(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール鎖セグメントおよび側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に置換フェニルボロン酸基を有する置換フェニルボロン酸基含有アミノ酸残基とを含むポリアミノ酸鎖セグメントを有するポリマーユニットαと、ポリエチレングリコール鎖セグメントおよび側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖にフェニルボロン酸結合部位を有するフェニルボロン酸結合部位含有アミノ酸残基とを含むポリアミノ酸鎖セグメントを有するポリマーユニットβと、薬物とを含み、
該ポリマーユニットαおよびβが、該ポリアミノ酸鎖セグメントが内側となり、該ポリエチレングリコール鎖セグメントが外側となるようにして放射状に配列してミセルを形成し、該ミセルに該薬物が内包されており、
該置換フェニルボロン酸基が、下記式（１）で表されるフッ素化フェニルボロン酸基であり、
【化１】
0006566936.tif 000020
（式（Ｉ）中、Ｆは独立に存在し、ｎは１、２、３または４のいずれかであり、ｎが１のときのＦおよびＢ（ＯＨ）２の導入箇所は、オルト、メタ、パラのいずれでもよい。）
該フェニルボロン酸結合部位がｃｉｓ−ジオール構造を含み、
該ポリマーユニットαにおける該カチオン性アミノ酸残基の総数に対する該置換フェニルボロン酸基含有アミノ酸残基の数の割合が、１０％以上であり（ただし、該カチオン性アミノ酸残基は、側鎖にカチオン性基と置換フェニルボロン酸基との両方を有するアミノ酸残基を含む）、
該ポリマーユニットβにおける該カチオン性アミノ酸残基の総数に対する該フェニルボロン酸基結合部位含有アミノ酸残基の数の割合が、５％以上であり（ただし、該カチオン性アミノ酸残基は、側鎖にカチオン性基とフェニルボロン酸基結合部位との両方を有するアミノ酸残基を含む）、
該置換フェニルボロン酸基と該フェニルボロン酸結合部位とが、酸性環境下あるいは競合的に結合可能な物質の存在下で崩壊し得る架橋構造を形成している、
医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリマーユニットαの前記ポリアミノ酸鎖セグメントが、リシン残基、α位またはβ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたアスパラギン酸残基およびα位またはγ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたグルタミン酸残基から選択される１種以上のアミノ酸残基と、該アミノ酸残基の側鎖に前記置換フェニルボロン酸基が導入されているアミノ酸残基と、を含む、請求項１に記載の医薬組成物
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
（式（ｉ）〜（ｉｖ）において、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数である）。
【請求項３】
前記ポリマーユニットβの前記ポリアミノ酸鎖セグメントが、リシン残基、α位またはβ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたアスパラギン酸残基およびα位またはγ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたグルタミン酸残基から選択される１種以上のアミノ酸残基と、該アミノ酸残基の側鎖に前記フェニルボロン酸結合部位が導入されているアミノ酸残基と、を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
（式（ｉ）〜（ｉｖ）において、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数である）。
【請求項４】
前記薬物が核酸である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記核酸がｐＤＮＡおよびｍＲＮＡから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、薬物を内包したミセル形態を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や核酸といった生体高分子を利用するバイオ医薬品は、低分子化合物を利用する従来型の医薬品に比べ、酵素で分解されたり免疫系によって排除されたりしやすい。こうしたバイオ系薬物の患部への到達性を向上させる観点から、ポリアミノ酸系のブロックコポリマーを利用したドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が進められている。当該開発の目標の一つは、血中での安定性（バイオ系薬物の保持性）と標的細胞内での薬物放出性を両立するキャリアの提供にあり、優れた両立性を実現するためにさらなる改善を図る必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１４０５３７号公報
【特許文献２】特開２００２−１７９６８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、バイオ系薬物の血中での安定性と標的細胞内での放出性を両立し得るキャリアを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の医薬組成物は、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有するポリマーユニットαと、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有するポリマーユニットβと、薬物とを含み、該ポリマーユニットαおよびβが、該カチオン性ポリマー鎖セグメントが内側となり該親水性ポリマー鎖セグメントが外側となるようにして放射状に配列してミセルを形成し、該ミセルに該薬物が内包されている。ポリマーユニットαのカチオン性ポリマー鎖セグメントは側鎖にフェニルボロン酸基を有し、ポリマーユニットβのカチオン性ポリマー鎖セグメントは側鎖にフェニルボロン酸結合部位を有し、該フェニルボロン酸基と該フェニルボロン酸結合部位とは、酸性環境下あるいは競合的に結合可能な物質の存在下で崩壊し得る架橋構造を形成している。
１つの実施形態においては、上記フェニルボロン酸基のフェニル環の少なくとも１つの水素は、生理的ｐＨ付近にｐＫａを有するように置換されている。
１つの実施形態においては、上記フェニルボロン酸結合部位はｃｉｓ−ジオール構造を含む。
１つの実施形態においては、上記薬物は核酸である。１つの実施形態においては、上記核酸はｐＤＮＡまたはｍＲＮＡである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、バイオ系薬物の血中での安定性と標的細胞内での放出性を両立し得るキャリアが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】Ａ/Ｐ＝６の場合に、ポリマーミセルにおいてポリオール構造の導入数を４０に固定してＦＰＢＡ基の導入数を変化させた場合のポリアニオンに対する置き換わり耐性を比較して示す電気泳動結果である。
【図１Ｂ】Ａ/Ｐ＝８の場合に、ポリマーミセルにおいてポリオール構造の導入数を４０に固定してＦＰＢＡ基の導入数を変化させた場合のポリアニオンに対する置き換わり耐性を比較して示す電気泳動結果である。
【図１Ｃ】ポリマーミセルにおいてＦＰＢＡ基の導入数を４４に固定してポリオール構造の導入数を変化させた場合のポリアニオンに対する置き換わり耐性を比較して示す電気泳動結果である。
【図２】実施例のポリマーミセルのＡＴＰ濃度応答性を示す電気泳動結果である。
【図３】実施例のポリマーミセルのグルコース耐性を示す電気泳動結果である。
【図４】実施例のポリマーミセルと比較例１〜３のポリマーミセルについて細胞取り込み評価を比較して示す図である。
【図５】（ａ）は、実施例のポリマーミセルと比較例１〜３のポリマーミセルについて遺伝子発現評価を示す図であり、（ｂ）は、当該ポリマーミセルを構成するポリマーの細胞毒性評価を示す図である。
【図６】実施例のポリマーミセルと比較例３のポリマーミセルについて血中滞留性評価を示す図である。
【図７】実施例のポリマーミセルと比較例のポリマーミセルについて遺伝子発現評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。
【０００９】
Ａ．医薬組成物の概要
本発明の実施形態による医薬組成物は、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有するポリマーユニットαと、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有するポリマーユニットβと、薬物とを含む。ポリマーユニットαおよびβは、カチオン性ポリマー鎖セグメントが内側となり親水性ポリマー鎖セグメントが外側となるようにして放射状に配列してミセルを形成し、当該ミセルに薬物が内包されている。ポリマーユニットαのカチオン性ポリマー鎖セグメントは側鎖にフェニルボロン酸基を有し、ポリマーユニットβのカチオン性ポリマー鎖セグメントは側鎖にフェニルボロン酸結合部位を有し、該ミセル内部において当該フェニルボロン酸基とフェニルボロン酸結合部位とは、酸性環境下あるいは競合的に結合可能な物質の存在下で崩壊し得る架橋構造を形成している。以下、医薬組成物の詳細について説明する。
【００１０】
Ｂ．ポリマーユニットα
ポリマーユニットαは、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有する。
【００１１】
Ｂ−１．親水性ポリマー鎖セグメント
親水性ポリマー鎖セグメントは、任意の適切な親水性ポリマーによって構成され得る。該親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。これらの中でも、ポリ（エチレングリコール）は、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられ得る。
【００１２】
Ｂ−２．カチオン性ポリマー鎖セグメント
