(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の13C-MR検査に用いるための、モノカルボン酸の過分極13Cエステルまたは(C1-C7)ジカルボン酸の過分極13Cジエステルを含む画像化剤であって、該検査において該エステルまたはジエステルのカルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極一次代謝産物のシグナルが検出される、画像化剤。
【請求項２】
該エステルが(C1-C7)モノカルボン酸のエステルである請求項１記載の画像化剤。
【請求項３】
該エステルまたはジエステルがエチルエステルまたはジエチルエステルである請求項１または２に記載の画像化剤。
【請求項４】
該エステルがエチルアセトアセテートである請求項１または２に記載の画像化剤。
【請求項５】
該対応する一次過分極代謝産物がアセトアセテートアニオンである請求項４記載の画像化剤。
【請求項６】
腫瘍の13C-MR検査に用いるための、予めモノカルボン酸の過分極13Cエステルまたは(C1-C7)ジカルボン酸の過分極13Cジエステルを含む画像化剤が投与された患者から、該エステルまたはジエステルのカルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極一次代謝産物のシグナルを検出する方法。
【請求項７】
該過分極13Cエステルがモノカルボン酸のエステルである請求項６記載の方法。
【請求項８】
該エステルまたはジエステルがエチルエステルまたはジエチルエステルである請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
該過分極13Cエステルがエチルアセトアセテートである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該対応する一次過分極代謝産物がアセトアセテートアニオンである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍の13C-MR検査に用いるための、予めモノカルボン酸の過分極13Cエステルまたは(C1-C7)ジカルボン酸の過分極13Cジエステルを含む画像化剤が投与された患者から、該エステルまたはジエステルのカルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極一次代謝産物のシグナルを検出し、該シグナルを用いて代謝プロフィールを作製する方法。
【請求項１２】
以下の工程を含むＭＲＩシステムの作動方法：
ａ．  腫瘍に罹患しているかまたは罹患していることが疑われる対象であって、予めＭＲＩシステムに乗せられ、モノカルボン酸の過分極13Cエステルまたは(C1-C7)ジカルボン酸の過分極13Cジエステルが投与され、該エステル又はジエステルがカルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極代謝産物に代謝的に変換されている対象から該過分極代謝産物のＭＲシグナルを記録し；
ｂ．腫瘍を含むまたは腫瘍が疑われる着目した領域由来の第１ＭＲシグナルを該対象由来または該対象から得た試料由来の第２ＭＲシグナルと比較する。
【請求項１３】
さらに以下の工程を含む請求項１２記載の方法：
ａ．該第１シグナルと該第２シグナルの差を測定し；
ｂ．工程ａ）と基準値との差を比較して偏差値を得；
ｃ．偏差値が絶対値で予め決定した値より高いか否かを決定する。
【請求項１４】
さらに以下の工程を含む、該第2シグナルを非腫瘍組織で測定する請求項１３記載の方法：
d.偏差値が絶対値で予め決定した値より高い場合は可能性のある腫瘍疾患の指標とする。
【請求項１５】
該指標が腫瘍の局在位置を得るために用いられる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該第1シグナルが、カルボキシルエステラーゼ変換の過分極代謝産物のシグナルと投与したエステルまたはジエステルのシグナルの比である請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法を実施するMRIシステム。
【請求項１８】
腫瘍の存在の指標とするための請求項１７記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気共鳴(MR)の分野、特に過分極13Cエステルを含む診断剤を用いる13C-MR研究方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴画像法(MRI)は、患者および医療関係者がX線などの潜在的に有害な放射線に暴露することなく非侵襲性に患者の身体またはその部分の画像を得ることができるので、医師にとって特に魅力的なものになってきた技術である。その高品質な画像と良好な空間的、時間的解像度のため、MRIは、軟部組織および器官を画像化するのに好都合な画像化技術である。しかしながら、造影MRIは、通常、非常に小さな組織変化の検出を可能にするので、例えば小腫瘍または転移などの初期の組織変化を検出するための強力な手段である。
【０００３】
過分極分子を用いるMRIは先端技術である。WO 9935508は、高T1剤の過分極溶液をMRI造影剤として用いる患者のMR研究方法を開示している。用語「過分極」は、該薬剤中に存在するNMR活性核、すなわち、非ゼロ核スピンの核、好ましくは13Cまたは15N核の核分極を増強することにより、MRシグナル強度を100倍およびそれ以上増幅することを意味する。
過分極13Cおよび/または15N豊富化高T1剤を用いると、天然の多量の13Cおよび/または15Nを無視できるのでバックグラウンドシグナルからの干渉が実質的になく、画像のコントラストが好都合に高くなる。従来のMRI造影剤とこれら過分極高T1剤の主な違いは、前者はコントラストの変化が体内の水プロトンの緩和時間に影響を及ぼすことにより生じるが、後者の薬剤のクラスは、生じるシグナルが該薬剤からのみ生じるので非放射性トレーサーとみなすことができることである。過分極がMRプローブとして用いる核と不対電子間のマイクロ波支援伝達を介して得られるとき、該技術は動的核分極(DNP)という。
【０００４】
MR造影剤として用いるための種々の可能性のある高T1剤が非内因性および内因性化合物を含めてWO9935508に開示されている。後者の例として、代謝活性を画像化するのに好ましいと言われている正常代謝回路中の中間体が記載されている。代謝活性のin vivo画像化により、組織の代謝状態の情報を得ることができ、該情報は、例えば、健康組織と罹患組織を識別するのに用いることができる。
【０００５】
例えば、WO 2009077575は、13Cマレートおよび所望により13Cフマレートおよび/または13Cスクシネートシグナルを検出することによりクエン酸および尿素回路の両方を検討するための過分極13Cフマレートを含む画像化剤を用いる13C-MR検出方法を開示する。該方法の好ましい態様において得られる代謝プロフィールは、実験下で身体および身体の部分の代謝活性に関する情報をもたらし、該情報は、次の工程に、例えば疾患を同定するために用いることができる。腫瘍組織は通常、代謝活性の変化を特徴とするので、そのような疾患は好ましくは癌である。技術的局面として、分極する化合物がその溶液を凍結または冷却すると結晶する場合は、ガラス形成添加物を溶液に添加しなければならない。
【０００６】
