(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
0006480258.tif 000018
で表される、化合物又はその塩。
【請求項２】
式２(a)：
0006480258.tif 000019
、又は式２(b)：
0006480258.tif 000020
で表される、化合物又はその塩。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ−１（COX-1）阻害剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、血小板凝集抑制剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する組成物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩、あるいは請求項５に記載の組成物を有効成分として含む、飲食品。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の化合物又はその塩、あるいはそれらを含む組成物の製造方法であって、
催涙成分生成酵素（ＬＦＳ）の活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより処理し、該化合物又はその塩を生成する工程
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、COX-1阻害活性を有する新規化合物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タマネギは古くから世界中で広く食されている野菜の一つであり、人に対して有効な生理作用を示すことに関しては多くの報告がある（非特許文献１）。さらに、2002年に催涙成分生成酵素（LFS）が発見され、タマネギの催涙成分(LF)であるpropanthial S-oxideが、前駆物質であるPRENCSOに酵素アリイナーゼが作用して1-プロペニルスルフェン酸（E-1-propenylsulfenic acid）となり、1-プロペニルスルフェン酸がLFSにより異性化されて生じる機構が明らかとなった。このため、LFSの発現を抑制できれば、タマネギ中の有用成分の量が増加し、有用な生理作用の効果も強くなるのではないかと期待されていた（非特許文献２）。
【０００３】
過去に行われた研究で、PRENCSOのアリイナーゼ分解物は、1-プロペニルスルフェン酸であることや、この1-プロペニルスルフェン酸から誘導されるチオスルフィネートは不安定なため、短時間でZwiebelanesと呼ばれる化合物に変化することが報告されていた（非特許文献３）。さらに、RNAi技術を用いて作出したLFS抑制タマネギについての成分分析の結果から、LFS抑制タマネギでは、通常のタマネギに比べてチオスルフィネート量が増加していることや、Zwiebelane isomerと呼ばれる成分が増加していることが確認されていた。Zwiebelane isomerの１つの光学異性体については、ネギ香を有するタマネギ由来成分としての報告がある（特許文献１）。また、本発明者らはこれまでに、Zwiebelane isomerと呼ばれる化合物がシクロオキシゲナーゼ-1(COX-1)阻害剤やα-グルコシダーゼ阻害剤として有用なものであることを見出し報告している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2010-143866号公報
【特許文献２】特開2012-111742号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Griffiths G et al.; Onions-A Global Benefit to Health. Phytother. Res. 16, 603-615 (2002)
【非特許文献２】Imai S et al.; An onion enzyme that makes the eyes water. Nature 419, 685 (2002).
【非特許文献３】Block E et al.; The Organosulfur Chemistry of the Onion. Phosphorus Sulfur and Silicon 58, 3-15 (1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、Zwiebelane isomerは水溶液中で不安定であることから、製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合に分解しやすいといった問題があった。
【０００７】
そこで、本発明は製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合においても安定な、COX-1を阻害活性を有する化合物、またその製造方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは低LFSタマネギの抽出液中の成分、及び、LFS非存在下でのPRENCSOのアリイナーゼ分解反応の反応液中の成分について鋭意研究を積み重ねた結果、これらの抽出液及び反応液中に前記Zwiebelane isomerとは異なるCOX-1阻害活性を有する新規化合物が存在し、当該化合物がZwiebelane isomerと比べて高い安定性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は以下の発明を包含する。
［１］  式Ｉ：
0006480258.tif 000002
（式中、
R1は水素又は低級アルキル基であり、
R2及びR3は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R4は
0006480258.tif 000003
であり、
R5及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R7は水素又は低級アルキル基であり、
ｎは3〜6の整数である。）
で表される、化合物又はその塩。
［２］  式１：
0006480258.tif 000004
で表される、［１］の化合物又はその塩。
［３］  式２(a)：
0006480258.tif 000005
、又は式２(b)：
0006480258.tif 000006
で表される、［１］の化合物又はその塩。
［４］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ−１（COX-1）阻害剤。
［５］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、血小板凝集抑制剤。
［６］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を含有する組成物。
［７］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩、あるいは［６］の組成物を含む、飲食品。
［８］［１］〜［３］のいずれかの化合物又はその塩、あるいはそれらを含む組成物の製造方法であって、
催涙成分生成酵素（ＬＦＳ）の活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより処理し、該化合物又はその塩を生成する工程
を含む、上記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、シクロオキシゲナーゼ-1(COX-1)を阻害する活性を有し、製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合においても安定な新規化合物、およびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はPRENCSO＋アリイナーゼの反応開始後、90分経過時にメタノールを添加した溶液についてのHPLCによる分析結果を示す。
【図２】図２はPRENCSO＋アリイナーゼの反応液（上清）についての大量分取HPLCシステムによる分析結果を示す。
【図３−１】図３−１は画分3の内、Peak 1及びPeak 2のMS/MSスペクトルの測定結果を示す。
【図３−２】図３−２は画分3の内、Peak 3及びPeak 4のMS/MSスペクトルの測定結果を示す。
【図４】図４はPRENCSO＋アリイナーゼの反応開始後、3分または90分経過時にメタノールを添加した溶液についてのHPLCによる分析結果を示す。
【図５】図５はニンニクジュース＋加熱タマネギジュースの反応液にメタノールを添加した溶液についてのHPLC-Orbitrap分析におけるm/z 203抽出イオンクロマトグラムを示す。
