(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする細胞修復剤。
【請求項２】
生体に対して殺菌処理および／または消毒処理を行う殺菌消毒手段と、
前記殺菌消毒手段による前記生体の被処理部に対して、請求項１記載の細胞修復剤を接触可能に設けられた後処理手段とを、
有することを特徴とする殺菌消毒システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞修復剤および殺菌消毒システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症に対するリスクは年齢とともに増加し、我が国における６０歳以上の年齢層では、感染症の一つである肺炎が死因の第４位となっている。感染症には、肺炎や敗血症といったような生命に関わる類のものから、皮膚感染である白癬菌症（水虫）や歯科疾患である歯周病などに至るまで、原因となる微生物あるいは感染部位などによって様々な病態が含まれる。いずれの感染症においても病原性微生物の除去が治療の第一目標であり、多くのケースで治療のために抗生物質などの薬剤の投与が行われている。しかしながら、抗生物質の多用は薬剤耐性菌の出現を招き、昨今問題となっている多剤耐性菌による院内感染の発生といったような深刻な問題に繋がることがある。従って、抗生物質の投与に変わる殺菌療法の確立が望まれている。【０００３】
塩化ナトリウムあるいは塩化カリウム水溶液を電気分解して得られる酸性電解水の活性本体は次亜塩素酸であるが（例えば、非特許文献１参照）、この次亜塩素酸が菌体細胞に入ると、活性酸素の一種であるヒドロキシルラジカルが生成され、その強力な酸化力により殺菌効果を発揮する（例えば、非特許文献２参照）。また、過酸化水素の光分解殺菌技術は、過酸化水素に近紫外可視光を照射して過酸化水素をホモリチックに分解することで生じるヒドロキシルラジカルの酸化力を応用した殺菌技術である（例えば、非特許文献３参照）。【０００４】
従来の抗生物質の投与による殺菌療法に対する、酸性電解水や過酸化水素の光分解殺菌技術といったヒドロキシルラジカルを利用した殺菌技術の大きな利点は、耐性菌を発生させないことである（例えば、非特許文献４参照）。酸性電解水は、この利点のため、食品分野のみならず医療分野でも活用されており、特に口腔内感染性疾患や手術時の殺菌消毒の目的でも使用が試みられている（例えば、非特許文献４または５参照）。過酸化水素の光殺菌技術も歯周病への応用が模索されている（例えば、非特許文献６参照）。しかし、酸性電解水および過酸化水素の光分解殺菌技術ともその強い酸化力のため、病原性微生物のみならず疾患部位の細胞に対しても障害を発揮する懸念がある（例えば、非特許文献７乃至９参照）。また、ヒドロキシルラジカルを介さない既存消毒剤にも細胞毒性が強いものがあり、同様に疾患部位の細胞に対しても障害を発揮する懸念はある（例えば、非特許文献１０参照）。【０００５】
一方、ポリフェノールは、抗酸化作用を有し、炎症部位において好中球などの炎症性細胞が産生する活性酸素による局所組織の酸化的傷害を抑制する作用を有することが知られており、皮膚外用薬や口腔用剤などに使用されている（例えば、特許文献１乃至６、非特許文献１１または１２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Mokudai et al., “Presence of hydrogen peroxide, a source of hydroxyl radicals, in acid electrolyzed water”, PLoS ONE, 2012, 7, e46392
【非特許文献２】福崎智司、「次亜塩素酸による洗浄・殺菌機構と細菌の損傷」、日本食品微生物学会雑誌、2009、26、p.76-80
【非特許文献３】H. Ikai et al., “Photolysis of hydrogen peroxide, an effective disinfection system via hydroxyl radical formation”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, 49, p.5086-5091
【非特許文献４】H. Ikai et al., “In vitro evaluation of the risk of inducing bacterial resistance to disinfection treatment with photolysis of hydrogen peroxide”, PLoS ONE, 2013, 8, e81316
【非特許文献５】田仲紀陽  他、「透析医療と強酸性電解水」、日本透析医学会雑誌、2004、37、p.1273-1283
【非特許文献６】A. Oyamada et al., “In vitro bactericidal activity of photo-irradiated oxydol products via hydroxyl radical generation”, Biocontrol Sciences, 2013, 18, p.88
【非特許文献７】K. Okubo et al., “Cytotoxicity and microbicidal activity of electrolyzed strong acid water and acidic hypochlorite solution under isotonic conditions”, 感染症学雑誌, 1999, 73, p.1025-1031
