(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルセゲパントを含む、
軟骨変性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨変性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節破壊をきたす代表的な疾患である変形性関節症（ＯＡ）は、はかり知れない苦痛と運動機能障害をもたらす。日本では、総人口１２５，０００万人のうちＯＡの患者数は１，２００万人であって、要治療者は７００万人と言われている。しかし、ＯＡの原因は解明されておらず、ＯＡの進行を防ぐ薬剤は存在しない。このため、ＯＡの進行例に対して人工関節置換術などの手術療法を行っているのが現状である。また、ＯＡに対する保存療法として、筋力訓練および可動域訓練といったリハビリテーション、温熱治療などの物理療法、装具療法、ヒアルロン酸の関節内投与、各種消炎鎮痛剤の投与が行われている。原発性のＯＡだけでなく、半月板損傷または切除後、あるいは外傷後においてもＯＡは発生する。さらに、これからの高齢化社会を考えると対象となる患者数は相当数になると考えられる。
【０００３】
関節軟骨は一旦損傷すると自己修復することができない。したがって、これまで、軟骨に焦点をあてた研究が多くなされてきた。その一方で、軟骨を支える軟骨下骨の重要性が認識されてきている。軟骨下骨は、軟骨の恒常性に重要な役割を担っている。軟骨下骨の変化が軟骨変性に影響を与えているという報告もある。実際のＯＡ患者では、ＯＡの進行により軟骨下骨の骨硬化および骨棘形成といった変化がみられる。初期のＯＡでは、まず軟骨下骨の骨硬化がみられる。
【０００４】
近年、感覚神経が骨代謝を制御していることが明らかとなった。神経ペプチドであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＧＲＰ）は、骨芽細胞分化・増殖の促進、破骨細胞分化の抑制に重要な役割を担うことが示されている。ＣＧＲＰの発現は、疼痛において増加し、ＯＡの疼痛にも重要な役割を担うことが示されている。
【０００５】
非特許文献１には、ＣＧＲＰ抗体を投与したＯＡモデルラットを用いたＯＡにおける疼痛に関する研究が開示されている。また、ＯＡでの軟骨下骨の変化を制御することで、ＯＡの進行を抑制するという試みが報告されている。例えば、非特許文献２には、骨粗鬆症治療薬であるビスフォスフォネートを、実際にＯＡの患者に投与した臨床試験の結果が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｓｃｈｏｐ  ＲＪ、外１６名、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｉｎ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、２０１４、２２（４）、５７８−５８５
【非特許文献２】Ｎｉｓｈｉｉ  Ｔ、外４名、「Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｈｉｐ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ２−ｙｅａｒ  ｔｒｉａｌ．」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１３、３２（１２）、１７５９−１７６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記非特許文献１では、ＣＧＲＰ抗体のＯＡにおける疼痛に対する効果が評価されており、ＣＧＲＰ抗体のＯＡにおける骨代謝および軟骨変性への影響については評価されていない。したがって、ＯＡの軟骨変性を抑制できる薬剤はいまだ見出されていない。また、上記非特許文献２によれば、臨床試験の結果、ビスフォスフォネートはＯＡの進行を抑制できなかった。
【０００８】
進行性の疾患であるＯＡを初期の段階で薬剤によって抑制できれば、手術療法が減り、患者への恩恵のみならず医療経済的効果も大きい。したがって、ＯＡに対して安全で低浸襲に投与できる薬剤の開発が急務である。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、安全で低浸襲に関節破壊を抑制することができる軟骨変性抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は、初期のＯＡにおける骨硬化、特に軟骨下骨の硬化を防ぐことができれば、軟骨変性の進行、ひいては関節変性症が抑制できるものと考え、鋭意研究を重ねた。その結果、本発明を完成させた。すなわち、
本発明の観点に係る軟骨変性抑制剤は、
オルセゲパントを含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安全で低浸襲に関節破壊を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＯＡモデルマウスのサフラニン−Ｏ染色された膝関節切片の画像を示す図である。
【図２】ＯＡモデルマウスの変形性関節症スコアを示す図である。
【図３】ＯＡモデルマウスの軟骨下骨の面積の割合を示す図である。
