(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療的に有用な作用物質を送達するためのナノ粒子であって、
（ｉ）無機マグネシウム塩からなるマグネシウム塩を含むコア；および
（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む医療的に有用な作用物質であって、該ＲＮＡは、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）または小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、作用物質
を含み、該ナノ粒子の平均の直径は、約１００ｎｍ以下であり、該無機マグネシウム塩はリン酸マグネシウムを含む、ナノ粒子。
【請求項２】
（ｉ）リン酸マグネシウムからなるコア；および
（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む医療的に有用な作用物質であって、該ＲＮＡは、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）または小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、作用物質
を含むナノ粒子であって、該ナノ粒子の平均の直径は、約１００ｎｍ以下である、ナノ粒子。
【請求項３】
被験体における疾患の処置における使用のためのナノ粒子であって、
（ｉ）無機マグネシウム塩からなるマグネシウム塩を含むコア；
（ｉｉ）ａｉＲＮＡを含む医療的に有用な作用物質；および
（ｉｉｉ）該コアを実質的に封入するシェルであって、界面活性物質およびタンパク質もしくはペプチドを含むシェル
を含み、該ナノ粒子は正に帯電しており、約１００ｎｍ以下の平均の直径を有し、該無機マグネシウム塩はリン酸マグネシウムを含む、ナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子は水溶液中で凝集しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記医療的に有用な作用物質は、前記コアの表面上または内部に配置される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記コアは、核酸、タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、アミノ酸、炭水化物、小分子、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または生体適合性ポリマーから選択される添加物を含む、請求項１または５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記コアを実質的に封入するシェルをさらに含む、請求項１、２または６のいずれか１項に記載のナノ粒子であって、該シェルは、
リガンドもしくは標的化リガンド、ペプチド、細胞透過性ペプチドおよび／もしくはＲＧＤトリペプチド、タンパク質、アルブミン、アルブミン誘導体、ヒストン、プロタミン、アミノ酸、界面活性物質、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）および／もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）、炭水化物、シクロデキストリン、脂質、核酸、小分子、および／または生体適合性ポリマーから選択される成分を含む、ナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子の平均の直径は、約５ｎｍと約１００ｎｍとの間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子の平均の直径は、約５ｎｍと約８０ｎｍとの間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記ナノ粒子の平均の直径は、約５ｎｍと約５０ｎｍとの間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記医療的に有用な作用物質は、核酸をさらに含み、該核酸が、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡおよび／またはアプタマーから選択される、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉ分子が、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記コアが、リン酸カルシウムを含まない、請求項１または請求項３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記医療的に有用な作用物質の哺乳動物被験体への送達における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記界面活性物質がＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記タンパク質がプロタミンまたはヒストンを含む、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記医療的に有用な作用物質を哺乳動物被験体へ送達するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のナノ粒子を調製する方法であって、
有機溶媒中に混合された、リン酸マグネシウムではない無機マグネシウム塩と、該医療的に有用な作用物質とを含む水溶液の第１のエマルジョンに、有機溶媒中に混合された無機リン酸塩の水溶液の第２のエマルジョンを加えること
を含み、
該第１のエマルジョンの該第２のエマルジョンに対する比率は、約１０：１〜約２０：１である、方法。
【請求項１８】
前記医療的に有用な作用物質は、ＲＮＡｉ分子を含み、該ＲＮＡｉ分子は、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７６１，０１２号の優先権およびその利益を主張し、当該出願は、適用可能な法律および規則が許容する程度に、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし。
【０００３】
発明の分野
本発明は、新規のナノ粒子組成物、それを製作する方法、および薬物送達キャリアとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
高分子および小分子の両方を含めた治療的作用物質がますます豊富になるとともに、生物医学業界および製薬業界では、哺乳動物、特にヒト集団のための、これらの治療的作用物質の、安全で、実用的でかつ効果的な送達ビヒクルの重要性がますます認識されてきた。満足な送達ビヒクルについて所望される特徴は多数存在する：送達ビヒクルは、非毒性であること、したがって生体適合性であること、好ましくは合理的な時間以内で生分解可能または吸収可能である必要がある。全身投与については、送達ビヒクルは、治療物質を、体内で分解または消化から保護しながら標的部位まで循環させるに十分に安定である必要があり、そして、送達が著しい免疫応答を引き起こすように実際に設計されているのでない限り、そのような著しい免疫応答を回避する必要がある。送達ビヒクルは、標的の組織、細胞、細胞区画またはオルガネラにアクセスするためには、生理的障壁を透過することができる必要がある。送達ビヒクルはまた、標的部位の生理的条件下で、またはそれが運搬する作用物質を放出する標的時間の間、十分に可溶性である必要がある。さらに、治療的作用物質の経時的で制御された放出が、多くの場合強く所望される。
【０００５】
ここ数十年で開発された新しい種類の治療的作用物質の中には、１９９８年のＦｉｒｅおよびＭｅｌｌｏによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓでのＲＮＡｉの発見の後のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の天然のプロセスに基づく治療的作用物質がある。ＲＮＡｉのプロセスにおいて中心的なのは、２つのタイプのリボ核酸（ＲＮＡ）分子（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および小分子もしくは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））である。研究者らは、両方のタイプの分子、ならびに植物および動物の両方における、最も顕著には転写遺伝子サイレンシングおよび転写後遺伝子サイレンシングにおける、それらの役割に基づき、将来性のある治療的適用を開発している。例えば、外因性ｓｉＲＮＡまたはそれらの発現ベクターは、宿主に直接導入されるか、または宿主細胞中で発現されて、発達、免疫応答および疾患に関わる遺伝子発現を制御するように操作されている。
【０００６】
天然に存在するｓｉＲＮＡ形態（二本鎖であり、両方の鎖に２−ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１塩基対長である）に基づく新しい種類のＲＮＡ分子もまた、合理的に考案されている。それは、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と呼ばれる。ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／０２９６８８号を参照されたい。ｓｉＲＮＡに優るａｉＲＮＡの利点としては、より優れた有効性および潜在能力、迅速な作用開始、より優れた耐久性、ＲＮＡ二重鎖がより短く非特異的インターフェロン様応答を回避すること、オフターゲット効果の低減、および合成コストの低減が挙げられる。
【０００７】
ＲＮＡｉへの大きな関心の爆発的増加にもかかわらず、そして多くの人がＲＮＡｉを近年の歴史の中で最も重要な薬理学的進歩と呼んでいるところ、研究者らは、哺乳動物におけるＲＮＡｉベースの治療の成功は、目的の遺伝子が発現される特定の組織および器官へのｓｉＲＮＡの細胞内送達に大部分が依存していることを認識するに至っている。Ｖａｉｓｈｎａｗ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｓｔａｔｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｓｉｌｅｎｃｅ  （２０１０）１：１４を参照されたい。実際に、満足な送達系がないことは、技術的ハードルの他の多数の側面が解決されるにつれ、ＲＮＡｉ治療剤の力の利用において、ますますボトルネックとなってきている。Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１１年５月）１２：３２９−３４０を参照されたい。例えば、ｓｉＲＮＡのための信頼できる送達系の考案における１つの困難は、ｓｉＲＮＡの血中循環半減期を増加させること、および中途での腎排泄を回避することである。その目標のために、研究者らは、結合体化に基づくアプローチを使用してｓｉＲＮＡを改変し、ある程度成功している。例えば、マウスの系において、静脈内投与されたコレステロール結合体化ｓｉＲＮＡは、循環半減期および肝臓中の標的ｍＲＮＡのノックダウンが顕著に増加していることが示されている。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２：１７３−１７８を参照されたい。しかしながら、臨床上適合性であり得る送達システムであって、そして十分なサイレンシングＲＮＡを組織および細胞に送達して有意義な遺伝子サイレンシングを実現することができる送達系の設計には、まだまだ最大の困難が残っている。
【０００８】
最適な薬物送達系の探索はまた、研究者らをナノ粒子技術へも導き、ナノ粒子技術は、薬物送達における空間的制御および時間的制御の両方において大きな可能性を示している。多数のナノ粒子が、生物学的高分子（例えば、タンパク質および核酸）のキャリアとしての使用のために提案されている、例えば、米国特許第５，２１９，５７７号および同第７，６５１，６９４号を参照されたい。２０１０年に、シクロデキストリンベースのポリマーで作製されたナノ粒子が用いられる標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）送達系を介した、患者へのｓｉＲＮＡの効果的な全身投与の報告が発表された（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６４，１０６７−１０７０を参照されたい）。しかしながら、シクロデキストリンベースのナノ粒子アプローチは、将来性はあるが、全身投与の後にわずかな遺伝子サイレンシングの有効性しか示さなかった。新規のナノ粒子技術は、薬物有効性のために必要な送達効率を実現するために、依然として緊急に必要とされている。
【０００９】
ＲＮＡｉベースの治療的作用物質のためのナノスケール送達ビヒクルの現在の探究の大部分は、リポソームベースのキャリアまたはポリマーベースのキャリアに焦点を合わせている。他の構成（例えば、金属（例えば、金）およびリン酸カルシウム）をベースとするナノ粒子（Ｌｉ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  （２０１０）１４２（３）：４１６−４２１を参照されたい）もまた研究されているが、はるかに低い程度である。しかしながら、特定の金属では生分解性がなく、その結果それらには細胞毒性があることに対しての、ならびにリン酸カルシウム粒子の安全性および送達有効性に対しての、懸念および失望が起こっている。結果として、ウイルスベクターに優るそれらの潜在的な利点にかかわらず、これらの材料で作製されたナノ粒子の、生物学的に活性な分子の実行可能な送達ツールとしての利用可能性は制限されたままである。したがって、薬物送達ビヒクルとしての革新的な非ウイルス性ナノ粒子組成物についての大きな必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２９６８８号
【特許文献２】米国特許第５，２１９，５７７号明細書
【特許文献３】米国特許第７，６５１，６９４号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖａｉｓｈｎａｗ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｓｔａｔｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｓｉｌｅｎｃｅ  （２０１０）１：１４
