(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアセチルCoA合成酵素、アセトアセチルCoAレダクターゼ、及びPHA重合酵素が導入された藻類。
【請求項２】
アセトアセチルCoA合成酵素がnphT7である、請求項１に記載の藻類。
【請求項３】
アセトアセチルCoAレダクターゼがphaBである、請求項１に記載の藻類。
【請求項４】
PHA重合酵素がphaCである、請求項１に記載の藻類。
【請求項５】
藻類がラン藻である、請求項１から４のいずれかに記載の藻類。
【請求項６】
アセトアセチルCoA合成酵素を藻類に導入することを含む、藻類における光合成によるポリヒドロキシアルカン酸の生産能を増強する方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の藻類を光合成可能な条件下で培養することを含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項８】
炭素源の施用下で培養する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
炭素源が二酸化炭素である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
炭素源が酢酸である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
空気交換制限条件下で培養を行う、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトアセチルCoA合成酵素が導入された藻類及びポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の製造における当該藻類の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラン藻は、地球上で最古の光合成生物グループの一つであり、今日我々が呼吸している酸素大気の進化において重要な役割を担ってきた（非特許文献１）。現代でもラン藻は、地球全体の炭素のリサイクリング、窒素サイクル、及び、最も重要なことには、大気の組成の維持において中心的な役割を演じている（非特許文献２、３）。ラン藻は、太陽エネルギーを利用して二酸化炭素をバイオマスに固定するため、様々な化学品や生物燃料の理想的な生産者であると考えられている。自然環境下では、窒素濃度の変動が絶えず生じており、微生物は様々な炭素やエネルギー貯蔵化合物を蓄積することによって栄養飢餓に対応している（非特許文献４）。これらの貯蔵ポリマー、特にPHAの研究は、近年、石油化学プラスチックによって生じた廃棄物処理問題に対処する試みにおいて、かなりの興味を引いてきた（非特許文献５）。【０００３】
現在、PHAの産業生産のために利用されている主要な生物学的プロセスは、従属栄養細菌の発酵である。にもかかわらず、汎用ポリマーとしてのPHAの経済的実用性は、発酵プロセスの間の高価な炭素物質やその他の必要物質による高い生産コストによって制限されている。相当な努力が、より費用効果の高いPHA生産プロセスの研究に注がれてきた（非特許文献６）。興味深くかつ将来性のあるアプローチは、PHA生産の宿主としての光合成ラン藻の利用である。“微生物工場”としてのラン藻は、大気からの二酸化炭素を光合成によって直接的に高分子量PHAに固定することができる。光独立栄養であることに加え、ラン藻は、増殖に最小限の栄養しか要求しないため、炭素源と複合的な増殖培地のコストを削減することができる（非特許文献７）。従って、ラン藻の利用は、この環境に優しいポリマーの生産のために、費用効果的かつ持続可能なアプローチを提供する。【０００４】
ラン藻におけるPHAの存在は、Carrによって最初に報告された。この報告では、ポリ(3-ヒドロキシブチレート)（略称：P(3HB)）のクロトン酸への酸加水分解とそれに続く加水分解産物のUVスペクトル測定に基づき、クロログレア  フリツキ（Chloroglea  fritschii）においてPHAを分析した（非特許文献８）。その後、多くの研究が、スイゼンジノリ（Aphanothece  sp.）（非特許文献９）、オリラトリア  リモサ（Oscillatoria  limosa）（非特許文献１０）、スピルリナ（Spirulina）属のいくつかの種（非特許文献１１、１２）、及び好熱性株シネココッカス（Synechococcus  sp.）MA19（非特許文献１３）を含むいくつかの他のラン藻においてPHAの存在を証明してきた。これまでラン藻は、3-ヒドロキシブチレート(3HB)及び／又は3-ヒドロキシバレレート(3HV)のモノマーのみを含むPHAの生産能力によって特徴づけられている（非特許文献９、１０、１４）。ラン藻におけるPHAの産生に関する多くの報告があるが、これらの研究の大部分は、ラン藻におけるPHA蓄積の生理学あるいは発酵の観点を探求したものである。【０００５】
ラン藻におけるPHA合成の生化学的及び分子的な基礎はあまり理解されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rasmussen  B  et  al.  (2008)  Nature  455:  1101-1104
【非特許文献２】Tian  F,  et  al.  (2005)  Science  308:  1014-1017
【非特許文献３】Raven  JA,  Falkowski  PG  (1999)  Plant  Cell  Environ  22:  741-755
【非特許文献４】Madison  LL,  Huisman  GW  (1999)  Microbiol  Mol  Biol  R  63:  21-53
【非特許文献５】Sudesh  K,  Iwata  T  (2008)  Soil,  Air,  Water  36:  433-442
【非特許文献６】Chen  G-Q  (2009)  Chem  Soc  Rev  38:  2434-2446
【非特許文献７】Panda  B,  Mallick  N  (2007)  Lett  Appl  Microbiol  44:  194-198
【非特許文献８】Carr  NG  (1966)  Biochim  Biophys  Acta  120:  308-310
