(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物であって、経静脈栄養剤または経腸栄養剤を含み、バリンを実質的に含まない、組成物。
【請求項２】
造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物であって、バリンを除いては経静脈栄養剤または経腸栄養剤としての組成を有し、バリンを実質的に含まない、組成物。
【請求項３】
投与対象が、造血幹細胞移植前のレシピエントである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
経静脈栄養剤または経腸栄養剤が、バリンを実質的に含まないことを除いては、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
経静脈栄養剤または経腸栄養剤が、バリンを実質的に含まないことを除いては、完全栄養製剤として設計された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
経静脈投与のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
培養物中の造血幹細胞を減少させることに用いるための細胞培養培地であって、
バリン若しくはシステインまたはその両方を実質的に含まないことを特徴とする、培地。
【請求項８】
対象の体内の造血幹細胞の減少を検出する方法であって、
（ａ）処置前のレシピエントから得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｂ）処置中または処置後のレシピエントから得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｃ）工程（ａ）で求められた細胞数と工程（ｂ）で得られた細胞数とを比較することとを含んでなり、
処置が、一定期間中、レシピエントにバリンを実質的に与えないことである、
方法。
【請求項９】
処置が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物の投与により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
処置が、一定期間中、対象にレシピエントにバリンを実質的に与えないことを特徴とする栄養療法である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物を製造する方法であって、
組成物にバリンが実質的に含まれないように生体に必須の栄養素を混合することを含む、
方法。
【請求項１２】
栄養素が、少なくとも、糖、必須アミノ酸、ビタミン類および必須微量元素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な量の栄養素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞を減少させることに用いるための医薬組成物を製造するための栄養素の使用であって、栄養素がバリン以外の栄養素である、使用。
【請求項１５】
造血幹細胞を減少させることに用いるための経静脈栄養剤または経腸栄養剤であって、バリンを実質的に含まない、経静脈栄養剤または経腸栄養剤。
【請求項１６】
造血器腫瘍を処置することに用いるための、または、造血幹細胞移植前のレシピエントを処置することに用いるための、請求項１５に記載の経静脈栄養剤または経腸栄養剤。
【請求項１７】
造血器腫瘍を処置することに用いるための、または、造血幹細胞移植前のレシピエントを処置することに用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞を減少させる組成物および培地並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液細胞の疾患を造血幹細胞移植によって治療する試みが盛んになされている。造血幹細胞移植に際しては、患者の造血幹細胞を除去する処置が必要とされる。造血幹細胞を除去する処置としては、患者に対する放射線照射や化学療法が挙げられるが、これらの処置は副作用が強く、患者に大きな負担をもたらしている。このことは、特に造血細胞移植を受ける患者が老人や小児の場合に顕著である。しかし、放射線照射や化学療法以外の有用な造血幹細胞の除去方法は知られていない。【０００３】
タンパク質を含まない餌で飼育されたマウスにおいて、重度の顆粒球減少症および貧血症が発症することが知られている（非特許文献１）。これら血球における異常は、１８％のカゼインおよび葉酸により回復した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kornberg A, Daft FS, Sebrell WH, Granulocytopenia and Anemia in Rats Fed Diets of Low Casein Content, Science, 1949, 103(2682):646-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、動物（特にヒト）体内の造血幹細胞を低減または除去する際に、放射線照射の代替となる手法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、下記実施例に記載されるように、バリンを与えないで動物を維持すると、動物体内において造血幹細胞を減少させることができることを見出した。造血幹細胞が減少する現象は、観察されるかぎり、造血幹細胞に特徴的な現象であった。【０００７】
本発明者らはさらに、バリンを与えないで維持することにより造血幹細胞を減少させた動物（「レシピエント動物」という）に、造血幹細胞移植を移植すると、移植造血幹細胞がレシピエント動物体内で生着することを見出した。また、レシピエント動物体内の造血幹細胞を詳細に調べると、レシピエント動物由来の細胞の造血系への寄与は確認されず、造血幹細胞が移植造血幹細胞に置き換わった。このことから、本発明の方法は、造血幹細胞移植前のレシピエントの処置に応用できることを見出した。【０００８】
本発明はこのような知見に基づきなされたものである。【０００９】
