(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢黄斑変性および網膜色素変性から選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；ならびにぶどう膜炎を治療するための、医薬組成物を調製するための、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）由来単球亜集団の使用であって、
該単球亜集団が、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を、該単球亜集団の総細胞数の５％を超えない量含むことを特徴とするヒトPBMC由来単球亜集団の使用。
【請求項２】
前記ヒトPBMC由来単球亜集団は、CD14+細胞を、該単球亜集団の総細胞数の６０％を超える量含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ヒトPBMC由来単球亜集団は、眼内注射用製剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
硝子体内注射用製剤である、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、炎症性成分を伴うまたは伴わない網膜変性および視神経変性の治療ならびに炎症性眼疾患、炎症性眼障害または炎症性眼病態の治療に有用なヒト単球亜集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（ＣＮＳ）組織が損傷を受けて神経細胞が死ぬと、神経毒性症状の悪循環に陥り、ホメオスタシスが迅速に回復されない限り損傷が広がる（Doble, 1999）。この際に誘導される防御・修復機構が十分でない場合には、神経細胞死がさらに進む。この現象は、病因や損傷の主因にかかわらず多くのＣＮＳ病態に関連しており、ＣＮＳの一部である網膜神経細胞や視神経でも見られる。ホメオスタシスからの逸脱が生じると、常在免疫細胞が活性化される。ＣＮＳでは常在ミクログリアがこのような免疫細胞に相当する。これらの免疫細胞の活性化が十分でない場合や、活性化されても活性化の収束までに時間を要した場合には、局所炎症の悪循環に陥ることがある。このような局所炎症は疾患の主因とはならないが、疾患の進行の一因となる可能性がある。免疫活性の収束までに時間を要する不十分な局所免疫活性を終わらせるには、消炎作用を有する細胞の働きが必要となる。このような消炎作用を有する細胞として、血中単球が挙げられ、血中単球は血流から新たに動員され、局所で教育を受けて消炎作用を有する細胞へと分化することができる。免疫細胞が関連する眼疾患について以下にまとめた。
【０００３】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、視力が鋭敏な網膜領域である眼の黄斑部が障害される疾患であり、網膜下の網膜色素上皮層の萎縮および光受容体（桿体および錐体）の消失として現れる。ＡＭＤ患者の約１０％は、異常血管の増殖により生じた網膜中心部の変性によって引き起こされる新生血管型黄斑変性または滲出型黄斑変性に罹患している。ＡＭＤの病態形成には多様な細胞プロセスが関連しており、例えば炎症、酸化ストレス、コレステロール代謝異常、および／または網膜色素上皮の機能障害が挙げられる。網膜における異常血管の増殖は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により刺激される。
【０００４】
ぶどう膜炎は、関節リウマチや強直性脊椎炎などの自己免疫疾患、感染症、または毒素暴露によって引き起こされると考えられている。しかし多く場合、原因不明である。ぶどう膜炎で最も一般的に見られるのは前部ぶどう膜炎であり、前眼部の炎症を伴う。この炎症は自己免疫疾患と関連している場合もあるが、多くの場合、健常者において発症する。後部ぶどう膜炎は、眼の脈絡膜および神経網膜が障害される炎症性眼病態であり、失明に至る可能性がある。ヒト後部ぶどう膜炎のモデルである実験的自己免疫性ぶどう膜炎（ＥＡＵ）を用いた多くの研究から、主にこの疾患の誘導相および効果相においてマクロファージが重要な役割を果たしていることが分かっている。これに反して、収束段階におけるマクロファージの存在を示す報告もある。しかし、これらの研究のほとんどにおいて、常在ミクログリアの機能と浸潤マクロファージの機能との識別はなされていない。また、単球由来マクロファージの種々のサブセットの特徴や、in vivoでの上記疾患の様々な相におけるそれらの機能については現在のところ報告されていない。
【０００５】
網膜色素変性（ＲＰ）は網膜ジストロフィーの一種であり、また、周辺視力の進行性喪失および夜間視力の低下（夜盲症）を特徴とする一連の遺伝障害であり、中心視力の喪失に至る可能性がある。ＲＰは、光受容体（桿体および錐体）または網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常によって引き起こされ、視力が徐々に失われる。ＲＰにおける持続性慢性炎症反応の存在を示す臨床的根拠が報告されており、炎症によりＲＰが生じている可能性が示唆されている（Yoshida et al., 2013）。
【０００６】
糖尿病性網膜症は、糖尿病の合併症として生じる網膜症であり、最終的には失明に至る可能性がある。糖尿病は、網膜において様々な代謝異常および生理的異常を引き起こすが、こうした異常のうちのいずれが、明らかとなっている糖尿病性網膜症（ＤＲ）の特徴に関わっているのかはあまり分かっていない。糖尿病患者の網膜で発症することが分かっている分子的異常および生理的異常の多くは、炎症と一致して見られた。また、様々な抗炎症療法が、動物モデルにおいてＤＲの種々の特性の発現を大幅に抑制することが見出されている（Tang et al., 2011）。
【０００７】
緑内障はゆっくりと進行する視神経障害であり、高齢者において発病率が高い（約１％）。緑内障は近年まで眼圧（ＩＯＰ）の上昇に関連するとされてきたため、降圧薬によって疾患の進行を遅らせる試みが集中的になされてきた。しかし、緑内障は一疾患群であり、そのすべてが眼圧と関連しているわけではないことがここ何年かで明らかとなった。また、疾患が眼圧と関連していても、眼圧が正常値まで低下し、さらには正常値よりも低い値となり、それでも変性が進行し続ける可能性があることも分かった。臨床医の間では、ＩＯＰ値が正常であるにも関わらず緑内障患者の変性が持続するのは、眼圧の他にも危険因子があることの現れであるのか、あるいは残存神経細胞や神経線維の脆弱性が増加しているためＩＯＰを正常値よりも低下させる必要があることの現れであるのかという議論が続けられている。緑内障によって、特に網膜神経節細胞（RGC）の神経変性が引き起こされ、視野が徐々に狭くなって視力喪失に至る。
【０００８】
病因
成熟神経細胞は増殖能力や失われた神経細胞を補填する能力が非常に低いため、成人ＣＮＳにおいて急性かつ／または慢性的に神経細胞が失われると、不可逆的な機能喪失につながる。したがって、機能を維持するためには、神経細胞の喪失を緩和するか抑制することが必須である。神経変性疾患の多くでは、その病因が明らかになっていないため治癒することができない。しかし、一次的な危険因子や二次的な危険因子がいくつかあり、これらの危険因子を標的として、神経細胞喪失の進行を抑制または緩和するための治療的介入がなされており、このような治療的介入を神経保護療法と総称している。危険因子のいくつかは疾患特異的であるが、例えば興奮性アミノ酸、フリーラジカル、および一酸化窒素などは神経変性障害すべてに共通する危険因子である。これらの危険因子は健常なＣＮＳの構成に必須の自己成分であるが、変性組織中において過剰に蓄積すると細胞毒となり、神経細胞死が生じた領域からさらに損傷が広がる。
【０００９】
グルタミン酸塩は、急性および慢性の変性障害において最も一般的に見られる毒性メディエーターの１つである（Pitt et al., 2000）。グルタミン酸塩はヒトＣＮＳにおける主要な興奮性神経伝達物質である。Ｌ−グルタミン酸塩はシナプスの大部分に存在し、２種の機能を発揮することができる。すなわち、機能が正常である場合には必須の神経伝達物質として中心的な役割を果たす一方、生理的レベルを超えた場合には毒性を示す。
【００１０】
現在の疾患管理
神経変性疾患の治癒方法は現在のところ存在せず、症状の緩和または管理に焦点を当てた治療が行われている。現在までになされた臨床研究のほとんどにおいて、神経保護療法の有効性は示されていない。ＡＭＤについては、抗血管新生剤または抗ＶＥＧＦ剤を眼の硝子体液中に直接注射することにより異常血管を退縮させて視力を改善できる可能性が示されている。
【００１１】
再生医療および防御自己免疫
再生医療は、これまで回復不能とされていた臓器を刺激して自己治癒を促すことにより損傷した組織および臓器を修復、置換および／または再生させることを目的とした新たに台頭しつつある分野であり、組織工学、生体材料、細胞療法などが含まれる。細胞の再生は、末梢組織において一般的に見られる治癒プロセスであるが、成人の神経網膜でもそれ以外のＣＮＳでも限定的にしか起こらない。しかし、網膜前駆細胞（RPC）の静止期細胞集団は、成人期を通して網膜毛様体（ＣＢ）に存在し、様々な網膜細胞に分化できる可能性を有しており、恐らく免疫調節物質や神経向性物質を産生できると考えられる。この静止期の前駆細胞集団は網膜損傷によって刺激を受けることが報告されたが、そのメカニズムは未だ明らかになっていない。損傷に応答して作動する治癒プロセスを解明し、このプロセスを増強できる方法を見出すことができれば、神経保護および細胞再生を促進するための新たな治療法の開発につながる可能性があり、これは当技術分野の研究目標の１つとなっている。
【００１２】
ＣＮＳ外における治癒プロセスでは、死細胞や細胞片の排除、および再増殖や細胞再生の促進に免疫系の助けを必要とする。このプロセスの一部には、治癒の過程で様々な表現型を獲得する種々のマクロファージサブセットが介在する。損傷に応答する過程での重要な段階として、単球由来のマクロファージの関与による局所免疫応答の終了が挙げられる。この単球由来マクロファージは、周囲環境全体の抗炎症性の獲得に寄与し、また再生に必要な増殖因子を産生する。
【００１３】
病変部内部への末梢血の浸潤および動員は、病変部から誘起されたシグナルによって制御され、これは脳脊髄液（ＣＳＦ）関門に影響を及ぼす。損傷を受けたＣＮＳの自然回復が限定的であることは、病変部に自発的に動員される有効な単球サブセットが結果的に不十分であることに一部起因していると考えられる。以上の考察をもとに、本発明者らは、身体の秀でた治癒機構である免疫系を利用した新規の生理学的方法を使用して、ＣＮＳ損傷によって生じる事象に対処し、さらには神経の保護および回復を試みた。
【００１４】