【図４】ＯＡモデルマウスのオステオカルシンを染色した膝関節切片の画像および骨髄細胞におけるオステオカルシン陽性細胞の割合を示す図である。
【図５】ＯＡモデルマウスの酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）を染色した膝関節切片の画像および単位面積当たりのＴＲＡＰ陽性細胞の個数を示す図である。
【図６】ＯＡモデルマウスのＣＧＲＰを標識した膝関節切片の画像および視野の総面積に対するＣＧＲＰ陽性領域の割合を示す。
【図７】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスのサフラニン−Ｏ染色された膝関節切片の画像を示す図である。
【図８】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスの変形性関節症スコアを示す図である。
【図９】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスのマトリックスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）１３を染色した膝関節切片の画像を示す図である。
【図１０】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスにおける軟骨細胞中のＭＭＰ１３陽性細胞の割合を示す図である。
【図１１】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスの軟骨下骨の面積の割合を示す図である。
【図１２】マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）で得られた画像および内側骨端（Ａ）の長さと外側骨端（Ｂ）の長さとの比を示す図である。
【図１３】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスのオステオカルシンを染色した膝関節切片の画像および骨髄細胞におけるオステオカルシン陽性細胞の割合を示す図である。
【図１４】ＢＩＢＮ４０９６を投与したＯＡモデルマウスのＴＲＡＰを染色した膝関節切片の画像および単位面積当たりのＴＲＡＰ陽性細胞の個数を示す図である。
【図１５】培養細胞におけるオステオカルシンの発現量およびＡＬＰ活性を示す。
【図１６】ＴＲＡＰを染色した培養細胞の画像を示す図である。
【図１７】培養細胞におけるＴＲＡＰ陽性細胞の個数を示す図である。
【図１８】リセドロネートを投与したＯＡモデルマウスのサフラニン−Ｏ染色された膝関節切片の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態）
実施の形態について詳細に説明する。本実施の形態に係る軟骨変性抑制剤は、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤を含む。ＣＧＲＰ受容体は、ＧＰＣＲ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＬＲ）、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＡＭＰ）および細胞内のＲｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＣＰ）から構成されるヘテロ三量体タンパク質である。３７個のアミノ酸からなるペプチドであるＣＧＲＰがＣＧＲＰ受容体に結合すると、細胞内のｃＡＭＰが増加し、血管拡張などの作用をもたらす。
【００１７】
ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、ＣＧＲＰに拮抗して、ＣＧＲＰとＣＧＲＰ受容体との相互作用を阻害し、ＣＧＲＰ受容体からのシグナルを遮断する任意の物質である。ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、ＣＧＲＰとＣＧＲＰ受容体との相互作用を直接的、あるいは間接的に抑制するあらゆる物質、例えば、合成物、天然物、ペプチド、抗体およびアプタマーなどの核酸を含む。ＣＧＲＰ受容体拮抗剤としては、例えば、オルセゲパント（ＢＩＢＮ４０９６）、テルカゲパント（ＭＫ−０９７４）およびＭＳ−６９４１５３などが挙げられる。また、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤としてベンゾジアゼピンＣＧＲＰ受容体拮抗物質（例えば、国際公開第２００５／０１３８９４号参照）を用いてもよい。
【００１８】
ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、公知の方法で合成してもよいし、市販のものを使用してもよいし、化合物ライブラリに含まれる化合物の中から、ＣＧＲＰ受容体拮抗作用を有する化合物として選択した化合物であってもよい。ＣＧＲＰ受容体拮抗作用を有する化合物の選択には、既知の方法、例えば、ヒトＣＧＲＰ受容体を発現する細胞を用いた受容体結合アッセイなどを利用できる。ＣＧＲＰ受容体を発現する細胞は、遺伝子組み換え技術により作製できる。例えば、当該細胞から公知の方法で膜を単離し、放射性ヨウ素で標識したヒトＣＧＲＰおよび被験物質を、単離した膜とインキュベーションした後に、放射性ヨウ素に基づいて膜画分に含まれるヒトＣＧＲＰを定量することで、ＣＧＲＰ受容体拮抗作用を有する化合物を選択できる。