動的核分極(DNP)は、最近、磁気共鳴分光法(MRS)に溶液で用いられており、感度の顕著な増加をもたらすことができる。この技術を用いて、種々の13C標識化合物の代謝を検討し、in vitroおよびin vivoの特異的酵素触媒反応の速度定数を推定している(Day SE、Kettunen MI、Gallagher FA、Hu DE、Lerche M、Wolber J、Golman K、Ardenkjaer-Larsen JH、Brindle KM. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat Med 2007；13:1382-1387；Gallagher FA、Kettunen MI、Hu DE、Jensen PR、Zandt RI、Karlsson M、Gisselsson A、Nelson SK、Witney TH、Bohndiek SE、Hansson G、Peitersen T、Lerche MH、Brindle KM. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2] fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2009；106:19801-19806)。さらに、いくつかの過分極13C標識基質については、in vivoで画像化する該基質とその代謝物両方の空間的分布に関して充分なシグナルがある。これら基質のあるものはすでに臨床的に比較的高濃度で投与されているので、この技術は臨床応用に結びつく可能性がある。今日までに最も研究された反応は、過分極[1-13C]ピルベートを含むものであり、該過分極標識を内因性ラクテートやアラニンと交換するか、または二酸化炭素に不可逆的に変換することができ、次いで、炭酸脱水酵素が触媒する反応でビカーボネートに変換される（Merritt ME、Harrison C、Storey C、Jeffrey FM、Sherry AD、Malloy CR. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc Natl Acad Sci USA 2007；104:19773-19777；Schroeder MA、Swietach P、Atherton HJ、Gallagher FA、Lee P、Radda GK、Clarke K、Tyler DJ. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate：a 13C and 31P MRS study. Cardiovasc Res 2010；86:82-91；Hu S、Chen AP、Zierhut ML、Bok R、Yen YF、Schroeder MA、Hurd RE、Nelson SJ、Kurhanewicz J、Vigneron DB. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol Imaging Biol 2009；11:399-407)。
【０００７】
過分極13Cピルベートまたは[13C,2H]ラクテートの使用も、特許文献、例えば以下の特許文献に開示されている。
【０００８】
EP2052273は、過分極13Cピルベートを含む画像化剤の投与を含む細胞死の検出方法を開示する。
US20100178249は、ラクテートおよび過分極13Cピルベートを含む画像化剤を開示する。
WO2011138269は、過分極[13C,2H]ラクテートを用いるLDH活性の測定を開示する。
US20110038802は、過分極13Cピルベートを含む画像化剤を用いるアラニントランスアミナーゼ活性の測定方法を開示する。
WO2008143519は、過分極13Cピルベートを含む画像化剤を用いる腫瘍の悪性度分類MR方法を開示する。ピルベートの変換は酸化的脱炭酸により生じる。
【０００９】
Hurd et al.の研究において、過分極エチル[1-13C]ピルベート(EP)の使用は、ピルベートの血液脳輸送が制限要因になりうる神経学的応用のためのMR代謝画像化における過分極[1-13C]ピルベートの代替アプローチとして提唱されている（Hurd RE、Yen Y、Mayer D、Chen A、Wilson D、Kohler S、Bok R、Vigneron D、Kurhanewicz J、Tropp J、Spielman D、Pfefferbaum A. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and ethyl [1-13C] pyruvate. Magn Reson Med. 2010；63(5)：1137-1143)。該研究の著者らは、脳への急速で優先的なエチル[1-13C]ピルベートの取り込みを証明し、神経変性疾患の研究における過分極EPの使用を示唆し、血液脳関門を横切る薬剤の急速で効率的な送達のためにエステルを用いる一般戦略も示唆する。
【００１０】
過分極エチルエステルの使用は、Brindle et al.の研究でも示されており(Clive Kennedy BW、Kettunen MI、Hu D、Bohndiek SE、Brindle KM. Detection of hyperpolarized 13C labelled ketone bodies in vivo. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 20（2012))、in vivoのケトン体代謝を検討するためにエチル[1,3-13C2]アセトアセテート(EAcAc)を非腫瘍および腫瘍保有マウスに注射している。EAcAcはアセトアセテートに急速に変換されることが示されているが、著者らは、該変換が非特異的エステラーゼ活性により血中で生じることを示唆し、したがって、in vivoのケトン代謝を検討するためのEAcAcの使用を無視している。
【００１１】
近年、他の内因性分子が過分極に成功しており、腫瘍のpHを過分極13C標識ビカーボネート注射後の13C標識ビカーボネートと二酸化炭素の相対濃度から測定し(Gallagher FA、Kettunen MI、Day SE、Hu DE、Ardenkjaer-Larsen JH、Zandt R、Jensen PR、Karlsson M、Golman K、Lerche MH、Brindle KM. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature 2008；453:940-943)；過分極マレートレベルの上昇が過分極13C標識フマレート注射後のin vivoの壊死腫瘍組織で証明され(Gallagher FA、Kettunen MI、Hu DE、Jensen PR、Zandt RI、Karlsson M、Gisselsson A、Nelson SK、Witney TH、Bohndiek SE、Hansson G、Peitersen T、Lerche MH、Brindle KM. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]humarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2009；106:19801-19806)；ミトコンドリア酵素グルタミナーゼが触媒するグルタミンのグルタメートへの代謝が過分極13C標識グルタミンをin vitroで細胞に投与後に観察され(Gallagher FA、Kettunen MI、Day SE、Lerche M、Brindle KM. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn Reson Med 2008；60:253-257)；過分極13C標識アセテートのアセチルCoAおよびアセチルカルニチンの器官特異的代謝がin vivoで観察され(Jensen PR、Peitersen T、Karlsson M、In’t Zandt R、Gisselsson A、Hansson G、Meier S、Lerche MH. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J Biol Chem 2009；284:36077-36082)、および分岐鎖アミノ酸の代謝が過分極13C標識α-ケトイソカプロエートを添加後の腫瘍で観察された(Karlsson M、Jensen PR、In't Zandt R、Gisselsson A、Hansson G、Duus JO、Meier S、Lerche MH. Imaging of branched chain amino acid metabolism in tumors with hyperpolarized 13C ketoisocaproate. Int J Cancer 2010；127:729-736.10)。
