(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患指標を定性的及び／又は定量的に決定する方法において、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも２つの凝集体型に関して１つの方法工程で試料を調査し、次の工程：
ａ）  調査されるべき試料を基板上に載せる工程、
ｂ）  それぞれの凝集体に特異的に結合することにより、それぞれの凝集体を標識する、検出のために特徴付けられたプローブを加える工程、及び
ｃ）  標識された凝集体をｓＦＩＤＡ法で検出する工程
を有し、
−  工程ａ）の前に工程ｂ）を実施することができ、かつ
−  前記疾患は、次の：
タウオパチー、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳ−プロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択されている、ことを特徴とする、疾患指標を定性的及び／又は定量的に決定する方法。
【請求項２】
前記試料を、少なくとも２つの異なる凝集体型に関して同じ基板上で調査することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体型は、Ｔａｕ−凝集体、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−凝集体、Ａ−ベータ−凝集体及び混合型凝集体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の前に、前記基板上に捕獲分子の固定化を行うことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記捕獲分子及び／又は前記プローブが蛍光色素で標識されていることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記捕獲分子及び／又は前記プローブが、前記凝集体を形成するタンパク質のエピトープに対する特異的抗体を有することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
内部標準物又は外部標準物を使用することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において使用するための、疾患指標のための捕獲分子及び／又は凝集体を有する精密に区画された領域を有する基板。
【請求項９】
次の構成要素：
−  請求項１に記載の方法において使用するための、疾患指標のための捕獲分子及び／又は凝集体を有する精密に区画された領域を有する基板、
−  内部標準物又は外部標準物、
−  プローブ、
−  溶液、
−  緩衝液
の１つ以上を有し、
前記疾患は、タウオパチー、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳ−プロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択される、鑑別診断用キット。
【請求項１０】
次の工程：
ｉ）  請求項１に記載の疾患指標を定量的に決定する工程；
ｉｉ）  前記データを基準値と比較する工程；
ｉｉｉ）  前記比較の際に、疾患指標の有意差がある量を確定する工程；
ｉｖ）  前記相違を、請求項１による疾患に分類する工程
を有する、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を有する疾患を決定するための鑑別診断のための指示書を含む、請求項９に記載の鑑別診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体が役割を果たす疾患を決定するための指標（疾患指標）を測定する方法、並びにこの疾患指標を選択的に定量化する及び／又は特性決定する方法に関する。
【０００２】
生体特有のタンパク質からなる病理学的凝集体、例えばオリゴマー又はフィブリルは、多くの神経変性疾患において生じる。
【０００３】
アミロイドーシスは、不溶性の、異常にフォールディングされたタンパク質の細胞外沈着により特徴付けられている疾患である。この凝集体は、一般に繊維、いわゆるベータ−フィブリルとして存在する。アミロイド（＝類デンプン）の概念は、コンゴーレッド染色されたフィブリル及びデンプンの分光測光による共通点に由来する。アミロイドーシスの病因は、遺伝的でも自発的でもありえる。いくつかのアミロイドーシスは二次疾患として現れる。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ、アルツハイマー型認知症、ラテン語＝Morbus Alzheimer）の場合にはＡ−ベータ−凝集体が生じる。ＡＤは、パーキンソン病と並んで、異質な群の臨床状態に属し、この共通の基準は、多くの場合（しかし専らではない）、それぞれ固有のタンパク質の、たいていはベータ−シート構造に富む形態での、細胞外の、全身性又は限局性の沈着である。
【０００５】
アミロイド−ベータ−ペプチド沈着（又はペプチド−フィブリル）は、一般に単にこのプロセスの最終段階である。ＡＤの病理学的な主要な特徴は、Ａ−ベータ−ペプチドからなる老人斑又はアミロイド斑の形成、及びＴａｕ−タンパク質からなる付加的な神経原線維の沈着である。Ａ−ベータ−ペプチドの前駆体タンパク質、ＡＰＰは、ニューロンの細胞壁に局在化している。これらから、このタンパク質分解的な分解及び後からの変性によって、多様な長さ及び種類のＡ−ベータ−断片、例えば、Ａ−ベータ１−４０、Ａ−ベータ１−４２又はｐＧｌｕＡ−ベータ３−４２が生じる。モノマーのＡ−ベータ−ペプチドは、健康な生体でも全生涯の間に生じる。
【０００６】
１９９０年からのアミロイド−カスケード−仮説によると、斑の形でのＡ−ベータ−沈着は、疾患症状の原因であるとされているが、ここ数年で多様な研究は、特に、自由に拡散する小さなＡ−ベータ−オリゴマーが、全Ａ−ベータ−種の中でも最も大きな毒性を示し、このＡＤの発生及び進行の要因であることを指摘している。従って、Ａ−ベータ−ペプチドの凝集体は、ＡＤの病因と直接関連していて、もしかするとＡＤについてのバイオマーカーとして使用できる（Wang-Dietrich et al.著、J. Alzheimers Disease 34, 2013, 985-994）。更なるルーチン手順による診断の支援は、もちろん、特に生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質に基づく他の疾患との区別のために役に立つ。
【０００７】
タンパク質凝集体は、更に、国際公開（ＷＯ−Ａ１）第２００５／０１８４２４号、国際公開（ＷＯ−Ａ２）第２００８／０７０２２９号、独国特許公開（ＤＥ−Ａ１）第１０２００６０１０６４７号明細書、Bannach et al.著（Plosone, May 2012, Vol. 7, issue 5, e36620）、国際公開（ＷＯ−Ａ１）第２０１０／００３２２７号、独国特許公開（ＤＥ−Ａ１）第１０２０１１０５７０２１号明細書及び国際公開（ＷＯ−Ａ２）第２０１３／０９２９５２号（公開日２０１３年６月２７日）に言及されている。
【０００８】
ＡＡ−アミロイドーシスは、−アミロイドーシスは、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような慢性炎症性腸疾患の際のかなり希な二次疾患である。大部分の男性患者の場合に、腎臓、消化管、脾臓、肝臓、膵臓及び心臓が侵される（低い頻度で）。ＡＡ−アミロイドーシスは、原病の出現後の１０〜２０年以内に発症する。臨床的症状は、ネフローゼ症状、タンパク尿症又は心筋症を含む。この全身性ＡＡ−アミロイドーシスは、神経細胞も侵す。ＡＡ−アミロイドーシスの治療のために一連の医薬品が使用され、この中に、アルキル化剤、メトトレキサート、ＴＮＦ−α−ブロッカー等がある。末期腎不全の場合には、透析又は腎移植を行うこともできる。しかし、治療の主な目標は、血清−アミロイド−Ａ−前駆体タンパク質の合成を阻害することである。
【０００９】
ＡＬ−アミロイドーシスは、全身性又は限局性で発症することがある。原因的には、クローンのプラズマ細胞の疾患が生じる。この場合、アミロイドの原因となる軽鎖が産生され、この軽鎖はフィブリルを形成し、多様な臓器の間質に沈着する。最も頻繁には、腎臓、心臓、腸、肝臓及び自律神経系が侵される。ポリニューロパチーの発症が典型的である。
【００１０】
ＡＡｐｏＡＩは、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）のタンパク質の構成要素であり、この本来の機能は、非水溶性コレステロール及びリン脂質を血中で輸送することである。Ｎ末端領域での突然変異が、ＡＡｐｏＡＩにアミロイドの原因となる特性を付与する。遺伝性ＡＡｐｏＡＩアミロイドーシスは、手足のポリニューロパチーで発症する。腎臓、心臓、肝臓（ＡＰ及びγ−ＧＴの上昇）、末梢神経系、皮膚、喉頭及び睾丸も、少ない頻度で侵される。
【００１１】
ＡＡｐｏＡＩＩは、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）のタンパク質の構成要素であり、この本来の機能は、非水溶性コレステロール及びリン脂質を血中で輸送することである。ＡｐｏＡＩＩ遺伝子の停止コドンの突然変異が、ＡＡｐｏＡＩＩにアミロイドの原因となる特性を付与する。この遺伝性ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスは、主に腎臓及び心臓で発症する。
【００１２】
ＡＴＴＲ−アミロイドーシスは、最も頻繁な遺伝性アミロイドーシスである。このアミロイドーシスは常染色体優性で遺伝する。原因的には、輸送タンパク質のトランスサイレチンについての遺伝子の突然変異が明らかとなっていて、これは血漿中でリチノール結合タンパク質及びサイロキシンと会合している。最も頻繁な突然変異Ｖａｌ３０Ｍｅｔは、このタンパク質にアミロイドの原因となりかつ従って病因性の特性を付与する。ＡＴＴＲ−アミロイドーシスの経過において、末梢神経系及び自律神経系でアミロイド沈着が生じる。主要な症状は、勃起機能不全、消化管不良、吸収不良及び限定的心筋症を含む。ＡＴＴＲアミロイドーシスの予後は未治療の場合に悪い。対症療法の他に、治療的なオプションとして、肝臓移植が残されているだけである。
【００１３】
臨床精神医学において、今まで、統合失調症又は鬱病を含めた全ての疾患は、臨床的には質問目録を用いた面談形式で及び場合により運動試験又は挙動試験によって単に診断していただけである。精神的な疾患の生物学的基礎に関する無知により、臨床的診断の基礎を固めるために、例えば神経学疾患の場合に使用されているような血液又は髄液に基づく診断試験は使用されていない。
【００１４】
この状況は、特に、薬学を研究する工業からも極めて不十分であると感じられる、というのも、客観的でかつ一義的に定量化可能な試験がないことは、最終的には潜在的に有効な治療の定量的モニタリングを阻害しているためである。
【００１５】
ＤＩＳＣ１のような原因となる疾患遺伝子の発見によって、生物学的な診断を開発することが初めて可能となる。ＤＩＳＣ１は、慢性的な精神疾患のサブグループ、例えば統合失調症及び再帰性鬱病の場合に、超顕微鏡的なタンパク質凝集体を脳内に発生させる。自身で発生させた抗体によって、死後の脳内にこのタンパク質凝集体を検出することができる。
【００１６】
ＡＬＳは、中枢神経系の、慢性的で急速に進行する疾患である。特に骨格筋組織の意図的な制御が侵される。この疾患の進行において、筋肉運動を調節する運動ニューロンの変性が起こる。これにより、身体運動及び身体反射が完全に停止するまでのかなりの障害が生じる。初期症状の出現後の平均余命は３年に過ぎない。このＡＬＳについて多様な病因が記載されている。ＡＬＳの最も頻繁な形は散発的性質である。しかしながら家族性に遺伝するＡＬＳ事例も存在する。この場合に最も頻繁なのは、スーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）の突然変異である。新たなデータは、遺伝子Ｃ９ｏｒｆ７２のヘキサヌクレオチド発現が、ＡＬＳの原因であることも、前頭側頭型認知症の原因であるとも考えられる。
【００１７】
ＡＬＳの診断は、この疾患の進行において後になって初めて下すことができる。この診断の遅れは、一般に初期症状の発症後の１年に達する。ＡＬＳの診断は、現在のところ、臨床的判定、電気生理学的調査（筋電図）及び神経病理学的分析（生検）を含む。付加的に、髄液の穿刺採取を行いかつ分画血液像を作製することができる。最終的にＡＬＳは他の疾患に対して鑑別診断によって区別しなければならない。
【００１８】
ＡＬＳの病理学的特徴は、特に、タンパク質ＦＵＳの細胞質封入である。細胞変性の場合に、この凝集体が放出され、周辺に達することができ、そこでこの凝集体が診断に利用される。他の神経変性疾患もＦＵＳ凝集体の沈着を示し、この疾患の中には、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）があり、その主要な症状は人格、社会行動及び言語能力の変化である。
【００１９】
ＡＬＳの別の病理学的特徴は、運動ニューロン中のタンパク質ＳＯＤ１の沈着である。細胞変性の場合に、この凝集体が放出され、周辺に達することができ、そこでこの凝集体が診断に利用される。
【００２０】
ＡＬＳの別の病理学的特徴は、ユビキチン化タンパク質ＴＤＰ−４３の細胞質封入である。細胞変性の場合に、この凝集体が放出され、周辺に達することができ、そこでこの凝集体が診断に利用される。
【００２１】
他の神経変性疾患もＴＤＰ−４３凝集体の沈着を伴い、この疾患の中には、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）があり、その主要な症状は人格、社会行動及び言語能力の変化である。新たな研究は、ＴＤＰ−４３沈着と慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）との間の関連も見られる。ＣＴＥには、特に、繰り返し頭骨−脳外傷をこうむる競技運動選手及び兵士が見舞われる。
【００２２】
２型糖尿病（ＤＭＴ２）の場合にも、凝集した生体特有のタンパク質が役割を果たす。例えば、ＤＭＴ２患者の膵臓内には、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）から主に生じる斑点が見られる。ＩＡＰＰはペプチドホルモンであり、膵臓のベータ細胞中で産生され、かつインスリンと一緒に分泌される。ＩＡＰＰの凝集は、膵島ベータ細胞の将来的な損失との関連があると推測される。
【００２３】
今までに、ルーチン使用での、組織内又は体液内でのＩＡＰＰオリゴマー又は凝集体についての生体外検出系は存在しない。
【００２４】
パーキンソン病は神経変性疾患である。主要な症状は、筋肉強剛、運動の緩慢化、筋肉の震え、姿勢保持の不安定化を有する。更に、条件的な随伴症状、例えば精神障害が記載されている。この疾患の過程で、黒質内のドーパミン産生性ニューロンの死滅が生じる。組織病理学的には、パーキンソン患者の脳組織内には、細胞質封入、いわゆるレビー小体が現れ、このレビー小体は主にα−シヌクレイン、ユビキチン及び他のタンパク質沈着物からなる。
【００２５】
タウオパチーは、神経変性疾患の一つのグループであり、これは脳内のＴａｕタンパク質の蓄積を特徴とする。超リン酸化により、微小管会合したＴａｕは、不溶性凝集体、いわゆる神経原線維束に変わることがある。このタウオパチーは、アルツハイマー病、大脳皮質変性症、嗜銀性顆粒病、ピック病、ＦＴＬＤ−ＭＡＰＴ（以前は：ＦＴＤＰ−１７、前頭側頭型認知症及び染色体１７のパーキンソン症候群）、進行性核上性麻痺、神経原線維変化症、グリア封入を伴うタウオパチー並びに分類不能タウオパチーのような多様な疾患像を含む。新たな研究は、慢性外傷性脳症もタウオパチーに数える。上述の多くの疾患、例えばＦＴＬＤ−ＭＡＰＴは、遺伝性に限られている。しかしながら、たいていのタウオパチーの原因は未だに不明である。
【００２６】
タウオパチーの臨床的な表出は極端に多様であり、かつ運動障害（Ｌ−ドーパ−過敏型又は不定型のパーキンソン症候群、「凍結性の」、核上性麻痺から大脳皮質変性症までを伴う無動）、行動障害及び言語障害及び精神医学的症状、例えば攻撃性、精神病状態像及び鬱病を含む。
【００２７】
ハンチントン病は、遺伝的な神経変性性疾患であり、この疾患は筋肉協調性を侵し、認識能力の抑制及び精神病的問題を引き起こす。この疾患は男性も女性も侵し、かつハンチンチン遺伝子の常染色体優性突然変異により引き起こされる。ＣＡＧ−トリプレットの繰り返しの発現が、成熟タンパク質中のこのポリグルタミン域の延長を引き起こし、それによりこのタンパク質は異常にフォールディング及び凝集する傾向が強くなる。
【００２８】
家族性の内臓性アミロイドーシスは、リゾチームの遺伝子の突然変異が原因であり、この突然変異が成熟タンパク質にアミロイドの原因となる特性を付与する。アミロイド沈着は、多くの臓器中で全身で見られる。
【００２９】
疾患指標、つまり疾患の認識のための指標（バイオマーカーともいう）は、疾患の診断のために常に考慮された。バイオマーカーの公知の例は、糖尿病の場合には尿中のグルコースの含有率であり又は妊娠試験の場合には尿中のＨＣＧの含有率である。
【００３０】
次第に多くのかつ次第に高齢になる人口を医学的にケアするために、より確実な診断を保証する、新規の、特異的なバイオマーカーを同定する必要がある。高い特異性は、特に、類似の症状及び疾患像を有する疾患の場合に、ここで有望な治療を実施するために必要である。更に、これらの疾患指標は、リスクのある人を、早期の疾患時期で又は再発の場合にできる限り速やかに同定することが好ましい。これらのバイオマーカーは、容易に得られる生体材料中に存在しかつ同定可能でありかつ迅速な検出が可能であるのが好ましい。それにより、疾患の経過を追跡できるだけでなく、治療及び予防の効果も追跡できる。
【００３１】
本発明の課題は、このようなバイオマーカー、特に異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を有する疾患についてのバイオマーカーを提供することであった。
【００３２】
他の課題は、選択的定量化及び／又は特性決定する迅速かつ確実な方法を提供することであった。特に、この疾患指標は臨床的なルーチン使用のために適しているのが好ましい。好ましい迅速試験でかつ場合により標準物を用いて特性決定でき、その結果、比較可能でかつ独立した値が測定されることが重要である。
【００３３】
更に、バイオマーカーの上述の要求が満たされるのが好ましく、かつ相応して先行技術と比較して改善された方法及び道具が提供されるのが好ましい。
【００３４】
ＡＡ−アミロイドーシスの診断は、臨床的な表出の判定を含む。この場合に、極めて多くの他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。前臨床的に、この診断は、コンゴーレッド染色によるＡＡアミロイドの組織学的検出によって可能なだけである。しかしながら、このためには、脂肪吸引生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００３５】
ＡＡ−アミロイドーシスは、血清−アミロイド−Ａ−前駆体タンパク質（ＡＡ）の異常なフォールディングを特徴としている。従って、このＡＡ−凝集体は、ＡＡ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＡＡは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＡの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００３６】
このＡＬ−アミロイドーシスの診断は、極めて可変に示されことがある臨床的な表出の判定を含む。更に、極めて多数の他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。標準法は、コンゴーレッド染色によるＡＬ−アミロイドの組織学的検出である。付加的に、免疫学的組織化学を実施するのが好ましい。しかしながら、このためには手間のかかる生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を最小侵襲で検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００３７】
