(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶、レモングラス、キダチアロエ、クマザサ、トウガラシ、オオムギ、アマチャヅル、ギムネマ、エビスグサ、ベニバナ、クワ、レイシ、プーアール茶、番茶、ハトムギ、ハブソウの抽出物を１種類以上含み、酸化蛋白質分解酵素（OPH）の酸化蛋白質分解活性を１．２倍以上活性化するOPH活性増強剤。
【請求項２】
ゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶の抽出物を１種類以上含み、OPHの酸化蛋白質分解活性を３倍以上活性化するOPH活性増強剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用飲食品。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用健康食品。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用食品添加物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用医薬品。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用化粧品。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のOPH活性増強剤を含有するOPH活性増強用医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化蛋白質を分解する生体内酵素である酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：OPH）の活性を増強させるOPH活性増強剤、及び、当該OPH活性増強剤を含有する飲食品や医薬品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における酸化反応が細胞や組織に悪影響を及ぼすことが知られている。例えば、組織コラーゲンなどの加齢変化、アルツハイマー病、白内障、皮膚老化などさまざまな疾患や老化の原因の一つとなる。
【０００３】
酸化蛋白質はOPHによって分解除去される。OPHは生体組織中に広く分布し、酸化蛋白質を優先的に分解するセリンプロテアーゼの一種であり、蛋白質のN末端アシル化アミノ酸を遊離する酵素であるアシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino-acid-releasing enzyme：AARE）として知られている。このOPHは加齢とともにその活性が低下することが知られている。
【０００４】
OPH活性は糖尿病ラットの血清中において顕著に上昇することや、OPH活性が上昇した血清ではカルボニル修飾蛋白質量が低いことが報告されており、OPHが糖尿病や老化進展抑制に関わる可能性があるとされている。
【０００５】
OPHの活性を促進させることにより、疾患や老化を予防することが期待されているものの、OPH活性を促進する作用物質としては、ドクダミ、セイヨウサンザシ、ローマカミツレ、ブドウが知られているに過ぎない（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２０１１／００４７３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の事情を鑑み、本発明は、OPHの活性を増強させるOPH活性増強剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、第一の発明として、ゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶、レモングラス、キダチアロエ、クマザサ、トウガラシ、オオムギ、アマチャヅル、ギムネマ、エビスグサ、ベニバナ、クワ、レイシ、プーアール茶、番茶、ドクダミ、ハトムギ、ハブソウの抽出物を１種類以上含む組み合わせからなり、酸化蛋白質分解酵素（OPH）の酸化蛋白質分解活性を１．２倍以上活性化するOPH活性増強剤を提供する。
【０００９】
第二の発明として、ゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶の抽出物を１種類以上含む組み合わせからなり、OPH活性を３倍以上活性化するOPH活性増強剤を提供する。
【００１０】
第三の発明として、ウーロン茶、ほうじ茶、レモングラス、番茶、プーアール、ベニバナの抽出物を1種類以上含む組み合わせからなり、OPHの酸化蛋白質分解活性を１．２倍以上活性化するとともにOPHのAGEs分解を活性化するOPH活性増強剤を提供する。
【００１１】
第四の発明としては、第一の発明から第三の発明に記載のOPH活性増強剤を１種類以上含む組み合わせを含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、OPHの酸化蛋白質分解活性を増強させるOPH活性増強剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１７種のサンプルのOPH活性増強作用の推移を示す図
