(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアが封入され、負の表面電位を付されたＧＵＶと、細胞と、の混合液に交流電場を印加して、前記ＧＵＶと前記細胞とを配列させる交流電場印加手順と、
前記混合液に直流パルス電場を印加して、前記ＧＵＶの膜と前記細胞の膜とを少なくとも一部融合させる直流電場印加手順と、含む、
細胞内へのミトコンドリア導入方法。
【請求項２】
前記細胞が由来する種と、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが由来する種が異なる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記交流電場印加手順の前に、
前記細胞内に発現させた制限酵素により前記細胞内の内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断するミトコンドリア除去手順をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記制限酵素は、前記細胞内の内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断するが、前記ＧＵＶに封入される外因性ミトコンドリアＤＮＡを切断しない、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が由来する種がマウスであり、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが由来する種がヒトであり、前記制限酵素はＡｇｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒｄＩ、ＰｓｈＡＩ及びＳｅｘＡＩからなる群から選択されるいずれか一以上の制限酵素である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ミトコンドリア除去手順において、前記制限酵素をコードする配列とミトコンドリア移行配列とを含む発現コンストラクトを前記細胞にトランスフェクションする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記内因性ミトコンドリア除去手順後の前記細胞をウリジンとピルビン酸の存在下で培養する手順と、
前記直流電場印加手順後の前記細胞をウリジンとピルビン酸の非存在下で培養する手順とをさらに含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝的に正常であり、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが遺伝子変異を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項２〜８に記載のいずれか一項に記載の方法により、細胞内に、該細胞が由来する種と異なる種のミトコンドリアを導入する工程を含む、他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項２〜８に記載のいずれか一項に記載の方法により、胚性幹細胞内に、該細胞が由来する種と異なる種のミトコンドリアを導入する工程と、
前記胚性幹細胞から個体を発生させる工程と、を含む、
他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された非ヒト動物の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝子変異を有し、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが遺伝的に正常である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法により、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを含む細胞内に、遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入する工程を含む、正常ミトコンドリアが導入された細胞の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法により、ミトコンドリア病患者由来の、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを含む細胞内に、遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入する工程を含む、正常ミトコンドリアが導入された細胞を含有するミトコンドリア病治療用細胞組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内へのミトコンドリア導入方法、外因性ミトコンドリアが導入された細胞及び動物の製造方法等に関する。より詳しくは、巨大単層膜リポソーム（Giant Unilamellar Liposome）を用いて、細胞に内在するミトコンドリア（内因性ミトコンドリア）とは遺伝的に異なる外来のミトコンドリア（外因性ミトコンドリア）を導入する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の生命活動に必要不可欠なＡＴＰを作り出すミトコンドリアには核ＤＮＡとは全く異なる独自のミトコンドリアＤＮＡ(mtDNA)が存在する。一細胞内に多コピー存在するｍｔＤＮＡは２つのｒＲＮＡ、２２種類のｔＲＮＡ、呼吸鎖酵素複合体の１３種類のサブユニットをコードしている。
【０００３】
細胞内における病原性突然変異型ｍｔＤＮＡの蓄積が呼吸機能欠損を引き起こす。個体レベルにおいての影響としてはミトコンドリア病と呼ばれる複合症を引き起こすことが知られ、さらに神経変性疾患、糖尿病、難聴などの病気と関与している可能性が示唆されている。しかし、同一の病原性突然変異型ｍｔＤＮＡが蓄積しても病状が多様であるなど詳しい発症メカニズムは解明されていない。
【０００４】
ミトコンドリアの構造は微小であり二重膜を持つ。そのため、外因性のｍｔＤＮＡを人為的にミトコンドリア内に導入することは非常に困難であり、核ゲノムで行われているようなＤＮＡ組換えの技術はミトコンドリアにおいては確立されていない。ミトコンドリア病の発症機構の解明、治療法の探索のために、外因性のミトコンドリアそのものを細胞内へ導入する手法の開発が求められる。
【０００５】
非特許文献１には、異種間又は同種間の２種類の細胞を用い、一方の細胞から内因性のミトコンドリアを除去し、他方の細胞から核を除去した上で両細胞を融合し、内因性ミトコンドリアが外因性ミトコンドリアで置換された細胞（サイブリッド細胞）を作成することが記載されている（図１参照）。
【０００６】
