(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体：
【化１】
0006464384.tif 000059
【請求項２】
３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミドである：請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された、請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含む、薬学的製剤。
【請求項４】
（Ａ）請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、および
（Ｂ）他の治療薬
を含有する組合せ製剤であって、
構成要素（Ａ）および（Ｂ）のそれぞれが、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体との混合物に製剤化されている組合せ製剤。
【請求項５】
薬剤に使用される、請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含有する炎症性疾患治療または予防のための薬剤。
【請求項７】
請求項３に記載の炎症性疾患治療または予防用の薬学的製剤。
【請求項８】
請求項４に記載の炎症性疾患治療または予防用の組合せ製剤。
【請求項９】
炎症性疾患が、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を包含する）、喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触皮膚炎もしくは乾癬、アレルギー性鼻炎、鼻炎、副鼻腔炎、結膜炎、アレルギー性結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を包含する）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／もしくは滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、術後白内障炎症、ブドウ膜炎（後部、前部および全ブドウ膜炎を包含する）、角膜移植片および角膜輪部細胞移植拒絶反応、グルテン過敏性腸疾患（小児脂肪便症）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、クローン病ならびに潰瘍性大腸炎を含むリストから選択される、請求項６に記載の炎症性疾患治療または予防のための薬剤。
【請求項１０】
炎症性疾患が、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を包含する）、喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触皮膚炎もしくは乾癬、アレルギー性鼻炎、鼻炎、副鼻腔炎、結膜炎、アレルギー性結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を包含する）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／もしくは滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、術後白内障炎症、ブドウ膜炎（後部、前部および全ブドウ膜炎を包含する）、角膜移植片および角膜輪部細胞移植拒絶反応、グルテン過敏性腸疾患（小児脂肪便症）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、クローン病ならびに潰瘍性大腸炎を含むリストから選択される、請求項７に記載の炎症性疾患治療または予防用の薬学的製剤。
【請求項１１】
炎症性疾患が、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を包含する）、喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触皮膚炎もしくは乾癬、アレルギー性鼻炎、鼻炎、副鼻腔炎、結膜炎、アレルギー性結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を包含する）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／もしくは滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、術後白内障炎症、ブドウ膜炎（後部、前部および全ブドウ膜炎を包含する）、角膜移植片および角膜輪部細胞移植拒絶反応、グルテン過敏性腸疾患（小児脂肪便症）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、クローン病ならびに潰瘍性大腸炎を含むリストから選択される、請求項８に記載の炎症性疾患治療または予防用の組合せ製剤。
【請求項１２】
炎症性疾患が、ブドウ膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症または糖尿病性黄斑浮腫である、請求項６または９に記載の炎症性疾患治療または予防のための薬剤。
【請求項１３】
炎症性疾患が、ブドウ膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症または糖尿病性黄斑浮腫である、請求項７または１０に記載の炎症性疾患治療または予防用の薬学的製剤。
【請求項１４】
炎症性疾患が、ブドウ膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症または糖尿病性黄斑浮腫である、請求項８または１１に記載の炎症性疾患治療または予防用の組合せ製剤。
【請求項１５】
請求項１に記載された化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体の、請求項６、９または１２に記載の炎症性疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための使用。
【請求項１６】
請求項１に記載された化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体の、請求項７、１０または１３に記載の炎症性疾患の治療または予防用の薬学的製剤を調製するための使用。
【請求項１７】
請求項１に記載された化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体の、請求項８、１１または１４に記載の炎症性疾患の治療または予防用の組合せ製剤を調製するための使用。
【請求項１８】
以下を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の調製方法：
（ａ）式ＩＩの化合物の、式ＩＩＩの化合物との反応；
【化２】
0006464384.tif 000060
【化３】
0006464384.tif 000061
Ｚ1およびＺ2のうちの一方は、式ＩＶの構造フラグメントであって、
【化４】
0006464384.tif 000062
Ｚ1およびＺ2のうちの他方は、式Ｖの構造フラグメントである。
【化５】
0006464384.tif 000063
【請求項１９】
以下を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の調製方法：
（ｂ）式ＩＩａの化合物の、好適なアジド形成剤との反応、当該反応に続いて、分離することなく、アシルアジド中間体（式Ｚ1−Ｃ（Ｏ）−Ｎ3）の熱転移によってその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で得られる式ＩＩの化合物、この化合物は式ＩＩＩの化合物と反応される；
【化６】
0006464384.tif 000064
【化７】
0006464384.tif 000065
【化８】
0006464384.tif 000066
Ｚ1およびＺ2のうちの一方は、式ＩＶの構造フラグメントであって、
【化９】
0006464384.tif 000067
Ｚ1およびＺ2のうちの他方は、式Ｖの構造フラグメントである。
【化１０】
0006464384.tif 000068
【請求項２０】
以下を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の調製方法：
（ｃ）式ＩＩｂの化合物の、式ＩＩＩの化合物との反応；
【化１１】
0006464384.tif 000069
【化１２】
0006464384.tif 000070
ＬＧ1は脱離基を表し、Ｚ1およびＺ2のうちの一方は、式ＩＶの構造フラグメントであって、
【化１３】
0006464384.tif 000071
Ｚ1およびＺ2のうちの他方は、式Ｖの構造フラグメントである。
【化１４】
0006464384.tif 000072
【請求項２１】
以下を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の調製方法：
（ｄ）式ＶＩの化合物の、式ＶＩＩの化合物との反応；
【化１５】
0006464384.tif 000073
ＬＧ2は、脱離基を示す。
【化１６】
0006464384.tif 000074
【請求項２２】
以下を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の調製方法：
（ｅ）式ＶＩＩａの化合物の式ＶＩＩｂの化合物との反応
【化１７】
0006464384.tif 000075
Ｒ4’は、ＨまたはＣ1-3アルキルを表す。
Ｈ2Ｎ−［ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ］2−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＣＨ3         ＶＩＩｂ。
【請求項２３】
式ＸＶの化合物の、式ＸＶＩの化合物との反応からなる、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【化１８】
0006464384.tif 000076
ＬＧ1は、脱離基を表す。
【請求項２４】
ＬＧ1がフェノキシを表す、請求項２３に記載の、式ＸＶＩの化合物。
【請求項２５】
式ＸＶまたはＸＶａの化合物。
【化１９】
0006464384.tif 000077
ＰＧ2は、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、（例えば、Ｐ３８  マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素のファミリー（本明細書において、Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤という）、例えば、そのαキナーゼのサブタイプ；Ｓｙｋキナーゼ；およびチロシンキナーゼのＳｃｒファミリーの１つ以上のメンバーを阻害する）抗炎症薬である化合物に関する。また、本発明は、単一療法および併用療法を含む治療、とりわけ、炎症性疾患における治療、例えば、（喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）といった）肺の炎症性疾患、（ブドウ膜炎および乾性角結膜炎（ドライアイ）といった）眼の炎症性疾患および（クローン病および潰瘍性大腸炎といった）胃腸管における炎症性疾患の治療を含む治療における、そのような化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における既に公開されたであろう刊行物についての項目または考察は、必ずしも、当該文献が技術水準の一部であること、あるいは、技術常識であることを確認するものと捉えられるべきものではない。
【０００３】
それぞれ組織における発現パターンが異なる、４つのｐ３８  ＭＡＰＫアイソフォーム（それぞれα、β、γおよびδ）が同定されている。ｐ３８  ＭＡＰＫαおよびβアイソフォームは、体全体に遍在しており、多くの異なるタイプの細胞に存在し、前述の多数の低分子量化合物によって阻害される。初期に分類される阻害剤は、当該化合物のオフターゲット効果を生じるこれらのアイソフォームが組織に広く分布することに起因して、非常に毒性の高いものであった。最近になって同定された阻害剤の中には、Ｐ３８  ＭＡＰＫαおよびβアイソフォームに対して改善された選択性を示し、かつ、安全域の広いものもある。
【０００４】
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、ヒトの疾患、例えば重症の喘息であるＣＯＰＤおよび炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）における慢性、持続性の炎症を引き起こしたり、継続させたりすることに関係しているシグナル経路の多くにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。現在では、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼが様々な炎症誘発性サイトカインによって活性化され、その結果として更なる炎症誘発性サイトカインのリクルートメントおよび放出が起きることを証明する文献が多く存在する。実際に、ある臨床的な研究データによって、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤を用いた処置の間、患者の疾患活動性が有益に変化することが実証されている。例えば、Smithは、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤の、ヒトＰＢＭＣ細胞からのＴＮＦα（ＩＬ−８ではない）の放出に対する阻害作用について説明している（Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404）。
【０００５】
ＣＯＰＤおよびＩＢＤの治療にｐ３８  ＭＡＰキナーゼの阻害剤を使用することも、提案されている。ｐ３８  ＭＡＰＫα／βを標的とする低分子阻害剤は、以下のものにおいて炎症の様々なパラメータを減少するのに有効であると証明されている：
‐  概してコルチコステロイドに非感受性である、ＣＯＰＤの患者から得た細胞および組織 （Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404）；
‐  ＩＢＤ患者からの生検（Docena, G. et al., J. Trans. Immunol., 2010, 162:108-115）；および
‐  in vivo動物モデル（Underwood, D. C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P. et al., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544:160-167）。
【０００６】
Irusenおよび共同研究者も、核における糖質コルチコイド受容器（ＧＲ）の結合親和性の減少を介して、コルチコステロイド非感受性へｐ３８  ＭＡＰＫα／βが関与する可能性を示唆した（Irusen, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109:649-657）。ＡＭＧ５４８、ＢＩＲＢ７９６、ＶＸ７０２、ＳＣＩＯ４６９およびＳＣＩＯ３２３といった様々なｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤を用いた、炎症性疾患における臨床試験について述べられてきた（Lee, M. R. and Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994.）。しかしながら、ヒト慢性炎症性疾患の治療におけるｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤の有用性を妨げている主要な障壁は、患者において観察される毒性であった。これは、上で具体的に述べた全ての化合物も含めて、進行していた多くの化合物の臨床的開発から撤退する結果となるのに十分なほど深刻なものだった。
【０００７】
ＣＯＰＤは、その基礎となる炎症がコルチコステロイドの吸入による抗炎症効果に対して実質的な耐性のあることが報告されている疾患である。従って、ＣＯＰＤを治療するための優れた戦略は、内在的な抗炎症効果と、吸入されたコルチコステロイドに対する、ＣＯＰＤ患者の肺組織の感受性を増加させる能力とを有するインターベンションを発展させることにあろう。Mercadoらの近著では、ＭＡＰＫ  γ  のサイレンシングによってコルチコステロイドに対する感受性が回復する可能性があることが立証されている（2007； American Thoracic Society Abstract A56）。したがって、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤をＣＯＰＤの治療に使用することは、患者にとって、二重の利益となり得る。
【０００８】
喘息またはＣＯＰＤと診断された多数の患者は、制御できない症状や、入院が必要となり得る医学的状態の増悪に苦しみ続けている。これは、コルチコステロイドの吸入および長期作用性β-アゴニストの薬学的な組合せを含めた、現在可能な最も高度な治療法が用いられているにもかかわらず生じている。この１０年にわたって蓄積されてきたデータは、肺において疾患の基となっている炎症性成分を効果的に管理できなくなることが、増悪が生じることの最も有力な原因であることを示している。確立した抗炎症薬としてのコルチコステロイドおよびとりわけ喘息の治療において吸入されるコルチコステロイドの有効性を考慮すれば、それら知見によって、非常に活発な研究がもたらされたといえる。研究結果から、患者の肺のコルチコステロイド非感受性の炎症状態の変化は、環境から損傷を受けることで引き起こされることが判明した。一例としては、ウイルスで仲介された上気道感染症（ＵＲＴＩ）から生じる反応が挙げられ、当該反応は、喘息およびＣＯＰＤに関連した羅病率の増加において、特に重要である。
【０００９】
ｃ-ＳｒｃおよびＳｙｋキナーゼの活性を阻害する化合物がライノウイルス複製に対する有効な薬剤であり（Charron, C.E. et al., WO 2011/158042）、ｐ５９-ＨＣＫを阻害する化合物がインフルエンザウイルス複製に対して有効である（Charron, C.E. et al., WO 2011/070369）ことは以前に開示されている。Ｐ３８  ＭＡＰＫの阻害とともに考え合わせると、これらは、慢性呼吸病の患者の治療を目的とする化合物にとって、特に魅力的な固有的特性である。
【００１０】
あるｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤も、呼吸器合胞体（ＲＳ）ウイルスの複製の阻害剤として説明された（Cass, L. et al., WO 2011/158039）。
【００１１】
ＩＢＤの正確な病因は、不確かであるが、遺伝的および環境的因子が相互作用して、管腔の微生物相の構成要素に対する、過剰であってかつ十分に制御されていない粘膜炎症反応を促進するがゆえに、この遺伝的および環境的因子がＩＢＤに影響していると考えられている。この反応は、末梢から炎症性好中球、樹状細胞およびＴ細胞の浸潤を介して伝達される。ｐ３８は炎症細胞に遍在して発現していることから、ｐ３８は当然にＩＢＤモデルの研究のためのターゲットとなった。ＩＢＤの動物モデルおよびＩＢＤ患者から得たヒト生検におけるｐ３８阻害剤の効能を調査した研究では、ｐ３８がＩＢＤの治療のためのターゲットとなりうることが示された（Hove, T. ten et al., Gut, 2002, 50:507-512, Docena, G. et al., J. Trans. Immunol. 2010, 162:108-115）。しかしながら、これらの知見は、ｐ３８阻害剤の効果はないと報告しているその他のグル-プの知見と、完全には一致していない（Malamut G. et al., Dig. Dis. Sci, 2006, 51:1443-1453）。ｐ３８  α阻害剤ＢＩＲＢ７９６を使用したクローン病の患者での治験では、Ｃ反応性タンパク質レベルの改善と共に潜在的な臨床的効力が実証された。しかしながら、この改善は一時的であり、８週間で基準値に戻った（Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334）。重症クローン病の患者でのＣＮＩ-１４９３、ｐ３８およびＪｎｋ阻害剤の有効性を調査した小規模の治験では、８週間以上の臨床的スコアの有意な改善を示した（Hommes D. et al. Gastroenterology. 2002 122:7-14）。
【００１２】
Ｔ細胞は、胃腸管の炎症の媒介で重要な役割を果たすことが知られている。Powrieおよび共同研究者による先駆的研究では、重症免疫不全（ＳＣＩＤ）動物へナイーブＣＤ４＋細胞が移入することで、共生細菌の存在に依存して大腸炎が発症することが証明された（Powrie F. et al. Int Immunol. 1993 5:1461-71）。さらに、ＩＢＤ患者の粘膜における調査では、患者がクローン病か潰瘍性大腸炎であるかに依存して偏在する、Ｔｈ１（ＩＦＮγ／ＩＬ-２）またはＴｈ２（ＩＬ５／ＴＧＦβ）である、ＣＤ４＋細胞のアップレギュレーションが示された（Fuss IJ. et al. J Immunol. 1996, 157:1261-70.）。同様に、ベーチェット患者の血清におけるＴ細胞関連サイトカイン（ＩＬ−１７およびＩＬ−２３）のレベルの増加を報告している様々な研究によって、Ｔ細胞が眼の炎症性疾患において重要な役割を果たしていることは公知である（Chi W. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008, 49:3058-64）。さらにこれらの観察結果を支持して、Direskeneliおよび共同研究者は、ベーチェット患者の末梢血で、Ｔｈ１７細胞が増加し、Ｔｒｅｇ細胞が減少することを証明した（Direskeneli H. et al. J Allergy Clin Immunol. 2011 128:665-6）。
【００１３】
Ｔ細胞活性を阻害する１つのアプローチとしては、Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体の活性に関与するキナーゼをターゲットにすることがある。ＳｙｋおよびＳｒｃファミリーキナーゼが、この経路において重要な役割を果たすことは公知であり、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ＦｙｎおよびＬｃｋ）は、Ｔ細胞受容体の下流で活性化される最初のシグナル分子である（Barber EK. et al. PNAS 1989 86:3277-81）。これらは、Ｓｙｋファミリーキナーゼ（ＺＡＰ-７０）のリクルートメントを導くＴ細胞受容体のチロシンのリン酸化を引き起こす。動物実験では、ＺＡＰ-７０ノックアウトによってＳＣＩＤのフェノタイプを生じることが示された （Chan AC. et al. Science. 1994 10;264(5165):1599-601）。
【００１４】
Ｓｙｋ阻害剤Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂを用いた関節リウマチ患者の臨床的な試験では、臨床結果が改善され、ＩＬ−６およびＭＭＰ−３の血中濃度が減少したことをもって、Ｓｙｋの抗炎症のターゲットになり得る可能性が実証された（Weinblatt ME. et al. Arthritis Rheum. 2008 58:3309-18）。Ｓｙｋキナーゼは、造血組織の細胞、中でも注目すべきＢ細胞および成熟したＴ細胞において、広く発現される。Ｓｙｋキナーゼは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）との相互作用によって、炎症細胞において免疫受容体シグナル伝達を仲介するだけでなく、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖の制御においても重要な役割を果たす。Ｓｙｋの活性はＩＬ−６およびＭＭＰの放出を導く。が、これらはＩＢＤおよび関節リウマチを含む、炎症性疾患において共通してアップレギュレートすることが分かっている炎症性メディエーターである（Wang YD. et al World J Gastroenterol 2007; 13: 5926-5932, Litinsky I et al. Cytokine. 2006 Jan 33:106-10）。
【００１５】
