語、組み換え宿主とは、そのゲノムが少なくとも１つの組み込まれたDNA配列により増補されている宿主を指すことを意図する。かかるDNA配列として、限定されないが、天然に存在しない遺伝子、通常はRNAに転写されないかまたはタンパク質に翻訳（「発現」）されないDNA配列、および非組み換え宿主中に導入することが所望される他の遺伝子もしくはDNA配列が挙げられる。典型的には、本明細書において記載される組み換え宿主のゲノムは、１以上の組み換え遺伝子の安定な導入を通して増補されることが理解されるであろう。しかしながら、自律的または伴複製的なプラスミドまたはベクターもまた、本開示の範囲内において用いることができる。さらに、本開示は、低コピー数、例えば単一コピー、または高コピー数（本明細書において例示されるように）のプラスミドまたはベクターを用いて実施することができる。
【００６０】
一般に、導入されたDNAは、当該DNAのレシピエントである宿主中には元々は存在しないが、所与の宿主からDNAセグメントを単離すること、およびその後に、例えば遺伝子の生成物の産生を増強するために、または遺伝子の発現パターンを改変するために、そのDNAの１以上のさらなるコピーを同じ宿主中に導入することは、本開示の範囲内である。いくつかの例において、導入されたDNAは、例えば相同組み換えまたは部位特異的変異誘発により、内在性の遺伝子またはDNA配列を改変するか、またはこれを置き換えることすらある。好適な組み換え宿主として、微生物、植物細胞および植物が挙げられる。
【００６１】
本明細書において、特に遺伝子工学および１もしくは２以上の遺伝子もしくは会合した遺伝子のクラスターを細胞中へ導入することに関して用いられる、用語「細胞」または産生細胞とは、任意の原核生物または真核生物細胞を指すことが理解される。原核生物および真核生物宿主細胞は、いずれも、本開示による使用のために企図され、E. coliまたはBacillus sp.のような細菌宿主細胞、S. cerevisiaeなどの酵母宿主細胞、Spodooptera frugiperdaなどの昆虫宿主細胞、またはHeLaおよびJurkatなどのヒト宿主細胞を含む。
【００６２】
特に、細胞は、真核生物細胞、好ましくは真菌、哺乳動物もしくは植物細胞、または原核生物細胞である。好適な真核生物細胞として、例えば、限定することなく、哺乳動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Sf9を含む）、両生類細胞（メラノフォア細胞を含む）、またはCaenorhabditis属（Caenorhabditis elegansを含む）の細胞を含む線虫（worm）細胞が挙げられる。好適な哺乳動物細胞として、例えば、限定することなく、COS細胞（Cos-1およびCos-7を含む）、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293 T-RexTM細胞、または他のトランスフェクト可能な真核生物細胞株が挙げられる。好適な細菌細胞として、限定することなくE. coliが挙げられる。
【００６３】
好ましくは、E. coli、Bacillus、Streptomycesなどの原核生物、HeLa細胞もしくはJurkat細胞のような哺乳動物細胞、またはシロイヌナズナなどの植物細胞を用いることができる。
【００６４】
好ましくは、細胞は、Aspergillus sp.または真菌細胞であり、好ましくは、属Saccharomyces、Candida、Kluyveromyces、Hansenula、Schizosaccaromyces、Yarrowia、PichiaおよびAspergillusからなる群より選択することができる。
【００６５】
好ましくは、E.coli宿主細胞は、工業および規制の当局により認識されるE.coli 宿主細胞であるE.coli 宿主細胞である（限定されないが、E.coli K12宿主細胞を含む）。
【００６６】
本開示により使用するための１つの好ましい宿主細胞は、E. coliであり、これは本明細書において記載されるとおり、組み換えにより調製することができる。したがって、組み換え宿主はE. coliであってよい。E. coliについて利用可能な変異体、プラスミド、詳細なコンピューター代謝モデルおよび他の情報のライブラリーが存在し、これにより、生成物の収率を増強するための多様なモジュールの合理的な設計が可能になる。組み換えE. coli微生物を作製するために、Saccharomycesについての上記のものと類似の方法を用いてもよい。
【００６７】
一態様において、組み換えE. coli微生物は、VaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子、または、限定されないが、そのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む、その機能的等価物／ホモロジーを含む。
【００６８】
好ましくは、組み換えE. coli微生物は、図２において提供されるとおり、CgVaoA-pETDuetコンストラクトを含む。
【００６９】
好ましくは、組み換えE. coli微生物は、図３において提供されるとおり、MtSADrbsAtADH-pRSFDuetコンストラクトを含む。
【００７０】
好ましくは、組み換えE.coli株は、オイゲノールをフェルラ酸に生物変換するプラスミドCgVaoA-pETDuetおよびMtSADrbsAtADH-pRSFDuetの両方を含む。
【００７１】
別の好ましい態様において、組み換えE.coli微生物は、echおよびfcs遺伝子、または、限定されないが、そのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む、その機能的等価物／ホモロジーを含む。
【００７２】
本開示により使用するための別の好ましい宿主細胞は、S. cerevisiaeであり、これは、合成生物学において広範に用いられるシャーシ・オーガニズム（chassis organism）である。したがって、組み換え宿主は、S. cerevisiaeであってよい。S. cerevisiaeについて利用可能な変異体、プラスミド、詳細なコンピューター代謝モデルおよび他の情報のライブラリーが存在し、これにより、生成物の収率を増強するための多様なモジュールの合理的な設計が可能になる。組み換えS. cerevisiae微生物を作製するための方法は公知である。
【００７３】
Saccharomyces cerevisiaeの組み換え株を用いるオイゲノールの変換によるフェルラ酸およびコニフェリルアルコールの生成は、Lambert et al (2013) Flavour and Fragrance Journal DOI 10.1002/ffj.3173において開示されている（例えば、US8344119Bおよび／またはEP2126059を参照）。
【００７４】
用語「細胞」は、特に、単一の細胞、または細胞株などの細胞培養中で培養された細胞を含むであろう。
【００７５】
用語「産生細胞」とは、本明細書において用いられる場合、特に、産生方法または生合成の産物、例えば代謝経路の産物を産生するように、組み換えにより操作された細胞を指すであろう。
【００７６】
所望される生物変換の産物を産生するクローンを選択した後で、産物は、典型的には、産生宿主細胞株により、ラージスケールで、好適な発現系および発酵により、例えば細胞培養中での微生物による産生により、産生される。
【００７７】
用語「細胞株」とは、本明細書において用いられる場合、長期間にわたり増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞株」とは、ポリペプチドまたはかかるポリペプチドにより媒介される細胞代謝物を産生するように、内在または組み換え遺伝子または代謝経路の産物を操作するかおよび／またはこれを発現させるために用いられる細胞株を指す。「産生宿主細胞株」または「産生細胞株」は、産生方法または生合成の産物、例えば代謝経路の産物を得るために、バイオリアクター中での培養のためにすぐ使用できる細胞株であるものと一般的に理解される。
【００７８】
あるいは、以下の酵素VAO、MtSAD1、AtADA、CalA、CalB、FCSおよびECHの任意の１以上を、安定発現系または一過性発現系を用いて発現させてもよい。安定な細胞株の作製は、周知である。
【００７９】
本明細書において記載される組み換え宿主微生物は、フェルラ酸／バニリンを生成する方法において用いることができる。例えば、組み換え宿主が微生物である場合、方法は、培養培地中で、フェルラ酸および／またはバニリン生合成遺伝子が発現される条件下において、組み換え微生物を増殖させることを含んでもよい。
【００８０】
組み換え微生物は、回分、流加回分、または持続的方法、あるいはこれらの組み合わせにおいて増殖させることができる。典型的には、組み換え微生物は、発酵槽中で、規定の温度で、好適な栄養源、例えば炭素源の存在下において、オイゲノールをフェルラ酸／バニリンに生物変換するために、および所望される量のフェルラ酸および／またはバニリンを生成するために所望される期間にわたり、増殖させる。
【００８１】
組み換え宿主細胞微生物は、その後の生物変換ステップのために好適な細胞を提供するために、多数の方法において培養することができる。培養は、かかる細胞がその後の生物変換ステップのために用いられる予定である場合には全ての場合において、生細胞を生じる条件下において行われる。生物変換ステップのために適用可能な微生物は広範に変化し得るので（例えば、酵母、細菌および真菌）、培養条件は、無論、各々の種の特異的な必要条件に対して調整しなければならず、これらの条件は周知であり、文書化されている。本開示のその後の生物変換ステップにおいて利用可能な細胞を作製するために、組み換え宿主細胞微生物の細胞を増殖させるための当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。
【００８２】
細胞の培養は、従来の様式において行う。培養培地は、炭素源、少なくとも１の窒素源および無機塩を含み、酵母抽出物をそれに添加する。この培地の構成要素は、問題の微生物の種を培養するために従来から用いられているものであり得る。
【００８３】
本方法において使用される炭素源として、組み換え宿主細胞により代謝されて、増殖ならびに／またはバニリンおよび／もしくはバニリングルコシドの産生を促進することができる、任意の分子が挙げられる。好適な炭素源の例として、限定されないが、スクロース（例えば糖蜜中に見出されるもの）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコース含有ポリマーが挙げられる。
【００８４】
酵母を宿主として用いる態様においては、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロールおよびグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は、培養期間全体にわたり宿主生物に提供してもよく、あるいは、生物を、一定の期間にわたり別のエネルギー源（例えばタンパク質）の存在下において増殖させて、次いで、流加回分期の間のみ炭素源を提供できる。
【００８５】
本開示における使用のための組み換え宿主細胞微生物の好適性は、簡単な試験手順により周知の方法を用いて決定することができる。例えば、試験されるべき微生物を、富栄養培地（例えば、LB培地、Bacto-トリプトン酵母抽出物培地、栄養培地など）中で、微生物の増殖のために一般的に用いられるｐＨ、温度および通気条件下において増殖させることができる。細胞は、遠心分離または濾過により収集し、同化可能な炭素源を含まない同一の無菌培地で洗浄する。
【００８６】
洗浄した細胞を、０．１％のオイゲノールおよび０．１％のグルコースを含む最少培地（例えば、Mandels培地、MCGC培地、YNB培地）中で懸濁し、混合物を、通気しながら、または通気せずに（好ましくは約２００ｒｐｍでの振とうにより通気しながら）、３０℃でインキュベートする。１２時間間隔でインキュベーション混合物から上清のアリコートを採取し、フェルラ酸についてHPLCにより分析する。フェルラ酸の存在は、フェルラ酸へのオイゲノール変換の指標である。
【００８７】
本開示の一態様において、M9Aなどの規定の最少培地を細胞培養のために用いる。
【００８８】
M9A培地の成分は、以下を含む：１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのグルコースおよび１．２５ｇ／Ｌの酵母抽出物）。
【００８９】
一態様において、用いられる培地組成物がM9Aであったとき、特にフェルラ酸のバニリン酸への生物変換に関して、生物変換の促進が観察される。
【００９０】
本開示の別の態様において、LB（Luria-Bertani）などの富栄養培地を用いた。LBの成分は、以下を含む：１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）。
【００９１】
本開示の別の態様において、グルコース酵母抽出物（GYE）培地を用いる。TSB培地の成分は、以下を含む：酵母抽出物、８ｇ／Ｌ；グルコース、３０ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌ；ならびにＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ。
【００９２】
無機培地およびM9無機培地の他の例は、例えばUS 6524831B2およびUS 2003/0092143A1において開示される。
【００９３】
生物変換ステップを行うために、オイゲノールおよび細胞培養培地を含む水溶液を、組み換え宿主細胞微生物と接触させて、生物変換混合物を形成し、これを、オイゲノールのフェルラ酸への変換を促進するために必要なｐＨ、温度および撹拌の条件下に維持する。
【００９４】
用語「混合物」は、本開示において、用語「培地」と交換可能に用いられる。
【００９５】
生物変換混合物がまた、微生物の生存能を促進するために必要な他の物質、例えば無機塩、バッファー、補助因子、栄養物質などを含むことが、非常に好ましい。フェルラ酸を分解する微生物の生存能の維持のための一般的な必要条件は、周知である。特定の微生物の生存能を維持するための特異的な必要条件もまた、文献においてよく文書化されており、または、そうでない場合は、技術を有する微生物学者により容易に決定される。好ましくは、生物変換混合物を形成するために用いられる溶液は、Mandels培地またはMCGC培地などの最少培地からなり、これに、オイゲノールおよび組み換え宿主細胞微生物を添加する。
【００９６】
混合物を、次いで、フェルラ酸および／またはバニリンの産生を促進するために必要なｐＨおよび温度に維持する。好ましいｐＨは、約ｐＨ３〜約ｐＨ７であり、好ましい温度は、約２０℃〜約４０℃である。さらに、生物変換混合物が、例えばグルコース、スクロース、フルクトース、マルトースなどの、組み換え宿主細胞微生物のために同化可能な炭素源を含むことが非常に好ましい。生物変換混合物中での同化可能な炭素源の使用は、フェルラ酸および／またはバニリンの収率を実質的に増大する。最も好ましい炭素源はグルコースである。
【００９７】
細胞の生存能を維持するための条件は、生物変換ステップ全体にわたり維持されなければならないが、活発な細胞増殖が起こる必要はない。実際には、このステップのために、組み換え宿主細胞が静止期にあることが好ましい。また、生物変換ステップの間に混合物中で還元条件が維持されることが好ましい。絶対的な嫌気条件は推奨されないが、バニリンの酸化を防ぐために、ｐＨが約６．０より高い場合は特に、撹拌（stiring／agitation）を通しての生物変換混合物中への酸素の組み込みは最小化されることが好ましい。また無論、生物変換ステップを、不活性雰囲気下において、例えば窒素ブランケット下において行うことにより、酸素を除外してもよい。
【００９８】
好ましくは、生体内変換／生物変換混合物は、培養培地として用いられる培地であって、好ましくは本明細書において記載される組み換え宿主細胞／微生物またはその変異体を含むものである。
【００９９】
よく制御されたバイオリアクター中で流加回分および持続培養のために用いられる培地組成物は、以下のとおりであった：
【０１００】
いくつかの態様において、フェルラ酸は、オイゲノールなどの前駆体分子を含む原材料を供給されるホールセルを用いて生成する。原材料は、細胞増殖の間または細胞増殖の後で供給することができる。ホールセルは、懸濁液中にあっても固定されていてもよい。ホールセルは、発酵ブロスまたは反応バッファー中であってよい。いくつかの態様において、基質の細胞中への効率的な輸送のために透過処理剤が必要とされる場合がある。
【０１０１】
本開示の生物変換方法は、オイゲノール源のバニリンへの最大の変換を提供するために、時間、温度、pH、栄養の型および濃度の条件、通気条件、メチオニン補充および限定されたグルコース濃度下で行われる。例１において詳細に記載されるとおり、好ましい態様において、流加回分発酵槽を用いてオイゲノール源をフェルラ酸に変換し、その後、フェルラ酸を有機抽出する（例えば、発酵ブロスを酸性化して有機溶媒で抽出する）か、またはｐＨの変化によりフェルラ酸を結晶化させ、有機溶媒抽出は用いない。流加回分発酵槽方法および有機抽出法は、当業者に公知である。オイゲノールは細胞にとって毒性であるので、細胞の完全性を維持して、反応を３６−４８−６４時間の期間にわたり持続させるために、オイゲノールは、３６−４８−６４時間の期間をかけてゆっくりと培養培地中に添加する。細胞が溶解した場合は、反応は停止し、収率は非常に低くなるであろう。したがって、オイゲノールは、任意の新たなオイゲノールを添加する前に変換が完了するように、繰り返し少量で添加する。宿主細胞は、可溶化したフェルラ酸を沈殿させるために有機溶媒を添加する前に、またはフェルラ酸を沈殿させるために酸（例えばＨＣｌ）を添加するまでに、培養培地から分離する。また、オイゲノールのフェルラ酸への変換率に影響を及ぼし得る正確なバイオマスを確実にするように注意する。
【０１０２】
多くのフェルラ酸前駆体出発材料により示される微生物にとっての一般的な毒性に起因して、生物変換混合物中でのかかるものの濃度を限定することが必要である場合がある。したがって、生体内変換の間の任意の所与の時間において、出発材料の濃度が限定されることが好ましい。これは特に、脂溶性である傾向がある前駆体（例えばオイゲノール）について真実であり、これは、例えばフェルラ酸などの、より高い水溶性およびより低い毒性を有するものとは対照的である。前駆体がバニリンに変換されるにつれてこれを置き換えるために、生物変換ステップの経過全体を通して、複数回の前駆体の添加を行ってもよい。
【０１０３】
好ましい態様において、生物変換混合物を、約３０℃〜約３７℃の温度、および約６．５〜約７．５のｐＨに維持する。生物変換混合物がまた、無機塩、バッファー、補助因子、栄養物質などの、組み換え微生物の生存能を促進するために必要な他の物質を含むことが好ましい。生物変換混合物は、好ましくは、定常状態の溶解酸素（ＤＯ）濃度に維持され、したがって、グルコースが限定された条件下に維持され、ここで、グルコース添加の速度は、溶解した酸素濃度のレベルにより決定される。微生物の生存能の維持のためのより一般的な必要条件は周知であり、特定の微生物の生存能を維持するための特異的な必要条件もまた、文献において文書化されることにより周知であり、またはそうでない場合は、当業者により容易に決定される。次いで、当該分野において公知の方法（例えば有機抽出）によりフェルラ酸を生物変換混合物から回収して、バニリンを産生する第２の組み換え宿主細胞と接触させることができる。
