(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス種細胞からの目的のタンパク質の発現を増加させる方法であって、
ａ）目的のタンパク質を産生可能な改変バチルス種細胞を得る工程であって、前記改変バチルス種細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現を減少させ、及び／又は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現を減少させるサイレント変異を含む、工程と、
ｂ）前記改変バチルス種細胞によって前記目的のタンパク質が発現するような条件下で前記改変バチルス種細胞を培養する工程であって、前記改変バチルス種細胞における前記目的のタンパク質の発現は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞における前記目的のタンパク質の発現と比較して増加する、工程と、を含み、
前記サイレント変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、方法。
【請求項２】
前記バチルス種細胞は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変バチルス種細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サイレント変異は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞と比較して、改変バチルス種細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写のレベルの減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サイレント変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こり、ここで、前記ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的のタンパク質は、酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のタンパク質は、プロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記目的のタンパク質を回収する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
改変バチルス種細胞であって、前記改変バチルス種細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つのサイレント変異を含み、前記サイレント変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、改変バチルス種細胞。
【請求項１０】
前記バチルス種細胞は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１１】
前記改変バチルス種細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１２】
前記改変バチルス種細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞におけるｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子とｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１３】
前記サイレント変異は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変バチルス種細胞と比較して、改変バチルス種細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写のレベルの減少をもたらす、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１４】
前記サイレント変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１５】
前記ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である、請求項１４に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１６】
前記改変バチルス種細胞は、目的のタンパク質を発現する、請求項９に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１７】
前記目的のタンパク質は、酵素である、請求項１６に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１８】
前記目的のタンパク質は、プロテアーゼである、請求項１６に記載の改変バチルス種細胞。
【請求項１９】
バチルス種細胞における目的のタンパク質の発現を増大させる方法であって、
ａ）ｐｄｈＤ遺伝子由来の変異体配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターで親バチルス種細胞を形質転換させる工程と、
ｂ）改変バチルス種細胞を作製するために、前記ベクターと、前記親バチルス種細胞のｐｄｈオペロンにおける対応する領域とを相同組換えさせる工程と、
ｃ）前記目的のタンパク質の発現に好適な条件下で前記改変バチルス種細胞を増殖させる工程であって、該改変バチルス種細胞における前記目的のタンパク質の産生は、前記形質転換工程前の前記バチルス種細胞と比較して増加する、工程と、を含み、
前記ａ）において、前記変異体配列は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、配列番号１の全て又は一部と少なくとも６０％同一であり、ｐｄｈＤ遺伝子内のヌクレオチド位置でのサイレント変異を含み、該サイレント変異は、前記サイレント変異がバチルス種細胞の内因性ｐｄｈＤ遺伝子内に存在する場合、ｐｄｈＡ遺伝子及び／又はｐｄｈＢ遺伝子の発現の減少をもたらし、前記サイレント変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年１２月３０日に出願された、米国特許仮出願第６１／９９２，０３８号の優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概ね、目的のタンパク質の発現の増加をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞と、そのような細胞の作製及び使用方法に関する。本発明の態様は、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現を減少させ、目的のタンパク質の発現の増大をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス種のようなグラム陽性細菌を含む。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子工学により、工業用バイオリアクタ、細胞工場として、かつ食品発酵において使用される微生物の改良が可能になった。有用なタンパク質及び代謝物を大量産生するために多くのバチルス種を含むグラム陽性微生物が使用されている（例えば、Ｚｕｋｏｗｓｋｉ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」，Ｉｎ：Ｄｏｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ．Ｍａｓｓ  ｐｐ  ３１１〜３３７［１９９２］を参照のこと）。工業用に使用される一般的なバチルス種としては、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、及びＢ．サブティリスが挙げられる。これらのＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）ステータスにより、これらのバチルス種の株は、食品産業及び医薬品産業において利用されるタンパク質の産生のための天然の候補である。グラム陽性細菌中で産生されるタンパク質の例としては、例えば、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ性（又はセリン）プロテアーゼなどの酵素が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細菌宿主細胞におけるタンパク質産生の理解が進んでいるにも関わらず、目的のタンパク質レベルの増加を発現する新規の組換え株の開発が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、目的のタンパク質レベルの増加を発現する組換えグラム陽性細胞と、同細胞の作製及び使用方法を提供する。詳細には、本発明は、遺伝子改変をしない細菌細胞と比較して、目的のタンパク質の発現の増加をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞に関する。本発明の態様は、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現を減少させ、目的のタンパク質の発現の増大をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス種のようなグラム陽性細菌を含む。そのような組換え細菌細胞の作製及び使用方法もまた提供される。
【０００６】
本発明の態様は、グラム陽性菌細胞から、目的のタンパク質の発現を増加させる方法であって、ａ）目的のタンパク質を産生可能な改変グラム陽性菌細胞を得る工程であって、前記改変グラム陽性菌細胞は、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、工程と、ｂ）前記改変グラム陽性菌細胞によって前記目的のタンパク質が発現するような条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を培養する工程であって、前記改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の発現は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の発現と比較して、増加する、工程と、を含む、方法を含む。
【０００７】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である（例えば、バチルス種株は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される）。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．サブティリス株である。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及びｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子における変異を更に含む。特定の実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【０００８】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。
【０００９】
特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞において、ｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物レベルの減少をもたらす。
【００１０】
特定の実施形態では、変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる。特定の実施形態では、ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である。特定の実施形態では、遺伝子改変は、サイレント変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である。
【００１１】
特定の実施形態では、目的のタンパク質は、相同タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシンである。特定の実施形態では、サブチリシンは、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、及びこれらの変異体からなる群から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、方法は、前記目的のタンパク質を回収する工程を更に含む。
【００１３】
本発明の態様は、改変グラム陽性菌細胞を含み、前記改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム、及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．サブティリス株である。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及びｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子における変異を更に含む。特定の実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００１４】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞中のｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす。
【００１５】
特定の実施形態では、変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる。特定の実施形態では、ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である。特定の実施形態では、遺伝子改変は、サイレント変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である（配列番号３で示す）。特定の実施形態では、改変細胞は、目的のタンパク質を発現する。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、相同タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、酵素である。
【００１６】
特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシンである。特定の実施形態では、サブチリシンは、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、及びその変異体からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の態様は、ｐｄｈオペロンにおいて１つ又は２つ以上の遺伝子の発現量を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を親グラム陽性菌細胞内に導入することを含む、改善されたタンパク質産生能力を有する、改変グラム陽性菌細胞を得るための方法が含む。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム、及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．サブティリス株である。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及びｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子における変異を更に含む。特定の実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００１８】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞におけるｐｈｄＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少する。
【００１９】
特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす。特定の実施形態では、変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる。特定の実施形態では、ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である。特定の実施形態では、遺伝子改変は、サイレント変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である（配列番号３で示す）。
【００２０】
特定の実施形態では、前記改変グラム陽性菌細胞は、目的のタンパク質を発現する。特定の実施形態では、方法は、前記目的のタンパク質をコードしている発現カセットを、前記親グラム陽性菌細胞に導入することを更に含む。特定の実施形態では、方法は、前記目的のタンパク質をコードしている発現カセットを、前記改変グラム陽性菌細胞に導入することを更に含む。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、相同タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシンである。特定の実施形態では、サブチリシンは、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、及びこれらの変異体からなる群から選択される。
【００２１】
特定の実施形態において、方法は、前記目的のタンパク質が前記改変グラム陽性菌細胞によって発現するような条件下で、前記改変グラム陽性菌細胞を培養することを更に含む。特定の実施形態では、方法は、前記目的のタンパク質を回収することを更に含む。
【００２２】
本発明の態様は、上記方法によって作製された改変グラム陽性菌細胞を含む。
【００２３】
本発明の態様は、ｐｄｈＤ遺伝子由来の変異体配列を含むポリヌクレオチドであって、前記変異体配列は、
少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、