すなわち、本願発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）バリンを実質的に含まない、経静脈栄養剤または経腸栄養剤。
（２）造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物であって、上記（１）に記載の栄養剤を含み、バリンを実質的に含まない、組成物。
（３）造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物であって、バリンを除いては経静脈栄養剤または経腸栄養剤としての組成を有し、バリンを実質的に含まない、組成物。
（４）投与対象が、造血幹細胞移植前のレシピエントである、上記（２）または（３）に記載の組成物。
（５）経静脈栄養剤または経腸栄養剤が、バリンを実質的に含まないことを除いては、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計された、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）経静脈栄養剤または経腸栄養剤が、バリンを実質的に含まないことを除いては完全栄養製剤として設計された、上記（２）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）経静脈投与のための、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）細胞培養培地であって、
バリン若しくはシステインまたはその両方を実質的に含まないことを特徴とする、培地。
（９）対象の体内の造血幹細胞の減少を検出する方法であって、
（ａ）処置前のレシピエントから得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｂ）処置中または処置後のレシピエントから得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｃ）工程（ａ）で求められた細胞数と工程（ｂ）で得られた細胞数とを比較することとを含んでなり、
処置が、一定期間中、レシピエントにバリンを実質的に与えないことである、
方法。
（１０）処置が、上記（１）に記載の栄養剤または上記（２）〜（７）のいずれかに記載の組成物の投与により行われる、上記（９）に記載の方法。
（１１）処置が、一定期間中、対象にレシピエントにバリンを実質的に与えないことを特徴とする栄養療法である、上記（９）に記載の方法。
（１２）造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物を製造する方法であって、
組成物にバリンが実質的に含まれないように生体に必須の栄養素を混合することを含む、
方法。
（１３）栄養素が、少なくとも、糖、必須アミノ酸、ビタミン類および必須微量元素である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）組成物が、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な量の栄養素を含む、上記（１２）に記載の方法。
（１５）造血幹細胞を減少させることに用いるための医薬組成物を製造するための栄養素の使用であって、栄養素がバリン以外の栄養素である、使用。【００１０】
本発明によれば、単にバリンまたはシステインを含まない培地で造血幹細胞を培養することで造血幹細胞を減少させることができる。細胞特異性が高く、幹細胞を特異性高く標的とできる点で有利である。また、本発明によれば、バリンを含まない食事を与えることで対象（例えば、ヒト）において造血幹細胞を減少させることができる。従来のような放射線照射を必要としない、または低減できる点で、本発明は有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、細胞培養培地中のアミノ酸含量を示す。
【図２】図２は、ＣＤ３４-ＫＳＬ細胞を１ウェルあたり４０細胞播種して、図１に示される組成の培地中で１週間培養した結果を示す図である。
【図３】図３Ａは、ＣＤ３４-ＫＳＬ細胞を１ウェルあたり４０細胞播種して、図１に示される組成の培地中で１週間培養して計測された細胞の数を示す。図３Ｂは、ＣＤ３４-ＫＳＬ細胞を１ウェルあたり４０細胞播種して得られた細胞を照射マウスに通常の細胞との競合条件で移植した場合のキメラ率を示す。
【図４】図４は、通常餌、バリンを含まない餌およびシステインを含まない餌の組成を示す図である。
【図５】図５は、通常餌またはバリンを含まない餌（-Val）でそれぞれ４週間飼育したマウスの末梢血および骨髄中のアミノ酸の含量を調べた結果である。
【図６】図６Ａは、通常餌またはバリンを含まない餌を４週間与えたマウスから得られた末梢血サンプル中の全血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）および血小板数（ＰＬＴ）を示す。図６Ｂは、骨髄中のＣＤ１５０+ＣＤ４１-ＣＤ４８-のＫＳＬ細胞の存在頻度を示す。図６Ｃは、細胞周期がＧ０期である細胞の頻度を示す。
【図７】図７は、通常餌またはバリンを含まない餌を与えられたマウスの骨髄Ｂ細胞、末梢血Ｂ細胞およびリンパ球系共通前駆細胞の存在頻度を示す。
【図８】図８は、通常餌、バリンを含まない餌（-Val）またはシステインを含まない餌（-Cys）で４週間飼育されたマウスの骨髄中のＣＤ３４-のＫＳＬ細胞の存在頻度を示す。
【図９】図９は、アミノ酸のいずれかを含まない餌で飼育されたマウスの生存曲線を示す。
【図１０】図１０は、通常餌またはバリンを含まない餌で４週間飼育されたマウスの組織切片像である。
【図１１】図１１Ａは、バリンを含まない餌を与えてから通常餌に変えたマウスの体重変化の推移を示す図である。図１１ＢおよびＣはそれぞれ、胸腺および脾臓がバリンを含まない餌で４週間飼育されたマウスで小さくなること、および、その後、通常の餌を４週間与えることで大きさが回復することを示す。
【図１２】図１２は、通常の餌またはバリンを含まない餌を与えて飼育されたマウスから得られた全骨髄を競合条件下で照射マウスに移植して、それぞれのキメラ率の推移を示す図である。
【図１３】図１３は、通常の餌またはバリンを含まない餌（-Val）で２週間飼育したマウスにポリＩ：Ｃを投与した後の生存率を示す図である。