【０１０４】
組み換え微生物を培養中で所望される期間にわたり増殖させた後で、次いで、当該分野において公知の多様な技術、例えば抽出、減圧蒸留、および水溶液からの多段階再結晶化、および超遠心による単離および精製を用いて、フェルラ酸を回収することができる。例として、細胞から培養ブロスを分離して、それを、限定されないが酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出することにより、フェルラ酸を回収することができる。
【０１０５】
好ましくは、精製は、精製液中でのフェルラ酸の溶解、および溶解しなかった不純物からのその分離を含む。
【０１０６】
未精製の第１の材料は、溶液からの沈殿により、好ましくは結晶または大結晶状態で、得ることができる。溶液は、生物変換／生体内変換培地であっても、かかる培地から、例えば生体触媒（これは、ホールセル、細胞の部分、または固定された酵素であってよい）の除去、低温殺菌および濃縮などの１以上のステップにより誘導してもよい。生物変換／生体内変換培地は、一般に、通常はフェルラ酸のバニリンへの生体内変換によりバニリンを産生する生物変換／生体内変換方法からのものである。
【０１０７】
他の態様において、フェルラ酸を、組み換え宿主から抽出物として単離する。このことに関して、フェルラ酸を単離してもよいが、必ずしも均一になるまで精製しなくともよい。
【０１０８】
このことに関して、生物変換産物に関する用語「単離された」とは、それに付随する他の成分から分離または精製された生成物を意味する。
【０１０９】
典型的には、生物変換産物は、それが、乾燥重量により少なくとも７０％、それが関連しているタンパク質および他の材料を含まない場合に、「単離された」と考えられる。好ましくは、本開示の生物変換産物は、乾燥重量により少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％である。したがって、例えば、かかるフェルラ酸の調製物は、乾燥重量により少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％である。
【０１１０】
いくつかの態様において、フェルラ酸は、均一（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％または９８％純粋）になるまで単離および精製される。望ましくは、精製されるフェルラ酸の量は、約１ｍｇ／ｌ〜約２０，０００ｍｇ／Ｌ（２０ｇ／Ｌ）またはそれ以上であり得る。
【０１１１】
例えば約１〜約１００ｍｇ／Ｌ、約３０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約５０〜約２００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約２５０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００（１ｇ／ｌ）〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ（１５ｇ／ｌ）、または約２，０００（２ｇ／ｌ）〜約１０，０００ｍｇ／Ｌ（１０ｇ／ｌ）、または約２，０００（２ｇ／ｌ）〜約２５，０００ｍｇ／Ｌ（２５ｇ／ｌ）、または約２，０００（２ｇ／ｌ）〜約２５，０００ｍｇ／Ｌ（２５ｇ／ｌ）、２６，０００ｍｇ／Ｌ（２６ｇ／ｌ）、２７，０００ｍｇ／Ｌ（２７ｇ／ｌ）、２８，０００ｍｇ／Ｌ（２８ｇ／ｌ）、２９，０００ｍｇ／Ｌ（２９ｇ／ｌ）、３０，０００ｍｇ／Ｌ（３０ｇ／ｌ）のフェルラ酸を生成することができる。
【０１１２】
一般的に、より長い培養時間は、より多量の生成物をもたらすであろう。したがって、組み換え微生物は、１日間〜７日間、１日間〜５日間、１日間〜３日間、３日間〜５日間、約３日間、約４日間、または約５日間にわたり培養することができる。
【０１１３】
好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌの濃度のフェルラ酸が、４〜１２０時間の期間内に生成される。
【０１１４】
好ましくは約５〜６ｇ／ｌの濃度のフェルラ酸が、約４〜約２５時間の期間内に生成される。
【０１１５】
好ましくは約１５〜１６ｇ／ｌの濃度のフェルラ酸が、約４〜約４０時間の期間内に生成される。
【０１１６】
好ましくは約２５〜２７ｇ／ｌの濃度のフェルラ酸が、約４〜約７０時間の期間内に生成される。
【０１１７】
例２が示すとおり、本開示は、生体内変換／生物変換方法を３０Ｌの発酵容積（５０Ｌの発酵ビヒクル中）までスケールアップした場合に、６４時間のインキュベーションの後で回収されたフェルラ酸（２６ｇ／ｌ）を提供する。
【０１１８】
したがって、本開示は、フェルラ酸を製造するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）経済的に魅力的であり；（ｉｉ）環境に優しく；（ｉｉｉ）出発材料において豊富かつ相対的に安価な資源を利用し；ならびに（ｉｖ）高収率のフェルラ酸を提供するものである。
【０１１９】
E.coliの組み換え株中でオイゲノールをフェルラ酸に変換するための生物変換／生体内変換方法が開示される。
【０１２０】
好ましくは、組み換え宿主細胞微生物は、少なくとも３ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも４ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、６ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ、８ｇ／ｌ、９ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、１１ｇ／ｌ、１２ｇ／ｌ、１３ｇ／ｌ、１４ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ、１６ｇ／ｌ、１７ｇ／ｌ、１８ｇ／ｌ、１９ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、２１ｇ／ｌ、２２ｇ／ｌ、２３ｇ／ｌ、２４ｇ／ｌ、２５ｇ／ｌ、２６ｇ／ｌ、２７ｇ／ｌ、２８ｇ／ｌ、２９ｇ／ｌ、３０ｇ／ｌのフェルラ酸を含む培地を生成する。
【０１２１】
異なる微生物によるオイゲノール、イソオイゲノールからのフェルラ酸産生は、過去１０年間に研究された。オイゲノールは、フェルラ酸生成のための最も重要な原材料のうちの一つであり、クローブ樹木Syzygium aromaticumから抽出されたオイルの主要な構成要素である。EhyAB、CalAおよびcalB酵素により触媒される、オイゲノールエポキシド、オイゲノールジオール、コニフェリルアルコールおよびコニフェリルアルデヒドのような中間体を伴う、オイゲノールのフェルラ酸への生体内変換の機序を解明するために、多くの研究がおこなわれてきた。オイゲノールからフェルラ酸への経路（図１）は、Pseudomonas（HR199）の株において特徴づけられた（Rabenhorst J Arch Microbiol Biotechnol (1996) 46: 470-474）。反応は、オイゲノールヒドロキシラーゼ（ehyAおよびehyB遺伝子）、コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（calA）およびコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（calB）により、首尾よく触媒される（Priefert et al 1999 Arch Microbiol (1999) 172: 354-363）。Penicillium simplicissimumからのバニリルアルコールオキシダーゼ（VaoA）はまた、オイゲノールを酸化してコニフェリルアルコールを生成することができる（Overhage et al (2003) Appl and Environ Microbiol 69(11) 6569-6576）。
【０１２２】
シュードモナスに由来する遺伝子ehyABによりコードされるオイゲノールヒドロキシラーゼは、それぞれまたシュードモナスに由来するcalAおよびcalBによりコードされるコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼおよびコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼと共に、最初は、出願人により、細菌中でオイゲノールからフェルラ酸を生成するために利用された。
オイゲノールヒドロキシラーゼは、コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼおよびコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼと共に、オイゲノールのフェルラ酸への微生物変換において成功することを証明したが、方法を促進することができるより効果的な酵素が探索された。出願人はまた、バニリルアルコールオキシダーゼ（VaoA）をコードするPenicillium simplicissimumからのVaoA遺伝子は、オイゲノールのコニフェリルアルコールへの変換を触媒することができることを確認した。このVaoA酵素は、オイゲノールヒドロキシラーゼのフラボタンパク質サブユニットのアミノ酸配列と広範囲な相同の領域を共有する。コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼおよびコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼと組み合わされたバニリルアルコールオキシダーゼ（VaoA）は、オイゲノールのフェルラ酸への生物変換／生体内変換を促進する。
【０１２３】
Overhageら（2003 Appl and Env Microbiol 69(11) 6569-6576）は、Penicillum simplicissimum CBS 170.90のVaoA遺伝子ならびにPseudomonas sp. HR199のCalAおよびcalB遺伝子からなるPlacベースの発現ベクター（pSKvaomPcalAmcalB）を用いて、Escherichia coliの組み換え株を構築し、これは、オイゲノールを、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒドおよび最終的にフェルラ酸に首尾よく変換し、モル濃度の収率は、１５時間のインキュベーション中に９１％であった。この生体内変換を３０Ｌの発酵容積までスケールアップしたところ、３０時間のインキュベーションの後でフェルラ酸（１４．７ｇ／ｌ）を回収した（９３．３％モル濃度収率）。インキュベーション時間を延長することにより、収率を改善するように当該方法を増強することができたか否かについては、データ／情報は提供されなかった。
【０１２４】
本開示は、E.coliの組み換え株においてオイゲノールをフェルラ酸に変換するための生物変換／生体内変換方法を提供する。既知のPseudomonas sp.HR199の細菌CalA／CalB遺伝子（Overhage et al 2003 Appl and Env Microbiol 69(11) 6569-6576)において開示されるもの）が、植物に基づく遺伝子（MtSAD1およびAtADH1）で置き換えられ、これらは首尾よく、オイゲノールを、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、そして最終的にはフェルラ酸に変換した。この生体内変換を３０Ｌの発酵容積までスケールアップしたところ、約６４時間のインキュベーションの後で、フェルラ酸（２６ｇ／ｌ）を回収した。開示される生物変換方法の一利点は、富栄養培養培地（LB、TSBまたはTBなど）よりも費用効率が高い無機培養培地（M9A培地など）中で、高い効率で発酵および変換を行うことができることである。
【０１２５】
E.coliの組み換え株においてオイゲノールからフェルラ酸を製造するための生物変換方法の首尾よい開発により、バニリン生成のための低コストかつ工業的に経済的な方法を提供することができる。
【０１２６】
本開示は、オイゲノールのフェルラ酸への生物変換、およびその後のバニリンへのさらなる変換を通してバニリンを生成するための方法を提供する。生物変換は、細菌Escherichia coliなどの細胞系において、同じ宿主細胞において、または異なる宿主細胞において（例えば異なるE.coli宿主細胞、もしくはE.coli株およびAmycolatopsis株などの異なる微生物種宿主細胞において）、媒介され得る。
【０１２７】
したがって、本開示の別の態様は、バニリンを製造する方法であって、該方法は、細胞系においてVaoA遺伝子を発現させること、細胞系においてMtSAD1遺伝子を発現させること、細胞系を培地中で増殖させること、オイゲノールを細胞系に供給すること、細胞系をインキュベートすること、ならびにフェルラ酸をバニリンに変換することを含む。方法はさらに、細胞系においてADH遺伝子を発現させることを含んでもよい。ADHの発現は、バニリンを製造するための生合成経路を増強する。方法を増強するために、細胞系においてcalA遺伝子をさらに発現させてもよい。同様に、同じまたは同様の方法を増強する目的のために、細胞系においてcalB遺伝子をさらに発現させてもよい。フェルラ酸のバニリンへの生物変換に関しては、これは微生物により、特にフェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ（FCS）、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼ（ECH）および任意にバニリンシンターゼを発現するものにより促進される。好適な微生物の例は、Pseudomonas sp. HR 199、Amycolatopsis sp. ATCC 39116、Amycolatopsis sp. HR167、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Pseudomonas fluorescens AN103、Streptomyces seotonii、Streptomyces sannanensis、Amycolalopsis sp.株（Zhp06）である（例えば、US2013/0115667A1からのCCTCC No. 2011265を参照）。
【０１２８】
別の態様において、バニリンを製造する方法において、フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ（FCS）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼ（ECH）を発現させることは、単独でまたは集合的に、細胞系において、またはin vitro系において、各々のステップを発現することをさらに含む。細胞系は、バニリンの発現を促進することができる任意の数の細胞系であってよい。一態様は、E. coliなどの細菌に基づく細胞系を用いる。別の態様は、Amycolatopsis／Streptomycesベースの細胞系を利用する。別の態様は、酵母に基づく細胞系を利用する。
【０１２９】
フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ（FCS）は、トランス−フェルロイル−ＣｏＡシンターゼ（EC 6.2.1.34）であって、化学反応：
【化３】
0006596009.tif 000004
を触媒する酵素である。この酵素の３つの基質は、フェルラ酸、CoASHおよびATPであり、一方、その２つの生成物は、トランス−フェルロイル−ＣｏＡおよびＡＴＰ分解の生成物である。この酵素は、リガーゼのファミリー、特に酸−チオールリガーゼなどの炭素−硫黄結合を形成するものに属する。この酵素クラスの体系名は、トランス−フェルラート：CoASHリガーゼ（ATP加水分解型）である。この酵素はまた、トランス−フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼとも称される（Narbad A, Gasson MJ (Pt 5).「Metabolism of ferulic acid via vanillin using a novel CoA-dependent pathway in a newly-isolated strain of Pseudomonas fluorescens」、Microbiology. 144 (5): 1397-405. doi:10.1099/00221287-144-5-1397. PMID 9611814. およびPometto AL 3rd Crawford DL (1983).「Whole-cell bioconversion of vanillin to vanillic acid by Streptomyces viridosporus」、Appl. Environ. Microbiol. 45 (5): 1582-5. PMC 242504. PMID 6870241を参照）。FCSは、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）において参照DSMZ 7063により入手可能である。FCSヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号７および８として提供される。
【０１３０】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ECH）／アルドラーゼは、Pseudomonas sp. DSMZ 7063のエノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ／アルドラーゼであり、UniProtからQ9EY87として入手可能である。ECHヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号９および１０として提供される。
【０１３１】
バニリンシンターゼ（EC 4.1.2.41）は、化学反応：
【化４】
0006596009.tif 000005
を触媒する酵素であり、そのため、この酵素は１つの基質、３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシ−３メトキシフェニル）プロパノイル−ＣｏＡ、および２つの生成物、バニリンおよびアセチル−ＣｏＡを有する。この酵素は、リアーゼ、特に炭素−炭素結合を切断するアルデヒド−リアーゼのファミリーに属する。この酵素クラスの体系名は、３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパノイル−ＣｏＡバニリン−リアーゼ（アセチル−ＣｏＡ形成型）である。一般に使用される他の名称として、３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロピニル−ＣｏＡ：およびバニリンリアーゼ（アセチル−ＣｏＡ形成型）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書において議論される多様な遺伝子およびモジュールは、単一の微生物ではなく、むしろ２または３以上の組み換え宿主微生物中に存在してもよいことが理解されるであろう。複数の組み換え微生物が用いられる場合、それらを、フェルラ酸および／またはバニリンを産生させるために混合培養において増殖させることができる。