【非特許文献９】Capon  RJ  et  al.  (1983)  Phytochemistry  22:  1181-1184
【非特許文献１０】Stal  LJ  et  al.  (1990)  Springer.  pp.  435-438
【非特許文献１１】Campbell  J  et  al.  (1982)  J  Bacteriol  149:  361-363
【非特許文献１２】Vincenzini  M  et  al.  (1990)  J  Bacteriol  172:  2791-2792
【非特許文献１３】Miyake  M  et  al.  (1996)  J  Ferment  Bioeng  82:  512-514
【非特許文献１４】Stal  LJ  (1992)  FEMS  Microbiol  Rev  103:  169-180
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、藻類を利用して高効率かつ廉価でポリヒドロキシアルカン酸を製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
藻類は、CO2を炭素源とした光合成により、他の栄養源を必要とせずに生育することができる。その中でも、ラン藻（シネコシティス株PCC6803）は、ゲノム情報の利用可能性（Kaneko  T  et  al.  (1996)  DNA  Res  3:  109-136）と自然形質転換能による遺伝操作の容易性（Williams  JGK  (1988)  Method  Enzymol  167:  766-778）から、様々なバイオテクノロジー生産に適している。そこで、本発明者は、ラン藻において、PHA生合成への中間体の流れを増加させ、かつ、高活性なPHA合成酵素を導入することによる代謝的な改変を試みた。【０００９】
具体的には、まず、ラン藻にPHAを生産させるため、PHA生産に必要なβ-ケトチオラーゼ（phaA；カプリアビダス属由来）、アセトアセチルCoAレダクターゼ（phaB；カプリアビダス属由来）、及びPHA重合酵素（phaC；クロモバクテリア属由来）という3つの酵素をコードする遺伝子の導入を行った。しかしながら、組換え体におけるPHAの生産効率は低かった。【００１０】
そこで、次に、βケトチオラーゼ遺伝子の代わりに、アセトアセチルCoA合成酵素（nphT7；ストレプトマイセス属由来）をコードする遺伝子を導入し、PHA生産の代謝経路の改変を試みた(図１)。その結果、糖を含まない無機塩類の培養液で育成し、空気中のCO2を炭素源とした光合成を行った場合でも、ラン藻の乾燥重量の14％にあたるPHAを合成させることに成功した。さらに、炭素源として酢酸を加えたところ、ラン藻の乾燥重量の41％までPHAを生産効率を高めることができた（図２）。この値は、光合成のみによるPHA生産の世界最高値である。【００１１】
驚くべきことに、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子の導入により最も高いPHA生産能を示した株では、ネイティブのPHA生合成関連遺伝子（β-ケトチオラーゼ及びアセトアセチルCoAレダクターゼ）の発現レベルが、これら遺伝子導入を行わない株と比較して相対的に低く、導入したPHA生合成関連遺伝子の発現レベルもまたβ-ケトチオラーゼ遺伝子を導入した株と比較して相対的に低かった（図３、４）。一方、光合成活性に関与する多くの遺伝子の発現が、これらの株と比較して上方制御されていた（図５）。従って、PHA生産において示された顕著な効果は、導入したアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子の発現によるPHA生産への流れの強制的な誘導のみならず、予期せず生じた光合成活性の増加にも起因すると考えられる。【００１２】
本発明は、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子が導入された藻類及びポリヒドロキシアルカン酸の製造における当該藻類の利用に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。【００１３】
[１]アセトアセチルCoA合成酵素が導入された藻類。【００１４】
[２]さらに、アセトアセチルCoAレダクターゼ及びPHA重合酵素が導入された、[１]に記載の藻類。【００１５】
[３]アセトアセチルCoA合成酵素がnphT7である、[１]又は[２]に記載の藻類。【００１６】
[４]アセトアセチルCoAレダクターゼがphaBである、[１]又は[２]に記載の藻類。【００１７】
[５]PHA重合酵素がphaCである、[１]又は[２]に記載の藻類。【００１８】
[６]藻類がラン藻である、[１]から[５]のいずれかに記載の藻類。【００１９】
[７]アセトアセチルCoA合成酵素を藻類に導入することを含む、藻類におけるポリヒドロキシアルカン酸の生産能を増強する方法。【００２０】
[８][１]から[６]のいずれかに記載の藻類を光合成可能な条件下で培養することを含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。【００２１】
[９]炭素源の施用下で培養する、[８]に記載の製造方法。【００２２】
[１０]炭素源が二酸化炭素である、[９]に記載の製造方法。【００２３】
[１１]炭素源が酢酸である、[９]に記載の製造方法。【００２４】
[１２]空気交換制限条件下で培養を行う、[８]に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
バイオプラスチックは生物由来のプラスチックであり、飲料容器や、車の内装、パソコンなどあらゆる用途に使われ始めている。また、微生物による分解性（生分解性）を備えた素材も開発され、石油由来のプラスチックには無い、環境負荷低減効果が期待されている。しかしながら、その生産性は、使用する植物や微生物の乾燥重量の数％以下と非常に低く、また、植物や微生物の生育遅延などの問題も報告されてきた。さらに、バイオプラスチックの生産には、微生物の培養に大量の糖と特別な施設が必要で、コスト面に課題があった。【００２６】
