(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなる、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのＮ-またはＣ-末端はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)からなる群から選択される保護基と結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
肌再生または傷治療に使用するための、配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなるペプチドを有効成分として含む、薬学的組成物。
【請求項４】
前記ペプチドのＮ-またはＣ-末端はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)からなる群から選択される保護基と結合されていることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは１乃至５００ng/ml濃度で含有されていることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記傷は創傷によるものであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
肌老化または傷改善に使用するための、配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなるペプチドを有効成分として含む、化粧品組成物。
【請求項９】
前記組成物は懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、ワックスまたはスプレー形態であることを特徴とする、請求項８に記載の化粧品組成物。
【請求項１０】
前記組成物は肌美白活性を有することを特徴とする、請求項８に記載の化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肌再生または傷治療用ペプチド及びこの用途に関するものである。  
【０００２】
本発明は、大韓民国汎部支援下で課題番号１７１１０３０９７５によってなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は創意素材ディスカバリー事業、研究課題名は機能性免疫体技術基盤の生分解性肌再生素材開発、研究期間は２０１５．１２．０４〜２０１６．０４．３０．である。  
【０００３】
本特許出願は、２０１６年０３月２３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０-２０１６-００３４３２７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。 
【背景技術】
【０００４】
肌は人体の一次防御膜として体内の器官らを温度、湿度変化、紫外線、公害物質など外部環境による刺激から保護してくれて、体温調節などの生体恒常性維持に重要な役割をする。このような肌の一番外側に存在する角質は肌の細胞が変化されて生じた組織であり、完全に死んだ細胞で構成されている。真皮層の肌結合組織中にきめが粗く形成された細胞層は表皮層に上がりながら細胞の生命力が消えて、堅固で規則的な細胞層に変わるようになる。このような構成からなる肌は一番外部で私らの身の水分を守ってくれて外から入って来るさまざまな物質らを防御する防御線のような役割をする。すなわち、肌の表面に傷が生じる場合、表皮の早い再生能力は傷の回復を促進して傷を通じた追加感染を防止して、肌表面の傷あとを減らしてくれる役割ができる。  
【０００５】
傷が生じた肌組織が再構成される場合、さまざまな反応らが関与して具体的に、角質細胞の移動、増殖、分化、損傷細胞の脱落、外被組織の生産が関与されている。傷治癒の過程は各種細胞と因子が関与して非常に複雑な反応として、先ず傷部位に血小板が凝集して形質転換増殖因子、血小板来由増殖因子、上皮細胞増殖因子などのさまざまな細胞増殖因子が遊離されることによって血管内皮、貪食細胞、繊維芽細胞、上皮細胞などに刺激を与えて細胞増殖を促進するようになって、これと同時にこれら細胞自身も自己分泌的に繊維芽細胞増殖、形質転換増殖因子、インターロイキンなどの物質を生産、放出しながら傷治癒機轉が進行される。  
【０００６】
現在、多様な活性を有していて傷治療製剤で広く使われているＥＧＦ(表皮成長因子、Epidermal growth factor)は精製して得るか、またはバクテリアで過剰発現して得る方法が使われている。直接精製して得る場合時間、お金、そして労動力がたくさん必要となって、またバクテリアでの過剰発現方法は、細胞内での低い発現量とバクテリアのタンパク質分解酵素などによって回収収率が非常に低いという問題点がある。また、ＥＧＦは慢性の傷部位には低い治療効果を示すという報告があり、温度及びタンパク質分解酵素による短い半減期によって効率対比価格が高いという問題によって商用化に困難を経験しているのが実情である。  
【０００７】
このような背景下で、従来の肌再生または傷治療用製剤の問題点を最小化させながら有効な治療効果を有する新しい治療剤の開発が要求されるのが実情であり、これに対する研究が活発に進行されているが(韓国公開特許第１０-２０１５-０１３５７４３号)、まだまだ不備なのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は前記のような問題点を解決するために案出されたものであり、本発明者らは肌再生または傷治療用製剤に対して例の研究をした結果、１５個以下のアミノ酸からなるペプチドを製造した上で、前記ペプチドを処理した場合、繊維コラーゲン生成量増進、黒色腫細胞のメラニン生成量及びチロシナーゼ活性抑制効果を確認して、これに基づいて本発明を完成するようになった。  