【図１４】図１４Ａは、造血幹細胞移植のスキームを示す。このスキームでは、レシピエントマウスは照射されず、バリンを含まない餌で２週間飼育されてからドナー細胞を移植される。図１４Ｂは、移植後のレシピエント中でのドナー細胞のキメラ率を示す図である。図１４Ｃは、移植の成功率および移植後のレシピエント中でのドナー細胞の寄与率を細胞ごとに示す図である。
【図１５】図１５は、ヒト造血幹細胞に対するアミノ酸欠損培地の影響を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１２】
本発明者らは、下記実施例に記載されるように、バリンを与えないで動物を維持すると、動物体内において造血幹細胞を減少させることができることを見出した。従って、本発明によれば、バリンを与えないで動物を維持することにより、動物体内において造血幹細胞を減少させる方法、またはその方法に用いる組成物が提供される。
【００１３】
本発明によれば、対象は、バリンを与えないよう栄養管理され得る。これにより、対象の体内の造血幹細胞は減少する。栄養管理の期間を延ばせば、対象の体内から実質的に完全に造血幹細胞を除去し得る。実質的に完全に細胞を除去するとは、細胞が、１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下、さらにより好ましくは１％以下、さらにより好ましくは０．１％以下、とりわけ好ましくは、０．０１％以下、最も好ましくは完全に消失することを意味する。
【００１４】
ある態様では、造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤を含むものであるが、経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤は、バリンを実質的に含まない組成物である。本明細書では、「バリンを含まない」とは、「バリンを欠如した」と相互互換的に用いられる。本明細書では、「バリンを含まない」とは、ペプチドとしてもバリンを含まないことを意味する。本明細書では、「実質的に」とは、製造工程で避けることのできない程度の混入があってもよいことを意味する。
【００１５】
ここで、「経静脈栄養製剤」とは、静脈栄養法に用いられる栄養剤を意味する。経静脈栄養製剤としては、末梢静脈内に栄養素を投与する末梢静脈栄養製剤と、中心静脈内に栄養素を投与する中心静脈栄養製剤が挙げられる。通常は、腸が機能している場合には、栄養法としては、経腸栄養法が選択され、経腸栄養製剤が対象に投与されるが、経腸栄養が困難である場合は、経静脈栄養法が選択され、経静脈栄養製剤が対象に投与される。経静脈栄養製剤としては、末梢静脈栄養製剤と中心静脈栄養製剤が挙げられる。経静脈栄養製剤は、通常、輸液製剤であり、糖、電解質およびアミノ酸を含む水溶液であり、ビタミンをさらに含んでいてもよい。中心静脈栄養製剤は、通常は、糖、電解質およびアミノ酸に加えて、ビタミンおよび生体に必要な微量元素（例えば、輸液用ビタミン剤、輸液用総合ビタミン剤および輸液用微量元素製剤）を含む。
【００１６】
「経腸栄養製剤」とは、経腸栄養法に用いられる栄養剤を意味する。経腸栄養製剤としては、半消化態栄養剤、消化態栄養剤および成分栄養剤が挙げられる。半消化態栄養剤は、窒素源としてタンパク質を含み、消化態栄養剤は、窒素源として低分子ペプチドおよびアミノ酸を含み、成分栄養剤は、窒素源としてアミノ酸を含む。本発明では、経腸栄養製剤としては、成分栄養剤が好ましく用いられ得る。
【００１７】
本明細書では、「バリンを除いては経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤としての組成を有する」とは、バリン以外の組成は、経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤と同一であるか、またはバリン以外の組成が類似しており、かつ経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤としての機能を有することを意味する。
【００１８】
本明細書では、「バリンを実質的に含まないことを除いては、完全栄養製剤として設計された」とは、完全栄養製剤として設計された栄養製剤の組成を有するが、その組成においてバリンを含まないことを意味する。すなわち、「バリンを実質的に含まないことを除いては、完全栄養製剤として設計された」組成物は、バリン以外の組成は、完全栄養製剤と同一とし得る。
【００１９】
本明細書では、「バリンを実質的に含まないことを除いては、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計された」または類似の表現は、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計された栄養製剤の組成を有するが、その組成においてバリンを含まないことを意味する。
【００２０】
医学的に対象の栄養管理が適切になされるよう、栄養管理法として経静脈栄養法または経腸栄養法が選択されることがある。上記経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤は、このような適切な栄養管理のために市販されている。経静脈栄養法または経腸栄養法では、上記経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤に加えて脂肪乳剤などのエネルギー摂取量を増加させる製剤が併用されてもよい。脂肪乳剤は、エネルギー供給のためや、脂肪酸欠乏の防止のために栄養製剤と併用投与され、一般的には脂肪酸の乳化物を含み、脂肪酸は例えば、大豆油由来であり得、乳化剤は卵黄由来のレシチンであり得る。
【００２１】
本発明では、バリンを与えないで動物を維持することにより、対象動物体内において造血幹細胞を減少させることができるので、バリンを実質的に含まない経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤が造血幹細胞を減少させるために好ましく用いられ得る。
【００２２】
