(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤を有効成分として含む抗癌補助用薬学組成物であって、
前記抗癌補助は、癌細胞における抗癌剤感受性を増強するものであり、前記癌細胞は、正常組織細胞と比べてＲＩＰ３タンパク質の低い発現又は活性レベルを有する、そして、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤が脱メチル化剤であることを特徴とする抗癌補助用薬学組成物。
【請求項２】
前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤は、化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体及び天然物よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌補助用薬学組成物。
【請求項３】
前記癌は、乳癌、子宮頸部癌、肝癌又は大腸癌であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌補助用薬学組成物。
【請求項４】
癌細胞に試験物質を接触させるステップ、
前記試験物質を接触した癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び、
対照試料と比較して前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルが増加した試験物質を選別するステップを含む抗癌補助剤のスクリーニング方法であって、
前記抗癌補助は、癌細胞における抗癌剤感受性を増強するものであり、そして、前記癌細胞は、正常組織細胞と比べてＲＩＰ３タンパク質の低い発現又は活性レベルを有する、抗癌補助剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）よりなる群から選ばれたいずれか一種の方法を用いて測定することを特徴とする請求項４に記載の抗癌補助剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記癌細胞は、乳癌細胞、子宮頸部癌細胞、肝癌細胞又は大腸癌細胞であることを特徴とする請求項４に記載の抗癌補助剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記抗癌剤は、ドキソルビシン、エトポシド又はタキソールであることを特徴とする請求項４に記載の抗癌補助剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、
正常組織細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び、
前記正常組織細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性に比べて前記癌細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性が低い場合、前記癌細胞は抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性のモニターリング方法。
【請求項９】
前記癌細胞は、乳癌細胞、子宮頸部癌細胞、肝癌細胞又は大腸癌細胞であることを特徴とする請求項８に記載の抗癌剤感受性のモニターリング方法。
【請求項１０】
前記抗癌剤は、ドキソルビシン、エトポシド又はタキソールであることを特徴とする請求項８に記載の抗癌剤感受性のモニターリング方法。
【請求項１１】
受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子を増幅させるためのプライマー又は前記遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを含む抗癌剤感受性診断用キット。
【請求項１２】
癌患者試料において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現又は活性レベルを測定するステップ、
正常対照試料において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び、
前記正常対照試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルに比べて前記癌患者試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルが低い場合に前記癌患者試料は抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性の決定のための方法。
【請求項１３】
前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現又は活性レベルは、抗原−抗体反応を用いて測定することを特徴とする請求項１２に記載の抗癌剤感受性の決定のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)発現促進剤を有効成分として含む抗癌補助用組成物及び抗癌剤との併用投与方法に関する。また、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を促して抗癌剤感受性を増進させる抗癌補助剤のスクリーニング方法及び受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現有無を用いた抗癌剤感受性のモニターリング方法に関する。更に、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子又は前記遺伝子から発現されたタンパク質を含む抗癌剤感受性診断用バイオマーカ組成物及び抗癌剤感受性の予後の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
受容体共役タンパク質キナーゼ−３（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−３、ＲＩＰ３又はＲＩＰＫ３）は、細胞の死滅に重要なタンパク質であり、死滅受容体による細胞の死滅や他の細胞的なストレスによる細胞の死滅においてその役割を果たす。これらの細胞死滅の信号は、リン酸化や脱アセチル化に依存的なＲＩＰ１との複合体及び混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（Ｍｉｘｅｄｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＬＫＬ）との結合を介して行われ、ミトコンドリアに存在するタンパク質が関与することが知られている。このような信号伝達系の調節された機序が死滅調節タンパク質により行われて発生するだけではなく、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、及び腸内の上皮細胞の細胞死滅、免疫反応を調節する。調節された壊死（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）は、退行性、免疫性及び感染疾患や虚血性損傷など多くの病因論的な過程においてその役割を更に果たしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤を有効成分として含む抗癌補助用薬学組成物及びこれを抗癌剤と併用投与することを特徴とする癌細胞の死滅の増進方法を提供することにある。
【０００４】
本発明の目的は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を促して抗癌剤感受性を増進させる抗癌補助剤のスクリーニング方法及び受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現有無を通じた抗癌剤感受性のモニターリング方法を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子又は前記遺伝子から発現されたタンパク質を含む抗癌剤感受性診断用バイオマーカ組成物を提供することにある。
【０００６】
