(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号４の塩基配列で表されるＰＮＡプローブ。
【請求項２】
リポーター及び消光剤のいずれか一つ以上が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項３】
配列番号９の塩基配列で表されるプライマー;及び
配列番号４の塩基配列で表されるＰＮＡプローブ;
を含むコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）の判別または検出用組成物。
【請求項４】
配列番号９の塩基配列で表されるプライマー;及び
配列番号４の塩基配列で表されるＰＮＡプローブ;
を含むコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）の判別または検出用キット。
【請求項５】
下記の段階を含むコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）の判別または検出方法:
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）前記標的核酸に含まれるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）の遺伝子マーカー塩基配列を、通常のプライマー対を利用して増幅させる段階；
（ｃ）前記増幅された遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、配列番号９の塩基配列で表されるプライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｄ）前記生成された一本鎖の遺伝子マーカー配列断片に配列番号４の塩基配列で表されるＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた、ＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら、温度依存融解曲線を得る段階；及び
（ｆ）前記（ｅ）段階で得られた融解曲線を分析することで融解温度を決定し、魚類におけるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ベルコビエＴＫ（Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ）に対する感染の有無を検出する段階。
【請求項６】
前記（ｃ）段階における一本鎖の遺伝子マーカー配列断片は、一本鎖形成用バッファー(ＳＳＧ  Ｂｕｆｆｅｒ)を添加することで生成されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖形成用バッファーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ(デオキシヌクレオチド)及び安定化剤（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を含有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｂ）段階における通常のプライマー対を利用して前記遺伝子マーカー塩基配列を増幅させる際に、さらにＴａｑＭａｎプローブを加えて増幅曲線を得ることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスの判別及び検出用遺伝子マーカー、及びこれを利用した原因ウイルスの判別及び検出方法に関し、より詳しくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）、マダイイリドウイルス病の原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）／感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）、またはコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の特定遺伝子をコードするＤＮＡ塩基配列を選定して増幅させた後、増幅産物を特異的に認識するペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，ＰＮＡ）をハイブリダイゼーションさせて、ハイブリダイゼーションされた産物の温度調節を介して温度別融解曲線を得て、前記得た融解曲線の分析を介して融解温度決定してウイルス類型を判別し、または魚類の前記ウイルス類型に対する感染の有無を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、感染性疾病診断のための方法のうち分子診断を使用した診断方法及びキットなどが開発されており、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）法を行った後、前記反応の増幅産物を電気泳動法で確認する方法、または蛍光プローブまたはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを利用してＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法などで確認する方法が主に使用されている。
【０００３】
特に、水産生物伝染病の中で法定伝染病と指定されているウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）、マダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）／感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）またはコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）を診断するためには世界動物保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，ＯＩＥ）水生動物衛生規約（Ａｑｕａｔｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｄｅ）の基準による通常のＰＣＲ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＰＣＲ）法を行ってＰＣＲ増幅産物を電気泳動で確認した後、増幅産物をクローニングして再び精製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＳａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇなどの方法を介して確認する作業を経ており、手続きが複雑で疾病診断のための分析に多くの時間がかかる短所がある。
【０００４】
魚類ウイルスであるＶＨＳＶ分子診断の場合、短時間に高い正確度及び敏感度を有するＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲなど遺伝子診断のための種々の技法が開発されている。ＶＨＳＶ診断にはＯＩＥ基準により１段階または２段階で構成された通常のＲＴ−ＰＣＲ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ）法が使用されている。特に、近年北米、アジア、ヨーロッパと大西洋地域を対象に前記ウイルスの遺伝的変異が周期的に発見されるにつれ原因ウイルスの力学的な動態に対する研究及び分子診断の際に正確な結果を得るために、ＯＩＥ基準によるＰＣＲ実行後、該当増幅産物のシーケンス（塩基配列分析、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を介した遺伝型分析の重要性が高まっている。近年簡便な遺伝型分析のためのＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の技法が開発されたが、現状は様々な遺伝型のウイルス検出には限界があって、現状はＯＩＥが推奨していない。
【０００５】
