(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）であって、前記IP-MSCは、前記病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の発現可能免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされており、各免疫反応性ポリペプチドは、前記病原体によって産生される抗原に特異的な若しくは前記毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸配列を含み、前記抗原結合領域配列は、前記病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配置されており、前記1つ以上のエピソームベクターが、非感染性、非組み込み性の環状エピソームベクターであり、前記IP-MSCが、脂肪由来間葉幹細胞から調製される、前記免疫防御初代間葉幹細胞。
【請求項２】
2〜100の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する、請求項1に記載のIP-MSC。
【請求項３】
1つ以上の他の免疫調節因子を更に発現する、請求項1又は2に記載のIP-MSC。
【請求項４】
前記1つ以上の免疫調節因子が、インターロイキン及びインターフェロンから選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項５】
前記1つ以上の免疫調節因子が、L-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IFNα、IFNβ及びIFNωから選択される、請求項3に記載のIP-MSC。
【請求項６】
各免疫反応性ポリペプチドが、完全長抗体、抗体単一鎖可変抗体フラグメント（ScFV）、一価抗体抗原結合フラグメント（Fab）、二価抗体抗原結合フラグメント（F(ab’)2）、ジアボディ及びトリボディから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項７】
前記病原体が、ウイルス病原体、細菌病原体、単細胞寄生生物病原体又は多細胞寄生生物病原体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項８】
前記病原体が、アデノウイルス、パピローマウイルス、へパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、単純ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス及び風疹ウイルスから成る群から選択されるウイルス病原体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項９】
前記病原体が、バシルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、ブルコールデリア属、カンピロバクター属、クラミジア属、クラミドフィラ属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、腸球菌属、エスケリキア属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、トレポネーマ属、ビブリオ属及びエルシニア属から成る群から選択される属由来の細菌病原体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項１０】
前記病原体が、アカントアメーバー、アニサキス、アスカリス・ルンブリコイデス、バランチジウム・コリ、多節条虫亜綱（サナダムシ）、ツツガムシ、コクリオミイヤ・ホミニボラクス、エントアメーバー・ヒストリチカ、ファシオラ・ヘパチカ、ギアルジア・ランブリア、鉤虫、リーシュマニア、リングアツラ・セルラータ、肝蛭、ロア糸状虫、肺吸虫（肺蛭）、ギョウチュウ、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、ストロンギロイデス・ステルコラリス、サナダムシ、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ、鞭虫及びウケレリア・バンクロフティから成る群から選択される寄生生物病原体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項１１】
前記抗原性ポリペプチドが以下から成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIP-MSC：インフルエンザヘマグルチニン1（HA1）；インフルエンザヘマグルチニン2（HA2）；インフルエンザノイラミニダーゼ（NA）；ラッサウイルス（LASV）糖タンパク質1（gp1）；LASV糖タンパク質2（gp2）；LASVヌクレオキャプシド関連タンパク質（NP）；LASV Lタンパク質；LASV Zタンパク質；SARSウイルスSタンパク質；エボラウイルスGP2；麻疹ウイルス融合1（F1）タンパク質；HIV-1トランスメンブレン（TM）タンパク質；HIV-1糖タンパク質41（gp41）；HIV-1糖タンパク質120（gp120）；C型肝炎ウイルス（HCV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；HCVエンベロープ糖タンパク質2（E2）；HCVヌクレオキャプシドタンパク質（p22）；西ナイルウイルス（WNV）エンベロープ糖タンパク質（E）；日本脳炎ウイルス（JEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；黄熱ウイルス（YFV）エンベロープ糖タンパク質（E）；ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；G型肝炎ウイルス（HGV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；呼吸系シンクチバルウイルス（RSV）融合（F）タンパク質；単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）gDタンパク質；HSV-1 gGタンパク質；HSV-2 gDタンパク質；HSV-2 gGタンパク質；B型肝炎ウイルス（HBV）コアタンパク質；エプスタイン-バーウイルス（EBV）糖タンパク質125（gp125）；細菌外膜タンパク質アッセンブリー因子BamA；細菌転移アッセンブリーモジュールタンパク質TamA；細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質；細菌表面抗原D15；炭疽防御タンパク質；炭疽致死因子；炭疽浮腫因子；腸チフス菌S1Da；腸チフス菌S1Db；コレラ毒素；コレラ熱ショックタンパク質；ボツリヌス菌抗原S；ボツリヌス毒素；エルシニア・ペスチスF1；エルシニア・ペスチスV抗原；エルシニア・ペスチスYopH；エルシニア・ペスチスYopM；エルシニア・ペスチスYopD；エルシニア・ペスチスプラスミノーゲンアクチベーター因子（Pla）；プラスモジウムサーカムスポロゾイトタンパク質（CSP）；プラスモジウムスポロゾイト表面タンパク質（SSP2/TRAP）；プラスモジウム肝病期抗原1（LSA1）；プラスモジウム輸出タンパク質1（EXP1）；プラスモジウム赤血球結合抗原175（EBA-175）；プラスモジウムシステインリッチ防御抗原（cyRPA）；プラスモジウム熱ショックタンパク質70（hsp70）；住血吸虫Sm29；及び住血吸虫シグナルトランスダクションタンパク質14-3-3。
【請求項１２】
前記1つ以上のエピソームベクターが、誘導性アポトーシス遺伝子を更にコードする、請求項1〜11のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項１３】
前記エピソームベクターが、エプスタイン‐バーウイルス核抗原１（ＥＢＶＮＡ１）発現カセットを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のIP-MSC。
【請求項１４】
前記免疫反応性ポリペプチドが、遺伝子が向き合う方向で前記エピソームベクターにコードされている、請求項13に記載のIP-MSC。
【請求項１５】
病原体によって引き起こされる感染症又は毒素への曝露による毒性を治療又は予防するための医薬組成物であって、医薬的に許容できる担体中に請求項1〜14のいずれか1項に記載のIP-MSCを含む、前記医薬組成物。
【請求項１６】
病原体によって引き起こされる感染症又は毒素への曝露による毒性の治療又は予防のための薬剤の製造における、請求項1〜13のいずれか1項に記載のIP-MSCの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は間葉幹細胞に関する。より具体的には、本発明は、病原性因子（例えば病原体及び毒素）に対して免疫反応性を有するポリペプチドをデリバリーする初代間葉幹細胞（MSC）、並びにそのようなMSCの調製方法及びそのようなMSCの病原性因子に対抗する利用に関する。
【０００２】
配列表の組み入れ
本出願の生物学的配列情報は、ASCIIテキストファイル（ファイル名“TU-491-SEQ.txt”、2013年3月11日作成、ファイルサイズ12,954バイト）（前記は参照により本明細書に組み入れられる）に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
間葉幹細胞（MSC）は他に類を見ない多能始原細胞であり、前記は多様な症状（癌及び自己免疫疾患を含む）に対する遺伝子療法ベクターとして現在盛んに利用されつつある。MSCはもっぱら同種異系MSC移植時の抗炎症特性について知られているが、ある種の状況下ではMSCは実際に適応免疫を促進するという証拠が存在する。MSCは広範囲の組織（骨髄、脂肪組織、胎盤及び臍帯血を含む）で確認されている。脂肪組織はMSCのもっとも豊富な供給源の1つとして知られている。
MSCはこれまで多様な病的又は前病的状況下で同種異系宿主に首尾よく移植されてきた。これらのドナーMSCはしばしば免疫寛容を促進する。前記免疫寛容には、主要組織適合性複合体（MHC）が不適合のドナーから細胞又は組織が移植された後で発生し得る移植片対宿主病（GvHD）の抑制が含まれる。MSC導入後のGvHD症状の減少は、T及びB細胞増殖、休止ナチュラルキラー細胞の細胞傷害作用及び樹状細胞（DC）成熟のMSCによる直接的阻害に起因する。少なくとも1つの研究が、移植された同種異系MSCに対する抗体の産生を報告している。それにもかかわらず、当該GvHD予防能力はまた、外来抗原を発現するMSCが、細胞性ワクチン免疫中にMSCによって発現される外来抗原に対してのみ選択的に免疫応答を誘発しドナーMSCには特異的に免疫応答を誘発しないという点で他の細胞タイプ（すなわちDC）を凌ぐ利点を有する可能性を示唆している。
【０００４】
改変MSCの使用もまたMSCの免疫調節特性を強化するために探求されてきた。IL-10を過剰生産するように形質導入されたMSCは、コラーゲン誘発関節炎をマウスモデルで抑制した（Choi et al., 2008）。さらにまた、アルツハイマー病マウスモデルに移植されたグルカゴン様ペプチド1発現MSCは、脳のA-ベータ沈着を減少させた（Klinge et al., 2011）。骨減少症マウスモデルでは、骨形成タンパク質を安定的に過剰発現する形質導入MSCを投与されたマウスは骨密度を増加させた（Kumar et al., 2010）。脊髄損傷ラットモデルでは、脳由来神経栄養因子を安定的に過剰発現するMSCで処置されたラットは、MSCだけを投与されたラットよりも良好な全体的結果を示した（Sasaki et al., 2009）。最後に、膀胱排出口閉塞ラットモデルでは、肝細胞増殖因子を安定的に過剰発現する形質導入MSCを投与されたラットは膀胱のコラーゲン蓄積を減少させた（Song et al., 2012）。これらの研究は、改変MSCは、多様な疾患及び組織を標的とするタンパク質発現及びデリバリーのために有用で実現性の高いベヒクルであることを示している。
【０００５】
MSCは、腫瘍のミクロ環境へのそれらの固有の帰巣性のために抗癌治療薬のデリバリーベヒクルとしてこれまで研究され、文献（Loebinger and James, 2010）にも完全に概説されている。MSCはまた、IFNα又はIFNγの発現を通して腫瘍原性細胞のアポトーシス促進に用いられてきた（Li et al., 2006；Ren et al., 2008）。さらにまた最近では、MSCは腫瘍形成及び転移の予防並びに阻害のために探求されている。Weiらの研究では、マウス腫瘍モデル（転移性線維肉腫細胞が投与される）で、ヒトパピローマウイルス（HPV）不朽化MSC（HPVタンパク質E6/E7を発現する）の改変E7融合タンパク質ワクチンとの併用使用が試験された（Wei et al., 2011）。このグループは、E7発現MSC及び改変E7タンパク質ワクチンの両方で免疫されたマウスだけが腫瘍増殖の減少及びE7特異的抗体応答を示すことを見出した。MSC又はタンパク質ワクチンだけを投与されたマウスは、抗E7応答を生じることも転移性肉腫の腫瘍増殖を阻害することもできなかった。これらの不朽化MSCは非腫瘍原性であると以前には決定されていたが、それら細胞は、投与後非常に短期間しか検出できない初代MSC（すなわち非不朽化）と異なり21日以上マウスで存続した（Gao et al., 2001；Abraham et al., 2004；Ohtaki etal., 2008；Prockop, 2009）。したがって、たとえ不朽化細胞が悪性ではないことが立証されたとしても、不朽化MSCを用いれば、長期間には予見し得ない出来事（すなわちこの研究では判定されなかった内因性MSCの打倒及び別個の免疫調節能力）が出現し得る。他の研究は、不朽化MSCが腫瘍原性となり得ること、したがって注意深く研究してそれらの使用が実際安全であるか否かを決定する必要があることを指摘した。移植された初代非不朽化MSCは、in vivoではせいぜい数日しか存続しない（Gao et al., 2001；Abraham et al., 2004；Ohtaki et al., 2008；Prockop, 2009）。