配列番号１の又は一部すべてと少なくとも６０％同一であり、
ｐｄｈＤ遺伝子中のヌクレオチド位置での少なくとも１つの変異を含み、該変異により、前記少なくとも１つの変異がグラム陽性菌細胞の内因性ｐｄｈＤ遺伝子内に存在する場合、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現の減少をもたらす、ポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、少なくとも１つの変異は、サイレント変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である。特定の実施形態では、変異体配列は、配列番号３のすべて又は一部と少なくとも９０％同一である。特定の実施形態では、変異体配列は、配列番号３のすべて又は一部と同一である。特定の実施形態では、変異体配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、変異体配列は、少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、変異体配列は、少なくとも２００ヌクレオチドの長さである。
【００２５】
本発明の態様は、上記のようなポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。特定の実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌細胞に形質転換したときに、相同組換えによって前記グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロン中の相当する位置に、前記ポリヌクレオチド配列中の少なくとも１つの変異を導入するために設計された、標的化ベクターである。
【００２６】
本発明の態様は、グラム陽性菌細胞における目的のタンパク質の発現を増大させる方法であって、
ａ）上記ベクターで親グラム陽性菌細胞を形質転換させる工程と、
ｂ）改変グラム陽性菌細胞を作製するために、前記ベクターと、前記親グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロンにおける対応する領域と、を相同組換えさせる工程と、
ｃ）前記目的のタンパク質の発現に好適な条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を増殖させる工程であって、該改変グラム陽性菌細胞における前記目的のタンパク質の産生は、前記形質転換工程前の前記グラム陽性菌細胞と比較して増加する、工程と、を含む、方法を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、親グラム陽性菌細胞は、バチルス種株である。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム及びＢ．チューリンギエンシスからなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．サブティリス株である。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及びｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子における変異を更に含む。特定の実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００２８】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞中のｐｈｄＡ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞中のｐｈｄＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞において、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞中のｐｈｄＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子の発現が減少している。特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた、前記親グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞中のｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす。
【００２９】
特定の実施形態では、変異は、前記ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる。特定の実施形態では、ｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である。特定の実施形態では、遺伝子改変は、サイレント変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置に存在する。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である（配列番号３で示す）。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、相同タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシンである。特定の実施形態では、サブチリシンは、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、及びこれらの変異体からなる群から選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、方法は、前記目的のタンパク質を回収することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】バチルス・サブティリス由来のｐｈｄオペロンの模式図である。実施例にて記述したサイレント変異の場所を示す。ｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ、及びｐｄｈＤ遺伝子を矢印で示す。転写開始部位を折れ矢印で示す。転写は、各転写開始部位からオペロンの末端まで続き、したがって、２つ以上の遺伝子を含む転写物が可能である（例えば、第一転写開始部位からの転写が、４つの遺伝子すべて、ｐｄｈＡＢＣＤをコードしているｍＲＮＡを産生可能である）。
【図２Ａ】ＡｍｙＥ発現ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）及びＣＢ１５−１４ｐｄｈ（ｐｄｈＤ変異を含有する株）の細胞密度のグラフを示す。
【図２Ｂ】ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）及びＣＢ１５−１４ｐｄｈ（ｐｄｈＤ変異を含有する株）におけるＡｍｙＥ発現のグラフを示す。
【図３Ａ】ＦＮＡ発現ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）並びにＣＢ１５−１４ｐｄｈ  ＃１及び＃１８（ｐｄｈＤ変異を含有する株）の細胞密度のグラフを示す。
【図３Ｂ】ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）及びＣＢ１５−１４ｐｄｈ  ＃１及び＃１８（ｐｄｈＤ変異を含有する株）におけるＦＮＡ発現のグラフを示す。
【図４Ａ】ＧＦＰ発現ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）及びＣＢ１５−１４ｐｄｈ  ＃１及び＃２（ｐｄｈＤ変異を含有する株）の細胞密度のグラフを示す。
【図４Ｂ】ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４（対照株）及びＣＢ１５−１４ｐｄｈ  ＃１及び＃２（ｐｄｈＤ変異を含有する株）におけるＧＦＰ発現のグラフを示す。
【図５Ａ】ＢｇｌＣ発現ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４  ＃１及び＃２（対照株）並びにｐｄｈＤ  ＃１及びｐｄｈＤ  ＃２（ｐｄｈＤ変異を含有する株）の細胞密度のグラフを示す。
【図５Ｂ】ＣＢ１５−１４誘導体であるＣＢ１５−１４  ＃１及び＃２（対照株）並びにｐｄｈＤ  ＃１及びｐｄｈＤ  ＃２（ｐｄｈＤ変異を含有する株）におけるＢｇｌＣ発現のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は概ね、目的のタンパク質の発現の増加をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞と、そのような細胞の作製及び使用方法に関する。本発明の態様は、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現を減少させ、目的のタンパク質の発現の増大をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス種細胞のようなグラム陽性細菌を含む。
【００３３】
本組成物及び方法をより詳細に記載する前に、本組成物及び方法は、記載されている特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然ながら、多様であり得ることが理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本組成物及び方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されたい。
【００３４】
値の範囲が提供される場合、間にある各値、文脈に別途記載がない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間及びその記載されている範囲内の任意の別の記載されている値又は間にある値が、本組成物及び方法の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してそれらのより小さい範囲内に含まれてもよく、言明した範囲内の任意の明確に除外されている限界の対象であり、本組成物及び方法の範囲内に包含される。言明した範囲が上限又は下限のうち１つ又は両方を含む場合、これらの含まれる上限及び下限のいずれか一方又は両方を除外する範囲もまた本組成物及び方法に含まれる。
【００３５】
本明細書において、ある特定の範囲は、用語「約」が前に来る数値で提示される。「約」という用語は、本明細書において、その後に続く正確な数、並びにその用語の後に続く数に近い数又は近似の数を文字通りに補強するために使用される。ある数が具体的に列挙されている数に近い数又は近似の数であるかどうかを判定するとき、その近い数又は近似する列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙されている数の実質的な同値を示す数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、その用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、その数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、そのｐＨ値が別途明確に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を指す。
【００３６】
本明細書において提供される見出しは、明細書全体を参照することにより有することができる、本組成物及び方法の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照することにより、より一層完全に定義される。
【００３７】
本文書は、読みやすさのために複数のセクションに編成されているが、読者は、１つのセクションで行われた記述が他のセクションに適用できることを理解するであろう。この方法では、開示の異なるセクションで使用される見出しは、限定的なものとして解釈されるべきではない。
【００３８】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本組成物及び方法が属する当業者により通常理解される意味と同一の意味を有する。本組成物及び方法を実施又は試験する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料もまた使用することができるが、代表的な例示の方法及び材料を以下に記載する。
【００３９】
本明細書において引用されているすべての出版物及び特許は、それぞれの個々の出版物又は特許が具体的かつ個々に示されて、参照として援用されるかのように、参照により本明細書に援用され、関連の出版物が引用された方法及び／又は材料を開示及び記述するために、参照により本明細書に援用される。任意の出版物の引用は、出願日の前のその開示に関するものであり、本発明の組成物及び方法が先行発明のためにそのような出版物に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。更に、提供されている出版日は、それぞれ別個に確認する必要があるであろう実際の出版日とは異なる場合があり得る。
【００４０】
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義を適用する。なお、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に別途記載がない限り、複数の指示対象が含まれることに、留意されたい。よって、例えば、「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「用量」という場合には、当業者には既知の１回又は２回以上の用量及びその当量などが含まれる。
【００４１】
特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成されてもよいことに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の構成要素の列挙、又は「消極的（negative）」限定の使用に関連して、「だけ（solely）」、「のみ（only）」などのような排他的な用語を使用するための先行する根拠として機能することを意図する。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、その用語の後の（複数の）成分が、前記（複数の）成分の作用又は活性に寄与又は干渉しない、全量が全組成物の３０重量％未満である他の既知の（複数の）成分の存在下にある、組成物を指すことに更に留意されたい。
【００４３】
用語「含む（comprising）」は、本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」の後の（複数の）成分を含むが、これらに限定されないことを意味することにもまた留意されたい。用語「含む（comprising）」の後の（複数の）成分は、必要又は必須であるが、この（複数の）成分を含む組成物は、他の必須ではない（複数の）成分又は任意の（複数の）成分を更に含んでもよい。
【００４４】
用語「〜からなる（consisting of）」は、本明細書において使用される場合、用語「〜からなる（consisting of）」の後の（複数の）成分を含むが、これらに限定されることを意味することにもまた留意されたい。したがって、用語「〜からなる（consisting of）」の後の（複数の）成分は、必要又は必須であり、かつ他の（複数の）成分が組成物中に存在しない。
【００４５】
本開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書において記述及び例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本明細書において記載されている本組成物及び方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の一部の実施形態のいずれかの特徴と容易に分離し、又はそれと組み合わせることができる別個の成分及び特徴を有する。列挙されているいずれの方法も、列挙されている事象の順序で又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００４６】
定義
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、新規に導入されたＤＮＡ配列に対する宿主又は発現ビヒクルとして働く能力を有する細胞を意味する。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、グラム陽性宿主細胞、バチルス種である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「バチルス属」又は「バチルス種」としては、Ｂ．サブティリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．ロータス、及びＢ．チューリンギエンシスが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に既知のような「バチルス」属内のすべての種が含まれる。バチルス属は、分類再構築を受け続けると認識される。したがって、属は、現在は、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と呼ばれている、Ｂ．ステアロサーモフィルスのような微生物を含むが、これに限定されない、再分類された種を含むことが意図される。酸素の存在下での耐性内生胞子の産生は、この特徴は、最近命名されたアリサイクロバチルス、アムピバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、パエニバチルス、サリバチルス、サーモバチルス、ウレイバチルス及びバルジバチルスにも当てはまるが、バチルス属を決定付ける特徴であると考えられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを表すかに関わらず、ヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、その断片又は部分、並びに二本鎖又は一本鎖であってもよい、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡを意味する。遺伝コードの縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が、所与のタンパク質をコードする可能性があることが理解されるであろう。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、細胞内で複製可能であり、新規遺伝子又はＤＮＡ断片を細胞内に運ぶことが可能な任意の核酸を意味する。したがって、本用語は、異なる宿主細胞間での伝達のために設計された核酸構造物を意味する。「発現ベクター」とは、外来細胞内に異種ＤＮＡ断片を組み込み、これを発現する能力を有するベクターを意味する。多くの原核細胞発現ベクター及び真核細胞発現ベクターが市販されている。「標的化ベクター」は、これを形質転換する宿主細胞の染色体内の一領域に相同であり、この領域での相同組換えを駆動可能なポリヌクレオチド配列を含むベクターである。標的化ベクターは、相同組換えにより、細胞の染色体内に変異を導入する際の使用が見受けられる。いくつかの実施形態では、標的化ベクターには、例えば、末端に追加される、他の非相同配列が含まれる（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）。末端は、標的化ベクターが、例えば、ベクター内への挿入のような、閉環を形成するように、閉じることが可能である。適切なベクターの選択及び／又は構築は、当業者の知識の範囲内である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」とは、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌及び一部の真核生物において、染色体外自己複製遺伝因子を形成する、環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を意味する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれることとなる。