巨大単層膜リポソーム（Giant Unilamellar LiposomeあるいはGiant Unilamellar Vesicle、以下「ＧＵＶ」と称する）は、脂質二重膜（lipid bilayer）が水溶液中で自然に閉じてできる人工膜小胞（liposome又はvesicle）であって、直径がマイクロメートルオーダー以上のものをいう（非特許文献２，３参照）。ＧＵＶは、細胞と同程度の大きさであり、位相差、蛍光、微分干渉、暗視野などの種々の光学顕微鏡法で直接観察ができる利点を持つ。ＧＵＶは、生体膜の形態形成や動態制御の機構をインビトロの系で研究する際、膜のモデルとして用いられてきている。
【０００７】
非特許文献４には、細胞の長期凍結・乾燥保存を目的として、膜非透過性の凍結・乾燥保護物質（トレハロースなどの糖類）を含むＧＵＶを細胞と電気融合させることで凍結・乾燥保護物質を細胞内に導入することが記載されている。当該文献は、トレハロース等の糖類に比してサイズが大きいミトコンドリア等の細胞内小器官（オルガネラ）を細胞内に導入すること及びそのためのＧＵＶの調製方法や電気融合条件等については記載していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Animal Biotechnology, 2014, 25, 139-149
【非特許文献２】Nature, 1991, 349, 475-481
【非特許文献３】Biosystems, 2003, 71, 93-100
【非特許文献４】Cryobiology, 2006, 53(3), 397
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞に内在するミトコンドリア（内因性ミトコンドリア）とは遺伝的に異なる外来のミトコンドリア（外因性ミトコンドリア）を細胞内に導入するための新たな技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［２５］を提供する。
［１］  ミトコンドリアが封入され、負の表面電位を付されたＧＵＶと、細胞と、の混合液に交流電場を印加して、前記ＧＵＶと前記細胞とを配列させる交流電場印加手順と、
前記混合液に直流パルス電場を印加して、前記ＧＵＶの膜と前記細胞の膜とを少なくとも一部融合させる直流電場印加手順と、含む、
細胞内へのミトコンドリア導入方法。
［２］  前記細胞が由来する種と、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが由来する種が異なる、［１］の方法。
［３］  前記交流電場印加手順の前に、
前記細胞内に発現させた制限酵素により前記細胞内の内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断するミトコンドリア除去手順をさらに含む、［２］の方法。
［４］  前記制限酵素は、前記細胞内の内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断するが、前記ＧＵＶに封入される外因性ミトコンドリアＤＮＡを切断しない、［３］の方法。
［５］  前記細胞が由来する種がマウスであり、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが由来する種がヒトであり、前記制限酵素はＡｇｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒｄＩ、ＰｓｈＡＩ及びＳｅｘＡＩからなる群から選択されるいずれか一以上の制限酵素である、［４］の方法。
［６］  前記ミトコンドリア除去手順において、前記制限酵素をコードする配列とミトコンドリア移行配列とを含む発現コンストラクトを前記細胞にトランスフェクションする、［３］〜［５］のいずれかの方法。
［７］  前記内因性ミトコンドリア除去手順後の前記細胞をウリジンとピルビン酸の存在下で培養する手順と、
前記直流電場印加手順後の前記細胞をウリジンとピルビン酸の非存在下で培養する手順とをさらに含む、［３］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝的に正常であり、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが遺伝子変異を有する、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］  前記ＧＵＶが−４０ｍＶ〜−２０ｍＶの表面電位を有する、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］  前記ＧＵＶの膜を構成する脂質全体に占めるコレステロールの割合が０〜１５モル％である、［１］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］  前記交流電場印加手順において、前記交流電場を５〜１５Ｖ／ｍｍで、１０〜６０秒印加し、前記直流電場印加手順において、前記直流パルス電場を１００〜１７５Ｖ／ｍｍで、３０〜５０マイクロ秒印加する、［１］〜［１０］のいずれかの方法。
【００１１】
［１２］  ［２］〜［１０］のいずれかの方法により、細胞内に、該細胞が由来する種と異なる種のミトコンドリアを導入する工程を含む、他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された細胞の製造方法。
【００１２】
［１３］  他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された細胞。
［１４］  前記細胞内の内因性ミトコンドリアを有さない、［１３］の細胞。
［１５］  前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝的に正常であり、前記外因性ミトコンドリアが遺伝子変異を有する、ミトコンドリア病モデル細胞である、請求項［１３］又［１４］記載の細胞。
【００１３】
［１６］  ［２］〜［１０］のいずれかの方法により、胚性幹細胞内に、該細胞が由来する種と異なる種のミトコンドリアを導入する工程と、
前記胚性幹細胞から個体を発生させる工程と、を含む、
他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された非ヒト動物の製造方法。
【００１４】
［１７］  他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された非ヒト動物。
［１８］  前記動物由来の内因性ミトコンドリアを有さない、［１７］の非ヒト動物。
［１９］  前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝的に正常であり、前記外因性ミトコンドリアが遺伝子変異を有する、ミトコンドリア病モデル動物である、［１７］又は［１８］の動物。
【００１５】