【非特許文献２】Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ＢＡＳＥＤ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｍａｙ  ２０１１）１２：３２９−３４０
【非特許文献３】Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２：１７３−１７８
【非特許文献４】Ｄａｖｉｓ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６４，１０６７−１０７０
【非特許文献５】Ｌｉ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  （２０１０）１４２（３）：４１６−４２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
概要
本発明は、ＲＮＡｉ技術に基づく治療的作用物質をはじめとする治療的作用物質の送達に用いることのできるナノ粒子の新しい材料および組成物を提供する。
【００１３】
１つの局面では、本発明は、医療的に有用な作用物質または治療的作用物質を送達するためのナノ粒子であって、該ナノ粒子が、マグネシウム塩を含む生分解性でかつ臨床上適合性のコアおよび医療的に有用な作用物質を含む、ナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、コアは、マグネシウム塩のみから実質的に構成されるキャリアまたは不活性成分から構成される、言い換えると、これらの実施形態では、コアを構成するために他の不活性成分は実質的に用いられない。マグネシウム塩は、無機マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）、または有機マグネシウム塩であってよい。医療的に有用な作用物質、または活性治療的成分は、例えば、核酸、タンパク質もしくはペプチド、または小分子であってよい。核酸は、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、およびアプタマーからなる群より選択され得る。ある実施形態では、ＲＮＡはａｉＲＮＡを含む。別の実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡとの混合物を含む。１つの特徴では、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、少なくとも、タンパク質をコードするか、哺乳動物の疾患に関係する生体経路の一部分を調節するかのいずれかのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とする。代替の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、抗体または抗体断片である。
【００１４】
１つの特徴では、医療的に有用な作用物質は、ナノ粒子のコアの内部に配置される。代替の特徴では、医療的に有用な作用物質は、ナノ粒子のコアの表面上に配置される。
【００１５】
１つの特徴では、必要に応じて、本発明のナノ粒子のコアは、リン酸カルシウムも含み得る。さらに、コアは添加物（例えば、核酸、タンパク質もしくは小ペプチド、脂質、界面活性物質、アミノ酸、炭水化物、小分子、および／または生体適合性ポリマー）も含み得る。
【００１６】
１つの特徴では、本発明のナノ粒子は、コアの周囲にシェルまたはコーティングをさらに含む；シェルは、界面活性物質（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｓｏｌｕｔｏｌ、および／またはＴｒｉｔｏｎ）、タンパク質もしくは小ペプチド（例えば、ヒストンおよび／またはプロタミン）、脂質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、核酸、小分子および／または生体適合性ポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、コアまたはシェルは、細胞タイプ特異的、組織特異的標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）リガンドおよびホーミングリガンドをはじめとする標的化リガンド、細胞透過性ペプチド（例えば、ポリアルギニンおよびポリリシン）、アルブミン、アルブミン誘導体、ヒストン、プロタミン、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、シクロデキストリン、ＲＧＤトリペプチド、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの組み合わせを含有し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（任意のシェルを含む）の平均の直径は、約２００ナノメートルもしくはそれより小さい、または、好ましくは、約５ナノメートルと約１００ナノメートルとの間、より好ましくは、約５．５ナノメートルと約８０ナノメートルとの間、そしてさらにより好ましくは、約５．５ナノメートルと約３０ナノメートルとの間である。
【００１８】
１つの特徴では、本発明のナノ粒子は、約７．０または約７．０より高いｐＨの溶液中より、約６．０と約７．０との間のｐＨ値の溶液中の方がより溶解性が高い。１つの実施形態では、ナノ粒子は、約７．０のｐＨの溶液中より、約６．０またはそれ未満の酸性ｐＨの溶液中で、さらにより溶解性が高い。
【００１９】
別の特徴では、本発明のナノ粒子は、約−３０ｍＶと約＋５０ｍＶとの間の、または好ましくは、約−１０ｍＶと約＋２０ｍＶとの間の、またはさらにより好ましくは、約−５ｍＶと約＋１０ｍＶとの間の表面電荷（存在すれば、コーティングまたはシェル上の）を特徴とする。
【００２０】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、明示的に否認されない限り、本明細書で記載される全ての実施形態に対して適用される。
【００２１】
第一の実施形態では、本発明は、マグネシウム塩から実質的に構成されるコア、およびコアの表面上にコーティングされた医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子を提供する。マグネシウム塩は、好ましくはリン酸マグネシウムである。ナノ粒子は、必要に応じて、コアの周囲にシェルを含み得る。そして医療的に有用な作用物質は、ａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【００２２】
第二の実施形態では、本発明は、リン酸マグネシウムのみを含むコア、および該コアの内部に配置された１つまたは複数の医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、必要に応じて、コアの周囲にシェルを含み得る。そして医療的に有用な作用物質は、ａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【００２３】
第三の実施形態では、本発明は、リン酸マグネシウムのみを含むコア、リン酸カルシウム、および１つ以上の医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、必要に応じて、コアの周囲にシェルを含み得る。そして医療的に有用な作用物質は、ａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【００２４】
第四の実施形態では、本発明は、リン酸マグネシウムを含むコア、生体適合性添加物、および医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子を提供する。添加物は、脂質、界面活性物質、タンパク質もしくはペプチド、アルブミンもしくはアルブミン誘導体、核酸、炭水化物、アミノ酸、生体適合性ポリマー、ポリアルギニン、ポリリシン、またはポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）であり得る。脂質は、コレステロールまたはリン脂質であり得る。そして医療的に有用な作用物質は、ａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。コアを取り囲む必要に応じたシェルが存在し得る。シェルは、上記で概要が記載され、そして下記で詳細が記載される様々な成分を含み得る。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明は、リン酸マグネシウムを含むコアであって、ａｉＲＮＡがコアの内部に配置されたコアと、コアの周囲のシェルであって、界面活性物質（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ、ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ）、タンパク質もしくはペプチド（例えば、ヒストンおよび／またはプロタミン）、脂質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸、および／または生体適合性ポリマーを含むシェルと、を含むナノ粒子を提供する。そしてナノ粒子の平均の直径は、約２ナノメートルと約２００ナノメートルとの間、より好ましくは約５ｎｍと、約１００ｎｍ、８０ｎｍまたは５０ｎｍとの間である。タンパク質またはペプチドは、アルブミンまたはアルブミン誘導体であり得、そして、脂質は、コレステロールまたはリン脂質であり得る。特に好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、活性作用物質と混合されたかまたは活性作用物質を負荷（ｌｏａｄ）されたリン酸マグネシウムコアを含む；該コアは、１つまたは複数の界面活性物質を含むシェルによってさらに覆われる。本発明の方法の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍと約５０ｎｍとの間のサイズを実現するように、そのコアを界面活性物質でコーティングすることにより製造される。
【００２６】
本発明の別の局面では、本発明のナノ粒子（例えば、複数のナノ粒子であって、それぞれが、マグネシウム塩および医療的に有用な作用物質を含む生分解性でかつ臨床上適合性のコアを含むナノ粒子）を含む医薬組成物が提供される。ある実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤をさらに含む。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。
【００２７】
本発明のさらなる局面では、哺乳動物被験体における疾患または状態を処置する方法が提供される。方法は、本発明の医薬組成物の治療的有効量を、哺乳動物被験体に投与することを含む。好ましい実施形態では、組成物は、被験体に経口投与される。
【００２８】
本発明のまた別の局面では、活性作用物質を、哺乳動物被験体に送達する方法が提供される。方法は、それぞれが本発明のナノ粒子である複数のナノ粒子を、哺乳動物被験体に投与することを含む。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、被験体に経口投与される。
【００２９】
本発明のある実施形態では、活性作用物質を、哺乳動物被験体に送達する方法が提供される。方法は、活性作用物質を負荷された少なくとも１つのナノ粒子を、好ましくはそれぞれが該作用物質を負荷された複数のナノ粒子を、被験体に経口投与することを含む。活性作用物質は、活性医薬成分であり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、マグネシウム塩を含むコアを含み、そして活性作用物質は、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかである。ある実施形態では、哺乳動物被験体における疾患を処置する方法であって、該方法は、複数のナノ粒子、好ましくはコアがマグネシウム塩を含む複数のナノ粒子によって運搬される活性医薬成分の治療的有効量を、該哺乳動物被験体に経口投与することを含む方法が提供される。
【００３０】
これらの局面に関連して、本発明は、活性作用物質（例えば、医薬成分または医療的に有用な作用物質）を哺乳動物被験体に経口で送達することに効果的なナノ粒子および医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、ナノ粒子および活性医薬成分を含む医薬組成物が提供され、該組成物は、経口投与された後に、少なくとも１つの疾患または状態を処置する医療的または治療的な効果を引出すことができ、したがって、組成物は、単独でまたは他の医薬品との組み合わせで、臨床適用のための通常の要件に適合する医薬候補として適格である。
【００３１】
本発明のさらなる局面は、アルブミンベースのコアおよび医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子を提供する。コアは、改変アルブミン、アルブミン断片またはアルブミンの誘導体であるペプチドを含み得る。ナノ粒子は、マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）をさらに含み得る。本発明の他の実施形態におけるのと同様に、医療的に有用な作用物質は、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、アプタマー、抗体、抗体断片および小分子であり得る。
【００３２】
本発明のまた別の局面に従い、金およびａｉＲＮＡを含むコアを有するナノ粒子が提供される。ある実施形態では、ａｉＲＮＡは、実質的に金であるコアの表面上にコーティングされる。コアは、（好ましくは、混合物としてａｉＲＮＡとともに同じ層において、または別の層においてコア上にコーティングされた）リン酸マグネシウムをさらに含み得る。ナノ粒子は、コアの周囲に必要に応じたシェルをさらに含み得る。シェルは、タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸、または生体適合性ポリマーを含み得る。ａｉＲＮＡは、１つの特徴では、少なくとも、タンパク質をコードするか、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患に関係する生体経路の一部分を調節するかのいずれかのＲＮＡを標的とする。１つの実施形態では、ａｉＲＮＡはヒトＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）機能を標的とする。別の実施形態では、ａｉＲＮＡは、ヒトＩＬ−６（インターロイキン−６）機能を標的とする。
