(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるポリペプチド。
（Ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ａ１）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（ａ２）配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチド、をコードする核酸。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるＤＮＡ。
（Ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ１）配列番号１における塩基番号１〜１８０６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号１における塩基番号１００〜１８０６で示される塩基配列。
（Ｂ）前記（Ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡの塩基配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸、及び／又は請求項３に記載のＤＮＡ、を含むベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸、請求項３に記載のＤＮＡ、及び／又は請求項４に記載のベクター、を保持する宿主細胞。
【請求項６】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む、ポリペプチドの製造方法。
（Ａ）請求項５に記載の宿主細胞を用いて、Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドを発現させる工程。
（Ｂ）前記（Ａ）の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１又は７に記載のポリペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
【請求項９】
ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の骨格中に存在するヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の割合が２０％〜７５％である、請求項８に記載の多糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパロサン−グルクロン酸−５−エピメラーゼに関する。具体的には、本発明は、Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するアフリカマイマイ由来の酵素、該活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該核酸及び／又は該ベクターを保持する宿主細胞、該ポリペプチドの製造方法、該酵素及び／又は該ポリペプチドを用いたヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願の明細書においては、以下の略号を使用することがある。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＰＧ：プロテオグリカン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＧｌｃＮ：グルコサミン
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸
ＨｅｘＡ：ヘキスロン酸
ａＭａｎ：２，５−アンヒドロマンノース
ＡＳ：アカラン硫酸
ＡＣＨ：アカラン（２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ）
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロサン
ＮＳＨ：Ｎ−脱アセチル化・Ｎ−硫酸化ヘパロサン
ＨＥＰ：ヘパリン
ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリン
ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰ：完全脱硫酸化・Ｎ−再硫酸化ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
Ｃ５−ｅｐｉ：ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ
ＨＧ−５ｅｐｉ：ヘパロサン−グルクロン酸−５−エピメラーゼ【０００３】
アカラン硫酸（ＡＳ）は、アフリカマイマイ（Ａｃｈａｔｉｎａ  ｆｕｌｉｃａ）から単離されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の一種であり、下記構造式（１）で表されるＧｌｃＮＡｃとＩｄｏＡ（２Ｓ）からなる二糖（−［４ＧｌｃＮＡｃα１−４ＩｄｏＡ（２Ｓ）α１］−）が繰り返し重合した構造からなる直鎖状のＧＡＧであることが知られている（非特許文献１、２）。また、ＡＳは、糖鎖骨格が共通するＧＡＧであるヘパリン（ＨＥＰ）またはヘパラン硫酸（ＨＳ）と類似した生理活性を有し、具体的には、血管新生阻害活性（非特許文献３）、免疫刺激活性（非特許文献４）、血糖降下活性（非特許文献４）、抗凝固活性（非特許文献５）、抗腫瘍活性（非特許文献６）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の接着阻害活性（非特許文献７）等を示すことが知られている。【０００４】
【化１】
0006478190.tif 000002
【０００５】
ＨＥＰおよびＨＳの生合成は、ノックアウトマウスまたは変異細胞株が発現する糖鎖構造の解析や、酵素の基質特異性を評価する実験の結果から、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＡからなる二糖（−［４ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡβ１］−）が繰り返し重合した構造からなるＧＡＧであるＮ−アセチルヘパロサン（ＮＡＨ）の合成、Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、ＧｌｃＡ残基のＩｄｏＡ残基への異性化、Ｏ−硫酸化、の順に行われていることが明らかにされている（非特許文献８、９）。これらのステップの内、ＧｌｃＡ残基のＩｄｏＡ残基への異性化は、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（Ｃ５−ｅｐｉ、ＥＣ：５．１．３．１７）により触媒される。すなわち、ＨＥＰおよびＨＳの生合成に関与する公知のＣ５−ｅｐｉは、いずれも、ＮＡＨがＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化されて生じるＧＡＧであるＮ−脱アセチル化・Ｎ−硫酸化ヘパロサン（ＮＳＨ）を基質とするが、ＮＡＨそのものを基質としないことが知られている（非特許文献１０〜１４、特許文献１、２）。【０００６】
アフリカマイマイにおいては、プロテオグリカン（ＰＧ）を生合成する酵素群を網羅的に同定するプロテオーム解析が行われており、既知タンパク質との相同性から、ＰＧのコアタンパク質またはＧＡＧを生合成する酵素が種々見出されている（非特許文献１５）。ＨＥＰおよびＨＳの合成系については、ＮＡＨの合成酵素、Ｎ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化酵素、およびＯ−硫酸化酵素と推定されるタンパク質が見出されている。しかしながら、公知の異性化酵素であるＣ５−ｅｐｉと相同性を有するタンパク質は見出されていない。また、アフリカマイマイにおいては、ＡＳの生合成に関する酵素カスケードは解明されておらず、ＩｄｏＡを合成する酵素が作用する基質や酵素反応によって得られるプロダクトは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第１９９８／０４８００６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００２／０４６３７９号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kim YS, Jo YY, Chang IM, Toida T, Park Y, Linhardt RJ., J Biol Chem. 1996 May 17; 271(20): 11750-5.
【非特許文献２】Kim YS, Ahn MY, Wu SJ, Kim DH, Toida T, Teesch LM, Park Y, Yu G, Lin J, Linhardt RJ., Glycobiology. 1998 Sep; 8(9): 869-77.
【非特許文献３】Ghosh AK, Hirasawa N, Lee YS, Kim YS, Shin KH, Ryu N, Ohuchi K., Br J Pharmacol. 2002 Oct; 137(4): 441-8.
【非特許文献４】Shim JY, Lee YS, Jung SH, Choi HS, Shin KH, Kim YS., Arch Pharm Res. 2002 Dec; 25(6): 889-94.
【非特許文献５】Li DW, Lee IS, Sim JS, Toida T, Linhardt RJ, Kim YS., Thromb Res. 2004; 113(1): 67-73.
【非特許文献６】Joo EJ, Yang H, Park Y, Park NY, Toida T, Linhardt RJ, Kim YS., J Cell Biochem. 2010 Aug 1; 110(5): 1272-8.
【非特許文献７】Sim JS, Hahn BS, Im AR, Park Y, Shin JE, Bae EA, Kim DH, Kim YS., Glycoconj J. 2011 Aug; 28(6): 411-8.
【非特許文献８】Lindahl U, Kusche-Gullberg M, Kjellen L., J Biol Chem. 1998 Sep 25; 273(39): 24979-82.
【非特許文献９】Esko JD, Lindahl U., J Clin Invest. 2001 Jul; 108(2): 169-73.
【非特許文献１０】Campbell P, Hannesson HH, Sandback D, Roden L, Lindahl U, Li JP., J Biol Chem. 1994 Oct 28; 269(43): 26953-8.
【非特許文献１１】Li J, Hagner-McWhirter A, Kjellen L, Palgi J, Jalkanen M, Lindahl U., J Biol Chem. 1997 Oct 31; 272(44): 28158-63.
【非特許文献１２】Hagner-Mcwhirter A, Lindahl U, Li Jp., Biochem J. 2000 Apr 1; 347 Pt 1: 69-75.
【非特許文献１３】Li JP, Gong F, El Darwish K, Jalkanen M, Lindahl U., J Biol Chem. 2001 Jun 8; 276(23): 20069-77.
【非特許文献１４】Crawford BE, Olson SK, Esko JD, Pinhal MA., J Biol Chem. 2001 Jun 15; 276(24): 21538-43.
【非特許文献１５】Gesteira TF, Coulson-Thomas VJ, Ogata FT, Farias EH, Cavalheiro RP, de Lima MA, Cunha GL, Nakayasu ES, Almeida IC, Toma L, Nader HB., Biochim Biophys Acta. 2011 Dec; 1814(12): 1862-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘパロサン−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（ＨＧ−５ｅｐｉ）を提供することを課題とする。具体的には、本発明は、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び／又は、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性（以下、総称して「ＨＧ−５ｅｐｉ活性」と言う。）、を有するアフリカマイマイ由来の酵素、該活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該核酸及び／又は該ベクターを保持する宿主細胞、該ポリペプチドの製造方法、該酵素及び／又は該ポリペプチドを用いたＨｅｘＡ残基が異性化された多糖の製造方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＡＳがＧｌｃＮＡｃとＩｄｏＡ（２Ｓ）を構成成分とし、ＧｌｃＮＳを骨格中に含まないＧＡＧであることに着目し、アフリカマイマイには、ＨＥＰおよびＨＳの生合成に関与する公知のＣ５−ｅｐｉとは基質特異性が全く異なる新規の異性化酵素が存在すると考えた。すなわち、本発明者らは、アフリカマイマイには、ＮＡＨを基質とする異性化酵素であるＨＧ−５ｅｐｉが存在し、ＡＳの生合成に関与していると考えた。【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、新規異性化酵素であるＨＧ−５ｅｐｉがアフリカマイマイに存在する事を見出し、ＨＧ−５ｅｐｉをコードするＤＮＡをアフリカマイマイから単離することに成功して、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通り例示される。
［１］
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特徴を有する、アフリカマイマイ由来の酵素。
（Ａ）Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
（Ｂ）Ｎ−硫酸化ヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−再硫酸化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を実質的に有しない。
［２］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるポリペプチド。
（Ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ａ１）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（ａ２）配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
［３］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の特徴を有するポリペプチド。
（Ａ）Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
（Ｂ）至適ｐＨが５．５〜６．０である。
（Ｃ）０．１％（ｗ／ｖ）以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下で前記活性が実質的に失われる。
［４］
前記酵素、又は前記ポリペプチド、をコードする核酸。
［５］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるＤＮＡ。
（Ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ１）配列番号１における塩基番号１〜１８０６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号１における塩基番号１００〜１８０６で示される塩基配列。
（Ｂ）前記（Ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡの塩基配列を含み、かつＮ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［６］
前記核酸、及び／又は前記ＤＮＡ、を含むベクター。
［７］
前記核酸、前記ＤＮＡ、及び／又は前記ベクター、を保持する宿主細胞。
［８］
以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む、ポリペプチドの製造方法。
（Ａ）前記宿主細胞を用いて、Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドを発現させる工程。
（Ｂ）前記（Ａ）の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
［９］
前記方法により得られるポリペプチド。
［１０］
Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する酵素及び／又はポリペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
［１１］
前記酵素及び／又は前記ポリペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
［１２］
前記方法により得られる多糖。
［１３］
Ｎ−アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基がイズロン酸残基に異性化された構造を含む多糖。
［１４］
多糖の骨格中に存在するヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の割合が２０％〜７５％である、前記多糖。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カラム精製して得たＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分を還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して得られるゲルのＣＢＢ染色後の写真像図である。
【図２】ＨＰＬＣポストカラムラベル法のフローダイアグラムを示す図である。
【図３】ＮＡＨまたはＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰをＮ−脱アセチル化および亜硝酸分解した後、ＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。
【図４】粗精製ＨＧ−５ｅｐｉと接触させたＮＡＨをＮ−脱アセチル化および亜硝酸分解した後、ＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。
【図５】粗精製ＨＧ−５ｅｐｉと接触させたＮＳＨを亜硝酸分解した後、ＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。
【図６】ＨＧ−５ｅｐｉと接触させたＮＡＨをＮ−脱アセチル化および亜硝酸分解した後、ＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（１）本発明の酵素
本発明の酵素は、以下の（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有する、アフリカマイマイ由来の酵素である。
（Ａ）ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び／又は、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性、を有する。
（Ｂ）ＮＳＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び／又は、ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性、を実質的に有しない。
【００１５】
ここにいう「アフリカマイマイ由来」とは、アフリカマイマイから取得できることを意味する。
【００１６】
本発明の酵素は、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する酵素である。ここにいう「ＨＧ−５ｅｐｉ活性」とは、先に述べた通り、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ヘパリン（ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ）のＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性、を意味する。ＨＧ−５ｅｐｉ活性は、例えば、後述する＜実施例１４＞、＜実施例１６＞、または＜実施例１７＞に記載のＨＰＬＣポストカラムラベル法を用いる方法により測定することができる。また、ＨＧ−５ｅｐｉ活性は、例えば、後述する＜実施例２０＞または＜実施例２１＞に記載の放射性同位体を用いる方法によっても測定することができる。具体的には、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性は、後述する＜実施例１４＞、＜実施例１６＞、＜実施例２０＞、または＜実施例２１＞の方法に従って測定することができる。また、具体的には、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性は、後述する＜実施例１７＞の方法に従って測定することができる。
【００１７】
本発明の酵素は、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性、の両方を有していてもよく、片方のみを有していてもよい。例えば、本発明の酵素は、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性を有し、且つ、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性を実質的に有していなくてもよい。
【００１８】
ＮＡＨは、ＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基からなる二糖を含む多糖である。ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰは、ＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基からなる二糖、及び、ＧｌｃＮＡｃ残基とＩｄｏＡ残基からなる二糖、を含む多糖である。以下、ＧｌｃＡとＩｄｏＡを総称して「ＨｅｘＡ」ともいう。すなわち、ＮＡＨおよびＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰは、いずれも、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖である。
