(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空多孔性微小球の製造方法であって、
気孔形成誘導物質と疎水性の生分解性高分子を揮発性溶媒に溶解させることを含む高分子溶液の製造段階；
前記高分子溶液を水又は相安定化剤を含む水溶液に分散させてＯ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する段階；
前記高分子溶液が分散された水溶液上で揮発性溶媒を揮発させて前記疎水性の生分解性高分子を固形化して、疎水性の生分解性高分子と前記気孔形成誘導物質との間の自発的相分離を発生させて、Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させることを含む中空多孔性微小球の製造段階；
前記中空多孔性微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階を含み、
前記気孔形成誘導物質は、アルカン（ａｌｋａｎｅ）類、植物性油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上である、
中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項２】
前記アルカン類は、オクタン（Ｏｃｔａｎｅ）、ウンデカン（Ｕｎｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（Ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上であり、
前記植物性油は、大豆油、とうもろこし油、綿実油、オリーブ油、ブドウ種子油、くるみ油、ゴマ油、エゴマ油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上である、請求項１に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項３】
前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、微細流体デバイスに前記水又は相安定化剤を含む水溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給された水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含む、請求項１に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項４】
前記高分子溶液を不連続相で供給する速度を調節して、中空多孔性微小球の粒子及び気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含む、請求項３に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項５】
前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、膜乳化装置に前記水又は相安定化剤を含む水溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給された水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含む、請求項１に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項６】
前記膜乳化装置の膜に形成された空隙大きさを調節して、中空多孔性微小球の粒子及び気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含む、請求項５に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項７】
前記微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階は、前記微小球を水で洗浄した後に凍結乾燥させて気孔形成誘導物質を除去する段階を含む、請求項１に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項８】
前記疎水性の生分解性高分子は、ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ、ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＧＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ）、ポリ−ε−（カプロラクトン）（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｉｙａｌｃｏｈｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｐｏｌｙ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）共重合体（ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−ｐｏｌｙ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ−ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、これらの共重合体及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上である、請求項１に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【請求項９】
前記製造される中空多孔性微小球は、