現在では、キナーゼ酵素は、炎症誘発性経路の活性を制御する細胞シグナル伝達事象において鍵となる役割を果たすことに加えて、ＤＮＡ完全性の維持（Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3:155-168）および細胞分裂の複雑な過程の調整を含めた、様々な細胞機能の活性を制御すると認識されている。事実、あるキナーゼ阻害剤（いわゆる「Ｏｌａｈａｒｓｋｉキナーゼ」）は、in vitroでの小核形成の頻度を変更することが分かっている（Olaharsk i, A.J. et al., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446； doi: 10.1371/journal.pcbi.1000446.）。小核形成は、有糸分裂の過程の阻害に関与しているか〔implicated in〕、または、関係しているので〔associated with〕、望ましくない。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３α（ＧＳＫ３α）の抑制が、小核形成を促進するキナーゼを抑制する可能性を高める上で、特に重要な要因であることがわかった。また、ＲＮＡｉによるキナーゼＧＳＫ３βを阻害することで小核形成が促進されることも報告されてきた（Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34）。
【００１６】
投与量の最適化および／または分子の投与経路の変更による、ＧＳＫ３αといったＯｌａｈａｒｓｋｉキナーゼの阻害の副作用を弱めることは可能かもしれない一方で、ＧＳＫ  ３αといったＯｌａｈａｒｓｋｉキナーゼに対する阻害の程度が少ないかもしくは無視でき、および／または、（例えば、有糸分裂アッセイ測定する時に）、有糸分裂過程の崩壊が少ないかもしくは無視できる程度である、治療に有益なさらなる分子を特定することが有益であろう。
【００１７】
尿素誘導体を含む様々な化合物は、１つ以上のキナーゼを阻害するとして開示されている。そのような化合物の例は、WO 99/23091、WO 00/041698、WO 00/043384、WO 00/055139、WO 01/36403、WO 01/04115、WO 02/083628、WO 02/083642、WO 02/092576、WO 02/096876、WO 2003/005999、WO 2003/068223、WO 2003/068228、WO 2003/072569、WO 2004/014870、WO 2004/113352、WO 2005/005396、WO 2005/018624、WO 2005/023761、WO 2005/044825、WO 2006/015775、WO 2006/043090、WO 2007/004749およびWO 2007/053394に見出せよう。更なる例は、以下に公表された論文に見出せよう：
-  Curr. Opin. Drug Devel. (2004, 7(5), 600-616)；
-  J. Med. Chem. (2007, 50, 4016-4026； 2009, 52, 3881-3891； and 2010, 53, 5639-5655)；
-  Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007, 17, 354-357； 2008, 18, 3251-3255； 2009, 19, 2386-2391； and 2010, 20, 4819-4824)；
-  Curr. Top. Med. Chem. (2008, 8, 1452-1467)；
-  Bioorg. Med. Chem. (2010, 18, 5738-5748)；
-  Eur. J. Pharmacol. (2010, 632, 93-102)および
-  J. Chem. Inf. Model. (2011, 51, 115-129)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
にもかかわらず、新規キナーゼ阻害剤、特に、炎症の治療に好適な代替ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤を同定して、開発することが依然要求されている。そして、現在使用できる治療よりも治療的有効性が改善されているか、または、特に、より高い治療指数を呈する、上述のような阻害剤（例えば、少なくとも、以前の薬剤と同様の有効な効果を奏し、かつ、適切な治療投与量において一以上の観点から従来の薬剤よりも毒性が低いといえる阻害剤）が、特に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、驚くべきことに、あるアニリン置換ジアリール尿素が、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＳｙｋおよびＳｒｃのファミリーのキナーゼを１つ以上阻害するゆえ、良好な抗炎症性を有することを見出した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
すなわち、本発明の最初の一側面によれば、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体が提供される。
【００２１】
【化１】
0006464384.tif 000002
【００２２】
以下、前記化合物を、「本発明の化合物」ということがある。
言及され得る薬学的に許容し得る塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。そのような塩は、常法、例えば、遊離酸または遊離塩基の形態である式Ｉの化合物を、１当量以上の好適な酸または塩基と、任意に溶媒中または塩が不溶である媒体中で、反応させ、次いで、標準的な方法を用いて（例えば、真空で、凍結乾燥またはろ過することにより、）前記溶媒または媒体を除去することで、形成してもよい。また、塩は、塩の形態である式Ｉの化合物のカウンターイオンを、例えば好適なイオン交換樹脂を用いて、他のカウンターイオンと交換することによって、調製してもよい。
【００２３】
薬学的に許容し得る塩の例としては、鉱酸および有機酸から誘導される酸付加塩、ならびに、金属から誘導される塩が挙げられる。
【００２４】
誤解のないように述べておけば、式Ｉの化合物は、天然または非天然同位体のいずれかである、上述の原子を含んでいてもよい。この点から、言及され得る本発明の態様として、以下の態様が挙げられる：
（ａ）式Ｉの化合物が、当該化合物のいずれかの原子について、同位体濃縮されていない、または、同位体標識されていない；
（ｂ）式Ｉの化合物が、当該化合物の１つ以上の原子について、同位体濃縮されている、または、同位体標識されている。
【００２５】
本明細書において、「同位体誘導体」は、これら二つの態様のうち、二番目の態様に関連する。本発明の特定の態様では、式Ｉの化合物は、（当該化合物の１つ以上の原子に関して、）１つ以上の安定同位体で、同位体濃縮または同位体標識されている。したがって、言及し得る本発明の化合物としては、例えば、重水素などといった１つ以上の原子で同位体濃縮または同位体標識されている化合物が挙げられる。
【００２６】
式Ｉの化合物は、互変異性を示してもよい。互変異性体およびその混合物は、全て、本発明の範囲に包含される。
【００２７】
式Ｉの化合物は、名前３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミドを有する。それはまた、３-[[４-[[４-[[５-ｔｅｒｔ-ブチル-３-(メタンスルホンアミド)-２-メトキシ-フェニル]カルバモイルアミノ]-１-ナフチル]オキシ]-ピリミジン-２-イル]アミノ]-５-エチニル-Ｎ-[２-[２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ]エチル]ベンズアミドと呼ばれることもある。
【００２８】
このように、一態様では、本発明は３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミドに関する。
【００２９】
式Ｉの化合物の塩の例としては、制限されることなく、ＨＣｌおよびＨＢｒの塩といった強鉱酸の酸付加塩およびメタンスルホン酸といった強有機酸の付加塩といった、全ての薬学的に許容し得る塩が挙げられる。
【００３０】
ここで言及され得る本発明の化合物（式Ｉの化合物）は、文脈上で具体的に示した場合を除いて、前記化合物、ならびに、当該化合物の薬学的に許容し得る塩、溶媒和物および／または互変異性体を全て包含する。この点において、言及され得る溶媒和物は、水和物を包含する。
【００３１】
本発明の化合物（式Ｉの化合物）は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ（とりわけαサブタイプ）、Ｓｙｋキナーゼおよび、例えばＳｒｃおよびＬｃｋであるＳｒｃファミリーキナーゼの阻害剤であり、それゆえ、薬剤、特に炎症性疾患の治療用、に有益である。したがって、言及され得る本発明の更なる側面として、以下の態様が挙げられる。
【００３２】
（ａ）薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含む、薬学的製剤。
（ｂ）（Ａ）上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、および
（Ｂ）他の治療薬
を含有する組合せ製剤〔combination product〕であって、
構成要素(Ａ)および(Ｂ)のそれぞれが、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体との混合物に製剤化されている組合せ製剤。
【００３３】
本発明のこの側面において、組合せ製剤は、単一（組み合わせ）薬学的製剤またはパーツキット〔kit-of-parts〕のいずれであってもよい。
【００３４】
したがって、本発明のこの側面には、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、ならびに、他の治療薬を含む薬学的製剤（以下、当該製剤を「組み合わせ調剤〔combined preparation〕」という）が包含される。
【００３５】
本願発明のこの側面には、以下の構成要素を含むパーツキットも包含される：
（ｉ）薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含む薬学的製剤；および、
（ｉｉ）薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された、他の薬剤を含む薬学的製剤。
【００３６】
ここで、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、各々、他方と共に投与するために好適な形態である。
【００３７】
したがって、パーツキットの構成要素（ｉ）は、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された上記構成要素（Ａ）である。同様に、構成要素（ｉｉ）は、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合された上記構成要素（Ｂ）である。
（ｃ）上記態様（ａ）の薬学的製剤の調製方法であって、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体と混合する工程を含む調製方法。
【００３８】
言及し得る本発明のこの側面の態様には、薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体が、局所的に許容し得るアジュバント、希釈剤または担体である（および／または、前記方法が、局所的薬学的製剤、すなわち、局所的投与に適合する薬学的製剤を製造するためのものである）態様が包含される。
【００３９】
（ｄ）薬剤〔medicine〕に使用される（または、調合薬〔medicament〕としてもしくは薬品〔pharmaceutical〕として使用される）、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体。
【００４０】
（ｅ）炎症性疾患の治療または予防に使用するための、上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または、本発明の側面（ａ）または（ｂ）に関連して定義した、薬学的製剤もしくは組合せ製剤。
【００４１】
（ｆ）上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または、
本発明の側面（ａ）または（ｂ）に関連して定義した、薬学的製剤もしくは組合せ製剤の炎症性疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための使用。
【００４２】
（ｇ）上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
本発明の側面（ａ）または（ｂ）に関連して定義した、薬学的製剤、または、組合せ製剤の有効量を患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療または予防の方法。
【００４３】
（ｈ）コルチコステロイドの抗炎症性効果に対して患者を敏感にさせる方法であって、
上で定義した式Ｉの化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
本発明の側面（ａ）または（ｂ）に関連して定義した、薬学的製剤、または、組合せ製剤の有効量を患者に投与することを含む方法。
【００４４】
言及し得る本発明のこの側面の態様には、患者が、コルチコステロイドの抗炎症性効果に不応の者である態様が包含される。
【００４５】
製剤
上述した側面（ａ）および（ｂ）に関して、言及し得る希釈剤および担体としては、非経口、経口、局所、粘膜および直腸投与に適したものを挙げることができるだろう。
【００４６】
上述した側面（ａ）および（ｂ）の薬学的製剤および組合せ製剤は、例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、硝子体内、眼周囲、眼球後方、結膜下、眼球鞘下、眼局所または関節周辺の投与のために、特に溶液、エマルジョンまたは懸濁液の液体の形態で；経口投与のために、特に錠剤またはカプセル剤の形態で、とりわけ、結腸を標的として薬剤を放出することを目的とする技術を伴うものであり(Patel, M. M. Expert Opin. Drug Deliv. 2011, 8 (10), 1247-1258)；局所、例えば肺または鼻腔内への投与のために、特に粉末、点鼻薬、エアゾールの形態で、また経皮投与のために；眼局所投与のために、特に、溶液、エマルジョン、懸濁液、軟膏、インプラント（移植）／挿入、ゲル、ゼリーまたはリポソーム微粒子薬剤の形態で(Ghate, D.； Edelhauser, H. F. Expert Opin. Drug Deliv. 2006, 3 (2), 275？287)；眼への投与のために、特に生分解性および非生分解性のインプラント（移植）、リポソームおよびナノ粒子の形態で (Thrimawithana, T. R. et al. Drug Discov. Today 2011, 16 (5/6), 270-277);例えばバッカル〔buccal〕（頬）、舌下、または膣の粘膜に対する、粘膜投与のために、および直腸投与のために、例えば座薬または浣腸の形態で、調製することができる。
【００４７】
上述した側面（ａ）および（ｂ）の薬学的製剤および組合せ製剤は、便利なように、単位剤形で投与することができ、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985) に記載されているような、製薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。非経口投与用の製剤には、賦形剤として、滅菌水または食塩水、プロピレングリコールのようなアルキレングリコール、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物性油、水素化ナフタレンなどを含めることができる。経鼻投与用の製剤は、固形でもよく、賦形剤として、例えば、ラクトースまたはデキストランを含めることができ、あるいは点鼻薬または計量スプレー〔metered spray〕の形態で使用するために水性または油性の溶液でもよい。バッカル投与の場合は、典型的な賦形剤としては、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが挙げられる。
【００４８】
経口投与に適した薬学的製剤および組合せ製剤は、一つ以上の生理学的に適合性のある担体および／または賦形剤を含有してもよく、固形または液状であってもよい。錠剤およびカプセル剤は、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカンタ、またはポリビニルピロリドン；ラクトース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシンといった充填材；ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカといった滑沢剤；およびラウリル硫酸ナトリウムのような界面活性剤を用いて調製することができる。液状の組成物は、懸濁化剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、砂糖シロップ、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、食用油脂；レシチンまたはアカシアといった乳化剤；アーモンドオイル、ココナッツオイル、タラ肝油、またはピーナッツオイルといった植物油；ブチルヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）といった防腐剤のような、慣習的な添加剤を含んでいてもよい。液状の組成物は、単位剤形とするために、例えばゼラチンの中に、カプセル化されていてもよい。
【００４９】
固形の経口服用剤形としては、錠剤、二片ハードシェルカプセルおよびソフト弾性ゼラチン（ＳＥＧ）カプセルが挙げられる。そのような二片ハードシェルカプセルは、例えば、ゼラチンまたはヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から作られていてもよい。
【００５０】
ドライシェル製剤は、典型的には、約４０〜６０ｗ／ｗ％の濃度のゼラチン、約２０〜３０％の濃度の可塑剤（グリセリン、ソルビトールまたはプロピレングリコ−ルなど）、および約３０〜４０％の濃度の水を含有する。保存料、色素、乳白剤および香料といったその他の材料が存在してもよい。液状の充填材料は、鉱物油、植物油、トリグリセリド、グリコール、ポリオールおよび界面活性剤といった溶媒または組み合わされた溶媒中の、（ミツロウ、硬化ヒマシ油またはポリエチレングリコール４０００のような懸濁化剤を用いて）溶解、可溶化もしくは分散した固形の薬物、または液状の薬物を含有する。
【００５１】
本発明の化合物は、（例えば、肺、眼または腸に）局所的に投与されてもよい。したがって、上述した、言及し得る側面（ａ）および（ｂ）の態様には、局所的投与に適合する薬学的製剤および組合せ製剤が包含される。そのような製剤としては、賦形剤（アジュバント、希釈剤および／または担体を任意に含んでいてもよい）が局所的に許容し得るものである製剤が挙げられる。
【００５２】
肺への局所的投与は、エアゾール製剤を用いることによって達成することができる。エアゾール製剤は、典型的には、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）といった適切なエアゾールの噴射剤に懸濁または溶解した有効成分を含有する。適切なＣＦＣ噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤１１）、ジクロロテトラフルオロエタン（噴射剤１１４）およびジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２）が挙げられる。適切なＨＦＣ噴射剤としては、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ−１３４ａ）およびヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ−２２７）が挙げられる。噴射剤は、典型的には、総吸入組成物の４０〜９９．５重量％、例えば４０〜９０重量％を構成する。この製剤は、共溶媒（例えばエタノール）および界面活性剤（例えばレシチン、ソルビタントリオレエートなど）を包含する賦形剤を含有してもよい。その他の考え得る賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどが挙げられる。エアゾール製剤はキャニスターに包装され、適切な用量は計量バルブ（例えば、Ｂｅｓｐａｋ、Ｖａｌｏｉｓもしくは３Ｍによって供給されているもの、または、Ａｐｔａｒ、ＣｏｓｔｅｒもしくはＶａｒｉによって供給されているもの）によって送達される。
【００５３】
また、肺への局所的投与は、水性の溶液または懸濁液のような加圧されない製剤を用いることによっても達成することができる。これはネブライザー、例えば、ハンドヘルドおよびポータブルとできるもの、または、家もしくは病院で使用することができる（すなわち、ポータブルでない）ものによって投与することができる。製剤は、水、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤および共溶媒といった賦形剤を含んでいてもよい。懸濁液およびエアゾール製剤（加圧されてるかされていない）は、典型的には、本発明の化合物を、例えば、Ｄ50が０．５〜１０μｍ、例えば約１〜５μｍである微細粉末形で含むであろう。粒度分布は、Ｄ10、Ｄ50およびＤ90の値を用いて表してもよい。粒度分布のＤ50中央値は、分布を半分に分ける、ミクロン単位の粒子径として定義される。レーザー回折から導き出される測定値は、体積分布としてより正確に表現されるので、この方法を用いて得られたＤ50の値は、より有意義に、Ｄｖ50値（体積分布の中央値）を表している。Ｄｖ値は、本明細書において使用したとき、レーザー回折を用いて測定された粒度分布をいう。同様に、レーザー回折の文脈で用いられるＤ10およびＤ90の値が、Ｄｖ10およびＤｖ90を意味しており、１０％の分布がＤ10値より低く、９０％の分布がＤ90値より低い粒子径をいう。
【００５４】
肺への局所的投与はまた、乾燥粉末製剤を用いることによっても達成することができる。乾燥粉末製剤は、微細粉末形の、典型的には空気動力学径の質量平均値〔mass mean aerodynamic diameter〕（ＭＭＡＤ）が１〜１０μｍ、または、Ｄ50が０．５〜１０μｍ、例えば、約１〜５μｍである、開示の化合物を含むだろう。微細粉末形である本発明の化合物の粉末は、微粉化処理または同様のサイズリダクション処理によって調製してもよい。微粉化は、Hosokawa Alpin社製のジェットミルといったジエットミルを用いて行ってもよい。得られた粒度分布は、（例えば、Malvern Masterisizer 2000S装置を用いて）レーザー回折を用いて測定してもよい。この製剤は、典型的には、通常は粒子径の大きな、例えばＭＭＡＤが５０μｍ以上、例えば、１００μｍ以上であるか、または、Ｄ50が４０〜１５０μｍである、ラクトース、グルコールまたはマンニトール（好ましくはラクトース）といった局所的に許容し得る希釈剤を含むだろう。、「ラクトース」という用語は、本明細書において使用した時は、α−ラクトース一水和物、β−ラクトース一水和物、α−ラクトース無水物、β−ラクトース無水物および無定形ラクトースを含む、ラクトース含有成分をいう。ラクトース成分は、微粒子化、ふるい分け、製粉、圧縮、凝集またはスプレー乾燥によって処理されていてもよい。多様な形態の市販品のラクトースの形態も包含され、例えば、Lactohale（登録商標）（吸入グレードラクトース；ＤＦＥファーマ）、InhaLac（登録商標）70（ふるい分けされた、乾燥粉末吸入用のラクトース；Meggle）、Pharmatose（登録商標） （ＤＦＥファーマ）およびRespitose（登録商標） （ふるい分けされた吸入グレードラクトース；ＤＦＥファーマ)の製品が包含される。一態様では、ラクトース成分は、α−ラクトース一水和物、α−ラクトース無水物および無定形ラクトースからなる群より選択される。好ましくは、ラクトースは、α−ラクトース一水和物である。
【００５５】
また、乾燥粉末製剤は、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸マグネシウムといった他の賦形剤を含んでいてもよい。
