(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物タンパク質発現系中における発現抗体のフコシル化を減少させ、かつグリコシル化パターンにおけるＭａｎ５及びＧ０のレベルを増加させるための方法であって：
培養培地を提供する工程；
真核生物タンパク質発現系を培養培地に導入する工程であって、真核生物タンパク質発現系が、発現抗体をコードする発現カセットを含み、発現抗体がイトリズマブであり、真核生物タンパク質発現系が哺乳動物細胞を含み、哺乳動物細胞がＣＨＯハムスター細胞又はＮＳＯマウス細胞である、工程；
マンガン含有培養培地を形成するために、培養培地及び／又は培養培地に添加されるフィード培地にマンガンまたはマンガンイオンを添加する工程であって、マンガンまたはマンガンイオンの濃度が、０．０７５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下の範囲にある、工程；
発現抗体を得るために、真核生物タンパク質発現系をマンガン含有培養培地中で培養する工程；
マンガン含有培養培地から、発現抗体を回収する工程であって、発現抗体が、マンガンまたはマンガンイオンを培養培地に導入しない培養培地中で培養した場合に発現した抗体と比較して、減少したフコシル化及びグリコシル化パターンにおけるＭａｎ５及びＧ０のレベルの増加を示す、工程；
を含む、方法。
【請求項２】
発現抗体が、３５％の非フコシル化レベルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現抗体が、ＣＤ２５およびＣＤ４について陽性である細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの低減をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒトまたは動物患者の疾患の処置用の医薬の製造のための、請求項１に記載の方法で製造された発現抗体の使用であって、
発現抗体が増加した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し、かつ、発現抗体のＣＤ６への結合が、Ｔ細胞活性化の下方調節及び炎症促進性サイトカインの合成における低減を引き起こす、使用。
【請求項５】
マンガンまたはマンガンイオンを添加しない場合のＭａｎ５の量と比較して、マンガンまたはマンガンイオンを添加した場合にＭａｎ５の量が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞増殖及び発現抗体の発現を維持するために、培養培地にアミノ酸を導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マンガンまたはマンガンイオンの濃度が、０．１ｍＭ以上０．２５ｍＭ以下の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発現抗体が、細胞媒介性免疫防御に関与する１つまたは複数の細胞表面抗原を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｇ０が下記の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【化１】
0006480926.tif 000009
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、インド特許庁に２０１３年７月２３日に出願されたインド仮特許出願第３２６２／ＣＨＥ／２０１３号および２０１３年７月２３日に出願されたインド仮特許出願第３２６５／ＣＨＥ／２０１３号の利益およびそれらに基づく優先権を主張する。２０１３年７月２３日に出願されたこれらの出願の内容は、ＰＣＴ規則４．１８に従って、本明細書に記載されていないＰＣＴ規則２０．５（ａ）で述べられるところの明細書、請求の範囲または図面の任意の要素または一部の組込みを含め、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質におけるフコシル化レベルを制御するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
真核生物発現系において発現されたタンパク質は、グリコシル化を含む翻訳後修飾プロセスを受ける。ＩｇＧ、およびＦｃ領域を含む他のモノクローナル抗体などの糖タンパク質の産生について今日確立されている真核生物発現系は、ポリペプチド鎖にＮ−グリカンを付加する。
【０００４】
ＩｇＧにおいて、最も重要なＮ−グリカンは、両方のＣＨ２鎖のＡｓｎ２９７で結合し（図１４を参照のこと）、これにはとりわけＮ−アセチル−ノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、マンノースおよびフコース残基が含まれる。
【０００５】
これは、基本的に、トランスジェニック植物発現系、ならびに哺乳動物細胞株、昆虫細胞株などにあてはまる。これらの全ての場合において、Ｎ−グリカンは、ポリペプチド鎖のＡｓｎ残基に結合したＮ−アセチル−グルコサミン残基に、α−３−グリコシド結合またはα−６−グリコシド結合した少なくとも１つのフコース残基を含む。
【０００６】
酵母発現系は、治療抗体が患者に投与される場合に望ましくない免疫反応を導く場合が多い、マンノースに富んだ高グリコシル化タンパク質（hyperglycoprotein）を産生する傾向がある。バキュロウイルスでトランスフェクトされた昆虫細胞系は、治療抗体のエフェクター機能に負の影響を与える低グリコシル化（hypoglycosylation）に起因する問題を引き起こす。さらに、主要な欠点は、完全なＩｇＧ産生の機会を狭める感染性バキュロウイルスの触媒特性である。
【０００７】
ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞が、特異的抗体が結合した標的細胞を能動的に溶解させる、細胞媒介性免疫の機構である。これは、体液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限および封じ込めるように作用できる機構の１つである。古典的なＡＤＣＣ媒介性エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞である。しかし、単球および好酸球もＡＤＣＣを媒介できる。ＡＤＣＣは、前の抗体応答へ依存するため、適応免疫応答の一部である。
【０００８】
標的細胞においてＡＤＣＣを惹起するために使用される治療抗体は、これらのエフェクター細胞のＦｃガンマ受容体によって認識されるために、Ｆｃ領域を必要とする。
【０００９】
最近の研究は、そのグリコシル化パターンにおいて低減された量のフコースを有するモノクローナル抗体が、フコシル化抗体と比較してかなり高い抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性を示すことを示している。ここでも基本的に、フコース残基の欠如がＡＤＣＣ増加を導くのは、Ａｓｎ２９７の位置である。低／無フコース抗体のＡＤＣＣ増加の背後にある機構は、ＦｃγＲ（例えば、ヒト免疫エフェクター細胞におけるＡＤＣＣに対する主要なＦｃ受容体であるＦｃγＩＩＩａ（CD16））に対する、そのように改変されたＦｃ領域の増加した親和性による媒介のようである（Shieldsら、2002）。
【００１０】
フコシル化は、糖タンパク質または糖脂質上のオリゴ糖が関与する最も一般的な改変の１つである。フコシル化は、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび糖脂質へのフコース残基の結合を含む。特別な型のフコシル化であるＯ−フコシル化は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に非常に重要である。フコシル化の調節機構は複雑である。多くの種類のフコシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコース合成経路およびＧＤＰ−フコーストランスポーターが、フコシル化の調節に関与する。