【図６】図６はPRENCSO＋アリイナーゼの反応液（沈殿物）についての大量分取HPLCシステムによる分析結果を示す。
【図７−１】図７−１はPeak A及びPeak BのMSスペクトルの測定結果を示す。
【図７−２】図７−２はPeak C1及びPeak C2のMSスペクトルの測定結果を示す。
【図７−３】図７−３はPeak D1及びPeak D2のMSスペクトルの測定結果を示す。
【図８】図８はニンニクジュース＋加熱タマネギジュースの反応液にメタノールを添加した溶液についてのHPLC-Orbitrap分析におけるm/z 227及びm/z 259抽出イオンクロマトグラムを示す。
【図９】図９は(A)アスピリン、(B)式1の化合物を含む画分3（3段階希釈液）、(C)式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物、(D)式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物の濃度とCOX-1阻害率との関係を示す。
【図１０】図１０は式1の化合物が有するCOX-1阻害活性と凍結乾燥後の保存期間及び保存温度との関係を示す。
【図１１】図１１は式2の化合物が有するCOX-1阻害活性と凍結乾燥後の保存期間及び保存温度との関係を示す。
【図１２】図１２はコントロール群、式1及び式2を含む被験物質短期投与群、及びアスピリン投与群の血小板凝集率を示す。
【図１３】図１３はコントロール群、式1及び式2を含む被験物質長期投与群、及びアスピリン投与群の血小板凝集率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．化合物
本発明の化合物は式Ｉ：
0006480258.tif 000007
（式中、
R1は水素又は低級アルキル基であり、
R2及びR3は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R4は
0006480258.tif 000008
であり、
R5及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R7は水素又は低級アルキル基であり、
nは3〜6の整数である。）
で表される平面構造を有する。
【００１３】
本明細書において、「低級アルキル基」とは、炭素原子数が１〜６個の直鎖又は分枝のアルキル基が好ましく、炭素原子数が１〜４個の直鎖又は分枝のアルキル基がより好ましい。例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル基等が挙げられる。
【００１４】
式Ｉで表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式Ｉで表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
【００１５】
本発明において「式Ｉで表される化合物」とは、式Ｉで表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
【００１６】
本発明において塩とは、医薬、飲食品等の用途に許容される慣用的なものを意味し、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩、有機アミン塩、有機酸塩、無機酸塩、スルホン酸塩等が挙げられる。
【００１７】
一実施形態において、本発明の化合物は式1：
0006480258.tif 000009
で表される平面構造を有する。式1で表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式1で表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
【００１８】
本発明において「式1で表される化合物」とは、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
【００１９】
式1で表される化合物は、構造式に基づいて化学的に合成しても良いし、あるいは後述する化合物の製造方法に基づいて調製することができる。すなわち、LFSの活性が低減された又は消失した条件下でのPRENCSOのアリイナーゼによる分解反応の反応物や、低LFSタマネギの粉砕物より、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物を得ることができる。
【００２０】
具体的には、当該反応物及び粉砕物には、以下の条件：
カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)、65分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて65分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650 nm、
の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラムにおいて、保持時間約13分〜約17分の間に主要な4つのピーク（Peak1〜Peak4）として現れる（図１）、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体化合物が含まれる。これらの光学異性体化合物は相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい。
【００２１】
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約13分〜約17分の間に現れる主要な4つのピークのうち、保持時間が3番目に長いPeak3（実施例1-3.では27.5分から28.5分）に対応する画分中の式1で表される化合物は、下記実施例1-3.に示す物理化学的特徴を有する。
【００２２】
式1で表される化合物は単離精製された形態の化合物で提供されてもよいし、式1で表される化合物を含む組成物として提供されてもよい。式1で表される化合物を含む組成物としては、組成物の固形分に対して当該化合物を0.001質量％以上、0.01質量％以上、0.1質量％以上、1質量％以上、10質量％以上、30質量％以上、50質量％以上、70質量％以上、又は90質量％以上の量で含む組成物が挙げられる。このような組成物は、後述する化合物の製造方法において調製することができる。
【００２３】
式1で表される化合物は、水との水和物や、低級アルコール等との溶媒和物の形態で存在していてもよい。水和物又は溶媒和物は医薬、飲食品等の用途に許容される水和物又は溶媒和物であれば特に限定されない。すなわち、本発明における「式1で表される化合物」には、それらの水和物又は溶媒和物の形態も下位概念として包含される。
【００２４】
また、一実施形態において、本発明の化合物は式2：
0006480258.tif 000010
（式中、
R1及びR7は同一又は異なって水素又は低級アルキル基であり、
R2, R3, R5 及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
ｎは3〜6の整数である。）
で表される平面構造を有する。式2で表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式2で表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
【００２５】
本発明において「式2で表される化合物」とは、式2で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
【００２６】
好ましくは、式2で表される化合物は式２(a)：
0006480258.tif 000011
、又は式２(b)：
0006480258.tif 000012
で表される平面構造を有する。式２(a)及び式２(b)で表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式２(a)及び式２(b)で表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
【００２７】
本発明において「式２(a)で表される化合物」とは、式２(a)で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。また、本発明において「式２(b)で表される化合物」とは、式２(b)で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
【００２８】