【００３３】
本発明の他の局面および実施形態は以下の発明の詳細な説明に説明されるか、または以下の発明の詳細な説明から容易に明らかとなる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
医療的に有用な作用物質を送達するためのナノ粒子であって、以下：
マグネシウム塩を含む生分解性でかつ臨床上適合性のコア；および
医療的に有用な作用物質、を含むナノ粒子。
（項目２）
前記マグネシウム塩は無機マグネシウム塩である、項目１に記載のナノ粒子。
（項目３）
前記マグネシウム塩はリン酸マグネシウムである、項目２に記載のナノ粒子。
（項目４）
前記マグネシウム塩は有機マグネシウム塩である、項目１に記載のナノ粒子。
（項目５）
前記作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、および小分子からなる群より選択される、項目１に記載のナノ粒子。
（項目６）
前記核酸は、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、およびアプタマーからなる群より選択される、項目５に記載のナノ粒子。
（項目７）
前記ＲＮＡはａｉＲＮＡを含む、項目６に記載のナノ粒子。
（項目８）
前記ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む、項目６に記載のナノ粒子。
（項目９）
前記ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、少なくとも、タンパク質をコードするか、または哺乳動物の疾患に関係する生体経路の一部分を調節するかのいずれかのＲＮＡを標的とする、項目７または８に記載のナノ粒子。
（項目１０）
前記タンパク質もしくはペプチドは、抗体および抗体断片からなる群より選択される、項目５に記載のナノ粒子。
（項目１１）
前記作用物質は、前記コアの内部に配置される、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１２）
前記作用物質は、前記コアの表面上に配置される、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１３）
前記コアは、リン酸カルシウムをさらに含む、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１４）
前記コアは、核酸、タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、アミノ酸、炭水化物、小分子、および／または生体適合性ポリマーからなる群より選択される添加物をさらに含む、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１５）
前記添加物は、標的化リガンド、細胞透過性ペプチド、アルブミン、アルブミン誘導体、ヒストン、プロタミン、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ、シクロデキストリン、ＲＧＤトリペプチド、コレステロール、リン脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される、項目１４に記載のナノ粒子。
（項目１６）
前記コアの周囲にシェルをさらに含む項目１に記載のナノ粒子であって、該シェルは、タンパク質もしくはペプチド、界面活性物質、脂質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、核酸、小分子および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含む、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１７）
前記成分は、標的化リガンド、細胞透過性ペプチド、アルブミン、アルブミン誘導体、ヒストン、プロタミン、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ、シクロデキストリン、ＲＧＤトリペプチド、コレステロール、リン脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される、項目１６に記載のナノ粒子。
（項目１８）
前記ナノ粒子の平均の直径は、約２００ナノメートルであるかまたはそれより小さい、項目１に記載のナノ粒子。
（項目１９）
前記ナノ粒子は、約７．０またはそれより高いｐＨの溶液中より、約６．０と約７．０との間のｐＨ値の溶液中でより溶解性が高い、項目１に記載のナノ粒子。
（項目２０）
前記ナノ粒子は、約７．０またはそれより高いｐＨの溶液中より、約６．０またはそれより低い酸性ｐＨの溶液中で、さらにより溶解性が高い、項目１９に記載のナノ粒子。
（項目２１）
前記ナノ粒子は、約−３０ｍＶと約＋５０ｍＶとの間の表面電荷を特徴とする、項目１に記載のナノ粒子。
（項目２２）
前記ナノ粒子は、約−１０ｍＶと約＋２０ｍＶとの間の表面電荷を特徴とする、項目１に記載のナノ粒子。
（項目２３）
前記コアは、実質的にマグネシウム塩、および１つまたは複数の医療的に有用な作用物質から構成される、項目１に記載のナノ粒子。
（項目２４）
マグネシウム塩から実質的に構成されるコア、および該コアの表面上にコーティングされた医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子。
（項目２４）
前記マグネシウム塩は、リン酸マグネシウムである、項目２３に記載のナノ粒子。
（項目２５）
前記作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、および小分子からなる群より選択される、項目２３に記載のナノ粒子。
（項目２６）
前記核酸はａｉＲＮＡを含む、項目２５に記載のナノ粒子。
（項目２７）
タンパク質もしくはペプチド、界面活性物質、脂質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、核酸、小分子および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含むシェルを、前記コアの周囲にさらに含む、項目２３に記載のナノ粒子。
（項目２８）
実質的にリン酸マグネシウムから構成されるコア、および前記コアの内部に配置された１つまたは複数の医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子。
（項目２９）
前記作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、および小分子からなる群より選択される、項目２８に記載のナノ粒子。
（項目３０）
前記核酸はａｉＲＮＡを含む、項目２９に記載のナノ粒子。
（項目３１）
タンパク質もしくはペプチド、界面活性物質、脂質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含むシェルを、前記コアの周囲にさらに含む、項目２８に記載のナノ粒子。
（項目３２）
リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、および１つまたは複数の医療的に有用な作用物質から構成されるコアを含むナノ粒子。
（項目３３）
前記作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、および小分子からなる群より選択される、項目３２に記載のナノ粒子。
（項目３４）
前記核酸はａｉＲＮＡを含む、項目３３に記載のナノ粒子。
（項目３５）
タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含むシェルを、前記コアの周囲にさらに含む、項目３２に記載のナノ粒子。
（項目３６）
リン酸マグネシウム、生体適合性添加物、および医療的に有用な作用物質を含むコアを含むナノ粒子。
（項目３７）
前記作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、および小分子からなる群より選択される、項目３６に記載のナノ粒子。
（項目３８）
前記核酸はａｉＲＮＡを含む、項目３７に記載のナノ粒子。
（項目３９）
タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含むシェルを、前記コアの周囲にさらに含む、項目３６に記載のナノ粒子。
（項目４０）
前記添加物は、脂質、界面活性物質、タンパク質もしくはペプチド、核酸、炭水化物、アミノ酸、生体適合性ポリマー、ポリアルギニン、ポリリシン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される、項目３６に記載のナノ粒子。
（項目４１）
前記脂質はコレステロールまたはリン脂質であり、前記タンパク質もしくはペプチドはアルブミンまたはその誘導体である、項目４０に記載のナノ粒子。
（項目４２）
リン酸マグネシウムを含むコアであって、ａｉＲＮＡが該コアの内部に配置されているコア；
該コアの周囲のシェルであって、タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸および生体適合性ポリマーからなる群より選択される成分を含むシェル；
を含むナノ粒子であって、
該ナノ粒子の平均の直径が約２ナノメートルと約２００ナノメートルとの間である、ナノ粒子。
（項目４３）
前記タンパク質もしくはペプチドはアルブミンまたはアルブミン誘導体であり、前記脂質はコレステロールまたはリン脂質である、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４４）
前記ナノ粒子の平均の直径は、約５ナノメートルと約１００ナノメートルとの間である、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４５）
前記ナノ粒子の平均の直径は、約５．５ナノメートルと約８０ナノメートルとの間である、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４６）
前記界面活性物質は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｓｏｌｕｔｏｌ、ＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎからなる群より選択される、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４７）
前記ナノ粒子は、約７．０より低いｐＨにおいてより溶解性が高い、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４８）
前記タンパク質もしくはペプチドは、プロタミンまたはヒストンである、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目４９）
前記ナノ粒子は、約−１０ｍＶと約＋２０ｍＶとの間の表面電荷を特徴とする、項目４２に記載のナノ粒子。
（項目５０）
それぞれが項目１〜４９のいずれかに記載のナノ粒子である複数のナノ粒子を含む、医薬組成物。
（項目５１）
薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤をさらに含む、項目５０に記載の医薬組成物。
（項目５２）
経口投与のために製剤化される、項目５０に記載の医薬組成物。
（項目５３）
ナノ粒子および活性医薬成分を含む医薬組成物であって、該組成物は、経口投与された後に、少なくとも１つの疾患または状態を処置する医療的効果を引出すことができ、その結果、該組成物は、臨床適用のための通常の要件に適合する医薬候補として適格である、医薬組成物。
（項目５４）
哺乳動物被験体に活性作用物質を送達する方法であって、該方法は、該哺乳動物被験体に、活性作用物質を負荷された少なくとも１つのナノ粒子を経口投与することを含む、方法。
（項目５５）
前記活性作用物質は、活性医薬成分である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ナノ粒子は、マグネシウム塩を含むコアを含み、前記活性作用物質は、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのいずれかである、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
哺乳動物被験体における疾患を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物被験体に、複数のナノ粒子により運搬される活性医薬成分の治療的有効量を、経口投与することを含む、方法。
（項目５８）
前記ナノ粒子は、マグネシウム塩を含むコアを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
哺乳動物被験体の疾患を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物被験体に、項目５０〜５３のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
（項目６０）
前記医薬組成物は、前記哺乳動物被験体に経口投与される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
哺乳動物被験体に活性作用物質を送達する方法であって、該方法は、該哺乳動物被験体に、それぞれが項目１〜４９のいずれかに記載のナノ粒子である複数のナノ粒子を投与することを含む、方法。
（項目６２）
前記ナノ粒子は、前記哺乳動物被験体に経口投与される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
アルブミンベースのコアおよび医療的に有用な作用物質を含むナノ粒子。
（項目６４）
