(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４５位のロイシン残基がアスパラギン酸残基によって置換され、６５位のアスパラギン残基がリジン残基によって置換され、６９位のロイシン残基がアルギニン残基によって置換されている、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１５突然変異ポリペプチド。
【請求項２】
異種ポリペプチドに融合された請求項１記載のＩＬ−１５突然変異ポリペプチドからなる融合タンパク質。
【請求項３】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２の融合タンパク質。
【請求項４】
免疫グロブリン定常ドメインが、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得られる、請求項３の融合タンパク質。
【請求項５】
免疫グロブリン定常ドメインがＦｃ領域である、請求項３の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＬ−１５突然変異ポリペプチドと免疫グロブリン定常ドメインが、リンカーによって連結されている、請求項３の融合タンパク質。
【請求項７】
リンカーが、４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個のアミノ酸残基を有する、請求項６の融合タンパク質。
【請求項８】
リンカーが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される、請求項６の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１記載のＩＬ−１５突然変異ポリペプチド又は請求項２〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸又は請求項１１記載のベクターによってトランスフェクトされ、感染され、又は形質転換された細胞。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１２記載の細胞を、該ポリペプチド又は融合タンパク質の発現を可能とするに適した条件下で培養すること；及び（ｉｉ）発現されたポリペプチド又は融合タンパク質を回収することからなる工程を含む、請求項１記載のＩＬ−１５突然変異ポリペプチド又は請求項２〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質を産生する方法。
【請求項１４】
請求項２〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質の二量体からなるＩＬ−１５アンタゴニスト。
【請求項１５】
請求項１記載のＩＬ−１５突然変異ポリペプチド、請求項２〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質、又は請求項１４記載のアンタゴニストを含む、患者における免疫応答を抑制するための医薬組成物。
【請求項１６】
患者が、リウマチ性疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合性結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群又はベーチェット病、ＩＩ型糖尿病、甲状腺の自己免疫疾患、例えば橋本甲状腺炎又はグレーブス病、中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、重症筋無力症、又は脳脊髄炎、様々な天疱瘡、例えば尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉性天疱瘡、シネア・アッシャー症候群、又はブラジル天疱瘡、乾癬、及び炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎、又はクローン病からなる群より選択された自己免疫疾患を患っている、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
移植片生着を促進するための、及び移植片対宿主病の患者を処置するための、請求項１５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）アンタゴニスト、並びに、特に自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置のためのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
ＩＬ−１５は、Ｔ細胞活性化因子として２つの研究グループによって同時に同定された１４〜１５kDaのサイトカインであり（Grabstein, K. H. et al., Science 1994, 264, 965-968; Burton, I. D. et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1994, 91, 4935-4939）、ＮＫ細胞及びＴ細胞の分化及び増殖に関与している。ＩＬ−１５の高レベルの発現は、自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えばクローン病（Kirman I., Am. I. Gastroenterol. 1996, 91: 1789-1794）、乾癬（Rickert R., J. Immunol., 2000, 165: 2240-2250）、白血病（YamadaY Leukemia and Lymphoma 1999, 35: 37-45）、及び関節リウマチ（ＲＡ）（McInnes I. B., Immunology Today 1998, 19: 75-79; Graft rejection (Pavlakis M, transplnatation 1996, Manfro RC., Transplant Proc. 1997）の病因と関連している。したがって、ＩＬ−１５アンタゴニストは、炎症性疾患を処置するための可能性ある治療薬であり得、いくつかのＩＬ−１５アンタゴニストが先行技術に記載されている。例えば、Ferrari-Lacraz S. et al.は、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されたＩＬ−１５突然変異体からなるＩＬ−１５アンタゴニストを記載し、該アンタゴニストは、関節リウマチの処置に有用であり得ることを実証した（Ferrari-Lacraz S, Zanelli E, Neuberg M, Donskoy E, Kim YS, Zheng XX, Hancock WW, Maslinski W, Li XC, Strom TB, Moll T. Targeting IL-15 receptor-bearing cells with an antagonist mutant IL-15/Fc protein prevents disease development and progression in murine collagen-induced arthritis. J Immunol. 