【図２】１９種のサンプルの90分後のOPH活性増強率を示す図
【図３】蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定結果を示す図
【図４】AGEs分解活性増強率がプラスとなった測定結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
<実施形態１>
<実施形態１  概要>
【００１５】
本実施形態は、酸化蛋白質の分解酵素であるOPHの酸化蛋白質分解活性（以下、単にOPH活性）の増強作用について、コントロール（サンプル無添加）と比較して、OPH活性増強作用が試験により認められた１７種類の植物の抽出物を含むOPH活性増強剤に関する。
<実施形態１  構成>
【００１６】
本実施形態に係るOPH活性増強剤は、ゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶、レモングラス、キダチアロエ、クマザサ、トウガラシ、オオムギ、アマチャヅル、ギムネマ、エビスグサ、ベニバナ、クワ、レイシ、プーアール茶、番茶、ドクダミ、ハトムギ、ハブソウの抽出物を１種類以上含む組み合わせからなる。ここに挙げられた１７種のサンプルは、後述するOPH酸化蛋白質分解活性増強作用測定試験を行った１００種を超えるサンプルの中で、サンプルを添加しないコントロールと比較して１．２倍以上のOPH酸化蛋白質分解活性増強作用が認められたものである。
【００１７】
本実施形態における植物の抽出物は、植物のどの部位から抽出したものであってもよく、例えば、全草、花、種子、果実、枝、茎、樹皮、根などから抽出したものであってよい。また、抽出物の性状を限定するものではない。以下に、本実施形態で用いられる植物を説明する。
【００１８】
「ゴボウ」Arctium lappaは、キク科ゴボウ属の多年草である。
【００１９】
「ウーロン茶」は、茶葉（Camellia sinensisの葉）を発酵途中で加熱して発酵を止め、半発酵させた茶である。
【００２０】
「ほうじ茶」は、番茶を焙じた茶である。
【００２１】
「レモングラス」Cymbopogon citratusは、イネ科オガルカヤ属の多年草植物である。
【００２２】
「キダチアロエ」Aloe arborescensは、ユリ科アロエ属の多肉植物である。
【００２３】
「クマザサ」Sasa veitchiiは、イネ科ササ属の植物である。
【００２４】
「トウガラシ」Capsicum annuumは、ナス科トウガラシ属の植物である。
【００２５】
「オオムギ」Hordeum vulgareは、イネ科オオムギ属の植物である。
【００２６】
「アマチャヅル」Gynostemma pentaphyllumは、ウリ科アマチャヅル属の植物である。
【００２７】
「ギムネマ」Gymnema sylvestreは、ガガイモ科ホウライアオカズラ属の植物である。
【００２８】
「エビスグサ」Senna obtusifoliaは、ジャケツイバラ科センナ属の植物である。
【００２９】
「ベニバナ」Carthamus tinctoriusは、キク科ベニバナ属の植物である。
【００３０】
「クワ」Morus lhou、M. bombycis、M. alba、M. nigra、M. serrata、M. laevigata、M. tiliaefolia、M. boninensisは、クワ科クワ属の植物である。
【００３１】
「レイシ」Ganoderma lucidumは、マンネンタケ科マンネンタケ属の菌類である。
【００３２】
「プーアール茶」は、茶葉（Camellia sinensisの葉）の酸化醗酵を加熱によって止め、麹などの微生物とともに熟成させて作る後発酵茶である。
【００３３】
「番茶」は、夏以降に摘む二番茶以降のかたい茶葉（Camellia sinensisの葉）を茎とともに刈り取って製茶したものである。
【００３４】
「ドクダミ」Houttuynia cordataは、ドクダミ科ドクダミ属の植物である。
【００３５】
「ハトムギ」Coix lacryma-jobi var. frumentaceaは、イネ科ジュズダマ属の植物である。
【００３６】
「ハブソウ」Senna occidentalisは、ジャケツイバラ科センナ属の植物である。
【００３７】
上述した１９種の植物抽出物の一種又は二種以上の組み合わせからなるOPH活性増強剤は、これを含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品などとして応用することが可能である（実施形態２についても同様である）。
<実施形態１  試験>
【００３８】
上述した１９種の植物抽出物は、以下の試験において、OPH活性増強作用が認められたものである。
<試験１>
【００３９】
（１）サンプルの抽出
【００４０】
各乾燥サンプル3.75gを恒温水槽中で80℃に加温した蒸留水150mL中に加えて1時間インキュベートした。その後、抽出液を4500rpmで15分間遠心分離して上清を回収し、サンプル抽出液とした。
【００４１】
（２）反応試薬の調製
【００４２】