本発明者らの研究室において、血液由来の単球を皮膚片と共にインキュベートすると、文献で報告されている抗炎症性Ｍ２単球の表現型に類似する非炎症性の表現型が得られることが示された。この単球をラットの損傷脊髄に注射したところ、脊髄損傷（ＳＣＩ）からの回復が改善した（US 5,800,812、US 6,117,424およびUS 6,267,955）。この方法を、臨床研究において重篤な急性脊髄損傷の患者に対して試験したところ、有望な結果が得られた（WO 03/044037；Knoller et al., 2005）。本発明者らはまた、末梢血単球プールに骨髄由来CD115+細胞を加えて補強するとＳＣＩからのマウスの機能回復が増強されることを示した（Shechter et al., 2009）。
【００１５】
血中単球は、様々な特徴および活性を有する種々の細胞からなる集団である。血中単球を治療目的で利用するためには、有害な機能を持つ単球と有益な単球とを区別する必要がある。
【００１６】
ヒトでは、単球のCD16の発現に基づいて、３種のサブセット、すなわちCD14++CD16-（classical）単球、CD14++CD16++（intermediate）単球、およびCD14dimCD16++（non-classical）単球を区別できることが提案されているが、生理学的条件下および病理学的条件下におけるそれぞれの役割は十分には分かっていない。近年、本発明者らは、脊髄損傷を受けた動物のＣＳＦにCD16+単球が濃縮された単球を注射すると、単球亜集団全体を注射した動物と比較して自然回復が遅延することを見出した。また、CD16発現細胞を含まない単球亜集団（CD16-）が脊髄損傷の回復に有益であることも見出した（PCT/IL2012/050522）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示は概して、網膜または視神経において、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護または神経再生の促進に使用するための末梢血単核細胞（PBMC）由来単球亜集団であって、該単球亜集団が、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないこと、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないこと、ならびに上記網膜または視神経が、眼疾患、眼障害または眼病態による損傷を有することを特徴とするPBMC由来単球亜集団に一部関する。
【００１８】
本開示はまた、炎症性眼疾患、炎症性眼障害または炎症性眼病態の治療に使用するためのPBMC由来単球亜集団であって、該単球亜集団が、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないこと、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないことを特徴とする、PBMC由来単球亜集団を提供する。
【００１９】
本開示はさらに、網膜または視神経において、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護または神経再生の促進のための、PBMC由来単球亜集団を含む組成物であって、該PBMC由来単球亜集団が、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないこと、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくは実質的に含んでいないこと、ならびに上記網膜または視神経が、眼疾患、眼障害または眼病態による損傷を有することを特徴とする組成物を提供する。
【００２０】
また、本開示は概して、炎症性眼疾患、炎症性眼障害または炎症性眼病態の治療に使用するための、PBMC由来単球亜集団を含む組成物であって、該PBMC由来単球亜集団がCD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないこと、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないことを特徴とする組成物に関する。
【００２１】
本開示はさらに、網膜または視神経において、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護または神経再生の促進を行うための方法であって、該網膜または視神経が、眼疾患、眼障害または眼病態による損傷を有し、該方法が、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないPBMC由来単球亜集団、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないPBMC由来単球亜集団を有効量で上記抑制、保護または促進を必要とする個体に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
また、本開示は概して、炎症性眼疾患、炎症性眼障害または炎症性眼病態を治療するための方法であって、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないPBMC由来単球亜集団、またはCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、もしくはこれらの細胞を実質的に含んでいないPBMC由来単球亜集団を有効量で上記治療を必要とする個体に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜Ｅは、グルタミン酸塩の毒性に暴露させた後に同系の単球を硝子体内に注射すると神経保護効果が得られることを示す。グルタミン酸塩の毒性に暴露させてから７日後に、損傷を与えなかった網膜、損傷を与えた網膜、および単球で処置した網膜について、これらの切片中の網膜神経節細胞（RGC）数を定量した。各条件につき４つの切片でBrn3a+RGCを定量し、カウント数（Ａ）および損傷を与えなかった網膜に対する生存率（％）（Ｂ）として示した。図１Ｃ〜Ｅは、損傷を与えなかったマウス（Ｃ）の網膜、または損傷を与えた後にＰＢＳ（Ｄ）もしくはマウス単球（Ｅ）を硝子体内に注射したマウス（Ｄ〜Ｅ）の網膜において、RGCマーカーであるBrn3a（赤色；スケールバー：１００μｍ）で標識したRGCを示す代表的な顕微鏡写真である。矢印はBrn3a+RGCを示す。ＰＢＳ処置群で見られるように損傷後にRGCが減少したこと、さらに単球（mouse mon）で処置した網膜ではRGCが補充されていることに注目されたい。図中のエラーバーは各群の平均値±ＳＥを示す。*はｐ＜０．０５、**はｐ＜０．０１を示す。GTはグルタミン酸塩、monは単球、RGCは網膜神経節細胞を示す。
【００２４】
【図２】図２Ａ〜Ｈは、硝子体内に注射したマウス単球の局在および特徴を示す顕微鏡写真である。グルタミン酸塩の毒性に暴露後７日目の網膜の代表的な顕微鏡写真を示し、これらの写真から、注射したマウス単球（CX3CR1-GFP、緑色）によって様々なサイトカインおよび神経栄養因子（赤色）が発現されたことが分かる。（Ａ）TGFβ、（Ｂ）IL-10、（Ｃ）CD38、（Ｄ）IGF-1、（Ｅ）BDNF、（Ｆ）Arg-1（アルギナーゼ−１）、（Ｇ）TNF-α、（Ｈ）IL-1β。細胞の非特異染色はヘキスト染色（青色）により実施した。注射した細胞は、硝子体内、損傷を与えたRGCの近傍、および網膜下腔に確認された。矢印は二重標識した細胞を示す。挿入図は、代表的な細胞を高倍率で観察した写真である（スケールバーは５０＿ｍを示し、挿入図のスケールバーは１０＿ｍを示す）。GCLは神経節細胞層、SRSは網膜下腔、vitは硝子体を示す。
【００２５】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ＣＮＳ由来自己免疫ワクチン予防接種によって、視神経挫滅（ＯＮＣ）後の網膜において免疫応答が増強されることを示す。ＯＮＣを行った７日後のキメラマウスの網膜において、総白血球数（CD45+；Ａ）、単球由来マクロファージの浸潤（CD11b+GFP＋；Ｂ）、およびＴ細胞の浸潤（TCRβ+；Ｃ）を定量した結果を示す。ＯＮＣの１週間前に、ＭＯＧ由来の改変ペプチド（４５Ｄ）を１群のマウスにワクチン接種した。ワクチン接種群のもう一方の網膜を、損傷を与えなかったコントロールとして用いた。グラフは各群の平均値±ＳＥを示す。*はｐ＜０．０５、**はｐ＜０．０１、***はｐ＜０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者らは、グルタミン酸塩の毒性にマウスの眼を暴露させると、損傷を受けた網膜に単球由来マクロファージが浸潤することを以前に報告している。この浸潤を抑制すると、網膜神経節細胞（RGC）の生存率が低下し、毛様体における網膜前駆細胞（RPC）の増殖細胞数が減少する。血中単球プールを増強すると、RGCの生存率およびRPCの再生率が上昇する。単球由来マクロファージが浸潤すると、損傷を受けた網膜の環境が抗炎症・神経保護状態へと変化し、他の免疫細胞の蓄積が抑制される。この結果、局所炎症が消散し、組織修復が増強される（London et al., 2011、この文献はその全体が本明細書に開示されたものとして本明細書に組み込まれる）。また、グルタミン酸塩は、生理的レベルを超えると、一次的な危険因子とは無関係に自己持続的な変性を起こす初期因子の１つとなる。
【００２７】
また、本発明者らは近年、CD3発現細胞、CD19発現細胞およびCD56発現細胞（および任意にCD16発現細胞）が相対的少量しか含まれていないか、これらの細胞がほとんど含まれていないか、あるいはこれらの細胞が全く含まれていないことを特徴とする血液由来ヒト単球亜集団が、脳脊髄液（ＣＳＦ）から脊髄中の損傷部位へと遊走して、組織修復を促進し、機能回復を改善することを見出した（PCT/IL2012/050522）。さらに、本発明者らは近年、損傷を受けた脊髄の治癒に有益な上記細胞のこのような効果は、上記細胞を皮膚片と共培養して活性化し、その細胞を脊髄中の病変部の辺縁に投与する方法によって、あるいは上記細胞を活性化させずに損傷脊髄のＣＳＦに投与する方法によって達成されることを見出した。
【００２８】
本発明により、骨髄由来マウスCD115+単球細胞を硝子体内に注射することによって、グルタミン酸塩の毒性の暴露を受けたマウスの網膜神経節細胞の生存率に対する保護効果が得られることが分かった（実施例４）。
【００２９】
Cluster of Differentiation（CD）分子Xなどの同定可能な特定のマーカーを表面に発現している細胞を本明細書においてCDX+と称する。例えば、CD3分子を表面に発現している細胞を本明細書においてCD3+と称する。細胞表面に発現されているCD分子の相対量は、「＋」を付加することにより示し、例えばCD3++はCD分子が多量に発現されていることを示す。また、「dim」を付加することによって、CD分子が相対的に低レベルであることを示す。特定のＣＤの発現により定義される細胞種を含む細胞集団をCD+と称し、これらの細胞が濃縮されている細胞集団をCD++と称し、これらの細胞を含まない細胞集団をCD-と称する。