【０１３３】
いくつかの態様において、バニリンを製造する方法は１ステップの方法であり、一方、他の態様においては、バニリンを製造する方法は２ステップの方法である。この２ステップの方法は、同じ微生物宿主細胞を用いても、異なる微生物宿主細胞を用いてもよい。
【０１３４】
本明細書において記載されるバニリン生成は、主要なバニラ香味化合物を含む、完全に展開し、良好にバランスが取れた香味プロフィールを有するバニリン生成物を提供する。
【０１３５】
バニラ香味剤の主要な構成要素は、バニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）である。それは一般に、バニラ莢のおよそ３重量％未満を構成する。バニラ莢に起源を有する天然バニラの芳香および香味は、多くがフェノール性の化合物の複雑な混合物に起因し、そのうちのバニリンは、単に組成物のパーセンテージに関して主要な一つに過ぎないことは、理解されねばならない。主要なバニラ香味化合物として、限定することなく、フェノール性化合物、フラン化合物、脂肪酸化合物、エタノールとの反応により形成される化合物、およびアセトアルデヒドジエチルアセタールが挙げられる。
【０１３６】
これらのフェノール性バニラ香味化合物として、限定することなく、アセトバニロンアルファ−エトキシ−ｐ−クレゾール、安息香酸、グアヤコール、４−メチルグアヤコール、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、メチルパラベン、メチルバニレート（vanillate）、２−メトキシ−４−ビニルフェノール５−メトキシバニリン、フェノール、バニリン、バニリン酸、バニリルアルコール、バニリルエチルエーテルおよびｐ−ビニルフェノールが挙げられる。これらのフェノール性バニラ香味化合物、特にグアヤコールは、望ましくは、それらが香味を支配し、その結果として香味のバランスの不均衡をもたらすことがないように、低濃度において存在する。
【０１３７】
フランバニラ香味化合物として、限定することなく、２−フルフラール、２−フルフロール（furfurol）５−（ヒドロキシメチル）−２−フルフラール、５−メチル−２−フルフラール、２−ヒドロキシフラネオール、ガンマ-ブチロラクトン（ジヒドロ２（３Ｈ）−フラノン）が挙げられる。脂肪酸バニラ香味化合物として、限定することなく、リノール酸およびパルミチン酸が挙げられる。バニラ香味をエタノールなどの溶媒で抽出する場合は、エタノールとの反応により形成されるバニラ香味化合物として、限定することなく、酢酸エチル、グリコール酸エチル、乳酸エチル、リノール酸エチル、ピルビン酸エチル、レブリン酸エチルおよびコハク酸ジエチルが挙げられる。伝統的な熟成（curing）方法を用いてバニラ莢から調製されたバニラ抽出物のものに匹敵する天然バニリン生成物を生成することを探求する者は、バニリンを選択的に生成することを探求するのではなく、多くがフェノール性の化合物の混合物を生成することを探求し、そのうちのバニリンは、単に組成物のパーセンテージに関して主要な一つであるに過ぎない。Overhageら（2003 Appl and Env Microbiol 69(11) 6569-6576）はまた、２つの組み換えE.coli株により触媒される２ステップの方法を用いる、オイゲノールからのバニリン生成を提案した。第１のステップにおいては、E.coli株XL1-Blue（pSKvaomPcalAmCalB）が、オイゲノールをFAに９３．３％モル濃度収率で変換し（上で議論されるとおり）、第２のステップにおいては、組み換えE.coli（pSKechE/Hfcs）が、フェルラ酸をバニリンに変換した。この方法は、オイゲノール基質からの４．６ｇ／ｌのフェルラ酸、０．３ｇ／ｌのバニリンおよび０．１ｇ／ｌのバニリルアルコールの生成をもたらし、これは、組み換えE.coli 宿主細胞を用いるオイゲノールのバニリンへの生物変換が低率で起きることを示している。WO 2012/172108においては、E.coliにおけるこの２ステップの方法からのバニリンの収率は低すぎて、経済的に実現可能な方法とは考えられないと報告された。
【０１３８】
例３が示すように、本開示は、バニリンを産生する遺伝子echおよびfcsを提供し、これらから、天然バニリンを産生させるためにE.coliにおいてクローニングしたものは、LB培養中では成功は限定されていたが、M9A培養培地中では変換率ははるかに改善された。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、フェルラ酸から天然バニリンを産生させるために、Amycolatopsis株の代わりに組み換えE.coli宿主微生物を使用することは、より良好な変換率に関する利点を有し得る。
【０１３９】
対照的に、典型的には、フェルラ酸から生成される最高濃度のバニリンは、Stepromyces setonii（例えば、EP0885968BおよびMuheim and Lerch (1999) Appl Microbiol Biotechnol 51: 456-461を参照）およびAmycolatopsis sp. HR167（EP0761817）を用いて得られ、これらの細菌を用いてフェルラ酸を発酵させた場合、約８〜１６ｇ／ｌの濃度が報告された。Amycolatopsis株HR167、DSM9991およびDSM9992について、１９．９ｇのフェルラ酸から３２時間以内に１０リットルスケールにおいて１１．５ｇ／ｌのバニリンが産生されたことが報告されている。
【０１４０】
本開示による生成の方法において、本開示の微生物は、選択された生成物を産生させることを可能にする条件下において、選択された出発材料に暴露される。かかる条件は、例えばフェルラ酸からのバニリンの産生についてはEP0885968BまたはEP0761817Bにおいて記載される。
【０１４１】
例として、Haarman & Reimer GmbHは、Amycolatopsisの２つの株を開示している（EP0761817Bおよび／またはUS6133003A）。それらのうちの１つを用いたところ、１１．５ｇ／ｌまでのバニリンおよび１ｇ／ｌまでの未反応のフェルラ酸を含む培養培地が達成された。濃度はHPLCにより決定された。後処理技術または生成物の単離の開示は存在しない。Givaudan SAは、EP0885968Bおよび／またはUS6235507B1において、バニリンおよびいくつかの副生成物を生成するためのStreptomyces setoniiの使用を開示した。バニリンの濃度は、８〜１６ｇ／ｌの範囲であると開示される。
【０１４２】
本開示の方法において用いることができる本開示の微生物は、Actinomycetalesの科に、好ましくはActinomycineae、Actinopolysporineae、Catenulisporineae、Corynebacterineae、Frankineae、Glycomycineae、Kineosporiineae、Micrococcineae、Micromonosporineae、Propionibacterineae、Pseudonocardineae、StreptomycineaeおよびStreptosporangineaからなる群より選択される亜目に属し、ここでPseudonocardineaeおよびStreptomycineaeの亜目が好ましく、さらにより好ましくはPseudonocardiaceaeまたはStreptomycetaceaeの科に、およびさらにより好ましくは属AmycolatopsisまたはStreptomycesに、および最も好ましくは属Amycolatopsisに属する。
【０１４３】
好ましくは、微生物は、Pseudomonas sp. HR 199、Amycolatopsis sp. ATCC 39116、Amycolatopsis sp. HR167、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Pseudomonas fluorescens AN103、Streptomyces seotonii、Streptomyces sannanensis、Amycolalopsis sp.株（Zhp06）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１４４】
属Amycolatopsisのうちで、それぞれ株Amycolatopsis sp. ATCC 39116、HR167およびDSMZ 9992は、本開示に関して特に好ましい。これらの株（特にATCC39116）は、非常に高いバニリン耐性を示し、本開示によるバニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠失の前ですら、フェルラ酸の変換によるバニリンの良好な収率の達成を可能にすることが報告される。
【０１４５】
好ましくは、フェルラ酸からの天然バニリンの生成のための生体内変換／生物変換培地は、好ましくはStreptomyces setoniiまたはAmycolatopsis微生物などのActinomycetes微生物、最も好ましくは受入番号ATCC39116下で受託された株（EP0885968および／もしくはUS6235507B1を参照）またはその変異体、例えばCCTCC番号2011265から（US2013/0115667A1から）入手可能な変異体を含む、培養培地である。
【０１４６】
好ましくは、微生物は、少なくとも３ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも４ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、６ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ、８ｇ／ｌ、９ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、１１ｇ／ｌ、１２ｇ／ｌ、１３ｇ／ｌ、１４ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ、１６ｇ／ｌ、１７ｇ／ｌ、１８ｇ／ｌ、１９ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、２１ｇ／ｌ、２２ｇ／ｌ、２３ｇ／ｌ、２４ｇ／ｌ、２５ｇ／ｌ、２６ｇ／ｌ、２７ｇ／ｌ、２８ｇ／ｌ、２９ｇ／ｌ、３０ｇ／ｌのバニリンを含む培地を産生する。
【０１４７】
上で議論された酵素（バニリンシンターゼを含む）のいずれかをコードするさらなる遺伝子（例えばechおよび／またはfcsおよび／またはCalAおよび／またはCalB）の付加は、それぞれの前駆体を対応する生成物へと変換するためのさらなる代謝手段を提供し、それによりそれぞれの反応を触媒する酵素の量を増加させることにより、バニリンの生成を改善する。
【０１４８】
本開示の特に好ましい微生物は、属Amycolatopsisのもの、さらにより好ましくは株Amycolatopsis sp. ATCC 39116のものであり、ここでバニリンデヒドロゲナーゼのための遺伝子を、バニリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子中への抗生物質耐性遺伝子の挿入により、不活化する。別の好ましい選択肢は、マーカーを含まない（markerless）バニリンデヒドロゲナーゼノックアウト変異体の作製である（例えば、WO2012/172108およびUS2014/0087428A1を参照）。
【０１４９】
本明細書において記載されるポリペプチドの機能的相同体（例えば少なくとも以下の遺伝子VaoA、MtSAD1、AtADH、CalA、CalB、fcs、echなどの１以上によりコードされる）はまた、組み換え宿主中でフェルラ酸および／またはバニリンを産生させることにおける使用のためにも好適である。したがって、組み換え宿主は、上記のポリペプチドの機能的相同体をコードする１以上の異種核酸、および／または上記の変異体ポリペプチドをコードする異種核酸を含んでもよい。
【０１５０】
機能的相同体は、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有するポリペプチドであって、参照ポリペプチドの１以上の生化学的または生理学的機能を担持するものである。機能的相同体および参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってよく、配列類似性は、収束進化的または分岐進化的イベントに起因するものであってよい。したがって、機能的相同体はときに、文献において、相同体、またはオルソログ、またはパラログとして呼ばれる。天然に存在する機能的相同体のバリアント、例えば、野生型コード配列の変異体によりコードされるポリペプチドは、それ自体が機能的相同体であってよい。機能的相同体はまた、ポリペプチドについてのコード配列の部位特異的変異誘発を介して、または天然に存在する異なるポリペプチドについてのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）により、作出することができる。本明細書において記載される機能的なものをコードする遺伝子を改変するための技術は、公知であり、とりわけ定向進化技術、部位特異的変異誘発技術およびランダム変異誘発技術を含み、所望の様式に、ポリペプチドの特定の活性を増大させるため、基質特異性を改変するため、発現レベルを改変するため、細胞内局在を改変するため、またはポリペプチド：ポリペプチド相互作用を修飾するために有用であり得る。かかる修飾されたポリペプチドは、機能的相同体とみなされる。用語「機能的相同体」はときに、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【０１５１】
機能的相同体は、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析により同定することができる。例えばヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースにおいて検索を行うことにより、コードされる遺伝子VaoA、MtSAD1、CalA、CalBポリペプチド、FCS／ECHポリペプチドなどの相同体を同定することができる。
【０１５２】
配列分析は、関連性のあるアミノ酸配列を参照配列として用いる、非重複データベースのBLAST、Reciprocal BLASTまたはPSI-BLAST分析を含んでもよい。アミノ酸配列は、いくつかの場合において、ヌクレオチド配列から推定される。データベース中の４０％より高い配列同一性を有するポリペプチドは、フェルラ酸／バニリン生合成ポリペプチドとしての適合性についてのさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列類似性は、１つの疎水性残基の別のものへの置換、または１つの極性残基の別のものへの置換などの、保存的アミノ酸置換を可能にする。所望される場合、さらに評価されるべき候補の数を狭めるために、かかる候補の手作業による検査を行ってもよい。手作業による検査は、ポリペプチドまたはバニリン生合成ポリペプチド中に存在するドメイン、例えば保存された機能的ドメインを有すると考えられる候補を選択することにより行うことができる。
【０１５３】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存された領域を同定するために有用である。関連するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存された領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。配列同一性は、上記のように決定することができる。
【０１５４】
発現されたMtSAD1は、アミノ酸配列番号１またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントに基づく。
【０１５５】
発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列に基づく。
【０１５６】
代替的な態様において、発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸に基づく。
【０１５７】
あるいは、発現されたMtSAD1は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に基づく。
【０１５８】
さらに、発現されたMtSAD1は、E. coliから発現されるアミノ酸配列に基づく。
【０１５９】
遺伝子のヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）同一性」は、最大の配列同一性のパーセントを達成するために配列をアラインメントし、必要な場合にはギャップを導入した後で、任意の保存的置換を配列同一性の部分としてみなすことなく、DNA配列中のヌクレオチドと同一である候補DNA配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列同一性のパーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野における技術の範囲内である多様な方法において公共で利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較されている全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１６０】
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、本明細書において交換可能に用いられ、長さまたは翻訳後修飾に関わりなく、任意のペプチド結合されたアミノ酸の鎖を意味する。
【０１６１】
本明細書において用いられる場合、用語「誘導体」は、限定されないが、バリアントおよび化学修飾された誘導体を含む。用語「誘導体」と「バリアント」とは、本明細書において交換可能に用いられる。
【０１６２】
本明細書において用いられる場合、用語「バリアント」は、それがアミノ酸配列中の１以上の変更により誘導されるポリペプチドと比較して異なるポリペプチドとして理解されるべきである。バリアントが誘導される元のポリペプチドはまた、親または参照ポリペプチドとしても知られる。典型的には、バリアントは、人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段により構築される。典型的には、バリアントが誘導される元のポリペプチドは、野生型タンパク質または野生型タンパク質ドメインである。しかしながら、本開示において使用可能なバリアントはまた、バリアントが親ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を示すことを前提として、親ポリペプチドの相同体、オルソログもしくはパラログから、または人工的に構築されたバリアントから誘導することができる。アミノ酸配列中の変更は、アミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーション、またはＣ末端トランケーション、またはこれらの変更の組み合わせであってよく、これは、１か所の部位で起きてもいくつかの部位で起きてもよい。
【０１６３】