OPHとして0.5Uのアシルアミノ酸遊離酵素（AARE； タカラバイオ）を入れたチューブに50mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液を1mL入れて希釈した。さらに200mmol/L Tris-HCl(pH7.4)で10倍希釈して0.05U/mL OPHとした。次に、50mmol/L のN-acetyl-L-alanine p-nitroanilide（AAPA）基質（フナコシ）50%エタノール水溶液を調製した。調製した各反応液を下記の表１の通りに混合して、反応試薬A〜Dを調製した。
【表１】
0006515427.tif 000002
【００４３】
（３）OPH活性増強作用の測定
【００４４】
調製した反応試薬（AAPA基質を除く）は、96ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れた後、AAPA基質を添加して反応を開始した。測定時のマイクロプレートリーダーの設定温度は37℃とし、405nmの測定波長における吸光度を10分毎に測定し、90分間測定を続けた。
【００４５】
OPH活性増強作用は、まず反応試薬A〜Dの各吸光度を求めた。そして、求められた各反応試薬の吸光度を下記の式に当てはめて得られた値をOPH活性増強率とした。OPH活性増強率が100を超えているサンプルはOPH活性を増強したことを示し、100を下回るサンプルはOPH活性を低下させたことを示す。
（式１）OPH活性増強率＝ (反応試薬B−C) ／ (反応試薬A−D)  ×  100
【００４６】
（４）結果
【００４７】
図１は、１９種のサンプルのうちハトムギとハブソウを除く１７種について、測定開始から30分後、60分後、90分後のOPH活性増強率の推移をグラフとして表したものである。
【００４８】
図２は、１９種のサンプルについて測定開始から90分後のOPH活性増強率を上位から並べて表したものである。
【００４９】
以上の通り、本実施形態に係る１９種の植物抽出物は、いずれも無添加のコントロールと比較して、１．２倍以上のOPH活性増強作用が認められた。とくに、ゴボウは599%、ウーロン茶は457%、ほうじ茶は326%という測定結果を得ることができ、いずれも無添加のコントロールと比較して、３倍以上のOPH活性増強作用が認められた。
<実施形態１  効果>
【００５０】
本実施形態に係る植物抽出物は、いずれも無添加のコントロールと比較して、１．２倍以上のOPH活性増強作用が認められ、とくにゴボウ、ウーロン茶、ほうじ茶については、３倍以上のOPH活性増強作用が認められた。
<実施形態２>
<実施形態２  概要>
【００５１】
本実施形態は、まず、酸化蛋白質を分解する酵素であるOPHに、糖化蛋白質や糖化最終生成物（AGEs）に対する分解作用が備わるのか否かの検証を行う。そして、OPHが分解作用を有する場合に、OPH活性増強作用が認められた実施形態１に係る１９種の植物抽出物が、OPHの糖化蛋白質やAGEsに対する分解作用をより活性化させることができるか否かについて示すものである。
【００５２】
糖化蛋白質やAGEsは、生体内の細胞や組織と生命維持に不可欠な糖質との反応により生成される。この糖化蛋白質やAGEsが、皮膚老化、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などといった悪影響を及ぼすことはよく知られている。
【００５３】
ところで、酸化蛋白質を分解する酵素としてプロテアソーム（proteasome）が知られているが、このプロテアソームは糖化蛋白質やAGEsを分解することはできない。したがって、酸素と糖質を摂取して生命活動を行っている限り不可避的に生じる蛋白質の酸化及び糖化反応のいずれをも抑制する効果をプロテアソームに求めることはできない。しかし、OPHが糖化蛋白質をも分解することができれば、OPHを摂取することにより効率的に酸化及び糖化反応のいずれをも抑制することが可能となる。
【００５４】
さらに、OPHの酸化蛋白質に対する分解作用を活性化する物質が、OPHの糖化蛋白質やAGEsに対する分解作用をも活性化することができれば、OPHの効果をより増大させることができ、ヒトが健康で若々しくいられることに大きく寄与することが期待される。
<実施形態２  試験>
<試験１>
【００５５】
本試験では、OPHが、糖化蛋白質やAGEsに対する分解作用を有するか否かについて測定試験を行う。なお、本試験で用いられるサンプルは、実施形態１に係る１９種の植物から抽出されたサンプルと同様である。
【００５６】
（１）AGEsの調整
【００５７】
100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4) 500μL、2mol/Lグルコース(Glc) 100μL、40mg/mLヒト血清アルブミン(HSA) 200μL、蒸留水200μLを混合し、GlcとHSAの混合液(Glc-HSA G+)を調製した。次に、100mmol/Lリン酸緩衝液500μL、40mg/mL HSA 200μL、蒸留水300μLを混合し、Glcを含まない溶液(Glc-HSA G-)を調製した。そして各混合液を60℃、40時間インキュベートした。
【００５８】
（２）OPHと糖化蛋白質の反応
【００５９】
インキュベート後のGlc-HSA G+とGlc-HSA G-を使用し、下記の表２のA〜Eの反応液を調製し37℃で90分インキュベートした。インキュベート後の反応液には、PCAを100μL加えて遠心分離し、蛋白を沈澱させ上清を除去した。さらに沈殿物にTris-HCl(pH7.4) 350μLを加えて再溶解した。