【００３０】
したがって、一実施形態において、上記ヒトPBMC由来単球亜集団は、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、またはこれらの細胞を実質的に含んでいない。例えば、本発明のPBMCは、CD3+細胞を相対的少量しか含んでおらず、かつCD19+細胞およびCD56+細胞を実質的に含んでいないものであってもよい。
【００３１】
一実施形態では、上記PBMC亜集団からCD16+細胞をさらに除去することによって、さらにCD16+細胞が実質的に取り除かれたPBMC由来単球亜集団、すなわちCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を相対的少量しか含んでいないか、またはこれらの細胞を実質的に含んでいない単球亜集団が提供される。例えば、本発明のPBMCは、CD3+細胞を相対的少量しか含んでおらず、かつCD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を実質的に含んでいないものであってもよい。
【００３２】
様々な単球亜集団を区別するために用いられる代表的な抗原は、非ヒト動物とヒトとで異なる。したがって、特定のマウス細胞集団の同定に用いられるマーカーは、これに対応するヒト細胞集団の同定に用いられるマーカーと異なっていてもよい。例えば、本明細書の実施例４において用いられているマウスCD115+単球はGR1+とGR1-の２つの亜集団に分けられるが、これに対応するヒト単球集団は、細胞膜マーカーCD14およびCD16の発現に基づいて３つの亜集団に分けられる（Geissman et al. (2008) Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and Cell Biology (2008) 86, 398-408）。
【００３３】
本明細書において「末梢血単核細胞（PBMC）」は、円形の核を有するあらゆる血液細胞、例えばリンパ球、単球、またはマクロファージを指す。当業者であれば、血液からPBMCを単離する方法を容易に理解できるであろう。血液からのPBMCの単離方法としては、例えば、血液を各層に分離する親水性多糖であるフィコールを用いて、単球およびリンパ球からなるバフィーコートを血漿層の下に形成させることにより全血からPBMCを抽出する方法、ならびに白血球濃縮物を調製して、白血球をほとんど含まない血漿と赤血球とをドナーに戻すことにより全血からPBMCを抽出する方法（白血球除去法）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書において、「（特定の細胞）を実質的に含まない細胞集団」という用語は、「（特定の細胞が）ほとんど存在しない」という用語と同じ意味で用いられ、好ましくは、特定の細胞種を全く含まない細胞集団、あるいは、細胞集団の総細胞数に対する特定の細胞種の相対量が約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％を超えない細胞集団を包含する。「（特定の細胞）を相対的少量しか含んでいない細胞集団」は、特定の細胞種の相対量が、新たに単離された処理前のヒトPBMC集団における同種の細胞の相対量よりも少ないが、この細胞種を「実質的に含まない」集団よりも相対量が多い細胞集団を指す。
【００３５】
したがって、一実施形態において、CD19+細胞およびCD56+細胞それぞれの相対量は、PBMC集団の総細胞数の約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％を超えない。特定の実施形態において、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を実質的に含まない単球亜集団におけるCD16+細胞の相対量は、総細胞数の約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％を超えない。
【００３６】
正常ヒトPBMC細胞集団では、特に、CD3+細胞の含量が７０％を超え、単球は約１０〜１５％を占める。したがって、「CD3+細胞を相対的少量しか含んでいない細胞集団」においては、７０％を超えていたCD3+細胞の相対量が、PBMC集団の総細胞数の約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％まで低減されている。しかし、細胞分離技術が向上していることから、本発明のPBMC集団にはCD3+細胞がほとんど存在しないことも考えられ、すなわちその相対量が、PBMC集団の総細胞数の約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％となることも考えられる。
【００３７】
一実施形態において、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、またはこれらの細胞を実質的に含まない（さらにCD16+細胞を実質的に含んでいなくてもよい）単球亜集団は、CD14＋細胞が実質的に濃縮されている。
【００３８】
「〜が実質的に濃縮されている細胞集団」は、該細胞集団の総細胞数に対する特定の細胞種の相対量が約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％を超えている細胞集団を指す。
【００３９】
一実施形態において、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を相対的少量しか含んでいないか、またはこれらの細胞を実質的に含まないPBMC由来単球亜集団は、CD14＋細胞を少なくとも約６０％含んでおり、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を実質的に含まない単球亜集団は、CD14＋細胞を少なくとも約８０％含む。したがって、本明細書において定義される単球亜集団は、本明細書においてCD14++CD16-集団とも称される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明の単球亜集団は、眼疾患、眼障害または眼病態による損傷を有する網膜または視神経における、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護または神経再生の促進に有用である。
【００４１】
例えば、一実施形態において、眼の神経細胞変性を引き起こしグルタミン酸塩の毒性により増悪する上記疾患、障害または病態は、加齢黄斑変性または網膜色素変性から選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；およびぶどう膜炎から選択される。これらの疾患は神経組織の損傷を引き起こし、特定の実施形態においては、本発明の単球亜集団の投与によって神経再生が促進される。本発明はまた、慢性または急性の網膜症、糖尿病や高血圧などの全身性疾患の結果生じた網膜症、放射線網膜症、および日光網膜症の治療を包含する。
【００４２】
急性損傷、加齢、毒素、代謝異常、血流の変化または変性遺伝子疾患によって二次的に生じた網膜ホメオスタシスの変化は、眼内において様々な炎症性カスケードを開始させる場合がある。こうした状態のいずれにおいても、免疫応答が長期間にわたって調節異常を起こすと、それ自体が疾患となり、網膜疾患の病因となったり、視力を脅かす合併症を引き起こしたりする場合がある。血液由来の単球は、炎症を消散してホメオスタシスを回復させるように作用し、それによって組織の自然治癒を促す。したがって、本発明はさらに、眼の神経変性を必ずしも引き起こさない炎症性眼疾患の治療に関する。いくつかの実施形態において、本発明において使用される単球亜集団は、強膜炎（強膜の炎症）、角膜炎（角膜の炎症）、角膜潰瘍（眼の角膜の表面上皮層の喪失）、雪眼炎（眼を保護せずに明るい光に暴露させたことにより痛みが生じた病態）、タイゲソン点状表層角膜炎、角膜血管新生、フックスジストロフィー（cloudy morning vision）、円錐角膜（角膜の厚みおよび形状の変化）、乾性角結膜炎（ドライアイ）、または虹彩炎（虹彩の炎症）などの炎症性眼疾患の治療に有効である。特定の実施形態において、本発明のPBMCは、炎症性眼疾患、炎症性眼障害または炎症性眼病態による損傷を有する網膜または視神経における、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護または神経再生の促進に有用である。
【００４３】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかにおいて用いられるPBMC由来単球亜集団はヒトPBMCを含む。
【００４４】
上記ヒトPBMC由来単球亜集団は自己由来のPBMCから単離したものであってもよい。すなわち、眼疾患の治療を必要とする患者から血液を採取し、本発明によるPBMC由来単球亜集団を下記で定義する通りに調製し、上記患者に投与して戻す。
【００４５】
あるいは、上記ヒトPBMC由来単球亜集団は同種異系由来のPBMCから単離したものであってもよい。すなわち、遺伝的に類似するが同一ではないドナーから血液を採取し、本発明によるPBMC由来単球亜集団を下記で定義する通りに調製し、必要に応じて細胞バンクに保管した後、上記患者に投与する。
【００４６】
一実施形態において、PBMC由来単球亜集団は注射用製剤、例えば眼内注射用製剤として調製される。
【００４７】
また、眼疾患、眼障害もしくは眼病態による損傷を有する網膜または視神経における、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護もしくは神経再生の促進のための組成物、または炎症性眼疾患、炎症性眼障害もしくは炎症性眼病態を治療するための組成物であって、上記で定義したPBMC由来単球亜集団を含む組成物が提供される。これらの組成物では、PBMC由来単球亜集団の細胞が、薬学的に許容される注射用担体、例えば眼内投与用担体中に懸濁されていてもよい。
【００４８】
本発明に従って使用される医薬組成物は、生理学的に許容される１種以上の担体または賦形剤を用いて従来の手法で調製されたものであってよい。担体は、本発明の組成物の他の成分と適合性があり、かつレシピエントに害を及ぼさないという点において「許容される」ものでなければならない。
【００４９】
以下に示す担体、投与方法、剤形などは、本発明と共に使用してもよい担体、投与方法、剤形などとして選択可能な公知のものを示したものである。ただし、当業者であれば、選択した任意の配合および投与方法によって所望の結果が得られるかどうかを確認するために、まず試験を行う必要があることを容易に理解できるであろう。