好ましい態様において、本開示において使用可能なバリアントは、アミノ酸配列中に２００まで（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００まで）の合計数の変更（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーションおよび／またはＣ末端トランケーション）を示す。アミノ酸交換は、保存的および／または非保存的であってよい。好ましい態様において、本開示において使用可能なバリアントは、それが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００までのアミノ酸交換、好ましくは保存的アミノ酸変更により誘導される、元のタンパク質またはドメインとは異なる。バリアントは、付加的に、または代替的に、アミノ酸の欠失を含んでもよく、これは、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションまたは内部欠失またはこれらの任意の組み合わせであってよい。Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションおよび／または内部欠失を含むかかるバリアントは、本願の文脈において、「欠失バリアント」または「フラグメント」として言及される。用語「欠失バリアント」と「フラグメント」とは、本明細書において交換可能に用いられる。欠失バリアントは、天然に存在するもの（例えばスプライスバリアント）であってもよく、またはそれは人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段により構築されてもよい。典型的には、欠失バリアントが誘導される元のタンパク質またはタンパク質ドメインは、野生型タンパク質である。しかしながら、本開示の欠失バリアントはまた、欠失バリアントが親ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を示すことを前提として、親ポリペプチドの相同体、オルソログまたはパラログから、または人工的に構築されたバリアントから誘導することができる。好ましくは、欠失バリアント（またはフラグメント）は、そのＮ末端においておよび／またはＣ末端においておよび／または内部に、親ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸までの欠失を有する。
【０１６４】
「バリアント」とは、本明細書において用いられる場合、代替的にまたは付加的に、それが誘導される元の親ポリペプチドに対する一定の程度の配列同一性により特徴づけることができる。本開示のバリアントは、それぞれの参照ポリペプチドに対して、またはそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性の配列同一性を有していてよい。表現「少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性」とは、本明細書全体にわたって、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較に関して用いられる。
【０１６５】
より正確には、本開示の文脈におけるバリアントは、その親ポリペプチドに対して「少なくとも８０％の配列同一性」を示す。好ましくは、配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多くのアミノ酸の連続的な区間にわたる。表現「少なくとも８０％の配列同一性」は、本明細書全体にわたり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較に関して用いられる。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチドに対して、またはそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を指す。好ましくは、問題のポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多くのアミノ酸の連続的な区間にわたり、指示される配列同一性を示す。好ましくは、問題のポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドは、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００またはそれより多くのヌクレオチドの連続的な区間にわたり、指示される配列同一性を示す。２つの配列が比較され、それと比較して配列同一性のパーセンテージが計算されるべき参照配列が特定されない場合、配列同一性は、他に特に示されない場合は、比較されるべき２つの配列のうちの長い方を参照して計算されるべきである。参照配列が示される場合は、配列同一性は、他に特に示されない場合は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０により示される参照配列の全長に基づいて決定される。
【０１６６】
例えば、２６９アミノ酸残基を有する全長MtSAD1のアミノ酸と比較した３０アミノ酸からなるペプチド配列は、１１．１５％（３０／２６９）の最大の配列同一性パーセンテージを示すことができ、一方、１５０アミノ酸の長さを有する配列は、５５．７０％（１５０／２６９）の最大の配列同一性パーセンテージを示すことができる。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列の類似性、すなわち、配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントを介して決定することができる。かかるアラインメントは、例えばhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/において、またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlにおいて、またはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlにおいて入手可能な、当該分野において公知のいくつかのアルゴリズムにより、好ましくはKarlinおよびAltschul（Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877）の数学的アルゴリズムにより、hmmalign（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）により、またはCLUSTALアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80）により、行うことができる。
【０１６７】
用いられる好ましいパラメーターは、それらがhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlにおいて設定されるとおりの、デフォルトのパラメーターである。配列同一性のグレード（配列マッチング）は、例えばBLAST、BLATまたはBlastZ（またはBlastX）を用いて計算することができる。類似のアルゴリズムを、Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラム中に組み込む。関連性のあるタンパク質をコードする核酸と相同なポリヌクレオチド配列を得るために、BLASTポリヌクレオチド検索は、BLASTNプログラムにより、スコア＝１００、文字長さ＝１２で行う。
【０１６８】
SrKOポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラムにより、スコア＝５０、文字長さ＝３で行う。比較の目的のためにギャップを含むアラインメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402において記載されるように利用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーターを用いる。配列マッチング分析は、Shuffle-LAGAN（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:154-162）またはMarkov random fieldsのような確立された相同性マッピング技術により補われてもよい。本願において配列同一性のパーセンテージが言及される場合、これらのパーセンテージは、他に特に示されない場合は、より長い配列の全長に対して相対的に計算される。
【０１６９】
「保存的置換」は、例えば、関係するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。２０個の天然に存在するアミノ酸は、以下の６個の標準的なアミノ酸群にグループ化することができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；ならびに
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１７０】
本明細書において用いられる場合、「保存的置換」は、上の６個の標準的なアミノ酸群のうちの同じ群内に列記されるアミノ酸の別のアミノ酸による交換として定義される。例えば、ＡｓｐのＧｌｕによる交換は、そのように修飾されたポリペプチドにおける１つの負の電荷を保持する。さらに、グリシンおよびプロリンは、α−へリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換することができる。上の６群内のいくつかの好ましい保存的置換は、以下の亜群内の交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＨｅ；（ｉｉ）ＳｅｒおよびＴｈｒ；（ｉｉ）ＡｓｎおよびＧｉｎ；（ｉｖ）ＬｙｓおよびＡｒｇ；ならびに（ｖ）ＴｙｒおよびＰｈｅ。既知の遺伝子コード、ならびに組み換えおよび合成DNA技術を所与として、技術を有する科学者は、保存的アミノ酸バリアントをコードするDNAを容易に構築することができる。
【０１７１】
本明細書において用いられる場合、「非保存的置換」または「非保存的アミノ酸交換」は、上に示される６つの標準アミノ酸群（１）〜（６）のうちの異なる群に列記される別のアミノ酸による、アミノ酸の交換として定義される。
【０１７２】
本明細書において用いられる場合、用語、ポリペプチドの「誘導体」とはまた、それが２０個の天然に存在するアミノ酸以外の他の化学基を含むように化学修飾されているポリペプチドを指す。かかる化学基の例として、限定することなく、グリコシル化されたアミノ酸およびリン酸化されたアミノ酸が挙げられる。誘導体が誘導される元のポリペプチドはまた、親ポリペプチドとしても知られる。この親ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質であってもよいが、また、上で定義されるようなタンパク質バリアントであってもよい。ポリペプチドの化学修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば増強された安定性、延長された生物学的半減期、または増大した水溶性の１以上を提供することができる。本開示において使用可能な誘導体に適用可能な化学修飾として、限定することなく、以下が挙げられる：PEG化、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化、または親ポリペプチドにおいて存在するグリコシル化パターンの改変。
【０１７３】
「生物学的活性」とは、本明細書において用いられる場合、ポリペプチドが示し得る任意の活性を指し、これは、限定することなく以下を含む：酵素活性；別の化合物に対する結合活性（例えば別のポリペプチドへの結合、特に、受容体に対する結合もしくは核酸に対する結合）；阻害活性（例えば酵素阻害活性）；活性化活性（例えば酵素活性化活性）；または毒性効果。バリアントまたは誘導体が親ポリペプチドと同じ程度までかかる活性を示すことは必要とされない。バリアントは、それが、親ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の程度まで適切な活性を示す場合に、本願の文脈内においてバリアントとみなされる。同様に、誘導体は、それが、親ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の程度まで適切な生物学的活性を示す場合に、本願の文脈内において誘導体とみなされる。
【０１７４】
本明細書において開示される酵素のいずれかのファミリーに属するポリヌクレオチドまたはタンパク質は、それぞれ関連性のある遺伝子またはタンパク質に対するその類似性に基づいて同定することができる。例えば、同定は、配列同一性に基づいてもよい。ある好ましい態様において、本開示は、（ａ）配列番号１、３、５、８または１０のポリペプチドをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号２、４、６、７または９のヌクレオチド配列、および（ｃ）配列番号２、４、６、７または９の、少なくとも３０（例えば、少なくとも３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００または１０１０）ヌクレオチドのセグメントを含む核酸分子に対して、少なくとも５０％（または５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％）同一である、単離された核酸分子に注目する。
【０１７５】
２つの核酸配列の間のパーセント同一性の決定は、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラム中に組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、HIN-1をコードする核酸に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラム、スコア＝１００、文字長さ＝１２により行う。BLASTタンパク質検索は、TAS2Rポリペプチドに対して相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTPプログラム、スコア＝５０、文字長さ＝３により行う。比較の目的のためにギャップを含むアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402において記載されるように利用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター。
【０１７６】
ハイブリダイゼーションもまた、２つの核酸配列の間の相同性の尺度として用いることができる。本明細書において開示されるタンパク質のいずれかをコードする核酸配列またはその部分は、ハイブリダイゼーションプローブとして、標準的なハイブリダイゼーション技術に従って用いることができる。試験ソース（例えば、哺乳動物細胞）からのDNAまたはRNAへのプローブのハイブリダイゼーションは、試験ソース中の関連性のあるDNAまたはRNAの存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991において見出すことができる。中程度のハイブリダイゼーション条件は、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での３０℃でのハイブリダイゼーションと、その後の１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での５０℃での洗浄に相当するものとして定義される。高ストリンジェントな条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での４５℃でのハイブリダイゼーションと、その後の０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での６５℃での洗浄に相当するものとして定義される。
【０１７７】
本開示によるフェルラ酸のバニリンへの生物変換は、主要な化合物としてバニリンを生成するが、またバニリン以外の化合物も生成し、これらは生物変換混合物に心地良いフレーバーノートを付与し、正の様式において混合物の知覚特性に対して寄与し、食品のための香料としてのその価値を増大させる。知覚分析は、例えば「３点比較法」、または訓練されたフレーバリストにより利用される他の良く確立された知覚試験を用いて行う。
【０１７８】
バニラは、世界中で最も広く用いられている香味剤のうちの一つである。それは、ランVanilla planifolia、Vanilla tahitiensisおよびVanilla pomponaから抽出される、バニラ豆の抽出物の主要成分である。バニラの抽出物中には多くの化合物が存在するが、化合物バニリン（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド）が、主に、バニラの特徴的なフレーバーおよび匂いの原因である。
【０１７９】
バニリンは、フェノール性アルデヒドであって、これは分子式Ｃ８Ｈ８Ｏ３を有する有機化合物である。その官能基は、アルデヒド、エーテルおよびフェノールを含む。それは、激烈に甘く非常に粘り強いクリーミーなバニラ様の香気を有する白色の針状結晶粉末である。バニラ種子の莢を生育させることは労働集約的であるため、バニラは、サフランの次に２番目に最も高価な香辛料である。その費用にもかかわらず、バニラはその香味のために高く評価される。さらに、消費者により主導される天然バニリンについての要求は、植物ソースにより抽出されるバニリンの量を高く超える。
【０１８０】
結果として、バニラは、商業および家庭の両方におけるベーキング、香水製造およびアロマセラピーにおいて、広く用いられる。それは、多様な機能的特性を有する主要な香味付け材料として用いられる。純粋なバニリンは、食品における香味を増強するために、およびバイオ保存剤（biopreservative）として（なぜならばそれは抗菌および抗酸化特性であるので）、広く用いられる。それは、製薬業における重要な原材料である。
【０１８１】
バニリンは、天然バニラ抽出物の代わりに、今や、食品、飲料および医薬における香味剤として、より頻繁に用いられる。バニリンの最大の使用は、通常は甘い食品における、香味剤としてのものである。アイスクリームおよびチョコレート工業は、一緒に、香味剤としてのバニリンについての市場の７５％を含み、より少ない量が、菓子および焼成製品において用いられる。バニリンはまた、フレグランス工業において、香水中で、ならびに医薬、家畜飼料および洗浄製品の不快な臭気または味をマスクするために用いられる。それはまた、香味剤工業において、多くの異なる香味、特にクリームソーダのようなクリーミーなプロフィールのための非常に重要なキーノートとして用いられる。さらに、バニリンは、医薬および他のファインケミカルの生成における化学中間体として用いられてきている。
【０１８２】
エタノール中の合成バニリンの溶液から基本的になる合成エッセンスは、フェノールから誘導され、高純度のものである。合成バニリンは、多数の家事用製品、デオドラント、エアフレッシュナー、床磨き剤および除草剤を製造するために用いられる。オイゲノールまたはイソオイゲノールからのバニリンの「古典的」合成は、１８９６年に開発され、約５０年間にわたり好ましい方法であり続けた。しかし、バニリンは、今では、Reimer-Tiemann反応により工業的に大量に調製される。これが、その生成のための代替的方法の研究をもたらした。結果として、リグニン、オイゲノール、イソオイゲノールおよびフェルラ酸からのバニリンの生成について、真菌、細菌、植物細胞または遺伝子操作された微生物を適用することにより、多様な生物工学に基づくアプローチが研究されてきた。生物工学は、重要な食品材料を製造する方法を開発するために、遺伝子工学のツールを使用する。それは、食品香味剤の生合成のための可能な基質の範囲を広げ、健康的で、より味が良く、安全な食品を提供することにおける消費者の選択肢を拡大する。生物工学的方法を通して天然基質から得られる生成物は、一般に、安全であるとみなされ、天然のものであると考えられる。