【非特許文献８】K. Gomi et al., “Microbicidal and cytotoxic effects of functional water in vitro”, Quintessence International, 2010, 41, e166-172
【非特許文献９】猪飼紘代  他、「過酸化水素光分解により生じるヒドロキシルラジカルの細胞毒性評価」、第64回日本参加ストレス学会学術集会−プログラム・抄録集−、73ページ
【非特許文献１０】中島啓二  他、「細胞増殖および創傷治癒に対する消毒剤の抑制作用(in vitro)」、日本病院薬剤師会雑誌、2004、40、p.1559-1562
【非特許文献１１】M. A. Soobrattee et al., “Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions”, Mutation Research, 2005, 579, p.200-213
【非特許文献１２】C. A. RICE-EVANS et al., “Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids”, Free Radical Biology & Medicine, 1996, 20, p.933-956
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００５／０９２３２７号
【特許文献２】特開平６−３３６４２２号公報
【特許文献３】特許第３９１７３７０号公報
【特許文献４】特願２００５−２１３２３４号公報
【特許文献５】特開２００９−５２１８５号公報
【特許文献６】特表２０１０−５１１０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献７乃至１０に記載のように、酸性電解水、過酸化水素の光分解殺菌技術、および既存の消毒剤が、その強い酸化力のため、病原性微生物のみならず疾患部位の細胞に対しても障害を発揮する恐れがあり、その障害を修復するための技術の開発が期待されていた。また、特許文献１乃至６、非特許文献１１および１２に記載のように、ポリフェノールが、炎症性細胞が産生する活性酸素による局所組織の酸化的障害の抑制作用を有することは知られていたが、酸性電解水等によって重度の障害を受けた細胞に対して修復作用を有することは、これまで確認されていなかった。【０００９】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、酸性電解水などの酸化力により障害を受けた細胞を修復することができる細胞修復剤、ならびに、安全かつ効率的に、皮膚や口腔内の感染創傷の殺菌および治癒を促進することができる殺菌消毒システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意研究の結果、カテコール基あるいはピロガロール基を有する特定のポリフェノールおよびその重合体組成物が、酸性電解水によって重度の障害を受けた細胞に対して、修復効果を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
即ち、本発明に係る細胞修復剤は、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る細胞修復剤は、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールのうちの少なくとも１種を含むため、殺菌消毒で使用される酸性電解水の酸化力などにより障害を受けた細胞を修復することができる。また、炎症部位において好中球などの炎症性細胞が産生する活性酸素による局所組織の酸化的傷害の抑制作用も期待できる。
【００１４】
本発明に係る細胞修復剤は、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールのうちの少なくとも１種を含むため、殺菌消毒で使用される酸性電解水などの酸化力により障害を受けた細胞を修復することができる。
【００１５】
本発明に係る殺菌消毒システムは、生体に対して殺菌処理および／または消毒処理を行う殺菌消毒手段と、前記殺菌消毒手段による前記生体の被処理部に対して、本発明に係る細胞修復剤を接触可能に設けられた後処理手段とを、有することを特徴とする。【００１６】
本発明に係る殺菌消毒システムは、殺菌消毒後に、本発明に係る細胞修復剤で処理することにより、殺菌消毒で使用される酸性電解水などの酸化力により障害を受けた細胞を修復することができる。このため、本発明に係る殺菌消毒システムは、安全かつ効率的に、皮膚や口腔内の感染創傷の殺菌および治癒を促進することができる。また、本発明に係る殺菌消毒システムは、取り扱いが容易であり、短時間の処理でも感染部位や手術時の殺菌消毒を安全かつ効率的に行うことができる。殺菌消毒手段としては、例えば、液体の殺菌剤および／または消毒剤を噴射、散布、浸漬、灌流または塗布する装置、気体の殺菌剤および／または消毒剤を充満または噴射する装置が挙げられる。後処理手段としては、例えば、細胞修復剤の溶液または分散液を噴射、散布、浸漬、灌流または塗布する装置が挙げられる。後処理手段は、殺菌消毒手段と別個に操作するようになっていても、殺菌消毒手段と連動して、殺菌消毒手段を操作すると細胞修復剤を接触させるようになっていてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、酸性電解水などの酸化力により障害を受けた細胞を修復することができる細胞修復剤、ならびに、安全かつ効率的に、皮膚や口腔内の感染創傷の殺菌および治癒を促進することができる殺菌消毒システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、様々な希釈率（dilution）の酸性電解水（ＡＥＷ）による、（Ａ）増殖期のマウス線維芽細胞の増殖率（cell viability）への影響、（Ｂ）定常期のマウス線維芽細胞の増殖率（cell viability）への影響を示すグラフである。
