(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４−３−３γ遺伝子を含む、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
１４−３−３γタンパク質を含む、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物。
【請求項３】
１４−３−３γ遺伝子またはタンパク質を含む細胞を候補物質と人体外で接触させ、
前記候補物質による前記遺伝子またはタンパク質の発現量の変化を測定することを含む、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記候補物質が１４−３−３γ遺伝子またはタンパク質の発現を上向き調節するとき、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬であると判別する、請求項３に記載の非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質をＰＰＡＲγ２タンパク質と共に候補物質と接触させ、
前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化を測定することを含む、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化の測定は、ＰＰＡＲγ２のＳｅｒ２７３残基に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化を測定することである、請求項５に記載の非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化の測定の結果、前記候補物質がＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質の結合を減少させたり、ＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３γタンパク質の結合を増加させるとき、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬であると判別する、請求項５に記載の非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝調節因子１４−３−３タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝（Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）は、代表的な肝臓疾患であって、肝の炎症と損傷を誘発する。非アルコール性脂肪肝が悪化すると、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳ）に発展し、その症状としては、硬変症と線維症が現れる。最近の報告によると、脂肪肝患者の肝でペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＰＡＲ）γ２という転写因子が過発現および活性化していると知られていた。また、ＰＰＡＲγ２の活性化によって肝の脂質代謝に関与する多様なターゲットタンパク質の発現が誘導される。このような転写因子の活性に関与する１４−３−３というタンパク質は、７種類のイソ型タンパク質（α／β、ε、η、γ、τ／θ、δ／ζ、およびσ）として存在する。１４−３−３のタンパク質は、転写因子のリン酸化の部分に結合して転写者の活性を調節すると知られており、代謝関連転写因子の調節にも関与する。よって、本発明者らは、脂肪肝の発病および調節において１４−３−３タンパク質の役割を調査した結果、１４−３−３βと１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の調節因子であって、脂肪代謝過程で重要な役割をするタンパク質であり、非アルコール性脂肪肝の治療のための標的として用いられることを糾明し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４，８１６，５７６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬の開発のための１４−３−３βおよび１４−３−３γの用途を提供することにある。
しかし、本発明が達成しようする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及されない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明は、１４−３−３β遺伝子に対する阻害剤を含み、前記阻害剤は、１４−３−３β遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはこれらを含むベクターである非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【０００６】
また、本発明は、１４−３−３γ遺伝子または１４−３−３γタンパク質を含む非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【０００７】
また、本発明は、脂肪肝が疑われる患者の試料から１４−３−３βおよび／または１４−３−３γ遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定するためのプローブを含む非アルコール性脂肪肝診断用組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、１４−３−３βまたは１４−３−３γ遺伝子またはタンパク質を含む細胞を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質による前記遺伝子またはタンパク質の発現量の変化を測定することを含む非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質をＰＰＡＲγ２タンパク質と共に候補物質と接触させ、前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化を測定することを含む非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、１４−３−３の二つのイソ型タンパク質である１４−３−３βと１４−３−３γが、それぞれ異なる調節因子であり、ＰＰＡＲγ２の転写活性を調節する。１４−３−３βは、ＰＰＡＲγ２と結合してＰＰＡＲγ２の転写活性を増加させるのに対し、１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を減少させる役割をする。したがって、１４−３−３βと１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の調節因子であって、脂肪代謝過程で重要な役割をするタンパク質であり、非アルコール性脂肪肝の予防または治療のための標的として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】図１Ａは、１４−３−３イソ型タンパク質の過発現によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図１ｂ】図１Ｂは、１４−３−３βの発現量の変化によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図１ｃ】図１Ｃは、１４−３−３γの発現量の変化によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図１ｄ】図１Ｄは、１４−３−３βの発現抑制によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図１ｅ】図１Ｅは、１４−３−３γの発現抑制によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図２】図２は、ＰＰＡＲγ２リガンドであるピオグリタゾン処理によるＰＰＡＲγ２との結合力を確認した図であり、図２のＡは、ＰＰＡＲγ２と１４−３−３βとの間の結合力を確認した結果であり、図２のＢは、ＰＰＡＲγ２と１４−３−３γとの間の結合力を確認した結果である。
【図３ａ】図３Ａは、ＰＰＡＲγ２のドメイン位置および欠失突然変異を確認した結果である。
【図３ｂ】図３Ｂは、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを利用してＰＰＡＲγ２の欠失突然変異と１４−３−３βとの間の結合を確認した結果である。
【図３ｃ】図３Ｃは、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを利用してＰＰＡＲγ２の欠失突然変異と１４−３−３γとの間の結合を確認した結果である。
【図４ａ】図４Ａは、ＰＰＡＲγ２のＳ１１２ＡおよびＳ２７３Ａ突然変異と１４−３−３βとの間の結合を確認した結果である。
【図４ｂ】図４Ｂは、ＰＰＡＲγ２のＳ１１２ＡおよびＳ２７３Ａ突然変異と１４−３−３γとの間の結合を確認した結果である。
【図４ｃ】図４Ｃは、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３Ａ突然変異と１４−３−３βとの間の結合によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図４ｄ】図４Ｄは、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３Ａ突然変異と１４−３−３γとの間の結合によるＰＰＡＲγ２の転写活性を確認した結果である。
【図５】図５は、１４−３−３γまたは１４−３−３βの過発現によるＰＰＡＲγ２との結合を確認した図であり、図５のＡは、１４−３−３γの過発現による１４−３−３βとＰＰＡＲγ２との間の結合を確認した結果であり、図５のＢは、１４−３−３βの過発現による１４−３−３γとＰＰＡＲγ２との間の結合を確認した結果である。
【図６ａ】図６Ａは、オレイン酸の処理によるＨｅｐＧ２細胞におけるＰＰＡＲγ２、１４−３−３β、および１４−３−３γの発現を確認した結果である。
