(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている、第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
ここで、第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；且つＦｃドメインがＩｇＧ Ｆｃドメインであり、
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成され、
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ分子が、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子が配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
標的細胞抗原がＣＤ２０であり、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子が配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
標的細胞抗原がＣＤ２０であり、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子が配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子がそれぞれ、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
ｂ）の第２のＦａｂ分子が、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ＦｃドメインがＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１〜７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項１〜８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、より小さな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換され（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的にＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１〜１０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基（Ｅ３５６Ｃ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１〜１１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
Ｆｃドメインが、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する、請求項１〜１３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ＦｃドメインがＦｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
前記一又は複数のアミノ酸置換がＬ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）の群から選択される一又は複数の位置においてである、請求項１〜１５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
Ｆｃドメインの各サブユニットが活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）である、請求項１〜１６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項１〜１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１〜１８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクター、具体的には発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載のポリヌクレオチド又は請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
ａ）請求項２２に記載の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、請求項１に記載され、ＣＤ３及び標的細胞抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項２５】
医薬としての使用のための、請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
必要とする個体における疾患の治療における使用のための、請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
疾患ががんである、請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項２９】
個体における疾患を治療するための医薬であって、請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を薬学的に許容可能な形態で含む、医薬。
【請求項３０】
前記疾患ががんである、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
標的細胞の溶解を誘導するための薬剤であって、１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子標的細胞を含み、標的細胞がＴ細胞の存在下で請求項１〜１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させられる、薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、Ｔ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば様々な臨床設定において望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することはがん治療の主要目的である。
【０００３】
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしそれらは従来の治療抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
【０００４】
これに関し、標的細胞上の表面抗原に一の「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、これは何れかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。従って、免疫応答は、標的細胞に再指向（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔ）され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、すなわち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
【０００５】
幾つかの二重特異性抗体フォーマットが開発され、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適合性が検討された。これらの中でも、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体）分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの有望さを示している（Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に掲載）。ＢｉＴＥは、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されているタンデムｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞結合体について評価された更なる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びその誘導体、例えばタンデム型ダイアボディ（Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）が含まれる。更に最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定性のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)）。全体がハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であり、また現在臨床試験において評価されつつあるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）は大きなサイズのフォーマットを表している（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に総説される）。
【０００６】
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞の再指向及び活性化により大きな可能性を示すものである。しかしながら、そのために適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単はなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴っている。
【０００７】
例えば、ＢｉＴＥ分子などの小さな構築物は、効果的にエフェクター細胞及び標的細胞を架橋することができるが、血清半減期が非常に短いため、連続注入によって患者に投与する必要がある。一方、ＩｇＧ−様フォーマットは、半減期が長いという大きな利点を有するが、ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのＩｇＧ様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体構築物を生産することで、これは、同時発現した際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とを誤って対にしてしまうことにより、正しく構築された構築物の収率が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副生成物が生じることに起因している。
【０００８】
二重特異性抗体における鎖会合の問題を克服するために、異なるアプローチがとられている（例えば、Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)参照）。例えば、「ノブ・イン・ホール（knobs-into-hole）」戦略は、接触界面を改変するためにＣＨ３ドメインに突然変異を導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対形成を強制することを目的とする。１つの鎖において、嵩高いアミノ酸が短い側鎖を有するアミノ酸によって置換され、「ホール（ｈｏｌｅ）」を形成する。逆に、大きな側鎖を有するアミノ酸は、他のＣＨ３ドメインに導入されて「ノブ」を形成する。これらの２つの重鎖（及び両方の重鎖に適切でなければならない２つの同一の軽鎖）を共発現することにより、ヘテロダイマー（「ノブ−ホール」）対ホモダイマー（「ホール−ホール」又は「ノブ−ノブ」）が観察されている（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及び国際公開第９６／０２７０１１号）。ヘテロ二量体のパーセンテージは、ファージディスプレイアプローチ及びヘテロダイマーを安定化させるためのジスルフィド架橋の導入を用いて２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を再構築することによって更に増加させることができた（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26−35）。ノブ・ツー・ホール技術の新しいアプローチは、例えば欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号に記載されている。
【０００９】
しかしながら、「ノブ・イン・ホール」戦略は、異なる標的抗原への結合のための異なる軽鎖を含む二重特異性抗体において生じる重鎖−軽鎖の誤対合の問題を解決しない。
【００１０】
重鎖−軽鎖の誤対合を防止するための戦略は、二重特異性抗体の結合アームの一つの重鎖と軽鎖の間でドメインを交換することである（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191（ドメイン交差を有する二重特異性ＩｇＧ抗体に関連する）を参照）。
【００１１】
二重特異性抗体（国際公開第２００９／０８０２５２号、Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191もまた参照のこと）の結合アームの一つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬを交換することにより、第１の抗原に対する軽鎖の第２の抗原に対する誤った重鎖との誤対合により生ずる副生成物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）明らかに減少させる。それにもかかわらず、これらの抗体調製物は、副生成物を完全に含まないわけではない。主な副生成物は、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型の相互作用に基づいている（Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191；補足の図Ｓ１Ｉ）。従って、このような副生成物の更なる減少は、例えばこのような二重特異性抗体の収率を改善するのに所望される。
【００１２】
Ｔ細胞媒介性免疫療法のための現在利用可能な二重特異性抗体に関連した困難及び欠点を考慮すると、そのような分子の新規な改良されたフォーマットが依然として必要とされている。本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、Ｔ細胞の活性化と再指向のために設計された二重特異性抗原結合分子を提供する。
【発明の概要】
【００１３】
発明の要旨
本発明によれば、望ましくない副生成物、特にそれらの結合アームの一つにおいてＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体に生じるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物と比較した所望の二重特異性抗体の比は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって改善され得る。
【００１４】
従って、第１の態様において、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ第２の抗原は標的細胞抗原であり、又は第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；かつ
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつ
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００１５】
本発明によれば、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域が交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である。特定の実施態様において、第１の（そして、もしあれば第３の）Ｆａｂ分子は従来型のＦａｂ分子である。更なる特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができる１つ以下のＦａｂ分子が、Ｔ細胞を活性化する二重特異性抗原結合分子に存在する（すなわち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原に一価の結合を提供する）。
【００１６】
特定の実施態様において、第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原である。より特異的な実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンである。一実施態様において、標的細胞抗原はＣＤ２０である。
【００１７】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつ
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００１８】
更なる実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００１９】
更に別の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びに、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００２０】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【００２１】
別の特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【００２２】
一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
を含み、
ここで、第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びに、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつ
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００２３】
更なる実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００２４】
更に別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びに、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００２５】
一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【００２６】
別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【００２７】
幾つかの実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含む。
【００２８】
