(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー前駆体を含む水溶液をウェルアレイのウェル内に適用することと、
不混和流体を前記ウェルアレイ上に適用して、前記ウェルアレイの前記ウェル内に前記水溶液を分離することと、
前記ウェルアレイの前記ウェル内に分離された前記ポリマー前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
【請求項２】
エマルションをウェルアレイのウェル上に適用することであって、前記エマルションが不混和連続相内に水性分散相を含み、前記水性分散相がポリマー前駆体を含み、前記分散相が前記ウェルアレイの前記ウェル内で融合する、前記適用することと、
第２の不混和流体を前記ウェルアレイの前記ウェル上に適用して、前記エマルションを置換することと、
前記ウェルアレイの前記ウェル内の前記ポリマー前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
【請求項３】
表面反応性官能基及びラジカル形成末端基を含む表面化合物で、ウェルアレイのウェル内の表面を処理することと、
ポリマー前駆体を含む水溶液を、前記ウェルアレイの前記ウェルに適用することと、
開始剤及び原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）触媒を用いて、前記表面結合化合物の前記ラジカル形成末端基を活性化させ、前記ポリマー前駆体のラジカル重合を前記ウェルアレイの前記ウェル内で開始させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
【請求項４】
前記１または複数のウェルが、０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１または複数のウェルが、０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲の厚さを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウェルアレイの前記１または複数のウェルがセンサーアレイのセンサーの上に重なり、前記ウェルが前記センサーアレイの前記センサーのイオン感応材料に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーマトリックスアレイのポリマーマトリックスが、前記ウェルアレイのウェルの壁と共形である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー前駆体が、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタリクレート、それらの変異形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマー前駆体が表面活性添加剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー前駆体がオリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー前駆体がＮ−（５−ブロモアセタミジルペンチル）アクリルアミドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶液を適用することが、分散相として前記水溶液を含むエマルションを適用することを含む、請求項１及び３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記不混和流体が、鉱物油、シリコーン油、ヘプタン、カーボネート油、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１、２、及び４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エマルションまたは前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを回転させることをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記エマルションまたは前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを超音波処理することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記エマルションまたは前記水溶液を適用する間、前記ウェルアレイを脱気することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記エマルションまたは前記水溶液を適用する前に、前記ウェルアレイを親水性流体で湿らせることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマー前駆体が開始剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記不混和流体が開始剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記エマルションまたは前記水溶液を適用する前に、表面活性剤で前記ウェル内の表面を処理することをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面反応性官能基がホスホネートを含む、請求項３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ラジカル形成末端基がアミンまたはヒドロキシル基を含む、請求項３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、反応体積を画定するマトリックスアレイ及びそのようなマトリックスアレイを形成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小体積のポリマーマトリックスのアレイは、分析化学及び分子生物学等の分野の研究者にとってますます興味深いものになっている。それらの小体積のポリマーマトリックスを使用して検体を捕捉して、希薄系で分析を行うことができる、またはそれらを使用して複数の検体の分析を同時に行うことができる。特に、それらのポリマーマトリックスアレイは、遺伝子配列技術に役立ち得る。
【０００３】
遺伝子配列のより古い技術、例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列は、多額の費用及び多大な時間を要することが証明されている。最近、蛍光系配列技術用のビーズアレイが調査されている。しかしながら、そのような技術には、配列が決定される対象のポリヌクレオチドを捕捉すること、及びそのような対象のポリヌクレオチドを配列決定中に溶解反応体積内に保持することに関連付けられる難点がある。さらに、ビーズ及びビーズアレイの調製に関連付けられる難点が実践者によって報告されている。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態では、ポリマーマトリックス前駆体を、１つ以上のセンサーに関連付けられるウェルのアレイに適用することができる。ポリマーマトリックス前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスのアレイを形成することができる。それらのポリマーマトリックスは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート可能であり、遺伝子配列技術を含む様々な分析技術で役立ち得る。
[本発明1001]
ポリマー前駆体を含む水溶液をウェルアレイのウェル内に適用することと、
不混和流体を前記ウェルアレイ上に適用して、前記ウェルアレイの前記ウェル内に前記水溶液を分離することと、
前記ウェルアレイの前記ウェル内に分離された前記ポリマー前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
[本発明1002]
前記ウェルが、0．1マイクロメートル〜2マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ウェルが、0．01マイクロメートル〜10マイクロメートルの範囲の厚さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記ウェルアレイの前記ウェルがセンサーアレイのセンサーの上に重なり、前記ウェルが前記センサーアレイの前記センサーのイオン感応材料に対応する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記ポリマーマトリックスアレイのポリマーマトリックスが、前記ウェルアレイのウェルの壁と共形である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記ポリマー前駆体が、ラジカル重合性モノマーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記ラジカル重合性モノマーが、ビニル系モノマーを含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記ビニル系モノマーが、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ポリマー前駆体が架橋剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記架橋剤がビス−アクリルアミドである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記ポリマー前駆体が表面活性添加剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記ポリマー前駆体がオリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記ポリマー前駆体がＮ−（5−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記水溶液を適用することが、分散相として前記水溶液を含むエマルションを適用することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記不混和流体が、鉱物油、シリコーン油、ヘプタン、カーボネート油、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを回転させることをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを超音波処理することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記水溶液を適用する間、前記ウェルアレイを脱気することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記水溶液を適用する前に、前記ウェルアレイを親水性流体で湿らせることをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記ポリマー前駆体が開始剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記不混和流体が開始剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記水溶液を適用する前に、表面活性剤で前記ウェル内の表面を処理することさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
エマルションをウェルアレイのウェル上に適用することであって、前記エマルションが不混和連続相内に水性分散相を含み、前記水性分散相がポリマー前駆体を含み、前記分散相が前記ウェルアレイの前記ウェル内で融合する、前記適用することと、
第2の不混和流体を前記ウェルアレイの前記ウェル上に適用して、前記エマルションを置換することと、
前記ウェルアレイの前記ウェル内の前記ポリマー前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
[本発明1024]
前記ウェルが、0．1マイクロメートル〜2マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記ウェルが、0．01マイクロメートル〜10マイクロメートルの範囲の厚さを有する、本発明1023の方法。
[本発明1026]
前記ウェルアレイの前記ウェルがセンサーアレイのセンサーの上に重なり、前記ウェルが前記センサーアレイの前記センサーのイオン感応材料に対応する、本発明1023の方法。
[本発明1027]
前記ポリマーマトリックスアレイのポリマーマトリックスが、前記ウェルアレイのウェルの壁と共形である、本発明1023の方法。
[本発明1028]
前記ポリマー前駆体が、ラジカル重合性モノマーを含む、本発明1023の方法。
[本発明1029]
前記ラジカル重合性モノマーが、ビニル系モノマーを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ビニル系モノマーが、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記ポリマー前駆体が架橋剤を含む、本発明1023の方法。
[本発明1032]
前記架橋剤がビス−アクリルアミドである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記ポリマー前駆体が表面活性添加剤を含む、本発明1023の方法。
[本発明1034]
前記ポリマー前駆体がオリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む、本発明1023の方法。
[本発明1035]
前記ポリマー前駆体がＮ−（5−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む、本発明1023の方法。
[本発明1036]
前記不混和流体が、鉱物油、シリコーン油、ヘプタン、カーボネート油、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1023の方法。
[本発明1037]
前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを回転させることをさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1038]
前記水溶液を適用することに続いて、前記ウェルアレイを超音波処理することをさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1039]
前記水溶液を適用する間、前記ウェルアレイを脱気することをさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1040]