式2で表される化合物は、構造式に基づいて化学的に合成しても良いし、あるいは後述する化合物の製造方法において調製することができる。LFSの活性が低減された又は消失した条件下でのPRENCSOのアリイナーゼによる分解反応の反応物、及び低LFSタマネギの粉砕物において、式2で表される平面構造を有する化合物の混合物が含まれる。
【００２９】
具体的には、当該反応物及び粉砕物には、以下の条件：
カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，65分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて65分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650 nm、
の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に主要な6つのピークが現れ（Peak A, Peak B, Peak C1, C2, Peak D1, D2）、そのうち保持時間が最も短いピーク及び保持時間が次に短いピークに式2で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体化合物が含まれる（図1）。これらの光学異性体化合物は相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい。
【００３０】
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に現れる主要な6つのピークのうち、保持時間が最も短いPeak A（実施例3.では23分から26分）に対応する画分中には式2(a)で表される化合物が含まれる。
【００３１】
また、上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に主要な6つのピークのうち、保持時間が次に短いPeak B（実施例3.では28.5分から31分）に対応する画分中の式2(b)で表される化合物が含まれる。
【００３２】
式2(a)で表される化合物及び式2(b)で表される化合物は、下記実施例3.に示す物理化学的特徴をそれぞれ有する。
【００３３】
式2で表される化合物は単離精製された形態の化合物で提供されてもよいし、式2で表される化合物を含む組成物として提供されてもよい。式2で表される化合物を含む組成物としては、組成物の固形分に対して当該化合物を0.001質量％以上、0.01質量％以上、0. 1質量％以上、1質量％以上、10質量％以上、30質量％以上、50質量％以上、70質量％以上、又は90質量％以上の量で含む組成物が挙げられる。このような組成物は、後述する化合物の製造方法において調製することができる。
【００３４】
式2で表される化合物は、アルコール、エーテル、アセトン、ヘキサン、クロロホルム等の有機溶媒との溶媒和物の形態で存在していてもよい。溶媒和物は医薬、飲食品等の用途に許容される溶媒和物であれば特に限定されない。すなわち、本発明における「式2で表される化合物」には、それらの溶媒和物の形態も下位概念として包含される。
【００３５】
ＩＩ．化合物の製造方法
本発明の化合物の製造は特に限定されず、構造式に基づいて化学的に合成しても良いが、好ましくは、PRENCSOをアリイナーゼにより処理する分解反応を含む方法により行うことができる。タマネギを粉砕することによりこの分解反応は進行するが、通常のタマネギ粉砕物中にはLFSが含まれるため、PRENCSOのアリイナーゼによる分解物（1-プロペニルスルフェン酸）はLFSによるLF(催涙成分)の合成に用いられて速やかに消費されるため、本発明の化合物は蓄積され難い。
【００３６】
そこで本明細書では、本発明の化合物を以下の2つの手法を含む方法により製造することを開示するが、該化合物を工業的に製造するには、LFSの活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む、下記第二の製造方法が好適である。
【００３７】
本発明の化合物又は該化合物を含む組成物の第一の製造方法は、LFSの活性が低減された低LFSタマネギを粉砕する工程を含む。第二の製造方法は、LFSの活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む。
【００３８】
上記第一の製造方法について詳述する。
【００３９】
低LFSタマネギは通常のタマネギと比較してLFSの活性が低減したタマネギであり、遺伝子組み換えや突然変異処理により得ることができる。好ましい低LFSタマネギは、親株（通常のタマネギ）のLFS活性の20分の1以下、好ましくは40分の1以下、より好ましくは160分の1以下、特に好ましくは400分の1以下のLFS活性を有する。LFS活性は以下の方法により測定することができる。
【００４０】
＜LFS活性測定方法＞
LFS活性は、酵素反応で発生した催涙成分（LF）のピーク面積に基づいて定量する。測定試料（タマネギ抽出液）10μlに対し、250 U/mlの精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/mlの精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させる。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、LF発生量を測定する。
【００４１】
ここで用いるHPLC条件としては以下の条件を適用することができる：
カラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm（センシュウ科学）,移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの, 温度：35℃, 検出波長：254nm, 流速：0.6ml/min。この条件を用いると、LFのピークは、保持時間9.6分に検出される。
【００４２】
移動相として用いた酸性水pH3.3としてはTFA溶液を使用することができる。作製方法は以下である。蒸留水2リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気する。脱気した蒸留水2リットルにTFA（アミノ酸配列分析用特製試薬  ナカライテスク  34902-11 1ｍｌアンプル×5本入り）1mlを加え、ストック溶液（TFA溶液（×10））とする。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で10倍に希釈して、酸性水 pH3.3を作製することができる。精製アリイナーゼ溶液及び精製PRENCSO溶液としては、下記実施例1-1.及び1-2.に記載の方法で作製したものを用いることができる。
【００４３】
本発明では低LFSタマネギとして該タマネギの鱗茎（一般に、「バルブ」または「球」と呼ばれる部分）、或いは鱗茎から伸びる鞘葉の部分を用いることができる。
【００４４】
低LFSタマネギの粉砕はホモジナイザー、ミキサー等の通常の粉砕装置により行うことができる。このようにして得られた低LFSタマネギの粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。
【００４５】
上記第一の製造方法は更に、低LFSタマネギの粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液から本発明の化合物を抽出する工程を含んでもよい。本発明の化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち徐々に生成されてくることから、粉砕後は速やかに抽出を行っても目的の化合物を十分に得ることはできない。そこで、低LFSタマネギ粉砕物から、粉砕後1〜120分、好ましくは3〜90分経過した後に、当該化合物を抽出することが好ましい。
【００４６】
低LFSタマネギ粉砕物からの本発明の化合物の抽出は、低LFSタマネギ粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液を水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどより適宜選択される一又は複数の抽出溶媒を用いて抽出する方法と、低LFSタマネギの粉砕物から固形物を取り除いた溶液を合成吸着剤により処理して前記化合物を合成吸着剤に吸着させ、次いでメタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水可溶な有機溶媒を含む溶液により、吸着された前記化合物を溶出させる方法等が挙げられる。特に、式１の化合物は水溶性の性質を示すため、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等を用いて抽出及び溶出することができる。また、式2の化合物は、例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム等を用いて抽出及び溶出することができる。合成吸着剤としては、ダイアイオンHP-20（三菱化学株式会社）やアンバーライトXAD-2（オルガノ株式会社）など各種吸着剤が使用できる。このようにして得られた抽出物は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。
