(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デオキシ−Ｄ−グルコースを有効成分とする、リルゾールが有効性を示さないＳＯＤ１遺伝子変異筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳ）は、有効な治療法確立が強く希求されている致死的神経変性疾患の代表で、日本においては厚生労働省の特定難病疾患に指定されている。ＡＬＳの有病率は１０万人口当たり約３人から５人とされ、現在日本では約４，０００から５，０００人の患者がいると考えられている（非特許文献１）。尚かつ、本疾患は働き盛りである中年以降に発症する。従って、ＡＬＳの新規治療法の開発は、極めて重要である。
【０００３】
歴史的には、ＡＬＳは１８６９年にＪｅａｎ−Ｍａｒｔｉｎ  ＣｈａｒｃｏｔとＡｌｅｘｉｓ  Ｊｏｆｆｒｏｙにより記載された一つの疾患単位である（非特許文献２）。主に上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの両者が障害される進行性の原因不明の疾患であり呼吸筋麻痺により死亡する運動ニューロン疾患として位置づけられる（非特許文献３）。この疾患が初めて記載されて以来、約１４５年経過した現在尚、その有効な治療法は確立していない。ＡＬＳ治療剤として神経栄養因子、神経保護効果、カスパーゼ抑制、銅キレート作用、グルタミン酸抑制作用等に基づいた薬剤の効果についての検討がなされている（特許文献１、非特許文献４）。しかし、現在、ＡＬＳ治療薬として販売されているのは、グルタミン酸受容体のアゴニストとしてグルタミン酸抑制作用のあるリルゾール（商品名リルテック、ＣＡＳ登録番号１７４４−２２−５）のみである（特許文献１）。当該リルゾールを使用しても、国外治験では運動機能改善は認められておらず、寿命を３か月延長させたのみで、延命させることができる生存期間は僅かであった（非特許文献５〜７）。日本でおこなった治験では有効性を証明できなかった。しかし、ＡＬＳは致死的神経変性疾患であるために当該治療薬が強く希求されている臨床現場を考慮して、国外治験結果の重要性と基礎・臨床の橋渡し試験を重要視することにより承認されている（非特許文献８、９）。
【０００４】
ＡＬＳのうち約５から１０％は家族性筋萎縮性側索硬化症（ＦＡＬＳ）である（非特許文献１０、１１）。ＡＬＳの病因解明の一つの糸口として、１９９３年にＦＡＬＳのうち約２０％に、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｃｏｐｐｅｒ／ｚｉｎｃ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；  ＳＯＤ１）遺伝子に異常を持つ家系が存在することが報告された（非特許文献１２、１３）。この発見に基づいて、ヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高発現するトランスジェニックマウスが遺伝子工学的に開発されている（非特許文献１４）。このＳＯＤ１の遺伝子異常については、その後の遺伝子解析により１００以上のＳＯＤ１遺伝子突然変異が報告されている。それに伴って、ＡＬＳモデル動物が複数種類開発されてきている（非特許文献１５）。当該ＡＬＳモデル動物のなかでも、最も症状の進行が早く、早期に四肢麻痺・呼吸筋を呈し、死に至る激烈な系統が、今回本発明者が有効性を確認したＡＬＳモデル動物Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（非特許文献１５）である。このため、最も激烈な当該系統において、臨床・病理学的にＡＬＳに対しての有効性が認められたならば、他のどの系統での有効性の証明よりＡＬＳ治療効果は高いと考えられる（非特許文献１５）。現在ＡＬＳ治療薬として唯一承認されているリルゾールでさえ、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいては有効性を示さない（非特許文献１６）。このＧ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスはヒトＳＯＤ１  遺伝子のＧ９３Ａ−ＳＯＤ１という点突然変異が２５コピー数遺伝子導入された系統で、発症は生後１００日前後、生存期間は１２５日前後である。一方、Ｇ１Ｌ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスと同じ変異遺伝子Ｇ９３Ａ  −ＳＯＤ１を１８コピー数遺伝子導入されたものである。しかし、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスとＧ１Ｌ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスとは臨床・病理学的観点からは、大きく異なる。Ｇ１Ｌ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、臨床学的には、ＡＬＳ症状の進行は緩やかで、２３０日経過した後に症状が顕在化し、３００日前後頃まで生存する（非特許文献１５）。病理学的には、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの運動脊髄前角細胞死の程度は、Ｇ１Ｌ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの運動脊髄前角細胞死の程度より高度である（非特許文献１５）。その他、Ｇ８５Ｒ、Ｈ４６Ｒ  などの変異ＳＯＤ１遺伝子が遺伝子導入されたモデルマウスが存在するが、当該マウスの症状進行はヒトの症状進行と同様緩やかで、生存期間も長い。このため、薬剤の有効性を判断する際に、生存日数や病悩期間の日数は、ＡＬＳモデル動物の系統が異なると単純に比較は出来ない。これら従来のトランスジェニックマウスは、ＳＯＤ１遺伝子の変異ごとの違いによる臨床・病理学的な差異は存在するが、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、ヒトＡＬＳと同様に運動ニューロン障害による運動障害症状を呈し、やがて四肢麻痺、最終的には呼吸筋麻痺を惹起させ瀕死状態に陥り、ＡＬＳ死する（非特許文献１５）。尚かつ病理学的にもヒトと同様の運動ニューロン死の病理組織像を示す（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２７１３３８４号公報
【特許文献２】特許第５３１７０５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】永井正規（編）．  電子入力された臨床調査個人表に基づく特定疾患治療研究医療受給者調査報告書．  ２００５；  １３３
【非特許文献２】Ｃｈａｒｃｏｔ  ＪＭ  ＆  Ｊｏｆｆｒｏｙ  Ａ．Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）１８６９；２：７４４−７６０
【非特許文献３】Ｋａｔｏ  Ｓら．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ａｎｄ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＩＳＮ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ  Ｐｒｅｓｓ，２００３：ｐｐ３５０−３６８
【非特許文献４】森若文雄、田代邦雄：神経治療、１７：３２６，２０００．
【非特許文献５】Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  Ｇ，Ｌａｃｏｍｂｌｅｚ  Ｌ，Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｖ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９４；３３０：５８５−５９１