前記水溶液を適用する前に、前記ウェルアレイを親水性流体で湿らせることをさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1041]
前記ポリマー前駆体が開始剤を含む、本発明1023の方法。
[本発明1042]
前記不混和流体が開始剤を含む、本発明1023の方法。
[本発明1043]
前記水溶液を適用する前に、表面活性剤で前記ウェル内の表面を処理することさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1044]
表面反応性官能基及びラジカル形成末端基を含む表面化合物で、ウェルアレイのウェル内の表面を処理することと、
ポリマー前駆体を含む水溶液を、前記ウェルアレイの前記ウェルに適用することと、
開始剤及び原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）触媒を用いて、前記表面結合化合物の前記ラジカル形成末端基を活性化させ、前記ポリマー前駆体のラジカル重合を前記ウェルアレイの前記ウェル内で開始させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することと
を含む、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法。
[本発明1045]
前記表面反応性官能基がホスホネートを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記ラジカル形成末端基がアミンまたはヒドロキシル基を含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記ウェルが、0．1マイクロメートル〜2マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記ウェルが、0．01マイクロメートル〜10マイクロメートルの範囲の厚さを有する、本発明1044の方法。
[本発明1049]
前記ウェルアレイのウェルがセンサーアレイのセンサーの上に重なり、前記ウェルが前記センサーアレイの前記センサーのイオン感応材料に対応する、本発明1044の方法。
[本発明1050]
前記ポリマー前駆体が、ラジカル重合性モノマーを含む、本発明1044の方法。
[本発明1051]
前記ラジカル重合性モノマーが、ビニル系モノマーを含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記ビニル系モノマーが、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記ポリマー前駆体がオリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む、本発明1044の方法。
[本発明1054]
前記ポリマー前駆体がＮ−（5−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む、本発明1044の方法。
[本発明1055]
前記ポリマー前駆体が架橋剤を含む、本発明1044の方法。
[本発明1056]
前記架橋剤がビス−アクリルアミドである、本発明1055の方法。
[本発明1057]
アクリレートまたはアクリルアミド及び臭素官能化アクリレートまたは臭素官能化アクリルアミドを含む前駆体から形成されたポリマーマトリックスを、ウェルのアレイのウェル内で硬化させることと、
チオ安息香酸オリゴヌクレオチド複合体を前記硬化されたポリマーに適用することであって、前記チオ安息香酸オリゴヌクレオチド複合体が前記ポリマーマトリックスと反応して、オリゴヌクレオチドコンジュゲートポリマーマトリックスを形成する、前記適用することと
を含む方法。
[本発明1058]
前記臭素官能化アクリレートまたは臭素官能化アクリルアミドが、Ｎ−（5−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記アクリレートまたはアクリルアミドが、ヒドロキシアルキルアクリルアミドを含む、本発明1057の方法。
[本発明1060]
増幅条件下で対象のポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートポリマーマトリックスに適用することをさらに含む方法であって、前記オリゴヌクレオチドが前記対象のポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を含む、本発明1057の方法。
[本発明1061]
前記オリゴヌクレオチドが、前記対象のポリヌクレオチドに少なくとも一部基づいて伸長される、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記ウェルに動作可能に連結されたセンサーを用いて、前記伸長されたオリゴヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
配列を決定することが、ヌクレオチドを含む溶液を前記ポリマーマトリックスに連続して適用することと、前記センサーを用いて反応を測定することとを含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、各センサーがイオン感応材料層を含む、センサーアレイと、
前記センサーアレイ上に配置されており、かつ前記複数のセンサーのセンサーに対応するウェルを画定しているウェルアレイであって、センサーの前記イオン感応材料層が、対応するウェルの底部表面を形成している、ウェルアレイと、
前記ウェル内に配置された共形ポリマーマトリックスと
を含む装置。
[本発明1065]
前記共形ポリマーマトリックスがポリアクリルアミドマトリックスを含む、本発明1056の装置。
[本発明1066]
前記ポリマーマトリックスが、所定の位置で硬化されたポリマーマトリックスである、本発明1056の装置。
[本発明1067]
前記共形ポリマーマトリックスがオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる、本発明1056の装置。
[本発明1068]
前記ウェルが、0．1マイクロメートル〜2マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する、本発明1056の装置。
[本発明1069]
前記ウェルが、0．01マイクロメートル〜10マイクロメートルの範囲の厚さを有する、本発明1056の装置。
[本発明1070]
前記複数のセンサーがイオン感応電界効果トランジスタである、本発明1056の装置。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
以下の図面を参照して本開示をよりよく理解することができ、その多くの特徴及び利点が当業者に明らかになった。
【０００６】
【図１】例示的な測定システムの図を含む。
【図２】例示的な測定構成要素の図を含む。
【図３】測定構成要素の例示的なアレイの図を含む。
【図４】例示的なウェルの構造の図を含む。
【図５】例示的なウェル及びセンサーの構造の図を含む。
【図６】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図７】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図８】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図９】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１０】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１１】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１２】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１３】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１４】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【図１５】例示的な方法によるプロセス中の加工部品の図を含む。
【０００７】
異なる図面内で同じ参照記号を使用することによって、類似するまたは同一の品目を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
例示的な実施形態では、測定システムはウェルに分配された親水性ポリマーマトリックスのアレイを含み、ウェルは、センサー、例えば、センサーアレイのセンサーに関連付けられる。一例では、親水性マトリックスはヒドロゲルマトリックスである。一対一の構造では、親水性マトリックスはセンサーアレイのセンサーと一致しなくてもよい。さらなる例では、センサーアレイのセンサーは、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）センサー、例えば、イオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）等を含み得る。特に、マトリックス材料は所定の位置で硬化され、検知デバイスの個々のウェルの構造に適合する。ウェル間の間隙領域にはポリマーマトリックスが実質的に存在し得ない。一例では、マトリックス材料を結合、例えば、ウェルの表面に共有結合することができる。一例では、ウェルは、１００ｎｍ〜１０マイクロメートルの深さまたは厚さを有する。別の例では、ウェルは、特徴的な直径を、０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの範囲で有し得る。
【０００９】
例示的な方法では、ポリマー前駆体を含む水溶液をウェルアレイのウェル内に適用することによって、ポリマーマトリックスアレイを形成することができる。ウェルアレイ上に配置される不混和流体を使用することによって、ウェルアレイによって画定される水性材料の体積を分離することができる。溶液の分離体積を使用して、マトリックス前駆体の重合を容易にすることができ、それによって、マトリックスアレイをウェル内に分配させることができる。一例では、水性前駆体をウェル上に流動させることにより、マトリックス前駆体を含む水溶液が検知デバイスのウェルに分配される。別の例では、水溶液はエマルション内に分散相として含まれる。分散相は沈澱し得る、またはウェルアレイのウェル内に誘引され得る。水相内または不混和流体内に配置された開始剤を使用することによって、マトリックス前駆体の重合を開始ことができる。別の例では、重合を熱的に開始することができる。
【００１０】
別の例示的な方法では、開始剤分子をウェルアレイのウェルの表面に固定することによって、マトリックスアレイを検知デバイスのウェル内に形成することができる。マトリックス前駆体を含む溶液をウェルアレイのウェル上に提供することができる。開始剤によってマトリックス前駆体の重合を開始することができ、それによってポリマーマトリックスをウェルアレイのウェル内に形成することができる。さらなる例では、上述の方法の態様を組み合わせて、マトリックスアレイの形成をさらに促進させることができる。
【００１１】
特定の例では、配列決定システムは、知覚アレイが設置されているフローセルを含み、知覚アレイを有する電子通信内に通信回路を含み、フローセルを有する流体連通内に容器及び流体制御を含む。一例では、図１は、フローセル１００の拡大及び断面図を示し、フローチャンバ１０６の一部を示す。試薬流１０８は、ウェルアレイ１０２の表面全体に流動し、その表面では、試薬流１０８はウェルアレイ１０２のウェルの開放端上で流動する。ウェルアレイ１０２及びセンサーアレイ１０５はともに集積ユニットを形成して、フローセル１００の低壁（または床）を形成することができる。参照電極１０４をフローチャンバ１０６に流体的に接続することができる。さらにフローセルカバー１３０は、フローチャンバ１０６を密封して、試薬流１０８を限定された領域内に収容する。
【００１２】
図２は、図１の１１０に示されるように、ウェル２０１及びセンサー２１４の拡大図を示す。発生する反応の特質、及び試薬、副生成物、または採用する標識技術（採用する場合）に基づいて、ウェルの体積、形状、アスペクト比（例えば、ベース幅対ウェルの深さの比）、及び他の寸法の特徴を選択することができる。センサー２１４は化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）であってよく、より詳細には、フローティングゲート２１８が、材料層２１６によってウェル内部から選択的に分離されたセンサープレート２２０を有するイオン感応ＦＥＴ（ＩＳＦＥＴ）であってよい。さらに、導電層（図示せず）を、センサープレート２２０上に配置することができる。一例では、材料層２１６はイオン感応材料層を含む。材料層２１６はセラミック層、例えば、ジルコニウムの酸化物、ハフニウム、タンタル、アルミニウム、または、特に、チタニウムもしくはチタニウムの窒化物等であってよい。代替として、金属層または材料層２１６を、金属、例えば、チタニウム、タングステン、金、銀、白金、またはそれらの組み合わせ等から形成することができる。一例では、材料層２１６は、５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲、例えば、１０ｎｍ〜７０ｎｍの範囲、１５ｎｍ〜６５ｎｍの範囲、または、さらに、２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の厚さを有することができる。
【００１３】
材料層２１６は、図示のＦＥＴ構成要素の限度を超えて伸長するものとして示されるが、材料層２１６は、ウェル２０１の底部に沿って、かつ任意に、ウェル２０１の壁に沿って伸長することができる。センサー２１４は、センサープレート２２０に対向する材料層２１６上に存在する電荷２２４の量に対応することができる（電荷２２４の量に対して出力信号を発生させることができる）。電荷２２４の変化によって、ｃｈｅｍＦＥＴの電源２２１とドレイン２２２との間の電流が変化し得る。ｃｈｅｍＦＥＴを直接使用して、電流ベースの出力信号を供給することができる、または追加の回路とともに間接的に使用して、電圧ベースの出力信号を供給することができる。拡散機構２４０によって、反応物、洗浄液、及び他の試薬は、ウェル内またはウェルから外へ移動することができる。
【００１４】
実施形態では、ウェル２０１内で実行された反応は分析反応であり得、関心対象の検体の特徴または特性を識別または決定する。そのような反応は副生成物を直接または間接的に発生させることができ、その副生成物はセンサープレート２２０に隣接する電荷の量に影響を与える。そのような副生成物が、少量生成される、または急速に劣化する、もしくは他の構成物質と反応する場合、発生する出力信号を増大させるために、同じ検体の複数の複製をウェル２０１で同時に分析することができる。実施形態では、検体の複数の複製を、ウェル２０１内へ堆積する前後のいずれかに、固相支持体２１２に堆積させることができる。固相支持体２１２は、ポリマーマトリックス、例えば、親水性ポリマーマトリックス等、例えば、ヒドロゲルマトリックス等であってよい。また、単純かつ容易に説明するために、固相支持体２１２も本明細書中でポリマーマトリックスとして指される。
