(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄ組織培養のための細胞を調製する方法であって、
ａ）適切な表面に、初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）をプレートする（ｐｌａｔｉｎｇ）工程、
ｂ）必要に応じて、上記表面に接着するそれらの細胞の能力をチェックする工程、
ｃ）上記表面に接着しなかった細胞を除去する（ｄｉｓｃａｒｄｉｎｇ）工程、
ｄ）接着した細胞を切離し（ｄｅｔａｃｈｉｎｇ）、そして、３Ｄ（三次元）組織培養プロセスにそれらを移動する工程、
を含む方法であって、ここで、
その方法は、ａ）乃至ｄ）の工程全体にわたる、生存性試験（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）の適用を包含せず、
その細胞は、プレートする（ｐｌａｔｉｎｇ）前、その間、または、後の何れの時にも、増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）させず、および、その細胞は、プレートした（ｐｌａｔｉｎｇ）後に、継代（ｐａｓｓａｇｅｄ）されない、方法。
【請求項２】
その方法において、３Ｄ組織培養プロセスが、
・スカホルド−ベース（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｂａｓｅｄ）の３Ｄ組織培養、
・ハイドロゲル−ベースの３Ｄ組織培養、
・細胞の自己組織化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）３Ｄ組織培養、および／または、
・３Ｄバイオプリンティング（３Ｄ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ）、
からなる群から選択される、少なくとも１つである、請求項１に記載された方法。
【請求項３】
その方法において、前記細胞が、プレートする（ｐｌａｔｉｎｇ）前に解凍される（ｔｈａｗｅｄ）凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）、細胞である、請求項１または２に記載された方法。
【請求項４】
その方法において、前記細胞が、冷凍（ｆｒｏｚｅｎ）されていない細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載された方法。
【請求項５】
その方法において、前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載された方法。
【請求項６】
哺乳類細胞が、
・ヒト細胞、
・カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）の細胞、
・ブタ細胞、
・イヌ（ｃａｎｉｎｅ）細胞、
・ラット細胞、
からなる群から選択される、請求項５に記載された方法。
【請求項７】
その方法において、前記細胞が、肝細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載された方法。
【請求項８】
３Ｄ組織培養が、回転楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）の形状を採用している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
・薬の有効性および／または毒性のスクリーニング、
・調査／機構の毒物学（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ／ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、
・ターゲットの発見／識別（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ／ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、
・医薬品リポジショニング研究（ｄｒｕｇ  ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ）
・薬物動態および薬力学のアッセイ（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｓｓａｙｓ）、および／または
・再生医療（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、
からなる群から選択される、少なくとも１つの目的のために、３Ｄ組織培養が使用される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、３次元組織培養の分野に関する。
【０００２】
［導入］
３Ｄ（３次元）の組織培養は、生物の細胞が、全３次元で、成長または、その周囲の環境との相互作用が許可される、人工的に作成された環境である。
３Ｄの培養は、様々な理由で、２Ｄ（２次元）培養（「単一層」とも呼ばれる）を超えた改良である。生体組織において、細胞は、複雑な（intricate）、細胞間や細胞−マトリックスの相互作用、および栄養素と細胞の複雑なトランスポート力学（dynamics）を有する、３次元の微小環境に存在する。標準的な２Ｄまたは単一層の細胞培養は、この環境の不適切な表現（representations）である。
【０００３】
３Ｄ組織培養の主な用途は、再生医療のような他の用途も、また、利用できるが、薬剤の有効性および／または毒性のスクリーニング、調査／機構上の毒性（investigative/mechanistic toxicology）、ターゲットの検出／識別、医薬のリポジショニング研究（drug repositioning studies）、および薬物動態学と薬力学のアッセイにある。
【０００４】
前記に関して、不十分な２Ｄ環境は、しばしば、２Ｄ培養を、生体内の薬剤の効力および毒性の予測因子を信頼性のないものとする。３Ｄ構造は、細胞性通信（cellular communication）、生化学的および物理−化学的勾配の形成、および細胞外マトリックスの開発の観点で、体内の臓器において、より密接に似ている。
これらのマトリックスは、細胞が、生体組織において移動する場合と同様の方法で、細胞が、３Ｄ構造内を移動することを補助する。３Ｄ構造は、したがって、細胞遊走、分化、生存と成長のための改良されたモデルである。さらに、２Ｄでは、細胞は、部分的にのみ極性化できるので、３Ｄ組織培養は、細胞の極性化のより正確な描写を提供する。後者は、医薬品の有効性と毒性のスクリーニングに使用される、３Ｄ組織培養において、好適な細胞のタイプの１つである、肝細胞（hepatocytes）に、特に重要である。さらに、３Ｄで育った細胞は、２次元で育った細胞よりも、異なった遺伝子発現を示す（ケルムら（Kelm et al）  ２０１０年、リッドキー（Ridky）ら  ２０１０年、コーディ（Cody et. al.)ら  ２００８年）。