【図２】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、様々な希釈率（dilution）の酸性電解水（ＡＥＷ）により、定常期のマウス線維芽細胞の内部で発生したＲＯＳ量を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、（Ａ）４倍希釈の酸性電解水、（Ｂ）酸性電解水原液により、マウス線維芽細胞の細胞内ＲＯＳを上昇させた後、それぞれジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）およびプロアントシアニジン（ＰＡ）で処理したときの細胞内ＲＯＳ量を示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のマウス線維芽細胞を様々な希釈の酸性電解水で処理した後、それぞれＤＭＳＯおよびプロアントシアニジンで後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のヒト歯肉線維芽細胞を様々な希釈の酸性電解水で処理した後、それぞれＤＭＳＯおよびプロアントシアニジンで後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（cell viability）を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のマウス線維芽細胞を１／４希釈および原液の酸性電解水で処理した後、（＋）−カテキンで後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図７】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のマウス線維芽細胞を酸性電解水原液で処理した後、それぞれクロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸で後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のマウス線維芽細胞を酸性電解水原液で処理した後、プロアントシアニジンで（Ａ）１分間、（Ｂ）５分間の後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図９】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のマウス線維芽細胞を（Ａ）クロルヘキシジン原液（ＣＨＬ）、（Ｂ）イソジン１５倍希釈液（ＩＳＯ）で処理した後、プロアントシアニジンで後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施の形態の細胞修復剤に関し、増殖期のヒト歯肉線維芽細胞を過酸化水素光分解殺菌法（Ｈ２Ｏ２＋ＬＤ）で処理した後、プロアントシアニジンで後処理を行ったときの、細胞増殖の程度（viable cells）を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施の形態の殺菌消毒システムの、歯周感染症に対する応用の一例を示す使用状態の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態の細胞修復剤は、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールのうちの少なくとも１種を含んでいる。
以下に、様々な試験の結果に基づいて、本発明の実施の形態の細胞修復剤について説明する。なお、本発明は、これらの試験例（実施例）になんら限定されるものではない。
【００２０】
［試験１：増殖期および定常期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の影響］
増殖期および定常期のマウス線維芽細胞に対する酸性電解水の影響を調べる試験を行った。試験に使用する酸性電解水（ＡＥＷ）は、０．０６〜０．０８％塩化ナトリウム水溶液を電解質溶液として、電気分解装置（株式会社アルテック社製「ALTRON-MINI AL-700」）を用いて、交流電圧１００Ｖおよび定格電流０．６Ａで１５分間電気分解することにより得た。得られた酸性電解水のｐＨ、酸化還元電位（ＯＲＰ）および残留塩素濃度は、ｐＨ／ＯＲＰメーター（Mettler-Toled社製「ＳＧ２」）および残留塩素メーター（HANNA Instruments Japan社製「HI96771C」）を用いて測定した。その結果、酸性電解水は、ｐＨが２．２〜２．７、ＯＲＰが１１００ｍＶ以上、残留塩素濃度が３０〜６０ｍｇ／ｌであることを確認した。
【００２１】
試験は、以下のようにして行った。まず、２５ｃｍ２フラスコで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した細胞（マウス由来３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞；ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より購入）を、0.25%Trypsin-EDTA液（Life Technologies社製）で処理し、常法に従って、細胞密度が２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう培地にて細胞懸濁液を調製した。ここで培地は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ；Life Technologies社製）に、ウシ胎児血清（Life Technologies社製）、およびペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン；和光純薬工業製）を、それぞれ１０％(ｖ／ｖ)、１％(ｖ／ｖ)になるよう添加したものを、増殖用培地として用いた。