本発明の更に他の目的は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子を増幅させるためのプライマー又は前記遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを含む抗癌剤感受性診断用キット及び組織内の癌を予測して診断するキットを提供することにある。
【０００７】
本発明の更に他の目的は、癌患者試料から受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルを測定するステップを含む抗癌剤感受性の予後の診断及び抗癌剤の反応性に必要な情報を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現促進剤又は活性化剤を有効成分として含む抗癌補助用薬学組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現促進剤又は活性化剤、及び抗癌剤を癌細胞に併用投与することを特徴とする癌細胞の死滅の増進方法を提供する。
【００１０】
更に、本発明は、癌細胞に試験物質を接触させるステップ、前記試験物質を接触した癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び対照試料と比較して前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルが増加された試験物質を選別するステップを含む抗癌補助剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１１】
更にまた、本発明は、癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、 正常組織細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び前記正常組織細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性に比べて前記癌細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性が低い場合に抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性のモニターリング方法を提供する。
【００１２】
更にまた、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現促進剤又は活性化剤を癌細胞に処理するステップ、前記処理された癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び前記処理前の対照試料に比べて前記処理後の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性が５０乃至１００％増加した場合に抗癌剤感受性が増進されたと判断するステップを含む抗癌剤感受性の増進方法を提供する。
【００１３】
更にまた、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子又は前記遺伝子から発現されたタンパク質を含む抗癌剤感受性の診断用バイオマーカ組成物を提供する。前記バイオマーカは、組織内の癌を予測して診断してもよい。
【００１４】
更にまた、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子を増幅させるためのプライマー又は前記遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを含む抗癌剤感受性の診断用キットを提供する。なお、前記キットを用いて組織内の癌の予測診断に必要な情報を提供することができる。
【００１５】
更にまた、本発明は、癌患者試料から受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルを測定するステップ、正常対照試料において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルを測定するステップ、及び前記正常対照試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現レベルに比べて前記癌患者試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現レベルが低い場合に抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性の予後の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００１６】
発明の効果
本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)発現促進剤を有効成分として含む抗癌補助用組成物及び抗癌剤との併用投与方法に関するものであり、現在、癌治療に際して問題が提起されるトリプルネガティブ（ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２陰性）患者の場合、９０％において低い受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を確認することができるが、同じ患者の正常組織に比べて癌組織における顕著な受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現の低下は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が腫瘍の発生及び成長中に選択的に欠如されることを示唆するといえるため、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が欠如された患者の場合、脱メチル化剤を前処置して受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導した後、従来型の化学療法剤を用いることが効果的な治療戦略になり得るものと見込まれる。また、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を促して抗癌剤感受性を増進させる抗癌補助剤のスクリーニング方法及び受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現有無を通じた抗癌剤感受性のモニターリング方法に関するものであり、現在、癌の治療に際して問題が提起されるトリプルネガティブ（ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２陰性）患者の場合、９０％において低い受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を確認することができるが、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現の調節が癌細胞の抗癌剤抵抗性に影響を及ぼすことを確認することができ、特に、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑制される場合、癌細胞が抗癌剤に耐性を有して抗癌剤の活性が抑制されるのに対し、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現される場合、抗癌剤の濃度依存的に癌細胞の死滅が増加されることを確認した。これは、抗癌治療に当たって抗癌剤感受性をモニターリングし、抗癌剤感受性を増進させる抗癌補助剤をスクリーニングする上で効果的な戦略になるものと見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常乳房及び乳癌細胞株における受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現分析結果である。
【図２】脱メチル化剤である５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、５−ＡＤ）による受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現結果である。
