(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタノール資化性微生物の培養物からタンパク質を除去する方法であって、
メタノール資化性微生物と１種類以上の非メタノール資化性微生物とを共に培養する工程を含み、
メタノール資化性微生物がハイホミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属）に属する微生物であり、
非メタノール資化性微生物がバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属）又はクリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属する微生物である、
方法。
【請求項２】
メタノール資化性微生物の培養液中に非メタノール資化性微生物が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非メタノール資化性微生物を添加する量がメタノール資化性微生物の培養液に対して０．００１から１０％であり、添加後の非メタノール資化性微生物濁度がＯＤ６１０ｎｍにおいて０．００００１から０．５である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いたピロロキノリンキノンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安価で大量に入手可能なメタノールを炭素源に用い、発酵法によって、夾雑タンパク質の少ない目的化合物を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵による物質生産においてメタノールは安価で大量に入手可能な炭素源であり、メタノール資化性菌を用いた物質生産はコスト面で非常に優れている。メタノール資化性菌には、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、メチロフィラス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属）、メチロバチルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ハイホミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属）などがある。医薬品のほか、各種酵素類、各種アミノ酸（特許文献１）、コエンザイムＱ１０などの補酵素類（特許文献２、３、４、５）、Ｓ−アデノシルメチオニン（特許文献６）、ビタミンＢ１２（特許文献７）、ポリヒドロキシ酪酸（特許文献８）などの工業生産に盛んに用いられている。
【０００３】
このように、現在数多くの物質を、メタノール資化性菌を用いた発酵法により製造することが可能である。しかし、その培養液には菌体、菌体破砕物、分泌物に由来する高分子不純物が発生しその除去が課題である。特にタンパク質成分が多く、その除去が問題であった。また、目的化合物と夾雑タンパク質が反応して純度を下げる危険性があった。タンパク成分は精製時の不純物としてカラムクロマトグラフィーへの閉塞等の製造上に問題を生じさせる。
【０００４】
また、不純物としてタンパク質を含有すると、まれにではあるがアレルギー成分となり、その除去は求められている。このようにタンパク質が培養液中に存在することは多くの欠点がある。これまでに、ｐＨを下げることでタンパク質を析出させ、遠心分離によって除去する方法（特許文献９）が知られている。しかし、大量に存在する培養液中からの除去は収率の低下、装置の大型化等により費用がかさむ欠点があった。そのため、より簡便で安価な方法が求められている。
【０００５】
培養生産の際に２種類以上の菌を使用して培養する方法が知られている。これまでの場合、アルコール発酵ではでんぷんの糖化に麹カビ、糖のアルコールへの変換に酵母のように２つの菌は異なる物質変換に使われている。２種類以上の微生物が共存する培養系を共培養または混合培養という。例えば、紅色非硫黄細菌の光合成によって水素を発生させ、その水素を水素資化性菌がメタンに変換する共培養方法（特許文献１０）や、グルコノバクター  オキシダンスを培養しソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸を合成する系においてバチルス  メガテリウムと共培養させることで生育が良好になる方法（特許文献１１）、メタノールを炭素源とする場合、メタノール資化性菌であるメチロバチルス属細菌をメタノールで培養し、生産、分泌した単糖類を炭素源とする有用物質生産菌と混合培養してアミノ酸などの有用物質を生産させる方法（特許文献１２）などが知られている。一方、ＰＱＱの製造方法として、ＰＱＱを合成するメタノール資化性微生物を培養する方法（特許文献１３）などが知られている                    
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２９５４５７号公報
【特許文献２】特開２０１３−０７８２９１号公報
【特許文献３】特許第２７５１１８３号公報
【特許文献４】特公平０５−０１６８３３号公報
【特許文献５】特公平０５−０１００７７号公報
【特許文献６】特開２００９−２１３４６９号公報
【特許文献７】特開平０９−２３８６９８号公報
【特許文献８】特開２００２−０１７３８０号公報
【特許文献９】特公平７−１１３０２４号公報
【特許文献１０】特開２０１３−１９２５４７号公報
【特許文献１１】特開平０１−０３４２９３号公報
【特許文献１２】特開平１０−１１３１９６号公報
【特許文献１３】特開平１−２１８５９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
メタノールを炭素源とする場合、メタノール資化性菌であるメチロバチルス属細菌をメタノールで培養し、生産、分泌した単糖類を炭素源とする有用物質生産菌と混合培養してアミノ酸などの有用物質を生産させる方法（特許文献１２）などが知られている。
これまでに、物質変換に有用な方法として使用されているが、精製に使用する例は知られていない。
【０００８】