特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である。これらの実施態様において、従って、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同じアミノ酸置換を含む。第１のＦａｂ分子と同様に、第３のＦａｂ分子は特に従来型のＦａｂ分子である。
【００２９】
第３のＦａｂ分子が存在する場合、特定の実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子は標的細胞抗原に特異的に結合し、第２のＦａｂ分子は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合する。
【００３０】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかの実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。特定の実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別の実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２のＦａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１のＦａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているかのどちらかである実施態様において、更に、Ｆａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合させることができる。
【００３１】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
【００３２】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意選択的に第３）のＦａｂ分子は、互いに、及び異なる方法でＦｃドメインに融合し得る。それらの成分は、直接的に、又は好ましくは、一又は複数の適切なペプチドリンカーを介して互いに融合し得る。融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対してである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介して行われる。
【００３３】
一実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合し得る。
【００３４】
一実施態様において、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、免疫グロブリン分子を含み、ここで、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換される（図１Ａ、Ｄ参照）。
【００３５】
別の実施態様において、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような特定の実施態様において、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、免疫グロブリン分子を含み、ここで、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換され、かつ付加的な（従来型の）Ｆａｂ分子が前記ＦａｂアームにＮ末端融合されている（図１Ｂ、Ｅ参照）。別のそのような実施態様において、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、免疫グロブリンＦａｂアームの１つにＮ末端に融合した付加的なＦａｂ分子を有する免疫グロブリン分子を含み、該付加的Ｆａｂ分子において、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されている（図１Ｃ、Ｆ参照）。
【００３６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる立体配置の全てにおいて、本明細書に記載のアミノ酸置換は、第１の及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインにおいて、又は第２のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインにおいてのどちらかに存在しうる。好ましくは、それらは、第１の及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念に従って、本明細書に記載のアミノ酸置換が第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第２のＦａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われない。
【００３７】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の他の実施態様において、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子において行われる場合、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。幾つかの実施態様において、第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプである。
【００３８】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。
【００３９】
特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００４０】
更により特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００４１】
更なる実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；及び
ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；又は
（ｉｉ）第２の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
ここで、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００４２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更により特定の実施態様において、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔの番号付け）を含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【００４３】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定のこのような実施形態において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、かつＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能である第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。
【００４４】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低下した結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を示す。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への低下した結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を有するように操作される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様において、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン中の一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）の群から選択される一又は複数の位置においてである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含んでおり、該アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）である。一つのそのような実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。他の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる２つのアミノ酸置換を含んでおり、該アミノ酸残基はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇである（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）。一つのそのような実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付け）を含む。
【００４５】
一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００４６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第２のＦａｂ分子は、ＣＤ３、より具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、前記第２のＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４７】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の更に特定の実施態様において、標的細胞抗原、特にＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、標的細胞抗原、特にＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。１つの特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子はＣＤ２０に特異的に結合し、配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更により特定の実施態様において、第１の（及び存在する場合は第３の）Ｆａｂ分子は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４８】
特定の態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）第１の抗原はＣＤ２０であり、かつ第２の抗原はＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
（ｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含み、かつｂ）の第２のＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み；
（ｉｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
（ｉｖ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）第１の抗原はＣＤ２０であり、かつ第２の抗原はＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンであり；
（ｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含み、かつｂ）の第２のＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み；
（ｉｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；
（ｉｖ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、かつｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
【００５０】
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）が提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）を含む一又は複数の発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド（１つ又は複数）又は発現ベクター（１つ又は複数）を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００５１】
別の態様において、ａ）本発明の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００５２】
本発明は更に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。本発明の一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
【００５３】
更に、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用と；個体に対し、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容可能な形態で投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法とが提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００５４】
本発明は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置。（Ａ、Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する（「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｇ、Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する（「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂ並びに別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「反転型」）を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図。黒い点：ヘテロ二量体化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：ＣＨ及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。
【図２】実施例１で調製されたＴＣＢの図。（Ａ）電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＣＨ１／ＣＬ交換）、（Ｂ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｃ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｄ）電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換）、（Ｅ）電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬ交換）、（Ｆ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ２０結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ３結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＫＫ＝１２３Ｋ、１２４Ｋ）、（Ｇ）電荷修飾及びＦｃ領域におけるＤＤＫＫ突然変異を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｈ）電荷修飾を有する「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｉ）電荷修飾を有する「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ、異なるＣＤ２０結合剤）、（Ｊ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、Ｅ＝２１３Ｅ；Ｒ＝１２３Ｒ）、（Ｋ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤におけるＶＨ／ＶＬ交換及び電荷修飾）。
【図３】（Ａ−Ｉ、Ｎ、Ｏ）実施例１で調製されたＴＣＢのＣＥ−ＳＤＳ分析（最終精製調製物）。（Ａ）図２Ａに示される分子「Ａ」の電気泳動図、（Ｂ）図２Ｂに示される分子「Ｂ」の電気泳動図、（Ｃ）図２Ｃに示される分子「Ｃ」の電気泳動図、（Ｄ）図２Ｄに示される分子「Ｄ」の電気泳動図、（Ｅ）図２Ｅに示される分子「Ｅ」の電気泳動図、（Ｆ）図２Ｆに示される分子「Ｆ」の電気泳動図、（Ｇ）図２Ｇに示される分子「Ｇ」の電気泳動図、（Ｈ）図２Ｈに示される分子「Ｈ」の電気泳動図、（Ｉ）図２Ｉに示される分子「Ｉ」の電気泳動図、（Ｎ）図２Ｊに示される分子「Ｊ」の電気泳動図、（Ｏ）図２Ｋに示される分子「Ｋ」の電気泳動図。レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元。（Ｊ−Ｌ、Ｐ、Ｑ）第１精製工程（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）後の実施例１で調製したＴＣＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｊ）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元；レーン１＝マーカー（Ｍａｒｋ  １２、未染色標準物質、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２−１１＝分子ＢのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの画分、（Ｋ）３−８％トリス・酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元；レーン１＝マーカー（ＨｉＭａｒｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２−１２＝分子ＣのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの画分、（Ｌ）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元；レーン１＝マーカー（Ｍａｒｋ  １２、未染色標準物質、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２−１４＝分子ＤのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの画分、（Ｐ）４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、非還元。レーン１＝マーカー（Ｍａｒｋ  １２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２−１０＝分子ＪのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの画分、（Ｑ）４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、非還元；レーン１＝マーカー（Ｍａｒｋ  １２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２−１２＝分子ＫのプロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの画分。（Ｍ）実施例１で調製したＴＣＢの分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；第１精製工程）、（分子Ａ（第１のＳＥＣ工程）、Ｂ及びＤ、示される通り）。