【００５２】
「精製された」又は「単離された」又は「濃縮された」は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、天然に関連する天然に生じる構築物のうちいくつか又はすべてから、それを分離する目的で、その天然の状態から変質されることを意味する。そのような単離又は精製は、最終組成物中で不要な無傷の細胞、細胞残渣、不純物、外来タンパク質又は酵素を除去するための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿又は他のタンパク質塩沈殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、マイクロ濾過、ゲル電気泳動又は勾配に基づく分離のような、当該技術分野において承認されている分離技術によって達成することができる。ついで、更なる利益を提供する、例えば、活性剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ又は他の酵素又は化学物質を制御するための化合物などの構成要素を精製又は単離した生体分子組成物に加えることも更に可能である。
【００５３】
本明細書において使用される場合、目的の生体分子（例えば、目的のタンパク質）の発現に言及する際の用語「増大された」、「改善された」及び「増加された」は、生体分子の発現が、本明細書における教示に従って変更されていないが、本質的に同一の増殖条件下で増殖した対応する宿主株（例えば、野生型株及び／又は親株）中の発現レベルより上であることを示すために、本明細書で相互互換的に使用される。
【００５４】
本明細書において使用される場合、タンパク質に適用される際の用語「発現」は、タンパク質が遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを意味し、したがって、転写及び翻訳の両方を含む。
【００５５】
細胞内にポリヌクレオチドを導入する文脈において本明細書において使用される場合、用語「導入された」は、この細胞内にポリヌクレオチドを伝達するために好適な任意の方法を意味する。導入のためのそのような方法は、原形質融合、トランスフェクション、形質転換、接合、及び形質導入を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｈａｒｄｗｏｏｄ，（ｅｄｓ．），ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，５７〜７２頁，［１９８９］を参照のこと）。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「形質転換された」及び「安定に形質転換された」は、人為的介入によってその内部にポリヌクレオチド配列が導入された細胞を意味する。ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内に統合されるか、又は少なくとも２世代維持されるエピソームプラスミドとして存在可能である。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「選択可能マーカー」又は「選択マーカー」は、核酸を含有する宿主の簡単な選択を許容する、宿主細胞における発現が可能な核酸（例えば、遺伝子）を意味する。そのような選択可能マーカーの例としては、抗菌剤が挙げられるが、これに限定されない。したがって、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が、目的の入来ＤＮＡを受け入れたか、又はいくつかの他の反応が発生したことを示唆する遺伝子を意味する。典型的に、選択可能マーカーは、外来ＤＮＡを含有する細胞を、形質転換の間、いかなる外来配列をも受領しなかった細胞から区別できるようにするために、宿主細胞上に抗菌剤耐性又は代謝優位性を与える遺伝子である。本発明に従う有用な他のマーカーとしては、トリプトファンのような栄養要求性マーカー、及びβ−ガラクトシダーゼのような検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「プロモータ」とは、下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を意味する。実施形態では、プロモータは、標的遺伝子が発現する宿主細胞に対して適切である。プロモータは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と共に、所与の遺伝子を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写終止配列、翻訳開始配列及び翻訳終止配列、並びにエンハンサ配列又はアクティベータ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「機能的に結合された」又は「操作可能に連結された」は、その既知の又は所望の活性に従って、標的の発現、分泌又は機能をその制御領域又は機能ドメインが制御することを許容するような様式で、その標的（例えば、遺伝子又はポリペプチド）に、プロモータ、ターミネータ、シグナル配列、又はエンハンサ領域のような、既知又は所望の活性を有する調節領域又は機能ドメインが、結合又は連結されることを意味する。
【００６０】
組換え細胞を記述するために使用する場合、用語「遺伝子改変」又は「遺伝的変化」は、親細胞と比較して、細胞が少なくとも１つの遺伝的差異を有することを意味する。１つ又は２つ以上の遺伝的差異は、染色体変異（例えば、染色体領域の挿入、欠失、置換、逆位、他の染色体との染色体領域の交換（例えば、染色体プロモータの異種プロモータとの交換）など）、及び／又は染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の導入であってもよい。いくつかの実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体に統合されて、安定なトランスフェクタント／形質転換体を生じることができる。本開示の実施形態には、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子（ｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ及びｐｄｈＤ）の発現を減少させる遺伝子改変が含まれる。本明細書で詳述されるように、そのような改変は、目的のタンパク質の発現を改善する。
【００６１】
遺伝子の「不活性化」は、遺伝子の発現若しくは遺伝子がコードされた生体分子の活性が阻害されるか、又は遺伝子の既知の機能を発揮することが不可能であることを意味する。不活性化は、例えば、上記のような遺伝子改変を介して、任意の好適な手段を介して生じ得る。１つの実施形態では、不活性化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物学的活性において相当する変化を有する、短縮タンパク質である。いくつかの実施形態では、改変グラム陽性細菌株には、好ましくは安定及び不可逆不活性化をもたらす、１つ又は２つ以上の遺伝子の不活性化が含まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、不活性化は、欠失によって得られる。いくつかの実施形態において、欠失のために標的とされる領域（例えば、遺伝子）は、相同組換えによって欠失する。例えば、欠失のために標的とされる領域に相同である配列によって、各側で隣接した選択マーカーを有する入来配列を含むＤＮＡ構造物が使用される（配列は、本明細書において「相同ボックス」と称されてもよい）。ＤＮＡ構造物は、宿主染色体の相同配列と整列し、二本鎖交差イベントにて、欠失のために標的とされる領域が、宿主染色体の外に切り出される。
【００６３】
「挿入」又は「添加」は、天然に存在する配列、又は親配列と比較して、それぞれ、１個又は２個以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の添加をもたらした、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列における変化である。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「置換」は、１つ又は２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の、それぞれ異なるヌクレオチド又はアミノ酸による交換によって生じる。
【００６５】
遺伝子を変異する方法は、当該技術分野において周知であり、部位特異的変異、ランダム変異の発生、及びギャップ付き二本鎖法（gapped-duplex approach）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号、Ｍｏｒｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６［１９８４］及びＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１［１９８４］を参照のこと）。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「相同遺伝子」は、互いに対応し、互いに同一であるか、又は非常に類似の、異なるが、通常関連する種からの一対の遺伝子を意味する。本用語は、種形成（すなわち、新規種の発生）によって分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製によって分離される遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「オルソログ」及び「オルソロガス遺伝子」は、種形成によって、共通の先祖遺伝子（すなわち相同遺伝子）から進化した、異なる種における遺伝子を意味する。典型的には、オルソログは、進化の過程にて、同一の機能を維持する。オルソログの同定は、新規に配列決定されたゲノム内の遺伝子機能の信頼性ある予測にて有用であることが分かる。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内の複製によって関連づけられる遺伝子を意味する。オルソログが進化の過程を通して同一の機能を維持する一方で、パラログは、いくつかの機能が、本来のものと関連する場合が多いが、新規機能を進化させている。パラロガス遺伝子の例としては、すべてがセリンプロテアーゼであり、同一の種内で同時に発生する、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「相同性」は、配列の類似性又は同一性を意味し、同一が好ましい。本相同性は、当該技術分野において既知の標準技術を用いて判定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３「１９７０」；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９９８］、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｏｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡのようなプログラム、及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照のこと）。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「類似配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・サブティリス株１６８から指定された遺伝子と本質的に同一であるものである。更に、類似遺伝子は、バチルス・サブティリス株１６８の遺伝子の配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を含む。あるいは、類似配列は、Ｂ．サブティリス１６８の領域中に見出される遺伝子の７０〜１００％の整列を有し、かつ／又はＢ．サブティリス１６８の染色体中の遺伝子と整列した領域にて見出される少なくとも５〜１０個の遺伝子を有する。更なる実施形態では、２つ以上の上記特徴が配列に適用される。類似配列は、配列整列の既知の方法によって決定される。通常使用される配列方法は、ＢＬＡＳＴであり、前述又は後述で示唆されるように、配列を整列する際の使用もまた見受けられる他の方法も存在する。
【００７１】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的なペアワイズアラインメントを使用して関連する配列の一群から、複数の配列整列を作製する。この方法はまた、整列を作製するために使用されたクラスタリング相関を示すツリーをプロット可能である。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント方法の単純化を使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１〜３６０［１９８７］）。本方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって記述された方法と同様である（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータには、３．００のギャップ加重デフォルト値、０．１０のギャップ長加重デフォルト値及び加重末端ギャップが含まれる。
【００７２】
有用なアルゴリズムの他の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，によって記述された、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０，［１９９０］；及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０〜４８０［１９９６］を参照のこと）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、数個の検索パラメータを使用し、これらのほとんどは、デフォルト値に設定される。調節可能なパラメータは、以下の値で設定される。オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ比率＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓパラメータ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成、及びそれに対して目的の配列を検索する特定のデータベースの組成に基づいて、プログラム自身によって確立される。しかしながら、値は、感度を増加させるように調節されてもよい。％アミノ酸配列同一性値は、整列した領域中の「より長い」配列の残基総数によって除した、一致している同一残基の数によって求められる。「より長い」配列は、整列した領域中のもっとも実際の残基を有するものである（整列スコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視される）。
【００７３】
本明細書において使用される場合、本明細書で同定されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であれば、配列を整列させ、ギャップを導入した後に、Ｍａｌ３Ａ配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一であるが、配列同一性の部分として、任意の保存的置換を考慮しない候補配列中の、アミノ酸残基又はヌクレオチドの割合として定義される。
【００７４】
「相同体」（又は「ホモログ」）によって、対象のアミノ酸配列と、対象のヌクレオチド配列との、特定の程度の同一性を有するエンティティを意味するものとする。相同配列は、従来の配列整列ツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて、対象の配列に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。典型的には、相同体は、他で特定しない限り、対象のアミノ酸配列と同一の活性部位残基を含むこととなる。
【００７５】
