(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側から前記観察空間側に至るまでの組成が傾斜分布をしており、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セル。
【請求項２】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側から前記観察空間側に至るまでの組成が傾斜分布をしており、
前記第１基板および第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セル。
【請求項３】
前記第１薄膜と前記第１基板との間には、前記第１薄膜および前記第１基板とは異なる材料の補強膜が形成されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の試料収容セル。
【請求項４】
前記第１薄膜は、前記第１開口部の側面の少なくとも一部と接触していることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の試料収容セル。
【請求項５】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜は、前記第１開口部の側面の少なくとも一部と接触していることを特徴とする試料収容セル。
【請求項６】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜は、前記第１開口部の側面の少なくとも一部と接触していることを特徴とする試料収容セル。
【請求項７】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第１基板は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜の第１層は、窒化シリコン膜であり、
前記第１薄膜の第２層は、前記第１薄膜の第１層よりも窒素含有量の少ない窒化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であることを特徴とする試料収容セル。
【請求項８】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第１基板は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜の第１層は、窒化シリコン膜であり、
前記第１薄膜の第２層は、前記第１薄膜の第１層よりも窒素含有量の少ない窒化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であることを特徴とする試料収容セル。
【請求項９】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第２層は、前記第１層に対して、膜厚が厚く、可視光に対する透過性が高いことを特徴とする試料収容セル。
【請求項１０】
第１開口部を有する第１基板と、
前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、
前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、
前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、
を備え、
前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、
前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、
前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有し、
前記第２層は、前記第１層に対して、膜厚が厚く、可視光に対する透過性が高いことを特徴とする試料収容セル。
【請求項１１】
前記第２薄膜は、積層構造を有することを特徴とする請求項５乃至請求項１０のいずれかに記載の試料収容セル。
【請求項１２】
前記第１層および前記第２層のいずれか一方にはピンホールが存在し、他方は当該ピンホールを塞ぐように形成されていることを特徴とする請求項５乃至請求項１０のいずれかに記載の試料収容セル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は観察対象の試料（Ｏｂｊｅｃｔ）を収容するセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
電子顕微鏡を用いた試料の観察は、一般的には、観察対象の試料が真空等の特殊な空間に曝される。一方、近年では、メカノバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれる技術分野において、生体細胞、生体組織等をそのまま観察したいという要求がある。しかしながら、電子顕微鏡での観察の際に試料を真空中に曝すと、細胞等は、液体成分が揮発していくことで変質し、また測定環境の汚染につながってしまう。これを防ぐために、様々な方法が開発されている。
【０００３】
例えば、試料を急速凍結して薄い氷の中に閉じ込め、冷凍状態で観察する技術がある。しかしながら、冷凍状態で観察する技術は、容易に観察用の試料を作製することができず、また、試料作成用の装置が非常に特殊であり高価なものであった。
【０００４】
さらに、液体中に試料を保持したまま観察することで、さらに試料を直接的に観察するための技術が、特許文献１に開示されている。この技術では、観察用のセルを構成する薄膜間に試料を含む液体を配置しつつ、試料が配置される空間をセルの外部空間と遮断する。電子線は、薄膜を透過して薄膜間の試料に到達するようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１６５２７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
また、特許文献１に開示されたセルのうち、注入口から試料を含む液体を注入する方式のセルにおいては、観察孔の大きさが小さい。そのため、観察孔に観察対象となる試料が到達しているか、電子顕微鏡による測定前に確認することが困難であった。また、試料を座体に配置した後に蓋体を被せ、座体と蓋体とを接着剤で接合する方式のセルについても特許文献１に開示されている。このようなセルでは、接合に高度な技術がユーザに求められ、座体と蓋体との接合がうまくいかずに内部の液体が漏れ出したり、座体と蓋体とのギャップ制御が困難であったりする場合があった。これらの複数の問題の少なくとも１つが生じる結果、試料を収容したセルが電子顕微鏡による観察に用いることができない状態であることも多くなり、ユーザの利便性を損ねていた。
【０００７】
本発明の目的の一つは、試料を収容するセルの利便性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１基板と、前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、を備え、前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セルを提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。
【０００９】
また、本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１基板と、前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、を備え、前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、前記第１薄膜は、前記第１基板側の第１層および前記観察空間側の第２層を少なくとも含む積層構造を有し、前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セルが提供される。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。
【００１０】
また、本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１基板と、前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、を備え、前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、前記第１薄膜は、前記第１基板側から前記観察空間側に至るまでの組成が傾斜分布をしており、前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、可視光線に対して透過性を有し、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セルが提供される。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。
【００１１】
また、本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１基板と、前記第１基板に対向して配置され、前記第１開口部に対向する位置に第２開口部を有する第２基板と、前記第１開口部の前記第２基板側を塞ぐ第１薄膜と、前記第２開口部の前記第１基板側を塞ぐ第２薄膜と、を備え、前記第１基板と前記第２基板との間には、試料が配置される前記第１薄膜と前記第２薄膜との間の観察空間と、当該観察空間と外部空間とを接続するための流路空間とが配置され、前記第１薄膜は、前記第１基板側から前記観察空間側に至るまでの組成が傾斜分布をしており、前記第１基板および第２基板の少なくとも一方は、シリコン基板であり、前記第１薄膜および前記第２薄膜は、電子線に対して透過性を有することを特徴とする試料収容セルが提供される。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。
【００１２】
前記第１薄膜と前記第１基板との間には、前記第１薄膜および前記第１基板とは異なる材料の補強膜が形成されていてもよい。これによれば、製造工程を容易にすることができる。
【００１３】
前記第１薄膜は、前記第１開口部の側面の少なくとも一部と接触していてもよい。これによれば、これによれば、製造工程を容易にすることができる。また、基板に対して薄膜が観察空間ＭＳ側へ突出した形状になりにくいため、観察空間ＭＳへの試料含有液体の注入が容易となる。
【００１４】
前記第１基板は、シリコン基板であり、前記第１薄膜の第１層は、窒化シリコン膜であり、前記第１薄膜の第２層は、前記第１薄膜の第１層よりも窒素含有量の少ない窒化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であってもよい。これによれば、第１薄膜の強度を保ち、第１薄膜と第１基板との密着性を向上することができる。
【００１５】
前記第１基板は、ガラス基板であり、前記第１薄膜の第２層は、窒化シリコン膜であり、前記第１薄膜の第１層は、前記第１薄膜の第２層よりも窒素含有量の少ない窒化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であってもよい。これによれば、第１薄膜の強度を保ち、第１薄膜と第１基板との密着性を向上することができる。
【００１６】
前記第２層は、前記第１層に対して、膜厚が厚く、可視光に対する透過性が高くてもよい。これによれば、第１薄膜の強度を保ちつつ、観察空間の試料位置の確認をしやすくなる。
【００１７】
前記第１層および前記第２層のいずれか一方にはピンホールが存在し、他方は当該ピンホールを塞ぐように形成されていてもよい。これによれば、第１薄膜の信頼性を向上させることができる。
【００１８】
前記第１基板および前記第２基板のいずれか一方はシリコン基板であり、他方はガラス基板であってもよい。これによれば、セルを容易に製造することができる。また、第１基板と第２基板との接合方法として、陽極接合を用いることができ、真空封入が可能な優れた接合を容易に実現することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。
【図２】本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。
【図３】本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。
【図４】本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。
【図５】本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。
【図６】本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。
【図７】本発明の第１実施形態における試料注入装置の試料注入処理を説明する図である。
【図８】本発明の第１実施形態における試料注入装置のセル封止処理を説明する図である。
【図９】本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図１０】図９に続く第１基板の製造工程を説明する図である。
【図１１】本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。
【図１２】本発明の第２実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。
【図１３】本発明の第２実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。