カチオン性ポリマー鎖セグメントは、任意の適切なカチオン性ポリマーによって構成され得る。カチオン性ポリマーの代表例としては、ポリアミノ酸が挙げられる。カチオン性ポリマー鎖セグメントは、側鎖にフェニルボロン酸（ＰＢＡ）基を含む。１つの実施形態においては、ＰＢＡ基は、血液に代表される生体環境（ｐＨ７．５未満）に適合させる観点から、生理的ｐＨ付近にｐＫａを有するように、ＰＢＡ基を構成するフェニル環の少なくとも１つの水素が任意の置換基によって置換されている。上記置換ＰＢＡ基のｐＫａは８未満であることが好ましく、７．５未満であることがより好ましい。置換ＰＢＡ基のｐＫａがこのような範囲であれば、後述するポリマーユニットβのフェニルボロン酸（ＰＢＡ）結合部位との間で所望のｐＨ範囲で崩壊し得る架橋構造を容易に形成することができる。例えば、置換ＰＢＡ基のｐＫａを制御することにより、ｐＨが約７の細胞外では構造を維持しｐＨが５〜６の細胞内後期エンドソーム内では容易に崩壊する架橋構造を形成することができる。置換される水素の数は、１、２、３、または４であり、水素が１つのみ置換されるときの置換基およびＢ（ＯＨ）２の導入箇所は、オルト、メタ、パラのいずれでもよい。置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン、ニトロ基等が挙げられる。なかでも、ブロックコポリマーの親水性を高める観点及びｐＫａを７．５未満にする観点から、置換ＰＢＡ基は、下記の式（Ｉ）で示されるフッ素化フェニルボロン酸基（以下、「ＦＰＢＡ基」と称する場合がある）であることが好ましい。上記置換ＰＢＡ基のｐＫａは、単量体として合成した置換ＰＢＡ基含有アミノ酸から特定するものとする。上記置換ＰＢＡ基のｐＫａの下限値は特に制限されないが、例えば２、また例えば３、であってよい。
【化１】
0006566936.tif 000002
（式（Ｉ）中、Ｆは独立に存在し、ｎは１、２、３または４のいずれかであり、ｎが１のときのＦおよびＢ（ＯＨ）２の導入箇所は、オルト、メタ、パラのいずれでもよい。）
【００１３】
さらに、ポリマーユニットαのカチオン性ポリマー鎖セグメントの側鎖部分に置換ＰＢＡ基を有することにより、水性媒体（好ましくは、中性近傍の水性媒体）中で極めて安定なポリマーミセルが形成され得るという効果が得られ得る。具体的には、負の電荷を有する薬物（代表的には、核酸）と正の電荷を有するカチオン性ポリマー鎖セグメントとが静電相互作用により結合することにより、ポリマーユニットαおよびβのカチオン性ポリマー鎖セグメントが内側となるようなポリマーミセルが形成される。形成されたポリマーミセルにおいては、ポリマーユニットαおよびβのカチオン性ポリマー鎖セグメントが近接しているので、ポリマーユニットαのカチオン性ポリマー鎖セグメントの置換ＰＢＡ基とポリマーユニットβのカチオン性ポリマー鎖セグメントのＰＢＡ結合部位との間の架橋が促進され、結果として、水性媒体中で極めて安定なポリマーミセルが形成され得る。上記のとおり、形成されたポリマーミセルにおいては、ポリマーユニットα（および後述のポリマーユニットβ）は、カチオン性ポリマー鎖セグメントを内側に、親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けて放射状に配列している。水性媒体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グッドバッファー（Ｇｏｏｄ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｓ）等の水性緩衝液が挙げられる。
【００１４】
以下、代表例として、ポリアミノ酸で構成され、ＰＢＡ基として置換ＰＢＡ基を有するカチオン性ポリマー鎖セグメント（ポリアミノ酸鎖セグメント）について説明する。
【００１５】
ポリアミノ酸鎖セグメントは、代表的には、ＰＢＡ基に加えて、側鎖にカチオン性基を有する。ポリアミノ酸鎖セグメントの側鎖部分にカチオン性基を有することによりカチオン性ポリマー鎖セグメントが形成され、当該カチオン性ポリマー鎖セグメントが生体高分子（例えば、核酸）と会合して複合体、例えば、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成し得る。したがって、１つの実施形態においては、ポリアミノ酸鎖セグメントは、側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に置換ＰＢＡ基を有する置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基とを含む。ここで、カチオン性アミノ酸残基と置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基とは、異なるアミノ酸残基であってもよく、同一のアミノ酸残基であってもよい。具体的には、当該ポリアミノ酸鎖セグメントは、側鎖に置換ＰＢＡ基を有さないカチオン性アミノ酸残基と側鎖にカチオン性基を有さない置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基とを含んでもよいし、これらの一方または両方に代えて、あるいは、これらに加えて、側鎖にカチオン性基と置換ＰＢＡ基との両方を有するアミノ酸残基を含んでもよい。
【００１６】
上記カチオン性アミノ酸残基としては、側鎖にアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基が好ましい。側鎖にアミノ基を有することにより、水性媒体中において、該アミノ基が置換ＰＢＡ基のホウ素に配位し得る。その結果、置換ＰＢＡ基の導入によるポリマーユニットαの疎水化が回避されて、高い親水性が維持され得る。
【００１７】
上記側鎖にアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基が由来するアミノ酸としては、例えば、リシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸に任意の適切なアミン化合物が導入されたアミノ酸誘導体が挙げられる。なかでも、リシンおよび酸性アミノ酸のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたアミノ酸誘導体が好ましく、リシンおよびアスパラギン酸のα位もしくはβ位またはグルタミン酸のα位もしくはγ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたアミノ酸誘導体がより好ましく、リシンおよびアスパラギン酸のα位もしくはβ位またはグルタミン酸のα位もしくはγ位のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が下記式（ｉ）の基で置換されたアミノ酸誘導体がさらに好ましい。
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
（式（ｉ）〜（ｉｖ）において、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数である。）
【００１８】
上記式（ｉ）〜（ｉｖ）において、ｐ１〜ｐ４およびｑ１〜ｑ６は、それぞれ相互に独立して、好ましくは２または３であり、より好ましくは２である。また、ｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、好ましくは１〜３の整数である。
【００１９】
上記カチオン性アミノ酸残基がリシン残基である場合には、ポリアミノ酸鎖の合成が容易であり、かつ、得られたブロックコポリマーが生体適合性に非常に優れるという利点がある。また、上記カチオン性アミノ酸残基が酸性アミノ酸のカルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）の−ＯＨ部が上記式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの基で置換されたアミノ酸残基である場合、これらの残基は、異なる複数のアミン官能基を有するので、ｐＫａが複数段階を示し、生理条件であるｐＨ７．４においては複数のアミン官能基は部分的にプロトン化状態にあり、細胞に対するダメージが低いことが明らかにされている。また、核酸等と相互作用することによりＰＩＣ等の複合体を好適に形成することができるという利点がある。さらに、こうして形成された複合体がエンドソーム内（ｐＨ５．５）へ取り込まれてｐＨが下がると、ポリアミノ酸鎖セグメントのプロトン化がさらに進行し、バッファー効果（またはプロトンスポンジ効果）、或いは膜傷害活性が高まることによりエンドソームエスケープを促進させ得る。その結果、細胞質への薬物送達効率が向上し得る。
【００２０】
上記置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基において、置換ＰＢＡ基は、代表的には、連結基を介してその側鎖に導入されている。当該連結基としては、例えば、アミド結合、カルバモイル結合、アルキル結合、エーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、スルホンアミド結合、ウレタン結合、スルホニル結合、チミン結合、ウレア結合、チオウレア結合およびこれらの組み合わせが挙げられる。当該連結基はこれらの結合の間に任意の適切なスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーとしては、例えば、炭素数１〜２７、好ましくは炭素数２〜５の直鎖状または分岐状アルキレン基、短鎖のエチレングリコール鎖（-ＯＣＨ２ＣＨ２-）ｎ等が挙げられる。
【００２１】
上記置換ＰＢＡ基が導入されるアミノ酸残基としては、上記連結基を介して置換ＰＢＡ基が導入され得る限りにおいて、任意の適切なアミノ酸残基が選択され得る。合成の容易さの観点から、置換ＰＢＡ基は、上記側鎖にアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基に導入されることが好ましい。具体例としては、置換ＰＢＡ基は、上記の側鎖にアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基に、当該アミノ基とフェニル環の少なくとも１つの水素が置換されたカルボキシフェニルボロン酸またはそのエステル等との反応によって生じるアミド結合を介して導入され得る。別の具体例としては、置換ＰＢＡ基は、２つのアミド結合とその間に含まれるプロピレン基とからなる連結基を介して上記の側鎖にアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基のアミノ基に導入され得る。ここで、側鎖に複数のアミノ基を有するカチオン性アミノ酸残基に対しては、置換ＰＢＡ基を１つのみ導入してもよく、複数導入してもよい。１つのみ導入する場合、導入後の置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基は、側鎖にアミノ基と置換ＰＢＡ基との両方を有するのでカチオン性アミノ酸残基でもある。したがって、本発明においては、このようなアミノ酸残基のみを含むポリアミノ酸鎖セグメントもまた、カチオン性アミノ酸残基と置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基との両方を含んでいると理解される。ただし、このようなアミノ酸残基を含むポリアミノ酸鎖セグメント中のカチオン性アミノ酸残基の数と置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の数との和を求める際には、当該アミノ酸残基については、どちらか一方としてのみ数えることとする。
【００２２】