【０１８３】
フェルラ酸／バニラ生成物またはその前駆体生成物は、そのまま（すなわち最終生成物として）、または中間体として（例えば、中間体を前駆体として、さらに誘導体もしくは最終生成物を生成するために）、商業的に用いることができる。単離され、任意に精製されたバニリンの抽出物は、食品、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬組成物、歯科衛生用組成物、および化粧品などの消耗品に香味付けることにおいて用途を見出す。
【０１８４】
食品はまた、ハーブ、香辛料およびシーズニング、および調味料などの薬味を含む。食品はまた、ダイエット用甘味料、液体甘味料、水で再構成することにより非炭酸飲料を提供する顆粒状の香味ミックス、インスタントのプディングミックス、インスタントのコーヒーおよび紅茶、コーヒー用粉末クリーム、麦芽乳ミックス、ペットフード、家畜飼料、タバコ、およびベーキング用途のための材料（パン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツなどの調製のための粉末ベーキングミックスなど）などの、調製された包装された製品を含む。食品はまた、スクロースを殆どまたは全く含まない、ダイエット用または低カロリーの食品および飲料を含む。本開示により想起される食品の他の例は、以下に、および本明細書全体にわたり、記載される。
【０１８５】
別の態様において、食品は、果物、野菜、果汁、肉製品（ハム、ベーコンおよびソーセージなど）；卵製品、果物濃縮物、ゼラチンおよびゼラチン様製品（ジャム、ゼリー、プリザーブなど）；乳製品（アイスクリーム、サワークリームおよぼシャーベットなど）；アイシング、糖蜜を含むシロップ；トウモロコシ、コムギ、ライムギ、ダイズ、カラスムギ、コメおよびオオムギ製品、ナッツ果肉およびナッツ製品、ケーキ、クッキー、菓子（飴、ガム、果物味のドロップおよびチョコレートなど）、クリーム、アイシング、アイスクリーム、パイおよびパンである。
【０１８６】
別の態様において、消耗品は医薬組成物である。好ましい組成物は、バニリンおよび／またはバニリンベータ−Ｄ−グルコシドおよび１以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含む、医薬組成物である。これらの医薬組成物は、生物学的効果を発揮する１以上の活性剤を含む医薬を処方するために用いることができる。したがって、医薬組成物は、好ましくは、生物学的効果を発揮する１以上の活性剤をさらに含む。かかる活性剤は、活性を有する、薬学的よび生物学的な剤を含む。かかる活性剤は、当該分野において周知である。
【０１８７】
本開示の一態様において、医薬組成物は、栄養補給組成物である。望ましくない味を有する栄養補給組成物の例は、必ずしもこれらに限定されないが、栄養欠乏、外傷、外科手術、クローン病、腎臓疾患、高血圧、肥満などの処置のため、運動競技の成績を向上させるため、筋肉増強、または一般的な福祉のため、またはフェニルケトン尿症などの先天的な代謝の誤りの処置のための、経腸栄養製品である。特に、かかる栄養補助処方物は、苦いまたは金属的な味または後味を有する１以上のアミノ酸を含んでもよい。
【０１８８】
別の態様において、食品、食品前駆体材料、または食糧の産生において用いられる添加物の製造のための方法が提供され、該方法は、本開示の方法により得ることができるバニリンを、調理済の製品、食品、食品前駆体材料、または食糧の産生において用いられる添加物と混合する方法を含む。
【０１８９】
さらなる態様において、栄養補給食品または医薬組成物の製造のための方法が提供され、該方法は、本開示の方法により得ることができるバニリンを、賦形剤と、ならびに任意に薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントと混合するステップを含む。
【０１９０】
さらなる態様において、先の段落の方法であって、医薬組成物を薬学的に受容可能な形態に処方するステップをさらに含む方法が提供される。
【０１９１】
摂取可能な（または調理済の）組成物は、「食品または飲料製品」および「非可食製品」の両方を含む。「食品または飲料製品」により、ヒトまたは動物による消費のために意図される、固体、半固体または液体（例えば飲料）を含む、任意の可食製品が意味される。
【０１９２】
用語「非可食製品」は、補助食品、栄養補給食品、機能性食品（例えば、栄養を補給する基本的な補給機能を超えて、健康を促進する、および／または疾患を予防する特性を有することを主張された、任意のフレッシュなまたは処理された食品）、医薬および市販薬（over the counter medication）、歯磨剤および洗口剤などの口腔ケア製品、リップバームなどの化粧品、および他のパーソナルケア製品を含む。
【０１９３】
摂取可能な（または調理済の）組成物はまた、医薬（pharmaceutical）、医薬（medicinal）、または代替的に処方物、例えば、医薬（pharmaceutical）もしくは医薬（medicinal）処方物または食品もしくは飲料の製品もしくは処方物を含む。本開示の化合物はまた、個別に、または既知のもしくは後で発見される任意の摂取可能な組成物と組み合わせて、提供することができる。
【０１９４】
香味剤、香水および材料の工業は、食品製造者および最終消費者からの、真偽およびトレーサビリティについての要求の増大に気が付いている。したがって、バニラ製品の植物学的起源を識別するための、より進歩した分析方法が開発されてきている。
【０１９５】
これらの分析方法は、限定されないが、以下の方法を含み、Lebensmittelchemie (2010) 64: 17-48中の「Herkunf und Authentizitaet von Vanillearomen」において詳細に議論され、抽出物は、背景の情報として以下に提供される：
【０１９６】
天然バニラ香味剤は、バニリンに加えて、例えばｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、バニリン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸などの他の特徴的な関連物質を含む。天然バニラ香味剤中のこれらの成分の濃度は、互いに特徴的な比率にあり、特定の状況において、真偽の試験において利用することができる。HPLCおよびGC法は、これらの物質の定量的決定のために用いられるようになってきている。
【０１９７】
バニラ莢から得られてきた天然バニリンは、安定な同位体比を用いて、合成によりまたは生物工学的に製造されたバニリンと区別することができる。安定な同位体の分画に基づく科学的原理は、技術文献において詳細に記載される（例えば、Gassenmeier et al (2013) Flavour Fragr. J. 28; 25-29を参照）。それらの光合成経路に従って、植物およびそれらの成分物質は、元素の炭素（１３Ｃ／１２Ｃ）および水素（２Ｈ／１Ｈ）の特異的な安定な同位体比を示す。したがって、植物においてＣＯ２固定についての３つの光合成経路が知られている。いわゆるＣ３植物（例えば、コムギ、コメ、サトウダイコン）は、リブロース二リン酸カルボキシラート反応を利用し、一方、Ｃ４植物（例えば、サトウキビ、トウモロコシ）は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ反応を使用する。多肉植物およびラン（例えば、Vanilla planifolia）などのＣＡＭ植物は、ベンケイソウ型酸代謝を有する。
【０１９８】
背景情報として、天然に存在するフェノール性化合物であるフェルラ酸は、Ｃ３、Ｃ４またはＣＡＭ植物の細胞壁中に見出される最も豊富なヒドロキシ桂皮酸であり、細胞壁において、それは多糖にエステル結合している。植物が太陽からエネルギーを取得して、それを糖の結合中に貯蔵する方法である光合成は、行うために光、水および二酸化炭素のみを必要とする単純な方法である。植物は、それらの光合成経路に依存して、３つの異なる型：Ｃ３、Ｃ４およびＣＡＭ植物に分けることができる。Ｃ３植物は、コメおよびコムギを含む。Ｃ４植物はトウモロコシおよび幾つかの型の草本を含む。ＣＡＭは、Ｃ３とＣ４との間の中間的な機構であり、ここで植物はＣ３またはＣ４経路を使用する。Ｃ３、Ｃ４またはＣＡＭ植物からの３つの光合成方法は、同位体効果、特に、以下で議論されるように植物学的起源のトレーサビリティに役立つ１３Ｃ同位体効果を生じるであろう。
【０１９９】
ガスクロマトグラフィー−IRMS（GC-IRMS）および元素分析計−IRMS（EA-IRMS）：元素分析計（EA）またはガスクロマトグラフ（GC）と、同位体比質量分析計（IRMS）との直接連結により、炭素、酸素および水素の安定な同位体を、高い正確性により決定することが可能である。
【０２００】
GC-IRMSの使用により、バニリンのおよび十分な濃度ではまた溶媒抽出物中の関連物質の同位体比に対して成分特異的分析を行うことが可能になる。炭素同位体比の決定はGC-燃焼（combustion）-IRMS（GC-C-IRMS）により、酸素および水素の同位体比の決定はGC-熱分解（pyrolysis）-IRMS（GC-P-IRMS）により行う。
【０２０１】
分取用合成により単離されたバニリンにおいて、１８Ｏ／１６Ｏおよび２Ｈ／１Ｈ同位体比は、高温変換元素分析計（TC/EA）により決定し、１３Ｃ／１２Ｃ同位体比は、燃焼元素分析計（C/EA）により決定する。
【０２０２】
全ての方法において、１３Ｃおよび１２Ｃ同位体の濃度を比として設定し、国際的に確立された標準Vienna Pee Dee Belemnite（ＶＰＤＢ）に関連付ける。パーミル（‰）ＶＰＤＢにおける炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）のデータ値（δ１３Ｃ値）は、式：
【化５】
0006596009.tif 000006
に従って報告される。
【０２０３】
水素（２Ｈ／１Ｈ）の、および酸素（１８Ｏ／１６Ｏ）の同位体比は、したがって、δ２Ｈまたはδ１８Ｏ値として計算され、‰ＶＳＭＯＷ（Vienna Standard Mean Ocean Water）として報告される、
【０２０４】
EA-IRMSおよびGC-IRMSにより様々な研究室の多くの技能検査の一部としてこれまで決定された単離されたバニリンのδ１３Ｃ値は、非常に良好な比較性を示してきた：したがって、それらの方法は、検証されたものとみなされるべきである。
【０２０５】
本明細書において用いられる場合、用語「δ１３Ｃ」とは、パーミル（‰）ＶＰＤＢにおける炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）を指し、式；
【化６】
0006596009.tif 000007
により報告される。
【０２０６】
以下の表１は、異なる地理的および植物学的起源のバニリン中の、および異なる原材料から生成されたバニリンの、炭素および水素についての、技術文献において公開されている安定な同位体比の概要を提供する。
【０２０７】
以下の表１から、多様な植物起源ならびに異なる製造方法からのバニリンを識別するために、δ１３Ｃ値を用いることができることを理解することができる：
−  Vanilla planifoliaもしくはVanilla tahitensisからの、またはこれらの変種の水性のエタノール性抽出物からの天然バニラは、−２１．５‰ＶＰＤＢよりも正側（positive）のδ１３Ｃ値をもたらす；
−  生物工学的に（例えばフェルラ酸（コメからの）から）製造され、食品法により天然バニラであると称され得るバニリンについて、δ１３Ｃ値は、典型的には−３６‰〜−３７‰ＶＰＤＢの領域である；
−  リグニン、オイゲノールまたはグアヤコールから化学的に合成され、なお施行中のAromenV（香味剤の規制）により「天然のものと同一（nature-identical）」として分類されるバニリンは、
−２５‰ＶＰＤＢよりも負側（negative）のδ１３Ｃ値を有する。
【０２０８】
別の報告における開示によれば（Cochennec C Perfumer & Flavourist (2013) 38: 20-27を参照）、植物のδ１３Ｃ同位体の偏向は、光合成の機構に依存して変化する。
【０２０９】
Cochennec（2013）においては、トウモロコシなどのＣ４光合成機構を有する植物は、−１９％〜−１６‰の範囲のトウモロコシなどのＣ４植物からのフェルラ酸についてのδ１３Ｃ値同位体偏向を示し、したがって、約１４‰のおよその−δ１３Ｃ値の平均の同位体偏向を示すであろうことが開示される。
【０２１０】
対照的に、Cochennec（2013）においてはまた、コメおよびコムギなどのＣ３植物からのフェルラ酸からのバニリンは、−３８％〜−３５‰の範囲のδ１３Ｃ値同位体変更を示し、これは、それを、Ｃ４植物のフェルラ酸からのバニリン、またはマメ類（CAM植物）からのバニリンと明らかに区別することが開示される。
【０２１１】
したがって、Ｃ４植物についてのδ１３Ｃ値は、一般に、Ｃ３植物についてのδ１３Ｃと比較して、値が「より負でない（less negative）」または「より高い」であろう。
【０２１２】
以下の表１において開示されるバニラ豆からのバニリンについてのδ１３Ｃ値（約−２１．５‰ＶＰＤＢ）は、Ｃ３植物とＣ４植物との間である。
【０２１３】
まとめると：一研究によれば（Cochennec C Perfumer & Flavourist (2013) 38: 20-27を参照）、Ｃ４植物（例えばトウモロコシ）からのフェルラ酸は、-１６〜-１９‰の範囲のδ１３Ｃ値を有し、Ｃ３植物（例えばコメ）からのバニリンは、-３５-３８‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２１４】
別の研究によれば（以下の表１を参照）、Ｃ３植物（例えばコメ）からのバニリンについてのδ１３Ｃ値は、典型的には−３６‰〜−３７‰ＶＰＤＢの領域である；
【０２１５】
本明細書において例５において開示されるように、出願人らは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２５〜約−３２‰の範囲のδ１３Ｃ値を有することを示した。
【０２１６】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２５‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２１７】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２６‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２１８】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２７‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２１９】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２８‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２２０】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−２９‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２２１】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−３０‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２２２】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−３１‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２２３】
好ましくは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／天然バニリン酸は、約−３２‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２２４】
天然フェルラ酸（ＦＡ）／天然バニリン（ＮＶ）（オイゲノールからのもの）は、他の天然植物ソースからのＦＡ／ＮＶとは異なる：
【０２２５】
したがって、上のデータを考慮すると、Ｃ３、Ｃ４およびＣＡＭ植物が異なるδ１３Ｃ値の特徴を有し、Ｃ３、Ｃ４の草本およびＣＡＭ植物を検出することおよびそれらのδ１３Ｃ値により区別することを可能にするのみならず、本開示の方法を用いてオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸および天然バニリンは、少なくとも、Ｃ３、Ｃ４植物から（すなわち、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンから選択される天然植物群のソースから）得られるδ１３Ｃ値とは異なる、およびＣＡＭ植物についてのδ１３Ｃ値（例えば、伝統的なバニラ豆の熟成からの、および／または加速させた生物学的方法（例えばWO2010/066060およびWO 2010/066061を参照；これらの全内容は、本明細書において参考として援用される）を用いることからのバニラ抽出物についてのδ１３Ｃ値）とは異なるδ１３Ｃ値を有する。
【０２２６】
表１：異なる起源および製造のバニリン中の炭素および水素の安定な同位体比（Lebensmittelchemie (2010) 64: 17-48中の「Herkunf und Authentizitaet von Vanillearomen」の翻訳として得られた）−表１中の文献についての全ての参照は、上記の2010年の刊行物において引用される文献についての参照である。
【表１】
0006596009.tif 000008
異なる科学的研究において決定された方法
【０２２７】
上で引用される２０１０年の刊行物（上の表１を提供する）において、以下のことが記述される：バニリン分子の様々な位置における２Ｈ／１Ｈ（Ｄ／Ｈ）比は、位置的（positional）２Ｈ−ＮＭＲ測定により決定することができる。ＳＮＩＦ−ＮＭＲ（登録商標）としても知られる方法はまた、分子の様々な位置における２Ｈ同位体の分布は、統計学的には起きないが、原材料の（生）合成の間の識別効果に依存的であるという事実に基づく。評価に関連性があるバニリン分子の４つの（Ｄ／Ｈ）同位体比にわたって、天然バニリンと合成バニリンとの配合すら検出することができる。方法は、AOAC（Association of Official Analytical Chemists）ラウンド・ロビン実験において試験され、特に芳香工業において真偽の監視のための用いられる。現在までに、最高の可能な純度を有する比較的大量の物質が必要とされているので、この方法は、食品の公的監視および質のコントロールの実施においては適用可能ではないか、または非常に限定された程度までしか適用可能でない。１３Ｃ−ＮＭＲは著しくより高感度であるため、ＮＭＲを用いるバニリン分子中の位置的１３Ｃ分布の決定についての第１の結果は、２Ｈ−ＮＭＲに対して利点を約束する。したがって、この場合において、化学的に合成されたバニリンを生合成バニリンから区別する、特に著しい可能性が存在する。この方法も、おそらくはまた、予見可能な将来の内においては、少数の特別な研究室において用いられ得るのみである。