【０００９】
これに、本発明の目的は、配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなる、肌再生または傷治療用ペプチドを提供することである。  
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記ペプチドまたはこれをコーディングするポリヌクレオチドを有効成分として含む、肌再生または傷治療用薬学的組成物を提供することである。  
【００１１】
また、本発明のまた他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む、肌老化または傷改善用健康機能食品/化粧品組成物を提供することである。  
【００１２】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題で制限されないし、言及されなかったまた他の課題などは下の記載から当業者に明確に理解されることができるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなる、ペプチドを提供する。  
【００１４】
本発明の一具体例として、前記ペプチドのＮ-またはＣ-末端はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)からなる群から選択される保護基と結合されてもよい。  
【００１５】
また、本発明は前記ペプチドまたはこれをコーディングするポリヌクレオチドを有効成分として含む肌再生または傷治療用薬学的組成物を提供する。  
【００１６】
本発明の一具体例として、前記ペプチドは１乃至５００ng/ml濃度で含有されてもよい。  
【００１７】
本発明の他の具体例として、前記傷は創傷によるものであってもよい。  
【００１８】
本発明のまた他の具体例として、前記組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。  
【００１９】
また、本発明は前記ペプチドを有効成分として含む肌老化または傷改善用化粧品組成物を提供する。  
【００２０】
本発明の一具体例として、前記組成物は懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、ワックスまたはスプレー形態であってもよい。  
【００２１】
本発明の他の具体例として、肌美白活性を有してもよい。  
【００２２】
また、本発明は前記ペプチドを個体に投与する段階を含む、肌再生または傷治療方法を提供する。  
【００２３】
また、本発明は前記ペプチドの肌再生または傷治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明による新規ペプチドは繊維芽細胞のコラーゲン生成量を増進させて傷の治癒を促進させるだけでなく、黒色腫細胞のメラニン生成量及びチロシナーゼ活性を抑制させて優秀な美白効果を示して、非常に小さな大きさのペプチドでなされて外部物質の投与による副作用を最小化させることができるところ、既存の肌再生または傷治療用製剤を取り替えることができる有効物質で活用されることができるものとして期待される。    
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のペプチド１処理によるヒト繊維芽細胞から生成されたProcollagenの量を測定した結果である。
【図２】本発明のペプチド１処理によるヒト繊維芽細胞から生成されたCol１A１の量を測定した結果である。
【図３】本発明のペプチド１処理による黒色腫細胞から生成されたメラニンの量を測定した結果である。
【図４】本発明のペプチド１処理による黒色腫細胞のチロシナーゼ(Tyrosinase)活性を評価した結果である。
【図５】本発明のペプチド１処理によるin vitro傷モデルでの傷治療効果を確認した結果である。
【図６】本発明のペプチド２処理によるin vitro傷モデルでの傷治療効果を確認した結果である。
【図７】本発明のペプチド１処理によるin vitro傷モデルでの傷治療効果を定量化して評価した結果である。
【図８】本発明のペプチド２処理によるin vitro傷モデルでの傷治療効果を定量化して評価した結果である。
【図９】本発明のペプチド１または２処理による急性創傷動物モデルでの傷治療効果を確認した結果である。
【図１０】本発明のペプチド１または２処理による急性創傷動物モデルでの傷治療効果を定量化して評価した結果である。
【図１１】本発明のペプチド１または２処理による急性創傷動物モデルでの肌組織変化をＨ＆Ｅ染色を通じて確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳しく説明することにする。  
【００２７】
本発明は、配列番号１または２で表示されるアミノ酸からなる、ペプチドを提供する。  
【００２８】
本発明で、""ペプチド(peptide)""はアミド結合(または、ペプチド結合)で連結された２個以上のアミノ酸からなるポリマーを意味して、本発明の目的上、肌再生または傷治癒活性を有するペプチドを意味する。  
【００２９】
ペプチド治療剤に対する多様な研究にもかかわらず、ペプチド自体大きさがとても大きくて標的組織または細胞に効果的に流入されることができないか、または半減期が短くて短期間に体内で消滅する短所を示したとこる、本発明は有効な治療効果を有すると共に２０個以下のアミノ酸からなる、新規ペプチドを最初に究明したという点に技術的意義がある。  