【００５０】
「担体」は、上記細胞と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。上記医薬組成物中の担体は、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ラクトース一水和物などの結合剤；アルギン酸、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤または界面活性剤；およびコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤を含んでもよい。
【００５１】
上記組成物は、例えば、ボーラス注射や持続点滴などの注射によって非経口投与するための製剤として調製されたものであってもよい。注射用製剤は、防腐剤を添加して、アンプルなどの単位剤形としてまたは複数回用量容器に入れた形態で提供されてもよい。上記組成物は、油性または水性ビヒクルを用いた懸濁剤、溶剤または乳剤の形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの調製用剤を含有していてもよい。
【００５２】
上記細胞または上記組成物の眼内投与は、硝子体内注射または網膜下注射により実施してもよい。
【００５３】
本発明者らは近年、上記PBMC由来単球亜集団が、皮膚片との共培養によりあらかじめ活性化されたものであるか（すなわち皮膚により活性化された細胞であるか）、あるいは活性化されていないものであるかにかかわらず、脊髄中の損傷部位の辺縁へと遊走して、損傷を緩和し機能回復を改善することを見出した（PCT/IL2012/050522）。
【００５４】
したがって、例えば、眼内に注射される本発明のPBMC由来単球亜集団の細胞は、皮膚により活性化された細胞であってもよい。
【００５５】
あるいは、眼内に注射される本発明のPBMC由来単球亜集団の細胞は、活性化されていない細胞であってもよい。
【００５６】
上記に開示したように、本明細書において定義されたPBMC由来単球亜集団およびこれを含有する上記組成物は、神経変性眼疾患、神経変性眼障害または神経変性眼病態の治療に有用である。具体的には、上記治療は神経組織修復の促進を含み、これには、例えば、神経細胞変性の予防もしくは抑制；神経細胞生存、軸索再生および／もしくは発芽の促進；損傷を受けた網膜もしくは視神経組織における神経発生；ならびに／または機能回復の促進が含まれる。本明細書においては、神経細胞に対するこうした有益な効果が、本明細書において定義された特定のPBMC由来単球亜集団によって炎症反応が調節されることに少なくともある程度起因することが示されている。
【００５７】
したがって、本発明はさらに、眼疾患、眼障害もしくは眼病態による損傷を有する網膜もしくは視神経において、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護もしくは神経再生の促進を行うための方法、または炎症性眼疾患、炎症性眼障害もしくは炎症性眼病態を治療するための方法であって、該方法が、上記の抑制、保護、促進もしくは治療を必要とする個体に本明細書において定義されたPBMC由来単球亜集団を有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００５８】
同出願人によるPCT/IL2012/050522は、本明細書に記載の、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を実質的に含まないヒトPBMC由来単球亜集団を血液から単離するための方法であって、（i）血液から単核細胞を単離する工程、および（ii）（i）の単核細胞からCD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を除去する工程を含み、工程（ii）において、マイクロビーズにそれぞれ結合させた抗CD3+抗体、抗CD19+抗体および抗CD56+抗体と上記単核細胞とを接触させてマイクロビーズに単核細胞を結合させ、マイクロビーズを除去することによって、CD3+細胞を相対的少量しか含まずCD19+細胞およびCD56+細胞が実質的に含まれないヒト末梢血単核細胞（PBMC）由来単球亜集団を血液から取得することを特徴とする方法を提供している。
【００５９】
PCT/IL2012/050522はさらに、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を実質的に含まないPBMC由来単球亜集団を血液から単離するための方法であって、（iii）血液から単核細胞を単離する工程、および（iv）（iii）の単核細胞からCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を除去する工程を含み、工程（iii）において、マイクロビーズにそれぞれ結合させた抗CD3+抗体、抗CD19+抗体、抗CD56+抗体および抗CD16+抗体と上記単核細胞を接触させてマイクロビーズに単核細胞を結合させ、マイクロビーズを除去することによって、CD3+細胞を少量しか含まずCD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞が実質的に含まれないヒトPBMC由来単球亜集団を血液から取得することを特徴とする方法を提供している。
【００６０】
一実施形態において、工程（iv）、すなわちCD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を除去する工程は、（v）CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を（iii）の単核細胞から除去し、これによって、CD3+細胞、CD19+細胞およびCD56+細胞を実質的に含まないヒトPBMC由来単球亜集団を血液から取得する副工程、ならびに（vi）CD16+細胞を（v）のPBMC集団から除去し、これによって、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞およびCD16+細胞を実質的に含まないヒトPBMC由来単球亜集団を血液から取得する副工程を含む。
【００６１】
一実施形態において、工程（iv）は単一の工程で実施される。
【００６２】
CD3、CD19、CD56および／またはCD16などの所望の抗原を表面に発現している単核細胞を捕捉する上記抗体は、まずビオチン化し、次いで、アビジンもしくはストレプトアビジンまたはこれらと同等なビオチン結合タンパク質を含むマイクロビーズに結合させてもよい。あるいは、先に単核細胞とマイクロビーズとを結合させてから、ここに上記抗体を加えてもよい。マイクロビーズは磁性でも非磁性でもよい。マイクロビーズが非磁性である場合、遠心分離によってマイクロビーズに結合した単核細胞を単核細胞懸濁液中から除去してもよく、マイクロビーズが磁性である場合、磁石の磁場に暴露させることによって、マイクロビーズに結合した単核細胞を単核細胞懸濁液中から除去してもよい。
【００６３】
一実施形態においては、上記抗体を磁気マイクロビーズに結合させてから該抗体を単核細胞と接触させ、単核細胞が結合したマイクロビーズを磁石で引き寄せて溶液中からマイクロビーズを除去することによって単核細胞を除去する。
【００６４】
上記に開示した方法は、CD3+細胞、CD19+細胞、CD56+細胞および／またはCD16+細胞を相対的少量含しか含まないか、またはこれらの細胞を実質的に含まないヒト末梢血単核細胞（PBMC）由来単球亜集団を血液から単離するために用いてもよく、このPBMC由来単球亜集団は本明細書において、眼疾患、眼障害もしくは眼病態による損傷を有する網膜もしくは視神経において、神経細胞変性の抑制、グルタミン酸塩の毒性からの神経細胞の保護もしくは神経再生の促進を行うため、または炎症性眼疾患、炎症性眼障害もしくは炎症性眼病態を治療するために使用される。
【００６５】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６６】
材料および方法
動物
成体雄（８〜１０週齢）C57BL/6Jマウスおよびヘテロ変異Cx3cr1GFP/+マウス（B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J、CX3CR1ケモカイン受容体対立遺伝子の一方が、GFPをコードする遺伝子で置換されたマウス；Jung, S., J. Aliberti, P. Graemmel, M. J. Sunshine, G. W. Kreutzberg, A. Sher, and D. R. Littman. 2000. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20: 4106-4114）を用いる。さらに、単球およびBMのドナーとして、C57BL/6Jマウス、ヘテロ変異Cx3cr1GFP/+マウス、MHC-II欠損マウス（B6.129S-H2dlAb1-Ea/J）、およびIL-10欠損マウス（B6.129P2-Il10tm1Cgn/J; Kuhn, R., J. Lohler, D. Rennick, K. Rajewsky, and W. Muller. 1993. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75:263-274）を用いる。CD11cの検出には、マウスCD11cプロモーターの制御下でGFPレポーターをコードする導入遺伝子を有するCD11cGFP/+トランスジェニックマウス（B6.FVB-Tg Itgax-DTR/GFP 57Lan/J; Jung, S., D. Unutmaz, P. Wong, G. Sano, K. De los Santos, T. Sparwasser, S. Wu, S. Vuthoori, K. Ko, F. Zavala, et al. 2002. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17:211-220）を用いる。FoxP3GFPマウスは、Memorial Sloan-Kettering Cancer CenterのAlexander Rudensky博士の厚意により入手した。ハンチンチンをコードするヒト遺伝子を過剰発現するトランスジェニックR6/2マウスは、ジャクソン研究所から入手した。
【００６７】
特に記載がない限り、動物は、ワイツマン科学研究所の動物飼育センターより提供を受けた。本明細書に詳細に記載された実験はいずれも、ワイツマン科学研究所の動物実験委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee）により策定された規程に準ずる。
