(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させる工程を含み、該蛍光プローブの蛍光強度を指標としてカルシプロテイン粒子量を測定する、カルシプロテイン粒子(CPP)の測定方法。
【請求項２】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血清を前記工程に供することで総CPP量を測定し、且つ血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することにより得られた上清を前記工程に供することで低密度CPP量を測定し、該総CPP量から該低密度CPP量を引いて高密度CPP量を算出する工程をさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によりカルシプロテイン粒子(CPP)を測定するためのキット。
【請求項５】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、請求項４記載のキット。
【請求項６】
血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させる工程を含み、該蛍光プローブの蛍光強度を指標としてカルシプロテイン粒子(CPP)量を測定する、慢性腎臓病の検査を補助する方法。
【請求項７】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
血清を前記工程に供することで総CPP量を測定し、且つ血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することにより得られた上清を前記工程に供することで低密度CPP量を測定し、該総CPP量から該低密度CPP量を引いて高密度CPP量を算出する工程をさらに含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブを含む、慢性腎臓病診断キット。
【請求項１０】
リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することで沈殿する高密度カルシプロテイン粒子(CPP)から成る慢性腎臓病診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば腎機能低下と共に血中に増加するカルシプロテイン粒子(calciprotein particle；CPP)の新規測定方法、並びに当該測定方法により測定することができる慢性腎臓病診断マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎機能低下と共に、血中にリン酸カルシウム結晶と血清タンパク質フェチュインA(Fetuin-A)との複合体ナノ粒子であるカルシプロテイン粒子(以下、「CPP」と称する)が増えてくることが知られている。
【０００３】
血清中のCPPは、高速(16,000g)で長時間(2時間)の遠心により沈殿するため、従来においては、当該高速での長時間の遠心前後で血清フェチュインA濃度をELISAで測定し、その差をもって血清CPPを間接的に測定してきた(非特許文献１及び２)。しかしながら、この方法では、CPPが低濃度になる程、遠心前後の血清フェチュインA濃度の差が小さくなるために測定誤差が大きくなるという原理的な限界が問題となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hamano T., et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2010年, Vol. 21, pp. 1998-2007
【非特許文献２】Smith E.R., et al., Nephrol. Dial. Transplant., 2012年, Vol. 27, pp. 1957-1966
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、従来において、血中のCPP濃度を直接的に、且つ高感度で測定できる方法は知られていなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、血中のCPP濃度を直接的に測定できる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、CPP中のリン酸カルシウム結晶に特異的に結合する蛍光プローブを使用することで、血中のCPP濃度を直接的に測定できることを見出した。また、見出した当該CPP測定方法によれば、血中には物性の異なる2種類のCPPが存在し、そのうちの高密度(大きくて重い)のCPPが慢性腎臓病患者において特異的に増加していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させる工程を含み、該蛍光プローブの蛍光強度を指標としてCPP量を測定する、CPPの測定方法。
（２）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、（１）記載の方法。