【図６ｂ】図６Ｂは、オレイン酸の処理によるマウス初代肝細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）におけるＰＰＡＲγ２、１４−３−３β、および１４−３−３γの発現を確認した結果である。
【図６ｃ】図６Ｃは、オレイン酸の処理によるＨｅｐＧ２細胞におけるターゲット遺伝子の発現を確認した結果である。
【図６ｄ】図６Ｄは、オレイン酸の処理によるマウス初代肝細胞におけるターゲット遺伝子の発現を確認した結果である。
【図７ａ】図７Ａは、ＨｅｐＧ２細胞で、１４−３−３βと１４−３−３γの発現によるターゲット遺伝子の発現を確認した結果である。
【図７ｂ】図７Ｂは、マウス初代肝細胞で、１４−３−３βと１４−３−３γの発現によるターゲット遺伝子の発現を確認した結果である。
【図７ｃ】図７Ｃは、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙ）を利用して１４−３−３βと１４−３−３γ発現によるＦＡＴ／ＣＤ３６プロモーターとの結合を確認した結果である。
【図７ｄ】図７Ｄは、１４−３−３βと１４−３−３γの発現による１４−３−３βと１４−３−３γの発現によるＳＲＥＢＰ−１ｃタンパク質の発現を確認した結果である。
【図８】図８は、オレイン酸の処理によるＰＰＡＲγ２との結合および１４−３−３βと１４−３−３γの過発現によるＰＡＲ−ＲＸＲ複合体の形成有無を確認した図であり、図８のＡは、オレイン酸の処理によるＰＰＡＲγ２と１４−３−３βとの間の結合を確認した結果；図８のＢは、オレイン酸の処理によるＰＰＡＲγ２と１４−３−３γとの間の結合を確認した結果であり、図８のＣは、１４−３−３βと１４−３−３γの過発現によるＰＰＡＲ−ＲＸＲ複合体の形成有無を確認した結果である。
【図９】図９は、マウス初代肝細胞とＨｅｐＧ２細胞で、オレイン酸の処理、１４−３−３βと１４−３−３γの過発現または発現抑制による脂肪蓄積の変化を確認した図であり、図９のＡは、オレイン酸の処理による脂肪蓄積の変化を確認した結果であり、図９のＢは、１４−３−３βと１４−３−３γの過発現による脂肪蓄積の変化を確認した結果であり、図９のＣは、１４−３−３βと１４−３−３γの発現抑制による脂肪蓄積の変化を確認した結果である。
【図１０】図１０は、マウス初代肝細胞とＨｅｐＧ２細胞で、１４−３−３βと１４−３−３γの過発現または発現抑制によるトリグリセリド蓄積の変化を確認した図であり、図１０のＡは、１４−３−３βと１４−３−３γの過発現によるトリグリセリド蓄積の変化を確認した結果であり、図１０のＢは、１４−３−３βと１４−３−３γの発現抑制によるトリグリセリド蓄積の変化を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００１３】
本発明者らは、１４−３−３の二つのイソ型タンパク質である１４−３−３βと１４−３−３γが、それぞれ異なる調節因子であって、ＰＰＡＲγ２の転写活性を調節することを発見した。１４−３−３βは、ＰＰＡＲγ２と結合してＰＰＡＲγ２の転写活性を増加させるのに対し、１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を減少させる役割をした。ＰＰＡＲγ２がＮＡＦＬＤで重要な役割をするので、１４−３−３βと１４−３−３γが脂肪蓄積にいかなる影響を与えるのかを調査するために、１４−３−３βと１４−３−３γを肝細胞に過発現させた。その結果、１４−３−３βが過発現した場合は、脂肪代謝に関与するＰＰＡＲγ２の標的遺伝子の発現が増加し、脂肪蓄積を強化させたが、１４−３−３γが過発現した場合は、ＰＰＡＲγ２の標的遺伝子の発現と脂肪蓄積が抑制された。すなわち、１４−３−３βと１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の調節因子であって、脂肪代謝過程で重要な役割をするタンパク質であり、ＮＡＦＬＤ治療のための標的タンパク質として用いられることを糾明した。
【００１４】
よって、本発明者らは、脂肪肝の予防または治療用医薬組成物の製造のための１４−３−３βと１４−３−３γの用途を提供する。
【００１５】
より具体的に、本発明は、１４−３−３β遺伝子に対する阻害剤を含む脂肪肝の予防または治療用医薬組成物、脂肪肝の予防または治療用医薬の製造のための前記阻害剤の用途、前記阻害剤を対象体に投与することを含む脂肪肝の予防または治療方法を提供する。
【００１６】
本発明において、脂肪代謝に関与するＰＰＡＲγ２の転写活性を調節するターゲットとして用いられる１４−３−３βは、１４−３−３β遺伝子を意味したり、１４−３−３βタンパク質を意味するものと解釈される。したがって、１４−３−３βに対する阻害剤は、１４−３−３β遺伝子および１４−３−３βタンパク質に対する阻害剤を全部含むものと解釈される。
【００１７】
前記１４−３−３βタンパク質、前記１４−３−３β遺伝子などには、これらと実質的に同じ活性を有するこれらの変異体または断片が含まれるものと解釈される。
【００１８】
一具体例において、１４−３−３β遺伝子に対する阻害剤は、前記遺伝子の発現を阻害して、１４−３−３βタンパク質の発現阻害によるＰＰＡＲγ２との結合を遮断する阻害剤であってもよい。１４−３−３β遺伝子は、これをコードするＤＮＡまたはこれから転写されるｍＲＮＡであってもよい。したがって、前記遺伝子に対する阻害剤は、遺伝子自体に結合して転写を妨害したり、遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの解読を妨害する阻害剤であってもよい。
【００１９】
一具体例において、１４−３−３β遺伝子に対する阻害剤は、１４−３−３β遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはこれらを含むベクターであってもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはこれらを含むベクターは、当業界に公知になった方法を利用して製作し得る。本発明において、前記「ベクター」は、ポリペプチドを暗号化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子作製物をいう。本発明に関連したベクターは、前記遺伝子を阻害する核酸配列がゲノム内に挿入されたベクターであって、これらのベクターは、ＤＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、酵母ベクター、またはウイルスベクターが例示できる。
【００２０】
一具体例において、１４−３−３βタンパク質に対する阻害剤は、１４−３−３βタンパク質と結合して１４−３−３βタンパク質とＰＰＡＲγ２との結合を遮断する阻害剤であってもよい。例えば、このような阻害剤は、１４−３−３βタンパク質と結合するペプチドまたは化合物などであってもよい。このような阻害剤は、タンパク質の構造分析などの下記に例示されたスクリーニング方法を用いて選定され得、当業界に公知になった方法を利用して設計され得る。一具体例において、前記阻害剤は、１４−３−３βタンパク質に対するポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体であってもよい。このようなポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体は、当業界に公知になった抗体の製作方法を利用して製作し得る。
【００２１】
１４−３−３γが過発現すると、ＰＰＡＲγ２の標的遺伝子の発現と脂肪蓄積が抑制されるので、１４−３−３γ遺伝子または１４−３−３γタンパク質は、それ自体でも非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物の有効成分として使用し得る。
【００２２】
したがって、本発明は、１４−３−３γ遺伝子を含む非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００２３】
医薬組成物の有効成分として含まれる遺伝子は、遺伝子自体または当該遺伝子を含むベクターの形態で医薬組成物内に含まれ得る。ベクターに対する定義は、前述した通りであり、これらのベクターの類型と製造方法は、当業界によく知られている。
【００２４】
また、本発明は、１４−３−３γタンパク質を含む非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明の非アルコール性脂肪肝の予防または治療用組成物は、天然型または組み換え１４−３−３γと、これらと実質的に同等の生理活性を有する１４−３−３γタンパク質を含むことができる。前記実質的に同等の生理活性を有するタンパク質には、天然型／組み換え１４−３−３γとその機能的同等物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）および機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が含まれる。
【００２６】
前記「機能的同等物」には、天然型タンパク質のアミノ酸のうち一部または全部が置換されたり、アミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体であって、天然型１４−３−３γと実質的に同等の生理活性を有するものをいう。
【００２７】
「機能的誘導体」は、前記１４−３−３γタンパク質の物理化学的性質を増加または減少させるための変形を加えたタンパク質であって、天然型１４−３−３γと実質的に同等の生理活性を有するものを意味する。
【００２８】
本発明の１４−３−３γタンパク質の由来は、特に限定されないが、好ましくは脊椎動物、好ましくはヒト、マウス、ラットなどに由来するタンパク質であってもよい。
【００２９】
一具体例によると、本発明に使用された１４−３−３γは、公知の配列から当業者に公知になった遺伝工学的方法で製造し得る。
【００３０】
天然型の１４−３−３γを遺伝子組み換え方法によりタンパク質を製造する場合、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）や昆虫細胞を利用するよりも哺乳動物細胞を利用する場合が、タンパク質の活性度や溶解性の観点から天然型のものと類似すると認められる。
【００３１】