【０００６】
MSCは主としてその免疫抑制特性について喧伝されているが、いくつかの公表された報告では、MSCは適応免疫を促進することが直接的に示されている。共同培養では、MSCは、B細胞増殖、IL-6発現及びin vitroのIgG分泌形質細胞形成を強化し、これらのB細胞応答は、TLRアゴニスト（リポ多糖類又はCpG DNA）と併用されたMSCによりさらに増大させることができた。破傷風類毒素でパルスされたMSCは、破傷風類毒素特異的CD4 T細胞株の増殖及びサイトカイン発現（IL-4、IL-10、IFNγ）を促進した。同様に、抗原の存在下に低比率（1：100）でリンパ球と培養したMSCは、リンパ球増殖及びCD4 Th17サブセット形成を改善した（前記は部分的にはIL-6及びTGFβ依存性であった）。MSCはまた、MHC-I及びクロスプレゼント抗原をCD8 T細胞のエキスパンジョンのためにin vitro及びin vivoの両方で発現することが見出された。
【０００７】
MSC免疫調節はまた外部シグナルに左右されることが見出された。炎症性サイトカイン又は刺激の存在下で、以前には抑制性であったMSC療法は免疫刺激性となり得る。例えば、特定の病原体付随分子パターン（PAMP）分子で処理されたMSCは、当該MSCがin vitroで処理されるPAMPに応じて抗炎症性にも前炎症性にも成り得る。コラーゲン誘発関節炎（炎症性疾患状況）では、同種異系MSC移植は、報告ではTh1免疫応答及びIL-6分泌を強化した（前記はMSCの直接的TNFα刺激をin vitroで模倣する）。報告では、MSCの投与はまたコラーゲン誘発関節炎症を悪化させ、IL-6及びIL-17の脾細胞分泌を増幅させた。MSCのIFNγによる（軽度の範囲内の）前処理は、報告ではMHC-I及びII発現をアップレギュレートして、抗原食作用及び抗原提示性能を改善し、それによってCD4及びCD8 T細胞増殖並びに抗腫瘍CD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の産出を刺激した。
【０００８】
ワクチンはしばしば伝染病予防の有効かつ費用効率のよい手段である。ワクチンはある壊滅的疾患（天然痘）の撲滅で変革的潜在能力を示したが、一方で、以前に広域にわたる罹病率及び死亡率をもたらした他の疾患（ジフテリア、ポリオ及び麻疹を含む）を制御する能力を提供した。ワクチンの開発は、病原体の弱毒化若しくは不活化型の試験又は病原体成分の同定（すなわちサブユニット、類毒素及びウイルス用粒子ワクチン）を必要とする（前記成分は、レシピエントが実際の病原体に曝露されたときレシピエントを疾患から防御する免疫応答を誘引する）。理想的な社会では、単一ワクチンが全ての主要なヒト病原体を標的とし（多用途性）、これらの病原体に対して望ましくない副作用を誘発することなく強力な免疫を誘引し、かつ一用量当たりなお適度に安価に製造され得よう。ウイルス又は宿主-細胞生成タンパク質の事例では、ヒトの翻訳後プロセッシングを含む（自然感染を模倣する）ワクチン製造がおそらく細菌や他の発現系より優れていることが立証されるであろう。
伝統的なワクチン手法はしたがってこれまでのところ、HIV、結核、マラリア及び他の多くの疾患（デング熱、ヘルペス及び通常カゼを含む）に対して防御を提供できなかった。伝統的なワクチン手法がこれらの疾患で成功しなかった理由は複雑であり多様である。例えば、HIVは機能的なプロウイルスゲノムを宿主細胞のDNAに組み入れ、それによって潜伏性又は持続性を確立させる。いったん潜伏性/持続性が確立されると、HIVを根絶することはたとえ高度に有効な抗レトロウイルス療法をもってしても不可能である。
【０００９】
より新しいまた別の免疫手法にはDNAワクチン及び細胞性ワクチンの両方が含まれる。DNAワクチンは、ワクチン接種組織部位の細胞に抗原コードプラスミドをトランスフェクトすることを必要とし、前記プラスミドは局所細胞（すなわち筋細胞）にin situでワクチン抗原を産生させる。細胞性ワクチンは、ワクチン抗原を発現又は提示している、予めパルスされた又はトランスフェクトされた宿主抗原提示細胞（例えば樹状細胞（DC））の直接移入を用いる。これらの手法の利点は、ワクチン抗原はin vivoで生成され、免疫学的プロセッシングのために直ちに利用され得るということである。前臨床試験は成功したという多くの報告にもかかわらず、そのような手法はともに障害に突き当たっている。ヒトのDNAワクチン免疫の研究は低い有効性を示し、前記はマウスとヒトとの間の本質的な相違と関係がある（Cavenaugh et al., 2011；Wang et al., 2011）。DCワクチン免疫戦略は、治療用癌ワクチン免疫については臨床的成功は限定的であり、かつ個々に調整が必要なために製造コストが高い（Bhargava et al., 2012；Palucka and Banchereau, 2012）。
従来のワクチン技術のさらに別の制限は与えられた病原体に対してワクチン開発に必要とされる時間である。前記は、新規出現病原体並びに意図的又は偶発的に放出される病原体及び毒素に曝露される事例で特に問題である（当該事例では、そのような出現病原体及び生物学的脅威を封じ込める迅速な防御手段が要求される）。本明細書に記載する方法及びエピソームトランスフェクトMSCはこれらの要求に向けられている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）並びに前記IP-MSCを調製及び使用する方法を提供する。前記IP-MSCは、病原体（例えばウイルス、細菌又は寄生生物の伝染性を有する種）又は毒素を特異的に標的とする複数の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する。IP-MSCは、2つ以上（例えば2つから約100）の発現可能な免疫反応性ポリペプチド（例えば完全長抗体、単一鎖可変抗体フラグメント（ScFV）、Fab又はF(ab')2抗体フラグメント、ジアボディ、トリボディなど）をコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされる。場合によって、IP-MSCは1つ以上の他の免疫調節ポリペプチド、例えばサイトカイン（（例えばIL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9及びIL-12）、インターフェロン（例えばIFNα、IFNβ又はIFNω）など）を発現することができる（前記ペプチドは抗原結合ポリペプチドの病原体又は毒素を中和する有効性を強化できる）。各免疫反応性ポリペプチドは、病原体によって産生される抗原に特異的な又は毒素に特異的な中和抗体（例えば曝露対象に由来する手を加えられていない抗体）由来の又は中和抗体の抗原結合領域のアミノ酸配列を含むか、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換（例えば保存的置換）を含み、かつ好ましくは当該手を加えられていない抗原結合領域と少なくとも約50％の配列同一性（例えば少なくとも約60、70、80、90又は95％の配列同一性）を共有する当該抗原結合領域のバリアント（variant）のアミノ酸配列を含む。各抗原結合領域ペプチド又はそのバリアントは、当該病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配列され（arrange）かつ適切な向きに配置される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、IP-MSCは、病原体又は毒素を特異的に標的とする、少なくとも2、3、4、5若しくは6つの免疫反応性ポリペプチド、又は約10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100までの免疫反応性ポリペプチドを発現する。例えば、各免疫反応性ポリペプチドは、病原性生物由来のタンパク質若しくはそのフラグメント又は毒素（例えばリシン、アブリン、炭疽毒素、ボツリヌス毒素）（前記は生物によってin situで産生されるか又は化学的に単離若しくは生成された形態で出現し得る）を特異的に標的としこれと結合することができる。
IP-MSCは、病原体による感染又は毒素への曝露に対して受動免疫を惹起するか又は前記の治療（例えば中和による）に有用である。IP-MSCは、病原体によって引き起こされる感染症の治療若しくは予防用、又は毒素の有害作用の緩和用医薬組成物として使用するために、医薬的に許容できる担体（例えば緩衝剤（例えばリン酸緩衝食塩水又は生命活性を有するトランスフェクトされる初代MSCの維持に適切な任意の他の緩衝性物質））中で提供され得る。いくつかの実施態様では、IP-MSCは骨髄由来MSCを含むが、いくつかの他の実施態様では、IP-MSCは、脂肪のMSC細胞、胎盤のMSC細胞、又は臍帯血のMSC細胞を含む。
【００１２】
本明細書に記載するIP-MSCは、少なくとも部分的には、初代MSCは一般的には免疫系の標的にならない低免疫原性であるという理由から、病原体及び毒素に対する一時的受動防御に特に有用である。したがって、IP-MSCは処置された対象によって許容され、前記対象は、免疫反応性ポリペプチドが発現され産生され放出されて、対象が既に曝露されたか若しくは曝露される可能性がある病原性生物又は毒素と結合し又はこれを中和するために十分な時間当該細胞の生存を可能にする。さらにまた、初代MSCは、一般的には体内で限定された寿命を有し、したがってMSCによる治療の望ましくない長期副作用（例えば癌原性）（前記は不朽化MSCに関する課題であり得る）の可能性を軽減する。
本発明の以下の実施態様1から35は、本発明の範囲及び多様な特徴の更なる説明のために提供される。これらの実施態様は、本明細書に記載するIP-MSC及び方法の非限定的な例示として提供される。
【００１３】
実施態様1は、病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）を含む。IP-MSCは、免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされる。各免疫反応性ポリペプチドは、病原体によって産生される抗原に特異的な若しくは毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換を含み、かつ当該抗原結合領域の配列と少なくとも約50％の配列同一性を共有する当該抗原結合領域配列のバリアントのアミノ酸配列を含み、さらに当該抗原結合領域配列又はそのバリアントは、病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配列されかつ適切な向きに配置され、ここで、該エピソームベクターは場合によって誘導性アポトーシス遺伝子を含む。
実施態様2は実施態様1のIP-MSCを含み、ここで前記IP-MSCは、2から約100の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する。
実施態様3は実施態様1又は2のIP-MSCを含み、ここで前記IP-MSCはまた1つ以上の他の免疫調節因子を発現する。
実施態様4は実施態様3のIP-MSCを含み、ここで前記1つ以上の免疫調節因子は、インターロイキン及びインターフェロンから選択される。
実施態様5は実施態様3のIP-MSCを含み、ここで前記1つ以上の免疫調節因子は、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IFNα、IFNβ及びIFNωから選択される。
【００１４】
実施態様6は実施態様1から5のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで各免疫反応性ポリペプチドは完全長抗体、単一鎖可変抗体フラグメント（ScFV）、一価抗体抗原結合フラグメント（Fab）、二価抗体抗原結合フラグメント（F(ab’)2）、ジアボディ及びトリボディから選択される。
実施態様7は実施態様1から6のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで1つ以上の免疫反応性ポリペプチドは抗原結合領域のバリアントのアミノ酸配列を含み、さらにバリアントのアミノ酸配列置換は保存的置換を含む。
実施態様8は実施態様1から7のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで1つ以上の免疫反応性ポリペプチドは抗原結合領域のバリアントのアミノ酸配列を含み、当該バリアントのアミノ酸配列は、当該抗原結合領域の配列と少なくとも約80％の配列同一性を共有する。
実施態様9は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体はウイルス病原体である。
実施態様10は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は細菌病原体である。
実施態様11は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は単細胞寄生生物病原体である。
実施態様12は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は多細胞寄生生物病原体である。
【００１５】
実施態様13は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は、アデノウイルス、パピローマウイルス、へパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、単純ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス及び風疹ウイルスから成る群から選択されるウイルス病原体である。