【００１９】
ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、ＣＧＲＰに相互作用することでＣＧＲＰとＣＧＲＰ受容体との相互作用を阻害する物質でもよい。したがって、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、例えば、ＡＬＤ４０３およびＬＹ２９５１７４２などのＣＧＲＰ抗体であってもよい。なお、公知の抗体作製方法で、ＣＧＲＰに対する抗体を作製してもよい。
【００２０】
本実施の形態に係る軟骨変性抑制剤は、有効成分として上記ＣＧＲＰ受容体拮抗剤を含む。当該軟骨変性抑制剤は、公知の方法で製造される。上記軟骨変性抑制剤の剤形は、限定されないが、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤および口腔内吸収剤などである。当該軟骨変性抑制剤は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質または無機担体物質である。また、当該軟骨変性抑制剤には、白糖、緩衝剤などの薬理的に許容される添加剤が含まれてもよい。必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を用いることもできる。
【００２１】
本実施の形態に係る軟骨変性抑制剤は、下記実施例１に示すように、軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性を抑制する。そこで、当該軟骨変性抑制剤は、好ましくは軟骨変性疾患の患者に投与される。軟骨変性抑制剤の投与方法は任意であるが、好ましくは経口投与または静脈内注射である。当該軟骨変性抑制剤の投与量は、患者の体重、病態など患者の状態に応じて適宜調整されるが、有効成分であるＣＧＲＰ受容体拮抗剤の１日の投与量にして１人あたり０．１ｍｇ〜１ｇ、または１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜１０ｍｇである。もちろん、投与回数、投与間隔などの投与方法は、患者の状態を見ながら、適宜調整することができる。
【００２２】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る軟骨変性抑制剤は、軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性を抑制する。軟骨には血管がなく、軟骨変性抑制剤の患部への効率的な輸送が問題となり得るが、軟骨下骨には血管があるため、当該軟骨変性抑制剤は、血行を介して軟骨下骨に到達でき、薬効が効率よく得られる。したがって、当該軟骨変性抑制剤は、安全で低浸襲に関節破壊を抑制することができる。
【００２３】
また、上記軟骨変性抑制剤は、上記ＣＧＲＰ受容体拮抗剤としてオルセゲパントを含んでもよいこととした。オルセゲパントは、偏頭痛の治療薬として臨床試験で使用されているため、患者に安全に投与できる。
【００２４】
また、別の実施の形態では、軟骨変性抑制剤として使用するためのＣＧＲＰ受容体拮抗剤が提供される。他の実施の形態は、軟骨変性抑制剤の製造のためのＣＧＲＰ受容体拮抗剤の使用である。さらに別の実施の形態では、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤を投与する工程を含む、軟骨下骨の骨硬化を抑制する方法、またはＣＧＲＰ受容体拮抗剤を投与する工程を含む、軟骨変性を抑制する方法が提供される。さらに他の実施の形態では、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤を、軟骨疾患の患者に投与する工程を含む、軟骨疾患の治療方法が提供される。
【００２５】
下記実施例１に示すように、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、軟骨下骨の骨硬化を抑制する。軟骨下骨の骨硬化は、上述のように、実際のＯＡ患者において、ＯＡの進行とともに見られる。このため、上記ＣＧＲＰ受容体拮抗剤は、変形性関節症抑制剤に有効成分として含まれてもよい。
【００２６】
別の実施の形態では、変形性関節症抑制剤として使用するためのＣＧＲＰ受容体拮抗剤が提供される。他の実施の形態は、変形性関節症抑制剤の製造のためのＣＧＲＰ受容体拮抗剤の使用である。さらに別の実施の形態では、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤を、変形性関節症の患者に投与する工程を含む、変形性関節症の治療方法が提供される。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、本実施例のすべての結果は、平均値±標準偏差で示した。３群または４群の比較は、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定で行った。２群間の差の検出には、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いた。Ｐ値が０．０５未満の場合を統計的に有意であるとした。
