(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏｌｆｍｌ−３ポリペプチドに特異的に結合し、血管新生を阻害し、腫瘍増殖を抑制する、単離されたモノクローナル抗体であって、
（ｉ）（ａ）配列番号７と同一である第１のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号８と同一である第２のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号９と同一である第３のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号１０と同一である第１のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号１１と同一である第２のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号１２と同一である第３のＶＬ  ＣＤＲ、または
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１と同一である第１のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号２２と同一である第２のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号２３と同一である第３のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号２４と同一である第１のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号２５と同一である第２のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号２６と同一である第３のＶＬ  ＣＤＲ
を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
（ａ）配列番号７と同一である第１のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号８と同一である第２のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号９と同一である第３のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号１０と同一である第１のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号１１と同一である第２のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号１２と同一である第３のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
（ａ）配列番号２１と同一である第１のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号２２と同一である第２のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号２３と同一である第３のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号２４と同一である第１のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号２５と同一である第２のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号２６と同一である第３のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
（ｉ）請求項１（ｉ）または請求項２に記載の抗体であって、４６Ａ９ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１）と少なくとも９５％同一であるＶＨドメイン、及び４６Ａ９ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２）と少なくとも９５％同一であるＶＬドメインを含む抗体、または
（ｉｉ）請求項１（ｉｉ）または請求項３に記載の抗体であって、９Ｆ８ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１９）と少なくとも９５％同一であるＶＨドメイン、及び９Ｆ８ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２０）と少なくとも９５％同一であるＶＬドメインを含む抗体
である、抗体。
【請求項５】
請求項４（ｉ）に記載の抗体であって、４６Ａ９ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１）と同一であるＶＨドメイン、及び４６Ａ９ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２）と同一であるＶＬドメインを含む抗体、または
請求項４（ｉｉ）に記載の抗体であって、９Ｆ８ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１９）と同一であるＶＨドメイン、及び９Ｆ８ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２０）と同一であるＶＬドメインを含む抗体
である、抗体。
【請求項６】
組換え体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ'）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト、ヒト化抗体、または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種と結合した、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体中に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
対象の癌を治療するのに使用するための、癌を治療するのに有効量である量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１４】
前記癌が、転移性腫瘍である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌  脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または皮膚癌である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８８８，７５９号、及び２０１４年６月３０日に出願された同第６２／０１８，９０６号の利益を主張し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
１１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定される）であり、２０１４年１０月８日に作成された「ＣＬＦＲ．Ｐ０４１０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子申請によって本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
１．技術分野
本発明は、概して、腫瘍学の分野に関する。より具体的には、Ｏｌｆｍｌ−３に対するモノクローナル抗体、及び血管形成関連状態の治療におけるそれらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連出願の記載
血管形成は、既存血管からの毛細管の出芽及び新脈管構造の形成の多段階細胞プロセスである。複雑なプロセスは、内皮接合部の分解、続いて内皮細胞の脱離、増殖、及び移動、ならびに後続の細胞間及び細胞マトリックス接触の再確立を伴う。そのため、内皮細胞自体または隣接する壁細胞に由来する様々な血管細胞接着分子及び成長因子の協調作用を要する。実際、血管形成は、血管形成促進及び抗血管形成因子により調節される厳密に調整されたプロセスである（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５）。
【０００５】
多くの研究が、過剰な血管形成が腫瘍成長、虚血性心血管病態、または慢性炎症性疾患を含む様々な疾患状態に顕著に影響を及ぼすことを示している（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２００３、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２００５、Ｇａｒｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｇａｒｄｎｅｒ，２００５）。
【０００６】
血管媒介病態から、腫瘍関連血管形成は最も広範囲にわたって研究されている。最初、腫瘍は、血管新生の不在下では２〜３ｍｍ３の大きさ以上に成長できないと仮定された（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１）。したがって、血管形成が腫瘍成長の必要条件であり、このプロセスを妨害することにより、腫瘍細胞のさらなる増殖を阻止することができる。さらに、血管形成の阻止は正常な組織を標的とし、腫瘍細胞に見られる変異誘発による療法を免れない。よって、抗血管形成療法は、腫瘍細胞に直接対処するいずれの他の治療よりも腫瘍成長を制御下におくことが良好に継続されると予想される。血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及び他の血管形成促進分子が血管形成に必須であるという事実にもかかわらず（Ｈａｎａｈａｎ，１９９７、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、腫瘍関連血管形成を支配する完全な分子及び血管メカニズムはほとんど理解されていない。
【０００７】
加えて、眼の血管漏出及び／または血管新生を併発する疾患が、先進国における視覚的病的状態及び盲目の大半を占める。網膜の血管新生は、糖尿病性網膜症などの虚血性網膜症において生じ、労働年齢の患者における失明の主な原因である（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。脈絡膜の血管新生は年齢関連性黄斑変性症の合併症として生じ、高齢患者における失明の主な原因である（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。高い失明率を減少させるための改善された治療が必要であり、それらの開発は、眼血管新生の分子病因学の理解を深めることにより促進される可能性が高い。
【０００８】
臨床試験では、結腸及び乳房の癌の状況における、ＶＥＧＦに対する抗体を用いた抗血管形成薬の有益な作用が、今までのところ達成されている。しかしながら、別の因子が関与し得る他の腫瘍ではあまり良好ではなかった。よって、血管形成に関与する他の分子が特定され、単独で、または成長因子と組み合わせて使用されるべきである。血管形成内皮細胞によって発現され、かつ／または分泌された新規血管分子を標的とすることは、さらなる手段に相当する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示のある特定の態様によると、血管形成においてＯｌｆｍｌ−３に結合し、Ｏｌｆｍｌ−３の活性を阻害するモノクローナル抗体またはその断片が提供される。よって、いくつかの実施形態では、Ｏｌｆｍｌ−３ポリペプチドに特異的に結合する、単離された、または組換えのモノクローナル抗体が提供される。ある特定の態様では、抗体は、Ｏｌｆｍｌ−３ポリペプチドの結合に関して、４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、またはＺ１４Ａ７モノクローナル抗体と競合する。好ましい抗体は、Ｏｌｆｍｌ−３ポリペプチドの結合に関して、４６Ａ９ＢＯモノクローナル抗体と競合する。ある特定の態様では、抗体は、４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、またはＺ１４Ａ７モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び／もしくは軽鎖可変領域の全て、またはその一部を含み得る。さらなる態様では、抗体は、本発明の実施形態のモノクローナル抗体の軽鎖可変鎖及び／もしくは重鎖可変鎖からの第１、第２、及び／または第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含み得る。
【００１０】
よって、ある特定の態様では、実施形態の単離されたまたは組換え抗体は、４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、またはＺ１４Ａ７重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域と少なくとも８０％、９０％、または９５％同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様では、抗体は、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ以上での１つまたは２つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を除き、４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、またはＺ１４Ａ７  ＣＤＲと同一のＣＤＲ領域を含む。例えば、抗体は、ＣＤＲ配列が４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、またはＺ１４Ａ７モノクローナル抗体のＣＤＲに対して、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及び／またはＶＬ  ＣＤＲ３において１つまたは２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲを含み得る。よって、いくつかの特定の態様では、実施形態の抗体は、（ａ）４６Ａ９ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号７）またはＺ１４Ａ７のＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号１３）と少なくとも８０％同一の第１のＶＨ  ＣＤＲ、（ｂ）４６Ａ９ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号８）またはＺ１４Ａ７のＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号１４）と少なくとも８０％同一の第２のＶＨ  ＣＤＲ、（ｃ）４６Ａ９ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号９）またはＺ１４Ａ７のＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号１５）と少なくとも８０％同一の第３のＶＨ  ＣＤＲ、（ｄ）４６Ａ９ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号１０）またはＺ１４Ａ７のＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号１６）と少なくとも８０％同一の第１のＶＬ  ＣＤＲ、（ｅ）４６Ａ９ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号１１）またはＺ１４Ａ７のＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号１７）と少なくとも８０％同一の第２のＶＬ  ＣＤＲ、及び（ｆ）４６Ａ９ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号１２）またはＺ１４Ａ７のＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号１８）と少なくとも８０％同一の第３のＶＬ  ＣＤＲを含む。さらなる態様では、実施形態の抗体は、（ａ）９Ｆ８ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号２１）と少なくとも８０％同一の第１のＶＨ  ＣＤＲ、（ｂ）９Ｆ８ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号２２）と少なくとも８０％同一の第２のＶＨ  ＣＤＲ、（ｃ）９Ｆ８ＢＯのＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号２３）と少なくとも８０％同一の第３のＶＨ  ＣＤＲ、（ｄ）９Ｆ８ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号２４）と少なくとも８０％同一の第１のＶＬ  ＣＤＲ、（ｅ）９Ｆ８ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号２５と少なくとも８０％同一の第２のＶＬ  ＣＤＲ、及び（ｆ）９Ｆ８ＢＯのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号２６）と少なくとも８０％同一の第３のＶＬ  ＣＤＲを含む。