本発明においては、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を導入した藻類を利用することにより、予想外の光合成活性の増加も相まって、溶液の炭素源なしでラン藻の乾燥重量の14％、さらに炭素源として微量の酢酸を加えることで41％という世界最高レベルのPHAの生産効率を達成することができた。本発明により、藻類におけるPHAの生産効率を飛躍的に高めるとともに、生産コストを大幅に低減することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明者が開発したPHA生産の代謝経路を示す図である。
【図２】シネコシスティスPCC6803株（pTKP2031V、CCsACnBCn、及びCCsNphT7BCn）におけるP(3HB)の蓄積の比較を示すグラフである。(A)2-3%  CO2でバブルしたもの、(B)0.4%(w/v)酢酸で補充して振とうしたもの、(C)空気交換制限条件下、0.4%(w/v)酢酸で補充して振とうしたもの。
【図３】シネコシスティスPCC6803株におけるPHA生合成遺伝子の発現レベルを比較定量した結果を示すグラフである。(A)pTKP2031V（標準）に対するCCsACnBCn、及びCCsNphT7BCn（標的）の結果（ネイティブ遺伝子を検出）、(B)CCsACnBCn（標準）に対するCCsNphT7BCn（標的）の結果（導入遺伝子を検出）。
【図４】組換えシネコシスティスにおけるPHA合成関連遺伝子発現の制御を示す図である。
【図５】組換えシネコシスティスにおける細胞内変化を示す図である。(a)pTKP2031Vに対するCCsACnBCn、及びCCsNphT7BCnの結果、(b)CCsACnBCnに対するCCsNphT7BCnの結果。黒の破線は、設計したルートを示す。発現の変動が見られた遺伝子を斜体で示した。下方制御された遺伝子には、遺伝子名の脇に下向きの矢印を示した。下向きの矢印が付されていな遺伝子は、全て上方制御された遺伝子である。なお、図中の略称と対応する正式名称の関係は次の通りである。AP,  アロフィコシアニン（allophycocyanin）;  PC/PEC,  フィコシアニン/フィコエリトロシアニン（phycocyanin/phycoerythrocyanin）;  Cytb6/f,  シトクローム  b6/f  複合体（cytochrome  b6/f  complex）;  PQ,  プラストキノン（plastoquinone）;  FNR,   フェレドキシン-NADP(+)  レダクターゼ（ferredoxin-NADP(+)  reductase）;  Pc,  プラストシアニン（plastocyanin）;  PSI,  光化学系I（photosystem  I）;  PSII,  光化学系II（photosystem  II）;  Ndh,  NADHデヒドロゲナーゼ（NADH  dehydrogenase）;  Glc-6-P,  グルコース-6-リン酸（glucose-6-phosphate）;  Fru-6-P,  フルクトース-6-リン酸（fructose-6-phosphate）;  Fru-1,6-bp,  フルクトース-1,6-ビスリン酸（fructose-1,6-biphosphate）;  Glycerate-1,3-P2,  1,3-ビスホスホグリセリン酸（1,3-biphosphoglycerate）;  3-P-Glycerate,  3-ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate）;  Ru-1,5-bisP,  リブロース-1,5-二リン酸（ribulose-1,5-biphosphate）;  PEP,  ホスホエノールピルビン酸（phosphoenolpyruvate）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、アセトアセチルCoA合成酵素が導入された藻類を提供する。本発明において「藻類」とは、水圏に棲む生物のうち、光合成能をもつものを意味する。本発明において用いられる藻類としては、例えば、ラン藻や海洋性藻類が挙げられるが、増殖速度が速いこと、遺伝子組換え手法が確立していること、ゲノム配列が解読されていること、及び遺伝子発現ベクターが整備されていることなどの理由からラン藻が好ましい。ラン藻の具体例としては、シネコシスティス（Synechocystis）属ラン藻、ミクロキスティス（Microcystis）属ラン藻（例えばミクロキスティス  エルギノーサ／Microcystis  aeruginosa）、アルスロスピラ（Arthrospira）属ラン藻（例えばアルスロスピラ  プラテンシス／Arthrospira  platensis）、シアノセイス（Cyanothece）属ラン藻、アルカリゲネス（Alcaligenes）属ラン藻（例えばアルカリゲネス  ユートロフス／Alcaligenes  eurtophus）、アナベナ（Anabaena）属ラン藻、シネココッカス（Synechococcus）属ラン藻、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属ラン藻（例えばサーモシネココッカス  エロンガタス／Thermosynechococcus  elongats）、フロエオバクター（Gloeobacter）属ラン藻（例えばグロエオバクター  ビオラセウス／Gloeobacter  violaceus）、アカリオクロリス（Acaryochloris）属ラン藻（例えばアカリオクロリス  マリーナ／Acaryochloris  marina）、ノストック（Nostoc）属ラン藻（例えばノストック  パンクチフォルメ／Nostoc  punctiforme）、トリコデスミウム（Trichodesmium）属ラン藻、プロクロロン（Prochloron）属ラン藻、プロクロロコッカス（Prochlorococcus）属ラン藻などが挙げられる。
【００２９】
本発明に用いられる「アセトアセチルCoA合成酵素」は、アセチルCoAとマロニルCoAとの不可逆的縮合によりアセトアセチルCoAを生成する反応を触媒する酵素である。当該酵素を藻類に導入することにより、PHA生産への流れを強制的に誘導することができる（図１）。藻類に導入するアセトアセチルCoA合成酵素としては、上記酵素活性を有する限り特に制限はないが、nphT7が好ましい。典型的なストレプトマイセス属由来のnphT7の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１及び２に示す。
