(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が結合したビーズを油中水型のエマルジョンに封入するエマルジョン生成工程、前記エマルジョン内の前記核酸を増幅する核酸増幅工程、前記エマルジョンを破壊するエマルジョン破壊工程、及び前記増幅された核酸を精製濃縮する精製濃縮工程を実行する、核酸増幅自動化装置であって、
各工程で用いる溶液及び／または試薬を分注する分注機を備える分注機ユニットと、
前記エマルジョン生成工程及び前記エマルジョン破壊工程を実行するエマルジョンユニットと、
前記エマルジョンユニットで前記エマルジョン生成工程により生成された前記エマルジョンを用いて、前記核酸増幅工程を実行する核酸増幅ユニットと、
前記エマルジョンユニットで前記エマルジョン破壊工程で得られた増幅核酸を含む溶液を用いて、精製濃縮工程を実行する精製濃縮ユニットとを有し、
前記エマルジョンユニットは、前記エマルジョンを収容するエマルジョン容器と、前記エマルジョンを生成及び破壊するために前記エマルジョン容器を横方向に振動させる振動体とを有し、前記エマルジョン容器は、Ｖ字状に下方に突出するＶ字状底面を備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記エマルジョン容器に対向する前記振動体の表面には、弾性材層が形成されている、核酸増幅自動化装置。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記エマルジョン容器は、前記エマルジョンを収容するための薄い空間を有する、核酸増幅自動化装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記核酸増幅ユニットは、前記エマルジョンを収容するＰＣＲ容器と、前記ＰＣＲ容器を加熱及び冷却する加熱冷却素子とを備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、前記エマルジョンを収容するための薄い空間を有する、核酸増幅自動化装置。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、幅広面及び幅狭面を有し、前記加熱冷却素子は、前記幅広面を加熱冷却する、核酸増幅自動化装置。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸増幅自動化装置において、前記幅広面は、一対の幅広面であり、前記加熱冷却素子は、前記一対の幅広面のそれぞれと接触する一対の加熱冷却素子である、核酸増幅自動化装置。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、Ｖ字状に下方に突出するＶ字状底面を備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記精製濃縮ユニットは、増幅核酸を精製するための一または複数のフィルターチューブを備えるフィルター部と、増幅核酸を濃縮する精製濃縮容器とを備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記フィルター部は、前記一または複数のフィルターチューブを加熱する加熱部材を備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記一または複数のフィルターチューブは、前記ビーズを通さない大きさのフィルターを底部に備え、前記フィルターの下方から減圧することによりフィルタリングを行う、核酸増幅自動化装置。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記精製濃縮容器は、当該精製濃縮容器の外側で移動可能な磁石を備え、前記磁石を前記精製濃縮容器の外面に近づけることにより、前記ビーズと結合した磁性ビーズを前記精製濃縮容器の内面に吸着する、核酸増幅自動化装置。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記一または複数のフィルターチューブを撹拌する撹拌体を備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記撹拌体は、前記フィルター部を振動する振動体である、核酸増幅自動化装置。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記分注機は前記Ｖ字状底面から溶液を吸引するために装着される細長いキャピラリーチューブを有する、核酸増幅自動化装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記エマルジョンユニット、前記核酸増幅ユニット、及び前記精製濃縮ユニットを装着するステージを備え、前記分注機ユニットは前記分注機を前記ステージ上を三次元的に移動可能とする移動機構を備える、核酸増幅自動化装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、
前記分注機は、前記核酸増幅工程のために前記エマルジョンユニットから前記核酸増幅ユニットに前記エマルジョンを移動し、前記エマルジョン破壊工程のために前記核酸増幅ユニットから前記エマルジョンユニットに増幅核酸を含むエマルジョンを移動し、前記精製濃縮工程のために、前記エマルジョンユニットから前記精製濃縮ユニットに前記エマルジョン破壊工程で得られた増幅核酸を含む溶液を移動する、核酸増幅自動化装置。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置を備え、前記核酸増幅自動化装置から得られた核酸を分析する核酸分析自動化装置において、
前記核酸を分析するために、ＤＮＡチップまたはシーケンサーを備える、核酸分析自動化装置。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置を備え、前記核酸増幅自動化装置から得られた核酸を分析する核酸分析自動化装置において、
