(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、アンチセンス分子、およびsiRNAからなる群より選択されるいずれか一を含む、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬組成物。
【請求項２】
がん細胞を候補物質で処理し、
処理した細胞におけるTAF15 mRNAを定量し、
候補物質による処理に応答してTAF mRNAレベルが低下した場合に、その候補物質を選択する、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
物質が、分子標的薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
物質が、TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、アンチセンス分子、siRNA、およびTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体からなる群より選択されるいずれか一である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
対象から得られた試料中のTAF15遺伝子またはその産物を分析することを含む、薬物が投与された対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現の予測を補助する方法であって、
TAF15遺伝子またはその産物を分析することが、TAF15 mRNAの量を測定することであり、
薬物の投与に応答してTAF mRNAレベルが低下した場合に、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現が抑制されると予測する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品および/または診断薬を開発するための標的分子としての、TAF15遺伝子およびその産物使用に関する。本発明は、医療、医薬品製造、腫瘍に関する研究等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
化学療法後のがんの再発は、不均一な細胞集団中のいくつかの薬物耐性細胞がストレスの多い条件下でたくましく生き残って増殖する生物学的現象である。臨床上は、がん患者の５０−９０％が、進行した消化器系腫瘍の見掛け上の「根治的」切除、続いてアジュバント化学療法を受けたにもかかわらず、疾患の再発により亡くなる（非特許文献１：Paoletti et al., 2010）。根治的切除は、患者の体内に検出可能ながん細胞が残存しない状態により定義される（非特許文献２：Sakuramoto et al., 2007）。アジュバント化学療法の間でさえ再発が起こり得ることから、がん細胞の極めて小さな集団が化学療法を切り抜けて生き残り、そして局所的な腫瘍の成長、リンパ腫／血中転移、および肋膜／腹膜播種性転移を促進し得ることが示唆される。最近の研究は、遺伝的変化の蓄積に基づいて腫瘍が致死的レベルに成長するまでに数十年要することを証明した（非特許文献３：Campbell et al., 2010; 非特許文献４：Yachida et al., 2010）。ほとんどの再発は消化器系がん患者の根治的治療後の５年以内に生じるが、がんが悪性度の高い表現型を獲得するのに必要とされる推定時間よりもはるかに短い期間である（非特許文献５：O'Connell et al., 1994）。
【０００３】
すべての再発の状況に関して決まった臨床上のガイドラインはないが、古典的なDNA傷害剤またはタキサン系薬剤がしばしば、もっとも重篤な末期がん状態の一つであるがん性腹膜炎（PC）に使用される（非特許文献６：Ansaloni et al., 2014; 非特許文献７：Sloothaak et al., 2014）。
【０００４】
一方、Amanita属の有毒きのこ種から生成される、環状ペプチド構造を持つ有毒成分（アマトキシン）の一つであるα‐アマニチンは、アマトキシンの中でも特に毒性が強いことが知られている。経口投与では、消化器症状に続いて、肝臓、腎臓が侵され、最終的には、には、血圧の急激な低下、昏睡などの中枢神経系の障害が起こり、死に至らしめる。細胞レベルでは真核生物のRNAポリメラーゼIIと特異的に結合し、RNA鎖合成を阻止することが知られている（非特許文献８：Lindell et al., 1970）。
【０００５】
α-AMA を利用する治療的な試みは、その消化管、肝臓および腎臓に対する毒性のため、ほとんど遂行されていない（非特許文献９：Ward et al., 2013）。しかしながら、最近の研究では、がんの治療において有用な標的結合部分とアマトキシンとを複合体化して用いることを提案し、100μg/kgの用量においてさえ全身の副作用なしにヒト膵臓がんマウス皮膚異種移植モデルにおいて、明確な成長抑制効果を示したことが報告されている（非特許文献１０：Moldenhauer et al., 2012）。このような複合体は特に、腺がん、例えば膵臓がん、胆管がん、乳がんおよび結腸直腸がんの治療に有用であると述べられている（特許文献１および２）。
【０００６】
TAF15は、TATA結合蛋白質（TBP）関連因子15をコードする（非特許文献１１：Andersson et al., 2008）。また、肉腫における融合蛋白質であるFUS、ユーイング肉腫タンパクであるEWS、およびTAF15蛋白質はFET（FUS/EWS/TAF15）ファミリーを形成し、遺伝子発現において様々な役割を有する（非特許文献１２：Tan and Manley, 2009）。TAF15は急性白血病（非特許文献１３：Martini et al., 2002）および骨外性粘液型肉腫（非特許文献１４：Sjogren et al., 1999）において染色体転座に関与していることが見出された。さらにTAF15を標的とした免疫治療のために、腫瘍特異的TAF15バリアントを抗原とするヒトIgG、PAT-BA4が開発された（非特許文献１５：Schatz et al., 2010; 特許文献３）。最近、TAF15蛋白質はRNAPIIのC末端ドメインに直接結合すると報告された（非特許文献１６：Kwon et al., 2013）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許公報ＥＰ１８５９８１１
【特許文献２】特表２０１２−５２３３８３
【特許文献３】特表２０１１−５０９６５２（ＷＯ２００９／０８７５７７）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Paoletti, X., Oba, K., Burzykowski, T., Michiels, S., Ohashi, Y., Pignon, J.P., Rougier, P., Sakamoto, J., Sargent, D., Sasako, M., et al. (2010). Benefit of adjuvant chemotherapy for resectable gastric cancer: a meta-analysis. JAMA 303, 1729-1737.
【非特許文献２】Sakuramoto, S., Sasako, M., Yamaguchi, T., Kinoshita, T., Fujii, M., Nashimoto, A., Furukawa, H., Nakajima, T., Ohashi, Y., Imamura, H., et al. (2007). Adjuvant chemotherapy for gastric cancer with S-1, an oral fluoropyrimidine. N Engl J Med 357, 1810-1820.
