(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法であって、
セルロース含有バイオマスを糸状菌由来セルラーゼで加水分解する工程（１）および
工程（１）で得られた加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る工程（２）
を含み、
工程（１）の前段または工程（１）中で、リパーゼでセルロース含有バイオマスを処理する、糖液の製造方法。
【請求項２】
前記セルロース含有バイオマスが、穀物皮類バイオマス、わらおよびバガスからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
前記穀物皮類バイオマスが、コーン外皮、大豆外皮および小麦外皮からなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
前記リパーゼの重量が、糸状菌由来セルラーゼの重量に対して１／１０以下である、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
前記工程（１）の前段または前記工程（１）中で、（ｉ）リパーゼおよびペクチナーゼ、（ｉｉ）リパーゼおよびグルコアミラーゼ、または（ｉｉｉ）リパーゼ、ペクチナーゼおよびグルコアミラーゼでセルロース含有バイオマスを処理する、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
前記工程（２）が、工程（１）で得られた加水分解物を固液分離して得られた溶液成分を限外ろ過膜に通じて濾過する工程である、請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項７】
前記固液分離がプレス濾過である、請求項６に記載の糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はセルロース含有バイオマスから発酵原料等で使用可能な糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されているが、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスより効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。【０００３】  セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法として、一般的に知られている濃硫酸を使用してセルロースおよびヘミセルロースを酸加水分解して糖液を製造する方法の他、セルロース含有バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が知られている（非特許文献１）。また酸を使用しない方法として、セルロース含有バイオマスを２５０〜５００℃程度の亜臨界水処理したあとに、さらに糖化酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献１）、またセルロース含有バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに糖化酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献２）が開示されている。これらの中でも、近年、特にエネルギー使用量および環境負荷が少なく、かつ糖収量が多い糖化酵素を使用したバイオマスの加水分解方法が広く検討されているが、糖化酵素を使用する方法の欠点として、酵素費が高いといった課題があった。【０００４】  糖化酵素処理による糖液の製造方法での前述の技術課題を解決する方法として、加水分解に使用した糖化酵素を回収再利用する方法が提案されている。例えば、スピンフィルターによる連続固液分離を行い、得られた糖液を限外濾過膜に通じてろ過し、酵素を回収する方法（特許文献３）、酵素糖化の段階において界面活性剤を投入することで酵素吸着を抑制し回収効率を向上させる方法（特許文献４）などが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−９５５９７号公報
【特許文献２】特許３０４１３８０号公報
【特許文献３】特開２００６−８７３１９号公報
【特許文献４】特開昭６３−８７９９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A. Adenら、“Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  上述の通り、糖化酵素を使用したセルロース含有バイオマスの加水分解方法が開発されているが、糖化酵素使用量を削減するという観点においてはその効果は依然不十分であった。したがって、本発明では、従来の方法でのセルロース含有バイオマスの加水分解における糖化酵素使用量の削減効果を上回る糖液製造プロセスを開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、以下の［１］〜［７］の構成を有する。［１］セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法であって、  セルロース含有バイオマスを糸状菌由来セルラーゼで加水分解する工程（１）および工程（１）で得られた加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る工程（２）を含み、  工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素でセルロース含有バイオマスを処理する、糖液の製造方法。［２］前記セルロース含有バイオマスが、穀物皮類バイオマス、わらおよびバガスからなる群から選ばれる１種以上である、[１]に記載の糖液の製造方法。