【００１１】
さらなる態様では、単離されたまたは組換え抗体は、それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２によって表されるモノクローナル抗体４６Ａ９ＢＯの対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。一態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体４６Ａ９ＢＯのＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様では、抗体はＩｇＧ２ｂ抗体である。
【００１２】
別の態様では、単離された抗体は、４６Ａ９ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＨドメイン、及び４６Ａ９ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＬドメインを含む。さらなる態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体４６Ａ９ＢＯのものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含む。
【００１３】
またさらなる態様では、単離されたまたは組換え抗体は、それぞれ、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、及び２６によって表されるモノクローナル抗体９Ｆ８ＢＯの対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。一態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体９Ｆ８ＢＯのＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様では、抗体はＩｇＧ２ｂ抗体である。
【００１４】
さらに別の態様では、単離された抗体は、９Ｆ８ＢＯのＶＨドメイン（配列番号１９）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＨドメイン、及び９Ｆ８ＢＯのＶＬドメイン（配列番号２０）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＬドメインを含む。さらなる態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体９Ｆ８ＢＯのものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含む。
【００１５】
またさらなる態様では、単離されたまたは組換え抗体は、それぞれ、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８によって表されるモノクローナル抗体Ｚ１４Ａ７の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。一態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体Ｚ１４Ａ７のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様では、抗体はＩｇＧ２ｃ抗体である。
【００１６】
別の態様では、単離された抗体は、Ｚ１４Ａ７のＶＨドメイン（配列番号３）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＨドメイン、及びＺ１４Ａ７のＶＬドメイン（配列番号４）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％同一のＶＬドメインを含む。いくつかの態様では、単離された抗体は、モノクローナル抗体Ｚ１４Ａ７のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含む。
【００１７】
いくつかの態様では、実施形態の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片であってよい。さらなる態様では、抗体は、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２  Ｆ（ａｂ′）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体であってよい。いくつかの場合では、抗体は、ヒト、ヒト化、または脱免疫化抗体であってよい。さらなる態様では、単離された抗体は、Ｚ１４Ａ７、９Ｆ８ＢＯ、または４６Ａ９ＢＯ抗体である。
【００１８】
ある特定の態様では、実施形態の抗体（またはその断片）は、グリコシル化抗体（例えば、哺乳類のグリコシル化パターンを有する）である。いくつかの態様では、抗体は、脱グリコシル化抗体（例えば、酵素的に処理された抗体、または細菌において生成された抗体）であるか、または非哺乳類のグリコシル化（例えば、酵母または昆虫細胞において生成された抗体）を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。
【００２０】
さらなる実施形態では、実施形態のモノクローナル抗体または組換えポリペプチドを生成する宿主細胞が提供される。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳類細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫細胞、または昆虫細胞である。ある特定の態様では、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
【００２１】
またさらなる実施形態では、細胞において本明細書に開示される抗体のＶＬまたはＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を発現し、細胞から抗体を精製することを含む、本発明の実施形態の抗体を製造する方法が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態では、本明細書に論じられる抗体または抗体断片を含む薬学的組成物が提供される。そのような組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み、追加の活性成分を含んでも、含まなくてもよい。
【００２３】
よって、いくつかの態様では（例えば、医療または臨床用途に関して）、抗体または断片は、Ｏｌｆｍｌ−３発現細胞を標的とする薬剤に結合され得る。薬剤は、細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管形成剤、化学療法剤、診断剤、造影剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、酵素、ホルモン、成長因子、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモン拮抗薬、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微小粒子、磁気ビーズ、マイクロデバイス、細胞、核酸、または発現ベクターであってよい。
【００２４】
薬学的に許容される担体において上述される抗体または断片のうちの１つ以上を含む薬学的組成物、例えば、抗体または断片及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供され得る。
【００２５】
上述の本発明のＯｌｆｍｌ−３抗体もしくは断片または組成物は、血管形成が役割を果たす、一般に血管形成関連状態と称されるあらゆる疾患または障害の治療に使用され得ることが想定される。本発明は、ヒトまたは動物におけるあらゆるそのような障害において適用性を見出すことが想定される。例示的な血管形成関連状態は、癌、眼血管新生、動静脈奇形、冠状動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチ、虚血性心血管病態、慢性炎症性疾患などを含む。
【００２６】
癌の場合では、例示的な血管形成癌は、血管形成乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病を含む。眼血管新生障害は、黄斑変性症（例えば、年齢関連性黄斑変性症（ＡＭＤ）、角膜移植片拒絶反応、角膜血管新生、早産児の網膜症（ＲＯＰ）、及び糖尿病性網膜症を含む。
【００２７】
ある特定の実施形態は、Ｏｌｆｍｌ−３に特異的に結合する単離された及び／または組換え抗体もしくはポリペプチドを含む抗体または組換えポリペプチド組成物を対象とする。ある特定の態様では、抗体またはポリペプチドは、本明細書に提供されるいずれのモノクローナル抗体の全てまたは一部と８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、少なくとも、または最大で８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一（またはその中で導き出せる任意の範囲）である配列を有する。またさらなる態様では、単離された及び／もしくは組換え抗体またはポリペプチドは、本明細書に提供される配列のいずれか（例えば、配列番号１、２、３、４、１９、または２０）、またはそのようは配列の組み合わせからの１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の隣接しているアミノ酸を有する、少なくとも、または最大で１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の隣接しているアミノ酸を有する。
【００２８】
またさらなる態様では、実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかの１つ以上のアミノ酸セグメントを含む。例えば、抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、その間の全ての値及び範囲を含む、長さが約、少なくとも、または最大で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個のアミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸セグメントを含み得る。ある特定の態様では、アミノセグメント（複数可）は、表１に提供されるＯｌｆｍｌ−３結合抗体のアミノ酸配列のうちの１つ（例えば、配列番号１、２、３、４、１９、または２０）から選択される。
【００２９】
またさらなる態様では、実施形態の抗体またはポリペプチドは、Ｏｌｆｍｌ−３結合抗体のＶ、ＶＪ、ＶＤＪ、Ｄ、ＤＪ、Ｊ、またはＣＤＲドメイン（表１に提供される）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である（またはその中で導き出せる任意の範囲）アミノ酸セグメントを含む。例えば、ポリペプチドは、表１に提供されるＣＤＲ１、２、及び／または３  Ｏｌｆｍｌ−３結合抗体と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である（またはその中で導き出せる任意の範囲）１つ、２つ、または３つのアミノ酸セグメントを含み得る。
【００３０】
本明細書で使用される、「一つの(ａ)」または「一つの(ａｎ)」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用されるように、請求項（複数可）において、用語「一つの(ａ)」または「一つの(ａｎ)」は、用語「含む」と共に使用される場合、１つまたは２つ以上を意味し得る。
【００３１】
請求項における用語「または」の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「及び／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される、「別の」は、少なくとも２つ目以降を意味し得る。
【００３２】
本願を通して、用語「約」は、値が、デバイスの誤差の固有の変化、値を決定するために採用された方法、または研究対象内に存在する変化を含むことを示すために使用される。
【００３３】
[本発明1001]
（ａ）46Ａ9ＢＯ（配列番号7）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号21）、またはＺ14Ａ7（配列番号13）のＶＨ  ＣＤＲ1と少なくとも80％同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）46Ａ9ＢＯ（配列番号8）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号22）、またはＺ14Ａ7（配列番号14）のＶＨ  ＣＤＲ2と少なくとも80％同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）46Ａ9ＢＯ（配列番号9）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号23）、またはＺ14Ａ7（配列番号15）のＶＨ  ＣＤＲ3と少なくとも80％同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）46Ａ9ＢＯ（配列番号10）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号24）、またはＺ14Ａ7（配列番号16）のＶＬ  ＣＤＲ1と少なくとも80％同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）46Ａ9ＢＯ（配列番号11）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号25）、またはＺ14Ａ7（配列番号17）のＶＬ  ＣＤＲ2と少なくとも80％同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）46Ａ9ＢＯ（配列番号12）、9Ｆ8ＢＯ（配列番号26）、またはＺ14Ａ7（配列番号18）のＶＬ  ＣＤＲ3と少なくとも80％同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、単離されたモノクローナル抗体。
[本発明1002]
（ａ）配列番号7と少なくとも80％同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号8と少なくとも80％同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号9と少なくとも80％同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号10と少なくとも80％同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号11と少なくとも80％同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号12と少なくとも80％同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1003]