【００３０】
本発明においては、さらに、アセトアセチルCoAレダクターゼ及びPHA重合酵素を藻類に導入することができる。本発明における「アセトアセチルCoAレダクターゼ」は、アセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチルCoAを生成する反応を触媒する酵素である。藻類に導入するアセトアセチルCoAレダクターゼとしては、上記酵素活性を有する限り特に制限はないが、phaBが好ましい。典型的なカプリアビダス属由来のphaBの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３及び４に示し、典型的なシュードモナス属由来のphaBの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：５及び６に示す。また、本発明における「PHA重合酵素」は、3-ヒドロキシブチルCoAからPHAを生成する反応を触媒する酵素である。藻類に導入するPHA重合酵素としては、上記酵素活性を有する限り特に制限はないが、phaCが好ましい。典型的なクロモバクテリア属由来のphaCの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：７及び８に示す。
【００３１】
なお、藻類に導入する上記の酵素のアミノ酸配列は、自然界において変異することがあり、また、人工的に変異させることもできる。上記酵素活性を有する限り、1若しくは複数のアミノ酸（例えば、30アミノ酸以内、10アミノ酸以内、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）が変異（置換、欠失、挿入、付加）した酵素も本発明において使用することができる。
【００３２】
本発明において上記酵素が藻類に「導入された」とは、遺伝子として藻類に導入された場合及びタンパク質として藻類に導入された場合の双方を含む意である。上記酵素をコードする遺伝子は、適当なベクターに挿入し、例えば、自然形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法などの一般的な方法で藻類に導入することができる。遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、光誘導性のpsbAIIプロモーターを利用することができる。上記酵素をタンパク質の形態で藻類に導入する場合には、例えば、マイクロインジェクション法やシグナルペプチドと結合して導入する方法を利用することができる。
【００３３】
こうして上記酵素が導入された藻類においては、PHAの生産能が増強される。従って、本発明は、上記酵素を藻類に導入することを含む、藻類におけるPHAの生産能を増強する方法を提供する。また、こうしてPHAの生産能が増強された藻類を光合成可能な条件下で培養することにより、PHAを高効率で製造することができる。従って、本発明は、上記酵素が導入された藻類を光合成可能な条件下で培養することを含む、PHAの製造方法をも提供する。
【００３４】
上記酵素が導入された藻類の培養は、糖を含まない無機塩類の培地で行うことができ、これにより培養コストを低減することができる。使用する培地としては、例えば、BG-11培地などを用いることができる。一定期間藻類を増殖させた後、栄養源を制限した培地（例えば、硝酸ナトリウムを欠くBG-11培地）に移植して培養すると、PHAの生産効率をより高めることができる。培地のpH、培養温度、及び照明の条件としては、一般的な条件、例えば、pH8.0、30℃、100μmol  photons  m-2s-1の条件を利用することができる。培養においては、振とうや空気によるバブルを行うことが好ましい。
【００３５】
本発明においては、培養を炭素源の施用下で行うことにより、PHAの生産効率を飛躍的に高めることができる。炭素源としては、二酸化炭素や酢酸を利用することができる。二酸化炭素を施用する場合には、バブルする空気を二酸化炭素で富化すればよい。この場合の二酸化炭素の濃度は、2〜3％（v/v）が好ましい。また、酢酸を施用する場合には、培地に酢酸を添加すればよい。添加する酢酸の濃度は、0.4％（w/v）以上が好ましい。
【００３６】
本発明においては、空気交換制限条件にすることによっても、PHAの生産効率を飛躍的に高めることができる。空気交換制限条件は、例えば、培養器の口を綿栓で塞ぎ、アルミフォイルで覆うことにより作り出すことができる。
【００３７】
こうして培養した藻類からのPHAの回収は、例えば、メタノールやエタノールを利用した抽出法あるいはBeadsbeader等の菌破砕装置を利用した方法により行うことができる。
【００３８】
なお、培養した藻類においてPHAの生産能が増強されたか否かは、上記酵素が導入された藻類において、対照（上記酵素が導入されていない藻類、例えば、上記酵素遺伝子を含まないベクターが導入された藻類）と比較して、PHAの生産量が増加しているか否かで評価することができる。藻類におけるPHAの生産量の定量は、例えば、本実施例に記載のように、乾燥させた細胞に対してクロロホルム抽出を行い、その抽出物をメタノール分解し、ヒドロキシアシルメチルエステルを含む有機相をガスクロマトグラフィー質量分析に供することにより行うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４０】
[材料と方法]
（１）化学品と試薬
特に明記しなければ、全ての化学品は、ナカライテスク(Tokyo,  Japan)又は和光純薬(Tokyo,  Japan)から購入した。KODプラス高正確性DNAポリメラーゼは、東洋紡から購入した(Tokyo,  Japan)。制限酵素とDNAライゲーションキットは、タカラから購入した(Shiga,  Japan)。【００４１】
（２）生物と培養条件