【００３０】
本発明のペプチドは配列番号１または２で表示されるアミノ酸でなされることができるし、前記配列番号１または２で表示されるアミノ酸配列とそれぞれ７５％以上、望ましくは８０％以上、より望ましくは、９０％以上、一番望ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、標的化配列、タグ(tag)、標識された残基、半減期またはペプチド安全性を増加させるための特定目的で製造されたアミノ酸配列も追加的に含むことができる。  
【００３１】
また、本発明のペプチドに対する機能性変異体も含むことができる。前記機能性変異体は本明細書に記載したペプチド配列(配列番号１または２)の生物学的同等物などを含む。例えば、ペプチドの結合親和度及び/またはその他生物学的特性をより改善させるためにペプチドのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形はペプチドのアミノ酸配列残基の欠失、挿入、及び/または置き換えを含んで、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷大きさなどに基礎してなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、模様及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンはすべて正の電荷を帯びた残基であり、アラニン、グリシンとセリンは類似した大きさを有して、フェニルアラニン、トリプトファンとタイロシンは類似した模様を有するということが分かる。したがって、このような考慮事項に基礎して、アルギニン、リシンとヒスチジンと、アラニン、グリシンとセリンと、そしてフェニルアラニン、トリプトファンとタイロシンなどは生物学的に機能同等物と言える。  
【００３２】
また、本発明のペプチドは当該分野で広く公知された多様な方法で獲得することができる。一例として、ポリヌクレオチドリコンビネーション（組換）とタンパク質発現システムを利用して製造するか、またはペプチド合成のような化学的合成を通じて試験管内で合成する方法、及び無細胞タンパク質合成法などで製造されることができる。  
【００３３】
また、より良い化学的安全性、強化された薬理特性(半減期、吸水性、力価、効能など)、変更された特異性(例えば、広範囲な生物学的活性スペクトラム)、減少された抗原性を獲得するために、ペプチドのＮ-またはＣ-末端に保護基が結合されてもよい。望ましくは、前記保護基はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)であり得るが、ペプチドの改質、特にペプチドの安全性を増進させることができる成分なら、制限なしに含むことができる。本発明で使用される用語、""安全性""は生体内タンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護するイン・ビボ安全性だけでなく、貯蔵安全性(例えば、常温貯蔵安全性)も意味する。  
【００３４】
本発明で、""ポリヌクレオチド(polynucleotide)""はヌクレオチドが結合された重合体として、遺伝情報を伝達する役割をする。本発明の目的上、配列番号１または２のペプチドをコーディングし、前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド配列とそれぞれ７５％以上、望ましくは８５％以上、より望ましくは９０％以上、一番望ましくは９５％以上配列相同性を有する配列を含むことができる。  
【００３５】
本発明で使用される用語、""相同性""は野生型アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列との類似の程度を示すためのものであり、このような相同性の比較は当業界で広く知られた比較プログラムを利用して遂行することができるし、２個以上の配列間相同性を百分率(％)で計算することができる。  
【００３６】
本発明の他の様態として、本発明は前記ペプチドまたはこれをコーディングするポリヌクレオチドを有効成分として含む、肌再生または傷治療用薬学的組成物と、肌再生または傷治療のための前記ペプチドの用途と、及び治療上有効量の前記ペプチドを個体に投与する段階を含む、肌再生または傷治療方法を提供する。  
【００３７】
本発明で使用される用語、""治療""は本発明による薬学的組成物の投与によって傷に対する症状が好転するか、またはよく変更されるすべての行為を意味する。  
【００３８】
本発明で、""個体""は傷の治療を要する対象を意味して、より具体的にはヒトまたは非-ヒトである霊長類、マウス(mouse)、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。  
【００３９】
本発明で使用される用語、""肌再生""は全般的な肌老化及び肌に誘発された外部刺激に対応して肌組織が再構成される一連の反応を称えるものとして、一具体例として肌美白、肌弾力増進、しわ改善効果を示す。  
【００４０】
前記""肌美白""はメラニン色素の合成を阻害することで肌トーンを明るくするだけでなく、紫外線、ホルモンまたは遺伝に起因した染みやそばかすなどの肌の過剰な色素沈着を改善することを言う。  
【００４１】
