(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドであって、前記Ｆｃ領域が、Ｎ２９７Ｇ変異を含み、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、前記ポリペプチドであって、
前記Ｆｃ領域が、配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、ＥＵ付番規定に基づいた、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ置換、又はＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列内にＡ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列内にＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｆｃ領域が、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列内にＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のＦｃ領域を含む、抗体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のＦｃ領域を含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１１または請求項１２に記載の前記宿主細胞。
【請求項１４】
さらに、リンカーを含むポリペプチドであって、前記リンカーが、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記リンカーが、Ｎ−糖鎖付加を含む、請求項１４に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１６】
前記リンカーが、ポリペプチド構造中のループに挿入されるか、またはそれを置き換える、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞培養物中で、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を発現することと、
ｂ）前記培養物からアグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を収集することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された、米国仮出願第６１／７８４，６６９号の利益を主張するものである。上に特定された出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子的フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、サイズが５７，３４４バイトである、２０１４年３月１３日に作成された、Ａ−１８９２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題したテキストファイルとして提供される。配列表の電子的フォーマット中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ−２は、ＩＬ−２結合時に細胞内シグナル伝達事象を一緒に活性化するＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγ、ならびにＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβγとの間の相互作用を安定化する働きをするＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）という３つの膜貫通受容体サブユニットに結合する。ＩＬ−２Ｒβγ  によって送達されるシグナルは、ＰＩ３−キナーゼ、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ、及びＳＴＡＴ５経路のシグナルを含む。
【０００４】
Ｔ細胞は、組織中に典型的に存在するＩＬ−２の低濃度に応答するために、ＣＤ２５の発現を必要とする。ＣＤ２５を発現するＴ細胞には、自己免疫性炎症の抑制に必須のＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、及びＣＤ２５を発現するために活性化されたＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の両方が含まれる。ＦＯＸＰ３−ＣＤ２５＋Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得、この両方が炎症、自己免疫、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病に寄与し得る。ＩＬ−２刺激性ＳＴＡＴ５シグナル伝達は、正常なＴ−ｒｅｇ細胞の成長及び残存、ならびに高ＦＯＸＰ３発現にとって極めて重要である。
【０００５】
共同所有のＷＯ第２０１０／０８５４９５号において、我々はＴｒｅｇ細胞を優先的に増殖または刺激するためのＩＬ−２変異タンパク質の使用について説明している。対象に投与される場合、Ｔｒｅｇ細胞への効果は、炎症性及び自己免疫疾患を治療するのに有用である。その中に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、インビボでＴｅｆｆ細胞を超えてＴｒｅｇ細胞を増殖させるのに有用であるが、ヒトの治療に最適な属性を有するＩＬ−２変異タンパク質を形成することが望ましかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０８５４９５号
【発明の概要】
【０００７】
高収率の製造可能性に適し、かつ最適化された薬理学的活性を有するＩＬ−２変異タンパク質が、本明細書に記載される。例示的なＩＬ−２変異タンパク質に基づくヒト治療を生み出す試みにおいて、多くの予期せぬ予測不可能な観測が起こった。本明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、その試みの結果である。
【０００８】
本明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２に対する最小限の数の変化を有し、それにより、Ｔｒｅｇの優先的な増殖及び活性化を維持しながら、ＩＬ−２変異タンパク質及び／または内因性ＩＬ−２に対する免疫応答を形成する見込みを減少させる。また、ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、対象に投与された場合に血清半減期を増加させる、例えば抗体Ｆｃ等の分子に融合される。ＩＬ−２変異タンパク質は、短い血清半減期（皮下注射の場合３〜５時間）を有する。本明細書に記載される例示的なＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合物は、ヒトにおいて、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、または少なくとも２５日の半減期を有する。ＩＬ−２変異タンパク質の薬物動態におけるこの効果は、ＩＬ−２変異タンパク質治療の、減少した、またはより少ない頻度の投与を可能にする。
【０００９】
また、薬学的大分子を作成する場合、凝集を最小限に抑え、分子の安定性を最大限にしながら、大分子を大量に生産する能力について考慮されなければならない。ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合分子は、そのような属性を示す。
【００１０】
加えて、ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。ＩｇＧ１のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を無効にすることが望ましい場合、位置２９７におけるアスパラギンのグリシンへの変異（Ｎ２９７Ｇ、ＥＵ付番規定）が、大幅に改善された精製効率、及びアグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃをもたらす他の変異を上回る生物物理学的特性を提供することが見出された。好ましい実施形態において、システインがＦｃ中に設計されてジスルフィド結合を可能にし、これがアグリコシル化Ｆｃ含有分子の安定性を増加させた。アグリコシル化Ｆｃの有用性は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合構成を凌ぐ。したがって、Ｎ２９７Ｇ置換、及び任意に１つ以上の追加的な残基のシステインへの置換を含む、Ｆｃ含有分子、Ｆｃ融合物、及び抗体が本明細書に提供される。
【００１１】
本発明の別の態様は、グリコシル化されたペプチドリンカーを含む。Ｎ−グリコシル化に適する好ましいリンカーペプチドには、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】短期間の刺激アッセイにおいて、ＩｇＧ−ＦｃのＣ末端への融合によるホモ二量体化は、低減された効力及びＣＤ２５に対する高親和性で、ＩＬ−２変異タンパク質の活性を変化させない。
【図２Ａ】示された変異を伴い、Ｆｃヘテロ二量体の１つの側のＣ末端に融合されるＩＬ−２変異タンパク質を、Ｔ細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化反応を刺激するそれらの能力について試験した。これらの変異タンパク質はまた、ＣＤ２５に対する高親和性を付与する３つの変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）を含有した。それらの活性を、Ｆｃ融合無しのＩＬ−２の３つの形態（中空き記号）、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対する高親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、及びＨａＤ（ＣＤ２５に対する高親和性、及び低減されたシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。ホスホ−ＳＴＡＴ５応答を、ゲート化ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋及びＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞について示す。
【図２Ｂ】示された変異を伴い、Ｆｃヘテロ二量体の１つの側のＣ末端に融合されるＩＬ−２変異タンパク質を、Ｔ細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化反応を刺激するそれらの能力について試験した。これらの変異タンパク質はまた、ＣＤ２５に対する高親和性を付与する３つの変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）を含有した。それらの活性を、Ｆｃ融合無しのＩＬ−２の３つの形態（中空き記号）、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対する高親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、及びＨａＤ（ＣＤ２５に対する高親和性、及び低減されたシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。ホスホ−ＳＴＡＴ５応答を、ゲート化ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋及びＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞について示す。
【図３】Ｆｃヘテロ二量体に融合するＩＬ−２変異タンパク質の用量設定に応答する、Ｔ細胞サブセットの増殖。融合タンパク質の活性を、Ｆｃ融合無しのＩＬ−２の３つの形態（中空き記号）、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対する高親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、及びＨａＤ（ＣＤ２５に対する高親和性、及び低減されたシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。
【図４】Ｆｃヘテロ二量体に融合するＩＬ−２変異タンパク質の用量設定に応答する、ＮＫ細胞の増殖。融合タンパク質の活性を、Ｆｃ融合無しのＩＬ−２の３つの形態（中空き記号）、ＷＴ  ＩＬ−２、ＨａＷＴ（ＣＤ２５に対する高親和性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）、及びＨａＤ（ＣＤ２５に対する高親和性、及び低減されたシグナル伝達活性）（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）と比較した。
【図５】Ｆｃホモ二量体、Ｎ２９７Ｇに融合するＩＬ−２変異タンパク質の用量設定に応答する、Ｔ細胞サブセットの増殖。Ｆｃ変異タンパク質の活性を、ＷＴ  ＩＬ−２（白丸）及びＦｃ．ＷＴ（黒丸）と比較した。ＣＤ２５に対する高親和性を付与する変異（ＨａＭｕｔ１）は、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐであった。
【図６】Ｆｃホモ二量体、Ｎ２９７Ｇに融合するＩＬ−２変異タンパク質の用量設定に応答する、ＮＫ細胞の増殖。Ｆｃ変異タンパク質の活性を、ＷＴ  ＩＬ−２（白丸）及びＦｃ．ＷＴ（黒丸）と比較した。
【図７Ａ】ＣＤ２５に対する高親和性を付与する変異を伴わないＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト化マウスにおいてＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３発現上昇を促進する。
【図７Ｂ】ＣＤ２５に対する高親和性を付与する変異を伴わないＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト化マウスにおいてＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３発現上昇を促進する。
【図８】Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の低い週量（動物当たり０．５μｇ）は、Ｆｃ．Ｎ８８Ｄ及びＦｃ．ＷＴに対してＦｃ．Ｖ９１Ｋについて観察される良好な活性を伴って、ヒト化マウスにおけるＴｒｅｇ増殖及びＦＯＸＰ３発現上昇を促進する。
【図９】Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄは、ＣＤ２５との会合を通じて、活性化されたＴ細胞の表面上に存続する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に体系付けの目的のためであり、記載される主題の制限として解釈されるべきではない。本明細書の本文内に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【００１４】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び転換、タンパク質精製等について、標準的な技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当分野において一般的に達成される通りに、もしくは本明細書に記載される通りに行われ得る。以下の手順及び技術は、当分野において公知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用及び考察される、様々な一般的かつより特定の参考文献において説明される通りに概して行われ得る。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される、分析化学、有機化学、ならびに医薬品化学及び薬化学に関連して使用される専門用語、ならびにそれらの実験室法及び技術は、当分野において公知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤、配合、ならびに患者の送達及び治療について、標準的な技術が使用され得る。
【００１５】
ＩＬ−２
本明細書に記載されるＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ヒトＩＬ−２の変異型である。本明細書で使用する場合、「野生型ヒトＩＬ−２」、「野生型ＩＬ−２」、または「ＷＴ  ＩＬ−２」は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味することとする。
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＸＱＳＩＩＳＴＬＴ
Ｘは、Ｃ、Ｓ、Ｖ、またはＡである（配列番号２）。
【００１６】
変異型は、野生型ＩＬ−２アミノ酸配列内に１つ以上の置換、欠損、または挿入を含有し得る。残基は、１文字のアミノ酸コードと、それに続くＩＬ−２アミノ酸の位置とによって本明細書において指定され、例えばＫ３５は、配列番号２の位置３５におけるリジン残基である。置換は、１文字のアミノ酸コードと、それに続くＩＬ−２アミノ酸の位置と、それに続く置換する１文字のアミノ酸コードとによって本明細書において指定され、例えばＫ３５Ａは、配列番号２の位置３５におけるリジン残基の、アラニン残基での置換である。
【００１７】
ＩＬ−２変異タンパク質
Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を優先的に刺激する、ヒトＩＬ−２変異タンパク質が本明細書に提供される。本明細書で使用する場合、「Ｔ制御性細胞を優先的に刺激する」とは、変異タンパク質が、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を超えて、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖、残存、活性化、及び／または機能を促進することを意味する。Ｔｒｅｇを優先的に刺激する能力を測定する方法は、末梢血中白血球の流動細胞計測法によって測定することができ、この中で、総ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加、総ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＦＯＸＰ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加、ＮＫ細胞に対するＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加、及び／またはＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５の発現レベルの、他のＴ細胞上のＣＤ２５発現の増加に対してより大きな増加が確認される。Ｔｒｅｇ細胞の優先的な成長はまた、重亜硫酸塩処理ゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の配列決定によって検出されるように、全血から抽出されるＤＮＡ中の脱メチル化ＣＤ３遺伝子に対する、脱メチル化ＦＯＸＰ３プロモーターＤＮＡ（すなわち、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域、またはＴＳＤＲ）の増加した表現としても検出できる（Ｊ．Ｓｅｈｏｕｌｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２，２３６−２４６）。
【００１８】
Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激するＩＬ−２変異タンパク質は、対象または末梢血液試料中において、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を超える、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の比率を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１０００％増加させる。
【００１９】
好ましいＩＬ−２変異タンパク質としては、限定されるものではないが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中にＶ９１ＫまたはＮ８８Ｄ置換を含む、ＩＬ−２変異タンパク質が挙げられる。例示的なＩＬ−２変異タンパク質は、配列番号１において示される。Ｃ１２５Ａ置換を含む、配列番号１に示されるアミノ酸配列が、特に好ましい。野生型ＩＬ−２配列に対する更なる変異の数を低減することが有利であり得るが、本発明は、Ｖ９１ＫまたはＮ８８Ｄ置換に加えて、切断もしくは追加的な挿入、欠損、または置換を有するＩＬ−２変異タンパク質を、該変異タンパク質がＴｒｅｇを優先的に刺激する活性を維持するという条件で含む。したがって、実施形態は、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激し、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、Ｖ９１ＫまたはＮ８８Ｄを有するアミノ酸配列を含む、ＩＬ−２変異タンパク質を含む。特に好ましい実施形態において、そのようなＩＬ−２変異タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
