(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）：
【化１】
0006492012.tif 000040
（式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、ハロゲン原子、または直鎖上若しくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル基であって、該Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシ基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基およびアシルアミノ基から選択される一つ以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｚは、ヒドロキシシクロヘキシル基であり、
Ｑは、二環式ヘテロアリール基であって、ハロゲン原子；ヒドロキシ基、メトキシ基若しくはピロリジニル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基；Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル基；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基；アミノ基；Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ基；ジＣ１−Ｃ４アルキルアミノ基；ヒドロキシ基；カルバモイル基；カルボキシル基；モルホリニル基；ピロリジニル基；ホルミル基；アセチル基；メシル基；ベンゾイル基およびアシルアミノ基から選択されるひとつ以上の置換基で置換されていてもよい。）
で示されるキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
二環式ヘテロアリール基が、テトラヒドロイソキノリル基、ベンゾチオフェニル基、ベンズイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、インドリル基、ベンゾトリアゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリル基およびインダゾリル基よりなる群から選択される、請求項１に記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
二環式ヘテロアリール基が、ベンズイミダゾリル基またはインダゾリル基である、請求項１または２に記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
二環式ヘテロアリール基が、ベンズイミダゾリル基である、請求項１〜３のいずれかに記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２が水素原子、ハロゲン原子、または直鎖上若しくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル基である、請求項１〜４のいずれかに記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、特にＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害作用を有し、抗腫瘍効果を示す新規なキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナルは、発生初期における体軸形成や器官形成、出生後の細胞の増殖や分化などを制御しており、Ｗｎｔシグナルの活性化は、複数の細胞内シグナル経路を介して多彩な細胞応答を誘導することが分かっている（非特許文献１）。Ｗｎｔシグナル経路の中で最もよく知られているのは、β-カテニン経路である。正常状態において細胞質内で蓄積しているβ-カテニンは、Ｗｎｔ刺激によって核内に移行し、転写因子であるＴ細胞因子／リンパ球活性化因子（ＴＣＦ／ＬＥＦ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ／Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）と結合し，ＡＸＩＮやｃ−ＭＹＣ等の遺伝子の発現を誘導する。Ｗｎｔシグナル経路に異常が生じると種々の疾患が引き起こされることが知られているが、特に、がんの発症と深い関係があり、Ｗｎｔシグナル経路の構成タンパク質であるβ-カテニンやＡＰＣ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）、ＡＸＩＮなどの遺伝子変異がヒトの癌症例で報告されている（非特許文献２）。これらのがん細胞では、核内でのβ-カテニンの異常な蓄積と、細胞増殖を促進するような種々の遺伝子発現が認められる。【０００３】
また、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路は、初期発生や臓器形成以外にも、幹細胞の未分化能の維持と分化に関与することも明らかになっている（非特許文献３、４）。がん細胞のうち、幹細胞と同じような性質をもった細胞（がん幹細胞）の存在が報告されており、がん幹細胞は、がん組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもとになっていると考えられている。Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路は、正常な幹細胞だけでなく、がん幹細胞においても、その幹細胞性の維持に関与している。がん幹細胞は一般的な抗がん剤による治療に抵抗性であるため、抗がん剤治療で生き残ったごく少数のがん幹細胞が、がんの再発、転移を引きおこすと考えられている（非特許文献５、６）。がん幹細胞は、発がん、がん転移及びがん再発の原因であると考えられているため、がん幹細胞は、腫瘍開始細胞、がん幹様細胞、幹様がん細胞、高度腫瘍形成性細胞又は超悪性細胞とも呼ばれる。
したがって、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を阻害する化合物は、Ｗｎｔシグナルが関与している疾患、特にがんの治療に有用であり、また、がん幹細胞を標的とした腫瘍の転移及び再発予防にも有用である。【０００４】
これまでに、種々のキナゾリン誘導体が知られており、出願人による特許文献１の他、特許文献２および特許文献３などが報告されている。しかし、本発明のキナゾリン誘導体については記載されておらず、また、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を阻害することも報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００９／８４６９５号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０４４０９０号公報
【特許文献３】ＫＲ２０１３００８４４７４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｏｇａｎ,Ｃ.Ｙ.  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ,Ｒ.,  Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｃｅｌｌ.Ｄｅｖ.Ｂｉｏｌ．，２００４，２０，７８１−８１０
【非特許文献２】Ｃｌｅｖｅｒｓ,Ｈ.  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ,Ｒ.,Ｃｅｌｌ，２０１２，１４９，１１９２−１２０５
【非特許文献３】Ｒｅｙａ,Ｔ.,  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ,Ｈ.,Ｎａｔｕｒｅ,２００５,４３４,８４３−８５０
【非特許文献４】Ｈｏｌｌａｎｄ,Ｊ.Ｄ.,Ｋｌａｕｓ,Ａ.,Ｇａｒｒａｔｔ,Ａ.Ｎ.,Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ,Ｗ.,Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.,２０１３,２５，２５４−２６４