本発明で使用される用語、傷(wound)は外部刺激によって組織が損傷される現象を意味するものとして、一般的な傷の治癒はたいてい細胞の変性及び死滅、周りの組織からの遊走細胞、組織流出、及び繊維素の析出と肉芽組織の形成などの過程を通るようになる。本発明の目的上、前記傷治療は前述したような過程を促進させて正常肌組織への再構成を助けることを称える、一方、前記傷は望ましくは、創傷によるものであることができるが、これに制限されるものではない。  
【００４２】
本発明の一実施例によれば、２種類のペプチド(ペプチド１及びペプチド２)を製造したし(実施例１参照)、前記ペプチドを処理することで、コラーゲン生成量を増進させて傷治癒を促進させることができ、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株のメラニン生成及びチロシナーゼ活性を抑制させて優秀な美白効果を確認することができた(実施例２乃至４参照)。また、ＨａＣａＴ細胞の移動能を評価するためのscratch assay、及び急性創傷動物モデルを利用して、前記ペプチドの優秀な傷治療効果(傷減少)を確認することができるところ(実施例５及び６参照)、既存の肌再生または傷治療用製剤を置き換えることができる有効物質及び肌美白製剤として幅広く活用されることができるであろう。  
【００４３】
一方、本発明のペプチドまたは、これをコーディングするポリヌクレオチドはコロイド懸濁液、粉末、食塩水、脂質、リポソーム、微小球体(microspheres)、またはナノ球形粒子のような薬学的に許容されることができる担体によって運搬されることができる。これらは運搬手段と複合体を形成するか、または関連されることができるし、脂質、リポソーム、微細粒子、金、ナノ粒子、ポリマー、縮合反応剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増進物質または脂肪酸のような当業界で公知の運搬システムを使って生体内に運搬されることができる。  
【００４４】
以外にも、薬学的に許容される担体は製剤時通常的に利用されるラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシア、ゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルハイドロキシベンゾエート、プロピルハイドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むことができるが、これらに限定されるものではない。また、前記成分など以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、風味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。  
【００４５】
また、本発明の薬学的組成物は本発明の目的上、肌再生効果のために望ましく本発明のペプチドを１乃至５００ng/ml濃度で含むことができるが、細胞毒性なしに有効な治療効果を期待することができる濃度なら、これに制限されるものではない。  
【００４６】
本発明の薬学的組成物は目的とする方法によって経口投与するか、または非経口投与(例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、または局所に適用)することができ、投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択されることができる。  
【００４７】
特に、本発明の薬学的組成物を肌外用剤で使用する場合、追加で脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤(foaming agent)、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小嚢など肌外用剤に通常的に使用される任意の他の成分と同じ肌科学分野で通常的に使用される補助剤を含むことができる。また、前記成分らは肌科学分野で一般的に使用される量で導入されることができる。また、前記薬学的組成物が肌外用剤で提供される場合、これに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であることができる。  
【００４８】
本発明の薬学的組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において、""薬学的に有効な量""は医学的治療に適用可能な合理的なメリット/危険の割合で疾患を治療するに十分な量を意味して、有効容量水準は患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の割合、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素及びその他医学分野でよく知られた要素によって決まることができる。本発明の他の薬学的組成物は個別治療剤で投与するか、または他の治療剤と併用して投与されることができるし、従来の治療剤とは同時に、別途で、または順次投与されることができるし、単一または多重投与されることができる。前記要素などをすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与するのが重要であり、これは当業者が容易に決めることができる。  
【００４９】
具体的に本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内に活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、疾病種類、併用される薬物によって変わることができるし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されることができる。  