【００１２】
その病因論は分からないが、癌は分子疾患として現象学的によく特徴付けられている。異なる種類の癌は非常に異なる生化学形を持つかもしれないが、一般的分子的特徴を共有しうる。早期診断はしばしば治療が成功するチャンスを増加させるので、癌の早期診断は大きな関心が持たれ続けている。実際に、癌の早期診断と最適な治療の利用の保証は、生存の顕著な改善をもたらす。
【００１３】
癌の早期診断は、癌における変化を早期に検出することができる、種々のタイプの癌細胞が共有する一般的分子的特徴を利用して達成することができよう。
【００１４】
カルボキシルエステラーゼ（CE、EC 3.1.1.1)は、酸およびアルコールにおけるエステルの化学変換を触媒する酵素のファミリーである。一般的反応式を上記に示す。
【化１】
0006507101.tif 000002
【００１５】
カルボキシルエステラーゼは哺乳類細胞に遍在性に発現する。多くのCEアイソフォームが、アミノ酸相同性に基づいて5スーパーファミリー(CE1〜5)に分類された。CE1酵素は、主に肝臓に局在するが、ほとんどの他の組織種にも発現する。ラット特異的CE1アイソフォームは、ラットおよびマウスの肝臓から血中に分泌され、このアイソザイムはヒトと比べて齧歯類で検出される高レベルの加水分解酵素活性と相関する(Yan、B. Dongfang Y.、Bullock、P.、Parkinson、A.、Rat serum carboxylesterases、1995、JBC、32（270)：19128-34；Rudakova、EV.、Botneva NP.、Makhaeva、GF. Comparative analysis of esterase activities of human、mouse and rat blood、2011、Bulletin of experimental biology and medicine、152(1)：73-75)。他の重要なアイソフォームはCE2ファミリーであり、これはヒト肝臓(CE1の約4分の1)およびほとんどの他の組織でもCE1より高度に発現する(Talvar、S. The expression of human carboxylesterases in normal tissues and cancer cell lines（2008)、Master thesis)。
【００１６】
カルボキシルエステラーゼの発現は、動物およびヒト組織の両方の癌で減少する。特に、肝臓癌細胞では正常肝細胞と比べてカルボキシルエステラーゼの発現の4倍の減少が測定された。アイソフォーム依存性に、該発現は、正常組織で対応する悪性組織より約1.5〜4倍高いことが報告された(Talvar、2008)。多くの研究が癌細胞のカルボキシルエステラーゼについて報告している。
【００１７】
カルボキシルエステラーゼの発現は、ヒト癌細胞(HEPG2)で検出可能であり、正常ヒト肝臓（肝細胞）のカルボキシルエステラーゼの約3〜4分の1と報告された(Talvar、2008)。肝臓癌（HCC）患者由来の非腫瘍および腫瘍組織についての患者研究は、腫瘍組織中のカルボキシルエステラーゼの発現のほぼ3倍の減少を示した（Na、K. et al.、Human plasma carboxylesterase 1、a novel serologic biomarker candidate for hepatocellular carcinoma（2009)、Proteomics、9：3989-99)。
【００１８】
別の研究は、カルボキシルエステラーゼ活性が結腸癌異種移植片でマウスの対応する正常結腸組織と比べて有意に低いことを示した(Jansen et al.、CPT-11 in human colon cancer cell lines and xenografts：characterization of cellular sensitivity determinants、1997、Int. J. Cancer 70:335-40.)。
【００１９】
ある研究は、カルボキシルエステラーゼ活性が健康および癌肺組織のエステラーゼの発現と相関する肺癌患者について報告した。この研究では、該活性は該発現と良く相関することがわかり、健康組織で約1.5倍高いことを示す(Liewald F. et al、Intracellular pH、esterase activity and DNA measurements of human lung carcinomas by flow cytometry. 1990、Cytometry、11：341-48)。
【００２０】
WO2012102773は、酵素PMPMEアーゼ(ヒトカルボキシルエステラーゼ1)の活性を測定することによる癌、特に肺癌の診断および治療方法を開示する。該活性は、先の例において、基質の消費または生成物の生成の測定により酵素発現または酵素活性をアッセイすることにより生物試料において測定される。酵素アッセイはin vivoで行うことができると一般的に記載されているのみである。
【００２１】
US8198038は、ヒト血液を回収し、血漿中のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼ 1（hCE1)の存在を検出する工程を含む、健康なヒトとヒト肝臓癌（肝細胞癌；HCC)のヒトを区別するスクリーニング方法を開示する（ここで、hCE1タンパク質レベルがHCC患者の血漿で健常者の血漿より増加している）。
【００２２】
WO2013/006520は、過分極ジアルキル13Cスクシネートを投与し、各過分極代謝産物を検出することによる代謝画像法を開示する。該出願で考察しているように、13C MRSスペクトルにおける検出された代謝物のピークは、特にKrebsトリカルボン酸回路(「TCA回路」)の各代謝産物、すなわち、スクシネート、アスパルテート、マレート、およびフマレートに対応する。他方、ジアルキル13Cスクシネートに対するエステラーゼ反応の一次代謝産物(すなわち、モノアルキル13Cスクシネート)は、該出願に記載の方法では検出されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上記から、特に種々の癌細胞に共通のin vivoの特徴を検出することにより腫瘍組織と健康組織を特異的に区別する方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
（発明の要約）
今回、癌組織におけるカルボキシルエステラーゼが触媒する過分極13Cエステルのその対応する一次過分極代謝産物への変換が健康組織と異なるシグナルを生じることがわかった。したがって、該過分極13Cエステルの腫瘍組織と非腫瘍組織のシグナルの違いは癌の診断に有用かもしれない。
【００２５】
癌診断の文脈において、カルボキシルエステラーゼにより代謝された過分極13Cエステルのシグナルの違いは、癌の存在の検出、抗癌療法の効果の評価、および/または癌の時間発展の測定に有用かもしれない。
【００２６】
したがって、本発明のある局面は、腫瘍の13C-MR研究に用いるためのモノカルボン酸の13Cエステルまたは(C1-C7)ジカルボン酸の13Cジエステルに関する（ここで、該エステルのカルボキシルエステラーゼ変換の対応する一次過分極代謝産物のシグナルを検出する）。
【００２７】
好ましくは、該モノカルボン酸は(C1-C7)カルボン酸である。より好ましくは、モノまたはジカルボン酸は(C3-C6)カルボン酸、さらにより好ましくはC4カルボン酸である。
【００２８】
本発明の別の局面は、過分極13Cエステルを含む画像化剤を用いる腫瘍の13C-MR研究方法に関する（ここで、カルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極代謝産物のシグナルを検出する）。
