(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５型アデノウイルスのゲノムのITR（inverted terminal repeat)配列を含み、HRE配列、hTERTプロモーター、デコリンをコードするDNA及びRGD配列を含むペプチドをコードするDNAが挿入された制限増殖型アデノウイルスに、さらに全長REIC DNA又はREIC CドメインDNAが挿入され、癌細胞で特異的に増殖しREICタンパク質又はREIC Cドメインタンパク質を発現する制限増殖型アデノウイルスであって、
(i)  hTERTプロモーターがc-Myc結合部位及びSp1結合部位の付加により修飾されたhTERTプロモーターであり、
(ii)  hTERTプロモーターの上流に配列番号３で表される塩基配列からなるHRE配列が６つ挿入され、
(iii)  E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）を欠失しており、
(iv)  E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のE1B-19kDaをコードする部分の塩基が欠失しており、
(v)  E3領域の一部が欠失しており、
(vi)  プロモーター配列、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトがE3領域中に挿入され、
(vii)  RGD配列を含むペプチドをコードするDNAが、E3領域中に挿入され、かつ
(viii)  CMVプロモーター配列、REIC タンパク質又はREIC Cドメインタンパク質をコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトがE1領域中に挿入されている制限増殖型アデノウイルス。
【請求項２】
(iii)  E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第923〜946のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）である24個の塩基を欠失しており、
(iv)  E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第1722〜1986のE1B-19kDaをコードする部分の塩基が欠失しており、
(v)  E3領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第28592〜30479の塩基が欠失している、請求項１記載の制限増殖型アデノウイルス。
【請求項３】
REICが全長REICである、請求項１又は２に記載の制限増殖型アデノウイルス。
【請求項４】
REICがREICのCドメインである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の制限増殖型アデノウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の制限増殖型アデノウイルスを有効成分として含む、癌治療剤。
【請求項６】
制限増殖型アデノウイルスが癌細胞中で特異的に増殖し、REICタンパク質を発現し、発現したREICタンパク質が小胞体ストレスにより癌細胞の細胞死を誘導し、さらにREICタンパク質が全身的抗癌免疫活性を誘導する、請求項５記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、REIC（REIC/Dkk-3）タンパク質を高発現する制限増殖型アデノウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、制限増殖型（癌細胞で特異的に増殖するように遺伝子改変した）各種ウイルスを用いた癌に対する医薬品の臨床治験が報告されている（非特許文献１）。これらの医薬品を用いた癌の治療においては一定の成果が上がっている一方、その効果が限定的であることが多く、さらに有効な医薬品の開発が望まれている。【０００３】
現在までに臨床治験の結果が報告されている制限増殖型ウイルスを用いた癌に対する医薬品の代表例として、adenovirus type 5を骨格とするTelomelysin（非特許文献２）とherpes simplex virus type 1を骨格とするTalimogene laherparepvec（T-VEC,旧名Oncovex）（非特許文献３）がある。【０００４】
近年、非特許文献１に示されるように、各種ウイルスを用いた癌に対する医薬品については、抗癌免疫を活性化するような機能を持たせることが重要であると考えられるようになってきた。この観点から考えると、Telomelysin（非特許文献２）については、抗癌免疫を活性化させるサイトカイン等の遺伝子がコードされておらず、Telomelysinを投与した局所においては当該アデノウイルスの増殖による癌細胞死が誘導できるものの、全身における強力な抗癌免疫活性化という作用が期待できない。このことが、Telomelysinの治療効果を限定的なものにしている可能性がある。【０００５】
また、T-VECについては、投与した局所における当該ヘルペスウイルスの増殖による癌細胞死・癌細胞の抗原化とサイトカインGM-CSFの発現による抗癌免疫の活性化が期待できる。しかしながらサイトカインGM-CSFには、癌抗原提示細胞である樹状細胞を分化誘導させるという抗癌免疫活性化作用の他に（非特許文献１）、高用量では免疫抑制系細胞を誘導し抗癌免疫機能を減弱させ、病状を悪化させる可能性があることも報告されており（非特許文献４）、このことがT-VECの治療効果を限定的なものにしている可能性がある。【０００６】
すなわち、現存の制限増殖型ウイルスを用いた癌に対する医薬品のこれらの問題点を踏まえた上で、さらに有効な当該医薬品の開発が望まれている。上記問題点を解決するための制限増殖型アデノウイルスとして種々の変異を含む制限増殖型アデノウイルスについて報告されていた（特許文献１及び２並びに非特許文献５〜１０）。【０００７】
一方、細胞の不死化に関連した遺伝子として、REIC（REIC/Dkk-3）遺伝子が知られており、がん細胞ではこの遺伝子の発現が抑制されていることが報告されており、REIC遺伝子を癌治療に用いることも報告されている（特許文献３）。REICは抗癌免疫を活性化する作用、遺伝子発現時に小胞体ストレスにより癌細胞に細胞死を誘導する作用を有する。また、REICの遺伝子の部分断片が全長REICと同様の効果を有することも報告され（特許文献４）、さらにREIC/Dkk-3遺伝子を発現するアデノウイルスについても報告されていた（特許文献５及び非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第4327844号公報
【特許文献２】特表2008-531010号公報
【特許文献３】国際公開第WO2001/038523号
【特許文献４】国際公開第WO2012/002582号
【特許文献５】国際公開第WO2012/161352号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】R.V. Dave et al., Surgeon 2014, Feb 4
【非特許文献２】John Nemunaitis et al., Molecular Therapy, Vol.18, No.2, 429-434, Feb. 2010