【図１４】本発明の第２実施形態における試料収容セルの断面構成（図１２、１３における断面線Ｃ−Ｃ’の断面構造）を示す模式図である。
【図１５】本発明の第２実施形態における試料収容セルの断面構成（図１２、１３における断面線Ｄ−Ｄ’の断面構造）を示す模式図である。
【図１６】本発明の第２実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図１７】図１６に続く第１基板の製造工程を説明する図である。
【図１８】本発明の第３実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。
【図１９】本発明の第３実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。
【図２０】本発明の第３実施形態における試料収容セルの断面構成（図１８、１９における断面線Ｅ−Ｅ’の断面構造）を示す模式図である。
【図２１】本発明の第３実施形態における試料収容セルの断面構成（図１８、１９における断面線Ｆ−Ｆ’の断面構造）を示す模式図である。
【図２２】本発明の第３実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図２３】本発明の第４実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。
【図２４】本発明の第４実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。
【図２５】本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成（図２３、２４における断面線Ｇ−Ｇ’の断面構造）を示す模式図である。
【図２６】本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成（図２３、２４における断面線Ｈ−Ｈ’の断面構造）を示す模式図である。
【図２７】本発明の第５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図２８】本発明の第６実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図２９】本発明の第７実施形態における試料収容セルに設けられたマーカを示す模式図である。
【図３０】本発明の第８実施形態における試料収容セルの第２薄膜の透過率特性を説明する図である。
【図３１】本発明の比較例における試料収容セルの流路空間に注入された試料含有液体の配置例を説明する図である。
【図３２】本発明の第９実施形態における試料収容セルの流路空間の形状を説明する図である。
【図３３】本発明の第１０実施形態における試料収容セルの流路空間に設けられた予備空間の形状を説明する図である。
【図３４】本発明の第１１実施形態における試料収容セルの流路空間に設けられた予備空間の形状を説明する図である。
【図３５】本発明の第１２実施形態における試料収容セルの表面処理、試料注入処理およびセル封止処理を説明する図である。
【図３６】本発明の第１３実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図３７】本発明の第１３実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図３８】本発明の第１４実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図３９】本発明の第１５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図４０】本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図４１】本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。
【図４２】本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程の他の例を説明する図である。
【図４３】本発明の第１６実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。
【図４４】本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。
【図４５】本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。
【図４６】本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程の他の例を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜第１実施形態＞
以下、本発明の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は本発明の実施形態の一例であって、本発明はこれらの実施形態に限定して解釈されるものではない。なお、本実施形態で参照する図面において、同一部分または同様な機能を有する部分には同一の符号または類似の符号（数字の後にＡ、Ｂ等を付しただけの符号）を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、図面の寸法比率（各構成間の比率、縦横高さ方向の比率等）は説明の都合上実際の比率とは異なったり、構成の一部が図面から省略されたりする場合がある。
【００２２】
［試料収容セルの構成］
図１は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０とを接合して製造されている。第１基板１０は、例えば、シリコン基板である。第２基板は、可視光線に対して透過性を有する基板であって、例えば、ガラス基板である。なお、第１基板も第２基板と同様に、可視光線に対して透過性を有する基板であってもよい。第１基板１０と第２基板２０との間には、内部に空間が配置されている。試料収容セル１は、電子顕微鏡の観察対象となる試料を液体に含ませた状態で、この内部空間に収容するセルである。
【００２３】
以下、試料を含む液体を、試料含有液体と表現する場合がある。試料収容セル１の大きさは、１辺が２．５ｍｍ〜３ｍｍ程度の正方形であり、この例では２．６ｍｍである。試料収容セル１の厚さは、第１基板１０と第２基板２０とをあわせて０．３〜１．２ｍｍ程度である。
【００２４】
第１基板１０および第２基板２０には、それぞれ開口部が形成されている。この例では、第１基板１０には開口部１１０、１２０、１３０が配置されている。第２基板には、開口部２１０（図３、図４参照）が配置されている。続いて、試料収容セル１の内部構造を含めた詳細な構造について、図２、図３、図４を用いて説明する。
【００２５】
図２は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図３は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。図４は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。
【００２６】
開口部１１０の第２基板２０側は、第１薄膜１５０により塞がれている。開口部２１０の第１基板１０側は、第２薄膜２５０により塞がれている。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは対向して配置されている。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、電子線に対して透過性を有する膜である。
【００２７】
第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、例えば、窒化シリコン膜とアモルファスシリコン膜の積層構造で形成される。第１薄膜１５０は、第１基板１０側から第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂを含む積層構造を有している。第２薄膜２５０は、第２基板２０側から第１層２５０ａおよび第２層２５０ｂを含む積層構造を有している。この例では、基板側の第１層１５０ａ、２５０ａは、アモルファスシリコン膜であり、第２層１５０ｂ、２５０ｂは、窒化シリコン膜である。なお、第１層１５０ａ、２５０ａは、窒化シリコン膜であってもよい。この場合、第１層１５０ａ、２５０ａを形成する窒化シリコン膜は、第２層１５０ｂ、２５０ｂを形成する窒化シリコン膜よりも、窒素含有量が少ない（シリコン含有量が多い）ことが望ましい。
【００２８】
また、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、２層に限らず、さらに多くの層を含んでいてもよい。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが異なる層構造を有していてもよい。
【００２９】
第１層１５０ａ、２５０ａは、基板（第１基板１０、第２基板２０）と接触する。第１層１５０ａは、第１基板１０と第２層１５０ｂとが接触する場合よりも、第１基板１０に対する密着性が高くなるため、第１基板１０と第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）との接合強度を高めることもできる。第２基板２０と第２薄膜２５０との関係においても同様である。
【００３０】
このように、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を窒化シリコン膜の単層で形成するよりも、膜厚を変化させずにその一部をアモルファスシリコン膜とした積層構造にすることで、膜の強度を向上させたり、各層の応力を調整することで薄膜に張りを与えたりすることもできる。また、積層構造にしたことにより、各層は薄膜化されてピンホール等が発生したとしても、積層構造にすることでピンホールが塞がれて、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０の膜の信頼性も向上する。
【００３１】
第１薄膜１５０および第２薄膜２５０の膜厚は、積層膜の合計で１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、望ましくは、１５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは同じ膜厚であってもよいし、異なる膜厚であってもよい。第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、１０ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、２００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。
【００３２】
第１薄膜１５０の膜厚が２０ｎｍである場合、例えば、第１層１５０ａ（アモルファスシリコン膜）の膜厚は７ｎｍであり、第２層１５０ｂ（窒化シリコン膜）の膜厚は１３ｎｍである。第１層１５０ａの膜厚は、第１薄膜１５０全体の膜厚の２０％以上５０％未満であることが望ましく、３０％以上４５％未満であることがさらに望ましい。この例では、第２薄膜２５０についても同様である。このようにすると、薄膜の強度を確保しつつ、薄膜の可視光線に対する透過率の低下を抑えることもできる。
【００３３】
また、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離は、１０ｎｍ以上４００ｎｍ以下、望ましくは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、この例では、２００ｎｍである。なお、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、それぞれ２０ｎｍであるため、この部分における第１基板１０と第２基板２０との距離は、２４０ｎｍとなる。第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離は、試料すなわち観察対象物（例えば細胞）の大きさに依存するため、少なくとも観察対象物よりも大きくなる必要がある。一方、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が観察対象物に対して大きすぎると、観察対象物が重なって個々の観察対象物の観察結果が得られにくくなる。
【００３４】
なお、観察対象物が大きすぎる場合、観察対象物自体を電子線が通過できないため、透過型電子顕微鏡による観察はできない。すなわち、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が、電子線が通過できない程度の距離以上にする必要はない。一方、観察対象物が小さくても、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離を小さくしすぎると、後述するスティッキング現象が発生しやすくなってしまう。
【００３５】
開口部１１０と開口部２１０とは対向して配置され、第１基板１０側から見た場合に、ほぼ同じ大きさで開口するように設計されている。開口部１１０および開口部２１０の開口の形状は、この例では、２０μｍ×２０μｍの正方形である。なお、この開口の形状は、５μｍ×２０μｍ等の長方形であってもよい。
【００３６】
開口部１２０、１３０の開口の形状は、開口部１１０と比べて、大きく、この例では、１．０ｍｍ×１．５ｍｍの長方形である。なお、この開口の形状は、１．０ｍｍ×１．０ｍｍ等の正方形であってもよい。このように、開口部１２０、１３０に比べて、開口部１１０は非常に小さいが、説明に用いた各図では、構造をわかりやすくする表現するために、これらの大きさを調整して示している。