【０２２８】
別の研究（Cochennec 2010）は、以下のことを教示する：１３Ｃ  ＩＲＭＳおよび２Ｈ−ＳＮＩＦ−ＮＭＲ（部位特異的天然同位体分画-核磁気共鳴）などの同位体偏向分析は、バニラの真偽の評価のための方法であり、バニラ豆からのバニラを、全ての他の既知のバニリンのソースまたはその混合物から明確に識別するために、一般に用いられる。１３ＣＩＲＭＳおよび２Ｈ−ＳＮＩＦ−ＮＭＲ同位体偏向法は、コメ糠からのフェルラ酸の生物変換により得られたバニリンを、バニラ豆由来のバニリンから完全に識別し、したがって、ソースの真性を保証したことが報告されている（Cochennec C Perfumer & Flavourist (2013) 38: 20-27を参照）。
【０２２９】
本明細書において用いられる場合、用語、位置的２Ｈ−ＮＭＲ測定、Ｄ−ＮＭＲおよびＳＮＩＦ−ＮＭＲ（登録商標）は、交換可能に用いられ、「Ｄ−ＮＭＲ」についての任意の参照は、２Ｈ−ＮＭＲ測定および／またはＳＮＩＦ−ＮＭＲ（登録商標）ｎについての参照である。
【０２３０】
同位体データベースにおいて先には知られていなかった各々の新たなバニリンのソース、例えばオイゲノールからのフェルラ酸からの天然バニリンについて、植物学的起源の決定は、Ｄ−ＮＭＲと組み合わせた同位体決定を用いて行うことができる。このことに関して、以下の議論により証明されるとおり、Ｄ−ＮＭＲは、出願人らにより、本発明の方法を用いてオイゲノールから得ることができる天然に誘導されたフェルラ酸／バニリンと、リグニンおよび／またはグアヤコールから得られた人工的に誘導されたおよび／または合成のフェルラ酸／バニリンとの間を区別するために、首尾よく用いられた。
【０２３１】
天然フェルラ酸（ＦＡ）／天然バニリン（ＮＶ）（オイゲノールからのもの）は、他の人工的に誘導された／化学的に合成されたＦＡ／ＮＶソースからのＦＡ／ＮＶとは異なる：
【０２３２】
上の表１および表６（例５）が示すとおり、人工的に／合成により誘導されたリグニンは、約−２７〜−２９‰の範囲のδ１３Ｃ値を有し、これは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができるフェルラ酸／バニリンについてのδ１３Ｃ値の範囲内の部分範囲である。さらに、人工的に／合成により誘導されたグアヤコールは、約−２５〜−３６‰の範囲のδ１３Ｃ値を有し、これは、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができるフェルラ酸／バニリンについての約−２５〜−３２‰のδ１３Ｃ値の範囲と重複する範囲である。
【０２３３】
しかし、例６が示すとおり、多様なソースからのバニリンのフェニル環上のデューテリウムの集積を測定する二次試験もまたＤ−ＮＭＲを用いて測定された場合に、本開示の方法によりオイゲノールから得られたフェルラ酸／バニリン試料は、リグニンおよび／またはグアヤコール試料とは異なる位置でクラスター形成し、したがって、δ１３Ｃ値測定と組み合わせた二次試験としてのＤ−ＮＭＲの使用もまた、天然フェルラ酸／バニリンの植物学的起源が同定されることを容易にする。
【０２３４】
本開示の他の側面は、以下の番号が付けられた段落を含む：
１．オイゲノールをフェルラ酸に変換する１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む、組み換えE.coli株。
２．フェルラ酸を調製する方法であって、オイゲノールを、１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む組み換えE.coli微生物、あるいはオイゲノールをフェルラ酸に生体内変換するその単離された酵素に、前記オイゲノールをフェルラ酸に生体内変換するために十分な期間にわたり供すること、ならびにこのようにして形成されたフェルラ酸を回収することを含む、前記方法。
３．前記フェルラ酸が天然フェルラ酸である、段落２に記載の方法。
４．フェルラ酸をバニリンにさらに変換することを用いることを含む、段落２または３に記載の方法。
５．バニリンを天然フェルラ酸から製造する、段落４に記載の方法。
６．第１の組み換えE.coli微生物がオイゲノールをフェルラ酸に生体内変換し、第２の組み換えE.coli株がフェルラ酸をバニリンに生体内変換する、段落４〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．第１の組み換えE.coli株が、１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含むE.coli微生物である、段落６に記載の方法。
８．第２の組み換えE.coli微生物が、１以上のechおよびfcs遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む、段落６または７に記載の方法。
９．フェルラ酸を調製する方法であって、オイゲノールを、オイゲノールをフェルラ酸に変換する、１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む組み換えE.coli微生物、あるいはその単離された酵素に、前記オイゲノールをフェルラ酸に変換するために十分な期間にわたり供すること、ならびにこのようにして形成されたフェルラ酸を回収することを含み、ここで、組み換えE.coli微生物が、オイゲノールをフェルラ酸に生体内変換する場合は、当該組み換えE.coli微生物を、炭素源を含む培地中に含有させる、前記方法。
１０．培地がM9A培地である、段落９に記載の方法。
１１．フェルラ酸が、約マイナス２５‰〜約マイナス３２‰のδ１３Ｃ値を有する、段落９または１０に記載の方法。
１２．フェルラ酸をバニリンにさらに変換することを含む、段落９〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．フェルラ酸を調製する方法であって、オイゲノールを、オイゲノールをフェルラ酸に生体内変換する、１以上のVaoA、MtSAD1およびAtADH遺伝子またはそのバリアント、相同体、変異体、誘導体もしくはフラグメントを含む組み換えE.coli微生物、あるいはその単離された酵素に供して、前記オイゲノールを、少なくとも５〜６ｇ／ｌの濃度で約４〜約２５時間の期間にわたり、約１５〜１６ｇ／ｌの濃度で約４〜約４０時間の期間にわたり、および約２５〜２７ｇ／ｌの濃度で約４〜約７０時間の期間にわたり、フェルラ酸に生体内変換すること、ならびにこのようにして形成されたフェルラ酸を回収することを含む、前記方法。
１４．バニリンが、約マイナス２５‰〜約マイナス３２‰のδ１３Ｃ値を有する、段落１３に記載の方法。
１５．δ１３Ｃ値および／またはD-NMR値測定を用いて天然フェルラ酸および／または天然バニリンの真偽を決定する、段落１１または段落１４に記載の方法。
１６．バニリンを製造する生物変換方法であって、混合物中でVaoA遺伝子を発現させること、混合物中でMtSAD1遺伝子を発現させること、混合物にオイゲノールを供給すること、ならびに菌Amycolalopsis sp.微生物（Zhp06）および／または組み換えE.coli微生物と共にインキュベートすることによりフェルラ酸をバニリンに変換することを含む、前記方法。
１７．段落１〜１６のいずれか一つに記載のオイゲノールから得ることができるフェルラ酸／バニリン試料の真偽を確認するための、δ１３Ｃ値および／またはD-NMR値測定の使用。
１８．マイナス２５‰〜約マイナス３２‰の範囲のδ１３Ｃ値が、オイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸および／または天然バニリンの指標である、段落１７に記載の使用。
１９．オイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸および／または天然バニリンの真偽を、D-NMR試験を用いて確認する、段落１８に記載の使用。
【０２３５】
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて用いることができるさらなる配列は、以下の通りである：
配列番号１７．PRT タルウマゴヤシ（MtSAD1のアミノ配列またはそのバリアント）
【数１】
0006596009.tif 000009
【０２３６】
配列番号１８．DNA タルウマゴヤシ（MtSAD1のDNA配列またはそのバリアント）
【数２】
0006596009.tif 000010
【０２３７】
配列番号１９．PRT シロイヌナズナ（AtADHのタンパク質配列またはそのバリアント）
【数３−１】
0006596009.tif 000011
【数３−２】
0006596009.tif 000012
【０２３８】
配列番号２０．DNA シロイヌナズナ（AtADHのDNA配列またはそのバリアント）
【数４】
0006596009.tif 000013
配列番号２１．DNA Penicillium simplicissimum（VaoAのDNA配列またはそのバリアント）
【数５】
0006596009.tif 000014
【０２３９】
本明細書全体およびそれに続く請求の範囲にわたり、文脈が他を必要としない限り、単語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのバリエーションは、記述された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味しないことが理解されるであろう。用語「含む（comprising）」はまた、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（comprising）」組成物は、排他的にＸからなっても、何か付加的なもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。また、本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の参照対象を含むことに注意しなければならない。例として、「a gene」または「an enzyme」についての参照は、「one or more genes」または「one or more enzymes」についての参照である。
【０２４０】
本開示は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解されるべきである。なぜならばそれらは変化し得るからである。また、本明細書において用いられる用語は、特定の態様を記載することのみを目的とし、添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろう本開示の範囲を限定することは意図されないことはまた理解される。他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示により、使用される従来の分子生物学、微生物学および組み換えDNA技術が存在し得、これらは当該分野における技術の範囲内である。
本開示は、その適用において、以下の説明において記載されるか、図面において説明される成分の構成および配置の詳細に限定されない。本開示は、他の態様ならびに多様な方法において実施されることおよび実行されることが可能である。また、本明細書において用いられる表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」および本明細書におけるそれらのバリエーションの使用は、その後に列記された項目およびそれらの均等物、ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
好ましくは、本明細書において用いられる用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」（Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.およびKolbl, H.編（1995）Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）において記載されるように定義される。
いくつかの文書は、本明細書の本文を通して引用される。本明細書において引用される文書（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書、GenBankの配列寄託の受入番号など）の各々は、上記または下記に関わらず、本明細書によりその全体において参考として援用される。
【０２４１】
本明細書において記載される例は、本開示の説明であり、本開示に対する限定となることは意図されない。本開示の異なる態様は、本開示により記載されてきた。本明細書において記載され説明される技術に対して、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、多くの修飾およびバリエーションが行われ得る。したがって、例は、単に説明的なものであって、本開示の範囲に対して限定するものではないことが理解されるべきである。
【０２４２】
より詳細な図面の説明
図１は、オイゲノールからフェルラ酸へ、そしてバニリンへの、既知および新規の酵素経路を説明する；
【０２４３】
図２は、CgVaoA-pETDuetコンストラクトの模式図を提供する。VaoA遺伝子を、ベクターpETDuetのNde/Xho部位中にクローニングし、CgVaoA-pETDuetを生じた；
【０２４４】
図３は、MtSADrbsAtADH-pRSFDuetコンストラクトの模式図を提供する。MtSADおよびAtADHを、cgcagcAGGAGGttaagのrbs配列で連結し、ベクターpRSFDuetのNde／Xho部位中にクローニングした。２つのコンストラクト、CgVaoA-pETDuetおよびMtSADrbsAtADH-pRSFDuetを、BL21（DE3）細胞中に同時形質転換した；
【０２４５】
図４は、E. coliにおけるMtSAD1のタンパク質発現を開示する。矢印はMtSAD1タンパク質を示す；
【０２４６】
図５Ａ〜５Ｂは、MtSAD1の遺伝子産物によるコニフェリルアルコールの生物変換を示す。図５Ａ（上パネル）において示されるとおり、MtSAD1を発現するE. coli細胞は、培養中に供給されたコニフェリルアルコール（ピーク１）をコニフェリルアルデヒド（ピーク３）に変換した。驚くべきことに、それはまた、フェルラ酸（ピーク２）を産生した。変換時間が増大するにつれて、コニフェリルアルデヒドのレベルは低下し、およびしたがって、フェルラ酸のレベルが増大した（図５Ｂ、下パネル）。これらの観察に基づいて、出願人は、MtSAD1タンパク質は二機能性酵素であり、アルコールをアルデヒドに生物変換し、さらにアルデヒドをフェルラ酸に変換することを示す；
【０２４７】
図６は、MtSAD1およびAtADHの遺伝子産物（これはアルコールのフェルラ酸へのin-vivo変換を増大した）を含むE. coliにおけるコニフェリルアルコールのフェルラ酸への生物変換を示す；
【０２４８】
図７は、M9A培地中でのE. coliにおけるオイゲノールによるフェルラ酸のin vivo生成を示す。
【０２４９】
VaoAおよびMtSAD1と共のE. coliの培養中では、３６時間中に約０．２ｇ／Ｌのフェルラ酸が産生されたが、AtADHの導入により、２５ｍＬのシェイカーフラスコ中で、２．４ｇ／Ｌのフェルラ酸が得られた；
【０２５０】
図８は、オイゲノールから調製されたフェルラ酸によるバニリンの生成を示す。出願人らの結果は、２１．６ｇ／Ｌのフェルラ酸（ＦＡ）から１３．４ｇ／Ｌのバニリンの収量が得られたことを示し、これは、７９．２％のバニリンのモル濃度収率に対応する。バニリンの蓄積は、多かれ少なかれ、発酵期間にわたって直線的である。しかしながら、出願人は、最初の２４時間における急速なＦＡの減少を観察し、このことは、S. viridosporus（Zhp06）が、ＦＡを、バニリンに生物変換される前に、異なる中間体へと生物変換することを示唆している；
【０２５１】
図９は、echおよびfcs遺伝子を含む、組み換えE. coli株が、LB培地中では低効率であるがM9A培地中では相対的により高い効率で（なぜならば、全ての添加されたフェルラ酸が、生物変換条件を用いて１１時間内にバニリンへと生物変換されたので）フェルラ酸（青色（上）矢印）をバニリン（赤色（下）矢印）へと転換することができることを示す；
【０２５２】
図１０は、M9A培地中でのバニリン生成のHPLC分析を示し、ここで、全ての添加されたフェルラ酸が、生物変換条件を用いて１１時間以内にバニリンに変換される；
【０２５３】
図１１は、多様なバニリン試料：合成バニリン−石油化学的前駆体から誘導されたバニリン（橙色のｘのもの）、ex-フェノール／グアヤコール（緑色のｘのもの）、ex-フェルラ酸（紫色の塗りつぶした三角形）、オイゲノールからのex-クローブ−ＵＳ「天然バニリン」（青色の塗りつぶしていない三角形）、ex-マダガスカルビーン(青色の塗りつぶしていない正方形）、ex-リグニン(紫色の塗りつぶしていない円）のＤ−ＮＭＲを示す；ならびに
【０２５４】
図１２は、オイゲノールのバニリンへの生体内変換、ならびにバニリンのバニリン酸およびプロトカテクアルデヒドへのさらなる変換のための模式的経路を示す。
【０２５５】
例
例２５ｍＬ（０．０２５リットル）シェイカーフラスコ中でのオイゲノールからのフェルラ酸の生成。
それぞれタルウマゴヤシおよびシロイヌナズナからの、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（MtSAD1）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（AtADH）のクローニング。MtSAD1およびAtADHを、タルウマゴヤシ（生態型A17）およびシロイヌナズナ（生態型Columbia-0）からクローニングした。Trizol Plus RNA精製キット（Invitrogen Inc.）を用いて、植物の全RNAを抽出した。Promega Inc.製のIm Prom-II（商標）逆転写系を、製造者の手引書に従って用いて、cDNAの合成を行った。New England Biolab’s Phusion PCRキットを表２において列記されるプライマーと共に用いて、合成されたcDNAから遺伝子を増幅した。
【０２５６】
対応する制限酵素によるPCR生成物の消化の後で、pRSFDuet-1ベクターのNde IおよびXho I部位のクローニング部位中にMtSAD1を挿入した。AtADHは、pCDFDuet-1のBgl IIおよびXho Iのクローニング部位中に挿入した。配列の確認の後で、これらのコンストラクトをそれぞれBL21（DE3）中に導入した。ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４において列記し、対応するアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号３において列記する。
表２．MtSAD1、AtADHおよびVaoAのクローニングのために用いられたプライマー
【表２】