【００１９】
ＮＡＨおよびＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰは、本発明の酵素が作用する基質の例示であり、本発明の酵素が作用する基質を限定するものではない。すなわち、本発明の酵素は、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する限り、さらに、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む他の多糖（ＮＡＨおよびＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ以外の多糖）における、ＧｌｃＮＡｃ残基に隣接したＨｅｘＡ残基を異性化する活性を有していてもよい。ここにいう「他の多糖」は、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖である限り特に限定されない。ここにいう「他の多糖」は、より具体的には、ＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基からなる二糖、及び／又は、ＧｌｃＮＡｃ残基とＩｄｏＡ残基からなる二糖、を含む多糖である。ここにいう「ＨｅｘＡ残基の異性化」とは、ＧｌｃＡ残基からＩｄｏＡ残基への異性化、及び／又は、ＩｄｏＡ残基からＧｌｃＡ残基への異性化、を意味する。
【００２０】
ここにいう「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」とは、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基が結合してなる二糖を意味する。ここにいう「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」におけるＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基の結合の順序は限定されない。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」としては、具体的には、例えば、下記構造式（２）〜（５）で表される二糖が挙げられる。
【００２１】
すなわち、本発明の酵素は、具体的には、例えば、多糖の骨格中に存在する下記構造式（２）で表されるＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基からなる二糖（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡ）を下記構造式（３）で表されるＧｌｃＮＡｃ残基とＩｄｏＡ残基からなる二糖（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＩｄｏＡ）に異性化する活性、及び／又は、多糖の骨格中に存在する下記構造式（３）で表される二糖を下記構造式（２）で表される二糖に異性化する活性、を有する酵素であってよい。
【００２２】
【化２】
0006478190.tif 000003
【００２３】
【化３】
0006478190.tif 000004
【００２４】
また、本発明の酵素は、具体的には、例えば、多糖の骨格中に存在する下記構造式（４）で表されるＧｌｃＡ残基とＧｌｃＮＡｃ残基からなる二糖（ＧｌｃＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を下記構造式（５）で表されるＩｄｏＡ残基とＧｌｃＮＡｃ残基からなる二糖（ＩｄｏＡα１−４ＧｌｃＮＡｃ）に異性化する活性、及び／又は、多糖の骨格中に存在する下記構造式（５）で表される二糖を下記構造式（４）で表される二糖に異性化する活性、を有する酵素であってもよい。
【００２５】
【化４】
0006478190.tif 000005
【００２６】
【化５】
0006478190.tif 000006
【００２７】
本発明の酵素によりＩｄｏＡ残基に異性化されるＧｌｃＡ残基の、ＮＡＨ等の多糖における位置は、特に限定されない。すなわち、このようなＧｌｃＡ残基は、ＮＡＨ等の多糖の骨格中において、還元末端に存在する場合、非還元末端に存在する場合、多糖の骨格中間部位に存在する場合の３通りが存在するが、このいずれであってもよい。
【００２８】
本発明の酵素によりＧｌｃＡ残基に異性化されるＩｄｏＡ残基の、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ等の多糖における位置は、特に限定されない。すなわち、このようなＩｄｏＡ残基は、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ等の多糖の骨格中において、還元末端に存在する場合、非還元末端に存在する場合、多糖の骨格中間部位に存在する場合の３通りが存在するが、このいずれであってもよい。
【００２９】
また、本発明の酵素は、Ｃ５−ｅｐｉ活性を実質的に有しない酵素である。ここにいう「Ｃ５−ｅｐｉ活性」とは、ＮＳＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性、及び／又は、完全脱硫酸化・Ｎ−再硫酸化ヘパリン（ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰ）のＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性、を意味する。Ｃ５−ｅｐｉ活性は、例えば、後述する＜実施例１５＞または＜実施例１８＞に記載のＨＰＬＣポストカラムラベル法を用いる方法により測定することができる。具体的には、ＮＳＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する活性は、後述する＜実施例１５＞の方法に従って測定することができる。また、具体的には、ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する活性は、後述する＜実施例１８＞の方法に従って測定することができる。
【００３０】
ここにいう「活性を実質的に有しない」とは、活性に対応する多糖を酵素と接触させる前後で比較した場合において、ＩｄｏＡ含量が全く変化（増加または減少）しない、あるいはほとんど変化（増加または減少）しないことを意味する。すなわち、例えば、「Ｃ５−ｅｐｉ活性を実質的に有しない」とは、ＮＳＨを酵素と接触させる前後で比較した場合において、ＩｄｏＡ含量が全く変化（増加または減少）しない、あるいはほとんど変化（増加または減少）しないこと、及び／又は、ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰを酵素と接触させる前後で比較した場合において、ＩｄｏＡ含量が全く変化（増加または減少）しない、あるいはほとんど変化（増加または減少）しないこと、を意味する。
【００３１】
ここにいう「ＩｄｏＡ含量」とは、多糖の骨格中に存在するＨｅｘＡ残基におけるＩｄｏＡ残基の割合、すなわち、ＩｄｏＡ残基の総数をＨｅｘＡ残基の総数（ＧｌｃＡ残基の総数とＩｄｏＡ残基の総数の合計）で除して百分率換算した値を意味する。このようなＩｄｏＡ含量は、例えば、後述する＜実施例１４＞、＜実施例１５＞、＜実施例１６＞、＜実施例１７＞、または＜実施例１８＞の方法に従って測定することができる。よって、ここにいう「ＩｄｏＡ含量がほとんど変化しない」とは、例えば、本発明の酵素と接触させる前後の多糖をそれぞれＨＰＬＣポストカラムラベル法に供し、ＩｄｏＡ含量を測定して比較した場合に、測定誤差程度の変化しか起こらない、具体的には、５％以下、２％以下、１％以下、または０．５％以下の変化しか起こらない（すなわち、酵素反応前のＩｄｏＡ含量がｎ（％）である場合に、酵素反応後のＩｄｏＡ含量がｎ−５（％）以上且つｎ＋５（％）以下、ｎ−２（％）以上且つｎ＋２（％）以下、ｎ−１（％）以上且つｎ＋１（％）以下、またはｎ−０．５（％）以上且つｎ＋０．５（％）以下である）、ことを意味してよい。
【００３２】
あるタンパク質がＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するか否かは、後述する＜実施例１４＞、＜実施例１６＞、＜実施例１７＞、＜実施例２０＞、または＜実施例２１＞の方法に従って判定することができる。また、あるタンパク質がＣ５−ｅｐｉ活性を実質的に有しないか否かは、後述する＜実施例１５＞または＜実施例１８＞の方法に従って判定することができる。よって、これらの方法に従えば、アフリカマイマイ由来の任意のタンパク質が本発明の酵素であるか否かを判定することができる。
【００３３】
本発明の酵素は、アフリカマイマイから取得することができる。具体的には、例えば、アフリカマイマイの細胞を破砕して得られる細胞破砕物または細胞抽出液から本発明の酵素を取得することができる。このような「破砕」は、細胞の種類に応じて適宜選択した方法により実施できる。破砕方法としては、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法等が例示される。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の酵素を取得する細胞は、本発明の酵素を発現している限り特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、粘液腺の細胞が挙げられる。
【００３４】
本発明の酵素の取得は、タンパク質の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００３５】
本発明の酵素は、本発明の酵素のみからなるものであってもよく、本発明の酵素以外の成分を含むものであってもよい。このような「本発明の酵素以外の成分」としては、アルカリ金属塩、界面活性剤、緩衝剤、アフリカマイマイ由来の成分等が例示される。また、本発明の酵素は形状についても特に限定されず、液状であってもよく、固形状であってもよい。本発明の酵素が液状で提供される場合は、凍結状態で提供されてもよいし、液体状態（融解状態）で提供されてもよい。また、本発明の酵素が固形状で提供される場合としては、凍結乾燥物、アガロースビーズ等に結合させた固定化酵素等としての提供が例示される。
【００３６】
本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、任意の濃度に適宜設定することができる。本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、または５０％以上であってよい。また、本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、例えば、１００％以下、７５％以下、５０％以下、２５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下であってよい。
【００３７】
（２）本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されない。本発明のポリペプチドの一態様は、上述した本発明の酵素の一態様であってよい。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、例えば、特定のアミノ酸配列を含み、且つ、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドであってよい。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるポリペプチドであってよい。
（Ａ）以下の（ａ１）または（ａ２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ａ１）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（ａ２）配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）上記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）上記（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチド。
【００４０】
すなわち、本発明のポリペプチドとしては、次の三つの態様が挙げられる。第一の態様は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜６０１または３４〜６０１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。第二の態様は、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである。第三の態様は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである。
【００４１】
なお、本願において、「アミノ酸配列を含む」という表現は、当該「アミノ酸配列からなる」場合を包含する。
【００４２】
第二の態様においていう「数個」とは、置換、欠失、挿入、及び／又は付加してもＨＧ−５ｅｐｉ活性を失わないアミノ酸残基の数を意味し、例えば、ポリペプチドを構成する全アミノ酸残基数に対して、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下、の数であってよい。
【００４３】
すなわち、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜６０１で示したアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合、全アミノ酸数が６０１であるので、「数個」とは、好ましくは２〜６０個、より好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１２個、特に好ましくは２〜６個であってよい。また、配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１のアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合は、全アミノ酸数が５６８であるので、「数個」とは、好ましくは２〜５６個、より好ましくは２〜２８個、さらに好ましくは２〜１１個、特に好ましくは２〜５個であってよい。また、これらのポリペプチドにおいて、「数個」とは、２個、２〜３個、２〜４個、または２〜５個であってもよい。
【００４４】
第二の態様においていう「置換、欠失、挿入、及び／又は付加」は、例えば、ＨＧ−５ｅｐｉ活性が失われない保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００４５】
また、第二の態様で示されるポリペプチドは、言い換えれば、例えば、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、ここでいう「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）とは、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。
【００４６】
第三の態様においていう「ペプチドタグ」とは、タンパク質の検出や精製を容易にするためのアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。ここにいう「ペプチドタグ」の長さおよびアミノ酸配列は、このペプチドタグを第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに付加した融合ポリペプチドがＨＧ−５ｅｐｉ活性を失わない限り、特に限定されない。このようなペプチドタグとしては、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（ＦＬＡＧタグ）、６×Ｈｉｓペプチド（Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標））、ｃ−ｍｙｃペプチド（ｍｙｃタグ）、プロテインＡ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−転移酵素）等が例示されるが、中でもＦＬＡＧペプチド（配列番号３２）が好ましい。
【００４７】
このような「ペプチドタグ」は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに直接付加されていてもよいし、任意のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを介して付加されていてもよい。ここにいう「ペプチドリンカー」の長さおよびアミノ酸配列は、ペプチドタグの場合と同様、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに付加した融合ポリペプチドがＨＧ−５ｅｐｉ活性を失わない限り、特に限定されない。このようなペプチドリンカーとしては、例えば、Ｎ末端側がアスパラギンでありＣ末端側がセリンであるジペプチド、Ｎ末端側がバリンでありＣ末端側がアスパラギン酸であるジペプチド、が挙げられる。
【００４８】
また、このような「ペプチドタグ」は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドのＮ末端側にのみ付加されてもよいし、Ｃ末端側にのみ付加されてもよいし、両末端に付加されてもよいが、中でもＮ末端側にのみ付加されることが好ましい。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである。ＨＧ−５ｅｐｉ活性の有無は、例えば、後述する＜実施例１４＞、＜実施例１６＞、＜実施例１７＞、＜実施例２０＞、または＜実施例２１＞の方法に従って判定することができる。よって、これらの方法によって、第二の態様または第三の態様で示されるポリペプチドを選択することができる。すなわち、第二の態様で示されるポリペプチドは、例えば、ＨＧ−５ｅｐｉ活性の有無を指標として、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を失わずに１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を導入可能な部位を、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列から選択して得ることができる。また、第三の態様で示されるポリペプチドは、例えば、ＨＧ−５ｅｐｉ活性の有無を指標として、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を失わずにペプチドタグを付加できるアミノ酸配列を、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列から選択して得ることができる。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する限り、さらに、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む他の多糖（ＮＡＨおよびＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ以外の多糖）における、ＧｌｃＮＡｃ残基に隣接したＨｅｘＡ残基を異性化する活性を有していてもよい。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、Ｃ５−ｅｐｉ活性を有していてもよく、実質的に有していなくてもよい。Ｃ５−ｅｐｉ活性の有無は、例えば、後述する＜実施例１５＞または＜実施例１８＞の方法に従って判定することができる。
【００５２】
本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性の至適ｐＨが５．５〜６．０であるという特徴を有していてもよい。至適ｐＨは、例えば、後述する＜実施例２２＞に記載の方法に従って決定することができる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、０．１％（ｗ／ｖ）以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下でＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われるという特徴を有していてもよい。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、アルカリ金属塩化物、及び／又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度に依存してＨＧ−５ｅｐｉ活性が低下するという特徴（すなわち、アルカリ金属塩化物、及び／又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度が増大するとＨＧ−５ｅｐｉ活性が低下するという特徴）を有していてもよい。ここにいう「アルカリ金属塩化物」としては、塩化ナトリウムが例示される。また、ここにいう「アルカリ土類金属塩化物」としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガンが例示される。当該特徴は、アルカリ土類金属塩化物、中でも塩化カルシウムにおいて顕著であってもよい。また、当該特徴は、具体的には、例えば、６４ｍＭ以上の塩化カルシウムの存在下でＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われるという特徴であってもよい。
【００５５】
ここにいう「ＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われる」とは、例えば、対象物質（デオキシコール酸ナトリウム、アルカリ金属塩化物、アルカリ土類金属塩化物等）の存在下におけるＨＧ−５ｅｐｉ活性が、対象物質の非存在下におけるＨＧ−５ｅｐｉ活性の１０％以下、５％以下、２％以下、または１％以下であることを意味してよい。
【００５６】