【００５６】
乾燥粉末製剤は、典型的には、乾燥粉末吸引（ＤＰＩ）装置を用いて供給する。乾燥粉末の送達系の例としては、ＳＰＩＮＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＨＡＬＥＲ、ＴＵＲＢＯＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＵＳおよびＣＬＩＣＫＨＡＬＥＲが挙げられる。乾燥粉末の送達系の更なる例としては、ＥＣＬＩＰＳＥ、ＮＥＸＴ、ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ、ＨＡＮＤＩＨＡＬＥＲ、ＡＥＲＯＬＩＳＥＲ、ＣＹＣＬＯＨＡＬＥＲ、ＢＲＥＥＺＨＡＬＥＲ／ＮＥＯＨＡＬＥＲ、ＭＯＮＯＤＯＳＥ、ＦＬＯＷＣＡＰＳ、ＴＷＩＮＣＡＰＳ、Ｘ−ＣＡＰＳ、ＴＵＲＢＯＳＰＩＮ、ＥＬＰＥＮＨＡＬＥＲ、ＭＩＡＴＨＡＬＥＲ、ＴＷＩＳＴＨＡＬＥＲ、ＮＯＶＯＬＩＺＥＲ、ＰＲＥＳＳＡＩＲ、ＥＬＬＩＰＴＡ、ＯＲＩＥＬドライパウダーインヘイラー（dry powder inhaler）、ＭＩＣＲＯＤＯＳＥ、ＰＵＬＶＩＮＡＬ、ＥＡＳＹＨＡＬＥＲ、ＵＬＴＲＡＨＡＬＥＲ、ＴＡＩＦＵＮ、ＰＵＬＭＯＪＥＴ、ＯＭＮＩＨＡＬＥＲ、ＧＹＲＯＨＡＬＥＲ、ＴＡＰＥＲ、ＣＯＮＩＸ、ＸＣＥＬＯＶＡＩＲおよびＰＲＯＨＡＬＥＲが挙げられる。
【００５７】
一態様では、本発明の化合物は、例えば、さらに、好適なグレードのラクトースを、任意にステアリン酸マグネシウムと共に、含み、ＡＥＲＯＬＩＳＥＲといった単一投与装置に充填された、または、ＤＩＳＫＵＳといった複合投与装置に充填された、微粉化した乾燥粉末製剤の状態で提供される。
【００５８】
また、本発明の化合物は、例えば座薬または浣腸の形態で、直腸に投与することもできる。その座薬または浣腸としては、水性または油性の溶液のみならず、懸濁液またはエマルション（乳濁液）も挙げられる。そのような組成物は、当業者に周知の、次のような標準的な手順で調製される。例えば、座薬は、有効成分をカカオバターまたは他のグリセリド（例えば、Ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ）のような慣用的な座薬基剤と混合することによって調製することが可能である。この場合、薬物は、常温では固形だが直腸温度では液状になり、それによって直腸内で溶けて薬物を放出することになる、適切な非刺激性の賦形剤と混合される。そのような材料はカカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【００５９】
一般的に、眼に局所的に投与することが意図される、点眼薬または眼軟膏の形態の組成物については、阻害剤の総量は約０．０００１から４．０％（ｗ／ｗ）未満である。
【００６０】
好ましくは、眼の局所的投与については、本発明により投与される組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、および他の投薬形態として製剤化されるだろう。製剤化が容易であること、それとともに、疾病に冒された眼に１または２滴の溶液を点眼することによって、患者がそのような組成物を容易に投与する能力を有することに基づけば、水溶液が一般的に好ましい。しかしながら、この組成物は、懸濁液、粘稠性もしくは半粘稠性のゲル、または他のタイプの固形もしくは半固形の組成物であってもよい。懸濁液は、水にわずかにしか溶けない化合物にとって好ましいといえる。
【００６１】
本発明により投与される組成物は、等張化剤、緩衝液、界面活性剤、安定化ポリマー、防腐剤、共溶媒および増粘剤〔viscosity building agent〕を包含する、しかしこれらに限定されない、様々な他の成分を含有してもよい。本発明の好ましい医薬組成物は、阻害剤を等張化剤および緩衝液とともに含有する。本発明の医薬組成物は、さらに任意で、界面活性剤および／または緩和剤〔palliative agent〕および／または安定化ポリマーを含有してもよい。
【００６２】
組成物の浸透圧を、点眼組成物について好ましくは天然の涙の浸透圧になるように、調節するために、様々な等張化剤を採用することができる。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ブドウ糖、フルクトース、ガラクトースといった単純な糖類、および／または、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルチトール、マルチトール、および水素化されたデンプン加水分解物などの糖アルコールのような単純なポリオールを組成物に添加し、おおよそ生理的な浸透圧になるようにすることができる。等張化剤のそのような量は、添加される特定の剤に応じて変動するだろう。しかしながら、一般的には組成物は、最終的な組成物が点眼用に許容し得る浸透圧（一般的には約１５０〜４５０ｍＯｓｍ、好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ、そして最も好ましくは約２９０ｍＯｓｍ）を有するものとなるのに、十分な量の等張化剤を有するだろう。一般的に、本発明の等張化剤は、２〜４ｗ／ｗ％の範囲で存在するだろう。本発明の好ましい等張化剤としては、単純な糖類またはＤ−マンニトールのような糖アルコールが挙げられる。
【００６３】
貯蔵条件下におけるｐＨドリフトを抑制するために、適当な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）を組成物に添加してもよい。採用する剤に応じて、特定の濃度は変動するだろう。しかしながら、好ましくは、目標とするｐＨがｐＨ５〜８の範囲内に維持されるように、より好ましくは目標とするｐＨをｐＨ５〜７とするように、緩衝液が選ばれるだろう。
【００６４】
界面活性剤は、阻害剤をより高い濃度で送達するために任意で採用してもよい。界面活性剤は、阻害剤を可溶化し、ミセル溶液、マイクロエマルション、エマルションおよび懸濁液といったコロイド分散液を安定化するために機能する。任意で使用することのできる界面活性剤の例としては、ポリソルベート、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシル〔polyoxyl〕４０、ポリオキシル〔polyoxyl〕ヒマシ油、チロキサポール、トリトン、およびソルビタンモノラウレートが挙げられる。本発明において採用される好ましい界面活性剤は、トリトンＸ１１４およびチロキサポールのように、１２．４〜１３．２の範囲の親水性・親油性・バランス“ＨＬＢ”を有し、かつ点眼の用途にとって許容し得るものである。
【００６５】
本発明の点眼組成物に添加することのできる更なる剤に、安定化ポリマーとして機能する粘滑剤〔demulcent〕がある。安定化ポリマーは、局所的な眼の用途にとって優先されるべき、イオン性の／荷電した例であり、より具体的には、物理的な安定性のために、そして水への分散液を作ることができるようにする（つまり水溶性にする）ために、（−）１０〜５０ｍＶのゼータ電位を呈する負の電荷を表面に帯びたポリマーである。本発明の好ましい安定化ポリマーは高分子電解質、または高分子電解質が一つ以上ならば、カルボマー、ポリカルボフィルおよびＰｅｍｕｌｅｎ（登録商標）、具体的にはＣａｒｂｏｍｅｒ  ９７４ｐ（ポリアクリル酸）のような、架橋ポリアクリレートのファミリーから選ばれるものであって、０．１〜０．５ｗ／ｗ％であるものだろう。
【００６６】
担体の粘性を増加させるために、他の化合物を本発明の点眼組成物に添加してもよい。
増粘剤〔viscosity enhancing agent〕の例としては、ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、セルロースファミリーの様々なポリマーといった多糖類；ビニルポリマー；およびアクリル酸ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
局所的な点眼製品は、典型的には複数回投薬の形態で包装される。それゆえ、使用の間の微生物汚染を防止するために防腐剤が必要とされる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウムブロマイド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に知られている他の薬剤が挙げられる。そのような防腐剤は典型的には０．００１〜１．０％ｗ／ｖの濃度で使用される。本発明の単位投薬組成物は、無菌とされるが、典型的に保存処理されない。そのため、そのような組成物は一般的に防腐剤を含まないだろう。
【００６８】
開業医または他の当業者は、本発明の化合物にとって適切な用量を、したがってどのような特定の薬学的製剤に含有されるべき本発明の化合物の量でも（単位投与量の形態でもそうでなくても）決定することができるだろう。
【００６９】
上記（ｂ）に記載した組合せ製剤に関連する、言及し得る本発明の態様は、他の治療剤が、呼吸器障害（例えば、以下に述べる特定の障害）の治療に好適である、当業者に公知の１つ以上の治療剤である態様を包含する。
【００７０】
例えば、（ＣＯＰＤまたは喘息といった）呼吸器障害の治療に対しては、他の治療剤は、以下のリストから選択される１つ以上の薬剤である：
‐  ステロイド（例えばブデソニド、ベクロメタゾン二プロピオン酸塩、フルチカゾンプロピオン酸塩、フランカルボン酸モメタゾン、フランカルボン酸フルチカゾン；更なる例としては、シクレソニド）；
‐  βアゴニスト、特にβ２アゴニスト（例えばテルブタリン、サルブタモール、サルメテロール、フォルモテロール；更なる例としては、ビランテロール、オロダテロール、レプロテロールおよびフェノテロール）；および、
‐  キサンチン（例えばテオフィリン）。
【００７１】
例えば、（ＣＯＰＤまたは喘息といった）呼吸器障害の治療に対しては、他の治療剤は、以下のリストから選択される１つ以上の薬剤である：
‐  ムスカリン拮抗剤（例えば、チオトロピウム、ウメクリジニウム、グリコピロニウム、アクリジニウムおよびダラトロピウム〔daratropium〕、例えば、臭化物塩であるこれらのいずれかのもの）；および
‐  ホスホジエステラーゼ阻害剤。
【００７２】
更に、胃腸障害（クローン病または潰瘍性大腸炎など）の治療に対しては、他の治療剤は、例えば、以下のリストから選択される一つ以上の薬剤であってもよい：
‐  ５-アミノサリチル酸またはそのプロドラッグ（例えばスルファサラジン、オルサラジンまたはｂｉｓａｌａｚｉｄｅ；
‐  コルチコステロイド（例えばプレドニソロン、メチルプレドニゾロンまたはブデソニド）；
‐  免疫抑制剤（例えばシクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、アザチオプリンまたは６-メルカプトプリン）；
‐  抗ＴＮＦα抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールまたはゴリムマブ）；
‐  抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えばウステキヌマブ）または低分子ＩＬ１２／ＩＬ２３阻害剤（例えばａｐｉｌｉｍｏｄ）；
‐  抗α４β７抗体（例えばベドリズマブ）；
‐  ＭＡｄＣＡＭ−１遮断薬（例えばＰＦ−００５４７６５９）；
‐  細胞接着分子α４−インテグリンに対する抗体（例えばナタリズマブ）；
‐  ＩＬ２受容体αサブユニットに対する抗体（例えばダクリズマブまたはバシリキシマブ」
‐  ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）；
‐  Ｓｙｋ阻害剤およびそのプロドラッグ（例えばｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂおよびＲ-４０６）；
‐  ホスホジエステラーゼ４阻害剤（例えばｔｅｔｏｍｉｌａｓｔ）；
‐  ＨＭＰＬ−００４；
‐  プロバイオティックス；
‐  デルサラジン；
‐  セマピモド／ＣＰＳＩ−２３６４；および
‐  タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えばＡＥＢ−０７１）。
【００７３】
眼の障害（ブドウ膜炎または乾性角結膜炎（ドライアイ）など）の治療に対しては、他の治療剤は、例えば、以下のリストから選択される一個以上の薬剤であってもよい：
‐  コルチコステロイド（例えばデキサメタゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンアセトニド、ジフルプレドナートまたはフルオシノロンアセトニド）；
‐  グルココルチコイド作動薬（例えばマプラコラト）；
‐  免疫抑制剤（例えばシクロスポリン、ｖｏｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチルまたはタクロリムス）；
‐  抗ＴＮＦα抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ＥＳＢＡ-１０５またはゴリムマブ）；
‐  抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えばセクキヌマブ）；
‐  ｍＴＯＲ阻害剤（例えばシロリムス）；
‐  ＶＧＸ−１０２７；
‐  アデノシンＡ３受容体作用薬（例えば、ＣＦ−１０１）；
‐  リフィテグラスト；
‐  ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）；および
‐  タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えばＡＥＢ−０７１）。
【００７４】
特定の態様においては、眼の障害（ブドウ膜炎または乾性角結膜炎（ドライアイ）など）の治療に対して、他の治療剤は、例えば、以下のリストから選択される一つ以上の薬剤であってもよい：
‐  コルチコステロイド（例えばデキサメタゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンアセトニド、ジフルプレドナートまたはフルオシノロンアセトニド）；
‐  免疫抑制剤（例えばシクロスポリン、ｖｏｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチルまたはタクロリムス）；
‐  抗ＴＮＦα抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ＥＳＢＡ-１０５またはゴリムマブ）；
‐  抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えばセクキヌマブ）；
‐  ｍＴＯＲ阻害剤（例えばシロリムス）；
‐  ＶＧＸ−１０２７；
‐  ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）；および
‐  タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えばＡＥＢ−０７１）。
【００７５】
医療用途
本発明の化合物は、炎症性疾患に対する単剤療法またはそのような疾患に対する併用療法に用いてもよい。
【００７６】
したがって、言及し得る前記側面（ｅ）〜（ｇ）の態様としては、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体）が、治療で利用される、単一の薬学的に有効な成分である態様が挙げられる。
【００７７】
しかしながら、前記側面（ｅ）〜（ｇ）の他の態様では、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体）が、１つ以上の他の治療剤も投与されている患者に投与される（例えば、１つ以上の他の治療剤が、組合せ製剤と関連して上で定義した通りである場合）。
【００７８】
「炎症性疾患」という用語には、本明細書において使用するときは、具体的には、以下のいずれか１つ以上が包含される：
（ｉ）嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、または、特に、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を包含する）、喘息もしくは小児喘息〔paediatric asthma〕といった、炎症性要素を有する肺の疾患または障害；
（ｉｉ）アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触皮膚炎または乾癬といった、炎症性要素を有する皮膚の疾患または障害；
（ｉｉｉ）アレルギー性鼻炎、鼻炎または副鼻腔炎といった、炎症性要素を有する鼻の疾患または障害；
（ｉｖ）結膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を包含する）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／または滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、術後白内障炎症、または、特に、乾性角結膜炎（ドライアイ）、ブドウ膜炎（後部、前部および全ブドウ膜炎を包含する）、角膜移植片 および角膜輪部細胞移植拒絶反応といった、炎症性要素を有する眼の疾患または障害；および、
（ｖ）グルテン過敏性腸疾患（小児脂肪便症）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、または、特に、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎といった、炎症性要素を有する消化器の疾患または障害。
【００７９】
本明細書において、炎症性要素を有する疾患には、上記疾患とは別の（非炎症性の）症状または結果があるかないかを問わず、炎症を伴う疾患が包含される。
【００８０】
本発明の更なる一側面によれば、以下を含む、式Ｉの化合物の調製方法が提供される：
（ａ）例えば当業者に公知の条件下、例えば周囲雰囲気（ambient）（例えば１５〜３０℃）〜約１１０℃の温度で、好適な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１,４ジオキサンまたはそれらの混合物といった、極性非プロトン性溶媒）の存在下での、式ＩＩの化合物の、式ＩＩＩの化合物との反応；
【００８１】
【化２】
0006464384.tif 000003
【００８２】
【化３】
0006464384.tif 000004
【００８３】
Ｚ1およびＺ2のうちの一方は、式ＩＶの構造フラグメントであって、
【００８４】
【化４】
0006464384.tif 000005
【００８５】
Ｚ1およびＺ2のうちの他方は、式Ｖの構造フラグメントである。
【００８６】
【化５】
0006464384.tif 000006
【００８７】
（ｂ）例えば当業者に公知の条件下、例えば準周囲雰囲気〜雰囲気温度（例えば、約−５〜５℃の開始温度〜続く反応の雰囲気温度まで）で、アミン塩基（例えば、トリエチルアミン、または、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンといった立体障害性アミン）および好適な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１,４ジオキサンまたはそれらの混合物といった、極性非プロトン性溶媒）の存在下での、式ＩＩａの化合物の、好適なアジド形成剤（すなわち、アジドリン酸ジフェニルといった、好適な遊離基源および好適な活性化アジドイオン源；例えば、Tetrahedron 1974, 30, 2151-2157参照）との反応、当該反応に続いて、分離することなく（式Ｚ1-Ｃ(Ｏ)-Ｎ3の）アシルアジド中間体の、（例えば、加熱下での）熱転移によって例えば（１５〜３０℃といった）雰囲気温度で、その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で得られる式ＩＩの化合物、この化合物は式ＩＩＩの化合物と上で定義したように反応され、式Ｉの化合物が合成される；
【００８８】
【化６】
0006464384.tif 000007
【００８９】
Ｚ1は、上で定義した通りである。
（ｃ）例えば雰囲気温度（例えば、周囲雰囲気〜８０℃、例えば約６０℃）で、アミン塩基（例えば、トリエチルアミン、または、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンといった立体障害性アミン）および好適な有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、または、イソプロピルアセテートといったエステルといった、非プロトン性溶媒）が任意で存在していてもよいといった、当業者に公知の条件下での、式ＩＩｂの化合物の、式ＩＩＩの化合物との、上で定義した反応；
【００９０】
【化７】
0006464384.tif 000008
【００９１】
ＬＧ1は好適な脱離基（例えば、イミダゾリル、クロロ、またはフェノキシといったアリールオキシ）を表し、Ｚ1は上で定義した通りである。
（ｄ）例えば高温（例えば、５０〜１１０℃）で、好適な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１，４ジオキサンまたはそれらの混合物といった、極性非プロトン性溶媒）の存在下で、かつ、酸触媒（例えば、ｐ-トルエンスルホン酸といったスルホン酸）が任意で存在していてもよいといった、（例えば、J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 15686-15696に記載されているような）当業者に公知の条件下、または、パラジウム触媒および、例えばBrettPhosである適切な配位子を含む、バックワルド（Buchwald）カップリング (Surry, D. S.; Buchwald, S. L. Chem. Sci. 2011, 2, 27-50) を通じた、式ＶＩの化合物の、式ＶＩＩの化合物との反応；
【００９２】
【化８】
0006464384.tif 000009
【００９３】
ＬＧ2は、好適な脱離基（例えば、クロロまたはブロモといったハロ基）を示す。
【００９４】
【化９】
0006464384.tif 000010
【００９５】
または
（ｅ）例えば、（ｉ）Ｒ4'がＣ1-3アルキル基を示すときの、雰囲気温度で、好適なルイス酸触媒（例えば、トリメチルアルミニウムといったトリアルキルアルミニウム剤）および非プロトン性有機溶媒（例えば、ＴＨＦ）の存在下での反応、（ｉｉ）Ｒ4'がＨを示すときの、ターシャリーアミン塩基（例えばトリエチルアミンもしくはジイソプロピルエチルアミンといったトリアルキルアミンまたはＮ-メチルピロリドンまたはＮ-メチルモルホリンといった環状アミン）、アミド（ペプチド）カップリング剤（例えばＴ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＣＤＩ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔまたはＤＣＣもしくはジイソプロピルカルボジイミドといったカルボジイミド）および非プロトン性有機溶媒（例えば、ＤＣＭといった塩素化溶媒、酢酸エチルといったエステル、ＤＭＦといったジメチルアミンのアミド、もしくはそのような有機溶媒のいずれかの混合物）の存在下での反応、または、（ｉｉｉ）式ＶＩＩｂの化合物との反応前に、式ＶＩＩａの化合物を、ＯＲ4'をハロで置き換えた対応する化合物(例えば、クロロ、このような化合物は、例えば、Ｒ4'がＨを示す式ＶＩＩａの化合物の、例えば塩化チオニルであるハロゲン化剤との反応により、例えば、５０〜７０℃といった高温で調製される)に変換し、当該変換に続く、得られた酸ハロゲン化物と、式ＶＩＩｂの化合物との反応、該反応は、例えば、非プロトン性有機溶媒(例えば、ＤＣＭといった塩素系溶媒)の存在下で行われるといった、当業者に公知の条件下での、
式ＶＩＩａ化合物の、式ＶＩＩｂ化合物との反応
【００９６】
【化１０】
0006464384.tif 000011
【００９７】
Ｒ4'は、ＨまたはＣ1-3アルキル（例えば、メチル）を表す。
【００９８】
H2N-[CH2CH2-O]2-CH2CH2-OCH3          VIIb
式ＩＩの化合物は、当業者に公知の方法に従って、またはそれに類似した方法によって、例えば、上で定義した式ＩＩａの化合物のアジド形成剤との反応、当該反応に続く、アシルアジド中間体の再配列（上記（ｂ）に示したような；例えば、Tetrahedron 1974, 30, 2151-2157参照）によって調製してもよい。
【００９９】
式ＩＩｂの化合物は、例えば、当業者に公知の条件下で、式ＶＩＩＩの化合物の、式ＩＸの化合物との反応によって調製してもよい。
【０１００】
【化１１】
0006464384.tif 000012