【００１５】
ウェル２０１を壁構造によって画定することができ、この壁構造を材料の１つ以上の層から形成することができる。一例では、壁構造は、ウェルの下面から上面に延在する０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲、例えば、０．０５マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲、０．１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲、０．３マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲、または０．５マイクロメートル〜６マイクロメートルの範囲等の厚さを有することができる。特に、厚さは、０．０１マイクロメートル〜１マイクロメートルの範囲、例えば、０．０５マイクロメートル〜０．５マイクロメートルの範囲、または０．０５マイクロメートル〜０．３マイクロメートルの範囲であってよい。ウェル２０１は特徴的な直径を有することができ、その直径は、断面積（Ａ）をＰｉ（例えば、ｓｑｒｔ（４＊Ａ／π）で除算した数の４倍の平方根として定義され、５マイクロメートル以下、例えば、３．５マイクロメートル以下、２．０マイクロメートル以下、１．６マイクロメートル以下、１．０マイクロメートル以下、０．８マイクロメートル以下、または、さらに、０．６マイクロメートル以下のものであってよい。一例では、ウェル２０１は、少なくとも０．０１マイクロメートルの特徴的な直径を有することができる。さらなる例では、ウェル２０１は、０．０５ｆＬ〜１０ｐＬの範囲の体積、例えば、０．０５ｆＬ〜１ｐＬの範囲、０．０５ｆＬ〜１００ｆＬの範囲、０．０５ｆＬ〜１０ｆＬの範囲、または、さらに、０．１ｆＬ〜５ｆＬの範囲の体積を画定することができる。
【００１６】
図２は、単層壁構造及び単層材料層２１６を示すが、このシステムは、１つ以上の壁構造層、１つ以上の導電層、または１つ以上の材料層を含むことができる。例えば、ケイ素の酸化物またはＴＥＯＳを含む層、もしくはケイ素の窒化物を含む層のうちの１つ以上の層から、壁構造を形成することができる。
【００１７】
図３に示される特定の例では、システム３００はウェル壁構造３０２を含み、このウェル壁構造３０２は、センサーアレイのセンサーパッド上に配置されたまたはそれに動作可能に連結されたウェル３０４のアレイを画定する。ウェル壁構造３０２は上面３０６を画定する。ウェルに関連付けられた下面３０８は、センサーアレイのセンサーパッド上に配置される。ウェル壁構造３０２は、上面３０６と下面３０８との間の側壁３１０を画定する。上述のように、センサーアレイのセンサーパッドに接する材料層は、ウェル３０４のアレイのウェルの下面３０８に沿って、またはウェル壁構造３０２によって画定された壁３１０の少なくとも一部に沿って、伸長することができる。上面３０６には材料層が存在しなくてよい。特に、ポリマーマトリックスを、ウェル３０４のアレイのウェル内に配置することができる。一例では、上面３０６には実質的にポリマーマトリックスが存在し得ない。例えば、上面３０６は、ポリマーマトリックスが存在しなくてよい。例えば、全領域の少なくとも７０％、全領域の少なくとも８０％、全領域の少なくとも９０％、または全領域のおよそ１００％を含むことができる。
【００１８】
図２の壁表面は、実質的に垂直にかつ外側に延出するものとして示されるが、壁表面は様々な方向に延出して様々な形状を有することができる。実質的に垂直にとは、センサーパッドによって画定された表面に対して垂直な構成要素を有する方向に延出することを意味する。例えば、図４に示すように、ウェル壁４０２は垂直に延出し、センサーパッドによって画定された表面の垂直な構成要素４１２に対して平行となり得る。別の例では、壁表面４０４は、センサーパッドから離れた外側の方向に実質的に垂直に延出して、ウェルの下面の領域よりも大きな開口をウェルに提供することができる。図４に示すように、壁表面４０４は、表面４１４の垂直構成要素４１２と平行する垂直構成要素を有する方向に延出する。代替の例では、壁表面４０６は、内側の方向に実質的に垂直に延出して、ウェルの下面の領域よりも小さな開口領域を提供する。壁表面４０６は、表面４１４の垂直構成要素４１２と平行する構成要素を有する方向に延出する。
【００１９】
表面４０２、４０４、または４０６は直線によって示されるが、いくつかの半導体またはＣＭＯＳ製造プロセスによって、非線形形状を有する構造がもたらされ得る。特に、壁表面、例えば壁表面４０８等、及び上面、例えば上面４１０等は、アーチ型の形状であってよい、または様々な非線形形態をなしてよい。本明細書中に示される構造及びデバイスは、線形の層、表面、または形状を有するものとして示さるが、半導体プロセスに起因する実際の層、表面、または形状は、ある程度異なってもよく、場合によっては図示の実施形態の非線形及びアーチ型の変形を含む。
【００２０】
図５は、イオン感応材料層を有する例示的なウェルの図を含む。例えば、ウェル構造５０２は、ウェル、例えば、例示的なウェル５０４、５０６、または５０８のアレイを画定することができる。ウェル（５０４、５０６、または５０８）を、内在するセンサー（図示せず）に、動作可能に連結することができる、またはそのように内在するセンサーに接続することができる。例示的なウェル５０４は、イオン感応性材料層５１０を含み、この層はウェル５０４の底部を画定し、構造５０２内へ伸長する。図５に図示されていないが、導電層、例えば、ゲート、例として、イオン感応電界効果トランジスタのフローティングゲートは、イオン感応材料層５１０下に存在し得る。
【００２１】
別の例では、ウェル５０６によって示されるように、イオン感応材料層５１２は、構造５０２内に伸長することなく、ウェル５０６の底部を画定することができる。さらなる例では、ウェル５０８は、イオン感応層５１４を含むことができ、このイオン感応層５１４は、構造５０２によって画定されたウェル５０８の側壁５１６の少なくとも一部に沿って伸長する。上述のように、イオン感応材料層５１２または５１４は、導電層上、または内在する電子デバイスのゲート上に存在し得る。
【００２２】
図２に戻ると、マトリックス材料２１２は、ウェル構造と共形である。特に、マトリックス材料は、ウェルの壁及び底部表面に対して共形となるように所定の位置で硬化され得る。上面は、ウェルが貫通して画定される上面は、実質的にマトリックス材料が不在の領域を含むことができる。例えば、全領域の少なくとも７０％、全領域の少なくとも８０％、全領域の少なくとも９０％、または全領域のおよそ１００％は、マトリックス材料が存在しなくてよい。ウェル構造の特質に応じて、ポリマーマトリックスをウェル壁構造に物理的に固定することができる。別の例では、ポリマーマトリックスはウェル壁構造に化学結合することができる。特に、ポリマーマトリックスはウェル壁構造に共有結合することができる。別の例では、水素結合またはイオン結合によって、ポリマーマトリックスをウェル壁構造に結合することができる。
【００２３】
マトリックス前駆体、例えば、ラジカル重合性モノマー等、例として、ビニル系モノマーから、ポリマーマトリックスを形成することができる。特に、モノマーは、親水性モノマー、例えばアクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、それらのコポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、親水性モノマーは、アクリルアミド、例えば、官能化されてヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンン基、またはそれらの組み合わせを含むアクリルアミドである。一例では、親水性モノマーは、アミノアルキルアクリルアミド、アミン末端ポリアルキルグリコール（以下に示すＤ）で官能化されたアクリルアミド、アクリルオピペラジン（以下に示すＣ）、またはそれらの組み合わせである。別の例では、アクリルアミドは、ヒドロキシアルキルアクリルアミド、例えば、ヒドロキシエチルアクリルアミドであり得る。特に、ヒドロキシアルキルアクリルアミドは、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル）アクリルアミド（以下に示すＡ）、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（以下に示すＢ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。アミン末端ポリアルキルグリコールで官能化されたアクリルアミドは、１〜２０個のユニットのアルキルグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはそれらの組み合わせを含むことができる。別の例では、コモノマーは、ハロゲンで変性されたアクリレートまたはアクリルアミド、例えば、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（以下に示すＥのＢＲＡＰＡ）を含むことができる。ＢＲＡＰＡは、ブロモアセトアミド基を含むものとして示されるが、２〜２０個の炭素のアルキル基を含むブロモアルキルアミドを使用することができる。さらに、ＢＲＡＰＡのペンチル基を、２〜２０の範囲の炭素長を有する別のアルキル基と置き換えることができる。別の例では、コモノマーは、オリゴヌクレオチドで変性されたアクリレートまたはアクリルアミドモノマーを含むことができる。さらなる例では、モノマーの混合物、例えば、ヒドロキシアルキアクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドの混合物、またはアクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドの混合物を使用することができる。一例では、１００：１〜１：１の範囲、例えば、１００：１〜２：１の範囲、５０：１〜３：１の範囲、５０：１〜５：１の範囲、または、さらに、５０：１〜１０：１の範囲のヒドロキシアルキルアクリルアミド対アミン官能化アクリルアミド比、またはアクリルアミド対アミン官能化アクリルアミド比で、アミン官能化アクリルアミドを含むことができる。別の例では、ヒドロキシアルキルアクリルアミド対臭素官能化アクリルアミド比、またはアクリルアミド対臭素官能化アクリルアミド比が、１００：１〜１：１の範囲、例えば、１００：１〜２：１の範囲、５０：１〜３：１の範囲、５０：１〜５：１の範囲、または、さらには、５０：１〜１０：１の範囲のアミン官能化アクリルアミドを含むことができる。
【化１】
0006464141.tif 000002
【００２４】
さらなる例では、オリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドまたはアクリレートモノマー、例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）モノマーを含んで、オリゴヌクレオチドをポリマーマトリックス内に組み込むことができる。
【００２５】
別の例示的なマトリックス前駆体は架橋剤を含む。一例では、モノマー対架橋剤の質量比が１５：１〜１：２の範囲、例えば、１０：１〜１：１の範囲、６：１〜１：１の範囲、または、さらに、４：１〜１：１の範囲で架橋剤を含む。特に、架橋剤はジビニル架橋剤であり得る。例えば、ジビニル架橋剤は、ジアクリルアミド、例えばＮ，Ｎ'−（エタン−１，２−ジイル）ビス（２−ヒドロキシルエチル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−（２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジイル）ジアクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。別の例では、ジビニル架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、それらの保護誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２６】
一態様では、ポリマーネットワークはポリアクリルアミドゲルを含み、全モノマーの割合は、１〜２０パーセント（例えば３〜２０パーセント）の範囲で、より好ましくは、２〜１０パーセントの範囲、例えば、５〜１０パーセント等である。一実施形態では、モノマーの架橋剤の割合は、５〜１０パーセントの範囲である。特定の実施形態では、ポリマーネットワークは、２〜１０パーセントの全アクリルアミドを含み、そのうちの１０パーセントがビスアクリルアミド架橋剤である。
【００２７】
溶液内の開始剤により、重合を開始することができる。例えば、開始剤は水性であってよい。別の例では、開始剤は疎水性開始剤であってよく、疎水性相内に優先的に存在する。例示的な開始剤は、過硫酸アンモニウム及びＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）を含む。ＴＥＭＥＤは、遊離ラジカルが過硫酸塩から形成される速度を加速させ、重合を触媒することができる。過硫酸塩遊離ラジカルは、例えば、アクリルアミドモノマーを遊離ラジカルに変換し、遊離ラジカルは非活性化モノマーと反応して、重合鎖反応を開始する。延長ポリマー鎖がランダムに架橋され、それによって、重合条件及びモノマー濃度によって決定する特徴的な多孔性を有するゲルをもたらすことができる。また、リボフラビン（すなわち、リボフラビン−５'−ホスフェート）を遊離ラジカルのソースとして使用することもあり、ＴＥＭＥＤと過硫酸アンモニウムとを組み合わせて使用することが多い。光及び酸素の存在下で、リボフラビンはそのロイコ形態に変換され、このロイコ形態は重合を開始する際に活性となるが、これは、光化学重合と称されることが多い。
【００２８】
別の例では、アゾ開始剤を使用して重合を開始することができる。例示的な水溶性アゾ開始剤は表１に示され、例示的な油溶性アゾ開始剤は表２に示される。特に、アゾ開始剤はアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）であってよい。
【００２９】
（表Ｉ）水溶性アゾ開始剤化合物
0006464141.tif 000003
【００３０】
（表ＩＩ）油溶性アゾ開始剤化合物
0006464141.tif 000004
【００３１】
