(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
0006462587.tif 000042
（式中、
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のアルコキシ基を示し；
Ｒ３ａは、ベンゼン環上に存在する１価の置換基を示し；
Ｒ３ｂは、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し； 
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し； 
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ１４ａ及びＲ１５ａは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し；
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１８）（Ｒ１９）−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−、又は−Ｃ（Ｒ２２）＝Ｃ（Ｒ２３）−（式中、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す）を示し；
Ｚは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｍ１＋ｍ２は４以下であり：
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｎ１＋ｎ２は４以下であり；
ｓ１及びｓ２は、それぞれ独立に、０〜３の整数であり、但し、ｓ１＋ｓ２は３以下である。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
ｍ２及びｎ２は、それぞれ独立に、１以上である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
ｓ２が１以上である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
下記の一般式（Ｉ）：
0006462587.tif 000043
（式中、
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のアルコキシ基を示し；
Ｒ３ａは、ベンゼン環上に存在する１価の置換基を示し；
Ｒ３ｂは、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し； 
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し； 
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ１４ａ及びＲ１５ａは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し；
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１８）（Ｒ１９）−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−、又は−Ｃ（Ｒ２２）＝Ｃ（Ｒ２３）−（式中、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す）を示し；
Ｚは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｍ１＋ｍ２は４以下であり：
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｎ１＋ｎ２は４以下であり；
ｓ１及びｓ２は、それぞれ独立に、０〜３の整数であり、但し、ｓ１＋ｓ２は３以下である。）
で表される化合物を製造する方法であって、
下記の工程：
（ａ）下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を酸性条件下で亜硝酸ナトリウム及びヨウ化カリウムと反応させて下記の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程；
0006462587.tif 000044
を含む、該製造方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−１）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰの存在下で、下記の一般式（ＩＶａ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ、Ｘ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）、及び一般式（ＩＶｂ）（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ、Ｙ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程
0006462587.tif 000045
（ｃ）上記の一般式（Ｖ）の化合物を、塩化スルホン酸と反応させることにより、下記一般式（ＶＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１4ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１、ｍ２、ｎ１及びｎ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ１4ｂ、Ｒ１５ｂはスルホン基である。）を得る工程；
0006462587.tif 000046
（ｄ）一般式（ＶＩ）の化合物を保護試薬と反応させて、下記一般式（ＶＩａ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ及びＲ１５ａ、ｍ１、ｍ２、ｎ１及びｎ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、（Ｒ１４ｂ’−Ｌ）及び（Ｒ１５ｂ’−Ｌ）は、夫々、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂが保護基Ｌにより保護された基を示す）を得る工程；
0006462587.tif 000047
（ｅ−１）上記一般式（ＶＩａ）の化合物を、下記一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、前記保護基Ｌを脱離し、及び、式（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して、一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上であり、Ｒ１4ｂ、Ｒ１５ｂはスルホン基である）を得る工程； 
0006462587.tif 000048
を含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−２）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰ等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式（ＩＶｃ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕは、Ｒ１４ｂ又はＲ１４ｂに変換可能な置換基を示す）、及び一般式（ＩＶｄ）（式中Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｖは、Ｒ１５ｂ又はＲ１５ｂに変換可能な置換基を示す）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖａ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕ及びＶは、夫々、一般式（ＩＶｃ）及び（ＩＶｄ）で定義した通りである）を得る工程； 
0006462587.tif 000049
（ｅ−２）上記一般式（Ｖａ）の化合物を、下記一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、式（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して、一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上である）を得る工程（ここで、Ｕ及びＶが、夫々、Ｒ１４ｂに変換可能な置換基及びＲ１５ｂに変換可能な置換基である場合には、（ｅ−２）の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、Ｕ及びＶを、夫々、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂに変換する工程を含んでもよい）；
0006462587.tif 000050
を含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−１）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰ等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式（ＩＶａ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）、及び一般式（ＩＶｂ）（式中Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程
0006462587.tif 000051
（ｅ−３）一般式（Ｖ）の化合物を、一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｎ１及びｎ２は０である）を得る工程； 
0006462587.tif 000052
を含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項８】
プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境を検出可能な蛍光プローブであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物とＲ３ｂの置換基、及び存在する場合はリンカーを介して結合した蛍光色素を含む蛍光プローブ。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物とＲ３ｂの置換基、及び存在する場合はリンカーを介して結合した蛍光色素を含む蛍光標識試薬。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物とＲ３ｂの置換基、及び存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な近赤外蛍光化合物、その製造方法、及び当該化合物を用いた蛍光プローブに関る。
【背景技術】
【０００２】
生命現象の解明を目指す上で、生体内でリアルタイムかつ高感度に様々な事象を観測することは極めて重要であり、その中で近年、生体内での観察に適した波長領域である６５０から９００ｎｍの近赤外光領域を用いた近赤外蛍光イメージング法に注目が集まっている。これは、装置の簡便性が高く、また、放射性物質を使用しないため安全性が高いからと考えられる。そのため、近赤外蛍光イメージングに用いる近赤外蛍光プローブの開発は活発に研究されている。【０００３】
しかしながら、可視光領域の蛍光プローブと比べて近赤外光領域における蛍光プローブの開発は依然として不十分である。これは、近赤外蛍光領域における有用な蛍光制御原理の不足による。蛍光制御原理の一つとして汎用されるＦＲＥＴは、近赤外光領域においても有効な蛍光制御法であり、これを利用した近赤外蛍光プローブは多数開発されている。特に、ＦＲＥＴのａｃｃｅｐｔｏｒとして無蛍光性の消光団を利用した場合はＳ／Ｎを高くできることから、有用なプローブの開発へと繋がる。