マダイイリドウイルス病の原因ウイルスであるＲＳＩＶまたはＩＳＫＮＶの診断には、組織ｓｍｅａｒサンプルを利用した染色法、ＭＡｂを利用したＩＦＡＴなどの血清学的診断方法が使用されていて、分子診断の場合ＯＩＥ基準により２種類のプライマーを使用した通常の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）ＰＣＲ法を行って診断する。ＯＩＥで勧告する前記診断法は、イリドウイルス病（ＲＳＩＶＤ）の診断法として“ＯＩＥ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １（ＯＩＥ  １）”ＰＣＲ法を使用してＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶ区分なしに診断が可能で、“ＯＩＥ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２（ＯＩＥ  ４）”ＰＣＲ法を使用する場合ＩＳＫＮＶは増幅せずＲＳＩＶだけを特異的に増幅して、イリドウイルス病の原因ウイルスであるＲＳＩＶとＩＳＫＮＶを区分することができる。従って、イリドウイルス病の診断と原因ウイルスの正確な同定のためにはＯＩＥ基準による２回の通常のＰＣＲ段階を経て行わなければならない短所がある。
【０００６】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の分子診断の場合、開示された様々なＰＣＲ方法の中でＫＨＶ診断に最も敏感であると確認された二つの通常のＰＣＲ法（ＯＩＥ、２０１４）を介して行う。一番目は、Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ等が２００５年に開発した“Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ  ＴＫ  ｐｒｉｍｅｒｓ”を使用した方法で、二番目は、Ｙｕａｓａ等によって開発された方法（Ｇｒａｙ  Ｓｐｈ  ｐｒｉｍｅｒｓ／Ｙｕａｓａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。既存のＰＣＲ法に比べて敏感度が高いｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲなどの診断法を多くの診断実験室で好むが、サンプル準備及びＰＣＲ過程の間の汚染などを避けるために、先述した２種類のＰＣＲ法が最も多く実行される。現在、前記法定伝染病の診断及び同定のために国で提示した標準診断法として通常のＰＣＲ法が使用されている。
【０００７】
また、ＯＩＥ基準に従ってＰＣＲ増幅産物の電気泳動確認時客観的な分析が不可能であるか（ｇｒａｙ  ｚｏｎｅ）、薄いＰＣＲ増幅産物をクローニングベクターを利用してクローニングした後、シーケンスを介して前記増幅産物の塩基配列を再確認するなどの検証段階を経る。このような検証段階は、非特異的産物（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  ｂａｎｄ）の配列を確認して検証する方式で、分析手続きが多くて多くの時間を費やすなどの問題点を有している。特に、通常のＰＣＲ法によって増幅産物が陽性と確認されると（シーケンス判定以前）、水産生物伝染病の感染が懸念されるケースに該当されて防疫措置を取ることにより、以後シーケンスにより偽陽性と判定される場合、検査機関の信頼性下落及び漁業者の被害発生事例もあるので、迅速かつ正確に法定伝染病を診断する方法の改善が切に求められる。
【０００８】
このような技術的背景下、本発明者等は、水産生物伝染病の原因ウイルスであるＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの判別または検出用ＰＣＲ産物の特異／非特異的増幅の有無をシーケンス段階なしにまたはシーケンス段階の前に魚類疾病ウイルスを判別して、前記原因ウイルスに感染した個体（例えば、魚類）を検出する方法を開発しようと鋭意努力した結果、魚類疾病原因ウイルスであるＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの類型判別及び／または検出用遺伝子マーカーを発見して、前記遺伝子マーカーに特異的なペプチド核酸及びプライマーを利用してウイルス類型毎に各々異なる蛍光の増幅及び融解曲線が現れるようにすることによって魚類疾病原因ウイルスを簡単・迅速・正確に判別することができる効果があることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、水産生物伝染病原因ウイルスであるＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの判別または検出用遺伝子マーカー,プライマー及びＰＮＡプローブを提供するところにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記プライマー及び前記ＰＮＡプローブを含むＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの判別または検出用組成物及びキットを提供するところにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記プライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させた後、生成された遺伝子マーカー配列断片に前記ＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせて、前記ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションによるＴｍ値を獲得して、ＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの類型を判別し、または個体の原因ウイル感染の有無を検出する方法を提供するところにある。
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用遺伝子マーカーであって、配列番号１１の塩基配列で表される遺伝子マーカーを提供する。
【００１３】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用遺伝子マーカーであって、配列番号１４または配列番号１５の塩基配列で表される遺伝子マーカーを提供する。
【００１４】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号６の塩基配列で表されるプライマーを提供する。
【００１５】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）または感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号７の塩基配列で表されるプライマーを提供する。
【００１６】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号８の塩基配列で表されるプライマーを提供する。
【００１７】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号９または配列番号１０の塩基配列で表されるプライマーを提供する。
【００１８】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号１の塩基配列で表されるＰＮＡプローブを提供する。
【００１９】
本発明はまた、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号４または配列番号５の塩基配列で表されるＰＮＡプローブを提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記プライマー及び前記ＰＮＡプローブを含む水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出用組成物及びキットを提供する。 
【００２１】
本発明はまた、下記の段階を含む水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出方法を提供する:
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）前記標的核酸に含まれる水産生物伝染病原因ウイルスの遺伝子マーカー塩基配列を通常のプライマー対を利用して増幅させる段階；