上記ポリアミノ酸鎖セグメントは、上記カチオン性アミノ酸残基および置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基に加えて、側鎖に疎水性基を有するアミノ酸残基（以下、「疎水性アミノ酸残基」と称する場合がある）をさらに含み得る。当該疎水性アミノ酸残基を含むことにより、水性媒体中において、ポリマーユニットα間に働く疎水性相互作用が大きくなり、その結果、より安定なポリマーミセルが形成され得る。さらに、疎水性アミノ酸残基が細胞膜の疎水性部分に突き刺さり、当該ポリマーミセルを細胞膜に固定するアンカーとして機能し得る。そのため、当該ポリマーミセルに核酸等の生体高分子を内包させた場合に、該生体高分子の細胞内への導入率が向上し得る。
【００２３】
上記疎水性アミノ酸残基が由来するアミノ酸としては、好ましくは２５℃の水１００ｇに対する溶解度が５ｇ以下、より好ましくは４ｇ以下であるアミノ酸が挙げられる。このようなアミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性天然アミノ酸や、側鎖に疎水性基が導入されたアミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。当該アミノ酸の疎水性誘導体としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の側鎖、アミン化合物が導入された酸性アミノ酸の側鎖、およびリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸の側鎖に疎水性基が導入された誘導体が挙げられる。
【００２４】
上記導入される疎水性基としては、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基（ステロイドに由来する残基）が好ましく例示され得る。
【００２５】
上記炭素数６〜２７の飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基としては、例えば、ヘキシル基（例えば、ｎ−ヘキシル基）、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、エイコシル基、ヘンイコシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ペンタコシル基、ヘキサコシル基、およびヘプタコシル基が挙げられる。上記炭素数６〜２７の不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基としては、例えば、上記に例示したアルキル基の鎖中の炭素−炭素結合の１個〜５個が、炭素−炭素二重結合となっている基が挙げられる。
【００２６】
上記炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基としては、アリール基、アラルキル基等が挙げられる。これらの好ましい具体例としては、フェニル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
【００２７】
上記ステリル基が由来するステロイドとしては、例えばステロールが挙げられる。ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護基により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。上記ステリル基が由来し得るステロールとしては、好ましくはコレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のステロールであり、さらに好ましくはコレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールであり、特に好ましくはコレステロールである。
【００２８】
上記ポリアミノ酸鎖セグメントは、カチオン性アミノ酸残基、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基として、それぞれ一種のみのアミノ酸残基を含んでもよく、二種以上のアミノ酸残基を含んでもよい。また、ポリアミノ酸鎖セグメントにおけるカチオン性アミノ酸残基、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。
【００２９】
上記ポリアミノ酸鎖セグメントに含まれるカチオン性アミノ酸残基、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の数は、各アミノ酸残基の種類等によって適切に調整され得る。
【００３０】
Ｂ−３．ポリマーユニットαを構成し得るブロックコポリマーの具体例
ポリマーユニットαを構成し得るブロックコポリマーの具体例を式（１）または（２）に示す。当該式（１）または（２）のブロックコポリマーにおいては、置換ＰＢＡ基は、カチオン性アミノ酸残基の側鎖に導入される。代表的には、置換ＰＢＡ基は、式（１）または（２）のブロックコポリマーのＱ１部分、あるいは、Ｒ６ａおよび／またはＲ６ｂ部分と反応することにより導入され得る。
【化２】
0006566936.tif 000003
（式（１）または（２）中、
Ｒ１の基は、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基であり、
Ｒ２の基は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル基あるいは炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基であり、
Ｒ３の基は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基あるいは炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル置換イミノ基であり、
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５ａおよびＲ５ｂの基は、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基であり、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基は、相互に独立して、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の基から選択される基であり、
Ｒ６ｃおよびＲ６ｄの基は、相互に独立して、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の基から選択される基のアミノ基に炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基が導入された基であり、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂの基は、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ８ａおよびＲ８ｂの基は、相互に独立して、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基であり、
Ｑ1の基は、−ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、または以下の式（ＩＩ）で表される基であり、
【化３】
0006566936.tif 000004
Ｑ２の基は、−ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、または上記式（ＩＩ）で表される基のアミノ基に炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基が導入された基であり、
Ｐの基は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンの側鎖であり、
Ｌ１およびＬ３は、相互に独立して、−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
Ｌ２は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯであり、
Ｌ４は、−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｐ２−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｐ３−ＣＯ−、または−Ｌ４ａ−（ＣＨ２）ｑ２−ＣＯ−であり、ここで、ｐ２、ｐ３、およびｑ２は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ４ａは、ＯＣＯＮＨ、−ＣＨ２ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、
ｋは、３０〜２０，０００の整数であり、
ｓは、１〜６の整数であり、
ｍは、０〜３００の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ａは、０〜３００の整数であり、
ｂは、０〜ａの整数であり、
ｖは、０〜３００の整数であり、
ｃは、０〜３００の整数であり、
ｘは、０〜３００の整数であり
ｙは、０〜ｘの整数であり
ｚは、０〜３００の整数であり、
ただし、ｍが０のときｚは２以上の整数であり；
ｚが０のときｍは１以上の整数であり；
ｚ個のＱ１の基に含有される１級アミノ基および２級アミノ基の総数と（ｍ−ｎ）個のＲ６ａの基とｎ個のＲ６ｂの基とに含有される１級アミノ基および２級アミノ基の総数との合計をｗとしたとき、１以上ｗ未満の当該アミノ基の水素原子が置換ＰＢＡ基（例えば、上記式（Ｉ）で示されるＦＰＢＡ基）を有する有機基（例えば、アシル基）で置換されている。）
【００３１】
上記式（１）または（２）において、Ｌ１およびＬ２の組み合わせ、ならびに、Ｌ３およびＬ４の組み合わせは、一緒になって一つの連結基となり得るように組み合わされる必要がある。例えば、Ｌ２が−ＮＨ−である場合、Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−でなく、原子価結合である。
【００３２】
上記式（１）または（２）において、エチレングリコール（またはオキシエチレン）の繰り返し数を表すｋは、３０〜２０，０００、好ましくは４０〜２，０００、より好ましくは５０〜１，５００の整数である。
【００３３】
上記Ｒ１〜Ｒ３の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、およびアルキル基のアルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基または炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が２以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。
【００３４】
このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素またはフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
【００３５】
