(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５４で表される３０番がアルギニン、３９番がアスパラギン、１０５番がトレオニン、１４５番がフェニルアラニン、１７１番がバリン、及び２０６番がバリンであるｓｆＧＦＰタンパク質のアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、
前記提示が、４〜１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示タンパク質。
【請求項２】
前記配列番号５４で表される３０番がアルギニン、３９番がアスパラギン、１０５番がトレオニン、１４５番がフェニルアラニン、１７１番がバリン、及び２０６番がバリンであるｓｆＧＦＰタンパク質のアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ提示されたペプチドの構造自由度が制限され、そして蛍光発生活性を有する請求項１に記載のペプチド提示タンパク質。
【請求項３】
前記挿入又は置換される４〜１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質、又は請求項４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、請求項７の宿主細胞を含むライブラリー。
【請求項９】
（１）（ａ）配列番号５４で表される３０番がアルギニン、３９番がアスパラギン、１０５番がトレオニン、１４５番がフェニルアラニン、１７１番がバリン、及び２０６番がバリンであるｓｆＧＦＰタンパク質のアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質、
（ｂ）配列番号５４で表される３０番がアルギニン、３９番がアスパラギン、１０５番がトレオニン、１４５番がフェニルアラニン、１７１番がバリン、及び２０６番がバリンであるｓｆＧＦＰタンパク質のアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、提示されたペプチドの構造自由度が制限され、そして蛍光発生活性を有するペプチド提示用タンパク質、又は
（ｃ）前記ペプチド提示用タンパク質（ａ）又は前記ペプチド提示用タンパク質（ｂ）と、表面提示タンパク質との融合タンパク質、
をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに、
４〜１５個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下であるペプチド、
をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び
（２）前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
を含むライブラリーの構築方法。
【請求項１０】
（１）標的分子及び請求項８に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、
（２）標的分子に結合した宿主細胞を回収する工程、
を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法。
【請求項１１】
（３）前記回収した宿主細胞を増幅する工程、
を更に含む請求項１０に記載のペプチドのスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記接触工程（１）、宿主細胞回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返す、請求項１１に記載のペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーに関する。本発明によれば、標的分子に対して特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
標的分子に高い特異性をもって結合する機能性ペプチドは創薬にとって有用であり、それらを獲得するために、各種のペプチド提示技術によるペプチドライブラリーの作製とハイスループットなスクリーニング技術が多数開発されている。具体的なペプチドライブラリーのための提示法としては、ファージ提示法（ファージディスプレイ）、大腸菌提示法、又は酵母提示法などが用いられている。例えば、ファージディスプレイでは、スクリーニングされるペプチドは、バクテリオファージ被膜タンパク質へのポリペプチド融合体として発現される。ペプチドがディスプレイされたファージ粒子を、標的物質が固定化されたマイクロタイタープレートと接触させ、アフィニティセレクションを行うことにより、標的物質と親和性を有するペプチドを持ったファージを濃縮することができる（非特許文献１）。
ファージディスプレイ法では、濃縮されたファージに提示されたペプチドと、それをコードする遺伝子が１対１で対応するため、目的のペプチドが容易に特定可能である。また、遺伝子を容易に増幅（増殖）できるため、ペプチドのスクリーニング方法として、広範に用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「サイエンス（Science）」（米国）１９９０年、第２４９巻、ｐ．３８６−３９０
【非特許文献２】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」（英国）２００６年、第２４巻、ｐ．７９−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のディスプレイ法で得られたペプチドは、標的分子と結合できるが、他の分子とも結合することが多かった。すなわち、標的分子との特異性が低いペプチドもスクリーニングされるため、医薬として実用化できないことが多かった。
従って、本発明の目的は、標的分子との特異性の高いペプチドのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、スクリーニングされたペプチドの特異性が低いことについて、鋭意検討した結果、従来のディスプレイ法によって提示されたペプチドは、その構造が自由に変化できる条件でスクリーニングされているのではないかと考えた。そのため、候補ペプチドとして得られたペプチドの多くが標的物質以外の分子にも結合してしまうと考えた。
本発明者は、提示されるペプチドの構造の自由度を抑制する方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ（非特許文献２；以下、ｓｆＧＦＰと称することがある）の１３１番〜１３９番の領域にペプチドを組込むことにより、ペプチドの構造の自由度が抑制され、標的分子と特異的に結合することのできるペプチドをスクリーニングできることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４〜１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示タンパク質、