【図３】脱メチル化剤である５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ、５−ＡＺＡ）による受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現結果である。
【図４】脱メチル化剤（５−ＡＤ）及び抗癌剤の併合処理による癌細胞株の死滅感作結果である。
【図５】脱メチル化剤（５−ＡＤ及び５−ＡＺＡ）及び抗癌剤の併合処理による癌細胞株の死滅の感作結果である。
【図６】受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現抑制による脱メチル化剤（５−ＡＤ）の癌細胞株の死滅感作効果の抑制結果である。
【図７】代表的な正常乳房組織及び乳癌組織の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の免疫染色写真である。
【図８】正常乳房組織及び乳癌組織の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の免疫染色に対する代表的なＨ-スコア図式結果である。
【図９】正常乳房組織及び乳癌組織の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の免疫染色に対する代表的なＨ-スコア図式結果である。
【図１０】受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑制された細胞における抗癌剤の濃度別の処理によるＨＴ−２９の生存率結果である。
【図１１】受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑制された細胞における抗癌剤の濃度別の処理によるＴ４７Ｄの生存率結果である。
【図１２】１，１６６名の乳癌患者の１０年間の転移再発のない生存率（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｌａｐｓｅ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
したがって、本発明者らは、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)に依存的な細胞の死滅が化学療法剤における細胞の毒性に効果を与えることを確認した。多くの癌細胞株において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑制されており、このような受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現の阻害が死滅受容体による細胞の死滅に対する抵抗性だけではなく、化学療法剤、特に、ＤＮＡ損傷薬物やタキサン（ｔａｘａｎｅｓ）などの様々な標準的な抗癌療法剤に対する抵抗性を与えることを確認することができた。本発明において用いた脱メチル化剤である５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、５−ＡＤ）による受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が戻り、化学療法剤に対する感受性が増加されたことを確認することができたが、このような結果は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が欠如された患者の場合、脱メチル化剤を前処置して受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導した後、従来型の化学療法剤を用いることが効果的な治療戦略になるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
また、本発明者らは、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現の調節が癌細胞株の抗癌剤に対する抵抗性に影響を及ぼすということを確認することができ、特に、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑制される場合、抗癌剤に対して癌細胞が耐性を有して抗癌剤の活性が抑制されるのに対し、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現される場合、抗癌剤の濃度依存的に癌細胞の死滅が増加されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤を有効成分として含む抗癌補助用薬学組成物を提供する。
【００２１】
詳しくは、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の遺伝子発現の調節部位に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体及び天然物であることが出来る。詳しくは、前記組成物は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の脱メチル化を誘導することができる。
【００２２】
好ましくは、前記癌は、乳癌、子宮頸部癌、肝癌又は大腸癌であることもできるが、これらに制限されるものではない。
【００２３】
好ましくは、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質は、ヒト、牛、ヤギ、羊、豚、マウス、ウサギなどの哺乳類を含む受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)を有するあらゆる真核生物由来のタンパク質であってもよく、例えば、ヒト受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿００６８６２．２）である場合もある。
【００２４】
本発明における用語「ペプチドミメティックス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)活性を誘導する受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の結合ドメインを抑制するペプチド又は非ペプチドである。
【００２５】
本発明における用語「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定的な３次構造を有し、且つ、標的分子に高い親和性及び特異性をもって結合可能な特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾核酸）である。アプタマーは、固有の高い親和性（普通、ｐＭレベル）及び特異性をもって標的分子に結合可能であるという特性のために単一抗体と比較され、特に、「化学抗体」といえるほど代替抗体としての高い可能性がある。
【００２６】
本発明の「抗体」は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の注入により調製されたもの又は市販されて購入したものが両方とも使用可能である。また、前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びエピトープと結合可能な断片などを含む。ポリクローナル抗体は、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)を動物に注射し、当該動物から採血して抗体を含む血清を得る従来の方法により産生可能である。このようなポリクローナル抗体は、当業界における周知のいかなる方法によっても精製可能であり、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌなどの任意の動物宿主から産生可能である。モノクローナル抗体は、連続細胞株の培養を用いた抗体分子の産生を提供するいかなる技術を使用しても製造可能である。このような技術としては、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞株ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる。