【００４７】
上記第一の製造方法は更に、得られた抽出物より式１及び／又は式２で表される化合物を精製する工程を含んでもよい。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の手段により行うことができる。
【００４８】
次に、上記第二の製造方法について詳述する。
【００４９】
原料として用いられるS-1-プロペニル-システインスルフォキシド(PRENCSO)は、天然由来の場合、以下の構造：
0006480258.tif 000013
を有する。ただし当該天然型とは異なるPRENCSOの立体異性体（例えばスルフォキシドの立体配置が異なる異性体）もまた原料PRENCSOとして利用可能である。
【００５０】
原料として用いるPRENCSOは合成されたものであってもよいし、タマネギ等に由来するものであってもよい。更に、PRENCSOを含む組成物を、PRENCSO原料として使用することもできる。例えば、タマネギを加熱処理して酵素を失活又は酵素活性を低減させる。加熱処理による酵素活性の低減又は失活は、少なくともLFSの活性が、未加熱のタマネギにおけるLFSの活性と比べて、20分の1以下、40分の1以下、160分の1以下、400分の1以下、800分の1以下、又はそれ以下であるか、あるいは消失していればよい。次いで加熱処理したタマネギを粉砕して調製されたジュースやペースト（加熱タマネギジュース、加熱タマネギペースト）はPRENCSOを含む組成物であり、PRENCSO原料としてアリイナーゼ処理に供することができる。
【００５１】
アリイナーゼ(E.C.4.4.1.4, S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide lyase)はアルキル（アルケニル）システインスルフォキシドをデヒドロアラニンとスルフェン酸に分解する酵素であり、アリインを分解する事からその名がつけられた。現在ではC-Sリアーゼとも呼ばれている（出典：香辛料成分の食品機能  岩井和夫、中谷延二  編集、(株)光生館  P174-175 (1989)）。上記第二の製造方法に用いることができるアリイナーゼの起源は特に限定されず、タマネギ、ニンニク、ネギ、ニラ、ラッキョなどのネギ属の他、アブラナ科のブロッコリーやカリフラワー、マメ科の灌木Albizzia lophantha (出典は上記と同じ)等に由来するものを使用することができる。
【００５２】
PRENCSOをアリイナーゼで処理する条件は特に限定されない。しかし、アリイナーゼの特性は由来によって異なるため、反応条件を使用する個々のアリイナーゼの特性に合わせるとPRENCSOの分解を効率化できる。例えば、アリイナーゼがニンニク由来の場合は、至適pHの範囲は広いのでpHは5〜8の範囲でよく、温度は37℃が最適である。一方、タマネギ由来のアリイナーゼを使う場合は、pHを7.5〜8.6にすると酵素活性が最適化され、Welsh onionの葉由来のアリイナーゼを用いる場合は、pHを7.0にすると最適化される（出典：香辛料成分の食品機能  岩井和夫、中谷延二  編集、(株)光生館  P174-175 (1989)）。なお、アリイナーゼは、ピリドキサールリン酸を補酵素とするため、実施例1-2.の様に、ピリドキサールリン酸を添加したバッファーを使う事も、アリイナーゼの活性を最適化するのに役立つ。
【００５３】
このようにして得られた、PRENCSOをアリイナーゼで分解処理して得られた反応液は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。
【００５４】
上記第二の製造方法は更に、PRENCSOをアリイナーゼで分解処理して得られた反応液から本発明の化合物を抽出する工程を含んでもよい。本発明の化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち徐々に生成されてくることから、処理後は速やかに抽出を行っても目的の化合物を十分に得ることはできない。そこで、処理後少なくとも1〜120分、好ましくは3〜90分経過した後に、当該化合物を抽出することが好ましい。抽出に際しては、反応物を遠心分離して、上清と沈殿物に分けて、それぞれより、目的の化合物を抽出することができる。すなわち、上清からは上記式1で表される化合物を抽出することができ、沈殿物からは上記式2で表される化合物を抽出することができる。上清からの上記式1で表される化合物の抽出は、例えば水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の抽出溶媒を用いて行うことができる。また、沈殿物からの上記式2で表される化合物の抽出は、例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム等の抽出溶媒を用いて行うことができる。得られた抽出物は、各式で表される化合物を含む組成物として利用することができる。
【００５５】
上記第二の製造方法は更に、抽出物から各式で表される化合物を精製する工程を含んでもよい。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の手段により行うことができる。
【００５６】
得られた式2で表される化合物又は式2で表される化合物を含む組成物は、凍結乾燥することにより、式2で表される化合物の活性（すなわち、COX-1阻害活性）を維持しながら、安定して保存することができる。
【００５７】
ＩＩＩ．用途
本発明の化合物は、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) 阻害剤の有効成分として有用である。本発明の化合物はCOX-1阻害作用を有しているため、血小板内のアラキドン酸からプロスタグランジンH2への酵素反応を阻害し、血小板の凝集を抑制することによる血栓形成の予防等に有用である。
【００５８】
本発明の化合物は、飲食品や医薬品などの最終的な形態において許容される成分であって、経口摂取可能な成分と共に組成物の形態とすることができる。
【００５９】
本発明の化合物を含む組成物は、飲食品組成物または医薬品組成物（医薬部外品組成物を含む。以下同じ）等の任意の形態であってよい。
【００６０】
飲食品組成物の形態としては、飲料、固形食品、半固形食品等が挙げられる。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態が挙げられる。半固形食品としては、例えばジャムのようなペーストの形態、チューイングガムのようなガムの形態が挙げられる。これらの飲食品組成物には本発明の化合物のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、飲食品原料として通常用いられる種々の成分を配合することができる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。
【００６１】
医薬品組成物としては種々の投与形態用に製剤化されたものを使用することができる。医薬品組成物の製剤形態は特に制限はなく、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒、散剤、チュアブル剤等の経口剤、注射剤等の非経口剤等の通常の製剤形態が挙げられる。上記製剤は本発明の化合物と、賦形剤等の製薬上許容される他の成分とを使用して常法により調製することができる。
【００６２】
本発明の化合物を含む飲食品組成物や医薬品組成物を摂取又は投与することにより、有効成分として含有する本発明の化合物のCOX-1阻害作用により、COX-1を阻害することにより改善される疾患又は症状を予防又は治療する等することができる。
【００６３】
あるいは、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む組成物は、in vitroにおいてCOX-1を阻害するための試薬として用いられてもよい。
【実施例】
【００６４】
実施例1.  式1の化合物の単離精製
実施例1-1.  精製PRENCSO溶液の調製
（１）加熱タマネギからPRENCSOの抽出
