(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを繰り返し単位として少なくとも含んでなる共重合体と、表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子との複合体からなる光活性化型ラマン分光分析用プローブであって、
前記光活性化型ラマン標識ユニットが式（ａ）：
【化１】
0006607746.tif 000022
（上記式中、
Ｒ１は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ２は式（ｉ）：
【化２】
0006607746.tif 000023
（上記式中、Ｒ１１〜Ｒ２０は、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基、不飽和の５〜７員の単環複素環式基または９〜１１員の不飽和の二環複素環式基を表し、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成していてもよく、Ｒ１５およびＲ１６は一緒になってＣ１−４アルキレン基を表していてもよく、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基が一緒になって形成する炭素環または複素環上の水素原子並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表すＣ１−４アルキレン基上の水素原子のいずれか一つは式（ａ）との結合を表す。）
を表す）
で表される、光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項２】
親水性ユニットが式（ｂ）：
【化３】
0006607746.tif 000024
（上記式中、
Ｒ３は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ４は水素原子、水酸基またはＣ１−６アルキル基（このアルキル基は１個または２個以上の水酸基、カルボキシル基および／またはアミノ基により置換されていてもよい）を表す）
で表される、請求項１に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項３】
共重合体がアクリル系共重合体またはメタクリル系共重合体である、請求項１または２に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項４】
共重合体の数平均分子量が４，０００〜８００，０００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項５】
共重合体が末端に金属粒子表面修飾ユニットをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項６】
金属粒子表面修飾ユニットが式（ｃ）：
【化４】
0006607746.tif 000025
（上記式中、Ｚは−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、Ｒ２１は芳香族基、基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１〜１４のアルキル基を表す）、基−Ｏ−Ｒ２３（Ｒ２３はＣ１−６アルキル基を表す）または基−Ｎ（−Ｒ２４）（−Ｒ２５）（Ｒ２４はＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２５は芳香族基を表す）を表す。）
で表される、請求項５に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項７】
共重合体が末端に標的結合ユニットをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項８】
標的結合ユニットが式（ｄ）：
【化５】
0006607746.tif 000026
（上記式中、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３はそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、−ＣＨ２ＮＨ２、チオール基、−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、ジベンゾシクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、ベンゾフェノン基、ビオチン基、イミノビオチン基、ハロゲン化アルキル基、シトシニルメチルフェニル基およびグアニルメチルフェニル基からなる群（以下「官能基群Ａ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−６アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−６アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ａから選択される官能基または官能基群Ａから選択される官能基により置換されたＣ１−６アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表す。）
で表される、請求項７に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項９】
共重合体が、下記式（Ｉａ）：
【化６】
0006607746.tif 000027
（上記式中、
Ｒ１は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ２は式（ｉ）：
【化７】
0006607746.tif 000028
（上記式中、Ｒ１１〜Ｒ２０は、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基、不飽和の５〜７員の単環複素環式基または９〜１１員の不飽和の二環複素環式基を表し、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成していてもよく、Ｒ１５およびＲ１６は一緒になってＣ１−４アルキレン基を表していてもよく、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基が一緒になって形成する炭素環または複素環上の水素原子並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表すＣ１−４アルキレン基上の水素原子のいずれか一つは式（ａ）との結合を表す。）
を表し、
Ｒ３は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ４は水素原子、水酸基またはＣ１−６アルキル基（このアルキル基は１個または２個以上の水酸基、カルボキシル基および／またはアミノ基により置換されていてもよい）を表し、
ｍおよびｎは各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００である。）
で表される共重合体である、請求項１または２に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項１０】
共重合体が、その一方の末端に式（ｃ）：
【化８】
0006607746.tif 000029
（上記式中、Ｚは−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、Ｒ２１は芳香族基、基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１〜１４のアルキル基を表す）、基−Ｏ−Ｒ２３（Ｒ２３はＣ１−６アルキル基を表す）または基−Ｎ（−Ｒ２４）（−Ｒ２５）（Ｒ２４はＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２５は芳香族基を表す）を表す。）
で表される金属粒子表面修飾ユニットを有し、もう一方の末端に式（ｄ）：
【化９】
0006607746.tif 000030
（上記式中、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３はそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、−ＣＨ２ＮＨ２、チオール基、−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、ジベンゾシクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、ベンゾフェノン基、ビオチン基、イミノビオチン基、ハロゲン化アルキル基、シトシニルメチルフェニル基およびグアニルメチルフェニル基からなる群（以下「官能基群Ａ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−６アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−６アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ａから選択される官能基または官能基群Ａから選択される官能基により置換されたＣ１−６アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表す。）
で表される標的結合ユニットを有するものである、請求項２または９に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項１１】
共重合体が、下記式（Ｉ）：
【化１０】
0006607746.tif 000031
（上記式中、
Ｒ１は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ２は式（ｉ）：
【化１１】
0006607746.tif 000032
（上記式中、Ｒ１１〜Ｒ２０は、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基、不飽和の５〜７員の単環複素環式基または９〜１１員の不飽和の二環複素環式基を表し、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成していてもよく、Ｒ１５およびＲ１６は一緒になってＣ１−４アルキレン基を表していてもよく、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基が一緒になって形成する炭素環または複素環上の水素原子並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表すＣ１−４アルキレン基上の水素原子のいずれか一つは式（ａ）との結合を表す。）
を表し、
Ｒ３は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ４は水素原子、水酸基またはＣ１−６アルキル基（このアルキル基は１個または２個以上の水酸基、カルボキシル基および／またはアミノ基により置換されていてもよい）を表し、
