(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胞体の分離方法であって、
脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体が、凹部を有する担体上に固定化された脂質膜構造体固定化担体と、
前記胞体を含む試料と、を接触させて、
前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記試料から胞体を分離させる、胞体の分離方法であり、
前記脂質膜構造体が、前記凹部の開口部を塞ぐように設けられ、且つ、
前記脂質膜構造体が、前記担体と前記脂質膜構造体とで囲まれた前記凹部の内部空間を形成するように設けられている
胞体の分離方法。
【請求項２】
前記担体が基板である、請求項１に記載の胞体の分離方法。
【請求項３】
胞体の検出方法であって、
請求項１又は２に記載の胞体の分離方法において、
前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合した融合体を検出する
胞体の検出方法。
【請求項４】
前記凹部の内部空間に反応試薬が収められており、
前記胞体と前記脂質膜構造体とを接触させて、前記胞体と前記脂質膜構造体とを膜融合させ、該膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、
前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する
請求項３に記載の胞体の検出方法。
【請求項５】
脂質膜構造体固定化担体であって、
脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体が、凹部を有する担体上に固定化され、
前記脂質膜構造体が、前記凹部の開口部を塞ぐように設けられ、且つ、
前記脂質膜構造体が、前記担体と前記脂質膜構造体とで囲まれた前記凹部の内部空間を形成するように設けられている
脂質膜構造体固定化担体。
【請求項６】
前記担体が基板である、請求項５に記載の脂質膜構造体固定化担体。
【請求項７】
前記凹部の内部空間に、前記胞体の構成成分と反応する反応試薬が収められている、請求項５又は６に記載の脂質膜構造体固定化担体。
【請求項８】
胞体の融合方法であって、
請求項５〜７のいずれか一項に記載の脂質膜構造体固定化担体に固定化された脂質膜構造体と前記胞体とを接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる
胞体の融合方法。
【請求項９】
前記胞体を含む液と膜融合を誘発する添加剤とを混合し、前記脂質膜構造体と前記胞体とを接触させる請求項８に記載の胞体の融合方法。
【請求項１０】
前記脂質膜構造体が膜融合誘発物質を含む請求項８又は９に記載の胞体の融合方法。
【請求項１１】
胞体の検出方法であって、
脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質、および、反応試薬を含む脂質膜構造体を、前記脂質膜構造体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により所定の場へと誘導し、
前記所定の場に前記胞体が配置されており、前記脂質膜構造体と前記胞体とを前記所定の場において接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する
胞体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二重膜を有する胞体と融合する（融合可能な）膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体、及び該脂質膜構造体が固定化された脂質膜構造体固定化担体、並びにこれらを用いた胞体の融合方法に関する。また、胞体の融合による胞体の分離方法、胞体の検出方法、胞体の移動方法に関する。
本願は、２０１４年７月２４日に、日本に出願された特願２０１４−１５０８６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞、細胞小器官等の生体由来の膜小胞、人工の膜小胞など、脂質二重膜により覆われた構造において、これらの構造の内容物や、脂質二重膜上に保持された物質等に対する分析が行われている。【０００３】
近年、細胞間情報伝達の方法として、脂質二重膜を有する小胞であるエキソソームによる方法が注目されている。
エキソソームは、蛋白質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡなどを内部に包含し、細胞間を移動することにより移動先の細胞に情報を伝達できることが知られた膜小胞である。例えば、がん細胞由来のマイクロＲＮＡを含むエキソソームを受容した細胞において、免疫機能が活性化したり、転移能を獲得したりすることが知られている。【０００４】
エキソソームには、エキソソームを放出した細胞が保持する遺伝情報その他のシグナル因子に加え、このエキソソームを受容した他の細胞の機能を制御できる因子が含まれていることから、エキソソームは、疾患を診断するための新たなバイオマーカーソースとして活用できると考えられている。
たとえば、特許文献１、３には、エキソソーム内のｍｉＲＮＡを分析し、がん又は有害な妊娠転帰を診断することが開示されている。
特許文献２には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）／ｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するために各ＲＮＡを測定することが開示されている。
特許文献４には、心血管系イベントを発症するリスクの指標となる蛋白質マーカーを検出することが開示されている。
特許文献５には、免疫反応性の自己抗体のレベルを測定し、がんや不妊症など自己抗体産生に関連する疾患を診断することが開示されている。
特許文献６には、尿中エキソソームのアクアポリン１を測定することにより小胞体ストレス応答および該応答に関連する腎疾患を検出することが開示されている。【０００５】
エキソソームは、エキソソームを含む試料から、超遠心分離や密度勾配超遠心分離など、密度差による分離によって分離し、調製することができる。また、特許文献７や特許文献８に記載された方法によってもエキソソームの分離ができる。また、エキソソームを分離精製するキットが市販されている（たとえば、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＥｘｏＱｕｉｃｋ、Ｌｉｆｅ、あるいは、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎなど）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特開２０１３−１０２７６８号公報
【特許文献２】日本国特表２０１１−５２４１６４号公報
【特許文献３】日本国特表２０１０−５３４４８０号公報
【特許文献４】日本国特表２０１３−５１６６１９号公報
【特許文献５】日本国特表２０１０−５１７０４８号公報
【特許文献６】日本国特開２０１３−７６９８号公報
【特許文献７】日本国特表２００３−５３１８６４号公報
【特許文献８】日本国特表２００２−５３５６６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
試料中から細胞外胞体を分離する場合、超遠心分離や密度勾配超遠心分離など、密度差による分離によって分離し、分離された細胞外胞体を調製する事ができる。また、細胞外胞体を試料から簡便に分離、精製するキットが市販されている。【０００８】
超遠心分離や密度勾配超遠心などは、細胞外胞体を分離するための作業手順が煩雑であり、分離精製に長時間を要する。さらに細胞外胞体以外の夾雑物の混入が避けられず、精製度や再現性には課題がある。また、細胞外胞体を簡便に分離する市販精製キットは、精製度が不十分であり信頼性に欠ける。【０００９】
細胞外胞体と抗体との結合によって、細胞外胞体を試料中から分離する手法では、多種類の細胞外胞体に広く有用であるとは限らない。【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は、より簡便で効率的に胞体を融合させることを可能とする脂質膜構造体及び脂質膜構造体固定化担体、並びに、脂質膜構造体及び脂質膜構造体固定化担体を用いた胞体の融合方法、胞体の分離方法、胞体の検出方法、及び胞体の移動方法を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一態様に係る胞体の分離方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体、又は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体が担体上に固定化された脂質膜構造体固定化担体と、前記胞体を含む試料と、を接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる。【００１２】
前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて得られた融合体を、外部引力、サイズ、重量、およびアフィニティーのいずれかにより前記試料から分離してもよい。【００１３】
本発明の第二態様に係る胞体の検出方法は、上記第一態様に係る胞体の分離方法において、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合した融合体を検出する。【００１４】
本発明の第三態様に係る胞体の移動方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体を所定の場へと誘導する。【００１５】
前記所定の場が、基板に設けられた凹部であってもよい。【００１６】
前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板であって、前記融合体を前記基板上に固定化された前記脂質膜構造体と融合させていてもよい。【００１７】
前記凹部に、前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質が設けられおり、前記融合体を基板上の脂質膜構造体と融合させてもよい。【００１８】
本発明の第四態様に係る胞体の検出方法は、上記第三態様に係る胞体の移動方法において、前記所定の場において前記融合体を検出する。【００１９】
前記所定の場に反応試薬が配置されており、前記反応試薬と前記融合体の構成成分との反応を行い、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出してもよい。【００２０】
前記所定の場が、基板上に形成された凹部であり、前記反応試薬が前記凹部に収められていてもよい。【００２１】
前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板であって、前記反応試薬が前記脂質膜構造体に含まれており、前記融合体と前記脂質膜構造体とを膜融合させ、前記融合体と前記脂質膜構造体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出してもよい。【００２２】
本発明の第五態様に係る脂質膜構造体固定化担体は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、担体上に固定化された脂質膜構造体を備える。【００２３】
前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、前記脂質膜構造体が前記凹部内に収められていてもよい。【００２４】
前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、前記脂質膜構造体が前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように固定化されていてもよい。【００２５】
本発明の第六態様に係る脂質膜構造体は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有する。【００２６】
本発明の第七態様に係る胞体の融合方法は、上記第五態様に係る脂質膜構造体固定化担体に固定化された脂質膜構造体、又は、上記第六態様に係る脂質膜構造体と、前記胞体と、を接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる。【００２７】
前記胞体を含む液と膜融合を誘発する添加剤とを混合し、前記脂質膜構造体と前記胞体とを接触させてもよい。【００２８】
前記脂質膜構造体が膜融合誘発物質を含んでいてもよい。【００２９】
本発明の第八態様に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体と、胞体が担体上に固定化された胞体固定化担体とを接触させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体を検出する。【００３０】
前記脂質膜構造体が前記胞体の構成成分と反応する反応試薬を含み、前記脂質膜構造体と前記胞体とを接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出してもよい。【００３１】
本発明の第九態様に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合可能な膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質、および、反応試薬を含む脂質膜構造体を、前記脂質膜構造体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により所定の場へと誘導し、前記所定の場に前記胞体が配置されており、前記脂質膜構造体と前記胞体とを前記所定の場において接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。【００３２】
また、本発明の他の態様は、以下の通りであってもよい。
（１）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体。
（２）前記脂質二重膜を有する胞体が細胞外胞体である前記（１）に記載の脂質膜構造体。
（３）胞状である前記（１）又は（２）に記載の脂質膜構造体。
（４）特性付与物質を含む前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体。
（５）膜融合誘発物質を含む前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体。
（６）前記胞体の構成成分と反応する反応試薬を含む前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体。
（７）前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体が固定化された脂質膜構造体固定化担体。
（８）前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、前記脂質膜構造体が前記凹部内に収められている前記（７）に記載の脂質膜構造体固定化担体。
（９）前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、前記脂質膜構造体が前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように固定化されている前記（７）に記載の脂質膜構造体固定化担体。
（１０）前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体、又は前記（７）〜（９）のいずれか一つに記載の脂質膜構造体固定化担体に固定化された脂質膜構造体と前記胞体とを接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる胞体の融合方法。
（１１）前記胞体を含む液と膜融合を誘発する添加剤とを混合し、前記脂質膜構造体と前記胞体とを接触させる前記（１０）に記載の胞体の融合方法。
（１２）前記脂質膜構造体が膜融合誘発物質を含む前記（１０）又は（１１）に記載の胞体の融合方法。
（１３）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体、又は、
脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が担体上に固定化されてなる脂質膜構造体固定化担体、と、
前記胞体を含む試料とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる胞体の分離方法。