前記コアは、改変アルブミン、アルブミン断片およびアルブミンの誘導体からなる群より選択されるペプチドをさらに含む、項目６３に記載のナノ粒子。
（項目６５）
マグネシウム塩をさらに含む、項目６３に記載のナノ粒子。
（項目６６）
前記作用物質は、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、アプタマー、抗体、抗体断片および小分子からなる群より選択される、項目６３に記載のナノ粒子。
（項目６７）
金およびａｉＲＮＡを含むコアを含むナノ粒子。
（項目６８）
前記コアは、リン酸マグネシウムをさらに含む、項目６７に記載のナノ粒子。
（項目６９）
タンパク質もしくはペプチド、脂質、界面活性物質、リガンド、アミノ酸、炭水化物、小分子、核酸および生体適合性ポリマーからなる群より選択される材料を含むシェルを、前記コアの周囲にさらに含む、項目６７に記載のナノ粒子。
（項目７０）
前記ａｉＲＮＡは、少なくとも、タンパク質をコードするか、または自己免疫疾患もしくは炎症疾患に関係する生体経路の一部分を調節するかのいずれかのＲＮＡを標的とする、項目６７に記載のナノ粒子。
（項目７１）
前記ａｉＲＮＡは、ヒトＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）機能を標的とする、項目６７に記載のナノ粒子。
（項目７２）
前記ａｉＲＮＡは、ヒトＩＬ−６（インターロイキン−６）機能を標的とする、項目６７に記載のナノ粒子。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１〜４は、本発明のナノ粒子の様々な実施形態を、横断面図で図示している。
【図２】図１〜４は、本発明のナノ粒子の様々な実施形態を、横断面図で図示している。
【図３】図１〜４は、本発明のナノ粒子の様々な実施形態を、横断面図で図示している。
【図４】図１〜４は、本発明のナノ粒子の様々な実施形態を、横断面図で図示している。
【図５】図５は、本発明のナノ粒子を製作する例示的な方法を模式的に図示しており、ここで、ナノ粒子の、ａｉＲＮＡを負荷されたマグネシウムベースのコアは、シェルでさらにコーティングされ、シェルは、様々な実施形態において、脂質、ポリマー、タンパク質および／または界面活性物質を含有し得る。
【図６】図６は、図解を通して、マグネシウムコアを有するナノ粒子の実施形態の物理的データを表している。６つの異なるバッチに由来する粒子のサイズ分布は、左上のグラフに示され、そしてこれらのバッチのゼータ電位分布は、左下のグラフに示される。右側の表は、これらの６つのバッチの平均サイズおよびゼータ電位を示している。
【図７】図７は、ヒストンコーティングを伴う本発明のリン酸カルシウムコアまたはリン酸マグネシウムコアを用いたＳＷ４８０細胞株に由来する細胞へのＧＦＰプラスミドのトラスフェクションの結果として生じる蛍光の写真画像から構成される。画像は、２４時間および４８時間のトランスフェクション時間を示している。
【図８】図８は、本発明の実施形態による、金ナノ粒子を製作し、そして金ナノ粒子にａｉＲＮＡを負荷する例示的な方法を模式的に図示している。
【図９】図９は、図解を通じて、金ナノ粒子実施形態についての物理的データを示しており、金ナノ粒子は、右側に、図８で概説されるようなａｉＲＮＡとの結合体化が起こる前のものが模式的に示されている。粒子のサイズ分布は左上のグラフに示され、そしてゼータ電位分布は左下のグラフに示されている。
【図１０】図１０は、図９に示される金ナノ粒子を、ａｉＲＮＡ分子とどのように結合体化することができるかを模式的に図示している。
【図１１】図１１は、ａｉＲＮＡ分子が、図１０に示される金ナノ粒子からどのように放出され得るかを模式的に図示している。
【図１２】図１２は、負荷をされていないＰＥＧ化金ナノ粒子と、ａｉＲＮＡを負荷されたＰＥＧ化金ナノ粒子との間で遺伝子サイレンシングの有効性を比較したウェスタンブロットゲル電気泳動の画像である。負荷をされていない金ナノ粒子の濃度は、３．１７×１０−１０Ｍであった。
【図１３】図１３は、ポリマーベースのシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。左側は、ウェスタンブロットゲル電気泳動の画像であり、図中左から数えて１番目および４番目のレーンはネガティブコントロール（負荷をされていないナノ粒子）であり、そして残りのレーンは様々な濃度のａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子である。右上は、負荷をされたナノ粒子の組成物を模式的に図示している。右下は、ナノ粒子の分析データを示す図表である。
【図１４】図１４は、タンパク質／ペプチドベースのシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。タンパク質はアルブミンであった。上の列は、２つのウェスタンブロットゲル電気泳動（左の画像はβカテニンを検出しており、そして右の画像はＰＬＫ１を検出している）の画像から構成される。右下は、ナノ粒子の分析データを示す図表である。
【図１５】図１５は、タンパク質／ペプチドベースのシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いた改変ａｉＲＮＡ（２’−Ｏ−Ｍｅ−ａｉＲＮＡ）の送達を通じて実現されたインビトロおよびインビボでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。タンパク質はアルブミンであった。上の列は、２’−Ｏ−Ｍｅ−ａｉＲＮＡの送達を通じたβカテニンの効果的な抑制を示している２つのウェスタンブロットゲル電気泳動の画像から構成される。下の列は、ＳＷ４８０異種移植片において観察されたインビボ有効性を図解的に図示している。
【図１６】図１６は、ヒストンベースのシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。左側は、様々な濃度のａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子を用いたβカテニン発現の抑制を示すウェスタンブロットゲル電気泳動の画像である。右側にあるのは、ナノ粒子の分析データを示す図表である。
【図１７】図１７は、ヒストンおよび小ペプチド（ＲＧＤトリペプチド）の両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。ここには、様々な濃度のａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子を用いたβカテニンの抑制を示す３つのウェスタンブロットの画像が含まれる（「Ｖ７」は環状ＲＧＤでコーティングされ、そして「Ｖ８」は直鎖状ＲＧＤでコーティングされた）。右側にあるのは、ナノ粒子の分析データを示す図表である。
【図１８】図１８は、ヒストンおよび小ペプチド（ＲＧＤトリペプチド）の両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビボでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。
【図１９】図１９は、ヒストンおよび界面活性物質もしくはＲＤＧトリペプチドの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの様々な程度の遺伝子サイレンシング効果を図示している。
【図２０】図２０は、ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。ここには、様々な濃度のａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子を用いたβカテニン、ＰＬＫ１、およびサバイビンの抑制を示す３つのウェスタンブロットの画像（左）が含まれる。右側にあるのは、ナノ粒子の分析データを示す図表である。
【図２１】図２１は、ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビボでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。
【図２２】図２２は、貯蔵の間の様々な時点での、ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を示す４つのウェスタンブロット画像を含む。貯蔵の間のナノ粒子の粒子サイズおよび電荷を概括する図表もまた含まれる。
【図２３】図２３は、プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子上に負荷されたａｉＲＮＡのヌクレアーゼ消化への抵抗性を示すノーザンブロット画像（左）を含む。ナノ粒子の分析データを示す図表も右側に含まれる。
【図２４】図２４は、プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を用いたａｉＲＮＡの送達を通じて実現されたインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を図示している。ここには、ナノ粒子のコーティングのための特定のステップ、およびナノ粒子濃度を変動させた、ａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子を用いたβカテニンの抑制を示す３つのウェスタンブロットの画像が含まれる。
【図２５】図２５は、プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子を、シェル中にシクロデキストリンを追加することを除いては同一のナノ粒子と比較して、特徴付けするデータを示している。「Ｋ７」組成物（５×プロタミンおよび５％のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを有するＭｇＰ）のナノ粒子のサイズ分布もまた、下部のグラフに示される。
【図２６】図２６は、プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子（「Ｋ７」ナノ粒子）によって運搬されるａｉＲＮＡ（βカテニンを標的とする）について、静脈内（ｉ．ｖ．）製剤と経口（ｐ．ｏ．）製剤との間で、異種移植腫瘍（ＳＷ４８０）に対するインビボの効果を比較している。
【図２７】図２７は、（１）ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの両方を含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子（「Ｖ１３」ナノ粒子）；または（２）プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含むシェルを有するリン酸マグネシウムベースのナノ粒子（「Ｋ７」ナノ粒子）によって運搬されるａｉＲＮＡ（βカテニンを標的とする）について、静脈内（ｉ．ｖ．）製剤による、腫瘍に対するインビボの効果を図示している。
【図２８】図２８は、ＳＷ４８０細胞における、「Ｋ７」ナノ粒子によって運搬されるａｉＲＮＡ（βカテニン、サバイビン、およびＰＬＫ１を標的とする）についての静脈内（ｉ．ｖ．）製剤を用いる効果的な抗腫瘍レジメンについてのさらなるインビボ研究からのデータを図示している。
【図２９】図２９は、ヒト膵臓がん腫瘍異種移植片をトランスフェクトされたマウスにおける、「Ｋ７」ナノ粒子によって運搬されるａｉＲＮＡ（βカテニン、サバイビン、およびＰＬＫ１を標的とする）についての静脈内（ｉ．ｖ．）製剤を用いる効果的な抗腫瘍レジメンについてのさらなるインビボ研究からのデータを図示している。
【図３０】図３０は、Ｋ７製剤における最も効果的なプロタミン濃度についてのインビボ研究からのデータを図示している。
【図３１】図３１は、Ｋ７製剤におけるシクロデキストランへの追加によってもたらされる任意の治療的効果についてのインビボ研究からのデータを図示している。
【図３２】図３２は、Ｋ７製剤におけるシクロデキストランおよびＬａｂｒａｆｉｌへの追加によってもたらされる任意の治療的効果についてのインビボ研究からのデータを図示している。ここでは、２’−Ｏ−Ｍｅ−ｉＲＮＡが用いられた。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本明細書において引用される全ての参考文献は、それぞれの個々の刊行物または特許または特許出願が、具体的かつ個別に、全ての目的についてその全体が参考として援用されると示されている場合と同じ程度に、かつ適用可能な法律が許容する程度に、全ての目的についてその全体が本明細書において参考として援用される。参考として援用された刊行物および特許もしくは特許出願が、本明細書に含まれる定義をはじめとする開示と矛盾する限りでは、いかなるそのような矛盾する事項についても、本明細書が取って代わる、および／または優先することが意図されている。
【００３６】
別段の定義がなされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なった要求をしていない限り、複数への言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「約」は、明示的に指示されるか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含めた数値を指す。「約」という用語は、一般的には、当業者が、挙げられた値と均等である（例えば、同一の機能または結果を有する）と考える数値の範囲（例えば、挙げられた値の＋／−５〜１０％）を指す。いくつかの例では、「約」という用語は、最近接有効数字へと丸められた数値を含み得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「臨床上適合性の」という用語は、適用される規制要件を超える十分な安全性を伴って調製、および患者に容易に投与することができる組成物または処方の特徴を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「封入される」、「包埋される」、「捕捉される」または「組み込まれる」ならびにそれらの派生の用語は、ある物質によって複合体化されること、ある物質に入れられること、ある物質と結合すること、ある物質でコーティングされること、ある物質と積層されることまたはある物質により包み込まれることを指す。したがって、粒子中に封入された物質または作用物質とは、物質または作用物質が、粒子構造中に組み込まれていること、または粒子表面にコーティング／付着されていること、あるいはその両方であることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、その天然の状態において通常付随している構成成分を、実質的または本質的に含まない材料を指す。純度または均質性は、典型的には、分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を用いて決定される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、特定の処置のレシピエントになる任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、任意の動物としては、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類等が挙げられるがそれに限定されない。典型的には、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書において、ヒト被験体を指して交換可能に用いられる。
