(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）ＲＭ３１株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１０５）。
【請求項２】
請求項１に記載のシュードノカルディアＲＭ３１株を含むことを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤。
【請求項３】
請求項２に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項４】
塩分の存在下で行う請求項３に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項５】
前記環状エーテル構造を有する有機化合物がジオキサン類である請求項３又は４に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項６】
請求項２に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする廃水の処理方法。
【請求項７】
前記廃水が塩分を含む請求項６に記載の廃水の処理方法。
【請求項８】
請求項２に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備える廃水の処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物とその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１,４−ジオキサン等の環状エーテル構造を有する有機化合物は、各種工業において主に抽出、反応溶剤、塩素系溶剤の安定剤の製造に使用されている。しかしながら、水に対する高い親和性と揮発性の低さから、環境での残留性が高い。また、１,４−ジオキサンについては、人体への発ガン性が指摘されており、国内では平成２１年に水質環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）が設けられている。
【０００３】
この環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水は、一般的な廃水微生物処理法では除去することが難しく、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解可能な新規微生物の探索が進められている。
【０００４】
特許文献１には、１，４−ジオキサン等のジオキサン環構造を有する化合物（以下、ジオキサン類と呼ぶ）を分解可能な新規微生物として、リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）ＥＰ１０株（ＦＥＲＭ−ＡＰ−２１７７１）が開示されている。この微生物は、１０％以下の塩分存在下でも増殖可能であり、ジオキサン類を分解可能であることが記載されている。
【０００５】
非特許文献１には、１，４−ジオキサンの分解可能な新規微生物として、シュードノカルディア・ジオキサニヴォランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）Ｄ１７株が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２５２７７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】山本哲史他、「１，４−ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究」、大成建設技術センター報、第４６号（２０１３）、５３−１〜５３−４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、例えば、塩分が高濃度であるなど過酷な環境下において、より環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物が求められている。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する放線菌が、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明は、以下の態様を含む。
（１）シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）ＲＭ３１株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１０５）。
（２）（１）に記載のシュードノカルディアＲＭ３１株を含むことを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤。
（３）（２）に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
（４）塩分の存在下で行う（３）に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
（５）前記環状エーテル構造を有する有機化合物がジオキサン類である（３）又は（４）に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
（６）（２）に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする廃水の処理方法。
（７）前記廃水が塩分を含む（６）に記載の廃水の処理方法。
（８）（２）に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備える廃水の処理装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】シュードノカルディアＲＭ３１株の顕微鏡写真である。