［２０］  前記細胞内の内因性ミトコンドリアが遺伝子変異を有し、前記ＧＵＶに封入されるミトコンドリアが遺伝的に正常である、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［２１］  前記ＧＵＶが−４０ｍＶ〜−２０ｍＶの表面電位を有する、［２０］の方法。
［２２］  前記ＧＵＶの膜を構成する脂質全体に占めるコレステロールの割合が０〜１５モル％である、［２０］又は［２１］の方法。
［２３］  前記交流電場印加手順において、前記交流電場を５〜１５Ｖ／ｍｍで、１０〜６０秒印加し、前記直流電場印加手順において、前記直流パルス電場を１００〜１７５Ｖ／ｍｍで、３０〜５０マイクロ秒印加する、［２０］〜［２２］のいずれかの方法。
【００１６】
［２４］  ［２０］〜［２３］のいずれかの方法により、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを含む細胞内に、遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入する工程を含む、正常ミトコンドリアが導入された細胞の製造方法。
【００１７】
［２５］  ［２０］〜［２３］のいずれかの方法により、ミトコンドリア病患者由来の、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを含む細胞内に、遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入する工程を含む、正常ミトコンドリアが導入された細胞を含有するミトコンドリア病治療用細胞組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、細胞に内在するミトコンドリア（内因性ミトコンドリア）とは遺伝的に異なる外来のミトコンドリア（外因性ミトコンドリア）を細胞内に導入するための新たな技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係るミトコンドリア導入方法におけるＧＵＶと細胞の電気融合の手順を説明する模式図である。
【図２−１】ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの塩基配列を示す図である。
【図２−２】ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの塩基配列を示す図である。
【図２−３】ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの塩基配列を示す図である。
【図２−４】ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの塩基配列を示す図である。
【図３】ＧＵＶとの電気融合により蛍光ビーズ（直径１μｍ）を導入した細胞の共焦点顕微鏡写真である。
【図４】サイズの異なる蛍光ビーズを封入したＧＵＶと電気融合させた細胞の共焦点顕微鏡写真である。
【図５】ＧＵＶとの電気融合によりＥＧＦＰ発現ベクターを導入した細胞の位相差顕微鏡写真及び共焦点顕微鏡写真である。
【図６】ＧＵＶとの電気融合によりＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉを導入した細胞の位相差顕微鏡写真及び共焦点顕微鏡写真である。
【図７】SHSY5Y細胞への蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）の導入率を計測した結果を示す図である。
【図８】SHSY5Y細胞への蛍光ミトコンドリア（Mito-DsRed）の導入率を計測した結果を示す図である。
【図９】SHSY5Y細胞への蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP及びMito-DsRed）の導入率を計測した結果を示す図である。
【図１０】制限酵素をコードする配列とミトコンドリア移行配列とを含む発現コンストラクトの具体例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２１】
１．細胞内へのミトコンドリア導入方法
本発明に係る細胞内へのミトコンドリア導入方法は、以下の手順２、３を含み、場合によって手順１、４を含んでいてもよい。
手順１：手順２の前に、細胞内に発現させた制限酵素により前記細胞内の内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断する手順（ミトコンドリア除去手順）。
手順２：ミトコンドリアが封入され、負の表面電位を付されたＧＵＶと、細胞と、の混合液に交流電場を印加して、前記ＧＵＶと前記細胞とを配列させる手順（交流電場印加手順）。
手順３：前記混合液に直流パルス電場を印加して、前記ＧＵＶの膜と前記細胞の膜とを少なくとも一部融合させる手順（直流電場印加手順）。
手順４：手順３の後に、前記混合液に交流電場を印加して、前記ＧＵＶの膜と前記細胞の膜との融合状態を維持する手順。
【００２２】
（１）交流電場印加手順
本手順では、ミトコンドリアが封入され、負の表面電位を付されたＧＵＶと、細胞と、の混合液に交流電場を印加して、ＧＵＶと細胞とを配列させる。
【００２３】
ミトコンドリアが封入され、負の表面電位を付されたＧＵＶは以下のようにして製造することができる。
【００２４】
（１−１）ＧＵＶ及びその製造方法
【００２５】
ＧＵＶの製造は、文献公知の静置水和法、エレクトロフォーメーション法及び界面通過法などの手法あるいはこれらの改良手法によって行うことができる。静置水和法は、試験管内に作製したリン脂質を主成分とする脂質フィルムに水溶液を加え静置してＧＵＶを作製する方法である（J. Mol. Biol., 1999, 287, 293-300; J. Mol. Biol., 1998, 284, 1671-1681; Curr. Biol., 2009, 19, 140-145）。エレクトロフォーメーション法は、白金や透明導電ガラス（ＩＴＯガラスなど）の表面にリン脂質を主成分とする脂質を塗布しておき、水溶液中で交流電圧を印加してＧＵＶを作製する方法である（Nature, 2010, 464, 864-869）。界面通過法は、油水界面にできる脂質の単層の膜（lipid monolayer）を利用してＧＵＶを作製する方法である（Langmuir, 2011, 27, 11528-11535; Method Enzymol., 2009, 464, 31-53）。
【００２６】
ＧＵＶの製造に用いられる脂質を列挙すれば、リン脂質、コレステロール、合成脂質などが挙げられる。
【００２７】