このＡＬ−アミロイドーシスは、ＩｇＧ軽鎖−前駆体タンパク質（ＡＬ）の異常なフォールディングを特徴とする。従って、このＡＬ−凝集体は、ＡＬ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＡＬは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＬの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００３８】
ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシスの診断は、臨床的な表出の判定を含む。この場合に、極めて多くの他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。標準法は、コンゴーレッド染色によるＡＡｐｏＡＩ−アミロイドの組織学的検出である。しかしながら、このためには手間のかかる生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を最小侵襲で検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００３９】
このＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシスは、アポリポタンパク質のＡＩ前駆体（ＡＡｐｏＡＩ）の異常なフォールディングを特徴とする。従って、このＡＡｐｏＡＩ−凝集体は、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＡＡｐｏＡＩは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＡｐｏＡＩの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００４０】
ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスの診断は、臨床的な表出の判定を含む。この場合に、極めて多くの他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。標準法は、コンゴーレッド染色によるＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドの組織学的検出である。しかしながら、このためには手間のかかる生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を最小侵襲で検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００４１】
このＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスは、アポリポタンパク質のＡＩＩ前駆体（ＡＡｐｏＡＩＩ）の異常なフォールディングを特徴とする。従って、このＡＡｐｏＡＩＩ−凝集体は、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＡＡｐｏＡＩＩは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＡｐｏＡＩＩの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００４２】
ＡＴＴＲ−アミロイドーシスの診断は、臨床的な表出の判定を含む。この場合に、極めて多くの他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。更に、初期症状の時点、疾患の経過及び表現形が局所的に異なる。標準法は、コンゴーレッド染色によるＡＴＴＲ−アミロイドの組織学的検出である。しかしながら、このためには手間のかかる生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００４３】
このＡＴＴＲ−アミロイドーシスは、トランスサイレチン−前駆体タンパク質（ＴＴＲ）の異常なフォールディングを特徴とする。従って、このＡＴＴＲ−凝集体は、ＡＴＴＲ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＡＴＴＲは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＴＴＲの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００４４】
統合失調性の精神障害は、現在のところ、初期症状の発症後の３〜５年で初めて診断することができる。バイオマーカーの検出に基づく診断は、例えば統合失調症のような慢性の精神疾患のためでは今までルーチン使用ではなかった。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００４５】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。新しい研究は、統合失調症又は再帰性鬱病のような慢性的な精神疾患と凝集したＤＩＳＣ１タンパク質（disrupted-in-schizophrenia-1）との間の関連性に目を向けている。このＤＩＳＣ１−凝集体は、統合失調症、再帰性鬱病及び他のＤＩＳＣ１オパチーのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＤＩＳＣ１は健康な生体内でも産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＤＩＳＣ１の高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００４６】
バイオマーカーの検出に基づく診断は、ＡＬＳにとっても、ＦＴＬＤにとっても、現在のところ、ルーチン使用ではない。同様に、現時点では、根源的治療法は存在しない。神経保護治療法及び対症療法が使用されているだけである。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００４７】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の場合に、ＲＮＡ結合タンパク質のＦＵＳ（Fused in Sarcoma）の細胞質沈着が記述されていた。このＦＵＳ凝集体は、記載された疾患像のための直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＦＵＳは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＦＵＳの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００４８】
現在では、血糖値が、ＤＭＴ２についての一般的に定評のあるバイオマーカーとして通用していて、これにより患者のための確実な診断を達成することができる。インスリンを用いて血糖値を調節する場合、ＤＭＴ２の検出はもはや不可能である。これは輸血のために使用される保存血液の分析にとって特に重要である、というのも場合によっては輸血者のための潜在的危険性に重要であるためである。ＤＭＴ２の根源的治療のためにも、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００４９】
ここ数年来、２型糖尿病（ＤＭＴ２）とアルツハイマー病（ＡＤ）との間の関係に関して報告されている。研究に基づくと、ＡＤ患者の約８０％は、ＤＭＴ２に罹患しているか又は血中の比較的高いグルコース含有率を示している。更に、ＤＭＴ２マウスとＡＤマウスとは、類似の行動に関する異常、認識異常及び血管異常を示す。この両方の疾患は、類似の病理学的特徴を示す：タンパク質フォールディング及びそれに続きそれぞれのＩＡＰＰ−ペプチド又はＡβ−ペプチドの原線維形成による、膵臓内でのアミロイド斑（ＤＭＴ２）又は脳内でのアミロイド斑（ＡＤ）の発生。特に、小さな凝集体が、ＤＭＴ２及びＡＤの発症及び進行のための主要な原因と見なされる。ＩＡＰＰ−凝集体は、従って、ＤＭＴ２についての直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＩＡＰＰは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＩＡＰＰの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００５０】
バイオマーカーの検出に基づく診断は、ＡＬＳにとって、現在のところ、ルーチン使用ではない。同様に、現時点では、根源的治療法は存在しない。神経保護治療法及び対症療法が使用されているだけである。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００５１】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、恐らく、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合に、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の沈着が示された。このＳＯＤ１凝集体は、ＡＬＳの直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＳＯＤ１は健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＳＯＤ１の高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００５２】
パーキンソン病の診断は、いわゆるＬ−ドーパ試験によって行われる。この場合、患者にＬ−ドーパをデカルボキシラーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。この処置が症状の明らかな改善を引き起こす場合、極めて高い確率でパーキンソン病と診断することができる。
【００５３】
しかしながら、体液中のバイオマーカーの最小侵襲の検出に基づく診断は、このパーキンソン病についても今までルーチン使用ではなかった。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００５４】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、恐らく、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。パーキンソン病は、凝集したα−シヌクレインの病理学的な蓄積を特徴としている。このα−シヌクレイン−凝集体は、パーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーのための直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもα−シヌクレインは健康な生体内でも産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーα−シヌクレインの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００５５】
多様なタウオパチーの神経病理学的表現系は死後に同定される。多様な神経病理学的変性のかなりの重複が困難である。更に、異なる病理学がしばしば組み合わさって存在し、このことはバイオマーカー研究の必要性を強調している。体液中のバイオマーカーの検出に基づく診断は、タウオパチーにとって、現在のところ、ルーチン使用ではない。同様に、現時点では、根源的治療法は存在しない。神経保護治療法及び対症療法が使用されているだけである。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００５６】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、恐らく、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。タウオパチーは、Ｔａｕ−タンパク質の病理学的沈着を特徴としている。このＴａｕ−凝集体は、多様な疾患像のための直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＴａｕは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＴａｕの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００５７】
バイオマーカーの検出に基づく診断は、ＡＬＳにとっても、ＦＴＬＤ及びＣＴＥにとっても、現在のところ、ルーチン使用ではない。同様に、現時点では、根源的治療法は存在しない。神経保護治療法及び対症療法が使用されているだけである。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因の場合にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００５８】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の場合に、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）の沈着が記述されていた。このＴＤＰ−４３−凝集体は、記載された疾患像のための直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもＴＤＰ−４３は健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＴＤＰ−４３の高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００５９】
ハンチントン病の疑いがある場合、この疾患を確実に確定できる遺伝子試験が実施される。しかしながら、体液中のバイオマーカーの最小侵襲の検出に基づく診断は、このハンチントン病についても今までルーチン使用ではなかった。この場合、治療法開発のために、早期の又は全くの前症状の疾患経過においてバイオマーカーの同定及び標準化が、非常にかつおそらく決定的に重要である。これは、遺伝的な要因のハンチントン病にも通用する、というのもここでは疾患の経過及び治療の経過を追跡することができるためである。
【００６０】
多数の中枢神経系の疾患について特徴的なのは、疾患の進行での、異常にフォールディングされ凝集されたタンパク質の出現である。ハンチントン病は、凝集したハンチンチンの病理学的な蓄積を特徴としている。このハンチンチン−凝集体は、ハンチントン病についての直接的なバイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもハンチンチンは健康な生体内でも産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーのハンチンチンの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００６１】
ＡＬｙｓ−アミロイドーシスの診断は、臨床的な表出の判定を含む。この場合に、極めて多くの他の疾患像と比べた鑑別診断による区別が問題である。標準法は、コンゴーレッド染色及び免疫組織化学によるＡＬｙｓ−アミロイドの組織学的検出である。しかしながら、このためには手間のかかる生検が必要である。バイオマーカーとして体液中のアミロイドタンパク質凝集体を最小侵襲で検出するルーチン診断は、現在ではまだ確立されていない。
【００６２】
家族性の臓器性アミロイドーシスは、リゾチーム−タンパク質前駆体（ＡＬｙｓ）の異常なフォールディングを特徴としている。従って、このＡＬｙｓ−凝集体は、ＡＬｙｓ−アミロイドーシスのための直接的バイオマーカーであることができる。この診断検出は、それにもかかわらず技術的な挑戦である、というのもリゾチームは健康な生体内でも至る所で産生されているためである。従って、この方法は、正常にフォールディングされたモノマーＡＬｙｓの高い過剰量に対しては不感でなければならない。
【００６３】
本発明の課題は、疾患指標を、特に同じ試料中に併存する複数の疾患指標を定量的に測定するルーチン法を提供することでもあった。更に、この方法は、試料を僅かな後処理工程だけで又は好ましくは後処理工程なしで分析できる方法を提供するのが好ましい。
【００６４】
多数の神経変性疾患及びアミロイドーシスは、多様な種類の凝集したタンパク質の同時出現を特徴とする。例として、アミロイドベータの沈着もＴａｕの沈着も観察されるアルツハイマー型認知症が挙げられる（Jucker及びWalker著, Annais of neurology 70, 532-540, 2011；Spillantini及びGoedert著, Lancet neurology 12, 609-622, 2013；これらは引用により取り込まれる）。前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の場合にも、病理学的タンパク質凝集体としてＴａｕ及びＴＤＰ−４３が同時に存在する（Mackenzie et al.著, Acta neuropathologica 119, 1-4, 2010）。ＴＤＰ−４３−病理学は、また、筋萎縮性側索硬化症及び慢性外傷性脳症においても現れる（Blennow et al.著, Neuron 76, 886-899, 2012；Blokhuis et al.著, Acta neuropathologica 125, 777-794, 2013；これらは引用により取り込まれる）。
【００６５】
この方法は、多様な凝集体型を併存して及び／又は同時に調査するために、十分な特異性を保証しなければならない。従って、本発明の課題は、異なる凝集体型の調査のために同時に高い特性を有する方法を提供し、かつ１つの凝集体型の調査を、第２の凝集体型によって妨害されることを排除することでもある。同様に、多様なタンパク質モノマーからなる凝集体混合型も調査できるのが好ましい。
【００６６】
今までに記載された上述の疾患のタンパク質凝集体は、それぞれの疾患像の病理学的な主要な特徴であるにすぎない。バイオマーカーとしてのその使用は保証されてはいない。
【００６７】
上述の課題は、次の工程：
ａ）  調査すべき試料を基板上に載せる工程、
ｂ）  それぞれの凝集体に特異的に結合することにより、それぞれの凝集体を標識する、検出のために標識されたプローブを加える工程、及び
ｃ）  標識された凝集体を検出する工程
を有し、ここで、
−  工程ａ）の前に工程ｂ）を実施することができ、かつ
−  疾患は、次の：
ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症
からなる群から選択されていて、かつ
−  試料中にＡ−ベータ−凝集体が測定された場合には、この試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１種の他の凝集体型に関して調査する、
生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１つの凝集体型、好ましくは少なくとも２つの凝集体型に関して試料を調査することを特徴とする、疾患指標を定性的及び／又は定量的に測定する方法によって解決される。
【００６８】
一実施態様の場合に、この方法は、試料を第１の凝集体型に関する試験の後に更なる後処理及び／又は処理を行わずに、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１つの他の、例えば第２の多様な凝集体型に関して調査することを特徴とする。
【００６９】
他の実施態様の場合に、この方法は、試料を少なくとも２つの異なる凝集体型に関して１つの方法工程で調査することを特徴とする。
【００７０】
他の実施態様の場合に、この方法は、試料を少なくとも２つの異なる凝集体型に関して同じ基板上で調査することを特徴とする。