本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、継時的投与により少なくとも対象由来の造血幹細胞が、投与前の好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下、さらにより好ましくは１％以下、最も好ましくは完全に消失するまでの期間を超えて、レシピエントを生存させるに十分な栄養素を供給可能なように設計されている。この際、組成物は、脂肪乳剤などのエネルギー摂取量を増加させる製剤が併用されてもよい。
【００２３】
従って、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、対象由来の造血幹細胞を、投与前の好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下、さらにより好ましくは１％以下、最も好ましくは完全に消失させるために対象に投与することができる。
【００２４】
ある態様では、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、２０種類のアミノ酸のうち、バリン以外のアミノ酸をすべて含んでいる。ある態様では、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、バリンを含むペプチドを実質的に含まない。また、ある態様では、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、２０種類のアミノ酸のうち、バリン以外のアミノ酸をすべて含み、かつ、糖、電解質、ビタミンおよび必須微量元素をさらに含む。ある態様では、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、２０種類のアミノ酸のうち、バリン以外のアミノ酸をすべて含み、かつ、糖、電解質、ビタミンおよび必須微量元素をさらに含み；かつ、脂肪乳剤と併用される。本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物に含ませる各成分の量は、通常の経静脈栄養剤または経腸栄養剤に含ませる各成分の量と同等とすることができる。
【００２５】
本発明では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。また、ある態様では、本発明の組成物の投与対象は造血器腫瘍の患者である。従って、本発明の組成物は、ある態様では、造血器腫瘍の患者において造血器腫瘍を処置するための医薬組成物である。ある好ましい態様では、造血器腫瘍は、造血系の癌幹細胞を伴う造血器腫瘍である。
【００２６】
経静脈投与の医薬組成物において、各栄養素は、薬学的に許容可能な成分からなる。
【００２７】
本発明のある態様では、本発明の組成物の投与対象は造血幹細胞移植前のレシピエントである。造血幹細胞移植のレシピエントは、栄養学的なリスクを有しているので、栄養障害の有無に関わらず、経静脈栄養法または経腸栄養法などの栄養管理が推奨される。また、造血幹細胞移植のレシピエントの栄養管理に使う経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤もよく知られている。従って、本発明の造血幹細胞減少させることに用いるための組成物は、造血幹細胞移植前のレシピエントの栄養管理に用いられる通常の経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤とすることができる（ただし、栄養製剤は、バリンを含まないことが条件である）。造血幹細胞移植のレシピエントの栄養管理に使う経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤は、通常用いるものよりも、エネルギー量やタンパク質量を増やしたものであり得る。
【００２８】
上記栄養剤によるエネルギー投与量は、当業者に周知の技術、例えば、間接熱量測定により測定することができる。
【００２９】
バリン実質的に含まない経静脈栄養製剤または経腸栄養製剤は、アミノ酸としてバリン以外のアミノ酸製剤を栄養剤の他の構成成分（糖および電解質など）と混合することによって得ることができる。
【００３０】
本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、継時的投与により少なくとも３週間の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計されたものであればよく、好ましくは、４週間若しくは５週間またはそれ以上の生命維持に十分な栄養素を供給可能なように設計されたものとすることができる。
【００３１】
ある態様では、本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、対象の体内から造血幹細胞を実質的に完全に除去することに用いるための組成物であり得る。
【００３２】
本発明によれば、対象にバリンを実質的に与えることなく、その他の栄養を与えると、対象の体内の造血幹細胞が減少する。従って、本発明によれば、対象の体内の造血幹細胞を減少させる方法であって、対象にバリンを実質的に与えないよう栄養管理する（栄養摂取させる）ことを含む、方法が提供される。栄養管理は、経腸栄養法または経静脈栄養法により行うことができる。栄養管理は、上記の経腸栄養製剤または経静脈栄養製剤を対象に投与することにより行ってもよい。
【００３３】
対象は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００３４】
本発明の造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物は、造血幹細胞の分裂を抑制することに用いるための組成物でもある。
【００３５】
本発明によれば、対象の体内の造血幹細胞の減少を検出する方法であって、
（ａ）処置前の対象から得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｂ）処置中または処置後の対象から得られた骨髄液または末梢血サンプル中の造血幹細胞数を計測することと、
（ｃ）工程（ａ）で求められた細胞数と工程（ｂ）で得られた細胞数とを比較することとを含んでなり、
処置が、一定期間中、対象にバリンを実質的に与えないことである、