しかしながら、ＦＲＥＴを制御機構とした場合においても、有用な近赤外光領域の消光団がないため、ＦＲＥＴ型のプローブ開発にも制限がある。従って、近赤外光領域における消光団を開発し、それを利用して様々な近赤外蛍光プローブを開発することは、生命科学の発展において非常に有用である。【０００４】
可視光領域に吸収蛍光波長を有するローダミンは、３、６位の窒素原子にフェニル基及びその誘導体を結合することによりローダミンの蛍光が消失し、長波長化することが知られている（特許文献１）。このような無蛍光性のキサンテン型化合物は消光団として汎用されている。しかしながら、その吸収波長は７００ｎｍ後半まで達しない。そのため、一般的な近赤外蛍光団であるＣｙ７やＣｙ７．５、ＩＣＧといった蛍光団の消光団としては適していなかった。【０００５】
このように近赤外光領域における蛍光プローブの母核構造として使用できる近赤外線消光団は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ００／６４９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な近赤外消光団を提供することにある。より具体的には、ローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した新規な化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ローダミンの３、６位の窒素原子にフェニル基及びその誘導体を結合したローダミン骨格を有する化合物においてキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換することで、更なる長波長化を行い、一般的な近赤外光蛍光団を消光可能な消光団の開発を目指して検討を行った。その結果、長波長化したまま無蛍光性化することができるものの、水中で徐々に吸収が減少することが観察された。そこで、この問題を解決すべく検討を行ったところ、キサンテン環９位に結合したベンゼン環の特定の位置に置換基を導入することにより、化合物の水中での安定性を向上させることができ、近赤外光領域の消光団として十分な吸収波長を有していることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
即ち、本発明は、以下に関するものである。
［１］下記一般式（Ｉ）：
0006462587.tif 000002
（式中、
Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のアルコキシ基を示し；
Ｒ３ａは、ベンゼン環上に存在する１価の置換基を示し；
Ｒ３ｂは、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し； 
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し； 
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ１４ａ及びＲ１５ａは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し；
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１８）（Ｒ１９）−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−、又は−Ｃ（Ｒ２２）＝Ｃ（Ｒ２３）−（式中、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す）を示し；
Ｚは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し；
ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｍ１＋ｍ２は４以下であり：
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数であり、但し、ｎ１＋ｎ２は４以下であり；
ｓ１及びｓ２は、それぞれ独立に、０〜３の整数であり、但し、ｓ１＋ｓ２は３以下である。）
で表される化合物又はその塩。
［２］ｍ２及びｎ２は、それぞれ独立に、１以上である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］ｓ２が１以上である、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］下記の一般式（Ｉ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ１５ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｍ１、ｍ２、ｎ１、ｎ２、ｓ１及びｓ２は、上記で定義した通りである）を製造する方法であって、
0006462587.tif 000003
下記の工程：
（ａ）下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を酸性条件下で亜硝酸ナトリウム及びヨウ化カリウムと反応させて下記の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程；
0006462587.tif 000004
を含む、該製造方法。
［５］前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−１）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰの存在下で、下記の一般式（ＩＶａ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ、Ｘ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）、及び一般式（ＩＶｂ）（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ、Ｙ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程
0006462587.tif 000005
（ｃ）上記の一般式（Ｖ）の化合物を、塩化スルホン酸と反応させることにより、下記一般式（ＶＩ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１4ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１、ｍ２、ｎ１及びｎ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ１4ｂ、Ｒ１５ｂはスルホン基である。）を得る工程；
0006462587.tif 000006
（ｄ）一般式（ＶＩ）の化合物を保護試薬と反応させて、下記一般式（ＶＩａ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ及びＲ１５ａ、ｍ１、ｍ２、ｎ１及びｎ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、（Ｒ１４ｂ’−Ｌ）及び（Ｒ１５ｂ’−Ｌ）は、夫々、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂが保護基Ｌにより保護された基を示す）；
0006462587.tif 000007
（ｅ−１）上記一般式（ＶＩａ）の化合物を、下記一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、前記保護基Ｌを脱離し、及び、式（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して、一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上であり、Ｒ１4ｂ、Ｒ１５ｂはスルホン基である）を得る工程； 
0006462587.tif 000008
を含む、［４］に記載の製造方法。
［６］前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−２）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰ等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式（ＩＶｃ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕは、Ｒ１４ｂ又はＲ１４ｂに変換可能な置換基を示す）、及び一般式（ＩＶｄ）（式中Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｖは、Ｒ１５ｂ又はＲ１５ｂに変換可能な置換基を示す）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖａ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕ及びＶは、夫々、一般式（ＩＶｃ）及び（ＩＶｄ）で定義した通りである）を得る工程； 
0006462587.tif 000009
（ｅ−２）上記一般式（Ｖａ）の化合物を、下記一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、式（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して、一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上である）を得る工程（ここで、Ｕ及びＶが、夫々、Ｒ１４ｂに変換可能な置換基及びＲ１５ｂに変換可能な置換基である場合には、（ｅ−２）の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、Ｕ及びＶを、夫々、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂに変換する工程を含んでもよい）； 
0006462587.tif 000010
を含む、［４］に記載の製造方法。
［７］前記工程（ａ）に続いて、
（ｂ−１）前記一般式（ＩＩＩ）の化合物を、酢酸パラジウム及びＢＩＮＡＰ等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式（ＩＶａ）（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）、及び一般式（ＩＶｂ）（式中Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）で表される化合物と反応させて、下記の一般式（Ｖ）で表される化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を得る工程
0006462587.tif 000011
（ｅ−３）一般式（Ｖ）の化合物を、一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３ｂ、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である）と反応させ、その後、（ＶＩＩ）においてＭが存在する場合には保護基Ｍを脱離して一般式（Ｉ）で表される化合物（但し、ｎ１及びｎ２は０である）を得る工程； 
0006462587.tif 000012
を含む、［４］に記載の製造方法。
［８］プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境などを検出可能な蛍光プローブであって、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物の残基を含む蛍光プローブ。
［９］蛍光標識試薬であって、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物の残基を含む蛍光標識試薬である。