生タマネギ3玉（約1000g）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで12分間加熱した。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えてから粗砕し、粗砕液を8000rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、陽イオン交換樹脂IR120B（Hタイプ）を加えて攪拌したのち、吸引濾過により、樹脂を回収した。回収した樹脂に蒸留水1Lを加え、これに濃アンモニア水を加えてpH8.5に調整した。吸引濾過により、上清を回収し、残った樹脂に再度pH8.5のアンモニア水を加えた。再度、吸引濾過により、上清を回収した。得られた溶液に1N塩酸を加えてpH7.0に中和した。エバポレーターを用いて溶液を濃縮乾固した。
【００６５】
（２）PRENCSOの精製
残留物に蒸留水50mlを加えて溶解させた。得られた粗PRENCSO溶液を中圧逆相クロマトグラフィーによって精製した。必要に応じて、さらにHPLC（カラム：ODS，移動相：酸性水pH3.3，温度：35℃，UV：230nm）によって精製した。カラムから得られた溶出液をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて乾固し、精製PRENCSO粉末（約100mg）を得た。
【００６６】
実施例1-2.  精製アリイナーゼ溶液の調製
（１）ニンニクを粉砕・酸沈
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やしておいた。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を4℃にセットして冷却しておいた。ニンニク片（100g）に等量のバッファー A（後述）を加えて、ミキサーで粉砕した。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめ、粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾した。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞った。得られたろ液を4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、上清を回収した。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、pHをモニターしながら、酢酸を加えていき、pHを4.0に調整した。pHが4.0になったら、そのまま5分間静置した。沈殿の出てきたサンプルを4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、遠心ペレットを回収した（バッファー Aを使用した）。
【００６７】
回収したペレットを50ml〜100mlにして（バッファー A）、そのまま、5℃で30分間静置した。回収したペレットの懸濁液を4℃、12000rpmで10分間遠心分離した。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のpHを6.5に調整した。これをアリイナーゼ粗抽出液とした。
【００６８】
（２）ハイドロキシアパタイトカラム処理
上記アリイナーゼ粗抽出液（遠心上清）をバッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにアプライした。アリイナーゼは、ハイドロキシアパタイトカラムに黄色のバンドとなって吸着された。サンプルをアプライしたハイドロキシアパタイトカラムを300mlのバッファー Aで洗浄した。洗浄の終了したハイドロキシアパタイトカラムに300mlのバッファー C（後述）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って10mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００６９】
（３）ConAカラムによるアリイナーゼの精製
集めたフラクション（20ml）の1/20倍volの20mM塩化カルシウム及び塩化マグネシウム溶液を加えて、サンプル溶液のカルシウムイオン及びマグネシウムイオン濃度を上げた。そうした上で、再生し、startingバッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）で平衡化したConAカラムにアプライした。サンプルをアプライした後のConAカラムを50mlのstartingバッファーで洗浄した。洗浄の終了したConAカラムに50mlのConA溶出バッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って2mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００７０】
（４）精製したアリイナーゼの濃縮方法
ConAカラム精製によって得られた黄色い溶出液（アリイナーゼ溶液）10mlをCENTRIPLUS CONCENTRATORS(up to 15ml,No.4421)（ミリポア社製）に入れた。CENTRIPLUS CONCENTRATORSを、4℃に冷却した遠心機にセットし、3000rpmで30分遠心した。中身を一度確認した後、もう一度、3000rpmで30分間遠心した。濃縮したアリイナーゼは250または500U/mlになるように適宜バッファー Dで希釈し、使用時まで-80℃で保存した。
【００７１】
［バッファー A］
上記バッファー A(pH7.0)（アリイナーゼ精製用50mMバッファーA）は次のように調製した。50mMリン酸水素二カリウム溶液（5.22gを600mlに溶解）と50mMリン酸二水素カリウム溶液（3.4gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
【００７２】
［バッファー C］
上記バッファー C(pH 7.0)（アリイナーゼ精製用500mMバッファー C）は、次のように調製した。500mMリン酸水素二カリウム溶液（43.6gを500mlに溶解）と500mMリン酸二水素カリウム溶液（34.0gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
【００７３】
［バッファー D］
上記バッファー D(pH6.5)（アリイナーゼ希釈用100mMバッファー D）は、次のように調製した。100mMリン酸水素二カリウム溶液（10.44gを600mlに溶解）と100mMリン酸二水素カリウム溶液（6.8gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを6.5に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
【００７４】
実施例1-3.  式1の化合物の誘導と単離精製
2mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液1200μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液800μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後にチューブを15000rpmで5分間遠心し、上清と沈殿物を回収した。
【００７５】
得られた上清について、島津製作所社の大量分取HPLCシステムを用いて、反応後期生成物-SUPを単離精製した。HPLC条件は、検出波長：210nm、カラム：GL Sciences Inertsil ODS-3 250 mm X 20 mm, 5μm、移動相（CH3CN/H2O）：0分（16%/84%），16分（16%/84%），35分（35%/65%），36分（90%/10%），41分（90%/10%），42分（16%/84%），65分（16%/84%）、流速：15ml/分とした。
【００７６】
HPLC保持時間20分から32分までの画分3（Fr-3）の内、Peak3（HPLC保持時間27.5分から28.5分）について分取した（図2）。分取したPeak3を含む画分について、エバポレーターを用いて濃縮乾固後、NMRとHPLC-Orbitrapを用いて解析した結果、式1の平面構造を有することが特定できた。
【００７７】
また、画分3の内、Peak1, Peak2及びPeak4については、HPLC-Orbitrapを用いたMSスペクトル解析の結果、Peak3と同様のスペクトルを示したことから、Peak3の異性体画分であることが確認できた（図3-1,3-2）。
【００７８】