【００１１】
グリコシル化は、治療モノクローナル抗体のエフェクター機能に影響を与えることが公知である。抗体のオリゴ糖鎖中の種々の糖残基のなかでもフコースは、産物によって誘導される抗体依存性細胞傷害（ADCC）に影響を与える重要な糖の１つである。
【００１２】
細胞培養パラメーターの操作は、抗体のガラクトシル化およびシアリル化を制御するためにしばしば使用される。フコシル化の制御は、ＦＵＴ８ノックアウト細胞および細胞株の遺伝子操作を介した他の遺伝子サイレンシングモデルを使用することによって主に行われる。
【００１３】
ＵＳ２００９０２０８５００は、ＦＵＴ８ノックアウト細胞の操作による、低減されたフコースおよび改善されたＦｃ機能を有する抗体の産生を開示している。
【００１４】
ＵＳ７９７２８１０は、エリスロポエチンおよびそのアナログまたは誘導体を含む糖タンパク質のグリコシル化またはシアリル化を改善する、細胞培養方法およびマンガン含有培地を開示している。この開示によれば、マンガンは、Ｏ−結合型およびＮ−結合型グリコシル化の場合にはシアリル化および部位占有率を増加させ（即ち、非グリコシル化産物を低下させ）、末端ガラクトシル化もまた増加させる。
【００１５】
さらに、モノクローナル抗体のフコース含量は、高い抗体依存性細胞傷害のために、培養培地のオスモル濃度によって制御され得る（Konnoら、2012）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかし、選択された細胞株において毎回ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトを創出する労力を要するプロセスを経ずに、組換え操作された抗体のフコース含量を制御しつつ、所望の細胞株において糖タンパク質を産生する効率的な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の実施形態
これらの目的は、本発明の独立請求項に従う方法および手段によって満たされる。従属請求項は、好ましい実施形態に関する。数値によって境界が定められた値の範囲は、これらの境界を定める値を含むと理解すべきであることを、さらに理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｆｃ領域を有する抗体を用いて実施した脱グリコシル化実験の結果
【図２】Ｆｃ領域を有する抗体を用いて実施した脱グリコシル化実験の結果
【図３】天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する細胞傷害性アッセイの結果
【図４】天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する混合リンパ球反応（MLR; Mixed Lymphocyte Reaction）実験の結果
【図５ａ】種々の免疫調節剤を比較する別の混合リンパ球反応（MLR）実験の結果
【図５ｂ】図５ａに示される実験の分析
【図６】天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する細胞傷害性アッセイの結果
【図７】Ｔ１ｈおよびリツキシマブを比較するＣＤＣアッセイの結果
【図８】プラズモン共鳴を用いた、ＦｃγＲＩＩＩａへのＴ１ｈの結合曲線の検出。ＦｃγＲＩＩＩａに対するＴ１ｈ抗体の結合曲線を示す
【図９】プラズモン共鳴を用いた、ＦｃγＲＩＩＩａへのＴ１ｈの結合曲線の検出。ＦｃγＲＩＩＩａに対するＢｍａｂ−６００抗体の結合曲線を示す
【図１０】プラズモン共鳴を用いた、ＦｃγＲＩＩＩａへのＴ１ｈの結合曲線の検出。ＦｃγＲＩＩＩａに対する脱グリコシル化Ｔ１ｈ抗体の結合曲線を示す
【図１１】マンガン（Mn）の添加によって引き起こされる非フコシル化
【図１２】マンガン（Mn）の添加による、Ｇ０、Ｍａｎ５および非フコシル化レベルにおける増加
【図１３】銅濃度は、フコシル化に対して影響しない
【図１４】免疫グロブリンＧの略図
【図１５】Ｎ−グリカン構造の命名法
【発明を実施するための形態】
【００１９】
開示の概要
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記載されたデバイスの特定の構成部品または記載された方法のプロセス工程に限定されないが、これは、このようなデバイスおよび方法は変更が可能なためであることを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定を意図しないことも理解すべきである。明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単数形および／または複数形の指示対象を含むことに留意すべきである。数値によって境界が定められるパラメーター範囲が与えられる場合、これらの範囲は、これらの上下限値(limitation values)を含むとみなされることをさらに理解すべきである。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、培地中のマンガンまたはマンガンイオンの総濃度が制御される、真核生物および／または真核生物タンパク質発現系におけるフコシル化を改変するための方法またはプロセスが提供される。
【００２１】
糖タンパク質のフコシル化は、フコシルトランスフェラーゼ（FUT）によって達成される。フコシルトランスフェラーゼは、Ｌ−フコース糖を、ＧＤＰ−フコース（グアノシン二リン酸−フコース）ドナー基質からアクセプター基質に移動させる酵素である。このアクセプター基質は別の糖であってもよく、例えば、Ｎ−結合型グリコシル化の場合にはコアＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）糖へのフコースの移動、またはＯ−フコシルトランスフェラーゼによって産生されるＯ−結合型グリコシル化の場合にはタンパク質へのフコースの移動などがある。哺乳動物には種々のフコシルトランスフェラーゼが存在し、その大部分は、ゴルジ体に位置する。近年、Ｏ−フコシルトランスフェラーゼは、小胞体（ER）に局在化することが示された。哺乳動物フコシルトランスフェラーゼの例は、ＦＵＴ１；ＦＵＴ２；ＦＵＴ３；ＦＵＴ４；ＦＵＴ５；ＦＵＴ６；ＦＵＴ７；ＦＵＴ８；ＦＵＴ９；ＦＵＴ１０およびＦＵＴ１１である。
【００２２】
マンガンは、多くの酵素系に関与する必須微量元素であるが、その役割はいまだ完全には理解されていない。マンガンは、エネルギー産生に必須の酵素において補因子として作用し、グルコースの代謝、肝臓におけるグリコーゲン貯蔵、タンパク質消化、ならびにコレステロールおよび脂肪酸の合成に関与する。マンガンは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の合成にも必須である。
【００２３】
マンガンは、神経系の成長および維持、骨および関節の発生および維持、雌性性ホルモンおよび甲状腺ホルモンの機能に必須である。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD、MnSOD）は、その構造中にマンガンを含む抗酸化酵素である。
【００２４】
細胞外液または真核生物には、マンガンは事実上存在しないが、哺乳動物では、マンガンの細胞内濃度は、０．０１０ピコグラム／細胞〜０．１０ピコグラム／細胞の範囲である。
【００２５】
しかし、本発明者らは、驚くべきことに、マンガンの濃度が、糖タンパク質のフコシル化レベルに対して直接的な影響を有することを見出した。
【００２６】
従って、本発明は、プロセス中に培地およびフィード中のマンガンまたはマンガンイオンの総濃度を変更することによる、グリコシル化タンパク質のフコース含量の改変を提供する。