別の実施形態において、Ｒ１の基は、標的結合部位を含む基で置換されてもよい。標的結合部位をポリマーの末端に導入することにより、標的となる所望の部位への薬物（例えば、核酸）の到達性を向上できる。標的結合部位を含む基としては、標的となる組織に対する指向性または機能性を有する限りにおいて任意の適切な基であり得、例えば、抗体もしくはその断片、またはその他の機能性もしくは標的指向性を有するタンパク質、ペプチド、アプタマー、ラクトース等の糖、葉酸といった生理活性物質およびその誘導体に由来する基であり得る。
【００３６】
標的結合部位を含む基で置換されたＲ１の基の一例を、以下の式（ＩＩＩ）に示す。
【化４】
0006566936.tif 000005
ここで、ｖは１〜５の整数を表し、Ｄは標的結合部位を表す。
【００３７】
Ｄは、好ましくは重量平均分子量が５０〜２０，０００のペプチドであり、より好ましくは重量平均分子量が１００〜１０，０００のペプチドであり、さらに好ましくは重量平均分子量が１５０〜３，０００のペプチドである。
【００３８】
また、Ｄは、１〜２００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることが好ましく、１〜１００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがより好ましく、１〜３０個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがさらに好ましい。
【００３９】
上記ペプチドとしては、例えば、血管新生や内膜肥厚、悪性腫瘍の増殖に関与するインテグリンと特異的に結合することができるペプチドが挙げられ、具体的には、ＲＧＤペプチドが挙げられる。ＲＧＤペプチドを標的結合部位として用いることにより、疾患部分を特異的に認識可能な粒子および該粒子を用いた医薬組成物が得られる。ここで、ＲＧＤペプチドとは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含むペプチドをいう。好ましくは、ＲＧＤペプチドは環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチドである。具体的には、Ｄは、下記式（ＩＶ）で表わされ得る。
【化５】
0006566936.tif 000006
【００４０】
上記式（１）または（２）において定義する上記式（ｉ）〜（ｉｖ）の基ならびに炭化水素基またはステリル基については、上述した通りである。Ｑ１、Ｑ２、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ８ａおよびＲ８ｂの基については、属する繰り返し単位全てについて同一の基が選択されてもよく、異なる基が選択されてもよい。また、ｓは、例えば、１、３、または４である。
【００４１】
Ｑ２、Ｒ６ｃまたはＲ６ｄの基に導入される疎水性基は、任意の適切な連結基を介して導入されていてもよい。該連結基の具体例としては、置換ＰＢＡ基の導入の際に適用可能な連結基として上述したものが挙げられる。
【００４２】
式（１）または（２）において、Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基の両者がエチレン基を表す場合には、代表的には、ｎおよびｂが整数０であるか、またはｍ−ｎおよびａ−ｂが整数０であるポリアミノ酸を表すことになる。前者は、例えば、グルタミン酸γ−ベンジルエステルのＮ−カルボン酸無水物の重合により得られるポリ−α−グルタミン酸を表し、後者は、例えば、納豆菌をはじめとする細菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株が生産するポリ−γ−グルタミン酸を表す。一方、Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基の両者ともメチレン基を表す場合には、これらの基を有するそれぞれの反復単位は共存し得るものと理解されている。式（１）または（２）におけるＲ５ａおよびＲ５ｂの基についても同様である。製造効率の観点からは、好ましくはＲ４ａおよびＲ４ｂの基がメチレン基であり、Ｒ５ａおよびＲ５ｂの基がエチレン基である。
【００４３】
ポリマーユニットαを構成するポリアミノ酸鎖セグメントに含まれるカチオン性アミノ酸残基および置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の総数は、１以上である。形成されるポリマーミセルの安定性の観点から、カチオン性アミノ酸残基および置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の総数は、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上の整数（例えば、３０以上、４０以上または５０以上の整数）であり、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、さらに好ましくは１５０以下、さらにより好ましくは１００以下の整数である。当該ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含む場合、カチオン性アミノ酸残基の数は、疎水性アミノ酸残基の数に応じて上記の好適な範囲から適切に調整され得る。当該ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含む場合、ミセルがより安定化し得ることから、カチオン性アミノ酸残基、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の総数は、好ましくは１０〜１５０、より好ましくは２０〜１００の整数であり得る。
【００４４】
ポリマーユニットαを構成するポリアミノ酸鎖セグメントにおいて、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の数は、カチオン性アミノ酸残基の種類または数等によって適切に調整され得る。具体的には、ポリマーミセルが安定して形成され得る限りにおいて、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の数または導入率は、任意の適切な値に設定され得る。例えば、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の導入率（ポリマーユニットαにおけるカチオン性アミノ酸残基の総数に対する置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の数）は、好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上であり、また、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である（ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含まない場合、該導入率は、例えば３０％〜９０％、４０％〜８０％、または５０％〜７０％であり得る）。置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基の導入率がこのような範囲であれば、所望の架橋密度の架橋構造が形成され、結果として、血中では安定性および薬物保持性に優れ、かつ、細胞内では崩壊性および薬物放出性に優れたポリマーミセルを実現することができる。
【００４５】
Ｂ−４．ポリマーユニットαの作製方法
１つの実施形態においては、ポリマーユニットαは、任意の適切な合成方法によって作製され得る。１つの実施形態におけるポリマーユニットαの合成方法の一例は次の通りである。すなわち、Ｒ１を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成すること、当該ポリエチレングリコール鎖の成長末端側にアミノ基を導入すること；当該アミノ末端からＮＣＡ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）等の保護されたアミノ酸誘導体を重合させてポリアミノ酸鎖セグメントを形成すること；当該ポリアミノ酸の側鎖を脱保護してアミノ基を露出させること；および、当該露出したアミノ基とフッ素化カルボキシフェニルボロン酸のカルボキシル基とを反応させて、アミド結合により所望の数のＦＰＢＡ基を当該側鎖に導入することによって作製され得る。
【００４６】
別の実施形態においては、ポリマーユニットαは、例えば、以下のようにして作製され得る。すなわち、Ｒ１を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成すること、当該ポリエチレングリコール鎖の成長末端側にアミノ基を導入すること；当該アミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート等の保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物を重合させてポリアミノ酸鎖セグメントを形成すること；次いで、当該ポリアミノ酸とジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等のアミン化合物とを反応させて、エステルアミド交換反応により当該アミノ酸側鎖にＤＥＴ基等のアミン残基を導入すること；次いで、当該アミン残基のアミノ基とフッ素化カルボキシフェニルボロン酸のカルボキシル基とを反応させて、アミド結合により所望の数のＦＰＢＡ基を当該側鎖に導入すること；によって作製され得る。このとき、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートとγ−ベンジル−Ｌ−グルタメートとを併用してポリアミノ酸鎖セグメントを形成すると、その後のエステルアミド交換反応がβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテートに対して優先的に生じる。その結果、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート由来のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基として含むブロックコポリマーが得られ得る。
【００４７】
なお、上記合成の過程でアミノ酸エステル残基の一部にアミンの求核攻撃に起因した構造変化（例えば、アミノ酸エステル残基の脱アルコールによるイミド環の形成）が生じる場合がある。本発明に用いられるポリアミノ酸鎖セグメントは、このような構造変化を経た残基もさらに含み得るものとする。この場合、上記構造変化を経た残基は、カチオン性アミノ酸残基、置換ＰＢＡ基含有アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基のいずれにも含めないものとする。また、カチオン性アミノ酸残基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基が合成過程での酸（主に塩酸）の使用に起因して塩（主に塩酸塩）になる場合があるが、本発明においては、ポリアミノ酸鎖セグメントは、こうした構造を含み得るものとする。すなわち、Ｑ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基は塩（例えば、塩酸塩）となっていてもよい。