［２］前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する［１］に記載のペプチド提示タンパク質、
［３］前記挿入又は置換される４〜１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質、
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
［５］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質、又は［４］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［６］［５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［７］［６］に記載のベクターを含む宿主、
［８］前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、［７］の宿主を含むライブラリー、
［９］配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４〜１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示用タンパク質、
［１０］前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する［９］に記載のペプチド提示用タンパク質、
［１１］前記挿入又は置換される４〜１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列である、［９］又は［１０］に記載のペプチド提示用タンパク質、
［１２］前記［９］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
［１３］前記［９］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び［１２］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［１４］［１３］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［１５］［１４］に記載のベクターを含む宿主、
［１６］（１）前記［１４］に記載のベクターに、４〜１５個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び（２）前記発現ベクターを宿主に導入する工程、を含むライブラリーの構築方法、
［１７］（１）標的分子及び［８］に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）標的分子に結合した宿主を回収する工程、を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法、
［１８］（３）前記回収した宿主を増幅する工程、を更に含む［１７］に記載のペプチドのスクリーニング方法、及び
［１９］前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返す、［１８］に記載のペプチドのスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーによれば、標的分子に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。また、ペプチドを提示させる親タンパク質であるｓｆＧＦＰは、蛍光タンパク質であるため、蛍光強度によって簡便に分子数を見積もることができる。従って、スクリーニングの際のペプチドの結合量を評価するのに有用である。本発明は、汎用されている提示技術（例えば、ファージ提示法、大腸菌提示法、酵母提示法、インビトロウイルス法、又はリボゾームディスプレイ法）に適用できる。従って、既存のハイスループットなスクリーニング技術に応用可能である。更に、本発明により得られるペプチドの配列情報、構造情報を基に分子標的治療薬の開発、ドラッグデリバリーシステムの開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｓｆＧＦＰの全長のアミノ酸配列、及び１３１番から１３９番のアミノ酸配列（白抜き）を示した図である。
【図２】実施例１〜１５及び比較例１〜５で導入されたカスパーゼ３認識ペプチドのカスパーセ３による切断を示した写真である。
【図３】実施例１〜１５及び比較例１〜５のペプチド提示タンパク質の、蛍光強度を示したグラフである。
【図４】ペプチド提示タンパク質に組み込んだペプチド（ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ７（比較例３））の分子動力学シミュレーションを示した図である。
【図５】乳がん細胞で高頻度に過剰発現が起こるＨＥＲ２タンパク質に結合するペプチドの配列（Ａ）及びそのペプチドを組込んだペプチド提示タンパク質のＨＥＲ２への結合（Ｂ）を示した図である。
【図６】１３１番〜１３７番における本発明のペプチド提示タンパク質であるｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）のアミノ酸配列（Ａ）及び分子動力学シミュレーション（Ｂ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］ペプチド提示タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主
《ペプチド提示タンパク質》
本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４〜１５個（好ましくは４〜１４個、より好ましくは４〜１３個、更に好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下、より好ましくは１３個以下、更に好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは５個以上である。本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献２に記載のｓｆＧＦＰであるが、本発明のペプチド提示タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができる。すなわち、ＧＦＰ又はＧＦＰ由来のＧＦＰ変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、又はＲＦＰを挙げることができる。