また、ＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われたか否かは、例えば、後述する＜実施例２３＞または＜実施例２４＞に記載の放射性同位体を用いる方法に従って判定することができる。その場合、「ＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われる」とは、具体的には、例えば、対象物質（デオキシコール酸ナトリウム、アルカリ金属塩化物、アルカリ土類金属塩化物等）の存在下でポリペプチドをＨｅｘＡ残基の５位の水素原子を３Ｈ（トリチウム）で置換した対象多糖（例えば[５−３Ｈ]ＮＡＨ）に接触させ、接触前後の反応液から前記対象多糖（例えば[５−３Ｈ]ＮＡＨ）を除去して回収した溶液をシンチレーションカウンターに供し、ＨＧ−５ｅｐｉ活性によって前記対象多糖（例えば[５−３Ｈ]ＮＡＨ）中のＨｅｘＡ残基が異性化された際に生じる３Ｈ２Ｏの放射活性を測定して比較した場合に、測定値（ｄｐｍ）に有意差がないこと、例えば、接触後の反応液に由来する溶液の測定値が接触前の反応液に由来する溶液の測定値の３倍以下の値であること、を意味してもよい。ここにいう「[５−３Ｈ]ＮＡＨ」は、例えば、後述する＜実施例１９＞の方法に従って調製することができる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドである限り、第一の態様〜第三の態様に示されるような特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドには限定されない。本発明のポリペプチドは、例えば、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有し、且つ、上記に例示した特徴の１またはそれ以上を有するポリペプチドであってもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の特徴を有するポリペプチドであってもよい。
（Ａ）ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する。
（Ｂ）至適ｐＨが５．５〜６．０である。
（Ｃ）０．１％（ｗ／ｖ）以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下でＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われる。
【００５９】
このようなポリペプチドは、さらに、上記に例示した特徴の１またはそれ以上を有していてよい。すなわち、このようなポリペプチドは、例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む他の多糖（ＮＡＨおよびＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ以外の多糖）における、ＧｌｃＮＡｃ残基に隣接したＨｅｘＡ残基を異性化する活性を有していてもよい。また、このようなポリペプチドは、例えば、Ｃ５−ｅｐｉ活性を有していてもよく、実質的に有していなくてもよい。また、このようなポリペプチドは、例えば、アルカリ金属塩化物、及び／又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度に依存して活性が低下するという特徴を有していてもよい。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、例えば、後述する本発明の宿主細胞を用いることで、遺伝子工学的手法によって調製することが可能である。このような「遺伝子工学的手法」としては、後述する＜実施例６＞〜＜実施例１３＞に記載の昆虫細胞を用いた方法が例示される。
【００６１】
（３）本発明の核酸
本発明の核酸は、本発明の酵素または本発明のポリペプチドをコードする核酸である。なお、上述の通り、本発明のポリペプチドの一態様は、上述した本発明の酵素の一態様であってよい。よって、本発明の核酸の一態様は、本発明の酵素をコードする核酸であってよい。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限り、特に限定されない。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限りにおいて、遺伝子暗号の縮重による異なった塩基配列からなる全ての核酸を包含する。
【００６２】
ここにいう「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。また、本発明の核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、二本鎖の場合はＤＮＡとＲＮＡからなるハイブリッド鎖であってもよい。さらに、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限り、本発明のポリペプチドをコードする領域内にイントロンの配列を含んだ核酸であってもよく、本発明のポリペプチドをコードする領域内にイントロンの配列を含まない核酸であってもよい。本発明の核酸としては、例えば、アフリカマイマイに由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡから逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡが挙げられる。また、本発明の核酸は、単離された核酸であってよい。
【００６３】
本発明の核酸は、例えば、特定の塩基配列を含み、且つ、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってよい。
【００６４】
本発明の核酸は、具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択されるＤＮＡであってよい。
（Ａ）以下の（ａ１）または（ａ２）の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ１）配列番号１における塩基番号１〜１８０６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号１における塩基番号１００〜１８０６で示される塩基配列。
（Ｂ）上記（Ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡの塩基配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００６５】
すなわち、本発明の核酸としては、次の三つの態様が挙げられる。第一の態様は、配列番号１における塩基番号１〜１８０６または１００〜１８０６で示される塩基配列を含むＤＮＡである。第二の態様は、第一の態様で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。第三の態様は、第一の態様または第二の態様で示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡの塩基配列を含み、かつＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。このようなＤＮＡは、単離されたＤＮＡであってよい。
【００６６】
なお、本願において、「塩基配列を含む」という表現は、当該「塩基配列からなる」場合を包含する。
【００６７】
第一の態様で示されるＤＮＡは、例えば、後述する＜実施例１＞〜＜実施例５＞に記載の方法により得ることができる。また、第一の態様で示されるＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応により、アフリカマイマイに由来する核酸（染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を鋳型としてＤＮＡ断片を増幅させることによっても得ることができる。
【００６８】
第二の態様においていう「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、ここにいう「ストリンジェントな条件」とは、第一の態様で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対し、特異的なハイブリッドが形成される条件を意味する。ストリンジェントな条件としては、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このような条件としては、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。また、このような条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、および１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃においてハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる溶液で室温において洗浄し、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる溶液で５０℃においてさらに洗浄する条件も挙げられる（Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。
【００６９】
第二の態様で示されるＤＮＡは、例えば、第一の態様で示されるＤＮＡの塩基配列に対して核酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加（以下、総称して「変異の導入」と言う。）を行うことで調製することができる。ここにいう「変異の導入」は、例えば、公知の方法により行うことが可能である。
【００７０】
「変異の導入」を行う方法としては、例えば、制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法が挙げられる。すなわち、所望のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするように塩基配列に変異を導入したＤＮＡ断片の両末端を制限酵素によって限定分解し、同じ制限酵素で限定分解した配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡをサブクローニングしたベクターと混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって両者をライゲーションさせることにより、変異を導入したＤＮＡを得ることができる。このような「塩基配列に変異を導入したＤＮＡ断片」は、例えば、そのような変異を導入したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応により得ることができる。また、所望の部位の塩基に変異を導入した配列となるように合成した２本の相補的なオリゴヌクレオチドを水溶液中で混合し、９０〜１００℃で１〜２分間加熱した後、室温まで冷却することによっても得ることができる。
【００７１】
また、「変異の導入」を行う方法としては、例えば、部位特異的変異導入法も挙げられる。部位特異的変異導入法としては、例えば、ＰＣＲ反応を用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)； Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)； Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。部位特異的変異導入法は、具体的には、例えば、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社製）を利用して行うことができる。
【００７２】
第三の態様においていう「ペプチドタグ」は、前記「（２）本発明のポリペプチド」において詳述したペプチドタグと同じである。よって、コードするポリペプチドがＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する限りにおいて、ペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡも本発明の核酸として例示される。ここにいう「ペプチドタグをコードするＤＮＡ」は、ペプチドタグのみをコードするＤＮＡであってもよく、ペプチドタグをコードするＤＮＡとリンカー配列をコードするＤＮＡからなる融合ＤＮＡであってもよい。
【００７３】
また、本発明の核酸は、その塩基配列を化学的に全合成することによっても得ることができる。
【００７４】
本発明の核酸がコードするポリペプチドは、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する。本発明の核酸がコードするポリペプチドは、前記「（２）本発明のポリペプチド」において記載した方法によって調製することができる。本発明の核酸がコードするポリペプチドのＨＧ−５ｅｐｉ活性の有無は、前記「（２）本発明のポリペプチド」において記載した方法によって判定することができる。
【００７５】
（４）本発明のベクター
本発明のベクターは、本発明の核酸を含むベクターである。本発明のベクターは、１種の本発明の核酸を含んでいてもよく、２種またはそれ以上の本発明の核酸を含んでいてもよい。本発明のベクターは、１コピーの本発明の核酸を含んでいてもよく、２コピーまたはそれ以上の本発明の核酸を含んでいてもよい。
【００７６】
ここにいう「ベクター」は、本発明の核酸を宿主細胞へ導入するために用いる核酸分子を意味する。ベクターは、宿主細胞において本発明の核酸の増幅または本発明の核酸がコードするポリペプチドの発現が可能である限り、特に限定されない。このようなベクターとしては、ファージ、プラスミド、ウイルス等が例示される。ベクターは、宿主細胞の種類や本発明の核酸がコードするポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主細胞として細菌細胞等の原核細胞を利用する場合、ベクターとしては、ファージやプラスミドを好適に利用することができる。また、例えば、宿主細胞として昆虫細胞等の真核細胞を利用する場合、ベクターとしては、プラスミドやウイルスを好適に利用することができる。
【００７７】
細菌細胞で利用できるファージとしては、例えば、ファージＤＮＡとして機能するプラスミドをパッケージングしたファージ粒子が挙げられる。細菌細胞で利用できるプラスミドとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）が挙げられる。昆虫細胞等で利用できるプラスミドとしては、例えば、ｐＩＺ−Ｖ５（ライフテクノロジーズ社製）が挙げられる。
【００７８】
昆虫細胞等で利用できるウイルスとしては、例えば、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）が好ましい。ＮＰＶとしては、ＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ）やＢｍＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ）が挙げられるが、中でもＡｃＮＰＶが好ましい。本発明の核酸が導入されたウイルスを常法により昆虫細胞等の宿主細胞に感染させることで、本発明の核酸を保持し、本発明の核酸がコードするポリペプチドを発現する宿主細胞が得られる。
【００７９】
ファージへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。ファージに本発明の核酸を導入する方法としては、後述の＜実施例２＞に記載の方法が例示される。すなわち、例えば、本発明の核酸を含むファージＤＮＡをファージ粒子にパッケージングすればよい。具体的には、例えば、ファージＤＮＡとして機能するプラスミドのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素サイトから任意の２つを選択し、プラスミドと本発明の核酸をこれらの制限酵素で限定分解した後にライゲーションすればよい。このようなプラスミドとしては、例えば、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩが挙げられる。また、本発明の核酸としては、制限酵素サイトを５’末端側に付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって得られるＤＮＡを用いればよい。また、本発明の核酸への制限酵素サイトの導入は、制限酵素で限定分解された際に生じる構造を５’末端に有するＤＮＡ断片を、本発明の核酸であるＤＮＡ断片にライゲーションして行ってもよい。
【００８０】
プラスミドへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。プラスミドに本発明の核酸を導入する方法としては、後述の＜実施例６＞、または＜実施例１０＞に記載の方法が例示される。すなわち、例えば、プラスミドのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素サイトから任意の２つを選択し、プラスミドと本発明の核酸をこれらの制限酵素で限定分解した後にライゲーションすればよい。本発明の核酸としては、制限酵素サイトを５’末端側に付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって得られるＤＮＡを用いればよい。また、本発明の核酸への制限酵素サイトの導入は、制限酵素で限定分解された際に生じる構造を５’末端に有するＤＮＡ断片を、本発明の核酸であるＤＮＡ断片にライゲーションして行ってもよい。
【００８１】
ウイルスへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。例えば、ウイルスへの本発明の核酸の導入は、バクミドを調製することにより行うことができる。具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したドナープラスミドを用いてバクミド調製用の細菌株を形質転換することで、本発明の核酸が導入されたバクミドを調製することができる。バクミド調製用の細菌株としては、例えば、大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ株が挙げられる。ドナープラスミドとしては、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ１が挙げられる。このようにして調製したバクミドは、昆虫細胞等の宿主細胞を形質転換することで、そのままウイルスとして機能する。
【００８２】
また、例えば、ウイルスへの本発明の核酸の導入は、トランスファーベクターと呼ばれるプラスミドを利用することによっても行うことができる。具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したトランスファーベクターとウイルスゲノムとを昆虫細胞等の宿主細胞にコトランスフェクションさせることにより、本発明の核酸が導入されたウイルスが得られる。トランスファーベクターとしては、ｐＰＳＣ８（プロテインサイエンス社製）やｐＶＬ１３９３（ＡＢベクター社製）が挙げられる。
【００８３】
（５）本発明の宿主細胞
本発明の宿主細胞は、本発明の核酸、及び／又は本発明のベクター（以下、総称して「本発明のベクター等」と言う。）を保持する宿主細胞である。なお、本発明のベクターは本発明の核酸を含むベクターであるため、本発明のベクターを保持する宿主細胞は、本発明の核酸を保持する宿主細胞にも該当する。本発明の宿主細胞は、１種の本発明のベクター等を保持していてもよく、２種またはそれ以上の本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、１コピーの本発明のベクター等を保持していてもよく、２コピーまたはそれ以上の本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、染色体上に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体外に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体上と染色体外の両方に本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、具体的には、本発明のベクター等を用いて形質転換された宿主細胞であってよい。ここにいう「宿主細胞」は、本発明のベクター等を増幅させるための宿主、または本発明のベクター等がコードするポリペプチドを発現させるための宿主として用いられる細胞を意味する。このような宿主細胞は、本発明のベクター等を用いた形質転換が可能である限り特に限定されない。宿主細胞は、単離された細胞であることが好ましい。宿主細胞は、本発明のベクター等を使用する目的に応じて適宜選択できる。
【００８４】
本発明のベクター等の増幅を目的とする場合は、宿主細胞は、例えば、原核細胞、具体的には、細菌細胞であることが好ましく、中でも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることが好ましい。大腸菌としては、例えば、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株が挙げられる。
【００８５】
本発明のベクター等がコードするポリペプチドの発現を目的とする場合は、宿主細胞としては、例えば、異種タンパク質の発現に通常用いられるものを利用できる。このような宿主細胞は、例えば、真核細胞、具体的には、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞、または酵母細胞であることが好ましく、中でも昆虫細胞であることが好ましい。昆虫細胞としては、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＳＦ＋細胞や、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞が挙げられる。昆虫細胞は、ヨトウガ由来であることが好ましく、中でもＳｆ２１細胞であることが好ましい。
【００８６】
宿主細胞の形質転換は、常法に従って行うことができる。宿主細胞を形質転換する方法は、宿主細胞へ本発明のベクター等を導入可能である限り特に限定されない。宿主細胞を形質転換する方法としては、具体的には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が例示されるが、中でもリポフェクション法であることが好ましい。リポフェクション法は、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  II  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて実施することが好ましい。
【００８７】
（６）本発明のポリペプチド製造方法
本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の宿主細胞を用いて製造することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、例えば、以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程を含む、ポリペプチドの製造方法（以下、「本発明のポリペプチド製造方法」と言う。）により製造することができる。
（Ａ）本発明の宿主細胞を用いてＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチドを発現させる工程。
（Ｂ）前記（Ａ）の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
【００８８】
上記（Ａ）の工程は、本発明の宿主細胞を培養し、本発明のベクター等がコードするＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチド（すなわち、本発明のポリペプチド）を発現させる工程である。
【００８９】
