(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された生物学的サンプルにおけるHIV感染の、又は単離された生物学的サンプルにおけるHIV感染の治療的処置の有効性の、バイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAをイン・ビトロ又はエクス・ビボで使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法。
【請求項２】
単離された生物学的サンプル内への上記miR-124の測定された発現レベルが対照基準値と比較され、上記対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの変化が、HIV感染を又は上記HIV感染の治療的処置の有効性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質又は細胞の生理的活性を変更する為に薬物候補又はワクチン候補の生物学的効果を評価する為の、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単離された生物学的サンプルにおいてHIV感染を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングする為のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAをイン・ビトロ又はエクス・ビボで使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法。
【請求項５】
対照基準値と比較される上記薬物候補又はワクチン候補の存在下において、単離された生物学的サンプル内への上記miR-124の測定された発現レベルが、及び前記対照基準値に相対的な前記測定されたレベルの変化が、上記単離された生物学的サンプルにおいてHIV感染を予防し及び／又は治療する際の上記薬物候補又はワクチン候補の生物学的効果を表す、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
上記生物学的サンプルが、生物学的組織サンプル、全血サンプル、綿棒サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、唾液サンプル、膣液サンプル、精液サンプル、咽頭流体サンプル、気管支流体サンプル、糞便流体サンプル、脳脊髄流体サンプル、涙流体サンプル、及び組織培養上清サンプルから成る群において選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記薬物候補又はワクチン候補が、式(I)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法：
【化１】
0006607568.tif 000015
ここで
−nは1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；R1及びR2が独立に水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；(C1〜C3)フルオロアルコキシ基；-NO2基；フェノキシ基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【請求項８】
上記薬物候補又はワクチン候補が、式(II)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法：
【化２】
0006607568.tif 000016
ここで、
−nは、1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；-CN基；水酸基；-COOR1基；(C1〜C3)フルオロアルキル基；-NO2基；R1及びR2が水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【請求項９】
単離された生物学的サンプルにおいてHIV感染があるとき、請求項７において定義された通りの式(I)の若しくは請求項８において定義された通りの式(II)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つの活性のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAをイン・ビトロ又はエクス・ビボで使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法。
【請求項１０】
上記キノリン誘導体が、請求項７において定義された通りの式(I)で表され、又はその医薬的に許容可能な塩の一つである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記キノリン誘導体が、請求項８において定義された通りの式(II)で表され、又はその医薬的に許容可能な塩の一つである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記キノリン誘導体で、HIV感染の処置に対する患者の応答性を評価する為の、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記キノリン誘導体で、HIV感染の処置の有効性を評価する為の、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
HIV感染を予防し及び／又は治療するための治療剤としての上記キノリン誘導体の治療学的有効性を評価する為の、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記キノリン誘導体での処置での患者コンプライアンスを評価する為の、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
単離された生物学的サンプルへの測定された発現レベルが対照基準値と比較され、当該対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が上記キノリン誘導体の活性を示す、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記測定された発現レベルが、上記対照基準値に対して少なくとも２倍増加されている、請求項２、５及び１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
HIVウィルスに感染されていると推定される患者からの単離された生物学的サンプルにおいてHIV感染を評価する為のイン・ビトロ又はエクス・ビボ方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−上記患者から予め得られた生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり；及び
ｂ−上記存在又は発現レベルを対照基準値と比較すること
を含み、上記対照基準値に相対的な上記miRNAの存在又は発現レベルの変化がHIV感染を示す、上記方法。
【請求項１９】
単離された生物学的サンプルにおいて、上記キノリン誘導体で処置された患者におけるHIV感染の予防及び／又は治療の有効性を評価する為に、請求項９〜１１のいずれか一項に記載されたキノリン誘導体の活性を評価するイン・ビトロ又はエクス・ビボ方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−上記キノリン誘導体を投与する前に上記患者から予め得られた第１の生物学的サンプルにおいて及び上記キノリン誘導体を投与した後に上記患者から予め得られた第２の生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり；及び
ｂ−上記存在又は発現レベルが、上記処置前に得られた上記第１の生物学的サンプルと比較して上記処置後に得られた上記第２の生物学的サンプルにおいて変化されているかを決定すること；
を含み、上記miRNAの存在又は発現レベルの変化が、患者におけるHIV感染を予防し及び／又は治療するのに有効な、上記キノリン誘導体の活性を示す、上記方法。
【請求項２０】
上記患者が、毎時間、一日二回、毎日、週二回、毎週、月二回、毎月、年二回、毎年、及び隔年から成る群から選択される時間間隔で試験される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
単離された生物学的サンプルにおいてHIV感染を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補の生物学的効果を評価する為の、イン・ビトロ又はエクス・ビボ方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−少なくとも１つのmiRNAを発現することが可能な少なくとも１つの単離された細胞を該薬物候補又はワクチン候補で処置すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり、上記細胞は、上記少なくとも１つのmiRNAを発現する為に適している条件下にあり、
ｂ−上記少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、
ｃ−上記測定された存在又は発現レベルを、未処置の単離された細胞における上記少なくとも１つのmiRNAの測定又は発現レベルと比較すること
を含み、上記miRNAの存在又は発現レベルの変化が、HIV感染に対する上記薬物候補又はワクチン候補の生物学的効果を示す、上記方法。
【請求項２２】
HIV感染を診断する為にmiR-124の存在又は発現レベルを測定する為の、又はHIV感染を予防し及び／又は治療する為に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補の活性を評価する為に使用する診断薬であって、miR-124に特異的にハイブリダイズすることが可能である単離された核酸プローブを含む、上記診断薬。
【請求項２３】
上記核酸プローブが、配列ID  NO：6〜配列ID  NO：87から成る群から選択される核酸配列からなる、請求項２２に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカー、特にウィルス感染に関連してのバイオマーカー、の分野に関する。
【０００２】
より特には、本発明は、ウィルス感染についての診断マーカーとして有用な新規なバイオマーカーに関する。より特に考慮されるウィルス感染は、RNAスプライシングを必要とするウィルス感染、特にレトロウィルス感染、例えばHIV及びAIDS関連症状、である。本発明はまた、上記感染、特にHIV及びAIDS関連症状、の治療の為のフォローアップマーカーに関する。
【背景技術】
【０００３】
高等真核生物において、メッセンジャーRNAは、それらの機能形において直接的に転写されないだけでなく、細胞翻訳機構によって読み取り可能にする為に多くの処理イベントを通過しなければならないプレ-メッセンジャーRNAとして転写されない。
スプライシングは、不要な配列(イントロン)を取り除き且つ意味のある配列（エクソン）を接合することを可能にする工程である。高度に調整されたスプライシング事象は、スプライセオソーム(Spliceosome)と呼ばれる大きな複合体中で起こる。この機能的超複合体(megacomplex)の形成は、エクソン−イントロン境界の識別を必要とするタンパク質及びRNAの結集された集合物(orchestrated  assembly)である。エクソンは、定期的に選択的にスプライシングされ、それはそれらが最終的な成熟mRNA転写物に含まれるか又は取り除かれることを意味する。最近の包括的なシークエンシング研究は、遺伝子の90％超が選択的スプライシングを経験することを観察した。選択的にスプライシングされたmRNAの産生が、mRNA前駆体それ自体上のシス作用部位に結合するトランス作用タンパク質の系によって変化される。そのようなタンパク質は、特定のスプライス部位の使用を促進スプライシング活性剤、及び特定の部位の使用を減らすスプライシングリプレッサーを含み、それぞれ、スプライシング・エンハンサー部位（イントロンのスプライシング・エンハンサー、ISE(intronic  splicing  enhancers)及びエクソンのスプライシング・エンハンサー、ESE(exonic  splicing  enhancers)）上で及びスプライシング・サイレンサー部位（イントロンのスプライシング・サイレンサー、ISS(intronic  splicing  silencers)及びエクソンのスプライシング・サイレンサー、ESS(exonic  splicing  silencers)）上で結合する。
【０００４】
ウィルス、特にレトロウィルス科からのウィルス、は、世界中の疾病の原因の一つである。３つのサブファミリー、オンコウィルス、レンチウィルス及びスプマウィルス、は、レトロウィルス科内で区別されることができる。
【０００５】