【０００５】
リアルな３Ｄ環境は、しばしば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞が、重要な生理学的な構造と機能を形成するために必要である。細胞の成長の３次元は、インテグリン結紮（integrin ligation）、細胞の収縮（cell contraction）および細胞内シグナル伝達（intracellular signaling）にさえ必要である、機械的入力と細胞接着のための（mechanical inputs and for cell adhesion）、より広い接触領域を提供する。
通常の溶質の拡散とエフェクタータンパク質（effector proteins）（成長因子および酵素のような）への結合は、また、３Ｄの細胞性マトリックスに依存するので、組織規模溶質濃度勾配（tissue scale solute concentration gradients）を確立するために重要である。
【０００６】
細胞の相互作用が、３Ｄ組織の、基本的な機能と持続可能性のための、キーであるという事実のため、使用される細胞の品質は、非常に（paramount）重要である。マイナーな品質を持つ細胞は、このような組織に統合されないか、または、上行（nascending）組織が、器官的アーキテクチャ（organotypic architecture）に適応するのを、部分的に阻害することのみを統合する。これは、組織の不可欠な（integral）部分となる機能不全の領域を齎し、そして、最終的に（eventually）全体の組織は、形態性、機能性、生存性または安定性の面で影響を受ける。
【０００７】
技術水準は、培養に使用される、細胞の生存性についての情報を齎す、細胞の生存性試験（viability assay）を提供する。
【０００８】
しかし、このようなアッセイは、細胞の生存性についての、全体的な信号を提供するのみで、個々の細胞の生存性についての、いかなる情報も提供しない。これらの理由から、細胞の生存性試験（viability assay）は、好適でない細胞の分離を可能にせず、そして、そのゆえ、生存性または生命力（vitality）の欠如のために、３Ｄ組織培養プロセスと負に干渉する、好適でない細胞を、処分することができない。
【０００９】
［発明の概要］
【００１０】
したがって、本発明の１つの主題は、上記の問題を克服するためのアプローチを提供することである。
【００１１】
本発明の別の主題は、組織の形成の前に、マイナーな品質または生存性の細胞を識別することを補助する、３Ｄ組織培養に適したアプローチを提供することである。
【００１２】
本発明の別の主題は、組織の形成の前に、マイナーな品質または生存性の細胞を、選別して除くこと（sort out）を補助する、３Ｄの組織培養に適したアプローチを提供することである。
【００１３】
現在の発明の別の主題は、３Ｄ組織の機能性、生存性と安定性を向上させることを補助する、３Ｄ組織培養に適したアプローチを提供することである。
【００１４】
明細書と同様に、従属クレームは、さらに好ましい実施の形態を開示し、これらの主題は、独立クレームの客体によって達成される。
【００１５】
［本発明の実施形態］
【００１６】
本発明の一実施形態によると、 ３Ｄ組織培養のための細胞を調製する方法が提供され、その方法は、以下の工程を含む。
ａ）適切な表面に、細胞をプレーティングする（plating）工程、
ｂ）必要に応じて、上記表面に接着する上記細胞の能力をチェックする工程、
ｃ）上記表面に接着しなかった上記細胞を除去する（discarding）工程、および
ｄ）接着細胞を切離し（detaching）、そして、３Ｄ（三次元）組織培養プロセスにそれらを移動する工程。
【００１７】
当該プロセスは、また、「生体（vital）細胞の選択」とも呼ばれる。先行技術の方法に従って、細胞生存性（生きているまたは死んでいる）は、しばしば、３Ｄ組織培養プロセスに、細胞を転送する前に評価される。これは、例えば，それらの生存性を維持または回復する、細胞の能力を決定する、好適な生存性試験（viability assay）の手段により、行うことができる。この目的のため、多数の方法がある。たとえば、膜の漏出アッセイである、トリパン  ブルー色素テストは、トリパン  ブルーが、細胞を透過するかどうかをテストする。Ｙｅｓの場合、生存していない（non-viable）と考えられる。細胞生存性は、たとえば、生存ずる細胞を、３Ｄ組織培養プロセスに移動されたことを意味する、細胞のサブサンプル（subsample）が、その上に置かれた、血球計算機（hemacytometer）の、グリッドの内の（within the grids）の全細胞数で割った数として計算される。
【００１８】
したがって、それぞれのテストは、細胞の生存性について、全体的な信号を提供する。それは、個々の細胞の評価によって得られたが、３Ｄ組織培養プロセスに転送されたことを意味する、個々の細胞の生存性についてのいかなる情報を提供しない。主な理由は、実際に、そのテストに付された細胞は、後に、処分され、そして、細胞は、試験試薬と処理されたので、３Ｄ組織培養のためには、さらに使用されることはないからである。したがって、生存性試験（viability assay）は、ほとんどの場合、３Ｄ組織培養プロセスで使用されている細胞の代表であることを意味する細胞のサンプルを用いて実行される。
【００１９】
したがって、生存性試験は、３Ｄ組織培養プロセスで使用されることを意味する、総細胞プールから、死んだか、または、不適当な細胞の分離を許容しない。それらは、使用されることを意味する、細胞の全体の生存性についての情報を提供するのみである。
【００２０】
ただし、そのような情報は役に立つかもしれないが、生存性または生命力（vitality）の欠如のために、３Ｄ組織培養プロセスと負に干渉するそれらの細胞を処分することの助けにはならない。３Ｄの組織は、（i）高密度の細胞、（ii）細胞外マトリックスの開発、および（iii）細胞間の接触の確立によって特徴付けられるので、生存していない細胞と低い生命力（vitality）の細胞の存在は、組織における生存していない細胞の量が高すぎる場合に、３Ｄ組織が機能不全になるという、究極の効果をもって、３Ｄ組織の機能に重大な影響を与えることができる。
【００２１】
さらに、おそらく、もはや、細胞間の接触を確立できないので、３Ｄ組織に統合することができない細胞が、依然として、生存性試験を通過するかもしれない。たとえば、それらの膜が、依然として元のままで、したがって、たとえば、トリパン  ブルーなどの試験試薬を通さない場合である。