［１０］［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物の残基を、存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光プローブ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物は、水中環境下で無蛍光性であり、６５０〜９００ｎｍまでの領域で吸収波長を有し、更に、水中において安定性を有する。従って、本発明の化合物は近赤外線消光団として有用であることから、近赤外蛍光イメージング法に応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】２−Ｍｅ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（比較化合物１）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル
【図２】２−Ｍｅ−ＳＯ３Ｈ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（比較化合物２）の吸収スペクトル
【図３】２−Ｍｅ−ＳＯ３Ｈ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（比較化合物２）の吸収スペクトルの経時変化
【図４ａ】本発明の化合物１の吸収スペクトルの経時変化
【図４ｂ】本発明の化合物２の吸収スペクトルの経時変化
【図５】化合物１（右）と化合物４（左）のＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ）中での吸収スペクトル
【図６】本発明のＭＭＰプローブのＴＣＮ緩衝液の酵素反応前後（MMP-14）での吸収スペクトルと蛍光スペクトル
【図７】本発明のＭＭＰプローブのＴＣＮＢ緩衝液の酵素反応前後（MMP-9）での吸収スペクトルと蛍光スペクトル
【図８】本発明のＭＭＰプローブ（１μＭ）又はコントロールによるＨＴ−１０８０細胞のＤＩＣ及び蛍光像の測定結果
【図９】本発明のＭＭＰプローブ又はコントロールを尾静注により投与したＨＴ−１０８０腫瘍保持ヌードマウスの蛍光像の測定結果
【図１０】本発明のＭＭＰプローブ（ｎ＝５）又はコントロール（ｎ＝５）を腫瘍組織に静注したときの、組織におけるＭＭＰプローブ又はコントロールの蛍光強度の経時変化（左図）及び蛍光強度比の経時変化（右図）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、さらに好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１３】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１４】
本明細書において「アリール基」という場合は、単環性又は多環性の芳香族基を意味するが、アリール基は環構成原子としてヘテロ原子（例えば酸素原子、窒素原子、又はイオウ原子など）を１個又は２個以上有していてもよい。２個以上のヘテロ原子を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール基として、好ましくはフェニル基を用いることができる。
【００１５】
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１６】
本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
0006462587.tif 000013
【００１７】
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のアルコキシ基を示す。Ｒ１及びＲ２がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。Ｒ１、Ｒ２としては、好ましくは、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、ブチル基である。また、Ｒ１とＲ２は、同じであっても異なっていてもよい。
【００１８】
本発明においては、キサンテン環９位に結合したベンゼン環のオルト位の両方（即ち、ベンゼン環の２位及び６位）に置換基を有することが重要である。当該ベンゼン環のオルト位の両方に置換基を有さない化合物においては、近赤外光領域の消光団として十分な吸収波長を有しているものの、水中で徐々に吸収が減少することが確認された。理論に拘束されることを意図するものではないが、これは、キサンテン環９位への水分子の求核付加反応が起こっていることによるものと考えられ、ベンゼン環のオルト位の両方に置換基を導入することで、キサンテン環９位への求核攻撃を抑え、化合物の水中での安定性を向上させることが可能となる。
【００１９】
Ｒ３ａが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基はさらに任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ３ａが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３ａが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ３ａが示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ３ａが示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。さらに、Ｒ３ａが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）において、ｓ１は、０〜３の整数である。ｓ１が２以上の場合は、Ｒ３ａは同一であっても異なっていてもよい。但し、ｓ１＋ｓ２は３以下である。
【００２１】
式（Ｉ）において、Ｒ３ｂは、存在する場合はリンカーを介して蛍光団と結合することができる置換基を示す。また、ｓ２は、０〜３の整数である。ｓ２が２以上の場合は、Ｒ３ｂは同一であっても異なっていてもよい。但し、ｓ１＋ｓ２は３以下である。
後述するとおり、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素、低酸素環境など（以下、これらを「測定対象物」と呼ぶ場合がある）を特異的に測定するための蛍光プローブの母核構造、又は生体成分の蛍光標識のための蛍光標識試薬の母核構造としても極めて有用である。従って、本発明の一つの側面において、一般式（Ｉ）において、ｓ２は１以上であり、存在する場合はリンカーを介して蛍光団と結合することができる置換基を少なくとも１つ有することが好ましい。このような置換基としては、好ましくは、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、イソチオシアネート基、又はアミノ基から選択される。一般式（Ｉ）の化合物がこのような置換基を少なくとも１つ有していれば、本発明の化合物に蛍光団を容易に導入することができる。なお、存在する場合はリンカーを介して蛍光団と結合することができる置換基のベンゼン環上の置換位置はいずれの位置でもよい。
【００２２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ４及びＲ５がともに水素原子である場合、又はＲ４及びＲ５がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。
また、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ６及びＲ７がともに水素原子である場合、又はＲ６及びＲ７がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。
【００２３】
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、水酸基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１がアルキル基の場合は、当該アルキル基は無置換でも置換基を有していてもよく、置換基を有していてもよいアルキル基はＲ３について説明したものと同様である。例えば、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１がいずれも水素原子であることが好ましいが、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１のうちのいずれか１個以上が水素原子であり、残りが炭素数１〜６個のアルキル基、水酸基、又は塩素原子などのハロゲン原子であることも好ましい。
【００２４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ１２及びＲ１３がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ１２及びＲ１３が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１２又はＲ１３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ１２又はＲ１３がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００２５】
Ｒ１４ａ及びＲ１５ａは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ１４ａ及びＲ１５ａが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１４及びＲ１５が示すアルキル基は、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
【００２６】
Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示す。
【００２７】
一般式（Ｉ）において、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数である。但し、ｍ１＋ｍ２は４以下である。ｍ１が２以上の場合は、Ｒ１４ａは同一であっても異なっていてもよい。また、ｍ２が２以上の場合は、Ｒ１４ｂは同一であっても異なっていてもよい。
【００２８】
一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、０〜４の整数である。但し、ｎ１＋ｎ２は４以下である。ｎ１が２以上の場合は、Ｒ１５ａは同一であっても異なっていてもよい。また、ｎ２が２以上の場合は、Ｒ１５ｂは同一であっても異なっていてもよい。
【００２９】
一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１４ｂ、Ｒ１５ｂとして、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を導入すると、一般式（Ｉ）の化合物の水溶性を高めることができ、当該化合物を水溶性蛍光プローブとして使用することができるため好ましい。従って、本発明の１つの好ましい実施形態においては、ｍ２及びｎ２は、それぞれ独立に、１以上である、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
また、本発明のより好ましい実施形態においては、ｍ２及びｎ２は１以上の整数であり、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂの少なくとも１つの組み合わせがアルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基である。
【００３０】
一般式（Ｉ）において、Ｘ及びＹは、それぞれ独立に−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１８）（Ｒ１９）−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−、又は−Ｃ（Ｒ２２）＝Ｃ（Ｒ２３）−を示す。ここで、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１〜６個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す。Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２又はＲ２３がアルキル基の場合は、当該アルキル基は無置換でも置換基を有していてもよく、置換基を有していてもよいアルキル基はＲ３について説明したものと同様である。