オンコウィルスはこのように呼ばれる。なぜならば、それらは癌及び悪性の感染に関連付けられることができるからである。例えば、白血病ウィルス(例えば、鳥白血病ウィルス(ALV：avian  leukemia  virus)、モロニー(Moloney)ウィルスとも呼ばれるマウス白血病ウィルス(MULV：murine  leukemia  virus)、猫白血病ウィルス(FELV：feline  leukemia  virus)、ヒト白血病ウィルス、例えばHTLV1及びHTLV2、サル白血病ウィルス、すなわちSTLV(simian  leukemia  virus)、ウシ白血病ウィルス、すなわちBLV(bovine  leukemia  virus)、霊長類D型オンコウィルス、乳腺腫瘍の誘導因子である型オンコウィルス、又は急速な癌を引き起こすオンコウィルス(例えば、ラウス肉腫ウィルス、すなわちRSV(Rous  sarcoma  virus))が言及されうる。
【０００６】
スプマウィルス(spuma  virus)は、所与の細胞型又は所与の種についてかなり低い特異性を発揮し、それらは時々、免疫抑制現象に関連付けられる；すなわち、例えば、サル泡沫状ウィルス（すなわち、SFV：simian  foamy  virus）についての場合である。
【０００７】
レンチウィルス、例えばHIV、は、このように呼ばれる。なぜならば、それらは、AIDSを含む免疫抑制現象に非常に頻繁に関与する病理学的状態を遅く進ませる為の原因であるからである。
【０００８】
ウィルス、特にレトロウィルス、例えばHIV、は、感染した個体内の細胞及び組織内で拡散し且つ広まる為にRNAスプライシング及びスプライシング調節に依存することが知られている。
【０００９】
最近、HIVは重要なウィルスタンパク質を発現する為にRNAスプライシングを必要とするレトロウィルスであるという事実が、ウィルス感染、特にAIDS、に対抗する為のスプライシング阻害に基づく新規な策略を展開するために利用されている(国際公開第WO2010/143169号)。事実、HIV-1ゲノムは、子孫ウィルスの為のゲノムRNAとして役に立つだけでなく、40個の種々のmRNAをも生成する9kbの一次転写産物を発現する。HIV-1は、4つの複数の代替5'スプライス部位と8つの複数の代替3'スプライス部位を使用する。これらのスプライシングされたmRNAは、2つのクラスに分けられることができる：多重にスプライシングされた(2kb)及び単独にスプライシングされた(4kb)RNA。スプライスシグナルの細胞スプライシング機構(cellular  splicing  machinery)による認識を低下させる準最適なスプライシング部位の存在の故に、HIV-1代替スプライシングの調節が主に生じる。ウィルススプライス部位でのスプライシングは更に、ESE、ESS及びISSの存在によって変化される。
【００１０】
この文脈において、キノリン誘導体、特に8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン、が開発されており、それはHIV-1及びHIV-2  T細胞指向性実験室株並びにnM濃度範囲で種々のサブタイプの臨床分離株の末梢血単核細胞(PBMC：Peripheral  Blood  Mononuclear  Cells)における複製を阻害することが示されている(国際公開第WO2010/143169号)。
【００１１】
マイクロRNA(miRNA)、最も包括的な非コード群、は、ターゲットmRNA転写物の非翻訳領域(UTR：UnTranslated  Region)への結合を介して遺伝子発現を阻害する約22ヌクレオチドの非コードRNAのクラスである(Lai  et  al.，Nature  Genetics，vol.  30，no.  4，pp.  363〜364，2002；Bartel  et  al.，Cell，vol.  136，no.  2，pp.  215〜233，2009)。miRNA遺伝子は、知られている真核生物のゲノムの約1〜2％を表す。予測は、各miRNAが200超の転写産物を標的とすることができること及び単一のmRNAが複数のmiRNAによって変化されることができることを示唆する(LINDOW，DNA  Cell  Biol.，vol.  26(5)，p.  339〜351，2007)。miRNAは、内因性ヘアピン型転写物から生成され、そして塩基対合の程度に応じてmRNA切断又は翻訳抑制をもたらす、ターゲットmRNAとの塩基対合によって作用する。2つの処理イベントは、成熟miRNA形成をもたらす：最初に、初期のmiRNA転写産物（pri-miRNA）が、核からエクスポートされる70ヌクレオチド前駆体(pre-miRNA)内で処理され、そして短い（約22ヌクレオチド長）成熟miRNAを生成するために細胞質内で切断される(LEE，EMBO  J.，vol.  21，p；4663-4670，2002)。miRNAは遺伝子間的に(intergenically)又は遺伝子内的に(intragenically)配置されることができる。遺伝子間の場合には、それらの発現は、クラスタとして他のmiRNAと調整される(Altuvia  et  al.，Nucleic  Acids  Research，vol.  33，no.  8，pp.  2697〜2706，2005，Ozsolak  et  al.，Genes  and  Development，vol.  22，no.  22，pp.  3172〜3183，2008)。遺伝子内の場合には、すなわちタンパク質をコードする遺伝子内に配置されている場合（イントロンでほぼ例外なく）には、それらはしばしば、それら宿主遺伝子と同じ鎖から(Liu  et  al.，Cell  Research，vol.  18，no.  10，pp.  985〜996，2008，Kim  et  al.，EMBO  Journal，vol.  26，no.  3，pp.  775〜783，2007)及び相関レベルで(Baskerville  et  al.，RNA，vol.  11，no.  3，pp.  241〜247，2005)発現される。
【００１２】
miRNAは最近、ウィルス感染における宿主と病原体との間の複雑なクロストーク(intricate  cross-talk)に関与しており、且つウィルス病原性における主要な役割を果たすと考えられている(NAIR，Trends  in  Microbiol.，vol.  14，p.  169〜175，2006)。確かに、ウィルスは、彼らの生存及び複製の為の細胞機構を使用する偏性細胞内寄生体であり、従ってこの依存性は、宿主遺伝子調節のメカニズムにそれらを受けやすくする。細胞miRNAは抗ウィルス防御機構に参加することができ、しかしまた、幾つかの場合に、ウィルス陽性調節因子であることがでる。一方、ウィルスそれ自体はまた、細胞プロセス又はウィルス遺伝子を調節するmiRNAを生成することができる。HIV-1感染に関与するmiRNAは、生合成のそれらのソースに従ってHIV-1エンコードされた又は宿主エンコードされたとして定義されることができる；それらはまた、その機能に応じて、感染の抑制剤又は活性化剤として定義されることができる。さらに、それらは、それらが、HIV-1転写物を直接的に標的とするか、又はウィルスのライフサイクルに関与する宿主因子を標的とすることによって又はHIV-1  RNAゲノム及びHIV-1感染に不可欠である宿主因子の両方を標的とすることによってHIV-1に間接的に影響を与えるかどうかに従って分けられることができる。幾つかのデータは、HIV-1感染が原因のmiRNA生合成摂動により全体的にだけでなく、miRNA発現プロファイル変性により個々にmiRNA経路に影響を与えることを証明する(Houzet  et  al.，Biochim  Biophys  Acta.  2011  Nov-Dec；1809(11〜12)：686〜693))。その上、宿主miRNAは、HIV-1を変化することが記載されている。
【００１３】
所与の薬物又はワクチンの開発の成功の為の一つの重要な要因は、その有効性を効率的に且つ迅速に評価するための可能性である。事実、高用量から生じる望ましくない影響を避ける為に又はあまりにも低い投与量による効率性の欠如を回避する為に、その治療濃度域において投与されることが所与の薬物又はワクチンの為に重要である。また、人は、適切な薬物又はワクチンが適切な患者に投与されていること及びこの患者が薬剤又はワクチンに実際に応答することを確認しなければならない。それ故に、所与の患者と所与の薬物又はワクチンとを一緒に単に結び付けることが、与えられた薬物またはワクチンは、有益な治療効果を得る為に必ずしも十分でない。それ故に、薬物又はワクチンの有効性を評価に依存する適切なツール、例えば特定のバイオマーカー、を有することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それ故に、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV(ヒト免疫不全ウィルス)感染、並びに、そのような状態の治療の有効性を評価する為の新規な且つ感度の高いツールの必要性がある。
【００１５】
ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染の治療の有効性を評価する為の新規なバイオマーカーの必要性がある。
【００１６】
ウィルス、特にレトロウィルス、例えばHIV、より特にはHIV-1及びHIV-2の阻害剤であるキノリン誘導体の有効性を評価する為の新規な且つ感度の高いツールの必要性がある。
【００１７】
ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し又は治療する為のキノリン誘導体に対する患者の反応性を評価する為の新規なバイオマーカーの必要性がある。
【００１８】
ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し又は治療する為のキノリン誘導体の治療学的有効性を評価する為の新規なバイオマーカーの必要性がある。
【００１９】
ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し及び／又は治療する為に有効な薬物候補又はワクチンをスクリーニングする為の新規なバイオマーカーの為の必要性がまたある。
【００２０】
本発明は、これら必要性を満たす為の目的を有する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
その目的の一つに従うと、本発明は、ウィルス感染の、又は当該ウィルス感染の治療的処置の有効性の、バイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する。
【００２２】
予想外に、本発明は、下記の実施例において詳述される通りに、HIV株で、特にADA-M  R5  HIV株で、感染されたPBMCにおいて、miR-124の発現レベルが感染されていないPBMCに対して減少されたことを観察した。
【００２３】
その上、本発明者らは予想外に、HIV株で、特にADA-M  R5  HIVで感染された末梢血単核細胞(PBMCs：Peripheral  blood  mononuclear  cells)のキノリン誘導体、例えば式(I)又は(II)のキノリン誘導体での処置、特に8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミンでの処置、がウィルスの除去を及びmiR-124発現の劇的な増加（対照に対して13倍）を結果として生じたことを観察した。キノリン誘導体は、国際公開第WO2010/143169号に記載された化合物から及びさらに下記に記載された化合物から選択されうる。従って、上記ウィルス感染の治療的処置は、キノリン誘導体での処置であることができる。
【００２４】
従って、上記miR-124は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、例えばHIV感染、特にそのような感染に患う個体内で監視する為の、並びにウィルス、特にレトロウィルス、で感染された、例えばHIVで感染された、個体を監視する為の、及び抗ウィルス薬で、特に下記で詳述される通りの式(I)又は(II)のキノリン誘導体で、特に8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミンで、処置されたそのような個体を監視する為の強力なツールとして、そうでなければバイオマーカーとして、それ自体明らかになった。
【００２５】
従って、miR-124の発現レベルを監視することによって、ヒトの研究試験に品質管理を追跡し又は実行すること、又は患者が適切な薬剤又はワクチン治療を受信していること（すなわち、投与量及び時間の観点において）を確認する為の手段を提供することによる薬物療法又はワクチンに対する患者コンプライアンスを監視することが可能である。上記miR-124バイオマーカーはまた、投与計画を最適化するために使用されることができる。従って、miR-124のバイオマーカーは、例えば患者処置、臨床試験、及び細胞に基づく研究に関連して使用されることができる。
【００２６】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染の、好ましくはレトロウィルスでの、より好ましくはヒト免疫不全ウィルス(HIV)での、バイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する。