［３］前記穀物皮類バイオマスが、コーン外皮、大豆外皮および小麦外皮からなる群から選ばれる１種以上である、[２]に記載の糖液の製造方法。［４］前記ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素の重量が、糸状菌由来セルラーゼの重量に対して１／１０以下である、[１]から[３]のいずれかに記載の糖液の製造方法。［５］前記工程（１）の前段または前記工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼの３種の酵素でセルロース含有バイオマスを処理する、[１]から[４]のいずれかに記載の糖液の製造方法。[６]前記工程（２）が、工程（１）で得られた加水分解物を固液分離して得られた溶液成分を限外ろ過膜に通じて濾過する工程である、[１]から[５]のいずれかに記載の糖液の製造方法。［７］前記固液分離がプレス濾過である、[６]に記載の糖液の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】  本発明では、セルロース含有バイオマスを原料とする糖液の製造工程から回収される糖化酵素の量を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】  本発明を実施するための形態に関し、工程ごとに詳細に説明する。［工程（１）］  工程（１）は、セルロース含有バイオマスを糸状菌由来セルラーゼで加水分解する工程である。
【００１１】  工程（１）で用いられるセルロース含有バイオマスとは、すくなくともセルロースを含む生物資源のことを指す。セルロース含有バイオマスの具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、わら（稲わら、麦わら）などの草本系バイオマス、あるいは樹木、廃建材などの木質系バイオマス、さらに藻類、海草など水生環境由来のバイオマス、コーン外皮、小麦外皮、大豆外皮、籾殻などの穀物皮類バイオマスなどが挙げられるが、穀物皮類バイオマスやわら、バガスに関して最も効果的であり、好ましく利用される。
【００１２】  セルロース含有バイオマスの加水分解とは、セルロースを低分子量化せしめ、単糖あるいはオリゴ糖を生成することを目的とするものである。セルロース含有バイオマスの加水分解では、キシラン、マンナン、アラビナン、などのヘミセルロース成分も同時に加水分解される。本工程では、セルロース含有バイオマスを加水分解するために糖化酵素として糸状菌由来セルラーゼを使用する。
【００１３】  糸状菌由来セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼなどの複数の酵素成分を含む、セルロースを加水分解して糖化する活性を有する酵素組成物である。糸状菌由来セルラーゼは、セルロース分解において複数の酵素成分の協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースの加水分解を実施することができる。
【００１４】  糸状菌由来セルラーゼとしては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、白色腐朽菌、褐色腐朽菌など由来のセルラーゼを例示することができる。こうした糸状菌由来セルラーゼの中でも、セルロース分解活性が高いトリコデルマ属由来セルラーゼを使用することが好ましい。
【００１５】  トリコデルマ属由来セルラーゼとは、トリコデルマ属微生物由来のセルラーゼを主成分とする酵素組成物である。トリコデルマ属微生物は特に限定されないが、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましく、具体的にはトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ  Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ９１２３）を例示することができる。また、前述のトリコデルマ属に由来する微生物であって、これらを変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００１６】  セロビオハイドロラーゼとは、セルロースの末端部分からセロビオース単位で加水分解していくことを特徴とする酵素の総称であり、セルロース鎖の還元末端側から切断していくセロビオハイドロラーゼＩと、非還元末端側から切断していくセロビオハイドロラーゼＩＩの２種類が知られている。ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドロラーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１７】  エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分からランダムに加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１８】  エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端からランダムに加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１９】  βグルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２０】  キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２１】  キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】  