(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が抗原刺激に対してＴｈ１型又はＴｈ２型のいずれの免疫応答を示すかを抗原刺激の前に判定する方法であって、
１）被験者から採取された血清又は血漿における、表１に規定される一種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程、
【表１】
0006566612.tif 000008
２）前記マイクロＲＮＡの発現量からその相対的発現量を算出する工程、及び
３）２）で算出されたｈｓａ−ｍｉＲ−６３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐの相対的発現量がそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者は抗原刺激に対してＴｈ１型の免疫応答を示すと判定する工程であって、ここで前記基準相対的発現量は、抗原刺激を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者から抗原刺激の前に採取された血清又は血漿における当該マイクロＲＮＡの相対的発現量である前記工程、
又は２）で算出されたｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐであるマイクロＲＮＡの相対的発現量がそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者は抗原刺激に対してＴｈ２型の免疫応答を示すと判定する工程であって、ここで前記基準相対的発現量は、抗原刺激を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者から抗原刺激の前に採取された血清又は血漿における当該マイクロＲＮＡの相対的発現量である前記工程、
を含む、前記判定方法。
【請求項２】
相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
被験者が抗原刺激に対してＴｈ１型又はＴｈ２型のいずれの免疫応答を示すかを抗原刺激の前に判定する方法であって、
１）被験者から採取された血清又は血漿における、表２に示される一種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程、
【表２】
0006566612.tif 000009
２）前記マイクロＲＮＡの発現量からグローバルノーマライゼーション法によってその相対的発現量を算出する工程、
及び
３）２）で算出されたｈｓａ−ｍｉＲ−６３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐの相対的発現量が前記表２に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者は抗原刺激に対してＴｈ１型の免疫応答を示すと判定する工程、又は２）で算出されたｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐの相対的発現量が前記表２に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者は抗原刺激に対してＴｈ２型の免疫応答を示すと判定する工程
を含む、前記判定方法。
【請求項４】
被験者の免疫応答がＴｈ１型又はＴｈ２型であるかを判定する方法であって、
１）抗原刺激の前及び後においてそれぞれ被験者から採取された血清又は血漿における、表３に規定される一種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程、並びに
【表３】
0006566612.tif 000010
２）１）の抗原刺激後の発現量が、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐについては抗原刺激前の発現量の２倍以上であるとき及び／若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐについては抗原刺激前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答はＴｈ１型であると判定する工程、又はｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐについては抗原刺激前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答はＴｈ２型であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
【請求項５】
マイクロＲＮＡの発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される相対的発現量である、請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
請求項１に規定される表１に示されるマイクロＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡと相補的なマイクロＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡ及び前記相補的なマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、対象の免疫応答をＴｈ１型又はＴｈ２型のいずれかへと制御するための免疫応答制御剤であって、前記機能的等価物は、表１に示されるマイクロＲＮＡをコードする核酸、表１に示されるマイクロＲＮＡの塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸若しくはこれらのキメラＲＮＡ、表１に示されるマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸をコードする核酸、表１に示されるマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸の塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸又はこれらのキメラＲＮＡである、前記免疫応答制御剤（ただし、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐと相補的なマイクロＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ及び前記相補的なマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、樹状細胞の抗原応答機能を制御するための免疫応答制御剤であって、前記機能的等価物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐをコードする核酸、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐの塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸若しくはこれらのキメラＲＮＡ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐに対する阻害性核酸をコードする核酸、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐに対する阻害性核酸の塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸若しくはこれらのキメラＲＮＡであって、かつ樹状細胞の抗原応答機能を制御することができる核酸又はキメラＲＮＡである、前記樹状細胞の抗原応答機能を制御するための免疫応答制御剤を除く）。
【請求項７】
請求項６に記載の免疫応答制御剤を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体特にヒトの免疫応答の型を予測又は確認することのできるバイオマーカーとして利用可能なマイクロＲＮＡ、これらバイオマーカーを用いた免疫体質又は免疫応答型の判定方法及び前記マイクロＲＮＡを有効成分とする免疫応答型制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの標準治療法は、化学療法、放射線治療及び外科的切除であるが、がん治療のオプションとしてがんワクチンによる免疫治療が提唱され、実用化に向けた研究が盛んに行われている。