実施態様14は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は、バシルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、ブルコールデリア属（Burkholderia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、腸球菌属（Enterococcus）、エスケリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、リステリア属（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）及びエルシニア属（Yersinia）から成る群から選択される属由来の細菌病原体である。
【００１６】
実施態様15は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで病原体は、アカントアメーバー（Acanthamoeba）、アニサキス（Anisakis）、アスカリス・ルンブリコイデス（Ascaris lumbricoides）、バランチジウム・コリ（Balantidium coli）、多節条虫亜綱（Cestoda）（サナダムシ）、ツツガムシ、コクリオミイヤ・ホミニボラクス（Cochliomyia hominivorax）、エントアメーバー・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）、ファシオラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）、ギアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、鉤虫、リーシュマニア（Leishmania）、リングアツラ・セルラータ（Linguatula serrata）、肝蛭、ロア糸状虫、肺吸虫（肺蛭）、ギョウチュウ、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、住血吸虫（Schistosoma）、ストロンギロイデス・ステルコラリス（Strongyloides stercoralis）、サナダムシ、トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）、トリパノソーマ（Trypanosoma）、鞭虫及びウケレリア・バンクロフティ（Wuchereria bancrofti）から成る群から選択される寄生生物病原体である。
【００１７】
実施態様16は実施態様1から8のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここで抗原性ポリペプチドは以下から成る群から選択される：インフルエンザヘマグルチニン1（HA1）；インフルエンザヘマグルチニン2（HA2）；インフルエンザノイラミニダーゼ（NA）；ラッサウイルス（LASV）糖タンパク質1（gp1）；LASV糖タンパク質2（gp2）；LASVヌクレオキャプシド関連タンパク質（NP）；LASV Lタンパク質；LASV Zタンパク質；SARSウイルスSタンパク質；エボラウイルスGP2；麻疹ウイルス融合1（F1）タンパク質；HIV-1トランスメンブレン（TM）タンパク質；HIV-1糖タンパク質41（gp41）；HIV-1糖タンパク質120（gp120）；C型肝炎ウイルス（HCV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；HCVエンベロープ糖タンパク質2（E2）；HCVヌクレオキャプシドタンパク質（p22）；西ナイルウイルス（WNV）エンベロープ糖タンパク質（E）；日本脳炎ウイルス（JEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；黄熱ウイルス（YFV）エンベロープ糖タンパク質（E）；ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；G型肝炎ウイルス（HGV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；呼吸系シンクチバルウイルス（respiratory synctival virus）（RSV）融合（F）タンパク質；単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）gDタンパク質；HSV-1 gGタンパク質；HSV-2 gDタンパク質；HSV-2 gGタンパク質；B型肝炎ウイルス（HBV）コアタンパク質；エプスタイン-バーウイルス（EBV）糖タンパク質125（gp125）；細菌外膜タンパク質アッセンブリー因子BamA；細菌転移アッセンブリーモジュールタンパク質TamA；細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質；細菌表面抗原D15；炭疽防御タンパク質；炭疽致死因子；炭疽浮腫因子；腸チフス菌（Salmonella typhii）S1Da；腸チフス菌S1Db；コレラ毒素；コレラ熱ショックタンパク質；ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）抗原S；ボツリヌス毒素；エルシニア・ペスチス（Yersina pestis）F1；エルシニア・ペスチスV抗原；エルシニア・ペスチスYopH；エルシニア・ペスチスYopM；エルシニア・ペスチスYopD；エルシニア・ペスチスプラスミノーゲンアクチベーター因子（Pla）；プラスモジウムサーカムスポロゾイトタンパク質（CSP）；プラスモジウムスポロゾイト表面タンパク質（SSP2/TRAP）；プラスモジウム肝病期抗原1（LSA1）；プラスモジウム輸出タンパク質1（EXP1）；プラスモジウム赤血球結合抗原175（EBA-175）；プラスモジウムシステインリッチ防御抗原（cyRPA）；プラスモジウム熱ショックタンパク質70（hsp70）；住血吸虫Sm29；及び住血吸虫シグナルトランスダクションタンパク質14-3-3。
【００１８】
実施態様17は実施態様1から6のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここでIP-MSCは骨髄由来間葉幹細胞から調製される。
実施態様18は実施態様1から6のいずれか1つのIP-MSCを含み、ここでIP-MSCは脂肪由来間葉幹細胞から調製される。
実施態様19は、病原体による感染症又は毒素曝露による障害状態の治療のための、実施態様1から18のいずれか1つのIP-MSCを含む。
実施態様20は、病原体による感染症の予防又は毒素曝露による障害状態の予防のための、実施態様1から18のいずれか1つのIP-MSCを含む。
実施態様21は、医薬的に許容できる担体中に実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCを含む、病原体によって引き起こされる感染症の治療又は毒素への曝露の治療のための医薬組成物を含む。
実施態様22は、医薬的に許容できる担体中に実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCを含む、病原体によって引き起こされる感染症の予防又は毒素への曝露の作用の緩和のための医薬組成物を含む。
実施態様23は、病原体によって引き起こされる感染症の予防又は毒素への曝露による障害状態の予防のための、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの使用を含む。
実施態様24は、病原体によって引き起こされる進行中の感染症の治療又は毒素への曝露の影響の緩和のための、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの使用を含む。
【００１９】
実施態様25は、病原体によって引き起こされる感染症の治療用又は毒素への曝露の影響の緩和用医薬組成物の製造のための、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの使用を含む。
実施態様26は、病原体によって引き起こされる感染症の予防用又は毒素への曝露による障害状態の予防用医薬組成物の製造のための、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの使用を含む。
実施態様27は、病原体によって引き起こされる感染症を治療するか又は毒素への曝露を治療する方法を含み、前記方法は、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの治療的に有効な投薬量を対象に投与する工程を含む。
実施態様28は、病原体によって引き起こされる感染症を予防するか又は毒素への曝露による障害状態を予防する方法を含み、前記方法は、実施態様1から20のいずれか1つのIP-MSCの予防的投薬量を対象に投与する工程を含む。
【００２０】
実施態様29は、病原体によって引き起こされる疾患の流行を治療若しくは予防するか、又は毒素への曝露を緩和する方法を含み、前記方法は、病原体又は毒素に曝露されるか若しくは暴露されるリスクを有する対象に免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）を投与する工程を含み、ここで、前記IP-MSCは、当該病原体又は毒素を特異的に標的とする少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされ、各免疫反応性ポリペプチドは、当該病原体又は毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域を含むか、又は当該抗原結合領域のバリアントをコードし、前記バリアントは当該抗原結合領域のアミノ酸配列に1つ以上の置換を含み、かつ当該中和抗体の抗原結合領域と少なくとも50％の配列同一性を共有する。
実施態様30は実施態様29の方法を含み、前記方法は、少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターを初代間葉幹細胞にトランスフェクトする追加の工程を含む。
実施態様31は実施態様30の方法を含み、前記方法は、初代MSCにトランスフェクトする前に、当該病原体の疾患又は毒素曝露の1人以上の生存者から入手した1つ以上の血液サンプルの当該病原体又は毒素に対する中和抗体を同定する追加の工程を含む。
【００２１】
実施態様32は実施態様29から31のいずれか1つの方法を含み、前記方法は、初代MSCにトランスフェクトする前に、少なくとも2つ以上の免疫反応性ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードする1つ以上のエピソームベクターを調製する追加の工程を含む。
実施態様33は実施態様29から32のいずれか1つの方法を含み、ここでIP-MSCは請求項1から20のいずれか1つから選択される。
実施態様34は、病原体によって引き起こされる疾患の流行を治療若しくは予防するか、又は毒素への曝露を緩和するために予防用若しくは治療用間葉幹細胞を調製する方法を含み、前記方法は、少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターを初代間葉幹細胞にトランスフェクトして免疫反応性ポリペプチドを発現する免疫防御初代間葉幹細胞を作製する工程を含み、前記免疫反応性ポリペプチドは、当該病原体又は毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸を含むか、又は当該抗原結合領域配列のバリアントをコードし、ここで前記バリアントは当該抗原結合領域のアミノ酸配列に1つ以上の置換を含み、かつ当該中和抗体の抗原結合領域配列と少なくとも50％の配列同一性を共有する。
実施態様35は実施態様34の方法を含み、前記方法は、初代MSCにトランスフェクトする前に、当該病原体の疾患又は毒素曝露の1人以上の生存者から入手した血液サンプルの当該病原体又は毒素に対する中和抗体を同定する追加の工程を含む。
【００２２】
実施態様36は実施態様34又は実施態様35の方法を含み、前記方法は、初代MSCにトランスフェクトする前に、少なくとも2つ以上の免疫反応性ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードする1つ以上のエピソームベクターを調製する追加の工程を含む。
実施態様37は実施態様34から36のいずれか1つの方法を含み、ここでIP-MSCは実施態様1から20のいずれか1つから選択される。
実施態様38は、免疫防御ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードするエピソームベクターを含み、ここで、各免疫反応性ポリペプチドは、病原体によって産生される抗原に特異的な若しくは毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換を含み、かつ当該抗原結合領域の配列と少なくとも約50％の配列同一性を共有する当該抗原結合領域配列のバリアントのアミノ酸配列を含み、当該抗原結合領域配列又はそのバリアントは、病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配列され、さらにエピソームベクターは場合によって誘導性アポトーシス遺伝子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】完全長IgG抗体、ScFV、タンデムジアボディ及びトリボディの模式図を提供する。
【図２】本明細書に記載の初代MSCにトランスフェクトされるエピソームベクターの模式図（パネルA）及びヒト抗LASV MAb GP19.7Eを発現させるためにヒト脂肪MSCのトランスフェクションに用いられる二シストロン性ベクター（パネルB）を示す。
【図３】ヒト抗LASV IgGMAb GP10.4B（配列番号:1）及びヒト抗LASV MAb GP19.7E（配列番号:1）の重鎖のヌクレオチド配列を示す。
【図４】ヒト抗LASV IgG MAb GP10.4B（配列番号:3）及びヒト抗LASV MAb GP19.7E（配列番号:4）の軽鎖のヌクレオチド配列を示す。