【００２７】
好ましくは、この方法またはプロセスは、フコシル化を減少させるための方法またはプロセスである。このような方法またはプロセスにおいて、上昇した総濃度のマンガンまたはマンガンイオンの存在下で、タンパク質の発現および／または翻訳後修飾が実施される。
【００２８】
驚くべきことに、本発明者らは、このような条件下で、発現された糖タンパク質が、減少したフコシル化レベルを有することを見出した。さらに、本発明者らは、細胞の成長、生存度および産生されたタンパク質の力価が、マンガンまたはマンガンイオン濃度の上昇によってはもたらされないことを見出した。
【００２９】
さらに、本発明者らは、上昇した総濃度のマンガンまたはマンガンイオンの存在下で、グリコシル化パターンの他の特性、即ちＧ０およびＭａｎ５が増加することを見出した。
【００３０】
本明細書において、用語「フコシル化レベル」とは、グリカンがフコースを保有する糖タンパク質の総量を指す。同様に、用語「非フコシル化（afucosylation）レベル」および「非フコシル化％」とは、糖タンパク質のグリカン中にフコースを有さない糖タンパク質の百分率を指す。
【００３１】
本発明に係る方法またはプロセスの好ましい一実施形態では、マンガンまたはマンガンイオンの上昇した濃度は、０．０５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の範囲である。
【００３２】
好ましくは、マンガンまたはマンガンイオンの上昇した濃度は、０．０５；０．１；０．１５；０．２；０．２５；０．３；０．３５；０．４；０．４５；０．５；０．５５；０．６；０．６５；０．７；０．７５；０．８；０．８５；０．９；０．９５；１；１．０５；１．１；１．１５；１．２；１．２５；１．３；１．３５；１．４；１．４５；１．５；１．５５；１．６；１．６５；１．７；１．７５；１．８；１．８５；１．９；１．９５；２；２．０５；２．１；２．１５；２．２；２．２５；２．３；２．３５；２．４；２．４５；２．５；２．５５；２．６；２．６５；２．７；２．７５；２．８；２．８５；２．９；２．９５；３；３．０５；３．１；３．１５；３．２；３．２５；３．３；３．３５；３．４；３．４５；３．５；３．５５；３．６；３．６５；３．７；３．７５；３．８；３．８５；３．９；３．９５；４；４．０５；４．１；４．１５；４．２；４．２５；４．３；４．３５；４．４；４．４５；４．５；４．５５；４．６；４．６５；４．７；４．７５；４．８；４．８５；４．９；４．９５；５；５．０５；５．１；５．１５；５．２；５．２５；５．３；５．３５；５．４；５．４５；５．５；５．５５；５．６；５．６５；５．７；５．７５；５．８；５．８５；５．９；５．９５；６；６．０５；６．１；６．１５；６．２；６．２５；６．３；６．３５；６．４；６．４５；６．５；６．５５；６．６；６．６５；６．７；６．７５；６．８；６．８５；６．９；６．９５；７；７．０５；７．１；７．１５；７．２；７．２５；７．３；７．３５；７．４；７．４５；７．５；７．５５；７．６；７．６５；７．７；７．７５；７．８；７．８５；７．９；７．９５；８；８．０５；８．１；８．１５；８．２；８．２５；８．３；８．３５；８．４；８．４５；８．５；８．５５；８．６；８．６５；８．７；８．７５；８．８；８．８５；８．９；８．９５；９；９．０５；９．１；９．１５；９．２；９．２５；９．３；９．３５；９．４；９．４５；９．５；９．５５；９．６；９．６５；９．７；９．７５；９．８；９．８５；９．９；９．９５；または１０ｍＭである。
【００３３】
これらの濃度は、タンパク質の発現および／または翻訳後修飾が起こる培地中の総濃度を指す。これは、例えば、フィード溶液が、顕著により高い濃度のマンガンまたはマンガンイオンを有し得ることを意味する。
【００３４】
好ましくは、マンガンの濃度は、培養培地および／またはフィード培地に、マンガンを添加することによって達成される。
【００３５】
同様に好ましくは、このマンガン濃度は、タンパク質の発現および／または翻訳後修飾の間に増加または減少される。
【００３６】
本発明に係る方法またはプロセスの好ましい一実施形態では、タンパク質の発現および／または翻訳後修飾は、
・昆虫細胞
・真菌細胞
・酵母細胞
・原生動物細胞、および／または
・哺乳動物細胞
からなる群より選択されるタンパク質発現系において実施される。
【００３７】
好ましくは、これらの哺乳動物細胞は、マウス細胞（例えば、NS0）、ハムスター細胞（例えば、CHOまたはBHK）および／またはヒト細胞（例えば、PER.C6）からなる群より選択される。
【００３８】
好ましくは、タンパク質は糖タンパク質である。より好ましくは、タンパク質は組換えタンパク質である。
【００３９】
本発明に係る方法またはプロセスの好ましい一実施形態では、タンパク質は免疫リガンド（immunoligand）である。
【００４０】
用語「免疫リガンド」は、本明細書において、十分な程度の感受性および／または特異性で別の生物学的実体に結合する能力を有する実体を意味するものとして使用される。
【００４１】
本発明に係る方法またはプロセスの別の好ましい一実施形態では、免疫リガンドは、
・モノクローナル抗体（マウス、キメラ、ヒト化、ヒト）またはその誘導体
・新しい抗体フォーマット
・標的結合部分、例えば受容体断片と融合した免疫グロブリンＦｃ領域からなる融合ペプチド
からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００４２】
上に列挙した免疫リガンドは、好ましくは、Ｆｃ領域、あるいはグリコシル化および／またはＦｃ受容体への結合が可能な別のドメイン、例えば、ＦｃγＲＩ（CD64）、ＦｃγＲＩＩＡ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＢ（CD32）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（CD16a）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（CD16b）を含む。
【００４３】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体（mAb）」とは、同種抗体集団、即ち、免疫グロブリン全体、またはその断片もしくは誘導体からなる同種集団を有する、抗体組成物を指すものとする。特に好ましくは、このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、あるいはそれらの断片もしくは誘導体からなる群より選択される。
【００４４】
本明細書において、用語「誘導体」とは、共通する抗体のコンセプトとは構造的に異なるが、ある程度の構造的関係性を有しているタンパク質構築物を指す。
【００４５】
キメラ、ヒト化および／またはヒトｍＡｂの産生および／または選択のための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＵＳ６３３１４１５は、キメラ抗体の産生を記載し、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０は、ＣＤＲ移植技術を記載し、ＣｅｌｌｔｅｃｈによるＵＳ５８５９２０５は、ヒト化抗体の産生を記載している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体ライブラリーは、とりわけ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによるＵＳ６３０００６４およびＭＲＣ／Ｓｃｒｉｐｐｓ／ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＵＳ６２４８５１６に開示されている。ファージディスプレイ技術は、例えば、ＤｙａｘによるＵＳ５２２３４０９に開示されている。トランスジェニック哺乳動物プラットフォームは、例えば、ＴａｃｏｎｉｃＡｒｔｅｍｉｓによるＵＳ２００３０２０４８６２１に記載されている。