2004 Nov 1;173(9):5818-26）。Bemard et al.は、２００４年に、ＩＬ１５−Ｒαへの結合のためのＩＬ−１５分子の２つの配列を同定した。そうした配列は、成熟タンパク質におけるアミノ酸４４〜５２及び６４〜６８を含み、彼らはまた、ＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用し得る突然変異タンパク質も記載した（Bemard I. et al. I Biol Chem 2004, 279: 24313-24322）。さらに、Pedreau H. et al.（Harmonie Perdreau; Ariane Plet; Yannick Jacques; Universite de Nantes. Unite de Formation et de Recherche de Medecine et des Techniques Medicales.; Ecole doctorale 502 Biologie-Sante (Nantes-Angers).Biologie de l'interleukine-15: de son ADN a ses voies de signalisation. 2010; These de doctorat : Medecine. Biologie, medecine et sante. Immunologie : Nantes : 2010）は、バキュロウイルスにおける産生のための２つのＩＬ−１５突然変異タンパク質を記載した。
【０００３】
発明の要約：
本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）アンタゴニスト、並びに、特に自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置のためのその使用に関する。
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、Ｆｃフラグメントに融合させることのできる新規なＩＬ−１５突然変異分子を設計した。突然変異はＩＬ−１５Ｒβ鎖と相互作用するＩＬ−１５界面上に位置し、これによりＩＬ−２及びＩＬ−１５の推定される受容体であるＩＬ−１５Ｒβ／γヘテロ二量体受容体及びＩＬ−１５Ｒββホモ二量体受容体の両方を通して、ＩＬ−１５のシグナル伝達を妨げる。したがって、一般的なγ鎖ではなくＩＬ−１５Ｒβ鎖を標的とするＩＬ−１５アンタゴニストを使用する戦略は、それ故、より効率的であろう。なぜなら、当業者は、ＩＬ−１５受容体の全てのあり得る形態（ＩＬ１５Ｒα／β／γ、ＩＬ−１５Ｒβ／γ、及びＩＬ−１５Ｒβ／β）を遮断することによって、該分子は、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方の作用をより効率的に遮断するであろうことを予期できるからである。
【０００５】
本発明は、４５位のロイシン残基がアスパラギン酸残基によって置換され、６５位のアスパラギン残基がリジン残基によって置換され、６９位のロイシン残基がアルギニン残基によって置換されている、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１５突然変異ポリペプチドに関する。
【０００６】
配列番号１：ＩＬ−１５（ホモサピエンス）
【化１】
0006474797.tif 000002
【０００７】
本発明はまた、異種ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−１５又はその突然変異体ではないポリペプチド）に融合された本発明に記載のＩＬ−１５突然変異ポリペプチドからなる融合タンパク質に関する。
【０００８】
本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、本発明と同じポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結された本発明のポリペプチドの全部又は部分（典型的には生物学的に活性な）を含む。融合タンパク質内の「作動可能に連結」という用語は、本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを示すことを意味する。異種ポリペプチドを、本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させることができる。典型的には、異種ポリペプチドは、インビボにおいてＩＬ−１５突然変異ポリペプチドの循環中半減期を増加させるのに特に適している。
【０００９】
特定の実施態様では、融合タンパク質はイムノアドヘシンである。本明細書において使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、本発明のＩＬ−１５突然変異ポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた、抗体様分子を示す。実施態様によっては、イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列を、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。実施態様によっては、免疫グロブリン配列は、典型的であって必ずしもではないが、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の価値ある化学的及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ配列及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、関心対象の結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成することができる。このようなイムノアドヘシンは患者に対して最小限の免疫原性であり、慢性使用又は反復使用において安全である。当業者は、最も適切なＦｃドメインを容易に選択することができる（Chan AC, Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nat Rev Immunol. 2010 May;10(5):301-16. doi: 10.1038/nri2761. Review.）。特定の実施態様では、Ｆｃ領域は、補体の結合及び／又はＦｃ受容体の結合を阻害する突然変異を含むか又は含まない（Zheng et al, Transplantation. 2006 Jan 15;81(1):109-16）。
【００１０】
特定の実施態様では、Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域である。特定の実施態様では、Ｆｃ領域は変異Ｆｃ領域である。さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域は機能的Ｆｃ領域である。本明細書において使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、これには天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端へ広がると定義される。