前記組み換え１４−３−３γタンパク質は、通常のカラムクロマトグラフィー方法などを利用して分離し得る。また、タンパク質の精製程度は、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ））などで確認し得る。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、有効成分の他に、薬剤学的に好適であり、生理学的に許容される添加剤を使用して製造され得、前記添加剤とては、賦形剤、崩解剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤が使用できる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、投与のために、有効成分の他に、さらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで医薬組成物で好ましく製剤化し得る。
【００３４】
液状溶液で製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適合したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加し得る。
【００３５】
また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化し得る。ひいては、当該分野の適切な方法としてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を利用して各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化し得る。
【００３６】
本発明の医薬組成物の薬剤製剤の形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤および活性化合物の徐放性製剤などになり得る。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を介して通常の方式で投与し得る。
【００３８】
本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防または治療、または骨成長の誘導効果を達成するのに要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般の健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めて多様な因子によって調節され得る。これに限定されるものではないが、例えば、成人の場合、１日１回〜数回投与時に、本発明の阻害剤は、１日１回〜数回投与時に、化合物の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、ポリペプチド、タンパク質または抗体の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡの場合、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの容量で投与し得る。
【００３９】
本発明において、「対象体」は、ヒト、オランウータン、チンパンジー、マウス、ラット、犬、牛、鶏、豚、ヤギ、羊などを含むが、これらの例に限定されるものではない。
【００４０】
また、本発明は、非アルコール性脂肪肝が疑われる患者の試料から１４−３−３βおよび／または１４−３−３γ遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定することによって、非アルコール性脂肪肝の発病の可能性に対する情報を提供する方法に関する。
【００４１】
具体的に、本発明は、非アルコール性脂肪肝が疑われる患者の試料から１４−３−３β遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定するためのプローブを含む非アルコール性脂肪肝診断用組成物を提供する。
【００４２】
また、本発明は、非アルコール性脂肪肝が疑われる患者の試料から１４−３−３γ遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定するためのプローブを含む非アルコール性脂肪肝診断用組成物を提供する。
【００４３】
一具体例において、前記遺伝子のｍＲＮＡの水準を測定するためのプローブは、前記ｍＲＮＡに対する核酸プローブまたはプライマーであってもよい。
【００４４】
前記核酸プローブは、自然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線状オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができ、自然的に存在したり、または人為的に合成されたものをいう。本発明によるプローブは、一本鎖であってもよく、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。本発明のプローブは、自然ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＴＭＰ）、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、本発明のプローブは、リボヌクレオチドも含むことができる。例えば、本発明のプローブは、骨格変形されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオアートＤＮＡ、ホスホロジアミデートＤＮＡ、アミド−連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ−連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡおよびメチルホスホナートＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡおよびアンヒドロヘキシトールＤＮＡ、および塩基変形を有するヌクレオチド、例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基はフルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチジル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−含む）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基はフルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−）、イノシンおよびジアミノプリンを含むことができる。
【００４５】
前記プライマーは、好適な温度および好適な緩衝液内で好適な条件（すなわち、４種の異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび重合反応酵素）下に鋳型−指示ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの好適な長さは、多様な要素、例えば、温度とプライマーの用途に応じて変化があり得る。また、プライマーの配列は、鋳型の一部配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型とハイブリダイズしてプライマー固有の作用をすることができる範囲内で十分な相補性を有すれば十分である。したがって、本発明におけるプライマーは、鋳型である遺伝子のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列を有する必要はなく、この遺伝子配列にハイブリダイズしてプライマー作用をすることができる範囲内で十分な相補性を有すれば十分である。また、本発明によるプライマーは、遺伝子の増幅反応に用いられることが好ましい。前記増幅反応は、核酸分子を増幅する反応を言い、このような遺伝子の増幅反応については、当業界によく知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、核酸塩基配列基盤増幅（ＮＡＳＢＡ）などが含まれ得る。
【００４６】
一具体例において、前記タンパク質の水準を測定するためのプローブは、前記タンパク質に対する抗体であってもよい。
【００４７】
抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体、またはこれらの断片が使用できる。
【００４８】
前記抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２およびＦｖ断片；ジアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体などが含まれる。
【００４９】
抗体をパパインで分解すると、２個の同じ抗原結合断片、すなわち単一抗原結合部位がある各「Ｆａｂ」断片、およびその残りである「Ｆｃ」断片が生成される。ペプシンを処理すると、２個の抗原結合部位があり、依然として抗原に交差結合し得るＦ（ａｂ´）断片が生成される。Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。この部位は、一つの重鎖および一つの軽鎖の可変領域の二量体で構成され、非共有結合で堅固に結合されている。
【００５０】
ポリクロナール抗体の製造方法は、当業者に公知になっている。ポリクロナール抗体は、哺乳動物に１回以上免疫化剤を注入し、必要な場合、免疫補強剤と共に注入して製造し得る。通常、免疫化剤および（または）免疫補強剤は、哺乳動物に皮下注射または腹腔内注射で数回注入される。免疫化剤は、本発明のタンパク質またはその融合タンパク質であってもよい。免疫化される哺乳動物に免疫原性があるものと公知になったタンパク質と共に免疫化剤を注射することが効果的である。
【００５１】
本発明によるモノクロナール抗体は、文献（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））に記載されたハイブリードマ方法で製造したり、または組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５７６号参照）で製造し得る。また、モノクロナール抗体は、例えば、文献（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１））に記載された技術を利用してファージ抗体ライブラリーから単離し得る。
【００５２】