【非特許文献６】Ｌａｃｏｍｂｌｅｚ  Ｌ，Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  Ｇ，Ｌｅｉｇｈ  ＰＮ，Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｐ，Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｖ．  Ｌａｎｃｅｔ．１９９６；３４７：１４２５−１４３１
【非特許文献７】Ｌａｃｏｍｂｌｅｚ  Ｌ，Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  Ｇ，Ｌｅｉｇｈ  ＰＮ，Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｐ，Ｐｏｗｅ  Ｌ，Ｄｕｒｒｌｅｍａｎ  Ｓ，Ｄｅｌｕｍｅａｕ  ＪＣ，Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｖ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９６；４７：Ｓ２４２−２５０
【非特許文献８】柳沢信夫，田代邦雄，東儀英夫．  医学の歩み．１９９７；１８２：８５１−８６６
【非特許文献９】柳沢信夫，田代邦雄，東儀英夫．  医学の歩み．１９９７；１８２：８６７−８７８
【非特許文献１０】Ｈｕｄｓｏｎ  ＡＪ．Ｂｒａｉｎ  １９８１；１０４：２１７−２４７
【非特許文献１１】Ｊｕｎｅｊａ  Ｔら．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７；４８：５５−５７
【非特許文献１２】Ｄｅｎｇ  ＨＸら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６１：１０４７−１０５１
【非特許文献１３】Ｒｏｓｅｎ  ＤＲら．Ｎａｔｕｒｅ  １９９３；３６２：５９−６２
【非特許文献１４】Ｇｕｒｎｅｙ  ＭＥら．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６４：  １７７２−１７７５
【非特許文献１５】Ｋａｔｏ  Ｓ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ  ２００８；１１５：９７−１１４
【非特許文献１６】Ｓｃｏｔｔ  Ｓら．Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２００８；９：４−９
【非特許文献１７】Ｋｉｒｉｎｏ  Ｔ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８２；２３９：  ５７−６９
【非特許文献１８】Ｋｉｌｉｃ  Ｅ  ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；１２８：３５６−３６４
【非特許文献１９】Ｒｙｂｅｒｇ  Ｈ  ら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００３；１０８：１−８
【非特許文献２０】Ｃｕｄｋｏｗｉｃｚ  ＭＥら、  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１４，；１３：１０８３−１０９１
【非特許文献２１】Ａｈｍａｄ  ＩＭら，Ｃｅｎｔ  Ｅｕｒ  Ｂｉｏｌ  ２０１０；５：７３９−７４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように未だ有効なＡＬＳ治療剤は開発されておらず、本発明の課題は、新たなＡＬＳ治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、最も激烈な系統であるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａ変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）過剰発現トランスジェニックＡＬＳモデルマウスを使用し、種々の薬物についてのＡＬＳ治療作用を検討してきたところ、全く意外にも、還元糖類縁体が優れたＡＬＳ治療作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
【００１０】
〔１〕還元糖類縁体を有効成分とする筋萎縮性側索硬化症治療剤。
〔２〕還元糖類縁体が、デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、デオキシマンノース、イズロン酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びグルクロン酸から選ばれる１種又は２種以上である〔１〕記載の筋萎縮性側索硬化症治療剤。
〔３〕還元糖類縁体が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである〔１〕又は〔２〕記載の筋萎縮性側索硬化症治療剤。
〔４〕筋萎縮性側索硬化症治療剤製造のための、還元糖類縁体の使用。
〔５〕還元糖類縁体が、デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、デオキシマンノース、イズロン酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びグルクロン酸から選ばれる１種又は２種以上である〔４〕記載の使用。
〔６〕還元糖類縁体が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである〔４〕又は〔５〕記載の使用。
〔７〕筋萎縮性側索硬化症を治療するための還元糖類縁体。
〔８〕デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、デオキシマンノース、イズロン酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びグルクロン酸から選ばれる１種又は２種以上である〔７〕記載の還元糖類縁体。
〔９〕２−デオキシ−Ｄ−グルコースである〔７〕又は〔８〕記載の還元糖類縁体。
〔１０〕還元糖類縁体を投与することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症の治療方法。
〔１１〕還元糖類縁体が、デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、デオキシマンノース、イズロン酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びグルクロン酸から選ばれる１種又は２種以上である〔１０〕記載の方法。
〔１２〕還元糖類縁体が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、還元糖類縁体を有する物質を投与することにより、優れたＡＬＳ症状の進行防止効果及び延命効果が得られ、ＡＬＳの治療が可能となる。
【００１２】
ＡＬＳの症状は、突然に、持っている物を落としたり、足がもつれたり、ろれつが回らなくなることで気づかれるが、患者によっては外傷等の契機で発症することもしばしばである。ＡＬＳの基本的症状は、筋肉の線維束性収縮症状、筋萎縮・筋力低下症状、球麻痺症状、錐体路症状である。筋肉の線維束性収縮症状は筋肉のピクツキとして認められる。筋萎縮・筋力低下症状に関しては、上肢や下肢の遠位部の筋萎縮・筋力低下から始まり、やがて両肢の近位部筋の障害に及ぶ。初期は握力低下（持っている物を落とす等）、足底の挙上困難（足首が上がらない等）であるが、やがて上肢挙上困難や歩行障害（足のもつれ・転倒等）を来たし、日常生活動作が困難・不可能になり、寝たきり状態となる。寝たきり状態になるとさらに筋肉を動かさなくなり、二次的な筋肉の廃用萎縮を来たし、筋萎縮・筋力低下を加速する。球麻痺症状とは咽喉頭筋・舌・咬筋・顔面筋等の筋萎縮・筋力低下徴候によるもので、発声・発語障害に基づく言語障害（言葉の不明瞭性等）や嚥下困難をきたす。やがて経口摂取困難状態になる。錐体路症状に関しては、両肢において筋肉の緊張が強くなり、つっぱって動かし難い等の異常筋緊張亢進を伴う運動麻痺（痙性麻痺）を生ずる。ＡＬＳではそれぞれの症状の程度と進展は様々であるが、予後はきわめて不良で、病期の進行は比較的速く、最終的には呼吸筋麻痺による呼吸不全を来たし、人工呼吸器を用いなければ通常２〜３年で死亡する。現在では気管切開後の人工呼吸器使用による呼吸管理により、生命そのものの延命は可能となったが、患者の生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ，ＱＯＬ）の高度の低下、経済的な保障不安、在宅療養での介護者（マンパワー）の不足等の問題要素があり、患者のみならず家族全員・家族全体に重大な社会的障害と苦痛を与える。しかも、患者の意識は最後まで正常で、一般に知能も障害されないため、患者は常に死の恐怖と向き合わなければならない過酷な状況となる。