【００１１】
実施態様によっては、イムノアドヘシンの接着部分と免疫グロブリン配列部分は、最小のリンカーによって連結されている。本明細書において使用される場合、「リンカー」という用語は、接着部分と免疫グロブリン配列部分とを連結する少なくとも１つのアミノ酸配列を指す。このようなリンカーは、立体障害を防ぐために有用であり得る。実施態様によっては、リンカーは、４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個のアミノ酸残基を有する。しかし、上限は重要ではないが、例えばこのようなポリペプチドの生物学的製剤の生産に関する簡便性の理由から選択される。リンカー配列は、天然配列であっても非天然配列であってもよい。治療目的のために使用される場合、リンカーは好ましくは、イムノアドヘシンが投与される被験体において非免疫原性である。１つの有用なリンカー配列の群は、国際公開第９６／３４１０３号及び国際公開第９４／０４６７８号に記載のような重鎖抗体のヒンジ領域から誘導されたリンカーである。他の例は、ポリ−アラニンリンカー配列である。リンカー配列のさらなる好ましい例は、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３（配列番号１０）、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４（配列番号１１）、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）（配列番号１２）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）（配列番号１３）、ｇｌｙ３（配列番号１４）及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３（配列番号１５）を含む、様々な長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。
【００１２】
配列番号１０（GGGGS GGGGS GGGGS）
配列番号１１（GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS）
配列番号１２（GGGGS）
配列番号１３（GGS）
配列番号１４（GGG）
配列番号１５（GGGSS GGGSS GGGSS）
【００１３】
特定の実施態様では、本発明による融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する。
【００１４】
配列番号２：ＩＬ−１５−ＩｇＧ１Ｆｃ（マウス）
【化２】
0006474797.tif 000003
【００１５】
配列番号３：ＩＬ−１５−ＩｇＧ１Ｆｃ（ヒト）
【化３】
0006474797.tif 000004
【００１６】
配列番号４：ＩＬ−１５−ＩｇＧ２Ｆｃ（ヒト）
【化４】
0006474797.tif 000005
【００１７】
配列番号７：ＩＬ−１５−リンカー−ＩｇＧ１Ｆｃ（マウス）
【化５】
0006474797.tif 000006
【００１８】
配列番号８：ＩＬ−１５−リンカー−ＩｇＧ１Ｆｃ（ヒト）
【化６】
0006474797.tif 000007
【００１９】
配列番号９：ＩＬ−１５−リンカー−ＩｇＧ２Ｆｃ（ヒト）
【化７】
0006474797.tif 000008
【００２０】
本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、当技術分野においてそれ自体公知の任意の技術によって、例えば、以下に限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝子的、又は酵素的技術を単独で又は組み合わせることによって産生され得る。所望の配列のアミノ酸配列が分かれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的な技術によって該ポリペプチドを容易に産生することができる。例えば、それらを、周知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって製造された装置）を使用して、及び製造業者の説明書に従って合成することができる。あるいは、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質を、当技術分野においては現在周知であるような組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、これらのフラグメントを、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組込み、このようなベクターを、所望のポリペプチドを発現するであろう適切な真核生物宿主又は原核生物宿主に導入した後にＤＮＡ発現産物として得ることができ、これからそれらを後に周知の技術を使用して単離することができる。
【００２１】
本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、単離（例えば精製）形で、又はベクター、例えば膜若しくは脂質小胞（例えばリポソーム）内に含めて使用され得る。
【００２２】
具体的な実施態様では、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質を、その治療効力を改善するために改変することができると考えられる。治療化合物のこのような改変は、毒性を低減させるため、循環時間を増加させるため、又は体内分布を改変するために使用され得る。例えば、重要である可能性のある治療化合物の毒性を、体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによって有意に低減させることができる。薬物の存続能を改善するための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。様々な水溶性ポリマーが、体内分布を改変し、細胞への取り込み機序を改善し、生理的バリアを通しての透過性を変化させ；体内からのクリアランス速度を改変することが示されている。標的化又は持続放出効果のいずれかを達成するために、ポリマー鎖上の末端基として、骨格の一部として、又は吊り下がった基として薬物部分を含有する、水溶性ポリマーが合成されている。例えば、ＰＥＧ化は、一連のポリペプチドの改変のための十分に確立されかつ検証されたアプローチである。利点としては、とりわけ以下が挙げられる：（ａ）ポリマーにより見かけの分子サイズが糸球体濾過限界値を超えて大きくなる結果としての、腎クリアランスの回避、及び／又は細胞クリアランス機構の回避に因る、インビボでの顕著に改善された循環中の半減期；（ｂ）ＰＥＧが付着した分子の低減された抗原性及び免疫原性；（ｃ）改善された薬物動態；（ｄ）コンジュゲートタンパク質のタンパク分解に対する増強された抵抗性；及び（ｅ）ＰＥＧ化ポリペプチドの改善された熱的及び機械的安定性。
【００２３】
本発明の別の目的は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする単離され、合成の又は組換えの核酸に関する。
【００２４】