前記ビーズは蛍光ビーズであり、前記蛍光ビーズに付着した増幅核酸と結合するＤＮＡチップと、前記蛍光ビーズに励起光を照射する光源と、前記励起光によって生じた蛍光を測定する蛍光測定装置とを備える、核酸分析自動化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅を自動化する装置に関し、より詳細にはエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）によりＤＮＡの増幅を自動化する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高速シークエンスを行う次世代型シークエンサーが開発され、処理できるＤＮＡ数が飛躍的に伸びている。【０００３】
現在市販されている主な次世代シークエンサーとして、エマルジョンＰＣＲを利用した４５４（Ｒｏｃｈｅ）、ＳＯＬｉＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などが知られている。ｅｍＰＣＲは、核酸を結合したビーズを油中に多数形成させた微小液滴（エマルジョン）内で反応を行うものであり、エマルジョンＰＣＲを利用した小型化ハイスループット核酸分析（特許文献１）、多重配列決定反応（特許文献２）などが提案されている。【０００４】
エマルジョンPCRは1分子由来のDNAもしくはRNA分子を個別の微小液的中の反応の場で、増幅かつ解析可能な技術であり、次世代シーケンサー以外の用途でも、RainDance社、Biorad社などに代表されるDigital PCR技術へ適応されている。これらの増幅産物はReal-time PCR法、end-point PCR法、Flow cytometry法などで解析される。【０００５】
しかしながら、エマルジョンＰＣＲを行うには、マイクロタイタープレートやピコタイタープレートなどのマイクロまたはピコスケールのウェル中にビーズを入れる必要があるため、個々のエマルジョンから試料を回収することが困難であり、作業に手間がかかる。
このため、作業の煩雑を解消するために自動化が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１９３８８４号公報
【特許文献２】特表２００７−５２３６２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、核酸試料の調製（エマルジョン生成）から、核酸の増幅及び精製までを、効率化できる装置、好ましくは自動化できる装置を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、核酸試料の調製から核酸の増幅及び精製、増幅された核酸の測定（検出または定量）までを、効率化できる装置、好ましくは自動化できる装置を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、エマルジョンユニット、核酸増幅ユニット，及び精製濃縮ユニットを設け、これらの各ユニットの間で自動的に溶液を移動可能とし、さらにエマルジョンの調製、及び核酸増幅後のエマルジョンから核酸の分離濃縮までの自動化に成功し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（態様１）核酸が結合したビーズを油中水型のエマルジョンに封入するエマルジョン生成工程、前記エマルジョン内の前記核酸を増幅する核酸増幅工程、前記エマルジョンを破壊するエマルジョン破壊工程、及び前記増幅された核酸を精製濃縮する精製濃縮工程を実行する、核酸増幅自動化装置であって、各工程で用いる溶液及び／または試薬を分注する分注機を備える分注機ユニットと、前記エマルジョン生成工程及び前記エマルジョン破壊工程を実行するエマルジョンユニットと、前記エマルジョンユニットで前記エマルジョン生成工程により生成された前記エマルジョンを用いて、前記核酸増幅工程を実行する核酸増幅ユニットと、前記エマルジョンユニットで前記エマルジョン破壊工程で得られた増幅核酸を含む溶液を用いて、精製濃縮工程を実行する精製濃縮ユニットとを有する、核酸増幅自動化装置。【００１０】
（態様２）態様１に記載の核酸増幅自動化装置において、前記エマルジョンユニットは、前記エマルジョンを収容するエマルジョン容器と、前記エマルジョンを生成及び／または破壊するために前記エマルジョンを撹拌する撹拌体とを有する、核酸増幅自動化装置。（態様３）態様２に記載の核酸増幅自動化装置において、前記エマルジョン容器は、前記エマルジョンを収容するための薄い空間を有する、核酸増幅自動化装置。（態様４）態様２または３に記載の核酸増幅自動化装置において、前記エマルジョン容器は、Ｖ字状に下方に突出するＶ字状底面を備える、核酸増幅自動化装置。（態様５）態様２〜４のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記撹拌体は、前記エマルジョン容器を振動する振動体である、核酸増幅自動化装置。【００１１】
（態様６）態様１〜５のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記核酸増幅ユニットは、前記エマルジョンを収容するＰＣＲ容器と、前記ＰＣＲ容器を加熱及び冷却する加熱冷却素子とを備える、核酸増幅自動化装置。（態様７）態様６に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、前記エマルジョンを収容するための薄い空間を有する、核酸増幅自動化装置。（態様８）態様７に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、幅広面及び幅狭面を有し、前記加熱冷却素子は、前記幅広面を加熱冷却する、核酸増幅自動化装置。（態様９）態様８に記載の核酸増幅自動化装置において、前記幅広面は、一対の幅広面であり、前記加熱冷却素子は、前記一対の幅広面のそれぞれと接触する一対の加熱冷却素子である、核酸増幅自動化装置。【００１２】