本発明におけるモノクロナール抗体は、具体的に、目的とする活性を発揮するのであれば、重鎖および（または）軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一であるか、相同性があるが、鎖の残りは、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体またはそのような抗体の断片と同一であるか、相同性がある「キメラ」抗体を含む。
【００５３】
非ヒト（例えば、ネズミ科動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２または抗体の他の抗原結合配列）である。多くの場合、ヒト化抗体は、レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を所望の特異性、親和度および能力を有するネズミ、マウスまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ残基で置換させたヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）を含む。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基により置換される。また、ヒト化抗体は、受容体抗体、または導入されるＣＤＲまたはフレームワークの配列で発見されない残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は、一つ以上、一般的に二つ以上の可変ドメインを実質的に全部含み、ここで、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、すべてのまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列の領域に該当する。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリン領域の一部を含む。
【００５４】
本発明の非アルコール性脂肪肝診断用組成物は、キットの形態で含まれ得る。
【００５５】
前記キットは、１４−３−３βまたは１４−３−３γ遺伝子の発現水準またはタンパク質の量を測定できるプライマー、プローブまたは抗体を含むことができ、これらの定義は、前述した通りである。
【００５６】
前記キットがＰＣＲ増幅過程に適用される場合、選択的に、ＰＣＲの増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から収得した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ補助因子およびｄＮＴＰｓを含むことができ、前記キットが免疫分析に適用される場合、本発明のキットは、選択的に二次抗体および標識の基質を含むことができる。ひいては、本発明によるキットは、前述した試薬成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントで製作され得る。
【００５７】
また、本発明の非アルコール性脂肪肝診断用組成物は、マイクロアレイの形態で含まれ得る。
【００５８】
本発明のマイクロアレイにおいて、前記１４−３−３βまたは１４−３−３γタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現水準を測定し得るプライマー、プローブまたは抗体は、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基質は、好適な堅固性または半堅固性支持体であって、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェーハ、ファイバー、磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子および毛細管を含むことができる。前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、前記基質上に配列されて固定化され、このような固定化は、化学的結合方法またはＵＶのような共有結合的方法により行われ得る。例えば、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、エポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように変形したガラスの表面に結合され得、また、ポリリジンコーティングの表面でＵＶにより結合され得る。また、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、リンカー（例えば、エチレングリコールオリゴマーおよびジアミン）を介して基質に結合され得る。
【００５９】
一方、本発明のマイクロアレイに適用される試料が核酸である場合には、標識され得、マイクロアレイ上のアレイ要素とハイブリダイズされ得る。ハイブリダイゼーションの条件は多様であり、ハイブリダイゼーション程度の検出および分析は、標識物質によって多様に実施され得る。
【００６０】
また、本発明は、前記１４−３−３βまたは１４−３−３γ遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の水準を測定する方法を用いて非アルコール性脂肪肝を診断するのに必要な情報を提供する方法を提供するが、より具体的に、前記方法は、（ａ）非アルコール性脂肪肝が疑われる患者の生物学的試料から１４−３−３βまたは１４−３−３γ遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量を測定する段階と、（ｂ）正常対照群試料から前記遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量を測定して、前記（ａ）段階の測定結果と比較する段階とを含むことができる。
【００６１】
前記で遺伝子の発現水準またはタンパク質の量を測定する方法は、公知の技術を利用して生物学的試料からｍＲＮＡまたはタンパク質を分離する公知の工程を含んで行われ得る。
【００６２】
前記生物学的試料は、非アルコール性脂肪肝の発生または進行の程度に応じた前記遺伝子の発現水準またはタンパク質の水準が正常対照群とは異なる、生体から採取された試料を言い、前記試料としては、例えば、これに限定されるものではないが、組織、細胞、血液、血清、血しょう、唾液および尿などが含まれ得る。
【００６３】
前記遺伝子の発現水準の測定は、好ましくはｍＲＮＡの水準を測定することであり、ｍＲＮＡの水準を測定する方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロットおよびＤＮＡチップなどがあるが、これに限らない。
【００６４】
前記タンパク質の水準の測定は、抗体を利用できるが、このような場合、生物学的試料内の前記タンパク質とこれに特異的な抗体は、結合物、すなわち抗原−抗体複合体を形成し、抗原−抗体複合体の形成量は、検出ラベルのシグナルのサイズを通じて定量的に測定し得る。このような検出ラベルは、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子、レドックス分子および放射線同位元素よりなるグループの中から選択することができ、これに限定されるものではない。タンパク質の水準を測定するための分析方法としては、これに限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射線免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがある。
【００６５】
したがって、本発明は、前記のような検出方法を通じて、対照群のｍＲＮＡの発現量またはタンパク質の量と非アルコール性脂肪肝が疑われる患者におけるｍＲＮＡの発現量またはタンパク質の量が確認でき、前記発現量の程度を対照群と比較することによって、非アルコール性脂肪肝の発病有無、進行段階などを診断し得る。
【００６６】
また、本発明による前記非アルコール性脂肪肝の診断のための情報提供方法は、本発明による１４−３−３β遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量が正常対照群の試料に比べて増加した場合、非アルコール性脂肪肝が誘発されたり、発病可能性が高いものと判断し得る。逆に、１４−３−３γの遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量が正常対照群の試料に比べて減少した場合、非アルコール性脂肪肝が誘発されたり、発病の可能性が高いものと判断し得る。
【００６７】
また、本発明は、１４−３−３βまたは１４−３−３γの遺伝子またはタンパク質を含む細胞を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質による前記遺伝子またはタンパク質の発現量の変化を測定することを含む脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。
【００６８】
例えば、前記候補物質が１４−３−３β遺伝子またはタンパク質の発現を下向き調節するとき、脂肪肝の予防または治療用医薬であると判別し得る。または、前記候補物質が１４−３−３γ遺伝子またはタンパク質の発現を上向き調節するとき、脂肪肝の予防または治療用医薬であると判別し得る。
【００６９】
また、本発明は、１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質をＰＰＡＲγ２タンパク質と共に候補物質と接触させ、前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化を測定することを含む脂肪肝の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。
【００７０】
一具体例において、前記候補物質によるＰＰＡＲγ２に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化の測定は、ＰＰＡＲγ２のＳｅｒ２７３残基に対する１４−３−３βタンパク質および／または１４−３−３γタンパク質の結合変化を測定することによって行われ得る。
【００７１】
前記候補物質は、通常の選定方式によって１４−３−３βおよび／または１４−３−３γ遺伝子塩基配列でｍＲＮＡ、タンパク質への転写、翻訳を促進したり抑制する物質または１４−３−３βおよび／または１４−３−３γの機能または活性を増進したり抑制する医薬としての可能性を有するものと推定されたり、または無作為に選ばれた個別的な核酸、タンパク質、ペプチド、その他抽出物または天然物、化合物などになり得る。