【００２８】
（実施例１：ＣＧＲＰ受容体拮抗剤の軟骨変性抑制作用の検討）
以下の手順でＯＡモデルマウスを作製した。まず、１０週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスの右膝関節の内側側副靭帯を切離するＯＡ手術を行った。軟骨下骨の早期変化を評価するために、ＯＡ手術を施したマウスを過剰量の麻酔で２日後および７日後に安楽死させた（各時点においてｎ＝６）。擬似手術（ｓｈａｍ）を施したマウスも同様に安楽死させた（ｎ＝６）。
【００２９】
ＯＡの進展に対するＣＧＲＰ受容体拮抗剤の効果を調べるために、ＯＡ手術後に、オルセゲパント（ＢＩＢＮ４０９６、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を０．６ｍｇ／ｋｇ／１００μｌの投与量で、腹腔内に注射することでマウスに投与した。コントロール群には、同じ投与量でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。
【００３０】
注射から１週間後、４週間後および８週間後に、膝関節を回収し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、μＣＴおよび組織学的評価を行った。μＣＴでは、４％ＰＦＡでの２４時間の固定後、高解像度μＣＴ装置（ＳｋｙＳｃａｎ１１７６、東洋テクニカ社製）を、マニュアルに従って用いて検体を解析した。得られた画像を再構成し、ｓｈａｍ、コントロール群およびＢＩＢＮ４０９６投与群について、内側骨端の長さおよび外側骨端の長さを算出した。
【００３１】
上記の４％ＰＦＡで固定した膝関節を２０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で２週間かけて脱灰し、パラフィンに包埋した。膝関節の内側区画の中央の荷重負荷領域から採取された４μｍの厚さの矢状切片を組織学的評価のために作製した。サフラニン−Ｏ  ファストグリーン法で切片を染色し、内側大腿顆および脛骨プラトーにおける病理学的変化を、マウスにおける関節変性症における膝軟骨の評価に関するＯＡＲＳＩ（Ｏｓｔｅｏ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）勧告に基づいて評価した。
【００３２】
各切片に関して、内側プラトーの骨端における軟骨下骨の面積／組織の面積（ＢＴ／ＴＶ、％）を、画像解析装置（ＢＺ−９０００、キーエンス社製）を用いて測定した。他の切片を、免疫組織化学およびＴＲＡＰ染色に使用した。ＴＲＡＰ染色には、和光純薬工業社製のキットをマニュアルに従って用いた。軟骨下骨の骨端におけるＴＲＡＰ陽性細胞を各切片について計数した。
【００３３】
免疫組織化学評価では、まず、パラフィンに包埋した膝関節の切片を、キシレン置換ｒｏ−Ｐａｒ  Ｃｌｅａｒａｎｔ（Ａｎａｔｅｃｈ社製）で脱パラフィン処理し、段階希釈されたエタノールおよび水で戻した。抗原脱マスキングでは、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の切片を電子レンジで加熱し、１．５分間、８０〜８５℃で維持した。抗原脱マスキングの後、スライドを室温で２０分間冷却した。ＰＢＳで洗浄後、５％血清を用いて、３０分間室温で切片をブロックした。
【００３４】
続いて、抗ＣＧＲＰ抗体（５０倍希釈、Ａｂｃａｍ社製）、抗オステオカルシン抗体（２０００倍希釈、タカラバイオ社製）および抗ＭＭＰ１３抗体（５０倍希釈、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、４℃で一晩、切片とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片をビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体と室温で３０分間インキュベートした。なお、ＣＧＲＰに対する二次抗体としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲーティッド抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
【００３５】
次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰアルカリフォスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて切片を３０分間インキュベートした。スライドを洗浄し、切片をアルカリフォスファターゼ基質と２０〜３０分間インキュベートした。
【００３６】
免疫組織化学シグナルは、次のように定量した。骨形成解析に関しては、軟骨下骨の骨端における骨髄細胞の総数を計数し、オステオカルシン陽性細胞の割合を算出した。ＣＧＲＰ発現に関しては、軟骨下骨の骨端の５箇所の視野を無作為に選択し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）を用いて、２００倍拡大下で各ＣＧＲＰ陽性領域を測定した。ここでは、各視野の総面積に対するＣＧＲＰ陽性領域の割合を算出した。ＭＭＰ１３の発現に関しては、４００倍拡大下で切片の４枚の写真を撮影し、各写真について切片の関節軟骨にみられる全軟骨細胞中のＭＭＰ１３陽性細胞の個数を計数した。