さらなる例では、ポリマーマトリックスの前駆体は表面反応性添加剤を含み、表面との結合を促進することができる。例示的な添加剤は、官能化アクリル系モノマーまたは官能化アクリルアミドモノマーを含む。例えば、アクリル系モノマーは官能化され、表面材料、例えば、セラミック材料等と結合し、ウェルの底部または側壁を形成することができる。一例では、添加剤は、アクリル−ホスホネート、例えばメタクリルホスホネートを含むことができる。別の例では、添加剤は、ジメチルアクリルアミドまたはポリジメチルアクリルアミドを含むことができる。さらなる例では、添加剤は、重合可能基、例えば、アクリレート基等で変性されたポリリシンを含むことができる。
【００３２】
別の例では、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を用いて、重合を容易に行うことができる。ＡＴＲＰシステムは、連鎖移動剤（ＣＴＡ）、モノマー、遷移金属イオン、及び配位子を含むことができる。例示的な遷移金属イオン錯体は銅系錯体を含むことができる。例示的な配位子は、２，２'−ビピリジン、４，４'−ジ−５−ノニル−２，２'−ビピリジン、４，４'，４''−トリス（５−ノニル）−２，２'：６'，２''−テルピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''−ペンタメチルジエチレントリアミン、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリジルメチル）オクタデシルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ［（２−ピリジル）メチル］エチレンジアミン、トリス［（２−ピリジル）メチル］アミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、トリス（２−ビス（３−ブトキシ−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミン、トリス（２−ビス（３−（２−エチルヘキソキシ）−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミン、トリス（２−ビス（３−ドデコキシ−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミン、脂肪族、芳香族、ならびに複素環式／複素芳香族アミン、それらの変形及び誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。例示的なＣＴＡは、２−ブロモプロパンニトリル、エチル２−ブロモイソブチレート、エチル２−ブロモプロピオナート、メチル２−ブロモプロピオナート、１−フェニル臭化エチル、塩化トシル、１−シアノ−１−メチルエチルジエチルジチオカルバマート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−イソ酪酸エチルエステル、ジメチル２，６−ジブロモヘプタンジオエート、及び他の官能化ハロゲン化アルキル、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。任意に、ＢＲＡＰＡモノマーは、ＡＴＲＰシステムの存在下で、分岐剤として機能し得る。
【００３３】
一例では、ＡＴＲＰは表面で開始され、ポリマーを表面に直接結合する。例えば、アクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）モノマー、スクシンイミジルアクリレート、ビス−アクリレートまたはビス−アクリルアミドモノマー、それらの誘導体もしくはそれらの組み合わせを、溶液内で、遷移金属イオン／配位子錯体が存在する開始表面に適用することができる。
【００３４】
別では、ＡＴＰＲシステムを使用して、変性ホスホネート、スルホネート、シリケート、チタネ-ト、またはジルコネート化合物を用いて、ポリマーをウェルの表面に付着させることができる。特に、アミン、またはヒドロキシル末端アルキルホスホネート、もしくはそれらのアルコキシ誘導体を表面に適用し、開始剤を使用して開始することができる。触媒錯体及びモノマーを適用して、表面化合物を伸長させることができる。
【００３５】
例示的な方法では、ポリマーマトリックスの前駆体を含む水溶液を、ウェルのアレイを画定する構造のウェル内に適用することができる。不混和流体をウェル上に提供し、ウェル内部の溶液内でポリマー前駆体の重合を開始することによって、ウェル内の水溶液を分離することができる。
【００３６】
例えば、図６は、ウェル６０４を画定する例示的なウェル構造６０２を示す。１つ以上のセンサー（図示せず）を、ウェル６０４に動作可能に連結または接続することができる。例えば、１つ以上のセンサーは、ウェル６０４の少なくとも底部表面と電気通信するゲート構造を含むことができる。他の構成要素の中から、ポリマー前駆体を含む水溶液６０６が、ウェル上に提供され、ポリマー前駆体を含む溶液をウェル６０４内へ分配する。例示的なポリマー前駆体は、モノマー、架橋剤、開始剤、または表面反応剤を含み、とりわけ、上述のようなもの等を含む。堆積する前に、任意に、親水性溶液、例えば、水、アルコール、またはそれらの混合物を含む溶液、もしくは水及び界面活性剤を含む溶液を使用して、ウェル６０４を湿らせることができる。例示的なアルコールはイソプロピルアルコールを含む。別の例では、アルコールはエタノールを含む。図示されていないが、ウェルの底部表面、及び、任意に、ウェルの側壁は、イオン感応材料を含むことができる。そのようなイオン感応材料は、内在する電子デバイス、例えば電界効果トランジスタ等の導電構造の上に重なることができる。ポリマー前駆体を含む溶液を適用する前に、表面反応性添加剤を用いてウェルの１つ以上の表面を処理することができる。
【００３７】
構造を揺動することにより、例えば、回転またはボルテックスすることにより、ポリマー前駆体を含む水溶液をウェル６０４内へ分配するのをさらに促進することができる。別の例では、振動、例えば、音波または超音波の振動を利用して、水溶液をウェル６０４内に分配するのを改善することができる。さらなる実施形態では、真空及び負のゲージ圧下で適用された溶液を利用して、ウェルを脱気することができる。一例では、水溶液を室温でウェルに分配する。別の例では、特に水性開始剤を使用するとき、水溶液を室温未満の温度で分配する。代替として、高温で水溶液を分配する。
【００３８】
図７に示すように、不混和流体７０８をウェル６０４上に適用して、水溶液６０６を押圧してウェルの上部から離し、図８に示すように、水溶液６０６をウェル６０４内に分離することができる。例示的な不混和流体は、鉱物油、シリコーン油（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））、ヘプタン、カーボネート油（例えば、ジエチルヘキシルカーボネート（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ（登録商標））、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
開始剤を水溶液６０６内に適用することができる。代替として、開始剤を不混和流体７０８内に提供することができる。基板の温度を変更することによって、重合を開始することができる。代替として、重合は室温で発生し得る。特に、ポリマー前駆体溶液を、２０℃〜１００℃の範囲、例えば、２５℃〜９０℃の範囲、２５℃〜５０℃の範囲、または２５℃〜４５℃の範囲の温度で、１０分〜５時間の範囲の時間で、例えば、１０分〜２時間の範囲、または１０分〜１時間の範囲で、保持することができる。
【００４０】
図９に示されるように、重合の結果、ポリマーマトリックス９１２のアレイがウェル６０４内で形成され、ウェル６０４はウェル構造６０２によって画定される。任意に、ベース、例えばＮａＯＨ（例えば１  Ｎ  ＮａＯＨ）等を用いてアレイを洗浄して、ウェル間の間隙領域からポリマーを除去することができる。
【００４１】
代替の例では、エマルションは、ポリマー前駆体の水溶液を分散相として不混和流体内に含み、水溶液の液滴をウェル内に堆積させるために使用され得る。例えば、図１０に示すように、ウェル構造１００２は、ウェル１００４を画定する。ウェル１００４を、１つ以上のセンサー（図示せず）に、動作可能に連結することができる、または電気的に接続することができる。上述のように、ウェル１００４の壁の底部表面、及び、任意にその側面を、イオン感応材料層によって画定することができ、イオン感応材料層は内在する電子デバイスの導電的特徴の上に重なることができる。
【００４２】
エマルション１００６は、連続不混和流体１０１０、及びポリマー前駆体を含む分散水性液滴１００８を含むことができる。液滴１００８はウェル１００４内に定着することができる。特に、水性液滴１００８は、不混和流体１０１０を超える密度を有する。例示的な不混和流体は、鉱物油、シリコーン油（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））ヘプタン、カーボネート油（例えば、ジエチルヘキシルカーボネート（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ（登録商標））、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる例では、流体または構造を、回転させる、ボルテックスする、または超音波処理することによって、水性液滴をウェル１００４内に容易に分配させることができる。堆積する前に、任意に、親水性溶液、例えば、水、アルコール、またはそれらの混合物を含む溶液、もしくは水及び界面活性剤を含む溶液を使用して、ウェル１００４を湿らせることができる。液滴が分配ウェル内に分配する間の温度は室温であってよい。代替として、高温で分配を行うことができる。
【００４３】
図１１に示すように、液滴は、ウェル１００４内で融合して、ポリマー前駆体１１１２を含む分離された溶液を提供する。任意に、エマルション１００６を、不混和流体、例えば、液滴１００８を含まない不混和流体１０１０、または異なる不混和流体１１１６と置き換えることができる。例示的な不混和流体は、鉱物油、シリコーン油（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））ヘプタン、カーボネート油（例えば、ジエチルヘキシルカーボネート（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ（登録商標））、またはそれらの組み合わせを含む。代替として、重合中、エマルション１００６は定位置に残存し得る。例えば、ウェル１００４内の溶液１１１２を、他のウェル１００４内の溶液から分離させる。図１２に示すように、重合を開始して、ポリマーマトリックス１２１４をウェル１００４内にもたらすことができる。上述のように、重合を熱的に開始することができる。別の例では、油相開始剤を用いて、重合を開始することができる。代替として、水性相開始剤を用いて重合を開始することができる。特に、第２のエマルションを、ウェル１００４上に適用することができる。第２のエマルションは、水性相開始剤を含む分散水性相を含むことができる。
【００４４】
基板の温度を変更することによって、重合を開始することができる。代替として、重合は室温で発生し得る。特に、ポリマー前駆体溶液を、２０℃〜１００℃の範囲、例えば、２５℃〜９０℃の範囲、２５℃〜５０℃の範囲、または２５℃〜４５℃の範囲の温度で、１０分〜５時間の範囲の時間で、例えば、１０分〜２時間の範囲、または１０分〜１時間の範囲で、保持することができる。任意に、ベース、例えばＮａＯＨ（例えば１  Ｎ  ＮａＯＨ）等を用いてアレイを洗浄して、ウェル間の間隙領域からポリマーを除去することができる。
【００４５】
別の例では、ウェルアレイの表面に固定された開始剤を使用して、マトリックス材料のアレイをウェルアレイのウェル内で形成することができる。例えば、図１３に示すように、構造１３０２はウェル１３０４を画定することができる。材料層１３０６はウェル１３０４の下面を画定することができる。固定化合物１３０８、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）で役立つ固定化合物を材料層１３０６に固定して、ウェル１３０４の底部表面を画定することができる。代替として、側壁材料は、ウェル内、またはウェル１３０４内で曝露された構造１３０２の層内で画定され、化合物、例えば、上述のＡＴＲＰで役立つ化合物を固定することができる。
【００４６】
そのような例では、溶液１３１０は、ポリマー前駆体、例えばモノマー、架橋剤、及び、任意に、表面反応性添加剤を含み、構造１３０２上及びウェル１３０４内に適用可能である。固定化合物１３０８は重合を容易に行うために発生させられて、固定化合物から延出し、ウェル１３０４内の重合を分離させ、ポリマーをウェル１３０４に固定させることができる。一例では、固定化合物は、表面反応基及び末端ラジカル形成基を有する。表面反応基は、ホスホネート、シリケート、スルホネート、ジルコネート、チタネ-ト、またはそれらの組み合わせを含むことができる。末端ラジカル形成基は、アミンまたはヒドロキシルを含み得、それらは、例えば、ハロゲン化（例えば、臭素化）化合物の移動を受けることができ、次いで、遊離ラジカルを形成してポリマー前駆体を重合させ、それによって得たポリマーをウェル表面に固定することができる。別の例では、固定化合物１３０８は、表面反応基で変性されたブロモ酢酸アルキルを含むことができる。例えば、固定化合物１３０８はブロモ酢酸アルキルホスホノ化合物を含むことができる。アルキル基は、３〜１６個の炭素、例えば６〜１６個の炭素、または９〜１３個の炭素を含むことができる。アルキル基は線形または分岐であってよい。特に、アルキル基は線形である。さらなる実施形態では、ブロモアセチル基を変性してアルキルで変性されたブロモアセチル基、例えば、エチルまたはメチルで変性されたブロモアセチル基等を含んで、表面官能化アルキル基を含むエステルを形成することができる。特定の例では、固定化合物は以下の化合物を含む：
【化２】
0006464141.tif 000005
。
【００４７】
統計的平均長または数のモノマーを添加した後に、ＡＴＲＰシステムを選択して、重合を終了させることができる。そのような方法では、ウェル１３０４内の重合の量を制御することができる。さらなる例では、鎖延長または停止に影響を与える他の物質を適用して、水溶液１３１０に添加することができる。
【００４８】
代替の実施形態では、固定化合物、例えば上述のようなものを、ポリマー前駆体溶液、例えば、図６または図１０に関連するようなものに含むことができる。続いて、固定化合物を硬化させることにより、ポリマーをウェルの内部表面に結合させることを補助することができる。
【００４９】
別の例では、図１４に示されるように、構造１４０２はウェル１４０４を画定することができる。ウェル１４０４は材料層１４０６を含むことができ、材料層１４０６は構造１４０２の側壁１４１０及びウェル１４０４に沿って延出する。開始剤１４０８を、ウェル１４０４の底部に沿ってかつ側壁１４１０に沿って、材料層１４０６に固定することができる。溶液１４１２は、ポリマー前駆体、架橋剤、及び他の薬剤を含み、構造１４０２及びウェル１４０４上に適用可能である。