上記（Ａ）の工程として、具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したｐＦａｓｔＢａｃ１を用いて形質転換した大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ株からバクミドを抽出し、このバクミドを用いてリポフェクション法により形質転換したＳｆ２１細胞を培養する工程が挙げられる。
【００９０】
宿主細胞を培養する際の培養条件は、本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドを発現できる限り特に限定されない。培養条件は、宿主細胞の種類や本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、昆虫細胞の培養には、昆虫細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。そのような培地としては、例えば、市販の昆虫細胞用の無血清培地が挙げられ、具体的には、Ｓｆ９００ＩＩＩ無血清培地が挙げられる。培養は、例えば、２７℃〜２８℃で、振とう培養により行うことができる。
【００９１】
上記（Ｂ）の工程は、上記（Ａ）の工程で宿主細胞に発現させた本発明のポリペプチドを採取する工程である。ここにいう「採取」とは、宿主細胞の培養液から本発明のポリペプチドを含む画分を得ることを意味する。すなわち、本発明のポリペプチドが細胞外に分泌される形態で発現された場合は、培養液そのものを本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、遠心分離後の上清を本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、カラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。
【００９２】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に蓄積する形態で発現された場合は、細胞を破砕して得る抽出液を本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、この抽出液をカラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。また、本発明のポリペプチドが細胞膜に蓄積する形態で発現された場合は、細胞そのものを本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、細胞を破砕して得る破砕物を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。このような「破砕」は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択した方法により実施できるが、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法等が例示される。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００９３】
精製は、タンパク質の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、が挙げられる。特に、本発明のポリペプチドにペプチドタグが付加されている場合は、当該タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行うことができる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００９４】
精製は、所望の程度に行うことができる。本発明のポリペプチドが採取した画分中に占める重量濃度は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、または５０％以上であってよい。また、本発明のポリペプチドが採取した画分中に占める重量濃度は、例えば、１００％以下、７５％以下、５０％以下、２５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下であってよい。
【００９５】
このようにして採取した画分に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、前記「（２）本発明のポリペプチド」において記載した方法に従い、ＨＧ−５ｅｐｉ活性の有無を測定することにより判定することができる。また、このようにして採取した画分に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇによっても、判定することができる。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇは、後述する＜実施例９＞の方法に従って行うことができる。
【００９６】
（７）本発明の多糖製造方法
本発明の多糖製造方法は、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する酵素及び／又はポリペプチド（以下、総称して「本発明のＨＧ−５ｅｐｉ」と言う。）を、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖の製造方法である。本発明のＨＧ−５ｅｐｉは、Ｃ５−ｅｐｉ活性を有していてもよく、実質的に有しなくてもよい。本発明のＨＧ−５ｅｐｉとしては、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する１種の酵素を用いてもよく、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する２種またはそれ以上の酵素を用いてもよい。本発明のＨＧ−５ｅｐｉとしては、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する１種のポリペプチドを用いてもよく、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する２種またはそれ以上のポリペプチドを用いてもよい。本発明のＨＧ−５ｅｐｉとしては、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する１種またはそれ以上の酵素とＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する１種またはそれ以上のポリペプチドを組み合わせて用いてもよい。「ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する酵素」としては、本発明の酵素が挙げられる。「ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有するポリペプチド」としては、本発明のポリペプチドが挙げられる。
【００９７】
ここにいう「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖」は、本発明のＨＧ−５ｅｐｉが作用する基質である限り特に限定されない。
【００９８】
ここにいう「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」とは、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基が結合してなる二糖を意味する。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」におけるＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基の結合の順序は限定されない。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」は、１分子の多糖の骨格中に少なくとも１箇所存在すればよい。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」は、１分子の多糖の骨格中に１箇所のみ存在してもよいし、２箇所またはそれ以上存在してもよい。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」が１分子の多糖中に２箇所またはそれ以上存在する場合は、２つまたはそれ以上の二糖が結合してなる四糖またはそれ以上の鎖長を有する糖鎖として多糖の骨格中に存在してもよいし、他の分子を介して結合している状態として多糖の骨格中に存在してもよい。ここにいう「他の分子」としては、例えば、１つまたはそれ以上の糖残基からなる糖鎖であって、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖以外の糖残基、が挙げられる。
【００９９】
「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」におけるＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基の結合様式は、本発明のＨＧ−５ｅｐｉが作用可能である限り特に限定されない。「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」の結合様式は、１−４グリコシド結合であることが好ましい。また、「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」におけるＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基のアノマーは、ＧｌｃＮＡｃ残基はαアノマー、ＧｌｃＡ残基はβアノマー、ＩｄｏＡ残基はαアノマーであることが好ましい。
【０１００】
このような「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」としては、具体的には、ＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基との結合が［−４ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡβ１−］または［−４ＧｌｃＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−］で示される二糖、ＧｌｃＮＡｃ残基とＩｄｏＡ残基との結合が［−４ＧｌｃＮＡｃα１−４ＩｄｏＡα１−］または［−４ＩｄｏＡα１−４ＧｌｃＮＡｃα１−］で示される二糖、が例示される。このような「ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖」を含む多糖としては、具体的には、ＮＡＨ、完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＳ（ＣＤＳＮＡｃ−ＨＳ）、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ、ＡＣＨ（２−０−脱硫酸化ＡＳ）等が例示されるが、中でもＮＡＨ、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰが好ましい。
【０１０１】
ここにいう「ＨｅｘＡ残基の異性化」とは、ＧｌｃＡ残基からＩｄｏＡ残基への異性化、及び／又は、ＩｄｏＡ残基からＧｌｃＡ残基への異性化、を意味する。すなわち、ここにいう「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」とは、本発明のＨＧ−５ｅｐｉを、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程、具体的には、多糖の骨格中に含まれる該二糖のＧｌｃＡ残基の全てまたは一部をＩｄｏＡ残基に異性化する工程、及び／又は、多糖の骨格中に含まれる該二糖のＩｄｏＡ残基の全てまたは一部をＧｌｃＡ残基に異性化する工程、によって得られる多糖を意味する。
【０１０２】
本発明の多糖製造方法は、ＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖の骨格中に含まれる該二糖のＨｅｘＡ残基（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ残基に隣接したＨｅｘＡ残基）を異性化し、該多糖のＩｄｏＡ含量を増加または減少させる方法、および、当該方法を利用した多糖の製造方法、を包含する。
【０１０３】
ここにいう「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」としては、具体的には、例えば、ＮＡＨのＧｌｃＡ残基の全てまたは一部がＩｄｏＡ残基に異性化された構造を含む多糖、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＧｌｃＡ残基の全てまたは一部がＩｄｏＡ残基に異性化された構造、及び／又は、ＩｄｏＡ残基の全てまたは一部がＧｌｃＡ残基に異性化された構造、を含む多糖、が挙げられる。
【０１０４】
ここにいう「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」は、ＩｄｏＡ残基を有する多糖であってよい。「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」におけるＩｄｏＡ含量は特に限定されず、本発明のＨＧ−５ｅｐｉをＧｌｃＮＡｃ残基とＨｅｘＡ残基からなる二糖を含む多糖と接触させる条件に応じて、任意の値に制御することができる。具体的には、反応系に添加する本発明のＨＧ−５ｅｐｉの量、反応時間等の諸条件を適宜設定し、所望のＩｄｏＡ含量となる条件に設定すればよい。ここにいう「ＩｄｏＡ含量」の定義は、前記「（１）本発明の酵素」において詳述した通りである。
【０１０５】
このような「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」は、例えば、ＩｄｏＡ含量が７７％であるＨＥＰや同含量が１９％であるＨＳ（Hook M, Lindahl U, Iverius PH., Biochem J. 1974 Jan; 137(1): 33-43.）とはＩｄｏＡ含量が異なることを特徴とする多糖であってよい。
【０１０６】
「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」のＩｄｏＡ含量は適宜設定することができる。「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」におけるＩｄｏＡ含量は、例えば、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、または５０％以上であってよい。また、ここにいう「ＩｄｏＡ含量」は、例えば、１００％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下であってよい。「ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖」におけるＩｄｏＡ含量としては、２０％〜７５％、２５％〜７５％、３０％〜７５％、３５％〜７５％、４０％〜７５％、２０％〜７０％、２５％〜７０％、３０％〜７０％、３５％〜７０％、４０％〜７０％、２０％〜６５％、２５％〜６５％、３０％〜６５％、３５％〜６５％、４０％〜６５％、２０％〜６０％、２５％〜６０％、３０％〜６０％、３５％〜６０％、４０％〜６０％等が好ましく例示される。
【０１０７】
本発明の多糖製造方法により得られるＨｅｘＡ残基が異性化された多糖は、新規素材として有用である。
【実施例】
【０１０８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。【０１０９】
本実施例で使用したＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ、ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰ、ＮＡＨ、およびＮＳＨは、公知の文献に記載の方法に従って得たものである。【０１１０】
ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰおよびＣＤＳＮＳ−ＨＥＰの調製においては、完全脱硫酸化ヘパリン（ＣＤＳ−ＨＥＰ）を中間体として用いた。【０１１１】
ＣＤＳ−ＨＥＰは、公知の文献を参照した方法によりＨＥＰを脱硫酸化して得たものである。すなわち、豚腸管由来のＨＥＰ（シグマ・アルドリッチ社製）をＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）−トリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）を用いた６−Ｏ−脱硫酸化、および、水酸化ナトリウムの存在下で凍結乾燥する２−Ｏ−脱硫酸化（Kariya Y, Herrmann J, Suzuki K, Isomura T, Ishihara M., J Biochem. 1998 Feb; 123(2): 240-6.）、ならびに、ＤＭＳＯ溶媒中で加熱するソルボリシス反応によるＮ−脱硫酸化（Ayotte L, Perlin AS., Carbohydr Res. 1986 Jan 1; 145(2): 267-77.）、に供して得たものである。このようにして得られるＣＤＳ−ＨＥＰは、ＨＥＰから実質的に全ての硫酸基が除去された構造を有する。【０１１２】
ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰは、ＣＤＳ−ＨＥＰを無水酢酸を用いたＮ−アセチル化（Danishefsky I., Methods Carbohydr. Chem. 1965; 5: 407-409.）に供して得たものである。【０１１３】
ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰは、ＣＤＳ−ＨＥＰを三酸化硫黄ピリジン錯体を用いたＮ−硫酸化（Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276(41): 37900-8.）に供して得たものである。【０１１４】
ＮＡＨは、公知の文献（特開２００４−０１８８４０号公報）に記載の方法に従い、大腸菌Ｋ５株（Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506）を培養し、培養上清を精製に供して得たものである。【０１１５】
ＮＳＨは、ＮＡＨを水酸化ナトリウム水溶液中で加熱するＮ−脱アセチル化、および、三酸化硫黄ピリジン錯体を用いたＮ−硫酸化（Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276(41): 37900-8.）に供して得たものである。【０１１６】
＜実施例１＞アフリカマイマイ粘液腺由来ｍＲＮＡの分取
アフリカマイマイのｍＲＮＡは、ホットフェノール法（例えば、Verwoerd TC, Dekker BM, Hoekema A., Nucleic Acids Res. 1989 Mar 25; 17(6): 2362.）によって粘液腺からトータルＲＮＡを抽出した後、磁気ビーズを用いる精製法に供してｍＲＮＡを分取することにより得た。手順を以下に示す。【０１１７】
アフリカマイマイ１匹をメスで切開して摘出した粘液腺を蒸留水で洗浄した後、１．５ｍＬのスクリューキャップチューブに密閉した。チューブを液体窒素に１分間浸して凍結させた後、ホモジェナイザーを用いて粘液腺を破砕し、水浴中で８０℃に加熱したｈｏｔ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５５℃の水浴中で加熱して融解させたフェノールと緩衝液（０．１Ｍ  ＬｉＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）を１：１で加えて撹拌した溶液）を０．５ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いて３０秒間撹拌した。その後、クロロホルム溶液（クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１で加えて撹拌した溶液）を０．２５ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いてさらに３０秒間撹拌した。【０１１８】
この溶液を２０，０００×ｇで５分間遠心し、上層（水層）から０．２ｍＬを別のチューブに移した後、４Ｍ  ＬｉＣｌを０．２ｍＬ加えて混合し、−２０℃に終夜静置した。その後、４℃において２０，０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去してトータルＲＮＡの沈殿を得た。この沈殿を蒸留水０．２５ｍＬに溶解させた後、３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）を０．０２５ｍＬ、エタノールを０．５ｍＬ加えて混合した。その後、２０，０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去してトータルＲＮＡの沈殿を再度得た。７０％エタノールを０．５ｍＬ加えて沈殿を洗浄した後に上清を除去し、風乾させてトータルＲＮＡの沈殿を再々度得た。【０１１９】
このトータルＲＮＡの沈殿に０．５ｍＬの蒸留水を加え、穏やかにピペッティングして沈殿を溶解させた。次に、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ（登録商標）  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この溶液からアフリカマイマイ粘液腺由来ｍＲＮＡを分取した。【０１２０】
＜実施例２＞アフリカマイマイｃＤＮＡファージライブラリーの調製
ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  Ｈｉ−Ｆｉ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記＜実施例１＞により得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを得た。すなわち、上記＜実施例１＞で得たｍＲＮＡを鋳型とし、ＸｈｏＩサイトを付加したオリゴｄＴプライマー（配列番号６）、５−メチルｄＣＴＰ、およびＭｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＭＭＬＶ−ＲＴ）を用いた逆転写反応を行った。次に、ＲＮａｓｅＨの存在下でＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉによるニックトランスレーション反応を行い、二本鎖ｃＤＮＡを得た。【０１２１】
この二本鎖ｃＤＮＡに対して、キットに添付のＰｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを作用させて、ｃＤＮＡの両末端を平滑化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプター（後述）をライゲーションさせた。次に、制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）を用いて限定分解し、ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って精製し、５’末端にＥｃｏＲＩの粘着末端および３’末端にＸｈｏＩの粘着末端を有するｃＤＮＡ断片を得た。【０１２２】