【図２】シュードノカルディアＲＭ３１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と近縁放線菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
【図３】実施例１において、環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌の集菌するために使用したパーコレーターと呼ばれる集菌装置の模式図である。
【図４】実施例１において、パーコレーターを用いた１６０日間の還流集積による１，４−ジオキサンの分解推移を示したグラフである。
【図５】実施例１において、成長の早い菌株Ｎｏ．１２、１７、２４、３１の４種について、１，４−ジオキサンの分解能の確認試験の結果を示したグラフである。
【図６】試験例１において、ＲＭ３１株による経時での１，４−ジオキサンの分解試験の結果を示したグラフである。
【図７】試験例２において、ＲＭ３１株による１,４−ジオキサン分解のｐＨによる影響の確認試験の結果を示したグラフである。
【図８】試験例３において、ＲＭ３１株による低濃度（１５０ｐｐｍ）の１,４−ジオキサン分解試験の結果を示したグラフである。
【図９】試験例４において、ＲＭ３１株による１,４−ジオキサン分解のＮａＣｌによる影響の確認試験の結果を示したグラフである。
【図１０】試験例５において、ＲＭ３１株による１，４−ジオキサン分解の温度による影響の確認試験の結果を示したグラフである。
【図１１】試験例６において、ＲＭ３１株による１，４−ジオキサン分解の培地濃度の影響の確認試験の結果を示したグラフである。
【図１２】試験例７において、ＲＭ３１株から抽出した粗酵素による１，４−ジオキサンの分解試験の結果を示したグラフである。
【図１３】試験例８において、ＲＭ３１株によるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の分解試験の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）ＲＭ３１株＞
一実施形態において、本発明は、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）ＲＭ３１株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１０５）を提供する。
【００１５】
本実施形態の微生物は、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に属し、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する。
シュードノカルディアは、放線菌門に属する真正細菌の一属である。
【００１６】
シュードノカルディアＲＭ３１株の分離精製は、以下の手順により行った。
即ち、沖縄県眞栄田美咲の海岸で採取された海水試料から、パーコレーターと呼ばれる集積装置（例えば、国際公開第００／０７８９２３号参照）を用いて、１５４日間還流集積を行い、１，４−ジオキサンの分解能を持つ微生物を単離した。これを、下記表１に組成を示す１，４−ジオキサンを含むＢＳＭ（Ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ  ｍｅｄｉｕｍ）寒天培地を用いて、２５℃で５日間培養し、菌株を確立した。形態観察その他からシュードノカルディア属の放線菌と同定し、ＲＭ３１株と名付けた。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
シュードノカルディアＲＭ３１株の微生物学的性質は以下の通りである。走査型電気顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影したシュードノカルディアＲＭ３１株の栄養型細胞（好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態の細胞）の顕微鏡写真を図１に示す。
【００１９】
（科学的性質）
塩分存在下で環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する。
【００２０】
（形態的性質）
（１）栄養型細胞は菌糸を形成して細長く増殖する。菌糸の太さは約１μｍである。
（２）気菌糸上に胞子連鎖を形成する。
【００２１】
（生殖様式）
（１）無性増殖、すなわち細胞分化の結果として無性胞子を形成する。
（２）菌糸の一部が断裂して均等な大きさの１列の細胞（分節胞子）の連鎖をつくり、やがて分離して、胞子の機能を持つ。
【００２２】
（生理学・生化学性状）
（１）培養液：海水や汽水及び海水塩を含む培養液で生育できる。
（２）生育温度域：２０℃以上３０℃未満（至適温度２５℃）。
（３）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜７．０（至適ｐＨ７．０）。
（４）栄養源：炭素源として、環状エーテル構造を有する有機化合物だけではなく、グルコースなどの易分解性の単糖でも生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
【００２３】
（分類学的性質）
シュードノカルディアＲＭ３１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。図２は、シュードノカルディアＲＭ３１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列と、近縁放線菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、シュードノカルディアＲＭ３１株は新規の放線菌株と判断した。