本発明の治療剤を用いれば、ＡＬＳにおけるこれらのＡＬＳ臨床症状が改善され、人工呼吸器装着までの期間を顕著に延長でき、患者のＱＯＬを維持できる期間が長くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】薬剤投与スケジュールを示す。第一治療実験系では、ＡＬＳ発症から終末期（人道的エンドポイント）まで、治療群には２−デオキシ−Ｄ−グルコースを、プラセボ投与群にはマウス用飲料水を連日経口投与した。終末期において、組織をサンプリングし解析した。第二治療実験系として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース治療群とプラセボ投与群の１１０日齢時点で組織をサンプリングした。具体的には、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、発症日より２−デオキシ−Ｄ−グルコースまたはプラセボであるマウス用飲料水を連日１日１回経口投与し、終末期に至る前の臨床症状に差の見られる１１０日齢の時点で、組織をサンプリングした。図１の下段の写真は、後肢麻痺を示すＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスである。正常コントロールとして、野生型同腹仔マウスには、マウス用飲料水を１１０日齢当日まで、連日経口投与した。
【図２】２−デオキシ−Ｄ−グルコースの有効性の解析結果を示す。左上は病悩期間、右上は発症日、左下は生存期間を示す。
【図３】プラセボであるマウス用飲料水を投与した終末期に相当した日数の野生型同腹仔マウスの腰髄組織におけるクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色像を示す。上段は弱拡大の腰髄組織像であり、下段は強拡大の腰髄組織像を示している。プラセボであるマウス飲料水を投与した１１０日齢の野生型同腹仔マウスにおいても、同一病理像を示していた。
【図４】プラセボであるマウス用飲料水を投与した終末期のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの腰髄組織におけるクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色像を示す。上段は弱拡大の腰髄組織像であり、下段は強拡大の腰髄組織像を示している。
【図５】２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与した終末期のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの腰髄組織におけるクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色像を示す。上段は弱拡大の腰髄組織像であり、下段は強拡大の腰髄組織像を示している。
【図６】腰髄における２５μｍ以上の直径を持つ脊髄前角細胞数を示す。    上段：プラセボであるマウス用飲料水を投与した終末期に相当した日数の野生型同腹仔マウス。プラセボであるマウス飲料水を投与した１１０日齢の野生型同腹仔マウスにおいても、同一脊髄前角細胞数を示した。    中段：プラセボであるマウス用飲料水を投与した終末期のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス    下段：２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与した終末期のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス
【図７】プラセボであるマウス用飲料水を投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの、生後１１０日齢時点での腰髄組織におけるクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色像を示す。
【図８】２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの生後１１０日齢時点での腰髄組織におけるクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＡＬＳ治療剤の有効成分は、還元糖類縁体である。
【００１５】
ここで還元糖とは、アルデヒド基を含む糖質を言う。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、水溶液中では形状が変わって鎖状構造となり、一部の２−デオキシ−Ｄ−グルコースはアルデヒド基が存在するようになる。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、還元能を調べるフェーリング試薬とも反応し、陽性を呈する。還元糖類縁体には、還元糖の４個のヒドロキシ基及びヒドロキシメチル基の１〜５個が、水素原子に置換されているか、他の置換基に置換されている化合物が含まれる。ここで他の置換基としては、カルボキシル基、アミノ基、アセトアミノ基、グリコリルアミノ基、グリセリル基等が挙げられる。
還元糖類縁体の例としては、デオキシ還元糖、イズロン酸、グルクロン酸等が挙げられ、このうちデオキシ還元糖がより好ましい。
【００１６】
デオキシ還元糖には、デオキシ還元単糖、デオキシ還元二糖等が含まれるが、デオキシ還元単糖が好ましい。デオキシ還元単糖としては、デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、及びデオキシマンノースから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。このうち、デオキシグルコースが好ましい。
【００１７】
デオキシ還元糖のデオキシ（ヒドロキシ基が水素原子に置換）の位置は、六員環上の１、２、３、４及び６位のいずれでもよく、１又は２以上でもよいが、２位又は６位が好ましい。すなわち、２−デオキシグルコース、２−デオキシフルクトース、２−デオキシガラクトース、２−デオキシマンノース、フコースがより好ましい。さらに、単糖部は、Ｄ−体でもＬ−体でもよいが、Ｄ−体であるのが好ましい。従って、Ｄ−フコース、フコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−フルクトース、２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−マンノースがより好ましい。このうち、特に２−デオキシ−Ｄ−グルコースが好ましい。
【００１８】
より好ましい還元糖類縁体の具体例としては、デオキシグルコース、デオキシフルクトース、デオキシガラクトース、デオキシマンノース、イズロン酸、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、グルクロン酸が挙げられる。
【００１９】
