(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤であって、
該トリブロックコポリマーが式ＩＩ
【化１１】
0006496252.tif 000019
式中、
Ｌ1’は、独立して
【化１２】
0006496252.tif 000020
からなる群より選ばれ、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｍの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリ
メチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、２０〜５，０００の整数である、
で表され、かつ、
該アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、
癒着防止用製剤。
【請求項２】
Ｒが、次式
【化４】
0006496252.tif 000021
式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基から選ばれ、Ｒの総数ｍの少なくとも８０％を前記式で表される基が占める、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
【請求項３】
ポリアニオン性ポリマーが、ポリアニオン性多糖類である、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
【請求項４】
ポリアニオン性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸からなる群より選ばれる請求項１に記載の癒着防止用製剤。
【請求項５】
ポリアニオン性多糖類が、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンからなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である、請求項３に記載の癒着防止用製剤。
【請求項６】
トリブロックコポリマーのアミノ基のモル数とポリアニオン性ポリマーのアニオン性基のモル数が、１またはそれを超える数：１である、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
【請求項７】
生理学的水性条件下で不可逆的ゲルを形成する、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
【請求項８】
生体内組織または器官の癒着防止用製剤を製造するためのトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物の使用であって、
該トリブロックコポリマーが式ＩＩ
【化１１】
0006496252.tif 000022
式中、
Ｌ1’は、独立して
【化１２】
0006496252.tif 000023
からなる群より選ばれ、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｍの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、２０〜５，０００の整数である、
で表され、かつ、
該アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、使用。
【請求項９】
トリブロックコポリマーと修飾されたポリアニオン性ポリマーを含む組成物であって、
該トリブロックコポリマーが式ＩＩ
【化１１】
0006496252.tif 000024
式中、
Ｌ1’は、独立して
【化１２】
0006496252.tif 000025
からなる群より選ばれ、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｍの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、２０〜５，０００の整数である、
で表され、かつ、
該修飾されたアニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルデキストラン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸からなる群より選ばれ、該アニオン性ポリマー分子中のカルボキシル基の５〜４０％を介して蛍光性色素が共有結合しているものである、
組成物。
【請求項１０】
Ｒが、次式
【化１０】
0006496252.tif 000026
式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基から選ばれ、Ｒの総数ｍの少なくとも８０％を前記式で表される基が占める、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が個体における組織または器官の癒着防止または生体内滞留性を評価するために使用される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
式ＩＩ
【化１１】
0006496252.tif 000027
式中、
Ｌ1’は、独立して
【化１２】
0006496252.tif 000028
からなる群より選ばれ、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｍの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、２０〜５，０００の整数である、
で表される、
トリブロックコポリマー。
【請求項１３】
請求項１２に記載のコポリマーの製造方法であって、
次式ａ
【化１３】
0006496252.tif 000029
式中、Ｌ1’およびｎは上記式ＩＩについて定義したとおりであり、ＣＴＡは、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる連鎖移動剤である、
で表される両末端が修飾されたポリ（エチレングリコール）を、不活性溶媒中で、ラジカル源としてのアゾ化合物の存在下で、クロロメチルスチレンと重合させることにより、次式ｂ
【化１４】
0006496252.tif 000030
式中、ＣＴＡ、Ｌ1’、ｍおよびｎは、上記定義のとおりである、
で表されるトリブロックコポリマーを得、次いで、
Ｈ2Ｎ−（Ｃ1-6アルキレン）q−Ｒ
式中、Ｒは式ＩＩについて定義したとおりである、
で表されるアミン化合物と反応させる工程を含んでなる、製造方法。
【請求項１４】
式ｂ
【化１５】
0006496252.tif 000031
式中、
Ｌ1’は、独立して
【化１６】
0006496252.tif 000032
からなる群より選ばれ、
ＣＴＡは、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6
アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる連鎖移動剤であり、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、２０〜５，０００の整数である、