（ａ）配列番号7と同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号8と同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号9と同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号10と同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号11と同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号12と同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1004]
（ａ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号21）のＶＨ  ＣＤＲ1と少なくとも80％同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号22）のＶＨ  ＣＤＲ2と少なくとも80％同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号23）のＶＨ  ＣＤＲ3と少なくとも80％同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号24）のＶＬ  ＣＤＲ1と少なくとも80％同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号25）のＶＬ  ＣＤＲ2と少なくとも80％同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）9Ｆ8ＢＯ（配列番号26）のＶＬ  ＣＤＲ3と少なくとも80％同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
（ａ）配列番号21と同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号22と同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号23と同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号24と同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号25と同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号26と同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1004の単離された抗体。
[本発明1006]
（ａ）配列番号13と少なくとも80％同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号14と少なくとも80％同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号15と少なくとも80％同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号16と少なくとも80％同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号17と少なくとも80％同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号18と少なくとも80％同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1007]
（ａ）配列番号13と同一である第1のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号14と同一である第2のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号15と同一である第3のＶＨ  ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号16と同一である第1のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号17と同一である第2のＶＬ  ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号18と同一である第3のＶＬ  ＣＤＲと
を含む、本発明1006の単離された抗体。
[本発明1008]
（ｉ）46Ａ9ＢＯのＶＨドメイン（配列番号1）と少なくとも約80％同一であるＶＨドメイン、及び46Ａ9ＢＯのＶＬドメイン（配列番号2）と少なくとも約80％同一であるＶＬドメイン、
（ｉ）9Ｆ8ＢＯのＶＨドメイン（配列番号19）と少なくとも約80％同一であるＶＨドメイン、及び9Ｆ8ＢＯのＶＬドメイン（配列番号20）と少なくとも約80％同一であるＶＬドメイン、または
（ｉｉｉ）Ｚ14Ａ7のＶＨドメイン（配列番号3）と少なくとも約80％同一であるＶＨドメイン、及びＺ14Ａ7のＶＬドメイン（配列番号4）と少なくとも約80％同一であるＶＬドメイン
を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1009]
46Ａ9ＢＯのＶＨドメイン（配列番号1）と同一であるＶＨドメイン、及び46Ａ9ＢＯのＶＬドメイン（配列番号2）と同一であるＶＬドメインを含む、本発明1008の抗体。
[本発明1010]
9Ｆ8ＢＯのＶＨドメイン（配列番号19）と同一であるＶＨドメイン、及び9Ｆ8ＢＯのＶＬドメイン（配列番号20）と同一であるＶＬドメインを含む、本発明1008の抗体。
[本発明1011]
Ｚ14Ａ7のＶＨドメイン（配列番号3）と同一であるＶＨドメイン、及びＺ14Ａ7のＶＬドメイン（配列番号4）と同一であるＶＬドメインを含む、本発明1008の抗体。
[本発明1012]
46Ａ9ＢＯ、9Ｆ8ＢＯ、またはＺ14Ａ7抗体である、本発明1008の抗体。
[本発明1013]
組換え体である、本発明1001〜1012のいずれかの抗体。
[本発明1014]
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片である、本発明1001〜1007のいずれかの抗体。
[本発明1015]
Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆ（ａｂ'）3、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、本発明1001〜1007のいずれかの抗体。
[本発明1016]
ヒト、ヒト化抗体、または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体である、本発明1001〜1012のいずれかの抗体。
[本発明1017]
造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種と結合した、本発明1001〜1012のいずれかの抗体。
[本発明1018]
薬学的に許容される担体中に本発明1001〜1017のいずれかの抗体を含む、組成物。
[本発明1019]
本発明1001〜1016のいずれかの抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
[本発明1020]
46Ａ9ＢＯのＶＨドメイン（配列番号7、8、及び9）のＣＤＲ1〜3、9Ｆ8ＢＯのＶＨドメイン（配列番号21、22、及び23）のＣＤＲ1〜3、またはＺ14Ａ7のＶＨドメイン（配列番号13、14及び15）のＣＤＲ1〜3を含む抗体ＶＨドメインを含む、組換えポリペプチド。
[本発明1021]
46Ａ9ＢＯのＶＬドメイン（配列番号10、11、及び12）のＣＤＲ1〜3、9Ｆ8ＢＯのＶＬドメイン（配列番号24、25、及び26）のＣＤＲ1〜3、またはＺ14Ａ7のＶＬドメイン（配列番号16、5、及び6）のＣＤＲ1〜3を含む抗体ＶＬドメインを含む、組換えポリペプチド。
[本発明1022]
本発明1020または1021のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
[本発明1023]
本発明1001〜1012のいずれかの抗体、または本発明1020もしくは1021の組換えポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、宿主細胞。
[本発明1024]
哺乳類細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫細胞、または昆虫細胞である、本発明1023の宿主細胞。
[本発明1025]
（ａ）細胞において、本発明1001〜1012のいずれかの抗体のＶＬ及びＶＨ鎖をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を発現させる段階と、
（ｂ）前記細胞から前記抗体を精製する段階と
を含む、抗体の製造方法。
[本発明1026]
血管形成関連状態を治療するのに有効である量の本発明1001〜1017のいずれかの抗体を、対象に投与する段階
を含む、対象の血管形成関連状態の治療方法。
[本発明1027]
前記血管形成関連状態が、癌を含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記癌が、固形腫瘍、転移性腫瘍、または非転移性腫瘍である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌  脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または皮膚癌である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記抗体が、全身投与される、本発明1026の方法。
[本発明1031]
前記抗体が、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与される、本発明1026の方法。
[本発明1032]
前記対象に少なくとも第2の抗癌療法を施す段階をさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1033]
前記第2の抗癌療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記血管形成関連状態が、眼血管新生、動静脈奇形、冠状動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチ、膵炎、腸疾患、虚血性心血管病態、または慢性炎症性疾患である、本発明1026の方法。
[本発明1035]
前記対象が、ヒト対象である、本発明1026の方法。
[本発明1036]
対象の血管形成関連状態を治療するのに使用するための、本発明1001〜1017のいずれかの抗体を含む、組成物。
[本発明1037]
前記血管形成関連状態が、癌を含む、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
前記癌が、固形腫瘍、転移性腫瘍、または非転移性腫瘍である、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌  脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または皮膚癌である、本発明1037の組成物。
[本発明1040]
前記組成物が、全身投与用である、本発明1036の組成物。
[本発明1041]
前記組成物が、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与されるように製剤化される、本発明1036の組成物。
[本発明1042]
少なくとも第2の抗癌剤をさらに含む、本発明1036の組成物。
[本発明1043]
前記血管形成関連状態が、眼血管新生、動静脈奇形、冠状動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチ、膵炎、腸疾患、虚血性心血管病態、または慢性炎症性疾患である、本発明1036の組成物。
[本発明1044]
前記対象が、ヒト対象である、本発明1036の組成物。
[本発明1045]
血管形成関連状態を治療するための薬剤の製造における、本発明1001〜1017のいずれかの抗体の使用。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかとなろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正がこの発明を実施するための形態から当業者に明らかであるため、単に図示の目的のためであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによりさらに良く理解され得る。
【００３５】
【図１】腫瘍成長に対する、ヒトＯｌｆｍｌ３に対するラットモノクローナル抗体の阻害作用。図１Ａ：ラットＩｇＧ２Ｂ（アイソタイプ対照）、９Ｆ８ＢＯ（抗Ｏｌｆｍｌ−３Ｂ）、または４６Ａ９ＢＯ（抗Ｏｌｆｍｌ−３Ｂ）抗体で処置されたマウスの９日目のＬＬＣ１腫瘍。バーは、１ｃｍに相当する。図１Ｂ：対照ＩｇＧ２Ｂ処置腫瘍と比較した、９Ｆ８ＢＯ（抗Ｏｌｆｍｌ−３Ｂ）及び４６Ａ９ＢＯ（抗Ｏｌｆｍｌ−３Ｂ）抗体で処置されたマウスの減少した腫瘍重量。誤差バーは、ＳＥＭ（１実験；５匹のマウス／群；２腫瘍／マウス）。＊Ｐ＜０．０５。
【図２】グラフは、腫瘍成長に対する、ヒトＯｌｆｍｌ３に対する４６Ａ９モノクローナル抗体の阻害作用を評価するためのさらなる試験の結果を示す。マウスにＬＬＣ１細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種し、続いて、接種５、７、及び９日後に対照ラットＩｇＧまたは３０、１５０、もしくは７５０μｇの４６Ａ９を注射した。１１日目に動物を屠殺した。研究の全過程にわたって腫瘍量を測定し、結果をグラフにする。
【図３】グラフは、腫瘍成長に対する、ヒトＯｌｆｍｌ３に対する９Ｆ８（ｍＡｂ  １）及び４６Ａ９（ｍＡｂ  ２）モノクローナル抗体の阻害作用を評価するためのさらなる試験の結果を示す。マウスにＬＬＣ１細胞を皮下接種し、続いて、接種５、７、及び９日後に対照ラットＩｇＧ、９Ｆ８、または４６Ａ９抗体（マウス当たり１５０μｇの用量）を注射した。１１日目に動物を屠殺した。研究の全過程にわたって腫瘍量を測定し、結果をグラフにした。誤差バーに、以下のように印を付ける：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図４Ａ】グラフは、９Ｆ８（ｍＡｂ  １）もしくは４６Ａ９（ｍＡｂ  ２）モノクローナル抗体、または対照（１１Ｇ８）抗体に曝露された腫瘍組織の免疫蛍光試験の結果を示す。腫瘍組織切片をＤＡＰＩで染色し、免疫蛍光により標識して、血管新生のマーカーとしてＰＥＣＡＭ−１を検出した。ＰＥＣＡＭ−１陽性組織面積の比率を定量化し（対照処置された試料において検出された面積のパーセント）、結果をグラフにした。
【図４Ｂ】処置された腫瘍組織における周皮細胞被覆の量を決定するために、さらなる免疫蛍光試験が使用された。再度、９Ｆ８（ｍＡｂ  １）もしくは４６Ａ９（ｍＡｂ  ２）モノクローナル抗体、または対照（１１Ｇ８）抗体に曝露された組織を切開した。腫瘍組織切片をＤＡＰＩで染色し、組織における周皮細胞被覆を決定するために、免疫蛍光により標識して、ＰＥＣＡＭ−１及びα−ＳＭＡを検出した。α−ＳＭＡ＋面積及びα−ＳＭＡ＋周皮細胞被覆の比率を定量化し、グラフにした。
【図５】グラフは、４６Ａ９ＢＯ抗体が組換え可溶性Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質に結合するＥＬＩＳＡ試験を示す。試験は、グリコシル化及び脱グリコシル化４６Ａ９ＢＯ抗体の両方で行われ、結果は、抗原認識が抗体グリコシル化とほとんど無関係であったことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例示的な実施形態の説明