【００３１】
一般式（Ｉ）において、Ｚは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示す。Ｚは、珪素原子又はゲルマニウム原子であることが好ましく、珪素原子であることが特に好ましい。
【００３２】
前述の通り、本発明は、ローダミン骨格のキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子等に置換し、更に、キサンテン環９位に結合したベンゼン環のオルト位の両方に置換基を導入した点に大きな特徴があり、従来技術からは着想し得なかったものである。即ち、理論に拘束されることを意図するものではないが、キサンテン環部位の１０位が酸素原子であるローダミン化合物においては、キサンテン環のＬＵＭＯエネルギーレベル（最低空軌道）が比較的高いためキサンテン環は比較的安定であるが、キサンテン環１０位の酸素原子を珪素原子に置換すると、キサンテン環のＬＵＭＯエネルギーレベルは酸素原子を含むローダミンのキサンテン環のＬＵＭＯエネルギーレベルより低くなり、ＬＵＭＯ係数の高いキサンテン環9位が、より求核攻撃を受けやすくなり、水分子による求核付加反応を受けキサンテン環の共役が切断され易くなる。このように、本発明は、ローダミン骨格のキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子等に置換することにより生じた問題を、キサンテン環９位に結合したベンゼン環の分子構造を制御することにより解決し得たものである。
【００３３】
一般式（Ｉ）で表される化合物は４級アンモニウム塩を形成するように適宜の対イオンＸを有していてもよい。対イオンとしては、例えばハロゲンイオン、シアンイオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオンなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。一般式（Ｉ）で表される化合物は４級窒素カチオンと分子内に存在する酸性基（例えばカルボキシル基やスルホ基）などと分子内対イオンを形成していてもよい。また、一般式（Ｉ）で表される化合物は塩の形態で存在することもできる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができ、酸付加塩としては塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩や、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３４】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００３５】
本発明の化合物の合成方法
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、例えば以下の方法により合成することができる。ここで、一般式（Ｉ）においてｍ２及びｎ２が１以上である化合物は合成スキーム１により、ｍ２及びｎ２が０である化合物（化合物（Ｉａ）ともいう）は合成スキーム２により、合成することができる。なお、以下の合成法においては、一般式（Ｉ）のＲ８とＲ１０、Ｒ９とＲ１１、ＸとＹ、Ｒ１４ａとＲ１５ａ、Ｒ１４ａとＲ１５ｂ、ｍ１とｎ１は同一である。
【００３６】
合成スキーム１
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0006462587.tif 000015
【００３７】
（１）工程（ａ）
一般式（II）の化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を、塩酸等の酸性水溶液と有機溶媒の混合溶媒に溶解し、０℃程度に冷却し、そこへ、１〜２当量のＮａＮＯ２水溶液を滴下し、所定時間撹拌後、１〜１０当量のヨウ化カリウムの水溶液を添加して反応させることにより、一般式（III）の化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ１２及びＲ１３は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を合成することができる。
【００３８】
（２）工程（ｂ−１）
一般式（III）の化合物をトルエン等の有機溶媒に溶解し、一般式（IVa）の化合物（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を１〜２当量及びＣｓＣＯ３を添加した後、アルゴン雰囲気下で、ＢＩＮＡＰ及び酢酸パラジウムを添加し、１００℃程度の温度で所定時間反応させることにより、一般式（V）の化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｍ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を合成することができる。
なお、一般式（VIa）の化合物とともに、一般式（IVb）の化合物（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を加えて反応させる、もしくは、(IVa)と反応後、中間体を粗精製し、再度（IVb)と同条件で反応させることで、一般式（Ｉ）のＲ８とＲ１０、Ｒ９とＲ１１、ＸとＹ、Ｒ１４ａとＲ１５ａ、Ｒ１４ａとＲ１５ｂ、ｍ１とｎ１が同一でない化合物を合成することもできる。
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【００３９】
（３）工程（ｃ）
一般式（V）の化合物をクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、氷浴上で０℃程度に冷却した後、塩化スルホン酸と反応させることにより一般式（VI）の化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１５ｂ、ｍ１、ｍ２、ｎ１及びｎ２は、一般式（Ｉ）で定義した通りである）を合成することができる。
【００４０】
（４）工程（ｄ）
一般式（V）の化合物をイソプロパノールなどのアルコール系溶媒に溶解し、スルホン酸基などのイオン性基を保護する試薬（例えば、オルト蟻酸トリイソプロピル等）を１〜１０当量添加し、６０〜８０℃で所定時間反応させることにより、一般式（VIa）の化合物を合成することができる。
【００４１】
（５）工程（ｅ−１）
一般式（VII）の化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である。保護基としては、例えば、ｔ−ブチル基、オキサゾリン基が挙げられる）の２〜１０当量を脱水ＴＨＦなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、２〜１０当量のｓｅｃ−ブチルリチウムＴＨＦ溶液を添加、その後一般式（VIa）の化合物のＴＨＦ溶液を添加し、所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式（I）の化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上であり、Ｒ１4ｂ、Ｒ１５ｂはスルホン基である）を合成することができる。
ここで、Ｒ３ｂの保護基Ｍが存在する場合には、塩酸溶液等を加え、加熱還流することにより、保護基Ｍを脱離する。
【００４２】
合成スキーム２
工程（ａ）は合成スキーム１と同じである。
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【００４３】
工程（ｂ−２）
一般式（III)の化合物をトルエン等の有機溶媒に溶解し、一般式（IVc）の化合物（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１４ａ及びｍ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕは、Ｒ１４ｂ又はＲ１４ｂに変換可能な置換基を示す）１〜２当量及び一般式（IVd)の化合物（式中Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５ａ及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｖは、Ｒ１５ｂ又はＲ１５ｂに変換可能な置換基を示す）１〜２当量及びＣｓＣＯ３を添加した後、アルゴン雰囲気下で、ＢＩＮＡＰ及び酢酸パラジウムを添加し、１００℃程度の温度で所定時間反応させることにより、一般式（Va）の化合物（式中、Ｒ４〜Ｒ１３、Ｒ１４ａ、Ｒ１５ａ、ｍ１及びｎ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｕ及びＶは、夫々、一般式(IVc)及び(IVd)で定義した通りである）を合成することができる。
ここで、Ｕ、ＶのＲ１４ｂ又はＲ１５ｂに変換可能な置換基としては、例えば、カルボニル基、ハロゲン基、リン酸エステル基、スルホン酸エステル基が挙げられる。
【００４４】
工程（ｅ−２）
一般式（VII）の化合物（式中、Ｒ１〜Ｒ３、ｓ１及びｓ２は、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、Ｍは、存在する場合はＲ３ｂの保護基である。保護基としては、例えば、ｔ−ブチル基、オキサゾリン基が挙げられる）を２〜１０当量脱水ＴＨＦなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、２〜１０当量のｓｅｃ−ブチルリチウムを添加後、一般式（Va）の化合物のＴＨＦ溶液を添加し所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式（I）の化合物（但し、ｍ２及びｎ２は１以上である）を合成することができる。
ここで、Ｒ３ｂの保護基Ｍが存在する場合には、工程（ｅ−１）に記載した方法と同様にして保護基Ｍを脱離する。
また、Ｕ及びＶが、夫々、Ｒ１４ｂに変換可能な置換基及びＲ１５ｂに変換可能な置換基である場合には、（ｅ−２）の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、Ｕ及びＶを、夫々、Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂに変換する工程を含んでもよい。Ｒ１４ｂ及びＲ１５ｂに変換するには、例えば、エステル保護基の加水分解反応などがある。
【００４５】
合成スキーム３
工程（ａ）〜（ｂ）は合成スキーム１と同じである。
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【００４６】
工程（ｅ−３）
一般式（VII）の化合物を２〜１０当量、脱水ＴＨＦなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、２〜１０当量のｓｅｃ−ブチルリチウムＴＨＦ溶液を添加し、その後一般式（V）の化合物のＴＨＦ溶液を添加し、所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式（Ia）の化合物を合成することができる。
ここで、Ｒ３ｂの保護基Ｍが存在する場合には、工程（ｅ−１）に記載した方法と同様にして保護基Ｍを脱離する。
【００４７】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、消光団骨格として極めて有用である。従って、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、好ましくはリンカーを介して、蛍光色素と結合させることにより、プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素など（以下、これらを「測定対象物」と呼ぶ場合がある）を特異的に測定するための蛍光プローブの母核構造として使用することができる。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、好ましくはリンカーを介して、蛍光色素と結合させることにより、生体成分の蛍光標識のための蛍光標識試薬の母核構造として使用することができる。このような蛍光プローブは、酵素反応などによって蛍光色素と消光団の結合が切断され活性な蛍光色素が形成され、この蛍光色素による蛍光を測定することにより様々な酵素反応等の検出が可能となる。