ここにいう「ＥｃｏＲＩアダプター」とは、制限酵素ＥｃｏＲＩで限定分解された際に生じる構造を５’末端に有するＤＮＡ断片である。このようなＤＮＡは、例えば、配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡを溶液中で混合し、９０〜１００℃で１〜２分間加熱した後、室温まで冷却することで調製することができる。配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡは、５’末端をリン酸化した後にＥｃｏＲＩアダプターの作製に用いることが好ましい。【０１２３】
次に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のｃＤＮＡ断片とＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲ（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（アジレント・テクノロジー社製）をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで限定分解し、５’末端を脱リン酸化したクローニング用ベクター）をライゲーションした。次に、Ｇｉｇａｐａｃｋ  III  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（アジレント・テクノロジー社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ライゲーションしたベクターをファージ粒子にパッケージングし、アフリカマイマイｃＤＮＡファージライブラリーを得た。パッケージングしたファージ溶液の力価は１．０×１０7  ｐｆｕ／ｍＬであった。【０１２４】
＜実施例３＞ＨＧ−５ｅｐｉのポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の取得
上記＜実施例２＞で得たｃＤＮＡファージライブラリーを感染させる宿主細胞（宿主菌）として大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株（アジレント・テクノロジー社製）を用い、下記に詳細を説明するプレートライセート法によりファージの増幅と回収を行った。【０１２５】
宿主菌を２０ｍＬのＬＢ培地（０．２％マルトース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有）に植菌して３７℃で終夜振盪培養し、測定波長６００ｎｍにおける吸光度が１．５程度の培養液を得た。上記＜実施例２＞で得たファージライブラリーの溶液を５０ｍＬの試験管３本に３０μＬずつ分注し、それぞれに宿主菌の培養液を５ｍＬ加えて混合した。その後、３７℃の水浴中に１５分間静置してファージ粒子を宿主菌に感染させた。【０１２６】
ファージ粒子が感染した宿主菌をプレート上で培養してプラークを形成させるため、このファージ粒子と宿主菌の混合液それぞれに４５℃に加温したＬＢトップアガー（寒天濃度：０．７％）３５ｍＬを加えて手早く混合し、３枚のＬＢプレート（縦：２４ｃｍ×横：２４ｃｍ）にそれぞれ重層した。その後、３７℃で６時間静置培養してプラークを形成させた。【０１２７】
プラークを形成させた各プレートそれぞれにＳＭ緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％  ゼラチン）５０ｍＬとクロロホルム１ｍＬの混合液を加えた後、４℃に終夜静置した。それぞれのプレートから４０ｍＬの上清を別々の遠心管に回収し、２ｍＬのクロロホルムを加えた後、試験管ミキサーを用いて数秒間撹拌した。これらの遠心管を８，０００×ｇで１５分間遠心し、上清からそれぞれ３５ｍＬを回収して合一した溶液をファージ溶液として使用した。回収したファージ溶液の力価は３．４×１０9  ｐｆｕ／ｍＬであった。【０１２８】
次に、Ｌａｍｂｄａ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このファージ溶液からλＤＮＡを得た。このλＤＮＡ０．５μｇを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のプライマーには、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、配列番号１２または配列番号１３のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして、それぞれ組み合わせて用いた。ＰＣＲ反応にはＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５５℃１分間、７２℃２分間）×４０サイクル、７２℃５分間とした。その結果、配列番号９および配列番号１３のプライマーを用いて実施したＰＣＲ反応により、約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１２９】
ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のＤＮＡ断片を精製した。次に、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＤＮＡ断片末端の平滑化と５’末端のリン酸化をした後、再度ＤＮＡ断片を精製した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＶ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）で限定分解した後にＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（ＣＩＰ）（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）で脱リン酸化したｐＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）（アジレント・テクノロジー社製）（以下、ｐＢＳとする。）とこのＤＮＡ断片をライゲーションさせた。【０１３０】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（以下、ＬＢ／Ａｍｐとする。）の寒天培地に塗布し、３７℃で終夜静置培養した。プレート上から任意の３個のシングルコロニーを、それぞれ１ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ培地に植菌して３７℃で５時間振盪培養し、培養液から０．５ｍＬをサンプリングして２０，０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。また、残りの培養液から１０μＬを２ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ培地に植菌し、３７℃で終夜振盪培養した。【０１３１】
常法に従ったアルカリミニプレップ法（Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）によりこの菌体からプラスミドの沈殿を得た後、風乾させた沈殿を１０μＬの蒸留水に溶解した。次に、このプラスミドを鋳型とし、Ｔ３プライマー（配列番号１４）とＴ７プライマー（配列番号１５）を用いたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、添付のプロトコールに従った操作を実施して遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応の条件は（９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間）×２５サイクルとした。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した結果、すべてのＰＣＲ反応液において約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認した。【０１３２】
次に、終夜振盪培養した上記の培養液２ｍＬを２０，０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するＤＮＡ断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて実施した。その結果、ＤＮＡの塩基配列は配列番号１６に示す通りであった。【０１３３】
＜実施例４＞ＨＧ−５ｅｐｉのポリペプチドをコードするＤＮＡのシークエンス
ＨＧ−５ｅｐｉのポリペプチドをコードするＤＮＡをシークエンスするため、＜実施例３＞で得られたＤＮＡ断片の５’側および３’側の未知領域について、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによるシークエンスを実施した。【０１３４】
上記＜実施例３＞で得たλＤＮＡ６μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）により限定分解した後、アガロースゲル電気泳動に供し、０．５〜４．０ｋｂｐの範囲をメスで切り出して回収した。その後、ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ＢａｍＨＩで限定分解されたλＤＮＡの断片を得た。次に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、λＤＮＡの断片をセルフライゲーションさせた。このライゲーション反応液を鋳型とし、配列番号１７および配列番号１８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃３分間）×４０サイクル、７２℃５分間とした。【０１３５】
さらに、このＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの反応液を鋳型として、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のプライマーには、配列番号１９および配列番号２０のオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応にはＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応は、（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃３分間）×４０サイクルの条件で実施した。その結果、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１３６】
Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ＤＮＡ断片末端の平滑化と５’末端のリン酸化をした後、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ  ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｍｏｖｅｒｓ（ミリポア社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。その後、ＥｃｏＲＶで限定分解した後にＣＩＰで脱リン酸化したｐＢＳとこのＤＮＡ断片をライゲーションさせた。【０１３７】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地４ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するＤＮＡ断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。その結果、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより得たＤＮＡ断片が、＜実施例３＞で得られた配列番号１６の塩基配列の一部を両端に含むＤＮＡであることを確認した。また、これにより、セルフライゲーションしたλＤＮＡの断片中の、配列番号１６の塩基配列を含むｃＤＮＡの両末端の塩基配列も決定された。【０１３８】
次に、当該ｃＤＮＡの両末端のそれぞれとアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲクローニングを実施し、ＨＧ−５ｅｐｉをコードするＤＮＡ全長の取得を試みた。すなわち、配列番号２１および配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、＜実施例３＞で調製したλＤＮＡ０．５μｇを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アジレント・テクノロジー社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間）×４０サイクル、７２℃５分間の条件で実施した。その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１３９】
ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のＤＮＡ断片を精製した。次に、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＤＮＡ断片末端の平滑化と５’末端のリン酸化をした後、再度ＤＮＡ断片を精製した。その後、ＥｃｏＲＶで限定分解した後にＣＩＰで脱リン酸化したｐＢＳとこのＤＮＡ断片をライゲーションさせた。【０１４０】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地に塗布し、３７℃で終夜静置培養した。３個のシングルコロニーを、それぞれ４ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ培地に植菌して３７℃で終夜振盪培養し、２０，０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するＤＮＡ断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した。その結果、ＰＣＲクローニングにより得たＤＮＡの塩基配列は配列番号２３に示す通りであった。【０１４１】
しかしながら、配列番号２３の塩基配列から予想されるＨＧ−５ｅｐｉのアミノ酸配列を公知のＣ５−ｅｐｉ（参考例１に記載のもの）のアミノ酸配列と比較したところ、配列番号２３の塩基配列は、ＨＧ−５ｅｐｉのＮ末側をコードする領域を欠く不完全なものであると考えられた。そこで、この配列番号２３の塩基配列を含むｃＤＮＡの５’側の配列をさらにシークエンスするため、５’ＲＡＣＥ法による未知領域ＤＮＡの増幅反応を行った。５’ＲＡＣＥ反応の鋳型となるｃＤＮＡの調製および５’ＲＡＣＥ反応は、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。ｃＤＮＡ合成の材料となるＲＮＡは、＜実施例１＞において精製したｍＲＮＡ０．５μｇを使用した。プライマーには配列番号２４と配列番号２５のオリゴヌクレオチドを用いた。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプターを結合させたｃＤＮＡ希釈液を鋳型とし、ＰＣＲ反応にはＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｉｘ（クロンテック社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃３０秒間、（９４℃５秒間、７２℃４分間）×５サイクル、（９４℃５秒間、７０℃４分間）×５サイクル、（９４℃５秒間、６８℃４分間）×２５サイクルとした。【０１４２】
さらに、この５’ＲＡＣＥの反応液を鋳型としてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のプライマーには配列番号２６および配列番号２７のオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応にはＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｉｘを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃３０秒間、（９４℃５秒間、７２℃４分間）×５サイクル、（９４℃５秒間、７０℃４分間）×５サイクル、（９４℃５秒間、６８℃４分間）×２５サイクルとした。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１４３】
ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のＤＮＡ断片を精製した。次に、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＤＮＡ断片末端の平滑化と５’末端のリン酸化をした後、再度ＤＮＡ断片を精製した。その後、ＥｃｏＲＶで限定分解した後にＣＩＰで脱リン酸化したｐＢＳとこのＤＮＡ断片をライゲーションさせた。【０１４４】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地に塗布し、３７℃で終夜静置培養した。３個のシングルコロニーを、それぞれ４ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ培地に植菌して３７℃で終夜振盪培養し、２０，０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するＤＮＡ断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した。その結果、５’ＲＡＣＥ反応により得たＤＮＡの塩基配列は配列番号２８に示す通りであった。【０１４５】
＜実施例５＞ＨＧ−５ｅｐｉのポリペプチド全長をコードするＤＮＡのクローニング
上記＜実施例４＞において得たＨＧ−５ｅｐｉのＤＮＡ断片をライゲーションしたｐＢＳそれぞれについて、同じ制限酵素で限定分解した後にライゲーションし、ＨＧ−５ｅｐｉの全長をコードするＤＮＡをサブクローニングしたベクター（ｐＢＳ／ＨＧ−５ｅｐｉ）を得た。手順を以下に示す。【０１４６】
配列番号２８の塩基配列からなるＤＮＡをライゲーションしたｐＢＳをＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＥｃｏＲＶで限定分解し、ＨＧ−５ｅｐｉのＮ末端側をコードするＤＮＡを含む約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このＤＮＡ断片を精製した。【０１４７】
また、配列番号２３の塩基配列からなるＤＮＡをライゲーションしたｐＢＳをＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで限定分解し、ＨＧ−５ｅｐｉのＣ末端側をコードするＤＮＡとｐＢＳのＤＮＡからなる約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＱＩＡＥＸ  II  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このＤＮＡ断片を精製した。次に、ＣＩＰでこのＤＮＡ断片を脱リン酸化した後、再度精製した。【０１４８】
なお、ＥｃｏＲＩはｐＢＳを１ヶ所切断する。また、ＥｃｏＲＶは、配列番号２８の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号２３の塩基配列からなるＤＮＡを、その重複する領域において１ヶ所切断する。よって、上記により得た２つのＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、ｐＢＳにサブクローニングされたＨＧ−５ｅｐｉの全長をコードするＤＮＡが得られる。【０１４９】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記により得た２つのＤＮＡ断片をライゲーションした。このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地４ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するＤＮＡ断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した。その結果、ｐＢＳにサブクローニングしたＤＮＡが配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡであることを確認した。【０１５０】
＜参考例１＞公知のＣ５−ｅｐｉとＨＧ−５ｅｐｉの相同性
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡがコードするＨＧ−５ｅｐｉのアミノ酸配列（配列番号２）について、公知のＣ５−ｅｐｉのアミノ酸配列との相同性をＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）で解析した結果、ヒト由来（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ＿０５６３６９、配列番号３）とは３９％、ゼブラフィッシュ由来（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ＿９９８０１５、配列番号４）とは３９％、線虫由来（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ＿４９７８７６、配列番号５）とは３０％であった。【０１５１】
＜参考例２＞ＨＧ−５ｅｐｉの疎水性プロファイル解析
ＨＧ−５ｅｐｉのアミノ酸配列（配列番号２）の疎水性プロファイル解析を行ったところ、ＨＧ−５ｅｐｉはＮ末に膜貫通領域を有する可能性が示唆された。そこで、以降のＨＧ−５ｅｐｉの発現実験には、配列番号１に示す塩基配列の内、Ｎ末の膜貫通領域をコードすると予想される部分を除いた、塩基番号１００〜１８０６の領域を利用した。【０１５２】
＜実施例６＞ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現系用ベクターの作製（１）
ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現系用ベクターを得るため、上記＜実施例５＞で得たｐＢＳ／ＨＧ−５ｅｐｉを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のプライマーには、配列番号２９および配列番号３０のオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応にはＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロジェン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃２０秒間、（９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、６８℃３分間）×２０サイクルとした。その結果、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１５３】
ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記ＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）を用いて限定分解した後、再度同様にＤＮＡ断片を精製した。発現ベクターであるｐＦＢＩＦ１（後述）についても同じ制限酵素による限定分解と精製を実施した。次に、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このＤＮＡ断片とｐＦＢＩＦ１をライゲーションさせた。【０１５４】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地４ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。次に、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いたシークエンス反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてシークエンス解析を行った。その結果、ライゲーションしたＤＮＡ断片の塩基配列が、配列番号１の塩基番号１００〜１８０６の塩基配列と同じであることを確認した。このようにして、ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現用ベクター（ｐＦＢＩＦ１／ＨＧ−５ｅｐｉ）を得た。【０１５５】
ここにいうｐＦＢＩＦ１とは、マウスＩｇκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）とＦＬＡＧタグのアミノ酸配列（配列番号３２）からなるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３４）をコードするＤＮＡを、ｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロジェン社製）のマルチクローニングサイトに挿入して作製した昆虫細胞発現用ベクターである。具体的には、ｐＦＢＩＦ１は、配列番号３３の塩基配列からなるＤＮＡをサブクローニングしたベクターを鋳型とし、配列番号３５および配列番号３６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ反応により得られるＤＮＡ断片を、制限酵素とＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いた上記の方法と同様にして、ｐＦａｓｔＢａｃ１のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを両端とする部位に挿入することで得られたベクターである。【０１５６】
配列番号３３の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとそれに相補的なヌクレオチドを合成し、それぞれの５’末端をＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅでリン酸化してから溶液中で混合し、９０〜１００℃で１〜２分間加熱した後、室温まで冷却することで調製することができる。よって、このＤＮＡを任意のベクター、例えば、ＥｃｏＲＶで限定分解した後にＣＩＰで脱リン酸化したｐＢＳにサブクローニングすることで、上記ＰＣＲ反応の鋳型として使用することができる。【０１５７】
このようにして得られるｐＦＢＩＦ１／ＨＧ−５ｅｐｉは、マウスＩｇκ鎖の分泌シグナル、ＦＬＡＧタグ、アスパラギンとセリンからなるジペプチドのリンカー、配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、が融合されたポリペプチドを発現させるためのベクターである。【０１５８】
＜実施例７＞ＨＧ−５ｅｐｉ発現用バクミドの調製（１）
続いて、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システム（インビトロジェン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ｐＦＢＩＦ１／ＨＧ−５ｅｐｉとバクミドの間で遺伝子の組換えを行い、バクミドにマウスＩｇκ鎖の分泌シグナル、ＦＬＡＧタグ、アスパラギンとセリンからなるジペプチドのリンカー、配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した。【０１５９】
すなわち、ｐＦＢＩＦ１／ＨＧ−５ｅｐｉを用いてバクミド調製用の大腸菌であるＤＨ１０Ｂａｃ株（インビトロジェン社製）を形質転換し、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養して白色のシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ培地１．５ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。その後、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムに添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からバクミドを得た。Ｍ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−４０）（配列番号４１）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４２）をプライマーとしたＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ断片の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認し、バクミドに目的のＤＮＡが全長挿入されたことを確認した。【０１６０】
＜実施例８＞昆虫細胞を用いたＨＧ−５ｅｐｉの調製（１）
上記＜実施例７＞で得たバクミドを、昆虫細胞Ｓｆ２１に導入した。すなわち、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（インビトロジェン社製）を２ｍＬ用い、３５ｍｍシャーレにＳｆ２１細胞を８×１０5個播種し、２７℃で１時間インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。細胞がシャーレに接着したことを確認した後、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液（後述）を０．２ｍＬ添加し、２７℃で５時間インキュベートした。その後、シャーレから培地を吸引除去した後にＳｆ９００ III培地（インビトロジェン社製）を４ｍＬ添加し、２７℃で７２時間インキュベートした。その後、ピペッティング操作によりプレートから遊離させた細胞と培養液を回収し、５，０００×ｇで５分間遠心した後、上清を一次ウイルス液として回収した。【０１６１】
ここで、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液とは、別々に調製したＡ溶液（Ｇｒａｃｅ'ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  １００μＬとバクミド（０．１μｇ／μＬ）１０μＬの混合液）とＢ溶液（Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  １００μＬとＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）  II  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）  ８μＬの混合液）を穏やかによく混合した後、室温で３０分間静置した溶液のことを意味する。【０１６２】
Ｓｆ９００ III培地を５０ｍＬ用い、スピナーフラスコ（容量：１００ｍＬ）にＳｆ２１細胞を５×１０7個播種した培養液に対して一次ウイルス液を全量添加し、２７℃で７２時間撹拌培養した。その後、培養液を５，０００×ｇで５分間遠心した後、上清を二次ウイルス液として回収した。【０１６３】
Ｓｆ９００ III培地を９００ｍＬ用い、バッフル付きフラスコ（容量：３Ｌ）にＳｆ２１細胞を１×１０9個播種した培養液に対して二次ウイルス液を４０ｍＬ添加し、２７℃で７２時間振盪培養した。その後、培養液を１０，０００×ｇで２０分間遠心した後、上清を回収してＨＧ−５ｅｐｉを含む培養液を得た。【０１６４】
＜実施例９＞ＨＧ−５ｅｐｉの精製（１）
上記＜実施例８＞で得たＨＧ−５ｅｐｉを含む培養液８０ｍＬに対し、１０％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を１．６ｍＬ加えて穏やかに混合した。この溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳ  １０ｍＬを用いて平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）１ｍＬに流速１ｍＬ／ｍｉｎで全量アプライした。続いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳを流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで４ｍＬ通液し、ＨＧ−５ｅｐｉを溶出させた。【０１６５】
ＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分は、抗ＦＬＡＧ抗体であるＭ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（シグマ・アルドリッチ社製）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により確認した。すなわち、上記のカラム精製における溶出画分を、還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ゲル内で分離されたタンパク質をセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に浸し、室温で１時間振盪させてブロッキングした。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ・アルドリッチ社製）を５％スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間振盪させて抗体染色した。ＴＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ（サーモサイエンティフィック社製）に１分間浸した後、発光シグナルをＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて検出した。濃度既知の標準試料として同時に電気泳動に供したＡｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＦＬＡＧ−ＢＡＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（シグマ・アルドリッチ社製）の発光シグナル強度（輝度）との比較からタンパク質濃度を算出した結果、ＨＧ−５ｅｐｉの濃度は０．４μｇ／μＬであった。【０１６６】
このようにして得られたＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分を、「粗精製組換えＨＧ−５ｅｐｉ」として、以後の実験に供した。【０１６７】
＜実施例１０＞ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現用ベクターの作製（２）
ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現系用ベクターを得るため、上記＜実施例５＞で得たｐＢＳ／ＨＧ−５ｅｐｉを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のプライマーには、配列番号３７および配列番号３８のオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応にはＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃２０秒間、（９４℃２０秒間、６２℃２０秒間、６８℃４分間）×１８サイクルとした。ＴＯＰＯ（登録商標）  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯに増幅したＤＮＡ断片を挿入したベクターを得た。【０１６８】
このベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地２ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。このベクターを制限酵素ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）およびＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）を用いて限定分解した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ＤＮＡ断片（約１．７ｋｂｐ）を精製して得た。発現ベクターであるｐＦＢＩＦ２（後述）についても同じ制限酵素による限定分解と精製を実施した。次に、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このＤＮＡ断片とｐＦＢＩＦ２をライゲーションさせた。【０１６９】
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社製）を形質転換した後、ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地４ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。次に、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いたシークエンス反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンス解析を行った。その結果、ライゲーションしたＤＮＡ断片の塩基配列が、配列番号１の塩基番号１００〜１８０６の塩基配列と同じであることを確認した。このようにして、ＨＧ−５ｅｐｉの昆虫細胞発現用ベクター（ｐＦＢＩＦ２／ＨＧ−５ｅｐｉ）を得た。【０１７０】
ここにいうｐＦＢＩＦ２とは、マウスＩｇκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）とＦＬＡＧタグのアミノ酸配列（配列番号３２）からなるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３４）をコードするＤＮＡを、ｐＦａｓｔＢａｃ１のマルチクローニングサイトに挿入して作製した昆虫細胞発現用ベクターである。具体的には、ｐＦＢＩＦ２は、配列番号３３の塩基配列からなるＤＮＡをサブクローニングしたベクターを鋳型とし、配列番号３９および配列番号４０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ反応により得られるＤＮＡ断片を、制限酵素とＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いた上記の方法と同様にして、ｐＦａｓｔＢａｃ１のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを両端とする部位に挿入することで得られたベクターである。【０１７１】
このようにして得られるｐＦＢＩＦ２／ＨＧ−５ｅｐｉは、マウスＩｇκ鎖の分泌シグナル、ＦＬＡＧタグ、バリンとアスパラギン酸からなるジペプチドのリンカー、配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、が融合されたポリペプチドを発現させるためのベクターである。【０１７２】
＜実施例１１＞ＨＧ−５ｅｐｉ発現用バクミドの調製（２）
続いて、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ｐＦＢＩＦ２／ＨＧ−５ｅｐｉとバクミドの間で遺伝子の組換えを行い、バクミドにマウスＩｇκ鎖の分泌シグナル、ＦＬＡＧタグ、バリンとアスパラギン酸からなるジペプチドのリンカー、配列番号２におけるアミノ酸番号３４〜６０１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した。【０１７３】
すなわち、ｐＦＢＩＦ２／ＨＧ−５ｅｐｉを用いてバクミド調製用の大腸菌であるＤＨ１０Ｂａｃ株を形質転換し、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ寒天培地のプレート上に塗布し、３７℃で終夜静置培養して白色のシングルコロニーを得た。このコロニーをＬＢ培地１．５ｍＬに植菌して３７℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。その後、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムに添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からバクミドを得た。Ｍ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−４０）（配列番号４１）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４２）をプライマーとしたＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ断片の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認し、バクミドに目的のＤＮＡが全長挿入されたことを確認した。【０１７４】
＜実施例１２＞昆虫細胞を用いたＨＧ−５ｅｐｉの調製（２）
上記＜実施例１１＞で得たバクミドを、昆虫細胞Ｓｆ２１に導入した。すなわち、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄを２ｍＬ用い、３５ｍｍシャーレにＳｆ２１細胞を８×１０5個播種し、２７℃で１時間インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。細胞がシャーレに接着したことを確認した後、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液（後述）を０．２ｍＬ添加し、２７℃で５時間インキュベートした。その後、シャーレから培地を吸引除去した後にＳｆ９００ III培地を４ｍＬ添加し、２７℃で７２時間インキュベートした。その後、ピペッティング操作によりプレートから遊離させた細胞と培養液を一次ウイルス液として回収した。【０１７５】
ここで、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液とは、別々に調製したＡ溶液（Ｇｒａｃｅ'ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  １００μＬとバクミド（０．１μｇ／μＬ）１０μＬの混合液）とＢ溶液（Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  １００μＬとＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  II  Ｒｅａｇｅｎｔ  ８μＬの混合液）を穏やかによく混合した後、室温で３０分間静置した溶液のことを意味する。【０１７６】
Ｓｆ９００ III培地を１００ｍＬ用い、スピナーフラスコ（容量：２００ｍＬ）にＳｆ２１細胞を１×１０８個播種した培養液に対して一次ウイルス液を全量添加し、２７℃で７２時間撹拌培養した。その後、培養液を二次ウイルス液として回収した。【０１７７】
Ｓｆ９００ III培地を１．８Ｌ用い、バッフル付きフラスコ（容量：３Ｌ）にＳｆ２１細胞を２×１０9個播種した培養液に対して二次ウイルス液を全量添加し、２７℃で９６時間振盪培養した。その後、培養液を１０，０００×ｇで２０分間遠心した後、上清を回収してＨＧ−５ｅｐｉを含む培養液を得た。【０１７８】
＜実施例１３＞ＨＧ−５ｅｐｉの精製（２）
上記＜実施例１２＞で得たＨＧ−５ｅｐｉを含む培養液４００ｍＬに対し、１０％  ＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を８ｍＬ加えて穏やかに混合した。この溶液を蒸留水５０ｍＬを用いて平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム  ５ｍＬに流速２ｍＬ／ｍｉｎで全量アプライした。続いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳを流速１ｍＬ／ｍｉｎで２２ｍＬ通液し、ＨＧ−５ｅｐｉを溶出させて分画回収した。ＨＧ−５ｅｐｉを含む画分を合一し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳ  １０ｍＬを用いて平衡化したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌカラム（シグマ・アルドリッチ社製）１ｍＬに流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで全量アプライした。続いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌを流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで１０ｍＬ通液してカラムを洗浄した後、０．４ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで６ｍＬ通液し、ＨＧ−５ｅｐｉを溶出させて分画回収した。ＨＧ−５ｅｐｉを含む画分を合一し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ７．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（サーモサイエンティフィック社製）に全量を移し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＣＨＡＰＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて透析した。【０１７９】