で表される、
トリブロックコポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性を有する物質を利用したフィルムもしくはシートタイプの癒着防止剤が手術の過程で使用されてきた。このような用途に向けた材料の一例としてヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースに由来するゲル組成物やコラーゲンをベースとする材料を利用したフィルムが提案されている（例えば、それぞれ、特許文献１、特許文献２参照）。しかし、このようなフィルムについては手術中における扱いが困難、組織表面への被覆能力が低いなどの問題が指摘されてきた。一方で、ゲル状のまま使用するための材料の開発が進められており、粘弾性に優れたハイドロゲルの形成を可能にするというカルボキシメチルセルロースの誘導体を医療用ゲルや癒着防止材として使用することが提案されている（例えば、特許文献３参照）。これらのゲル状の癒着防止材の中には、既に実用化を目指して開発が進められているものもある。しかしながら、より効果的な癒着防止能を有するゲル状の癒着防止材（または剤）に対するニーズは依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１９１９４号公報
【特許文献２】特開平３−２９５５６１号公報
【特許文献３】ＷＯ２００９／０７８４９２号公表公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、環状ニトロキシドラジカルを特定のブロックコポリマーに共有結合せしめることで該ニトロキシドラジカルを安定化することに成功し、また、活性酸素種（ＲＯＳ）を効果的に消去できることを見出した（ＷＯ２００９／１３３６４７参照）。さらに、本発明者等は、かような環状ニトロキシドラジカルを特定のトリブロックコポリマーに共有結合せしめたカチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーで形成したイオンコンプレックスが活性酸素の消去を必要とする生体内局所、例えば、歯周ポケット、癌病巣部等に滞留し、炎症を抑制し得るゲルを提供することに成功し、こうして完成した発明について特許出願した（ＷＯ２０１３／１１１８０１参照）。【０００５】
今回、かようなゲルを提供し得るイオンコンプレックスの水性溶液が、生理学的条件下または生体内において、不可逆的ゲルを形成するとともに生体内で組織または器官どうしの接着を防ぐ物理的バリアーとして機能し、優れた癒着防止効果を発揮することを見出した。また、特に該イオンコンプレックスを水溶液中のミセル状態で使用すると、生体に投与後迅速に不可逆ゲルを形成し得ることも見出した。理論に拘束されるものではないが、このようなすぐれた癒着防止効果は、前記の迅速に形成し得る不可逆的ゲルによる優れた物理的バリアー性に加えて、手術等により損傷を受けた組織または器官と周辺の組織または器官の間で生じる炎症の抑制作用によるものと理解している。【０００６】
したがって、前記課題を解決するための手段として、下記式Ｉで表されるトリブロックコポリマーと下記のポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤、生体内組織または器官の癒着防止用製剤を製造するための当該組成物の使用、あるいは投与を必要とする生体局所に当該組成物を前記癒着防止に有効な量を投与することを含んでなる癒着防止方法を提供する。【０００７】
【化１】
0006496252.tif 000002
【０００８】
式中、
Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｍの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、５〜５，０００の整数である。
【０００９】
一方、該アニオン性ポリマーはポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である。
さらに、本発明は、当該組成物においてポリアニオン性ポリマーにおけるカルボキシル基の５〜４０％が蛍光性色素により修飾されている組成物に関する。
また、本発明は、当該式Ｉで表されるトリブロックコポリマーの一部の新規コポリマー及びそれらの合成前駆体に関する。【００１０】
＜発明の詳細な説明＞
はじめに、本明細書において使用する技術用語は、別に定義しない限り、当該技術分野において常用されている意味、内容のものとして使用している。
＜癒着＞
一般的に、手術によって傷ついた正常な生体内の組織または器官同士を縫合すると、その組織または器官はくっついて自然に治癒（創傷治癒）する。しかし、治癒の過程で本来は離れているべき組織同士がくっつくことがあり、これを「術後癒着」と呼ぶが、本発明にいう癒着は、このような術後癒着を包含し、広範に、本来離れているべき組織同士や器官（臓器）若しくは組織面が外傷や炎症のためにくっついてしまう状態を意味する。生体内とは、哺乳動物、特にヒトに関するものを意図しており、患者とは哺乳動物、特にヒトを意図している。【００１１】
＜トリブロックコポリマー＞
前記式Ｉで表されるトリブロックコポリマーは、上式中、
各Ｌ1が、好ましくは、独立して、単結合、−Ｓ−（ＣＨ2）c−、−Ｓ−（ＣＨ2）cＣＯ−、−（ＣＨ2）cＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）cＳ−、【００１２】
【化２】
0006496252.tif 000003
【００１３】
からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｙが、好ましくは、Ｈであるか、または−ＳＨ、【００１４】
【化３】
0006496252.tif 000004
【００１５】
からなる群から選ばれ、
Ｒが、独立して、Ｒの総数ｍの中、一般的には２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは約９０％以上または１００％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、独立して、好ましくは、３〜１００、より好ましくは３〜５０の整数であり、そして
ｎは、好ましくは、５〜１０００、より好ましくは１０〜２００の整数である、
で表される。
なお、式Ｉにおける連結基Ｌ１について例示する、例えば−Ｓ−（ＣＨ２）ｃ−等の結
合部位が異なる場合、記載されている方向の右側の結合子（当該事例では、（ＣＨ２）ｃ−で表される結合子）を介して式中の酸素原子（Ｏ）に結合し、Ｌ２についてはＲに対してＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−の結合子を介して結合する、ことを意味する。
【００１６】