【００２９】
過分極エステル分子において、13C炭素原子は、酸、アルコール、またはその両方の分子部分の部分でありうる。したがって、検出された代謝産物は、対応する酸、対応するアルコール、またはその両方でありうる。好ましくは、13C炭素原子は酸部分中にあり、より好ましくは該カルボキシル基の炭素は13C炭素原子である。該カルボン酸の特異的pKaに応じて、該酸は多かれ少なかれ解離することができ、したがって、生理学的pHで検出された生成物は、非解離酸形または対応するカルボキシレートアニオンでありうる。したがって、本明細書において用語「酸（または酸性)代謝物(または生成物)）は、特記しない限り、解離形と非解離形の両方を含むだろう。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、該過分極エステルは(C1-C4)アルキルエステル、より好ましくはエチルエステルである。
【００３１】
本発明の別の好ましい態様において、該過分極13Cエステルは、モノカルボン酸のエステル、好ましくは(C1-C4)アルキルエステル、より好ましくはエチルエステル、さらにより好ましくはエチルアセトアセテートである。検出された代謝物は、好ましくは各酸代謝物、より好ましくはカルボキシレートアニオン、さらにより好ましくはアセトアセテートアニオンである。
【００３２】
本発明のある態様において、着目した領域から得られた第1シグナルを第2シグナル(典型的には、基準試料由来のシグナル、例えば、対応する非腫瘍/健康組織由来のシグナル)と比較し；該比較は、腫瘍組織と非腫瘍組織の違いをみいだすのに有用であり、より具体的には腫瘍の局在位置を示すのに用いることができる。
【００３３】
さらに、腫瘍組織を含む着目した領域から得た第1シグナルをより初期に着目した同じ領域から得た第2シグナルと比較する場合は、該第1シグナルと該第2シグナルの比較は、時間発展のグレードに関する情報を提供することができ、これは腫瘍の悪性度、および/または該腫瘍を（免疫）薬理学療法および/または外科療法および/または放射線療法で治療したときは治療効果の指標にもなりうる。
【００３４】
好ましい態様において、該第1シグナルは、カルボキシルエステラーゼ変換の一次代謝産物のシグナルと着目した領域で検出された投与した基質（過分極13Cエステル)のシグナルの比である。
【００３５】
本発明の別の局面は、該シグナルを、13Cエステルの対応する過分極一次代謝産物への代謝的カルボキシルエステラーゼ変換に基づく、腫瘍の指標を検出または提供するのに有用な代謝プロフィールを得るのに用いる、上記13C-MR研究方法である。
【００３６】
本発明のある態様において、該代謝プロフィールを着目した領域（腫瘍組織の存在が分かっているかまたは疑われる)で測定し、基準の代謝プロフィール（例えば、対応する非腫瘍組織、典型的には腫瘍組織に極めて接近した健康組織に対して)と比較する。
【００３７】
本発明の別の局面は、以下の工程を含むMRIシステムの操作方法である：
a. MRIシステムに乗せ、過分極13Cジエステルで処置した腫瘍に罹患しているかまたは罹患していることが疑われる対象に、13C核において核スピン遷移を励起するように選んだ周波数を有する放射線を照射し、ここで、該過分極13Cジエステルはカルボキシルエステラーゼ変換の対応する過分極代謝産物に代謝的に変換される；
b.該励起した核からのMRシグナルを記録し；
c.該腫瘍または該疑われる腫瘍を含む着目した領域由来の第1MRシグナルを該対象由来または該対象から得た試料由来の第2MRシグナルと比較する。
【００３８】
本発明のある態様において、該第2シグナルは、該対象の非腫瘍組織由来のMRシグナルである。本発明の別の態様において、該第2シグナルは、該第1シグナルに対してより以前に着目した領域から得たMRシグナルである。
【００３９】
本発明の別の局面は、さらに以下の工程を含む上記方法である：
d.該第1シグナルと該第2シグナルの差を測定し；
e.工程d)と基準値との差を比較して偏差値を得；そして
f.偏差値が絶対値で予め決定した値より高いか否かを決定する。
【００４０】
本発明の別の局面は、さらに以下の工程を含む、該第2シグナルを非腫瘍組織で測定する上記方法である：
g. 偏差値が絶対値で予め決定した値より高い場合は腫瘍に罹患している可能性の指標とする。
【００４１】
本発明の別の局面は、工程a)〜f)を含むMRIシステムの上記操作方法であって、該第2シグナルが該第1シグナルに対してより早い時点で着目した領域で測定され、所望により該システムに保存される、さらに以下の工程を含む方法である：
g’.偏差値が絶対値で予め決定した値より高い場合は腫瘍変化の指標とする。
【００４２】
本発明の別の局面は、工程a)〜f)を含むMRIシステムの上記操作方法であって、該対象が抗腫瘍治療を受けており、該第2シグナルが該第1シグナルに対してより早い時点で着目した領域で測定され、所望により該システムに保存される、さらに以下の工程を含む方法である：
g”. 偏差値が絶対値で予め決定した値より高い場合は治療効果の指標とする。
【００４３】
好ましい態様において、該第2シグナルは治療開始時、またはその前または後に測定され、該第2シグナルの効果的な検出時は、患者の病状、治療の種類、疾患の重症度、およびそれに関する一般知識内の他のあらゆる臨床パラメーターに従って当業者が決定するであろう。該第2シグナルの測定時の例は、数日間、例えば1〜5日間、1週間またはそれ以上、1カ月間またはそれ以上である。
【００４４】
本発明は、腫瘍組織と非腫瘍組織の差の選択的グレードを用いて腫瘍を診断するためのMRI技術に用いることができる過分極13Cエステルを含む画像化剤を利用可能にする利点を提供する。
【００４５】
さらなる利点は、抗腫瘍療法を施しながら該療法の進展をモニターするために腫瘍組織中の過分極13CエステルのMRシグナルの種々の登録をする可能性で示される。
【００４６】
さらなる利点は、腫瘍組織中のカルボキシルエステラーゼ変換の対応する13C過分極代謝産物の形成の発現をモニターすることにより侵攻型の腫瘍を検出する可能性で示される。
【００４７】
本発明のこれらおよび他の局面および利点を図面および実施例により下記説明にて詳細に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】4つの異なる癌細胞株(ラット肝臓癌、Morris；ヒト肝臓癌、HepG2；ヒト前立腺癌、PC-3；ヒト乳癌、MCF-7)のNAを基質にして測定した全体的カルボキシルエステラーゼ活性。
【図２】A)ラットおよびヒト肝臓癌細胞(ラット肝臓癌、Morris；ヒト肝臓癌、HepG2)におけるエチル[1,3-13C2]アセトアセテートの細胞DNP変換。DNP実験は10ｘ106個の細胞を用いて行う。B)全Morris細胞におけるエチル[1,3-13C2]アセトアセテート注射からの代謝物[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンの増強。
【図３】A)ラットおよびヒト肝臓癌細胞(ラット肝臓癌、Morris；ヒト肝臓癌、HepG2)におけるエチル[1,3-13C2]アセトアセテートおよび[1-13C]ピルベートの相対的細胞DNP変換。DNP実験は10ｘ106個の細胞を用いて行う。B) 全Morris細胞における代謝物[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンおよび[1-13C]ラクテートアニオンの増強。アセトアセテートアニオンC1由来のシグナルのみの増強がみられる。
【図４】A)基質エチル[1,3-13C2]アセトアセテートの濃度増加に伴う強度。B) [1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンシグナルの対応する変化。C)基質 [1-13C]ピルベートの濃度増加に伴う強度を示す。D)[1-13C]ラクテートシグナルの対応する変化を示す。