【００５０】
また、本発明の他の様態として、本発明は前記ペプチドまたはこれをコーディングするポリヌクレオチドを有効成分として含む、肌老化または傷改善用健康機能食品/化粧品組成物を提供する。  
【００５１】
本発明で使用される用語、""改善""とは、治る状態と関連したパラメーター、例えば、症状の程度を少なくても減少させるすべての行為を意味する。この時、前記健康機能食品/化粧品組成物は、肌老化または傷の予防または改善のために、関連疾患の発病段階以前または発病後、治療のための薬剤と同時にまたは別に使用されることができる。  
【００５２】
本発明の健康機能食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加するか、または他の食品または食品成分と共に使用されることができるし、通常の方法によって適切に使用されることができる。有効成分の混合量はその使用目的(予防または改善用)によって好適に決めることができる。一般に、食品または飲み物の製造時に本発明の組成物は原料に対して望ましく１５重量％以下、望ましくは１０重量％以下の量で添加されることができる。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には前記量は前記範囲以下であることがある。  
【００５３】
本発明の健康機能食品組成物は、前記有効成分を含むこと以外に特別な制限なしに他の成分などを必修成分として含むことができる。例えば、通常の飲み物のようにさまざまな風味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。前述した天然炭水化物の例はモノ−サッカライド、例えば、葡萄糖、果糖などと、ジ−サッカライド、例えばマルトス、スクロースなどと、及びポリサッカライド、例えばシクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであることができる。前述以外の風味剤として天然風味剤(ソーマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど))及び合成風味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を好適に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は当業者の選択によって適切に決めることができる。  
【００５４】
前記以外に本発明の健康機能食品組成物は、さまざまな営養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。このような成分は独立してまたは組み合わせて使用することができ、このような添加剤の割合も当業者によって適切に選択されることができる。
【００５５】
本発明の化粧料組成物は当業界で通常製造されるどのような剤形でも製造されることができるし、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤-含有クレンジングオイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどとして剤形化されることができるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形として製造されることができる。  
【００５６】
本発明の化粧料組成物に含有された有効な担体は剤形によって、当業界で通常利用される担体が利用されることができる。本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合には担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用されることができる。  
【００５７】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には担体成分としてラクトス、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが利用されることができるし、特に、スプレーの場合には追加的にクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００５８】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合には担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジル ベンゾエート、プロピレングリコール、１、３-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。  
【００５９】
本発明の剤形が懸濁液の場合には担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが利用されることができる。  
【００６０】
本発明の剤形が界面-活性剤含有クレンジングの場合には担体成分として脂肪族アルコールソルべイト、脂肪族アルコールエーテルソルべイト、スルホこはく酸モノエステル、イセチオナート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルソルべイト、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用されることができる。  