方法が提供される。この方法では、工程（ｃ）において、工程（ａ）で求められた細胞数よりも工程（ｂ）で得られた細胞数が少ないときに、体内の造血幹細胞が減少したと判断することができる。ある態様では、処置は、経腸栄養法または経静脈栄養法による栄養療法である。ある態様では、処置は、上記の経腸栄養製剤または経静脈栄養製剤を対象に投与することにより行ってもよい。
【００３６】
本発明の対象の体内の造血幹細胞の減少を検出する方法では、一定期間は、好ましくは１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上または４週間以上であり、患者が死亡するほど長い期間であってはならない。本発明のある態様では、一定期間は、１日〜５週間、１週間〜４週間、または２週間〜３週間程度である。
【００３７】
本発明の対象の体内の造血幹細胞の減少を検出する方法では、対象は、哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトとすることができる。本発明のある態様では、対象は、造血幹細胞移植の移植前のレシピエントである。本発明のある態様では、対象は、造血器腫瘍の患者である。
【００３８】
本発明によれば、造血幹細胞を減少させることに用いるための組成物を製造する方法であって、組成物にバリンが実質的に含まれないように栄養素を混合することを含む、方法が提供される。混合される栄養素は、糖、アミノ酸、ビタミン、電解質および必須の微量元素であり得る。ある態様では、混合されるアミノ酸は、トリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、ロイシン、イソロイシンおよびヒスチジンなどの必須アミノ酸から選択される１以上のアミノ酸またはすべてのアミノ酸である。経静脈栄養法により投与する組成物は、薬学的に許容可能な成分からなる。
【００３９】
体内に必要な微量元素としては、例えば、鉄、亜鉛、銅、セレン、クロム、コバルト、ヨウ素、マンガンおよびモリブデンが挙げられる。必須微量元素の投与量は、概ね以下の通りである。
鉄        ：２０〜２００μｇ／ｋｇ体重／日
亜鉛      ：４０〜６０μｇ／ｋｇ体重／日
銅        ：２０〜５０μｇ／ｋｇ体重／日
セレン    ：２〜７μｇ／ｋｇ体重／日
クロム    ：０．１〜０．２μｇ／ｋｇ体重／日
ヨウ素    ：１〜１５μｇ／ｋｇ体重／日
マンガン  ：１〜６０μｇ／ｋｇ体重／日
モリブデン：０．１〜０．５μｇ／ｋｇ体重／日
従って、上記必要量を目安にして本発明の組成物に必須微量元素を混入させることができる。
【００４０】
本発明によれば、造血幹細胞の移植方法であって、
移植の前処理として、一定期間中、対象にバリンを実質的に与えないで（すなわち、それ以外の栄養素を与えて）移植のレシピエントの生命を維持し、それにより、患者体内の造血幹細胞を減少させることを含む、方法が提供される。本発明の造血幹細胞の移植方法は、患者の造血幹細胞が実質的に除去されるまで、対象にバリンを実質的に与えないことと、除去後、造血幹細胞を移植することとをさらに含んでいてもよい。
【００４１】
本発明によれば、その必要のある患者において造血器腫瘍を処置する方法であって、
一定期間中、対象にバリンを実質的に与えないで（すなわち、それ以外の栄養素を与えて）患者の生命を維持し、それにより、患者体内の造血幹細胞を減少させることを含む、方法が提供される。本発明の造血器腫瘍を処置する方法は、造血器腫瘍の処置に用いられる抗癌剤による治療の前若しくは後または最中に行ってもよい。本発明の造血器腫瘍を処置する方法は、患者の造血幹細胞が実質的に除去されるまで、対象にバリンを実質的に与えないことと、除去後、造血幹細胞を移植することとをさらに含んでいてもよい。本発明の造血器腫瘍を処置する方法は、特に造血に係る癌幹細胞の量を低減できる点で造血器腫瘍の処置にきわめて高い効果を奏するものである。
【００４２】
本発明によれば、造血幹細胞を減少させることに用いるための医薬組成物を製造するための栄養素の使用であって、栄養素がバリン以外の栄養素である、使用に関する。使用される栄養素は、糖、アミノ酸、ビタミン、電解質および必須の微量元素であり得る。ある態様では、使用されるアミノ酸は、トリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、ロイシン、イソロイシンおよびヒスチジンなどの必須アミノ酸から選択される１以上のアミノ酸または上記必須アミノ酸から選択されるすべてのアミノ酸である。ある態様では、栄養素はアミノ酸としてバリン以外のすべてのアミノ酸を含む。
【００４３】
ある態様では、使用されるアミノ酸は、すべてのアミノ酸（バリンを除く）である。従って、ある態様では、使用される栄養素は、糖、アミノ酸、ビタミン、電解質および必須の微量元素であり、アミノ酸は、トリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、ロイシン、イソロイシンおよびヒスチジンなどの必須アミノ酸から選択される１以上のアミノ酸または上記必須アミノ酸から選択されるすべてのアミノ酸である。
【００４４】
ある態様では、使用される栄養素は、糖、アミノ酸、ビタミン、電解質および必須の微量元素であり、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、アラニン、リジン、トリプトファンおよびアルギニンである。
【００４５】
ある態様では、使用される栄養素は、糖、アミノ酸、ビタミン、電解質および必須の微量元素であり、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、アラニン、リジン、トリプトファン、システインおよびアルギニンである。
【００４６】
使用される各栄養素の含量は、投与対象に応じて当業者により適宜決定することができる。例えば、使用される各栄養素の含量は、経静脈栄養剤または経腸栄養剤における各栄養素の含量と同等とすることができる。
【００４７】
本発明のある態様では、造血幹細胞を減少させることに用いるための細胞培養培地が提供される。本発明の細胞培養培地は、バリン若しくはシステインまたはその両方を実質的に含まないことを特徴とする。ある態様では、本発明の細胞培養培地は、バリン若しくはシステインまたはその両方を実質的に含まないことを除けば、通常の細胞培養培地と同じ組成を有する。例えば、通常の細胞培養培地は、合成培地（完全合成培地）である。従って、ある態様では、本発明の細胞培養培地は、バリン若しくはシステインまたはその両方を実質的に含まない完全合成培地である。完全合成培地の組成は、当業者であれば適宜決定することができる。各成分の含量は、通常用いられる完全合成培地と同等とすることができる。本発明の細胞培養培地は、例えば、造血幹細胞から細胞を分化させて得た分化培養物から、未分化細胞（造血幹細胞）を除去することなどに用いることができる。