培養液からのタンパク質除去方法は多くの作業工程を必要としてきた。そのため高価な設備と運転費用が必要であった。また、その後の精製工程を行うにも問題が生じやすい。そのため、なるべく培養段階でタンパク質成分の高度の除去ができる簡便な方法が求められている。本発明の目的は培養段階で不純物のタンパク質を除去する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、培養を２種類以上の菌で行うことでタンパク質を含む不純物の少ない目的化合物を含む水溶液を得られる本発明に至った。本発明は以下のとおりである。
（１）メタノール資化性微生物と１種類以上の非メタノール資化性微生物とを共に培養するメタノール資化性微生物の培養方法。
（２）メタノール資化性微生物の培養液中に非メタノール資化性微生物を添加することを特徴とする培養方法。
（３）メタノール資化性微生物がメチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、メチロフィラス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属）、メチロバチルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ハイホミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ属）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ属）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属）、メチロファーガ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ属）、アンシロバクター属（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ属）、キサントバクター属（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、オリゴモナス属（Ｏｌｉｇｏｍｏｎｕｓ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属）に属することを特徴とする（１）又は（２）の培養方法。
（４）非メタノール資化性微生物がバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属することを特徴とする（１）又は（２）の培養方法。
（５）非メタノール資化性微生物を添加する量がメタノール資化性微生物の培養液に対して０．００１から１０％であり、添加後の非メタノール資化性微生物濁度がＯＤ６１０ｎｍにおいて０．００００１から０．５である（２）の培養方法。
（６）（１）又は（２）の方法を用いたピロロキノリンキノンの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、メタノール資化性菌を用いることで安価なメタノールを炭素源として物質生産が可能であるだけでなく、メタノール資化性菌と共培養させる微生物がメタノールを炭素源としないため、メタノール資化性菌が生産する目的化合物の生産性を低下させることなく、しかもそれらがメタノール資化性菌由来のタンパク質を消費することで、目的化合物の安定性に寄与することに加え、工業生産の際には培養上清中の不純物が少ないことで精製工程の負荷が大幅に軽減される点において、これまでにない画期的な物質生産方法であると言える。
すなわち、本発明により、メタノール資化性菌で目的化合物を生産すると共に簡便に培養液中のタンパク質を代表とする水溶性高分子を除去する方法を提供できる。言い換えると不純物の少ない培養液を得ることができ、精製工程の効率化を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例４におけるＰＱＱ生産菌培養上澄液のＳＤＳＰＡＧＥ像
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明はメタノール資化性微生物と１種類以上の非メタノール資化性微生物とを共に培養するメタノール資化性微生物の培養方法である。
これによりメタノール資化性微生物で目的物を生産すると共に、簡便に培養液中のタンパク質を代表とする水溶性高分子除去する方法を提供できる。
【００１３】
目的物はメタノール資化性微生物によって生産にできるものであれば構わない。具体的にはピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記すことがある）類やポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）が挙げられる。
【００１４】
メタノール資化性微生物とは、メタノールを炭素源として利用でき、メタノールを酸化することでエネルギーを獲得できる微生物であれば構わない。本発明で利用できるメタノール資化性微生物として例えば、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、メチロフィラス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属）、メチロバチルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ハイホミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ属）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ属）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属）、メチロファーガ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ属）、アンシロバクター属（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ属）、キサントバクター属（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、オリゴモナス属（Ｏｌｉｇｏｍｏｎｕｓ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属）に属する微生物が挙げられる。
【００１５】
