(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0006464145.tif 000021
から選択されるアルブミン結合残基を含むアルブミン結合側鎖を含む、2〜20mg/mLの成長ホルモン-アルブミン結合剤 コンジュゲートと、緩衝剤と、保存剤と、0.5〜5.0mg/mLのポロキサマーとを含み、pHが6.5〜7.0である、医薬組成物。
【請求項２】
0.5〜4.0mg/mLのポロキサマーを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
1.0〜3.0mg/mLのポロキサマーを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ポロキサマー188を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒスチジン緩衝剤を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
グリシンを含まない、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
pHが6.8である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
2.0〜4.0mg/mLのフェノール又は3.0〜4.0mg/mLのフェノールを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
等張剤を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
等張剤、例えば、20〜50mg/mL又は40〜45mg/mLのマンニトールを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
成長ホルモン-アルブミン結合剤 コンジュゲートが、式AB-GHで表されるように、互いに共有結合(-)した、アルブミン結合側鎖(AB)及び成長ホルモンタンパク質(GH)を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
AB-が、GHにおけるcys残基を介してGHに結合している、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
GHが、ヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも1つの点突然変異を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
GHが、ヒト成長ホルモンと比較して、アミノ酸AA98〜105のいずれか1つに1つの点突然変異を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
GHにおける点突然変異が、Cys突然変異である、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
GHが、L101C突然変異を含む、請求項14に記載の組成物。
【請求項１７】
AB-が、GHのL101Cに結合している、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
成長ホルモン-アルブミン結合剤コンジュゲートが、以下の式
A-W-B-Q-GH
(式中、
GHは、成長ホルモンタンパク質/化合物を表し、
Aは、アルブミン結合残基であり、
Bは、親水性スペーサーであり、
Qは、GH及びBを連結する化学基であり、
Wは、B及びAを連結する化学基であり、
「-」は、共有結合である)
を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
A-W-B-Q-が、GHにおけるL101C突然変異に結合している、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
Aが、
【化２】
0006464145.tif 000022
(式中、*は、Wを介したBへの結合を示す)
から選択される、請求項18又は19に記載の組成物。
【請求項２１】
成長ホルモン-アルブミン結合剤コンジュゲートが、
【化３】
0006464145.tif 000023
0006464145.tif 000024
からなる群から選択される、請求項の1から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
【化４】
0006464145.tif 000025
から選択されるアルブミン結合残基を含むアルブミン結合側鎖を含む、成長ホルモン-アルブミン結合剤 コンジュゲートと、0.5〜2mg/mLのポロキサマー188と、0.5〜2g/mLのヒスチジンと、35〜50mg/mLのマンニトールと、2〜5mg/mLのフェノールとを含み、
pHが6.5〜7.0である、医薬組成物。
【請求項２３】
【化５】
0006464145.tif 000026
から選択されるアルブミン結合残基を含むアルブミン結合側鎖を含む、5〜10mg/mLの成長ホルモン-アルブミン結合剤 コンジュゲートと、1〜3mg/mLのポロキサマー188と、0.5〜1.0mg/mLのヒスチジン緩衝剤と、40〜45mg/mLのマンニトールと、3〜4mg/mLのフェノールとを含み、
pHが6.5〜7.0である、医薬組成物。
【請求項２４】
成長ホルモン欠損症(GHD)又は成人成長ホルモン欠損症(AGHD)の治療方法における使用のための、請求項1から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
週1回の投与による治療方法における使用のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
0.01〜0.08mg/kgの投与量の週1回の投与による成長ホルモン欠損症(GHD)又は成人成長ホルモン欠損症(AGHD)の治療における使用のための、請求項1から25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
成長ホルモン欠損症に罹患した成人患者に週1回投与するための、請求項24〜26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
成長ホルモン欠損症に罹患した患者に投与される組成物であって、投与量当たり0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン-アルブミン結合剤 コンジュゲートが投与される、請求項24又は25に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、成長ホルモン化合物の医薬組成物又は製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン(GH)は、哺乳動物において下垂体前葉により分泌されるポリペプチドホルモンである。種に依存して、GHは、約22kDaの分子量に相当する約190アミノ酸残基で構成されるタンパク質である。GHは、細胞表面受容体であるGH受容体(GHR)に結合し、それを介してシグナル伝達する。GHは、成長を促進し、正常な身体組成、同化作用、及び脂質代謝を維持する上で重要な役割を果たす。また、GHは、例えばグルコース取り込みの減少、脂質分解の増加、並びにアミノ酸取り込み及びタンパク質合成の増加等、中間代謝に対する直接的な効果を有する。また、このホルモンは、脂肪組織、肝臓、腸、腎臓、骨格、結合組織及び筋肉を含む他の組織に対する効果を発揮する。
【０００３】
GHは、2つの保存されたジスルフィド結合を有する「上-上-下-下(up-up-down-down)」トポロジーを示す4へリックスバンドルタンパク質として分類される。具体的には、成熟野生型ヒトGH(配列番号1により特定されるhGH)は、191アミノ酸残基で構成され、53位、165位、182位及び189位に4つのシステイン残基を有し、これは、それぞれC53をC165に、及びC182をC189に結合する2つの分子内ジスルフィド結合を形成することにより、タンパク質の3次元構造を安定化する。
【０００４】
組換えhGH(ソマトロピン)は、例えば、Genotropin(登録商標)(Pfizer社)、Nutropin(登録商標)及びProtropin(登録商標)(Genentech社)、Humatrope(登録商標)(Eli Lilly社)、Serostim(登録商標)(Serono社)、Norditropin(登録商標)(Novo Nordisk社)、Omnitrope(登録商標)(Sandoz社)、Nutropin Depot(登録商標)(Genentech社及びAlkermes社)として市販されている。更に、N末端に追加的なメチオニン残基を有する類似体もまた、例えば、Somatonorm(登録商標)(Pharmacia Upjohn/Pfizer社)として市販されている。
【０００５】
成長ホルモンは、成長ホルモン欠損症を治療するために使用されるが、残念ながら、本明細書において上述されたhGH及び組換え形態は、比較的短い半減期を有し、これは、成長ホルモン治療を受ける患者が、典型的には毎日の成長ホルモン投与を必要とすることを意味する。更に、成長ホルモンはタンパク質であるため、投与形態は注射であり、これは患者に対する毎日の不便さを示す。
【０００６】
より便利な製品を提供するために、持続放出製剤が要求され得、又は、代替として、長期半減期を有する成長ホルモン化合物を提供することが望ましい。
【０００７】
hGHは、US2003/0162949、WO02/055532及びWO06/048777等に記載のような成長ホルモンのプロテアーゼ安定化突然変異、システイン突然変異、及びPEG化型を含む、改変された化学的又は生物学的特性を有するhGH類似体及びそのコンジュゲートを生成するために、広範囲の突然変異生成及び様々な改質に供されている。
【０００８】
増加した半減期等の増加した機能性を有する成長ホルモン化合物の探求は、必要とされる化合物の量及び治療薬の投与頻度を低減することを目標としている。
【０００９】
増加した半減期を有する成長ホルモン化合物は入手可能であり、実験設定においては機能的であるが、化合物は、その安全及び便利な使用を可能とする製剤として患者に利用可能とならなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】US2003/0162949
【特許文献２】WO02/055532
【特許文献３】WO06/048777
【特許文献４】WO2011/089255
【特許文献５】WO11/015649
【特許文献６】WO11/050923
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一態様では、長期保存に好適である長期半減期を有する成長ホルモン化合物を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、成長ホルモンコンジュゲート、特に成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを含んでもよい。そのような成長ホルモンコンジュゲートの化学的性質は、産業及び患者からの要求及び希望を満足する医薬組成物、例えば、容易に調製し、取り扱い、好ましくは室温でもまた保存することができ、容易でより頻度の少ない投薬を可能とする組成物を求める化学者に対してさらなるチャレンジをもたらす。本発明は、組成物の安定性の目安として、振盪及び高温を含む長期のストレスにわたり安定性を維持する医薬組成物に関する。