本発明の実施形態は、一部、血管形成調節因子としてのＯｌｆｍｌ−３の役割に基づく。本発明の実施形態の態様は、Ｏｌｆｍｌ−３媒介血管形成に関連する疾患もしくは障害を阻止または治療するために使用することができる。Ｏｌｆｍｌ−３の機能は、モノクローナル抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体により減少させることができる。ある特定の態様では、本発明の実施形態は、癌などの血管形成関連疾患を治療するための、Ｏｌｆｍｌ−３に特異的なモノクローナル抗体の組成物、及びその送達方法を提供する。本発明のさらなる実施形態及び利点は、以下に説明される。
【００３７】
Ｉ．Ｏｌｆｍｌ−３
オルファクトメジン様タンパク質３（Ｏｌｆｍｌ−３）は、ヒトにおいて、ＯＬＦＭＬ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。以前に、発明者は、差次的に発現され、血管形成に関連する新規分子を特定するために、ｔ．Ｅｎｄ．１Ｖ高血管形成及びｔ．Ｅｎｄ．１Ｖ低休止細胞系を使用した。特定された血管形成関連遺伝子の中で、マウスＯｌｆｍｌ−３遺伝子（オルファクトメジン様３）（同義語：ｍＯＮＴ３、ＨＮＯＥＬ−イソ、ｈＯＬＦ４４）を特定した。
【００３８】
一部のオルファクトメジンファミリーメンバーは、それらがティアリン（ｔｉａｒｉｎ）（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｐＤＰ４（Ｒｏｓｅｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、及びノエリン（ｎｏｅｌｉｎ）（Ｍｏｒｅｎｏ  ａｎｄ  Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ，２００５、Ｂａｒｅｍｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）などの調節的な役割を果たす発達プロセスと関連付けられる。機能獲得試験は、ツメガエル胚において過剰発現される場合、ティアリンに関して示されるように、Ｏｌｆｍｌ−３（ｍＯＮＴ３）が背側化作用を呈することを示し（Ｉｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ツメガエル外胚葉パターン形成におけるその活性を示唆する。近年、ツメガエルＯＮＴ１が、それがコーディンのＢ１ＴＰ媒介分解の分泌された足場として作用するコーディン／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）系を微調整するための主要分子であることが示された（Ｈａｒｌａｎｄ，２００８、Ｉｎｏｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｓａｋｕｒａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これは、Ｏｌｆｍｌ−３が異なる酵素及び基質の足場として作用することを示唆する（Ｔｏｍａｒｅｖ  ａｎｄ  Ｎａｋａｙａ，２００９）。疾患状態から発達事象までのこれら全てのデータは、オルファクトメジンドメイン含有タンパク質の機能を理解する重要性を強調する。
【００３９】
ヒトｈＯＬＦ４４遺伝子は、オルファクトメジン／ノエリン／ティアリンファミリーに属する分泌された糖タンパク質をコードすることが、系統発生分析によって特定された。ｍＯＮＴ２（オルファクトメジン様１）及びニワトリｃＯＮＴ１と共に、ヒトＯｌｆｍｌ−３遺伝子は、ｍＯＮＴ３、ｒＯＮＴ３、ｈＯＮＴ３、ｃＯＮＴ１、ｍＯＮＴ２、ｒＯＮＴ２、及びｈＯＮＴ２を含む、分泌分子の新規の未特定オルファクトメジン様（ＯＮＴ）サブファミリー（Ｉｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に属する。この分泌糖タンパク質は、Ｎ末端に推定シグナルペプチド、配列の中間にコイルドコイルドメイン、及びＣ末端にオルファクトメジン様（ＯＬＦ）ドメインを含む（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。この分子は、嗅覚神経細胞の周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成に関与し（Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｙｏｋｏｅ  ａｎｄ  Ａｎｈｏｌｔ，１９９３）、脊椎動物の神経発達において調節的な役割を有する（Ｂａｒｅｍｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００４０】
高レベルのヒトＯｌｆｍｌ−３（ｈＯＬＦ４４）ｍＲＮＡ発現が胎盤において見られたが、発現レベルは低いが肝臓及び心臓においても見られた（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。内因性ｈＯＬＦ４４は、ヒト妊娠末期胎盤の胎児側の栄養膜合胞体層細胞の周囲の細胞外空間において見られ、分子が分泌されたことを示唆する（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。タグ付けされた組換えｈＯＬＦ４４タンパク質は、ＣＯＳ−７細胞の核周辺領域、おそらく小胞体に富化され、古典的な分泌経路を取る可能性がある証拠を提供する（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの知見は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に関連する構成成分としてのヒトＯｌｆｍｌ−３の役割がマトリックス関連胎盤及び胚の発達または類似するプロセスに関与する可能性を示唆する（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００４１】
ヒトＯｌｆｍｌ−３のラット相同分子種（ラットＨＮＯＥＬ−イソ）遺伝子は、虹彩、強膜、網膜の線維柱帯、及び視覚神経において発現されることが分かった（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ヒトＯｌｆｍｌ−３（ｍＯＮＴ３）遺伝子のマウス対応物の発現は、胚形成中非常に早くに検出された：最初に、尿膜（ａｌａｎｔｏｉｓ）の近位領域、続いて、推定側方中胚葉板、次いで、胎生期Ｅ８．５のＣＮＳ及び心臓（Ｉｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｍＯＮＴ−３ノックアウトマウス（雄及び雌）は、生存可能であり、正常かつ繁殖性であることが分かり、ｍＯＮＴ３が正常な胚形成に不要であり、他のファミリーメンバーによって補われることを示唆する（Ｉｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。さらに、機能獲得試験は、ツメガエル胚において過剰発現される場合、ｍＯＮＴ３が背側化作用を呈することを示し（Ｉｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、胚パターン形成における役割を示唆する。
【００４２】
ＩＩ．治療用抗体
ある特定の実施形態では、Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質の少なくとも一部分に結合し、血管形成においてＯｌｆｍｌ−３活性を阻害する抗体またはその断片、及び疾患の治療におけるそれらの関連する使用が想定される。本明細書で使用される、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥなどの任意の免疫結合剤、ならびに抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを広く指すことが意図される。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択され得る。好ましくは、抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体はヒト化抗体である。既知の手段により、及び本明細書に記載されるように、Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質、そのそれぞれのエピトープのうちの１つ以上、または前述のいずれかの結合体に特異的であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（前述のいずれかの操作された形態を含む）は、そのような抗原もしくはエピトープが天然源から単離されるか、または天然化合物の合成誘導体もしくは変異体であるかにかかわらず、作製することができる。
【００４３】
一実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）に移植された非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。一実施形態では、非ヒトドナーはラットである。一実施形態では、抗原結合配列は、合成であり、例えば、変異誘発（例えば、ファージ提示スクリーニング等）によって得られる。一実施形態では、本発明のキメラ抗体は、マウスＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一実施形態では、マウス軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖に融合される。一実施形態では、マウス重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｃ領域に融合される。
【００４４】
本発明に好適な抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片、（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）、ここで、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、２つのドメインが会合して結合ドメインを形成することができるペプチドリンカーによって連結される、（ｖｉｉｉ）２重特異性単鎖Ｆｖダイマー（米国特許第５，０９１，５１３号を参照）、及び（ｉｘ）遺伝子融合によって構築されたダイアボディ、多価、もしくは多選択性断片（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る。ＣＨ３ドメインに接合されたｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００４５】
抗体様結合ペプチド摸倣物も実施形態に想定される。Ｌｉｕら（２００３）は、縮小された抗体として作用し、長い血清半減期ならびに合成方法があまり面倒でないというある特定の利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド摸倣物」（ＡＢｉＰ）を説明する。
【００４６】
動物は、Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質またはペプチドに特異的な抗体を生成するために、Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質またはペプチドなどの抗原を接種され得る。頻繁に、抗原は別の分子と結合（bind）または結合（conjugate）され、免疫応答を増強する。本明細書で使用される、結合体は、動物において免疫応答を誘発するために使用される抗原に結合される任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質性物質である。抗原接種に応答して動物において生成された抗体は、Ｂリンパ球を生成する様々な個々の抗体から作製された様々な異なる分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体は、抗体種の混合集団であり、その各々は、同一抗原上で異なるエピトープを認識することができる。動物においてポリクローナル抗体を生成するための適当な条件を与えると、動物の血清中の抗体の大半は、動物が免疫化された抗原性化合物上に集団エピトープを認識する。この特異性は、関心の抗原またはエピトープを認識するそれらの抗体のみを選択するように、親和性精製によってさらに増強される。
【００４７】
モノクローナル抗体は、全ての抗体生成細胞が単一のＢリンパ球細胞系に由来するため、全ての抗体分子が同じエピトープを認識する、単一種の抗体である。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するのと同じ系に沿って始まる。いくつかの実施形態では、マウス及びラットなどのゲッ齒類は、モノクローナル抗体を生成するのに使用される。いくつかの実施形態では、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞がモノクローナル抗体を生成するのに使用される。ラットの使用は周知であり、ある特定の利点を提供し得る。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は日常的に使用され、一般に、高率の安定した融合をもたらす。
【００４８】
ハイブリドーマ技術は、Ｏｌｆｍｌ−３抗原で以前に免疫化されたマウスの単一Ｂリンパ球と不死骨髄腫細胞（通常、マウスの骨髄腫）の融合を伴う。この技術は、同じ抗原またはエピトープ特異性を有する無制限量の構造的に同一の抗体（モノクローナル抗体）が生成され得るような、無数の世代に単一抗体生成細胞を伝播するための方法を提供する。
【００４９】
モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインと交換し、外来性抗体の可変領域を無傷のままにしておくための方法が開発された。別の方法としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックマウスにおいて、「完全ヒト」モノクローナル抗体が生成される。ゲッ齒類及びヒトアミノ酸配列の両方を有する抗体ドメインを組換えにより構築することにより、モノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト形態に変換するための方法も開発された。「ヒト化」モノクローナル抗体において、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク領域は、ヒトアミノ酸配列に由来する。ゲッ齒類の特性である抗体のアミノ酸配列を、ヒト抗体の対応する位置で見出されるアミノ酸配列と交換することにより、治療的使用中の有害な免疫反応の可能性が減少すると考えられる。抗体を生成するハイブリドーマまたは他の細胞は、ハイブリドーマによって生成された抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい遺伝的変異または他の変化を受けることもできる。
【００５０】
本来の抗体の抗原またはエピトープ特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子、すなわち、結合ドメインを有する分子を生成するために、モノクローナル及び他の抗体ならびに組換えＤＮＡ技術を使用して、操作された抗体を作製することが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる抗体のフレームワーク領域、定常領域、または定常領域とフレームワーク領域の遺伝子材料に導入することを伴い得る。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号及び同第６，８８１，５５７号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。
【００５１】