Ｚは−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、
Ｒ２１は芳香族基、基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１〜１４のアルキル基を表す）、基−Ｏ−Ｒ２３（Ｒ２３はＣ１−６アルキル基を表す）または基−Ｎ（−Ｒ２４）（−Ｒ２５）（Ｒ２４はＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２５は芳香族基を表す）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３はそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、−ＣＨ２ＮＨ２、チオール基、−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、ジベンゾシクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、ベンゾフェノン基、ビオチン基、イミノビオチン基、ハロゲン化アルキル基、シトシニルメチルフェニル基およびグアニルメチルフェニル基からなる群（以下「官能基群Ａ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−６アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−６アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ａから選択される官能基または官能基群Ａから選択される官能基により置換されたＣ１−６アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表し、
ｍおよびｎは各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００である。）
で表される共重合体である、請求項１または１０に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
【請求項１２】
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブを試料と接触させる工程と、
（ｂ）前記試料に光照射し、試料からの光活性化ラマンスペクトルを検出する工程を含んでなる、試料をイメージングする方法。
【請求項１３】
試料が細胞を含有し、細胞内および／または細胞外の分析対象の存在をイメージングする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料が細胞を含有し、細胞および／または細胞小器官をイメージングする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）の前に、（ｃ）細胞内移行物質および／または分析対象と相互作用する物質を光活性化型ラマン分光分析用プローブに連結する工程をさらに含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
光照射およびラマンスペクトルの検出をレーザーラマン顕微鏡を用いて行う、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光活性化型ラマン分光分析用プローブおよびそれを用いたラマンイメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ラマン分光法に基づく分子イメージング（ラマンイメージング）が注目を集めている。ラマンイメージングは分子内在の振動を検出し可視化する技術に基づくものであり、局在する分子の振動を指標にすることから無染色・無標識での細胞小器官等のイメージングが可能である。
【０００３】
ラマンイメージングは、また、生体内に本来存在しない分子骨格をタグとして利用し、標的分子のみを選択的にイメージングすることができる。このようなタグとして、例えば、アセチレンやシアン化物といった炭素−炭素または炭素−窒素三重結合を有する分子や金属ナノ粒子等が知られ、これらを組み合わせた方法もこれまでに報告されている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of American Chemical Society, 136, 2014, 13558-13561
【非特許文献２】Chemical Communications, 47, 2011, 3156-3158
【非特許文献３】Nanoscale, 2, 2010, 1413-1416
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方で、細胞等の試料に導入されたタグはいずれも常にシグナルを発しているため、分析対象の経時的・空間的な挙動の追跡が困難であり、ラマンイメージングから得られる情報は限られていた。
【０００６】
よって、本発明は、所望のタイミングで所望の場所に存在する場合にのみシグナルを発するような刺激応答性のプローブとそれを用いたイメージング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、親水性部位とシクロプロペノン骨格で保護されたアルキンを含む光活性化部位とがそれぞれ複数導入されたポリマーと、金属ナノ粒子との複合体が光活性化型ラマン分光分析用プローブとして機能することを見出した。本発明者らはまた、光活性化型ラマン分光分析用プローブを実際に生細胞中に導入し、光照射後、細胞内から発生したアルキンシグナルをラマン顕微鏡で検出できることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを繰り返し単位として少なくとも含んでなる共重合体と、表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子との複合体からなる光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（２）光活性化型ラマン標識ユニットが式（ａ）：
【化１】
0006607746.tif 000002
（上記式中、
Ｒ１は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ２は式（ｉ）：
【化２】
0006607746.tif 000003
（上記式中、Ｒ１１〜Ｒ２０は、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基、不飽和の５〜７員の単環複素環式基または９〜１１員の不飽和の二環複素環式基を表し、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成していてもよく、Ｒ１５およびＲ１６は一緒になってＣ１−４アルキレン基を表していてもよく、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０、Ｒ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基が一緒になって形成する炭素環または複素環上の水素原子並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表すＣ１−４アルキレン基上の水素原子のいずれか一つは式（ａ）との結合を表す。）
を表す）
で表される、上記（１）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（３）親水性ユニットが式（ｂ）：
【化３】
0006607746.tif 000004
（上記式中、
Ｒ３は水素原子またはＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ４は水素原子、水酸基またはＣ１−６アルキル基（このアルキル基は１個または２個以上の水酸基、カルボキシル基および／またはアミノ基により置換されていてもよい）を表す）
で表される、上記（１）または（２）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（４）共重合体がアクリル系共重合体またはメタクリル系共重合体である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（５）共重合体の数平均分子量が４，０００〜８００，０００である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（６）共重合体が末端に金属粒子表面修飾ユニットをさらに含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（７）金属粒子表面修飾ユニットが式（ｃ）：
【化４】
0006607746.tif 000005
（上記式中、Ｚは−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、Ｒ２１はフェニルなどの芳香族基、基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１〜１４のアルキル基、好ましくは炭素数１２のアルキル基、を表す）、基−Ｏ−Ｒ２３（Ｒ２３はＣ１−６アルキル基、好ましくはエチル基、を表す）または基−Ｎ（−Ｒ２４）（−Ｒ２５）（Ｒ２４はＣ１−６アルキル基、好ましくはメチル基、を表し、Ｒ２５はフェニルなどの芳香族基を表す）を表す。）
で表される、上記（６）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（８）共重合体が末端に標的結合ユニットをさらに含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（９）標的結合ユニットが式（ｄ）：
【化５】
0006607746.tif 000006
（上記式中、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３はそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、−ＣＨ２ＮＨ２、チオール基、−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、ジベンゾシクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、ベンゾフェノン基、ビオチン基、イミノビオチン基、ハロゲン化アルキル基、シトシニルメチルフェニル基およびグアニルメチルフェニル基からなる群（以下「官能基群Ａ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−６アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−６アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ａから選択される官能基または官能基群Ａから選択される官能基により置換されたＣ１−６アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表す。）