Peak3として現れる式1の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色粉末
（２）HR MS [M+H]+：m/z 221.0661 (221.0664 calcd. for C9H17O2S2)
（３）分子式：C9H16O2S2
（４）溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 230 (in 43% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 6.53, 6.45, 5.19, 4.08, 2.31, 2.03, 1.93, 1.24, 1.05
（７）13C NMRスペクトル：δ 139.10, 131.66, 84.39, 73.70, 53.52, 42.59, 17.51, 16.64, 12.43
（８）HPLC保持時間：15.5〜15.9分 (ピークトップの検出時間:15.67分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ポジティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：3.5 kV、Capillary温度：300℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
【００７９】
実施例2.  式1の化合物の誘導
（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から
1.5mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液30μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液20μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から3分または90分後に10μg/mlホルモノネチン含有メタノール150μlを添加し、30秒間混合した。チューブを15000rpmで3分間遠心し、得られた上清について、Thermo Fisher Scientific社のHPLC-Orbitrapを用いて下記の条件にて分析を行った。
【００８０】
[HPLC条件]
HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
【００８１】
[Orbitrap条件]
Ionaizationモード：ポジティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：3.5 kV、Capillary温度：300℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
【００８２】
結果を図4に示す。HPLC保持時間13〜17分にピークが観察され、式1の化合物が誘導されたことが確認された。また、式1の化合物は反応開始から90分後においても十分に存在していたのに対して、Zwiebelane isomerは、反応開始から90分後には顕著に減少していることが確認できた。これは式1の化合物が、Zwiebelane isomerと比べて、水溶液中にてより安定な化合物であることを示す。
【００８３】
（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から
ニンニクジュースはニンニクの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を粉砕して調製した。また、加熱タマネギジュースはタマネギの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を加熱処理した後、粉砕して調製した。
【００８４】
1.5mlマイクロチューブにニンニクジュース30μlを採った。ここに加熱タマネギジュース300μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後に10 μg/mlホルモノネチン含有メタノールを990μl添加した後、チューブを15000rpmで5分間遠心し、得られた上清について、上記「（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から」に記載のHPLC-Orbitrap条件にて分析を行った。但し、検出は式1の化合物のプロダクトイオンであるm/z 203でイオンクロマトグラム抽出を行った。
【００８５】
結果を図5に示す。HPLC保持時間13〜17分にピークが観察され、式1の化合物が誘導されたことが確認された。
【００８６】
実施例3.  式2の化合物の単離精製
実施例1-3で回収された沈殿物を1mlのメタノールに溶解し、島津製作所社の大量分取HPLCシステムを用いて、反応後期生成物-PPTを単離精製した。HPLC条件は、検出波長：210 nm、カラム：GL Sciences Inertsil ODS-3 250 mm X 20 mm, 5μm、移動相（CH3CN/H2O）：0分（50%/50%），40分（90%/10%），45分（90%/10%），46分（50%/50%），70分（50%/50%）、流速：10ml/分とした。
【００８７】
HPLC保持時間23分から26分までのPeak Aと、28.5分から31分までのPeak Bについて分取した（図6）。分取したPeak A及びPeak Bを含む各画分について、エバポレーターを用いて濃縮乾固後、NMRとHPLC-Orbitrapを用いて解析した結果、Peak Aは式2(a)の平面構造を有するトリスルフィドタイプの構造を有すること、Peak Bは式2(b)の平面構造を有するテトラスルフィドタイプの構造を有することが特定できた。
【００８８】
Peak Aとして現れる式2(a)の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色油状
（２）HR MS [M＋HCOO]-：m/z 403.0205 (403.0205 calcd. for C13H23O4S5)
（３）分子式：C12H22O2S5
（４）溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 280 (in 74.8% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 5.18, 5.14, 4.49, 4.34, 2.12, 1.85, 1.84, 1.73, 1.18, 1.16, 1.10, 1.04
（７）13C NMRスペクトル：δ 86.57, 83.41, 65.99, 64.19, 52.81, 51.20, 49.08, 47.25, 15.15, 14.79, 14.76, 12.68
（８）HPLC保持時間：35〜36分 (ピークトップの検出時間:35.65分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
【００８９】
また、Peak Bとして現れる式2(b)の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色油状
（２）HR MS [M-H]-：m/z 388.9871 (388.9871 calcd. for C12H21O2S6)
（３）分子式：C12H22O2S6
（４）溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 300 (in 80.4% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 5.19, 5.17, 4.52, 4.39, 2.15, 1.89, 1.86, 1.74, 1.20, 1.16, 1.11, 1.05
（７）13C NMRスペクトル：δ 86.63, 83.55, 66.14, 64.13, 52.74, 51.28, 49.34, 47.54, 15.09, 14.92, 14.69, 12.69
（８）HPLC保持時間：38.5〜39.5分 (ピークトップの検出時間:38.96分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
【００９０】
実施例4.  式2の化合物の誘導
（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から
実施例2の「（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から」にて得られた上清について、Thermo Fisher Scientific社のHPLC-Orbitrapを用いて同様の条件にて分析を行った。