【００２２】
この細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６−ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに播種した。増殖期の細胞は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で約２５時間培養後、また定常期の細胞は、４日間培養後、培地を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（phosphate buffered saline，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で洗浄後、純水にて希釈した２倍希釈系列の酸性電解水を１００μｌずつ各ｗｅｌｌに加えた。３０秒後に２倍希釈系列の酸性電解水を除去し、ＰＢＳで洗浄した。
【００２３】
増殖期の細胞は、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を再開した。培養２４時間後に、ＭＴＴ（methyl thiazolyl tetrazorium）法により細胞増殖の程度を測定した。具体的には、培養２２時間後にＭＴＴ試薬（Trevigen社製）を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養した。培養後、Detergent試薬（Trevigen社製）を各１００μｌ加え、遮光下、室温で一晩放置した。その後、５９５ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製「FilterMaxＴＭ  Ｆ５  Multi-Mode Microplate Reader」）を用いて測定した。滅菌生理食塩水処理を対照群（control）とし、対照群の吸光度を１００％とした時の各処理群の割合（％）を算出した。
【００２４】
定常期の細胞は、洗浄後にＭＴＴ試薬（Trevigen社製）を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養後、同様の操作を行い、対照群（control）の吸光度を１００％とした時の各処理群の割合（％）を算出した。なお、各対照群の平均値との有意差は、Dunnettの多重比較解析法で検定した。
【００２５】
試験の結果を、図１に示す。図１（ａ）に示すように、増殖期のマウス線維芽細胞に対しては、酸性電解水（ＡＥＷ）の希釈率（dilution）が３２倍程度までは、酸性電解水の希釈率が小さくなる（濃度が高くなる）に従って、細胞の増殖率（cell viability）が低下していくことが確認された。特に希釈率が４倍以下のときに、細胞の増殖率が有意に低く、酸性電解水により多くの細胞に障害が発生していると考えられる。また、図１（ｂ）に示すように、定常期のマウス線維芽細胞に対しては、酸性電解水（ＡＥＷ）の希釈率（dilution）が２倍以下のときに、細胞の増殖率が有意に低くなっていることが確認され、酸性電解水により多くの細胞に障害が発生していると考えられる。
【００２６】
［試験２：定常期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の影響−細胞内ＲＯＳ量−］
定常期のマウス線維芽細胞に酸性電解水を接触させたときに発生する、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を調べる試験を行った。まず、試験１と同様に調製・培養した定常期のマウス線維芽細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄後、純水にて希釈した４倍希釈系列の酸性電解水を１００μｌずつ各ｗｅｌｌに加えた。３０秒後に２倍希釈系列の酸性電解水を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、直ちに細胞内ＲＯＳ量を測定キット（Cell Biolabs社製「OxiselectTM Intracellular ROS Assay Kit」）を用いて測定した。
【００２７】
具体的には、血清無添加培地（ＤＭＥＭのみ）に溶解した１００μｌの1mM 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin Diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を各ｗｅｌｌに加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間培養した。培養後、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、2X Cell Lysis Buffer（Cell Biolabs社製）１００μｌと血清無添加ＤＭＥＭ１００μｌとを加え、５分間静置した。各Ｗｅｌｌより１５０μｌをブラック９６穴マイクロプレートに移し、励起波長４５０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製「FilterMaxTM F5 Multi-Mode Microplate Reader」）にて測定した。標準曲線は、2’,7’-dichlorodihydrofluorescein（ＤＣＦ）を用いて作製し、細胞内ＲＯＳ量はＤＣＦ当量（ｎＭ）で表した。なお、各対照群（control）の平均値との有意差は、Dunnettの多重比較解析法で検定した。