【００４８】
また、α末端に標的結合部位を有するポリエチレングリコールを用いて上記のようなブロックコポリマーの合成を行うか、またはα末端に後から標的結合部位を含む基を導入できるような官能基を有するポリエチレングリコールを用いて上記のようなブロックコポリマーの合成を行った後に標的結合部位を含む基を導入することにより、親水性ポリマー（ポリエチレングリコール）の末端に標的結合部位を持つブロックコポリマーを合成することができる。標的結合部位を含む基を導入する方法としては種々の方法が用いられるが、例えばα末端がアセタール化されたポリエチレングリコール鎖を有するブロックコポリマーとシステイン末端を有する所望の標的結合部位を有する化合物とを酸性溶液中で混合することにより、ポリエチレングリコール鎖側の末端に上記標的結合部位を付与することができる。
【００４９】
Ｃ．ポリマーユニットβ
ポリマーユニットβは、ポリマーユニットαと同様に、親水性ポリマー鎖セグメントおよびカチオン性ポリマー鎖セグメントを有する。親水性ポリマー鎖セグメントは、ポリマーユニットαに関して上記Ｂ−１項で説明したとおりである。以下、ポリマーユニットβのカチオン性ポリマー鎖セグメントについて、ポリマーユニットβにおいて特徴的な部分のみを説明する。それ以外の部分については、ポリマーユニットαに関して上記Ｂ−２項で説明したとおりである。
【００５０】
ポリマーユニットβのカチオン性ポリマー鎖セグメントは側鎖にＰＢＡ結合部位を有する。ＰＢＡ結合部位としては、ＰＢＡ基と結合して架橋構造を形成し得る任意の適切な化学構造が採用され得る。ＰＢＡ結合部位を構成し得る化学構造としては、例えば、ポリオール（特に、ｃｉｓ−ジオール）、ジアミン、ヒドロキシアミン、ヒドロキサム酸、アルコキシカルボキシアミドが挙げられる。ＰＢＡ結合部位とＰＢＡ基との反応は代表的には脱水反応であり、したがって、ＰＢＡ結合部位とＰＢＡ基との結合は代表的には共有結合である。ＰＢＡ結合部位となり得る化学構造を有する化合物としては、例えば下記の化合物１〜４３およびこれらの誘導体が挙げられる。
【化６】
0006566936.tif 000007
【化７】
0006566936.tif 000008
【化８】
0006566936.tif 000009
【化９】
0006566936.tif 000010
【化１０】
0006566936.tif 000011
【００５１】
上記のような化合物には、任意の適切な反応を用いて任意の適切な位置にアミノ基と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）が導入され得る。このような官能基を導入することにより、カチオン性ポリマー鎖セグメントの側鎖のアミノ基との反応が容易であり、結果として、ＰＢＡ結合部位の導入が容易となる。
【００５２】
ＰＢＡ結合部位がポリオール構造である場合、当該ポリオール構造の由来となるポリオール化合物に含まれる水酸基の数は、目的等に応じて適切に選択され得る。好ましくは、ポリオール構造はｃｉｓ−ジオール構造を含む。ｃｉｓ−ジオール構造はＰＢＡ基との間にエステル結合を形成しやすいので、ポリマーユニットαのＰＢＡ基とポリマーユニットβのポリオール構造との間でエステル結合が容易に形成され、結果として、非常に安定なポリマーミセルが形成され得る。また、上記のとおり、ポリオール化合物には、任意の適切な反応を用いて任意の適切な位置に例えばカルボキシル基が導入され得る。カルボキシル基を導入することにより、カチオン性ポリマー鎖セグメントの側鎖（実質的には、当該側鎖のアミノ基）との反応が容易であり、結果として、ポリオール構造の導入が容易となる。上記のような観点から、化合物１（グルコン酸誘導体）が好ましい。また、このような化合物からのポリオール構造は、ポリマーユニットαのＰＢＡ基との反応性にも優れ、所望の架橋構造を形成し得る。
【００５３】
ポリマーユニットβへのＰＢＡ結合部位（例えば、ポリオール構造）の導入方法は、ポリマーユニットαへのＰＢＡ基の導入方法と同様である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖セグメントとポリアミノ酸鎖セグメントとを有するブロックコポリマーにおけるポリアミノ酸鎖セグメントの側鎖のアミノ基と、ＰＢＡ結合部位を有する化合物（例えば、化合物１のグルコン酸誘導体のようなポリオール化合物）のカルボキシル基とを反応させることにより、ポリオール構造を当該側鎖に導入することができる。なお、ＰＢＡ結合部位を導入する前のブロックコポリマーの主鎖および側鎖の構造は、ＰＢＡ基を導入する前のブロックコポリマーの主鎖および側鎖の構造と同様であるので、ポリマーユニットαについての上記Ｂ−２〜Ｂ−４項の説明が参照され得る。
【００５４】
上記のとおり、ポリマーユニットβを構成し得るブロックコポリマーは、ポリマーユニットαを構成し得るブロックコポリマーと同様であり、具体例として上記式（１）または（２）で表されるブロックコポリマーが挙げられる（ただし、ｚ個のＱ１の基に含有される１級アミノ基および２級アミノ基の総数と（ｍ−ｎ）個のＲ６ａの基とｎ個のＲ６ｂの基とに含有される１級アミノ基および２級アミノ基の総数との合計をｗとしたとき、１以上ｗ未満の当該アミノ基の水素原子がＰＢＡ結合部位を有する残基で置換されている）。ポリマーユニットβを構成するポリアミノ酸鎖セグメントに含まれるカチオン性アミノ酸残基およびＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基の総数は、それぞれ、ポリマーユニットαにおける場合と同様である。具体的には、該総数は、１以上であり、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上の整数（例えば、３０以上、４０以上または５０以上の整数）であり、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、さらに好ましくは１５０以下、さらにより好ましくは１００以下の整数である。ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含む場合、カチオン性アミノ酸残基の数は、疎水性アミノ酸残基の数に応じて上記の好適な範囲から適切に調整され得る。当該ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含む場合、ミセルがより安定化し得ることから、カチオン性アミノ酸残基、ＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の総数は、好ましくは１０〜１５０、より好ましくは２０〜１００であり得る。
【００５５】
ポリマーユニットβを構成するポリアミノ酸鎖セグメントにおいて、ＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基の数は、カチオン性アミノ酸残基の種類または数等によって適切に調整され得る。具体的には、ポリマーミセルが安定して形成され得る限りにおいて、ＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基の数または導入率は、任意の適切な値に設定され得る。例えば、ＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基の導入率（ポリマーユニットβにおけるカチオン性アミノ酸残基の総数に対するＰＢＡ基結合部位含有アミノ酸残基の数）は、好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上であり、また、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である（ポリアミノ酸鎖セグメントが疎水性アミノ酸残基を含まない場合、該導入率は、例えば３０％〜９０％、４０％〜８０％、または５０％〜７０％であり得る）。ＰＢＡ結合部位含有アミノ酸残基の導入率がこのような範囲であれば、所望の架橋密度の架橋構造が形成され、結果として、血中では安定性および薬物保持性に優れ、かつ、細胞内では崩壊性および薬物放出性に優れたポリマーミセルを実現することができる。
【００５６】
Ｄ．ポリマーミセルおよび架橋構造
Ｄ−１．ポリマーミセル
上記のとおり、本発明の実施形態による医薬組成物は、上記ポリマーユニットαおよびβが、カチオン性ポリマー鎖セグメントが内側となり親水性ポリマー鎖セグメントが外側となるようにして放射状に配列し、ポリマーミセルを形成している。ポリマーミセルの平均粒径は、好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、さらに好ましくは３０ｎｍ〜１２０ｎｍである。
【００５７】
ポリマーミセルにおけるポリマーユニットαおよびβの含有量は、薬物のアニオンに対するポリマーユニットαおよびβのカチオンの電荷比が１以上であればよい。例えば薬物が核酸である場合、ポリマーミセルにおいて、ｐＨ７．４における［カチオン性ポリマー鎖セグメントの正電荷数］／［核酸の負電荷数］が、例えば１／１〜２０／１、好ましくは１／１〜１０／１であり得る。ポリマーミセルにおけるポリマーユニットαとポリマーユニットβとの含有比は、好ましくは２：３〜３：２であり、より好ましくは１：１近傍である。
【００５８】
Ｄ−２．架橋構造
ポリマーミセルにおいては、ポリマーユニットαのフェニルボロン酸基とポリマーユニットβのＰＢＡ結合部位とが、下記のような架橋構造を形成している。なお、下記のイメージは、架橋構造とともにポリマーミセルに内包された薬物も模式的に示している。
【化１１】
0006566936.tif 000012
【００５９】