【００７２】
それ以後、候補物質が処理された細胞で前記遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性を測定し得、測定の結果、前記遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性が増加または減少することが測定されると、前記候補物質は、脂肪肝を予防または治療し得る物質であると判断できる。
【００７３】
前記で遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性を測定する方法は、当業界に公知になった多様な方法を用いて行われるが、例えば、これに限定されるものではないが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射免疫分析（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）および免疫沈殿分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）などを利用して行うことができる。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法を用いて得た、１４−３−３βおよび／または１４−３−３γ遺伝子の発現を阻害／増進させたり、タンパク質の機能を阻害／増進させる活性を示す候補物質が脂肪肝の予防または治療用医薬の候補物質になり得る。
【００７５】
このような脂肪肝の予防または治療用医薬の候補物質は、今後の脂肪肝治療剤の開発過程でリード化合物（ｌｅａｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として作用するようになり、リード化合物が１４−３−３βおよび／または１４−３−３γ遺伝子またはそれから発現するタンパク質の機能を促進または抑制効果を示すことができるように、その構造を変形させ、最適化することによって、新しい脂肪肝治療剤を開発し得る。
【００７６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるわけではない。
【実施例】
【００７７】
＜実験材料＞
ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）、１９９培地（Ｍ１９９）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で購入した。
【００７８】
ｓｉ−１４−３−３βおよびｓｉ−１４−３−３γｓｉＲＮＡ、抗−ＰＰＡＲγ、抗−ＧＦＰ、抗−ＧＳＴ、抗−Ｆｌａｇ、抗−ｐ−Ｃｄｋ５（Ｔｙｒ１５）、抗−Ｃｄｋ５および抗−ＨＡ、抗−ＳＲＥＢＰ−１ｃ抗体、ロスコビチンは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）で購入し、抗−ｐ−ＰＰＡＲγ２（Ｓｅｒ２７３）抗体は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、ＰＡ、ＵＳＡ）で購入した。
【００７９】
Ｅ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔは、Ｌｕｇｅｎ  Ｓｃｉ．（Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）で購入した。
【００８０】
ルシフェラーゼ分析システムは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で購入した。
【００８１】
ピオグリタゾンとオレイン酸は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で購入した。
【００８２】
トリグリセリド分析システムは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）で購入した。
【００８３】
＜実施例１＞ＰＰＡＲγ２の転写活性を調節する１４−３−３βと１４−３−３γの確認
ＰＰＡＲγ２の転写活性は、肝疾患関連タンパク質の発現に重要な役割をする。したがってＰＰＡＲγ２により調節されるａＰ２プロモーターを利用してＰＰＡＲγ２の転写活性を測定し、７種類の１４−３−３タンパク質の役割を確認した。このために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０５細胞を播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、０．５μｇのａＰ２プロモーター構造物と１４−３−３イソ型タンパク質（α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ）（０．５μｇ）またはｓｉ−１４−３−３βおよびｓｉ−１４−３−３γｓｉＲＮＡ（５ｎＭと１０ｎＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎ；Ｐｉｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）１０μＭを２４時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびレポータライシスバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でウェル当たり８０μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して上澄み液を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。機器は、ルミノメーター２０／２０ｎ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用した。標準化（Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために、ｐＳＶ４０−β−ガラクトシダーゼを共トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。収集した上澄み液は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性を補正して、値をグラフで示した。このためにβ−ガラクトシダーゼ酵素分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、ＤＵ５３０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。
【００８４】
ａＰ２プロモーター活性の測定の結果、１４−３−３βは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を増加させ、１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を減少させることを確認した。しかし、他の５種類のイソ型タンパク質では、変化がなかった（図１Ａ）。
【００８５】
ＰＰＡＲγ２の転写活性に１４−３−３βと１４−３−３γが関与するか否かを正確に確認するために、１４−３−３βと１４−３−３γを濃度別に過発現して測定した結果、１４−３−３βの場合、濃度依存的にＰＰＡＲγ２の転写活性が増加した（図１Ｂ）。しかし、１４−３−３γの場合、濃度依存的にＰＰＡＲγ２の転写活性を減少させた（図１Ｃ）。
【００８６】
これに対し、ｓｉ−１４−３−３βを利用して１４−３−３βの発現を抑制する場合、ＰＰＡＲγ２の転写活性が減少し（図１Ｄ）、１４−３−３γの発現を抑制する場合、ＰＰＡＲγ２の転写活性が増加した（図１Ｅ）。
【００８７】
したがって、本実験の結果によると、１４−３−３βは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を増加させることに関与し、１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の転写活性を抑制する役割をし、互いに反対に調節する遺伝子であると判断される。
【００８８】
＜実施例２＞１４−３−３βと１４−３−３γのＰＰＡＲγ２との結合の確認
転写活性の実験の結果、１４−３−３βと１４−３−３γがＰＰＡＲγ２の転写活性を調節することから見て、１４−３−３βと１４−３−３γがＰＰＡＲγ２と結合し得ると認められる。
【００８９】
したがって、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを行って、１４−３−３βと１４−３−３γがＰＰＡＲγ２と結合するか否かを確認した。
【００９０】
このために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり２×１０６細胞を播種した後、Ｍｙｃ−ＰＰＡＲγ２  ＤＮＡ（４μｇ）とｍＧＳＴ−１４−３−３β（４μｇ）またはｍＧＳＴ−１４−３−３γ（４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）１０μＭを２４時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり５００μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、タンパク質を抽出した後、１０００μｇのタンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）２０μＬと６時間反応させた後、ビーズを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄する過程を５回繰り返して行い、ビーズを１００℃で１０分間沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットを行った。ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とＭｙｃ抗体（自己生産）は、１：３０００の比率で使用した。各タンパク質を検出するために、Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して暗室で確認した。