アミノ酸配列について、配列同一性及び／または類似性は、当分野で既知の標準的な技術を用いて決定されるが、これらの技術としては、限定されるものではないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって説明され、好ましくはデフォルト設定を使用するか、または検定によって使用する、Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムが挙げられる。好ましくは、パーセント同一性は、ＦａｓｔＤＢによって、以下のパラメーター、１のミスマッチペナルティー、１のギャップペナルティー、０．３３のギャップサイズペナルティー、及び３０のジョイニングペナルティーに基づいて計算される（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００２１】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進性の、対でのアラインメントを用いて、一群の関連配列から複数の配列アラインメントを形成する。ＰＩＬＥＵＰはまた、アラインメントを形成するために使用されるクラスタリングの関係性を示すツリーを図化することができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の累進アライメント法の単純形を使用し、この方法はＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３によって説明されるものと類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップ重、０．１０のデフォルトギャップ長重、及び加重末端ギャップを含む。
【００２２】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られた、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを用いるが、それらの大部分はデフォルト値に設定される。調節可能なパラメーターは以下の値、オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ部分＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１で設定される。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的値であり、特定の配列の構成と、目的とする配列がそれに対して検索されている、特定のデータベースの構成とに応じてプログラム自体によって確定されるものの、この値は感度を増加させるために調節され得る。
【００２３】
追加的な、有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２により報告されるような、ギャップ化ＢＬＡＳＴである。ギャップ化ＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア、つまり、９に設定した閾値Ｔパラメーター、非ギャップ化伸長を引き起こす２ヒット法、１０＋ｋのコストであるｋの加重ギャップ長、１６に設定したＸｕ、及びデータベース検索段階用に４０に設定し、アルゴリズムの出力段階用に６７に設定したＸｇを使用する。ギャップ化アライメントは、約２２ビットに対応するスコアによって引き起こされる。
【００２４】
アミノ酸配列変異を導入するための部位または領域は事前に決定され得るが、変異自体を事前に決定する必要はない。例えば、所定の部位における変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダム突然変異誘発が、標的コドンまたは領域において実行され得、発現したＩＬ−２変異タンパク質は、所望の活性の最適化な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ中の事前に決定した部位での置換変異を作製するための技術は公知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発、及びＰＣＲ変異誘発である。変異体のスクリーニングは、例えば、本明細書に記載されるアッセイを用いて為され得る。
【００２５】
アミノ酸置換は、典型的には単一残基であり、挿入は通常、およそ、約１〜約２０アミノ酸残基であるが、相当に大きな挿入物が許容され得る。欠損は、約１〜約２０アミノ酸残基の範囲であるが、いくつかの場合、欠損は、遥かに大きくなり得る。
【００２６】
置換、欠損、挿入、またはそれらの任意の組合せが、最終的な誘導体または変異型に到達するために使用され得る。一般的に、これらの変化は、分子の変化、特に抗原結合タンパク質の免疫原性及び特異性の変化を最小限に抑えるために、数個のアミノ酸上で為される。しかし、より大きな変化が、ある特定の状況においては許容され得る。保存的置換は一般的に、表１として表される以下の表に従って行われる。
【表１】
0006480409.tif 000002
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、表１に示される置換よりも保存的でない置換を選択することによって生じる。例えば、変化の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、αヘリックスまたはβシート構造、標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または側鎖の大きさにより有意に影響を与える置換が行われ得る。一般的にポリペプチドの特性に最も大きな変化を生むと予期される置換は、（ａ）例えばセリルもしくはトレオニル等の親水性残基が、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニル等の疎水性残基と（または残基に）置換される、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基と（または残基に）置換される、（ｃ）例えばリジル、アルギニル、もしくはヒスチジル等の電気陽性の側鎖を有する残基が、例えばグルタミルもしくはアスパルチル等の電気陰性の残基と（または残基に）置換される、または（ｄ）例えばフェニルアラニン等の、体積の大きい側鎖を有する残基が、例えばグリシン等の側鎖を有しないものと（またはそれに）置換される場合のものである。
【００２７】
変異型は典型的に、同一の定性的な生物学的活性を提示し、天然に存在する類似体と同一の免疫応答を誘発することになるが、変異体はまた、必要に応じてＩＬ−２変異タンパク質の特性を修正するために選択される。代わりに、変異型は、ＩＬ−２変異タンパク質の生物学的活性が変化するように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、本明細書に考察されるように変化または除去され得る。
【００２８】
伸長した血清半減期を有するＩＬ−２変異タンパク質
本明細書に提供されるＩＬ−２変異タンパク質は、例えばＴｅｆｆ細胞またはＮＫ細胞を超えて、優先してＴｒｅｇ細胞を増殖するため、患者に投与される場合の安全性特性は、野生型ＩＬ−２またはＰＲＯＬＥＵＫＩＮのものとは異なるであろうことが予期される。野生型ＩＬ−２またはＰＲＯＬＥＵＫＩＮに関連付けられる副作用としては、インフルエンザ様症状、寒気／悪寒、関節痛、発熱、発疹、掻痒症、注射部位反応、低血圧症、下痢、吐き気、不安症、混乱、及び鬱が挙げられる。本明細書に提供されるＩＬ−２変異タンパク質は、そのような半減期の伸長が患者における副作用または有害事象の見込みまたは強度を増加させるようなリスクを増加させることなく、変異タンパク質の血清半減期を伸長する分子を含むように、またはそれに融合するように改変され得る。そのような伸長された血清半減期の変異タンパク質の皮下投与は、より少ない全身性の最大曝露（Ｃｍａｘ）を伴う遷延性の標的範囲を可能にし得る。伸長された血清半減期は、より少ない、またはより頻度の低い変異タンパク質の投与計画を可能にし得る。
【００２９】
本明細書に提供されるＩＬ−２変異タンパク質の血清半減期は、当分野で既知の、本質的に任意の方法によって伸長され得る。そのような方法としては、新生児のＦｃγ受容体に結合するペプチドを含むように、または例えばＩｇＧもしくはヒト血清アルブミン等の、伸長された血清半減期を有するタンパク質に結合するように、ＩＬ−２変異タンパク質の配列を改変することが挙げられる。他の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、融合分子に伸長された半減期を付与するポリペプチドに融合される。そのようなポリペプチドとしては、新生児のＦｃγ受容体、ヒト血清アルブミン、または伸長された血清半減期を有するタンパク質に結合するポリペプチドに結合する、ＩｇＧ  Ｆｃまたは他のポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃ分子に融合される。
【００３０】
ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。実施例において示されるように、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣ末端への融合は、ＩｇＧ  ＦｃのＮ末端に融合される場合よりも大きな度合いでＩＬ−２変異タンパク質活性を維持する。
【００３１】
本発明の一実施形態は、ＩＬ−２変異タンパク質を抗体のＦｃ領域に融合することによって形成される２つのＦｃ融合ポリペプチドを含む、二量体を対象とする。例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクター中に挿入し、組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で遺伝子融合を発現し、発現された融合タンパク質が抗体分子に非常に似たものを構築することを許容し、その上で鎖間結合がＦｃ部分間で形成されて二量体を生むことによって、二量体を作製することができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ領域」には、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然形態及び変異タンパク質形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切断型もまた含まれる。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。伸長された血清半減期と共に、Ｆｃ部分（及びそれから形成されるオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。好ましいＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、ヒトＩｇＧに由来する。本明細書において、Ｆｃ内の特定の残基が位置により特定される。全てのＦｃ位置は、ＥＵ付番規定に基づく。
【００３３】
抗体のＦｃ部分の機能のうちの１つは、抗体がその目標と結合するときに免疫系に連絡することである。これは「エフェクター機能」とみなされる。連絡は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃとＦｃ受容体との結合を通じて媒介される。ＣＤＣは、例えばＣ１ｑ等の補体系のタンパク質とのＦｃの結合を通じて媒介される。
【００３４】
ＩｇＧサブクラスは、エフェクター機能を媒介するそれらの能力において相違する。例えば、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの媒介において、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも遥かに優れている。したがって、エフェクター機能が望ましくない実施形態においては、ＩｇＧ２  Ｆｃが好ましいことになる。しかしながら、ＩｇＧ２  Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、製造がより困難であり、例えばより短い半減期等の、有する生物物理学的特性の魅力がより低いことが既知である。
【００３５】
抗体のエフェクター機能は、１つ以上の変異をＦｃに導入することによって増加または減少され得る。本発明の実施形態には、エフェクター機能を増加させるように設計されたＦｃを有する、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が含まれる（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国第７，３１７，０９１号、及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５−６９１，２００９）。増加したエフェクター機能を有する例示的なＩｇＧ１  Ｆｃ分子としては、以下の置換を有するものが挙げられる。
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ
Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
【００３６】
ＩｇＧ  Ｆｃ含有タンパク質のエフェクター機能を増加させる別の方法は、Ｆｃのフコシル化を低減させることによるものである。Ｆｃに結合する二分岐複合型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合またはＣＤＣエフェクター機能を変化させることなく、ＡＤＣＣエフェクター機能を大きく増加させる。例えば抗体等のＦｃ含有分子のフコシル化を低減または無効にするためのいくつかの方法が既知である。それらとしては、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ系Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、特にＦＵＴ８遺伝子に対する小さな干渉ＲＮＡを含む細胞株、ならびにβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα−マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞株を含む、ある特定の哺乳動物細胞株における組み換え発現が挙げられる。代わりに、植物細胞、酵母菌、または大腸菌等の原核細胞等の非哺乳動物細胞中で、Ｆｃ含有分子を発現させてもよい。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を減少させるように設計されたＦｃを含む。減少したエフェクター機能を有する例示的なＦｃ分子としては、以下の置換を有するものが挙げられる。
Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｑ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）
Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）
Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）
【００３８】
ヒトＩｇＧ１は、Ｎ２９７（ＥＵ付番規定）においてグリコシル化部位を有し、グリコシル化は、ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与することが既知である。例示的なＩｇＧ１配列が、配列番号３において提供される。群は、アグリコシル化抗体を作製するため、Ｎ２９７を変異させている。変異は、グルタミン等の、生理化学的な性質においてアスパラギンに類似するアミノ酸でＮ２９７を置換すること（Ｎ２９７Ｑ）、または極性基無しでアスパラギンに擬するアラニンで置換すること（Ｎ２９７Ａ）に焦点を有する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「アグリコシル化抗体」または「アグリコシル化ｆｃ」は、Ｆｃの位置２９７におけるグリコシル化状態を指す。抗体または他の分子は、１つ以上の他の場所においてグリコシル化を含有し得るが、それでもなおアグリコシル化抗体、またはアグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質とみなされ得る。
【００４０】
エフェクター機能の無いＩｇＧ１  Ｆｃを作製する我々の試みにおいて、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｎ２９７のグリシンへの変異、すなわちＮ２９７Ｇが、その残基における他のアミノ酸置換を超えて、遥かに優れた精製効率及び生物物理学的特性を提供することが見出された。実施例８を参照されたい。したがって、好ましい実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含む。Ｎ２９７Ｇ置換を含むＦｃは、分子がヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含む任意の構成中で有用であり、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合物の構成における使用に制限されるものではない。ある特定の実施形態において、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するＦｃを含む。
【００４１】
Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含むＦｃはまた、更なる挿入、欠損、及び置換を含んでもよい。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、Ｎ２９７Ｇ置換を含み、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。特に好ましい実施形態において、Ｃ末端リジン残基は置換される、または欠損する。Ｎ２９７Ｇ置換、及びＣ末端リジンの欠損を含む、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。
【００４２】
アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子よりも安定性が低いことが示された。Ｆｃ領域は、アグリコシル化分子の安定性を増加させるために更に設計され得る。一部の実施形態において、二量体状態においてジスルフィド結合を形成するよう、１つ以上のアミノ酸が、システインに置換される。配列番号３に示されるアミノ酸配列の残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２は、システインで置換され得る。好ましい実施形態において、残基の特定の対は、それらが優先的にジスルフィド結合を互いに形成し、したがってジスルフィド結合がスクランブルすることを制限または阻止するような置換である。好まれる対としては、限定されるものではないが、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、ならびにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられる。
【００４３】
残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、またはＩ３３２のうちの１つ以上がシステインで置換される、Ｆｃ含有分子が本明細書に提供される。好まれるＦｃ含有分子としては、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、またはＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ置換を含むものが挙げられる。
【００４４】
例示的なＦｃ含有分子は、以下を含む。
Ｎ２９７Ｇ、Ａ２８７Ｃ、Ｌ３０６Ｃ置換及びＣ末端Ｋの欠損を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＣＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＣＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭ（配列番号３９）
Ｎ２９７Ｇ、Ｖ２５９Ｃ、Ｌ３０６Ｃ置換及びＣ末端Ｋの欠損を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＣＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＣＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４０）