【非特許文献３】Campbell, P.J., Yachida, S., Mudie, L.J., Stephens, P.J., Pleasance, E.D., Stebbings, L.A., Morsberger, L.A., Latimer, C., McLaren, S., Lin, M.L., et al. (2010). The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature 467, 1109-1113.
【非特許文献４】Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., Fu, B., Kamiyama, M., Hruban, R.H., Eshleman, J.R., Nowak, M.A., et al. (2010). Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature 467, 1114-1117.
【非特許文献５】O'Connell, M.J., Martenson, J.A., Wieand, H.S., Krook, J.E., Macdonald, J.S., Haller, D.G., Mayer, R.J., Gunderson, L.L., and Rich, T.A. (1994). Improving adjuvant therapy for rectal cancer by combining protracted-infusion fluorouracil with radiation therapy after curative surgery. N Engl J Med 331, 502-507.
【非特許文献６】Ansaloni, L., Coccolini, F., Morosi, L., Ballerini, A., Ceresoli, M., Grosso, G., Bertoli, P., Busci, L., Lotti, M., and Cambria, F. (2014). Pharmacokinetics of concomitant cisplatin and paclitaxel administered by hyperthermic intraperitoneal chemotherapy to patients with peritoneal carcinomatosis from epithelial ovarian cancer. British journal of cancer.
【非特許文献７】Sloothaak, D., Mirck, B., Punt, C., Bemelman, W., van der Bilt, J., D'Hoore, A., and Tanis, P. (2014). Intraperitoneal chemotherapy as adjuvant treatment to prevent peritoneal carcinomatosis of colorectal cancer origin: a systematic review. British journal of cancer 111, 1112-1121.
【非特許文献８】Lindell, T.J., Weinberg, F., Morris, P.W., Roeder, R.G., and Rutter, W.J. (1970). Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin. Science 170, 447-449.
【非特許文献９】Ward, J., Kapadia, K., Brush, E., and Salhanick, S.D. (2013). Amatoxin poisoning: case reports and review of current therapies. J Emerg Med 44, 116-121.
【非特許文献１０】Moldenhauer, G., Salnikov, A.V., Luttgau, S., Herr, I., Anderl, J., and Faulstich, H. (2012). Therapeutic potential of amanitin-conjugated anti-epithelial cell adhesion molecule monoclonal antibody against pancreatic carcinoma. J Natl Cancer Inst 104, 622-634.
【非特許文献１１】Andersson, M.K., Stahlberg, A., Arvidsson, Y., Olofsson, A., Semb, H., Stenman, G.,Nilsson, O., and Aman, P. (2008). The multifunctional FUS, EWS and TAF15 proto-oncoproteins show cell type-specific expression patterns and involvement in cell spreading and stress response. BMC Cell Biol 9, 37.
【非特許文献１２】Tan, A.Y., and Manley, J.L. (2009). The TET family of proteins: functions and roles in disease. J Mol Cell Biol 1, 82-92.
【非特許文献１３】Martini, A., La Starza, R., Janssen, H., Bilhou-Nabera, C., Corveleyn, A., Somers, R., Aventin, A., Foa, R., Hagemeijer, A., Mecucci, C., et al. (2002). Recurrent rearrangement of the Ewing's sarcoma gene, EWSR1, or its homologue, TAF15, with the transcription factor CIZ/NMP4 in acute leukemia. Cancer research 62, 5408-5412.
【非特許文献１４】Sjogren, H., Meis-Kindblom, J., Kindblom, L.G., Aman, P., and Stenman, G. (1999). Fusion of the EWS-related gene TAF2N to TEC in extraskeletal myxoid chondrosarcoma. Cancer research 59, 5064-5067.
【非特許文献１５】Schatz, N., Brandlein, S., Ruckl, K., Hensel, F., and Vollmers, H.P. (2010). Diagnostic and therapeutic potential of a human antibody cloned from a cancer patient that binds to a tumor-specific variant of transcription factor TAF15. Cancer research 70, 398-408.
【非特許文献１６】Kreso, A., O'Brien, C.A., van Galen, P., Gan, O.I., Notta, F., Brown, A.M., Ng, K., Ma, J., Wienholds, E., Dunant, C., et al. (2013). Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer. Science 339, 543-548.
【非特許文献１７】Ramaswamy, S., Ross, K.N., Lander, E.S., and Golub, T.R. (2003). A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat Genet 33, 49-54.
【非特許文献１８】Sharma, S.V., Lee, D.Y., Li, B., Quinlan, M.P., Takahashi, F., Maheswaran, S., McDermott, U., Azizian, N., Zou, L., Fischbach, M.A., et al. (2010). A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80.
