(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）由来の野生型ＦｌｇＭをコードする核酸配列、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列、制御可能な転写調節エレメント、及び対象ペプチドをコードする核酸配列を含むコンストラクトを含む細胞株を培地中で培養して、野生型ＦｌｇＭ、プロテアーゼ切断部位及び対象ペプチドを含むポリペプチドを生成する工程を含む、対象ペプチドを製造する方法であって、
前記制御可能な転写調節エレメントはアラビノース誘導性プロモータであり、
前記細胞株は、２００ｍＭ〜４００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む培地中で培養され、これにより細胞株が１００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む培地中で培養された場合と比較して、より多くの前記対象ペプチドが得られ、
前記プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（ＥＴＫ）切断部位であり、且つ
前記細胞株は、前記対象ペプチドを含むポリペプチドを分泌させるための、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系を含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象ペプチドがδ−ＳＶＩＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コンストラクトが精製タグをコードする核酸配列を更に含む、請求項１又は２に記載の方法であって、
前記精製タグがポリヒスチジンである、前記方法。
【請求項４】
前記コンストラクトが精製タグをコードする核酸配列を更に含む、請求項１又は２に記載の方法であって、
前記精製タグをコードする核酸配列と、対象ペプチドをコードする核酸配列が、精製タグが対象ペプチドのＣ末端にあるように配置されている、前記方法。
【請求項５】
前記コンストラクトが精製タグをコードする核酸配列を更に含む、請求項１又は２に記載の方法であって、
５’から３’の方向の配列の順序が、下記の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）サルモネラ・エンテリカ由来の野生型ＦｌｇＭをコードする核酸配列、精製タグをコードする核酸配列、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列及び対象ペプチドをコードする核酸配列；又は
（ｂ）精製タグをコードする核酸配列、サルモネラ・エンテリカ由来の野生型ＦｌｇＭをコードする核酸配列、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列及び対象ペプチドをコードする核酸配列、
の順序である、前記方法。
【請求項６】
プロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列が、サルモネラ・エンテリカ由来の野生型ＦｌｇＭをコードする核酸配列と対象ペプチドをコードする核酸配列の間にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記コンストラクトがＰaraBADプロモータを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、サルモネラ・エンテリカ由来の野生型ＦｌｇＭ、プロテアーゼ切断部位、対象ペプチド及び精製タグを含み、
前記プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ（ＥＴＫ）切断部位であり、且つ
前記対象ペプチドがδ−ＳＶＩＥである、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記精製タグがポリヒスチジンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）プロテアーゼ切断部位がＦｌｇＭと対象ペプチドとの間にあるか、或いは
（ｂ）ＦｌｇＭが精製タグのＮ末端にあり、精製タグがプロテアーゼ切断部位のＮ末端にあり、且つプロテアーゼ切断部位が対象ペプチドのＮ末端にあるか、或いは
（ｃ）精製タグがＦｌｇＭのＮ末端にあり、ＦｌｇＭがプロテアーゼ切断部位のＮ末端にあり、且つプロテアーゼ切断部位が対象ペプチドのＮ末端にあるか、或いは
（ｄ）精製タグが対象ペプチドのＣ末端にある、
請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞株が、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の野生型株、又はサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の変異体株からなる群から選択される細菌由来である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞株が、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来であり、且つ
（ａ）前記細胞株のゲノムが、１種以上のフラジェリン又はフック付随タンパク質遺伝子に対する改変を含み、ここで前記１種以上のフラジェリン又はフック付随タンパク質遺伝子がｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢ及びｆｌｉＤから成る群から選択されるか、或いは
（ｂ）前記細胞株のゲノムが、鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１種以上の阻害剤に対する改変を含み、ここで前記鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の阻害剤は、ｆｉｍＺ、ｓｒｇＤ、ｈｄｆＲ、ｒｂｓＲ、ｏｍｐＲ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｌｒｈＡ、ｙｄｉＶ、ｄｓｋＡ、ｅｃｎＲ、ｆｌｉＴ及びｒｃｓＢからなる群から選択されるか、或いは
（ｃ）前記細胞株は、ＦｌｇＭ Ｔ３Ｓ−シャペロン遺伝子ｆｌｉＡの転写量又は翻訳産物の量を増大させる変異を有する、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
培地から対象ペプチドを精製する工程を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象ペプチドをアフィニティーカラムを用いて精製する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アフィニティーカラムがσ28アフィニティーカラムである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１２年５月３０日出願の米国仮出願第６１／６８９，２８４号に対する優先権をクレームし、同出願は、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
政府による援助を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＧＭ０６２２０６およびＧＭ４８６７７として、連邦政府の支援により行われた。米国連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表への参照
米国特許法施行規則第１．５２条（ｅ）（５）により、２０１３年５月３０日に作成された、サイズが１８，４６１バイトであり「２１１０１＿０２９０Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名のテキストファイルとして２０１３年５月３０日に提出された配列表が、参照により本明細書に援用される。
【０００４】
開示の本発明は、一般に、対象ペプチドの発現のためのＩＩＩ型分泌系におけるＦｌｇＭの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
タンパク質の組み換え発現において大きな進歩があったにもかかわらず、タンパク質の特定のクラスの効率的な発現はまだ難題である。これらには、ジスルフィド架橋が高密度である、小型で極めて安定であり、薬理活性を有するポリペプチドが含まれる。この一般的クラス内の主要なグループには、動物毒液中に存在するポリペプチドが含まれる。いくつかの異なる系統発生学的な系統が、毒液を独立に進化させてきたが、見いだされるポリペプチドは全て、別の生物への注入時に、それらを特別に安定化させる、共通する一連の特性を収斂進化させてきた。これらのポリペプチドは、その多くが新規の薬理活性を有し、したがって基礎研究において有用なリガンドとなるか、または直接的な診断および治療適用を有するため、関心を集めている。これらのペプチドの１つである、３個のジスルフィド結合を有する２５アミノ酸ペプチドであるＭＶＩ１Ａは、難治性の疼痛に対する承認薬となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
小型のジスルフィドリッチポリペプチドの組み換え発現を試みても、一般に収率が低い。根本的な問題は、発現レベルが高い際に生じる細胞中の高濃度のポリペプチドが、分子間凝集を形成させることがあり、組み換えポリペプチドの大半が封入体で見つかるという点である。封入体から生物学的に活性のある形態でポリペプチドを回収できるかは予測できず、発現されるポリペプチドによって異なる後続の段階が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
現在、システインリッチポリペプチドの産生および精製の障害を克服するための組成物および方法が本明細書に開示される。分泌型タンパク質の収率を向上させるための、鞭毛遺伝子発現、イオン状態、細胞成長期の調節、および細菌性プロテアーゼまたは分泌競合物除去のための様々な要因の特性評価が開示される。
【０００８】
成熟生成物においてジスルフィド架橋を形成する、高密度のシステイン残基を含有する、小型で極めて安定であり、薬理活性を有するポリペプチドの分泌のために、ベクターとして鞭毛ＦｌｇＭタンパク質を利用する方法が、本明細書に開示される。例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のμ−コノトキシンＳＩＩＩＡの組み換え発現のための細菌性分泌系が提供される。
【０００９】
また、鞭毛Ｔ３Ｓを介したタンパク質精製を目的として分泌型タンパク質を高収率で得るために使用し得る細菌株も本明細書に開示される。
【００１０】
細菌鞭毛系を用いたポリペプチドの産生および精製のための組成物および方法が開示される。
【００１１】
ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列を含むコンストラクトが開示される。コンストラクトは、精製タグをコードする核酸配列をさらに含んでよい。精製タグはポリヒスチジンであってよい。
【００１２】
開示のコンストラクトのＦｌｇＭ核酸配列は、野生型ＦｌｇＭであってよい。切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位またはエンテロキナーゼ（ＥＴＫ）切断部位であってよい。
【００１３】
開示のコンストラクトの対象核酸配列は、システインリッチペプチドをコードし得る。システインリッチペプチドは、向神経活性毒素、例えばコノペプチドなどであってよい。コノペプチドは、μ−コノトキシン、例えばＳＩＩＩＡなどであってよい。
【００１４】
開示のコンストラクトは、ＦｌｇＭ核酸配列と対象核酸配列との間に切断部位を有し得る。本コンストラクト中での配列の順序は、ＦｌｇＭ核酸配列、精製タグをコードする核酸配列、切断部位および対象核酸配列であってよい。本コンストラクト中での配列の順序は、精製タグをコードする核酸配列、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列であってよい。本コンストラクト中での配列の順序は、対象核酸配列に対してＣ末端にある精製タグをコードする核酸配列も含んでよい。
【００１５】
開示のコンストラクトは、ＰaraＢＡＤプロモーターも含んでよい。
【００１６】
ＦｌｇＭ、切断部位および対象ペプチドを含むポリペプチドも開示される。本ポリペプチドは、精製タグをさらに含んでよい。精製タグはポリヒスチジンであってよい。
【００１７】
開示のポリペプチド中のＦｌｇＭは、野生型ＦｌｇＭであってよい。切断部位は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位またはＥＴＫ切断部位であってよい。
【００１８】
開示のポリペプチド中の対象ペプチドは、システインリッチペプチドであってよい。システインリッチペプチドは、向神経活性毒素、例えばコノペプチドなどであってよい。コノペプチドは、μ−コノトキシン、例えばＳＩＩＩＡであってよい。
【００１９】
開示のポリペプチドは、ＦｌｇＭと対象ペプチドとの間に切断部位を有し得る。本ポリペプチド中の配列の順序は、ＦｌｇＭが精製タグに対してＮ末端にあり、精製タグが切断部位に対してＮ末端にあり、切断部位が対象ペプチドに対してＮ末端にあるものであってよい。本ポリペプチド中の配列の順序は、精製タグがＦｌｇＭに対してＮ末端にあり、ＦｌｇＭが切断部位に対してＮ末端にあり、切断部位が対象ペプチドに対してＮ末端であるものであってよい。一部の態様において、前記精製タグは、対象ペプチドに対してＣ末端にある。
【００２０】
開示のコンストラクトの何れかを含む組み換え細胞株も開示される。組み換え細胞株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の野生型株由来であってよい。
【００２１】
開示の組み換え細胞株のゲノムは、１以上のフラジェリンまたはフック付随タンパク質遺伝子に対する改変を含んでよい。この１以上のフラジェリン遺伝子は、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢおよびｆｌｉＤからなる群から選択され得る。
【００２２】
開示の組み換え細胞株は、鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１以上の阻害剤に対する改変を含んでよい。鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の阻害剤は、ｆｉｍＺ、ｓｒｇＤ、ｈｄｆＲ、ｒｂｓＲ、ｏｍｐＲ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｌｒｈＡ、ｙｄｉＶ、ｄｓｋＡ、ｅｃｎＲ、ｆｌｉＴおよびｒｃｓＢからなる群から選択され得る。
【００２３】
開示の組み換え細胞株は、ＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓ−シャペロン遺伝子ｆｌｉＡの転写または翻訳を向上させるために突然変異を含んでよい。
【００２４】
培地中で、対象ペプチドを含む開示のポリペプチドの何れかを含む細胞株を培養することを含む、対象ペプチドを作製する方法も開示される。本方法は、培地から対象ペプチドを精製することをさらに含んでよい。本方法は、開示のコンストラクトの何れかを含む細胞株を使用し得る。
【００２５】
対象ペプチドの精製は、σ28アフィニティーカラムなどのアフィニティーカラムを含んでよい。
【００２６】
開示の方法は、対象ペプチドを含むポリペプチドを分泌させるためにサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系系を含む細胞株を使用し得る。
【００２７】
開示の方法は、１以上のフラジェリンフック付随タンパク質遺伝子に対する改変を含む細胞株を使用し得る。１以上のフラジェリンまたはフック付随タンパク質遺伝子は、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢおよびｆｌｉＤからなる群から選択され得る。
【００２８】
開示の方法は、鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１以上の阻害剤に対する改変を含む細胞株を使用し得る。鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の阻害剤は、ｆｉｍＺ、ｓｒｇＤ、ｈｄｆＲ、ｒｂｓＲ、ｏｍｐＲ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｌｒｈＡ、ｙｄｉＶ、ｄｓｋＡ、ｅｃｎＲ、ｆｌｉＴおよびｒｃｓＢからなる群から選択され得る。
【００２９】
開示の方法は、ＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓ−シャペロン遺伝子ｆｌｉＡの転写または翻訳を向上させるための突然変異を含む細胞株を使用し得る。
【００３０】
開示の方法および組成物のさらなる利点は、以下の説明に一部示し、一部はその記載から理解されるか、または開示の方法および組成物の実施により習得され得る。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に挙げる要素および組み合わせによって実現および達成される。前述の一般的な記載および次の詳細な説明のいずれも、例示であり、単なる説明に過ぎず、特許請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【００３１】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物の一部の実施形態を例示し、本記載とともに、開示の方法および組成物の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＳＩＩＩＡコノトキシンの分泌のための鞭毛ＩＩＩ型分泌系の組み替えを示す。（Ａ）モデル：ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ翻訳融合物は、細菌Ｔ３ＳＳの分泌基質である。融合コンストラクトは、ＦｌｇＭ分泌に適格な鞭毛構造を通じて培地に鞭毛チャネルを通じて鞭毛特異的なＴ３ＳＳを介して分泌される。ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡの発現はアラビノースの付加時に誘導され、鞭毛クラスＩおよびＩＩ遺伝子発現とは独立している。ＨＢＢ組み立て中、ＦｌｇＭは、サイトゾル内部に留まり、クラスＩＩＩ遺伝子、例えばフラジェリンサブユニットＦｌｉＣまたはｓｔａｔｏｒ（ステータ）タンパク質ＭｏｔＡＢをコードする遺伝子、の抗σ２８−因子妨害転写物として作用する。ＨＢＢ構造は、３０分内に完成され、これは、早期から後期−基質分泌への鞭毛分泌系（図面内のオレンジ色の星印により示される。）内の基質特異性切り替えと一致する。この結果、鞭毛組み立ての最終段階中に必要とされるＦｌｇＭおよび基質の分泌が起こる。ＯＭ：外膜、ＰＧ：ペプチドグリカン層、ＩＭ：内膜。（Ｂ）ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ融合タンパク質の発現および分泌。ＴＣＡを用いて、分泌型ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡを沈殿させ、ＦｌｇＭに対する抗体による免疫ブロットを細胞および上清分画に対して示す。ネイティブＦｌｇＭ（白三角）およびＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ（黒三角）融合物のタンパク質バンドをブロットの隣にマークする。コンストラクト１から３（ｃ１からｃ３として表示）は、次のタンパク質融合物に相当する：ｃ１＝Ｈ６−ＦｌｇＭ−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ、ｃ２＝ＦｌｇＭ−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ−Ｈ６、ｃ３＝ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ。ポリヒスチジンタグの位置が異なる３種類のＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡコンストラクトの分泌効率を調べた。分泌レベルは、ＴＨ４３７（ｗｔ、レーン１）、ＴＨ４８８５（ΔｆｌｉＦ、レーン２）、ＴＨ５１３９（ΔＦｌｇＭ、レーン３）、ＴＨ１０８７４（Ｐａｒａ：：ＦｌｇＭ−ＦＫＦ、レーン４）、ＴＨ１５７０５（ｆｌｉＡ*  Ｐａｒａ：：コンストラクト１、レーン５）、ＴＨ１５７０６（ｆｌｉＡ*  Ｐａｒａ：：コンストラクト２、レーン６）およびＴＨ１５７０７（ｆｌｉＡ*  Ｐａｒａ：：コンストラクト３、レーン７）に対して示す。レーン５から７の野生型ＦｌｇＭバンドは、曝露を延長した場合に可視的となった。（Ｃ）ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡをアラビノースプロモーターから発現させ、ｆｌｉＡｗｔ（レーン２）、ｆｌｉＡ*（Ｈ１４Ｄ、レーン３）およびΔｆｌｉＣＤ（レーン４）バックグラウンドにおいて分泌を比較した。そのネイティブプロモーターから発現される野生型ＦｌｇＭの分泌をレーン１で示す（ＴＨ４３７、ｗｔとして表示）。
【図２】組み換えコノトキシンＳＩＩＩＡの精製および電気生理学、および鞭毛Ｔ３ＳＳを介した様々な生物からの毒素の分泌を示す。（Ａ）ＦｌｇＭに融合した組み換えＳＩＩＩＡを発現し、分泌する株（ＴＨ１５７０７ｆｌｉＡ*（Ｈ１４Ｄ）ΔａｒａＢＡＤ１０３６：：ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ）の上清をろ過し、実施例１に記載のようにＮｉ２＋−ＩＤＡカラムに結合させた。結合後マトリックスを洗浄し（Ｗ１−Ｗ３）、イミダゾール含有溶出緩衝液で３段階でＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡを溶出させた（Ｅ１−Ｅ３）。ウエスタンブロット検出のために、試料をＴＣＡ沈殿させた。溶出分画中のＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ濃度上昇ゆえに、溶出分画１から３のＴＣＡ沈殿のために体積の１／１０のみを使用した。（Ｂ）組み換えＳＩＩＩＡは、電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．２を遮断する。ラットＮａＶ１．２を発現するアフリカツメガエル卵母細胞を１０μＭのｒＳＩＩＩＡに曝露し、同時に実施例１に記載のようにナトリウム電流を監視した。毒素曝露前（対照、灰色のトレース）および１０μＭのｒＳＩＩＩＡへの曝露〜２０分後（黒色のトレース）に電流を記録した。各トレースは、５回の反応の平均に相当する。２つのトレース間のピーク値の相違は、チャネルＮａＶ１．２に対してｒＳＩＩＩＡが有する阻害効果に対応する。（Ｃ）ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶを翻訳によりイモガイ由来の６種類の異なる毒素およびそれぞれイソギンチャク、サソリ、クモおよびヘビ由来の１種類の毒素に融合させ、ＦｌｇＭ−Ｈ６を（Ｄ）コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）に融合させた（詳細なリストについては表３も参照）。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ポリフックバックグラウンドにおいて毒素を発現させた。３種類の独立した生物学的複製物を用いて、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株ＴＨ１６２２９からのジテリア毒素断片Ａの分泌を試験した（１から３で標識）。前に記載のように組み換え毒素の分泌を行った。
【図３】分泌におけるサルモネラポリフックバックグラウンドの影響を示す。（Ａ）ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−毒素融合物の分泌のために使用されるポリフックバックグラウンドＴＨ１６７７８の免疫染色。上左：ＦＭ−６４で染色した膜。上右：ヘキストで染色したＤＮＡ。下左：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８と連結された抗ヘマグルチニン抗体で標識される鞭毛フック−基底小体複合体（ｆｌｇＥ：：３ｘＨＡ）。スケールバーは５μｍである。（Ｂ）ＴＣＡを用いて分泌型タンパク質を沈殿させ、ＦｌｇＭおよびＦｌｉＫに対する抗体での免疫ブロットを細胞および上清分画に対して示す。ネイティブＦｌｇＭ（白三角）およびＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ融合物（黒三角）のタンパク質バンドをブロットの隣にマークする。ＩｍａｇｅＪを用いて検出されたバンドのデンシトメトリー強度を測定することによって、分泌レベルを比較した。Ｐａｒａ野生型バックグラウンド（第一レーン）における分泌に対する分泌値を対応するバンドの下に提示する。