【図４】電荷修飾（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）のＣＤ３及びＣＤ２０結合（実施例１を参照）。
【図５】ヒトＰＢＭＣとの２２時間のインキュベーションにより電荷修飾（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）によって誘導された腫瘍細胞溶解（実施例１を参照）。
【図６】電荷修飾（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）によって誘導されるＣＤ２０発現腫瘍標的細胞（Ｎａｌｍ−６）のＴ細胞媒介性死滅に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ｂ）の活性化（実施例１を参照）。
【図７】電荷修飾（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）によって誘導されるＣＤ２０発現腫瘍標的細胞（Ｚ−１３８）のＴ細胞媒介性死滅の際のＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）の活性化（実施例１を参照）。
【図８】電荷修飾（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）とのインキュベーションによる健常なヒトの全血におけるＢ細胞枯渇；２４時間のアッセイ（実施例１を参照）。
【図９】（「電荷残基」）を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（「ＣＤ２０  ＴＣＢ」）によって誘導される健常なヒトの全血におけるＣＤ２０発現Ｂ細胞のＴ細胞媒介性死滅の際のＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）の活性化（実施例１を参照）。
【図１０】ヒトＣＤ２０（Ａ）及びＣＤ３発現（Ｂ）標的細胞への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）の結合。
【図１１】ヒト及びカニクイザルＣＤ２０及びＣＤ３発現標的細胞への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）の結合。（Ａ）Ｂ細胞、（Ｂ）ＣＤ４  Ｔ細胞、（Ｃ）ＣＤ８  Ｔ細胞。
【図１２】異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解。
【図１３】異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解及びその後のＴ細胞活性化。（Ａ−Ｃ）３つの異なるヒトドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞によるＺ１３８腫瘍標的細胞の溶解。（Ｄ）示されたＤＬＢＣＬ腫瘍細胞株のパネルの溶解。
【図１４】異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介されるヒト全血におけるＢ細胞枯渇。
【図１５】Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを用いたＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価される、異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによるＴ細胞の活性化。
【図１６】ＮＯＧマウスのまばらなサンプリングデータからの抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）の０．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．のボーラス投与薬物動態パラメーター。
【図１７】完全ヒト化ＮＯＧマウスにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）のＢ細胞枯渇活性を評価するための試験デザインの模式図。
【図１８】（Ｂ）抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）又は（Ａ）ビヒクル対照で処置した完全ヒト化ＮＯＧマウスの血液中のＢ細胞及びＴ細胞頻度の速度論。Ｄ０、Ｄ７：治療用注射の日。
【図１９】完全ヒト化マウスにおけるビヒクル（黒色の棒）又は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示される分子「Ｂ」）（白棒）注射後３日目（Ｄ３）及び１０日目（Ｄ１０）の末梢Ｔ細胞における異なる表面マーカーの発現の分析。
【図２０】試験終了時（最初の治療用注射後のＤ１０）にビヒクル（黒棒）又は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）（白棒）で処置された完全ヒト化マウスの脾臓におけるＢ細胞頻度（Ａ）、Ｔ細胞頻度（Ｂ）及びＴ細胞上の表面マーカー発現（Ｃ）の分析。
【図２１】ｈｕＰＢＭＣを移植されたＮＯＧマウスのＷＳＵ−ＤＬＣＬ２モデルにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（図２Ｂに示す分子「Ｂ」）（０．５ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回）の抗腫瘍活性。
【図２２】実施例２で調製した「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子の図。（１）電荷修飾を有しない分子、（２）ＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾を有する分子（ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＫＫ＝１２３Ｋ、１２４Ｋ）。
【図２３】実施例２で使用した「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子のＣＥ−ＳＤＳ分析（レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＡのピークの表）。異なる精製方法（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＰＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）、及び最終サイズ排除クロマトグラフィー工程（ｒｅ−ＳＥＣ））を電荷修飾を有しない分子（８３Ａ１０−ＴＣＢ）及び電荷修飾を有する分子（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）に適用した。
【図２４】プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＰＡ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製工程の後に１対１（Ｈ２Ｈ）の比較で行った、実施例２で使用した「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子のＣＥ−ＳＤＳ分析（レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＡのピークの表）。
【図２５】ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株に対する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体の結合のフローサイトメトリー分析。（Ａ）Ｈ９２９細胞及びＭＫＮ４５細胞上の８３Ａ１０−ＴＣＢ、（Ｂ）Ｈ９２９細胞及びＭＫＮ４５細胞上の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｃ）Ｈ９２９細胞上での８３Ａ１０−ＴＣＢと８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの比較。
【図２６】ＬＤＨ放出によって測定した抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ、（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）によるＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の死滅。
【図２７】実施例３で調製されたＴＣＢの図。（Ａ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、Ｈｅｒ２結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｂ）電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、Ｈｅｒ２結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）。
【図２８】実施例３で調製されたＴＣＢのＣＥ−ＳＤＳ分析（最終精製調製物）。（Ａ）図２７Ａに示すＨｅｒ２  ＴＣＢの電気泳動図、（Ｂ）図２７Ｂに示すＨｅｒ３  ＴＣＢの電気泳動図。レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元。
【図２９】ＦＡＣＳによって決定された、Ｈｅｒ２  ＴＣＢ（Ａ）及びＨｅｒ３  ＴＣＢ（Ｂ）の細胞への結合。フローサイトメトリーで測定したＪｕｒｋａｔ細胞（左）上のヒトＣＤ３又はＫＰＬ−４細胞（右）上のヒトＨｅｒ２（Ａ）若しくはＨｅｒ３（Ｂ）に対するＨｅｒ２  ＴＣＢ分子の結合の蛍光強度の中央値。描かれているのは、トリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に基づく、ＳＤを含む蛍光値の中央値である。
【図３０】Ｈｅｒ３  ＴＣＢによるＴ細胞活性化。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞、ＫＰＬ−４標的細胞及び漸増濃度のＨｅｒ３  ＴＣＢの同時インキュベーションの際に、ＣＤ６９陽性ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを４８時間後にＦＡＣＳによって測定した。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。
【図３１】発光によって測定される、５時間後のＣＤ３を介したＪｕｒｋａｔ細胞の活性化。ＫＰＬ４腫瘍細胞をＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（Ｅ：Ｔ  ５：１（Ａ）又は２．５：１（Ｂ））及び漸増濃度のＨｅｒ２  ＴＣＢ（Ａ）又はＨｅｒ３  ＴＣＢ（Ｂ）とインキュベートする際に、Ｊｕｒｋａｔの活性化が、５時間後の相対発光シグナル（ＲＬＵＳ）によって測定された。ＥＣ５０値がＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（３４．４ｐＭ（Ａ）及び２２ｐＭ（Ｂ））により算出された。示されるのはトリプリケートの平均値であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図３２】（Ａ、Ｂ）Ｈｅｒ２陽性ＫＰＬ４、Ｎ８７、Ｔ４７Ｄ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞をヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ  １０：１）及び漸増濃度のＨｅｒ２  ＴＣＢ分子と共に２５時間（Ａ）又は４６時間（Ｂ）にわたってインキュベートした際に、ＬＤＨ放出によって測定された腫瘍細胞溶解。示されるのはトリプリケートの平均値であり、エラーバーはＳＤを示す。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにより算出した：７．５ｐＭ（ＫＰＬ４細胞）、２５．６ｐＭ（Ｎ８７細胞）、３０．６ｐＭ（Ｔ４７Ｄ細胞）、及び５９．９ｐＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）。（Ｃ）Ｈｅｒ３陽性ＫＰＬ４標的細胞を、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ  １０：１）及び漸増濃度のＨｅｒ３  ＴＣＢ分子と共に２４時間又は４８時間にわたって示されるようにインキュベートした際に、ＬＤＨ放出によって測定された腫瘍細胞溶解。示されるのはトリプリケートの平均値であり、エラーバーはＳＤを示す。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにより算出した：２．５４ｐＭ（２４時間）及び０．５３ｐＭ（４８時間）。
【図３３】カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）３／７活性（発光）によって決定されるＨｅｒ３  ＴＣＢによって誘導される腫瘍細胞溶解。示されるのは、ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１）と異なる濃度のＨｅｒ３  ＴＣＢとの６．５時間の同時インキュベーションの後に、示されるようにＫＰＬ−４−カスパーゼ−３／７ ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ標的細胞におけるカスパーゼ３／７活性の結果として測定された相対発光シグナルである。示されているのはＳＤを伴うトリプリケートである。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにより算出した：０．７ｐＭ．
【図３４】実施例４で調製されたＴＣＢの図。（Ａ）電荷修飾を有する「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＭＣＳＰ結合剤中に電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）、（Ｂ）電荷修飾を有しない「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換）。
【図３５】実施例４で調製された電荷修飾を有するＴＣＢのＣＥ−ＳＤＳ分析（最終精製調製物）。図３４Ａに示す（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ−ＬＣ００７ｃｖの電気泳動図。レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元。
【図３６】フローサイトメトリーで測定したＭＶ−３細胞（左）上のヒトＭＣＳＰ又はＪｕｒｋａｔ細胞（右）上のヒトＣＤ３に対するＴＣＢ分子の結合の蛍光強度の中央値。描かれているのは、トリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に基づく、ＳＤを含む蛍光値の中央値である。
【図３７】ヒトＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３細胞をヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ  １０：１）及び漸増濃度のＴＣＢ分子と共に２４時間又は４８時間にわたってインキュベートした際に、ＬＤＨ放出によって測定された腫瘍細胞溶解。示されるのはトリプリケートの平均値であり、エラーバーはＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用されるように使用される。
【００５７】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
【００５８】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００５９】
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。従って、「抗原に結合する一価」という表現は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
【００６０】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
【００６１】
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと直接方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義し、且つ当該技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
【００６２】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるたんぱく質（例えば、ＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理により得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３のイプシロンサブユニットである（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号１；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）。特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３又は標的細胞抗原の中で保存された、ＣＤ３又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。
【００６３】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）の何れかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００６４】
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表される。この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００６５】