【００３７】
なお、これらの開口部１１０、１２０、１３０の開口の形状は、四角形以外の多角形であってもよいし、円形、楕円形等、曲線で囲まれた形状であってもよいし、直線と曲線とで囲まれた形状であってもよい。また、開口部１２０の形状と開口部１３０の形状とが異なっていてもよい。
【００３８】
開口部１１０、２１０は、その内壁が、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が拡がる平面（基板表面）に対して傾き（テーパ形状）を持って形成されている。開口部１２０、１３０についても、その内壁がその基板表面に対して傾きを持って形成されている。開口部内において傾きの程度が一定でなく変化していてもよい。すなわち、開口部１１０、１２０、１３０は第１薄膜１５０側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。また、開口部２１０は第２薄膜２５０側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。開口部１１０、２１０の内壁がテーパ形状であると、電子線の入射角のマージンを確保することができる。
【００３９】
第１基板１０と第２基板２０とは、外周に沿った領域ＣＡにおいて接合している。領域ＣＡに囲まれた領域において第１基板１０と第２基板との間には、空間が形成されている。この空間は、観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰを含む。観察空間ＭＳは、開口部１１０およ開口部２１０との間の領域に形成される空間であり、電子顕微鏡に用いられる電子線が通過する空間である。
【００４０】
流路空間ＦＰは、観察空間ＭＳと外部空間１０００とを接続するための空間である。この例では、流路空間ＦＰは、少なくとも２つの開口部を介して外部空間１０００と接続し、この例では開口部１２０、１３０を介して外部空間１０００に接続する。
【００４１】
一方の開口部が試料含有液体を注入するための開口であり、他方が流路空間ＦＰの空気を外部空間１０００に押し出すための排気口として機能する。なお、一方の開口部（例えば、開口部１３０）が、第１基板１０の別の部分に形成されていてもよいし、第２基板２０に形成されていてもよいし、後述する実施形態に例示するように第１基板１０と第２基板２０との間に形成されていてもよい。
【００４２】
以上が、試料収容セル１の構成についての説明である。続いて、試料収容セル１に試料含有液体を配置して、電子顕微鏡にて観察できる状態にするための処理（観察セル作製処理）について説明する。
【００４３】
［観察セル作製処理］
図５は、本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。試料含有液体７００は、第１基板１０と第２基板２０との間の空間に開口部１２０から注入されると、その空間内を移動して観察空間ＭＳに至り、さらには、開口部１３０まで到達する。なお、開口部１２０ではなく開口部１３０に試料含有液体７００が注入されてもよいが、以下の説明では、開口部１２０に試料含有液体７００が注入される注入口であるものとして説明する。
【００４４】
観察空間ＭＳに対応する開口部１１０、２１０は、試料収容セル１の全体の大きさに比べると非常に小さい。そのため、開口部１１０、２１０を視認するだけでは、観察空間ＭＳに試料含有液体７００が到達しているかわかりにくい。試料収容セル１では、第２基板２０が可視光線を透過する材料で形成されているため、第２基板２０側から試料含有液体７００の位置を確認することができる。
【００４５】
したがって、試料含有液体７００または液体中の試料自体の位置を第２基板２０側から確認しつつ、開口部１２０からの注入量、注入圧力等を制御することにより、目的とする範囲（例えば、流路空間ＦＰ、観察空間ＭＳおよび開口部１３０）に試料含有液体７００を拡げることができる。このとき、試料含有液体７００は、流路空間ＦＰの全体を充填するように、注入されることが望ましい。後述のように封止材で封止された後に、流路空間ＦＰを含む封止された空間において試料含有液体７００によって充填されない部分が気泡として存在すると、電子顕微鏡による観察がされるまでにその気泡が観察空間ＭＳに移動してしまう可能性があるためである。
【００４６】
図６は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。試料含有液体７００が流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳに充填された後、開口部１２０、１３０を封止材３２０、３３０で塞ぐことで、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、外部空間１０００と分離される。封止材３２０、３３０は、例えば、エポキシ樹脂等の樹脂であり、ＵＶ硬化型の樹脂であってもよいし、２液混合型硬化樹脂（例えば、２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプ）であってもよい。ＵＶ硬化型の場合には、開口部１２０、１３０を塞ぐように硬化前の樹脂を形成し、ＵＶ照射によって硬化させて封止材３２０、３３０が形成される。なお、封止材３２０、３３０によって外部空間１０００と分離された内部空間には気泡が含まれないようにしてもよいし、硬化前の樹脂と試料含有液体７００とが混合しないように、少なくとも樹脂が硬化するまでは互いに離れた状態（試料含有液体と封止材との間に気泡が存在する状態）にしてもよい。
【００４７】
観察空間ＭＳに配置された試料含有液体７００は、外部空間１０００と離隔されているため、電子顕微鏡による観察が行われる際に、試料収容セル１が真空環境に曝されても、試料含有液体７００が揮発してしまうことを防ぎ、液体の状態を保持することができる。また、観察空間ＭＳは、電子線に対して透過性を有する数十ｎｍ程度の第１薄膜１５０および第２薄膜２５０に囲まれている。観察空間ＭＳの高さ（第１薄膜１５０および第２薄膜２５０との距離）、すなわち試料含有液体７００の厚さは、電子線に対して透過性を有する程度の大きさである。
【００４８】
そのため、電子顕微鏡で用いられる電子線（図６における電子線ＥＢ）は、開口部１１０を通って、第１薄膜１５０、試料含有液体７００および第２薄膜２５０を通過し、さらに開口部２１０を通って、試料収容セル１全体を通過することができる。電子線ＥＢの方向は図６に示す方向とは逆であってもよい。
【００４９】
また、上記の通り、第１薄膜１５０は第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層構造であり、積層構造全体と同じ膜厚を有する単層構造の場合よりも薄膜の全体的な強度を向上させたり、信頼性を向上させたりすることができる。そのため、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を薄膜化したり、観察空間ＭＳの領域を大きくしたりすることもできる。
【００５０】
図５における試料注入処理、および図６におけるセル封止処理については、手動処理であっても、自動処理であってもよい。手動処理の場合には、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスキャピラリの先端と開口部１２０、１３０との位置関係を、実体顕微鏡を用いて確認し、ガラスキャピラリに接続されたインジェクタを用いて試料含有液体７００を注入したり、封止材３２０、３３０を注入したりすればよい。
【００５１】
また、自動処理の場合には、試料注入処理およびセル封止処理を自動的に実行して観察セルを作成する装置を用いればよい。
【００５２】
［観察セル作製装置］
図７は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置の試料注入処理を説明する図である。観察セル作製装置８００は、試料注入器８１０、ＵＶ照射器８６０およびステージ８８８を備える。ステージ８８８には、チップ台８２５、カップ台８３５、８４５、試料台８５０が取り付けられている。チップ台８２５は、チップ８２０を収容する。チップ８２０は、試料含有液体７００を吸い取るためのノズルを有するピペットチップである。カップ台８３５は、試料含有液体７００を保持する試料カップ８３０を収容する。カップ台８４５は、封止材となる硬化前樹脂３００を保持する試料カップ８４０を収容する。試料台８５０は、試料収容セル１を設置する。また、ステージ８８８には、チップ８２０を廃棄するための廃棄口８７０が配置されている。
【００５３】
試料注入器８１０に対して、ステージ８８８は水平方向（図７における左右方向、以下、Ｘ方向という）に移動可能である。また、試料注入器８１０は、水平方向であってステージ８８８の移動方向とは垂直な方向（図７における奥行き方向、以下、Ｙ方向という）と、鉛直方向（図７における上下方向、以下、Ｚ方向という）とに移動可能である。したがって、試料注入器８１０とステージ８８８とでＸ、Ｙ、Ｚ方向で相対的に移動可能になっている。なお、ステージ８８８上の試料台８５０については、別途Ｙ方向にも移動可能であってもよい。
【００５４】
試料注入器８１０は、チップ取付部８１１、支持部８１３、制御部８１５およびチップ取り外し部８１７を備える。チップ取付部８１１は、先端にチップ８２０が差し込まれて取り付けられる部分である。支持部８１３は、装置天井に対してＹ方向、Ｚ方向に移動させるように試料注入器８１０を支持する。制御部８１５は、チップ取付部８１１に取り付けられたチップ８２０に試料カップ内の液体を吸い込んで保持したり、チップ８２０に保持された液体を排出したりするための制御を行う。チップ取り外し部８１７は、下方に移動することによって、チップ８２０を下方に押し出してチップ取付部８１１から取り外す。
【００５５】
ＵＶ照射器８６０は、硬化前樹脂３００を硬化させるためのＵＶ光を照射する装置である。ＵＶ光の照射範囲は、試料台８５０に設置された試料収容セル１全体を含んでいてもよいし、開口部１２０、１３０に対応する部分にスポットで照射するようにしてもよい。開口部１２０、１３０に対応する部分にスポットで照射するようにすれば、試料へのＵＶ光の影響を抑えることができる。
【００５６】
図７（ａ）は、試料収容セル１がセル保管庫等から運ばれて、観察セル作製装置８００の試料台８５０に設置された状態を示している。続いて、ステージ８８８と試料注入器８１０とを移動させ、以下に示す順に処理を実行する。まず、チップ取付部８１１にチップ８２０を取り付ける（図７（ｂ））。その後、試料注入器８１０は、試料カップ８３０内の試料含有液体７００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図７（ｃ））。試料含有液体７００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の試料含有液体７００を排出して開口部１２０から試料収容セル１内部に注入する（図７（ｄ））。
【００５７】
なお、チップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させる際には、例えば、試料注入器８１０は、カメラ等の撮像部を用いて試料収容セル１の形状を画像認識し、さらには開口部１２０の位置を認識し、開口部１２０の位置にチップ８２０を移動させる。また、試料台８５０に試料収容セル１の内部の状態を第２基板２０側から撮像する撮像部を用いることで、試料含有液体７００の注入の程度を検出し、その程度に応じて注入量、注入圧力が調整されるようにしてもよい。続いて、観察セル作製装置８００の封止処理について説明する。
【００５８】
図８は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置のセル封止処理を説明する図である。試料注入器８１０は、試料カップ８４０内の硬化前樹脂３００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図８（ａ））。硬化前樹脂３００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の硬化前樹脂３００を排出して開口部１２０に滴下し（図８（ｄ））、続いて、開口部１３０に滴下する（図８（ｅ））。なお、開口部１３０への滴下前に、再度チップ８２０内に硬化前樹脂３００を吸い上げておいてもよい。なお、硬化前樹脂３００が、ＵＶ硬化型ではなく、上述した２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプであっても同様であり、この場合には、後述するＵＶ光の照射は不要である。
【００５９】
続いて、試料台８５０をＵＶ照射器８６０の下方に移動させ、試料収容セル１にＵＶ照射器８６０からのＵＶ光を照射する。この照射によって、試料収容セル１の開口部１２０、１３０に滴下された硬化前樹脂３００を硬化させる。これによって、試料収容セル１の内部空間に試料含有液体７００が外部空間１０００と離隔された状態で収容される。また、試料注入器８１０は、チップ取り外し部８１７によって、チップ８２０をチップ取付部８１１から取り外して廃棄口８７０に廃棄する。ＵＶ光の照射中にチップ８２０の廃棄が実施されてもよい。
【００６０】
その後、試料含有液体７００を収容した試料収容セル１が回収され、新たな試料収容セル１が試料台８５０に設置される（図７（ａ））。なお、チップ８２０は、試料収容セル１毎に交換するプロセスを説明したが、開口部１２０に滴下する硬化前樹脂３００を吸い上げる前にチップ８２０を交換してもよい。
【００６１】
以上が、観察セル作製装置８００による試料注入処理およびセル封止処理についての説明である。続いて、試料収容セル１の製造方法について図９〜図１１を用いて説明する。