Ｎ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ置換及びＣ末端Ｋの欠損を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＣＥＥＱＹＧＳＴＹＲＣＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４１）
Ｎ２９７Ｇ、Ａ２８７Ｃ、Ｌ３０６Ｃ置換を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＣＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＣＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２）
Ｎ２９７Ｇ、Ｖ２５９Ｃ、Ｌ３０６Ｃ置換を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＣＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＣＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３）
Ｎ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ置換を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＣＥＥＱＹＧＳＴＹＲＣＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４４）
【００４５】
ＩｇＧ１  Ｆｃに為され得る追加的な変異としては、Ｆｃ含有ポリペプチド内でヘテロ二量体形成を助長するものが挙げられる。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、細胞中で共発現された場合、２つの異なるＦｃ含有ポリペプチド鎖のヘテロ二量体形成を助長する、「ノブ」及び「ホール」を形成するように設計されている。米国第７，６９５，９６３号。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、細胞中で共発現された場合、２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドのホモ二量体形成を防止しながら、ヘテロ二量体形成を助長するように、静電ステアリングを使用するために改変される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ第０９／０８９，００４号。好まれるヘテロ二量体Ｆｃとしては、Ｆｃの１つの鎖がＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ置換を含み、Ｆｃのもう一つの鎖がＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ置換を含むものが挙げられる。他の実施形態において、Ｆｃの１つの鎖はＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及びＥ３５７Ｋ置換を含み、Ｆｃのもう一つの鎖がＫ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ３７０Ｄ置換を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が単量体である、すなわち単一のＩＬ−２変異タンパク質分子のみを含有することが有利であり得る。そのような実施形態において、融合タンパク質のＦｃ領域は、ヘテロ二量体形成を助長する１つ以上の変異を含有し得る。融合タンパク質は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合ポリペプチド中のものへの相互変異だが、ＩＬ−２変異タンパク質を欠く相互変異を有するＦｃ領域を伴って共発現する。２つのＦｃ含有ポリペプチドのヘテロ二量体が形成される場合、結果として生じるタンパク質は単一のＩＬ−２変異タンパク質のみを含む。
【００４７】
単量体のＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を形成する別の方法は、ＩＬ−２変異タンパク質を単量体Ｆｃ、すなわち二量体化しないＦｃ領域に融合させることである。安定した単量体Ｆｃは、二量体化を防止し、分子を単量体形態に安定化する変異を含む。好ましい単量体Ｆｃは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ第２０１１／０６３３４８号において開示される。ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、位置３９２及び４０９における負に荷電されたアミノ酸を、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｖ３９７、Ｌ３９８、Ｆ４０５、またはＹ４０７におけるトレオニン置換と共に含むＦｃを含む。
【００４８】
ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃとＩＬ−２変異タンパク質との間のリンカーを含む。多くの異なるリンカーポリペプチドが当分野において既知であり、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の構成において使用され得る。好ましい実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃとＩＬ−２変異タンパク質との間に、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）からなるペプチドの１つ以上の複製を含む。一部の実施形態において、Ｆｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質領域との間のポリペプチド領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）の単一の複製を含む。本明細書に示されるように、リンカーＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）は、適切な細胞中で発現される場合グリコシル化され、そのようなグリコシル化は、溶液中で、ならびに／またはインビボで投与される場合、タンパク質の安定化に役立ち得る。したがって、ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質は、Ｆｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質領域との間のグリコシル化リンカーを含む。
【００４９】
ポリペプチドの構成中に配置された場合、グリコシル化リンカーは有用であり得ることが企図される。ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入された、またはポリペプチドのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸を置き換える、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）を含むポリペプチドが本明細書に提供される。好ましい実施形態において、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）は、ポリペプチド三次構造のループ中に挿入される。他の実施形態において、ループの１つ以上のアミノ酸が、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号７）で置き換えられる。
【００５０】
ＦｃのＣ末端部分、及び／またはＩＬ−２変異タンパク質のアミノ末端部分は、哺乳動物細胞中で発現された場合、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化特性を変化させる１つ以上の変異を含有し得る。ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、例えばＴ３ＮまたはＴ３Ａ等のＴ３置換を更に含む。ＩＬ−２変異タンパク質は、Ｓ５Ｔ等のＳ５置換を更に含み得る。
【００５１】
ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の共有結合修飾が、本発明の範囲内に含まれ、常にではないが一般的に、翻訳後に為される。例えば、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の共有結合修飾のいくつかの種類が、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の特定のアミノ酸残基を、選択される側鎖、またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。
【００５２】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生み出す。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により、誘導体化され得る。
【００５３】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化されるが、これは、この作用剤が、ヒスチジル側鎖について比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で０．１Ｍのナトリウムカコジレート中で行われる。
【００５４】
リジニル残基及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの作用剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、例えばメチルピコリンイミデート等のイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応等が挙げられる。
【００５５】
アルギニル残基は、１種または複数種の従来の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化には、アルカリ性条件で反応を行うことが必要である。更に、これらの試薬は、リジンの基、ならびにアルギニンのε−アミノ基と反応しうる。
【００５６】
芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基中へのスペクトル標識の導入における特別の関心を伴い、チロシル残基の特異的修飾が為され得る。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、放射免疫測定法において使用するための標識タンパク質を調製するが、上に記載されるクロラミンＴ法が好適である。
【００５７】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等の、式中のＲ及びＲ’が、任意に異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
【００５８】
二官能剤での誘導体化は、様々な方法における使用のために、水不溶性支持体マトリックスまたは表面に抗原結合タンパク質を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成可能な光活性化中間体を生む。代わりに、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、及び同第４，３３０，４４０号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性水不溶性マトリックス及び反応性基材が、タンパク質固定化のために採用される。
【００５９】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、多くの場合、それぞれ、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基へと脱アミド化される。代わりに、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に包含される。
【００６０】
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００６１】
本発明の範囲内に含まれる、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の共有結合修飾の別の形式は、タンパク質のグリコシル化パターンの改変を含む。当分野において既知であるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下に考察される、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在もしくは非存在）、またはその中でタンパク質が生成される宿主細胞もしくは生物体の両方に依存し得る。特定の発現系が下で考察される。
【００６２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。式中のＸがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ−結合型グリコシル化とは、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【００６３】
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上に記載されるトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって便宜的に達成され得る（Ｎ−結合型グリコシル化部位に対して）。改変はまた、出発配列に対する１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加またはそれらによる置換によって為され得る（Ｏ結合グリコシル化部位に対して）。簡便性のため、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように、特に、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを事前選択された塩基において変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変される。
【００６４】
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質にグリコシドを化学的または酵素的に連結することによるものである。これらの手順は、Ｎ−及びＯ−結合型グリコシル化についてのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の生成を必要としないという点において有利である。使用される連結モードに依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）例えばシステインのもの等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）例えばセリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ第８７／０５３３０号、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載される。
【００６５】
出発ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、ポリペプチドを不変のままにしつつ、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２、及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により説明される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により説明されるように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成できる。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により説明されるように、化合物、ツニカマイシンの使用によって阻止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻害する。
【００６６】
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の共有結合修飾の別の形式は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に示される様式で、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン等の様々なポリオールを含む様々な非タンパク質性ポリマーにＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を連結することを含む。加えて、ＰＥＧ等のポリマーの付加を助長するために、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質内の様々な位置でアミノ酸置換を為し得る。したがって、本発明の実施形態は、ペグ化されたＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を含む。そのようなペグ化されたタンパク質は、ペグ化されていないタンパク質を超えて、増加した半減期、及び／または低減された免疫原性を有し得る。
【００６７】
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸が、本発明内に包括される。本発明の態様は、本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド変異型（例えば、縮重による）を含む。好ましい実施形態において、単離された核酸によってコードされるポリペプチドは、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の構成要素である。
【００６８】
核酸の単離のためのプローブもしくはプライマーとして、またはデータベース検索のための問い合わせ配列として使用するための、本明細書に記載されるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、アミノ酸配列からの「逆翻訳」によって獲得できる。公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順が、ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離及び増幅するために採用され得る。ＤＮＡ断片の組み合わせの所望の終端を定義するオリゴヌクレオチドが、５’及び３’プライマーとして採用される。オリゴヌクレオチドは、追加的に、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含有して、発現ベクターへの、ＤＮＡ断片の増幅された組み合わせの挿入を助長し得る。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９），ｐｐ．１８９−１９６、及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００６９】
本発明の核酸分子は、一本鎖及び二本鎖形態の両方のＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補的配列を含む。自然発生源から単離される核酸の場合、「単離核酸」は、核酸がそれから単離される生物体のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から切り離された核酸である。例えばＰＣＲ生成物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチド等の、鋳型から酵素的に、または化学的に合成される核酸の場合、そのようなプロセスから結果として得られる核酸は、単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形態である、またはより大きい核酸構築物の構成要素としての核酸分子を指す。１つの好ましい実施形態において、核酸は、汚染内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で概説されるもの等）によって、その構成要素ヌクレオチド配列の特定、操作、及び回収を可能にする、実質的に純粋な形態で、かつ量または濃度で少なくとも一度単離された、ＤＮＡまたはＲＮＡに好ましくは由来している。そのような配列は、好ましくは、真核細胞遺伝子中に典型的に存在する、内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、オープンリーディングフレームの形態で、提供及び／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームからの５’または３’に存在し得、同配列は、コード領域の操作または発現に干渉しない。