典型的には、該核酸は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり、これは任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターに含められ得る。「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語はビヒクルを意味し、これによってＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、よって、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる。
【００２５】
よって、本発明の別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００２６】
このようなベクターは、被験体への投与時に該ポリペプチドの発現を引き起こす又は指令するための、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を含んでいてもよい。該ベクターはさらに、１つ又はいくつかの複製起点及び／又は選択マーカーを含んでいてもよい。プロモーター領域は、コード配列に対して同種であっても異種であってもよく、インビボでの使用を含む、任意の適切な宿主細胞において、遍在的で構成的で調節された及び／又は組織特異的な発現を与え得る。プロモーターの例としては、細菌性プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーター等）、ウイルス性プロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥ等）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫ等）等が挙げられる。プラスミドの例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等が挙げられる。このような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開第９４／１９４７８号に見い出され得る。
【００２７】
本発明の別の目的は、本発明による核酸及び／又はベクターによってトランスフェクトされ、感染され、又は形質転換された細胞に関する。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味し、これによって、宿主細胞は導入遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容しかつ発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００２８】
本発明の核酸は、適切な発現系において本発明の組換えポリペプチド又は融合タンパク質を産生するために使用され得る。「発現系」という用語は、適切な条件下、例えば、ベクターによって担持され宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。
【００２９】
一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が挙げられるがこれらに限定されない。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、又はサッカロマイセス（Saccharomyces）酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）並びに初代又は確立された哺乳動物細胞培養液（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生）が挙げられる。
【００３０】
本発明はまた、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を発現している組換え宿主細胞を産生するための方法に関し、該方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボで、上記のような組換え核酸又はベクターをコンピテントな宿主細胞に導入すること、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボで得られた組換え宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）場合により、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を発現する及び／又は分泌する細胞を選択することからなる工程を含む。このような組換え宿主細胞を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質を産生し得る。
【００３１】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）本発明による形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチド又は融合タンパク質の発現を可能とするに適した条件下で培養すること；及び（ｉｉ）発現されたポリペプチド又は融合タンパク質を回収することからなる工程を含む。
【００３２】
実施態様によっては、本発明は、本発明の融合タンパク質の二量体からなるＩＬ−１５アンタゴニストに関する。本発明によるＩＬ−１５アンタゴニストは、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞によって得ることができる。典型的には、本発明によるＩＬ−１５アンタゴニストは、実施例１に記載のプロトコールに従って産生され得る。
【００３３】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質、及びアンタゴニストは、自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置を含む治療目的に特に適している。
【００３４】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストの用量を投与し、これによりＩＬ−１５依存性免疫応答を調節することによって、患者における免疫応答を抑制する方法に関する。
【００３５】
この方法は、以下を含むがこれらに限定されない、自己免疫疾患を患う患者を処置するために使用され得る：（１）リウマチ性疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合性結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群又はベーチェット病、（２）ＩＩ型糖尿病、（３）甲状腺の自己免疫疾患、例えば橋本甲状腺炎又はグレーブス病、（４）中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、重症筋無力症、又は脳脊髄炎、（５）様々な天疱瘡、例えば尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉性天疱瘡、シネア・アッシャー症候群、又はブラジル天疱瘡、（６）乾癬、及び（７）炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎、又はクローン病）。