【００６１】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は有効成分と担体成分以外に、化粧料組成物に通常利用される成分などを含んで、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含むことができる。  
【００６２】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより易しく理解するために提供されるものであるだけで、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。  
【実施例】
【００６３】
実施例１．ペプチドの製造  
【００６４】
本実施例では、下記表１のペプチドを製造した。以後、高性能液体クロマトグラフィー(SHIMADZU  Prominence HPLC)を利用して合成されたペプチドを純粋分離し、カラムはShiseido capcell pak Ｃ１８Column(４．６x５０mm)を利用した。また、質量分析機(HP １１００ series ＬＣ/ＭＳＤ)を利用して、合成されたペプチドの質量を確認した。  
【００６５】
【表１】
0006573295.tif 000002
【００６６】
実施例２．ヒト繊維芽細胞のコラーゲン生成能評価 
コラーゲンは肌結合組織の主成分であり、創傷などの傷治療または肌再生過程でコラーゲンの発現増加は必須であると言える。ここで、本実施例では、前記実施例１で製造したペプチド(ペプチド１)の処理によるヒト繊維芽細胞(Human dermal fibroblast、ＨＤＦ)のコラーゲン生成能を従来文献(J. Biol. Chem. １９９３ ２６８(１４):９９４１-９９４４)に開示された実験法を通じて評価した。まず、ヒト繊維芽細胞を１０％Fetal Bovine Albumin(ＦＢＳ)が添加されたＤＭＥＭ培地で培養し、前記培養された細胞を６ well-plateに各２×１０５cell/well濃度で分注して、これを２４時間培養した後、２％ＦＢＳで培地を入れ替えた。これから２４時間経過後、本発明のペプチド(１００、１０、１ng/ml)を処理して再び２４時間培養し、以後Procollagen Type I Ｃ-peptide(ＰＩＰ)EIA Kitを使って培養培地で分泌されたprocollagenの量を測定し、Trizol reagentでＲＮＡ抽出した後、real-time ＰＣＲを通じてヒト繊維芽細胞のCol１A１(collagen type I、alpha １)ｍＲＮＡの発現を確認した。一方、対照群で別途処理を加えない群(Control)、陽性対照群としてはＴＧＦ−βで処理した群(ＴＧＦ−β)を利用した。  
【００６７】
その結果、図１及び図２に示したように、本発明のペプチドで処理した群は、対照群及びＴＧＦ-βで処理した群に比べてprocollagenの分泌量が増加し、Col１A１の発現も１０ng/ml以上の濃度で有意に増加することが分かった。  
【００６８】
前記結果から本発明のペプチドはコラーゲン生成を誘導して肌再生または傷治癒の促進に寄与することが分かった。  
【００６９】
実施例３．黒色腫細胞のメラニン生成能評価  
肌の色はメラニン細胞によって生成されたメラニン色素の量によって決まって、非正常な肌の色素沈着を改善するために多くの研究が進められて来た。特に、慢性創傷で発生する過度な色素沈着は重要な医学的問題として扱われているが、いまだに確かな治療方法が開発されていないのが実情である。ここで、本実施例では、前記実施例１で製造したペプチド(ペプチド１)の処理による黒色腫細胞株のメラニン生成能を従来文献(Life Sci. ２０１３ Aug １４；９３(５-６):２２６-３２)に開示された実験法を通じて評価した。黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞を１０％ Fetal Bovine Albuminが添加されたＤＭＥＭ培地で培養し、前記培養された細胞を１２well-plateに各１×１０５cell/well濃度で分注した。これを２４時間培養した後、メラニン合成を促進させるα-ＭＳＨ(１０ｕＭ)と本発明のペプチド(１、１０、１００ng/ml)で処理して再び２４時間培養し、各wellをＰＢＳで洗浄した後、２００ulの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加して１００℃で３０分間溶解した。以後、ELISA readerで、４０５nmで吸光度を測定して黒色腫細胞株から生成されたメラニンの量を確認した。一方、対照群で別途処理を加えない群、陽性対照群としてはα-ＭＳＨのみで処理した群を利用した。  
【００７０】
その結果、図３に示したように、α-ＭＳＨのみで処理した群では黒色腫細胞株から多量のメラニンが生成された反面、本発明のペプチドで処理した群ではメラニン生成量が大きく減少し、特に、α-ＭＳＨで処理しなかった群と比較しても大きな差を見せなかった。前記結果から本発明のペプチドはメラニン生成抑制による肌美白効果があることが分かった。  
【００７１】
実施例４．黒色腫細胞のチロシナーゼ活性評価  