【非特許文献５】Ｄｅａｎ,Ｍ.,Ｆｏｊｏ,Ｔ.,Ｂａｔｅｓ,Ｓ．．Ｎａｔ.Ｒｅｖ.Ｃａｎｃｅｒ,２００５,５，２７５−２８４
【非特許文献６】Ｌｉ,Ｆ.,Ｔｉｅｄｅ,Ｂ.,Ｍａｓｓａｇｕｅ,Ｊ.,Ｋａｎｇ,Ｙ.,Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ.,２００７，１７，３−１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、医薬、特にＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害作用を有し、抗腫瘍効果を示す新規なキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩によって達成される。
（１）下式（Ｉ）： 
【化１】
0006492012.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｚは、置換基を有するシクロアルキル基または置換基を有するシクロアルケニル基を表し、Ｑは、置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基を表す。）
で示されるキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
（２）Ｚが置換基を有するシクロアルキル基である、上記（１）に記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
（３）Ｚがヒドロキシシクロヘキシル基である、上記（１）または（２）に記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
（４）下式（Ｉａ）：
【化２】
0006492012.tif 000003
（式中、Ｒ１ａおよびＲ２ａは水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を表し、Ｚａは、置換基を有するシクロアルキル基または置換基を有するシクロアルケニル基を表し、Ｑａは、置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基を表す。）
で示されるキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
（５）Ｚａがヒドロキシシクロヘキシル基である、上記（４）に記載のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために種々検討を重ねた結果、前記（１）〜（３）で示される新規なキナゾリン誘導体およびその薬学的に許容される塩が、優れたＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害作用を有し、抗腫瘍効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。本発明により提供される化合物は、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を介した異常な細胞応答に関連していることが知られている疾患、特にがんの治療に有用であり、また、がん幹細胞を標的とした腫瘍の転移及び再発予防にも有用である。また、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害剤として、実験用、研究用の試薬に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の化合物が、大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６のＡＸＩＮ２遺伝子の発現を濃度依存的に抑制していることを示す（試験例２）。
【図２】実施例１の化合物が、大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６のｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を濃度依存的に抑制していることを示す（試験例２）。
【図３】実施例１の化合物が、大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６のＡＸＩＮ２及びｃ−ＭＹＣのタンパク質発現を濃度依存的に抑制していることを示す（試験例３）。
【図４】実施例１の化合物が、ヒト由来がん細胞株のヌードマウス皮下移植モデルにおいて、用量依存的に腫瘍増殖を抑制していることを示す（試験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の新規なキナゾリン誘導体は、下式（Ｉ）
【化３】
0006492012.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｚは、置換基を有するシクロアルキル基または置換基を有するシクロアルケニル基を表し、Ｑは、置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基を表す。）
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００１２】
前記式（Ｉ）において、
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素などが挙げられる。
置換基を有してもよい低級アルキル基の低級アルキル基部分としては、炭素数１から４の直鎖状、分枝状のアルキル基のいずれでもよく、例えば、メチル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を挙げることができる。
置換基を有するシクロアルキル基のシクロアルキル基部分としては、炭素数３から７の環状のアルキル基のいずれでもよく、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。
【００１３】
置換基を有するシクロアルケニル基のシクロアルケニル基部分としては例えば、炭素原子数５から７の環状のアルケニル基のいずれでもよく、例えば、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基の二環式ヘテロアリール基部分としては、例えば、４から６員の環が縮合した二環性で、窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む芳香族へテロ環基のいずれでもよく、例えば、テトラヒドロイソキノリル基、ベンゾチオフェニル基、ベンズイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、インドリル基、ベンゾトリアゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリル基、インダゾリル基などが挙げられる。
【００１４】
置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有するシクロアルキル基、置換基を有するシクロアルケニル基、置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基の置換基は、特に記載のない限り、１または２個以上の任意の種類の置換基を、化学的に可能な任意の位置に有してもよく、当該置換基が２個以上の場合、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよく、例えば、ハロゲン原子、置換もしくは非置換アルキル基、シクロアルキル基、置換もしくは非置換アルコキシ基、置換もしくは非置換アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換アルキルアミノ基、置換もしくは非置換カルバモイル基、カルボキシル基、モルホリニル基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基、置換もしくは非置換アシルアミノ基などが挙げられる。
【００１５】
より具体的には、「置換基を有してもよい低級アルキル基」の置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、アミノ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基、またはアシルアミノ基等が例示される。