【００９１】
その結果、ＰＰＡＲγ２と１４−３−３βとの結合が、ＰＰＡＲγ２リガンドであるピオグリタゾンの処理時にさらに強くなった（図２Ａ）。１４−３−３βとは反対に、ＰＰＡＲγ２と１４−３−３γとの結合は減少した（図２Ｂ）。このような結果は、ＰＰＡＲγ２の活性化が進行する場合、１４−３−３βとの結合が増加し、１４−３−３γとの結合は減少して、このような二つのタンパク質によりＰＰＡＲγ２の転写活性を調節して、ターゲット遺伝子の発現を調節するものと判断された。
【００９２】
＜実施例３＞１４−３−３βと１４−３−３γがＰＰＡＲγ２と結合するドメインの確認
ＰＰＡＲγ２タンパク質は、活性化関数１（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １；ＡＦ−１、アミノ酸１−１３８）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ、アミノ酸１３９−２０３）、ヒンジ領域（アミノ酸２０４−３１０）、活性化関数２（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ２；ＡＦ−２、アミノ酸３１１−５０５）ドメインからなると報告されたことがある（図３Ａ）。したがって、ＰＰＡＲγ２のいかなるドメインの部分に１４−３−３βと１４−３−３γが結合するのかを確認するために、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを進めた。
【００９３】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり２×１０６細胞を播種した後、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（１−５０５）ＤＮＡ（４μｇ）、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（１−３１０）ＤＮＡ（４μｇ）、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（１３９−５０５）ＤＮＡ（４μｇ）とｍＧＳＴ−１４−３−３β（４μｇ）またはｍＧＳＴ−１４−３−３γ（４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（１−３１０）ＤＮＡ、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（１３９−５０５）ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＡｐａＩ制限酵素を利用してｐＣＭＶ−３Ｔａｇ−１ベクターにクローニングした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり５００μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、タンパク質を抽出した後、１０００μｇのタンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）２０μＬと６時間反応させた後、ビーズを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄する過程を５回繰り返して行い、ビーズを１００℃で１０分間沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットを行った。ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とＦｌａｇ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）は、１：３０００の比率で使用した。各タンパク質を検出するために、Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して暗室で確認した。
【００９４】
ＰＰＡＲγ２遺伝子の野生型および二つの欠失突然変異と１４−３−３βまたは１４−３−３γの結合を確認した結果、ＰＰＡＲγ２（１−３１０）欠失突然変異とＰＰＡＲγ２（１３９−５０５）欠失突然変異で１４−３−３β（図３Ｂ）と１４−３−３γ（図３Ｃ）が結合した。このような結果は、１４−３−３βと１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２のＤＢＤまたはヒンジ領域と結合することを意味する。
【００９５】
＜実施例４＞１４−３−３βと１４−３−３γが結合するＰＰＡＲγ２の残基の確認
１４−３−３タンパク質は、ターゲットタンパク質のリン酸化した残基に結合すると知られている。ＰＰＡＲγ２の活性に関連したリン酸化残基は、セリン１１２とセリン２７３であると知られている。これにより、セリン１１２とセリン２７３残基がリン酸化しないＰＰＡＲγ２の突然変異（ＰＰＡＲγ２のＳ１１２ＡとＳ２７３Ａ）を製作して、１４−３−３タンパク質との結合をＧＳＴ−プルダウンアッセイを通じて確認した。
【００９６】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり２×１０６細胞を播種した後、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（ＷＴ）ＤＮＡ（４μｇ）、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ１１２Ａ）ＤＮＡ（４μｇ）、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ２７３Ａ）ＤＮＡ（４μｇ）とｍＧＳＴ−１４−３−３β（４μｇ）またはｍＧＳＴ−１４−３−３γ（４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ１１２Ａ）ＤＮＡ、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ２７３Ａ）ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて増幅したＤＮＡ断片をＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり５００μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、タンパク質を抽出した後、１０００μｇのタンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）２０μＬと６時間反応させた後、ビーズを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄する過程を５回繰り返して行い、ビーズを１００℃で１０分間沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットを行った。ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とＦｌａｇ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）は、１：３０００の比率で使用した。各タンパク質を検出するために、Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して暗室で確認した。
【００９７】
また、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０５細胞を播種した後、ａＰ２プロモーター構造物（０．５μｇ）とＦｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ１１２Ａ）ＤＮＡ（０．５μｇ）またはＦｌａｇ−ＰＰＡＲγ２（Ｓ２７３Ａ）ＤＮＡ（０．５μｇ）とｍＧＳＴ−１４−３−３β  ＤＮＡ（０．５μｇ）またはｍＧＳＴ−１４−３−３γＤＮＡ（０．５μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびレポータライシスバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でウェル当たり８０μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、上澄み液を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。機器は、ルミノメーター２０／２０ｎ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用した。標準化のために、ｐＳＶ４０−β−ガラクトシダーゼを共トランスフェクションした。収集された上澄み液は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定してルシフェラーゼ活性を補正し、値をグラフで示した。このためにβ−ガラクトシダーゼ酵素分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が使用され、ＤＵ５３０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。
【００９８】
その結果、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３Ａ突然変異で１４−３−３βと１４−３−３γの結合がいずれも抑制された（図４Ａと図４Ｂ）。また、１４−３−３βの過発現に伴って増加したＰＰＡＲγ２の転写活性が、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３Ａ突然変異の場合、転写活性に変化がなかった（図４Ｃ）。また、１４−３−３γの過発現時に減少したＰＰＡＲγ２の転写活性が、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３Ａ突然変異の場合、転写活性に変化がなかった（図４Ｄ）。したがって、ＰＰＡＲγ２のセリン２７３残基に１４−３−３βと１４−３−３γが結合して、ＰＰＡＲγ２の転写活性を調節することが確認された。
【００９９】
＜実施例５＞１４−３−３βと１４−３−３γのＰＰＡＲγ２との競争的結合の確認