（３）血清を前記工程に供することで総CPP量を測定し、且つ血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することにより得られた上清を前記工程に供することで低密度CPP量を測定し、該総CPP量から該低密度CPP量を引いて高密度CPP量を算出する工程をさらに含む、（１）又は（２）記載の方法。
（４）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブを含む、CPPの測定キット。
（５）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、（４）記載のキット。
（６）血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させる工程を含み、該蛍光プローブの蛍光強度を指標としてCPP量を測定する、慢性腎臓病の検査方法。
（７）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、（６）記載の方法。
（８）血清を前記工程に供することで総CPP量を測定し、且つ血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することにより得られた上清を前記工程に供することで低密度CPP量を測定し、該総CPP量から該低密度CPP量を引いて高密度CPP量を算出する工程をさらに含む、（６）又は（７）記載の方法。
（９）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブを含む、慢性腎臓病診断キット。
（１０）リン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブが、ビスホスホネートと蛍光色素とのコンジュゲートである、（９）記載のキット。
（１１）血清を16,000〜24,000gで1.5〜2時間遠心分離に供することで沈殿する高密度CPPから成る慢性腎臓病診断マーカー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血中のCPP濃度を直接的に、且つ高感度で測定でき、また慢性腎臓病を正確に検査することができる。また、本発明によれば、慢性腎臓病の診断に有用なマーカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】透析患者(実線)と健常者(破線)の血清における総CPPの測定結果を示すグラフである。
【図２】透析患者(実線)と健常者(破線)の血清におけるL-CPPの測定結果を示すグラフである。
【図３】透析患者(黒塗り棒グラフ)と健常者(白抜き棒グラフ)の血清におけるH-CPPの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るCPPの測定方法(以下、「本方法」と称する)は、血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させる工程を含むものである。本方法では、CPP中のリン酸カルシウム結晶に当該蛍光プローブが特異的に結合し、結合した当該蛍光プローブの蛍光強度を指標としてCPP量(濃度)を直接的に且つ高感度で測定することができる。また、CPPは慢性腎臓病患者の血中において増加することから、本方法は、慢性腎臓病の検査方法、慢性腎臓病の評価又は判定方法、慢性腎臓病を検出するためのin vitroにおけるデータ収集方法等ということができる。
【００１２】
本方法で使用する血清が由来する被験体は、例えばヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物、マウス、モルモット、ウサギ等の実験動物、を含めた哺乳動物であって良く、好ましくはヒトである。また、血清は、当該被験体から得られた血液を例えば約3,000gで約10分間遠心分離に供することで、上清として得ることができる。
【００１３】
本方法で使用するリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとしては、リン酸カルシウム結晶に特異的に結合し、且つ蛍光を発するプローブであれば特に限定されないが、例えば、リン酸カルシウム結晶に特異的に結合するビスホスホネートと蛍光色素(例えば、Rhodamin, FITC, IRDye, Alexa Fluoraなど)とのコンジュゲート等が挙げられる。さらに、当該コンジュゲートとしては、例えば下記の式：
【化１】
0006566697.tif 000002
で示される、ビスホスホネートの一種であるパミドロネート(Pamidronate)に近赤外線蛍光色素IRDye(excitation 668 nm, emission 687 nm)をアミン・カップリングにより共有結合させた化合物であるOsteosense(登録商標)(Perkin Elmer社製)が挙げられる。
【００１４】