（ｃ）前記増幅された遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として前記プライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｄ）前記生成された一本鎖の遺伝子マーカー配列断片に前記ＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた、ＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら温度依存融解曲線を得る段階；及び
（ｆ）前記（ｅ）段階で得られた融解曲線を分析することで融解温度を決定し、水産生物伝染病原因ウイルスのウイルス類型を判別する、または魚類における前記ウイルス類型に対する感染の有無を検出する段階。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＣＲ増幅産物検証用ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙのウイルス類型の判別または個体のウイルス感染検出用増幅曲線を得る段階の技術的特徴を示した概念図である。
【図２】ウイルス類型の判別方法及び個体のウイルス感染検出方法において、ペプチド核酸のハイブリダイゼーションによる融解曲線を得る段階を示した模式図である。
【図３】ＶＨＳＶのＯＩＥ基準による検出用ＰＣＲ法で導き出された増幅産物でプライマー及びペプチド核酸が含んでいる塩基配列部位を説明するための遺伝子位置図である。
【図４】ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶのＯＩＥ基準による検出用“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １（ＯＩＥ  １）”法で導き出された増幅産物でプライマー及びペプチド核酸が含んでいる塩基配列部位を説明するための遺伝子位置図である。
【図５】ＲＳＩＶのＯＩＥ基準による検出用“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２（ＯＩＥ  ４）”方法で導き出された増幅産物でプライマー及びペプチド核酸が含んでいる塩基配列部位を説明するための遺伝子位置図である。
【図６】ＫＨＶのＯＩＥ基準による検出用ＰＣＲ（Ｂｅｒｃｏｉｖｅｒ  ＴＫ）方法で導き出された増幅産物でプライマー及びペプチド核酸が含んでいる塩基配列部位を説明するための遺伝子位置図である。
【図７】ＫＨＶのＯＩＥ基準による検出用ＰＣＲ（Ｇｒａｙ  ＳｐＨ）方法で導き出された増幅産物でプライマー及びペプチド核酸が含んでいる塩基配列部位を説明するための遺伝子位置図である。
【図８】図１〜図７で説明したウイルス類型別プライマー及びペプチド核酸を利用したウイルス検出方法に係る増幅曲線と融解曲線グラフを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２４】
本発明は一様態で世界動物保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，ＯＩＥ）の水生動物衛生規約（Ａｑｕａｔｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｄｅ）基準による水産生物伝染病の原因ウイルスであるＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶまたはＫＨＶの特定遺伝子マーカーに対するＰＣＲ産物の特異／非特異的増幅の有無をシーケンス段階なしにまたはシーケンス段階の前に原因ウイルスを判別して、前記原因ウイルスに感染した個体（例えば、魚類）を検出する方法を開発しようと試みた。その結果、ウイルス類型による特異的塩基配列を有するマーカー及び前記マーカーに対応するウイルス類型判別用プライマー及びペプチド核酸プローブ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ，ＰＮＡ  ｐｒｏｂｅ）を利用して水産生物伝染病の原因ウイルスを検出して各々の原因ウイルスの類型を判別／検出することができた。
【００２５】
より詳細に説明すると、前記原因ウイルスを類型別に判別／検出できる、
（１）ＶＨＳＶ、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶ、ＲＳＩＶまたはＫＨＶに各々特異的な検出用ＰＮＡプローブ（配列番号１〜配列番号５）及びプライマー（配列番号６〜配列番号１０）を含むオリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）；及び
（２）前記プライマーを利用して生成されたＰＣＲ増幅産物を鋳型として一本鎖ＤＮＡを生成して、前記一本鎖に前記ＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせるためのＳＳＧバッファー（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）；
を含む組成物またはキット（ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙ含む）を利用して水産生物伝染病の原因ウイルスを検出して、各々の原因ウイルスの類型を判別することができた。
【００２６】
ここで、前記組成物またはキット（ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙ含む）は、前記原因ウイルスを類型別に判別／検出できる、
（１）ＰＮＡプローブ（配列番号１）及びプライマー（配列番号６）を含むＶＨＳＶのＰＣＲ同定法による産物検出用オリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）;
（２）ＰＮＡプローブ（配列番号２）及びプライマー（配列番号７）を含むＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶの「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １（ＯＩＥ  １）」同定法による産物検出用オリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）;
（３）ＰＮＡプローブ（配列番号３）及びプライマー（配列番号８）を含むＲＳＩＶ  の「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２（ＯＩＥ  ４）」同定法による産物検出用オリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）;
（４）ＰＮＡプローブ（配列番号４）及びプライマー（配列番号９）を含むＫＨＶの「ＰＣＲ（Ｂｅｒｃｏｉｖｅｒ  ＴＫ）」同定法による産物検出用オリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）;及び／または
（５）ＰＮＡプローブ（配列番号４）及びプライマー（配列番号９）を含むＫＨＶの「ＰＣＲ（Ｇｒａｙ  ＳｐＨ）」同定法による産物検出用オリゴマー混合物（ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を含む。
【００２７】
従って、一観点において、本発明は、配列番号１１の塩基配列で表示される、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用遺伝子マーカーに関する。
【００２８】
他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）または感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）の判別または検出用であって、配列番号１２の塩基配列で表示される遺伝子マーカーに関する。
【００２９】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）の判別または検出用遺伝子マーカーであって、配列番号１３の塩基配列で表示される遺伝子マーカーに関する。
【００３０】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用遺伝子マーカーであって、配列番号１４または配列番号１５の塩基配列で表される遺伝子マーカーに関する。
【００３１】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号６の塩基配列で表されるプライマーに関する。
