(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性閉塞性肺疾患の治療用の、Ｎ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２】
投与されるＮ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩の投薬量が、全身的にアスコルビン酸塩を再産生することができる量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記治療が患者の呼吸器の病的状態及び／又は死亡のリスクを低減させる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
慢性閉塞性肺疾患を患っている患者のその症状を一つ以上軽減する方法に使用するための、Ｎ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項５】
前記症状が骨格筋の疲労及び／又は咳及び／又は痰の産生である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記治療の方法の患者が喫煙者又は前喫煙者である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記患者が気管支拡張薬、抗コリン作用薬又はコルチコステロイドから選択される活性成分の投与を含む治療も受けている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
慢性閉塞性肺疾患の治療薬の製造のための、Ｎ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項９】
投与されるＮ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩の投薬量が、全身的にアスコルビン酸塩を再産生することができる量である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記治療が患者の呼吸器の病的状態及び／又は死亡のリスクを低減させる、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
慢性閉塞性肺疾患を患っている患者のその症状を一つ以上軽減する方法のための薬の製造のための、Ｎ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１２】
前記症状が骨格筋の疲労及び／又は咳及び／又は痰の産生である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記治療の方法の患者が喫煙者又は前喫煙者である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記患者が気管支拡張薬、抗コリン作用薬又はコルチコステロイドから選択される活性成分の投与を含む治療も受けている、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知の重金属キレート化合物の新しい用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性的な気流の不足、息切れ、咳、及び痰の産生により特徴付けられる閉塞性の肺疾患である。
【０００３】
世界的にＣＯＰＤは約６００，０００，０００人が発症していると考えられる。ＣＯＰＤの患者の大多数は、圧倒的に喫煙者または前喫煙者である。
【０００４】
ＣＯＰＤの考えられる原因は多く知られており、最も一般的に考えられる原因は喫煙であることが知られている。他の原因としては、特に燃料の燃焼（例えば、木材の煙）からの大気汚染が挙げられる。また、疾患には遺伝的要素があるとも考えられている。
【０００５】
ＣＯＰＤは、肺での炎症反応を起こすこれらの刺激物への長期の曝露によって引き起こされると理解されている。その結果、気管支の収縮および肺組織の破壊（肺気腫）が生じる。
【０００６】
ＣＯＰＤは、（例えば、それを引き起こす病原への曝露を減らすことによって）ほとんど予防可能な病気であると考えられているが、それはまだ世界で３番目に一般的な死亡原因である。
【０００７】
患者の治療は重要な課題を提起する。現在の最先端の治療には吸入性気管支拡張剤およびコルチコステロイドが含まれる。しかし、ＣＯＰＤ患者の気流の減少は、一般的に、現在使用されている医薬品の投与によってもあまり改善せず、それは多くの場合、酸素療法や肺移植を含むより劇的な手段を意味する。しばしば、症状の悪化には入院が必要となる。
【０００８】
効果的な治療がないために、ＣＯＰＤの経済的負担は巨大であり、２０１０年には２兆１０００億ドルと見積もられている。ＣＯＰＤの社会経済学的費用は、先進国では寿命とともに増大しているようであり、発展途上国では増加している。ＥＵでは、２００万人の悪性の罹患患者の治療の直接費用は、年間約３００億（３０Ｂｎ）ユーロ（患者一人あたり年間１５，０００ユーロ）である。他の２０００万人の罹患患者の治療の直接費用は、約１００億（１０Ｂｎ）ユーロ（患者一人あたり年間５００ユーロ）である。従って、総費用は、約４００億（４０Ｂｎ）ユーロであり、その費用には、生産性の損失による追加の間接費は含まれていない。併存症は、ＣＯＰＤでは非常に一般的であり、さらに治療の費用を膨らます。
【０００９】
従って、新しい及び／又はより良いＣＯＰＤの治療のための、膨大な臨床的に満たされていないニーズがある。また、病気の進行を緩和する可能性のある重要な病理学的プロセスをターゲットとし、病気のより重篤な段階に進行している患者の数を減少できる改良された治療にも明確なニーズがある。
【００１０】
Ｎ，Ｎ−ビス−２−メルカプトエチルイソフタルアミド（ＮＢＭＩ）は、特許文献１で最初に開示された。健康補助食品としての、及び酸化ストレスの軽減におけるその使用は特許文献２に開示されている。ＮＢＭＩは、水銀、カドミウム及び鉛などの重金属の強力なキレート剤として知られている。非特許文献１も参照のこと。
【００１１】
ＮＢＭＩのアナログは、特に、特許文献３、特許文献４および特許文献５に開示されている。
【００１２】
しかしながら、前記の文書はいずれもＣＯＰＤの潜在的な治療におけるＮＢＭＩまたは関連する化合物の使用の可能性を開示していない。
【００１３】
ＣＯＰＤ患者においては、タバコの煙自体からと、結果的に活性化される炎症性細胞から活性酸素種（ＲＯＳ）の遊離が増加することからとの両方の酸化負荷の結果として、肺及び全身で酸化ストレスが増加することが一般的に知られている。
【００１４】
細胞内真核細胞は、アスコルビン酸塩を、その酸化物質であるデヒドロアスコルビン酸塩（ＤＨＡ）から再産生する酵素システムを有しており、抗酸化機能のない下流の生産物に対するその不可逆的な酸化を防止する（例えば、非特許文献２参照）。したがって、このメカニズムは細胞内のアスコルビン酸塩濃度を維持するために必須であり、グルタレドキシン（非特許文献３参照）及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（非特許文献４）などのデヒドロアスコルビン酸塩還元酵素の作用を介して酵素的に引き起こされることもあり、ＧＳＨによるその還元を介して非酵素的に引き起こされることもある（非特許文献５）。
【００１５】