本発明に関して、Ｃ1-6アルキルまたはそれらを含む基、例えばＣ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオ中のアルキル部分は、限定されるものではないが具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル等の分岐もしくは直鎖の低級アルキル基を挙げることができる。【００１７】
Ｃ1-6アルキレンは、限定されるものではないが具体的には、メチレン、１，２−プロパンジイル、１，３−プロパンジイル、１，４−ブタンジイル、等の相当するアルキルのジイル基を挙げることができる。【００１８】
Ｒ基の環状ニトロキシドラジカルは、好ましくは、
次式【００１９】
【化４】
0006496252.tif 000005
【００２０】
上式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基を挙げることができる。【００２１】
このようなトリブロックコポリマーは、前記ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されており、記載内容は、ここに引用することにより本明細書の内容となる。また、当該国際公開パンフレットに記載の方法で製造できないものは、後述する方法によって効率よく製造することができる【００２２】
＜ポリアニオン性ポリマー＞
本発明で用いる、ポリアニオン性ポリマーは、水性溶液中で前記式Ｉ表されるトリブロックコポリマーと安定なポリイオンコンプレックスを形成できるポリアニンオン性有機高分子化合物である。具体的なものとしては、限定されるものでないが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質等からなる群から選ばれる１種またはそれ以上であり、好ましいものとしては、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリンからなる群より選ばれるポリアニオン性多糖類、アルブミン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸からなる群より選ばれるアニオン性タンパク質を挙げることができる。特に、アニオン性多糖類が好ましい。これらのポリアニオン性ポリマーの分子量は、ポリマーの種類によって最適値が異なり、限定されるものでない。しかし、ポリアクリル酸の場合、Ｍｎが、１０００〜１００００００、好ましくは、１０００〜１０００００、より好ましくは、１０００〜１００００であり、ポリアニオン性多糖類、例えばコンドロイチン硫酸の場合、ＭｎまたはＭｗが１０００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００であり、アニオン性タンパク質、例えば、ポリアスパラギン酸の場合、ＭｎまたはＭｗが１０００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００ある。これらは市販のものを、必要に応じて精製して使用することができる。
また、修飾されたアニオン性ポリマーは、前記ポリアニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルデキストラン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸が、それらのカルボキシル基と蛍光色素、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、アレキサフローラ類等のカルボキシル基と共有結合し得る官能基との間で共有結合することにより修飾されたものを意味する。【００２３】
＜トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーの使用の態様＞
トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーは、それらを含む組成物が、一般的な水性溶液（例えば、純水もしくはイオン交換水中に溶質を溶解もしくは分散させた溶液）中でそれらの分子が会合してミセルを形成することにより、透明なポリイオンコンプレックスミセルとして存在し得る割合で使用することが望ましい。本発明の理解を容易にする目的で、このようなイオンコンプレックスミセルの概念図を図１に示す。このようなミセル溶液は、さらに本発明の目的に沿うためには、水性溶液のイオン強度、ｐＨ、温度等の変化、特に、室温等のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調製ミセル溶液から生体内環境下または生理学的条件下への変化により、不可逆的ゲルを形成する割合でトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーが含められる必要がある。このような変化は、例えば、イオン強度が、イオン濃度０（ゼロ）もしくは数十ｍＭからイオン濃度１５０ｍＭのように変化することにより、また、温度の変化は、通常室温で前記ミセルが形成されるが、３７℃程度以上に上昇することを意味する。したがって、本発明により提供される組成物は、生体内滞留性を示し、一方で、トリブロックコポリマーが担持する環状ニトロキシドラジカル化合物が活性酸素を消去し得るので、炎症を伴う組織または器官の癒着を効果的に防止できる。また、トリブロックコポリマーと修飾されたアニオン性ポリマーを含む組成物は、前記生体内滞留性を示し、かつ、修飾基または部分により当該組成物（ポリイオンコンプレックス）の生体内での挙動を検出することを可能にする。このような検出には、ＩＶＩＳイメージングを適用できる。【００２４】
このような割合は、トリブロックコポリマーのアミノ基（もしくはイミノ基）のモル数とポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーのアニオン性基のモル数が１：４〜４：１、好ましくは、１：１〜４：１であり、より好ましくは前者のモル数が後者のモル数を超えるものである。【００２５】
前記組成物から形成されたポリイオンコンプレックスは、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むポリイオンコンプレックスミセルの水溶液として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、鉱酸を含む酸性水溶液、生理食塩水、生理学的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、賦形剤は、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。このように調製される製剤の有効量は、後述するような実験動物を用いる効能試験等の結果に基づき、専門医師が容易に決定できる。【００２６】
本発明では、組成物が前記のポリイオンコンプレックス、特に、そのミセル溶液は、必要により、当該技術分野で公知の滅菌方法、電子線照射等、により滅菌した後、生体内の組織または器官の癒着を防止もしくは抑制する必要のある局所に適用または投与される。かような適用は、注射器等の適当な注入用具を用いて注入可能であるので、標的とする特定の局所を選択する際に制限を受けない。【００２７】