【００６２】
［試料収容セル１の製造方法］
試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０とが接合されて形成される。第１基板１０および第２基板２０のそれぞれは、以下に説明する所定の製造工程を経てから接合される。
【００６３】
［第１基板１０に対する製造工程］
図９は、本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。図１０は、図９に続く第１基板の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。まず、図９（ａ）に示す第１基板１０を準備する。第１基板１０は、上述したように、シリコン基板であり、この例では、７５０μｍの厚さを有する。なお、３００μｍ程度のシリコン基板を用いることで、後述する図１０（ｃ）の薄化処理が不要となるため、図１０（ｂ）に示す支持基板１６を用いなくてもよい。
【００６４】
第１基板１０に熱酸化膜１２を形成し（図９（ｂ））、フォトリソグラフィ技術を用いて、流路空間ＦＰ、観察空間ＭＳに対応する領域の熱酸化膜１２を除去する（図９（ｃ））。熱酸化膜１２が第１基板１０の両面に形成されている場合には、一方の面（図９に下側の面）の熱酸化膜１２は全て除去される。なお、膜の除去のためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。また、この熱酸化膜１２は、この時点では残しておき、後の工程において除去してもよい。なお、熱酸化膜ではなくＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理によって形成された膜であってもよい。以下に形成される様々な膜についても、蒸着処理、めっき処理等により形成されればよい。
【００６５】
続いて、熱酸化膜１２をマスクとして第１基板１０をエッチングし、キャビティ１０１を形成する（図９（ｄ））。この例では、キャビティ１０１の深さは２４０ｎｍである。なお、後述した他の実施形態で例示するように、第１基板１０と第２基板１０との接合部分に、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０の少なくとも一方が形成される場合もある。この場合には、これらの厚さも考慮して、目的とする基板間の距離が得られるようにキャビティ１０１の深さを調整する。
【００６６】
キャビティ１０１を覆うように、第１薄膜１５０の第１層１５０ａとなる膜１５０１および第２層１５０ｂとなる膜１５０２を形成する（図９（ｅ））。このとき、膜１５０１が形成された後、膜１５０２が形成される前に、膜１５０１の表面に対して洗浄（例えば、水洗）を行うようにしてもよい。このようにすると、膜１５０１に埋め込まれたパーティクルが存在した場合に、これを除去しておくことができる。このパーティクルが除去されると、パーティクルとともに膜１５０１の一部が除去されてしまいピンホールが形成される場合がある。一方、このピンホールは、この後に形成される膜１５０２によって覆われて塞がれることになる。これによって、第１薄膜１５０全体としては、ピンホールが発生する可能性を大幅に低減することができる。第２薄膜２５０についても同様である。
【００６７】
膜１５０１および膜１５０２を形成した後、フォトリソグラフィ技術を用いて、膜１５０１、１５０２の一部をエッチングしてキャビティ１０１内に第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層膜（第１薄膜１５０）を形成する（図９（ｆ））。この例では、膜１５０１（第１層１５０ａ）はアモルファスシリコン膜であり、７ｎｍの膜厚を有する。膜１５０２（第２層１５０ｂ）は窒化シリコン膜であり、１３ｎｍの膜厚を有する。
【００６８】
キャビティ１０１および第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層膜を覆うように図１０（ｄ）で実施されるエッチングストッパとなるストッパ膜１４を形成する（図１０（ａ））。この例では、ストッパ膜１４は、アルミニウム膜であり、１μｍの膜厚を有する。第１基板１０のストッパ膜１４側に粘着層を含む支持基板１６を貼り付ける（図１０（ｂ））。支持基板１６の粘着層は、貼り合わせ面に設けられており、熱、光等の刺激の印加により粘着力が低下するようになっている。この例では、ＵＶ光の照射によって粘着力が低下する粘着層を用いている。なお、キャビティ１０１の深さはストッパ膜１４に比べて非常に小さいため、図においては、ストッパ膜において埋め込まれているものとして、ストッパ膜１４の表面形状については、詳細の形状を省略して示している。また、支持基板１６を貼り付けることによって、キャビティ１０１の深さ程度の段差は粘着層等によって埋め込まれるが、埋め込まれない部分があってもよい。
【００６９】
支持基板１６によって支持された第１基板１０を薄化する（図１０（ｃ））。第１基板１０の薄化は、例えば、ＣＭＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、ウエットエッチングを用いる。ウエットエッチングを用いる場合には、例えば、第１基板１０をエッチングすることのできる液体として、フッ酸およびフッ化アンモニウムの混合液が用いられる。第１基板１０は７５０μｍの厚さを有しているが、この薄化処理によって、２５０μｍ程度まで薄くなる。第１基板１０が支持基板１６によって支持されているため、第１基板１０が薄化しても第１基板１０の反りが抑制され、また、製造工程中の強度を保つこともできる。
【００７０】
続いて、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１基板１０に開口部１１０、１２０、１３０を形成する（図１０（ｄ））。このエッチング工程では、Ｄ−ＲＩＥ（Ｄｅｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｉｎｇ）を用いる。エッチングの際、開口部１１０、１２０、１３０の内壁が第１基板１０の表面に対して傾きを有するように処理していてもよい。なお、このエッチング工程において、ストッパ膜１４と第１薄膜１５０とが、エッチングストッパとなる。このとき、第１薄膜１５０の第１層１５０ａがアモルファスシリコン膜である場合、または、第２層１５０ｂよりも窒素含有量が少ない（シリコン含有量が多い）窒化シリコン膜である場合には、第２層１５０ｂよりもエッチングに対して耐性を有する膜がエッチングストッパとなるため、製造工程が容易になる。
【００７１】
ストッパ膜１４を用いていることにより、開口部１１０が開口したときに、第１薄膜１５０の補強膜としての役割を有する。第１基板１０が厚いため開口部１１０の開口には時間を要する。そのため、補強膜は、このような状況において特に有効に働く。また、開口部１２０、１３０が開口したときに、支持基板１６の粘着層が露出することを防ぐことができる。粘着層が露出すると、有機物である粘着層からガスが発生する場合があるが、これを防ぐことができる。このような効果を期待できるが、後述する他の実施形態での製造工程で例示しているように、ストッパ膜１４は用いられても用いられなくてもよい。なお、上述のとおり、第１基板１０として予め薄いシリコン基板を用いると、支持基板１６を用いなくてもよい。このエッチング工程においては、基板を冷却するためにステージとの間に冷媒であるＨｅガスを循環させる空間が設けられている。支持基板１６を用いていない場合に、ストッパ膜１４が存在しないと、開口部１２０、１３０が開口したときにＨｅガスがエッチングチャンバ内に流れ出し、不具合が生じる。このような条件の下において、ストッパ膜１４が存在することが必要となり、それ以外の条件の下であってもストッパ膜１４が存在することが望ましい場合がある。
【００７２】
開口部１１０、１２０、１３０を形成後、ＵＶ光を照射して粘着層の粘着力を低下させて支持基板１６を剥がし（図１０（ｅ））、ストッパ膜１４をエッチングして除去する（図１０（ｆ））。これらの工程を経て、第１基板１０側の製造工程が終了する。なお、キャビティ１０１の壁を構成する部分の下面、すなわち第１基板１０の領域ＣＡ（図下方の面）が第２基板２０と接合する領域である。
【００７３】
［第２基板２０に対する製造工程］
図１１は、本発明の第１実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。この図は、図３に対応する断面構造を示している。まず、図１１（ａ）に示す第２基板２０を準備する。第２基板２０は、上述したように、可視光線に対する透過性を有する基板であって、この例ではガラス基板である。この例では、第２基板２０は、７００μｍの厚さを有する。なお、３００μｍ程度のガラス基板を用いることで、後述する図１１（ｅ）の薄化処理が不要となるため、図１１（ｄ）に示す支持基板２６を用いなくてもよい。なお、支持基板２６を用いない場合には、上述のようにストッパ膜に相当する構成を支持基板２６の代わりに用いることが望ましい。
【００７４】
第２基板２０上に、第２薄膜２５０の第１層２５０ａとなる膜２５０１および第２層２５０ｂとなる膜２５０２を形成する（図１１（ｂ））。そして、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１層２５０ａおよび第２層２５０ｂの積層膜（第２薄膜２５０）を形成する（図１１（ｃ））。この例では、膜２５０１（第１層２５０ａ）はアモルファスシリコン膜であり、７ｎｍの膜厚を有する。膜２５０２（第２層２５０ｂ）は窒化シリコン膜であり、１３ｎｍの膜厚を有する。
【００７５】
続いて、第１基板１０の製造工程と同様に、第２基板２０の第２薄膜２５０（積層膜）を覆うように、粘着層を含む支持基板２６を貼り付ける（図１１（ｄ））。支持基板２６は、上記支持基板１６と同様の構成である。支持基板２６によって支持された第２基板２０を薄化する（図１１（ｅ））。第２基板２０の薄化は、例えば、ＣＭＰ、ウエットエッチングを用いる。第２基板２０は７００μｍの厚さを有しているが、この薄化処理によって、２５０μｍ程度まで薄くなる。第２基板２０が支持基板２６によって支持されているため、第２基板２０が薄化しても第２基板２０の反りが抑制され、また、製造工程中の強度を保つこともできる。
【００７６】
続いて、フォトリソグラフィ技術を用いて、第２基板２０に開口部２１０を形成する（図１１（ｆ））。エッチングの際、開口部２１０の内壁が第２基板２０の表面に対して傾きを有していてもよい。なお、開口部２１０を形成する前に、開口部２１０に対応する部分にレーザを照射しておき、第２基板２０のエッチングレートを増加させてもよい。この場合には、レジストマスク等を用いずに、ウエットエッチング処理でレーザ照射部分を開口することによって開口部２１０を形成するようにしてもよい。
【００７７】
開口部２１０を形成後、ＵＶ光を照射して粘着層の粘着力を低下させて支持基板２６を剥がす（図１１（ｇ））。これらの工程を経て、第２基板２０側の製造工程が終了する。なお、第２薄膜２５０の周囲の面、すなわち第２基板２０の領域ＣＡ（図下方の面）が第１基板１０と接合する領域である。
【００７８】
［第１基板１０と第２基板２０との接合］
このように形成された第１基板１０と第２基板２０とは、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが対向するようにして、領域ＣＡで接合される。この例では、第１基板１０がシリコンであり、第２基板２０がガラスであるため、この接合には陽極接合が用いられる。この接合によって、第１基板１０と第２基板２０とが強固に接合され、これらの間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを含む空間が形成される。
【００７９】
なお、上述した試料収容セル１は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１が同時に形成されている。したがって、それぞれの試料収容セル１を個片化するためにダイシングを行う。なお、上述した製造方法における各構成の材料、エッチング方法等の各種条件については一例であって、様々な条件に設定可能である。以上が試料収容セル１の製造方法についての説明である。
【００８０】
上述した一実施形態に係る試料収容セル１は、予め第１基板１０と第２基板２０とが強固な接合をしているため、内部に注入された試料含有液体７００が漏れることはほとんどなく、また、第２基板２０が可視光線に対する透過性を有しているため、注入状態を確認しながら、第１基板１０と第２基板２０との間の内部空間への試料含有液体７００を注入することができる。また、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は積層構造を有している。そのため、単層構造である場合に比べて、薄膜の強度を向上させることができるため、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０を薄膜化したり、観察空間ＭＳの領域を大きくしたりすることもできる。このように、利便性の高い試料収容セル１を提供することができる。
【００８１】
＜第２実施形態＞
第２実施形態においては、第１基板と第２基板との間に配置されるギャップ膜を第１基板に形成して内部に空間が形成される試料収容セル１Ａについて説明する。
【００８２】
図１２は、本発明の第２実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。第１実施形態では、試料収容セル１は、第１基板１０と第２基板２０とを接合して形成されていたが、第２実施形態では、第１基板１０Ａと第２基板２０との間にギャップ膜３０が配置されて、互いに接合されている。そして、ギャップ膜３０の高さが第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離を決めている。