【００４８】
本発明のある態様では、本発明の細胞培養培地に含まれるアミノ酸は、トリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびヒスチジンなどの必須アミノ酸から選択される１以上のアミノ酸または上記必須アミノ酸から選択されるすべてのアミノ酸である（ただし、栄養素は、バリン若しくはシステインまたはその両方を含まないことが条件である）。
【００４９】
本発明のある態様では、本発明の細胞培養培地に含まれるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、アラニン、リジン、トリプトファンおよびアルギニンである。
【００５０】
本発明のある態様では、本発明の細胞培養培地に含まれるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、アラニン、リジン、トリプトファン、システインおよびアルギニンである。
【００５１】
本発明のある態様では、本発明の細胞培養培地に含まれるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、アラニン、リジン、トリプトファン、バリンおよびアルギニンである。
【００５２】
本発明のヒト用の細胞培養培地は、ある態様では、アミノ酸として、アラニン、システイン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、グルタミンおよびバリンからなる群から選択される１以上のアミノ酸を含まず、好ましくは、システインまたはバリンを含まない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：細胞培養培地におけるアミノ酸欠損の影響
２０アミノ酸のうち１アミノ酸を欠損させた細胞培養培地を作製し、各アミノ酸が欠損することによる造血幹細胞の増殖に対する影響を調べた。【００５４】
C57BL/6 (B6-Ly5.2)マウスは、日本SLC社から購入し、C57BL/6 (B6-Ly5.1)マウスおよびNOD/scid (Ly5.2)マウスは、三協ラボサービス社から購入した。マウスは、東京大学医科学研究所実験動物施設（the Animal Research Facility of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo）にて、動物実験および組換えDNA実験に関する東京大学の指針（the guidance of the University of Tokyo for animal and recombinant DNA experiments）に従って飼育した。【００５５】
細胞培養培地は、アミノ酸を含まないRPMI1640培地（製品番号：R8758）およびDMEM/F12培地（製品番号：D6421）をシグマアルドリッチ社から購入した。これらの培地を等量ずつ混合した。アミノ酸は、図１に示される通りに培地に添加した。Ｓ−ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−Ｏ３培地は、三光純薬社から購入した。【００５６】
造血幹細胞としては、ＣＤ３４-のマウスＫＳＬ細胞を用いた。ＣＤ３４-のマウスＫＳＬ細胞は、８〜１２週齢のC57BL/6 (B6-Ly5.1)マウスの骨髄から採取した。具体的には、骨髄細胞をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗ｃ−ｋｉｔ抗体（eBioscience社製）で染色し、ｃ−Ｋｉｔ+細胞を抗ＡＰＣ磁気ビーズ（Miltenyi Biotech社製）で濃縮した。得られた細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート抗ＣＤ３４抗体（eBioscience社製）とフィコエリスリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗Ｓｃａ−１抗体（eBioscience社製）で染色し、さらにリニエージマーカーである、抗Ｇｒ−１抗体、抗Ｍａｃ−１抗体、抗Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１２７／ＩＬ７Ｒα抗体、および抗Ｔｅｒ−１１９抗体の抗体カクテル（eBioscience社製）で染色した。その後、べクトン・デッキンソン（ＢＤ）社製のセルソーターを用いてＣＤ３４-のマウスＫＳＬ細胞を精製した。【００５７】
得られた造血幹細胞を上記の１アミノ酸を欠損した細胞培養培地（１％ウシ血清アルブミン、５０ｎｇ／ｍＬマウスＳＣＦ（PeproTech社製）および５０ｎｇ／ｍＬマウスＴＰＯを含む）中で各ウェル４０細胞を１週間培養し、培養後の細胞の数を計測した。実験は独立して３回繰り返した。【００５８】
図２は、上記アミノ酸欠損培地で１週間培養した細胞の写真を示す。図２によれば、バリン（−Ｖａｌ）およびシステイン（−Ｃｙｓ）の場合に、細胞塊が観察されなかった。細胞の計数結果は図３に示される通りであった。図３Ａに示されるように、バリン（−Ｖａｌ）およびシステイン（−Ｃｙｓ）の場合は、細胞が増えなかった。【００５９】
このことから、造血幹細胞の増殖にバリン（−Ｖａｌ）およびシステイン（−Ｃｙｓ）が必要であることが明らかとなった。【００６０】
実施例２：アミノ酸欠損培地で培養した造血幹細胞の移植
次に、実施例１の方法で培養した造血幹細胞を照射マウスに投与して細胞の生着を確認した。【００６１】
アミノ酸欠損培地で培養した造血幹細胞としては、実施例１で培養して得られた造血幹細胞（ドナー造血幹細胞という）を用いた。照射マウスは、C57BL/6 (B6-Ly5.2)マウスに９．５Ｇｙの線量を照射して得た。競合条件下で細胞の増殖を観察するため、Ly5.1とLy5.2のF1マウスから１×１０6細胞の骨髄細胞（競合細胞という）を得た。【００６２】