【００２４】
シュードノカルディアＲＭ３１株は、２０１５年８月２０日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定化で受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１０５として国内寄託されている。
【００２５】
（培地）
本実施形態において、シュードノカルディアＲＭ３１株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、シュードノカルディア属に属する放線菌が生育する条件であれば制限はないが、海水塩、海水、濃縮海水又は人工海水を含む培地が、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることから、特に好ましい。
例えば、このような培地として、上記表１に示した組成のＢＳＭ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製の「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｂａｃｔｏ」（牛肉エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ含有）等）等を挙げることができるが、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物の分解することから、上記表１に示した組成のＢＳＭ培地が特に好ましい。
【００２６】
（塩濃度）
本発明者らは、培地中に塩分を含むことにより、シュードノカルディアＲＭ３１株の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上することを見出した。よって、培地に最適濃度の塩を添加することで、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることができる。
本実施形態において、使用が可能な塩は、公知慣用の海水塩等を挙げることができる。海水塩としては、海水を蒸発乾固させて得られたものであっても、海水や海水の濃縮液を用いてもよいが、培地中に含まれる濃度を調節するためには、海水の固形分である海水塩を用いてもよい。
【００２７】
また、人工海水を用いてもよい。人工海水とは、海水の組成を模して人工的に調製された粉末や濃縮液を意味し、海水を必要とする生物の飼育や培養において、入手性、再現性、廉価性などの理由から天然海水の代用となるものである。また、市販の人工海水を用いてもよい。市販の人工海水とは、塩化ナトリウムを主成分として、様々な無機塩類やｐＨ調整剤などが含まれたものを意味し、用途により水道水や蒸留水で希釈することによって海水に近い成分となるものもある。
その他、上記の海水塩等でなくても、本発明の目的に適う培地として使用が可能な塩を調製して用いてもよい。
【００２８】
培地中の塩濃度は、０．５％以上５％以下が好ましく、２％以上３．５％以下がより好ましく、３．５％が特に好ましい。シュードノカルディアＲＭ３１株は海洋圏で生育する微生物であり、海水の塩濃度が３．５％であることから、上記範囲内において、増殖させることができ、さらに、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることができる。
【００２９】
（培養方法）
本実施形態において、シュードノカルディアＲＭ３１株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
【００３０】
培養におけるｐＨは、６．０〜７．０の中性付近で行うことができ、ｐＨ７．０であることが好ましい。
【００３１】
培養温度としては、２０℃以上３０℃未満で行うことができ、２５℃で行うことが好ましい。シュードノカルディアＲＭ３１株は海洋圏で生育する微生物であり、夏場でも水温が２４〜２８℃であることから、従来の放線菌よりも低温で培養することができ、さらに、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。また、培養温度が上記範囲内である場合、培養温度を調節するためにエネルギーを必要とせず、また、特別な設備も必要としない。
【００３２】
本実施形態の培養方法により、シュードノカルディアＲＭ３１株を培養すると、安定した増殖を示すばかりでなく、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上したシュードノカルディアＲＭ３１株が得られる。
【００３３】
＜環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤＞
一実施形態において、本発明は、上述のシュードノカルディアＲＭ３１株を含む環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を提供する。
【００３４】
本実施形態の分解剤によれば、塩類の存在下において、温和な条件で、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。
【００３５】
本実施形態において、シュードノカルディアＲＭ３１株の培養液をそのまま、又は水溶液に希釈して利用してもよい。また、培養液から、ろ過、遠心分離等の固液分離手段により回収し利用してもよい。さらに、凍結乾燥法等による乾燥状態で使用してもよい。
【００３６】
シュードノカルディアＲＭ３１株は適宜製剤化して分解剤として利用してもよい。例えば、シュードノカルディアＲＭ３１株を、珪藻土、タルク、活性炭、ゼオライト、カオリナイト等の多孔質物質と混合し、表面へ付着又は多孔質に吸着させて分解剤として利用することが挙げられる。