【０１０１】
ＬＧ1は、上で定義した通りである。
【０１０２】
【化１２】
0006464384.tif 000013
【０１０３】
Ｚ1は、上で定義した通りである。
【０１０４】
式ＩＸのアミンは、上記（ｂ）で説明した経路により、式ＩＩａのカルボン酸から調製してもよい。ここで、イソシアネートＩＩ中間体は、水で加水分解され、二酸化炭素を失ってＩＸを生じるカルバミン酸を生じる。同様に、イソシアネートＩＩ中間体は、ｔ-ブタノールといったアルコールと反応させて、保護型のＩＸを生成させることができる。
【０１０５】
Ｚ2が式Ｖの構造フラグメントを表す式ＩＩＩの化合物、または、Ｚ1が式Ｖの構造フラグメントを表す式ＩＸの化合物は、スキーム１で概説した経路を用いて合成することができる（例えば：WO2003/072569；およびWO2008/046216参照）。ここで、ＬＧ3およびＬＧ4は脱離基、例えば、ハロゲンまたはメタンスルホニルであり、ＦＧはＮＨ2基そのものまたは潜在的なＮＨ2基、すなわち、ニトロまたはＰＧ2が典型的な保護基（例えば：Greene, T. W.； Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis； Wiley, 4th revised edition, 2006； ISBN10: 0471697540参照）、例えばカルバミン酸エステルまたはカルボキサミドである保護された異形（variant）ＮＨ-ＰＧ2といったＮＨ2基に容易に変換する基を表す。シークエンスは、Ｘが塩基で処理されてエステルＸＩＩを生じるときのアロキシド（aroxide）形成によって、ＸＩにおけるＬＧ3の塩基媒介ＳNＡｒ置換から出発する。次いで、エーテルＸＩＩの残留ハロゲンまたはメタンスルホニル置換基（ＬＧ4）が、ｉ）第二のＳNＡｒ反応における式ＶＩＩのアミンによって、または（ｉｉ）式ＶＩＩのアミンとのＢｕｃｈｗａｌｄカップリング（例えば、WO2009/017838参照）により所望の化合物（ＦＧがＮＨ2であるとき）またはＸＩＩＩ（ＦＧがニトロまたはＮＨ-ＰＧ2であるとき）を生じる経由で、置換される。ＦＧがＸＩＩＩにおいてニトロであるとき、ＮＨ2基は、還元反応によって生じ、典型的には、好適な触媒、例えば、カーボン上のパラジウムを用いるか、または、氷酢酸中の鉄といった、金属を溶解する条件を用いる水素化によってなされる。また、ＦＧが保護基であるときは、ＮＨ2基は、脱保護反応によって生じさせてもよい。このシークエンスの最終工程で生じるとだけ説明したが、ＦＧで表される潜在的なＮＨ2基の脱マスキングは、スキーム１に示した合成経路のいずれの段階でも行うことができることに留意されたい。
【０１０６】
スキーム１
【０１０７】
【化１３】
0006464384.tif 000014
【０１０８】
同様の方法で、Ｚ1が式ＩＶの構造フラグメントを表す式ＩＸのアミンは、式ＸＩＩＩａの化合物における潜在的なＮＨ2基のＮＨ2基そのものへの変換によって合成してもよい。
【０１０９】
【化１４】
0006464384.tif 000015
【０１１０】
ＦＧ'は、ＮＨ2を表さない以外は上記ＦＧの定義と同じである。
【０１１１】
Ｚ2が式Ｖの構造フラグメントを表す式ＩＩＩの化合物、または、Ｚ1が式Ｖの構造フラグメントを表す式ＩＸの化合物は、本明細書で説明した、式Ｉの化合物の調製方法
（上記工程（ｅ）参照）および式ＩＩＩの他の化合物の調製方法（例えば、上記スキーム１参照）、例えば、当業者に公知の条件（例えば、上記工程（ｅ）に関連して説明したペプチドカップリング条件）下で、式ＸＩＩＩｂの化合物の式ＶＩＩｂの化合物との、上で定義した反応、当該反応に続いて、スキーム１に関連して説明したような、ＦＧのＮＨ2への変換（必要であれば）、と同様に調製してもよい。
【０１１２】
【化１５】
0006464384.tif 000016
【０１１３】
ＦＧおよびＲ4'は、上で定義した通りである。
【０１１４】
式ＶＩの化合物は、式Ｉの化合物と同様に合成してもよい（例えば、選択可能なものとして上記工程（ａ）〜（ｃ）参照）。例えば、式ＶIの化合物は、式ＩＩｘの化合物の式ＩＩＩｘの化合物との反応により調製でき、式ＩＩｘおよびＩＩＩｘの化合物は、Ｚ1およびＺ2の一方が、上で定義した、式ＩＶの構造フラグメントを表し、かつ、Ｚ1およびＺ2の他方が、式Ｖａの構造フラグメントを表すことを除いて、式ＩＩおよびＩＩＩの化合物と同様に定義される。
【０１１５】
【化１６】
0006464384.tif 000017
【０１１６】
式ＶＩＩの化合物は、当業者に公知の手順または類似の手順、例えば、当業者に公知の条件（例えば、上記工程（ｅ）に関連して説明したペプチドカップリング条件）下で、式ＸＩＶの化合物の、式ＶＩＩｂの化合物との、上で定義した反応、当該反応に続いて、ＦＧがＮＨ-ＰＧ2を表すときの、ＰＧ2保護基の除去、または、ＦＧがＮＯ2を表すときの、ＮＯ2のＮＨ2への還元により、調製してもよい。
【０１１７】
【化１７】
0006464384.tif 000018
【０１１８】
ＦＧは、上で定義した通りである。
【０１１９】
当業者であれば、式ＩＩ、ＩＩｘおよびＩＩｂで表される化合物が、通常、反応性中間体であることは理解できよう。これら中間体は、その場（in situ）で形成してもよいし、単離することなく、式ＩＩＩの化合物と直接反応させて、式Ｉの化合物を調製してもよい。さらに、当業者であれば、適切な保護基を使用することが、化学的に敏感な官能基、例えば、ヒドロキシル基またはアミノ官能基を有するＺ1およびＺ2基のいずれかに対する上述の処理の間に、必要になることは理解されよう。
【０１２０】
スキーム中で説明した化合物の多くは、市販品として得ることができるか、引用した手順を用いて得ることができるか、または、当業者による従来の方法に依って容易に調製できる。例えば、Regan, J. et al.； J. Med. Chem. 2003, 46, 4676-4686、WO2000/043384、WO2007/053346、WO2007/087448、WO2007/089512、WO2009/117080およびWO2014/027209を参照のこと。
【０１２１】
本発明の特定の態様は、式Ｉの化合物の調製方法に関し、該方法は、例えば当業者に公知の条件下、例えば、高温（例えば、４０〜８０℃、例えば約６０℃）、アミン塩基（例えば、トリエチルアミン）および非プロトン性有機溶媒（例えば、酢酸イソプロピルといったエステル）存在中での、式ＸＶの化合物の式ＸＶＩの化合物との反応からなる。
【０１２２】
【化１８】
0006464384.tif 000019
【０１２３】
【化１９】
0006464384.tif 000020
【０１２４】
ＬＧ1は、上で定義した通り（例えばフェノキシ）である。
【０１２５】
式ＸＶの化合物は、対応する式ＸＶａの化合物の脱保護、例えば当業者に公知の条件下、例えば、ＰＧ2が、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニルを表す時には、強酸（例えば、アルキルまたはアリルスルホン酸（例えば、ｐ-トルエンスルホン酸および／または、特に、トリフルオロ酢酸）との、非プロトン性有機溶媒（例えば、ＤＣＭといった塩素系溶媒）存在中での反応、により調製される。
【０１２６】
【化２０】
0006464384.tif 000021
【０１２７】
ＰＧ2は、上で定義した通り（例えば、ＰＧ2は、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニルである）である。
【０１２８】
式ＸＶａの化合物は、例えば当業者に公知の条件下、例えば、高温（例えば４０〜８０℃、例えば６０〜７０℃の間）で、非プロトン性溶媒（例えば、ＴＨＦ）および、任意に、酸触媒（例えば、para-トルエンスルホン酸といった、スルホン酸）の存在中での、上で定義した、式ＶＩＩの化合物の、上で定義した、但しＦＧがＮＨ−ＰＧ2（例えば、ＮＨ-Ｃ(Ｏ)Ｏ-Ｃ(ＣＨ3)3）を表す場合の式ＸＩＩの化合物（例えば、ＬＧ4がクロロを表す式ＸＩＩの化合物）との反応により調製される。
【０１２９】
式ＶＩＩの化合物は、例えば上述した方法によって調製される。例えば、式ＶＩＩの化合物は、式ＶＩＩ（Ｐ）の化合物の脱保護、例えば当業者に公知の条件下、例えば、雰囲気温度での、極性、非プロトン性溶媒（例えば、アセトニトリル）中での、ＴＢＡＦまたはフッ化セシウムといったフッ化物イオン源との反応、によって調製される。
【０１３０】
【化２１】
0006464384.tif 000022
【０１３１】
Ｒ'、Ｒ''およびＲ'''は、独立にＣ1-4アルキル（例えば、Ｒ'、Ｒ''およびＲ'''が全てイソプロピルを表す）を表す。
【０１３２】
式ＶＩＩ（Ｐ）の化合物は、式ＸＶＩＩの化合物の式ＸＶＩＩＩとのカップリング（例えば、Sonogashira coupling; see Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 5084-5121）、例えば当業者に公知の条件下、例えば、高温（例えば、５０〜８０℃または、特に、６０〜７０℃）で、ＣｕＩおよびＰｄ（０）触媒（例えば、Ｐｄ(ＰＰｈ3)4）、並びにＴＨＦといった反応不活性有機溶媒の存在下での反応、によって調製される。
【０１３３】
【化２２】
0006464384.tif 000023
【０１３４】
ＬＧ5はブロモといったハロを表し、
【０１３５】
【化２３】
0006464384.tif 000024
【０１３６】
Ｒ'、Ｒ''およびＲ'''は、上で定義した通りである。
【０１３７】
式ＸＶＩＩの化合物は、例えば当業者に公知の条件下、例えば、高温（例えば、約５０〜７０℃）で、水素雰囲気下（例えば、約３ＭＰａの圧力のＨ2下）、好適な触媒（例えば、Ｐｔ／Ｃ）、反応不活性溶媒（例えば、ＴＨＦ）および酸（例えば、酢酸）存在下での、または、代わりに水とエタノール中で、酸性媒体（例えば、塩酸）中の鉄による、式ＸＩＸの化合物の還元によって調製される。
【０１３８】
【化２４】
0006464384.tif 000025
【０１３９】
ＬＧ5は上で定義した通りである。
【０１４０】
式ＸＩＸの化合物は、式ＸＸの化合物のハロゲン化剤（例えば、塩化チオニル、例えば６０〜７０℃で）との反応、該反応に続いて、上で定義した、例えば当業者に公知の条件下、例えば２５℃以下で、非プロトン性有機溶媒（例えば、ＤＣＭ）および例えば、トリエチルアミン、ＤＩＰＥＡまたはＮａＨＣＯ3といった塩基存在中での、酸ハライド中間体と式ＶＩＩｂの化合物との反応により、調製される。あるいは、この変換は、第三級アミン塩基（例えば、トリエチルアミンまたはＤＩＰＥＡといったトリアルキルアミン、またはＮ-メチルピロリジンまたはＮ-メチルモルホリンといった環状アミン）、アミド（ペプチド）カップリング剤（例えば、Ｔ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＣＤＩ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔまたは、ＤＣＣ若しくはジイソプロピルカルボジイミドといったカルボジイミド）、および非プロトン性有機溶媒（例えば、ＤＣＭといった塩素系溶媒、酢酸エチルといったエステル、ＤＭＦといったジメチルアミンのアミド、またはそのような溶媒の混合物）存在下での縮合によって行うことができる。
【０１４１】
【化２５】
0006464384.tif 000026
【０１４２】
ＬＧ5は上で定義した通りである。
【０１４３】
式ＸＶＩの化合物は、式ＸＸＩの化合物(US2003/0065034)の、式ＸＸＩＩの化合物との反応により、例えば当業者に公知の条件下、例えば約２０℃未満で、塩基（例えば、ＮａＨＣＯ3）および反応不活性有機溶媒（例えば、ＴＨＦ、ＤＣＭまたは、特に、これらの混合物）の存在下で、調製される。
【０１４４】
【化２６】
0006464384.tif 000027
【０１４５】
【化２７】
0006464384.tif 000028
【０１４６】
ＬＧ1およびＬＧ2は、脱離基（例えば、ＬＧ1はフェノキシを示し、ＬＧ2はクロロといったハロを示す）を示す。
【０１４７】
式ＸＸＩの化合物は、式ＸＸＩＩＩの化合物の、例えば当業者に公知の条件下、例えば水素雰囲気下（例えば、約０．３〜０．４ＭＰａの圧力のＨ2下）、好適な触媒（例えば、Ｐｄ／Ｃ）および溶媒（例えばメタノール）存在下での、還元によって調製される。
【０１４８】
【化２８】
0006464384.tif 000029
【０１４９】
式ＸＸＩの化合物は、例えば当業者に公知の条件下、例えば２５と４０℃の間で、塩基（例えば、ピリジン）および反応不活性有機溶媒（例えば、トルエン）存在下での、式ＸＸＩＶの化合物の、塩化メタンスルホニルとの反応によって調製される。
【０１５０】
【化２９】
0006464384.tif 000030
【０１５１】
式ＸＸＩＶの化合物は、例えば当業者に公知の条件下、高温（例えば、７０〜８０℃）で、水素源（例えば、４-メチル-１-シクロヘキセン）、好適な触媒（例えば、Ｐｄ／Ｃ）および溶媒（例えば、メタノール、エタノールまたは、工業用変性アルコールといったこれらの混合物、といったアルコール）の存在下での、式ＸＸＶの化合物の部分的還元により調製される。
【０１５２】
【化３０】
0006464384.tif 000031
【０１５３】
特定の態様において、本発明は、式Ｉの化合物の調製方法に関し、前記方法は以下からなる：
（ａ）  本明細書に記載された、式ＸＶの化合物の調製方法；および／または
（ｂ）  本明細書に記載された、式ＸＶＩの化合物の調製方法
本発明のこれらの態様に関連して、式Ｉの化合物の調製方法は、本明細書に記載された、任意の一つまたはそれ以上の、式ＸＶａ、ＶＩＩ（Ｐ）、ＶＩＩ、ＸＶＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶ化合物の調製方法からなる。
【０１５４】
本明細書に記載した新規中間体は、本発明の一側面を形している。この点において、本発明の更なる一側面は、上で定義した式ＸＶＩの化合物（例えば、ＬＧ1がフェノキシを表す式ＸＶＩの化合物）に関する。
【０１５５】
本明細書に記載した本発明の側面（例えば上述の化合物、組み合わせ、方法および使用）は、本明細書に記載した症状の治療において、それらの症状またはその他の治療において使用するための、従来技術において知られている、類似する化合物、組み合わせ、方法（治療）または使用よりも、医師および／または患者にとってより都合のよい効果を有する、より有効である、より少ない毒性である、より良い選択性を有する、より幅広い範囲の活性を有する、より強力である、より副作用が少ない、より良い薬物動態学的および／または薬力学的特性を有する、より好適な固形状態の形態学を有する、より良い長期安定性を有する、または他の有益な薬理学的特性を有することができる。
【０１５６】
本発明の化合物は、さらに（または代わりに）：
‐  長期間作用性および／または作用の持続性を呈する（例えば、ＢＩＲＢ７９６といった、以前公開された他のｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して）；
‐  ＧＳＫ３αを強く阻害しない；
‐  キノームのより小さな部位を標的とする、すなわち、低減されたＫｉｎｏｍｅＳｃａｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅが示すように、改善された選択性を有する；
‐投与間で比較的高い局所的薬剤濃度を維持する（例えば、ＢＩＲＢ７９６といった以前公開された他のｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して高い局所的濃度）；
‐  特に局所的／局部的投与に適した特性（例えば、高い腎または肝抽出の結果として、例えば、局所的／局部的投与に続いて、式（Ｉ）の化合物の高い標的組織中濃度、しかし低い血漿中濃度、および／または血漿からの式（Ｉ）の化合物の急速なクリアランスを生み出すこと）を呈する；
‐  細胞の有糸分裂における、β-カテニンの誘導および／または抑制をほとんどまたは全く呈さない；
‐  in vitro小核試験において、ヒトリンパ球中に小核を含む二核細胞で増加を生じない；
‐  チトクロームＰ４５０スーパーファミリーのメンバーの、時間依存的な阻害をほとんどまたは全く呈さない；
‐  例えばＢＩＲＢ７９６といった以前公開されたｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して、水の存在下で、改善された化学的安定性を示す（例えば、高温での、水性混合物中での、加水分解に対する安定性）
‐  患者への投与に続いて、安全（例えば、毒）性にほとんどまたは全く関連しない代謝産物を生じさせる；
‐  良好な溶解性および／または細胞透過性を呈する；
‐  高い結晶化度を有する；および／または、
‐  固体状態において、ほとんどまたは全く吸湿性を呈さない。
【実施例】
【０１５７】
実験方法
基本手順
全ての出発物質および溶媒は、商業的供給源から得たか、または文献からの引用によって調製した。特に明記しない限り、すべての反応は撹拌しながら行なった。有機溶液は、無水硫酸マグネシウムにより常法に従って乾燥した。マイクロ波反応は、ＣＥＭ  ＤｉｓｃｏｖｅｒおよびＳｍｉｔｈｃｒｅａｔｏｒマイクロ波反応器により、可変出力のマイクロ波の照射により一定温度に加熱して行った。
【０１５８】
順相カラムクロマトグラフィは、あらかじめ充填されたシリカ(２３０-４００メッシュ、４０-６３μｍ)カートリッジを用いたＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ＣｏｍｐａｎｉｏｎまたはＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ＲＦシステムといった自動フラッシュクロマトグラフィシステムで常法に従って行った。ＳＣＸはＳｕｐｅｌｃｏから購入し、使用前に１Ｍの塩酸で処理した。特に明記しない限り、精製される反応混合物は、最初にメタノールで希釈し、２、３滴の酢酸によって酸性にした。この溶液は直接ＳＣＸに投入し、メタノールで洗浄した。それから、所望の材料を１％のＮＨ3のメタノール溶液を用いた洗浄によって溶出した。
【０１５９】
分析方法
ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて、０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液の勾配（グラジエント）によって溶出すること、またはＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮの勾配（グラジエント）によって溶出することにより行った。溶出ピークのＵＶスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システムのダイオードアレイまたは可変波長検出器のいずれかを用いて測定した。
【０１６０】
ＬＣＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて、０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液の勾配（グラジエント）によって溶出すること、またはＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮの勾配（グラジエント）によって溶出することにより行った。溶出ピークのＵＶスペクトルおよび質量スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００または正および負イオンエレクトロスプレーを備えた６１２０シングル四重極質量分析計を有するＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  １２６０  ＬＣＭＳのいずれかの可変波長検出器を用いて測定した。
【０１６１】
分取用ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍのカラムを用いて、０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液の勾配（グラジエント）によって溶出すること、またはＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、５μｍ,１９×５０ｍｍのカラムを採用して、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮの勾配（グラジエント）によって溶出することにより行った。フラクションは、Ｇｉｌｓｏｎ２１５分取用ＨＰＬＣまたはＶａｒｉａｎ  ＰｒｅｐＳｔａｒ分取用ＨＰＬＣの可変波長検出器によって測定される単一波長のＵＶ検出、または正および負イオンエレクトロスプレーを備えたＺＱシングル四重極質量分析計、およびＷａｔｅｒｓ  ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ  ＬＣＭＳの二波長検出器によって測定される質量および単一波長のＵＶ検出によって集められた。
【０１６２】
1Ｈ  ＮＭＲ分光法
1Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータの報告は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ分光計によって、４００ＭＨｚで得られた。クロロホルム-ｄ、ジメチルスルホキシド-ｄ6の中心ピークまたはトリメチルシランの内部標準を参照として用いた。
【０１６３】
実施例
実施例１
３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
（化合物Ｉ）
【０１６４】
【化３１】
0006464384.tif 000032
【０１６５】
（ｉ）３-ブロモ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)-５-ニトロベンズアミド
Ｔ３Ｐの５０重量パーセントＥｔＯＡｃ溶液(２５ｍｌ、４２.０ｍｍｏｌ)を、３-ブロモ-５-ニトロ安息香酸(７.０５ｇ、２８.７ｍｍｏｌ)、２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エタンアミン(４ｇ、２４．２５ｍｍｏｌ)およびＥｔ3Ｎ(１２ｍｌ、８６ｍｍｏｌ)のＥｔＯＡｃ(５０ｍｌ)溶液にゆっくり加え、その間 氷浴に浸していた。一旦加えることが完了したら、氷浴は取り除き、室温において２時間を撹拌しながら反応を行なった。混合物は、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液 (１００ｍｌ)とＥｔＯＡｃ(１００ｍｌ)とで分配した。有機層は、乾燥する(ＭｇＳＯ4)前に、Ｋ2ＣＯ3水溶液(１００ｍｌ中に１０ｇ)で洗い、塩水(１００ｍｌ)で洗い、そして、ろ過し、真空で濃縮し、副題の化合物(８.２３ｇ)を茶色の油として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (t, 1H), 8.65-8.64 (m, 1H), 8.53 (t, 1H), 8.46 (t, 1H), 3.57-3.43 (m, 10H), 3.41-3.38 (m, 2H), 3.21 (s, 3H).
LCMS m/z 391/393 (M+H)+ (ES+); 389/391 (M-H)- (ES-)
【０１６６】
（ｉｉ）３-アミノ-５-ブロモ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
鉄粉(５.９０ｇ、１０６ｍｍｏｌ)を、上記段階（ｉ）からの生成物(８.２４ｇ、２０.４３ｍｍｏｌ)および濃ＨＣｌ(２ｍｌ、２３.４０ｍｍｏｌ)をエタノール(６５ｍｌ)および水(１５ｍｌ)に溶解した溶液に加えた。その混合物は、１時間７５℃ (ブロック温度)において加熱した。それから、反応物は、水(３０ｍｌ)で希釈される前に室温に冷まし、ろ過し、真空で濃縮した。残渣は、塩基性にし(ＮａＨＣＯ3)、ＥｔＯＡｃ(３５０ｍｌ)と水(２７５ｍｌ)との間で分配した。有機層は乾燥し(ＭｇＳＯ4)、ろ過し、真空で濃縮し、オレンジ色の油を得た、それをシリカゲルのクロマトグラフィ(２２０ｇのカラム、０−５％のＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)によって精製し、副題の化合物(５.２５ｇ)をオレンジ色の油として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.36 (t, 1H), 7.07 (t, 1H), 7.00-6.99 (m, 1H), 6.84 (t, 1H), 5.57 (s, 2H), 3.52-3.48 (m, 8H), 3.42-3.39 (m, 2H), 3.35 (q, 2H), 3.22 (s, 3H).