＜新規なトリブロックコポリマー＞
式Ｉ中のＬ1が、独立して【００２８】
【化５】
0006496252.tif 000006
【００２９】
からなる群より選ばれ、かつ、
Ｙが、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれる、トリブロックコポリマー、すなわち、下式ＩＩ【００３０】
【化６】
0006496252.tif 000007
【００３１】
式中、Ｌ1’は、独立して【００３２】
【化７】
0006496252.tif 000008
【００３３】
からなる群より選ばれ、
Ｙが、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれる、かつ、
Ｌ2、Ｒ、ｍ及びｎは、上記式Ｉについて定義したとおりである、
で表されるトリブロックコポリマーは、ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されておらず、また、本発明者等の知る限り、従来技術文献に未載の新規化合物である。【００３４】
このようなトリブロックコポリマーは、例えば、次式ａ【００３５】
【化８】
0006496252.tif 000009
【００３６】
式中、Ｌ1’およびｎは上記式ＩＩについて定義したとおりであり、ＣＴＡは連鎖移動剤、例えば、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる、
で表される両末端が修飾されたポリ（エチレングリコール）またはポリ（オキシエチレン）誘導体に対し、不活性溶媒、例えばトルエン等中で、ラジカル源としてのアゾ化合物、例えば、２，２’―アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）の存在下、２０〜８０℃にて、１８〜２４時間、クロロメチルスチレン【００３７】
【化９】
0006496252.tif 000010
【００３８】
を重合させることにより、次式ｂ【００３９】
【化１０】
0006496252.tif 000011
【００４０】
式中、ＣＴＡ、Ｌ1’、ｍおよびｎは、上記定義のとおりである
で表されるトリブロックコポリマー前駆体を得、次いで、
Ｈ2Ｎ−（Ｃ1-6アルキレン）q−Ｒ
式中、Ｒは式Ｉについて定義したとおりである
で表されるアミンと、溶媒、例えばジメチルフォルムアミド中で、必要により、脱ハロゲン化水素剤、例えば、ピリジンの存在下、室温〜７０℃にて、３〜７２時間反応させ、さらに必要により、還元条件下で処理することにより、提供できる。【００４１】
これらの方法は、ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されたトリブロックコポリマーの製造方法に比べて製造コストの点で商業的規模での製造に適し、また、ポリマー自体も分子量や分散度をより効果的に制御できる点で、利点を有している。【００４２】
したがって、本発明は、本発明の組成物を製造するためのかようなトリブロックコポリマー、その前駆体、および製造方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明にしたがうイオンコンプレックスミセルの概念図である。
【図２】製造例１で得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトル測定の結果を表す図である。
【図３】製造例１で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図４】製造例２で得られたＢｒ−ＰＥＧ−ＢｒポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図５】製造例２で得られたＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図６】製造例２で得られたＰＣＭＳ−ＰＥＧ−ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図７】製造例２で得られたＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図８】製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ＋ＣＳ）の粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。
【図９】製造例２で調製したポリイオンコンプレックスミセルの粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。
【図１０】製造例１（１）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。
【図１１】製造例１（２）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。
【図１２】製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）の粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。
【図１３】製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。
【図１４】製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。
【図１５】製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ＋ＣＳ）の癒着防止効果を示す写真である。
【図１６】試験２を行う際の実験手順を示す図である。
【図１７】試験２で使用した癒着スコアシステムに関する図である。
【図１８】試験２におけるスコアシステムによる癒着レベルの定量評価を表す図である。
【図１９】試験２における腹膜切片の活性酸素産生評価の図である。
【図２０】試験２における腹膜切片の組織観察図である。
【図２１】試験２における腹膜切片の膜厚測定結果を表す図である。
【図２２】試験２におけるＭＰＯ活性評価の図である。
【図２３】試験３を行う際の実験手順に関する図である。
【図２４】試験３で使用した癒着スコアシステムに関する図である。
【図２５】試験３におけるスコアシステムによる癒着レベルの定量評価を表す図である。
【図２６】試験３における血中白血球数を表す図である。
【図２７】試験３における腹膜切片の活性酸素産生評価の図である。
【図２８】試験３における腹膜切片のＭＰＯ活性評価の図である。
【図２９】試験３における脂質過酸化量評価の図である。
【図３０】製造例３(２)及びゲル化の概念図である。
【図３１】製造例３(２)のイオンコンプレックスのゲル化試験の結果を示す図に代わる写真である。
【図３２】試験４における各サンプルのイメージングの結果を示す図面に代わる画像写真である。
【図３３】試験４における各サンプルの残存量を示す定量データのグラフ表示である。
【実施例】
【００４４】
以下に、具体例を挙げ、さらに本発明をより具体的に説明するが、これらの具体例に本発明を限定することを意図するものではない。【００４５】