シュードノカルディアＲＭ３１株は、担体に固定化して分解剤してもよい。担体への固定化方法としては、例えば担体結合法、包括法、吸着法等が挙げられる。担体の材質は、有機又は無機のいずれのものでも構わない。分解剤の製造方法としては、例えば、公知の放線菌培地にオートクレーブ処理等の殺菌処理を施した担体を添加し、通常の培養方法で行えばよい。固定化した微生物はそのまま使用してもよい。また、遠心分離により回収して使用してもよい。また、凍結乾燥、真空乾燥等の処理により乾燥状態にして使用してもよい。
【００３７】
（環状エーテル構造を有する有機化合物）
シュードノカルディアＲＭ３１株が分解することが可能な環状エーテル構造を有する有機化合物は、特別な限定はなく、例えば、オキシラン、オキセタン、オキソラン（テトラヒドロフラン：ＴＨＦ）、オキサン（テトラヒドロピラン：ＴＨＰ）、ジオキサン又はオキセパン等の環状エーテル環構造を有する化合物等が挙げられる。これらの環状骨格を形成する炭素原子には少なくとも一つの置換基が結合した構造を有する化合物であってもよい。置換基としては、アルキル基、水酸基等が挙げられる。
中でも、環境負荷の観点から、ジオキサン類が好ましい。ジオキサン類の具体例としては、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、４−ジオキサン−２，３−ジオール、１，４−ジオキサンジメタノール等が挙げられる。
【００３８】
＜環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いた環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法を提供する。
【００３９】
本実施形態の分解方法によれば、塩類の存在下において、温和な条件で、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。これは、分解剤に含まれるシュードノカルディアＲＭ３１株が、上述の通り、塩分存在下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上するためである。
【００４０】
本実施形態の分解方法において、シュードノカルディアＲＭ３１株と環状エーテル構造を有する有機化合物を共存させることにより実施すればよい。共存とは、シュードノカルディアＲＭ３１株と化合物が接触することを意味する。例えば、分解対象化合物を含む水溶液中で好適な条件でシュードノカルディアＲＭ３１株を増殖させることにより実施する方法等が挙げられる。
【００４１】
本実施形態の分解方法において、環状エーテル構造を有する有機化合物とは、上述のものが挙げられる。中でも、環境負荷の観点から、ジオキサン類に好ましく適用される。
【００４２】
＜廃水の処理方法＞
一実施形態において、本発明は上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いた廃水の処理方法を提供する。
【００４３】
本実施形態の廃水の処理方法によれば、環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水を、温和な条件下で効率的に処理することができる。また、廃水は塩分を含んでいてもよい。これは、分解剤に含まれるシュードノカルディアＲＭ３１株が、上述の通り、塩分存在下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上するためである。
【００４４】
また、廃水には、環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を含んでいてもよい。この場合、シュードノカルディアＲＭ３１株を含む分解剤による、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解除去を行う前に、環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を除去する前処理を行えばよい。前処理方法としては、通常の生物処理方法や凝集処理方法等が挙げられ、これら複数の処理方法を組み合わせてもよい。また、前処理において、ｐＨの調整を行ってもよい。分解剤に含まれるシュードノカルディアＲＭ３１株は、ｐＨが中性付近で効率よく環状エーテル構造を有する有機化合物を分解するため、必要に応じてｐＨを調整してもよい。
【００４５】
本実施形態において、廃水の処理方法は、上述のシュードノカルディアＲＭ３１株の培養方法と同様の条件で行えばよい。ｐＨが中性付近であればよく、温度も２０℃以上３０℃であればよいため、温和な条件で廃水の処理を行うことができる。また、温度調節等が必要ないため、エネルギーの消費を抑えることができる。
【００４６】
＜廃水の処理装置＞
一実施形態において、本発明は上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備えた廃水の処理装置を提供する。
【００４７】
本実施形態の廃水の処理装置によれば、環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水を、温和な条件下で効率的に処理することができる。
【００４８】
環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽は、特別な限定はなく、従来の廃水の処理装置で用いられる生物処理槽を用いればよい。また生物処理槽の数は１つに限らない。複数の槽で構成されていてもよい。
【００４９】