【００７１】
他の実施態様の場合に、この方法は、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体型は、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−凝集体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択されることを特徴とする。
【００７２】
他の実施態様の場合に、この方法は、工程ｃ）における検出を、空間分解された信号を用いる方法で、好ましくはｓＦＩＤＡ法で行うことを特徴とする。
【００７３】
他の実施態様の場合に、この方法は、工程ａ）の前に基板上に捕獲分子の固定化を行うことを特徴とする。
【００７４】
他の実施態様の場合に、この方法は、捕獲分子及び／又はプローブが蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
【００７５】
他の実施態様の場合に、この方法は、捕獲分子及び／又はプローブが、凝集体を形成するタンパク質のエピトープに対して特異的な抗体を有することを特徴とする。
【００７６】
他の実施態様の場合に、この方法は、内部標準物又は外部標準物を使用することを特徴とする。
【００７７】
他の実施態様の場合に、この方法は、捕獲分子、プローブ及び／又は標準物が、モノマー配列から構成されたポリマーを有し、このモノマー配列はその配列に関して、生体特有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質であることを特徴とする。
【００７８】
本発明の主題は、モノマー配列から構成されたポリマーを有する、上述の疾患指標の選択的定量化及び／又は特性決定のための標準物でもあり、このモノマー配列はその配列に関して、生体特有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質である。
【００７９】
本発明による標準分子は、それぞれのタンパク質凝集体の不活性化のために、例えば、このタンパク質凝集体の結合又は分解による不活性化のために使用されるか、又はタンパク質凝集体の形成を阻害するために予防的に使用される。従って、本発明の主題は、医学における使用のための、医薬品における使用のための、及び／又は治療法、診断法及び／又は手術法における使用のための標準物である。
【００８０】
他の主題は、上述の疾患標識及び／又は凝集体のための捕獲分子を備えた精密に区画された領域を有する基板である。
【００８１】
更に、本発明の主題は、次の工程：
ｉ）  本発明による方法で決定された疾患指標を定量的に決定する工程；
ｉｉ）  このデータを基準値と比較する工程；
ｉｉｉ）  この比較の際に、疾患指標の有意差がある量を確定する工程；
ｉｖ）  この相違を、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択される疾患に分類する工程
を有する、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を有する疾患を決定するための鑑別診断である。
【００８２】
「凝集体型」の概念とは、本発明の意味範囲で、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の、特定の定義された組成の凝集体であると解釈される。別の選択肢の場合には、凝集体型は、同じペプチド（モノマー）から構成（構築）されていて、つまり同じアミノ酸配列のペプチドから、又は１つの同じペプチドの異なる相同体から構成されている。更に別の選択肢の場合には、この凝集体型は、異なるペプチド（モノマー）から構成、構築されていて、つまり異なるアミノ酸配列のタンパク質から、又は異なるペプチドの相同体から構成されている。１つの試料に２つの選択肢が存在していてもよい。
【００８３】
本発明の一実施態様の場合に、「疾患指標の定性的決定」とは、新たな特異的なバイオマーカーの同定を意味する。換言すると、疾患指標が同定されかつ新たに定義される。本発明の場合には、疾患指標は、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質のそれぞれの１種以上の凝集体の存在、特に特定濃度での存在、及び／又は不存在により定義される。
【００８４】
他の実施態様の場合に、「疾患指標の定性的決定」は、これらのバイオマーカーの存在及び／又は不存在の調査もしくは決定を意味する。
【００８５】
本発明の意味範囲で、この「疾患指標の定量的決定」は、第１の選択肢の場合、バイオマーカーの濃度の決定を意味する。第２の選択肢の場合に、バイオマーカーの組成、サイズ及び／又は形状が決定される。両方の選択肢を、好ましくは同時に、１つの方法工程で実施することもできる。
【００８６】
この疾患指標の定量的決定は、バイオマーカーとしての凝集体型の選択的定量化及び／又は特性決定と同等である。疾患指標の特徴が定義されている限り、その定量的決定、つまり選択的定量化：つまり存在又は不存在に関する情報を含む濃度決定；及び／又はその特性決定：つまり組成、サイズ及び／又は形状の決定が行われる。
【００８７】
本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも２つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも３つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも４つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも５つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも６つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも７つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも８つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも９つの凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１０の凝集体型に関して調査する。本発明の一つの選択肢の場合に、試料を、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の凝集体型に関して調査する。
【００８８】
本発明による一実施態様の場合に、凝集体は、次の分類を有するSEQ ID NO: 1-15のペプチド又はモノマー及び／又はこの相同体から構成されている：
血清−アミロイド−Ａ−タンパク質凝集体：SEQ ID NO: 1；ＩｇＧ−軽鎖−凝集体：SEQ ID NO: 2；ＡａｐｏＡＩ−凝集体：SEQ ID NO: 3；ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体：SEQ ID NO: 4；ＡＴＴＲ−凝集体：SEQ ID NO: 5；ＤＩＳＣ１−凝集体：SEQ ID NO: 6；ＦＵＳ−凝集体：SEQ ID NO: 7；ＩＡＰＰ−凝集体：SEQ ID NO: 8；ＳＯＤ１−凝集体：SEQ ID NO: 9；α−シヌクレイン−凝集体：SEQ ID NO: 10；Ｔａｕ−凝集体：SEQ ID NO: 11；ＴＤＰ−４３−凝集体：SEQ ID NO: 12；ハンチンチン−凝集体：SEQ ID NO: 13；リゾチーム−凝集体：SEQ ID NO: 14及びＡ−ベータ−凝集体：SEQ ID NO: 15。
【００８９】
一実施態様の場合に、少なくとも上述の群からなる凝集体型及び他の凝集体型に関して調査する。
【００９０】
しかしながら、少なくとも２つの異なるタンパク質、モノマーから構築された混合した凝集体、いわゆる凝集体混合型が存在することもある。
【００９１】
「生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体型を調査する」の概念又は例えば同義語のその「調査」は、本発明の範囲内で、それぞれの凝集体型の定性的及び／又は定量的決定（分析）を意味する。定性的決定の際にはその存在又は不存在が決定され、定量的決定の際には、その濃度、組成、サイズ及び／又は形状が決定される。
【００９２】
第２の凝集体型に関する調査のために、試料を「更に後処理せず及び／又は処理せずに」の概念は、本発明において、一つの選択肢の場合に、異なる凝集体型に関する２つの調査の間に、試料の後処理及び／又は処理を行わないことを意味する。他の選択肢の場合に、第１の又は１つの他の凝集体型の調査の後に試料中で化学反応が行われない。好ましくは、第１の試験及び第２の試験及び場合により更なる全ての試験は、１つの試料アリコート中で行われる。この試料は、場合により、例えば温度変化又はピペット添加のような単なる物理的又は機械的影響を受けるだけである。更なる又は付加的な選択肢の場合には、この試料は、物理的又は機械的影響を受けない。更なる又は付加的な選択肢の場合には、第２の凝集体型の調査のための試料は、第１の凝集体型の調査のための試料と同じ化学組成を有し、しかしながら、場合により同じ化合物が異なる濃度で存在する。更に、第２の凝集体型の調査のためにこの試料は、場合により、第１の凝集体型の調査のための捕獲分子、プローブ及び／又は標準物、並びに場合により凝集体、捕獲分子及び／又はプローブからなる相応する化合物を含む。更なる又は付加的な選択肢の場合に、第２の凝集体型に関して調査するためのプローブは、第１の凝集体型に関する調査の後に初めて添加され、その結果、唯一の化学反応としては、プローブ中含まれる限り、第２の凝集体型に対して特異的なプローブのこの凝集体への結合である。
【００９３】
同様に、上述の状況が、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０及び／又はそれ以上の凝集体型の調査につても当てはまる。
【００９４】
一実施態様の場合に、本発明は、次の工程：
ａ）  調査すべき試料を基板上に載せる工程、
ｂ）  それぞれの凝集体に特異的に結合することにより、それぞれの凝集体を標識する、検出のために標識されたプローブを加える工程、及び
ｃ）  標識された凝集体を検出する工程
を有し、ここで、工程ａ）の前に工程ｂ）を実施することができ、かつ
疾患は、次の：
ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病及び／又は家族性臓器性アミロイドーシス
からなる群から選択されている、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を有する疾患を決定するための指標の決定方法に関する。
【００９５】
疾患指標ともいわれるバイオマーカーは、本発明の場合に、ＮＩＨの定義に依拠して、通常の生物学的病原性プロセスのため又は治療的介入に関する薬理学的応答のための指標として考慮するために、特性を客観的に測定できるパラメータである。本発明により決定されかつ使用される疾患指標は、物理的方法及び／又は化学的方法で定性的及び定量的に特性決定することができる。
【００９６】
凝集体は、本発明の意味範囲で、
・  複数の、好ましくは同じ構成要素からなり、互いに共有結合されていない粒子及び／又は
・  複数のモノマーの非共有結合の集合物並びに
・  異種凝集体、「共凝集体」、つまり異なるモノマーからなる凝集体
である。
【００９７】
本発明による方法にとって人体又は動物体から試料を採取し、この人体又は動物体に再び供給しない。
【００９８】
この方法の一つの選択肢の場合、疾患指標の測定のため、特に定性的決定のために、潜在的バイオマーカーを有する試料を、健康と診断された個人及び／又は病気と診断された個人の試料と比較する。この診断は、例えば、他の診断法の臨床的表出又は評価の鑑定に基づく。検出された凝集体の量の比較によって、バイオマーカーとしてのその適性に関する表現が可能である。
【００９９】
一つの選択肢の場合に、臨床的なルーチン使用のために適した疾患指標が問題となる。バイオマーカーは、本発明の場合に、特に、物理学的方法及び／又は化学的方法に基づいた、学術的に検出可能でかつ再現可能な証明を提供する限り、臨床的なルーチン使用のために適している。
【０１００】
本発明の主題は、次の方法：
ａ）  調査すべき試料を基板上に載せる工程、
ｂ）  それぞれの凝集体に特異的に結合することにより、それぞれの凝集体を標識する、検出のために標識されたプローブを加える工程、及び
ｃ）  標識された凝集体を検出する工程
を有し、ここで、工程ａ）の前に工程ｂ）を実施することができ、かつ
疾患は、次の：
ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病及び／又は家族性臓器性アミロイドーシスからなる群から選択される、疾患指標を選択的に定量化及び／又は特性決定する方法でもある。
【０１０１】
従って、本発明の主題は、凝集体の組成、サイズ及び／又は形状を決定する方法でもある。この場合、上述の及び上記の方法工程が使用される。
【０１０２】
本発明の一実施態様の場合に、試料の前処理を、好ましくは次の方法の１つ以上により行う：
−  加熱（試料の沸点までの温度に）、
−  １回以上の凍結融解サイクル、
−  水又は緩衝液での希釈、
−  酵素、例えばプロテイナーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼによる処理、
−  遠心分離、
−  沈殿、
−  場合により存在する抗体を排除するために、プローブとの競合。
【０１０３】
基板として、本発明の場合に、特に異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体に関してできる限り僅かな、非特異的な結合能力を有する材料が選択される。
【０１０４】
本発明の一実施態様の場合に、基板はガラスから選択される。
【０１０５】
この基板は、親水性材料、好ましくは、ポリ−Ｄ−リシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくはヘテロバイオ官能性ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）又はデキストラン、特にデキストラン、好ましくは、カルボキシメチル−デキストラン（ＣＭＤ）で被覆されていてもよい。
【０１０６】
本発明による方法の一実施態様の場合に、ガラス表面をヒドロキシル化し、引き続きアミノ基で活性化する。
【０１０７】
この被覆に関しての基板の前処理のために、次の工程の１つ以上を実施する：
・  超音波浴又はプラズマクリーナー中でのガラス製の基板又はガラス支持体の洗浄、これとは別に５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも３時間インキュベーション、
・  水で洗浄し、引き続き窒素下で乾燥、
・  ヒドロキシル基の活性化のために、３：１の比率での濃硫酸と過酸化水素との溶液中に浸漬、
・  中性のｐＨになるまで水で、引き続きエタノールで洗浄、及び窒素雰囲気下で乾燥、
・  乾燥トルエン又はエタノールアミンの溶液中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（１〜７％）を有する溶液中に浸漬、
・  アセトン又はＤＭＳＯ及び水で洗浄、及び窒素雰囲気下で乾燥。
【０１０８】
デキストラン、好ましくはカルボキシメチル−デキストラン（ＣＭＤ）で被覆するために、この基板を、ＣＭＤの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌの濃度で）及び場合によりＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、（２００ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、（５０ｍＭ）と一緒にインキュベーションし、引き続き乾燥する。
【０１０９】
このカルボキシメチル−デキストランは、一実施態様の場合に、上述のように、まずヒドロキシル化し、引き続きアミノ基で活性化されたガラス表面に共有結合されている。
【０１１０】
基板として、微量滴定プレート、好ましくはガラス底を備えた微量滴定プレートも使用できる。ポリスチレン枠を使用する場合に濃硫酸の使用は不可能であるため、ガラス表面の活性化は、本発明の一実施態様の場合に、Janissen et al.（Colloids Surf B Biointerfaces, 2009, 71 (2), 200-207）と同様に行う。
【０１１１】
本発明の一実施態様の場合に、ガラス表面を苛性ソーダ液（５Ｍ）と共に室温で１５分間インキュベーションし、水で３回洗浄し、塩酸を添加し、新たに室温で１５分間インキュベーションする。水で３回洗浄し、エタノールで２回洗浄した後、基板（ガラス表面）を窒素雰囲気下で乾燥する。
【０１１２】
ガラス表面にアミノ基を作製するために、これをエタノールアミン（５．６Ｍ）と共に室温で一晩中インキュベーションする。引き続き、この基板をＤＭＳＯで３回、エタノールで２回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥する。
【０１１３】
ヘテロバイオ官能性ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＭＷ３，４００Ｄａ）をＤＭＳＯ中５０ｍＭで７０℃で１分間で溶かし、室温に冷却し、トリエチルアミン２％に調節する。この溶液と共に室温で少なくとも１時間インキュベーションする。この溶液を除去し、ガラス表面を水で３回洗浄する。
【０１１４】
ＰＥＧ被覆の活性化のために、ＮＨＳ及びＥＤＣそれぞれ１００ｍＭをＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）中に溶かし、１：１の比率でそれぞれ５０ｍＭの最終濃度にまで混合する。この溶液と共に、この基板を３０〜６０分間インキュベーションする。溶液の除去後に、ＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）で３回洗浄する。
【０１１５】
この捕獲−抗体を、ＰＢＳ中で３０ｎｇ／μｌに希釈し、これと共に、基板を室温で１〜３時間インキュベーションした。引き続き、この溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回、次いでＰＢＳで３回洗浄する。
【０１１６】
３％ＢＳＡを、あらかじめ１００，０００ｇ（４℃で１時間）で遠心分離した。上澄液と共に、この基板を室温で１時間インキュベーションする。ＢＳＡ溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄する。
【０１１７】
試料（例えば、組み替えタンパク質及び天然タンパク質試料からなる凝集体）を、必要な場合に、ＰＢＳ中で希釈し、載せる。この試料を備えた基板を、４℃で１時間１，０００ｇで減衰振動ロータ中で遠心分離する。上澄液を除去し、ガラス表面をＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄する。
【０１１８】
検出プローブとして、蛍光標識した抗体を使用する。これを、ＰＢＳ中で１〜２ｎｇ／μｌに希釈し、１．５％ＢＳＡを添加する。このバッチを、４℃で１時間１００，０００ｇで遠心分離する。上澄液を基板上に置き、室温で１〜２時間インキュベーションする。引き続き、この溶液を除去し、ＰＢＳＴで５回、ＰＢＳで５回洗浄する。
【０１１９】
本発明の一実施態様の場合に、この試料の載置を基板（被覆されていない基板）に直接行い、場合により活性化された基板表面に共有結合により行う。
【０１２０】
本発明の一実施態様の場合に、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を捕獲しかつ固定するために、この基板上に捕獲分子を固定化する。
【０１２１】
好ましくは、捕獲分子として、凝集した生体特有のタンパク質の抗体を使用する。この抗体は、凝集した生体特有のタンパク質のエピトープに特異的に結合する。
【０１２２】