【非特許文献１９】Baylin, S.B. (2011). Resistance, epigenetics and the cancer ecosystem. Nat Med 17, 288-289.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ほとんどの再発がんは、悪性度の高い表現型を獲得するのに必要とされる推定時間よりもはるかに短い期間で生じることから、再発の機構は、根本的な遺伝的原因を有することよりむしろ悪性表現型の薬物耐性に関連することが知られている、クロマチンの構造変化、選択的遺伝子発現および集団選択を含む機能的変化（非特許文献１７〜１９：Kreso et al., 2013; Ramaswamy et al., 2003; Sharma et al., 2010）に基づくと仮定した。したがって、薬物治療後に細胞分裂および増殖を抑制し得る標的分子を同定することが重要である。
【００１０】
一方、そのような標的の定義は、薬物および細胞の種類に依存して不均一な集団の異なる生存機構から生じるかもしれないさまざまな標的のために難しいかもしれない（非特許文献２０：Baylin, 2011）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
がんの再発機構を解明するため、本発明者らは、抗がん剤存在下で生存可能な亜集団である薬剤耐性コロニー（DTC）を用い、DTC生存に対するRNAポリメラーゼII（RNAPII）阻害のインパクト、ならびにもっとも重篤な末期がん状態の一つであるがん性腹膜炎（PC）を予防すべく、RNAPII阻害およびシスプラチン（CIS）が続いて投与された場合について鋭意研究した。その結果、本発明者らは、汎用のCISを用いた化学療法と組み合わせたRNAPII阻害剤α-アマニチン（α-AMA）がPCの抑制において顕著な役割を担うことを見出した。
【００１２】
さらに本発明者らは、α-AMAの分子標的を探索した結果、RNAPIIに直接結合する転写因子であるTAF15のmRNAが、DTC形成を開始するための重要な要因の一つであることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、以下を提供する。
[１]腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、TAF15遺伝子またはその産物の使用（ヒト個体での実施を除く。）。
[２]腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための物質（substance）の開発における、TAF15遺伝子またはその産物の使用。
[３]物質が、分子標的薬である、２に記載の使用。
[４]物質が、TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、ペプチド、アンチセンス分子、siRNAおよび低分子化合物、ならびにTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体からなる群より選択されるいずれか一の開発における、２に記載の使用。
[５]TAF15遺伝子の産物の使用であり、該産物が、mRNAである、１〜５のいずれか１項に記載の使用。
[６]TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、ペプチド、アンチセンス分子、siRNAおよび低分子化合物、ならびにTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体からなる群より選択されるいずれか一を含む、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬組成物。
[７]TAF15遺伝子またはその産物を用いることを特徴とする、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための物質（substance）のスクリーニング方法。
[８]物質が、分子標的薬である、７に記載の方法。
[９]物質が、TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、ペプチド、アンチセンス分子、siRNAおよび低分子化合物、ならびにTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体からなる群より選択されるいずれか一である、７に記載の方法。
[１０]対象から得られた生物学的試料中のTAF15遺伝子またはその産物を分析することを含む、対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現の予測を補助する方法。
[１１]TAF15遺伝子またはその産物を分析することが、TAF15_mRNAの量またはTAF15蛋白質の量を測定することにより決定される、１０に記載の方法。
[１２]TAF15遺伝子またはその産物の、対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を予測するためのバイオマーカーとしての使用。
[１３]対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現の予防のための、殺細胞性抗腫瘍薬と抗TAF15抗体との複合体。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】(A)それぞれの細胞株のシート形態およびコロニーの形態の代表的イメージ。スケールバー＝100μm。(B)シートおよびコロニー中の細胞の薬剤感受性。各細胞株のGI50およびCI50濃度を、それぞれ増殖抑制アッセイおよびコロニー形成アッセイにより測定した。星印は阻害がなかったことを示す。点線はヒトにおける各薬剤のピーク血漿濃度を示す。全ての実験は３重に実施した。エラーバーは± SEMを表す。
【図２】MKN45由来の未処理コロニーおよびDTC。用量反応曲線中に、コロニー出現抑制に必要なCIS濃度を示す。未処理コロニーはCIS不在下にて得て（薄い灰色の矢印）、DTCはIC50においてCISにより処理した後に得た（黒の矢印）。各実験は３回行った。エラーバーは±SEMを表す。
【図３】短期間のα-アマニチン処理はがん細胞のコロニー形成能力および播種性転移能力を枯渇させる。（A）遺伝子発現プロセスおよび蛋白質合成プロセスにおける、分子標的部分の模式図。（BおよびC）コロニー形成アッセイに基づいた阻害化合物のスクリーニング。（B）トリコスタチンA（TSA）、アクチノマイシンD（AMD）、α-アマニチン（α-AMA）およびシクロヘキシミド（CHX）の１０倍連続希釈を含む培地にHCT116細胞を播種した（左）。黒矢印は、一時的な薬物処理によるコロニー形成アッセイに関して使用された濃度である、各化合物に関してのCI50値より１０倍大きい濃度を示す。左のパネルの黒矢印に対応する濃度における細胞の播種前の各化合物を用いた一時的処理（０、４および２４時間）によるコロニー形成の阻害（右）。（C）５つのがん細胞株におけるα-AMA処理のコロニー形成に対する効果の確認。細胞の播種前に細胞を一時的に（４または２４時間）各化合物により処理した。非処理のコロニー数に対するコロニー数をパーセンテージとして示す。細胞株を右側に示す。（DおよびE）一時的（４時間）なα-AMA処理はヌードマウスにおいてMKN45細胞の腹膜播種性転移を枯渇させる。（D）DMSOまたはα-AMAにより処理されたMKN45細胞の腹膜内注入後のヌードマウスの体重。実験の各群は３つのbiological replicatesのセットにおいて実施した。エラーバーは± SEMを表す。腹膜注射後の２８日目にDMSOまたはα-AMAを処理された群を比較するための**p < 0.01、スチューデントｔ検定。（E）DMSOまたはα-AMAを処理された群における播種性腹膜小結節を有する腸間膜（左）。MKN45細胞の腹膜内注入後２８日目の小結節の数（右）。実験の各群は６つのbiological replicatesのセットにおいて実施した。エラーバーは± SEMを表す。***p < 0.001、スチューデントｔ検定。