最近の研究により、アスコルビン酸塩の注入によりＣＯＰＤの患者の骨格筋の疲労抵抗性が増加することが示された（例えば、非特許文献６参照）
【００１６】
我々は、ＮＢＭＩが、ＣＯＰＤ患者で発現することが知られているインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）などの主要な抗炎症性マーカーの放出を阻害できる（例えば、非特許文献７、非特許文献８、及び非特許文献９、及び非特許文献１０参照）だけでなく、驚くべきことに、ＮＢＭＩは、気道内膜の体液中のアスコルビン酸塩を再産生できることを発見した。さらに、ＮＢＭＩはアスコルビン酸塩のリサイクルのための電子ドナーとして機能することによってこの作用を発揮する可能性があることが分かった。また驚くべきことに、我々は、重大で有害な副作用を起こすことなく、症状を改善し、病気の進行を緩和／抑制することによって、ＮＢＭＩを患者に投与してＣＯＰＤを治療的に処置できる可能性も発見した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６，５８６，６００号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０２２７８１２号明細書
【特許文献３】米国特許第８，４２６，３６８号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１１／０３８３８５号
【特許文献５】国際公開第２０１２／１２１７９８号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２，３８３（２０１２）
【非特許文献２】Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，５００，１０７（２０１０）
【非特許文献３】Ｓａａｒａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．，１２，１５（２０１０）
【非特許文献４】Ｎａｒｄａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，８８２５（２００１）
【非特許文献５】Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１７，３３３（１９９４）
【非特許文献６】Ｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３０５，（２０１３）
【非特許文献７】Ｒｕｂｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１２，３１５（２０１３）
【非特許文献８】Ｔｈｏｒｌｅｉｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．，１０３，１５４８（２００９）
【非特許文献９】Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，３４，１６２（２０１４）
【非特許文献１０】Ｄａｄｖａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，（２０１４），Ｆｅｂ  ２０）
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、アスコルビン酸塩酸化モデルにおける、９，１０−フェナントレンキノン（９，１０−ＰＱ）によるアスコルビン酸塩をＤＨＡとする酸化と、それに続くＮＭＢＩとジチオスレイトール（ＤＴＴ）によるＤＨＡのリサイクルを説明する。
【図２】図２は、アスコルビン酸塩酸化モデルにおける、ＣｕＳＯ４によるアスコルビン酸塩をＤＨＡとする酸化と、それに続く１０、２０および３０分で添加したＮＭＢＩとＤＴＴのＤＨＡリサイクルを説明する。左の画面では、アスコルビン酸塩の酸化とリサイクルのキネティクスを示す。また右の画面では、ＮＭＢＩとＤＴＴ添加後の対応するアスコルビン酸塩濃度の急増と継続する増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第一の態様では、ＣＯＰＤの治療方法に使用するための、ＮＢＭＩ、その薬学的に許容される塩又はその誘導体を提供する。その方法には、その治療が必要な患者に対するＮＢＭＩの薬学的に有効な量の投与が含まれる。
【００２１】
用語「ＣＯＰＤ」は、例えば、慢性的な気流の不足、息切れ、咳、痰の産生によって特徴付けられる慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＬＤ）または慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＡＤ）として文献で様々に言及されるこれらの疾患を含むと理解される。
【００２２】
誤解を避けるために、本明細書では、用語「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療／処置）」、「ｔｈｅｒａｐｙ（治療）」及び「ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｔｈｏｄ（治療法）」には、ＣＯＰＤ又は本明細書で言及する他の関連する疾患の患者が必要とする治療的または緩和的処置が含まれる。「Ｐａｔｉｅｎｔｓ（患者）」にはヒトである患者も含まれる。
【００２３】
ＮＢＭＩの薬学的に許容される塩としては、アルカリ土類金属塩と、より具体的には、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム及びフランシウム塩などのアルカリ金属塩を挙げることができる。
【００２４】
このような塩は、従来の方法、例えばＮＢＭＩと等量以上の適切な塩基との反応（任意にその塩が不溶である溶媒又は媒体中で反応させ、その後、通常の方法（例えば真空内、凍結乾燥、ろ過）を用いてその溶媒又は媒体を除去する）によって形成できる。また、塩は、例えば適切なイオン交換樹脂を用いて、塩の形態の有効成分の対イオンを別の対イオンと交換することによっても作製できる。
【００２５】
ＮＢＭＩの薬学的に許容される誘導体としては、グルタチオン、システイン、α−ジヒドロリポ酸、シスタミン、チオールリン酸、５’−チオアデノシン、Ｌ−ホモシステイン、補酵素Ａ、２―メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、フルオロ酢酸またはクロロ酢酸誘導体を挙げることができる。このような誘導体は、例えば米国特許出願公開第２０１１／０２３７７７６号明細書に記載のように作製できる。
【００２６】
ＮＢＭＩ、その薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される誘導体は、以下これらを一緒にまとめて単に「ＮＢＭＩ」という。
【００２７】
本発明の別の態様では、その患者においてアスコルビン酸塩を（例えば、全身的に）再産生するのに十分に薬学的に有効な投薬量のＮＢＭＩを投与することにより、患者のＣＯＰＤを治療する方法を提供する。
【００２８】
また本明細書において「アスコルビン酸塩」を、アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はビタミンＣと様々に称してもよいことを当業者は十分に承知する。
【００２９】
ＣＯＰＤは、呼吸器の病的状態と死亡に関連することが知られており、本発明によれば、そのリスクはＮＢＭＩによって減少する可能性がある。