【００２７】
本発明の薬学組成物は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド及び天然物抽出物を有効成分として含むことができる。本発明の薬学組成物又は複合製剤は、有効成分以外に、薬剤学的に適しており、且つ、生理学的に許容される補助剤を用いて製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩解剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤又は香味剤などの可溶化剤が使用可能である。本発明の薬学組成物は、投与のために有効成分以外に更に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで医薬組成物に好適に製剤化可能である。液状溶液として製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。なお、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の薬剤製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁剤、乳剤、点滴剤又は注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などであってもよい。本発明の医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻腔内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内又は皮内経路を介して通常の方式により投与可能である。本発明の医薬組成物の有効成分の有効量とは、疾患の予防又は治療に求められる量のことをいう。このため、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有されている有効成分及び他の成分の種類及び含有量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節可能である。これに制限されるものではないが、例えば、成人の場合、１日につき１回乃至数回に亘って投与するとき、本発明の阻害剤は、１日につき１回乃至数回に亘って投与するとき、化合物である場合に０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、ポリペプチド、タンパク質又は抗体である場合に０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡである場合に０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの容量にて投与してもよい。
【００２９】
また、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤及び抗癌剤を癌細胞に併用投与することを特徴とする癌細胞の死滅の増進方法を提供する。
【００３０】
詳しくは、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤を癌細胞に処理するステップ、及び前記処理された癌細胞に抗癌剤を投与するステップを含むことができる。
【００３１】
好ましくは、前記癌細胞は、乳癌細胞、子宮頸部癌細胞、肝癌細胞又は大腸癌細胞であってもよく、前記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）又はエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）であってもよいが、これに制限されない。
【００３２】
本発明は、癌細胞に試験物質を接触させるステップ、前記試験物質を接触した癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ及び対照試料と比較して前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルが増加された試験物質を選別するステップを含む抗癌補助剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）よりなる群から選ばれたいずれか一種の方法により測定可能であるが、これに制限されない。
【００３４】
詳しくは、前記抗癌補助剤は、抗癌剤感受性を増進させることができる。より詳しくは、前記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）又はタキソール（ｔａｘｏｌ）であることが好ましいが、これに制限されない。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法を言及しながら用いる用語「試験物質」とは、遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否か、或いは、タンパク質の発現又は活性に影響を及ぼすか否かを検査するためにスクリーニングにおいて用いられる未知の候補物質のことをいう。前記試料は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス−ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ：ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）及び天然物抽出物を含むが、これに制限されない。
【００３６】
また、本発明は、癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、正常組織細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び前記正常組織細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性に比べて前記癌細胞において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性が低い場合に抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性のモニターリング方法を提供する。
【００３７】
好ましくは、前記癌細胞は、乳癌細胞、子宮頸部癌細胞、肝癌細胞又は大腸癌細胞である場合もあり、前記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）又はタキソール（ｔａｘｏｌ）であってもよいが、これに制限されない。
【００３８】
更に、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質発現促進剤又は活性化剤を癌細胞に処理するステップ、前記処理された癌細胞において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性レベルを測定するステップ、及び前記処理前の対照試料に比べて前記処理後の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現又は活性が５０乃至１００％増加された場合に抗癌剤感受性が増進されたと判断するステップを含む抗癌剤感受性の増進方法を提供する。
【００３９】
更にまた、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子又は前記遺伝子から発現されたタンパク質を含む抗癌剤感受性診断用バイオマーカ組成物を提供する。
本明細書における用語「診断」は、特定の疾病若しくは疾患に対するある対象体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、ある対象体が特定の疾病又は疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかった対象体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、又はセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために対象体の状態をモニターリングすること）を含む。