全てのシネコシスティスPCC6803株(Williams  JGK  (1988)  Method  Enzymol  167:  766-778)は、100μmol  photons  m-2s-1の連続照明下、30℃で、20mM  HEPES-KOH（pH8.0）で緩衝したBG-11培地（Rippka  R  et  al.  (1979)  Journal  of  General  Microbiology  111:  1-61）中で培養した。液体培養は、振とう(100r.p.m.)するか又は2-3%(v/v)CO2で富化した空気でバブルした。プラスミドクローニングに使用した大腸菌（Escherichia  coli）DH5αは、振とう(180r.p.m)下、37度にてLB培地中で増殖させた。プラスミドの選抜と維持のために、カナマイシン(50μg/mL)又はアンピシリン(100μg/mL)を添加した。ラン藻におけるPHA生合成を促進するために、2段階培養を実施した。培養物は、最初に、後期対数増殖期までBG-11培地中で増殖させ、その後、回収し、洗浄し、硝酸ナトリウムを欠くBG-11培地に移植した。リン欠乏は、リン酸カリウムを含まないBG-11中で細胞を培養することによって行った。PHA蓄積における炭素補充の効果を研究するために、異なる炭素[0.2%(w/v)及び0.4%(w/v)のフルクトース及び／又は酢酸]を添加した。培養における空気交換制限条件は、棉栓で培養器の口を塞ぎ、アルミニウムフォイルで覆うことによって行った（上記非特許文献７）。ラン藻培養物は、上記の培養条件で、7日間、10日間、又は14日間培養を行い、遠心(8000g,  10分)によって回収し、その後、凍結乾燥した。【００４２】
（３）プラスミド構築とシネコシスティスの形質転換
シネコシスティスの形質転換のための構築物は、pTKP2031Vに由来する。pTKP2031Vを、カナマイシン耐性カセットとともに、部位slr2030とslr2031の間のゲノムに相同組換えで挿入するためにデザインした（Satoh  S  et  al.  (2001)  J  Biol  Chem  276:  4293-4297）。全てのラン藻構築物の発現は、psbAIIプロモーターの制御下とした。β-ケトチオラーゼ(phaACn)とアセトアセチルCoAレダクターゼ(phaBCn)を含む遺伝子クラスターを、プライマーphaABCn(F;NdeI)及びphaABCn(R;HpaI)(表１）を用いて、C.ネカトールH16の染色体DNAから増幅した。【００４３】
【表１】
0006492011.tif 000002
【００４４】
なお、表中のアンダーラインは、制限酵素消化部位を示す。【００４５】
得られたPCR産物をNdeIとHpaIで消化し、NdeIとHpaIで消化したpTKP2031Vに挿入してpTKP2031V-phaABCnを得た。PHA合成酵素(phaCCs)を、プライマーphaCCs(F;SfuI)とphaCCs(R;AatI)を用いてクロモバクテリウム（Chromobacterium  sp.）USM2の染色体DNAから調製した。このPCR断片をSfuIとAatIで消化し、ライゲーションによりpTKP2031V-phaABCnの適当な制限酵素部位にサブクローニングしてpTKP2031V-phaCCsACnBCnを得た。pTKP2031V-phaCCsnphT7phaBCnは、pTKP2031V-phaCCsACnBCnにおけるphaACnをnphT7で置換することにより構築した。ストレプトマイセス（Streptomyces  sp.）CL190由来のnphT7遺伝子は、プライマーnphT7(F;SfuI)とnphT7(R;AatI)を用いて、前もって調製した鋳型pHis_nphT7（Okamura  E  et  al.  (2010)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  107:  11265-11270）から増幅した。シネコシスティスの形質転換は、従前の報告に従い行った（Osanai  T  et  al.  (2011)  J  Biol  Chem  286:  30962-30971）。簡単に述べると、100-200μLの対数増殖培養物をプラスミド溶液と混合し、終濃度1-2.5μg/mLとした。その混合物をBG-11プレート上のニトロセルロース膜フィルターの上に広げ、連続的な白色光(75-100μmol  photons/m2s)下で30℃にてオーバーナイトでインキュベートした。膜フィルターを50μg/mLのカナマイシンを含む新しいBG-11プレート上に移した。カナマイシン耐性クローンを単離し、3回、再播種した。ラン藻ゲノムにおける異種遺伝子の存在と分離をPCR分析と配列決定により確認した。【００４６】
（４）PHAの定量分析
約25-30mgの凍結乾燥させたラン藻細胞をメタノールで洗浄し、65℃でオーバーナイトで乾燥させた。続いて乾燥細胞を65℃で48時間クロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出物を85%(v/v)メタノールと15%(v/v)濃硫酸からなる溶液で、100℃で140分間、メタノール分解に供した（Braunegg  G  et  al.  (1978)  Eur  J  Appl  Microbiol  Biotechnol  6:  29-37）。ヒドロキシアシルメチルエステルを含む有機相を、HP-5  column(Agilent,  USA)を装備したAgilent  7890A  GC/5975  MSD  systemを用いてガスクロマトグラフィー質量分析を行った。【００４７】
（５）RNA調製
トリゾール試薬(Invitrogen,  USA)をPureLink  RNA  Mini  Kit(Invitrogen,  USA)と組み合わせて用い、製造業者のプロトコールに従って、全RNAを細胞から抽出した。RNA試料に残っている微量のDNAをDNase  I(Takara,  Japan)で消化することにより除去した。RNA試料の量と質をBioanalyzer  2100(Agilent,  USA)を用いて分析した。【００４８】
（６）リアルタイムPCR分析