これらのデオキシ還元糖は、既に知られており、市販品として入手可能である。例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、ホスホグルコースイソメラーゼを競合的に、またヘキサナーゼを非競合的に阻害することが知られており、がん治療薬やてんかん治療薬として有用である可能性が報告されている（特表２００６−５１５８８３号公報等）。また、２−デオキシグルコースの標識体、例えば１８Ｆ−フルオロデオキシグルコースは腫瘍組織の画像診断に利用されている。しかし、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとＡＬＳの関係については一切報告されていない。２−デオキシ−Ｄ−グルコースとＡＬＳとの直接的関連性を記載した文献は検索した限りは見いだせず、本発明は全く新しい発想に基づくものである。ただ唯一、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがＡＬＳとは全く無関係の脳虚血モデルマウスにおいて、グルタミン酸の放出を抑制したという記載があるのみである（特許文献２）。しかも、この文献には、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがＡＬＳに有効であるとの記載は一切ない。脳虚血後再灌流モデルにおける脳虚血後の遅発性の神経細胞死の機序は、グルタミン酸の過剰によるとされているが、この場合障害される細胞は、記憶・情動を司る大脳の海馬の神経細胞である（非特許文献１７）。ＡＬＳで障害される運動神経細胞と脳虚血後再灌流モデルで障害される神経細胞は全く別の細胞である。しかも、ＡＬＳと脳虚血との間には関連はないことも報告されている（非特許文献１８）。つまり、グルタミン酸の放出を抑制したことは、ＡＬＳとは基本的には全く関連性はない。しかも、グルタミン酸は興奮性アミノ酸であるので、このグルタミン酸放出を抑制する物質には、抗てんかん薬のラモトリギン、レベチラセタム、ガバペンチン、鎮痛剤のプレガバリン、抗炎症剤フルファサラジン等の数多くの物質が存在する。このようにグルタミン酸誘発興奮性を抑える薬剤としては、種々の薬剤が存在し、これらの薬剤においてＡＬＳの有効性が検討されてきているが、現時点でＡＬＳで有効性が認められているものはない（非特許文献１９、２０）。
【００２０】
後述の実施例に示すように、還元糖類縁体は、最も症状の進行が速く、生存期間も短いＡＬＳ症状の激烈な系統であるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａ変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）過剰発現トランスジェニックＡＬＳモデルマウスにおいて、ＡＬＳ発症後の経口投与で、その症状の進行を顕著に抑制し、生存期間も延長させた。従って、本発明のＡＬＳ治療剤を、ＡＬＳ発症後に投与すれば、人工呼吸器装着までの期間を顕著に延長でき、患者のＱＯＬを維持できる期間が長くなる。
また、還元糖類縁体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコースの毒性は、ＬＤ５０が２ｇ／ｋｇ以上という報告があり（非特許文献２１）、有効量に対しての安全性も高く、長期間継続して投与可能である。
【００２１】
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口投与としては髄腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、吸入、直腸内、鼻腔内投与及び点鼻、点耳、点眼、外用投与等が挙げられる。
【００２２】
本発明の医薬としては、有効成分である還元糖類縁体をそのまま患者に投与してもよいが、好ましくは、還元糖類縁体と薬学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物の形態の製剤として投与すべきである。薬学的に許容し得る添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００２３】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、又は外用剤（貼付、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、スプレーなどを含む）などを挙げることができる。
【００２４】
経口投与に適する製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。注射、又は点滴用に適する製剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成し得る溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。坐剤に適する製剤には、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の基剤、及び必要に応じて非イオン界面活性剤のような界面活性剤等の添加物を用いることができる。
【００２５】
貼付剤に適する製剤としては、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布したものが挙げられる。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００２６】
本発明の医薬の投与量は、疾患の進行状況、又は症状の程度、患者の年齢や体重などの諸条件に応じて適宜選択可能である。薬剤の血中濃度は、体表面積と相関する（Ｇａｍｅｌｉｎ  Ｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６（１３）：２０９９−２１０５）ことから、還元糖類縁体量として、一般的には成人に対して１日当たり０．０３〜３  ｍｇ／体表面積１ｃｍ２、即ち５０ｋｇ体重であれば体表面積１５０００ｃｍ２に相当するので、０．４５〜４５  ｇを経口的に投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２８】
Ｉ．材料及び方法
１．薬剤
２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を使用した。
【００２９】
２．投与方法
１）マウスの体表面積１ｃｍ２当たりの２−ＤＧのマウスへの投与量は、これまでの炎症疾患モデルマウスへの投与量を参考として０．２６３ｍｇ／ｃｍ２と決定した。例えば、体重２０ｇのマウスの体表面積は７６ｃｍ２である。つまり、体重２０ｇのマウスの場合、１匹当たり薬剤投与量は２０ｍｇとなる。微量の薬剤・溶剤の計量は誤差が大きくなるため、ある程度の量を秤量し、薬剤を準備した。５００ｍｇの２−ＤＧを５ｍｌマウス用飲料水に溶解し、体重２０ｇのマウスであれば、そのうち０．２ｍｌを投与すればよいことになる
【００３０】
２）プラセボとしては、溶剤としてのマウス用飲料水を使用した。すなわち、薬剤投与マウスの溶剤と等容量を１日１回経口投与した。
３）経口投与の方法は、プラスチックシリンジにて個々のマウスの体重に相当する薬剤を含有する容量を正確に測量し、プラスチックシリンジに直接マウス用胃ゾンデをつなげ、経口・経食道的に確実に投与した。
【００３１】
３．実験動物
ＡＬＳモデル実験動物には、Ｇ９３Ａ点変異のヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高コピー数（２０−３０コピー）過剰発現させた雄トランスジェニックマウスＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ（Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａ，ＪＲ２７２６；Ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，米国）から購入し、使用した。同時に、その雄の野生型同腹仔マウスＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）もＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、使用した。
【００３２】
４．プラセボ、２−ＤＧ投与方法による実験グランドデザイン：
第一治療実験群（終末期解析実験群）と第二治療実験群（１１０日齢解析実験群）