【００２７】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングする為のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する。
【００２８】
その目的の他に従うと、本発明は、タンパク質又は細胞の生理的活性を変更する為に候補化合物の生物学的効果、特に薬理的ポテンシャル、を評価する為のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
この点において、miR-124の発現レベルは、薬理学的活性を有することが知られている種々の化合物の投与に応じて変化することが、本明細書内に示されている。従って、本発明者等は、miR-124が候補化合物の潜在的な薬理学的活性関連バイオマーカーからなることを示している。
【００３０】
特に、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する際に有効あると推定される上記薬物候補又はワクチン候補は、キノリン誘導体であることができる。
【００３１】
特に、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する際に有効あると推定される上記薬物候補又はワクチン候補が、式(I)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つであることができる：
【００３２】
【化１】
0006607568.tif 000002
【００３３】
ここで、
−nは1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；R1及びR2が独立に水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；(C1〜C3)フルオロアルコキシ基；-NO2基；フェノキシ基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【００３４】
ウィルス感染を予防し及び／又は治療する際に有効あると推定される上記薬物候補又はワクチン候補がまた、式(II)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つであることができる：
【００３５】
【化２】
0006607568.tif 000003
【００３６】
ここで、
−nは、1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；-CN基；水酸基；-COOR1基；(C1〜C3)フルオロアルキル基；-NO2基；R1及びR2が水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【００３７】
本発明内で、語「予防する」は、所与のイベント、すなわち本発明の文脈においてウィルス感染、の発生の可能性を減らすことを意味することを意図する。
【００３８】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染があるとき、キノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つの活性のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する。
【００３９】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、があるとき、下記式(I)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つの活性のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する：
【００４０】
【化３】
0006607568.tif 000004
【００４１】
ここで、
−nは1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又(C1〜C3)アルキル基；R1及びR2が独立に水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；(C1〜C3)フルオロアルコキシ基；-NO2基；フェノキシ基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【００４２】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、があるとき、式(II)のキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つの活性のバイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する：
【００４３】
【化４】
0006607568.tif 000005
【００４４】
ここで、
−nは、1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；-CN基；水酸基；-COOR1基；(C1〜C3)フルオロアルキル基；-NO2基；R1及びR2が水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【００４５】
特定の実施態様に従うと、本発明のキノリン誘導体は、8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン又は8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-イル]キノリン-2-アミンでありうる。
【００４６】
従って、その目的の他に従うと、本発明は、下記から選択されるキノリン誘導体の活性バイオマーカーとして、少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiR-124である、上記方法に関する：
【００４７】
【化５】
0006607568.tif 000006
【００４８】
本発明内で、表現「ウィルス感染」及び「ウィルスでの感染」は、何らかのウィルス感染、特に何らかのレトロウィルス感染、を言及し、それは、細胞、組織、器官又は本発明のバイオマーカーを発現しやすい個体内に生じうる。好ましくは、レトロウィルス感染は、レンチウィルス感染、より好ましくはHIV感染、でありうる。本発明内の個体は、哺乳動物、好ましくは本発明のバイオマーカーを発現しやすい人でありうる。本発明内で、個体及び患者は、交換可能に使用される。
【００４９】
本発明内で、語「ウィルス」は、任意のウィルス、特にレトロウィルス、好ましくはレンチウィルス、例えばHIVウィルス、より好ましくはHIV-1又はHIV-2、を言及する。
【００５０】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルスに感染されていると推定される患者においてウィルス感染、特にレトロウィルス感染、及びより特にはHIV感染、を評価する為の方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−上記患者から予め得られた生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり；及び
ｂ−上記存在又は発現レベルを対照基準値と比較すること
を含み、上記対照基準値に相対的な上記miRNAの存在又は発現レベルの変化がウィルス感染を示す、上記方法に関する。
【００５１】
その目的の他に従うと、本発明は、上記キノリン誘導体で処置された患者におけるウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し及び／又は治療する為に、式(I)のキノリン誘導体の活性を評価する方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−上記キノリン誘導体を投与する前に上記患者から予め得られた第１の生物学的サンプルにおいて及び上記キノリン誘導体を投与した後に上記患者から予め得られた第２の生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり；及び
ｂ−上記存在又は発現レベルが、上記処置前に得られた上記第１の生物学的サンプルと比較して上記処置後に得られた上記第２の生物学的サンプルにおいて変化されているかを決定すること
を含み、上記miRNAの存在又は発現レベルの変化が上記キノリン誘導体の活性を示す、上記方法に関する。
【００５２】
本明細書において使用される場合に、「生物学的サンプル」は一般に、イン・ビボ(in  vivo)又はイン・シチュー(in  situ)で得られた、到達された又は集められた生物組織又は流体起源のサンプルを含む生物学的被験物から得られるサンプルを言及する。そのようなサンプルは、哺乳動物から単離された器官、組織、画分及び細胞でありうるが、これらに限定されない。例示的な生物学的サンプルは、細胞溶解物、細胞培養物、細胞株、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、オルガネラ、生体液、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプル、皮膚サンプルなどを含むが、これらに限定されない。好ましい生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、PBMC、組織生検、口腔粘膜、唾液、間質液、又は尿のサンプルなどを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
一つの実施態様において、本発明に適している生物学的サンプルが、生物学的組織サンプル、全血サンプル、綿棒サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、唾液サンプル、膣液サンプル、精液サンプル、咽頭流体サンプル、気管支流体サンプル、糞便流体サンプル、脳脊髄流体サンプル、涙流体サンプル、及び組織培養上清サンプルから成る群において選択されうる。
【００５４】
本発明はさらに、バイオマーカーを含む単離された生物学的サンプルであって、上記生物学的サンプルが、組織サンプル、全血サンプル、綿棒サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、唾液サンプル、膣液サンプル、精液サンプル、咽頭流体サンプル、気管支流体サンプル、糞便流体サンプル、脳脊髄流体サンプル、涙流体サンプル、及び組織培養上清サンプルを含む群において、好ましくはそれらからなる群において、選択され；ここで、上記バイオマーカーがmiRNAバイオマーカー、好ましくはmiR-124、である、上記生物学的サンプルに関する。
【００５５】
その目的の他に従うと、本発明は、候補化合物の生物学的効果を評価する為の、特にウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングする為の、方法であって、少なくとも下記ステップ：
ａ−少なくとも１つのmiRNAを発現することが可能な少なくとも１つの単離された細胞を該候補化合物で処置すること、当該少なくとも１つのmiRNAはmiR-124であり、上記細胞は、上記少なくとも１つのmiRNAを発現する為に適している条件下にあり、
ｂ−上記少なくとも１つのmiRNAの存在又は発現レベルを測定すること、
ｃ−上記測定された存在又は発現レベルを、未処置の単離された細胞における上記少なくとも１つのmiRNAの測定又は発現レベルと比較すること
を含み、上記miRNAの存在又は発現レベルの変化が、上記候補化合物の生物学的効果を、特にウィルス感染に対する上記薬物候補又はワクチン候補の有効性を、示す、上記方法に関する。
【００５６】
本発明内で、語「変化」又は「存在又は発現レベルの変化」は、本発明のバイオマーカーの上記存在又は発現レベルが、誘発されるか若しくは増加されること、又は抑制されるか若しくは減少されることのいずれかを意味することを意図する。
【００５７】
従って、miR-124、とりわけmiR-124の発現レベル、が、細胞の代謝変化を含む、タンパク質又は細胞の生理学的変化を表す関連バイオマーカーからなり、当該変化が有益な薬理学的効果を実現化することを本願明細書において含まれる実験結果から生じる。
【００５８】
従って、以前に述べられているとおり、本発明はまた、候補化合物の生物学的効果、特に薬理学的効果、を評価する為の少なくとも１つのmiRNAを使用する方法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiRNA-124である、上記方法に関する。
【００５９】
本発明はまた、タンパク質又は細胞の生理的活性を変更する為の候補化合物の能力を評価する為の少なくとも１つのmiRNAの使用法であって、上記少なくとも１つのmiRNAがmiRNA-124である、上記使用方法に関する。
【００６０】
タンパク質又は細胞の生理的活性の上記変更は、細胞の生理学的パラメータの測定における（細胞の代謝パラメータの測定における、を含む）何らかの検出可能な変化（それは、電気生理学的変化、細胞膜透過性変化、酵素活性変化、タンパク質発現変化、miRNA発現変化、遺伝子発現変化、細胞内pH値などを包含する）の識別によって当業者により容易に決定されうる。