cDNA合成には、250ngのRNAを使用し、QuantiTect  Reverse  Transcription  Kit(Qiagen,  USA)を利用した。リアルタイムPCR定量には、Thunderbird  SYBR  qPCR  Mix(Toyobo,  Japan)及び遺伝子特異的プライマーを使用し、Mx3000P  QPCR  system(Agilent,  USA)を利用した。サイクリング条件は、次の通りである。95℃で10分を40サイクル、95℃で15秒、及び60℃で1分。反応特異性を保証するため、各増幅の後に融解曲線分析(60℃-95℃)を行った。転写レベルは、定量化サイクル(Ct)の決定に基づき定量した。対象となる遺伝子の転写レベルを、本研究に用いたハウスキーピング遺伝子(16S  rRNA)のレベルで標準化した。pTKP2031V(標準物質)に対するシネコシスティスPCC6803株CCsNphT7BCn及びCCsACnBCn(標的)における対象遺伝子の発現レベル、及びCCsACnBCn(標準物質)に対するCCsNphT7BCn(標的)における対象遺伝子の発現レベルを比較するために、比較定量化を行った。【００４９】
（７）RNA-seqライブラリー調製、Illumina配列決定、及びデータ解析
各試料につき、2μgの全RNAをRibo-Zero  rRNA  removal  kit(Epicentre,  USA)を用いたリボソームRNA除去に供した。RNA-seqのためのcDNAライブラリーは、製造業者の説明書に従って、Illumina  TruSeq  Stranded  mRNA  Sample  Preparation  Kit(Illumina,  USA)を利用しrRNAを除去した全RNAから構築した。簡単に言うと、cDNAライブラリーの調製は、次の段階を含む。RNA断片化、cDNA合成、3’末端アデニル化、アダプターライゲーション、及びcDNA鋳型の富化。ライブラリーの定量は、Bioanalyzer  2100(Agilent,  USA)を用いて行い、4〜6pMの鋳型をクラスター生成に用いた。ライブラリーは、2x250  paired  endプロトコールによりMiseq(Illumina,  USA)装置で配列決定した。配列データは、アクセション番号GSE50688としてNCBI  Gene  Expression  Omnibus(GEO)に供している。RNA-seqデータ分析は、CLC  Genomics  Workbench  6  software(CLC  bio,  Denmark)を利用して行った。配列の読み取りは、低品質の読み取りを整え、20bpよりも短い読み取りを選別するために前処理した。選別した配列の読み取りをシネコシスティスPCC  6803ゲノム(NC_000911)にマップし、最大2つのミスマッチを許容した。参照ゲノム配列及び注釈をNCBIからダウンロードした(2013年5月23日)。非コードRNAにマップされた配列読み取り及び特有の位置にマップされなかった読み取りは、さらなる解析から除外した。転写産物レベルは、遺伝子の長さと試料においてマップされた読み取りの全数により遺伝子の読み取り数を標準化するRPKM（reads  per  kilobase  of  exon  model  per  million  mapped  reads）（Mortazavi  A  et  al.  (2008)  Nat  Meth  5:  621-628）で表した。統計解析を行い、FDR（False  Discovery  Rate）p値補正が<0.05である遺伝子を、差異のある制御を受けた遺伝子として決定した（Baggerly  KA  et  al.  (2003)  Bioinformatics  19:  1477-1483）。【００５０】
[結果]
（１）組換えラン藻における増強されたPHA生産
よく研究されたカプリアビダス  ネカトール（Cupriavidus  necator）の生合成経路において、P(3HB)合成は3段階の反応で生じ、β-ケトチオラーゼによるアセチルCoAのアセトアセチルCoAへの縮合で始まる（Tsuge  T  (2002)  Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering  94:  579-584）。ラン藻におけるアセチルCoAプールは、光合成条件下で熱力学的に好ましくない縮合反応を前に推進するのに不十分であると仮定されている（Lan  EI,  Liao  JC  (2012)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  109:  6018-6023）。アセトアセチルCoAを生成させるために、ネイティブのβ-ケトチオラーゼが仲介する縮合のみに依存することに代え、ストレプトマイセス（Streptomyces  sp.）CL190由来のアセトアセチルCoA合成酵素(nphT7Ss)をP(3HB)経路デザインに組み入れた。【００５１】
nphT7Ss遺伝子は、アセトアセチルCoAを生成するためにアセチルCoAとマロニルCoAとの不可逆的縮合を触媒し、PHAの生成への反応を推進する。縮合反応からの二酸化炭素の発生は、アセトアセチルCoAの生成への反応を効率的に押し進める（Okamura  E  et  al.  (2010)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  107:  11265-11270）。クロモバクテリウム（Chromobacterium  sp.）由来の高活性PHA合成酵素であるUSM2(phaCCs)（Bhubalan  K  et  al.  (2011)  Appl  Environ  Microbiol  77:  2926-2933）をnphT7Ssと共発現させ、シネコシスティスにおけるP(3HB)の光合成生産を改良した。PHA蓄積における栄養制限、炭素補充、及び空気交換制限の同時効果（上記非特許文献７、Sharma  L,  Mallick  N  (2005)  Bioresour  Technol  96:  1304-1310）の観点から、これらの培養条件、すなわち、窒素又はリンの欠乏、空気交換制限、及び／又は炭素源(CO2、酢酸、及び／又はフルクトース)の存在下での生合成実験をデザインした。【００５２】