例えばＦｃ受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定されるように、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
【００６６】
本明細書で使用する「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞活性化を誘導することが可能である、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現する抗原決定基を意味する。具体的には、活性化Ｔ細胞抗原と抗原結合分子との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様において、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３のイプシロンサブユニットである（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号１；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）。
【００６７】
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、本明細書において記載される技術分野で既知である。
【００６８】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様において、標的細胞抗原はＣＤ２０、特にヒトＣＤ２０である（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１１８３６を参照）。
【００６９】
本明細書で使用されるように、Ｆａｂ分子などに関して「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、部分の各種類が２つ以上存在する場合、便宜上区別するために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
【００７０】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００７１】
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
【００７２】
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
【００７３】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインが交換されている（すなわち、互いに置換されている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬと重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖定常ドメインＣＬ（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ−ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【００７４】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、すなわち重鎖可変ドメインと定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖、及び軽鎖可変ドメインと定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００７５】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【００７６】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
【００７７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原に結合する部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００７８】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供される。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００７９】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 頁91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００８０】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 及びChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提として、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。本明細書に示されるＣＤＲ配列は、一般的にＫａｂａｔの定義に従う。
0006464255.tif 000002
【００８１】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔの番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。可変領域配列に関連して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔの番号付け」とは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載の番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００８２】
本明細書中で使用されるように、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載され、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の647-660頁を参照）がκ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２及びＣＨ３）にはＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けシステム（６６１−７２３頁を参照）が使用されており、この場合「ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け」を参照することにより本明細書において更に明確にされる。
【００８３】
配列リストのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされている。しかしながら、配列リストの番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは
当業者の通常の技術の範囲内である。
【００８４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８５】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８６】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体は、重鎖のＣ末端からの一又は複数の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受け得る。従って、全長重鎖をコードする特異的核酸分子の発現によって宿主細胞によって生成される抗体は、全長重鎖を含み得るか、又は全長重鎖の切断型変異体（本明細書において「切断型変異体重鎖」とも称する）を含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である場合があり得る。従って、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを含まずに本明細書に示される。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載の薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子及び切断型変異体重鎖を有する分子を含み得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子及び切断型変異体重鎖を有する分子の混合物からなり得、ここではＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断型変異体重鎖を有する。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、そのような組成物は、本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；付加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び付加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に記載のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子からなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う（上記を参照）。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００８７】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合結合によるホモダイマーの形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一であり得る。幾つかの実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００８８】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８９】
本明細書において使用される「改変する、改変された、改変」などの用語は、ペプチド骨格の何れかの操作、又は天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組合せが含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的な構築物が所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的な構築物に到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置換が含まれる。アミノ酸変異体は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
【００９１】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特異的な長さの生成物を指すのではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は二つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の何れかの代わりに、又は何れかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
【００９２】
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルのどのような精製も必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
【００９３】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて完全に一致するとされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【００９４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミド  ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【００９５】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【００９６】
少なくとも、例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％まで複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間の何れかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、何れか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【００９７】
用語「発現カセット」は、組換えにより又は合成により、標的細胞内の一連の特定の核酸の転写を許可する特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【００９８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子を導入しその発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【００９９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１００】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【０１０１】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇の何れかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
【０１０２】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１０３】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１０４】
「個体」又は「被験体」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は被験体はヒトである。
【０１０５】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される被験体にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１０６】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容可能な担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１０８】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１０９】
実施態様の詳細な説明
本発明は、特に（例えば、純度、収率に関して）改善された生産性を有する治療用途に好ましい特性を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるＦａｂ分子のアミノ酸置換は、それらの結合アームの１つ（又は２つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合にはそれ以上）においてＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多特異的抗原結合分子の生成において生じ得る、非適合重鎖（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ型副生成物）との軽鎖の誤対合を減少させるのに特に有効である（全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５７１６５号、特にその中の実施例も参照）。
【０１１０】
本発明の第１の態様は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの；
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ第２の抗原は標的細胞抗原であり、又は第１の抗原は標的細胞抗原であり、かつ第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；かつ
ここで、
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【０１１１】
本発明によれば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載された修飾の両方を含まない。第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換されない（すなわち、交換されないままである）。
【０１１２】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）置換され、かつａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【０１１３】
更なる実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換され、かつａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【０１１４】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に（好ましい一実施態様において、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立に）（Ｋａｂａｔによる番号付け）置換され、並びに、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【０１１５】
より特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【０１１６】
更により特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、かつ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、並びにａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、かつ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。
【０１１７】
特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプのものである。
【０１１８】
あるいは、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行うことができる。特定の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはκアイソタイプのものである。