で表される、上記（８）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（１０）共重合体が、上記（２）に記載の式（ａ）の光活性化型ラマン標識ユニットと、上記（３）に記載の式（ｂ）の親水性ユニットとを繰り返し単位として少なくとも含んでなるものである、上記（１）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（１１）共重合体が、下記式（Ｉａ）：
【化６】
0006607746.tif 000007
（上記式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記（２）に記載の式（ａ）および上記（３）に記載の式（ｂ）において定義された内容と同義であり、ｍおよびｎは各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００である。）
で表される共重合体である、上記（１）または（１０）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（１２）共重合体が、その一方の末端に上記（７）に記載の式（ｃ）の金属粒子表面修飾ユニットを有し、もう一方の末端に上記（９）に記載の式（ｄ）の標的結合ユニットを有するものである、上記（１０）または（１１）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（１３）共重合体が、下記式（Ｉ）：
【化７】
0006607746.tif 000008
（上記式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ２１、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３は上記（２）に記載の式（ａ）、上記（３）に記載の式（ｂ）、上記（７）に記載の式（ｃ）および上記（９）に記載の式（ｄ）において定義された内容と同義であり、ｍおよびｎは各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００である。）
で表される共重合体である、上記（１）または（１２）に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブ。
（１４）（ａ）上記（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の光活性化型ラマン分光分析用プローブを試料と接触させる工程と、
（ｂ）前記試料に光照射し、試料からの光活性化ラマンスペクトルを検出する工程を含んでなる、試料をイメージングする方法。
（１５）試料が細胞を含有し、細胞内および／または細胞外の分析対象の存在をイメージングする、上記（１４）に記載の方法。
（１６）試料が細胞を含有し、細胞および／または細胞小器官をイメージングする、上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）工程（ａ）の前に、（ｃ）細胞内移行物質および／または分析対象と相互作用する物質を光活性化型ラマン分光分析用プローブに連結する工程をさらに含んでなる、上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）光照射およびラマンスペクトルの検出をレーザーラマン顕微鏡を用いて行う、上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明のラマン分光分析用プローブは、光照射に応答して生体や細胞内外での分子や、細胞、細胞小器官、組織など生体試料のイメージングに適した強いラマンシグナルを発することができる。従って、本発明のラマン分光分析用プローブによれば、所望のタイミングで所望の場所に存在する標的をイメージングすることができ、ひいては標的の経時的・空間的な挙動を追跡することができる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化合物９のＰＢＳ溶液（２ｍＭ）の光照射前後のラマンスペクトルを示した図である。Ａ：光照射前、Ｂ：光照射後。横軸は波数（１／ｃｍ−１）を、縦軸はラマン強度をそれぞれ表す。
【図２】化合物９のＰＢＳ溶液（２００μＭ）の光照射前後のラマンスペクトルを示した図である。Ａ：光照射前、Ｂ：光照射後。横軸は波数（１／ｃｍ−１）を、縦軸はラマン強度をそれぞれ表す。
【図３】化合物９と金ナノ粒子との複合体溶液の光照射前後のラマンスペクトルを示した図である。Ａ：光照射前、Ｂ：光照射後。
【図４】本発明の光活性化型ラマン分光分析用プローブが導入されたＨｅＬａ細胞を光照射有りまたは光照射無しの条件下で観察した結果を示した図である。Ａ：光照射後の細胞の顕微鏡写真、Ｂ：光照射前の細胞の顕微鏡写真、Ｃ：Ａの顕微鏡像の交差点におけるラマンスペクトル、Ｄ：Ｂの顕微鏡像の交差点におけるラマンスペクトル。
【図５】細胞全体を含む領域を走査して得られたラマンイメージング画像の全スペクトルの主成分解析の結果を示す図である。Ａ：光照射後の細胞の解析結果、Ｂ：光照射前の細胞の解析結果。
【発明の具体的説明】
【００１１】
定義
本明細書において「Ｃ１−６アルキル基」は、炭素数１〜６のアルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、すなわち、Ｃ１−４アルキル基である。基または基の一部としての「アルキル基」は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素数１〜６のアルキル基を意味する。「Ｃ１−６アルキル基」の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｉ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｉ−ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
【００１２】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ基」とは、炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基、すなわち、Ｃ１−４アルコキシ基である。基または基の一部としての「アルコキシ基」は、アルキル部分が直鎖、分岐鎖または環状の炭素数１〜６のアルコキシ基を意味する。「Ｃ１−６アルコキシ基」の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等が挙げられる。
【００１３】
本明細書において「不飽和の炭素環」および「不飽和の複素環」とは、二重結合等の不飽和結合を１以上有する炭素環および複素環を意味する。
【００１４】
本明細書において「５〜７員の単環炭素環」は、環員原子が５〜７個の単環性炭化水素を意味する。５〜７員の単環炭素環式基の例としては、フェニル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルが挙げられる。
【００１５】
本明細書において「９〜１１員の二環炭素環」は、環員原子が９〜１１個の二環性炭化水素を意味する。９〜１１員の二環炭素環式基の例としてはナフチルが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「５〜７員の単環複素環」は、環員原子が５〜７個の単環性複素環を意味し、１〜３個、好ましくは１または２個のヘテロ原子を環員原子として含み、残りの環員原子が炭素原子である単環性複素環であることができる。ここで「ヘテロ原子」は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択され、複素環が複数のヘテロ原子を含有する場合には該へテロ原子は同一であっても異なっていてもよい。５〜７員の複素環基の例としては、ピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、ピラニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピぺリジニル、ピぺラジニル、モルホリニル、モルホリノ、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾイル、イソチアゾリルおよびピラジルが挙げられる。
【００１７】
本明細書において「９〜１１員の二環複素環」は、環員原子が９〜１１個の二環性複素環を意味し、１〜４個、好ましくは１または２個のヘテロ原子を環員原子として含み、残りの環員原子が炭素原子である二環性複素環であることができる。９〜１１員の二環複素環基の例としては、ナフチリジニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニルおよびフタラジニルが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「置換されていてもよいアルキル基」とは、アルキル基上の１またはそれ以上の水素原子が１またはそれ以上の置換基（同一または異なっていてもよい）により置換されたアルキル基および非置換アルキル基を意味する。置換基の最大数はアルキル上の置換可能な水素原子の数に依存して決定できることは当業者に明らかであろう。
【００１９】
本明細書において「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子である。
【００２０】
本明細書において「光活性化型ラマン分光分析用プローブ」とは、光照射に応答してラマン分光分析に適したシグナル発することができるプローブを意味する。具体的な構成については以下で説明する。
【００２１】
光活性化型ラマン分光分析用プローブ
本発明の光活性化型ラマン分光分析用プローブ（以下、「本発明のプローブ」ということがある。）は、光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを少なくとも含んでなる共重合体と、表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子との複合体からなる。
【００２２】
本発明のプローブを構成する共重合体はアクリル系共重合体またはメタクリル系共重合体であることができる。本発明のプローブを構成する共重合体がアクリル系共重合体である場合には、該共重合体を構成する繰り返し単位は、アクリル酸、アクリル酸エステル、アクリル酸アミドなどのモノマー由来の繰り返し単位であることができる。本発明のプローブを構成する共重合体がメタクリル系共重合体である場合には、該共重合体を構成する繰り返し単位は、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、メタクリル酸アミドなどのモノマー由来の繰り返し単位であることができる。これらの繰り返し単位は後述のように前記基−Ｒ２の光活性化型ラマン標識部位や前記基−Ｒ４の親水性基を有することができる。
【００２３】