【００６８】
BMキメラ
過去の報告（Rolls, A., R. Shechter, A. London, Y. Segev, J. Jacob-Hirsch, N. Amariglio, G. Rechavi, and M. Schwartz. 2008. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Med. 5:e171.; Shechter et al., 2009）に従って、[Cx3cr1GFP/+>WT]BMキメラを作製する。すなわち、WTレシピエントマウスの頭部を遮蔽して全身に致死量の放射線（９５０ｒａｄ）を照射する。頭部を遮蔽することによって、網膜への直接的な損傷と、グルタミン酸塩の毒性暴露により誘導される骨髄系細胞以外の骨髄系細胞による浸潤を防ぐ。翌日、過去に報告されたプロトコル（Shechter et al., 2009）に従い、BM細胞５×１０６個を用いてマウスを新たに作製する。BM移植の８〜１２週間後、キメラマウスをグルタミン酸塩による毒性暴露またはＥＡＵ誘導プロトコルに供する。
【００６９】
MC-21の投与
MC-21（CCR2に対する抗体；Mack, M., J. Cihak, C. Simonis, B. Luckow, A. E. Proudfoot, J. Plachy, H. Bruhl, M. Frink, H. J. Anders, V. Vielhauer, et al. 2001. Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 and CCR5 in mice. J. Immunol. 166:4697-4704）の腹腔内注射を損傷形成直後から開始し、実験期間を通して継続する。ＥＡＵ誘導の場合、注射はＥＡＵのピークの前後に行い、１日おきに合計５回行った（注射１回につき８μｇ投与）。
【００７０】
養子単球移入
過去の報告（Varol, C., L. Landsman, D. K. Fogg, L. Greenshtein, B. Gildor, R. Margalit, V. Kalchenko, F. Geissmann, and S. Jung. 2007. Monocytes give rise to mucosal, but not splenic, conventional dendritic cells. J. Exp. Med. 204:171-180）に従って、CD115+単球を単離する。すなわち、マウスの大腿骨および脛骨からBM細胞を採取し、フィコール密度勾配により単核細胞を濃縮する。製造元のプロトコルに従ってビオチン化抗CD115抗体およびストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク）を用いたMACSで濃縮することによってCD115+BM単球集団を単離する。次いで、損傷形成後１日目に単球（WT、Cx3cr1GFP/+、IL-10欠損、またはMHC-II欠損）を静脈内注射する（マウス１匹につき４〜５×１０６個の細胞を投与）。
【００７１】
BrdUの投与レジメン
Zhao et al., 2005（Growth factor responsive progenitors in the postnatal mammalian retina. Dev. Dyn. 232:349-358）に記載の方法を一部変更したプロトコルを用いて、BrdU（シグマアルドリッチ）をＰＢＳ中に溶解し、該溶液の硝子体内注射（眼球１つあたり１μｇ投与）を損傷形成直後から開始し、３日間継続して行う。この反復注射は、組織の他の部分を穿孔することなく、同じ孔から行う。これによって、網膜は、注射を１回しか受けていない場合と同等な形態を維持すると考えられる。最後の注射から１日後に動物を屠殺して増殖前駆細胞数の測定を行う。あるいは、最後の注射から１週間後に動物を屠殺して細胞の分化を検出する。コントロール動物には、グルタミン酸塩による毒性暴露やＩＯＰの上昇を行うことなく、同じ投与レジメンに従って硝子体にBrdUを投与する。様々な単球操作を行った動物の網膜や毛様体を比較する際にこれと同じプロトコルが用いられることから、損傷とそれに次ぐBrdUの反復注射による増殖RPC数に対する相乗効果を否定することはできないが、こうした操作の後に見られる増殖前駆細胞数の変化は単球を介した効果に起因する可能性が高いと考えられることには注目されたい。
【００７２】
フルオロゴールドによるRGCの標識
解剖学的に無傷の神経細胞を検出するため、損傷形成後３日目に、５％フルオロゴールド（蛍光色素）の生理食塩水溶液１μｌをマウスの両側上丘に注射する。両側上丘における注射位置は、ブレグマの後方２．９２ｍｍ、正中線の側方０．５ｍｍ、および頭蓋からの深さ２ｍｍとする。７２時間後にマウスを屠殺して眼球を取り出し、網膜を平坦にしながらＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて全載標本とする。視神経円板からの距離がほぼ同じとなるように（０．３ｍｍ）視野を選択して、視神経円板からの距離に応じたRGC密度の変動を除外した。マウスに施した処置についての情報を持たない観察者によって蛍光顕微鏡（倍率８００倍）下で視野をカウントした。各網膜について、１視野あたりの平均RGC数を算出した。詳細については、Schori et al., 2001（Vaccination for protection of retinal ganglion cells against death from glutamate cytotoxicity and ocular hypertension: implications for glaucoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:3398-3403）およびSchwartz and Kipnis, 2007（Model of acute injury to study neuroprotection. Methods Mol. Biol. 399:41-53）を参照されたい。
【００７３】
免疫組織化学的検査
過去の報告（Shechter, R., Y. Ziv, and M. Schwartz. 2007. New GABAergic interneurons supported by myelin-specific T cells are formed in intact adult spinal cord. Stem Cells 25:2277-2282）に従って、ＰＢＳ灌流固定後に眼球を取り出し、２．５％ＰＦＡ中で２４時間かけて後固定して、７０％エタノール中に移し、続いてパラフィン包埋した。病理組織学的検査を行うため、切片をいくつか選択してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫標識に用いた抗体は、ウサギ抗GFP（1:100、MBL）およびマウス抗Brn3a（1:50、サンタクルーズバイオテクノロジー社）であった。M.O.M. Immunodetection Kit（ベクターラボラトリーズ）を使用して、マウス一次モノクローナル抗体の局在を特定した。活性化した骨髄系細胞を標識するため、FITC標識Bandeiraea simplicifoliaイソレクチンB4（IB-4；1:50；シグマアルドリッチ）を二次抗体溶液に加え、１時間インキュベートした。使用した二次抗体は、Cy2/Cy3標識ロバ抗マウス抗体またはCy2/Cy3標識ロバ抗ウサギ抗体（1:150〜1:200、いずれもJackson ImmunoResearch Laboratories社より入手）を含んでいた。スライドをヘキスト（1:2,000；インビトロジェン）で１分間染色した。顕微鏡分析には蛍光顕微鏡（E800、ニコン）を使用した。この蛍光顕微鏡は、デジタルカメラ（DXM 1200F；ニコン）、および２０×、ＮＡ０．５０の対物レンズまたは４０×、ＮＡ０．７５の対物レンズ（Plan Fluor；ニコン）を備えていた。画像取得ソフトウェアNIS-Elements F3（ニコン）を使用して、後固定後の組織の撮影を２４℃で行った。撮影した画像は、フォトショップ９．０（アドビ）を使用してコントラストを微調整してトリミング、結合および最適化し、Canvas X（Deneba Software）を使用してレイアウトした。
【００７４】
網膜の単離およびフローサイトメトリー分析
過去の報告（Kerr, E.C., B. J. Raveney, D. A. Copland, A. D. Dick, and L. B. Nicholson. 2008. Analysis of retinal cellular infiltrate in experimental autoimmune uveoretinitis reveals multiple regulatory cell populations. J Autoimmun 31:354-361, Luger, D., P. B. Silver, J. Tang, D. Cua, Z. Chen, Y. Iwakura, E. P. Bowman, N. M. Sgambellone, C. C. Chan, and R. R. Caspi. 2008. Either a Th17 or a Th1 effector response can drive autoimmunity: conditions of disease induction affect dominant effector category. J Exp Med 205:799-810）に従って、ＰＢＳで心臓内灌流を行い、解剖により網膜を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。蛍光色素標識モノクローナル抗体（mAb）をBD社、BioLegend社、eBioscience社またはAbDSerotec社から購入し、製造元のプロトコルに従って使用した。使用した蛍光色素標識モノクローナル抗体は、PEで標識した抗CD11b抗体、抗CD206（MMR）抗体および抗IL-4Rα抗体；PerCP-cy5.5で標識した抗Ly6C抗体および抗CD11b抗体；アロフィコシアニン（APC）で標識した抗CD115抗体、抗TCRβ抗体、抗FoxP3抗体および抗CD204抗体；Alexa647で標識した抗デクチン−１抗体；ならびにPacific Blue/Brilliant Violetで標識した抗TCRβ抗体、抗CD4抗体および抗CD45.2抗体であった。製造元のプロトコルに従ってFoxp3染色バッファーセット（eBioscience）を使用してFoxP3染色を行った。FACSDivaソフトウェアを使用してFACS LSRIIサイトメーター（いずれもBD社）により細胞を分析した。FlowJoソフトウェア（Tree Star社）で分析を行った。いずれの実験においても、関連する陰性コントロール群および陽性コントロール群を用いて、目的とする集団を決定し、それ以外の集団は除外した。
