(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法であって、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼ（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅとも表記する）を発現する能力を有するＣＨＯ細胞を宿主細胞として用い、前記宿主細胞による前記イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの生産量、または、前記宿主細胞による前記イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼをコードするＤＮＡの発現量を定量することによって、前記組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法。
【請求項２】
ＤＮＡの発現量の定量を、定量ＰＣＲを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼが、配列番号３または４で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼをコードするＤＮＡが、配列番号１または２で示される塩基配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質生産の分野に関する。さらに詳しくは、宿主細胞において生産される組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の生産過程では、研究分野のみならず、バイオ医薬品の製造において、高生産性細胞の選択を必要とする。宿主細胞の染色体はヒストンのアセチル化や高度な凝集等により遺伝子の発現が制御されており、ベクターを用いて細胞を形質転換する場合、挿入される染色体の場所によって遺伝子の発現量は大きく異なる。そのため形質転換細胞において目的とする組換えタンパク質遺伝子の発現量ひいては生産量は細胞ごとに大きく異なる。 
【０００３】
細胞ごとに組換えタンパク質の生産量を定量し、細胞をスクリーニングするためには継代培養を必要とするため、目的の組換えタンパク質を高レベルで生産する形質転換細胞の選別に膨大な労力と時間を要している。
【０００４】
加えて、組換えタンパク質を高レベルで生産する細胞でも、血清存在下で樹立した生産株を製造のために無血清馴化する場合や、導入遺伝子が安定導入された細胞を選択するために添加した抗生剤を除去する場合、さらに長期に継代培養する場合など、培養を継続するうちに次第に生産量が低下する例が少なからず存在する。これは、遺伝子サイレンシングにより組換えタンパク質遺伝子の発現が抑制されるためと考えられる。ランダムにインテグレーションされる場合、目的とする組換えタンパク質遺伝子のゲノム導入位置を制御することは通常不可能であるため、遺伝子サイレンシングの効果による生産量の低下を予測することは極めて困難である。 
【０００５】
上述の理由より、当該分野において、組換えタンパク質の生産量レベルと相関し、かつ迅速に検出可能なバイオマーカーを同定することが要求されている。一方、組換えタンパク質の発現と相関するバイオマーカーについての研究は少数の報告があるのみであり（特許文献１、非特許文献１）、顕著な進展はみられていない。本発明は、組換えタンパク質の生産量レベルを予測し、組換えタンパク質の生産性が高い細胞を迅速、かつ効率よく選別するためのバイオマーカーを同定することでこの要求に貢献する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０５７２３９（特表２０１３−５１０３２４）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｄｒａｉｇ  Ｄｏｏｌａｎ  ｅｔ ａｌ．, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｊ，  ７,   ５１６−５２６（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、動物細胞、特に哺乳類細胞において、組換えタンパク質の生産性が高い細胞を迅速、かつ効率よく選別するための効果的なバイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、組換えタンパク質の産生に広く使用されているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、組換えタンパク質の生産量の変化と相関して発現量が変化する遺伝子として、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ（以下、イノシトールリン酸とも表記する。）の代謝に関連するタンパク質群をコードする遺伝子を見出した。この知見を基に、バイオマーカーとして、前記タンパク質群から選ばれる１つ以上のタンパク質の生産量、または、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することで、組換えタンパク質の生産レベルを迅速かつ簡便に予測できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．
組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法であって、宿主細胞としてイノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質群から選ばれる１つ以上のタンパク質を発現する能力を有する細胞を用い、前記宿主細胞による前記タンパク質の生産量、または、前記宿主細胞による前記タンパク質をコードするＤＮＡの発現量を定量することによって、前記組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法。