【非特許文献３】Neil N. Senzer et al., Journal of Clinical Oncology, Vol. 27, No. 34, December 1, 2009, 5763-5771
【非特許文献４】G. Parmiani et al., Annals of Oncology 18; 226-232, 2007
【非特許文献５】Oh-Joon Kwon et al., Clin Cncer Res; 16(24) December 15, 2010
【非特許文献６】Eunhee Kim et al., Human Gene Therapy 14:1415-1428 (October 10, 2003), 1415-1427
【非特許文献７】Candelaria Gomez-Manzano et al., Onvogene (2004)23, 1821-1828
【非特許文献８】Jaesung Kim et al., Cancer Gene Therapy(2002)9, 725-736
【非特許文献９】I-K Choi et al., Gene Therapy(2010) 17, 190-201
【非特許文献１０】Hao Wu et al., J Gene Med 2011; 13: 658-669
【非特許文献１１】Watanabe M et al., Oncology Letters 7: 595-601, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、強力な抗癌作用を有する制限増殖型アデノウイルスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、従来報告されている制限増殖型アデノウイルスの技術群（上記特許文献１及び２並びに非特許文献５〜１０）を有効に組み合わせることにより独自の制限増殖型アデノウイルスを作製した。さらに、このアデノウイルスに、独特の抗癌免疫活性化作用を有するREICタンパク質（上記非特許文献１１)を発現するREIC遺伝子を新たにコードした。これにより、独自性・新規性を兼ね備えた、かつ、既存の制限増殖型ウイルスを用いた癌に対する医薬品群を凌駕する抗癌作用を持つことが期待される進歩性の高い、抗癌ウイルス製剤の開発に成功し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  ５型アデノウイルスのゲノムのITR（inverted terminal repeat)配列を含み、HRE配列、hTERTプロモーター、デコリンをコードするDNA及びRGD配列を含むペプチドをコードするDNAが挿入された制限増殖型アデノウイルスに、さらに全長REIC DNA又はREIC CドメインDNAが挿入され、癌細胞で特異的に増殖しREICタンパク質又はREIC Cドメインタンパク質を発現する制限増殖型アデノウイルス。
[２]  プロモーター配列、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトが５型アデノウイルスのE3領域中に挿入されている、[１]の制限増殖型アデノウイルス。
[３](i)  hTERTプロモーターがc-Myc結合部位及びSp1結合部位の付加により修飾されたhTERTプロモーターであり、
(ii)  hTERTプロモーターの上流に配列番号３で表される塩基配列からなるHRE配列が６つ挿入され、
(iii)  E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）を欠失しており、
(iv)  E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のE1B-19kDaをコードする部分が欠失しており、
(v)  E3領域の一部が欠失しており、
(vi)  プロモーター配列、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトがE3領域中に挿入され、
(vii)  RGD配列を含むペプチドをコードするDNAが、E3領域中に挿入され、かつ
(viii)  CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトがE1領域中に挿入されている[１]又は[２]の制限増殖型アデノウイルス。
[４]  (iii)  E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第923〜946のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）である24個の塩基を欠失しており、
(iv)  E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第1722〜1986のE1B-19kDaをコードする部分の塩基が欠失しており、
(v)  E3領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第28592〜30479の塩基が欠失している、
[３]の制限増殖型アデノウイルス。
[５]  REICが全長REICである、[１]〜[４]のいずれかの制限増殖型アデノウイルス。
[６]  REICがREICのCドメインである、[１]〜[４]のいずれかの制限増殖型アデノウイルス。
[７]  [１]〜[６]のいずれかの制限増殖型アデノウイルを有効成分として含む、癌治療剤。
[８]  制限増殖型アデノウイルスが癌細胞中で特異的に増殖し、REICタンパク質を発現し、発現したREICタンパク質が小胞体ストレスにより癌細胞の細胞死を誘導し、さらにREICタンパク質が全身的抗癌免疫活性を誘導する、[７]の癌治療剤。【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-110672号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の制限増殖型アデノウイルスは従来の制限増殖型アデノウイルスを改良し、従来のものよりも強力な抗癌作用を有する。さらにREIC DNAを挿入した該制限増殖型アデノウイルスは、制限増殖型アデノウイルス自体の抗癌作用のみならず、REICの抗癌免疫を活性化する作用、遺伝子発現時に小胞体ストレスにより癌細胞に細胞死を誘導する作用を併せ持ち、これらの作用が協働し、癌に対して相乗的な強力な治療効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】オンコリティックアデノウイルスの構造を示す図である。
【図２】m-hTERTプロモーターの配列を示す図である。
【図３】オンコリティックアデノウイルスの添加による各細胞でのREICタンパク質の発現を示す図である。
【図４】オンコリティックアデノウイルス(オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REIC）の添加による各細胞での細胞死誘導率を示す図である。
【図５】オンコリティックアデノウイルス(オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REIC）を投与した場合の各マウスにおける腫瘍体積の変化を示す図である。
【図６】オンコリティックアデノウイルス(オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REIC）を投与した場合の各マウスにおけるNK細胞誘導を示す図である。