【００４６】
用語「新しい抗体フォーマット」は、例えば、二重特異性または三重特異性抗体構築物、ダイアボディ（Diabody）、ラクダ抗体、ドメイン抗体、ｓｃＦｖからなる２つの鎖を有する二価ホモダイマー、ＩｇＡ（J鎖によって接続された２つのIgG構造および分泌成分）、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク＋非新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含むダイマー化構築物、および抗体コンジュゲート（例えば、毒素、サイトカイン、放射性同位体または標識に連結された抗体または断片または誘導体）を包含する。しかし、このリストに限定されない。
【００４７】
さらに、この用語は、免疫毒素、即ち、抗体またはその断片、および細胞傷害性因子、放射活性因子またはアポトーシス因子からなるヘテロダイマー分子もまた包含する。このような型のフォーマットは、例えば、Ｐｈｉｌｏｇｅｎによって開発されているか（例えば、ヒトTNFに融合した抗EDBヒト抗体L19）、または細胞傷害性メルタンシン（Mertansine）（DM1）に連結されたトラスツズマブからなるトラスツズマブエムタンシン（T-DM1）である。
【００４８】
用語「融合ペプチド」または「融合タンパク質」タンパク質は、例えば、免疫グロブリンＦｃ部分＋標的結合部分（いわゆる-cept分子）からなるタンパク質に関する。
【００４９】
本発明に係る方法またはプロセスの別の好ましい一実施形態では、この免疫リガンドは、上昇した濃度のマンガンまたはマンガンイオンの非存在下で発現された免疫リガンドと比較して、フコシル化の程度が低減している。
【００５０】
好ましくは、フコシル化の程度は、当該分野に従う方法によって決定される。このような方法は、とりわけ、抗体を脱グリコシル化するためのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGase F）による消化（さらなる詳細については、図１の説明を参照のこと）、および単離されたグリカンのその後の収集を含む。収集されたグリカンは、アントラニル酸（anthranicilic acid）で標識され、次いで、ＮＰ  ＨＰＬＣによって分析される。この方法の完全な詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｕｍｕｌａ（2012）に開示されている。
【００５１】
用語「上昇した濃度のマンガンまたはマンガンイオンの非存在」は、プロセスの間またはプロセスの準備において、マンガンまたはマンガンイオンが積極的に導入されていないことを意味する。これは、水などの媒体中に天然に生じる微量のマンガンがなおも存在し得ることを排除しない。
【００５２】
本発明に係る方法またはプロセスの好ましい一実施形態では、この免疫リガンドは、（ｉ）上昇した濃度のマンガンもしくはマンガンイオンの非存在下で発現された免疫リガンド、または（ｉｉ）よりフコシル化の程度が高い免疫リガンドと比較して、増加したＡＤＣＣ活性を実証する。
【００５３】
用語「ＡＤＣＣ」は、その膜表面抗原に特異的抗体が結合している免疫系のエフェクター細胞が、標的細胞を能動的に溶解させる、細胞媒介性免疫防御の機構に関する。これは、体液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限および封じ込めるように作用できる機構の１つである。古典的なＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（NK）細胞によって媒介され、マクロファージ、好中球および好酸球もまた、ＡＤＣＣを媒介できる。ＡＤＣＣは、前の抗体応答へのその依存に起因して、適応免疫応答の一部である。
【００５４】
好ましくは、このＡＤＣＣ活性は、当該分野に従う方法によって決定される。このような方法は、とりわけ、図３に示すような細胞傷害性アッセイを含む。
【００５５】
他の適切なアッセイには、クロム−５１［Ｃｒ５１］放出アッセイ、ユーロピウム［Ｅｕ］放出アッセイおよび硫黄−３５［Ｓ３５］放出アッセイが含まれる。通常、特定の表面曝露された抗原を発現する標識された標的細胞株は、その抗原に特異的な抗体と共にインキュベートされる。洗浄後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞は、抗体標識された標的細胞と共に同時インキュベートされる。標的細胞の溶解は、シンチレーションカウンターまたは分光光度法によって、細胞内標識の放出によって引き続いて測定される。共役生物発光法ａＣｅｌｌａ  ＴＯＸは、現在、ＡＤＣＣおよび他の細胞傷害性の評価のために、広く使用されている。この技術は、標的細胞中に天然に存在する酵素の放出を測定するので、標識化工程は必要とされず、放射活性剤は使用されない。
【００５６】
好ましくは、この免疫リガンドは、細胞媒介性免疫防御に関与する１つまたは複数の細胞表面抗原を標的化する。
【００５７】
好ましくは、これらの細胞表面抗原は、シクロフィリンＣ、補体因子Ｉ、ＣＤ６、ＣＤ５、ウシＷＣ−１およびＭ１３０からなる群より選択される。
【００５８】
ＣＤ６は、ヒトＴ細胞、およびＢ細胞のサブセットによって、ならびに一部のＢ細胞慢性リンパ球性白血病およびニューロンによって優勢に発現される重要な細胞表面タンパク質である（Aruffoら1991、Kantounら1981、Mayerら1990）。ＣＤ６は、Ｉ型マクロファージのスカベンジャー受容体システインリッチドメイン（SRCR）に対して相同な少なくとも１つのドメインを有することを特徴とする、タンパク質の大きいファミリーのメンバーである（Matsumotoら1991およびResnickら1994）。このファミリーの他のメンバーには、ＣＤ５（Jonesら、1986）シクロフィリンＣ（Friedmanら1993）、活性化された補体タンパク質Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合する補体因子Ｉ（Goldbergerら、J. Biol. Chem. 1987, 262: 10065）、τ／δT細胞によって発現されるウシＷＣ−１（Wijingaardら1992）ならびにマクロファージ活性化マーカーのＭ１３０（Lawら1993）が含まれる。
【００５９】
他の好ましい表面抗原は、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／νおよび膜結合型ＴＮＦを包含する。
【００６０】
本発明に係る方法またはプロセスの好ましい一実施形態では、この免疫リガンドはイトリズマブである。
【００６１】
イトリズマブ（INN、商品名Alzumab（登録商標））は、Ｂｉｏｃｏｎによって開発された「ファーストインクラス」ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。これは、Ｔ細胞の同時刺激、接着および成熟化に関与する汎Ｔ細胞マーカーＣＤ６を選択的に標的化する。イトリズマブは、ＣＤ６と結合することによって、Ｔ細胞活性化を下方調節し、炎症促進性サイトカインの合成における低減を引き起こし、おそらくは、炎症の部位におけるＴ細胞浸潤を低減させることによって重要な役割を果たす。イトリズマブの二重盲検プラセボ対照第ＩＩＩ相処置−Ｐｌａｑ研究は、プラセボと比較して、中程度〜重症の乾癬を有する患者における１２週間の処置後に、ＰＡＳＩ−７５（乾癬面積および重症度指数（Psoriasis Area and Severity Index））スコアにおける顕著な改善の、事前に指定した主要エンドポイントを首尾よく満たした。Ｂｉｏｃｏｎは、２０１３年１月にＤｒｕｇｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ（DCGI）からこの薬物についての販売承認を受け、２０１３年８月にインド国内での販売を開始した（Jayaraman、2013）。