【００７０】
本発明による変異型は、通常、カセットもしくはＰＣＲ変異導入法、または当分野において公知の他の技術を用いて、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異によって調製されて、変異型をコードするＤＮＡを生成し、その後本明細書に概説されるように、細胞培養物中で組み替えＤＮＡを発現する。しかしながら、ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合物は、確立された技術を用いて、インビトロ合成によって調製してもよい。変異型は典型的に、例えばＴｒｅｇの増殖等の、天然に存在する類似体と同一の定性的な生物学的活性を提示するが、下でより完全に概説されるように、修正された特性を有する変異型もまた選択され得る。
【００７１】
当業者によって理解されるように、遺伝子コードの縮重により、極度に多数の核酸を作製してもよく、この全てが本発明のＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を特定した後、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化しない方法で１つ以上のコドンの配列を修飾するだけで、任意の数の異なる核酸を作製することができる。
【００７２】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミド、発現ベクター、転写物、または発現カセットの形態で、発現系及び構築物を提供する。加えて、本発明は、そのような発現系または構築物を含む宿主細胞を提供する。
典型的には、宿主細胞のうちのいずれにおいても使用される発現ベクターは、プラスミド維持のため、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有することになる。集合的に「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は、ある特定の実施形態において、典型的に、以下のヌクレオチド配列、プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及び受容スプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択可能なマーカー要素のうちの１つ以上を含むことになる。これらの配列のうちのそれぞれが、下で考察される。
【００７３】
任意に、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のコード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく、オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓ（配列番号２１）等）、または市販の抗体が存在する、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）、もしくはｍｙｃ等の別の「タグ」をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＩＬ−２変異タンパク質の親和性精製または検出のための手段として働くことができる。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてのタグに対する抗体を用いる、カラムクロマトグラフィーによって、達成することができる。任意に、タグは、切断のためにある特定のペプチダーゼを使用すること等の様々な手段によって、精製されたＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質から後に除去することができる。
【００７４】
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つ以上の供給源からのフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であってもよい。したがって、フランキング配列源は、フランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、かつ宿主細胞機構によって活性化され得るという条件で、任意の原核もしくは真核生物、任意の脊椎もしくは無脊椎動物、または任意の植物であってもよい。
【００７５】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当分野で公知のいくつかの方法のいずれによっても獲得し得る。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングによって、及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に特定されているものであり、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適正な組織源から単離することができる。いくつかの場合において、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が既知であり得る。ここで、フランキング配列は、本明細書に記載される、核酸合成またはクローニングのための方法を用いて合成してもよい。
【００７６】
フランキング配列の全てが既知であるか、一部分のみが既知であるかにかかわらず、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ならびに／または同一もしくは別の種からの、オリゴヌクレオチド及び／もしくはフランキング配列断片等の好適なプローブでゲノムライブラリーを選別することによって獲得し得る。フランキング配列が既知でない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片が、例えば、コード配列、または１つもしくは複数の更に別の遺伝子を含有し得る、ＤＮＡのより大きい断片から単離されてもよい。単離は、適正なＤＮＡ断片を生成する制限エンドヌクレアーゼ消化と、それに続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いた単離とによって、または当業者に既知である他の方法によって達成されてもよい。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者にとって容易に明白であろう。
【００７７】
複製起点は、典型的には、商業的に購入されるそれら原核発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選ばれたベクターが複製起点部位を含有しない場合、起点を既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性菌にとって好適であり、様々なウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶ等のパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。概して、複製起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起源がしばしば使用されるのは、ただウイルス初期プロモーターも含有するからである）。
【００７８】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、ポリＴ配列が後に続く、Ｇ−Ｃが豊富な断片である。配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として商業的に購入さえされるが、本明細書に記載されるもの等の核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
【００７９】
選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培地で成長させられる宿主細胞の残存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、原核宿主細胞用のアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンへの耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補完するか、または（ｃ）複合または規定培地から利用できない決定的に重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。特定の選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核及び真核宿主細胞の両方での選択に使用されてもよい。
【００８０】
他の選択可能な遺伝子が、発現されることになる遺伝子を増幅するために使用されてもよい。増幅は、成長または細胞生存のために重要なタンパク質の生成に必要とされる遺伝子が、組み換え細胞の継続的世代の染色体内で一列になって反復される、プロセスである。哺乳動物細胞にとって好適な選択可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターを持たないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択可能な遺伝子により、生存するように一意的に適合される。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続して増加させられる条件下で、形質転換細胞を培養することによって課せられ、それにより、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質等の、選択可能な遺伝子及び別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅をもたらす。結果として、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質等の増加した量のポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【００８１】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。本要素は、典型的には、プロモーターに対して３’、かつ発現されるポリペプチドのコード配列に対して５’に位置する。ある特定の実施形態において、１つ以上のコード領域が、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に動作可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
【００８２】
グリコシル化が真核宿主細胞発現系で所望される場合等のいくつかの場合において、グリコシル化または収率を改善するために、様々なプレまたはプロ配列を操作してもよい。例えば、特定の単一のペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、またはプロ配列を追加してもよく、これはまたグリコシル化にも影響を及ぼし得る。最終タンパク質生成物は、（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対する）−１位置で、完全には除去されていない場合がある、発現から起こる１つ以上の追加のアミノ酸を有し得る。例えば、最終タンパク質生成物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位において見出される、１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。代わりに、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態をもたらし得る。
【００８３】
本発明の発現及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする分子に動作可能に連結される、プロモーターを含有するであろう。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５’）（概して約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する、非転写配列である。プロモーターは、従来、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの２つの部類のうちの１つにグループ分けされる。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは欠如、または温度の変化等の培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下のＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。一方、構成的プロモーターは、それらが動作可能に連結される遺伝子を均一に転写し、すなわち、遺伝子発現に対する制御をほとんど、または全く伴わない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される、多数のプロモーターが公知である。
【００８４】
酵母宿主と共に使用するために好適なプロモーターもまた、当分野において公知である。酵母エンハンサーが、有利なことに、酵母プロモーターと共に使用される。哺乳動物宿主細胞と共に使用するために好適なプロモーターは公知であり、限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから獲得されるものを含む。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【００８５】
目的とされ得る追加的なプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター及び制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、ならびにβ−ラクタマーゼプロモーター等の原核プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられる。また、組織特異性を提示し、遺伝子導入動物で利用されている以下の動物転写制御領域、すなわち膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６、Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ球系、及び肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１  ：２６８−２７６）、肝臓において活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）、肝臓において活性であるα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅ��ｌ  ４６：８９−９４）、脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、ならびに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）も目的とする。
【００８６】
エンハンサー配列が、高等な真核生物による転写を増加させるためにベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常は、長さが約１０〜３００ｂｐである、ＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは、配向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対する５’及び３’の両方の位置で見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能であるいくつかのエンハンサー配列が、既知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルスからのエンハンサーが使用される。当分野で既知の、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが、真核性プロモーターの活性のための例示的な増強要素である。エンハンサーは、コード配列に対して５’または３’のいずれかでベクター中に位置付けられてもよいが、典型的には、プロモーターからの部位５’に位置する。ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の細胞外分泌を促進するように、適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を、発現ベクター中に組み込むことができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、タンパク質が生成される宿主細胞の種類に依存し、異種シグナル配列が、天然シグナル配列を置き換えることができる。哺乳動物宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドの実施例としては、以下の、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列、ＥＰ特許第０３６７  ５６６号に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、ＥＰ特許第０  ４６０  ８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【００８７】
ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたときに発現を助長する、１つ以上の要素を含有してもよい。実施例としては、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）、及びマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造的組織化を媒介し、「位置」効果から統合ベクターを遮蔽してもよい。したがって、ＭＡＲは、ベクターが安定した形質移入体を形成するために使用されるときに特に有用である。いくつかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸、例えば米国特許第６，２３９，３２８号、同第７，３２６，５６７号、同第６，１７７，６１２号、同第６，３８８，０６６号、同第６，２４５，９７４号、同第７，２５９，０１０号、同第６，０３７，５２５号、同第７，４２２，８７４号、同第７，１２９，０６２号が、当分野において既知である。
【００８８】
本発明の発現ベクターは、市販のベクター等の出発ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもよく、または含有しなくてもよい。本明細書に記載されるフランキング配列のうちの１つ以上がベクターにまだ存在していない場合、それらは、個別に獲得され、ベクターに結合させられ得る。フランキング配列のうちのそれぞれを獲得するために使用される方法は、当業者に公知である。
【００８９】
ベクターが構築され、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子がベクターの適正な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞中に挿入されてもよい。選択された宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、形質移入、感染、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、または他の既知の技術を含む公知の方法によって達成されてもよい。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の種類の関数であろう。これらの方法及び他の好適な方法が、当業者に公知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に示される。
【００９０】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されたとき、後に培地から（宿主細胞がそれを培地中へ分泌する場合）、またはそれを生成する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）収集することができる、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化またはリン酸化等）のために望ましい、または必要であるポリペプチド修飾、及び生物学的に活性な分子に折り畳む簡便性等の様々の要因に依存するであろう。宿主細胞は、真核または原核であってもよい。