Ａ．ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレントリブロックコポリマー及びその環状ニトロキシドラジカルの修飾化合物、並びに該修飾化合物とポリアニオン性ポリマー（イオンコンプレックス）及びその使用について
＜製造例１＞
（１）  ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：【００４６】
【化１１】
0006496252.tif 000012
【００４７】
両末端にチオール基を有しているポリエチレングリコール（ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：１００００；０．１０７ｍｍｏｌ，１．０７ｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に２，２’−アゾビスイソブチロニトリル／トルエン（０．１０７ｍｍｏｌ／１０ｍｌ）溶液とクロロメチルスチレン（８．０３ｍｍｏｌ，１．１３ｍｌ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１．２８ｍｇであり、収率は９０．３％であった。得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの結果を図２に示す。【００４８】
（２）  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックポリマー（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の合成
反応容器に、上記（１）で得られる、ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：１３２６３；１．１２ｇ，０．０８４ｍｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（１．５４５ｇ，０．４２２ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で２４時間攪拌を行った。反応終了後、反応溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｓｉｚｅ  ３，５００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）中に加え、２Ｌのメタノールに対して透析を行った。メタノールは２時間ごとに８回交換し、エバポレーションを行い、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、９０．１％であった。  1Ｈ  ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた（図３参照）。【００４９】
＜製造例２＞
（１）  Ｂｒ−ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））−Ｂｒの合成
Ｂｒ−ＰＥＧ−Ｂｒは、次の合成スキーム２に従い合成した：【００５０】
【化１２】
0006496252.tif 000013
【００５１】
両末端にヒドロキシル基を有しているポリ（エチレングリコール）（ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ）（Ｍｎ：１００００：５０ｇ）を１１０℃で１２時間減圧乾燥し脱水した。次にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍｌ加え、そこへブチルリチウム１０ｍｌ（１６ｍｍｏｌ）とジブロモキシレン２５ｇを加えて５０℃、２４時間反応させることにより両末端がブロモ化したＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒを得た。得られたポリマーは２−プロパノールに沈殿し、真空乾燥することで精製し。得られたＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図４に示す。【００５２】
（２）ＣＴＡ（連鎖移動剤（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ））―ＰＥＧ−ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）の合成（ジチオフェニルエステル両末端化ＰＥＧの合成）
ＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡは、次の合成スキーム３に従い合成した：【００５３】
【化１３】
0006496252.tif 000014
【００５４】
ＴＨＦ５０ｍｌに二硫化炭素を２．４ｍｌ加えた。次いで、ベンジルマグネシウムブロミド６．７ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）を氷冷化で徐々に加えて反応させ、マグネシウムベンゾチオブロマイドを得た。製造例２（１）で合成したＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒ  ５０ｇをＴＨＦ２００ｍｌに溶かし作製したマグネシウムベンゾチオブロマイドを全て加え、６０℃、２４時間反応させることで、目的物質であるＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）―ＰＥＧ−ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）を得た。得られたＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡは２−プロパノールで沈殿し、真空乾燥で精製した。得られたポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図５に示す。【００５５】
（３）  ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム４に従い合成した：【００５６】
【化１４】
0006496252.tif 000015
【００５７】
製造例２（２）で合成したＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡ  １０ｇとアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）６０ｍｇを窒素雰囲気下でトルエンを２００ｍｌ加えて、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）を１５ｍｌ加え、６０℃、２４時間攪拌することで、目的物質であるＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを得た。得られたポリマーは２―プロパノールで沈殿し、減圧乾燥にて精製した。得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図６に示す。【００５８】