本発明のプローブを構成する共重合体の重量平均分子量は、５，０００〜９００，０００とすることができるが、好ましくは５，０００〜２００，０００である。本明細書において「重量平均分子量」は、公知のゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によるポリスチレン換算により得ることができる。
【００２４】
本発明のプローブを構成する共重合体の数平均分子量は、４，０００〜８００，０００とすることができるが、好ましくは４，０００〜２００，０００である。本明細書において「数平均分子量」は、公知のＧＰＣ法によるポリスチレン換算により得ることができる。
【００２５】
本発明のプローブを構成する共重合体は光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを少なくとも含んでなるものである。共重合体中の光活性化型ラマン標識ユニットおよび親水性ユニットは、同一であっても異なっていてもよい。
【００２６】
光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとのモル比は生体から得られた試料においてラマン分光分析を行うことができれば特に限定されないが、例えば、１：０．１〜１：１００とすることができ、好ましくは、１：１〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：２０である。
【００２７】
本発明のプローブを構成する共重合体において、各ユニットの配列順序は特に限定されず、ランダムに配列されても（ランダム共重合体）、交互に配列されても（交互共重合体）、各々がブロック状に配列されても（ブロック共重合体）よい。本発明のプローブを構成する共重合体は、好ましくはランダム共重合体である。
【００２８】
光活性化型ラマン標識ユニットは光照射に応答してラマン分光分析に適したシグナル発することができるユニットである。光活性化型ラマン標識ユニットは、共重合体を構成する繰り返し単位であって、前記式（ｉ）の光活性化型ラマン標識部位を有する繰り返し単位であることができ、好ましくは前記式（ａ）で表される繰り返し単位である。
【００２９】
式（ａ）中、Ｒ１は、好ましくは水素原子またはメチル基である。
【００３０】
式（ａ）中のＲ２は式（ｉ）を表す。式（ｉ）中のＲ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０は、好ましくは、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基または不飽和の５〜７員の複素環式基を表し、Ｒ１５およびＲ１６は一緒になって炭素数２のアルキレン基を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表す炭素数２のアルキレン基上の水素原子のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、より好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１４から選択される一つとＲ１７〜Ｒ２０から選択される一つが同一または異なっていてもよくＣ１−４アルコキシ基（特に好ましくはメトキシ）を表し、残りが水素原子を表し、Ｒ１５およびＲ１６が一緒になって炭素数２のアルキレン基を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０並びにＲ１５およびＲ１６が一緒になって表す炭素数２のアルキレン基上の水素原子のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す。上記の場合、好ましくは、炭素数２のアルキレン基上の１つの水素原子が式（ａ）の基との結合を表す。
【００３１】
式（ｉ）中のＲ１１〜Ｒ２０はまた、好ましくは、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基または不飽和の５〜７員の複素環式基を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、より好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１５から選択される一つとＲ１６〜Ｒ２０から選択される一つが同一または異なっていてもよくＣ１−４アルコキシ基（特に好ましくはメトキシ）を表し、残りが水素原子を表し、Ｒ１１〜Ｒ２０のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す。
【００３２】
式（ａ）中のＲ２は好ましくは下記式（ｉｉ）を表す。
【化８】
0006607746.tif 000009
（上記式中、Ｒ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０は式（ｉ）において定義された内容と同義であり、Ｒ１０１およびＲ１０２は同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基、不飽和の５〜７員の単環複素環式基または９〜１１員の不飽和の二環複素環式基を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｒ１７〜Ｒ２０、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す。）
【００３３】
上記式（ｉｉ）のＲ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０は、好ましくは、同一または異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、メルカプト基、カルボキシル基、フェニル基または不飽和の５〜７員の複素環式基を表し、Ｒ１０１およびＲ１０２は水素原子を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｒ１７〜Ｒ２０、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、より好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１４から選択される一つとＲ１７〜Ｒ２０から選択される一つが同一または異なっていてもよくＣ１−４アルコキシ基（特に好ましくはメトキシ）を表し、残りが水素原子を表し、Ｒ１０１およびＲ１０２は水素原子を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｒ１７〜Ｒ２０、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す。上記式（ｉｉ）においては、好ましくは、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、他方が水素原子を表す。
【００３４】
式（ｉ）および式（ｉｉ）中のＲ１１〜Ｒ２０の隣り合う二つの基はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成していてもよい。ここで、「隣り合う二つの基」とは、式（ｉ）ではＲ１１とＲ１２、Ｒ１２とＲ１３、Ｒ１３とＲ１４、Ｒ１４とＲ１５、Ｒ１６とＲ１７、Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９およびＲ１９とＲ２０を意味する。また、式（ｉｉ）ではＲ１１とＲ１２、Ｒ１２とＲ１３、Ｒ１３とＲ１４、Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９およびＲ１９とＲ２０を意味する。式（ｉ）において隣り合う二つの基が炭素環または複素環を形成する場合、好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１５から選択される一組の隣り合う二つの基と、Ｒ１６〜Ｒ２０から選択される一組の隣り合う二つの基のいずれか一方の組または両方の組が炭素環または複素環を形成することができる。炭素環または複素環を形成しないＲ１１〜Ｒ２０は好ましくは同一または異なっていてもよく水素原子またはＣ１−４アルコキシ基（特に好ましくはメトキシ）を表し、より好ましくは水素原子を表す。式（ｉｉ）において隣り合う二つの基が炭素環または複素環を形成する場合、好ましくは、Ｒ１１〜Ｒ１４から選択される一組の隣り合う二つの基と、Ｒ１７〜Ｒ２０から選択される一組の隣り合う二つの基のいずれか一方の組または両方の組が炭素環または複素環を形成することができる。炭素環または複素環を形成しないＲ１１〜Ｒ１４およびＲ１７〜Ｒ２０は好ましくは同一または異なっていてもよく水素原子またはＣ１−４アルコキシ基（特に好ましくはメトキシ）を表し、より好ましくは水素原子を表す。
【００３５】
隣り合う二つの基により形成される炭素環および複素環としては、ベンゼン環、ピリジン環、ピリミジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、ピラン環、ピリダジン環、ピロリジン環、ピぺリジン環、ピぺラジン環、モルホリン環、イソオキサゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、イミダゾール環、イソチアゾール環およびピラジン環が挙げられる。
【００３６】
光活性化型ラマン標識ユニットの好ましい態様としては、Ｒ１が水素原子またはメチル基を表し、かつ、Ｒ２が式（ｉ）（ここで、Ｒ１１〜Ｒ１５から選択される一つの基とＲ１６〜Ｒ２０から選択される一つの基がメトキシを表し、残りが水素原子を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す）を表す、式（ａ）の繰り返し単位が挙げられる。
【００３７】
光活性化型ラマン標識ユニットの好ましい態様としては、Ｒ１が水素原子またはメチル基を表し、かつ、Ｒ２が式（ｉｉ）（ここで、Ｒ１１〜Ｒ１４から選択される一つの基とＲ１７〜Ｒ２０から選択される一つの基がメトキシを表し、残りが水素原子を表し、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、他方が水素原子を表す）を表す、式（ａ）の繰り返し単位が挙げられる。
【００３８】
光活性化型ラマン標識ユニットの好ましい態様としてはまた、Ｒ１が水素原子またはメチル基を表し、かつ、Ｒ２が式（ｉ）（ここで、Ｒ１１〜Ｒ１５から選択される一組の隣り合う二つの基と、Ｒ１６〜Ｒ２０から選択される一組の隣り合う二つの基のいずれか一方の組または両方の組がそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成し、残りが水素原子を表し、但し、Ｒ１１〜Ｒ２０のいずれか一つが式（ａ）との結合を表す）を表す、式（ａ）の繰り返し単位が挙げられる。
【００３９】
光活性化型ラマン標識ユニットの好ましい態様としてはまた、Ｒ１が水素原子またはメチル基を表し、かつ、Ｒ２が式（ｉｉ）（ここで、Ｒ１１〜Ｒ１４から選択される一組の隣り合う二つの基と、Ｒ１７〜Ｒ２０から選択される一組の隣り合う二つの基のいずれか一方の組または両方の組がそれらが結合している炭素原子と一緒になって５〜７員の飽和または不飽和の単環炭素環または単環複素環あるいは９〜１１員の飽和または不飽和の二環炭素環または二環複素環を形成し、残りが水素原子を表し、Ｒ１０１およびＲ１０２のいずれか一つが式（ａ）との結合を表し、他方が水素原子を表す）を表す、式（ａ）の繰り返し単位が挙げられる。