配列整列を実施し、配列同一性を決定するための方法は、当業者に既知であり、不要な実験なしに実施されてもよく、同一性値の計算は、定値性で求められてもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。多数のアルゴリズムが、配列を整列し、配列同一性を決定するために利用可能であり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカル相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性検索法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３〜１８７（１９９７）、及びＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照のこと）が含まれる。
【００７６】
これらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラムも利用可能であり、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２６６：４６０〜４８０（１９９６））、又はＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡにて入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、並びにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、比較される配列の長さに渡る最大の配列を得るために必要なアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定可能である。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されたデフォルトパラメータを用いて決定される。とりわけ、配列同一性は、デフォルトパラメータ、すなわち以下を有するＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０）を使用することによって決定可能である。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
本明細書において使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、当該技術分野において既知のように、核酸の鎖が、塩基対を通して相補鎖と結合するプロセスを意味する。
【００７９】
中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下にて、２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は、参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５°低い）で生じ、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い温度で生じ、「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い温度で生じ、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０〜２５℃低い温度で生じる。機能上、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブに厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用してもよく、一方で、中又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログを同定又は検出するために使用可能である。
【００８０】
中及び高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である。高ストリンジェンシー条件の例として、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ及び１００ｇ／ｍＬの変性キャリアＤＮＡ中約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、室温での２回の洗浄、及び０．１×ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中４２℃での更に２回の洗浄が挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃での一晩インキュベーションと、続く１×ＳＳＣ中３７〜５０℃での濾紙の洗浄が挙げられる。当業者は、温度、イオン強度などを、プローブ長等のような要因に適合するために必要なように、どのような調節をするかを知っている。
【００８１】
生物学的構成成分又は組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関して使用する場合の用語「組換え体」は、当該生物学的構成成分又は組成物が、天然では見られない状態であることを示唆する。換言すれば、生物学的構成成分又は組成物は、その天然の状態から人為的介入によって改変されてきた。例えば、組換え細胞は、元の親（すなわち、非組換え）細胞には見られない１つ又は２つ以上の遺伝子を発現する細胞、その元の親細胞からは異なった量で、１つ又は２つ以上の生来の遺伝子を発現する細胞、及び／又はその元の親細胞とは異なった条件下で、１つ又は２つ以上の生来の遺伝子を発現する細胞を包含する。組換え核酸は、１個又は２個以上のヌクレオチドが生来の配列からは異なってもよく、異種配列（例えば、異種プロモータ、非天然配列又は変異体シグナル配列をコードしている配列など）に操作可能に連結してもよく、イントロン配列を欠いてもよく、かつ／又は単離された形態であってもよい。組換えポリペプチド／酵素は、生来の配列と１個又は２個以上のアミノ酸が異なっていてもよく、異種配列と融合されていてもよく、短縮されている又はアミノ酸の内部欠失を有していてもよく、（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から）元の細胞には見られない様式で発現されていてもよく、かつ／又は単離された形態であってもよい。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチド／酵素が、その野生型対応物と同一であるが、非天然形態（例えば、単離又は濃縮形態）での配列を有することを強調しておく。
【００８２】
本明細書において使用される場合、用語「標的配列」は、宿主細胞ゲノム内に挿入されるべき入来配列に対して所望の配列をコードしている宿主細胞内のＤＮＡ配列を意味する。いくつかの実施形態では、標的配列は、機能的野生型の遺伝子又はオペロンをコードし、一方で他の実施形態では、標的配列は、機能的変異の遺伝子若しくはオペロン、又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「フランキング配列」は、議論している配列の上流又は下流のいずれか一方である任意の配列を意味する（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃに対して、遺伝子Ｂは、Ａ遺伝子配列及びＣ遺伝子配列と隣接する）。実施形態では、入来配列は、各側にて相同ボックスと隣接する。他の実施形態では、入来配列と相同ボックスは、各側にてスタッファー配列と隣接するユニットを含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、片方側（３’又は５’のいずれか一方）のみで存在するが、実施形態では、配列の両側で隣接している。各相同ボックスの配列は、バチルス染色体における配列と相同である。これらの配列は、バチルス染色体内で、新規の構造が統合される場所及び入来配列によって交換されることとなるバチルス染色体の部分を指示する。実施形態では、選択マーカーの５’末端及び３’末端に、不活性化している染色体セグメントを含むポリヌクレオチド配列が隣接している。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、片方側（３’又は５’にいずれか一方）のみに存在する一方で、実施形態では、隣接している配列の両側に存在する。
【００８４】
本明細書において使用される場合、用語「増幅可能マーカー」、「増幅可能遺伝子」、及び「増幅ベクター」は、適切な増殖条件下、遺伝子の増幅を許容する遺伝子をコードしている遺伝子又はベクターを意味する。
【００８５】
「鋳型特異性」は、酵素の選択によって、ほとんどの増幅技術において達成される。増幅酵素は、増幅酵素を使用する条件下、核酸の異種混合物中、特異的な配列の核酸のみを処理することとなる酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡは、レプリカーゼに対する特異的鋳型である（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：３０３８［１９７２］を参照のこと）。他の核酸は、本増幅酵素によって複製されない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、本増幅酵素は、その固有のプロモータに対して、厳格な特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２８：２２７［１９７０］を参照のこと）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、酵素は、２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをライゲートせず、ライゲーションジャンクションにおいて、オリゴヌクレオチド基質又はポリヌクレオチド基質と鋳型との間のミスマッチが存在する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］を参照のこと）。最後に、Ｔａｑポリメラーゼ及びＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する自身の能力のおかげで、プライマーによって結合されて定義される配列に対して高い特異性を示すことが見出され、高温が、標的配列でのプライマーハイブリダイゼーションに有利となる熱力学的な条件をもたらし、非標的配列ではハイブリダイゼーションしない。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「増幅可能核酸」は、任意の増幅法によって増幅されてもよい核酸を意味する。「増幅可能核酸」は、「試料鋳型」を通常含むであろうことが想到される。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「試料鋳型」は、「標的」（以下に定義）の存在に関して解析した試料由来の核酸を意味する。対照的に、「背景鋳型」は、試料中に存在してもよく、又は存在しなくてもよい試料鋳型以外の核酸に関連して使用される。背景鋳型は、ほとんどの場合、意図しないものである。背景鋳型は、キャリーオーバーの結果であってもよく、又は試料から精製除外されることが求められる核酸夾雑物の存在によってもよい。例えば、検出されるべきもの以外の微生物由来の核酸が、試験試料中に背景として存在してもよい。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「プライマー」は、精製された制限消化物の中でのように非人工物として生じるか、又は合成で産生されるかのいずれかに関わらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下、かつ好適な温度及びｐＨにて）に置いたときに、合成の開始点として機能することが可能な、オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、別法として二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーを、伸長産物の調製のために使用する前に、その鎖を分離するようにまず処理する。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下、伸長産物の合成を開始するために十分長くなければならない。プライマーの実際の長さは、温度、プライマーの供給源及び方法の使用を含む多くの因子に依存することとなる。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「プローブ」は、精製された制限消化物の中でのように非人工物として生じるか、合成的、組換え的、又はＰＣＲ増幅によって産生されるかのいずれかに関わらず、目的の他のオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）を意味する。プローブは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用する任意のプローブは、酵素系（例えば、ＥＬＩＳＡ並びに酵素ベースの組織化学アッセイ）、蛍光系、放射性物質系及び発光系を含むが、これらに限定されない任意の検出系にて検出可能であるような、任意の「レポーター分子」で標識されることとなることを想到する。本発明は、特定の検出系又は標識に限定する意図はない。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用する時に、本明細書において使用される場合、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応のために使用するプライマーによって結合された核酸の領域を意味する。したがって、「標的」は、他の核酸配列から探索され、選別される。「セグメント」は、標的配列内の核酸の一領域として定義される。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同４，９６５，１８８号の方法を意味し、これらの方法は、クローニング又は精製なしに、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法を含む。標的配列を増幅するための本プロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物へ導入することからなり、その後、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での正確な順序でのサーマルサイクルが行われる。２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いで、プライマーを標的分子内のプライマーの相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、プライマーを、相補鎖の新規対を形成するように、ポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長の工程は、所望の標的配列の増幅したセグメントを高濃度で得るために、多数回繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長が１回の「サイクル」を構成し、複数回の「サイクル」が可能である）。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決定され、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスの態様を繰り返すことから、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅したセグメントは、混合物において（濃度の点で）主要な配列となるため、これらは「ＰＣＲ増幅」と呼ばれる。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）を意味する。典型的には、他の反応成分とともに、増幅試薬が反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に配置され、収容される。
【００９３】
ＰＣＲにて、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを、種々の異なる方法論（例えば、標識化プローブでのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みと続くアビジン−酵素共役物検出、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰのような３２Ｐ−標識化デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメント内への取り込み）によって検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列を、適切な組のプライマー分子で増幅可能である。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作製された増幅セグメントは、その増幅セグメント自身が、続くＰＣＲ増幅に対して効果的な鋳型である。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」、及び「増幅産物」は、変性、アニーリング及び伸長の２回又は３回以上のサイクルが完了した後に得られる化合物の混合物を意味する。これらの用語は、１つ又は２つ以上の標的配列の、１つ又は２つ以上のセグメントの増幅である場合を包含する。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列の複製及び増幅を意味する。本方法において、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，３２２，７７０号での記述のような、ほとんどの場合、熱安定性ポリメラーゼが使用される１つの酵素処理手段を使用して、逆転写がＰＣＲと結びつく。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡ鋳型は、ポリメラーゼの逆転写酵素活性によってｃＤＮＡに変換され、ついでポリメラーゼの重合化活性を用いて（すなわち、他のＰＣＲ方法と同様に）増幅される。
【００９６】