【００２２】
別の方法としては、非生存細胞から、生存細胞を、分離するために、例えば、二重蛍光  ＣａｌｃｅｉｎＡＭ／ＰＩ  アプローチ（dual fluorescent CalceinAM/PI approach）に基づいて、細胞は、使用前に、ＦＡＣＳを通して、ソートされてもよい。さらに、発明者は、そのようなＦＡＣＳアッセイは、非生存細胞から、生存細胞を分離するための助けになる細胞特異的な情報を齎すが、「生存」として分類される群は、３Ｄ組織において、十分に機能しない細胞を包含することを見出した。したがって、後者の群は、上記の技術によって分離することができない、全ての生存細胞のサブグループを形成する。
【００２３】
本発明による方法は、３Ｄ組織を形成するのに使用することができるに十分に生存する、それらの細胞の効率的な選択を可能にするツールを提供することによって、この問題を解決する。そして、そのような生存性の欠如するそれらの細胞を処分することを、さらに許容する。
【００２４】
本発明による方法によって適用される標準は、細胞の接着性（plateability）、すなわち、細胞培養表面に接着する細胞の能力に依存する。そして、また、これも、細胞の生存性のための、そして、３Ｄ組織培養で起こるように、細胞の３Ｄネットワークに統合するそれらの適合性のための、優れた物差し（measure）である。接着性（Plateability）は、次に、細胞の３Ｄネットワークへの統合に重要な機能である、細胞外マトリックスを形成する細胞の能力に依存する。
【００２５】
しかしながら、細胞をプレーティング（plating）することは、主に、３Ｄ細胞培養ではなく、２Ｄの細胞培養で使用される標準的なアプローチである。３Ｄ細胞培養において、このような工程は、それ自体、とにかく、多くの不確実性の対象である細胞培養法に、さらなる努力を追加し、そして、そうでなければ、３Ｄ細胞培養に依然として使用される、細胞が失われる、または、生存性を失うリスクを有する、追加のストレスに、細胞を付すので、明らかに無用である。
【００２６】
この文脈で、３Ｄ細胞培養が、再生医療の目的のために使用されることを意味する場合だけでなく、３Ｄ細胞培養が、例えば、創薬スクリーニングなどのスクリーニングのために使用されることを意味する場合においても、十分な細胞塊を提供することが、３Ｄ細胞培養で重要な問題であると、理解することが重要である。このため、当業者は、３Ｄ細胞培養のために、細胞の取扱および調製中に、細胞塊を失わないように、極めて注意深くする。
【００２７】
多くの場合、３Ｄ細胞培養に使用される細胞は、臓器提供から派生した、ヒトの初代細胞という事実によって、この精査（scrutiny）は、発展（fostere）さえされる。一般的に、臓器は、移植治療（therapeutic transplantation）のための質にないものが使用される。しかし、これらの臓器でさえ、非常に供給不足である（short supply）。このため、当業者は、３Ｄ培養のために取扱いおよび調製中に、細胞をリスクの状態に置かないようにする傾向がある。
【００２８】
本発明の発明者は、このリスクと、関連する不利益（prejudice）を知っていた。しかし、彼らは、驚くべきことに、本発明による方法を使用する場合に得られる利益は、上記の欠点を補うことを発見した。
【００２９】
換言すれば、３Ｄ培養プロセスの前に、２Ｄプレーティング（plating）工程において、機能不全の細胞が分離された場合に得ることができる３Ｄ組織の、増加する品質および機能性が、この工程における細胞塊の潜在的な損失を正当化することを見出した。
【００３０】
実験的アプローチの１つにおいて、例えば、Pichard et al．（２００６）に開示されているように、本発明者は、コラゲナーゼの消化の方法によって、ヒトのドナーの肝臓から得られた肝細胞を使用した。このプロセスは、それぞれ、最大８×１０６で、最大３００バイアルの肝細胞を生産した。３Ｄ組織作製前に、本発明に従って、実行されたプレーティング（plating）工程は、細胞が、プレート表面に十分に接着していないために、細胞の６０％まで、すなわち、８００万のうちの４８０万個の細胞の喪失を齎すことができ、そして、３２０万個の肝細胞が保持され、そして、３Ｄ組織作製のために使用することができ、優れた品質の最大３０００の微小組織（microtissue）を提供できる。
【００３１】
プレーティング（plating）プロセスは、したがって、細胞が失われる結果となるが、そうでなければ、低い生命力（vitality）の細胞の負の干渉によって、浪費されることになる、３Ｄ組織の品質を向上させることを補助できる。
【００３２】
本発明に包含される、細胞をプレーティング（plating）し、そして、接着しなかったそれらの細胞を除去する工程は、技術水準に従った生存性試験（viability assay）ではないことを理解することが重要である。厳密には、それは、広義には、単純に、プレーティング（plating）工程と、引き続く、接着していない細胞を除去する洗浄工程を含むだけなので、アッセイでは全くない。
【００３３】
好ましい実施形態では、プレーティング（plating）工程自体は、３０分と９８時間の間の時間、継続することができる。さらなる詳細は、本明細書において記載されている。
【００３４】
好ましい実施形態によると、本発明の方法は、工程ａ）からｄ）の全体にわたる、生存性試験（viability assay）の適用を包含しない。
【００３５】
前述の通り、このような生存性試験（viability assay）は、（i）細胞の生存性の全体的な信号のみを提供し、（ii）個々の細胞の生存性に関するいかなる情報も提供しない、（iii）不適切な細胞の分離を許容しない、および（iv）生存性または生命力（vitality）の欠如により、３Ｄ組織培養プロセスを悪化させる（deteriorate）、それらの細胞を処分することを補助しない。
【００３６】
したがって、そのような試験は、有害ではないが、その情報的価値（informative value）は、現在の文脈においては、非常に限られており、そして、不適当な細胞から、細胞集団をクリアする目的を果たすことはない。
【００３７】
本発明の好ましい別の実施の形態によると、３Ｄ組織培養プロセスは、以下から成る群から選択される少なくとも１つである。
・スカホルド−ベース（scaffold-based）の３Ｄ組織培養、
・ハイドロゲル−ベースの３Ｄ組織培養、
・細胞の自己組織化（cellular self-assembly）３Ｄ組織培養、
・３Ｄバイオプリンティング（３Ｄ bioprinting）
【００３８】