【００４０】
親水性ユニットは共重合体に親水性を付与することができるユニットである。親水性ユニットは、共重合体の繰り返し単位であって、前記基−Ｒ４（親水性基）を有する繰り返し単位であることができ、好ましくは前記式（ｂ）で表される繰り返し単位である。
【００４１】
式（ｂ）中、Ｒ３は、好ましくは水素原子またはメチル基である。
【００４２】
式（ｂ）中、Ｒ４は、好ましくは１個または２個以上の水酸基により置換されたＣ１−６アルキル基であり、より好ましくは１個または２個以上の水酸基により置換されたＣ１−４アルキル基であり、より一層好ましくは１個または２個の水酸基により置換されたＣ１−４アルキル基である。
【００４３】
親水性ユニットの好ましい態様としては、Ｒ３が水素原子またはメチル基を表し、かつ、Ｒ４が１個または２個の水酸基により置換されたＣ１−４アルキル基を表す、式（ｂ）の繰り返し単位が挙げられる。
【００４４】
本発明のプローブは共重合体の末端に金属粒子表面修飾ユニットを有することができる。金属粒子表面修飾ユニットは表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子と複合体を形成することができるユニットである。金属粒子との複合体形成の手法は当業界に広く知られており、当業者であれば金属粒子表面修飾ユニットを選択し、導入することができる。
【００４５】
金属粒子表面修飾ユニットとしては、例えば、ジチオフェニルエステル基、トリチオアルキルカルボナート基およびチオール基が挙げられる。後述のように本発明の共重合体はＲＡＦＴ重合により製造することができるが、その場合、ベンゾジチオエートやアルキルトリチオカルボナートをＲＡＦＴ剤として用いることで末端にジチオフェニルエステル構造を有する共重合体や、トリチオアルキルカルボナート構造を有する共重合体をそれぞれ製造することができる。また、ジチオフェニルエステル基やトリチオアルキルカルボナート基を重合後に還元することによって、チオール構造を有する共重合体を製造することもできる。
【００４６】
また、細胞内プローブなどと複合化させることを意図した表面修飾された金ナノ粒子が市販されており（コスモ・バイオ社など）、このような表面修飾金ナノ粒子と複合化させるために、所定の官能基や結合物質を有する金属粒子表面修飾ユニットを共重合体の末端に導入してもよい。
【００４７】
金属粒子表面修飾ユニットは、好ましくは前記式（ｃ）で表される繰り返し単位である。式（ｃ）で表される繰り返し単位のうち好ましいものとしては、
・Ｚが−Ｃ（＝Ｓ）−を表し、Ｒ２１がフェニルを表すもの、
・Ｚが−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、Ｒ２１がフェニルを表すもの、
・Ｚが−Ｃ（＝Ｓ）−を表し、Ｒ２１が基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１０〜１４のアルキル基を表す）を表すもの、
・Ｚが−ＣＨ（−ＳＨ）−を表し、Ｒ２１が基−Ｓ−Ｒ２２（Ｒ２２は炭素数１０〜１４のアルキル基を表す）を表すもの
が挙げられる。
【００４８】
金属粒子表面修飾ユニットの具体例は以下の通りである。
【化９】
0006607746.tif 000010
【００４９】
本発明のプローブは、金属粒子表面修飾ユニットとは別に、共重合体の末端に標的結合ユニットを有することができる。標的結合ユニットは必要に応じて分析対象と相互作用できる部分や細胞等への移行物質を導入できるユニットである。このようなユニットとしては、例えば、分析対象と相互作用できる部位等を共有結合で繋ぎ止めることができる官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基等）を有する構造体が挙げられる。後述のように本発明の共重合体はＲＡＦＴ重合により製造することができるが、その場合、ベンゾジチオエートやアルキルトリチオカルボナートをＲＡＦＴ剤として用いる際に該エステル部分に標的結合ユニットを導入しておくことで、末端に標的結合ユニットを有する共重合体を製造することができる。また、重合後に末端に有する官能基に対する化学反応によって、新たに望ましい官能基を導入することができる。このような官能基としては、例えば、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、チオール基、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、ジベンゾシクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、ベンゾフェノン基、ビオチン基、イミノビオチン基、ハロゲン化アルキル基、シトシニルメチルフェニル基、グアニルメチルフェニル基が挙げられる。
【００５０】
標的結合ユニットは、好ましくは前記式（ｄ）で表される繰り返し単位である。式（ｄ）で表される繰り返し単位のうち好ましいものとしては、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３がそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、パラニトロフェニルエステル基、アミノ基、−ＣＨ２ＮＨ２、チオール基および−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨからなる群（以下「官能基群Ｂ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−４アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ｂから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−４アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ｂから選択される官能基または官能基群Ｂから選択される官能基により置換されたＣ１−４アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表す
ものが挙げられる。
【００５１】
式（ｄ）で表される繰り返し単位のうちより好ましいものとしては、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３がそれぞれ独立して
水素原子、
シアノ、カルボキシル基、−ＣＨ２ＮＨ２および−Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ２＋Ｃｌ−）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨからなる群（以下「官能基群Ｃ」という）から選択される官能基、
Ｃ１−４アルキル基（このアルキル基は同一または異なっていてもよく前記官能基群Ｃから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）、または
−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキル（Ｑ１は結合またはＣ１−４アルキレンであり、Ｑ２は−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、Ｃ１−６アルキル基は、同一または異なっていてもよく前記官能基群Ａから選択される１種または２種以上の官能基により置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも一つが前記官能基群Ｃから選択される官能基または官能基群Ｃから選択される官能基により置換されたＣ１−４アルキル基あるいは前記官能基群Ａから選択される官能基により置換された基−Ｑ１−Ｑ２−Ｃ１−６アルキルを表す
ものが挙げられる。
【００５２】
標的結合ユニットの具体例は以下の通りである。
【化１０】
0006607746.tif 000011
【００５３】
本発明における共重合体の好ましい態様としては、前記式（ａ）の繰り返し単位と、式（ｂ）の繰り返し単位とを少なくとも含んでなるものであり、より好ましい態様としては前記式（Ｉａ）で表される共重合体である。式（Ｉａ）の共重合体中、光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットは特に限定されず、ランダムに配列されても、交互に配列されても、ブロック状に配列されてもよい。また、式（Ｉａ）中、ｍおよびｎは光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットの比（モル比）を表し、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００であり、好ましくは１〜１００であり、より好ましくは１〜２０である。
【００５４】
本発明における共重合体のよりいっそう好ましい態様としては、前記式（ａ）の繰り返し単位と、式（ｂ）の繰り返し単位とを少なくとも含んでなり、その一方の末端に式（ｃ）の繰り返し単位を有し、場合によって、もう一方の末端に式（ｄ）の繰り返し単位を有する共重合体が挙げられ、特に好ましくは前記式（Ｉ）で表される共重合体である。式（Ｉ）の共重合体中、光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットは特に限定されず、ランダムに配列されても、交互に配列されても、ブロック状に配列されてもよい。また、式（Ｉ）中、ｍおよびｎは光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットの比（モル比）を表し、ｍが１のとき、ｎは１〜１０００であり、好ましくは１〜１００であり、より好ましくは１〜２０である。
【００５５】
式（Ｉ）および式（Ｉａ）において、光活性化型ラマン標識ユニットの繰り返し単位数（ｍ’）と、親水性ユニットの繰り返し単位数（ｎ’）は、例えば、ｍ’＝１〜１００で、かつ、ｎ’＝１０〜１０００とすることができ、好ましくは、ｍ’＝５〜２０で、かつ、ｎ’＝５０〜２００である。
【００５６】
式（Ｉ）および式（Ｉａ）で表される共重合体の重量平均分子量は、５，０００〜９００，０００とすることができるが、好ましくは５，０００〜２００，０００である。
【００５７】
式（Ｉ）および式（Ｉａ）で表される共重合体の数平均分子量は、４，０００〜８００，０００とすることができるが、好ましくは４，０００〜２００，０００である。
【００５８】
本発明のプローブは光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを少なくとも含んでなる共重合体を、表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子との複合化してなるものである。
【００５９】