【図７】オンコリティックアデノウイルス(オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REIC）を投与した場合の抗原特異的免疫応答誘導を腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の解析の結果により示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、REIC（REIC/Dkk-3） DNAを含み、REICタンパク質の発現に用いることができる制限増殖型アデノウイルスである。
【００１８】
制限増殖型アデノウイルスは、遺伝子改変され、癌細胞の中のみで増殖するアデノウイルスをいう。正常の細胞には作用しないが、癌細胞の中でのみ増殖し癌細胞を溶解させ、癌細胞を効果的に殺すことができる。制限増殖型アデノウイルスをオンコリティック（oncolytic）アデノウイルスや溶解性アデノウイルスとも呼ぶ。また、本発明の制限増殖型は外来遺伝子を挿入して用いることができるので、制限増殖型アデノウイルスベクターと言うこともできる。
【００１９】
本発明においては、制限増殖型アデノウイルスに全長REIC DNA又はREIC DNA断片を導入しており、上記の制限増殖型アデノウイルス自体の殺癌細胞効果のみならず、抗癌免疫を活性化する効果、遺伝子発現時に小胞体ストレスにより癌細胞に細胞死を誘導する効果等のREICの癌細胞に対する効果により相乗的な殺癌細胞効果を奏することができる。
【００２０】
本発明において、制限増殖型アデノウイルスをオンコリティックアデノウイルス(オンコリティックAd）と呼び、全長REIC DNAを含み全長REICを発現し得る制限増殖型アデノウイルスをオンコリティックAd-REICと呼び、REIC CドメインDNAを含みREIC Cドメインを発現し得る制限増殖型アデノウイルスをオンコリティックAd-REIC domainと呼ぶ。
【００２１】
本発明で用いる制限増殖型アデノウイルスは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT)プロモーターにより増殖が制限される５型アデノウイルスの骨格を有する。本発明の制限増殖型アデノウイルスは５型アデノウイルスのITR(inverted terminal repeat)を含み、さらに、腫瘍の形成と成長を抑制するタンパク質であるデコリンをコードするDNAを含むことを特徴とし、その他の修飾（特定の配列の挿入及び欠失）がなされている。デコリンDNAはCMVプロモーターにより発現する。５型アデノウイルスのゲノム配列は、Virology, 186 (1), 1992, pp.280-285に記載され、また、GenBank Accession No.M73260で登録されている。５型アデノウイルスのゲノム配列を配列番号４に示す。アデノウイルスのゲノムは両端にITR(inverted terminal repeat)を有し、初期転写領域として5'側から順に、E1A領域、E1B領域、E2領域、E3領域及びE4領域を有する。
【００２２】
以下に本発明の制限増殖型アデノウイルスの特徴を示す。
（１）５型アデノウイルスのITR(inverted terminal repeat)を含む。ITRは100〜200塩基からなりアデノウイルスDNAのDNA複製及びパッケージングに必須なエレメントである。
【００２３】
（２）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT)プロモーターを含む。hTERTプロモーターは、５型アデノウイルスゲノムのE1領域の上流に含まれ、例えばE1領域の直ぐ上流に連結される。hTERTプロモーターは好ましくは修飾されている。修飾されたhTERTプロモーターをm-hTERTプロモーターと呼ぶ。修飾されたhTERTプロモーターは、１つ以上のc-Myc結合部位（cacgtg、cacgcg又はcatgcg）及び／又は１つ以上のSp1結合部位（gggcgg, ccgccc, ctccgcctc, cccagcccc, gggcgg, ggggcgg又はcccccgcccc（配列番号１）を含む。野生型hTERTプロモーターには２つのc-Myc結合部位と５つのSp1結合部位が含まれている。本発明の制限増殖型アデノウイルスのhTERTプロモーターは、例えば、さらに１つのc-Myc結合部位と５つのSp1結合部位が付加され、合計で３個のc-Myc結合部位及び10個のSp1結合部位を含む。c-Myc結合部位及びSp1結合部位はhTERTプロモーターの3'末端に含まれていても、5'末端に含まれていても、さらに、hTERTプロモーター配列の内部に含まれていてもよい。修飾されたhTERTプロモーターの一例の配列を図２及び配列番号２に示す。図１において「E-box」はc-Myc結合配列を示す。hTERTプロモーターに１つのc-Myc結合部位及び５つのSp1結合部位をさらに含ませたm-hTERTプロモーター（配列番号２）を製造するためには、例えば、２つのc-Myc結合部位及び５つのSp1結合部位が存在する野生型hTERTプロモーターに、１つのc-Myc結合部位及び５つのSp1結合部位が入っているhTERTプロモーターを結合させればよい。このためには、まず１つのc-Myc結合部位及び５つのSp1結合部位が含まれたpGL2-hTERTベクターをEcoRIとHindIIIで切断した後、同種の制限酵素で処理されたpSEAP-TERTに挿入してpSEAP-mTERTを製造すればよい。該修飾されたhTERTプロモーターについては、特許第4327844号公報及びEUNHEE KIM et al., Human Gene Therapy 14: 1415-1428 (October 10, 2003)に記載されている。
【００２４】
（３）低酸素応答性領域（Hypoxia Responsive Element: HRE)を含む。HREは低酸素状態（ハイポキシア）で活性化される遺伝子が有する、ハイポキシアに応答するDNAエレメントであり、コンセンサス配列としてACGTGを含む。本発明で用いる制限増殖型アデノウイルスは前記コンセンサス配列を含む５〜40塩基の配列を含む。正常組織では酸素濃度は２〜９％程度であるが、癌細胞は約1.3％と低酸素状態にある。このため、HREを含む制限増殖アデノウイルスは癌細胞で増殖が促進される。HRE配列として例えば、ヒト血管内皮増殖細胞（human vascular endothelial growth factor：hVEGF)遺伝子（GenBank Accession No. M63971)の前記コンセンサス配列を含む配列が挙げられ、具体的には、hVEGF遺伝子の第1379番目の塩基から1412番目の塩基の塩基配列（配列番号３）が挙げられる。HREは複数個を連結して用いてもよく、３〜１２個を連結して用いることができ、例えば、６個連結したもの（HRE×６）や12個連結したもの（HRE×12）を用いることができる（Oh-Joon Kwon et al., Clin Cancer Res; 16(24) December 15, 2010, pp.60716082)。好ましくは６個連結したもの（HRE×６）を用いる。HREはhTERTプロモーターの上流、例えば直ぐ上流に連結させればよい。
【００２５】