【表２】
0006515427.tif 000003
【００６０】
（３）蛍光性AGEsの測定
【００６１】
再溶解後の反応液A〜Eを96ウェルマイクロプレートに250μL添加し、マイクロプレートリーダーで励起波長370nm、検出波長440nmにおける蛍光を測定した。
【００６２】
（４）ペントシジンの測定
【００６３】
再溶解後の反応試薬A〜Eに6N 塩酸1mLを加え、ブロックインキュベーターで100℃、18時間加水分解した。その後、反応液サンプルを乾固し蒸留水1mLで溶解した．次に、各反応液サンプル500μLをイオン交換カラム(Oasis MCX)に注入し、0.1N 塩酸 3mLを通液後、7% NH3水溶液 4.5mLでペントシジンを溶出した。
【００６４】
ペントシジン溶出液を蒸発乾固し、そこに10%アセトニトリル(ACN)を含む0.2%HFBAを300μL加え溶解した。次いで本サンプルを逆相HPLCにて分析した。
【００６５】
カラムはYMC Triart C18/S-5μm/12nm 150 x 4.6mm使用し、分析条件は流速1.0ml/min、カラム温度40℃、蛍光検出(励起波長335nm，蛍光波長385nm)とした。インジェクション量は50μLとし，溶離液条件はA) 0.2% HFBA, B) ACNとして、20%B (0-9min),100%B (9-17min),のグラジェント分析とした。
【００６６】
（５）CMLの測定
【００６７】
再溶解後の反応試薬A〜E中のCMLを、CircuLex CML/Nε-(carboxymethyl) Lysine ELISA Kit (サイクレックス)を使用して測定した。
【００６８】
（６）OPHによるAGEs分解作用の測定
【００６９】
蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定値は下記式２（OPHを含む蛍光値）及び式３（OPHを含まない蛍光値）より求めた。
（式２）OPH+＝    反応液A−C−E
（式３）OPH-＝    反応液B−D
【００７０】
（７）結果
【００７１】
図３は、蛍光性AGEs、ペントシジン、CMLの各測定結果を示すものである。図示するように、いずれにおいても、OPHを含まない「OPH-」よりもOPH を含む「OPH+」の方が低い蛍光値を示していることから、OPHはGlc-HSA G+に含有されるAGEsを分解したものと認められる。
<試験２>
【００７２】
上記試験１において、OPHがAGEsを分解することが認められた。そこで、OPH活性増強作用が認められた実施形態１に係る１９種の植物抽出物が、OPHのAGEsに対する分解作用をより活性化させることができるか否かについて試験を行った。
【００７３】
（１）AGEs分解活性増強作用の測定
【００７４】
100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4) 500μL、2mol/Lグルコース(Glc)100μL、40mg/mLヒト血清アルブミン(HSA)200μL、蒸留水200μLを混合し、GlcとHSAの混合液(Glc-HSA G+)を調製した。同様にGlcを添加しない溶液(Glc-HSA G-)を調製した。
【００７５】
この各混合液を60℃、40時間インキュベートして得られた反応液を含む下記の表A〜Dの反応試薬を調製した。調製したA〜Dの反応試薬は37℃、90分インキュベートし、その後70%PCAを100μL加え遠心分離し、反応液中の蛋白を沈澱させた。
【表３】
0006515427.tif 000004
【００７６】
沈殿した蛋白質は50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)を加えて溶解して再溶解させた後、反応試薬A〜Dを96ウェルマイクロプレートに250μLずつ添加した。マイクロプレートリーダーで励起波長370nm、検出波長440nmにおけるAGEs由来の蛍光を測定した。AGEs分解活性増強率は反応試薬A〜Dを下記の式４に当てはめて蛍光値から求めた。
（式４）AGEs分解活性増強率（％）＝１００−（反応試薬B-C-D）/（反応試薬A-C-D）×１００
【００７７】
（２）結果
【００７８】
図４は、AGEs分解活性増強率の測定結果のうち、プラスの結果が得られたサンプルを示すものである。
【００７９】
図示するように、番茶、レモングラス、ほうじ茶、ウーロン茶、プーアール、ベニバナについて、OPHのAGEsに対する分解作用をより活性化させることが示された。したがって、この６種の植物抽出物がOPHの酸化蛋白質の分解作用を活性化させるだけでなく、AGEsに対する分解作用をも活性化させることが示された。
<実施形態２  効果>
【００８０】
本実施形態により、ウーロン茶、ほうじ茶、レモングラス、番茶、プーアール、ベニバナの抽出物を1種類以上含有させることにより、OPHのAGEs分解をも活性化するOPH活性増強剤を提供することが可能となる。
【図１】
0006515427.tif 000005
【図２】
0006515427.tif 000006
【図３】
0006515427.tif 000007
【図４】
0006515427.tif 000008