【００７５】
in vivo蛍光イメージング
マウスを麻酔し、プラスチック器具を使用して軽く固定する。網膜を可視化するため、０．５％トロピカミド（Dr. Fischer）を１滴滴下して瞳孔を広げ、眼用潤滑剤（Celluspan；Dr. Fischer）を１滴滴下して眼球上にガラス製カバースリップを載せる。マウスにローダミンデキストラン（マウス１匹につき１ｍｇ；シグマアルドリッチ）を静脈内注射して血管を可視化した。蛍光照明装置およびPixelfly QE電荷結合素子カメラ（PCO）を備えたZoom Stereo Microscope SZX-RFL-2（オリンパス）の観察野にマウスを置く。赤色フィルターセットの励起波長は５１０〜５５０ｎｍであり、発光波長は５９０ｎｍである（ロングパス）。緑色フィルターセットの励起波長は４６０〜４９０ｎｍであり、発光波長は５１０〜５５０ｎｍである。蛍光露光時間は５０ミリ秒とする。画像の取得はCamwareカメラ制御ソフトウェアプログラム（PCO）を使用して行う。画像分析はImageJ 1.43ソフトウェア（W. Rasband、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を使用して行う。
【００７６】
統計的分析
データ分析では、スチューデントのｔ検定を用いて２群を比較する。複数の群の比較には一元配置分散分析を用いる。帰無仮説が否定された場合、フィッシャーのＬＳＤ検定により各群を一対比較して追跡を行う（Ｆ＜０．０５）。結果は平均値±ＳＥで示す。グラフ中、ｙ軸のエラーバーはＳＥを表す。ぶどう膜炎に関する研究では、Levene検定により等分散性を調べた。等分散であった場合、２群の比較にはスチューデントのｔ検定を用い、複数の群の比較には一元配置分散分析を用いてデータの分析を行った。帰無仮説が否定された場合、TukeyのＨＳＤ検定により各群を一対比較して追跡を行った（ｐ＜０．０５）。不等分散であった場合、データを対数変換して可能であれば等分散とし、等分散とすることができなかった場合、Kruskal-Wallis検定を用いて複数の群を比較し、続いてDunn検定を行った。結果は平均値±ＳＥで示す。グラフ中、ｙ軸のエラーバーはＳＥを表す。
【００７７】
実施例１：CX3CR1の高レベル発現およびCCR2の低レベル発現を示すヒト単核細胞のPBMCからの単離
ヒト単球は、CD14およびCD16の発現に基づいて３つの集団、すなわち、CD14＋CD16-単球集団、CD14＋CD16+単球集団、およびCD14dimCD16+単球集団に分けられる。CD14＋CD16-単球は血中単球の８０％〜９０％を占め、ケモカイン受容体CCR2を高レベルで発現し、ケモカイン受容体CX3CR1（フラクタルカインの受容体）を低レベルで発現する。この主要なサブセットとは対照的に、ヒトCD16+単球はCX3CR1を高レベルで発現し、CCR2を低レベルで発現する（Cros et al., 2010）。Crosら（2010）によれば、遺伝子発現分析により、ヒトCD14dimCD16+単球とマウスパトロールGr1dim単球との類似性が示された。CD14dimCD16+細胞は局所組織の自然免疫監視および自己免疫疾患の病態形成に関与する真性単球である。
【００７８】
CX3CR1の高レベル発現およびCCR2の低レベル発現を示すCD14dimCD16+細胞をPBMCから単離するため、スキームＩに示す通り、PBMCからのCD14＋の単離をコントロールとして、CCR2のネガティブ選択（CCR2＋除去）とCD14＋（CD14＋）のポジティブ選択とを組み合わせた方法を用いた。
0006474082.tif 000002
【００７９】
CD14dimCD16+細胞集団の濃縮：
（i）ヒト末梢血からの単核細胞の単離：
健常なドナーから採取した新鮮血（８ｍｌ）をＰＢＳ中２．５％ＦＣＳで１：１に希釈し、フィコール勾配（Ficoll-Paque plus、アマシャムバイオサイエンス）上に重層した。チューブを１０００ｇ、２０℃で２０分間遠心分離した。単核細胞相を採取し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００８０】
（ii）CCR2＋の除去：
ＦｃＲブロッキング試薬（細胞１０６個あたり２．５μｌ）（130-059-901、ミルテニーバイオテク）を使用して、単核細胞を室温で１５分間処理することにより、Ｆｃ受容体をブロッキングした。次いで、洗浄せずに、抗ヒトCCR2モノクローナル−ビオチン試薬（FAB151B、Ｒ＆Ｄシステムズ）（細胞１０６個あたり１０μｌ）を添加し、２〜８℃で３５分間インキュベートした。細胞を冷MACS（登録商標）バッファー（ＰＢＳ中、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％ＦＣＳ）で洗浄し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（130-048-101、ミルテニーバイオテク）（細胞１０７個あたり２０μｌ）を添加し、２〜８℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、MACSバッファー０．５ｍｌ中に再懸濁した。製造元のプロトコルに従ってＬＤカラム（130-042-901、ミルテニーバイオテク）を使用し、CCR2＋細胞を除去した。
【００８１】
（iii）CD14＋細胞の単離：
上記細胞をMACSバッファー（細胞１０７個あたり８０μｌ）中に再懸濁し、CD14＋マイクロビーズ（130-050-201、ミルテニーバイオテク）（細胞１０７個あたり２０μｌ）を添加し、２〜８℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、MACSバッファー０．５ｍｌ中に再懸濁した。製造元のプロトコルに従って、ＬＳカラム（130-042-401、ミルテニーバイオテク）を使用した磁気分離を行い、CD14＋細胞をポジティブ選択した。
【００８２】
（iv）蛍光活性化セルソーティング（FACS（登録商標））によるヒト単核細胞の染色
各試料を製造元のプロトコルに従って以下のように染色した。各試料を７０μｍナイロンメッシュに通し、ＦＣＲブロッキング試薬（細胞１０６個あたり３０μｌ）（130-059-901、ミルテニーバイオテク）を用いて室温で１５分間ブロッキングした。製造元のプロトコルに従って蛍光色素標識抗ヒトモノクローナル抗体を使用した。使用した抗体は、PerCP標識抗CD45抗体（345809、ＢＤ）、FITC標識抗CD115抗体（FAB329F、Ｒ＆Ｄシステムズ）、Pacific Blue（登録商標）標識抗CD14抗体（BLG-325616）、Alexa Fluor（登録商標）700標識抗CD16抗体（BLG-302026）、PE標識抗CX3CR1抗体（MBL-D070-5）、およびPerCP標識抗CCR2抗体（BLG-335303）であった。
【００８３】
実施例２：網膜における神経細胞変性の抑制
いくつかの網膜変性モデルを選択して使用する。使用する網膜変性モデルは、神経変性条件下において一般的に見られる毒性メディエーターであるグルタミン酸塩を用いて網膜を毒性暴露させたＥＡＵ誘導；視神経挫滅；高ＩＯＰモデル；および色素上皮変性病態を最もよく模倣するトランスジェニックマウスである。
【００８４】
ＥＡＵ誘導
ＥＡＵ誘導はヒト後部ぶどう膜炎のモデルである。ぶどう膜炎は網膜変性を生じることが多いため、このモデルをＣＮＳ神経変性のモデルとみなす。２．５ｍｇ／ｍｌの濃度（最終濃度：１．２５ｍｇ／ｍｌ）の結核菌H37.RA株を含有するフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）との１：１エマルションとして、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）に由来するペプチド（１〜２０番目の残基）（２２）（AnaSpec社、GL Biochem (Shanghai)社、またはワイツマン研究所のペプチド合成ユニット）５００μｇをマウスに皮下注射する。これと同時に、マウスの腹腔内に百日咳毒素（シグマ）１μｇを注射する。
【００８５】
上記の投与により、免疫してから１４日後までに８０〜１００％のマウスにおいて疾患が誘導される。疾患のピークは免疫後２２日目〜２９日目に見られる。特異的RGCマーカーであるBrn3aの免疫染色（Nadal-Nicolas, F. M., M. Jimenez-Lopez, P. Sobrado-Calvo, L. Nieto-Lopez, I. Canovas-Martinez, M. Salinas-Navarro, M. Vidal-Sanz, and M. Agudo. 2009. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:3860-3868）、および解剖学的に無傷な軸索を有する細胞の標識に広く用いられている方法であるフルオロゴールドを用いたRGCの逆行性標識（上掲のSchori et al., 2002；上掲のSchwartz and Kipnis, 2007）を使用して、グルタミン酸塩による毒性暴露後７日目、またはＥＡＵ疾患のピークの前後およびＥＡＵ疾患のピーク期に生存しているRGCを評価する。
【００８６】
硝子体内グルタミン酸塩毒性モデル
ＣＮＳ障害の多くにおいてグルタミン酸塩の上昇が報告されている。グルタミン酸塩は、興奮毒性化合物として、急性および慢性の変性障害（緑内障の視神経変性を含む）において最も一般的に見られる毒性メディエーターの１つである（Doble, 1999）。したがって、グルタミン酸塩は、中枢神経系神経の神経変性の全般的なモデルとなる。このモデルにグルタミン酸塩を眼内注射すると、網膜変性障害（加齢黄斑変性、網膜色素変性など）、前部虚血性視神経症、緑内障、またはぶどう膜炎といった様々な眼疾患において生じるような網膜神経節細胞の神経変性を特に典型的に示す。過去の報告（Yoles E, Friedmann I, Barouch R, Shani Y, Schwartz M. Self-Protective mechanism awakened by glutamate in retinal ganglion cells. J Neurotrauma. 2001, Mar; 18(3):339-4; Schori, H., E. Yoles, L. A. Wheeler, T. Raveh, A. Kimchi, and M.Schwartz. 2002. Immune-related mechanisms participating in resistance and susceptibility to glutamate toxicity. Eur. J. Neurosci. 16:557-564）に従って、マウスを麻酔し、局所麻酔（Localin；Dr. Fischer）を眼に直接投与することにより処置し、ｌ−グルタミン酸塩（シグマアルドリッチ）４００ｎｍｏｌを含有する生理食塩水を総量１μｌで硝子体内注射する。
