(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する際に、前記生理学的事象として前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の変化またはこれらの組み合わせを用いることを特徴とする被験物質の評価方法。
【請求項２】
前記低浸透圧液が、前記細胞内液の浸透圧よりも４０〜２００ｍＯｓｍ低い浸透圧を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生理的事象が、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる前記ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化である請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧料などの外用剤に清涼化剤、パラベン類、アルカリ剤などが含まれている場合、使用者によっては、前記外用剤を用いたときに、皮膚に不快な刺激を感じることがある。しかしながら、近年、使用者の安全意識の高まりから、このような不快な刺激を与えないか、または不快な刺激が少ない外用剤が好まれる傾向にある。
【０００３】
皮膚に対する物質の刺激性などの評価は、例えば、ヒトパッチ試験、ヒトによるスティンギング試験などの方法によって行なわれている。しかし、前記方法では、被験者によるバラつきなどが生じやすいため、評価結果に誤差が生じることがある。また、前記方法では、被験者によって、感覚刺激に対する感受性に違いがあるため、皮膚における感覚刺激の程度の違いを十分な感度で評価することができないことがある。したがって、前記方法には、皮膚における感覚刺激を再現性よく高い感度で評価し難いという欠点がある。
【０００４】
ところで、例えば、清涼化剤、パラベン類、アルカリ剤などは、一過性受容体電位チャネルの１つであるＴＲＰＡ１を活性化し、活性化されたＴＲＰＡ１を介して不快な刺激を引き起こすことが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−０７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−０８２０５３号公報
【特許文献３】特開２００９−２２５７３３号公報
【特許文献４】特開２０１２−０６２３０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、ＴＲＰＡ１と低浸透圧との関連性や、前記関連性を利用して、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を再現性よく高い感度で評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する際に、前記生理学的事象として前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の変化またはこれらの組み合わせを用いることを特徴とする被験物質の評価方法、
（２）前記低浸透圧液が、前記細胞内液の浸透圧よりも４０〜２００ｍＯｓｍ低い浸透圧を有する前記（１）に記載の方法、ならびに
（３）前記生理的事象が、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる前記ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化である前記（１）または（２）に記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を再現性よく高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例１において、細胞内液の浸透圧との差と細胞面積上昇率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】試験例１において、細胞内液の浸透圧との差とＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図３】(Ａ)は試験例１において、低浸透圧液と接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液と接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）はＴＲＰＡ１アンタゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アンタゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例１において、細胞内液の浸透圧との差と蛍光強度比との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．被験物質の評価方法
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ（すなわち、低浸透圧液中で前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ）、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価することを特徴とする。
【００１２】
本発明の被験物質の評価方法は、前記低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価するという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。前記低浸透圧液によれば、ＴＲＰＡ１が活性化される。そのため、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記操作が行なわれているので、細胞内液と同じ浸透圧を有する等浸透圧液を用いた場合と比べ、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を高い感度で測定することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記操作が行なわれているので、被験物質が少量であっても、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を高い感度で評価することができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する際に、前記ＴＲＰＡ１発現細胞を用いてＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定しているので、同一条件下に同時に何回も並行して評価を行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を再現性よく評価することができる。
【００１３】
前記被験物質としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、ＴＲＰＡ１発現細胞の生育、ＴＲＰＡ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１４】
本明細書において、特に断りのない限り、浸透圧〔ｍＯｓｍ（イオン量換算）〕は、式（Ｉ）：
【００１５】
〔浸透圧（ｍＯｓｍ）〕
＝〔電解質イオン量〕＋〔浸透圧調整剤量〕                              （Ｉ）
【００１６】
（式中、「電解質イオン量」は浸透圧に影響を与える電解質を構成する電解質アニオンおよび電解質カチオンそれぞれのモル数の和、「浸透圧調整剤量」は浸透圧調整剤のモル数を示す）
に基づいて算出される。
【００１７】
前記電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどのハロゲン化アルカリ土類金属などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記前記浸透圧調整剤としては、例えば、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１８】
前記前記浸透圧調整剤としては、例えば、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書において、細胞内液の浸透圧（以下、「浸透圧Ａ」ともいう）よりも低浸透圧液の浸透圧（以下、「浸透圧Ｂ」ともいう）との差（浸透圧Ａ−浸透圧Ｂ）は、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、ＴＲＰＡ１活性化作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは４０ｍＯｓｍ（９０８ｈＰａ）以上、より好ましくは８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）以上であり、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは２００ｍＯｓｍ（４５４０ｈＰａ）以下、より好ましくは１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）以下である。前記浸透圧Ｂは、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、ヒトの細胞の細胞内液の浸透圧は、通常、２８０〜３２０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：６３５６〜７２６４ｈＰａ）、好ましくは３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）である。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞がヒトの細胞に由来する場合、前記低浸透圧液の浸透圧は、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは１００ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：２２７０ｈＰａ）以上、より好ましくは１４０（２５℃での浸透圧：３１７８ｈＰａ）ｍＯｓｍ以上であり、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、ＴＲＰＡ１活性化作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは２６０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５９０２ｈＰａ）以下、より好ましくは２４０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５４４８ｈＰａ）以下である。