自然定着の微生物を保有するマウスにおける感染症等を排除し、可能な限り、個体差を最小限にさせる目的で、当該Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス及び野生型同腹仔マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入後、個別に３週間隔離し、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ：特定病原体のいない微生物制御状態）であることを再度確認する。実験は、ＳＰＦを再度確認した後、当該Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの雄Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの２群に分けた。即ち、第一段階の第一治療実験群（終末期解析実験群）では、コントロール群（ｎ＝５）であるマウス用飲料水投与群と治療群である２−ＤＧ治療投与群（ｎ＝５）の２群である。野生型同腹仔マウス（ｎ＝１０）を正常コントロール群として用いた。第二段階の第二治療実験群（１１０日齢解析実験群）では、コントロール群（ｎ＝２）であるマウス用飲料水投与群と治療群である２−ＤＧ治療投与群（ｎ＝４）の２群である。野生型同腹仔マウス（ｎ＝３）を正常コントロール群として用いた。
【００３３】
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスにおけるＡＬＳとしての自然臨床経過は、ほぼ単一的自然臨床経過で以下のごとくのＡＬＳ臨床経過をとった。即ち、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは、しばらくの間は、野生型同腹仔と同一俊敏性の行動が認められている。しかし、生後１００日齢を過ぎた頃より、個体により、多少の差はあるものの、次のような臨床症状を呈し始める。即ち、不活発性・小刻みなふるえ（ｊｉｔｔｅｒｉｎｇ／ｔｒｅｍｏｒ）・尻尾挙上不全（ｌｉｍｐ  ｔａｉｌ）・俊敏性の欠如した緩徐歩行・一側性の極めて軽度の後肢不完全麻痺のいずれか一つ以上の臨床症状を呈する。これらの臨床症状の一つ以上を認めた場合をステージ１度の臨床症状と定義づける。それ以後のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおける自然臨床経過は、前肢は麻痺のない正常にもかかわらず、明らかな一側あるいは両側の後肢不完全麻痺を呈する臨床症状を示し始める（ステージ２度）。その後，前肢はほぼ正常のまま、後肢は高度の両側麻痺を呈するようになる（ステージ３度）。そして、両側後肢高度麻痺を呈したまま、一側あるいは両側の前肢不完全麻痺を発症し始める（ステージ４度）。やがて、全てのＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは終末期を迎えることになる。即ち、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスは高度四肢麻痺もしくは瀕死状態の臨床症状を示し始める（ステージ５度）。また、野生型同腹仔マウスは、１歳齢まで観察しても、ＡＬＳ臨床症状を発症しなかった。
当該研究の実験グランドデザインは、ＡＬＳが発症をもって治療薬の投与を開始する実際のヒトにおける臨床治験方法を考慮して、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの投与方法をグランドデザイン化した。
【００３４】
１）プラセボ投与実験群：
同一出生日のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス５匹と野生型同腹仔マウス１０匹とを使用した。Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス５匹のそれぞれの個体が、ＡＬＳ症状の発症後、即ち、臨床症状ステージ１度を確認の後、この時点を含む日よりプラセボであるマウス用飲料水を経口投与した。野生型同腹仔マウス１０匹全例は、ＡＬＳ症状は認めないために、野生型同腹仔マウスは１０匹全例１００日齢から投与した。経口投与期間は、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス５匹においては、臨床症状ステージ１度を確認した日から、ステージ５度の臨床症状を確認した期間まで連日投与した。野生型同腹仔マウス１０匹は、プラセボであるマウス用飲料水を１００日齢から、２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群のマウス個体のうち、最長延命可能であったマウス個体の最長日齢まで連ステージ５度の臨床症状を確認した期間まで連日投与した（図１）。
【００３５】
当該研究の実験グランドデザインは、ＡＬＳが発症をもって治療薬の投与を開始する実際のヒトにおける臨床治験方法を考慮して、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの投与方法をグランドデザイン化した。ＡＬＳ症状の発症後、即ち、臨床症状ステージ１度を確認の後、この時点を含む日より２−ＤＧ投与治療実験群には０．２６３  ｍｇ  ２−ＤＧ／マウス体表面積１ｃｍ２を胃ゾンデにて連日経口投与した。マウス用飲料水のプラセボ投与群にはマウス用飲料水のみを、体表面積あたり２−ＤＧ投与量と等量になるように、胃ゾンデを用いて連日経口投与した。
【００３６】
図１の下段写真は、当該実験に使用したＡＬＳモデル動物である。即ち、Ｇ９３Ａ点変異のヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高コピー数（２５コピー）過剰発現させた雄トランスジェニックマウスＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ（Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａ，ＪＲ２７２６；Ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ）Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスである。矢印は当該マウスの後肢を示していて、高度の両側後肢麻痺を呈しているが、前肢の運動評価はほぼ正常であるステージ３度を表している。
【００３７】
５．実験動物のサンプリング方法
第一段階での第一治療実験系（終末期解析実験系）：
第一段階の２−ＤＧ治療実験系として、２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群、マウス用飲料水投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスプラセボ投与のコントロール群、マウス用飲料水投与野生型同腹仔マウス正常対照群の各群のそれぞれの個体について、上述してある２−ＤＧあるいはマウス用飲料水投与期間についての当該実験最終日において、実験動物のサンプリングを実施した。即ち、２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群の５匹、マウス用飲料水投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスプラセボ投与のコントロール群の５匹、マウス用飲料水投与野生型同腹仔マウス正常対照群の１０匹の合計２０匹を当該研究の実験動物として採用した。
【００３８】
第一段階での治療実験系では、２−ＤＧのＡＬＳ進行の抑制、生存の延長効果を見るために、Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの終末期の時点まで、治療群には２−ＤＧを、プラセボ投与のコントロール群にはマウス用飲料水を投与した。２−ＤＧ治療群では、進行の抑制、生存期間の延長、終末期の遅延が予想される。長期間生存を示す２−ＤＧ治療群も短期間生存を示すプラセボ投与のコントロール群の２群とも、ともに終末期の時点での臨床症状はステージ５度の終末期の臨床症候を示し、同一臨床症状となってしまう。即ち、両群とも、高度四肢麻痺、呼吸筋麻痺の状態であり、生存期間の長短とは無関係に、終末期臨床症状を示してしまった脊髄の病理組織像は同程度の像を呈することは想像に難くない。
【００３９】
第二段階での第二治療実験系（１１０日齢解析実験系）：