それぞれの精製工程において、ＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分は、抗ＦＬＡＧ抗体であるＭ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙを用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により確認した。すなわち、上記のカラム精製における溶出画分を、還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ゲル内で分離されたタンパク質をセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に浸し、室温で１時間振盪させてブロッキングした。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体を５％スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間振盪させて抗体染色した。ＴＢＳ−ＴでＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａに１分間浸した後、発光シグナルをＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００を用いて検出した。濃度既知の標準試料として同時に電気泳動に供したＡｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＦＬＡＧ−ＢＡＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎの発光シグナル強度（輝度）との比較からタンパク質濃度を算出した結果、ＨＧ−５ｅｐｉの濃度は０．５μｇ／μＬであった。【０１８０】
また、上記のカラム精製によって得られたＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分は、図１に示す通り、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したゲルをＣＢＢ染色した際に、分子量スタンダード（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオラッド社製）と比較して約７５ｋＤａの単一バンドのみが認められる画分であった。【０１８１】
このようにして得られたＨＧ−５ｅｐｉの溶出画分を、「組換えＨＧ−５ｅｐｉ」として、以後の実験に供した。【０１８２】
＜参考例３＞ＨＰＬＣポストカラムラベル法によるＩｄｏＡ含量の測定方法
ＩｄｏＡ含量の測定は、図２にフローダイアグラムを示したＨＰＬＣポストカラムラベル法により行った。蛍光光度計による検出のために糖を標識する試薬（ラベル化試薬）には２−シアノアセトアミドを用いた。分析カラムには、ガードカラムとしてＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（内径：４ｍｍ×長さ：５０ｍｍ）（日本ダイオネクス社製）を、分離カラムとしてＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（内径：４ｍｍ×長さ：２５０ｍｍ）（日本ダイオネクス社製）を用い、両者を直列に接続したカラムを使用した。また、カラム温度は室温とした。【０１８３】
溶離液を送液するＨＰＬＣシステムは、Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５（ウォーターズ社製）を用いた。移動相には、溶媒Ａ（蒸留水）および溶媒Ｂ（０．１Ｍ  酢酸ナトリウム）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から２分後までは溶媒Ｂの割合を０％とし、２分後から５分後までの間に溶媒Ｂの割合を０％から５％に、５分後から６５分後までの間に溶媒Ｂの割合を５％から１０％に変化させた。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎとした。【０１８４】
ラベル化試薬を送液するＨＰＬＣポンプは、６００Ｅ（ウォーターズ社製）を用いた。移動相には、溶媒Ｃ（０．５％  ２−シアノアセトアミド）および溶媒Ｄ（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）を用いた。送液はアイソクラティックで行い、溶媒Ｃと溶媒Ｄをオンラインで１：１の割合で混合させた溶液を送液した。流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。【０１８５】
上記の条件に従ってカラムを通液させた溶離液とラベル化試薬を３方ジョイントを通じて合流させた後、反応コイル（内径：０．５ｍｍ×長さ：１０ｍ）、冷却コイル（内径：０．２５ｍｍ×長さ：３ｍ）、蛍光検出器の順に通液させた。カラムから溶出された糖を２−シアノアセトアミドで標識するため、反応コイルはＤｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂａｔｈ  ＤＢ−５（シマムラテック社製）を用いて１２５℃に加熱した。反応コイルで加熱された溶液を冷却するため、冷却コイルは室温の蒸留水に浸した状態で使用した。蛍光検出器には２４７５（ウォーターズ社製）を用い、励起波長を３４６ｎｍおよび蛍光波長を４１０ｎｍに設定した。【０１８６】
ＮＡＨまたはＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰをＮ−脱アセチル化および亜硝酸分解し、ＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られたクロマトグラムを図３に示す。Ｎ−脱アセチル化および亜硝酸分解は、後述の＜実施例１４＞、＜実施例１６＞、または＜実施例１７＞に記載した方法に従って実施した。Ｎ−脱アセチル化および亜硝酸分解して得られる二糖は、ＮＡＨの場合はＧｌｃＡとａＭａｎからなる二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎ）のみであり、ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰの場合はＩｄｏＡとａＭａｎからなる二糖（ＩｄｏＡ−ａＭａｎ）とＧｌｃＡ−ａＭａｎの２種類である。よって、両クロマトグラムの比較から、ＧｌｃＡ−ａＭａｎとＩｄｏＡ−ａＭａｎを分離して検出できたことが分かる。【０１８７】
また、ＧｌｃＡ−ａＭａｎとＩｄｏＡ−ａＭａｎの標準品をそれぞれＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して得られたピーク面積を比較した結果、ピーク面積あたりの物質量はＩｄｏＡ−ａＭａｎがＧｌｃＡ−ａＭａｎの１．３倍であることが分かった。よって、ＩｄｏＡ含量は、下記の数式にＧｌｃＡ−ａＭａｎとＩｄｏＡ−ａＭａｎのピーク面積を代入して算出することができる。【０１８８】
【数１】
0006478190.tif 000007
【０１８９】
ここで用いたＧｌｃＡ−ａＭａｎの標準品は、後述する＜参考例４＞により得たものである。また、ここで用いたＩｄｏＡ−ａＭａｎの標準品は、後述する＜参考例５＞により得たものである。【０１９０】
＜参考例４＞ＧｌｃＡ−ａＭａｎ標準品の調製
ＮＡＨの乾燥粉末２０ｍｇをヒドラジン試薬（ヒドラジン硫酸４０ｍｇをヒドラジン一水和物１ｍＬに溶解した溶液）４ｍＬに溶解し、ヒートブロックを用いて９６℃で５時間インキュベートした。この溶液に蒸留水４ｍＬを加えて希釈した後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ２．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、この溶液を凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。この乾燥粉末を３ｍＬの３３％酢酸に溶解し、３ｍＬの５％亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に９０分間静置した。この溶液に３ｍＬの１２．５％スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に３０分間静置した。このようにして、ＧｌｃＡ−ａＭａｎを含有する溶液を得た。【０１９１】
遠心エバポレーターを用いてこの溶液を１ｍＬに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムには、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４  Ｇｅｌ（バイオラッド社製）を充填したカラム（内径：２ｃｍ×長さ：１２０ｃｍ）を使用した。また、カラム温度は４℃とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．１５ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出液を４．３ｍＬずつ分画し、カルバゾール硫酸法（BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.）によって、ＧｌｃＡ−ａＭａｎの溶出画分を確認した。ＧｌｃＡ−ａＭａｎの溶出画分を合一し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０１９２】
この乾燥粉末を０．２ｍＬの蒸留水に溶解し、全量を２回に分けてＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（内径：９ｍｍ×長さ：２５０ｍｍ）（日本ダイオネクス社製）に供して精製した。移動相には、溶媒Ａ（蒸留水）および溶媒Ｂ（０．１Ｍ  酢酸ナトリウム）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、０〜５分後までは溶媒Ｂの割合を０％とし、５〜１２分後までは溶媒Ｂの割合を０％から５％に、１２〜１６２分後までは溶媒Ｂの割合を５％から１０％に変化させた。流速は１．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出液を０．８ｍＬずつ分画し、各画分をＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して、ＧｌｃＡ−ａＭａｎの溶出画分を確認した。ＧｌｃＡ−ａＭａｎの溶出画分を合一し、カルバゾール硫酸法によってモル濃度を定量した。【０１９３】
以上によって、２５６μＭのＧｌｃＡ−ａＭａｎ標準品の溶液３．２ｍＬを得た。【０１９４】
＜参考例５＞ＩｄｏＡ−ａＭａｎ標準品の調製
ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰの乾燥粉末４０ｍｇを蒸留水０．４ｍＬに溶解し、３．６ｍＬの亜硝酸−硫酸溶液（２ｍＬの氷冷した０．５Ｍ亜硝酸バリウムに２ｍＬの０．５Ｍ硫酸を加えて混合した後、２０，０００×ｇで１分間遠心して得られた上清）を加えて混合した後、室温に２０分間静置した。このようにして、ＩｄｏＡ−ａＭａｎを含有する溶液を得た。【０１９５】
この溶液に１．１ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて混合した後、遠心エバポレーターを用いて１ｍＬに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムには、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４  Ｇｅｌを充填したカラム（内径：２ｃｍ×長さ：１２０ｃｍ）を使用した。また、カラム温度は４℃とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．２４ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出液を４ｍＬずつ分画し、カルバゾール硫酸法によって、ＩｄｏＡ−ａＭａｎの溶出画分を確認した。ＩｄｏＡ−ａＭａｎの溶出画分を合一し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０１９６】
この乾燥粉末を０．２ｍＬの蒸留水に溶解し、全量を３回に分けてＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（内径：９ｍｍ×長さ：２５０ｍｍ）に供して精製した。移動相には、溶媒Ａ（蒸留水）および溶媒Ｂ（０．１Ｍ  酢酸ナトリウム）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、０〜５分後までは溶媒Ｂの割合を０％とし、５〜１２分後までは溶媒Ｂの割合を０％から５％に、１２〜１６２分後までは溶媒Ｂの割合を５％から１０％に変化させた。流速は１．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出液を０．８ｍＬずつ分画し、各画分をＨＰＬＣポストカラムラベル法に供して、ＩｄｏＡ−ａＭａｎの溶出画分を確認した。ＩｄｏＡ−ａＭａｎの溶出画分を合一し、カルバゾール硫酸法によってモル濃度を定量した。【０１９７】
以上によって、３６２μＭのＩｄｏＡ−ａＭａｎ標準品の溶液８ｍＬを得た。【０１９８】
＜実施例１４＞ＮＡＨを基質とした粗精製ＨＧ−５ｅｐｉの活性測定
上記＜実施例９＞で得た粗精製組換えＨＧ−５ｅｐｉを５μＬ（２μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で１７時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを１１７μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水１００μＬに溶解した。さらに、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水６０μＬに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０１９９】
この乾燥粉末をヒドラジン試薬（ヒドラジン硫酸４０ｍｇをヒドラジン一水和物１ｍＬに溶解した溶液）０．１２ｍＬに溶解し、ヒートブロックを用いて９６℃で５時間インキュベートした。蒸留水０．２ｍＬを加えて希釈した後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ２．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２００】
この乾燥粉末を８０μＬの３３％酢酸に溶解し、８０μＬの５％亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に８０分間静置した。その後、８０μＬの１２．５%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に３０分間静置した。遠心エバポレーターを用いて乾燥させた後、蒸留水５０μＬに溶解し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）２本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を２００ｎｍに設定した。二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎまたはＩｄｏＡ−ａＭａｎ）が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２０１】
続いて、上記＜参考例３＞に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を３００μＬの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、５０μＬをＨＰＬＣポストカラムラベル法に供した。その結果を図４に示す。図４のクロマトグラムに示した通り、ＩｄｏＡ−ａＭａｎのピークを確認できたため、ＨＧ−５ｅｐｉがＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する酵素であることが分かった。また、ＧｌｃＡ−ａＭａｎとＩｄｏＡ−ａＭａｎのピーク面積比（ＧｌｃＡ−ａＭａｎのピーク面積：ＩｄｏＡ−ａＭａｎのピーク面積）は７２．７：２７．３であった。よって、上記の数式１により、ＩｄｏＡ含量は３２．８％と算出された。【０２０２】
＜実施例１５＞ＮＳＨを基質とした粗精製ＨＧ−５ｅｐｉの活性測定
上記＜実施例９＞で得た粗精製組換えＨＧ−５ｅｐｉを２０μＬ（８μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で１７時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５ｍｇ／ｍＬ  ＮＳＨ、の組成となるように調製した。その後、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを１１７μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水１００μＬに溶解した。さらに、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して沈殿を風乾させた後、蒸留水１０μＬに溶解した。【０２０３】
この溶液に４０μＬの亜硝酸−硫酸溶液（０．５ｍＬの氷冷した０．５Ｍ亜硝酸バリウムに０．５ｍＬの０．５Ｍ硫酸を加えて混合した後、２０，０００×ｇで１分間遠心して得られた上清）を加えて混合した後、室温に１５分間静置した。１２μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて混合した後、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）２本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を２００ｎｍに設定した。二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎまたはＩｄｏＡ−ａＭａｎ）が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２０４】
続いて、上記＜参考例３＞に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を３００μＬの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、５０μＬをＨＰＬＣポストカラムラベル法に供した。その結果を図５に示す。図５のクロマトグラムに示した通り、ＩｄｏＡ−ａＭａｎのピークは検出されなかったため、ＨＧ−５ｅｐｉがＮＳＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に実質的に異性化しない酵素であることが分かった。【０２０５】
＜実施例１６＞ＮＡＨを基質としたＨＧ−５ｅｐｉの活性測定
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを１０μＬ（５μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で１２時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを１１７μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水１００μＬに溶解した。さらに、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水６０μＬに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２０６】
この乾燥粉末をヒドラジン試薬（ヒドラジン硫酸４０ｍｇをヒドラジン一水和物１ｍＬに溶解した溶液）０．１２ｍＬに溶解し、ヒートブロックを用いて９６℃で５時間インキュベートした。蒸留水０．２ｍＬを加えて希釈した後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ２．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２０７】
この乾燥粉末を１００μＬの３３％酢酸に溶解し、１００μＬの５％亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に８０分間静置した。その後、１００μＬの１２．５%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に３０分間静置した。遠心エバポレーターを用いて乾燥させた後、蒸留水５０μＬに溶解し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）２本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を２００ｎｍに設定した。二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎまたはＩｄｏＡ−ａＭａｎ）の溶出画分をカルバゾール硫酸法によって確認して分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２０８】
続いて、上記＜参考例３＞に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を２５０μＬの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、５０μＬをＨＰＬＣポストカラムラベル法に供した。その結果を図６に示す。図６のクロマトグラムに示した通り、ＩｄｏＡ−ａＭａｎのピークを確認できたため、ＨＧ−５ｅｐｉがＮＡＨのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化する酵素であることが分かった。また、ＧｌｃＡ−ａＭａｎとＩｄｏＡ−ａＭａｎのピーク面積比（ＧｌｃＡ−ａＭａｎのピーク面積：ＩｄｏＡ−ａＭａｎのピーク面積）は７３．１：２６．９であった。よって、上記の数式１により、ＩｄｏＡ含量は３２．４％と算出された。【０２０９】
＜実施例１７＞ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰを基質としたＨＧ−５ｅｐｉの活性測定
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを２〜１６μＬ（１．０〜８．０μｇ）用いて全量１００μＬの反応液を調製し、３０℃のヒートブロックに静置して６時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰ、の組成となるように調製した。その後、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水１００μＬに溶解した。さらに、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水２００μＬに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２１０】