【００９１】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系が当分野において公知であり、限定されるものではないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が挙げられ、本発明の組み換えポリペプチドを作製するために、当分野において既知の発現系で使用される任意の細胞系を使用することができる。一般に、宿主細胞は、所望のＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合をコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで形質転換される。採用され得る宿主細胞の中には、原核生物、酵母菌、または高等な真核細胞がある。原核生物としては、例えば大腸菌または桿菌等の、グラム陰性またはグラム陽性生物体が挙げられる。高等な真核細胞としては、昆虫細胞及び哺乳動物起源の確立された細胞系が挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯ及び無血清培地で成長する関連細胞系等のそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、ならびにＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ    Ｊ．１０：２８２１によって説明されるようなアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、例えば２９３、２９３  ＥＢＮＡ、またはＭＳＲ  ２９３等のヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。任意に、様々なシグナル変換またはレポーターアッセイでポリペプチドを使用することが望ましい場合、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、またはＳ４９等の哺乳動物細胞系を、ポリペプチドの発現に使用することができる。
【００９２】
代わりに、酵母菌等の下等な真核生物で、または細菌等の原核生物でポリペプチドを生成することが可能である。好適な酵母菌としては、サッカロミセス・セレビシア、シゾサッカロミセス・ポンベ、クリベロミセス株、カンジダ、または異種ポリペプチドを発現可能な任意の酵母菌株が挙げられる。好適な細菌株としては、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、または異種ポリペプチドを発現可能な任意の細菌株が挙げられる。ポリペプチドが酵母菌または細菌中で作製される場合、機能性ポリペプチドを獲得するために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、その中で生成されるポリペプチドを修飾することが望ましくあり得る。そのような共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を用いて達成することができる。
【００９３】
ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を１つ以上の昆虫発現ベクター中の好適な制御配列に動作可能に連結し、昆虫発現系を採用することによって、生成することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．からキット形態（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）で市販されており、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）、及びＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されるように、当分野において公知である。無細胞翻訳系もまた、本明細書に開示される核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを生成するために採用することができる。細菌、真菌、酵母菌、及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）によって説明される。好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列に動作可能に連結される、本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」である。
【００９４】
ある特定の態様において、本発明は、Ｔ制御性細胞を刺激し、Ｖ９１Ｋ置換と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列とを含む、ヒトＩＬ−２変異タンパク質をコードする単離核酸酸を含む。単離核酸は、本明細書に提供される例示的なＩＬ−２変異タンパク質のいずれかを含み得る。
【００９５】
本明細書に記載される例示的なＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質のいずれかをコードする単離核酸もまた含まれる。好ましい実施形態において、抗体のＦｃ部分及びヒトＩＬ−２変異タンパク質は、単一のオープンリーディングフレーム内に、任意にＦｃ領域とＩＬ−２変異タンパク質との間にコードされたリンカーを伴ってコードされる。
【００９６】
別の態様において、プロモーターに動作可能に連結される、上記のＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターが本明細書に提供される。
【００９７】
別の態様において、上記のＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードする単離核酸を含む宿主細胞が、本明細書に提供される。宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞であってもよく、あるいは哺乳動物細胞等の真核細胞であってもよい。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【００９８】
別の態様において、ヒトＩＬ−２変異タンパク質を作製する方法が、本明細書に提供される。本方法は、ヒトＩＬ−２変異タンパク質に動作可能に連結されるプロモーターが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む。後に、ヒトＩＬ−２変異タンパク質は、該培養物から収集される。ＩＬ−２変異タンパク質は、培地及び／または宿主細胞可溶化液から収集されてもよい。
【００９９】
別の態様において、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法が、本明細書に提供される。本方法は、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質に動作可能に連結されるプロモーターが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む。後に、ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、該培養物から収集される。ヒトＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、培地及び／または宿主細胞可溶化液から収集されてもよい。
【０１００】
薬学的組成物
一部の実施形態において、本発明は、治療有効量のＩＬ−２変異タンパク質を、薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／または補助剤と共に含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の構成内である。本発明の薬学的組成物としては、限定されるものではないが、液体、凍結、及び凍結乾燥組成物が挙げられる。
【０１０１】
好ましくは、製剤物質は、採用される投与量及び濃度において受容者に対して非毒性である。特定の実施形態において、例えばＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合物等の治療用分子を含有する、治療有効量のＩＬ−２変異タンパク質を含む、薬学的組成物が提供される。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本薬学的組成物は、例えば、本組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着、または浸透を修正、維持、または保存するための製剤物質を含有してもよい。そのような実施形態において、好適な製剤物質としては、限定されるものではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、またはリジン等）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸等）、増量剤（マンニトールまたはグリシン等）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）、充填剤、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン等）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）、着色、着味、及び賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウム等）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素等）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０等のポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等）、安定性強化剤（蔗糖またはソルビトール等）、張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトール、ソルビトール等）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または配合剤が挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば意図された投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者によって決定されることになる。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。ある特定の実施形態において、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、生体内放出速度、及び生体内排除速度に影響を及ぼし得る。ある特定の実施形態において、薬学的組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、性質が水性または非水性のいずれであってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらくは非経口投与用の組成物において一般的な他の物質が補充された、注射用蒸留水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水が、更なる例示的なビヒクルである。特定の実施形態において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、更に、ソルビトールまたはその好適な代替物を含んでもよい。本発明のある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の随意の製剤化剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって、貯蔵のために調製されてもよい。更に、ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質生成物は、蔗糖等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【０１０４】
本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択することができる。代わりに、本組成物は、吸入のため、または経口等の消化管を通じた送達のために選択されてもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当分野の技能内である。製剤成分は、好ましくは、投与の部位に対して許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態において、緩衝剤が、生理学的ｐＨで、またはそれよりもわずかに低いｐＨで、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内で本組成物を維持するために使用される。
【０１０５】
非経口投与が企図される場合、本発明の使用のための本治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＩＬ−２変異タンパク質組成物を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射用の特に好適なビヒクルは、無菌蒸留水であり、その中でＩＬ−２変異タンパク質組成物が適正に保存された無菌等張液として製剤化される。ある特定の実施形態において、調製は、蓄積注射を介して送達することができる生成物の制御または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体内受食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソーム等の作用剤との、所望の分子の製剤化を伴うことができる。ある特定の実施形態において、循環において持続する期間を促進する効果を有する、ヒアルロン酸もまた使用されてもよい。ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質を導入するために、埋込型薬剤送達デバイスを使用してもよい。
【０１０６】
持続または制御送達製剤中にＩＬ−２変異タンパク質組成物を伴う製剤を含む、追加的な薬学的組成物が、当業者に明白となるであろう。リポソーム担体、生体内受食性微粒子または多孔質ビーズ、及び蓄積注射等の、様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技法もまた、当業者に既知である。例えば、参照より組み込まれ、薬学的組成物の送達のための多孔質高分子微粒子の制御放出を説明する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。持続放出調合剤は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成形された物品の形態で、半透性ポリマーマトリックスを含んでもよい。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、（それぞれが参照により組み込まれる、米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ  ０５８４８１号に開示されるような）ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７、及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ  １３３，９８８号）が挙げられ得る。持続放出組成物はまた、当分野で既知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができる、リポソームを含んでもよい。例えば、参照により組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ  ０３６，６７６号、同第ＥＰ  ０８８，０４６号、及び同第ＥＰ  １４３，９４９号を参照されたい。
【０１０７】
生体内投与に使用される薬学的組成物は、典型的には、無菌調合剤として提供される。滅菌は、無菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。本組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれで行われてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で保管することができる。非経口組成物は、概して、例えば静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル等の無菌アクセスポートを有する容器の中へ配置される。
【０１０８】
本発明の態様は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ  ０６１３８１８１Ａ２号（第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９号）に記載されるように、薬学的組成物として使用することができる、自己緩衝性ＩＬ−２変異タンパク質製剤を含む。
【０１０９】
上で考察されたように、ある特定の実施形態は、ＩＬ−２変異タンパク質組成物に加えて、本セクション及び本明細書の他の場所に例証的に記載される賦形剤等の１つ以上の賦形剤を含む、ＩＬ−２変異タンパク質組成物、特に、薬学的なＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質を提供する。賦形剤は、粘度の調整等の製剤の物理的、化学的、または生物学的性質を調整すること、ならびに／または有効性を改善するため、及び／もしくはそのような製剤を安定化するための本発明のプロセス、ならびに例えば、製造、出荷、保管、使用前調製、投与中、及びその後に発生する応力による、劣化及び腐敗に対する処理等の多種多様の目的で、この点に関して本発明で使用することができる。
【０１１０】
それぞれが参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，”ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）等の様々な解説が、具体的には、本発明による自己緩衝性タンパク質製剤用の賦形剤及び同賦形剤のプロセスに関する部分で、特に獣医学及び／またはヒト医療使用のためのタンパク質医薬製品及びプロセスに関して、タンパク質安定化、ならびにこの点に関して有用な製剤物質及び方法について利用可能である。
【０１１１】
例えば、製剤のイオン強度及び／もしくは等張性を調整するため、ならびに／または本発明による組成物のタンパク質もしくは他の成分の可溶性及び／もしくは物理的安定性を改善するために、塩が、本発明のある特定の実施形態に従って使用されてもよい。
【０１１２】
公知であるように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、ならびにタンパク質中の荷電及び極性基を遮蔽し、それらの静電相互作用、引力、及び反発相互作用の強度を低下させることによって、タンパク質の天然状態を安定化することができる。イオンはまた、特に、タンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって、タンパク質の変性状態を安定化することもできる。更に、タンパク質中の荷電及び極性基とのイオン相互作用はまた、分子間静電相互作用を低減させ、それにより、タンパク質凝集及び不溶性を阻止または低減することもできる。
【０１１３】
イオン種は、タンパク質へのそれらの効果において有意に異なる。本発明による薬学的組成物を製剤化する際に使用することができる、イオン、及びタンパク質へのそれらの効果のいくつかのカテゴリーランキングが開発されている。一例は、イオン性及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質の立体配座安定性へのそれらの効果別にランク付けする、ホフマイスター順列である。安定化溶質は、「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化溶質は、「カオトロピック」と呼ばれる。コスモトロープは、一般的に、溶液からタンパク質を沈殿させる（「塩析」）ために高濃度（例えば、１モル超の硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般的に、タンパク質を変性させるため、及び／または可溶化する（「塩溶」）ために使用される。「塩溶」及び「塩析」するイオンの相対的有効性が、ホフマイスター順列においてそれらの位置を定義する。
【０１１４】
遊離アミノ酸を、増量剤、安定剤、及び酸化防止剤、ならびに他の標準用途として、本発明の様々な実施形態によるＩＬ−２変異タンパク質製剤で使用することができる。製剤中のタンパク質を安定させるために、リジン、プロリン、セリン、及びアラニンを使用することができる。グリシンは、正しいケーキ構造及び性質を確保するための凍結乾燥において有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質凝集を妨げるのに有用であり得る。メチオニンは、酸化防止剤として有用である。