リン脂質としてグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリホボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセド、ジガラクトシルジグリセド、ガラクトシルジグリセド及びジクリコシルジグリセド等を挙げることができる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレフブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等を挙げることができる。
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチシジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質等の天然または合成のリン脂質を挙げることができる。
【００２８】
上記ホスファチジルコリンとしては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトオレオイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。
上記ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
上記ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、パルミトオレオイルホスファチジルセリン及びジステアロイルホスファチジルセリン等を挙げることができる。
上記ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、パルミトオレオイルホスファチジルグリセロール及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等を挙げることができる。
上記ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、パルミトオレオイルホスファチジルイノシトール及びジステアロイルホスファチジルイノシトール等を挙げることができる。
【００２９】
合成脂質としては，例えば、アルキル化アンモニウム塩を挙げることが出来る。アルキル化アンモニウム塩としては，ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジパルミチルアンモニウムブロミド、ジオクタデシルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド１水和物等を挙げることができる。
【００３０】
これらの脂質のうち、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシトールは形成されるＧＵＶに負の表面電位を付与し、アルキル化アンモニウム塩は正の表面電位を付与する。これら２群の脂質の比率を調整することで、所望の表面電位を有するＧＵＶを製造できる。ＧＵＶの表面電位は、好ましくは０ｍＶ未満であり、より好ましくは−２０ｍＶ以下であり、さらに好ましくは、−４０ｍＶ〜−２０ｍＶである。このような表面電位を与える脂質組成として、ジオレオイルホスファチジルコリン：ジオレオイルフォスファチジルグリセロール：コレステロール＝９：１：１（モル比）を例示できる。表面電位が高過ぎる場合、ＧＵＶと細胞との意図しない接着が生じ、ＧＵＶと細胞との電気融合が不能となったり、電気融合後にＧＵＶと細胞を分離できなくなったりする。また、表面電位が上記範囲よりも低過ぎる場合、ＧＵＶが不安定となる。
【００３１】
コレステロールとしては、コレステロール、ベーターコレステロール、ベーターシトステロール及びスティグマステロール等を挙げることができる。
【００３２】
脂質全体に占めるコレステロールの割合を調整することで所望の膜強度を有するＧＵＶを製造できる。脂質全体に占めるコレステロールの割合が大きい程膜強度は大きくなる。コレステロールの割合は、例えば０〜２０モル％、好ましくは０〜１５モル％、より好ましくは０〜１０モル％、さらに好ましくは０〜５モル％、最も好ましくは０モル％である。すなわち、ＧＵＶはコレステロールを含まない脂質からなることが最も好ましい。
【００３３】
ＧＵＶのサイズは、通常、直径でマイクロメートルオーダー以上とされる。ＧＵＶのサイズは、本発明においては、交流電場による細胞との配向の影響を考慮して、細胞と同程度のサイズとなる直径１０μｍ以上５０μｍ以下が好ましい。また、ＧＵＶのサイズは、導入される物体よりも充分に大きいことが望ましい。
【００３４】
（１−２）ミトコンドリア
ミトコンドリアの調製は、従来公知の手法によって溶解した細胞を分画化し、ミトコンドリア画分を得ることによって行うことができる。
【００３５】
細胞内に導入するミトコンドリアは、当該細胞とは遺伝的に異なるミトコンドリアであってよい。具体的には、細胞内に導入するミトコンドリアは、当該細胞が由来する生物種と同種の別個体に由来するものであってよく、異種に由来するものであってもよい。また、細胞内に導入するミトコンドリアは、当該細胞と同種類の細胞から抽出されたものであってよく、異種類の細胞から抽出されたものであってもよい。
【００３６】
本発明で用いるＧＵＶには、直径１００ｎｍ以上の大きさの物体を封入することが可能である。ミトコンドリアの大きさは、生物種や細胞種、細胞の状態によって変わるが、長軸長で２μｍ程度である。
【００３７】
（１−３）ＧＵＶ内へのミトコンドリアの封入
静置水和法、エレクトロフォーメーション法及び界面通過法などを用いてＧＵＶを製造する際に、物体を含んだ溶液又は分散液を用いることで、内部に物体を取り込んだＧＵＶを形成できる。誘電率の高い物体をＧＵＶ内に導入する場合には、エレクトロフォーメーション法以外の方法を用いることが好ましく、特に界面通過法を用いることが好ましい。
【００３８】
このようにして製造される本発明に係るＧＵＶは、好ましくは、ミトコンドリアを含み、−４０ｍＶ〜−２０ｍＶの表面電位を有し、膜を構成する脂質全体に占めるコレステロールの割合が０〜１５モル％とされたものである。
【００３９】
（１−４）交流電場印加
以上のようにして製造されたＧＵＶと、細胞と、の混合液に交流電場を印加することで、ＧＵＶと細胞とを配列させる。図１を参照して説明する。
【００４０】
ミトコンドリア２を封入したＧＵＶ１と、細胞３とを適当な緩衝液中で懸濁、混合する。緩衝液は、特に限定されないが、細胞内溶液と浸透圧が同等または近いものが望ましい。例えば、３００ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム及び０．１ｍＭ塩化マグネシウムの溶液が挙げられる（図（Ａ）参照）。
【００４１】
次に、ミトコンドリアを封入したＧＵＶ１と細胞３との混合液に交流電場を印加する（図（Ｂ）参照）。この手順は、一対の電極４，４間に混合液を導入して交流電場を印加することによって行うことができ、市販の細胞電気融合装置（電極及び電圧調整器等を含む）を用いて行うことができる。交流電圧としては、特に限定されないが、例えば５〜１５Ｖ／ｍｍ程度で１０〜６０秒程度とされる。交流電場を印加することによって、ＧＵＶ１と細胞３が電極４，４間に一列に配列し、互いに接触して数珠状（パールチェーン状）に連なった状態となる。