【００３０】
本発明の別の態様では、患者の呼吸器の病的状態と死亡のリスクを低減させる（すなわち予防）方法を提供する。該方法は、ＣＯＰＤの症状を示すその患者にＮＢＭＩを投与することを含む。
【００３１】
用語「病的状態」は、一般的に、衰弱させる病気に少なくともある程度かかった状態、障害や病気及び／又は体調不良を含むことを当業者は理解する。したがって、「呼吸」の病的状態は、例えばＣＯＰＤの結果として生じるそのような状態を含む。
【００３２】
ＮＢＭＩは、疲労（例えば骨格筋疲労）、息切れ、咳および痰の産生を含むＣＯＰＤの症状の軽減に有用であることが分かった。
【００３３】
本発明の別の態様では、ＣＯＰＤを患っている患者のＣＯＰＤの症状を一つ以上軽減する方法を提供する。該方法は、その患者にＮＢＭＩを投与することを含む。
【００３４】
これには制限されないが、本発明の使用と治療方法は、患者として喫煙者または前喫煙者が挙げられることを含む。
【００３５】
本明細書に記載された使用と方法において、ＮＢＭＩは、好ましくは局所的または全身的に、例えば経口で、静脈内または動脈内に（血管内または他の血管周囲の装置／剤形（例えば、ステント）を含む）、筋肉内に、皮膚に、皮下に、経粘膜的に（例えば、舌下または口腔に）、直腸に、経皮的に、経鼻的に、肺に（例えば、吸入で、気管または気管支に）、局所的に、または、他の非経口ルートによって、薬学的に許容される投与形態で化合物を含む製剤の形で、投与される。送達の好ましい方法は、経口（特に）、静脈、皮膚もしくは皮下、経鼻、筋肉内または腹膜内伝達を含む。
【００３６】
ＮＢＭＩは、通常、予定された投与のルートおよび標準的な薬学的慣例に鑑みて選択されるであろう薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物である一つ以上の医薬組成物の形で投与される。そのような薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用の状況下では有害な副作用または毒性を有さない。またそのような薬学的に許容される担体は、即時の又は変更されたＮＢＭＩの放出を与えることができる。
【００３７】
適切な医薬組成物は市販されている場合もあり、それ以外の場合は文献に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‐Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）およびＭａｒｔｉｎｄａｌｅ‐Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（３５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）並びにそれらの中で参照される文献であり、これらの全ての文献に関連した開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。あるいは、適切な製剤の製造は、通常の技術を用いる当業者によって非発明的に達成されうる。ＮＢＭＩを用いた使用のための適切な医薬組成物は、米国特許出願公開第２０１０／０２２７８１２号明細書にも記載されている。
【００３８】
製剤中のＮＢＭＩの量は、疾患の深刻さ、治療を受ける患者および使用する化合物に依存するが、当業者によって非発明的に決定されうる。
【００３９】
治療を受ける患者および投与のルートに応じて、ＮＢＭＩは、それを必要とする患者に様々な治療的に有効な投薬量で投与することができる。
【００４０】
しかしながら、ヒトに投与される投薬量は、（上述のように）本発明においては合理的な時間枠において治療反応をもたらすのに十分でなければならない。当業者は、正確な投薬量および組成並びに最も適切な送達の計画の選択は、とりわけ製剤の薬学的特性、治療を施す疾患の特質および深刻さ、レシピエントの健康状態と知力、並びに、治療を受ける患者の年齢、状態、体重、性別および反応、病気の段階／深刻さ、および、患者間の遺伝的差異にも影響されることを認識する。
【００４１】
ＮＢＭＩの投与は、連続的であっても断続的（例えば大量瞬時投与による）であってもよい。投薬量は、投与のタイミングと頻度で決定できる。
【００４２】
したがって、ＮＢＭＩの適切な投薬量は、１日につき患者の総体重のキログラム当たり、化合物が、約０．５ｍｇと約１００．０ｍｇの範囲にあり、約１ｍｇと約６０ｍｇの間、例えば約１．５ｍｇと約４０ｍｇの間が挙げられる。
【００４３】
いずれにしても、医師または他の当業者は、個々の患者に最も適切な実際の投薬量を日常的に決定することができる。上記の投薬量は典型的な平均的ケースである；当然に、より高い又はより低い投薬量の範囲が適する個々の例がありうる。そして、それは本発明の範囲内である。
【００４４】
本明細書に記載された使用と方法では、ＮＢＭＩは、ＣＯＰＤの治療において潜在的に有用な又は使用のために示された１つ以上の活性成分と併用することができる。すなわち、そのような患者は、１つ以上のその活性成分の投与に基づく治療も（及び／又は、すでに）受けることができる。これは、ＮＢＭＩによる治療の前に、ＮＢＭＩによる治療に加えて、及び／又はＮＢＭＩによる治療の後に、本明細書に記載された１つ以上の活性成分の規定された投薬量が与えられることを意味する。
【００４５】
そのような活性成分には、短時間で作用する気管支拡張薬（サルブタモール／アルブテロール、レボサルブタモール／レバルブテロール、ピルブテロール、エピネフリン、エフェドリン及びテルブタリンなど）、持続性の気管支拡張薬（サルメテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、バンブテロール及びインダカテロールなど）、抗コリン作用薬（チオトロピウム及びイプラトロピウム臭化物など）、コルチコステロイド（フルニソリド、フルチカゾンプロピオン酸塩、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンジプロピオネート及びブデソニドなど）並びに長期型抗生物質（例えば、エリスロマイシンなどのマクロライド剤）、粘液溶解薬および酸素などのＣＯＰＤの治療で使用される他の薬剤が含まれる。
【００４６】
またＮＭＢＩは、ビタミン−Ｅ、ビタミン−Ｄ、システイン、シスチン、グルタチオン、リポ酸グルタチオン（ＧＳＨ）、ジヒドロリポ酸（ＤＬＰＡ）、リポ酸（ＬＰＡ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸塩（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこれらの混合物を含む酸化防止剤またはキレート化剤と共に同時投与され得る。
【００４７】
ＣＯＰＤの治療において有用な他の活性成分の薬学的に許容される塩としては、酸付加塩と塩基付加塩を挙げることができる。そのような塩は従来の方法で形成することができる。
【００４８】
ＣＯＰＤの治療に有用な他の活性成分の適切な投薬量は、当業者に公知であり、問題の薬物として医学文献にリストされたものが挙げられる。例えば、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ‐Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（３５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）及びその中で参照される文献であり、これらの文献の全てに関連した開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４９】