【０１１５】
ポリオールは、例えばマンニトール、蔗糖、及びソルビトール等の糖、ならびに例えばグリセロール及びプロピレングリコール等の多価アルコール、ならびに本明細書の考察の目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護するように、液体及び凍結乾燥製剤の両方で、有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の張性を調整するのに有用である。
【０１１６】
本発明の選択実施形態で有用なポリオールの中には、凍結乾燥製剤中のケーキの構造的安定性を確保するために一般的に使用される、マンニトールがある。マンにトールは、ケーキへの構造的安定性を確保する。マンニトールは概して、凍結乾燥防止剤、例えば蔗糖と共に使用される。ソルビトール及び蔗糖は、張性を調整するための好ましい作用剤の中にあり、輸送中の凍結融解応力または製造プロセス中のバルクの調製に対して保護する安定剤である。グルコース及びラクトース等の還元糖（遊離アルデヒドまたはケトン基を含有する）は、表面リジン残基及びアルギニン残基を糖化し得る。故に、それらは概して、本発明による使用のための好ましいポリオールの中にはない。加えて、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、結果として糖化を引き起こす蔗糖等の、そのような反応種を形成する糖もまた、この点に関して本発明の好ましいポリオールの中にはない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化するために、ならびに抗凍結剤として有用であり、この点に関して本発明で使用することができる。
【０１１７】
ＩＬ−２変異タンパク質製剤の実施形態は更に、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面上の吸着の影響、ならびに空気−液体、固体−液体、及び液体−液体界面での変性及び結果的凝集の影響を受けやすい場合がある。これらの効果の増減は、概して、タンパク質濃度と逆比例する。これらの有害な相互作用の増減は、概して、タンパク質濃度と逆比例し、典型的には、物理的撹拌、例えば製品の出荷及び取扱中に発生するもの等によって悪化させられる。
【０１１８】
界面活性剤は、表面吸着を防止、最小限化、または低減するために日常的に使用される。この点に関して本発明での有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。
【０１１９】
界面活性剤はまた、タンパク質の立体配座安定性を制御するためにも一般的に使用される。任意の所与の界面活性剤が、典型的には、一部のタンパク質を安定させ、他のタンパク質を不安定化することになるため、この点に関する界面活性剤の使用は、タンパク質に特異的である。
【０１２０】
ポリソルベートは、酸化分解の影響を受けやすく、多くの場合、供給されたときに、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすために十分な量の過酸化物を含有する。結果として、ポリソルベートは、慎重に使用されるべきであり、使用される場合、それらの最低有効濃度で採用されるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤はそれらの最低有効濃度で使用されるべきであるという通則を例示する。
【０１２１】
ＩＬ−２変異タンパク質製剤の実施形態は更に、１つ以上の酸化防止剤を含む。周囲酸素及び温度の適正なレベルを維持することによって、ならびに光への曝露を回避することによって、タンパク質の有害な酸化を医薬製剤においてある程度阻止することができる。タンパク質の酸化分解を阻止するために、酸化防止賦形剤も使用することができる。この点に関して有用な酸化防止剤の中には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、及びキレート剤がある。本発明による治療用タンパク質製剤で使用するための酸化防止剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間全体を通してそれらの活性を維持する。ＥＤＴＡが、この点に関して、本発明による好ましい酸化防止剤である。
【０１２２】
酸化防止剤は、タンパク質を損傷し得る。例えば、特にグルタチオン等の還元剤が、分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明で使用するための酸化防止剤は、とりわけ、製剤中のタンパク質を自ら損傷する可能性を排除するか、または十分に低減するように選択される。
【０１２３】
本発明による製剤は、タンパク質補因子であり、かつある特定のインスリン懸濁液を形成するために必要な亜鉛等の、タンパク質配位錯体を形成するために必要である金属イオンを含んでもよい。金属イオンはまた、タンパク質を分解する、一部のプロセスを妨げ得る。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスを触媒する。
【０１２４】
アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を妨げるために、マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、因子ＶＩＩＩを安定化することができ、それは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化し得、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増加し得る。
【０１２５】
ＩＬ−２変異タンパク質製剤の実施形態は更に、１つ以上の防腐剤を含む。防腐剤は、同じ容器からの２回以上の抜き出しを伴う、複数投与非経口製剤を開発する場合に必要である。それらの主要な機能は、微生物成長を妨げ、薬剤製品の有効期間または使用期間全体を通して製品の無菌性を確保することである。一般的に使用されている防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。防腐剤は、小分子非経口剤との使用の長い歴史を有するが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤はほぼ必ず、タンパク質への不安定化効果（凝集）を有し、これが、複数投与タンパク質製剤での防腐剤の使用を制限する主要な要因となっている。現在まで、ほとんどのタンパク質薬剤は、単回使用のためにのみ製剤化されている。しかしながら、複数投与製剤が可能である場合、それらは、患者の利便性及び増加した市場性を可能にするという追加される利点を有する。良好な例は、保存製剤の開発がより利便的な多用途注射ペン表現の商品化につながった、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例である。ｈＧＨの保存製剤を含有する、少なくとも４本のそのようなペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−二重チャンバカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）がフェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールを伴って製剤化される。
【０１２６】
いくつかの態様が、保存投与剤形の製剤化及び開発中に考慮される必要がある。薬剤製品中の有効防腐剤濃度は、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なうことなく抗菌有効性を付与する濃度範囲を伴う投与剤形で、所与の防腐剤を試験することを必要とする。
【０１２７】
予期され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥した製品は、防腐剤を伴わずに凍結乾燥し、使用時に希釈剤を含有する防腐剤と共に再構成することができる。これは、防腐剤がタンパク質と接触している時間を短縮し、関連付けられる安定性のリスクを有意に最小限化する。液体製剤では、防腐剤の有効性及び安定性が、製品有効期間（約１８〜２４ヶ月）全体にわたって維持されるべきである。留意するべき重要な点は、防腐剤の有効性が、活性薬剤及び全ての賦形剤構成要素を含有する最終製剤で実証されるべきであるということである。
【０１２８】
ＩＬ−２変異タンパク質製剤は概して、とりわけ、生物学的利用能及び持続性の範囲を伴う、投与の特定の経路及び方法のために、特定の投与量及び投与の頻度のために、特定の疾患の特定の治療のために設計されることになる。したがって、製剤は、限定されるものではないが、経口、経耳、経眼、直腸、及び経膣を含む任意の好適な経路による、ならびに静脈内及び動脈内注射、筋肉内注射、及び皮下注射を含む非経口経路による送達について、本発明に従って設計され得る。
【０１２９】
薬学的組成物がいったん製剤化されると、それは、溶剤、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、結晶として、または乾燥もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中に保存され得る。そのような製剤は、使用準備済みの形態、または投与前に再構成される形態（例えば凍結乾燥）のいずれで保存されてもよい。本発明はまた、単回用量投与単位を生成するためのキットも提供する。本発明のキットはそれぞれ、乾燥したタンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器との両方を含有し得る。本発明のある特定の実施形態において、単一及び複数のチャンバの、事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結シリンジ）を含有するキットが提供される。
【０１３０】
採用されるＩＬ−２変異タンパク質を含有する薬学的組成物の治療有効量は、例えば治療上の構成及び目的に依存することになる。当業者ならば、治療のための適切な投与量レベルが、部分的には、送達される分子、ＩＬ−２変異タンパク質がそれのために使用されている兆候、投与の経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、もしくは器官の大きさ）及び／または条件（年齢及び一般的な健康状態）に依存して変動することになることを認識するであろう。ある特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療上の効果を獲得するために、投与量の滴定及び投与の経路の修正を行ってもよい。典型的な投与量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態において、投与量は、０．５μｇ／ｋｇ〜最大約１００μｇ／ｋｇ、任意に２．５μｇ／ｋｇ〜最大約５０μｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１３１】
治療上の有効量のＩＬ−２変異タンパク質は、好ましくは、病徴の重症度の軽減、病徴のない期間の頻度もしくは持続期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは能力障害の阻止を結果としてもたらす。
【０１３２】
薬学的組成物は、医療機器を用いて投与されてもよい。薬学的組成物を投与するための医療機器の例は、米国特許第４，４７５，１９６号、同第４，４３９，１９６号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４８７，６０３号、同第４，５９６，５５６号、同第４，７９０，８２４号、同第４，９４１，８８０号、同第５，０６４，４１３号、同第５，３１２，３３５号、同第５，３１２，３３５号、同第５，３８３，８５１号、及び同第５，３９９，１６３号に記載され、これら全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
自己免疫障害または炎症性障害を治療する方法
ある特定の実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、自己免疫障害または炎症性障害を治療するために使用される。好ましい実施形態においては、ＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が使用される。
【０１３４】
本明細書に開示されるＩＬ−２変異タンパク質での治療に特に適する障害としては、限定されるものではないが、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、傍腫瘍性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性脈管炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、脈管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆型乾癬、膿胞性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギラン・バレー疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えばグレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、腎障害、Ｃ型肝炎誘発性脈管炎、妊娠の自然消失、及び同類のものが挙げられる。
【０１３５】
好ましい実施形態において、自己免疫障害または炎症性障害は、狼瘡、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性脈管炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、妊娠の自然消失、アトピー性疾患、及び炎症性腸疾患である。
【０１３６】
Ｔｒｅｇ細胞を増殖させる方法
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、対象または試料内でＴｒｅｇ細胞を増殖させるために使用され得る。Ｔｒｅｇの非制御性Ｔ細胞に対する比率を増加させる方法が、本明細書に提供される。本方法は、Ｔ細胞の集団を、有効量のヒトＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合と接触させることを含む。比率は、Ｔ細胞の集団内におけるＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞のＣＤ３＋ＦＯＸＰ３−細胞に対する比率を決定することによって測定され得る。ヒト血液中の典型的なＴｒｅｇ頻度は、総ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の５〜１０％であるが、このパーセンテージは、上に列挙された疾患においては、より低く、またはより高くあり得る。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇのパーセンテージは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１０００％増加する。Ｔｒｅｇ中の最大の折り畳み増加は、特定の疾患について異なり得るが、ＩＬ−２変異タンパク質の治療を通じて獲得され得る最大Ｔｒｅｇ頻度は、総ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の５０％または６０％である。ある特定の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が、対象に投与され、対象の末梢血液内の制御性Ｔ細胞の非制御性Ｔ細胞に対する比率は増加する。
【０１３７】
ＩＬ−２変異タンパク質及びＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、他の細胞型を超えて優先的にＴｒｅｇを増殖させるため、これらはまた、対象の末梢血液内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する比率の増加についても有用である。比率は、ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞の、ＣＤ１６＋、ならびに／またはＣＤ１９−及びＣＤ３−であるＣＤ５６＋リンパ球細胞に対する比率を決定することによって測定され得る。
【０１３８】
ＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が、患者の末梢血液内における、Ｔｒｅｇの非制御性Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対する比率を有意に拡大すること無く、患者内の疾患または障害に治療上の効果を有し得ることが企図される。治療上の効果は、炎症または自己免疫の部位におけるＩＬ−２変異タンパク質またはＩＬ−２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質の局在性活性によるものであり得る。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例（実際の実施例及び予言的な実施例の両方）は、本発明の特定の実施形態または特徴を例証する目的のために提供されており、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【０１４０】
実施例１：ＣＤ２５に対する高親和性を与える変異の数の低減
ＣＤ２５に対する親和性の上昇及びＩＬ−２Ｒβγを介したシグナル強度の低下を伴うＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔｒｅｇの成長及び機能を優先的に促進する。潜在的な免疫原性を低減するために、ＣＤ２５に対する高親和性の実現に必要な最小数の変異が求められた。ＩＬ−２の、その３つの受容体（ＰＤＢコード−２Ｂ５Ｉ）と複合した結晶構造は、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐが、ＣＤ２５と相互作用する螺旋構造中に位置することを示す。これは、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐが高ＣＤ２５結合親和性についての２つの独立したＩＬ−２変異誘発スクリーンにおいてしばしば単離された理由を説明し得る（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｔｈａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。この実施例は、Ｒａｏらのスクリーンにおいて特定された、ＩＬ−２変異タンパク質“２−４”中のその他の変異のいずれがＶ６９Ａ及びＱ７４Ｐのみで観察される上記の親和性を増加させるために最も重要であるかということを探求する。以下のタンパク質を、活性化されたＴ細胞の表面上でのＣＤ２５に対する結合について流動細胞計測法によってスクリーニングした。全ての構築物がまた、精製及び検出のために、Ｃ末端ＦＬＡＧ及びポリ−Ｈｉｓタグを含んだ。特異的変異を括弧内に提供する。
ＨａＭｕｔ１Ｄ（Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号８）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＩＶＥＦＬＮＲＷＩＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ２Ｄ（Ｎ３０Ｓ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号９）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＳＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ３Ｄ（Ｋ３５Ｒ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１０）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＲＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ４Ｄ（Ｔ３７Ａ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１１）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＡＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ５Ｄ（Ｋ４８Ｅ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＥＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ６Ｄ（Ｅ６８Ｄ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１３）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＤＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ７Ｄ（Ｎ７１Ｒ，Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１４）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＡＬＲＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡ  ＩＶＥＦＬＮＲＷＩＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