【００４２】
（２）直流電場印加手順
本手順では、混合液に直流パルス電場を印加して、ＧＵＶ１の膜と細胞３の膜とを少なくとも一部融合させる（図（Ｃ）参照）。直流パルス電圧の印加により、接触し合うＧＵＶ１の脂質膜と細胞３の細胞膜とが融合し、ＧＵＶ１内のミトコンドリア２が細胞３内に導入される（図（Ｄ）参照）。直流パルス電圧としては、特に限定されないが、例えば１００〜１７５Ｖ／ｍｍ程度で３０〜５０マイクロ秒程度とされる。
【００４３】
本手順の後に、混合液に交流電場を印加して、ＧＵＶ１の膜と細胞３の膜との融合状態を維持する手順を行ってもよい。この手順は、必要に応じて行われるものであるが、通常は省略でき、省略することが好ましい場合もある。交流電圧としては、特に限定されないが、例えば５〜３０Ｖ／ｍｍ程度で１０秒程度以下とされる。電気融合後、細胞３を洗浄してＧＵＶ１と分離させる。
【００４４】
本発明に係る細胞内へのミトコンドリア導入方法においては、以上の手順により、複雑な操作を要することなく、多数の生細胞（１０5個／ｍｌ程度）に同時にミトコンドリアを導入できる。
【００４５】
（３）ミトコンドリア除去手順
また、本発明に係る細胞内へのミトコンドリア導入方法において、内因性ミトコンドリアを予め除去しておくことで、内因性ミトコンドリアとは遺伝的に異なる外因性ミトコンドリアによって内因性ミトコンドリアを置換することもできる。これによって、内因性ミトコンドリアが外因性ミトコンドリアで置換された細胞を作成することが可能である。
【００４６】
内因性ミトコンドリアの除去は、交流電場印加手順の前に、細胞内に発現させた制限酵素により内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断することによって行うことができる。この際に用いる制限酵素は、内因性ミトコンドリアＤＮＡを切断するが、外因性ミトコンドリアＤＮＡを切断しないものとされる。
【００４７】
用いる制限酵素は、内因性ミトコンドリアの塩基配列及び外因性ミトコンドリアの塩基配列に応じて選択されるものであり、内因性ミトコンドリアの塩基配列内のみに認識配列を有するものとされる。
【００４８】
例えば、細胞が由来する種がマウスであり、ＧＵＶに封入される外因性ミトコンドリアが由来する種がヒトである場合、制限酵素としては、マウスミトコンドリアＤＮＡを切断するがヒトミトコンドリアＤＮＡを切断しない制限酵素が用いられる。具体的には、ＡｇｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｒｄＩ、ＰｓｈＡＩ及びＳｅｘＡＩからなる群から選択されるいずれか一以上の制限酵素を使用できる。
【００４９】
細胞内における制限酵素の発現は、制限酵素をコードする配列とミトコンドリア移行配列とを含む発現コンストラクト（発現ベクター）を細胞にトランスフェクションすることにより行うことができる。
【００５０】
発現コンストラクトの構築とトランスフェクションは従来公知の手法によって行えばよい。また、ミトコンドリア移行配列としては、ＡＴＰ５Ｂ（ATP synthase subunit beta, mitochondrial precursor）遺伝子の５’端領域の配列及び３’端領域の配列が公知であり、これに限られず、その他公知の配列を用いることができる。ヒトＡＴＰＢの５’非翻訳領域の塩基配列（配列番号１８４）と、３’非翻訳領域の塩基配列（配列番号１８５）を以下に示す。
【００５１】
ヒトＡＴＰ５Ｂ  ５’非翻訳領域
actgcagcgtaggcctcgcctcaacggcaggagagcaggcggctgcggttgctgcagccttcagtctccacccggactacgccATGTTGGGGTTTGTGGGTCGGGTGGCCGCTGCTCCGGCCTCCGGGGCCTTGCGGAGACTCACCCCTTCAGCGTCGCTGCCCCCAGCTCAGCTCTTACTGCGGGCCGCTCCGA
ヒトＡＴＰ５Ｂ  ３’非翻訳領域
TGAAGAGCATTCATCGTGAggggtctttgtcctctgtactgtctctctccttgcccctaacccaaaaagcttcatttttctgtgtaggctgcacaagagccttgattgaagatatattctttctgaacagtatttaaggtttccaataaaatgtacacccctcagaatttgtctgattctcttggttctgacaacatagtcaacact
（小文字は非翻訳領域、大文字はミトコンドリア局在シグナルのコード領域を表す）
【００５２】
また、ミトコンドリア移行配列として、ＡＴＰ５Ｂ遺伝子の５’端領域及び３’端領域の配列を用いた発現ベクターの具体例を図１０に示す。Ａは、プロモーター（CMVプロモーター）の下流に、ＡＴＰ５Ｂ遺伝子の５’端領域の配列、制限酵素遺伝子及びＡＴＰ５Ｂ遺伝子の３’端領域の配列をこの順番で挿入したベクターの構成を示す。Ｂは、プロモーターの下流に、ＡＴＰ５Ｂ遺伝子の５’端領域の配列、制限酵素遺伝子、２Ａ配列、ｅＧＦＰ遺伝子及びＡＴＰ５Ｂ遺伝子の３’端領域の配列をこの順番で挿入したベクターの構成を示す。このベクターは、「制限酵素−２Ａ−ＥＧＦＰ」の融合タンパクを発現するが、該融合タンパクは２Ａ配列で切断され、制限酵素とＥＧＦＰに分離される。
【００５３】
内因性ミトコンドリアが除去されたことを確認するため、本手順の後であってかつ交流電場印加手順の前に、細胞をウリジンとピルビン酸の非存在下で培養する手順を行ってもよい。ミトコンドリアが欠失した細胞は、ウリジンとピルビン酸の存在下では生存できるが、非存在下では生存できない。このため、ウリジンとピルビン酸の非存在下での培養により、内因性ミトコンドリアが除去された細胞のみを選択することが可能となる（EMBO reports, 2007, 8, 188-193参照）。
【００５４】
また、ミトコンドリア除去手順は、内因性ミトコンドリアの除去を完全なものとするため、交流電場印加手順の後あるいは直流電場印加手順の後にも行うことができる。
【００５５】
２．応用例
本発明に係る細胞内へのミトコンドリア導入方法によれば、上述の通り、内因性ミトコンドリアとは遺伝的に異なる外因性ミトコンドリアを細胞内に導入することができ、内因性ミトコンドリアが外因性ミトコンドリアで置換された細胞を製造できる。
【００５６】
従って、例えば、遺伝的に正常な内因性ミトコンドリアを有する細胞に、ＧＵＶを用いて遺伝子変異を有する外因性ミトコンドリアを導入すれば、ミトコンドリア病モデル細胞を製造することができる。
【００５７】