一つの選択肢の場合に、この捕獲分子は基板と共有結合している。
【０１２３】
他の選択肢の場合に、この捕獲分子は、被覆と、好ましくはデキストラン層と共有結合している。
【０１２４】
本発明の一実施態様の場合に、この捕獲分子（抗体）は、場合によりＣＭＤで被覆された支持体をＥＤＣ／ＮＨＳの混合物（それぞれ２００ｍＭ及び５０ｍＭ）により活性化した後に、基板上に固定化される。
【０１２５】
捕獲分子と結合していない残留するカルボキシラート末端基は、失活させることができる。
【０１２６】
ＣＭＤスペーサー上のこのカルボキシラート末端基の失活のために、ＤＭＳＯ中のエタノールアミンを使用する。試料を置く前に、基板又は支持体をＰＢＳで洗浄する。
【０１２７】
この測定されるべき試料は、このようにして調製された基板上でインキュベーションされる。
【０１２８】
一実施態様の場合に、捕獲分子及び／又はプローブは、モノマー配列から構成されたポリマーを有し、このモノマー配列はその配列に関して生体特有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質である。
【０１２９】
この意味範囲で、ここで、「モノマー配列」の概念は、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を形成する個々のタンパク質の部分領域を表す。
【０１３０】
好ましくは、モノマー配列は、凝集体を形成するタンパク質に特定基に結合する抗体が結合するエピトープを形成する領域である。
【０１３１】
本発明の一実施態様の場合に、生体特有のタンパク質とは、SEQ ID NO. 1-15の配列のポリペプチド並びに、特に遺伝学的突然変異により形成されたこの相同体であると解釈することができる。生体特有のタンパク質は、このペプチドのオリゴマー又はポリマーであることもできる。SEQ ID NO: 1-15は、ペプチドとも、ポリペプチドともいわれる。
【０１３２】
「相同性」又は「相同配列」とは、本発明の意味範囲で、異常にフォールディングされたタンパク質の、生体特有の病原性の凝集体又はオリゴマー又は異常にフォールディングされたタンパク質からなるペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有するアミノ酸配列であると解釈される。「同一性」の概念の代わりに、この明細書中で、「相同」又は「相同性」の概念は、同じ意味で使用される。２つの核酸配列の間の又は２つのポリペプチド配列の間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.Sのアルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981))に基づくプログラムBESTFITを用いた比較により、アミノ酸については次のパラメータ：ギャップ生成ペナルティ：８及びギャプ伸張ペナルティ：２の設定の下で、及び核酸については次のパラメータ：ギャップ生成ペナルティ：５０及びギャップ伸張ペナルティ：３の設定の下で計算される。好ましくは、２つの核酸配列の間の又は２つのポリペプチド配列の間の同一性は、Needleman, S.B.及びWunsch, CD.のアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48: 443-453）に基づくプログラムGAPを用いて、アミノ酸について次のパラメータ：ギャップ生成ペナルティ：８及びギャップ伸張ペナルティ：２の設定の下で、及び核酸について次のパラメータ：ギャップ生成ペナルティ：５０及びギャップ伸張ペナルティ：３の設定の下での比較により計算されるような、核酸配列／ポリペプチド配列のそれぞれの全体の配列長さに関する同一性により定義される。
【０１３３】
２つのアミノ酸配列は、本発明の範囲内で、これらが同じアミノ酸配列を有する場合に同一であるとする。
【０１３４】
更なる工程において、凝集体は、後の検出のために標識されているプローブで標識される。
【０１３５】
一実施態様の場合に、捕獲分子及び／又はプローブは、蛍光染料で標識されている。
【０１３６】
一つの選択肢において、捕獲分子及び／又はプローブは、凝集体を形成するタンパク質のエピトープに対して特異的な抗体を含む。
【０１３７】
本発明の一実施態様の場合に、プローブとして抗体を使用する。捕獲分子とプローブとは同じであってよい。
【０１３８】
本発明の一実施態様の場合に、捕獲分子とプローブとは区別される。よって、例えば異なる抗体を、捕獲分子及びプローブとして使用してもよい。
【０１３９】
本発明の他の実施態様の場合に、場合により染料標識を除いて互いに同一である捕獲分子とプロープとが使用される。本発明の一実施態様の場合に、場合による染料標識を除いて互いに同一である異なるプローブが使用される。本発明の他の実施態様の場合に、異なる抗体を含むか又は異なる抗体でありかつ場合により異なる染料標識も有する少なくとも２又はそれ以上の異なる捕獲分子及び／又はプローブが使用される。
【０１４０】
しかしながら、捕獲分子として、例えば異なる抗体又は異なる分子を含む抗体のような異なる分子を使用することもできる。
【０１４１】
同様に、プローブとして、例えば異なる抗体を含むか又は異なる抗体である、複数の異なる分子を使用することができる。
【０１４２】
表面の後の品質調節のため、例えば捕獲分子による被覆の均一性のため、蛍光染料で標識された捕獲分子を使用することもできる。このため、好ましくは、検出のために干渉しない染料が使用される。それにより、構築の後からの調節も、並びに測定結果の標準化も可能である。
【０１４３】
検出のために、このプローブは、蛍光発光、生物発光及び化学発光並びに吸光からなる群から選択される、光学的に検出可能な信号を発するように標識されている。
【０１４４】
一つの選択肢の場合に、このプローブは染料で標識されている。好ましくは、これは蛍光染料である。
【０１４５】
本発明の一実施態様の場合に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の異なるプローブを使用する。これらのプローブは、凝集体とのその特異的な結合についても、その異なる標識、例えば蛍光染料による異なる標識についても異なることができる。
【０１４６】
検出としてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer)）を使用するために適したプローブを相互に組み合わせることもできる。
【０１４７】
異なる蛍光染料で標識されている複数の異なるプローブの使用は、測定の際に得られる相関信号の特異性を高める。付加的に、それによりモノマー、つまり凝集されていない分子の信号をカットすることもできる。モノマーの検出は、特に、プローブ及び捕獲分子が同じである場合、又は両方が重複するエピトープを認識する場合に排除することができる。
【０１４８】
従って、本発明の主題は、凝集体特異的プローブ又はオリゴマー特異的プローブの利用又は使用でもある。これらのプローブは、所定の凝集体又はオリゴマーに、好ましくは上述の種類の異常にフォールディングされたタンパク質についての凝集体又はオリゴマーに特異的に結合する。所定の凝集体又はオリゴマーへの特異的な結合により、凝集体又はオリゴマーの種類及び／又はサイズ並びに構造が決定できる。
【０１４９】
従って、本発明の他の主題は、凝集体特異的プローブ又はオリゴマー特異的プローブでもある。
【０１５０】
本発明の意味範囲で、モノマーの概念は、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を形成するペプチド分子である個別のタンパク質を表す。この起源種（ヒト及び／又は動物）及びプロセシングに応じて、モノマーの正確なアミノ酸配列は、長さ及び種類が変化することがある。好ましいモノマーは、SEQ ID NO: 1-15並びにこれらの相同体から選択される。
【０１５１】
本発明の意味範囲で、オリゴマーの概念は、凝集体も、オリゴマーも、さらには自由に拡散する小さなオリゴマーも表す。本発明の意味範囲で、オリゴマーは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のモノマー又はその倍数から形成されたポリマーである。この場合、１つのオリゴマー中の全てのモノマーが互いに同じであることができるが、同じである必要はない。
【０１５２】
従って、凝集体とは、オリゴマーであるとも、自由な小さなオリゴマーであるとも解釈される。
【０１５３】
他の選択肢の場合に、プローブとして、蛍光染料で標識された生体特有のタンパク質を使用することができる。
【０１５４】
調査されるべき試料として、生体特有の液体又は組織を使用することができる。本発明の一実施態様の場合に、この試料は、髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、粘膜及び／又は生検材料から選択される。これらの試料を、当業者に公知の多様な後処理工程に供することができる。
【０１５５】
本発明の利点は、未処理の試料、好ましくはＣＳＦ中の凝集体を決定できる点にある。
【０１５６】
本発明の一実施態様の場合に、内部標準物又は外部標準物を使用する。
【０１５７】
このような標準物は、モノマー配列から構成された、好ましくはSEQ ID NO: 1-15による配列の一つ又はSEQ ID NO: 1-15の一つの配列の一部から構成されたポリマーを含むか又はポリマーであり、この配列又はその一部は、その配列に関して生体特有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質である。
【０１５８】
本発明の場合に、生体特有のタンパク質のモノマーの検出は、試験系中で３つの異なるプローブ又は３つの異なるように標識したプローブを使用し、これらのプローブは類似のエピトープ又は同じエピトープにそれぞれ結合することにより排除される。これとは別に又は付加的に、モノマーの検出は、低い強度を有する信号を強度カットオフにより評価しないことにより排除することができる。比較的大きな凝集体は、異なる染料で標識された両方のプローブに対して複数の結合箇所を有するため、モノマーの検出は、これとは別に又は付加的にこれらの信号の相互相関により排除することができる。
【０１５９】
標識された凝集体の検出は、スキャナ又は他の種類の表面画像化により行われる。この検出は、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、特に相互相関と組み合わせて、及び単粒子免疫吸着レーザースキャニングアッセイ（Single-Particle-Immunosolvent Laserscanning-Assay）及び／又はレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）で行う。これとは別に、この検出は、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）によって行う。
【０１６０】
この検出は、本発明の一つの選択肢の場合に、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて実施される。
【０１６１】
本発明の一実施態様の場合には、例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点、又はＦＣＳ（蛍光相関分光法系）、並びに相応する超解像度バリエーション、例えばＳＴＥＤ又はＳＩＭが使用される。これとは別に、この検出は、ＴＩＲＦ顕微鏡、並びにその相応する超解像度バリエーション、例えばＳＴＯＲＭ，ｄＳＴＯＲＭによって行うことができる。
【０１６２】
従って、本発明の実施態様の場合に、空間分解されない信号（nicht-ortsaufgeloestem Signal）に基づく方法、例えばＥＬＩＳＡ又はサンドイッチＥＬＩＳＡは排除される。
【０１６３】
この検出の場合、高い空間分解能が好ましい。本発明による方法の一実施態様の場合、ここでは、例えば機器特有のノイズ、他の非特異的信号又は非特異的に結合したプローブが原因となるバックグラウンド信号に対して、凝集体の検出が可能になるように多くのデータポイントが集められる。このように、存在する空間分解された事象、例えばピクセルのような多くの値が読み取られる（読み出し値）。この空間分解によって、それぞれの事象はそれぞれのバックグラウンドに対して決定され、よって１つの読み出し値だけを有する、少ない読み出し値を有する及び／又は空間分解された信号がないＥＬＩＳＡ法と比較して有利である。
【０１６４】
一つの選択肢の場合に、本発明による方法において複数の異なるプローブを使用する。それにより、この情報、つまり読み出された値は何倍にもなる、というのも各点について、各凝集体について又は各検出事象について、信号を提供するそれぞれのプローブに依存して、個別の情報が得られるためである。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性は高められる。それにより、検出された各凝集体についてその組成、つまり凝集体の種類、つまりモノマー又はその混合物からなる組成を決定することもできる。
【０１６５】
異なるプローブの数は、この場合、使用されるべき蛍光染料の干渉によって制限されるだけである。よって、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の異なるプローブ−染料の組み合わせを使用することができる。
【０１６６】
１つより多くのプローブを使用する場合に、上述の方法による評価にとって重要であるのは、空間分解された及び時間分解された情報である。これは、例えば、蛍光の種類及び／又は強度であってもよい。使用されかつ検出された全てのプローブについてのこれらのデータを評価する場合、本発明の場合には、凝集体の数、凝集体の形状、凝集体のサイズ及び／又は凝集体の組成が決定される。この場合、オリゴマーのサイズに関する情報は、粒子が使用された画像法の時間分解能又は空間分解能よりも小さいか又は大きいかに依存して、直接的又は間接的に得ることができ、一実施態様の場合に、バックグラウンド最小化のためのアルゴリズムを使用し、及び／又は強度閾値を適用することができる。
【０１６７】
蛍光染料として当業者に公知の染料を使用することができる。これとは別に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescence Protein)）、その抱合体及び／又はその融合タンパク質、並びに量子ドットを使用することもできる。
【０１６８】
内部標準物又は外部標準物を使用することにより、試験結果は相互に客観的に比較可能でありかつそれにより表現力が強くなる。
【０１６９】
本発明の一実施態様の場合に、内部標準物又は外部標準物は凝集体の定量化のために使用される。
【０１７０】
蛍光強度分布の解析（ＦＩＤＡ−蛍光強度分布解析(FIDA-Fluoreszenz-Intensity-Distribution-Analysis)）によって、本発明による方法は、いわゆる表面−ＦＩＤＡ（Surface-FIDA, sFIDA）である。この検出は、共焦点蛍光顕微鏡、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）及び／又は全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）、好ましくはＬＳＭ及び／又は全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）で行われる。
【０１７１】
本発明の一実施態様の場合に、１ウェル当たり、１蛍光チャネル当たり５０枚の個別画像（１０００×１０００ピクセル、１１４ｎｍ／ピクセル）を高感度ＣＣＤカメラで画像化する。
【０１７２】
画像データ中のバックグラウンド信号は、強度閾値によって処理される。この閾値を超えるグレースケール値を有するピクセルの平均数を決定する（ｓＦＩＤＡ読み出し）。複数の検出プローブを使用する場合、全ての蛍光チャネル中に同時に局在化された事象だけを評価する。
【０１７３】
このｓＦＩＤＡ法は、Bannach et al.著（2012. Detection of prion protein particles in blood plasma of scrapie infected sheep. PloS one 7, e36620）並びにWang-Dietrichet al.著（2013. The amyloid-beta oligomer count in cerebrospinal fluid is a biomarker for Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's disease 34, 985-994）に記載されていて、これらは参照により取り込まれる。
【０１７４】
捕獲分子及びプローブ分子の選択により、検出（信号検出）のために寄与するために、オリゴマーがどのサイズを有していなければならないかを決定することができる。よって、例えばモノマー、ダイマー、トリマーなどを検出することができる。しかしながら、最小の検出可能な単位として、例えばダイマー又は他のポリマーである捕獲分子及びプローブ分子を使用することもできる。
【０１７５】
一実施態様の場合に、モノマー配列から構成された、好ましくはSEQ ID NO: 1-15による配列の一つ又はSEQ ID NO: 1-15の一つの配列の一部から構成されたポリマーであるか又はこのポリマーを含む捕獲分子及び／又はプローブを使用し、この配列又はその一部は、その配列に関して生体特有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質である。
【０１７６】
本発明による方法によって、更に、自由に拡散可能な小さな凝集体の正確な分析も可能である。光学顕微鏡のためのその解像度を下回るそのサイズに基づいて、小さなオリゴマーは、バックグラウンド蛍光（例えば結合されていない光源により引き起こされる）と区別することが難しかった。
【０１７７】
この極端に高い感度の他に、本発明による方法は、大きな範囲にわたる凝集体の数に関して線形性も示す。
【０１７８】
本発明の他の主題は、タンパク質凝集性疾患、特にＡＤの検出及び識別のためのバイオマーカーとしてのＴａｕ−凝集体との関連での、自由に拡散可能な小さなＡ−ベータ−凝集体の使用である。本発明は、特に、患者の体液の試料、好ましくはＣＳＦ又は血液、特にＣＳＦを、本発明による上述の方法で分析することを特徴とする、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳ−プロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択されるタンパク質凝集性疾患の識別及び／又は検出する方法にも関する。
【０１７９】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性によりデキストラン層を用いて共有結合で被覆）。その後に、ＡＡ−含有粒子（例えば抗ＡＡ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０１８０】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０１８１】
３．  試料中に潜在的に含まれるＡＡ−粒子（例えばＡＡ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＡ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＡ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＡ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＡ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＡ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０１８２】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、ＡＡー抗体、好ましくは抗血清アミロイドＡ抗体クローン１１５、ｍｃ１及び／又は２９１を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ４１３４を使用する。