【図４】（A）各染色体および細胞遺伝学的なバンドに対応する遺伝子セットを染色体の数およびサイトバンドに基づいてプロットした（上部パネル）。DTCsに比較して未処理細胞においておよび未処理細胞に比較してDTCsにおいて、顕著におよび濃縮された４７遺伝子セット（FDR < 0.25およびp < 0.05）が強調されている。各遺伝子セットは、Normalized Enrichment Score（NES）に従い色づけされ、垂直線として示される。DTCsまたは未処理コロニーのいずれかにおいて濃縮されたもっとも顕著な６つの遺伝子セットのGSEAプロットを左下のパネルに示す。顕著ではない６つの遺伝子セットも、右下のパネルに示す。（B）0.2μM CIS存在下におけるコロニー形成の前に、MKN45細胞をTSAおよびα-AMAの２倍連続希釈により一時的（４時間）に処理した。各薬剤のもっとも高い濃度は、底部の各々のパネルにおいて示されたとおり、CI25値であった。***p < 0.001、スチューデントｔ検定。ns：有意でなかった。（C）DCTsにおいて上昇した発現を有する１０のヌクレオチド結合蛋白質コード遺伝子（左）。転写マイクロアレイ分析からの１０の候補のうち、TAF15がRNAPIIを直接結合する蛋白質をコードする唯一の遺伝子である。MKN45に由来するDTCsおよび未処理コロニーにおけるTAF15蛋白質レベルを判定するためのウエスタンブロットを示す（右上部パネル）。GAPDHをローディングコントロールとして用いた。TAF15遺伝子の転写開始領域におけるCpGサイトの相対的メチル化レベルを示す（右底部パネル）。（D）TAF15のmRNAの相対量をqRT-PCRを用いて定量した。０、４、および２４時間DMSOまたはα-AMAにより処理されたMKN45細胞から全RNAを単離した。値はGAPDH mRNAと比較して標準化され、log10比として表された。各実験は３重に実施した。**p < 0.01、スチューデントｔ検定。（E）α-AMA処理およびTAF15 siRNAトランスフェクションの両方がMKN45細胞において形態的変化を誘導する。スケールバー= 20μM。（F）２つの個別のTAF15標的化siRNAs（si-TAF15）またはスクランブルsiRNAをトランスフェクトされたMKN45細胞のコロニー形成アッセイ。0.2μM CISの存在（DTCs）および非存在（未処理）下におけるコロニー形成アッセイの前に、MKN45細胞にsiRNAsをトランスフェクトした。播種から１３日後、クリスタルバイオレットで染色された細胞を計数した。トランスフェクトされなかった細胞と比較したsiRNAトランスフェクト細胞のコロニー数をパーセンテージとして示す。si-TAF15 #1および#2は、CDS3'UTRをそれぞれ標的とした。各実験は３重に実施した。エラーバーは± SEMを表す。**p < 0.01、スチューデントｔ検定。
【図５】α-AMAはヌードマウスにおける化学療法後にPCを予防した。（A）α-AMA単剤投与（α-AMA）、CIS単剤投与（CIS）、α-AMAおよびCIS逐次投与（α-AMA/CIS）された、または未処理のPCマウスの体重変化。実験の各群は１６のbiological replicatesのセットにおいて実施した。エラーバーは± SEMを表す。（B）未処理、CIS、α-AMA、およびα-AMA/CIS群からの腸間膜組織中に播種した腹膜小結節の代表的イメージ。（C）MKN45細胞腹膜注入後２８日の未処理およびCIS、α-AMA、およびα-AMA/CIS群のPCマウス中の小結節の平均数の比較。実験の各群は６つのbiological replicatesにおいて実施した。***p < 0.001、スチューデントｔ検定。（D）未処理またはCIS、α-AMA、およびα-AMA/CISによる処理群のPCマウスのカプランマイヤープロット。実験の各群は１０のbiological replicatesのセットにおいて実施した。p値はlogランク検定を用いて測定した。（E）未処理、CIS、α-AMA、およびα-AMA/CIS群の死までの平均時間の比較。α-AMA/CIS群は死まで顕著に長い時間を示した。エラーバーは±SEMを表す。**p < 0.05、マンホイットニーU検定。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
数値範囲をX〜Yは、両端の値XおよびYを含む。Aおよび／またはBは、AとBの少なくとも一方であることを意味し、Aである場合、Bである場合、AおよびBである場合を含む。疾患または状態に関し、処置というときは、予防、発症の遅延、発症後の場合は進行の遅延、状態の改善、治療を含む。医薬は、医薬組成物（製剤）、医薬組成物の組み合わせ、キット（製剤、製剤の組み合わせに加えて、それ以外のもの、例えば説明のための情報、投与のための治具等を含む。）を含む。
【００１６】
本発明は、 腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、TAF15遺伝子またはその産物の使用に関する。また本発明は、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための物質（substance）の開発における、TAF15遺伝子またはその産物の使用に関する。物質は、抽出物、組成物、化合物を含み、また治療のためのもの、診断のためのものを含む。
【００１７】
TAF15遺伝子およびTAF15蛋白質の配列は、公知であり、例えば、TAF15についてはAccession No. NM 003487を、TAF15蛋白質については、前掲非特許文献１５：Schatz et al., 2010および特許文献３において明らかである。また本発明および本明細書でTAF15遺伝子またはその産物というときは、上記のAccession No.または文献において開示された配列からなるポリヌクレオチドのみならず、そのバリアント（すなわち高い配列同一性を有し、かつその発現産物である蛋白質が、TAF15蛋白質と同等のRNAPIIへの結合活性を有するもの）も含む。高い配列同一性とは、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を有することをいう。本発明で配列に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で一致した塩基の個数の百分率を意味し、市販されている当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより計算することができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。また、本発明で結合活性に関し「同等」というときは、特に記載した場合を除き、目的の結合能力が、TAF蛋白質の少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上であることをいう。
【００１８】
物質は、分子標的薬であり得る。また、物質は、TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、ペプチド、アンチセンス分子、siRNAおよび低分子化合物、ならびにTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体であり得る。なお、本明細書で、抗TAF15抗体というときは、TAF15遺伝子またはその産物に対する抗体を指す。TAF15遺伝子の産物は、TAF15_mRNAおよびTAF15蛋白質を含む。