【図５】ヒト抗LASV IgG MAb GP10.4B（HC：配列番号:5；LC：配列番号:7）及びヒト抗LASV MAb GP19.7E（HC：配列番号:6；LC：配列番号:8）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図６】無抗体培養液処置コントロールモルモットと比較した、ヒト抗LASV IgG MAb GP10.4B及びヒト抗LASV MAb GP19.7E処置モルモットのLASV感染後日数に対する生存動物の百分率のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に記載する免疫防御初代間葉幹細胞は、問題の病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する。各免疫反応性ポリペプチドは、病原体によって産生される抗原に特異的な又は毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換を含み、かつ当該抗原結合領域と少なくとも約50％の配列同一性を共有する当該抗原結合領域のバリアントのアミノ酸配列を含む。該抗原結合領域又はそのバリアントは、すなわちIP-MSCを病原体又は毒素と接触させるときに（例えばIP-MSCを対象に投与し、対象が病原体又は毒素に曝露されるときに）、該病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配列され、かつ適切な向きに配置される。バリアント内の置換は、保存的置換又はいくつかの事例では非保存的置換を含むか又は前記から成り、前記置換は、手を加えられていない抗原結合領域と対比してバリアントの結合親和性又は結合選択性を強化するか、又は当該免疫反応性ポリペプチドの1つ以上の特性（例えば物理的、化学的又はコンフォーメーション特性）を改善し強化し或いは前記に所望の影響を与えることができる。
【００２５】
IP-MSCは潜在的には、中和抗体を同定し得るいずれの病原体又は毒素にも利用できる。本明細書に記載するIP-MSC及び方法は、病原体又は毒素に対して比較的迅速に利用できるが短期間である（1ヶ月又は2ヶ月まで）受動免疫の提供に特に有用である。そのような病原体にはウイルス、細菌寄生生物（単細胞及び多細胞性寄生生物）などが含まれる。例えば、IP-MSCは、病原体又は毒素の意図的又は偶発的放出の事例で防御薬剤として利用できる。さらにまた、個々の病原性ウイルス（例えばLASV、エボラウイルス、デングウイルス）、細菌（発疹熱リケッチア（Rickettsia typhi）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ボレリア属の種（Borrelia spp.）、コレラ菌（Vibrio cholerae）など）、又は寄生生物（プラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニア、住血吸虫など）に対抗するIP-MSCは、当該病原体の流行地域を旅行する対象の一時的防御として、又は入院患者が通常的に感染する感染症（例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus Aureus）、緑膿菌（Psuedomonas Aeruginosa）、バンコマイシン耐性腸球菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）など）の予防のために用いることができる。
MSCに関連して考案される治療薬で重要な寄与要件は、MSCの単離及び培養でのエキスパンジョンの容易さである。理論的には、その固有のエキスパンジョン性能の故にMSCのためのただ1回の骨髄採集が数千の臨床利用に十分なMSCを提供できる（Newman et al., 2009）。そのようなエキスパンジョンの潜在能力は、臨床に適用されるMSCの使用についてGMPに関する製造性能を大いに強化し、さらに他の細胞タイプと比較したとき製造コストを減少させる。
【００２６】
本明細書で用いられるように、“免疫反応性ポリペプチド”という用語及びその文法的変化形は、問題の病原体又は毒素に対する中和抗体の抗原結合領域、又は当該病原体又は毒素に対する特異性を維持するが手を加えられていない当該アミノ酸配列中の1つ以上の置換（例えば保存的置換）の存在によって当該手を加えられていない抗体構造と相違する抗原抗体領域のバリアントをコードするペプチドを含むポリペプチドを指す。免疫反応性ポリペプチドの非限定的な例には、完全長抗体（例えばIgG抗体）、そのような完全長抗体の抗原結合領域、及び抗原と結合するように配列され適切な向きに配置されてあるそのような抗体の1つ以上の相補性決定領域（CDR）が含まれる。機能的な抗原結合抗体フラグメントにはFab、F(ab')2、Fv、ScFV、ジアボディ、及びトリボディポリペプチドが含まれる。
本明細書で用いられるように、“抗原結合領域“という用語は、抗原と結合する抗体の部位を指す。抗原結合領域は重鎖及び軽鎖可変ドメイン（VH及びVL）で構成され、前記の各々は4つの保存されたフレームワーク領域（FR）及び3つのCDRを含む。CDRは配列が多様であり、個々の抗原に対して抗体の特異性を決定する。VH及びVLドメインは一緒になって、個々の抗原と特異的に結合する部位を形成する。
【００２７】
Fab（抗原結合フラグメント（fragment antigen binding）の略）抗体フラグメントは、重鎖可変領域（VH）及び重鎖定常領域1（CH1）部分から成るポリペプチド並びに軽鎖可変領域（VL）及び軽鎖定常（CL）部分から成るポリペプチドで構成される抗体の一価抗原結合ドメインを含む免疫反応性ポリペプチドであり、前記ではCL及びCH1は、好ましくはCys残基間でジスルフィド結合によって一緒に結合される。
Fv抗体フラグメントは、VH及びVLドメインを含むダイマーである。
F(ab')2フラグメントは2つのFab型ポリペプチドで構成され、前記はそのCH1部分間でジスルフィド架橋によって一緒に結合される。
ScFV（“単一鎖可変フラグメント（single chain fragment）”又は“単一鎖抗体（single chain antibody）”の略）はVL及びVHペプチドを含む免疫反応性ポリペプチドであり、前記VL及びVHは、それらVL及びVHが抗原結合立体配置で会合できるように十分な長さ（一般的には約15アミノ酸の長さ）を有する可撓性で一般的には親水性の連結ペプチドによって一緒に継ぎ合わされる。1つの一般的な可撓性連結ペプチドは(Gly4Ser)3である。場合によって、VH及びVLの会合は1つ以上の分子内ジスルフィド結合によって安定化される。
【００２８】
本明細書で用いられるようにかつ当業界で一般的に理解されているように、“ジアボディ”という用語は、（a）短いペプチド又は2つのScFV間（例えばVL部分との間）の結合によって一緒に連結されてタンデムダイマーScFVを形成する2つのScFVを含むか、又は（b）2つのScFV様ポリペプチドを含む複合体であって、前記複合体では連結ペプチドが短すぎて同じポリペプチド鎖のVL及びVH間の直接的相互作用が不可能であり、したがって2つのそのような分子はダイマーとして分子間で会合しなければならない免疫反応性ポリペプチドを指す。ジアボディのこの2つの抗原結合ドメインは同じ抗原又は2つの異なる抗原に特異的であってもよい。
本明細書で用いられるようにかつ当業界で一般的に理解されているように、“トリボディ”という用語は、3つのScFV様抗原結合ドメインを含む免疫反応性ポリペプチドを指す。構造的には、トリボディは、ジスルフィド架橋によって一緒に結合される2つのポリペプチド鎖で構成されるダイマーであり、ここで、第一のポリペプチドはまた別のVLドメインとCLポリペプチド鎖を介して連結されるScFVを含み、第二のポリペプチドはまた別のVHドメインとCH1ポリペプチド鎖を介して連結されるScFVを含む。ジスルフィド架橋はCLのCys残基とCH1のCys残基との間で形成され、したがって第一のポリペプチドの当該また別のVLは第二のポリペプチド当該また別のVHと抗原結合立体配置で会合し、したがってトリボディは全体として3つの抗原結合ドメインを含む。トリボディの3つの抗原結合ドメインは、同じ抗原又は2つ若しくは3つの異なる抗原と特異的であり得る。
図1は、上記で考察した完全長IgG抗体、ScFV、タンデム型ジアボディ及びトリボディを模式的に示す。
【００２９】
“a”、“an”及び“the”という用語並びに同様な指示語は、本発明を記述する文脈では（特に上記の特許請求の範囲の文脈では）、本明細書で特段の指示がなければ又は文脈によって明瞭な矛盾が生じなければ単数及び複数の両方を包含すると解されるべきである。“含む（comprising）”、“有する（having）”、“含む（including）”及び“含む（containing）”という用語は、特段の記載がなければ末端開放用語（すなわち“〜を含むが、ただし前記に限定されない”）と解されるべきである。本明細書で値の範囲の記載は、本明細書で特段の指示がなければ、当該範囲内に入る各々別々の値を個々に指すための便法として利用することを単に意図し、それぞれ別個の値は、それが個々に本明細書に列挙されているかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載する全ての方法が、本明細書で特段に指示されなければ又は文脈によって明瞭な矛盾が生じなければ任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例又は例示の文言（例えば“such as（例えば）”）の使用は単に本発明をより良く例示することを意図し、特段の請求がなければ本発明の範囲を限定しようとするものではない。本明細書のいずれの文言も、特許請求されていない成分を本発明の実施に必須であると主張していると解されるべきではない。
【００３０】
好ましくは、該免疫防御ポリペプチドは、天然に存在する（手を加えられていない）抗体の抗原結合領域と少なくとも約50％の配列同一性（例えば天然に存在する抗体の抗原結合領域と少なくとも約55、60、65、70、75、80、85、90、95、98又は99％の配列同一性）を共有する。本明細書で用いられるように、“天然に存在する抗体”、“手を加えられていない抗体”及びその文法的変化形は問題の病原体又は毒素に特異的な抗体を指し、前記は当該病原体又は毒素に曝露された対象の血液サンプルで同定される。
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得るウイルス病原体の非制限的な例には以下が含まれる：アデノウイルス、パピローマウイルス、へパドナウイルス（例えばB型肝炎）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、単純ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス（例えばエボラウイルス及びマールブルグウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス（RSV）、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス及びヒトメタニューモウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザA、インフルエンザB及びインフルエンザC）、ラブドウイルス（例えばリッサウイルス（狂犬病ウイルスとしても知られている））、アレナウイルス（例えばラッサウイルス）、コロナウイルス（重篤な急性呼吸器症候群（SARS））、ヒトエンテロウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1））、ロタウイルス、フラビウイルス（例えば西ナイルウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス）、ヘパシウイルス（例えばC型肝炎ウイルス）、及び風疹ウイルス。
【００３１】
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得る細菌病原体の非制限的な例には以下から選択される属の任意の病原性細菌種が含まれる：バシルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、ブルコールデリア属、カンピロバクター属、クラミジア属、クラミドフィラ属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、腸球菌属、エスケリキア属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、トレポネーマ属、ビブリオ属及びエルシニア属。
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得る寄生生物病原体の非制限的な例には、単細胞及び多細胞寄生生物、例えば以下が含まれる：アカントアメーバー、アニサキス、アスカリス・ルンブリコイデス、バランチジウム・コリ、多節条虫亜綱（サナダムシ）、ツツガムシ、コクリオミイヤ・ホミニボラクス、エントアメーバー・ヒストリチカ、ファシオラ・ヘパチカ、ギアルジア・ランブリア、鉤虫、リーシュマニア、リングアツラ・セルラータ、肝蛭、ロア糸状虫、肺吸虫（肺蛭）、ギョウチュウ、熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）、住血吸虫、ストロンギロイデス・ステルコラリス、サナダムシ、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ、鞭虫及びウケレリア・バンクロフティ。
【００３２】