目的物がＰＱＱ類の場合は、培養液はメタノール資化性微生物であって、ＰＱＱ類を生産する微生物を培養して得られる。具体的にはメチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、メチロフィラス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属）、メチロバチルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ハイホミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ属）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ属）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属）、メチロファーガ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ属）、アンシロバクター属（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ属）、キサントバクター属（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、オリゴモナス属（Ｏｌｉｇｏｍｏｎｕｓ属）に属する微生物であれば特に使用する微生物に制限はなく、例えばメチロフィラス  フラバス、メチロフィラス  メチロトロファス、グルコノバクター  オキシダンス、グルコノバクター  セレビシエ、ミクロコッカス  ルテウス、ミクロコッカス  フラバス、シュードモナス  アエルギノサ、シュードモナス  メンドシナ、コリネバクテリウム  シュードツベルクロシス、コリネバクテリウム  ジフテリエ、コリネバクテリウム  ウルセランス、セラチア  プリムチカ、セラチア  マルセセンス、キサントバクター  アウトトロフィカス、ハイホミクロビウム  メチロボラム、ハイホミクロビウム  デ二トリフィカンス、ハイホミクロビウム ブルガレ、メチロバチルス グリコゲネス、メチロバクテリウム エクストロクエンス、メチロバクテリウム オルガノフィラム、メチロバクテリウム ロディウム、メチロバクテリウム  メソフィリカム、メチロバクテリウム ラジオトレランス、アンシロバクター アキュアティカス、キサントバクター オートトロフィカス、キサントバクター フラバム、アセトバクター メタノリカス、パラコッカス デニトリフィカンス、チオバチルス ノベルス、オリゴモナス メタノリカ、メチロファーガ マリーナおよびメチロファーガ サラシカなどを使用することができる。
【００１６】
本発明における非メタノール資化性菌とはメタノール以外の物質を炭素源として利用できる微生物をいう。炭素源となるものは例えばメタノール資化性菌が分泌あるいは漏出した有機物が挙げられ、具体的にはタンパク質、ペプチド、アミノ酸のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸類、グルコース、フルクトースなどの単糖類、スクロース、ラクトースなどの二糖類、ラフィノース、マルトトリオース、シクロデキストリンなどのオリゴ糖類、Ｎ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルムラミン酸などのアミノ糖類、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、セラミドなどの脂質、エタノール、ブタノール、グリセロールなどのアルコール類が挙げられる。本発明において、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸を炭素源として利用できる非メタノール資化性菌である。使用できる非メタノール資化性微生物は、メタノール資化性微生物の存在下で培養可能な微生物であり、メタノール耐性が０〜５ｗｔ％の微生物である。
メタノール資化性微生物がピロロキノリンキノン類を生産する場合、ピロロキノリンキノン類の濃度が１００から５０００ｐｐｍの濃度で培養可能な微生物であることが好ましい。具体的にはバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ属）、オクロバクトラム属（Ｏｃｒｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属）、クプリアヴィダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属）、ヘルバスピリラム属（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属）に属する微生物を使用できる。制限はないが、例えばバークホルデリア ヴィエトナミエンシス、バークホルデリア  セノセパシア、バークホルデリア  マルチボランス、ステノトロホモナス マルトフィリア、クリセオバクテリウム ホミニス、クリセオバクテリウム  ビスセラム、ブルセラ  イノピナタ、ブルセラ  ピニペディアリス、オクロバクトラム  トリティシ、オクロバクトラム  アンスロピ、オクロバクトラム  インテルメディウム、ラルストニア  ピケティ、ラルストニア  インシディオサ、ラルストニア  マンニトリリティカ、ラルストニア  シジギ、クプリアヴィダス  ネカトル、クプリアヴィダス  レスピラクリ、クプリアヴィダス  カンピネンシス、ヘルバスピリラム  ヒルトネリ、ヘルバスピリラム  クロロフェノリカム、ヘルバスピリラム  フリシンゲンセなどの微生物を使用することが好ましい。
メタノール資化性微生物の培養で製造されたＰＱＱ類の培養液に含まれる不純物のタンパク質やその他の培養生産物は、非メタノール資化性微生物により該微生物内に取り込まれ除去される。
【００１７】
製造方法として、非メタノール資化性微生物はメタノール資化性微生物と同時に添加しても良いし、二段培養としてメタノール資化性微生物で調製した培養液に添加しても良い。二段培養とはある微生物の培養上清を用いて別の微生物を培養する方法を言う。
添加する非メタノール資化性微生物は培地で増殖させたストック、あるいは培地で増殖させた後、遠心分離などで取り除き得られた沈殿菌体ペレットにメタノール資化性微生物培養上澄液を加えたストックのいずれも用いることができる。
【００１８】
添加する非メタノール資化性微生物の菌濃度範囲は、ＯＤ６１０ｎｍで０．００１から５が好ましい。この濃度範囲で非メタノール資化性微生物の添加量は、メタノール資化性微生物培養液の０．００１から1０％であり、添加後の非メタノール資化性微生物濁度がＯＤ６１０ｎｍにおいて０．００００１から０．５であるのが好ましい。この範囲とすることで、メタノール資化性微生物の増殖、目的化合物の生産に悪影響が少なく好ましい。