中央に形成された空洞；及び前記空洞を取り囲む微細気孔を含む隔壁を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の中空多孔性微小球の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚組織のような生体組織内に伝達できる組織工学用足場を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容施術を目的として販売されている美容施術用医療機器のうちのフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）は、しわや陥没部位の皮膚組織に注入するといった方式で用いられる。大半のフィラーは皮膚組織に注入され、該物質自体の体積によって皮膚組織の体積を増大させる方式で皮膚のしわや陥没部位を改善する。現在最も多用されるフィラーとしては、ヒアルロン酸とコラーゲンなどのゲル状の無形物質があるが、経時的に皮膚組織内に吸収されるために、その美容施術の効果が長期に亘り保持されないという問題がある。
【０００３】
また、美容施術用医療機器として幅広い使用範囲を有するためには、注射によって伝達されなければならないが、既存開発のフィラー成分である多孔性材料は、その大きさが数十ｍｍ以上であったため、注射によっては皮膚組織への移植が不可能であり、専ら皮膚組織を切開する手術によって皮膚組織内に移植しなければならないという短所があった。
【０００４】
従来の多孔性材料の製造方法としては、疎水性の生分解性高分子微小球に空隙を形成するためのポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）としてアルジネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）といった水溶性高分子物質を適用して、Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）、Ｗ／Ｏ（Ｗａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌ）、Ｗ／Ｏ／Ｗ（Ｗａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）、またはＯ／Ｗ／Ｏ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌ）といった多相エマルジョン（ｍｕｌｔｉ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する技術がある。しかし、Ｏ／Ｗ型の工程では大きな気孔を有する微小球を形成し難い。Ｗ／Ｏ、Ｗ／Ｏ／Ｗ及びＯ／Ｗ／Ｏ型の工程の場合、二相乳化工程が必要となり、二相乳化を安定化するための内相安定剤と外相安定化剤の双方が要求される。また、製造される微粒子の比重が水より重いことから、沈殿した微粒子を収得するためには、フィルターリング工程が別途に必要となるという短所がある。さらには、製造工程が複雑で且つ制御する因子が多いことから、回分式反応工程によって製造が行われるため、生産効率が低下すると共に、微小球に形成される空隙の均一性に劣り、且つ工程中の損失率が高いため、産業的応用が難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報第２０１１−００７５６１８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、皮膚組織のような生体組織内に伝達することができる組織工学用足場を製造する方法を提供することにある。具体的に、工程が単純且つ多孔性微小球の空隙率及び空隙の形態を容易に調節することができるため、注射によって皮膚組織内に注入することができると共に、前記多孔性微小球内で細胞を増殖させて皮膚組織の体積を増大させることができる多孔性微小球の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記したような目的を解決するために、本発明の一観点は、中空多孔性微小球の製造方法であって、
気孔形成誘導物質と疎水性の生分解性高分子を揮発性溶媒に溶解させることを含む高分子溶液の製造段階；
前記高分子溶液を水又は相安定化剤を含む水溶液に分散させてＯ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する段階；
前記高分子溶液が分散された水溶液上で揮発性溶媒を揮発させて前記疎水性の生分解性高分子を固形化して、疎水性の生分解性高分子と前記気孔形成誘導物質との間の自発的相分離を発生させて、前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる中空多孔性微小球の製造段階；及び
前記中空多孔性微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階を含む、
中空多孔性微小球の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法は、多孔性微小球に含まれる疎水性の生分解性高分子と気孔形成誘導物質との自発的相分離によってＯ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球形態の構造に容易に具現することができ、二相乳化型の微小球製造の際に求められる内相安定化剤を添加することなく製造することができ、これによる内相安定化剤の除去のための洗浄工程を考慮する必要がない。したがって、従来の親水性気孔形成誘導物質を用いて、別途の一次及び二次乳化工程によってＷ／Ｏ／ＷやＯ／Ｗ／Ｏ型に製造していた技術よりも生産工程を単純化させることができる。
【０００９】
本発明は、微小球内空隙率及び空隙の形態及び大きさを容易に調節することができ、微小球内皮膚組織細胞が増殖することができる中空及びこれを取り囲む隔壁に含まれる微細気孔を製造することが可能となり、気孔均一度に優れる。