【図５】A)[1-13C]ラクテートアニオンおよび[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンへのDNP変換（基質シグナルのパーセンテージ）(n=3)。B)ヒト全血中の[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンと比較した[1-13C]ラクテートアニオンの代謝物増強。アセトアセテートシグナルの減衰のみを検出することができるので、基質エステルの加水分解は、DNP分解手順時に生じたと思われる。
【図６】A)[1-13C]ラクテートアニオンおよび[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンへのDNP変換（基質シグナルのパーセンテージ）(n=3)。B)ラット全血中の[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンと比較した[1-13C]ラクテートアニオンの代謝物増強。
【図７】単離したブタ肝臓カルボキシルエステラーゼの5基質について測定した種々のエチルおよびジエチルエステル変換速度。比較に含めた基質は以下の通りである：EAA、エチルアセトアセテート；EA、エチルアセテート；EB、エチルブチレート；EPG、エチルピログルタメート；DES、ジエチルスクシネート。
【図８】冠状1H解剖学的MR画像、およびエチルアセトアセテートの1-13Cピークの13C CSIマップ。健康な肝臓では20秒間の捕捉時間中にエチルアセトアセテートはその過分極代謝産物にほぼ完全に変換されるため、腫瘍塊のみに顕著な量のエチルアセトアセテートがみられる。
【図９】腫瘍塊(実線)および健康肝臓組織(点線)のROIにおけるCSI個別スペクトルの平均として得られたエチル[1,3-13C2]アセトアセテート投与後の腫瘍および肝臓組織の13Cスペクトル。アセトアセテートアニオン(AA)およびエチルアセトアセテート(EAA)の1-13Cおよび3-13C由来のピークが明らかに認められる。
【図１０】腫瘍および健康肝臓ROIからのボクセル平均13C CSIスペクトルのEAAピークとAAピークの面積比。ウィスカーボックスプロットは、n＝4 Morris肝細胞癌保有ラットで得られたデータの分布を示す。2つの組織間のEAA/AA比に有意差が認められ、EAAの酵素的変換効率の違いを指摘する。
【００４９】
（本発明の詳細な説明）
本発明の範囲内において、用語MRIは、当該分野で通常意図される、例えばWO200977575およびその中に記載の参考文献に記載の磁気共鳴(MR)による画像化法（典型的には診断目的の）を意味する。
【００５０】
本発明の範囲内において、「画像化剤」および「造影剤」は、当該分野で通常意図される、例えばWO200977575およびその中に記載の参考文献に記載のごとく同義語として用いる。
本発明の範囲内において、用語「過分極」、「過分極」、または当該分野で通常意図される、例えばWO200977575およびその中に記載の参考文献に記載の高T1剤中に存在するNMR活性核の核分極を増強する同様の意味。
【００５１】
本発明の範囲内において、用語動的核分極(DNP)は、当該分野で通常意図される、例えばWO200977575およびその中に記載の参考文献に記載の磁気共鳴画像化法における技術である。
【００５２】
本発明の意味内において、用語「過分極」は、熱平衡より高い化合物の核スピン分極を意味する。本発明の範囲内において、「MRIシステム」は、特に診断目的でMR実験を行うのに有用な装置、機器、およびすべての機能および付属品を意味する。
【００５３】
本発明の範囲内において、本発明の過分極13Cエステルの酵素的変換を表す用語「一次過分極代謝産物」は、出発過分極エステル化合物の酵素的カルボキシルエステラーゼ変換により直接得られる代謝産物を意味する。従って、出発化合物がモノカルボン酸のエステルである場合は、カルボキシルエステラーゼ変換の一次代謝産物は、該エステルを形成するジカルボン酸およびアルコールの各モノエステルである。
【００５４】
過分極13Cエステルは、例えば、WO9935508、特にWO2011124672に記載の既知の方法である動的核分極(DNP)により製造することができる。
【００５５】
カルボキシルエステラーゼアイソフォームの活性は基質依存性が高い。一般的に、酸基より小さなアルコール基を有する基質はカルボキシルエステラーゼアイソフォームCE1により高い親和性を有することが報告されており、酸基より大きなアルコール基を有する基質の逆クラスは、CE2酵素に高い親和性を有するだろう(Imai、T. Human Carboxylesterase Isozymes：Catalytic Properties and Rational Drug Design、(2006) Drug Metab. Pharmacokinet 21(3)：173-85)。
【００５６】
本願のカルボン酸を表す場合、用語(C1-C7)、(C2-C6)、C4などは、アルキル鎖中に単結合や二重結合を含むことがある、種々に置換（例えば酸素、アミノ基などで）されることがある2〜7(またはそれぞれ3〜6または4など)個の炭素原子(カルボン酸のものを含む)を含む直鎖アルキル鎖、分岐鎖アルキル鎖、または環式アルキル鎖を有するカルボン酸を含む。
【００５７】
（C1-C7)、好ましくは(C3-C6)モノ-およびジ-カルボン酸のエチルエステルがCE1アイソフォームの好ましい基質である。
【００５８】
エチルモノエステル群内の適切な基質は、低分子量エチルモノエステルのクラス内の、特に(C2-C6)カルボン酸のエチルエステルである。特に好ましい基質は、アセトアセテートエチルエステルおよびブチレートエチルエステルである。
【００５９】
より好ましい基質はモノエステルエチルアセトアセテートである。エチルアセトアセテートは、CE1酵素が高度に発現する肝細胞中で有効に加水分解される利点がある。エチルアセトアセテートは、高溶解性、高分極、長T1、in vivoで加水分解産物を検出するための基質と生成物の充分な化学シフト分離などの良好な物理化学特性も提供する。
【００６０】
C1-C7ジカルボン酸のアルキル(好ましくはエチル)ジエステルを用いる場合は、1個のアルキル基のみがカルボキシルエステラーゼ(特にCE1)により加水分解され、酸性モノアルキルエステルおよび各アルコール(またはエタノール)を生じるだろう。例えば、7未満の炭素原子を有するジエステルに対するエステラーゼ活性が純粋なモノエステルだけを生じる(8またはそれ以上の炭素原子を有するジカルボン酸のエステルでは代謝物は二塩基酸である)ことを示す、Lobell et al.、「Enzyme preparation of Pure Alkalenedicarboxylic acids monoesters：chain-length dependence of porcine liver esterase（PLE)-catalysed hydrolyses」、J. Chem Soc. Perkin Trans. I、1993、1713-1714頁を参照のこと。ジエステルとモノエステルの化学シフトは、in vivoで基質から生成物を区別することができるのに十分である。好ましいジエステルは、対称ジエステル、すなわち、同じエステルを形成するアルキル基、例えばスクシネートジエチルエステルおよび2-オキソグルタレートジエチルエステルである。
【００６１】
一般的に、カルボキシルエステラーゼと反応すると、内因性に、すなわち、本発明の方法を受けた器官、組織、または細胞が独立してその中に発現または発生する一次代謝化合物をもたらすカルボン酸エステル基質を用いるのが好ましい。したがって、例えば以下のような各内因性酸およびアルコール分子に代謝されるモノカルボン酸のアルキルエステルを用いるのが好ましい：エチルアセトアセテート(エタノールとアセト酢酸に代謝される)、エチルブチレート(エタノールと酪酸)、エチルアセテート(エタノールと酢酸)、またはエチルピログルタメート(エタノールとピログルタミン酸)。
【００６２】