ＨａＭｕｔ８Ｄ（Ｋ３５Ｒ，Ｋ４８Ｅ，Ｅ６８Ｄ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１５）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＲＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＥＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＤＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＤＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ
【０１４１】
ＨａＭｕｔ７Ｄは、元来の単離物“２−４”とほぼ同一の親和性（約２００ｐＭ）でＣＤ２５と結合し、変異Ｎ７１ＲがＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐのみで観察される上記の親和性（ＨａＭｕｔ１Ｄ、約２ｎＭ）を大きく増加させることが可能であることを示した。その他の構築物は、ＷＴ  ＩＬ−２の親和性よりも僅かしか高くない親和性を有するＨａＭｕｔ８Ｄを除いて、ＨａＭｕｔ１Ｄと同様の、またはそれよりも僅かに高い親和性を有した。
【０１４２】
実施例２：半減期の改善のためにＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合するＩＬ−２変異タンパク質
必要とされる投与頻度を低減させて、ＩＬ−２変異タンパク質を伴うＴｒｅｇ富化を達成するために、ＩＬ−２とＩｇＧ１−Ｆｃドメインとの間の様々な融合物を評定した。Ｆｃドメインは、標的細胞溶解等のＩｇＧ１によって媒介されるエフェクター機能を無効にする点変異を含んだ。我々の研究に利用したＦｃエフェクター機能変異は、Ａ３２７Ｑ、Ａｌａ  Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）、またはＮ２９７Ｇのいずれかであった。Ｔｒｅｇ選択的ＩＬ−２変異タンパク質はＩＬ−２効力を部分的に低下させるため、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達に有意に影響を及ぼさないような方法でＩＬ−２をＦｃに融合させることが重要であった。したがって、Ｆｃ融合を伴う、またはそれを伴わないＩＬ−２変異タンパク質を、ＩＬ−２Ｒ活性化について試験した。
【０１４３】
Ｆｃ融合によるＩＬ−２二量体化が、ＩＬ−２Ｒについての増加した結合活性によってＩＬ−２Ｒシグナル伝達強度を増加するかどうかを判定するために、より弱いＩＬ−２変異タンパク質（ｈａＤ５）（米国第２０１１０２７４６５０号）を、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカー配列によって分離された、Ｆｃのアミノ末端に融合した。この変異タンパク質は、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達に影響を及ぼす３つの変異（Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｎ８８Ｄ）、ＣＤ２５に対する高親和性を付与する８つの変異（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、ならびにシステイン不対合及び凝集を阻止するＣ１２５Ｓを有した。この様式でのＦｃへの融合は、ｈａＤ５の生物学的活性を完全に抑止する一方で、細胞表面のＣＤ２５に対するその高親和性結合は、おそらくは二量体化からの増加した結合活性によって増進された。
【０１４４】
ＩＬ−２変異タンパク質を、Ｆｃ二量体の１つの鎖のみがＩＬ−２ドメインを生み出すように、Ｆｃヘテロ二量体のＮ末端またはＣ末端のいずれかにも融合させた。２つの非対称のＦｃ鎖間のヘテロ二量体の対合を、一方のＦｃ鎖上の導入されたリジンと、他方のＦｃ鎖上の導入されたアスパラギン酸との間の静電相互作用によって促進した。ＩＬ−２変異タンパク質ｈａＤ６を、１つのＦｃ鎖または他方のＮ末端に、１つの構成が好ましい場合融合させ、ｈａＤ６．ＦｃＤＤ及びｈａＤ６．ＦｃＫＫと呼ばれる２つのタンパク質構造を結果としてもたらした。また、変異タンパク質ｈａＭｕｔ７ＤをＦｃヘテロ二量体のＣ末端に、１つまたは２つのＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカーで融合させた（ＦｃＫＫ（Ｇ４Ｓ）ｈａＭｕｔ７Ｄ，ＦｃＫＫ（Ｇ４Ｓ）２ｈａＭｕｔ７Ｄ）。ＩＬ−２変異タンパク質ｈａＤ６のＦｃヘテロ二量体のＮ末端への融合は、ｐＳＴＡＴ５及びＴ細胞増殖実験の両方における遊離ｈａＤ６に対する活性の部分的な喪失を結果としてもたらした。対照的に、１つまたは２ついずれかのＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカーでのｈａＭｕｔ７ＤのＦｃヘテロ二量体のＣ末端への融合は、ｈａＭｕｔ７Ｄの効力を変化させなかった。
【０１４５】
ＩＬ−２変異タンパク質のＦｃホモ二量体のＣ末端への融合もまた調査した。総ＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を用いて１００ｍｌ当たり３億個の細胞で、Ｔ７５組織培養フラスコ中で活性化した。培養の３日目に、細胞を３回洗浄し、３日間新鮮な培地中に静置した。次いで、ＩＬ−２変異型を用いて１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の１０×用量滴定で、５０μｌの最終用量で、細胞を刺激した。ＳＴＡＴ５リン酸化のレベルを、ＢＤ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ  ｂｕｆｆｅｒキットを用いて測定した。手短に言えば、１ｍｌのＢＤ  ｌｙｓｅ／ｆｉｘ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ  ｂｕｆｆｅｒを添加して、刺激を停止した。細胞を２０分間３７℃で固定し、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、及びｐＳＴＡＴ５を染色する前に、氷上で１×ＢＤ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ  ｐｅｒｍ  ｂｕｆｆｅｒを用いて透過処理した。
【０１４６】
図１に見ることができるように、変異タンパク質ｈａＭｕｔ１Ｄ及びｈａＭｕｔ７Ｄの生物活性は、Ｆｃホモ二量体のＣ末端への融合によっては変化しなかった。したがって、ＩＬ−２のＮ末端とＦｃのＣ末端との間の融合は、Ｆｃ．ＩＬ−２ホモ二量体の構成においてすら、ＩＬ−２変異タンパク質のアゴニスト活性を損なわなかった。これらの構築物において、製造の改善のために、Ｃ１２５Ｓの代わりにＣ１２５Ａ変異を使用した。
【０１４７】
実施例３：優先的なＴｒｅｇの成長を達成するためのＩＬ−２変異タンパク質の効力の調整
ＩＬ−２変異タンパク質の初期パネルは、Ｎ８８Ｄのみを含有するか、またはＩＬ−２Ｒシグナル伝達に影響を及ぼす１つもしくは２つの追加の変異を伴ってＮ８８Ｄを含有する。Ｎ８８Ｄ系のアゴニズムと同様の、またはそれよりも僅かに強力なアゴニズムを伴う変異タンパク質を特定することを目指し、変異タンパク質の第２のパネルを、その全てが単一の点変異を有するように設計した。２４個のシグナル伝達変異のパネルを、予期されたＩＬ−２Ｒβ−相互作用性アミノ酸（結晶構造、ＰＤＢコード−２Ｂ５Ｉ）に基づき特定した。変異タンパク質とＩＬ−２Ｒβとの間の結合自由エネルギーにおける予期された減少に基づき、特定の置換を選択した。結合自由エネルギーを、ＥＧＡＤ計算アルゴリズム（Ｈａｎｄｅｌ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて計算した。変異体の結合自由エネルギーを、ΔΔＧｍｕｔ＝μ（ΔＧｍｕｔ−ΔＧｗｔ）と定義する。ここで、μ（一般に、＝０．１）は、実験的エネルギーと比較した場合に傾き１を有するように結合親和性における予期された変化を正規化するために使用される、スケーリング因子である（Ｐｏｋａｌａ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｅｌ  ２００５）。解離（ΔＧ）の自由エネルギーを、錯体（ΔＧ束縛）と自由状態（ΔＧ自由）との間のエネルギー差異として定義した。解離エネルギーΔＧｍｕｔを、それぞれの置換について計算した。
【０１４８】
以下の置換（Ｈ１６Ｅ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｋ、Ｄ２０Ｒ、Ｄ２０Ｋ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｙ、Ｍ２３Ｈ、Ｄ８４Ｋ、Ｄ８４Ｈ、Ｓ８７Ｙ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｋ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｙ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｒ、Ｉ９２Ｈ、Ｅ９５Ｋ、Ｅ９５Ｒ、またはＥ９５Ｉ）を伴うＩＬ−２変異タンパク質のパネルを、Ｆｃヘテロ二量体へのＣ末端融合物として発現させた。これらの構築物はまた、高ＣＤ２５結合親和性についてのｈａＭｕｔ７変異（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）及び効率的な折り畳みについてのＣ１２５Ａも含有した。
【０１４９】
実施例２のＴ細胞ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおける効力についてパネルをスクリーニングし、Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒが、野生型ＩＬ−２よりも小さく、Ｎ８８Ｄよりも大きい活性を有することを見出した（図２）。
【０１５０】
Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒは、野生型ＩＬ−２よりも小さく、Ｎ８８Ｄよりも大きい活性を有した。
【０１５１】
選択された変異タンパク質を、Ｔ細胞及びＮＫの成長アッセイにおいても試験した。
【０１５２】
Ｔ細胞アッセイについては、総ＰＢＭＣを、１００ｎｇのＯＫＴ３を用いて３百万／ｍｌで活性化した。２日目に、細胞を３回洗浄し、５日間新鮮な培地中に静置した。次いで、細胞をＣＦＳＥでラベル付けし、更にＦＡＣＳ分析の前に７日間、ＩＬ−２含有培地中において、５０万／ウェルの２４ウェルプレート中で培養した。Ｔ細胞サブセットの増殖は、ＣＳＦＥ希釈物として図３に提示される（中央値ＣＦＳＥ蛍光）。
【０１５３】
ＮＫ細胞アッセイについては、ＭＡＣＳ選別ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を、３日間、ＩＬ−２含有媒地中において、１０万／ウェルの９６ウェルプレート中で培養した。０．５μＣｉ３Ｈ−チミジンを、インキュベーションの最後の１８時間の間に各ウェルに添加した。結果を図４に示す。
【０１５４】
変異体Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｋ、及びＶ９１Ｒ変異体は、ＷＴ  ＩＬ−２と同様にＴｒｅｇの成長を刺激することができたが、他のＴ細胞に対してはおよそ１０倍効力が低く（図３）、ＮＫ細胞に対してはおよそ１００倍効力が低かった（図４）。
【０１５５】
Ｆｃヘテロ二量体と変異タンパク質ｈａＭｕｔ７（Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｃ１２５Ａ）との間の距離を一連の個別のアミノ酸切断によって低減させたＦｃ．ＩＬ−２融合タンパク質の別個のパネルを設計した。
【化１】
0006480409.tif 000003
【０１５６】
切断１〜切断４は、ＳＴＡＴ５リン酸化によって、ならびに図２、３、及び４について説明されたようなＴ細胞及びＮＫ細胞増殖によって測定された、完全長の親構築物Ｆｃ．ｈａＭｕｔ７に等しい効力を有した。切断５及び切断６は、より弱い応答を刺激したが、これはＮ８８Ｄ変異（ｈａＤ及びｈａＭｕｔ７Ｄ）によって刺激された応答よりも強く、Ｖ９１Ｋによって刺激された応答に非常に類似した。切断７はＮ８８Ｄ変異タンパク質よりも弱く、切断８は活性をほぼ有さなかった。しかしながら、ＮＫ細胞について試験したときに、切断５及び切断６はＶ９１Ｋよりも強いアゴニストであり、Ｔｒｅｇ選択性が、近位のＦｃドメインによる立体障害よりもむしろシグナル伝達変異によってより容易に達成されることを示した。
【０１５７】
実施例４：Ｆｃホモ二量体の構成中の高ＣＤ２５親和性変異
高ＣＤ２５結合親和性を付与した変異を、それらがＣＤ２５−高Ｔ細胞への指向性を増加させたため、かつそれらが長期のＣＤ２５：：ＩＬ−２変異タンパク質会合及び遷延性のシグナル伝達を促進したため、有利であるとみなした。しかしながら、変異の数を低減することは、免疫原性潜在性を低減し得る。ｈａＭｕｔ１高親和性変異Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐを伴う、ならびにそれらを伴わない、Ｎ８８ＤまたはＶ９１Ｋ変異タンパク質を、Ｆｃホモ二量体のＣ末端への融合物として発現させ、生物活性について比較した。ｐＳＴＡＴ５刺激アッセイにおいて、ホモ二量体化は、単量体変異タンパク質に対してシグナル強度において効果を全く有さなかった。高親和性変異Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐの復帰変異もまた、ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達に影響を与えなかった。Ｔ細胞成長アッセイにおいて、高親和性変異は、従来のＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞への活性を低減したが、制御性Ｔ細胞ではそうではなかった（図５）。高親和性変異はまた、ＮＫ細胞における増殖応答も変化させなかった（図６）。
【０１５８】
高親和性変異がインビボでＴ細胞応答に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ヒト化マウス（ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成されたＮＯＤ．ＳＣＩＤ．Ｉｌ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウス）にＦｃ．Ｉｌ−２変異タンパク質融合タンパク質を投与し、Ｔｒｅｇ発現を監視した。７週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤ．Ｉｌ２ｒｇ−ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に放射線を照射し（１８０ラド）、９４，０００のヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成した。２１週目に、マウスをキメラ化率（ＰＢＬの流動細胞計測法によって決定）の等しい分配に基づいて６つの群に分類し、０日目及び７日目に、示されるＦｃ．変異タンパク質融合タンパク質またはＰＢＳの皮下注射１μｇを投与した。１１日目に、血中のＴ細胞サブセット頻度を、流動細胞計測法によって決定した。動物当たり１μｇの低用量では、高親和性変異は、Ｎ８８ＤまたはＶ９１Ｋ変異のみで観察されたものを超えてＴｒｅｇ増殖を改善することはなかった（図７）。
【０１５９】
Ｔｒｅｇ増殖は、ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヒトＢ及びＴ細胞、ならびにマウス骨髄性細胞の混合物を含む総末梢血中白血球（ＰＢＬ）に対して多量には増加しなかったという点において選択的である。更に、より高い用量では、高親和性変異は、ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞における増加を促進し、したがってＴｒｅｇ選択性を低減した。したがって、Ｆｃホモ二量体の構成中において、高親和性変異は、優先的なＴｒｅｇの成長を促進するために必要であるとはみなされなかった。
Ｆｃ．ＷＴ  ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ）（配列番号１６）
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Ｆｃ．ｈａＭｕｔ１Ｖ９１Ｋ  ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｖ９１Ｋ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１７）
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Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ  ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１８）
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Ｆｃ．ｈａＭｕｔ１Ｎ８８Ｄ  ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｖ６９Ａ，Ｑ７４Ｐ，Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号１９）
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Ｆｃ．Ｎ８８Ｄ  ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ａ）（配列番号２０）
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【０１６０】
実施例５：Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の遷延性細胞表面ＣＤ２５会合
ヒト化マウス研究からの予期せぬ結果は、それらの低下したシグナル伝達能力にもかかわらず、変異タンパク質が、Ｆｃ．ＷＴ  ＩＬ−２に対してより頑強なＴｒｅｇ富化を誘発したことであった。Ｆｃ．ＷＴで見られたものに対してより大きなＴｒｅｇ富化及びＦＯＸＰ３発現上昇を、１μｇ／マウスの用量で（図７）、ならびに０．５μｇ／マウスのより少ない用量で（図８）観察した。このインビボの増加した効力は、Ｔ細胞による低下した消費からもたらされた可能性があり、Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質を遷延性のシグナル伝達についてより利用可能にする。
【０１６１】
しかしながら、インビトロ及びインビボＰＫ研究は、活性Ｔ細胞培養物または被投与マウスからの血清からの上清中のＦｃ．ＷＴに対して、Ｆｃ．Ｖ９１ＫまたはＦｃ．Ｎ８８Ｄの有意に増加した持続性を実証できなかった。Ｆｃ融合物は２つのＩＬ−２変異タンパク質ドメインを生み出すため、我々は、増加したエンドソームの再循環が、ＣＤ２５についての増加した結合活性により遷延性の細胞表面会合をもたらし得ると判断した。実際、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ及びＦｃ．Ｎ８８Ｄが、融合タンパク質の短時間の曝露に続いて前もって活性化されたＴ細胞の表面上において、Ｆｃ．ＷＴよりも効率的に持続した（図９）。
【０１６２】
主要なＰＢＭＣを、２日間、１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を用いて予備刺激した。細胞を収集し、４回洗浄し、培地中で夜通し静置した。次いで、細胞を、３７℃で３０分間、４００ｐＭのＦｃ．ＩＬ−２を用いてパルスした。パルス後、細胞を１回の洗浄後にＴ０として収集するか、あるいは１２ｍｌの温かい培地中で更に３回洗浄し、４時間培養した。細胞結合性Ｆｃ．ＩＬ−２を検出するため、細胞を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した。
【０１６３】
実施例６：融合配列最適化