【００１０】
このように、前記本発明の製造方法によれば、中空多孔性微小球は粒子内の中央に形成された巨大空洞と微細気孔を含む隔壁を含む二重構造を有するので、生体内皮膚組織細胞がチャンネルとして前記微細気孔を用いて前記中空多孔性微小球内に容易に移動することができ、前記巨大空洞内で前記移動した皮膚組織細胞が効果的に増殖することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例に従って中空多孔性微小球を製造する方法に関する概略的な図である。
【図２】本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球の製造時のポロゲンの種類及び含量による粒子表面と切片の電子走査顕微鏡写真を示した図である。
【図３】本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球で線維芽細胞を培養したＬｉｖｅ／ｄｅａｄ染色共焦点顕微鏡写真を示した図である。
【図４】本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球で線維芽細胞を培養した後にＭＴＴ  ａｓｓａｙによって細胞成長率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「平均径」とは、対象の横断面の両端を結ぶ線分である径を平均した値を意味し、例えば、本発明の空洞の場合、中空多孔性微小球内に形成される空洞が真球状ではないときに前記空洞自体が持つ径の平均値を意味していてよい。または、複数の微小球内に存在する各空洞の径の平均値を意味していてもよい。微細気孔の場合、微細気孔自体が真球状ではないときに前記微細気孔自体が持つ径の平均値または複数の微細気孔の径の平均値を意味していてよい。
【００１３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、気孔形成誘導物質と疎水性の生分解性高分子を揮発性溶媒に溶解させることを含む高分子溶液の製造段階；前記高分子溶液を水又は相安定化剤（ｐｈａｓｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を含む水溶液に分散させてＯ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する段階；前記高分子溶液が分散された水溶液上で揮発性溶媒を揮発させて前記疎水性の生分解性高分子を固形化して、疎水性の生分解性高分子と前記気孔形成誘導物質との間の自発的相分離を発生させて、前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる中空多孔性微小球の製造段階；及び前記中空多孔性微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供する。
【００１５】
従来の多孔性微小球を製造するための技術として適用されてきた多相エマルジョン形成技術、すなわち多相乳化技術では、疎水性の生分解性高分子を含む油相を連続相にし、空隙を形成するための気孔形成誘導物質を含む水相を不連続相で適用して一次エマルジョンを形成しなければならない。この際に製造される一次エマルジョン内の不連続相の大きさや分布を均一にさせるためには、持続的な撹拌と温度調節が必須であった。しかし、本発明の一実施例によれば、疎水性の生分解性高分子と空隙及び気孔形成誘導物質が同一の溶媒に溶解されるので、別途の操作を行うことなく組成均一性と組成安定性を確保することができる。
【００１６】
また、従来の多相エマルジョン形成技術では、二次エマルジョンを形成させた後に二次エマルジョン内の不連続相の大きさと形態均一性を維持するための撹拌と温度維持は可能であるが、二次エマルジョン内に形成された不連続相内の不連続相、すなわち水溶性高分子のような気孔形成誘導物質を含む水溶液の大きさや分布を、疎水性の生分解性高分子が固形化して安定化するまでに制御し得る手段がないという問題がある。一方、本発明の一実施例によれば、気孔形成誘導物質として疎水性の生分解性高分子と相溶性がなく、且つ密度が水よりも低い疎水性流体を用いるので、高分子溶液内の揮発性溶媒が除去されると疎水性の生分解性高分子は固形化し、疎水性の生分解性高分子と相溶性のない疎水性で液状の気孔形成誘導物質は自然に相分離して、疎水性の生分解性高分子からなる微小球内に空隙を形成するようになる。したがって、別途の操作を行うことがなくても疎水性の生分解性高分子が固形化する前の溶液相を維持するため組成均一性を確保することができ、疎水性の生分解性高分子が固形化すると、疎水性の生分解性高分子が持つ強度によって空隙均一性と安定性を確保することができる。
【００１７】
一実施例として、前記気孔形成誘導物質は、疎水性の生分解性高分子と相溶性がなく、且つ密度が水よりも低い疎水性流体を含んでいてよい。前記気孔形成誘導物質は、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）ともいう。前記気孔形成誘導物質は、疎水性の生分解性高分子と相溶性がなく、且つ密度が水よりも低い疎水性流体であればその種類は特に制限されない。具体的に、前記気孔形成誘導物質は、１ａｔｍ、２５０℃以下で沸点を有する物質であればよく、１ａｔｍ、３０〜１５０℃で液状の物質であればよい。例えば、前記気孔形成誘導物質は、アルカン（ａｌｋａｎｅ）類、植物性油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上であってよい。一実施例として、前記アルカン類は、オクタン（Ｏｃｔａｎｅ）、ウンデカン（Ｕｎｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（Ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上であり、前記植物性油は、大豆油、とうもろこし油、綿実油、オリーブ油、ブドウ種子油、くるみ油、ゴマ油、エゴマ油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上を含んでいてよい。本発明は、前記具体的な物質以外に他の物質を適用して気孔を形成することもでき、一実施例として、本発明は、前記中空多孔性微小球の製造の際に気孔を形成するポロゲンの濃度及び種類によって中空及び微細気孔の大きさや形態を調節することができ、且つ気孔均一度も増加させることができる。例えば、前記気孔形成誘導物質は、高分子溶液の総質量に対して０．１〜５０質量％、より具体的には１〜１０質量％で含まれていてよい。