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得るウイルス抗原の非制限的な例には以下が含まれる：インフルエンザポリペプチド、例えばヘマグルチニン1（HA1）、ヘマグルチニン2（HA2）及びノイラミニダーゼ（NA）；ラッサウイルス（LASV）ポリペプチド、例えばLASV糖タンパク質1（gp1）、LASV糖タンパク質2（gp2）、LASVヌクレオキャプシド関連タンパク質（NP）、LASV Lタンパク質及びLASV Zタンパク質；SARSウイルスポリペプチド、例えばSARSウイルスSタンパク質；エボラウイルスポリペプチド、例えばエボラウイルスGP2；麻疹ウイルスポリペプチド、例えば麻疹ウイルス融合1（F1）タンパク質；HIV-1ポリペプチド、例えばHIVトランスメンブレン（TM）タンパク質、HIV糖タンパク質41（gp41）、HIV-1糖タンパク質120（gp120）；C型肝炎ウイルス（HCV）ポリペプチド、例えばHCVエンベロープ糖タンパク質1（E1）、HCVエンベロープ糖タンパク質2（E2）、HCVヌクレオキャプシドタンパク質（p22）；西ナイルウイルス（WNV）ポリペプチド、例えばWNVエンベロープ糖タンパク質（E）；日本脳炎ウイルス（JEV）ポリペプチド、例えばJEVエンベロープ糖タンパク質（E）；黄熱ウイルス（YFV）ポリペプチド、例えばYFVエンベロープ糖タンパク質（E）；ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）ポリペプチド、例えばTBEVエンベロープ糖タンパク質（E）；G型肝炎ウイルス（HGV）ポリペプチド、例えばHGVエンベロープ糖タンパク質1（E1）；呼吸系発疹ウイルス（RSV）ポリペプチド、例えばRSV融合（F）タンパク質；単純ヘルペスウイルス1（HSV）ポリペプチド、例えばHSV-1 gDタンパク質、HSV-1 gGタンパク質、HSV-2 gDタンパク質及びHSV-2 gGタンパク質；B型肝炎ウイルス（HBV）ポリペプチド、例えばHBVコアタンパク質；並びにエプスタイン-バーウイルス（EBV）ポリペプチド、例えばEBV糖タンパク質125（gp125）。
【００３３】
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得る細菌抗原の非制限的な例には以下が含まれる：外膜タンパク質アッセンブリー因子BamA；転移アッセンブリーモジュールタンパク質TamA；ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質；多様な細菌種の細菌表面抗原D15；炭疽菌（Bacillus anthracis）ポリペプチド、例えば炭疽防御タンパク質、炭疽致死因子及び炭疽浮腫因子；腸チフス菌ポリペプチド、例えばS1Da及びS1Db；コレラ菌ポリペプチド、例えばコレラ毒素及びコレラ熱ショックタンパク質；ボツリヌス菌ポリペプチド、例えば抗原S及びボツリヌス毒素；並びにエルシニア・ペスチスポリペプチド、例えばF1、V抗原、YopH、YopM、YopD及びプラスミノーゲンアクチベーター因子（Pla）。
本明細書に記載するIP-MSCによって産生される免疫防御ポリペプチドが標的とし得る寄生生物抗原の非制限的な例には以下が含まれる：マラリア原虫（プラスモジウム）ポリペプチド、例えばサーカムスポロゾイトタンパク質（CSP）、スポロゾイト表面タンパク質（SSP2/TRAP）、肝病期抗原1（LSA1）、輸出タンパク質1（EXP1）、赤血球結合抗原175（EBA-175）、システインリッチ防御抗原（cyRPA）、及びプラスモジウム熱ショックタンパク質70（hsp70）；並びに住血吸虫ポリペプチド、例えばSm29及びシグナルトランスダクションタンパク質14-3-3。
【００３４】
好ましくは、IP-MSCは非経口的に（例えば静脈内、皮下若しくは筋肉内注射又は輸液）投与される。IP-MSCは、溶液、懸濁物又は乳濁物として医薬的に許容できる担体ベヒクル（例えば無菌的な水、食塩水、デキストロース溶液、リン酸緩衝食塩水及び生きた幹細胞の投与に適切な類似の素材）と一緒にして処方することができる。場合によって、等張性（例えばマンニトール）又は化学的安定性（例えば保存料）を維持する添加物を当該担体に加えることができる。
本明細書で用いられるように、“治療的に有効な投薬量”は、投与されたときにIP-MSCが既存の疾患徴候の減少又は排除をもたらすことができる量（例えばIP-MSCの数）である（例えば約100,000から約100,000,000細胞）。対象に投与される投薬量及び用量数（例えば一用量又は複数用量）は、多様な因子（投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、併用治療、処置の頻度及び所望される効果、IP-MSCによって発現される抗原ポリペプチドの実体及び数などを含む）に応じて変動するであろう。投薬量範囲の確定における調整及び操作並びに個体の治療有効性のin vitro及びin vivo決定方法は、医療関係業者の能力の範囲内である。
“予防的投薬量”は、投与されたときにMSCが、前記IP-MSCによって発現されるポリペプチドを誘導した病原体による感染症を予防できる量である（例えば約100,000から約100,000,000細胞）。対象に投与される投薬量及び用量数（例えば一用量又は複数用量）は多様な因子（投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、併用治療、処置の頻度及び所望される効果、IP-MSCによって発現される抗原ポリペプチドの実体及び数などを含む）に応じて変動するであろう。投薬量範囲の確定における調整及び操作並びに個体の予防有効性のin vitro及びin vivo決定方法は、医療関係業者の能力の範囲内である。
【００３５】
本明細書で用いられるように、“エピソームトランスフェクト”という用語及びその文法的変化形は、非改変染色体DNAを有する細胞を作製する、外因性エピソームDNA（例えばプラスミド又は他のエピソームベクター）の非組み込みトランスフェクションを指し、前記細胞では、当該DNAによってコードされるポリペプチドはMSC内でエピソームとして（すなわち当該外因性DNAのゲノム組み込みは生じない）発現される。本明細書で用いられるように、“エピソーム”及びその文法的変化形は、核内で複製する閉環状DNA分子を指し、前記用語はMSCに導入される外因性プラスミドを包含することが意図される。好ましくは、初代MSCが抗原性ポリペプチドをコードするプラスミドをトランスフェクトされ、さらに好ましくは調節エレメント（例えばプロモーター）もまたコードされて、当該抗原性ポリペプチドのエピソーム発現が促進される。場合によって、MSCにはまた誘導性アポトーシス遺伝子をエピソームトランスフェクトして、適切なシグナル（例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを用いてアポトーシス遺伝子の転写を作動させるテトラサイクリン制御転写活性化（“Tet-on又はTet-off”とも呼ばれる）が利用される）で活性化したときに細胞死（アポトーシス）を誘導し、望ましいか又は必要な場合には（例えば望ましくない副作用が発生する場合）、IP-MSCを対象から排除することができる。“エピソームベクター”という用語は、抗原性ポリペプチドをコードするプラスミド又は他の環状DNAを含む発現ベクターを指す。
【００３６】
任意の適切な方法論によって初代MSCにエピソームトランスフェクトすることができる。例えば、抗原性ポリペプチドをコードするプラスミドをエレクトロポレーション、リポフェクションなどを用いて初代MSCにトランスフェクトすることができる。エレクトロポレーションが、陽イオン脂質を利用する他のトランスフェクション（すなわちリポフェクション）と異なり好ましい方法である。なぜなら後者の方法は、デリバリーのためにMSCを処理するときに完全には除去し得ない残留脂質がトランスフェクション後に存在することがあり、予期せぬ副作用をもたらし得るからである。
真核細胞（すなわち初代MSC）のトランスフェクションのために非組み込みベクターとして使用される適切なエピソームベクターの非限定的な例には、シミアンウイルス40系ベクター、エプスタイン-バーウイルス系ベクター、パピローマウイルス系ベクター、BKウイルス系ベクターなどが含まれ、前記は分子遺伝学分野でよく知られている。
【００３７】
本明細書に記載されるものはまた、病原性疾患を治療若しくは予防するか又は毒素への曝露を軽減する方法であり、前記は本明細書に記載するIP-MSCを利用する。ある方法の実施態様は以下の工程を含む：場合によって、病原性疾患又は毒素曝露の1人以上の生存者の血液サンプルで識別された病原体又は毒素に対する中和抗体を同定する工程；当該病原体又は毒素に特異的な中和抗体（例えば工程（a）で同定された抗体）の抗原結合領域を含むか、又は当該抗原結合領域のバリアントをコードする、少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターを初代間葉幹細胞にトランスフェクトして、免疫反応性ポリペプチドを発現するIP-MSCを作製する工程；及び該病原体又は毒素に曝露されたか又は暴露されるリスクがある対象に該IP-MSCを投与する工程。該バリアントは、利用される場合には当該抗原結合領域のアミノ酸配列に1つ以上の置換を含み、好ましくは当該中和抗体の抗原結合領域と少なくとも50％の配列同一性を共有する。
【００３８】
抗体及び免疫分子の選択並びに設計
病原性因子又は毒素に曝露された生存者の免疫細胞の輸送のための高等な方法：血液サンプル由来末梢血単核球（PBMC）の単離及び冷凍保存は、事実上あり得るかぎり多くのB細胞の完全性を保全し、最終的な回収及び豊かでかつ稀少な特殊性の性状分析を担保するはずである。概念の立証として、西アフリカの臨床研究拠点（Kenema Government Hospital, Sierra Leone and Irrua Specialist Teaching Hospital, Nigeria）の回復期のラッサ熱（LF）患者を最新の組換えタンパク質による免疫診断学を用いて同定する。十分なインフォームドコンセントを得た後で、全血を採取し、寄贈された完全装備の細胞培養一式でPBMCを単離する。確立された緩衝液（RPMI/20％FBSΔ/10％DMSO）及び方法（約-80℃の最終温度まで約-1℃の冷却速度/分、＞5ｘ106細胞/バイアル）を用いてPBMCを冷凍保存する（前記は、融解後に高度に生命活性を有する細胞培養を生じる）。IATA承認の低温容器で更なる処理のためにサンプルを迅速に米国へ輸送する。凍結保存前のB細胞の数及びパーセンテージは、各単離手順においてPBMC及び特にB細胞（CD19+, CD20+）、T細胞（CD3+, CD 4+, CD 8+）、NK細胞（CD16+, CD 56+）及び単球（CD14+, CD 16+）の総数を決定することによって、現場で定量的フローサイトメーター（高度に持ち運び可能なBD ACCURIC6サイトメーターの補助による）により判定される。前記手順は融解に際して繰り返し、PBMC及び細胞サブセットの損失率を決定する。類似の手順を最近の感染が報告された対象のPBMCによって産生された他の抗体（例えばインフルエンザ抗体）の同定に利用することができる。適切な場合には、インフルエンザの事例のように、凍結保存を無視して新鮮血採取物からB細胞を単離してもよい。
【００３９】
病原体又は毒素の回復期にある指標患者のマイクロバイオームの迅速な決定方法：MSC遺伝子デリバリープラットフォームは、高度に伝播性の疾患に対抗する高リスク団（戦闘員、第一線対応者など）のための防火帯として迅速に配置され得ることを示すために、シエラレオネ又はナイジェリアで同定された新規病原体をモデルとして使用する。前記は、意図的放出又は偶発的放出病原体又は毒素と同様に、例えば出所が既知又は未知の病原体又は毒素に曝露されてから約2から3週間後にアクセスし得る患者のシナリオに極めて近似するか又は模倣する。
微生物メタゲノム解析（微生物核酸の偏りのない性状分析）は、未知の生物的脅威から回復しつつある患者で伝染性病原体を迅速に同定することができる。臨床サンプルに存在する微生物は、典型的には培養によって又は標的を定めた分子的アプローチ（例えばPCR又は抗原捕捉）によって同定される。培養には多くの時間がかかり、さらに多くの微生物が簡単にはin vitroで培養できない。標的を定めるアプローチもまた当該生物に関するアプリオリな情報を必要とするので欠点を有する。シエラレオネ及びナイジェリアの原因不明発熱（FUO）サンプルでは、微生物に関する判読の約30％はGENBANKデータベースで一致を示さない。本明細書に記載する技術は鋭敏であり（すなわち内因性微生物の多岐にわたる混合物で低コピー病原体を検出できる）、かつ計測可能である（すなわち極めて多数の患者サンプルを迅速に調査することができる）。ナノグラムに準じる量のRMAを用いる改善された分子的イルミナ・シーケンシングライブラリー構築方法を開発する。従来のライブラリー構築方法をスケールアップし、それによって数百のサンプルを並行して処理することができる。大量の次世代シーケンシングデータセットに存在する全ての微生物を迅速に同定できるバイオインフォーマティクスパイプラインを開発する。これらの方法を適所で用い、未知のウイルスから約2日以内に、未知の細菌から約4日以内に完全なゲノムがアッセンブリーされる。
【００４０】
病原体のビルレンス決定基（例えばウイルスの侵入糖タンパク質又は毒素）を同定するコンピュータプログラム：ビルレンス因子は、微生物がヒトの中でそれ自体を確立して疾患を引き起こすその性能を強化することを可能にするタンパク質（すなわち遺伝子生成物）を指す。以前には未知であった生物のビルレンス因子を大量のメタゲノム解析データセットから迅速に同定することができるバイオインフォーマティクス及びコンピュータ支援パイプラインを開発する。前記は、公開されているビルレンス因子データベース（MvirDB , Tox-Prot, SCORPION, PRINTSビルレンス因子, VFDB, TVFac, Islander, ARGO及びVIDAのサブセット）を大いに利用し、新規に完成させたゲノム配列データに対してビルレンス因子の迅速な（数時間以内）同定を可能にする。複数の実験を実施して防御抗体の標的となり得るビルレンス因子を正確に同定する当該プログラムの能力を確認する。
【００４１】