【００３６】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質又はアンタゴニストの投与はまた、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の処置にも有用であり得る。
【００３７】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質又はアンタゴニストのための別の信頼できる用途としては、後期ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ球向性ウイルス）Ｉにより誘発された成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫の処置が挙げられる。Burton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4935 (1994)を参照されたい。
【００３８】
同様に、該方法は、生物学的材料、例えば臓器、組織、又は細胞の移植片の移植を受けた患者を処置するために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストは、移植片（同種移植片又は異種移植片）生着を促進するのに、及び移植片対宿主病の患者を処置するのに特に適し得る。
【００３９】
典型的には、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストは、典型的には、治療有効量で投与される。「治療有効量」によって、あらゆる医療的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を処置及び／又は予防するための本発明の融合タンパク質又はアンタゴニストの十分量を意味する。本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される疾患及び疾患の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；医学分野において周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルより低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは当該分野の技術範囲内で周知である。しかし、製品の１日用量は、成人１人あたり０．０１〜１，０００mg/日と幅広い範囲で変動し得る。好ましくは、該組成物は、処置される患者への投与量の症候による調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの活性成分を含む。医薬品は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、０．０００２mg/kg（体重）/日から約２０mg/kg（体重）/日、特に、約０．００１mg/kg（体重）/日から７mg/kg（体重）/日の投与量レベルで供給される。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、アテローム性動脈硬化症の予防又は処置のための、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストを含む医薬組成物に関する。
【００４１】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の種類の製剤化補助剤を指す。
【００４２】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストを、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【００４３】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与剤形としては、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、及び直腸投与剤形が挙げられる。
【００４４】
好ましくは、医薬組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は、場合に応じて滅菌水又は生理的食塩水の添加時に注射液の形成を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。
【００４５】
注射用途に適した剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保存されていなければならない。
【００４６】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、及び油中においても調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
【００４７】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストを中性形又は塩形の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは、例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄等の無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導され得る。
【００４８】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、適切なその混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、該組成物に、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【００４９】
無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分からの必要とされる他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前の滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末が得られる。
【００５０】
製剤時に、溶液を、投与製剤と適合する方法で、治療有効量で投与する。該製剤は、様々な剤形で、例えば上記の注射液の形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。
【００５１】
水溶液での非経口投与のために、例えば、該溶液を必要であれば適切に緩衝化し、液体希釈剤をまず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することのできる無菌水性媒体は、本開示を鑑みて当業者には公知である。例えば、１用量を、等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下点滴療法用液 １０００mlに加えるか、又は提案される注入部位に注射し得る。投与量の幾分の変動が、処置される被験者の状態に応じて必然的に起こるだろう。投与責任者は、いずれにしても、個々の被験体に対する適切な用量を決定するだろう。