【００１９】
添加する非メタノール資化性微生物のＯＤ６１０ｎｍが０．００１未満であり、かつ添加量がメタノール資化性微生物培養液の０．００１％未満であっても特に問題ない。
添加する非メタノール資化性微生物のＯＤ６１０ｎｍが５以下で、かつ添加量がメタノール資化性微生物培養液の１０％以下とすることにより、添加微生物由来の不純物が増えることなく、また添加微生物の菌体量が増えることなく、遠心分離工程やタンパク質除去工程での目的化合物の収率が上がり、メタノール資化性微生物等の目的化合物を適切に生産することが出来る。
【００２０】
非メタノール資化性微生物を添加するタイミングは添加する微生物の濃度と量にもよるが、培養終了の１２時間前までに、好ましくは２４時間前までに添加すると、添加微生物が十分に増殖し、それに伴ってタンパク質などの有機物が消費されるため、よりタンパク質除去効果が高い。
溶液のＰＱＱ類の濃度は０．０１から３０ｇ／L, 好ましくは０．５から１０ｇ／Lである。この濃度範囲とすることで、析出することなく、良好な生産性を維持することが出来る。濃度が低い場合には培養液の濃縮をおこなって使用することができる。
培養液に含まれるタンパク質の濃度は培養状態によって変わるが、好ましくは０．０００１から１０ｇ／Ｌである。この濃度範囲であれば、不溶成分が生じることなく、配管が詰まることなく、好ましい。この範囲より低い場合は、他の方法で除去できる可能性が高い。
【００２１】
本発明での培養条件は一般的な微生物の培養条件が使用でき、０から５０℃、好ましくは１０から４０℃の範囲で培養すればよい。培養期間は適時決めることができる。一般的には１から４０日が培養期間である。
培養方法はバッチ式、連続式で培養できる。培養装置は特に制限がないが、気泡搭、攪拌方式、試験管、フラスコ等目的に合わせて選択すればよい。ｐＨは２から１１が使用でき、好ましくは５から８である。この範囲を外れると培養が困難である。
ｐＨ調整のために加える酸の種類は特に制限されないが、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸などが挙げられ、その中でも塩酸が好ましい。
ｐＨ調整のために加える塩基の種類は特に制限されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、アンモニア、炭酸アンモニウム、コリン、テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド等が使用できる。
培養に使用した微生物はリボソームＲＮＡの配列で同定可能であり、粗結晶等からも残留する塩基をＰＣＲで増幅することで特定できる。
【００２２】
さらにこれまで知られている一般的な処理でタンパク質等の不純物を除くことは可能である。培養状態でのタンパク質の量が減ることはこれらの後工程の負荷を下げ、カラムの長寿命や負荷量の増加を行えるようになることで低価格で製造できる。
前記のように処理された溶液に含まれるタンパク量は低く、その後の精製は一般的なカラムクロマトグラフィーや再結晶法で精製することができる。カラムクロマトグラフィーとしては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ （ジエチルアミノエチル系陰イオン交換樹脂−セファデックス 以下同様）（フアルマシア社、登録商標）Ａ−25カラムに吸着後、ＫＣｌ溶液で溶出する方法（M.Ameyama et al.,Agric.Biol.Chem.,第48巻、p.561〜565（1984））のようなイオン交換樹脂での精製が使用できる。さらにその後、また、塩化ナトリウムや塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムを使用する塩析による溶解度を下げる方法、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトニトリルのような貧溶媒を加えて結晶を析出させる方法が使用できる。または懸濁、もしくは溶液状態でｐＨを変えて溶解度を変えて析出させる方法も使用できる。
【００２３】
除去できる水溶性高分子としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のほかＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸類、グルコース、フルクトースを始めとした単糖類、スクロース、ラクトースなどの二糖類、ラフィノース、マルトトリオース、シクロデキストリンなどのオリゴ糖類、Ｎ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルムラミン酸などのアミノ糖類、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、セラミド、などの脂質、エタノール、ブタノール、グリセロールなどのアルコール類が挙げられる。
【００２４】
本発明で得られたＰＱＱ類は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。また、ＰＱＱは、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ群、ビタミンＣおよびビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω3脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例及び参考例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例及び参考例のみに限定されるものではない。
【００２６】
ピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱瓦斯化学製を使用した。また、特に断りがない限り、和光製試薬を使用した。
ＰＱＱ分析
装置： 島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−１０Ａ
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（５μｍ）、４．６×１５０ｍｍ Ｉ．Ｄ.