本明細書に記載される既知の手段により、Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質、そのそれぞれのエピトープのうちの１つ以上、または前述のいずれかの結合体に特異的であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（前述のいずれかの操作された形態を含む）は、そのような抗原もしくはエピトープが天然源から単離されるか、または天然化合物の合成誘導体もしくは変異体であるかにかかわらず、作製することができる。
【００５２】
抗体は、鳥類及び哺乳類を含むあらゆる動物源から生成され得る。好ましくは、抗体は、ヒツジ、マウス（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。加えて、新しい技術は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリからのヒト抗体の開発及びそのためのスクリーニングを可能にする。例えば、米国特許第６，９４６，５４６号に記載されるように（参照により本明細書に組み込まれる）、バクテリオファージ抗体発現技術により、特定の抗体を動物免疫化の不在下で生成させることができる。これらの技法は、Ｍａｒｋｓ（１９９２）、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｇｒａｍら（１９９２）、Ｂａｒｂａｓら（１９９４）、及びＳｃｈｉｅｒら（１９９６）にさらに記載されている。
【００５３】
様々な動物種においてポリクローナル抗体を生成するための、ならびにヒト化、キメラ、及び完全ヒトを含む様々な種類のモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野において周知であり、十分予想可能である。これらの抗体を生成するための方法も周知であり、予想可能である。例えば、以下の米国特許及び特許出願は、そのような方法の実施可能な説明を提供し、参照により本明細書に組み込まれる：米国特許出願第２００４／０１２６８２８号及び同第２００２／０１７２６７７号、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，１９６，２６５号、同第４，２７５，１４９号、同第４，２７７，４３７号、同第４，３６６，２４１号、同第４，４６９，７９７号、同第４，４７２，５０９号、同第４，６０６，８５５号、同第４，７０３，００３号、同第４，７４２，１５９号、同第４，７６７，７２０号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８６７，９７３号、同第４，９３８，９４８号、同第４，９４６，７７８号、同第５，０２１，２３６号、同第５，１６４，２９６号、同第５，１９６，０６６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，４２０，２５３号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７１，６９８号、同第５，６２７，０５２号、同第５，６５６，４３４号、同第５，７７０，３７６号、同第５，７８９，２０８号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８４４，０９１号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８６１，１５５号、同第５，８７１，９０７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，０５４，２９７号、同第６，１６５，４６４号、第６，３６５，１５７号、同第６，４０６，８６７号、同第６，７０９，６５９号、同第６，７０９，８７３号、同第６，７５３，４０７号、同第６，８１４，９６５号、同第６，８４９，２５９号、同第６，８６１，５７２号、同第６，８７５，４３４号、及び同第６，８９１，０２４号。本明細書及びその中に引用される全ての特許、特許出願公開、及び他の刊行物は、本願に参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
動物種、モノクローナル細胞系、または他の抗体の供給源にかかわらず、Ｏｌｆｍｌ−３に対する抗体がＯｌｆｍｌ−３の作用を中和または相殺する能力を有することが十分に予想される。ある特定の動物種は、抗体の「Ｆｃ」部分を通した補体系の活性によりアレルギー反応を引き起こす可能性が高い場合があるため、治療用抗体を生成するのにあまり好ましくない場合がある。しかしながら、全抗体は、「Ｆｃ」（補体結合）断片に、及び結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体断片に酵素により消化され得る。Ｆｃ部分の除去は、抗体断片が望ましくない免疫応答を誘発する可能性を減少させ、よって、Ｆｃを含まない抗体は、予防的または治療上の処置に優先的であり得る。上述のように、抗体は、他の種において生成された、または他の種からの配列を有する抗体を動物に投与することによる有害な免疫結果を減少または排除するために、キメラ、部分的、または完全にヒトであるようにも構築され得る。
【００５５】
置換型変異体は、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位で１つのアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを含み、他の機能または性質の損失を伴って、または伴わずにポリペプチドの１つ以上の性質を調節するように設計され得る。置換は、保存的であってよい、つまり、１つのアミノ酸が類似する形状及び電荷のうちの１つと交換される。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリン、アルギニンからリジン、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン、アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン、イソロイシンからロイシンまたはバリン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、リジンからアルギニン、メチオニンからロイシンまたはイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン、及びバリンからイソロイシンまたはロイシンの変化を含む。別の方法としては、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるような非保存的であってよい。非保存的変化は、典型的には、極性または帯電しているアミノ酸などの化学的に異なるものを有する残基が非極性または無電荷のアミノ酸を置換することを伴い、逆もまた同様である。
【００５６】
タンパク質は、組換えであるか、またはインビトロで合成され得る。別の方法としては、非組換えまたは組換えタンパク質は、細菌から単離され得る。そのような変異体を含む細菌が組成物及び方法に導入され得ることも想定される。したがって、タンパク質は単離される必要はない。
【００５７】
組成物中、１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの合計ポリペプチド、ペプチド、及び／またはタンパク質が存在することが想定される。よって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または最大約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌ以上（またはその中で導き出せる任意の範囲）であってよい。この約、少なくとも約、または最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％がＯｌｆｍｌ−３に結合する抗体であってよい。
【００５８】
抗体または好ましくは抗体の免疫部分は、他のタンパク質を有する融合タンパク質と化学的に結合されるか、またはそれとして発現され得る。本明細書の目的及び添付の請求項に関して、全てのそのような融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫部分の定義に含まれる。
【００５９】
実施形態は、少なくとも１つの薬剤に連結されて、抗体結合体またはペイロードを形成するＯｌｆｍｌ−３、ポリペプチド、及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子を提供する。診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分を連結または共有結合または複合するのが慣習である。そのような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であってよいが、これらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞毒性活性を有する分子を含む。抗体に結合されたエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、治療用酵素、抗生物質、放射標識されたヌクレオチドなどが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分として定義される。抗体に結合されるレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。
【００６０】
抗体をその結合部分に結合（attachment）または結合(conjugation)するためのいくつかの方法が当該技術分野において既知である。一部の結合方法は、例えば、抗体に結合されるそのようなジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、及び／またはテトラクロロ−３−６α−ジフェニルグリコリル−３の有機キレート剤を採用する金属キレート錯体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸などのカップリング剤の存在下で酵素と反応することもできる。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。
【００６１】
ＩＩＩ．疾患の治療
本発明の実施形態のある特定の態様は、Ｏｌｆｍｌ−３媒介血管形成に関連する疾患もしくは障害を阻止または治療するために使用することができる。Ｏｌｆｍｌ−３の機能は、血管形成を阻止するための任意の好適な物質によって減少させることができる。そのような例示的な物質は、モノクローナル抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体であり得る。
【００６２】
「治療」及び「治療する」は、疾患または健康に関連する状態の治療利益を得る目的のために、対象に治療剤を投与もしくは適用する、または対象に手順もしくは物理療法を行うことを指す。例えば、治療は、結腸直腸癌などの腫瘍の成長または浸潤を最小限に抑える目的のために、Ｏｌｆｍｌ−３の機能を阻害する治療有効量の抗体の投与を含み得る。
【００６３】
「対象」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００６４】
本明細書を通して使用される、用語「治療利益」または「治療的に有効」は、この状態の医学的治療に関して対象の健康を促進または増強するあらゆるものを指す。これは、疾患の兆候もしくは症状の頻度または重篤度の減少を含むが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の侵襲性の減少、癌の成長率の減少、または転移の阻止を伴い得る。癌の治療は、癌を有する対象の長期生存も指す場合がある。
【００６５】
本発明のある特定の態様は、Ｏｌｆｍｌ−３の増加した発現に関連する任意の状態または疾患を治療するために使用され得る。例えば、疾患は、血管形成関連状態または疾患であり得る。血管形成関連状態または疾患は、不均衡な血管形成プロセスの結果であり、過剰な量の新しい血管を生じさせる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、非病原性である血管形成、すなわち、対象における正常なプロセスから生じる血管形成を阻害するために使用され得る。非病原性血管形成の例としては、子宮内膜血管新生、及び脂肪組織またはコレステロールの生成に関与するプロセスが挙げられる。よって、本発明は、非病原性血管形成を阻害するため、例えば、体重を制御する、もしくは脂肪損失を促進するため、コレステロールレベルを減少させるため、または堕胎薬としての方法を提供する。
【００６７】
本発明の方法は、血管形成疾患、すなわち、病原性が、不適切なまたは未制御の血管形成に関連する疾患に関連する血管形成を、阻害することもできる。例えば、最も癌性の固形腫瘍は、腫瘍部位及びその周囲に血管形成を誘発することにより自身で十分な血液供給をもたらす。この腫瘍誘発血管形成は、多くの場合、腫瘍成長に必要であり、転移性細胞が血流に侵入することも可能にする。
【００６８】
他の血管形成疾患は、糖尿病性網膜症、年齢関連性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、乾癬、関節リウマチ、及び他の炎症性疾患を含む。これらの疾患は、血管新生の領域に新しく形成された血管による正常な組織の破壊を特徴とする。例えば、ＡＲＭＤにおいて、脈絡膜が浸潤され、毛管により破壊される。ＡＲＭＤにおける脈絡膜の血管形成による破壊は、最終的に、部分的または完全な盲目につながる。血管形成関連状態は、眼血管新生、動静脈奇形、冠状動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチ、虚血性心血管病態、または慢性炎症性疾患も含む。
【００６９】
治療または阻止される例示的な眼の血管形成疾患は、年齢関連性黄斑変性症、眼ヒストプラスマ症、病的近視、及び網膜色素線条症を含むがこれらに限定されない任意の原因による脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）も含む。これは、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、及び早産児の網膜症を含むがこれらに限定されない任意の原因の網膜血管新生にも当てはまる。これは、任意の原因の虹彩血管新生及び角膜血管新生にも当てはまる。
【００７０】
血管新生はまた、眼の創傷に関連する血管新生であってもよい。例えば、創傷は、角膜裂傷などの眼球に対する外傷性障害の結果であり得る。あるいは、創傷は、眼科手術の結果であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、網膜硝子体手術後の増殖性硝子体網膜症のリスクを阻止もしくは減少させる、角膜手術（角膜移植及びレーザー手術など）後の角膜混濁を阻止する、線維柱帯切除術の閉塞を阻止する、翼状片（ｐｔｅｒｙｇｉｉ）の再発を阻止または実質的に遅らせるために適用され得る。
【００７１】
血管新生は、対象の眼の上またはその内のいずれかに位置し得る。例えば、血管新生は、角膜血管新生（角膜上皮上または角膜の内皮表面上のいずれかに位置する）、虹彩血管新生、硝子体腔内の血管新生、網膜血管新生、または脈絡膜血管新生であってよい。血管新生はまた、結膜疾患に関連する血管新生であってもよい。
【００７２】
Ｏｌｆｍｌ−３に結合する抗体は、癌を治療するために投与され得る。癌は、固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌であり得る。ある特定の実施形態では、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮で生じ得る。
【００７３】