「置換基を有するシクロアルキル基」または「置換基を有するシクロアルケニル基」の置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、アミノ基、スルホニル基で置換されていてもよい炭素数１から４のアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基、またはアシルアミノ基等が例示される。特に、ヒドロキシ基およびアミノ基が好ましい。
「置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基」の置換基としてはハロゲン原子、ヒドロキシ基、メトキシ基若しくはピロリジニル基で置換されていてもよい炭素数１から４のアルキル基、炭素数３〜５のシクロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、アミノ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ジ（炭素数１から４のアルキル）アミノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、モルホリニル基、ピロリジニル基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基、またはアシルアミノ基等が例示される。
【００１６】
本発明はまた、新規キナゾリン誘導体（Ｉａ）：
【化４】
0006492012.tif 000005
（式中、Ｒ１ａおよびＲ２ａは水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を表し、Ｚａは、置換基を有するシクロアルキル基または置換基を有するシクロアルケニル基を表し、Ｑａは、置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基を表す。）
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
上記式（Ｉａ）において、ハロゲン原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、およびシクロアルケニル基は、上記式（Ｉ）の場合と同様である。
Ｑａの二環式ヘテロアリール基は４から６員の環が縮合した二環性で、窒素原子の他、硫黄原子および酸素原子から選ばれるヘテロ原子を含んでもよい芳香族含窒素へテロ環基のいずれでもよく、例えば、ベンズイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリル基、インダゾリル基などが挙げられる。
また、Ｑａにおける「置換基を有してもよい二環式ヘテロアリール基」の置換基は、ハロゲン原子、（ハロゲン原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、ジメチルアミノ基若しくはピロリジニル基で置換されていてもよい）炭素数１から４のアルキル基、炭素数３〜５のシクロアルキル基、炭素数１から４のアルコキシ基、アミノ基、炭素数１から４のアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、モルホリニル基等が例示される。
Ｑａとしては、低級アルキル基で置換されていてもよいインダゾリル基またはベンズイミダゾリル基が好ましく、さらに当該低級アルキル基はヒドロキシ基で置換されていてもよい。
また、「置換基を有するシクロアルキル基」および「置換基を有するシクロアルケニル基」の置換基はヒドロキシ基およびアミノ基から選択される。
以下の本発明の化合物（Ｉ）に関する説明は、本発明の化合物（Ｉａ）にも適用される。
【００１７】
本発明の化合物（Ｉ）は、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体（幾何異性体、光学異性体、互変異性体など）も含有し、異性体単体、またはそれらの混合物も含有する。
【００１８】
また、本発明の化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸等との無機酸塩、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との有機酸塩等が挙げられる。また、ナトリウム、カリウム等とのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等とのアルカリ土類金属塩、低級アルキルアミン、低級アルコールアミン等との有機アミン塩、リジン、アルギニン、オルニチン等との塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩等も本発明に包含される。
本発明化合物およびその薬学的に許容しうる塩には、その分子内塩、その水和物等の溶媒和物のいずれもが含まれる。
【００１９】
本発明の化合物（Ｉ）およびその薬学的に許容される塩は、例えば以下の方法によって製造することができる。なお、以下に示した製造法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、または当該方法を実施するのに不向きな場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］等の手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
【００２０】
以下の説明で使用される略語、記号の意味は次の通りである。
ＤＣＭ  ：  ジクロロメタン
ＴＨＦ  ：  テトラヒドロフラン
ＤＭＦ  ：  ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ：  ジメチルスルホキシド
ＣＤＣｌ３  ：  重クロロホルム
【００２１】
［本発明の化合物（Ｉ）の製法］
式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、例えばスキーム１によって製造することができる。
［スキーム１］
【化５】
0006492012.tif 000006
0006492012.tif 000007
【００２２】
化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＩ）の水酸基とＺ基導入剤（ＺＸ）との求核置換反応により製造することができる。
Ｘが適当な脱離基、例えば、メシル化若しくはトシル化された水酸基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基などの場合、化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＩ）と１〜５モル当量、好ましくは１〜１．５モル当量のＺ基導入剤、および１〜５モル当量、好ましくは１〜３．５モル当量の炭酸セシウムのような塩基存在下、溶媒中加熱反応させることによって得ることができる。溶媒は反応に不活性なものであればいずれでも良く、特に限定されるものではないが、好ましくはＤＭＳＯ、もしくはＤＭＦを用いることができる。反応は８０〜１８０℃において、１〜２４時間加熱することで実施することができるが、好ましくは１００〜１５０℃において１〜４時間反応させることにより実施することができる。
【００２３】
また、化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＩ）の水酸基と、水酸基を有するＺ基導入剤（Ｘ＝ＯＨ）を、光延反応により反応させても製造することができる。すなわち、化合物（ＩＩ）と１〜５モル当量、好ましくは１〜２モル当量のアルコール基を有するＺ基導入剤、および１〜１０モル当量、好ましくは１〜５モル当量の光延試薬、例えば、シアノメチレントリブチルホスホラン存在下、溶媒中加熱反応させることによって得ることができる。
溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは１，４−ジオキサン、もしくはＴＨＦを用いることができる。反応は５０〜１５０℃において、１〜２４時間加熱することで実施することができるが、例えば１００℃において３〜１６時間反応させることにより実施することができる。
Ｚ基導入剤は市販品として、または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
【００２４】