【００８７】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）毒性モデル
様々な動物種において、ＭＮＵを単回全身投与すると網膜変性が引き起こされる。この網膜変性は再現性が高く、また、ヒト網膜色素変性と類似したアポトーシスを介して、ＭＮＵ投与後７日以内に光受容体細胞の喪失が起こる（Tsubura A, Yoshizawa K, Kuwata M, Uehara N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol Histopathol. 2010 Jul;25(7):933-44. Review）。
【００８８】
マウスにおける視神経挫滅
適切に設定された視神経挫滅により、軸索損傷の逆行性シグナル伝達が生じて進行性の神経節細胞死が誘導される（Levkovitch-Verbin H, Harris-Cerruti C, Groner Y, Wheeler LA, Schwartz M, Yoles E. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec;41(13):4169-74）。すなわち、マウスを麻酔し、以下のようにして眼球から１〜２ｍｍの視神経眼窩内部位に重篤な挫滅創を形成させる。手術用双眼顕微鏡を用いて結膜を切開し、視神経を露出させる。調整されたクロスアクション鉗子を使用し、血液供給を妨げないよう十分注意しながら、神経を２秒間挫滅させる。
【００８９】
高ＩＯＰモデル
眼圧（ＩＯＰ）は緑内障の危険因子であり、網膜や視神経の変性を引き起こす場合があるため、一般に神経変性モデルとして、特に緑内障モデルとして使用される。過去の報告（Da, T., and A. S. Verkman. 2004. Aquaporin-4 gene disruption in mice protects against impaired retinal function and cell death after ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:4477-4483; Ben Simon, G. J., S. Bakalash, E. Aloni, and M. Rosner. 2006. A rat model for acute rise in intraocular pressure: immune modulation as a therapeutic strategy. Am. J. Ophthalmol. 141:1105-1111）に従って虚血性損傷を作製する。すなわち、麻酔を行った後、等張食塩溶液（生理食塩水）を入れた容器と連結したマイクロピペットを前房内に挿入することによって眼圧（ＩＯＰ）を上昇させる。この容器を適切な高さに配置することにより、１２０ｍｍＨｇの眼圧を６０分間にわたって誘導する。
【００９０】
トランスジェニックマウスモデル
適切なトランスジェニックマウスとして、例えば、コロイデレミア（ＣＨＭ）ノックアウトマウス（Tanya Tolmachova, Silene T. Wavre-Shapton, Alun R. Barnard, Robert E. MacLaren, Clare E. Futter, and Miguel C. Seabra. Retinal Pigment Epithelium Defects Accelerate Photoreceptor Degeneration in Cell Type-Specific Knockout Mouse Models of Choroideremia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 October; 51(10): 4913-4920.）や、ロドプシン変異（Pro23His）を有するトランスジェニックマウス（Jane E. Olsson, Jon W. Gordon, Basil S. Pawlyk, Dorothy Roof, Annmarie Hayes, Robert S. Molday, Shizuo Mukai, Glenn S. Cowley, Eliot L. Berson, Thaddeus P. Dryja. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): A mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron (1992) 9:815-830）が挙げられる。
【００９１】
プロトコル
移植用の単球を同系マウスの骨髄から単離した。抗CD3抗体、抗CD19抗体および抗CD56抗体を結合させたマイクロビーズでPBMCを標識し、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を除去した。磁気カラムを通過した非標識細胞を採取した。この画分を抗CD16マイクロビーズで標識し、再び上記磁気カラムに載せた。カラムを通過した細胞を採取し、CD14蛍光抗体およびCD16蛍光抗体で染色してFACS分析を行った。PBMCのうち、生細胞全体の１９％は単球（CD14＋）である。これらの単球のうち約１０％はCD16+である。最終生成物中、生細胞の約９０％は単球であり、そのうちCD16+は０．１％未満である。
【００９２】
次いで、網膜神経節細胞に損傷を与える前または与えた後に上記亜集団を眼内注射することによって、網膜損傷発症後に該亜集団が網膜神経節細胞を保護する能力を調べる。
【００９３】
損傷発症後の様々な時点において、自己由来単球の単回注射によりマウスを処置する。各動物モデルにつき、（i）硝子体内注射および（ii）網膜下注射の２種の投与経路について調査する。この研究は、形態学的評価基準または網膜断面の生存細胞成分のカウント数に基づいた網膜神経細胞の生存の評価をエンドポイントとする。
【００９４】
単球亜集団の網膜下注射は、例えばWarfinge et al., 2011の記載に従って実施できるが、網膜下に単球を注射できる技術であればどのようなものを用いてもよい。過去の報告（K. Warfvinge, J. F. Kiilgaard, E. B. Lavik et al., “Retinal progenitor cell xenografts to the pig retina: morphologic integration and cytochemical differentiation,” Archives of Ophthalmology, vol. 123, no. 10, pp. 1385-1393, 2005）に従って、動物を全身麻酔し、硝子体網膜手術を実施する。すなわち、ミダゾラム、ゾラゼパム、チレタミン、キシラジン、ケタミンおよびメサドンからなる筋肉内注射によりブタを前麻酔する。次いで挿管し、人工呼吸器につなぎ、イソフルラン／酸素で麻酔する。手術中、フェニレフリン、トロピカミドおよびアトロピンを局所投与することによって瞳孔を広げる。手術野を準備し、通常の滅菌手法によりドレープをかけてから手術を開始する。局所的３ポート経毛様体扁平部硝子体切除術を行い、緑色アルゴンレーザーを用いて網膜の中心領域を格子状に焼き付ける。網膜切開術を準備し、レーザーで焼き付けた領域の下の網膜下腔に上記単球を適切な注射針で注入する。移植組織が正確な位置に注入されたかどうかは、注射の際に直接可視化することによって確認する。感染予防のため、手術終了時にクロラムフェニコールを予防的に投与する。
【００９５】
実施例３：単球亜集団による加齢黄斑変性の治療
１２時間の周期で明期と暗期とを繰り返す３０００ルクスの光にアルビノラットを暴露させ、これを１ヶ月間、３ヶ月間または６ヶ月間継続する。安楽死させる前に、眼底検査、眼底写真撮影、フルオレセインおよびインドシアニングリーンによる血管造影、ならびに光コヒーレンストモグラフィーを行う。光暴露させたラットを１ヶ月後、３ヶ月後または６ヶ月後に安楽死させ、病理組織学的評価を行う。４−ヒドロキシ−２−ノネナール修飾タンパク質およびニトロチロシン修飾タンパク質の存在について、免疫蛍光染色により網膜を調べる（Daniel M. Albert et al., 2010. Development of choroidal neovascularization in rats with advanced intense cyclic light-induced retinal degeneration. Arch Ophthalmol. 2010;128(2):212-222）。また、損傷発症後の様々な時点において、光暴露させたラットを自己由来単球の単回注射により上記と同様にして処置する。各動物モデルにつき、（i）硝子体内注射および（ii）網膜下注射の２種の投与経路ついて調査する。この研究は、形態学的評価基準または網膜断面の生存細胞成分のカウント数に基づいた網膜神経細胞の生存の評価をエンドポイントとする。
【００９６】
ＡＭＤおよびアルツハイマー病の類似点