【図４】ＰａｒａＢＡＤ過剰発現条件下でのＦｌｇＭ分泌を示す。染色体ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ−ＦｌｇＭ＋）からＦｌｇＭを過剰発現する株の上清分画のウエスタンブロット分析。一晩培養したものをＬＢ培地中で１００倍希釈し、３７℃で２時間温置し、その後、ＰａｒａＢＡＤ−ＦｌｇＭ＋を誘導するためにアラビノースを０．２％になるように添加した。３７℃で５時間さらに温置した後、遠心によって上清から細胞を分離し、分泌型タンパク質を沈殿させるために細胞上清にＴＣＡを添加した（実施例２参照）。分泌型タンパク質分析のために、１００ＯＤ単位の試料を各レーンに負荷した。全細胞タンパク質分析のために、５０ＯＤ単位の試料を負荷した。分泌型および全細胞ＦｌｇＭレベルを決定するために抗ＦｌｇＭ抗体を使用した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭ、０．２％アラビノース＝Ａｒａ）。
【図５】分泌型ＦｌｇＭおよび細胞運動性のレベルにおけるｆｌｈＤＣオペロン発現の効果を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いて定量的ウエスタンブロット分析により、ｆｌｈＤＣオペロン発現に影響が及ぼされる株においてＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、細胞可溶性ＦｌｇＭ＝Ｓｏ  ＦｌｇＭ、細胞不溶性ＦｌｇＭ＝Ｉｎｓｏ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。（Ｃ）誘導因子を添加せず、１μｇ／ｍＬアニヒドロテトラサイクリン（ａｎｙｈｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｉｌｎｅ）（ＡＴｃ，）を添加し、ＡＴｃおよび０．２％アラビノース（Ａｒａ）の両方を添加した株ＴＨ１８６４９（ΔＰｆｌｈＤＣ８０８９：：ｔｅｔＲ−ＰｔｅｔＡ  ΔａｒａＢＡＤ１１５６：：ＦｌｇＭ＋）軟寒天プレート上のスイム（Ｓｗｉｍ）表現型。（Ｄ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加ありおよびなしで、ΔａｒａＢＡＤ１１５６：：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図６】分泌型ＦｌｇＭおよび細胞運動性のレベルにおけるｆｌｉＡ（σ２８）対立遺伝子の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、σ28構造遺伝子ｆｌｉＡの様々な対立遺伝子を有する株におけるＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した。（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｉＡ＝ＷＣ  ＦｌｉＡおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。（Ｃ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加ありおよびなしで、ΔａｒａＢＡＤ１１５６：：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図７】分泌型ＦｌｇＭレベルおよび細胞運動性における、鞭毛後期基質欠失、増殖期およびｆｌｊＢｅｎｘ  ｖｈ２突然変異の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、様々な鞭毛後期基質遺伝子（ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤおよびｆｌｊＢ）欠失突然変異体、増殖期（Δｈｉｎ−５７１７、Δｈｉｎ−５７１８）突然変異体およびｆｌｊＢｅｎｘ  ｖｈ２突然変異体を有する株においてＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した。（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、細胞可溶性ＦｌｇＭ＝Ｓｏ  ＦｌｇＭ、細胞不溶性ＦｌｇＭ＝Ｉｎｓｏ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。（Ｃ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加ありおよびなしで、ΔａｒａＢＡＤ  １１５６：：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図８】分泌型ＦｌｇＭレベルおよび細胞運動性における後期鞭毛Ｔ３Ｓシャペロン欠失突然変異の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、鞭毛Ｔ３Ｓシャペロン遺伝子ｆｌｇＮ、ｆｌｉＳおよびｆｌｉＴ構造遺伝子の様々な欠失突然変異体対立遺伝子を有する株において、ＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した。（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。
【図９】分泌型ＦｌｇＭレベルおよび細胞運動性におけるＳｐｉ−１およびＳｐｉ−２突然変異欠失突然変異の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、Ｓｐｉ１またはＳｐｉ２遺伝子の何れかの欠失突然変異体対立遺伝子を有する株において、ＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。（Ｃ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加ありおよびなしで、ΔａｒａＢＡＤ１１５６：：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図１０】分泌型ＦｌｇＭレベルおよび細胞運動性における細胞性プロテアーゼ突然変異体対立遺伝子の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、機能的ｆｌｈＤＣオペロンありの場合となしの場合とで、ｏｍｐＴ、ｄｅｇＰ、ｃｌｐＡ、ｃｌｐＸまたはｃｌｐＰ遺伝子の欠失突然変異体対立遺伝子を有する株において、ＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）ｆｌｈＤ＋Ｃ＋およびｆｌｈＤＣヌルバックグラウンドにおける相対的ＦｌｇＭ分泌型レベルおよびｆｌｈＤＣヌルバックグラウンドにおける相対的全細胞ＦｌｇＭ蓄積レベル。（Ｃ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加なしおよびありで、ΔａｒａＢＡＤ１１５６：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図１１】分泌型ＦｌｇＭレベルおよび細胞運動性における、ＮａＣｌおよびＫＣｌイオン強度の影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、記載の濃度のＮａＣｌおよびＫＣｌを添加した培地中でＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、細胞可溶性ＦｌｇＭ＝Ｓｏ  ＦｌｇＭ、細胞不溶性ＦｌｇＭ＝Ｉｎｓｏ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。（Ｃ）様々な突然変異体バックグラウンドにおける運動性アッセイは、０．２％アラビノース添加なしおよびありで、ΔａｒａＢＡＤ１１５６：：ＦｌｇＭ＋を用いて示した。
【図１２】分泌型ＦｌｇＭのレベルにおける、様々な突然変異の組み合わせの影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、記載の様々な突然変異の組み合わせを有する株において、ＦｌｇＭの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ、全細胞ＦｌｇＭ＝ＷＣ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  Ｄｎａｋ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ分泌型レベル。
【図１３】分泌型ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥレベルにおける、様々な突然変異の組み合わせの影響を示す。（Ａ）消費増殖培地の上清中で検出されるＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥに対して抗ＦｌｇＭ抗体を用いた定量的ウエスタンブロット分析によって、記載の様々な突然変異の組み合わせを有する株において、ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥの分泌型レベルを決定した（分泌型ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＳＶＩＥ、分泌型ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ、分泌型ＦｌｇＭ＝Ｓｅ  ＦｌｇＭおよび全細胞ＤｎａＫ＝ＷＣ  ＤｎａＫ）。（Ｂ）相対的ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ分泌型レベル。
【図１４】ＩＩＩ型分泌型タンパク質を示す。野生型および突然変異体株におけるサルモネラ細胞の消費増殖培地からのクーマジー染色ＳＤＳゲルを実験した。レーン１野生型、レーン２  ｍｏｔ、レーン３  ｆｌｉＫ、レーン４  ｆｌｈＤ、レーン５  ｆｌｈＤ  ｉｎｖＡ。
【図１５】サルモネラＳＰＩ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）系を示す。（Ａ）ＳＰＩ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）の構造および組み立てを必要とする全遺伝子が染色体においてクラスター化する。（Ｂ）ＳＰＩ１遺伝子は、ＦｌｉＺ、ＨｉｌＤおよびＨｉｌＡ制御因子の連続的転写につながる鞭毛マスターオペロンｆｌｈＤＣの調節下にあり、ＨｉｌＡは、インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）遺伝子転写に必要とされる。（Ｃ）インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）基底小体（ＩＢＢ）完成後、（Ｄ）ニードルおよび（Ｅ）トランスロコン組み立てが続く。
【図１６】鞭毛およびＳＰＩ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）構造を示す。この構造は、基底および分泌関連要素タンパク質に対する強い相同性がある構造において全体的な類似性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示の方法および組成物は、特定の実施形態の以下の詳細な説明およびそこに包含される実施例、ならびに図面とそれらの上記および下記の説明とを参照することによってより容易に理解され得る。
【００３４】
開示の方法および組成物は、別段の記載のない限り、具体的な合成方法、具体的な分析技術または特定の試薬に限定されず、それ自体変わってもよいことを理解されたい。本明細書中で使用される語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定するものではないことも理解されたい。
【００３５】
Ａ．定義
開示の方法および組成物は、記載される特定の方法、プロトコールおよび試薬が変わってもよいように、これらに限定されないことを理解されたい。本明細書中で使用される語が、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
【００３６】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術および科学用語は全て、開示の方法および組成物が属する技術分野の熟練者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本方法および組成物の実施または試験において、本明細書中に記載のものと同様または同等の何らかの方法および材料を使用し得るものの、特に有用な方法、デバイスおよび材料は記載のとおりである。本明細書中で引用される刊行物およびそれらが引用される材料は、本明細書に具体的に参照により援用される。本明細書中で、先行発明に対してこのような開示に先行することを本発明が求める権利がないことを受容するものと解釈すべきものはない。何らかの引用文献が先行技術を構成することを自認するものではない。引用文献の考察はその著者が主張することを述べるが、出願者は、引用される書類の正確性および適切性に対して異議申し立てを行う権利を保有する。多くの刊行物が本明細書中で参照されるが、このような引用文献は、これらの書類の何れかが当技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することを受け入れることを構成しないことが明らかに理解されよう。
【００３７】
文脈から明らかに示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形、「ａ」、「ａｎ」および［ｔｈｅ」は、複数の対象を包含する点に留意すべきである。したがって、例えば、「ポリペプチド」に対する言及は、このようなポリペプチドの複数を含み、「細胞株」への言及は、１以上の細胞株および当業者にとって公知のそれらの均等物への言及などである。
【００３８】
「任意の」または「場合によっては」とは、これに続けて記載される事象、状況または材料が、起こってもよいしまたは起こらなくてもよい、または存在してもよいしまたは存在しなくてもよく、その記載が、事象、状況または材料が起こるかまたは存在する例およびそれが起こらないかまたは存在しない例を含むことを意味する。
【００３９】
範囲は、本明細書中で、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現され得る。文脈から明白でない限り、このような範囲が表現される場合、また、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までの範囲も具体的に企図され、考慮され、開示される。同様に、値が「約」という先行詞を使用して近似として表現される場合、文脈から明白でない限り、特定の値が、考慮され開示されるべきである別の具体的に企図される実施形態を形成することを理解されよう。文脈から明白でない限り、範囲のそれぞれの終点が、他方の終点に関して、および他方の終点と独立して、の両方で重要であることがさらに理解されよう。最後に、当然のことながら、文脈から明白でない限り、個々の値全ておよび明確に開示される範囲内に含有される値の部分的範囲もまた具体的に企図され、考慮開示されるべきである。特定の場合において、これらの実施形態の一部または全てが明確に開示されるか否かにかかわらず、前述のものが適用される。
【００４０】
本明細書の説明および特許請求の範囲にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、その変形、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などは、「含むが限定されない」を意味し、例えば他の追加物、構成要素、整数または段階を排除するものではない。特に、１以上の段階または操作を含むと記載される方法において、各段階が、列挙されるものを含むことが具体的に企図され（段階が、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの限定する用語を含まない限り）、つまり、各段階は、例えばその段階で列挙されない他の追加物、構成要素、整数または段階を排除しようとするものではない。
【００４１】
「ベクター」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞に輸送可能である核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に適切な形態の（例えば転写調節エレメントに連結される）遺伝子コンストラクトを含有する何らかのベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を含む。「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが一般に使用されるベクターの形態であるため、プラスミドと交換可能に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むものとする。
【００４２】
「対象配列」または「対象核酸配列」という用語は、それが導入される細胞にとって、部分的または完全に異種である、すなわち外来の核酸配列（例えばシステインリッチペプチドをコード可能な遺伝子）を意味し得る。
【００４３】
「対象配列」または「対象核酸配列」という用語は、それが導入される細胞の内在性遺伝子と部分的または完全に相同であるが、ゲノムを改変するような方法で細胞のゲノムに挿入されるように設計される核酸配列も意味し得る（例えば、天然遺伝子の場合とは異なる位置でそれが挿入されるか、またはその挿入の結果、「ノックイン」が起こる。）。例えば、対象配列は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはｍＲＮＡであってよい。
【００４４】
「対象ペプチド」または「対象タンパク質」は、対象配列または対象核酸配列から発現されるペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、システインリッチペプチド）を意味する。
【００４５】
「…に操作可能に連結される」という用語は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位および他のシグナル配列は、他の配列に操作可能に連結される核酸配列の例である。例えば、ＤＮＡと転写調節エレメントとの操作可能な連結は、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。
【００４６】
「形質転換」および「形質移入」という用語は、核酸、例えば発現ベクターの受容細胞への導入を意味し、その細胞の染色体ＤＮＡへの核酸の導入が含まれる。
【００４７】
転写調節エレメント（ＴＣＥ）も開示される。ＴＣＥは、それに操作可能に連結された核酸配列の発現を駆動可能なエレメントである。本明細書に開示されるコンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＥを含む。ＴＣＥは、場合によっては構成的または制御可能であってよい。
【００４８】
開示の方法および組成物のために使用し得る、それと組み合わせて使用し得る、そのための調製において使用し得る、またはそれの製品である、材料、組成物および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の、組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、各様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよびこれらの化合物の変形の具体的な言及が明確に開示され得ない一方で、それぞれが具体的に本明細書中で企図され、記載されることを理解されたい。例えば、コンストラクトが開示およに記載され、コンストラクトを含む多くの分子に対してなされ得る多くの修飾が記載される場合、具体的に別段の断りがない限り、可能であるコンストラクトおよび修飾のありとあらゆる組み合わせおよび変形が具体的に企図される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび組み合わせ分子の例と同時に開示される場合、ＡからＤが開示され、また、それぞれがここに列挙されないとしても、それぞれが個々におよび集合的に企図される。したがって、この例において、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆそれぞれが具体的に企図され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；および組み合わせの例Ａ−Ｄの開示から、考慮、開示されるべきである。同様に、これらのいかなるサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され、開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが具体的に企図され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；および組み合わせの例Ａ−Ｄの開示から、考慮、開示されるべきである。この概念は、開示の組成物を作製および使用する方法における段階を含むが限定されない本願の全態様に適用する。したがって、行われ得る様々なさらなる段階がある場合、開示の方法の何らかの具体的な実施形態また実施形態の組み合わせを用いてこれらのさらなる段階のそれぞれを行い得ること、およびそれぞれのこのような組み合わせが具体的に企図され、考慮され開示されるべきであることが理解される。
【００４９】
当業者は、通常の実験を超えない範囲で、本明細書に記載の方法および組成物の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【００５０】
Ｂ．細菌鞭毛
多くの細菌は、ストレス環境から遠ざかるか、または栄養源、Ｏ2、光および他の陽性刺激に向かうかの何れかで、特定の方向に移動するために鞭毛を利用する。細菌鞭毛は、その構築のために３０を超える遺伝子産物を必要とする複雑な細胞機構である。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の場合、現在、生物発生およびその鞭毛機能に関与する６０を超える遺伝子がある。これらの遺伝子は、３種類のプロモータークラスの転写階層に構成される。鞭毛転写階層の最上部は、ヘテロ多量体、転写活性化複合体を形成するマスター制御因子タンパク質ＦｌｈＤおよびＦｌｈＣをコードするｆｌｈＤＣオペロンである。ＦｌｈＤ４Ｃ２複合体は、σ70ＲＮＡポリメラーゼがクラス２鞭毛プロモーターから転写するように支配する。クラス２鞭毛遺伝子は、鞭毛組み立てにおけるキーとなる構造中間体である、フック基底小体（ＨＢＢ）と呼ばれる回転モーターの構造および組み立てに必要とされるタンパク質をコードする。ＨＢＢは鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系を含み、これは、組み立て中に鞭毛タンパク質を細胞質から成長中の構造まで搬出する。ＨＢＢ遺伝子発現に加えて、鞭毛クラス２転写は、σ28（ＦｌｉＡ）およびＦｌｇＭを生成させる。これらは、鞭毛クラス３プロモーターの転写をＨＢＢの完成と連結させる制御タンパク質である。σ28タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼが鞭毛クラス３プロモーターから転写するように支配する鞭毛特異的な転写因子である。クラス３遺伝子は、鞭毛フィラメントの構造遺伝子および細胞外リガンド濃度の変化に従い鞭毛回転の方向を調節する化学感覚シグナル伝達系の遺伝子を含む。ＨＢＢ完成前に、ＦｌｇＭはσ28に結合し、鞭毛クラス３プロモーター転写を阻止する。ＨＢＢ完成時に、鞭毛Ｔ３Ｓ基質特異性の変化の結果、ＦｌｇＭ分泌および鞭毛クラス３プロモーターからのσ28依存性転写開始が起こる。Ｔ３Ｓ基質に対する分泌シグナルの必要性は未だ不明であるが、全基質は、構造が乱れたＮ末端ペプチド分泌シグナルを利用し、ＩＩ型の分泌とは異なり、分泌過程中には切断されない。基質分泌は、分泌装置に対するＴ３Ｓシャペロンによる送達により促進されることが多い。ＦｌｇＭタンパク質は、９７アミノ酸長であり、その分泌は、Ｎ末端分泌シグナルに依存する。ＦｌｇＭ分泌は、その分泌シャペロン、ＦｌｇＭのＣ末端半分に結合するσ28により大きく促進される。
【００５１】
ＦｌｇＭは小型のＴ３Ｓ基質であり、最終的な鞭毛構造の一部ではないので、精製目的のためのタンパク質の分泌を支配するためにビヒクルとして使用し得る。周辺質または細胞外環境の何れかにそれらの分泌を向けるためにＦｌｇＭのＣ末端への外来ペプチドの融合を使用し得る。組み換えタンパク質を発現させ、精製するために、ＦｌｇＭＩＩＩ型分泌系を使用し得る。
【００５２】
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））の鞭毛分泌系を活用し、組み換え小型ペプチド発現の封入体の問題を迂回する発現系を使用するコンストラクトおよび方法が開示される。
【００５３】
Ｃ．核酸コンストラクト
ＦｌｇＭ核酸配列と、切断部位と、対象核酸配列と、を含む核酸コンストラクトが開示される。コンストラクトは、精製タグをコードする核酸配列をさらに含んでよい。
【００５４】
ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列の順序は変わってもよい。一部の態様において、配列の順序は、５’から３’で、ＦｌｇＭ核酸配列、精製タグをコードする核酸配列、切断部位および対象核酸配列であってよい。一部の態様において、配列の順序は、５’から３’で、精製タグをコードする核酸配列、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列であってよい。一部の態様において、配列の順序は、５’から３’で、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位、精製タグをコードする核酸配列および対象核酸配列であってよい。一部の態様において、配列の順序は、５’から３’で、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位、対象核酸配列および精製タグをコードする核酸配列であってよい。したがって、精製タグをコードする核酸配列は、対象核酸配列に対して５’または３’であってよい。
【００５５】
１．ＦｌｇＭ
開示のコンストラクトは、ＦｌｇＭ核酸配列を含む。ＦｌｇＭ核酸配列は、野生型ＦｌｇＭであってよい。一部の態様において、ＦｌｇＭ核酸配列は、ＦｌｇＭの突然変異体配列であってよい。ＦｌｇＭの突然変異体配列は、野生型ＦｌｇＭと比較して、１以上のヌクレオチド突然変異を有し得る。一部の態様において、この突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変化させない。一部の態様において、ＦｌｇＭの突然変異体核酸配列中の突然変異は、コードされるＦｌｇＭペプチドが対象核酸配列によりコードされるペプチドの分泌のためにベクターとして作用する能力に影響を及ぼさない。
【００５６】
２．切断部位
開示のコンストラクトは、ＦｌｇＭ核酸配列と対象核酸配列との間に切断部位を含んでよい。この切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位またはエンテロキナーゼ（ＥＴＫ）切断部位であってよい。当業者にとって公知の他の切断部位が使用され得る。切断部位はＦｌｇＭ核酸配列と対象核酸配列との間にあるものの、切断部位は必ずしもこれらの配列と連続していなくてもよい。言い換えると、精製タグをコードする配列は、切断部位のすぐ前または後であってよい。
【００５７】
切断部位は、プロテアーゼ切断部位であってよい。したがって、切断部位の核酸配列は、プロテアーゼ切断部位をコードし得る。切断部位は、ヌクレアーゼ切断部位ではなく、したがって、コンストラクト中に存在する核酸配列は切断されない。切断部位によって、開示のコンストラクトによりコードされるポリペプチドの切断が可能になる。開示のコンストラクトによりコードされるポリペプチドの切断によって、（ＦｌｇＭ核酸配列によりコードされる）ＦｌｇＭペプチドから（対象核酸によりコードされる）対象ペプチドが放出され得る。
【００５８】
３．対象核酸配列
開示のコンストラクトは、対象核酸配列を含む。対象核酸配列は、本明細書中で提供されるＦｌｇＭ系を用いて、発現させ、精製しようとする対象ペプチドをコードし得る。
【００５９】
一部の態様において、対象核酸配列は、システインリッチペプチドまたはジスルフィドリッチペプチドをコードする。小さなジスルフィドリッチポリペプチドの組み換え発現の結果、一般に収率は低くなる。これらのリペプチドの過剰発現は、分子間凝集体形成につながり得、組み換えポリペプチドが封入体中で見出され得る。封入体からのポリペプチドの回収は困難であり、時間を要し得るので、これらのジスルフィドリッチポリペプチドは、本明細書に開示されるＦｌｇＭ発現系を用いて最良に精製される。
【００６０】
一部の態様において、対象核酸配列は、システインリッチペプチドまたはジスルフィドリッチペプチドをコードし、このジスルフィドリッチまたはシステインリッチポリペプチドは向神経活性毒素である。向神経活性毒素は、何らかの向神経活性毒素であってよい。一部の態様において、向神経活性毒素は、コノイデアン（ｃｏｎｏｉｄｅａｎ）由来毒素（すなわちコノイデアン（ｃｏｎｏｉｄｅａｎ）からの毒素）であってよい。一部の態様において、向神経活性毒素はコノペプチドであってよい。コノペプチドは、μ−コノトキシンであってよい。μ−コノトキシンの例としては、ＳＩＩＩＡが挙げられるが限定されない。
【００６１】
４．精製タグ
開示のコンストラクトは、精製タグをコードする配列をさらに含んでよい。精製タグの例としては、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるが限定されない。したがって、これらの精製タグをコードする核酸配列が開示される。精製タグおよびそれらをコードする核酸配列は当技術分野で周知である。
【００６２】
５．プロモーター
開示のコンストラクトは、転写調節エレメント（ＴＣＥ）も含んでよい。ＴＣＥは、それらに操作可能に連結される核酸配列の発現を駆動可能なエレメントである。本明細書に開示されるコンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＥを含む。ＴＣＥは、場合によっては構成的または制御可能であってよい。例えば、ＰaraBADプロモーターを含むコンストラクトが本明細書に開示される。ＰaraBADプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターである。これにより、アラビノースの存在または非存在でプロモーターの下流の核酸配列の発現をオンまたはオフにすることが可能となる。
【００６３】
制御可能なＴＣＥは、転写抑制ドメインが、制御可能なＴＣＥ内で含有される核酸配列の転写を抑えるように作用するように、制御因子コンストラクトから発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合可能な核酸配列を含んでよい。
【００６４】
あるいは、制御可能なＴＣＥを含むコンストラクトは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む、薬物による調節可能な（例えば薬物誘導性など）リプレッサー融合タンパク質をコード可能な核酸配列をさらに含んでよい。このような配列において、薬物調節可能な（例えば薬物誘導性など）リプレッサー融合タンパク質をコード可能な核酸配列は、リプレッサー融合タンパク質が結合する制御可能なＴＣＥと同じコンストラクト上にある。
【００６５】
制御可能ＴＣＥは、場合によっては制御因子標的配列を含んでよい。制御因子標的配列は、転写抑制ドメインが、制御可能ＴＣＥ内に含有される核酸配列の転写を抑えるように作用するように、制御因子コンストラクトから発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合可能な核酸配列を含んでよい。制御因子標的配列は、１以上のｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含んでよい。制御因子標的配列は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＡＬ−４コード核酸配列を含むが限定されない他の配列と操作可能に連結され得る。
【００６６】
制御可能ＴＣＥおよび制御因子配列の存在は、それらが同じまたは異なるコンストラクト上にあってもなくても、制御可能ＴＣＥに操作可能に連結される配列の誘導性および可逆性発現を可能にする。それ自体、制御可能ＴＣＥは、対象配列の発現を選択的に誘導し、逆転する手段を提供し得る。
【００６７】
制御可能ＴＣＥは、例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンにより制御可能であってよい。さらに、ＴＣＥは、場合によっては少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含んでよい。
【００６８】
Ｄ．ポリペプチド
本明細書中の上記および他の部分で開示の核酸コンストラクトによりコードされるポリペプチドも本明細書に開示される。例えば、ＦｌｇＭと、切断部位と、対象ペプチドと、を含むポリペプチドが本明細書に開示される。ポリペプチドは、精製タグをさらに含んでよい。
【００６９】
開示のポリペプチドにおいて、ＦｌｇＭは、精製タグに対してＮ末端にあり得、精製タグは、切断部位に対してＮ末端にあり得、切断部位は、対象ペプチドに対してＮ末端にあり得る。あるいは、精製タグは、ＦｌｇＭに対してＮ末端にあり得、ＦｌｇＭは、切断部位に対してＮ末端にあり得、切断部位は、対象ペプチドに対してＮ末端にあり得る。一部の態様において、精製タグは、対象ペプチドに対してＣ末端にあり得る。
【００７０】
したがって、ポリペプチドの順序は、例えば、１）タグ−ＦｌｇＭ−切断部位−対象ペプチド、２）ＦｌｇＭ−Ｔａｇ−切断部位−対象ペプチド、３）ＦｌｇＭ−切断部位−タグ−対象ペプチドまたは４）ＦｌｇＭ−切断部位−対象ペプチド−タグであってよい。
【００７１】
１．ＦｌｇＭ
ＦｌｇＭを含むポリペプチドが開示される。ＦｌｇＭは、野生型ＦｌｇＭであってよい。一部の態様において、ＦｌｇＭは、突然変異体ＦｌｇＭであってよい。突然変異体ＦｌｇＭは、野生型ＦｌｇＭと比較して１以上のアミノ酸突然変異を有し得る。一部の態様において、突然変異体ＦｌｇＭ中の突然変異は、対象ペプチドの分泌のためにベクターとして作用するＦｌｇＭの能力に影響を及ぼさない。
【００７２】
２．切断部位
開示のポリペプチドは、ＦｌｇＭと対象ペプチドとの間に切断部位を含んでよい。切断部位は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位またはＥＴＫ切断部位であってよい。切断部位がＦｌｇＭと対象ペプチドとの間にあるものの、切断部位は、ＦｌｇＭおよび対象ペプチドと必ずしも連続していなくてもよく、言い換えると、精製タグは、切断部位のすぐ前または後にあり得る。
【００７３】
切断部位は、プロテアーゼ切断部位であってよい。切断部位によってポリペプチドの切断が可能となる。ポリペプチドの切断によって、ＦｌｇＭから対象ペプチドが放出され得る。
【００７４】
３．対象ペプチド
開示のポリペプチドは、対象ペプチドを含む。対象ペプチドは、本明細書中で提供されるＦｌｇＭ系を用いて発現させようとするペプチドであってよい。
【００７５】
一部の態様において、対象ペプチドは、システインリッチペプチドまたはジスルフィドリッチペプチドであってよい。ジスルフィドリッチまたはシステインリッチペプチドは、向神経活性毒素であってよい。向神経活性毒素は、何らかの向神経活性毒素であってよい。一部の態様において、向神経活性毒素は、コノイデアン（ｃｏｎｏｉｄｅａｎ）由来毒素（すなわちコノイデアン（ｃｏｎｏｉｄｅａｎ）からの毒素）であってよい。一部の態様において、向神経活性毒素はコノペプチドであってよい。コノペプチドは、μ−コノトキシンであってよい。μ−コノトキシンの例としては、ＳＩＩＩＡが挙げられるが限定されない。
【００７６】
対象ペプチドはサイズが変わってもよい。一部の態様において、対象ペプチドは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸長であってよい。一部の態様において、対象ペプチドは、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５アミノ酸長であってよい。対象ペプチドはサイズが変わってもよい。一部の態様において、対象ペプチドは、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００アミノ酸長であってよい。一部の態様において、対象ペプチドは、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００アミノ酸長であってよい。
【００７７】
４．精製タグ
開示のポリペプチドは、精製タグをさらに含んでよい。精製タグの例としては、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるが限定されない。
【００７８】
精製タグは、それがＦｌｇＭ分泌系を介して培地中に分泌された後、ポリペプチドを精製するために使用され得る。
【００７９】
Ｅ．細胞株
表１および４で提供されるような組み換え細胞株が開示される。
【００８０】
ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列を含む開示のコンストラクトの何れかを含む組み換え細胞株も本明細書に開示される。一部の態様において、組み換え細胞株は、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列、の配列のうち１以上を含んでもよい。一部の態様において、組み換え細胞株は、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列を含むコンストラクトの突然変異を有し得る。
【００８１】
本組み換え細胞株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の野生型株由来であってよい。一部の態様において、本組み換え細胞株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の突然変異体株由来であってよい。本組み換え細胞株は、他の腸内細菌種由来であってよい。例えば、本組み換え細胞株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはエルシニア由来であってよい。
【００８２】
ゲノムが１以上のフラジェリンまたはフック付随タンパク質遺伝子に対する改変を含む、組み換え細胞株が開示される。１以上のフラジェリン遺伝子は、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢおよびｆｌｉＤからなる群から選択され得る。
【００８３】
鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１以上の阻害剤に対する改変を含む、組み換え細胞株が開示される。鞭毛ＦｌＨＤ４Ｃ２マスター制御因子タンパク質複合体の阻害剤は、ｆｉｍＺ、ｓｒｇＤ、ｈｄｆＲ、ｒｂｓＲ、ｏｍｐＲ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｌｒｈＡ、ｙｄｉＶ、ｄｓｋＡ、ｅｃｎＲ、ｆｌｉＴおよびｒｃｓＢからなる群から選択され得る。σ70と一緒に、ＦｌｈＤ４Ｃ２は、ｆｌｉＡ、ＦｌｇＭおよびフック基底小体組み立てに対する遺伝子のものを含め、クラスＩＩプロモーターの転写を活性化する。ＦｌｈＤ４Ｃ２の阻害の結果、ＦｌｇＭまたはフック基底小体構造の数の減少が起こり得る。したがって、鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１以上の阻害剤に対する改変を有する組み換え細胞株は、開示のポリペプチドの分泌に正の影響を及ぼし得る。
【００８４】
本組み換え細胞株は、ＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓ−シャペロン遺伝子ｆｌｉＡの転写または翻訳を向上させるために突然変異を含んでよい。ＦｌｉＡは、σ28をコードし、σ28がＦｌｇＭに結合して、細胞の細胞質においてＦｌｇＭをタンパク質分解から保護するので、ＦｌｇＭＴ３Ｓ−シャペロン遺伝子が考慮される。したがって、ｆｌｉＡ遺伝子の転写または翻訳を向上させる突然変異が、より多くより良好なＦｌｇＭ分泌につながり得る。そして、本明細書中でのコンストラクトに開示のように、ＦｌｇＭは、対象ペプチドも含有するポリペプチドの一部である。したがって、ＦｌｇＭのより多いかまたはより良好な分泌により、対象ペプチドがより多くまたはより良好に分泌される。一部の態様において、ｆｌｉＡ遺伝子中の突然変異の結果、コードされるσ28においてＨ１４Ｎ、Ｈ１４Ｄ、Ｔ１３８ＩまたはＥ２０３Ｄ突然変異が生じた。
【００８５】
開示の細胞株の何れかの組み合わせも開示される。これらの組み合わせ株は、ＦｌｇＭ核酸配列、切断部位および対象核酸配列を有する開示のコンストラクトの何れかを含んでよい。
【００８６】
Ｆ．方法
ＦｌｇＭと、切断部位と、対象ペプチドと、を含有する開示のポリペプチドの何れかを含む細胞株を培地中で培養することを含む、対象ペプチドを生成させる方法が開示される。本方法は、培地から対象ペプチドを精製することをさらに含んでよい。
【００８７】
開示の方法は、ＦｌｇＭ核酸配列と、切断部位と、対象核酸配列と、を含有する開示の核酸コンストラクトの何れかを含む細胞株を含んでよい。対象核酸配列は、生成しようとしている対象ペプチドをコードする。
【００８８】
対象ペプチドを精製する段階は、アフィニティーカラムを含んでよい。一部の態様において、アフィニティーカラムは、σ28アフィニティーカラムであってよい。アフィニティーカラムは、ポリペプチド上のペプチドの１つとアフィニティーカラム上の分子との間の引力を使用することによって、対象ペプチドまたは、対象ペプチドを含有する対象ポリペプチドを精製するために設計された何らかのカラムであってよい。例えば、σ28は、対象ペプチドも含有するポリペプチド上にあるＦｌｇＭに結合するので、σ28アフィニティーカラムが使用され得る。また、アフィニティーカラムは、ポリペプチドに存在する精製タグに基づき得る。一部の態様において、アフィニティーカラムは、ＦｌｇＭ、精製タグまたは対象ペプチドに結合する抗体を有し得る。
【００８９】
対象ペプチドの精製は、ＦｌｇＭと、切断部位と、対象ペプチドと、を含むポリペプチドの精製を含んでよい。
【００９０】
対象ペプチドは、ＦｌｇＭと対象ペプチドとの間に存在する切断部位を使用することによって切断され得る。対象ペプチドは、精製の前、後またはその最中に切断され得る。例えば、ＦｌｇＭと、切断部位と、対象ペプチドと、を含むポリペプチドを有する開示細胞株を用いることによって、ＦｌｇＭがポリペプチドを支配し、鞭毛ＩＩＩ型分泌系を通じて細胞が培養される培地に分泌されるようになる。対象ペプチドは、ポリペプチドの切断部位に特異的なプロテアーゼを添加することによって、ポリペプチドの残りの部分から切り離され得る。次に、対象ペプチドを培地から精製し得る。あるいは、対象ペプチドを含むポリペプチドの残りの部分とともに対象ペプチドを精製し得る。精製後、本ポリペプチドが切断され、対象ペプチドが放出され得る。あるいは、対象ペプチドは精製中に切断され得る。本ポリペプチドは、精製中にアフィニティーカラムに結合され得、結合中にポリペプチドが切断されて、残りのポリペプチドから対象ペプチドが放出され得る。
【００９１】
開示の方法の細胞株は、開示の組み換え細胞株の何れかであってよい。一部の態様において、細胞株は、対象ペプチドを含むポリペプチドを分泌するために、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィウリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系を有し得る。一部の態様において、細胞株は、１以上のフラジェリン遺伝子またはフック付随タンパク質遺伝子に対する改変を有し得る。１以上のフラジェリンまたはフック付随タンパク質遺伝子は、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢおよびｆｌｉＤからなる群から選択され得る。一部の態様において、細胞株は、鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の１以上の阻害剤に対する改変を有し得る。鞭毛ＦｌｈＤ４Ｃ２マスター制御タンパク質複合体の阻害剤は、ｆｉｍＺ、ｓｒｇＤ、ｈｄｆＲ、ｒｂｓＲ、ｏｍｐＲ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｌｒｈＡ、ｙｄｉＶ、ｄｓｋＡ、ｅｃｎＲ、ｆｌｉＴおよびｒｃｓＢからなる群から選択され得る。一部の態様において、細胞株は、ＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓ−シャペロン遺伝子ｆｌｉＡの転写または翻訳を向上させるために突然変異を有し得る。
【００９２】
Ｇ．キット
開示の方法を行うことまたはそれを行うことを支援するのに有用なキットとして何らかの適切な組み合わせで、上述の材料ならびに他の材料を一緒にパッケージ化し得る。ある種のキット中のキット構成要素が設計され、開示の方法で一緒に使用するのに適合化される場合、これは有用である。例えば、対象ペプチドを生成させるためのキット、開示の組み換え細胞株のうち１つを含むキットが開示される。本キットは、培地も含有し得る。
【００９３】
開示のキットは、対象ペプチドを精製するための材料も含んでよい。例えば、本キットは、ポリペプチド上に存在する精製タグに基づき、対象ペプチドを精製するためのアフィニティーカラムを含んでよい。
実施例
【００９４】
Ａ．実施例１  鞭毛ＩＩＩ型分泌系を用いた組み換え向神経活性ペプチドの選択的精製
本試験では、成熟生成物においてジスルフィド架橋を形成する高密度のシステイン残基を含有する、小型で極めて安定であり、薬理活性を有するポリペプチドの分泌のためにベクターとして鞭毛ＦｌｇＭタンパク質を利用した。原理の証明として、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）におけるμ−コノトキシンＳＩＩＩＡの組み換え発現のために、細菌分泌系を操作した。鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）装置を用いて、図１に示すように、組み換えコノトキシンを培地に選択的に分泌させた。
【００９５】
１．材料および方法
ｉ．細菌株、プラスミドおよび培地
使用され得る代表的な細菌株を表１に記載する。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で細胞を培養し、必要に応じてアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）またはテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を補給した。Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｐ２２  ＨＴ１０５／１  ｉｎｔ−２０１の一般形質導入ファージを形質導入クロス（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓｅｓ）において使用した。
表１：この試験で使用した株
【表１】
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【００９６】
ｉｉ．染色体発現されるＦｌｇＭ−毒素融合物の構築
ＳＩＩＩＡ（ＱＮＣＣＮＧＧＣＳＳＫＷＣＲＤＨＡＲＣＣＧＲ；配列番号２）をコードする全６６塩基対をカバーする長いプライマーＳＩＩＩＡ＿ｌｏｎｇ＿ｆｗ（ＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣ；配列番号１）を用いて、デ・ノボフィルインＰＣＲ反応においてＳＩＩＩＡを増幅した。サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の最適コドン使用に従い、ＳＩＩＩＡ配列を設計した。鋳型プライマーの３’末端からのフィルインを開始する短いリバースプライマー（ＳＩｌＩＡ＿ｓｈｏｒｔ＿ｒｖ：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＴＧ；配列番号３）を活用して、６６ｂｐ配列を２本鎖化した。
【００９７】
３つの異なるコンストラクト（コンストラクト１〜３と呼ぶ。）を生成させるｆｌｇＭおよびＳＩＩＩＡの増幅中に、ＴＥＶプロテアーゼに対する切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号４）およびポリヒスチジンタグ（（ＣＡＴＣＡＣ）3配列番号５によりコードされるＨ６）を様々な位置に挿入した。
【００９８】
以降、典型例としてコンストラクト１の構築し、それに基づいてコンストラクト２およびコンストラクト３を設計した（プライマー配列については表２参照）手順を詳細に説明する。フォワードプライマー１＿ＨＳ１＿ＦｌｇＭ＿ｆｗおよびリバースプライマー１＿ＨＳ２＿ＦｌｇＭ＿ｒｖを用いて、ゲノムＤＮＡ（ＴＨ２７８８）からｆｌｇＭ遺伝子を増幅した。リバースプライマーは、５’ＳＩＩＩＡ配列（上記参照）と相同であった１８ｂｐの突出部をコードした。相同領域の長さを延長させるために、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位の配列に対して相同性があるさらなる１０ｂｐ重複を付加する、プライマー１＿ＨＳ３＿ＳＩＩＩＡ＿ｆｗおよび１＿ＨＳ４＿ＳＩＩＩＡ＿ｒｖにより、以前に合成した鋳型からＳＩＩＩＡを増幅させた。ＦｌｇＭおよびＳＩＩＩＡのＰＣＲ産物を精製し、フォワードプライマー１＿ＨＳ１＿ＦｌｇＭ＿ｆｗおよびリバースプライマー１＿ＨＳ４＿ＳＩＩＩＡ＿ｒｖとともに、続く融合ＰＣＲにおいて鋳型として使用した。この方法によって、（コンストラクト１の場合）２８塩基対の相同性を共有する２つのＰＣＲ産物の融合が可能となり、その結果、１つの長いｆｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ融合コンストラクトが得られる。全コンストラクトが、ｐＵＣ１８へのクローニングのために、５’−ＢａｍＨ１および３’−ＥｃｏＲ１制限部位を含有し、その結果、サブクローニングベクター（ｐＨＳ１（ｐＵＣ１８  ＢａｍＨＩ−Ｈｉｓ６−ＦｌｇＭ−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ−ＥｃｏＲＩ）、ｐＨＳ２（ｐＵＣ１８  ＢａｍＨＩ−ＦｌｇＭ−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ−Ｈｉｓ６−ＥｃｏＲＩ）およびｐＨＳ３（ｐＵＣ１８  ＢａｍＨＩ−ＦｌｇＭ−Ｈｉｓ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ−ＥｃｏＲＩ）が得られた。