本方法では、血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを接触させるように混合し、血清中のCPPと当該蛍光プローブとを結合させる。例えば、5〜50μM(好ましくは50μM)の蛍光プローブ溶液10〜100μl(好ましくは45μl)に、血清0.5〜5μl(好ましくは5μl)を加えて、緩やかに振盪しながら室温(約24℃)で0.5〜2時間(好ましくは1時間)反応させる。
【００１５】
反応後、例えば以下のいずれかの方法によりリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブに基づく蛍光強度を測定し、血中(血清中)のCPP量(濃度)を測定することができる。
(1) 反応後、遊離の蛍光プローブを除くように、反応物をゲル濾過スピンカラム(例えばMicro Bio-Spin P-30(Bio-rad社製))に供し、次いで800〜1,200g(好ましくは1,000g)で1.5〜3分間(好ましくは2分間)遠心分離に供し、溶出画分を得る。さらに、CPPを溶解するように、得られた溶出画分4〜40μl(好ましくは40μl)に250〜500mM(好ましくは500 mM) EDTAを1〜10μl(好ましくは10μl)、5〜10％(好ましくは10％)SDSを1〜10μl(好ましくは10μl)加えて、室温(約24℃)で5〜10分間(好ましくは5分間)放置する。放置後、使用する蛍光プローブの励起波長と蛍光波長(近赤外線蛍光色素の場合、励起波長： 668 nm、蛍光波長：687 nm)に準じて、蛍光プローブの蛍光強度を読み取る。読み取った蛍光強度から血中(血清中)CPP量(濃度)を定量する。
(2) 反応後、反応物を、抗フェチュインA抗体を用いるELISAに供した後、上記同様に蛍光プローブの蛍光強度を読み取る。
【００１６】
また、リン酸カルシウム結晶であるヒドロキシアパタイトを使用して、本方法の工程同様にヒドロキシアパタイトに結合させたリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブに基づく蛍光強度を測定し、検量線を作成する。当該検量線から、ヒドロキシアパタイトに結合する蛍光プローブ量を算出し、血中(血清中)CPP濃度を、ヒドロキシアパタイト濃度として換算することもできる。
【００１７】
血中には2種類のCPP(すなわち、小さくて軽い低密度CPPと大きくて重い高密度CPP)が存在し、そのうちの高密度のCPPが慢性腎臓病患者において特異的に増加する。すなわち、高密度CPPは、慢性腎臓病診断マーカーとして有用である。
【００１８】
低密度CPPは、血清を例えば16,000〜24,000g(好ましくは16,000g)で1.5〜2時間(好ましくは2時間)遠心分離に供することで得られた上清に存在し、一方、高密度CPPは当該遠心分離により得られた沈殿物に存在する。
【００１９】
そこで、本方法により血清から低密度CPPと高密度CPPとを含む総CPP量を測定し、且つ本方法により血清由来の上記上清から低密度CPP量を測定する。当該総CPP量から当該低密度CPP量を引くことで、高密度CPP量を算出することができる。
【００２０】
あるいは、本方法において、血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを反応後、反応物を16,000〜24,000g(好ましくは16,000g)で1.5〜2時間(好ましくは2時間)遠心分離に供し、得られた沈殿物から蛍光プローブの蛍光強度を読み取ることで、高密度CPP量を直接測定することもできる。
【００２１】
また、本方法において、血清とリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブとを反応後、反応物を、高密度CPPと低密度CPPとを分離できるポアサイズのフィルターに供し、高密度CPPを分離する。分離した高密度CPPから蛍光プローブの蛍光強度を読み取ることで、高密度CPP量を直接測定することができる。
【００２２】
本方法において、被験体由来の血中(血清中)総CPP又は高密度CPP量(濃度)が、健常者の血中(血清中)総CPP又は高密度CPP量(濃度)と比較して有意に(例えば、1.1〜10倍、好ましくは1.5〜10倍)高い場合に、被験体は慢性腎臓病であると判断することができる。
【００２３】
また、本発明は、上述のリン酸カルシウム結晶特異的結合性蛍光プローブを含む、CPP測定又は慢性腎臓病診断キットに関する。当該キットは、当該蛍光プローブ以外に、さらにCPP測定又は慢性腎臓病診断のための取り扱い説明書、容器、試薬等を適宜含むことができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕血中CPP測定法
１．原理
血中CPP測定法の原理は以下の通りである：
(1) リン酸カルシウム結晶に特異的に結合する近赤外線蛍光プローブOsteosenseを血清に加えてCPPに結合させる；
(2) 次いで、ゲル濾過スピンカラムでFreeのOsteosenseを除く；
(3) CPPに結合したOsteosenseの蛍光を近赤外線スキャナーで定量する。
【００２６】
２．試薬
血中CPP測定法に使用する試薬は以下の通りである：