アミノ酸欠損培地で培養した造血幹細胞とF1マウスの骨髄細胞を照射マウスに移植した。ドナー造血幹細胞の寄与率（キメラ率）を計算するため、移植１２週間後に末梢血（ＰＢ）を採取し、ＰＥ／Ｃｙ７−コンジュゲート抗Ly5.1抗体（Tonbo社製）およＦＩＴＣ−コンジュゲート抗Ly5.2抗体（BioLegend社製）でそれぞれドナー造血幹細胞および競合細胞を染色した。さらにＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞およびその他の細胞の割合を計算するために、末梢血をさらにＰＥ−コンジュゲート抗Ｍａｃ−１抗体および抗Ｇｒ−１抗体、ＡＰＣ−コンジュゲート抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体、並びにＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０−コンジュゲート抗Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒ抗体でさらに染色した。【００６３】
ドナー造血幹細胞および競合細胞の細胞数をFACS Canto II（Becton Dickinson社製）を用いて計測し、キメラ率を求めた。キメラ率は、ドナー造血幹細胞の細胞数をドナー造血幹細胞および競合細胞の細胞数の和で除して求めた。【００６４】
結果は、図３Ｂに示される通りであった。図３Ｂに示されるように、バリン（−Ｖａｌ）およびシステイン（−Ｃｙｓ）の場合は、キメラ率はほぼ０であった。【００６５】
実施例３：アミノ酸のいずれかを含まない餌を与えて飼育したマウスの解析
本実施例では、バリンまたはシステインを含まない餌を与えられたマウスにおける異常の有無を解析した。【００６６】
餌は、図４に記載の通りの製品番号および組成を有し、Research Diet社から購入した。まず、通常の餌またはバリンを含まない餌で４週間飼育したマウスの末梢血および骨髄における各アミノ酸の含量を測定した。【００６７】
アミノ酸含量の測定用の末梢血サンプルは、眼窩からサンプリングした血液を遠心分離して細胞成分を除去した後に、Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filter（Merck Millipore社製）を用いてタンパク質成分を除去して得た。アミノ酸含量の測定用の骨髄サンプルは、骨髄を水で溶出させてからAmicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filterを用いてタンパク質を除去して得た。これらのサンプル中の各アミノ酸含量は、Prominence Amino Acid Analysis System (Shimadzu社製)を用いて測定した。【００６８】
結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、バリンを含まない餌を４週間与えたマウスでは、末梢血においても、骨髄においても、バリン含量が低減していた。【００６９】
次に、バリンを含まない餌を４週間与えたマウスから得られた末梢血サンプル中の全血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）および血小板数（ＰＬＴ）を日本光電社製の自動血球計数器（MEK-6258）を用いて計数すると、図６Ａに示されるように、全血球数において大きな減少が観察された。赤血球数でも有意差が見られた。【００７０】
さらに、バリンを含まない餌を４週間与えたマウスにおける造血幹細胞の数を調べた。造血系幹細胞としてＣＤ１５０+ＣＤ４１-ＣＤ４８-のＫＳＬ細胞を以下の方法で取得した。まず、バリンを含まない餌を４週間与えたＢ６マウスから骨髄細胞を採取した。細胞を上記リニエージマーカーカクテル、ＡＰＣコンジュゲート抗ｃ−ｋｉｔ抗体、パシフィックブルーコンジュゲート抗Ｓｃａ１抗体、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＣＤ４１抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗ＣＤ４８抗体、およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１５０抗体並びにストレプトアビジン−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０抗体で染色した。【００７１】
細胞数の計測は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ−２（BD Biosciences社製）により行い、FlowJo Software（Tree Star社製）を用いて解析した。【００７２】
その結果、図６Ｂに示されるように、バリンを含まない餌を与えられたマウスでは造血幹細胞の出現頻度が大きく減少した。ＣＤ３４の発現およびピロニンＹ染色でＧ０期の細胞の割合を調べたところ、バリンを含まない餌を与えられたマウスは、通常の餌を与えられたマウスとＧ０期の細胞の割合はほとんど変わらなかった（図６Ｃ）。また、バリンを含まない餌を与えられたマウスでは末梢血および骨髄のいずれでもＢ細胞の大きな減少が見られた（図７）。また、バリンを含まない餌を与えられたマウスではリンパ球系共通前駆細胞（ＣＬＰ）の細胞数においても大きな減少が見られた（図７）。【００７３】
さらに、ＣＤ３４-のＫＳＬの造血幹細胞の頻度を確認したところ、バリンを含まない餌で４週間飼育したマウスでは、ＣＤ３４-のＫＳＬの造血幹細胞が大きく減少していた（図８）。【００７４】
実施例３：アミノ酸のいずれかを含まない餌のマウスへの影響
本実施例では、アミノ酸のいずれかを含まない餌を与え続けたマウスの生存率を確認した。【００７５】
絶食下で２日間飼育したＣ５７ＢＬ／６に示されたアミノ酸のいずれかを含まない餌を与え続け、生存率を確認した。【００７６】
結果は、図９に示される通り、イソロイシンを含まない餌やトリプトファンを含まない餌で飼育したマウスでは、１か月程度でマウスが全滅した。バリンを含まない餌で飼育したマウスは、少なくとも４０日間程度はマウスの生存率に影響はなかった。【００７７】