【００１９】
本発明はまた、TAF15遺伝子またはその産物に結合性の、ペプチド、アンチセンス分子、siRNAおよび低分子化合物、ならびにTAF15遺伝子またはその産物に対する抗体からなる群より選択されるいずれか一を含む、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬組成；ならびにTAF15遺伝子またはその産物を用いることを特徴とする、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための物質（substance）のスクリーニング方法を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、対象から得られた試料中のTAF15遺伝子またはその産物を分析することを含む、対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現の予測する方法、およびその予測を補助する方法；ならびにTAF15遺伝子またはその産物の、対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を予測するためのバイオマーカーとしての使用も提供する。予測の補助は、医師による医療行為を含まない。対象は、培養細胞、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、サル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、愛玩動物、家畜等）、ヒト（健常人、がんに罹患するリスクの高い人、患者等）であり得る。バイオマーカーは、試料を得た対象の状態を予測しまたは表すためのものである。TAF15遺伝子またはその産物を分析することは、TAF15_mRNAの量またはTAF15蛋白質の量を測定することであり得る。
【００２１】
遺伝子の発現レベルの決定は、様々な技術によって実施できる。好ましくは、決定は、試料をプローブ、プライマーまたはリガンドのような選択的試薬と接触させること、そしてそれによりもともと試料中にある対象となる核酸の存在を検出または量を測定する事を含む。ｍＲＮＡの量を検出する方法は、当業者によく知られている。例えば、試料（例えばがん患者から調製される生検）中に含まれる核酸は、最初に標準的な方法に従い、例えば、溶解酵素または化学的溶液を用いて抽出されるか、または製造者の説明書に従い核酸結合レジンによって抽出される。抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）により検出される。所望の態様において、遺伝子の発現レベルはＲＴ−ＰＣＲにより決定され、好ましくは定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、さらにもっと好ましくはリアルタイム定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。
【００２２】
増幅の他の方法は、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。
【００２３】
遺伝子の発現レベルの決定は、対象から得られた試料中の蛋白質の濃度を計測する事により実施される。好ましくは、蛋白質の濃度は、対象から得られた血液、血漿または血清において計測される。計測は、既存の方法により実施できる。
【００２４】
特定の態様では、そのような方法は、試料を、試料中存在する目的蛋白質と選択的に相互作用できる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーはポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。別の態様では結合パートナーはアプタマーであり得る。アプタマーは、既存の方法に従って産生できる。アプタマーは分子認識の点から抗体の代替に相当するクラスの分子であり、高いアフィニティーと特異性を有する、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドである。
【００２５】
抗体またはアプタマーのような結合パートナーは、蛍光分子、酵素、放射活性物質、または既存のいずれかの標識のような検出可能な分子または物質で標識できる。
【００２６】
本発明はまた、対象における腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発、または抗がん剤に対する耐性を示す細胞の出現の予防のための、殺細胞性抗腫瘍薬と抗TAF15抗体との複合体を提供する。このような複合体分子は、新規なものである。
【００２７】
殺細胞性抗腫瘍薬には、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、抗がん抗生物質、微小管作用抗がん剤（アルカロイド系抗がん剤）に分類できるが、これらのうちでは、特にアルキル化剤または白金化合物が好ましい。
【００２８】
白金化合物は、白金を含み、ＤＮＡ分子の鎖間架橋形成によってＤＮＡ合成を阻止する化合物である。白金化合物の例は、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、シスプラスチン、サトラプラチン、およびＺＤ０４７３、ＢＢＲ３４６４である。
【００２９】
殺細胞性抗腫瘍薬として、抗がん剤として慣用されているものを用いてもよく、このような例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン，イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン が挙げられる。本発明者らの検討によると、特に好ましい例は、シスプラチンである。
【００３０】
複合体はまた、殺細胞性抗腫瘍薬に替えて、または殺細胞性抗腫瘍薬とともにRNAポリメラーゼII阻害剤を含んでいてもよい。殺細胞性抗腫瘍薬または殺細胞性抗腫瘍薬のいずれか一方を複合体とし、他方を併用する態様もまた、本発明の範囲内である。RNAポリメラーゼII阻害剤の好ましい例は、アマトキシンまたはその誘導体である。
【００３１】
アマトキシンは、アマニタ（Amanita）属から単離され参考文献（Wieland, T. and Faulstich H., 1978）に記載されるような８個のアミノ酸から構成される環状ペプチドである。機能的には、アマトキシンは、哺乳動物のRNAポリメラーゼIIを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリンおよびアマヌリン酸、およびそれらの類縁体である。本発明における使用のために特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチンである。
【００３２】
ある化合物の類縁体は、その化合物に類似する化学構造を有するが、その化合物中には存在しない少なくとも１つの化学基を含有し、および／または該化合物中に存在する少なくとも１つの化学基を欠く化学種、およびその化合物の医薬として許容される塩を指す。医薬として許容される塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸との反応により得られる塩が例示できる。類縁体は、１つまたは複数の工程で親化合物から作製することができる。
【００３３】