【００３２】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）または感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号７の塩基配列で表されるプライマーに関する。
【００３３】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号８の塩基配列で表されるプライマーに関する。
【００３４】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用プライマーであって、配列番号９または配列番号１０の塩基配列で表されるプライマーに関する。
【００３５】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号１の塩基配列で表されるＰＮＡプローブに関する。
【００３６】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）または感染性脾臓及び腎臓壊死ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号２の塩基配列で表されるＰＮＡプローブに関する。
【００３７】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号３の塩基配列で表されるＰＮＡプローブに関する。
【００３８】
さらに他の観点において、本発明は、水産生物伝染病原因ウイルスであるコイヘルペスウイルス（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）の判別または検出用ＰＮＡプローブであって、配列番号４または配列番号５の塩基配列で表されるＰＮＡプローブに関する。
【００３９】
本発明の前記ＰＮＡプローブは、両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とリポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の蛍光物質が結合し得る。前記リポーターは、FAM(6-carboxyfluorescein)、Texas  red、HEX(2'、4'、5'、7'、-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)、JOE、Cy3及びCy5で構成される群から選択される一つ以上であってもよく、前記消光剤は、TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2及びDabcylで構成される群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されず、好ましくは、Dabcyl(FAM-labeled)を使用いてもよい。
【００４０】
ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ＰＮＡ）は、核酸塩基がリン酸結合でないペプチド結合で連結された類似ＤＮＡで、１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎ等によって初めて合成された。ＰＮＡは、自然界では発見されず人工的に化学的な方法で合成される。
【００４１】
ペプチド核酸は、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＭＮＡ（Ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のように遺伝子認識物質の一つで人工的に合成して、基本骨格が、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）で構成されている。ＰＮＡは、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）と選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）が非常に優れて、核酸分解酵素に対する安定性が高くて現存する制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）で分解されない。また、熱／化学的に物性及び安定性が高くて保管が容易で分解され難い長所がある。
【００４２】
ＰＮＡは、相補的な塩基配列の天然核酸とハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を介して二本鎖を形成する。長さが同じ場合、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖よりも、ＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖よりも安定する。また、ＰＮＡは、単一塩基ミスマッチ（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）のために、二本鎖が不安定になる程度が大きいので、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出する能力が天然核酸よりさらに優れる。
【００４３】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合力よりもＰＮＡ−ＤＮＡ結合力が非常に優れて一つのヌクレオチドミスマッチ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｓ  ｍａｔｃｈ）でも１０〜１５℃程度差が生じる。このような結合力の差を利用して、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及びＩｎ／Ｄｅｌのヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の変化が検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）できるようになる。
【００４４】
本発明に係るＰＮＡ塩基配列の長さは特に制限されないが、ウイルス種類による特定塩基配列（例えば、塩基変異または単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ））が含まれるように、１２〜１８ｍｅｒ長さで製作することができる。この時、ＰＮＡプローブの長さを調節して所望のＴｍ値を有するようにＰＮＡプローブをデザインしてもよく、同じ長さのＰＮＡプローブでも塩基配列に変化をもたらしてＴｍ値を調節することも可能である。また、ＰＮＡプローブは、ＤＮＡより結合力が優れて基本的なＴｍ値が高いため、ＤＮＡより短い長さでデザインが可能で、近く隣り合う塩基変異またはＳＮＰでも検出が可能である。既存のＨＲＭ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔ）方法によると、Ｔｍ値の差が約０．５℃で非常に少なく追加的な分析プログラムや細かい温度変化または補正を必要とし、このために二つ以上の塩基変異またはＳＮＰが現れる場合には、分析が難かったが、本発明に係るＰＮＡプローブは、ＰＮＡプローブの配列とＳＮＰに対しては影響を受けないため、簡便に分析が可能である。
【００４５】
本発明のように、ＰＮＡプローブが１４個の塩基配列を含む場合には、真ん中の塩基配列の中の一つ以上の位置に、ウイルスの塩基変異またはＳＮＰ部位に相応する配列を有することが好ましい。また、ＰＮＡプローブは、塩基配列の真ん中の部分にウイルスの塩基変異またはＳＮＰ部位に相応する配列を含んで構造的な変形を有することができ、これにより完全なハイブリダイゼーションが行われた標的核酸（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）との融解温度（Ｔｍ）差をより大きくすることができる。
【００４６】
さらに他の観点において、本発明は、前記プライマー及び前記ＰＮＡプローブを含む、水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出用組成物及びキットに関する。