【００１３】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートと、緩衝剤と、保存剤と、0.5〜5.0mg/mLの界面活性剤、例えば1.0〜3.0mg/mLの界面活性剤とを含む。界面活性剤は、ポロキサマー188及びポリソルベート80から選択され得る。医薬組成物は、更に、6.5〜7.0、好ましくは6.8のpHを確実とするために、ヒスチジン等の緩衝剤を含んでもよい。さらなる実施形態では、組成物は、フェノール等の保存剤、及び/又はマンニトール等の等張剤を含む。
【００１４】
成長ホルモン化合物は、式AB-GHにより表されるように、互いに共有結合(-)したアルブミン結合側鎖(AB)及び成長ホルモンタンパク質(GH)を含む成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートであってもよい。
【００１５】
そのようなコンジュゲートの例は、GHにおけるシステイン残基を介してAB-がGHに結合した分子を含む。組成物のコンジュゲートは、以下の式A-W-B-Q-GH(式中、GHは、成長ホルモンタンパク質又は変異体を表し、Aは、アルブミン結合残基であり、Bは、(親水性)スペーサーであり、Qは、GH及びBを連結する化学基であり、Wは、B及びAを連結する化学基であり、「-」は、共有結合である)で表すことができる。
【００１６】
コンジュゲートの濃度は、2〜15mg/mL等であってもよく、組成物は、週1回等の皮下投与用であってもよく、例えば、組成物は、週1回の皮下投与による治療方法における使用のためのものであってもよい。
【００１７】
本発明の組成物は、成長ホルモン欠損症、又は、患者が循環成長ホルモンのレベルの増加から利益を受ける疾患若しくは障害の治療方法における使用のためのものである。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明による医薬組成物の調製方法、治療方法における使用のための医薬組成物の調製、特に成長ホルモン欠損症の治療方法における使用のための医薬組成物の調製に関する。
【００１９】
本発明は、更に、本発明による医薬組成物の製造のための成長ホルモン化合物の使用に関する。
【００２０】
一態様では、本発明は、成長ホルモン欠損症、又は、患者が循環成長ホルモン活性のレベルの増加から利益を受ける疾患若しくは障害の治療のための、前記医薬組成物を投与する工程を含む治療法に関する。
【００２１】
［配列表］
配列番号1:成熟hGH 1〜191(ソマトトロピン)(本明細書において、短縮してhGHと呼ばれる)
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】異なるpHを有する緩衝液中での5℃で90日間の保存期間中の、0.0mg/mL又は3mg/mLのポロキサマー188を含む医薬組成物中のHMWP含量を示すグラフである。
【図２】pH6.0の組成物中の異なる濃度の様々な界面活性剤を含む医薬組成物中のHMWP含量を示すグラフである。5℃で90日の期間の保存中に測定されたHMWP含量が示されている。
【図３】pH6.2及び6.8における様々な量の界面活性剤(ポロキサマー188)を有する一連の組成物中のHMWP含量を示すグラフである。30℃で180日の期間の保存中に測定されたHMWP含量が示されている。
【図４】物理的ストレス(ピペッティング及び振盪)後の、様々な量のポロキサマー(0mg/mL、1.0mg/mL、3.0mg/mL)を含む様々なpH(6.2、6.5及び6.8)の一連の医薬組成物の340nmでのODを示すグラフである。図A及び図Bは、同じデータを表すが、左軸の異なる部分に焦点を置いており、Bは、低い範囲の測定値を可視化するために低い範囲を拡大したものである。
【図５Ａ】異なる成長ホルモン化合物(WT hGH)を含む一連の医薬組成物の340nmでのODを示すグラフである。
【図５Ｂ】異なる成長ホルモン化合物(GH L101C)を含む一連の医薬組成物の340nmでのODを示すグラフである。
【図５Ｃ】異なる成長ホルモン化合物(コンジュゲートI)を含む一連の医薬組成物の340nmでのODを示すグラフである。
【図６】日本人対象(A)及び非アジア系対象(B)における平均IGF-I標準偏差スコアを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本出願は、成長ホルモン化合物の医薬組成物に関する。本発明による組成物又は製剤は、製剤の製造中及び保存中の両方において、成長ホルモン化合物の活性の実質的な損失、改質、又は別様の悪影響をもたらすことなく、成長ホルモン化合物に適応することができるはずである。
【００２４】
本発明の態様は、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【００２５】
医薬組成物は、液体組成物として調製されてもよく、液体組成物は、溶液、懸濁液又はエマルション等であってもよい。
【００２６】
さらなる実施形態では、そのような組成物は、少なくとも50%w/wの水、例えば50〜80%w/w、例えば50〜70%w/w、例えば50〜60%w/wの水を含む水性組成物である。
【００２７】
成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲート
組換えhGHに対して成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートのより低頻度の投与に対応するために、コンジュゲートは、十分に高い濃度で製剤化されなければならない。コンジュゲートの濃度は、mg/mL又はモル濃度で表すことができ、後者は、アルブミン結合剤側鎖に依存する様々な分子量のため、より正確であるとみなすことができる。
【００２８】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、2.0mg/mLから20.0mg/mL、例えば3.0〜10.0mg/mLの濃度の成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを含む。必要とされる投与量によっては、様々な濃度の活性成分、例えば成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを有する医薬組成物を保存することができることが有利となり得る。一実施形態では、濃度は、例えば6.0〜8.0mg/mL、又は例えば6.0〜7.0mg/mLである。一実施形態では、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの濃度は、6.7mg/mLである。代替の実施形態では、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの濃度は、2〜5mg/mL、例えば2.5〜4mg/mLである。さらなる代替例において、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの濃度は、8〜12mg/mL、例えば9〜11mg/mLである。好ましい実施形態では、医薬組成物のさらなる成分の組成及び濃度は不変のままであり、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの濃度のみが調節される。
【００２９】
成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートは、アルブミン結合側鎖を成長ホルモンタンパク質にコンジュゲートすることにより得られる。したがって、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートは、式AB-GHにより表されるように、互いに共有結合(-)したアルブミン結合側鎖(AB)及び成長ホルモンタンパク質(GH)を含み得る。アルブミン結合側鎖(AB)は、アルブミン結合残基(A)、及び任意選択で化学物質(W)により互いに連結されたスペーサー(B)で構成され得る。成長ホルモンへの結合は、化学基Qを介してもよい。したがって、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートは、拡大された式GH-Q-B-W-Aにより表すことができる。一実施形態では、本発明による組成物は、式GH-Q-B-W-Aの成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを含む。
【００３０】
突然変異又は改質を含む任意の成長ホルモン化合物において、それらの変化が野生型成長ホルモンと比較して活性に影響するかどうかを考慮することが重要である。複数の試験が当業者に利用可能であり、本出願の目的において、成長ホルモン化合物、タンパク質、又はコンジュゲートは、全て生物学的に活性であると考えられ、例えば、当該技術分野において公知であり、WO2011/089255等に記載されている、BAFアッセイ又はマウス若しくはラット試験において測定され得る成長ホルモン受容体を刺激することができると考えられる。いくつかのアッセイにおける活性は、野生型成長ホルモンと比較して減少し得るが、分子の構造変化に起因する増加した半減期がこれを打ち消し、長期的効果を有する分子をもたらし得ることが留意される。
【００３１】
ヒト成長ホルモン(hGH)は、本明細書において、配列番号1により定義されるような191アミノ酸残基の成熟ヒト成長ホルモンタンパク質の配列を説明するために使用される。
【００３２】
ヒト成長ホルモンの配列における突然変異が許容されるが、最小限の数の突然変異が好ましく、これは配列番号1との同一性のレベルとして表現され得る。一実施形態では、コンジュゲートのGHは、hGHと少なくとも95%同一、例えばhGHと96%、例えば97%、例えば98%、又は例えば99%同一である。
【００３３】
さらなる実施形態では、コンジュゲートのGHは、hGHと比較して最大4つの点突然変異、例えば最大3つの点突然変異、例えばhGHと比較して最大2つの点突然変異、又は例えば厳密に1つの点突然変異を有する。
【００３４】
GHに対するアルブミン結合側鎖の結合は、野生型残基又は突然変異アミノ酸残基を介してもよい。
【００３５】
一実施形態では、成長ホルモン(GH)は、ヒト成長ホルモンと比較して、アミノ酸AA98〜105のいずれか1つにおいて点突然変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン(GH)は、Cys突然変異を含み、これは、GH配列におけるシステインの野生型残基の置換である。一実施形態では、GHは、ヒト成長ホルモンと比較して、アミノ酸AA98〜105のいずれか1つにおいてCys突然変異を含む。
【００３６】
一実施形態では、成長ホルモン(GH)は、L101C突然変異を含む。
【００３７】
一実施形態では、側鎖(AB)は、ループ2(L2、AA99〜106)におけるアミノ酸残基、又は成長ホルモン変異体における対応する残基を介して成長ホルモンに結合している。
【００３８】
一実施形態では、本発明による組成物は、以下の式A-W-B-Q-GH
(式中、
GHは、成長ホルモンポリペプチドを表し、
Aは、アルブミン結合残基であり、
Bは、(親水性)スペーサーであり、
Wは、A及びBを連結する化学基であり、
Qは、GH及びBを連結する化学基-NH-C(O)-(CH2)-であり、