（４）  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックコポリマー（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の合成
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴは、次の合成スキーム５に従い合成した：【００５９】
【化１５】
0006496252.tif 000016
【００６０】
製造例２（３）で合成したＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ  ５ｇと４−アミノ  ＴＥＭＰＯ  ７．７ｇをＤＭＳＯに溶解し、５０℃で撹拌し、反応させることで目的物質であるＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴｂ−ＰＭＮＴを得た。得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ―ｂ−ＰＭＮＴは２―プロパノールに沈殿し、減圧乾燥にて精製した。ポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図７に示す。【００６１】
＜実施例１＞  ポリイオンコンプレックスミセルの作製
製造例１（４）で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとコンドロイチン硫酸（ＣＳ；Ｍｗ：６０ｋ）をそれぞれＮａ2ＨＰＯ4バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とアニオンＣＳ水溶液を調製した。さらに、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液をコンドロイチン硫酸水溶液に撹拌したなら滴下し、ｐＨが３．０、４．０、５．０、６．０と条件を変えたポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＣＳのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＣＳの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が４５〜６０ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された。また、図８に粒径の分布を示す。【００６２】
【表１】
0006496252.tif 000017
【００６３】
＜実施例２＞  ポリイオンコンプレックスミセルの作製
製造例２（４）で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマー１００ｍｇをメタノールに溶解し、そこへ水に溶解したポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）１７．２ｍｇを加えた。次いで、この溶液を水に対して透析することによって、ポリイオンコンプレックスミセルを作製した。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が３１ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された（図９参照）。【００６４】
＜実施例３＞  インジェクタブルゲルの調製
（１）実施例１で作製した各ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。実験の結果を示す図面に代わる写真を図１０に示す。この図から、ｐＨ４．０のＰＩＣミセル溶液で、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲルが形成したことが確認される。【００６５】
（２）また、ポリカチオン（Ｎ+）とポリアニオン（ＣＯＯ-）の比を、１：１、２：１および１：２とし、ｐＨを５．０にしたこと以外（１）に記載の試験管反転法を繰り返した。その結果を示す図面に代わる写真を図１１に示す。ポリカチオンの割合を増加させることにより凝集体が生じていたｐＨ値（ｐＨ  ５．０）においても不可逆的ゲル化が起こることが確認された。【００６６】
＜実施例４＞  ポリイオンコンプレックスミセルの作製
製造例１（２）で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末１ｇを０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）をそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とアニオン性ＰＡＡ水溶液を調製した。さらに、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液をポリアクリル酸水溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨ＝６．２のポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により決定したところ、平均粒径が４０〜５０ｎｍ程度の単峰性の粒子であることが確認された（図１２参照）。【００６７】
＜実施例５＞  インジェクタブルゲルの調製
実施例４で作製した各ポリイオンコンプレックスミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。ｐＨ４．０またはｐＨ６．２のＰＩＣミセル溶液で、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲル化したことが確認された（それぞれ、図１３または図１４参照）。【００６８】
＜試験１＞  レドックスインジェクタブルゲルによる癒着防止能評価実験（動物実験）
実施例３（２）にしたがって作製したＰＩＣミセル（ｐＨ５、Ｎ+：ＣＯＯ-＝２：１）を癒着モデルマウスに対して腹腔内投与して癒着防止効果の評価を行った。【００６９】
具体的には、ＩＧＳマウス（ｎ＝３，２５〜３０ｇ）の腹腔内に炎症を引き起こし、癒着を生じさせるタルク（Ｔａｌｃ：１００ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内注射により３００μｌ投与し、１日後サンプル（ＰＢＳ、ＰＩＣミセル（３０ｍｇ／ｍｌ））を同様に腹腔内に５００μｌ投与した。サンプルの投与から４日後、ＩＧＳマウスの腹部を開腹し癒着の程度を確認した（結果を示す図面に代わる写真を図１５に示す）。ＰＢＳを投与した場合（図１５左）、臓器間（肝臓や小腸）において強固な癒着が見られる一方、ＰＩＣミセルを投与したマウスでは癒着が見られないことが確認できる。このことから生体環境下においてゲル化したＰＩＣミセルが癒着防止効果を示す材料として使用できることが理解できる。【００７０】