【００４０】
加えて、本発明は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子を増幅するためのプライマー又は前記遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを含む抗癌剤感受性診断用キットを提供する。
【００４１】
本明細書における用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸基（ｆｒｅｅ３’ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列をもって相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）及び塩基対を形成し、鋳型鎖の複製のための開始点として働く短い核酸配列のことをいう。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度において重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）及び異なる４種類のヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界における公知の技術により適切に選択可能である。
【００４２】
また、本発明のキットは、マーカ成分に特異的に結合する抗体、基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応すべき発色基質溶液、洗浄液及び酵素反応停止溶液などを含んでいてもよく、使用されるべき試薬成分を含む多数の別途のペッケージング又はコンパートメントにより製作可能である。
【００４３】
前記２次抗体接合体の標識体としては、発色反応をする通常の発色剤を用いることが好ましく、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイド状金（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ポリ−Ｌ−リジン−フロオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：ｐｏｌｙＬ−ｌｙｓｉｎｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミンＢイソチオシアン酸塩（ＲＩＴＣ：ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）などが使用可能である。
【００４４】
また、本発明は、癌患者試料において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルを測定するステップ、正常対照試料において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルを測定するステップ、及び前記正常対照試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現レベルに比べて前記癌患者試料において測定された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の発現レベルが低い場合に抗癌剤抵抗性があると判断するステップを含む抗癌剤感受性の予後の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００４５】
詳しくは、前記受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルは、抗原−抗体反応により測定可能であり、更に詳しくは、前記抗原−抗体反応は、従来、開発されてきた様々な定量的又は定性的な免疫分析プロトコールにより行われてもよい。前記免疫分析フォーマットは、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、酵素基質発色法及び抗原−抗体凝集法を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書における用語「患者試料」とは、抗癌剤感受性診断用バイオマーカである受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルにおいて正常対照と違いが出る組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髓液、又は尿などの試料を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の理解への一助となるために実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記の実施例に限定されることはない。本発明の実施例は、当業界における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００４８】
下記の実験例は、本発明によるそれぞれの実施例に共通的に適用される実験例を提供するためのものである。
【００４９】
１．試薬
受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)抗体は、Ａｂｃａｍ社から購入した。Ａｃｔｉｎ抗体、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５−ＡＤ、５−ＡＺＡは、シグマアルドリッチ社から入手した。
【００５０】
２．細胞培養
様々な癌細胞株は、ＡＴＣＣにおいて提示する培地において培養した。ＤＬＤ１、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７は、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭのグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養された。ＨＣＣ１９３７、ＢＴ−５４９、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、ＳＫ−ＢＲ３、ＺＲ７５−１、Ｔ４７Ｄは、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭのグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加されたロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）において培養された。
【００５１】
３．正常ヒト細胞
乳房上皮細胞（ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ＨＭＥ）は、クロネティクス社（サンディエゴ、ＣＡ）から得た。ＨＭＬＥは、正常乳房上皮細胞であるが、ｈＴＥＲＴにより不死化され、なお、ＳＶ４０ｌａｒｇｅ及びｓｍａｌｌ Ｔ抗原としてレトロウイルスにより感染された。
【００５２】
４．ヒト乳癌組織調製
ヒト乳癌及び比較正常サンプルは、延世大学の医科大学（ソウル、大韓民国）から得た。全てのケースにおいて、全ての参加者から同意書を受け、本研究は、延世大学の治験審査委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ）の承認を受けた。
【００５３】
５．レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ｓｈＲＮＡ実験