「-」は、共有結合である)
を有する成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートを含む。
【００３９】
1つのそのような実施形態では、A-W-B-Q-は、GHにおけるCys残基を介してGHに結合しているが、これは、追加的なCys残基を導入するCys突然変異等であってもよい。
【００４０】
一実施形態では、A-W-B-Q-は、GHのL101Cに結合している。
【００４１】
さらなる実施形態では、Aは、
【００４２】
【化１】
0006464145.tif 000002
【００４３】
(式中、*は、Wを介したBへの結合を示す)
から選択される。
【００４４】
さらなる実施形態では、Wは、式Wa-Wb(式中、Waは、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-から選択され、Wbは、-CH2-C6H12-C(=O)-、-OEG-、-Lys、-Glu、-γ-Glu-、-CH-、-CH-(CH2-SO3H)-C(O)-、-S(O)2-(CH2)3-C(O)-、又は原子価結合から選択される)を有する。
【００４５】
さらなる実施形態では、Wは、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、又は原子価結合から選択される。さらなる実施形態では、Wは、-C(O)NH-S(O)2-(CH2)3-C(O)-である。
【００４６】
一実施形態では、スペーサーBは、親水性スペーサーBである。Bの親水性は、アルブミン結合側鎖(AB-又はA-W-B-Q-)及び得られる成長ホルモンコンジュゲートの水に対する溶解度を増加させる。したがって、そのような側鎖及び化合物は、処理中及び保存中の両方において、水溶液に非常に適している。したがって、化合物の少なくとも一部は、水分子と相互作用し、したがって水及び他の極性物質若しくは溶媒に溶解する傾向を有する。
【００４７】
一実施形態では、スペーサーBは、少なくとも1つのOEGモチーフ、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸基、すなわち-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-を含む。
【００４８】
さらなる特定の実施形態では、親水性スペーサー(B)は、少なくとも2つのOEGモチーフを含む。そのようなOEGモチーフの配向は、一実施形態では、-C(O)-が成長ホルモン化合物に最も近接し、一方-NH-がアルブミン結合残基に最も近接するような配向である。
【００４９】
2つのOEGモチーフを含む追加的な実施形態では、2つのモチーフは、同一の配向又は異なる配向を有する。一実施形態では、2つのそのようなOEGモチーフは、お互いに隣り合って位置し、一方代替の実施形態では、そのようなOEGモチーフは、1つ又は複数の共有結合原子により隔てられている。
【００５０】
一実施形態では、親水性スペーサーは、少なくとも1つのグルタミン酸残基を含む。アミノ酸であるグルタミン酸は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマカルボキシ基は、リシンのイプシロンアミノ基と、又は、存在する場合にはOEG分子のアミノ基と、又は、存在する場合には別のGlu残基のアミノ基とアミド結合を形成するために使用され得る。代替として、アルファカルボキシ基は、リシンのイプシロンアミノ基と、又は、存在する場合にはOEG分子のアミノ基と、又は、存在する場合には別のGlu残基のアミノ基と同様のアミド結合を形成するために使用され得る。Gluのアミノ基は、一方で、アルブミン結合残基のカルボキシ基と、又は、存在する場合にはOEGモチーフのカルボキシ基と、又は、存在する場合には別のGluのガンマカルボキシ基若しくはアルファカルボキシ基とアミド結合を形成し得る。1つのGluのアミノ基の第2のGluのガンマカルボキシ基への結合は、「ガンマ-Glu」モチーフと呼ぶことができる。
【００５１】
一実施形態では、親水性スペーサーは、少なくとも1つの組み合わされたOEG-Gluモチーフ(-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)NH-CH(C(O)OH)-(CH2)2-C(O)-)、又は少なくとも1つの組み合わされたGlu-OEGモチーフ(-NH-CH(C(O)OH)-(CH2)2-C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-)、又はそれらの組合せを含み、そのようなGlu-OEG及びOEG-Gluモチーフは、1つ又は複数の共有結合した原子により隔てられてもよく、又は、Gluのアミド結合により互いに直接結合してガンマ-Gluを形成してもよい。
【００５２】
一実施形態では、親水性スペーサーは、少なくとも1つの組み合わされたOEG-Lysモチーフ(-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)NH-CH(C(O)OH)-(CH2)4-NH-)、又は少なくとも1つの組み合わされたLys-OEGモチーフ(-NH-CH(C(O)OH)-(CH2)4-NHC(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-)、又はそれらの組合せを含み、そのようなLys-OEG及びOEG-Lysモチーフは、1つ又は複数の共有結合した原子により隔てられてもよい。
【００５３】
さらなる実施形態では、Bは、式-X1-X2-X3-
(式中、X1、X2及びX3は、独立して、原子価結合、並びに全てペプチド結合により連結されてもよい-OEG-、-Lys-、-Glu-及び-γ-Glu-のエレメントから選択され、X3は、好ましくは-OEG-又は-Lys-である)
を有する。
【００５４】
一実施形態では、Bは、式-X1-X2-X3-X4-、
(式中、
X4は、-NH-CH(-COOH)-(CH2)4NH-であり、
X3は、-OEG-であり、
X2は、-γ-Glu-γ-Glu-であり、
X1は、-OEG-である)
を有する。
【００５５】
一実施形態では、Bは、式-X1-X2-X3-X4-
(式中、
X4は、-NH-CH(-COOH)-(CH2)4NH-であり、
X3は、-OEG-であり、
X2は、-γ-Glu-γ-Glu-であり、
X1は、原子価結合である)
を有する。
【００５６】
一実施形態では、Bは、式-X1-X2-X3-
(式中、
X1は、-W1-[(CHR1)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR2)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR3)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR4)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR5)l5-W6]m7-であり、
l1、l2、l3、l4及びl5は、独立して、0〜16から選択され、
m1、m3、m4、m6及びm7は、独立して、0〜10から選択され、
m2及びm5は、独立して、0〜16から選択され、
n1、n2、n3及びn4は、独立して、0〜6から選択され、
R1、R2、R3、R4及びR5は、独立して、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CH2S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2又はC1〜6-アルキルから選択され;アルキル基は、任意選択で、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN又は-OHで置換されてもよく、
E1及びE2は、独立して、-O-、-N(R6)-、-N(C(O)R7)-又は原子価結合から選択され、R6及びR7は、独立して、水素又はC1〜6-アルキルを表し、
W1からW6は、独立して、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-(CH2)s1C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、又は原子価結合から選択され;s1及び2は、独立して、0、1、2、3又は4である)
を有する。
【００５７】
さらなる実施形態では、l1、l2、l3、l4及びl5は、独立して、0〜6である。さらなる実施形態では、m1、m3、m4、m6及びm7は、独立して、0〜6である。さらなる実施形態では、m2及びm5は、独立して、0〜10である。さらなる実施形態では、n1、n2、n3及びn4は、独立して、0〜4である。さらなる実施形態では、E1及びE2は、独立して、-O-又は-N(R6)-又は原子価結合から選択される。
【００５８】
さらなる実施形態では、W1からW6は、独立して、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2NHC(O)-、-(CH2)s1C(O)NH-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-NHC(O)C1〜6-アルキル、-C(O)NHC1〜6-アルキル又は原子価結合からなる群から選択され;アルキル基は、任意選択でオキソで置換されている。
【００５９】
さらなる実施形態では、R1、R2、R3、R4及びR5は、独立して、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OH又はC1〜6-アルキルから選択され;C1〜6-アルキル基は、任意選択で、-C(O)OH、-C(O)NH2又は-S(O)2OHで置換されている。
【００６０】
さらなる実施形態では、-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR2)I2-W3]m3}n2-及び-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR4)l4-W5]m6}n4-(式中、E1及びE2は、-O-である)は、
【００６１】
【化２】
0006464145.tif 000003
【００６２】
(式中、*は、結合点、すなわち開いた結合を指すように意図される)
から選択される。
【００６３】
さらなる実施形態では、Bは、
【００６４】
【化３】
0006464145.tif 000004
【００６５】
から選択される。
【００６６】
さらなる実施形態では、GHコンジュゲートは、
【００６７】
【化４】
0006464145.tif 000005
【化５】
0006464145.tif 000006
【００６８】
から選択される。
【００６９】
医薬賦形剤
本明細書において上述されたように、本発明は、成長ホルモンコンジュゲートと、製剤を安定化することができる界面活性剤とを含む医薬組成物に関する。
【００７０】
組成物は、更に、医薬賦形剤、例えば緩衝剤系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤及びさらなる界面活性剤を含んでもよい。便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000年を参照されたい。