（４）E1A領域が部分的に欠失している。E1A領域は５型アデノウイルスゲノム（配列番号４）の第342番目〜第1545番目に存在し、E1Aタンパク質はRB(Retinoblastoma)遺伝子産物と結合する。E1A領域はアデノウイルスの複製に必須の領域であり、本発明の制限増殖型アデノウイルスは、E1A領域のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）が欠失しており、複製能自体は保持している。本発明の制限増殖型アデノウイルスにおけるE1A領域の部分的な欠失を、変異された活性のE1A遺伝子を含むという。ここで、変異された活性のE1A遺伝子は、Rb(retinoblastomaタンパク質)結合部位をコーディングするヌクレオチド配列中で、45番目Glu残基がGlyに置換された変異及び121〜127番目アミノ酸配列が全体的にGlyに置換された変異を有する。腫瘍細胞では、p53蛋白質の変異だけではなく、Rbの突然変異あるいはRb関連信号メカニズムが相当部分損傷されているため、Rbとの結合能が消失されたアデノウイルスは、正常細胞では、Rbの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、Rbの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を選択的に殺傷することができる。したがって、上述のRb結合部位における変異を含む本発明の組み換えアデノウイルスは、癌細胞特異性が非常に大きく増大される。また、Rb結合部位における変異は、例えば、E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第923〜946のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）である24個の塩基を欠失させることでも可能である（ΔE1A（24bp））（Candelaria Gomez-Manzano et al., Oncogene (2004) 23, pp.1821-1828）。
【００２６】
（５）E1B領域が部分的に欠失している。E1B領域は５型アデノウイルスゲノム（配列番号４）の第1714番目〜第3509番目に存在し、E1B領域の遺伝子産物であるE1B-55kDaタンパク質はp53タンパク質と結合することによりウイルスの複製に関与する。E1B領域の部分的な欠失をE1B領域において非活性化部分を有するともいい、本発明の制限増殖型アデノウイルスは、非活性化されたE1B 19kDa遺伝子、E1B 55kDa遺伝子、またはE1B 19kDa/E1B 55kDa遺伝子を有し、好ましくは、非活性化されたE1B 19kDa及びE1B 55kDa遺伝子を有する。本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語「非活性化」は、その遺伝子の転写及び/又は解読が正常的になされず、その遺伝子によりコーディングされる正常的なタンパク白質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化E1B 19kDa遺伝子は、その遺伝子に変異(置換、付加、部分的欠失、または全体的欠失)が発生され、活性のE1B 19kDaタンパク質を生成できない遺伝子である。E1B 19kDa遺伝子が欠失された場合は、細胞アポトーシス能を増加させることができて、E1B 55kDa遺伝子が欠失された場合は、腫瘍細胞特異性を有するようにする(大韓民国特許出願第100528727号)。例えば、E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第1722〜1986の塩基を欠失させればよい。この塩基配列の欠失により、55kDaのE1Bタンパク質のトランススプライシング産物である19kDaのE1B-19kDaをコードする部分が欠失することになるので、この欠失をΔE1B(19kDa)と呼ぶ（Jaesung Kim et al., Cancer Gene Therapy (2002) 9, pp.725-736）。また、E1B領域のE1B(19kDa)のみが発現しないようにストップコドンを導入してもよい。
【００２７】
（６）E3領域が欠失している。E3タンパク質をコードするDNAの全部又は一部が欠失していればよい。E3領域は５型アデノウイルスゲノム（配列番号４）の第27858番目〜第30839番目に存在する。E3領域はアデノウイルスの増殖には不要であり、E3領域に外来遺伝子を挿入することができる。この際、E3領域を部分的に欠失させ、その部分に外来遺伝子を挿入すればよい。例えば、E3領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第28592〜30479の塩基を欠失させればよい（ΔE3）。この部分に、例えば後述のデコリンをコードするDNAを挿入することができる。
【００２８】
（７）腫瘍の形成と成長を抑制するタンパク質であるデコリン（Decorin：DCN）をコードするDNAが挿入されている。デコリンはSLRP（small leucin rich proteoglycan)に属するタンパク質であって、10〜12個のロイシンリッチリピートから構成されており、コア部位は、アーチ状になっており、細胞外基質に存在する数種の成長因子又はデコリン受容体と結合する。デコリンは、腫瘍成長因子(TGF-β）の活性を抑制することにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質の構成(matrix assembly)に関与して、腫瘍細胞の成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に天然拮抗剤(antagonist)として作用する。制限増殖型アデノウイルスにデコリンを導入することにより癌細胞へ導入されやすくなり、殺腫瘍細胞活性が増加する。本発明の制限増殖型アデノウイルスにおいて、デコリンをコードするDNAの上流にプロモーターが連結され、デコリンをコードするDNAの下流に、ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）が連結される。プロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、デコリン遺伝子の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、U6プロモーター、H1プロモーター、CMV(Cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVのtkプロモーター、RSVプロモーター、EF1アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、誘導性(inducible)プロモーター、癌細胞特異的プロモーター(例えば、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター及びAFPプロモーター)及び組織特異的プロモーター(例えば、アルブミンプロモーター)を含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、CMVプロモーターまたは癌細胞特異的プロモーターを用いる。癌細胞特異的プロモーターを利用する場合、TERTプロモーター又はE2Fプロモーターを利用することが好ましい。TERT(telomere reverse transcriptase)プロモーターとして野生型ヒトhTERT(human telomere reverse transcriptase)プロモーター又は上記（２）のm-hTERTプロモーターを用いてもよい。ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列（BGH polyA)やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列をDNAコンストラクトに含ませることにより、転写効率が増大する。