（態様１０）態様６〜９のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記ＰＣＲ容器は、Ｖ字状に下方に突出するＶ字状底面を備える、核酸増幅自動化装置。（態様１１）態様１〜１０のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記精製濃縮ユニットは、増幅核酸を精製するための一または複数のフィルターチューブを備えるフィルター部と、増幅核酸を濃縮する精製濃縮容器とを備える、核酸増幅自動化装置。（態様１２）態様１１に記載の核酸増幅自動化装置において、前記フィルター部は、前記一または複数のフィルターチューブを加熱する加熱部材を備える、核酸増幅自動化装置。【００１３】
（態様１３）態様１１または１２に記載の核酸増幅自動化装置において、前記一または複数のフィルターチューブは、前記ビーズを通さない大きさのフィルターを底部に備え、前記フィルターの下方から減圧することによりフィルタリングを行う、核酸増幅自動化装置。（態様１４）態様１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記精製濃縮容器は、当該精製濃縮容器の外側で移動可能な磁石を備え、前記磁石を前記精製濃縮容器の外面に近づけることにより、前記ビーズと結合した磁性ビーズを前記精製濃縮容器の内面に吸着する、核酸増幅自動化装置。【００１４】
（態様１５）態様１〜１４のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記フィルターチューブを撹拌する撹拌体を備える、核酸増幅自動化装置。（態様１６）態様１５に記載の核酸増幅自動化装置において、前記撹拌体は、前記フィルター部を振動する振動体である、核酸増幅自動化装置。（態様１７）態様４または１０に記載の核酸増幅自動化装置において、前記分注機は前記Ｖ字状底面から溶液を吸引するために装着される細長いキャピラリーチューブを有する、核酸増幅自動化装置。（態様１８）態様１〜１７に記載の核酸増幅自動化装置において、前記エマルジョンユニット、前記核酸増幅ユニット、及び前記精製濃縮ユニットを装着するステージを備え、前記分注機ユニットは前記分注機を前記ステージ上を三次元的に移動可能とする移動機構を備える、核酸増幅自動化装置。【００１５】
（態様１９）態様１〜１８のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置において、前記分注機は、前記核酸増幅工程のために前記エマルジョンユニットから前記核酸増幅ユニットに前記エマルジョンを移動し、前記エマルジョン破壊工程のために前記核酸増幅ユニットから前記エマルジョンユニットに増幅核酸を含むエマルジョンを移動し、前記精製濃縮工程のために、前記エマルジョンユニットから前記精製濃縮ユニットに前記エマルジョン破壊工程で得られた増幅核酸を含む溶液を移動する、核酸増幅自動化装置。【００１６】
（態様２０）態様１〜１９のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置を備え、前記核酸増幅自動化装置から得られた核酸を分析する核酸分析自動化装置において、前記核酸を分析するために、ＤＮＡチップまたはシーケンサーを備える、核酸分析自動化装置。（態様２１）態様１〜１９のいずれか一項に記載の核酸増幅自動化装置から得られた核酸を分析する核酸分析自動化装置において、前記ビーズは蛍光ビーズであり、前記蛍光ビーズに付着した増幅核酸と結合するＤＮＡチップと、前記蛍光ビーズに励起光を照射する光源と、前記励起光によって生じた蛍光を測定する蛍光測定装置とを備える、核酸分析自動化装置。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、核酸増幅自動化装置及び核酸増幅分析自動化装置が提供される。本発明の装置は、核酸の調製、エマルジョン生成、並びに核酸の増幅、エマルジョンの破壊、及び核酸の精製濃縮を自動的に行なうことができ、ユーザの作業の煩雑を回避するとともに作業効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る核酸増幅自動化装置を示す斜視図である。
【図２】図１の核酸増幅自動化装置のステージを示す上面図である。
【図３】図２のエマルジョンユニットを示す概念図である。
【図４】図２のＰＣＲユニットを示す斜視図である。
【図５】図４のＰＣＲユニットに用いるＰＣＲ容器を示す概念図である。
【図６】図２の精製濃縮ユニットのフィルター部を示す概念図である。
【図７】図の２精製濃縮ユニットのエンリッチメントチューブを示す概念図である。
【図８】本発明の第１の実施形態に係る核酸増幅自動化装置の制御ブロック図である。
【図９】本発明の第１の実施形態に係る核酸増幅自動化装置によるｅｍＰＣＲ動作を示すフローチャートである。
【図１０】本発明の第３の実施形態に係る核酸増幅検出自動化装置の動作を示す模式図である。
【図１１】本発明の第４の実施形態に係るデジタルＰＣＲ装置の動作を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の核酸増幅自動化装置及び核酸増幅分析自動化装置の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明において、「自動」、「自動化」、及び「自動的」とは一切の手作業を除外するものではなく、各工程における処理の少なくとも一部を所定のプログラムにしたがって装置が実行するものも含まれる。
【００２０】
〔第１の実施形態の概要〕
本発明の第１の実施形態に係る核酸増幅自動化装置は、エマルジョン生成工程、エマルジョン内の核酸を増幅する増幅工程、エマルジョン破壊工程、増幅された核酸を分離、精製、濃縮する精製濃縮工程を自動処理する。まず、本発明の装置を説明するに際し、本発明において行なわれるエマルジョン生成工程から核酸の精製濃縮工程までの一連の工程について説明する。