本明細書において使用される場合、「遺伝子改変宿主株」（例えば、遺伝子改変バチルス株）は、遺伝子操作された宿主細胞を意味し、また組換え宿主細胞とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、遺伝的に改変した宿主細胞では、本質的に同一の増殖条件下で増殖した対応する非改変宿主細胞株における同一の目的のタンパク質の発現及び／又は産生と比較して、目的のタンパク質の発現が増大（増加）する。いくつかの実施形態では、発現レベルの増大は、ｐｄｈオペロンに由来する１つ又は２つ以上の遺伝子の発現の減少からもたらされる。いくつかの実施形態では、改変株は、１つ又は２つ以上の欠失した生来の染色体領域又はその断片を有する遺伝子操作されたバチルス種であり、目的のタンパク質は、本質的に同一の増殖条件下で増殖した対応する非改変バチルス宿主株と比較して、発現レベル又は産生レベルが増大している。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「対応する非改変バチルス株」等は、示唆した遺伝子改変を有しない宿主細胞（例えば、由来（親）株及び／又は野生型株）である。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「染色体統合」は、それによって入来配列が宿主細胞（例えば、バチルス）の染色体内に導入されるプロセスを意味する。ＤＮＡを形質転換する相同領域は、染色体の相同領域と整列する。続いて、相同ボックス間の配列は、二重クロスオーバー（すなわち、相同組換え）において入来配列によって置換される。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ構造物の不活性化染色体セグメントの相同区画が、バチルス染色体の生来の染色体領域の隣接相同領域と整列する。続いて、生来の染色体領域は、二重クロスオーバー（すなわち、相同組換え）においてＤＮＡ構造物によって欠失される。
【００９９】
「相同組換え」は、同一又はほぼ同一のヌクレオチド配列の部位における２つのＤＮＡ分子間又は対となる染色体間での、ＤＮＡ断片の交換を意味する。実施形態では、染色体統合は、相同組換えである。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「相同配列」は、比較のために最適に整列したときに、別の核酸又はポリペプチド配列に対して１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％、又は７０％配列同一性を有する、核酸又はポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、相同配列は、８５％〜１００％配列同一性を有し、一方で、他の実施形態では、９０％〜１００％配列同一性であり、更なる実施形態では、９５％〜１００％配列同一性である。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸」は、ペプチド配列又はタンパク質配列、又はその部分を意味する。用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、相互互換的に使用される。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「目的のタンパク質」及び「目的のポリペプチド」は、所望の、かつ／又は評価されるタンパク質／ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、細胞内タンパク質であり、一方で他の実施形態では、分泌ポリペプチドである。詳細には、ポリペプチドは、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酸化還元酵素、及び植物細胞壁分解酵素から選択される酵素を含むが、これらに限定されない酵素を含む。より詳細には、これらの酵素としては、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペリオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、及びキチナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、シグナルペプチドに融合した分泌ポリペプチド（すなわち、分泌されるべきタンパク質上のアミノ末端伸長）である。ほぼすべての分泌タンパク質が、膜を通過する前駆体タンパク質への標的化、及び転座において重要な役割を果たすアミノ末端タンパク質伸長を使用する。この伸長部は、膜輸送の間、又は直後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質分解的に除去される。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、ホルモン、抗体、増殖因子、受容体等から選択される。本発明に包含されるホルモンとしては、卵細胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。増殖因子は、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、表皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３）のようなサイトカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子などが含まれるが、これらに限定されない。抗体は、抗体が産生されることが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない。加えて、本発明は、改変抗体を包含する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体がまた、本発明によって包含される。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」又は「変異体」は、Ｃ−末端及びＮ−末端のいずれか一方又は両方への１個又は２個以上のアミノ酸の添加、アミノ酸配列中の１個所又は多数箇所の異なる部位での１個又は２個以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドのいずれか一方の末端又は両方の末端、又はアミノ酸配列中の１個所又は２個所以上の部位での１個又は２個以上のアミノ酸の欠失、アミノ酸配列中１個所又は２個所以上の部位での１個又は２個以上のアミノ酸の挿入、及びこれらの任意の組み合わせによる、前駆体ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）由来のポリペプチドを意味する。ポリペプチドの誘導体又は変異体の調製は、任意の従来の様式、例えば、天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の改変、そのＤＮＡ配列の好適な宿主への形質転換、及び誘導体／変異体ポリペプチドを形成するための改変ＤＮＡ配列の発現にて達成されてもよい。誘導体又は変異体は、化学的に改変されたポリペプチドを更に含む。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、用語「異種タンパク質」は、宿主細胞において天然には存在しないタンパク質又はポリペプチドを意味する。異種タンパク質の例としては、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、及びリパーゼを含むヒドロラーゼ；ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、又はムターゼのようなイソメラーゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼのような酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、増殖因子、サイトカイン、リガンド、受容体及び阻害剤、並びにワクチン及び抗体を含むが、これらに限定されない、治療上重要なタンパク質又はペプチドである。更なる実施形態では、タンパク質は、商業的に重要な工業用タンパク質／ペプチド（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ及びグルコアミラーゼのようなカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及びリパーゼ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードしている遺伝子は、天然に存在する遺伝子であり、一方で他の実施形態では、変異導入遺伝子及び／又は合成遺伝子が使用される。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「相同タンパク質」は、天然の、又は細胞内で天然に存在するタンパク質又はポリペプチドを意味する。実施形態では、細胞は、グラム陽性細胞であり、一方で特定の実施形態では、細胞は、バチルス宿主細胞である。他の実施形態では、相同タンパク質は、大腸菌を含むがこれに限定されない他の微生物によって産生された天然タンパク質である。本発明は、組換えＤＮＡ技術を介して相同タンパク質を産生する宿主細胞を包含する。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、「オペロン」は、共通のプロモータからの単一転写ユニットとして転写可能であり、それによって共制御の対象である、一群の連続遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、オペロンは、多数の異なるｍＲＮＡの転写を駆動する複数のプロモータを含んでもよい（例えば、図１において模式的に示したｐｈｄオペロン内のプロモータを参照のこと）。
【０１０８】
本発明は概ね、目的のタンパク質の発現の増加をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞と、そのような細胞の作製及び使用方法に関する。本発明の態様は、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現を減少させ、目的のタンパク質の発現の増大をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス種のようなグラム陽性細菌を含む。
【０１０９】
上で要約したように、本発明の態様は、グラム陽性菌細胞由来の目的のタンパク質の発現を増加させるための方法を含み、対応する非遺伝子改変グラム陽性細胞（例えば、野生型細胞及び／又は親細胞）における同一の目的のタンパク質の発現レベルと比較して、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現が減少するように遺伝子改変されたグラム陽性細胞において目的のタンパク質の産生が増加するという観察に基づく。遺伝子改変とは、例えば、エピソーム添加及び／又は染色体挿入、欠失、逆位、塩基変更などによって、宿主細胞の遺伝子構成を変更する宿主細胞内の任意の改変を意味する。これに関する限定は意図されていない。
【０１１０】
特定の実施形態では、方法は、ｐｄｈオペロンにおいて１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含み、目的のタンパク質を産生でき、目的のタンパク質が改変グラム陽性菌細胞によって発現されるような条件下で、改変グラム陽性菌細胞を培養することが可能である、改変グラム陽性菌細胞を作製すること、又は得ることを伴う。したがって、目的のタンパク質の発現は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞における目的のタンパク質の発現と比較して、改変グラム陽性菌細胞において増加する。
【０１１１】
特定の実施形態に従って、遺伝子改変グラム陽性菌細胞（又は遺伝子改変グラム陽性菌細胞が作製される親細胞）は、バチルス株であり得る。いくつかの実施形態では、目的のバチルス株は、好アルカリ性である。多数の好アルカリ性バチルス株が既知である（例えば、米国特許第５，２１７，８７８号、及びＡｕｎｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＩＶ  ＩＦＳ：Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２９９〜３０５［１９７２］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、目的のバチルス株は、工業用バチルス株である。工業用バチルス株の例としては、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、及びＢ．アミロリクエファシエンスが挙げられるが、これらに限定されない。更なる実施形態において、バチルス宿主株は、上述のように、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンギエンシス、Ｂ．クラウシイ及びＢ．メガテリウム、並びにバチルス属内の他の微生物からなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｂ．サブティリスが使用される。他の好適な株が本発明における使用のために想到されるが、例えば、米国特許第５，２６４，３６６号、同第４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）に本発明での使用が見受けられる種々のバチルス宿主株が記述されている。
【０１１２】
本明細書で記述したような、遺伝子改変細胞の親株（例えば、親バチルス株）は、非組換え株、天然に存在する株の変異株、又は組換え株を含む、工業用株であってもよい。特定の実施形態では、親株は、目的のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが宿主内に導入された、組換え宿主株である。目的のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの導入は、親株において実施されてもよいが、この工程はまた、本明細書で詳述したように、ポリペプチド産生の増加のために、既に遺伝的に改変された株において実施されてもよい。いくつかの実施形態では、宿主株は、バチルス・サブティリス宿主株、例えば、組換えＢ．サブティリス宿主株である。
【０１１３】
１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０及びＰＥＰ  ２１１株（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３：２１５〜２２８［１９７３］、米国特許第４，４５０，２３５号、米国特許第４，３０２，５４４号及び欧州特許第０１３４０４８号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない、本発明の態様での使用が見受けられる多くのＢ．サブティリス株が既知である。発現宿主としてのＢ．サブティリスの利用が、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．及び他で更に記述されている（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１〜８７［１９８２］を参照のこと、またＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４［１９８６］及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９〜４７［１９８８］も参照のこと）。
【０１１４】
特定の実施形態では、工業用プロテアーゼ産生バチルス株が、親発現宿主として利用可能である。いくつかの実施形態では、本発明におけるこれらの株の使用により、効率及びプロテアーゼ産生の更なる増大がもたらされる。２種の一般的なタイプのプロテアーゼは典型的には、バチルス種、すなわち、中性プロテアーゼ（又は「メタロプロテアーゼ」）及びアルカリ性（又は「セリン」）プロテアーゼによって分泌される。セリンプロテアーゼは、必須セリン残基が活性部位に存在するペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。セリンプロテアーゼは、２５，０００〜３０，０００の範囲の分子量を有する（Ｐｒｉｅｓｔ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４１：７１１〜７５３［１９７７］を参照のこと）。サブチリシンは、本発明での使用のためのセリンプロテアーゼである。多種多様なバチルス由来サブチリシン、例えば、サブチリシン１６８，サブチリシンＢＰＮ’，サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、及びサブチリシン３０９が同定され、配列決定されている（例えば、欧州特許第４１４２７９  Ｂ号、国際公開第８９／０６２７９号、及びＳｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９：８１１〜８１８［１９８４］を参照のこと）。本発明のいくつかの実施形態では、バチルス宿主株は、変異（例えば、変異体）プロテアーゼを産生する。多数の参考文献が、変異体プロテアーゼの例及び参照を提供している（例えば、国際公開第９９／２０７７０号、国際公開第９９／２０７２６号、国際公開第９９／２０７６９号、国際公開第８９／０６２７９号、再発行特許第３４，６０６号、米国特許第４，９１４，０３１号、米国特許第４，９８０，２８８号、米国特許第５，２０８，１５８号、米国特許第５，３１０，６７５号、米国特許第５，３３６，６１１号、米国特許第５，３９９，２８３号、米国特許第５，４４１，８８２号、米国特許第５，４８２，８４９号、米国特許第５，６３１，２１７号、米国特許第５，６６５，５８７号、米国特許第５，７００，６７６号、米国特許第５，７４１，６９４号、米国特許第５，８５８，７５７号、米国特許第５，８８０，０８０号、米国特許第６，１９７，５６７号、及び米国特許第６，２１８，１６５号を参照のこと）。
【０１１５】