遺伝子変異を有する外因性ミトコンドリアを導入する細胞は、ミトコンドリア病モデル細胞となり得る体細胞に限られず、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。胚性幹細胞内に、該細胞が由来する種と異なる種のミトコンドリアを導入すれば、当該胚性幹細胞から個体を発生させることで、他種由来の外因性ミトコンドリアが導入された非ヒト動物を製造することができる。さらに、遺伝子変異を有する外因性ミトコンドリアを用いれば、ミトコンドリア病モデル動物を作出することができる。
【００５８】
あるいは、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを有する細胞に、ＧＵＶを用いて遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入することもできる。ミトコンドリア病患者由来の、遺伝子変異を有する内因性ミトコンドリアを含む細胞内に、遺伝的に正常な外因性ミトコンドリアを導入すれば、正常ミトコンドリアが導入された患者由来の細胞を製造することができ、ミトコンドリア病治療用の細胞組成物として利用できる。正常ミトコンドリアが封入されたＧＵＶと細胞とを含む細胞組成物も、ミトコンドリア病の治療用に利用できる。
【００５９】
例えば、ミトコンドリア病の一種であるＰｅａｒｓｏｎ病では、ミトコンドリアＤＮＡ異常のために貧血を主体とする汎血球減少症をきたすが、患者から分離した骨髄幹細胞、あるいは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導性多能性細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞から誘導して得た骨髄幹細胞に正常ミトコンドリアを導入し移植することで、根本的な治療が可能である。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１：細胞内への物体導入＞
１．ＧＵＶの調製
文献（PNAS, 2003, 100:10718-10721; J. Physical Chemistry B Lett., 2008, 112:14678-14681; PNAS, 2012, 109:5942-5947）記載の油中水型エマルション通過法に従って、ＧＵＶを作製した。ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）及びコレステロールをモル比９：１：１（合計１０５ｍｇ）でクロロホルム（１０５０μｌ）に溶解した。溶液をガラスチューブに移し、アルゴンガス雰囲気下での乾燥と真空乾燥を行った後、液体パラフィン（５００μｌ）と混合した。混合物を６０℃で６０分間超音波処理した。
【００６１】
蛍光ビーズ、ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉ又はプラスミドＤＮＡを内部溶液（９０ｍＭスクロース、２１０ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）と混合し、この内部溶液（５０μｌ）を上記脂質混合物に加えた。
【００６２】
蛍光ビーズには、直径０．２、０．５、１．０、２．０μｍのカルボン酸修飾されたＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標、Invitrogen）を用いた。プラスミドＤＮＡには、市販のキット（NucleoBond Xtra Midi plus kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.）を用いて作製したＥＧＦＰ発現ベクターを用いた。細断された矩形のＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉ（６０ｎｍ×９０ｎｍ）を、ソフトウェア（caDNAno）を用いて設計した。図２に、ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの塩基配列（配列番号１〜１８３）を示す。ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉには、６０×９０ｎｍ2の面に２８２個のＦＩＴＣラベルを配置した。
【００６３】
チューブを撹拌して、マイクロメーターサイズのＷ／Ｏエマルションを生成させた。エマルションを外部溶液（３００ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）上に静かに注いだ。４℃で３０分間遠心分離（１８，０００ｇ）した後、エマルションを脂質で飽和させたＷ／Ｏ界面を通過させて脂質二分子膜をもつＧＵＶを形成させた。油と水との混合を避けるため、チューブの底にニードルで開けた穴からＧＵＶを抽出した。
【００６４】
得られたＧＵＶの平均直径は、顕微鏡下での画像解析により、２０μｍと推計された。蛍光顕微鏡下での画像解析により、各ＧＵＶに封入されたビーズの数は１０1〜１０4オーダーと計測された。また、各ＧＵＶに封入されたプラスミド及びＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉの濃度は、それぞれ２２０ｎｇ／μｌ、３．３６ｎＭと計算された。
【００６５】
２．ＧＵＶと細胞の電気融合
ＨｅＬａ細胞を融合バッファー（３００ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）に分散させた。ＧＵＶのマンニトール溶液（４００μｌ）と細胞分散液（４００μｌ、１×１０5細胞／ｍｌ）の混合溶液を、細胞電気融合装置（ECFG21, NEPA GENE）の発電機に接続された電気融合チャンバ―（NEPA GENE）に導入した。ＧＵＶ数は、顕微鏡下での画像解析により、２×１０4／ｍｌと計測された。チャンバ―は、２ｍｍ間隔で配された２枚のプラチナ平行電極（２×８０×５ｍｍ）を含む。
【００６６】
混合溶液に１５Ｖ／ｍｍの交流電場を３０秒かけ、細胞とＧＵＶを一列に配列させた（第一手順）。次に、１７５Ｖ／ｍｍの直流パルスを５０マイクロ秒かけ、細胞とＧＵＶを融合させた（第二手順）。細胞とＧＵＶの融合は、細胞とＧＵＶが接触している領域の膜が不可逆的に電気絶縁膜破壊されることによって引き起こされる。続いて、１５Ｖ／ｍｍの交流電場を１０秒かけ、細胞とＧＵＶの接触を維持した（第三手順）。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭを入れた培養ディッシュに移した。
【００６７】
３．細胞内への物体導入
（１）蛍光ビーズ
蛍光ビーズ（直径１μｍ）を封入したＧＵＶと電気融合させた細胞を図３に示す。図左上は立体観察像、左下は垂直断面観察像、右は水平断面観察像を示す。細胞内に蛍光ビーズが導入されているのが確認できる。
【００６８】