【００２１】
エマルジョン生成工程では、核酸サンプルが結合したビーズ、ＰＣＲ試薬（ポリメラーゼ、プライマー、ＰＣＲ緩衝液等）及び疎水性溶媒を容器に混合して撹拌することで、油中水型のエマルジョンを作製する。エマルジョンの作製を容易にするために、後述するエマルジョン容器を機械的に撹拌、振動、またはボルテックスさせることが好ましい。
【００２２】
続いて、生成されたエマルジョンをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅工程にかける。増幅は、ミリリットルレベルの反応液、例えば３〜１０ｍｌの容量の溶液中、サーマルサイクラー（後述のＰＣＲユニット）により行なうことができる。
【００２３】
ＰＣＲ後は、イソプロパノール等のブレーキング溶液によりエマルジョンの破壊（ブレーキングという）を行い、増幅液を洗浄する。洗浄後、増幅核酸が結合したビーズを選別して目的核酸を濃縮（エンリッチメント）する。この選別には、磁性ビーズを使用することが好ましい。
【００２４】
本発明においては、上記基本となるエマルジョン生成及び破壊工程、核酸増幅工程、及び精製濃縮工程を行なう各ユニットまたは容器を独立させる。各ユニットまたは容器間の溶液の移動は、分注機を使用して自動で行うものとする。
【００２５】
〔核酸増幅自動化装置の全体構造〕
第１の実施形態に係る核酸増幅自動化装置１は、上記各工程を自動化するものであり、図１〜図９を用いて説明する。図１において、核酸増幅自動化装置１は、図２に示す各ユニットを備えるステージ１０と、ステージ１０上に設けられ分注機２１を有する分注機ユニット２０とを備える。ステージ１０の下には、各種廃液が収容される廃液ボトル１１と、分注機２１に取り付けられたチップ等が廃棄される廃棄ボックス１２との一方又は双方を任意選択で設けることもできる。
【００２６】
分注機ユニット２０の移動機構は、分注機２１をステージ１０上で三次元的に移動して、各ユニットに対して溶液または試薬を分注し、各ユニットから溶液を吸引することができる。この移動機構は、分注機ユニット２０の三次元的な移動のために、分注機ユニット２０をＸ方向に移動するＸ軸方向移動部２３と、分注機ユニット２０をＹ方向に移動するＹ軸方向移動部２４と、分注機２１をＺ軸方向に移動するＺ軸方向移動部２５とから構成される。
【００２７】
図２は、核酸増幅自動化装置１に設けられる作業用ステージ１０の上面図である。ステージ１０には、エマルジョン生成工程及びエマルジョン破壊工程を行うエマルジョンユニット３０と、核酸増幅工程を行うＰＣＲユニット（核酸増幅ユニット）４０と、増幅核酸の精製及び濃縮工程を行う精製濃縮ユニット５０とを備える。
【００２８】
さらに、ステージ１０には、分注機２１に装着される複数のチップを収容するチップカセット１３と、廃棄ボックス１２に接続されるチップ等の廃棄用開口１４と、より少量の複数の試薬を保管する第１試薬カセット１５と、より大量の複数の試薬を保管する第２試薬カセット１６と、増幅前の核酸等のサンプルを収容するサンプルチューブ１７と、精製濃縮後の核酸を収容するアウトプットチューブ１８と、のいずれか１つまたは任意の複数の組合せを任意選択で備えてもよい。
【００２９】
（エマルジョンユニット）
エマルジョンユニット３０では、エマルジョンの生成及び破壊（ブレーキング）が行われる。エマルジョンユニット３０を図３の模式図を用いて説明する。エマルジョンユニット３０は、薄い内部空間を有する平たいエマルジョン容器３１と、エマルジョン容器３１の周囲に配置され容器３１を振動させる振動体（撹拌体）３３と、振動体３３を振動させる振動体駆動部（撹拌体駆動部）３５とから構成される。エマルジョン容器（エマルジョンバイアル）３１は、容器上面に設けられ溶液を出し入れする、好ましくは筒状の開口部３１ａと、Ｖ字状に下方に突出するＶ字状底面３１ｂとを備える。エマルジョン容器３１内の溶液を分注機２１のチップで溶液を吸引すると、最後に残った溶液がＶ字状底面３１ｂ内に集まる。この状態で、分注機２１のチップの先端を、Ｖ字状底面３１ｂの下端に合わせて吸引することにより、ほとんどの溶液を吸引することができ、溶液移動の際のロスを減らすことができる。
【００３０】
エマルジョン容器３１に対向する振動体３３の表面には、ゴム等の弾性材層３３ａが形成されており、振動体３３の振動時に、振動をエマルジョン容器３１に伝えつつ振動で破損しないようにエマルジョン容器３１を保護している。振動体３３には、アームを介して振動体駆動部３５が接続されている。振動体駆動部３５は、後述の機械制御部１１００によって、予め定められた周波数、振幅、及び時間で振動を発生してエマルジョンを生成する。振動体駆動部３５は、偏心カム型、アンバランスマス型、油圧型、または動電型等の任意の振動発生デバイスを用いることができる。偏心カム型とは、偏心カムをステッピングモータ等のモータで駆動することにより振動体駆動部を振動させるものである。アンバランスマス型振動発生デバイスとは、モータに返信したマス（おもり）をつけモータの回転によって発生する遠心力により振動を発生させるものであり、携帯電話やスマートフォンのバイブレータ等に使用されている。油圧型振動発生デバイスは、ピストンを油圧によって駆動し振動を発生させるものである。動電型は、スピーカの振動と同じ原理で、磁界中でコイルに電流を流すことにより発生する力を利用し振動を発生させるものである。
【００３１】