（１４）前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて得られた融合体を、外部引力、サイズ、重量、アフィニティーのいずれかにより前記試料から分離する前記（１３）に記載の胞体の分離方法。
（１５）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体、又は、
前記脂質膜構造体が担体上に固定化された脂質膜構造体固定化担体、と、
前記胞体とを接触させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体を検出する胞体の検出方法。
（１６）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体と、胞体が担体上に固定化された胞体固定化担体とを接触させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体を検出する胞体の検出方法。
（１７）前記脂質膜構造体が前記胞体の構成成分と反応する反応試薬を含み、前記脂質膜構造体と前記胞体とを接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する前記（１５）又は（１６）に記載の胞体の検出方法。
（１８）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体を所定の場へと誘導する胞体の移動方法。
（１９）前記所定の場が、基板に設けられた凹部である前記（１８）に記載の胞体の移動方法。
（２０）前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板であって、前記融合体を基板上に固定化された脂質膜構造体と融合させる前記（１８）又は（１９）に記載の胞体の移動方法。
（２１）前記凹部には、前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質が設けられおり、前記融合体を基板上の脂質膜構造体と融合させる前記（１９）に記載の胞体の移動方法。
（２２）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体を所定の場へと誘導し、前記所定の場において前記融合体を検出する胞体の検出方法。
（２３）前記所定の場に反応試薬が配置されており、前記反応試薬と前記融合体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する前記（２２）に記載の胞体の検出方法。
（２４）前記所定の場が、基板上に形成された凹部であり、前記反応試薬が前記凹部に収められている前記（２３）に記載の胞体の検出方法。
（２５）前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板であって、前記反応試薬が前記脂質膜構造体に含まれており、前記融合体と前記脂質膜構造体とを膜融合させ、前記融合体と前記脂質膜構造体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する前記（２３）又は（２４）に記載の胞体の検出方法。
（２６）脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体を、前記脂質膜構造体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により所定の場へと誘導し、
前記所定の場に前記胞体が配置されており、前記脂質膜構造体と前記胞体とを前記所定の場において接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する胞体の検出方法。
（２７）  小胞体の評価方法であって、第１の固定物質を有する第１の小胞体、及び、前記第１の固定物質とは異なる第１の検出物質を有する第１の被検小胞体からなる第１の複合体、または、第２の検出物質を有する第２の小胞体、及び、前記第２の検出物質とは異なる第２の固定物質を有する第２の被検小胞体からなる第２の複合体を形成し、
前記第１の固定物質で前記第１の複合体を、または、第２の固定物質で第２の複合体を、担体に固定分離化し、
前記第１の検出物質または前記第２の検出物質を検出する小胞体の評価方法。
（２８）  前記第１の小胞体及び前記第２の小胞体、ならびに、前記第１の被検小胞体及び前記第２の小胞体は脂質二重膜である前記（２７）に記載の小胞体の評価方法。
（２９）  前記第１の小胞体及び前記第１の被検小胞体により形成された前記第１の複合体、及び、前記第２の小胞体及び前記第２の被検小胞体により形成された前記第２の複合体を、人為的に融合させる前記（２７）または前記（２８）に記載の小胞体の評価方法。
（３０）  前記第１の小胞体を含む液と膜融合を誘発する第１の添加剤とを混合し、前記第１の小胞体と前記第１の被検小胞体とを接触させ、
前記第２の小胞体を含む液と膜融合を誘発する第２の添加剤とを混合し、前記第２の小胞体と前記第２の被検小胞体とを接触させる前記（２７）〜前記（２９）のいずれか一つに記載の小胞体の評価方法。
（３１）  前記第１の小胞体及び前記第２の小胞体のうち少なくとも１つが膜融合誘発物質を含む前記（２７）〜前記（３０）のいずれか一つに記載の小胞体の評価方法。
（３２）  前記担体が前記第１の固定物質及び前記第２の固定物質のうち少なくとも１つと特異的に結合する物質を前記担体の表面に有し、
前記担体が、基板、フィルム、磁性ビーズ、シリカビーズ、ガラスビーズ、及びポリマーのうち少なくともいずれか１つである前記（２７）〜前記（３１）のいずれか一つに記載の小胞体の評価方法。
（３３）  前記第１の検出物質及び前記第２の検出物質のうち少なくとも１つが、蛍光物質、比色物質、発光物質、酸化還元物質、抗原、核酸、及び酵素からなる群から選ばれた１種以上の物質である前記（２７）〜前記（３２）のいずれか一つに記載の小胞体の評価方法。
（３４）  前記第１の検出物質及び前記第２の検出物質のうち少なくとも１つと反応する物質を含む、前記（３３）に記載の小胞体の評価方法。
（３５）  前記第１の検出物質及び前記第２の検出物質のうち少なくとも１つと反応する物質が、基質、化学発光物質、酸化還元物質、及び抗体からなる群から選ばれた１種以上の物質である前記（３４）に記載の小胞体の評価方法。
（３６）  前記第１の検出物質及び前記第２の検出物質のうち少なくとも１つが膜融合前後で蛍光強度が増大する波長領域を持つ２種の蛍光物質から選ばれる前記（２７）〜前記（３２）のいずれか一つに記載の小胞体の評価方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の上記態様に係る脂質膜構造体又は脂質膜構造体固定化担体により、簡便で効率的に細胞外胞体を融合、分離、検出、及び移動させることが可能である。また、本発明の上記態様に係る胞体の融合方法、胞体の分離方法、胞体の検出方法、及び胞体の移動方法によれば、簡便で効率的に細胞外胞体を融合、分離、検出及び移動させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】第２実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体を模式的に示した図である。
【図２】第３実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体を模式的に示した図である。
【図３】第４実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体を模式的に示した図である。
【図４】第５実施形態に係る胞体の融合方法を説明するための図である。
【図５】第６実施形態に係る胞体の融合方法を説明するための図である。
【図６】第７実施形態に係る胞体の融合方法を説明するための図である。
【図７】第８実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図８】第９実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図９】第１０実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図１０】第１１実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図１１】第１２実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図１２】第１３実施形態に係る胞体の分離方法を説明するための図である。
【図１３】第１４実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図１４】第１５実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図１５】第１６実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図１６】第１７実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図１７】第１８実施形態に係る胞体の移動方法を説明するための図である。
【図１８】第１９実施形態に係る胞体の移動方法を説明するための図である。
【図１９】第２０実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図２０】第２０実施形態に係る胞体の検出方法の変形例を説明するための図である。
【図２１】第２１実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図２２】第２２実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図２３】第２３実施形態に係る胞体の検出方法を説明するための図である。
【図２４Ａ】実施例１においてリポソームの膜融合を行った後、リポソームの粒径を測定した結果を示すグラフである。
【図２４Ｂ】実施例１におけるリポソームの膜融合の様子を模式的に表した図である。
【図２５Ａ】実施例２において蛍光封入リポソームの膜融合を行った後、蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。
【図２５Ｂ】実施例２において蛍光封入リポソームの膜融合を行った後、蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。
【図２５Ｃ】実施例２におけるリポソームの膜融合の様子を模式的に表した図である。
【図２６】本発明の第２４実施形態に係る説明図である。
【図２７】本発明の第２５実施形態に係る説明図である。
【図２８】参考例１および実施例４の結果を示す図である。
【図２９】実施例５におけるＴＥＭ画像である。
【図３０】実施例５における粒度分布の測定結果である。
【図３１】実施例５における胞体の融合実験を説明する模式図である。
【図３２】実施例５における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【図３３】実施例６におけるＴＥＭ画像である。
【図３４】実施例６における粒度分布の測定結果である。
【図３５】実施例６における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【図３６】実施例７における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【図３７】実施例８における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【図３８】実施例９における蛍光画像である。
【図３９】実施例９における蛍光画像である。
【図４０】実施例９における蛍光画像である。
【図４１】実施例１０における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【図４２】実施例１１における蛍光検出の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
≪脂質膜構造体≫
本発明の第１実施形態に係る脂質膜構造体は、脂質二重膜を有する胞体と融合する（融合可能な）膜融合性脂質を含有する。
脂質膜構造体は、胞体と融合する脂質膜構造を一層以上形成した脂質膜を有している。
脂質膜構造体は、脂質膜が二層に重なった脂質二重層を形成していることが好ましい。脂質二重層とは、細胞の細胞膜に代表される。脂質膜構造体の有する膜融合性は、脂質膜構造体に含まれる脂質自体の性質であってもよく、脂質膜全体としての性質であってもよい。
脂質膜構造体の脂質膜を形成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
リン脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及びこれらの水素添加物等が挙げられる。
糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質等が挙げられる。
ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール等の植物由来のステロール；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールが挙げられる。
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【００３６】
脂質二重膜に対する脂質膜の膜融合は自発的に起こる事象であるが、好ましくはｐＨ、温度、電荷、光などの外部刺激により、膜構造が変化し膜融合を起こす脂質膜である事が好ましい。
【００３７】
本実施形態に係る脂質膜構造体に係る脂質膜は、脂質膜を形成する脂質の他に、脂質膜の形成を阻害しない限りにおいて任意の物質を含んでいてもよい。当該物質としては、膜安定化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられ、これらの物質を含むことで膜の安定性を高めたり、膜の電荷を調節したりすることができる。
【００３８】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。
ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられる。
負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。
【００３９】
脂質二重膜を有する胞体とは、脂質二重膜によって胞状の形を形成しており、人工的に作られた胞体であっても、天然の胞体であってもよい。天然の胞体としては、脂質二重層を有する細胞、単細胞生物、微生物、菌、細菌、ウィルス、細胞小器官、液胞、膜小胞、小胞、輸送小胞、及びそれらの集合体等が挙げられる。人工的に作られた脂質二重膜を有する胞体としては、リポソーム、天然の胞体を破砕して再び胞状に形成した胞体等が挙げられる。また、脂質二重膜を有する胞体とは、脂質二重膜を有する胞体に由来する胞体であってもよい。後述するように、脂質二重膜を有する胞体として、脂質二重膜を有する胞体と本実施形態に係る脂質膜構造体との融合体も包含される。
【００４０】
前記脂質二重膜を有する胞体は、細胞外胞体であることが好ましい。細胞外胞体とは、細胞外に存在する胞体であり、細胞から分泌された胞体であることが好ましい。細胞外に分泌された胞体の例として、小胞、微小胞、ナノ小胞、分泌小胞、エキソソームを挙げることができる。
ここで、本実施形態及び本願明細書における細胞外胞体とは、細胞外胞体に由来する胞体を含む。細胞外胞体に由来する胞体とは、細胞外胞体と他の脂質二重膜を有する胞体とが膜融合して生じた融合体及び、細胞外胞体から切り出された胞体が挙げられる。ここで、他の脂質二重膜を有する胞体として、本実施形態に係る脂質膜構造体が包含される。
上記脂質膜構造体と融合する細胞外胞体としては、エキソソームであることが好ましい。エキソソームは、蛋白質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡなどを包含し、細胞間を移動することにより移動先の細胞に情報を伝達できることが知られている。
【００４１】
脂質膜構造体は、例えば単独自立膜、水溶液、オイル、高濃度溶液等の界面上膜、金属、ガラス、プラスチック等の基板上膜を脂質膜とすることができる。
【００４２】
脂質膜構造体の形状は、特に制限されないが、例えば、脂質二重膜を有する胞体と融合する脂質を平面状に少なくとも一層以上形成したシート状の脂質膜を例示できる。脂質膜構造体の形状は、シート状又は胞状であることが好ましく、胞状であることがより好ましい。