癌は、具体的には、以下の組織学的分類のものであり得るが、これらに限定されない：新生物（悪性）、癌、癌（未分化）、巨細胞癌及び紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮細胞癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、毛母癌（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、移行上皮癌、乳頭状移行細胞癌、腺癌、ガストリノーマ（悪性）、胆管細胞癌、肝細胞癌、肝細胞癌及び胆管細胞癌の複合、線維柱帯腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープにおける腺癌、腺癌（家族性ポリポーシス）、固形癌、カルチノイド腫瘍（悪性）、細気管支肺胞腺癌、乳頭状腺癌、嫌色素性癌、好酸性癌、好酸性腺癌、塩基好性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、乳頭状及び濾胞性腺癌、非被包性硬化性癌、副腎皮質細胞癌、類内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂性腺癌、耳垢腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭状嚢腺癌、乳頭状漿液嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、パジェット病（乳腺）、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、胸腺腫（悪性）、卵巣間質腫（悪性）、莢膜細胞腫（悪性）、顆粒膜細胞腫（悪性）、細胞腫（悪性）、セルトリ細胞腫、ライディッヒ細胞腫（悪性）、脂質細胞腫（悪性）、傍神経節腫（悪性）、乳房外傍神経節腫（悪性）、褐色細胞腫、血管球血管肉腫、悪性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、表在拡大型黒色腫、巨大色素性母斑における悪性黒色腫、類上皮細胞黒色腫、青色母斑（悪性）、肉腫、線維肉腫、線維性組織球腫（悪性）、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、間質性肉腫、混合腫瘍（悪性）、ミュラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、間葉腫（悪性）、ブレンナー腫瘍（悪性）、葉状腫瘍（悪性）、滑膜肉腫、中皮腫（悪性）、未分化胚細胞腫、胚性癌、奇形腫（悪性）、卵巣甲状腺腫（悪性）、絨毛癌、中腎腫（悪性）、血管肉腫、血管内皮腫（悪性）、カポジ肉腫、血管外皮腫（悪性）、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫（悪性）、間葉性軟骨肉腫、骨の巨細胞腫、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍（悪性）、エナメル芽細胞歯牙肉腫、エナメル上皮腫（悪性）、エナメル芽細胞線維肉腫、松果体腫（悪性）、脊索腫、膠腫（悪性）、上衣腫、星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、線維性星状細胞腫、星状芽細胞腫、膠芽腫、乏突起神経膠腫、乏突起膠芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅神経腫瘍、髄膜腫（悪性）、神経線維肉腫、神経鞘腫（悪性）、顆粒細胞腫（悪性）、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキン、側肉芽腫（ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ；ｐａｒａｇｒａｎｕｌｏｍａ）、悪性リンパ腫（小リンパ球性）、悪性リンパ腫（大細胞型、拡散）、悪性リンパ腫（濾胞性）、菌状息肉症、他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球増殖症、多発性骨髄腫、マスト細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞性白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、マスト細胞白血病、巨核芽球性白血病、骨髄肉腫、ならびに有毛細胞白血病。
【００７４】
ＩＶ．薬学的調製物
モノクローナル抗体を含む組成物の臨床適用が実施される場合、意図される適用に適切な薬学的組成物を調製することが一般的に有益である。これは、典型的には、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物を本質的に含まない薬学的組成物を調製することを伴う。錯体に安定性を付与し、標的細胞が取り込むことができる適切な緩衝剤を採用することもできる。
【００７５】
句「薬学的または薬理学的に許容される」は、必要に応じて、ヒトなどの動物に投与される場合、有害、アレルギー、または他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。阻害性核酸または追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（２００５）により例示されるように（参照により本明細書に組み込まれる）、本開示を考慮すれば、当業者には既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与に関して、ＦＤＡ生物学的基準室（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）によって要求される無菌性、発熱性、安全性全般、及び純度の基準を満たすべきであることを理解する。
【００７６】
本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」は、当業者に既知であろう任意の及び全ての溶媒、分散培地、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、風味剤、染料、そのような同様の材料、及びこれらの組み合わせを含む。薬学的に許容される担体は、特に、ヒトに投与するために製剤化されるが、ある特定の実施形態では、非ヒト動物に投与するために製剤化されるが、ヒトへの投与には認められないであろう（例えば、政府の規制により）薬学的に許容される担体を使用することが望ましい場合がある。任意の従来の担体が活性成分と不適合である限りを除き、治療用または薬学的組成物におけるその使用が想定される。
【００７７】
患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重篤度、治療される疾患の種類、以前のまたは同時治療介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの物理的及び生理学的要因により決定され得る。投与を担当する実施者が、いかなる場合においても、組成物中の活性成分（複数可）の濃度、及び個々の対象に適切な用量（複数可）を決定する。
【００７８】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または例えば、約２５％〜約６０％、及びその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。他の非限定的な例において、用量は、投与当たり約１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このそのような範囲は間の用量を含む）以上、及びその中で導き出せる任意の範囲も含み得る。本明細書に列記される数字から導き出せる範囲の非限定的な例において、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲が投与され得る。各用量は、１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００以上のμｌもしくはｍｌ、または前述の間にある任意の数字の体積であってよい。
【００７９】
治療用組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物中、及び油中で調製され得る。一般的な貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するために防腐剤を含む。
【００８０】
本発明の治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能な組成物の形態で有利に投与され、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固形形態も調製され得る。これらの調製物は乳化することもできる。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水の１ミリリットル当たり１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含み得る。他の薬学的に許容される担体は、水溶液、非毒性賦形剤を含み、塩、防腐剤、緩衝液などを含む。
【００８１】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、生理食塩水溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンゲルデキストロース等を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補充物を含む。防腐剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスを含む。様々な構成成分薬学的組成物（ｔｈｅ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータにより調節される。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳類の眼に適用するのに適している。例えば、製剤は、溶液、懸濁液、またはゲルであってよい。いくつかの実施形態では、組成物は、硝子体内インプラントなどの生分解性インプラント、または結膜の表面に対して設置するために設計された眼球インサートなどの眼球インサートを介して投与される。いくつかの実施形態では、治療剤は、医療用装置または埋込型装置をコーティングする。
【００８３】
好ましい態様では、本発明の製剤は、液滴の形態の水溶液で眼に適用される。これらの液滴は、単回投与アンプルから送達することができ、これは、好ましくは、無菌であってよく、よって、製剤の静菌性構成成分が不要である。別の方法としては、液滴は、多回投与ボトルから送達することができ、これは、好ましくは、送達されるときに製剤から防腐剤を抽出する装置を備えてよく、そのような装置は当該技術分野において既知である。
【００８４】
他の態様では、本発明の構成成分は、瞼の下に設置される溶解性インサートを形成する濃縮されたゲルまたは類似するビヒクルとして眼に送達され得る。
【００８５】
さらなる製剤は、経口投与に適している。経口製剤は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、そのような典型的な賦形剤を含む。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出性製剤、または粉末の形態を取る。
【００８６】
本発明の治療用組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本発明による治療用組成物の投与は、標的組織がその経路を介して得られる限り、任意の一般的な経路を介する。これは、経口、鼻、頬側、直腸、膣、または局所を含む。局所投与は、化学療法誘発脱毛症または他の皮膚過剰増殖障害を阻止するための皮膚癌の治療に特に有利であり得る。別の方法としては、投与は、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射であってよい。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝液、または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与されるだろう。肺または気道の状態の治療用に、エアロゾル送達が使用され得る。エアロゾルの体積は、約０．０１ｍｌ〜０．５ｍｌである。
【００８７】
治療用組成物の有効量は、意図される目標に基づき決定される。例えば、当業者は、対象の大きさ及び体重、血管新生または疾患浸透の程度、対象の年齢、健康状態、及び性別、投与経路、ならびに投与が局所または全身であるかなどの要因を考慮することにより、所与の対象に投与される本発明の抗体の有効量を容易に決定することができる。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象に使用するのに適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路及び治療レジメンに関連して上記に論じられる所望の応答をもたらすように計算された既定の量の治療用組成物を含む。治療及び単位用量の数の両方による、投与される量は、所望の保護または作用による。
【００８８】
治療用組成物の正確な量は、実施者の判断にもより、特に各個人による。用量に影響を及ぼす要因は、患者の身体的及び臨床状態、投与経路、治療の意図される目標（例えば、症状の軽減対治癒）、及び特定の治療物質の効力、安定性、及び毒性を含む。
【００８９】
Ｖ．組み合わせ治療
ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、第２のまたは追加の療法と併用して、血管形成におけるＯｌｆｍｌ−３の活性を阻害するために、それに対する抗体または抗体断片を伴う。そのような療法は、Ｏｌｆｍｌ−３の増加した発現または活性に関連する任意の疾患の治療に適用することができる。例えば、疾患は、血管形成関連疾患であり得る。
【００９０】
組み合わせ療法を含む方法及び組成物は、治療もしくは保護作用を増強し、かつ／または別の抗血管形成、抗癌、もしくは抗過剰増殖療法の治療作用を増加させる。治療的及び予防的方法ならびに組成物は、癌細胞の死滅及び／または細胞過剰増殖の阻害などの所望の作用を達成するのに有効な併用量で提供され得る。このプロセスは、細胞を抗体及び第２の療法の両方と接触させることを伴い得る。組織、腫瘍、または細胞は、薬剤（すなわち、抗体または抗癌剤）のうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物または薬理学的製剤と、または組織、腫瘍、及び／もしくは細胞を２つ以上の別個の組成物または製剤と接触させることにより接触され得、１つの組成物は、１）阻害抗体、２）抗癌剤、または３）阻害抗体及び抗癌剤の両方を提供する。また、そのような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科療法、または免疫療法と併用して使用され得ることが想定される。
【００９１】
用語「接触される」及び「曝露される」は、細胞に適用される場合、本明細書において、治療用抗体及び化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接並んで置かれるプロセスを説明するために使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、両薬剤は、細胞を死滅させるのに、または細胞が分裂するのを阻止するのに有効な併用量で細胞に送達される。
【００９２】
阻害抗体は、抗癌治療前、治療中、治療後、または治療に対して様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時、数分、数日から数週間の範囲の間隔であってよい。遺伝子発現の阻害が抗癌剤とは別に患者に提供される実施形態では、大幅な時間期間が、２つの化合物が患者に対して有利に併用作用をもたらすことができるように、各送達時の間で消滅しないことを一般的に確実にする。そのような場合において、互いに約１２〜２４または７２時間以内、より具体的には、互いに約６〜１２時間以内に抗体及び抗癌療法が患者に提供され得ることが想定される。いくつかの場合では、それぞれの投与間で数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する、治療の時間期間を大幅に延長することが望ましい場合がある。
【００９３】