【００６１】
本明細書において使用される場合に、語「決定する」、「測定する」、「評価する(evaluating)」、「評価する(assessing)」、及び「アッセイする」は一般に、測定の何らかの形態を言及し、且つ、要素が存在するか又は存在しないかを決定することを含む。これら語は、定量的及び／又は定性的な決定を含む。評価することは、相対的又は絶対的でありうる。句「の存在を評価すること」は、存在する何かの量を決定すること、並びにそれが存在するか又は存在しないかを決定することを含む。
【００６２】
一つの好ましい実施態様に従うと、ウィルス感染を評価するときに、対照基準値に相対的な上記miRNAの減少された若しくは抑圧された存在又は減少した発現レベルの観察がウィルス感染を示しうる。
【００６３】
一つの好ましい実施態様に従うと、ウィルス感染の治療の為に式(I)のキノリン誘導体の活性を評価するときに又はウィルス感染を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングするときに、対照基準値に相対的な上記miRNAの誘発された又は増加された存在又は増加された発現レベルの観察が、式(I)の上記キノリン誘導体の活性を又は上記薬物候補又はワクチン候補の有効性を示しうる。
【００６４】
好ましい実施態様に従うと、本発明の使用及び方法は、イン・ビトロ(in  vitro)又はエクス・ビボ(ex  vivo)で実行される。
【００６５】
その目的の他に従うと、本発明は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を診断する為にmiR-124の存在又は発現レベルを測定する為の、又は薬物候補又はワクチン候補、特にウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、を予防し及び／又は治療する為に有効な薬物候補又はワクチン候補、の活性を評価する為の診断薬としての、miR-124に特異的にハイブリダイズすることが可能である単離された核酸プローブに関する。
【００６６】
本明細書において使用される場合に、語「プローブ」は一般に、特定のターゲットmiRNAバイオマーカー配列に向けられる捕捉剤を言及する。従って、一つのプローブ・セットの各プローブは、個々のターゲットmiRNAバイオマーカーを有する。プローブ/ターゲットmiRNAデュプレックス(duplex)は、プローブをそのターゲットmiRNAバイオマーカーにハイブリダイズすることによって形成される構造である。
【００６７】
本発明に適している単離された核酸プローブは好ましくは、配列ID  NO：6〜配列ID  NO：87から成る群から選択される核酸配列からなる核酸プローブでありうる。
【００６８】
その有利点の一つに従うと、本発明は、ウィルスに、好ましくはレトロウィルスに、より好ましくはウィルスに、感染した患者の追跡調査(follow-up)の為の有用な且つ信頼できるバイオマーカーを提供する。
【００６９】
その有利点の一つに従うと、本発明は、ウィルスに、好ましくはレトロウィルスに、より好ましくはHIVウィルスに、感染し、且つ式(I)のキノリン誘導体で処置された患者の為の有用な且つ信頼できるバイオマーカーを提供する。
【００７０】
その有利点の他に従うと、本発明は、患者のベッドで用意に使用されうる賢明な且つ信頼できるバイオマーカーを提供する。
【００７１】
使用及び方法
【００７２】
一つの実施態様に従うと、本発明に従う使用及び方法は特に、患者におけるウィルス感染を決定すること、特にそのような感染の追跡調査をすること、を許しうる。
【００７３】
一つの実施態様に従うと、miR-124の存在又は発現レベルが、単離された生物学的サンプル内で測定され、その後、対照基準値と比較される。
【００７４】
対照基準値に相対的なmiR-124の存在又は発現レベルの変化は、ウィルス感染を示しうる。特に、対照基準値に相対的な上記miRNAの減少若しくは抑制された存在、又はその減少された発現レベルは、ウィルス感染を示しうる。
制御基準値のmiRNAの相対指標であってもよいです。
【００７５】
一つの実施態様において本発明の使用は、単離された生物学的サンプルにおいて上記miR-124の測定された発現レベルを得ること、及び対照基準値に対して上記測定された発現レベルを比較することを含みうる。上記対照基準値に相対的な上記測定されたレベルを変化することの観察は、ウィルス感染を示しうるか、又は上記ウィルス感染の治療的処置の有効性を示しうる。
【００７６】
サンプルからのmiR-124が、対照基準値と比較された場合に、患者から単離された生物学的サンプルにおいて「減少される」又は「下方制御される」場合に、この減少は例えば、比較対照基準値(すなわち、上記キノリン誘導体による処置無し)の約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、100％、200％、300％、500％、1,000％、5,000％又はそれよりも多くであることができる。
【００７７】
特に、miR-124上記測定された発現レベルが、上記対照基準値に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、好ましくは少なくとも６倍、好ましくは少なくとも８倍、より好ましくは少なくとも１０倍、減少されていうる。
【００７８】
一つの実施態様に従うと、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、の為のバイオマーカーとしてのmiR-124の使用方法及びそれを実装する方法が、上記感染からの特定の他のバイオマーカーの決定、例えば上記ウィルスから特定のペプチド、タンパク質又は核酸配列の存在又は発現レベルの決定、と組み合わせられうる。ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染、からの特定の他のバイオマーカーは例えば、Tat、gp120若しくはgp41をコードするタンパク質若しくは核酸配列、又は、レベルT4リンパ球でありうる。
【００７９】
上記miR-124バイオマーカーが、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にはHIV感染又はAIDS(後天性免疫不全症候群：Acquired  Immune  Deficiency  Syndrome)、に患う患者を監視し又は管理する為に使用されうる。
【００８０】
一つの実施態様に従うと、ウィルス感染を患いこの感染についての処置を受ける前の患者から採取された生物学的サンプルに対して、ウィルス感染を患い且つこの感染についての処置を受けている同じ患者から採取された生物学的サンプルにおいてmiR-124の存在又は発現レベルの増加は、上記処置の有効性を表しうる。
【００８１】
一つの実施態様に従うと、本発明の上記使用及び方法は、式(I)の上記キノリン誘導体で、処置に対する患者の応答性を評価する為のものでありうる。
【００８２】
他の実施態様に従うと、本発明の上記使用及び方法は、式(I)の上記キノリン誘導体で、処置の有効性を評価する為のものでありうる。
【００８３】
他の実施態様に従うと、本発明の上記使用及び方法は、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する為の治療剤としての式(I)のキノリン誘導体の治療学的有効性を評価する為のものでありうる。
【００８４】
一つの実施態様に従うと、本発明の上記使用及び方法は、式(I)の上記キノリン誘導体での処置での患者コンプライアンスを評価する為のものでありうる。
【００８５】
上記miR-124バイオマーカーが、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にHIV感染又はAIDS(後天性免疫不全症候群)の患者処置中に式(I)のキノリン誘導体活性を監視し又は管理する為に使用されうる。
【００８６】
キノリン誘導体で処置される患者において式(I)のキノリン誘導体の上記活性を評価し又は監視する方法であって、単離されたサンプル、好ましくは単離されたPBMC(末梢血単核細胞：Peripheral  Blood  Mononuclear  Cell)、においてmiR-124の発現レベルを測定すること、及び、上記測定された発現レベルを、上記処置の前に患者から採取された単離されたサンプルにおけるmiR-124の発現レベルと比較することを含み得る。上記miR-124レベルに従うことにより、上記キノリン誘導体の上記活性が、経時的に監視されることができる。
【００８７】
一つの実施態様に従うと、本発明に従う使用及び方法は、患者の投与計画を最適化する為に実装されうる。患者は、年齢、健康、遺伝的背景、他の合併症の存在、疾病の進行、及び他の薬物の併用投与のような要因に依存して、式（I）の所与のキノリン誘導体に異なって応答しうる。患者におけるキノリン誘導体の投与計画、例えば投与量及び／又は投与スケジュール、を評価し且つ最適化するためにmiR-124バイオマーカーを利用することが有用でありうる。この点において、miR-124に基づくバイオマーカーがまた、経時的に個々の患者の治療有効性を追跡し且つ調整する為に使用されることができる。上記バイオマーカーがまた、患者の治療における調整を行うために必要とされる情報を集め、必要において剤の量を増加し又は減少する為に使用されることができる。例えば、キノリン誘導体を受ける患者は、上記投与が有効になってきているか又はより積極的な処置計画が整えられる必要があるかを見る為に、上記miR-124に基づくバイオマーカーを用いて試験されることができる。従って、投与される薬剤の量、投与のタイミング、投与頻度、投与期間が、上記miR-124バイオマーカー測定に応じて変化されうる。
【００８８】
上記miR-124バイオマーカーがまた、個々の処置計画中に又は臨床試験中に患者コンプライアンスを追跡する為に使用されうる。これは、試験に含まれる患者が支持された通りに薬物を服用しているかを確認する為に設定された間隔で追われることができる。その上、キノリン誘導体を受ける患者は、当該患者が処置計画の投与計画に準拠しているかを判断する為に上記miR-124バイオマーカーを用いて試験されることができる。未処置の対照サンプルの発現レベルと比較しての上記バイオマーカーの増加した発現レベルは、上記プロトコルでの遵守を示す。
【００８９】
本発明のバイオマーカーが、式(I)のキノリン誘導体の有効性を評価し且つ追う為に実装されうる。従って、miR-124の存在又は発現レベルが、式(I)のキノリン誘導体で予め処置された患者から得られた単離された生物学的サンプルにおいて測定されうる。次に、単離された生物学的サンプルにおけるmiR-124の測定された存在又は発現レベルが、対照基準値と比較されうる。
【００９０】
対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が観察される場合に、その結果上記測定値が式(I)の上記キノリン誘導体の活性を示す。
【００９１】
他の実施態様において、対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が観察される場合に、その結果上記測定値が式(I)の上記キノリン誘導体での処置に対する患者の応答性を表しうる。
【００９２】
他の実施態様において、対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が観察される場合に、その結果上記測定値が式(I)の上記キノリン誘導体での処置の有効性を表しうる。
【００９３】
他の実施態様において、対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が観察される場合に、その結果その結果上記測定値が、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する為の治療剤としての式(I)の上記キノリン誘導体の治療学的有効性を表しうる。
【００９４】
サンプルからのmiR-124が、非処置である対照基準値と比較された場合にキノリン誘導体での処置後の「増加されている」又は「上方制御されている」場合に、この増加は例えば、比較対照基準値（すなわち、上記キノリン誘導体による処置無し）の約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、100％、200％、300％、500％、1,000％、5,000％又はそれよりも多いものであることができる。
【００９５】
特に、miR-124の上記測定された発現レベルは、上記対照基準値に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、好ましくは少なくとも６倍、好ましくは少なくとも８倍、より好ましくは少なくとも１０倍、増加されていうる。
【００９６】
本発明の他の実施態様において、ウィルス感染を監視し又はウィルス感染処置、特に式(I)のキノリン誘導体でのウィルス感染処置、の有効性を評価する場合に、患者は、毎時間、一日二回、毎日、週二回、毎週、月二回、毎月、年二回、毎年、及び隔年から成る群から選択される時間間隔で試験されうる。次に、集められたサンプルが、迅速に試験されることができ、又は後の試験の為に保存されることができる。