LCMS m/z 361/363 (M+H)+ (ES+)
【０１６７】
（ｉｉｉ）３-アミノ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)-５-((トリイソプロピルシリル)エチニル)ベンズアミド
上記段階（ｉｉ）からの生成物(５.０６ｇ、１３.３１ｍｍｏｌ)、エチニルトリイソプロピルシラン(４.５ｍｌ、２０.０６ｍｍｏｌ)、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ(１３０ｍｇ、０.６８３ｍｍｏｌ)およびＥｔ３Ｎ(８ｍｌ、５７.４ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(４５ｍｌ)に溶解し、脱気された溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ3)4(７７０ｍｇ、０.６６６ｍｍｏｌ)を加えた。反応物は、８５℃で３時間加熱し、室温に冷却する前に、ＥｔＯＡｃ(２５０ｍｌ)と塩水(２５０ｍｌ)とで分配した。水相をＥｔＯＡｃ(２５０ｍｌ)によって更に抽出し、合わせた有機抽出液は、乾燥する(ＭｇＳＯ4)前に、水(３×２００ｍｌ)で洗い、塩水(２００ｍｌ)で洗い、ろ過し、真空で濃縮し、 暗色の茶色の油を得た。粗生成物は、シリカゲルのクロマトグラフィ(２２０ｇのカラム、０−３％のＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)によって精製し、副題の化合物(５.４ｇ)をオレンジ色の油として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.39 (t, 1H), 7.06-7.03 (m, 2H), 6.79-6.78 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 3.54-3.49 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 4H), 3.21 (s, 3H), 1.10 (s, 21H).
LCMS m/z 463 (M+H)+ (ES+)
【０１６８】
（ｉｖ）３-アミノ-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
上記段階（ｉｉｉ）からの生成物(５.３３ｇ、１１.４０ｍｍｏｌ)をＥｔＯＡｃ(７５ｍｌ)中で撹拌している溶液に、１ＭのＴＢＡＦのＴＨＦ(１１.４０ｍｌ、１１.４０ｍｍｏｌ)溶液を加えた。反応は、水(３００ｍｌ)とＥｔＯＡｃ(４００ｍｌ)とで分配される前に、室温で１時間撹拌し、水相は、ＥｔＯＡｃ(３００ｍｌ)によって、更に抽出した。合わせた有機抽出液は、乾燥する(ＭｇＳＯ4)前に、塩水(４００ｍｌ)で洗い、ろ過し、濃縮し、オレンジ色の油を得た。粗生成物は、最小限の量のＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸへかけた。カラムは、ＭｅＯＨ(カラム体積の３倍)によって溶出し、続いて１％のＮＨ3のＭｅＯＨ溶液(カラム体積の３倍)によって溶出した。生成物を含有している画分は、真空で濃縮し、副題の化合物(３.２７ｇ)を茶色の油として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.38 (t, 1H), 7.06-7.04 (m, 2H), 6.75-6.74 (m, 1H), 5.46 (s, 2H), 4.09 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 8H), 3.41-3.39 (m, 2H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.21 (s, 3H).
LCMS m/z 307 (M+H)+ (ES+)
【０１６９】
（ｖ）ｔｅｒｔ-ブチル(４-((２-((３-エチニル-５-((２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)-アミノ)ピリミジン-４-イル)オキシ)ナフタレン-１-イル)カルバメート
上記段階（ｉｖ）からの生成物(１ｇ、３.１３ｍｍｏｌ)およびｔｅｒｔ-ブチル(４-((２-クロロピリミジン-４-イル)オキシ)ナフタレン-１-イル)カルバメート(例えば、Ｉｔｏ，Ｋ．ら．，ＷＯ２０１０/０６７１３０、２０１０年６月１７日参照；７７７ｍｇ、２.０９０ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(６０ｍｌ)中で撹拌している溶液に、ｐＴＳＡ一水和物(２００ｍｇ、１.０５１ｍｍｏｌ)を加えた。その結果生じた溶液は、６０℃において７２時間撹拌した。反応物は、室温に冷まし、ＥｔＯＡｃ(１５０ｍｌ)と飽和ＮａＨＣＯ3水(１００ｍｌ)とで分配した。水層はＥｔＯＡｃ(２×１５０ｍｌ)によって更に抽出し、合わせた有機抽出液は乾燥する(ＭｇＳＯ4)前に、水(３×２００ｍｌ)で洗い、塩水(２００ｍｌ)で洗った。そして、ろ過し、濃縮し、オレンジ色の油(１.１７ｇ)を得た。粗生成物は、シリカゲルのクロマトグラフィ(８０ｇのカラム、０−５％のＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ溶液)によって精製し、副題の化合物(５５２ｍｇ)を明るい茶色の泡状物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.73 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.11-8.09 (m, 2H), 7.92-7.88 (br m, 1H), 7.83-7.80 (m, 1H), 7.62-7.53 (m, 3H), 7.56-7.55 (m, 1H), 7.42 (d, 1H), 6.57 (d, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.54-3.48 (m, 8H), 3.40-3.35 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 1.52 (s, 9H).
LCMS m/z 642 (M+H)+ (ES+)
【０１７０】
（ｖｉ）３-((４-((４-アミノナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシ-エトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
上記段階（ｖ）からの生成物(５４０ｍｇ、０.８２５ｍｍｏｌ)をＤＣＭ溶液(８ｍｌ)中で撹拌している溶液に、ＴＦＡ(３.２ｍｌ、４１.５ｍｍｏｌ)を加えた。反応物は、室温において１時間撹拌した。溶液は真空で濃縮し、そして、結果として生じる油は最少量のＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸへかけた。カラムは、ＭｅＯＨ(カラム体積の３倍)で溶出し、それから１％のＮＨ3のＭｅＯＨ溶液(カラム体積の３倍)によって溶出した。生成物を含有する画分は、真空で濃縮し、 副題の化合物(４０５ｍｇ)を、明るい茶色の泡状物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.73 (s, 1H), 8.45 (t, 1H), 8.36 (d, 1H), 8.14-8.10 (m, 1H), 8.07-8.05 (br m, 1H), 7.94-7.92 (br m, 1H), 7.65-7.61 (m, 1H), 7.47-7.40 (m, 3H), 7.15 (d, 1H), 6.72 (d, 1H), 6.37 (d, 1H), 5.87 (br s, 2H), 4.17 (s, 1H), 3.54-3.48 (m, 8H), 3.40-3.36 (m, 4H), 3.20 (s, 3H).
LCMS m/z 542 (M+H)+ (ES+)
【０１７１】
（ｖｉｉ）フェニル(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)カルバメート
フェニルクロロホルメート(０.５ｍｌ、３.９９ｍｍｏｌ)をN-(３-アミノ-５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシフェニル)メタンスルホンアミド(例えば、Ｃｉｒｉｌｌｏ，Ｐ．Ｆ．ら．，ＷＯ２００２/０８３６２８、２００２年１０月２４日参照;１ｇ、３.６７ｍｍｏｌ) およびＮａＨＣＯ3(６２０ｍｇ、７.３８ｍｍｏｌ)のＴＨＦ(１０ｍｌ)およびＤＣＭ(１０ｍｌ)の攪拌している溶液に加えた。混合物は２時間撹拌した。そして、水(２０ｍｌを加えた。有機層を分離し、乾燥し (ＭｇＳＯ4)、ろ過し、蒸発させて茶色の泡状物を得て、それをシクロヘキサン(２０ｍｌ)中で撹拌して、副題の化合物(１.４ｇ)を無色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.49 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.50 - 7.37 (m, 2H), 7.31 - 7.13 (m, 4H), 3.77 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 1.25 (s, 9H)
LCMS m/z 393 (M+H)+ (ES+); 391 (M-H)- (ES-)
【０１７２】
（ｖｉｉｉ）３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)-ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ−(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
フェニル(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)-カルバメート(上記のステップ１（ｖｉｉ）を参照；９５ｍｇ、０.２３９ｍｍｏｌ)、上記段階（ｖｉ）からの生成物(１２０ｍｇ、０.２１７ｍｍｏｌ)およびＥｔ3Ｎ(６ μＬ、０.０４３ｍｍｏｌ)のｉ−ＰｒＯＡｃ(３ｍｌ)中で撹拌している混合物を、７０℃でオーバーナイトで加熱した。反応物は、室温に冷まして、真空で濃縮された。残渣はシリカゲルのクロマトグラフィ(４０ｇのカラム、ＥｔＯＡｃにおいて０-５％のＭｅＯＨ)によって精製して油を得た、その油をジエチルエーテルですり潰し、明るいベージュ固体を得た。粗生成物は、分取ＨＰＬＣ(Ｖａｒｉａｎ、塩基性(１０ｍＭのアンモニウムビカーボネート)、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍカラム、３５−７０％のＭｅＣＮ水溶液)によって精製し、標題化合物(６９ｍｇ)をオフホワイトの固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.74 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.26 (d, 1H), 8.17 (d, 1H), 8.09-8.07 (m, 2H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.02 (d, 1H), 6.55 (d, 1H), 4.11 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.53-3.47 (m, 8H), 3.40-3.35 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 1.26 (s, 9H).
LCMS m/z 840 (M+H)+ (ES+); 838 (M-H)- (ES-)
【０１７３】
実施例２
３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
（化合物Ｉ）
（ｉ）３-ブロモ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)-５-ニトロベンズアミド
スクラバを備えた１０Ｌのフラスコに、窒素下、３-ブロモ-５-ニトロ安息香酸(２６８６ｇ、１０.９１モル)および塩化チオニル(５.３７Ｌ、７５.８モル)を加えた。反応物は６８℃［気体発生］に加熱し、それから６０℃でオーバーナイトで撹拌し、その後、ＬＣ分析は反応が完了したことを示した。反応物は、室温に冷まし、真空で濃縮したところ、３.２ｋｇの材料を与えた、塩化チオニル(収率１００％=２.８８ｋｇ)の存在を示す量であった。混合物は、トルエン(２×３Ｌ)から濃縮し、塩化チオニルのすべての痕跡量を取り除いた。合計３３７０ｇの酸クロリドが得られ、トルエンにより過剰な収率となった。
【０１７４】
窒素下の２０Ｌのフラスコに、２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エタンアミン(８９０ｇ、５.４５モル)およびＤＣＭ(３.５Ｌ)を加えた。続いて、８％のＮａＨＣＯ3水溶液(９Ｌ)を加えた。酸クロリド(１３７３ｇ有効、４.８９モル)はそれから混合物に加え、その間混合物を２５℃以下の温度に維持した［発熱および気体発生］。混合物は３０分間撹拌した。そして、その後、ＬＣは反応が完了したことを示した。有機層は、分離し、乾燥する前に１ＭのＨＣｌ(４.５Ｌ)で洗い、８％のＮａＨＣＯ3水溶液(４.５Ｌ)で洗い、ろ過し、真空で濃縮し、合計１９５６ｇの副題の化合物(収率９５％)を得た。１ＨのＮＭＲによる分析は、＞９５％の生成物純度を示した。
【０１７５】
（ｉｉ）３-アミノ-５-ブロモ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
上記段階（Ｉ）からの生成物(１ｋｇ、２.５６モル)をＴＨＦ(３.５Ｌ)およびＡｃＯＨ(５００ｍｌ)に溶解し、５％のＰｔ／Ｃ(３０ｇのＪＭタイプ１８ＭＡ、５５％の水
）で６０℃に加熱し、３ＭＰａ(３０ｂａｒ)の水素で水素化した。５時間後の分析は、ＡｒＮＨＯＨ及びＡｒＮＨ2の１:１の比率を示した。反応は、オーバーナイト後に完了し、1ＨのＮＭＲ分析が３％の脱ブロモ副生成物を示した。触媒はろ過して取り除いた、そして、残渣は酢酸エチル(３Ｌ)で希釈して、２０％の炭酸カリウム溶液(３.５Ｌ)によって洗った。有機層は、それから、乾燥し、ろ過し、真空で濃縮し、得られた残渣を５倍の体積のジエチルエーテル中で、オーバーナイトでスラリー化し、脱ブロモ種(スラリー化後＜２％)のレベル減少させた。副題の化合物は、９０％の収率で、ＬＣによると８６％の純度で得られた。
【０１７６】
（ｉｉｉ）３-アミノ-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)-５-((トリイソプロピルシリル)エチニル)ベンズアミド
窒素下の１０Ｌのフラスコに、上記段階（ＩＩ）からの生成物(７００ｇ、１.９３モル)およびＴＨＦ(５.５９Ｌ)を加えた。続いて、ＣｕＩ(１９.２ｇ、０.１モル)、トリエチルアミン(１.２９L、９.２７モル)およびエチニルトリイソプロピルシラン(３８９ｇ、２.１３モル)を加えた。反応物は、脱気して、窒素によって３回パージした。Ｐｄ（ＰＰｈ3)4(１２５.５ｇ、０.１９８モル)を加え、 反応物を脱気して、窒素によってパージした。反応物は６５℃でオーバーナイトで加熱した。そして、その後、ＬＣは９１％の生成物および＜１％の出発原料を示した。反応物混合物は真空で濃縮した、そして、残渣は酢酸エチル(２L)に取り、シリカプラグ(２ｋｇ)を通過させ、さらなる酢酸エチル(３０Ｌ)で溶出した。生成物含有画分は真空で濃縮し、粗生成物はＴＢＭＥ(５Ｌ)に溶解し、６Ｎ ＨＣｌ(５Ｌ)によって抽出した。水性ＨＣｌ層は、６Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ９−１０まで塩基性にする前に、ＴＢＭＥ(２×５Ｌ)によって洗った。生成物は、それからＴＢＭＥ(２×５Ｌ)によって抽出し、有機層を乾燥し、ろ過し、真空で濃縮し、６３５ｇの副題の化合物を1Ｈ  ＮＭＲで、＞９５％の 純度（溶媒を除く）で得た。
【０１７７】
（ｉｖ）３-アミノ-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
上記段階（ＩＩＩ）からの生成物 (１２００ｇ、２.５９モル)のＭｅＣＮ(８.８Ｌ)溶液にＣｓＦ(４３３.６ｇ、２.８５モル)を加えた。反応物は室温でオーバーナイトで撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は１.７％の生成物、９７.４％の出発原料を示した。さらなるＣｓＦ(４２０ｇ、２.７６モル)を仕込み、反応物を室温でオーバーナイトで撹拌した。すると、ＨＰＬＣ分析は、９１.０％の生成物、４.４％の出発原料を示した。混合物はろ過し、ろ液を真空下で濃縮し、ＨＰＬＣによれば、９２.５％の生成物、０.７％の出発原料である材料を得た。残渣は、ＤＣＭ溶液(３Ｌ)およびＥｔＯＡｃ(３Ｌ)溶解し、２つの等しい量に分割した。分割したそれぞれを、シリカパッド(１.６ｋｇ)を通して、ＥｔＯＡｃ(５０Ｌ)によって溶出した。ろ液は、合わせて、真空で濃縮した。粗生成物は、ヘプタン(２×４Ｌ)によって洗い、シリル不純物を除去した。合計７１９ｇの副題の化合物を、単離した(1Ｈ  ＮＭＲ分析によれば８３％、７５％の有効収率、５９７ｇ有効)。
【０１７８】
（ｖ）ｔｅｒｔ-ブチル(４-((２-((３-エチニル-５-((２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)-アミノ)ピリミジン-４-イル)オキシ)ナフタレン-１-イル)カルバメート
窒素下、上記段階（ＩＶ）からの生成物(３０１.２ｇ、２５０.０ｇ有効、０.８１６モル)、ｔｅｒｔ-ブチル(４-((２-クロロピリミジン-４-イル)オキシ)ナフタレン-１-イル)カルバメート(例えば、Ｉｔｏ，Ｋ．ら．，ＷＯ２０１０/０６７１３０、２０１０年６月１７日参照；２５２.８ｇ、０.６８０モル)、ｐＴＳＡ．Ｈ2Ｏ(２４.７ｇ、０.１３０モル)およびＴＨＦ(７６００ｍｌ)を充填した。暗赤色の溶液を還流のために６時間加熱し、室温に冷却した。その後、ＨＰＬＣ分析が、０.２５％の段階（ＩＶ）の生成物、２２.２４％の段階（ＶＩ）の生成物、８.９８％のクロロピリミジン出発原料、および６４.０８％の段階（Ｖ）の生成物を示した。さらに上記段階（ＩＶ）からの生成物 (２７.１ｇ、２２.５ｇ有効、７３.４ｍｍｏｌ)を充填し、反応物を再加熱して還流し、オーバーナイトで撹拌した。その後ＨＰＬＣ分析をすると、０.２０％の段階（ＩＶ）の生成物、３０.２３％の段階（ＶＩ）の生成物、４.５０％のクロロピリミジン出発原料、５８.６１％の段階（Ｖ）の生成物を示した。反応物は室温に冷却し、２０％のＫ2ＣＯ3(７３５ｍｌ)によってクエンチし、それから層を分離し、有機層を飽和塩水(８８０ｍｌ)で洗った。有機層はＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮して、茶色の粘着性の固体を単離した。収率= ４９１.２ｇ(９３.８％)、ＨＰＬＣは、３０.５９％の段階（ＶＩ）の生成物、５９.５０％段階（Ｖ）の生成物を示し、1ＨのＮＭＲの構造に適合した。
【０１７９】
（ｖｉ）３-((４-((４-アミノナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
窒素下、上記段階（Ｖ）からの粗生成物混合物(４９１.２ｇ)およびＤＣＭ(３７００ｍｌ)を充填した。ＴＦＡ(６９５ｍｌ、１２.３当量)を滴下した、その間、温度を２０℃以下に維持した。暗い茶色の溶液は室温においてオーバーナイトで撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は、８６.９０％の段階（ＶＩ）の生成物および０.９４％の段階（Ｖ）の生成物を示した。混合物は濃縮し、残渣は、ＥｔＯＡｃ(３７００ｍｌ)に取った。その後、飽和ＮａＨＣＯ3水(２×２０００ｍｌ)によってｐＨ７-８になるまで洗った。有機層はＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮し、紫の固体を単離した。収率= ３６０.８ｇ、ＨＰＬＣ純度７８.５８％。
【０１８０】
（ｖｉｉ）５-ｔｅｒｔ-ブチル-２メトキシ３-ニトロアニリン
窒素下、４-ｔｅｒｔ-ブチル-２,６-ジニトロアニソール(６２０ｇ、２.４３９モル)、ＩＭＳ(４７７４ｍｌ)および１０％のＰｄ／Ｃ(３１.８ｇ)を充填した。反応混合物は加熱して還流(７８℃)し、４-メチル-１-シクロヘキセン(５００ｍｌ、４.１５９モル)を４.５時間を超えて滴下した。反応物は還流しながらオーバーナイトで撹拌した。そして、ＨＰＬＣ分析は７２.１３％の生成物および２７.１７％の出発原料を示した。更に４-メチル-１-シクロヘキセン(１６０ｍｌ、１.３３１モル)を３時間を超えて滴下し、反応物が還流しながら７２時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、９２.７２％の生成物および０％の出発原料を示した。反応物は室温に冷却した。そして、触媒は真空ろ過により除去されて、ＩＭＳ(５００ｍｌ)で洗った。溶媒は、およそ１２００ｍｌに濃縮し、１：４.４５生成物：エタノール(ターゲット１：５)の比となった。２ＭのＨＣｌ(１２４ｍｌ)を残渣に滴下した、その間温度を２３℃以下で維持した。水(３１００ｍｌ)を加え、その結果として生じた懸濁液を室温において１.５時間撹拌した。固体は、真空ろ過をして収集し、水(２×１０００ｍｌ)によって洗った。結果として生じたオレンジ色の針状物は、真空下で、４０℃においてオーバーナイトで乾燥した。収率= ７５.２ｇ(８６.９％)、1Ｈ  ＮＭＲによる純度＞９７％、ＨＰＬＣ純度９８.８％、ＫＦ ０.３６％。
【０１８１】
（ｖｉｉｉ）Ｎ-(５-ｔｅｒｔ-ブチル-２-メトキシ-３-ニトロフェニル)メタンスルホンアミド
窒素下、段階（ＶＩＩ）からの生成物(４７１ｇ、２.０９９モル)、トルエン(１８８０ｍｌ)およびピリジン(４７１ｍｌ)を充填し、それから、メタンスルホニルクロリド(１７９ｍｌ)を１時間を超えて滴下し、その間温度を３５℃以下で維持した。反応物は３０−３５℃でオーバーナイトで撹拌し、その後２０℃以下に冷却し、それから水(１８８０ｍｌ)および２ＭのＨＣｌ(１８８０ｍｌ)を加えた(ｐＨ ３になった)。層は分離し、有機相を２.５％の塩水(１８８０ｍｌ)で洗った。ヘプタン(３７６０ｍｌ)を、それから０.５時間を超える時間をかけて有機層に加え、沈殿物を分離した。混合物は、０℃に冷却し、１時間撹拌した。固体は、真空ろ過により収集し、ヘプタン(１８８０ｍｌ)で洗い、真空下で４０℃でオーバーナイトで乾燥した。収率= ５５１ｇ(８７％)、ＨＰＬＣ純度９８.５％。1Ｈ  ＮＭＲによる純度＞９７％。
【０１８２】
（ｉｘ）Ｎ-(３-アミノ-５-ｔｅｒｔ-ブチル-２-メトキシフェニル)メタンスルホンアミド