【００４８】
例えば、プロトン、金属イオン、活性酸素種、又は酵素などを検出可能な蛍光プローブを製造するにあたり、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を利用することが可能である。また、生体成分の蛍光標識のための蛍光標識試薬を製造するにあたり、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を利用することができる。
従って、本発明の一つの実施態様は、プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境などを検出可能な蛍光プローブであって、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう一つ別の実施態様は、蛍光標識試薬であって、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を含む蛍光標識試薬である。
本明細書において「残基」の用語は、一般式（Ｉ）で表される化合物から１個又は２個以上の水素原子を除いた残りの化学構造を意味している。
【００４９】
本発明のもう一つ別の側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を、存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう一つ別の側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物の残基を、存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光標識試薬である。
【００５０】
本発明においては、蛍光色素として、従来公知の近赤外蛍光色素を使用することができる。このような近赤外蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ７．５、ＩＣＧ、Ｄｙ７３０、ＤＹ７５０、ＤＹ７８０（Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、 Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７９０（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などが挙げられる。
【００５１】
リンカーは、一般式（Ｉ）で表される化合物が近赤外蛍光色素に対して消光団として作用することができるように選択されるが、この性質を有している限り、リンカーの種類は特に限定されることはない。リンカーは炭素原子のみからなるリンカーであってもよいが、窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子などのヘテロ原子を１個又は２個以上含むリンカーでもよい。リンカーは直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるものであってもよい。例えば、リンカーの連結原子数は１から９個程度であり、１から６個程度であることが好ましい。本明細書において、リンカーの連結原子数とは、リンカーの一方の末端の原子から他方の末端の原子に至る最短経路に含まれる原子個数を意味する。リンカーは１又は２個以上の置換基を有していてもよい。
【００５２】
一般式（Ｉ）の化合物がリンカーを介して近赤外蛍光色素と結合する場合は、Ｒ３ｂの少なくとも１つは、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基又はアミノ基から選択される置換基であることが好ましい。このとき、一般式（Ｉ）の化合物とリンカーとの結合様式は特に限定されるものではないが、例えばアミド結合、エステル結合、スルホアミド結合などが挙げられる。
Ｒ３ｂの少なくとも１つがこのような置換基であれば、本発明の化合物に蛍光団を容易に導入することができる。
【００５３】
リンカーの一例として、例えば、アルキルリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、ペプチドリンカー、ＤＮＡリンカー、ＲＮＡリンカー等のリンカーを挙げることができる。
【００５４】
本発明の蛍光プローブの測定対象物として、金属イオンとしては、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなどを挙げることができる。活性酸素種としては、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、スーパーオキシド、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸などを挙げることができる。また、酵素としては、カテプシン、エラスターゼ、ＭＭＰなどを挙げることができる。また、本発明の蛍光標識試薬の測定対象物としては、ＧＳＨやシステインなどの生体成分を挙げることができる。もっとも、測定対象物はこれらに限定されることはない。
【００５５】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれる観察対象酵素の活性測定や、生細胞内での酵素活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む蛍光プローブは、活性酸素種、例えば、Ｈ２Ｏ２、−ＯＣｌ、ＯＮＯＯ−、Ｏ２−、ヒドロキシラジカルの測定に好適に用いることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。【００５７】
［比較例１］
以下の合成スキーム３により、比較化合物１を合成した。【００５８】
合成スキーム４
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【００５９】
（１）Ｉ−Ｓｉ−キサントンの合成
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ＮＨ２−Ｓｉ−キサントン（２２８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を２ＮＨＣｌ水溶液４ｍＬとアセトニトリル４ｍＬに溶解し、氷浴上で０℃に冷却した。そこに、水１ｍＬに溶解させたＮａＮＯ２（１４０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下した。３０分間撹拌後、水２ｍＬに溶解させたＫＩ（２．８２ｇ、８．５０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら滴下した。１時間撹拌後、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて化合物を抽出し、有機層の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２）にて精製し、Ｉ−Ｓｉ−キサントン（７２ｍｇ、収率１７％）を得た。【００６０】
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ 0.51 (s, 6H), 7.92 (dd, J = 8.10 Hz, J = 1.50 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 8.10 Hz, 2H). 13C NMR (300MHz, DMSO): δ -1.65, 101.8, 131.8, 131.4, 139.5, 139.5, 140.9, 141.8, 187.0.【００６１】
（２）インドリン−Ｓｉ−キサントンの合成
0006462587.tif 000021
Ｉ−Ｓｉ−キサントン（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬシュレンク管に入れ、トルエン１０ｍＬに溶解させた。そこに、インドリン（２８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（７８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、脱気後、アルゴン置換した。アルゴン雰囲気下で、ＢＩＮＡＰ（７．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＯＡＣ）２（２．６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加し、１００℃で一晩撹拌した。濾過後、溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝８／２）にて精製し、インドリン−Ｓｉ−キサントン（３１ｍｇ、収率５４％）を得た。【００６２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ 0.52 (s, 6H), 3.20 (t, J = 8.10 Hz, 4H), 4.10 (t, J = 8.10 Hz, 4H), 6.86 (t, J = 7.50 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 7.50 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 7.20 Hz, 2H), 7.31-7.37 (m, 4H), 7.42 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 8.47 (d, J = 9.00 HZ, 2H); 13C NMR (300MHz, DMSO):δ -1.20, 28.1, 51.8, 109.6, 117.6, 119.1, 120.3, 125.4, 127.2, 131.5, 132.1, 133.0, 140.4, 145.4, 146.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 473.2049; found, 473.2007 (−4.2 mmu).【００６３】
（３）２−Ｍｅ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（比較化合物１）の合成
0006462587.tif 000022
【００６４】
インドリン−Ｓｉ−キサントン（４４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、アルゴン置換し、８０℃で加熱還流した。その中に、１Ｍｏ−トリルマグネシウムブロミドのＴＨＦ溶液１ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で３時間加熱還流した。その後、室温に戻し、２ＮＨＣｌ溶液を加え、１５分撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で溶出後、溶媒を除去し、ＨＰＬＣにて精製し、２−Ｍｅ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（１５ｍｇ、収率３０％）を得た。【００６５】
1H NMR (300 MHz, CD3CN):δ 0.65 (s, 6H), 2.16 (s, 3H), 3.26 (t, J = 8.10 Hz, 4H), 4.32 (t, J = 8.10 Hz, 4H), 7.12-7.49 (m, 16H), 7.57(d, J = 8.10 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 2.40 Hz, 2H); 13C NMR (300MHz, CDCl3):δ -1.5, -1.1, 19.5, 28.2. 53.1, 114.5, 117.2, 124.0, 125.6, 126.4, 127.8, 128.9, 129.2, 130.4, 130.5, 135.5, 135.7, 138.1, 141.7, 142.0, 148.8, 149.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 547.2570; found, 547.2536 (−3.4 mmu).【００６６】