例えば、脂質二重膜を有する脂質が親水部と疎水部を有している場合、水溶液中に存在する脂質二重膜は、表面には親水部が、内側には疎水部が配置されるようにして整列する。このとき層が胞状であれば、疎水部が表面となる端の部分がないため、シート状の場合よりも安定に液中に存在できる。このように、胞状の脂質膜構造体は溶媒中で安定に存在できるため、脂質膜構造体の形状は、胞状であることがより好ましい。胞状の脂質膜構造体は溶媒中で安定に存在できるため、移動性にも優れる。そのため、胞状の脂質膜構造体では、脂質二重膜を有する胞体と融合するための接触機会が高まり、脂質膜構造体と胞体との融合の効率を向上させることができる。さらには、脂質膜構造体の形状が胞状であることにより、胞体の内部に物質を保持することができる。
【００４３】
脂質膜構造体が胞状であるとき、胞状の脂質膜構造体のサイズは最大直径が１０ｎｍ〜１００μｍであることが好ましく、５０ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。胞状の脂質膜構造体のサイズは最大直径が５０ｎｍ〜１０μｍであるときには、５０ｎｍ〜５００ｎｍであること又は１μｍ〜１０μｍであることがより好ましい。
【００４４】
脂質膜構造体と融合する脂質二重膜を有する胞体の組み合わせとしては、脂質二重膜を有する胞体が細胞外胞体であり、脂質膜構造体が人工胞体である組み合わせを、好適な組み合わせとして例示できる。
また、脂質二重膜を有する胞体が、脂質二重膜を有する胞体に由来する胞体であって、該胞体が細胞外胞体と人工胞体との融合体であり、脂質膜構造体が人工胞体である組み合わせも、好適な組み合わせとして例示できる。
【００４５】
脂質膜構造体は、特性付与物質を含むことが好ましい。特性付与物質を含むとは、脂質膜構造体の脂質膜に特性付与物質を含む状態、脂質膜構造体の脂質膜の外側に特性付与物質が係留されている状態のほか、脂質膜構造体が胞状である場合には、脂質膜構造体の内部に特性付与物質を含む状態も包含する。
【００４６】
特性付与物質とは、脂質膜構造体と融合し得る胞体に特性を付与する物質である。特性付与物質は、脂質膜構造体と融合した胞体に新たな特性を付け加える、又は該胞体の既存の特性のレベルを変化させる物質である。特性付与物質によって付与される特性としては、例えば重量、サイズ、任意の物質とのアフィニティー、電荷、磁性、及びこれらの組み合わせが挙げられる。上記に挙げた重量、サイズ、任意の物質とのアフィニティー、電荷、磁性のいずれの特性も、脂質膜構造体と融合し得る胞体の有する既存の特性である場合が想定されるので、特性付与物質によって、これらの特性のレベルが変化させられるといえる。なかでも、アフィニティー、及び磁性は、脂質膜構造体と融合し得る胞体の有する既存の特性でない新たな特性となり易いため、特性付与物質によって付与される特性としては、アフィニティー、及び磁性がより好ましい。
【００４７】
より具体的な特性付与物質としては、金属化合物、磁性体、電荷物質、及びアフィニティー物質が挙げられる。
金属化合物は、任意の形状の一つ以上の金属物質または金属粒子を含み、脂質膜構造体と融合し得る胞体よりも比重が大きい事が好ましい。金属化合物としては金コロイド等の金属コロイド粒子が好ましい。他方、金コロイド粒子以外の金属コロイドとしては、例えば各種磁性金属の微粒子が用いられる。
磁性体は、任意の形状の一つ以上の磁性物質または磁化可能粒子を含み、磁力発生手段によって引き付けられる。磁性体としてはマグネタイトなどのフェライト粒子が好ましい。他方、フェライト以外の磁性体としては、例えば各種磁性金属の微粒子、又は各種磁性化合物が用いられる。
電荷物質としては、電荷性脂質、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリマー等が挙げられる。
アフィニティー物質は特定の物質と結合・脱離が可能な物質であり、例えばＨｉｓ−ｔａｇ等のアフィニティータグや抗体等のタンパク質が挙げられる。
【００４８】
特性付与物質は、脂質膜構造体と融合し得る胞体に特性付与物質の有する特性を付与することができるので、付与された特性を利用して、胞体を分離、検出、移動させることができる。
【００４９】
脂質膜構造体は、膜融合誘発物質を含むことが好ましい。膜融合誘発物質を含むとは、脂質膜構造体の脂質膜に膜融合誘発物質を含む状態、脂質膜構造体の脂質膜の外側に膜融合誘発物質が係留されている状態のほか、脂質膜構造体が胞状である場合には、膜融合誘発物質の内部に特性付与物質を含む状態も包含する。しかし、膜融合を誘発するという観点からは、膜融合誘発物質は、脂質膜構造体の表面に存在していることが好ましい。すなわち、膜融合誘発物質は脂質膜構造体の脂質膜に含まれていることが好ましい。
【００５０】
膜融合の誘発とは、脂質膜構造体と胞体との膜融合を誘発する、促進する、頻度を高めることを含む。
膜融合誘発物質は例えば膜透過性ペプチド、膜融合性ポリマー、ウィルス由来タンパク質、及び刺激感受性ペプチドやポリマー等である。
膜透過性ペプチドとしては、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン等が挙げられる。膜融合性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。ウィルス由来タンパク質としては、ＨＡタンパク質等が挙げられる。刺激感受性ペプチドとしては、ＧＡＬＡペプチド、ＫＡＬＡペプチド等が挙げられる。刺激感受性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等が挙げられる。
膜融合誘発物質によって、細胞外胞体と人工胞体との膜融合における膜融合効率を向上させることができる。
【００５１】
脂質膜構造体は、胞体の構成成分と反応する反応試薬を含むことが好ましい。反応試薬を含むとは、脂質膜構造体の脂質膜に反応試薬を含む状態、脂質膜構造体の脂質膜の外側に反応試薬が係留されている状態のほか、脂質膜構造体が胞状である場合には、脂質膜構造体の内部に反応試薬を含む状態も包含する。
【００５２】
胞体の構成成分とは、胞体の脂質膜を構成している成分及び胞体の内容物も含む。
反応試薬は例えば核酸分析試薬、タンパク質分析試薬等の生化学分析試薬である。核酸分析試薬としては、例えばインベーダー反応試薬等、タンパク質分析試薬としては、例えばイムノアッセイ試薬等である。
【００５３】
脂質膜構造体が、胞体の構成成分と反応する反応試薬を含むことにより、胞体及び、胞体内の内容物もしくは胞体の構成物質の存在を検出することができる。
【００５４】
≪脂質膜構造体固定化担体≫
本発明の第２〜第４実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体は、上記第１実施形態に係る脂質膜構造体が固定化されている。第２〜第４実施形態に係る脂質膜構造体については、上記第１実施形態に説明したものと同様であるため、説明を省略する。
担体としては、脂質膜構造体を固定化できるものであれば、特に制限されない。担体の形状としては板状であっても、粒子状であってもよく、担体を構成する材料としては、ガラス、多孔質ガラス、有機化合物、高分子化合物、樹脂、ゲル、金属、半導体、無機化合物、有機化合物と無機化合物の混合物等が挙げられる。
樹脂としては、生化学反応容器等に用いられる樹脂が好ましい。例としてポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートを挙げることができる。
担体が反応を阻害する可能性がある場合は、担体表面に反応阻害しない樹脂などをコーティングして担体とすることが好ましい。
これらの担体は、後述する基板としても利用可能である。
【００５５】
脂質膜構造体固定化担体は、さらに、電気泳動力発生手段、磁力発生手段等の外部引力発生手段を備えていてもよい。電気泳動力発生手段としては、例えば、電気泳動装置や電場印加装置、電極等が挙げられる。磁力発生手段としては、例えば、磁力発生装置、マグネタイト、フェライト、ネオジウム等の永久磁石、電磁石等が挙げられる。
脂質膜構造体固定化担体が外部引力発生手段を備えることで、脂質膜構造体、胞体、及び脂質膜構造体と胞体との融合体のふるまいを制御することができるので、脂質膜構造体と、融合対象の胞体との融合をより高効率で実現することができる。
【００５６】
また、脂質膜構造体固定化担体は、さらに、胞体の構成成分と反応する反応試薬を備えていてもよい。当該反応試薬としては、上記の脂質膜構造体に含まれ得る試薬として説明した試薬と同様の試薬を挙げることができる。
脂質膜構造体固定化担体が反応試薬を備えることで、脂質膜固定化担体に係る脂質膜構造体と膜融合した胞体、及び、胞体内の内容物もしくは胞体の構成物質の存在を検出することができる。
【００５７】
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体は、前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が前記凹部内に収められている。脂質膜構造体固定化担体は、脂質膜構造体が収められた凹部を複数有していてもよい。
図１は、本実施形態に係る脂質膜構造体固定化基板１を示す模式図である。基板２は、表面３に凹部４が形成された板状部材である。凹部４には人工胞体５（胞状である脂質膜構造体）が収められており、凹部４の底面に固定化されている。人工胞体５の固定化方法としては、疎水性相互作用による物理吸着、静電的相互作用による静電吸着、及び化学結合による化学吸着等が挙げられる。人工胞体５の内部には、融合対象である胞体の構成成分と反応する反応試薬６を含んでいる。
【００５８】
（第３実施形態）
本発明の第３実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体は、前記担体が基板であり、シート状である脂質膜構造体が基板に固定化されている。
図２は、本実施形態の脂質膜構造体固定化基板１を示す模式図である。基板２の表面３には融合膜１５（シート状である脂質膜構造体）が固定化されている。
【００５９】
（第４実施形態）
本発明の第４実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体は、前記担体が基板であり、前記基板には凹部が形成されており、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体が前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように固定化されている。第４実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体における基板は、基板上の脂質膜構造体が位置する側とは反対の側（位置）に、外部引力発生手段（外部引力発生装置）を備える。
図３は、本実施形態の脂質膜構造体固定化基板１を示す模式図である。基板２は、表面３に凹部４が形成された板状部材である。融合膜１５（シート状である脂質膜構造体）が凹部４の基板表面３の開口部を塞ぐように固定化されている。融合膜１５によって塞がれた凹部４内部には、反応試薬６が収められている。基板２の脂質膜構造体が位置する面とは反対の面には、磁力発生装置７（外部引力発生手段）を備える。脂質膜構造体固定化担体は、脂質膜構造体が固定化された凹部を複数有していてもよい。
【００６０】
≪胞体の融合方法≫
本発明の第５〜第７実施形態に係る胞体の融合方法は、上記実施形態に係る脂質膜構造体、又は上記実施形態に係る脂質膜構造体固定化担体に固定化された脂質膜構造体と前記胞体とを接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる方法である。脂質膜構造体及び脂質膜構造体固定化担体は、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫及び≪脂質膜構造体固定化担体（第２〜第４実施形態）≫において説明したものを、同様に例示できる。特に、膜融合誘発物質を含む脂質膜構造体、及び膜融合誘発物質を含む脂質膜構造体が担体に固定化された脂質膜構造体固定化担体を好適なものとして例示できる。
【００６１】
（第５実施形態）
本発明の第５実施形態に係る胞体の融合方法では、細胞外胞体（胞体）１１０を含む液と、膜融合を誘発する添加剤１１１とを混合し、人工胞体（脂質膜構造体）５と前記胞体１１０とを接触させる（図４）。
膜融合の誘発とは、脂質膜構造体と胞体との膜融合を誘発する、促進する、頻度を高めることを含む。
胞体を含む液は、例えば、血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、これらを調製して得られた溶液等、胞体を含み得る任意の材料を用いることができる。
【００６２】
胞体１１０を含む液と添加剤１１１との混合は、脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させる前に、予め行ってもよく、脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させるのと同時、又は脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させた後に行ってもよい。
胞体１１０を含む液と添加剤１１１との混合を、脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させる前に行う場合としては、例えば、細胞外胞体１１０を含む血清に添加剤１１１を混合して血清と添加剤１１１の混合液を得た後に、該混合液を、人工胞体５を含有する溶液に添加することである。同様に、生体由来の血清に添加剤１１１を混合して血清と添加剤１１１の混合液を得た後に、該混合液を人工胞体固定化基板２０１に接触させることである。
胞体１１０を含む液と添加剤１１１との混合を、脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させた後に行う場合としては、例えば、生体由来の血清と人工胞体５を含有する溶液とを混合して血清と人工胞体５を含有する溶液の混合液を得た後に、該混合液に添加剤１１１を添加することである。同様に、生体由来の血清を人工胞体固定化基板２０１に接触させた後に、人工胞体固定化基板２０１に接触している血清に添加剤１１１を添加することである。
本実施形態では、人工胞体固定化基板１を利用することも可能である。
【００６３】
前記添加剤１１１としては、ｐＨ調整剤、界面活性剤、金属化合物などを例示できる。
ｐＨ調整剤としては、各種緩衝液が挙げられる。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ等が挙げられる。
金属化合物としては、カルシウム含有化合物（例えば、塩化カルシウムなど）、マグネシウム含有化合物等が挙げられる。
【００６４】
添加剤１１１を細胞外胞体１１０と人工胞体５の融合場に添加する事によって、膜融合を任意に制御する事ができる。
【００６５】
（第６実施形態）
本発明の第６実施形態の胞体の融合方法では、胞体１１０と人工胞体５との膜融合を起こすために、膜融合誘発装置１１３を用いる（図５）。膜融合誘発装置１１３は例えば電場印加装置や加温装置等である。
膜融合の誘発とは、脂質膜構造体５と胞体１１０との膜融合を誘発する、促進する、頻度を高めることを含む。
膜融合誘発装置１１３によって任意に膜構造を変化させ、膜融合のタイミング、膜融合の対象物、膜融合の効率等を制御することができる。
【００６６】
（第７実施形態）
本発明の第７実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体との膜融合を起こすため、膜融合誘発物質１１４で修飾されている人工胞体１１５を用いる（図６）。膜融合誘発物質１１４は例えば膜透過性ペプチド、膜融合性ポリマー、ウィルス由来タンパク質、及び刺激感受性ペプチドやポリマー等である。
膜融合誘発物質１１４によって、細胞外胞体１１０と人工胞体との膜融合における膜融合効率を向上させることができる。
【００６７】
≪胞体の分離方法≫
本発明の第８〜第１３実施形態に係る胞体の分離方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体、又は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が担体上に固定化されてなる脂質膜構造体固定化担体、と、前記胞体を含む試料とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させる。
本実施形態及び本願明細書における胞体の分離方法は、胞体を含む試料中から胞体を分離する方法である。胞体を含む試料とは、例えば、血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、これらを調製して得られた溶液等、胞体を含む可能性がある任意の材料を用いることができる。
【００６８】
本実施形態に係る胞体の分離方法に係る脂質膜構造体及び脂質膜構造体固定化担体は、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫及び≪脂質膜構造体固定化担体（第２〜第４実施形態）≫において説明したものを、同様に例示できる。特に、特性付与物質を含む脂質膜構造体、及び特性付与物質を含む脂質膜構造体が固定化された脂質膜構造体固定化担体を好適なものとして例示できる。