この乾燥粉末をヒドラジン試薬（ヒドラジン硫酸４０ｍｇをヒドラジン一水和物１ｍＬに溶解した溶液）０．３ｍＬに溶解し、ヒートブロックを用いて９６℃で７時間インキュベートした。蒸留水０．２ｍＬを加えて希釈した後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ２．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅに全量を移し、蒸留水を用いて透析した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２１１】
この乾燥粉末を２００μＬの３３％酢酸に溶解し、２００μＬの５％亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に９０分間静置した。その後、２００μＬの１２．５%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に３０分間静置した。遠心エバポレーターを用いて１００μＬに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）２本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を２００ｎｍに設定した。二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎまたはＩｄｏＡ−ａＭａｎ）が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２１２】
続いて、上記＜参考例３＞に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を３００μＬの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、５０μＬをＨＰＬＣポストカラムラベル法に供した。その結果を表１に示す。【０２１３】
【表１】
0006478190.tif 000008
【０２１４】
表１に示した通り、ＨＧ−５ｅｐｉの添加量に依存してＩｄｏＡ含量が減少する傾向が認められたため、ＨＧ−５ｅｐｉがＣＤＳＮＡｃ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化する酵素であることが分かった。【０２１５】
＜実施例１８＞ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰを基質としたＨＧ−５ｅｐｉの活性測定
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを５μＬ（２．５μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で１７時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰ、の組成となるように調製した。その後、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを１１７μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水１００μＬに溶解した。さらに、１．３％酢酸カリウム含有エタノールを２３４μＬ加えて混合した後、２０，０００×ｇで５分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して沈殿を風乾させた後、蒸留水１０μＬに溶解した。【０２１６】
この溶液に４０μＬの亜硝酸−硫酸溶液（０．５ｍＬの氷冷した０．５Ｍ亜硝酸バリウムに０．５ｍＬの０．５Ｍ硫酸を加えて混合した後、２０，０００×ｇで１分間遠心して得られた上清）を加えて混合した後、室温に１５分間静置した。１２μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて混合した後、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）２本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には０．１Ｍ酢酸アンモニウムを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を２００ｎｍに設定した。二糖（ＧｌｃＡ−ａＭａｎまたはＩｄｏＡ−ａＭａｎ）の溶出画分をカルバゾール硫酸法によって確認して分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。【０２１７】
続いて、上記＜参考例３＞に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を３００μＬの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、５０μＬをＨＰＬＣポストカラムラベル法に供した。その結果を表２に示す。【０２１８】
【表２】
0006478190.tif 000009
【０２１９】
表２に示した通り、反応前後におけるＩｄｏＡ含量が実質的に変化しなかったため、ＨＧ−５ｅｐｉがＣＤＳＮＳ−ＨＥＰのＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に実質的に異性化しない酵素であること、および、ＣＤＳＮＳ−ＨＥＰのＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に実質的に異性化しない酵素であること、が分かった。【０２２０】
＜実施例１９＞[５−３Ｈ]ＮＡＨの調製
放射性同位体を用いたＨＧ−５ｅｐｉ活性の測定における基質として用いるため、ＨｅｘＡ残基の５位の水素原子を３Ｈ（トリチウム）で置換したＮＡＨ（以下、「[５−３Ｈ]ＮＡＨ」と言う。）を調製した。手順を以下に示す。【０２２１】
上記＜実施例９＞で得た粗精製組換えＨＧ−５ｅｐｉを０．２ｍＬ（０．０８ｍｇ）用い、全量２．７ｍＬの反応液を調製して、３０℃のヒートブロックで２４時間インキュベートした。反応液は、０．５Ｍ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）  ０．２５ｍＬ、１０％  ＣＨＡＰＳ  ０．０２５ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＨ  １ｍＬ、の混合液を凍結乾燥した後、凍結乾燥物を２．５ｍＬの３Ｈ２Ｏ（トリチウム水）に再溶解して得た溶液に対し、組換えＨＧ−５ｅｐｉを０．２ｍＬ混合して調製した。その後、ヒートブロックを用いて９５℃で５分間インキュベートし、酵素を失活させた。【０２２２】
この溶液を２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．０）／０．１％  ＣＨＡＰＳ  １００ｍＬを用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）２０ｍＬに流速２ｍＬ／ｍｉｎで全量アプライした。続いて、２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／０．１％  ＣＨＡＰＳ／０．１Ｍ  ＮａＣｌを６６ｍＬ通液してカラムを洗浄した後、２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／０．１％  ＣＨＡＰＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌを３４ｍＬ通液し、[５−３Ｈ]ＮＡＨを溶出させて分画回収した。【０２２３】
[５−３Ｈ]ＮＡＨの溶出画分は、液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ３１１０ＴＲ；パーキンエルマー社製）を用いた測定により確認した。[５−３Ｈ]ＮＡＨを含む画分を合一し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ２．０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅに全量を移し、蒸留水を用いた透析により脱塩した。この溶液を凍結乾燥に供して乾燥粉末にした後、蒸留水１．６ｍＬに再溶解した。【０２２４】
上記の酵素反応から［５−３Ｈ］ＮＡＨの回収に至るまでの操作は２回行い、得られた画分を合一した。以上によって、６．３ＫＢｑ／ｍＬの[５−３Ｈ]ＮＡＨの溶液を３．０ｍＬ得た。【０２２５】
＜実施例２０＞放射性同位体を用いたＨＧ−５ｅｐｉの活性測定（１）
放射性同位体を用いたＨＧ−５ｅｐｉ活性の測定方法は、基質として[５−３Ｈ]ＮＡＨを用い、ＨＧ−５ｅｐｉ活性によって[５−３Ｈ]ＮＡＨ中のＨｅｘＡ残基が異性化された際に生じる３Ｈ２Ｏの放射活性を測定してＨＧ−５ｅｐｉ活性を定量する方法である。手順を以下に示す。【０２２６】
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを０．３〜１０μＬ（０．１５〜５μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で４時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１００ｋｄｐｍ／ｍＬ  [５−３Ｈ]ＮＡＨ、の組成となるように調製した。反応終了後、この溶液から[５−３Ｈ]ＮＡＨを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ０．１６ｍＬを充填したスピンカラムに全量をアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心した。次に、０．１ｍＬの蒸留水をスピンカラムにアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心する操作を２回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中の３Ｈ濃度（ｄｐｍ）を測定した。その結果を表３に示す。【０２２７】
【表３】
0006478190.tif 000010
【０２２８】
表３に示した通り、組換えＨＧ−５ｅｐｉの混合量（ＨＧ−５ｅｐｉ活性の量）と測定値（ｄｐｍ）が正に相関したため、本実施例に記載の方法によってＨＧ−５ｅｐｉ活性を定量できることが分かった。また、組換えＨＧ−５ｅｐｉの混合量を適宜設定することで、所望のＩｄｏＡ含量からなる多糖を得られることが分かった。【０２２９】
＜実施例２１＞放射性同位体を用いたＨＧ−５ｅｐｉの活性測定（２）
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを０．２１〜５μＬ（０．１１０〜２．６３０μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で２〜４８時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１８０ｋｄｐｍ／ｍＬ  [５−３Ｈ]ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを０．１ｍＬ混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[５−３Ｈ]ＮＡＨを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ０．１６ｍＬを充填したスピンカラムに全量をアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心した。次に、０．１ｍＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓをスピンカラムにアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心する操作を２回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中の３Ｈ濃度（ｄｐｍ）を測定した。その結果を表４に示す。【０２３０】
【表４】
0006478190.tif 000011
【０２３１】
表４に示した値（ｄｐｍ／μｇ）は、３Ｈ濃度の測定値（ｄｐｍ）からブランクの値を減算した後、混合したＨＧ−５ｅｐｉの量（μｇ）で除して算出した値である。表４に示した通り、反応時間と単位酵素量あたりの測定値（ｄｐｍ／μｇ）は正に相関したため、[５−３Ｈ]ＮＡＨを用いるＨＧ−５ｅｐｉの活性測定においては、測定値（ｄｐｍ）はＨＧ−５ｅｐｉの混合量（ＨＧ−５ｅｐｉ活性の量）と反応時間の積に対して正に相関することが分かった。よって、反応時間と測定値は正に相関し、３Ｈ濃度（ｄｐｍ）の経時変化を測定することによってＨＧ−５ｅｐｉ活性を定量できることが分かった。また、反応時間を適宜設定することで、所望のＩｄｏＡ含量からなる多糖を得られることが分かった。【０２３２】
＜実施例２２＞ＨＧ−５ｅｐｉ活性の至適ｐＨの検討
ＨＧ−５ｅｐｉ活性の至適ｐＨを検討するため、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．５の水溶液中で酵素反応を行い、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を測定した。【０２３３】
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを５μＬ（２．５μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で２時間インキュベートした。反応液は、終濃度で５０ｍＭ  ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．５〜７．５）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１８０ｋｄｐｍ／ｍＬ  [５−３Ｈ]ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを０．１ｍＬ混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[５−３Ｈ]ＮＡＨを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ０．１６ｍＬを充填したスピンカラムに全量をアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心した。次に、０．１ｍＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓをスピンカラムにアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心する操作を２回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中の３Ｈ濃度（ｄｐｍ）を測定した。その結果を表５に示す。なお、表５に記載した測定値（ｄｐｍ）は、ｐＨ７．０におけるブランクの値、すなわち、組換えＨＧ−５ｅｐｉの代わりに等量の水を加えて上記と同じ操作を行って得た溶液の測定値、を減算した後の値である。【０２３４】
【表５】
0006478190.tif 000012
【０２３５】
表５に示した通り、ＨＧ−５ｅｐｉ活性はｐＨ５．５で最大となり、ｐＨ６．０においても同等の活性を示した。よって、ＨＧ−５ｅｐｉは至適ｐＨがｐＨ５．５〜６．０の酵素であることが分かった。【０２３６】
＜実施例２３＞塩がＨＧ−５ｅｐｉ活性に与える影響の検討
塩がＨＧ−５ｅｐｉ活性に与える影響を評価するため、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、または塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、を終濃度で１〜６４ｍＭとなるように混合して酵素反応を行い、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を測定した。【０２３７】
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを２μＬ（１μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で５時間インキュベートした。反応液は、所望の終濃度となるように塩を添加することの他、終濃度で５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）、１８０ｋｄｐｍ／ｍＬ  [５−３Ｈ]ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを０．１ｍＬ混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[５−３Ｈ]ＮＡＨを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ０．１６ｍＬを充填したスピンカラムに全量をアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心した。次に、０．１ｍＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓをスピンカラムにアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心する操作を２回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中の３Ｈ濃度（ｄｐｍ）を測定した。その結果を表６に示す。【０２３８】
【表６】
0006478190.tif 000013
【０２３９】
表６に示した通り、ＨＧ−５ｅｐｉ活性はＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、またはＭｎＣｌ２の濃度に依存して阻害されることが分かった。特に、６４ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下では、測定値がブランク値（３０ｄｐｍ）の３倍以下であったため、ＨＧ−５ｅｐｉ活性が実質的に失われることが分かった。【０２４０】
＜実施例２４＞界面活性剤がＨＧ−５ｅｐｉ活性に与える影響の検討
界面活性剤がＨＧ−５ｅｐｉ活性に与える影響を評価するため、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、を終濃度で０．０１〜０．３％（ｗ／ｖ）となるように混合して酵素反応を行い、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を測定した。【０２４１】
上記＜実施例１３＞で得た組換えＨＧ−５ｅｐｉを２μＬ（１μｇ）用い、全量５０μＬの反応液を調製して、３０℃の水浴中で５時間インキュベートした。反応液は、所望の終濃度となるように界面活性剤を添加することの他、終濃度で５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）、１８０ｋｄｐｍ／ｍＬ  [５−３Ｈ]ＮＡＨ、の組成となるように調製した。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを０．１ｍＬ混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[５−３Ｈ]ＮＡＨを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ０．１６ｍＬを充填したスピンカラムに全量をアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心した。次に、０．１ｍＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓをスピンカラムにアプライし、２，０００×ｇで２０秒間遠心する操作を２回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中の３Ｈ濃度（ｄｐｍ）を測定した。その結果を表７に示す。【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
表７に示した通り、ＨＧ−５ｅｐｉ活性はＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、またはｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドの濃度に依存して阻害されることが分かった。特に、ＨＧ−５ｅｐｉ活性はデオキシコール酸ナトリウムによって強く阻害され、終濃度０．１％以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下ではＨＧ−５ｅｐｉ活性が完全に阻害されることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
本発明によれば、ＨＧ−５ｅｐｉ活性を有する酵素またはポリペプチドを提供することができ、よって、ＨｅｘＡ残基が異性化された多糖を製造することができる。このようなＨｅｘＡ残基が異性化された多糖は、新規素材として有用であると期待される。【０２４５】
＜配列表の説明＞
配列番号１：アフリカマイマイのＨＧ−５ｅｐｉのｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２：アフリカマイマイのＨＧ−５ｅｐｉのアミノ酸配列
配列番号３：ヒトのＣ５−ｅｐｉのアミノ酸配列
配列番号４：ゼブラフィッシュのＣ５−ｅｐｉのアミノ酸配列
配列番号５：線虫のＣ５−ｅｐｉのアミノ酸配列
配列番号６：プライマー
配列番号７、８：ＥｃｏＲＩアダプター
配列番号９〜１５：プライマー
配列番号１６：アフリカマイマイのＨＧ−５ｅｐｉのｃＤＮＡの部分配列
配列番号１７〜２２：プライマー
配列番号２３：アフリカマイマイのＨＧ−５ｅｐｉのｃＤＮＡの部分配列
配列番号２４〜２７：プライマー
配列番号２８：アフリカマイマイのＨＧ−５ｅｐｉのｃＤＮＡの部分配列
配列番号２９、３０：プライマー
配列番号３１：マウスＩｇκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３２：ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列
配列番号３３：マウスＩｇκ鎖の分泌シグナルペプチドおよびＦＬＡＧタグをコードする組換えＤＮＡの塩基配列
塩基番号３４：マウスＩｇκ鎖の分泌シグナルペプチドおよびＦＬＡＧタグからなるポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３５〜４２：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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