ｈＲＩＰ３ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００６８７１）のコーディング部位又は３’ＵＴＲを標的とするＭＩＳＳＩＯＮ短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）プラスミド及び非標的対照群配列（ＮＭ−０２７０８８）は、シグマアルドリッチ社から入手した。レンチウイルスプラスミドは、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン、１１６６８０１９）を用いて２９３Ｔ細胞（システムバイオサイエンス、ＬＶ９００Ａ−１）で形質感染させた。偽ウイルス粒子（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、レンチウイルスプラスミド形質感染２日後に収集され、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で癌細胞に感染させた。感染２日後に、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）で感染細胞は選別し、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）は、免疫ブロッティングで確認した。既存に内在性受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)を発現しなかった細胞は、今後４日間５−ＡＤを処理し、その後、免疫ブロッティングで分析した。
【００５４】
６．ウェスタンブロット分析（免疫ブロッティング）
細胞は、Ｍ２緩衝液で溶解された。同量の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを用いて分析して、増加された化学発光法（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＥＣＬ、アマシャム）により可視化させた。
【００５５】
７．細胞毒性の分析
細胞の死滅は、テトラゾリウム染料比色分析法（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｄｙｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｔｅｓｔ）［ＭＴＴ試験］を用いて測定し、５７０ｎｍにおいて測定した。
【００５６】
８．免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析
免疫組織化学分析は、製造社の指示に従い、ウルトラビジョンＬＰ検出システムＴＬ−０６０−ＨＤ（サーモサイエンティフィック、バイオアナリチカ社）を利用した。薄いパラフィン部分（４．５μｍ）はキシレンにより除去され、様々な濃度のエタノール水溶液において再び水和された。抗原の修復は、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において電子レンジを用いて１５分間スライドを加熱して行った。ＴＢＳに溶かした３％の過酸化水素に１０分間反応させることにより内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、１：３００にて希釈された抗受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)抗体を用いて４℃において一晩中反応させた。クロモゲンは、３，３’−ジアミノベンジジン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＬ−０１５−ＨＤ、サーモサイエンティフィック、バイオアナリチカ社、ギリシャ）溶液を用いて５分間反応させ、マイヤーヘマトキシリンを用いて対比染色を行った。免疫組織化学染色は、染色された細胞の割合及び免疫染色の強さに基づいて測定した。本発明は、Ｈスコアを用いるが、これは、染色された細胞の割合（％）及び染色の強さ［０（陰性）、１（弱い）、２（中間）又は３（強い）］を乗じて求めた。Ｈスコアは、０乃至３００の範囲を有する。腫瘍及び正常組織において各サンプル当たりに同じ時間をかけて染色を行った。染色結果は、臨床データについては知らない専門病理学者により解析された。
【００５７】
９．統計分析
データは、平均±Ｓ．Ｄにて示す。統計分析は、ＡＮＯＶＡ及び対応のないスチューデントのｔ検定を用いて行った。０．０１又はこれよりも低いＰ値の場合、統計学的な有意性があると判断された。統計学的な計算は、ＷｉｎｄｏｗｓＶｅｒｓｉｏｎ １２．０のＳＰＳＳソフトウェアを用いて行った（ＳＰＳＳ、シカゴ、イリノイ州）。
【００５８】
＜実施例１＞  乳癌細胞株における受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現分析
癌細胞株を溶解（ｌｙｓｉｓ）してタンパク質を分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。乳癌細胞株の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)発現パターンを分析したところ、６０％以上の細胞株において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現しないことを確認した。受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が癌細胞株においては特定の機構により抑えられていることを確認した（図１）。
【００５９】
＜実施例２＞  脱メチル化剤によるＲＩＰの発現分析
癌細胞株を１０〜２０％の密度にて培養した後、４日間２回に亘って５−ＡＤを処理した後、ウェスタンブロッティング技法を用いて受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現パターンを分析した。受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現されていない３種類の癌細胞株（ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＢＴ５４９）に脱メチル化剤（５−ＡＤ、２μＭ）を処理した場合、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が誘導されることを確認し、この結果は、癌細胞株においてはメチル化により受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑えられていることを意味する（図２）。
また、癌細胞株を１０〜２０％の密度にて培養した後、４日間２回に亘って５−ＡＺＡを処理した後、ウェスタンブロッティング技法を用いて受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現パターンを分析した。受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現されていないＤＬＤ−１大腸癌細胞株に５ＡＤと同じ系列の５−ＡＺＡを濃度別に処理した場合、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が誘導されることを確認し、この結果は、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)がメチル化により癌細胞株において発現が抑えられていることを反証するものである（図３）。
【００６０】
＜実施例３＞  脱メチル化剤及び抗癌剤の併合処理による癌細胞株の死滅感作
癌細胞株を１０〜２０％の密度にて初期培養した後、４日間２回に亘って５−ＡＤ又は５−ＡＺＡを処理して受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導した。薬物を処理しなかった同じＨｅＬａ癌細胞株と同じ数を培養した後、同じ濃度の抗癌剤を処理して脱メチル化剤による感作効果を分析した。
【００６１】
５−ＡＤによる受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導した後、抗癌剤と併合処理する場合、癌細胞株の死滅が感作される効果を確認することにより、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が抗癌剤による癌細胞株の死滅と関連していることを確認した（図４）。
【００６２】