（４）２−Ｍｅ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１の吸収蛍光プロファイル
１Ｍの比較化合物１についてＰＢＳ、メタノール、ＤＭＦおよびクロロホルムの溶液（共溶媒としてそれぞれ０．１％のＤＭＳＯを含有）について、吸収スペクトル及び蛍光スペクトル（励起波長７６０ｎｍ）を測定した。その結果を図１に示す。また、比較化合物１について得られた光物理特性を表１に示す。【００６７】
0006462587.tif 000023
* For determination of the quantum efficiency of the fluorescence (φfl), ICG in DMSO (φfl = 0.13) was used as a fluorescence standard.【００６８】
２−Ｍｅ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１の吸収スペクトルは８５０ｎｍまで到達し、近赤外光領域消光団に適した波長領域に吸収スペクトルを有していた。また、水中および有機溶媒中共に蛍光量子収率は低く、０．００１以下であった。【００６９】
［比較例２］
比較化合物１にスルホン基を導入した化合物（比較化合物２）を以下の合成スキームによる合成した。【００７０】
合成スキーム５
0006462587.tif 000024
【００７１】
（１）ＳＯ３Ｈ−インドリン−Ｓｉ−キサントンの合成
0006462587.tif 000025
【００７２】
インドリン−Ｓｉ−キサントン（４００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、氷浴上で０℃に冷却した。そこにＣｌＳＯ３Ｈ（２５９ｍｇ、２０４μＬ、２．２３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下した。ＴＬＣにて反応の進行を確認後、水を加え、有機溶媒のみを減圧留去し、水槽をＨＰＬＣにて精製し、ＳＯ３Ｈ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（４６５ｍｇ、収率７４％）を得た。【００７３】
1H NMR (300 MHz, DMSO):δ 0.54 (s, 6H), 3.22 (t, J = 9.00 Hz, 4H), 4.15 (t, J= 9.00 Hz, 4H), 7.29 (d, J = 8.70 Hz, 2H), 7.45 (dd, J = 2.40, 8.70 Hz, 2H), 7.49 (s, 2H), 7.63-7.66 (m, 4H), 8.37 (d, 8.70 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3):δ -1.44, 27.1, 51.7, 108.1, 117.5, 119.5, 122.9, 125.1, 130.8, 131.8, 132.1, 140.1, 140.5, 144.9, 145.7, 183.6; HRMS (ESI−): Calcd for [M−H]−, 630.0951; found, 630.0991 (+4.0 mmu).【００７４】
（２）ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントンの合成
0006462587.tif 000026
【００７５】
ＳＯ３Ｈ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬｉ−プロパノールに溶解し、オルト蟻酸トリイソプロピル２ｍＬを添加後、５５℃で４時間撹拌した。目的物が析出後、濾過し、ヘキサンで洗浄してＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（８０ｍｇ、収率７１％）を得た。【００７６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ 0.54 (s, 6H), 1.31 (d, J = 6.00 Hz, 12H), 3.27 (t, J = 8.70 Hz, 4H), 4.22 (t, J = 8.70 Hz, 4H), 4.76 (sep, J = 6.00 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 1.50, 8.10 Hz, 2H), 7.41-7.46 (m, 4H), 7.69 (s, 2H), 7.70 (dd, J = 2.40, 7.80 Hz, 2H), 8.50 (d, J = 8.10 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3):δ -1.30, 22.9, 27.4, 52.4, 108.0, 119.2, 130.8, 124.6, 127.4, 128.8, 131.7, 132.7, 134.8, 140.5, 145.1, 150.1, 184.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 717.2124; found, 717.2169 (+4.5 mmu).【００７７】
（３）２−Ｍｅ−ＳＯ３Ｈ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（比較化合物２）の合成
0006462587.tif 000027
【００７８】
ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（１３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、アルゴン置換し、８０℃で加熱還流した。１Ｍのｏ−トリルマグネシウムブロミドＴＨＦ溶液１ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を添加し、８０°Ｃで３時間加熱還流した。その後、室温に戻し、２ＮＨＣｌ溶液を加え、１００℃で３時間加熱還流した。反応溶液を室温に戻した後、ＨＰＬＣにて精製し、２−Ｍｅ−ＳＯ３Ｈ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（４ｍｇ、収率３２％）を得た。【００７９】
1H NMR (300 MHz, DMSO):δ 0.67 (s, 3H), 0.70 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 3.25 (t, J = 7.50 Hz, 4H), 4.41 (t, J = 7.50 Hz, 4H), 7.15 (d, J = 9.10 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 7.50 Hz, 1H), 7.45-7.59 (m, 11H), 7.82 (d, J = 2.10 Hz, 2H); HRMS (ESI-): Calcd for [M-2H]-, 705.1549; found, 705.1586 (+3.7 mmu).【００８０】
（４）２−Ｍｅ−ＳＯ３Ｈ−Ｓｉ−ＱＳＹ２１の水中での吸収蛍光プロファイル
１Ｍの比較化合物２のＰＢＳ溶液（共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含有）について、吸収スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。図２より、スルホン基の導入により吸収波長に変化は見られず、近赤外光領域の消光団として十分な吸収波長を有していることが分かる。
しかしながら、比較化合物２の吸収スペクトルの経時変化を観察したところ、図３に示すように、水中では徐々に吸収の減少が観察され、水中での不安定性が示唆された。ここで、４００ｎｍ以上の波長に消光団の吸収の減少に伴う新たな吸収の増大が観察されなかったことから、キサンテン環９位への水分子の求核付加反応が起こっていると考えられる。【００８１】
［実施例１及び２］
ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントンから、以下の合成スキームにより本発明の化合物１及び２を合成した。【００８２】
合成スキーム６
0006462587.tif 000028
【００８３】
（１）２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（化合物１）の合成
0006462587.tif 000029
【００８４】
アルゴン置換下、２−ブロモ−ｍ−キシレン（２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、−７８℃に冷却した。その後、撹拌しながら１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉＴＨＦ溶液を１５０μＬ添加した。３０分撹拌後、ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（１１ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、添加した。添加後室温に戻し、６０℃に加熱し、２時間撹拌した。撹拌後、２ＮＨＣｌ溶液を加え、２時間加熱還流を行い、有機溶媒を減圧留去した後に、ＨＰＬＣにて精製し、２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（５ｍｇ、収率４６％）を得た。【００８５】
1H NMR (300 MHz, DMSO):δ 0.70 (s, 6H), 2.05 (s, 6H), 3.33 (br, 4H), 4.43 (t, 6.60 Hz, 4H), 7.27-7.43 (m, 7H), 7.62 (d, J = 8.70 Hz, 2H), 7.75-7.84 (m, 6H); HRMS (ESI−): Calcd for [M−2H]−, 719.1706; found, 709.1702 (−0.4 mmu).【００８６】
（２）２，６−ｄｉＯＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（化合物２）の合成
0006462587.tif 000030
【００８７】
アルゴン置換下、２，６−ジメトキシブロモベンゼン（３２．６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、−７８℃に冷却した。その後、撹拌しながら１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉＴＨＦ溶液を１５０μＬ添加した。３０分撹拌後、ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（１４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、添加した。添加後室温に戻し、６０℃に加熱し、２時間撹拌した。撹拌後、２ＮＨＣｌ溶液を加え、２時間加熱還流を行い、有機溶媒を減圧留去した後に、ＨＰＬＣで精製し、２，６−ｄｉＯＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１（６ｍｇ、収率４１％）を得た。【００８８】
1H NMR (300 MHz, DMSO):δ 0.66 (s, 6H), 3.24 (t, J = 7.50 Hz, 4H), 3.66 (s, 6H), 4.39 (t, J = 7.50 Hz, 4H), 6.93 (d, J = 8.70 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 9.60 Hz, 2H), 7.43 (dd, J = 2.10, 9.60 Hz, 2H), 7.49-7.61 (m, 7H), 7.78 (d, J = 2.10 Hz, 2H); HRMS (ESI-): Calcd for [M−2H]−, 751.1604; found, 751.1567 (−3.7 mmu).【００８９】
（３）化合物１及び２の吸収プロファイル