上記架橋構造は、酸性環境下、好ましくはｐＨが６以下、より好ましくはｐＨが４〜６の範囲で崩壊し得る。このような架橋構造を形成することにより、細胞への高い薬物（例えば、核酸）送達能を達成することができる。具体的には、生体内においては、細胞外のｐＨは約７であるのに対し、細胞内後期エンドソーム内のｐＨは５〜６である。したがって、上記のような架橋構造は、細胞外では構造を維持し、細胞内後期エンドソーム内では容易に崩壊する。その結果、本発明の実施形態による医薬組成物（例えば、ポリマーミセル）は、標的細胞に達するまでは薬物（例えば、核酸）を内包した形態を安定して維持することができ、かつ、標的細胞に取り込まれた後は、当該薬物を標的細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができる。より詳細には、薬物の放出は以下のようにして実現され得る。標的細胞に取り込まれたポリマーミセルは、後期エンドソーム内の酸性（代表的には、ｐＨが５〜６）環境下において架橋構造が崩壊する。その結果、薬物との相互作用が相対的に強いポリマーユニットが会合する。一方、薬物との相互作用が相対的に弱いポリマーユニットはミセルから離脱し、エンドソーム膜に対して膜障害活性を示すことにより、薬物はエンドソーム脱出を達成する。エンドソーム内の薬物（例えば、核酸）会合体は、細胞内に高濃度で存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の作用により、静電結合および疎水性相互作用が弱められ、同様に細胞内に高濃度で存在する核酸やたんぱく質などのアニオン性物質との置き換わり反応により、薬物は細胞に放出され得る。あるいは、上記架橋構造は、競合的に結合可能な物質の存在下で崩壊し得る。本明細書において「競合的に結合可能な物質」とは、ＰＢＡ基とＰＢＡ結合部位との結合（架橋構造）よりも、ＰＢＡ基またはＰＢＡ結合部位との間でより容易に結合を形成し得る官能基を有する物質をいう。すなわち、このような物質の存在下において、ＰＢＡ基またはＰＢＡ結合部位が優先的に当該物質の官能基と結合することにより、架橋構造が崩壊し得る。架橋構造崩壊後の薬物放出のメカニズムは上記と同様である。競合的に結合可能な物質の具体例としては、ＲＮＡ、ＡＴＰ等のリボヌクレオチドまたはリボヌクレオシド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンが挙げられる。なお、リボヌクレオチド、リボヌクレオシド、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰはｃｉｓ−ジオール構造を有するので、ＰＢＡ結合部位を有する化合物でもある。競合的に結合可能な物質の一例として、ＡＴＰについて説明する。すなわち、細胞外ではポリマーユニットαのＰＢＡ基とポリマーユニットβのＰＢＡ結合部位との結合がポリマーミセルの安定化に大きく寄与している一方、細胞内（ＰＢＡ基と結合可能な分子であるＡＴＰが豊富に存在する）では、ポリマーミセル内のＰＢＡ基とＰＢＡ結合部位との結合がＰＢＡ基とＡＴＰとの結合に置き換わる。その結果、ＰＢＡ基とＰＢＡ結合部位の結合が切断されて架橋構造が崩壊し、ポリマーミセルが崩壊し得る。競合的に結合可能な物質は、好ましくは、高いＰＢＡ結合能を有する。例えば、血中に豊富にあるグルコースはＰＢＡ基との結合能を有するものの結合能は非常に低いので、ポリ��ーミセル内のＰＢＡ基とＰＢＡ結合部位との結合が維持され、血中のポリマーミセルも安定して維持される。
【００６０】
さらに、上記の架橋構造は、中性環境下においてきわめて容易に形成され得るという効果を有する。すなわち、ポリマーユニットαとポリマーユニットβとを中性の水性媒体中で単純に混合するだけで、架橋構造が形成されたポリマーミセルが容易に形成され得る。したがって、ポリマーユニットαとポリマーユニットβと薬物とを中性の水性媒体中で単純に混合するだけで、優れた薬物保持特性を有する薬物内包ポリマーミセルが容易に形成され得る。具体例としては、ポリマーユニットαとポリマーユニットβとを中性溶媒中で混合し、次いで、薬物を添加してさらに混合する、ポリマーユニットαとポリマーユニットβと薬物とを中性溶媒中で混合する、ポリマーユニットαと薬物とを中性溶媒中で混合し、次いで、ポリマーユニットβを添加してさらに混合する、ポリマーユニットβと薬物とを中性溶媒中で混合し、次いで、ポリマーユニットαを添加してさらに混合する等の形成方法が挙げられる。
【００６１】
Ｅ．薬物
薬物としては、ポリマーミセルに内包され得る限り任意の適切な薬物が用いられ得る。上記のようなポリマーミセルに好適に内包され得る薬物としては、核酸が挙げられる。好ましい核酸は長鎖（すなわち、高分子量の）核酸であり、より好ましくはｍＲＮＡおよびｐＤＮＡである。ｍＲＮＡは３’末端におけるＰＢＡ基との結合が困難であり、結果としてポリマーユニットαへの結合が困難であるので、上記のようなポリマーミセルの架橋構造による内包および保持が非常に有用である。ｐＤＮＡはＰＢＡ基との結合が実質的に不可能であるので、ｍＲＮＡと同様に上記のようなポリマーミセルの架橋構造による内包および保持が非常に有用である。なお、上記のような核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであってもよく、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであってもよい。
【００６２】
ポリマーミセルにおける薬物の含有量は、目的および用途等に応じて適切に設定され得る。薬物が核酸である場合、Ｎ／Ｐ比は、好ましくは１〜１００であり、より好ましくは１〜５０であり、さらに好ましくは１〜１０である。このような範囲であれば、生理的条件下での安定性に優れ、かつ、毒性が抑制され得る。なお、Ｎ／Ｐ比とは、［ポリマーミセルに含有されるポリマーユニット中のポリアミノ酸側鎖のアミノ基］／［核酸中のリン酸基］を意味する。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、例えば「ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５」という表記は、ポリアミノ酸鎖セグメントが重合度（アミノ酸残基数）７５のポリアスパラギン酸誘導体にＦＰＢＡ基を４４個導入したものであることを示す。また、実施例において合成されたポリマーユニットのＰＥＧの分子量は１２０００である。【００６４】
＜製造例１：ポリマーユニットαの合成＞
（１−ｉ）ＰＥＧ−ＰＢＬＡの合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル））を以下のスキームで合成した。
【化１２】
0006566936.tif 000013
【００６５】
ベンゼンで一晩凍結乾燥したＭｅｔｈｏｘｙ（ＭｅＯ）−ＰＥＧ−ＮＨ２（日油株式会社製、Ｍｗ＝１２０００）５０５ｍｇを、ＤＭＦ：ジクロロメタン（１：１０）混合溶媒５．１ｍｌに完全に溶解させた。Ａｒ雰囲気下で、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル（ＢＬＡ）のＮ−カルボキシ酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、中央化成品株式会社製）９２０ｍｇを、上記と同様の混合溶媒９．２ｍｌに溶解させた。ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液をＰＥＧ溶液に加え、２５℃の水浴で７２時間撹拌した。ＩＲ測定により反応が終了していることを確認した後、当該反応液を撹拌されている酢酸エチル：ヘキサン（４：６）混合溶媒３００ｍｌに滴下し、ＰＥＧ−ＰＢＬＡの白色沈殿を得た。吸引ろ過にて溶媒を除去し、減圧乾燥を経て白色粉末のＰＥＧ−ＰＢＬＡ (１．１１ｇ)を得た。ＰＢＬＡの重合度（アミノ酸残基数）は７５であった。【００６６】
（１−ｉｉ）ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の合成
次に、ＰＥＧ−ＰＢＬＡとジエチレントリアミン（ＤＥＴ）とのエステルアミド交換反応により、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を合成した。合成スキームは以下のとおりである。
【化１３】
0006566936.tif 000014
【００６７】
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  ６００ｍｇを少量のジクロロメタンに溶解し、ベンゼンを加えて一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥したＰＥＧ−ＰＢＬＡを、Ａｒ雰囲気下で、チオウレア０．５Ｍを含有する脱水Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）３０ｍｌに溶解させた。他のフラスコにＰＢＬＡに対して５０当量の脱水ＤＥＴ（９ｍｌ）をとり、脱水ＮＭＰ（９ｍｌ）に溶解した。ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液とＤＥＴ溶液を共に１０℃に冷却し、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液をＤＥＴ溶液にゆっくり滴下し、２時間程度反応させた。反応後、反応溶液を撹拌中の５Ｍ塩酸水溶液中に塩氷で冷却しながら滴下した。この際、溶液が５℃を越えないようにした。滴下終了後速やかに、０．０１Ｍ塩酸水溶液で４℃にて透析を開始した。透析は０．０１Ｍ塩酸水溶液で３回、純水で２回行った。透析後に一晩凍結乾燥し、少量の純水に再溶解して０．２μｍのシリンジフィルターでろ過し、再度一晩凍結乾燥を行った。このようにして、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（５５１ｍｇ）を得た。【００６８】
（１−ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）へのＰＢＡ基の導入
次に、トリアジン系縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを用いた脱水縮合反応により、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の側鎖にＰＢＡ基（本製造例ではＦＰＢＡ基）を導入した。反応スキームは以下のとおりである。
【化１４】
0006566936.tif 000015
【００６９】
ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）４０ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬社製）１５５ｍｇ、およびマンニトール１０２ｍｇを、２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液７．５ｍｌに溶解した。一方、下記表１に示すように所定の導入率に応じた量のＦＰＢＡ（和光純薬社製）をメタノールに溶解させた。ＦＰＢＡの質量が１０ｍｇ以下の場合はメタノール２ｍｌに溶解させ、ＦＰＢＡの質量が１０ｍｇを超える場合はメタノール７．５ｍｌに溶解させた。ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とＦＰＢＡ溶液とを混合し、1時間ごとにＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬社製）１５５ｍｇを加えながら、４℃で３時間、攪拌しながら反応させた。反応後速やかに、０．０１Ｍ塩酸水溶液で４℃にて透析を開始した。透析は０．０１Ｍ塩酸水溶液で３回、純水で２回行った。透析後に０．２μｍのシリンジフィルターでろ過して凍結乾燥し、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲにより解析したところ、実際のＦＰＢＡ基導入数は表１の通りであった。【００７０】
【表１】
0006566936.tif 000016
【００７１】
＜製造例２：ポリマーユニットβの合成＞
（２−ｉ）ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の合成
製造例１と同様にしてＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を合成した。【００７２】
（２−ｉｉ）グルコン酸誘導体（ポリオール）の合成
グルコノラクトンをγ-アミノ酪酸と反応させて開環し、グルコン酸誘導体（ポリオール）を合成した。合成スキームは以下のとおりである。