本明細書中で、例えば量（例えば、活性成分の投薬量）についての文脈において、用語「約」が使用された場合は常に、その値がおおよその値であり、そのため明細書中で規定された数値から±１０％、例えば±５％、好ましくは±２％（例えば±１％）変動しうることは言うまでもない。
【００５０】
ＣＯＰＤの治療において本明細書中に記載される使用／方法は、その治療で使用される公知の先行技術の類似する方法（治療）に比べて、医師及び／又は患者にとってより便利であり、より有効であり、より毒性が低く、活性の範囲がより広く、より強力であり、副作用がより少ないであろう点や、他の有益な薬理学的特性を有するであろう点で有利であろう。
【００５１】
以下の実施例によって本発明を説明するが、決して制限されるものではない。
図１は、アスコルビン酸塩酸化モデルにおける、９，１０−フェナントレンキノン（９，１０−ＰＱ）によるアスコルビン酸塩をＤＨＡとする酸化と、それに続くＮＭＢＩとジチオスレイトール（ＤＴＴ）によるＤＨＡのリサイクルを説明する。
【００５２】
図２は、アスコルビン酸塩酸化モデルにおける、ＣｕＳＯ４によるアスコルビン酸塩をＤＨＡとする酸化と、それに続く１０、２０および３０分で添加したＮＭＢＩとＤＴＴのＤＨＡリサイクルを説明する。左の画面では、アスコルビン酸塩の酸化とリサイクルのキネティクスを示す。また右の画面では、ＮＭＢＩとＤＴＴ添加後の対応するアスコルビン酸塩濃度の急増と継続する増加を示す。
【実施例】
【００５３】
実施例１
ＮＢＭＩを用いたＩＬ−６およびＩＬ−８の抑制
粒子曝露に反応したときの炎症性サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８（並びにＧＭ−ＣＳＦおよびＭＣＰ−１）の細胞培養液中への分泌は、以下の方法を用いてＡ５４９およびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞で測定した。
【００５４】
２４穴のプレートに肺上皮細胞を５×１０４個播種した。事前にＮＢＭＩ、陽性対照として用いられる抗酸化化合物であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）または溶媒と共に３時間インキュベートした後、培養液を除去した。
【００５５】
異なった濃度で様々な粒子（下記）を含む新鮮な培養液を総量で０．５ｍｌ添加し、さらに２４時間インキュベートした。その後、遠心によって細胞から上清を分取した。
【００５６】
細胞外液中のＩＬ−８、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＣＰ−１を、メーカーの説明書に従って、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，アビンドン，ＵＫ）を用いて測定した。
【００５７】
陰性対照として培養液のみの曝露を用いた。個々の実験は４連で２回実施した。
【００５８】
概して、二酸化チタン型Ｐ２５および都市粉塵（基準  ＳＲＭ  １６４９  ｂ）の両方が、肺上皮細胞株Ａ５４９およびＢＥＡＳ−２Ｂの炎症性サイトカインの産生を誘導した。
【００５９】
粒子によって誘導されるサイトカイン産生に対する５０μＭのＮＢＭＩを用いた事前インキュベーションの影響を様々な濃度の関連粒子で検討した。
【００６０】
本検討によって、ＮＢＭＩが両方の細胞株の炎症性サイトカインの粒子誘導性分泌を減少させることができるが、その減少はいくつかの場合では、バックグランドレベルまでのみであることが示された。
【００６１】
ＩＬ−８およびＩＬ−６は、７５μｇ／ｃｍ２のＴｉＯ２  Ｐ２５を曝露したＡ５４９細胞の上清において最も高い濃度に達した。この濃度のとき、５０μＭのＮＢＭＩはＩＬ−８の分泌を２９％、ＩＬ−６の分泌を３８％減少させた。
【００６２】
Ａ５４９細胞に対する１００μｇ／ｃｍ２の都市粉塵において、５０μＭのＮＢＭＩを用いたプレインキュベートは、ＩＬ−８の分泌を３０％、ＩＬ−６の分泌を３８％減少させた。
【００６３】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に対する１００μｇ／ｃｍ２のＴｉＯ２  Ｐ２５において、５０μＭのＮＢＭＩを用いたプレインキュベートは、ＩＬ−８の分泌を４９％、ＩＬ−６の分泌を３７％減少させた。
【００６４】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に対する１００μｇ／ｃｍ２の都市粉塵において、５０μＭのＮＢＭＩを用いたプレインキュベートは、ＩＬ−６の分泌を４７％減少させた。
【００６５】
また、５ｍＭのＮＡＣを用いたプレインキュベートは、炎症性サイトカインの分泌の減少に効果的であった。
【００６６】
実施例２
ＮＢＭＩを用いたアスコルビン酸塩の再産生
ＮＢＭＩがアスコルビン酸塩の再産生のための電子ドナーとして機能するかどうかを調べるために試験を実施した。
【００６７】
１μＭの９，１０−ＰＱ及び２μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）によって提供されたアスコルビン酸塩の酸化のキネティクスを、アスコルビン酸塩減少アッセイ（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓ．Ｒｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｆｆ．Ｉｎｓｔ．，１６３，３（２０１１））を用いて調べた。ＮＢＭＩの作用をそのキレート性と独立して調べるために９，１０−ＰＱを使用した。
【００６８】
すべての試験は、最終量２００μＬでＵＶ９６穴平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）を用いて３連で実施した。Ｃｈｅｌｅｘ−１００レジンで処理した１６０μＬの水（１０％ＤＭＳＯを含む）と１０μＬの水、４ｍＭのＣｕＳＯ４保存液または２ｍＭの９，１０−ＰＱ保存液および１０μＬのＮＭＢＩ（４ｍＭおよび２００μＬ）を含む各ウェルに、２０μＬの高濃度のアスコルビン酸塩保存液（２ｍＭ）を添加することによって曝露を開始した。
【００６９】
すべての溶液はＣｈｅｌｅｘ−１００レジンで処理した水（１０％ＤＭＳＯを含む）で調製した。これにより、最終濃度は、ウェル中でアスコルビン酸塩２００μＭ、ＣｕＳＯ４  ２μＭまたは９，１０−ＰＱ  １μＭおよびＮＢＭＩ  １０〜２００μＭとなった。
【００７０】
アスコルビン酸塩を各アッセイウェルに添加する直前に、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０）中でプレートを３７℃で１０分間、プレインキュベートした。曝露中、そのプレートをこの温度で維持した。アスコルビン酸塩を添加後、各ウェルに残存する濃度を２６５ｎｍで吸光度を測定することによって２分ごとに２時間モニターした。アスコルビン酸塩濃度は、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ’ｓ  ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）を使用した濃度時間プロットの最初の部分の線形回帰を実施することによってアスコルビン酸塩酸化率を用いて標準曲線を参照し測定した。これは各３連で実施し、最終的にアスコルビン酸塩減少率は、アスコルビン酸塩の１×１０−９減少モル平均±標準偏差として表した。