糸状菌由来セルラーゼとしては、粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌がセルラーゼを産生するよう調製した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するために、セルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいは菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００２３】  粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドロラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ等が含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、βグルコシダーゼに関しては、細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβグルコシダーゼ活性は低いため、粗酵素物に、さらに異種または同種のβグルコシダーゼを添加してもよい。異種のβグルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されている“Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８”などを例示することができる。粗酵素物に異種または同種のβグルコシダーゼを添加する方法としては、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、その培養液を単離する方法でもよい。
【００２４】  セルロース含有バイオマスを糸状菌由来セルラーゼにより加水分解するに先立ち、加水分解効率を向上させるために、セルロース含有バイオマスを前処理することが好ましい。セルロース含有バイオマスの前処理方法としては特に制限はなく、具体的には酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、苛性ソーダ処理、アンモニア処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理、蒸煮処理が挙げられるが、本発明においては水熱処理、希硫酸処理であることが好ましい。
【００２５】  水熱処理とは、バイオマスの固形物濃度が０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃の温度で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、セルロースまたはヘミセルロースの加水分解が起こる。特に温度は、１００℃〜２５０℃の範囲であることが好ましく、処理時間は、５分から〜３０分であることが好ましい。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。特に該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。
【００２６】  また、水熱処理において硫酸を添加して希硫酸処理にしてもよい。硫酸の添加量は、セルロース含有バイオマス１ｇ重量あたり硫酸を０．１〜１５０ｍｇ添加することが好ましい。
【００２７】  糸状菌由来セルラーゼによる加水分解の反応条件としては、糸状菌由来セルラーゼの好ましい反応条件に準じて行えば限定されないが、糸状菌由来セルラーゼを使用する際の、一般的な反応温度は１５〜１００℃の範囲が好ましく、４０〜６０℃がより好ましく、５０℃が更に好ましい。加水分解のｐＨは、ｐＨ３〜９の範囲が好ましく、ｐＨ４〜５．５がより好ましく、ｐＨ５がさらに好ましい。なお、ｐＨ調整には、酸あるいはアルカリを所望のｐＨとなるように添加し調整することができ、また、適宜緩衝液を使用してもよい。その他、セルロース含有バイオマスと糖化酵素の接触を促進させるため、また、加水分解物の糖濃度を均一にするために攪拌混合を行うことが好ましく、セルロースの固形分濃度が好ましくは１〜２５重量％、より好ましくは５〜２０重量％の範囲となるよう加水をする。
【００２８】  ［工程（２）］  工程（２）では、前記工程（１）で得られた加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を得る。非透過液として回収した酵素は、工程（１）に再利用することも可能であり、工程（１）での酵素の使用量を低減することが可能となる。
【００２９】  本発明で使用する限外濾過膜の分画分子量は、少なくとも単糖であるグルコース（分子量１８０）やキシロース（分子量１５０）を透過でき、糸状菌由来セルラーゼを阻止できる限外濾過膜であれば特に限定されず、具体的には分画分子量５００〜５０，０００の範囲であることが好ましく、酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を酵素と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。
【００３０】  限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルはセルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。
【００３１】  限外濾過膜の濾過方式として、デッドエンド濾過、クロスフロー濾過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフロー濾過であることが好ましい。
【００３２】  限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００３３】  ［ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上による酵素処理］  本発明は、工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素でセルロース含有バイオマスを処理することを特徴とする。工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素でセルロース含有バイオマスを処理することにより、処理しない場合と比較して工程（２）で回収されうる糸状菌由来セルラーゼ量が増大するといった効果が得られ、特に、糸状菌由来セルラーゼに含まれる酵素成分のうち、セルロース含有バイオマスを加水分解するうえで主要な酵素成分であるセロビオハイドロラーゼの回収量が顕著に増大するという効果が得られる。