【００４７】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ補因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのような標的核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、さらに様々なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、様々なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。また、前記キットは、特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得した当業者によって容易に決定され得る。典型的に、本発明のキットは、先述した構成成分を含む別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で製作され得る。
【００４８】
前記キットを利用すると、ＰＮＡプローブによる溶解曲線分析を介して標的核酸の単一塩基変異及び塩基の欠損または挿入による変異を効果的に検出することができ、これによりウイルスの類型判別が可能である。
【００４９】
本発明は他の様態で、水産生物伝染病原因ウイルスである魚類ウイルス４種に対してＯＩＥ基準による検出用ＰＣＲ産物に相応する遺伝子塩基配列を比較分析して、配列番号６〜配列番号１０の塩基配列で表示される検出用プライマーを利用して合成された一本鎖のＰＣＲ増幅産物に配列番号１〜配列番号５の塩基配列で表示されるＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせて得た融解曲線から融解温度（Ｔｍ）を確認して、水産生物伝染病の原因ウイルスを判別して検出することができた。
【００５０】
従って、さらに他の観点において、本発明は、
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）前記標的核酸に含まれる水産生物伝染病原因ウイルスの遺伝子マーカー塩基配列を通常のプライマー対を利用して増幅させる段階；
（ｃ）前記増幅された遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、前記プライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｄ）前記生成された一本鎖の遺伝子マーカー配列断片に前記ＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた、ＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら、温度依存融解曲線を得る段階；及び
（ｆ）前記（ｅ）段階で得られた融解曲線を分析することで融解温度を決定し、水産生物伝染病原因ウイルスのウイルス類型を判別する、または魚類における前記ウイルス類型に対する感染の有無を検出する段階；
を含む水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出方法に関する。
【００５１】
本発明は、他の様態において、
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）マダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として配列番号８の塩基配列で表されるプライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｃ）前記一本鎖で生成された遺伝子マーカー配列断片に配列番号３の塩基配列で表されるＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階におけるＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら温度別融解曲線を得る段階；及び
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた融解曲線の分析を介して融解温度を決定してマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）を判別または検出する段階；を含むマダイイリドウイルス（Ｒｅｄ  Ｓｅａ  Ｂｒｅａｍ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，ＲＳＩＶ）の判別または検出方法を提供してもよい。
【００５２】
本発明は、さらに他の様態において、
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）コイヘルペスウイルスベルコイバーティーケー（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ(HSV)Bercoiver  TK）の遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として配列番号９の塩基配列で表されるプライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｃ）前記一本鎖で生成された遺伝子マーカー配列断片に配列番号４の塩基配列で表されるＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階においてＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら温度別融解曲線を得る段階；及び
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた融解曲線の分析を介して融解温度を決定してコイヘルペスウイルスベルコイバーティーケー（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ(HSV)Bercoiver  TK）を判別または検出する段階；を含むコイヘルペスウイルスベルコイバーティーケー（Ｋｏｉ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ(HSV)Bercoiver  TK）の判別または検出方法を提供してもよい。
【００５３】
本発明は、さらに他の様態において、
（ａ）検体試料から標的核酸を抽出する段階；
（ｂ）コイヘルペスウイルスグレーエスピーエッチ(HSV  Ｇｒａｙ  Ｓｐｈ)の遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として配列番号１０の塩基配列で表されるプライマーを利用して一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させる段階；
（ｃ）前記一本鎖で生成された遺伝子マーカー配列断片に配列番号５の塩基配列で表されるＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階においてＰＮＡプローブでハイブリダイゼーションされた産物の温度を高めながら温度別融解曲線を得る段階；及び
（ｅ）前記（ｄ）段階で得られた融解曲線の分析を介して融解温度を決定してコイヘルペスウイルスグレーエスピーエッチ(HSV  Ｇｒａｙ  Ｓｐｈ)を判別または検出する段階；を含むコイヘルペスウイルスグレーエスピーエッチ(HSV  Ｇｒａｙ  Ｓｐｈ)の判別または検出方法を提供してもよい。
【００５４】
本発明において、前記方法で一本鎖の遺伝子マーカー配列断片は、一本鎖形成用バッファー(ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、ＳＳＧ  Ｂｕｆｆｅｒ)を添加することで生成されることを特徴とする。
本発明において、前記一本鎖形成用バッファーは、ＤＮＡポリメラーゼ、dNTPs(デオキシヌクレオチドdeoxynucleotides)及び安定化剤（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を含有することができ、ここで、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであってもよいが、これに限定されない。
本発明において、前記（ｂ）段階で通常のプライマー対を利用して前記遺伝子マーカー塩基配列を増幅させる際に、さらにＴａｑＭａｎプローブを加えて増幅曲線を得ることを特徴とする。
【００５５】
本発明において、２以上の標的核酸検出することで、一つ以上の水産生物伝染病原因ウイルスのウイルス類型を判別または検出し、ここで、２以上の標的核酸を使用し、ＰＮＡプローブに標識されるリポーターが前記標的核酸の種類に応じて異なることを特徴とする。
【００５６】