本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３８番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４〜１４個（好ましくは４〜１３個、より好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３８番のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下、より好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１３９番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３７番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４〜１３個（好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３７番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３７番のアミノ酸配列の１〜７個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１３個以下（好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１３９番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
なお、提示されるペプチドの長さが短い方が、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。また、提示される領域が１３１〜１３９番の領域に比べて、１３１番〜１３８番の領域、又は１３１番〜１３７番の領域の場合、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。
【０００９】
《ペプチド提示用タンパク質》
本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４〜１５個（好ましくは４〜１４個、より好ましくは４〜１３個、更に好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下、より好ましくは１３個以下、更に好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは５個以上である。
更に、本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１４０番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する前記のペプチド提示用タンパク質であってもよい。配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献２に記載のｓｆＧＦＰであるが、本発明のペプチド提示用タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができる。すなわち、ＧＦＰ又はＧＦＰ由来のＧＦＰ変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、又はＲＦＰを挙げることができる。
本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３８番の領域にペプチドを提示できるペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４〜１４個（好ましくは４〜１３個、より好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３８番のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下、より好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１３９番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番〜１３７番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４〜１３個（好ましくは４〜１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３７番のアミノ酸配列の１〜７個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番〜１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１３個以下（好ましくは１２個以下）である。また、１３１番〜１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番〜１３０番のアミノ酸配列又は１３９番〜２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
【００１０】
本明細書において、「ペプチド提示タンパク質」とは、例えばｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番の領域に、ペプチドが提示されたタンパク質を意味する。例えば、１３１番〜１３９番の領域に、ペプチドスクリーニングに用いる任意のペプチドが既に組込まれたｓｆＧＦＰのタンパク質を意味する。具体的な１つの態様としては、本発明のペプチドライブラリーに含まれるベクターから発現されるタンパク質を意味する。
一方、本明細書において「ペプチド提示用タンパク質」とは、例えばｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番の領域に、ペプチドが提示可能なように設計されたタンパク質を意味する。例えば、１３１番〜１３９番の領域に、ペプチドスクリーニングに用いる任意のペプチドが組込み可能であるが、まだスクリーニングされるペプチドが組込まれていないｓｆＧＦＰのタンパク質を意味する。具体的な１つの態様としては、ｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番の領域にペプチドが組込み可能に設計されたベクターから、翻訳されるタンパク質を意味する。従って、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するための制限酵素サイトを有することが好ましい。
前記１３１番〜１３９番の領域は、好ましくは１３１番〜１３８番の領域であり、更に好ましくは１３１番〜１３７番の領域である。領域の長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。更に、挿入されるペプチドの長さは、好ましくは４〜１５個であり、より好ましくは４〜１４個であり、更に好ましくは４〜１３個であり、最も好ましくは４〜１２個である。挿入されるペプチドの長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。
【００１１】
（提示領域：１３１番〜１３９番のアミノ酸配列）
ｓｆＧＦＰのアミノ酸配列における１３１番〜１３９番のアミノ酸配列は「ＫＥＤＧＮＩＬＧＨ」（配列番号７８）である。この９個のアミノ酸配列の領域を、４〜１５個（好ましくは４〜１４個）のアミノ酸配列からなるペプチドに置換した場合、ペプチドの構造自由度が制限され、安定した構造でｓｆＧＦＰ上に提示される。そのため、ペプチドライブラリーとして用いることにより、標的分子に対して特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