シネコシスティスにおけるPHA生産経路のデザインのために、ベクタープラスミドpTKP2031Vを利用し、slr2030とslr2031の部位の間の相同組換えを介して異種遺伝子を導入した（Satoh  S  et  al.  (2001)  J  Biol  Chem  276:  4293-4297）。光誘導性psbAIIプロモーターの制御下でphaCCs遺伝子、nphT7Ss遺伝子、及びC.ネカトール  アセトアセチルCoAレダクターゼ(phaBCn)遺伝子を保持するプラスミドでシネコシスティスを形質転換した。成功した形質転換体株であるCCsNphT7BCnにつき、連続する細胞増殖段階とPHA蓄積段階からなる2段階培養系の下でPHA生産を分析した。CCsNphT7BCn株は、CO2からのPHAの直接光合成生産が助長され、培養7日目において最大の14wt%  P(3HB)容量に達した(図1A)。これと比較して、phaCCs、C.ネカトールβ-ケトチオラーゼ(phaACn)、及びphaBCnを発現するCCsACnBCnでは同じ培養条件でP(3HB)容量(7wt%)において減少が認められた。唯一、カナマイシン耐性カセットがゲノムに組み込まれているpTKP2031V株は、最も低いP(3HB)生産能(5wt%)を示した。しかしながら、14日目までの延長した培養は、光独立栄養条件でのラン藻のP(3HB)蓄積能において有意な影響を及ぼさなかった。より高い細胞密度では、二酸化炭素と光の競合によって、P(3HB)蓄積が制限されるのかもしれない。【００５３】
P(3HB)生産を増大させるために、PHA蓄積段階において、外部からの炭素源[0.4%(w/v)酢酸]をラン藻培養に供給した。CCsNphT7BCn株は、培養10日目において最大のPHA容量29wt%を記録した(図1B)。炭素源の添加によるP(3HB)プールの増加は、PHA生産における外部からの炭素源の補充が与える影響に関する初期の知見を支持する（上記非特許文献７、Sharma  L,  Mallick  N  (2005)  Bioresour  Technol  96:  1304-1310）。空気交換制限の効果においては、CCsNphT7BCn株においてP(3HB)の有意な増加(41wt%まで)が観察された(図1C)。これらの観察は、シネコシスティスにおけるP(3HB)蓄積能が炭素源と空気交換の供給によって影響されることを暗示する。興味深いことに、シネコシスティスの光独立培養に対するCO2供給の増加(5%)が、CCsNphT7BCn株におけるPHA容量を16wt%まで増加させることが見出された(表２)。pTKP2031V株の窒素とリンの欠乏培養に対する酢酸とフルクトースの同時添加は、光独立条件(5%CO2)と比較してP(3HB)蓄積の減少を示した。同様の条件下においてCCsNphT7BCn株とCCsACnBCn株では、P(3HB)容量において有意な変化は見られなかった。本研究において試験した培養条件下での7日目における組換えシネコシスティスのPHA生産能の順は、CCsNphT7BCn>CCsACnBCn>pTKP2031Vである。【００５４】
【表２】
0006492011.tif 000003
【００５５】
（２）PHA合成関連遺伝子の発現レベル
phaCSs、phaASs及びphaBSsから構成されるシネコシスティスのネイティブPHA生合成遺伝子の発現レベルをリアルタイムPCR分析によりモニターした(図2A及び2B)。驚くべきことに、シネコシスティスCCsNphT7BCn株におけるphaASsとphaBSsの発現レベルを定量化すると、TKP2031V株に対して約2倍低い発現が示された。しかしながら、調査した組換えシネコシスティス(pTKP2013V、CCsACnBCn、及びCCsNphT7BCn)において、ネイティブphaCSs遺伝子の発現レベルには、有意な差異は認められなかった。同じオペロン上のゲノムに導入されたphaCCsとphaBCnの発現レベルは、CCsNphT7BCn株では、CCsACnBCn株と比較して少なくとも3倍低い発現を示した。CCsNphT7BCnにおけるより高いPHA蓄積レベルにもかかわらず、この株における大部分のPHA生合成関連遺伝子の発現レベルは、CCsACnBCn及びpTKP2013Vと比較して相対的に低かった。【００５６】
（３）光独立栄養PHA蓄積条件下でのシネコシスティス転写応答の解析
ラン藻におけるPHA蓄積への知見を得るために、異なるPHA生産能を持つ組換えシネコシスティスの転写産物を解析した。光独立栄養条件下、窒素欠乏BG-11で7日間培養した細胞からRNA-seqライブラリーを調製した。6サンプルに対して全体で9300万の読み取り（サンプル当たりに平均1550万の読み取り）をもたらすイルミナプラットフォーム（Illumina  platform）を用いて配列決定を行った。各組換えネコシティスサンプルに対する2つの生物学的反復実験の間の散布図が0.96-0.98の間の相関係数を示したが、これは配列データの再現性を示している。各遺伝子の発現レベルは、RPKM（reads  per  kilobase  of  exon  model  per  million  mapped  reads）として定量化した。【００５７】
RNA-seqデータは、組換えシネコシスティス株pTKP2013V、CCsACnBCn、及びCCsNphT7BCnにおいて、光独立栄養PHA蓄積条件に応答して制御される遺伝子の詳細な情報を提供する。概して、シネコシスティスでより高い発現を示した遺伝子は、主として光合成、電子伝達鎖、タンパク質代謝プロセス、及び核酸代謝に関与していた。特に、光化学系I(psaB、psaA、psaF、及びpsaL)と光化学系II(psbA3、psbA2、psbX、psbY、psbU、psbK及びpsbD2)の活性に関与する遺伝子の転写レベルは、最も豊富であった。参照株(pTKP2013V)に対してPHA生産がより効率的であった組換え株(CCsACnBCn及びCCsNphT7BCn)における遺伝子発現の比較を行った。CCsACnBCn株及びCCsNphT7BCn株において上方制御された遺伝子は、光合成、輸送、及び細胞間情報伝達を有意に高めるものであった。対照的に、下方制御された遺伝子は、概ね、コファクターとビタミン、タンパク質代謝プロセス、及びDNA結合に関与していることが見出された。ラン藻においてのみ検出されている光化学系I反応中心サブユニットXII遺伝子(psaM)は、CCsACnBCnとCCsNphT7BCnの双方で強く上方制御されていた。他の光化学系I反応中心サブユニット遺伝子であるpsaJは、10倍以上も上方制御されていることが見出された。