細胞の自己組織化の、好ましい例は、懸滴培養（hanging drop cultures）、液体オーバーレイ培養（liquid overlay cultures）またはマイクロパターン化表面における培養（cultures on micro-patterned surfaces）である。
【００３９】
懸滴培養技術は、最初は、幹細胞胚様体（stem cell embryoid bodies）の育成のために開発された。懸滴培養を準備するには、適切なプレートの下側で（at the lower side of a suitable plate）、細胞懸濁滴（cell suspension drop）が懸濁される。好ましくは、マイクロタイター  プレート（microtiter plates）に類似する、いわゆる、懸滴プレートが、この目的に使用され、同様の形式であるが、細胞懸濁液を供給することができる穴を有する。そのようなタイプのシステムは、ブランド名「GravityPLUSTM  ３Ｄ培養およびアッセイ  プラットフォーム」で、InSphero AG、スイス連邦共和国、から入手できる。懸滴培養は、２から１００μｌの間の容量を想定することができ、そして、その後、３Ｄの組織を形成することを意味する、１００から５００００細胞を収容（accommodate）できる。それぞれの各液滴において、細胞は、単純に、重力によって液滴の底で濃縮され、そして、気液界面で、単一のスフェロイド（spheroids）を形成する。背景とプロトコルは、Kelm et al，２００３年、およびKelm & Fussenegger  ２００４年に開示されている。
【００４０】
懸滴培養技術は、細胞が、他の容器においては、培養皿の平らな平面のような、固液界面に接着する傾向がある、組織を形成することを許容する。懸滴培養は、そのような界面がなく、したがって、細胞が、その構造において、真の組織に似た３Ｄ構築を形成することを許容する。
【００４１】
液体オーバーレイ培養技術は、３Ｄ組織スフェロイドを形成する別の技術である。このアプローチで、マルチタイター  プレート（multititer plate）は、たとえば、アガロースでのコーティングにより、または、光力学化学パターン化（photodynamic chemical patterning）により、非接着性で、作られる。細胞は、その後、ウェルあたり、１００−１００００細胞の密度で、ウェルに植えられ、そして、その後、培養培地で培養される。プロトコルは、たとえば、Yuhas et al（１９７７年）またはMetzger et al（２０１１年）に開示されている。
【００４２】
３Ｄバイオプリンティング（3D bio-printing）は、組織を形成するマトリックスに、細胞がプロットされるプロセスです。３Ｄバイオプリンティングは、フォトリソグラフィ（photolithography）、磁気バイオプリンティング（magnetic bioprinting）、ステレオリソグラフィ（stereolithography）および細胞押出成形（cell extrusion）のような技術を含むことができる。
【００４３】
スカホルド−ベース（scaffold-based）の３Ｄ組織培養は、細胞が植えられる足場（scaffold）を使用する。この足場は、生物分解が可能であっても、なくてもよい（例えば、キトサン、ポリ乳酸、ポリスチレンなど）。この技術の広範な議論は、Carlettiら（２０１１年）で見られる。
【００４４】
ハイドロゲルーベースの３Ｄ組織培養（「足場のない（Scaffoldless）３Ｄ組織」とも呼ばれる）は、細胞が、ハイドロゲル  マトリックスの中で育ち、そして、３Ｄ組織を形成するアプローチである。この技術は、たとえば、Geckil et al．（２０１０年）に開示されている。
【００４５】
本発明の方法が、上記のアプローチのすべてに有利に使用できるということを理解することが重要である。本発明のキーの特徴の一つは、非生存細胞が、培養プロセスの前に、分別されることである。したがって、組織形成過程を乱す可能性のある機能不全の細胞が除去されたため、得られる組織の品質が顕著に増加する。この利点は、本明細書の実施例で示される、懸滴培養技術に適用されるだけでなく、スカホルド−ベース（scaffold-based）の３Ｄ組織培養、ハイドロゲルを用いた３Ｄ組織培養、３Ｄバイオプリンティングおよび液体オーバーレイのような他の、細胞の自己組織化（cellular self-assembly）３Ｄ組織培養方法にも適用できる。
【００４６】
本発明の特に好ましい実施形態によると、細胞は、プレーティング（plating）前に解凍される、凍結保存された（crypopreserved）細胞である。
【００４７】
本明細書に記載された、細胞型のほとんどは、凍結保存された（crypopreserved）細胞でよく、そして、その解凍後まだ使用することができる。凍結保存の可能性は、与えられた種類の３Ｄ組織のオンデマンドによる生産能力のための在庫に十分な細胞質量を持つために重要である。
【００４８】
しかし、同様に好ましくは、細胞は非凍結細胞である。このアプローチにより、必要な場合に、３Ｄ組織の緊急の製造（on-the-fly production）を許容するが、しかし、たとえば、ドナー臓器から直接取得されたように、非凍結の生存細胞を入手できることが必要である。
【００４９】
本発明の特に好ましい実施形態によると、使用される細胞は、以下から選択される。
・初代細胞（primary cells）、
・幹細胞（stem cells）、および／または、
・不死化細胞（immortalized cells）。
【００５０】
対象者から直接、培養された細胞は、初代細胞として知られている。腫瘍由来の一部を除いて、ほとんどの初代細胞培養は、寿命がある。集団倍加（population doublings）（ヘイフリック限界（Hayflick limit）と呼ばれる）のある特定の数の後、一般的に生存性を維持しながら、細胞は老化のプロセスを経、そして、分裂を停止する。
【００５１】
幹細胞は、未分化の、または、部分的に分化した、生物学的細胞であり、特定の細胞に分化することができ、より多くの幹細胞を生成するように分裂できる（細胞分裂を通じて）。それらは、多細胞生物で見出だされる。哺乳類では、２つの広範な種類の幹細胞があり：胚盤胞の内部細胞塊（inner cell mass of blastocysts）から単離された、胚盤胞幹細胞（embryonic stem cells）、および、種々の組織で見出される成人幹細胞（adult stem cells）である。大人の生物では、幹細胞と前駆細胞（progenitor cells）は、成人の組織を補充する（replenishing）、体の修復システムとして機能する。３Ｄ組織モデルに基づく開発において、ヒト多能性幹細胞（hPSC）の使用は、ジェンセンら（２００９年）によって記載されている。Sartipy & Bjoerquist（２０１１年）は、心臓と肝毒性評価のためのｈＰＳＣに基づくモデルの使用を記載する。