【００５２】
本発明のポリペプチド、融合タンパク質、又はアンタゴニストは、治療混合物内に製剤化されて、１用量あたり約０．０００１〜１．０mg、又は約０．００１〜０．１mg、又は約０．１〜１．０mg、又はさらには約１０mg等を含み得る。複数の用量を投与してもよい。
【００５３】
静脈内注射又は筋肉内注射等の非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る剤形としては、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【００５４】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかし、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃは、コラーゲン誘発関節炎の発症を阻害した。コラーゲンで予備刺激されたＤＢＡ／１マウスを１０個の群に無作為に分類し、２１日目に負荷し、２２日目に開始するＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ（■）又は対照のマウスＩｇＧ２Ａ（●）１．５μgの腹腔内注射を１４日間毎日行った。マウスを、体重及び疾患の進行について２日間毎又は３日間毎にモニタリングし、これは、体重（Ａ）、関節炎を有する足の数の平均値（Ｂ）、足厚の平均値（Ｃ）及び臨床スコアの平均値（Ｄ）として定量化された。数値は、平均値±標準誤差である。Ａにおける縦の線は、負荷の日を示す。Ｃでは、５匹の健康なマウスの足厚の平均値の曲線（△）が報告された。健康に対しては＊＊Ｐ＜０．０１、マウスＩｇＧ２ａに対しては＃Ｐ＜０．０５、ニューマン・コイルス多重比較検定。
【図２】ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃを用いての処置は、脾臓ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を改変させなかった。マウスの単離された脾臓リンパ球を、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ３ｅ ｍＡｂ、ＡＰＣにコンジュゲートさせた抗マウスＮＫｐ４６ ｍＡｂ、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ１１ｂ ｍＡｂ、及びフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ２７（BD Pharmingen）、又はＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ３ｅ ｍＡｂ、ＡＰＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ８ ｍＡｂ、ＰＥにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ１２２ ｍＡｂ、及びＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ４４ ｍＡｂのいずれかを使用して染色し、その後、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【図３】ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃは、関節炎が確立されたマウスにおける疾患の進行を防ぐのに効果的である。ＩＩ型コラーゲンを用いての皮内免疫化及び腹腔内への負荷後、マウスを、関節炎の発症について毎日モニタリングした。ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ（■）又は対照のＩｇＧ２ａ（●）（１．５μg/マウス/日）のいずれかを用いての処置を、個々の動物において少なくとも１の疾患重度と点数化されるとすぐに開始した。処置は１４日間継続した。マウスを、体重及び疾患の進行について毎日モニタリングし、これは、体重（Ａ）、関節炎を有する足の数の平均値（Ｂ）、足厚の平均値（Ｃ）及び臨床スコアの平均値（Ｄ）として定量化された。数値は、平均値±標準誤差である。Ａにおける縦の線は、負荷の日を示す。Ｃでは、３匹の健康なマウスの足厚の平均値の曲線（△）が報告された。Ｂ、Ｃ及びＤでは、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ対ＩｇＧ２ａについては＊＊＊Ｐ＜０．００１、マンホイットニー検定。
【図４】ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの薬物動態。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ １０mgの１回の静脈内注射を受け、血液を回収し、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ濃度を、２時間毎に測定した（ｎ＝３）。
【図５】ＮＫ細胞及びＴ細胞の恒常性に対するＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの効果。脾臓における（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ集団及び（Ｂ）ＣＤ３−ＮＫ１．１＋集団のフローサイトメトリー分析。スチューデントｔ検定を使用して、条件間を比較した；ｎｓ：有意ではない。
【００５６】
実施例１：
材料及び方法：
ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
ＩＬ−１５アンタゴニストは、Quick change部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, USA）を用いて作製された２つの拮抗性の点突然変異Ｎ６５Ｋ及びＬ６９Ｒを保持して、ＩＬ−１５と受容体のβサブユニットとの結合を消失させるように設計された。ＩＬ−１５の発現を増加させるために、コード配列の３'末端に存在するＡＴリッチ配列を、アミノ酸を変化させることなく、５’リン酸化オリゴ：アンチセンスオリゴ5'-CTCCTTGATGTTCTTCTCCTCCAGTTCCTCAC-3'（配列番号５）及びセンスオリゴ5'-TTCCTGCAGAGCTTCGTACATATTGTCCAAATGTTCATC-3'（配列番号６）を使用してＰＣＲで突然変異させた。ＩＬ−１５の生物学的活性を顕著に変化させることなく、ＩＬ−１５の溶解度を高めるために、ロイシン４５をアスパラギン酸へとＰＣＲで切り替えた。さらに、ＩＬ−１５アンタゴニストの三重突然変異体を、ＦｃγＲ及びＣ１ｑの結合にとって、並びにＩＬ−２シグナルペプチドによって駆動される発現にとって重要であるアミノ酸上で突然変異させた、工学操作されたマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域に融合させた（ｐＦｕｓｅ−ｍＩｇＧ２Ａａ１-Ｆｃ２、Invivogen、San Diego）。ＩＬ−１５ ＤＮＡフラグメントを、ｐＦｕｓｅプラスミドのＥｃｏＲＩ部位とＮｃｏＩ部位との間にライゲートし、２つのドメイン間にＡＭＶＲＳペプチドリンカーを作った。得られた発現カセットをＰＣＲで抽出し、平滑なライゲーションによって、ヒトＥＦ１αプロモーターの下流のｐＬＶ−ＥＦ１−ＭＣＳレンチウイルス発現プラスミドにさらにライゲートした。ウイルスに由来するベクターをVectalys（Labege, France）によって作製し、これを使用してＣＨＯ−Ｓ細胞に形質導入し、１０ml/LのＨＴ補助剤を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地中でさらに培養した。ＩＬ−１５アンタゴニストを、組換えＣＨＯ−Ｓ細胞の５日間培養液の上清から回収し、ＧＴＰ技術（Labege, France）によってプロテインＡセファロースカラムでアフィニティ精製し、Superdex G200でゲル濾過した。