【００８３】
図１３は、本発明の第２実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図１４は、本発明の第２実施形態における試料収容セルの断面構成（図１２、１３における断面線Ｃ−Ｃ’の断面構造）を示す模式図である。図１５は、本発明の第２実施形態における試料収容セルの断面構成（図１２、１３における断面線Ｄ−Ｄ’の断面構造）を示す模式図である。
【００８４】
ギャップ膜３０は、例えば、酸化シリコンで形成され、２００ｎｍの膜厚を有している。ギャップ膜３０は、第１基板１０Ａと第２基板２０との間において、外周に沿って配置されている。そのため、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、第１基板１０Ａと第２基板２０とギャップ膜３０とに囲まれた空間として形成される。なお、ギャップ膜３０は、第１実施形態と同様に、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との距離が、１０ｎｍ以上４００ｎｍ以下、望ましくは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下となるように決められる。
【００８５】
なお、図１２、１３では記載を省略しているが、図１４、１５において示すように、ギャップ膜３０と第１基板１０Ａとの間には、第１薄膜１５０と同じ積層膜の周辺薄膜１５１が配置されている。この例では、第１薄膜１５０の周囲を囲うように周辺薄膜１５１が形成されている。なお、第１薄膜１５０と周辺薄膜１５１とが接続されて、一体の膜になっていてもよい。この場合には、第１薄膜１５０と周辺薄膜１５１の一体膜は、開口部１２０、１３０の第２基板２０側において、開口を塞がないように一部に開口部が設けられていればよい。また、第２基板２０とギャップ膜３０との間に第２薄膜と同じ膜が存在してもよい。この膜は、観察空間ＭＳに接する第２薄膜２５０から延在した一体膜であってもよいし、第２薄膜２５０とは分離された膜であってもよい。一体膜とする場合には、第２基板２０の製造方法において、図１１（ｃ）に示す第２薄膜２５０を形成する工程は不要であり、膜２５０１、２５０２をそのまま第２薄膜２５０として用いればよい。
【００８６】
続いて、試料収容セル１Ａの第１基板１０Ａ側の製造工程について説明する。なお、第２基板２０は、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。また、以下の説明においては、第１実施形態と異なる部分について詳細に説明し、それ以外の部分は簡単な説明としたり、その説明を省略したりする場合がある。
【００８７】
［第１基板１０Ａに対する製造工程］
図１６は、本発明の第２実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。図１７は、図１６に続く第１基板の製造工程を説明する図である。いずれの図も、図１４に対応する断面構造を示している。まず、図１６（ａ）に示す第１基板１０Ａを準備する。第１基板１０Ａは、第１実施形態における第１基板１０と同じものである。
【００８８】
第１薄膜１５０の第１層１５０ａとなる膜１５０１、第２層１５０ｂとなる膜１５０２およびギャップ膜３０となる膜３００１を第１基板１０Ａに形成する（図１６（ｂ））。この例では、膜１５０１はアモルファスシリコン膜であり、７ｎｍの膜厚を有する。膜１５０２は窒化シリコン膜であり、１３ｎｍの膜厚を有する。また、膜３００１は酸化シリコン膜であり、２００ｎｍの膜厚を有する。
【００８９】
続いて、フォトリソグラフィ技術を用いて、流路空間ＦＰ、観察空間ＭＳに対応する領域の膜３００１を除去してギャップ膜３０を形成し（図１６（ｃ））、さらに、膜１５０１、１５０２の一部をエッチングして第１薄膜１５０および周辺薄膜１５１を形成する（図１６（ｄ））。なお、周辺薄膜１５１の部分については、ギャップ膜３０をマスクとしてエッチングされてもよい。
【００９０】
第１基板１０Ａの第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層膜を覆うように、粘着層を含む支持基板１６を貼り付ける（図１６（ｅ））。支持基板１６を貼り付ける前に、第１実施形態におけるストッパ膜１４を形成してもよい。支持基板１６によって支持された第１基板１０Ａを薄化し（図１７（ａ））、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１基板１０Ａに開口部１１０、１２０、１３０を形成する（図１７（ｂ））。
【００９１】
開口部１１０、１２０、１３０を形成後、ＵＶ光を照射して粘着層の粘着力を低下させて支持基板１６を剥がす（図１７（ｃ））。これらの工程を経て、第１基板１０Ａ側の製造工程が終了する。なお、ギャップ膜３０の下面（図下方の面）、すなわち領域ＣＡが第２基板２０と接合する領域である。
【００９２】
＜第３実施形態＞
第３実施形態においては、第１基板と第２基板との間に形成される内部空間と外部空間とが側面において接続されている試料収容セル１Ｂについて説明する。
【００９３】
図１８は、本発明の第３実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。第１実施形態では、試料収容セル１は、第１基板１０に開口部１２０、１３０が形成されていたが、第３実施形態では、第１基板１０Ｂと第２基板２０との間（試料収容セル１Ｂの側面部分）に、開口部１２０、１３０に対応する構成、すなわち内部空間と外部空間とが接続される構成が配置されている。
【００９４】
図１９は、本発明の第３実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図２０は、本発明の第３実施形態における試料収容セルの断面構成（図１８、１９における断面線Ｅ−Ｅ’の断面構造）を示す模式図である。図２１は、本発明の第３実施形態における試料収容セルの断面構成（図１８、１９における断面線Ｆ−Ｆ’の断面構造）を示す模式図である。
【００９５】
第１基板１０Ｂには、開口部１２０、１３０が存在しない。一方、図１９、２０に示すように、流路空間ＦＰは、試料収容セル１Ｂの側面に開口した開口部１２５、１３５を介して外部空間１０００に接続される。なお、開口部１２５、１３５は、開口部１１０の幅（図１９における上下方向の距離）と同じであってもよいし、狭くてもよいし、広くてもよい。
【００９６】
続いて、試料収容セル１Ｂの第１基板１０Ｂ側の製造工程について説明する。なお、第２基板２０は、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。また、以下の説明においては、第１実施形態と異なる部分について詳細に説明し、それ以外の部分は簡単な説明としたり、その説明を省略したりする場合がある。
【００９７】
［第１基板１０Ｂに対する製造工程］
図２２は、本発明の第３実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。この図は、図２１に対応する断面構造を示している。第１実施形態において説明した図９（ｆ）までの製造工程については、第３実施形態においても同様であるため、説明を省略する。図２２（ａ）に示す図は、図示する断面の向きは異なっているものの第１実施形態における図９（ｆ）に対応する図である。また、図９（ｆ）におけるキャビティ１０１は、４辺を第１基板１０で囲まれた形状であったが、図２２（ａ）のキャビティ１０１Ｂは、２辺において第１基板１０Ｂによる壁面（図２２（ａ）における左右側の壁に対応）を有し、他の２辺については壁面を有しない。すなわちキャビティ１０１Ｂは、溝形状になっている。
【００９８】
第１基板１０Ｂの第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層膜を覆うように、粘着層を含む支持基板１６を貼り付ける（図２２（ｂ））。支持基板１６によって支持された第１基板１０Ｂを薄化し（図２２（ｃ））、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１基板１０Ｂに開口部１１０を形成する（図２２（ｄ））。
【００９９】
開口部１１０を形成後、ＵＶ光を照射して粘着層の粘着力を低下させて支持基板１６を剥がす（図２２（ｅ））。これらの工程を経て、第１基板１０Ｂ側の製造工程が終了する。なお、キャビティ１０１Ｂの壁を構成する部分の下面、すなわち第１基板１０の領域ＣＡ（図下方の面）が第２基板２０と接合する領域である。
【０１００】
＜第４実施形態＞
第４実施形態においては、第２実施形態と同様に第１基板に形成されるギャップ膜を、第１基板と第２基板との間に配置されるようにして内部に空間を形成し、かつ第３実施形態のように、その内部空間と外部空間とが側面において接続されている試料収容セル１Ｃについて説明する。
【０１０１】
図２３は、本発明の第４実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。第２実施形態では、第１基板１０Ａと第２基板２０との間にギャップ膜３０が配置されて、互いに接合されているが、第４実施形態では、試料収容セル１Ｃの側面部分に、開口部１２０、１３０に対応する構成が形成されたギャップ膜３０Ｃを備えている。
【０１０２】
図２４は、本発明の第４実施形態における試料収容セルを第１基板側から見た平面図である。図２５は、本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成（図２３、２４における断面線Ｇ−Ｇ’の断面構造）を示す模式図である。図２６は、本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成（図２３、２４における断面線Ｈ−Ｈ’の断面構造）を示す模式図である。
【０１０３】
ギャップ膜３０Ｃは、例えば、酸化シリコンで形成され、２００ｎｍの膜厚を有している。ギャップ膜３０Ｃは、第１基板１０Ｃと第２基板２０との間において、外周の２辺に沿って配置されている。そのため、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、第１基板１０Ｃと第２基板２０とギャップ膜３０Ｃとに囲まれた空間として形成され、その端部に開口部１２５、１３５が形成される。
【０１０４】
なお、図２３、２４では記載を省略しているが、図２５、２６において示すように、ギャップ膜３０Ｃと第１基板１０Ｃとの間には、第１薄膜１５０と同じ積層膜の周辺薄膜１５１が配置されている。この例では、第１薄膜１５０の周囲を囲うように周辺薄膜１５１が形成されている。なお、第１薄膜１５０と周辺薄膜１５１とが接続されて、一体の膜になっていてもよい。
【０１０５】
試料収容セル１Ｃの第１基板１０Ｃ側の製造工程については、第２実施形態とほとんど同じ製造工程である。異なる点は、図１６（ｃ）におけるギャップ膜３０を形成するときの配置パターン、および図１７（ｂ）における開口部１２０、１３０の形成をしないことである。また、第２基板２０については、第１実施形態と同様である。したがって、試料収容セル１Ｃの製造方法についての説明を省略する。
【０１０６】
＜第５実施形態＞
第５実施形態においては、第１実施形態における第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とのスティッキング現象を抑制するための突出部１５５、２５５を有する試料収容セル１Ｄについて説明する。
【０１０７】
図２７は、本発明の第５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。図２７に示すように、第１薄膜１５０（第２層１５０ｂ）の第２薄膜２５０側の表面には突出部１５５が配置され、第２薄膜２５０（第２層１５０ｂ）の第１薄膜１５０側の表面には突出部２５５が配置されている。そして、突出部１５５と突出部２５５とは互いに向かい合って配置されている。
【０１０８】
何らかの外力によって第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが近づいたときに、突出部１５５、２５５が存在しない場合には、互いに広い面積で接触してしまう場合があり、静電引力等により貼り付いてしまう現象（スティッキング現象）が発生する場合がある。試料観察時には、試料収容セルは真空環境に曝されるため、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とは離れる方向に力が働く。しかしながら、スティッキング現象が強力で１度接触すると、真空環境に曝されても、離れなくなる場合もある。
【０１０９】
一方、この試料収容セル１Ｄのように突出部１５５、２５５が存在する場合には、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが近づいても、突出部の存在によって広い面積での接触を妨げるため、スティッキング現象の発生を抑え、仮に発生してしまったとしてもその力を弱くして、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０とが離れやすくすることができる。
【０１１０】
突出部１５５、２５５の突出量は、この例では、４０ｎｍである。突出部１５５、２５５との間の距離は、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０との間の距離の５０％以上となるように突出量が決められていることが望ましい。また、突出部１５５または突出部２５５のいずれか一方のみが存在する場合もある。
【０１１１】
＜第６実施形態＞