本発明において、前記増幅は、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法で行うことを特徴とする。
【００５７】
本発明で「検体試料」とは、様々な試料を含み、好ましくは、本発明の方法を利用して生物試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）を分析する。より好ましくは、本発明に記載されたウイルス種（ｓｐｅｃｉｅｓ）と混合された試料であるか前記ウイルスに感染した個体（例えば、魚類など）の試料であってもよく、植物、動物、ヒト、菌類、バクテリア及びウイルス由来の生物試料が分析され得る。哺乳類またはヒト由来の試料を分析する場合、前記試料は、特定組織または器官から由来することができる。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉または神経組織が含まれる。器官の代表的な例としては、目、脳、肺、肝、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、すい臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。分析される生物試料は、生物学的根源から出てきたいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、または本発明によって良好に分析できるいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これはヒト、動物、ヒトまたは動物の消費のために製造された食べ物から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は、体液試料を含み、これは血液、血清、血しょう、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球流液、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃腺組織抽出物が含まれるか、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の「標的核酸」、「合成ＤＮＡ」または、「人工合成オリゴ」とは、検出有無を判別しようとする核酸配列（ＳＮＰ含む）を意味し、生理/生化学的機能を有するタンパク質をコードする「標的遺伝子」の核酸配列の特定部位を含み、ハイブリダイゼーション(混成化)、アニーリングまたは増幅条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたは混成化される。
【００５９】
本発明の「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは二つの核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）起きるか、または一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起きることがある。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件により変わり、特に温度によって調節され得る。
【００６０】
本発明において、前記融解曲線分析は、蛍光融解曲線分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＦＭＣＡ）方法で行うことを特徴とする。
【００６１】
本発明のリポーター及び消光剤が含まれるＰＮＡプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーションされた後、蛍光信号が発生して、温度が上がるにつれプローブの適正融解温度で標的核酸と速く融解されて蛍光信号が消光され、このような温度変化による前記蛍光信号から得られた高解像度の融解曲線分析を介して標的核酸の塩基変性（塩基変異またはＳＮＰ含む）の有無を検出することができる。前記ＰＮＡプローブは、標的核酸塩基配列と完全なハイブリダイゼーション（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）をなす場合、予想とおりの融解温度（Ｔｍ）値を示すが、塩基変異が存在する標的核酸とは不完全なハイブリダイゼーション（ｍｉｓｍａｔｃｈ）をなして予想よりも低い融解温度（Ｔｍ）値を示すことを特徴とする。
【００６２】
本発明の「塩基変異」とは、標的核酸の塩基配列に変異が起きたもので、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）だけでなく、塩基の置換、欠失または挿入されて変異が起きたものを含むことを特徴とし、本発明のＰＮＡプローブは標的核酸のＳＮＰまたは標的核酸の塩基が置換、欠失または挿入されて変異が起きたものを融解曲線分析を介して分析することができる。
【００６３】
本発明の前記ＰＮＡプローブは、両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とリポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の蛍光物質が結合し得る。前記リポーターは、FAM(6-carboxyfluorescein)、Texas  red、HEX(2'、4'、5'、7'、-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)、JOE、Cy3及びCy5で構成される群から選択される一つ以上であってもよく、 前記消光剤は、TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2及びDabcylで構成される群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されず、好ましくは、Dabcyl(FAM-labeled)を使用いてもよい。
【００６４】
ＰＮＡプローブのヌクレオチドとこれに相補的に結合するＤＮＡのヌクレオチドの差によってもＴｍ値の変化を示し、これを利用したアプリケーション（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の開発が容易である。ＰＮＡプローブは、ＴａｑＭａｎプローブの加水分解方法（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）とは異なるハイブリダイゼーション方法（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して分析して似た役割をするプローブとしては、分子ビーコンプローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅ）、スコーピオンプローブ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）がある。
【００６５】
ＰＮＡプローブを利用した特定塩基配列（例えば、塩基変異またはＳＮＰ）分析のためには、まず特定塩基配列を認識する塩基（等）が含まれるプローブとＰＣＲのための正方向／逆方向（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーセット（通常のプライマー対：ＯＩＥ（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｓ、世界動物保健機構）基準による）及び前記プライマーセットによって増幅された遺伝子マーカー塩基配列を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として一本鎖の遺伝子マーカー配列断片を生成させるプライマーだけあれば充分である。前記ＰＣＲ条件は、既存の方法を使用可能でＰＣＲが終わった後、融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）過程が必要で０．５℃ずつ増加する度に蛍光の強度を測定してＴｍ値を得る。特に通常のリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）装置は広く普及されていて、ＨＲＭ（Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ）のように付加的なプログラム購入や細かい温度変化を要しない長所がある。
【００６６】