【００３７】
（結果）
図１は、ＯＡモデルマウスの膝関節から作製した切片の画像を示す。内側側副靭帯を切離したＯＡモデルマウスでは、２日、７日と経時的に軟骨下骨の骨形成が進み、骨髄腔の減少がみられた。また、ＯＡモデルマウスでは、経時的に軟骨変性が進行していた。なお、以下で説明する図中のバーは１００μｍの長さを示す。
【００３８】
ＯＡモデルマウスの脛骨および大腿骨に関して、ＯＡの程度を示すＯＡＲＳＩスコアを図２に示す。ＯＡモデルマウスでは、経時的に、脛骨および大腿骨の両方でＯＡが統計的に有意に進行していた。図３は、ＯＡモデルマウスの組織の面積に対する軟骨下骨の面積の割合を示す。膝関節が正常なｓｈａｍと比較して、７日目では、軟骨下骨の面積が増加していた。
【００３９】
図４は、免疫組織化学評価において、オステオカルシンを染色したＯＡモデルマウスの膝関節の切片の画像および骨髄細胞に対するオステオカルシン陽性細胞の割合を示す。ＯＡが進行するにつれて、軟骨下骨の骨髄腔が減少した。また、オステオカルシン陽性細胞、すなわち骨芽細胞の割合が有意に増加していた。図５は、免疫組織化学評価において、ＴＲＡＰを染色したＯＡモデルマウスの膝関節の切片の画像および単位面積あたりのＴＲＡＰ陽性細胞の個数を示す。２日目では、ＴＲＡＰ陽性細胞、すなわち破骨細胞の個数が増加するが、７日目に減少していた。図６は、軟骨下骨におけるＣＧＲＰを標識した膝関節切片の画像と各視野の総面積に対するＣＧＲＰ陽性領域の割合を示す。ＯＡモデルマウスの軟骨下骨において、ＣＧＲＰの発現が経時的に増加していた。
【００４０】
ＯＡモデルマウスにＢＩＢＮ４０９６を投与した場合の膝関節切片の画像を図７に示す。コントロール群では、１、４、８週と経時的に軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性が進行していた。一方、ＢＩＢＮ４０９６投与群では、軟骨下骨の骨硬化は軽度で、軟骨変性の進行も軽度であった。図８は、コントロール群およびＢＩＢＮ４０９６投与群のＯＡＲＳＩスコアを示す。ＢＩＢＮ４０９６投与群では、ＯＡＲＳＩスコアが有意に低値を示した。
【００４１】
ＯＡモデルマウスの膝関節切片における軟骨変性マーカーＭＭＰ１３の発現を図９に示す。コントロール群に比較して、ＢＩＢＮ４０９６投与群におけるＭＭＰ１３の発現は少なかった。図１０に示すように、ＢＩＢＮ４０９６投与群における軟骨細胞中のＭＭＰ１３陽性細胞の割合は、コントロール群に対して有意に少なかった。図１１は、ＢＩＢＮ４０９６投与群における組織の面積に対する軟骨下骨の面積の割合を示す。軟骨下骨の骨量は、コントロール群と比較して、１、４および８週目においても有意に小さいことが示された。
【００４２】
μＣＴによる解析で得られた画像および内側骨端の長さと外側骨端の長さとの比を図１２に示す。コントロール群では、脛骨内側顆の骨硬化を認め、切離した内側骨端の長さが短くなっていた。一方、ＢＩＢＮ４０９６投与群では、脛骨内側顆の骨硬化が認められず、内側骨端の長さはｓｈａｍと同程度であった。
【００４３】
図１３は、ＢＩＢＮ４０９６投与群において、オステオカルシンを染色した膝関節の切片の画像および骨髄細胞に対するオステオカルシン陽性細胞の割合を示す。ＢＩＢＮ４０９６投与群における骨芽細胞の割合は、コントロール群と比較して有意に小さかった。図１４は、ＴＲＡＰを染色したＢＩＢＮ４０９６投与群の膝関節の切片の画像および単位面積あたりのＴＲＡＰ陽性細胞の個数を示す。ＢＩＢＮ４０９６投与群における破骨細胞の個数は、コントロール群と比較して有意に増加していた。
【００４４】
（実施例２：骨形成に対するＢＩＢＮ４０９６の影響）
第２継代および第３継代のヒト骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＳＣ成長培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で増殖させた。第４継代のＭＳＣを１２穴プレートに播種し、骨形成を誘導した。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む骨形成誘導培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、１週間に２回交換し、２１日間インキュベートした。なお、１００ｎＭのＣＧＲＰ（ペプチド研究所製）をさらに含む骨形成誘導培地、および１００ｎＭのＣＧＲＰとＢＩＢＮ４０９６とをさらに含む骨形成誘導培地でも同様に骨形成を誘導した。
【００４５】
２１日間のインキュベート後、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析のために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＲＮＡを単離した。そして、アルカリフォスファターゼ活性の評価のためにタンパク質を抽出した。
【００４６】