第６実施形態においては、第１実施形態における開口部１２０、１３０に相当する構成が、第２基板側に形成されている試料収容セル１Ｅについて説明する。
【０１１２】
図２８は、本発明の第６実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。第１基板１０Ｅは、第１実施形態の第１基板１０において開口部１２０、１３０を形成していない構成である。したがって、第１基板１０Ｅ側の製造工程は、第１実施形態とほぼ同様であり、開口部１１０が形成される工程において開口部１２０、１３０が形成されないようになっている。
【０１１３】
第２基板２０Ｅは、開口部２１０に加えて、開口部１２０、１３０に対応する構成として開口部２２０、２３０が形成されている。したがって、第２基板２０Ｅ側の製造工程は、第１実施形態における第２基板２０側の製造工程とほぼ同様であり、開口部２１０を形成する工程において開口部２２０、２３０が形成される。
【０１１４】
このように、可視光線に対する透過性を有する基板側に、試料含有液体７００を注入するための開口部が形成されるようになっていてもよい。
【０１１５】
また、流路空間ＦＰ等の内部空間を形成するために第１基板側にキャビティが形成されるのではなく、第２基板側にキャビティが形成されてもよいし、双方の基板にキャビティが形成されてもよい。
【０１１６】
＜第７実施形態＞
第７実施形態においては、試料収容セル１の表面にマーカが形成される場合について説明する。このマーカは、電子顕微鏡による観察時に観察空間ＭＳの位置、または観察空間ＭＳに配置された試料の位置を確認するために用いられる。
【０１１７】
図２９は、本発明の第７実施形態における試料収容セルに設けられたマーカを示す模式図である。この例では、第１基板１０の表面（第１薄膜１５０が形成されている面とは反対側の面）にマーカＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４が形成されている。マーカの形状は様々に取り得るが、この例では、観察空間ＭＳ重心部分に矢印が向くような図形が描かれている。なお、マーカは第２基板２０側に形成されていてもよい。
【０１１８】
マーカＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、電子顕微鏡で観察可能な大きさであり、光学顕微鏡であっても観察できる大きさであることが望ましい。光学顕微鏡で事前にマーカを基準とした試料の位置を確認しておき、電子顕微鏡でマーカを基準に観察位置を合わせることができる。
【０１１９】
＜第８実施形態＞
上述した第２基板２０の製造工程において、開口部２１０を形成する前に開口部２１０に対応する部分にレーザを照射して、第２基板２０のエッチングレートを増加させる処理を行う場合には、第２薄膜２５０の第２層２５０ｂをレーザが吸収されにくい膜で形成することが望ましい。なお、この処理において用いられるレーザの波長は３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下であることが多いため、この波長範囲において第２層２５０ｂの透過率が高いことが望ましい。
【０１２０】
図３０は、本発明の第８実施形態における試料収容セルの第２薄膜の透過率特性を説明する図である。図３０においては、第２薄膜２５０に適用される窒化シリコン膜において、シリコンの組成比が相対的に大きい膜（ＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈ）と、窒素の組成比が相対的に大きい膜（ＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈ）とを比較した。ＳｉｘＮｙと表したとき、この例では、ＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈはｘ＝５、ｙ＝１であり、ＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈはｘ＝２、ｙ＝１である。また、膜厚は２０ｎｍである。
【０１２１】
上記の条件において、ＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈにおいては、３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長において、９０％以上の透過率を有する。第２層２５０ｂがこの程度の透過率を有することにより、レーザ照射による第２層２５０ｂへの影響を抑えることができる。一方、第１層２５０ａについては、上述したようにＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈの窒化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜を用いているため、レーザ照射による影響を受けてもよい。
【０１２２】
第１薄膜１５０は、ＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈの窒化シリコン膜を用いてもよい。この窒化シリコン膜（ＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈ）によれば、３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長において、１５％以下の透過率を有する。このようにすると、３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長に対して弱い試料、例えば、細胞等の有機物が観察空間ＭＳに配置されている場合に、この試料の変質を抑えることができる。なお、３５０ｎｍ以下の波長に対して１０％以下の透過率を有する窒化シリコン膜としてもよい。開口部１２０、１３０が設けられている側の第１薄膜１５０において、封止材の硬化時のＵＶ光などの影響を受けやすいため、このような低透過率にすることが望ましいが、第２薄膜２５０の第２層２５０ｂについてもＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈの窒化シリコン膜を用いてもよい。
【０１２３】
上述したように、開口部１２０、１３０を封止する封止材３２０、３３０として、ＵＶ硬化型の樹脂を用いた場合、硬化時に照射されるＵＶ光が観察空間ＭＳに到達するのを抑制することもできる。
【０１２４】
＜第９実施形態〜第１１実施形態＞
上記実施形態においては、流路空間ＦＰと外部空間１０００とを接続する開口部（開口部１２０、１２５、１３０、１３５）は、流路空間ＦＰの両端に配置されている。この流路空間ＦＰの端部が開口部の外側に位置する構成である場合には、その端部に試料含有液体７００が拡がりきらず、気泡が発生しやすくなる。この状況について図３１を用いて説明する。
【０１２５】
図３１は、本発明の比較例における試料収容セルの流路空間に注入された試料含有液体の配置例を説明する図である。この例における試料収容セル１Ｚは、第１基板１０Ｚに形成されたキャビティによって形成される流路空間ＦＰを有する。この流路空間ＦＰの端部は、開口部１２０、１３０よりも外側に存在する。このような端部は、開口部１２０から注入された試料含有液体７００が拡がりきれない部分ＢＳを生じる。その部分ＢＳは気泡となる。
【０１２６】
このような気泡は、その位置を変化させなければ電子顕微鏡における観察に影響を及ぼさない。しかしながら、観察までの動きによって気泡が移動してしまう場合がある。気泡が観察空間ＭＳに移動してしまうと、電子顕微鏡による観察ができなくなってしまう。そのため、流路空間ＦＰ（および観察空間ＭＳ、開口部を含む）には気泡が入らないようにすることが望ましい。また、気泡が入ってしまっても、観察空間ＭＳに気泡が移動してこないようにすることが望ましい。そこで、流路空間ＦＰの形状は、上記実施形態で説明したとおりの形状としている。さらに別の方法により気泡対策を施した試料収容セルについて、第９実施形態から第１１実施形態として説明する。
【０１２７】
図３２は、本発明の第９実施形態における試料収容セルの流路空間の形状を説明する図である。試料収容セル１Ｆは、開口部１２０から開口部１３０に至る間において、開口部１２０の範囲から一度拡がり、その後、開口部１３０の範囲まで狭くなる形状の流路空間ＦＰを有する。開口部１２０から注入された試料含有液体７００は、流路空間ＦＰが拡がっている方が、その空間内に注入されやすい。そして、開口部１３０に向かっては、流路空間ＦＰが狭くなっていくことで、開口部１３０から気泡が押し出されることになる。そのため、流路空間ＦＰに気泡が残りにくい。
【０１２８】
第１０実施形態および第１１実施形態では、流路空間ＦＰに気泡が残った場合に、気泡の移動を妨げる構成を有する試料収容セル１Ｇ、１Ｈについて、図３３、３４を用いて説明する。試料収容セル１Ｇ、１Ｈは、残った気泡の位置を固定するための予備空間を有する。予備空間は、流路空間ＦＰよりも狭い空間である。
【０１２９】
図３３は、本発明の第１０実施形態における試料収容セルの流路空間に設けられた予備空間の形状を説明する図である。この例では、流路空間ＦＰの端部に予備空間ＳＳ１が配置されている。この例では、開口部１３０に対してセル外周側に予備空間ＳＳ１が配置されている。なお、予備空間ＳＳ１は、流路空間ＦＰの端部に接続されていれば、異なる位置に配置されていてもよい。
【０１３０】
流路空間ＦＰと予備空間ＳＳ１とは、接続空間ＣＳ１で接続されている。この接続空間ＣＳ１は、流路空間ＦＰと予備空間ＳＳ１とを狭い空間で接続し、流路空間ＦＰから予備空間ＳＳ１に向かう際の流路で最も狭くなる領域になっている。すなわち、流路空間ＦＰから予備空間ＳＳ１へ向かう方向を法線ベクトルとして有する断面の面積（通過面積）が接続空間ＣＳ１において最も小さい。
【０１３１】
流路空間ＦＰで残った気泡が存在する場合には、試料収容セル１Ｇを傾けたり、揺すったりして、気泡を予備空間ＳＳ１に移動させる。接続空間ＣＳ１の形状によって、予備空間ＳＳ１に入った気泡は、大きな力を受けないと流路空間ＦＰに移動しない。そのため、電子顕微鏡による観察を行うまでに、予期せず気泡が観察空間ＭＳに移動してくる可能性を低減することができる。
【０１３２】
図３４は、本発明の第１１実施形態における試料収容セルの流路空間に設けられた予備空間の形状を説明する図である。この例では、流路空間ＦＰの端部に予備空間ＳＳ２が配置されている。この例では、流路空間ＦＰの第１基板１０Ｈ側に予備空間ＳＳ２が配置されている。なお、予備空間ＳＳ２が、流路空間ＦＰの第２基板２０側に配置されていてもよい。
【０１３３】
流路空間ＦＰと予備空間ＳＳ２とは、接続空間ＣＳ２で接続されている。この接続空間ＣＳ２は、流路空間ＦＰと予備空間ＳＳ２とを狭い空間で接続し、流路空間ＦＰから予備空間ＳＳ２に向かう際の流路で最も狭くなる領域になっている。すなわち、流路空間ＦＰから予備空間ＳＳ２へ向かう方向を法線ベクトルとして有する断面の面積（通過面積）が接続空間ＣＳ２において極小値を有する。
【０１３４】
流路空間ＦＰで残った気泡が存在する場合には、試料収容セル１Ｈを傾けたり、揺すったりして、気泡を予備空間ＳＳ２に移動させる。接続空間ＣＳ２の形状によって、予備空間ＳＳ２に入った気泡は、大きな力を受けないと流路空間ＦＰに移動しない。そのため、電子顕微鏡による観察を行うまでに、予期せず気泡が観察空間ＭＳに移動してくる可能性を低減することができる。電子顕微鏡による観察が終了するまでは、予備空間ＳＳ２が流路空間ＦＰに対して上方に位置するように、試料収容セル１Ｈを保持しておくことが望ましい。このようにすれば、気泡が予備空間ＳＳ２から出てこないようにすることができる。
【０１３５】
なお、接続空間ＣＳ２が予備空間ＳＳ２に対して狭い空間になっていなくてもよい。このようにすると、気泡を予備空間ＳＳ２に留めておく力は弱くなるが、予備空間ＳＳ２が流路空間ＦＰに対して上方に位置するように保つことで、予備空間ＳＳ２に気泡が入り込み水平方向への移動を抑制することができる。
【０１３６】
＜第１２実施形態＞
開口部および第１基板と第２基板との間の空間（流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳ）の内壁部分については、親水性を付与する親水処理または親油性（疎水性）を付与する親油（疎水）処理が施されていてもよい。例えば、親水処理であれば、シリコン基板表面を酸化膜で覆う処理であればよく、フッ素および酸素によるプラズマ処理で形成してもよいし、酸素含有雰囲気下での熱処理で形成してもよい。また、シリコン基板表面に形成された自然酸化膜を親水表面としてもよい。一方、親油（疎水）処理であれば、フッ素および窒素によるプラズマ処理によりシリコン基板表面にフッ化物を形成してもよいし、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシロキサン）処理によってシリコン基板表面にメチル基を形成してもよい。
【０１３７】
シリコン基板を例として説明したが、ガラス基板であっても、親水処理は、基板表面に水酸基、カルボキシル基、アミノ基などの親水基を形成する処理とし、親油（疎水）処理は、基板表面にメチル基、ビニル基、アルキル基など炭化水素基を形成する処理とすればよい。
【０１３８】
注入される試料含有液体７００の特性に応じた処理が施された試料収容セルを用いれば、試料含有液体７００の注入を容易に実施することができる。例えば、水分系の試料含有液体７００を用いる場合には、内壁部分に親水処理を施してもよい。このとき、試料収容セルの外面についても同様に親水処理がされていてもよい。
【０１３９】