提示領域が１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は４〜１５個であり、好ましくは４〜１４個であり、１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１部を含んでいてもよい。従って、１３１番〜１３９番のアミノ酸配列を欠失することなく、４〜６個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の１〜９個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で５〜１５個、好ましくは５〜１４個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
提示領域は、好ましくは１３１番〜１３８番のアミノ酸配列である。この場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は４〜１４個であり、好ましくは４〜１３個であり、１３１番〜１３８番のアミノ酸配列の１部を含んでいてもよい。従って、１３１番〜１３８番のアミノ酸配列を欠失することなく、４〜６個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、１３１番〜１３８番のアミノ酸配列の１〜８個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で４〜１４個、好ましくは４〜１３個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
更に、効率的にペプチドライブラリーを構築するためには、挿入又は置換されるペプチドの両末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチドの組み込みに用いられる制限酵素サイトは、限定されるものではないが、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳｓｐＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＭｆｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｂｆＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｃｉＩ、ＨｐａＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＫｐｎＩ又はＢｓａＩを用いることができる。例えば、挿入又は置換される４〜１４個のペプチドの両末端のアミノ酸配列はこれらの制限酵素が認識する塩基配列を含むヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列であってもよい。
なお、このような制限酵素サイトから翻訳されるペプチドをリンカーペプチドと称することがある。
【００１２】
（アミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加）
前記のように、本発明の「ペプチド提示タンパク質」、及び「ペプチド提示用タンパク質」の親タンパク質は、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができるが、ＧＦＰ系のタンパク質をコードするアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するタンパク質であってもよい。
本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸」とは、ＧＦＰ系のタンパク質であることを意味するか、又は部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、更により好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００１３】
本明細書において「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。また、化学的に類似していない場合でも、アミノ酸の構造が類似したアミノ酸残基で置き換えてもよい。例えばアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）への置換、アスパラギン（Ｅ）からアラニン（Ａ）への置換、チロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換などを挙げることができる。
【００１４】
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質とが融合したタンパク質である。
本明細書において、表面提示タンパク質とは、後述の宿主の表面に提示されるタンパク質を意味する。例えば、宿主がファージの場合は、ファージの表面タンパク質を意味する。また、宿主が細菌の場合は、細菌表面タンパク質を意味する。更に、宿主が酵母の場合は、酵母の表面タンパク質を意味し、宿主が動物細胞の場合は、動物細胞の表面タンパク質を意味する。
ペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、宿主の表面たんぱく質とが融合することにより、ペプチド提示タンパク質は、宿主の表面に提示されることができる。従って、本発明のペプチドライブラリーを用いて、目的ペプチドのアフィニティーセレクション（スクリーニング）を行う場合、容易に目的ペプチドの濃縮を行うことができる。
【００１５】
ファージの表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｍ１３ファージのｇ３ｐ、ｇ８ｐ、又はＴ７ファージのＧ１０を挙げることができる。
細菌の表面タンパク質、例えば大腸菌の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、ＯｍｐＡを挙げることができる。
酵母の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｆｌｏ１、αアグルチニン、又はＡＧＡ２を挙げることができる。
動物細胞の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、human Toll-like receptor 4、ＥＧＦＲ、LDL receptor、angiotensin II receptor、又はＰＤＧＦＲを挙げることができる。