【００２０】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つであるＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、ＴＲＰＡ１アゴニストによる化学刺激、冷覚刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能；前記刺激による細胞における膜電位の調節能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ＴＲＰＡ１のアゴニストとしては、例えば、メントール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、アルカリ剤（例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、水酸化カリウムなど）、アリルイソチオシアネート、メチルパラベン、アリシン、イシリン、過酸化水素、ブラジキニン、アクロレイン、香油成分（例えば、シトラール、オイゲノール、シンナムアルデヒドなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２１】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、内因性ＴＲＰＡ１を発現している内因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよい。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で的確に測定することができる観点から、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞が好ましい。
【００２２】
前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞としては、例えば、感覚神経細胞、内耳細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、ヒトにおける被験物質のＴＲＰＡ１活性化作用を的確に評価する観点から、好ましくはヒト由来の細胞である。
【００２３】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２４】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。
【００２５】
ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。ヒトにおける被験物質のＴＲＰＡ１活性化作用を的確に評価する観点から、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。なお、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づき設計され、合成された２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などにより得られる。
【００２６】
変異型核酸としては、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  １１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１が有する生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されない。
【００２７】
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によりコードされるポリペプチドの生理学的機能と同等またはそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と、配列番号：１に対する配列相同性が少なくとも８０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２８】
組換えベクターは、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後の細胞のなかからの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択が容易であることから、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。また、ベクターは、必要により、ＴＲＰＡ１を連結させるための部位の上流に、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるに適した発現プロモーターを有していてもよい。ベクターとしては、例えば、大腸菌のプラスミドベクター、酵母のプラスミドベクターなどのプラスミドベクター；レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２９】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質のＴＲＰＡ１活性化作用を的確に評価する観点から、好ましくは動物細胞である。前記動物細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などのヒト細胞；ＣＯＳ−７細胞などのサル細胞；ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などのマウス細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの動物細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質のＴＲＰＡ１活性化作用を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。
【００３０】
形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞である場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。
【００３１】
前記低浸透圧液は、例えば、精製水と電解質とイオン強度に関係しない浸透圧調整剤とを混合することなどによって得ることができる。
【００３２】
前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、被験物質の量は、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００３３】
前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、１ｃｍ2あたりのＴＲＰＡ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、１×１０3細胞以上、より好ましくは１×１０4細胞以上であり、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、１×１０6細胞以下、より好ましくは５×１０5細胞以下である。
【００３４】
前記生理学的事象としては、例えば、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。
【００３６】
前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用は、例えば、前記低浸透圧液と前記被験物質とに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度と、前記低浸透圧液と接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度との差；前記低浸透圧液と前記被験物質とに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位と、前記低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位の差、これらの組み合わせなどを調べることにより測定される。
【００３７】