防御抗体：MACSセパレーター（Miltenyi Biotec）及び例えばαCD2、CD4、CD11b、CD16、CD36、αIgE、CD235aなどを被覆した磁性ビーズを用いて、PBMCから非B細胞を枯渇させることによってB細胞を濃縮する。フルオロクロムで標識した組換えビルレンス決定基（例えばLASV GP又はインフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA））と結合する抗原特異的循環メモリーB細胞をフローサイトメトリーで仕分けし、一細胞密度で96ウェルプレートに直接分配する。単一細胞からRNAを単離し（Norgen Biotek, Qiagen）、cDNAに逆転写し、続いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を増幅する。注文設計オリゴは、特許ベクターで重鎖及び軽鎖遺伝子を直接クローニングして完全なヒトモノクローナル抗体としての発現を可能にするか（CHOLCelectTM, 米国特許US8076102（Luis M Branco et al.）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））、又は単一鎖、ジアボディ又はトリボディとして再操作して大腸菌（E. coli）培養から迅速に発現及び精製することを可能にする。ビルレンス決定基（GP又はHA）との結合に関するELISA又は病原体中和（偽粒子系）アッセイを用いて潜在的防御抗体を迅速に同定する。所望の特性を有する抗体を本明細書に記載するポリクローナル発現ベクターでクローニングし、生ウイルス中和アッセイで単一特異性として試験し、より相関性を有するin vitroの生物学的な系で性能を立証する。
【００４２】
不適切に組み合わされたキメラ抗体の形成を回避する方法：もっとも広範囲に適用でき、防御性でありかつ逸出変異体耐性のプラットフォームの開発を担保するために、オリゴクローン抗体設計を実施する。この目的のために、望ましい中和特性をディスプレーする各抗体を完全長及び単一鎖（ScFV）型として試験する。多くのScFVが、極めて重要な抗原結合CDRの忠実な表示により親の全IgG特性を保全する。また別に、治療用使用のために、発現ベクタープラットフォームにジアボディ及びトリボディの組み合わせを取り込ませることができる。このIgG/ScFVオリゴクローンアプローチは、2つ以上の抗体が一MSC内で発現されるときに不適切に混合された重鎖及び軽鎖が生成されるのを防止するであろう。いくつかの実施態様では、所望レベルの治療性能が、いくつかのScFV及び1つの完全長抗体を組み込むことによって達成される（前記抗体についてはエフェクター機能が同定されるか、又は単一鎖バリアントへの変換時に性能が失われ得る）。
【００４３】
核酸構築物の選別及び設計
チャレンジに対する防御のために十分な発現レベル及び発現持続を可能にするベクターの設計：非感染性、非組み込み性のマルチコピー環状エピソームを用いて、複数の（潜在的には数百の）細菌、ウイルス、カビ、又は寄生生物のタンパク質又はタンパク質類毒素に対する、防御性の完全にヒトの単一鎖抗体フラグメント、完全長IgG又は他の免疫防御ポリペプチドを同時に発現する（IgG、ScFV、ジアボディ及びトリボディ型免疫調節物質を例示する図1を参照されたい）。いくつかの好ましい実施態様では、エピソームは、エプスタイン-バーウイルス（EBV）核抗原1発現カセット（EBNA1）及びOriP複製起点から誘導された成分を土台にする。これらは、好ましくは使用されるEBV成分のみであり、したがってウイルスは複製もアッセンブリーもされない。この系は、間葉幹細胞での安定な染色体外存続及び長期異所性遺伝子発現をもたらす。本明細書に記載する方法では、ScFV又は他の免疫反応性ポリペプチドは、MSCで効果的に発現されMSCから防御的な量で分泌される。概念の立証として、hADMSCで完全長のLASV中和抗体が発現されている。EBV系エピソームがヒト細胞で非常に大量のヒトゲノムDNAフラグメント（＞300kb）を導入し維持する能力は、本明細書に記載する方法における別の重要な利点である。この特色は、細菌で複製可能で大規模精製に適したベクターでの何ダースもの発現エレメントのクローニング、hMSCへのトランスフェクション、及びエピソームプラスミドとしての複製を可能にする。免疫反応性ポリペプチド（例えばScFV）の目標とされる発現レベルは、各免疫反応性ポリペプチドについて約10pg/細胞/日、好ましくは5pg/細胞/日の発現レベルである。各免疫反応性ポリペプチドについて生成率が10pg/細胞/日である約1ｘ1011のMSCの輸液は、1日当たり約1グラムの可溶性ポリペプチドを生成し、これは75Kgの成人の循環中で15mg/mLに匹敵し、これは適切な治療用投薬レベルである。各タイプの免疫調節分子の発現を駆動するために、プロモーター及び他の調節エレメントが用いられる。
【００４４】
文献のいくつかの報告は、よく性状分析されたプロモーターによるMSCでの非古典的発現パターンを指摘している。ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子プロモーター（CMV-MIE）は既知の最強プロモーターの1つであり、1リットル当たり何グラムもの組み換えタンパク質薬を生成する安定な哺乳動物細胞株の作製で主要な成分である。しかしながら、CMV-MIEはMSCでは比較的転写が貧弱である。対照的に、EF1A、UBC及びCAGGプロモーターは、明瞭な徴候又はプロモーターサイレンシング無しにMSCで高レベルの発現を示した。本明細書に記載する方法で用いられるエピソームベクターはそのようなプロモーターのいずれかを含むことができる。図2のパネルAは、pEBV MSCエピソームベクターの代表的で非限定的な例を提供する。抗生物質選別マーカーを含まない発現ベクターもまた大腸菌でのプラスミドのエキスパンジョンのために提供される。当該エピソームプラスミドのこの複製にかかわる性向は、抗生物質耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊する制限エンドヌクレアーゼによるその線状化を不可能にする。したがって、遺伝子再配列が抗生物質耐性遺伝子の発現をもたらし、選別事例においてヒトで望ましくない抗生物質耐性媒介副作用を生じるかもしれないことが考えられる。このシナリオは、大腸菌株でのプラスミドの成長及び増殖のために必要又は所望される場合は、抗生物質耐性遺伝子を代謝選別性マーカーで代用することによって回避できる。
【００４５】
個々の治療用分子の目標とされる発現レベル及びシャットオフのための調節エレメントの設計：ベクター中の調節エレメントを利用して、問題の各免疫調節分子の所望される分泌レベル及び血清レベルを調整する。完全長抗体、ScFV又は他の免疫反応性ポリペプチドの発現は強力なプロモーター（例えばCMV、EF1A、CAGGなど）による利益を享受し、MSCの投与後1日未満で治療的血清レベルを達成する。他の免疫調節分子（例えばサイトカイン）は、しばしば低レベルでかつ一過性にMSCによって発現及び分泌される。要求される柔軟性を本質的に異なる発現レベル及びタイミングで調整するために、該当遺伝子は低基礎量プロモーター（すなわちTK）により駆動されるか、又はTet on/offプロモーターにより制御誘導を介して駆動される。Tetプロモーター系は、無害な抗生物質アナローグ（例えば無水テトラサイクリン（前記はテトラサイクリンよりも2log以下の濃度でTetプロモーターを活性化する））の使用により利益を享受し、腸内菌叢の調節不良をもたらさず、ポリケチド抗生物質耐性を生じず、抗生物質活性を示さない。無水テトラサイクリンは完全に水溶性であり、飲水中で投与してトランスフェクトされたMSC中の選別遺伝子の活性化を高めることができる。無水テトラサイクリンの潜在的毒性（ヒト体内の最初の分解生成物）は、他のアナローグ（例えばドキシサイクリン（前記はまたTet on/offプロモーター系を活性化するFDA承認テトラサイクリンアナローグ））を投与することによって回避することができる。この系はもっぱらフェイルセーフ“殺滅スイッチ”の設計で利用され、前記では、強力なプロアポトーシス遺伝子（例えばBax）の誘導性発現が厳密に調節されて、不利な副作用事象で又は所望の治療目標が達成されたときにトランスフェクトMSCに標的を定めたアポトーシスが開始される。Tet-on系の最近の進歩は、本来のTet系の場合よりも100倍まで低い濃度のDoxに対してはるかに強化されたプロモーター漏出性及び応答性の抑制をもたらした（Tet-On AdvancedTM, Tet-On 3GTM）。薬剤選別性マーカーは、トランスフェクトMSC:EBV系ベクターでのベクター安定性の維持には用いられない（前記は複製し細胞周期毎に嬢細胞で90−92％の割合で維持されることが知られている）。
【００４６】
ベクターの安全性/免疫原性の研究：エピソームは複製性ウイルスを産生せず、それらベクターを発現する細胞は有意な量ではMHCを全く生成しないので、エピソームは、当該プラットフォームのその後の個体での使用を妨げることとなるベクター由来免疫を生じない。このことは、エプスタイン-バーウイルス（EBV）核抗原１発現カセットに由来する成分及びMSCバックグラウンド（HLA型）に対する免疫応答を検出するための鋭敏なアッセイ（抗体ELISA及びT細胞系アッセイ）を設計することによって確認できる。遺伝学的試験を実施して、宿主細胞染色体へのEBVの組み込み率を精査し（FISH、サザンブロット、qPCR）、ベクターの一過性複製性向を測定する。EBVベクターは選別マーカー非存在下では細胞周期毎に約90から92％の複製を維持することが報告されている。複製率の低下は宿主系のベクター除去に寄与する。細胞膜透過性染料（前記染料はエステル化に際して脂質二重層を通過せず、高度に蛍光性になる）（緑色CMFDA、橙色CMTMR）を予めロードした蛍光標識細胞をトラッキングすることにより、感染MSCの区画化を非ヒト霊長動物で判定する。そのような測定を、新しく調製した組織切片（リンパ節、肝、脾筋肉、脳、膵、腎、腸、心臓、肺、眼、雌雄生殖組織）で又は全身スキャンで実施する。さらに別の組織切片をDNA及びRNA単離のために処理し、ベクター配列及び対応する転写物を分析する。各免疫反応性ポリペプチド、サイトカイン及びシャットオフ転写物に特異的なオリゴの設計は、全ての組織における個々の遺伝子発現の査定を可能にする。いくつかのプロモーターはいくつかの組織で他の組織よりも活発に転写され、このことは、注射後の末梢組織へのMSC優先的局在化、及びMSC在留と組換え遺伝子の対応する転写活性の両方の査定を要求する。この目的のために、2つの人工的“バーコード”核酸タグを組み入れることができる。1つはTet on/off駆動RNA転写物に特異的であり、他方はエピソームベクターDNAに特異的である。これらのタグは、NHP及びヒトゲノム及びトランスクリプトームバックグラウンド間で非常に固有の配列の迅速な同定を可能にする（図2参照）。
【００４７】
デリバリー戦略の選択及び設計
治療用分子のための一過性デリバリーベヒクルとしてのMSC：MSCは大規模エレクトロポレーションに適し、90％までの効率を示す。マックスサイト社（MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD）はMaxCyte(商標)VLXTM大規模トランスフェクション系を市販する。前記は、無菌的な閉鎖トランスフェクション環境下での極めて大きな体積の一過性トランスフェクションのために特別に設計された、場所をとらない使用が容易な装置である。フローエレクトロポレーション技術を用い、MAXCYTE VLXは、無菌的で閉鎖されたトランスフェクション環境下で、約30分未満で約2ｘ1011までの細胞に高い細胞生存率及びトランスフェクション効率でトランスフェクションを実施できる。このcGMPを順守する系は、ベンチ規模からcGMPパイロット及び商業的製造に至るまで、組換えタンパク質の迅速な製造に有用である。MSCは、化学的規定（CD）培地で大規模細胞培養環境により増殖させることができる。バイオプロセッシング操作における最近の進歩は、多能性の特徴及び遺伝的安定性の保持を喪失することなくMSCの大規模エキスパンジョンを支持するCD処方物の迅速な開発をもたらした。脂肪由来MSCは脂肪吸引手法により容易に入手できる。平均的な手順で約1ｘ108のMSCを入手でき、したがって、備蓄前のex vivoエキスパンジョンのために十分な細胞数を提供し（約25回のダブリング、＞3ｘ1015細胞）、輸液後数週間の治療分子のin vivo発現及びデリバリーを維持するために十分な寿命及びダブリング回数（約25回）を残す。MSCは一般的48から72時間の範囲のダブリング速度を示し、したがって潜在的には50から75日の範囲のin vivo寿命を提供する。輸液MSCのターンオーバー速度は、トランスジーン生成物の循環レベルの測定、並びにヒトの血液、鼻汁吸引物及び尿中のEBV配列のqPCRによる検出によって判定できる。所望の治療期間後のMSCの本質的に完全な除去は、発現ベクター中に構築されてあるプロアポトーシス遺伝子の制御された誘導性発現を介して自己破壊を誘発することによって達成される。循環しているMSC由来免疫反応性ポリペプチド又は他の免疫調節因子の注射後レベル、及びベクター誘発自己免疫又はNHPにおけるGVHD応答もまた査定することができる。ヒトでは、自己免疫又は同種異系免疫応答に付随するまた別のマーカー、例えば肝損傷バイオマーカー（ALT、AST）、肝バイオマーカー（ALB、BIL、GGT、ALPなど）及び腎機能マーカー（BUN、CRE、尿素、電解質など）を測定することができる。
【００４８】
単離、性状分析及び治療的使用のための備蓄MSC：リンパ造血系列抗原の欠如によって、MSCは、造血細胞、内皮細胞、単球、B細胞及び赤芽球から区別される。初代MSCは不死ではなく、したがって初代細胞の約50分裂の“ヘイフリック限界”にしたがう。それにもかかわらず、エキスパンジョンの性能は極めて高く、1個の細胞が約1015の嬢細胞を生じる。さらにまた、MSCはバッチ対バッチ変動が少ない。リスクを有する数百万の個体を迅速に防御することができる細胞備蓄サイズは、多数のスクリーニング前のドナーの脂肪組織由来MSCをプールすることによって作製できる。すなわち、1ｘ108細胞/ドナーで100人のドナー／ex vivoで1人のドナーｘ25世代＝約3ｘ1017細胞；約1ｘ1011細胞/輸液＝約3百万用量。2つのアプローチを治療用MSC備蓄の作製に用いることができる：（1）単離、エキスパンジョン、検査、備蓄、続いてトランスフェクション、回収及び投与；及び（2）単離、エキスパンジョン、検査、トランスフェクション、備蓄して、融解及び短時間回収時に投与待機状態の細胞を作製する。