上述のカップリング反応を実施するにあたり、必要に応じて化合物（ＩＩ）のＱやＺ基導入剤に存在する官能基を有機合成化学で通常用いられる方法を適宜組み合わせて保護、脱保護することでも化合物（Ｉ）を製造することができる。例えば、水酸基やアミノ基の官能基の保護、脱保護［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］を用いることができる。
【００２５】
スキーム１の原料として用いられる化合物（ＩＩ）は、例えばスキーム２に表す方法によって製造することができる。
［スキーム２］
【化６】
0006492012.tif 000008
0006492012.tif 000009
【００２６】
化合物（ＩＩ）は、化合物（ＩＩＩ）と１〜５モル当量、好ましくは１〜１．５モル当量のアミン（Ｑ−ＮＨ２）を溶媒中、必要に応じて塩酸のような酸触媒存在下、加熱反応させることによって得ることができる。溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、低級アルコール、好ましくはエタノール、２−プロパノール、もしくは１−ブタノールを用いることができる。反応は８０〜１５０℃において、３〜２４時間加熱することで実施することができるが、例えば１００〜１１０℃において６〜１６時間反応させることにより得ることができる。
スキーム１の原料の一つであるアミン（Ｑ−ＮＨ２）は市販品（例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製品）として、または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
【００２７】
スキーム２の原料として用いられる化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ１及びＲ２が水素原子である化合物（ＩＩＩ-ａ）、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が臭素原子である化合物（ＩＩＩ-ｂ）は、例えばスキーム３に表す方法によって製造することができる。
［スキーム３］
【化７】
0006492012.tif 000010
【００２８】
化合物（ＩＩＩ-ａ）は、２−アミノ−３−メトキシ安息香酸（ＩＶ）を出発原料として製造することができる。すなわち、２−アミノ−３−メトキシ安息香酸（ＩＶ）と尿素を加熱反応させた化合物（Ｖ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン存在下、塩化ホスホリルで処理して化合物（ＶＩ）を得ることができる。得られた化合物（ＶＩ）を、水素雰囲気下、塩基性条件下でパラジウム−炭素と反応させることにより４位のクロロ基を選択的に除去し、得られた化合物（ＶＩＩ）を、三臭化ホウ素で処理することによって、化合物（ＩＩＩ-ａ）を製造することができる。
化合物（ＩＩＩ-ｂ）は、化合物（ＩＩＩ-ａ）を溶媒中、ジイソプロピルアミン存在下、Ｎ-ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）を反応させることにより得ることができる。
【００２９】
スキーム２の原料として用いられる化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ１が臭素原子、Ｒ２が水素原子である化合物（ＩＩＩ-ｃ）は、例えばスキーム４に表す方法によって製造することができる。
［スキーム４］
【化８】
0006492012.tif 000011
化合物（ＩＩＩ-ｃ）は、２−アミノ−３−メトキシ安息香酸（ＩＶ）を臭素でブロモ化し、得られた化合物（ＶＩＩＩ）のカルボン酸を、ボラン還元してアルコールに変換した後、再度アルデヒドに酸化した化合物（Ｘ）を、尿素と加熱反応させて化合物（ＸＩ）を得、次いで塩化ホスホリルで処理して化合物（ＸＩＩ）に変換、その後、三臭化ホウ素で処理することによって製造することができる。
【００３０】
スキーム２の原料として用いられる化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ１がフッ素原子、Ｒ２が水素原子である化合物（ＩＩＩ-ｄ）は、例えばスキーム５に表す方法によって製造することができる。
［スキーム５］
【化９】
0006492012.tif 000012
化合物（ＩＩＩ-ｄ）は、３−フルオロ−５−メトキシ安息香酸（ＸＩＩＩ）をニトロ化後、パラジウム−炭素で還元して得た化合物（ＸＶ）を、スキーム３と同様に処理することにより製造できる。
【００３１】
スキーム２の原料として用いられる化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がメチル基である化合物（ＩＩＩ-ｅ）は、例えばスキーム６に表す方法によって製造することができる。
［スキーム６］
【化１０】
0006492012.tif 000013
【００３２】
化合物（ＩＩＩ-ｅ）は、３−アミノ−４−メチル安息香酸（ＸＩＸ）をアセチル化し、続いてニトロ化して得た化合物（ＸＸ）を、水酸化カリウムで処理し得られたフェノール体をメチル化し、さらにパラジウム−炭素で還元して合成した化合物（ＸＸＩＩ）を、スキーム３と同様に処理することにより製造できる。
なお、上記の方法を適宜組み合わせ、有機合成化学で通常用いられる方法（例えば、アミノ基のアルキル化反応、アルキルチオ基をスルホキシド基もしくはスルホン基へ酸化する反応、アルコキシ基をヒドロキシル基、もしくはその逆へ変換する反応）を実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する本発明の化合物（Ｉ）を得ることができる。
【００３３】
［本発明の化合物（Ｉ）の用途］
本発明の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、経口投与、非経口投与または局所的投与に適した従来の薬学製剤（医薬組成物）の形態に調製することができる。
経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、およびシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒または粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、本発明の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩を溶解または懸濁することによって調製することができる。
【００３４】
非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ−オキシ安息香酸メチル）中に適宜組み入れることができる。
【００３５】
本発明の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩の用量は、疾患の重症度、患者の年齢および体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路または非経口経路によって、１回、または２回もしくは３回に分割して投与することができる。
また、本発明の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害剤として、実験用、研究用の試薬として用いることもできる。
また、本発明の化合物（Ｉ）を放射性標識した化合物は、ＰＥＴ用分子プローブとしても用いることもできる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例および試験例などを挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
化合物の同定は水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ）およびマススペクトル（ＭＳ）により行った。1Ｈ−ＮＭＲは、特に指示のないかぎりは４００ＭＨｚで測定されたものであり、また化合物および測定条件によっては交換性水素が明瞭に観測されない場合がある。なお、ｂｒ．は幅広いシグナル（ブロード）を意味する。
ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーは、市販のＯＤＳカラムを用い、特に記載のない限りは水／メタノール（ギ酸を含む）を溶出液としてグラジェントモードにて分取した。【００３７】
参考例１
２−クロロキナゾリン−８−オールの製造
【化１１】