【００５０】
図１５に示すように、重合が開始された結果、ポリマーマトリックス１５１２が形成され、ウェル１３０４内の表面、例えば、材料層１３０６によって画定された表面から延出する。
【００５１】
基板の温度を変更することによって、重合を開始することができる。代替として、重合は室温で発生し得る。特に、ポリマー前駆体溶液を、２０℃〜１００℃の範囲、例えば、２５℃〜９０℃の範囲、２５℃〜５０℃の範囲、または２５℃〜４５℃の範囲の温度で、１０分〜５時間の範囲の時間で、例えば、１０分〜２時間の範囲、または１０分〜１時間の範囲で、保持することができる。
【００５２】
ポリマーマトリックスは、いったん形成されると、活性化され、対象の検体、例えばポリヌクレオチド等と容易にコンジュゲートすることができる。例えば、ポリマーマトリックス上の官能基を、対象の検体または検体受容体（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）と結合するよう促進することができる。特定の例では、親水性ポリマー官能基を反応性部分に変換することができる試薬で親水性ポリマーマトリックスの官能基を変性させることができ、その反応性部分は求核または求電子置換を受けることができる。例えば、ヒドロキシル基の少なくとも一部をスルホネート基または塩素と置き換えることによって、ポリマーマトリックス上のヒドロキシル基を活性化させることができる。例示的なスルホネート基は、トレシル、メシル、トシル、または塩化フォシル、もしくはそれらの任意の組み合わせから得ることができる。スルホネートは、求核試薬にスルホネートを置き換えさせるように機能することができる。スルホネートはさらに、遊離塩素と反応して塩化された官能基を提供することができ、その塩化された官能基を、マトリックスをコンジュゲートさせるプロセス中で使用することができる。別の実施形態では、ポリマーマトリックス上のアミン基を活性化させることができる。
【００５３】
例えば、対象の検体または検体受容体は、スルホネート基との求核置換によって、親水性ポリマーに結合することができる。特定の例では、対象の検体受容体は、求核試薬、例えば、アミンまたはチオール等で最終処理され、求核置換を受けて、ポリマーマトリックス内のスルホネート基に取って代わることができる。活性化の結果、コンジュゲートポリマーマトリックスを形成することができる。
【００５４】
別の例では、スルホン化ポリマーマトリックスをさらに、モノ−、または多官能化モノ−、もしくは多求核性の試薬と反応させることができ、それらはマトリックスへの付着を形成しながら、求核活性を維持することができ、これによって、オリゴヌクレオチドが求電子基、例えばマレイミド等を含むことができる。その上、多求電子基を含む試薬に付着することによって、残留求核活性を求電子活性に変換することができ、続いて、この多求電子基は、求核基を含むオリゴヌクレオチドに付着することができる。
【００５５】
別の例では、モノマーは官能基を含み、重合中に添加可能である。モノマーは、例えば、カルボン酸、エステル、ハロゲン、または他のアミン反応基を含むアクリルアミドを含むことができる。アミンオリゴと反応する前に、エステル基を加水分解することができる。
【００５６】
他のコンジュゲーション技術は、アミンを含むモノマーの使用を含む。アミン基は、アミン反応性ビ−官能化ビス−求電子試薬で変性することができる求核基であり、この試薬はモノ−官能化求電子基をもたらし、続いて、このモノ−官能化求電子基はポリマーマトリックスに付着する。そのような求電子基を、求核基、例えば、アミンまたはチオール等を有するオリゴヌクレオチドと反応させ、これによって、空位求電子剤と反応することによって、オリゴヌクレオチドを付着させることができる。
【００５７】
ポリマーマトリックスを、アミノ−とヒドロキシル−アクリルアミドの組み合わせから調製する場合、ポリマーマトリックスは、求核アミノ基と中性ヒドロキシル基との組み合わせを含む。アミノ基を、ジ−官能化ビス−求電子部分、例えば、ジ−イソシアネートまたはビス−ＮＨＳエステル等で変性することができ、その結果、親水性ポリマーマトリックスが求核試薬と反応する。例示的なビス−ＮＨＳエステルは、ビス−スクシンイミジルＣ２−Ｃ１２アルキルエステル、例えば、スベリン酸ビス−スクシンイミジルまたはグルタル酸ビス−スクシンイミジルを含む。
【００５８】
他の活性化化学は、特定の官能基を変換して特定の望ましい結合を適応させるための複数のステップを組み込むことを含む。例えば、いくつかの方法によって、スルホネートで変性されたヒドロキシル基を求核基に変換することができる。一例では、スルホネートがアジドアニオンと反応して、アジド置換された親水性ポリマーをもたらす。アジドを直接使用して、「ＣＬＩＣＫ」化学を介してアセチレン置換された生体分子にコンジュゲートさせることができるが、この「ＣＬＩＣＫ」化学は、銅触媒を使用して、または使用せずに、実行可能である。任意に、例えば、水素を用いた触媒還元、または有機ホスフィンを用いた還元によって、アジドをアミンに変換することができる。次いで、その結果生じたアミンを、様々な試薬、例えば、ジ−イソシアネート、ビス−ＮＨＳエステル、塩化シアヌール、またはそれらの組み合わせ等を用いて、求電子基に変換することができる。一例では、ジ−イソシアネートを使用することによってポリマーとリンカーとの間に尿素結合がもたらされ、それによって残留イソシアネート基がもたらされ、この残留イソシアネート基は、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間に、尿素結合をもたらすることができる。別の例では、ビス−ＮＨＳエステルを使用することによってポリマーとリンカーと残留ＮＨＳエステル基との間にアミド結合がもたらされ、この残留ＮＨＳエステル基は、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間に、アミド結合をもたらすることができる。別の例では、塩化シアヌールを使用することによってポリマーとリンカーと２つの残留クロロ−トリアジン基との間にアミノ−トリアジン結合がもたらされ、これら２つの残留クロロ−トリアジン基のうちの１つは、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間にアミノ−トリアジン結合をもたらすることができる。スルホネートを活性化させることによって、他の求核基をマトリックス内に組み込むことができる。例えば、スルホン化したマトリックスがチオ安息香酸アニオンと反応し、その結果生じたチオ安息香酸を加水分解することによって、チオールをマトリックス内に組み込み、続いて、そのチオールが、マレイミド置換された生体分子と反応してチオ−スクシンイミド結合を生体分子にもたらすことができる。
【００５９】
また、チオールは、ブロモ−アセチル基またはブロモ−アミジル基と反応することもできる。特定の例では、ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）をコモノマーとして含むとき、チオベンズアミド−オリゴヌクレオチド化合物を形成することによって、オリゴヌクレオチドを組み込むことができるが、これは、例えば、以下に示すように、ポリマー上のブロモ−アセチル基と反応するためである。
【化３】
0006464141.tif 000006
【００６０】
以下のジチオ安息香酸−ＮＨＳ化合物をアミン末端オリゴヌクレオチドと反応させ、ジチオベンズアミド−オリゴヌクレオチド化合物を活性化させて以上で示したチオベンズアミド−オリゴヌクレオチド化合物を形成することによって、チオベンズアミド−オリゴヌクレオチド化合物を形成することができる。
【化４】
0006464141.tif 000007
【００６１】
代替として、アクリダイトオリゴヌクレオチドを重合中に使用して、オリゴヌクレオチドを組み込むことができる。例示的なアクリダイトオリゴヌクレオチドは、イオン交換されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００６２】
耐火性物質上またはポリマー基板上の生体分子の共有結合を発生させることができるが、これは、生体分子上の求核部分と連結する基板上の求電子部分、または、生体分子上の求電子結合と連結する基板上の求核結合を使用して行うことができる。それらの連結に最適な溶媒は、関心対象の最も一般的な生体分子の親水性特質のために、水、またはいくつかの水溶性有機溶媒を含む水であり、そのため、生体分子を基板上に分散させる。特に、ポリヌクレオチドは一般に、そのポリ−アニオン性の特質のために、水系内の基板に連結する。水が、求電子剤をコンジュゲーション用の不活性部分に加水分解することによって、求電子剤のための求核試薬と競合するので、水性系によって連結生成物がわずかに生成されるが、その生成は連結の求電子部分に基づく。反応連結の求電子部分の高生成が望まれるとき、高濃度の求核試薬によって反応が活発化されて加水分解が緩和されてしまうため、求核試薬が非効率に使用されてしまう。ポリ核酸の場合、ホスフェートの金属対イオンを脂肪性対イオンと置き換えて、生体分子が極性、非反応性、非水溶性溶媒中で可溶化するのを補助することができる。それらの溶媒は、アミドまたは尿素、例えば、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホルアミド、ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル尿素、Ｎ，Ｎ'−ジメチル−Ｎ，Ｎ'−トリメチレン尿素、またそれらの組み合わせ、カーボネート、例えば、ジメチルカーボネート、プロピレンカーボネート、またはそれらの組み合わせ、エーテル、例えば、テトラヒドロフラン、スルホキシド及びスルホン、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、またはそれらの組み合わせ、ヒンダードアルコール、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールまたはそれらの組み合わせを含むことができる。脂溶性カチオンは、テトラアルキルアンモミウムまたはテトラアリールアンモニウムカチオン、例えば、テトラメチルアモニウム、テトラエチルアモニウム、テトラプロピルアモニウム、テトラブチルアモニウム、テトラペンチルアモニウム、テトラヘキシルアモニウム、テトラヘプチルアモニウム、テトラオクチルアモニウム、及びアルキル、ならびにそれらのアリール混合物、テトラアリールホスホニウムカチオン、例えば、テトラフェニルホスホニウム、テトラアルキルアルソニウム、またはテトラアリールアルソニウム、例えば、テトラフェニルアルソニウム、トリアルキルスルホニウムカチオン、例えば、トリメチルスルホニウム、またはそれらの組み合わせを含むことができる。金属カチオンと脂溶性カチオンを交換してポリ核酸を有機溶媒可溶材料に変換することを、様々な標準カチオン交換技術によって行うことができる。
【００６３】
特定の実施形態では、ポリマーマトリックスは対象のポリヌクレオチドへ曝露され、このポリヌクレオチドは、ポリマーマトリックスにコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドと相補的なセグメントを有する。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を介して、増幅の影響を受けやすい。例えば、対象のポリヌクレオチドを低濃度で提供することにより、単一のポリヌクレオチドが、ポリマーマトリックスのアレイの単一のポリマーマトリックスに内在し得る。酵素、ヌクレオチド、塩、または対象のポリヌクレオチドの複製を容易に行うのに十分な他の成分にポリマーマトリックスを曝露することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、酵素、例えば、ポリメラーゼが存在し、ポリマーマトリックスに結合する、または、それに近接近する。本明細書中に記載の方法では、様々な拡散ポリメラーゼを使用することができる。例示的な実施形態では、ポリメラーゼは、酵素、その断片またはサブユニットを含むことができ、それらはポリヌクレオチドの複製を触媒することができる。別の実施形態では、ポリメラーゼは、自然発生のポリメラーゼ、組み換え型ポリメラーゼ、突然変異ポリメラーゼ、異形ポリメラーゼ、融合、またはさもなければ、改変ポリメラーゼ、化学的に変性されたポリメラーゼ、合成分子、もしくは類似体、誘導体、あるいはそれらの断片であり得る。
【００６５】
実施形態では、ポリメラーゼは、任意のＦａｍｉｌｙ  Ａ  ＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩファミリーとしても知られる）、または任意のＦａｍｉｌｙ  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼであってよい。実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、非組み換え型ＤＮＡポリメラーゼと比較して精度及び生産性が優れたポリヌクレオチドを複製することができる組み換え形態であってよい。例えば、ポリメラーゼは、高忠実度ポリメラーゼまたは耐熱性ポリメラーゼを含むことができる。実施形態では、ポリヌクレオチドの複製の条件には、「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ」条件、例えば、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ、例えば、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等を含むことができる。典型的には、「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ」ポリメラーゼは、耐熱性ポリメラーゼと、大気温度でＤＮＡポリメラーゼ活性及び３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を阻害する１つ以上の抗体とを含む。
【００６６】