【００２９】
デコリンをコードするDNAを含むアデノウイルスについては、特開2008-531010号公報、I-K Choi et al., Gene Therapy (2010)17, 190-201に記載されている。デコリンをコードするDNAの塩基配列（GenBank Accession No. NM_001920.3）を配列番号５に示す。また、CMVプロモーターの塩基配列（GenBank Accession No. X17403）を配列番号６に、BGH polyA付加配列の塩基配列（GenBank Accession No. M57764）を配列番号７に示す。
【００３０】
デコリンをコードするDNAを含む、プロモーター配列、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトは、E1A領域、E1B領域又はE3領域に挿入すればよく、好ましくはE3領域に挿入する。下記のように本発明のアデノウイルスベクターにおいては、５型アデノウイルスゲノムのE1A領域、E1B領域及びE3領域が部分的に欠失している。CMVプロモーター、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列をこの順番で連結したDNAコンストラクトは、該欠失部分に挿入すればよい。例えば、上記DNAコンストラクトを相同組換えにより、E1A領域、E1B領域及びE3領域が部分的に欠失させると同時に５型アデノウイルスゲノムに挿入することができる。例えば、上記（６）の配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第28592〜30479の塩基を欠失させた部分に挿入すればよい。
【００３１】
（８）RGD（Arg-Gly-Asp）配列を含むペプチドをコードするDNAが挿入されている。RGD配列を含むペプチドとしては、RGDを含む４（GRGDS(配列番号８）等）〜１５個アミノ酸からなるペプチドが挙げられ、例えば、CDCRGDCFC（配列番号９）やGSCDCRGDCFCSG（配列番号１０）で表されるペプチドが挙げられる。RGD配列を含むペプチドをコードするDNAは、例えば、E3領域中に挿入され、具体的には５型アデノウイルスゲノムE3領域の第32676番目の塩基と第32677番目の塩基の間に挿入すればよい。RGD配列を含むペプチドをコードするDNAを含むことにより、制限増殖型アデノウイルスが癌細胞へ導入されやすくなる。RGD配列を含むアデノウイルスについては、例えば、Hao Wu et al., J Gene Med 2011; 13: 658-669に記載されている。
【００３２】
上記特徴（１）〜（８）を有する本発明の制限増殖型アデノウイルスは、５型アデノウイルスのゲノムのITR（inverted terminal repeat)配列を含み、HRE配列、hTERTプロモーター、デコリンをコードするDNA及びRGD配列を含むペプチドをコードするDNAが挿入された構造を有する。
【００３３】
本発明の制限増殖型アデノウイルスの構造の例を図１Aに示す。図１Dには本発明の制限増殖型アデノウイルスの野生型の５型アデノウイルスからの変異が図示され、さらに、デコリンDNA及びREIC DNAの挿入位置が図示されている。図１B及び図１CがREIC DNAが挿入された制限増殖型アデノウイルスの構造を示す。図１Aに示す制限増殖型アデノウイルスの構造は図１Dに示す構造において、E3領域にCMVプロモーター、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列をこの順番で連結したDNAコンストラクトが挿入されている。図１Aに構造を示す制限増殖型アデノウイルスにおいては、５型アデノウイルスゲノムのE1A領域の一部が欠失し、E1B領域の一部が欠失し、さらにE3領域の一部が欠失し、E1A領域の上流にHRE配列と修飾されたhTERTプロモーターが含まれ、E3領域の下流にRGD配列を含むペプチドをコードするDNAが含まれ、さらに、E3領域にプロモーター、デコリンをコードするDNA及びpolyA配列からなるコンストラクトが含まれている。
【００３４】
例えば、図１Aに示す本発明の制限増殖型アデノウイルスは、以下の構造的特徴を有する。
(i)  hTERTプロモーターがc-Myc結合部位及びSp1結合部位の付加により修飾されたhTERTプロモーターである。
(ii)  hTERTプロモーターの上流に配列番号３で表される塩基配列からなるHRE配列が６つ挿入されている。
(iii)  E1A領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）を欠失している。例えば、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第923〜946のRb結合領域（Retinoblastoma遺伝子結合領域）である24個の塩基を欠失している。
(iv)  E1B領域の一部であって、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列のE1B-19kDaをコードする部分の塩基が欠失している。例えば、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第1722〜1986のE1B-19kDaをコードする部分の塩基が欠失している。
(v)  E3領域の一部が欠失している。例えば、配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第28592〜30479の塩基が欠失している。
(vi)  プロモーター配列、デコリンをコードするDNA及びpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトがE3領域中に挿入されている。
(vii)  RGD配列を含むペプチドをコードするDNAが、E3領域中に挿入されている。
【００３５】
また、E1A領域、E1B領域又はE3領域中に外来遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位（挿入部位）を有していてもよい。該マルチクローニング部位には、後記のREIC DNA等の外来遺伝子を挿入することができる。
【００３６】
上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
【００３７】
例えば、本発明の制限増殖型アデノウイルスは、ITR-ΔE1A-ΔE1B-プロモーター-デコリンDNA-ポリＡ付加配列-RGD配列-ITRで表される構造を有しており、「プロモーター-デコリンDNA-ポリＡ付加配列」からなるコンストラクトは、欠失されたE3領域に挿入されている。このような制限増殖型アデノウイルスの構造（遺伝子地図）を図１に示す。
【００３８】
上記の制限増殖型アデノウイルス(オンコリティックAd)に全長REIC DNA又はREIC CドメインDNAを挿入することにより、オンコリティックAd-REIC又はオンコリティックAd-REIC domainを作製することができる。