【０１８３】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０１８４】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点、又は例えばＴＩＲＦＭ）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０１８５】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０１８６】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０１８７】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＡＬ−含有粒子（例えば抗ＡＬ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０１８８】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０１８９】
３．  試料中に潜在的に含まれるＡＬ−粒子（例えばＡＬ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＡＬ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＬ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＬ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＬ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＬ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０１９０】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、Ａ抗ラムダ軽鎖抗体クローンＥＰＲ５３６７、ＨＰ６０５４及び／又は２Ｇ９を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ５３６７を使用する。
【０１９１】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０１９２】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０１９３】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０１９４】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０１９５】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＡＡｐｏＡＩ−含有粒子（例えば抗ＡＡｐｏＡＩ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０１９６】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０１９７】
３．  試料中に潜在的に含まれるＡＡｐｏＡＩ−粒子（例えばＡＡｐｏＡＩ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＡＡｐｏＡＩ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＡｐｏＡＩ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＡｐｏＡＩ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＡｐｏＡＩ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＡｐｏＡＩ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０１９８】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体クローン１２Ｃ８、１４０９及び／又はＧ２を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ１３６８Ｙを使用する。
【０１９９】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２００】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２０１】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２０２】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２０３】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＡＡｐｏＡＩＩ−含有粒子（例えば抗ＡＡｐｏＡＩＩ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２０４】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２０５】
３．  試料ａ中に潜在的に含まれるＡＡｐｏＡＩＩ−粒子（例えばＡＡｐｏＡＩＩ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＡＡｐｏＡＩＩ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＡｐｏＡＩＩ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＡｐｏＡＩＩ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＡｐｏＡＩＩ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＡｐｏＡＩＩ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２０６】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗アポリポタンパク質ＡＩＩ抗体クローン４Ｆ３、ＥＰＲ２９１３及び／又はＥＰ２９１２が使用される。
【０２０７】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２０８】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２０９】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２１０】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２１１】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＡＴＴＲ−含有粒子（例えば抗ＡＴＴＲ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２１２】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２１３】
３．  試料中に潜在的に含まれるＡＴＴＲ−粒子（例えばＡＴＴＲ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＡＴＴＲ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＴＴＲ含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＴＴＲ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＴＴＲ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＴＴＲ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２１４】
一つの選択肢として、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗プレアルブミン抗体クローンＥＰ２９２９Ｙ、ＥＰＲ３１１９及び／又は１０Ｅ１を使用する。
【０２１５】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２１６】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２１７】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２１８】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２１９】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＤＩＳＣ１−含有粒子（例えば抗ＤＩＳＣ１−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２２０】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２２１】
３．  試料中に潜在的に含まれるＤＩＳＣ１−粒子（例えばＤＩＳＣ１−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＤＩＳＣ１−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＤＩＳＣ１−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＤＩＳＣ１−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＤＩＳＣ１−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＤＩＳＣ１−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２２２】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗ＤＩＳＣ１抗体クローン１４Ｆ２、２Ｃ７及び／又はＦＦＤ５を使用する。一つの選択肢の場合に、抗ＤＩＳＣ１−ＡＫ  １４Ｆ２を捕獲抗体として使用し、かつ１４Ｆ２−ＡＦ６３３を検出プローブとして使用する。
【０２２３】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２２４】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかという情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２２５】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２２６】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２２７】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＦＵＳ−含有粒子（例えば抗ＦＵＳ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２２８】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２２９】
３．  試料中に潜在的に含まれるＦＵＳ−粒子（例えばＦＵＳ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＦＵＳ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＦＵＳ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＦＵＳ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＦＵＳ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＦＵＳ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２３０】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗ＴＬＳ／ＦＵＳ抗体クローンＥＰＲ５８１２、ＥＰＲ５８１３及び／又はＣＬ０１９０を使用する。
【０２３１】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２３２】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２３３】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２３４】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２３５】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＩＡＰＰ−含有粒子（例えば抗ＩＡＰＰ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２３６】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２３７】
３．  試料中に潜在的に含まれるＩＡＰＰ−粒子（例えばＩＡＰＰ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＩＡＰＰ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＩＡＰＰ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＩＡＰＰ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＩＡＰＰ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＩＡＰＰ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２３８】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗アミリン抗体クローンＲ１０／９９を使用する。
【０２３９】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２４０】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２４１】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２４２】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２４３】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＳＯＤ１−含有粒子（例えば抗ＳＯＤ１−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２４４】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２４５】
３．  試料中に潜在的に含まれるＳＯＤ１−粒子（例えばＳＯＤ１−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＳＯＤ１−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＳＯＤ１−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＳＯＤ１−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＳＯＤ１−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＳＯＤ１−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２４６】
一つの選択肢として、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗スーパーオキシドジスムターゼ１抗体クローン２Ｆ５、７１Ｇ８及び／又はＥＰＲ１７２６を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ１７２６を使用する。
【０２４７】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２４８】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２４９】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２５０】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２５１】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、α−シヌクレイン−含有粒子（例えば抗α−シヌクレイン−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２５２】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２５３】
３．  試料中に潜在的に含まれるα−シヌクレイン−粒子（例えばα−シヌクレイン−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗α−シヌクレイン−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このα−シヌクレイン−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗α−シヌクレイン−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でα−シヌクレイン−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、α−シヌクレイン−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２５４】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗アルファ−シヌクレイン抗体クローン２Ｂ２Ａ１１、３Ｈ２８９７及び／又は２１１を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲抗体として抗αＳｙｎ−ＡＢ  ２Ｂ２Ａ１１を使用し、検出プローブとして蛍光標識された抗αＳｙｎ−ＡＢｓ  ３Ｈ２８９７−ＡＦ６３３又は２１１−ＡＦ４８８を使用する。
【０２５５】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２５６】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２５７】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２５８】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２５９】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、Ｔａｕ−含有粒子（例えば抗Ｔａｕ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２６０】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２６１】