【０００３】
これまで、がんの免疫治療によって生命予後の延長といった一定の効果は散見されている。しかしながら、ワクチン投与後に誘導された抗腫瘍免疫応答が臨床効果に直接結び付かない症例や、ワクチンの頻回投与による抗腫瘍免疫応答の疲弊が生じた症例も認められており、当初期待された腫瘍の完全退縮のような治療効果は限定的である。そのため、がん免疫治療は、標準的ながん治療法に至っているとは言いがたい状況にある。
【０００４】
がん免疫治療の効果が限定的であることの要因の一つとして、がん患者体内での免疫機能の低下を含む抗腫瘍免疫の不良が考えられている。例えば、がん微小環境下で産生誘導されるＩＬ−６が樹状細胞の機能抑制をもたらしていることが指摘されている（非特許文献１）。ＩＬ−６は、樹状細胞に作用することで、ＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６の発現を抑制して抗原提示能を低下させると共に、ナイーブＴ細胞からのエフェクターＴ細胞であるヘルパーＴ細胞への分化誘導能を有するＩＬ−１２の産生も抑制するためである。
【０００５】
また、免疫治療によってがんを縮退させるためには、キラーＴ細胞の誘導などを含むＴｈ１型の免疫応答が持続して惹起されることが重要である。しかし、免疫治療に利用可能な腫瘍抗原は数多く提唱されている一方で、個々の患者において果たしてＴｈ１型の免疫応答が惹起され得るかどうかを予見する有効な手段は、未だ見いだされていない。同様に、免疫治療を継続していく過程で、Ｔｈ１型の免疫応答が適切に惹起されているかどうかを簡便に判定することのできる臨床学的指標又はバイオマーカーも報告されていない。
【０００６】
このように、優れた効果を奏するがん免疫治療の開発には、治療前及び治療過程における、がん患者の免疫応答を予測し又は評価する標準化されたモニタリング法の開発や、臨床効果を予見し得る新規バイオバーカーの探索と同定が求められている。
【０００７】
一方、様々な疾患に関連して、特異的な塩基配列を有する微小なＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、以下、ｍｉＲと表す）が注目されている。ｍｉＲは２０〜２５塩基からなる短い一本鎖ＲＮＡであり、これと相補的な配列を持つｍＲＮＡと相互作用することによって遺伝子発現及び転写調節に関与することが知られている。また最近では、血清中にもｍｉＲが安定的に存在していることが明らかになり、各種がんの悪性度、患者の生命予後の予測に加え、ＨＩＶ感染、ＨＣＶ感染、関節リウマチ、薬物性肝障害、心筋梗塞や脳梗塞のバイオマーカー又は診断薬としてのｍｉＲの利用に関する研究開発が試みられている。
【０００８】
しかし、免疫治療の開始前において、患者が免疫治療を受けたときにその免疫応答がＴｈ１型Ｔｈ２型のいずれになり易いかという免疫体質を予測することのできるバイオマーカーとしてのｍｉＲは依然として報告されていない。また、免疫治療を受けている患者の免疫応答がＴｈ１型であるかＴｈ２型であるかを判定することのできるバイオマーカーとしてのｍｉＲも、依然として報告されていない。さらに、患者の免疫応答の型を制御することができるｍｉＲ又はその機能を阻害し得る核酸も報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｒｉｔａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３年、第１９０巻、第８１２−８２０ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、患者の免疫体質を予測することのできるバイオマーカーとなり得るｍｉＲ、患者の免疫応答の型を判定することのできるバイオマーカーとなり得るｍｉＲ、及び患者に投与することでその免疫応答の型を制御することのできるｍｉＲを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、免疫治療を受けることによってＴｈ１型又はＴｈ２型の免疫応答を呈するに至った患者の血清中におけるｍｉＲの発現量を測定した結果、特定のｍｉＲの発現パターン又はその変化を確認することで、事前に患者の免疫体質を予測し、また治療経過における免疫応答の型を簡便に判定することができること、さらにこれらｍｉＲを用いることで免疫応答を制御することができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１２】
（１）表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲである、被験者の免疫体質の判定に用いるためのバイオマーカー。
【００１３】
【表１】
0006566612.tif 000002
【００１４】
【表２】
0006566612.tif 000003
【００１５】
（２）被験者の免疫体質を判定する方法であって、
１）被験者から採取された試料における、（１）に規定される表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上を含む複数のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から前記表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、及び
３）２）で算出された前記表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が前記表１に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者の免疫体質をＴｈ１型であると判定し、又は２）で算出された前記表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が前記表２に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者の免疫体質をＴｈ２型であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
（３）相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、（２）に記載の判定方法。
（４）表３〜表６に示されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、被験者の免疫応答の型の判定に用いるためのバイオマーカー。
【００１６】
【表３】
0006566612.tif 000004
【００１７】
【表４】
0006566612.tif 000005
【００１８】
【表５】
0006566612.tif 000006
【００１９】
【表６】
0006566612.tif 000007
【００２０】
（５）被験者の免疫応答の型を判定する方法であって、
１）免疫治療開始前及び開始後においてそれぞれ被験者から採取された試料における、（４）に規定される表３、表４、表５及び／又は表６に示されるｍｉＲよりなる群から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、並びに
２）１）の治療開始後の発現量が、前記表３に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の２倍以上であるとき及び／若しくは前記表４に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答の型をＴｈ１型であると判定し、又は前記表５に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の２倍以上であるとき及び／若しくは前記表６に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答の型をＴｈ２型であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