化合物１及び２のＰＢＳ溶液（共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含有）について、吸収スペクトルの経時変化を測定した。その結果を図４ａ及び図４ｂに示す。
図４で示すように、化合物１及び２は共に水中での吸収の減少は観察されなかった。この結果より、キサンテン環9位に結合したベンゼン環のオルト位に置換基を導入することで、キサンテン環9位への求核攻撃を抑え、化合物の水中での安定が向上したと考えられる。【００９０】
［実施例３］
ＳＯ３Ｈ−インドリン−Ｓｉ−キサントンから以下の合成スキームにより化合物３を合成した。【００９１】
合成スキーム７
0006462587.tif 000031
a) 2-(4-bromo-3,5-dimethoxyphenyl)-4,4-dimethyl-4,5-dihydrooxazole, sec-BuLi, THF, 60 °C, ii) 2N HClaq, acetone, reflux, 2 days, y. 60%【００９２】
２，６−ｄｉＯＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１  ＣＯＯＨ（化合物３）の合成
アルゴン置換下、２−（４−ブロモ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロオキサゾール（６５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、−７８℃に冷却した。その後、撹拌しながら１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉＴＨＦ溶液を２１０μＬ添加した。３０分撹拌後、ＳＯ３ｉＰｒ−インドリン−Ｓｉ−キサントン（３０ｍｇ、０．０４２ ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、添加した。添加後室温に戻し、６０℃に加熱し、２時間撹拌した。撹拌後、６ＮＨＣｌ溶液を加え、２時間加熱還流を行い、有機溶媒を減圧留去した後に、ＨＰＬＣで精製し、化合物３（２，６−ｄｉＯＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン−Ｓｉ−ＱＳＹ２１  ＣＯＯＨ）（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。【００９３】
［実施例４］
以下の合成スキームにより本発明の化合物４を合成した。
0006462587.tif 000032
合成スキーム８
0006462587.tif 000033
【００９４】
（１）テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントンの合成
0006462587.tif 000034
【００９５】
Ｉ−Ｓｉ―キサントン（２４５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬシュレンク管に入れ、トルエン１０〜２０ｍＬに溶解させた。そこに、テトラヒドロキノリン（１．３３ｇ、２．００ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（３．２５ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を添加し、脱気後、アルゴン置換した。アルゴン雰囲気下で、ＢＩＮＡＰ（６２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＯＡｃ）２（２２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、１００℃で一晩撹拌した。溶液を室温に戻した後に水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を除去した。その後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１／１）にて精製し、テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（１５０ｍｇ、収率６０％）を得た。【００９６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.43 (s, 6H), 2.06 (qt, J = 6.0 Hz, 4H), 2.82 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.74 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 6.87 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.04 (dt, J = 1.5, 8.7 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.34 (dd, J = 3.0, 9.0 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 8.39 (d, J = 8.7 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ-1.43, 23.6, 27.4, 49.1, 118.7, 120.9, 121.8, 123.6, 126.3, 128.4, 129.3, 131.3, 134.1, 140.2, 142.1, 150.4, 185.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 501.2362; found, 501.2412 (+5.0 mmu).【００９７】
（２）ＳＯ３Ｈ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントンの合成
0006462587.tif 000035
【００９８】
テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、氷浴上にて０℃に冷却した。そこにＣｌＳＯ３Ｈ（１８２μＬ）を滴下し、溶液を２時間、０℃で撹拌した。その後、水を加えて反応を止めた後に、減圧留去によってＣＨ２Ｃｌ２を除き、残った水溶液をＨＰＬＣにて精製し、ＳＯ３Ｈ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（７８ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。【００９９】
1H NMR (300 MHz, DMSO): δ0.46 (s, 6H), 1.97 (q, J = 6.0 Hz, 4H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.74 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 7.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.38-7.42 (m, 4H), 7.55 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, DMSO): δ-1.6, 23.1, 26.9, 38.7, 38.9, 39.2, 39.5, 39.8, 40.1, 40.3, 48.8, 117.2, 121.5, 123.7, 123.8, 126.7, 127.4, 130.5, 133.2, 140.3, 141.7, 149.9, 183.8; HRMS (ESI-): Calcd for [M-H]-, 658.1264; found, 658.1243 (-2.1 mmu).【０１００】
（３）ＳＯ３ｉＰｒ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントンの合成
0006462587.tif 000036
【０１０１】
ＳＯ３Ｈ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（６６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を３．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１．０ｍＬのＤＭＦの混合液に溶解させた後に、アルゴン雰囲気下、０℃に冷却した。その溶液に、塩化オキサリル（８５μＬ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を２時間撹拌した。その後、溶媒を減圧留去し、残渣をアルゴン雰囲気下ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。そこに１５ｍＬのピリジンと５．０ｍＬのｉ−プロパノールを加え、混合液を室温で２時間撹拌した。その後、溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル＝１／１）にて精製し、ＳＯ３ｉＰｒ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（２６ｍｇ、収率３５％）を得た。【０１０２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.48 (s, 6H), 1.31 (d, J = 6.6 Hz, 12H), 2.14 (tt, J = 6.0 Hz, 4H), 2.93 (t, J = 6.00 Hz, 4H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 4.75 (sep, J = 6.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42-7.50 (m, 6H), 7.62 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 8.47 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ-1.47, 22.2, 22.9, 27.5, 50.4, 115.4, 125.3, 125.4, 126.3, 126.5, 127.5, 129.3, 131.8, 136.8, 140.8, 147.5, 149.4, 185.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 767.2257; found, 767.2210 (-4.7 mmu).【０１０３】
（４）２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈテトラヒドロキノリン―Ｓｉ―ＱＳＹ２１（化合物４）の合成
0006462587.tif 000037
【０１０４】
アルゴン置換下、２−ブロモーｍ―キシレン（２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、−７８ｏＣに冷却した。その後、撹拌しながら１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉＴＨＦ溶液（１５０μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。３０分撹拌後、ＳＯ３ｉＰｒ―テトラヒドロキノリン―Ｓｉ―キサントン（１１ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ２．０ｍＬに溶解させ、添加した。添加後室温に戻し、２時間撹拌した。撹拌後、２ＮＨＣｌ溶液を加え反応を止めた後に、さらに１５分間撹拌した。その後、ＣＨ２Ｃｌ２にて抽出後、有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、減圧留去した。残渣を２ＮＨＣｌとアセトニトリルの混合液に溶解し、溶液をアルゴン雰囲気下で加熱還流した。溶液を室温に戻した後に、その溶液をＨＰＬＣにて精製し、２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈテトラヒドロキノリン―Ｓｉ―ＱＳＹ２１（６ｍｇ、収率５４％）を得た。【０１０５】