【００６９】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法に係る脂質膜構造体と前記胞体との膜融合については、上記の≪胞体の融合方法（第５〜第７実施形態）≫において説明した方法を好適に用いることができる。
分離された胞体は、脂質膜構造体と胞体との融合体として、回収することができる。
【００７０】
（第８実施形態）
本発明の第８実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）が基板２０２上に固定化された人工胞体固定化基板２０１と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料１１６とを接触させて人工胞体と細胞外胞体１１０とを膜融合させる胞体の分離方法である（図７）。図７に示すように、人工胞体１１５には膜融合誘発物質１１４が含まれていてもよい。
試料１１６に含まれる細胞外胞体１１０を人工胞体１１５と接触させ、互いに膜融合させることにより、試料１１６中に含まれる細胞外胞体１１０を迅速且つ簡便に試料から分離することができる。
人工胞体固定化基板２０１は、図１に示す脂質膜構造体固定化基板１の凹部４のない基板２０２を用いて、人工胞体を固定化したものである。
【００７１】
また、人工胞体１１５と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体１１５とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００７２】
なお、本実施形態では、人工胞体固定化基板２０１と試料１１６とを接触させる場合を例示したが、基板等の担体に固定化されていない状態の人工胞体と、試料１１６とを接触させる場合であっても、人工胞体と細胞外胞体１１０の融合により、例えば細胞外胞体１１０のサイズを増加させることができる。そのため、従来の胞体の分離方法と比較して、胞体の分離効率を向上させることができる。また、本実施形態に係る胞体の分離方法は、従来の胞体の分離方法と組み合わせて用いることができる。たとえば、従来の胞体の分離方法の前処理方法としても用いることができる。
本実施形態に係る胞体の分離方法と組み合わせるのに好適な従来の胞体の分離方法としては、超遠心分離や密度勾配超遠心、及びフィルター分離等が挙げられる。
【００７３】
本実施形態に係る胞体の分離方法においては、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて得られた融合体１１２を、外部引力、サイズ、重量、アフィニティーのいずれかにより前記試料１１６から分離してもよい。
【００７４】
（第９実施形態）
本発明の第９実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて人工胞体と細胞外胞体１１０とを膜融合させて得られた融合体１１２を、重量により前記試料から分離する方法である。
本実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体との融合体１１２を効率良く分離するため、金属化合物１１７等を内包した人工胞体１１８を用いる。金属化合物１１７としては、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫の特性付与物質において説明したものと同様である。
図８は、本実施形態に係る胞体の分離方法を説明する模式図である。人工胞体は、金属化合物１１７を内包している。金属化合物内包人工胞体１１８を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、金属化合物内包人工胞体１１８と細胞外胞体１１０を接触させて、融合体１１２を得る。この際、ｐＨ、温度等の制御を行い、膜融合を誘発させてもよい。
また、本実施形態においては、細胞外胞体１１０と金属化合物１１７とを内包した人工胞体１１８が膜融合した融合体１１２を試料中から区別するため、遠心力発生手段を用いる。遠心力発生手段としては、遠心分離装置等が好ましい。遠心力発生手段によって、融合体１１２をより容易に試料中から分離することができる。
【００７５】
また、本実施形態の胞体の分離方法によれば、人工胞体と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００７６】
（第１０実施形態）
本発明の第１０実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて人工胞体と細胞外胞体１１０とを膜融合させて得られた融合体１１２を、電荷（外部引力）により前記試料から分離する方法である。
本実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体との融合体１１２を効率よく分離するため、電荷物質１１９で修飾されている人工胞体１２０を用いる。電荷物質１１９としては、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫の特性付与物質において説明したものと同様である。
図９は、本実施形態に係る胞体の分離方法を説明する模式図である。人工胞体は、電荷物質１１９で修飾されている。電荷物質修飾人工胞体１２０を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、電荷物質修飾人工胞体１２０と細胞外胞体１１０を接触させて、融合体１１２を得る。この際、ｐＨ、温度等の制御を行い、膜融合を誘発させることを行ってもよい。
また本実施形態においては、細胞外胞体１１０と電荷物質１１９を修飾した人工胞体が融合した融合体１１２を試料中から区別するため、電気泳動力発生手段１２１を用いる。電気泳動力発生手段１２１としては、例えば電気泳動装置や電場印加装置である。電気泳動力発生手段１２１によって、融合体１１２のふるまいを制御することができる。例えば、図９に示す人工胞体１２０では、負に帯電する電荷物質１１９で修飾されているため、融合体１１２はより陽極側へと引き寄せられやすいように特性が改変されており、融合体１１２をより容易に試料中から分離することができる。
【００７７】
また、本実施形態の胞体の分離方法によれば、人工胞体と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００７８】
（第１１実施形態）
本発明の第１１実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）５と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて人工胞体５と細胞外胞体１１０とを膜融合させて得られた融合体１１２を、サイズにより前記試料から分離する方法である。
本実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体５との融合体１１２を効率よく分離するため、サイズ排除可能な人工胞体５を用いる。サイズ排除可能な人工胞体５としては、試料中のタンパク質等の夾雑物よりも大きいサイズの人工胞体である事が好ましく、細胞外胞体１１０よりも大きいサイズの人工胞体であることがより好ましい。
図１０は、本実施形態に係る胞体の分離方法を説明する模式図である。人工胞体５は、細胞外胞体１１０よりも大きいサイズである。人工胞体５を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、人工胞体５と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得る。この際、ｐＨ、温度等の制御を行い、膜融合を誘発させることを行ってもよい。
また本実施形態においては、細胞外胞体１１０と、サイズ排除可能な人工胞体５との融合体１１２と、を分離するため、サイズ排除分離手段１２２を用いる。サイズ排除分離手段１２２としては例えばカラム等である。サイズ排除分離手段１２２によって、融合体１１２を容易に試料中から分離することができる。
【００７９】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法によれば、人工胞体５と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体５とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００８０】
（第１２実施形態）
本発明の第１２実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて人工胞体と細胞外胞体１１０とを膜融合させて得られた融合体１１２を、アフィニティーにより前記試料から分離する方法である。
本実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体との融合体１１２を分離するため、アフィニティー物質１２３が修飾されている人工胞体１２４を用いる。アフィニティー物質１２３は特定の物質と結合、好ましくは結合及び脱離が可能な物質であり、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫の特性付与物質において説明したものと同様である。
図１１は、本実施形態の胞体の分離方法を説明する模式図である。人工胞体は、アフィニティー物質１２３で修飾されている。電荷物質修飾人工胞体１２０を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、電荷物質修飾人工胞体１２０と細胞外胞体１１０とを接触させて、アフィニティー物質１２３で修飾された融合体１１２を得る。この際、ｐＨ、温度等の制御を行い、膜融合を誘発させることを行ってもよい。
また、本実施形態においては、細胞外胞体１１０とアフィニティー物質１２３を修飾した人工胞体１２４が融合した融合体１１２を試料中から分離するため、アフィニティー分離手段１２５が用いられる。アフィニティー分離手段１２５としては、アフィニティー物質１２３と結合可能な物質を備えるカラム等が好ましい。アフィニティー分離手段１２５によって、融合体１１２を容易に試料中から分離及び回収することができる。
【００８１】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法によれば、人工胞体と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００８２】
（第１３実施形態）
本発明の第１３実施形態に係る胞体の分離方法は、人工胞体（脂質膜構造体）と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて人工胞体と細胞外胞体１１０とを膜融合させて得られた融合体１１２を、磁力（外部引力）により前記試料から分離する方法である。
本実施形態においては、細胞外胞体１１０と人工胞体との融合体１１２を効率良く分離するため、磁性体１２６を内包した人工胞体１２７を用いる。磁性体１２６としては、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫の特性付与物質において説明したものと同様である。
図１２は、本実施形態の胞体の分離方法を説明する模式図である。人工胞体は、磁性体１２６を内包している。磁性体内包人工胞体１２７を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、磁性体内包人工胞体１２７と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得る。この際、ｐＨ、温度等の制御を行い、膜融合を誘発させることを行ってもよい。
また本実施形態においては、細胞外胞体１１０と磁性体１２６を内包した人工胞体が膜融合した融合体１１２を試料中から区別するため、磁力発生手段７を用いる。磁力発生手段７としては、永久磁石や電磁石である。磁力発生手段７によって、融合体１１２をより容易に試料中から分離することができる。
【００８３】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法によれば、人工胞体と融合していない細胞外胞体１１０と、細胞外胞体１１０と人工胞体とが融合して得られた融合体１１２とを区別することもできる。
【００８４】
≪胞体の検出方法−Ｉ≫
本発明の第１４〜第１７実施形態に係る胞体の検出方法における脂質膜構造体及び脂質膜構造体固定化担体は、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫及び≪脂質膜構造体固定化担体（第２〜第４実施形態）≫において説明したものを、同様に例示できる。特に、反応試薬を含む脂質膜構造体、及び反応試薬を含む脂質膜構造体が固定化された脂質膜構造体固定化担体を好適なものとして例示できる。
【００８５】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法における脂質膜構造体と前記胞体との膜融合については、上記の≪胞体の融合方法（第５〜第７実施形態）≫において説明した方法を好適に用いることができる。
【００８６】
（第１４実施形態）
本発明の第１４実施形態に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体と、前記胞体と、を接触させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体１１２を検出する。
図１３は、本実施形態に係る胞体の検出方法を説明する模式図である。人工胞体５を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液と、を混合して、人工胞体５と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得た後、該融合体１１２を検出手段１２８により検出する。検出手段１２８は、例えばＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）やＱＣＭ（水晶振動子）を利用したセンサーである。
細胞外胞体１１０を融合体１１２として検出することにより、従来法では検出が難しかった微小な胞体であっても検出対象とすることができ、検出効率を上げることができる。
【００８７】
（第１５実施形態）
本発明の第１５実施形態に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有する脂質膜構造体５と、胞体１１０が担体上に固定化された胞体固定化担体とを接触させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて、前記脂質膜構造体５と前記胞体１１０とが膜融合して生じた融合体１１２を検出する。
図１４は、本実施形態の胞体の検出方法を説明する模式図である。人工胞体５を含む溶液を、細胞外胞体１１０が基板上に固定化された細胞外胞体固定化基板３０１に接触させる。基板には、検出手段１２８が備えられている。基板上で人工胞体５と細胞外胞体１１０との融合体１１２を得て、該融合体１１２を検出手段１２８により検出する。検出手段１２８は例えばＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）やＱＣＭ（水晶振動子）を利用したセンサーである。
細胞外胞体１１０が固定化された細胞外胞体固定化基板３０１は、従来公知の方法を用いて得たものであってもよいし、細胞外胞体１１０に由来する胞体（融合体）１１２が固定化された基板として、上記実施形態に係る胞体の分離方法を用いて得たものであってもよい。先に説明した実施形態としては、≪胞体の分離方法≫の第８実施形態で示したように、人工胞体（脂質膜構造体）５が基板上に固定化された人工胞体固定化基板２０１と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて前記脂質膜構造体５と前記胞体１１０とを膜融合させて得られた細胞外胞体固定化基板（融合体固定化基板）を例示できる。
このようにして、細胞外胞体１１０を融合体１１２として検出することができ、細胞外胞体１１０の検出効率を上げることができる。
【００８８】
（第１６実施形態）
本発明の第１６実施形態に係る胞体の検出方法は、脂質膜構造体５が前記胞体１１０の構成成分と反応する反応試薬６を含み、脂質膜構造体５と胞体１１０とを接触させて、脂質膜構造体５と胞体１１０とを膜融合させ、脂質膜構造体５と胞体１１０との膜融合により反応試薬６と胞体１１０の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