チロシナーゼ(Tyrosinase)はメラニン生合成過程で反応を触媒する速度調節酵素として、細胞内メラニンの量を調節することに決定的な役割をするものとして知られている。これに、本実施例では、前記実施例１で製造したペプチド(ペプチド１)での処理による黒色腫細胞株のチロシナーゼ活性を従来文献(J. Dermatol. Sci. Vol.５７(２０１０)１７０-１７７)に開示された実験法を通じて評価した。黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞を１２well-plateに各１×１０５cell/well濃度で分注して２４時間培養した後、α-ＭＳＨ(１Ｍ)と本発明のペプチド(１、１０、１００ng/ml)で処理し、再び２４時間培養し、各wellをＰＢＳで洗浄した後１％ Triton X-１００を含んだ５０mM Phosphate buffer(ｐＨ６．８)で懸濁した。Vortexing後、-８０℃で３０分凍結した後、室温で融解させて、１０００gで１０分間遠心分離後４０ulの上層液と１０ｍＭ L-DOPA １００ulを９６well-plateに入れて３７℃で反応させた。以後、ELISA readerで４０５nmで吸光度を測定して黒色腫細胞株のチロシナーゼ活性を確認した。一方、対照群で別途処理を加えない群、陽性対照群ではα−ＭＳＨのみを処理した群、及びKojic acidを処理した群を利用した。  
【００７２】
その結果、図４に示したように、α-ＭＳＨのみで処理した群では黒色腫細胞株のチロシナーゼ活性が大きく増加した一方、本発明のペプチドで処理した群では酵素活性が大きく減少し、チロシナーゼ活性抑制能を有したKojic acidで処理した群と比較しても大きな差を見せなかった。前記結果から本発明のペプチドはチロシナーゼ活性抑制による肌美白効果があることがわかった。  
【００７３】
実施例５．In vitro傷治療モデルを利用した傷治療効果確認  
本実施例では、前記実施例１で製造したペプチド(ペプチド１及び２)での処理による傷治療効果をscratch assayを通じて確認した。Serum free培地にmitomycin C(１０ug/ml)を添加してヒト上皮細胞株であるHaCaT細胞を２時間の間培養してscratch傷を誘発させた。１０％ＦＢＳが添加された培地でペプチド(１または１０ng/ml)、陽性対照群としてＴＧＦ-β(１ng/ml)で処理した後、時間の経過による細胞の移動能を観察し、傷大きさの減少を定量化した。  
【００７４】
その結果、図５及び６に示したように、本発明のペプチドで処理した群で、HaCaT細胞の移動がペプチド濃度依存的に増加することを確認することができた。また、傷大きさを定量化して評価した結果、図７及び８に示したように、ペプチド１またはペプチド２処理による有意な傷の大きさの減少を確認することができ、特に、ペプチド２の効果がより著しく、高濃度(１０ng/ml)だけでなく相対的に低濃度(１ng/ml)の場合にも明らかな傷減少効果を観察することができた。  
【００７５】
実施例６．急性創傷動物モデルを利用した傷治療効果確認
本実施例では、前記実施例１で製造したペプチド(ペプチド１及び２)での処理による傷治療効果を、急性創傷動物モデルを利用してin vivoで確認した。  
【００７６】
６-１．傷の大きさの変化確認  
８週齢Balb/c nudeマウスをAvertin(２．５％)を利用して痲酔した後、１０mm直径の円形punchを使って動物などの一部の肌を切開して急性創傷を誘発させた。摘出部位に２４時間間隔で総５回ペプチドを処理して(５００ng/１回)、時間による傷の広さの減少を１４日間測定し、陽性対照群としてＥＧＦを利用した(１０ug/１回)。この時、ペプチドは２０％pluronic F-１２７(ＰＢＳ)と混合（mixture）した状態で処理し、デジタルカメラとImageJプログラムを利用して時間の経過による傷の大きさを測定して数値化して、これを比べた。  
【００７７】
その結果、図９及び１０に示したように、ペプチド１またはペプチド２で処理した場合、陽性対照群と近似であるか、またはより優秀な傷の大きさの減少を確認することができた。特に、ペプチド２はペプチド１の二量体形態として２倍の分子量を有するので、ペプチド１に比べてさらに低い濃度で処理されたにもかかわらず、ペプチド１で処理した場合よりその効果が優秀であっただけでなく、陽性対照群に比べてもさらに優秀な傷の治療効果を確認することができた。  
【００７８】
６-２．組織変化確認
前記実施例６-１と等しい方法で急性創傷を誘発させ、急性創傷を誘発させてから５日目の肌組織を切開して組織切片を製作した。以後、Ｈ＆Ｅ染色を実施し、これを、顕微鏡で観察することで、ペプタイド処理による組織学的変化を観察した。一方、陽性対照群としてＥＧＦを利用した。  
【００７９】
その結果、図１１で示したように、ペプチド１及びペプチド２で処理された組織は、陽性対照群と同じく表皮(epidermis)、真皮(dermis)層の厚さがＰＢＳ陰性対照群に比べて厚くなっていたし、上皮化（epithelialization)も活発に進行されていたところ、傷の治療または回復と関連される組織学的所見を確認することができた。  
【００８０】
前記結果らを総合して見る時、本発明のペプチド(ペプチド１及びペプチド２)は傷の回復速度を著しく促進させることができるところ 、傷の治療のための有効物質に活用されることができることが分かった。  
【００８１】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有した者は本発明の技術的思想や必須な特徴を変更しなくても他の具体的な形態で易しく変形が可能であるということを理解することができるであろう。そのため、以上で記述した実施例などはすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものとして理解しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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