５Ｌの水素化装置に、上記段階(ＶＩＩＩ)からの生成物(２０９.４ｇ、０.６９３モル)、メタノール(１６７５ｍｌ、８倍の体積)および１０％のＰｄ／Ｃ(１０.２ｇ)を充填した。容器は３×Ｎ2および３×Ｈ2によってパージして、それから０.３４４７のＭＰａ(５０ｐｓｉ)Ｈ2の下で、さらなる発熱が観察されなくなるまで撹拌し、ＨＰＬＣが９６.３５％の生成物および１.１０％の出発原料を示した。反応物はＴＨＦ(３１４ｍｌ)で希釈し、触媒を真空ろ過(Ｃｕｎｏフィルタ)により除去し、その後ＴＨＦ(１０００ｍｌ)によって洗った。溶媒は濃縮し、明るい茶色の固体を単離した、そして、それは真空下で４０℃においてオーバーナイトで乾燥した。収率= １６７.０ｇ(８８.５％)、ＨＰＬＣ純度９６.７％、1Ｈ  ＮＭＲによる純度＞９５％。
【０１８３】
（ｘ）フェニルＮ-［５-ｔｅｒｔ-ブチル-３-(メタンスルホンアミド)-２-メトキシフェニル］カルバメート
窒素下、上記段階(ＩＸ)からの生成物(１６７.０ｇ、６１３ｍｍｏｌ)、ＮａＨＣＯ3(７７.３ｇ、９２０ｍｍｏｌ)、ＴＨＦ(８７０ｍｌ)およびＤＣＭ(１４４０ｍｌ))を充填した。フェニルクロロホルメート(８２.６ｍｌ、６５９ｍｍｏｌ)を滴下し、その間、温度を２０℃以下で維持し、反応物が室温において４時間撹拌した。反応物混合物のＨＰＬＣ分析は、９８.６％の生成物および０.０３％の出発原料を示した。反応物混合物はろ過し、そのケーキをＴＨＦ(〜５０ ｍｌ)で洗った。ろ液は〜９００ ｍｌに濃縮し、シクロヘキサン(２４００ｍｌ)を加え、それから、混合物はオーバーナイトで撹拌した。その結果生じた固体は、真空ろ過を経て収集し、シクロヘキサン(５００ｍｌ)で洗った。得られた薄いピンク色の固体は、真空下で、４０℃において４時間乾燥した。収率= ２３２.６ｇ(９６.７％)、ＨＰＬＣ純度９４.５％、1Ｈ  ＮＭＲ純度＞９５％。
【０１８４】
（ｘｉ）３-((４-((４-(３-(５-(ｔｅｒｔ-ブチル)-２-メトキシ-３-(メチルスルホンアミド)フェニル)ウレイド)ナフタレン-１-イル)オキシ)ピリミジン-２-イル)アミノ)-５-エチニル-Ｎ-(２-(２-(２-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ベンズアミド
窒素下、上記段階（ｖｉ）からの生成物(１７５.５ｇ、０.３２４モル)、上記段階（Ｘ）からの生成物(１４５.０ｇ、０.３６９ｍｍｏｌ)およびｉＰｒＯＡｃ(８８００ｍｌ)を充填した。その結果生じた溶液は６０℃に加熱し、ＮＥｔ3(９.３ｍｌ)を一度に充填した。混合物は６０℃でオーバーナイトで撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は２５.７７％の段階（ＶＩ）の生成物、３.６０％の段階（Ｘ）の生成物および５７.８５％の段階（ＸＩ）の生成物を示した。さらに段階（Ｘ）の生成物(３６.０ｇ、０.０９２モル)を加え、反応物は６０℃においてオーバーナイトで撹拌した。そうして、ＨＰＬＣ分析は、５.４７％の段階（ＶＩ）の生成物、３.７２％の段階（Ｘ）の生成物および７３.３３％の段階（ＸＩ）の生成物を示した。反応物混合物は、室温に冷却し、その後濃縮して、暗い紫の固体(５２２.９ｇ)を単離した。この固体はアセトニトリル(２６１５ｍｌ、５倍の体積)から再結晶し、その後に、真空ろ過を経て収集し、ｉＰｒＯＡｃ(２×５００ｍｌ)によって洗った。得られたピンク色の固体は、真空下で、４０℃においてオーバーナイトで乾燥し、１８１.１ｇ(６６.５％) の標題化合物をＨＰＬＣ純度の９９.２７％で得た。1Ｈ  ＮＭＲは、構造に一致した。
【０１８５】
生物学的テスト：実験方法
酵素結合アッセイ（Kinomescan）
本明細書において開示される化合物のキナーゼ酵素結合活性は、固定されたリガンドに対して活性部位特異的に競合的結合を測定する独自のアッセイを使用して決定された（Fabian, M.A.ら, Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336)。これらのアッセイはDiscoverX（旧Ambit; San Diego, CA）により行われた。被検化合物とともにインキュベーションすることによって得られる阻害率は、阻害を起こさないコントロールに対して相対的に算出されうる。
【０１８６】
酵素阻害アッセイ
本明細書において開示される化合物の酵素阻害活性は、ドナー蛍光体およびアクセプター蛍光体（Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, UK）によって標識化された合成ペプチドを使用するＦＲＥＴによって決定される。
【０１８７】
ｐ３８ＭＡＰＫα酵素阻害
以下の異なる２つのアッセイが、ｐ３８ＭＡＰＫαの阻害力を決定するために使用することができる。
【０１８８】
方法１
ｐ３８ＭＡＰＫαアイソフォーム（ＭＡＰＫ１４：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する被検化合物の阻害活性は、その下流分子であるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性／リン酸化のレベルを決定することによって、間接的に評価される。ｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質（８０ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）は、被検化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬ、それぞれ２．５μＬ）と、室温において２時間混合される。それから、ｐ３８αが活性を阻害するターゲットであるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，６００ｎｇ／ｍＬ）およびＦＲＥＴペプチド（８μＭ；ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のリン酸化ターゲット）の混合溶液（２．５μＬ）を加え、その後、ＡＴＰ（４０μＭ、２．５μＬ）を添加することによってキナーゼ反応が開始される。この混合物は、室温で１時間インキュベートされる。反応試薬（プロテアーゼ、５μＬ）は、蛍光マイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標） Flash, ThermoFisher Scientific）で検出を行う１時間前に添加される。
【０１８９】
方法２
この方法は、上記の方法１と同じ方法に従うが、より高い濃度のｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質（８０ｎｇ／ｍＬのｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質２．５μＬの代わりに２００ｎｇ／ｍＬのｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質２．５μＬ）を被検化合物と混合して使用する（１μｇ／ｍＬ，０．１μｇ／ｍＬ，０．０１μｇ／ｍＬまたは０．００１μｇ／ｍＬのいずれかでテストした)。
【０１９０】
ｐ３８  ＭＡＰＫγ酵素阻害
ｐ３８ＭＡＰＫγ（ＭＡＰＫ１２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する本発明の化合物の阻害活性は、前述の方法と同様な方法で評価される。酵素（８００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）は、被検化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬ、それぞれ２．５μＬ）と室温において２時間インキュベートされる。それから、ＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）および適当なＡＴＰ溶液（２．５μＬ、４００μＭ）を酵素／化合物の混合物に添加して、１時間インキュベートする。反応試薬（プロテアーゼ、５μＬ）は蛍光マイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標）Flash, Thermo Scientific）による検出を行う１時間前に添加される。
【０１９１】
ｃ−ＳｒｃおよびＳｙｋ酵素阻害
ｃ−ＳｒｃおよびＳｙｋ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する本発明の化合物の阻害活性は、前述の方法と同様の方法で評価される。関連する酵素（３０００ｎｇ／ｍＬまたは２０００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）は、被検化合物（１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬまたは０．００１μｇ／ｍＬのいずれか、それぞれ２．５μＬ）と、室温において２時間インキュベートされる。それから、ＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）および適当なＡＴＰ溶液（ｃ−Ｓｒｃについては２．５μＬ、８００μＭ、Ｓｙｋについては６０μＭのＡＴＰ）が酵素／化合物混合物に添加され、該混合物は１時間インキュベートされる。反応試薬（プロテアーゼ、５μＬ）は、蛍光マイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標）Flash、Thermo Scientific）による検出を行う１時間前に添加される。
【０１９２】
ＧＳＫ３α酵素阻害
以下の２種類のアッセイはＧＳＫ３α阻害力の決定に使用することができる。
【０１９３】
方法１
上記ＧＳＫ３α酵素アイソフォーム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する本発明の化合物の阻害活性は、標的ペプチドの活性／リン酸化のレベルを決定することによって評価する。ＧＳＫ３−αタンパク質（５００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）は、被検化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬ、それぞれ２．５μＬ）と室温において２時間混合される。ＧＳＫ３αのリン酸化の標的であるＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）と、ＡＴＰ（４０μＭ、２．５μＬ）は、酵素／化合物の混合物に添加されて、得られる混合物が１時間インキュベートされる。反応試薬（プロテアーゼ、５μＬ）は、蛍光マイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標） Flash、ThermoFisher Scientific）による検出を行う１時間前に添加される。
【０１９４】
全ての場合において、特定部位特異的なプロテアーゼは、非リン酸化ペプチドのみを切断して、ＦＲＥＴシグナルを除去する。各反応のリン酸化レベルは、クマリンの発光
（ドナー）に対するフルオレセインの発光（アクセプター）の比率を使用して算出された。高い比率は高いリン酸化を示し、低い比率は低いリン酸化レベルを示す。各反応における阻害率は、阻害しないコントロールに対して相対的に算出される。そして、その濃度−反応曲線から５０％阻害濃度（ＩＣ50値）が算出される。
【０１９５】
方法２
この方法は、上記の方法１と同じ工程に従うが、ＧＳＫ３−αタンパク質と被検化合物との混合をより短い時間（２時間の代わりに１０５分）で行う。また、使用した被検化合物の濃度は、それぞれ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬまたは０．０１μｇ／ｍＬである。
【０１９６】
細胞アッセイ
本発明の化合物は、以下の複数のアッセイの１つ以上を使用して研究された。
【０１９７】
（ａ）ジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ  ｃｅｌｌｓ）におけるｐ３８ＭＡＰＫαとＬｃｋの阻害
ジャーカットＴ細胞は、実験の前に、飢餓培地（ＦＢＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０）中で２４時間培養された。細胞は採取されて飢餓培地中に１０×１０6細胞／ｍＬで再懸濁された。そして、丸底９６ウェルプレートの中へ１ウェル当たり１×１０6個の細胞で播種された。被験物質の連続希釈物が刺激前に２時間かけて添加された（ＤＭＳＯ終濃度１％）。（被検）物質とのプレインキュベーションに続いて、細胞はＨ2Ｏ2（終濃度０．０５％）で５分間刺激された。２０００ｒｐｍ（３分間、４℃）で遠心分離することにより、当該反応を停止した後、その上清が除去された。そして、１００μＬの冷却したｆｉｘ／ｐｅｒｍ液（ＢＤ  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット＃５５４７１４）が添加された。遠心分離と、購入した１×洗浄バッファー（ＢＤ  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット＃５５４７１４）を用いる洗浄を行う前に、プレートを４℃で２０分間インキュベートした。細胞は、Cell Signalling Technologyにより提供された（9211s）、リン酸化−ｐ３８α（Ｔ１８０／１８２）について染色するか、R＆Dから提供された（MAB7500）、リン酸化−Ｌｃｋ（Ｙ３９４）について染色される。抗体は、暗闇中、４℃で１時間インキュベートされる前に、洗浄バッファー中で、５μｇ／ｍＬ（R&D）、または１：２００（Cell Signaling Technology）に希釈された。引き続いて氷冷した洗浄バッファーで３回洗浄を繰り返した後、二次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ  ＃F1362、または、抗マウスＦＩＴＣ  ＃F2883、ともにSigma社）が１：１０００希釈で添加されて、暗闇中、４℃で１時間インキュベートされた。細胞は冷却された洗浄バッファー中で３回洗浄された後、冷却されたＰＢＳ緩衝液にて最終的に洗浄され、１５０μＬの冷却されたＰＢＳに再懸濁された。細胞は、「BD Accuri C6」を使用するフローサイトメトリにより解析された。
【０１９８】
（ａａ）ｄ−Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘発性のＴＮＦα／ＩＬ−８の放出
ヒト単球の細胞系統であるＵ９３７細胞は、４８〜７２時間、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ；１００ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベーションすることにより、マクロファージタイプの細胞に分化する。細胞は、最終濃度の被検化合物と２時間プレインキュベートされ、０．１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｅ．  Ｃｏｌｉ：  ０１１１：Ｂ４、Sigma）により４時間刺激される。その上清は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−セット、R&D systems）によるＴＮＦαおよびＩＬ−８の濃度の決定のために回収される。ＴＮＦα生産の阻害力は、被検化合物の各濃度において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＲＢ７９６により達成される溶媒コントロールと比較したときの割合として算出される。相対的な５０％有効濃度（ＲＥＣ50）は、濃度−反応曲線から結果的に決定される。ＩＬ−８産生の阻害は、被検化合物の各濃度において、溶媒コントロールと比較して算出される。５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、濃度−反応曲線からから結果的に決定される。
【０１９９】
（ｂ）ＰＢＭＣ細胞におけるＬＰＳ誘発性のＴＮＦα／ＩＬ−８の放出
健康な対象者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、密度勾配（Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare）により全血から分画される。上記ＰＢＭＣｓは、９６穴プレートに播種されて、正常組織培養液条件（３７℃、５％ＣＯ2）の下で１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Escherichia Coli 0111:B4系統由来、Sigma Aldrich）を２４時間かけて添加する前に、所望の濃度において２時間、本発明の化合物で処理される。その上清は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−セット、R&D systems）によるＩＬ−８およびＴＮＦα濃度の決定のために回収されて、蛍光マイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標） Flash, ThermoFisher Scientific）に読み込まれる。ＩＬ−８およびＴＮＦα産生における５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、用量−反応曲線から算出される。
【０２００】
（ｃ）ＰＢＭＣ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８刺激によるＩＬ−２およびＩＦＮγの放出
健康な対象者由来のＰＢＭＣｓは、密度勾配（Lymphoprep，Axis-Shield Healthcare）を使用して全血から分画される。細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８単クローン抗体（それぞれ０．３μｇ／ｍＬ eBioscience、および３μｇ／ｍＬ BD Pharmingen）の混合物でプレコートされた９６穴プレートに添加される。所望の濃度の化合物がウェルに添加されて、当該プレートは正常組織培養液条件下で３日放置される。上清は回収されて、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−セット、R&D systems）により、ＩＬ-２およびＩＦＮγの放出が決定される。そのＩＣ50は用量−応答曲線から決定される。
【０２０１】
（ｄ）ＨＴ２９細胞におけるＩＬ−１β誘発性のＩＬ−８の放出
ヒト大腸腺癌細胞系統であるＨＴ２９細胞は、９６穴プレートに塗布（plate）されて、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（Abcam）を２４時間かけて添加する前に、所望の濃度において２時間、本発明の化合物によって前処理がなされる。サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−セット，R&D systems）によるＩＬ−８の定量のために上清が回収される。ＩＣ50は、用量−応答曲線から決定される。
【０２０２】
（ｅ）プライマリーマクロファージにおけるＬＰＳ誘発性のＩＬ−８およびＴＮＦαの放出
健康な対象者由来のＰＢＭＣｓは、密度勾配（Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare）を使用して全血から分画される。細胞は２時間インキュベートされ、非接着細胞が洗浄により取り除かれる。細胞からマクロファージに分化させるために、細胞は、正常組織培養液条件の下、５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech）で７日間インキュベートされる。そして、２４時間の１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによる刺激の前に、本発明の化合物が、２時間の前処理のために所望の濃度で細胞に添加される。上清は回収され、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−セット，R&D Systems）によってＩＬ−８およびＴＮＦαの放出が決定される。ＩＣ50は、用量−反応曲線から決定される。
【０２０３】
（ｆ）ＢＥＡＳ２Ｂ細胞におけるポリＩ：Ｃで誘導されたＩＣＡＭ−１の発現
ポリＩ：Ｃは、単純な、ＲＮＡウイルス模倣体としてこれらの研究において使用される。ポリＩ：Ｃ−オリゴフェクタミン混合物（１μｇ／ｍＬのポリI:C；Invivogen Ltd., San Diego, CA、±２％のオリゴフェクタミン，２５μＬ；Invitrogen, Carlsbad, CA）をＢＥＡＳ２Ｂ細胞（ヒト気管支の上皮細胞，ＡＴＣＣ）の中にトランスフェクションする。細胞は、最終濃度の被検化合物とともに２時間プレインキュベートされ、細胞表面上のＩＣＡＭ１の発現レベルは細胞ベースのＥＬＩＳＡによって決定される。ポリＩ：Ｃトランスフェクションの１８時間後の時点において、細胞はＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定される。内因性ペルオキシダーゼは、アジ化ナトリウムを０．１％含有し過酸化水素を１％含有している洗浄バッファー（１００μＬの０．０５％でＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を添加することによってクエンチされる。細胞は洗浄バッファー（２００μＬ）で３回洗浄される。ミルクを５％含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１００μＬ）でウェルを１時間ブロッキングした後、前記細胞は、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体（５０μＬ；Cell Signalling Technology, Danvers, MA）とともにＢＳＡを１％含むＰＢＳ中で一晩、４℃でインキュベートされる。
【０２０４】
前記細胞は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μＬ）によって３回洗浄されて、二次抗体（１００μＬ；ＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧ, Dako Ltd., Glostrup, Denmark）とともにインキュベートされる。それから、上記細胞は、基質（５０μＬ）の中で２〜２０分間インキュベートされ、次いで停止溶液（５０μＬ、１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）が添加される。ＩＣＡＭ−１のシグナルは、分光光度計により、基準波長６５５ｎｍに対する波長４５０ｎｍにおける吸光度を読み込むことによって検出される。上記細胞は、次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μＬ）で３回洗浄される。そして、クリスタル・バイオレット（２％ＰＢＳ溶液５０μＬ）で染色した後に、１％ＳＤＳの蒸留水溶液（１００μＬ）により溶出し、５９５ｎｍの吸光度を読み込むことによって各ウェル中の全細胞数が決定される。その決定されたＯＤ４５０〜ＯＤ６５５の数値は、各ウェルのＯＤ５９５の数値で割ることにより正確な細胞数に修正される。ＩＣＡＭ−１発現の抑制は、溶媒コントロールと比べた被検化合物の各濃度で算出される。５０％抑制濃度（ＩＣ50）は、結果として生じる濃度−反応曲線から決定される。