【００４３】
本明細書で使用される「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」または「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」または「緩和すること（ｔｏ  ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」といった用語は、（１）診断された病的状態または障害を治癒させるか、遅くするか、症状を減らすか、および／またはその進行を停止させるような治療的措置、ならびに（２）標的とされる病的状態または障害の発症を防ぐかまたは遅らせる予防的または防止的な措置、の両方を指す。したがって、処置を必要とする者としては、すでに障害を有する者；障害を有しやすい者；およびその者の障害を防ぐべき者が挙げられる。
【００４４】
マグネシウムは、哺乳動物における多数の細胞機能において重要な役割を果たしている。マグネシウムは、ヒトの体内において４番目に豊富なミネラルである。マグネシウムは、体内の３００を超える生化学反応のために必要とされ、強固な骨、正常な筋肉および神経の機能、ならびに規則的な心臓のリズムを維持することを補助する。マグネシウムはまた、炭水化物代謝およびタンパク質合成にも関与する。そしてその欠乏は、多数の症状および疾患（例えば、興奮性亢進、めまい、筋痙攣、筋力低下、疲労、および糖尿病）をもたらし得る。
【００４５】
ヒトの体は、通常、食物の取り込みを通じてマグネシウムを吸収し、そして総体内マグネシウムの約５０％が骨を構築するのに用いられる。残りの半分の大多数は、体の組織および器官の細胞において見出され、約１％は血中に見出される。全米アカデミーの一部である米国医学研究所の食品栄養委員会によれば、成人男性についての推奨量（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ａｌｌｏｗａｎｃｅｓ）（ＲＤＡ）は４００ｍｇ／日またはそれより高い量であり、成人非妊娠女性については３１０ｍｇ／日またはそれより高い量である。Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔによる２００９年の研究によれば、米国人口の６０％近くが、マグネシウムの食物取り込みについての米国ＲＤＡに適合していない。したがって、マグネシウムおよび多数のマグネシウムイオンは、安全で、生体適合性でかつ人体によって吸収可能であるだけでなく、大きく必要とされている栄養素を提供もする。
【００４６】
マグネシウム塩は、二価陽イオンＭｇ２＋を産生し、そして、無機粒子であれば微生物の攻撃を受けず、良好な貯蔵時安定性を有する。マグネシウム塩は、高分子および小分子と複合体を形成することができ、そしてイオンチャネル媒介のエンドサイトーシスを介して細胞膜を横切って輸送する。
【００４７】
したがって、本発明は以下を提供する：
【００４８】
Ａ．マグネシウム塩に基づきかつ医療的に有用な作用物質を封入されるナノ粒子
【００４９】
基本的な形態において、本発明は、マグネシウム塩を含む生分解性でかつ臨床上適合性のコアを含むナノ粒子であって、医療的に有用な作用物質を封入するナノ粒子を提供するものとして特徴づけられ得る。
【００５０】
コアは、概してかつ実質的に球状の形状であり、それは、断面が実質的に円形または楕円形であり、そしてコアは、切子面を有さず実質的に滑面である粒子、または切子面を有する粒子を含むことを意味する。コアは、切子面または角を有し得るが、それでも本発明によって予期されるものの範囲内である。
【００５１】
本発明において有用なマグネシウム塩は、好ましくは無機マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）であるが、いくつかの実施形態では有機マグネシウム塩（例えば、有機リン酸マグネシウム）でもあり得る。リン酸マグネシウム（本明細書において時には「ＭｇＰ」と略される）は、第三リン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２）、第二リン酸マグネシウムもしくはリン酸二マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）、リン酸一マグネシウム（Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２）、または上記のいずれかの組み合わせを意味し得る。リン酸マグネシウムは、酸性条件においてよりよく溶解する。ｐＨが約７．０である水性環境と比較して、リン酸マグネシウムの溶解性は、ｐＨ値が６．０と７．０との間の溶液中で増加し、ｐＨが６．０より低い場合にまださらに増加し、そしてｐＨが５．０より低い場合にまださらにより増加する。そして、酸性条件で同様の溶解性の増加を示す他の１つまたは複数のマグネシウム塩もまた、本発明の目的のためにリン酸マグネシウムの代わりに、またはリン酸マグネシウムに加えてのいずれかで使用することができる。
【００５２】
標的部位への送達のために本発明のナノ粒子に封入された医療的に有用な作用物質は、生物学的に活性な高分子または小分子であり得る。医療的に有用な作用物質は、治療剤、薬物、または診断用作用物質であり得る。診断用作用物質の例としては、薬物送達の部位の可視化を可能にする画像造影作用物質が挙げられる。
【００５３】
一般的に述べると、本発明において有用な医療的に有用な作用物質は、核酸、タンパク質もしくはペプチド、多糖、炭水化物、脂質、小分子または上記のいずれかの組み合わせであり得る。作用物質は、結合体化されているか、またはそうでなければ、それらの可溶性、電荷性状、安定性、サイズ、形状等を変化させるために化学的に改変されている１つまたは複数の高分子であり得る。核酸は、ＤＮＡ（例えば、アンチセンスＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、およびアプタマーであり得る。ある実施形態では、ＲＮＡはａｉＲＮＡを含む。別の実施形態では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの混合物を封入する。１つの特徴では、ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、少なくとも、タンパク質をコードするかまたは哺乳動物の疾患に関係する生体経路の一部分を調節するかのいずれかのＲＮＡを標的とする。代替の実施形態では、タンパク質もしくはペプチドは、抗体または抗体断片である。
【００５４】
多数の薬物を、本発明のナノ粒子に容易に組み込むことができる。その例としては、インスリン、成長ホルモン、ステロイド、インターフェロン、抗がん薬物、抗生物質、抗ウイルス薬物、治療的抗体、抗凝固作用物質（例えば、ヘパリン）等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「がん」および「がん性」という用語は、哺乳動物における、細胞の集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする生理的状態を指す、またはそれを説明する。
【００５５】
ある実施形態では、本発明において有用な医療的に有用な作用物質は、レーザーアブレーション等をはじめとするハイパーサーミア療法またはハイポサーミア療法に適切なエネルギー伝導体である。
【００５６】
医療的に有用な作用物質は、コアの内部、コアの表面上、またはその両方にあってよい。コアは、実質的に滑面の表面を有する中実体、または開口部が点在する表面を有する多孔体であってよい。コアはコーティングされるか、または裸であってよい。コアの表面がある材料でコーティングされる場合、その材料は、本明細書において「シェル」と称されるコーティングを形成する。シェルは、いくつかの実施形態ではたしかにコア表面の全体を覆うかまたは囲むが、シェルは、多孔質であってよく、コア表面の全体を覆う必要も囲む必要もない。コアの周囲には、シェルの複数の層が存在し得る。
【００５７】
マグネシウム塩に加えて、コアは、別の生体吸収可能な材料であってナノ構造体のコア材料として用いられているリン酸カルシウムを、さらに含むことができる。Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｄａｒａｎｉ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  Ｉｒａｎｉｃａ（２０１０）４８（３）：１３３−１４１を参照されたい。
【００５８】
添加物がコア表面上にコーティングまたは吸着される場合、シェルがコアの周囲に形成される。ナノ粒子のサイズを低減または維持することを補助すること、上述のナノ粒子の電荷を保存または調節することに加えて、任意選択のシェルの構成成分は、他の重要な目的にも役立ち得る。一般的に、シェルは、コアおよびその負荷物（ｐａｙｌｏａｄ）を、リソソーム分解、酵素的分解、およびＤＮａｓｅもしくはＲＮａｓｅ分解から保護し、血中のその循環を延長し、そして負荷物の時間制御放出を実現するのを補助する。例えば、Ｌｉ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１０）１４２（３）：４１６−４２１を参照されたい。いくつかの（好ましくは生分解性の）ポリマー（例えば、ＰＥＧまたは核酸）の追加は、粒子サイズを小さく保つのを補助し、その立体的効果を通じて良好なコロイド安定性を得る。ＰＥＧは、約５００ダルトンから約２０，０００ダルトン（例えば、約５００、１０００、５０００、１０，０００、１５，０００、および２０，０００ダルトン）の分子量を有し得る。
【００５９】
本発明の１つの特徴では、１つまたは複数の界面活性物質が、ナノ粒子コアの表面上にコーティングまたは吸着される。驚くべきことに、界面活性物質は、ナノ粒子のサイズを低減または維持するという目標を実現するのに、大きく寄与した。生物物理学的環境における医療的に有用な作用物質の送達について、ナノ粒子の平均のサイズは、特定の生体障壁を通過し、さらに血流から直ちにろ過で取り除かれないようにするために、好ましくは約５ｎｍと約２００ｎｍとの間、そしてより好ましくは約５ｎｍと約１００、８０、または６０ｎｍとの間でさえある。本発明のいくつかの実施形態では、界面活性添加物は、粒子サイズを上記で言及した範囲に低減させるだけではなく、約５ｎｍと約５０ｎｍとの間の範囲にまでさらに低下させ、または、全てのナノ粒子の製造者にとって大きな技術的困難である、約２０ｎｍもしくは１５ｎｍより小さいサイズまでさらになお低下させる。本発明の様々な実施形態では、界面活性添加物は、非イオン性、例えばアルコール（例えば、脂肪アルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコールおよびオレイルアルコール）である。好ましい実施形態では、界面活性物質は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（本明細書において一般的に「Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ」と呼ばれる）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリソルベート−２０もしくはポリソルベート−８０としても公知であり、本明細書において一般的に時には「Ｔｗｅｅｎ」と呼ばれる）、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、および／またはＴｒｉｔｏｎである。
【００６０】
本発明のナノ粒子のシェルの一部分であり得る他の可能性のある添加物としては、以下が挙げられる：ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ、タンパク質もしくはペプチド（例えば、アルブミンもしくはその誘導体、ならびに好ましくは、プロタミンおよび／またはヒストン）、脂質（例えば、コレステロール、またはリン脂質）、炭水化物、賦形剤、ならびに標的化リガンド（例えば、細胞タイプ特異的、組織特異的標的化リガンドまたはホーミングリガンド（例えば、細胞表面マーカーのリガンド、抗体もしくは抗体断片、ナノボディ））。そのようなリガンドは、ナノ粒子を、特定の標的組織または細胞（例えば、がん細胞）に導くのを補助する。１つの実施形態では、標的化リガンドは、シグマ−１レセプターリガンドであるアニスアミドであり、これはＰＥＧと組み合わされて、そして本発明のナノ粒子に係留され、腫瘍細胞を標的とすることができる。Ｇｕｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１２）  ３３（３１）：７７７５−７７８４を参照されたい。
【００６１】
本発明のナノ粒子への別の任意選択の添加物は、ナノ粒子の細胞への取り込みの促進を補助する細胞透過性ペプチドである。典型的な細胞透過性ペプチドは、比較的豊富な正に帯電したアミノ酸（ポリカチオン性）（例えば、ポリアルギニンおよびポリリシン）、または極性／帯電アミノ酸と、非極性、疎水性アミノ酸との交互のパターン（両親媒性）、あるいは天然に存在する細胞透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ）の誘導体または模倣体のいずれかを含むアミノ酸配列を含む。
【００６２】