【００２８】
試験の結果を、図２に示す。図２に示すように、定常期のマウス線維芽細胞に対しては、酸性電解水（ＡＥＷ）の希釈率（dilution）が４倍以下のときに、ＤＣＦ当量が有意に増加しており、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）が増えていることが確認された。図１の結果と合わせると、希釈率が２〜４倍以下の酸性電解水をマウス線維芽細胞に接触させることにより、細胞内のＲＯＳが増加して細胞毒性を誘発し、多くの細胞に障害が発生するものと考えられる。
【００２９】
［試験３：酸性電解水により上昇した定常期マウス線維芽細胞内ＲＯＳ量に及ぼすＤＭＳＯおよびプロアントシアニジンの影響］
試験２と同様に、定常期のマウス線維芽細胞を、４倍希釈の酸性電解水および酸性電解水原液で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、ヒドロキシルラジカルのスカベンジャーとして、１４０ｍＭ  ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）あるいは１ｍｇ／ｍｌのプロアントシアニジン（Indeda社製「Leucoselect（登録商標）」）を含む１ｍＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡを、各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間培養した。培養後、試験２と同様に、細胞内細胞内ＲＯＳ量を定量した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００３０】
試験の結果を図３に示す。図３に示すように、酸性電解水（ＡＥＷ）により増加した定常期マウス線維芽細胞内のＲＯＳは、ヒドロキシラジカルの消去剤であるＤＭＳＯおよびプロアントシアニジン（ＰＡ）により有意に低下していることが確認された。
【００３１】
［試験４：増殖期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の細胞毒性に及ぼすＤＭＳＯおよびプロアントシアニジンの影響］
試験１と同様に、増殖期のマウス線維芽細胞を、４倍希釈の酸性電解水および酸性電解水原液で３０秒間処理した。リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１４０ｍＭ  ＤＭＳＯあるいは１ｍｇ／ｍｌのプロアントシアニジンを、各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００３２】
試験の結果を、図４に示す。図４に示すように、酸性電解水（ＡＥＷ）により影響を受けた増殖期のマウス線維芽細胞では、ＤＭＳＯを使用しても、細胞の増殖状態に変化が認められないことが確認された。このことから、酸性電解水によりＲＯＳが増加して細胞毒性が誘発された細胞は、酸性電解水処理直後に重度の障害を受けており、ＤＭＳＯでＲＯＳを消去しても、その障害から回復できないものと考えられる。これに対し、プロアントシアニジンを使用した場合には、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認され、細胞が修復されて障害から回復していると考えられる。
【００３３】
［試験５：増殖期のヒト歯肉線維芽細胞に対する酸性電解水の細胞毒性に及ぼすＤＭＳＯおよびプロアントシアニジンの影響］
増殖期のヒト歯肉線維芽細胞について、試験４と同様の試験を行った。まず、２５ｃｍ２フラスコで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養したヒト歯肉線維芽細胞（株式会社プライマリーセルより購入）を、マウス線維芽細胞の場合と同様に、細胞密度が２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう培地にて細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６−ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後、試験４と同様に、増殖期の細胞を４倍希釈の酸性電解水および酸性電解水原液で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１４０ｍＭ  ＤＭＳＯあるいは１ｍｇ／ｍｌのプロアントシアニジンを、各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００３４】
試験の結果を、図５に示す。図５に示すように、図４と同様に、酸性電解水（ＡＥＷ）により影響を受けた増殖期のヒト歯肉線維芽細胞では、ＤＭＳＯを使用しても、細胞の増殖状態に変化が認められないことが確認された。このことから、酸性電解水によりＲＯＳが増加して細胞毒性が誘発された細胞は、酸性電解水処理直後に重度の障害を受けており、ＤＭＳＯでＲＯＳを消去しても、その障害から回復できないものと考えられる。これに対し、プロアントシアニジンを使用した場合には、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認され、細胞が修復されて障害から回復していると考えられる。
【００３５】