【００１８】
また、本発明の一実施例に係る前記疎水性の生分解性高分子は、ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ、ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＧＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ）、ポリ−ε−（カプロラクトン）（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｉｙａｌｃｏｈｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｐｏｌｙ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）共重合体（ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−ｐｏｌｙ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ−ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、これらの共重合体、及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上を含んでいてよいが、皮膚組織内に注入されたときに安全且つ分解可能なものであれば、必ずしもこれらに制限されものではない。
【００１９】
本発明の一実施例に係る前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、前記水又は相安定化剤（ｐｈａｓｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を含む水溶液を連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）にして前記水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）で供給する段階を含んでいてよい。このとき、前記相安定化剤を含む水溶液は、界面を安定化させる物質を含む水溶液であって、例えば、ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ、ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｉｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリエチレングリコール−ｃｏ−ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏ−ｐｏｌｙｐｒｏｐｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール−ｃｏ−ポリプロピレングリコール−ｃｏ−ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏ−ｐｏｌｙｐｒｏｐｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール−ｃｏ−ポリ乳酸（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏ−ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びポリエチレングリコール−ｃｏ−ポリ乳酸-ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏ−ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）などからなる群より選択された一つ以上の相安定化剤が溶解された水溶液である。
【００２０】
具体的に、前記高分子溶液を水又は相安定化剤を含む水溶液に分散させる段階は、一実施例として、微細流体デバイスに前記水又は相安定化剤を含む水溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給される水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含んでいてよい。このとき、前記段階は、前記連続相を移送する微細導管内に前記高分子溶液を不連続相で供給する速度を調節して、中空多孔性微小球の粒子並びに、中空及び微細気孔のような気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含んでいてよい。
【００２１】