0006492012.tif 000014
２−クロロ−８−メトキシキナゾリン（８．８５ｇ，４５．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（９１ｍＬ）に氷冷下、三臭化ホウ素（１Ｍ／ＤＣＭ、１００ｍＬ）を滴下したのち、混合物を室温で１６時間攪拌した。反応混合物を−５℃に冷却して析出した固体を濾取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄して、２−クロロキナゾリン−８−オールの粗生成物を５．８４ｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm)： 10.58 (s, 1H), 9.53 (s, 1H), 7.6-7.65 (m, 2H), 7.36-7.42 (m, 1H); 
ＬＣ−ＭＳ(m/z) 181.0 [M+H]+.【００３８】
参考例２
ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシシクロヘキシル メタンスルホネートの製造
【化１２】
0006492012.tif 000015
(第１工程)
ｔｒａｎｓ−シクロヘキサン−１，４−ジオール（５．００ｇ，４３．０ｍｍｏｌ）及び4-ジメチルアミノピリジン（０．２７ｇ，２．２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４５ｍＬ）に、氷冷下でトリエチルアミン（６ｍＬ，４３．０ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（６．４９ｇ，４３．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２５分間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈したのち、水で２回洗浄して得られた有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去して得られた残渣を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシシクロヘキサノール（５．３２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm)： 4.45 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.54-3.66 (m, 1H), 3.36-3.46 (m, 1H), 1.7-1.8 (m, 4H), 1.12-1.3 (m, 4H), 0.84 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).【００３９】
(第２工程)
ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシシクロヘキサノール（５．３２ｇ，２３．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．８５ｍＬ，２７．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液 （７７ｍＬ）に、氷冷下で、塩化メタンスルホニル（１．９７ｍＬ，２５．４ｍｍｏｌ）を滴下したのち、室温で１６時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止したのち、反応混合物をクロロホルムで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、標記化合物（６．７１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm): 4.6-4.7 (m, 1H), 3.7-3.8 (m, 1H), 3.16 (s, 3H), 1.92-2.0 (m, 2H), 1.7-1.8 (m, 2H), 1.5-1.65 (m, 2H), 1.32-1.45 (m, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.04 (s, 6H).【００４０】
実施例１
ｃｉｓ−４−（｛２−［（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）アミノ］キナゾリン−８−イル｝オキシ）シクロヘキサノールの製造
【化１３】
0006492012.tif 000016
【００４１】
（第１工程）
参考例１の化合物（０．９７ｇ，５．２６ｍｍｏｌ）及び１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−アミン（０．７０ｇ，５．２６ｍｍｏｌ）の２−プロパノール溶液（１５ｍＬ）を、１００−１１０℃で１６時間攪拌した。室温まで冷却後、析出した固体を濾取し、２−プロパノールで洗浄後、乾燥させて、２−［（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）アミノ］キナゾリン−８−オール（１．０７ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm): 10.31 (s, 1H), 9.6-9.75 (br, 1H), 9.50 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.98 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 9.0, 1.7 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.2-7.35 (m, 2H); 
ＬＣ−ＭＳ(m/z) 278.2 [M+H]+.【００４２】
(第２工程)
２−［（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）アミノ］キナゾリン−８−オール(１．５０ｇ，５．４１ｍｍｏｌ)及び参考例２の化合物（２．５０ｇ, ８．１２ｍｍｏｌ)のＤＭＳＯ懸濁液（４０ｍＬ)に炭酸セシウム（５．４５ｇ，１６．７８ｍｍｏｌ）を加えたのち、１３０℃で１時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）およびＴＨＦ（５０ｍＬ）で希釈し、続いて氷水（２５ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、Ｎ−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）−８−（｛ｃｉｓ−４−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル)オキシ）クロヘキシル］オキシ｝キナゾリン−２−アミン（１．１６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm)： 11.99-12.32 (m, 1H), 9.72-9.90 (m, 1H), 9.16-9.31 (m, 1H), 8.28-8.37 (m, 1H), 7.99-8.18 (m, 2H), 7.38-7.63 (m, 2H), 7.30-7.38 (m, 1H), 7.16-7.30 (m, 1H), 4.76 (br, 1H), 3.84 (br, 1H), 1.92-2.07 (m, 2H), 1.67-1.91 (m, 4H), 1.56-1.67 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.06 (s, 6H)； 
ＬＣ−ＭＳ(m/z) 490.2 [M+H]+.【００４３】
（第３工程）