【００６２】
イトリズマブは、マウス由来ＮＳ０細胞株から産生され（本明細書では「T1h」と呼ぶ）、およびまたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株から産生される（本明細書では「Bmab-600」と呼ぶ）。翻訳後修飾、特に非フコシル化パターンが細胞株および培養条件によって変動するので、Ｂｍａｂ−６００およびＴ１ｈのＦｃ部分は、異なる親和性でＦｃγＲＩＩＩａに結合する。
【００６３】
イトリズマブは、例えば、マウス由来ＮＳ０細胞株から産生され得（本明細書では「T1h」と呼ぶ）、およびまたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株から産生され得る（本明細書では「Bmab-600」と呼ぶ）。翻訳後修飾、特に非フコシル化パターンが細胞株および培養条件によって変動するので、Ｂｍａｂ−６００およびＴ１ｈのＦｃ部分は、異なる親和性でＦｃγＲＩＩＩａに結合する。
【００６４】
本発明の別の一態様によれば、糖タンパク質が提供され、この糖タンパク質は、本発明の方法またはプロセスのいずれかに従う方法またはプロセスを用いて産生される。
【００６５】
好ましくは、この糖タンパク質は組換えタンパク質である。より好ましくは、この糖タンパク質は、免疫リガンド、好ましくは抗体である。この糖タンパク質は、そのグリコシル化パターンにおいて減少したフコース含量を有することが、特に好ましい。
【００６６】
好ましくは、糖タンパク質またはＦｃ領域などのそのサブドメインは、およそ３５％の非フコシル化レベルを有する。
【００６７】
好ましい一実施形態では、糖タンパク質は、増加したＡＤＣＣを有する。好ましくは、糖タンパク質はイトリズマブである。
【００６８】
別の好ましい一実施形態では、糖タンパク質は、ＣＤ２５およびＣＤ４について陽性である細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの低減をもたらす。
【００６９】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明に係る抗ＣＤ６抗体の使用が、表面抗原ＣＤ２５およびＣＤ４について陽性である細胞（図５Ｂおよび説明を参照のこと）、特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の低減を導くことを示した。
【００７０】
用語「細胞の低減」とは、本明細書において、（ｉ）増殖の阻害、（ｉｉ）枯渇、（ｉｉｉ）アポトーシスの誘導または（ｉｖ）このような細胞の低減を導く他の機構を指す。
【００７１】
本発明の別の一態様によれば、ヒトまたは動物患者の処置のための医薬の製造のための、上に示した糖タンパク質の使用が、提供される。同様に、ヒトまたは動物患者の処置のための、上に示した糖タンパク質の使用が、提供される。
【００７２】
このような使用の好ましい一実施形態では、ヒトまたは動物患者は、
・腫瘍、リンパ腫および白血病、特にＢ細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）、特にＴ細胞白血病を含む、新生物疾患
・関節リウマチ、乾癬、クローン病、エリテマトーデスおよび／またはシェーグレン病を含む、自己免疫疾患
・多発性硬化症、および／またはパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病および／または筋萎縮性側索硬化症を含む、神経変性疾患、ならびに／あるいは
・感染性疾患
からなる群より選択される疾患に罹患している、またはその疾患を発症するリスクがあると診断されている。
【００７３】
好ましくは、このような使用は、移植を受けたヒトまたは動物におけるＧＶＨＤ（移植片対宿主病）などの有害反応の処置または予防に関する。このような移植には、臓器移植ならびに骨髄移植が含まれる。
【実施例】
【００７４】
実験および図／実施例
本発明を、図面および上述の記載中に詳細に説明および記載してきたが、このような説明および記載は、説明的または例示的とみなすべきであって、これらに限定されない。本発明は、開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他のバリエーションは、図面、開示および添付の特許請求の範囲の研究から、特許請求された発明を実践する際に、当業者によって理解され得およびもたらされ得る。特許請求の範囲において、単語「含む」は、他の要素または工程を排除せず、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を排除しない。特定の手段が、相互に異なる従属請求項において列挙されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが利益を得るために使用できないことを示すわけではない。特許請求の範囲中の任意の参照記号は、その範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００７５】
図１：Ｆｃ領域を有する抗体を用いて実施した脱グリコシル化実験の結果。
【００７６】
抗ＣＤ抗体イトリズマブ（T1hとも呼ぶ）は、イトリズマブ（５ｍｇ／ｍｌ）に対して１：１の比で、脱グリコシル化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ＝８．１）と共にインキュベートし、その後ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGase）酵素（１ｍｇ抗体について１０Ｕ）の２４時間のインキュベーションを行った。
【００７７】
３７℃で２４時間にわたってインキュベートした後、サンプル中等体積のＴ１ｈ緩衝液（ヒスチジントレハロース緩衝液）を添加し、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎチューブ（50kDカットオフフィルター）において遠心分離する。残留体積を、Ｔ１ｈ緩衝液を含む等体積中で再度再懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。脱グリコシル化Ａｂを、最終貯蔵チューブ中に貯蔵し、濃度を、Ｎａｎｏ  ｄｒｏｐによって推定する。脱グリコシル化（deglycoslation）を、ＣＥ−ＳＤＳ（Capillary Electrophoresis）によって確認する。次いで、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析を実施した。簡潔に述べると、ＨＵＴ７８細胞（T細胞株）を、抗ＣＤ６抗体Ｔ１ｈで標識し、または脱グリコシル化Ｔ１ｈ抗体を、上記のように産生する。
【００７８】
引き続いて、ＦＩＴＣで標識した二次抗Ｆｃ抗体を伴って、シグナルを観察する。図１は、Ｔｈ１のＦｃ領域の脱グリコシル化が、ＣＤ６発現細胞株に結合するその能力を損なわないことを示している。これらの結果を、プラズモン共鳴実験によってさらに確認した。
【００７９】
図２：Ｆｃ領域を有する抗体を用いて実施した脱グリコシル化実験の結果。
【００８０】
特に、この抗ＣＤ抗体イトリズマブを、上で議論したように脱グリコシル化した。次いで、活性化されたＴ細胞の増殖を阻害するその能力を、適切な増殖アッセイにおいて未改変Ｔ１ｈの能力と比較した。イトリズマブのものと同じＩｇＧ骨格を有するがＥＧＦＲに結合する抗体であるニモツズマブを、陰性対照として使用した。
【００８１】