または、本発明の一実施例に係る前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）乳化装置に前記水溶性溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給される水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含んでいてよい。微細流体デバイスで用いる微細導管の代わりに空隙の大きさが一定の膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通じて不連続相を連続相が流れる導管に移送し、このとき、前記段階は、前記膜乳化装置の膜に形成された空隙の大きさを調節して、中空多孔性微小球の粒子並びに、中空及び微細気孔のような気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含んでいてよい。
【００２２】
前記微細流体デバイスまたは膜乳化装置を用いると、微小球の製造の際に微小球の大きさや形態、中空及び気孔の粒度分布を制御することができる。
【００２３】
一実施例として、前記中空多孔性微小球の中央に形成された空洞は５〜１５０μｍの平均径を有していてよい。前記空洞の径が５μｍ未満であると細胞の成長が困難となり、また１５０μｍを超えると微小球の強度が弱すぎて生体内注入の際に破壊され得る。具体的に、前記空洞の平均径は、５μｍ以上、１０μｍ以上、１３μｍ以上、１５μｍ以上、１７μｍ以上、２０μｍ以上、２３μｍ以上、２５μｍ以上、２７μｍ以上、３０μｍ以上、３３μｍ以上、３５μｍ以上、３７μｍ以上、４０μｍ以上、４３μｍ以上、４５μｍ以上、４８μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上または１５０μｍであってよい。また、前記空洞の平均径は、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４７μｍ以下、４５μｍ以下、４３μｍ以下、４０μｍ以下、３７μｍ以下、３５μｍ以下、３３μｍ以下、３０μｍ以下、２８μｍ以下、２５μｍ以下、２３μｍ以下、２０μｍ以下、１８μｍ以下、１５μｍ以下、１３μｍ以下、１０μｍ以下または５μｍ以下であってよいが、皮膚組織細胞の増殖が可能な大きさであれば必ずしも前記した大きさに制限されるものではない。
【００２４】
一実施例として、本発明に係る組成物に含まれる前記中空多孔性微小球の粒子は、５０〜２００μｍの平均径を有していてよいが、注射によって皮膚組織内注入が可能であり、且つ皮膚組織細胞の増殖が可能であれば必ずしも前記範囲に制限されるものではない。前記中空多孔性微小球は、前記したような範囲の小さい粒子サイズを有することで、皮膚組織内に３００μｍ以下の内径を有する注射針を介して投与することができ、既存の多孔性材料は大きい粒子サイズにより皮膚組織を切開して移植する必要があったという短所を解決することができる。前記中空多孔性微小球の径が５０μｍ未満であれる皮膚組織細胞の増殖が困難となり、また２００μｍを超えると注射針を用いた施術が容易ではない。具体的に、前記中空多孔性微小球粒子の平均径は、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、１５０μｍ以上、１６０μｍ以上、１７０μｍ以上、１８０μｍ以上、１９０μｍ以上または２００μｍであってよい。また、前記中空多孔性微小球粒子の平均径は、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下または５０μｍであってよい。
【００２５】
一実施例として、前記中空多孔性微小球の空洞の体積は、前記中空多孔性微小球の全体積に対して２０〜８０体積％であってよい。前記体積が２０体積％未満であると皮膚組織細胞が増殖する空間が十分ではなく、また８０体積％を超えると、隔壁の厚みが薄すぎるようになるため微小球の形態が保持できずに崩れ得る。一実施例として、前記隔壁の厚みは、前記中空多孔性微小球の全径の１／５〜１／２であってよい。
【００２６】
具体的に、前記中空多孔性微小球の隔壁に含まれる微細気孔は、一実施例として、５〜５０μｍの平均径を有していてよい。前記平均径が５μｍ未満であると前記中空多孔性微小球を皮下組織に注入したときに皮膚組織細胞が微小球内部に移動することができず、また前記平均径が５０μｍを超えると隔壁内気孔が占める体積が増加して微小球の形態が保持され難くなる。
【００２７】
例えば、前記中空多孔性微小球の好ましい空隙率は、平均２０〜８０％であってよい。
【００２８】
本発明の一実施例に係る製造方法において、前記多孔性微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階は、一実施例として、前記微小球を水で洗浄した後に凍結乾燥させて気孔形成誘導物質を除去する段階を含んでいてよい。前記凍結乾燥は真空乾燥であってよい。本発明で用いる上述した気孔形成誘導物質は、１ａｔｍ、３０〜１５０℃で液状を保持し、１ａｔｍ、２５０℃以下で沸点を有しており、本発明の疎水性の生分解性高分子を用いた多孔性微小球の製造工程中で揮発又は蒸発することなく多孔性微小球内に空隙を満たした状態で残留するようになる。したがって、前記したように気孔形成誘導物質を凍結乾燥を通じて除去する前までは、多孔性微小球内に空隙を形成した気孔形成誘導物質が保持されながら空隙安定性を極大化することができる。
【００２９】
本発明の一実施例に従い上述の製造方法にて製造された中空多孔性微小球は、中央に形成された空洞；及び前記空洞を取り囲む微細気孔を含む隔壁を含んでいてよい。また、本発明の一実施例は、中空多孔性微小球を含む皮膚組織の再生又は皮膚組織のボリューム増進注射用組成物を提供することができる。前記本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球を注射用組成物に含ませて皮膚組織内に注入すると、生体内皮膚組織細胞が前記微細気孔を通じて前記中空多孔性微小球内に移動し、中央の空洞で前記移動した皮膚組織細胞が増殖して、皮膚組織を再生又はボリュームを増進させることができる。すなわち、生体組織内に存在する細胞が前記中空多孔性微小球内に浸透し、成長分裂して新規生体組織を形成することができる。本発明の一実施例によれば、前記空隙及び気孔形成誘導物質と疎水性の生分解性高分子の混合比を調節することで、微小球の中央に形成される空洞の及び隔壁の微細気孔の大きさや形態を調節自在とすることができ、前記中空多孔性微小球の外部に存在する線維芽細胞、脂肪細胞などが多孔性微小球内に浸透した後、成長し分裂することができる空間を与えることができる。