リアルタイムＰＣＲ解析では、まず、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＬＩＯ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をマニュアルに従って用いて、１μｇの全ＲＮＡから相補的ＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲのプローブには、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  ｐｒｏｂｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のオステオカルシン（Ｈｓ０１５８７８１４＿ｇ１）およびＧＡＤＰＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｍ１）を用いた。各遺伝子の発現を、ＧＡＤＰＨの発現に対して評価した。リアルタイムＰＣＲのデータ解析には、ΔΔＣｔ法を用いた。
【００４７】
骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性の評価では、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで処理して細胞溶解物を収集し、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＡＬＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（和光純薬工業社製）をマニュアルに従って用いて、上清を評価した。マイクロプレート分光計で４０５ｎｍの吸光度を各試料について測定した。
【００４８】
（結果）
図１５は、オステオカルシンの発現量およびＡＬＰ活性を示す。ＣＧＲＰ存在下で、骨形成の誘導によるオステオカルシンの発現が増加した。一方、ＢＩＢＮ４０９６を加えることで、オステオカルシンの発現量が有意に低下した。同様に、ＣＧＲＰ存在下では、ＡＬＰ活性が増加した。一方、ＢＩＢＮ４０９６を加えることで、ＡＬＰ活性が有意に低下した。
【００４９】
（実施例３：破骨細胞形成に対するＢＩＢＮ４０９６の影響）
１２穴プレートで、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα−ミニマル・エッセンシャル培地で培養した。破骨細胞形成を評価するために、３日ごとに５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業社製）および５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ（和光純薬工業社製）を含む培地に交換し、１週間培養した。なお、１００ｎＭのＣＧＲＰをさらに含む培地、および１００ｎＭのＣＧＲＰとＢＩＢＮ４０９６とをさらに含む培地でも同様に培養した。７日目に、和光純薬工業社製の上記キットを用いて、細胞のＴＲＡＰを染色した。４個以上の核を有するＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞として同定した。２００倍拡大の顕微鏡観察下で、各ウェルで顕微鏡の１０視野における破骨細胞を計数した。すべての実験は３重に、少なくとも３回行った。
【００５０】
（結果）
ＴＲＡＰを染色した細胞の画像を図１６に示す。破骨細胞への分化誘導によって確認されたＴＲＡＰ陽性細胞が、ＣＧＲＰを加えることで減少した。一方、ＢＩＢＮ４０９６を加えると、ＴＲＡＰ陽性細胞が増加した。図１７は、ＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）の個数を示す。ＢＩＢＮ４０９６を加えることで、ＴＲＡＰ陽性細胞の個数が有意に増加した。
【００５１】
以上の結果より、早期ＯＡにおいて、軟骨変性に関連する軟骨下骨の硬化およびＣＧＲＰの発現増加が示された。さらに、ＣＧＲＰ受容体拮抗剤がこの軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性を抑制し、ＯＡを抑制することが実証された。
【００５２】
（比較例）
上記ＯＡモデルマウスに、ビスフォスフォネートの１種であるリセドロネートを、ＯＡ手術後に０．０６ｍｇ／ｋｇ／１００μｌの投与量で静脈内に投与した。投与から１週間後および４週間後に、膝関節を回収し、上記実施例１と同様に組織学的評価を行った。
【００５３】
（結果）
図１８は、リセドロネートの投与から１週間後および４週間後のサフラニン−Ｏ  ファストグリーン法で染色した膝関節の切片の画像を示す。図７のＢＩＢＮ４０９６投与群の１週および４週と比較して、軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性の進行が認められる。ビスフォスフォネートは、破骨細胞の機能を抑制するため、軟骨下骨の骨硬化および軟骨変性を抑制できないと考えられる。
【００５４】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、軟骨変性を抑制するための医薬に好適である。本発明に係る軟骨変性抑制剤は、ＯＡの進行例に対する手術療法を減少させ、運動機能障害の抑制、運動機能の向上および患者の生活の質の向上に寄与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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