（６）ｍｉＲの発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される相対的発現量である、（５）に記載の判定方法。
（７）（１）に規定される表１及び表２並びに（４）に規定される表３〜表６に示されるｍｉＲ、前記ｍｉＲと相補的なｍｉＲ、前記ｍｉＲ及び前記相補的なｍｉＲに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、免疫応答型制御剤。
（８）（７）に記載の免疫応答型制御剤を含有する医薬。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、患者の免疫体質を予め判定することによって、又は免疫治療を受けている患者の免疫応答の型を判定することによって、感染症やがんワクチン治療の効果を予見することができる他、免疫治療の実施によるアナフィラキシーショックや自己免疫応答などの副作用を回避することが可能となる。また、患者の免疫体質が明らかになることで、食物アレルギー応答などの回避も可能となる。さらには、本発明で特定されるｍｉＲ、これに対する阻害性核酸又はそれらの機能的等価物を医薬として利用することにより、患者の免疫応答型を制御することができ、広く免疫関連疾患の予防、改善、治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５のＩＦＮ−γ産生促進能（左のグラフ）及びＩＬ−５産生抑制能（中のグラフ）並びにその阻害性核酸であるｍｉＲ−６３５−ＩのＩＬ−５産生促進能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図２】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐのＩＦＮ−γ産生促進能（左のグラフ）及びその阻害性核酸であるｍｉＲ−２２４−３ｐ−ＩのＩＬ−５産生促進能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図３】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐのＩＦＮ−γ産生促進能（左のグラフ）及びＩＬ−５産生抑制能（中のグラフ）並びにその阻害性核酸であるｍｉＲ−２２４−５ｐ−ＩのＩＬ−５産生促進能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図４】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐのＩＦＮ−γ産生促進能（左のグラフ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐ−ＩのＩＬ−５産生促進能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図５】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐのＩＬ−５産生促進能（左のグラフ）並びにその阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ−ＩのＩＦＮ−γ産生促進能（中のグラフ）及びＩＬ−５産生抑制能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図６】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐのＩＬ−５産生促進能（左のグラフ）並びにその阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ−ＩのＩＦＮ−γ産生促進能（中のグラフ）及びＩＬ−５産生抑制能（右のグラフ）を表したグラフである。
【図７】ヒト末梢血細胞に対する、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐのＩＬ−５産生促進能（左のグラフ）及びその阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ−ＩのＩＦＮ−γ産生促進能（右のグラフ）を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書を通じ、ｍｉＲのＩＤ及びアクセション番号は、ｍｉＲの配列情報等を集めたデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に定められたものを使用しており、各ｍｉＲの塩基配列も前記データベースに全て登録されている。
【００２４】
本発明にいう免疫応答の型とはＴｈ１型又はＴｈ２型の免疫応答をいい、またＴｈ１型又はＴｈ２型の免疫応答とは、生体特にヒト患者が抗原刺激を受けたときに、Ｔｈ１細胞が免疫応答において優位な状態となること又はＴｈ２細胞が免疫応答において優位な状態となることをそれぞれ意味する。また免疫体質とは、生体特にヒト患者が抗原刺激を受けたときにＴｈ１型又はＴｈ２型のどちらの免疫応答を示すかに関する、生体特にヒトの性質ないし傾向を意味する。
【００２５】
本明細書にいう相対的発現量とは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定されるｍｉＲの発現量を比較解析方法によって補正した値を意味する。かかる方法としては、グローバルノーマライゼーション法、ｑｕａｎｔｉｌｅ法、ｌｏｗｅｓｓ法、７５ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ法などを挙げることができる。これらの方法は、いかなる検体であっても複数の遺伝子の発現データを一塊とし、遺伝子発現データ群としてとらえた場合には、発現量に差がないという原理を前提とするものである。本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値が２５になるように補正するグローバルノーマライゼーション法（例えば特開２０１４−００７９９５号公報など）で算出された相対的発現量を採用して説明する。
【００２６】
本発明における複数のｍｉＲとは、上記の相対的発現量を算出することが可能な程度の数のｍｉＲを意味し、具体的には前記試料に含まれるｍｉＲの一部又は全部、好ましくはマイクロアレイ法によってｍｉＲの網羅的検出又は解析を行うためのＤＮＡチップに固定されている核酸とハイブリダイズし得る、試料に含まれるｍｉＲの一部又は全部である。
【００２７】
被験者から採取された試料としては、本発明のバイオマーカーであるｍｉＲを含む試料であればいずれでもよいが、好ましくは血液及びリンパ液であり、血液から調製される血清又は血漿がより好ましい。
【００２８】
本発明の第一の態様は、表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、被験者の免疫体質の判定に用いるためのバイオマーカーに関する。以下、表１及び表２に示されるｍｉＲを免疫体質判定用バイオマーカーと表す。
【００２９】
また本発明は、上記第一の態様に関連して、表１及び／又は表２に示される免疫体質判定用バイオマーカーを利用した、被験者の免疫体質を判定する方法であって、
１）被験者から採取された試料における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上を含む複数のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、及び
３）２）で算出された表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が表１に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者の免疫体質をＴｈ１型であると判定し、又は２）で算出された表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が表２に示されるそれぞれの基準相対的発現量以上であるときは被験者の免疫体質をＴｈ２型であると判定する工程
を含む、前記判定方法を提供する。
【００３０】