本実施形態において、エマルジョンとは、単一のビーズを含む親水性の微小水滴が疎水性液体に囲まれたミセル中に封入されたものを意味する。エマルジョンに封入されるビーズを、ポリマー、例えばポリスチレンから形成することができる。さらに、ビーズに蛍光色素を含有させた蛍光ビーズとすることもできる。このような、蛍光ビーズとして、蛍光ナノシリカを用いることもできる（国際公開第２００７／０７４７２２号が参照により援用される（Incorporation by Reference））。ビーズの粒径は任意に選択可能であるが、ビーズの粒径は好ましくは１〜２０μｍ、より好ましくは１〜３μｍ、さらに好ましくは約１．５μｍとすることができる。蛍光ビーズを用いることにより、増幅核酸が付着した蛍光ビーズを、本出願人による国際公開２０１０／１２２９９０号に記載の「生体関連物質測定用チューブおよび定量システム」等のシステムの蛍光測定装置を用いて、蛍光強度を測定することにより簡易に定量及び／または検出することができる。国際公開２０１０／１２２９９０号は参照により援用される。蛍光ビーズに付着した核酸を、前記生体関連物質測定用チューブに含まれる目的物質捕捉ビーズで捕捉することにより、定量及び／または検出可能となる。ただし、蛍光ビーズの粒径が大きいと目的物質捕捉ビーズで捕捉することが困難になるので、ビーズの粒径を好ましくは１〜２０μｍの範囲とすることができる。さらに、増幅核酸が付着した蛍光ビーズを、ＤＮＡチップで分析する際に、蛍光ビーズの蛍光強度を測定することにより核酸の量を定量することもできる。
【００３２】
（ＰＣＲユニット）
図４は、エマルジョンＰＣＲにより核酸を増幅するＰＣＲユニット（核酸増幅ユニット）４０を示している。ＰＣＲユニット４０は、幅広面及び幅狭面を備えて薄い反応空間を形成する平たいＰＣＲ容器４１と、ＰＣＲ容器４１の一対の幅広面にそれぞれ熱伝達可能に接触する一対のペルチェ素子収容部４２と、一対のペルチェ素子収容部４２に含まれる一対のペルチェ素子４２ａにそれぞれ熱伝達可能に接触する一対のヒートシンク４３と、一対のヒートシンク４３のそれぞれに送風する一対のファン４５とから構成されている。ペルチェ素子収容部４２は、ペルチェ素子４２ａの周囲を断熱材で覆ったものであり、その内部のペルチェ素子４２ａは、後述の機械制御部１１００によって予め定められた温度及び時間にしたがって、ＰＣＲ容器４１に収容される溶液を加熱または冷却してサーマルサイクルを実行する。
【００３３】
図５の模式図に示すように、ＰＣＲ容器４１は、容器上面に設けられ溶液を出し入れする、好ましくは筒状の開口部４１ａと、好ましくはＶ字状に下方に突出するＶ字状の底面４１ｂとを備える。ＰＣＲ容器４１の容量は、好ましくは５〜１０ｍｌ、より好ましくは約７ｍｌであり、一対のペルチェ素子４２ａに挟まれるＰＣＲ容器４１の幅狭面の幅は、好ましくは２〜５ｍｍ、より好ましくは約３ｍｍである。
【００３４】
このような好ましいＰＣＲ容器４１の容積及の形状において、通常用いる分注機用チップは、ＰＣＲ容器から溶液を吸引することが困難である。そこで、図５に示すように、ＰＣＲ容器４１内の溶液を分注機２１に装着された細長いキャピラリーチップ２１ａで溶液を吸引すると、最後に残った溶液がＶ字状底面４１ｂ内に集まる。この状態で、分注機２１のキャピラリーチップ２１ａの先端を、Ｖ字状底面４１ｂの下端に合わせて吸引することにより、ほとんどの溶液を吸引することができ、溶液移動の際のロスを減らすことができる。
【００３５】
（精製濃縮ユニット）
図２に示すように、精製濃縮ユニット５０は、第１及び第２フィルターチューブ５３及び５４を備えるフィルター部５２と、エンリッチメントチューブ５７とを有する。図６の概念図に示すように、フィルター部５２には、第１フィルターチューブ５３と、第２フィルターチューブ５４と、第１フィルターチューブ５３及び第２フィルターチューブ５４の下部を取り囲んでこれらを加熱するヒートブロック（加熱部材）５６と、第１フィルターチューブ５３、第２フィルターチューブ５４、及びヒートブロック５６に振動Ｖを与える振動体（撹拌体）５８と、振動体５８を駆動させる振動体駆動部（撹拌体駆動部）５９とから構成される。第１フィルターチューブ５３及び第２フィルターチューブ５４は、それぞれ１または複数設けることができる。第１フィルターチューブ５３の容量は、好ましくは第２フィルターチューブ５４の容量より大きい。ヒートブロック５６に対向する振動体５８の表面には、好ましくはゴム等の弾性材層５８ａが形成されており、振動体５８の振動時に、振動を第１及び第２フィルターチューブ５３及び５４に伝えつつ振動により第１及び第２フィルターチューブ５３及び５４を破損しないように保護している。さらに、精製濃縮ユニット５０の振動体５８及び振動体駆動部５９は、エマルジョン生成ユニット３０の振動体３３及び振動体駆動部３５と同じものとすることができる。
【００３６】
さらに図６を参照しつつ、フィルター部５２によるフィルタリング構造を説明する。第１フィルターチューブ５３及び第２フィルターチューブ５４の底部には、核酸結合ビーズの径よりも小さい孔径を有する第１フィルタ５３ａ及び第２フィルタ５４ａがそれぞれ設けられる。第１フィルタ５３ａ及び第２フィルタ５４ａは好ましくはメンブレンフィルターとすることができる。第１フィルタ５３ａ及び第２フィルタ５４ａの下側には配管５５が接続され、配管５５は真空トラップ（廃液ボトル１１）を介して真空ポンプに接続される。好ましくは配管５５の少なくとも一部を可撓性部材で形成することにより、振動体５８の振動による破損及び液漏れが防止される。
【００３７】
図７に示すように、エンリッチメントチューブ（濃縮容器）５７の側面外側には磁石５７ａが配置される。磁石５７ａは、磁石移動機構５７ｂにより、エンリッチメントチューブ５７の側面に対して、接近位置Ａと離れた位置Ｂとの間で移動可能である。この磁石５７ａを用いて溶液中に含まれる磁性粒子を吸着して、不純物を分離することができる。磁石移動機構５７ｂとしては、限定されないが、好ましくは空気圧アクチュエータやカム機構等を用いることができる
【００３８】
（ブロック図）