図１５は、本実施形態に係る胞体の検出方法を説明する模式図である。反応試薬内包人工胞体１２９を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液と、を混合して、反応試薬内包人工胞体１２９と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得た後、該融合体１１２を検出手段１２８により検出する。反応試薬６は、細胞外胞体１１０の構成成分と反応するので、細胞外胞体１１０と反応試薬内包人工胞体１２９とが融合体１１２を形成してはじめて反応が生じる。したがって、細胞外胞体１１０と反応試薬内包人工胞体１２９との融合体１１２のみを検出することができる。
反応試薬６としては、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫において説明した試薬と同様である。反応試薬６は細胞外胞体１１０の内容物又は構成物質と反応することによりシグナルを発生する。発生するシグナルは例えば、呈色、蛍光、酸化還元電位等である。それぞれのシグナルに応じた検出手段１２８を用いて、シグナルを検出すればよい。検出手段１２８としては、ＣＣＤカメラ、フローサイトメーター等が挙げられる。また、検出されたシグナルによって、セルソーター等の分離装置を用いて融合体１１２を分離することも可能である。
【００８９】
（第１７実施形態）
本発明の第１７実施形態に係る胞体の検出方法は、上記第１６実施形態に係る胞体の検出方法の変形例である。図１６は、本実施形態に係る胞体の検出方法を説明する模式図である。反応試薬内包人工胞体１２９が基板上に固定化されている。本実施形態では、さらに電気泳動力発生手段１２１を用いる。図１６に示すように、細胞外胞体１１０は負に帯電しているため、基板側に正極を配置することで、基板へと細胞外胞体１１０を誘導することができる。電気泳動力発生手段（電気泳動装置）１２１を用いることにより、反応試薬内包人工胞体１２９と細胞外胞体１１０との融合効率を向上させることができ、細胞外胞体１１０の構成成分と反応試薬６との反応により発生するシグナルを検出する工程の時間短縮となり、検出効率を向上させることができる。
【００９０】
≪胞体の移動方法≫
本発明の第１８実施形態および第１９実施形態に係る胞体の移動方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体を所定の場へと誘導する。
【００９１】
本実施形態に係る胞体の移動方法における脂質膜構造体は、上記の≪脂質膜構造体（第１実施形態）≫において説明したものを、同様に例示できる。特に、特性付与物質を含む胞状の脂質膜構造体を好適なものとして例示できる。
【００９２】
また、本実施形態に係る胞体の分離方法における脂質膜構造体と前記胞体との膜融合については、上記の≪胞体の融合方法（第５〜第７実施形態）≫において説明した方法を好適に用いることができる。
【００９３】
本実施形態に係る胞体の移動方法は、胞体を含む任意の液中で行うことができ、本実施形態に係る胞体の移動方法を、胞体を含む試料液中で行うことで、試料液中からの胞体の分離方法を兼ねることも可能である。
【００９４】
前記所定の場とは、例えば、胞体に由来する胞体（融合体）の検出を行うための検出手段が備えられた検出部、融合体の回収を行うための回収部、脂質膜構造体と胞体との融合させるための反応部等が挙げられる。前記所定の場の形状は特に制限されないが、例えば、基板に設けられた凹部である。該凹部としては、例えば反応ウェルである。
【００９５】
前記所定の場には、第１実施形態に係る脂質膜構造体が備えられていてもよい。
例えば、前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板であって、前記融合体を基板上に固定化された脂質膜構造体と融合させてもよい。
或いは、前記所定の場が基板に設けられた凹部であって、前記凹部には、前記凹部の基板表面の開口部を塞ぐように、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質が設けられおり、前記融合体を基板上の脂質膜構造体と融合させてもよい。
【００９６】
（第１８実施形態）
本発明の第１８実施形態に係る胞体の移動方法においては、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体１１２に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体１１２を所定の場へと誘導し、前記所定の場が、基板に設けられた凹部である。
図１７は、本実施形態の胞体の移動方法を説明する模式図である。磁性体内包人工胞体１２７を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液と、を混合して、磁性体内包人工胞体１２７と細胞外胞体１１０を接触させて、融合体１１２を得る。融合体１１２の移動対象の場は、基板に設けられた凹部である。
凹部には、磁力発生手段（磁力発生部材、磁力発生装置）７が配置されている。次いで、磁力発生手段７を用いて磁性体１２６を内包した融合体１１２を誘導する。磁力発生手段７は、例えば永久磁石や電磁石である。磁力発生手段７によって、人工胞体の挙動を制御することができ、細胞外胞体１１０を含む試料液中から、任意の場所へと人工胞体を移動・分離することができる。
【００９７】
（第１９実施形態）
上記第１８実施形態においては、磁力発生手段７を用いたが、本発明の第１９実施形態においては、磁力発生手段７に代えて、電気泳動力発生手段（電気泳動装置）１２１を用いてもよい。
図１８は、本実施形態の胞体の移動方法を説明する模式図である。人工胞体は、電荷物質１１９で修飾されている。電気泳動力発生手段１２１によって、人工胞体の挙動を制御することができ、試料中等の細胞外胞体１１０を含む液から、基板に設けられた凹部へと人工胞体を移動・分離することができる。
【００９８】
≪胞体の検出方法−ＩＩ≫
ここで説明する本発明の第２０〜２３実施形態に係る胞体の検出方法は、上記≪胞体の検出方法―Ｉ（第１４〜第１７実施形態）≫において例示した方法と上記≪胞体の移動方法（第１８実施形態および第１９実施形態）≫とを組み合わせた方法である。なお、反応試薬と胞体の構成成分とを反応させるためには、膜融合は必須ではない。
【００９９】
（第２０実施形態）
本発明の第２０実施形態に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質を含む脂質膜構造体と、前記胞体とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体とが膜融合して生じた融合体１１２に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、前記融合体１１２を所定の場へと誘導する胞体の移動方法を用いた胞体の検出方法であり、前記所定の場において前記融合体１１２を検出する。
【０１００】
前記所定の場に反応試薬６が配置されていてもよい。前記所定の場が、基板上に形成された凹部であり、前記反応試薬６が前記凹部に収められている態様を例示することができる。
図１９は、本実施形態の胞体の検出方法を説明する模式図である。電荷物質修飾人工胞体１２０を含む溶液と細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、電荷物質修飾人工胞体１２０と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得る。融合体１１２の移動対象の場は、基板に設けられた凹部である。凹部には、電気泳動力発生手段（電気泳動装置）１２１が配置されており、凹部内部には反応試薬６が収められている。次いで、電気泳動力発生手段１２１を用いて電荷物質１１９で修飾された融合体１１２を誘導する。
反応試薬６と胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。本実施形態において、反応試薬６と反応する胞体の構成成分としては、例えば、細胞外胞体１１０の膜タンパク質が挙げられる。
【０１０１】
なお、反応試薬６は、第１実施形態に係る脂質膜構造体１に収められていてもよい。
図２０は、第２０実施形態の胞体の検出方法の変形例を説明する模式図である。磁性体内包人工胞体１２７を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、磁性体内包人工胞体１２７と細胞外胞体１１０を接触させて、融合体１１２を得る。融合体１１２の移動対象の場は、基板に設けられた凹部である。凹部には、磁力発生手段７が配置されており、凹部内部には反応試薬６を内包する人工胞体１２９が収められている。次いで、磁力発生手段（磁力発生部材、磁力発生装置）７を用いて磁性体１２６を内包した融合体１１２を誘導する。磁力発生手段７は、例えば永久磁石や電磁石である。融合体１１２を基板上の人工胞体１２９と融合させることにより、反応試薬６と胞体１１０の構成成分との反応を行い、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
【０１０２】
（第２１実施形態）
本発明の第２１実施形態に係る胞体の検出方法は、上記第２０実施形態における基板に形成された凹部の基板表面の開口部を塞ぐように、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質が設けられおり、人工胞体を基板上の脂質膜構造体と融合させることにより、前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
図２１は、第２１実施形態に係る胞体の検出方法を説明する模式図である。磁性体内包人工胞体１２７を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、磁性体内包人工胞体１２７と細胞外胞体１１０を接触させて、融合体１１２を得る。融合体１１２の移動対象の場は、基板に設けられた凹部である。凹部には、磁力発生手段（磁力発生部材、磁力発生装置）７が配置されており、凹部内部には反応試薬６が収められている。
次いで、磁力発生手段７を用いて磁性体１２６を内包した融合体１１２を誘導する。磁力発生手段７は、例えば永久磁石や電磁石である。基板に形成された凹部の基板表面の開口部を塞ぐように、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質が設けられおり、人工胞体を基板上の脂質膜構造体と融合させることにより、反応試薬６と胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
【０１０３】
（第２２実施形態）
本発明の第２２実施形態に係る胞体の検出方法は、前記所定の場が、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状である脂質膜構造体が基板上に固定化された脂質膜構造体固定化基板２０１であって、前記反応試薬が前記脂質膜構造体に含まれており、前記融合体と前記脂質膜構造体とを膜融合させ、前記融合体と前記脂質膜構造体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
図２２は、本実施形態の胞体の検出方法を説明する模式図である。磁性体内包人工胞体１２７を含む溶液と、細胞外胞体１１０を含む試料溶液とを混合して、磁性体内包人工胞体１２７と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合体１１２を得る。融合体１１２の移動対象の場は、人工胞体１２７が基板上に固定化された人工胞体固定化基板２０１である。該基板には、磁力発生手段（磁力発生部材、磁力発生装置）７が配備されており、人工胞体１２７は反応試薬６を内包する。次いで、磁力発生手段７を用いて磁性体１２６を内包した融合体１１２を誘導する。磁力発生手段７は、例えば永久磁石や電磁石である。融合体１１２を基板上の人工胞体１２７と融合させることにより、反応試薬６と胞体１１０の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
【０１０４】
（第２３実施形態）
本発明の第２３実施形態に係る胞体の検出方法は、脂質二重膜を有する胞体と融合する膜融合性脂質を含有し、胞状であり、特性付与物質および反応試薬を含む脂質膜構造体を、前記脂質膜構造体に含まれる前記特性付与物質により付与又は変動された特性により、所定の場へと誘導する脂質膜構造体の移動方法を用いた胞体の検出方法であり、前記所定の場に前記胞体が配置されており、前記脂質膜構造体と前記胞体とを前記所定の場において接触させて、前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させ、前記脂質膜構造体と前記胞体との膜融合により前記反応試薬と前記胞体の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
図２３は、本実施形態の胞体の検出方法を説明する模式図である。磁性体１２６及び反応試薬６を内包する人工胞体１３０を含む溶液を、細胞外胞体１１０が固定化された細胞外胞体固定化基板３０１へと接触させる。基板には、磁力発生手段（磁力発生部材、磁力発生装置）７が配置されており、磁性体１２６を内包した人工胞体１３０を基板へと誘導する。続いて、人工胞体１３０と細胞外胞体１１０とを接触させて、融合させ、反応試薬６と細胞外胞体１１０の構成成分とを反応させ、前記反応又は前記反応により生じた反応産物を検出する。
【０１０５】
細胞外胞体１１０が固定化された基板は、従来公知の方法を用いて得た基板であってもよいし、細胞外胞体１１０に由来する胞体（融合体）１１２が固定化された基板として、第８〜第１３実施形態に係る胞体の分離方法を用いて得た基板であってもよい。先に説明した実施形態としては、≪胞体の分離方法≫の第８実施形態で示したように、人工胞体（脂質膜構造体）が基板上に固定化された人工胞体固定化基板と、細胞外胞体（胞体）１１０を含む試料とを接触させて前記脂質膜構造体と前記胞体とを膜融合させて得られた胞体固定化基板（融合体固定化基板）を例示できる。
【０１０６】
上記第２０〜２３実施形態で示されるように、細胞外胞体１１０もしくは融合体１１２を基板に形成された凹部等の所定の場に誘導することにより、所定の場に配置された反応試薬６との反応により発生するシグナルを検出する工程の時間短縮となり、検出効率を上げることもできる。
また、上記第２０〜２３実施形態で示されるように、所定の場に本発明の脂質膜構造体が配置されている場合には、細胞外胞体１１０もしくは融合体１１２を凹部等の所定の場に誘導する事により、脂質膜との融合効率を向上させることができる。また、所定の場に配置された反応試薬６との反応により発生するシグナルを検出する工程の時間短縮となり、検出効率を上げることもできる。
【０１０７】
≪小胞体の評価方法≫
本発明の第２４〜第２７実施形態に係る小胞体の評価方法を以下に説明する。
本実施形態における小胞体および被検小胞体は、脂質二重膜を含む。
脂質二重膜を構成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
リン脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及びこれらの水素添加物等が挙げられる。
糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質等が挙げられる。
ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール等の植物由来のステロール；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールが挙げられる。
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【０１０８】
脂質膜は、脂質膜を形成する脂質の他に、脂質膜の形成を阻害しない限りにおいて任意の物質を含んでいてもよい。当該物質としては、膜安定化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられ、これらの物質を含むことで膜の安定性を高めたり、膜の電荷を調節したりすることができる。
【０１０９】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。
ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられる。
負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。
【０１１０】
脂質二重膜を有する小胞体または被検小胞体とは、脂質二重膜によって胞状の形を形成しており、人工的に作られたものであっても、天然のものであってもよい。天然の小胞体としては、脂質二重層を有する細胞、単細胞生物、微生物、菌、細菌、ウィルス、細胞小器官、液胞、膜小胞、小胞、輸送小胞、及びそれらの集合体等が挙げられる。人工的に作られた脂質二重膜を有する胞体としては、リポソーム、天然の胞体を破砕して再び胞状に形成した小胞体等が挙げられる。また、脂質二重膜を有する小胞体とは、脂質二重膜を有する小胞体に由来する小胞体であってもよい。