したがって、図１を参照すると、本発明の図示された実施形態では、ナノ粒子１０は、実質的に球状のコア２０を含む。コア２０は、マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）から実質的に構成される。１つの実施形態では、コアは、実質的に純粋なリン酸マグネシウムのみから構成される。コア２０の表面は、医療的に有用な作用物質１５（例えば、ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）の層３０によってコーティングされ、コア２０の周囲の第一のシェルを形成する。医療的に有用な作用物質１５の吸着は、ナノ粒子の成長または凝集を止めるのを補助し得、それによりそのサイズを小さく保ち得る。
【００６３】
必要に応じて、１つまたは複数の添加物の第二の層４０が、第一のシェル３０を覆う外側のシェルを形成する。ここで図示される例示的な添加物は脂質４５であるが、本明細書で記載される任意の添加物（例えば、界面活性物質）であってよい。
【００６４】
図２を参照すると、本発明の別の図示された実施形態では、ナノ粒子１０は、医療的に有用な作用物質１５（例えば、ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）がマグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）の内部に封入されたコア２０を含む。コア２０の周囲の任意選択のシェル３０は、１つまたは複数の添加物を含む。この図においてここで図示される例示的な添加物は、アルブミン４３、ＰＥＧ４７および標的化リガンド４９を伴うＰＥＧを含むが、本明細書で記載される任意の添加物（例えば、１つまたは複数の脂質、生分解性ポリマー、界面活性物質、タンパク質および賦形剤）であってよい。
【００６５】
ここで図３を参照すると、本発明の別の図示された実施形態では、ナノ粒子１０は、医療的に有用な作用物質１５（例えば、ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）が、マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）とリン酸カルシウム２２との混合物の内部に封入されたコア２０を含む。図示されたバージョンでは、コア２０は裸であるが、その周囲に１つまたは複数の必要に応じたシェルを有してよい。リン酸カルシウム（本明細書において時には「ＣａＰ」と略される）は、Ｃａ３（ＰＯ４）２、ＣａＨＰＯ４、またはＣａ（Ｈ２ＰＯ４）２、あるいは以上のいずれかの組み合わせを意味し得る。
【００６６】
ここで図４を参照すると、本発明のさらに別の図示された実施形態では、ナノ粒子１０は、医療的に有用な作用物質１５（例えば、ａｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）が、マグネシウム塩（例えば、リン酸マグネシウム）と生体適合性ポリマー２４との混合物の内部に封入されたコア２０を含む。図示されたバージョンでは、コア２０は、例示的な標的化リガンド４９によって形成された必要に応じたシェル３０によって覆われる。シェル３０は、この例示的なバージョンでは、やや多孔質である；コア２０についても同様である。
【００６７】
本発明はまた、本明細書で記載されるナノ粒子ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む医薬組成物も提供する。適切なキャリアおよびその製剤は、当該分野で公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において記載される。医薬組成物は、液剤、カプセル剤、錠剤、散剤、およびエアゾール剤の剤形に製剤化され得る；そして、静脈内、筋肉内、皮内、経口送達、粘膜送達、局所、または眼表面への送達等に適切な剤形に製剤化され得る。組成物は、他の構成成分（例えば、緩衝剤、保存剤、非イオン性界面活性物質、可溶化作用物質、安定化作用物質、皮膚軟化物質、滑沢剤および等張化作用物質）を含み得る。組成物は、高分子の制御放出を実現するために製剤化され得る。
【００６８】
それぞれのキャリアは、製剤の他の成分と適合性であって、患者にとって傷害性ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能なキャリアとして働くことのできる材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびポテトスターチ）；セルロース、およびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；粉末トラガント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス）；油（例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；寒天；緩衝作用物質（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤作用物質、懸濁物質および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー）、ならびに着色作用物質、放出作用物質、コーティング作用物質、甘味化、香味化および芳香化作用物質、保存物質および抗酸化物質もまた、本発明の組成物中に存在してよい。
【００６９】
Ｂ．本発明のナノ粒子を製作する方法
【００７０】
マグネシウム塩ベースのナノ粒子は、ダブルエマルジョンプロセスもしくはナノ沈降プロセスのいずれかによって調製するか、ナノ粒子を製作する他の周知のプロセスから改作することができる。
【００７１】
例示的方法Ｉ：
【００７２】
図５を参照すると、ステップ−１では、第一のエマルジョンが、まず所望の量の医療的に有用な作用物質（例えば、ａｉＲＮＡ溶液）、およびマグネシウム塩水溶液（例えば、ＭｇＣｌ２、または硝酸マグネシウム）を混合すること、ならびに次に該水溶液を、界面活性物質を含むか、または含まない有機溶液（シクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０（７１／２９，ｖ／ｖ））に、激しく攪拌しながら添加してよく分散したマイクロ−、ナノ−エマルジョンを形成することにより調製される。カルシウムベースのコアを作製するため、またはコアにカルシウムを加えるためには、ＭｇＣｌ２をＣａＣｌ２に置き換えるか、または単純にＣａＣｌ２を加えるかのいずれかである。混合物は、室温でさらにインキュベートされる。有機溶液混合物は、シクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０溶液（７１／２９  ｖ／ｖ）を、マグネティックスターラー上での連続的回転により混合して混合を確実にすることによって調製することができる。
【００７３】
第二のエマルジョンは、リン酸塩（例えば、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、または、リン酸水素二アンモニウム）水溶液を、激しく攪拌しながら、界面活性物質を含む、または含まない有機溶液（シクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ  Ｃｏ−５２０（７１／２９，ｖ／ｖ））に加えてよく分散したマイクロ−またはナノ−エマルジョンを形成することにより調製することができる。混合物は、室温でさらにインキュベートされる。
【００７４】
次に、第二のエマルジョンは、激しく攪拌している第一のエマルジョン中に、非常にゆっくりと（例えば、一滴ずつ）加えられ、コンビネーション混合物を形成する。コンビネーション混合物中の、第一のエマルジョンと第二のエマルジョンとの間の比率は、所望の粒子サイズを実現するのに決定的であり、様々な実施形態では、約１０〜２０対１である。コンビネーション混合物は、その所望のサイズに応じて、ある時間の間室温でさらにインキュベートされる。
【００７５】
次に、ステップ−２では、上記ステップから得られたナノ粒子を洗浄するために溶媒（例えば、無水エタノール）が加えられる。上清は、遠心分離プロセスを通じて除去される。得られたナノ粒子は、それぞれ実質的に無機マグネシウム塩（ＭｇＰ）のみから構成されるコアを有し、低圧条件で乾燥されるか、単純に空気乾燥される。
【００７６】
コーティングステップ（図示されているステップ３）では、ナノ粒子が懸濁され、そして、シェルのために選択された成分（例えば、脂質、生分解性ポリマー、タンパク質および／または界面活性物質）と組み合わせられた後に、ナノ粒子の周囲にシェルが形成される。例えば、タンパク質／界面活性物質ベースのシェルを本発明のナノ粒子の周囲に作製するために、界面活性物質を含む、または含まないタンパク質の溶液（例えば、１０×（負荷物との関係においてｗ／ｗ）ヒストンおよび１％の界面活性物質（ｖ／ｖ））が、ヌクレアーゼを含まない水（または、食塩水、ヒトアルブミン溶液（例えば、１０％））中でまず調製され、室温でインキュベートされる。前記溶液は、ａｉＲＮＡを負荷されたＭｇＰコアの乾燥したチューブに加えられ、次に、完全に混合される。次に、混合物は、凝集を防いでナノ懸濁液を得るために超音波処理（例えば、ウォーターバス超音波処理機を用いて）される。懸濁液は、必要に応じて、７．０にｐＨ調整され、室温でインキュベートされ、そして、その上清の回収、分析、および治療的投与への使用のために遠心分離される。ナノ粒子調製物はまた、当該分野で周知であるように、投与経路または目的に応じて製剤化され得る。
【００７７】
脂質ベースまたはポリマーベースのシェルを有するナノ粒子は、同様の様式で調製することができる。例えば、脂質ベースのシェルを作製するために、所望の脂質内容物は、適正な比率で混合され、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｖａｐ）を３〜４時間用いて乾燥したフィルムにされることができる。次に、必要な体積のリン酸緩衝食塩水が、乾燥したフィルムを再構成するために加えられる。所望の体積の溶液が、ａｉＲＮＡを負荷されたＭｇＰコアの乾燥したチューブに加えられ、そして完全に混合された後に、室温で５分間の同一の超音波処理ステップ、および３０秒間の遠心分離ステップが続く。
【００７８】
例示的方法ＩＩ：
【００７９】
代替の実施形態では、医療的に有用な作用物質（例えば、ａｉＲＮＡ）は、ナノ粒子が、第一のエマルジョン中に医療的に有用な作用物質を含まないことを除いては上記で記載されるように、最初に形成された後に、マグネシウム塩ベースのナノ粒子に加えられる。シェルのために選択された１つまたは複数の材料（例えば、アルブミンもしくはその誘導体、界面活性物質、シクロデキストリンまたはアミノ酸）もまた、上記で記載された様態と同様に、ナノ粒子に加えられる。
【００８０】
Ｃ．本発明のナノ粒子を使用する方法
【００８１】
本発明はまた、哺乳動物被験体における疾患を処置する方法も提供する。方法は、哺乳動物被験体に、本発明の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む。
【００８２】
本発明はまた、活性で、医療的に有用なもしくは医療的な作用物質を、哺乳動物被験体に送達する方法も提供する。方法は、哺乳動物被験体に、それぞれが本発明のナノ粒子である複数のナノ粒子を投与することを含む。活性作用物質は、治療剤だけでなく、イメージング作用物質（例えば、放射性薬剤イメージングに有用な作用物質）でもあり得る。
【００８３】
本発明の組成物の投与は、当該分野で公知の任意の手段によるものであり得、手段としては以下が挙げられる：経口、静脈内、皮下、吸入を介して、動脈内、筋肉内、心臓内、脳室内、非経口、くも膜下腔内、および腹腔内。投与は全身性（例えば、静脈内）、または局所性であり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物のナノ粒子は、腸溶性コーティングを含む。腸溶性にコーティングされた粒子は、経口経路により適切に投与され得る。
【００８５】
本発明の粒子は、粘膜免疫防御、粘膜ワクチン送達、または粘膜薬物送達のために、粘膜表面に医療的に有用な作用物質を送達するために用いられ得る。具体的には、治療的作用物質は、本発明のナノ粒子を介して、呼吸器系疾患を処置するために呼吸管の粘膜表面へ、眼の疾患を処置するために眼の表面へ、胃腸系疾患を処置するために胃腸管へ送達され得る。ある実施形態では、作用物質は、本発明のナノ粒子を介して、皮膚科学的適応症を処置するために局所的に送達される。医療的に有用な作用物質の非限定的な例としては、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：抗原性材料、自然免疫強化因子、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド材料、治療的薬物、例えば、インスリン、抗がん薬物、または粘膜表面に投与された際に治療的効果を有することのできる他の任意の組成物。粒子は、任意の生理的に許容可能な賦形剤と複合体化され得、そして粘膜表面を通じて（例えば、経口で、肺内に、経鼻で、直腸内に、または眼に）投与され得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、活性作用物質を送達するためおよび／または状態もしくは疾患を処置するために、哺乳動物被験体に経口で投与される。ナノ粒子を用いた経口送達は、粒子のどのような製剤であっても、消化系における強力な酵素消化から活性作用物質を保護する必要があるだけではなく、作用物質を循環系に吸収させる必要もあるという特定の困難に直面する。本発明のナノ粒子の様々な製剤が、哺乳動物被験体に経口で投与された際に、治療的有効性（例えば、実質的な遺伝子サイレンシング効果）を有することが証明されている。
【００８７】
ある実施形態では、本発明の医薬組成物は、腫瘍学的適応症ならびに肝臓および肝細胞の病理に関係する疾患を処置するために用いられる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、代謝性疾患（例えば、肝臓に関係する疾患）を処置するために用いられる。
【００８８】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、結腸がんおよび他の腫瘍学的適応症を処置するために用いられる。
【実施例】
【００８９】
Ｄ．実施例
【００９０】
実施例１：リン酸マグネシウムコアを有するナノ粒子を用いたＧＦＰトランスフェクション