前記生理学的事象として、前記被験物質の接触前後に前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を用いる場合、前記低浸透圧液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内では、細胞内液の浸透圧と同じ浸透圧を有する等浸透圧液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が増大する。したがって、前記低浸透圧液と前記被験物質とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞では、前記等浸透圧液と被験物質とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が相対的に増大し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加の幅が大きくなる。よって、前記低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞との接触により、細胞内カルシウムイオン濃度をより高感度で測定することができる。この場合、前記被験物質がＴＲＰＡ１活性化作用を有することの判断基準としては、例えば、
（Ｉ）前記低浸透圧液と被験物質とに接触させたときの前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度が、前記低浸透圧液に接触させたときの前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度よりも大きいこと、
（ＩＩ）前記低浸透圧液と被験物質とに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、細胞内液と同じ浸透圧を有する等浸透圧液と被験物質とに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度との差が、前記低浸透圧液とＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、前記等浸透圧液とＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差と同じであるかそれよりも大きいこと
などが挙げられる。
【００３８】
前記カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、当該ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに前記カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を定量する方法などによって測定することができる。
【００３９】
前記カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を簡便な操作で定量することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。前記光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。前記カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記カルシウム指示薬のなかでは、測定が容易であり、かつＴＲＰＡ１発現細胞内に存在する夾雑物質の動態との区別化が容易である観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、ＦＵＲＡ  ２、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。前記カルシウム指示薬が前記蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光マグネシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、しかも被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用の評価の精度をより高めることができることから、２種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬が好ましい。
【００４０】
カルシウムイオン濃度の測定に際し、１種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、ＴＲＰＡ１活性化作用を評価することができる。また、カルシウムイオン濃度の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用の評価の精度をより高める観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長それぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、ＴＲＰＡ１活性化作用を評価することができる。
【００４１】
カルシウムイオン濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。この場合、前記蛍光強度比は、例えば、式（ＩＩ）：
【００４２】
蛍光強度比＝第１蛍光強度／第２蛍光強度                                （ＩＩ）
【００４３】
にしたがって求めることができる。この場合、前記被験物質がＴＲＰＡ１活性化作用を有することの判断基準としては、例えば、
（ｉ）前記低浸透圧液と被験物質とに接触させたときの蛍光強度比〔以下、「蛍光強度（Ａ）」という〕が、前記低浸透圧液に接触させたときの蛍光強度比〔以下、「蛍光強度（Ｂ）」という〕よりも大きいこと、
（ｉｉ）前記低浸透圧液と被験物質とに接触させたときの蛍光強度比（Ａ）と、前記等浸透圧液と被験物質とに接触させたときの蛍光強度比〔以下、「蛍光強度（Ｃ）」という〕との差〔蛍光強度比（Ａ）−蛍光強度比（Ｃ）〕が、前記低浸透圧液とＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとに接触させたときの蛍光強度比〔以下、「蛍光強度（Ｄ）」という〕と、前記等浸透圧液とＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとに接触させたときの蛍光強度比〔以下、「蛍光強度（Ｅ）」という〕との差〔蛍光強度比（Ｄ）−蛍光強度比（Ｅ）〕と同じであるかそれよりも大きいこと
などが挙げられる。
【００４４】
前記生理学的事象として、前記ＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の変化を用いる場合、前記被験物質がＴＲＰＡ１活性化作用を有することの判断基準としては、例えば、前記低浸透圧液と被験物質とに接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内における一定電位下での電流〔以下、「電流（Ａ）」という〕が、前記低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞内における一定電位下での電流〔以下、「電流（Ｂ）」という〕よりも大きいことなどが挙げられる。前記電流の変化の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４５】
なお、前記低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させるに先立って、生理学的機能を発現させるに適した状態にＴＲＰＡ１発現細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞を、任意の時間培養してもよい。ＴＲＰＡ１発現細胞の培養方法は、用いられる細胞の種類に応じた方法であればよく、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などの方法が挙げられる。また、培養温度、培養時間、培養液のｐＨ、二酸化炭素濃度などの培養条件は、用いられる宿主細胞に応じて適宜設定される。ＴＲＰＡ１発現細胞に用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞は、細胞を良好に生育させる観点から、通常、５体積％二酸化炭素中、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で培養される。ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＡ１発現細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に、前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地などが挙げられる。ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地は、ＴＲＰＡ１発現細胞の種類により培養条件が異なるため、一概に決定することができない。例えば、用いられるＴＲＰＡ１発現細胞が、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００４６】