【００３０】
また、本発明によれば、一定期間の経過後に前記中空多孔性微小球が皮膚内で生分解した後でも前記新規に増殖した皮膚組織細胞がその体積を保持するので、皮膚しわまたは皮膚陥没部位などの皮膚組織のボリューム増進効果を増大させるだけでなく、その効果を安全且つ長期に亘り保持することができる。したがって、本発明は、皮膚組織のような生体組織内に伝達することができる組織工学用足場を製造する技術であって、前記本発明によって製造された中空多孔性微小球は、皮膚組織再生を通じて皮膚しわまたは陥没部位の改善だけではなく、骨組織の再生のような医薬の産業にも適用され得る。より具体的に、本発明の前記中空多孔性微小球は、皮膚しわを含む老化の改善、皮膚色調の改善、又は皮膚弾力の改善用フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）又はリフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ）などを目的にして用いられてよいが、皮膚の組織再生のためであれば必ずしもこれらに制限されるものではない。例えば、人工皮膚、人工軟骨、骨充填剤、整形補型物などに用いられていてよい。
【００３１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではないと解釈されることは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００３２】
［実施例１］中空多孔性微小球の製造１
本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球を下記の方法で製造した（図１参照）。
段階１：微細流体デバイス（ｓｉｍｐｌｅ  ｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）の製作
ＰＶＣチューブに９０゜で折り曲げた３０ゲージの注射針を入れ、注射針とＰＶＣチューブとの間に微細ガラス管を挿入して微細流体デバイスを製作した。製作された微細流体デバイスはエポキシ接着剤を用いて微細な隙間を埋め込んだ。
【００３３】
段階２：アルカン類が含まれたＰＬＬＡ溶液の製造
疎水性の生分解性高分子としてＰＬＬＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ  ＬＲ  ７０４Ｓ、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＡＧ）０．１ｇ、揮発性溶媒としてジクロロメタン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ；３４３５５−０３５０、Ｊｕｎｓｅｉ）１０ｇ、気孔形成誘導物質としてアルカン類物質、具体的にオクタン（Ｏｃｔａｎｅ、４１２２３６、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）またはウンデカン（Ｕｎｄｅｃａｎｅ、Ｕ４０７、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）またはトリデカン（Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ、Ｔ５７４０１、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）またはペンタデカン（Ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、７６５１０、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ０．１ｇ、０．３ｇ及び０．６ｇ混ぜ合わせて疎水性の生分解性高分子（ＰＬＬＡ）溶液を製造した。
【００３４】
段階３：均一なＰＬＬＡエマルジョンの製造
微細流体デバイスに、２％  ＰＶＡ溶液を流速が分当たり１．５ｍｌの連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）で供給し、且つ前記ＰＶＡ溶液に、前記段階２で得たアルカン類が含まれたＰＬＬＡ溶液を３０ケージ注射器針を用いて流速が分当たり０．１ｍｌの不連続相（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）で供給して、一定の大きさを有するエマルジョンが形成されるようにした。
【００３５】
段階４：均一な中空多孔性微小球の製造
前記段階３で得たエマルジョンを２％  ＰＶＡ収集相（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）に分散させて１５０ｒｐｍで撹拌させた後、ジクロロメタンを十分に揮発させた。
【００３６】
段階５：気孔形成誘導物質を除去して多孔性付与
前記段階４で得たＰＬＬＡビードを蒸留水（Ｄ．Ｗ．）で数回洗浄した後、凍結乾燥器を利用してアルカン類を昇華させて均一な大きさの中空多孔性微小球の多孔性ＰＬＬＡビードを製造した。
【００３７】
前記製造された各中空多孔性微小球を図２に示した。気孔形成誘導物質の含量が増加するにつれて、または炭化水素鎖の長さが長くなるにつれて、微小球の中央に空洞がより効果的に製造されることを確認することができる。
【００３８】
［実施例２］中空多孔性微小球の製造２
本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球を下記の方法で製造した。