さらに、廃水に含まれる環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を除去するための前処理槽を備えていてもよい。また、前処理槽には、廃水のｐＨを調節するために、酸（例えば、塩酸、硫酸等）及びアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）のうち少なくともいずれかのｐＨ調整剤を含む装置を備えていてもよい。その他、従来、廃水の処理を行うために必要とされる装置を備えていてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌の単離
（１）スクリーニング
沖縄県眞栄田美咲の海岸で採取された海水を試料とした。環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌を単離するために、パーコレーターと呼ばれる集菌装置（分解菌迅速集積装置、藤原製作所製）を用いた（図３参照）。
パーコレーターの原理としては、多孔質の炭化資材に微生物を閉じ込め、そこに唯一の炭素源を添加した液体培地を還流し続けることで、培地中の炭素源の濃度は減少していく。炭化資材中の微生物が増殖すると炭素源の減少速度は速くなり、炭化資材を砕いて抽出した液を寒天培地に塗布することで単離することができる。
【００５２】
まず、オートクレーブで滅菌処理したパーコレーター１０に、上記沖縄県でサンプリングした海水に１日漬けた炭化資材Ａ１３０（マングローブを炭にして直径２ｍｍ〜４ｍｍに砕いたもの）１を１０ｇ入れ、下記表２に示した組成のＢＳＭ液体培地２を還流液として２５０ｍＬ入れ、エアレーションポンプ３を用いて、還流を開始した。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
表２において、Ｖｉｔａｍｉｎ  ５ｍｉｘｔｕｒｅには、下記表３に示した成分が含まれる。また、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓには、下記表４に示した成分が含まれる。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
【表４】
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【００５７】
還流液中の１，４−ジオキサンの減少傾向を簡易的に追うために、初期濃度を１，０００ｐｐｍに調製し、１００ｐｐｍを切ったことを確認したら、その日の内に装置内の還流液を全て交換し、還流を再開して１,４−ジオキサンの減少傾向を追った。この操作を１６０日間繰り返し行った。結果を図４に示す。海水サンプルにおいて、１，４−ジオキサンの分解速度が安定した１５４日目で集積培養を停止し、菌が存在している炭化資材Ａ１３０を取り出した。
【００５８】
炭化資材Ａ１３０を砕き、リン酸バッファーで抽出した。次に、上記表２からＶｉｔａｍｉｎ  ５ｍｉｘｔｕｒｅとＴｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔを除いたＢＳＭ培地をベースにした寒天培地を作製した。リン酸バッファーの抽出液を作製した寒天培地に平板塗抹した。寒天培地には、３２個のコロニーが生えてきた。
【００５９】
（２）１，４−ジオキサンの分解能の確認試験
続いて、３２個のコロニーの内、特に成長の早い菌株Ｎｏ．１２、１７、２４、３１の４種について、１，４−ジオキサンの分解能の確認試験を行った。
分解確認試験は、１０ｃｍ程度のふた付きガラス管に１，０００ｐｐｍに調整したＢＳＭ液体培地を２ｍｌ入れた。続いて、それぞれ単離したコロニーを、白金耳を用いて入れ、４日間振とうした。その後１,４−ジオキサンの濃度をＨＰＬＣで測定した。測定条件は、親水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＩＬＩＣ）カラムを使用した。さらに、アセトニトリルと０．１％リン酸の比を、９５：５、６０：４０、９５：５と経時的に変え、濃度勾配を作り、１５分間測定した。結果を図５に示す。図５において、Ｆｉｒｓｔとは、菌体を入れてすぐの１，４−ジオキサン濃度を表す。また、コントロールとは、菌体を含まないＢＳＭ液体培地を用いて４日間振とうし、同様の試験を行った結果を表す。
【００６０】
図５から、Ｎｏ．３１の菌株について、１０００ｐｐｍ濃度の１,４−ジオキサンを約７０％分解する能力があることが明らかとなった。Ｎｏ．３１の菌株を１,４−ジオキサン分解菌ＲＭ３１株と命名した。
続いて、ＲＭ３１株について、様々な条件下でどのように分解に影響するか検討した。
また、ＲＭ３１株から１６Ｓ  ｒＲＮＡを分離増幅して、（株）テクノスルガ・ラボに同定を依頼したところ、その相同性からＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属の一種であることが明らかとなった。
【００６１】
［試験例１］ＲＭ３１株による経時での１，４−ジオキサン分解試験
２００ｍＬの三角フラスコに１,４−ジオキサンの濃度を１，０００ｐｐｍに調整したＢＳＭ液体培地を２０ｍＬ入れ、菌体量を全体の５％になるように添加した。フラスコはゴム栓とパラフィルムをして、２５℃、１５０ｒｐｍで振とうし、０、６、１０．５、２４、４８、７２、１２０時間ごとにサンプリングした。ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて、サンプル中の１,４−ジオキサンの濃度を測定した。結果を図６に示す。
【００６２】
図６から、４８時間で約４００ｐｐｍ程度の１,４−ジオキサンを分解したことが確かめられた。さらに、４８時間後は、１,４−ジオキサン濃度がほぼ横ばいとなり、分解活性が低下することが確かめられた。４８時間の内に、液体培地内の栄養をほとんど使い果たしたか、又は、酸素濃度の低下やｐＨ等、実験装置内の環境要因の変化が分解活性に大きく影響している可能性が示唆された。