実施形態では、ポリメラーゼは、酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ（サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの）、Ｔｆｉポリメラーゼ（サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）からの）、Ｂｓｔポリメラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの）、Ｐｆｕポリメラーゼ（パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）からの）、Ｔｔｈポリメラーゼ（サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの）、Ｐｏｗポリメラーゼ（パイロコッカス・ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）からの）、Ｔｌｉポリメラーゼ（サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からの）、Ｕｌｔｉｍａポリメラーゼ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からの）、ＫＯＤポリメラーゼ（サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）からの）、Ｐｏｌ  Ｉ及びＩＩポリメラーゼ（パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）からの）、及びＰａｂ（パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）からの）であり得る。
【００６７】
実施形態では、ポリメラーゼは、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）の組み換え型形態であり得る。実施形態では、ポリメラーゼは、ＫＯＤまたはＫＯＤに類似するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＫＯＤポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＯＤ「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ」ポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＯＤ  Ｘｔｒｅｍｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり得る。実施形態では、ポリメラーゼは、本明細書中で考察されるそれらのポリメラーゼの類似突然変異を含むＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００６８】
特に、ポリマーマトリックスによって、増幅されるポリヌクレオチドを捕捉することができる。核酸を捕捉するための例示的な方法は、ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成して、それをポリマーマトリックスに付着させること含み得る。実施形態では、核酸を捕捉するための方法は、（ａ）単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、捕捉用オリゴヌクレオチド）に付着したポリマーマトリックスを提供することと、（ｂ）単鎖ポリヌクレオチドを提供することと、（ｃ）単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することとを含み、それらを行うことによって単鎖ポリヌクレオチドをポリマーマトリックスに捕捉する。それぞれのポリマーマトリックスを、複数の単鎖オリゴヌクレオチド（例えば捕捉用オリゴヌクレオチド）に付着させることができる。複数の単鎖ポリヌクレオチドを使用してステップ（ｃ）を実施することができる。実施形態では、単鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、単鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補である（または部分的に相補である）。
【００６９】
一例では、本方法は、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド内に増幅させることと、複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をポリマーマトリックスに付着させることとをさらに含み、それによって、付着された複数のポリヌクレオチドを含むポリマーマトリックスを生成する。代替として、本方法は、オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補ポリヌクレオチド内に増幅させることをさらに含み、それによって、付着した複数のポリヌクレオチドを含むポリマーマトリックスを生成することができる。
【００７０】
実施形態では、ヌクレオチドを組み込むための方法はヌクレオチド重合反応をポリヌクレオチド上で実施することを含み、そのポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、そのオリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させる。実施形態では、ヌクレオチドを組み込むための方法は、（ａ）単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマーマトリックスを提供することと、（ｂ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、（ｃ）単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することと、（ｄ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼ及び少なくとも１つのヌクレオチドに接触させることであって、ポリメラーゼが、少なくとも１つのヌクレオチドの重合を単鎖オリゴヌクレオチド上に触媒するのに好適な条件下で行われる、前記接触させることとを含み、これによって、ヌクレオチドの組み込みが行われる。実施形態では、それぞれのポリマーマトリックスを、複数の単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、捕捉用オリゴヌクレオチド）に付着させることができる。複数の単鎖ポリヌクレオチドを使用して、ステップ（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）を実施することができる。実施形態では、単鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、単鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補である（または部分的に相補である）。実施形態では、システムは、単鎖ポリヌクレオチドを含み、この単鎖ポリヌクレオチドを単鎖オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、この単鎖オリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させ、少なくとも１つのヌクレオチドを単鎖オリゴヌクレオチドの端部上に重合させる。
【００７１】
実施形態では、プライマー伸長方法は、プライマー伸長反応をポリヌクレオチド上で実施することを含み、このポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、このオリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させる。実施形態では、核酸プライマー伸長方法は、（ａ）単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマーマトリックスを提供することと、（ｂ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、（ｃ）単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することと、（ｄ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼ及び少なくとも１つのヌクレオチドに接触させることであって、ポリメラーゼが少なくとも１つのヌクレオチドの重合を単鎖オリゴヌクレオチド上に触媒するのに好適な条件下で行われる、前記接触させることとを含み、これによって、プライマーを伸長させる。実施形態では、それぞれのポリマーマトリックスを、複数の単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、捕捉用オリゴヌクレオチド）に付着させることができる。実施形態では、複数の単鎖ポリヌクレオチドを使用してステップ（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）を実施することができる。実施形態では、単鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、単鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補である（または部分的に相補である）。実施形態では、システムは、単鎖ポリヌクレオチドを含み、この単鎖ポリヌクレオチドを単鎖オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、この単鎖オリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させ、単鎖オリゴヌクレオチドが１つ以上のヌクレオチドを用いて伸長される。
【００７２】
実施形態では、核酸増幅方法は、プライマー伸長反応をポリヌクレオチド上で実施することを含み、このポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成し、このオリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させる。実施形態では、核酸増幅方法は、（ａ）単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマーマトリックスを提供することと、（ｂ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、（ｃ）単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することと、（ｄ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼ及び少なくとも１つのヌクレオチドに接触させることであって、ポリメラーゼが少なくとも１つのヌクレオチドの重合を単鎖オリゴヌクレオチド上に触媒するのに好適な条件下で行われる、前記接触させることとを含み、伸長した単鎖オリゴヌクレオチドを生成する。実施形態では、本方法は、（ｅ）単鎖鋳型ポリヌクレオチドを伸長した単鎖オリゴヌクレオチドから除去して（変性させて）、単鎖オリゴヌクレオチドをポリマーマトリックスに付着させたまま残存させることと、（ｆ）残存する単鎖オリゴヌクレオチドを第２の単鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することと、（ｇ）第２の単鎖鋳型ポリヌクレオチドを第２のポリメラーゼ及び少なくとも１つの第２のヌクレオチドに接触させることであって、第２のポリメラーゼが少なくとも１つの第２のヌクレオチドの重合を単鎖オリゴヌクレオチド上で触媒するのに好適な条件で行われる、前記接触させることとを含み、後続の伸長した単鎖オリゴヌクレオチドを生成する。実施形態では、ステップ（ｅ）、（ｆ）、及び（ｇ）を少なくとも１度繰り返すことができる。実施形態では、ポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼを含む。実施形態では、ヌクレオチド重合に好適な条件は、ヌクレオチド重合ステップ（例えば、ステップ（ｄ）または（ｇ））を高温で実施することを含む。実施形態では、ヌクレオチド重合に好適な条件は、ヌクレオチド重合ステップ（例えば、ステップ（ｄ）または（ｇ））を変温（例えば、高温及び比較的低温）で実施することを含む。実施形態では、変温は６０〜９５℃の範囲である。実施形態では、温度サイクルは、約１０秒〜約５分、または約１０分、もしくは約１５分、あるいはそれ以上であり得る。実施形態では、核酸増幅方法は、１つ以上のポリマーマトリックスを生成することができ、それぞれのポリマーマトリックスを複数の鋳型ポリヌクレオチドに付着させ、それら複数の鋳型ポリヌクレオチドは、単鎖鋳型ポリヌクレオチドまたは第２の単鎖鋳型ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む。実施形態では、それぞれのポリマーマトリックスを、複数の単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、捕捉用オリゴヌクレオチド）に付着させることができる。実施形態では、複数の単鎖ポリヌクレオチドを使用して、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）を実施することができる。実施形態では、単鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、単鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補である（または部分的に相補である）。実施形態では、核酸増幅方法（上述）を、油相（例えば、分散相液滴）内の水性相溶液内で実施することができる。
【００７３】
ＰＣＲまたはＲＰＡに従って、増幅ポリマーマトリックスを形成する。ポリマーマトリックスのアレイのポリマーマトリックスは単クローン性であり得、単一種の対象のポリヌクレオチドの複写を含む。ポリヌクレオチドはポリマーマトリックス内で伸長することができる。ヒドロゲル及び親水性ポリマーマトリックスは、水に対して低濃度のポリマーを有し、ポリヌクレオチドセグメントをポリマーマトリックスの内部及びそのいたる所に含むことができる。特に、酵素、ヌクレオチド、プライマー、及び反応を観察するのに使用される反応生成物がポリマーマトリックスによって拡散され得る。マトリックスあたりの多数のポリヌクレオチドによって、より優れた信号が生成される。
【００７４】
一例では、水中のポリマーマトリックスは、５０重量％以下のポリマー、例えば、３０重量％以下のポリマー、２０重量％以下のポリマー、１０重量％以下のポリマー、５重量％以下のポリマー、または、さらに、２重量％以下のポリマーであってよい。一例では、ポリマーマトリックスは、少なくとも０．０１重量％のポリマーを含むことができる。
【００７５】
追加の例では、ポリマーマトリックスは、多孔性を有することで、タンパク質及び酵素を拡散させることができる。一例では、ポリマーマトリックスは多孔性を有することでタンパク質を拡散させることができ、このタンパク質は、少なくとも５０キロダルトン、例えば、少なくとも１００キロダルトン、少なくとも２００キロダルトン、少なくとも２５０キロダルトン、または、さらに、少なくとも３５０キロダルトンの量を有する。一例では、１０６キロダルトンの量を有するタンパク質を制限する。
【００７６】