さらに、バリンを含まない餌で４週間飼育したマウスの各組織の切片を調べた。切片は常法により作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色したものを観察した。すると、図１０に示されるように、通常の餌と比較して、バリンを含まない餌で飼育したマウスの脳、心臓、肺、腎臓、胃、膵臓および精巣では違いが観察できなかった。一方、大腸では絨毛が伸びており、横紋筋や褐色脂肪細胞に変化が見られた（図１０）。【００７８】
次に、マウスを、バリンを含まない餌で１、２、３または４週間飼育した後に通常の餌に戻して飼育し、マウスの体重変化の推移や脾臓、胸腺の大きさを確認した。すると、図１１Ａに示されるようにバリンを含まない餌で飼育したマウスは体重の増加がみられないが、通常の餌に戻して飼育すると迅速に体重が回復した。【００７９】
また、図１１ＢおよびＣに示されるように、バリンを含まない餌で４週間飼育すると脾臓も胸腺も小さくなるが、通常の餌に戻して４週間飼育すると脾臓、胸腺の大きさは、ずっと通常の餌で飼育したマウスのそれらと同じ大きさに回復した。【００８０】
このことは、バリンを含まない食事により患者を生命維持してその体内の造血幹細胞を除去したとしても、その後、バリンを含む通常の食事を与えれば、バリン欠損の影響から回復させることができることを示唆するものである。【００８１】
実施例４：バリンを含まない餌の長期の造血への影響
本実施例では、照射マウスの体内に、バリンを含まない餌で飼育したマウスの全骨髄と通常の餌で飼育したマウスの全骨髄を等量ずつ移植する競合条件下で、バリンを含まない餌で飼育したマウスの全骨髄の生着率を調べた。【００８２】
照射マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．２）マウスに致死量の放射線を照射して得た。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）マウスをバリンを含まない餌で４週間飼育して全骨髄を得た。また、Ｂ６（Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２）マウスを通常の餌で４週間飼育して全骨髄を得た。【００８３】
同じ量の全骨髄を競合条件下で照射マウスに移植して、それぞれの全骨髄からの造血を血球細胞のキメラ率により確認した。【００８４】
すると、図１２に示されるように、全血球、骨髄細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞のいずれにおいても、移植約８週間後には大きな減少は認められなかったものの、移植約１２週間後には、バリンを含まない餌で飼育したマウスの全骨髄に由来する細胞はほとんど見られなかった。【００８５】
このことは、バリンを含まない餌により、血球系のうち特に造血幹細胞が影響を受けたことを示唆するものである。【００８６】
実施例５：バリンを含まない餌の造血幹細胞の分裂への影響
本実施例では、バリン欠損の造血幹細胞の分裂に対する影響を調べた。【００８７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをバリンを含まない餌で２週間飼育し、さらに７日後にポリＩ：Ｃを腹腔内投与した。すると、図１３に示されるように、バリンを含まない餌で飼育したマウスは投与３日後から死亡した。ポリＩ：Ｃは、インターフェロン−１を誘導して細胞を強制的に分裂させることで知られている。従って、この結果から、バリンは細胞の分裂に必要であることが示唆された。【００８８】
実施例６：造血幹細胞移植実験
通常は、造血幹細胞移植のレシピエントは照射して造血幹細胞を除去してから、ドナー由来の造血幹細胞を移植する。本実施例では、バリンを含まない餌を与えてレシピエントの体内の造血幹細胞を低減させ、その後、ドナー由来の造血幹細胞を移植して、ドナー由来の造血幹細胞の生着を確認した。【００８９】
具体的には、図１４Ａに示されるように、レシピエントとしてのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｌｙ５．１）を、２日間絶食させた後に、通常の餌またはバリンを含まない餌で２週間飼育して、ドナーとしてのＢ６マウス（Ｌｙ５．２）由来のＫＳＬ細胞５×１０3個をレシピエントに移植し、その後は、通常の餌で飼育し、３か月間にわたって、造血幹細胞のキメラ率をモニターした。【００９０】
すると、図１４Ｂに示されるように、通常の餌で２週間飼育したマウスでは、ドナー細胞の生着は認められなかったが、バリンを含まない餌で２週間飼育したマウスでは、ドナー細胞の生着が認められた。【００９１】
また、図１４Ｃに示されるように、バリンを含まない餌で２週間飼育したマウスでは、１０匹中死亡した４匹を除いてはすべてでドナー細胞の生着が確認された。また、移植１か月後のレシピエントマウスでは、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞が確認された（図１４Ｃ）。【００９２】
このことから、造血幹細胞移植においては、レシピエント由来の造血幹細胞を照射により除去してからドナー由来の造血幹細胞を移植するのが従来の方法であるが、照射の代わりにバリンを含まない餌で飼育するだけでも、ドナー由来の移植造血幹細胞が生着させることができることが分かった。【００９３】
実施例７：ヒト造血幹細胞に対するバリン欠損の影響
臍帯血からＣＤ３４+ＣＤ３８-Ｌｉｎ-の造血幹細胞を常法により得た。得られたヒト造血幹細胞をアミノ酸のいずれかを含まない培地（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−３およびＩＬ−６を含む）で１０日間培養して常法によりメチルセルロース培地を用いてコローにアッセイをした。【００９４】
その結果は、図１５に示される通りであった。ヒト造血幹細胞は、バリンを含まない培地で培養するとコロニーを形成することができなかった。ヒト造血幹細胞は、システイン、ヒスチジン、リジン、メチオニンまたはグルタミンを含まない培地で培養しても、コロニーを形成することができなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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