以前の実験結果を通じて１４−３−３βと１４−３−３γがリン酸化したＰＰＡＲγ２のセリン２７３残基に結合することを確認したのであり、同じ残基における結合は、二つのタンパク質が競争的に結合すると判断された。したがって、ＰＰＡＲγ２との結合で１４−３−３βと１４−３−３γが競争的な結合をするか否かを確認するために、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを進めた。
【０１００】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり２×１０６細胞を播種した後、ｍＧＳＴ−ＰＰＡＲγ２  ＤＮＡ（４μｇ）とＧＦＰ−１４−３−３β  ＤＮＡ（４μｇ）またはＧＦＰ−１４−３−３γＤＮＡ（４μｇ）およびＨＡ−１４−３−３β  ＤＮＡ（２と４μｇ）またはＨＡ−１４−３−３γＤＮＡ（２と４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）１０μＭを２４時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり５００μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、タンパク質を抽出した後、１０００μｇのタンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）２０μＬと６時間反応させた後、ビーズを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄する過程を５回繰り返して行い、ビーズを１００℃で１０分間沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットでそれぞれ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＨＡ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の抗体を使用してタンパク質を確認し、すべての抗体は、１：３０００の比率で使用した。
【０１０１】
その結果、１４−３−３γの発現量が増加するに伴って、１４−３−３βとＰＰＡＲγ２の結合が減少し（図５Ａ）、１４−３−３βの発現量が増加するに伴って、１４−３−３γとＰＰＡＲγ２の結合が減少した（図５Ｂ）。これは、１４−３−３βと１４−３−３γは、リン酸化したＰＰＡＲγ２のセリン２７３残基に競争的に結合することを示す。
【０１０２】
＜実施例６＞オレイン酸によるＰＰＡＲγ２の発現増加およびＰＰＡＲγ２のターゲット遺伝子の発現調節
肥満マウスの肝でＰＰＡＲγ２の発現および活性度が増加しており、そのターゲット遺伝子の発現が増加していると知られている。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験でこのような肥満環境を作るために、脂肪酸の一種類であるオレイン酸（ＯＡ）を処理して、ＰＰＡＲγ２および１４−３−３βと１４−３−３γのｍＲＮＡの発現量を確認した。
【０１０３】
ＨｅｐＧ２とマウス初代肝細胞を６−ウェルプレートに各ウェル当たり４×１０５細胞を播種した後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理した。ｍＲＮＡの抽出は、当該細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でウェル当たり１ｍＬを使用して細胞を溶解させた後、クロロホルム２００μＬを添加してよく混ぜた後、常温に５分間放置して１２，０００×ｇに４℃で１５分間遠心分離して、上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）をイソプロパノール５００μＬと混ぜた後、１０分間氷上に置き、１２，０００×ｇに４℃で１５分間遠心分離して、上清液を除去し、ペレットをジエチルピロカルボン酸（ＤＥＰＣ）処理された３次蒸留水で溶かした。２μｇのｍＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）を利用してｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてヒトのＰＰＡＲγ２、１４−３−３β、１４−３−３γ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＣＤ−１、ＡＣＣ、ＦＡＢＰ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、β−アクチン特異的なプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて増幅し、マウスのＰＰＡＲγ２、１４−３−３β、１４−３−３γ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマーを利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を通じて増幅した。β−アクチンとＧＡＰＤＨは、各細胞のｍＲＮＡを同一量で比較したものであるかを把握できる対照群として使用した。
【０１０４】
オレイン酸濃度依存的にＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡの発現が増加した。しかし、１４−３−３βと１４−３−３γのｍＲＮＡの発現量には変化がなかった（図６Ａと図６Ｂ）。また、オレイン酸濃度依存的にＰＰＡＲγ２ターゲット遺伝子である脂肪代謝関連遺伝子のｍＲＮＡ発現も増加した（図６Ｃと図６Ｄ）。本実験の結果、オレイン酸は、ＰＰＡＲγ２とＰＰＡＲγ２のターゲット遺伝子の発現を増加させ、１４−３−３βと１４−３−３γの発現には影響がなかった。この結果から１４−３−３βと１４−３−３γの発現よりは、活性化したＰＰＡＲγ２のリン酸化残基に１４−３−３βと１４−３−３γの結合による転写活性の調節が重要であると判断された。
【０１０５】
＜実施例７＞オレイン酸によるＰＰＡＲγ２のターゲット遺伝子の発現調節で１４−３−３βと１４−３−３γの役割
ＨｅｐＧ２細胞を６−ウェルプレートに各ウェル当たり４×１０５細胞を播種した後、ＧＦＰ−１４−３−３β  ＤＮＡ（４μｇ）またはＧＦＰ−１４−３−３γＤＮＡ（４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理し、ｍＲＮＡの抽出は、当該細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でウェル当たり１ｍＬを使用して細胞を溶解させた後、クロロホルム２００μＬを添加してよく混ぜた後、常温に５分間置き、１２，０００×ｇに４℃で１５分間遠心分離して、上清液をイソプロパノール５００μＬと混ぜた後、１０分間氷に置き、１２，０００×ｇに４℃で１５分間遠心分離して、上清液を除去し、ペレットをジエチルピロカルボン酸（ＤＥＰＣ）処理された３次蒸留水で溶かした。２μｇのｍＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）を利用してｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてヒトのＰＰＡＲγ２（配列番号１、２）、１４−３−３β（配列番号３、４）、１４−３−３γ（配列番号５、６）、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、β−アクチン特異的なプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて増幅し、マウスのＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマーを利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を通じて増幅した。β−アクチンとＧＡＰＤＨは、各細胞のｍＲＮＡを同一量で比較したものであるかを把握できる対照群として使用した。
【０１０６】
また、クロマチン免疫沈降分析法（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）は、ＨｅｐＧ２細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり４×１０６細胞を播種した後、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲγ２  ＤＮＡ（４μｇ）とｍＧＳＴ−１４−３−３β  ＤＮＡ（４μｇ）またはｍＧＳＴ−１４−３−３γＤＮＡ（４μｇ）およびｓｉ−１４−３−３β（２０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはｓｉ−１４−３−３γ（２０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。当該細胞を０．７５％のホルムアルデヒドを１５分間常温で処理した後、グリシンを添加し、氷冷ＰＢＳで細胞をかき取り、１，０００×ｇに４℃で３分間遠心分離して、上清液を除去し、ペレットをＦＡライシスバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％のナデオキシコレート）４００μＬで溶解した後、超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して高電圧、３０秒破砕−３０秒休息の条件で１０分ずつ２回繰り返して破砕した。抗−Ｆｌａｇ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を利用してＤＮＡ−タンパク質複合体を免疫沈降させた後、ＦＡＴ／ＣＤ３６プロモーター特異的なプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて増幅した。
【０１０７】
また、ＨｅｐＧ２細胞を６−ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０５細胞を播種した後、ＨＡ−１４−３−３β  ＤＮＡ（１μｇ）またはＨＡ−１４−３−３γＤＮＡ（１μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり８０μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、タンパク質を抽出した後、３０μｇのタンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットでそれぞれ（ＨＡ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の抗体を使用してタンパク質を確認し、すべての抗体は、１：３０００の比率で使用した。