測定温度：４０℃
検出：２６０ｎｍにおける吸光度
溶離液：１２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／６．７Ｍ ＣＨ３ＯＨ
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ  
タンパク質分析
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法
Ｂｉｏ−ｒａｄ社Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を使用し５９５ｎｍ吸光度を測定し、その値からタンパク含量を決定した。なお、検量線はγ−グロブリンの希釈系列液で作成した。
吸光度の測定はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＡＲＶＯ  Ｘ３を用いた。
タンパク質除去率
菌接種前のＰＱＱ含有メタノール資化性微生物培養上澄液に含まれるタンパク質濃度と、菌接種後の任意の時間における培養上澄液中のタンパク質濃度をそれぞれＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定し、その濃度の差を菌接種前のタンパク質濃度で除した値をタンパク質除去率とした。
培養液濁度測定（ＯＤ）
光路長１ｃｍの樹脂性セルに、イオン交換水で適当に希釈した培養液を適量入れ、６１０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。これをＯＤ６１０ｎｍとする。希釈倍率は培養液の濃度によるが、ＯＤ６１０ｎｍ＝０．１から０．４の範囲に収まるように希釈した。分光光度計はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＧＥＮＥＳＹＳ２０を用いた。
ＰＱＱ含有メタノール資化性菌培養上澄液
ハイホミクロビウム  エスピーを用いて、特許文献１３と同様の方法で３Ｌジャーで培養し、その培養液を遠心分離して菌体を取り除いた上澄液を用いた。
培養液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
３種類の非メタノール資化性菌をＰＱＱ含有メタノール資化性菌培養上澄液に植菌し遠心分離で取り除いた培養上澄液とサンプルバッファを１：１で混合し、９５℃で５分間加熱処理した。ただちに冷却し、垂直型ミニゲル電気泳動装置（ＴＥＦＣＯ社、ＴＣ−８０８）にゲル濃度１２％のプレキャストゲル（ＴＥＦＣＯ社、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ）をセットしてサンプルを各ウェルに１０μｌずつロードした。
【００２７】
参考例１  微生物準備
新潟市北区の海辺で採取した微生物３種をスラント化し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析を実施し、同定した。使用したプライマーは以下の表１に示す。本プライマーを用いたＰＣＲの結果得られた配列、ＢＬＡＳＴ検索結果および最も高い相同性を示した種とその相同率を表２に示す。同定したこれらの微生物を以下ステノトロホモナス  エスピー、バークホルデリア  エスピー、クリセオバクテリウム  エスピーと記す。
【表１】
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【表２】
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ＬＢ培地を３０ｍｌの試験管に５ｍｌ入れ、ステノトロホモナス エスピー、バークホルデリア エスピー、クリセオバクテリウム エスピーの３種類の非メタノール資化性微生物をそれぞれ接種後、３０℃で２日間、２１０ｒｐｍにて振とう培養した。この培養液を１５０００ｒｐｍで３分間遠心して菌体を沈降させ、液を取り除いた後、メタノール資化性菌の一種ハイホミクロビウム属微生物の培養液であるＰＱＱ含有メタノール資化性菌培養上澄液に再懸濁し、等量のＤＭＳＯを加えて−８０℃で冷凍保存した。
【００２８】
比較例１  酸を用いたタンパク質除去方法
メタノール資化性菌の一種ハイホミクロビウム属微生物の培養液であるＰＱＱ含有メタノール資化性菌培養上澄液に硫酸を加えｐＨを４に調整して１０〜３０℃で１日保存し、析出物を取り除くことによって、液中のタンパク質を９０％取り除くことができた。
【００２９】
実施例１  １種類のメタノール資化性微生物と３種類の非メタノール資化性微生物の共培養
バークホルデリア エスピー、ステノトロホモナス エスピー、クリセオバクテリウム エスピーの３種について、濁度ＯＤ６１０が０．５〜２．０の参考例１のＤＭＳＯストックと、メタノール資化性微生物であるハイホミクロビウム属細菌を合わせて３０ｍｌ試験管に入れたＰＱＱ含有メタノール資化性微生物培養液１ｍｌに４種同時にそれぞれ２０μＬずつ接種した。これを３０℃、３００ｒｐｍで９４時間振とう培養した。
タンパク濃度  ０．７３ｇ／Ｌ      