【００５７】
ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルの誘発
６〜８週令の雄ＤＢＡ／１マウス（Janvier（登録商標））を全ての実験に使用した。ウシ気管軟骨に由来するＩＩ型コラーゲン（Sigma C1188）を、４℃の０．１M 酢酸中２mg/mlで一晩溶解した。その後、ＩＩ型コラーゲン溶液を、小さな刃を有するホモジナイザーを使用して、等容量のフロイント完全アジュバント（Difco 231131）と共に前記されているように（Ruchatz, The Journal of Immunology, 1998, 160: 5654-5660）乳化させた。コラーゲン誘発関節炎を誘発するために、ＩＩ型コラーゲン ２００μgを、ＤＢＡ／１マウスの尾の付け根に皮内注射した。免疫化から２１日後、０．０５M 酢酸中ＩＩ型コラーゲン２００μgを用いて動物の腹腔内に負荷した。
【００５８】
動物の処置
ＩＩ型コラーゲンを用いての免疫化及び続く負荷の後、２２日目から開始して、動物を２つの群に分類した：各群は、ＩｇＧ２ａ（eBioscience 14-4724）又はＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかの１日あたり１回の注射あたり１．５μgの腹腔内注射を１日１回２週間受けた。マウスを、以下の基準に基づいて関節炎の兆候について毎日評価した：等級０、正常な関節及び腫脹なし；等級１、軽度の腫脹及び／又は紅斑；等級２、顕著な浮腫、又は足若しくはいくつかの指の発赤；及び等級３、全ての足の重度な腫脹及び／又は関節強直。各々の手足について個々に等級付けを行ない、各マウスについての臨床スコアの最大値は１２であった。
【００５９】
関節炎の確立された動物の処置
ＤＢＡ／１マウスを、上記のようにＩＩ型コラーゲンを用いて免疫化及び負荷し、以下の基準に基づいて関節炎の兆候について毎日モニタリングした：：等級０、正常な関節及び腫脹なし；等級１、軽度の腫脹及び／又は紅斑；等級２、顕著な浮腫、又は足若しくはいくつかの指の発赤；等級３、全ての足の重度な腫脹；及び等級４、関節強直。動物が、１という臨床スコアの最小値を有する顕性の関節炎を発症した場合、それらを処置群に無作為に割り当て、それらにＩｇＧ２ａ又はＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質（１日あたり１回の注射あたり１．５μg）のいずれかを１４日間連続して投与した。関節炎を発症した動物のみを分析に含めた。
【００６０】
インビボでのＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞のフローサイトメトリー分析
脾臓ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ又はＩｇＧ２Ａの最後の腹腔内注射（３５日目）から１時間後にＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用することによって決定した。マウス脾臓細胞を、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ３ｅ ｍＡｂ、ＡＰＣにコンジュゲートさせた抗マウスＮＫｐ４６ ｍＡｂ、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ１１ｂ ｍＡｂ、及びフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ２７（BD Pharmingen）、又はＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ３ｅ ｍＡｂ、ＡＰＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ８ ｍＡｂ、ＰＥにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ１２２ ｍＡｂ、及びＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗マウスＣＤ４４ ｍＡｂのいずれかの飽和量（１μg/１０６個の細胞）と共にインキュベートした。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（BD Biosciences）を使用して処理した。
【００６１】
組織学的検査
足を死後に取り出し、１％パラホルムアルデヒド中で３日間かけて固定させ、５％ＥＤＴＡ中で２週間かけて脱灰し、その後、薄片を作るためにパラフィンに包埋させた。連続矢状切片を作製し、スライドガラス上にのせ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織切片を光学顕微鏡によって分析した。
【００６２】
結果
ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの作製
前臨床試験のための具体的なＩＬ−１５アンタゴニストを得るために、ヒトＩＬ１５に対応する配列を発現ベクター（GTP Technology, Labege, France）にクローニングし、ＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させ、突然変異させた後、最適化し、工学操作されたマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域に連結させた。ＩＬ−１５アンタゴニスト−ＩｇＧ２ａタンパク質を抽出し、プロテインＡセファロースアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。その分析は、ゲル濾過カラムで見かけ上２６０kDaの一本の同質なピークとして溶出した、９７％の純粋なタンパク質を示した。予想されたサイズよりも大きなこのサイズは、グリコシル化タンパク質の非定型的な挙動、又はＦｃ−二量体の二量体の存在に起因する可能性がある。１０pM ＩＬ−１５を用いて誘導された、ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおけるインビトロでの精製タンパク質のアンタゴニスト活性は、２．５nMという最大半量の濃度（ＩＣ５０）で完全な阻害を示した（示されていない）。
【００６３】
ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃでの処置は、コラーゲン誘発関節炎の重度を低減させた