ある特定の実施形態では、治療過程は、１〜９０日以上続く（このそのような範囲は介在する日を含む）。１つの薬剤が１日目から９０日目のいずれかの日に（このそのような範囲は介在する日を含む）またはこれらのいずれかの組み合わせで与えられ、別の薬剤が１日目から９０日目のいずれかの日に（このそのような範囲は介在する日を含む）またはこれらのいずれかの組み合わせで与えられることが想定される。１日以内（２４時間の間）に、１つまたは複数の薬剤の投与が患者に与えられ得る。さらに、治療過程後、抗癌治療が施されない時間期間があることが想定される。この時間期間は、患者の予後、体力、健康状態などの患者の状態により、１〜７日、及び／または１〜５週間、及び／または１〜１２ヶ月以上（このそのような範囲は介在する日を含む）続く場合がある。治療周期は、必要に応じて繰り返されるだろうことが予想される。
【００９４】
様々な組み合わせが採用され得る。以下の例において、阻害抗体療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。
0006496719.tif 000002
【００９５】
本発明の任意の化合物または療法の患者への投与は、存在する場合、薬剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与についての一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、組み合わせ療法に起因する毒性を監視するステップが存在する。
【００９６】
特定の態様では、標準的な療法は、抗血管形成療法、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科療法、または遺伝子療法を含み、本明細書に記載される、阻害抗体、抗癌療法、または阻害抗体と抗癌療法の両方との組み合わせで採用され得ることが想定される。
【００９７】
Ａ．抗血管形成療法
当業者は、追加の抗血管形成療法が本発明の方法と組み合わせて、または併用して使用され得ることを理解する。例えば、追加の抗血管形成療法は、ＶＥＧＦ及び／またはＦＧＦシグナル伝達経路を拮抗し得る。よって、いくつかの場合では、及び追加の療法は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ、またはＦＧＦ受容体に結合する抗体の投与を含み得る。ある特定の態様では、本発明の方法及び組成物は、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）、または抗炎症薬と併用して使用され得る。よって、ある特定の場合では、薬学的に許容される担体中に抗Ｏｌｆｍｌ−３組成物及びベバシズマブまたはペガプタニブナトリウムを含む治療用組成物が提供される。
【００９８】
またさらなる態様では、血管形成を調節する遺伝子は、本発明の方法と併用して送達され得る。例えば、いくつかの態様では、血管形成を調節する遺伝子は、メタロプロテイナーゼ、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩ、エンドスタチンＸＶ、クリングル１〜５、ＰＥＸ、マトリックスメタロプロテアーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチン及びアンギオスタチンの融合タンパク質、ヒトプラスミノーゲンのエンドスタチン及びクリングル５ドメインの融合タンパク質、インターフェロン−γによるモノカイン誘発（Ｍｉｇ）（ｍｏｎｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）、インターフェロン−α誘発タンパク質１０（ＩＰ１０）、Ｍｉｇ及びＩＰ１０の融合タンパク質、可溶性ＦＬＴ−１（フィン様チロシンキナーゼ１受容体）、及びキナーゼインサートドメイン受容体（ＫＤＲ）遺伝子の組織阻害剤であってよい。ある特定の態様では、そのような血管形成調節遺伝子は、米国特許第７，１２２，１８１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにおいて送達され得る。
【００９９】
Ｂ．化学療法
本発明によると、多種多様の化学療法剤が使用され得る。用語「化学療法」は、癌を治療するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を意味するように使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内のそれらの活性様態、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすか、及びそれらがどの段階で細胞周期に影響を及ぼすかにより分類される。別の方法としては、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡ内に介入する、または核酸合成に影響を及ぼすことにより、染色体及び有糸分裂異常を誘発するその能力に基づき特徴付けされ得る。大半の化学療法剤は、以下の分類に入る：アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、及びニトロソ尿素。
【０１００】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、などのアジリジン類；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチルアメラミン類；アセトゲニン類（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（その合成類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素類；抗生物質、例えば、エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質（例えばカリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシンＡを含む；クロドロネートなどのビスホスホネート類；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン類（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン類（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）（マイトマイシンＣなど）、マイコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン類（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）などのマイタンシノイド類；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇ���ｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２'，２''−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）、（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａ及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどのプラチナ配位錯体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス型プラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１０１】
抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びトレミフェン；副腎においてエストロゲン生成を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート、エキセメスタン、フォルメスタニ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、及びアナストロゾール；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、接着細胞増殖に関連するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ及びＨ−Ｒａｓ；ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。
【０１０２】
Ｃ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されてきた他の要因は、γ線、Ｘ線、及び／または放射性同位体の腫瘍細胞への指向送達として一般的に知られるものを含む。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射などのＤＮＡ損傷要因の他の形態も想定される。これらの要因の全てがＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の組み立て及び維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）に関して、５０〜２００レントゲンの日用量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放射された放射線の強度及び種類、ならびに腫瘍細胞による取り込みによる。
【０１０３】
用語「接触される」及び「曝露される」は、細胞に適用される場合、本明細書において、治療用構築物及び化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接並んで設置されるプロセスを説明するために使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、両薬剤は、細胞を死滅させる、または細胞が分裂するのを阻止するのに有効な併用量で細胞に送達される。
【０１０４】
Ｄ．免疫療法
癌治療の文脈において、免疫療法は、一般に、癌細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））は、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに対して抗体特異的であってよい。抗体単独では、療法のエフェクターとして機能するか、または抗体は、細胞死滅に実際に影響を及ぼす他の細胞を動員し得る。抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に結合されてもよく、単に標的剤として機能する。別の方法としては、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞は、細胞毒性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む。治療法の組み合わせ、すなわち、直接細胞毒性活性及びＥｒｂＢ２の阻害または減少は、ＥｒｂＢ２過剰発現癌の治療に治療上の利益をもたらすだろう。
【０１０５】
別の免疫療法は、上に論じられる遺伝子サイレンシング療法との併用療法の一部として使用することもできる。免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的の影響を受けやすい、すなわち、大部分の他の細胞に存在しないあるマーカーを保有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが本発明の文脈における標的に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ及びｐ１５５を含む。免疫療法の別の態様は、抗癌作用と免疫刺激作用とを組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、及びγ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−８などのケモカイン、ならびにＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子も存在する。タンパク質として、または腫瘍抑制因子と組み合わせた遺伝子送達を使用するいずれかで免疫刺激分子を組み合わせることにより、抗腫瘍作用を増強することが示された（Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに、これらの化合物のいずれかに対する抗体は、本明細書に論じられる抗癌剤を標的とするために使用することができる。
【０１０６】
現在検証されている、または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、ウシ結核菌、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ；ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号、同第５，８４６，９４５号）、及びモノクローナル抗体、例えば、抗ガングリオシドＧＭ２、抗ＨＥＲ−２、抗ｐ１８５（Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗癌療法が本明細書に記載される遺伝子サイレンシング療法と共に採用され得ることが想定される。
【０１０７】
活性物質免疫療法では、一般に、異なる細菌性アジュバントと共に、抗原性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自家性もしくは同種間腫瘍細胞組成物または「ワクチン」が投与される（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｏｎ，１９９１、Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０１０８】
養子免疫療法では、患者の循環リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球がインビトロで単離される、ＩＬ−２などのリンホカインにより活性化される、または腫瘍壊死のために遺伝子を形質導入され、再投与される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；１９８９）。
【０１０９】
Ｅ．外科手術
癌を有する約６０％の個人は、ある種の手術を受け、これには、予防、診断、または段階判定、治癒、及び緩和手術が含まれる。治癒手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／または代替療法などの他の療法と併用して使用され得る癌治療である。
【０１１０】
治癒手術は、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去される、切り取られる、及び／または破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡的に制御された手術（モース手術）を含む。本発明のある特定の態様は、表在性癌、前癌、または偶発量の正常組織の除去と共に使用され得ることがさらに想定される。
【０１１１】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切り取るときに、身体に空洞が形成される場合がある。治療は、追加の抗癌療法と共に、領域の灌流、直接注射、または局所適用により達成することができる。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週間毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、様々な投薬量のものであってもよい。
【０１１２】
Ｆ．他の薬剤