【００９１】
ナノ粒子を、上記のダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。具体的には、１００μＬの５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドＤＮＡと混合し、その後激しく攪拌している５ｍＬのシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０（７１／２９，ｖ／ｖ）に加えた。第二のエマルジョンを、１００μＬの２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４から調製した。そして、ＤＮＡを負荷された得られたＭｇＰコアを乾燥させた後に、１０×（プラスミドＤＮＡとの関係においてｗ／ｗ）ヒストンおよび１％  界面活性物質（ｖ／ｖ）を含むヌクレアーゼ非含有水溶液を、それに加えた。得られた混合物は、作用物質（この場合は、ＧＦＰコーディングＤＮＡ）のためのキャリアとしてのマグネシウム塩からなる臨床上適合性のコアを有するナノ粒子であって、ここでコアは、界面活性物質および小ペプチド（ヒストン）の両方を有するシェルまたはコーティングによってさらに覆われているナノ粒子を生成した。コアのキャリア材料は、この具体例においては他の材料は存在せず、実質的に純粋なマグネシウム塩のみから構成された。
【００９２】
ＧＦＰプラスミドを負荷したナノ粒子のサイズおよびゼータ電位分布を含めた分析データは、図６に示される。示される６つの記録について、シェルを含めた平均の直径は、約１０から約２５ｎｍの範囲であり、そして、平均のゼータ電位は、約−６．０から約−１８．０ｍＶの範囲である。
【００９３】
蛍光の結果は、図７に示され、図中、下の列の写真は、緑色の蛍光スポットを示しており、ＳＷ４８０細胞株におけるインビトロ送達ビヒクルとして本発明のナノ粒子を用いたトランスフェクションの４８時間後の成功裡のＧＦＰ発現を示す。
【００９４】
実施例２：金ナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達は、インビトロでの遺伝子サイレンシングをもたらす
【００９５】
本発明の実施形態に従って金ナノ粒子にａｉＲＮＡを結合体化するステップを図示する図８を参照する。最初に、市販の金ナノ粒子をまずＰＥＧ化、すなわち、表面改変を通じてＰＥＧ鎖により官能基化した。改変金ナノ粒子のサイズ分布およびゼータ電位分布は、改変ナノ粒子の模式的図面とともに図９に示される。ＰＥＧ化金ナノ粒子は、平均で約１９ｎｍの直径であった。金ナノ粒子の平均のゼータ電位は、改変前は約−８．５３ｍＶであり、改変後は約−７．２９ｍＶであった。
【００９６】
再び図８を参照すると、金ナノ粒子をＰＥＧ化した後、医療的に有用な作用物質であるａｉＲＮＡとジスルフィド結合を形成するために、金ナノ粒子をさらに改変した。まず、ＰＥＧ化金ナノ粒子を、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）分子で架橋し、それがジスルフィド結合を形成することができるようにした。次に、ナノ粒子を、そのチオレートが露出した改変ａｉＲＮＡへと導入した。結果として、ａｉＲＮＡは金ナノ粒子上に、それら２つの間に新しいジスルフィド結合が形成された状態で負荷された。このステップの詳細は、図１０にさらに図示される。
【００９７】
ここで図１１を参照すると、金ナノ粒子から結合体化されたａｉＲＮＡを放出するために、ＤＴＴを用いてジスルフィド結合を還元した。リボグリーンアッセイを用いてジスルフィド結合の還元に続いて放出されたａｉＲＮＡの濃度を定量し、そしてＣは、約４．１２〜５．２μｇ／ｍｌのａｉＲＮＡの金ナノ粒子からの放出であった。
【００９８】
図１２は、本実施例の上記の方法を用いて調製した金ナノ粒子の送達有効性を示している。以下の配列であって、βカテニン発現をサイレンシングするように設計したａｉＲＮＡを、上記の通り金ナノ粒子に結合体化した：
【００９９】
５’−ＣＡＣＡＡＧＡＵＧＧＡＡＵＵＵ−３’  （配列番号１）
３’−ＡＡＵＡＡＡＵＵＣＣＡＵＣＵＵＧＵＧＡＵＣ−５’  （配列番号２）
【０１００】
１０×ヒストン（ａｉＲＮＡとの関係においてｗ／ｗ）および１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する溶液を、金ナノ粒子をシェルでコーティングするために、金ナノ粒子に添加した。図に示されるように、負荷をされたナノ粒子は、標的であるβカテニンに対してインビトロで、非負荷ナノ粒子より顕著に大きな遺伝子サイレンシング効果を示した。
【０１０１】
実施例３：ポリマーベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１０２】
ａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰコアを、上記のダブルエマルジョンプロセスを主として用いて調製した。具体的には、以下：
【０１０３】
バイアルＡおよびＢのそれぞれの中で、５ｍＬのシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０溶液（７１／２９  ｖ／ｖ）を、それぞれＥＭＤおよびＳｉｇｍａから入手可能な試薬から調製した。その一方で、ａｉＲＮＡを、１×ＲＮＡｓｅ非含有緩衝液に分散させて所望の濃度（例えば、約５μｇ／μＬ）にした。ある分量のａｉＲＮＡ（例えば、約５０μｇ）を、１００μＬの５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２と混合した。次に、ＭｇＣｌ２−ａｉＲＮＡ溶液を、バイアルＡの油／界面活性物質溶液に、滴下方式で加えて逆相マイクロ−エマルジョンを含まないよく分散したエマルジョンを形成させた。
【０１０４】
バイアルＢにおいて、１００μＬの２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ＝９）を、油／界面活性物質溶液に、滴下方式で加えた。次に、バイアルＡおよびＢの内容物を、混合し、室温で３０分間攪拌した。その後、内容物を、１０本の遠心管（１．５ｍＬ）中に移し、１３，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを無水エタノール（１ｍＬ）で２回洗浄した。アルコールを除去した後、得られたペレットを、３〜４時間風乾した。
【０１０５】
ポリマーベースのシェルを、予めａｉＲＮＡを負荷されたＭｇＰナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、生分解性ポリマーであるＰｅｇ（５ｋ）−ポリ−Ｌ−リシン（１０Ｕ）、ポリ−Ｌ−アルギニン（５０Ｕ）を、２．５：１のポリマー比（ＰＬＬ：ＰＬＲ）および２．５：１の複合体比（ポリマー：ａｉＲＮＡ）でコア上にコーティングした。
【０１０６】
図１３を参照すると、得られたナノ粒子についての物理的および薬理学的データが、右側に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは約７０ｎｍ（そして他の実験では約８０ｎｍであるが、確実に２００ｎｍまたは１００ｎｍより小さい）であり、そして表面電荷は約＋２５ｍＶであった。本発明のナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示していない）が実現された。
【０１０７】
インビトロ効果は、ナノ粒子ビヒクルでは観察するのが常に困難であったため、図１３の左側に示されるような強力な遺伝子サイレンシング効果（８０〜９０％）が観察されたことは特に励みになることであった。試験した細胞株には、ＳＷ４８０細胞およびＤＬＤ１細胞（ヒト結腸がん細胞株およびヒト結腸直腸がん細胞株）が含まれた。ａｉＲＮＡによって標的とされたタンパク質発現はサバイビンであり、そして該ａｉＲＮＡは（サバイビンが標的とされた別段の注釈がない他の実施例についてと同じく）以下の配列を有する：
【０１０８】
５’−ＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡＡ−３’  （配列番号３）
３’−ＡＡＵＵＵＧＡＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣ−５’  （配列番号４）
【０１０９】
実施例４：アルブミンベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１１０】
ａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰコアを、前記実施例において記載したダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。タンパク質／ペプチドベースのシェルを、予めａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、ヒト血清アルブミン（１０％）を、コア上にコーティングした。
【０１１１】
得られたナノ粒子についての物理的および薬理学的データは、図１４に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは約２５〜３５ｎｍであり、表面電荷は、約−８から−１２ｍＶであった。ナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示していない）が実現された。
【０１１２】
遺伝子サイレンシング効果（７５〜８５％）が、図１４の左側に概括されるように観察された。試験した細胞株は、ＳＷ４８０を含んだ。ここでは、２つのタンパク質（それぞれβカテニン、およびＰＬＫ１（ｐｏｌｏ様キナーゼ１））の発現を、ａｉＲＮＡによって標的とした。ＰＬＫ１は、結腸がんおよび肺がんをはじめとする様々ながんに関係するプロトオンコジーンである。βカテニンを標的とするために用いたａｉＲＮＡ配列は、配列番号１および２の上記配列と同一であった。そしてＰＬＫ１を標的とするために用いたａｉＲＮＡ配列は（ＰＬＫ１が標的とされた別段の注釈がない他の実施例についてと同じく）以下の通りである：
【０１１３】
５’−ＧＡＵＣＡＣＣＣＵＣＣＵＵＡＡ−３’（配列番号５）
３’−ＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＧＧＧＵＧＡＵＣＵＵＣ−５’（配列番号６）
【０１１４】
実施例５：アルブミンベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いた２’−Ｏ−Ｍｅ−ａｉＲＮＡ送達はインビトロおよびインビボでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１１５】
リボース分子の２’−ＯＨ残基にメチル基を有するオリゴヌクレオチドは、様々な適用において有利であり得る。とりわけ、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはＤＮＡと同一の挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護されるため、より安定である。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはまた、ＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、相補的なＲＮＡ鎖とより安定なハイブリッドを形成する。
【０１１６】
リン酸マグネシウムのみを用いるコアであって、アルブミンベースのシェルでさらにコーティングしたコアを有するナノ粒子を用いて、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡを成功裡に送達し、標的とした遺伝子発現を、インビトロおよびインビボの両方で抑制した。データは、図１５に表される。βカテニンを標的とするために用いたａｉＲＮＡ配列は、配列中のある選択された位置のヌクレオチドを２’−ＯＨメチル基で改変したことを除いては、配列番号１および２の上記配列と同一であった。
【０１１７】
実施例６：ヒストンベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１１８】
ａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰコアを、前記実施例で記載したダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。次に、タンパク質／ペプチドベースのシェルを、既にａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、５×仔ウシヒストン（ａｉＲＮＡ負荷物との関係において、ｗ／ｗ）と混合した７×ヒトヒストンを（正しいか）コア上にコーティングした。
【０１１９】
得られたナノ粒子についての物理的および薬理学的データは、図１６に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは約１５〜２５ｎｍであり、表面電荷は、約＋１０から＋２０ｍＶであった。ナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示していない）が実現された。
【０１２０】
遺伝子サイレンシング効果（６５〜７５％）が、図１６の左側に概括するように観察された。試験した細胞株は、ＳＷ４８０を含んだ。ここでは、βカテニンの発現を、前記ａｉＲＮＡによって標的とした。
【０１２１】
実施例７：ヒストンおよび小ペプチドベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロおよびインビボでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１２２】
ＭｇＰから構成され、ａｉＲＮＡを負荷されたナノ粒子コアを、上記のダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。
【０１２３】
タンパク質および小ペプチドベースのシェルを、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、３×小ペプチド（ＲＧＤ）と混合した５×仔ウシヒストンを、コア上にコーティングした。アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチドは、トリペプチドであり、標的化リガンドと類似の細胞認識に用いることができる。