別の例では、ポリマーマトリックスは、コンジュゲートされたとき、ポリヌクレオチドの密度を含むことができ、この密度は、ヌクレオチド密度と称され、μｍ３あたり少なくとも７×１０４である。例えば、ヌクレオチド密度は、μｍ３あたり少なくとも１０５、例えば、μｍ３あたり少なくとも１０６、μｍ３あたり少なくとも５×１０６、μｍ３あたり少なくとも８×１０６、μｍ３あたり少なくとも１×１０７、または、さらに、μｍ３あたり少なくとも３×１０７であり得る。さらなる例では、ヌクレオチド密度は、μｍ３あたり１０１５以下であり得る。
【００７７】
例示的な実施形態では、ポリマーマトリックスアレイを、デバイスの配列を決定するのに使用することができる。例えば、デバイスの配列を決定することは、ウェルのアレイを含むことができ、その内部でポリマーマトリックスが形成される。酵素及びヌクレオチドをウェルに提供して、検出反応、例えば、ヌクレオチド組み込みを容易に行うことができる。
【００７８】
ヌクレオチドの添加を検出することによって、配列決定を行うことができる。例えば、蛍光発光方法またはイオン検出方法等の方法を用いて、ヌクレオチドの添加を検出することができる。例えば、蛍光標識されたヌクレオチドの一組は、システムに提供され得て、ウェルに移動し得る。また、励起エネルギーをウェルに提供することもできる。ポリメラーゼによってヌクレオチドを捕捉し、伸長するプライマーの端部にヌクレオチドを添加したとき、ヌクレオチドの標識は蛍光を発して、どの種類のヌクレオチドが添加されたかを示すことができる。
【００７９】
代替の実施形態では、溶液は、単一種のヌクレオチドを含み、連続して供給され得る。ヌクレオチド添加に反応して、ウェルの局所環境内のｐＨは変化し得る。ｐＨのそのような変化を、イオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）によって検出することができる。したがって、ｐＨの変化を利用して、ポリマーマトリックスのポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドの順序を示す信号を生成することができる。
【００８０】
特に、配列決定システムは、ウェルまたは複数のウェルをイオンセンサー、例えば、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）等のセンサーパッド上に配置することを含み得る。実施形態では、システムはウェル内にポリマーマトリックスを含み、そのウェルは、イオンセンサー（例えば、ＦＥＴ）または複数のウェル内のポリマーマトリックスのセンサーパッド上に配置され、その複数のウェルはイオンセンサー（例えば、ＦＥＴ）のセンサーパッド上に配置される。実施形態では、ＦＥＴは、ｃｈｅｍＦＥＴまたはＩＳＦＥＴであり得る。「ｃｈｅｍＦＥＴ」、すなわち化学電界効果トランジスタは、化学センサーとして機能する種類の電界効果トランジスタを含む。ｃｈｅｍＦＥＴはＭＯＳＦＥＴトランジスタの構造類似体を有し、その構造類似体では、化学プロセスによってゲート電極の変化を適用する。「ＩＳＦＥＴ」、すなわち、イオン感応電界効果トランジスタを使用して、溶液中のイオン濃度を測定することができ、イオン濃度（例えば、Ｈ＋）が変化したとき、トランジスタ中の電流もそれに従って変化する。
【００８１】
実施形態では、ＦＥＴはＦＥＴアレイであってよい。本明細書中で使用される、「アレイ」は例えば、センサーまたはウェル等の要素の平面配列である。アレイは一次元または二次元であってよい。一次元アレイは、１つの段（または列）の要素を第１の次元に有し、複数の段（また列）の構成要素を第２の次元に有するアレイであってよい。第１及び第２の次元内の段（または列）の数は、同じであっても、同じでなくてもよい。ＦＥＴまたはアレイは、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７またはそれ以上のＦＥＴを含むことができる。一例では、ＦＥＴアレイは、１０１５以下のＦＥＴを含むことができる。
【００８２】
実施形態では、１つ以上の微小流体構造をＦＥＴセンサーアレイ上に組み立てて、生体または化学反応の封じ込めまたは閉じ込めを提供することができる。例えば、一実装例では、微小流体構造（複数可）を、アレイの１つ以上のセンサー上に配置される１つ以上のウェル（または、本明細書中で用語が互換的に使用されるように、マイクロウェル、もしくは反応チャンバ、あるいは反応ウェル）として、構成することができ、それによって、所定のウェルが上に配置される１つ以上のセンサーが、所定のウェル内の検体の存在、レベル、または濃度を検出または測定する。実施形態では、ＦＥＴセンター及び反応ウェルの１：１の対応があってよい。
【００８３】
別の例では、ウェルのアレイのウェルを測定デバイスに動作可能に接続することができる。例えば、蛍光発光方法では、ウェルを、光検出デバイスに動作可能に連結することができる。イオン検出の場合、ウェルの下面を、イオンセンサー、例えば、電界効果トランジスタ等のセンサーパッド上に配置することができる。
【００８４】
一例示的なシステムは、ヌクレオチド組み込みのイオン副生成物の検出によって配列を決定することに関わり、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）またはＰｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これらは、イオン系配列決定システムであり、ヌクレオチド組み込みの副生成物として生成された水素イオンを検出することによって、核酸鋳型の配列を決定する。典型的には、水素イオンは、ポリメラーゼによる鋳型依存性核酸の合成中に発生するヌクレオチド組み込みの副生成物として放出される。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）またはＰｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーは、ヌクレオチド組み込みの水素イオン副生成物を検出することによって、ヌクレオチド組み込みを検出する。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）またはＰｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドを含むことができ、それらの鋳型ポリヌクレオチドは配列され、それぞれの鋳型は、アレイ内のそれぞれの配列決定反応ウェル内に配置される。アレイのウェルをそれぞれ、少なくとも１つのイオンセンサーに連結することができ、そのイオンセンサーは、Ｈ＋イオンの放出、またはヌクレオチド組み込みの副生成物として生成された溶液のｐＨの変化を検出することができる。イオンセンサーは、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を含み、このトランジスタはイオン感応検出層に連結し、この層は、Ｈ＋イオンの存在、またはヌクレオチド組み込みによってもたらされた溶液のｐＨの変化を感知することができる。イオンセンサーは、ヌクレオチド組み込みを示す出力信号を提供することができ、ヌクレオチド組み込みは、電圧の変化として示され得て、その変化の大きさは、それぞれのウェルまたは反応チャンバ内のＨ＋イオン濃度と相関する。複数の種類のヌクレオチドを、反応チャンバ内に連続的に流入させることができ、ポリメラーゼを用いて伸長するプライマー（または重合サイト）に、鋳型の配列によって決定された順序で組み込むことができる。反応ウェル内のＨ＋イオンを放出させると同時に、局所ｐＨを変化させることによって、それぞれのヌクレオチド組み込みを達成することができる。センサーのＦＥＴでＨ＋イオンの放出を記録することができ、そのセンサーはヌクレオチド組み込みの発生を示す信号を生成する。特定のヌクレオチド流中に組み込まれなかったヌクレオチドは、信号を生成し得ない。また、ＦＥＴからの信号の振幅も特定の種類のヌクレオチドの数と相関し得、特定の種類のヌクレオチドは、伸長する拡散分子内に組み込まれ、それによってホモポリマー領域を分割する。したがって、シーケンサーの動作中は、複数のヌクレオチドは、反応チャンバ内に流入すると同時に、多様なウェル中に組み込まれて観察される、または、反応チャンバによって、機器が多数の拡散鋳型の配列を同時に分割することが可能になる。さらに、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）またはＰｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーの構成、設計、及び動作に関する詳細を、例えば、米国特許出願第１２／００２７８１号で、現在は米国特許公開第２００９／００２６０８２号として公開され、米国特許第８，２６２，９００号として発行されているもの、米国特許出願第１２／４７４８９７号で、現在は米国特許公開第２０１０／０１３７１４３号として公開されているもの、及び米国特許出願第１２／４９２８４４号で、現在は米国特許公開第２０１０／０２８２６１７号として公開されているもので理解することでき、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれている。
【実施例】
【００８５】
ＩＯＮ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｃｈｉｐを、１６５マイクロリットルの１  Ｎ  ＮａＯＨ溶液で３分間事前処理し、１ｍＬの脱イオン水で２度洗浄し、メタノールで２度洗浄する。残留するメタノールを吸引によって除去する。チップを、デシケーター内で２０分間、真空下で乾燥させる。
【００８６】
１５ｍＬの管内では、１６０ｍｇのアクリルアミドと５ｍＬの水とを混合することによって、ポリマー混合物を調製する。この溶液を、Ｎ２を用いて２０分間散布する。この溶液に、１０％重量／体積の１６５ｍｇのｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）溶液を添加する。さらに、１１．５ｍｇの１１．５ｍｇのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、及び１００マイクロリットルの５％重量／体積の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液を添加する。この溶液を簡潔にボルテックスする。
【００８７】
出口貯蔵器が覆われるまで、入口ポートを介して１６５マイクロリットルのポリマー混合物を添加することにより、チップをさらに処理する。入口貯蔵器は、ポリマー混合物の残留物で覆われる。両貯蔵器はテープで覆われる。チップを９０分間室温で温置する。任意に、テープした直後、チップに１分間遠心力を作用させることができる。９０分後、余分なポリマー溶液を入口貯蔵器から吸引する。チップを１ｍＬの水で２０分以上５度洗浄する。任意に、チップを、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて１分〜１０分の間、１〜５度洗浄する。チップを水で充填してテープする。
【００８８】
チップを官能化するために、ＤＭＳＯ内で、ベンズチオＢプライマーＴＥＡ塩の１ｍＭの溶液を、乾燥されたアリコートまたは１ｍＭの水性アリコートのいずれかから形成することによって、溶液を調製する水性アリコートから形成される場合、水性アリコートよりも大きいＤＭＳＯ５０％のアリコートを水性アリコートに添加して、体積が初期水性アリコートの体積に減少するまで、Ｓｐｅｅｄｖａｃ上で蒸発させる。（約４５分）生成したばかりの４当量の１００ｍＭのＤＴＴ／ＤＭＳＯ溶液を添加する。（約１００ｕｌの１ｍＭのオリゴ溶液を、４ｕＬの１００ｍＭのＤＴＴ／ＤＭＳＯ溶液で処理する。）ＤＴＴはジチオトレオトールである。
【００８９】
１０分後、ＤＴＴ処理されたオリゴ／ＤＭＳＯ溶液を、１０００部のＤＭＳＯ／ヨウ化ナトリウムで飽和した５０部のＤＭＳＯ／５０部のジイソプロピルエチルアミンであるＤＭＳＯ溶液を使用して、２００ｕＭに希釈する。この溶液を簡潔にボルテックスする。このアプローチは、４体積の希釈剤〜１体積のＤＴＴ／オリゴＤＭＳＯ溶液を提供することが多い。この溶液を直ちに使用する。
【００９０】
チップ内で表面水が観測されなくなるまで、チップは吸引乾燥チップである。出口貯蔵器が覆われるまで、入口ポートを介して１３５マイクロリットルの量の官能溶液を添加する。溶液の残留物を使用して入口貯蔵器を覆う。入口及び出口ポートをテープで覆う。チップを、少なくとも１時間、一般には２〜３時間、室温で温置する。テープを除去し、チップを１ｍＬの水で４度洗浄する。チップを水中に保存し、貯蔵器をテープで覆う。
【００９１】
特に、上述のシステム及び方法の実施形態は技術的優位性をもたらすが、その技術的優位性には、約０．０５ｆＬ〜１ｐＬの体積を画定する小さなウェル内への堆積が含まれる。そのような堆積技術は特に、約０．０５ｆＬ〜１０ｆＬの堆積を画定するウェル内にポリマーマトリックスを堆積させるのに有利である。
【００９２】
第１の態様では、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法は、ポリマー前駆体を含む水溶液をウェルアレイのウェルに適用することと、不混和流体をウェルアレイ上に適用して水溶液をウェルアレイのウェル内に分離することと、ウェルアレイのウェル内に分離されたポリマー前駆体を重合させて、ポリマーマトリックスアレイを形成することとを含む。
【００９３】
第１の態様の一例では、ウェルは、０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの特徴的な直径を有する。第１の態様の別の例及び上述の例では、ウェルは０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの厚さを有する。
【００９４】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、ウェルアレイのウェルはセンサーアレイのセンサーの上に重なり、ウェルは、センサーアレイのセンサーのイオン感応材料に対応する。
【００９５】
第１の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマーマトリックスアレイのポリマーマトリックスは、ウェルアレイのウェルの壁と共形である。
【００９６】
第１の態様の別の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、ラジカル重合性モノマーを含む。例えば、ラジカル重合性モノマーは、ビニル系モノマーを含む。一例では、ビニル系モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９７】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は架橋剤を含む。例えば、架橋剤はビス−アクリルアミドである。
【００９８】
第１の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、表面活性添加剤を含む。
【００９９】