【０１１１】
被検小胞体や小胞体を含む試料として、例えば血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、これらを調製して得られた溶液、バッファー等、任意のものを用いることができる。
【０１１２】
使用する担体１０８は、基板、フィルム、磁性ビーズ、シリカビーズ、ガラスビーズ、及びポリマーの少なくともいずれか１つであり第一物質１０７を表面に固定されていればよい。
【０１１３】
（第２４実施形態）
本発明の第２４実施形態に係る膜融合評価システムについて説明する。図２６は、本実施形態に係る膜融合評価システムの模式図である。
【０１１４】
第２４実施形態は、前記担体１０８が基板であり、前記小胞体１０３は第１の蛍光物質１０４と第２の蛍光物質１０５を有した脂質二重膜体であり、第１の蛍光物質１０４の蛍光波長と第２の蛍光物質１０５との励起波長が近い蛍光物質とする。前記被検小胞体１０１は固定物質１０２を含む脂質二重膜小胞体である。被検小胞体１０１および小胞体１０３は膜融合性脂質を含有していてもよい。
複合体１０６形成後、固定物質１０２と第一物質１０７の結合によって前記担体１０８に固定される。複合体１０６は脂質が混合される事により、第１の蛍光物質１０４と第２の蛍光物質１０５との距離が離れるため、第１の蛍光物質１０４の蛍光波長が増大し、被検小胞体１０１と小胞体１０３が融合した事を評価できる。
【０１１５】
第一物質１０７は、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれる少なくとも１つの物質が被検物質に応じて選択して採用される。第一物質１０７は、固定物質１０２に対する特異性が高いことが好ましい。例えば、第一物質１０７は、試料中において固定物質１０２に対して結合しやすく、固定物質１０２とは別の物質には結合しにくい。
また、固定物質１０２と第一物質１０７の結合をはずし、複合体を回収する事も可能である。
【０１１６】
使用する第１の蛍光物質１０４，第２の蛍光物質１０５は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を引き起こすドナー分子とアクセプター分子の組み合わせであればいずれの物質であっても使用できる。具体的には３，３’‐ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（３，３’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）（以下ＤｉＯと略す）とオクタデシルローダミンＢ塩化物（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（以下ローダミンと略す）との混合物、あるいは４，４‐ジフルオロ‐５‐オクチル‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン‐３‐ペンタン酸（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−ｏｃｔｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（以下Ｃ８‐ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５００／５１０Ｃ５と略す）とローダミンとの混合物、ニトロベンゾオキサジアゾール（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）（以下ＮＢＤと略す）とローダミンＢ塩化物との混合物等が挙げられる。これらの蛍光物質は膜融合が発生すると膜に標識された蛍光分子が拡散・希釈され、ドナー分子とアクセプター分子の距離が離れるため、ドナー分子の蛍光強度が増大する。また本実施形態における蛍光物質の組み合わせはこれらの例に限定されるものではない。
【０１１７】
（第２５実施形態）
本発明の第２５実施形態では、複合体１０６において第二物質１０９と反応する物質で検出を行う。第二物質１０９と反応する物質としては、基質、化学発光物質、および酸化還元物質等が挙げられる。本実施形態では、第二物質１０９と上記物質の反応によるシグナルを検出することにより、被検小胞体１０１と小胞体１０３から成る複合体１０６のみが、検出され評価する事ができる。また、複合体１０６において担体１０８に第二物質１０９で固定し、固定物質１０２と反応する物質で検出させてもよい。
【０１１８】
検出物質は、比色物質、発光物質、酸化還元物質、核酸、および酵素からなる群から選ばれる少なくとも１つの標識物質であり、発光物質としては、蛍光分子、リン光分子、化学発光分子、酵素結合分子等が挙げられる。核酸を標識物質とした時の検出方法としては、イムノＰＣＲ、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎ法、蛍光プローブ法等の核酸検出法が挙げられる。
【０１１９】
（第２６実施形態）
本発明の第２６実施形態は、上述の前記被検小胞体１０１、前記小胞体１０３の複合体１０６を形成した後に担体１０８に固定化させて検出し評価する方法に代えて、予め担体１０８に被検小胞体１０１もしくは小胞体１０３を固定化させ、その後に複合体１０６を形成した後に、検出評価することもできる。
【０１２０】
（第２７実施形態）
本発明の第２７実施形態では、酵素が内包された被検小胞体１０１が、基質が内包された小胞体１０３に融合することによって、小胞体内で反応し色が変化することで検出評価することもできる。
また、基質が内包された被検小胞体１０１に酵素が内包された小胞体１０３に対し融合することによって小胞体内で反応し色が変化することで検出評価してもよい。
【実施例】
【０１２１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１２２】
［実施例１］膜融合誘発剤添加による人工胞体の膜融合
膜融合のモデルとして、人工胞体としてジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）リポソーム（粒径：１００ｎｍ、Ｆｏｕｒｍｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、膜融合誘発剤（添加剤）としてポリエステルグリコール（ＰＥＧ）（分子量：６０００、和光純薬）を用いて膜融合実験を行った。
ＤＯＰＣリポソーム溶液１００μｇ／ｍＬに対して、各濃度ＰＥＧ溶液（０，１０，２０，４０ｗｔ％）を添加し、２０分間撹拌してリポソームの膜融合を行った。膜融合の評価はナノ粒子計（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ−５００、日本カンタムデザイン）を用いて、各濃度ＰＥＧ溶液添加後のＤＯＰＣリポソームの粒径測定を行った。結果を図２４Ａに示す。図２４Ｂは、本実施例における人工胞体の膜融合の様子を模式的に表した図である。ＰＥＧ濃度０ｗｔ％におけるリポソームの平均粒径（１５３．０１ｎｍ）と比較して、ＰＥＧ濃度を添加した場合では、添加するＰＥＧ濃度に依存して添加、撹拌後リポソームの平均粒径が増加する事が確認された。【０１２３】
［実施例２］膜融合誘発剤による蛍光封入人工胞体の膜融合
蛍光封入胞体としてＮＢＤ封入リポソーム（モル比、ＤＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＮＢＤ＝５４：４５：１）とＲｈｏｄａｍｉｎｅ封入リポソーム（モル比、ＤＯＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＝５４：４５：１）（粒径：１００ｎｍ、Ｆｏｕｒｍｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、膜融合誘発剤（添加剤）としてポリエステルグリコール（ＰＥＧ）（分子量：６０００、和光純薬）を用いて膜融合検証を行った。
ＤＯＰＣリポソーム溶液１００μｇ／ｍＬに対して、各濃度ＰＥＧ溶液（０，１０，２０，４０ｗｔ％）を添加し、２０分間撹拌してリポソームの膜融合を行った。膜融合の評価は蛍光プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔ  Ｍ２００，ＴＥＣＡＮ）を用いて、各濃度ＰＥＧ溶液添加後のリポソームのＦＲＥＴ蛍光測定を行った。結果を図２５Ａ,図２５Ｂに示す。図２５Ｃは、本実施例における蛍光封入人工胞体の膜融合の様子を模式的に表した図である。ＰＥＧ濃度０ｗｔ％におけるＦＲＥＴ蛍光強度と比較して、添加するＰＥＧ濃度に依存して、ＰＥＧ添加及び撹拌後のリポソームのＦＲＥＴ蛍光強度が増加する事が確認された。【０１２４】
以上の結果より、リポソームの膜融合が確認された。リポソームの膜融合は、膜融合誘発剤（添加剤）ＰＥＧ添加濃度に依存して、促進された。また、ＦＲＥＴ蛍光強度の測定により、リポソームの融合体の形成が確認され、該融合体の存在を検出できた。【０１２５】
［実施例３］
＜ビオチン修飾リポソームと蛍光標識リポソームの融合評価＞
本実施例では、小胞体としてビオチン修飾リポソームと蛍光標識リポソームを用いて、膜融合の評価実験を行った。第一物質としてはビオチンを認識するアビジンを基板固定化して用いた。第二物質としては蛍光物質ローダミンを用いた。【０１２６】
＜蛍光標識リポソーム作製＞
ガラス試験管に１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（以下ＤＯＰＳと略す，日本油脂社製）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（以下Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥと略す）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）がモル比＝１００：１になるように、クロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜と２５ｍＭ ＭＥＳ １２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝７．４ ｂｕｆｆｅｒ（以下、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒと略す）１ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理をすることで蛍光標識リポソームを作製した。
上記蛍光標識リポソームのサイズを調整するため孔径１００ｎｍのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ ｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｗｈａｔｍａｎ社製）のフィルターに通過させることで均一な蛍光標識リポソームを作製した。【０１２７】
＜ビオチン修飾リポソーム作製＞
ＤＯＰＳ（日本油脂社製）、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｃａｐ ｂｉｏｔｉｎｙｌ）（以下ＤＯＰＥ−ｂｉｏｔｉｎと略す、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）がモル比＝１００：１になるように、クロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳ・ＤＯＰＥ−ｂｉｏｔｉｎクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳ・ＤＯＰＥ−ｂｉｏｔｉｎクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約一分間超音波処理をすることでビオチン修飾リポソームを作製した。
上記ビオチン修飾リポソームのサイズを調整するため孔径１００ｎｍのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ ｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｗｈａｔｍａｎ社製）のフィルターに通過させることで均一なビオチン修飾リポソームを作製した。【０１２８】
＜２色蛍光標識リポソーム作製＞
ガラス試験管にＤＯＰＳ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、ＮＢＤ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（以下ＮＢＤ−ＰＥと略す、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）がモル比＝１００：１：０．５となるように、クロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ・ＮＢＤ−ＰＥクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ・ＮＢＤ−ＰＥクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜と２５ｍＭ ＭＥＳ １２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ＝７．４ ｂｕｆｆｅｒ（以下、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒと略す）１ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約一分間超音波処理をすることで２色蛍光標識リポソームを作製した。
上記２色蛍光標識リポソームのサイズを調整するため、孔径１００ｎｍのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ ｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｗｈａｔｍａｎ社製）のフィルターに通過させることで均一な２色蛍光標識リポソームを作製した。【０１２９】
［参考例１］
参考例１では、前記ビオチン修飾リポソーム（ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ）、および、蛍光標識リポソーム（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を用いて９６穴プレートを用いて検出を行った。
ビオチン修飾リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬとＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １９０μＬとを混合した溶液、および、蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬとＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １９０μＬとを混合した溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。その後、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ（ＨＢＣ）Ｂｌａｃｋ ９６−ｗｅｌｌ ｗｉｔｈ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）に反応させたリポソーム溶液（脂質濃度は６２．５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、２５℃で５時間インキュベーションした。
３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄後、プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ社製）でローダミン（励起波長：５６０ｎｍ、蛍光波長：５８０ｎｍ）の蛍光強度を測定した。結果を図２８に示す。【０１３０】
［実施例４］
実施例４では、参考例１と同様に、前記ビオチン修飾リポソーム、および、蛍光標識リポソームの混合溶液を調製し、９６穴プレートを用いて蛍光リポソームの検出を行った。
ビオチン修飾リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １８０μＬと、を混合した溶液（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ）、および、ビオチン修飾リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＣａＣｌ２溶液（最終濃度５ｍＭ）１８０μＬと、を混合した溶液（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ＋Ｃａ ５ｍＭ）を３７℃で１時間インキュベーションした。その後、３００μＬＰＢＳで３回洗浄したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ（ＨＢＣ）Ｂｌａｃｋ ９６−ｗｅｌｌ ｗｉｔｈ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに反応させたリポソーム溶液（脂質濃度は６２．５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、２５℃で５時間インキュベーションした。