本発明者らは、がんワクチン投与を伴うがん免疫治療を受けた進行又は再発大腸がん患者について、治療開始前と開始後、具体的にはがんワクチンの投与直前とがんワクチンを一定間隔で繰り返し投与した後の２回にわたって血液を採取し、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて血清中に含まれるｍｉＲの発現量を網羅的に解析した。また、治療開始後の各患者におけるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ及びインターロイキン（ＩＬ）−４の発現量を測定することで、免疫治療を受けた後の患者の免疫応答の型を調べた。これらの結果から、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答又はＴｈ２型の免疫応答を示した患者群それぞれに、特定のｍｉＲの発現量の特徴的な変動パターンが確認された。
【００３１】
表１は、上記免疫治療開始前の血清において、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、Ｔｈ２型の免疫応答を示した患者群と比較して２倍以上の相対的発現量を示したｍｉＲと治療開始前の血清中におけるその相対的発現量を示す。この相対的発現量が、本態様の方法における基準相対的発現量として用いられる。
【００３２】
表１に示されるｍｉＲは、被験者の免疫体質を判定するための、特にその被験者の免疫体質がＴｈ１型の免疫応答を示すものであると判定するための免疫体質判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に関して、免疫治療開始前の血清における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表１に示される基準相対的発現量以上であるときは、その被験者は免疫治療を受けることによってＴｈ１型の免疫応答を示す免疫体質を有する、と判定することができる。本発明は、かかる免疫体質の判定方法も提供する。
【００３３】
表２は、上記免疫治療開始前の血清において、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、Ｔｈ１型の免疫応答を示した患者群と比較して２倍以上の発現量を示したｍｉＲと治療開始前の血清中における相対的発現量を示す。この相対的発現量が、本態様の方法における基準相対的発現量として用いられる。
【００３４】
表２に示されるｍｉＲは、被験者の免疫体質を判定するための、特にその被験者の免疫体質がＴｈ２型の免疫応答を示すものであると判定するための免疫体質判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に関して、免疫治療開始前の血清における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表２に示される基準相対的発現量以上であるときは、その被験者は免疫治療を受けることによってＴｈ２型の免疫応答を示す免疫体質を有する、と判定することができる。本発明は、かかる免疫体質の判定方法も提供する。
【００３５】
表１及び表２に示される免疫体質判定用バイオマーカーであるｍｉＲはいずれか一種を利用してもよいが、複数のｍｉＲを利用することが好ましい。同様に、本態様の判定方法は、表１及び表２に示される免疫体質判定用バイオマーカーであるｍｉＲのいずれか１種の相対的発現量を基に行ってもよいが、好ましくは複数のｍｉＲの相対的発現量を基に、より好ましくはより多数のｍｉＲの相対的発現量を基に判定することが好ましい。さらに好ましくは、表１に示されるｍｉＲ及び表２に示されるｍｉＲのいずれについても相対的発現量を測定し、Ｔｈ１型Ｔｈ２型双方の視点から免疫体質を判定することが好ましい。このように、複数又は多数のｍｉＲを対象とすることで、本発明の方法による判定の信頼性は向上する。ただし、複数のｍｉＲを対象とした場合、必ずしも全てのｍｉＲの相対的発現量が考慮されることは必要とはされない。
【００３６】
本態様の免疫体質の判定方法により、免疫治療を実行する前に被験者の免疫体質を判定することが可能となる。これにより、治療効果が期待でき、免疫治療を受けるべき患者の判断根拠と成り得るとともに、副作用又は治療効果の観点から免疫治療を回避すべき患者を予め選別することができ、免疫治療の実施による副作用を回避することができる他、免疫治療以外の適切な治療方法を効率的に選択することが可能になる。
【００３７】
本発明の第二の態様は、表３〜表６に示されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、被験者の免疫応答の型の判定に用いるためのバイオマーカーを提供する。以下、本態様のバイオマーカーを免疫応答型判定用バイオマーカーと表す。
【００３８】
また、本発明は上記第二の態様に関連して、表３〜表６に示される免疫応答型判定用バイオマーカーを利用した被験者の免疫応答の型を判定する方法であって、
１）免疫治療開始前及び開始後においてそれぞれ被験者から採取された試料における、表３、表４、表５及び／又は表６に示されるｍｉＲよりなる群から選択される少なくとも１種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、並びに
２）１）の治療開始後の発現量が、表３に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の２倍以上であるとき及び／若しくは表４に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答の型をＴｈ１型であると判定し、又は表５に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の２倍以上であるとき及び／若しくは表６に示されるｍｉＲについては治療開始前の発現量の１／２以下であるときは被験者の免疫応答の型をＴｈ２型であると判定する工程
を含む、前記判定方法を提供する。
【００３９】
表３は、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における発現量と比較して治療開始後の血清における発現量が２倍以上に上昇したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を示す。
【００４０】
表３に示されるｍｉＲは、被験者の免疫応答の型を判定するための、特にその被験者がＴｈ１型の免疫応答を示していると判定するための免疫応答型判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に免疫治療を行ったときに、治療開始前後の血清における表３に示されるｍｉＲの発現量を測定してその変動比が２倍以上となっているときは、当該被験者はＴｈ１型の免疫応答を示していると判定することができる。本発明は、かかる免疫応答型の判定方法も提供する。
【００４１】
一方、表４は、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における相対的発現量と比較して治療開始後の血清における相対的発現量が１／２以下に減少したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を示す。
【００４２】
表４に示されるｍｉＲは、被験者の免疫応答の型を判定するための、特にその被験者がＴｈ１型の免疫応答を示していると判定するための免疫応答型判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に免疫治療を行ったときに、治療開始前後の血清における表４に示されるｍｉＲの発現量を測定してその変動比が１／２以下となっているときは、当該被験者はＴｈ１型の免疫応答を示していると判定することができる。
【００４３】
表５は、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における発現量と比較して治療開始後の血清における発現量が２倍以上に上昇したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を示す。
【００４４】
表５に示されるｍｉＲは、被験者の免疫応答の型を判定するための、特にその被験者がＴｈ２型の免疫応答を示していると判定するための免疫応答型判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に免疫治療を行ったときに、治療開始前後の血清における表５に示されるｍｉＲの発現量を測定してその変動比が２倍以上となっているときは、当該被験者はＴｈ２型の免疫応答を示していると判定することができる。