他の薬剤が治療の治療有効性を改善するために本発明のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることが想定される。これらの追加の薬剤は、免疫調節剤、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の下方調節に影響を及ぼす薬剤、細胞分裂阻害剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘発物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤、または他の生物学的薬剤を含む。免疫調節剤は、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−２及び他のサイトカイン、Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカイン類似体、またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、及び他のケモカインを含む。細胞表面受容体またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）などのそれらのリガンドの上方調節は、過剰増殖細胞に対する自己分泌またはパラ分泌作用の確立により本発明のアポトーシス誘発能力を増強させるだろうことがさらに想定される。ＧＡＰ接合部の数の上昇による細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させるだろう。他の実施形態では、細胞分裂阻害剤及び分化剤は、治療の抗過剰増殖の有効性を改善するために、本発明のある特定の態様と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善することが想定される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。治療有効性を改善するために、抗体ｃ２２５などのアポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の薬剤が本発明のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに想定される。
【０１１３】
ホルモン療法も、本発明のある特定の態様と併用して、または前述の任意の他の癌療法と組み合わせて使用することができる。ホルモンの使用は、テストステロンまたはエストロゲンなどのある特定のホルモンのレベルを低下させる、またはその作用を阻害するために、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌などのある特定の癌の治療において採用され得る。この治療は、多くの場合、治療選択肢として、または転移のリスクを減少させるために、少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて使用される。
【０１１４】
ＶＩ．キット及び診断
本発明の様々な態様では、治療剤ならびに／または他の治療剤及び送達剤を含むキットが想定される。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の療法を調製する、及び／または投与するためのキットを想定する。キットは、本発明の薬学的組成物のいずれかを含む１つ以上の封止されたバイアルを含み得る。キットは、例えば、少なくとも１つのＯｌｆｍｌ−３抗体、ならびに本発明の構成成分を調製、製剤化、及び／もしくは投与するための、または本発明の方法の１つ以上のステップを行うための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブなど、キットの構成成分と反応しない容器である、好適な容器手段も含み得る。容器は、プラスチックまたはガラスなどの減菌可能な材料で作製され得る。
【０１１５】
キットは、本明細書に記載される方法の手順ステップを概説する取扱説明書をさらに含み得、本明細書に記載される同様の手順に実質的に従うか、または当業者に既知である。取扱情報は、コンピュータを使用して実行される場合、薬学的有効量の治療剤を送達する実際のまたは仮想の手順を表示する機械可読取扱説明書を含むコンピュータ可読媒体であってよい。
【実施例】
【０１１６】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。実施例に開示される技法は、本発明の実践においてよく機能するよう本発明者によって発見された示される技法に従い、よって、その実践のための好ましい様態を構成すると考えられ得ることを当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示される特定の実施形態において、多くの変更を行うことができ、尚も本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様のまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
【０１１７】
実施例１−モノクローナル抗体の生成
発明者は、組換えＯｌｆｍｌ−３タンパク質に対する一連のモノクローナル抗体を生成した。ヒトＯｌｆｍｌ３に対する３つの抗体は、標準的な技法を使用して、コイルドコイルにエピトープ
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及び免疫原としてオルファクトメジン様ドメイン
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を含む２つの１４アミノ酸長のペプチドをラットに同時に注射することにより生成された（Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。簡潔に、雌のウィスターラットを免疫化するために、１００μｇのＫＬＨ担体タンパク質（キーホールリンペットヘモシアニン、Ｐｉｅｒｃｅ）に結合され、アジュバントＳ６３２２（Ｓｉｇｍａ）と混合されたヒトＯｌｆｍｌ３ペプチドＡ及びＢが使用された。合計で３回の注射が９日毎に行われた。ヒトＯｌｆｍｌ３ペプチドの最終皮下注射２日後、流入領域リンパ節からの芽細胞をＳｐ２／０細胞に融合し、ＨＡＴ含有培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてハイブリドーマが選択された。ヒトＯｌｆｍｌ３−ＦＬＡＧを特異的に認識するモノクローナル抗体を生成するために、ＥＬＩＳＡにより成長クローンがスクリーニングされた。陽性クローンをサブクローン化し、再スクリーニングし、さらに試験した。製造者の指示に従い、タンパク質Ｇセファロースカラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）で抗体を精製した。Ｏｌｆｍｌ３結合抗体４６Ａ９ＢＯ及び９Ｆ８ＢＯの２つが、ＩｇＧ２ｂアイソタイプサブクラスのものであり、Ｚ１４Ａ７の１つが、ＩｇＧ２ｃアイソタイプサブクラスのものである。４６Ａ９ＢＯ及び９Ｆ８ＢＯモノクローナル抗体は、インビボ腫瘍グラフトモデルに使用された。
【０１１８】
抗体４６Ａ９ＢＯ、９Ｆ８ＢＯ、及びＺ１４Ａ７のＶＨ及びＶＬ鎖は、配列決定され、相補性決定領域（ＣＤＲ）が決定された。総ＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞ペレットから抽出され、ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写によりＲＮＡから作製された。モノクローナル抗体ＤＮＡのＶＨ及びＶＬ領域の両方を増幅するために、可変ドメインプライマーを使用してＰＣＲ反応が行われた。生成物を抽出し、ゲル精製し、次いで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１中にクローン化し、陽性形質転換体用にＴＯＰ１０に形質転換した。選択したコロニーを採取し、各抗体のコンセンサス配列が生成された配列決定により分析した（表１）。ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番付システムにより決定された（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１１９】
抗体４６Ａ９ＢＯは、配列番号７、８、及び９に対応するＶＨ  ＣＤＲ配列、ならびに配列番号１０、１１、及び１２に対応するＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。抗体９Ｆ８ＢＯは、配列番号２１、２２、及び２３に対応するＶＨ  ＣＤＲ配列、ならびに配列番号２４、２５、及び２６に対応するＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。抗体Ｚ１４Ａ７は、配列番号１３、１４、及び１５に対応するＶＨ  ＣＤＲ配列、ならびに配列番号１６、５、及び６に対応するＶＬ  ＣＤＲ配列を含む。
【０１２０】
４６Ａ９ＢＯ抗体のさらなる研究は、抗原認識が抗体のグリコシル化とはほとんど無関係であることを示した。ＥＬＩＳＡ研究は、抗体が脱グリコシル化されたか否かにかかわらず、組換え可溶性Ｏｌｆｍｌ−３タンパク質が用量依存様式で４６Ａ９ＢＯ抗体に結合されたことを示したが（図５を参照）、グリコシル化抗体がより効率的に抗原に結合した。グリコシル化及び脱グリコシル化４６Ａ９ＢＯのＯｌｆｍｌ−３ペプチドＢ配列への結合を試験したとき（ペプチドＡ配列への結合は両場合において観察されなかった）、同じ結果が達成された。
【０１２１】
実施例２−抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体４６Ａ９ＢＯ及び９Ｆ８ＢＯはインビトロで腫瘍成長を減少させる
８〜１０週齢の雌のＣ５６ＢＬ６／Ｊマウスに、０．５×１０６のマウスルイス肺癌細胞（ＬＬＣ１；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから得た）を皮下（ｓ．ｃ．）接種した。次いで、マウスに、以下のように抗体を腹腔内に注射した：１日目に５０μｇ、５日目に５０μｇ、及び８日目に５０μｇのモノクローナル抗体４６Ａ９ＢＯ、モノクローナル抗体９Ｆ８ＢＯ、またはアイソタイプ一致対照ラットＩｇＧ２Ｂ抗体。９日目に腫瘍を切り取り、分析した。腫瘍重量を測定した。
【０１２２】
腫瘍重量は、アイソタイプ一致対照抗体と比較して、４６Ａ９ＢＯまたは９Ｆ８ＢＯの抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体のいずれかで処置されたマウスにおいて有意に減少した（図１）。ＬＬＣ１腫瘍はＯｌｆｍｌ−３を発現しないため、腫瘍成長における減少は、腫瘍血管形成に対する抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体の作用によった。
【０１２３】
治療及び用量作用を試験するために、さらなる研究が４６Ａ９抗体のインビボ腫瘍成長阻害活性を評価するために行われた。再度、マウスにＬＬＣ１細胞を皮下接種した。次いで、接種されたマウスは、接種５、７、及び９日後に、対照ラットＩｇＧ、または３０、１５０、もしくは７５０μｇの４６Ａ９で処置された。１１日目に動物を屠殺した。腫瘍量は、研究の全過程にわたって測定された。結果は図２のグラフに示され、これは、４６Ａ９抗体の全ての試験された用量が腫瘍量において統計的に有意な減少を達成したことを示す。
【０１２４】
１１日目にマウスを屠殺した後、組織試料は、採取され、任意の毒性の可能性を評価するために組織学的分析を受けた。マウスからの肺、心臓、肝臓、及び腎臓の組織試料の詳細な分析は、最大試験投薬量である７５０μｇの４６Ａ９においてさえも毒性の兆候を明らかにしなかった。したがって、抗Ｏｌｆｍｌ−３療法は、試験された条件下で、本質的に非毒性であるように思われる。
【０１２５】
さらなるマウス研究が、９Ｆ８（ｍＡｂ  １）及び４６Ａ９（ｍＡｂ  ２）モノクローナル抗体の抗腫瘍活性の可能性を評価するために行われた。本質的には、上に詳述されるように、研究を完了した。簡潔に、マウスにＬＬＣ１細胞を皮下接種し、続いて、接種５、７、及び９日後に対照ラットＩｇＧ、９Ｆ８、または４６Ａ９抗体（マウス当たり１５０μｇの用量）を注射した。１１日目に動物を屠殺した。研究の全過程にわたって腫瘍量を測定し、結果をグラフにした。図３のグラフに示されるように、研究は、９Ｆ８及び４６Ａ９抗体の両方が対照抗体処置に対して腫瘍成長を有意に阻害することができたことを示す。
【０１２６】
腫瘍血管新生に対する９Ｆ８及び４６Ａ９抗体の作用を評価するために、さらなる研究を完了した。これらの研究に関して、９Ｆ８、４６Ａ９、または対照抗体に曝露された腫瘍から組織切片を採取した。血管新生のマーカーとしてのＰＥＣＡＭ−１を検出するために、組織切片を標識した。ＰＥＣＡＭ陽性組織面積の比率は定量化され、結果は図４Ａのグラフに示される。同様に、腫瘍組織切片をＤＡＰＩで染色し、処置された腫瘍組織における周皮細胞被覆を決定するために、免疫蛍光により標識して、ＰＥＣＡＭ−１及びα−ＳＭＡを検出した。組織におけるα−ＳＭＡ＋面積及びα−ＳＭＡ＋周皮細胞被覆の比率をグラフにし、図４Ｂに示す。よって、これらの研究は、両方の研究された抗Ｏｌｆｍｌ−３抗体がＰＥＣＡＭ−１発現及び周皮細胞被覆により測定される腫瘍組織血管新生を有意に減少させることができたことを示す。
【０１２７】
（表１）抗体配列
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【０１２８】
実施例３−４６Ａ９ＢＯ抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体を用いた毒性研究
抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体の毒性の可能性を評価するために、マウスに高用量（７５０μｇ）の４６Ａ９ＢＯまたは対照として総ラットＩｇＧを注射した。処置後、マウスは屠殺され、病理学分析を受けた。染色された臓器組織切片は、なんらかの毒性の兆候を検出するために、顕微鏡検査を受けた。４６Ａ９ＢＯ処置動物と対照との間で肺、肝臓、心臓、または腎臓組織切片を比較した際、組織構造において相違は見られなかった。よって、高投薬量で投与されたときでさえも、抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体は、マウスモデル系において検出可能な毒性を示さなかった。
【０１２９】
実施例４−９Ｆ８ＢＯ及び４６Ａ９ＢＯ抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体を用いたヒト組織染色
ヒト組織の免疫蛍光（ＩＦ）染色に関する抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体の有効性がさらに研究された。凍結されたヒト組織切片は、抗Ｏｌｆｍｌ−３モノクローナル抗体及びＶＥ−カドヘリンに対する抗体を使用して、別個に、または組み合わせて可視化された。例えば、正常な乳房組織対転移性乳管癌（試料Ｈ１４００３７４３）のＩＦ研究は、腫瘍組織において有意に増強された９Ｆ８標識を示し、これはＶＥ発現と大幅に重複した。同様に、正常組織対子宮、上皮、及び平滑筋癌肉腫腫瘍（試料Ｈ１４００３５３７）のＩＦ研究は、腫瘍組織において有意に増強された９Ｆ８標識を示し、再度、ＶＥ発現と大幅に重複した。４６Ａ９抗体を用いたさらなるＩＦ研究は、ヒト結腸腺癌切片（試料Ｈ１４００２６９１）対正常組織において、有意に増加した４６Ａ９染色も示した。これらの組織における４６Ａ９は、ＶＥカドヘリン染色と大幅に重複した。
【０１３０】
本明細書において開示され、主張される方法の全ては、本開示を考慮すれば、過度に実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、変形が、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法、及び方法のステップまたはステップの順序に適用され得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、同じまたは類似する結果が達成されるであろうが、化学的及び生理学的の両方に関連するある特定の薬剤が、本明細書に記載される薬剤を置換できることが明らかであろう。当業者に明らかである全てのそのような類似する置換及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の趣旨、範囲、及び概念内であると見なされる。
【０１３１】
参照文献
以下の参照文献は、それらが本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲内において、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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