簡潔に述べると、この抗体を、ｐＨ９．５の炭酸水素塩緩衝液を用いて、濃度範囲０〜１μｇ／ｍｌで無菌９６ウェルプレート上に一晩被覆した。洗浄後、正常な健康志願者由来の精製されたリンパ球を、これらのプレートに添加した。イトリズマブ８０〜１μｇ／ｍｌを添加し、培養物を４日間インキュベートした。ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅを添加して、増殖を測定した。未刺激細胞対照と比較した差の倍率を計算する。アイソタイプニモツズマブ抗体を、対照として使用した。プレート結合した抗ＣＤ３（使用した抗CD3は、キューバの分子免疫学センター（center for molecular immunology）で製造したOKT3クローンである）は、正常な健康志願者由来のナイーブＴ細胞（Ficollの密度勾配上で精製した、ヒトドナー由来の末梢血単核球（PBMC））の増殖を刺激する。
【００８２】
ニモツズマブ（８０μｇ／ｍｌ）は、Ｔ細胞増殖のいずれの阻害も示さず、未刺激細胞と比較して、細胞における約２．７５倍の増加を生じるが、天然Ｔ１ｈは、Ｔ細胞増殖の阻害を示す（８０μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌの範囲において３５〜２０％の阻害）。それとは対照的に、脱グリコシル化Ｔ１ｈの影響は、ニモツズマブの影響と類似である。これは、脱グリコシル化の際に、この抗体が、Ｔ細胞の増殖を阻害するその能力を喪失することを意味している。
【００８３】
図３：天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する細胞傷害性アッセイの結果。
【００８４】
凍結ＰＢＭＣを、ＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍＬの濃度）の存在下で１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で解凍し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。次の日、細胞を、ＩＬ−２を含まない培地中に再懸濁し、４〜５時間インキュベートした。９６ウェルプレートにおいて、１２，０００のＨｕｔ−７８細胞／５０μＬを、各ウェルに添加した。鋳型通りに３×濃縮薬物（１０マイクログラム／ｍｌにおける、天然T1h、脱グリコシル化T1hまたは抗CD3のいずれか）５０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２時間インキュベートした。ＰＢＭＣを、アッセイ培地中に再懸濁し、２４０，０００のＰＢＭＣ／５０μＬ／ウェルを添加して、１：２０の標的対エフェクター比を得た。これらのプレートを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２２時間インキュベートした。Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｇｌｏ  ５０μＬを、これらのプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。これらのプレートを、発光についてＳｐｅｃｔｒａｍａｘを使用して読み取り、細胞傷害性を決定した。
【００８５】
天然Ｔ１ｈは、Ｔ細胞を標的化する部分的枯渇化抗体である抗ＣＤ３と比較して、軽度ではあるが統計的に一貫した抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性を示すが、このＡＤＣＣ活性は、分子の脱グリコシル化に際して顕著に低減され、これは、Ｔ１ｈのエフェクター機能を示す。イトリズマブのＦａｂ２断片の使用もまた、脱グリコシル化分子と匹敵してＡＤＣＣ活性を低減させることができる。
【００８６】
図４：天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する混合リンパ球反応（MLR; Mixed Lymphocyte Reaction）実験の結果。
【００８７】
ＰＢＭＣの調製：血液３０ｍｌを、健康なドナーから収集した。ＰＢＭＣを、標準的なＦＩＣＯＬＬ密度勾配遠心分離によって単離した。
【００８８】
単球枯渇および設定
【００８９】
樹状細胞（DC）誘導アッセイ：これらの細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で２時間インキュベートした。単球を、プラスチック表面上に接着させた。非接着細胞（PBL）を、引き続いてフラスコから除去した。全てのフラスコを、１×ＰＢＳで１回洗浄した。ＤＣ培地（作製されたストック５０ｍｌ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）１０μｌ、およびアッセイ培地５０ｍｌ中IL−4  ５μｌ）２０ｍｌを、各フラスコに添加した。これらのフラスコを、ＣＯ２インキュベーター中で６日間維持した。
【００９０】
成長中の樹状細胞へのＬＰＳ処理：６日目に、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）を含むＤＣ培地を、各フラスコに添加し（フラスコ中のLPSの最終濃度は４ｕｇ／ｍｌである）、ＣＯ２インキュベーター中に戻して４０〜４８時間維持した。
【００９１】
ＤＣの調製：ＬＰＳ処理後、細胞懸濁物（DC）を、２つのフラスコから収集した。各フラスコを、１×ＰＢＳで１回洗浄した。細胞懸濁物を、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、培地３ｍｌ中で再構成した。ＬＰＳ処理したＤＣを計数し、アッセイ要求に従って培地中で再構成した。
【００９２】
ＰＢＬの調製：既報のプロトコールと同じプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ分離を、別の健康な個体から血液を収集した後に遂行した。単球枯渇後、非接着末梢血リンパ球（PBL）を収集し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、培地５ｍｌ中で再構成した。ＰＢＬを計数し、１．０×１０６細胞／ｍｌになるように再構成した。
【００９３】
樹状細胞（DC）へのＳＥＢ処理：ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（SEB）ストックの濃度は、１ｍｇ／ｍｌである。このストックから、ＳＥＢ３μｌを、培地３ｍｌ中に溶かし、ＳＥＢの１ｍｇ／ｍｌ作業溶液を得た。規格化されたプロトコールに従って、０．０６×１０６のＤＣを、ＳＥＢ０．６ｕｇで処理する。ストック０．１×１０６細胞／ｍｌ（LPS処理した成熟DC）を製造する。これから、細胞懸濁物６００μｌを、アッセイ培地２．４ｍｌ中に溶かす（細胞懸濁物の総体積は、０．０２×１０６細胞／ｍｌを含む３ｍｌである）。これを、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、ＳＥＢ（１ｕｇ／ｍｌ）６００ｍｌを、ペレットに添加する。これを、ＣＯ２インキュベーターの内側で３７℃で２０分間インキュベートする。過剰な培地（２ｍｌ）を、インキュベーション後にチューブに添加し、１５００ｒｐｍで５分間洗浄する。上清を廃棄し、細胞を、培地３ｍｌで再度洗浄する。最後に、ペレットを、アッセイ培地３ｍｌ中に溶かす。
【００９４】
ＰＢＬへのマイトマイシン（Mytomycin）Ｃ処理：２５μｇ／ｍｌマイトマイシン溶液を、１ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンストックから製造する。０．５×１０６のＰＢＬを、３７℃で、ＣＯ２インキュベーターの内側で３０分間にわたって、２５μｇ／ｍｌマイトマイシン５００μｌで処理する。過剰の培地（２ｍｌ）を、インキュベーション後にそれに添加し、細胞を、５つの培地について１５００ｒｐｍで洗浄する。上清を廃棄し、細胞を、培地３ｍｌで再度洗浄する。
【００９５】