マウスにおける前臨床研究において、我々のＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質は、無傷分子の血清濃度をヒトＦｃ部分のみのものと比べた場合差別的な曝露を示し、循環するヒトＦｃカタボライトを示した。我々のＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のインビボの安定性及び薬物動態を最適化するために、全身性循環中の、ならびに細網内皮系を通じた再循環の間の、Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のタンパク質分解におけるそれらの影響について融合配列修飾の特性を明らかにした。以下の構築物を、インビトロ及びインビボのタンパク質分解について評定した。
【化２】
0006480409.tif 000004
【０１６４】
安定性を、総ヒトＦｃの経時的な濃度を無傷Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のものと比べる定量的免疫測定法によって測定した。Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のタンパク質分解を、抗ＩＬ−２及び抗ヒトＦｃ抗体を利用するウェスタンブロット解析と、それに続くカタボライトの免疫捕獲、及び質量分析法による特性評価によって実証した。インビトロ及びインビボ試料からの（Ａｌａ＿Ａｌａ）＿Ｇ４Ｓのカタボライトの質量分析法による特性評価は、ＦｃドメインのＣ末端Ｌｙｓをタンパク質分解の切断部位として特定した。ＦｃドメインのＣ末端リジンの欠損または変異（（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）＿Ｇ４Ｓ及び（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴ）は、３７℃のマウス血清中において、Ｃ末端リジンを伴うＦｃ構築物（（Ａｌａ＿Ａｌａ）＿Ｇ４Ｓ）と比較して、遷延性のインビトロ安定性をもたらした。この遷延性のインビトロ血清安定性は、Ｆｃ．ＩＬ−２変異タンパク質の血清濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定されるように、マウスにおけるより大きな曝露と換言された。Ｃ末端Ｆｃリジンを欠くＦｃ．ＩＬ−２変異タンパク質のこの遷延性の安定性はまた、カニクイザル及びヒトからの血清中において、インビトロで観察された。ＩＬ−２のＴｈｒ−３のＡｌａへの変異（（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡ）は、マウス血清中において、ならびに組み換えヒトカテプシンＤ及びＬを伴う別個のインキュベーション中において、（（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴと比べて）３７℃で減少したインビトロ安定性をもたらした。この減少したインビトロ血清安定性は、（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴと比べて、（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡ）のインビボのマウスにおけるより低い曝露（ＡＵＣ）と換言された。インビトロ及びインビボ試料からの（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡのカタボライトの質量分析法による特性評価は、ＩＬ−２変異タンパク質ドメインのＬｙｓ８及びＬｙｓ９を、（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴの同等の試料については観察されなかったタンパク質分解の影響を受けやすい残基として特定した。（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＴの安定性に対する（Ｎ２９７Ｇ＿ＫｔｏＡ）＿ＡＡＰＡの３７℃での減少した安定性はまた、カニクイザル及びヒトからの血清中において、インビトロで観察された。
【０１６５】
この領域におけるグリコシル化の重要性によって、ならびに融合タンパク質の製造可能性を潜在的に改良するために、融合配列を、Ｏ−結合型グリコシル化よりもむしろＮ−結合型グリコシル化を促進するために、以下のように改変した。
元来
【化３】
0006480409.tif 000005
改変後
【化４】
0006480409.tif 000006
【０１６６】
実施例７：カニクイザルＰＫ／ＰＤ判定
標準的なＩＬ−２免疫刺激療法は、望ましくない副作用を回避するため、投与サイクルの間に薬剤を摂らない休日（曝露無し）を必要とする。対照的に、Ｔｒｅｇ増殖または刺激療法は、Ｔｒｅｇ刺激にとって十分ではあるが、免疫活性化につながる薬物濃度より最大曝露（血清Ｃｍａｘ）が下側である、持続性のトラフ薬物濃度（血清Ｃｍｉｎ）を伴う遷延性の曝露を必要とし得る。この実施例は、最大曝露（血清Ｃｍａｘ）を炎症誘発性免疫活性化のために必要であると企図される薬物濃度の下側に維持しながら、伸長された標的範囲（血清Ｃｍｉｎ）についてのカニクイザルにおける半減期伸長変異タンパク質の投与戦略を実証する。
【０１６７】
カニクイザルに、Ｆｃ．Ｖ９１Ｋ（ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｇ＿ｄｅｌＫ）：：Ｇ４Ｓ：：ｈｕＩＬ−２（Ｖ９１Ｋ，Ｃ１２５Ａ）を４つのグループ（Ａ〜Ｄ）で投与し、３つのグループ（Ａ〜Ｃ）には皮下で投与し、１つのグループ（Ｄ）には静脈内で投与する。各グループについて、生物学的に未成熟なオスのカニクイザルに、下に概説される投与戦略によって投与する。半減期伸長変異タンパク質の皮下投与は、より大きなリンパ吸収を可能にし得、より低い最大曝露（血清Ｃｍａｘ）及び／またはより頑強な薬理学的応答（Ｔｒｅｇ増殖）をもたらす。グループＡについての投与戦略は、１サイクルの０、２、及び４日目の連続した１０マイクログラム／キログラムの投与、ならびに１４日目の１０マイクログラム／キログラムからなり、５０マイクログラム／キログラムのより高い初回量に類似する遷延性の標的範囲を、より低い最大曝露（Ｃｍａｘ）を維持しながら可能にする。グループＢについての投与戦略は、グループＡとの比較のため、０日目及び１４日目の５０マイクログラム／キログラムの投与である。グループＣについての投与戦略は、０日目及び２８日目の５０マイクログラム／キログラムの投与である。これは、トラフ範囲がＴｒｅｇ富化を持続させるために必要とされるか、または薬剤を摂らない休日が投与サイクルの間で有益であるかということの判定を可能にする。静脈投与腕グループＤについての投与戦略は、０日目の５０マイクログラム／キログラムの投与であり、最大曝露（Ｃｍａｘ）及びＴｒｅｇ富化の差異を、皮下投与のものと比較することを可能にする。
【０１６８】
薬物動態（無傷分子及び総ヒトＦｃについての定量的免疫測定法）、抗薬剤抗体、流出した可溶性ＣＤ２５、ならびに血清サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、及びＩＬ−１３）を、各投与グループについて明示された以下の時間点で測定する。
グループＡ：投与前（第１サイクル、投与１）、４８（投与前第１サイクル、投与２）、９６（投与前第１サイクル、投与３）、１００、１０４、１２０、１６８、２１６、２６４、３３６（投与前第２サイクル）、３４０、３４４、３６０、４０８、４５６、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、及び１００８時間。
グループＢ：投与前（第１サイクル）、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６（投与前第２サイクル）、３４０、３４４、３６０、４０８、４５６、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、及び１００８時間。
グループＣ：投与前（第１サイクル）、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、６７２（投与前第２サイクル）、６７６、６８０、６９６、７４４、７９２、８４０、９１２、１００８、１０８０、及び１１７６時間。
グループＤ：投与前（第１サイクル）、０．２５、１、４、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、及び６７２時間。
【０１６９】
薬動力学（末梢血液Ｔｒｅｇ、非制御性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞の免疫表現型検査及び列挙）を、各投与グループについて明示された以下の時間点で測定する。
グループＡ：投与前（第１サイクル、投与１）、９６（投与前第１サイクル、投与３）、１６８、３３６（投与前第２サイクル）、４５６、及び５７６時間。
グループＢ：投与前（第１サイクル）、１２０、２４０、３３６（投与前第２サイクル）、４５６、及び５７６時間。
グループＣ：投与前（第１サイクル）、１２０、２４０、６７２（投与前第２サイクル）、７９２、及び９１２時間。
グループＤ：投与前（第１サイクル）、１２０、及び２４０時間。
【０１７０】
血液学及び臨床化学を、全ての動物及び投与グループについて、投与グループごとに、投与前及び初回投与後２４時間で評価した。以下のパラメーターを評定した。
血液学
・  白血球数（全微分及び絶対微分）
・  赤血球数
・  ヘモグロビン
・  ヘマトクリット値
・  平均血球ヘモグロビン、平均血球体積、平均血球ヘモグロビン濃度（算定）
・  網状赤血球絶対数
・  血小板数
・  血球形態学
・  赤血球分布幅
・  平均血小板容積
臨床化学
・  アルカリホスファターゼ
・  総ビリルビン量（総ビリルビン量が１ｍｇ／ｄＬを超える場合は直接型ビリルビンを用いる）
・  アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
・  アラニンアミノトランスフェラーゼ
・  γグルタミルトランスフェラーゼ
・  尿素窒素
・  クレアチニン
・  総タンパク質量
・  アルブミン
・  グロブリン及びＡ／Ｇ（アルブミン／グロブリン）比（算定）
・  グルコース
・  総コレステロール
・  トリグリセリド
・  電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物）
・  カルシウム
・  リン
【０１７１】
実施例８：アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ
天然に存在するＩｇＧ抗体は、重鎖の定常ドメイン２（ＣＨ２）中にグリコシル化部位を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体は、位置Ａｓｎ２９７（ＥＵ付番）に位置するグリコシル化部位を有する。現在まで、アグリコシル化抗体を作製するための方策は、Ａｓｎ残基を、物理化学的性質の見地からＡｓｎに類似するアミノ酸（例えば、Ｇｌｎ）で、または極性基無しのＡｓｎ側鎖に擬するＡｌａ残基で置き換えることを伴う。この実施例は、Ａｓｎをグリシンで置き換えること（Ｎ２９７Ｇ）の利点を実証する。Ｎ２９７Ｇ  Ｆｃは、より良好な生物物理学的特性、及び製造可能性属性（例えば、精製中の回収）を備えるアグリコシル化分子である。
【０１７２】
Ｆｃ断片及びＩｇＧ抗体の複数の既知の結晶構造の検査は、グリコシル化ループ断片の周辺、特にグリコシル化された位置Ａｓｎ２９７における相当な配座柔軟性を明らかにした。既知の結晶構造の多くにおいて、Ａｓｎ２９７は、正の骨格二面角に適合した。Ｇｌｙは、側鎖原子の欠如により、正の骨格二面角に適合するという高い傾向を有する。故に、この配座及び構造の理由に基づいて、Ｇｌｙは、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａよりも良好なＡｓｎのための置換であり得る。
【０１７３】
Ａｓｎ２９７をＧｌｙで変異させることは、精製プロセスにおける遥かに改善された回収（または効率性）、及び生物物理学的特性を伴うアグリコシル化分子につながる。例えば、タンパク質Ａプールからの回収のパーセンテージ（最終収率）は、Ｎ２９７Ｑ変異体での４５．６％及びＮ２９７Ａ変異体での３９．６％と比較すると、Ｎ２９７Ｇ変異体では８２．６％であった。ＳＰＨＰカラム分析は、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａ変異体についての、回収のより低いパーセンテージがテーリングピークによるものであることを明らかにし、これは高分子量凝集及び／またはミスフォールド種を示した。この結果は、より大きい、２Ｌスケールの泳動において再確認された。
【０１７４】
生物薬学産業において、大規模な生産への潜在ニーズ、例えば薬剤として販売される可能性、を伴う分子は、その分子が大規模生産及び精製に適さないというリスクを軽減するために、多くの属性について評価される。製造可能性の評価において、Ｎ２９７Ｇは、ｐＨの変化に対する頑強性を明らかにした。Ｎ２９７Ｇが凝集の問題を有さなかった一方で、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａは、それぞれ、凝集において２０％及び１０％の増加を有した。Ｎ２９７Ｇはより良好な製造可能性の属性を有するものの、Ｎ２９７Ｇは、それが試験された全ての機能アッセイにおいてＮ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａに類似した。例えば、ＡＤＣＣアッセイにおいて、Ｎ２９７Ｇは、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ａに類似して、細胞傷害性を有さなかった。
【０１７５】
実施例９：安定化アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ
この実施例は、設計されたジスルフィド結合（複数可）を導入することによって、ＩｇＧ抗体足場の安定性を改善する方法について説明する。天然に存在するＩｇＧ抗体は、安定した分子である。しかしながら、一部の治療上の用途のために、変異の作製、またはアグリコシル化分子の形成が必要な場合がある。例えば、アグリコシル化ＩｇＧ分子は、ＡＤＣＣ及びＦｃγ受容体への結合を回避するための必要性が存在する、治療上の兆候において使用され得る。しかしながら、アグリコシル化ＩｇＧ１は、グリコシル化ＩｇＧ１よりも遥かに低い融解温度を有する（ＣＨ２ドメインの融解温度は、約１０℃、７０℃から６０℃へ減少する）。観察されるより低い融解温度は、アグリコシル化ＩｇＧ１の様々な生物物理学的特性にネガティブな影響を及ぼす。例えば、アグリコシル化ＩｇＧ１は、グリコシル化ＩｇＧ１と比べて増加したレベルの凝集を低いｐＨにおいて有する。
【０１７６】
ジスルフィド結合を設計するために、Ｃ−α原子間の距離計算を伴う構造に基づく方法を最初に使用して、Ｃｙｓへの変異のためのＦｃ領域中の５４残基対を特定した。これらの５４部位を４つの残基対（Ｖ２５９Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃ）にまで更に絞り込んだ。使用された判定基準としては、（ｉ）ＣＨ２ドメイン内の位置、（ｉｉ）ループ、ターン、及び糖から離れている、（ｉｉｉ）Ｆｃγ受容体及びＦｃＲｎ相互作用部位から離れている、（ｉｖ）溶媒接近性（好ましい埋設位置）等が挙げられる。
【０１７７】
対のシステインの置換を、アグリコシル化Ｎ２９７Ｇ  Ｆｃの構成において形成した。非還元ペプチドマッピング分析は、４つの設計された部位のうちの３つが、予期したように、及びその構成において設計したようにジスルフィド結合を形成したことを明らかにした。Ｖ２５９Ｃ−Ｌ３０６Ｃ変異はジスルフィド結合を正しく形成せず、ＣＨ２ドメイン中に既に存在した元々のジスルフィドとの不対合につながった。その他の３つの設計、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃは、予測及び設計したように、ジスルフィド結合を正しく形成した。Ｎ２９７Ｇ変異へのジスルフィド結合の付加は、Ｎ２９７Ｇ変異単独を超える、熱安定性における約１５℃の改善につながった。Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ、Ａ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃ、及びＶ３２３Ｃ−Ｉ３３２Ｃジスルフィド変異型のうち、Ｒ２９２Ｃ−Ｖ３０２Ｃ及びＡ２８７Ｃ−Ｌ３０６Ｃは、ラットに投与されたとき、良好な薬物動態を有した（それぞれ、１１日間及び９日間のｔ１／２）。これは、５日間のｔ１／２を有した、以前に公開されたＣＨ２ドメインジスルフィド結合Ｌ２４７Ｃ−Ｋ３３９Ｃ（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９  ２８４：１４２０３−１４２１０）についての、ラットで我々が観察した薬物動態特性とは対照的である。
【０１７８】
ＣＨ２ドメイン中にジスルフィド結合を設計することは、グリコシル化ＩｇＧ１分子と同等に、アグリコシル化分子の安定性を改善する（示差走査熱量測定によって決定される通り、融解温度における１０〜１５℃の改善）。本明細書に記載される設計された部位は、ジスルフィドがスクランブルすることにはつながらず、その集団のうちおよそ１００％において予測された通りにジスルフィドが形成される。より重要なことに、公開されたＣＨ２ドメイン中のジスルフィド結合部位とは異なり、本明細書に記載されるジスルフィド結合はラットのＰＫに影響を及ぼさない。
【０１７９】
安定化アグリコシル化抗体の薬物動態（ＰＫ）特性を、カニクイザルにおいて判定した。Ｎ２９７Ｇ、Ａ２８７Ｃ、及びＬ３０６Ｃ置換を有するＩｇＧ１抗体（Ａｂ２−１）、及びＮ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、及びＶ３０２Ｃ置換を有するＩｇＧ１抗体（Ａｂ２−２）を、カニクイザルに５ｍｇ／ｋｇで皮下注射した（Ｎ＝２）。血清試料を、投与前、投与後０．５、２、８、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、及び１６８０時間で収集した。試料を、抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用することによって、Ａｂ２−１及びＡｂ２−２抗体レベルについてアッセイした。ＰＫ研究試料中の血清ヒトＩｇＧレベルを測定するために、以下の方法を使用し、ハーフエリアブラックプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６９４）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ、抗体１．３５．１で被覆し、次いで４℃で夜通しインキュベートした。次いでプレートを洗浄し、Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、４℃で夜通しブロッキングした。試料を希釈する必要があった場合、カニクイザル血清中で試料を希釈した。次いで、基準及び試料を、１Ｘ  ＰＢＳ＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、及び１％のＢＳＡ緩衝液（５％血清）中で１：２０に希釈した。プレートを洗浄し、希釈された標準及び試料の５０μｌの試料を抗体１．３５．１で被覆されたプレートに移し、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで１００ｎｇ／ｍｌのＩ−Ｂｌｏｃｋ（商標）＋５％  ＢＳＡに結合する抗ヒトＦｃ抗体２１．１−ＨＲＰを５０μｌ添加し、１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで５０μｌのＰｉｃｏ基質を添加し、その後プレートをルミノメーターで直ぐに分析した。時間濃度データを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）（Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．１．１，２００６，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で、非区画方法を用いて分析した。
【０１８０】
カニクイザルにおけるＡｂ２−１及びＡｂ２−２抗体のＰＫ曝露を、Ｎ２９７Ｇのみを有するＩｇＧ１抗体、及びＮ２９７Ｇ、Ｌ２４７Ｃ、及びＫ３３９Ｃを有するＩｇＧ１抗体と比較した。カニクイザルにおけるＡｂ２−１及びＡｂ２−２抗体のＰＫ曝露は両方ともに、Ｎ２９７Ｇのみを有するＩｇＧ１抗体、及びＮ２９７Ｇ、Ｌ２４７Ｃ、及びＫ３３９Ｃを有するＩｇＧ１抗体よりも高かった。また、Ａｂ２−２は、親ＩｇＧ１抗体に匹敵する曝露及び放出を有した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
0006480409.tif 000016
【図９】
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【配列表】
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