一方、これとは逆に、試料収容セルの外面については、内壁部分に施した処理と逆の処理を施しておいてもよい。例えば、開口部の内壁部分に親水処理を施した場合には、試料収容セルの外面には親油（疎水）処理を施してもよい。このようにすると、注入の際に外側にこぼれた試料含有液体７００をセル表面から取り除くことが容易になる。また、封止材がアルコール系（油系）であれば、開口部内に浸入しにくくなり、試料含有液体との接触を避けて混合しないようにすることもできる。なお、開口部の内壁の一部において親水処理等の表面処理がされずに、内壁の一部において表面処理がされていてもよい。
【０１４０】
図３５は、本発明の第１２実施形態における試料収容セルの表面処理、試料注入処理およびセル封止処理を説明する図である。この例では、試料収容セル１Ｊは、開口部１２０の内壁全体に、封止材に用いる硬化前樹脂３００に対してなじまない表面処理がされた領域ＳＳを有している。例えば、試料含有液体７００が水分系であり、封止材がアルコール系（油系）であれば、領域ＳＳは、親水性を有するように親水処理がされている。このとき、流路空間ＦＰの内壁にも親水処理がされていてもよい。なお、開口部１３０についても開口部１２０と同様の表面処理がされていてもよい。また、試料収容セル１Ｊの外面についても開口部１２０と同様の表面処理（この例では親水処理）がされていてもよい。
【０１４１】
このようにすると、図３５（ｃ）、（ｄ）に示すように、チップ８２０から滴下された硬化前樹脂３００が、領域ＳＳの影響により開口部１２０の内部に入り込みにくくなる。したがって、試料含有液体７００と硬化前樹脂３００とが接触しにくくなり、互いに混合しにくくすることができる。なお、図示の通り、試料含有液体７００については、領域ＳＳに至らない程度（開口部に入らない程度）、またはわずかに重なる程度（開口部に一部はいる程度）の量を注入することが望ましい。
【０１４２】
この構成において、例えば、試料含有液体７００が、仮に硬化前樹脂３００と同様にアルコール系（油系）であると、領域ＳＳの影響を受けて内部に入り込みにくくなることが考えられる。この場合であっても、図３５（ａ）、（ｂ）に示すように、チップ８２０を開口部１２０に接触させることで、開口部１２０をチップ８２０でほぼ塞ぎ、試料含有液体７００を注入すれば、容易に流路空間ＦＰに注入することが可能である。このときには、流路空間ＦＰの内壁には開口部１２０の内壁になされた処理とは逆の特性を有する表面処理、この例では親油処理がされていてもよい。
【０１４３】
なお、試料含有液体７００が水分系であってもアルコール系（油系）であっても、チップ８２０で開口部１２０をほぼ塞ぐことで、流路空間ＦＰにできるだけ近いところから試料含有液体７００を加圧して注入することもできる。このとき、流路空間ＦＰに接続されたもう一つの開口部１３０（排気口）の存在により、チップ８２０と開口部１２０とが完全に接触していなくても、ある程度の接触をしていれば、加圧注入が可能である。
【０１４４】
具体的には、図３５（ａ）、（ｂ）に示すように、チップ８２０を開口部１２０に接触させることで、開口部１２０をチップ８２０でほぼ塞ぎ、試料含有液体７００を注入することが望ましい。開口部１２０がテーパ形状を有していると、チップ８２０のノズル先端を開口部１２０に接触させることが容易になる。すなわち、開口部１２０の外部空間１０００側（上部開口）の開口面積が大きく、流路空間ＦＰ側（下部開口）の開口面積が小さくなっている。このとき、チップ８２０のノズル先端の大きさが、上部開口より小さく、下部開口よりも大きいチップ８２０を、試料含有液体７００の注入に用いる。
【０１４５】
このようにすれば、チップ８２０のノズル先端を開口部１２０内に押し込んだときに、ノズル先端を開口部１２０内壁に接触させて止めることができる。ノズル先端を開口部１２０内に押し込み、開口部１２０をノズル先端で塞ぐようにすることができるため、試料含有液体７００を加圧して注入することが容易になる。また、開口部１２０の下部開口側に近い部分から直接的に試料含有液体７００を注入することができるため、領域ＳＳの特に上部開口側に試料含有液体７００が残りにくくすることもできる。上述したように、封止材は、領域ＳＳの影響により開口部内に入り込みにくくなり、その結果、試料含有液体７００との接触を妨げることができる。
【０１４６】
＜第１３実施形態＞
第１３実施形態では、第２実施形態におけるギャップ膜が第１基板と直接接触している場合、例えば、シリコンの熱酸化膜で形成する場合の試料収容セル１Ｋについて説明する。
【０１４７】
図３６は、本発明の第１３実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。この例では、第１基板１０Ｋはシリコン基板である。ギャップ膜３０Ｋは第１基板１０Ｋのシリコン基板表面に熱酸化膜として形成されている。ギャップ膜３０Ｋの表面には、第１薄膜１５０と同じ積層膜の周辺薄膜１５１Ｋが配置されている。周辺薄膜１５１Ｋと第２薄膜２５０Ｋと同じ積層膜の周辺薄膜２５１Ｋとが接触している。
【０１４８】
このようにして、第１基板１０Ｋと第２基板２０Ｋとは、ギャップ膜３０Ｋ、周辺薄膜１５１Ｋおよび周辺薄膜２５１Ｋを介して接続される。第１基板１０Ｋと第２基板２０Ｋとの距離は、ギャップ膜３０Ｋ、周辺薄膜１５１Ｋおよび周辺薄膜２５１Ｋの合計膜厚で決まり、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０Ｋとの距離は、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０Ｋの膜厚とは関係なく、ギャップ膜３０Ｋの膜厚で決まる。ギャップ膜３０Ｋを第１基板１０Ｋ（シリコン基板）の熱酸化膜で形成する場合は、熱酸化膜の膜厚制御性の良さから、第１薄膜１５０と第２薄膜２５０Ｋとの距離を精密に制御することができる。なお、ギャップ膜は、熱酸化膜ではなくＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理によって形成された膜であってもよい。
【０１４９】
図３７は、本発明の第１３実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。まず、図３７（ａ）に示すように、シリコン基板である第１基板１０Ｋを熱酸化して、表面に熱酸化膜３００１Ｋを形成する。続いて、フォトリソグラフィ技術を用いて、流路空間ＦＰ、観察空間ＭＳに対応する領域の熱酸化膜３００１Ｋを除去してギャップ膜３０Ｋを形成する（図３７（ｂ））。
【０１５０】
第１基板１０Ｋおよびギャップ膜３０Ｋを覆うように、膜１５０１Ｋ、１５０２Ｋを形成し（図３７（ｃ））、膜１５０１Ｋ、１５０２Ｋの一部をエッチングして第１層１５０ａおよび第２層１５０ｂの積層膜（第１薄膜。１５０）および周辺薄膜１５１Ｋを形成する（図３７（ｄ））。その後の工程については、図１６（ｅ）および図１７に示す第２実施形態での製造工程と同様である。
【０１５１】
第２基板２０Ｋについても、第２実施形態での製造方法と同様であるが、周辺部においても第２薄膜２５０Ｋとともに周辺薄膜２５１Ｋが残存するように形成される。第１基板１０Ｋと第２基板２０Ｋとを接続する場合には、周辺薄膜１５１Ｋと周辺薄膜２５１Ｋとを接触させる。
【０１５２】
＜第１４実施形態＞
第１４実施形態における試料収容セルは、第１基板と第２基板との間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを形成するために、第１基板と第２基板との間にスペーサを配置する場合について説明する。
【０１５３】
図３８は、本発明の第１４実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。この例では、径が２００ｎｍのガラスフィラー４１を含む接着剤４０を、第１基板１０Ｌと第２基板２０Ｌとの間において周囲を囲むように塗布する（図３８（ａ））。そして、第１基板１０Ｌと第２基板２０Ｌとを近づけて接着剤４０で固定することにより、試料収容セル１Ｌが作製される（図３８（ｂ））。接着剤４０にはガラスフィラー４１が含まれているため、ガラスフィラー４１の径に応じて第１基板１０Ｌと第２基板２０Ｌとの距離が保たれる。
【０１５４】
なお、第１基板と第２基板とのスペーサとしては、このようにフィラーを含む接着剤を用いる場合に限らず、変形しやすい金属（例えば、インジウム）等、金属のシール材として使われる材料を用いてもよいし、さらに接着剤を併用してもよい。
【０１５５】
＜第１５実施形態＞
第１５実施形態では、薄膜と基板との間に補強残膜が存在する試料収容セル１Ｍについて説明する。
【０１５６】
図３９は、本発明の第１５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。図３９に示す試料収容セル１Ｍでは、図１４に示す試料収容セル１Ａと異なる点として、第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）と第１基板１０Ｍとの間に、補強残膜１４１が形成された構成になっている。この補強残膜１４１は、製造工程において製造を容易にするために用いられた膜である。また、補強残膜１４１は、その材料によっては、第１層１５０ａと第１基板１０Ｍとの接合強度を高める接合膜としても機能する場合がある。第２基板２０Ｍ側についても同様である。続いて、補強残膜１４１の製造工程における役割について説明する。
【０１５７】
図４０は、本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。図４０（ａ）は、図１６（ｄ）において、第１薄膜１５０と第１基板１０Ｍとの間に最終的に補強残膜１４１となる補強膜１４０１が配置された構成を示している。なお、以下に説明する製造工程では支持基板１６を用いずに説明しているが、上記の実施形態と同様に、支持基板１６を用いてもよい。
【０１５８】
図４０（ａ）における第１基板１０Ｍに開口部１１０、１２０、１３０を形成する（図４０（ｂ））。このとき、補強膜１４０１がエッチングストッパとして機能する。エッチングされる第１基板１０Ｍが補強膜１４０１に比べて非常に厚いため、補強膜１４０１は、第１基板１０Ｍに対するエッチングにおいて、選択比が大きな材料であることが望ましい。例えば、選択比（第１基板１０Ｍのエッチングレート／補強膜１４０１のエッチングレート）が２以上であることが望ましい。第１基板１０Ｍがシリコン基板であり、エッチング液としてＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）が用いられる場合は、補強膜１４０１は、例えば、酸化シリコン膜（シリコン基板の熱酸化膜でもよい）、窒化シリコン膜（ＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈ）、または、金属膜（アルミニウム、クロム等）であることが望ましい。
【０１５９】
そして、開口部１１０、１２０、１３０の底部に露出している補強膜１４０１をエッチングすることで、補強残膜１４１を形成する（図４０（ｃ））。このとき、開口部１１０の底部では第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）が露出するため、この膜がエッチングストッパとして機能することが望ましい。したがって、補強膜１４０１に対するエッチングにおいて、第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）がある程度の選択比を有するように、補強膜１４０１の材料が決められることが望ましい。この選択比（補強膜１４０１のエッチングレート／第１層１５０ａのエッチングレート）は、第１基板１０Ｍに対するエッチングにおける選択比よりは、少なくてもよく、２以下であってもよい。なお、第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）が、窒化シリコン膜である場合には、補強膜１４０１は、上述した例のうち、金属膜（クロム（Ｃｒ）、チタン（Ｔｉ）、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）等）であることが望ましい。選択比は大きくないが、補強膜１４０１は、酸化シリコン膜（シリコン基板の熱酸化膜）であってもよい。
【０１６０】
図４１は、本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。図４１（ａ）は、図１１（ｂ）において、第２薄膜２５０と第２基板２０Ｍとの間に最終的に補強残膜２４１となる補強膜２４０１が配置された構成を示している。なお、以下に説明する製造工程では支持基板２６を用いずに説明しているが、上記の実施形態と同様に、支持基板２６を用いてもよい。
【０１６１】
図４１（ａ）における第２基板２０Ｍに開口部２１０を形成する（図４１（ｂ））。このとき、補強膜２４０１がエッチングストッパとして機能する。エッチングされる第２基板２０Ｍが補強膜２４０１に比べて非常に厚いため、補強膜２４０１は、第２基板２０Ｍに対するエッチングにおいて、選択比が大きな材料であることが望ましい。例えば、選択比（第２基板２０Ｍのエッチングレート／補強膜１４０１のエッチングレート）が２以上であることが望ましい。第２基板１０Ｍがガラス基板であり、エッチング液としてフッ酸が用いられる場合は、補強膜２４０１は、例えば、アモルファスシリコン膜、または、金属膜（クロム（Ｃｒ）、チタン（Ｔｉ）、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）等）であることが望ましい。
【０１６２】