【００６３】
［試験例２］ＲＭ３１株による１,４−ジオキサン分解のｐＨによる影響の確認試験
まずＢＳＭ培地を調製した。ＢＳＭ培地の初期ｐＨは７．５で中性を示した。１％ＨＣｌと１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、ＢＳＭ培地のｐＨを３〜１０まで段階的に調整し、その他の条件は試験例１と同様にして、２５℃、１５０ｒｐｍで５日間振とう培養した。ｐＨ調整直後（Ｆｉｒｓｔ）、１日後、５日後の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図７に示す。
【００６４】
図７から、ｐＨが低下するごとにＲＭ３１株の分解活性が低下していくことが明らかとなった。また、ＢＳＭ培地は白色に濁っている培地であるが、ｐＨが低下していくごとに無色透明に近づくことが明らかとなった。培養試験を行っている中で、ＲＭ３１株を添加した液体培地の濁度が、一度低下した後に再び増殖するという現象が確認された。これは、ＲＭ３１株が１,４−ジオキサンを分解することで二酸化炭素が実験装置内に増加し、それが液体培地に溶け込むことでｐＨが酸性に近づいたためと推察される。また、それに伴い、分解活性も低下し、４８時間以降の分解率の低下に繋がったと推察される。
【００６５】
［試験例３］ＲＭ３１株による低濃度（１５０ｐｐｍ）の１,４−ジオキサン分解試験
発見されている１,４−ジオキサン分解菌の中には、低濃度では活性が働かないものも存在する。ＲＭ３１株について、低濃度の条件で１,４−ジオキサンの分解能が作用されるかを確認するための試験を実施した。
１,４−ジオキサンの初期濃度を１５０ｐｐｍと低めに設定し、その他の条件は試験例１と同様の条件にして、１日間振とう培養した。試験終了後の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図８に示す。コントロールとして、ＲＭ３１株を含まないＢＳＭ液体培地についても同様の試験を実施した。また、Ｎ．Ｄとは、検出限界以下であることを意味する。
【００６６】
図８から、１,４−ジオキサンが低濃度の条件下でも、高濃度の時と比較して分解能を維持し、１,４−ジオキサンを分解することが確かめられた。また、コントロールでは、ほとんど１,４−ジオキサンが減少していないため、揮発による影響はないものと推察される。
【００６７】
［試験例４］ＲＭ３１株による１,４−ジオキサン分解のＮａＣｌによる影響の確認試験
ＢＳＭ培地は海水を模した培地であるため、塩分濃度が３％になるようにＮａＣｌが添加されている。１,４−ジオキサンは主に陸圏の地下水を中心に汚染している物質であるため、真水に近い状態での分解能を検討する必要がある。上記表２の組成からＮａＣｌを除外した培地を作製し、その他の条件は試験例１と同様の条件にして、２５℃、１５０ｒｐｍで２日間振とう培養した。培地調製直後、１日後、２日後の培地中の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図９に示す。コントロールとして、３％ＮａＣｌを含むＢＳＭ培地についても同様の試験を実施した。
【００６８】
図９から、３％ＮａＣｌが添加されているものと同様に、４８時間後で最も多く１，４−ジオキサンを分解した。ＮａＣｌを添加していないものでは、２００ｐｐｍ程度（全体の２５％程度）の１，４−ジオキサンを分解していることから、３％ＮａＣｌが添加されているものと比較して、活性がやや低下するが、十分に１，４−ジオキサンの分解能を有することが確かめられた。
【００６９】
［試験例５］ＲＭ３１株による１，４−ジオキサン分解の温度による影響の確認試験
環境要因として温度が分解能にどのように影響するかを調べるために、恒温槽の温度を２０℃と３０℃にそれぞれ設定し、その他の条件は試験例１と同様の条件にして、５日間振とう培養を行った。培地調製直後、１日後、２日後、５日後の培地中の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図１０に示す。２０℃での試験結果が（Ａ）であり、３０℃での試験結果が（Ｂ）である。コントロールとして、ＲＭ３１株を添加していないＢＳＭ培地についても同様の試験を実施した。
【００７０】
図１０（Ａ）及び（Ｂ）から、２０℃の方が３０℃よりも高効率で１,４−ジオキサンを分解することが確かめられた。
これは、採取した環境の水温が、夏の時期でも２４〜２８℃しかないため、３０℃では、１,４−ジオキサンの分解活性が失活してしまったものと推察される。２０℃でも十分に１,４−ジオキサンの分解をしているが、試験例１と比較すると、２５℃のほうが１,４−ジオキサンをより分解している。よって、ＲＭ３１株にとって、２５℃が最適な温度であると推察される。
また、コントロールにおいて、１,４−ジオキサンの量が減少しているのは、経時的に揮発したためであると推察される。
【００７１】
［試験例６］ＲＭ３１株による１，４−ジオキサン分解の培地濃度の影響の確認試験
表２の培地成分について、ＮａＣｌと１,４−ジオキサン以外の全ての試薬について、２倍の量を添加し、培地を調製した。その他の条件は試験例１と同様の条件にして、５日間振とう培養を行った。培地調製直後、１日後、２日後、５日後の培地中の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図１１に示す。コントロールとして、ＲＭ３１株を添加していないＢＳＭ培地についても同様の試験を実施した。
【００７２】