表２：毒素構築のためのプライマー配列
【表２】
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【００９９】
ネイティブｆｌｇＭ遺伝子座またはアラビノース遺伝子座（ΔａｒａＢＡＤ）に対してそれぞれ相同性領域を有するプライマーを用いて、全ｆｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ融合物を個々のサブクローニングベクターから増幅した。λ−Ｒｅｄ介在組み換えを用いて染色体挿入物を構築した。
【０１００】
サルモネラにおけるＳＩＩＩＡの発現の結果、生理的条件下で通常は存在する翻訳後修飾のない組み換えペプチドが得られた。これらには、中性Ｎ末端ピログルタミン酸、Ｃ末端アミド化およびＳＩＩＩＡｐｒｅと呼ばれる２残基断片の切断が含まれる。しかし、関連するμ−コノトキシンＧＩＩＩＡにおける機能性試験によると、ＳＩＩＩＡの効力は、位置１１のリジンによって決定され、したがって、何れのＮおよびＣ末端配列の変動によっても影響を受けない。
【０１０１】
様々な生物（カタツムリ、クモ、ヘビおよびイソギンチャク）由来の全ての他の毒素を対応して構築し、それらの配列を表３および表２に記載する。
表３：この実験で使用される毒素
【表３】
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【０１０２】
プライマーＤＴＡ−ＦｌｇＭ＿ｆｗ（ＡＣＴＣＧＣＴＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ；配列番号１０）およびＤＴＡ−ＦｌｇＭ＿ｒｖ（ＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＴＡＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧ；配列番号１１）を用いて、ジフテリア毒素（ＤＴＡ  Ｙ６５Ａ）の断片ＡをプラスミドｐＴＨ７９４から増幅させた。ＤＴＡ増幅には、Ｈｉｓ−ｔａｇとＤＴＡの第一のアミノ酸との間で、Ｈｉｓ−タグおよびＳＳＧＬＶＰＲ−リンカーの前に、ＧＳＳ−リンカーとともにポリヒスチジン−タグ（Ｈ6）が含まれる。λ−Ｒｅｄ−介在性組み換えによって染色体性にＤＴＡを挿入した。ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ+バックグラウンドにおいて挿入を行った。ｆｌｇＭ停止コドンの前にＤＴＡを標的化し、その結果、翻訳的ＦｌｇＭ−ＤＴＡ融合が生じた。
【０１０３】
ｉｉｉ．ＳＩＩＩＡコノトキシンの組み換え発現および精製
ＳＩＩＩＡコノトキシン融合物を発現する株を新鮮な単一コロニーから採取し、１０ｍＬのＬＢ中で一晩増殖させた。一晩培養物を１Ｌの新鮮培地に入れて１：１００希釈し、６時間増殖させた。適切な場合、０．２％アラビノースの添加によって、最初の２時間後にＳＩＩＩＡ発現を誘導した。遠心（７，０００ｒｐｍ）によって細胞をペレット化し、残存細菌を除去するために、ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡを含有する上清を０．２２μｍポリエーテルスルホンフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）−低タンパク質結合膜に通過させた。さらなる精製のために、３ｇのＮｉ−ＩＤＡ樹脂（Ｐｒｏｔｉｎｏ  Ｎｉ−ＩＤＡ，Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を充填した重力流カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液を用いてｐＨ７．５でネイティブ条件下でアフィニティータグ付加タンパク質を溶出した。
【０１０４】
ｉｖ．分泌アッセイ
一晩培養物をＬＢ中で１：１００希釈し、０．２％Ｌ−アラビノースを添加することによって個々のＦｌｇＭ−毒素融合物の発現を誘導する前に、３７℃で２時間増殖させた。さらに４時間にわたり細胞を３７℃で維持し、その間に融合タンパク質を発現させた。全部で６時間後、全ての株に対して６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０１０５】
２ｍＬの得られた細胞培養物のアリコートを４℃および７，０００ｒｐｍで１０分間遠心して、各アリコートに対してペレットおよび上清を得た。０．２μｍ孔径（Ａｃｒｏｄｉｓｋ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ，ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の低タンパク質結合フィルターを通じて上清をろ過して、残存細胞を除去した。あるいは、最大スピードでアリコートを２回遠心して、残存細胞を除去した。ＴＣＡ（１０％最終濃度）の添加によって、ろ過または２回遠心した上清中の分泌型タンパク質を沈殿させた。２ｘＳＤＳ試料緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２％β−メルカプトエタノール、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０４％ブロモフェノールブルー）中で上清試料を再懸濁し、２０ＯＤ600単位／μＬに調整した。細胞、ペレット分画を２ｘＳＤＳ試料緩衝液中で懸濁し、２０ＯＤ600単位／μＬとするためにその体積を調整した。
【０１０６】
ｖ．ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
全細胞溶解液および培養上清の発現ＦｌｇＭ−毒素融合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、検出のためにポリクローナル抗ＦｌｇＭおよびポリクローナル抗ＦｌｉＫ抗体（ウサギ）を用いて免疫ブロットすることによって分析した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを用いた化学発光または赤外線検出によって抗原−抗体複合体を可視化した。化学発光による発色の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合体化した二次ヤギα−ウサギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。赤外線検出の場合、二次抗ウサギ−ＩＲＤｙｅ６９０（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ用のＩｍａｇｅＪ  １．４５ｓを用いてＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡおよびＦｌｉＫバンドのデンシトメトリー測定を行った。
【０１０７】
ｖｉ．ＴＥＶプロテアーゼ切断
ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、鞭毛分泌基質から、ＳＩＩＩＡを切り出した。４５０ＵのＴＥＶプロテアーゼを、７５０ｍＬ培養物からの分泌型タンパク質に相当する１５ｍＬの溶出分画に添加した。室温で一晩、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶出緩衝液中で切断を行った。
【０１０８】
ｖｉｉ．ＳＩＩＩＡの折り畳み
１ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で組み換えＳＩＩＩＡを折り畳ませた。折り畳み反応を一晩室温で進行させ、８％の最終濃度になるようにギ酸を添加することにより反応を停止させた。
【０１０９】
ｖｉｉｉ．ＳＩＩＩＡの固相抽出
Ｃ18固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ  ＬＣ−１８，Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して、折り畳みおよび切断反応の他の構成要素から酸化ペプチドを除去した。次に、単離ペプチドを乾燥させ、二重波長吸収検出器およびＶｙｄａｃ  Ｃ18分析カラムを備えたＷａｔｅｒｓ６００クロマトグラフ上でＨＰＬＣによって精製した。全体にわたり０．１％ＴＦＡに維持しながら、４．５％〜３３．５％（ａｑ）のアセトニトリル（０．９％変化／分）の直線勾配で、ＨＰＬＣ分離を行った。これによって、適正な折り畳み生成物の精製が可能になり、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって質量を確認した。
【０１１０】
ｉｘ．哺乳動物ＮａVチャネルの電気生理学
ＮａV１．２を発現するアフリカツメガエル卵母細胞を用いて組み換えＳＩＩＩＡの機能的活性を電気生理学的に評価した。簡潔に述べると、卵母細胞をＮＤ９６で灌流され、２本の電極が固定された、３０μＬの記録チャンバー中に置いた。−８０ｍＶの保持電位を使用し、２０秒ごとに５０ｍｓ、段階的に電位を−１０ｍＶまで変化させることによって、ナトリウムチャネルの活性化を達成した。次のように、ペプチドを保護するために静止浴中で毒素への曝露を行った。毒素適用前に、浴槽の灌流を停止し、対照反応を記録した。次に、ペプチド（最終濃度の１０倍で３μＬ）を浴槽に適用し、マイクロピペットを用いてこれを５秒間撹拌した。約２０分間、ペプチドによる遮断の開始の記録を得、その後、ＮＤ９６での灌流を再開して未結合のペプチドを除去し、一方で約２０分間にわたり遮断からの回復速度を監視した。遮断の開始の時間経過を単一指数関数にフィットさせ、遮断の実測の速度定数、ｋobsを得た。ペプチド洗い流し中の遮断からの回復速度は、遅すぎて曲線フィッティングにより測定できなかったので、洗浄の２０分後の回復レベルおよび遮断の指数関数的減衰を仮定してｋoffを推定した。全記録を室温で得た。
【０１１１】
ｘ．免疫染色
蛍光顕微鏡分析を行った。
【０１１２】
２．結果および考察
ウミイモガイの毒腺および電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）を含む標的イオンチャネルからコノトキシンを合成する。ＳＩＩＩＡは、カエルにおけるテトロドトキシン（ＴＴＸ）−耐性ＶＧＳＣおよびげっ歯類におけるＴＴＸ−感受性ＶＧＳＣを阻害する、コヌス・ストリアツス（Ｃｏｎｕｓ  ｓｔｒｉａｔｕｓ）からのμ−コノトキシンである。μ−コノトキシンＳＩＩＩＡは、ＶＧＳＣのα−サブユニットの部位１に結合し、それによってチャネル孔を塞ぎ、ナトリウム伝導性を遮断する。生理学的条件下で、２つの形態のＳＩＩＩＡ：前駆体型および成熟ペプチドが存在するが、この成熟ペプチドは、アミノ基に対してＣ末端グリシン−アルギニン残基をプロセシングし、Ｎ末端グルタミン残基をピログルタミン酸に変化させることによって修飾されている。本明細書中で、２つの形態のＳＩＩＩＡ、前駆体ペプチドおよび、生理学的成熟型（ピログルタミン酸の代わりにＮ末端グルタミン酸）と最も密接に類似するペプチドを組み換えにより発現させた。哺乳動物調製物において、μ−ＳＩＩＩＡは、ＮａV１．２および１．６などの神経性ナトリウムチャネルおよび骨格筋サブタイプＮａV１．４を効果的に遮断する。ＳＩＩＩＡはＶＧＳＣを標的とし、マウスにおいて強力な鎮痛活性を有するので、医学研究および薬物探索のために使用され得る。Ｔ３ＳＳ細菌発現系を開発することにおける基本的な利点は、翻訳後、鞭毛構造において狭い分泌チャネルを通じてポリペプチドが移動させられ、それによって、封入体での凝集の問題が回避されることである。ポリペプチド分泌は、細胞質中での分子間凝集を防ぐ。ポリペプチド鎖が細菌細胞質の還元環境に存在し、酸化する細胞外環境に入るので、分子内ジスルフィド結合が形成される。
【０１１３】
様々なコンストラクトがＩＩＩ型分泌基質として働く効率を評価した。ＳＩＩＩＡプレトキシン（表３における「μ−ＳＩＩＩＡｐｒｅ」、これ以降、「ｒＳＩＩＩＡ」と呼ぶ。）は、ＳＩＩＩＡの前のＮ末端ＴＥＶ切断部位とＦｌｇＭが融合した小さな２２アミノ酸ペプチドである。的確な分泌を確実にし、ＦｌｇＭの構造性分泌シグナルでの妨害の可能性を減少させるために、異なる位置でポリ−ヒスチジンタグを用いて３種類の異なるコンストラクトを設計した。アラビノース−誘導性プロモーターＰaraBADから全コンストラクトを染色体性に発現させた。図１Ｂは、全ての３種類のコンストラクトを分泌プロファイルを示す。コンストラクト３（ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ）は、最も顕著な分泌生成物を提示し；コンストラクト２（ＦｌｇＭ−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡ−Ｈ６）は、最低分泌レベルを提示した。この分泌順位付けは、試験した全バックグラウンドにおいて一貫しており、これらの一部は、このＦｌｇＭ分泌−シャペロンタンパク質の安定性を促進する、σ28構造遺伝子ｆｌｉＡにおける突然変異（ｆｌａ*またはＨ１４Ｄ）を保有した。ＦｌｇＭレベルは、野生型株におけるものと比較して、鞭毛構造を形成できない株（ΔｆｌｉＦ）において非常に低かった。
【０１１４】
鞭毛特異的な転写因子σ28は、ＦｌｇＭ分泌を促進するためのシャペロンとして作用する。図Ｃｃに示すように、その安定性が促進されたσ28Ｈ１４Ｄは、細胞内および分泌型ＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡのレベルを上昇させた。σ28Ｈ４１Ｄもまた、ＦｌｇＭ安定性を上昇させる。これは、ｆｌｉＡ*バックグラウンドにおけるＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡレベル上昇の原因である（図１Ｃ、レーン２および３）。後期鞭毛分泌基質（および潜在的分泌競合物）ＦｌｉＣおよびＦｌｉＤを除去する効果（ΔｆｌｉＣＤ）も試験した。ｆｌｉＣおよびｆｌｉＤ遺伝子は多岐に転写される。しかし、ｆｌｉＤ遺伝子は、全鞭毛遺伝子発現のＦｌｉＴ阻害剤をコードする、ｆｌｉＴとともにオペロン中にある。したがって、ΔｆｌｉＣＤ欠失の結果、鞭毛基底構造の数の増加に加えて、ＦｌｇＭに対する分泌競合物の除去が起こる。正味の影響は、細胞からのＦｌｇＭおよびＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ両方の産生および分泌上昇であった（図１Ｃ、レーン２および４）。
【０１１５】
ＦｌｇＡ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡは最も高いレベルの分泌を示したので、さらなる精製実験のためにこのコンストラクトを使用した。鞭毛分泌系の完成と高レベル発現の同期を可能にするために、アラビノース誘導性プロモーターからＳＩＩＩＡ融合物を発現させた。細菌細胞培養物から分泌型ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡを遠心によって分離し、ニッケル−アフィニティークロマトグラフィーによってネイティブ条件下で上清から得た。図２Ａに示すように、ＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ−ＳＩＩＩＡは、効率的にＮｉ−ＩＤＡ樹脂に結合し、イミダゾール含有溶出緩衝液で溶出させた。溶出分画の濃縮後、ＴＥＶプロテアーゼを用いてＦｌｇＭ−Ｈ６−ＴＥＶ分泌シグナルからｒＳＩＩＩＡを切り出した。ウエスタンブロット分析およびクーマジー染色から、室温で３時間後、ＴＥＶ切断が完全であったことが明らかになった。
【０１１６】
全システインリッチペプチドと同様に、ネイティブジスルフィド結合の形成は、生物学的に活性のあるＳＩＩＩＡを生成させることに関与する過程である。しかし、ＴＥＶプロテアーゼの最適緩衝液条件は、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）であってよい。この酸化還元剤は、ＴＥＶプロテアーゼに対する還元力を提供するが、同時に、対象ペプチドにおけるＳ−Ｓ結合を還元し得る。この理由のために、電気生理学的分析前にｒＳＩＩＩＡを再折り畳みさせた。酸化および還元グルタチオンの酸化還元緩衝液中で再折り畳みを行い、これにより、ネイティブジスルフィド結合の形成に都合がよいことが知られている条件下でチオール−ジスルフィド交換反応が可能となった。
【０１１７】
ラットＮａV１．２を発現するアフリカツメガエル卵母細胞におけるｒＳＩＩＩＡ前駆体型の試験から、その機能活性が化学合成ＳＩＩＩＡの機能活性と同様であったことが明らかとなった。脱分極に反応したナトリウム電流を記録した。図２Ｂは、ｒＳＩＩＩＡがＮａV１．２コンダクタンスを遮断した代表的実験からの結果を示す［ｒＳＩＩＩＡ曝露前（灰色の軌跡）および後（黒色の軌跡）に卵母細胞のピーク電流を比較］。１０μＭのｒＳＩＩＩＡへの曝露後の遮断開始およびその洗い流し後の遮断からの回復のキネティクスを評価した。遮断の開始に対する実測の速度定数（ｋobs）および遮断からの回復に対する速度定数（ｋoff）はそれぞれ０．１７±０．０４分-1および０．００４３±０．０００４分-1（平均±ＳＤ、ｎ＝３卵母細胞）であった。ｋoff値は、化学合成ＳＩＩＩＡで観察される値に近いが、ｋobs値は、化学合成ＳＩＩＩＡで観察される値よりも約６倍低かった。ｋobsの差異は、２つのペプチドの配列の相違によるものである（ＴＥＶ切断後のＮ末端グリシンの持ち越しおよび翻訳後修飾の欠如）。
【０１１８】
ＳＩＩＩＡプレトキシンの分泌に加えて、様々な生物由来のいくつかの他の毒素、例えばクモ（ＧｓＭＴｘ４）、サソリ（クロロトキシン）、ヘビ（カルシセプチン）、カタツムリ（ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＧＶＩＡ、コンツラキン−Ｇ、α−Ｖｃ１．１、コナントキン−Ｇ、成熟ＳＩＩＩＡ）およびイソギンチャク（Ｓｈｋ）など、を補完的アプローチにおける組み換え発現および続く分泌について試験した（詳細なリストについては表３参照）。細胞レベルおよび分泌効率の差があったにもかかわらず、図２Ｃに示される結果から、全試験毒素が培養上清に分泌されたことが明らかとなる。ＦｌｇＭに融合されたジフテリア毒素の不安定な１９０アミノ酸長の触媒サブユニットの分泌も試験した（図２Ｄ）。タンパク質が細胞から分泌されると、サイトゾル分画内で観察されたタンパク質分解性の分解は起こらなかった。
【０１１９】
サルモネラ分泌株のさらなる最適化のために、次の特徴を有した非モチーフポリフック突然変異体を構築したが、これは、対象毒素融合物の鞭毛ＩＩＩ型分泌を減弱または妨害し得る、鞭毛関連ＳＰＩ−１（ΔｐｒｇＨ−ｈｉｌＡ、）病原性系ならびに全クラス３鞭毛遺伝子（ΔｆｌｇＫＬ、ΔｆｌｊＢ−Ｔ、ΔＦｌｇＭＮ、Δａｅｒ−ｍｃｐＣ、ＰｍｏｔＡ、ΔｍｏｔＡ−ｃｈｅＺ、ΔｍｃｐＡ、ΔｍｃｐＢ、Δｔｓｒ）を欠いていた。さらに、その株は、ｆｌｈＤプロモーターにおける突然変異（Ｐ*ｆｌｈＤ）を保有し、鞭毛マスター制御因子ＦｌｈＤ４Ｃ２の負の制御因子を欠いていた（ΔｌｒｈＡ、ΔｙｄｉＶ、ΔｅｃｎＲ）。ＬｒｈＡは、マスター制御因子のプロモーター領域に直接結合することによって、ｆｌｈＤＣ転写の負の制御因子として作用する。ＥＡＬドメインタンパク質ＹｄｉＶは、複合体をＣｌｐＸＰ−依存性分解に対して標的化することによって、翻訳後的にＦｌｈＤ４Ｃ２タンパク質の活性を制御し、それによってＦｌｈＤＣ−依存性鞭毛クラス２プロモーター活性に負の影響を与える。ＦｌｈＤＣのこれらの負の制御因子におけるトランスポゾン挿入は、鞭毛遺伝子発現を上昇させる。
【０１２０】
図３Ａにおける鞭毛フック構造の蛍光標識付加により示されるように、これらの突然変異の結果、野生型細胞と比較して、細胞あたりの鞭毛分泌構造がおおよそ２倍増加し、同様に鞭毛タンパク質の分泌速度が実質的に上昇した。ＦｌｉＫおよびＦｌｇＭ−ＳＩＩＩＡ（コンストラクト３）の分泌速度は、野生型およびｆｌｉＡ*バックグラウンドの場合と比較して、ポリフックバックグラウンドにおいておおよそ２倍高かった（図３Ｂ）。
【０１２１】
この系の主要な利点は、ワークフローである。アラビノースでの誘導後、細菌細胞は、組み換えポリペプチドを発現し、続いて毒素を培地に分泌する。従来の方法による神経ペプチドの精製とは逆に、これによって、毒素を精製するために細胞を溶解する必要がなくなる。代わりに、鞭毛Ｔ３ＳＳを介して組み換えＳＩＩＩＡが選択的に分泌され、培養上清中にそれが蓄積した。産生の数時間後、単純な遠心およびろ過によって細胞が除去された。この系の他の態様は、分泌を促進するかまたは分泌基質の安定性を向上させるＩＩＩ型分泌シャペロンである。ＩＩＩ型分泌基質は通常、折り畳まれていないかまたは部分的に折り畳まれた状態で分泌されるが、これは、分泌型タンパク質の二次構造とシャペロンの相互作用によって達成されることが多い。ＳＩＩＩＡは、ＩＩＩ型分泌基質であるＦｌｇＭに融合されたので、ＦｌｇＭの同系のＩＩＩ型分泌系シャペロンである、ＦｌｉＡ（σ28）との相互作用によって未熟な折り畳みが避けられた。開示の組み換え発現に対して、全長ＦｌｇＭを使用し、これにより、そのＦｌｉＡシャペロン結合部位の存在ゆえに分泌効率が向上した。
【０１２２】
開示の系は、ペプチドの回収および溶解度を凌ぐ課題である、複雑な毒素精製に対して使い易い方法を提供するが、また、ペプチドおよびタンパク質が正しく折り畳まれ活性のある状態になり易くもなる。
【０１２３】
Ｂ．実施例２  サルモネラＦｌｇＭタンパク質分泌に影響を及ぼす因子の分析
本試験において、組み換え小型ペプチド発現の封入体問題を回避する発現系を使用する新しいアプローチを開始した。これは、鞭毛分泌シグナル、例えばフックタンパク質ＦｌｇＥまたはフラジェリンＦｌｉＣに融合される場合、非鞭毛タンパク質を輸送することが示されているサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））の鞭毛分泌系を活用する。鞭毛分泌系は、細胞質から外部媒体にタンパク質を選択的に分泌する細菌ＩＩＩ型分泌系のファミリーのメンバーである。今までのところ特徴が調べられているほぼ全てのＩＩＩ型分泌系は、植物および動物病原体の多くに対する毒性決定因子の分泌または細菌鞭毛の構造および機能のために必要とされるタンパク質分泌の何れかに必要とされる。細菌鞭毛は、細胞壁および膜内に埋め込まれた回転モーターに連結される、細胞表面から多くの体長を延長させる外部ヘリックスフィラメントから構成される。サルモネラの場合、化学感覚系は、鞭毛回転の時計回りおよび反時計回りの方向を調節し、これにより、細菌が、栄養などの誘引物質に向かって、または細菌にとって有害である細菌忌避物質から遠ざかるように移動することができるようになる。
【０１２４】
鞭毛基質分泌に対する特異性は、混乱した構造を有するＮ末端ペプチド分泌シグナルによって主に決定される。多くの分泌基質はまた、分泌を促進するために特異的な分泌シャペロンも必要とする。１つの鞭毛分泌基質であるＦｌｇＭは、鞭毛組み立てを遺伝子発現と連結させる制御タンパク質である。鞭毛プロモーターに特異的な転写因子であるσ28は、鞭毛モーターの完成後に特異的に必要とされる遺伝子の転写を支配し、それによってフィラメントおよび化学感覚遺伝子の発現を誘導する。ＦｌｇＭは、σ28と結合し、ＲＮＡポリメラーゼとのその会合を防ぐ。鞭毛モーターの完成の結果、鞭毛分泌装置の基質特異性が変化し、モーター組み立てに必要とされるタンパク質の分泌から、フィラメント組み立てにおいて必要なタンパク質の後期基質分泌に切り替わる。ＦｌｇＭそれ自身は、後期分泌基質であり、その分泌によってσ28が放出され、σ28がモーターの完成時にのみフィラメントおよび化学感覚遺伝子を転写できるようになる。同時に、σ28転写因子は、その阻害剤、ＦｌｇＭの分泌を促進する分泌シャペロンとして作用する。
【０１２５】
本試験において、成熟生成物においてジスルフィド架橋を形成する、高密度のステイン残基を含有する小型で極めて安定であり、薬理活性を有するポリペプチドの分泌のためのベクターとして、鞭毛ＦｌｇＭタンパク質を利用した。サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）におけるμ−コノトキシンＳＩＩＩＡの組み換え発現のために、細菌分泌系を作製した。鞭毛ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）装置を用いて、組み換えコノトキシンを選択的に培地に分泌させた。
【０１２６】
１．材料および方法
ｉ．細菌株および増殖条件