フロイント完全アジュバント中ＩＩ型コラーゲンを皮内に注射されたマウスは、２１日後にコラーゲンを腹腔内に負荷された時に重度の関節炎を発症した。罹患した関節は、顕著な腫脹及び浮腫を示し、最終的には制限された可動性及び関節強直が生じた。疾患の発症は、コラーゲンによる負荷後すぐに始まった体重の減少を伴い、これは約２週間続き、その後、マウスの体重は増大した（図１Ａ及び図３Ａ）。疾患発症の重度は、ＩｇＧ２ａを受けた対照と比較して、コラーゲン負荷後の日に始めたＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ １．５μgの腹腔内注射を毎日受けたマウスにおいて顕著に減少した。ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの効果は、足厚の平均値に関して特に明白であったが（図１Ｃ）、臨床スコアの平均値に関しては可視的ではあるが有意ではなかった（図１Ｄ）。ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃを毎日２週間処置することは、マウスの脾臓における全ての成熟したＮＫｐ４６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７−ＮＫ細胞並びに全てのＣＤ８＋細胞及び記憶ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋細胞の比率に影響を及ぼさなかった（図２）。
【００６４】
進行中のコラーゲン誘発関節炎に対するＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃによる処置の治療効果
すでに関節炎の確立されたマウスにおける疾患進行に対するＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの効力を決定するために、免疫化動物の処置を、マウスが少なくとも１の臨床スコアの平均値を有する顕性の関節炎を発症した場合にのみ開始し（臨床スコアの平均値、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ群及びＩｇＧ２ａ群について、それぞれ１．２±０．４及び２．０±０．９）、その後、マウスは、ＩｇＧ２ａ又はＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ（１．５μg/日）のいずれかを１４日間腹腔内に受けた。図３Ｃ及びＤに示されているように、対照ＩｇＧ２ａを用いての処置は、関節炎の進行に影響を及ぼさなかった。対照的に、ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃを用いての処置は、処置の経過の最中及び処置後において疾患の進行を制限した（示されていない）。この治療効果は非常に有意であった（マンホイットニー検定、ｐ＜０．００１）。
【００６５】
実施例２：
材料及び方法：
マウス：
８週令のＣ５７ＢＬ／６（JANVIER LABS）を使用した。
【００６６】
インビボにおけるＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの薬物動態
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ １０mgの１回の静脈内注射後にＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの半減期を評価した。各時点で、血液を回収し（１時点あたり３匹のマウス）、遠心分離にかけ、血漿を−２０℃で保存した。ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。薬物動態パラメーターを、１−コンパートメントモデル：Ａｅ−Ｂｘを使用して計算し、ＡはＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの開始濃度（１０μg）であり、Ｂは、GraphPad Prismソフトウェアを用いて決定された。半減期Ｔ１/２＝Ｌｎ（２）／Ｂ。
【００６７】
ＥＬＩＳＡアッセイ：
血漿中のＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの量を決定するために、１．２５μg/mlの濃度のＦｃ−ＩＬ−１５Ｒα（R&D system）を捕捉分子として使用した。プレートを、１時間の間にＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ５％ミルクを用いて飽和させた。洗浄後、血清を室温で２時間かけて加えた。Ｆｃに対して指向された２５０ng/mLで希釈されたＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（INTERCHIM）を、１時間かけて加えた。洗浄後、ＴＭＢ（INTERCHIM）基質溶液を最後に加え、吸光度を分光光度法（４５０nm）によって測定した。ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの標準的な範囲を平行して実施した。
【００６８】
ＮＫ細胞及びＴ細胞の恒常性に対するＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃの効果
ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃが定常状態のＮＫ細胞及びＴ細胞の発達に対して効果を及ぼすかどうかを決定するために、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群（３匹／群）に、異なる用量のＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃ（１．５、５及び２５μg）を１日１回腹腔内注射し、５日目に屠殺した。脾臓を回収し、ＮＫ細胞（BD Biosciencs製のＦＩＴＣハムスター抗マウスＣＤ３、及びe-Bioscience製のＡＰＣ抗マウスＮＫ１．１）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（BD Biosciencs製のＦＩＴＣハムスター抗マウスＣＤ３、及びe-Bioscience製のＡＰＣ抗マウスＣＤ８α）集団を、フローサイトメトリーＣＡＬＩＢＵＲによって決定し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。
【００６９】
結果：
ＩＬ−１５ＡＮ−Ｆｃは、インビボで約１２時間の半減期を有する（図４）。異なる濃度での４日間かけてのその注射は、マウスＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の恒常性に対して全く効果を及ぼさなかった（図５）。
【００７０】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の状態を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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