【００９１】
[HPLC条件]
HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5ml/分、検出190〜650nm
【００９２】
[Orbitrap条件]
Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
【００９３】
結果を図4に示す。HPLC保持時間35〜46分にピークが観察され、式2の化合物が誘導されたことが確認された。また、式1の化合物と同じく、式2の化合物は反応開始から90分後においても十分に存在していることが確認できた。これは式2の化合物が、Zwiebelane isomerと比べて、水溶液中にてより安定な化合物であることを示す。また、HPLC-Orbitrapの分析で検出されたPeak C1, C2, Peak D1, D2は、精密質量から算出される組成式とMSスペクトル解析の結果、ペンタスルフィドタイプ、ヘキサスルフィドタイプの構造を有することが確認できた（図7-1, 7-2, 7-3）。
【００９４】
（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から
実施例2の「（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から」にて得られた上清について、上記「アリイナーゼとPRENCSOの混合液」と同様の条件にてHPLC-Orbitrap分析を行った。但し、式2の化合物のプロダクトイオンであるm/z 227および259でイオンクロマトグラム抽出を行った。
【００９５】
結果を図８に示す。HPLC保持時間35〜40分にピークが観察され、式2(a)の化合物及び式2(b)の化合物が誘導されたことが確認された。
【００９６】
実施例5.  COX-1阻害活性
＜使用試薬＞
20または25 U/μlのCOX-1（Cayman Chemical：76011）を100mM Tris-HCl（pH 8.0）で2.5 U/μlに希釈した。COX-1の補酵素として、ヘム（Cayman Chemical：760116）を100mM Tris-HCl（pH 8.0）で22.7倍希釈した。基質として、22mMのアラキドン酸エタノール溶液（Cayman Chemical）を0.5mM KOH溶液で110μMに希釈した。ポジティブコントロールとして、濃度の異なるアスピリン（Cayman Chemical：70260 / 179.2mM、44.8mM、11.2mM、2.8mM）のエタノール溶液を調製した。
【００９７】
阻害活性試験用試料として、実施例1-3で分取した式1の化合物を含む画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、ならびに実施例3で単離精製した式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物（10μg, 20μg, 40μg, 80μg, 120μg, 160μg）及び実施例3で単離精製した式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物（11μg, 22μg, 44μg, 87μg, 131μg, 175μg）をそれぞれ含むメタノール溶液、を調製した。
【００９８】
＜実験方法＞
1.5 mlのマイクロチューブに200mM Tris-HCl（pH 8.0）Buffer、蒸留水、ヘム、COX-1を下表に従って添加した。次に、テスト区では各種濃度のアスピリン、あるいは式1の化合物を含む画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、あるいは各種濃度の式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物を含むメタノール溶液、または式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物を含むメタノール溶液を添加して24℃の恒温槽で5分加温した。その後、アラキドン酸溶液を加えて24℃の恒温槽で更に1分加温した後、800μlのエタノールを添加して酵素反応を止めた。一方、Blank区ではアスピリン、画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、各種濃度の式2(a)又は式2(b)の化合物を含むメタノール溶液の代わりに、エタノール、蒸留水、メタノールをそれぞれ添加して上記と同様の操作を行った。各反応液をUPLC-MS/MSで分析を行い、アラキドン酸のCOX-1による反応産物であるプロスタグランジンH2（PGH2）を検出した。試料の酵素阻害率は、以下の式で求めた。
【００９９】
酵素阻害率（%）＝｛（ブランク区のPGH2のピーク面積−テスト区のPGH2のピーク面積）／ブランク区のPGH2のピーク面積）｝＊100
【０１００】
［UPLC-MS/MS条件］
UPLC：Waters Acquity、カラム：Waters Acquity UPLC BEH C18 100mm X 2.1mm, 1.7μm、カラムオーブン：40℃、移動相（1mM トリエチルアミン（TEA）in CH3CN/1mM TEA in H2O）：0分(5%/95%), 10分(60%/40%), 10.5分(80%/20%), 15.5分(80%/20%), 15.51分(5%/95%), 40分(5%/95%)、流速：0.3 ml/分、サンプルトレイ：5℃
検出器：Micromass Quattro Premier XE、Ionizationモード：ネガティブ、Capillary電圧：3 kV、Cone電圧：15 V、Source温度：120℃、Desolvation温度：350℃、Coneガス流速：50 L/hr、Desolvationガス流速：600 L/hr、Collisionエネルギー：16 eV、MRM条件：Parent m/z=351, Daughter m/z=271
【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
＜結果＞
その結果、アスピリン、式1の化合物を含む画分3、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物には、それぞれCOX-1阻害活性があることを確認した（図９）。
【０１０３】
COX-1阻害に要するIC50値で比較すると、下記表２に示すとおり、本評価系でのアスピリンのIC50（酵素反応液200μl中での濃度）はおよそ3.3mMであったのに対して、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物のIC50は720μM、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物のIC50は464μMであった。すなわち、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物はアスピリンの約5倍、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物はアスピリンの約7倍、COX-1阻害活性が高いことがわかった。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
実施例6.  安定性
（１）凍結乾燥した式1の化合物
1.5mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液10μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液20μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後にチューブを15000rpmで5分間遠心し、上清及び沈殿物を回収した。
【０１０６】
次に上清を凍結乾燥し40℃または50℃で保存した。40℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28, 56, 84日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。50℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。酵素反応終了直後のサンプルについては、反応終了後に20μlの蒸留水を添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。凍結乾燥直後及び保存開始後のサンプルについては、50μlの蒸留水を添加混合した後、10μlを検液として同様にCOX-1阻害活性試験に供した。