性状分析のために、無菌性、マイコプラズマ、in vitro及びin vivo外来因子検査、レトロウイルス検査、細胞密度、電子顕微鏡検査、及び多数の特定ウイルスPCRアッセイについてマスター細胞備蓄を検査することができる（FDAは1993年及び1997年の手引き書で14アッセイを要求し、さらに前記リストにはその上にいくつかの推奨ウイルス（主としてポリオーマウイルス）が追加されている）。初代培養条件で最初の使用となり得る血清に関しては、9CFRパネルのウシウイルスについて検査することができる。細胞が通常の操作の間にブタ生成物と接触する場合は、同様にブタウイルスについての検査も実施するのが好ましい。
【００４９】
薬物動態学/薬力学（PK/PD）：組織修復のためにMSCを使用することに関する制限の1つは、ex vivoエキスパンジョン及びそれら細胞が由来した人間へ再注射後に器官で永久的に定住する能力を細胞がもたないということであった。MSCは、MHC適合又は不適合個体に注入されたか否かにかかわりなく、限定的期間（例えば数週間又は数ヶ月）の間循環する。成人MSCの普遍的遺伝子デリバリープラットフォームの開発におけるこの欠点は本明細書に記載する方法では長所である。トランスフェクトMSCで発現される各トランスジーンの薬物動態（PK）プロフィールは、開発された各操作デリバリーベクタープラットフォームについてNHPで判定することができる。一用量実験をカニクイザルで所望にしたがって実施する（トランスフェクトMSCが静脈内に投与される）。そのような実験では、2匹の雄サル及び2匹の雌サルのそれぞれが、MSCの高用量（約1011細胞）、中間用量（約108細胞）、及び低用量（約105細胞）を静脈内（i.v.）投与される。査定されるべきエンドポイントには以下が含まれる：臨床観察、体重、定性的食物消費、眼科学、心電図、臨床病理学（例えば血液学、化学、血液凝固、尿分析）、免疫学（例えば免疫グロブリン及び末梢白血球（例えばB細胞、T細胞及び単球）、免疫原性、肉眼的病変（例えば壊死及び選択器官の重量）、組織病変、組織結合及び薬物動態。各組換え抗体の血清濃度を1、3、6、12、24、36、48及び63日目に9週間にわたって定性サンドイッチ型ELISA（抗体特異的捕捉及び検出試薬（HRP標識抗id試薬）を利用する）でモニターすることができる。PK分析は、WINNOLINソフト（Pharsight Corp.）を用いて非コンパートメント法によって実施できる。各抗体についての薬物動態パラメーターは、最大血清濃度（Cmax）、用量標準化血清濃度（Cmax/D）、0時間から無限大までの濃度-時間曲線下の面積（AUC0-∞）、用量標準化した0時間から無限大までの濃度-時間曲線下の面積（AUC0-∞/D）、全身体クリアランス（CL）、定常状態の分配体積（Vss）、終末相における見かけの分配体積（Vz）、終末排除相半減期（t1/2,term）及び平均在留時間（MRT）として表すことができる。注射されたMSCの末梢循環及び区画化は、上記に記載したように、細胞膜透過性CMFDA又はCMTMR染料を予めロードした蛍光標識細胞を新しく調製した組織切片でトラッキングすることによって、又は全身スキャンを通して判定できる。ベクターDNA配列及び転写物は、上記で概略したようにqPCRでモニターすることができる。
【００５０】
再利用性：in vivoでのMSC拒絶の欠如を記載する大量の文献群が存在する。それにもかかわらず、この現象は、同種及び異種DNAベクターで改変された同種MSCの多重注射とその後の同種異系応答の免疫学的プロファイリングに関してNHPで評価することができる。例えば、NHPの一グループにLASV抗体を発現するエピソームベクターをトランスフェクトした同種MSCをボーラス注射し、別のグループにインフルエンザ抗体を発現する類似のベクターを注射することができる。当該MSCプラットフォーム及びベクター成分に対する免疫応答を77日間のコースにわたって毎週査定することができ、その間に一切の免疫学的応答は検出されるはずである。ドキシサイクリン又は他のテトラサイクリンアナローグの投与によるシャットオフメカニズムの活性化後の安全性及び免疫原性は、類似の態様で査定できる。ドキシサイクリンレジメンの施術に続いて、ベクター成分及びMSCデリバリープラットフォームに対する有害な免疫学的応答を、先ず初めに最初の2週間は一日2回、続いて付加された77日間は毎週1回類似の態様で査定することができる。アポトーシス細胞死のまた別のマーカー（例えば乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）及びカスパーゼの血清中の上昇、循環MSC中のホスファチジルセリン（PS））を確立されたアッセイでトラッキングすることができる。ベクター及びMSCに対する免疫学的応答がこの77日期間の後で検出されない場合、NHPに同種MSCを再注射することができる。一方のグループには同種ベクターをトランスフェクトしたMSCが、他方のグループには異種DNAベクターが投与されるであろう。同種及び異種ベクターは同じバックグラウンドを有するが、異なる組換え抗体レパートリーを有するであろう。このアプローチは、組換え抗体レパートリーに関係なく、MSC及び発現DNAベクターに対する免疫原性を明示し得る。カニクイザルのヒト抗体に関するマルチ用量毒物動態実験に基づいて、MSCプラットフォームに対する免疫学的反応の査定のために77日タイムラインを選択する（前記実験では、10mg/kgで投与された組換え抗体のピーク血清レベルの平均5000倍の減少がこの時間枠にわたって示される）。そのような実験では、いくつかのNHPは最初の投与に続いて50から60日ごろに抗ヒト抗体応答を生じ、一方、いくらかの動物は当該異種IgGに対して検出可能な液性応答を全く生じ得ない。
【００５１】
MSCの輸送：望ましくは、MSCは、冷却チェーン輸送の排除を可能にする、サンプル収容性能が増し細胞操作技術を備えた、遺伝的改変MSCの保温チェーン（37℃）輸送を可能にする装置（例えばMicroQ Technologiesの装置）で輸送することができる。これらの装置は、約24から約168時間にわたって厳密な保温を実施し、それによって世界中のいずれの場所でも直ちに使用できる治療薬を準備するための十分な時間を可能にする。被包化細胞のさらに別の貯蔵及び輸送の性能を導入することができ、ガス交換を促進することができるカプセルが必要に応じて調製され得る。被包化から投与までの経過時間は、IP-MSCの代謝変化、細胞増殖速度、生存率の変化、及び性能に影響を及ぼすいずれかさらに別の生成物の変化の要因となるであろう。
【００５２】
一過性防御免疫の提示
防御抗体発現MSCを輸液されたマカクのチャレンジ実験：シノマルガス・マカク（Cynomolgus macaques）に抗LASV GP単一鎖抗体を発現するマカクMSCを輸液し、続いてLASVウイルス（ジョシア（Josiah）株）の1000プラーク形成単位（pfu）で筋肉内注射によりチャレンジし、Geisbertらが記載したように評価する。終末LFと一致する臨床徴候を示す動物は安楽死させる。チャレンジに続いて、プラークアッセイ及びRT-PCRによるウイルス血症の測定のために生物サンプルを処理する。ウイルスRNAを配列決定して、NHPの治療に際してGPC遺伝子の特異的変異が生じていないか否かを同定する。チャレンジを回避した一切の動物について、組織病理学、免疫組織化学、ウイルス単離及びゲノム検出のために多様な生物サンプル（組織、血液及び他の体液を含む）を採取する。一連のウェスタンブロット及びELISAアッセイを実施し、主要なウイルス構造タンパク質（G1、G2、NP、Z）に対する一切の抗体応答の証拠を検出することによって、生存マカクをウイルス抗原に対する液性応答についてモニターする。インフルエンザウイルスに対する防御抗原を発現するMSC構築物を用いる同様な実験をヒトチャレンジ実験に用いる。
以下の非限定的な例は、本明細書に記載するIP-MSC及び方法のある種の特色及び特徴を例示するために提供される。
【実施例１】
【００５３】
ラッサウイルス（LASV）中和抗体
約30ミリリットルの全血をシエラレオネのラッサ熱と確認された成人生存者から採集した。前記生存者は、退院後8週間以前ではなくかつ数カ月までの回復期にある。末梢血単球（PBMC）をフィコール（Ficoll）グラジエント遠心分離によって血液サンプルから単離して凍結保存し、凍結試料運搬容器で米国へ輸送した。PBMCの培養を96ウェルプレートに低密度でプレートし、B細胞のポリクローン活性化のためにR848及びインターロイキン-2（IL-2）で刺激した。刺激後にコロニー増殖を示すウェルの上清を、組換え発現LASV NP、GPC（GP1+GP2）、GP1又はZタンパク質で被覆したELISAプレートへのヒトIgG結合についてスクリーニングした。有意な反応性を示すクローンをエキスパンドしてクローンを採取し再度スクリーニングした。LASVタンパク質に特異的なIgGを産生するB細胞クローンからRNAを単離した。当該IgGのヒト軽鎖（LC）及び重鎖（HC）遺伝子をRT-PCRによって増幅し、線状の単一鎖発現ベクターでクローニングした。HEK-293細胞を適合LC及びHC構築物で共トランスフェクトして、個々のLASVヒトモノクローナル抗体（huMAb）の発現を査定し、さらに予備的in vitro性状分析試験のために少量の抗体を精製した。
シエラレオネから送られてきた凍結PBMCは、優れた生存率及び抗体産生メモリーB細胞の高い頻度を有していた。種々の患者に由来する糖タンパク質に対して75を超える別個のB細胞クローンが単離された。LASV GPC成分特異的huMAbの結合及び特異性プロフィールを免疫沈澱及びELISAアッセイで決定した。
【００５４】
LASVプラーク減少中和検査（PRNT）アッセイ：ラッサウイルス（Josiah, GA391及び803213（前記に対して良好なモルモットモデルが存在し利用可能である））を、Vero又はVero E-6細胞の感染前に、各MAbの種々の希釈（例えば約10pMから約300nM）とともに前インキュベートすることができる。感染後にリン酸緩衝食塩水（PBS）で2回洗浄してウイルスを除去し、0.5％アガロースを含む細胞培地オーバーレイを各培養に添加できる。その後約48時間して中性紅染色に続いてプラークを数えることができる。続いて阻害レベルを濃度に対してプロットし、IC50（50％侵入阻害に必要なタンパク質量）を計算できる。
P10.4B及びGP19.7Eとして設計された2つの同定LASV huMAbは、LASVプラーク減少中和検査（PRNT）アッセイでウイルスのin vitro中和を示した。GP19.7Eは10.4Bよりも顕著に強力であった。huMAb GP10.4B及びGP19.7Eはまた生のLASVに対してもまた顕著な中和性能を示した。GP10.4B及びGP19.7Eの重鎖（HC）及び軽鎖（LC）ヌクレオチド配列は図3（HC）及び図4（LC）に示される。対応するアミノ酸配列は図5に示される。
【実施例２】
【００５５】
抗LASV免疫防御ポリペプチドを発現する免疫防御初代MSCの調製
脂肪組織由来MSCを、10％FBS補充改変イーグル培地アルファ（MEMアルファ）培養液に約百万細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。次の日、製造業者の推奨にしたがって、LIPOFECTAMINE2000（Invitrogen）又はPEI（Polyplus）のどちらか及びpCMVintA_17HSD:huMAb 19.7E構築物を用いて細胞にトランスフェクトした。huMAbs GP19.7E由来の軽鎖及び重鎖抗体遺伝子を最適Kozak配列及び畳み込まれた5’UTRを用いて再操作し、さらに二シストロン性哺乳動物発現ベクターで（タンデムにかつ向き合う方向で）クローニングした（図2、パネルB）。一過性トランスフェクトHEK-293T/17細胞で、向き合う方向の遺伝子構築物は、タンデムの対照物よりも高い抗体分泌レベルをもたらした。向き合う方向の抗体遺伝子構築物をトランスフェクトすることによって、huMAb GP19.7Eを発現するNS0細胞株を作製した。トランスフェクションから約48時間後に上清を採集し、ELISAのために1ｘPBS/0.1％BSA/0.1％TWEEN-20で連続希釈した。この方法を用いて、脂肪MSCは約60ng/mLのGP19.7E抗体を生成し、一方、空ベクターコントロールについてはシグナルを検出できなかった。
【実施例３】
【００５６】
複数の中和抗LASV抗体の投与によるLASV防御免疫
抗LASV IgG huMAbの免疫治療活性を示すために、異系交配モルモットに、LASVチャレンジと同じ日にMAb GP19.7E及びMAb GP10.4Bの約30mg/Kg及び15mg/Kgの一用量をそれぞれ注射した。LASV Josiahは、腹腔内（i.p.）ルートで均一な致死モデルを生じる異系交配モルモットに順応させた。これらの異系交配モルモットは、同系交配モルモット株13及びヒトで観察される当該疾患の臨床症状に類似するものを示した。無抗体希釈物を注射した全てのコントロールモルモットは、実験16日目までに典型的なラッサ熱症状で死亡した（図6）。huMAb処置モルモットを21日まで追跡した。これらのhuMAb処置動物のいずれも死亡せず、又はラッサ熱の症状を全く示さなかった。ラッサウイルス糖タンパク質特異的huMAbのこの組み合わせによる処置は単に生存を引き延ばしただけでなく、ラッサウイルスによる致死作用に対し完全な防御を提供した。