【００４５】
一方、表６は、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における発現量と比較して治療開始後の血清における発現量が１／２以下に減少したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を示す。
【００４６】
表６に示されるｍｉＲは、被験者の免疫応答の型を判定するための、特にその被験者がＴｈ２型の免疫応答を示していると判定するための免疫応答型判定用バイオマーカーとして利用することができる。具体的には、ある被験者に免疫治療を行ったときに、治療開始前後の血清における表６に示されるｍｉＲの発現量を測定してその変動比が１／２以下となっているときは、当該被験者はＴｈ２型の免疫応答を示していると判定することができる。
【００４７】
なお、ｍｉＲの発現量はＲＴ−ＰＣＲその他の方法で測定してもよいが、表に示されるｍｉＲと相補的に結合し得る核酸を含むいわゆるＤＮＡマイクロアレイ用チップを用いて測定した発現量であることが好ましく、特にグローバルノーマライゼーション法によって算出される相対的発現量であることが好ましい。
【００４８】
表３〜表６に示される免疫応答型判定用バイオマーカーであるｍｉＲはいずれか一種を利用してもよいが、複数のｍｉＲを利用することが好ましい。同様に、本態様の判定方法は、表３〜表６に示される免疫応答型判定用バイオマーカーであるｍｉＲのいずれか１種の発現量を基に行ってもよいが、好ましくは複数のｍｉＲの発現量を基に、より好ましくはより多数のｍｉＲの発現量を基に判定することが好ましい。さらに好ましくは、表３又は表４及び表５又は表６に示されるｍｉＲのいずれについても相対的発現量を測定し、Ｔｈ１型Ｔｈ２型双方の視点から免疫応答の型を判定することが好ましい。このように、複数又は多数のｍｉＲを対象とすることで、本発明における判定の信頼性はより向上する。ただし、複数のｍｉＲを測定対象とした場合、必ずしも全てのｍｉＲの発現量が考慮されることは必要とはされない。
【００４９】
本態様の判定方法により、免疫治療を実行する過程において被験者の免疫応答をモニタリングすることが可能となる。これにより、被験者における治療効果の確認を追跡することができ、免疫治療の継続又は中止の判断根拠の一つとすることができる。
【００５０】
本発明はさらに、表１〜表６に示されるｍｉＲ、前記ｍｉＲと相補的なｍｉＲ、前記ｍｉＲ及び前記相補的なｍｉＲに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、免疫応答型制御剤を提供する。
【００５１】
前記表１〜表６に示されるｍｉＲは、生体特にヒトが抗原刺激を受けたときに示されるＴｈ１型又はＴｈ２型免疫応答に関与する様々な遺伝子をターゲットとして、それらの機能発現を制御していると考えられる。かかるターゲット遺伝子は、それぞれの型の免疫応答を誘導、促進若しくは亢進したりする、又は阻害若しくは抑制したりするなどの様々な機能が想定される。
【００５２】
したがって、前記表１〜表６に示されるｍｉＲを適切に選択することによって、ヒトの免疫応答をＴｈ１型に若しくはＴｈ２型に誘導、促進若しくは亢進したり、又はＴｈ１型の若しくはＴｈ２型の免疫応答を阻害若しくは抑制したりすることができると期待される。本発明にいう免疫応答の型の制御とは、免疫応答をＴｈ１型に若しくはＴｈ２型に誘導、促進若しくは亢進したり、又はＴｈ１型の若しくはＴｈ２型の免疫応答を阻害若しくは抑制したりすることを意味する。
【００５３】
本発明の免疫応答型制御剤の効果は、生体にｍｉＲを直接投与して各免疫応答が誘導される又は抑制されることを本発明の判定方法を用いて確認してもよく、また例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に免疫応答型制御剤であるｍｉＲを導入して、Ｔｈ１型免疫応答の指標であるＩＦＮ−γ又はＴｈ２型免疫応答の指標であるＩＬ−５の発現がＰＢＭＣにおいて誘導、促進、若しくは亢進される又は阻害若しくは抑制されることをもって確認してもよい。
【００５４】
また、ｉ）前記ｍｉＲと相補的なｍｉＲ、すなわちｍｉＲの塩基配列と相補的な塩基配列からなるｍｉＲ、ｉｉ）適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表６に示されるｍｉＲと同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、並びにｉｉｉ）表１〜表６に示されるｍｉＲの機能を阻害することのできる阻害性核酸、例えば表１〜表６に示されるｍｉＲの塩基配列を基に適宜設計することができる塩基配列を有することで表１〜表６に示されるｍｉＲの機能を実質的に阻害することができる核酸、表１〜表６に示されるｍｉＲの塩基配列を認識してその機能を阻害することができるｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉誘導性核酸、又は適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表６に示されるｍｉＲの機能を実質的に阻害するＲＮＡ若しくはＲＮＡ干渉誘導性核酸であるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸なども、本発明における免疫応答型制御剤として利用することができるものと期待される。ｍｉＲとこれに相補的なｍｉＲは、例えばｍｉＲ−４７０９−５ｐとｍｉＲ−４７０９−３ｐなどのように、ｍｉＲのＩＤにおいて５ｐ及び３ｐと表記されて区別される関係にある。
【００５５】
阻害性核酸を設計及び生産する手法は当業者に広く知られている他、このような設計から生産を受託により行う会社等も多数存在する。例えばこの様な受託生産は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ．ｈｔｍｌ）、ＱＩＡＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔａｌｏｇ／ａｓｓａｙ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｓｃｒｉｐｔ−ｍｉｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０２４００）などが行っている。このような受託先に本明細書に記載の各表中のＩＤ又はアクセッション番号から特定される塩基配列を提供すれば、阻害性核酸を入手することができる。
【００５６】
さらに、表１〜表６に示されるｍｉＲを含む上記核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸も、本発明における免疫応答型制御剤に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などを挙げることができる。
【００５７】
また、表１〜表６に示されるｍｉＲを含むＲＮＡ中のリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラＲＮＡもまた、本発明における免疫応答型制御剤に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン、５‐ブロモウリジンなど；８位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば８‐ブロモグアノシンなど；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンなど；Ｏ−又はＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどを挙げることができる。
【００５８】
本発明では、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表６に示されるｍｉＲと同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、表１〜表６に示されるｍｉＲの塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸及びこれらのキメラＲＮＡを、表１〜表６に示されるｍｉＲと機能的に等価な核酸又はｍｉＲの機能的等価物と表すこととする。