図１１から、ＮａＣｌ及び１,４−ジオキサン以外の窒素源を始めとする無機塩類の添加量を２倍にしても、１,４−ジオキサンを十分に分解できることが確かめられた。このことから、窒素源の量は１,４−ジオキサンの分解にあまり影響していないことが明らかとなった。よって、試験例１において分解速度が減少したのは、培地の栄養不足が原因ではなく、ｐＨの低下等、他の環境要因によるものであると推察される。
【００７３】
［試験例７］ＲＭ３１株から抽出した粗酵素による１，４−ジオキサンの分解試験
遠沈管にＲＭ３１株の入ったＢＳＭ培地を入れて遠心した。次に、上清を捨て、０．１Ｍ  リン酸バッファーを用いて３回程度洗浄した。続いて、海砂を添加してＲＭ３１株の菌体を破砕した。さらにそれを遠心し、上清を粗酵素液として回収した。１，４−ジオキサンの濃度を１，０００ｐｐｍに調整したＢＳＭ培地に上記回収した粗酵素液が１％（体積比）になるように添加し、２５℃、１５０ｒｐｍで３０分振とうした。培地中の１,４−ジオキサン濃度を、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図１２に示す。コントロールとして、０．１Ｍ  リン酸バッファーのみを添加したものについても同様の試験を実施した。
【００７４】
図１２から、試験例１等の菌体を用いた試験と比較して、短時間で１,４−ジオキサンの分解を確かめられた。実験装置は短時間での揮発の影響を受けにくいことから、ＲＭ３１株がこの酵素を内包している可能性が示唆された。
【００７５】
［試験例８］ＲＭ３１株によるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の分解試験
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は１,４−ジオキサンに構造が良く似ており、また、汚水等の水質汚染地域でもよく同時に検出されている有機物質である。テトラヒドロフラン又は１,４−ジオキサンを含むＢＳＭ培地で５日間生育させたＲＭ３１株を用いて、テトラヒドロフランの分解能を確認した。
まず、下記表３で示した組成のテトラヒドロフランの濃度を１，０００ｐｐｍになるようにＢＳＭ液体培地を調製した。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
続いて、その他の条件は、試験例１と同様の条件にして、テトラヒドロフランを含むＢＳＭ培地で生育させたＲＭ３１株（以下、ＴＨＦ−ＲＭ３１株と呼ぶ。）と、１,４−ジオキサンを含むＢＳＭ培地で生育させたＲＭ３１株（以下、１,４−ジオキサン−ＲＭ３１株と呼ぶ。）を添加し、５日間振とう培養を行った。培地調製直後、１日後、２日後、５日後の培地中のテトラヒドロフランを、ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて測定した。結果を図１３に示す。コントロールとして、いずれのＲＭ３１株も添加していないテトラヒドロフランを１，０００ｐｐｍ含むＢＳＭ培地を用いて、同様の試験を実施した。
【００７８】
図１３から、ＴＨＦ−ＲＭ３１株及び１,４−ジオキサン−ＲＭ３１株共にテトラヒドロフランの分解能を有することが確かめられた。このことから、テトラヒドロフランの分解において、１,４−ジオキサンを分解する酵素と同じ分解酵素（ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を用いた可能性が示唆された。また、両者を比較すると、ＴＨＦ−ＲＭ３１株の方が１０％以上テトラヒドロフランの分解能が高いことが明らかとなった。これは予めテトラヒドロフランを含む環境で生育したことで、テトラヒドロフランのエネルギー源への変換が効率よく行われたためであると推察される。
【００７９】
［試験例９］ＲＭ３１株とその他の１，４−ジオキサン分解菌との１，４−ジオキサン分解能の比較試験
シュードノカルディア・ジオキサニウォラン（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）Ｄ１７株を用いて、１００ｐｐｍの１，４−ジオキサンを含む下記表４に示した組成の無機塩培地に菌体量を全体の５％になるように添加した。続いて、２８℃、１２０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。
【００８０】
【表６】
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【００８１】
ＨＰＬＣ（実施例１の条件で実施。）を用いて、培地調製直後、５、１０、１５、２０、２４時間後にサンプル中の１,４−ジオキサンの濃度を測定した。
【００８２】
その結果、２０時間で全ての１，４−ジオキサンを分解したことが確かめられた。よって、Ｄ１７株の１，４−ジオキサン分解速度は、５．０ｍｇＬ−１／ｈであることが明らかとなった。
【００８３】
一方、試験例１において、ＲＭ３１株は、４８時間で４００ｐｐｍの１，４−ジオキサンを分解したことが確かめられており、ＲＭ３１株の１，４−ジオキサン分解速度は、３１．６ｍｇＬ−１／ｈであった。また、試験例４において、ＮａＣｌを含まない環境でも、４８時間で２００ｐｐｍの１，４−ジオキサンを分解したことが確かめられており、ＲＭ３１株の１，４−ジオキサン分解速度は、１５．８ｍｇＬ−１／ｈであった。
よって、ＲＭ３１株は、Ｄ１７株と比較して、１，４−ジオキサン分解速度が３倍以上であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物を提供することができる。
【符号の説明】
【００８５】
１…炭化資材Ａ１３０、２…ＢＳＭ液体培地、３…エアレーションポンプ、１０…パーコレーター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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