本発明においてカルボン酸のエステルを基質に用いるさらなる利点は、それらが天然分子であるためその細胞内への取り込みが主に細胞膜からの拡散により生じることである。したがって、それらは取り込み制限的でなく、その代謝酵素の活性のみが生じる過分極生成物の量に影響を及ぼす。これは、本発明において検出されるシグナルがカルボキシルエステラーゼ活性を高く表し、該基質をリアルタイムの分子造影剤として特に有用なものにすることを意味する。これに対し、モノカルボン酸（例えばピルビン酸）などの基質は、取り込み制限的であるという欠点がありうるので、その過分極生成物のシグナルは検出すべき特異酵素の活性を表さないかもしれない。
【００６３】
本発明の方法は、in vivoのカルボキシルエステラーゼ活性のリアルタイム代謝評価を可能にする非侵襲的方法である。該活性を表す画像を、該基質の静脈内注射後数秒間から数分間収集する。
【００６４】
本質的に、本発明のMRIシステムの操作方法は以下の工程を含む：a)励起した核からのMRシグナルを記録し、そしてb)腫瘍または疑われる腫瘍由来の第1MRシグナルを同じ対象またはその試料由来の第2MRシグナルと比較する。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、腫瘍由来の該第1シグナルは該第2MRシグナルより低い。
【００６６】
本発明のある態様において、工程d〜fに示すように、MRI装置は該第1シグナルおよび該第2シグナルを、互いに比較し、両シグナル間の差を計算し、その差を基準値と比較することにより処理することができ、上記工程gに示すように、この比較が絶対値で予め決定した値より高い値をもたらす場合、該MRI装置は可能性のある腫瘍疾患の指標を提供する。
【００６７】
腫瘍に罹患した対象の抗腫瘍療法に対する反応をモニターし(工程g’)または腫瘍の侵攻性を評価する（工程g”）ための該装置の使用が本発明のさらなる局面である。
【００６８】
該腫瘍の例には、肝臓、結腸、前立腺、および乳腺からなる群から選ばれる癌がある。最も好ましい腫瘍は肝臓腫瘍である。
【００６９】
本発明によれば、該エステルは、癌細胞の発癌性に重要な分子の標的化を意図する標的療法のマーカーとして用いることができる。
本発明の方法の実施において、第1シグナル(S1)、第2シグナル(S2)、および基準値(R)は、本発明の方法をどのように適用するかに依存する。
【００７０】
典型的には、比較データを得るために、本発明の方法で得られるMRシグナルは、基質として用いるエステルの対応するシグナルに対して正規化される。
【００７１】
本発明の方法を可能性のある腫瘍疾患の指標を得るために実施する場合は、該第1シグナルS1は、疑わしい癌を含む着目した領域で検出された、カルボキシルエステラーゼ変換の過分極代謝産物のMR線の積分と投与した基質(過分極13Cエステル)のMR線の積分との比であり、第2シグナルS2は、非腫瘍組織で計算された同様の比であり、基準値Rは、S2と等しいか、または過分極代謝産物（例えば酸性産物）のシグナルがない場合は、検討中の健康組織に検出され、Rは、同容量の基質シグナルで割ったノイズの標準偏差の3倍に設定する。好ましくは、MRシステムが外科的介入の評価に極めて重要な腫瘍の正確な画像化をもたらすことができるように、非腫瘍組織は腫瘍の周囲である。
【００７２】
第1シグナルと第2MRシグナルは、単一シグナルとして得るか、または着目した選択領域(S1)または非腫瘍組織(S2)で測定した（種々のボクセルからの）複数の各シグナルの平均値として計算することができる。
【００７３】
本発明のある態様において、該第1シグナルと該第2シグナルを単一シグナルとしてまたは複数のシグナルの平均値として直接比較し、腫瘍組織の目的とする情報を得ることができる。本発明の別の態様において、該シグナルを用いてパラメトリック画像を得、該比較を、該第1シグナルと該第2シグナルに対応する該画像の区域を比較することにより行うことができる。
【００７４】
本発明では、該第1シグナルと該第2シグナルの差を測定する。この差(S1-S2)は、本発明の異なる範囲に重要である。この差を基準値と比較し、該基準値との差の偏差(D)を表す値を得る：D＝(S1-S2)/R。
【００７５】
この偏差が絶対値で予め決定した値より高い値をもたらすと特定されたら、この偏差は、本発明の方法の目的に応じて、可能性のある腫瘍疾患、抗癌療法の効果、または腫瘍の侵攻性の指標となる。例えば、本発明の態様において、該予め決定した値は2に設定することができ、したがって、計算値「D」が2と等しいかそれより高ければ、これは、本発明の方法の目的に応じて、着目した領域に腫瘍が存在する可能性、抗癌療法の効果、または腫瘍の侵攻性の指標となりうる。好ましくは、2〜10の偏差値Dは、該存在、効果または侵攻性の指標となり得、偏差は、より好ましくは2〜20、さらにより好ましくは2〜40であり、偏差は、特に好ましくは2〜60、最大に好ましくは2〜80、最も好ましくは2〜100またはそれ以上である。
【００７６】
本発明のある態様において、該方法は、腫瘍に罹患しているかまたは罹患が疑われる対象に対して実施する。
【００７７】
本発明の別の態様において、上記方法は、抗癌治療を受けているかまたは受けた対象に対して実施し、基準値は、該治療中その前または後に決定した着目した領域のカルボキシルエステラーゼ変換の過分極代謝産物のシグナルである。上記のごとく、偏差Dが絶対値で予め決定した値より高いと計算された場合は（例えば2より高く、好ましくは上記範囲内）、これは、抗腫瘍治療の効果の指標となる。
【００７８】
ある態様において、本発明は、いわゆる「オーダーメイド医療（個別化医療）」の分野または同様の意図に用いることができる。上記のように、腫瘍療法は、同じタイプの腫瘍に同じ抗癌療法プロトコールを用いてもその効果の変動の影響を受ける。そのような変動は、患者の個々の反応が異なることによる。
【００７９】
本発明の方法の実施は、腫瘍療法の効果をモニタリング（フォローアップ）し、医師が該療法を患者に適合させるのを可能にする。
【００８０】
ヒト対象における本発明のエステルを用いる典型的代謝画像化方法は、磁場＞1Tで実施すべきである。注射した基質（エステル）と観察された代謝物（酸またはアルコール）のスペクトル分離は適用した磁場の強度に比例して変化するので、1.5Tまたはそれより高い磁場の強さが好ましい。MRスキャナーは、1Hに加えて13Cシグナルを検出することができるべきであり、常に必須ではないが、表面または内視鏡的高周波コイルは、特定器官でより良い結果を達成するのを可能にするだろう。例えば前立腺研究では、直腸内13Cは、標準全身共鳴装置に関する方法の感度を顕著に増加させると期待される。過分極シグナルは典型的には該エステルの縦緩和速度のほぼ3〜5倍の時間範囲で利用可能であるので、代謝MR法の総取得時間は3分間以下であろう。分光画像法シーケンス、例えばシングルボクセル分光法(SVS)または化学シフト画像法(CSI)を、基質由来のシグナルを過分極代謝産物由来のシグナルから分離するために用いる必要がある。高速分光画像法シーケンス、例えばEPSIは、該取得のために利用可能な時間が限定されているので好ましい。
【００８１】
該方法が充分な感度をもたらすには、特にin vivo適用において、注射時に少なくとも10％の分極を維持することができるエステル製剤と溶解/輸送プロトコールが好ましい。好ましくは、少なくとも約20％の分極が維持され、より好ましくは少なくとも約30％の分極が維持され、さらにより好ましくは少なくとも約60％の分極が維持され、最も好ましくは少なくとも約80％の分極が維持される。
【００８２】
本発明をさらに下記実施例で説明する。
【００８３】
（実施例）
特記しない限り、下記実施例で用いた化学薬品と試薬は、市販されているか、当該分野でよく知られている方法に従って製造することができる。
【実施例１】
【００８４】
癌細胞における一般カルボキシルエステラーゼ活性