３００μＬＰＢＳで３回洗浄後、プレートリーダーでローダミンの蛍光強度を測定した。結果を図２８に示す。【０１３１】
図２８に、蛍光標識リポソームの結果（参考例１）、ビオチン修飾リポソームの結果（参考例１）、「蛍光標識リポソーム＋ビオチン修飾リポソーム」の結果（実施例４）、「蛍光標識リポソーム＋ビオチン修飾リポソーム」に５ｍＭＣａを添加した試料（実施例４）の結果を示す。
なお、縦軸は洗浄後のローダミン蛍光強度を示す。【０１３２】
図２８に示すように、Ｃａ添加による融合の有無によって蛍光強度に違いが確認され、ビオチン修飾リポソームと蛍光標識リポソームとを用いて、小胞体の融合の評価が出来ることが確認された。【０１３３】
［実施例５］
＜ＤＯＰＳリポソーム作製＞
ガラス試験管にＤＯＰＳ（日本油脂社製）をクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理をすることでＤＯＰＳリポソームを作製した。
上記ＤＯＰＳリポソームのサイズを調整するため孔径１００ｎｍのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ ｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｗｈａｔｍａｎ社製）のフィルターに通過させることで均一なＤＯＰＳリポソームを作製した。
＜Ｃａ添加融合検証＞
上記ＤＯＰＳリポソームと、実施例３に記載した方法で作成された２色蛍光標識リポソームを用いて、以下の実験を行った。
ＤＯＰＳリポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）および２色蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）の混合液２μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒおよびＣａＣｌ２混合液（終濃度０、１、３、５ｍＭ）１９８μＬと、を混合した溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。
図２９に、ＤＯＰＳリポソームおよび２色蛍光標識リポソームの混合液に添加するＣａ濃度を０、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭと変化させた場合において、ＤＯＰＳリポソームと２色蛍光標識リポソームとの融合体を観察したＴＥＭ画像を示す。
図２９に示すように、ＴＥＭを用いて、Ｃａ濃度が３ｍＭ以上において、融合体の粒径の増加が顕著に確認できた。
図３０にＣａ濃度を０〜５ｍＭと変化させた場合における融合体の粒度分布の結果を示す。粒度分布測定には、ナノ粒子計（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ−５００、日本カンタムデザイン製）を用いた。
図３０に示すように、Ｃａ濃度が３ｍＭ以上で融合体の平均粒径の増加、および、膜融合に起因する粒子数の減少を確認した。
図３１に本実施例に係る胞体の融合実験を説明する模式図を示す。
ＮＢＤとローダミンを修飾した脂質膜構造体（２色蛍光標識リポソームに対応する）は、ＮＢＤとローダミンが隣接しているため、蛍光が消光している状態にある。当該ＮＢＤとローダミンを修飾した脂質膜構造体における蛍光強度をＦＲＥＴ解消率０％と定義した。
また、脂質膜構造体と胞体との融合体に界面活性剤を添加して、融合体をバーストさせた場合（融合体を完全に解離させた場合）には、ＦＲＥＴ解消率が１００％であると定義した。
当該脂質膜構造体（２色蛍光標識リポソームに対応）と、胞体（ＤＯＰＳリポソームに対応）とを混合し、脂質膜構造体と、胞体と、が膜融合した場合には、ＮＢＤとローダミンとの間の距離が離れることにより、ＦＲＥＴの解消と共に、蛍光強度の増加が観察される。このような方法により、蛍光強度の変化（ＦＲＥＴ解消率）により、膜融合の程度を評価できる。
図３２に、胞体に添加するＣａ濃度を０〜５ｍＭと変化させた場合におけるＦＲＥＴ解消率（％）のグラフを示す。また、界面活性剤（ｔｒｉｔｏｎ）を用いて、融合体をバーストさせた（融合体を完全に解離させた）結果も図３２に示す。
図３２に示すように、Ｃａ濃度が３ｍＭ以上において、ＦＲＥＴ解消率が上昇した（蛍光強度が増大した）。
本実施例より、膜融合を誘発する添加剤として、Ｃａを添加することにより、脂質膜構造体と胞体との膜融合が誘発されることが確認された。【０１３４】
［実施例６］
＜ｐＨ応答性リポソーム、ｐＨ応答性蛍光標識リポソーム作製＞
ガラス試験管に１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−Ｇｌｙｃｅｒｏ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（以下ＤＯＰＥと略す，日本油脂社製）と、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ（以下ＣＨＥＭＳと略す）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）とがモル比＝３：２になるように、クロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥ・ＣＨＥＭＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＥ・ＣＨＥＭＳクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理をすることでｐＨ応答性リポソームを作製した。
また、ガラス試験管に、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＮＢＤ−ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥがモル比＝６０：４０：１：０．５になるようにクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥ・ＣＨＥＭＳ・ＮＢＤ−ＰＥ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＥ・ＣＨＥＭＳ・ＮＢＤ−ＰＥ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理をすることでｐＨ応答性蛍光標識リポソームを作製した。
上記ｐＨ応答性リポソーム、ｐＨ応答性蛍光標識リポソームのサイズを調整するため孔径１００ｎｍのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ ｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｗｈａｔｍａｎ社製）のフィルターに通過させることで均一なｐＨ応答性リポソーム、ｐＨ応答性蛍光標識リポソームを作製した。
＜ｐＨ応答融合検証＞
ｐＨ応答性リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）およびｐＨ応答性蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）の混合液２μＬと、各ｐＨのＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４）１９８μＬと、を混合した溶液を、３７℃で１時間インキュベーションした。
図３３に、ｐＨ応答性リポソーム、および、ｐＨ応答性蛍光標識リポソームの膜融合において、ｐＨ変化させた場合（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４）のＴＥＭ観察結果を示す。
図３３に示すように、ＴＥＭを用いて、ｐＨ５．５以上において、ｐＨ応答性リポソームとｐＨ応答性蛍光標識リポソームとの融合体の粒径の増加が顕著に確認できた。
すなわち、ｐＨ５．５以下において、膜融合が促進されることが確認された。
図３４にｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４における融合体の粒度分布測定の結果を示す。粒度分布測定には、ナノ粒子計（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ−５００、日本カンタムデザイン製）を用いた。
図３４に示すように、ｐＨ５．５以下とすることにより、融合体の平均粒径の増加、および、膜融合に起因する粒子数の減少を確認した。
図３５に、ｐＨ応答性リポソームおよびｐＨ応答性蛍光標識リポソームの混合液のｐＨがｐＨ７．４、ｐＨ５．５の際のＦＲＥＴ解消率（％）のグラフを示す。本実施例においては、ｐＨ７．４の場合をＦＲＥＴ解消率０％と定義した。
また、界面活性剤（ｔｒｉｔｏｎ）を用いて、融合体をバーストさせた（融合体を完全に解離させ、ＦＲＥＴ解消率１００％の場合）結果も図３５に示す。
図３５に示すように、ｐＨ５．５以下において、ＦＲＥＴ解消率が上昇した（蛍光強度が増大した）。
本実施例より、ｐＨ応答性脂質を脂質膜構造体に修飾することにより、脂質膜構造体と胞体との膜融合が誘発されることが確認された。【０１３５】
［実施例７］
ビオチン修飾リポソーム、蛍光標識リポソーム、および、９６穴プレートを用いて蛍光リポソームの検出を行った。
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ（ＨＢＣ）Ｂｌａｃｋ ９６−ｗｅｌｌ ｗｉｔｈ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにビオチン修飾リポソーム（脂質濃度は６２．５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、２５℃で５時間インキュベーションし、人工胞体（脂質膜構造体）が基板上に固定化された人工胞体固定化基板を作製した。３００μＬＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ １９０μＬと、を混合した溶液（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、および、蛍光標識リポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ−ＣａＣｌ２溶液（最終濃度５ｍＭ）１９０μＬと、を混合した溶液（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋Ｃａ ５ｍＭ）を３７℃で１時間インキュベーションした。３００μＬＰＢＳで３回洗浄後、プレートリーダーでローダミンの蛍光強度を測定した。
ビオチン化したリポソーム（ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ）を固定した人工胞体固定化基板に対し蛍光分子を有するリポソーム（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を添加した例（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ）と、ビオチン化したリポソーム（ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ）を固定した基板に対し蛍光分子を有するリポソーム（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）およびＣａを添加した例(ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋ＤＯＰＳ／ｂｉｏｔｉｎ＋Ｃａ ５ｍＭ)を図３６に示す。図３６の縦軸は、ｒｈｏｄａｍｉｎｅに起因する蛍光強度を示す。
図３６に示すように、ビオチン化したリポソームを固定した人工胞体固定化基板を用いた場合においても、蛍光分子を有するリポソーム（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）に加えてＣａを添加することにより、リポソーム同士の膜融合が促進されることが確認された。
本実施例より、脂質膜構造体固定化担体（人工胞体固定化基板）を用いて、担体上で胞体同士が融合可能であること（脂質膜構造体と胞体とが融合可能であること）が確認された。
また、本実施例より、脂質膜構造体固定化担体を用いて、胞体の分離、移動、検出ができることが確認された。【０１３６】
［実施例８］
＜磁性体内包リポソーム作製＞
ガラス試験管にＤＯＰＳ（日本油脂社製）をクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳクロロホルム溶液、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノール混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜と２００ｎｍ磁性粒子（多摩川精機社製）、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、ボルテックスミキサーで約一分攪拌処理をすることで磁性体内包リポソームを作製した。
上記磁性体内包リポソームのサイズを調整するため、孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一な磁性体内包リポソームを作製した。
未封入の磁性粒子、磁性体未封入のリポソームを除去するため、遠心分離（２０，０００×Ｇ、１０分）、磁気スタンドによる捕集、洗浄を３回繰り返すことで磁性体内包リポソームを作製した。
＜蛍光標識ＧＵＶリポソーム＞
ガラス試験管に、ＤＯＰＳ（日本油脂社製）、および、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）がモル比＝１００：１となるように、クロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノール混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、ボルテックスミキサーで約一分攪拌処理をすることで蛍光標識リポソームを作製した。
上記蛍光標識ＧＵＶリポソームのサイズを調整するため、孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一な蛍光標識リポソームを作製した。
＜融合・磁気分離検証＞
磁性体内包リポソーム、蛍光標識ＧＵＶリポソーム５μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＣａＣｌ２溶液（最終濃度５ｍＭ）９５μＬと、を混合した溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。磁気スタンドによる捕集、洗浄３回後、プレートリーダーでローダミンの蛍光強度を測定した。
図３７に融合体を磁気分離した際の結果を示す。図３７におけるＣａ（＋）とは、磁性体内包リポソームと蛍光リポソームとの混合溶液内にＣａを含む場合を示す。磁性体内包リポソームと蛍光リポソームとの混合溶液内にＣａを含む場合には、融合体の形成が促進される。
図３７におけるＣａ（−）とは、混合溶液内にＣａを添加しない場合を示す。
図３７におけるＭｇ（＋）とは、磁力発生装置（磁気スタンド）により、磁気分離した場合を示す。
図３７におけるＭｇ（−）とは、磁気分離を行わなかった場合を示す。
図３７の縦軸は、蛍光強度を示す。
図３７に示すように、Ｃａを添加しない場合、磁気分離を行わない場合と比較して、Ｃａを添加し、融合体を形成した場合において、磁気分離を行った場合（Ｃａ（＋）、Ｍｇ（＋）のとき）、蛍光強度が大きく増大した。
すなわち、Ｃａの添加により膜融合が生じた磁性体を含む融合体が、磁気分離され、蛍光検出された。
本実施例より、磁力発生手段を用いて、任意の場所（例えば、検出部位など）に、融合体を分離、移動、検出できることが確認された。【０１３７】
［実施例９］
＜膜チャンバー作製＞