項２．
イノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質が、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、イノシトールポリリン酸ホスファターゼとも表記する。）（ＥＣ ３．１．３．５６またはＥＣ ３．１．３．６２）である、項１に記載の方法。
項３．
イノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質が、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼとも表記する。）（ＥＣ ３．１．３．５６）である、項１に記載の方法。
項４．
宿主として動物細胞を用いる、項１から３のいずれかに記載の方法。
項５．
宿主として哺乳類細胞を用いる、項４に記載の方法。
項６．
宿主としてＣＨＯ細胞を用いる、項５に記載の方法。
項７．
ＤＮＡの発現量の定量を、定量ＰＣＲを用いて行う、項１から６のいずれかに記載の方法。
項８． 
宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼが、配列番号３または４で示されるアミノ酸配列を有する、項７に記載の方法。
項９．
宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼをコードするＤＮＡが、配列番号１または２で示される塩基配列である、項７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、目的とする組換えタンパク質の生産量を直接定量するよりも迅速に、組換えタンパク質の生産量レベルを予測し、効率的に組換えタンパク質を高生産する細胞を選択することができる。また、バイオマーカーの発現量の定量方法は特に限定されないが、定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、本明細書ではｑＰＣＲとも表す。）を用いた定量を行うことで、組換えタンパク質の生産量を、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等を行いて直接定量するよりも迅速かつ簡便に、予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】選択用薬剤（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）除去後に、抗体産生能が低下した細胞と選択用薬剤除去をしていない抗体産生能を維持した細胞について、次世代シークエンサーを用いたＲＮＡｓｅｑ解析から、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量の差を算出した結果を示した図である。
【図２】複数（ｎ＝５）の細胞株において、組換えタンパク質の生産量をＥＬＩＳＡで定量した結果とＩｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現をｑＰＣＲで定量した結果を比較した図である。組換えタンパク質の生産量についてＰｕｒｏｍｙｃｉｎ除去前の値を基準に除去後の値と比較した倍率をＸ軸に、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ除去前の値を基準に除去後の値と比較した倍率をＹ軸にプロットした。図中の１から５の数字は細胞株の番号を示す。
【図３】経日的に組換えタンパク質の生産量が減少した結果を示した図である。組換えタンパク質の生産量はＥＬＩＳＡで定量した。
【図４】図３に示した経日的に組換えタンパク質の生産量が減少した細胞株におけるＩｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量の変化を示した図である。Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量はｑＰＣＲで定量した。
【図５】５つの細胞株において、ＥＬＩＳＡを用いて定量した組換えタンパク質生産量を示した図である。図中の１から５は細胞株の番号を示す。
【図６】図５に示した細胞株におけるＩｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量をｑＰＣＲで定量した結果を示した図である。図中の１から５の数字は細胞株の番号を示す。
【図７】組換えタンパク質の生産をＥＬＩＳＡで定量した図５の結果と、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現をｑＰＣＲで定量した図６の結果との相関を示した図である。図中の１から５の数字は細胞株の番号を示す。
【図８】図７のＹ軸について、各細胞株でのＩｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量を細胞株３のＩｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現量で除した値に変更した図である。図中の１から５の数字は細胞株の番号を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法であって、宿主細胞としてイノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質群から選ばれる１つ以上のタンパク質を発現する能力を有する細胞を用い、バイオマーカーとして、前記宿主細胞の前記タンパク質の生産量、または、前記宿主細胞の前記タンパク質をコードする遺伝子の発現量を定量することによって、前記組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法である。