【００３９】
REIC DNAの塩基配列は、配列番号１１に表される。また、REIC DNAがコードするREICタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１２に表される。本発明において、REICをREIC/Dkk-3と呼ぶこともある。
【００４０】
また、REIC CドメインDNAの塩基配列は配列番号１３に表され、該ドメインがコードするREIC Cドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に表される。
【００４１】
また、本発明の制限増殖型アデノウイルスに含まれるREIC DNA又はREIC CドメインDNAは、配列番号１１又は１３に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号１１又は１３に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、又は前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAなどのうち、抗癌免疫を活性化する作用、遺伝子発現時に小胞体ストレスにより癌細胞に細胞死を誘導する作用を有するタンパク質をコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待し得る。ただし、上記のSSC、SDS及び温度の条件の組み合わせは例示であり、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。「ストリンジェントな条件」は、当業者ならば配列同一性が高いDNAがハイブリダイズする条件として適宜決定することができる。さらに、本発明のDNAコンストラクトに含まれるREICのDNAは、配列番号２に表されるタンパク質をコードするDNAである。
【００４２】
REIC DNA又はREIC CドメインDNAは、配列番号１１〜１４の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。
【００４３】
全長REIC DNA又はREIC CドメインDNAの上流にはCMV（cytomegarovirus）プロモーターが連結され、下流には、ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）が連結される。ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列（BGA polyA)やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列をDNAコンストラクトに含ませることにより、転写効率が増大する。CMVプロモーターの塩基配列（GenBank Accession No. X17403）を配列番号６に、BGH polyA付加配列の塩基配列（GenBank Accession No. M57764）を配列番号７に示す。
【００４４】
REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNAを含む、CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトは、E1A領域、E1B領域又はE3領域に挿入すればよく、好ましくはE1領域（E1A又はE1B領域）に挿入する。例えば、上記DNAコンストラクトを相同組換えにより、５型アデノウイルスゲノムのE1A領域、E1B領域又はE3領域に挿入することができる。
【００４５】
例えば、上記の制限増殖型アデノウイルスのE1領域中に挿入すればよい。相同組換えの際、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNAを含む、CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトのみを挿入することもできるが、E1領域を含むコンストラクトであって、E1領域にREIC DNA又はREIC CドメインDNAを含むDNAコンストラクトを挿入し、かつE1A領域の一部及びE1B領域の一部を欠失させたコンストラクトを相同組換えにより挿入してもよい。この相同組換えにより、５型アデノウイルスのE1A領域及びE1B領域を部分的に欠失（ΔE1A（24bp）及びΔE1B(19kDa)）させるとともに、５型アデノウイルスにREIC DNA又はREIC CドメインDNAを含むDNAコンストラクトを挿入することができる。
【００４６】
例えば、具体的には配列番号４に示す５型アデノウイルスゲノム配列の第342番目と第3522番目の塩基の間に相同組換えにより挿入すればよい。REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNAを含む、CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトは、例えば、E1シャトルベクターであるpE1sp1B-HmT-Rd19/CMV-REIC-polA（（左側homology部分：22-341）（右側homology部分：3523-5790））を用いて相同組換えにより、E1領域に挿入すればよい。このシャトルベクターを用いることにより、５型アデノウイルスゲノム配列の第342番目〜3522番目に、以下のDNAコンストラクトが挿入される。
【００４７】
E1領域にCMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトが挿入されており、かつE1A領域のRb結合部位が欠失し、E1B領域のE1B-19kDaをコードする部分が欠失したコントストラクト。
【００４８】
この結果、５型アデノウイルスのE1A領域及びE1B領域を部分的に欠失（ΔE1A（24bp）及びΔE1B(19kDa)）させるとともに、５型アデノウイルスに、CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトを挿入することができる。
【００４９】
また、例えば、CMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトを５型アデノウイルスゲノム配列の第3524番目と3525番目の間、又は3523番目と3524番目の間に挿入してもよい。
【００５０】
REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNAを挿入した制限増殖型アデノウイルスの構造を図１B（オンコリティックAd-REIC)及びC（オンコリティックAD-REIC domain）に示す。図１B及びCに示す構造は、図１Aに構造を示す制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd)のE1領域にCMVプロモーター配列、REIC DNA又はREIC CドメインDNAをコードするDNA、並びにpolyA付加配列からなるDNAコンストラクトが3524の位置に挿入されている。
【００５１】
上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
【００５２】
本発明の制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd）、全長REIC DNAを含む制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd-REIC）又はREIC CドメインDNAを含む制限増殖型アデノウイルス（Ad-REIC C domain)は上記記載及び引用した文献の記載に従って作製することができる。