0006596009.tif 000015
配列番号１．MtSAD1のアミノ配列：
【数６】
0006596009.tif 000016
配列番号２．MtSAD1のDNA配列
【数７】
0006596009.tif 000017
配列番号３．AtADHのタンパク質配列
【数８】
0006596009.tif 000018
配列番号４．AtADHのDNA配列
【数９】
0006596009.tif 000019
【０２５７】
VaoA発現ベクターの構築。VaoA遺伝子は、E. coliにおけるコドン最適化により、以下に列記されるDNA配列として合成し、タンパク質配列を生じた。
配列番号５．VaoAのタンパク質配列
【数１０】
0006596009.tif 000020
配列番号６．VaoAのDNA配列
【数１１】
0006596009.tif 000021
【０２５８】
遺伝子を、上記のとおりPCRで、表２において列記されるプライマーを用いて増幅した。アガロースゲルからPCR生成物を回収し、Nde IおよびXho Iで消化し、次いでpETDuet-1発現ベクターのNde IおよびXho I部位に挿入した。発現ベクターを、次いで、Topo 10コンピテント細胞中にトランスフォームした。シークエンシングにより正しいインサートを有するコンストラクトを確認し、VaoA-pETDuetと命名した。
【０２５９】
E coli中でのVaoAおよびMtSAD1の共発現。VaoA-pETDuetおよびMtSAD1-pRSFDuetのプラスミドを、慣用的なプロトコルに従って、E. coli BL21（DE3）コンピテント細胞中に共トランスフォームした。カナマイシンおよびアンピシリンを用いてLBプレート上で生育するコロニーを、２つの外来遺伝子の存在のコロニーPCR評価のためにピックアップした。陽性のコロニーを、生物変換研究のために用いた。
【０２６０】
E coli中でのVaoA、MtSAD1およびAtADHの共発現。VaoA-pETDuet、MtSAD1-pRSFDuetおよびAtADH-pCDFDuetのプラスミドを、慣用的なプロトコルに従って、E. coli BL21（DE3）コンピテント細胞中に共トランスフォームした。カナマイシン、アンピシリンおよびスペクチノマイシンを用いてLBプレート上で生育するコロニーを、３つの外来遺伝子の存在について、コロニーPCRによりチェックした。陽性のコロニーを、生物変換研究のために用いた。
【０２６１】
図２は、CgVaoA-pETDuetコンストラクトの模式図を提供する。VaoA遺伝子を、ベクターpETDuetのNde／Xho部位中にクローニングし、CgVaoA-pETDuetを生じた。
【０２６２】
図３は、MtSADrbsAtADH-pRSFDuetコンストラクトの模式図を提供する。MtSADおよびAtADHをcgcagcAGGAGGttaagのrbs配列で連結し、ベクターpRSFDuetのNde／Xho部位中にクローニングした。２つのコンストラクト、CgVaoA-pETDuetおよびMtSADrbsAtADH-pRSFDuetを、BL21（DE3）細胞中に共トランスフォームした。
【０２６３】
プラスミドCgVaoA-pETDuetおよびMtSADrbsAtADH-pRSFDuetの両方を含む新たな組み換えE.coli株は、オイゲノールをフェルラ酸に生物変換する。
【０２６４】
コニフェリルアルコールの生物変換。MtSAD1またはMtSAD1＋AtADHを含むE coli BL21（DE3）を、１．２５ｇ／Ｌの酵母抽出物を５０μｇ／Ｌのアンピシリンおよび１００μｇ／Ｌのスペクチノマイシンと共に加えたM9培地中で、ＯＤ６００＝０．６まで、シェイカー中で３７℃で増殖させ、次いで、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度までラクトースを添加しながら３０℃に変化させ、２つの遺伝子の発現を誘導した。８時間の発現誘導の後で、５０％のメタノール中に溶解したコニフェリルアルコールを、培養に添加した。同じ培養条件下において培養を振とうし続け、HPLC分析のために、間隔をあけて試料を採取した。
【０２６５】
オイゲノールのフェルラ酸への生物変換。VaoA、MtSAD1およびAtADHを含むE coli BL21（DE3）を、１．２５ｇ／Ｌの酵母抽出物を５０μｇ／Ｌのアンピシリンおよび１００μｇ／Ｌのスペクチノマイシンと共に加えたM9A培地中で、ＯＤ６００＝０．６まで、シェイカー中で３７℃で増殖させ、次いで、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度までラクトースを添加しながら３０℃に変化させ、２つの遺伝子の発現を誘導した。８時間の発現誘導の後で、オイゲノールを、１リットルの培養物あたり０．１ｍＬ／時間の速度で培地に添加した。同じ培養条件下において培養を振盪し続け、HPLC分析のために、間隔をあけて試料を採取した。
【０２６６】
発酵槽中でのフェルラ酸のバニリンへの変換。用いたS. viridosporus種培地は、グルコース酵母抽出物（GYE）培地であり、発酵槽の培地成分は、以下のとおりである：酵母抽出物、８ｇ／Ｌ；グルコース、３０ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ；ならびに０．２ｍＬ／Ｌの消泡剤。培地を、１２０℃で、それぞれ１５分間および３０分間、オートクレーブした。
【０２６７】
単一のS. viridosporus［改名されたAmycolalopsis sp.株（Zhp06）］コロニーを、TSB中に播種し、３０℃で、対数期後期まで振とうし、次いで、２Ｌの発酵槽中に５％で継代した。発酵槽（New Brunswick Scientific Bioflo-115 3.0L）を、３０℃において、２０％を超えるＤＯを維持するように、ｒｐｍおよび通気により制御した。増殖の間、ｐＨは７に制御した。新たに作製した１ＭのＮａＯＨ中のフェルラ酸（ＦＡ）ストック溶液を、静止期初期の間、発酵槽中に約１０％で供給し、HPLCアッセイにより、ＦＡ、バニリンおよびバニリンアルコールの濃度を追跡した。ＦＡが培養から枯渇した場合、ＦＡ溶液の新たなバッチを発酵槽に供給して、生体内変換を持続させた。Amycolalopsis sp.株（Zhp06）を用いてＦＡを天然バニリン（ＮＶ）に変換する方法は、US2013/00115667A1およびCN102321563B1において詳細に記載され、これらの内容は、本明細書において参考として援用される。
【０２６８】
HPLC分析。Dionex Ultimate 3000系を用いて、フェルラ酸およびオイゲノールのHPLC分析を行った。Dionex Acclaim 120 C18カラム（粒子サイズ３μｍ；１５０ｘ２．１ｍｍ）における逆相クロマトグラフィーにより、０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸（溶離液Ａ）およびアセトニトリル（溶離液Ｂ）、溶離液Ｂ１０〜４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の範囲における勾配で、０．６ｍｌ／分の流速で、中間体を分離した。定量化のために、全ての中間体を、外部標準によりキャリブレーションした。系におけるダイオードアレイ検出器により同定される保持時間ならびに対応するスペクトルにより、化合物を同定した。
【０２６９】
発酵を通して得られるバニリンおよびフェルラ酸基質の同位体分析。フェルラ酸の様々なソースと共に、生体内変換されたバニリンの数回分のバッチを、Isotech Laboratories, Inc.（Champaign, Illinois）においてEA-IRMSによりδ１３Ｃ分析のために分析した。
【０２７０】
結果Ｉ
MtSAD1タンパク質は二機能性である
【０２７１】
MtSAD1タンパク質は、コニフェリルアルコールのコニフェリルアルデヒドへの変換、およびコニフェリルアルデヒドのフェルラ酸への変換を触媒することにおいて、二機能性活性を示した。図２において示されるとおり、MtSAD1遺伝子産物は、SDS-PAGEにより試験されたE. coliにおいて首尾よく発現された。MtSAD1タンパク質は、可溶性および不溶性の両方の画分中に存在した。
【０２７２】
MtSAD1タンパク質は、コニフェリルアルコールのコニフェリルアルデヒドへの変換を触媒する；それはまた、後者をフェルラ酸に変換する。
【０２７３】
図５Ａ（上パネル）において示されるとおり、、MtSAD1の発現を有するE. coli細胞は、培養中に供給されたコニフェリルアルコール（ピーク１）をコニフェリルアルデヒド（ピーク３）に変換した。驚くべきことに、それはまた、フェルラ酸（ピーク２）を産生した。変換時間が増大するにつれて、コニフェリルアルデヒドのレベルは低下し、およびしたがって、フェルラ酸のレベルが増大した（図５Ｂ、下パネル）。これらの観察に基づいて、出願人は、MtSAD1タンパク質は二機能性酵素であり、アルコールをアルデヒドに変換し、アルデヒドをフェルラ酸にさらに変換することを示す。
【０２７４】
AtADHタンパク質の存在は、E. coliにおけるオイゲノールのフェルラ酸への変換効率を改善する。
【０２７５】
上の結果から、出願人は、工業的利用のためには触媒効率が低いことを認める。アルデヒドデヒドロゲナーゼを、シロイヌナズナ（AtADH）からクローニングした。MtSAD1およびAtADHの共発現を有するE. coli細胞は、アルコールのフェルラ酸へのin vivo変換を劇的に増大させた（図４）。
【０２７６】
VaoA、MtSAD1およびAtADHを含むE. coliにおけるオイゲノールを用いるフェルラ酸の生成。
【０２７７】
VaoA、MtSAD1の発現を有するE. coli細胞は、オイゲノールをフェルラ酸に変換することができる。AtADHの導入により、フェルラ酸の生成は、劇的に増大した。２５ｍＬのシェイカーフラスコ中で、VaoAおよびMtSAD1を有するE. coliの培養においては３６時間中に約０．２ｇ／Ｌのフェルラ酸が産生されたが、AtADHの導入により、２．４ｇ／Ｌのフェルラ酸が得られた（図５Ａ〜５Ｂ）。
【０２７８】
例２Ａ．５０リットルの発酵槽中の３０Ｌ容積中でのオイゲノールを用いるフェルラ酸の生成。
CgVaoA-pETDuetおよびMtSADrbsAtADH-pRSFDuetを保有するE. coli細胞を含む１ミリリットルのグリセロールストック溶液を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１ＬのLB培地中に播種し、３７℃で一晩種培養として培養し、これをついで、５０リットルの発酵槽中の１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する３０リットルのLB培地中に移した。初期温度を３７℃に設定し、３００ｒｐｍで撹拌し、溶解酸素（ＤＯ）を３０％を超えるように維持し、０．６ｖｖｍで通気し、ｐＨは初めは制御しなかった。１〜１．５時間後に、温度を３０℃に低下させ、２Ｌの２２．５ｇ／Ｌのラクトースを添加し、１５ｇ／Ｌの最終濃度にして、誘導を開始した。この時点において、容積は約３３〜３４リットルである。通気を０．６ｖｖｍに維持し、撹拌を３５０ｒｐｍに上げ、ＤＯを１５％を超えるように維持した。１４〜１６時間にわたる発酵の後で、基質オイゲノールを添加し、温度を３０℃に、通気を０．６ｖｖｍに、撹拌を３５０ｒｐｍに、ＤＯを１５％超に維持した。オイゲノール添加の速度は、以下のとおりである：オイゲノールを、１６〜３２時間において発酵ブロス１Ｌあたり約０．６７％／ｈで、３２〜４８時間において約０．４％／ｈ／Ｌまで低下させ、その後、７２時間における終了時までにさらに約０．３％／ｈ／Ｌまで低下させた。HPLC分析のために、間隔をあけて発酵槽から試料を採取した。
【０２７９】
結果２Ａ
本発明者らの発酵研究において、オイゲノールからのＦＡの高変換が達成された。平均して、本発明者らの研究条件下において、約２５〜３０ｇ／Ｌのタイターが得られ、中間体生成物であるコニフェリルアルコール（ＣＡ）の蓄積は非常に少なかった（表３）。
表３．５０リットル発酵槽中でのオイゲノールのフェルラ酸への生物変換。
【表３】
0006596009.tif 000022
【０２８０】
比較データ
Overhageら（Appl Env Microbiol (2003) 69; 6569-6576）は、E.coliの組み換え株中での、オイゲノールをフェルラ酸に変換するための生体内変換方法、およびバニリンへのさらなる変換を開示する。生体内変換方法は、首尾よく３０Ｌスケールにトランスファーされ、ここで、３０時間の総発酵時間の後で、１４．７ｇ／ｌのフェルラ酸濃度が得られた。インキュベーション時間を延長することにより収率を改善するために方法を増強することができたか否かについては、何らのデータ／情報も提供されなかった。US 20140087428Aにおいては、第２の組み換えE.coli株を用いて得られたバニリンの収量（２時間後に０．３ｇ／ｌのバニリン）は、経済的に実現可能な方法のためには低すぎたことが報告された。
【０２８１】
E.coliにおける代謝工学アプローチの首尾よい採用により、バニリン生成のための低コストかつ工業的に経済的な方法を提供することができる。E.coliの組み換え株においてオイゲノールをフェルラ酸に変換するための生物変換／生体内変換方法が開示される。Pseudomonas sp.HR199の既知の細菌のCalA／CalB遺伝子（Overhage et al 2003 Appl Env Microbiol (2003) 69; 6569-6576において開示されるもの）を、植物に基づく遺伝子（MtSAD1およびAtADH1）で置き換え、これは、オイゲノールを、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒドそして最終的にはフェルラ酸に首尾よく変換した。この生体内変換を３０Ｌの発酵容積までスケールアップしたところ、６４時間のインキュベーションの後で、フェルラ酸（２６ｇ／ｌ）を回収した。
【０２８２】
例２Ｂ．フェルラ酸のバニリンへの生物変換。
本発明者らのVaoA-MtSAD1-AtADH系によりオイゲノールから変換された、精製されたフェルラ酸（ＦＡ）を、バニリン生成のための基質として用いた。Amycolalopsis sp.株（Zhp06）とUS 2013/0115667A1およびCN102321563B1において記載されるような方法とを用いて、ＦＡを天然バニリン（ＮＶ）に変換した。出願人らの結果は、２１．６ｇ／ＬのＦＡから１３．４ｇ／Ｌのバニリンの収量が得られたことを示し、これは、７９．２％におけるバニリンのモル濃度収率に相当する（図８）。バニリンの蓄積は、多かれ少なかれ、発酵期間にわたり直線的である。しかしながら、出願人は、最初の２４時間における急速なＦＡの減少を観察し、このことは、S. viridosporusが、ＦＡを、バニリンに変換される前に異なる中間体に変換することを示唆している。
【０２８３】
例３．フェルラ酸を用いてバニリンを生成するためのE. coli株の開発
天然バニリンを生成するために、バニリンを産生する遺伝子ech（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼ）およびfcs（トランス−フェルロイル−ＣｏＡシンターゼ）を、E. coli中にクローニングした。
【０２８４】
例示的方法
AmFCS発現ベクターの構築。AmFCS遺伝子は、E. coliにおけるコドン最適化により、以下に列記される配列として合成した。PCRで遺伝子を増幅し、pCDFDuet-1発現ベクターのNde IおよびXho I部位中に挿入し、AmFCS-pCDFDuetのプラスミドを生じた。
配列番号７：FCSについてのヌクレオチド配列
【数１２】
0006596009.tif 000023
配列番号８：FCSについてのアミノ酸配列：
【数１３】
0006596009.tif 000024
【０２８５】
PfECH発現ベクターの構築。PfECH遺伝子をE. coliにおけるコドン最適化により、以下に列記される配列として合成した。PCRで遺伝子を増幅し、pRSFDuet-1発現ベクターのNde IおよびXho I部位中に挿入し、AmFCS-pRSFDuetのプラスミドを生じた。
配列番号９：ECHについてのヌクレオチド配列
【数１４】
0006596009.tif 000025
配列番号１０：ECHについてのアミノ酸配列：
【数１５】
0006596009.tif 000026
【０２８６】
E coli中でのAmFCSとPfECHとの共発現。AmFCS-pCDFDuetおよびPfECH-pRSFDuetのプラスミドを、BL21（DE3）中に共トランスフォームした。カナマイシンおよびスペクチノマイシンを含むLBプレート中で生育するコロニーを、コロニーPCRチェックのためにピックアップした。陽性のコロニーを生物変換研究のために用いた。
【０２８７】
フェルラ酸のバニリンへの生物変換。AmFCS-pCDFDuetおよびPfECH-pRSFDuetを含むE coli BL21(DE3）を、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを加えたLB培地またはM9A培地（１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのグルコース）中で、ＯＤ６００＝０．６まで、シェイカー中で３７℃で増殖させ、次いで、IPTGを０．５ｍＭの最終濃度まで添加しながら３０℃に変化させ、２つの遺伝子の発現を誘導した。５時間の発現誘導の後、０．１ＭのＮａＯＨ中に溶解したフェルラ酸（１００ｇ／Ｌ）を、２ｇ／Ｌの最終濃度まで培養に添加した。同じ培養条件下において培養を振とうし続け、最初のフェルラ酸の添加の後で、１ｇ／Ｌのフェルラ酸を培養に添加し、HPLC分析のために、間隔をあけて試料を採取した。
【０２８８】
HPLC分析。Dionex Ultimate 3000系により、フェルラ酸およびバニリンのHPLC分析を行った。Dionex Acclaim 120 C18カラム（粒子サイズ３μｍ；１５０ｘ２．１ｍｍ）における逆相クロマトグラフィーにより、０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸（溶離液Ａ）およびアセトニトリル（溶離液Ｂ）、溶離液Ｂ１０〜４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の範囲における勾配で、０．６ｍｌ／分の流速で、中間体を分離した。定量化のために、全ての中間体を、外部標準によりキャリブレーションした。系におけるダイオードアレイ検出器により同定される保持時間ならびに対応するスペクトルにより、化合物を同定した。
【０２８９】
図９が示すとおり、組み換えE. coli株は、LB培地中で、相対的に低い効率で、フェルラ酸（青色（上）矢印）をバニリン（赤色（下）矢印）に変換する。フェルラ酸の添加の１１時間後、LB培養中には、少量のバニリンが観察された。対照的に、M9A培地中での変換効率は、本発明者らの変換条件において１１時間以内に全ての添加されたフェルラ酸がバニリンに変換されたことから、相対的に高い（図９）。合計３ｇ／Ｌの添加されたフェルラ酸の全てが、完全に変換され、２４時間の変換の後で、バニリンの収量は約２．２ｇ／Ｌであった。
【０２９０】
天然バニリンを生成するために、バニリンを産生する遺伝子echおよびfcsを、E.coli中にクローニングし、LB培養中では成功は限定されたが、M9A培養培地中では変換率ははるかに改善された。
【０２９１】
例４．δ１３Ｃ（Ｃ１３／Ｃ１２）同位体分析.