【００１４】
本発明において、「組換えタンパク質」は、宿主細胞に導入された組換え発現ベクター（宿主−ベクター系）により行われる遺伝子の転写および翻訳の結果、生産されたタンパク質を指す。本発明の生産量の予測方法等に適用できる前記タンパク質の種類は特に限定されない。たとえば、研究分野やバイオ医薬品などの分野で有用な種々のタンパク質に適用することができる。具体的には、ＩｇＧ抗体などが挙げられる。
【００１５】
本発明において、イノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質は特に限定されない。例えば、イノシトールポリリン酸ホスファターゼ、ホスファチジルイノシトールキナーゼ、ホスホリパーゼＣなどの酵素が挙げられるが、好ましくはイノシトールポリリン酸ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．５６またはＥＣ ３．１．３．６２）である。その中でも、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼ（ＥＣ ３．１.３．５６）が好ましい。
【００１６】
イノシトールリン脂質代謝は，細胞外の情報を細胞内に伝える主要な機構であり、イノシトールポリリン酸ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．５６またはＥＣ ３．１．３．６２）はイノシトールリン脂質代謝を制御する酵素の一つである。現在のところイノシトールポリリン酸ホスファターゼの全ての機能が知られているわけではないが、イノシトールポリリン酸ホスファターゼは直接または間接に組換えタンパク質の生産に関与しているようである。イノシトールポリリン酸ホスファターゼの機能については、本発明におけるバイオマーカーとしての正確さを決定するための要件ではない。
【００１７】
本発明を実施する際に用いられる宿主細胞としては、イノシトールリン酸の代謝に関連するタンパク質群から選ばれる１つ以上のタンパク質を発現する能力を有する細胞であれば特に限定されない。
例えば、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）や、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの細胞が例示されるが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が好適に使用される。ただし、上述の宿主細胞に限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞なども対象とすることができる。また、酵母、昆虫細胞などを用いたタンパク質生産システムにおける実施にも応用しうる。前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞等において予め無血清馴化を済ませた細胞であってもよい。これらの細胞は市販のものを入手することができる。
【００１８】
本発明の方法に用いる組換えタンパク質発現ベクターは特に限定されない。例えば、プラスミドベクターであることができる。また、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。これらのベクターは市販のものを入手することができる。例えばＭａｍｍａｌｉａｎ  ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）が挙げられる。
【００１９】
本発明における「バイオマーカー」の一例であるイノシトールポリリン酸ホスファターゼは、ＮＧＳ（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、次世代シーケンサー）を用いたＲＮＡシークエンス（ＲＮＡ−ｓｅｑ）による発現差解析（シークエンスしたＲＮＡ配列断片の数をサンプル間で比較する方法）及びｑＰＣＲを用いた解析で、組換えタンパク質の生産量との相関を確認し、同定したものである。
なお、ＮＧＳとは、一般的に、近年市場に現れたＤＮＡシークエンサーの内、サンガー法を原理とするキャピラリーシークエンサーと対比される一群の装置の総称であり、例えば、イルミナ社のＭｉＳｅｑやＨｉＳｅｑなどがある。
【００２０】
本発明の方法において、宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼのアミノ酸配列は特に限定されない。例えば、配列番号３または４で示されるアミノ酸配列が示される。また、宿主が発現するイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼをコードするＤＮＡの塩基配列も特に限定されない。例えば、配列番号１または２で示される塩基配列が示される。
なお、細胞種が変われば、配列も変わる。
【００２１】
宿主細胞にＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いる場合、バイオマーカーとして、好ましくは配列番号１および２内の塩基配列、もしくは配列番号３および４内のアミノ酸配列を利用することができる。
【００２２】
組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法は特に限定されない。例えば、バイオマーカーの発現量を確認することができる方法を用いて、基準試料の発現量と被検試料の発現量との相対比較（発現差解析）を行う。