【化１５】
0006566936.tif 000017
【００７３】
グルコノラクトン８９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ、東京化成社製）とγ-アミノ酪酸５２ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ、東京化成社製）とを混合し、当該混合物をメタノール１４ｍｌ／トリエチルアミン１．５ｍｌ混合溶媒に溶解させた。溶液を７５℃で還流しながら一晩放置して反応させた。反応終了後、酢酸エチル：ヘキサン（ １：１）混合溶媒で再結晶させ、減圧乾燥してグルコン酸誘導体を得た。【００７４】
（２−ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）へのポリオール構造の導入
次に、トリアジン系縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを用いたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とグルコン酸誘導体との脱水縮合反応により、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の側鎖にポリオール構造を導入した。反応スキームは以下のとおりである。
【化１６】
0006566936.tif 000018
【００７５】
ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）４０ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬社製）１５５ｍｇ、および、下記表２に示すように所定の導入率に応じた量のグルコン酸誘導体を、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液に溶解した。予定導入数が７５の系は−２０℃で凍結および融解させて反応させた(凍結融解法)。他の３つの系は４℃で３時間、攪拌しながら反応させた。反応後速やかに、０．０１Ｍ塩酸水溶液で４℃にて透析を開始した。透析は０．０１Ｍ塩酸水溶液で３回、純水で２回行った。透析後に０．２μｍのシリンジフィルターでろ過して凍結乾燥し、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲにより解析したところ、実際のポリオール構造導入数は表２の通りであった。【００７６】
【表２】
0006566936.tif 000019
【００７７】
＜実施例Ａ：ｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの調製＞
上記の製造例１Ａ〜１Ｆで得られたポリマーユニットαと上記の製造例２Ａ〜２Ｄで得られたポリマーユニットβとを組み合わせで用いてポリマーミセル溶液を調製した。具体的には、以下の手順でポリマーミセル溶液を調製した。ポリマーユニットαおよびポリマーユニットβをそれぞれ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた。これらの溶液をＮ／Ｐ比に応じて濃度を調整し、ポリマーユニットαの溶液５μｌとポリマーユニットβの溶液５μｌとを混合した後、５０μｇ／ｍｌ（１ＯＤ）のｐＤＮＡを２０μｌ加えてｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。なお、以下の評価において、血中滞留評価においてのみｐＤＮＡとしてｐＣＡＧ−Ｌｕｃ２を用い、それ以外はｐＤＮＡとしてｐＣＡＧ−Ｌｕｃを用いてｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。具体的には、ｐＣＡＧ−Ｌｕｃは、ｐＣＡＧＧＳベクター(Niwa et al., Gene 108, 193-200, 1991)のＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にＬｕｃｉｆａｒａｓｅ遺伝子（配列番号：１）を組み込んで得られる発現ベクターを意味する。ｐＣＡＧ−Ｌｕｃ２は、ｐＣＡＧＧＳベクター(Niwa et al., Gene 108, 193-200, 1991)のＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にＬｕｃｉｆａｒａｓｅ遺伝子（配列番号：３）を組み込んで得られる発現ベクターを意味する。【００７８】
＜比較例１＞
製造例１において合成されたポリマーユニットα（５０％）およびＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（５０％）を用いたこと以外は実施例と同様にして、ｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。【００７９】
＜比較例２＞
製造例２において合成されたポリマーユニットβ（５０％）および製造例１において合成されたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（５０％）を用いたこと以外は実施例と同様にして、ｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。【００８０】
＜比較例３＞
製造例１において合成されたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のみを用いたこと以外は実施例と同様にして、ｐＤＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。【００８１】
＜ポリマーミセルの粒径＞
上記の製造例１Ａ〜１Ｆで得られたポリマーユニットαと上記の製造例２Ａ〜２Ｄで得られたポリマーユニットβとのすべての組み合わせについてポリマーミセルを調製した。得られたポリマーミセル溶液を４℃で一晩放置した後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用してＤＬＳ測定を行い、ポリマーミセルの粒径を測定した。その結果、すべての組み合わせについてポリマーミセルが形成されていることを確認した。例えば、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]との組み合わせのポリマーミセルは、平均粒径１０３．２ｎｍ、多分散度０．１７２であった。【００８２】
＜ポリアニオン耐性試験＞
まず、製造例２Ｄのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ４０）７５]と製造例１Ａ〜１Ｆのポリマーユニットαとの組み合わせを用いて、ポリオール構造の導入数を４０に固定してＦＰＢＡ基の導入数を変化させた場合のポリアニオンに対する置き換わり耐性を比較した。手順は以下のとおりである。Ｔｒｉｓが３．３ｍＭ、酢酸ナトリウムが１．７ｍＭ, ＥＤＴＡ・２Ｎａが１ｍＭとなるように１×ＴＡＥ  ｗｅａｋバッファーを調製し、電気泳動用バッファーとした。アガロース０．５４ｇにＴＡＥバッファーを加えて総量を６０ｇとし、純水を１５ｇ加えた後、電子レンジで加熱してそれを冷却することで０．９重量％アガロースゲルを作成した。Ｎ／Ｐ比を３に調整した各ポリマーミセル溶液にＡ／Ｐ比（アニオン電荷とｐＤＮＡのリン酸基のモル比）に応じたデキストラン硫酸１０μｌと７５０ｍＭのＮａＣｌ溶液１０μｌを加えた後、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ローディングバッファーを加えて１００Ｖで６０分間電気泳動を行い、ｐＤＮＡの放出の有無を確認した。Ａ/Ｐ＝６およびＡ/Ｐ＝８の結果をそれぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａおよび図１Ｂから、ポリオール構造の導入数を４０に固定した場合には、ＦＰＢＡ基の導入数が４４であるポリマーミセルが最も高い安定性（ポリアニオンに対する置き換わり耐性）を示すことがわかる。【００８３】
上記の結果をふまえ、ＦＰＢＡ基の導入数を４４に固定してポリオール構造の導入数を変化させた場合のポリアニオンに対する置き換わり耐性を比較した。すなわち、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ａ〜２Ｄのポリマーユニットβとを組み合わせて用いた。手順は上記と同様である。結果を図１Ｃに示す。図１Ｃから、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]とから得られるポリマーミセルが最も高い安定性（ポリアニオンに対する置き換わり耐性）を示すことがわかる。したがって、このようなポリマーミセルは、生体内に多く存在するアニオン性分子の静電相互作用等により崩壊しづらく、生体内における安定性および薬物保持性に優れることが示唆される。【００８４】
＜ＡＴＰ濃度応答性＞
上記の「ポリアニオン耐性試験」において最も高い安定性を示した、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]とから得られるポリマーミセルを用いた（ただし、Ｎ／Ｐ比を３．５とした）。上記の「ポリアニオン耐性試験」と同様にしてアガロースゲルを作成した。混合後０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、３．０ｍＭ、および５．０ｍＭとなるように調製したＡＴＰ溶液５μｌと７５０ｍＭのＮａＣｌ溶液５μｌとをポリマーミセル溶液１５μｌに加え、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、１００Ｖで６０分間電気泳動を行い、ｐＤＮＡの放出の有無を確認した。結果を図２に示す。図２から、ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ〜１．０ｍＭではｐＤＮＡは放出されず、ＡＴＰ濃度が３．０ｍＭ以上でｐＤＮＡが放出されることがわかる。細胞外ＡＴＰ濃度は約０．３ｍＭであり細胞内ＡＴＰ濃度は約３ｍＭであるので、ポリマーミセルが細胞内ＡＴＰ濃度に対する応答性を有していることが示唆される。【００８５】
＜グルコース耐性＞
上記の「ＡＴＰ濃度応答性」と同様のポリマーミセルを用い、および、同様のアガロースゲルを作成した。混合後に５．０ｍＭおよび１０ｍＭとなるようにＡ／Ｐ比＝３のデキストラン硫酸で調製したグルコース溶液５μｌと７５０ｍＭのＮａＣｌ溶液５μｌとをポリマーミセル溶液１５μｌに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、１００Ｖで６０分間電気泳動を行い、ｐＤＮＡの放出の有無を確認した。結果を図３に示す。血中グルコース濃度は健常者で約５．６ｍＭであり糖尿病患者で約１０ｍＭであるので、図３から、ポリマーミセル中のグルコン酸誘導体部分（ポリオール構造）とグルコースとの置き換わり反応によるポリマーミセルの崩壊は生じないことが示唆される。【００８６】
＜細胞取り込み評価＞