本発明の実施のために本発明者らが知る最良の態様を含む本発明の好ましい態様が本明細書に記載されている。これら好ましい態様の変型は、前述の記載を読むとき当業者には明白となろう。本発明者らは当業者が適宜そのような変型を利用することを予想し、さらに本発明者らは、本明細書に特に記載した態様以外の態様で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律が許容するように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された内容の全ての改変及びその等価物を包含する。さらにまた、上記記載の成分のその可能な全ての変型における一切の組み合わせもまた、本明細書に特段の指示がなければ或いは文脈に明らかな矛盾が生じなければ本発明に包含される。
【００５７】
参考文献
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本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）であって、前記IP-MSCは、前記病原体又は毒素を特異的に標的とする複数の発現可能免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされており、各免疫反応性ポリペプチドは、前記病原体によって産生される抗原に特異的な若しくは前記毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換を含みかつ前記抗原結合領域配列と少なくとも約50％の配列同一性を共有する前記抗原結合領域配列のバリアントのアミノ酸配列を含み、前記抗原結合領域配列又はそのバリアントは、前記病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配置されており、さらに前記エピソームベクターは場合によって誘導性アポトーシス遺伝子を含む、前記免疫防御初代間葉幹細胞。
〔２〕2〜約100の免疫反応性ポリペプチドをエピソームにより発現する、前記〔1〕に記載のIP-MSC。
〔３〕1つ以上の他の免疫調節因子を更に発現する、前記〔1〕又は〔2〕に記載のIP-MSC。
〔４〕前記1つ以上の免疫調節因子が、インターロイキン及びインターフェロンから選択される、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔５〕前記1つ以上の免疫調節因子が、L-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、 IL-12、IFNα、IFNβ及びIFNωから選択される、前記〔3〕に記載のIP-MSC。
〔６〕各免疫反応性ポリペプチドが、完全長抗体、抗体単一鎖可変抗体フラグメント（ScFV）、一価抗体抗原結合フラグメント（Fab）、二価抗体抗原結合フラグメント（F(ab’)2）、ジアボディ及びトリボディから選択される、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔７〕前記免疫反応性ポリペプチドの1つ以上が、前記抗原結合領域のバリアントのアミノ酸配列を含み、前記バリアントのアミノ酸配列置換が保存的置換を含む、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔８〕前記免疫反応性ポリペプチドの1つ以上が、前記抗原結合領域のバリアントのアミノ酸配列を含み、前記バリアントのアミノ酸配列が前記抗原結合領域の配列と少なくとも約80％の配列同一性を共有する、前記〔1〕〜〔7〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔９〕前記病原体が、ウイルス病原体、細菌病原体、単細胞寄生生物病原体又は多細胞寄生生物病原体である、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔１０〕前記病原体が、アデノウイルス、パピローマウイルス、へパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、単純ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス及び風疹ウイルスから成る群から選択されるウイルス病原体である、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔１１〕前記病原体が、バシルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、ブルコールデリア属、カンピロバクター属、クラミジア属、クラミドフィラ属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、腸球菌属、エスケリキア属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、トレポネーマ属、ビブリオ属及びエルシニア属から成る群から選択される属由来の細菌病原体である、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔１２〕前記病原体が、アカントアメーバー、アニサキス、アスカリス・ルンブリコイデス、バランチジウム・コリ、多節条虫亜綱（サナダムシ）、ツツガムシ、コクリオミイヤ・ホミニボラクス、エントアメーバー・ヒストリチカ、ファシオラ・ヘパチカ、ギアルジア・ランブリア、鉤虫、リーシュマニア、リングアツラ・セルラータ、肝蛭、ロア糸状虫、肺吸虫（肺蛭）、ギョウチュウ、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、ストロンギロイデス・ステルコラリス、サナダムシ、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ、鞭虫及びウケレリア・バンクロフティから成る群から選択される寄生生物病原体である、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔１３〕前記抗原性ポリペプチドが以下から成る群から選択される、前記〔1〕〜〔12〕のいずれか1項に記載のIP-MSC：インフルエンザヘマグルチニン1（HA1）；インフルエンザヘマグルチニン2（HA2）；インフルエンザノイラミニダーゼ（NA）；ラッサウイルス（LASV）糖タンパク質1（gp1）；LASV糖タンパク質2（gp2）；LASVヌクレオキャプシド関連タンパク質（NP）；LASV Lタンパク質；LASV Zタンパク質；SARSウイルスSタンパク質；エボラウイルスGP2；麻疹ウイルス融合1（F1）タンパク質；HIV-1トランスメンブレン（TM）タンパク質；HIV-1糖タンパク質41（gp41）；HIV-1糖タンパク質120（gp120）；C型肝炎ウイルス（HCV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；HCVエンベロープ糖タンパク質2（E2）；HCVヌクレオキャプシドタンパク質（p22）；西ナイルウイルス（WNV）エンベロープ糖タンパク質（E）；日本脳炎ウイルス（JEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；黄熱ウイルス（YFV）エンベロープ糖タンパク質（E）；ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）エンベロープ糖タンパク質（E）；G型肝炎ウイルス（HGV）エンベロープ糖タンパク質1（E1）；呼吸系シンクチバルウイルス（RSV）融合（F）タンパク質；単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）gDタンパク質；HSV-1 gGタンパク質；HSV-2 gDタンパク質；HSV-2 gGタンパク質；B型肝炎ウイルス（HBV）コアタンパク質；エプスタイン-バーウイルス（EBV）糖タンパク質125（gp125）；細菌外膜タンパク質アッセンブリー因子BamA；細菌転移アッセンブリーモジュールタンパク質TamA；細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質；細菌表面抗原D15；炭疽防御タンパク質；炭疽致死因子；炭疽浮腫因子；腸チフス菌S1Da；腸チフス菌S1Db；コレラ毒素；コレラ熱ショックタンパク質；ボツリヌス菌抗原S；ボツリヌス毒素；エルシニア・ペスチスF1；エルシニア・ペスチスV抗原；エルシニア・ペスチスYopH；エルシニア・ペスチスYopM；エルシニア・ペスチスYopD；エルシニア・ペスチスプラスミノーゲンアクチベーター因子（Pla）；プラスモジウムサーカムスポロゾイトタンパク質（CSP）；プラスモジウムスポロゾイト表面タンパク質（SSP2/TRAP）；プラスモジウム肝病期抗原1（LSA1）；プラスモジウム輸出タンパク質1（EXP1）；プラスモジウム赤血球結合抗原175（EBA-175）；プラスモジウムシステインリッチ防御抗原（cyRPA）；プラスモジウム熱ショックタンパク質70（hsp70）；住血吸虫Sm29；及び住血吸虫シグナルトランスダクションタンパク質14-3-3。
〔１４〕骨髄由来間葉幹細胞又は脂肪由来間葉幹細胞から調製される、前記〔1〕〜〔13〕のいずれか1項に記載のIP-MSC。
〔１５〕病原体によって引き起こされる感染症又は毒素への曝露による毒性を治療又は予防するための医薬組成物であって、医薬的に許容できる担体中に前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のIP-MSCを含む、前記医薬組成物。
〔１６〕病原体によって引き起こされる感染症又は毒素への曝露による毒性を治療又は予防する方法であって、有効な投薬量の前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のIP-MSCを対象に投与する工程を含む、前記方法。
〔１７〕病原体によって引き起こされる疾患の流行を治療若しくは予防するか又は毒素への曝露を緩和する方法であって、前記病原体又は毒素に曝露されているか若しくは暴露されるリスクを有する対象に免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）を投与する工程を含み、前記IP-MSCが、前記病原体又は毒素を特異的に標的とする少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターをトランスフェクトされており、各免疫反応性ポリペプチドが、前記病原体又は毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域を含むか又は前記抗原結合領域のバリアントをコードし、前記バリアントが前記抗原結合領域のアミノ酸配列に1つ以上の置換を含み、かつ前記中和抗体の抗原結合領域と少なくとも50％の配列同一性を共有する、前記方法。
〔１８〕少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターを初代間葉幹細胞にトランスフェクトする追加の工程を含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔１９〕前記初代MSCにトランスフェクトする前に、前記病原体の疾患又は毒素曝露の1人以上の生存者から入手した1つ以上の血液サンプルから前記病原体又は毒素に対する中和抗体を同定する追加の工程を含む、前記〔18〕に記載の方法。
〔２０〕前記初代MSCにトランスフェクトする前に、前記少なくとも2つ以上の免疫反応性ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードする1つ以上のエピソームベクターを調製する追加の工程を含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔２１〕病原体によって引き起こされる疾患の流行を治療若しくは予防するか又は毒素への曝露を緩和するための予防用若しくは治療用間葉幹細胞を調製する方法であって、少なくとも2つの免疫反応性ポリペプチドをコードする1つ以上のエピソームベクターを初代間葉幹細胞にトランスフェクトして前記免疫反応性ポリペプチドを発現する免疫防御初代間葉幹細胞（IP-MSC）を作製する工程を含み、前記免疫反応性ポリペプチドが、前記病原体若しくは毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸を含むか又は前記抗原結合領域配列のバリアントをコードし、前記バリアントが前記抗原結合領域由来のアミノ酸配列に1つ以上の置換を含み、かつ前記中和抗体の抗原結合領域配列と少なくとも50％の配列同一性を共有する、前記方法。
〔２２〕前記初代MSCにトランスフェクトする前に、前記病原体の疾患又は毒素曝露の1人以上の生存者から入手した血液サンプルから前記病原体又は毒素に対する中和抗体を同定する追加の工程を含む、前記〔21〕に記載の方法。
〔２３〕前記初代MSCにトランスフェクトする前に、前記少なくとも2つ以上の免疫反応性ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードする1つ以上のエピソームベクターを調製する追加の工程を含む、前記〔21〕に記載の方法。
〔２４〕免疫防御ポリペプチドの発現可能なアミノ酸配列をコードするエピソームベクターであって、各免疫反応性ポリペプチドが、前記病原体によって産生される抗原に特異的な若しくは前記毒素に特異的な中和抗体の抗原結合領域由来のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中に1つ以上の置換を含み、かつ前記抗原結合領域の配列と少なくとも約50％の配列同一性を共有する前記抗原結合領域配列のバリアントのアミノ酸配列を含み、前記抗原結合領域配列又はそのバリアントが、前記病原体又は毒素と特異的に結合しこれを中和するように配置されており、さらにエピソームベクターが場合によって誘導性アポトーシス遺伝子を含む、前記エピソームベクター。
〔２５〕病原体によって引き起こされる感染症又は毒素への曝露による毒性の治療又は予防のための、前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のIP-MSCの使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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