【００５２】
不死化細胞株は、通常は、無限に増殖せず、突然変異により、正常細胞の老化を避け、そして、代わりに、分裂を継続し続けることができる、多細胞生物由来の細胞集団である。その細胞は、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、長時間成長できる。不死に必要な突然変異は、自然に発生するか、または実験の目的のために意図的に誘導することができる。不死の細胞株は、多細胞生物の生化学と細胞生物学における研究のための、非常に重要なツールである。このような細胞株の１例は、初代ヒト肝細胞の多くの特徴を保持する、ヒト肝前駆細胞株に由来する、末期的に分化した肝細胞（terminally differentiated hepatic cells）である、HepaRG細胞である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によると、細胞は、プレーティング（plating）の前、最中または後に、増殖（expanded）されず、および／またはプレーティング（plating）後、細胞は継代（passaged）されない。
【００５４】
線維芽細胞（Fibroblasts）または軟骨細胞（Chondrocytes）のような、２，３の初代細胞は、培養において、増殖（expanded）されることができるが、大抵の初代細胞は、増殖（expanded）される限られた能力のみを有する。それと対照的に、幹細胞、不死化細胞および腫瘍細胞は、一般的に言えば、増殖（expanded）される能力を持っている。
【００５５】
細胞のプレーティング（plating）は、３Ｄ細胞培養の１つの特別な部分（particular subdivision）、すなわち、３Ｄ組織培養プロセスに細胞を送るに先立ち、細胞が増殖（expanded）されるような細胞培養のタイプにおいてのみ、役割を果たす。前述の通り、これは、幹細胞、腫瘍細胞および不死化細胞だけでなく、非常に限られた数の初代細胞にのみ適用される。
【００５６】
さらに、イクスパンジョン（expansion）は、細胞の連続継代（serial passaging of the cells）が必要で、それは、主に、プロセスの後半に、Ｔフラスコやローラー  ボトルなどの単層培養で達成される。細胞イクスパンジョン（expansion）の１つの主な欠点は、ネイティブの細胞表現型（脱分化）の潜在的な喪失であり、ネイティブの機能の喪失、および遺伝子／染色体の変化が続く。特に、毒性のアッセイのため、および、再生医療のための、最も重要な細胞のタイプのいくつかは、ともかく、増殖（expanded）できない。
【００５７】
本発明の好ましい別の実施の形態によると、細胞は、哺乳類細胞、好ましくは、以下から成る群から選択される。
・ヒト細胞、
・カニクイザル（cynomolgus）の細胞、
・ブタ細胞、
・イヌ（canine）細胞、および／または
・ラット細胞。
【００５８】
特に好ましくは、使用される細胞は、肝細胞である。肝細胞は、肝の細胞質質量（cytoplasmic mass）の７０−８５％を構成する、肝臓の主要な組織の細胞である。ヒト肝細胞の初代培養は、例えば、毒性のアッセイなどの、スクリーニング目的のためだけでなく、肝臓の生理学と病理学の多くの側面を検討するために、広く使用されている、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルである。ヒト肝細胞の単離に使用される技術は、寄贈された肝臓の２段階のコラゲナーゼ灌流（perfusion）の技術に基づく。
【００５９】
肝細胞の機能は、正反対の表現型（polar phenotype）の形成能力に大きく依存する。これは、スクリーニング目的のための有用性だけでなく、準最適な条件の下で、めったに５日を超えない、それらの寿命にも影響を与える。しかし、このような正反対の表現型（polar phenotype）は、２Ｄ培養においてではなく、細胞の自然な環境を模倣する３Ｄ培養によってのみ、確立される。肝細胞から作られた３Ｄ組織は、従って、しばしば、「チップの上の器官」または「ウェルの中の器官」と愛称で呼ばれる。
【００６０】
本発明の別の態様によると、３Ｄ組織培養プロセスが提供され、当該プロセスは、以下から成る群から選択される。
・スカホルド−ベース（scaffold-based）の３Ｄ組織培養、
・ハイドロゲル−ベースの３Ｄ組織培養、
・細胞の自己組織化（cellular self-assembly）３Ｄ組織培養、および／または、
・３Ｄバイオプリンティング（３Ｄ bioprinting） 
そして、当該プロセスにおいて、本発明に係る方法に従って調製された細胞が使用される。
【００６１】
本発明の別の態様によると、上記のプロセスを用い、および／または本発明の方法に従って調製された細胞から得られた、３Ｄ組織培養が提供される。
【００６２】
好ましくは、前記３Ｄ組織培養は、回転楕円体の形状となり、好適には、≧２および≦５００μｌ、間の容積を想定でき、そして、好適には、その後、３Ｄの組織を形成することを意味する、≧１００および≦５００００の間の細胞を収容する。
【００６３】
本発明のまだ別の局面によれば、下記からなる群から選択される、少なくとも１つの目的のための、本発明による３Ｄ組織の使用が提供される。
・薬の有効性および／または毒性のスクリーニング、
・調査／機構の毒物学（investigative/mechanistic toxicology）、
・ターゲットの発見／識別（target discovery/identification）、
・医薬品リポジショニング研究（drug repositioning studies）
・薬物動態および薬力学のアッセイ（pharmacokinetics and pharmacodynamics assays）、および／または
・再生医療（regenerative medicine）。
【００６４】
［実験と図］
【００６５】
本発明は、図面と上述の説明において、詳しく、図解され、説明されたが、そのような図および説明は、例または代表と考慮すべきであり、制限ではない；本発明は、開示された実施形態に制限されない。開示された実施形態についての他のバリエーションは、図面、開示、および添付されたクレームの研究から、クレームされた発明を実施する分野の当業者によって、理解でき、影響を受ける。クレームにおいて、「含む」という語は、他の要素またはステップを排除しない。そして、無限定の語「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外しない。特定の方法が、相互に異なる従属クレームでリサイト（recite）されているという単なる事実は、これらの方法の組み合わせは利点として使用できないことを示さない。クレームにおける、いかなる参照のサイン（Any reference signs）も、その範囲を制限するものとして解釈してはならない。