また、５−ＡＤに加えて、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導する５−ＡＺＡの場合にも、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を誘導した後に抗癌剤と併合処理した場合に癌細胞株の感作効果を確認した（図５）。
【００６３】
＜実施例４＞  受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現抑制による脱メチル化剤の癌細胞株の死滅感作効果の抑制
【００６４】
レンチウイルスシステムを用いて、子宮頸部癌細胞株（ＨｅＬａ細胞株）において持続的に受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を抑える安定的な細胞を作成した。非標的とは反対に、ｓｈ受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)細胞株の場合、５−ＡＤを処理するにも拘わらず、ｓｈＲＮＡにより受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑えられる。このため、抗癌剤及び脱メチル化剤の併合処理による感作効果から受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の機能を確認することができた。非標的細胞株及びｓｈ受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)細胞株を１０〜２０％の密度にて初期培養した後、４日間２回に亘って５−ＡＤを処理して受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現有無を判別した。なお、同じ数を培養した抗癌剤との併合処理による感作効果に対して細胞死滅実験（ＭＴＴａｓｓａｙ）を用いて分析した（図６）。
【００６５】
脱メチル化剤（５−ＡＤ、５−ＡＺＡ）は、特定のタンパク質に特異的な薬物ではないため、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)に加えて、様々なタンパク質の発現を引き起こすことがある。このため、抗癌剤及び脱メチル化剤の併合処理による細胞死滅の感作効果が受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ではない他のタンパク質による効果であるか否かを判別するために、特異的に受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を抑えるｓｈ受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)細胞株を用いて実験を行った。非標的細胞株においては、５−ＡＤを処理する場合、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現により抗癌剤との併合処理に感作効果が発生するが、特異的に受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を抑えたｓｈ受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)細胞株においては、たとえ５−ＡＤを処理しても、ｓｈＲＮＡシステムにより受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現されない。このような結果に基づいて細胞死滅実験を行ったとき、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現されていないｓｈ受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)細胞株の場合、感作効果が抑えられる結果を通じて、脱メチル化剤及び抗癌剤との併合処理における感作効果は受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が重要な分子であることを確認することができ、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現を促すことにより、癌細胞株の死滅を増加させる新たな抗癌戦略を提示する。
【００６６】
＜実施例５＞  正常乳房組織及び乳癌組織の免疫染色分析
１３２名の乳癌患者から腫瘍組織及び非腫瘍組織を分離してパラフィンブロックを製作した。製作されたパラフィンブロックは、４．５μｍの厚さに薄切りした後に、スライドに塗抹させて用いた。キシレンによる脱パラフィン化及びエタノール−水の濃度別の水溶液への含水過程を経た後、過酸化水素を用いて非特異的な酵素反応を除去した後、クエン酸溶媒を用いて潜在抗原（ｌａｔｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）を解離する。次いで、希釈された正常血清を２０分間反応させて非特異的な反応を遮断した後、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)を（１：３００）にて２４時間かけて反応させる。水洗した後、ビオチン付き２次抗体を３０分間反応させた後に水洗する。アビジン−ビオチン複合体を用いて３０分間反応させた後に水洗過程を行い、ＤＡＢ発色剤を用いて５分間発色させた後にヘマトキシリンを用いて核を染色した後に水洗して封入する。
【００６７】
ＤＡＢにより発色された度合いの強さの基準を０（発色なし）、１（弱い発色）、２（中間）、３（強い発色）にし、染色された範囲及び強さを乗じた値をＨスコアにて示し、染色結果の分析は、病理課専門医が監修した。
【００６８】
実験結果は、代表的な正常乳房組織及び乳癌組織の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の免疫染色写真を示し、その結果をＨスコアにて図式化した（図７、図８及び図９）。正常乳房組織に比べて癌組織において受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が格段に劣ることを確認することができた。
【００６９】
＜実施例６＞  受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑えられた細胞における抗癌剤の濃度別の処理によるＨＴ−２９の生存率の分析
ＨＴ−２９細胞（アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション）は、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０ＩＵ／ｍｌ）及び１０％のＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地を用いて３７℃のインキュベーターにおいて培養した。本発明において用いたｓｈＲＮＡｉ二重螺旋は、シグマ−アルドリッチ社において商業的に合成された。本発明において用いられたｓｈＲＮＡは、ヒトＲＩＰＫ３ｍＲＮＡ配列のコーディング領域のターゲットのために考案された（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６８７１）。
【００７０】
まず、培養されたＨＴ−２９細胞を３５ｍｍ皿に２×１０５分注した。翌日に、プロトコールの指示に従い、前記細胞をポリブレン（１０μｇ／ｍｌ）とともにｓｈＲＮＡ粒子を用いて形質転換させた。対照群としては、特定のタンパクをターゲットとしないｓｈＲＮＡを用いた（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２７０８８）。
【００７１】
前記調製された形質転換細胞内において産生される受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質の量を測定するために、まず、ＰＢＳを用いて形質転換されたＨＴ−２９細胞を洗浄した後、溶解緩衝液を処理して上澄み液を得た後、ＢＩＯ−ＲＡＲＤ社製のウェスタンブロットキットを用いてタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、適正な抗体と反応をした後（抗−β−アクチン（１：５，０００、シグマ社製)、抗-受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)（１：１，０００、アブカム社製）及び２次ＨＲＰ-共役抗体（ジャクソン社製）ＨＲＰは、イモビロンウェスタン化学発光ＨＲＰ基質キット（サーモ社製）を用いて検出した。