本試験に使用した株は全て、野生型株サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であるＬＴ２の誘導体であり、表４に記載する。一連のこの実験中に全株を構築した。株構築は、Ｐ２２を介して行われる形質導入またはλＲｅｄを介した標的化突然変異誘発の何れかを利用した。そのネイティブプロモーターから発現されるｆｌｈＤＣオペロンがある株の場合、一晩静置した培地から新鮮ＬＢ培地（１０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトン、５ｇ  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物および５ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）への１００倍希釈液によって鞭毛遺伝子発現が誘導された。トランスポゾンＴｎ１０のｔｅｔＡプロモーターから発現されるｆｌｈＤＣオペロンがある株（ΔＰflhDC８０８９：：ｔｅｔＲ−ＰｔｅｔＡ）の場合、テトラサイクリン類似体アンヒドロ−テトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）の付加によって鞭毛遺伝子発現を誘導した。この実験で使用した株の場合は全て、アラビノース利用オペロンａｒａＢＡＤをＦｌｇＭ+遺伝子またはＦｌｇＭ遺伝子融合物ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥまたはＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ（それぞれ、ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ+、ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥまたはΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ−６Ｈｉ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥＩ）で置換した。これにより、増殖培地へのＬ−アラビノースの添加によって、ＰaraBADプロモーターからのＦｌｇＭ、ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ産生の誘導が可能となった。ｆｌｈＤＣオペロンの誘導の２時間後に、アラビノースを０．２％最終濃度になるように添加した。さらに５時間後、培養物を１０，０００ｇで３０分間遠心し、細胞をペレット化した。０．２μｍ低タンパク質結合フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｋ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ，ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で上清をろ過し、残存細胞を除去した。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を１０％最終濃度になるように添加することによって、ろ過上清中の分泌型タンパク質を沈殿させた。５ｍＭ  ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含有する冷ＰＢＳ（リン酸緩衝塩水）中で細胞ペレットを再懸濁し、続いて超音波処理を行い、細胞縣濁液を溶解させた。細胞溶解液は、全細胞タンパク質について直接分析するか、または４℃で３０分間遠心（１５，０００ｇ）することによって、可溶性および不溶性分画分析のために分離した。ＦｌｇＭ分泌における様々な濃度のＮａＣｌおよびＫＣｌの影響を試験するために、ＬＢ培地をＮａＣｌなしで調製し、ＮａＣｌまたはＫＣｌの何れかを所望の濃度になるように添加した。
表４：ＬＴ２の株および誘導体
【表４】
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【０１２７】
ｉｉ．ウエスタンブロッティングアッセイ
分泌型の可溶性、不溶性または全細胞タンパク質のレベルをウエスタンブロットによって分析した。１４％勾配ゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、全細胞溶解液および培養上清中の発現ＤｎａＫ、ＦｌｇＭおよびσ28レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ+コンストラクトを含有する株の分析、５０単位および１００ＯＤ単位の同等物をそれぞれ細胞および上清分画に対して載せた。ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ分泌について株を分析するために、５０および３００ＯＤ単位を細胞および上清分画に対してそれぞれ載せた。検出のために、抗ＤｎａＫ（マウス）、抗σ28および抗ＦｌｇＭ抗体（ウサギ）を使用した。ローディング濃度に対して、および細胞溶解ゆえの上清中のタンパク質の存在に対して、タンパク質標準対照としてＤｎａＫを使用した。抗原−抗体複合体を可視化するために、二次抗ウサギ−ＩＲＤｙｅ６９０および抗マウス−ＩＲＤｙｅ８００抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システムソフトウェアを用いて、ＦｌｇＭ、σ28およびＤｎａＫバンドのデンシトメトリー測定を行った。培養試料において３つ組で全アッセイを行った。
【０１２８】
ｉｉｉ．運動性アッセイ
運動性アッセイは、軟寒天トリプトンプレート（１Ｌあたり：１０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトン、５ｇ  ＮａＣｌ、３ｇ  Ｂａｃｔｏアガー）を利用した。爪楊枝で細菌コロニーを拾い、軟寒天に突き刺し、続いて３７℃で約５時間温置した。必要に応じて、ＰaraBADまたはｆｌｈＤＣオペロン誘導のために、それぞれ、アラビノース（０．２％）またはアンヒドロ−テトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）の何れかを添加した。
【０１２９】
２．結果
ｉ．ＰaraBAD：：ＦｌｇＭから産生されるＦｌｇＭが分泌される。
ＦｌｇＭは、外部の消費された増殖培地に完成したＨＢＢを通じて分泌される。精製前に細胞を溶解させる必要がないタンパク質精製のために、ＦｌｇＭのＣ末端への外来タンパク質の融合を使用し得ることが示されている。分泌シグナルとしてＦｌｇＭを用いたタンパク質精製のために鞭毛Ｔ３Ｓ系を発展させるために、ＦｌｇＭ産生および分泌の既知の態様は、この系を用いてタンパク質産生を最大化することを特徴とした。ＦｌｇＭ遺伝子は、ｆｌｇＡ  ＭＮオペロンにおいてクラス２鞭毛プロモーターから転写される。この結果、最初のＨＢＢ組み立て中にＦｌｇＭ産生が起こる。クラス２産生ＦｌｇＭは、２つのｆｌｉＡＺ転写物のうち１つにおいてクラス２転写を介しても産生される、ｆｌｉＡ遺伝子の産物であるσ28タンパク質と結合する。ＨＢＢ完成時に、鞭毛Ｔ３Ｓ系の分泌基質特異性の変化の結果、ＦｌｇＭ分泌およびσ28依存性クラス３転写の開始が起こる。ＦｌｇＭおよびσ28は、それぞれσ28−依存性ＦｌｇＭＮおよびｆｌｉＡＺ転写物から産生され続ける。約８０％の定常状態ＦｌｇＭ転写は、そのクラス３プロモーター由来である。ＦｌｇＭは抗σ28因子であるので、クラス３プロモーターを介したその産生は、自己阻害下にある。この例において、アラビノース−誘導性染色体ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰaraBAD）から転写されるＦｌｇＭ遺伝子があるコンストラクトを使用することによって、ＦｌｇＭ遺伝子転写をＦｌｇＭ自己阻害から外した。染色体ａｒａＢＡＤオペロンの標的化欠失と、それに続くその場でのＦｌｇＭ+遺伝子の挿入によってこれを完遂した。この結果、ａｒａＢＡＤ構造遺伝子の欠失ゆえにアラビノース誘導因子が分解されない株においてＦｌｇＭ産生のアラビノース−依存性誘導が生じた。ＰaraBADから転写されたＦｌｇＭは、そのネイティブプロモーターから生成され、分泌されるＦｌｇＭより高いレベルで、アラビノースの存在下で生成され、分泌された（図４）。鞭毛構造を形成しないｆｌｉＦ欠失株は、ＰaraBAD−誘導性ＦｌｇＭを分泌することができなかった（図４）。これらの結果から、ＦｌｇＭ内在性ペプチド分泌シグナルが高レベルＦｌｇＭ分泌に十分であり、鞭毛−依存性Ｔ３Ｓ系をＦｌｇＭ分泌のために使用し得ることが示される。
【０１３０】
ｉｉ．ＦｌｈＤ４Ｃ２活性に影響を及ぼす突然変異は、ＦｌｇＭ分泌にも影響を及ぼす。
ｆｌｈＤＣオペロンは、鞭毛転写階層の最上部にある。ｆｌｈＤＣの制御は複雑であり、ｆｌｈＤＣプロモーター領域内に６個の既知の転写開始部位がある。カノニカルなＴＡＴＡＡＴ配列（ＰflhDC７７９３対立遺伝子）に対する、ｆｌｈＤＣプロモーター領域内のＰ１およびＰ４転写開始部位に対する−１０配列の変化の結果、細胞あたりのＨＢＢ構造数が２倍になり、鞭毛フックタンパク質の産生および分泌が向上した。他の突然変異の結果、フックタンパク質分泌が増加し、細胞あたりのＨＢＢ構造が増加し、その結果、ｆｌｈＤＣオペロン転写もしくは転写後調節の既知の阻害剤の発現低下または除去が生じた。ＰaraBADから転写されたＦｌｇＭの分泌におけるｆｌｈＤＣ制御因子の突然変異の影響を試験した。この例に含まれるｆｌｈＤＣ発現の既知の転写および転写後阻害剤は、ＥｃｎＲ、ＲｓｃＢ、ＬｒｈＡ、ＦｌｉＴ、ＤｓｋＡおよびＹｄｉＶであった。ＥｃｎＲは、ＦｌｈＤＣ介在性自己抑制に関与する。ＦｌｈＤ４Ｃ２複合体は、ｅｃｎＲの転写を支配し、同様に、その結果、ＲｃｓＢタンパク質に呼応してｆｌｈＤＣ転写の抑制が起こる。膜および細胞壁の損傷に反応して莢膜多糖合成および遺伝子数を制御するＲｃｓＢは、ｆｌｈＤＣ転写のリプレッサーである。ＬｒｈＡはまた、ｆｌｈＤＣプロモーター領域内で結合し、ｆｌｈＤＣオペロン転写を阻害することが示されているｆｌｈＤＣの制御因子でもある。ＦｌｉＴは、クラス２およびクラス３鞭毛プロモーターの両方から転写される。ＦｌｉＴは、ＦｌｈＤ４Ｃ２複合体に結合し、鞭毛クラス２転写の活性化を妨げる。また、ＦｌｉＴは、鞭毛フィラメントキャッピングタンパク質ＦｌｉＤに対する分泌シャペロンでもある。ＨＢＢ完成後のＦｌｉＤの分泌によって、ＨＢＢ完成とＦｌｈＤ４Ｃ２によるさらなるクラス２転写の阻害が連結される。ＤｓｋＡタンパク質は、ｆｌｈＤＣの転写を阻害するためにｐｐＧｐｐとともに作用する。また、ＤｓｋＡは、ＲｐｏＳ−介在機構を通じてｆｌｈＤＣ転写を阻害し得るｒｐｏＳ翻訳も刺激し得る。ＹｄｉＶは、栄養増殖条件での変化に反応した分解に対してＣｌｐＸＰプロテアーゼにＦｌｈＤ４Ｃ２を標的化する転写後制御因子である。対照として、ｆｌｈＤＣ  ｍＲＮＡ安定性の正の制御因子であるＣｓｒＡを使用した。ｆｌｈＤＣプロモーター調節領域をトランスポゾンＴｎ１０からのｔｅｔＲ−ＰtetAカセットで置換することによって、ＰflhDC８０８９対立遺伝子を構築した。この結果、テトラサイクリン類似体アンヒドロ−テトラサイクリンの添加により誘導され得る、ｔｅｔＡプロモーターの調節下でのｆｌｈＤＣオペロンの置換が生じた。フック産生および分泌を増加させる、ｆｌｈＤＣ  Ｐ１およびＰ４カノニカルプロモーターアップ（ｕｐ）変化も試験した（ＰflhDC７７９３対立遺伝子）。ＰaraBADから発現される分泌型ＦｌｇＭタンパク質のレベルにおけるｆｌｈＤＣ制御突然変異の影響を図５で示す。
【０１３１】
ｆｌｈＤＣ  ｍＲＮＡ安定性に必要とされる、ｆｌｈＤＣ構造オペロンの欠失またはｃｓｒＡ遺伝子の欠失では、分泌分画には検出可能なＦｌｇＭはなく、細胞質中でＦｌｇＭが蓄積された。ｆｌｈＤＣ発現の既知の転写および翻訳後阻害剤における突然変異欠失の結果、ＰflhDC７７９３プロモーターアップ（ｕｐ）対立遺伝子の存在で生じたように、分泌型ＦｌｇＭのレベルが上昇した。ＰflhDC７７９３、ＰflhDC８０８９９（ｔｅｔＲ−ＰtetA−ｆｌｈＤＣ）、ｆｌｉＴ、ｒｃｓＢおよびｅｃｎＲ突然変異体株のＦｌｇＭの分泌型レベルは、それぞれ野生型の場合よりも、４．５、４．５、３．８、４．７および４倍高かった。ＦｌｇＭの分泌型レベルは、ｙｄｉＶ、ｌｒｈＡおよびｄｓｋＡ突然変異体株において、野生型と比較して、それぞれ２倍、１．５倍および２．７倍低かった（図５Ｂ）。各試験株に対して、ＦｌｇＭの蓄積細胞レベルは、分泌型ＦｌｇＭレベルと反比例した。著しく、トランスポゾンＴｎ１０からのｔｅｔＡプロモーターおよび制御領域によるｆｌｈＤＣプロモーター領域の置換により、試験したｆｌｈＤＣ発現の負の制御因子に対する機能欠失型突然変異体で観察されるＦｌｇＭ分泌型レベルと合致するかまたはそれを超えるレベルでの分泌型ＦｌｇＭの産生が可能となった。ＰflhDC８０８９（ｔｅｔＲ−ＰtetA−ｆｌｈＤＣ）におけるｆｌｈＤＣの誘導によって、スイムプレート（ｓｗｉｍ  ｐｌａｔｅ）上での運動性も付与された（図５Ｃ）。
【０１３２】
ｆｌｈＤＣの負の制御因子を欠く株において、軟寒天プレート上での泳ぐ（ｓｗｉｍｍｉｎｇ）表現型から、野生型ＬＴ２と比較して運動性の向上が示された（図５Ｄ）。ＰaraBADからＦｌｇＭが過剰発現している同じ株における運動性の実質的レベルは注目すべきであった（図５Ｄ）。ＦｌｇＭは、１：１の化学量論でσ28を阻害する。ＰaraBADからのＦｌｇＭの誘導は、特に野生型ＬＴ２バックグラウンドにおいて全σ28−依存性鞭毛クラス３プロモーター転写を妨げ得る。この観察から、過剰発現された細胞ＦｌｇＭが凝集して不活性型になったという結論が導かれた。したがって、分泌型および細胞ＦｌｇＭレベルのウエスタンブロット分析において、細胞ペレットからの可溶性および不溶性分画の両方から、ＦｌｇＭの細胞成分を分析した。ＦｌｇＭが可溶性タンパク質であったものの、過剰発現条件下で産生された大半の細胞ＦｌｇＭは不溶性であり（図５Ａ）、このことから、過剰な細胞ＦｌｇＭが封入体に行ったことが示され、ＦｌｇＭ誘導条件下で観察される運動性から、ＦｌｇＭの不溶性型は活性がなかったことが示された。
【０１３３】
ｉｉｉ．ＦｌｇＭ分泌におけるＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓ−シャペロン、σ28の影響
ＨＢＢの完成は、ロッドフック型の分泌基質から後期またはフィラメント型分泌基質への鞭毛Ｔ３Ｓ基質−特異性の切り替えと一致する。後期分泌基質は、フック−フィラメント接合部タンパク質（ＦｌｇＫおよびＦｌｇＬ）、フィラメントキャップタンパク質（ＦｌｉＤ）、あるいは発現フィラメントタンパク質（ＦｌｉＣまたはＦｌｊＢ）および抗σ28因子ＦｌｇＭを含む。各後期分泌基質の効率的な分泌には、同系のＴ３Ｓシャペロンの助けが必要である。これらは、ＦｌｇＮ（ＦｌｇＫおよびＦｌｇＬの場合）、ＦｌｉＴ（ＦｌｉＤの場合）、ＦｌｉＳ（ＦｌｉＣおよびＦｌｊＢの場合）およびσ28（ＦｌｇＭの場合）を含む。Ｔ３Ｓシャペロンは３種類のクラスに分けられる：ｉ）分泌前にその系において基質に結合し、タンパク質分解から保護するもの、ｉｉ）基質分泌を促進するものおよびｉｉｉ）分泌を安定化し、かつ促進するもの。σ28タンパク質は、後者のカテゴリーに入り、これは、細胞質においてＦｌｇＭをタンパク質分解から保護し、おそらく鞭毛の基部へのＦｌｇＭの局在化を促すことによってＦｌｇＭの分泌を促進する。−１０および−３５プロモーター配列（Ｒ９１ＣおよびＬ２０７Ｐ）の認識を欠如させる２個のアミノ酸置換があるσ28の突然変異体は、ＦｌｇＭ分泌に対するそのＴ３Ｓシャペロン活性を保持する。このことから、σ28のＴ３Ｓシャペロン機能が、その転写活性とは個別の過程であったことが示された。
【０１３４】
σ28タンパク質は、全σ70型ハウスキーピングシグマ因子で保存される４領域のうち３つを含有し、領域２、３および４は、サブ領域２．１、２．２、２．３、２．４、３．１、３．２、４．１および４．２にさらに分割される。領域２．１、３．１、３．２および４．１は、コアＲＮＡポリメラーゼに対する結合に関与し、一方で領域２．４および４．２は、それぞれプロモーター配列の−１０および−３５領域の認識に必要である。ＦｌｇＭは、ＦｌｇＭ：σ28共結晶構造におけるσ28の全３領域と相互作用することが示された。さらに、σ28−依存性鞭毛転写のＦｌｇＭ阻害を欠いた単一アミノ酸置換突然変異は、領域２．１、３．１、４．１および４．２に位置した。ＨＢＢ形成を欠く株において、通常はｆｌｉＡ+バックグラウンドにおいてＦｌｇＭにより阻害されるクラス３鞭毛プロモーター転写が生じたので、これらをＦｌｇＭ−バイパス突然変異体と名付けた。σ28ＦｌｇＭバイパス突然変異体は、２つのクラスがあった。殆どがＦｌｇＭへの結合を有さなかったが、２個の対立遺伝子、Ｈ１４ＤおよびＨ１４Ｎそれぞれの結果、安定性が向上したσ28タンパク質が得られ、これは、ＦｌｇＭ阻害を克服するのに十分であった。
【０１３５】
ＰaraBADから発現されるＦｌｇＭの分泌に対するσ28領域２、３および４におけるＦｌｇＭバイパス突然変異体の影響を試験した（図６Ａ，図６Ｂ）。領域２．１突然変異体には、結果的にタンパク質安定性が向上する、Ｈ１４ＤおよびＨ１４Ｎおよび、結合ＦｌｇＭを欠くＶ３３Ｅ対立遺伝子が含まれた。試験した他のＦｌｇＭ−バイパス突然変異体には、領域３．１からのＴ１３８Ｉ対立遺伝子および領域４．１からのＬ１９９Ｒおよび領域４．２の開始点のＥ２０３Ｄが含まれた。
【０１３６】
ｆｌｉＡヌル対立遺伝子は、ｆｌｉＡ+株の５％であったレベルへのＦｌｇＭ分泌の強い減少を示した。Ｖ３３ＥおよびＬ１９９Ｒ対立遺伝子の結果、それぞれ、ＦｌｇＭ分泌レベルがｍ野生型の１２％および５９％となった。Ｈ１４ＤおよびＨ１４Ｎ対立遺伝子は、分泌型ＦｌｇＭレベルが、野生型で見られるレベルの２．１倍および１．５倍であった。ＦｌｇＭとの結合を欠くＴ１３８ＩおよびＥ２０３Ｄ対立遺伝子によって、分泌型ＦｌｇＭレベルがそれぞれ野生型の１．２倍および１．４倍、上昇した。ｆｌｉＡのプロモーター結合−欠損二重突然変異体（Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ）も試験し、野生型と比較して、分泌型ＦｌｇＭの３９％レベルが示された。また、プロモーター結合−欠損Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ置換は、Ｈ１４Ｄ安定性向上置換とも組み合わせ、単にＲ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ二重突然変異体またはＨ１４Ｄ単一突然変異体の何れかで観察されるものの間の分泌型ＦｌｇＭレベルが観察された。
【０１３７】
野生型ＦｌｉＡ、Ｈ１４Ｎ、Ｈ１４Ｄ、Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７ＰおよびＨ１４Ｄ  Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐの場合、細胞中のＦｌｉＡレベルは、ＦｌｇＭ分泌レベルと一致した（図６Ａ）。ＦｌｇＭ分泌型レベルは、細胞内のＦｌｉＡ濃度と関連があった。したがって、細胞内ＦｌｉＡ濃度を向上させる可能性がある他の突然変異体を導入して、それらがＦｌｇＭ分泌に影響を及ぼし得るか否かを調べた。これらの突然変異体には、Ｈ１４Ｎ安定化置換またはｆｌｉＡリボソーム結合配列（ＲＢＳ）のカノニカル配列（ＣＲＢＳ）への変化の何れかと組み合わせた、ＧＴＧからＡＴＧへのｆｌｉＡ開始コドン変化が含まれた。これらの変化の全ては、結果的に、ＦｌｉＡ細胞内レベルおよび分泌型ＦｌｇＭレベルが、野生型の２〜４倍向上した（図６Ａ，図６Ｂ）。ｆｌｉＡ  ＣＲＢＳ  ＡＴＧ二重突然変異体、バックグラウンドにおける染色体ＦｌｇＭ遺伝子の欠失の結果、細胞内ＦｌｉＡおよび分泌型ＦｌｇＭの両方が減少した。したがって、ｆｌｉＡ  ＣＲＢＳ  ＡＴＧ二重突然変異体バックグラウンドで産生される過剰なσ28は、ＦｌｇＭ分泌を改善する、σ28安定性に寄与するためのＰaraBAD−発現ＦｌｇＭに加えて、染色体ＦｌｇＭ発現を含み得る。これは、ＦｌｇＭが抗シグマ因子として作用するだけでなく、分解からＦｌｉＡを保護することを示す結果と一致する。
【０１３８】
ＦｌｇＭ誘導性条件下でのｆｌｉＡ突然変異体の運動性アッセイを図６Ｃで示す。ｆｌｉＡヌル対立遺伝子および、鞭毛クラス３プロモーターを転写することができず、したがってフラジェリンを産生することができない、Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ対立遺伝子を含有する突然変異体は、あらゆる条件下で非運動性である。Ｈ１４Ｎ、Ｈ１４Ｄ、ＡＴＧ置換突然変異体は、野生型と比較して、運動性プレート上の遊走群の大きさの増大を示した。Ｖ３３Ｅ、Ｔ１３８Ｉ、Ｌ１９９ＲおよびＥ２０３Ｄは、野生型よりも、ＦｌｇＭ存在下での鞭毛転写活性が、それぞれ８．０倍、３１倍、４５倍および７倍高く、ＦｌｇＭ誘導条件下でのスイムプレート（ｓｗｉｍ  ｐｌａｔｅ）上でのそれらの運動性表現型が、これらのレベルと相関することが報告されている。Ｈ１４Ｎ  ＡＴＧおよびＣＲＢＳ  ＡＴＧ二重突然変異体は、スイムプレート上での運動性低下を示したが、これらのσ28の細胞レベルは野生型株よりも高い。
【０１３９】
ｉｖ．ＦｌｇＭ分泌における鞭毛後期Ｔ３Ｓ分泌−基質競合物の影響
ＨＢＢ完成時のＦｌｇＭ分泌の最初の報告から、分泌型ＦｌｇＭレベルがＦｌｇＭに対する分泌競合物候補であるフィラメントタンパク質を欠く株でより高かったことを示す定性的データが与えられた。分泌型ＦｌｇＭレベルにおいて潜在的な後期分泌−基質競合物を除去する影響を試験して、それらの除去によって、分泌型ＦｌｇＭの収率が向上するか否かを調べた。組み立てられた鞭毛における後期基質サブユニット数は、フック−フィラメント接合部タンパク質ＦｌｇＫおよびＦｌｇＬに対してそれぞれ約１１であり、フィラメントキャッピングタンパク質ＦｌｉＤに対して５であり、ＦｌｉＣまたはＦｌｊＢに対しては、最長で２０，０００のフィラメント長に依存する。図７Ａ，図７Ｂに示す結果は、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＬまたはＦｌｉＤの除去の影響は、分泌型ＦｌｇＭレベルにおいて殆どない一方で、フィラメント基質除去の結果、分泌型ＦｌｇＭレベルが野生型よりも最大で１．９倍高くなったことを示す。この結果は、後期Ｔ３Ｓ基質レベルが鞭毛を通じたＦｌｇＭの分泌において重要な制限因子ではないことを示す。
【０１４０】
ＦｌｇＭ分泌における鞭毛相変化の影響も試験した（図７Ａ，図７Ｂ）。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）は、２個の鞭毛サブユニット遺伝子、ｆｌｉＣまたはｆｌｊＢのうち１個を交互に発現する。ｈｉｎ−５７１７対立遺伝子を有する株は、ＦｌｉＣ0NＦｌｊＢ0FF鞭毛発現方式に固定され、一方でｈｉｎ−５７１８対立遺伝子を有する株は、ＦｌｉＣ0FFＦｌｊＢ0Nである。ｆｌｊＢenx  ｖｈ２は、ＦｌｉＣ0N  ＦｌｊＢ0FFでもある、過去の残存物（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｅｌｉｃ）であり、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＬＴ２からのｈｉｎ−ｆｌｊＢＡ領域を、ＦｌｉＣON  ＦｌｊＢOFF方式に固定化されたサルモネラ・アボルツス−エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ）からの同じ領域で置換したことにより得られる。ｈｉｎ−５７１７対立遺伝子を有する株におけるＦｌｇＭ分泌レベルは、野生型株のレベルと同等であった。ｈｉｎ−５７１７バックグラウンドでのｆｌｉＣ遺伝子の欠失の結果、分泌型ＦｌｇＭが、野生型と比較して１．９倍増加した。ｈｉｎ−５７１８対立遺伝子単独の存在で、分泌型ＦｌｇＭレベルが１．９倍増加し、このバックグラウンドにおけるｆｌｉＣ遺伝子のさらなる除去によって、ＦｌｉＣフラジェリンがｈｉｎ−５７１８バックグラウンドで産生されないにもかかわらず、分泌型ＦｌｇＭレベルが、さらに野生型の場合の２．７倍上昇した。しかし、ｈｉｎ−５７１８バックグラウンドにおいて、ｆｌｉＣ  ｍＲＮＡが生成されるが、翻訳されず、このことから、ｆｌｉＣ  ｍＲＮＡがＦｌｇＭタンパク質分泌において負の影響を有することが示される。ｆｌｊＢenx  ｖｈ２バックグラウンドにおけるＦｌｇＭの分泌型レベルは、野生型株の場合よりも２．９倍高く、このバックグラウンドにおけるｆｌｉＣ遺伝子のさらなる除去によって、分泌型ＦｌｇＭレベルが野生型の４．３倍に上昇した。
【０１４１】
ｖ．ＦｌｇＭ分泌における鞭毛後期Ｔ３Ｓシャペロンの影響
ＰaraBADから発現されるＦｌｇＭの分泌型レベルにおける、後期分泌シャペロン、ＦｌｇＮ、ＦｌｉＳおよびＦｌｉＴの除去の影響も試験し、これらが搬出のためのＦｌｇＭの鞭毛分泌系への送達に対してσ28と競合するか否かを調べた。また、Ｔ３Ｓシャペロンは、それらの同系分泌基質の非存在下での制御機能と関連付けられる。ＦｌｇＫおよびＦｌｇＬに対するＴ３ＳシャペロンであるＦｌｇＮは、ＦｌｇＭ  ｍＲＮＡ翻訳を阻害する。σ28は、鞭毛クラス３プロモーターに対する転写因子であり、ＦｌｉＴは抗ＦｌｈＤ４Ｃ２因子として作用する。ＦｌｉＳのみが、その同系分泌基質ＦｌｉＣおよびＦｌｊＢ非存在下で制御機能を有することを報告されていない。
【０１４２】
ＦｌｇＮの除去は、ＦｌｇＭ分泌にさほど影響しなかった（図８Ａ，図８Ｂ）。ＦｌｇＫおよびＦｌｇＬは、分泌型ＦｌｇＭレベルにおいて何れも顕著な影響がなかった（図７Ａ，図７Ｂ参照）。図４においても報告されたＦｌｉＴの除去の結果、分泌型ＦｌｇＭレベルが４倍上昇した。そのシャペロン活性からその抗ＦｌｈＤ４Ｃ２活性を分離するｆｌｉＴの対立遺伝子は使用しなかった。したがって、分泌型ＦｌｇＭレベルの上昇は、ＦｌｉＴ非存在下でのＦｌｈＤ４Ｃ２活性促進によるものである。ＦｌｉＳ非存在下での分泌型ＦｌｇＭレベルの３倍上昇が観察された。しかし、ｆｌｉＴ遺伝子のオペロン上流においてｆｌｉＳが転写される。したがって、ｆｌｉＴ上のｆｌｉＳ対立遺伝子の何らかの極性効果の結果、ｆｌｉＴ遺伝子発現低下ゆえにＦｌｇＭ分泌型レベルが上昇する。