【００９７】
他の実施態様に従うと、本発明に従う使用及び方法は特に、薬物候補としての潜在的な活性剤のスクリーニング、同定又は評価を許しうる。
【００９８】
特に、本発明に従う使用及び方法は特に、潜在的な活性剤、例えば薬物候補としての又はウィルス感染に対して有効と考えられるワクチンのスクリーニング、同定又は評価の為に有利である。
【００９９】
本発明の他の実施態様において、miR-124バイオマーカーは、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する為に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングする為に実装されうる。そのような実施態様において、miR-124の存在又は発現レベルが、単離された生物学的サンプル又はスクリーニングされるべき薬物又はワクチンと予め接触された単離された細胞において測定されうる。次に、上記得られた測定値が対照基準値と比較されうる。
【０１００】
単離された生物学的サンプル又はスクリーニングされるべき化合物、薬物、又はワクチンと予め接触された単離された細胞において対照基準値に相対的な上記測定されたレベルの増加が観察される場合に、その結果上記測定値は、生物学的効果を有する為の、特に細胞の生理的活性を変更する為に有効である為の、上記候補を表しうる。
【０１０１】
特に、薬物候補又はワクチン候補は、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染、より特にHIV感染、を予防し及び／又は治療する際に有効であるとして特徴付けられうる。
【０１０２】
サンプルからのmiR-124が、非処置である対照基準値と比較された場合に薬物候補又はワクチンでの処置後の「増加されている」又は「上方制御されている」場合に、この増加は例えば、比較対照基準値（すなわち、上記キノリン誘導体による処置無し）の約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、100％、200％、300％、500％、1,000％、5,000％又はそれよりも多いものであることができる。
【０１０３】
特に、miR-124の上記測定された発現レベルは、上記対照基準値に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、好ましくは少なくとも６倍、好ましくは少なくとも８倍、より好ましくは少なくとも１０倍、増加されていうる。
【０１０４】
本発明の上記使用及び方法は、単離された生物学的サンプルにおいてmiR-124の発現レベルを測定することを含みうる。任意の適切なサンプルが、上記miR-124バイオマーカーを評価する為に使用されうる。
【０１０５】
特に、本発明に適している生物学的サンプルは、生体液、例えば血液、血漿若しくは血清、唾液、間質液、又は尿サンプル；細胞サンプル、例えば細胞培養、細胞株、又はPBMCサンプル、組織生検、例えば口腔組織、胃腸組織、皮膚、口腔粘膜サンプル、又は臨床試験からの複数のサンプルでありうる。上記サンプルは、粗試料であることができ、又は、保存、処理又は測定の前に、様々な程度に精製されることができる。
【０１０６】
本発明の上記使用及び方法の為に生物学的サンプルを集める工程は、本発明を実行する前に実行され、且つ、本発明に従う使用方法又は方法の工程でない。
【０１０７】
miRNA評価のためのサンプルは、任意の所望の時間間隔中に取得されることができる。例えば、サンプルは、毎時間、一日二回、毎日、毎週、毎月、隔月、毎年などで採取されることができる。当該サンプルは、迅速に試験されることができ、又は後の試験の為に保存されることができる。
【０１０８】
上記サンプルは、試験前に精製されることができる。幾つかの実施態様において、上記miR-124は、試験前に細胞内容物から分離されることができる。さらに、上記miR-124分子は、所望であれば上記サンプル中のmRNAの残りから分離されることができる。例えば、上記miR-124は、試験前に寸法違いに基づいてmRNAから分離されることができる。
【０１０９】
試験された生物学的サンプルにおけるmiR-124の上記測定された発現レベルを比較する為に使用されるべき対照基準値が、対照サンプルから得られる。
【０１１０】
対照サンプルは、様々な起源から採取されることができる。幾つかの実施態様において、対照サンプルが処置前に又は疾病の存在前に患者から採取される（例えば、記録の血液サンプル）。他の実施態様において、上記対照サンプルは、集団の通常の、非疾病のメンバーのセットから採取されます。他の実施態様において、細胞アッセイは、例えば上記試験化合物で処置されていない、又は参照化合物、例えば8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン、で処置されている対照細胞培養物上で実行されることができる。
【０１１１】
一つの実施態様に従うと、患者におけるウィルス感染の決定又は監視について、対照基準値が、そのような状態に患わないことが知られている個体又は個体のグループから得られる単離された生物学的サンプルから得られうる。
【０１１２】
他の実施態様に従うと、患者内にウィルス感染の処置の有効性の決定又は監視について、対照基準値は、そのような状態に患わないことが知られており且つ決定又は監視されるべき処置の有効性を受け取らない個体又は個体のグループから得られる単離された生物学的サンプルから得られうる。代替的に、対照基準値は、ウィルス感染に患う患者から得られ且つ決定又は監視されるべき処置の有効性を受け取る単離された生物学的サンプルから得られ得、当該単離されたサンプルは上記処置の投与前に患者から採取される。
【０１１３】
多数の方法が、上記miR-124バイオマーカーの存在又は発現レベルを測定する為に当業者に利用可能である。
【０１１４】
例えば、核酸アッセイ又はアレイは、サンプル中のmiR-124の存在及び／又は発現レベルを評価する為に使用されることができる。
【０１１５】
上記miR-124の配列は、サンプル中の上記miR-124バイオマーカーを検出する為の種々の核酸アッセイ、例えばそれらに限定されないがノーザンブロット法及びPCRに基づく方法(例えば、リアル−タイム逆転写-PCR又はqRT-PCR)において使用されるべき相補的プローブ又はプライマーとして作用する対応するヌクレオチドを調製する為に使用されうる。方法、例えばqRT-PCR、が、サンプル中のmiRNAの量を正確に数値化する為に使用されうる。
【０１１６】
本発明に従うセンス及びアンチセンスプローブ又はプライマーは、当業者に知られている全ての工程、特にSambrook  et  al.  (Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，3rd  ED.，2001,  Cold  Spring  Harbour,  N.  Y.)に記載されているそれら、を用いて得られうる。
【０１１７】
RNA又はDNAの検出及び数量化に関連する方法が、当分野において周知である。当業者は例えば、Wang  et  al.  (1989,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  Vol.  86：917〜921)、Wong  et  al.  (2005,  Bio  Techniques,  Vol.  39(1)：75〜85)、Nolan  et  al.  (2006,  Nat  Protoc,  Vol.  1(3)：1559-1582)、及びKlinck  et  al.  (2008,  Cancer  Research,  Vol.  68：657〜663)を、又はBustin  (2000,  Journal  of  Molecular  Endocrinology,  Vol.  25：169〜193)によって発行された一般的な評論を参照しうる。
【０１１８】
一つの実施態様において、核酸の検出及び数値化の為の方法は、核酸濃度が上記核酸に結合するリガンド、例えば染料、の蛍光強度を測定することによって評価されるところの蛍光染料に基づく方法でありうる。蛍光染料は、当分野において周知である。
【０１１９】
代替的に、上記核酸は、分光光度計を用いて数値化されうる。
【０１２０】
他の実施態様において、核酸の検出及び数値化の為の方法は、ハイブリダイゼーションに基づく方法でありうる。当該ハイブリダイゼーションに基づく方法は、PCR及び定量PCR(qRT-PCR又はq-PCR)技術又は逆転写酵素／ポリメラーゼに基づく技術を包含しうる。有利的に、上記方法は、シークエンシング工程を含むか又は当該工程をさらに組み合わされうる。
【０１２１】
それら方法は、(i)細胞mRNAの抽出の工程、(ii)逆転写酵素を用いてmRNAのDNAへの逆転写の工程、及び前の工程で得られたDNAからのDNA増幅の工程を含みうる。通常、同じサンプルから出発すると、下記核酸が増幅される：(a)ターゲットmRNAの逆転写工程後に得られるDNA及び(b)細胞によって構成的に且つ常に発現されるmRNA、例えば遺伝子MRPL19、PUM1及びGADPHによってコードされたRNA、の逆転写後に得られる一つのDNA又は複数のDNA(≪ハウスキーピング遺伝子≫)。
【０１２２】
増幅されたDNAが、電気泳動による分離、そしてDNAバンドの測定後に定量されることができる。ターゲットmRNA(１又は複数)に関連する結果が、≪ハウスキーピング≫遺伝子によってコードされるmRNAと比較して相対単位として表される。幾つかの実施態様において、増幅されたDNAの分離の工程は、濃度測定でそれらのバンド中に含まれるDNAの数量化の前に、アガロースゲル電気泳動、その次に臭化エチジウムでのDNAバンドの発色化後に達成される。他の実施形態において、人は、レーザビームを用いて上記放出されたシグナルの数量化の前に、増幅されたDNAがキャピラリー電気泳動によって分離されるマイクロチャンネルデバイスを使用しうる。そのようなデバイスは、会社Caliper  LifeSciences  (Hopkinton,  MA,  USA)によって市販されている例えば≪GX≫シリーズからのLabChip(登録商標)でありうる。
【０１２３】
qRT-PCRによって得られる定量的結果はときどき、定性的データよりも多くの情報であることができ、且つ、アッセイ標準及び品質管理を簡素化することができる。従って、幾つかの実施態様において、qRT-PCRに基づくアッセイは、細胞に基づくアッセイの間に、miRNAレベルを測定する為に有用であることができる。上記qRT-PCR方法はまた、患者治療を監視する際に有用でありうる。市販の入手可能なqRT-PCRに基づく方法は、(例えば、TaqmanR  Array(商標))である。
【０１２４】
任意の適切なアッセイプラットフォームが、サンプルにおける上記miRNAの発現又は存在を決定する為に使用されることができる。例えば、アッセイは、計深棒(dipstick)、膜、チップ、ディスク、試験紙(test  strip)、フィルター、ミクロスフェア、スライド、マルチウェルプレート、又は光ファイバーの形態でありうる。アッセイシステムは、上記miRNAに対応するオリゴヌクレオチドが付着されている固体指示体を有しうる。上記固体支持体は例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、ガラス、膜、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖類、キャピラリー、フィルム、プレート、又はスライドを含みうる。アッセイ成分は、miRNAを検出する為のキットとして一緒に調製され、そして包装されることができる。
【０１２５】
幾つかの実施態様において、生物学的サンプルにおいてキノリン誘導体又は薬物候補活性について試験する為のオリゴヌクレオチドアレイが、調製され又は購入されることができる。アレイは典型的に、固体支持体及び当該支持体を接触する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、上記オリゴヌクレオチドは、上記miR-124バイオマーカーの少なくとも一部に対応する。幾つかの実施態様において、上記miR-124バイオマーカーの上記部分は、少なくとも5、10、15、20又はそれ以上の塩基を含む。
【０１２６】
一つの実施態様に従うと、miR-124の上記存在又は発現は、バイオマーカーとしてまた使用される他のmiRNAと組み合わせてアッセイされうる。そのような実施形態において、アレイは、miRNA-124を含む、サンプル中の複数のmiRNAの発現又は存在を評価する為に使用されることができる。一般に、上記方法は、下記工程を含む：a)特異的結合が生じるのに十分な条件下でプローブ・セットを含むアレイで上記サンプルを接触すること；及びb）上記アレイを試験して何らかの検出可能なラベルの存在を検出し、それによって上記サンプル中の個々のターゲットmiRNAの量を評価すること。発現アレイの使用は、所定のサンプルについてのmiRNA発現プロファイルを得ることを許す。
【０１２７】
アッセイ又はmiRNAをアッセイする為のアレイを調製する方法は、当業者に周知であり、本明細書において詳細に述べられる必要は無い。