ＭＬＲアッセイ−増殖の阻害：ＭＬＲアッセイを、ＤＣ：ＰＢＬ＝１：５０比で遂行する。使用する陰性対照は、ニモツズマブである。天然Ｔ１ｈを、完全に機能的なＦｃ領域を欠くそのＦａｂ２バージョンに対して試験した。６日後、プレートを、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｇｅｎ５プレートリーダーを使用して、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅを用いて読み取った。
【００９６】
インタクトな抗体は、この反応において誘導されたＴ細胞の増殖を阻害できるが、異なる特異性を有する陰性対照ニモツズマブは阻害できない。Ｆｃ領域を有さないＴ１ｈは、Ｔ細胞増殖を阻害することもできず、これは、Ｆａｂと併せたグリコシル化Ｆｃ領域が、このアッセイにおけるＴ１ｈの阻害能力にとって重要であることを示唆している。類似の効果が、脱グリコシル化Ｔ１ｈの使用によっても観察されており、それによって、Ｔ１ｈのエフェクター機能にとってのグリコシル化の必要が確認される。
【００９７】
図５ａ：種々の免疫調節剤を比較する別の混合リンパ球反応（MLR）実験の結果。
【００９８】
プロトコールは、図４と同一である。これは、混合リンパ球反応である。４つの濃度の天然Ｔ１ｈに加えて、他の免疫抑制剤および免疫調節剤を使用した、即ち、ピメクロリムス（Pim）、アバタセプト（Aba）およびダクリズマブ（Dac）を、このアッセイの陽性対照として含める。ニモツズマブ（hR3）を、陰性対照として使用する。
【００９９】
Ｔ１ｈは、アイソタイプ抗体、ヒトＥＧＦＲに結合するニモツズマブと比較して、混合リンパ球反応において誘導されたＴ細胞の増殖を低減させることが可能ということがわかった。Ｔ１ｈによって誘導される低減倍数は、アバタセプト（CTLA4-IgG1Fc）、ダクリズマブ（抗CD25）およびピメクロリムス（小分子、IL2阻害剤）によって誘導されるものに匹敵する。
【０１００】
図５ｂ：図５ａに示される実験の分析。
【０１０１】
この分析は、混合リンパ球反応における１４４時間（６日間）後の、培養物由来の細胞に関する。Ｂ−−、Ｂ＋＋、Ｂ＋−およびＢ−＋は、象限である。ここで、ＭＬＲにおける培養物中の細胞を、６日後に評価した。Ｔ１ｈの阻害能力は、他の抗体に十分匹敵するが、経路は、Ｔ１ｈとは異なり、これは、他の分子とは異なって、ＣＤ４／ＣＤ２５活性化Ｔ細胞集団における顕著な減少があるからである。Ｔ１ｈは、ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞における低減を示す。これは、Ｔ細胞のサブセットの選択的枯渇を示す。従って、図５Ａに示されるように、ＭＬＲにおけるＴ１ｈによる阻害は、ダクリズマブ、アバタセプトおよびピメクロリムスの阻害に匹敵するが、Ｔ１ｈのみが、ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞における減少を示す。
【０１０２】
図６：天然抗体および脱グリコシル化抗体を比較する細胞傷害性アッセイの結果。
【０１０３】
図３と同じアッセイを使用して、陽性対照抗ＣＤ３と比較して、異なる非フコシル化含量を有する抗体を評価した。示されるデータは、ｎ＝４の独立した実験からの編集である。
【０１０４】
非フコシル化は、本明細書の他の場所に記載されるように起きた（例えば、図１１の説明を参照のこと）。イトリズマブのＦｃ領域の増加した非フコシル化は、陽性対照抗体（抗ヒトCD3）に対して、抗体によって示されるＡＤＣＣ活性における線形の増加を示す。これは、非フコシル化Ｆｃグリカン含量を単に増加させることによって、イトリズマブがより細胞傷害性になる能力を実証している。例えば、抗ＣＤ３のものと比較して、２０％から４０％超までＡＤＣＣを増強するためには、抗体における非フコシル化含量は、１０％超でなければならない。
【０１０５】
このような増加は、以下で議論するｂｉａｃｏｒｅのデータに示されるように、ＦｃγＲＩＩＩへのより良い結合によって引き起こされ得る（ここで、Bmab 600は、T1hと比較してより良い親和性で結合する）。従って、抗体における非フコシル化種を増加させることは、ＦｃγＲＩＩＩへのより良い結合を引き起こし得、これは、より良いＡＤＣＣの機能的活性へと変わる。
【０１０６】
図７：Ｔ１ｈおよびリツキシマブを比較するＣＤＣアッセイの結果
【０１０７】
ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｈｕｔ７８（ATCC（登録商標）TIB-161（商標））を使用して、Ｔ１ｈのＣＤＣ活性を評価した。１×１０４の細胞を、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬにおけるそれぞれの薬物希釈と共に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２０分間インキュベートした。プールした正常ヒト血清を、１：１０の最終濃度で添加し、細胞を、３７℃で２時間インキュベートした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Invitrogen）を添加し、細胞を、３７℃で２０〜２２時間インキュベートした。細胞による色素の取り込みと、その後のその低減とを、５３０／５９０ｎｍにおける蛍光として読み取る。
【０１０８】
Ｂ細胞株（Daudi）上のＣＤ２０受容体を標的化し補体依存性細胞傷害（CDC）を引き起こす抗ＣＤ２０、リツキシマブを、このアッセイにおける陽性対照として使用し、ＣＤＣを生じる血清成分がインタクトであったことを示した。
【０１０９】
Ｔ１ｈは、ＣＤＣ活性を示さない。イトリズマブの非フコシル化種における増加は、分子のＣＤＣ活性を増加させず、これは、ＡＤＣＣエフェクター機能のみが、非フコシル化における増加と共に増強されることを結論付ける。
【０１１０】
【表１】
0006480926.tif 000002
【０１１１】
グリコシル化パターンの分析は、標準的な方法を用いて行った。簡潔に述べると、抗体を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGase F）で消化して、抗体を脱グリコシル化し（さらなる詳細については、図１の説明を参照のこと）、単離されたグリカンを収集した。収集したグリカンを、アントラニル酸で標識し、次いで、ＮＰ  ＨＰＬＣによって分析した。この方法の完全な詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｕｍｕｌａ（2012）に開示されている。
【０１１２】
この表では、以下の略号を使用する：Ｇ０＝ガラクトースなし、Ｇ１＝１個の末端ガラクトース残基、Ｇ２＝２個の末端ガラクトース残基、ＧＮ＝Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＧｌｃＮａｃ、Ｆ＝フコース、Ｍａｎ５＝５個のマンノース残基、Ｍａｎ６＝６個のマンノース残基、およびＳ＝シアル酸。
【０１１３】
本明細書に示される実験の過程において決定されたグリコシル化パターンの解説、および使用される命名法を、図１５に提供する。
【０１１４】
図８〜１０：プラズモン共鳴を用いた、ＦｃγＲＩＩＩａへのＴ１ｈの結合曲線の検出
【０１１５】
ＢＩＡｃｏｒｅは、センサー表面近傍の屈折率における表面プラズモン共鳴ベースの変化における差異を検出する分析デバイスである。Ｆｃ受容体リガンドに対する抗体の親和性定数を決定するこの方法は、広く使用されてきた。相互作用を検出するために、１つの分子（リガンド）を、センサー表面上に固定化する。その結合パートナー（分析物）を、フローセルを介して、また連続フロー下で、水性溶液（サンプル緩衝液）中に注入する。分析物がリガンドに結合すると、表面上でのタンパク質の蓄積は、屈折率における増加を生じ、これを時間に対してプロットして、センサーグラムを得る。会合（Ka）、解離速度定数（Kd）および平衡解離定数（KD）を、センサーグラムの分析から決定する。