【００７１】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、液体製剤である。本発明の一実施形態では、医薬組成物は、水性組成物、すなわち、成分が水中に溶解又は懸濁した組成物である。そのような組成物は、典型的には、溶液又は懸濁液である。組成物が、水中に溶解し得ない成分を含む場合、組成物は、2つの液体、多くは水及び油又は脂肪酸系液体のエマルションであってもよい。別の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物であり、医師又は患者は使用前にこれに溶媒及び/又は希釈剤を添加する。
【００７２】
ヒト成長ホルモンは、pHの変化に対して脱アミノ化及び凝集の両方により反応する、不安定なタンパク質である。したがって、新たな成長ホルモン化合物に対して、高い安定性を提供するpH及び緩衝剤組成物を決定することが高い関心の的である。
【００７３】
一実施形態では、本発明の組成物は、5.0〜8.0、例えば6.0〜7.5、例えば6.5〜7.0のpHを有する。pHはまた、6.6〜6.9、又は6.7〜6.9であってもよい。さらなる実施形態では、組成物のpHは、6.6、6.7、6.8、6.9又は7.0である。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、医薬組成物は、グリシンを含まない。一実施形態では、組成物は、緩衝剤としてヒスチジンを含む。
【００７５】
一実施形態では、組成物は、ヒスチジンを含み、6.5〜7.0のpHを有する。
【００７６】
一実施形態では、ヒスチジンの濃度は、0.5mg/mLから2mg/mL、例えば0.6〜1.0mg/mL、例えば0.6〜0.8mg/mL、又は0.6〜0.7mg/mL、例えば0.65〜0.70mg/mL、又は約0.7mg/mLである。代替の実施形態では、ヒスチジンの濃度は、1.0〜2.0mg/mL、又は例えば1.5〜1.8mg/mL、又は例えば1.5〜1.6mg/mL、例えば約1.5mg/mLである。
【００７７】
成長ホルモン、特に成長ホルモンコンジュゲートは、凝集する望ましくない傾向を示す。この場合、成長ホルモンに連結した疎水性アルブミン結合剤は、医薬組成物中に希釈された場合、分子の凝集傾向の増加をもたらし得る。
【００７８】
界面活性剤は、疎水性の油性物質の水溶性を増加させる、又は、異なる疎水性、ひいては逆の溶解度を有する2つの物質の混和性を別様に増加させるのに役立ち得る。界面活性剤は、更に、液体医薬組成物中の界面活性剤とタンパク質分子との間の相互作用による凝集を低下させるのに役立ち得る。本発明の一実施形態では、組成物は、界面活性剤を含む。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態では、界面活性剤は、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマーである。一実施形態では、界面活性剤は、Pluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188及び407を含むポロキサマー、並びにTriton X-100等の非イオン性界面活性剤から選択される。一実施形態では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体(ツイーン、例えばTween-20、Tween-40、Tween-80及びBrij-35)から選択される。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート80である。一実施形態では、本発明の組成物は、ポロキサマー188及びポリソルベート80から選択される界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー188である。
【００８０】
一実施形態では、組成物は、0.1〜5.0mg/mLの界面活性剤、例えば0.5〜3.0mg/mLの界面活性剤、例えばポロキサマー188又はポリソルベート80を含む。
【００８１】
一実施形態では、組成物は、1mg/mLのポロキサマー188を含む。
【００８２】
一実施形態では、組成物は、ヒスチジンを含み、6.5〜7.0のpHを有し、界面活性剤を含む。一実施形態では、組成物は、ヒスチジンを含み、6.5〜7.0のpHを有し、0.1〜5.0mg/mLのポロキサマー188、例えば1.0〜3.0mg/mLのポロキサマー188、又は3mg/mLを含む。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態では、組成物は、薬学的に許容される保存剤を更に含む。本発明のさらなる実施形態では、保存剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3-(p-クロルフェノキシ)プロパン-1,2-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態では、組成物は、フェノールを含む。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、保存剤は、0.1mg/mLから20mg/mLの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、保存剤は、0.1mg/mLから5mg/mLの濃度で存在する。一実施形態では、本発明による組成物は、2.0〜4.0mg/mLのフェノール、例えば3.0〜4.0mg/mLのフェノールを含む。
【００８６】
医薬組成物を調製するための方法
医薬組成物の調製の出発点として、成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートは、溶液、通常は水溶液として提供される。この出発溶液は、好ましくは、医薬組成物の調製中の希釈を可能とするために、高濃縮されている。一実施形態では、成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートの出発溶液は、15mg/mL超、例えば15〜30mg/mL、又は例えば15〜25mg/mLである。
【００８７】
通常の調製方法は、賦形剤(水中の緩衝剤、界面活性剤、等張剤及び保存剤)を、最終組成物の濃度の2倍濃度の各賦形剤を含む2倍緩衝溶液中に溶解させることである。成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲート溶液(出発溶液)の濃度に依存して、最終医薬組成物の濃度に達するために必要な量を含めるように、適切な体積のこの溶液を添加する。混合は、化合物溶液を徐々に添加し、撹拌による連続的混合を確実とすることにより行うことができる。最後に、全体積に到達するまで水を添加する。pHは、化合物溶液、2倍緩衝液及び最終医薬組成物の1つ又は複数等、異なる工程で調節され得る。
【００８８】
当業者は、例えば、異なる混合関係が必要である場合、又は最終組成物の成分の1つ若しくは複数が化合物溶液中にすでに存在する場合、2倍緩衝液の濃度を調節するために様々な様式で方法を修正する方法を認識し、そのため、2倍緩衝液中のそのような成分の濃度は、最終濃度の2倍未満であるべきである。
【００８９】
本明細書における実施例8及び実施例9は、上記の一般的方法に調整を加えたGH組成物の調製を説明している。重要な情報は、GHと高濃度のフェノールとの混合を回避する必要があることである。
【００９０】
治療方法
背景技術の項において説明されたように、成長ホルモン生成物は、成長ホルモン欠損症の治療に好適である。基本的に、本発明による医薬組成物は、患者が循環成長ホルモン活性の増加から利益を受ける任意の疾患又は障害の治療における使用のためのものであってもよい。この治療において、成長ホルモンタンパク質が投与される。代替として、成長ホルモン活性を提供するために、長期半減期を有する成長ホルモン化合物が投与されてもよい。
【００９１】
本発明の一態様は、治療、特に小児成長ホルモン欠損症及び/若しくは成人成長ホルモン欠損症、又は、患者が本明細書に記載のような成長ホルモンのレベルの増加から利益を受ける他の疾患若しくは状態の治療用の医薬の製造のための、成長ホルモン組成物の使用に関する。
【００９２】
本発明は、更に、治療方法における使用のための本発明による医薬組成物の調製、及び治療方法における使用のための医薬組成物の態様に関する。
【００９３】
そのような実施形態では、本発明による医薬組成物は、小児成長ホルモン欠損症及び/又は成人成長ホルモン欠損症の治療又は予防の方法における使用のためのものである。循環成長ホルモンの濃度の増加が有益となり得る他の疾患又は障害もまた、本発明の医薬組成物を使用して治療又は予防され得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、循環成長ホルモンの量の増加による利益が観察される疾患又は状態を治療するための方法における使用のためのものである。そのような疾患又は状態は、成長ホルモン欠損症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染(HIV/HALS小児);在胎期間の短い(SGA)低身長出生児;超低出生時体重(VLBW)であるがSGAでない小児における低身長;骨格異形成;低軟骨形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD;脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、及び手指等の、長骨における骨折若しくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、及び足の趾節骨底等の、海綿骨における骨折若しくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、若しくは肩における腱若しくは靭帯の手術後の患者;仮骨延長法を施されている、若しくはこれを経過しつつある患者;股関節若しくは椎間板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術、又は膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、若しくは顎関節等における装具固定術後の患者;ネイル、スクリュー、及びプレート等の骨合成材料が体内に固定された患者;骨折の偽関節若しくは変形治癒を示す患者;例えば脛骨又は第一趾からの骨切除術後の患者;移植片植え込み後の患者;外傷若しくは関節炎により引き起こされる、膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);APCDにおける栄養不良関連心血管疾患;APCDにおける悪液質の可逆化;APCDにおけるがん;APCDにおける慢性閉塞性肺疾患;APCDにおけるHIV;APCDである高齢者;APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;IBD、UC、肝機能不全;HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満;HIV関連脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物の解毒、若しくは神経外傷後の患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;代謝症候群;グルココルチコイドミオパシー;或いは小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長を含む。成長ホルモンはまた、筋肉組織、神経組織、若しくは創傷の治癒の加速化;損傷した組織への血流の加速化若しくは改善;又は損傷した組織における感染率の低減にも使用されている。