直径０．２、０．５、１．０、２．０μｍの蛍光ビーズを封入したＧＵＶと細胞を電気融合させた結果を図４に示す。図は、細胞質、蛍光ビーズ及び核の蛍光観察像とこれらの合成像を示す。また、上段から対照（ビーズなし）、直径０．２、０．５、１．０、２．０μｍの蛍光ビーズの結果を示す。直径０．２、０．５、１．０μｍの蛍光ビーズが細胞内に導入されているのが確認できる。直径２μｍの蛍光ビーズは、細胞内へ導入されなかった。細胞内への蛍光ビーズの導入率をフローサイトメータで測定した結果、直径０．２、０．５、１．０、２．０μｍの蛍光ビーズでそれぞれ７３、５０、４０、０．３８％であった。
【００６９】
（２）プラスミド
ＥＧＦＰ発現ベクターを封入したＧＵＶと電気融合させた細胞を図５に示す。電気融合後１日及び５日の培養後、細胞のＧＦＰ発現が確認され、細胞内にＥＧＦＰ発現ベクターを導入できたことが確認された。細胞へのＥＧＦＰ発現ベクターの導入効率は約２０％であった。
【００７０】
（３）ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉ
ＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉを封入したＧＵＶと電気融合させた細胞を図６示す。ＦＩＴＣで標識されたＤＮＡ  ｏｒｉｇａｍｉが細胞内に導入されているのが確認できる。
【００７１】
なお、蛍光ビーズ（直径１μｍ）を封入したＧＵＶとＥＧＦＰ発現ベクターを封入したＧＵＶとを組み合わせて用いることにより、細胞内に蛍光ビーズとＥＧＦＰ発現ベクターを同時に導入できることも分かった（不図示）。
【００７２】
＜実施例２：ＧＵＶの表面電位の検討＞
実施例１の「１．ＧＵＶの調製」において、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）及びコレステロールのモル比を９：１：１のままあるいは９：０：１に変更し、実施例１で用いた蛍光ビーズ（直径０．２μｍ）が封入されたＧＵＶを作製した。また、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）：ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）及びコレステロールをモル比９：１．２６：１で用いて同様に蛍光ビーズが封入されたＧＵＶを作製した。
【００７３】
以下の手順でＧＵＶの表面電位（ゼータ電位）測定を行った。前記の脂質組成と手順でＧＵＶ（蛍光ビーズは封入しない）を調製し、エクストルーダー （Mini-Extruder，Avanti Polar Lipids社製）を使用して直径を１μｍにそろえた（メンブレンポアサイズ１μｍ、液量１ｍｌに対してポア通過２１回）。このリポソーム分散溶液３００μｌを微粒子測定器（nano Partica SZ-100 series、堀場製作所製）に導入し、ゼータ電位の測定を行った。測定値を「表１」に示す。
【００７４】
【表１】
0006607750.tif 000002
【００７５】
実施例１の「２．ＧＵＶと細胞の電気融合」と同様にしてＨｅＬａ細胞とＧＵＶの電気融合を行い、蛍光ビーズを細胞に導入した。融合操作後，以下の手順で蛍光ビーズ（直径０．２μｍ）の細胞への導入率を算出した。導入細胞を遠心分離（1000g，3min）し、上清を取り除いた後、融合バッファーを用いて再懸濁し洗浄した。再懸濁後の細胞をフローサイトメータ（Cell Lab Quanta SC MPL、ベックマンコールター社製）によって解析し、細胞への物質導入効率を求めた。直径７μｍ以上の物質を計測対象とした。細胞の計測数（1.5×104cells）のうち、融合操作を行わないネガティブコントロール（検出した蛍光強度<1×101）以上の蛍光強度を有するものの割合を算出した。結果を「表２」に示す。
【００７６】
【表２】
0006607750.tif 000003
【００７７】
負の表面電位を有するＧＵＶ（ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：コレステロール＝９：１：１あるいは９：０：１）では蛍光ビーズの導入が可能であったが、正の表面電位を有するＧＵＶ（ＤＯＰＣ：ＤＯＤＡＢ：コレステロール＝９：１．２６：１）では、電気融合後洗浄を経た細胞にもＧＵＶが付着し、評価が不能であった。また、より低い負の表面電位を有するＧＵＶにおいてより高い蛍光ビーズの導入効率が得られた。
【００７８】
＜実施例３：ＧＵＶのコレステロール含有率の検討＞
実施例１の「１．ＧＵＶの調製」において、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）及びコレステロールのモル比を９：１：１から９：１：０，９：１：０．１，９：１：０．４、９：１：２又は９：１：５に変更し、実施例１で用いた蛍光ビーズ（直径０．５μｍ）が封入されたＧＵＶを作製した。
【００７９】
実施例１の「２．ＧＵＶと細胞の電気融合」と同様にしてＨｅＬａ細胞とＧＵＶの電気融合を行い、蛍光ビーズを細胞に導入した。実施例３と同様にしてフローサイトメータを用いて蛍光ビーズの細胞への導入率を算出した。結果を「表３」に示す。コレステロール比がより低いＧＵＶにおいて、より高い蛍光ビーズの導入率が得られる傾向があった。コレステロールの割合は、好ましくは０〜１６．６モル％、より好ましくは０〜９．１モル％、さらに好ましくは０〜３．８モル％、さらにより好ましくは０〜０．９モル％、最も好ましくは０モル％である。
【００８０】
【表３】
0006607750.tif 000004
【００８１】
＜実施例４：ポストフュージョン交流電場の印加時間の検討＞
実施例１の「２．ＧＵＶと細胞の電気融合」の第三手順での交流電場（１５Ｖ／ｍｍ）の印加時間を１０秒から０，２０，６０秒に変化させて蛍光ビーズ（０．５μｍ）の細胞への導入を行った。実施例３と同様にしてフローサイトメータを用いて蛍光ビーズの細胞への導入率を算出した。結果を「表４」に示す。
【００８２】
【表４】
0006607750.tif 000005
【００８３】
＜実施例５：細胞内へのミトコンドリア導入＞
１．蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）のSHSY5Y細胞への導入
蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）を以下のようにして調製した。
【００８４】
ミトコンドリアに蛍光タンパク質（YFP又はDsRed）を発現させたヒト神経芽細胞腫株（SHSY5Y）から蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP又はMito-DsRed）を抽出した。
培養した細胞を、緩衝液（PBS）で洗浄後、トリプシンで処理して剥離した。
剥離した細胞を培地（DMEM-F12）に分散し、遠心分離（1000×g，3min）によって回収した。
回収した細胞を緩衝液Ａに分散した。
【００８５】
緩衝液Ａ（Homogenization buffer）
30mM Tris-HCl(pH7.4)