なお、本発明は、目的のタンパク質としてプロテアーゼに限定していないことに留意されたい。実際、本開示は、グラム陽性細胞における発現の増加が望ましい多種多様なタンパク質を包含する（以下で詳述する）。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明の態様で使用する株は、有益な表現型を提供する他の遺伝子において、更なる遺伝子改変を有してもよい。例えば、以下の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、及びｄｅｇＱのうち少なくとも１つにおける変異又は欠失を含むバチルス種が用いられてもよい。いくつかの実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ遺伝子において起こり、例えば、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異である（Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８２４〜８３４［１９９０］及びＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５３：５６２〜５６７［１９９７］を参照のこと。したがって、本発明の態様において使用が見出される親グラム陽性株／遺伝子改変グラム陽性株の１つの例は、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）変異を有するバチルス・サブティリス細胞である。更なる実施形態では、バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４における変異又は欠失（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９〜７３４０［２００１］を参照のこと）、ｓｐｏＩＩＥにおける変異又は欠失（Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１４０７〜１４１５［１９９９］を参照のこと）、ｏｐｐＡ又はｏｐｐオペロンの他の遺伝子における変異又は欠失（Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３〜１８５［１９９１］を参照のこと）を含んでもよい。実際、ｏｐｐＡ遺伝子における変異として同一の表現型を引き起こすｏｐｐオペロンにおける任意の変異は、本発明の改変バチルス株のいくつかの実施形態において使用が見受けられることとなることが想到される。いくつかの実施形態では、これらの変異が単独で発生する一方、他の実施形態では、変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態では、本発明の改変バチルスは、上記遺伝子のうち１つ又は２つ以上に対して既に変異を含んでいる親バチルス宿主株から得られる。他の実施形態では、先に遺伝子を改変された本発明のバチルスは、上述の遺伝子のうち１つ又は２つ以上の変異を含むように更に遺伝子操作される。
【０１１７】
上で示唆したように、ｐｄｈオペロンの少なくとも１つの遺伝子の発現は、（本質的に同一の条件下で増殖した）野生型細胞及び／又は親細胞と比較して、遺伝子改変グラム陽性細胞において減少する。この発現の減少は、任意の従来の様式で達成可能であり、転写、ｍＲＮＡ安定化、翻訳のレベルで生じ得、又はその活性が減少するｐｄｈオペロンから産生されたポリペプチドのうち１つ又は２つ以上における変化の存在によって生じ得る（すなわち、ポリペプチドの活性に基づく発現の「機能的」減少である）。そのように、遺伝子改変の型又はｐｄｈオペロンにおける少なくとも１つの遺伝子の発現が減少する様式における限定は意図されていない。例えば、いくつかの実施形態では、グラム陽性細胞における遺伝子改変は、転写活性の減少をもたらしているｐｄｈオペロンにおけるプロモータのうち１つ又は２つ以上を改変させるものである。特定の実施形態では、改変は、（例えば、実施例で示すような）ｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらすｐｄｈオペロン内のサイレント変異である。あるいは、グラム陽性細胞における遺伝子改変は、細胞内での安定性が減少した転写物をもたらしているｐｄｈオペロンにおけるヌクレオチドを改変させるものであり得る。特定の実施形態では、ｐｄｈオペロンにおいて１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる２つ以上の遺伝子改変が、遺伝子改変グラム陽性細胞中に存在してもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現が、本質的に同一の培養条件下で培養した野生型細胞及び／又は親細胞における発現レベルの約３％まで遺伝子改変グラム陽性細胞において減少し、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％又は約８０％を含む。そのため、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現の減少範囲は、約３％〜約８０％、約４％〜約７５％、約５％〜約７０％、約６％〜約６５％、約７％〜約６０％、約８％〜約５０％、約９％〜約４５％、約１０％〜約４０％、約１１％〜約３５％、約１２％〜約３０％、約１３％〜約２５％、約１４％〜約２０％などであり得る。上で列記した範囲内の発現の任意の下位範囲が想到される。
【０１１９】
特定の実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞におけるこれらの遺伝子の発現と比較して、ｐｄｈＡ遺伝子、及び／又はｐｄｈＢ遺伝子、及び／又はｐｄｈＣ遺伝子、及び／又はｐｄｈＤ遺伝子、又はそれらの任意の組み合わせの発現を減少させる。特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞におけるｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす。
【０１２０】
特定の実施形態では、変異は、ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において起こる。親グラム陽性細胞内（すなわち、本明細書で記述するように遺伝子改変される前）のｐｄｈＤ遺伝子は、配列番号１に少なくとも６０％同一である遺伝子であり、配列番号１に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変は、サイレント変異であり、サイレント変異は、翻訳されたとき、コードされたポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらさない遺伝子のコード領域の核酸配列における変異を意味する（当該技術分野においてよく理解される用語）。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である（配列番号３で示す）。
【０１２１】
上で示唆したように、多くの異なるタンパク質が、グラム陽性細胞において目的のタンパク質（すなわち、その発現が遺伝子改変細胞において増加するタンパク質）としての使用が見受けられる。目的のタンパク質は、相同タンパク質又は異種タンパク質であってもよく、野生型タンパク質又は自然変異体又は組換え変異体であってもよい。特定の実施形態において、目的のタンパク質は、酵素であり、特定の場合には、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、プロテアーゼであり、プロテアーゼは、サブチリシンであってもよく、サブチリシンは、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン・カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、及びこれらの変異体からなる群から選択されるサブチリシンであってもよい。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【０１２２】
特定の実施形態では、本方法は、目的のタンパク質を回収することを更に含む。目的のタンパク質の発現／産生のレベルが、（野生型細胞又は親細胞と比較して）遺伝子改変グラム陽性細胞において増加するため、本質的に同一の培養条件下（かつ同一のスケールで）培養した対応する野生型細胞及び／又は親細胞と比較して、回収した目的のタンパク質の量は増加する。細胞内発現ポリペプチド及び細胞外発現ポリペプチドの発現レベル／産生を検出及び測定するための、当業者に既知の種々のアッセイがある。そのようなアッセイは、本発明の使用者によって判定されることとなり、目的のタンパク質の同一性及び／又は活性（例えば、酵素活性）に依存し得る。例えば、プロテアーゼに関して、２８０ｎｍでの吸光度として測定されるカゼイン若しくはヘモグロビン由来の酸溶解ペプチドの放出に基づくアッセイ、又はフォリン法（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ［１９８４］を参照のこと）を比色分析的に使用するアッセイがある。他のアッセイは、色素基質の可溶化を伴う（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」  ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］、ｐｐ  ２５１〜３１７を参照のこと）。アッセイの他の例としては、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に既知の多数の更なる参照文献により、好適な方法が提供される（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５［１９８３］、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１１９〜１２９［１９９４］及びＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１〜２２７［１９９９］を参照のこと）。
【０１２３】
また、上で示唆したように、宿主細胞における目的のタンパク質の分泌レベルを判定する方法、及び発現したタンパク質を検出する方法は、目的のタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれか一方を用いる免疫アッセイの利用を含む。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。しかしながら、他の方法も当該技術分野において既知であり、目的のタンパク質をアッセイする際の使用が見受けられる（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ［１９９０］及びＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１［１９８３］を参照のこと）。当該技術分野において既知のように、本発明を使用して作製した改変バチルス細胞を、目的のポリペプチドの発現及び細胞培養液からの回収に好適な条件下で維持し、かつ増殖させる（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照のこと）。更に、本明細書で記述した遺伝子改変細胞は、２種類又はそれ以上、３種類又はそれ以上、４種類又はそれ以上、５種類又はそれ以上、６種類又はそれ以上、７種類又はそれ以上、８種類又はそれ以上、９種類又はそれ以上、１０種類又はそれ以上等を含む、２種類以上の目的のタンパク質を発現してもよい。いくつかの実施形態では、細菌セクレトームにおけるタンパク質の発現の増加が望ましく、細胞から分泌される多数の異なるタンパク質が含まれる。
【０１２４】
本発明の態様は、タンパク質産生能が改善した、改変グラム陽性菌細胞を得るための方法を含む。概ね、方法は、（上で定義したように）ｐｄｈオペロンにおいて１つ又は２つ以上の遺伝子の発現が減少する遺伝子改変株をもたらすために、親グラム陽性細胞を遺伝的に改変させることを含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、方法は、染色体内に統合されると、又はエピソーム遺伝子要素として維持されると、親グラム陽性菌細胞にポリヌクレオチド配列を導入することを含み、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現レベルが減少する遺伝子改変グラム陽性細胞がもたらされる。
【０１２６】
ポリヌクレオチドベクター（例えば、プラスミド構築物）を使用して、バチルスの染色体を改変させるための、又はバチルスの中のエピソーム遺伝的要素を保持するための、バチルス種の形質転換に関する種々の方法が既知である。バチルス細胞内にポリヌクレオチド配列を導入するための好適な方法は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐａｇｅｓ  ５７〜７２で見られる。また、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８〜７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５〜１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１〜１３５［１９８６］；及びＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］；Ｂ．サブティリスに関して、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１〜１１５［１９７９］；Ｂ．メガテリウムに関して、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１〜２６３［１９８０］；Ｂ．アミロリクエファシエンスに関して、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４（１９８６）；Ｂ．チューリンギエンシスに関して、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３〜２１７［１９８１］；及びＢ．スファエリカスに関して、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］を参照のこと。実際、プロトプラスト形質転換と会合とを含む形質転換、形質導入及びプロトプラスト融合のような方法が既知であり、本発明での使用に好適である。形質転換の方法は、具体的には、本発明によって提供されたＤＮＡ構築物を宿主細胞内に導入することである。
【０１２７】
更に、ＤＮＡ構築物の宿主細胞への導入は、標的化ＤＮＡ構造物のプラスミド又はベクターへの挿入なしに、宿主細胞内へＤＮＡを導入するための、当該技術分野において既知の物理的方法及び化学的方法を含む。そのような方法には、塩化カルシウム沈降、エレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡ、リポソームなどが含まれるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、ＤＮＡ構築物を、プラスミド内に挿入せずに、プラスミドにと共に同時形質転換可能である。
【０１２８】
選択可能なマーカー遺伝子を、安定形質転換体を選択するために使用する実施形態において、任意の従来の方法を使用して、遺伝子改変グラム陽性株から選択マーカーを欠失することが所望され、多くの方法が当該技術分野において既知である（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１〜４１８［１９８４］及びＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５〜２６４［２０００］を参照のこと）。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、２つ又はそれ以上のＤＮＡ構築物（すなわち、それぞれが、宿主細胞を遺伝子的に改変させるように設計されたＤＮＡ構築物）を親グラム陽性細胞に導入し、細胞における２つ又はそれ以上の遺伝子改変の導入、例えば、２個所又は３個所以上の染色体領域の改変がもたらされる。いくつかの実施形態では、これらの領域は、連続しており（例えば、ｐｄｈオペロン内の２つの領域、又はｐｄｈオペロンと隣接遺伝子若しくは隣接オペロン内の２つの領域）、他の実施形態では、領域は、分離している。いくつかの実施形態では、遺伝子改変のうち１つ又は２つ以上は、エピソーム遺伝的要素の添加によるものである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、２つ又はそれ以上の遺伝子が宿主細胞において不活性化した改変バチルス株を作製するために、本発明に従った１つ又は２つ以上のＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転換する。いくつかの実施形態では、２つ又はそれ以上の遺伝子を宿主細胞染色体から欠失させる。他の実施形態では、２つ又はそれ以上の遺伝子をＤＮＡ構築物の挿入によって不活性化する。いくつかの実施形態では、（欠失及び／又は挿入によってのいずれかに関わらず不活性化された）不活性化遺伝子は連続しているが、一方で他の実施形態では、これらは連続遺伝子ではない。
【０１３１】
遺伝的改質宿主細胞が作製されると、目的のタンパク質が発現するような条件下で培養可能であり、特定の実施形態では、目的のタンパク質が回収される。
【０１３２】
本発明の態様は、改変グラム陽性菌細胞を含み、この改変グラム陽性菌細胞は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変グラム陽性細胞は、上述したように作製される。上で更に述べられたように、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス種株、例えば、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ロータス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．メガテリウム、又はＢ．チューリンギエンシス株であり得る。特定の実施形態では、バチルス種株は、Ｂ．サブティリス株である。いくつかの態様では、改変グラム陽性菌細胞は、細胞の表現型を改善する更なる変異、例えば、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及びｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子における変異を更に含む。特定の実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【０１３３】