前記発現差解析においてバイオマーカーの発現量を確認することができる方法は特に限定されるものではないが、例えば、後述の実施例１に示すＣＨＯ−Ｋ１細胞株のような、組換えタンパク質の生産量とバイオマーカーの発現量とが相関しており、かつ、培養時にある特定の薬剤（実施例１ではピューロマイシン）が存在する場合と存在しない場合とで前記生産量および前記発現量に差がある細胞株を用いて、前記生産量および前記発現量の低い条件で培養したものを基準試料とし、前記生産量および前記発現量の高い条件で培養したものを被検試料として発現量の比較を行えばよい。
また、発現差解析における基準試料および被検試料の設定は、サンプリングポイントの異なる同じ細胞株由来の試料間で行っても良いし、由来となる細胞株が異なっていても良い。
【００２３】
また経時的にサンプリングした同じ細胞株由来の試料を、基準試料及び被検試料として用いる場合、イノシトールポリリン酸ホスファターゼの経時的な発現変化の傾向から、組換えタンパク質生産量レベルの変化を予測することが可能である。
【００２４】
組換えタンパク質の生産量レベルを予測する方法として、具体的には以下の方法が例示できる。
＜組換えタンパク質の生産量予測方法＞
（１）基準とする試料の組換えタンパク質量を定量するステップ。
（２）基準とする（１）と同試料のイノシトールポリリン酸ホスファターゼの発現を定量するステップ。
（３）組換えタンパク質の生産量を予測したい被検試料のイノシトールポリリン酸ホスファターゼの発現量を定量するステップ。
（４）基準試料と、被検試料とで、イノシトールポリリン酸ホスファターゼの発現量を比較するステップ。
（５）組換えタンパク質生産量とイノシトールポリリン酸ホスファターゼの発現量は比例するため、基準試料の既知の組換えタンパク質生産量から、被検試料での組換えタンパク質生産量レベルを予測するステップ。
【００２５】
バイオマーカーの発現量を確認する方法は特に限定されず、定性的な方法、定量的な方法のいずれであってもよいが、定量的な方法が好ましい。定量の対象は特に限定されないが、例えば、バイオマーカーのｍＲＮＡ転写物のレベルまたはタンパク質のレベルであってよい。例えば、前記宿主細胞による前記タンパク質の生産量、または、前記宿主細胞による前記タンパク質をコードするＤＮＡの発現量などが発現量確認の物差しとして挙げられる。
これらは、ＮＧＳを用いたＲＮＡ−ｓｅｑによる発現差解析、ｑＰＣＲを用いた解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現差解析およびＥＬＩＳＡ等の方法で定量することができるが、迅速に定量できることからｑＰＣＲを用いて行うことが好ましい。
【００２６】
本発明により、細胞選抜に要する日数を短縮することで、短時間、高効率に組換えタンパク質高生産細胞を取得することが可能になり、従来技術と比べて顕著な効果を示す。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：組換えタンパク質生産低下株におけるＮＧＳを用いた発現差解析
組換えタンパク質生産量と発現量が相関関係にあるバイオマーカーをスクリーニングする目的でＮＧＳを用いた発現差解析を行った。
【００２９】
組換えタンパク質の産生に広く使用されているＣＨＯ細胞系統を以下の実施例全体を通して利用した。本実施例には、ヒト化ＩｇＧ抗体遺伝子とピューロマイシン（以下、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎとも記載する。）耐性遺伝子を含むベクターを用いて形質転換し、シングルクローン化したヒト化ＩｇＧ抗体産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研バイオリソースセンター、Ｎｏ．ＲＣＢ０２８５）由来系統を用いた。
ＣＨＯ細胞系統では、薬剤選択マーカー発現カセットを用いた薬剤選択に使用される薬剤であるピューロマイシンを除去することにより組換えタンパク質の生産量が低下する細胞株が少なからず存在する。そこで、本実施例ではさらに、前記細胞系統から、宿主細胞の培養時に、ピューロマイシンを除去することで、組換えタンパク質であるヒト化ＩｇＧ抗体の生産量が２７ｍｇ／Ｌから１ｍｇ／Ｌに著しく低下した細胞株を選抜した。
この細胞株を用いて、培養時のピューロマイシンの存在時・非存在時におけるヒト化ＩｇＧ抗体の生産量の差をバイオマーカー候補の発現量と比較することにより、組換えタンパク質生産量と発現量が相関関係にあるバイオマーカーをスクリーニングすることができる。
【００３０】
宿主細胞の培養時に、ピューロマイシンを除去することで、組換えタンパク質（ヒト化ＩｇＧ抗体）の生産量が２７ｍｇ／Ｌから１ｍｇ／Ｌに著しく低下した細胞株から、ピューロマイシン除去前後で、それぞれ全ＲＮＡを抽出し、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍＲＮＡ調製キット（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてサンプルを調製した。調製したサンプルを用いて、ピューロマイシン除去を行ったサンプルと行わなかったサンプルでＮＧＳを用いたＲＮＡ−ｓｅｑ解析を実施した。ＮＧＳはＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いた。解析は、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣＢｉｏ社製）を用いた。
【００３１】