【００７１】
アスコルビン酸塩に添加するＮＢＭＩの影響を調べる実験のために、その後、ＣｕＳＯ４および９，１０−ＰＱ減少アッセイをタイムコースで試験した。最初の５５〜６０分間に１９０μＬのみでプレートを測定し、プレートリーダーから取り外した後、１０μＬのＮＭＢＩまたは公知の還元剤であるＤＴＴ保存液または水のいずれかを各ウェルに添加した。その後、プレートを、プレートリーダーに戻し、２６５ｎｍで吸光度をさらに６０分間モニターした。
【００７２】
測定されたアスコルビン酸塩濃度の即時の増加を測定し、即時のリサイクル能力の測定として「急増（Ｊｕｍｐ）」と称した。インキュベーションの残りの６０分にわたって持続した「増加」も測定した。２つの間の違いは、ＣｕＳＯ４−または９，１０−ＰＱ−が提供したアスコルビン酸塩酸化率を引き続き抑制する添加化合物の能力を反映している。
【００７３】
図１は、実験の最初の６０分間にわたる９，１０−ＰＱを用いたインキュベーションによって提供されたアスコルビン酸塩酸化のキネティクスを示す。この時、ＮＭＢＩ（２００μＭ）を添加し、その結果、４２．８μＭのアスコルビン酸塩の即時のリバウンドが示された。その後、アスコルビン酸塩酸化率は最初の６０分間に比べて減少した。
【００７４】
ＤＨＡのアスコルビン酸塩への再産生を示すアスコルビン酸塩のリバウンドは驚きであり、２００μＭのＤＴＴを用いて行われた、持続しない、５．１μＭのアスコルビン酸塩の低い即時の回復に比べて非常に大きかった。
【００７５】
図２は、１０、２０および３０分でインキュベーションしたときのＣｕＳＯ４アスコルビン酸塩モデルにおけるＤＨＡをリサイクルするＮＭＢＩの能力を示す。これらの早い時点に焦点をあてると、ＮＭＢＩ添加後のアスコルビン酸塩増加のリバンウンドは、おそらく化合物のキレート化の性質のために、クエンチされたその後の酸化率を用いた２つの試験された高濃度のものでは最も顕著であった。
【００７６】
これらの実験は、６０分間でＮＭＢＩおよびＤＴＴ（いずれも２００μＭ）の添加を繰り返した。これは、ＮＭＢＩでは２４．９８±５．５４μＭの増加であるのに対し、ＤＴＴでは７．９３±６．５８μＭのアスコルビン酸塩濃度での即時の「急増」であることを明らかにした。インキュベーションの残りの６０分にわたるアスコルビン酸塩の持続的な「増加」は、ＤＴＴおよびＮＢＭＩでそれぞれ１０．７９±２．４５μＭおよび２５．４５±２．４５μＭであった。
【００７７】
これらの結果は、ＮＢＭＩの今まで未知であった驚くべき性質を示し、ＤＨＡをアスコルビン酸塩に再産生できることを示唆する。
【００７８】
実施例３
ＣＯＰＤ患者の治療
数年前にＣＯＰＤと医学的に診断された米国在住の退職した女性は、定期的に２４時間中２〜４回の咳の発作を起こし、それは昼でも夜でもいつでも始まり、約４０〜７５分間続いた。
【００７９】
これらの咳の発作の結果として、その患者の呼吸は浅く、彼女の喉はヒリヒリし、彼女の声はかすれ、彼女の活力レベルは非常に低く、彼女の生活の質は非常に低下していた。
【００８０】
１００ｍｇのＮＢＭＩをカプセルで１日３回（食事時）、８日間投与した結果、症状に著しい改善が見られた。８日間の投与によって、その患者は咳の発作が無くなり、呼吸がかなり改善した。
【００８１】
実施例４
「喫煙マウス」のＩｎ  ｖｉｖｏ試験Ｉ
タバコの煙を１日あたり５〜６本分、週に５日間曝露したときに、Ｃ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂ／ｃマウスの両方において炎症性の肺の反応を誘導できることが研究によって示されている（例えば、Ｄ’ｈｕｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，２６，２０４（２００５）  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１３，２１９（２０１３）参照）。
【００８２】
タバコの煙（ＣＳ）によって誘導される気道疾患のマウスモデルを開発し、フィルターのついた研究用タバコからの副流煙および主流煙の組み合わせを作り出すタバコの煙の装置を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス４群に対して２週間にわたって週７日間ＣＳを曝露（鼻のみ）した。
【００８３】
１４日間の用量設定試験の一部として、ＣＳを曝露する前にＮＭＢＩを３群のマウスに皮下投与した（５，３０または１５０ｍｇ／ｋｇ）。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の炎症細胞数、ＢＡＬ中のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析およびサイトカイン解析を実施した。
【００８４】
材料と方法
本試験では雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌｅｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オランダ）を使用した。それらは、吸収性の床敷材料を敷いたプラスチックケージで飼育し、１２時間の日照サイクルで維持した。餌と水は自由摂食で与えた。それらの世話と実験プロトコルはウーメオの動物実験の地域倫理委員会によって承認された。タバコの曝露プロトコルを開始したときのマウスは１２週齢であった。
【００８５】
ＣＳ−曝露プロトコル
ＣＳ（副流煙および主流煙）の吸入を動物に実施した。研究用タバコから煙を産生するマイクロプロセッサで制御したタバコの煙の装置（ＴＥ−１０，Ｔｅａｇｕｅ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＣＳ曝露を実施した（１Ｒ５Ｆ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，レキシントン，ＫＹ，ＵＳＡ）。
【００８６】
タバコは自動的にホイールにロードされ、点火され、膨らみ、放出される。それぞれのタバコは１０分間吸われ、装置を通した気流は１２Ｌ／分の流速に設定された。タバコは必要になるまで−２０℃で保管した。２週間にわたって週７日間１日１回、毎回１０分間に４本のタバコ×３（すなわち、３０分間にわたって１２本のタバコ）をマウスに施した。煙は、同等かつ同時にＣＳへの曝露を提供するスモークタワー（ＥＭＭＳ，ＵＫ）に移動させた。
【００８７】
マウスをプラスチックチャンバーに置き、「鼻だけ」の吸入によってＣＳを施した。コントロールマウスは毎日世話し、部屋の空気を吸わせたが、これらのケージからは出さなかった。
【００８８】
したがって、５つの投与群は以下の通りである。
１．毎日、清浄な空気を曝露（プラセボ群）
２．毎日、ＣＳを曝露（ＣＳ−曝露プラセボ群）
３．毎日、ＣＳを曝露；５ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  ５ｍｇ／ｋｇ群）
４．毎日、ＣＳを曝露；３０ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  ３０ｍｇ／ｋｇ群）