特定の実施形態では、ｐｄｈオペロンの少なくとも１つの遺伝子の発現が、（本質的に同一の条件下で増殖した）野生型細胞及び／又は親細胞と比較して、遺伝子改変グラム陽性細胞において減少する。発現のこの減少は、任意の従来の様式で達成可能であり、転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳のレベルで生じ得、又はその活性を減少させるｐｄｈオペロンから産生したポリペプチドのうち１つ又は２つ以上における変化の存在によって生じ得る（すなわち、ポリペプチドの活性に基づく発現の「機能的」減少である）。そのように、遺伝子改変の形式又はｐｄｈオペロンにおける少なくとも１つの遺伝子の発現が減少する様式における限定は意図されていない。例えば、いくつかの実施形態では、グラム陽性細胞における遺伝子改変は、転写活性の減少をもたらすｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上のプロモータを改変させるものである。特定の実施形態では、改変は、（例えば、実施例で示すような）ｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす、ｐｄｈオペロンにおけるサイレント変異である。あるいは、グラム陽性細胞中の遺伝子改変は、細胞中の安定性が減少する転写物をもたらす、ｐｄｈオペロン中のヌクレオチドを改変させるものであり得る。特定の実施形態では、ｐｄｈオペロンにおける１つ又は２つ以上の遺伝子の発現を減少させる２つ以上の遺伝子改変が、遺伝子改変グラム陽性細胞内に存在してもよい。特定の実施形態では、遺伝子改変は、本質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞においてｐｄｈオペロン由来のｍＲＮＡ転写物のレベルの減少をもたらす。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、宿主細胞内に安定して組み込まれたときに、（上で詳細に記述したように）ｐｄｈオペロンにおいて１つ又は２つ以上の遺伝子の発現が減少するように細胞を遺伝的に改変する入来配列を含むＤＮＡ構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、インビトロでアセンブリされ、続いて、ＤＮＡ構築物が宿主細胞染色体内に統合されるように、コンピテントグラム陽性（例えば、バチルス）の宿主内へ構築物を直接クローニングする。例えば、ＰＣＲ融合及び／又はライゲーションを用いて、インビトロでＤＮＡ構築物をアセンブリすることが可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、非プラスミド構築物であり、一方、他の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、ベクター（例えば、プラスミド）内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、環状プラスミドが使用される。実施形態では、環状プラスミドは、適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築物を破壊しない酵素）を使用するように設計されている。したがって、直鎖プラスミドは、本発明での使用が見受けられる。しかしながら、当業者に既知のように、他の方法が、本発明での使用に好適である（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，」ｉｎ（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ［１９９３］を参照のこと）。
【０１３５】
特定の実施形態では、ＤＮＡ標的化ベクターの入来配列には、ｐｄｈＤ遺伝子由来の変異体配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。これらの実施形態のうちいくつかでは、変異体配列は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、配列番号１のすべて又は一部と少なくとも６０％同一であり、グラム陽性菌細胞の内因性ｐｄｈＤ遺伝子内に変異が存在する場合に、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の発現の減少をもたらす少なくとも１つの変異をｐｄｈＤ遺伝子内のヌクレオチド位置に有する。変異体配列は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１１００ヌクレオチド、約１２００ヌクレオチド、約１３００ヌクレオチド、約１４００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。上で更に記述されたように、変異体配列は、配列番号１に対して少なくとも約６０％同一であってもよく、配列番号１に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％同一であることを含む。特定の実施形態では、変異体配列中の遺伝子改変は、サイレント変異であり、サイレント変異は、翻訳されたとき、コードされたＰｄｈＤポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらさないｐｄｈＤ遺伝子のコード領域の変異体配列における変異を意味する（当該技術分野においてよく理解される用語）。特定の実施形態では、変異体配列における変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置において起こる。特定の実施形態では、変異体配列における変異は、配列番号１のヌクレオチド７２９に対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である（配列番号３で示される）。
【０１３６】
本発明の態様には、上記のようなポリヌクレオチド配列を含むベクターが含まれる。特定の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチド配列中の少なくとも１つの変異を、グラム陽性菌細胞に形質転換したときに相同組換えによって、グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロン内の対応する場所へ導入するように設計された標的ベクターである。いくつかの実施形態では、入来配列／ベクターには、選択マーカーが含まれる。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、２つのｌｏｘＰ部位間に位置し（Ｋｕｈｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０：１７５〜２０４［２００２］）、その後、抗菌遺伝子がＣｒｅタンパク質の作用によって欠失される。
【０１３７】
本発明の態様には、上述したＤＮＡ構築物又はベクターで親グラム陽性菌細胞を形質転換すること（すなわち、宿主細胞内に安定して組み込んだときに、入来配列を含み、ｐｄｈオペロン中の１つ又は２つ以上の遺伝子の発現が減少するように細胞を遺伝的に変質させるもの、例えば、上に列記したｐｄｈＤ遺伝子内の変異を含むもの）と、ベクターと、親グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロン内の対応する領域との相同組換えを許容して変異グラム陽性菌細胞を作製することと、目的のタンパク質の発現に好適な条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を増殖させることであって、前記目的のタンパク質の産生が、工程における前記形質転換の前の前記グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞において増加する、改変グラム陽性菌細胞を増殖させることと、を含む、グラム陽性菌細胞内の目的のタンパク質の発現を増大させるための方法が含まれる。本発明の本態様での使用が見受けられるグラム陽性株、変異及び他の特徴が上で詳細に記述されている。
【０１３８】
ＤＮＡ構築物をベクター内に組み込むか、又はプラスミドＤＮＡの存在なしに使用するかのいずれかに関わらず、微生物を形質転換するためにＤＮＡ構築物が使用される。形質転換のための任意の好適な方法は、本発明での使用が見受けられることとなることが想到される。実施形態では、ＤＮＡ構築物の少なくとも１つのコピーを宿主バチルス染色体へ統合する。いくつかの実施形態では、本発明の１つ又は２つ以上のＤＮＡ構築物を、宿主細胞を形質転換するために使用する。
【０１３９】
本発明を実施する様式及び方法は、以下の実施例を参照することで、当業者はより完全に理解されることができ、実施例は、本発明の範囲又はこれを目的とする特許請求の範囲を制限することを一切意図しない。
【０１４０】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び態様を例証し、更に説明するために提供され、その範囲を制限すると解釈するべきではない。
【０１４１】
以下の実験の開示において、以下の略語の一部を適用する。℃（摂氏温度）、ｒｐｍ（毎分回転数）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μＬ（マイクロリットル）、ｍＬ（ミリリットル）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈｒ（時間）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）。
【実施例】
【０１４２】
（実施例１）
ｐｄｈオペロン内の変異によるバチルス内のタンパク質発現の増加
Ａ．ｐｄｈオペロン
図１は、バチルス・サブティリスのｐｄｈオペロンの模式図を示す。図１において、ｐｄｈオペロンにおける各コード領域は、転写の方向を示す矢印（ｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ、及びｐｄｈＤ）で示される。コード領域に加えて、転写開始部位は、折れ矢印で示される。図１上で示すように、ｐｄｈＡコード領域及びｐｄｈＢコード領域の転写は、ｐｄｈＡ遺伝子の前に存在するＳｉｇＡプロモータによって制御されると考えられる。同様に、ｐｄｈＣ遺伝子及びｐｄｈＤ遺伝子は、ｐｄｈＣ遺伝子の前に存在するＳｉｇＡプロモータによって制御されると考えられる。ｐｄｈＣ遺伝子の前のＳｉｇＡプロモータに加えて、ｐｄｈＤ遺伝子の転写は、（ｐｄｈＤ遺伝子の前に疑問符記号とともに折れ矢印として示した）ｐｄｈＣ遺伝子の前のＳｉｇＡプロモータに加えて、それ自身のプロモータによって制御されてもよい。本模式図は、ｐｄｈオペロンの転写の制御に関する現在の本発明者らの理解を表す一方で、包括的であることを意味するわけではない。または、図１で図示されない他のプロモータ／転写因子の相互作用は、ｐｄｈオペロンにおける遺伝子の転写を制御することに関与してもよい。
【０１４３】
図１に示すｐｄｈオペロン内の遺伝子は以下の通りである。
１．ＰｄｈＡ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分、アルファサブユニット）、
２．ＰｄｈＢ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分、ベータサブユニット）、
３．ＰｄｈＣ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ［ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼＥ２サブユニット］）、及び
４．ＰｄｈＤ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ［ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼＥ３サブユニット］）。
【０１４４】
上で列記した遺伝子のうち、ｐｄｈＡは、必須遺伝子であると考えられる。ｐｄｈＤ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡ経路におけるピルビン酸のリサイクルに関与し、ｐｄｈオペロンの最終遺伝子である。（ｐｄｈＡＢ）−ｐｄｈＣＤ。
【０１４５】
Ｂ．ｐｄｈオペロンにおけるｐｄｈＤ遺伝子の変異
サイレント変異を、Ｊａｎｅｓ及びＳｔｉｂｉｔｚ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７４（３）：１９４９，２００６）によって記述された方法を使用して、ｐｄｈオペロンのｐｄｈＤ遺伝子において、親バチルス・サブティリス株ＣＢ１５−１４（ａｍｙＥ：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ，ΔｏｐｐＡ，ΔｓｐｏｌｌＥ，ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣ）に導入した。ｐｄｈＤサイレント変異は、野生型ｐｄｈＤのコード配列のセンス鎖のヌクレオチド位置７２９におけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への単一ヌクレオチド変化である（配列番号１は、野生型配列を示し、配列番号３は、Ｃ７２９Ｔサイレント変異を示す）（サイレント変異は、遺伝子のコード領域中の部位の核酸配列を変化させる変異であるが、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない変異である）。得られた株ＣＢ１５−１４  ｐｄｈＤは、「ｐｄｈＤ変異株」、「変異株」、又はそれらの等価物として本明細書で参照される場合がある。非変異株（ＣＢ１５−１４）は、「親株」又はその等価物として本明細書で参照される場合がある。
【０１４６】
Ｃ．ｐｄｈＤ変異株におけるアミラーゼ発現
ａｐｒＥプロモータからのＡｍｙＥ（配列番号４に示した成熟配列）の発現を駆動し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子（ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ  ｃａｔＲと示される）を含むアミラーゼ発現構築物を、ｐｄｈＤ変異株及び非変異親株のａｐｒＥ座内に導入した。２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬｕｒｉａ寒天平板培地上で株を増幅させた。ｐｄｈＤ変異株と野生型株とを、５ｍＬのＬｕｒｉａブロス培地において一晩増殖させた。ａｍｙＥアミラーゼ遺伝子の発現を試験するために、１ｍＬのプレ培養液を使用して、３７℃、２５０ｒｐｍにて、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＬｕｒｉａブロス培地に接種した。細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、１時間おきに、６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図２Ａに示す。図２Ａは、ＡｍｙＥ発現親株ＣＢ１５−１４及びＡｍｙＥ発現ＣＢ１５−１４  ｐｄｈ株の細胞培養が等価であることを示し、これは、ＣＢ１５−１４  ｐｄｈ株におけるｐｄｈＤ変異の存在が細胞増殖に影響を与えないことを示唆している。
【０１４７】
ブロス全体のＡｍｙＥアミラーゼ活性を、Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して測定した。Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキットからのＣｅｒａｌｐｈａ試薬ミックスをまず、１０ｍＬのＭｉｌｉＱ水に溶解し、ついで、ｐＨ５．６の５０ｍＭマレイン酸緩衝液を３０ｍＬ添加した。培養上清を、ＭｉｌｉＱ水に４０倍で希釈し、５μＬの希釈試料を、５５μＬの希釈標準基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを、振盪の後、室温で４分間インキュベートした。反応を、ｐＨ１０．２の２００ｍＭホウ酸緩衝液（停止液）を７０μＬ加えることによってクエンチした。溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して４００ｎｍで測定した。４００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中のグラフは、ＣＢ１５−１４  ｐｄｈ変異株における増殖６時間時点で開始したＡｍｙＥ産生の増加を示す。（図２Ａで示すように）細胞増殖が、変異株において影響を受けないことを考慮すると、同一の培養条件下で増殖させた親細胞と比較して、ｐｄｈＤ変異を有するバチルス細胞におけるＡｍｙＥ産生の増加は、培養液中の細胞数の増加に起因するのではなく、細胞それ自身における（すなわち、細胞ごとの）発現レベルの増加に起因する。
【０１４８】
Ｄ．ｐｄｈＤ変異株におけるプロテアーゼ（ＦＮＡ）発現
ＦＮＡプロテアーゼ（Ｙ２１７Ｌ置換を含有するサブチリシンＢＰＮ’、配列番号５）の発現における、ｐｄｈＤ遺伝子中のサイレント変異の効果を試験するために、（ａｐｒＥプロモータからのＦＮＡを発現し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔ）マーカー遺伝子を含む）ＰａｐｒＥ−ＦＮＡ  ｃａｔＲ構築物を、ＣＢ１５−１４親株及びＣＢ１５−１４  ｐｄｈＤ変異株のａｐｒＥ座中に導入した。ＰａｐｒＥ−ＦＮＡ  ｃａｔＲ構築物を、上記（Ｃ）にて記述したように増幅した。２つのクローンをそれぞれに対して解析した（親ＦＮＡ細胞に対してクローン１及び２、変異細胞に対してクローン１及び１８）。ｐｄｈＤ変異株と野生型株とを、５ｍＬのＬｕｒｉａブロス内で一晩増殖させた。プロテアーゼ発現を試験するために、１ｍＬのプレ培養液を使用して、２５ｍＬのＮＢ培地（２倍）（栄養ブロス（２倍）、ＳＮＢ塩（１倍）、国際公開第２０１０／１４４８３号に記載）に、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ製フラスコ中、２５０ｒｐｍにて接種した。２０倍に希釈されたブロス全体の細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、１時間間隔で、６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図３Ａに示す。図３Ａは、ＦＮＡ発現親株Ｃ１５−１４の細胞増殖が、ＦＮＡ発現ＣＢ１５−１４  ｐｄｈ株と比較して減少することを示しており、これは、これらのＦＮＡ発現株中のｐｄｈＤ変異が細胞増殖に正に影響を与えることを示唆している。
【０１４９】