【００９４】
一実施形態では、成長ホルモン化合物及びその組成物は、小児GHD、成人GHD(AGHD)、ターナー症候群(TS)、ヌーナン症候群、特発性低身長(ISS)、在胎期間の短い低身長(SGA)、プラダー-ウィリー症候群(PWS)、慢性腎不全(CRI)、骨格異形成、SHOX不全、AIDS消耗、HIV関連脂肪異栄養症(HARS)、ステロイド依存性疾患を任意選択で含む短腸症候群、嚢胞性線維症、及び線維筋痛の治療のためのものである。
【００９５】
一実施形態では、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートは、本明細書に記載のような医薬組成物の製造における使用のためのものである。
【００９６】
一実施形態では、本発明は、上述の疾患又は状態を治療する方法に関し、本発明による医薬組成物の活性は、前記疾患又は状態の治療に有用である。医薬組成物、例えば成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの投与は、患者における循環成長ホルモン化合物の量の増加と関連した治療上の利益をもたらす。一実施形態では、前記方法は、患者に、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与し、それにより前記患者の症状を改善する工程を含む。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者への、治療有効量の本発明による医薬組成物の投与を含む方法に関する。したがって、本発明は、これらの疾患又は状態を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明による医薬組成物中の治療有効量の成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを投与する工程を含む方法を提供する。
【００９８】
本発明の化合物の「治療有効量」は、本明細書において使用される場合、所与の疾患及びその合併症の臨床兆候を治癒、軽減又は部分的に停止するのに十分な量を意味する。これを達成するための適切な量が、「治療有効量」として定義される。
【００９９】
それぞれの目的での有効量は、例えば、疾患又は傷害の重症度、並びに対象の体重、性別、年齢及び全身状態に依存する。
【０１００】
本明細書において説明されるように、医薬組成物の成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートは、各投薬後の患者における化合物への曝露を増加させることを目指した長期半減期を有し、医薬組成物の投与計画は、効果的な曝露を達成するように調節されるべきである。
【０１０１】
一実施形態では、医薬組成物は、皮下注射による投与用のものである。
【０１０２】
一実施形態では、医薬組成物は、皮下注射による治療方法における使用のためのものである。
【０１０３】
IGF-1応答はGH機能性の特徴であるため、治療有効投与量は、所与の成長ホルモンアルブミン-結合剤 コンジュゲートのIFG-1応答に基づく推定値であってもよい。図6に見られるように、コンジュゲートIの投与は、全ての投与量において、IGF-1レベルの上昇を伴う用量依存的IGF-1応答をもたらし、そのような化合物が週1回の投与に好適であることを示している。
【０１０４】
一実施形態では、医薬組成物は、成長ホルモンコンジュゲートを投与量当たり約0.01〜2.0mg/kgの量で投与する治療方法における使用のためのものである。成人においては、組成物は、投与量当たり0.02〜0.10mg/kg、又は例えば0.02〜0.08mg/kg、又は例えば0.03〜0.06mg/kg、0.02〜0.05mg/kg、又は例えば0.02〜0.04mg/kgの成長ホルモンコンジュゲートを投与するためのものであってもよい。さらなる実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者が小児である場合、投与量当たり0.05〜0.18mg/kg、例えば0.08〜0.16mg/kgの成長ホルモンコンジュゲートを投与する治療方法における使用のためのものである。分かるように、範囲は、成人に対してはより広くてもよく、性別に依存し得るが、通常、0.01〜0.08mg/kgの範囲内である。
【０１０５】
この治療オプションは、主に、いくつかの組換え成長ホルモン生成物の1日1回の注射である。
【０１０６】
一実施形態では、医薬組成物は、約週1回、若しくは7日毎の投与による治療方法における使用のためのものであり、又は、おそらくは更に10日毎に1回の投与のためのものである。
【０１０７】
本明細書において本発明のある特定の特徴を例示及び説明したが、当業者は、多くの修正、置換、変更、及び均等物を思い付くだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような修正及び変更の全てを、本発明の真の精神に含まれるものとして網羅することを意図することを理解されたい。
【０１０８】
本発明は、以下の限定されない実施形態において更に説明され、更に後述される実施例により例示される。
【０１０９】
実施形態
1.  a)2〜20mg/mLの成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートと、
b)0.5〜5.0mg/mLの界面活性剤と
を含む医薬組成物。
【０１１０】
2.  0.5〜4.0mg/mLの界面活性剤を含む、実施形態1に記載の組成物。
【０１１１】
3.  1.0〜3.0mg/mLの界面活性剤を含む、実施形態1に記載の組成物。
【０１１２】
4.  約1.0mg/mLの界面活性剤を含む、実施形態1に記載の組成物。
【０１１３】
5.  ポロキサマー188及びポリソルベート80から選択される界面活性剤を含む、実施形態1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１４】
6.  界面活性剤として1mg/mLのポロキサマー188を含む、実施形態1に記載の組成物。
【０１１５】
7.  緩衝剤を含む、実施形態1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１６】
8.  酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される緩衝剤を含む、実施形態1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１７】
9.  シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン及びアルギニンからなる群から選択される緩衝剤を含む、実施形態1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１８】
10.  リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタンからなる群から選択される緩衝剤を含む、実施形態1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１９】
11.  グリシンを含まない、実施形態1から10のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２０】
12.  ヒスチジン緩衝剤を含む、実施形態1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２１】
13.  0.5〜2mg/mLの濃度のヒスチジン緩衝剤を含む、実施形態1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２２】
14.  組成物のpHが、6.0〜8.0、例えば5〜7.0、又は例えば約6.8である、実施形態1から13のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２３】
15.  等張剤を含む、実施形態1から14のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２４】
16.  組成物が、等張剤を含み、等張剤が、糖アルコールである、実施形態1から14のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２５】
17.  組成物が、等張剤を含み、等張剤が、マンニトールである、実施形態1から14のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２６】
18.  20〜50mg/mLの等張剤を含む、実施形態1から14のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２７】
19.  20〜50mg/mLのマンニトールを含む、実施形態1から18のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２８】
20.  40〜50mg/mLのマンニトールを含む、実施形態1から18のいずれか一項に記載の組成物。
【０１２９】
21.  保存剤を含む、実施形態1から18のいずれか一項に記載の組成物。
【０１３０】
22.  保存剤としてフェノールを含む、実施形態1から18のいずれか一項に記載の組成物。
【０１３１】
23.  2.0〜4.0mg/mLのフェノール、例えば3.0〜4.0mg/mLを含む、実施形態1から22のいずれか一項に記載の組成物。
【０１３２】
24.  成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートが、式AB-GHにより表されるように、互いに共有結合(-)したアルブミン結合側鎖(AB)及び成長ホルモンタンパク質(GH)を含む、実施形態1に記載の組成物。
【０１３３】
25.  GHが、ヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも1つの点突然変異を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の組成物。
【０１３４】
26.  成長ホルモンが、ヒト成長ホルモンと比較して、アミノ酸AA98〜105のいずれか1つに1つの点突然変異を含む、実施形態25に記載の組成物。
【０１３５】
27.  点突然変異が、Cys突然変異である、実施形態25に記載の組成物。
【０１３６】
28.  成長ホルモンが、L101C突然変異を含む、実施形態25に記載の組成物。
【０１３７】
29.  側鎖(AB)が、ループ2(L2、AA99〜106)におけるアミノ酸残基、又は成長ホルモン変異体における対応する残基を介して成長ホルモンに結合している、実施形態24に記載の組成物。
【０１３８】
30.  AB-が、GHにおけるCys残基を介してGHに結合している、実施形態24に記載の組成物。
【０１３９】
31.  AB-が、GHのL101Cに結合している、実施形態24に記載の組成物。
【０１４０】
32.  成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが、以下の式
A-W-B-Q-GH
(式中、