３．  試料中に潜在的に含まれるＴａｕ−粒子（例えばＴａｕ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗Ｔａｕ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＴａｕ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗Ｔａｕ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＴａｕ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、Ｔａｕ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２６２】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗Ｔａｕ抗体クローンＥ１７８、Ｔａｕ４６及び／又はＴａｕ５を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗Ｔａｕ  ６Ｅ１０／Ａｔｔｏ４８８及び／又はＮａｂ２２８を使用する。
【０２６３】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２６４】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２６５】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２６６】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２６７】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＴＤＰ−４３−含有粒子（例えば抗ＴＤＰ−４３−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２６８】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２６９】
３．  試料中に潜在的に含まれるＴＤＰ−４３−粒子（例えばＴＤＰ−４３−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＴＤＰ−４３−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＴＤＰ−４３−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＴＤＰ−４３−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＴＤＰ−４３−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＴＤＰ−４３−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２７０】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗ＴＡＲＤＢＰ抗体クローンＥＰＲ５８１０、３Ｈ８及び／又はＫ１Ｂ８を使用し、一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ  ５８１０を使用する。
【０２７１】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２７２】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２７３】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２７４】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２７５】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ハンチンチン−含有粒子（例えば抗ハンチンチン−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２７６】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２７７】
３．  試料中に潜在的に含まれるハンチンチン−粒子（例えばハンチンチン−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ハンチンチン−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このハンチンチン−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ハンチンチン−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でハンチンチン−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ハンチンチン−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２７８】
一つの選択肢として、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗ハンチンチン抗体クローンＥＰ８６７Ｙ、Ｄ７Ｆ７及び／又はＨＩＰ−１を使用する。
【０２７９】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２８０】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこに信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２８１】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２８２】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２８３】
一実施態様の場合に、上述の課題は、次の方法、いわゆるｓＦＩＤＡアッセイにより解決される：
１．  表面（好ましくはガラスからなる表面）を、できる限り僅かな非特異的な結合能力を有するように前処理する（例えば、化学変性により共有結合するデキストラン層又はポリエチレングリコールで被覆）。その後に、ＡＬｙｓ−含有粒子（例えば抗ＡＬｙｓ−抗体）用の捕獲分子を（好ましくは共有結合で）結合させる。この捕獲分子は全て同一であるか又は異なる捕獲分子の混合物であることもできる。
【０２８４】
２．  こうして準備された表面に、次いで、あらかじめ後処理工程ありで又は後処理工程なしで、調査されるべき試料（例えば髄液、血液、血漿、尿、唾液、粘膜、生検材料）を置く。非特異的に結合した物質を、洗浄工程により除去することができる。
【０２８５】
３．  試料中に潜在的に含まれるＡＬｙｓ−粒子（例えばＡＬｙｓ−凝集体）を、更なる検出のために有益なプローブ（例えば蛍光染料を結合した抗ＡＬｙｓ−抗体）で標識する。好ましい蛍光染料は、特に量子ドットであることができる。好ましくは、このＡＬｙｓ−含有粒子を、少なくとも１種の他のプローブ（例えば蛍光染料と結合した抗ＡＬｙｓ−抗体）で標識する。異なる蛍光染料とカップリングしている複数の異なるプローブの使用は、一方で、最後に得られる相関信号の特異性を高め、他方でＡＬｙｓ−モノマーの排除も可能にする。特に、検出プローブの一つが（工程１からの）捕獲分子と同一であるか又は両方が重複するエピトープを認識する場合、ＡＬｙｓ−モノマーの検出を排除することができる。特異性を向上させるために、付加的な検出プローブとしてアミロイド特異性染料のThioflavin Tを使用することができる。
【０２８６】
一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブとして、抗リゾチーム抗体クローンＢＧＮ／０６／９６１及び／又はＢＧＮ／０６９６／２Ｂ１０を使用する。一つの選択肢の場合に、捕獲分子及び／又はプローブ（ＡＦ４８８標識）として：ＥＰＲ２９９４を使用する。
【０２８７】
４．  工程２と３とを交換することもできる。適切な洗浄工程により過剰のプローブを除去する。
【０２８８】
５．  標識された凝集体の検出を、スキャナ（例えばレーザー走査顕微鏡において使用されるようなレーザー焦点）により又は他の種類の表面画像化（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡）により行う。ここで時間分解及び空間分解が高くなればそれだけ、より多くのデータポイントが得られ、このデータポイントは、バックグラウンド信号（例えば機器特有のノイズ、非特異的信号、非特異的に結合したプローブにより生じる）に対してそれぞれ凝集体の検出を可能にする。このように、１つだけの読み出し値（これはＥＬＩＳＡの場合に該当する）ではなく、例えば時間分解及び空間分解された事象（例えばピクセル）が存在するような多くの読み出し値が生じる。複数の異なるプローブ（工程３参照）を使用することにより、この情報は何倍にもなり、各点について、各凝集体について又は各検出事象について、どのプローブがそこで信号を供給しているのかについての情報を個別に得ることができる。よって、それぞれの事象にとって、信号の特異性を高めることができる。
【０２８９】
６．  評価のために、例えば凝集体の数、凝集体のサイズ及び凝集体の組成を決定するために、使用されかつ検出された全てのプローブの時間分解された及び空間分解された情報（例えば蛍光強度）が考慮される。この場合、例えばバックグラウンド最小化のアルゴリズムを使用することもでき及び／又は更なる評価のために強度閾値を使用することもできる。
【０２９０】
７．  試験結果を互いに（距離、時間及び実験者に関して）比較可能にするために、標準物（内部及び／又は外部）を使用することができる。
【０２９１】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＡ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０２９２】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＡ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体型の、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０２９３】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＬ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中のＩｇＧ−軽鎖−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０２９４】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＬ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０２９５】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡａｐｏＡＩ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中のＡＡｐｏＡＩ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０２９６】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＡａｐｏＡＩ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０２９７】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡａｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中のＡＡｐｏＡＩＩ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０２９８】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０２９９】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＴＴＲ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中のＡＴＴＲ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３００】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＡＴＴＲ−アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＡＴＴＲ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３０１】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチーのためのバイオマーカーとして、体液中のＤＩＳＣ１−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型、好ましくはＦＵＳ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体及び／又はＴＤＰ−４３−凝集体について調査する。
【０３０２】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチーのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＤＩＳＣ１−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３０３】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳ−プロテイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中のＦＵＳ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型、好ましくはＤＩＳＣ１−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体及び／又はＴＤＰ−４３−凝集体について調査する。
【０３０４】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳ−プロテイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＦＵＳ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３０５】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、２型糖尿病のためのバイオマーカーとして、体液中のＩＡＰＰ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３０６】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、２型糖尿病のためのバイオマーカーとして、体液中の、ＩＡＰＰ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３０７】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症のためのバイオマーカーとして、体液中のＳＯＤ１−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型、好ましくはＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体及び／又はＴＤＰ−４３−凝集体について調査する。
【０３０８】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症のためのバイオマーカーとして、体液中の、ＳＯＤ１−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３０９】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中のα−シヌクレイン−凝集体型の凝集体を選択的定量化する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３１０】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中の、α−シヌクレイン−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３１１】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、タウオパチーのためのバイオマーカーとして、体液中のＴａｕ−凝集体型の凝集体の選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型、好ましくはＡ−ベータ−凝集体について調査する。
【０３１２】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、タウオパチーのためのバイオマーカーとして、体液中の、Ｔａｕ−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体の群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３１３】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中のＴＤＰ−４３−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型、好ましくはＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体及び／又はＳＯＤ１−凝集体について調査する。
【０３１４】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ＴＤＰ−４３−プロテイノパチーのためのバイオマーカーとして、体液中の、ＴＤＰ−４３−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３１５】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ハンチントン病のためのバイオマーカーとして、体液中のハンチンチン−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３１６】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、ハンチントン病のためのバイオマーカーとして、体液中の、ハンチンチン−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、リゾチーム−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３１７】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、家族性臓器性アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中のリゾチーム−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−誘導体及びＡ−ベータ−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３１８】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、家族性臓器性アミロイドーシスのためのバイオマーカーとして、体液中の、リゾチーム−凝集体型の、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体及びＡ−ベータ−凝集体の群から選択される１種以上のタンパク質との混合型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。