【０１２４】
得られたナノ粒子についての物理的および薬理学的データは、図１７の図表に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは約１５〜２５ｎｍであり、そして表面電荷は約＋１０ｍＶから＋２０ｍＶであった。ナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示されていない）が実現された。
【０１２５】
遺伝子サイレンシング効果（８０〜９０％）が、図１７の左側に概括するようにインビトロで観察された。試験した細胞株は、ＳＷ４８０を含んだ。βカテニンおよびＰＬＫ１の発現を、それぞれのａｉＲＮＡで標的とした。環状ＲＧＤ（「Ｖ７」）および直鎖状ＲＧＤ（「Ｖ８」）の両方を試験した。
【０１２６】
顕著な遺伝子サイレンシング効果が、図１８の右側に概括されるように、インビボでも観察された（ここでは、直鎖状ＲＧＤでコーティングされたナノ粒子についてのデータのみが示される）。腫瘍異種移植片ＳＷ４８０を、マウスにおいて試験した。βカテニンおよびＰＬＫ１の発現を、それぞれのａｉＲＮＡで標的とした。
【０１２７】
実施例８：異なる界面活性物質を含むシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達
【０１２８】
ＭｇＰから構成され、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コアを、上記ダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。図１９に示されるように、コアの周囲のシェル／コーティングのために、ヒストン（５×）の他に、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（それぞれ「Ｖ１３〜１６」）を含めた様々な界面活性物質を用いた。
【０１２９】
βカテニンに対するインビトロでの遺伝子サイレンシングの結果は、ヒストンを有するシェルにおける環状ＲＧＤを負荷されたナノ粒子および直鎖状ＲＧＤを負荷されたナノ粒子について横並びで示された。結果は均一でなかったものの、遺伝子サイレンシングの程度の変動がみられた。
【０１３０】
実施例９：ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロおよびインビボでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１３１】
ＭｇＰから構成され、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コアを、上記ダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。タンパク質および界面活性物質ベースのシェルを、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、５％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬと混合された５×仔ウシヒストンを、上記の方法を用いてコア上にコーティングした。
【０１３２】
得られたナノ粒子（「Ｖ１３」）についての物理的および薬理学的データは、図２０の図表に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは非常に小さく、約６〜１５ｎｍであった。ナノ粒子の表面電荷は、約＋５から＋１２ｍＶであった。ナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示されていない）が実現された。
【０１３３】
インビトロで観察され、図２０の左側に概括された遺伝子サイレンシング効果もまた優れており、なんと８５〜９８％に達した。試験した細胞株はＳＷ４８０を含んだ。βカテニン、ＰＬＫ１およびサバイビンの発現を、それぞれのａｉＲＮＡで標的とした。それぞれの標的タンパク質についての得られたウェスタンブロット画像は、図２０の左側に示される。スクランブルコントロールとして用いたａｉＲＮＡ配列は、（別段の注釈がない他の実施例についてと同じく）以下の通りである：
【０１３４】
５’−ＧＵＡＧＵＵＡＵＡＧＵＣＧＡＵ−３’（配列番号７）
３’−ＡＡＣＡＵＣＧＡＣＵＡＵＡＡＣＵＡＣＣＵＧ−５’（配列番号８）
【０１３５】
顕著な遺伝子サイレンシング効果が、図２１に図示されるように、インビボでも観察された。腫瘍異種移植片ＳＷ４８０を、マウスにおいて試験した。βカテニンの発現を、ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒでコーティングしたリン酸マグネシウムナノ粒子により送達されるａｉＲＮＡによって標的とした。図２１に示されるように、本発明のナノ粒子を用いた投薬の後の１３日目において、腫瘍成長に対する顕著な阻害は、依然として明白であった。
【０１３６】
このナノ粒子はまた、図２２に図示されるように、持続する安定性も示した。４℃で保管したところ、「Ｖ１３」ナノ粒子は、６週間の時間を通して、その元の粒子サイズおよび電荷を大部分維持した。遺伝子サイレンシングの誘導における有効性もまた、様々な時点で撮影されたゲル写真が示すように（図２２）、６週間の間損なわれないままであった。「Ｖ１３」ナノ粒子はまた、５０％マウス血漿中に２時間置いた後でも、ヌクレアーゼ分解に耐えるに十分に安定であった（データは示されていない）。様々な試験において、「Ｖ１３」ナノ粒子または、それらの送達能力またはそれらが運搬する医療的に有用な作用物質の有効性を顕著に損なうことなく、凍結乾燥および再構成できることも示された。
【０１３７】
実施例１０：プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１３８】
ａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰコアを、前記実施例において記載されたダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。タンパク質／界面活性物質ベースのシェルを、既にａｉＲＮＡを負荷したＭｇＰナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、５％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒと混合した７×プロタミン（ａｉＲＮＡ負荷物との関係において、ｗ／ｗ）を、コア上にコーティングした。
【０１３９】
得られたナノ粒子についての物理的および薬理学的データは、図２３に示される。例えば、ナノ粒子の平均のサイズは、約９〜２０ｎｍであり、そして表面電荷は、約＋５から＋１８ｍＶであった。ナノ粒子は、良好な血漿安定性を示し、そして、細胞への取り込みおよびエンドソーム脱出の両方（データは示されていない）が実現された。
【０１４０】
図２３のゲル写真によって示されるように、得られたナノ粒子はまた、５０％マウス血漿中に４時間置かれた後でも、ヌクレアーゼ分解に耐えるに十分に安定であった。
【０１４１】
図２４の上面に概括されるように、遺伝子サイレンシング効果（インビトロで７０〜８０％）が観察された。試験した細胞株はＳＷ４８０を含んだ。ここでは、βカテニンの発現を、ａｉＲＮＡによって標的とした。コーティング溶液をナノ粒子コア上に吸着することにおけるステップを、送達有効性に対する効果を試験するために変化させた。
【０１４２】
実施例１１：プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡ送達はインビトロでの遺伝子サイレンシングを実現する
【０１４３】
ＭｇＰから構成され、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コアを、上記ダブルエマルジョンプロセスを用いて調製した。タンパク質および界面活性物質ベースのシェルを、ａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子コア上にコーティングした。具体的には、５×仔ウシプロタミン（ａｉＲＮＡ負荷物との関係においてｗ／ｗ）を５％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬと予め混合したコーティング溶液を、上記の方法を用いてコアに加えた。必要に応じて、コーティング溶液に、３．５％  ｗ／ｖヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンを加えた。
【０１４４】
得られたナノ粒子（「Ｋ７」はプロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒによるシェル製剤であり、「Ｋ７Ｃ」は、シクロデキストリンを添加した同一の製剤である）についての物理的および薬理学的データは、図２５の図表に示される。Ｋ７ナノ粒子については、平均粒子サイズは約１３〜２１ｎｍであった。Ｋ７ナノ粒子の表面電荷は約＋１５から＋１８ｍＶであった。Ｋ７Ｃナノ粒子については、平均粒子サイズは約１３〜２０ｎｍであった。Ｋ７ナノ粒子の表面電荷は、約＋１４から＋１６ｍＶの範囲であった。
【０１４５】
ナノ粒子はまた、特にヒト血漿またはマウス血漿に対する、良好な血漿安定性を示した（データは示されていない）。
【０１４６】
ナノ粒子を用いた遺伝子サイレンシング効果は、ＳＷ４８０細胞においてインビトロで観察された。時間経過プロファイルは、βカテニンを標的とするａｉＲＮＡを負荷したナノ粒子について投与の後７２時間までは単回投薬の効果が継続したことを示した（データは示されていない）。
【０１４７】
Ｍｇコアの周囲のシェルのための様々な他の組成物もまた、少なくともインビトロでの遺伝子サイレンシング効果を実現することができた。これらの組成物は、シェル中にＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ−１５、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒから選択される２つの界面活性物質の様々な組み合わせを有する組成物を含んだ（データは示されていない）。
【０１４８】
実施例１２：プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子に基づく医薬製剤
【０１４９】
実施例１０および１１において上記で記載されたＫ７ナノ粒子（プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ含有シェルを有するＭｇＰコア）について、図２６に示されるように、静脈内投与を通じてもたらされた腫瘍阻害を、経口投与と比較する。両方が、インビボ（図２６）およびインビトロ（示されていない）の両方のデータで強力な臨床有効性を示した。
【０１５０】
実施例１３：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒおよび小タンパク質ベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子に基づく医薬製剤
【０１５１】
実施例９において上記で記載されたＶ１３ナノ粒子（ヒストンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ含有シェルを有するＭｇＰコア）ならびに実施例１０および１１において上記で記載されたＫ７ナノ粒子（プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ含有シェルを有するＭｇＰコア）について、静脈内投与を通じて（図２７）、および経口投与を通じて、インビボでの腫瘍阻害がもたらされた。両方の種類のナノ粒子が、どちらの投与の経路を介しても、顕著な臨床有効性を示した。
【０１５２】
実施例１４：プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒベースのシェルを有するリン酸マグネシウムナノ粒子を用いたａｉＲＮＡリード選択
【０１５３】
プロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ含有シェルに覆われたＭｇＰコアをそれぞれが有するＫ７ナノ粒子上に負荷したａｉＲＮＡを用いて、利用可能な医薬レジメンのための様々なオンコジーンまたはプロオンコジーンに対する選択を、マウスにおいて行った。このビヒクルを用いて、先に試験した静脈内（ｉ．ｖ．）製剤を、βカテニン、サバイビン、およびＰＬＫ１の発現に対して試験した（図２８）。腫瘍成長の効果的な阻害は、３つの標的全てに対して、迅速な開始および継続する効果の両方について観察された。同様の実験を、ヒト膵臓がん異種移植片において行い、同様の強い効果を生む結果が観察された（図２９）。
【０１５４】
実施例１５：薬学的最適化
【０１５５】
検証された薬物製剤のさらなる最適化を、ＭｇＰコアを有するナノ粒子を用いて行った。図３０〜３２に示されるように、Ｌａｂｒａｆｉｌ（図３２）を含む、または含まないシクロデキストラン（図３１）の追加は、ナノ粒子コアをプロタミンおよびＣｒｅｍｏｐｈｏｒを含有するシェルで覆う検証された静脈内製剤の薬学的有効性を、さらに向上させた。
【０１５６】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件、分析結果などを表現する全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において述べられる数値パラメータは、本発明によって獲得されることが求められる所望の特性に依存して変化し得る近似値である。少なくとも、そして本特許請求の範囲への均等論の適用を制限する企図としてではなく、それぞれの数値パラメータは、有効桁数および通常の丸めアプローチの観点から解釈されるべきである。
【０１５７】
本発明の改変および変更は、当業者にとって明らかであるようにその意図および範囲から逸脱せずに行うことができる。本明細書で記載された具体的な実施形態は、例示の形でのみ提供され、そしていかなる形であれ制限的であることを意味するものではない。本明細書および実施例は、例示的としてのみ考えられることが意図されており、本発明の真の範囲および意図は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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