【０１４３】
ｖｉ．サルモネラ病原性アイランド１（Ｓｐｉ１）の欠失の結果、分泌型ＦｌｇＭのレベルが上昇する。
ｆｌｈＤＣオペロンは、鞭毛レギュロンおよびＳｐｉ１の遺伝子の両方のマスターオペロンである。Ｓｐｉ１レギュロンは、Ｓｐｉ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）Ｔ３Ｓ系の構造および組み立てに必要とされる遺伝子をコードする。ｆｌｉＺ遺伝子はｆｌｉＡＺオペロンにおいて転写され、ＦｌｉＺは、その産物がＳｐｉ１転写を同様に活性化するｈｉｌＤの転写を活性化する。ＨｉｌＤ活性化遺伝子の一産物であるＲｔｓＢは、鞭毛−Ｓｐｉ１レギュロン全体に対するフィードバックループを提供するｆｌｈＤＣ転写を抑制するように作用する。過剰発現ＦｌｇＭ（ＰaraBADから）の分泌型レベルにおけるＳｐｉ１およびＳｐｉ２サルモネラ病原性系の両方の欠失の影響を試験した。Ｓｐｉ１の欠失の結果、Ｓｐｉ１誘導条件下で細胞を増殖させなかったにもかかわらず、ＦｌｇＭ分泌型レベルが野生型の場合の５５％に低下し、一方、Ｓｐｉ２の欠失は、ＦｌｇＭの分泌型レベルに顕著な影響がなかった（図９Ａ，図９Ｂ）。
【０１４４】
ｖｉｉ．ＦｌｇＭ分泌型レベルにおけるプロテアーゼ除去の影響
細胞質からタンパク質収率を向上させるために使用される共通技術は、細胞性プロテアーゼを除去することによる。さらに、ＯｍｐＴなど、外膜に存在するプロテアーゼは、細胞溶解後の分解によって、タンパク質収率を低下させ得る。ＣｌｐＡおよびＣｌｐＸタンパク質は、分解のためＣｌｐＰセリンプロテアーゼへの送達のための様々な基質と相互作用する。ＤｅｇＰは、広い基質特異性を示す周辺質プロテアーゼである。ＤｅｇＰは、非折り畳み、誤局在化、ハイブリッドおよび、周辺質における過剰発現から不適切に折り畳まれている組み換えタンパク質を排他的に対象とする。
【０１４５】
ＦｌｇＭ分泌型レベルにおけるプロテアーゼ除去の結果を図１０で示す。ＯｍｐＴの除去の結果、分泌型ＦｌｇＭの収率が僅かに上昇するが、ＤｅｇＰの欠失はさほど影響がなかった。ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸおよびＣｌｐＰの除去によって、野生型と比較して、ＦｌｇＭ分泌収率がそれぞれ１．７倍、５．４倍および６．１倍上昇した（図１０Ａ，図１０Ｂ）。これは、ＦｌｈＤ４Ｃ２が、ＣｌｐＸＰプロテアーゼ系によるＹｄｉＶを標的とした分解のための基質であるという観察と一致する。細胞溶解に対する対照として、プロテアーゼ突然変異体バックグラウンドにおけるｆｌｈＤＣの欠失は、分泌型分画において検出可能なＦｌｇＭを示さなかった。このバックグラウンドにおいて、ＦｌｇＭの細胞レベルは、依然としてＤｅｇＰ突然変異の欠失により影響を受けず、一方でｆｌｈＤＣバックグラウンドにおけるｃｌｐＡ、ｃｌｐＸおよびｃｌｐＰ突然変異のヌル対立遺伝子によって、細胞内ＦｌｇＭ蓄積が、それぞれ１．３倍、１．５倍および２．１倍、増加した（図１０Ｂ）。この結果から、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸおよびＣｌｐＰが、ＦｌｈＤＣと独立してＦｌｇＭ分解に関与し、ｃｌｐＡヌル株におけるＦｌｇＭ分泌増加が、細胞レベルＦｌｇＭのみの上昇によるものであったことが示される。ｆｌｈＤ+ｆｌｈＣ+存在下でのＣｌｐＸＰプロテアーゼの影響は、ＦｌｇＭ安定性およびＦｌｈＤ４Ｃ２安定性の両方によるものであった。これは、ｃｌｐＰおよびｃｌｐＸ突然変異体株で観察される運動性向上と一致する（図１０Ｃ）。
【０１４６】
ｖｉｉｉ．分泌型ＦｌｇＭレベルにおけるイオン強度の影響
高浸透圧によって、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）においてＳｐｉ１  ｉｎｖＡ遺伝子転写が上昇し、Ｓｐｉ１依存性ＩＩＩ型分泌は、高塩分条件下で増殖させた細菌でのみ生じた。ＰaraBAD−ＦｌｇＭ+により産生されるＦｌｇＭの分泌型レベルにおける高ＮａＣｌまたはＫＣｌの何れかの影響を試験した。ＮａＣｌ濃度を２００ｍＭに上昇させ、次いで４００および６００ｍＭの濃度で低下させた場合、ＦｌｇＭ分泌型レベルが上昇した。２００ｍＭ  ＮａＣｌで、ＦｌｇＭ分泌型レベルは、標準的なＬＢ培地中のＮａＣｌ濃度（８６ｍＭ）と近い１００ｍＭ  ＮａＣｌのレベルよりも３．７倍高い（図１１Ａ，図１１Ｂ）。したがって、ＬＢ培地中のＮａＣｌ濃度は、ＦｌｇＭ分泌にとって最適ではない。ＫＣｌは、分泌型ＦｌｇＭレベルにおいて同様の影響を有し、２００および４００ｍＭ  ＫＣｌによって、分泌型ＦｌｇＭの最大レベルが、１００ｍＭ  ＮａＣｌの分泌型ＦｌｇＭレベルと比較して３．２倍および３．６倍となった。これは、細胞質中でのＦｌｇＭの溶解度における影響によるものである。軟寒天での運動性はσ28−依存性鞭毛クラス３転写の阻害ゆえにＦｌｇＭ誘導条件下で抑制されたにもかかわらず、イオン強度の上昇は、軟寒天での運動性においても正の効果を有した（図１１Ｃ）。
【０１４７】
ｉｘ．ＦｌｇＭ分泌における複数の条件の影響
ＰaraBAD：：ＦｌｇＭ+によるＦｌｇＭ過剰発現状態下でのこの収率を最大化した株および条件を得るために、分泌型ＦｌｇＭの収率を向上させた上述の個々の結果を組み合わせた（図１２Ａ，図１２Ｂ）。これらの株の一部（例えばｆｌｊＢenx  ｖｈ２およびｃｌｐＸを含有する株、ｆｌｈＤ８０８９を含有する株など）は、最大ＦｌｇＭ分泌レベルを与える。これらの全てが、野生型の約５倍の分泌型ＦｌｇＭレベルを生じさせる。これらの株において、細胞内に蓄積したＦｌｇＭは微量であり、このことから、細胞ＦｌｇＭの発現および安定性が限定的であったことが示される。
【０１４８】
ｘ．δ−ＳＶＩＥを分泌させるための、ＴＴＳシグナルとしてのＦｌｇＭの使用
δ−ＳＶＩＥタンパク質は、有毒ウミイモガイにより産生される小型ペプチドであり、脊椎動物神経筋系においてナトリウムチャネルを阻害する。この３１アミノ酸ペプチド（ＤＧＣＳＳＧＧＴＦＣＧＩＨＰＧＬＣＣＳＥＦＣＦＬＷＣＩＴＦＩＤ）は疎水性であり、３対の分子内ジスルフィド結合を形成する６個のシステイン残基を含有する。本ペプチドの疎水性の性質とδ−ＳＶＩＥの活性立体構造を生成させるための複数のジスルフィド結合形成に対する要件とが、このペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で過剰発現される場合、適正な折り畳みを妨げる障害でとなる。したがって、ＦｌｇＭ介在分泌を介した活性型δ−ＳＶＩＥの産生について試験した。細胞からの分泌はＦｌｇＭのＮ末端から開始するので、ＦｌｇＭ−δ−ＳＶｌＥ融合物のδ−ＳＶＩＥ配列は、Ｎ末端からＣ末端に、それがリボソームを出るように細胞から出る。これは、活性立体構造への、δ−ＳＶＩＥの適正な折り畳みおよびジスルフィド形成を促進し得る。２つのタンパク質間で操作されたＴＥＶまたはＥＴＫプロテアーゼ切断部位の何れかを有するヘキサ−Ｈｉｓ−タグ付加（６Ｈｉｓ）ＦｌｇＭへのδ−ＳＶＩＥのＣ末端融合物を染色体ＰaraBAD発現遺伝子座から発現させた。６Ｈｉｓによって、Ｎｉ−アガロースアフィニティーカラムを用いた精製が容易になり、ＴＥＶおよびＥＴＫ切断部位はそれぞれＴＥＶプロテアーゼおよびエンテロキナーゼにより認識され、これによって、分泌型δ−ＳＶＩＥがそのＦｌｇＭ分泌シグナルから分離されるようになる。
【０１４９】
選択された単一突然変異体全てが、ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥ分泌を増加させた（図１３Ａ，図１３Ｂ参照）。ＰaraBAD発現融合タンパク質レベルの分泌型レベルは、分泌型ＦｌｇＭレベルを上昇させた突然変異体バックグラウンドにおいて促進された。ｆｌｈＤ７７９３（ＴＨ１８８８０）、ｆｌｈＤ８０８９（ＴＨ１８６４７）、ｆｌｉＴ（ＴＨ１８７６９）、ｒｃｓＢ（ＴＨ１８８３０）、ｃｌｐＸ（ＴＨ１８３５３）およびｆｌｉＡ（ＣＲＢＳ  ＡＴＧ）（ＴＨ２００５６）株におけるＦｌｇＭ−６Ｈ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥの分泌型レベルは、野生型（ＴＨ１７８３１）と比較して、それぞれ１６．８倍、１０．９倍、９．４倍、６．３倍、１６．７倍および１６．６倍であった。ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥ分泌レベルを試験するために、異なる突然変異を一緒に組み合わせた。複数の突然変異体バックグラウンドにおいて、株ｆｌｈＤ７７９３  ｒｃｓＢ（ＴＨ１９６７５）、ｆｌｈＤ７７９３  ｒｃｓＢ  ＦｌｇＭ（ＴＨ２００４４）、ｒｃｓＢ  ｆｌｉＴ（ＴＨ１９６７３）、ｆｌｊＢenx  ｖｈ２  ｆｌｉＢ−Ｔ（ＴＨ２００７５）、ｆｌｊＢenx  ｖｈ２  ｆｌｉＣ（ＴＨ２００５０）、ｆｌｊＢenx  ｖｈ２  ｃｌｐＸ（ＴＨ２００７７）およびｆｌｈＤ８０８９  ｆｌｊＢenx  ｖｈ２  ｃｌｐＸ（ＴＨ２００４４）は、それぞれ野生型の場合の３４倍、１７倍、４９倍、１６．７倍、１１．７倍、２８．２倍および５２．７倍であった。６Ｈｉｓ−ＥＴＫをＦｌｇＭとＳＶＩＥとの間に挿入した場合、ｆｌｈＤ７７９３（ＴＨ１９１１８）、ｆｌｈＤ７７９３  ＦｌｇＭ（ＴＨ１９１２２）、ｆｌｈＤ７７９３  ＦｌｇＭ  ｃｌｐＸ（ＴＨ１９１４５）およびｆｌｈＤ７７９３  ｌｒｈＡ  ｆｌｉＢ−Ｔ  ｙｄｉＶ  ｈｉｎ−ｆｌｊＡ  ＦｌｇＭＮ  ｆｌｇＫＬ（ＴＨ１９１２０）株は、ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥ分泌レベルを野生型の場合の最大で１９倍、８．５倍、１７倍および１１０倍上昇させた。ｆｌｈＤ７７９３  ｌｒｈＡ  ｆｌｉＢ−Ｔ  ｙｄｉＶ  ｈｉｎ−ｆｌｊＡ  ＦｌｇＭＮ  ｆｌｇＫＬ株（ＴＨ１９１２０）を除き、１００ｍＭ  ＮａＣｌの添加の結果、株ＴＨ１９１１８（ｆｌｈＤ７７９３）、ＴＨ１９１２２（ｆｌｈＤ７７９３ＦｌｇＭ）およびＴＨ１９１４５（ｆｌｈＤ７７９３  ＦｌｇＭ  ｃｌｐＸ）による融合タンパク質の分泌レベルが上昇し、野生型の３．３倍、１．５倍、２．２倍および２．４倍となった。
【０１５０】
３．考察
鞭毛およびインジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）のＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系は、Ｔ３Ｓシグナルに融合される組み換えタンパク質の産生および精製に対する経路を提供する。Ｎ末端が異常なペプチドシグナルおよび分泌燃料としてのプロトン駆動力への連結があり得る。全てではないが多くのＴ３Ｓ基質は、細胞質におけるそれらの安定性のために、および／またはＴ３Ｓ基質を細胞質膜における分泌装置に標的化するための分泌パイロットとして、同系Ｔ３Ｓシャペロンを利用し得る。Ｔ３Ｓ系の別の特性は、初期から後期分泌基質特異性への分泌−特異性切り替えを受ける能力である。鞭毛系において、これは、４０ｎｍを超える長さである細胞外フック成長の完成時に起こり、その結果、フィラメント型基質分泌および組み立てへの移行が起こる。ＦｌｇＭタンパク質は、フック完成からフィラメント組み立てへの移行の不可欠な部分である。ＦｌｇＭは、後期フィラメント型鞭毛分泌基質および抗σ28因子である。ＦｌｇＭは、小型の９７アミノ酸タンパク質である。ＦｌｇＭのＮ末端半分はＴ３Ｓシグナルを含み、一方でＣ末端半分は抗σ28相互作用ドメインを含む。ＦｌｇＭのＣ末端への組み換えタンパク質の融合によって、精製前に細胞を溶解させる必要なく、それらの分泌および精製が可能となることが示された。ＦｌｇＭ産生および分泌を促進する条件を調べた。次に、組み換えタンパク質ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥを作製し、鞭毛Ｔ３Ｓ系を介して細胞から−δ−ＳＶＩＥタンパク質の分泌を支配するためのベクターとしてＦｌｇＭを用いて細胞溶解なくこれらのタンパク質を作製し、精製するために、これらの条件を適用した。
【０１５１】
ａｒａＢＡＤコード領域をＦｌｇＭまたはＦｌｇＭ−δ−ＳＶＩＥ融合コード領域で置換することによって、染色体ＰaraBADプロモーターからＦｌｇＭおよびＦｌｇＭ−δ−ＳＶＩＥ融合コンストラクトを過剰発現させた。ａｒａＢＡＤを除去することによって、アラビノース誘導因子が炭素供給源として消費されることが保証された。この誘導系によって、細胞が分泌し得るもの超える量でＦｌｇＭを生成させるのに十分であることが証明された（図５）。次に、分泌型ＦｌｇＭの産生を増加させるために、ＦｌｇＭ安定性および分泌を向上させる突然変異を導入することによって、細胞を操作した。
【０１５２】
分泌型ＦｌｇＭレベルにおいて細胞あたりの鞭毛Ｔ３Ｓ系の数を増加させる突然変異の影響を調べた。これらは、ｆｌｈＤＣ転写（ｅｃｎＲ、ｒｃｓＢ、ｌｒｈＡ、ｄｓｋＡ）およびｆｌｈＤＣプロモーターアップ（ｕｐ）対立遺伝子ＰflhDC７７９３およびＰflhDC８０８９の負の制御因子においてヌル突然変異であった。転写後レベルでＦｌｈＤ４Ｃ２機能を阻害するｆｌｉＴおよびｙｄｉＶのヌル対立遺伝子も試験した。このような突然変異は、以前、周辺質への鞭毛フックタンパク質の産生および分泌を向上させることが示された。全突然変異体バックグラウンドを試験した結果、分泌型ＦｌｇＭのレベルが上昇した。ＰflhDC８０８９対立遺伝子は、誘導性ｔｅｔＡプロモーター領域でのｆｌｈＤＣプロモーター領域の置換物であり、これは、ｆｌｈＤＣ転写の全ての既知の負の制御因子の作用部位を除去する。ＰflhDC８０８９対立遺伝子はまた、ｆｌｈＤＣ転写をテトラサイクリンおよびその類似体による誘導下に置く。誘導因子なしでは細胞はスイミングプレート上で運動性がなく、このことから、ｆｌｈＤＣが転写されなかったことが示された。ＦｌｇＭは、ＣｓｒＡがｆｌｈＤＣ  ｍＲＮＡを安定化させ得るので、ｃｓｒＡヌル突然変異体株において分泌されなかった。
【０１５３】
ｆｌｉＡ遺伝子によりコードされるＦｌｇＭ  Ｔ３Ｓシャペロンσ28の様々な対立遺伝子の影響を探索した。これらは、ＦｌｇＭの存在下でクラス３転写を可能にするｆｌｉＡのＦｌｇＭバイパス対立遺伝子、プロモーター結合−欠損二重突然変異体Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ、ＡＴＧ開始コドン突然変異体（ＧＴＧより）およびカノニカルリボソーム結合配列突然変異体（標識ＣＲＢＳ）であった。ＦｌｇＭバイパス対立遺伝子、Ｈ１４Ｄ、Ｈ１４Ｎ、Ｖ３３Ｅ、Ｔ１３８Ｉ、Ｌ１９９ＲおよびＥ２０３Ｄは全て、ＲＮＡＰに対して同様の親和性を有し、コアＲＮＡＰに対する測定Ｋdは、それぞれ２．０ｎＭ、１．９ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、１．２ｎＭおよび１．４ｎＭであり、一方で野生型σ28の場合は０．９であった。Ｈ１４ＤおよびＨ１４ＮのＦｌｇＭに対する相対的親和性は野生型と同じであり、一方でＶ３３Ｅ、Ｔ１３８Ｉ、Ｌ１９９ＲおよびＥ２０３Ｄ対立遺伝子は、それぞれ親和性が１０倍、２０倍、６００倍および１０倍低下する。Ｖ３３Ｅ対立遺伝子は分泌型ＦｌｇＭの最低レベルを示し、一方でＬ１９９Ｒは、野生型としてのＦｌｇＭの分泌型レベルの約半分であった。しかし、Ｖ３３Ｅ  σ28対立遺伝子の低細胞レベルは、それが、観察された分泌型ＦｌｇＭレベル低下に関与する限定的σ28であることを示す。ＦｌｇＭに対するＴＩ３８ＩおよびＶ２０３Ｅの親和性低下は、ＦｌｇＭ過剰発現条件（ＰaraBADより）下で限定因子ではない。Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐプロモーター結合−欠損二重突然変異の結果、σ28細胞レベルが低下し、これは分泌型ＦｌｇＭのレベル低下と対応した一方で、Ｈ１４ＤおよびＨ１４Ｎ対立遺伝子は逆の影響を有した。Ｈ１４ＤおよびＨ１４Ｎ対立遺伝子によって、細胞σ28レベルが上昇し、分泌型ＦｌｇＭのレベル上昇と対応した。Ｒ９１Ｃ  Ｌ２０７Ｐ二重突然変異体へのＨ１４ＤまたはＨ１４Ｎの付加の結果、σ28レベルおよびＦｌｇＭの分泌型レベルが上昇した。さらなるＨ１４Ｎ置換もしくはカノニカルリボソーム結合配列突然変異体（ＡＴＧ  ＣＲＢＳ）があるかまたはないＡＴＧは、全て、細胞σ28および分泌型ＦｌｇＭレベル上昇を引き起こした。これらの結果から、σ28の細胞レベル上昇の結果、ＦｌｇＭ過剰発現条件下でＦｌｇＭ分泌が対応して増加することが示される。
【０１５４】
ＦｌｇＭ分泌の後期分泌競合物またはそれらの同系シャペロンの除去は、混交した結果となった。４種類の分泌競合物、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＬ、ＦｌｉＤおよびＦｌｉＣ／ＦｌｊＢのうち、ＦｌｇＭ分泌の顕著な影響を有したのは、フィラメント後期分泌基質ＦｌｉＣ／ＦｌｊＢの除去のみであった。鞭毛中のフィラメントサブユニットの量は、他の３種類の構成成分の約１０００倍である。ＦｌｉＤ分泌シャペロンＦｌｉＴの除去もまた、ＦｌｉＤ安定性向上におけるその役割とは独立して、ＦｌｇＭ分泌を増加させた。ＦｌｉＴは、ＦｌｈＤ４Ｃ２プロモーター活性の制御因子であり、その除去の結果、細胞あたりのＨＢＢ分泌経路が増加した。フィラメントＴ３Ｓシャペロンタンパク質、ＦｌｉＳの除去の結果、分泌型ＦｌｇＭレベルが３倍上昇し、一方でＦｌｇＫおよびＦｌｇＬ  Ｔ３Ｓシャペロンの除去は影響がなかった。ｆｌｉＳおよびｆｌｉＴは同じオペロン（ｆｌｉＳはｆｌｉＴの上流）において同時転写されるので、ｆｌｉＳのあらゆる欠失突然変異がｆｌｉＴ遺伝子発現に影響を及ぼし得る。鞭毛相変化突然変異体対立遺伝子、ｆｌｊＢenx  ｖｈ２は、ｈｉｎ−５７１７対立遺伝子と比較して分泌型ＦｌｇＭレベルの顕著な上昇を示した。分泌型ＦｌｇＭレベル上昇は、細胞をＳｐｉ１非誘導条件下で増殖させた場合でも、Ｓｐｉ１でも観察された。
【０１５５】
また、細胞性プロテアーゼの除去によって、ＦｌｇＭ分泌において混交した結果が生じた。ＣｌｐＸＰプロテアーゼは、ＹｄｉＶタンパク質により支配されるＦｌｈＤ４Ｃ２複合体の分解によって細胞あたりの鞭毛数を制御する。ＹｄｉＶは、乏栄養増殖状態中に産生される。ＹｄｉＶは、ＦｌｈＤ４Ｃ２のＦｌｈＤ成分と結合し、これによりＦｌｈＤ４Ｃ２とＤＮＡとの間のさらなる相互作用が妨げられる。次に、ＹｄｉＶは、ＦｌｈＤ４Ｃ２を、分解のためにＣｌｐＸＰプロテアーゼに標的化する。ＣｌｐＸまたはＣｌｐＰの何れかの除去の結果、ＦｌｇＭ分泌型レベルが上昇した。ＤｅｇＰまたはＯｍｐＴプロテアーゼの除去もＦｌｇＭ分泌に対する影響について試験し、影響は観察されなかった。
【０１５６】
過剰発現ＦｌｇＭの分泌型レベルについて試験した最後の可変要素は、イオン強度であった。高浸透圧によってＩＩＩ型分泌を誘導した。ＦｌｇＭ分泌におけるＮａＣｌおよびＫＣｌ濃度の影響を試験し、２００ｍＭまでのＮａＣｌまたは２００〜４００ｍＭのＫＣｌの添加の結果、ＬＢ中のＮａＣｌ濃度に近い（０．５％または８６ｍＭ）１００ｍＭ  ＮａＣｌと比較して、分泌型ＦｌｇＭレベルが約４倍上昇したことが観察された。ＮａＣｌの影響は、プロトン駆動力の可能性が向上することによるものであった。しかし、ＫＣｌの添加によって同じ影響が観察され、これは、ＦｌｇＭ分泌型レベルを調節するものが単なるイオン強度であることを示す。イオン強度によって、ＦｌｈＤ４Ｃ２の安定性が向上し得る。
【０１５７】
ＦｌｇＭの分泌型レベルにおける異なる突然変異の影響を調べた後、細胞から分泌されるＦｌｇＭ量を最大化するいくつかの株の構築とこの観察を組み合わせた。ｆｌｉＢ−Ｔ、ｃｌｐＸまたはｆｌｈＤ８０８９を含有する株は全て、ＦｌｇＭ分泌を野生型株の場合の約５倍増加させ、組み合わせによってＦｌｇＭ分泌はさらに大きく増加しなかった。これは、ＦｌｇＭのほぼ全てが分泌され、細胞中に蓄積したＦｌｇＭがごく微量であったからである。つまり、異なる突然変異を一緒に組み合わせた場合、ＦｌｇＭの発現レベルがＦｌｇＭ分泌レベルの制限因子となった。
【０１５８】
最後に、ペプチドが分泌され得るか否かおよび突然変異およびイオン濃度がどのようにその分泌に影響を及ぼすかを試験するために、ジスルフィドリッチ小型ペプチドδ−ＳＶＩＥコントキシン（ｃｏｎｔｏｘｉｎ）をＦｌｇＭに融合させた。ＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥおよびＦｌｇＭ−６Ｈｉｓ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥの両方が培地に分泌され得、ＦｌｇＭ分泌を刺激した突然変異もこれらの融合タンパク質分泌を増加させた。ｒｃｓＢ  ｆｌｉＴ株およびｆｌｈＤ８０８９  ｆｌｊＢenx  ｖｈ２  ｃｌｐＸ株などのいくつかの組み合わせ突然変異体は、ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＴＥＶ−δ−ＳＶＩＥ分泌を野生型に対して約５０倍増加させた。別の組み合わせ株ｆｌｈＤ７７９３  ｌｒｈＡ  ｅｃｎＲ  ｆｌｉＢ−Ｔ  ｙｄｉＶ  ｈｉｎ−ｆｌｊＡ  ｆｌｇＫＬ  ＦｌｇＭＮは、野生型株と比較して１００倍超、ＦｌｇＭ−６Ｈ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥの分泌を増加させた。ＬＢ培地への１００ｍＭ  ＮａＣｌの添加によって、ｆｌｈＤ７７９３株、ｆｌｈＤ７７９３ＦｌｇＭ株およびｆｌｈＤ７７９３ＦｌｇＭ  ｃｌｐＸ株においてＦｌｇＭ−６Ｈ−ＥＴＫ−δ−ＳＶＩＥの分泌を増加させ得る。これらの結果から、大腸菌過剰発現系を介して行うことが困難であるかまたは不可能であるタンパク質を発現させ、精製するために、ＦｌｇＭがＴ３Ｓシグナルとして使用され得ることが示された。
【０１５９】
Ｃ．実施例３：増殖培地への直接分泌を介した大規模なＩＩＩ型−依存性タンパク質産生
多数のジスルフィド結合を有するコノペプチドおよび、その不安定性のために細胞質中で検出不可能なジフテリア毒素のＡサブユニットなど、以前生成困難であったタンパク質の分泌を促進するための分泌シグナルとしてのＦｌｇＭの使用から、タンパク質産生および、さもなくば産生されないタンパク質の精製に対するこの系の有用性が明らかとなる。
【０１６０】
染色体標的化のためにλＲＥＤ技術を用いて、この系は細菌遺伝子株構築を根本から変化させ得る。所望の遺伝的バックグラウンドにおいて、ｔｅｔＲＡエレメントによってａｒａＢＡＤオペロンを置換し得る。ｔｅｔＲＡエレメントは、テトラサイクリンに対する耐性を付与する、テトラサイクリン排出ポンプをコードするトランスポゾンＴｎ１０からのｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子（ＴｅｔＡ）およびＴｅｔＲリプレッサーであってよい。これは、４８−マーオリゴヌクレオチドを用いたｔｅｔＲＡエレメントのＰＣＲ増幅により完成され得る。ある１つのオロゴ（ｏｌｏｇｏ）は、ａｒａＢ遺伝子の始めの５’側と相同である４０塩基と、それに続く、ｔｅｔＲＡの５’−ｔｅｔＲ末端から増幅され得る１８塩基を有する。第二のものは、ａｒａＤ遺伝子の末端の３’側に対して相同性である４０塩基とそれに続く、ｔｅｔＲＡの３’−ｔｅｔＡ末端から増幅し得る１８塩基を有する。ｔｅｔＲＡ含有ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、標的に対して相同性の４０塩基が隣接するｔｅｔＲＡエレメントが生成される。λ組み換え遺伝子（ＲＥＤ）を発現する株への増幅断片の導入の結果、隣接する相同性の４０塩基での組み換えが起こり、その結果、ｔｅｔＲＡにより置換されるａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失が起こる（ΔａｒａＢＡＤ：：ｔｅｔＲＡ、Δは欠失に対する遺伝子用語であり、：：は、挿入に対する遺伝子用語である。）。ｔｅｔＲＡエレメントの利点は、それが、選択され得ることである。染色体におけるｔｅｔＲＡエレメントの存在によって、テトラサイクリン耐性が付与されるが、フザリン酸の感受性も付与される。したがって、λＲＥＤ存在下でａｒａＢに対して５’およびａｒａＤに対して３’の相同性の同じ４０塩基を用いてＦｌｇＭコード配列がＰＣＲ増幅され、フザリン酸培地に置かれる場合、これは、ΔａｒａＢＡＤ：：ｔｅｔＲＡのｔｅｔＲＡをＦｌｇＭ+配列で置換する組み換えに対して選択し、この組み換えの結果ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ+が生じ、ここでＦｌｇＭ+遺伝子がアラビノース−誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターから転写される。次に、同じ方法によって、ｔｅｔＲＡをａｒａＢＡＤにおいてＦｌｇＭ+の下流に置き、その結果、ΔａｒａＢＡＤ：：ＦｌｇＭ+−ｔｅｔＲＡが得られ、その後そのｔｅｔＲＡをタンパク質Ｘで置き換えると、その結果、増殖培地へのアラビノース添加によりＦｌｇＭ−Ｘ融合物が発現され得るようになる。この系を用いて、対象タンパク質の最終精製を容易にするためにプロテアーゼ切断配列に介入することによって、アラビノース誘導下のあらゆるタンパク質のＦｌｇＭへのあらゆる融合物を構築し得る。
【０１６１】
１．株および条件最適化