一般カルボキシルエステラーゼ活性を、先に記載のごとく(Rudakova、2011)カルボキシルエステラーゼ基質1-ナフチルアセテート(NA)を用いて分光法により測定した。簡単には、超音波処理した細胞を150mMリン酸緩衝液(pH7.5)中の1mM基質とインキュベーションし、1-ナフトールの生成を322nmでモニターし、その吸光係数を定量した(2200M-1cm-1)。反応を30度で10分間生じさせる。アッセイが線形挙動を示すアッセイ条件が得られる基質濃度と温度を選ぶ。
【００８５】
下記は一般エステラーゼ検出アッセイの反応スキームである：
【化２】
0006507101.tif 000003
【００８６】
種々の起源の細胞(ラット肝臓癌、Morris；ヒト肝臓癌、HepG2；ヒト前立腺癌、PC-3；ヒト乳癌、MCF-7)を採取し、10ｘ106細胞/mlの濃度となるようリン酸緩衝液に再溶解した。試料の組成は以下の通りであった：923μlリン酸緩衝液(150mM pH7.3)＋77μl NA溶液(アセトン中13mM)＋100μl浮遊液中細胞。試料の吸光度を基質の代わりにアセトンを加えた基準試料と比較した。エステラーゼ活性を吸光係数ε322＝2200M-1cm-1を用いて計算した。
【００８７】
結果
NAはカルボキシルエステラーゼCE1とCE2の両方の基質であるので、本実施例は、一般カルボキシルエステラーゼ活性が予期したように肝細胞だけでなく前立腺細胞および乳腺細胞でもみられることを示す（図1）。カルボキシルエステラーゼ触媒反応においてエチルアセトアセテートを加水分解する肝臓癌細胞（ラットおよびヒト起源）と前立腺癌細胞の能力は非常に高く、測定された活性は最大95mU/106細胞であった。
【実施例２】
【００８８】
過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートで測定したカルボキシルエステラーゼ活性
2.a.過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートの作製
A) フィンランドラジカル、カルボン酸型(0.85mg、0.82μmol)をエチル[1,3-13C2]アセトアセテート(48μl、50.1mg、0.378mmol)に溶解した。該溶液に、ガドリニウム錯体[[α1,α4,α7-トリス[(フェニルメトキシ)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラアセテート(4-)]ガドリネート(1-)]水素(1.1mgの100μmol/g溶液)のDMSO溶液を加えた。ラジカルとガドリニウムの濃度は、それぞれ17mMおよび2.3mMであった。
B) 30μmolの溶液A)は過分極であった。試料を5mlリン酸緩衝液(40mM、pH7.3)に溶解した。溶解後のpHは7.3であった。
2.b. カルボキシルエステラーゼ活性を過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを用いてラット肝臓癌細胞(Morris7777)とヒト肝臓癌細胞(HepG2)で測定した。
【００８９】
A) 10ｘ106個の細胞(ラット肝臓癌細胞(Morris7777)またはヒト肝臓癌細胞(HEP-G2))を採取し、500mlリン酸緩衝液(PBS)で再溶解した。浮遊液の細胞を10mm NMRチューブに移し、接続管にて37℃の14.1T磁石中においた。
B) 2mlの溶解過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを総基質濃度3.5mMとなるよう接続ライン（デッドボリューム1ml）を介して注射した。一連の30度パルスを2秒毎に（合計56スキャン）得た。取得を過分極基質の注射直前に開始した。
【００９０】
結果
ラットおよびヒト肝臓癌中に生じた過分極1,3-13C-アセトアセテートアニオンのアカウントを図2に示す。この実験から全Morris7777および全HepG2細胞において過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートの加水分解から生じる生成物過分極[1,3-13C2]アセトアセテートアニオンの増強をたどる可能性があると認識することができる。
【実施例３】
【００９１】
肝臓癌細胞における過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートと過分極[1-13C]ピルベートの代謝の比較
本実験は、実験において各基質約3.5mMの濃度となる等量の化合物（30μmol）のエチル[1,3-13C2]アセトアセテートと[1-13C]-ピルビン酸の共分極で行う。エチル[1,3-13C2]アセトアセテートのDNP調製は実施例2.a.に記載のごとく行い、[1-13C]ピルベートのDNP調製はWO 2006/011809に記載のごとく行った。2つの基質は、基質を混合せずに共分極した。2.5μl NaOHを加えた5mlリン酸緩衝液(40mM pH7.3)に溶解して該ピルビン酸を中和し（ピルベートアニオン形に変換される）、次いで、基質混合物を浮遊液中の10ｘ106細胞に注射した。本実験は実施例2.b.に記載のごとく行った。データは第1スペクトルの基質シグナルで割った代謝物の曲線下面積で表し、100をかけて該単位を得た。DNP変換はパーセンテージで表す（図3）。
【００９２】
結果
2個の標識炭素原子の付加から生じる[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンの量は、ラット肝臓癌Morris細胞を用いる細胞実験のDNPにおける[1-13C]ラクテートアニオンに対するシグナルの約2倍である。該基質の分極レベルとT1緩和の違いは適用した実験条件下では小さいかまたはほとんど重要でないため、これは2つの基質の同様の代謝回転を示す。同様の比較は、ヒト肝臓癌細胞(HepG2)で行われた。代謝物[1-13C]ラクテートアニオンおよび[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンの過分極シグナルの相対量はこの例でより大きい（図3）。
【実施例４】
【００９３】
ラット癌細胞における過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートおよび過分極[1-13C]ピルベートの濃度依存性代謝
すべての実験は、実施例3に記載のごとく固体溶液を溶解および中和した後に各基質の約1、3.5、および10mMの実験濃度を生じる等量の化合物（約10、30、および90μmol)のエチル[1,3-13C2]アセトアセテートおよび[1-13C]-ピルビン酸の共分極で行った。すべての実験で10ｘ106細胞を用いた。実施例2.bの実験設定を用いた。データは基質または代謝物シグナルの最大ピーク強度で示す。
【００９４】
結果
図4は、増加する濃度のエチルアセトアセテート（EAA)およびピルベート由来の対応するより高い基質シグナルを示す。同様に、代謝物([1,3-13C2]-アセトアセテートアニオン(AA)および[1-13C]ラクテートアニオン)の測定量の得られた変化が基質濃度の増加に伴ってみられる。エチルアセトアセテート由来の代謝物シグナルは、基質濃度の増加に伴ってほぼ定量的に増加する。一方、ラクテートシグナルは3mM〜10mMで変化がなく、ピルベートが基質の時は取り込み制限または細胞代謝制限を示唆する。
【実施例５】
【００９５】
ラットおよびヒト血液における過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートと過分極[1-13C]ピルベートの代謝の比較
すべての実験は、実施例3に記載のごとく固体溶液を溶解および中和後、実験において各基質の約5mMの濃度をもたらす等量の化合物（90μmol）のエチル[1,3-13C2]アセトアセテートおよび[1-13C]ピルベートの共分極で行った。すべての実験において、2.5mlヒト血液または2.5mlラット血液を用いた。実験2.bからの実験設定を適用した。データは、第1スペクトルの基質シグナルで割った代謝物の曲線下面積で表し、100をかけて該単位を得た。DNP変換はパーセンテージで表す。