第二段階での２−ＤＧ治療実験系では、２−ＤＧのＡＬＳ進行抑制効果を病理組織学的に実証するために、ＡＬＳ症状の終末期ではなく、１１０日齢の時点での病理組織像の解析を行った。第二段階の治療実験系として、治療群（ｎ＝４）には２−ＤＧを、プラセボ投与のコントロール群（ｎ＝２）にはマウス用飲料水を第一段階治療実験系と同様に発症と同時に同一投与量で経口投与を開始し、終末期に至る前の臨床症状に差のみられる１１０日齢の時点で組織をサンプリングし、病理組織像を解析した。加えて、１１０日齢の時点の野生型同腹仔マウス（ｎ  ＝３）もサンプリングし、病理組織像を解析した。
【００４０】
終末期の２−ＤＧ治療群（ｎ＝５）と対照のマウス用飲料水のプラセボ投与群（ｎ＝５）のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスと、終末期に相当する日数の野生型同腹仔マウス（ｎ＝１０）、および１１０日齢時点での２−ＤＧ治療群（ｎ＝４）と対照のマウス用飲料水のプラセボ投与群（ｎ＝２）と、１１０日齢の野生型同腹仔マウス（ｎ  ＝３）の各個体の臓器組織のサンプリング方法は、以下のごとく実施した。
１６匹のＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス及び１３匹の野生型同腹仔マウスは個体体重１ｇ当たり１ｍＬのペントバルビタールナトリウム（商品名ネンブタール、ＣＡＳ登録番号５７−３３−０、大日本住友製薬、大阪）の腹腔内注射にて、全身麻酔を施行した。完全に麻酔下にあることを確認した。その後、麻酔下にある各個体は更に二酸化炭素処理による安楽死後、開腹・開胸を行った。左心室の大動脈経由により、生理的食塩水にて全身臓器の血液を除去した。その後直ちに、大脳の右前頭葉の一部分、脊髄の一部分、心臓の左右両心室の一部分、右肺の一部分、肝臓の一部分、左右腎臓の一部分、左精巣の各新鮮臓器を採取し、ドライアイスにて瞬間凍結させた。その後、各新鮮臓器は−８０℃の超低温フリーザーに保存した。各新鮮臓器の瞬間凍結操作と同時並行操作として、各新鮮臓器として採取した部分を除く残存臓器部分と他の全ての臓器は、４％パラホルムアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて、直ちに浸潤固定した。
【００４１】
６．Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスと野生型同腹仔マウスの臓器組織のパラフィン包埋とパラフィン切片の作製
大脳・小脳・脳幹・脊髄をはじめとする全臓器はパラフィンに包埋してミクロトームで薄切した。即ち、臓器組織の処理は、臓器組織の固定、脱水、脱エタノール、パラフィン浸透、パラフィン包埋、パラフィン切片作製の６ステップの操作方法にて実施した。
１）臓器組織の固定は、各組織を４％パラホルムアルデヒド・０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．３）にて浸潤固定した。
２）臓器組織の脱水は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、水道水の流水にて一晩洗浄後、７０％エタノールにて１２時間室温、８０％エタノールにて１２時間室温、９０％エタノールにて１２時間室温、９９．５％エタノールにて１２時間室温、再度９９．５％エタノールにて１２時間室温、１００％エタノールにて１２時間室温、無水エタノールにて１２時間室温にて浸透させ、臓器組織の水分をエタノールに完全に置換した。
３）臓器組織の脱エタノールは、脱水用のエタノールを除去するために、クロロホルムにて置換した。クロロホルム置換は、クロロホルム槽内にて室温で２時間３回浸透させた。
４）臓器組織のパラフィン浸透工程は、臓器組織をクロロホルム槽から６０℃パラフィン槽に移すことにより実施した。
５）６０℃パラフィン槽内にて、２時間４回浸透させることにより、完全にクロロホルムを抜き、臓器組織にパラフィン浸透を完全に実施した。その後、包埋用パラフィンにて、臓器組織をパラフィン内に包埋した。
６）パラフィン切片の作製は、パラフィン包埋された臓器組織のパラフィンブロックを、ミクロトームにて５μｍ厚で薄切した。
【００４２】
７．組織化学的染色
１）パラフィン切片の組織化学的染色に先立ち、以下の脱パラフィン・親水操作を行った。即ち、脱パラフィン操作として、パラフィン切片をキシレン槽内に５分間４回入れ、次に親水操作として、脱パラフィン切片を１００％エタノール槽内に５分間２回、９５％エタノール槽内に５分間１回、９０％エタノール槽内に５分間１回、８０％エタノール槽内に５分間１回入れた。その後、水道水の流水にて洗浄を５分間行った。
【００４３】
２）組織化学的染色は、ヘマトキシリン・エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色とクリューバー・バレラ（Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色を行った。ＨＥ染色及びＫＢ染色操作後の切片は、脱水・透徹・封入の各工程を実施した。まず脱水工程を以下の手順で行った。５０％エタノール５分間３回、７０％エタノール５分間３回、８０％エタノール５分間３回、９０％エタノール５分間３回、９５％エタノール５分間３回、１００％エタノール５分間５回、無水エタノール５分間５回である。透徹工程は、キシレン５分４回浸透させた。封入工程は、封入剤（Ｎｅｗ  Ｍ・Ｘ；松浪硝子工業株式会社、大阪）をカバーグラスに少量たらし、空気を入れないように組織切片を覆った。
【００４４】
８．定量的解析法
定量的解析のための各マウス個体の脊髄からの標本作製部位は腰髄膨大部から２カ所の切り出しを実施した。異なる２カ所の腰髄膨大部から切り出されパラフィンブロック化したブロックから、５μｍ厚パラフィン切片として連続２６パラフィン切片を薄切した。連続２６パラフィン切片のうち１番目、７番目、１３番目、１９番目、２５番目の５μｍ厚パラフィン切片のそれぞれをＨＥ染色に供した。そして、２番目、８番目、１４番目、２０番目、２６番目の５μｍ厚パラフィン切片のそれぞれをクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色に供した。即ち、ＨＥ染色及びクリューバー・バレラ（Ｋｌuｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ）染色における各５μｍ厚パラフィン切片の間隔が２５μｍ間隔となるように標本作成した。
脊髄における運動神経細胞である脊髄前角細胞の細胞数を計測するために、連続２６パラフィン切片のうちの１番目、７番目、１３番目、１９番目、２５番目の各５μｍ厚パラフィン切片のそれぞれのＨＥ染色の脊髄前角領域、特に、脊髄におけるレキシード分類（Ｐａｒｅｎｔ  Ａ．  Ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ：ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ’ｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ，９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９６：３２５−６７）の領域ＶＩＩ、領域ＶＩＩＩ、領域ＩＸの各領域の写真を撮影した。写真撮影及び写真撮影後の画像イメージ解析は、画像イメージ解析ソフト（ＦＬＶＦＳ−ＬＳ  Ｖｅｒ．１．１２：オリンパス、東京、日本）搭載の３ＣＣＤデジタルカメラシステム（ＦＸ３８０：オリンパス，東京、日本）装備の光学顕微鏡（ＢＸ４１：オリンパス，東京、日本）にて、写真撮影と共に画像イメージ解析を実施した。