【００５３】
本発明の制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd)をヒトやその他の哺乳動物である被験体に投与することにより、被験体の癌細胞にデリバリーされ、癌細胞中で増殖し、癌細胞を死滅させる。
【００５４】
また、本発明の全長REIC DNAを含む制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd-REIC）及びREIC CドメインDNAを含む制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd-REC domain）をヒトやその他の哺乳動物である被験体に投与することにより、被験体の癌細胞にデリバリーされる。オンコリティックアデノウイルスの作用で癌細胞を死滅させるとともに、癌細胞中で全長REICタンパク質又はREIC Cドメインタンパク質が発現し、発現時の小胞体ストレスにより癌細胞に選択的に細胞死を誘導すると共に癌免疫を活性化し、腫瘍細胞増殖を抑制し、癌治療効果を発揮する。また、REICによる抗癌免疫活性は、癌細胞に局所的に作用するだけでなく、全身における強力な抗癌免疫活性化をもたらす。全長REIC DNAを含む制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd-REIC）及びREIC CドメインDNAを含む制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd-REC domain）は制限増殖型アデノウイルス自体の殺癌効果とREICの抗癌免疫活性等による抗癌効果が相乗的に作用し、より強い抗癌効果を得ることができる。本発明は、このような制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd、オンコリティックAd-REIC、オンコリティックAd-REIC domain）を含む癌治療用ウイルス製剤を包含する。治療対象となる癌としては、限定されないが、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明の制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd、オンコリティックAd-REIC、オンコリティックAd-REIC domain）は原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。
【００５５】
本発明の制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd、オンコリティックAd-REIC、オンコリティックAd-REIC domain）は、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、胸腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。
【００５６】
本発明の制限増殖型アデノウイルス（オンコリティックAd、オンコリティックAd-REIC、オンコリティックAd-REIC domain）は、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００５８】
実施例１  オンコリティックアデノウイルス（Oncolytic Adenovirus：Oncolytic Ad)の作製
E1領域及びE3領域において、それぞれ、REIC若しくはREIC Cドメイン（REIC-C)並びにデコリン（DCN)を発現するオンコリティックアデノウイルスを作製するために、最初にREIC又はREIC Cを発現するpCA14 Ad E1シャトルベクターを作製した。REIC又はREIC C遺伝子をpShuttole/REIC又はREIC-CからNheI-blunt-HindIIIを用いて切り出し、あらかじめXbaI-blunt-HindIII で消化しておいたpCA14 Ad E1シャトルベクターにサブクローニングした。pCA14/REIC及びpCA14/REIC-CベクターをBglIIで消化し、次いでCMV-REIC-polA及びAMV-REIC-C-polA発現カセットをあらかじめBglIIで消化しておいたpΔE1sp1B-HmT-Rd19シャトルベクター（Kim E et al., Hum Gene Ther 2003;14:1415-1428；Kim JH et al., J Natl Cancer Inst 2006;98:1482-1493)にクローニングし、pΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC及びpΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC-CアデノウイルスE1シャトルベクターを得た。pSP72-E3/DCN（I-K Choi et al., Gene Therapy 2010;17:190-201.） E3シャトルベクターをXmnIを用いて線状化し、SpeIで線状化したアデノウイルストータルベクターdel-RGDと共にBJ5183大腸菌株を共形質転換し相同組換えを行った。その結果、複製能力のないアデノウイルスベクターdel-RGD/DCNを得た。新たに構築したpΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC及びpΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC-CアデノウイルスE1シャトルベクターをXmnI消化により線状化し、次いでBstBIで消化したde1-RGD/DCNと共にBJ5183大腸菌株を共形質転換し相同組換えを行った。その結果、REIC若しくはREIC-C並びにデコリンを発現する腫瘍特異的オンコリティックアデノウイルスを得た。プラスミドDNAをPacIで消化し、293A細胞に導入し増殖させた。【００５９】
アデノウイルスの精製、タイター測定及び質の分析はYoo JY et al., Mol Ther 2007;15:295-302の記載に従って行った。【００６０】
REICを含まないオンコリティックアデノウイルスベクターをオンコリティックAdと、全長REIC DNAを含むオンコリティックアデノウイルスベクターをオンコリティックAd-REICと、REIC CドメインDNAを含むオンコリティックアデノウイルスベクターをオンコリティックAd-REIC domainと呼ぶ。【００６１】
実施例２  オンコリティックAd、オンコリティックAd-REIC及びオンコリティックAd-REIC domainの添加による各種細胞でのREICタンパク質の発現
方法
Ad-REIC処理後のREICタンパク質発現を測定するため、細胞を平底６ウェルプレートに播き24時間インキュベートした。細胞を図に記載のMOI(multiplicity of infection）でアデノウイルスを完全培地（300μl）中で１時間感染処理し、PBS（phosphate buffered saline）で２回洗浄し、溶解バッファー(50 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml aprotinin, 2 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 10 mM β-GP)を用いて溶解させ、REICタンパク質を抽出した。【００６２】