本発明の被験物質の評価方法に供することによって、ＴＲＰＡ１の活性化物質であることが判明した被験物質は、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす物質であると考えられる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、例えば、化粧料などの外用剤などの成分として用いられる化合物などを被験物質として用いることにより、前記化合物などが感覚刺激を引き起こさないかどうかを調べることができる。これにより、感覚刺激を引き起こす物質を予め除外することも可能となる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、感覚刺激を引き起こす物質のスクリーニング、薬理学的評価などを行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、皮膚トラブルを生じやすいヒトに適した化粧料などの外用剤などの開発に用いられることが期待されるものである。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、バスソリューションの浸透圧（イオン量換算）は、式（Ｉ）にしたがって算出された値である。
【００４８】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００４９】
また、５体積％二酸化炭素雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００５０】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００５１】
（製造例２）
塩化ナトリウム、マンニトール、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコースおよび２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸緩衝液（以下、「ＨＥＰＥＳ緩衝液」ともいう）（ｐＨ７．４）を、下記組成：６０ｍＭ塩化ナトリウム、１６０ｍＭマンニトール、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、細胞内液の浸透圧と同じ浸透圧を有するバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）〕を得た。
【００５２】
（製造例３）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を８０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）〕を得た。
【００５３】
（製造例４）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を４０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１２０ｍＯｓｍ（２７２４ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）〕を得た。
【００５４】
（製造例５）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）であるを有するバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）〕を得た。
【００５５】
（試験例１）
（１）低浸透圧刺激と細胞面積上昇率との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞（５×１０4細胞）を循環チャンバー〔ワーナーインストゥルメンツ製、商品名：ＲＣ−２６〕に入れた。その後、チャンバー中のＴＲＰＡ１発現細胞を、浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）を有する標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊ〔アメリカ国立衛生研究所のウェブページｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／にて提供〕とを用い、細胞内液と同じ浸透圧を有する等浸透圧液と接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ0」ともいう）を求めた。
【００５６】
つぎに、洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例２〜５で得られたバスソリューションを添加した。前記バスソリューションの添加後の細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊとを用い、細胞内液よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ1」ともいう）を求めた。
【００５７】
つぎに、細胞面積Ａ0および細胞面積Ａ1を用い、式（ＩＩＩ）：
細胞面積上昇率
＝（細胞面積Ａ1−細胞面積Ａ0）／細胞面積Ａ0      （ＩＩＩ）
【００５８】
に基づいて細胞面積上昇率を求めた。
【００５９】
試験例１において、細胞内液の浸透圧との差と細胞面積上昇率との関係を調べた結果を図１に示す。
【００６０】
図１に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、細胞面積上昇率が高いことがわかる。
【００６１】
（２）低浸透圧刺激とＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１活性化度との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕にて洗浄した。つぎに、ＴＲＰＡ１発現細胞を製造例２、製造例３、製造例４または製造例５で得られたバスソリューションに曝露した。曝露後１分間経過後に、溶液Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕を含む電極の先端を前記ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ１０〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕とを用い、電圧を６０ｍＶに固定したときの電流変化を測定した。
【００６２】
算出された開口確率（Ｐｏ）と、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数とを用い、式（ＩＶ）：
【００６３】
ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）
＝ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数（Ｎ）×開口確率（Ｐｏ）    （ＩＶ）
【００６４】
にしたがって、ＴＲＰＡ１活性化度を求めた。
【００６５】
試験例１において、細胞内液の浸透圧との差とＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を図２に示す。
【００６６】
図２に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）が大きいことがわかる。これらの結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液により、ＴＲＰＡ１発現細胞のＴＲＰＡ１がより活性化されることがわかる。したがって、これらの結果から、ヒトにおいて、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、痛覚が引き起こされることが示唆される。また、これらの結果から、例えば、ヒトの眼に低浸透圧液が接触したときにヒトが知覚する眼刺激感は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、引き起こされることが示唆される。
【００６７】
（３）細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１活性化度の変化との関係の評価
試験例１（１）において、製造例２、製造例３または製造例５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率を求めた。また、試験例１（２）において、製造例２〜５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、前記種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（２）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。
【００６８】
また、前記において、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いる代わりに、１μＭＴＲＰＡ１アゴニスト（アリルイソチオシアネート）を含有し、かつ種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率およびＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。
【００６９】
試験例１において、低浸透圧液を接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液を接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３(Ａ)、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図中、Ｒは相関係数を示す。
【００７０】