ガラス上に、直径５μｍ、深さ３μｍの微小孔を形成した、ＣＹＴＯＰ（旭硝子社製）チャンバーと送液用板ガラスとを組み合わせたフローセルに対して、ＭｇＣｌ２溶液（最終濃度１ｍＭ）、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．９）、１％グリセロール、Ａｌｅｘａ４８８（最終濃度２μＭ）混合溶液２０μＬを２回送液後、１,２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（以下ＤＯＰＣと略す、日本油脂社製）、１,２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（以下ＤＯＰＧと略す、日本油脂社製）、４ｍｇをヘキサデカン１ｍＬに溶解した脂質溶液２０μＬを送液し、さらにＭｇＣｌ２溶液（最終濃度１ｍＭ）、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．９）、１％グリセロール混合溶液２０μＬを２回送液し、蛍光封入膜チャンバーを作製した。
＜蛍光標識リポソーム作製＞
ガラス試験管に、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ（日本油脂社製）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）がモル比＝１００：１００：１となるように、クロロホルムに溶解し、１５ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣ・ＤＯＰＥ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＣ・ＤＯＰＥ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥクロロホルム溶液、および、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノール混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜と、ＭｇＣｌ２溶液（最終濃度１ｍＭ）、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．９）、１％グリセロール混合溶液１ｍＬと、を混合し、ボルテックスミキサーで約一分攪拌処理をすることで蛍光標識リポソームを作製した。
上記蛍光標識リポソームのサイズを調整するため、孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一な蛍光標識リポソームを作製した。
未封入の蛍光脂質を除去するため、遠心分離（２０，０００×Ｇ、１０分）による捕集、洗浄を３回繰り返すことで蛍光標識リポソームを作製した。
＜膜チャンバー・リポソーム融合検証＞
上記、蛍光封入膜チャンバーに対して、蛍光標識リポソーム、ＣａＣｌ２溶液（最終濃度１ｍＭ）２０μＬを送液し、さらにＭｇＣｌ２溶液（最終濃度１ｍＭ）、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．９）、１％グリセロール混合溶液８０μＬを送液した後、蛍光顕微鏡ＢＸ５０（ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いてＡｌｅｘａ４８８及びローダミンの蛍光を観察した。
図３８に、脂質膜が基板の凹部（ウェル）に形成された膜チャンバーの膜内の蛍光画像を示す。図３８に示すように、基板上に膜チャンバーが形成されていることが確認された。
図３９に、蛍光標識リポソームの蛍光画像を示す。蛍光標識リポソームが存在する場合、図３９に示すような蛍光画像が得られることが分かった。
図４０には、膜チャンバー・リポソーム融合検証実験を行った場合における膜チャンバーの蛍光画像を示す。
図４０の結果より、膜チャンバー上に形成された脂質膜と蛍光標識リポソームとが融合することに起因した、蛍光の増大が検出された。
本実施例より、人工胞体を基板上の脂質膜構造体と融合させることにより、反応試薬と胞体の構成成分との反応を行い、反応又は反応により生じた反応産物を検出できることが確認された。【０１３８】
[実施例１０]
＜融合体内での検出反応検証＞
本実施例においては、図１５に示すような、融合体内の反応の検出の検討を行った。
＜Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ封入リポソーム、ＮＢＤ封入リポソーム作製＞
ガラス試験管にＤＯＰＳ（日本油脂社製）をクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳクロロホルム溶液、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノール混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）・ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、ボルテックスミキサーで約一分攪拌処理をすることで蛍光標識リポソームを作製した。
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソームのサイズを調整するため、上記蛍光標識リポソームを孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一なＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識リポソームを作製した。
未封入の蛍光脂質を除去するため、遠心分離（２０，０００×Ｇ、１０分）による捕集、洗浄を３回繰り返すことでＲｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソームを作製した。
ガラス試験管にＤＯＰＳ（日本油脂社製）をクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＳクロロホルム溶液、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノール混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＮＢＤ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社製）・ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、ボルテックスで約一分攪拌処理をすることで蛍光標識リポソームを作製した。
上記ＮＢＤ内包リポソームのサイズを調整するため、孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一なＮＢＤ標識リポソームを作製した。
未封入の蛍光脂質を除去するため、遠心分離（２０，０００×Ｇ、１０分）による捕集、洗浄を３回繰り返すことでＮＢＤ内包リポソームを作製した。
＜融合体内ＦＲＥＴ検証＞
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソームおよびＮＢＤ内包リポソームの混合液５μＬと、ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ−ＣａＣｌ２溶液（最終濃度５ｍＭ）９５μＬと、を混合した溶液を３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートリーダーでＦＲＥＴの蛍光強度（励起波長：４６３ｎｍ、蛍光波長：５８０ｎｍ）を測定した。
図４１に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソーム（ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＮＢＤ内包リポソーム（ＤＯＰＳ／ＮＢＤ）、「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソーム＋ＮＢＤ内包リポソーム（ＤＯＰＳ／ＮＢＤ＋ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）」、および「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ内包リポソーム＋ＮＢＤ内包リポソーム」に５ｍＭＣａを添加した試料（ＤＯＰＳ／ＮＢＤ＋ＤＯＰＳ／ｒｈｏｄａｍｉｎｅ＋Ｃａ ５ｍＭ）の結果を示す。
なお、縦軸はＦＲＥＴの蛍光強度を示す。
図４１に示すようにＣａを添加しない場合と比較して、Ｃａ添加による融合体において、蛍光強度が大きく増大した。
すなわちＣａ添加により膜融合が生じた融合体内で、ＲｈｏｄａｍｉｎｅとＮＢＤとがＦＲＥＴ反応し、蛍光強度の増大が検出された。
本実施例より、膜融合を用いて、融合体内での反応を検出できることが確認された。【０１３９】
[実施例１１]
＜リポソーム−エキソソーム融合、粒径分布検証＞
＜ＤＯＰＣリポソーム、ＤＯＰＳリポソーム作製＞
ガラス試験管にＤＯＰＣまたは、ＤＯＰＳ（日本油脂社製）をクロロホルムに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣクロロホルム溶液、または、１０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＳクロロホルム溶液を調製した。当該ＤＯＰＣクロロホルム溶液、または、ＤＯＰＳクロロホルム溶液と、１０ｍＭグルコース（和光純薬社製）メタノールとの混合溶液をデシケーターで減圧乾燥し、有機溶媒を除去することで脂質薄膜を調製した。この脂質薄膜とＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬとを混合し、ボルテックスミキサーで約一分攪拌処理をすることでＤＯＰＣリポソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＣ））、または、ＤＯＰＳリポソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＳ））を作製した。
上記ＤＯＰＣリポソームまたは、ＤＯＰＳリポソームのサイズを調整するため、孔径３μｍのｐｏｌｙｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のシリンジフィルターに通過させることで均一なＤＯＰＣリポソームまたは、ＤＯＰＳリポソームを作製した。
＜リポソーム−エキソソーム融合検証＞
ＤＯＰＣリポソーム、またはＤＯＰＳリポソーム、ヒト血清（Ｌｏｎｚａ社製）より調製したエキソソーム４．５μＬとＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ９５．５μＬとを混合した溶液を、３７℃で１時間インキュベーションした。
図４２にＤＯＰＣリポソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＣ））、ＤＯＰＳリポソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＳ））、エキソソーム、ＤＯＰＣリポソーム＋エキソソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＣ）ｅｘｏｓｏｍｅ）、ＤＯＰＳリポソーム＋エキソソーム（ＧＵＶ（ＤＯＰＳ）ｅｘｏｓｏｍｅ）の粒径分布の結果を示す。粒径分布測定には、ナノ粒子計（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ−５００、日本カンタムデザイン製）を用いた。
図４２に示すように、ＤＯＰＳリポソーム＋エキソソームにおいて、エキソソーム平均粒径の増加、及び粒子数の減少を確認した。
本実施例より、ＤＯＰＳリポソーム−エキソソーム間において、相互作用が確認された。【０１４０】
以上、本発明の実施形態について、図面を参照し、実施例を交えて詳述したが、具体的な構成はこれらの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。また、上述の各実施形態において示した構成要素は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明に係る質膜構造体又は脂質膜構造体固定化担体により、簡便で効率的に細胞外胞体を分離、検出、及び移動させることが可能である。また、本発明に係る胞体の融合方法、胞体の分離方法、胞体の検出方法、及び胞体の移動方法によれば、簡便で効率的に細胞外胞体を融合、分離、検出及び移動させることができる。これらは、従来行われている胞体のサンプルの調製法、回収装置、検出法などに代わるものとして、広く普及すると考えられる。
【符号の説明】
【０１４２】
１，２０１    脂質膜固定化基板（脂質膜構造体固定化基板、人工胞体固定化基板）
２，２０２    基板
３    表面
４    凹部
５    人工胞体（脂質膜構造体）
１５  融合膜
６    反応試薬
７    磁力発生装置（磁力発生手段）
１０１  被検小胞体
１０２  固定物質
１０３  小胞体
１０４  第１の蛍光物質
１０５  第２の蛍光物質
１０６  複合体
１０７  第一物質
１０８  担体
１０９  第二物質
１１０  細胞外胞体
１１１  添加剤
１１２  融合体
１１３  膜融合誘発装置
１１４  膜融合誘発物質（融合誘発物質）
１１５  膜融合誘発物質で修飾されている人工胞体（膜融合誘発物質修飾人工胞体）
１１６  細胞外胞体を含む試料
１１７  金属化合物
１１８  金属化合物内包人工胞体
１１９  電荷物質
１２０  電荷物質修飾人工胞体
１２１  電気泳動力発生手段（電気泳動装置、電気泳動力誘発装置）
１２２  サイズ排除分離手段
１２３  アフィニティー物質
１２４  アフィニティー物質が修飾されている人工胞体（アフィニティー物質修飾人工胞体）
１２５  アフィニティー分離手段
１２６  磁性体
１２７  磁性体内包人工胞体
１２８  検出手段（センサー）
１２９  反応試薬内包人工胞体（試薬内包人工胞体）
１３０  磁性体及び反応試薬を内包する人工胞体
１３１  リポソーム
１３２  ＰＥＧ
１３３  ＮＢＤ
１３４  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
３０１  細胞外胞体固定化基板
【図１】
0006597614.tif 000002
【図２】
0006597614.tif 000003
【図３】
0006597614.tif 000004
【図４】
0006597614.tif 000005
【図５】
0006597614.tif 000006
【図６】
0006597614.tif 000007
【図７】
0006597614.tif 000008
【図８】
0006597614.tif 000009
【図９】
0006597614.tif 000010
【図１０】
0006597614.tif 000011
【図１１】
0006597614.tif 000012
【図１２】
0006597614.tif 000013
【図１３】
0006597614.tif 000014
【図１４】
0006597614.tif 000015
【図１５】
0006597614.tif 000016
【図１６】
0006597614.tif 000017
【図１７】
0006597614.tif 000018
【図１８】
0006597614.tif 000019
【図１９】
0006597614.tif 000020
【図２０】
0006597614.tif 000021
【図２１】
0006597614.tif 000022
【図２２】
0006597614.tif 000023
【図２３】
0006597614.tif 000024
【図２４Ａ】
0006597614.tif 000025
【図２４Ｂ】
0006597614.tif 000026
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
0006597614.tif 000028
【図２５Ｃ】
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【図２６】
0006597614.tif 000030
【図２７】
0006597614.tif 000031
【図２８】
0006597614.tif 000032
【図２９】
0006597614.tif 000033
【図３０】
0006597614.tif 000034
【図３１】
0006597614.tif 000035
【図３２】
0006597614.tif 000036
【図３３】
0006597614.tif 000037
【図３４】
0006597614.tif 000038
【図３５】
0006597614.tif 000039
【図３６】
0006597614.tif 000040
【図３７】
0006597614.tif 000041
【図３８】
0006597614.tif 000042
【図３９】
0006597614.tif 000043
【図４０】
0006597614.tif 000044
【図４１】
0006597614.tif 000045
【図４２】
0006597614.tif 000046