遠心分離後、上清を同容積の4 x SDSサンプルバッファーで希釈し、95℃で５分間加熱した。サンプル（タンパク質５μg）を10％ SDS-PAGEゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に電気泳動転写した。転写したブロットを５％脱脂ミルクパウダー、0.1％ Tween-20含有TBS（Tris buffered saline）を用いて室温で１時間ブロッキングした。次いで、マウスモノクローナル抗体ヒトREIC/Dkk-3抗体（1:1000希釈）（一次抗体）を反応させ、0.1％ Tween-20含有TBS（T-TBS）で十分洗浄した後西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体と反応させた。さらにを、T-TBSで洗浄後、化学発光検出法キットであるECLキット（Amersham Pharmacia Biotech, Chandler, AZ）を用いて発色させた。REICタンパク質のバンドはウエスタンブロットで60kDa付近に認められる。【００６３】
結果
図３に、オンコリティックAd（アデノウイルス）、オンコリティックAd-REIC、オンコリティックAd-REIC domainの添加による各種細胞でのREICタンパク質のウエスタンブロット分析での発現を示す。【００６４】
各種細胞においてオンコリティックAd-REICを添加することにより、従来のAd-REICと同等かそれ以上のREICタンパク質の発現が可能となる。REICタンパク質には、生体内で抗癌免疫を活性化する作用が認められる為（WO2009/119874号公報）、オンコリティックAd-REICについても生体内で抗癌免疫を活性化する作用が期待される。【００６５】
実施例３  オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REICの添加による各種細胞での細胞死誘導率の確認
方法
Ad-REIC処理後の殺細胞率を調べるために、細胞を平底６ウェルプレートに播き24時間インキュベートした。細胞を図に記載のMOI(multiplicity of infection）でアデノウイルスで完全培地（300μl）中で１時間処理し、新鮮培地1700μlを添加した。図に示した日数経過後、死細胞率（％）を５視野の顕微鏡観察により測定した。なお、図４〜６において、データは平均±標準偏差で表す。統計的有意差検定は分散分析又はMann-Whitney Uテストで行った。p<0.05で有意差があると判断した。【００６６】
結果
オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REICの添加による各種細胞での細胞死誘導率を図４に示す。図４に示すように、オンコリティックAd-REICは他の化合物に比べ有意に細胞死を誘導した。【００６７】
実施例４  オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REICのヒト前立腺癌治療効果
方法
PC3ヒト前立腺癌細胞2 x 106個／0.1ml PBSを成体雄ヌードマウスの右大腿部に皮下注射により投与した。腫瘍体積が200〜300mm3になった10日後に、アデノウイルスを腫瘍内投与した（図５のDay 0）。腫瘍体積は式1/2 (w1 x w2 x w2)を用いて計算した。この式において、w1は最大腫瘍直径を、w2は最少腫瘍直径を示す。【００６８】
結果
結果を図５に示す。図５に示すように、オンコリティックAd-REICを用いた場合、治療効果は用量依存的に認められた。他の治療群に比較して、オンコリティックAd-REIC（107)の効果が大きかった。実験に供したすべてのマウスに対して明確な毒性は認められなかった。【００６９】
実施例５  オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REICのNK細胞誘導効果
方法
PC3ヒト前立腺癌細胞2 x 106個／0.1ml PBSを成体雄ヌードマウスの左右の大腿部に皮下注射により投与した。このマウスは少なくとも２か所の腫瘍部位を有するマウス腫瘍モデルである。両側の腫瘍体積が200〜300mm3になった10日後に、アデノウイルスを右側の腫瘍内に投与した。ベクター注射３日後に、末梢リンパ球中のナチュラルキラー（NK)細胞を抗NK細胞抗体(eBioscience Inc., 10255 Science Center Drive, San Diego, CA 92121, USA)を用いたフローサイトメトリーにより測定した。【００７０】
結果
結果を図６に示す。図６に示すように、オンコリティックAd-REICを用いた場合、他の治療群に比較して、NK細胞誘導効果は有意に大きかった。【００７１】
実施例６  オンコリティックAd及びオンコリティックAd-REICによる抗原特異的免疫応答の誘導
方法
免疫正常マウスでの担癌モデルを作製し、オンコリティックAd-REIC又はオンコリティックAdを腫瘍内投与後に、抗癌免疫を担う癌特異的CTL細胞を同定する研究を行った。正常の免疫系を持つC57/BL6マウスに、外来抗原であるOVA（卵白アルブミン）遺伝子を導入した悪性胸腺腫細胞[EG-7]株（1.0 x 106 cells）を皮下移植して担癌マウスモデルを作成した。腫瘍径が100mm3以上になった時点で、オンコリティックAd-REIC又はオンコリティックAdを腫瘍内へ注入した（投与量は1.0 x 106pfu/tumor）。治療後3日目に腫瘍を回収し、腫瘍内浸潤リンパ球（TIL）において、OVAに対する特異的CD8陽性CTLが占める割合の動態を、CD8抗体、OVAテトラマー（H-2kb拘束性にOVAエピトープを認識する抗体）を用いてフローサイトメトリーで解析した。【００７２】
結果
結果を図７に示す。図７に示すように、オンコリティックAd-REIC投与のマウスの腫瘍内において、テトラマー陽性のCD8細胞の頻度が上昇していた。すなわち、オンコリティックAd-REIC を投与することにより、オンコリティックAdを投与した場合と比べて、より強いOVA抗原特異的免疫応答が誘導された。本実験の結果を踏まえて、REIC遺伝子をコードしREICタンパク質を発現するオンコリティックAd-REICを腫瘍内に投与することにより、癌抗原特異的免疫応答を誘導することが可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の制限増殖型アデノウイルスは癌治療に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号１、２、３、８、９、１０  合成【００７５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
0006566214.tif 000003
【図３】
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【図４】
0006566214.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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