その結果、ピューロマイシン除去前後で発現量に差がある遺伝子群の情報を得た。得られた結果のうち、本発明におけるバイオマーカーであるイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．  ３．５６）の発現量の差を図１に示す。図中の値はピューロマイシン除去前の値を基準に除去後の値と比較した倍率を示す。−２２．２倍は、ピューロマイシン除去後の値が除去前の値の１／２２．２に低下したことを示す。
【００３２】
上記の発現差解析では、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼ以外のイノシトールリン酸の代謝に関連する遺伝子も確認されたが、ＮＧＳで十分な発現量かつ、明確な発現量の差があったのは、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼのみであった。
【００３３】
実施例２：複数細胞株を用いたｑＰＣＲ解析
実施例１より、ピューロマイシンの有無で発現量に差があったイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼについて、組換えタンパク質の生産量レベルとの相関を確認する目的で、ピューロマイシン除去後の組換えタンパク質の生産量レベルが異なる複数の細胞株で、ｑＰＣＲを用いて発現量を確認した。（ピューロマイシン除去前の細胞株由来の試料を基準試料、ピューロマイシン除去後の細胞株由来の試料を被検試料とした。）
【００３４】
各細胞株のピューロマイシン除去前後の組換えタンパク質の生産量はＥＬＩＳＡを行い定量した。具体的には、１０００倍希釈したＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｆｃ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、１００００倍希釈したＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｆｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ添加して室温で１時間インキュベートした後、さらにＷａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、ＴＭＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。１００μＬの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。
【００３５】
一方、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量はｑＰＣＲを用いて定量した。具体的には、各細胞株のピューロマイシン除去前後の全ＲＮＡをそれぞれ鋳型にしてＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  −α−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲは、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、各６ｐｍｏｌのプライマー（イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼ用のペア：配列番号５および６、β−ａｃｔｉｎ用のペア：配列番号７および８）を含む２０μＬの反応液をそれぞれ調製した。反応は９５℃、１分の前反応の後、「９５℃、１５秒→６０℃、３０秒」を４０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて行った。イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で除して補正した相対定量値を用いて比較を行った。
【００３６】
結果を図２に示す。組換えタンパク質の生産量またはイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量について、ピューロマイシン除去前の値を基準に除去後の値と比較した倍率をプロットした。ピューロマイシン除去前後の組換えタンパク質の生産量差とイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量差との相関係数は０．９６（ｎ＝５）であり、高い相関があることが示唆された。
【００３７】
実施例３：経日変化の確認
実施例２より、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量が組換えタンパク質の生産量と高い相関を示すことが示唆されたが、組換えタンパク質の生産量の変化後、時間を要してイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量変化が起きている場合、組換えタンパク質の生産レベルを迅速に予測する用途に利用することができない。そのため、組換えタンパク質の生産レベルとイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量の変化との関係を時間的に確認した。
【００３８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を培地（ＦＢＳ  １０％、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ７．５μｇ／ｍＬ、培地はＢａｌａｎＣＤＴＭＣＨＯＧＲＯＷＴＨ  Ａに８ｍＭになるようにＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを加えたもの）で培養後、ピューロマイシン除去を行い、ピューロマイシン除去後、経日的にサンプリングした。組換えタンパク質の生産量をＥＬＩＳＡで、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をｑＰＣＲで定量した。ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲは実施例２記載の方法で実施した。（ピューロマイシン除去前の細胞株由来の試料を基準試料、ピューロマイシン除去後の細胞株由来の試料を被検試料とした。）