図３（Ａ）および（Ｂ）に示された結果から、低浸透圧液を接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液を接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間およびＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の両方において、相関係数Ｒが０．５１であることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧液を接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液を接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間には、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の場合と同様に正の相関がみられることがわかる。これらの結果から、低浸透圧液による細胞の膨張と、細胞内カルシウム濃度の増加とが関連していることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧によって細胞が膨張することにより、ＴＲＰＡ１の活性が増大することが示唆される。
【００７１】
（製造例６）
アリルイソチオシアネート、塩化ナトリウム、マンニトール、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコースおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、下記組成：１μＭアリルイソチオシアネート、６０ｍＭ塩化ナトリウム、１６０ｍＭマンニトール、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、細胞内液の浸透圧と同じ浸透圧を有するバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）〕を得た。
【００７２】
（製造例７）
製造例６において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を８０ｍＭに設定したことを除き、製造例６と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）〕を得た。
【００７３】
（製造例８）
製造例６において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を４０ｍＭに設定したことを除き、製造例６と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１２０ｍＯｓｍ（２７２４ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）〕を得た。
【００７４】
（製造例９）
製造例６において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を０ｍＭに設定したことを除き、製造例６と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）〕を得た。
【００７５】
（実施例１）
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００７６】
得られたＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶液Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００７７】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例２〜９で得られたバスソリューションを添加した。なお、製造例２で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）、製造例３で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）、製造例４で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）、製造例５で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）、製造例６で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）、製造例７で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）、製造例８で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）、製造例９で得られたバスソリューションとＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）であった。
【００７８】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３４０ｎｍ」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３８０ｎｍ」という）を測定した。
【００７９】
測定された蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを用い、式（Ｖ）：
蛍光強度比＝蛍光強度３４０ｎｍ／蛍光強度３８０ｎｍ                      （Ｖ）
に基づいて蛍光強度比を求めた。
【００８０】
実施例１において、細胞内液の浸透圧との差と蛍光強度比との関係を調べた結果を図４に示す。図中、黒色バーは被験物質として既知のＴＲＰＡ１アゴニストであるアリルイソチオシアネートを含有するバスソリューション（製造例６〜９のバスソリューション）を用いたときの蛍光強度比、白色バーはアリルイソチオシアネートを含有しないバスソリューション（製造例１〜５のバスソリューション）を用いたときの蛍光強度比を示す。
【００８１】
図４に示された結果から、バスソリューションの浸透圧が低いほど、細胞内液と同じ浸透圧〔浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）〕を有するバスソリューションを用いたときの蛍光強度比と比べ、蛍光強度比が大きいことがわかる。また、ＴＲＰＡ１アゴニストであるアリルイソチオシアネートを含有するバスソリューションを用いたときの蛍光強度比は、アリルイソチオシアネートを含有しないバスソリューションを用いたときの蛍光強度比と比べ、著しく高いことがわかる。これらの結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときの生理学的事象であるカルシウムイオン流入の度合いが、細胞内液と同じ浸透圧を有する等浸透圧液（製造例２のバスソリューション）下に被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときの生理学的事象であるカルシウム流入の度合いと比べ、より顕著になっていることがわかる。
【００８２】
したがって、これらの結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価することにより、被験物質が少量であっても、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を高い感度で評価することができることがわかる。また、前記被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を評価する際に、前記ＴＲＰＡ１発現細胞を用いてＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する場合、同一条件下に同時に何回も並行して評価を行なうことができることから、前記操作を行なうことにより、被験物質が有するＴＲＰＡ１活性化作用を再現性よく評価することができることがわかる。
【００８３】
以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法に供することによって、ＴＲＰＡ１の活性化物質であることが判明した被験物質は、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす物質であると考えられる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、例えば、化粧料などの外用剤などの成分として用いられる化合物などを被験物質として用いることにより、前記化合物などが感覚刺激を引き起こさないかどうかを調べることができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、感覚刺激を引き起こす物質のスクリーニング、薬理学的評価などを行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、皮膚トラブルを生じやすいヒトに適した化粧料などの外用剤などの開発に用いられることが期待されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006508969.tif 000004
【図４】
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【配列表】
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