ＰＱＱ回収率  ９７％      
でタンパク質の４９％が除去できたことに加え、ＰＱＱ濃度の減少もなかった。
【００３０】
実施例２  ＰＱＱ生産メタノール資化性微生物の培養液に３種類の非メタノール資化性微生物を添加した培養
実施例１と同様に、参考例１で準備したバークホルデリア エスピー、ステノトロホモナス エスピー、クリセオバクテリウム エスピーの３種類の非メタノール資化性微生物を、メタノール資化性微生物であるハイホミクロビウム属細菌の培養液１ｍｌを入れた３０ｍｌ試験管にそれぞれ２０μｌずつ接種した。これを実施例１の条件で培養を行った。
タンパク濃度  ０．６５ｇ／Ｌ
ＰＱＱ回収率  ９６％
でタンパク質の５５％が除去できたことに加え、ＰＱＱ濃度の減少もなかった。
【００３１】
実施例３  ３種類の非メタノール資化性菌を接種した３Ｌジャーでの培養
特許文献１３と同様にＰＱＱを生産するメタノール資化性菌であるハイホミクロビウム属微生物を丸菱バイオエンジ  ３Ｌジャー  Ｂｉｏｎｅｅｒ  を用いて培養液量１．５Ｌにて培養した。培養開始後、培養液中ＰＱＱ濃度が十分に高くなった時点で、参考例１のバークホルデリア エスピー、ステノトロホモナス エスピー、クリセオバクテリウム エスピーの３種類の非メタノール資化性微生物を植菌した。植菌後１日１回サンプリングし、約９０時間培養を継続した後停止した。その間のタンパク質濃度およびＰＱＱ濃度の推移を下の表３に示す。３種の菌を植菌した時点を０時間とした。
【表３】
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【００３２】
実施例４  培養液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例３のジャー培養の培養上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。培養上澄液とサンプルバッファを１：１で混合し、９５℃で５分間加熱処理した。ただちに冷却し、垂直型ミニゲル電気泳動装置（ＴＥＦＣＯ社、ＴＣ−８０８）にゲル濃度１２％のプレキャストゲル（ＴＥＦＣＯ社、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ）をセットしてサンプルを各ウェルに１０μｌずつロードした。マーカーはＧＥヘルスケア  ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔを使用し、４μlをウェルにロードした。３種の非メタノール資化性微生物を添加した時点を０時間とした。図１のように４９時間後には分子量６６ｋＤａ付近に存在していたタンパク質のバンドはほぼ消失しており、全体のタンパク質濃度が大きく低下しており、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法の結果と一致することを確認した。
【００３３】
実施例５  １種のみを接種したジャー培養
非メタノール資化性微生物のクリセオバクテリウム  エスピーの参考例１のストックをＰＱＱ生産菌培養途中の培養液に植菌した。クリセオバクテリウム  エスピーを接種した時点を０時間とし、ＰＱＱ生産量とタンパク質濃度の経時変化を下の表４に示す。同時に、クリセオバクテリウム  エスピーを植菌せずにＰＱＱ生産菌のみを同じ条件で培養し、コントロールとした。
【表４】
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【００３４】
実施例１，２，３，５より、２種類以上の菌の共培養において、非メタノール資化性細菌はメタノール資化性細菌が菌体外に排出あるいは菌体が破壊されたことで培地中に放出されたタンパク質・ペプチド類などの有機物を炭素源として分解し吸収している可能性が高いと考えられる。加えて、非メタノール資化性微生物は、メタノール資化性微生物のメタノール資化を阻害せず、その生育や目的生産物の合成にも悪影響を与えない。本発明はＰＱＱ類の生産だけでなく、広くメタノール資化性微生物の培養生成物の発酵生産における非常に優れたタンパク質除去方法であるといえる。また、比較例１の酸を用いたタンパク質除去方法と比較して遜色ないタンパク質除去率であることから、プロセスの削減、設備コストの削減に寄与する画期的な技術であると考えられる。工業的にＰＱＱを生産する場合において、ＰＱＱ類と反応してその濃度を下げるタンパク質やペプチドを分解し吸収する細菌との共培養は有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により簡便なメタノール資化性微生物由来有用化合物の製造方法を提供することができる。また高品質の目的化合物も提供でき、食品、医薬品、化粧品の用途に広く使用することが可能である。特に、本発明はＰＱＱ類を簡便に製造することができ、得られるＰＱＱ類は純度が高く、医薬や機能性食品の有効成分として好適に使用することができる。
【図１】
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