【００９６】
結果
図5および6においてヒト（図5）およびラット（図6）全血の乳酸脱水素酵素（LDH)活性をカルボキシルエステラーゼ活性と比較する。
これらの実験に適用した実験条件下ではヒト全血中のエチルアセトアセテート由来の代謝物シグナルの増強は測定されなかったが、ラット血液中でエチルアセトアセテートの変換がみられる。ラクテートの増強は、ラットおよびヒト全血で共に顕著であり、両マトリックス中でエチルアセトアセテートの変換より高い。2つの異なる実験における細胞サイズと細胞量の違いにより血液と癌細胞における相対変換を定量的に比較することはできない。カルボキシルエステラーゼは、ラット血液中に低量みられ、ヒト血液でさらに低量みられるかもしれないが、組織の測定した代謝物シグナルへの血液由来の代謝物シグナルの混入はわずかであり、すべての例で、[1-13C]ピルベートを基質として用いる場合より問題ではない。
【実施例６】
【００９７】
種々のエチルエステルに対するカルボキシルエステラーゼ活性の比較
本実験は、市販のブタ肝臓由来CE1を用いて行った。基質として用いたエチルエステルは、エチルアセトアセテート（EAA)；エチルアセテート(EA)；エチルブチレート(EB)；エチルピログルタメート（EPG)；エチルブチレート(EP)；ジエチルスクシネート（DES)である。該基質の個々の試料をすべて以下のように作製した：26μmolをエッペンドルフチューブ中で計量した。550μl重水素化リン酸緩衝液(200mM、pH7.5)を加え、基質を回転混合により溶液とした。該溶液を5mm NMRチューブに移し、37℃の分光計に挿入した。基準実験値を酵素を含まない基質溶液について得、次いで、10μlのエステラーゼストック溶液(重水素化リン酸緩衝液中37U/ml)をチューブの上部に加えた。試料を混合し、分光計に戻した。一連の熱1D 1H NMR実験値を5分間ごとに60分間記録した。データを分析し、第1スペクトルの基質シグナルのピーク強度に合わせて調整した生成物のピーク強度で表した。
【００９８】
結果
検討したエステルはすべて代謝回転速度が非常に異なるCE1の基質であった（図7）。全体で最も速く変換された基質はジエチルスクシネートであり、エチルブチレートおよびエチルアセトアセテートよりほぼ2倍速く変換され、エチルアセテートより10倍速く変換された。ジエチルスクシネートにおいて該エステル基の1つだけが加水分解され、該モノエステルはCE1の基質ではない。ピログルタメートのエチルエステルの変換はほとんど検出できず、エチルピルベートでは変換は全く測定できなかった。
【実施例７】
【００９９】
Morris7777腫瘍を移植したラット肝臓におけるin vivoで過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを用いて測定したカルボキシルエステラーゼ活性
麻酔した4匹のBuffaloラットの肝臓左葉の肝臓被膜下に0.2mLのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に浮遊した106個のMcA-RH7777細胞を注射した。実施例2.aの記載に従って作製した0.24mmolのエチル[1,3-13C2]アセトアセテート試料を過分極した。試料をEDTA 100mg/lを添加した5ml TRIS緩衝液(40mM、pH7)に溶解した。溶解後のpHは7.5であった。
【０１００】
各動物に対し、2.8mlの量の溶解過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを動物の尾静脈に取り付けたカテーテル（デッドボリューム0.3ml)から約0.25mL/sの注射速度で静脈内注射し、総投与用量を0.4mmol/kgとした。化学シフト画像法(CSI)マップを、ラットの腹部領域の約8mm冠状切片について得た。面内視野を40 x 55 mm2に設定し、対応するマトリックスサイズは14x14であった。残りの取得パラメーターは以下の通りである：RFフリップ角＝5°、反復時間＝105ms。取得は、エチル[1,3-13C2]アセトアセテートの注射終了時に開始し、20秒後に終了した。
【０１０１】
結果
図8において、典型的なMorris肝細胞癌保有ラットにおけるエチルアセトアセテートの分布のCSIマップを報告する。エチルアセトアセテートは主として腫瘍塊に認められる。図9は、腫瘍塊および肝臓の着目した領域(ROI)について平均した対応する13Cスペクトルを示す。図10は、図9に示すボクセル平均スペクトルから計算した肝臓と腫瘍のエチルアセトアセテートとアセトアセテートアニオンのピーク面積比のデータ分布（4匹のラットの）を示す。
【０１０２】
すべての実験結果は、癌組織に比べて正常肝細胞でエチル[1,3-13C2]アセトアセテートの変換がより速いことを示す。正常組織と罹患組織の代謝活性の差の存在は、過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを投与後にCSIを取得することにより肝細胞癌ラットモデル中の腫瘍塊の診断を可能にする。
【実施例８】
【０１０３】
健康肝臓および肝臓癌におけるエチル[1,3-13C2]アセトアセテートの変換を示すin vivo 13CMRSデータ
106個のMcA-RH7777細胞を0.2mLのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に浮遊させ、麻酔したBuffaloラットの肝臓の左葉の肝臓被膜下に注射した。実施例2aの記載に従って作製した0.24mmolのエチル[1,3-13C2]アセトアセテート試料を過分極させた。試料をEDTA 100mg/lを加えた5ml TRIS緩衝液(40mM、pH7)に溶解した。溶解後のpHは7.5であった。
【０１０４】
2.8mlの量の溶解過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートを、動物の尾静脈に取り付けたカテーテル（デッドボリューム0.3ml)から約0.25mL/sの注射速度で静脈内注射し、総投与用量を0.4mmol/kg、基質濃度を48mMとする。
【０１０５】
合計8匹の動物を試験に用いた。4匹のラットに腫瘍を移植し（すなわち移植群）、残りの動物をコントロールに用い（すなわち肝臓群）、同じ系統の健康組織と罹患組織の比較を行った。注射したエチル[1,3-13C2]アセトアセテートの代謝的運命、次いで局所的分光法シーケンスにより、腫瘍組織または健康肝臓組織の選択的取得を可能にした。取得は過分極基質の注射直前に開始し、3sの速度でサンプリングした一連の64時間領域点を含む。適用したフリップ角は10度に等しかった。
【０１０６】
結果
過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートは健康肝細胞と罹患肝細胞の両方に取り込まれ、DNP実験の時間尺度でその過分極代謝物である[1,3-13C2]-アセトアセテートアニオンに変換される。過分極基質のシグナルは減衰するが、その過分極代謝産物のシグナルは過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテートのその代謝物への部分的変換により増大し、最終的にそのT1緩和速度に応じて減衰する。
【０１０７】
過分極基質(エチル[1,3-13C2]アセトアセテート)シグナルのより速やかな減少は、癌組織に対する健康肝臓で観察された代謝物のシグナルのより高い上昇率(典型的には＞2)と共に、疾患組織に対する正常肝臓組織におけるより高い変換率およびより高いエステラーゼ活性を示す。したがって、健康組織と罹患組織の代謝活性の差の存在を、過分極エチル[1,3-13C2]アセトアセテート投与後の局所的動的13C分光法により強調することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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