本発明において、「表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子」は、表面増強ラマン散乱活性（ＳＥＲＳ活性）を有するものであれば特に限定されないが、例えば、金、銀、白金等の金属粒子（好ましくは金属ナノ粒子）が挙げられる。表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子のうちより強いラマンシグナルが得られるものとしては金ナノ粒子および銀ナノ粒子が挙げられ、最も好ましくは金ナノ粒子である。
【００６０】
本発明のプローブで複合体を形成する金属粒子としては、粒径が５〜９００ｎｍ程度のものを使用することができ、好ましくは１０〜１００ｎｍ程度のものである。なお、金属粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察結果から求めることができる。
【００６１】
製造方法
本発明のプローブは共重合体部分を製造し、該共重合体を金属粒子と複合化することで製造することができる。
【００６２】
本発明のプローブを構成する共重合体がアクリル系共重合体である場合には、ビニル結合を有するアクリル酸、アクリル酸エステル、アクリル酸アミドなどのモノマーをラジカル重合反応などにより重合させることにより該共重合体を製造することができる。本発明のプローブを構成する共重合体がメタクリル系共重合体である場合には、ビニル結合を有するメタクリル酸、メタクリル酸エステル、メタクリル酸アミドなどのモノマーをラジカル重合反応などにより重合させることにより該共重合体を製造することができる。
【００６３】
光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを繰り返し単位として少なくとも含んでなる共重合体は、光活性化型ラマン標識部位や親水性基が導入されていない原料モノマーを重合させて重合体を製造し、次いで、光活性化型ラマン標識部位と親水性基を重合体に導入することで製造することができる。この場合、重合体の繰り返し単位中の側鎖が反応性の官能基である場合にはそこに光活性化型ラマン標識部位と親水性基を導入することができる。重合体の繰り返し単位中の側鎖の官能基（例えば、カルボキシル基）が活性エステル構造である場合にはアミンの求核反応によりアミド結合で光活性化型ラマン標識部位と親水性基を導入することができる。金属粒子表面修飾ユニットや標的結合ユニットを重合体の末端に導入する場合には、両ユニットを有するＲＡＦＴ剤を用いて重合反応を実施することにより行うことができる。
【００６４】
光活性化型ラマン標識ユニットと親水性ユニットとを繰り返し単位として少なくとも含んでなる共重合体は、光活性化型ラマン標識部位があらかじめ導入された原料モノマーと、親水性基があらかじめ導入された原料モノマーとを準備し、これらを重合させて製造することもできる。
【００６５】
本発明のプローブを構成する共重合体は、好ましくはＲＡＦＴ重合反応により製造できる。具体的には、原料モノマーを重合させて重合体を調製し、次いで光活性化型ラマン標識部位と親水性基を導入することで製造することができる。ＲＡＦＴ重合反応に使用するＲＡＦＴ剤としてベンゾジチオエートやアルキルトリチオカルボナートをＲＡＦＴ剤として用いることで末端にジチオフェニルエステル構造やトリチオアルキルカルボナート構造を有する重合体を製造することができる。また、上記の場合、ベンゾジチオエートやアルキルトリチオカルボナートのエステル部分に標的結合ユニットを導入しておくことで、一方の末端に標的結合ユニットを有する重合体を製造することができる。
【００６６】
ＲＡＦＴ重合反応による重合体骨格の合成は下記スキームに従って実施することができる。反応条件は使用する重合開始剤の種類に応じて適宜設定することができるが、反応開始剤として例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビ（４−メトキシ２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）などを用いた場合には、３０〜１００℃の反応温度で、４〜７２時間かけて重合反応を実施することができる。
【化１１】
0006607746.tif 000012
（上記スキーム中、Ｒ１は前記式（ａ）で定義された内容と同義であり、Ｒ４１はペンタフルオロフェニルなどの活性エステルを表し、Ｚは−（Ｃ＝Ｓ）−を表し、Ｒ２１は前記式（ｃ）で定義された内容と同義であり、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３は前記式（ｄ）で定義された内容と同義であり、ｐは約１０〜約１０００を表す。）
【００６７】
また、ＲＡＦＴ重合により得られた重合体骨格への光活性化型ラマン標識部位および親水性基の導入は下記スキームに従って実施することができる。すなわち、活性エステルへのアミンの求核反応によりアミド結合で光活性化型ラマン標識部位と親水性基を導入し、式（Ｉ）の共重合体を得ることができる。
【化１２】
0006607746.tif 000013
【化１３】
0006607746.tif 000014
（上記スキーム中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１〜Ｒ１４、Ｒ１７〜Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ４１、ｍおよびｎは前記式（ａ）、式（ｂ）、式（ｃ）、式（ｄ）、式（ｉｉ）、式（Ｉ）および前記スキームで定義された内容と同義であり、Ｚは−（Ｃ＝Ｓ）−を表し、Ｘはハロゲン原子（例えば塩素原子）を表す。）
【００６８】
式（ｉｉ’）の光活性化型ラマン標識化合物は実施例１に従って合成することができる。すなわち、実施例１にはＲ１３およびＲ１８がメトキシ基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ１０１が水素原子である式（ｉｉ’）の光活性化型ラマン標識部位の製造方法が記載されているが、上記以外の光活性化型ラマン標識化合物は、目的とする光活性化型ラマン標識部位に対応する置換基や構造を有する原料化合物を準備するなどすることにより合成できることは当業者に自明であろう。
【００６９】
本発明のプローブは、上記のようにして製造した共重合体部分を表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子と複合化することにより製造することができる。
【００７０】
複合体の形成は公知の方法に従って行うことができる。例えば、末端に金属粒子表面修飾ユニットを有する共重合体と表面増強ラマン散乱活性を有する金属粒子とを接触させることにより複合体を形成させることができる。また、表面修飾金属粒子を使用する場合には、所定の官能基や結合分子を有する共重合体と反応させるか、あるいは接触させることで複合体を形成させることができる。
【００７１】
ラマン分光分析によるイメージング方法
本発明のプローブはラマン分光分析の標識剤として用いることができ、試料をラマンスペクトルによりイメージングすることができる。ここで、「イメージング」とは分析対象を可視化することを意味する。
【００７２】
本発明のプローブは光応答性のラマンシグナルを発することができる。特に重合体部分に前記式（ｉ）や式（ｉｉ）の光活性化型ラマン標識部位を有する本発明のプローブは、炭素−炭素三重結合がシクロプロペノン骨格で保護されているところ、光照射により炭素−炭素三重結合が生じることとなる。この炭素−炭素三重結合は生体内には本来存在しない分子骨格であることから、プローブは識別性のあるラマンシグナルを発することができる。従って、本発明のプローブを光応答性の標識剤として用いることで、所望のタイミングで所望の場所の分析対象を標識し、その存在をラマンシグナルとして検出することができる。
【００７３】
例えば、ある物質と結合できる本発明のプローブを細胞内に注入し、細胞内の所望の場所に所望のタイミングで光照射した場合、あるタイミングで細胞内のある場所から別の場所に移動した分子のみを選択的にイメージングすることができる。また、本発明のプローブを細胞や細胞小器官に注入し、所望の場所に所望のタイミングで光照射した場合、細胞の空間的な挙動や形態の変化をイメージングすることができる。このようなイメージングは、例えば、創薬標的タンパク質の細胞内輸送の追跡、重要な生命現象や疾病に関わる細胞における細胞小器官の形態や挙動のイメージング、個体発生時の特定細胞の生体内イメージングと追跡などに用いることができる。一例を挙げると、細胞の核内物質と結合できる本発明のプローブを細胞内あるいは細胞核内に集積させ、細胞核のある部位にレーザー照射して標識を光活性化し、細胞をラマン顕微鏡で観察することで、核内物質の細胞内での挙動を観察することができる。ここで、「細胞小器官」とは細胞内の膜系小器官（例えば、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体）に加えて、細胞外に分泌される分泌小胞（例えば、エクソソーム）も含む意味で用いられる。
【００７４】
本発明のイメージング方法において「試料」は、光照射およびラマンスペクトルの検出が可能である限り特に限定されるものではないが、本発明のプローブは生体試料のバックグラウンドシグナルの影響を受けずにラマンスペクトルを検出できることから、好ましくは生体試料である。生体試料としては、例えば、組織、細胞、血液、血清、血漿などの生体から単離された試料が挙げられ、これら以外にも、植物から単離された試料（例えば、植物細胞、植物組織）、微生物などが挙げられる。
【００７５】
本発明のプローブは、分析対象に直接結合させることで分析対象をイメージングすることができ、あるいは、分析対象と特異的に結合する抗体、リガンド、受容体、相補的な核酸プローブ、アプタマー、多糖、脂質などの分析対象と相互作用する物質と結合させ、これらを介して分析対象をイメージングすることができる。
【００７６】
本発明のプローブを細胞内外の分析対象のイメージングに使用する場合には、細胞や細胞小器官への移行物質および／または分析対象と相互作用する物質を光活性化型ラマン分光分析用プローブに連結する工程を、本発明のプローブと試料との接触工程の前に実施してもよい。分析対象と相互作用する物質や、細胞および細胞小器官に集積させる物質は各種の架橋剤やリンカー化合物を介して結合させることができる。本発明で使用可能な架橋剤やリンカー化合物は当技術分野で慣用されており、当業者であれば適宜選択して使用することができる。
【００７７】
イメージングできる分析対象としては生体分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明のイメージング方法の対象となる分析対象の例としては、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、阻害物質、薬剤、製剤、栄養分、プリオン、トキシン、毒物、爆発物、農薬、化学兵器物質、生物学的有害物質、放射線同位体、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異誘発物質、麻薬、アンフェタミン、バルビツール酸塩、幻覚発現物質、廃棄物、汚染物質等が挙げられる。
【００７８】