【０１１６】
ＦｃγＲＩＩＩａは、中間体親和性受容体とみなされる。これは、モノマー性ＩｇＧに可変的に結合でき、より低い親和性のＦｃガンマ受容体よりも、ＩｇＧに対する高い親和性を有するようである。これらは、血液細胞のＮＫ細胞および単球上で発現される。
【０１１７】
翻訳後修飾、特に非フコシル化パターンは、細胞株および培養条件によって変動するので、Ｂｍａｂ−６００およびＴ１ｈのＦｃ部分は、異なる親和性でＦｃγＲＩＩＩａに結合する。本発明者らは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器において、ＦｃγＲＩＩＩａに対するこれら２つの産物の結合親和性を評価した。Ｂｍａｂ−６００の結合親和性結果は、Ｔ１ｈと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する結合においてより高い親和性を示す。以下のサンプルを、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体で固定化された表面上で分析した：
１．Ｔ１ｈ抗体
２．Ｂｍａｂ−６００抗体
３．脱グリコシル化Ｔ１ｈ抗体
【０１１８】
各サンプルを２回分析し、平均ＫＤ（μΜ）値を報告し、互いに対して比較した。図８は、ＦｃγＲＩＩＩａに対するＴ１ｈ抗体の結合曲線を示し、図９は、ＦｃγＲＩＩＩａに対するＢｍａｂ−６００抗体の結合曲線を示し、図１０は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する脱グリコシル化Ｔ１ｈ抗体の結合曲線を示す。
【０１１９】
この方法は、高感度であり、Ｂｍａｂ−６００およびＴ１ｈの別個に非フコシル化されたサンプルにおいて固有に存在している非フコシル化差異間の差異を捉えることができた。データは、非フコシル化レベルが増加する場合に、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性値が比例して減少する（より高い親和性を意味する）こともまた示している。この方法の特異性は、結合相互作用が観察されなかった、Ｔ１ｈの脱グリコシル化サンプルを分析することによっても実証された。
【０１２０】
【表２】
0006480926.tif 000003
【０１２１】
【表３】
0006480926.tif 000004
【０１２２】
【表４】
0006480926.tif 000005
【０１２３】
【表５】
0006480926.tif 000006
【０１２４】
図１１：マンガン（Mn）の添加によって引き起こされる非フコシル化
【０１２５】
培地濃度（０．００５μΜ）よりも高い濃度でのＭｎの添加を、Ｔ１ｈモノクローナル抗体を産生するＣＨＯ−Ｓ細胞株について試験した。この試行を、８０万〜９０万細胞／ｍｌの初期細胞計数で開始した。グルコースおよびアミノ酸の規則的な供給を、細胞の栄養要求を満たすために、このプロセスの間に実施した。周期的サンプルを採取して、細胞成長、生存度およびＩｇＧ力価プロファイルをチェックした。ブロスを、培養の最後に収穫し、本明細書の他の場所に記載したように、グリコシル化プロファイルについて分析した。
【０１２６】
この試行を、２セット行った。第１のセットは、振盪フラスコにおいて実施し、第２のセットは、５０Ｌバイオリアクタにおいて遂行した。マンガンを、実行の間、特定の間隔での供給を介して、培養培地中に添加した。
【０１２７】
図１１は、供給を介した、培養培地におけるマンガンの添加による、非フコシル化レベルにおける増加を示す。これらの非フコシル化プロファイルは、０．１ｍＭ、０．２ｍＭおよび０．２５ｍＭの場合には、１０日目のサンプルに対応し；０．０７５ｍＭおよび０．２３ｍＭの場合には、１１日目のサンプルに対応する。これらの結果を、以下の表にまとめる：
【０１２８】
【表６】
0006480926.tif 000007
【０１２９】
【表７】
0006480926.tif 000008
【０１３０】
上記実験に基づいて、非フコシル化％における増加が、総マンガン濃度における増加と共に観察された。細胞成長、生存度およびＩｇＧ力価プロファイルは、Ｍｎ添加によって影響を受けなかった。
【０１３１】
図１２：マンガン（Mn）の添加による、Ｇ０、Ｍａｎ５および非フコシル化レベルにおける増加
【０１３２】
０．００２５μΜ〜０．５ｍＭの範囲のマンガンの影響を、培養培地中の濃度を変更することによって試験した。供給を介したマンガン添加は行わなかった。この試行を、振盪フラスコにおいて実施し、サンプルを、８日目に、グリコシル化プロファイルについて分析した。マンガン濃度における増加に伴う、Ｇ０、Ｍａｎ５および非フコシル化レベルにおける漸進的増加が観察できた。
【０１３３】
図１３：銅濃度は、フコシル化に対して影響しない。
【０１３４】
他の二価カチオンの影響を評価するために、Ｃｕは、グリコシル化経路における補因子でもあったので（酵素シアリルトランスフェラーゼについて）、Ｃｕをこの研究のために選択した。０．０１μＭ〜２００μＭの範囲の、培養培地中の異なる濃度の銅を、振盪フラスコにおいて試験した。図３に示すように、値（G0、Man5および非フコシル化）のいずれにおいても、増加／影響は観察されなかった。これは、銅イオンが、タンパク質における非フコシル化レベルに影響を与えないことを立証している。
【０１３５】
図１４：免疫グロブリンＧの略図
【０１３６】
図１４は、免疫グロブリンＧ（IgG）の略図を示す。ＩｇＧは、２つの同一の軽鎖（各々、２つのドメインVLおよびVHから構成される）および２つの同一の重鎖（各々、４つのドメインVH、CH1、CH2およびCH3から構成される）から構成される。抗原結合表面は、重鎖および軽鎖の可変ドメインによって形成され、エフェクター機能、例えば、補体活性化および細胞傷害性細胞の結合は、抗体のＶｃ領域によって媒介される。
【０１３７】
図１５：Ｎ−グリカン構造の命名法
【０１３８】
図１５は、異なるＮ−グリカンの概観を示す。一般に、用語「Ｎ−グリコシル化」とは、アミノ酸残基アスパラギン（N）のグリコシル化を指す。ここで、オリゴ糖鎖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ中に存在するアスパラギン残基に結合され、式中、Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る。
【０１３９】
本明細書に示される実験から、以下が明確に実証される。
ａ）糖タンパク質のフコース含量は、タンパク質発現プロセスにおいて培地および供給中のマンガンまたはマンガンイオンの総濃度を変更することによって操作が可能である、
ｂ）マンガンまたはマンガンイオンの総濃度を増加させることは、糖タンパク質のグリコシル化パターンにおいて増加した非フコシル化または減少したフコース含量を導く、
ｃ）Ｆｃ領域を有する抗体などの免疫リガンドでは、上昇した濃度のマンガンまたはマンガンイオンの存在下でのタンパク質発現は、（ｉ）より高い程度の非フコシル化および（ｉｉ）増加したＡＤＣＣを導く、
ｄ）これらの免疫リガンドでは、非フコシル化の程度を増加させることは、増加したＣＤＣを導かない、
ｅ）対照的に、Ｆｃ領域を有する抗体などの免疫リガンドの脱グリコシル化は、増加したＡＤＣＣを導かない、
ｆ）非フコシル化のほか、Ｆｃ領域を有する抗体などの免疫リガンドの脱グリコシル化は、特に、機能的活性が、エフェクター機能および／またはＡＤＣＣなどの活性に関連する場合には、このような免疫リガンドのそのような機能的活性の喪失を導き得る。
【０１４０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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