Ｎ−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）−８−（｛cis−４−［（tert−ブチルジメチルシリ）ル］オキシ｝シクロヘキシル）オキシ）キナゾリン−２−アミン（４．０ｇ，８．１８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（２０ｍＬ）に、０℃で４Ｎ−ＨＣｌ／１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）を加えた後、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去して得られた残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾取し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で洗浄後、乾燥して、標記化合物（２．０ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm)： 12.29-12.54 (m, 1H), 9.73-10.0 (m, 1H), 9.15-9.3 (m, 1H), 8.65-9.11 (m, 1H), 7.98-8.27 (m, 1H), 7.52-7.69 (m, 2H), 7.4-7.52 (m, 1H), 7.36 (dd, J = 7.9, 1.2 Hz, 1H), 7.26 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 5.51-5.9 (m, 1H), 4.88 (s, 1H), 3.45-3.85 (m, 1H), 1.82-2.13 (m, 4H), 1.49-1.85 (m, 4H)； 
ＬＣ−ＭＳ(m/z) 376.2 [M+H]+.【００４４】
実施例２〜４６
以下の実施例化合物［表１］は、それぞれ対応する原料（市販品、または市販化合物から公知の方法もしくはそれに準じた方法により誘導体化した化合物）を用い、上述の実施例記載の方法に従い、必要に応じて、有機合成化学で通常用いられる方法を適宜組み合わせて製造した。【００４５】
また、各々の化合物の物理化学データを［表２］に示した。
【表１】
0006492012.tif 000017
0006492012.tif 000018
0006492012.tif 000019
0006492012.tif 000020
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0006492012.tif 000023
0006492012.tif 000024
【表２】
0006492012.tif 000025
0006492012.tif 000026
0006492012.tif 000027
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実施例４７
ｃｉｓ−４−（｛２−［（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）アミノ］キナゾリン−８−イル｝オキシ）シクロヘキサノール塩酸塩の製造
【化１４】
0006492012.tif 000034
実施例１の化合物（１９．３ｇ，５１．４ｍｍｏｌ）に０．２Ｍ塩酸−エタノール（２７３ｍL，５１．４ｍｍｏｌ）を加えて、３５〜５０℃で２４時間撹拌した。室温まで冷却後、析出物を濾取し、少量のエタノールで洗浄し、乾燥して、標記化合物（１８．０ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6) δ(ppm): 10.34 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 9.33 (s, 1H), 8.91 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 9.1, 1.9 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.0, 1.2Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.0, 0.9 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.78 - 4.95 (m, 1H), 3.69 - 3.85 (m, 1H), 1.96 - 2.11 (m, 2H), 1.81 - 1.96 (m, 2H), 1.60 - 1.83 (m, 4H)； LC-MS (m/z) 376.0 [M+H]+；融点 241.6℃ (onset)．
【００４６】
試験例１  Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルの阻害活性評価
本発明の化合物のＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害活性の評価は、Ｗｎｔ３ａリガンドによって活性化されるＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路に対する本発明の化合物の阻害活性を、市販のＴＣＦ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイシステムを用いて評価した。
（使用する細胞の培養）
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ社Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）は、Ｔ７５フラスコ中、１０％ＦＢＳ（ＡｕｓＧｅｎｅ社）および１％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加したＤＭＥＭ培地（ナカライ社Ｎｏ．０８４５９−３５）を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。【００４７】
（レポータージーンのトランスフェクションおよび被験化合物の添加）
培養したＨＥＫ２９３細胞を細胞密度２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、１０％ＦＢＳのみを添加したＤＭＥＭ培地で希釈して、９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社  ＶｉｅｗＰｌａｔｅ  Ｎｏ．６００５１８１）の各ウェルに１００μＬずつ播種後、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏ．１１０５８）に、ｐＧＬ４．４９［ｌｕｃ２Ｐ／ＴＣＦ−ＬＥＦ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ]プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏ．Ｅ２６９１）を各々１μｇ／ｍＬおよび３μＬ／ｍＬになるように添加して、試薬添付プロトコール通りにトランスフェクション溶液を作成した。一晩培養したＨＥＫ２９３細胞の各ウェルに、トランスフェクション溶液を１００μＬずつ静かに添加し５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養してトランスフェクションを行った。
ＤＭＥＭ培地に、０．５％  Ｃｈａｒｃｏａｌ／ｄｅｘｔｒａｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｏ．ＳＨ３００６８．０２）及びＬｉＣｌ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｎｏ．Ｌ９６５０）を加え、ＬｉＣｌ含有培地（ＬｉＣｌの最終濃度１０ｍＭ）を作成した。一晩培養してレポータージーンをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の各ウェルの培地をデカンテーションで除き、各ウェルにＬｉＣｌ含有培地（９０μＬ）を静かに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。【００４８】
試験濃度の１０倍になるように、被験化合物のＤＭＳＯストック溶液をＬｉＣｌ含有培地で１００倍希釈して被験化合物溶液を作成した。また、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｗｎｔ−３ａ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃１３２４−ＷＮ）を４０μｇ／ｍＬとなるように０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に溶解し、さらにＬｉＣｌ含有培地で１００ｎｇ／ｍＬに希釈して、Ｗｎｔ−３ａ溶液を作成した。ＬｉＣｌ含有培地で一晩培養した上記ＨＥＫ２９３細胞の各ウェルに、被験化合物溶液を１０μLずつ添加して、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間培養したのち（被験化合物の最終濃度３〜０．０３μＭ）、各ウェルにＷｎｔ３ａ溶液を１０μＬずつ添加して、さらに５時間培養した。【００４９】