【００５９】
同様に、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表６に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸と同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、表１〜表６に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸及びこれらのキメラＲＮＡを、表１〜表６に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸と機能的に等価な核酸又は阻害性核酸の機能的等価物と表すこととする。
【００６０】
後の実施例に示すように、Ｔｈ１型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｍｉＲであるｈｓａ−ｍｉＲ−６３５及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ、並びに同じく相対的発現量が高いｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐは、抗ＣＤ３抗体による刺激（抗原刺激）を受けたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生を促進する効果を有している。すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐは、上記ＰＢＭＣに対してＩＦＮ−γ産生促進能を有し、Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は亢進する免疫応答型制御剤として利用可能である。
【００６１】
特にｈｓａ−ｍｉＲ−６３５及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐは、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５の産生を抑制する機能を有しており、Ｔｈ２型免疫応答を抑制する免疫応答型制御剤としても利用可能である。
【００６２】
一方で、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐ−Ｉ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５に対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５−Ｉ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉ）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ−Ｉ）は、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５の産生を促進する効果を有しており、Ｔｈ２型免疫応答を誘導又は亢進する免疫応答型制御剤として利用可能である。
【００６３】
また、Ｔｈ２型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｍｉＲであるｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ、及び同じく相対的発現量が高いｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐと相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐは、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５の産生を促進する効果を有している。すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐはＩＬ−５産生促進能を有し、Ｔｈ２型免疫応答を誘導又は亢進する免疫応答型制御剤として利用可能である。
【００６４】
一方で、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ−Ｉ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ−Ｉ）は上記ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生を促進する効果及びＩＬ−５の産生を抑制する効果を有しており、Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は亢進する又はＴｈ２免疫応答を抑制する免疫応答型制御剤として利用可能である。さらにｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ−Ｉ）は、上記ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生を促進する機能を有しており、Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は亢進する免疫応答型制御剤として利用可能である。
【００６５】
本発明の免疫応答型制御剤である核酸は、化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に知られ又は周知である方法を採用することができる。またいわゆるＤＮＡシンセサイザーなどの機器を用いることで、本発明の免疫応答型制御剤を製造してもよい。
【００６６】
本発明の免疫応答型制御剤である核酸は、生体に直接投与されてもよい。また、生体から分離された免疫細胞、典型的には造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞などに適当な方法によって導入されてもよい。また、本発明の免疫応答型制御剤である核酸は、そのまま造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞などに導入されてもよく、又はこれらの細胞内で適切に所望のＲＮＡが誘導されるように機能的に組み込まれた発現ベクターの形態で免疫担当細胞に導入されてもよい。
【００６７】
発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターなどのプロモーター配列、オペレーター配列、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記核酸と機能的に連結され得る。本発明の核酸を含む発現ベクターなどの核酸構築物もまた、本発明の範囲内にある。なお、本発明において２以上の核酸を用いる場合、これらの核酸は単一の発現ベクターに組み込んでもよく、２以上のベクターに別々に組み込んでもよい。
【００６８】
本発明の核酸は、任意の既知の細胞導入手法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、又はマイクロインジェクション法などを用いることによって、造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞内に導入され得る。
【００６９】
発現ベクターの構築及びその造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞などへの導入を行う遺伝子工学的方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。
【００７０】
本発明はまた、哺乳動物の免疫応答を制御する方法を提供し、具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の免疫応答型制御剤を投与して哺乳動物の免疫応答を制御する方法を含む。
【００７１】
本明細書中で用いられる「哺乳動物」の例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明の方法は特にヒトを対象とする。
【００７２】