【０３１９】
一実施態様の場合に、本発明の主題は、アルツハイマー型認知症のためのバイオマーカーとして、体液中のＡ−ベータ−凝集体型、及び少なくとも１種の他の凝集体型、好ましくはＴａｕ−凝集体型の凝集体を選択的定量化及び／又は特性決定する方法である。一実施態様の場合に、更に、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−誘導体及びリゾチーム−凝集体からなる群から選択される他の凝集体型について調査する。
【０３２０】
本発明の主題は、更に、モノマー配列から構成されたポリマーを有する疾患指標の選択的定量化及び／又は特性決定のための標準物であり、このモノマー配列はその配列に関して、生体固有のタンパク質の部分領域と同一であるか又は相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有し、ここで、上述のポリマーは凝集せず、かつ生体特有のタンパク質が凝集するタンパク質である。
【０３２１】
標準物とは、本発明の意味範囲で、特性及び／又は量の比較及び決定のために、特に生体特有の（異常にフォールディングされた）タンパク質からなる（病原性）凝集体のサイズ及び量の決定のために利用される、一般的に有効でかつ認められた確実な基準値をいう。この標準物は、本発明の意味範囲で、機器及び／又は測定値の校正のために使用することができる。
【０３２２】
本発明による標準物にとって重要なのは、この標準物は凝集しないことであり、好ましくは、生体特有のタンパク質の相応する部分領域が凝集に対して原因とならないために凝集しないか、又は凝集に対して原因となる基の遮断により凝集しないモノマー配列の使用によって凝集しないことである。
【０３２３】
この意味範囲で、ここで、「モノマー配列」の概念は、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を形成する個々のタンパク質（モノマー）の部分領域である断片を表す。
【０３２４】
一実施態様の場合に、この部分領域は、エピトープであるか、又はこれと少なくとも５０％の同一性を有しかつエピトープ、特にSEQ ID NO: 1-15の一つに含まれるエピトープの生物学的活性を有する相同体である。
【０３２５】
このように選択されたモノマー配列は、所望の数で、本発明による標準物の構築の際に組み立てられ及び／又は相互に本発明の場合に連結される。
【０３２６】
本発明による標準物は、上述のモノマー配列、好ましくはエピトープから構成されていて、場合により他の構成要素も含むポリマーである。
【０３２７】
本発明の他の実施態様の場合に、上述のモノマー配列、好ましくはエピトープ、及び／又は相応するエピトープの生物学活性を有するその相同体は、標準物の残りのモノマー種のそれぞれの数を基準として及び／又は他の全てのモノマーの数を基準として、モノマーの同じ又はより多くの数に調節される。
【０３２８】
本発明による標準物分子は、上述に定義されたモノマー配列からなるポリマーである。オリゴマーとは、本発明の意味範囲で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のモノマー配列、又はその倍数、好ましくは２〜１６、４〜１６、８〜１６、特に好ましくは８又は１６、又はその倍数から形成されているポリマーである。
【０３２９】
本発明の一つの選択肢の場合に、この標準物は水溶性である。
【０３３０】
本発明の一つの選択肢の場合に、本発明による標準物は、同じモノマー配列から構成されている。
【０３３１】
本発明の一つの選択肢の場合に、本発明による標準物は、異なるモノマー配列から構成されている。
【０３３２】
本発明の一つの選択肢の場合に、このような上述に定義されたモノマー配列は、線形のコンフォメーションで互いに接して並べられている。
【０３３３】
本発明の一つの選択肢の場合に、このような上述に定義されたモノマー配列は、互いに接して並べられて、分枝した本発明によるオリゴマーになる。
【０３３４】
本発明の一つの選択肢の場合に、このような上述に定義されたモノマー配列は、互いに接して並べられて、架橋した本発明によるオリゴマーになる。
【０３３５】
分枝した又は架橋した、本発明によるオリゴマーは、リシン又はクリックケミストリーによって個々の構成要素の連結により製造することができる。
【０３３６】
上述のように、本発明による標準物、つまり本発明によるオリゴマーもしくはポリマーは、精密に区画された数で存在するモノマー配列、好ましくはエピトープに対して付加的に、更に付加的なアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を含んでいてもよく、これらによって、このモノマー配列、好ましくはエピトープは、相互に共有結合されている。
【０３３７】
一つの選択肢の場合に、システインによる、特にシステインによるジスルフィド架橋によるモノマー配列、好ましくはエピトープの直接的な結合は除外される（還元性試薬がこの架橋を分離することを避けるため）。同様に、他の態様の場合に、一方でスペーサーとモノマー配列との、他方でシステインとの直接的な結合も除外される。
【０３３８】
官能基によるエピトープの多重化は、個々の構成要素の合成の前又は後で実施することができる。本発明による標準物について特徴的であるのは、モノマー配列の共有結合である。
【０３３９】
本発明により使用されるべきモノマー配列は、タンパク質の配列と同一であるか、又は凝集体を形成する全長タンパク質の一つの配列と、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の相同性を示すことができる。
【０３４０】
これとは別に、本発明による標準物分子の構築のために、全長タンパク質の部分領域と同一であるか、もしくは全長タンパク質の部分領域と５０、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の相同性を示すモノマー配列も使用する。
【０３４１】
本発明により使用された配列にとって重要であるのは、凝集しない（又は条件に応じて制御されて凝集する）特性及び／又はエピトープとしての活性である。
【０３４２】
標準物は、一つの選択肢として、好ましくは、生体特有のタンパク質からなる病原性凝集体又はオリゴマーよりも水性媒体中での高い溶解度を有する。
【０３４３】
本発明の一実施態様の場合に、この標準物は、精密に区画された数のエピトープを有し、このエピトープは、相応する結合相手の結合について、互いに（直接的に又はアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を介して）共有結合している。
【０３４４】
この意味範囲で、標準物に関して、結合相手は、抗体、ナノボディ及びアフィボディ（Affibody）からなる群から選択される。結合相手は、更に、検出されるべき凝集体に対して十分な結合特異性を有する全ての分子、例えば染料（Thioflavin T、コンゴーレッド、等）である。
【０３４５】
本発明による標準物分子は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の多様な結合相手に対するエピトープを含むことができる。
【０３４６】
多様な結合相手に対して特徴的なエピトープは、本発明による標準物に、１つの又は異なるタンパク質（異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を形成する）の異なる領域と同一であるか、もしくは、これに対して少なくとも５０％の相同性を有するが、相応するエピトープの活性を有するモノマー配列を使用することにより組み込むことができる。
【０３４７】
本発明の一実施態様の場合に、標準物分子はいわゆるスペーサーである。
【０３４８】
スペーサーとは、共有結合を介して標準物分子内へ組み込まれていて、所定の物理特性及び／又は化学特性を有し、この特性により標準物分子の特性を変更する分子であると解釈される。本発明による標準物の一実施態様の場合に、親水性又は疎水性、好ましくは親水性スペーサーが使用される。親水性スペーサーは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−Ｌ−リシン又はベータ−アラニンから形成される分子の群から選択される。
【０３４９】
本発明による標準物は、本発明の一つの選択肢の場合に、（他の）官能基を含む。
【０３５０】
官能基とは、標準分子と共有結合されている分子であると解釈される。一つの態様の場合に、官能基はビオチン基を含む。それにより、ストレプトアビジンに関して強い共有結合が可能となる。よって、ビオチン基を有する標準物分子は、ストレプトアビジン基を有する分子に結合することができる。本発明による標準物分子がビオチン基及び／又はストレプトアビジン基を含む場合、より大きな標準を構成することができるか、又は複数の、場合により異なる標準物分子を１つの骨核に結合させることができる。
【０３５１】
本発明の他の選択肢の場合に、標準物分子は、分光測光法による決定のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含む。芳香族アミノ酸は、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンであるか、もしくはこれらの群から選択される。トリプトファンの組み込みにより、溶液中の標準物の濃度の分光測光法による決定が可能である。
【０３５２】
本発明による他の実施態様の場合に、標準物はデンドリマーとして構成されている。本発明によるデンドリマーは、上述の本発明により使用されるべきモノマー配列から構成されていて、かつ中央の骨核分子を含んでいてもよい。好ましくは、この骨核分子は、ストレプトアビジン−モノマー、特に好ましくはポリマー、殊にテトラマーである。
【０３５３】
本発明によるデンドリマーは、一つの態様の場合に、タンパク質の部分領域と同一であるか、又は相応する部分領域に対して少なくとも５０％の相同性を示す配列を有するモノマー配列を含む。
【０３５４】
本発明の場合に、少なくとも５０％の相同性の概念は、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％からなる群から選択される、より高い相同性であるとも解釈される。
【０３５５】
本発明の他の主題は、配列に関して、生体特有のタンパク質と相応する部分領域中で同一であるか、又は生体特有のタンパク質の相応する部分領域に関して少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチドを含むデンドリマーである。
【０３５６】
本発明によるデンドリマーは、標準物の上述の各特徴又はこの特徴の各任意の組み合わせを含むことができる。
【０３５７】
本発明の一つの選択肢の場合に、これは次のものである：
・  結合相手と共有結合するために、精密に区画された数のエピトープを含むデンドリマー、
・  異常にフォールディングされたタンパク質、好ましくはSEQ ID NO: 1-15によるタンパク質の凝集体を形成する１つ以上のタンパク質のエピトープを含むデンドリマー、
・  水性媒体中で、生体特有のタンパク質からなる病原性凝集体よりも高い溶解度を有することを特徴とするデンドリマー、
・  官能基を含むデンドリマー、
・  少なくとも１つのスペーサー分子を含むデンドリマー及び／又は
・  分光測光法により決定するための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含むデンドリマー。
【０３５８】
本発明の場合に、デンドリマーは放射相称を示す。
【０３５９】
一つの態様の場合に、デンドリマーの第一世代の分枝は、リシン、特に３つのリシン−アミノ酸を介して行われる。
【０３６０】
本発明の他の選択肢の場合に、標準物、特にデンドリマー中に、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープが、硫黄原子に対する結合を介してではなく、チオエーテル結合を介してではなく及び／又はシステイン（場合により、システインによるジスルフィド架橋により）を介してではなく、相互に又は標準物の他の構成要素、例えばアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上記の構成要素と結合、特に共有結合している。同様に、他の態様の場合に、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープ、及びこれと結合するスペーサーは、スペーサーと、硫黄原子に対する結合を介してではなく、チオエーテル結合を介してではなく、及び／又はシステインを介してではなく、相互に又は標準物の他の構成要素、例えばアミノ酸、他のスペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上述の構成要素と結合、特に共有結合している。
【０３６１】
本発明は、更に、上述のような標準物の製造方法に関する。
【０３６２】
一実施態様の場合に、本発明による標準物は、当業者に公知のペプチド合成又は組み替え法によって製造される。
【０３６３】
本発明の他の主題は、生体特有のタンパク質からなる病原性凝集体又はオリゴマーを定量化するための、上述の標準物又は上述のデンドリマーの使用である。
【０３６４】
本発明の場合に、本発明による標準物は、生体特有のタンパク質からなる病原性凝集体又はオリゴマーを定量化する方法において使用される。
【０３６５】
本発明による標準物は、本発明の一実施態様の場合に、表面ＦＩＤＡ法（ｓＦＩＤＡ）、Ｅｌｉｓａ（サンドイッチ−Ｅｌｉｓａ）又はＦＡＣＳにおいて、校正のために使用される。
【０３６６】
他の実施態様の場合に、本発明は、本発明による標準物を有するキットに関する。本発明のキットの化合物及び／又は構成成分は、容器中に、場合により緩衝液と共に／緩衝液中で及び／又は溶液と共に／溶液中で包装されていてもよい。これとは別に、個々の成分は同一の容器中に包装されていてもよい。これに対して付加的に又はこれとは別に、１種以上の成分を、固体の支持体、例えばガラスプレート、チップ又はナイロン膜又は微量滴定プレートのウェルに吸収させていてもよい。
【０３６７】
このようなキットは、次の成分の１つ以上を有していてもよい：
−  疎水性材料、好ましくはデキストラン、好ましくはカルボキシメチルデキストラン又はポリエチレングリコール、好ましくはヘテロバイオ官能性ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）で被覆されているガラス製の基板；
−  標準物；
−  捕獲分子；
−  プローブ；
−捕獲分子を備えた基板。
【０３６８】
更に、このキットは、任意の実施形態のためのキットの使用についての取り扱い説明書を有していてもよい。
【０３６９】
本発明の一つの選択肢の場合に、この標準は、生体特有のタンパク質の病原性凝集体又はオリゴマーを定量化するために次のように用いられる：
第１の工程で標準物又はデンドリマーを結合相手で標識し、かつこの標準又はデンドリマーと結合した結合相手の数を決定する、
第２の工程で、生体特有のタンパク質からなる病原性凝集体又はオリゴマーをプローブで標識し、それぞれの病原性凝集体又はオリゴマーと結合したプローブの数を決定する、
第３の工程で、それぞれ工程１の標準物又はデンドリマーと結合する結合相手の数を、工程２の凝集体と結合するプローブの数とを比較する、及び
第４の工程で、それにより体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。
【０３７０】
本発明の一つの態様の場合に、本発明による標準物、好ましくはデンドリマーを、表面−ＦＩＤＡ法の校正のために使用する。第１の工程で、体液からの生体特有の病原性凝集体をガラス面に固定化する。この固定化の後に、この凝集体を２つの異なるプローブで標識する。これらの検出プローブは、好ましくは異なる蛍光染料で標識されている。それにより、顕微鏡、例えばレーザー走査顕微鏡中でこの標識を見ることができる。
【０３７１】
本発明による標準物は、捕獲分子としても及び／又はプローブとしても使用することができ、又はその一部であることもできる。従って、本発明の主題は、本発明による標準物を含む捕獲分子及び／又はプローブでもある。
【０３７２】
本発明の主題は、疾患指標及び／又は凝集体のための捕獲分子を備えた精密に区画された領域を有する基板である。
【０３７３】
この基板は、次の：
アルツハイマー型認知症、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症
からなる群から選択される疾患を診断する方法で使用される。
【０３７４】
試料の採取後の全ての方法工程は、生体外（試験管内）で、つまりヒト又は動物の体外で実施される。
【０３７５】
この試料は、ヒト又は動物から採取することができる。生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体型は、次の疾患において見られ、かつバイオマーカーとして又はバイオマーカーの一部として使用することができる：表Ａ、１〜１５行。
【０３７６】
表Ａ：
【表１】
0006478987.tif 000002
【０３７７】
本発明の一実施態様の場合に、表Ａのバイオマーカーを、この表中のバイオマーカーの同じ列に示されたものとは別の表Ａの疾患用の疾患指標として使用することもできる。
【０３７８】
例えば、Ｔａｕ−凝集体は、アルツハイマー型認知症のためのバイオマーカーとしても利用でき、又は同様にこの表中に示されたＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体又はＴＤＰ−４３−凝集体を複数の疾患のために利用できる
例えば、Ｔａｕとα−シヌクレインからなる混合型凝集体も、例えばパーキンソン病のためのバイオマーカーとして利用できる。他の全ての混合型凝集体も、バイオマーカーとして使用できる。
【０３７９】
従って、疾患の組み合わせの診断が可能であるだけでなく、その結果から他の疾患を除外することもできる。それにより、同様に正確な診断が可能となる。
【０３８０】
本発明の主題は、次の工程：
ｉ）  次の：
ａ）  ヒト又は動物の身体から試料を採取し、場合により前処理し、かつ調査されるべき試料を基板上に置く工程、
ｂ）  それぞれの凝集体に特異的に結合することにより、それぞれの凝集体を標識する、検出のために標識されたプローブを加える工程、及び
ｃ）  標識された凝集体を検出する工程
を有し、ここで、工程ａ）の前に工程ｂ）を実施することができ、かつ
疾患は、次の：
ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択されている方法で、試料中の異常にフォールディングされたタンパク質−凝集体の量を決定する工程、
ｉｉ）  このデータを基準値と比較する工程；
ｉｉｉ）  この比較の際に、タンパク質凝集体の有意に高い量を確定する工程；
ｉｖ）  この相違を疾患指標に応じた疾患像に分類する工程
を有する、異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体を有する疾患を決定するための鑑別診断である。
【０３８１】
本発明による基板上に、少なくとも２つの精密に区画された領域内に、生体特有のタンパク質の異なる凝集体に結合する特異的な捕獲分子を固定化する。一つの選択肢の場合に、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又はそれ以上の異なる特異的な捕獲分子を基板の精密に区画された領域に固定化する。凝集体の結合及び引き続く検出に相応して、次いで鑑別診断が可能である。