GHは、成長ホルモンタンパク質/化合物を表し、
Aは、アルブミン結合残基であり、
Bは、(親水性)スペーサーであり、
Qは、GH及びBを連結する化学基であり、
Wは、B及びAを連結する化学基であり、
「-」は、共有結合である)
を有する、実施形態1から31のいずれか一項に記載の組成物。
【０１４１】
33.  A-W-B-Q-が、GHにおけるL101C突然変異に結合している、実施形態32に記載の組成物。
【０１４２】
34.  化学基Qが、-NH-C(O)-(CH2)-である、実施形態32又は33に記載の組成物。
【０１４３】
35.  Aが、
【０１４４】
【化６】
0006464145.tif 000007
【０１４５】
(式中、*は、Wを介したBへの結合を示す)
から選択される、実施形態32又は33又は34に記載の組成物。
【０１４６】
36.  親水性スペーサーBが、少なくとも1つのOEGモチーフ、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸基、すなわち-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-を含む、実施形態32、33、34又は35に記載の組成物。
【０１４７】
37.  Wが、式Wa-Wb
(式中、Waは、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)-、-C(O)-、-C(O)O-及び-OC(O)-から選択され、
Wbは、-CH2-C6H12-C(=O)-、-OEG-、-Lys、-Glu、-γ-Glu-、-CH-、-CH-(CH2-SO3H)-C(O)-、-S(O)2-(CH2)3-C(O)-及び原子価結合から選択される)
を有する、実施形態32から36のいずれか一項に記載の組成物。
【０１４８】
38.  Wが、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、又は原子価結合から選択される、実施形態32から36のいずれか一項に記載の組成物。
【０１４９】
39.  成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが、
【０１５０】
【化７】
0006464145.tif 000008
【化８】
0006464145.tif 000009
【０１５１】
からなる群から選択される、実施形態1から38のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５２】
40.  液体である、実施形態1から39のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５３】
41.  水性組成物である、実施形態1から40のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５４】
42.  治療方法における使用のための、実施形態1から41のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５５】
43.  成長ホルモン欠損症の治療方法における使用のための、実施形態1から42のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５６】
44.  皮下注射による投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から43のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５７】
45.  1日1回より少ない投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から44のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５８】
46.  週2回より少ない投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から45のいずれか一項に記載の組成物。
【０１５９】
47.  週1回の投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から46のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６０】
48.  最大週1回の皮下投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から47のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６１】
49.  2〜20mg/mLの成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲート(GH-AB)と、緩衝剤と、保存剤と、0.5〜5.0mg/mLの界面活性剤とを含む、実施形態1から48のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６２】
50.  3〜10mg/mLの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートを含む、実施形態1から49のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６３】
51.  0.01〜0.20mg/kg、例えば0.02〜0.08mg/kgの成長ホルモンコンジュゲートの週1回の投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から50のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６４】
52.  投与量当たり0.01〜0.16mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートの投与用の、治療方法における使用のための実施形態1から51のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６５】
53.  0.01〜0.08mg/kgの週1回の投与量による成長ホルモン欠損症の治療方法における使用のための、実施形態1から52のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６６】
54.  成人への投与による治療方法における使用のための、実施形態1から53のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６７】
55.  成人成長ホルモン欠損症(AGHD)の治療方法における使用のための、実施形態1から54のいずれか一項に記載の組成物。
【０１６８】
56.  成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートと、ポロキサマー188から選択される界面活性剤と、0.5〜2g/mLのヒスチジンと、35〜50mg/mLのマンニトールと、2〜5mg/mLのフェノールとを含む医薬組成物。
【０１６９】
57.  成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートと、0.5〜2mg/mLのポロキサマー188と、0.5〜2g/mLのヒスチジンと、35〜50mg/mLのマンニトールと、2〜5mg/mLのフェノールとを含む医薬組成物。
【０１７０】
58.  5〜10mg/mLの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートと、
1〜3mg/mLのポロキサマー188と、
0.5〜1.0mg/mLのヒスチジン緩衝剤と、
40-45mg/mLのマンニトールと、
3〜4mg/mLのフェノールと
を含む医薬組成物。
【０１７１】
59.  実施形態1から58のいずれか一項に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【０１７２】
60.  成長ホルモン欠損症の治療のための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の実施形態1から58のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【０１７３】
61.  患者が循環成長ホルモンのレベルの増加から利益を受けることができる疾患又は状態を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、実施形態1から58のいずれか一項に記載の医薬組成物中の治療有効量の成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを投与する工程を含む方法。
【０１７４】
62.  組成物が、成人成長ホルモン欠損症(AGHD)に罹患した患者に最大週1回投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１７５】
63.  組成物が、成人成長ホルモン欠損症(AGHD)に罹患した患者に投与され、投与量当たり0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１７６】
64.  組成物が、成人成長ホルモン欠損症(AGHD)に罹患した患者に投与され、0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが最大週1回投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１７７】
65.  組成物が、成長ホルモン欠損症(GHD)に罹患した患者に週1回投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１７８】
66.  組成物が、成長ホルモン欠損症(GHD)に罹患した患者に投与され、投与量当たり0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１７９】
67.  組成物が、成長ホルモン欠損症(GHD)に罹患した患者に投与され、0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが週1回投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１８０】
68.  組成物が、成人患者に最大週1回投与される、請求項60に記載の方法。
【０１８１】
69.  組成物が、成人成長ホルモン欠損症(AGHD)に罹患した患者に最大週1回投与される、実施形態60に記載の方法。
【０１８２】
70.  組成物が、成人成長ホルモン欠損症(AGHD)に罹患した患者に投与され、投与量当たり0.01〜0.08mg/kgの成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートが投与される、実施形態60に記載の方法。
【実施例】
【０１８３】
成長ホルモン アルブミン結合剤 コンジュゲートは、標準的方法に従って調製され得る。成長ホルモンタンパク質は、大腸菌等の好適な宿主において発現され、精製される。コンジュゲーション反応は、当該技術分野において当業者に知られている方法に従って行われてもよい。そのようなコンジュゲートを調製するのに有用な一般的方法が、本明細書に記載の特定のコンジュゲートに関する詳細を含めて以下に示される。当業者は、当該技術分野における一般的知識に基づいて、代替のコンジュゲートを調製するために方法を適合させることができる。