５．毎日、ＣＳを曝露；１５０ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群）
【００８９】
１５日目にマウスを放血させ、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。総量１ｍＬ＋３×１ｍＬのＣａ２±／Ｍｇ２＋フリーのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，シュタインハイム，ドイツ）を用いて、気管チューブを介して４回肺を洗浄した。
【００９０】
その後、直ぐにＢＡＬ液を遠心した（１０分，４℃，１７５０ｒｐｍ）。さらなる解析まで上清を除去した後、細胞のペレットを再懸濁し、０．５ｍＬのＰＢＳで希釈した。２０，０００個の白血球をロードできるように、血球計算板で手作業で計数し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（登録商標）ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｓｈａｎｄｏｎ（登録商標）ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ３ｃｙｔｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，細胞調製システム）を用いて遠心した。
【００９１】
細胞遠心された調製物をメイグリュンワルドギムザ染色液で染色し、炎症性肺細胞（マクロファージ、好中球、リンパ球および好酸球）の種々の細胞を標準の形態学的基準を用いてカウントし、サイトスピンの１調製あたり３００細胞とした。
【００９２】
ＢＡＬおよび血清中の炎症性メディエーターは、インターロイキン（ＩＬ）−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１２ｐ７０，ＩＬ−１３，ＩＬ１７，エオタキシン，Ｇ−ＣＳＦ，ＩＮＦγ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＫＣ，ＭＣＰ−１，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−ｌβ，ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦαの存在について解析した。すべてのサイトカインの分析は、メーカーの説明書（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従いｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｋｉｔ（ＢｉｏＰｌｅｘ（商品名）Ｐｒｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２３−ｐｌｅｘ  ｐａｎｅｌ）を用いて同時に実施し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（商品名）ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ハーキュリーズ，ＣＡ）で解析した。
【００９３】
ＢＡＬからの白血球はＢＤ  ＦＡＣＳｏｒｔ（商品名）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，サンノゼ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーで解析した。ＢＡＬからの細胞は上述のようにＰＢＳで再懸濁した。抗体染色は９６穴プレート中でサンプルあたり２．０×１０５個を用いて実施した。
【００９４】
細胞は非特異的な結合を減らすためにＦｃＲブロッキングＡｂ（抗体）（ａｎｔ−ＣＤ１６／ＣＤ３２；クローン２．４Ｇ２）と事前にインキュベートした。Ｔ細胞のサブタイプを同定するために用いたｍＡｂ（モノクローナル抗体）は、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（クローン１７Ａ２），ＣＤ４−ＰＥ（クローンＨ１２９．１９）及びＣＤ８ａ−ＰＥ−Ｃｙ５（クローン５３−６．７）であった。アイソタイプ適合抗体を陰性コントロールとして使用した。標準手順に従いＢＤ  ＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，サンノゼ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーを実施し、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。すべての抗体はＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンディエゴ，ＣＡ）製であった。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞として定義した。
【００９５】
結果は、平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として示した。群間の差を調べるために２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたパラメータ法によって統計的有意差を評価し、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法での事後検定を実施した。適切な場合には、一元配置ＡＮＯＶＡまたは対応のないスチューデントｔ検定を用いた。統計解析結果のｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【００９６】
統計解析を実施し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０  ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてグラフを作成した。
【００９７】
結果
すべての動物は、１日目から１５日目の間、最後の煙の曝露から２４時間の体重を測定した。１日目においてマウスに有意な体重の違いはなかった。１５日目においてＮＢＭＩ  ５ｍｇ／ｋｇ群のマウスの最終体重（１９．５±０．３ｇ）はＣＳを曝露したマウス（２０．３±０．３ｇ，ｐ＜０．０５）に比べて低かった。ＮＢＭＩの用量にかかわらずＣＳを曝露したすべてのマウスが１日目から１５日目で有意に体重が減少した。
【００９８】
ＣＳ曝露動物の総ＢＡＬ細胞数（１５日目）はコントロール群に比べて有意には高くなかった（ＣＳ曝露：２９６，７００±４３，６５０及びＣＳ曝露なし：２８４，６７０±６３，２００細胞／ｍＬ，ｐ＞０．０５）。ＣＳ曝露はＢＡＬ液中の好中球の有意な増加を誘導した（ＣＳ曝露：９４０±２５０及びＣＳ曝露なし：２６０±１６０細胞／ｍＬ，ｐ＜０．０５）。１５日目において、ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群およびＮＢＭＩ  ３０ｍｇ／ｋｇ群の動物の好中球数はＣＳを曝露されたマウスに比べて有意に低かった。
【００９９】
２週間のＣＳ曝露は、Ｇ−ＣＳＦを除いてＢＡＬ中の炎症性メディエーターの濃度を有意に増加させなかった。ＮＢＭＩ  ５ｍｇ／ｋｇ群のＭＩＰ−１α濃度は、ＣＳ曝露プラセボ群に比べて低かった（ｐ＜０．０５）。分析された炎症性メディエーター間で他に有意な差はなかった。