ヒト肝がん（Ｈｕｈ−７）細胞を６ｗｅｌｌプレートに５０，０００細胞／１ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように播種して３７℃で２４時間培養した。新しい培地と交換後、Ｃｙ−５でラベル化されたｐＤＮＡを用いてＮ／Ｐ比に応じてｐＤＮＡ濃度が２／３ＯＤとなるように調製したポリマーミセルを７５μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間培養した。培養後に培地を取り除き、Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞表面を３回洗浄して１０倍希釈したＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を１ｍｌ／ｗｅｌｌ加え、ｗｅｌｌ全体になじませた後Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を取り除き、３７℃で３分間インキュベーションした。Ｄ−ＰＢＳ（−）を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加えて細胞を剥がし、得られた細胞懸濁液をフローサイトメーターにより評価した。なお、ポリマーミセルを形成するポリマーユニットとして、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]とを用いた。以降のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの評価において、製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]とから形成されるポリマーミセルを実施例とする。なお、上記のとおり、比較例１は対応するポリマーユニットα５０％とＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）５０％とから形成されたポリマーミセル、比較例２は対応するポリマーユニットβ５０％とＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）５０％とから形成されたポリマーミセル、比較例３はＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のみから形成されたポリマーミセルを用いた。【００８７】
本評価の結果を図４に示す。図４から、実施例のポリマーミセルにおいてのみ高い細胞取り込みが確認された。具体的には、実施例のポリマーミセルは、比較例１〜３のポリマーミセルの約１０倍の取り込み量を示した。これは、実施例のポリマーミセルが比較例１〜３のポリマーミセルとは異なり、内部の架橋構造（ＰＢＡ基とポリオール構造による架橋構造）により安定したことに起因するものと推察される。【００８８】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子発現試験＞
Ｈｕｈ−７細胞を２４ｗｅｌｌプレートに２０，０００細胞／４００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種して３７℃で２４時間培養した。新しい培地と交換後、ｐＣＡＧ−Ｌｕｃを用いてＮ／Ｐ比に応じてｐＣＡＧ−Ｌｕｃ濃度が２／３ＯＤとなるように調製したポリマーミセルを３０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間培養した。その後、新しい培地と交換して再び３７℃で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞表面を数回洗浄して５倍希釈したＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、得られた細胞溶解液を９６ｗｅｌｌプレートに２０μｌ／ｗｅｌｌで加え、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えた後、ルミノメーターによりルシフェラーゼ発光量を評価した。
並行して、ポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]、ポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]、およびＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のそれぞれについて、細胞毒性試験を行った。具体的には以下のとおりである。Ｈｕｈ−７細胞を９６ｗｅｌｌプレートに５，０００細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種して３７℃で２４時間培養した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させたポリマーを添加し、３７℃で４８時間培養した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを１０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１．５時間培養し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００８９】
ポリマーの細胞毒性評価とポリマーミセルの遺伝子発現評価を図５に示す。図５（ｂ）から明らかなように、ポリマーミセルを構成するポリマーユニットのいずれにおいても、顕著な細胞毒性は確認されず、ポリマーミセルは細胞毒性を有さないことが示唆される。図５（ａ）から明らかなように、遺伝子発現試験においては、実施例のポリマーミセルは、比較例１〜３のいずれのポリマーミセルに対しても約８倍以上、比較例３のポリマーミセルに対して約２０倍の発現効率を示した。これは、取り込まれたポリマーミセルが細胞内で実際にｐＤＮＡを放出していることを示している。また、上記の細胞取り込み量の差が実施例と比較例で約１０倍程度であるのに対し、約２０倍の発現効率を示しているということは、ポリマーミセルが細胞内に取り込まれてから発現に至るまでに差異が存在することを示しており、実施例のポリマーミセルが細胞内ＡＴＰ濃度に応答している可能性が示唆される。【００９０】
＜血中滞留性評価＞
ｐＤＮＡ濃度が２．０ＯＤとなるように調製したポリマーミセル溶液２００μｌをマウス尾静脈より投与した（Ｎ＝４）。５分、１０分、２０分、および４０分後に尾静脈から血液を２μｌ採取し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋからなる混合溶液と混合した。また、ｐＤＮＡ濃度を１／５ＯＤとしたミセル溶液を上記の混合溶液と混合し、これを０分でのコントロール値とした。採取した血液サンプルからＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ＆  ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液２ μｌをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎとプライマーと超純水からなる溶液１８μｌと混合し、ＰＣＲ測定を行なった。【００９１】
本評価の結果を図６に示す。図６から明らかなように、実施例のポリマーミセルは、比較例３のポリマーミセルに比べて血中滞留性が大幅に向上していることがわかる。すなわち、実施例のポリマーミセルは、生体内環境においても優れた安定性を有することが確認された。これは、ＰＢＡ基とポリオール構造との架橋効果が生体内環境においても有用であることを示している。【００９２】
＜実施例Ｂ：ｍＲＮＡ内包ポリマーミセルの調製＞
製造例１Ｃのポリマーユニットα[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ＦＰＢＡ４４）７５]と製造例２Ｃのポリマーユニットβ[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ／ｐｏｌｙｏｌ２０）７５]とを組み合わせで用いてポリマーミセル溶液を調製した。具体的には、以下の手順でポリマーミセル溶液を調製した。ポリマーユニットαおよびポリマーユニットβをそれぞれ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた。これらの溶液をＮ／Ｐ比に応じて濃度を調整し、ポリマーユニットαの溶液５μｌとポリマーユニットβの溶液５μｌとを混合した後、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを０．２５μｇ加えて実施例のｍＲＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した（Ｎ／Ｐ比＝３、ｍＲＮＡ濃度＝２／３ＯＤ）。また、ポリマーユニットαとして[ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）７５]を用いたこと以外は同様にして、比較例のｍＲＮＡ内包ポリマーミセルの溶液を調製した。なお、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡは、ｐＣＡＧ−Ｌｕｃ２を鋳型とし、ＲＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズジャパン社製、製品名「ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ＠Ｋｉｔ」）を用いて調製した。【００９３】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子発現試験＞
Ｈｕｈ−７細胞を４８ｗｅｌｌプレートに１０，０００細胞／２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種して３７℃で２４時間培養した。新しい培地と交換後、実施例または比較例のポリマーミセルを１５μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞表面を数回洗浄して５倍希釈したＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、得られた細胞溶解液を９６ｗｅｌｌプレートに２０μｌ／ｗｅｌｌで加え、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えた後、ルミノメーターによりルシフェラーゼ発光量を評価した（Ｎ＝４）。結果を図７に示す。【００９４】
図７から明らかなように、遺伝子発現試験においては、実施例のポリマーミセルは、比較例のポリマーミセルに対して約１０倍の発現効率を示した。これは、取り込まれたポリマーミセルが細胞内で実際にｍＲＮＡを放出していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の医薬組成物は、ＤＤＳの分野において好適に適用され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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