［試験６：増殖期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の細胞毒性に及ぼす（＋）−カテキンの影響］
試験４と同様に、増殖期のマウス線維芽細胞を、４倍希釈の酸性電解水および酸性電解水原液で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１ｍｇ／ｍｌの（＋）−カテキン（東京化成工業社製）を各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００３６】
試験の結果を、図６に示す。図６に示すように、酸性電解水（ＡＥＷ）により影響を受けた増殖期のマウス線維芽細胞に、（＋）−カテキンを使用した場合には、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認された。このことから、酸性電解水処理直後にＲＯＳの増加により重度の障害を受けた細胞であっても、（＋）−カテキンを使用することにより修復されて障害から回復するものと考えられる。
【００３７】
［試験７：増殖期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の細胞毒性に及ぼすクロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸の影響］
試験４と同様に、増殖期のマウス線維芽細胞を、酸性電解水原液で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１ｍｇ／ｍｌのクロロゲン酸（Sigma-Aldrich社製）、カフェイン酸（東京化成工業社製）および没食子酸（東京化成工業社製）を、各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分あるいは３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００３８】
試験の結果を、図７に示す。図７に示すように、酸性電解水（ＡＥＷ）により影響を受けた増殖期のマウス線維芽細胞に、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸をそれぞれ使用した場合には、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認された。このことから、酸性電解水処理直後にＲＯＳの増加により重度の障害を受けた細胞であっても、クロロゲン酸、カフェイン酸または没食子酸を使用することにより修復されて障害から回復するものと考えられる。
【００３９】
［試験８：増殖期マウス線維芽細胞に対する酸性電解水の細胞毒性に及ぼすプロアントシアニジン後処理時間の影響］
試験４と同様に、増殖期のマウス線維芽細胞を、酸性電解水原液で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１ｍｇ／ｍｌのプロアントシアニジンを各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、それぞれ室温で１分間および５分間静置した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００４０】
試験の結果を、図８に示す。図８（ａ）に示すように、酸性電解水（ＡＥＷ）により影響を受けた細胞を、プロアントシアニジンで１分間処理することにより、細胞の増殖状態が有意に向上することが確認された。また、図８（ｂ）に示すように、プロアントシアニジンで５分間処理した場合には、細胞の増殖状態がさらに向上し、対照群（control）の程度まで回復していることが確認された。
【００４１】
［試験９：増殖期マウス線維芽細胞に対するクロルヘキシジンおよびイソジンの細胞毒性に及ぼすプロアントシアニジンの影響］
試験４と同様に、増殖期のマウス線維芽細胞を、クロルヘキシジン原液（ＣＨＬ；Xttrium Laboratories社製）あるいは、ＰＢＳで１５倍希釈したイソジンガーグル液７％（ＩＳＯ；明治製菓社製）で３０秒間処理した。ＰＢＳで洗浄後、血清無添加ＤＭＥＭで調製した１ｍｇ／ｍｌのプロアントシアニジンを各ｗｅｌｌに１００μｌ加え、室温で５分間静置した。ＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００４２】
試験の結果を、図９に示す。図９に示すように、それぞれクロルヘキシジン（ＣＨＬ）およびイソジン（ＩＳＯ）により影響を受けた増殖期のマウス線維芽細胞に、プロアントシアニジン（ＰＡ）を使用した場合にも、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認された。このことから、クロルヘキシジンやイソジンなどの消毒薬で処理し、重度の障害を受けたと考えられる細胞であっても、プロアントシアニジンを使用することにより修復されて障害から回復するものと考えられる。
【００４３】
［試験１０：増殖期のヒト歯肉線維芽細胞に対する過酸化水素光分解殺菌法の細胞毒性に及ぼすプロアントシアニジンの影響］
試験５と同様にして得られた増殖期のヒト歯肉線維芽細胞を、ＰＢＳで洗浄後、５００ｍＭ過酸化水素水を１００μｌ加え、４０５ｎｍのレーザー光を出力１００ｍＷ（放射照度は３１０ｍＷ／ｃｍ２）で３０秒間照射した。レーザー光照射は、インジウムガリウム窒化物をレーザーダイオードとして装着したレーザー装置（リコー光学株式会社製「ＲＶ−１０００」）を用いて行った。
【００４４】