マウス脊髄における運動神経細胞である脊髄前角細胞の定義は次のごとくに決定した。即ち、２５μｍ以上の直径を持つ細胞質を有するレキシード分類の領域ＶＩＩ、領域ＶＩＩＩ、領域ＩＸに存在する神経細胞を脊髄前角細胞とした。（Ｋｌｉｖｅｎｙｉ  Ｐ，Ｆｅｒｒａｎｔｅ  ＲＪ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＲＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９；５：３４７−５０、Ｋｏｎｇ  Ｊ，Ｘｕ  Ｚ．Ｍａｓｓｉｖｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ＳＯＤ１．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９８；１８：３２４１−５０、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｂ，Ｎａｖａｒｒｅｔｅ  Ｒ，Ｇｕｉｌｏｆｆ  ＲＪ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｓｕｍｅｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｅ  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２００１；２７：３５２−６１、Ｓｕｍｉ  Ｈ，Ｎａｇａｎｏ  Ｓ，Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｒｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ａｎｄ  Ｌｅｗｙ−ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｈｙａｌｉｎｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇ９３Ａ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｄｉｓｍｕｔａｓｅ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ２００６；１１２：５２−６３）。
【００４５】
９．統計解析法
病悩期間日数（発症日を含め、臨床ステージ５度に至るまでの日数）・生存期間日数（臨床ステージ５度に至るまでの日数）及び脊髄前角細胞数の定量的数値は、平均値±標準偏差で表示した。すべての統計解析はマッキントッシュソフトウエアのＳｔａｔｖｉｅｗ（Ｖｅｒ．５．０，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア、米国）を用いて実施した。有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇ−ｒａｎｋ検定とＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用い、危険率Ｐ＜０．０５を持って統計的有意差が有ると判定した。
本研究は鳥取大学動物実験委員会の承認を得ている（承認番号１２−Ｙ−３４）。
【００４６】
ＩＩ．結果
１．プラセボ投与野生型同腹仔マウス実験群の臨床結果：
マウス用飲料水投与野生型同腹仔マウスは、ＡＬＳ臨床症状を発症しなかった。
【００４７】
２．プラセボ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス実験群の臨床結果：
マウス用飲料水投与実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの発症日は、１０５．２±０．４日、生存期間は、１２３．０±３．７日、病悩期間１８．８±３．６日であった。
【００４８】
３．２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス実験群の臨床結果：
２−ＤＧ投与実験群におけるＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群の発症日は、１０５．２±０．４日、生存期間１３７．６±３．４日、病悩期間３３．２±３．１日であった。
【００４９】
４．プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群との比較による２−ＤＧの有効性の解析結果：
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、ＡＬＳ発症と同時に、０．２６３ｍｇ２−ＤＧ／１ｃｍ２体表面積を連日経口に投与することにより、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法のＬｏｇ−ｒａｎｋ検定による解析を施行したところ、マウス用飲料水投与プラセボ群より、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０５）と生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．０５）を認めた（図２）。即ち、２−ＤＧ経口投与によって、病悩期間延長効果と生存期間延長効果の各効果の明らかな有効性を認めた。
【００５０】
Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスに、ＡＬＳ発症と同時に、０．２６３ｍｇ２−ＤＧ／マウス体表面積１ｃｍ２を連日経口に投与することにより、マウス用飲料水投与プラセボ群より、病悩期間を有意に延長させる病悩期間延長効果（Ｐ＜０．０５）と生存期間を有意に延長させる生存期間延長効果（Ｐ＜０．０５）を認めた。
【００５１】
５．プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群の終末期の神経病理学組織像に関する結果：
プラセボであるマウス用飲料水を投与した野生型同腹仔マウスの腰髄組織においては、ＨＥ染色及びＫＢ染色共に腰髄組織像としては、正常マウスの腰髄組織像と同一組織像を示した（図３）。
プラセボであるマウス用飲料水を投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの腰髄組織（図４）及び２−ＤＧを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの腰髄組織（図５）において、プラセボであるマウス用飲料水を投与した野生型同腹仔マウスの腰髄組織に比較して、ＨＥ染色及びＫＢ染色共に腰髄に存在する２５μｍ以上の直径を持つ細胞質を有する神経細胞である脊髄前角運動神経細胞は明らかに減少していた。ヒト遺伝性ＡＬＳにおいてはＳＯＤ１遺伝子異常が存在していた場合、両親のうちのいずれかからの遺伝で有り、１コピーの変異遺伝子導入といえる。しかるに、当該実験に使用したＡＬＳモデルマウスは、Ｇ９３Ａ点変異のヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を２０コピーから３０コピーも遺伝子導入させたＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスである。ヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を２０−３０コピーも遺伝子導入させたＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスのごとくの高コピー数においてさえ、２−ＤＧ経口投与により生命予後を有意に延命させた（図２）。Ｇ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスはＡＬＳモデルマウスという観点から異常遺伝子に基づいてＡＬＳで有り続けるようにデザインされた動物であることを考慮した場合、たとえ、２−ＤＧ経口投与により生命予後を有意に極長期に延命したとしても、運動麻痺により終末期を迎えた状態においては、最終的には、その運動を司る２５μｍ以上の直径を持つ腰髄前角運動神経細胞は減少することが判明した。
【００５２】
６．プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群の終末期の定量的残存前角細胞数解析に関する結果：  第一段階での第一治療実験系（終末期解析実験系）の２−ＤＧ治療実験系として、プラセボ投与群と２−ＤＧ投与実験群の人道的エンドポイントとした生存限界を確認したために、病理組織像の解析のための組織を採取した時期は、治療群ではプラセボ投与群よりも有意に延長した長い生存日数の時点であった。いずれの群も終末期つまり、臨床症状からは、四肢麻痺・呼吸筋麻痺で、臨床症状には差のない状態であり、病理組織学的にも、残存脊髄前角細胞数に有意差がないことは、容易に想像できた。しかしながら、極長期に生存しても、短期生存しても、臨床徴候が同一終末期であれば、真に病理組織像は同一であるという事柄を証明するためにも、ＡＬＳ発症の病理組織学的根拠として、脊髄前角の残存神経細胞数を解析した。