【０１１９】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含み得る。特定の実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である。これらの実施態様において、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子のそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われるであろう。あるいは、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなく、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行うことができる。
【０１２０】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
【０１２１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な立体配置で互いに融合することができる。例示的な立体配置を図１に示す。
【０１２２】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【０１２３】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１２４】
一つのそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｇ及び図１Ｋに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１２５】
別のそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ａ及び図１Ｄに模式的に示されている。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０１２６】
一実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１２７】
一つのそのような実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｈ及び図１Ｌに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１２８】
Ｆａｂ分子は、直接、又は一以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインへ又はお互いに融合し得る。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常は１〜１０、典型的には２〜４の数である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、一実施態様では５〜１００アミノ酸の長さ、さらなる実施態様では１０〜５０アミノ酸の長さを有する。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）、一実施態様において、ｘ＝４及びｎ＝２又は３、更なる実施態様において、ｘ＝４及びｎ＝２である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を連結するために適した例示的ペプチドリンカーは配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１及び１２）である。付加的に、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特にＦａｂ分子がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、付加的なペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１２９】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示される）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる可能性がある。
【０１３０】
他の多くのケースにおいては、しかしながら、例えば、標的部位への標的化を最適化するために又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を有することが有利であろう（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示す例を参照）。
【０１３１】
従って、特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含む。第１の抗原は、好ましくは標的細胞抗原である。一実施態様では、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。一実施態様において、第３のＦａｂ分子は、第１のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第１及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置を有する（すなわち、従来型又は交差型））。特定の実施態様において、第２のＦａｂ分子は、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に特異的に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子は標的細胞抗原に特異的に結合する。
【０１３２】
代替的な実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を更に含む。これらの実施態様において、第２の抗原は、好ましくは標的細胞抗原である。一つのそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子（Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子）である。一つのそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は、第２のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第２及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置を有する（すなわち、従来型又は交差型））。一つのそのような実施態様において、第１のＦａｂ分子は、活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に特異的に結合し、第２及び第３のＦａｂ分子は標的細胞抗原に特異的に結合する。
【０１３３】
一実施態様において、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１３４】
特定の実施態様において、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は、図１Ｂ及び１Ｅ（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である）並びに図１Ｉ及び１Ｍ（代替的な実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１３５】
別の実施態様において、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、かつ第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、基本的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような立体配置は、図１Ｃ及び１Ｆ（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である）並びに図１Ｊ及び１Ｎ（代替的な実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様において、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様において、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１  ＦｃドメインであるヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合していてよい。
【０１３６】
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合したＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の立体配置において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０１３７】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかにおいては、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の立体配置に依存して、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は更に、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を低減し、また本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の幾つかの発現に必要なプラスミドの数を低減する。
【０１３８】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合される。
【０１３９】
幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）を含む。
【０１４０】
これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドを含む。これらの実施態様の他のものにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、又は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））を必要に応じて含む。
【０１４１】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニット（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））と共有するポリペプチドを含みうる。特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合される。
【０１４２】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｏ及び図１Ｓに模式的に示されている。
【０１４３】
他の実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｐ及び図１Ｔに模式的に示されている。
【０１４４】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｑ及び図１Ｕに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１４５】
幾つかの実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｗ及び図１Ｙに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同じである）。
【０１４６】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｒ及び図１Ｖに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１４７】
幾つかの実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に第３のＦａｂ分子を含み、ここで前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様において、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様において、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、ここで第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような立体配置は図１Ｘ及び図１Ｚに模式的に示されている．（特定の実施態様において、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同じである）。
【０１４８】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。
【０１４９】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１５１】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））を更に含む。
【０１５２】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。
【０１５３】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これが次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））と共有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。
【０１５４】
上記実施態様のいずれによっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）の成分は、直接融合するか、又は様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合する。このようなリンカーは本明細書に記載されているか、又は当該技術分野で既知である。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１〜１０、典型的には２〜４の整数である。
【０１５５】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないＦｃドメインを含む。
【０１５６】
本発明による一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（カバット番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な配列は配列番号１３に与えられる。
【０１５７】
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なるＦａｂ分子を含み、従ってＦｃドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組合わせをもたらす。従って、組換え生成におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
【０１５８】
すなわち、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。従って、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０１５９】
ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための幾つかのアプローチが存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に記載される。典型的には、このようなアプローチのすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、相補的な様式で両方とも操作され、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）はもはやそれ自身とホモ二量体化することができないが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するように強制される（第１及び第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体は形成されないように）。本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において、軽鎖の誤対合及びＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物を減少させる、改良された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、重鎖軽鎖修飾（１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬ交換／置換並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる選択肢として検討されている。
【０１６０】
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾はいわゆる「ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含んでいる。
【０１６１】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１６２】
このように、特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１６３】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【０１６４】
好ましくは、より小さな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【０１６５】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
【０１６６】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６７】
また更なる実施態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基（Ｅ３５６Ｃ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１６８】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１６９】
特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（所望により標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子を介して）融合される。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子をＦｃドメインのノブ含有サブユニットに融合させることにより、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つのＦａｂ分子を含む抗原結合分子の生成を（更に）最小限に抑えることができる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
【０１７０】