ＡＭＤおよびアルツハイマー病はいずれも、かなりの割合の高齢者が罹患する慢性神経変性疾患である。これらの疾患は不可逆的な機能喪失を特徴とし、これに対する治療法は存在しない。ＡＭＤおよびアルツハイマー病において生じる変性の病態形成にはある程度の共通点がある（Klaver et al.,1999. Is age-related maculopathy associated with Alzheimer’s disease? The Rotterdam study. Am J Epidemiol;150:963-8）。ＡＭＤおよびアルツハイマー病の病因はほとんど分かっていないが、これらの疾患の病態形成は驚くほど類似している。ＡＭＤの初期における組織病理学的所見は細胞外におけるドルーゼンの沈着および基底膜沈着である（Hageman, GS. & Mullins, RF. Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Mol Vis 5, 28 (1999)）。これらの病変は、脂質、糖タンパク質およびグリコサミノグリカンを含有し、変性しつつある神経網膜に由来すると考えられる。ドルーゼン沈着物の蓄積は、光受容体の喪失およびそれに続く黄斑機能の低下と関連している（Holz et al., Bilateral macular drusen in age-related macular degeneration. Prognosis and risk factors. Ophthalmology 101, 1522-8 (1994)）。上述したように、アルツハイマー病の初期における病理学的特徴は、細胞外老人斑の存在である（Selkoe, 1991. The molecular pathology of Alzheimer’s disease. Neuron 6, 487-98）。老人斑は様々な成分から構成されており、そのなかには、アミロイド前駆体タンパク質として知られる膜貫通型ポリペプチドファミリーのタンパク質分解切断により生じる小さなペプチドが含まれる。２種のペプチドがアルツハイマー病の病態形成の主因として広く認められており、これらはアミロイド−β（Ａβ）ペプチドとして知られている。アミロイド沈着物とドルーゼンとでいくつかの成分が共通しており、このような成分として例えばビトロネクチン、アミロイドＰ、アポリポタンパク質Ｅなどのタンパク質が挙げられ、さらには、アルツハイマー病のアミロイド斑に関連するＡβペプチドおよびアミロイドオリゴマーもこのような成分に含まれる（Luibl et al., 2006. Drusen deposits associated with aging and age-related macular degeneration contain nonfibrillar amyloid oligomers. J Clin Invest 116, 378-85; Mullins et al., 2000. Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease. Faseb J 14, 835-46; Yoshida et al., 2005. The potential role of amyloid beta in the pathogenesis of age-related macular degeneration. J Clin Invest 115, 2793-800）。
【００９７】
アルツハイマー病において見られるＡβペプチドはミクログリア細胞を活性化して、反応性酸素種、反応性窒素種、炎症性サイトカイン、補体タンパク質、神経変性変化を引き起こす他の炎症性メディエーターなどの、神経毒性を持つ可能性のある物質を産生させる。アルツハイマー病に関連する炎症反応においては、ＣＮＳでの自然免疫を担うCD11b+活性化ミクログリアが見られる場合が多い。CD11b+ミクログリアは高齢者の正常脳と関連していることが報告されており（Streit, 2004. Microglia and Alzheimer’s disease pathogenesis. J Neurosci Res 77, 1-8）、このミクログリアは加齢性認知障害と神経発生障害の両方を引き起こしている可能性がある（Monje et al., 2003. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science 302, 1760-5）。また、CD11bはアルツハイマー病患者においても確認されている（Akiyama & McGeer, 1990. Brain microglia constitutively express beta-2 integrins. J Neuroimmunol 30, 81-93）。さらに、炎症性メディエーターはアミロイド沈着物とドルーゼンの両方に存在することから、ＡＭＤおよびアルツハイマー病の炎症経路において共通の役割を果たしていることが示唆される（Hageman et al., 2001. Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Mol Vis 5, 28）。ドルーゼンの生合成において局所炎症が果たしている役割から、アルツハイマー病において生じるプロセスとの類似性が示唆され、アルツハイマー病では、細胞外プラークや沈着物の蓄積によって慢性的な局所炎症反応が誘導され、これによって一次的な病原性刺激作用が増強される（Akiyama et al., 2000. Inflammation and Alzheimer’s disease. Neurobiol Aging 21, 383-421）。
【００９８】
上記を考慮すれば、上記で定義された単球亜集団のＡＭＤ治療に対する有効性を、凝集Ａβに暴露させた神経細胞を利用したモデルを用いて評価することもできる。
【００９９】
実施例４：マウス単球の硝子体内注射−グルタミン酸塩の毒性に暴露させた後の網膜神経節細胞の生存率に対する効果および注射した細胞の特徴分析
プロトコル：
マウスを麻酔し、Ｌ−グルタミン酸塩（GT）（生理食塩水１μｌ中）４００ｎｍｏｌを右眼に硝子体内注射した。翌日、マウス由来のCD115+骨髄単核細胞（BMMC）を硝子体内注射用細胞として精製した。すなわち、（cx3cr1骨髄プロモーターの制御下にGFPレポーターを有する）ドナーマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を採取し、フィコール密度勾配により単核細胞を濃縮した。目的の集団をポジティブ選択するためのビオチン化抗CD115抗体およびストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク）を使用した磁気細胞分離（MACS）システムにより、CD115+BM単球集団を単離した。GTの毒性に暴露させた眼にマウス１匹につき（ＰＢＳ１μｌ中）１０５個の単球を（前日にGTを注入した孔から）硝子体内注射した。コントロール群にはＰＢＳを注射した。
【０１００】
GT注射後７日目に、マウスを灌流固定し、眼球を採取して２．５％ＰＦＡ中に一晩おいた。次いでこの溶液を１％ＰＦＡに交換し、さらに３〜４日間にわたって眼球を浸漬した後、RGCマーカーであるBrn3aで免疫組織染色した。１試料につき、眼の深さ方向の様々な位置から切片を４つ採取し、それぞれの切片について測定を行った。網膜の神経節細胞層において、Brn3a+、IB-4-およびHoechst＋の細胞をカウントした。ＰＢＳを注射した眼を陰性コントロールとして使用し、同一マウスの損傷を与えなかった反対側の眼をRGC生存率の陽性コントロールとして使用した。
【０１０１】
GFPで染色することにより、注射したマウス細胞を眼内で追跡し、さらに、いくつかの免疫マーカー（サイトカイン、増殖因子、食作用マーカー）を染色してこの細胞の表現型の特徴を分析した。
【０１０２】
結果：
硝子体内に注射したマウス単球はRGCに対して保護効果を示した（図１Ａ〜Ｃ）。単球は、注射した眼の硝子体内と神経節細胞層（損傷を与えたRGCが存在する部位）の近傍に検出された。また、いくつかの単球は網膜下腔でも検出できた（図２）。
【０１０３】
GFPと様々な免疫マーカーとを二重免疫染色したところ、CX3CR1−GFP＋マウス単球において、IL-10、TGF-β、IGF-1、BDNF、CD36およびArg-1（アルギナーゼ−１）の発現が見られ、さらにTNFαおよびIL-1βが発現していることも分かった（図２）。この分析は定性分析であることから、注射した細胞におけるこれらの様々なマーカーの発現頻度は測定できていないことには注意されたい。
【０１０４】
実施例５：ＣＮＳ由来自己免疫ワクチン接種による、視神経挫滅後の網膜へのマクロファージおよびＴ細胞の浸潤の増強
損傷神経系部位への単球の動員を増強する方法が重要ではないこと、および網膜の損傷だけでなく視神経の損傷も治療できる可能性があることを示すため、ＣＮＳ特異的抗原を用いた免疫化により内在性細胞の視神経損傷部位への遊走を促した。
【０１０５】
プロトコル：
[Cx3cr1GFP/+→WT]BMキメラを以下のようにして作製した。WTレシピエントマウスの全身に致死量の放射線（９５０ｒａｄ）を照射した。この際、頭部を遮蔽して、網膜への直接的な損傷と、視神経挫滅（ＯＮＣ）により誘導される骨髄系細胞以外の骨髄系細胞による浸潤を防いだ。翌日、Cx3cr1GFP/+トランスジェニックマウスに由来する骨髄細胞５×１０６個を尾静脈に注射することによって、マウスを新たに作製した。得られたマウスにおいては、血液から浸潤した単球のみがGFP標識を有する。
【０１０６】
次いで、２．５ｍｇ／ｍｌのフロイントの完全アジュバント（Difco）にＭＯＧ改変ペプチド（４５Ｄ；配列：MEVGWYRSPFDRVVHLYRNGK）１００μｇを乳化させたエマルション１００μｌを１群のマウスに皮下注射した。
【０１０７】
ワクチン接種から１週間後、マウス（ワクチン接種群およびワクチン非接種群）を麻酔し、手術用双眼顕微鏡下でクロスアクション鉗子を使用して右視神経に重篤な挫滅創を形成した。反対側の神経には挫滅創を形成しなかった。
【０１０８】
ＯＮＣから７日目にマウスを灌流固定し、網膜を採取し、単一細胞懸濁液を作製してフローサイトメトリー分析を行った。
【０１０９】
結果：
ＯＮＣにより網膜中の総白血球数（CD45+）が増加し、この白血球の増加は、４５Ｄをワクチン接種した損傷マウスにおいて増強された（図３Ａ）。
【０１１０】
ワクチン非接種の損傷マウスの網膜と比較して、ＯＮＣを行う前に４５Ｄをワクチン接種したマウスの網膜では、マクロファージおよびＴ細胞も増加した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。
【０１１１】
実施例６：ＣＮＳ由来自己免疫ワクチン接種によってもたらされる、視神経挫滅後の網膜神経節細胞に対する神経保護効果の評価
プロトコル：
損傷網膜における末梢単球数の増加に対するワクチン接種の効果と、視神経挫滅損傷後のRGCの生存率との相関関係を以下の実験により証明することができる。２．５ｍｇ／ｍｌのフロイントの完全アジュバント（Difco）にＭＯＧ改変ペプチド４５Ｄ（４５番目のセリンがアスパラギン酸に改変されたミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５）１００μｇを乳化させたエマルション１００μｌを１群のマウスに皮下注射する。
【０１１２】
ワクチン接種から１週間後、マウス（ワクチン接種群およびワクチン非接種群）を麻酔し、手術用双眼顕微鏡下でクロスアクション鉗子を使用して右視神経に重篤な挫滅創を形成する。反対側の神経には挫滅創を形成しない。
【０１１３】
ＯＮＣから７日後にマウスを灌流固定し、眼球を採取して固定液（２．５％ＰＦＡ→１％ＰＦＡ）に入れ、RGCマーカーであるBrn3aを用いた免疫組織染色を行う。１試料につき、眼の深さ方向の様々な位置から切片を４つ採取し、それぞれの切片について測定を行う。網膜の神経節細胞層において、Brn3a+、IB-4-およびHoechst＋の細胞をカウントする。ワクチン非接種マウスの損傷を与えなかった方の眼をRGC生存率の陽性コントロール（１００％）として使用する。
【０１１４】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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