【００６６】
実施例１：ヒト肝臓の微小組織（microtissue）を製造するための最適化された方法
【００６７】
１．凍結保存の肝細胞の解凍
・低温タンク（cryo-tank）から、選んだ細胞瓶（cell-vial）を取り、そして、水浴（３７℃）へ移す；２分でタイマー設定する。
・５０ｍｌのチューブに洗浄／解凍培地の４０ｍｌをピペットする
・チューブに肝細胞を移し、培地１ｍｌで洗う。
・５０ｍｌのチューブを、遠心分離機に配置し；５０ｒｃｆ（６００ｒｐｍに相当）で、５分間、遠心分離を開始する。
・上清を除去する。
・２０ｍｌ洗浄緩衝液でペレットを洗浄する。
・５０ｍｌのチューブに、慎重に、洗浄／解凍培地３ｍｌを置く。
・２Ｄ細胞培養培地で、細胞ペレットを再懸濁する。
・トリパン  ブルーなどで、肝細胞を数える。
【００６８】
２．肝細胞のプレ・プレーティング（pre-plating）
・プレ播種のために（for pre-seeding）、コラーゲン被覆細胞培養皿を使用する。
・６ｃｍの皿に、肝細胞を播く：１０００００−２５００００肝細胞／ｃｍ２。ｃｍ２あたり、０．０５−０．５ｍｌ
・ＣＯ２を含むインキュベーターに、３７℃で置く。
・所望により：無血清の２Ｄ培養培地で接着（attachment）後、培地の交換をする。
・１２−９６時間後（１２時間以上の場合、毎日培地交換）、肝細胞を収穫する。
・予め温めておいたリン酸緩衝生理食塩水で、３回、非接着の肝細胞を洗浄して除去する。
・５０−５００ｕｌ／ｃｍ２のウェルから、肝細胞を除去（dislodge）するために、コラゲナーゼ／アキュターゼ（accutase）混合物のような細胞剥離液（cell detachment solution）を、培養皿に添加する。
・３７℃で、５−３０分間（ほとんどの細胞が、表面から剥離されるまで、目視観察）、インキュベートする。
・分散した肝細胞を、注意して、洗浄緩衝液で、事前充填された５０ｍｌのチューブに移す。
・常温で、５０ｒｃｆ（６００ｒｐｍに相当）で、５分間、遠心分離する
・上清を吸引、ペレットに、１−５０ｍｌの洗浄培地を加え、そして、穏やかに、そのチューブを回転して、ペレットを再度懸濁する。
・常温で、５０ｒｃｆ（６００ｒｐｍに相当）で、５分間、遠心分離手順を繰り返す。
・ペレットに、再凝集培地１ｍｌを加え、チューブを穏やかに回転して、肝細胞を溶解する。
・肝細胞数を数える。
【００６９】
３．微小組織（microtissue）の生産
Ａ．ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳTM  プレート（Ｉｎｓｐｈｅｒｏ  ＡＧ社、スイス）の調製
・ＰＢＳ／アンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｈｅｒｉｃｉｎ）の０．７５の１５ｍｌで、オムニトレイ（Omnitray）を満たし、加湿パッド（humidifier pad）を加える。
・フレーム（frame）を、オムニトレイ（Ｏｍｎｉｔｒａｙ）の上に置く。
・前記プレートに蓋をし、プレートをラベルする（label plate）。
Ｂ．細胞懸濁液の調製
・ファルコン  チューブ（falcon tubes）に、規定された細胞数の細胞懸濁液を調製（すなわち、ｍｌ当たり、２５’０００Ｈｅｐｓ／２５’０００ＮＰＣ）する。
・チューブを回して（pivoting the tube）、細胞懸濁液を均質化する（Homogenize）。
Ｃ．播種（Seeding） 
・Ｖｉａｆｌｏ電子マルチ  チャンネル  ピペット  （インテグラ  バイオサイエンス社）  を使用する。
・Ｖｉａｆｌｏパラメーターを設定する：分配：４０ｕｌ、速度３、繰返し：（Ｖｉａｆｌｏの９６ウェルに対して１回）
・貯留槽（reservoir）における細胞懸濁液を空にする（細胞の適切な分配を確保するため、貯留槽に３０ｍｌ以上を注がない）。
・ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳプレートから、蓋を除く。
・細胞懸濁液の前吸引（Prior Aspiration of cell suspension）、細胞の均一な分配のために、貯留槽を優しく回転（gently pivot reservoir）する。
・Ｖｉａｆｌｏプログラムを起動する：繰り返し分配する。
・挿入物（inserts）の上に、水平に、Ｖｉａｆｌｏを置く、挿入物の上に、Ｖｉａｆｌｏで穏やかに圧力をかけ、そのトップに液滴がタップすることを避ける。
・プレートに、蓋を戻す。
【００７０】
４．使用される培地
0006492106.tif 000002
【００７１】
実施例２：３Ｄ組織培養の安定性
【００７２】
本発明による方法で得られた、３Ｄ組織培養の安定性をテストするため、肝臓の微小組織（microtissue）を、時間をかけてモニターした。それらは、一定のＡＴＰ量によって示されるように、培養において、５週間以上、安定であったことが判明した（図５ａ）。肝細胞の２Ｄ培養と較べて、この拡張した寿命は、肝細胞の分化状態を維持するために不可欠な、広範な細胞−細胞接触のせいであることが、最も可能性が高い。更に、永続的なアルブミン分泌によって示されているように、肝臓の微小組織（microtissue）の安定した生存性、機能は、５週間を超えて維持された（図５ｂ）。
【００７３】
実施例３：本発明に従って製造された、３Ｄ組織培養を、肝毒性のスクリーニングに使用
【００７４】
本発明にしたがって生成された、３Ｄ組織培養の延長された寿命および機能は、慢性肝毒性の効果を評価するための、繰返し投与による長期試験を許容する。肝毒性の化合物である、アセトアミノフェンとジクロフェナクは、それらの長期毒性のプロファイルに関して、試験された。アセトアミノフェンは、ヒトの薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）の主要な原因である。治療用量で、薬の一部は、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４によるバイオ活性化を受ける。この反応性中間体は、肝細胞の細胞死に至る細胞内グルタチオン  プールを枯渇（depletes）させる。これまでのところ、肝細胞の２Ｄ培養では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、アセトアミノフェン誘発毒性の説得力のある再現（recapitulate）は、可能となっていない（FeyおよびWrzesinski  ２０１２年）。