【０１２８】
核酸アレイは、生物学的サンプルにおけるmiRNAの存在又は差次的発現を検出する為に使用されることができる。ポリヌクレオチドアレイ(例えば、DNA又はRNAアレイ)は典型的に、支持体上で所定の構成で配置される通常異なる配列ポリヌクレオチド(「捕捉剤」)の領域を含む。上記アレイは、これらの領域（ときどき、「アレイフィーチャ」と言及される）がアレイの上記支持体上で異なる所定の場所（「アドレス」）を有するという点で「アドレス可能」である。上記アレイ上での特定の所定の場所（すなわち、「アドレス」）での上記領域(すなわち、上記アレイの「フィーチャ」又は「スポット」)が、特定のmiRNAターゲットを検出するだろう。上記ポリヌクレオチドアレイは典型的に、特定の様式において上記支持体上で以前に得られたポリヌクレオチドを置くことによって又は上記支持体上で上記ポリヌクレオチドのイン・シチュー合成において特異的な部位によってのいずれかで平面の支持体上で作られる。miRNA発現を検出する為のアレイが、プリカーサー単位(例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸モノマー)又は予め合成された捕捉剤のいずれかで置くとによって(例えば、接触に若しくはジェットに基づく方法又はフォトリソグラフィーによって)作られることができる。上記支持体上に上記ポリヌクレオチド捕捉剤を置いた後に、上記支持体は典型的に処置され(例えば、洗浄されそしてブロックされるなど)、そして使用前に保存される。
【０１２９】
miRNA発現を検出する為のアレイは、少なくとも２、３、４又は５の異なるサブジェクト(subject)プローブを有する。しかしながら、ある実施態様において、サブジェクトアレイは、miRNAの対応する数を検出することができる、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、又は少なくとも1,000、又はそれよりも多いプローブを有するプローブ・セットを包含しうる。幾つかの実施態様において、上記サブジェクトアレイは、有機体の上記識別されたmiRNAの少なくとも一部又は全部を検出する為のプローブを含みうるか、又は複数の有機体からのオーソロガス(orthologous)プローブを含みうる。
【０１３０】
核酸アレイが、サンプル中のmiRNAの特異的な結合を促進する条件下でmiRNA解析物を含むサンプル又はラベル付けされたサンプルを上記アレイ上に存在する１以上の上記捕捉剤に接触されて、観察された結合パターンを示しうる。この結合パターンは、上記アレイのインターロゲーションに応じて検出されることができる。例えば、上記サンプル中の上記ターゲットmiRNAは、適切なラベル（例えば、蛍光化合物）でラベル付けされることができ、次に当該ラベルが、上記アレイの上記サンプルへの暴露後に当該アレイ上で（例えば、上記蛍光パターンを観察することによって）正確に観察されることができる。上記観察された結合パターンは、上記サンプルのmiRNA成分の１以上の存在及び／又は濃度を表すことができる。
【０１３１】
miRNAの上記ラベル付けは、当業者に周知の方法を用いて、例えばDNAリガーゼ、ターミナル・トランスフェラーゼを用いて、又はRNAバックボーンをラベル付けすることによって実行されうる。幾つかの実施態様において、上記miRNAは、蛍光ラベルでラベル付けされうる。例示的な蛍光色素は、キサンテン色素、フルオレセイン色素、ローダミン色素、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、6  カルボキシ-2  l  ,4  l  ,7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、6  カルボキシ  4',  5'  ジクロロ  2',  7'  ジメトキシフルオレセイン(JOE又はJ)、N,N,N',N'  テトラメチル  6  カルボキシローダミン(TAMRA又はT)、6  カルボキシ  X  ローダミン(ROX又はR)、5  カルボキシローダミン  6G  (R6G5又はG5)、6  カルボキシローダミン  6G(R6G6又はG6)、及びローダミン  110；シアニン染料、例えばCy3、Cy5及びCy7染料；アレクサ(Alexa)染料、例えばAlexa-fluor-555；クマリン、ジエチルアミノクマリン、ウンベリフェロン、ベンズイミド色素、例えば例えばヘキスト(Hoechst)  33258；フェナントリジン色素、例えばテキサスレッド(Texas  Red)エチジウム色素；アクリジン染料；カルバゾール染料；フェノキサジン色素；ポルフィリン染料；ポリメチン色素、BODIPY色素、キノリン色素、ピレン、フルオレセインクロロトリアジニル、Rl  10、エオシン(Eosin)、JOE、R6G、テトラメチルローダミン、リサミン(Lissamine)、ROX、ナフトフルオレセイン(Naptho  fluorescein)などを含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
幾つかの実施態様において、免疫調節活性を評価する為のオリゴヌクレオチドアレイが調製されるか又は例えばAffymetrixから購入されることができる。上記アレイは、固体支持体及び当該支持体と接触する複数のオリゴヌクレオチドを含みうる。上記オリゴヌクレオチドは、上記固体支持体上の、特定の、アドレス可能な場所において存在しうる；それぞれは、細胞又は患者におけるキノリン誘導体又は薬物候補の処置に応じて異なって発現されうるmiRNA配列の少なくとも一部に対応する。上記miRNA配列は、少なくとも１つのmiR-124配列を含む。
【０１３３】
アレイが、miRNAを評価する為に使用される場合、典型的な方法は、1)表面結合サブジェクト・プローブを含む上記アレイを得ること；2)特定的な結合を提供する為に十分な条件下で、miRNAの集団の上記表面結合プローブへのハイブリダイゼーション、(3)ハイブリダイゼーション後の洗浄をして、上記ハイブリダイゼーションにおいて結合していない核酸を除去すすること；及び、（4）ハイブリダイゼーションされたmiRNAの検出の工程を含むことができる。これら工程及び使用の為のそれら条件のそれぞれにおいて使用される試薬は、特定の用途に依存して変わりうる。
【０１３４】
ハイブリダイゼーションは、所望のストリンジェンシーで異なりうる適切なハイブリダイゼーション条件下で実行されることができる。典型的な条件は、相補的結合メンバー間での、すなわち表面結合したサブジェクト・プローブとサンプル中の相補的miRNAとの間でのアレイ表面上でプローブ/ターゲット複合体を生産する為に十分である。或る実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられることができる。ハイブリダイゼーションは典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる。当分野において周知である標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、上記アレイ上のプローブへのサンプル中のターゲットmiRNAの特異的結合を提供する為に十分な条件下）は、サンプルを核酸配列にハイブリダイズするために使用される。温度、塩濃度、ポリヌクレオチド濃度、ハイブリダイゼーション時間、洗浄条件のストリンジェンシー、などを含む適切な条件の選択が、サンプルの起源、捕捉剤の同一性、予想される相補性の程度などを含む実験設計に依存し、且つ、当業者のルーチン的な実験の問題として決定されうる。一般に、核酸ハイブリダイゼーションの文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は典型的には、配列依存性であり、且つ異なる実験条件下で異なる。ハイブリダイゼーションは、約12〜約24時間の期間にわたって行われうる。上記洗浄条件のストリンジェンシーは、miRNA配列が、相補的捕捉剤に特異的にハイブリダイゼーションされる程度に影響を与えることができる。当業者は、代替的なしかし同等なハイブリダイゼーション及び洗浄条件が、同様のストリンジェンシーの条件を提供する為に利用されることができる。
【０１３５】
図示されている通り、一つの実施態様において、上記miRNA発現プロファイリング実験が、Affymetrix  Genechip  miRNA  Array  2.0を用いて及び取扱説明書に記載されたプロトコルを守って実行されうる。
【０１３６】
一つの特定の実施態様において、上記ハイブリダイゼーションは、GeneChip(登録商標)ハイブリダイゼーション、洗浄及び染色キット(Wash,  and  Stain  Kit)(Affymetrix  Ref.  #900720)を用いて実行されることができる。有利的には、上記ハイブリダイゼーションは、製造者の下記プロトコルに従うことによって実行される。
【０１３７】
上記miRNAハイブリダイゼーション手順の後、上記miRNAのアレイ表面結合ポリヌクレオチドは典型的に、結合していない核酸を除く為に洗浄される。洗浄は、任意の便利な洗浄プロトコルを用いて行われ得、上記洗浄条件は、会社Affymetrixによって販売される洗浄バッファー(Ref.  #900721及び#900722)を用いて実行されうる。次に、上記プローブへの上記ターゲットmiRNAのハイブリダイゼーションが、アレイを読むことの標準的な技術を用いて検出される。結果として得られたハイブリダイゼーションされた配列を読むことが、miRNA/プローブ結合複合体を検出する為に、例えば上記アレイを照らし、そして上記アレイの各フィーチャで得られた蛍光の位置及び強度を読むことによって達成されうる。
【０１３８】
miRNA-124
【０１３９】
マイクロRNA(miRNA)は、それらの同族のターゲットメッセンジャーRNAの発現又はmRNAのタンパク質生産物の翻訳における減少を引き起こす為に細胞の細胞質に作用することができる小さい、一本鎖非コードRNAである。成熟miRNAは典型的には、長さが約19〜23ヌクレオチドである。それらターゲットタンパク質の生成を阻害するmiRNAの能力は、細胞活動の多くのタイプ、例えば細胞運命決定、アポトーシス、分化、及び腫瘍形成、の調節をもたらす。
【０１４０】
miR-124は、最初に、マウスにおいてクローン化された。ヒトmiR-124プリカーサー(又はmiRN-124又はmiRNA-124又はマイクロRNA  124)がこれまでに同定化されており(Guo  et  al.,  PLoS  ONE,  2009,  4(11)：e7944)、それから３個がヒトにおいて存在する：hsa-miR-124-1、hsa-miR-124-2及びhsa-miR-124-3(配列ID  NO：1〜配列ID  NO：3)。
【０１４１】
上記miR-124マイクロRNAプリカーサーは、小さい、一本鎖非コードRNA分子である。上記成熟〜21  ヌクレオチドマイクロRNAが、ダイサー(Dicer)酵素によってヘアピンプリカーサー配列から処理される。上記成熟配列は、miR-124-3'について配列ID  NO：4，UAAGGCACGCGGUGAAUGCC 及びmiR-124-5'について配列ID  NO：5，CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU である。
【０１４２】
miRNA-124は優先的に脳において発現され、SCP1発現を下方制御することによって神経発生に寄与することができる。マウス神経細胞におけるmiR124の発現が、PTBP1のmRNAを直接的に標的とすることによって一般的スプライシングからニューロン特異的な選択的スプライシングへのスイッチを誘発する。miR-124は、これらmRNAのナンセンス変異依存分解機構(nonsense-mediated  decay)を導くPTBP1依存エクソンスキッピングを防止することによってニューロン特異的PTBP2及びGabbr1  mRNAの存在量を増大する。
【０１４３】
脊椎動物の神経系内の有糸分裂終了の時点で、細胞が多能性を失い且つ生涯に亘って持続するだろう安定な接続を展開することを始める場合に、ATP依存クロマチンリモデリング機構におけるスイッチが生じる。この遷移は、miR9*(miR9ステム-ループプリカーサーの反対側のアーム(arm)から処理されたmiRNA)及びmiR-124によるBAF53Aの抑制によって媒介されることができる。
【０１４４】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE：Experimental  autoimmune  encephalomyelitis）は、CNSにおける在住マクロファージの活性化に関連付けられた中枢神経系（CNS）若しくは小膠細胞(microglia)の炎症又は当該CNSへの末梢免疫細胞の浸潤によって特徴付けられる多発性硬化症のげっ歯類モデルである。miR-124は小膠細胞及び神経において高度に発現されることが見出されている。miR-124の発現は、EAEの間の活性化された小膠細胞において且つ培養物における活性化された小膠細胞において減少された。miR-124のトランスフェクションは骨髄由来マクロファージを不活性化し、及び、miR-124の静脈内投与は、病変の展開を阻害し且つEAEの3マウスモデルにおいてCNS炎症を減少させた。miR-124は、CEBPA-PU.1経路を介してマクロファージを不活性化することによって、小膠細胞休眠を促進することが見付けられた。