【００３４】  ペクチナーゼとは、ペクチンを分解する活性を有する酵素のことを指す。ペクチンとは、植物体を構成する複合多糖であって、ガラツクロン酸がα−１、４結合したポリガラツクロン酸を主成分とする多糖である。ペクチナーゼとは、ポリガラクツクロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１０）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）、ペクチン酸メチルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１１）など少なくともペクチンの加水分解に関連する酵素種を含む定義である。
【００３５】  グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）とは、澱粉の非還元末端のα１，４結合を加水分解する活性を有する酵素のことを指す。
【００３６】  リパーゼとは、脂質を加水分解する酵素であって、特に脂肪酸とトリグリセリドのエステル結合を加水分解する活性を有する酵素（ＥＣ３．１．１．３）のことを指す。
【００３７】  本発明で使用するペクチナーゼ、グルコアミラーゼまたはリパーゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来であることが好ましい。アスペルギルス属としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｎｉｇａｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｏｒｉｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ａｃｒｅｔｕｓ）などを例示できる。アスペルギルス属由来の酵素は、酵素活性が最大となる至適反応温度が５０℃付近であるため、後述のように糸状菌由来セルラーゼと併用する際、同一温度で使用できる。
【００３８】  工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素でセルロース含有バイオマスを処理するとは、具体的には工程（１）におけるセルロース含有バイオマスを、工程（１）における糸状菌由来セルラーゼによる加水分解前、あるいは加水分解時に、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素で加水分解する工程である。また、工程（１）で得られた加水分解物をペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素で加水分解する工程も含まれる。ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素処理は、工程（１）におけるセルロース含有バイオマスを、工程（１）におけるセルラーゼの加水分解前、あるいは加水分解時単独であってもそれらを組み合わせて実施してもよいが、少なくとも工程（１）におけるセルラーゼの加水分解時に実施することが好ましい。
【００３９】  工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素の添加量は特に制限はないが、酵素費用の削減の観点から糸状菌由来セルラーゼに対してその重量比で１／１０以下であることが好ましい。なお、ここでいう酵素の添加量は、工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素の総量である。酵素の添加量の下限は本発明の効果が得られる限り特に制限はないが、セルロース含有バイオマス重量に対する投入酵素重量比で０．００１ｍｇ／ｇバイオマスである。
【００４０】  工程（１）の前段または工程（１）中に添加される、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素の構成としては、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼ、リパーゼのそれぞれ単独であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよいが、２種以上の組み合わせであることが好ましく、３種の組み合わせであることがより好ましい。
【００４１】  ［その他の工程］  その他、工程（１）で得られた加水分解物を固液分離することが好ましい。固液分離は、糖を含む溶液成分（以下、糖水溶液ともいう。）と、固形分である糖化残さに分離することで工程（２）での糖液と糸状菌由来セルラーゼの分離回収を効率よく実施できるようにすることを目的とする。
【００４２】  固液分離の方法は特に限定されず、スクリューデカンタなどの遠心分離、フィルタープレス、ベルトプレスなどのプレス濾過により固液分離を行うことができる。好ましくはフィルタープレス、ベルトプレスなどのプレス濾過であって、遠心分離に比べ不溶性の固体が少なく、濁質の少ない溶液成分が得られる。濁質が少ないことは、後段の限外ろ過膜のファウリングを抑制する観点からも好ましい。また、固液分離がフィルタープレス、ベルトプレスなどのプレス濾過である場合、工程（１）の前段または工程（１）中で、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼおよびリパーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素処理によって固液分離の処理時間が短縮できるという効果ももたらされる。