最適分泌株を同定し得る。ｆｌｈＤＣプロモーターのプロモーターアップ（ｕｐ）対立遺伝子であるｆｌｈＤ７７９３およびｆｌｈＤＣプロモーターの、アンヒドロテトラサイクリン（ＡｎＴｃ）誘導性ｔｅｔＡプロモーターでの置換の結果生じる対立遺伝子であるｆｌｈＤ８０８９によって、それぞれ、ＦｌｇＭ分泌が実質的に増加し、これは、ｆｌｈＤＣ転写の阻害剤：ＦｌｉＴ、ＬｒｈＡ、ＤｓｋＡ、ＲｃｓＢまたはＥｃｎＲの除去により観察されるものよりも大きい（図５Ａ）。ＡｎＴｃ−誘導性ｆｌｈＤＣオペロン（ｆｌｈＤ８０８９対立遺伝子）は注目すべきものであるが、それは、これが、全ての既知の阻害剤タンパク質の結合部位に対して欠失しており、発現に対してＡｎＴｃにのみ依存するからである。ｆｌｈＤ８０８９対立遺伝子は、ＦｌｇＭの分泌シャペロンのｆｌｉＡ（σ28）Ｈ１４Ｎ対立遺伝子と組み合わせられ得るが、これは、ＦｌｇＭ分泌において最大の正の影響に対して示した（図６Ａ）。ｃｌｐＸプロテアーゼ突然変異体対立遺伝子とのさらなる組み合わせによって、分泌が増加し得る（図１０Ａ）。ＦｌｇＭ鞭毛ＩＩＩ型分泌シグナルに融合した対象タンパク質も発現する株においてこの遺伝子バックグラウンドを使用することによって、特に２００ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ存在下で増殖させられる場合、対象タンパク質の産生が向上し得る（図１１Ａ）。
【０１６２】
２．σ28精製カラム
σ28タンパク質は、ｆｌｉＡ遺伝子およびＦｌｇＭに対するＩＩＩ型分泌シャペロンの産物である。σ28レベル上昇の結果、分泌型ＦｌｇＭ融合タンパク質基質のレベルが上昇する（図６Ａ）。σ28タンパク質はまた、タンパク質精製系のためにも使用され得る。ＦｌｇＭ−σ28複合体の見かけのＫdは、２ｘ１０-10Ｍである。この非常に高い親和性は、ＦｌｇＭの精製の結果、σ28が同時に精製され得、その逆も同様であることを意味する。インテイン自己切断部位により挟まれたキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）に融合されたＦｌｇＭが構築されている。この融合キメラを発現する細胞からの抽出物をキチンカラム全体に注いだ場合、σ28付きの複合体中のＦｌｇＭ−インテイン−ＣＢＤキメラがカラムに結合した。還元剤の添加によって、精製ＦｌｇＭ−σ28複合体を放出するインテイン自己切断が触媒された。キチンカラムにσ28−ＣＢＤを結合させるのは、この態様を使用し得る。発明者らの鞭毛分泌株から産生されるＦｌｇＭ−インテイン−Ｘキメラ（Ｘは対象タンパク質である。）の消費増殖培地をこのようなカラム全体に注ぎ得る。インテイン自己切断の誘導により、純粋な形態のタンパク質Ｘが放出され得る。これは、低コストで高収率のタンパク質産生系を提供し得る。
【０１６３】
活性立体構造を維持するために酸化状態を保たなければならないタンパク質は、インテインの代わりに、酸化条件下で開裂するプロテアーゼ切断配列、例えばエンテロキナーゼなどを有し得る。
【０１６４】
開示の系および方法はまた、サルモネラにおいて達成された大腸菌鞭毛Ｔ３Ｓ系によりタンパク質分泌および産生を得るために、大腸菌へも発展させ得る。これは、熱耐性株などの他の株を含むように拡張され得る。熱耐性株由来のタンパク質は、高温でのタンパク質安定性が向上しており、それにより構造分析が行いやすくなるため、結晶学およびＮＭＲ研究で使用されることが多い。
【０１６５】
タンパク質産生のためのＳＰＩ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）Ｔ３Ｓ系を開発し得る。ＳＰＩ１インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）Ｔ３Ｓ系によって、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢおよびＳｉｐＣタンパク質が高レベルで分泌される（図１４）。融合コンストラクトでのタンパク質分泌を促進し、鞭毛系と同様のタンパク質産生系を開発するためにこれらのタンパク質を使用し得るか否か判定するために、これらのタンパク質を試験し得る。Ｓｐｉ１産生は、ＨｉｌＤの調節下にあり、アラビノース−誘導性ＰaraBADプロモーターからのｈｉｌＤ+の調節発現の結果、Ｓｐｉ１  ｍＲＮＡ産生が高レベルになると断定された。
【０１６６】
大腸菌は基本的にサルモネラと同一の鞭毛Ｔ３Ｓを有し、そのため、大腸菌において最適分泌株を再構築することが容易である。しかし、大腸菌は、ＳＰＩ１系を欠くので、遺伝子の全ＳＰＩ１セットが大腸菌染色体に挿入され得る。図１５Ａに示すように、ＳＰＩ１遺伝子は、増幅され、λＲＥＤ技術を用いて大腸菌染色体に挿入され得る単一の「病原性アイランド」に編成される。搬出装置およびニードル複合体遺伝子を使用し得、一方でｈｉｌＡ＋遺伝子がａｒａＢＡＤ遺伝子座に挿入され、ＳＰＩ１のアラビノース誘導が可能となる。
【０１６７】
膜−タンパク質精製系を開発するために、ＳＰＩ１系も使用し得る。このような系は、膜タンパク質産生および特性評価を根本的に変化させ得る。ＳＰＩ１系は、そのトランスロコンチップを通じて宿主細胞の細胞質膜に挿入することにより作用する（図１６参照）。できるだけ短いが、正常なトランスロコン形成および宿主細胞の膜への挿入が依然として可能である最小機能ニードルを開発するために、インジェクチソーム（ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ）ニードル長の改変を行い得る。膜タンパク質が横断しなければならないニードル長を最小化することは有益であってよい。人工膜小胞へのＳＰＩ１系を使用した膜タンパク質の分泌の転移とこれを組み合わせ得る。
【０１６８】
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１４．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｍ．，Ｋ．Ｎａｍｂａ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０１０．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎａｎｏｍａｃｈｉｎｅｓ：ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：ａ０００２９９．
１５．Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｂ．，Ｍ．−Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ｏ．Ｂｕｃｚｅｋ，Ｌ．Ａｚａｍ，Ｇ．Ｂｕｌａｊ，Ｒ．Ｓ．Ｎｏｒｔｏｎ，Ｂ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒａ，ａｎｄ  Ｄ．Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ．２００８．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｏｔａ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＲＸＩＡ，ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｎａ（Ｖ）１．２，１．６  ａｎｄ  １．７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７５：２３３４−２３４４．
１６．Ｆｒｙｅ，Ｊ．，Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｈ．Ｒ．Ｆｅｌｉｓｅ，Ｂ．Ｍａｒｚｏｌｆ，Ｎ．Ｄｏｗｉｄａｒ，Ｍ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：２２３３−２２４３．
１７．Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｐ．Ｃａｔｌｉｎ，Ｍ．−Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ｂ．Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｗ．Ｂａｙｕｄａｎ，Ａ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｎｏｒｔｏｎ，Ｂ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ，Ｂ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒａ，ａｎｄ  Ｇ．Ｂｕｌａｊ．２００７．Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｐａｃｅｒｓ：ｃｌａｄｉｓｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ，ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：３９９−４０７．
１８．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｋ．Ｌ．Ｇｉｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｓｅｍｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ．１９９３．Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１２７７−１２８０．
１９．Ｈｕｉ，Ｋ．，Ｇ．Ｌｉｐｋｉｎｄ，Ｈ．Ａ．Ｆｏｚｚａｒｄ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｆｒｅｎｃｈ．２００２．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｌｏｃｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｙ  ｍｕ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１９：４５−５４．
２０．Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇ．Ｂｕｌａｊ．２０００．Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ  −  ｎｅｗ  ｖｉｓｔａｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ６：１２４９−１２８５．
２１．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ｅ．２００７．ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４２１：１９９−２０９．
２２．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｓ．Ｔａｎａｋａ，Ｖ．Ｂｅｔｔｅｎｗｏｒｔｈ，Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｗ．Ｂｏｏｓ，Ｓ．Ｉ．Ａｉｚａｗａ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０００．Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｏｋ−ｂａｓａｌ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ  ｉｓ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ＦｌｇＭ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｉＣ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１２２０−１２３１．
２３．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｋ．１９９４．Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４３：６０５−６１２．
２４．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００６．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｏｏｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦｌｇＥ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：３３０８−３３１６．
２５．Ｌｅｈｎｅｎ，Ｄ．，Ｃ．Ｂｌｕｍｅｒ，Ｔ．Ｐｏｌｅｎ，Ｂ．Ｗａｃｋｗｉｔｚ，Ｖ．Ｆ．Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，ａｎｄ  Ｇ．Ｕｎｄｅｎ．２００２．ＬｒｈＡ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａ，ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４５：５２１−５３２．
２６．Ｍｉｌｊａｎｉｃｈ，Ｇ．１９９７．Ｖｅｎｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  ４：６．
２７．Ｍｉｌｊａｎｉｃｈ，Ｇ．Ｐ．２００４．Ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ：ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｉｎ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １１：３０２９−３０４０．
２８．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙ．Ｎｉｗａ，Ｙ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｋｏｈｎｏ，Ｋ．Ｓａｔｏ，Ｙ．Ｏｂａ，ａｎｄ  Ｈ．Ｎａｋａｍｕｒａ．２００１．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｇ−１３  ｏｆ  ｍｕ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＩＩＩＡ  ｗｉｔｈ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ−Ａｒｇ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０３：１０７−１１０．
２９．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｌｉｎｏ．１９９２．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ａｎ  ａｎｔｉｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｉｇｍａ  Ｆ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３１４９−３１５７．
３０．Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．２０００．ω−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＭＶＩＩＡ：Ｆｒｏｍ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｎａｉｌ  Ｖｅｎｏｍ  ｔｏ  Ａｎａｌｇｅｓｉｃ  Ｄｒｕｇ．Ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｅａ（Ｆｕｓｅｔａｎｉ，Ｎ．，ｅｄ）：ｐｐ．７７−８５．
３１．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｒｏｔｈ．１９８３．Ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＶＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７：４１０−４５３．
３２．Ｔａｋａｙａ，Ａ．，Ｍ．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｋ．Ｋａｒａｔａ，Ｋ．Ｗｉｎｔｅｒｂｅｒｇ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０１２．ＹｄｉＶ：ａ  ｄｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＦｌｈＤＣ  ｆｏｒ  ＣｌｐＸＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂｏｕｎｄ  ＦｌｈＤＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８３：１２６８−１２８４．
３３．Ｔｅｒｌａｕ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒａ．２００４．Ｃｏｎｕｓ  ｖｅｎｏｍｓ：ａ  ｒｉｃｈ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８４：４１−６８．
３４．Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｃ．，Ｃ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｋ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００８．Ｔ−ＰＯＰ  ａｒｒａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＥｃｎＲ  ａｎｄ  ＰｅｆＩ−ＳｒｇＤ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
３５．Ｙａｏ，Ｓ．，Ｍ．−Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ，Ｌ．Ａｚａｍ，Ｂ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｇ．Ｂｕｌａｊ，ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｎｏｒｔｏｎ．２００８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｍｕ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＳＩＩＩＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：１０９４０−１０９４９．
３６．Ｆｒｙｅ，Ｊ．，Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｈ．Ｒ．Ｆｅｌｉｓｅ，Ｂ．Ｍａｒｚｏｌｆ，Ｎ．Ｄｏｗｉｄａｒ，Ｍ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：２２３３−２２４３．
１．Ａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｃ．，Ｋ．Ｐｏｏｎｃｈａｒｅｏｎ，Ｓ．Ｓａｉｎｉ，Ｔ．Ｅｗｅｎ，Ａ．Ｓｏｌｏｙｖａ，Ｃ．Ｖ．Ｒａｏ，Ｋ．Ｉｍａｄａ，Ｔ．Ｍｉｎａｍｉｎｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ａｌｄｒｉｄｇｅ．２０１０．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：１４１６−１４３０．
２．Ａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｃ．Ａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｂｉｒｃｈａｌｌ，Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｙａｇａｓａｋｉ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００６．Ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｉｇｍａ２８，ｉｓ  ｔｈｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ２８  ｆａｃｔｏｒ  ＦｌｇＭ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０：２３１５−２３２６．
３．Ａｕｖｒａｙ，Ｆ．，Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒ，ａｎｄ  Ｃ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００１．Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｅｘｐｏｒｔ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：２２１−２２９．
４．Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｇ．Ｇｅｏｒｇｉｕｏ．１９９０．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４９１−４９４．
５．Ｂａｒｅｍｂｒｕｃｈ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｅｎｇｇｅ．２００７．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＦｌｉＡ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ＦｌｇＭ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：７６−８９．
６．Ｂｅｒｇ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ．１９７３．Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｗｉｍ  ｂｙ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２４５：３８０−３８２．
７．Ｂｏｎｉｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００３．Ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：３５６７−３５７４．
８．Ｃｈａｄｓｅｙ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００１．Ａ  ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｍａ２８  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＦｌｇＭ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｍａ２８  ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０６：９１５−９２９．
９．Ｃｈｅｖａｎｃｅ，Ｆ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００８．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４５５−４６５．
１０．Ｃｈｕｂｉｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｙ．Ａ．Ｇｏｌｕｂｅｖａ，Ｄ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｓｌａｕｃｈ．２０１０．ＦｌｉＺ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ  １  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｌｏｃｕｓ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＨｉｌＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２：６２６１−６２７０．
１１．Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ．２０００．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５．