【０１４５】
ヒト線維芽細胞におけるmiR-124発現は、それらのニューロンへの転換を誘発することがまた実証されている。さらに、神経性転写因子  ASCL1及びMYT1Lの添加は、転換の速度及び上記転換されたニューロンの成熟を助長し、一方、上記のマイクロRNA無しでのこれら転写因子の発現は無効である。
【０１４６】
miR-124の存在又は発現レベルを測定するのに適している単離された核酸プローブは、miR-124に特異的にハイブリダイズすることが可能である核酸プローブ、例えばプリカーサー又は成熟miR-124、である。
【０１４７】
そのような核酸プローブは、18〜30のヌクレオチド、特に20〜27、好ましくは20〜25、好ましくは20、22又は25、より好ましくは約25のヌクレオチドを含みうる。先に示されている通り、そのような核酸プローブは、当分野において任意の公知の方法に従って調製されうる。
【０１４８】
所与のプローブ及び所与のターゲットについての最適なハイブリダイゼーション温度を予測する為の方法及び常とう手段が当分野において周知である。
【０１４９】
従って、当業者は、プローブのセットに、所与のターゲット配列に基づいて、及びハイブリダイゼーションの特定の条件で、最適なハイブリダイゼーション温度を容易に計算しうる。
【０１５０】
有利的に、上記プローブの最適のハイブリダイゼーション温度は、40°C〜60°C、より特には45°C〜55°Cであり、好ましくは約48°Cである。
【０１５１】
本発明のバイオマーカーへ本発明の核酸プローブをハイブリダイズする為に有用で或るバッファーの例として、人は、ハイブリダイゼーションバッファとして100mM  MES、1M  [Na+]、20mM  EDTA、0.01％  Tween-20を含むバッファー、非ストリンジェントな洗浄バッファーとして6X  SSPE、0.01％  Tween-20を含むバッファー、及びストリンジェントな洗浄バッファーとして100mM  MES、0.1M  [Na+]、0.01％  Tween-20を含むバッファー、を言及しうる。
【０１５２】
miR-124の存在又は発現レベルを測定する為に適している核酸プローブは例えば、配列ID  NO：6〜配列ID  NO：87から成る群から選択される核酸配列で構成される核酸プローブでありうる。
【０１５３】
上記miR-124-1プリカーサーの存在又は発現レベルを測定する為に適している核酸プローブは例えば、配列ID  NO：6〜配列ID  NO：34、配列ID  NO  86及び配列ID  NO  87から成る群から選択される核酸配列で構成される核酸プローブでありうる。
【０１５４】
上記miR-124-2プリカーサーの存在又は発現レベルを測定する為に適している核酸プローブは例えば、配列ID  NO：35〜配列ID  NO：65、配列ID  NO  86及び配列ID  NO  87から成る群から選択される核酸配列で構成される核酸プローブでありうる。
【０１５５】
上記miR-124-3プリカーサーの存在又は発現レベルを測定する為に適している核酸プローブは例えば、配列ID  NO：66〜配列ID  NO：85、配列ID  NO  86及び配列ID  NO  87から成る群から選択される核酸配列で構成される核酸プローブでありうる。
【０１５６】
成熟miR-124の存在又は発現レベルを測定する為に適している核酸プローブは例えば、配列ID  NO  86及び配列ID  NO  87から成る群から選択される核酸配列で構成される核酸プローブでありうる。
【０１５７】
キノリン誘導体
【０１５８】
本発明の為に有用な上記キノリン誘導体は、ウィルス感染を処置する為に有効なキノリン誘導体、例えば国際公開第WO2010/143169号に記載されているそれら、でありうる。
【０１５９】
特に、本発明の為に有用な上記キノリン誘導体は、下記一般式(I)によって表されうるキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つである：
【０１６０】
【化６】
0006607568.tif 000007
【０１６１】
ここで、
−nは1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；R1及びR2が独立に水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；(C1〜C3)フルオロアルコキシ基；-NO2基；フェノキシ基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であり、
−R”は、水素原子又は(C1〜C4)アルキル基である。
【０１６２】
一つの実施態様に従うと、R'及びR"が好ましくは、水素原子である。
【０１６３】
他の実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、Rが独立に、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；R1及びR2が独立に水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；(C1〜C3)フルオロアルコキシ基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基であるところの式(I)でありうる。
【０１６４】
他の実施態様に従うと、Rが独立に、フッ素原子若しくは塩素原子、又はメチル基若しくはエチル基、-NH2基、メトキシ基若しくはエトキシ基；及び(C1〜C3)フルオロアルコキシ基から選択される基で表される。
【０１６５】
他の実施態様に従うと、nは好ましくは、1である。
【０１６６】
好ましい実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、nが1であり、Rが(C1〜C3)フルオロアルコキシ基であり、並びにR'及びR"が各水素原子であるところの式(I)でありうる。
【０１６７】
好ましい実施態様に従うと、Rは、少なくとも１つのフッ素原子で置換されたメトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基である。好ましくは、Rは、モノ、ジ、又はリフルオロメトキシ基である。
【０１６８】
代替的に、本発明の為に有用な上記キノリン誘導体は、式(II)のキノリン誘導体によって表されうるキノリン誘導体又はその医薬的に許容可能な塩の一つである：
【０１６９】
【化７】
0006607568.tif 000008
【０１７０】
ここで、
−nは1又は2であり、且つRは独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基；-CN基；水酸基；-COOR1基；(C1〜C3)フルオロアルキル基；-NO2基；R1及びR2が水素原子又は(C1〜C3)アルキル基である-NR1R2基；及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基を表し、
−R’は、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C4)アルキル基及び(C1〜C4)アルコキシ基から選択される基である。
【０１７１】
一つの実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、R'及びR"が好ましくは水素原子であるところの式(II)でありうる。
【０１７２】
他の実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、Rが独立に、水素原子、ハロゲン原子、又は(C1〜C3)アルキル基、(C1〜C3)フルオロアルキル基、水酸基、-CN基、COOH基及び(C1〜C3)アルコキシ基から選択される基であるところの式(II)でありうる。
【０１７３】
他の実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、Rが独立に、水素原子、ハロゲン原子、-CN基、(C1〜C3)アルキル基；(C1〜C3)フルオロアルキル基、及び水酸基を表すところの式(II)でありうる。他の実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、Rが独立に、(C1〜C3)フルオロアルキル基であるところの式(II)でありうる。
【０１７４】
他の実施態様に従うと、nは好ましくは、1である。
【０１７５】
好ましい実施態様に従うと、本発明に適しているキノリン誘導体は、nが1であり、Rが(C1〜C3)フルオロアルキル基であり、並びにR'及びR"が各水素原子であるところの式(II)でありうる。
【０１７６】
従って、上記実施態様に従うと、キノリン誘導体は下記式によって表されうる：
【０１７７】
【化８】
0006607568.tif 000009
【０１７８】
一つの実施態様に従うと、本発明の為に有用なキノリン誘導体又はその塩は、下記からなる基から選択されうる：
【０１７９】
【化９】
0006607568.tif 000010
【０１８０】
本発明のキノリン誘導体、より特には本発明に従う一般式(I)又は(II)を有する化合物、の医薬的に許容可能な塩は、一般式(I)又は(II)を有する化合物とアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウムとの塩（有機アンモニウム塩基を用いて得られた塩を含む）、及び、一般式(I)又は(II)を有する化合物と有機酸又は無機酸との塩でありうる。
【０１８１】
本発明により特に適している塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの塩、第四級アンモニウム塩（例えば、テトラメチルアンモニウム又はテトラエチルアンモニウム）、アンモニア及び医薬的に許容可能な有機アミン（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン及びトリス（2-ヒドロキシエチル）アミン）を伴う付加塩でありうる。
【０１８２】
本発明のキノリン誘導体の塩、より特には一般式(I)又は(II)を有する化合物の塩、及び本発明に適している無機酸の塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸又はリン酸で得られうる。
【０１８３】
本発明のキノリン誘導体の塩、より特には一般式(I)又は(II)を有する化合物の塩、及び本発明に適している有機酸の塩は、カルボン酸及びスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はp-トルエンスルホン酸で得られうる。
【０１８４】
好ましい実施態様に従うと、本発明の為に有用な上記キノリン誘導体は、下記式によって表されうる、8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミンである：
【０１８５】
【化１０】
0006607568.tif 000011
【０１８６】
上記本発明に適しているキノリン誘導体は、国際公開第WO2010/143169号に記載されている通りに調製されうる。
【０１８７】
上記処置は、キノリン誘導体の経口又は非経口の投与であることができる。投与及び投薬計画の適切な方式は、国際公開第WO2010/143169号に記載されている。
【０１８８】
投与の任意の経路が使用されうる。例えば、キノリン誘導体は、経口、非経口、静脈内、経皮、筋肉内、直腸、舌下、粘膜、鼻又は他の手段によって投与されることができる。加えて、キノリン誘導体は、医薬組成物の形態及び/又は単位剤形で投与されることができる。
【０１８９】
適切な剤形は、カプセル剤、錠剤（急速な溶解錠剤及び遅延放出錠剤を含む）、粉末、シロップ、経口懸濁液及び非経口投与のための溶液を含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
本明細書において提供される実施例は単に例示的であることが意図されており、当業者は、日常の実験にすぎないもの、特定の化合物、材料及び手順の多数の等価物を用いて認識し又は確認することができるだろう。全てのそのような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、且つ添付の特許請求の範囲によって包含される。
【実施例１】
【０１９１】
実施例１
【０１９２】
8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミンを用いたmiRNA発現の変化
【０１９３】
材料及び方法
【０１９４】
上記キノリン誘導体、8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン、によるHIV-1阻害の文脈において、上記処置が宿主miRNA発現を変化することができるかを調べられた。
【０１９５】