国際公開第２０１０／１４４２８３号に記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製）を使用して、プロテアーゼ発現をモニタした。簡潔に、ブロス全体をアッセイ緩衝液（１００ｍＭトリス、０．００５％ツイン８０、ｐＨ８．６）中で４０倍に希釈し、１０μＬの希釈した試料をマイクロタイタープレート内に配列した。ＡＡＰＦストック溶液を希釈し、アッセイ緩衝液（１００ｍｇ／ｍＬのＡＡＰＦストック溶液をＤＭＳＯ中で１００倍に希釈したもの）及び１９０μＬの本溶液をマイクロタイタープレートに添加し、本溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示すように、ＦＮＡ産生が、同一の培養条件下で増殖させた親細胞の培養液と比較して、ｐｄｈＤ変異を有するバチルス細胞培養液において増加している。ＦＮＡ産生の増加は、親株培養液と比較して、ｐｄｈＤ変異細胞培養液中に存在する細胞数の増加に起因するとしてもよい。
【０１５０】
Ｅ．ｐｄｈＤ変異株におけるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現
他のタンパク質の発現における、ｐｄｈＤ遺伝子におけるサイレント変異の効果を試験するために、ａｐｒＥプロモータによって制御されたＧＦＰ発現を有し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性マーカー（配列番号６は、ＧＦＰのアミノ酸配列を示す）を含む、ＰａｐｒＥ−ＧＦＰ  ｃａｔＲ構築物を、ＣＢ１５−１４親株及びＣＢ１５−１４  ｐｄｈＤ変異株のａｐｒＥ座中に導入した。形質転換体を、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬｕｒｉａ寒天平板培地上で選択した。ＧＦＰを発現している２つのｐｄｈＤ変異株（クローン１及び２）と、ＧＦＰを発現している２つの野生型株（クローン１及び２）とを、５ｍＬのＬｕｒｉａブロス内で一晩増殖させた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を試験するために、１ｍＬのプレ培養液を使用して、２５ｍＬのＮＢ培地（２倍）（栄養ブロス（２倍）、ＳＮＢ塩（１倍））に、振盪フラスコ中で、３７℃、２５０ｒｐｍで接種した。２０倍に希釈されたブロス全体の細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、１時間間隔で６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図４Ａに示す。定常期（ＮＢ培地（２倍）での増殖の４時間目と６時間目との間）に突入する際、ｐｄｈＤ突然変異株の細胞の増殖の減少は、ｐｄｈＤ変異により改善した細胞の生存性を示す対照株と比較すると、遅延している。
【０１５１】
ＧＦＰ発現を測定するために、１００μＬの培養物を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４８５ｎｍの励起波長、５０８ｎｍの発光波長を使用して、４９５ｎｍの発光カットオフフィルターを使用して、蛍光プレートリーダーにおいてＧＦＰ発現を測定した。４８５／５０８ｎｍでの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を時間の関数としてプロットし、その結果を図４Ｂに示す。グラフは、ｐｄｈＤ変異により、増殖６時間目からＧＦＰ発現が増加していることを示す。野生型株と比較して、変異株でのＧＦＰ発現の増加レベルは、図４Ａで見られる、単に細胞生存における改善から予想されると考えられるレベルを超過している。
【０１５２】
Ｆ．ｐｄｈＤ変異株におけるβ−Ｄ−グルコシダーゼ（ＢｇｌＣ）発現
β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＢｇｌＣ）発現における、ｐｄｈＤ遺伝子におけるサイレント変異の効果を試験するために（配列番号７は、ＢｇｌＣのアミノ酸配列を示す）、ａｐｒＥプロモータによって制御されたＢｇｌＣ発現を有し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性マーカーを含む、ＰａｐｒＥ−ＢｇｌＣ  ｃａｔＲ構築物を、ＣＢ１５−１４親株及びＣＢ１５−１４  ｐｄｈＤ変異株のａｐｒＥ座中に導入した。形質転換体を、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬｕｒｉａ寒天平板培地上で選択した。ＢｇｌＣを発現している２つのｐｄｈＤ変異株（クローン１及び２）と２つの野生型株（クローン１及び２）とを、５ｍＬのＬｕｒｉａブロス内で一晩増殖させた。分泌されたＢｇｌＣの発現を試験するために、１ｍＬのプレ培養液を使用して、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＮＢ培地（２倍）（栄養ブロス（２倍）、ＳＮＢ塩（１倍））を、３７℃、２５０ｒｐｍで接種した。２０倍に希釈されたブロス全体の細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、１時間間隔で、６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図５Ａに示す。同様の細胞密度が、対照株とｐｄｈＤ変異を含有する誘導株に関して見られた。
【０１５３】
４−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））、カタログ番号Ｎ５７５９０）を使用して、ＢｇｌＣ発現をモニタした。基質を１ｍＬのＤＭＳＯ中で溶解して、１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液を生成した。１０ｍＬのアッセイ緩衝液（１００ｍＭトリス、０．００５％ツイン８０、ｐＨ８．６）中で３５μＬのストック溶液を希釈することによって、標準基質溶液を作製した。４０マイクロリットルの各培養物を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、１８０μＬのワーキング基質溶液を各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートを室温で５時間インキュベートし、インキュベーション期間の終わりに、本溶液の吸収度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））を使用して、４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、その結果を図５Ｂに示す。グラフは、時間経過実験を通して、同一の培養条件下の親株と比較して、変異株からのＢｇｌＣの発現レベルの増加を示す。（図５Ａで示すように）細胞増殖が、変異株において影響を受けないことを考慮すると、同一の培養条件下で増殖させた親細胞と比較して、ｐｄｈＤ変異を有するバチルス細胞におけるＢｇｌＣ産生の増加は、培養液中の細胞数の増加に起因するのではなく、細胞それ自身における（すなわち、細胞ごとの）発現レベルの増加に起因する。
【０１５４】
Ｇ．ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子のｍＲＮＡ転写物は、ｐｄｈＤ変異株において減少する。
定量ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施して、ｐｄｈＡ遺伝子及びｐｄｈＢ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルにおける、ｐｄｈＤ遺伝子中のサイレント変異の効果を決定した。全ＲＮＡを、ＮＢ培地（２倍）中、４時間時点にてＦＮＡを発現しているＣＢ１５−１４親株及びｐｄｈＤ変異株から抽出し（指数的増殖期中の細胞、細胞は、上記（Ｄ）にて実施した実験由来）、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ）で処理した。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲ実験を、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＬＣ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（ＵＳＡ））と、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とを使用して実施し、野生型及び変異株におけるｐｄｈＡ転写物及びｐｄｈＢ転写物の量を比較した。ｐｄｈＡ  ｍＲＮＡ及びｐｄｈＢ  ｍＲＮＡを、以下のオリゴマーとユニバーサルプローブ（ＵＰＬ）を使用して増幅した。
【０１５５】
ｐｄｈＡ：
ＵＰＬプローブ１４８
オリゴ６４４：５’−ａｇｃｔａｔｃｇｔｔｇａｃａｇｔａａｇａａｇｃａ−３’（配列番号８）
オリゴ６４５：５’−ｔｔｇｇａａｃｇｔｔｔｃｇａａｃｔｇｃ−３’（配列番号９）
【０１５６】
ｐｄｈＢ
ＵＰＬプローブ１３６
オリゴ６４６：ａｔｃａｔｃａｃｔｔａｃｇｇｃｇｃａａｔ  ＵＰＬ（配列番号１０）
オリゴ６４７：ｔｃａｇｃａｇａａａｔｇｃｃｇｔｃｔｔ  ＵＰＬ（配列番号１１）
【０１５７】
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０ソフトウェア（１５．０）を使用して、画分サイクル数（交差点、Ｃｐ）を求め、転写物量を定量した。ｐｄｈＡ転写物及びｐｄｈＢ転写物の絶対量を、各試料の画分サイクル数の指数関数によって計算した（ｌｏｇ２［Ｃｐ］）。親株ＣＢ１５−１４におけるｐｄｈＡ転写物及びｐｄｈＢ転写物の量を、ｐｄｈＤ変異株における転写物量と比較した。
【０１５８】
ＣＢ１５−１４及びｐｄｈＤ変異株におけるｐｄｈＡ転写物及びｐｄｈＢ転写物の相対量を表１で示す。
【０１５９】
【表２】
0006573891.tif 000003
【０１６０】
表１は、ｐｄｈＡ転写物及びｐｄｈＢ転写物の量が、親株においてよりも、ｐｄｈＤ変異株において有意に低いことを示す。
【０１６１】
上述のデータを考慮すると、（すなわち、親細胞と比較すると）グラム陽性菌細胞のｐｄｈオペロン（例えば、ｐｄｈＡ遺伝子及び／又はｐｄｈＢ遺伝子）からの発現における減少が、同一の又は本質的に同一の培養条件下で培養した場合、親細胞と比較して、目的のタンパク質の発現の増加をもたらすことは明らかである。
【０１６２】
上記組成物及び方法は、一部の詳細において理解の明確化の目的のために例示及び実施例により説明したが、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなくこれに一定の変更及び修正を加えることができることは、本明細書の教示を考慮すれば当業者であれば容易に理解される。
【０１６３】
したがって、上記記載は単に本組成物及び方法の原理を述べたに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明瞭に記載され又は示されていなくとも、本組成物及び方法の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内で様々な組み合わせを考案できることは明らかである。更に、本明細書に記載されるすべての例及び条件付きの文言は、本組成物及び方法の原理並びに当該技術分野の進歩に寄与する本発明者らの概念を読者が理解するように補助するためのものであり、そのように具体的に記載した例及び条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。また、本明細書において、本組成物及び方法の原理、態様、及び実施形態を記載するすべての表現、並びにその具体例は、その構成及び機能の両方の等価物を包含することを意図している。更に、そのような等価物は、現在既知の等価物と、将来創出される等価物、すなわち、構造にかかわらず同一の機能をもたらすように創出された任意の要素と、の両方を包含することを意図している。したがって、本組成物及び方法の範囲は、本明細書に示され、記載される実施形態に限定されるものではない。
【０１６４】
配列表
配列番号：１−ｐｄｈＤ野生型コード配列、センス鎖
ＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＣＧＴＣＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＴＡＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＡＡＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＧＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡ
【０１６５】
配列番号：２−ｐｄｈＤタンパク質配列
ＭＶＶＧＤＦＰＩＥＴＤＴＬＶＩＧＡＧＰＧＧＹＶＡＡＩＲＡＡＱＬＧＱＫＶＴＶＶＥＫＡＴＬＧＧＶＣＬＮＶＧＣＩＰＳＫＡＬＩＮＡＧＨＲＹＥＮＡＫＨＳＤＤＭＧＩＴＡＥＮＶＴＶＤＦＴＫＶＱＥＷＫＡＳＶＶＮＫＬＴＧＧＶＡＧＬＬＫＧＮＫＶＤＶＶＫＧＥＡＹＦＶＤＳＮＳＶＲＶＭＤＥＮＳＡＱＴＹＴＦＫＮＡＩＩＡＴＧＳＲＰＩＥＬＰＮＦＫＹＳＥＲＶＬＮＳＴＧＡＬＡＬＫＥＩＰＫＫＬＶＶＩＧＧＧＹＩＧＴＥＬＧＴＡＹＡＮＦＧＴＥＬＶＩＬＥＧＧＤＥＩＬＰＧＦＥＫＱＭＳＳＬＶＴＲＲＬＫＫＫＧＮＶＥＩＨＴＮＡＭＡＫＧＶＥＥＲＰＤＧＶＴＶＴＦＥＶＫＧＥＥＫＴＶＤＡＤＹＶＬＩＴＶＧＲＲＰＮＴＤＥＬＧＬＥＱＶＧＩＥＭＴＤＲＧＩＶＫＴＤＫＱＣＲＴＮＶＰＮＩＹＡＩＧＤＩＩＥＧＰＰＬＡＨＫＡＳＹＥＧＫＩＡＡＥＡＩＡＧＥＰＡＥＩＤＹＬＧＩＰＡＶＶＦＳＥＰＥＬＡＳＶＧＹＴＥＡＱＡＫＥＥＧＬＤＩＶＡＡＫＦＰＦＡＡＮＧＲＡＬＳＬＮＥＴＤＧＦＭＫＬＩＴＲＫＥＤＧＬＶＩＧＡＱＩＡＧＡＳＡＳＤＭＩＳＥＬＳＬＡＩＥＧＧＭＴＡＥＤＩＡＭＴＩＨＡＨＰＴＬＧＥＩＴＭＥＡＡＥＶＡＩＧＳＰＩＨＩＶＫ
【０１６６】
配列番号：３−ｐｄｈＤ変異体コード配列、センス鎖（Ｃ７２９Ｔサイレント変異あり）
ＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＣＧＴＣＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＴＡＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＡＡＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＧＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡ
【０１６７】
配列番号：４−ＡｍｙＥタンパク質配列
ＬＴＡＰＳＩＫＳＧＴＩＬＨＡＷＮＷＳＦＮＴＬＫＨＮＭＫＤＩＨＤＡＧＹＴＡＩＱＴＳＰＩＮＱＶＫＥＧＮＱＧＤＫＳＭＳＮＷＹＷＬＹＱＰＴＳＹＱＩＧＮＲＹＬＧＴＥＱＥＦＫＥＭＣＡＡＡＥＥＹＧＩＫＶＩＶＤＡＶＩＮＨＴＴＳＤＹＡＡＩＳＮＥＶＫＳＩＰＮＷＴＨＧＮＴＱＩＫＮＷＳＤＲＷＤＶＴＱＮＳＬＬＧＬＹＤＷＮＴＱＮＴＱＶＱＳＹＬＫＲＦＬＤＲＡＬＮＤＧＡＤＧＦＲＦＤＡＡＫＨＩＥＬＰＤＤＧＳＹＧＳＱＦＷＰＮＩＴＮＴＳＡＥＦＱＹＧＥＩＬＱＤＳＡＳＲＤＡＡＹＡＮＹＭＤＶＴＡＳＮＹＧＨＳＩＲＳＡＬＫＮＲＮＬＧＶＳＮＩＳＨＹＡＳＤＶＳＡＤＫＬＶＴＷＶＥＳＨＤＴＹＡＮＤＤＥＥＳＴＷＭＳＤＤＤＩＲＬＧＷＡＶＩＡＳＲＳＧＳＴＰＬＦＦＳＲＰＥＧＧＧＮＧＶＲＦＰＧＫＳＱＩＧＤＲＧＳＡＬＦＥＤＱＡＩＴＡＶＮＲＦＨＮＶＭＡＧＱＰＥＥＬＳＮＰＮＧＮＮＱＩＦＭＮＱＲＧＳＨＧＶＶＬＡＮＡＧＳＳＳＶＳＩＮＴＡＴＫＬＰＤＧＲＹＤＮＫＡＧＡＧＳＦＱＶＮＤＧＫＬＴＧＴＩＮＡＲＳＶＡＶＬＹＰＤ
【０１６８】
配列番号：５−ＦＮＡタンパク質配列（プロドメインあり）
ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ
【０１６９】
配列番号：６−ＧＦＰタンパク質配列
ＶＮＲＮＶＬＫＮＴＧＬＫＥＩＭＳＡＫＡＳＶＥＧＩＶＮＮＨＶＦＳＭＥＧＦＧＫＧＮＶＬＦＧＮＱＬＭＱＩＲＶＴＫＧＧＰＬＰＦＡＦＤＩＶＳＩＡＦＱＹＧＮＲＴＦＴＫＹＰＤＤＩＡＤＹＦＶＱＳＦＰＡＧＦＦＹＥＲＮＬＲＦＥＤＧＡＩＶＤＩＲＳＤＩＳＬＥＤＤＫＦＨＹＫＶＥＹＲＧＮＧＦＰＳＮＧＰＶＭＱＫＡＩＬＧＭＥＰＳＦＥＶＶＹＭＮＳＧＶＬＶＧＥＶＤＬＶＹＫＬＥＳＧＮＹＹＳＣＨＭＫＴＦＹＲＳＫＧＧＶＫＥＦＰＥＹＨＦＩＨＨＲＬＥＫＴＹＶＥＥＧＳＦＶＥＱＨＥＴＡＩＡＱＬＴＴＩＧＫＰＬＧＳＬＨＥＷＶ
【０１７０】
配列番号：７−ＢｇｌＣタンパク質配列
ＡＡＧＴＫＴＰＶＡＫＮＧＱＬＳＩＫＧＴＱＬＶＮＲＤＧＫＡＶＱＬＫＧＩＳＳＨＧＬＱＷＹＧＥＹＶＮＫＤＳＬＫＷＬＲＤＤＷＧＩＴＶＦＲＡＡＭＹＴＡＤＧＧＹＩＤＮＰＳＶＫＮＫＶＫＥＡＶＥＡＡＫＥＬＧＩＹＶＩＩＤＷＨＩＬＮＤＧＮＰＮＱＮＫＥＫＡＫＥＦＦＫＥＭＳＳＬＹＧＮＴＰＮＶＩＹＥＩＡＮＥＰＮＧＤＶＮＷＫＲＤＩＫＰＹＡＥＥＶＩＳＶＩＲＫＮＤＰＤＮＩＩＩＶＧＴＧＴＷＳＱＤＶＮＤＡＡＤＤＱＬＫＤＡＮＶＭＹＡＬＨＦＹＡＧＴＨＧＱＦＬＲＤＫＡＮＹＡＬＳＫＧＡＰＩＦＶＴＥＷＧＴＳＤＡＳＧＮＧＧＶＦＬＤＱＳＲＥＷＬＫＹＬＤＳＫＴＩＳＷＶＮＷＮＬＳＤＫＱＥＳＳＳＡＬＫＰＧＡＳＫＴＧＧＷＲＬＳＤＬＳＡＳＧＴＦＶＲＥＮＩＬＧＴＫＤＳＴＫＤＩＰＥＴＰＳＫＤＫＰＴＱＥＮＧＩＳＶＱＹＲＡＧＤＧＳＭＮＳＮＱＩＲＰＱＬＱＩＫＮＮＧＮＴＴＶＤＬＫＤＶＴＡＲＹＷＹＫＡＫＮＫＧＱＮＦＤＣＤＹＡＱＩＧＣＧＮＶＴＨＫＦＶＴＬＨＫＰＫＱＧＡＤＴＹＬＥＬＧＦＫＮＧＴＬＡＰＧＡＳＴＧＮＩＱＬＲＬＨＮＤＤＷＳＮＹＡＱＳＧＤＹＳＦＦＫＳＮＴＦＫＴＴＫＫＩＴＬＹＤＱＧＫＬＩＷＧＴＥＰＮ
【０１７１】
配列番号：８−ｐｄｈＡに対するオリゴ６４４：ａｇｃｔａｔｃｇｔｔｇａｃａｇｔａａｇａａｇｃａ
【０１７２】
配列番号：９−ｐｄｈＡに対するオリゴ６４５：ｔｔｇｇａａｃｇｔｔｔｃｇａａｃｔｇｃ
【０１７３】
配列番号：１０−ｐｄｈＢに対するオリゴ６４６：ａｔｃａｔｃａｃｔｔａｃｇｇｃｇｃａａｔ
【０１７４】
配列番号：１１−ｐｄｈＢに対するオリゴ６４７：ｔｃａｇｃａｇａａａｔｇｃｃｇｔｃｔｔ
【図１】
0006573891.tif 000004
【図２Ａ】
0006573891.tif 000005
【図２Ｂ】
0006573891.tif 000006
【図３Ａ】
0006573891.tif 000007
【図３Ｂ】
0006573891.tif 000008
【図４Ａ】
0006573891.tif 000009
【図４Ｂ】
0006573891.tif 000010
【図５Ａ】
0006573891.tif 000011
【図５Ｂ】
0006573891.tif 000012
【配列表】
0006573891000001.app