【００１６】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチド提示タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、ペプチド提示ポリヌクレオチドと称することがある）、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、ペプチド提示用ポリヌクレオチドと称することがある）、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、融合ポリヌクレオチドと称することがある）である。融合ポリヌクレオチドは、ペプチド提示タンパク質又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質との間に存在することのあるリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。なお、配列番号５３の塩基配列は、ｓｆＧＦＰをコードするヌクレオチドの塩基配列である。
【００１７】
（ベクター）
本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、ペプチド提示タンパク質、又は融合タンパク質として、容易に発現させることができる。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
例えば、本発明のライブラリーとして用いる場合、Ｍ１３ファージベクター、又はＴ７ファージベクターを用いることが好ましい。ファージディスプレイのベクターとして用いることができるからである。
【００１８】
（宿主）
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、ペプチド提示タンパク質又は融合タンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものでなく、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
【００１９】
［２］ライブラリー
本発明のライブラリーは、ペプチド提示ライブラリーであり、提示されるペプチドは任意のアミノ酸配列を有するものである。本発明のペプチド提示ライブラリーは、標的分子に結合するペプチドをスクリーニングするために用いることができる。従って提示されるペプチドは、ランダムなアミノ酸配列からなる複数（多種類）のペプチドが含まれているものが好ましい。また、本発明のライブラリーは、前記の宿主を含むライブラリーであり、ファージディスプレイ、又は細菌、酵母、昆虫細胞、若しくは動物細胞の細胞ディスプレイのライブラリーを挙げることができる。
本発明のライブラリーを用いたスクリーニングに供される提示ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、例えば４〜１５であり、好ましくは４〜１４であり、より好ましくは４〜１３である。
【００２０】
［３］ライブラリーの構築方法
本発明のライブラリーの構築方法は、（１）本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、４〜１５個（好ましくは４〜１４個）のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１〜９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番〜１３９番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下）であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び（２）前記ベクターを宿主に導入する工程、
を含む。ライブラリーは、具体的にはペプチド提示ライブラリーであり、任意のペプチドを提示することのできるライブラリーである。
本発明のライブラリーの構築方法は、好ましくは（１）本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、４〜１４個（好ましくは４〜１３個）のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番〜１３８番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番〜１３８番の提示領域のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番〜１３８番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下）であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び（２）前記ベクターを宿主に導入する工程、を含む。
【００２１】
ライブラリーの構築方法に用いるベクターは、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターであり、任意のポリペプチドコードするポリヌクレオチドを、例えば制限酵素サイトにより、容易に組込むことができる。
組込まれるヌクレオチドがコードするポリペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、例えば４〜１５であり、好ましくは４〜１４であり、より好ましくは４〜１３である。
【００２２】
ベクターの構築及びベクターの宿主への導入は、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主がファージである場合、制限酵素のクローニングサイトを持つベクターアームに提示するペプチドのライブラリー遺伝子をライゲーションによって組込む。得られたライゲーション溶液を、ファージタンパク質を含むパッケージング溶液と混合し、ファージ粒子を形成させる。このファージ粒子を大腸菌（例えば、ＢＬＴ５４０３）に感染させることによってファージライブラリーを構築することができる。
【００２３】
（ライブラリー遺伝子）
ライブラリーに組込む遺伝子は、公知の方法で調整することができる。
例えば、ランダムなアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）を任意のアミノ酸をコードするコドンと部位特異的に置換する。置換には当該領域を含むオリゴＤＮＡを化学合成し、制限酵素を利用して組込む、あるいはＰＣＲを用いてベクター全長を複製する方法が用いられる。
【００２４】
［４］スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、（１）標的分子及び前記のペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）標的分子に結合した宿主を回収する工程、