本明細書中で用いられる「有効量」とは、哺乳動物の免疫応答を制御するのに効果的な免疫応答型制御剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
【００７３】
本発明の治療方法の好ましい実施形態の一つは、Ｔｈ１型の免疫応答を誘導又は亢進することのできる本発明の免疫応答型制御剤の存在下で培養したヒトのがん患者由来の造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞などを当該がん患者に投与して、がん細胞に対するその患者の免疫応答をＴｈ１型とする方法である。かかる造血幹細胞、Ｔ細胞や樹状細胞などの培養は適当ながん抗原又はがんワクチンを含む培地を用いて行われることが好ましい。また、同様の方法によって、細菌、真菌、ウイルスその他の外来生物による感染症に対する患者の免疫応答を活性化させることも可能である。
【００７４】
本発明の治療方法の好ましい別の実施形態の一つは、Ｔｈ１型の免疫応答を抑制する又は阻害することのできる本発明の免疫応答型制御剤をヒト患者に投与して、その患者における肝炎、自己免疫疾患を治療する方法である。本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患を挙げることができる。
【００７５】
本発明の治療方法のさらなる実施形態の一つは、Ｔｈ２型の免疫応答を誘導又は亢進することのできる本発明の免疫応答型制御剤をヒト患者に投与して、寄生虫その他の外来生物による感染症を治療する方法である。
【００７６】
本発明の治療方法のさらなる好ましい実施形態の一つは、Ｔｈ２型の免疫応答を抑制する又は阻害することのできる本発明の免疫応答型制御剤をヒト患者に投与して、その患者におけるアレルギー疾患又は自己免疫疾患を治療する方法である。本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患を挙げることができる。
【００７７】
本発明の免疫応答型制御剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分と共に医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することが好ましい。特に、核酸製剤の調製に好適な賦形剤等の利用が好ましい。かかる医薬組成物又は製剤の形態にある免疫応答型制御剤も、本発明の免疫応答型制御剤の一態様である。
【００７８】
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、ＲＮＡ干渉誘導性核酸などを含む製剤で利用されている各種の成分を利用することが好ましい。治療対象となる疾患に応じて、本発明の免疫応答型制御剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。
【００７９】
本発明の免疫応答型制御剤を含む医薬組成物は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった、製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。本発明の免疫応答型制御剤を含む医薬組成物はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含んでもよい。
【００８０】
また、本発明の免疫応答型制御剤を含む医薬組成物は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア及びナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入及び／又は固定することもできる。
【００８１】
本発明の免疫応答型制御剤を含む医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明の免疫応答型制御剤を含む医薬組成物は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。
【００８２】
ウイルスベクターを利用して哺乳動物の体内で本発明の核酸の発現を誘導する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３〜１×１０１４、好ましくは１×１０５〜１×１０１２、より好ましくは１×１０６〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０７〜１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。
【００８３】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種及び属、コンストラクト並びに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。
【実施例】
【００８４】
＜実施例１＞
１）血清の調製
国際特許公開ＷＯ２００９／１２３１８８号パンフレットに記載のサーバイビンヘルパーペプチドを用いたがんワクチン免疫療法の第ＩＩ相臨床試験において、所定の試験プロトコルに従って前記ペプチドを大腸がん患者に投与した。治療期間１におけるペプチドワクチンの投与は初回投与、初回投与から１４日後、２８日後及び４２日後の計４回行った。初回投与前と各回投与後１４日目に患者から採血して、それぞれ常法に従って血清を調製した。また、採血された血液中の末梢血リンパ球から調製した非付着性細胞（２×１０６個／ウェル）と別途ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦで誘導した樹状細胞（１×１０５個／ウェル）とをワクチンペプチド（５μＭ）で２回、１週間ごとに刺激をして、２週間培養し、２週間後の段階で、誘導されたＴリンパ球（５×１０４個／ウェル）と樹状細胞は（５×１０３個／ウェル）をワクチンペプチド（２μＭ）で再刺激した際に、培養上清中にペプチド特異的反応により産生されたＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γをそれぞれ測定した。サイトカイン測定からＩＦＮ−γがＩＬ−４に比して高産生されたＴｈ１免疫応答を示した患者５名を選択し、それらの血清を一つに纏めて混合した。同様にＩＦＮ−γの産生に対してＩＬ−４の産生が比較的高値のＴｈ２免疫応答を示した患者５名分の血清を一つに纏めて混合した。尚、Ｔｈ１免疫応答を示した患者５名においては、上記方法で測定されたＩＦＮ−γ濃度は、いずれも約３８９０ｐｇ/ｍＬ以上であった。一方、Ｔｈ２免疫応答を示した患者５名においては、上記ペプチドワクチン４回投与後のＩＬ−４濃度は、上記方法で測定した場合、いずれも約１７３ｐｇ/ｍＬ以上であった。
【００８５】
２）マイクロアレイ解析
１）のＴｈ１型の免疫応答を示した患者の血清及びＴｈ２型の免疫応答を示した患者の血清に対して、東レ株式会社に委託して「ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ」を用いたマイクロアレイ解析を行い、検出されたｍｉＲごとの相対的発現量をグローバルノーマライゼーション法によって算出した。
【００８６】
３）免疫体質判定用バイオマーカーの特定
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療開始前の血清において、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、Ｔｈ２型の免疫応答を示した患者群と比較して２倍以上の相対的発現量を示したｍｉＲと治療開始前の血清中におけるその相対的発現量を表１に示した。
【００８７】
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療開始前の血清において、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、Ｔｈ１型の免疫応答を示した患者群と比較して２倍以上の相対的発現量を示したｍｉＲと治療開始前の血清中におけるその相対的発現量を表２に示した。
【００８８】
４）免疫応答型判定用バイオマーカーの特定