その目的の為に、5人の健康なドナーの末梢血単核細胞(PBMCs：Peripheral  blood  mononuclear  cells)が、末梢血単核細胞（PBMC）をフィコール(FICOLL)勾配遠心分離での遠心分離によって単離されている。次に、上記細胞が、10％ウシ胎仔血清（FCS:fetal  calf  serum）(Thermo  Fischer  Ref  SV30160.03)、1000  U/mLのIL2(Peprotech  Ref  200-02)及び5  μg/mLのPHA(Roche  ref  1249738)を補充されたRPMI  Glutamax培地(Life  Technologies  Ref  61870-010)において1x106細胞/mLの濃度まで37°C、5％  CO2で培養された。３日後、細胞がプールされ、そして、10％  ウシ胎仔血清(FCS)、1000  U/mLのIL-2を補充されたRPMI  Glutamax培地において1x106細胞/mLの濃度まで再懸濁され、そして1.2  mL/ウェルを有する12ウェルプレート(Falcon  Ref  353043)に分配された(１条件当たり4ウェル)。
【０１９６】
HIV-1感染が、1  ngのAda-M  R5  HIV株/ウェルで実行された。細胞が、8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミンの60  μM溶液の1.2  mL/ウェルで、又は0.12％  DMSO  (陰性対照として、Sigma  Ref  D4818)で、6日間処置された
【０１９７】
次に、細胞が条件によってプールされ、遠心分離され、そしてペレットがQiagenからのmiRNeasyキット抽出(Qiagen  Ref  217004)の為の700  μLのQiazol溶解バッファー(Qiagen  Ref  217004)において再懸濁された。RNAは、製造業者の指示書に従って抽出された。抽出されたRNAの質と量は、Agilent  Bioanalyzer  2100及びNanodrop  spectrophotometry  ND-1000を用いて制御された。平均RIN値は、8.84(7.2〜9.7)であった。１サンプル当たり90ngの全RNAの量が、FlashTag(商標)  Biotin  HSR  RNA  Labeling  Kit  (901911)を用いてラベル付けされ、そしてAffymetrix  Genechip  miRNA  Array  2.0.  (901753)に一晩ハイブリダイズされた。上記アレイが、標準的なAffymetrixプロトコルを用いて洗浄され且つ染色され、そしてAffymetrix  Scannerを用いてスキャンニングされた。品質コントロールが、AffymetrixからのExpression  Console  metrics(version  1.2)を用いて実行された。
【０１９８】
データが、Expression  Console「RMA+DABG」正規化方法を用いて正規化され、そして対応するDABG  P値が0.05以下であった場合に、miRNAが発現されたと考えられた。一つの実施態様において、miRNAがこの条件のPBMCドナーの少なくとも75％において発現された場合に、miRNAが発現されたと考えられた。ペアのスチューデントのt検定(paired  Student’s  t-test)は、倍率変化が1.5以上であり且つt検定P値が0.05以下であった場合に、2つの条件の間で異なって発現されたと考えられる発現されたmiRNAに適用された。
【０１９９】
結果
【０２００】
感染した細胞と感染していない細胞との間のmiRNA発現の比較が、HIV-1感染に起因する複数の変更(上方又は下方の制御)を強調した。特に、miRNA-124がHIV感染されたPBMCにおいて下方制御されたことが観察される。
【０２０１】
対照的に、8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン処置された又は処置されていないHIV感染されたPBMCとの比較が、一つのみのmiRNA、miR-124、を強調し、その発現は処置下で確信をもって増加された(約13倍)。
【０２０２】
従って、miR-124は、AIDS患者において抗ウィルス薬として本発明に従うキノリン誘導体、特に8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン、の有効性を監視する為の関連バイオマーカーであるとして検証される。
【０２０３】
実施例２
【０２０４】
miR-124  3pの発現でのキノリン誘導体の有効性の評価
【０２０５】
HIV-1感染の文脈においてmi-RNA発現の評価を提供する実施例１に加えて、実施例２は、HIV-1の非存在下でのmiR-124発現の変化を評価する。スクリーニング方法は、キノリン誘導体及び既知の抗レトロウィルス薬、例えばマラビロク(Maraviroc)、エファビレンツ(Efavirenz)、ダルナビル(Darunavir)及びアジドチミジン(azidothymidine)(AZT)、のセットを評価する為に試験された。
【０２０６】
材料及び方法
【０２０７】
FICOLL(商標)グラジエントを用いてのPBMCの抽出
【０２０８】
その目的の為に、４人の健康なドナーの末梢血単核細胞(PBMCs：Peripheral  blood  mononuclear  cells)が、標準プロトコルに従ってFICOLL(商標)グラジエントでの遠心分離によって単離された。
【０２０９】
簡単に述べると、60〜70  mLのバフィーコート(buffy-coat)が175  cm2のフラスコ中に注がれ、そして容積が、約5倍の希釈のバフィーコートを得る為に、PBSを用いて300  mLに調整される。次に、38  mLの希釈されたバフィーコートのが、周囲温度で12  mLのFICOLL(商標)(Histopack-1077)を含む50  mLのFalcon(商標)チューブに加えられる。調製物が、周囲温度で30分間、1600  rpm  (=515  rcf)で遠心分離される。リンパ球のリングは、トランスファーピペット(Pastette(登録商標))を備えているFalcon(商標)チューブから回収され、次に、上清が透明になるまで、周囲温度で10分間、1200  rpm  (=290  rcf)で洗浄される。
【０２１０】
次に、上記細胞が、10％ウシ胎仔血清(FCS)(Thermo  Fischer  Ref  SV30160.03)を補充された且つ活性無しのRPMI  Glutamax培地(Life  Technologies  Ref  61870-010)において1,5x106  細胞/mLの濃度まで37℃で再懸濁される。細胞が、5％  CO2下、48時間、37℃でインキュベーションされる。
【０２１１】
スクリーニングされた分子での細胞の処置
【０２１２】
６個のウェルプレートが、スクリーニングの為に使用される。3.106  細胞/4  mlを含む各ウェル内に、10％ウシ胎仔血清及び40  U/mLのIL-2  (Peprotech  Ref  200-02)を補充されたRPMIが、スクリーニングされた分子に添加される。100％  DMSO  (0,8  μL)が上記ウェルに添加され、そして陰性対照として試験される。
【０２１３】
各試験された条件が本明細書の下記に記載された通りに設定され、そして最終の対応する容量がウェル内において適切に調製される：
【０２１４】
1)キノリン誘導体：100％  DMSO  (5  μM及び最終容量0,4  μL)中、(8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]キノリン-2-アミン及び8-クロロ-N-[4-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-イル]キノリン-2-アミン−個々に、化合物1及び8)：
【０２１５】
【化１１】
0006607568.tif 000012
【０２１６】
2)他の抗レトロウィルス薬：
マラビロク、エファビレンツ、ダルナビル、AZT(全てについて10  μM、最終容量0,8  μL)
【０２１７】
上記ウェルが、5％  CO2下、37°Cで3日間インキュベーションされる。培地は、標準的なプロトコル（3日目）に従って変更される。簡単に述べると、プレートが、1200  rpmで5分間遠心分離され、3mLの上清が除去される。次に、10％ウシ胎仔血清及び40  U/mLのIL-2を補充された3  mLのRPMIが、陰性対照として100％  DMSO中50  mMで又は100％  DMSOの0,6  μLでスクリーニングされた分子の貯蔵液の0,6  μL(10  μM最終濃度について)又は0,3  μL  (5  μM最終濃度について)で添加される。
【０２１８】
miRNAの抽出(6日目)
【０２１９】
細胞が、1200  rpmで5分間遠心分離され、15  mLのFalcon(商標)チューブ内に回収され、次に10  mL  PBS内で洗浄され、さらに1200  rpmで5分間遠心分離される。次に、細胞が、1  mL  PBS内に再懸濁され、そして計数される。
【０２２０】
6x106  細胞が回収され、そして1200  rpmで5分間遠心分離された。細胞ペレットが、Macherey  Nagel  Nucleospin(登録商標)  miRNA抽出キット(Macherey  Nagel  Ref  740971)からの300  μLのML溶解バッファー中で溶解され、そしてさらに−20°Cで保存される。
【０２２１】
スパイク−イン対照(spike-in  control)(QIAGEN)(登録商標)からのCe_miR-39−reference  219610、配列  5’  UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG  3’)の5  μLの2x108  コピー/μLが、各サンプルについて添加される。上記miRNA抽出は、RNAの50  μL及びmiRNAの30  μLの溶出容量を用いてMacherey  Nagel  Nucleospin(登録商標)  miRNA  抽出キットからのプロトコルを用いて達成され、そしてさらに−20°Cで保存される。
【０２２２】
miRNAの逆転写(6日目)
【０２２３】
逆転写工程が、miScript  HiSpecバッファーを用いてQIAGEN(著作権)からのmiScript  RT  II  逆転写(RT：reverse  transcription)キットを用いて12  μLのmiRNAについて行われ、そしてさらに−20°Cで保存される。
【０２２４】
miRNAの定量PCR(6日目)
【０２２５】
定量PCR工程が、製造者のプロトコルに従って、QIAGEN(著作権)  miScript  SYBR(登録商標)  Green  PCRキット及びmiScript  Primer  Assaysを用いて達成される。
【０２２６】
【表１】
0006607568.tif 000013
【０２２７】
上記反応は、LightCycler(登録商標)  380  Roche  Real-Time  PCR  systemでの製造者のプロトコルに従って、384ウェルプレートにおいて３回繰り返される。サイクリング条件がまた、製造者のプロトコルに従って設定される：
【０２２８】
【表２】
0006607568.tif 000014
【０２２９】
qPCRの相対定量及び絶対定量は当分野において知られている技術であり、及び、以下においてさらに詳述される通りに達成されることができる。
【０２３０】
1)相対定量
miScriptプライマー・アッセイ  (Hs_miR-124a、Hs_miR-26a及びHs_miR-191)を用いて、上記miR-124  qPCR  (Hs_miR-124a)に関してH2O中1/10までの又は参照/ハウスキーピング遺伝子qPCR  (Hs_miR-26a及びHs_miR-191)に関して1/100までの希釈液から。
【０２３１】
分析は、miR-124についての３回分からの交差点(Cp)値の平均とmiR-26a及びmiR-191についての３回分の平均の平均とを用いて効率補正(2-ΔΔCp)無しに相対定量モデルを用いて達成される。
【０２３２】
2)絶対定量
miScriptプライマー・アッセイ  (Hs_miR-124a及びCe_miR-39)を用いて、上記miR-124  qPCRに関してH2O中1/10までの希釈液から。検量線は、標準的なプロトコルに従って達成される。分析は、miR-124についての３回分の平均をmiR-39についての３回分の平均で正規化することによって、そしてさらに細胞の数で正規化することによって達成される。
【０２３３】
結果
【０２３４】
結果は、全ての分子について相対定量と絶対定量との間の良好な一致を示す。DMSO対照サンプルは、１の倍数変化を有し、miR-124a発現における変化なしを意味する。上記試験された全てのキノリン誘導体は、miR-124の発現の10倍に対応するmiR-124の変化を示す。
【０２３５】
比較において、他の抗レトロウィルス薬は、miR-124の発現の有意な変化を誘発しない。
【０２３６】
従って、この実施例は、上記miR-124が、ウィルス感染を予防し及び／又は治療する際に有効と考えられる薬物候補又はワクチン候補をスクリーニングする為の適切なバイオマーカーを示す。それは、本発明のキノリン誘導体の活性を評価する為に特にまた有用である。
【配列表】
0006607568000001.app