を含み、好ましくは（３）前記回収した宿主を増幅する工程を更に含む。本発明のスクリーニング方法は、前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返し、標的分子に結合するペプチドを濃縮することが好ましい。前記接触工程（１）における標的分子及びペプチドライブラリーの接触は、標的分子を不溶性担体（例えば、ウエル又はディッシュ）に固相化して行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、本発明のライブラリーを用いる以外は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主としてファージを用いたファージライブラリーのスクリーニングは、以下のようにことができる。プレートなどに、固相化した標的分子と、ファージライブラリーとを接触させることにより反応させる。洗浄によって標的分子と結合しなかったファージを除去する。標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させ、溶菌、そして増殖させる。溶菌後の培養上清、又は精製したファージを、更に固相化した標的分子と反応させる（パンニングさせる）ことによって、標的分子に特異的な結合分子を提示したファージを濃縮する。最終的にファージをクローン化し、提示ペプチドをシークエンスにより同定する。
得られたペプチドは、標的分子と結合することができるペプチドである。本発明のスクリーニング方法では、ペプチドが本発明のペプチド提示用タンパク質に提示されているため、ペプチドの構造が安定し、標的分子に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００２６】
《参考例１：ｓｆＧＦＰ発現ベクターの構築》
本参考例では、ｓｆＧＦＰを発現するベクターを構築した。
Enhanced GFP（ＥＧＦＰ）の遺伝子を持つベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−３−ＰＴＤ−３−ＯＤＤ−ＥＧＦＰ（Kizaka-Kondohら、Clin. Cancer. Res.、２００９年、１５巻、３４３３−３４４１頁）を鋳型として、プライマー（配列番号１及び２）（表２）を用いて、ＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）にてＰＣＲを行い、両端に制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩ認識部位が付加された０．７ｋｂのＥＧＦＰ遺伝子断片を得た。この断片をＢａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで切断し、予めＢａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで切断しておいたクローニングベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）（プロメガ）に連結した。これにより、ＥＧＦＰ遺伝子が挿入されたベクターｐＧＥＭ−ＥＧＦＰを得た。
ベクターｐＧＥＭ−ＥＧＦＰを鋳型としてプライマー（配列番号３−１６）（表２）を用いて、PfuUltra High fidelity DNA Polymerase（アジレント・テクノロジー）にてＰＣＲを行い、９個のアミノ酸を置換するための変異を部位特異的に導入してｓｆＧＦＰ遺伝子が挿入されたベクターｐＧＥＭ−ｓｆＧＦＰを得た。このベクターをＢａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで切断してＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片を得た。この断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−３（ＧＥヘルスケア）のＢａｍ  ＨＩ部位とＥｃｏ  ＲＩ部位に連結し、ｓｆＧＦＰ遺伝子を挿入したベクターｐＧＥＸ−ｓｆＧＦＰを得た。ｐＧＥＸ−ｓｆＧＦＰは、５．６ｋｂｐの大きさであり、ｔａｃプロモーターの下流にＧＳＴ及びｓｆＧＦＰの構造遺伝子の塩基配列をこの順で有する。従って、ｐＧＥＸ−ｓｆＧＦＰは、ＧＳＴ及びｓｆＧＦＰを、この順に１つの融合タンパク質として大腸菌細胞内に発現する。
【００２７】
《実施例１〜１７》
本実施例では、ｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番のアミノ酸配列に、カスパーゼ３の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
参考例１で構築したベクターｐＧＥＸ−ｓｆＧＦＰを鋳型として、プライマー（配列番号１７、１８、２３−２８、３１−４６、５８−５９、６４−７１）（表２）を用いて、PfuUltra High fidelity DNA PolymeraseにてＰＣＲを行い、部位特異的にＣａｓｐａｓｅ−３認識ペプチド配列（ＤＥＶＤ）を組み込んだｓｆＧＦＰを発現するためのベクターｐＧＥＸ−ｍ１（実施例１）、ｐＧＥＸ−ｍ４〜ｐＧＥＸ−ｍ６（実施例２〜４）、ｐＧＥＸ−ｍ１０〜ｐＧＥＸ−ｍ２２（実施例５〜実施例１７）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表１に示す。なお、実施例１６（ｍ１０）及び実施例１７（ｍ２２）で得られたペプチド提示タンパク質は、不溶化しやすかった。【００２８】
《比較例１〜５》
本比較例では、ｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の領域以外のアミノ酸配列に、カスパーゼ３の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
プライマーとして、配列番号１９及び２０（比較例１）、配列番号２１及び２２（比較例２）、配列番号２９及び３０（比較例３）、配列番号６０及び６１（比較例４）、配列番号６２及び６３（比較例５）のプライマーを用いた以外は、実施例１の操作を繰り返して、ベクターｐＧＥＸ−ｍ２（比較例１）、ｐＧＥＸ−ｍ３（比較例２）、ｐＧＥＸ−ｍ７（比較例３）、ｐＧＥＸ−ｍ８（比較例４）、ｐＧＥＸ−ｍ９（比較例５）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表１に示す。【００２９】
【表１】
0006478410.tif 000002
【００３０】
《ペプチド提示タンパク質の発現及び精製》
前記実施例１〜１７及び比較例１〜５で得られたベクターを用いて、ペプチド提示タンパク質の発現及び精製を行った。
前記発現ベクターｐＧＥＸ−ｓｆＧＦＰ、ｐＧＥＸ−ｍ１〜ｐＧＥＸ−ｍ２２を、ヒートショック法で大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）株（アジレント・テクノロジー）にそれぞれ導入した。発現ベクターが導入された大腸菌を、５０ｍＬのＬＢＡ培地（０．０１％アンピシリンを含む、１％Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ培地）中で３７℃にてＯ．Ｄ．６００＝０．５になるまで培養した。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを０．１ｍＭになるように培養液に添加し、２０℃にて一晩培養してＧＳＴ融合タンパク質を発現させた大腸菌を得た。【００３１】