【０２０５】
（ｇ）細胞の有糸分裂アッセイ
健康な対象者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）は、密度勾配（Histopaque（登録商標）‐1077，Sigma-Aldrich, Poole, UK）を使用する全血（Quintiles, London, UK）から分画される。このＰＢＭＣｓ（１サンプル当たり３百万個の細胞）は、その後、２％のＰＨＡ（フィトヘマグルチニン、Sigma-Aldrich、Poole、UK）を用いて４８時間処理され、引き続いて、様々な濃度の被検化合物に２０時間曝露される。コレクションの２時間前に、細胞を中期で停止するために、ＰＢＭＣｓはデメコルチン（０．１μｇ／ｍＬ；Invitrogen, Paisley, UK）で処理される。有糸分裂細胞を観察するために、ＰＢＭＣｓは、IntraPrep（５０μＬ; Beckman Coulter, France）を添加することにより透過処理して固定され、抗リン酸化ヒストン３（０．２６ｎｇ／Ｌ；＃9701；Cell Signalling, Danvers, MA）、およびヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich, Poole, UK）により、先述したように染色される（Muehlbauer P.A. and Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130)。蛍光は、ＡＴＴＵＮＥフローサイトメーター（Invitrogen, Paisley, UK）を用いて観察され、リンパ球についてゲーティング（gating）される。有糸分裂の阻害率は、各処理について溶媒（０．５％ＤＭＳＯ）処理と比較して算出される。
【０２０６】
（ｈ）ライノウイルスにより誘導されるＩＬ−８放出およびＩＣＡＭ−１の発現
ヒトライノウイルスＲＶ１６は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas,VA）から得られる。ウイルスストックは、細胞の８０％が変性されるまでＨＲＶでＨｅＬａ細胞を感染させることによって生成される。
【０２０７】
ＢＥＡＳ２Ｂ細胞はＭＯＩ＝５でＨＲＶを感染させられ、吸収を促進するために穏やかに振とうしながら３３℃で２時間インキュベートする。次いで、上記細胞はＰＢＳで洗浄され、新鮮な培地を加え、該細胞をさらに７２時間インキュベートする。その上清は、Duoset ELISA現像キット（Duoset ELISA development kit、R&D systems, Minneapolis, MN）を使用して、ＩＬ−８濃度の分析のために回収される。
【０２０８】
ＩＣＡＭ−１が細胞表面に発現するレベルは、細胞ベースのＥＬＩＳＡによって決定される。感染から７２時間後、細胞は、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定される。０．１％アジ化ナトリウムおよび１％の過酸化水素を加えることによって、内因性ペルオキシダーゼをクエンチした後、ウェルを洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルクで１時間、十分にウェルをブロッキングした後、その細胞は、５％ＢＳＡ：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１：５００）中の抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体とともに一晩インキュベートされる。ウェルは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄され、二次抗体（ＨＲＰが結合した抗ウサギＩｇＧ：Dako Ltd）と共にインキュベートされる。そのＩＣＡＭ−１シグナルは、基質を添加し、分光光度計を用いて参照波長６５５ｎｍを使用し、４５０ｎｍで読み取ることによって検出される。次に、上記ウェルがＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄されて、クリスタルバイオレット染色および１％ＳＤＳ溶液で溶出した後に、５９５ｎｍでの吸光度を読み取ることによって各ウェル中の全細胞数が決定される。測定したＯＤ450〜ＯＤ655の値は、各ウェルのＯＤ595で割ることにより細胞数について補正される。（被検）物質は、ＨＲＶ感染の２時間前に添加され、また、非感染のＨＲＶが洗い流される、感染２時間後に添加される。
【０２０９】
（ｉ）ＭＲＣ５細胞におけるＨＲＶ１６で誘発される細胞変性効果（ＣＰＥ）の評価
ＭＲＣ−５細胞は、５％のＦＣＳおよび１．５ｍＭの塩化マグネシウムを含有しているＤＭＥＭ中で、ＭＯＩ＝１でＨＲＶ１６に感染させられ、引き続いて、３３℃で１時間のインキュベ−ションにより吸着を促進する。その上清は吸引され、新しい培地が添加され、引き続いて、４日間インキュベ−ションする。適切な場合には、細胞は、（被検）物質またはＤＭＳＯとともに２時間、プレインキュベ−トされ、さらに、ウイルスを洗い流した後に（被検）物質およびＤＭＳＯが再び添加される。
【０２１０】
上清が吸引され、メチレンブルー溶液（１００μＬ、２％のホルムアルデヒド、１０％のメタノールおよび０．１７５％のメチレンブルー）で２時間、室温においてインキュベートされる。洗浄後、ＳＤＳを１％含む蒸留水（１００μＬ）が各ウェルに添加され、そのプレートは、６６０ｎｍにおける吸光度を読み込む前に、１〜２時間軽く振盪させられる。各ウェルについて阻害率が算出される。そのＩＣ50値は、被検化合物の段階希釈により得られる濃度−反応曲線から算出される。
【０２１１】
（ｊ）生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における気管支一次上皮細胞へのＲＳＶウイルス負荷
９６穴プレートにおいて成育させた正常ヒト気管支の上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）は、１５ｍＭの塩化マグネシウムを含有しているＬＨＣ８  Ｍｅｄｉａ：ＲＰＭＩ−１６４０（５０：５０）中で、ＭＯＩ＝０．００１でＲＳＶ  Ａ２（Strain A2, HPA, Salisbury, UK）に感染させられ、ウイルス吸着のために３７℃で１時間インキュベートされる。この細胞は、ＰＢＳ（２００μＬ）によって３回洗浄されて、新しい培地（２００μＬ）が添加され、さらに４日間インキュベーションが継続される。適切な場合には、細胞は、上記（被検）物質またはＤＭＳＯとともに２時間プレインキュベートされて、ウイルスを洗い流した後、再び添加される。
【０２１２】
前記細胞は、ホルムアルデヒドを４％含むＰＢＳ溶液（５０μＬ）で２０分間固定され、ＷＢ（洗浄バッファー、ＢＳＡを０．５％、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ）（２００μＬ）で３回洗浄されて、ブロッキング溶液（コンデンスミルクを５％含むＰＢＳ）中で１時間インキュベートされる。そして、細胞は、ＷＢ（２００μＬ）で３回洗浄され、抗ＲＳＶ（２Ｆ７）Ｆ−融合タンパク抗体（４０μＬ; マウスモノクローナル（抗体）, lot 798760, Cat. No.ab43812, Abcam）と共に、ＢＳＡを５％含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で、室温で１時間インキュベートされる。洗浄後、細胞は、ＢＳＡを５％含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（lot 00053170, Cat.No. P0447, Dako）のＨＲＰ結合型二次抗体溶液（５０μＬ）とともにインキュベートされ、そしてＴＭＢ基質（５０μＬ；substrate reagent pack, lot 269472, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc.）が添加される。この反応は、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4（５０μＬ）の添加によって停止させられ、結果として生じるシグナルはマイクロプレートリーダー（Varioskan（登録商標） Flash, ThermoFisher Scientific）において比色測定（ＯＤ：４５０ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）により決定される。
【０２１３】
細胞は、次に洗浄され、２．５％のクリスタルバイオレット溶液（５０μＬ；lot 8656, Cat. No. PL7000, Pro-Lab Diagnostics）に３０分間浸漬させられる。洗浄バッファーで洗浄した後に、ＳＤＳを１％含有する蒸留水（１００μＬ）を各ウェルに添加し、５９５ｎｍにおいてその吸光度を読み込む前に、シェーカー上で上記プレートを１時間かけて軽く振盪する。その測定されたＯＤ450-655の読取値は、ＯＤ450-655をＯＤ595によって割ることで細胞数に補正される。各ウェルについて阻害率が算出され、そのＩＣ50値は（被検）物質の段階希釈から作成される濃度−反応曲線から算出される。
【０２１４】
（ｋ）細胞生存率アッセイ：ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ
分化させたＵ９３７細胞は、２つのプロトコールの下で各被検化合物（以下に示される培地２００μＬ培地中、終濃度１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ）とともにプレインキュベートされる：前者は５％のＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地中で、４時間インキュベートされ、後者は１０％のＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間インキュベートされる。その上清は、新しい培地（２００μＬ）と置換され、ＭＴＴ原液（１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）が各ウェルに添加される。１時間のインキュベーション後に前記培地が取り除かれ、ＤＭＳＯ（２００μＬ）が各ウェルに添加され、５５０ｎｍでその吸光度を読み込む前に、上記プレートは１時間軽く振盪させられる。各ウェルについての細胞生存率の損失分は、溶媒（０．５％のＤＭＳＯ）処理と比較して算出される。従って、溶媒と比較した薬物治療についての細胞生存率の見かけの増加は、負のパーセンテージとして表される。
【０２１５】
（ｌ）ヒトの生検アッセイ
腸粘膜生検は、ＩＢＤ患者の大腸の炎症を起こした領域から得られる。この生検材料は小さな切片（２〜３ｍｍ）にカットされ、無血清培地の中で、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2雰囲気下、３７℃で、器官培養室（organ culture chamber）の鋼鉄グリッドに配置される。ＤＭＳＯコントロールまたは所望の濃度の被検化合物が、生検材料の組織に添加され、器官培養室中で２４時間インキュベートされる。その上清は、Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの各レベルの測定のために回収される。被検化合物によるサイトカイン放出の阻害率は、ＤＭＳＯコントロール（１００％）により測定されるサイトカインの放出量と比較して算出される。
【０２１６】
（ｍ）ｄ−Ｕ９３７細胞におけるβカテニンの蓄積
ヒト単球の細胞系統であるＵ９３７細胞は、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに４８〜７２時間インキュベーションされることにより、マクロファージ（型）細胞に分化する。該細胞は、次に終濃度の被検化合物または溶媒とともに１８時間インキュベートされる。被検化合物によるβ−カテニンの誘導は、培地を４％のホルムアルデヒド溶液に置き換えることによって停止させられる。内因性の過酸化物の活性は、クエンチングバッファー（１００μＬ、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含有し、アジ化ナトリウムを０．１％含有し、Ｈ2Ｏ2を１％含有するＰＢＳ）とともに２０分間インキュベートすることにより中和される。この細胞は、洗浄バッファー（２００μＬ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ）により洗浄され、ブロッキング溶液（２００μＬ；５％牛乳／ＰＢＳ）によって１時間インキュベートされ、洗浄バッファー（２００μＬ）により再洗浄され、次に、抗β−カテニン抗体溶液（５０μＬ：１％をＢＳＡ含むＰＢＳ）（BD, Oxford, UK）とともに一晩インキュベートされる。
【０２１７】
洗浄バッファー（２００μＬ；Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ）により３回洗浄した後、細胞は、ＢＳＡを１％含むＰＢＳ（Dako、Cambridge, UK）のＨＲＰ結合型二次抗体溶液（１００μＬ）とともにインキュベートされ、結果として生じるシグナルがＴＭＢ基質（５０μＬ；R&D Systems、Abingdon, UK）を使用して比色測定により決定される（ＯＤ：４５０ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。この反応は、１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4溶液（５０μＬ）の添加によって停止される。細胞は、次に洗浄バッファーにより洗浄され、２％のクリスタルバイオレット溶液（５０μＬ）に３０分間浸漬される。洗浄バッファー（２００μＬ）で３回洗浄した後、１％のＳＤＳ（１００μＬ）を各ウェルに添加し、（Varioskan（登録商標） Flash、Thermo-Fisher Scientificで）ウェルの５９５ｎｍにおける吸光度を測定する前に、１時間軽く上記プレートを振盪する。
【０２１８】
上記測定されたＯＤ450-655の読取値は、ＯＤ450-655の読取値をＯＤ595の読取値によって割ることによって細胞数として補正される。各ウェルについて誘導率が溶媒と比較して算出され、該誘導率は参照化合物（Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド）（１μｇ／ｍＬ）を含む標準的なコントロールにより行われる誘導を１として定義して比較することで標準化した。
【０２１９】
（ｎ）Ｔ細胞増殖
健康な対象者由来のＰＢＭＣｓは、密度勾配（Lymphoprep,、Axis-Shield Healthcare）を使用して全血から分画される。リンパ球画分は、先ず、メーカーの説明書（Miltenyi Biotec 130-091-155）の通りに、ネガティブ磁気セルソーティング（netative magnetic cell sorting）によってＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮される。次に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、メーカーの説明書（130-045-901）の通りにミクロビーズを用いるＣＤ４５ＲＡ＋細胞のポジティブ磁気セレクション（positive magnetic selection）を利用して分離される。細胞は、平坦な底面の９６穴プレート（Corning Costar）上において、ＦＢＳを１０％含有するＲＰＭＩ（１００μＬ）の１ウェル毎に２ｘ１０5個の細胞がプレーティングされる。２５μＬの被検化合物は、通常の培地において適切な濃度（終濃度の８倍）に希釈され、０．０３ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬの用量反応範囲を得るために上記プレート上にある同条件の複数のウェルに添加される。ＤＭＳＯは、ネガティブコントロールとして添加される。プレートは、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（抗体）（OKT3; eBioscience）で刺激する前に２時間プレインキュベートしてもよい。７２時間後、各ウェル内の培地は１０μＭのＢｒｄＵ （Roche）を含有している１５０μＬの新しい培地と置換される。１６時間後、その上清を取り除かれ、上記プレートは乾燥され、メーカーの説明書（Roche）の通りに１００μＬの固定／変性溶液を各ウェルに添加することにより、２０分間かけて上記細胞が固定される。抗ＢｒｄＵ検出抗体の添加の前にＰＢＳでプレートが１回洗浄され、室温において９０分間インキュベートされる。次に、プレートは、充填される洗浄バッファーで穏やかに３回洗浄され、１００μＬの基質溶液の添加により反応が行われる。該反応は５０μＬの１ＭのＨ2ＳＯ4の添加によって停止される。そして、プレートリーダー（Varioskan（登録商標） Flash、ThermoFisher Scientific）により４５０ｎｍにおける吸光度が読み込まれ、そのＩＣ50が、用量−反応曲線から決定される。
【０２２０】
（ｏ）ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＩＢＤ患者由来のＬＰＭＣ細胞におけるＩＬ−２およびＩＦＮγの放出
粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣｓ）は、以下の通り、外科的標本の炎症を起こしたＩＢＤ粘膜から、または、外科標本の通常の粘膜から単離、精製される：
上記粘膜は外科標本のより深い層から、外科用メスにより取り除かれて、３〜４ｍｍのサイズの切片にカットされる。その上皮は、ＨＢＳＳ（Sigma-Aldrich）中の１ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma-Aldrich、Poole、UK）でマグネチックスターラーを用いる撹拌により、上記組織断片を３回洗浄し、各洗浄の後、その上清を放棄することによって取り除かれる。その後、サンプルはタイプ１Ａコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）を用いて３７℃、１時間撹拌することによって処理される。その結果として生じた細胞懸濁液は、次に１００μｍ細胞濾過器を使用して濾過され、２回洗浄され、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地（Sigma-Aldrich）中に再懸濁されて、細胞培養のために使用される。
【０２２１】
新しく単離されたＬＰＭＣ細胞（２ｘ１０5細胞／ウェル）は、ＤＭＳＯコントロールまたは適切な濃度の化合物の存在下において、１μｇ／ｍＬのα−ＣＤ３／α−ＣＤ２８で４８時間刺激される。４８時間後、その上清は、Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＩＦＮγの存在を分析するために取り除かれる。被検化合物によるサイトカイン放出の阻害率は、ＤＭＳＯコントロール（１００％）について測定されるサイトカイン放出と比較して算出される。
【０２２２】
（ｐ）ＩＢＤ患者から分離された筋線維芽細胞からのサイトカイン放出の阻害
炎症を起こしたＩＢＤ粘膜由来の筋線維芽細胞は以下のように単離される：
上記粘膜は切開され、取り除かれ、１ｍｍの大きさとなった粘膜サンプルが２０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸（Invitrogen、Paisley、UK）、１００のＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および１μｇ／ｍＬのアンフォテリシン（Sigma-Aldrich）が添加されたダルベッコの改変イーグル培地（DMEM、Sigma-Aldrich）において湿潤ＣＯ2インキュベーターで３７℃において培養される。筋線維芽細胞の確立したコロニーが、２５ｃｍ2の培養フラスコに播種されて、２０％のＦＢＳおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ（培地）において培養され、刺激実験で使用するための十分な量を提供するために少なくとも４回継代された。
【０２２３】
次に、筋線維芽細胞のサブコンフルエントになった単層を、ウェルあたり３×１０5細胞になるように１２個のウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2においてＤＭＳＯコントロールまたは適切な濃度の（被検）物質の存在下で２４時間培養される前に、２４時間無血清培地において２４時間飢餓状態におく。２４時間後、その上清が、Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８およびＩＬ−６の存在の分析のために除去される。被検化合物によるサイトカイン放出の抑制割合は、ＤＭＳＯコントロール（１００％）において測定されるサイトカイン放出と比較して算出される。
【０２２４】
（ｑ）ヒト好中球脱顆粒
好中球は、以下の手法により、ヒト末梢血から分離される：
血液は、静脈穿刺によって集められ、１：１のＥＤＴＡ：滅菌リン酸緩衝食塩水（Ｃａ＋／Ｍｇ＋を含有しないＰＢＳ）の添加によって血液凝固が阻止される。デキストラン（３％ｗ／ｖ）が添加され（デキストラン溶液１に対して血液４の割合）、そして血液は室温において、ほぼ２０分間放置される。その上清は、慎重に密度勾配（Lymphoprep、Axis-Shield Healthcare）によって層にされて、遠心分離される（１５分、２０００回転数／分、制動装置なし）。その上清は吸引され、６０秒より長くならないように（汚染された赤血球を溶解させるために）滅菌食塩水（０．２％）において再懸濁される。それから１０倍の体積のＰＢＳが添加され、細胞が遠心分離される（５分、１２００回転数／分）。細胞は、５×１０6の細胞数／ｍＬにするために、ＨＢＳＳ＋（cytochalasin B（５μｇ／ｍＬ）および１ｍＭのＣａＣｌ2を含有しているHanks buffered salt solution（フェノールレッド不含有））において再懸濁される。
【０２２５】