１２．Ｄａｕｇｈｄｒｉｌｌ，Ｇ．Ｗ．，Ｍ．Ｓ．Ｃｈａｄｓｅｙ，Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ，ａｎｄ  Ｆ．Ｗ．Ｄａｈｌｑｕｉｓｔ．１９９７．Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｌｆ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ，ＦｌｇＭ，ｂｅｃｏｍｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｗｈｅｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ，ｓｉｇｍａ  ２８．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：２８５−２９１．
１３．Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｒｏｔｈ．１９８０．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
１４．Ｄｏｒｅｌ，Ｃ．，Ｐ．Ｌｅｊｅｕｎｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅ．２００６．Ｔｈｅ  Ｃｐｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ａ  ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ？  Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５７：３０６−３１４．
１５．Ｅｌｌｅｒｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｓｌａｕｃｈ．２００３．ＲｔｓＡ  ａｎｄ  ＲｔｓＢ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：５０９６−５１０８．
１６．Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｓｔｏｃｋｅｒ．１９７５．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｔ  ｈａｇ  ｏｒ  ｅｌｓｅｗｈｅｒｅ，ｏｆ  Ｈ２（ｐｈａｓｅ−２  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）  ｇｅｎｅｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｏ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８１：５９５−６１４．
１７．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０１０．Ｃ−ｒｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｓ  ｂｙｐａｓｓｅｄ  ｂｙ  ＦｌｈＤＣ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：３７６−３９３．
１８．Ｆａｔｔｏｒｉ，Ｊ．，Ａ．Ｐｒａｎｄｏ，Ａ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｆ．Ｈ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，ａｎｄ  Ｌ．Ｔａｓｉｃ．２０１１．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．１８：１５８−１６６．
１９．Ｆｌｙｎｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓ．Ｂ．Ｎｅｈｅｒ，Ｙ．Ｉ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｔ．Ｓａｕｅｒ，ａｎｄ  Ｔ．Ａ．Ｂａｋｅｒ．２００３．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｌｐＸＰ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｉｖｅ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ＣｌｐＸ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：６７１−６８３．
２０．Ｆｒａｎｃｅｚ−Ｃｈａｒｌｏｔ，Ａ．，Ｂ．Ｌａｕｇｅｌ，Ａ．Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｒｔ，Ｎ．Ｄｕｂａｒｒｙ，Ｆ．Ｗｉｏｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｐ．Ｃａｓｔａｎｉｅ−Ｃｏｒｎｅｔ，Ｃ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ａｎｄ  Ｋ．Ｃａｍ．２００３．ＲｃｓＣＤＢ  Ｈｉｓ−Ａｓｐ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｆｌｈＤＣ  ｏｐｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８２３−８３２．
２１．Ｆｒａｓｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ｈｕｇｈｅｓ．１９９９．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＦｌｇＮ  ａｎｄ  ＦｌｉＴ，ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｆｏｒ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：５６９−５８０．
２２．Ｇａｌａｎ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｒ．ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ．１９９０．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｉｎｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１８７９−１８８５．
２３．Ｇｉｌｌｅｎ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．１９９１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦｌｇＭ，ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６４５３−６４５９．
２４．Ｇｉｌｌｅｎ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．１９９３．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ＦｌｇＭ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：７００６−７０１５．
２５．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｋ．Ｔ．，Ａ．Ｄｅｓｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｇｒａｙ，ａｎｄ  Ｃ．Ｇｒｕｂｍｅｙｅｒ．１９９３．Ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｎａｄＣ  ｇｅｎｅ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｄ−Ｐ２２  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕｉｎｏｌｉｎａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：４７９−４８６．
２６．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｋ．Ｌ．Ｇｉｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｓｅｍｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ．１９９３．Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１２７７−１２８０．
２７．Ｉｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｓ．Ｉｙｏｄａ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌｉＡ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：１３８９−１３９６．
２８．Ｉｙｏｄａ，Ｓ．，Ｔ．Ｋａｍｉｄｏｉ，Ｋ．Ｈｉｒｏｓｅ，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，ａｎｄ  Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ．２００１．Ａ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｆｌｉＺ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３０：８１−９０．
２９．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ｅ．２００７．ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４２１：１９９−２０９．
３０．Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ｌｏｎｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０００．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｅｌｌ  １０２：４８７−４９７．
３１．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｋ．１９９４．Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４３：６０５−６１２．
３２．Ｌｅｈｎｅｎ，Ｄ．，Ｃ．Ｂｌｕｍｅｒ，Ｔ．Ｐｏｌｅｎ，Ｂ．Ｗａｃｋｗｉｔｚ，Ｖ．Ｆ．Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，ａｎｄ  Ｇ．Ｕｎｄｅｎ．２００２．ＬｒｈＡ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａ，ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：５２１−５３２．
３３．Ｌｅｍｋｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｔ．Ｄｕｒｆｅｅ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｇｏｕｒｓｅ．２００９．ＤｋｓＡ  ａｎｄ  ｐｐＧｐｐ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｃａｓｃａｄｅ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：１３６８−１３７９．
３４．Ｌｕｃａｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｃ．Ｐ．Ｌｏｓｔｒｏｈ，Ｃ．Ｃ．ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｍ．Ｐ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｂ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ，ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｌｅｅ．２０００．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｈｉｌＡ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１８７２−１８８２．
３５．Ｍａｃｎａｂ，Ｒ．Ｍ．２００３．Ｈｏｗ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓｓｅｍｂｌｅ  ｆｌａｇｅｌｌａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：７７−１００．
３６．Ｍａｃｎａｂ，Ｒ．Ｍ．２００４．Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６９４：２０７−２１７．
３７．Ｍｅｒｄａｎｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｔ．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｍ．Ｋａｉｓｅｒ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｅｈｒｍａｎｎ．２０１１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：１４９−１６８．
３８．Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｎａｍｂａ．２００８．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＰａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｍｏｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：４８５−４８８．
３９．Ｎａｍｂａ，Ｋ．２００１．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ６：１−１２．
４０．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｉｉｎｏ．１９９０．Ｇｅｎｅ  ｆｌｉＡ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：１３９−１４７．
４１．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｌｉｎｏ．１９９２．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ａｎ  ａｎｔｉｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｉｇｍａ  Ｆ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１４９−３１５７．
４２．Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｔ．ｄｅｌ  Ｐｅｓｏ−Ｓａｎｔｏｓ，ａｎｄ  Ｖ．Ｓｈｉｎｇｌｅｒ．２０１１．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｕｓｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３７−５５．
４３．Ｐａｕｌ，Ｋ．，Ｍ．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ，Ｄ．Ｆ．Ｂｌａｉｒ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００８．Ｅｎｅｒｇｙ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：４８９−４９２．
４４．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｍ．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ａ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ，Ｇ．Ｂｕｌａｊ，Ｂ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒａ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０１２．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．ＭＢｉｏ  ３．
４５．Ｓｏｒｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｓ．Ｓ．Ｒａｙ，ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｄａｒｓｔ．２００４．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｉｇｍａ／ａｎｔｉ−ｓｉｇｍａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｉｇｍａ（２８）／ＦｌｇＭ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４：１２７−１３８．
４６．Ｓｏｕｒｊｉｋ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｎ．Ｓ．Ｗｉｎｇｒｅｅｎ．２０１２．Ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２４：２６２−２６８．
４７．Ｔａｋａｙａ，Ａ．，Ｍ．Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｋ．Ｋａｒａｔａ，Ｋ．Ｗｉｎｔｅｒｂｅｒｇ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２０１２．ＹｄｉＶ：ａ  ｄｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＦｌｈＤＣ  ｆｏｒ  ＣｌｐＸＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂｏｕｎｄ  ＦｌｈＤＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：１２６８−１２８４．
４８．Ｔｏｍｏｙａｓｕ，Ｔ．，Ｔ．Ｏｈｋｉｓｈｉ，Ｙ．Ｕｋｙｏ，Ａ．Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕ，Ａ．Ｔａｋａｙａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｓｅｋｉｙａ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，ａｎｄ  Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ．２００２．Ｔｈｅ  ＣｌｐＸＰ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆｌａｇｅｌｌｕｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６４５−６５３．
４９．Ｗａｄａ，Ｔ．，Ｔ．Ｍｏｒｉｚａｎｅ，Ｔ．Ａｂｏ，Ａ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｋ．Ｉｎｏｕｅ−Ｔａｎａｋａ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ．２０１１．ＥＡＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＹｄｉＶ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＦｌｈＤ４Ｃ２  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９３：１６００−１６１１．
５０．Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｙ．Ｚｈａｏ，Ｍ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｈａｒｓｈｅｙ．２００７．Ｔｈｅ  ＲｃｓＣＤＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｓｗａｒｍｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｎｄ  ＳＰＩ−２  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：８４４７−８４５７．
５１．Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｒ．Ｔ．Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｐ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．ＭｃＫａｙ．２００６．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＦｌｈＤＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：７９８−８０８．
５２．Ｗｅｉ，Ｂ．Ｌ．，Ａ．Ｍ．Ｂｒｕｎ−Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｊ．Ｗ．Ｓｉｍｅｃｋａ，Ｂ．Ｍ．Ｐｒｕｓｓ，Ｐ．Ｂａｂｉｔｚｋｅ，ａｎｄ  Ｔ．Ｒｏｍｅｏ．２００１．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｌｈＤＣ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣｓｒＡ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４５−２５６．
５３．Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｃ．Ｅ．，Ｃ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｋ．Ｔ．Ｈｕｇｈｅｓ．２００９．Ｔ−ＰＯＰ  ａｒｒａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＥｃｎＲ  ａｎｄ  ＰｅｆＩ−ＳｒｇＤ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：１４９８−１５０８．
５４．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ．２００６．ＦｌｉＴ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＦｌｈＤ２Ｃ２  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：６７０３−６７０８．
５５．Ｙａｎａｇｉｈａｒａ，Ｓ．，Ｓ．Ｉｙｏｄａ，Ｋ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｉｉｎｏ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｍａｓｔｅｒ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７４：１０５−１１１．
５６．Ｙｏｋｏｓｅｋｉ，Ｔ．，Ｋ．Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ，Ｋ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｉｉｎｏ．１９９５．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌｉＤ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：１７１５−１７２２．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｅ】
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【図１６】
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【配列表】
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