フェルラ酸の異なるソース（例えばトウモロコシおよびオイゲノールからのもの）と共に、生物変換／生体内変換されたバニリンの数回分のバッチを、１３Ｃ／１２Ｃ（δ１３Ｃ）分析のために、Isotech Laboratories, Inc.（Isotech Laboratories, Inc. 1308 Parkland Court｜Champaign Illinois 61821）においてEA-IRMSにより分析した（表４）。
【０２９２】
トウモロコシからのフェルラ酸／バニリンは、WO 2014/106189A2において開示される方法に従って調製した。WO 2014/106189A2の全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０２９３】
オイゲノールからのフェルラ酸／バニリンは、本明細書において開示され、請求される方法に従って調製した。
【０２９４】
δ１３Ｃ値は、以下のとおり決定した：
【０２９５】
１３Ｃ／１２Ｃについての比は、δ１３Ｃとして報告される。定義は、パーミルにおいて：
【化７】
0006596009.tif 000027
ここで、標準は、確立された参照材料である。
【０２９６】
炭素−１３の研究のために確立された標準は、Pee Dee Belemnite（PDB）であり、サウスカロライナのPee Dee層からの白亜紀の海洋化石Belemnitella americanaに基づく。この材料は、異常に高い１３Ｃ：１２Ｃ比（０．０１１２３７２）を有し、ゼロのδ１３Ｃ値として確立された。この標準の使用は、殆どの天然材料に負のδ１３Ｃを与える。標準は、質量分析の正確性を検証するために用いる；同位体研究が一般的になるにつれて、標準についての要求が供給を消耗させた。Vienna PDBについてVPDBとして知られるものを含む他の標準が、元のものを置き換えてきている。
【０２９７】
Ｃ３およびＣ４植物は、異なるδ１３Ｃの特徴を有し、これにより、以下のように要約し得るδ１３Ｃ値測定を用いてＣ４の草本を検出することが可能である：
【０２９８】
一研究によれば（Cochennec C Perfumer & Flavourist (2013) 38: 20-27を参照）、Ｃ４植物（例えばトウモロコシ）からのフェルラ酸は、−１６〜−１９‰の範囲のδ１３Ｃ値を有し、Ｃ３植物（例えばコメ）からのバニリンは、−３５〜−３８‰のδ１３Ｃ値を有する。
【０２９９】
別の研究によれば（Lebensmittelchemie (2010) 64: 17-48における「Herkunf und Authentizitaet von Vanillearomen」からの表を参照）、
【０３００】
Ｃ３植物（例えばコメ）から生物工学的に生成されたバニリンについてのδ１３Ｃ値は、典型的には、−３６‰〜−３７‰ＶＰＤＢの領域である；
【０３０１】
したがって、Ｃ４植物についてのδ１３Ｃ値は、一般に、Ｃ３植物についてのδ１３Ｃ値と比較して、値が「より負でない」または「より高い」であろう。
【０３０２】
結果４
炭素同位体（δ１３Ｃ）分析は、本開示の方法により、オイゲノールから調製されたフェルラ酸（ＦＡ）、およびこのＦＡ調製から生成されたバニリンは、トウモロコシ穂軸からのフェルラ酸／バニリンについてのδ１３Ｃ値とは異なるδ１３Ｃ値を有することを示唆する。表４は、トウモロコシから得られたバニリンについてのδ１３Ｃ値が−１６．６‰であることを示す。トウモロコシ穂軸ＦＡから調製されたバニリンについてのδ１３Ｃの平均値の範囲は、約−１９〜−１６．０‰である（Cochennec C Perfumer &Flavourist (2013) 38; 20-27を参照）。対照的に、表４は、本開示の方法によりオイゲノールから調製されたフェルラ酸（ＦＡ）およびその結果生じたバニリンについて、約−３２‰のδ１３Ｃ値が観察されたことを示す。
【０３０３】
理論により拘束されることは望まないが、これら２つの異なる植物ソース（すなわちトウモロコシおよびオイゲノール）からのフェルラ酸／バニリンについてのδ１３Ｃ値の間の差異は、植物ソース出発材料のための異なる光合成経路に起源を有し得る。殆どのオイゲノールが由来する植物は、Ｃ３植物であり、これは、１３Ｃよりも多くの１２Ｃを光合成により同化し、このことが、それらの植物材料からのフェルラ酸／バニリンについて、Ｃ４植物と比較して、潜在的により低い（すなわちより負の）δ１３Ｃ値をもたらす。トウモロコシはＣ４植物であり、その二酸化炭素固定は、はるかにより低い１２Ｃと１３Ｃとの間の区別を示すので、トウモロコシから得ることができるフェルラ酸／バニリンについてのδ１３Ｃ値は、環境中のものに匹敵し得る。
表４．異なる生体材料ソースからのバニリンおよびフェルラ酸の同位体分析
【表４】
0006596009.tif 000028
【０３０４】
天然フェルラ酸（ＦＡ）／天然バニリン（ＮＶ）（オイゲノールからのもの）は、他の天然植物ソースからのＦＡ／ＮＶとは異なる：
【０３０５】
表４における結果、および上で議論されるとおり引用される先行技術における結果は、少なくともＣ３、Ｃ４およびＣＡＭ植物は異なるδ１３Ｃの特徴を有し、このことにより、Ｃ３、Ｃ４の草本およびＣＡＭ植物を、それらのδ１３Ｃ値により検出し、区別することが可能であることを示す。さらに、表４におけるデータは、本開示の方法を用いてオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸および天然バニリンはまた、（約−３２‰の）δ１３Ｃ値を有し、これは、少なくともＣ３、Ｃ４（例えば、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンから選択される天然植物群のソースからのものなど）ならびに／またはＣＡＭ植物から得られるδ１３Ｃ値（（例えば、バニラ豆の伝統的な熟成からの、および／または加速させた生物学的方法を用いたものからの（例えば、WO2010/066060およびWO 2010/066061を参照）バニラ抽出物についてのδ１３Ｃ値）とは異なる。
【０３０６】
例５
Overhageら（Appl Env Microbiol (2003) 69; 6569-6576）において記載される既知の生物変換方法を用いてVaoA／CalAおよびCalB遺伝子を用いて得られたフェルラ酸／バニリンについてのδ１３Ｃ値と、VaoA／MtSAD1およびAtADH遺伝子を用いる本開示の生物変換方法の比較を行った。これらの生物変換方法は、それぞれ「既知の」および「新たな」方法と名付けられる。
【０３０７】
結果５
驚くべきことに、同位体分析は、「新たな」方法を用いて得られたバニリンについて、δ１３Ｃが約−２８．１であることを示し、これは、「既知の」方法を用いて得られたバニリンについての−３１．７のδ１３Ｃ値とは異なる。
表５．代替的な酸化酵素によりオイゲノールから誘導されたバニリンについてのδ１３Ｃ値
【表５】
0006596009.tif 000029
【０３０８】
酸化酵素＃１（CalA）を組み込む既知の方法（Overhageら（Appl Env Microbiol (2003) 69; 6569-6576において開示されるような））は、（約−３２‰の）δ１３Ｃ値をもたらした。酵素＃２（MtSAD1）による酸化酵素＃１（CalA）の置き換えは、−３１．７‰から−２８．１‰へのδ１３Ｃ値の変化をもたらした。表５において開示されるデータ、および異なる領域および地域からのオイゲノールの異なる植物学的ソースが異なるδ１３Ｃ値を有し得るという事実を考慮して、出願人は、本開示の方法によりオイゲノールから得ることができる天然フェルラ酸／バニリン酸は、約−２５〜−３２‰の範囲のδ１３Ｃ値を有することを提案する。
【０３０９】
理論に拘束されることは望まないが、観察されたδ１３Ｃ値の変化を説明し得る２つの提案される経路が存在する。第１の場合においては、酵素＃２（MtSAD1）が、可逆反応においてバニリンをプロトカテク酸へと脱メチル化する二次活性を有し得る（図２参照）。逆反応の間に、細胞を増殖させるために用いられたＣ４ベースのトウモロコシ糖から誘導されたメチル基が、プロトカテク酸上に組み込まれて、バニリンを生じる。Ｃ３源上の元のメチル基がＣ４ベースのメチル基で置き換えられるので、期待値からのδ１３Ｃ値の変化が存在する。
【０３１０】
δ１３Ｃ値の変化が起こり得る第２の経路は、酵素の動力学および動的同位体効果を考慮する。酵素＃２（MtSAD1）は、二次活性として、バニリンのバニリン酸への付加的酸化を引き起こす。アルデヒド酸化の速度は、各々の炭素同位体について異なり、これが、部分がバニリン酸として流出するにつれて、バニリンについてのδ１３Ｃ値を改変し得る。さらなる研究は、酵素＃２が経路中に組み込まれた場合にバニリン酸が形成されるか否かを決定するであろう。
【０３１１】
例６
マイナス２５‰〜マイナス３２‰の範囲のδ１３Ｃ値は、それ自体の課題のセットを有する。なぜならば、それは、グアヤコールまたはリグニンまたはＵＳ天然バニリンから人工的に誘導されたバニリン（これは−２８．７‰〜−２６．５‰の範囲のδ１３Ｃ値を有する（以下の表６を参照））と確実に区別することができないからである。したがって、二次的なD-NMR試験を用いて、多様なソースからのバニリンのフェニル環上のデューテリウムの集積を測定した。
【０３１２】
結果６
図９が示すとおり、多様なソースからのバニリンについて、クラスターを見ることができる。試料20130630-A1（赤色の塗りつぶされた円）および131206（青色の塗りつぶされた三角）は、オイゲノールの２つのソースから、方法において酵素＃１（CalA）を用いて調製された。試料131225は、方法において酵素＃２（MtSAD1）を組み込むオイゲノールから得られたバニリンを代表する。３つ全ての試料は、緊密に、しかしオイゲノールから誘導されるＵＳの「天然」バニリンに対応するクローブからのものとは別に、クラスター化する。無関係に、δ１３Ｃ値は、人工／不純物が混じった（adulterated）バニリン（例えばグアヤコールまたはリグニンから人工的に誘導されたバニリン）と誤解され得るが、一方、D-NMRの結果は、D-NMR法が、オイゲノールからの天然バニリン、他のソースからの天然バニリン、およびグアヤコールまたはリグニンから人工的に誘導されたバニリンならびにオイゲノールから誘導されたＵＳの「天然」バニリンを区別することができることを示唆するであろう。
【０３１３】
まとめると、オイゲノールからフェルラ酸／天然バニリン（ＦＡ／ＮＶ）を生成するための生物変換方法を開発し、本明細書において開示するが、ＦＡ／ＮＶ材料が人工的に、合成により、またはＥＵにおいて受け入れられない手段により誘導されたものからユニークであることを証明するためには、２種類の証拠を必要とし得る。
表６．多様なソースからのバニリンについてのδ１３Ｃ値（データはLebensmittelchemie (2010) 64: 17-48中の「Herkunf und Authentizitaet von Vanillearomen」から得られた）
【表６】
0006596009.tif 000030
【０３１４】
本開示は、発酵に基づく方法を提供し、これは、オイゲノールを、ＥＵにおける天然材料についての規制上の必要条件に適合するバニリンに変換する。発酵に基づく方法は、オイゲノールのフェルラ酸への変換を促進する新規の酸化酵素（MtSAD1）を組み込む。この酵素を用いる新たな方法は、Overhageら（2003）における開示に基づくVaoA／CalA／CalB発酵方法を用いる発酵に基づく方法を用いて得られたものと比較して期待されるものと異なるδ１３Ｃ値の範囲をもたらすことを発見した。
【０３１５】
要旨
E.coliにおける生物変換方法の首尾よい採用は、バニリン生成のための低コストかつ工業的に経済的な方法を提供する。Pseudomonas sp.HR199の既知の細菌CalA／CalB遺伝子を、植物に基づく遺伝子（MtSAD1およびAtADH1）で置き換え、これは、２４時間のインキュベーション中に９０％〜９６％のモル濃度収率で、フェルラ酸を天然バニリンに首尾よく変換した。この生体内変換を、５０Ｌのバイオリアクター中で３０Ｌの発酵容積までスケールアップしたところ、VaoAと植物に基づく遺伝子（MtSAD1およびAtADH1）とを含む新規の組み換えE.coli微生物を用いた約６０時間のインキュベーションの後で、フェルラ酸（２６ｇ／ｌ）を回収した。
【０３１６】
E.coliの組み換え株におけるオイゲノールをフェルラ酸に変換するための生体内変換方法およびバニリンへのさらなる変換を開示する。生体内変換方法を、首尾よく３０Ｌのスケールに移し、ここで、６４時間の総発酵時間の後で、２６ｇ／ｌのフェルラ酸濃度を得た。この首尾よい変換に基づいて、オイゲノールからバニリンをもたらす２つの異なる２ステップの生体内変換方法を確立した。
第１の２ステップの生体内変換方法は、フェルラ酸を天然バニリンに変換するために、第１のステップにおいて組み換えE.coli株を、第２のステップにおいてStreptomyces／Amcolatopsis株を用いる。第２の２ステップの生体内変換方法は、第１のステップにおいて組み換えE.coli株を、第２のステップにおいて異なる組み換えE.coli株を用いる。
【０３１７】
第１の２ステップの生体内変換方法を用いると、出願人らの結果は、２１．６ｇ／ＬのＦＡから１３．４ｇ／Ｌのバニリンの収量が得られたことを示し、これは、７９．２％のバニリンのモル濃度収率に相当する。バニリンの蓄積は、多かれ少なかれ、発酵時間全体にわたって直線的である。しかしながら、初めの２４時間において急速なＦＡの減少が観察され、このことは、S. viridosporusが、フェルラ酸を、バニリンに変換される前に異なる中間体に変換することを示唆している。第２の２ステップの生体内変換方法を用いると、ハイブリッドプラスミドAmFCS-pCDFDuetおよびPfECH-pRSFDuetを保有する２つの組み換えE.coli株の連続適用は、初めに、２４時間後に、３ｇ／ｌのフェルラ酸から２．２ｇ／ｌの産生をもたらし、これは、２時間の後で０．３ｇ／ｌのＦＡの生産量が得られたOverhageら（2003）により得られたものよりも良い収量である。
【０３１８】
本開示は、発酵に基づく方法を提供し、これは、オイゲノールを、ＥＵにおける天然材料についての規制上の必要条件に適合するバニリンに変換する。新規の発酵に基づく方法は、オイゲノールのフェルラ酸への変換を促進する酸化酵素（MtSAD1）を組み込む。新規方法が、コメ、トウモロコシ、サトウダイコン、コムギおよびクルクミンから選択される他の植物ソースから得られたフェルラ酸／バニリンについて得られるδ１３Ｃ値の範囲と比較した場合に異なるδ１３Ｃ値の範囲を有するフェルラ酸／バニリン生成物をもたらすことを発見した。
【図１】
0006596009.tif 000031
【図２】
0006596009.tif 000032
【図３】
0006596009.tif 000033
【図４】
0006596009.tif 000034
【図５Ａ】
0006596009.tif 000035
【図５Ｂ】
0006596009.tif 000036
【図６】
0006596009.tif 000037
【図７】
0006596009.tif 000038
【図８】
0006596009.tif 000039
【図９】
0006596009.tif 000040
【図１０】
0006596009.tif 000041
【図１１】
0006596009.tif 000042
【図１２】
0006596009.tif 000043
【配列表】
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