ヘテロ二量体化を強制するためのＣＨ３修飾の他の技術は、本発明による代替案として考えられており、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載される。
【０１７１】
一実施態様において、欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。このアプローチは、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の好ましい一実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である。
【０１７２】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、更にＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１７３】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、又は前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、更にＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（全ての番号はＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む。
【０１７４】
一実施態様において、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｄ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるアミノ酸変異を更に含む。
【０１７５】
一実施態様において、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２の位置に、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）から選択される更なるアミノ酸変異を含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施態様において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を更に含む。
【０１７６】
一実施態様において、例えば３６８及び４０９からなる群から選択される位置（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸修飾を有する、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。
【０１７７】
一実施態様において、上述したノブ−イントゥ−ホール技術を使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｙ４０７Ｔ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１７８】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレットに記載されるヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用される。
【０１７９】
代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、ＰＣＴ刊行物国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。そのような実施態様の１つにおいて、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）とのアミノ酸置換、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））とのアミノ酸置換、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））とのアミノ酸置換、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄを更に含む。更なる実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））とのアミノ酸置換を更に含む（全ての番号はＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０１８０】
更に別の実施態様において、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。一実施態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８１】
更に別の実施態様において、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量化アプローチが代替的に使用される。
【０１８２】
一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１８３】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかし、同時に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の所望されない標的化を導く。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、抗原結合部分の長い半減期とＴ細胞活性化特性が組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与の際に重篤な副作用をもたらす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を更に低下させることすらある。
【０１８４】
従って、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％、特に約８０％、更には特に約９０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
【０１８５】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への低下した結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を有するように操作される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する一実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にまで低下する。一実施態様では、改変されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、更には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈しうる。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低下からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、改変されていないＦｃドメイン（又は改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０１８６】
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのような１つの実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、更にＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。具体的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。１つのそのような実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組合せは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
【０１８７】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｌ２３５の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０１８８】
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８９】
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）により置き換えるアミノ酸置換を含む。
【０１９０】
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１９１】
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１９２】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０１９３】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０１９４】
幾つかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されている幾つかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。
【０１９５】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、すなわち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（すなわち、各々が可変及び定常ドメインを含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
【０１９６】
抗原結合部分の少なくとも一つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組換え生成において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬとＶＨ）が交換されている。しかし、このドメイン交換であっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合された重鎖と軽鎖との間のいわゆるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型相互作用のために、ある種の副生成物を含むことがある（Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191を参照）。異なるＦａｂ分子からの重鎖及び軽鎖の誤対合を更に減少させ、従って本発明による所望のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を増加させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸が、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子又は活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子の何れかのＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入される。電荷修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｊに示されるようなもの）、又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ−Ｆ、Ｋ−Ｎに示されているようなもの）の何れかで行われる（但し、両方ではない）。特定の実施態様において、電荷修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（特定の実施態様では標的細胞抗原に特異的に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子において行われる。
【０１９７】
本発明による特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に同時結合することができる。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原と活性化Ｔ細胞抗原に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。更に特定の実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性化、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、標的細胞への同時結合を含まないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の活性化Ｔ細胞抗原、具体的にはＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
【０１９８】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害性活性を標的細胞へと再指向することができる。特定の一実施態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
【０１９９】
特に、本発明の実施態様の何れかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０２００】
活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）に特異的に結合する少なくとも１つのＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、最大で一つの、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子（又は他のＦａｂ分子）を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に対する一価の結合を提供する。
【０２０１】
特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。
【０２０２】
そのような実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合する二つ以上のＦａｂ分子が存在する実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
【０２０３】
代替の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。
【０２０４】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号１）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性（すなわち、特異的に結合する）である。幾つかの実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
【０２０５】
幾つかの実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子は、ＣＤ３、具体的にはＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
【０２０６】
一実施態様において、ＣＤ３結合Ｆａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２０７】
別の実施態様において、ＣＤ３結合Ｆａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２０８】
一実施態様では、ＣＤ３結合Ｆａｂ分子は、配列番号３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
【０２０９】
一実施態様において、ＣＤ３結合Ｆａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
一実施態様において、ＣＤ３結合Ｆａｂ分子は、配列番号３の重鎖可変領域配列と、配列番号７の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
【０２１０】
標的細胞抗原結合Ｆａｂ分子
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原（本明細書では「標的細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）に特異的に結合する少なくとも１つのＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合する２つのＦａｂ分子を含む。このような特定の実施態様では、これらのＦａｂ分子の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。更により特定の実施態様では、これらのＦａｂ分子はすべて同一であり、すなわち、それらが本明細書に記載のＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換（存在する場合）を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合する、最大で２つのＦａｂ分子を含む。
【０２１１】
特定の実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子（単数又は複数）は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子（単数又は複数）は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。
【０２１２】
代替的実施態様において、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子（単数又は複数）は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。そのような実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。
【０２１３】
標的細胞抗原結合Ｆａｂ分子は、特異的抗原決定基に結合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えば抗原決定基を保持する特定の型の腫瘍細胞に指向することができる。
【０２１４】
特定の実施態様では、標的細胞抗原結合Ｆａｂ分子は、細胞表面抗原に特異的に結合する。
【０２１５】
特定の実施態様では、標的細胞抗原結合Ｆａｂ分子は、病状に関連付けられる抗原、例えば、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞上に現れる抗原に指向される。適切な標的細胞抗原は、細胞表面抗原、例えば、限定されないが、細胞表面受容体である。特定の実施態様では、標的細胞抗原はヒト抗原である。例示的な標的細胞抗原には、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４としても知られる）、又はＢＣＭＡ（ヒトＢ細胞成熟標的、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても知られる）を含む。