これらのサブユニットの双方が機能的な光化学系Iの形成に必要である（Xu  W  et  al.  (2001)  Biochim  Biophys  Acta  1507:  32-40）。光化学系Iサブユニットをコードする遺伝子に加えて、光化学系IIに関与する遺伝子も有意に上方制御されていた。光化学系IIの安定に不可欠であるとされているPsbX及びPsbKは、CCsACnBCn及びCCsNphT7BCnの双方で5倍以上誘導されていた。シトクロームB6-f複合体サブユニットであり、その複合体の安定あるいは会合に重要なPetG及びPetLの上方制御も観察された（Schwenkert  S  et  al.  (2007)  Plant  Physiol  144:  1924-1935）。ポルフィリンと葉緑素の代謝に関与する2つの遺伝子であるマグネシウム-プロトポルフィリンIXモノメチルエステルシクラーゼ(sll1874)とプロトヘムIXファネシルトランスフェラーゼ(sll1899)が双方の株で上方制御されていた。全体として、光合成活性、例えば、光化学系IとII、シトクローム、及び葉緑素の代謝といった、いくつかの観点に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、活発にPHAを合成する組換えシネコシスティスにおいて上方制御されていた。【００５８】
その一方、タンパク質代謝(転写、翻訳、アミノ酸合成など)に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写レベルは、組換えシネコシスティス株CCsACnBCn及びCCsNphT7BCnにおいて減少していた。これらのタンパク質［DNAミスマッチタンパク質(MutL)メチオニンスルホキシドレダクターゼB(sll1680)、プロヒビチン(slr1106)、エキソザイムS合成タンパク質B(ExsB)、3-デヒドロキナ酸デヒドラター(AroQ)及びヒドロゲナーゼ(HypA)］をコードする遺伝子の転写レベルの減少は、窒素欠乏条件下でのシネコシスティスの減少した増殖に関係しているのかもしれない。細胞は、栄養制限条件に対して、PHA蓄積と同時に生じる代謝活性の減少によって応答している。コファクターとビタミンの代謝に関係している遺伝子[リポペプチド抗生物質イチュリンa生合成タンパク質(slr0495)、コバラミンシンターゼ(CobS)、4-ヒドロキシスレオニン-4-リン酸デヒドロゲナーゼ(PdxA)、コバルト-プレコリン-6xリダクターゼ(CobK)、リボフラビン生合成タンパク質(RibG)、リポリトレンスフェラーゼ(LipB)、及びo-スクシニル安息香酸シンターゼ(sll0409)]の発現レベルの減少が観察された。【００５９】
過剰なPHA蓄積に適応するためのラン藻の全体的な応答について実質的な知見を得るために、組換えシネコシスティス株CCsNphT7BCn及びCCsACnBCnにおける遺伝子発現の間の比較を行った。この解析により、CCsNphT7BCn株が、PHA蓄積段階の間、誘導されたストレス応答、光合成、エネルギー代謝、及び輸送の組み合わせを利用していることが示された。特に、光合成活性のいくつかの観点に関与するタンパク質、例えば、ウロポルフィノーゲンデカルボキシラーゼ(HemE)、フェレドキシンコンポーネント(slr1205)、プロトクロロフィリドリダクターゼサブユニット(BchB)、プロトホームIXファネシルトランスフェラーゼ(CtaB)、光科学系II反応中心タンパク質N(PsbN)、及び鉄ストレスクロロフィルII結合タンパク質(IsiA)をコードする遺伝子が、CCsACnBCn株と比較してCCsNphT7BCn株で上方制御されていた。【００６０】
増強された光合成活性は、ポリマーへの炭素の増加された流用に適応するために、炭素固定能が増強されたことを示唆する。ポリヒドロキシアルカン酸は、生理的ストレス条件への応答において合成される細菌の貯蔵化合物である（Anderson  AJ,  Dawes  EA  (1990)  Microbiol  Rev  54:  450-472）。最近の研究では、コシャペロニン(groES)、ホリデージャンクションリゾルバーゼ(ruvC)、分子シャペロン(groEL)、スーパーオキシドディスムターゼ(sodB)、及び熱ショックタンパク質90(htpG)を含むラン藻におけるストレス関連遺伝子が、わずかに上方制御されていた。PHA蓄積は、変化する環境における生存とストレス耐性を与えるのではないかと考えられているが（Pham  TH  et  al.  (2004)  Microbiology  150:  3405-3413）、ストレス条件はPHA生産を支持する反応を刺激するのかもしれない。加えて、全体的な窒素制御因子であるNtcAの転写レベルが、増加したレベルで検出された。NtcAは、窒素代謝に関与する数多くの遺伝子の発現を制御することが知られており（Bradley  RL,  Reddy  KJ  (1997)  J  Bacteriol  179:  4407-4410）、このタンパク質をコードする遺伝子の誘導は、シネコシスティスにおけるPHA合成を増加させるために適用された窒素欠乏培養条件に関係しうる。逆に、DNA結合、輸送、翻訳、及びDNA修復に関与する遺伝子の下方制御が、CCsNphT7BCn株で観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
上記の通り、本発明により、バイオプラスチックの１つであるPHAを、高効率かつ廉価で製造することが可能となった。従って、本発明は、PHAを利用する様々な化学品や生物燃料の生産に大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号９〜２６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
0006492011.tif 000004
【図２】
0006492011.tif 000005
【図３】
0006492011.tif 000006
【図４】
0006492011.tif 000007
【図５】
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【配列表】
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