【００７５】
肝臓の微小組織（microtissue）を、１４日以上、３回の再投与による処理は、濃度依存的に、７５４．２μＭのＩＣ５０値で、細胞死の増加を齎した（図６ａ）。ジクロフェナクは、肝毒性と強く結びついている、非ステロイド系の抗炎症薬である。そのメカニズムは、フェーズIの酵素活性（複数のＰ４５０が触媒する酸化反応）、フェーズIIの酵素活性（グルコノロニル化）およびメカニズムに基づく抑制を含むと考えられている。ヒト肝細胞の２Ｄ培養と比較して（３３１μＭのＩＣ５０値と計算される）、長期処理された肝臓の微小組織（microtissue）は、１７８．６μＭのＩＣ５０値を持つ、この薬剤に対する感受性の増加を示す（図６ｂ）。大抵の直接的肝毒性化合物は、前臨床試験中に検出される。しかし、免疫系を含む、間接的肝毒性化合物は、トロバフロキサシンのように、前臨床試験フェーズ中には検出されない。最近の動物実験では、トロバフロキサシンは、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＴＮＦ−αなどの炎症性刺激との組み合わせた場合のみ、肝毒性を有することが示されている。そのメカニズムは、カスパーゼ活性化とその後の肝障害の原因となる、強化されたサイトカイン分泌と肝臓における蓄積を含むと考えられている。ＬＰＳによる、肝臓の微小組織（microtissue）における炎症性応答の誘導は、肝の微小組織（microtissue）に組み込まれたマクロファージの応答を確認し（図６ｃ）、ＩＬ−６の分泌のレベルの上昇を齎した。ＬＰＳの追加は、トロバフロキサシンの肝毒性閾値を、約３倍、２２０（ＬＰＳなし）から、ＬＰＳの存在下の７１μＭへとシフトさせた（図６ｄ）。従来の２Ｄ培養の制限を克服するために開発された、マルチ細胞型３Ｄ肝微小組織（microtissue）は、肝臓様の細胞組成および培養中の増大した安定性について似ている。肝微小組織（microtissue）の長期的な生存性および機能性は、慢性および炎症介在の毒性だけでなく、化合物の日常的試験を許容する。９６のウェル  フォーマットは、医薬品開発の初期の時点で、器官型（organotypic）肝臓モデルの実行を可能にする、微小組織（microtissue）の大量生産を許容する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】［図１：解凍後、直接播種（seed）する場合の、不完全な微小組織（microtissue）の形成］ヒトの肝微小組織（microtissue）形成は、解凍後に、直接、懸滴培養プレートに、播種される、凍結保存された、接着可能な（ｐｌａｔｅａｂｌｅ）、初代ヒト肝細胞で開始される。２つの異なる培地成分を試験した（培地Ａ＋Ｂ）。３つの代表的な懸滴培養（Ｎｒ．１、２、３）は、播種直後および懸滴培養で、１および４日後を画像化した。肝細胞は、培養４日目まで、懸滴培養のメニスカス（meniscus）で蓄積し、緩やかな集合体を形成した。同じ幹細胞のロットは、解凍後、２Ｄのコラーゲン−Iでコートされた培養皿に接着することを示し、この肝細胞の２Ｄ培養に対する適合性を示した。
【図２】［図２；生命力のある（vital）細胞の選択が、完全な微小組織（microtissue）形成を可能にする］ヒト肝微小組織（microtissue）の形成は、凍結保存された、接着可能な（plateable）、初代ヒト肝細胞の５つの独立したロット（ドナー  １−５）で開始され、解凍後、コラーゲン−Iでコートされた、２Ｄの培養皿に、直接、２４時間、播種（seed）された。生命力のある（vital）細胞を選択した後、その細胞は、培養皿から剥離されて、懸滴培養プレートに播種（seed）された。肝細胞は、懸滴培養のメニスカス（meniscus）で蓄積され、培養５日以内に、タイトな微小組織（microtissue）（「hepatospheres」とも呼ばれる）を形成した。微小組織（microtissue）は、レシーバー  プレート（ＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰTM）に移され、微小組織（microtissue）の外観およびサイズを画像化した。全ての５つの肝細胞のロットは、培養５日以内に、堅牢かつ均一の微小組織（microtissue）の形成を示した。
【図３】［図３：初代ヒト肝細胞の生命力のある（vital）細胞の選択を伴う、ヒト肝微小組織（microtissue）の再現性のある形成］（Ａ）凍結保存した、ヒト肝細胞のプレ・プレーティング（plating）後に生産された、ヒト肝微小組織（microtissue）のサイズバリエーション。標準偏差を含む（ｎ＝６）、２４の製造における、ヒト肝微小組織（microtissue）の直径が示される。同じ肝細胞のロットを用いて、２４の製造における、ヒト肝微小組織（microtissue）の直径が決定された。１製造当たりの、６つの微小組織（microtissue）のサイズ測定について、平均直径および標準偏差が表示される。微小組織（microtissue）は、各製造における、５％未満のサイズ  バリエーションを示した。全２４の製造の平均微小組織（microtissue）のサイズは  ２８０μｍで、生産間では、１０％未満の相対サイズ偏差があった。（Ｂ）アッセイ変動の結果（Resulting assay variability）ヒト肝微小組織（microtissue）を用いた、４０アッセイの、細胞内ＡＴＰ量を、１４日後に、CellTiter  Glo（R）アッセイで定量した。３回（in triplicates）、測定を行った。全４０アッセイの平均ＲＬＵを１００％に設定し、各測定の、平均値（mean）に対する、相対標準偏差が示されている。全４０の測定の平均の相対標準偏差は、１４．６％である。
【図４】［図４：イヌの肝細胞の微小組織（microtissue）形成は、生命力のある（vital）細胞選択をした場合でのみ、達成される］イヌの肝微小組織（microtissue）形成は、凍結保存された、接着可能な（plateable）、初代イヌ肝細胞を用いて開始され、懸滴培養において、直接に、播種されるか（Ｂ）、または、コラーゲン−Iでコートされた、２Ｄ培養皿に、２４時間、プレ・プレーティング（plating）処理された（Ｃ，Ｄ）。イヌ肝微小組織（microtissue）形成は、培養において、凍結保存された肝細胞の直接播種後、４日まで観察されなかった。生命力のある（vital）細胞が選択されたイヌの肝細胞は、懸滴培養で、４日以内に、密度の高い微小組織（microtissue）を形成した（Ｃ）。（Ｄ）図４ｄは、懸滴培養から、レシーバープレートへ移動された、イヌ肝微小組織（microtissue）のイメージである。