【０２１６】
特定の実施態様では、標的細胞抗原はＣＤ２０、特にヒトＣＤ２０である。一実施態様において、標的細胞抗原はＣＤ２０であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。更なる実施態様において、標的細胞抗原はＣＤ２０であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号３１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。なお更なる実施形態において、標的細胞抗原はＣＤ２０であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号３０の重鎖可変領域配列と、配列番号３１の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号１９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８のポリペプチド配列、配列番号１９のポリペプチド配列、配列番号２０のポリペプチド配列、及び配列番号２１のポリペプチド配列を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号１９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３２のポリペプチド配列、配列番号１９のポリペプチド配列、配列番号２０のポリペプチド配列、及び配列番号２１のポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号３９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６のポリペプチド配列、配列番号３７のポリペプチド配列、配列番号３８のポリペプチド配列、及び配列番号３９のポリペプチド配列を含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号４１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４０のポリペプチド配列、配列番号４１のポリペプチド配列、配列番号２０のポリペプチド配列、及び配列番号２１のポリペプチド配列を含む。
【０２１７】
他の実施態様では、標的抗原はＨｅｒ２、特にヒトＨｅｒ２である。一実施態様において、標的細胞抗原はＨｅｒ２であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。更なる実施形態において、標的細胞抗原はＨｅｒ２であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６１の重鎖可変領域配列と、配列番号６２の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号５４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のポリペプチド配列、配列番号５２のポリペプチド配列、配列番号５３のポリペプチド配列、及び配列番号５４のポリペプチド配列を含む。
【０２１８】
他の実施態様では、標的抗原はＨｅｒ３、特にヒトＨｅｒ３である。一実施態様において、標的細胞抗原はＨｅｒ３であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号６４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。更なる実施形態において、標的細胞抗原はＨｅｒ３であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６３の重鎖可変領域配列と、配列番号６４の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号５６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のポリペプチド配列、配列番号５５のポリペプチド配列、配列番号５６のポリペプチド配列、及び配列番号５７のポリペプチド配列を含む。
【０２１９】
他の実施態様において、標的抗原はメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、特にヒトＭＣＳＰである。一実施態様において、標的細胞抗原はＭＣＳＰであり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号６６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。更なる実施形態において、標的細胞抗原はＨｅｒ２であり、前記標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号６５の重鎖可変領域配列と、配列番号６６の軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
【０２２０】
幾つかの実施態様において、標的抗原はＢＣＭＡである。他の実施態様において、標的細胞抗原はＢＣＭＡではない。
【０２２１】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を含む。幾つかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
【０２２２】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、二つ以上）のポリヌクレオチドとして発現されうる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、Ｆａｂ分子の軽鎖部分は、Ｆａｂ分子の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意選択的に別のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してＦａｂ分子を形成するであろう。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
【０２２３】
幾つかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体を本明細書に鬼才のようにコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリヌクレオチドを、本明細書に記載のようにコードする。
【０２２４】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。
【０２２５】
組換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物の中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、二つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードしうる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導���所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２２６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２２７】
後の精製を容易にするため又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
【０２２８】
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−���６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０２２９】
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０２３０】
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
【０２３１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、通常互いに融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０２３２】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２３３】
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記述する）； Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述する）； Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述する）；及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述する）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例え���、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
【０２３４】
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第一の標識された抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第一の標識された抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２３５】
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。親和性クロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性クロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正しく会合していると示された（例えば図３を参照）。３つのバンドはおよそ分子量２５０００、分子量５００００及び分子量７５０００で分離され、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測された分子量に対応する。
【０２３６】
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０２３７】
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、受容体又は組み換え発現により得られるもののような標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
【０２３８】
一実施態様によれば、ＫＤは２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥヘルスケア）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。
【０２３９】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付組換えＦｃ受容体が、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）によって捕捉され、二重特異性構築物は分析物として使用される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度測定のため、二重特異性構築物の４倍段階希釈（５００ｎＭから４０００ｎＭ）が、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で２５℃で約３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入される。
【０２４０】
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性構築物は、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載したように、活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉される。結合したタンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性構築物は３００ｎＭで９０秒間で捕捉される。標的抗原は、３０μｌの／分の流速で２５０〜１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過する。解離は１８０秒間モニターされる。
【０２４１】
バルクの屈折率の差は、参照フローセル上で得られた応答を差し引くことにより補正される。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
【０２４２】
活性のアッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物学的活性は、例えばＴ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮の誘導及び／又は生存の改善を含み得る。
【０２４３】
組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかと、薬学的に許容可能な担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れか及び少なくとも一つの付加的治療剤、例えば下記のものを含む。
【０２４４】
更に提供されるのは、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をインビボ投与に適した形態で生成する方法であって、該方法は、（ａ）本発明による二Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体で製剤化することを含み、これにより、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物がインビボ投与用に製剤化される。
【０２４５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された治療的に有効な量の一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に付加的活性成分を含有する薬学的組成物の調製物は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物（例えば、ヒト）投与では、ＦＤＡ生物学的基準局（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）又は他の国の対応当局によって要求されるように、調製物が無菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たさなければならないことが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのPharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（出典明記によってここに援用する））。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
【０２４６】
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び何れかの追加の治療剤）は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄（ｌａｖａｇｅ）によって、クリームにおいて、液体組成物（例えばリポソーム）において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照（出典明記によってここに援用する））。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
【０２４７】
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液中、好ましくは生理学的適合した緩衝液、例えばＨａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。代替的には、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容可能な適切な担体としては、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが含まれる。
【０２４８】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのPharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２４９】
先に記載した組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２５０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、通常の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【０２５１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２５２】
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
【０２５３】
治療法での使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
【０２５４】
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体の治療法において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの付加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するためにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０２５５】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。更なる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、方法は更に、個体に対し、少なくとも一つの付加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２５６】
更なる態様において、本発明は、疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容可能な形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの付加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２５７】
更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む。更なる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２５８】