本発明のプローブはまた、マイクロインジェクションなどの手法により細胞や細胞小器官に集積させ、細胞や細胞小器官をイメージングすることができ、あるいは、抗体、リガンド、受容体、アプタマー、多糖などで修飾した本発明のプローブを細胞や細胞小器官と接触させることにより、細胞や細胞小器官に選択的に集積させて細胞や細胞小器官をイメージングすることもできる。後者の場合、ポリアルギニンペプチドなどの細胞透過性物質や、ポリエチレンイミンなどの細胞質導入物質を連結することで本発明のプローブを細胞内や細胞質に移行ないし集積させることができる。また、特定細胞への集積を可能にする物質を連結することで本発明のプローブを該特定細胞へ集積することができ、この場合特定細胞をイメージングすることができる。例えば、葉酸、環状ＲＧＤペプチドなどのがん細胞集積物質を連結することで本発明のプローブをがん細胞にそれぞれ移行ないし集積させ、がん細胞の挙動（走化性や免疫細胞による貪食など）を時空間的に追跡することが可能になる。
【００７９】
本発明のプローブを細胞や細胞小器官のイメージングに使用する場合には、細胞や細胞小器官への移行物質を光活性化型ラマン分光分析用プローブに連結する工程を、本発明のプローブと試料との接触工程の前に実施してもよい。細胞および細胞小器官に集積させる物質は各種の架橋剤やリンカー化合物を介して結合させることができる。本発明で使用可能な架橋剤やリンカー化合物は当技術分野で慣用されており、当業者であれば適宜選択して使用することができる。
【００８０】
本発明のイメージング方法において、光照射およびラマンスペクトルの検出を含むラマン分光分析は通常のラマン分光の測定方法に従って行うことができる。
【００８１】
光照射の際の励起波長は特に制限されないが、２８０〜４５０ｎｍとすることができ、好ましくは３００〜４００ｎｍである。ラマンスペクトルを測定する波長は特に制限されないが、式（ｉ）の光活性化部位を有するプローブの場合４５０〜９００ｃｍ−１とすることができ、好ましくは５００〜８００ｃｍ−１である。
【００８２】
例えば、ラマン分光の測定は、市販のラマン分光分析器を用いて行うことができる。ラマン分光分析器としては、一般的なラマン分光分析装置全般等が挙げられるが、好ましくはレーザーラマン顕微鏡である。
【実施例】
【００８３】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００８４】
実施例１：光活性化型ラマン分光分析用プローブの製造
（１）Ｎ−（１，２−ビス（３−メトキシフェニル）エチル）アミン（化合物２）の合成
【化１４】
0006607746.tif 000015
【００８５】
乾燥させた１００ｍＬ三ツ口フラスコにマグネシウム（６．４ｇ、２６６ｍｍｏｌ）を加え、１，２−ジブロモエタン（１００μＬ）を含有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１０ｍＬ）を滴下し、撹拌を開始した。そこへ更に３−メトキシベンジルクロリド（化合物１）（５．５０ｍＬ、３７．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５５ｍＬ）を３時間かけて滴下したのち、更に３０分撹拌を行った。得られたＴＨＦ溶液を３−メトキシベンゾニトリル（３．３ｍＬ、２７．０ｍｍｏｌ）の入った２００ｍＬ二ツ口フラスコに移し、１時間加熱還流を行った。その後、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（２．８３ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（４０ｍＬ）にゆっくり加え１時間撹拌を行った。この反応溶液を溶媒留去により濃縮した。純水で懸濁させジクロロメタンで３回抽出を行い、有機相を硫酸マグネシウムにより乾燥し濃縮した。粗精製状態で薄層クロマトグラフィー（トリクロロメタン：メタノール＝５０：１、Ｒｆ＝０．２１）を行ったところ、ニンヒドリンによる呈色が確認された。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリクロロメタン：メタノール＝５０：１）による精製を行い、同一物質のフラクションを集め溶媒を減圧留去し、薄黄色のオイルとして化合物２を得た。収量は６．９６ｇ、収率は６４％であった。同定は１Ｈ  ＮＭＲにて行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １．５７（ｂｒｓ，２Ｈ），２．７７（ｄｄ，１Ｈ），２．９７（ｄｄ，１Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），４．１６（ｄｄ，１Ｈ），６．７２−６．９６（ｍ，６Ｈ），７．２０（ｍ，２Ｈ）
【００８６】
（２）Ｎ−（１，２−ビス（３−メトキシフェニル）エチル）トリフルオロアセトアミド（化合物３）の合成
【化１５】
0006607746.tif 000016
【００８７】
化合物２（２．８５ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２８ｍＬ）にピリジン（４．１ｍＬ）を加えた。０℃に冷却したのち、トリフルオロ酢酸無水物（３．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を滴下し、氷浴を外し一晩反応させた。薄層クロマトグラフィーにより出発物質である化合物２の消失を確認した。水でクエンチしたあと、水相から２回抽出を行った。抽出した有機相を合わせ水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５，Ｒｆ＝０．３）により精製し同一分画を濃縮し、薄黄色固体として化合物３を得た。収量は３．０５ｇ、収率は７８％であった。同定は１Ｈ  ＮＭＲにて行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ３．１１（ｄ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），５．２１（ｑ，１Ｈ），６．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），６．５６−６．８５（ｍ，６Ｈ），７．１６（ｔ，１Ｈ），７．２８（ｔ，１Ｈ）
【００８８】
（３）Ｎ−（４，９−ジメトキシ−１−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｅ］−シクロプロパン［ｃ］シクロオクテン−６−イル）トリフルオロアセトアミド（化合物４）の合成
【化１６】
0006607746.tif 000017
【００８９】
乾燥させた１００ｍＬ二つ口フラスコに塩化アルミニウム（４．４０ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）を加え、その後アルゴン雰囲気にした。これにジクロロメタン（４５ｍＬ）、テトラクロロシクロプロペン（１．０５ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分撹拌した後−２０℃に冷却した。さらに化合物３（２．８５ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６９ｍＬ）を滴下し、２時間撹拌を行った。室温に戻し更に１時間撹拌を行った。反応溶液に水２４ｍＬを加え３０分間激しく撹拌した。水相からジクロロメタンで３回抽出を行い硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン：ヘキサン＝１：１、Ｒｆ＝０．２５→７：３）を行い、同一分画を濃縮し、薄黄色固体として化合物４を得た。収量は１．５８ｇ、収率は４９％であった。同定は１Ｈ  ＮＭＲで行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２．９０（ｄ，１Ｈ），３．４１（ｄｄ，１Ｈ），３．８２（ｓ，６Ｈ），４．８４（ｂｒｓ，１Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），７．０９（ｍ，３Ｈ），７．８９（ｍ，２Ｈ），１０．４６（ｄ，１Ｈ）
【００９０】
（４）Ｎ−（４，９−ジメトキシ−１−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｅ］−シクロプロパン［ｃ］シクロオクテン−６−イル）  アミン塩酸塩（化合物５）の合成
【化１７】
0006607746.tif 000018
【００９１】
１００ｍＬ二つ口フラスコに化合物４（１６８ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）を加え、その後アルゴン雰囲気にした。これにメタノール（８．６ｍＬ）、４０％塩酸（６．６ｍＬ）を加えて、４０℃で２４時間反応を行った。懸濁状態であったが、溶液が黄色になった。薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）により出発物質である化合物４の消失が確認された。室温で撹拌しながら減圧することで、溶媒を留去した。２−プロパノールに溶解したあとに、ジエチルエーテルを加えることで沈殿させ、吸引ろ過により固体を回収した。反応は定量的に進行し、薄黄色の粉末として化合物５を得た。塩酸塩の形になっていると考えられる。同定は１Ｈ  ＮＭＲで行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．０４（ｄ，２Ｈ），３．１０（ｓ，１Ｈ），３．３０（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，６Ｈ），４．４２（ｂｒｓ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｓ，２Ｈ），７．８８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ）
【００９２】
（５）ポリ（ペンタフルオロフェニルメタクリレート）（化合物８）の合成
【化１８】
0006607746.tif 000019
【００９３】
フレームドライによって乾燥させた５０ｍＬシュレンク管に４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（化合物７）（５４．８ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（４．１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加え、減圧乾燥後アルゴン雰囲気にした。さらにジオキサン（１．０ｍＬ）、ペンタフルオロフェニルメタクリレート（化合物６）（１．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。凍結脱気を６サイクル行い、酸素を除いた。最後は窒素置換を行った。オイルバスを９０℃に設定し、１８時間反応させた。反応後、ヘキサンを加えると、沈殿が生じた。沈殿を吸引ろ過により回収した。ＴＨＦで再溶解しヘキサンを加え沈殿させ、吸引ろ過によって回収する作業を２回行うことで精製し、薄赤色の粉末として化合物８を得た。収量は３７３ｍｇ、転換率は３７％であった。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果から、未反応のモノマーを除去することに成功したことが確認された（データ省略）。また、末端の芳香環と、主鎖のプロトンプロトン比から、得られたポリマーの平均重合度は６３であり（ｐ＝６３）、そこから求められる平均分子量はＭｎ＝１５．９ｋＤａであった。