【図５】［図５：５週間以上、培養した、３Ｄ組織の生存性および機能性（Ａ）  組織内のＡＴＰの定量化］微小組織（microtissue）あたりのＡＴＰ量は、細胞の生存性と生命力（vitality）の指標として記載した（ｐｍｏｌ  ＡＴＰ／ＭＴ）。（Ｂ）最初の肝細胞数と時間に対して正規化された  時間に対する、ＥＬＩＳＡによる、分泌されたアルブミンの定量化。
【図６】［図６：本発明により製造された、ヒト肝微小組織（microtissue）を用いた、長期毒性および炎症介在する試験］（Ａ）処理から１４日後（３回の再投与）の、アセトアミノフェン毒性の用量−応答は、７５４．２μＭのＩＣ５０値を齎した。 （Ｂ）１４日間（３回の再投与）、ジクロフェナクで補足された、用量−応答曲線は、１７８．６μＭのＩＣ５０値を齎した。 （Ｃ）ＥＬＩＳＡ測定を用いた、IＬ−６分泌の定量化。ヘパトスフィア（Hepatosphere）は、４８時間、１０  ｌｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導された。ＬＰＳによる誘導は、IＬ−６分泌において、１０倍の増加につながった。（Ｄ）ＬＰＳの存在および不存在において、毒性を誘発した、トロバフロキサシンの用量−応答。ＬＰＳの存在は、ＩＣ５０を、２２０（−ＬＰＳ）から、７１μＭ（＋ＬＰＳ）へ、３倍減少した。
【図７】［図７：プレ・プレーティング（plating）なしとプレ・プレーティング（plating）ありの場合に、製造された、ヒト肝微小組織（microtissue）の構造的完全性（integrity）］ 組織学的調製は、ホルマリン固定、および、パラフィンで封入された、ヒト肝微小組織（microtissue）から作成された。該ヒト肝微小組織（microtissue）は、凍結保存された肝細胞の解凍後、直接、または、コラーゲン被覆細胞培養皿の上で、２４時間、肝細胞をプレ・プレーティング（plating）後、製造された。３−５ｕｍ厚のセクションは、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で着色された。画像は、１０倍で撮影された。図７の上段は、事前のプレ・プレーティング（plating）なしで、製造された、微小組織（microtissue）を示す。一方、下段は、事前のプレ・プレーティング（plating）ありで、製造された、微小組織（microtissue）を示す。＃３のドナーについて、プレ・プレーティング（plating）工程なしで、凍結保存された肝細胞を使用した、微小組織（microtissue）は、形成されなかった。その他の調製において、密な好酸球（eosinophilic）染色および組織内の核の欠如によってあきらかな、高度の壊死領域は、プレ・プレーティング（plating）なしの群で見られた（特に、ドナー  ２および４については優勢であり、統合された、生存する、いかなる肝細胞を有することが難しいように見える。）。プレ・プレーティング（plating）工程は、肝微小組織（microtissue）の構造形態を大きく向上させる。
【００７７】
参照
Pichard et al. (2006) Human hepatocyte culture. Meth Mol Biol 320: 283-293.
Kelm et al., Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 2003, 83, 173-180.
Kelm et al 2010, A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology
Ridky TW et al., Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine 2010 
Cody NA et al., Influence of monolayer, spheroid, and tumor growth conditions on chromosome 3 gene expression in tumorigenic epithelial ovarian cancer cell lines.
BMC Med Genomics. 2008
Kelm & Fussenegger, Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends Biotechnol. 2004, 22, 195-202.
Yuhas, J et al., Simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 1977, 37, 3639-3643.
Metzger et al, The liquid overlay technique is the key to formation of co-culture spheroids consisting of primary osteoblasts, fibroblasts and endothelial cells. Cytotherapy. 2011 Sep;13(8):1000-12. 
Geckil et al, Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond). 2010 April ; 5(3): 469-484.
Carletti E et al, Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 2011;695:17-39.
Fey and Wrzesinski, Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol Sci. 2012 Jun;127(2):403-11
Jensen J, Hyllner J, Bjorquist P. Human embryonic stem cell technologies and drug discovery. J Cell Physiol 2009; 219: 513-519.
Sartipy & Bjorquist. Concise Review: Human Pluripotent Stem Cell-Based Models for Cardiac and Hepatic Toxicity Assessment. Stem Cells 2011; 29 (5): 744-748
【図１】
0006492106.tif 000003
【図２】
0006492106.tif 000004
【図３】
0006492106.tif 000005
【図４】
0006492106.tif 000006
【図５】
0006492106.tif 000007
【図６】
0006492106.tif 000008
【図７】
0006492106.tif 000009