【０１０８】
オレイン酸により増加したｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）と脂肪酸トランスロカーゼ（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ；ＦＡＴ）／ＣＤ３６のｍＲＮＡの発現が、１４−３−３βの過発現によりさらに増加した。しかし、１４−３−３γの過発現時にＳＲＥＢＰ−１ｃとＦＡＴ／ＣＤ３６のｍＲＮＡの発現が減少した（図７Ａおよび図７Ｂ）。
【０１０９】
また、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙ）を利用してＦＡＴ／ＣＤ３６プロモーターに存在するＰＰＡＲγ２の結合サイトと知られているＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を利用してＰＰＡＲγ２の結合および１４−３−３βと１４−３−３γの発現による結合力を確認した。その結果、ＦＡＴ／ＣＤ３６プロモーターへのＰＰＡＲγ２の結合が１４−３−３βの過発現では増加し、１４−３−３γの過発現時にその結合が抑制された（図７Ｃ、上段）。
【０１１０】
しかし、１４−３−３βの発現を抑制する場合、ＰＰＡＲγ２と１４−３−３βの結合が減少し、１４−３−３γの発現抑制時に結合力が増加することを確認した（図７Ｃ、下段）。
この結果は、ＣＤ３６遺伝子の発現を調節するためにプロモーター地域に結合するＰＰＡＲγ２が１４−３−３βにより増加し、１４−３−３γにより減少することが分かる。
【０１１１】
このようなＰＰＡＲγ２のターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現調節が、タンパク質の発現においても同一に示されるかを確認するために、ＳＲＥＢＰ−１ｃタンパク質の発現量をウェスタンブロット方法で確認した。実験の結果、１４−３−３βの過発現によりＳＲＥＢＰ−１ｃのタンパク質の発現が増加し、１４−３−３γの過発現により減少することを確認した（図７Ｄ）。
【０１１２】
したがって、前記実験の結果から、脂肪酸の刺激によりＰＰＡＲγ２の発現および活性化が増加し、増加したＰＰＡＲγ２の転写活性を１４−３−３βと１４−３−３γが互いに反対に調節することを確認した。
【０１１３】
＜実施例８＞ＰＰＡＲγ２の活性化による１４−３−３βと１４−３−３γとの結合
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１００ｍｍのプレートに各ウェル当たり２×１０６細胞を播種した後、ｍＧＳＴ−ＰＰＡＲγ２  ＤＮＡ（４μｇ）とＨＡ−１４−３−３β  ＤＮＡ（４μｇ）またはＨＡ−１４−３−３γＤＮＡ（４μｇ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄およびライシスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤入り）でウェル当たり５００μＬを使用して細胞を溶解させた後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離してタンパク質を抽出した後、１０００μｇのタンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）２０μＬと６時間反応させた後、ビーズを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄する過程を５回繰り返して行い、ビーズを１００℃で１０分間沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ウェスタンブロットでそれぞれ（ＧＳＴ、ＨＡ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の抗体を使用してタンパク質を確認したのであり、すべての抗体は、１：３０００の比率で使用した。
【０１１４】
オレイン酸の処理時にＰＰＡＲγ２と１４−３−３βの結合が増加するが（図８Ａ）、１４−３−３γとの結合は減少した（図８Ｂ）。現在までに知られている報告によると、ＰＰＡＲ−ＲＸＲ複合体は、代謝調節および代謝関連遺伝子の発現に重要な役割をすると知られている。したがって、ＰＰＡＲとＲＸＲの複合体の形成において１４−３−３βと１４−３−３γの過発現が影響を及ぼすか否かを確認した結果、ＰＰＡＲγ２−ＲＸＲαの複合体の形成には影響を与えなかった（図８Ｃ）。すなわち、オレイン酸により活性が増加したＰＰＡＲγ２は、１４−３−３βとの結合が増加し、１４−３−３γとの結合は減少し、ＰＰＡＲγ２とＲＸＲαの複合体の形成には関与しなかった。
【０１１５】
＜実施例９＞オレイン酸の処理による肝細胞の脂肪蓄積で１４−３−３βと１４−３−３γの役割
ＨｅｐＧ２細胞とマウス初代肝細胞を６−ウェルプレートに各ウェル当たり４×１０５細胞を播種した後、ＧＦＰ−１４−３−３β  ＤＮＡ（１μｇ）またはＧＦＰ−１４−３−３γＤＮＡ（１μｇ）およびｓｉ−１４−３−３β（１０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはｓｉ−１４−３−３γ（１０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理し、当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒドを利用して細胞を固定し、６時間室温で０．３５％のオイルレッドＯ溶液で細胞を染色した。染色された細胞を１ｍＬのイソプロパノールで脱色して、５５０ｎｍの波長でＤＵ５３０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１１６】
オレイン酸の濃度依存的処理の結果、マウス初代肝細胞とＨｅｐＧ２細胞で脂肪蓄積が増加した（図９Ａ）。１４−３−３βの過発現は、オレイン酸による脂肪蓄積を増加させ、１４−３−３γの過発現は、脂肪蓄積を減少させた（図９Ｂ）。また、ｓｉ−１４−３−３βを通じて１４−３−３βの発現を抑制する場合、脂肪蓄積が減少し、１４−３−３γの発現抑制時に脂肪蓄積が増加した（図９Ｃ）。
【０１１７】
本実験の結果は、オレイン酸により増加したＰＰＡＲγ２の活性を１４−３−３βがさらに増加させて脂肪蓄積が増加し、１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２の活性を減少させて脂肪蓄積を減少させることを証明する。
【０１１８】
＜実施例１０＞トリグリセリドの蓄積における１４−３−３βと１４−３−３γの役割
トリグリセリド（中性脂肪）は、脂肪酸の一形態であり、これは、脂肪量の指標として用いられる。トリグリセリドを測定して生化学的な脂質検査を進めた。
【０１１９】
ＨｅｐＧ２細胞とマウス初代肝細胞を６−ウェルプレートに各ウェル当たり４×１０５細胞を播種した後、ＧＦＰ−１４−３−３β  ＤＮＡ（１μｇ）またはＧＦＰ−１４−３−３γＤＮＡ（１μｇ）およびｓｉ−１４−３−３β（１０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはｓｉ−１４−３−３γ（１０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｕｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＥ−ｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔの比率は、１：２で使用し、方法は、製造社のマニュアルに沿って行った。トランスフェクションした後、オレイン酸（ＯＡ）２００μＭを７２時間処理し、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用してトリグリセリド量を測定した。当該細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｉｌｕｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔで細胞をかき取り、超音波破砕機で２０回繰り返して細胞を破砕した後、酵素緩衝液（ｅｎｚｙｍｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と１５分間反応させた後、５５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を利用して測定した。
【０１２０】
脂肪蓄積の結果と同様に、マウス初代肝細胞オレイン酸の処理時にトリグリセリドの蓄積が増加し、１４−３−３βの過発現によりトリグリセリドの蓄積がさらに増加し、１４−３−３γの過発現は、トリグリセリドの蓄積を減少させた（図１０Ａ）。また、１４−３−３βの発現の抑制は、トリグリセリドの蓄積を減少させたのであり、１４−３−３γの発現の抑制は、蓄積を増加させた（図１０Ｂ）。
【０１２１】
前記すべての結果に基づいて総合してみると、１４−３−３βと１４−３−３γは、ＰＰＡＲγ２のような残基に結合して、相異にＰＰＡＲγ２の活性を調節し、その調節は、互いに競争的に作用することが分かる。基礎条件では、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３残基に１４−３−３βと１４−３−３γの結合が均衡を成す基礎代謝維持をし、脂肪酸が多い条件では、ＰＰＡＲγ２のＳ２７３残基に対する１４−３−３βの結合が増加して、脂肪蓄積が増加し、これにより、非アルコール性脂肪肝に発展すると予想される。したがって、１４−３−３βと１４−３−３γの発現量の調節を通じてＰＰＡＲγ２の活性を調節することによって、非アルコール性脂肪肝を予防または治療できると期待される。
【図１ａ】
0006507307.tif 000002
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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