本発明の融解曲線分析は、標的核酸であるＤＮＡまたはＲＮＡとプローブで形成される二重鎖核酸の融解温度を解釈する方法である。このような方法は、例えば、Ｔｍ解釈、または前記二重鎖の融解曲線の解釈によって行われるので、融解曲線分析と呼ばれている。検出対象（標的）の特定塩基配列（塩基変異またはＳＮＰ含む）に相補的なプローブを利用して、検出試料の標的単一鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二重鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を実施して、温度上昇によるハイブリッドの解離（融解）を、吸光度などのシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決めることによって、特定塩基配列の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高いほど高く、相同性が低いほど低くなる。このために、検出対象の特定塩基配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体に対して予めＴｍ値（評価基準値）を求めておいて、検出試料の標的単一鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定して、測定値が評価基準値と同じ程度であれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに特定塩基配列が存在すると判断し、測定値が評価基準値より低いと、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに変異が存在しないと判断することができる。
【００６７】
本発明の蛍光融解曲線分析は、蛍光物質を使用して融解曲線を分析する方法として、より具体的に、蛍光物質を含むプローブを利用して融解曲線を分析することができる。蛍光物質は、リポーターまたは消光剤であってもよく、インターカレーター性蛍光物質であってもよい。
【００６８】
本発明のリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法は、蛍光物質がＰＣＲ過程で二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡ鎖に結合（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ）されるようにして、ＰＣＲ産物の増幅と共に、温度を高めてＤＮＡ二本鎖を解くことによって、ＤＮＡ二本鎖の間に存在する蛍光物質の量が減るような融解曲線のパターン、特にＤＮＡが融解（変性）される温度（Ｔｍ）を分析して特定塩基配列（塩基変異、ＳＮＰ含む）の有無でウイルス類型の検出及び／または判別が可能である。
【００６９】
図１または図２は、一実施例に係るＰＣＲ検証用ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙの技術的特徴を説明するための概念図で、ここで示されたとおり、ＰＮＡプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーションされた後、蛍光信号を発生させることができ、温度が高まるにつれプローブの適正融解温度（Ｔｍ）で標的核酸から速く融解されて蛍光信号を消光させる。本発明は、このような温度変化による前記蛍光信号から得られた高解像度の融解曲線分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＦＭＣＡ）を介して、標的核酸の存在の有無及び塩基差の有無を検出できるものである。本発明に係るＰＮＡプローブは、標的核酸塩基配列と完全なハイブリダイゼーション（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）をなす場合、予想とおりの融解温度（Ｔｍ）値を示すが、塩基変異が存在する標的核酸とは不完全なハイブリダイゼーション（ｍｉｓｍａｔｃｈ）をなして予想より低い融解温度（Ｔｍ）値を示して、標的核酸が存在しない場合、融解温度（Ｔｍ）値を示さないことを特徴とする。
［実施例］
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００７０】
実施例１：水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出用遺伝子マーカー、及び前記ウイルスに特異的なプライマー及びＰＮＡプローブの製作
１−１：水産生物伝染病原因ウイルス：ＶＨＳＶ
ＶＨＳＶのＮ−遺伝子（Ｎ−ｇｅｎｅ）を標的とする“ＯＩＥ基準の検出用ＰＣＲ”方式で合成される遺伝子断片の配列を米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）のヌクレオチドＤＢ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に登録された塩基配列と比較分析してウイルス類型別遺伝子の塩基配列を確保しようと試みた。
【００７１】
その結果、５’−ＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１１）で表示されるＶＨＳＶの共通の塩基配列を確保して、前記塩基配列をＶＨＳＶの判別または検出用遺伝子マーカーとして選定した。
また、前記遺伝子マーカーの一本鎖ＤＮＡ生成用プライマーであって、配列番号６で表示されるプライマー１（ｐｒｉｍｅｒ  １）及び前記遺伝子マーカーのハイブリダイゼーション用プローブであって、配列番号１で表示されるＰＮＡ１を製作した。
【００７２】
図３は、ＶＨＳＶの前記遺伝子の一部の判別／検出用塩基配列及びこれから導き出されたＰＮＡの塩基配列一例を示した塩基配列図で、ＰＮＡプローブ該当塩基配列は青色で表記した。
１−２：水産生物伝染病原因ウイルス：ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶ
ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶのＯＩＥ基準の検出用”ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １（ＯＩＥ  １）”法で合成される遺伝子断片の配列を米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）のヌクレオチドＤＢ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に登録された塩基配列と比較分析してウイルス類型別遺伝子の塩基配列を確保しようと試みた。
【００７３】
その結果、５’−ＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１２）で表示されるＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶの共通の塩基配列を確保して、前記塩基配列をＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶの判別または検出用遺伝子マーカーとして選定した。
また、前記遺伝子マーカーの一本鎖ＤＮＡ生成用プライマーであって、配列番号７で表示されるプライマー２（ｐｒｉｍｅｒ  ２）及び前記遺伝子マーカーのハイブリダイゼーション用プローブであって、配列番号２で表示されるＰＮＡ２を製作した。
【００７４】
図４は、ＲＳＩＶ／ＩＳＫＮＶの前記遺伝子の一部の判別／検出用塩基配列及びこれから導き出されたＰＮＡの塩基配列一例を示した塩基配列図で、ＰＮＡプローブ該当塩基配列は青色で表記した。
１−３：水産生物伝染病原因ウイルス：ＲＳＩＶ
ＲＳＩＶのＯＩＥ基準の検出用”ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２（ＯＩＥ  ４）”法で合成される遺伝子断片の配列を米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）のヌクレオチドＤＢ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に登録された塩基配列と比較分析してウイルス類型別遺伝子の塩基配列を確保しようと試みた。
【００７５】