【００３９】
組換えタンパク質の生産量が経日的に低下した細胞株の各タイムポイントでの組換えタンパク質の生産量を図３に示す。同タイムポイントでのイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量を図４に示す。組換えタンパク質（ヒト化ＩｇＧ抗体）の生産量はピューロマイシン除去前（Ｐｒｅ）で３４ｍｇ／Ｌ、ピューロマイシン除去８日目（Ｄａｙ８）で３８ｍｇ／Ｌ、１２日目（Ｄａｙ１２）で２７ｍｇ／Ｌ、１４日目（Ｄａｙ１４）で８ｍｇ／Ｌであった。一方、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で除して相対定量した値を、ピューロマイシン除去前を基準に除去後と比較した倍率は、Ｄａｙ８で１．８倍、Ｄａｙ１２で−１．５倍、Ｄａｙ１４で−１．５倍であった。Ｄａｙ１２で組換えタンパク質がわずかに低下した時点で、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼは明らかな減少に転じた。この結果は、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼが減少傾向であることから、組換えタンパク質量も低下傾向である（今後大きく低下する）と予測できる可能性を示す。よってイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼをバイオマーカーとして用いることで、ＥＬＩＳＡを行い組換えタンパク質の生産量を確認するより、簡便かつ迅速に組換えタンパク質の生産量低下を予測できることが示唆された。
【００４０】
実施例４：細胞株間での比較
実施例２及び３では、本来のイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量が細胞株によって大きく異なる可能性を考慮し、同じ細胞株で組換えタンパク質の生産量変化前後の発現差を基準として、組換えタンパク質の生産量変化と比較した。つまり、実施例２及び３の場合、細胞株ごとに、事前のサンプリングを行い、ベースとなるイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量を確認する労力を要する。そこで、組換えタンパク質の生産量低下前の事前サンプリングを行うことなく、組換えタンパク質の生産量レベルを予測可能か検討した。
【００４１】
イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量及び組換えタンパク質の生産量の定量は実施例２及び３に記載の方法で行った。
【００４２】
組換えタンパク質（ヒト化ＩｇＧ抗体）生産量を図５に、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量を図６に示す。ＥＬＩＳＡにより定量した各細胞株の組換えタンパク質生産量と、ｑＰＣＲで定量した各細胞株のイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で除した相対定量値とで比較すると相関係数は０．８５（ｎ＝５）であり高い相関を示した（図７）。よって、異なる細胞株間でも、ベースとなるイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量は比較的一定であり、組換えタンパク質の生産量変化前に事前サンプリングを行わなくても、組換えタンパク質の生産量を予測できることが示唆された。
【００４３】
組換えタンパク質の生産性が高い細胞の選抜にイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼを用いる場合、例えば図８で、組換えタンパク質生産量が２０ｍｇ／Ｌ以下である細胞株番号３のイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で除した相対定量値を組換えタンパク質生産量低値の基準とし、組換えタンパク質の生産量レベルを予測したい細胞株のイノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で除した相対定量値と比較する（抗体の発現量が低い細胞株番号３が基準試料となる。）。予測したい細胞株の値が組換えタンパク質の生産量が低い株（細胞株番号３）の値の２倍に満たない場合は、組換えタンパク質の生産量が低い、あるいは低下する細胞株であると判定して除外することで、組換えタンパク質を高発現する細胞株を簡便に選別することができる。図８の場合、組換えタンパク質生産量が５０ｍｇ／Ｌを超える細胞株番号５のみが選別されることになる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は迅速に組換えタンパク質の生産量レベルを予測し、生産量が低い細胞を除去することを可能とする。これにより、研究分野のみならず、抗体医薬品の製造等において、高効率発現株を容易に選抜できるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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