＜試験２＞  レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）による癒着防止能評価実験（動物実験）
実施例４に従って作製したポリイオンコンプレックスミセル（ｐＨ６．２，Ｎ+：ＣＯＯ-＝１：１）を癒着モデルマウスに対し腹腔内投与し癒着防止効果およびＲＩＧの有する活性酸素除去能による抗炎症効果を評価した。実験手順については図１６を参照されたい。【００７１】
ＩＧＳマウス（ｎ＝８，２５〜３０ｇ）に癒着剤としてタルク（１００ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ腹腔内に投与し炎症を誘発させることによって癒着モデルマウスを作製した。ＲＩＧによる癒着防止の評価のため、作製したＲＩＧ（３０ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ同様に腹腔内投与（Ｔａｌｃ投与の１日後）し時間経過をおって（Ｔａｌｃ投与の２日後、５日後）に評価を行った。本試験で使用したマウスの実験群としては健常（Ｈｅａｌｔｈｙ群（Ｎｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ））、Ｔａｌｃ群（Ｔａｌｃのみ腹腔内投与）、Ｔａｌｃ＋ＲＩＧ群（Ｔａｌｃ投与後、ＲＩＧを投与）である。【００７２】
試験結果１：癒着スコアシステムによる癒着レベルの比較
腹部を開腹、腹腔内を観察し図１７に示すスコアシステムにしたがい、癒着の程度をスコア別に分類した（腸をピンセットで持ち上げた際にどの程度の臓器と接着、癒着を形成しているか評価）。【００７３】
それぞれの群をスコア（Ｓｃｏｒｅ）別に評価した結果を図１８に示す。図より、Ｔａｌｃ投与群においては腹腔内で激しい癒着が見られた。また５日後の結果においてＴａｌｃ投与群とＴａｌｃ＋ＲＩＧ投与群において癒着スコアに有意差が見られ、ＲＩＧによる癒着防止効果が確認された。【００７４】
試験結果２：ＲＩＧによる活性酸素除去能評価
上記にしたがって作製したＲＩＧの活性酸素（ＲＯＳ）除去能を蛍光測定により評価した。具体的にはマウスの腹膜切片を採取し、ＰＢＳ（１ｍｌ）中で組織をホモジナイズしたのち遠心分離し（１００００ｒｐｍ，１０分，４℃）、上澄み（１００ｕｌ）に１ｍＭのジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を１００μｌ加え蛍光測定（ｅｘ＝５３０ｎｍ，ｅｍ＝６２０ｎｍ）により活性酸素の産出を定量評価した（図１９参照）。【００７５】
図より、Ｔａｌｃ投与群においてＲＯＳの産出が確認され、ＲＩＧを投与した群においてはＲＯＳの産出を低減させた。このことにより炎症部位に発生している酸化ストレスをＲＩＧが抑制させる効果があるものと理解できる。【００７６】
試験結果３：腹膜切片の膜厚測定
Ｔａｌｃの投与により炎症が生じた部位からは好中球やマクロファージの浸潤に伴い、繊維が堆積し膜厚が増加することが報告されている。本実験では腹膜切片を採取し１０％ホルマリンに１日、７０％エタノールに２日浸したのち、腹膜を７μｍに切り出しマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて組織切片の観察および膜厚測定を行った。結果を図２０及び図２１に示す。【００７７】
これらの図より、Ｔａｌｃ投与群においては激しい繊維の堆積が見られ、炎症が生じていることが確認された。一方Ｔａｌｃ＋ＲＩＧの投与群においては膜厚の減少（Ｔａｌｃ投与群との有意差も確認された）がみられＲＩＧの有する抗酸化作用による抗炎症効果が示唆される。【００７８】
試験結果４：ＭＰＯ活性評価
炎症性バイオマーカーとして知られるミオペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を評価した。マウスから腹膜切片を採取し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０，Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ０．５％  ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）１ｍｌ中でホモジナイズ、遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０分，４℃）した。上澄み１０μｌに対して、５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６）１９０μｌ，０．５％  ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ５ｕｌ，２０ｍＭ  Ｈ2Ｏ2  ５μｌ加えて吸光度測定（ａｂｓ  ４６０ｎｍ）を行った。それぞれの組織の全タンパク質量はＢＣＡ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により産出し、等量タンパク質量当たりのＭＰＯ活性の値を評価した。結果を図２２に示す。【００７９】
図より、Ｔａｌｃ投与群とＴａｌｃ＋ＲＩＧ投与群にいてＭＰＯ活性の値に有意差が見られ、ＲＩＧによる抗炎症能が確認された。また図１９、図２１と比較して同様の傾向が見られたことから、ＲＩＧの抗酸化能が抗炎症作用に大きく寄与し局所炎症部位での治療効果に大きく貢献したものと考えられる。【００８０】
＜試験３＞  癒着防止効果（市販セプラフィルム*（Ｓｅｐａｒａｆｉｌｍ）との比較）
*科研製薬株式会社製：カルボキシセルロースとヒアルロン酸ナトリウ
ムからなるフィルム型の生体吸収性癒着防止材【００８１】
５週齢ＩＧＳマウス（２５−３０ｇ）に３００μｌのタルク分散液（１００ｍｇ／ｍｌ）を腹腔に投与した。一日後に開腹し、下記に示すサンプルを塗布または留置し開腹部を閉じた。５日後開腹し、臓器癒着を評価した。実験手順については図２３を参照されたい。【００８２】
＜サンプル＞
群１：  無処理コントロール
群２：  開腹未処置
群３：  開腹後ＮＨ2−ＴＥＭＰＯ水溶液（６．４ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ
腹腔内に塗布し開腹部を閉じた。
群４：  開腹後ｎＲＩＧ（抗酸化能を有さないインジェクタブルゲル、３０
ｍｇ／ｍｌ水溶液）を腹腔内に塗布し、開腹部を閉じた。
群５：  開腹後ＲＩＧ（３０ｍｇ／ｍｌ水溶液）を腹腔内に塗布し、開腹部
を閉じた。
群６：  開腹後市販セプラフィルム（５ｍｍｘ５ｍｍを二枚）腹腔内に留置
し、開腹部を閉じた。
群７：  開腹後、６．４ｍｇ／ｍｌのＮＨ2−ＴＥＭＰＯ溶液７５μｌを市販
セプラフィルム両面にそれぞれ塗布、乾燥させたのち（５ｍｍｘ５
ｍｍを二枚）腹腔内に留置し、開腹部を閉じた。
群８：  開腹後、３０ｍｇ／ｍｌのＲＩＧ溶液７５μｌを市販セプラフィル
ム両面にそれぞれ塗布、乾燥させたのち（５ｍｍｘ５ｍｍを二枚）
腹腔内に留置し、開腹部を閉じた。【００８３】
５日後に開腹、臓器癒着を図２４に示すようにスコア化し、図２５にまとめた。この図に示すように本発明のＲＩＧおよびＲＩＧをコートしたセパラフィルムは優位に癒着抑制効果を有することが認められる。市販のセパラフィルムはある程度の癒着防止効果が見られるものの、有意差が見られなかった。フィルムの移動が見られ、ばらつきが大きくなることが原因とみられる。【００８４】