その結果、５’−ＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１３）で表示されるＲＳＩＶの共通の塩基配列を確保して、前記塩基配列をＲＳＩＶの判別または検出用遺伝子マーカーとして選定した。
また、前記遺伝子マーカーの一本鎖ＤＮＡ生成用プライマーであって、配列番号８で表示されるプライマー３（ｐｒｉｍｅｒ  ３）及び前記遺伝子マーカーのハイブリダイゼーション用プローブであって、配列番号３で表示されるＰＮＡ３を製作した。
【００７６】
図５は、ＲＳＩＶの前記遺伝子の一部の判別／検出用塩基配列及びこれから導き出されたＰＮＡの塩基配列一例を示した塩基配列図で、ＰＮＡプローブ該当塩基配列は青色で表記した。
１−４：水産生物伝染病原因ウイルス：ＫＨＶ 
ＫＨＶのＯＩＥ基準の検出用”Bercoiver  TK  ＰＣＲ”法で合成される遺伝子断片の配列を米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）のヌクレオチドＤＢ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に登録された塩基配列と比較分析してウイルス類型別遺伝子の塩基配列を確保しようと試みた。
【００７７】
その結果、５’−ＧＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣ−３’（配列番号１４）で表示されるＫＨＶの共通の塩基配列を確保して、前記塩基配列をＫＨＶの判別または検出用遺伝子マーカーとして選定した。
また、前記遺伝子マーカーの一本鎖ＤＮＡ生成用プライマーであって、配列番号９で表示されるプライマー４（ｐｒｉｍｅｒ  ４）及び前記遺伝子マーカーのハイブリダイゼーション用プローブであって、配列番号４で表示されるＰＮＡ４を製作した。
【００７８】
図６は、ＫＨＶの前記遺伝子の一部の判別／検出用塩基配列及びこれから導き出されたＰＮＡの塩基配列一例を示した塩基配列図で、ＰＮＡプローブ該当塩基配列は青色で表記した。
１−５：水産生物伝染病原因ウイルス：ＫＨＶ
ＫＨＶのＯＩＥ基準の検出用”Ｇｒａｙ  Ｓｐｈ  ＰＣＲ”法で合成される遺伝子断片の配列を米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）のヌクレオチドＤＢ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に登録された塩基配列と比較分析してウイルス類型別遺伝子の塩基配列を確保しようと試みた。
【００７９】
その結果、５’−ＴＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１５）で表示されるＫＨＶの共通の塩基配列を確保して、前記塩基配列をＫＨＶの判別または検出用遺伝子マーカーとして選定した。
また、前記遺伝子マーカーの一本鎖ＤＮＡ生成用プライマーであって、配列番号１０で表示されるプライマー５（ｐｒｉｍｅｒ  ５）及び前記遺伝子マーカーのハイブリダイゼーション用プローブであって、配列番号５で表示されるＰＮＡ５を製作した。
【００８０】
図７は、ＫＨＶの前記遺伝子の一部の判別／検出用塩基配列及びこれから導き出されたＰＮＡの塩基配列一例を示した塩基配列図で、ＰＮＡプローブ該当塩基配列は青色で表記した。
このように、本発明に係るウイルス遺伝子マーカー、ＰＮＡプローブ及びプライマー塩基配列を決めて、表１に示した。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
ＴａｑＭａｎ及びＰＮＡプローブなどのような蛍光が含まれないように、各々ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ５を結合して製作した。その後、表１に示されたような塩基配列とリポーター及び消光剤でＰＮＡプローブを製作した。本発明で使用したＰＮＡプローブは、ＰＮＡプローブデザイナー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を利用して設計して、ＰＮＡプローブはパナジン（Ｐａｎａｇｅｎｅ、韓国）でＨＰＬＣ精製方法で合成して、合成された全プローブの純度は、質量分析法を利用して確認した（標的核酸とのより効果的な結合のためにプローブを要しない二次構造は避けた）。
【００８３】
実施例２：水産生物伝染病原因ウイルスの判別または検出用ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙキットの最適化
実施例１で製作されたＰＮＡプローブ及びプライマーを利用して、４種の水産生物伝染病原因ウイルスのＤＮＡサンプルに対して産物に対して増幅曲線及び溶解曲線を導き出して、これを分析してＰＣＲ産物の検証を行うことによって、原因ウイルスの判別または検出を最適化しようと試みた。この時、ＯＩＥ（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｓ、世界動物保健機構）基準による前記原因ウイルスの判別または検出用ＴａｑＭａｎプローブ（及びこれと相応するプライマーセット（通常のプライマー対））を利用することができる。
【００８４】
ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙ反応はＣＦＸ９６ＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、米国）を利用して行い、ＰＣＲ産物を一本鎖標的核酸を生成するためにＳＳＧバッファー（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）及びプローブの結合する鎖の相補的な方向である単一プライマーを利用した。前記ＳＳＧバッファーの組成は２Ｘの使用濃度でｎＴａｑ−ＨＯＴ（０．２ｕｎｉｔ／μｌ）、ｎＴａｑ−ＨＯＴ  ｂｕｆｆｅｒ（４ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有）、ｄＮＴＰ混合物（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ各０．４ｍＭ）及び安定化剤（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を含む。
ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙ反応のための反応物の組成は、表２に示した。ＭｅｌｔｉｎｇＡｒｒａｙキットのｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを作った後、前記ＰＣＲ産物を１〜３μＬ添加して分析を行った。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
表３は、反応物のハイブリダイゼーション反応条件を示したもので、ＰＣＲ産物から一本鎖ＤＮＡを形成する段階、変性段階、及びＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションして、前記ハイブリダイゼーションされた産物の温度を高める過程を示したものである。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
その結果、図８に示したように、５種のＰＮＡプローブを利用して融解曲線分析で、水産生物伝染病原因ウイルスを判別または検出する可能性があることを確認した。
【００８９】
実施例３：ＰＮＡプローブを利用した融解ピークによるウイルスの判別または検出方法
本発明に係るＰＮＡプローブを利用して未知のウイルス由来ＤＮＡサンプルに対してウイルス類型を判別または検出しようとする場合、表４のような融解温度別スコア表を予め作っておいて、これを活用することが可能である。
実施例２のように融解曲線分析を行った後、導き出した蛍光信号及びＴｍ値を、相補性が完全な時の（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）温度に合わせてデジタル化した。すなわち、ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ温度の±２℃範囲を作って、未知のウイルスＤＮＡンプルに対するＴｍ値が前記範囲の中に入るとウイルス類型を特定して判別することができる。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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