核酸増幅自動化装置１の制御ブロックを図８を用いて説明する。核酸増幅自動化システム１は、好ましくは、機械制御部１１００と、機械制御部１１００に通信ラインで接続されるＰＣ（パーソナルコンピュータ）１２００とを備える。機械制御部１１００は、好ましくは、分注機ユニット２０のＸ軸方向移動部２３を駆動するＸ軸モータ１１０１と、分注機ユニット２０のＹ軸方向移動部２４を駆動するＹ軸モータ１１０２と、分注機ユニット２０のＺ軸方向移動部２５を駆動するＺ軸モータ１１０３と、分注器２１をポンピングする分注器モータ１１０４と、エマルジョンユニット４０の振動または撹拌（ボルテックス）を制御する第１ボルテックスモータ１１０５と、精製濃縮ユニット５０の振動または撹拌（ボルテックス）を制御する第２ボルテックスモータ１１０６と、精製濃縮ユニット５０の磁石移動機構５７ｂを駆動する磁石移動モータ１１０７とを備える。さらに、機械制御部１１００は、その内部に、制御用情報やプログラムを記憶するＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む記憶部等を備える。さらに、ＰＣ１２００には、好ましくは表示部及び入力装置を有する入力表示機１２２１を接続してもよい。なお、表示部と入力装置とをそれぞれ独立した装置としてＰＣ１２００に接続してもよい。
【００３９】
また、機械制御部１１００は、好ましくは、ＰＣＲユニット４０の温度を制御するＰＣＲ温度制御部１１２０と、ヒートブロック５６内に設けられるヒートブロック加熱部１１２２とを備える。ＰＣＲ温度制御部１１２０には、ＰＣＲ容器４１の温度を測定する温度センサ１１２０ａと、ペルチェ素子収容部４２のペルチェ素子４２ａとが接続される。ヒートブロック加熱部１１２２には、温度センサー１１２２ａが設けられて、ヒートブロック５６の温度が適切な範囲に維持される。さらに、機械制御部１１００には、第１及び第２フィルター５３ａ及び５４ａ下流の圧力を測定する圧力センサ１１１２と、真空ポンプ１１１４と、廃液ボトルの水位センサ１１１６とのいずれか一つまたは複数を任意選択で備えることができる。
【００４０】
（核酸増幅自動化装置の動作）
本実施形態に係る核酸増幅自動化装置１を用いてｅｍＰＣＲを実行する際の具体的な動作を図９を参照しつつ説明する。ステップＳ９０１で、ステージ１０上で分注機２０は、各種試薬及び溶液を調整し、エマルジョンユニット４０に分注する。ステップＳ９０２で、エマルジョンユニット４０の容器４１を振動体３３で振動または撹拌させて、ｅｍＰＣＲ用のエマルジョン生成工程が実行される。
【００４１】
ステップＳ９０３では、分注機２１は生成されたエマルジョンをエマルジョンユニット４０から吸引して、ＰＣＲユニット４０のＰＣＲ容器４１に分注する。また、分注機２１はＰＣＲに必要な各種試薬及び溶液をＰＣＲ容器４１に分注する。エマルジョン、試薬及び溶液の分注が完了した後、一対のペルチェ素子４２ａがＰＣＲ容器４１を加熱または冷却してＰＣＲ工程を実行する。
【００４２】
具体的に、ＰＣＲユニット４０で実行されるＰＣＲのサーマルサイクルの一例を説明する。ＰＣＲ容器４１中に分注機２１を用いて移送されたエマルジョン溶液は、核酸が結合したビーズを含む油中水型エマルジョンであり、さらに、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸等の核酸増幅試薬を含んでいる。増幅の反応条件は、例えば、まず９４℃で１〜３分反応させた後（但しこの反応は任意である）、９４℃で３０秒〜１分の変性、４０〜６０℃で３０秒〜１分のアニーリング、及びプライマーが核酸から分離せずにポリメラーゼの反応が可能な温度範囲（例えば７２℃程度）で１分〜３分の伸長反応を１サイクルとしてこれを所定サイクル行ない、核酸を増幅する。必要に応じて、核酸増幅後に溶液を７２℃で再び５分〜１０分程度加熱してもよい。
【００４３】
ＰＣＲ終了後、分注機２１は、増幅核酸を含むエマルジョンをＰＣＲユニット４０からエマルジョンユニット３０に移動して、ステップＳ９０４の破壊（ブレーキング）工程を行う。ステップＳ９０４では、分注機２１は、増幅核酸を含むエマルジョンにイソプロパノール等のエマルジョン破壊液を加えて、振動体３３を用いてエマルジョン容器３１を振動または撹拌することにより、エマルジョンを破壊する。エマルジョンの破壊が完了した後、分注機２１は、エマルジョンが破壊された溶液をエマルジョン容器３１からフィルター部５１の第１フィルターチューブ５３に移動して、ステップＳ９０５の精製濃縮工程を実行する。
【００４４】
ステップＳ９０５では、第１フィルターチューブ５３で溶液中の増幅核酸が付着したビーズのフィルタリング、加熱、冷却を行う。また、エンリッチメントチューブ５７で、増幅核酸が付着したビーズに磁性ビーズを結合させて、増幅核酸の濃縮を行う。以下、ステップＳ９０５に含まれるサブステップを詳細に説明する。
【００４５】
増幅核酸が付着したビーズを含む溶液が第１フィルターチューブ５３に収容された状態で、第１フィルター５３ａ下流を減圧することにより、不要なイソプロパノールや油分を吸引しつつ、増幅核酸が付着したビーズを洗浄する。さらに、第１フィルターチューブ５３内の混合液をヒートブロック５６で加熱し室温に冷却し、再度、第１フィルター５３ａ下流を減圧してビーズを洗浄し、ビーズに溶液を加える。
【００４６】
冷却後、分注機２１は、ビーズを含む溶液を第１フィルターチューブ５３からエンリッチメントチューブ５７に移動する。そして、分注機２１がエンリッチメントチューブ５７に、磁性ビーズを含む溶液を加えて、核酸が付着したビーズを含む溶液と混合する。磁性ビーズは、核酸が付着したビーズと親和性が高いため、エンリッチメントチューブ５７内で、磁性ビーズと増幅核酸が付着したビーズとが凝集体となる。凝集体が形成された後、磁石５７ａを図７の接近位置Ａに移動させると、凝集体が磁石５７ａに吸着される。凝集体が磁石５７ａに吸着された状態で、分注機２１はエンリッチメントチューブ５７の底から核酸を含まない溶液を吸引して、第１フィルターチューブ５３に分注して配管５５経由で廃棄する。
【００４７】