（ルシフェラーゼ活性の測定）
ＯＮＥ-ＧｌｏTM  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏ．Ｅ６１１０）を用い、マイクロプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＨ１、ＢｉｏＴｅｋ社）で各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。化合物非添加かつＷｎｔ３ａ刺激群の発光強度を１００％、化合物非添加かつＷｎｔ３ａ無刺激群の発光強度を０％として、各化合物濃度における発光強度からＩＣ５０値を求めた。【００５０】
（評価結果）
本発明化合物は、ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにおいて、強い阻害活性を示した。本発明の代表化合物のＴＣＦ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにおける阻害活性を表３に示す。ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポータージーンアッセイでの阻害作用は、ＩＣ５０値が、０．３μＭ未満を＊＊＊印、０．３μＭ以上１μＭ未満を＊＊印、１μＭ以上３μＭ未満を＊印で示した。
【表３】
0006492012.tif 000035
この結果は、本発明の化合物（Ｉ）が、強いＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害活性を有することを示している。【００５１】
試験例２  Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル下流遺伝子の発現量変化の検討
本発明の化合物のＷｎｔ／β-カテニンシグナル活性に及ぼす作用を、リアルタイムＰＣＲ法を用い、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル伝達経路の標的遺伝子の発現量変化を指標に検討した。
（使用する細胞の培養）
ＲＰＭＩ−１６４０培地（ナカライ社）に、１０％ＦＢＳ（ＡｕｓＧｅｎｅ社）および１％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加して、細胞培養培地を調整した（以降、培地１）。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ社Ｎｏ．ＣＣＬ−２４７）を、Ｔ７５フラスコ中、培地１を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。【００５２】
（被験化合物の添加）
培養したＨＣＴ１１６細胞を細胞密度１．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、培地１で希釈して、Ｔ７５フラスコに１３．５ｍＬ播種後、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、この細胞溶液に、被験化合物の１０及び３ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液を培地１で１００倍希釈した被験化合物溶液を１．５ｍＬ添加した（被験化合物の最終濃度：１０および３μＭ）。その後、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出および逆転写反応液の調整）
培養上清を遠心操作して、浮遊している細胞をペレットとして回収した。このペレットおよびＴ７５フラスコ内に付着した細胞を合わせ、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｏ．７４１３４）およびＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｏ．７９６５４）を用い、キット添付のプロトコールに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。微量分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｎｏ．ＮＤ−１０００）によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度を測定し、１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｒ）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社  Ｎｏ．ＦＳＱ−２０１）を用いて、試薬添付プロトコールに従って逆転写反応を行い、逆転写反応液を調整した。
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によるＷｎｔシグナル下流遺伝子の定量）【００５３】
１μＬの逆転写反応液に、１０μＬのＴａｑＭａｎ(Ｒ)  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｏ．４３０４４３７）及び１μＬの遺伝子ごとのＴａｑＭａｎ（Ｒ）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（下記表４参照）、滅菌水（８μＬ）を加えて２０μＬとし、リアルタイムサーマルサイクラー（ＰＲＩＳＭ  ７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９６ウェルプレートを用い、５０℃で２分間、さらに９５℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の加温を１サイクルとして、４０サイクル繰り返した。結果は、内在性コントロール遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）に対する標的遺伝子の発現の比として、ＤＭＳＯ群を基準として比較Ｃｔ法で算出した。【００５４】
【表４】
0006492012.tif 000036
図１および図２に示す通り、実施例１の化合物は、ＨＣＴ１１６細胞において、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルの標的遺伝子であるＡＸＩＮ２及びｃ−ＭＹＣの発現を濃度依存的に抑制した。以上のことから、本発明化合物によるＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路の活性抑制が標的遺伝子の発現レベルで確認できた。【００５５】
試験例３  Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル伝達経路の標的タンパク質の発現量変化の検討
本発明の化合物のＷｎｔ／β-カテニンシグナル活性に及ぼす作用を、ウェスタンブロッティング法を用い、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル伝達経路の標的タンパク質の発現量変化を指標に検討した。
（被験化合物の添加）
試験例２と同様な方法で培養したＨＣＴ１１６細胞を細胞密度５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、培地１で希釈して、Ｔ２５フラスコに５ｍＬ播種後、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、被験化合物の１０および３ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液を培地１で１００倍希釈した被験化合物溶液を、最終溶液量の１／１０量になるようにフラスコに添加した（被験化合物の最終濃度：１０および３μＭ）。その後、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。【００５６】
（タンパク質の抽出）