ある化合物の類縁体は、該化合物と構造的に関連するが同一ではなく、該化合物の少なくとも１つの活性を示す。類縁体の比較対象となる化合物は、親化合物として知られる。活性は、別の化合物との結合活性、阻害活性、例えば酵素阻害活性、毒性効果、活性化活性、例えば酵素活性化活性を含むがこれらに限定されない。類縁体は、活性を親化合物と同程度示す必要はない。ある物質が親化合物の活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の活性を示す場合、該物質は類縁体とみなされる。したがって、アマトキシンの類縁体は、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリンおよびアマヌリン酸のいずれか１つと構造的に関連し、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリンおよびアマヌリン酸の少なくとも１つと比較して哺乳動物のRNAポリメラーゼIIに対する少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の阻害活性を示す物質を指す。好適なアマトキシンの類縁体はさらに、哺乳動物のRNAポリメラーゼIIに対してα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリンまたはアマヌリン酸のいずれか１つより大きな阻害活性を有しうるか、および／またはα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリンまたはアマヌリン酸のいずれか１つより低減された毒性を有しうる。阻害活性は、当業者にはよく知られた方法により測定することができる。
【００３４】
RNAポリメラーゼII阻害剤の他の例は、5,6-ジクロロベンゾイミダゾール1-β-D-リボフラノシド（DRB）である（Selective inhibitation of transcription elongation a)L. A. Chodosh, A. Fire, M. Samuels, P. A. Sharp, J. Biol. Chem. 1989, 264, 2250）。
【００３５】
複合体は、医薬組成物とすることもできる。製剤の形態とする場合、製剤の剤型に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示でき、経口剤が好ましい。
【００３６】
医薬には、医薬として許容される種々の賦形剤を添加することができる。このような賦形剤としては、通常の薬物に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。具体的な賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。
【００３７】
医薬は、一の剤型に製剤化したもの（１剤型製剤）でも、同時にまたは間隔を空けて別々に使用できるように、有効成分を単剤（単一の有効成分を含有する製剤）として複数の剤型に製剤化したもの（他剤型製剤）であってもよい。また、少なくとも一の殺細胞性抗腫瘍薬および少なくとも一のRNAポリメラーゼII阻害剤等を含む医薬は、上記製剤ごとにそれぞれ個別に製造・梱包・流通されるものでもよく、また、上記製剤の全てまたは一部を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・梱包・流通されるものでも良い。また、複数の剤型に製剤化する場合は、当該製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってよい。
【００３８】
キットは、化学療法後または手術後、２週間以内に投与することの情報を含んでいてもよい。情報は、紙等の媒体に記録したものとすることができ、具体的には、添付文書、パンフレット等の形態を採りうる。情報は、製剤またはキットのパッケージに印刷・添付されていてもよい。
【００３９】
医薬の投与スケジュールは、患者の年齢、性別、体重、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、化学療法または治療的切除の直後から、またはそのおよそ２週間以内、例えば、１４日以内、１０日以内、５日以内、３日以内、２日以内、１日以内に投与を開始することができる。本発明により、下記実施例にて詳述されるように、化学療法または治療的切除の後の早期の段階に投与することが可能であり、効率的に再発を処置することができ、有利である。
【００４０】
医薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、病期、転移の有無、治療歴、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択することができる。また、当該抗腫瘍剤の投与スケジュールは、患者の年齢、体重、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択することができ、例えば、１日１回または２〜４回に分割して連日投与することが好ましい。
【００４１】
医薬は、他の抗腫瘍剤と併用して投与することもできる。
【実施例】
【００４２】
［実験１：殺細胞性抗腫瘍薬のコロニー形成抑制効果］
対数的に成長する細胞の成長抑制アッセイは、薬物が固形腫瘍のサイズを減少させるかまたは安定化する能力を反映するが、コロニー形成アッセイは薬物耐性腫瘍惹起single cells（Singh et al., 2003）からもたらされる最小数のがん細胞による再発を模倣する。慣用の化学療法剤について、５つのがん細胞株を用いてコロニー形成を５０％抑制するのに必要な薬物濃度（CI50）を求めた。
【００４３】
方法：
各細胞株のGI50およびCI50濃度を、それぞれ増殖抑制アッセイおよびコロニー形成アッセイにより測定した。
コロニー形成アッセイは、次のように行った。細胞の播種の前に、薬物非添加の対照を含めて、薬物の６通りの１０倍連続希釈（出発濃度は各条件に関してCI50であった）を６ウエルプレートに分配した。次に、用意された６つのプレート中に低密度にて（10-20 cells/cm2）細胞を入れた。播種後８−２１日以内に薬剤非添加対照において、ウェルあたり約５０のコロニーが出現した。
【００４４】
コロニーの計数は、コロニー形成アッセイセクションに記載されたとおりに実施した。
【００４５】
結果：
形態的観察により、成長抑制アッセイのための対数増殖期の細胞がフラスコの中で二次元的に伸展する（即ち、シート状）のに対し、コロニー形成細胞は密集して、小さく、そして縦方向に増殖することが観察された（図１A）。いずれの細胞株に対しても、慣用の殺細胞性抗腫瘍薬シスプラチン（CIS）およびドセタキセル（DTX）のCI50は、成長抑制に必要な濃度（GI50）よりも２−３桁小さかった。これに対し、分子標的薬物ゲフィチニブ（GEF）およびソラフェニブ（SOR）のCI50は、対応するGI50の数倍〜１０倍未満であった（図1B）。
【００４６】
［実験２：コロニー惹起へのRNAPII阻害の高い有効性］
薬物耐性コロニー（DTC）は、CI50濃度において抗がん剤の存在下にて生存し得るコロニーとして定義される（図2）。本発明者らは、別の研究により、DTC形成のためのもっとも重要な機構の一つは、転写の制御であるとの知見を得ていた。今般、どの段階がコロニー形成細胞における転写活性に支配的に影響するのかを検討した。図3Aに、遺伝子発現プロセスおよび蛋白質合成プロセスにおける、分子標的部分の模式図を示した。
【００４７】
実験方法：
クロマチン形成、転写または蛋白質合成を阻害する４つの化合物により単純なスクリーニングを実施した。トリコスタチンA（TSA）は、クラスI/IIのヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を阻害する抗菌性抗生物質である（Bolden et al., 2006）。アクチノマイシンD（AMD）は、RNAPI（0.05μg/mlにおいて）、RNAPII（0.5μg/mlにおいて）およびRNAPIII（5μg/mlにおいて）の阻害剤として作用することにより複数の種類の肉腫を治療するための臨床的応用性を有する環状ポリペプチド含有抗生物質である（Bensaude, 2011）。α-AMAはキノコの毒素であって、RNAPIIの阻害剤である（Bensaude, 2011; Lindell et al., 1970）。シクロヘキシミド（CHX）は抗菌性抗生物質であって、翻訳伸長の阻害剤である（Schneider-Poetsch et al., 2010）。