【００７２】
その結果、図１０に示すように、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ｓｈＲＮＡにより形質転換されたＨＴ−２９細胞内の受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質がほとんど検出されないことが分かり、これを通じて、形質転換された受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ｓｈＲＮＡが受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子を効果的にノックダウンさせることを確認することができた。
【００７３】
本発明者らは、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子が抗癌剤感受性と関連しているか否かを確認するために、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ｓｈＲＮＡにより形質転換されたＨＴ−２９にドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）及びエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を濃度別に処理した後、前記癌細胞の細胞生存率を測定した。詳しくは、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ｓｈＲＮＡにより形質転換されたＨＴ−２９細胞は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）２．５μＭ、５μＭ及びエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）５０μＭ、１００μＭを処理した後に４８時間かけて培養し、テストは、０．１ｍｇのＭＴＴ（３−（［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ０］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を含む新鮮な培地に交換した後に更に２時間かけて培養する。生存細胞が溶解されたテトラゾリウム塩を紫色のホルマザン結晶に還元させて調製した沈殿物に対して色相分析を用いて行う。次いで、培地は除去し、生成されたホルマザン結晶は、５００μｌのＤＭＳＯで溶解してＥＬＩＳＡリーダー（５７０ｎｍにおける）を用いて吸光度を測定した。細胞の生存率は、１００％の生存率と定義された対照群による相対パーセントにて示す。
【００７４】
その結果、図１０（右側）に示すように、対照群は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）及びエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）の濃度に依存して細胞の生存率が減少されるのに対し、ｓｈＲＮＡを用いて受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)をノックダウンさせた実験群は、対照群に比べて細胞の生存率が増加したことを確認した。
【００７５】
＜実施例７＞  受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑えられた細胞における抗癌剤の濃度別の処理によるＴ４７Ｄの生存率の分析
受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が乳癌細胞にも影響を及ぼすか否かを確認するために、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現するＴ４７Ｄ細胞を用いた。まず、＜実施例６＞に記載の方法と同様にして受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)を形質転換させた。
【００７６】
ウェスタンブロッティング方法を用いて、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)ｓｈＲＮＡにより形質転換されたＴ４７Ｄにおいて受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)タンパク質がほとんど検出されないことが分かり、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)遺伝子は、効果的にノックダウンさせたことを確認することができた（図１１）。受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が乳癌細胞Ｔ４７Ｄにおいて抗癌剤感受性を増加させるか否かを確認するためにＭＴＴ分析を行った。対照群及び受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)がノックダウンされた実験群にドキソルビシン及びエトポシド、タキソールを図１１（右側）に示された濃度別に４８時間反応した。ＭＴＴ分析によれば、対照群においては、抗癌剤の濃度に応じて死滅したのに対し、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が形質転換された細胞株は、特に、エトポシドを処理した実験群において対照群に比べて抗癌剤抵抗性が格段に増加した。
【００７７】
これを通じて、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現の調節が抗癌剤癌細胞株に対する抵抗性に影響を及ぼすことを確認することができ、特に、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現が抑えられる場合、抗癌剤に対して癌細胞が耐性を有して抗癌剤の活性が抑えられるのに対し、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)が発現される場合、抗癌剤の濃度依存的に癌細胞の死滅が増加されることが分かる。
【００７８】
＜実施例８＞  乳癌患者の１０年間の転移再発のない生存率の分析
図１２は、１，１６６名の乳癌患者の１０年間の転移再発のない生存率のグラフを示す。受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の遺伝子の発現レベルを５０％以上及び５０％以下にして生存率を分析したところ、統計的にｐ＜０．００８５の有意味な差を示すことが分かり、受容体共役タンパク質キナーゼ−３(ＲＩＰ３)の発現レベルが患者の生存率に影響を及ぼすことを証明した。結果は、Ｊｅｚｅｑｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ ２０１２、１３１：７６５−７５）により考案されたＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ−ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｉｎｅｒ ｖ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【００７９】
以上、本発明の特定の部分について詳細に説明したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないということは明白である。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びこれらの等価物により定義されるものといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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