タンパク質を発現させた大腸菌を遠心操作により集菌し、２０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁した。得られた菌体は３回の凍結融解及び超音波により破砕し、その後に終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００を加え、氷上で３０分静置した。次に、菌体液を５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、タンパク質の含まれる上清を回収した。次に、ＰＢＳで洗浄したＧＳＴアガロースビーズに回収した溶液を加え、４℃で一晩ゆっくり回転させながらＧＳＴ融合タンパク質を吸着させた。ビーズをＰＢＳで洗い、更にPrescission Cleavage Buffer（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗った。次に、ＧＳＴと、ｓｆＧＦＰ又はｓｆＧＦＰ改変体（ｓｆＧＦＰ−ｍ１〜ｓｆＧＦＰ−ｍ２２）を切り離すために１ｍＬのPrescission Cleavage Buffer及び５μＬのPrescission Protease（ＧＥヘルスケア）を加え、室温で４時間反応させた後４℃で一晩反応させた。次に、３０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心して上清を回収し、１０ｋＤａ  ｃｕｔの限外ろ過によりＰＢＳに置換し、およそ５ｍｇのペプチド提示タンパク質（ｓｆＧＦＰ−ｍ１〜ｍ９及びｓｆＧＦＰ−ｍ１１〜ｍ２１）を得た（以下、ｐＧＥＸ−ｍ１〜ｍ９及びｐＧＥＸ−ｍ１１〜ｍ２１から得られたペプチド提示タンパク質を、それぞれｍ１〜ｍ９及びｍ１１〜ｍ２１と称することがある）。ｓｆＧＦＰ−ｍ１０及びｓｆＧＦＰ−ｍ２２は、封入体で発現した。【００３２】
《提示ペプチドのカスパーゼ３による切断》
ｐＧＥＸ−ｍ１〜ｍ９及びｍ１１〜ｍ２１から得られたペプチド提示タンパク質は、カスパーゼ３認識ペプチド配列（ＤＥＶＤ）が組込まれている。この提示ペプチドの構造自由度を検討のために、ペプチド提示タンパク質のカスパーゼ３による切断を行った。
１０μＭのペプチド提示タンパク質ｍ１〜ｍ９及びｍ１１〜ｍ２１をカスパーゼ３反応バッファー（２０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％スクロース、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中で、４ｍＵ／ｍＬのヒトカスパーゼ３（Sigma-Aldrich）と３７℃で２４時間反応させた。コントロールとしてｓｆＧＦＰを用いた。反応液は１５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、Hybond ECL membranes（ＧＥヘルスケア）に２０Ｖ電圧一定で１時間転写した。次に５％スキムミルクでブロッキングを行い、一次抗体（ラビットポリクローナル抗ＧＦＰ抗体）を４℃で一晩反応させ、二次抗体（ＨＲＰ結合抗ラビットＩｇＧ抗体）を室温で１時間反応させ、ECL prime（ＧＥヘルスケア）を添加して切断断片を検出した。この結果、ｍ２（比較例１）、ｍ３（比較例２）、ｍ７（比較例３）、ｍ８（比較例４）、ｍ９（比較例５）はカスパーゼ３に分解された。一方、ｍ１（実施例１）、ｍ４（実施例２）、ｍ５（実施例３）、ｍ６（実施例４）、ｍ１１（実施例５）、ｍ１２（実施例６）、ｍ１３（実施例７）、ｍ１４（実施例８）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１７（実施例１１）、ｍ１８（実施例１２）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２０（実施例１４）、ｍ２１（実施例１５）ではほとんど切断されなかった（表１及び図２）。これはｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番の領域に、アミノ酸長５−１４の認識ペプチドを組み込んだ場合、カスパーゼ３に結合されないことを示し、これ以外の領域ではカスパーゼ３が結合可能であることを示している。すなわち、ｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番の領域に組込まれたペプチドは、構造的に固定されており、ペプチドの構造自由度が制限されていると考えられた。【００３３】
《ペプチド提示タンパク質の蛍光強度》
ペプチドを組込むことによるペプチド提示タンパク質の蛍光強度への影響を検討した。
ペプチド提示タンパク質（ｍ１〜ｍ９及びｍ１１〜ｍ２１）を、バッファー（２０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０スクロース、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で１０μＭに調整して蛍光を測定した（励起／蛍光波長＝４８０／５１０ｎｍ）。ペプチドの構造自由度が制限されているｍ１（実施例１）、ｍ４（実施例２）、ｍ５（実施例３）、ｍ６（実施例４）、ｍ１１（実施例５）、ｍ１２（実施例６）、ｍ１３（実施例７）、ｍ１４（実施例８）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１７（実施例１１）、ｍ１８（実施例１２）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２０（実施例１４）、ｍ２１（実施例１５）では蛍光が見られたが、ｍ２（比較例１）、ｍ３（比較例２）、ｍ７（比較例３）、ｍ８（比較例４）、ｍ９（比較例５）では蛍光が消失していた（表１及び図３）。すなわち、ｓｆＧＦＰの１３１番〜Ｈ１３９番の領域に、アミノ酸長５−１４の認識ペプチドを組み込んだ場合は、ＧＦＰの蛍光が維持されることが示された。【００３４】
《解析例１：Ｋ１３１−Ｈ１３９領域の構造的ゆらぎの検討》
作製したペプチド提示タンパク質に組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていれば、分子動力学シミュレーションにおいてＫ１３１−Ｈ１３９領域は構造的なゆらぎが小さくなると考えられた。
カスパーゼ３に分解されにくいｓｆＧＦＰ、ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）の分子動力学シミュレーションを実施した。コントロールとしてカスパーゼ３に分解されるｍ７（比較例３）を用いた。これらのタンパク質の初期構造はｓｆＧＦＰの結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｂ３Ｐ）より作成した。計算を簡便にするために蛍光団を構成する２アミノ酸（６５Ｔ，６６Ｙ）はグリシン残基に置換した。Ａｍｂｅｒ  １１  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｍｂｅｒ）のｆｆ９９ＳＢ力場を利用して初期構造から熱力学的な安定構造を計算した。分子動力学シミュレーションはＡｍｂｅｒ  １１のＳａｎｄｅｒモジュールを利用し、ＧＢ／ＳＡ溶媒モデルにおいて１０ナノ秒の計算を行い、平衡状態に達した４．５ナノ秒〜１０ナノ秒の構造を用いてゆらぎを評価した。【００３５】