【００４８】
本発明者らは最初に、TSA、AMD、α-AMAおよびCHXの１０倍連続希釈を含む培地にHCT116細胞を播種し、実験１に記載の手法に従い、各阻害剤に関してCI50濃度を決定した。各化合物のCI50値の１０倍濃度をコロニー形成アッセイにおいて、４および２４時間の暴露に用いた。
【００４９】
結果：
結果を図3Bに示した。TSAは２４時間の暴露によりコロニー形成を抑制した。α-AMAは、TSAと同様の２４時間の処理による完全なコロニーの抑制に加えて、４時間のみの暴露においても効果を生じた。一方、特異性の低いRNAP阻害剤AMDは４時間および２４時間の両方において顕著なコロニーの抑制を示さなかったことから、RNAPIIの選択的阻害がコロニー形成の阻害効果において顕著な役割を担うことが示唆される。CHXはコロニー形成をわずかに抑制したが、蛋白質合成のCHX-誘導性阻害のコロニー形成減少に対する効果は、エピジェネティック制御およびmRNA合成のそれよりも穏やかなようであった。クロマチン修飾は、コロニー形成の間の遺伝子発現における変化に隠れた主要な原因の一つであるかもしれないが（Shi et al., 2011）、本実験による発見は、初期mRNA合成のRNAPII依存性阻害がコロニー形成のほぼ完全な抑制を生じさせるのに十分であることを暗示する。
【００５０】
本発明者らは、RNAPII阻害により生じたコロニー抑制効果が別の細胞株において起こるか否かも実験した。５つのがん細胞株（HCT116、Hela、HT29、MFC7、およびMKN45）の播種前に細胞を一時的に（４または２４時間）各化合物により処理し、それぞれに生じたコロニー数を計数し、非処理のコロニー数に対するコロニー数のパーセンテージを求めた（図３C）。TSAおよびα-AMAの両者が２４時間暴露の後に顕著なコロニー抑制を示した。４時間のα-AMA暴露は試験された細胞株すべてに関してのほぼ完全なコロニー抑制効果に十分であった。
【００５１】
コロニー抑制がインビボにおいて再生され得るか否かを実験するため、本発明者らは次に４時間α-AMAで処理された1.0×106個のMKN45細胞の腹膜注射後のヌードマウスを観察した。MKN45細胞の腹膜注射を受けたマウスは体重の一定の減少を示した一方で、α-AMAで処理した細胞を注射されたマウスは体重を維持し（図3D）、これは消化管の機能不全が低減されたためのように思われた。がん細胞の腹膜注射の２８日目に、α-AMA処理されたがん細胞を受けたマウスにおける腹膜の小結節の数が、未処理のMKN45細胞を受けたマウスに比較して顕著に減少した（図3E）。
【００５２】
［実験３：RNAPII依存性薬物耐性表現型とTAF15遺伝子発現の関連］
DTCsに関連する転写制御機構は、薬剤の存在下で無期限に増殖するがん細胞の小集団である薬剤耐性細胞集団（DTEPs）の出現の間に起こる、非ランダムな全体的なクロマチンの変化に関連するとの報告がある（Sharma et al., 2010）。予想されたとおり、さまざまな染色体局在に伴う別々に発現された遺伝子のDTC中の分布は大部分ランダムでなかった（図６A）。別の実験では、遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）は、高密度の遺伝子発現が染色体座特異的に観察され、染色体メチル化の状態とおおよそ一致したことを明らかにした。これらの観察をもとに、短時間（４時間）暴露後のDTC抑制におけるHDAC阻害剤TSAの効果を検証した。
【００５３】
短時間（４時間）の暴露後のDTC発生の抑制に関して、TSAおよびα-AMAの効果をさらに検討した。具体的には、ヒト胃がん細胞系MKN45の細胞を高密度にて（1.0×105 cells/cm2）４８ウエルプレート上にプレートし、TSA（0、2.1、4.2、および8.4μM）またはα-AMA （0、0.7、1.4、および2.8μM）により処理した。
【００５４】
高濃度のTSAを用いて顕著なDTCの抑制が観察されたが、α-AMAはそれでもなおDTCの抑制に関して、より有力であるようにみえた（図4B）。
【００５５】
我々は、次に、転写DNAマイクロアレイデータに基づいて、可能性のある分子標的をスクリーニングした（図4A）。DTCsにおいて特異的に誘導された遺伝子の上位2.5%で、遺伝子産物がRNAPIIに結合することからTAF15に焦点を絞った（Kwon et al., 2013）。TAF15のプロモーターのメチル化状態およびタンパク発現レベルは遺伝子発現データと十分に一致した（図4C）。TAF15は、RNA結合蛋白質のFET（FUS/EWS/TAF15）ファミリーの一つであるTATA結合蛋白質（TBP）関連因子15をコードする（Andersson et al., 2008）。最近、TAF15タンパクはRNAPIIのC末端ドメインに直接結合すると報告された（Kwon et al., 2013）。α-AMA 処理に応答して、TAF15 mRNAレベルは時間依存性に低下したことから、TAF15 mRNA に対するRNAPII活性はα-AMAにより阻害されたことが示唆された（図4D）。注目すべきことに、類似の形態的変化がTAF15ノックダウンおよびα-AMA処理後のMKN45細胞において観察された（図4E）。コロニー形成アッセイでは、TAF15ノックダウンがDTCsおよび未処理コロニーの両方の出現を抑制したことから、TAF15はDTC抑制においてα-AMA の重要な標的であることが示唆された（図4F）。
【００５６】
これらの結果は、α-AMA 処理がDTCsにより引き起こされるPCなどの疾患において、TAF15 mRNA 合成阻害を機序とする治療の可能性を示唆する。
【００５７】
［実験４：α-AMAによる、CIS処理後生存細胞によるPCの抑制］
実験3で示したように、α-AMAによるインビトロにおけるDTC発生の抑制（図4B）は、α-アマニチンがPCの処置に有用であることを期待させる。α-AMAの経口摂取は消化管、肝臓および腎臓における毒性のために直接死に結びつくことが報告されている（Word et al., 2013）。本発明者らは、確立された再発PCモデルを用いて、薬物処理後のMKN45細胞の腹腔内接種により、α-AMAの治療的特性および毒物学的特性の両方を調べた。
【００５８】
I.  方法
細胞をsingle cell懸濁液にまで希釈して、0.2μM CISの存在または不在下で低密度にて（2.6×102cells/cm2）播種した。条件ごとに播種後１３日目のコロニー数をカウントした。
【００５９】
1.0 x 106のMKN45細胞を６週齢のメスヌードマウス（BALB/cAjcl-nu/nu, CLEA）に腹腔内注射した。次に、マウスをCIS（4 mg/kg, 腹腔内投与）、またはCISおよびα-AMAの組み合わせ（0.4 mg/kg, 腹腔内投与）により処置した。組み合わせの処置に関しては、α-AMAをCISの２４時間前に投与した。処置後２８日間体重を監視した。なお、すべての動物実験は動物実験規則に関する岩手医科大学倫理委員会により承認された。
【００６０】
II.  結果
腫瘍細胞接種後のマウスの体重は、α-AMAのみ（α-AMA）、CISのみ（CIS）および非処理の群において１０日目から急激な減少を示したのに対し、α-AMAおよびCIS（α-AMA/CIS）の連続投与を受けた群は、体重を維持した（図5A）。
【００６１】