さらに、以下のビーズの洗浄動作が複数実行される。初めに、分注機２１はエンリッチメントチューブ５７に洗浄溶液を加える。そして、磁石移動部５７ｂを用いて、磁石５７ａをエンリッチメントチューブ５７に対して、図７の接近位置Ａから、図７の離れた位置Ｂに移動する。磁石５７ａの移動により、エンリッチメントチューブ５７内に磁石５７ａの磁力が及ばなくなると、凝集体がエンリッチメントチューブ５７内に分散する。分注機２１は、この分散状態の溶液の吸引及び吐出を複数回繰り返して、増幅核酸が付着したビーズの洗浄を行う。次に、磁石５７ａを離れた位置Ｂから、再度接近位置Ａに移動して、凝集体をエンリッチメントチューブ５７の内側面に吸着する。凝集体が磁石５７ａに吸着された状態で、分注機２１はエンリッチメントチューブ５７の底から核酸を含まない溶液を吸引して、第１フィルターチューブ５３に分注して配管５５経由で廃棄する。
【００４８】
凝集体が磁石５７ａに吸着され不要な溶液が廃棄された状態で、分注機２１はエンリッチメントチューブ５７に溶液を加えて、磁石５７ａを離れた位置Ｂに移動して凝集体を分散し、凝集体に分離液を加えて、核酸付着ビーズと磁性ビーズとが分離した状態で、接近位置Ａに磁石５７ａを移動させて溶液中に磁性ビーズのみをエンリッチメントチューブ５７の内側面に吸着する。磁性ビーズが吸着された状態で、分注機２１が核酸付着ビーズを含む溶液をエンリッチメントチューブ５７から第２フィルターチューブ５４に移動する。第２フィルターチューブ５４で第１フィルター５４ａの下流側から吸引して、溶液を取り除き、残った核酸付着ビーズに、分注機２１が溶液及びシークエンシングプライマーを加えてヒートブロック５６で溶液を加熱冷却する。最後に、第２フィルターチューブ５４でフィルター５４ａの下流側から吸引して、溶液を取り除き、分注機２１が残った増幅核酸付着ビーズに溶液を加えて、この溶液をアウトプットチューブ１８に分注して終了する。以上が、ステップＳ９０５の詳細である。
【００４９】
本実施形態の核酸増幅自動化装置１は、図９のステップＳ９０１からステップＳ９０５までを自動化するものであるが、後述の核酸増幅分析装置とする場合には、ステップＳ９０６を実行する。ステップＳ９０６では、ステップＳ９０５で得られた増幅核酸を、以下説明する核酸分析装置（シーケンサーまたはＤＮＡチップ）を用いて、検出及び／または定量する。
【００５０】
〔第２の実施形態〕
本発明の第２の実施形態の核酸増幅分析装置は、第１の実施形態の核酸増幅自動化装置１に、核酸分析装置を接続したものである。具体的には、核酸増幅自動化装置１で精製濃縮された核酸を、分注機２１によりシーケンサー（パイロシーケンサー）またはＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）に自動的に移動して、核酸の分析を自動的に行うものである。これによって、核酸の増幅から分析までの一連の工程を自動で実行することが可能となる。
【００５１】
〔第３の実施形態〕
本発明の第３の実施形態に関する、ｅｍＰＣＲによる増幅精製用の及びＤＮＡチップによる分析用の自動化装置及び方法を図１０を用いて説明する。なお、図１０で用いるビーズａ〜ｃは、好ましくは、ビーズ自体に蛍光体が固定化された蛍光ビーズである。
【００５２】
図１０のステップＳ１０１では、サンプルＤＮＡ等のＤＮＡ断片、プライマーが結合したビーズ（プラスチック等の蛍光ビーズ）、ＰＣＲ用試薬等を含むサンプル溶液を準備する。好ましくは、サンプルＤＮＡには、アダプターが連結される。図１０のステップＳ１０２は、エマルジョンを生成するためのオイルをサンプル溶液に混合する。サンプル溶液には、第１ビーズａ、第２ビーズｂ、第３ビーズｃが含まれている。各ビーズ上には、プライマーが固定されている。好ましくは、プライマーとしては、遺伝子特異的プライマー（gene specific primer）又はアダプター用のユニバーサルプライマーを用いることができる。図１０のステップＳ１０３では、サンプル溶液を撹拌してエマルジョン化する。エマルジョンには、第１ビーズａを包含する第１エマルジョンａｅｍ、第２ビーズｂを包含する第２エマルジョンｂｅｍ、第３ビーズｃを包含する第３エマルジョンｃｅｍ、が含まれている。これらのエマルジョンには、プライマー、酵素、反応用の４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）などＰＣＲに必要な物質が含まれる。第１ビーズａのプライマーには、第１ＤＮＡ断片がハイブリダイズ（結合）している。第２ビーズｂのプライマーには、ＤＮＡ断片はハイブリダイズしていない。第３ビーズｃのプライマーには、第３ＤＮＡ断片がハイブリダイズしている。
【００５３】
図１０のステップＳ１０４では、ＰＣＲを行って各エマルジョン内でＤＮＡを増幅する。第１エマルジョンａｅｍ内では第１ＤＮＡ断片が増幅され、第２エマルジョンｂｅｍ内でＤＮＡ断片は増幅されず、第３エマルジョンｃｅｍ内では第３ＤＮＡ断片が増幅される。図１１のステップＳ１０５では、ステップＳ１０４のエマルジョンのブレーキングを行ってＤＮＡ断片がハイブリダイズしたビーズを抽出する。ステップＳ１０６では、ＤＮＡ断片がハイブリダイズしたビーズを含む溶液をＤＮＡチップに供給する。ＤＮＡチップでは、第１遺伝子特異的プライマーが固相化された第１スポットａ’で第１ビーズａにハイブリダイズした第１ＤＮＡ断片と結合し、第３遺伝子特異的プライマーが固相化された第３スポットｃ’で第３ビーズｃにハイブリダイズした第３ＤＮＡ断片と結合する。しかし、第２遺伝子特異的プライマーが固相化された第２スポットｂ’では、第２ビーズｂと結合しない。第２ビーズｂには、第２ＤＮＡ断片が結合していないため、第２スポットｂ’と結合できないからである。
【００５４】
最後に、各領域に蛍光ビーズが結合した状態で、好ましくは、光源から励起光を照射して、このビーズが発する蛍光強度を測定する。これによって、各ビーズに結合しているＤＮＡ断片の検出及び／または定量が可能となる。なお、図１０のステップＳ１０１及びＳ１０２は、図９のステップＳ９０１で用いる装置によって同じを処理を実行することができる。図１０のステップＳ１０３、Ｓ１０４、Ｓ１０５は、それぞれ図９のステップＳ９０２、Ｓ９０３、Ｓ９０４で用いる装置によって同じ処理を実行することができる。