225mM マンニトール
75mM スクロース
0.5% BSA
0.1mM EGTA
【００８６】
注射針を付けたシリンジによる、細胞分散液の吸引と排出を繰り返すことにより、細胞を破砕した。
遠心分離（600×g，5min）を行って回収した上清を、さらに遠心分離（7,000g，10min）して沈殿物を得た。
沈殿物を緩衝液Ｂに分散し、遠心分離（7,000×g，10min）を行った。上清を取り除き、再度、遠心分離（10,000×g，10min）を行って、ミトコンドリアを含む沈殿物を得た。
【００８７】
緩衝液Ｂ（Fractionation buffer）
30mM Tris-HCl(pH7.4)
225mM マンニトール
75mM スクロース
【００８８】
沈殿物を緩衝液Ｃに分散し、ミトコンドリア分散液とした。
【００８９】
緩衝液Ｃ（Mitochondira resusupending buffer）
5mM Hepes-KOH(pH7.4)
250mM マンニトール
0.5mM mEGTA
【００９０】
調製した蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）を以下のようにしてSHSY5Y細胞に導入した。
【００９１】
ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）及びコレステロールをモル比９：１：０．５（合計１０５ｍｇ）でクロロホルム（２１００μｌ）に溶解した。溶液をガラスチューブに移し、アルゴンガス雰囲気下での乾燥と真空乾燥を行った後、液体パラフィン（５００μｌ）と混合した。混合物を６０℃で６０分間超音波処理した。
【００９２】
緩衝液Ｄと蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）溶液を混合し、上記脂質混合物に加えた。チューブを撹拌して、マイクロメーターサイズのＷ／Ｏエマルションを生成させた。
【００９３】
緩衝液Ｄ（Inner buffer）
210mM マンニトール
90mM スクロース
0.1mM CaCl2
0.1mM MgCl2
【００９４】
エマルションを外部溶液（３００ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）上に静かに注いだ。４℃で３０分間遠心分離（１８，０００×ｇ）した後、エマルションを脂質で飽和させたＷ／Ｏ界面を通過させて脂質二分子膜をもつＧＵＶを形成させた。
【００９５】
SHSY5Y細胞を融合バッファー（３００ｍＭマンニトール、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）に分散させた。蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）を封入したＧＵＶの溶液（４００μｌ）と細胞分散液（４００μｌ、１×１０4細胞／ｍｌ）の混合溶液を、細胞電気融合装置（ECFG21, NEPA GENE）の発電機に接続された電気融合チャンバ―（NEPA GENE）に導入した。
【００９６】
混合溶液に１５Ｖ／ｍｍの交流電場（１ＭＨｚ）を３０秒以上４分以内（平均２分）かけ、細胞とＧＵＶを一列に配列させた（第一手順）。次に、１７５Ｖ／ｍｍの直流パルス（パルスインターバル０．５秒）を５０マイクロ秒かけ（パルス回数５回）、細胞とＧＵＶを融合させた（第二手順）。細胞とＧＵＶの融合は、細胞とＧＵＶが接触している領域の膜が不可逆的に電気絶縁膜破壊されることによって引き起こされる。続いて、１５Ｖ／ｍｍの交流電場（１ＭＨｚ）を１０秒かけ、細胞とＧＵＶの接触を維持した（第三手順）。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭを入れた培養ディッシュに移した。
【００９７】
フローサイトメータ（Cell Lab Quanta SC MPL, Beckman Coulter, USA）で細胞中の蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）に由来する蛍光を検出することにより、細胞内への蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）の導入率を測定した。導入率は、１５．８２％であった（図７参照）。
【００９８】
２．蛍光ミトコンドリア（DsRed）のSHSY5Y細胞への導入
蛍光ミトコンドリア（Mito-DsRed）を上記の方法により調製した。調製した蛍光ミトコンドリア（Mito-DsRed）を上記の方法によりSHSY5Y細胞に導入し、導入率を測定した。導入率は、１５．７６％であった（図８参照）。
【００９９】
３．蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP及びDsRed）のSHSY5Y細胞への導入
さらに、蛍光ミトコンドリア（DsRed）を導入したSHSY5Y細胞に蛍光ミトコンドリア（Mito-YFP）を導入し、導入率を測定した。導入率は、２１．８３％であった（図９参照）。
【０１００】
＜実施例６：細胞内へ導入したミトコンドリアの機能評価＞
１．ミトコンドリアＤＮＡ欠失細胞（ΔmtDNA細胞）の作製
細胞を培養ディッシュに播種し（約1×105 cell/ml）、エチジウムブロマイド（30〜200ng/ml）を添加した培地（5% FBS DMEM）で培養する。
エチジウムブロマイドを含まない培地に交換し、さらにウリジン（50μg/ml）とピルビン酸（100μg/ml）を含まない培地に交換する。
さらに培養を行って、ΔmtDNA細胞を選択培養する。
【０１０１】
２．ΔmtDNA細胞へのミトコンドリア導入
作製されたΔmtDNA細胞内に実施例５と同様にしてミトコンドリアを導入する。
【０１０２】
３．ミトコンドリアの機能評価
ミトコンドリアを導入したΔmtDNA細胞におけるミトコンドリアの機能を評価し、導入されたミトコンドリアが細胞内で機能していることを確認する。
【図１】
0006607750.tif 000006
【図２−１】
0006607750.tif 000007
【図２−２】
0006607750.tif 000008
【図２−３】
0006607750.tif 000009
【図２−４】
0006607750.tif 000010
【図３】
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【図４】
0006607750.tif 000012
【図５】
0006607750.tif 000013
【図６】
0006607750.tif 000014
【図７】
0006607750.tif 000015
【図８】
0006607750.tif 000016
【図９】
0006607750.tif 000017
【図１０】
0006607750.tif 000018
【配列表】
0006607750000001.app