次に、これらの処置マウスを開腹後、血液を採取し、白血球量を調べた。結果を図２６に示す。ＲＩＧおよびＲＩＧコートセパラフィルムは血中白血球量が有意に抑えられ，全身への炎症拡散が抑制されていることが解かる。【００８５】
次に、これらの処置マウスの５日後の腹膜を採取し、活性酸素量、ＭＰＯ活性（好中球の浸潤）およびＭＤＡ量（脂質過酸化量）を定量した。結果を、それぞれ図２７、２８および２９に示す。いずれの場合もＲＩＧおよびＲＩＧコートセパラフィルムにおいて、各測定値が有意に低下しており、優位性が示された。
Ｂ．Ａのイオンコンプレックスにおけるアニオン性ポリマーが標識を担持するように修飾されたもので置き換わったイオンコンプレックスの製造、及びその使用について
＜製造例３＞
（１）フルオレセインを担持したポリアクリル酸（ＰＡＡ-ＦＬ）の合成
ＰＡＡ-ＦＬの合成は次の合成スキーム５に従い合成した。
【化１６】
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０．０４ｍｍｏｌのポリアクリル酸(分子量５０００ｇ／ｍｏｌ)を５ｍｌのＨ２Ｏに、０．２ｍｍｏｌの５-アミノフルオレセイン（５-Ａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を５ｍｌのＤＭＳＯにそれぞれ溶解させた。これら２つの溶液を混合し、０．４ｍｍｏｌの塩酸１-エチル−３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え２４時間撹拌した。その後、０．１ＭのＨＣＬ溶液を加え、ｐＨを７．０に調整し、透析膜（ＭＷＣＯ=３５００）中に入れて、２Ｌの水に対して透析を行い未反応のアミノフルオレセインを除去した。水は２時間ごとに８回交換し、水系凍結乾燥にて凍結乾燥を行い、ＰＡＡ-ＦＬを回収した。合成したＰＡＡ-ＦＬをリン酸バッファーに溶解させた後、ＰＤ１０カラムに通すことで精製の確認を行い、未反応のアミノフルオレセインが除去されたことを確認した。
（２）フルオレセインを担持したレドックスインジェクタブル（ＦＬ-ＲＩＧ）の作製
ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載された方法により合成したＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマー（前記式（Ｉ）中のＬ１が−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｌ２が−ＣＨ２−ＮＨ−であり、Ｒが４-アミノＴＥＭＰＯに由来する基であり、ＹがＨであり、ｍ及びｎがそれぞれ約２２及び約４５４である）とＰＡＡ-ＦＬをそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整したカチオンＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴ水溶液と濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整したアニオン性ＰＡＡ-ＦＬ水溶液を調製した。こうして、それぞれ調製したＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液をポリアクリル酸水溶液に撹拌しながら滴下しｐＨ=６．２のポリイオンコンプレックスミセルを作製した。ここでは、ＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルが調製された（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数]）。
＜ゲル化＞
前述のように作製したポリイオンコンプレックスミセル溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を遠心エバポレーションにより濃縮（３０ｍｇ／ｍｌ）し、イオン強度を１５０ ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。
なお、製造例３（２）及びゲル化に関する概念図を図３０に示す。
上記検討の結果、３７℃の条件下で不可逆的ゲル化が確認された(図３１）。比較のため、同様の手順でＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴポリマー（ＷＯ２００９／１３３６４７に記載されているか、或は記載された方法により製造される）とＰＡＡ-ＦＬからレドックスナノ粒子溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を作製した。この比較例の水溶液は上記のゲル化実験により生体条件下でゲル化挙動を示さなかった。
＜試験４＞ 製造例３（２）のレドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ-ＦＬ）の腹腔内滞留性評価 （ＩＶＩＳイメージングを用いたＲＩＧ腹腔内滞留性評価）
低分子蛍光物質(アミノフルオレセイン:ＡＦＬ）、ＦＬを担持したレドックスナノ粒子溶液（ＦＬ-ＲＮＰ）およびＦＬを担持したレドックスインジェクタブルゲル（ＦＬ-ＲＩＧ）を使用し、以下のスキームにて腹腔内滞留性を評価した。
Ｎｕｄｅマウス（ｎ＝４、２５〜３０ｇ）を使用し、飼料からの蛍光検出を防ぐためオリエンタル酵母株式会社より購入したＩＶＩＤ♯２を実験開始１週間前に与えて実験を行った。イソフルランの吸入麻酔下にてマウスの腹部を開腹し、サンプル（ＡＦＬ，ＦＬ-ＲＮＰ（ミセル濃度３０ｍｇ／ｍｌ），ＦＬ-ＲＩＧ（ミセル濃度３０ｍｇ／ｍｌ））を３００μｌ投与し腹部を縫合した。腹腔内滞留性評価方法としては、サンプルに担持したフルオレセインの蛍光（励起波長：５００ｎｍ, 蛍光波長：５４０ｎｍ）を投与直後から各タイムポイントでイメージングすると共に、投与直後の蛍光強度からの蛍光減少を定量することで腹部に残存しているサンプル量を評価した。イメージングの際にはイソフルランでの麻酔下にてイメージングを行った。各サンプルのイメージング画像を図３２に、サンプルの残存量を示す定量データを図３３に示す。ＲＩＧ投与群において、腹腔内でのゲル化により滞留性が向上し、対照群（ＡＦＬ，ＦＬ-ＲＮＰ）と比較して有意差が見られた。これらの結果は作製したＲＩＧが腹腔内で組織間の接触を抑制し、癒着防止剤としての高い機能を発揮することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本願明細書に開示する本発明のポリイオンコンプレックスミセルが癒着防止効果を示すことが確認されたことから理解できるように、本発明は、医療に用いることのできる癒着防止用製剤を製造、販売する産業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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