照射後、１０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（和光純薬工業社製、血清無添加ＤＭＥＭで希釈したもの）を１００μｌ注入した。全ｗｅｌｌにおいて本処理が終了した後、血清無添化ＤＭＥＭで２回洗浄し、プロアントシアニジンを１ｍｇ／ｍｌ含有する血清無添化ＤＭＥＭを１００μｌ添加し、３０分間培養した。培養後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後、新鮮培地を１００μｌ加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞増殖の程度をＭＴＴ法で測定した。なお、各群間の有意差は、Tukey-Krammerの多重比較解析法で検定した。
【００４５】
試験の結果を、図１０に示す。図１０に示すように、ヒドロキシラジカルを活性本体とする過酸化水素の光分解殺菌（Ｈ２Ｏ２＋ＬＤ）により影響を受けた増殖期のヒト歯肉線維芽細胞に、プロアントシアニジン（ＰＡ）を使用した場合にも、細胞の増殖状態が有意に向上していることが確認された。このことから、過酸化水素の光分解殺菌法で処理し、重度の障害を受けたと考えられる細胞であっても、プロアントシアニジンを使用することにより修復されて障害から回復するものと考えられる。
【００４６】
以上の各試験結果から、以下のことがわかる。すなわち、図１および図２に示すように、酸性電解水は、マウス線維芽細胞やヒト歯肉線維芽細胞に対して、細胞内ＲＯＳの上昇を介して細胞毒性を誘発する。この細胞内ＲＯＳは、図３に示すように、ヒドロキシルラジカルの消去剤であるＤＭＳＯおよびプロアントシアニジン処理により有意に低下したことから、すくなくともヒドロキシルラジカルを含んでいる。しかし、図４および図５に示すように、増殖期の細胞に対する酸性電解水の細胞毒性は、ＤＭＳＯによっては影響を受けなかったことから、細胞は酸性電解水処理直後からＲＯＳにより重度の障害を受け、その後にＲＯＳを消去しても細胞は障害から回復できない状態にあることがわかる。
【００４７】
しかしながら、図４乃至図７に示すように、そのような状態の細胞に対しても、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、カフェイン酸、クロロゲン酸などで処理した場合には、細胞は障害から有意に回復していた。また、図８に示すように、プロアントシアニジンの試験では、１分間および５分間という短い時間でも有意な回復がみられた。従って、酸性電解水を殺菌消毒の目的で生体に処理した後、プロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノールで処理する構成は、酸性電解水による組織障害を大きく改善できる、非常に優れた新しい殺菌消毒システムになる。
【００４８】
図９および図１０に示すように、酸性電解水に加えて、クロルヘキシジンやイソジンなどの消毒薬、ヒドロキシルラジカルを活性本体とする過酸化水素の光分解殺菌法の細胞毒性も、プロアントシアニジン後処理により有意に改善されたことから、細胞毒性のある抗菌化学療法とプロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノール後処理との組み合せは、抗菌化学療法の組織障害を軽減する技術として有用である。
【００４９】
また、再生医療の分野で実施される、各種幹細胞の増殖時における細胞障害性の刺激からの保護技術としての応用も可能である。例えば、骨髄幹細胞の場合は、洗浄処理が必要であるが、洗浄処理中あるいは処理後にポリフェノールを少量加えることで、洗浄処理による細胞障害を軽減することができる。
【００５０】
本発明の実施の形態の細胞修復剤を利用した殺菌消毒システムの一例を、図１１に示す。図１１に示すように、本発明の実施の形態の殺菌消毒システム１０は、歯周感染症に対する殺菌消毒システムであり、先端の噴射口１１ａから液体を噴出可能に設けられた噴射器本体１１と、噴射口１１ａから酸性電解水を噴射して殺菌処理を行う殺菌消毒手段１２と、殺菌消毒手段１２による被処理部に対して、噴射口１１ａから本発明の実施の形態の細胞修復剤であるポリフェノール溶液を噴射可能に設けられた後処理手段１３とを有している。
【００５１】
殺菌消毒システム１０は、以下のようにして使用される。すなわち、図１１に示すように、殺菌消毒手段１２により歯周病患部（歯周ポケット）１を酸性電解水で灌流し、続いて後処理手段１３により歯周病患部１をポリフェノール溶液で灌流する。このとき、ポリフェノール溶液で後処理することにより、酸性電解水の酸化力により障害を受けた細胞を修復することができる。このように、殺菌消毒システム１０は、安全かつ効率的に、皮膚や口腔内などの感染創傷の殺菌および治癒を促進することができる。また、殺菌消毒システム１０は、取り扱いが容易であり、短時間の処理でも感染部位や手術時の殺菌消毒を安全かつ効率的に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
酸性電解水、過酸化水素光分解殺菌、各種消毒薬などの抗菌化学療法に続くプロアントシアニジン、（＋）−カテキン、クロロゲン酸、カフェイン酸および没食子酸からなる群から選ばれるポリフェノール処理は、その効果から、医療用の薬剤として使用することができるため、本発明に係る殺菌消毒システムは、医療、特に皮膚治療、口腔内治療の分野において有用である。また、本発明に係る細胞修復剤は、酸性電解水等による殺菌消毒後の細胞の修復に限らず、癌手術や心臓手術、移植手術などの手術後の細胞の修復に利用することもできる。
【符号の説明】
【００５３】
１  歯周病患部
１０  殺菌消毒システム
１１  噴射器本体
１１ａ  噴射口
１２  殺菌消毒手段
１３  後処理手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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