小結節はα-AMA群、CIS群および非処理群において主に腸間膜において延展し、1 - 5 mmの直径に及んだが、α-AMA/CIS群の大多数は、ほとんどまたはまったく小結節を呈さなかった（図5B）。事実、α-AMA/CIS群の小結節の平均数は顕著に減少し、一方CISおよびα-AMAの単一投与群は類似の抑制効果を呈したものの、程度は低かった（図5C）。
【００６２】
α-AMA群における６０日全体の生存率は１０％であり、そしてα-AMA/CIS群においては５６％であった（図5D）。４つの処理群の死までの平均時間の比較から、α-AMA/CIS群のみが死までに顕著に長い期間を示したことが明らかになった（図5E）。α-AMA/CIS処理により死までの平均時間の延長は、６０日の期間内において約１０日であった。
【００６３】
これらの結果から、CISと共に投与されたα-AMAは場合、PCによりがんの再発を予防する能力を有することが示される。総合すると、α-AMAとCISの組み合わせは、PCに関してα-AMAの抑制効果を増強し、同時にその毒性を減少させると考えられる。
【００６４】
［考察］
本発明者らは、抗がん剤の存在下で生存する亜集団である再発性のがん細胞のインビトロモデルとして、DTCを用いた。各薬物に対するDTCは、single cellまたは極めて少数の細胞のいずれかから惹起することが可能であり、治療的外科手術、続くアジュバント化学療法の後のヒトにおけるがんの再発のプロセスを模倣しうる。
【００６５】
本研究により、RNAPII阻害剤であるα-AMAがDTC発生を抑制することが分かった。またα-AMAはインビボにおいてPCの阻害効果を示した。これらのことからα-AMAは化学療法後、PCの予防のために適用されうることが示唆される。
【００６６】
α-AMAの分子標的探索の結果、RNAPIIに直接結合する転写関連因子TAF15をコードするTAF15遺伝子が同定された。TAF15は、RNAPII依存性転写機構およびpre-mRNAスプライシングを惹起する一般的な転写因子IID複合体においてTATA結合タンパク関連因子（TAF）として最初に単離されたものである（Bertolotti et al., 1996; Calvio et al., 1995）。TAF15タンパクは、肉腫における融合タンパクであるFUS、ユーイング肉腫タンパク（EWS）とともにFET（FUS/EWS/TAF15）ファミリーを形成し、遺伝子発現において様々な役割を有する（Tan and Manley, 2009）。TAF15は急性白血病（Martini et al., 2002）および骨外性粘液型肉腫（Sjogren et al., 1999）において染色体転座に関与し、細胞浸潤および接着を通して腫瘍の悪性度を高める融合タンパクを発現することがわかっている（Andersson et al., 2008）。このような研究から、TAF15の分子標的療法のために、ヒトIgG PAT-BA4が腫瘍特異的TAF15に対して開発された（Schatz et al., 2010）。PAT-BA4の治療効果はインビトロに限定的であったが、TAF15標的療法は癌細胞において接着および転移に抑制的な効果を示したことから、腫瘍悪性化におけるTAF15の重要性が示された。本研究においては、我々はTAF15のmRNAが癌再発に関連したDTC形成を惹起するための重要な因子の一つであることを証明した。
【００６７】
［実施例の項で引用した文献］
Bensaude, O. (2011). Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription 2, 103-108.
Bolden, J.E., Peart, M.J., and Johnstone, R.W. (2006). Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors. Nat Rev Drug Discov 5, 769-784.
Calvio, C., Neubauer, G., Mann, M., and Lamond, A.I. (1995). Identification of hnRNP P2 as TLS/FUS using electrospray mass spectrometry. RNA 1, 724-733.
Campbell, P.J., Yachida, S., Mudie, L.J., Stephens, P.J., Pleasance, E.D., Stebbings, L.A., Morsberger, L.A., Latimer, C., McLaren, S., Lin, M.L., et al. (2010). The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature 467, 1109-1113.
Lindell, T.J., Weinberg, F., Morris, P.W., Roeder, R.G., and Rutter, W.J. (1970). Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin. Science 170, 447-449.
Schneider-Poetsch, T., Ju, J., Eyler, D.E., Dang, Y., Bhat, S., Merrick, W.C., Green, R., Shen, B., and Liu, J.O. (2010). Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol 6, 209-217.
Shi, L., Sun, L., Li, Q., Liang, J., Yu, W., Yi, X., Yang, X., Li, Y., Han, X., Zhang, Y., et al. (2011). Histone demethylase JMJD2B coordinates H3K4/H3K9 methylation and promotes hormonally responsive breast carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7541-7546.
Singh, S.K., Clarke, I.D., Terasaki, M., Bonn, V.E., Hawkins, C., Squire, J., and Dirks, P.B. (2003). Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer research 63, 5821-5828.
Ward, J., Kapadia, K., Brush, E., and Salhanick, S.D. (2013). Amatoxin poisoning: case reports and review of current therapies. J Emerg Med 44, 116-121.
Wieland, T. (1968). Poisonous principles of mushrooms of the genus Amanita. Four-carbon amines acting on the central nervous system and cell-destroying cyclic peptides are produced. Science 159, 946-952.
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、TAF15の遺伝子のノックダウンによる、腫瘍の再発を抑制するための方法が提供される。本発明は、医療、医薬品製造、腫瘍に関する研究等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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