【０１００】
２週間のＣＳ曝露は、血清中の炎症性メディエーターの濃度を有意に増加させなかった。ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群のＩＬ−１β，ＩＬ−３，ＩＬ−６，エオタキシン，ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳ濃度はＣＳ曝露プラセボ群に比べて有意に低かった。ＮＭＢＩ  ３０ｍｇ／ｋｇ群は血清中のＩＬ−１０濃度を増加させた。分析された炎症性メディエーター間で他に有意な差はなかった。
【０１０１】
２週間のＣＳ曝露は、ＢＡＬ液中のＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞の濃度を有意に増加させなかった。いずれの群間でも有意な差はなかった。
【０１０２】
ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群のマウスは首に傷を形成していた。他の２つのＮＢＭＩ群には潰瘍の兆候は見られず、プラセボ群のいずれにおいてもみられなかった。
【０１０３】
実施例５
「喫煙マウス」のＩｎ  ｖｉｖｏ試験ＩＩ
上記の実施例４で述べられた試験の結果から、２週間のタバコ喫煙は炎症性反応を引き起こすのに、おそらく十分な時間ではなかったことが結論づけられた。
【０１０４】
したがって、１４日間の用量設定試験に引き続いて、上記の実施例４で述べたものと基本的に同じ装置およびプロトコルを用いて９０日間の試験を実施した。
【０１０５】
今回は、５つの投与群は以下の通りであった：
１．毎日、清浄な空気を曝露（プラセボ群；Ｇｒ．１）
２．毎日、ＣＳを曝露（ＣＳ−曝露プラセボ群；Ｇｒ．２）
３．毎日、ＣＳを曝露；３０ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  ３０ｍｇ／ｋｇ群；Ｇｒ．３）
４．毎日、ＣＳを曝露；６０ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  ６０ｍｇ／ｋｇ群；Ｇｒ．４）
５．毎日、ＣＳを曝露；１５０ｍｇ／ｋｇ用量でＮＢＭＩを投与（ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群；Ｇｒ．５）
【０１０６】
９１日目において、動物の体重を測定し、ペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔した（９０ｍｇ／ｋｇ  体重，ｉ．ｐ．）。マウスを１８ゲージのカニューレで気管切開し、小動物用呼吸装置（ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（商品名），ＳＣＩＲＥＱ（登録商標））を用いて、３Ｈｚの周波数および１２ｍＬ／ｋｇ（体重）の呼吸量（ＶＴ）で機械的に準正弦法で人工呼吸した。３ｃｍ  Ｈ２Ｏの呼吸終末陽圧を適用した。
【０１０７】
動物の心機能の結果を、呼吸メカニズム評価を通じてモニターした。実験前に安定したベースラインの呼吸メカニズムを確立し、同様の量的な履歴を保証する実験の開始時に３×ＶＴでの４回の操作を行う前に、マウスをパンクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ  体重，ｉ．ｐ．（地元供給業者））を用いて麻痺させた。
【０１０８】
正弦標準呼吸を適用することによって動的な肺メカニズムを測定し、単一のコンパートメントモデルおよび多重線形回帰を用いて解析し、呼吸の抵抗（ＲＲＳ）、エラスタンス（弾性）（ＥＲＳ）およびコンプライアンス（柔軟性）（ＣＲＳ）を得た。ＲＲＳの測定は、誘導気道の狭窄および肺の変化の両方を反映する。ＣＲＳおよびＥＲＳの測定は、肺周囲の事象のみ、特に、肺胞の虚脱を引き起こす気道閉鎖を反映する。反対にＣＲＳの選択的な変化はより末梢部の作用を示している。
【０１０９】
肺メカニズムのより詳細な評価は、Ｊｏｎａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．，９，２３（２００８）及びＲｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１６５，２２９（２００９）に従い、強制オシレーション法（ＦＯＴ）を用いて実施した。本試験のＦＯＴ測定から得られたパラメータは以下であった：ニュートン抵抗（ＲＮ）、組織ダンピング（Ｇ）（これは、組織抵抗と密接に関係し、肺組織でのエネルギー消耗を反映する）および組織エラスタンス（弾性）（Ｈ）（これは、組織の剛性を特徴づけ、組織のエネルギー保管を反映する）。
【０１１０】
動的圧量（ＰＶ）曲線は、３０ｃｍ  Ｈ２Ｏの最大圧力に肺を膨らますことによって決定し、量と圧力について測定するために、コンピューターで制御したＦｌｅｘｉｖｅｎｔ排気装置を用いて受動的に呼吸させた。各動物の個々の結果をまとめた。すべてのＰＶ測定は３連で実施した。準静的ＰＶループはゆっくりとした段階的な肺の膨張と収縮によって得られた。ＰＶループは３ｃｍ  Ｈ２ＯのＰＥＥＰレベルで行われた。ＰＶループの下降部分の形状係数（ｋ）はＳａｌａｚａｒ−Ｋｎｏｗｌｅｓの方程式にデータを適合させることによって算出した。パラメータｋの値は、線維症と気腫の両方で特徴的に変化すると考えられている。準静的なコンプライアンス（柔軟性）（Ｃｓｔ）およびエラスタンス（弾性）（Ｅｓｔ）及び２０ｃｍの水に到達するのに十分に吸入された空気量も得られた。
【０１１１】
基本的に、上記の実施例４で述べたように気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施し、ＢＡＬの細胞のフローサイトメトリーおよびＢＡＬおよび血清中の炎症性メディエーターの解析を行った。
【０１１２】
凍結された肺組織を２ｍＬのチューブ内で１ｍＬ  ＰＢＳとともに４℃で２分間ミキサーミル（Ｒｅｔｃｈ  ｍｍ４００）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズ後直ぐに、チューブを１５分間遠心した（１５００ｒｐｍ，４°Ｃ）。上清を除去し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａ２８０）を用いてタンパク濃度を測定するために取っておいた。タンパク含有量を分析後、各サンプルからの等量のタンパクをトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）１〜３の分析のために取っておいた。肺組織ホモジネート中のＴＧＦ−β  １〜３を、メーカーの説明書（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従いｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  ＴＧＦ−β  ３−Ｐｌｅｘ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて同時に分析し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（商品名）ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ハーキュリーズ，ＣＡ）で解析した。