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における相対的発現量と比較して４回目投与後の血清における相対的発現量が２倍以上に上昇したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を表３に示した。
【００８９】
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療を受けることでＴｈ１型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における相対的発現量と比較して４回目投与後の血清における相対的発現量が１／２以下に減少したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を表４に示した。
【００９０】
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における相対的発現量と比較して４回目投与後の血清における相対的発現量が２倍以上に上昇したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を表５に示した。
【００９１】
上記マイクロアレイの解析結果から、免疫治療を受けることでＴｈ２型の免疫応答を示した患者群に関して、治療開始前の血清における相対的発現量と比較して４回目投与後の血清における相対的発現量が１／２以下に減少したｍｉＲと、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定した発現量からグローバルノーマライゼーション法によって算出した相対的発現量を基にしたそれぞれの変動比を表６に示した。
【００９２】
＜実施例２＞
表１に示されるｍｉＲすなわちＴｈ１型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｍｉＲであるｈｓａ−ｍｉＲ−６３５及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ、及びそれらに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−６３５−Ｉ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ−Ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉ、さらにＴｈ１型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐ−Ｉを化学合成した。
【００９３】
健常ヒト末梢血から常法によって回収したＰＢＭＣ（１×１０５個／ウェル）に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従って上記ｍｉＲ及び阻害性核酸各３０ｐｍｏｌ／ウェルをそれぞれ加えた。２４時間後に抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含むＴ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて抗原刺激をＰＢＭＣに与えた。刺激から２４時間又は４８時間後に培養上清を回収し、ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ｓｅｔ及びｈｕｍａｎ  ＩＬ−５  ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ｓｅｔ（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−５のＥＬＩＳＡによる定量を行った。その結果を図１〜図４に示す。
【００９４】
図１〜４に示されるように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐは、抗原刺激を受けたＰＢＭＣに対してＩＦＮ−γ産生促進能を有することが確認された。また、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５及びｍｉＲ−２２４−５ｐは、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５の産生を抑制する機能を有していることが確認された。
【００９５】
一方、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３５−Ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ−Ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐ−Ｉは、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５の産生を促進する効果を有していることが確認された。
【００９６】
＜実施例３＞
表２に示されるｍｉＲすなわちＴｈ２型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｍｉＲであるｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ、及びこれらに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ−Ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ−Ｉ、さらにＴｈ２型の免疫応答を示す免疫体質を有する被験者において優位に相対的発現量が高いｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐに相補的なｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ及びこれに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ−Ｉを化学合成し、実施例１と同様にＰＢＭＣに導入し、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−５を定量した。その結果を図５〜図７に示す。
【００９７】
図５〜図７に示されるように、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ及びｍｉＲ−２０ｂ−５ｐは、抗原刺激を受けたＰＢＭＣに対してＩＬ−５産生促進能を有することが確認された。
【００９８】
一方、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ−Ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ−Ｉ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ−Ｉは、上記ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生を促進する効果を有していることが確認された。さらにｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ−Ｉ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−３ｐ−Ｉは、上記ＰＢＭＣからのＩＬ−５産生を抑制する機能を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明のバイオマーカーを用いることで、患者の免疫体質の予測又は免疫治療を実行中の患者の免疫応答の型の判定が可能となり、感染症やがんワクチン治療の効果の予測に用いるコンパニオン診断薬として有用である。また、免疫治療の実施によるアナフィラキシーショックや自己免疫応答などの副作用の回避、食物アレルギー応答などの回避などを行うことも可能となる。さらに、本発明で特定されるｍｉＲ、これに対する阻害性核酸又はそれらの機能的等価物を免疫応答型制御剤として利用することができる。このように、本発明のバイオマーカー、判定方法及び免疫応答型制御剤は、免疫関連疾患の予防、改善、治療分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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