【００３９】
段階１：微細流体デバイス（ｓｉｍｐｌｅ  ｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）の製作
ＰＶＣチューブに９０゜で折り曲げた３０ケージの注射針を入れ、注射針とＰＶＣチューブとの間に微細ガラス管を挿入して微細流体デバイスを製作した。製作された微細流体デバイスはエポキシ接着剤を利用して微細な隙間を埋め込んだ。
【００４０】
段階２：植物性油が含まれたＰＬＬＡ溶液の製造
疎水性の生分解性高分子としてＰＬＬＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ  ＬＲ  ７０４Ｓ、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＡＧ）０．１ｇ、Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（３４３５５−０３５０、Ｊｕｎｓｅｉ）１０ｇ、気孔形成誘導物質として綿実油または大豆油をそれぞれ０．５ｇに混ぜ合わせて疎水性の生分解性高分子（ＰＬＬＡ）溶液を製造した。
【００４１】
段階３：均一なＰＬＬＡエマルジョンの製造
微細流体装置に、２％  ＰＶＡ溶液を流速が分当たり１．５ｍｌの連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）で供給し、且つ前記ＰＶＡ溶液に、前記段階２で得た植物性油が含まれたＰＬＬＡ溶液を３０ケージ注射器針を用いて流速が分当たり０．１ｍｌの不連続相（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）で供給して、一定の大きさを有するエマルジョンが形成されるようにした。
【００４２】
段階４：均一なＰＬＬＡビードの製造
前記段階３で得たエマルジョンを２％  ＰＶＡ収集相（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）に分散させて１５０ｒｐｍで撹拌させた後、ジクロロメタン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）を十分に揮発させた。
【００４３】
段階５：内部気孔形成誘導物質を除去して多孔性付与
前記段階４で得たＰＬＬＡビードを蒸留水（Ｄ．Ｗ.）で数回洗浄した後、凍結乾燥器を利用して植物性油を除去して均一な大きさの中空多孔性微小球の多孔性ＰＬＬＡビードを製造した。
【００４４】
［試験例１］皮膚組織細胞の培養
本発明の一実施例に係る中空多孔性微小球の中空形成の有無による細胞移動性及び増殖効能を比べるための実験を下記のように行った。
【００４５】
比較例として、中空を含まない多孔性微小球（ｓｍａｌｌ  ｐｏｒｅｓ：トリデカン３質量％）及び前記実施例１の中空を含む多孔性微小球（Ｌａｒｇｅ  ｐｏｒｅｓ：アルカン類でトリデカンを６質量ｗｔ％含む）をそれぞれ７０％エタノールで滅菌処理した後、ＰＢＳで十分に洗浄し、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を移植して細胞増殖の挙動を観察した。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培養培地に分散させスピンナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ）を利用して６時間撹拌した後、多孔性粒子を培養容器（ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ）に移して培養した。細胞培養して１、３、７、１０日目に前記培養した各多孔性微小球粒子をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色した後、細胞の付着及び増殖の有無を共焦点顕微鏡とＭＴＴ  ａｓｓａｙによって確認した。図３及び図４に示したように、中空を含む中空多孔性微小球（Ｌａｒｇｅ  ｐｏｒｅｓ）が、中空を含まず微細気孔のみを含む多孔性微小球（Ｓｍａｌｌ  ｐｏｒｅｓ）に比べて、内部気孔へのＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の浸透及び増殖が１０日目までに順調になされることを確認することができる。これは、多孔性微小球内に含まれた中空が細胞の浸透及び増殖において大きな効果があることを意味する。
【００４６】
本発明は、一実施例として次の実施形態を提供することができる。
【００４７】
第１実施形態は、中空多孔性微小球の製造方法であって、気孔形成誘導物質と疎水性の生分解性高分子を揮発性溶媒に溶解させることを含む高分子溶液の製造段階；前記高分子溶液を水又は相安定化剤を含む水溶液に分散させてＯ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する段階；前記高分子溶液が分散された水溶液上で揮発性溶媒を揮発させて前記疎水性の生分解性高分子を固形化して、疎水性の生分解性高分子と前記気孔形成誘導物質との間の自発的相分離を発生させて、Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させることを含む中空多孔性微小球の製造段階；及び前記中空多孔性微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００４８】
第２実施形態は、第１実施形態において、前記気孔形成誘導物質は、疎水性の生分解性高分子と相溶性がなく、且つ密度が水よりも低い疎水性流体である、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００４９】