５×１０4の細胞は、Ｖ底９６穴プレートの各ウェルに添加されて、適切な濃度の被検化合物（０．３−１０００ｎｇ／ｍＬ）または溶媒（ＤＭＳＯ：終濃度０．５％）によって、インキュベートされる（３０分、３７℃）。脱顆粒はｆＭＬＰ（終濃度１μＭ）の添加により刺激され、更にインキュベーション（３０分、３７℃）した後、該細胞は、遠心分離（５分、１５００回転数／分）により取り除かれ、上清は平底９６穴プレートへ移される。同容量のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が添加され、１０分後、等しい体積の硫酸（０．５Ｍ）添加によって反応は終了され、吸光度が４５０ｎｍ（６５５ｎｍにおけるバックグラウンドは減算される）において測定される。その５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、結果として生じる濃度−反応曲線から決定される。
【０２２６】
（ｒ）細胞毒性アッセイ
５×１０4のＴＫ６細胞（リンパ芽球Ｔ細胞系統）は、９６穴プレートの適切な数のウェルの１９５μＬの培地（１０％ウシ胎児血清が添加されたＲＰＭＩ）の中へ添加される。５μＬのＤＭＳＯコントロール（終濃度０．５％ｖ／ｖ）または被検化合物（終濃度５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ）は、上記ウェルに添加されて、３７℃、５％ＣＯ2においてインキュベートされる。２４時間後に、このプレートは３分間、１３００回転数／分で、遠心分離され、その上清が廃棄される。そして細胞は、プロピジウム・ヨウ化物（ＰＩ）を７．５μｇ／ｍＬで含有するＰＢＳによって再懸濁される。１５分後、細胞は、フローサイトメトリー（BD accuri）によって分析される。生存率（％）は、ＤＭＳＯコントロールに対して標準化されたテストウェル中の、プロピジウム・ヨウ化物（ＰＩ）を含まない細胞に対する細胞の割合として算出される。
【０２２７】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）スクリ−ニング：薬力学および抗炎症作用
（ｉ）マウスにおける、ＬＰＳ誘発性の好中球の蓄積
絶食していないＢａｌｂ／ｃマウスは、ＬＰＳチャレンジの適用による炎症反応の刺激の前に、（２〜８時間の範囲内で）示された時間に、溶媒または被験物質が気管内経路によって投与された。時点Ｔ＝０において、マウスは曝露室に入れられて、ＬＰＳ（７．０ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液）に３０分間曝される。更に８時間後に、動物は麻酔され、気管にカニューレが挿入され、気管カテーテルを経て１．０ｍＬのＰＢＳを注入して、その後肺から引き出すことにより、ＢＡＬＦが抽出される。このＢＡＬＦサンプルにおける全血および分化した白血球数が、Ｎｅｕｂａｕｒ血球計算器を使用して計測される。上記ＢＡＬＦサンプルのサイトスピン（集細胞遠心装置）によるスメア（全血塗抹標本）は、室温において５分間の２００回転数／分の遠心分離によって調製され、ディフ・クイック染色法（Dade Behring）を用いて染色される。細胞は、油浸顕微鏡を用いて計数される。ＢＡＬ中の好中球数のデータは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（平均値の標準誤差）として示される。好中球蓄積の阻害率は、それぞれの処理について溶媒処理と比較して算出される。
【０２２８】
（ｉｉ）タバコ煙モデル
Ａ／Ｊマウス（オス、５週齢）は、タバコの煙（タバコの煙を空気で４％に希釈したもの）に３０分間／日で１１日間、小動物用のタバコの煙吸入実験システム（Model SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan）を使用して曝される。被験物質は、最終的なタバコの煙への曝露後に、１日１回、３日間、鼻腔内投与（ＤＭＳＯを５０％含むＰＢＳ溶液３５μＬ）される。最後の投与後１２時間の時点で、各動物が麻酔され、気管カニューレを挿入され、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取される。肺胞のマクロファージおよび好中球の数は、抗マウスＭＯＭＡ２抗体（マクロファージ）または抗マウス７／４抗体（好中球）を使用するＦＡＣＳ分析（EPICS（登録商標）ALTRA II、eckman Coulter, Inc.、 Fullerton、CA、USA）により決定される。
【０２２９】
（ｉｉｉ）マウスにおいてＤＳＳにより誘発された大腸炎
絶食していない１０〜１２週間齢の雄のＢＤＦ１マウスは、ＤＳＳによる処理による炎症反応の刺激の１日前（Ｄａｙ：−１）に、１日２回経口胃管栄養法によって溶媒、参照物質（５−ＡＳＡ）または被検化合物が投与される。試験の開始日（Ｄａｙ：０）に、飲料水にいれたＤＳＳ（５％ｗ／ｖ）が投与され、続いて、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）、参照化合物（１００ｍｇ／ｋｇ）または被検化合物（５ｍｇ／ｋｇ）が１日２回、７日間投与される。ＤＳＳを含有した飲料水は３日毎に補給される。試験の期間中、動物は毎日計量され、そして糞は観察され、糞の硬さに基づいてスコアとして記録される。６日目（Ｄａｙ：＋６）の犠牲の時に、大腸は取り除かれ、長さおよび重量が記録される。大腸の切片は、好中球の浸潤を測定するためのＭＰＯ分析、または疾患の重症度を決定するための、スコアとしている組織病理学のために採取される。
【０２３０】
（ｉｖ）マウスにおけるＴＮＢＳにより誘発された大腸炎
絶食していない１０〜１２週間齢の雄のＢＤＦ１マウスは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（１５ｍｇ／ｍＬ：５０％エタノール／５０％生理的食塩水）による処理による炎症反応の刺激の１日前（Ｄａｙ：−１）に、１日２回、経口胃管栄養法により、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ体重）、参照化合物（ブデソニド２．５ｍｇ／ｋｇ体重）または被検化合物（１または５ｍｇ／ｋｇ体重）が投与される。研究の開始日（Ｄａｙ：０）に、ＴＮＢＳ（２００μＬ）は、プラスチック・カテーテルを経て中腸に投与され、その後、２日間連続または４日間連続で、溶媒、参照化合物または被検化合物のＢＩＤ投薬がなされる。試験の期間中、動物は毎日秤量され、そして糞は観察され、糞の硬さに基づいてスコアとして記録される。２日目（または４日目）の犠牲の際に、大腸は取り除かれ、長さおよび重量が記録される。大腸の切片は、疾患の重症度を決定するための組織病理学スコアリング用に採取される。
【０２３１】
（ｖ）マウスの養子免疫細胞移入（adoptive transfer）
試験の開始日(Ｄａｙ：０)に、雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを犠牲死させ、ＣＤ４５ＲＢhigh細胞を単離するために（ＳＣＩＤ  ＩＢＤ細胞分離プロトコルを使用して）脾臓を取得する。およそ４×１０5細胞／ｍＬのＤ４５ＲＢhigh細胞は、それから雌のＳＣＩＤ動物へ腹腔内投与される（１００μＬ／マウス）。試験１４日目(Ｄａｙ：１４)に、マウスは秤量され、無作為抽出されて体重に基づいた処理グループに分けられる。試験１４日目に、被検化合物は、コーン油（３２．５％）、トランスクトール（２０％）、マイシン（１２．５％）およびクレモホールＥＬＰ（３５％）の所定の溶媒中、以下表６Ａおよび表６Ｂに概説する用量レベルで、５ｍＬ／ｋｇの用量で、ＢＩＤ（１日２回）、強制経口投与される。治療は、試験日４２日まで継続され、そこで、朝の投与後４時間の時点で上記動物は剖検に供される。この結腸の長さと重量が記録され、大腸浮腫の測定などの研究における二次エンドポイントとして使用される。この結腸は、その後、６個の断面に分割され、そのうち４個は組織病理学的スコアリングに使用される（主要評価項目）。２個はサイトカイン分析のためにホモジナイズ（homogenise）される。データは、ナイーブ動物と溶媒投与の動物（vehicle animals）との間の誘導ウィンドウ（induction window）に阻害％で示され、高い阻害は、非疾患、ナイーブの表現型に近いものを意味する。
【０２３２】
（ｖｉ）ラットにおけるエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎、
雄のルイスラット（Lewis rats）（６〜８週齢、Charles River UK Limited）は、３個のカゴの中で、１９〜２１℃、１２時間の明／暗サイクル（０７：００／１９：００）で飼育し、げっ歯類飼料の標準飼料と水を自由に与える。非絶食ラットは、秤量され、尾に付けた永久的なマーカーで個々が識別され、３２ゲージの針を使用してリポ多糖（ＬＰＳ）（大腸菌０１１１：Ｂ４由来のものをＰＢＳに調製したもの、Sigma Aldrich、UK）を１００ｎｇ／１匹の動物で、右の硝子体液へ（５μＬ用量で）一回投与を受ける。未処理のラットにはＰＢＳを注射する。被検化合物、デキサメタゾン（Dex）または溶媒（脱イオン水中に20％ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン、０．１％ＨＰＭＣ、０．０１％塩化ベンザルコニウム、０．０５％ＥＤＴＡ、０．７％ＮａＣｌを含むもの）が、ＬＰＳ投与の３０分前、ＬＰＳ投与時、ＬＰＳ投与後１時間、ＬＰＳ投与後２時間、ＬＰＳ投与後４時間の時点で、動物の右眼に（１０μＬ）局所的投与される。投与前に、投与される溶液または懸濁液は、均一な懸濁液を確保するために５分間撹拌される。ＬＰＳ投与の６時間後に、ペントバルビタールを過剰投与することにより動物を安楽死させる（i.v.）。安楽死に続いて、各動物の右目が摘出され、レンズ周りのフロント（前方）の切片と背面（後方）の切片とに解剖される。各切片は、秤量され、滅菌したＰＢＳ５００μＬ中でホモジナイズ（均質化）され、続いて４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離される。得られた上清は３等分されて、R＆D DuoSet ELISAによるその後のサイトカイン分析まで−８０℃で保存される。
【０２３３】
インビトロおよびインビボのスクリーニング結果のまとめ
【０２３４】
【表１ａ】
0006464384.tif 000033
【０２３５】
KINOMEscan（商標）技術を使用しているLeadHunter Discover Services（DiscoveRx Corporation、Fremont、CA）によって行われた研究により、実施例の化合物（化合物Ｉ）が、キナーゼＢ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）のそれらの標準的なリガンドへの結合にいかなる影響も及ぼさないことがわかった。また、その被検化合物は、低い選択性スコア（表１ｂ）によって証明される参照化合物（Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド）（ＷＯ２０１０／１１２９３６）と比較して、実質的に改善された選択性を示した。
【０２３６】
【表１ｂ】
0006464384.tif 000034
【０２３７】
【表１ｃ】
0006464384.tif 000035
【０２３８】
【表１ｄ】
0006464384.tif 000036
【０２３９】
【表２】
0006464384.tif 000037
【０２４０】
以下の表３に示されるように化合物Ｉは、細胞アッセイ（ｌ）、すなわち、前述したｅｘ  ｖｉｖｏでのヒトの生検アッセイでもスクリーニングした。この化合物は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者からの生検（細胞診）において有意な抗炎症作用を示した。健常人とは対照的に、ＵＣ患者からの腸管粘膜生検（細胞）が、自然にｉｎ  ｖｉｔｒｏで炎症性サイトカインを放出することが示されている（Onken,J.E. et al., J Clin Immunol, 2008, 126(3): 345-352）。したがって、化合物Ｉは、潰瘍性大腸炎患者からの生検と２４時間、１μｇ／ｍＬで、インキュベートした場合、ＤＭＳＯの対照と比べて阻害性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）放出を有意に阻害した。
【０２４１】
【表３】
0006464384.tif 000038
【０２４２】
下記の表４ａに示すように、化合物Ｉは、ＰＢＭＣにおいて細胞分裂への影響（有糸分裂）を測定する上記アッセイ（ｇ）において、上記参照化合物（Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド、国際公開２０１０／１１２９３６）よりも著しく低い活性である。
【０２４３】
【表４ａ】
0006464384.tif 000039
【０２４４】
以下の表４ｂに示すように、化合物Ｉは、上述したアッセイ（ｍ）で調べたとき、実質的なβ−カテニン誘導を誘発しなかった。したがって、この化合物がβ−カテニンの細胞内濃度を増加させる可能性は、種々の試験濃度におけるこの化合物の誘導効果が参照化合物（１μｇ／ｍＬ）により得られる誘導効果よりも実質的に低かったことで、否定的であることが見出された。
【０２４５】
【表４ｂ】
0006464384.tif 000040
【０２４６】
以下の表５に示すように、化合物Ｉは、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（ｉｖ）においてもスクリーニングされた。これは、コーン油（３２．５％）、トランスクトール（２０％）、マイシン（１２．５％）、およびクレモホールＥＬＰ（３５％）からなる所定の混合物を含む溶媒である自己マイクロ乳化薬剤送達システム（ＳＭＥＤＤＳ）を用いて、２日間にわたって行われた。組織病理学的分析は、大腸炎のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、化合物Ｉが、活性を示したことを明らかにした。特に、５ｍｇ／ｋｇで経口投与されたときに、化合物Ｉは溶媒の対照と比較して、潰瘍等級および上皮修復において著しい改善を示した。さらに、これは、網様体および粘膜固有層における炎症性細胞浸潤の顕著な減少をもたらした。
【０２４７】
【表５】
0006464384.tif 000041
【０２４８】
以下の表６ａおよび表６ｂに示すように、化合物Ｉは、インビボ（養子細胞移入）アッセイ（ｖ）においてもスクリーニングされた。ナイーブ動物、コントロール動物および処理動物の大腸の長さに対する大腸の重量の相対比の分析は、化合物Ｉが、結腸炎のインビボモデルにおいて、上記Ｔ細胞で駆動された有意な活性を示すことを明らかにした。
【０２４９】
【表６ａ】
0006464384.tif 000042
【０２５０】
【表６ｂ】
0006464384.tif 000043
【０２５１】
以下の表６ｃに示されるように、化合物Ｉも、養子移植モデルにおけるマウス由来の結腸組織サンプルにおいてプロ炎症性サイトカインのレベルを大幅に低下させた。
【０２５２】
【表６ｃ】
0006464384.tif 000044
【０２５３】
追加試験の概要
薬物動態パラメータの決定
化合物Ｉの血漿薬物動態および総大腸組織分布を調査するために、Sai Life Sciences （Hinjewadi、Pune、India）によって研究が行われた。具体的には、
−単回経口投与後のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス；および、
−単回静脈内投与後または単回経口投与後のオスのＷｉｓｔａｒ系ラット
において薬物動態学的研究を行った。
【０２５４】
このデータは、化合物Ｉが、実質的な結腸濃度を達成し、プラズマ照射は、非常に低いか、無視できる程度であることを明らかにした。
【０２５５】
【表８ａ】
0006464384.tif 000045
【０２５６】
【表８ｂ】
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【０２５７】
【表９ａ】
0006464384.tif 000047
【０２５８】
【表９ｂ】
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【０２５９】
【表９ｃ】
0006464384.tif 000049
【０２６０】
ADMEパラメータの決定
化合物Ｉに関して、特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、および排泄）パラメータの評価が、BioFocus (Saffron Walden、UK) により行われた。この結果は、化合物Ｉが、ヒト肝細胞によって迅速に除去されること、および、シトクロムＰ４５０の時間依存性阻害に関するデメリットを軽減していることを明らかにしている。
【０２６１】
【表１０】
0006464384.tif 000050
【０２６２】
【表１１ａ】
0006464384.tif 000051
【０２６３】
【表１１ｂ】
0006464384.tif 000052
【０２６４】
ｈＥＲＧ阻害試験
化合物Ｉは、Essen Bioscience（Welwyn Garden City, England）のIonWorks（商標）パッチクランプ電気生理学（IonWorks（商標） patch clamp electrophysiology）を使用して、ｈＥＲＧ（human Ether-a-go-go Related Gene）チャネル阻害について試験した。
【０２６５】
【表１２】
0006464384.tif 000053
【０２６６】
代謝物の分析
ラット、カニクイザルまたはヒトの肝細胞とのインキュベーション後に、化合物Ｉの代謝運命を決定するための研究がBioFocus（Saffron Walden, UK）によって行われた。
【０２６７】
化合物Ｉ（初期濃度１０μＭ）またはＤＭＳＯコントロールは、反応の終了およびアセトニトリルを用いた化合物抽出が行われる前に、別箇に各種由来の凍結保存した肝細胞（５０万細胞／ｍＬ）と、３７℃、０分、６０分，９０分でインキュベーションされ（ｎ=３）た。サンプルの複製物が分析前にプールされた。
【０２６８】
潜在的な代謝物は、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、トリプル四重極（ＴＱ）の質量分析計を用いて同定した。
【０２６９】
その結果、化合物Ｉは肝細胞において９種の代謝物を生じること、このうち８種はアミド部分のポリエチレングリコール鎖上の酸化から生じることが明らかとなった。カニクイザルの肝細胞に主に見られる他の代謝産物は、５‐（ｔｅｒｔ‐ブチル）‐２‐メトキシ‐３‐（メチルスルホンアミド）フェニル断片の上の酸化を介して生じる。したがって、ナフタレン部分での代謝（ｐ３８α阻害剤であるＢＩＲＢ７９６に関する肝毒性現象（Iwano, S., et al., J. Appl. Toxicol. 2011, 31, 671-677)）に関する代謝物は確認されなかった。ヒト肝細胞におけるインキュベーションで同定された全ての代謝産物は、ラットまたはカニクイザルのいずれかの肝細胞におけるインキュベーションでも検出された。
【０２７０】
変異原性評価（細菌復帰突然変異スクリーニング）
試験は、化合物Ｉについて、ネズミチフス菌における２系統のヒスチジン依存性栄養素要求体株であるＴＡ９８およびＴＡ１００に対する突然変異の誘発能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するため、Sequani (Ledbury, Herefordshire, UK)により行われた。
【０２７１】
突然変異スクリーニングは、プレート法を使用して行い、かつ、Ｓ−９画分（Ａｒｏｃｌｏｒ  １２５４で処理したラットの肝臓に由来する肝臓のポスト・ミトコンドリア画分）の存在下および不存在下の両方で行った。細菌は、ジメチルスルホキシドに溶解した被検化合物に曝露した。この溶媒はネガティブコントロールとしても使用した。投与レベルは、０．３２μｇ／プレート、１．６μｇ／プレート、８μｇ／プレート、４０μｇ／プレート、２００μｇ／プレート、１０００μｇ／プレートまたは５０００μｇ／プレートであった。
【０２７２】
被検化合物の分析可能な処理レベルは、５０００μｇ／プレートでは巨大な沈殿が観察されてコロニーのスコアリングに影響を与えたことから、その不溶性により１０００μｇ／プレート以下に制限させられた。沈殿は、Ｓ−９混合物の存在下および非存在下における１０００μｇ／プレートで双方の株において認められた。
【０２７３】
化合物Ｉでは、Ｓ−９混合物の存在下または非存在下のネズミチフス菌株において、投与量に依存した、或いは、統計学上有意な復帰突然変異株のコロニーの増加はなかった。
【０２７４】
加水分解安定性の検討
ＤＭＳＯと水の混合物（３：１）中、１ｍｇ／ｍＬの試験化合物の濃度で、化合物Ｉの化学的安定性を評価した。
【０２７５】
一般的なＨＰＬＣ手順
アジレント社の「Waters X-Select C18」、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍカラム、４分の方法、５〜９５％ＭｅＣＮ／水（０．１％ギ酸）
流速２．５ｍＬ／分
カラムオーブン温度＝４０℃
検出＝２５４ｎｍ
【０２７６】
試料の調製
１．０ｍｇの被験化合物のサンプルをＤＭＳＯ７５０μＬに溶解した。水（２５０μＬ）をゆっくりと添加し、沈殿が生じないようにした。
【０２７７】
記録安定性
被験溶液の５０μＬアリコートを取り出し、５μＬをＨＰＬＣ注入することにより２連で分析した。対応するＵＶトレースの手動統合の後に、被験化合物のピーク面積が記録された。
【０２７８】
被験溶液を撹拌しながら６０℃に加熱し、５０μＬのアリコートを５時間の時点及び２４時間の時点でＨＰＬＣ分析のために取り出した。全ての場合において、５μＬのＨＰＬＣ注入が行われ、サンプルは２連で分析された。
【０２７９】
被験化合物のピーク面積は、後続の時点と、経過時間に対するピーク面積の％変化から算出された％分解との双方が記録された。
【０２８０】
参照化合物Ｂ（３−エチニル−５−（（４−（（４−（３−（３−イソプロピル−１−（ｐ−トリル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ−（２−モルホリノエチル）ベンズアミド；Ｃａｒｉｏｕ，  Ｃ．  Ａ．  Ｍ．，  他，  ＷＯ２０１４／０２７２０９）は、試験を検証するための対照として、安定性試験に含めた。完全に安定な、本発明の化合物とは対照的に、この参照化合物は、実験条件下で実質的な分解をした。
試験結果は以下の表に報告されている。
【０２８１】
【表１３】
0006464384.tif 000054
【０２８２】
【表１４−１】
0006464384.tif 000055
【０２８３】
【表１４−２】
0006464384.tif 000056
【０２８４】
【表１４−３】
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【０２８５】
【表１４−４】
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