【０１８４】
成長ホルモンタンパク質を調製するための一般的方法
成長ホルモンタンパク質をコードする遺伝子を、組換えによりプラスミドベクターに挿入する。その後、プラスミドベクターを使用して、好適な大腸菌株を形質転換する。N末端メチオニンを用いて、又はその後MEAE配列が切断されるMEAE融合体として、ヒトGH又はGH変異体を発現させることができる。
【０１８５】
25%グリセロール中で細胞原液を調製し、-80℃で保存する。グリセロール原液の株をLBプレート内に播種し、その後、37℃で一晩インキュベートする。各プレートの内容物をLB培地で洗浄し、500mLのLB培地に希釈して、発現させる。0.6のOD600に達するまで、培養物を220rpmで振盪しながら37℃でインキュベートする。0.2mMのIPTGを使用して、25℃で6時間後続の誘導を行う。最後に、遠心分離により細胞を回収する。
【０１８６】
その後、0.05%のTween20、2.5mMのEDTA及び4Mの尿素を含有する10mMのTris-HCl、pH=9.0に細胞を懸濁させ、30kPSIで細胞破砕器を使用して破壊する。遊離システイン(コンジュゲーションのため)を有するGH分子を発現させる場合、10mMのシステアミンが懸濁緩衝液に含められる。遠心分離により上清を回収し、その後クロマトグラフィー精製に供する。
【０１８７】
イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用を使用して精製を行い、続いて、CHO細胞から発現したヒトジペプチジルペプチダーゼI(hDPPI)を使用して、ペプチドタグの除去を行う。等電沈殿(isoprecipitation)及びイオン交換クロマトグラフィーにより、最終的な精製が達成される。
【０１８８】
精製はまた、これらに限定されないが、当業者に知られているイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び膜ベースの分離技術により達成され得る。
【０１８９】
GH(L101C)を含む単一cys GH変異体の調製:
上述のような最初の精製後、変異体は、その遊離システインの一部がグルタチオン及びシスタミンによりブロックされ得る。非ブロック化は、GSH及びGSSGを含有する平衡緩衝液中で、グルタレドキシンII(Grx2)を使用して酵素的に行われる。非ブロック化されたGH(L101C)は、Sephadex G25カラムで交換された緩衝液により、低分子量GSH/GSSGから分離される。
【０１９０】
精製された成長ホルモン化合物のタンパク質化学的特性決定
MALDI-MSを使用して、無傷の精製されたタンパク質を分析し、観察された質量がアミノ酸配列から導出された理論質量に対応したことを確認する。予測される結合であるジスルフィド結合は、トリプシン及びAspN分解に続く、DTTによるジスルフィド結合の還元前及び還元後の分解物のMALDI-MS分析を使用したペプチドマッピングにより実証され得る。
【０１９１】
アルブミン-結合剤側鎖調製
側鎖(I)
4-(1H-テトラゾール-16-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブタノイル-OEG-γGlu-γGlu-OEG-Nε(C(O)CH2Br)Lys-OH (I):
【０１９２】
【化９】
0006464145.tif 000010
【０１９３】
スキーム1に従い、ABI433合成機上で、標準的Fmoc-ペプチド化学を使用し、1mMの規模で固体支持体上で側鎖(I)を合成した。Fmoc-OEG-OH及びFmoc-Glu-OtBu保護アミノ酸を使用して、Fmoc-Lys(MTT)-Wang樹脂上でペプチドをアセンブルした。4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)酪酸を、DCM/NMP中のDIC/NHS、2等量を使用して一晩手作業でカップリングさせたが、TNBS試験は、反応が完了したことを示した。次いで、流水式構成において、黄色い色が消失するまで約20分樹脂を50mLのDCM/TFA/TIS/水(94:2:2:2)で処理し、続いてDIPEA/DMFで洗浄及び中和した。DCM/NMP(1:1)中のブロモ酢酸(4mM)を、NHS及びDICの1mM混合物で活性化し、濾過し、さらなる1mMのDIPEAの添加と共に樹脂に加えた。1時間後、反応は完了した。樹脂を80mLのTFA/TIS/水(95:2.5:2.5)で1時間処理した。N2のストリームで蒸発させ、Et2Oの添加により沈殿させ、Et2Oで洗浄し、乾燥させた。粗生成物を、分取HPLCにおいて、水中0.1%のTFAに対して30〜80%の0.1TFA/MeCNの勾配で精製した(2回)。画分を回収し、約50%のMeCNで凍結乾燥すると、側鎖(I)が得られた。TOF-MS:質量1272.52(M+1)
【０１９４】
【化１０】
0006464145.tif 000011
【０１９５】
側鎖(II)
上記と同様の様式で、Fmoc-Lys(Mtt)-OH及びWang樹脂を使用して以下の側鎖(II)を調製した。TOF-MS:質量844.84(M+1)
【０１９６】
【化１１】
0006464145.tif 000012
【０１９７】
アルブミン結合剤側鎖を成長ホルモンタンパク質にコンジュゲートするための一般的方法
内部遊離単一cys(GH-SH)を有するGHタンパク質の、上述のようなアルブミン結合側鎖(AB-Halo)とのカップリング。
a)好適な選択的還元剤を用いたジスルフィド(VI)の還元によるGH-SH(VII)の放出:
b)ABが単一Cys残基の「-S-」に結合した成長ホルモンコンジュゲートを生成する、ハロゲン活性化アルブミン結合剤(VIII)による遊離GH-SH(VII)のアルキル化。
【０１９８】
【化１２】
0006464145.tif 000013
【０１９９】
アルブミン結合剤側鎖の、側鎖(I)を有するGH(101C)とのコンジュゲーション
アルブミン結合剤側鎖(78mg/5等量)を、5%のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを含む170mLのHEPES/EDTA緩衝液中に溶解し、MTP(2.1mL、1%)及び0.5MのNaCl(6.34g)を添加する。この混合物に、濃縮GH(L101C)(1等量、46mL)を添加し、混合物を室温で一晩静置した。溶液は、一晩で濁った。HPLCは、未反応の出発材料を示したため、最小量のNMPに溶解した5等量の実施例5からのアルブミン結合剤を更に添加した。得られた混合物を室温で更に16時間撹拌した。コンジュゲーション及び精製の方法に関するさらなる詳細は、WO11/089255を参照されたい。
【０２００】
以下に示される成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートI及びIIは、上述の方法を使用して得られた。
【０２０１】
【化１３】
0006464145.tif 000014
【０２０２】
WO11/015649に既に記載されているように、トランスグルタミナーゼ反応を使用したN末端C末端コンジュゲーション及びGln又はLys残基への鎖部位特異的コンジュゲーションを含む代替の方法を使用して、代替の成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートを調製することができる。また、上述のような単一Cysコンジュゲーションにおいて、WO11/050923に記載のように、代替のコンジュゲーションプロセスを適用することができる。
【０２０３】
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によるHMWP含量の決定
分析手順は、サイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)試験であり、試料はTSK G2000 SWxlカラム、リン酸ナトリウム/イソプロパノール緩衝液を使用した定組成溶離、及びその後の215nmでのUV検出を使用して分析される。全積分面積に対して%HMWPが計算される。
【０２０４】
目視検査
ガラスバイアル又はカートリッジ(I型)内に保存された試料(2mLの最小体積)を、アーキテクトランプ下及びライトチャンバ内で検査する。試料の視覚的外観は、1から5のスコアの透明性及び粒子の基準を有する視覚的スコアにより定量されるが、1は透明で粒子を含まず、5は視認され得る沈殿物を有する試料を指す。
【０２０５】
光学密度(OD)を使用したタンパク質凝集体の決定
Varian Cary 100 Bio UV-VIS分光光度計を使用して、340nmで試料の光学密度を測定する。
【０２０６】
Micro-Flow Imaging(MFI)を使用した粒子の決定
Micro-Flow Imagingフロー顕微鏡MFI 5000において、フロー顕微鏡法を使用して未希釈溶液(1mL)中でのサイズ及び形態による粒子の定量を行った。2μm超、10μm超及び25μm超の視認できない粒子の定量及び特性決定を行った。最終的な気泡及びシリコン液滴を除去するフィルタ(真円度0〜0.85)もまた適用した。
【０２０７】
(実施例1)
異なる界面活性剤並びに界面活性剤及び緩衝剤(ヒスチジン)濃度の変化を含む上述のコンジュゲートIの製剤の安定性を、異なるpH(pH6.0及び6.6)で調査した。試験は、実験(DoE)試験のデザインとして行った。
【０２０８】
試験した製剤は、成長ホルモンコンジュゲートIに加えて、0.68mg/mL又は1.55mg/mLの濃度の界面活性剤及びヒスチジン緩衝剤を含み、また40mg/mLのマンニトール及び3.0mg/mLのフェノールも含む。
【０２０９】
0日、30日、60日及び90日の時点からの試料において、HMWP(高分子量タンパク質)の量を、90日間にわたり5℃で測定した。25℃で同様のデータを得た。TSKゲルG3000 SWXLカラム、定組成溶離によるリン酸ナトリウム/イソプロパノールpH7.0移動相、及びその後の215nmにおけるUV検出を使用したサイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)により、HMWP含量を測定した。
【０２１０】
図1は、ポロキサマー188が、調製の時点で製剤を安定化することを示す。ポロキサマー188を含まない製剤において、ゼロの時点(t=0)でHMWP量の増加が見られた。しかしながら、ポリソルベート80製剤及び界面活性剤を含まない製剤において、HMWPのレベルは、5℃で1ヶ月の保存後に分析されたポロキサマーを含む製剤に匹敵するレベルまで減少した。
【０２１１】
図2は、3mg/mLのポロキサマー188が、低いpHで1.0mg/mLのポリソルベート80よりも優れていることを示す。
【０２１２】
(実施例2)
コンジュゲートIの製剤の調製において製造可能性試験を行った。
【０２１３】
【表１】
0006464145.tif 000015
【０２１４】
液体コンジュゲートI原薬調製物(ヒスチジン緩衝剤を含む)のpHを、最終体積の約40%の体積でpH6.5及び7.1に調節した。約60%の体積の緩衝溶液(ヒスチジン、マンニトール、ポロキサマー及びフェノール)のpHを、pH6.8に調節した。2つの溶液の混合後、最終製剤のpHをpH6.8に調節した。異なるpHを有する調製物から調製されたpH6.8の製剤を、続いて25℃で1ヶ月の保存中の安定性試験に使用した。
【０２１５】