1H NMR (300 MHz, DMSO): δδ0.58 (s, 6H), 1.98 (br, 10H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 4.01 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 7.04 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 2.4, 9.3 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.36-7.47 (m, 5H), 7.53 (s, 2H), 7.81 (d, J = 2.1 Hz, 2H); HRMS (ESI-): Calcd for [M-2H]-, 747.2019; found, 747.2051 (+3.2 mmu). HPCL analysis; eluent, a 20-min linear gradient, from 1% to 100% solvent B; flow rate, 1.0 ml/min; detection wavelength, 650 nm.【０１０６】
２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈインドリン―Ｓｉ―ＱＳＹ２１（化合物１）と２，６−ｄｉＭｅ−ＳＯ３Ｈテトラヒドロキノリン―Ｓｉ―ＱＳＹ２１（化合物４）のＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ）中での吸収スペクトルを図５に示す。化合物１の極大吸収波長は７６３ｎｍであり、化合物４の極大吸収波長は７３２ｎｍであった。【０１０７】
［実施例５］
ＭＭＰプローブの調製
化合物３を用いて、生体内での血中滞留性が６時間程度は確認されているＰＥＧ１１をＣ末端に結合させたプローブを合成し、動物個体への応用を検討した(Zhu, L., et al, Theranostics, 2011, 1, 18-27)。また、本プローブにおいてはＮ末端側に蛍光団（Ｄｙ７２０）を結合させた。リンカーは広範なＭＭＰにより認識されると考えられている配列であるＰＬＧＶＲＧを使用した。また、コントロールとして同時にＤ体のアミノ酸を用いたプローブを合成した。
ＭＭＰプローブの構造と合成スキームを以下に示す。【０１０８】
ＭＭＰプローブ（Ｓｉ−ＱＳＹ７８０）の構造
0006462587.tif 000038
【０１０９】
合成スキーム９
0006462587.tif 000039
a) Ac2O, pyridine, crude; b) TFA, CH2Cl2, crude.【０１１０】
（１）Ｎ−（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル）アセトアミドの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル)カルバメート（１ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を無水酢酸２ｍＬ、ピリジン２ｍＬの混合溶媒に溶解させ、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、トリフルオロ酢酸２ｍＬを添加し、４時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、Ｎ−（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル）アセトアミド（１．２ｇ、quant）を得た。HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 587.3755; found, 687.3708 (-4.7 mmu).【０１１１】
合成スキーム１０
0006462587.tif 000040
a) DY730-SE, DIEA, DMF, crude; b) TFA, triethylsilane, H2O, crude ; c) SulfoSiQSY780-SE, DIEA, DMF, y.7% (in 3steps); d) 3, HATU, DIEA, DMF, y.５１%. 【０１１２】
（２）ＭＭＰプローブの合成
ＤＹ７３０−ＳＥ（２０ｍｇ）とペプチドリンカー（２０ｍｇ）をＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、そこにＤＩＥＡを３滴滴下後、４時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、ＴＦＡ２ｍＬ、トリエチルシラン１０μＬ、水１０μＬの混合溶媒に溶解させ、２時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、ＨＰＬＣで粗精製を行った。目的物の分画を凍結乾燥し、得られた固体をＤＭＦ１ｍＬに溶解させ、ｓｕｌｆｏＳｉＱＳＹ０−ＳＥ（５．２ｍｇ）を添加し、ＤＩＥＡ３滴滴下後、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ＨＰＬＣで精製し、中間体（５ｍｇ、収率７％）LRMS (ESI+): 1120 [M]2+を得た。これをＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、Ｎ−（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル）アセトアミド（１５ｍｇ、）を添加し、ＨＡＴＵ（３８ｍｇ）添加後、室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ＨＰＬＣで精製し、ＭＭＰプローブ（３．２ｍｇ、収率５１％）を得た。LRMS (ESI+): 1404 [M]2+【０１１３】
合成スキーム１１
0006462587.tif 000041
a) DY730-SE, DIEA, DMF, crude; b) TFA, triethylsilane, H2O, crude; c) SulfoSiQSY780-SE, DIEA, DMF, y.7% (3steps); d) PEG11, HATU, DIEA, DMF, y.８７%.【０１１４】
（３）コントロールＭＭＰプローブの合成
ＤＹ７３０−ＳＥ（２０ｍｇ）とコントロールペプチドリンカー（２０ｍｇ）をＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、そこにＤＩＥＡを３滴滴下後、４時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、ＴＦＡ２ｍＬ、トリエチルシラン１０μＬ、水１０μＬの混合溶媒に溶解させ、２時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、ＨＰＬＣで粗精製を行った。目的物の分画を凍結乾燥し、得られた固体をＤＭＦ１ｍＬに溶解させ、sulfoSiQSY0-SE(5.2 mg, )を添加し、ＤＩＥＡ３滴滴下後、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ＨＰＬＣで精製し、中間体（５.2 ｍｇ、収率７％）を得た。LRMS (ESI+): 995 [M]2+これをＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、Ｎ−（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル）アセトアミド（１５ｍｇ）を添加し、ＨＡＴＵ（３８ｍｇ）添加後、室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ＨＰＬＣで精製し、コントロールＭＭＰプローブ（５．４ｍｇ、収率８７％）を得た。
LRMS (ESI+): 853 [M+H]3+.【０１１５】
［実施例６］
（１）ＭＭＰプローブを用いた酵素反応の観察
ＭＭＰプローブ（Ｓｉ−ＱＳＹ７８０）がＭＭＰによって切断されることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した。
ＭＭＰプローブのＴＣＮ緩衝液及びＴＣＮＢ緩衝液（いずれも共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有、プローブの最終濃度：１μＭ）について、酵素反応前後での吸収及び蛍光スペクトルを図５（ＭＭＰ−１４）及び図７（ＭＭＰ−９）に示す（各図において左側の図は吸収スペクトルを右側の図は蛍光スペクトルを示す）。酵素反応は、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）触媒ドメイン（５μｇ）（図６）または、ＭＭＰ−９触媒ドメイン（５μｇ）（図７）を添加し、２日間培養して行った。励起波長は７２０ｎｍである。
図６及び図７で、酵素反応後に蛍光強度が増大しており、ＭＭＰによりプローブが切断されたことが示される。【０１１６】
（２）ＭＭＰプローブを用いた培養細胞系でのイメージング
ＭＭＰプローブ（Ｓｉ−ＱＳＹ７８０）を用いて、以下のプロトコルにより培養細胞でのイメージングを行った。
プロトコル
・ＨＴ−１０８０細胞を５×１０５細胞／ｍＬで８チャンバーに撒き、２日間培養
・ＰＢＳで洗浄後、ＨＢＳＳに置換
・プローブを１μＭになるように添加
・６時間培養
・撮像（ＩＸ７１（オリンパス））【０１１７】
ＭＭＰプローブ（１μＭ）又はコントロール（いずれも共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ溶液）によるＨＴ−１０８０細胞のＤＩＣ及び蛍光像を図８に示す。
図８で示されるように、細胞外液、および細胞内での蛍光上昇が観察され、コントロールとの有意差は認められた。【０１１８】
（３）ＭＭＰプローブを用いた皮下腫瘍モデルマウスでのイメージング
本発明の蛍光プローブがｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに応用可能であることを示すために、合成したＭＭＰプローブ（Ｓｉ−ＱＳＹ７８０）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＭＰ活性の検出を行った。モデルとしてはＨＴ−１０８０細胞を左下肢に皮下注射して作製した皮下腫瘍モデルマウスでの検討を以下のプロトコルに基づき行った。
プロトコル
・ＨＴ−１０８０細胞をＢＡＬＢｎｕ／ｎｕマウス（雌６週齢）の皮下に１００００００細胞／１００μＬ打ち込み、腫瘍を作製
・麻酔下でプローブ１００μＭを１００μＬ尾静注により投与
・各時間で撮像【０１１９】
図９は、ＭＭＰプローブ（１００μＭ）又はコントロール（いずれも共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有する１００μＬのＰＢＳ溶液）を尾静注により投与したＨＴ−１０８０腫瘍保持ヌードマウスの蛍光像を示す。
また、図１０は、ＭＭＰプローブ（ｎ＝５）又はコントロール（ｎ＝５）を腫瘍組織に静注したときの、組織におけるＭＭＰプローブ又はコントロールの蛍光強度の経時変化（左図）及びＭＭＰプローブ又はコントロールの蛍光強度比（Ｔｕｍｏｒ／Ｍｕｓｃｌｅ）の経時変化（右図）を示す。【０１２０】
皮下腫瘍モデルマウスに静注することで、腫瘍近傍のＭＭＰ活性を検出可能であった。特に、腫瘍と正常組織との接触部位での蛍光強度が高くなっている。これは、これまでにＭＭＰｓｅｎｓｅを用いてＭＭＰを検出した場合にも同様の現象が観察されることが知られており、がんの浸潤、転移に関係があるＭＭＰの活性ががんと血管の接触部位で上昇していると考えられている。
プローブとコントロールでの有意差はあり、２時間以内にはＭＭＰ活性が確認できるようになっている。コントロールの蛍光が上昇しているのは、腫瘍部位だけでなく全身の蛍光値が上昇しているため、長時間滞留しているプローブが非特異的に切断されるなどして蛍光が上昇していると考えられる。
これらの結果から、実際に本発明の化合物は動物個体におけるイメージングに応用可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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