【０１０７】
その結果、両保存温度においても保存経過時間と共に、COX-1阻害活性は減衰することが確認された（図１０）。すなわち、凍結乾燥した式1の化合物は不安定であることを確認した。
【０１０８】
（２）凍結乾燥した式2の化合物
上記「（１）凍結乾燥した式1の化合物」にて回収した沈殿物に150μlの蒸留水を添加混合し、15000rpmで5分間遠心し、沈殿を回収した。次に沈殿を凍結乾燥し40℃または50℃で保存した。40℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28, 56, 84日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。50℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。酵素反応終了直後のサンプルについては、回収した沈殿に50μlのメタノールを添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。一方、凍結乾燥直後及び保存開始後のサンプルについては、50μlのメタノールを添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。
【０１０９】
その結果、両保存温度においても保存経過時間と共に、COX-1阻害活性は減衰しないことが確認された（図１１）。すなわち、凍結乾燥した式2の化合物は安定であることを確認した。
【０１１０】
実施例7． ラット血小板凝集抑制効果（短期投与）
血小板凝集抑制効果についてSDラット（雄）を用いて評価を行った。即ち、1群7匹の10週齢Slc:SD(SPF)雄（日本エスエルシー株式会社）を市販固型飼料CRF-1（オリエンタル酵母工業株式会社）、および水を自由摂取させて6日間飼育した。その後、コンピュータを用いた層別無作為化割付により、体重が各群で均一になるようコントロール群、被験物質投与群、アスピリン投与群の3群に分けた。コントロール群には、蒸留水で2倍希釈したバッファーD、被験物質投与群には、実施例1-1，1-2で作製した40mg/ml精製PRENCSOと500U/ml精製アリイナーゼを1:1の割合で混合し室温で90分反応させた後、凍結乾燥後にPRENCSOの最終濃度が2mg/mlとなるように2倍希釈バッファーDで溶解または縣濁させたもの、アスピリン投与群には、3mg/mlとなるようにアスピリンを注射用水で溶解または縣濁させたものを、それぞれ10ml/kg（ラット体重）になるようにフレキシブル胃ゾンデおよび注射筒を用いて強制経口投与した。また投与は午前11時から12時の間に行い、投与期間は4日間とした。
【０１１１】
投与期間中は、全例について1日1回の頻度で一般状態の観察、投与開始日および血小板凝集能測定日に体重測定を実施した。また最終投与日前日（投与3日目）の17時から絶食を行い、翌日（投与4日目）の経口投与の3時間後に35mg/kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与の麻酔下にて、腹部大動脈に注射針を挿入して、5mlシリンジ（3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液を0.5ml充填）で5mlの採血（3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液1容に対して血液が9容）を行った。
【０１１２】
採取した血液を25℃、220 X gで10分間遠心分離したのち、上層の多血小板血漿（Platelet-Rich Plasma:PRP）を採取した。下層を25℃、2,300 X gで15分間遠心分離し、上層（Platelet-Poor Plasma:PPP）を採取した。PRPおよびPPP画分の血小板数をそれぞれ自動血球計数装置（Sysmex F-820、シスメックス株式会社）により測定し、血小板数を5.0 X 105 cells/μlに調整した。
【０１１３】
調整したPRPを専用キュベットに240μl入れ、37℃で90秒間保温した後、62.5μg/mlコラーゲン溶液を10μl添加し、血小板凝集能測定装置（MCMヘマトレーサー313M）を用いて血小板凝集能を測定した。測定時間はコラーゲン添加後10分間とし、得られた最大凝集率（%）を採用した。
【０１１４】
結果を図12に示す。尚、各群の代表値は平均値±標準誤差で表した。統計解析はコントロール群と被験物質投与群、アスピリン投与群の間で、ダネットの多重比較検定を行った。有意水準は5%（*）及び1%（**）で表示した。被験物質投与群では、血小板最大凝集率がコントロールと比較して有意に減少していることが確認できた（図12）。
【０１１５】
実施例8． ラット血小板凝集抑制効果（長期投与）
（１）被験物質の調製
タマネギの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を加熱処理した後、粉砕して調製した加熱タマネギジュースに、その1/200当量のすりおろしニンニクペーストを混合させたのち、室温で60分間反応させたものを、凍結乾燥して得られた粉末（式１及び式２の化合物を含む）を、式２の化合物が所定の濃度にて含まれるように、蒸留水、又はクエン酸緩衝液で再懸濁させたものを、被験物質として以下の実験に利用した。
【０１１６】
（２）ラット血小板凝集効果確認試験
被験物質をSDラット（雄）に6週間投与したときの、血小板凝集抑制効果について評価を行った。即ち、1群7匹の5週齢Slc:SD(SPF)雄(日本エスエルシー株式会社) を市販固型飼料CRF‐1(オリエンタル酵母工業株式会社)、及び水を自由摂取させて6日間飼育した。その後、コンピュータを用いた層別無作為化割付により、体重が各群で均一になるように、表３に示す群構成で5群に分けた。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
このうち1群には、正常食（MF粉末飼料）を自由摂取させ、クエン酸緩衝液を注射筒を用いて強制経ロ投与した（コントロール1）。残りの4群には、高脂肪食（配合を表４に示す）を自由摂取させ、表３に示す通りに、クエン酸緩衝液、被験物質、又はアスピリンをそれぞれフレキシブル胃ゾンデおよび注射筒を用いて強制経ロ投与した。また投与は午前11時から12時の間に行った。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
投与期間中は、全例について1日1回の頻度で一般状態の観察、投与開始日および血小板凝集能測定日に体重測定を実施した。また最終投与日前日(投与41日目)の17時から絶食を行い、翌日(投与42日目)の経ロ投与の3時間後に35mg/kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与の麻酔下にて、腹部大動脈に注射針を挿入して、5mlシリンジ(3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液を0.5ml充填)で5mlの採血(3〜8 w/v%クエン酸三ナトリウム溶液1容に対して血液を9容)を行った。
【０１２１】
採取した血液を25℃、220 X gで10分間遠心分離したのち、上層の多血小板血葉(Platelet‐Rich Plasma：PRP)を採取した。下層を25℃、2,300 X gで15分間遠心分離し、上層(Platelet‐Poor Plasma：PPP)を採取した。PRPおよびPPP画分の血小板数をそれぞれ自動血球計数装置(Sysmex F‐820、シスメックス株式会社)により測定し、血小板数を5.0 X 105 cells/μlに調整した。
【０１２２】
調整したPRPを専用キュベットに240 μl入れ、37℃で90秒間保温した後、62.5μg/mlコラーゲン溶液を10μl添加し、血小板凝集能測定装置(MCMヘマトレーサー313M)を用いて血小板凝集能を測定した。測定時間はコラーゲン添加後10分間とし、得られた最大凝集率(%)を採用した。
【０１２３】
結果を図13に示す。尚、各群の代表値は平均値±標準誤差で表した。統計解析はコントロール群と各被験物質投与群の間で、ダネットの多重比較検定を行った。有意水準は5%(＊)及び1%(♯♯)で表示した。被験物質投与群では、血小板最大凝集率がコントロールと比較して有意に減少していることが確認できた(図13)。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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