(i) Osteosense 680EX(Perkin Elmer #NE10010EX)(Krebs-Ringer-Hepes Bufferで50 μMの濃度に溶解)；
(ii) 500 mM EDTA, pH 8.0；
(iii) 10％ SDS；
(iv) DMEM(Gibco 12100-046)(1 M HEPES(pH 7.4)を終濃度25 mMになるように加える)；
(v) Micro Bio-Spin P-30(Bio-rad 732-6226)；
(vi) 96 well optical bottom plate(Nunc 165305)；
(vii) Hydroxyapatite nanoparticles(Sigma-Aldrich 677418）。
【００２７】
３．方法
３−１．総CPPの測定
総CPPの測定を、以下の工程により行った：
(1) (i)Osteosense溶液を(iv)DMEMで10倍希釈した；
(2) 上記Osteosense希釈液45 μlに血清5 μlを加えた；
(3) 緩やかに振盪しながら室温(24℃)で1時間反応させた；
(4) この間に、(v)スピンカラムを(iv)DMEMで平衡化しておいた；
(5) 上記反応液30 μlと(iv)DMEM 30 μlを(v)スピンカラムにapplyした；
(6) 1,000 gで2分間遠心し、溶出画分を回収した；
(7) 溶出画分40 μlを(vi)96穴プレートに移し、(ii)500 mM EDTAを10 μl、(iv)DMEMを40 μl、(iii)10％ SDSを10 μl加えて室温で5分間放置し、CPPを溶かした；
(8) 近赤外線スキャナー(LI-COR Odyssey CLx)でOsteosenseの蛍光強度を定量し、血中CPP濃度とした。
【００２８】
３−２．L-CPP(低密度CPP)の測定
L-CPPの測定の工程は、上記総CPPの測定における工程(2)で、血清5 μlの代わりに、血清を16,000 gで2時間遠心した上清5 μlを用いた以外は、当該総CPPの測定の工程と同じであった。
【００２９】
３−３．H-CPP(高密度CPP)の測定
上記総CPPの測定による総CPP値から、上記L-CPPの測定によるL-CPP値を引いて算出した。
【００３０】
３−４．血中CPP濃度の別の表示方法
血中CPP濃度のもう一つの表示方法として、上記総CPPの測定における工程(8)で得たOsteosenseの蛍光強度に等しい蛍光強度を発する市販のリン酸カルシウム結晶の標準品(vii)Hydroxyapatite(HA)の濃度として表示する方法がある。この場合、以下のように、HAを使った検量線を作成する：
(1) HAを(iv)DMEMで懸濁し、希釈系列(1000, 500, 150, 125, 62.5 μg/ml)を作成する；
(2) 上記総CPPの測定における工程(2)で、血清5 μlの代わりにHA懸濁液5 μlを加える；
(3) 緩やかに振盪しながら室温(24℃)で1時間反応させる；
(4) 16,000 gで2時間遠心する；
(5) 上清40 μlを(vi)96穴プレートに移し、(ii)500 mM EDTAを10 μl、(iv)DMEMを40 μl、(iii)10％ SDSを10 μl加えて室温で5分間放置する；
(6) 近赤外線スキャナー(LI-COR Odyssey CLx)でOsteosenseの蛍光強度を定量して検量線を作成し、HA 1 μg/mlに結合するOsteosense量を算出する；
(7) Osteosenseの蛍光強度で表した血中CPP濃度を、同量のOsteosenseが結合できるHA濃度(μg/ml)に換算する。
【００３１】
〔実施例２〕透析患者(慢性腎臓病患者)と健常者由来の血清におけるCPPの測定
透析患者5例と健常者4例の血清を用いて、実施例１に記載の方法で総CPP、L-CPP及びH-CPPを測定した。
【００３２】
結果を図１〜３に示す。
図１は、透析患者(実線)と健常者(破線)の血清における総CPPの測定結果を示すグラフである。
【００３３】
図２は、透析患者(実線)と健常者(破線)の血清におけるL-CPPの測定結果を示すグラフである。
【００３４】
図３は、透析患者(黒塗り棒グラフ)と健常者(白抜き棒グラフ)の血清におけるH-CPPの測定結果を示すグラフである。
【００３５】
本実施例では、上記総CPPの測定における工程(6)の後に300 μlの(iv)DMEMで7回分画し、CPPに結合しなかった過剰のOsteosenseが溶出するところまで確認した。最初の画分(図１及び２における矢印)がCPPに相当した。
【００３６】
図１に示すように、透析患者の血中総CPP値は、健常者よりも高値であることが分かった。
【００３７】
同じ症例でL-CPPを測定した。図２に示すように、L-CPP値は透析患者と健常者で差がなかった。
【００３８】
総CPP値からL-CPP値を引いてH-CPPを算出した。図３に示すように、透析患者では主にH-CPPが上昇していることが分かった。
【図１】
0006566697.tif 000003
【図２】
0006566697.tif 000004
【図３】
0006566697.tif 000005