【００４３】  また、固液分離して得られた糖水溶液を工程（２）に供する前に、精密ろ過膜でろ過することが好ましい。精密ろ過膜のろ過により、固液分離では分離しきれなかった固形分を取り除くことができるため、工程（２）をさらに効率よく実施できるようになる。
【００４４】  精密ろ過膜とは、平均細孔径が０．０１μｍ〜５ｍｍである膜のことである。精密ろ過膜の材質としては上述の固液分離では分離しきれなかった固形分を取り除きうるものであれば特に限定されるものではないが、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料、あるいはステンレス等の金属、あるいはセラミック等の無機材料が挙げられる。
【００４５】  本発明で得られた糖液は、発酵原料として使用することができ、微生物を培養することで化学品を製造することができる。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。
【実施例】
【００４６】  以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４７】  （参考例１）糸状菌由来セルラーゼ（培養液）の調製方法  糸状菌由来セルラーゼ（培養液）は、次の方法で調製した。【００４８】  ［前培養］  コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃の温度で７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）。【００４９】  ［本培養］  コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製、ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法で液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃の温度で８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で振とう培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製のステリカップ−ＧＶ、材質：ＰＶＤＦ）した。この前述条件で調整した培養液を糸状菌由来セルラーゼとして、以下の実施例に使用した。【００５０】  （参考例２）糖濃度の測定  糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記��示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。カラム：Ｌｕｎａ  ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）反応液：なし検出方法：ＲＩ（示差屈折率）温度：３０℃。【００５１】  （参考例３）糸状菌由来セルラーゼの活性測定方法  セルラーゼ活性として、セルロースの分解に関与するセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼの活性を（１）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｌａｃ）分解活性より、βグルコシダーゼの活性を（２）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−Ｇｌｃ）の分解活性より、また、ヘミセルロースの主成分であるキシランの分解に関与するエンドキシラナーゼ、キシロシダーゼの活性を（３）４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘｙｌ）の分解活性より求めた。各分解活性の測定方法を以下に示す。なお、上記（１）〜（３）の基質をまとめてｐＮＰ−糖という。【００５２】  各基質をそれぞれ１ｍＭの濃度で含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．９ｍＬに酵素液を０．１ｍＬ加え、３０℃で反応させた。反応時間は、基質がｐＮＰ−Ｌａｃの場合６０分間、ｐＮＰ−Ｇｌｃの場合１０分間、ｐＮＰ−Ｘｙｌの場合３０分間とし、反応後、０．１ｍＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｔｅｓｔ）。ブランクとして、基質溶液に２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、酵素液の順に添加したものについても同様に４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｂｌａｎｋ）。上記反応系で１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。なお、上記反応系における４−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数は１７．２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍである。ｐＮＰ−Ｌａｃ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×６０（分間）×０．１（ｍＬ）｝ｐＮＰ−Ｇｌｃ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×１０（分間）×０．１（ｍＬ）｝ｐＮＰ−Ｘｙｌ分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×６０（分間）×０．１（ｍＬ）｝。【００５３】  （実施例１）  セルロース含有バイオマスとして、（１）コーン外皮、（２）大豆外皮、（３）わら、（４）バガスを使用した。