【００５５】
〔第４の実施形態〕
本発明の第４の実施形態に係る、デジタルＰＣＲを用いた核酸増幅分析自動化装置及び方法を図１１を用いて説明する。デジタルＰＣＲとは、単分子のＤＮＡ断片を含む微小な（ピコリットルレベル）の液滴（油滴）を溶液中に作成して、液滴内でＰＣＲを行い、ＰＣＲ後、各液滴毎に蛍光強度を測定してターゲットＤＮＡの検出及び／または定量を行うものである。
【００５６】
図１１に示すように、液滴形成デバイス６０は、ＤＮＡ断片を含むサンプル液を供給するサンプル液供給部６１と、サンプル液供給部６１に接続されるサンプル流路管６３と、ミネラルオイル等のオイルを流路６３に供給する一対のオイル供給管６５と、オイル供給管６５を流路管６３に接続する接続部６７と、流路管６３を流れる液滴を流出する液滴流出部６９とを備える。サンプル液には、ＰＣＲ用試薬、プライマー、及び蛍光体等が含まれている。
【００５７】
液滴形成デバイス６０は、接続部６７でＤＮＡサンプル液とオイルが混合して、混合液がエマルジョン化する（液滴を生成する）。液滴の生成時に、ＤＮＡ断片は、ポアソン分布をとるため、ターゲットＤＮＡ（第１ＤＮＡ断片）ありの液滴Ｄ１と、ＤＮＡ断片なしの液滴Ｄ２と、ターゲットＤＮＡ以外のＤＮＡ断片（第２ＤＮＡ断片）を含む液滴Ｄ３とが生成する。これらの液滴を含む溶液は、ＰＣＲ容器７１に移動される。液滴形成デバイス６０からＰＣＲ容器への液滴溶液の移動は、液滴流出部６９の下方にＰＣＲ容器７１を設けて重力落下により自動的に行うか、分注機２１によって自動的に行ってもよい。ＰＣＲ容器７１は、図４に示したようなＰＣＲユニット４０のＰＣＲ容器４１と同様の構造とすることもできる。この場合には、ＰＣＲユニット４０によって、各液滴内のＤＮＡ断片が各液滴毎に増幅される。ＰＣＲ後の液滴には、ターゲットＤＮＡ、ターゲットＤＮＡと結合するプライマー及び蛍光体を含む液滴Ｄ１と、ＤＮＡ断片を含まない単なる液滴Ｄ２と、非蛍光あるいはターゲットＤＮＡ以外のＤＮＡ断片を含む液滴Ｄ３とが含まれる。
【００５８】
液滴中のＤＮＡ分析するためにデジタルＰＣＲ用分析装置を用いる。デジタルＰＣＲ用分析装置は、一つの液滴のみが通過可能な直径の透明なキャピラリー（細長管）と、このキャピラリーに設けられ蛍光体に励起光を照射する光源と、このキャピラリーに設けられ蛍光体が発する蛍光強度を測定する蛍光測定部とを備える。ＰＣＲ容器７１からＰＣＲ用分析装置のキャピラリーへの液滴を含む溶液の移動は、分注機２１によって自動的に実行してもよい。
【００５９】
液滴Ｄ１〜Ｄ３を含む溶液がキャピラリーを流れる際、液滴Ｄ１が光源から励起光が照射された励起光により蛍光を発して、この蛍光強度が蛍光測定部によって測定される。液滴Ｄ２は、蛍光体を含まないため発光しない。液滴Ｄ３に含まれる第２ＤＮＡ断片を検出及び定量するためには、サンプル液に、予め第２ＤＮＡ断片と結合するプライマー及び蛍光体を加えておけばよい。さらに、第１ＤＮＡ断片用の蛍光体の蛍光スペクトルと、第２ＤＮＡ断片用の蛍光体の蛍光スペクトルとが相違するようにそれぞれの蛍光体を選択することもできる。これによって視覚的に液滴を識別することもできる。また、これらの蛍光強度の比率を測定することにより、第１ＤＮＡ断片と第２ＤＮＡ断片の存在比を算出することも可能となる。液滴Ｄ１及び／またはＤ３の蛍光を測定する場合に、これらの液滴は、第１の実施形態で説明した蛍光ビーズと同様の機能を有するため、液滴を蛍光ビーズとみなすことができる。
【００６０】
本発明の各実施形態において、核酸増幅自動化装置で増幅される核酸は、ＤＮＡに限らずマイクロＲＮＡ等のＲＡＮも含まれる。ＲＮＡを増幅する場合には、ＲＮＡを逆転写してＤＮＡにする工程が追加される。また、本発明の各実施形態の核酸増幅分析自動化装置において、マルチプレックスディテクションを行うこともできる。即ち、核酸増幅自動化装置から得られた核酸を、任意の複数の分析自動化装置（例えば、シーケンサー及びＤＮＡチップ）で並列的に分析するものである。このような分析によって核酸情報の多元的な分析が可能となる。
【００６１】
第２の実施形態で使用するシーケンサーは限定されないが、ロッシュアプライドサイエンス社が提供する、ロッシュ４５４シークエンシングシステムやＧＳ  ｊｕｎｉｏｒシステムを用いることができる。第２または第３の実施形態で使用するＤＮＡチップとしては、プレシジョン・システム・サイエンス社が製造販売するＬｕＢＥＡを用いることができる。なお、ＬｕＢＥＡに関する技術は、本出願人が国際公開２０１０／１２２９９０号に記載の「生体関連物質測定用チューブおよび定量システム」として出願しており、その内容は本明細書に参照により援用される（Incorporation by Reference）。第２または第３の実施形態において、ＬｕＢＥＡをＤＮＡチップとして用いることにより、デジタルＰＣＲと同等レベルの検出感度でＤＮＡを分析及び／または定量することが可能となる。
【００６２】
さらに、第２または第３の実施形態で使用するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）としては、アフィメトリクス社が開発したＧｅｎｅＣｈｉｐ、ｃＤＮＡマイクロアレイ（スタンフォード型）を用いることもできる。なお、ＤＮＡチップ用の分析装置（スキャナー）は、好ましくは、蛍光ビーズに励起光を照射する光源と、前記励起光によって生じた蛍光を測定する蛍光測定装置とを備える。
【符号の説明】
【００６３】
１  核酸増幅自動化装置
１０  ステージ
２０  分注機ユニット
２１  分注機
３０  エマルジョンユニット
４０  ＰＣＲユニット
５０  精製濃縮ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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