２５μｍ以上の直径を持つ細胞質を有する脊髄前角細胞数は、プラセボであるマウス用飲料水投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスコントロール群では１２．４±４．８であった。２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群では１２．８±５．８であった。終末期の直径２５μｍ以上の脊髄前角細胞数には両群に統計的に有意差は認められなかったことは当然の帰結であった（ｐ＝０．９１６３，Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）（図６）。
【００５３】
ＡＬＳの神経病理学的所見の本質は、脊髄前角細胞が変性し萎縮することである。ヒトのＡＬＳ剖検例における神経病理学的解析では、ヒトのＡＬＳ剖検例において変性し萎縮した残存脊髄前角細胞は一回り小型化したｓｍａｌｌ−ｓｉｚｅｄ  ｎｅｕｒｏｎｓとして同定される。つまり、脊髄前角細胞が残存していたとしても、ヒトにおいては、運動麻痺により終末期を迎えた状態においては、すべての脊髄前角細胞はＡＬＳの病態により、正常サイズを維持することが困難となる。このことはＧ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳモデルマウスにもあてはまり、プラセボを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（図４）に比較して、２−ＤＧを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（図５）は、２５μｍ以上の直径を持つ脊髄前角細胞は、統計的には有意差を認めなかったものの、２５μｍ未満の直径を持つ脊髄前角細胞数は残存していた（図４，図５）。即ち、病理組織学的には、終末期においてさえ、２−ＤＧを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（図５）の方が、プラセボを投与したＧ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（図４）より、脊髄運動神経細胞死を抑制していたと判定できた。
【００５４】
７．プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群の１１０日齢時点の病理学的組織像に関する結果：
終末期の臨床症状は、高度四肢麻痺・呼吸筋麻痺の状態で、プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群のＧ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳモデルマウスの生存期間には有意差があるものの、最終的な終末期の臨床像はほぼ同一となってしまう。これはつまり、病理組織学的にも、プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群のＧ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳモデルマウスでは、同程度の病理像を呈することを意味する。実際、２５μｍ以上の直径を持つという基準を満たす残存脊髄前角細胞数に関しては、終末期においては統計学的有意差は認められなかった。但し、マウス用飲料水を投与したコントロール群と比較して、２−ＤＧ投与実験群のＧ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳモデルマウスにおいては、やや小型萎縮した脊髄前角細胞は残存する傾向が見られた。このため、終末期に至る前の、コントロール投与実験群と２−ＤＧ投与実験群の間で臨床症状に差の見られた時点、つまり１１０日齢時点での病理組織像を解析した。
【００５５】
第二段階での第二治療実験系（１１０日齢解析実験系）として、コントロール群と２−ＤＧ投与実験群いずれも１１０日齢の時点の脊髄前角には、コントロール群と２−ＤＧ投与実験群の終末期（図４，５）と比較して、ＨＥ染色及びＫＢ染色において、直径２５μｍ以上の基準を満たす細胞が多く残存していた（図７，８）。また２５μｍ以上の直径を持つという基準を満たさない脊髄前角細胞も終末期のＨＥ染色及びＫＢ染色と比べて比較的多く観察された。プラセボであるマウス用飲料水を投与した１１０日齢の野生型同腹仔マウスの脊髄前角細胞数は、プラセボであるマウス用飲料水を投与した終末期に相当する野生型同腹仔マウスの脊髄前角細胞数と同一であった。Ｇ１Ｈ−Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳモデルマウスにおける前角神経細胞は、１００日齢の発症後、１１０日齢を過ぎてから、急激のその数を減じていくことが，終末期の病理組織像との比較より判明した。マウス用飲料水であるプラセボ投与実験群（図７）と２−ＤＧ投与実験群（図８）の１１０日齢の脊髄前角の病理組織像の比較では、２−ＤＧ投与実験群で残存脊髄前角細胞数は有意に多かった。
【００５６】
マウス用飲料水であるプラセボ投与実験群（図７）では、細胞質が萎縮し濃縮した脊髄前角細胞が３個みられる。一方、２−ＤＧ投与実験群では、まだ、比較的大きさの保たれていて、萎縮を示していない正常な脊髄前角細胞が６個確認される。２−ＤＧ投与実験群では、脊髄前角細胞の変性、萎縮、消失がマウス用飲料水であるプラセボ投与実験群と比べて有意に抑制され、有意な運動前角細胞死抑制が確認された。
【００５７】
６．プラセボ投与実験群と２−ＤＧ投与実験群の１１０日齢時点の定量的残存前角細胞数解析に関する結果：
１切片あたり２５μｍ以上の直径を持つ細胞質を有する脊髄前角細胞数は、プラセボであるマウス用飲料水投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスコントロール群では２．３±２．０であった。２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群では１０．６±４．７であった。既に、１１０日齢の時点の直径２５μｍ以上の脊髄前角細胞数には両群に統計的に有意差が認められ、２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群では脊髄前角細胞は有意な残存が認められた（ｐ＜０．０００１，Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）。この結果は、最も症状の進行が早く、生存期間の短い最も症状の激烈なＡＬＳモデルマウスにおいて、２−ＤＧによるＡＬＳ進行抑制、生存期間の延長というＡＬＳに対する有効性を実証するものである。しかも、２−ＤＧは、１日１回、経口投与で有効であることが判明し、ヒトへの応用が容易である。更に、生後１１０日齢の時点の病理組織像の解析から、２−ＤＧ投与群では、プラセボであるマウス用飲料水投与群に比べて、有意に残存脊髄前角細胞数が多く、有意に脊髄前角細胞死を抑制した。ＡＬＳに対する有効性は、１１０日齢の時点の２−ＤＧの病理組織像からも実証された。また、２−ＤＧ投与Ｇ１Ｈ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス治療実験群では、重大な有害な副作用を、臨床症状的にも、病理組織学的にも示さず安全性も確認した。
【図１】
0006607599.tif 000002
【図２】
0006607599.tif 000003
【図３】
0006607599.tif 000004
【図４】
0006607599.tif 000005
【図５】
0006607599.tif 000006
【図６】
0006607599.tif 000007
【図７】
0006607599.tif 000008
【図８】
0006607599.tif 000009