糸状菌由来セルラーゼによる加水分解に先立つセルロース含有バイオマスの前処理は、下記のとおり原料毎に異なる前処理条件にて処理を行った。【００５４】  （１）コーン外皮（前処理条件：希硫酸処理）  コーン外皮は、中国産の乾燥品を使用した（株式会社ゴードーより購入）。コーン外皮（乾燥）１ｋｇに対して、含水率７０％となるように１３ｇ／Ｌ硫酸水２．３ｋｇを添加した（３０ｍｇ硫酸／ｇコーン外皮）。硫酸水を添加したコーン外皮は、１２０℃で３０分オートクレーブを使用して水熱処理した。オートクレーブ後、前処理物にアンモニア水を添加し、ｐＨ５に調製し、これを前処理物１とした。【００５５】  （２）���豆外皮（前処理条件：希硫酸処理）  大豆外皮は、中国産の乾燥品を使用した（株式会社ゴードーより購入）。大豆外皮（乾燥）１ｋｇに対して、含水率７０％となるように６５ｇ／Ｌ硫酸水２．３ｋｇを添加した（１５０ｍｇ硫酸／ｇ大豆外皮）。硫酸水を添加した大豆外皮は、１２０℃で３０分オートクレーブを使用して水熱処理した。オートクレーブ後、前処理物にアンモニア水を添加してｐＨ５に調製し、これを前処理物２とした。【００５６】  （３）わら（前処理条件：水熱処理）  わら（稲わら）は、日本産の乾燥品を使用した（農家より分譲）。わらを奈良機械製作所製のロータリーカッターミル・ＲＣＭ−４００（８ｍｍメッシュ）にて回転速度４２０回転／分で粉砕した。その後、水熱処理を行った。装置は、日本電熱株式会社製の爆砕装置（反応器２Ｌサイズ）を使用した。蒸気発生装置は４０ｋＷの電気ボイラを使用した。設定した処理圧力を設定すると一義的に処理温度も決定するため、反応条件は、２１５℃で５分処理を行い、本条件で１回２００ｇの粉砕したわらを投入し、合計５回実施した。爆砕処理した含水した固形分を２Ｌの水を加えて攪拌し、日立工機株式会社製のラボ用遠心分離機“ＨｉｍａｃＣＦ７Ｄ２”を用いて５０００ｒｐｍで水熱処理液と固形物に分離した。固形物の含水率は７０％になるよう調製しアンモニア水を使用してｐＨ５に調製した。これを前処理物３とした。【００５７】  （４）バガス（前処理条件：希硫酸処理）  バガスは、台湾製の乾燥品を使用した（台糖農産販売株式会社より購入）。バガスを奈良機械製作所製のロータリーカッターミル・ＲＣＭ−４００（２０ｍｍメッシュ）にて回転速度４２０回転／分で粉砕した。バガス（乾燥）１ｋｇに対して、含水率７０％となるように１３ｇ／Ｌ硫酸水２．３ｋｇを添加した（３０ｍｇ硫酸／ｇバガス）。硫酸水を添加したバガスは、１２０℃で３０分オートクレーブを使用して水熱処理した。オートクレーブ後、前処理物にアンモニア水を添加し、ｐＨ５に調製し、これを前処理物４とした。【００５８】  前処理物１〜４に対し、水を添加し、固形分濃度１０％となるように調製した。さらに参考例１で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解を行った。糸状菌由来セルラーゼの添加量は、前処理物１では２ｍｇ／ｇ前処理物、前処理物２では４ｍｇ／ｇ前処理物、前処理物３では８ｍｇ／ｇ前処理物、前処理物４では８ｍｇ／ｇ前処理物で添加し、加水分解を開始した。加水分解は５０℃で４８時間反応を行った。【００５９】  前記工程（１）の加水分解において、ペクチナーゼ（天野エンザイム株式会社製、“ペクチナーゼＰＬ「アマノ」”）、グルコアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製、“ＡＭＹＬＯＧＬＵＣＯＳＩＤＡＳＥ”）、リパーゼ（天野エンザイム株式会社製、“リパーゼＡＳアマノ”）をそれぞれ表１の組み合わせになるように添加し（添加量は１種類を添加する場合は、０．２ｍｇ／ｇ前処理物。２種類を組み合わせる場合は、１種類あたり０．１ｍｇ／ｇ前処理物。３種類を組み合わせる場合は、１種類あたり０．０６ｍｇ／ｇ前処理物。）、酵素処理を行った。また、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼ、リパーゼのいずれも添加しない場合を比較例１とした。【００６０��  前述の工程で得られた各酵素処理物８ｋｇを、薮田機械株式会社製フィルタープレスに０．２ＭＰａで圧入し、固液分離を行った。ろ布は薮田産業製織布Ｔ２７３１Ｃ（ポリエステル製、二重織）を用いた。空気による圧搾を、圧力０．３ＭＰａで実施し、固液分離したバイオマスから圧搾液を回収し、固液分離で分離した液体と混合し、溶液成分として糖水溶液６ｋｇを回収した。固液分離に要した時間を表１に示す。【００６１】
【表１】
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【００６２】  回収した各糖水溶液６ｋｇを、孔経０．２２μｍの精密ろ過膜を用いて全量濾過後、さらに得られた透過液を限外ろ過膜によるろ過処理を行った。限外ろ過膜は、ＨＦＵ（Ｔｏｒａｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＵＳＡ社製、材質：ポリビニリデンフルオライド、分画分子量:１５０，０００）を用いた。限外ろ過は、平膜ろ過ユニット“ＳＥＰＡ−ＩＩ”（ＧＥオスモニクス製）を用い、膜面線速度２０ｃｍ／秒、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側から回収される液量が０．６Ｌになるまでろ過処理を行った。限外ろ過処理後に得られる非透過液中の酵素を回収酵素と定義し、回収酵素の活性を参考例３の糸状菌由来セルラーゼの活性測定方法で測定した。投入した糸状菌セルラーゼに対する回収酵素の活性を表２〜５に示す。【００６３】
【表２】
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【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００６７】  本発明における糖液の製造方法はセルロース含有バイオマスを原料とし、得られた糖液は、各種化学品の発酵原料として使用することができる。