【０３８２】
一つの選択肢の場合に、ウェル１つ当たり、１６以上の異なる捕獲分子を定義された基板表面に施す（配置する）ことができる。それにより、唯一の試料中の異なる凝集体型及び更に異なるモノマーからなる異種凝集体を同定することができる。このために、少量の体液で十分である。更に、凝集体の同定のために格子位置を利用することができる。
【０３８３】
一つの選択肢の場合に、唯一の基板（ウェル）中に異なる捕獲抗体の関する混合物を固定することができるか、又は「スポッティング」法により唯一の表面内の異なる位置に、例えば微量滴定プレートウェルの底に、例えば１つ以上のプローブに特異的に結合するか又は１つ以上の凝集されたタンパク質に特異的に結合する異なる捕獲分子（例えば抗体）を施すことができる。それぞれ異なる蛍光体を有する異なるプローブの使用により、多様な凝集体種をほぼ同時に唯一の試料アリコート中で分析できる。
【０３８４】
同様に、異なるタンパク質−モノマーからなる凝集体混合型を同定することもできる。
【０３８５】
従って、疾患の組み合わせの診断が可能であるだけでなく、その結果から他の疾患を除外することもできる。それにより、同様に正確な診断が可能となる。
【０３８６】
本発明による方法の利点は、タンパク質凝集を伴う多数の存在を有する唯一の患者試料を用いて、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質に基づく可能な全ての凝集体型を調査することが可能であることである。更なる利点は、直接、生体外で、試料、例えば血液及び髄液試料又は尿、唾液、粘膜、生検材料、特に血液及び髄液試料中のタンパク質凝集体を、凝集体型に関して調査することができることである。
【０３８７】
本発明による方法により、新たな疾患指標を、定性的に及び／又は定量的に決定することができる。従って、本発明の主題は、本発明により調査される生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の凝集体型の存在により、及び場合により少なくとも１種の他の凝集体型の存在及び／又は不存在により特徴付けられる疾患指標であるバイオマーカーでもある。
【０３８８】
本発明による方法及び新規バイオマーカーにより、異常にフォールディングされたタンパク質凝集体に基づく（上述のような）疾患の一つを同定し、かつ場合により類似の又は重複する症状を有する群の他の疾患と明確に区別することができる。
【０３８９】
従って、本発明の主題は、更に、本発明の方法を用いて、血清−アミロイド−Ａ−凝集体、ＩｇＧ−軽鎖−凝集体、ＡａｐｏＡＩ−凝集体、ＡａｐｏＡｌｌ−凝集体、ＡＴＴＲ−凝集体、ＤＩＳＣ１−凝集体、ＦＵＳ−凝集体、ＩＡＰＰ−凝集体、ＳＯＤ１−凝集体、α−シヌクレイン−凝集体、Ｔａｕ−凝集体、ＴＤＰ−４３−凝集体、ハンチンチン−凝集体、リゾチーム−凝集体及びＡ−ベータ−凝集体又はこれらの凝集体混合型からなる群から選択される、生体特有の異常にフォールディングされたタンパク質の少なくとも１つの凝集体型の存在により、及び場合により少なくとも１つの他の上述の凝集体型又は凝集体混合型の存在及び／又は不存在により決定されるバイオマーカーである。
【０３９０】
本発明による方法は、更に、疾患像又は疾患の診断のために重要である、タンパク質−凝集体の濃度の限界値を確定するために使用することができる。
【０３９１】
本発明の主題は、次の構成要素：
−  上述のような基板、
−  上述のような標準物、
−  プローブ、
−  溶液、
−  緩衝液
の１つ以上を有し、ここで、疾患は、ＡＡ−アミロイドーシス、ＡＬ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩ−アミロイドーシス、ＡＡｐｏＡＩＩ−アミロイドーシス、ＡＴＴＲ−アミロイドーシス、統合失調症及び他のＤＩＳＣ１オパチー、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症及び他のＦＵＳプロテイノパチー、２型糖尿病、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、慢性外傷性脳症及び他のＴＤＰ−４３−プロテイノパチー、ハンチントン病、家族性臓器性アミロイドーシス及び／又はアルツハイマー型認知症からなる群から選択される、鑑別診断用のキットである。
【０３９２】
本発明の他の主題は、本発明による方法の、上記疾患の診断、早期診断及び／又は予想のための使用である。
【０３９３】
本発明の他の主題は、本発明による方法の、上述の疾患の治療の監視並びに作用物質の作用及び／又は治療措置の監視及び／又は点検のための使用である。これは、臨床試験、研究、並びに治療法モニタリングの場合にも使用できる。このために、試料を本発明による方法により測定し、結果を比較する。
【０３９４】
本発明の他の主題は、本発明による方法及びバイオマーカーの、個人を臨床研究に取り上げるかどうかを決定するための使用である。このために、試料を本発明による方法で測定し、限界値に関して決定を下す。
【０３９５】
本発明による他の主題は、本発明による方法を用いて作用物質の作用及び／又は治療措置の効果を決定する方法であり、この場合、試料の結果を相互に比較する。試料は、作用物質の投与又は治療措置の実施の前、又は後、又はその後の異なる時点で採取された体液である。この結果に基づき、凝集体の減少が起こる作用物質及び／又は治療措置を選択する。本発明の場合に、この結果は、作用物質及び／又は治療措置に供されなかった対照と比較される。
【図面の簡単な説明】
【０３９６】
【図１Ａ】ＡｐｏＡＩ−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図１Ｂ】ＡＬ−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図１Ｃ】ＳＯＤ１−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図１Ｄ】ＡＬｙｓ−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図１Ｅ】血清アミロイドＡ−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図１Ｆ】ＴＤＰ−４３−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡを示す図。
【図２Ａ】ＣＳＦ中のＤＩＳＣ１−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡ−検出を示す図。
【図２Ｂ】ＣＳＦ中のシヌクレイン−タンパク質凝集体のｓＦＩＤＡ−検出を示す図。
【図３】特異性分析を示す図。
【図４】Ｔａｕタンパク質の存在でのＡベータ特的ｓＦＩＤＡを示す図。
【０３９７】
実施例
１．  材料及び方法
試料支持体として、このアッセイで、１７０μｍの厚さのガラス底を有するマルチウェルプレートを使用した（SensoPlate Plus 384 Greiner Bio One, Kremsmuenster、オーストリア国）。使用する全ての試薬及び溶液を、最高純度クラスで購入し、使用の前に粒子不含に滅菌した。
【０３９８】
第１の工程で、それぞれの試料室（ウェル）を苛性ソーダ（５Ｍ）１００μｌで満たし、室温で１５分間インキュベーションし、水で３回洗浄し、塩酸１００μｌを添加し、新たに室温で１５分間インキュベーションした。水で３回洗浄し、エタノールで２回洗浄した後、このウェルを窒素雰囲気下で乾燥させた。
【０３９９】
ガラス表面にアミノ基を作製するために、それぞれエタノールアミン（５．６Ｍ）２０μｌをウェルに注入し、室温で一晩中インキュベーションした。このウェルを、ＤＭＳＯで３回、エタノールで２回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。
【０４００】
ヘテロバイオ官能性ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＭＷ３，４００Ｄａ）をＤＭＳＯ中で５０ｍＭで７０℃で１分間で溶かし、室温に冷却し、トリエチルアミン２％に調節した。この溶液からそれぞれ１５μｌをウェルに注入し、室温で少なくとも１時間インキュベーションした。この溶液をウェルから除去し、ウェルを水で３回洗浄した。
【０４０１】
ＰＥＧ被覆の活性化のために、ＮＨＳ及びＥＤＣ（カルボジイミド）をそれぞれＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５、ＭＥＳ：２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）中に１００ｍＭで溶かし、１：１の比率でそれぞれ５０ｍＭの最終濃度にまで混合した。この溶液それぞれ３０μｍをウェル中に充填し、３０〜６０分間インキュベーションした。この溶液の除去後に、ウェルをＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）で３回洗浄した。
【０４０２】
捕獲−抗体をＰＢＳ中で３０ｎｇ／μｌに希釈した。ここから、１５μｌをウェルに注入し、室温で１〜３時間インキュベーションした。引き続きこの溶液を除去し、ＰＢＳＴ（Tween 20を有するＰＢＳ）で３回、次いでＰＢＳで３回洗浄した。
【０４０３】
３％ＢＳＡを、あらかじめ１００，０００ｇ（４℃で１時間）で遠心分離した。上澄みそれぞれ５０μｌをウェルに充填し、室温で１時間インキュベーションした。ＢＳＡ溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０４０４】
この試料（例えば組み替えタンパク質及び天然タンパク質試料からなる凝集体）を、必要な限り、ＰＢＳ中に希釈し、そこからそれぞれ１５μｌをウェルに注入した。このマルチウェルプレートを、１，０００ｇで４℃で１時間減衰振動ロータ中で遠心分離した。この上澄みを除去し、ウェルをＰＢＳＴで３回、及びＰＢＳで３回洗浄した。
【０４０５】
検出プローブとして、蛍光標識した抗体を使用した。これを、ＰＢＳ中で１〜２ｎｇ／μｌに希釈し、１．５％ＢＳＡを添加した。このバッチを、４℃で１時間１００，０００ｇで遠心分離した。上澄みそれぞれ１５μｌをウェルに充填し、室温で１〜２時間インキュベーションした。引き続き、この溶液を除去し、ＰＢＳＴで５回、ＰＢＳで５回洗浄した。
【０４０６】
この表面蛍光を、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）で可視化した。これとは別に、このタンパク質粒子を、ガラス表面の平面上の共焦点レーザー走査で可視化することができる。ウェル１つ当たり、１蛍光チャネルあたり５０枚の個別画像（１０００×１０００ピクセル、１１４ｎｍ／ピクセル）を高感度ＣＣＤカメラで画像化した。
【０４０７】
画像データ中のバックグラウンド信号を強度閾値によって処理した。この閾値を超えるグレースケール値を有するピクセルの平均数を決定する（ｓＦＩＤＡ読み出し）。最後に、複数の検出プローブを使用した場合、全ての蛍光チャネル中に同時に局在化された事象だけを評価した。
【０４０８】
２．  ｓＦＩＤＡプロトコル
２．１．  前処理
・  １５ｍｉｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ）１００μｌ／ウェル
・  ３×  Ｈ2Ｏ
・  １５ｍｉｎ  ＨＣｌ（１Ｍ）１００μｌ／ウェル
・  ３×  Ｈ2Ｏ
・  ２×  ＥｔＯＨ  洗浄
・  Ｎ2で乾燥
２．２．  ガラス活性化（アミノ基）
・  ２０μｌ／ウェル  エタノールアミン（５．６Ｍ）［×］インキュベーションＵＮ（一晩中）室温又はより長く４℃で
────────────────────────────
・  ３×  ＤＭＳＯ
・  ２×  ＥｔＯＨ
・  Ｎ2で乾燥
２．３．  スペーサー  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ
・  １７ｍｇ  ＰＥＧを１００μｌ  ＤＭＳＯ中に７０℃（短時間）で溶かし、冷却させ、＋  ２μＬ  トリエチルアミン（ＴＥＡ）
・  １５μｌ／ウェル［×］インキュベーション：ｍｉｎｄ．１ｈ
・  ３×  Ｈ2Ｏ
２．４．  ＮＨＳ／ＥＤＣ（５０ｍＭ）によるＰＥＧ活性化
・  ５．８ｍｇ  ＮＨＳ及び９．６ｍｇ  ＤＥＣを５００μｌ  ＭＥＳ（０．１Ｍ）中に希釈し、直接適用  １：１混合
・  ３０μｌ／ウェル［×］インキュベーション：３０ｍｉｎ〜最大１ｈ
・  すぐに  ３×ＭＥＳ（０．１Ｍ）
２．５．  捕獲
・  捕獲−抗体をＰＢＳ中に希釈（３０ｎｇ／μｌ）
・  １５μｌ  ウェル  →  インキュベーション  １〜３ｈ  ＲＴ又はより長く４℃で
・  ３×ＰＢＳＴ、３×ＰＢＳ
２．６．  遮断
・  ３％  ＢＳＡ  １ｈ  １００，０００×ｇ、４℃（Rotor TLA-45）
・  ５０μｌ／ウェル［×］インキュベーション  １ｈ
・  ３×ＰＢＳＴ
・  ３×ＰＢＳ
２日
──────────────────────────────────
２．７．  ターゲット
・  １５μｌ  ターゲット、ＰＢＳ中に希釈
・  インキュベーション  １ｈ  ｚｆ、１０００ｇ、２５℃、
・  ＨＨ：３×０．２％  ＳＤＳ／ＰＢＳ；５×ＰＢＳＴ；５×ＰＢＳ
・  血漿及び組み替え凝集体：３×ＰＢＳＴ；３×ＰＢＳ
２．８．  検出抗体
・  １〜２ｎｇ／μｌ  １．５％  ＢＳＡ中、１００，０００×ｇ後にＰＢＳ、４℃（Rotor TLA-45）
・  それぞれ１５μｌ  上澄み／ウェル［×］インキュベーション＞＝１〜２ｈ、ＲＴ
・  ５×ＰＢＳＴ
・  ５×ＰＢＳ
（洗浄工程について、それぞれ相応する溶液１００μｌを使用した）。
【０４０９】
３．  組み替えタンパク質からなる凝集体を用いた適用
まず、多様な凝集体種の検出のためのｓＦＩＤＡアッセイの原則的な実現性を説明した。実験的に、異なるタンパク質（ＡａｐｏＡＩ、ＡＬ、ＳＯＤ１、ＡＬｙｓ、ＡＡ、ＴＤＰ−４３）の凝集体を作製し、相応する希釈系列をｓＦＩＤＡアッセイで調査した。この場合、捕獲抗体及び検出抗体として、それぞれ同じ、それぞれのタンパク質に結合する抗体を使用した。この検出プローブを、それぞれAlexafluor 488で標識した。全ての凝集体は、濃度に依存してピコモル領域内までｓＦＩＤＡによって検出できる。
【０４１０】
図１Ａ〜Ｆ：異なるタンパク質凝集体のｓＦＩＤＡ。このタンパク質凝集体は、記載された濃度で、ＰＢＳ緩衝液中に希釈し、ｓＦＩＤＡアッセイで分析した。ネガティブコントロールとして、ＰＢＳ緩衝液を使用した。Ａ）  ＡｐｏＡＩ、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  １３６８Ｙ  Ｂ）  ＡＬ、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  ５３６７  Ｃ）  ＳＯＤ１、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  １７２６  Ｄ）  ＡＬｙｓ、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  ２９９４（２）  Ｅ）  ＡＡ、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  ４１３４  Ｆ）ＴＤＰ−４３、捕獲プローブ及び検出プローブ（AF488で標識）：ＥＰＲ  ５８１０。
【０４１１】
４．  ネガティブ試料の適用
血液試料及び髄液試料（ＣＳＦ試料）又は尿、唾液、粘膜、生検材料中のタンパク質凝集体を検出できることを実験的に説明するために、タンパク質凝集体（α−シヌクレイン及びＤＩＳＣ１）をＣＳＦ中に希釈し、ｓＦＩＤＡを用いて分析した。α−シヌクレインの検出のために、捕獲−抗体として、抗αＳｙｎ−ＡＢ  ２Ｂ２Ａ１１を、検出プローブとして蛍光標識した抗αＳｙｎ−ＡＢ  ３Ｈ２８９７−ＡＦ６３３又は２１１−ＡＦ４８８を使用した。ＤＩＳＣ１凝集体の検出のために、抗ＤＩＳＣ−ＡＫ  １４Ｆ２を捕獲−抗体として、及び１４Ｆ２−ＡＦ６３３を検出プローブとして使用した。シヌクレイン凝集体も、ＤＩＳＣ１凝集体も、濃度依存してピコモル範囲内までｓＦＩＤＡにより測定できる（図２Ａ及びＢを参照）。
【０４１２】
統合失調症の分子的基礎を調査するために、Carsten Korthの実験室で、タンパク質ＤＩＳＣ１を強く発現するラットモデルを開発した。このタンパク質が天然で凝集体として存在するかどうかを調査するために、トランスジェニック動物のＣＳＦ試料をｓＦＩＤＡで分析した。２匹の対照動物と比較して、トランスジェニック試料中には、ＤＩＳＣ１−凝集体の明らかに高められた力価が示された（図２Ａ、試料ＷＴ１、ＷＴ２、Ｔｇ）。
【０４１３】
図２：  ＣＳＦ中のタンパク質凝集体のｓＦＩＤＡ検出。組み替えタンパク質からなる凝集体をヒトＣＳＦ中に希釈し、ｓＦＩＤＡアッセイで調査した。Ａ）  ＤＩＳＣ１−検出。捕獲抗体及び検出プローブ（AF633で標識）として、ｍＡＢ  １４Ｆ２を使用した。組み替えＤＩＳＣ１凝集体（１０ｐｇ〜１０ｎｇ）に対して付加的に、ラットのＣＳＦ試料（ＷＴ１、ＷＴ２、Ｔｇ）をｓＦＩＤＡ分析に供した。Ｂ）  ２Ｄ  ｓＦＩＤＡを用いたシヌクレイン検出。捕獲−抗体として抗αＳｙｎ−ＡＢ  ２Ｂ２Ａ１１を使用し、検出プローブとして蛍光標識された抗αＳｙｎ−ＡＢｓ  ３Ｈ２８９７−ＡＦ６３３又は２１１−ＡＦ４８８を使用した。２つのカラーチャネルにおいて閾値を超えて共に局在化された信号だけを考慮した。
【０４１４】
５．  ｓＦＩＤＡの鑑別診断の適用
１つの試料を、異なる捕獲抗体で被覆されている異なる反応室（ウェル）に分配した。これとは別に、混合物を、唯一のウェル中の異なる捕獲抗体に固定化するか、又は唯一の表面内の多様な位置に、例えば微小滴定プレートウェルの底に、「スポッティング」法により、異なる捕獲抗体を適用することができる。
【０４１５】
それぞれ異なる蛍光体を有する異なるプローブの使用により、多様な凝集体種をほぼ同時に唯一の試料アリコート中で分析した。
【０４１６】
この実施例中で、ＡＬｙｓ特異的ｓＦＩＤＡアッセイ（プローブ及び捕獲体としての抗リゾチーム抗体）を広い濃度範囲で、異なるタンパク質凝集体とは交差反応しなかったことが示された（図３）。プローブ及び捕獲体としての抗リゾチーム抗体は、ＡＬｙｓ型の凝集体とだけ相互作用した。
【０４１７】
他の実施例中では、他のタンパク質の存在がアミロイド−ベータ−凝集体の検出性に不利な影響を及ぼさないことが判明した。このために、アミロイド−ベータ−凝集体とＴａｕ−凝集体との混合物をｓＦＩＤＡ分析に供した。
【０４１８】
図３  特異性分析。捕獲抗体のラビットモノクローナルＥＰＲ２９９４（２）及び検出プローブのＥＰＲ２９９４（２）−ＡＦ４８８を用いるＡＬｙｓ特異性ｓＦＩＤＡアッセイにおいて、組み替えＡＬｙｓ凝集体の希釈の他に、他のタンパク質凝集体（Ｔａｕ、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤ１、ＡＡ、ＡＬ、シヌクレイン、ＡｐｏＡＩ）を交差活性について調査した。
【０４１９】
図４：  Ｔａｕタンパク質の存在でのＡベータ特異的ｓＦＩＤＡ。Ａベータからなるタンパク質凝集体を記載された濃度に希釈し、１μＭのＴａｕタンパク質凝集体の存在又は不存在で、Ａベータ特異的ｓＦＩＤＡアッセイ（検出プローブ６Ｅ１０／Ａｔｔｏ４８８、捕獲  Ｎａｂ２２８）で分析した。
【図１Ａ】
0006478987.tif 000003
【図１Ｂ】
0006478987.tif 000004
【図１Ｃ】
0006478987.tif 000005
【図１Ｄ】
0006478987.tif 000006
【図１Ｅ】
0006478987.tif 000007
【図１Ｆ】
0006478987.tif 000008
【図２Ａ】
0006478987.tif 000009
【図２Ｂ】
0006478987.tif 000010
【図３】
0006478987.tif 000011
【図４】
0006478987.tif 000012
【配列表】
0006478987000001.app