【００９４】
（６）化合物８に光活性化部位と親水性部位とが導入された化合物（化合物９）の合成
【化１９】
0006607746.tif 000020
【００９５】
５０ｍＬ二つ口フラスコに、化合物８（２０４．５ｍｇ）と化合物５（６１．２ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気にした。これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／ＴＨＦ（１：１）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．１３ｍＬ）を加え、室温で一晩反応を行った。更に１−アミノ−２−プロパノール（1-amino-2-propanol）（０．２５ｍＬ）を加え、１１時間反応を行った。反応溶液を氷浴につけたジエチルエーテルに加えると、沈殿を生じた。生じた沈殿を遠心分離（１００００ｇ、１０分）により落とし、上澄みを除いた。そこにＤＭＦを加え再溶解させ、氷浴につけたジエチルエーテルに加え、沈殿を生じさせた。生じた沈殿を遠心分離（１００００ｇ、１０分）により落とし、上澄みを除いた。この操作を黄色の粘性化合物が観察されなくなるまで繰り返した。最後にジエチルエーテルで一回洗浄し、ＤＭＦを洗った。減圧下で一晩乾燥を行い、白色粉末として化合物９を得た。収量は９０ｍｇであった。同定は１Ｈ  ＮＭＲで行った。化合物５と１−アミノ−２−プロパノールが導入されたことに起因するピークが見られた（データ省略）。その積分比から、ポリマー中の光活性化部位の割合は、１０．６ｍｏｌ％から１２．２ｍｏｌ％であると考えられた。つまり、重合度６３のうち、６．６〜７．７が光活性化部位に変換されたことが確認された。また、計算から平均分子量は１０．６ｋＤａ〜１０．８ｋＤａであると見積もられた。
【００９６】
（７）化合物９と金ナノ粒子との複合体形成
金ナノ粒子（ＧＮＰ）（シグマアルドリッチ社製）とクエン酸緩衝液をスクリュー瓶に入れて、室温で撹拌を行った。得られたＧＮＰ溶液（０．０３２ｎＭ、４００μＬ）に化合物９のＰＢＳ溶液（４４μＬ）を加え、室温で３０分間撹拌を行い、化合物９と金ナノ粒子との複合体を作製した（化合物９：２００μＭ、ＧＮＰ：０．０３ｎＭ）。これを本発明の光活性化型ラマン分光分析用プローブとした。
【００９７】
実施例２：光活性化型ラマン分光分析用プローブを用いたラマン顕微鏡観察
実施例１（６）で作製された化合物９にＰＢＳを加え、２ｍＭおよび２００μＭの溶液を調製した。これらの溶液に対して３６５ｎｍの光照射（２．４ｍＷ／ｃｍ２）を行い、光活性化を行った（７８５ｎｍ励起）。光照射前後の溶液について、ｉｎＶｉａ共焦点ラマンマイクロスコープ（レニショー社製）を用いてラマンスペクトル測定を行った。
【００９８】
その結果、２ｍＭ溶液の場合、光照射前ではシクロプロぺノンのＣ＝Ｏ伸縮に由来する１８５０ｃｍ−１のピークが観測されたが（図１Ａ）、光照射後ではこのピークが消失し、新たに２１３８ｃｍ−１と２１６５ｃｍ−１にＤＢＣＯのアルキン由来のブロードな２つのピークが生じた（図１Ｂ）。一方、２００μＭ溶液の場合は、光照射前後で上記の特徴的なピークが弱いか、あるいは観測されなかった（図２ＡおよびＢ）。すなわち、化合物９についてはミリモルオーダーの高濃度でしかシグナルが検出できないことが明らかとなった。
【００９９】
次に、実施例１（７）で作製された複合体溶液に対して３６５ｎｍの光照射（２．４ｍＷ／ｃｍ２）を行い、光活性化を行った（５３２ｎｍ励起）。光照射前後の溶液について、ｉｎＶｉａ共焦点ラマンマイクロスコープ（レニショー社製）を用いてラマンスペクトル測定を行った。
【０１００】
その結果、光照射前ではシクロプロぺノンのＣ＝Ｏ伸縮に由来する１８５０ｃｍ−１のピークが観測されたが（図３Ａ）、光照射後では、このピークが消失し、新たに２１４２ｃｍ−１と２１６８ｃｍ−１に２つのＤＢＣＯアルキン由来のブロードなピークが生じた（図３Ｂ）。
【０１０１】
以上の結果から、実施例１（７）で作製された複合体（本発明の光活性化型ラマン分光分析用プローブ）はマイクロモルオーダーでもシグナルの検出は可能であることが確認された。
【０１０２】
実施例３：細胞内導入用光活性化型ラマン分光分析用プローブの製造
光活性化型ラマン分光分析用プローブがエンドサイトーシスにより細胞内に導入されるのを可能にするために、光活性化型ラマン分光分析用プローブの生体分子結合ユニットに細胞内導入用の分子デバイス（ポリアルギニンペプチド）を導入したプローブ（細胞内導入用光活性化型ラマン分光分析用プローブ）を作製した。
【０１０３】
（１）アジド化された化合物９の合成
【化２０】
0006607746.tif 000021
実施例１（６）で作製された化合物９（１３．４ｍｇ、１．２６μｍｏｌ、１ｅｑ．）とＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．５１ｍｇ、２．４７μｍｏｌ、１．９６ｅｑ．）を二口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気にした。これにＤＭＦ（０．３ｍＬ）、アジドプロピルアミン（１０μＬ、７６．３μｍｏｌ、６０．６μｍｏｌ）を加え、１９時間撹拌を行った。その後、薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）により、出発物質である化合物９の消失を確認した。更に、ニンヒドリン呈色によりアジド由来の呈色も確認した。そこで、反応溶液を氷冷したジエチルエーテル中に加えて遠心分離を行い、得られた再沈殿物を回収し、減圧乾燥を行い、アジド化された化合物９を得た。
【０１０４】
（２）ポリアルギニンペプチドで修飾された化合物９の合成
ペプチド（Ｇ３Ｒ１５ＧＹＣ（ＮＨ２−ＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＹＣ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）：Ｍｗ＝２８５５．３、１．１０ｍｇ、７６４μＭ、１ｅｑ．）をＰＢＳ（０．５ｍＬ）に溶解させた。これにマレイミドアルキン（０．２１ｍｇ、１ｅｑ．）のＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）を加え、室温、遮光下で２４時間反応させた。得られた反応溶液にアルゴンバブリングを１５分間行ったものを、実施例３（１）で作製されたアジド化された化合物９（４．０６ｍｇ、１ｅｑ．）、硫酸銅五水和物（０．９２ｍｇ、９．６ｅｑ．）、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）（１．８６ｍｇ、１１．２ｅｑ．）およびアスコルビン酸ナトリウム（７．３７ｍｇ、９３．４ｅｑ．）を入れたチューブに移し、振とう器で４日間反応を行った。得られた反応溶液を透析チューブ（分子量分画：３．５ｋＤａ）に移し、透析による精製を８時間行い、ポリアルギニンペプチドで修飾された化合物９を得た。
【０１０５】
（３）ポリアルギニンペプチドで修飾された化合物９と金ナノ粒子との複合体形成
金ナノ粒子をクエン酸緩衝液に溶解させて得られた溶液１．５ｍＬ（０．０３２ｎＭ）をマイクロチューブに加え、遠心分離（１５００ｇ、４℃、３０分）を行った後、上清を除いた。これに、実施例３（２）で作製されたポリアルギニンペプチドで修飾された化合物９の水溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、遮光下で４日間振とう器で反応を行った。遠心分離（１５００ｇ、４℃、３０分）を行った後、上清を除いた。これにｍｉｌｌｉＱ水を加えて再分散させ、遠心分離（１５００ｇ、４℃、３０分）を行った後上清を除く操作を２回行い、これを細胞内導入用光活性化型ラマン分光分析用プローブとした。なお、細胞内導入用光活性化型ラマン分光分析用プローブはこのまま保存し、細胞イメージングに用いる直前に、無血清ＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）を加えて再分散させたものを以下の実施例４で使用した。
【０１０６】
実施例４：光活性化型ラマン分光分析用プローブを用いたラマン顕微鏡観察
石英ガラスボトムディッシュ（直径３５ｍｍ）を用いて、ＨｅＬａ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を血清入りＤＭＥＭ培地で１０時間培養した。培地を除き、ＰＢＳ溶液で洗浄後、実施例３（３）で作製した細胞内導入用光活性化型ラマン分光分析用プローブ（１ｍＬ）を加え、３７℃で２時間培養を行った。培養後、波長３６０ｎｍ（４．３Ｊ／ｃｍ２）の光照射を行うものと、光照射を行わないコントロールのそれぞれについてｉｎＶｉａ共焦点ラマンマイクロスコープ（レニショー社製）を用いてラマン顕微鏡観察およびラマンスペクトル測定を行った。なお、ラマン顕微鏡で観察する前に、培地を除き血清入りのＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）に交換した。ラマン顕微鏡観察には７８５ｎｍの励起光を用いた。
【０１０７】
その結果、光を照射した細胞内のラマンスペクトルからは、ＳＥＲＳ効果によって増強されたポリマーのピークが観察されるとともに、光照射によって活性化されたアルキン由来のピーク（２１６０ｃｍ−１）も観察された（図４ＡおよびＣ）。一方、光を照射していない細胞内のラマンスペクトルからは、ＳＥＲＳ効果によって増強されたポリマーのピークは観察されるが、アルキン由来のピークは観察されなかった（図４ＢおよびＤ）。
【０１０８】
次に、上記結果が、細胞内の都合の良い部位のラマンスペクトルのみを選択して示しているのではないことを示すために、細胞全体を含む領域を走査して得られたラマンイメージング画像の全スペクトルをラマン顕微鏡画像解析用ソフト（WiRE4、レニショー社）を用いて主成分解析を実施した。
【０１０９】
その結果、光を照射した細胞からは、第３成分および第４成分にアルキン由来のピークが観察されたが（図５Ａ）、光を照射していない細胞からは、第１０成分まで調べてもアルキン由来のピークが観察されなかった（図５Ｂ）。なお、第５成分以降は大部分がノイズであり、有意なピークが観察されなかったため割愛した。
【０１１０】
以上の結果から、生体分子結合ユニットに細胞内導入用の分子デバイスを修飾することによって細胞内に光活性化型ラマン分光分析用プローブを導入することができること、また、光照射によってそのアルキンシグナルを細胞内で活性化でき、ラマン顕微鏡によってそのアルキンシグナルを検出できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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