培養上清を遠心操作して、浮遊している細胞をペレットとして細胞を回収した。フラスコに接着している細胞は、氷冷したＰＢＳ中でラバーポリスマンを用いて丁寧に剥がし取り、遠心操作してペレットとして回収した。これらのペレットを合わせ、氷冷したＰＢＳで２回洗浄後、Ｌｙｓｉｓバッファー[Ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（アクティブ・モティフ社  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｏ−ＩＰ  Ｋｉｔ  ＃５４００２）に、５％Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（同上）、１％Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（同上）および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加したもの］を５０μＬ添加し、軽く攪拌したのち３０分間氷上に静置した。遠心操作（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）により上清を回収し、タンパク質量を定量した。この上清から５０μｇのタンパク質量に相当する量を測りとり、ＳＤＳ−サンプルバッファーと混合後、９５℃で５分間反応させてタンパク質を変性させて、サンプル溶液とした。４−２０％のグラジエントアクリルアミドゲル（コスモバイオ社、Ｎｏ．４１４８７９）の各ウェルにサンプル溶液をアプライし、電気泳動を行った。その後、ｉＢｌｏｔゲルトランスファーシステム（ライフテクノロジーズ社）を用いてＰＶＤＦ膜にゲル中のタンパク質を転写した。【００５７】
（ＡＸＩＮ２、ｃ−ＭＹＣおよびβ−Ａｃｔｉｎの検出）
転写したＰＶＤＦ膜を２％ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社）でブロッキング処理した後、一次抗体として抗ＡＸＩＮ２ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｎｏ．２１５１）、抗ｃ−ＭＹＣウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｎｏ．５６０５）もしくは抗β−Ａｃｔｉｎマウス抗体（ａｂｃａｍ社、Ｎｏ．ａｂ６２７６）を用い、４℃で１晩反応させた。未反応の一次抗体をＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、二次抗体としてＨＲＰラベルした抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、Ｎｏ．ｓｃ２００４）あるいは抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＺＹＭＥＤ社、Ｎｏ．６２−６５２０）を用い、２％ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加したＴＢＳＴバッファー中で、室温で１時間反応させた。未反応の二次抗体をＴＢＳＴバッファーで洗浄後、Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライ社）を用いて添付のプロトコールどおりに反応させた後、ＣＣＤカメラ（ＧＥヘルスケア社、  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００）を用いて、それぞれのバンドを化学発光で検出した。検出されたバンドをデンシトメトリー（ＧＥヘルスケア社、  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ８．１．０．０）により数値化し、ＤＭＳＯ添加群のバンドの発光を１００％として、各群におけるバンドの強度から阻害率を算出した。なお、それぞれのバンドは、β−Ａｃｔｉｎのバンド強度により補正を行なった。【００５８】
本試験で用いた一次抗体と二次抗体の組み合わせおよび希釈濃度は表５の通りである。
【表５】
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【００５９】
図３及び表６に示す通り、実施例１の化合物は、ＨＣＴ１１６細胞において、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルの標的タンパク質であるＡＸＩＮ２およびｃ−ＭＹＣの発現を濃度依存的に抑制した。以上のことから、本発明化合物によるＷｎｔ／β-カテニンシグナル経路の活性抑制が標的タンパク質の発現レベルで確認できた。
【表６】
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【００６０】
試験例４  ヒト由来がん細胞株のヌードマウス皮下移植モデルにおける抗腫瘍効果
本発明化合物の抗腫瘍効果を、Ｗｎｔシグナル伝達経路が恒常的に活性化されている、ヒト由来大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６のヌードマウス皮下移植モデルを用いて検討した。
（担癌モデルの作製）
試験例２と同様に培養したＨＣＴ１１６細胞を細胞密度７．５×１０７個／ｍＬになるようにＤ−ＰＢＳ（ナカライテスク社）で調整し、その細胞懸濁液を１５ｍＬチューブ中で氷冷した。この細胞懸濁液に、細胞懸濁液の１／４量のマトリゲル（ＢＤ社）を加え、移植用細胞調製液を作製した。この移植用細胞調製液０．１ｍＬを、ＢＡＬＢ／ｃ Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（雌、８週齢、日本エスエルシー社）の背部皮下に注射した。がん細胞を移植してから７日目に担癌マウスの腫瘍体積（下記計算式参照）の平均値が近似するように群分けを行った。【００６１】
（被験物質の投与用試料溶液の調製）
被験物質の投与用試料溶液は、各投与用量に合わせて、８ｍｇ／ｍＬと４ｍｇ／ｍＬの２種類の溶液を調製した。被験物質（５１２ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（６．４ｍＬ，ナカライテスク社）に溶解させ、次いでポリエチレングリコール＃４００（２８．８ｍＬ，ナカライテスク社）を加えて被験物質の保存液を作成し、使用当日まで遮光保存した。使用当日に保存液５．５ｍＬをチューブに移し、３０％（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）-β-ｃｙｃｌoｄｅｘｔｒｉｎ（ＨＰ−β−ＣＤ）水溶液(シグマアルドリッチ社)を４．５ｍＬ加えて、８ｍｇ/ｍＬの投与用試料溶液を作製した。この溶液を、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール＃４００および３０％ＨＰ−β−ＣＤ水溶液の混合液（１：４．５：４．５）で２倍希釈して、４ｍｇ／ｍＬの投与用試料溶液を作製した。【００６２】
（被験物質の抗腫瘍効果試験）
がん細胞を移植した各マウス（各群９匹）に、それぞれの当日の体重から求めた投与量の被験物質を、１日２回（６時間間隔以上）、計１４日間の強制経口投与を行なった。各マウスの腫瘍体積を以下の式を用いて算出し、相対腫瘍体積比を指標として抗腫瘍効果を評価した。
【数１】
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図４に示すように、本発明化合物である実施例１の化合物は、用量依存的に有意な腫瘍増殖抑制を示し、最終投与日のＴＧＩ％は、４０ｍｇ／ｋｇにおいて４２％、８０ｍｇ／ｋｇにおいて７０％であった。このことから、本発明化合物がＷｎｔシグナル経路の活性を抑制し、Ｗｎｔシグナルが恒常的に活性化されている癌の治療において有用であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により提供される化合物は、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を介した異常な細胞応答に関連していることが知られている疾患、特にがんの治療に有用であり、また、がん幹細胞を標的とした腫瘍の転移及び再発予防にも有用である。また、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路阻害剤として、実験用、研究用の試薬に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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