【０１１３】
組織学的解析を行う動物は、組織の完全性を維持するために呼吸機能試験を実施しなかった。右の肺葉を除去し、パラフィン包埋するときまで４％パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋後、組織を３μｍの厚さの切片に切り、プラスに帯電したスライド上に設置した。炎症細胞の浸潤を評価するために、その切片を脱パラフィンし、脱水し、ヘマトキシリンとエオシンを用いて染色した。染色した切片の病理組織学的評価は、スウェーデンのウプサラにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＶＡ）にて小動物専門のプロフェッショナルな病理学者によって実施された。
【０１１４】
統計解析は、基本的に上記の実施例４で述べられたように実施した。
【０１１５】
結果
下記表１に、種々の分析に使用したマウスの数を示す。血液はすべてのマウスから収集した。
【０１１６】
【表１】
0006474423.tif 000002
【０１１７】
９０日の曝露の間、５匹のマウスが死亡した。ほとんどの場合、それらのマウスは大きな体重減少および昏睡などの健康状態の悪化のために安楽死させた（表５参照）。分析中、６匹のマウスが著しく異常値であり、そのため、データセットから除いた（表２）。
【０１１８】
【表２】
0006474423.tif 000003
【０１１９】
すべてのＣＳ曝露マウスは、曝露によって視覚的な影響を受けた。それらは、毛並みが乱れ、筋力が低下した。ＮＢＭＩを投与された動物（Ｇｒ．３及びＧｒ．４）は、プラセボを投与された他の群のマウスに比べていくらか健康であるように見えた（動物の専門家の観察）。瘢痕化および潰瘍形成を避けるためにＮＢＭＩの皮下注射部位を変えた。この努力にもかかわらず、Ｇｒ．５のマウスの首に傷と腱膜瘤が形成された。他の２つのＮＢＭＩ群に潰瘍の兆候は見られず、プラセボ群にも見られなかった。コントロールマウスにはＧｒ．５のＮＢＭＩと同じ濃度でＤＭＳＯを投与した。
【０１２０】
ＣＳ曝露マウスは、９０日目にコントロール動物に比べて有意な体重変化を示した。コントロールマウスは体重が１５％増加したが（２．８±０．２ｇ）、ＣＳ曝露マウスの体重は有意な程度には増加しなかった（−０．１±０．３ｇ）。ＮＢＭＩを投与した動物はすべて開始時に比べて体重が増加した（Ｇｒ．３：１．０±０．４ｇ，Ｇｒ．４：０．７±０．２ｇ及びＧｒ．５：０．６±０．２ｇ）。
【０１２１】
９０日目におけるＣＳ曝露マウスの総ＢＡＬ細胞数は、コントロール群に比べて有意に高かった（ＣＳ曝露：２４６，７００±２１，９８０細胞／ｍＬ及びＣＳ曝露なし：１５２，０００±２０，５４０細胞／ｍＬ，ｐ＜０．０１）。ＣＳ曝露マウスはＢＡＬ液中のマクロファージを有意に増加させた（ＣＳ曝露：２２９，３００±２１，４００細胞／ｍＬ及びＣＳ曝露なし：１３４，２００±１８，６００細胞／ｍＬ，ｐ＜０．０１）。
【０１２２】
ＣＳ曝露はコントロール群に比べて、ＢＡＬ液中の浸潤好中球およびリンパ球の数を増加させなかった（Ｇｒ．１）。ＮＢＭＩを投与した動物（３０，６０および１５０ｍｇ／ｋｇ）のＢＡＬ液中のマクロファージ数は有意に低くはなかった。しかし、Ｇｒ．４およびＧｒ．５の好中球数は低い傾向にあり、ＮＭＢＩを投与した群ではリンパ球数が低い傾向にあった。
【０１２３】
ＦＡＣＳ解析で示されるように、９０日間のＣＳ曝露は、ＢＡＬ液中のヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）の濃度を有意に増加させなかった。両方のリンパ球タイプのパーセンテージは、ＮＢＭＩ投与後に有意に変化はしなかった。しかし、リンパ球はＮＢＭＩ投与後に減少したので、ＮＢＭＩ投与動物のＢＡＬ液中の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）はＧｒ．２に比べて有意に低下した。
【０１２４】
９０日間のＣＳ曝露は、減少したＣＲＳとともにＥＲＳおよびＨの増加による、比較的大きい及び比較的小さい気道におけるＣＳ誘導変化に見られるように、コントロール動物に比べての肺の構造の変化を引き起こした（Ｇｒ．２対Ｇｒ．１）。ＣＳで減少したｈｙｓｔｅｒｅｓｉｖｉｔｙ係数ηは肺の不均質性の減少を反映した。
【０１２５】
ＮＢＭＩの比較的高い用量（Ｇｒ．４とＧｒ．５）は、比較的小さい及び比較的大きい気道抵抗性（ＲＲＳ及びＧ）を有意に増加させた。
【０１２６】
ＰＶ曲線を、ＣＳに曝露したマウス（Ｇｒ．２）において測定し、部屋の空気に曝露したマウス（Ｇｒ．１）と比較した。ＣＳ曝露は著しく肺を硬化させ、肺を膨らませるためにより大きな圧力が必要であった。ＮＢＭＩ（３０、６０、および１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスは、プラセボ群（Ｇｒ．２）に比べて、有意な呼吸機能の変化は示さなかった。Ｃｓｔ、Ｅｓｔおよびｋは煙の曝露による影響はなかった。
【０１２７】
９０日間のＣＳ曝露は、ＢＡＬと血清中の炎症性メディエーターの濃度を有意に増加させることはなかった。ＮＢＭＩ  １５０ｍｇ／ｋｇ群（Ｇｒ．５）において、ＣＳ曝露されたプラセボ群（Ｇｒ．２）に比べて、ＭＩＰ−１β（ｐ＜０．０５）およびＧＭ−ＣＳＦ（ｐ＜０．０１）の濃度は低下した。分析された炎症性メディエーター間には他に有意な違いはなかった。
【０１２８】
ＣＳ曝露動物（Ｇｒ．２）は、コントロール群（Ｇｒ．１）に比べて肺ホモジネート中のＴＧＦβの濃度を増加させなかった。ＮＢＭＩ投与された動物は、ＣＳを曝露されたプラセボ群（Ｇｒ．２）に比べて、ＴＧＦβ  １−３の量を有意に変化させなかった。
【０１２９】
すべての肺の気管支内腔および肺胞に少数のマクロファージが認められた。投与群において、マクロファージは少し数が多く、細胞質性の黄色の色素または黒の色素の顆粒を示した。黒の色素はタバコの曝露による煤のようであり、黄色の色素はリポフスチンかもしれない。
【０１３０】
白血球（好中球、好酸球、単球、マクロファージ）の数の少なさは、ＣＳ曝露動物において、時々肺胞中隔に、また、肺領域周辺の胸膜下に観察された。タバコを曝露された群で若干増加したマクロファージ数はわずかであり、肺の炎症は閾値以下のままであった。観察された変化に臨床的兆候を引き起こすような激しいものはなかった。
【０１３１】
本試験のコントロール動物は、ＣＳ曝露マウスに比べて、非常に良好な気道機能を示し、体重もより大きく増加したが、ＢＡＬ液中の細胞の増加はＧｒ．２と有意に相違しなかった。コントロールマウスはＣＳの煙に曝露されないだけでなくＧｒ．２と同じ処置を受けた。しかし、すべての動物は研究所の同じ設備を共有した。
【０１３２】
結論
ＣＳ曝露マウスは、体重減少（または、体重増加の減少）、マクロファージの増加、および呼吸のコンプライアンス（柔軟性）の低下に伴う肺の硬化を示した。
【０１３３】
ＮＢＭＩ投与（Ｇｒ．３およびＧｒ．４）は、９０日間毎日ＣＳを曝露したマウスの健康状態を改善する。肯定的な投与効果は、ＣＳ曝露したプラセボ群（Ｇｒ．２）に比べたときの、体重増加、ＢＡＬ液中のリンパ球数の減少傾向、ＣＤ８＋細胞の減少によって裏づけされる。
【図１】
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【図２】
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