結果を図４に示す。縦軸は４．５ナノ秒〜１０ナノ秒のシミュレーションにおける各残基のゆらぎの大きさを表し、横軸は残基番号を表す。ｓｆＧＦＰ、ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）のＫ１３１−Ｈ１３９領域のゆらぎは、ほとんどの残基で０．１ナノメートル以内に収まっていた。しかし、ｍ７（比較例３）では最大で０．３ナノメートル程度まで大きくなっており、Ｋ１３１−Ｈ１３９領域は大きくゆらぐことが示された。従って、カスパーゼ３に分解されにくい改変体では、ゆらぎはほとんどなく、組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていることが示された。【００３６】
《実施例１６〜２０》
本実施例では、乳癌マーカータンパク質ＨＥＲ２に結合することが報告されている５種のペプチドをｓｆＧＦＰの１３１番〜１３９番のアミノ酸配列の領域に組み込み、発現ベクター及び精製タンパク質を得た。
プライマーとして、配列番号４７及び４８（実施例１６）、配列番号４９及び５０（実施例１７）、配列番号５１及び５２（実施例１８）、配列番号７２及び７３（実施例１９）、配列番号７４及び７５（実施例２０）のプライマーを用いた以外は、実施例１の操作を繰り返して、ベクターｐＧＥＸ−ｍＨ１（実施例１６）、ｐＧＥＸ−ｍＨ２（実施例１７）、ｐＧＥＸ−ｍＨ３（実施例１８）、ｐＧＥＸ−ｍＨ４（実施例１９）、及びｐＧＥＸ−ｍＨ５（実施例２０）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を図５（Ａ）に示す。ｍＨ１は「ＫＥＤＧＫＣＣＹＳＬＧＨ」（配列番号５５）、ｍＨ２は「ＫＥＤＧＣＤＧＦＹＡＣＧＨ」（配列番号５６）、ｍＨ３は「ＫＥＤＧＦＨＡＨＰＧＨ」（配列番号５７）、ｍＨ４は「ＫＥＤＧＷＹＡＷＭＬＧＨ」（配列番号７６）、そしてｍＨ５は「ＫＥＤＧＷＹＳＷＬＬＧＨ」（配列番号７７）である。
更に、ベクターｐＧＥＸ−ｍＨ１、ｐＧＥＸ−ｍＨ２、ｐＧＥＸ−ｍＨ３、ｐＧＥＸ−ｍＨ４、及びｐＧＥＸ−ｍＨ５を用いたことを除いては、前記「ペプチド提示タンパク質の発現及び精製」の操作を繰り返して、ペプチド提示タンパク質を得た（以下、ｐＧＥＸ−ｍＨ１〜ｍＨ５から得られたペプチド提示タンパク質を、それぞれｍＨ１〜ｍＨ５と称することがある）。【００３７】
乳がん細胞で高頻度に過剰発現が起こるＨＥＲ２タンパク質は、乳がんの治療標的・イメージング標的として有用であり、マウス生体内でも機能するペプチドが報告されている。ｍＨ１のペプチドは、ファージライブラリーよりスクリーニングされ、隣り合うシステイン間でＳ−Ｓ結合を持ち、部分的に構造が制限されている（Karassevaら、J. Protein Chem.、２００２年、２１巻、２８７−２９６頁）。ｍＨ２のペプチドはＨＥＲ２結合抗体の結合表面を参考にデザインされたペプチドで、環状化されて構造が制限された状態で結合活性を持つ（Parkら、Nat. Biotechnol.、２０００年、１８巻、１９４−１９８頁）。ｍＨ３のペプチドは自由に構造を取れる条件のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングにより選抜された（Nakajimaら、Breast Cancer、２００８年、１５巻、６５−７２頁）。ｍＨ４及びｍＨ５のペプチドはｍＨ１のペプチドと同時にスクリーニングされ、構造は制限されていない。ｍＨ１及びｍＨ２は既にマウス生体内で機能することが報告されていた（Deutscher SL、Chem. Rev.、２０１０年、１１０巻、３１９６−３２１１頁）。【００３８】
《ＨＥＲ２ペプチドを組み込んだペプチド提示タンパク質の癌細胞への結合》
２．５×１０４個のＨＥＲ２陽性Ｎ８７胃がん細胞及びＨＥＲ２陰性ＳＵＩＴ−２膵がん細胞を８ｗｅｌｌスライドチャンバー培養プレート中で１６時間培養した。細胞は４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーと１５分反応させて固定し、ＰＢＳ溶液で洗浄、３％ウシ血清アルブミン／ＴＢＳＴで１５分ブロッキングした。次に２μＭのペプチド提示タンパク質（ｍＨ１、ｍＨ２、ｍＨ３、ｍＨ４、又はｍＨ５）を添加して４℃で１６時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察により結合性を評価した。この結果、ｍＨ１及びｍＨ２ではＮ８７細胞への特異的な結合が見られたが、ｍＨ３、ｍＨ４、及びｍＨ５は結合しなかった（図４（Ｂ））。つまり、構造が制限されている条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んだ場合には同様に高い結合性が見られ、構造が自由に変化する条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んでも結合は見られなかった。前者は既にマウス生体内でも機能することが分かっている。従って、ｓｆＧＦＰのＫ１３１−Ｈ１３９領域にペプチドを組み込み評価に利用することで、生体内でも機能する特異性の高い標的結合ペプチドを簡便に高感度にスクリーニングできることが示された。【００３９】
【表２−１】
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【００４０】
【表２−２】
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【００４１】
《解析例２：Ｋ１３１−Ｌ１３７領域の構造的ゆらぎの検討》
Ｋ１３１−Ｌ１３７領域における本発明のペプチド提示タンパク質であるｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）の分子動力学シミュレーションを実施した。陽性コントトールとして、ｓｆＧＦＰを用いた。ｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）を用いた以外は、解析例１の操作を繰り返した。【００４２】
アミノ酸配列を図６（Ａ）に示し、解析結果を図６（Ｂ）に示す。縦軸は４．５ナノ秒〜１０ナノ秒のシミュレーションにおける各残基のゆらぎの大きさを表し、横軸はアミノ酸配列を表す。カスパーゼ３に分解されにくい改変体は、ゆらぎはほとんどなく、組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーは標的分子に特異的に結合することのできるペプチドのスクリーニングに用いることができる。本発明のペプチドライブラリーによって、スクリーニングされたペプチドは、医薬の有効成分として、有効用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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