そして、開口部２１０の底部に露出している補強膜２４０１をエッチングすることで、補強残膜２４１を形成する（図４１（ｃ））。このとき、開口部２１０の底部では第２薄膜２５０（第１層２５０ａ）が露出するため、この膜がエッチングストッパとして機能することが望ましい。したがって、補強膜２４０１に対するエッチングにおいて、第２薄膜２５０（第１層２５０ａ）がある程度の選択比を有するように、補強膜２４０１の材料が決められることが望ましい。この選択比（補強膜２４０１のエッチングレート／第１層２５０ａのエッチングレート）は、第２基板２０Ｍに対するエッチングにおける選択比よりは、少なくてもよく、２以下であってもよい。なお、第２薄膜２５０（第１層２５０ａ）が、窒化シリコン膜である場合には、補強膜２４０１は、上述した例のように、アモルファスシリコン膜、または、金属膜（クロム（Ｃｒ）、チタン（Ｔｉ）、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）等）であることが望ましい。なお、第２基板２０Ｍがガラス基板である場合には、補強膜２４０１は、流路空間ＦＰが視認できるように、可視光線に対して所定の透過率（例えば、１０％以上の透過率）を有する程度に薄膜化されていることが望ましい。
【０１６３】
また、補強膜１４０１、２４０１を用いた製造工程としては、様々な製造工程が取り得る。第１基板１０Ｍの製造工程について、他の一例を説明する。
【０１６４】
図４２は、本発明の第１５実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程の他の例を説明する図である。第１基板１０Ｍに補強膜１４０１が形成される（図４２（ａ））。続いて、第１基板１０Ｍに開口部１１０、１２０、１３０を形成する（図４２（ｂ））。
【０１６５】
補強膜１４０１側に、第１薄膜１５０およびギャップ膜３０を形成する（図４２（ｃ））。これらの形成方法は、上記の実施形態で説明した方法と同様であるから詳細の形成プロセスについては省略する。そして、開口部１１０、１２０、１３０の底部に露出している補強膜１４０１をエッチングすることで、補強残膜１４１を形成する（図４２（ｄ））。
【０１６６】
このように補強膜１４０１、２４０１を用いることで、製造工程、特に第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が張られた状態にするための工程を容易にすることができる。
＜第１６実施形態＞
第１６実施形態では、薄膜が開口部の側面の少なくとも一部と接触している試料収容セル１Ｎについて説明する。
【０１６７】
図４３は、本発明の第１６実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。図４３に示す試料収容セル１Ｎは、図１４に示す試料収容セル１Ａと異なる点として、第１薄膜１５０が第１基板１０Ｎに形成された開口部１１０の側面に沿って形成されて開口部１１０の底部を塞いでいる。この例では、第１薄膜１５０は、開口部１１０の側面の全体を覆い、第１基板１０Ｎの外部空間１０００側の表面まで延在しているが、開口部１１０の底部を塞いでいれば、開口部１１０の側面の少なくとも一部と接しているだけでもよい。第２基板２０Ｎについても同様である。
【０１６８】
図４４は、本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程を説明する図である。図４４（ａ）は、図１６（ｃ）において、膜１５０１、１５０２が形成されず、ギャップ膜３０が形成され、さらに補強膜１４０１が形成された構成を示している。なお、以下に説明する製造工程では支持基板１６を用いずに説明しているが、上記の実施形態と同様に、支持基板１６を用いてもよい。
【０１６９】
図４４（ａ）における第１基板１０Ｎに開口部１１０、１２０、１３０を形成する（図４４（ｂ））。このとき、補強膜１４０１がエッチングストッパとして機能する。そして、第１基板１０Ｎの開口部１１０、１２０、１３０側から第１薄膜１５０となる膜１５０２を形成し、さらに膜１５０１を形成する。（図４４（ｃ））。開口部１１０、１２０、１３０の底部には、補強膜１４０１が露出されている。そのため、開口部１１０、１２０、１３０の底部において、膜１５０２は、補強膜１４０１上に形成される。
【０１７０】
そして、開口部１２０、１３０に対応する部分の膜１５０１、１５０２をエッチングすることで、第１薄膜１５０（第１層１５０ａ、第２層１５０ｂ）を形成する（図４４（ｄ））。このとき、第１薄膜１５０は、開口部１１０の底部を塞ぎ、開口部１１０の側面の少なくとも一部と接触して支持されていればよい。
【０１７１】
その後、補強膜１４０１をエッチングし、第１薄膜１５０を開口部１１０の底部から露出させる（図４４（ｅ））。ここで、補強膜１４０１は、第１５実施形態と同様に、第１基板１０Ｎに対するエッチングにおいて、選択比を有する材料であることが望ましい。また、補強膜１４０１に対するエッチングにおいて、第１薄膜１５０（第２層１５０ｂ）が選択比を有するように、補強膜１４０１の材料が決められることが望ましい。なお、ギャップ膜３０を形成する前の膜３００１（例えば、図１６（ｂ）参照）を補強膜として用い、図４４（ｅ）に対応する工程において、ギャップ膜３０を形成するようにしてもよい。
【０１７２】
図４５は、本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第２基板の製造工程を説明する図である。図４５（ａ）は、第２基板２０Ｎに補強膜２４０１が配置された構成を示している。なお、以下に説明する製造工程では支持基板２６を用いずに説明しているが、上記の実施形態と同様に、支持基板２６を用いてもよい。
【０１７３】
図４５（ａ）における第２基板２０Ｎに開口部２１０を形成する（図４５（ｂ））。このとき、補強膜２４０１がエッチングストッパとして機能する。そして、第２基板２０Ｎの開口部２１０側から第２薄膜２５０となる膜２５０２を形成し、さらに膜２５０１を形成する。（図４５（ｃ））。開口部２１０の底部には、補強膜２４０１が露出されている。そのため、開口部２１０の底部において、膜２５０２は、補強膜２４０１上に形成される。その後、補強膜２４０１をエッチングし、第２薄膜２５０を開口部２１０の底部から露出させる（図４５（ｄ））。ここで、補強膜２４０１は、第１５実施形態と同様に、第２基板１０Ｍに対するエッチングにおいて、選択比を有する材料であることが望ましい。また、補強膜２４０１に対するエッチングにおいて、第２薄膜２５０（第２層２５０ｂ）が選択比を有するように、補強膜２４０１の材料が決められることが望ましい。
【０１７４】
このように補強膜１４０１、２４０１を用いることで、製造工程、特に第１薄膜１５０および第２薄膜２５０が張られた状態にするための工程を容易にすることができる。また、基板に対して薄膜が観察空間ＭＳ側へ突出した形状になりにくいため、観察空間ＭＳへの試料含有液体７００の注入が容易となる。
【０１７５】
また、補強膜１４０１、２４０１を用いた製造工程としては、様々な製造工程が取り得る。第１基板１０Ｎの製造工程について、他の一例を説明する。
【０１７６】
図４６は、本発明の第１６実施形態における試料収容セルのうち第１基板の製造工程の他の例を説明する図である。図４６（ａ）は、図４４（ｃ）に対応する。この例では、この後に、補強膜１４０１をエッチングして、第１薄膜１５０を開口部１１０、１２０、１３０の底部から露出させる（図４６（ｂ））。そして、開口部１２０の底部に孔１２１を形成し、開口部１３０の底部に孔１３１を形成する（図４６（ｃ））。
【０１７７】
この孔１２１、１３１は、物理的な力によって膜１５０１、１５０２を破ることによって形成される。物理的な力とは、開口部１２０、１３０の底部に位置する膜１５０１、１５０２に対して針状の物体を押し当てて孔を形成する方法が例として挙げられる。なお、物理的な力とは、膜１５０１、１５０２に接触して力を伝達する方法に限らず、空気を強く吹き付けることなどによって、膜１５０１、１５０２に対して間接的に力を伝達する方法であってもよい。
【０１７８】
なお、このように物理的な力を用いて開口部１２０、１３０の底部に位置する膜に孔を形成する方法は、この実施形態に限らず、開口部１２０、１３０に相当する構成を有する他の実施形態に対しても適用可能である。この場合には、第１薄膜１５０の開口部１２０、１３０に対応する部分を予めエッチングしておかなくてもよい。
【０１７９】
＜薄膜を構成する層の組み合わせ例＞
薄膜が２層である場合について、基板の種類に応じた層の組み合わせの例を説明する。まず、第１基板１０がシリコン基板である場合の第１薄膜１５０について、第１層１５０ａと第２層１５０ｂとの組み合わせ例を説明する。
【０１８０】
第１層１５０ａが窒化シリコン膜であると、第１基板１０と第１層１５０ａとにおいて良好な密着性が得られる。また、この窒化シリコン膜の窒素含有量が比較的多い構成（上述のＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈ）である場合には、さらに、第１基板１０に開口部を形成するときのＴＭＡＨによるエッチングに対して、良好な選択比が得られる。
【０１８１】
第２層１５０ｂがアモルファスシリコン膜、または、窒化シリコン膜であってもシリコン含有量が比較的多い構成（上述のＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈ）である場合には、膜の強度が得られる場合がある。
【０１８２】
続いて、第２基板２０がガラス基板である場合の第２薄膜２５０について、第１層２５０ａと第２層２５０ｂとの組み合わせ例を説明する。
【０１８３】
第１層２５０ａがアモルファスシリコン膜または窒化シリコン膜であると、第２基板２０と第１層２５０ａとにおいて良好な密着性が得られる。また、この窒化シリコン膜のシリコン含有量が比較的多い構成（上述のＳｉＮ−Ｓｉ  ｒｉｃｈ）またはアモルファスシリコン膜である場合には、さらに、第２基板２０に開口部を形成するときのフッ酸によるエッチングに対して、良好な選択比が得られる。
【０１８４】
第２層２５０ｂが窒化シリコン膜であっても窒素含有量が比較的多い構成（上述のＳｉＮ−Ｎ  ｒｉｃｈ）である場合には、引張膜となって、たるみの少ない膜が得られる。
【０１８５】
このように、基板と薄膜との組み合わせによって、得られる効果が異なる場合があるが、使用環境等に応じて適宜設定すればよい。すなわち、薄膜が２層の積層構造である場合において、２層の組み合わせは上記の組み合わせに限るものではない。
【０１８６】
＜その他の実施形態＞
第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、窒化シリコン膜とアモルファスシリコン膜との積層構造に限らず、他の組成の膜、例えば酸化シリコン膜を用いた積層構造であってもよい。また、電子線の透過性を有する膜であれば、これ以外の膜が積層構造に含まれていてもよい。また、第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、単層構造であってもよい。
【０１８７】
第１薄膜１５０および第２薄膜２５０は、それぞれ２層の積層構造であったが、各層の境界が明確でない構造であってもよい。例えば、第１薄膜１５０が、観察領域側の第１表面における組成と、開口部１１０（外部空間１０００）側の第２表面における組成が異なり、第１表面から第２表面に至るまでの組成の分布が傾斜分布をするようになっていてもよい。傾斜分布とは、例えば、徐々に変化していく場合であるが、不連続な変化がなければ、膜厚方向に対する組成の変化率が一定でなくてもよい。薄膜を積層構造にすると多様な制御が可能となる。一方、組成を傾斜分布とすることで、例えば、導入ガスの量を制御して一度の膜形成で組成を徐々に変化させることもできるため、両面の性質が異なる膜を容易に形成することが可能となる。
【０１８８】
電子顕微鏡による観察時において、試料収容セルのチャージアップを防止するために、数ｎｍのカーボン等の導電膜をセル外面（第１基板、第２基板、第１薄膜および第２薄膜の表面の少なくとも一部）に配置しておいてもよい。また、第１層１５０ａ、２５０ａに用いられるアモルファスシリコン膜は、不純物が添加された導電性を有する膜であってもよい。
【０１８９】
上記の各実施形態では、第２基板は可視光線に対して透過性を有する基板として説明したが、第１基板と同様にシリコン基板等の可視光線に対して透過性を有しない基板であってもよい。この場合には、第１基板と第２基板とが共に可視光線に対して透過性を有しない基板ということになるが、第１基板と第２基板との接続、製造上の容易性等を考慮すると、利便性の高いセルを実現することができる。
【０１９０】
上記の各実施形態は、それぞれ独立して適用される構成ではなく、重複して適用されてもよい。例えば、第１実施形態における開口部１３０に代えて第３実施形態における開口部１３５が形成される試料収容セルが実現されてもよい。
【符号の説明】
【０１９１】
１…試料収容セル、１０…第１基板、１２…熱酸化膜、１４…ストッパ膜、１６，２６…支持基板、２０…第２基板、３０…ギャップ膜、４０…接着剤、４１…ガラスフィラー、１０１…キャビティ、１１０，１２０，１２５，１３０，１３５，２１０，２２０，２３０…開口部、１４１，２４１…補強残膜、１５０…第１薄膜、１５０ａ，２５０ａ…第１層、１５０ｂ，２５０ｂ…第２層、１５１，２５１…周辺薄膜、１５５，２５５…突出部、２５０…第２薄膜、３００…硬化前樹脂、３２０，３３０…封止材、７００…試料含有液体、８００…観察セル作製装置、８１０…試料注入器、８１１…チップ取付部、８１３…支持部、８１５…制御部、８１７…チップ取り外し部、８２０…チップ、８２５…チップ台、８３０，８４０…試料カップ、８３５，８４５…カップ台、８５０…試料台、８６０…ＵＶ照射器、８７０…廃棄口、８８８…ステージ、１０００…外部空間、１５０１，１５０２，２５０１，２５０２，３００１…膜、１４０１，２４０１…補強膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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