第３実施形態は、第１実施形態及び第２実施形態のいずれか一つ以上において、前記気孔形成誘導物質は、アルカン（ａｌｋａｎｅ）類、植物性油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上の、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５０】
第４実施形態は、第３実施形態において、前記アルカン類は、オクタン（Ｏｃｔａｎｅ）、ウンデカン（Ｕｎｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（Ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上であり、前記植物性油は、大豆油、とうもろこし油、綿実油、オリーブ油、ブドウ種子油、くるみ油、ゴマ油、エゴマ油及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上である、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５１】
第５実施形態は、第１実施形態〜第４実施形態のいずれか一つ以上において、前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、微細流体デバイスに前記水又は相安定化剤を含む水溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給された水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５２】
第６実施形態は、第１実施形態〜第５実施形態のいずれか一つ以上において、前記高分子溶液を不連続相で供給する速度を調節して、中空多孔性微小球の粒子及び気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５３】
第７実施形態は、第１実施形態〜第６実施形態のいずれか一つ以上において、前記Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型のエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に含まれた油相高分子溶液をＯ／Ｓ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ）微小球に変換させる段階は、膜乳化装置に前記水又は相安定化剤を含む水溶液を連続相で供給し、前記連続相で供給された水又は相安定化剤を含む水溶液に前記高分子溶液を不連続相で供給する段階を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５４】
第８実施形態は、第７実施形態において、前記膜乳化装置の膜に形成された空隙の大きさを調節して、中空多孔性微小球の粒子及び気孔のうちの一つ以上の大きさ及び形態を調節する段階をさらに含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５５】
第９実施形態は、第１実施形態〜第８実施形態のいずれか一つ以上において、前記微小球に含まれた気孔形成誘導物質を除去する段階は、前記微小球を水で洗浄した後に凍結乾燥させて気孔形成誘導物質を除去する段階を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５６】
第１０実施形態は、第１実施形態〜第９実施形態のいずれか一つ以上において、前記疎水性の生分解性高分子は、ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ、ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＧＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ）、ポリ−ε−（カプロラクトン）（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｉｙａｌｃｏｈｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｐｏｌｙ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）共重合体（ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−ｐｏｌｙ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ−ｐｏｌｙ  ｅｔｈyｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、これらの共重合体及びこれらの混合物からなる群より選択された一つ以上である、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５７】
第１１実施形態は、第１実施形態〜第１０実施形態のいずれか一つ以上において、前記製造される中空多孔性微小球は、中央に形成された空洞；及び前記空洞を取り囲む微細気孔を含む隔壁を含む、中空多孔性微小球の製造方法を提供することができる。
【００５８】
第１２実施形態は、第１実施形態〜第１０実施形態のいずれか一つ以上の製造方法によって製造された中空多孔性微小球を含む皮膚組織の再生又は皮膚組織のボリューム増進注射用組成物を提供することができる。
【００５９】
前記実施形態は本発明の説明のために開示されたものであり、前記説明は本発明の範囲を制限するものではない。したがって、当該技術分野の通常の技術者であれば本発明の意味及び範囲を逸脱することなく、種々の修正、変形、及び代替が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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