時点=0、1日、2週間及び1ヶ月で採取した試料を分析した。試料は全て、目視検査から透明の外観を有したが、SE-HPLCから測定された%HMPWを以下の表に記載する。
【０２１６】
【表２】
0006464145.tif 000016
【０２１７】
最終生成物製剤の調製中のGHコンジュゲートDS溶液のpHに依存する、製剤間でのHMWPのレベルにおける明確な差は観察されなかった。全ての製剤は、調製の時点で同様のレベルのHMWPを示し、25℃で1ヶ月の保存中の安定性を試験した加速安定性試験において、同様の安定性を示している。pH6.5でDSから調製された製剤において、より多量のポロキサマー188(1.0mg/mL及び3.0mg/mL)を有する製剤が経時的により多量のHMWPを生じる若干の傾向が観察され得る。
【０２１８】
緩衝溶液(pH6.8)は最終生成物溶液の約60%を占めるため、緩衝剤及びDS溶液の混合後の製剤におけるほぼ同等のpHにより、全ての製剤のほぼ同様の安定性がもたらされると予測される。
【０２１９】
(実施例3)
マンニトール及びフェノールを含むヒスチジン緩衝剤(0.68mg/mLヒスチジン、44mg/mLマンニトール、及び3mg/mLフェノール)中のポロキサマー188(1.0mg/mL、3.0mg/mL及び5.0mg/mL)の濃度を変化させて、コンジュゲートIの製剤を作製した。HMWPを測定することにより、pH6.2、6.8、及び7.4における30℃での安定性を試験した。試験は、実験(DoE)試験のデザインとして行った。
【０２２０】
図3に見られるように、試料は、時点0(T=0)で等量のHMWPを示した。HMWPデータの統計分析では、30℃で4週間の保存後に、ポロキサマーの有意な効果は見られなかった。しかしながら、pH6.2及び6.8の両方において、増加した量のポロキサマーを有する製剤が経時的により多量のHMWPを生じる傾向が観察されたが、これは、組成物が長期保存用である場合は、高濃度のポロキサマー188を避けるべきであることを示している。pH7.4からのデータは、pH効果が主に概して低いHMWP形成をもたらすため、図に含められていない。
【０２２１】
(実施例4)
以下の実験において、pH6.2、6.5及び6.8での効果を試験した。ポロキサマー188の濃度を変化させて(0.0mg/mL、1.0mg/mL、3.0mg/mL)、またpHを変化させて(6.2、6.5及び6.8)、コンジュゲートI製剤を作製した。試験された組成物の他の成分は、実施例3の通りであった。試料に、室温で7日間、せん断により物理的ストレスを加えた。3時間及び6時間後、並びに1日、2日、5日、6日及び7日後に試料を採取した。他の試料には、25回のピペッティングによりストレスを与えた。全ての試料を視覚的に検査し、更に340nmでのOD(光学密度)を分析した。
【０２２２】
図4に見られるように、ポロキサマー188を含まない試料は、振盪及びピペッティング試験の両方において、1.0mg/mL及び3.0mg/mLのポロキサマー188を含む試料と比較してOD340の明確な増加を示した。この傾向は、全てのpHレベルにおいて確認された。図4Aは、全体の結果を示し、一方図4Bは、低いOD340測定値のみを示している。更に、視覚的スコア化により、ポロキサマーを含まない試料は濁り、濁度は、低下するpHにおいて増加することが明確に示された。
【０２２３】
(実施例5)
3つの追加的な成長ホルモン化合物を使用して、pH6.2及び6.8での実施例4と同様の実験を行った。野生型ヒト成長ホルモン(WT hGH)、コンジュゲートI、及びコンジュゲートIのGHタンパク質でもある101 Cys突然変異(GH L101C)を含む成長ホルモン変異体。図5A、図5B及び図5Cから分かるように、上記の結論が確認された。低い界面活性剤含量は、7日間の間試験されたように、初期及びストレス後の両方の組成物の安定性を改善する。コンジュゲートIの場合、ポロキサマーを含まない試料は、特にpHに依存するようであった。視覚的スコア化により、pHの低下と共に濁度の増加が観察された。
【０２２４】
(実施例6)
Micro-flow Imaging(MFI)評価を使用して、成長ホルモン組成物中の粒子形成を測定した。Micro-Flow Imagingフロー顕微鏡MFI 5000において、試料(1mL)を測定した。上述のように、以下の化合物が評価に含められた:野生型ヒト成長ホルモン(hGH)、コンジュゲートI、コンジュゲートII及び成長ホルモン変異体L101C(GH L101C)。
【０２２５】
pH6.2及びpH6.8において、6.7mg/mLの成長ホルモン化合物を用いて、ポロキサマー188の安定化効果を評価した。
【０２２６】
試験は、室温で7日間までの試料の振盪によるストレス安定性試験として設定される。0.0mg/mL、1.0mg/mL又は3.0mg/mLのポロキサマー188を含むpH6.2及び6.8での成長ホルモン組成物を作製し、T=0及びT=2(2日)で測定を行った。組成物は全て、0.68mg/mLのヒスチジン、44.0mg/mL及び3mg/mLのフェノールを含んでいた。T=0で得られたデータは、以下のtable 1(表3)に含まれ、一方2日後(T=2)に得られたデータは、table 2(表4)に含まれる。
【０２２７】
【表３】
0006464145.tif 000017
【０２２８】
【表４】
0006464145.tif 000018
【０２２９】
ポロキサマー188は、試験された全ての成長ホルモン化合物組成物において、粒子形成を抑制することが結論付けられた。更に、より高濃度(1mg/mLと比較して3mg/mL)のポロキサマー188は、粒子形成に対してより強い効果を有する。GHのコンジュゲートにおいて、pHは、粒子抑制に対して顕著な効果を有するようであり、pH6.2よりもpH6.8においてより良好な結果が得られ、高いポロキサマー濃度の利点が低減される。目視検査によっても同様の結論に達した。
【０２３０】
(実施例7)
無作為化二重盲検プラセボ対照複数投薬及び用量漸増試験を、日本人及び非アジア系健常男性対象において行い、安全性、耐容性並びに薬力学的(PK)及び薬物動態学的(PD)パラメータを評価した。
【０２３１】
16名の対象の4つのコホートに、コンジュゲート1(n=12)又はプラセボ(n=4)の週1回連続4週間の皮下投与を施した(同数の日本人及び非アジア系対象)。投与量は、個々のコホートにおいて0.02mg/kg、0.08mg/kg、0.16mg/kg及び0.24mg/kgであった。化合物は、凍結乾燥製剤として提供され、使用前に再構成された。
【０２３２】
コンジュゲートIの薬力学を、4回目(第4)の投薬後に評価した。コンジュゲート1の平均血漿濃度の用量依存的増加が観察された(データは示さず)。IGF-I応答を測定することにより(免疫診断システム(IDS))、コンジュゲートI投与の薬物動態学的パラメータを評価した。
【０２３３】
用量依存的なIGF-I及びIGFBP-3応答が観察され、全ての用量においてIGF-Iレベルが上昇した。平均IGF-I標準偏差スコア(SDS)プロファイル(図6)は、コンジュゲートIが週1回の投薬に好適となり得ることを示している。これは更に、0.08mg/kg以下の用量において、臨床的に関連するIGF-I反応が誘導されたことを示している。
【０２３４】
(実施例8)
医薬組成物は、成長ホルモン アルブミン-結合剤 コンジュゲートの調製物を、必要な賦形剤と混合することにより調製されてもよい。以下のプロセスは、コンジュゲートの液体調製が出発点である場合に有用である。
【０２３５】
最終組成物:
成長ホルモンコンジュゲートI(6.7mg/ml)
1.0mg/mlのポロキサマー188
0.68mg/mlのヒスチジン
44mg/mlのマンニトール
4.0mg/mlのフェノール
製剤化のためのpHは6.8である。
【０２３６】
原液:
21.3mg/ml及び20.5mg/mlの成長ホルモンコンジュゲートI(0.68mg/mlのヒスチジン中)(バッチNLfK040501及びNLfK040503)
20mg/mlのポロキサマー188(WFI中)
緩衝液:110mg/mlのマンニトール、10mg/mlのフェノール及びヒスチジン。ヒスチジン濃度は、使用されるDSの体積/量に依存する。
pH調節用のHCl
【０２３７】
コンジュゲートI調製物(ヒスチジン緩衝剤を含む)を秤量し、ポロキサマー188を原液として添加した。WFIを溶液に添加して、最終体積の55%に到達させた。マンニトール、ヒスチジン、フェノール及びpHの調節用の塩酸を含む緩衝溶液を調製した。緩衝溶液(最終体積の40%)をコンジュゲートI及びポロキサマー188の溶液に添加し、最終体積の95%を得た。pHを測定し(及び必要に応じて調節し)、最後にWFIを添加して、最終体積に到達させた。
【０２３８】
調製中、コンジュゲートI及びポロキサマー188の溶液から、並びに中間的製剤及び最終医薬組成物から試料を採取した。高分子量タンパク質の含量(%HMWP)をSE-HPLCにより測定すると(table 1(表5))、プロセス全体にわたり低いことが判明した。最終医薬組成物は、透明で無色であることが観察された。
【０２３９】
【表５】
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【０２４０】
(実施例9)
別の試験において、フェノールをフェノール-緩衝溶液中に様々な濃度(5mg/ml、10mg/ml及び30mg/ml)で含め、コンジュゲートI調製物に導入した。以下で分かるように、30mg/mlのフェノールの使用は、最終製剤中の%HMWPの増加をもたらした。HMWPのレベルは、溶液中のコンジュゲートIの濃度及びフェノールの濃度に依存する。
【０２４１】
原液及び賦形剤:
コンジュゲートI調製物(バッチIHJe12-021):18.0mg/ml
フェノール溶液30mg/ml、10mg/ml及び5mg/ml
50mg/mlのポロキサマー
マンニトール(粉末)。
ヒスチジン
【０２４２】
各製剤において、最終製剤中の所望の濃度に達するフェノール及びヒスチジンの全量を含むフェノール及びヒスチジン溶液を調製した。最終製剤中の全量に達する量のコンジュゲートI調製物を、フェノール-ヒスチジン溶液に添加し、プロセス中試料を採取し、その後、ポロキサマー188及びマンニトールを、最終製剤中の所望の濃度に達する量で添加した。以前の試験(示さず)では、ポロキサマー188及びマンニトールが緩衝溶液中に含まれた場合の溶解度の問題が明らかとなった。最後に、WFIを添加して最終体積に到達させ、塩酸でpHを調節した。
【０２４３】
最終製剤:
2.0mg/ml、3.3mg/ml;6.7mg/ml;及び10mg/mlの成長ホルモンコンジュゲートI
1.0mg/mlのポロキサマー188
0.68mg/mlのヒスチジン
44mg/mlのマンニトール
3.0mg/mlのフェノール
pH6.3。
【０２４４】
【表６】
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【０２４５】
Table 2(表6)は、出発フェノール濃度及びGH濃度に依存するプロセス中試料及び最終製剤中のHMWP(%)を示す。コンジュゲートI調製物の初期HMWPレベルは、3.7%であった。高濃度のフェノールを低濃度の成長ホルモンコンジュゲートと混合した場合、非常に高いHMWP含量が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
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