第１の態様の別の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、オリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む。第１の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む。
【０１００】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、水溶液を適用することは、水溶液を分散相として含むエマルションを適用することを含む。
【０１０１】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、不混和流体は、鉱物油、シリコーン油、ヘプタン、カーボネート油、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０２】
第１の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用することに続いてウェルアレイを回転させることをさらに含む。
【０１０３】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用することに続いてウェルアレイを超音波処理することをさらに含む。
【０１０４】
第１の態様の追加の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する間にウェルアレイを脱気することをさらに含む。
【０１０５】
第１の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する前にウェルアレイを親水性流体で湿らせることをさらに含む。
【０１０６】
第１の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は開始剤を含む。
【０１０７】
第１の態様の追加の例及び上述の例では、不混和流体は開始剤を含む。
【０１０８】
第１の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する前にウェル内の表面を表面活性剤で処理することをさらに含む。
【０１０９】
第２の態様では、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法は、エマルションをウェルアレイのウェル上に適用することを含む。エマルションは、水性分散相を不混和連続相内に含む。水性分散相はポリマー前駆体を含む。分散相はウェルアレイのウェル内で融合する。本方法は、第２の不混和流体をウェルアレイのウェル上に適用させてエマルションを置換することと、ウェルアレイのウェル内のポリマー前駆体を重合させてポリマーマトリックスアレイを形成することとをさらに含む。
【０１１０】
第２の態様の一例では、ウェルは、０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの特徴的な直径を有する。第２の態様の別の例及び上述の例では、ウェルは０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの厚さを有する。
【０１１１】
第２の態様のさらなる例及び上述の例では、ウェルアレイのウェルはセンサーアレイのセンサーの上に重なり、ウェルは、センサーアレイのセンサーのイオン感応材料に対応する。
【０１１２】
第２の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマーマトリックスアレイのポリマーマトリックスは、ウェルアレイのウェルの壁と共形である。
【０１１３】
第２の態様の別の例及び上述の例では、ポリマー前駆体はラジカル重合性モノマーを含む。例えば、ラジカル重合性モノマーは、ビニル系モノマーを含む。一例では、ビニル系モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１４】
第２の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は架橋剤を含む。一例では、架橋剤はビス−アクリルアミドである。
【０１１５】
第２の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、表面活性添加剤を含む。
【０１１６】
第２の態様の別の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、オリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む。
【０１１７】
第２の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む。
【０１１８】
第２の態様の追加の例及び上述の例では、不混和流体は、鉱物油、シリコーン油、ヘプタン、カーボネート油、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１９】
第２の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用することに続いてウェルアレイを回転させることをさらに含む。
【０１２０】
第２の態様のさらなる例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用することに続いてウェルアレイを超音波処理することをさらに含む。
【０１２１】
第２の態様の追加の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する間にウェルアレイを脱気することをさらに含む。
【０１２２】
第２の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する前にウェルアレイを親水性流体で湿らせることをさらに含む。
【０１２３】
第２の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は開始剤を含む。
【０１２４】
第２の態様の追加の例及び上述の例では、不混和流体は開始剤を含む。
【０１２５】
第２の態様の別の例及び上述の例では、本方法は、水溶液を適用する前にウェル内の表面を表面活性剤で処理することをさらに含む。
【０１２６】
第３の態様では、ポリマーマトリックスアレイを形成する方法は、ウェルアレイのウェル内の表面を表面反応性官能基及びラジカル形成末端基を含む表面化合物で処理することと、ポリマー前駆体を含む水溶液をウェルアレイのウェルに適用することと、表面結合化合物のラジカル形成末端基を開始剤及び原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）触媒を用いて活性化させ、ポリマー前駆体のラジカル重合をウェルアレイのウェル内で開始して、ポリマーマトリックスアレイを形成することとを含む。
【０１２７】
第３の態様の一例では、表面反応性官能基はホスホネートを含む。
【０１２８】
第３の態様の別の例及び上述の例では、ラジカル形成末端基はアミンまたはヒドロキシル基を含む。
【０１２９】
第３の態様のさらなる例及び上述の例では、ウェルは０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する。第３の態様の追加の例及び上述の例では、ウェルは、０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲の厚さを有する。
【０１３０】
第３の態様の別の例及び上述の例では、ウェルアレイのウェルはセンサーアレイのセンサーの上に重なり、ウェルは、センサーアレイのセンサーのイオン感応材料に対応する。
【０１３１】
第３の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体はラジカル重合性モノマーを含む。例えば、ラジカル重合性モノマーは、ビニル系モノマーを含む。一例では、ビニル系モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレート、それらの変形もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３２】
第３の態様の追加の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、オリゴヌクレオチド官能化アクリルアミドを含む。
【０１３３】
第３の態様の別の例及び上述の例では、ポリマー前駆体は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む。
【０１３４】
第３の態様のさらなる例及び上述の例では、ポリマー前駆体は架橋剤を含む。例えば、架橋剤はビス−アクリルアミドである。
【０１３５】
第４の態様では、方法は、ポリマーマトリックスをウェルのアレイのウェル内で硬化させることを含む。ポリマーマトリックスを、アクリレートまたはアクリルアミド及び臭素官能化アクリレートまたは臭素官能化アクリルアミドを含む前駆体から形成する。本方法は、チオ安息香酸オリゴヌクレオチド複合体を硬化されたポリマーに適用することをさらに含む。チオベンズアミドオリゴヌクレオチド複合体はポリマーマトリックスと反応して、オリゴヌクレオチドコンジュゲートポリマーマトリックスを形成する。
【０１３６】
第４の態様の一例では、臭素官能化アクリレートまたは臭素官能化アクリルアミドは、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミドを含む。
【０１３７】
第４の態様の別の例及び上述の例では、アクリレートまたはアクリルアミドは、ヒドロキシアルキルアクリルアミドを含む。
【０１３８】
第４の態様のさらなる例及び上述の例では、本方法は、増幅条件下で対象のポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドコンジュゲートポリマーマトリックスに適用することをさらに含み、オリゴヌクレオチドは対象のポリヌクレオチドと相補的な配列を含む。一例では、対象のポリヌクレオチドに少なくとも一部基づいて、オリゴヌクレオチドを伸長させる。追加の例では、本方法は、ウェルに動作可能に連結されたセンサーを用いて、伸長されたオリゴヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む。別の例では、配列を決定することは、ヌクレオチドを含む溶液をポリマーマトリックスに連続して適用することと、センサーを使用して反応を測定することとを含む。
【０１３９】
第５の態様では、装置は複数のセンサーを含むセンサーアレイを含み、センサーはそれぞれイオン感応材料層を含む。本装置は、センサーアレイ上に配置されておりかつ複数のセンサーのセンサーに対応するウェルを画定しているウェルアレイをさらに含む。センサーのイオン感応材料層は、対応するウェルの底部表面を形成する。本方法は、ウェル内に配置された共形ポリマーマトリックスをさらに含む。
【０１４０】
第５の態様の一例では、共形ポリマーマトリックスはポリアクリルアミドマトリックスを含む。
【０１４１】
第５の態様の別の例及び上述の例では、ポリマーマトリックスは、所定の位置で硬化されたポリマーマトリックスである。
【０１４２】
第５の態様のさらなる例及び上述の例では、共形ポリマーマトリックスは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる。
【０１４３】
第５の態様の追加の例及び上述の例では、ウェルは、０．１マイクロメートル〜２マイクロメートルの範囲の特徴的な直径を有する。第５の態様のさらなる例及び上述の例では、ウェルは０．０１マイクロメートル〜１０マイクロメートルの範囲の厚さを有する。
【０１４４】
第５の態様の別の例及び上述の例では、複数のセンサーはイオン感応電界効果トランジスタである。
【０１４５】
概要または実施例に記載される上述の活性が全て必要というわけではなく、特定の活性の一部を必要としない可能性があり、上述の活性に加えて１つ以上の活性をさらに行う可能性があるということを留意されたい。さらには、活性を記載する順序は、必ずしも活性が行われる順序ではない。
【０１４６】
上述の明細書には、特定の実施形態を参照して概念を記載している。しかしながら、以下の特許請求の範囲に記載されるように、本発明の範囲から逸脱することなく様々な修正及び変更をなし得ることを、当業者は理解する。したがって、本明細書及び図面は、限定的な意味ではなく例示的な意味でみなされるべきであり、そのような全ての修正は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１４７】
本明細書中で使用される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、またはそれらの他の変形は、非排他的包含を網羅することを意図する。例えば、プロセス、方法、物品、または装置は特徴のリストを含むが、必ずしもそれらの特徴のみに限定されず、明確に記載されていない特徴、またはそのようなプロセス、方法、物品、または装置に固有の他の特徴を含むことができる。さらに、それとは反対に、明確に記載されない場合、「または」は、排他的な「または」でなく、包括な「または」を指す。例えば、以下のうちの任意の１つによって条件ＡまたはＢが満たされる：Ａが正しく（または存在する）かつＢが誤りである（または存在しない）、Ａが誤りであり（または存在しない）かつＢが正しい（または存在する）、及びＡとＢのいずれもが正しい（または存在する）。
【０１４８】
また、「１つ」または「１つ」の使用を採用して、本明細書中に記載される要素または構成要素を記載する。これは、単に便宜上行われるものであり、本発明の範囲の一般的な意味合いをもたらすものである。他に意味することが明らかではない限り、それらの記載は、１つまたは少なくとも１つを含んでいると解釈されるべきであり、また、単数形は複数も含んでいる。
【０１４９】
実施形態を参照して、利益、他の利点、及び問題の解決策を上述している。しかしながら、利益、利点、問題の解決策、及び任意の特徴（複数可）は、任意の利益、利点、または解決策をもたらし得るまたはそれらを明白にし得るが、任意のまたは全ての特許請求の範囲の、重要な、必須の、または必要不可欠な特徴として解釈されるものではない。
【０１５０】
特定の特徴を、個別の実施形態との関連で明確にするために本明細書中に記載して、単一の実施形態内で組み合わせて提供し得るということを、当業者は、本明細書を解釈した後に理解するであろう。反対に、様々な特徴を、単一の実施形態との関連で簡潔にするために記載しているが、個別にまたは任意に部分的に組み合わせて提供することもできる。さらに、範囲に記載される値への参照は、範囲内のそれぞれ及び全ての値を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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