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。幾つかの実施態様では、幾つかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。従って、幾つかの実施態様では、生理的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２５９】
幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２６０】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な容量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の付加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定される。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定されないが、様々な時点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
【０２６１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約０．００５  ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる何れかの範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などが投与されうる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０投与量、又は例えば約６投与量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２６２】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２６３】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２６４】
初期投与量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２６５】
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日にわたる。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２６６】
局所投与又は選択的取り込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２６７】
治療的に有効な用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な標準の薬学的手順によって決定できる。ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、被験体の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。
【０２６８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動する。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動する。
【０２６９】
その他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与される。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような付加的治療剤は、治療されている特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、付加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
【０２７０】
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上記他の要因によって決まる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２７１】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、付加的治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２７２】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性な薬剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する組成物を中に含む第一の容器；及び（ｂ）更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
【実施例】
【０２７３】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０２７４】
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている： Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、NIH出版番号91-3242。
【０２７５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２７６】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２７７】
実施例１
電荷修飾を有する及び有しないＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製（抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３）
以下の分子がこの実施例で調製され、その模式図を図２に示す：
Ａ．電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＣＨ１／ＣＬ交換）（図２Ａ、配列番号１４−１７）
Ｂ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾）（図２Ｂ、配列番号１８−２１）
Ｃ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾）（図２Ｃ、配列番号３２、１９−２１）
Ｄ．電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換）（図２Ｄ、配列番号３３、１５、１７、２１）
Ｅ．電荷修飾を有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬ交換）（図２Ｅ、配列番号３４、１５、１７、３５）
Ｆ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ２０結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ３結合剤中に電荷修飾）（図２Ｆ、配列番号３６−３９）
Ｇ．電荷修飾及びＦｃ領域におけるＤＤＫＫ突然変異を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾）（図２Ｇ、配列番号４０、４１、２０、２１）
Ｈ．電荷修飾を有する「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾）（図２Ｈ、配列番号４２、４３、２０、２１）
Ｉ．電荷修飾を有する「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾、異なるＣＤ２０結合剤、異なるＣＤ２０結合剤）（図２Ｉ、配列番号４３−４５、２１）
Ｊ．電荷修飾２１３Ｅ、１２３Ｒを有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換、ＣＤ２０結合剤中に電荷修飾）（図２Ｊ、配列番号６９−７１、２１）
Ｋ．電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（ＣＤ３結合剤中にＶＨ／ＶＬ交換及び電荷修飾）（図２Ｋ、配列番号１５、１７、７２、７３）
【０２７８】
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、合成ポリＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に位置する。加えて、各ベクターはＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２７９】
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、対応する発現ベクターを１：２：１：１の比で用いて（Ａ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＨ１）」；Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、Ｋ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」：Ｃ：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」：Ｅ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＨ１）」：Ｆ：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＨ１）」）トランスフェクトされ、又は１：１：１：１の比で用いて（Ｈ、Ｉ：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」）トランスフェクトされた。
【０２８０】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む無血清のＥｘｃｅｌｌ培養液中で懸濁状態で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業容量４００ｍｌ）内での生成のために、６億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地中で最終的に４００μｇのＤＮＡの量まで混合する。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、３６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ＋６ｍＭのＬ−グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、７％のＦｅｅｄ １（Ｌｏｎｚａ）を添加した。７日後、３６００×ｇで２０〜３０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離機）によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えた。溶液を４℃で維持した。
【０２８１】
培養培地中の構築物の濃度は、プロテインＡ−ＨＰＬＣによって決定した。分離の基礎は、ｐＨ８．０でのプロテインＡに対するＦｃ含有分子の結合及びｐＨ２．５からの段階的溶出であった。２つの移動相があった。これらは異なるｐＨ（８及び２．５）に調整した以外は同じであるトリス（１０ｍＭ）−グリシン（５０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１００ｍＭ）緩衝液であった。カラム本体は、ＰＯＲＯＳ  ２０Ａを充填した約６３μｌの内部容量を有するＵｐｃｈｕｒｃｈ  ２×２０ｍｍプレカラムであった。平衡化された物質上に１００μｌの各試料を０．５ｍｌ／分の流速で注入した。０．６７分後、試料をｐＨ２．５までのｐＨステップで溶出した。定量は、２８０ｎｍ吸光度の測定及び１６〜１６６ｍｇ／ｌのヒトＩｇＧ１の濃度範囲を有する標準曲線を用いた計算によって行った。
【０２８２】
分泌タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いた親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製した。親和性クロマトグラフィーのために、２５ｍＭの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。非結合タンパク質は、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄し、続いて６カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５を用いた追加の洗浄工程により除去した。次いで、カラムを２０ｍｌの１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄し、標的タンパク質は、６カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。分子Ａは、１００％の最終モノマー含量を達成するために、追加の分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程によって精製しなければならなかった。従って、第１のサイズ排除工程からのモノマー含量の高い画分をプールし、濃縮し、再びＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。この追加の精製工程は、他の分子については必要ではなかった（副生成物プロファイルに依存するが、画分の貯留、従って第１のサイズ排除クロマトグラフィー後の回収はこれらの分子について異なっていた）。
【０２８３】
分子の純度及び分子量は、還元剤の非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる第１精製工程（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）及びクーマシー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色後に分析した。製造元の指示（４−１２％のＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲル又は４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用した。
【０２８４】
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【０２８５】
最終精製工程後に分子の純度及び分子量が、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。
【０２８６】
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニング緩衝液）中において、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０２８７】
全ての分子は、（上記のように、追加のＳＥＣ工程に供された分子Ａを除いて）同じ方法に従って生成され精製された。
【０２８８】
分子Ａは、最初の分取サイズ排除クロマトグラフィーの後に高い凝集物含有量を示した。この精製工程後の凝集物の含有量は、高分子量不純物とモノマー画分とのベースライン分離がなかったために決定できなかった。１００％のモノマー物質を得るためには、追加の分取サイズ排除クロマトグラフィー工程が必要であった。分子Ｂは、１回の分取サイズ排除クロマトグラフィーの後に１００％モノマーであった。
【０２８９】
上清中の濃度は分子Ａの方が高かったが、最終収率は（高い凝集物含有量に起因して）分子Ｂよりも２．３倍低かった（表２）。
【０２９０】
ＣＥ−ＳＤＳ分析によって示される最終純度は、分子Ａよりも分子Ｂのほうが高かった（表３、図３Ａ及びＢ）。図３Ｍ及び３Ｎは、分子Ａが分子Ｂと比較して広いピークを有するＳＥＣ精製工程（分取ＳＥＣ）のクロマトグラムを示しており、ＳＥＣにロードされた分子Ａの調製物は均一ではなく、他方分子Ｂの調製物は大部分モノマー性であることを示している。
【０２９１】
分子Ｃは高力価で生成することができたが、分子Ｂと比較して、適用されたクロマトグラフィー法により完全に除去することができなかった高含有量の副生成物に起因して、最終回収率は低かった（表２；表３；図３Ｂ及びＪ、並びに図３Ｃ及びＫ）。図３Ｂ及び３Ｋに示すように、プロテインＡ精製工程後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は分子Ｂの副生成物を示さなかったが、一方分子Ｃの調製物は１００ｋＤａの見かけの分子量で現れる幾つかの副生成物を含有している。
【０２９２】
分子Ｄは、抗ＣＤ２０  Ｆａｂ中に荷電残基が存在しない場合にのみ、分子Ｂとは異なる。この分子は、高力価で一時的に生成することもできるが、分子Ｃについて既に記載したように、分析ＳＥＣで示される最終品質（分子Ｄについては９８％のモノマーに対して、分子Ｂについては１００％のモノマー）及び回収率は副生成物の高い含有量に起因して分子Ｂよりも低かった（表２；表３；図３Ｂ及びＪ並びに図３Ｄ及びＬ）。図３Ｊ及び３Ｌに示すように、プロテインＡ精製工程後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は分子Ｂの副生成物を示さなかったが、一方分子Ｄの調製物は６６ｋＤａ及び４０ｋＤａの見かけの分子量で現れる幾つかの副生成物を含有している。図３Ｎ及び３Ｏは、分子Ｄが分子Ｂと比較して広いピークを有するＳＥＣ精製工程（分取ＳＥＣ）のクロマトグラムを示しており、ＳＥＣにロードされた分子Ｄの調製物は均一ではなく、他方分子Ｂの調製物は大部分モノマー性であることを示している。
【０２９３】
また、分子Ｅの生成物の力価は高かったが、分析用ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動によって示されるように（表２；表３；図３Ｅ）、最終生成物は依然として低分子量不純物を含有していた。
【０２９４】
分子Ｂとは対照的に、分子Ｆは腫瘍標的結合部分のＦａｂ上でＶＨ−ＶＬ交換を有するが、電荷修飾は抗ＣＤ３  Ｆａｂに導入されている。この分子は高力価でも生産することができたが、最終回収率は副生成物に起因して低かった。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢについては、抗ＣＤ２０  Ｆａｂにおいて電荷修飾を有するフォーマットが、生成及び精製に関して好ましい。
【０２９５】
分子Ｇは、「ノブ−イントゥ−ホール」変異を置き換える、Ｆｃ領域における電荷修飾を有する分子である（「ＤＤ」＝Ｋ３９２Ｄ；Ｋ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインのサブユニットの１つにおいて）、「ＫＫ」＝Ｄ３５６Ｋ；Ｄ３９９Ｋ（Ｆｃドメインの他方のサブユニットにおいて）（ＥＵの番号付け））。二重特異性分子の生成は、１つの重鎖に２つのアスパラギン酸残基を導入し、第２の重鎖に２つのリジン残基を導入することによって促進される（図２Ｇ）。この分子は高力価で生成することができたが、分析用ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動によって示されるように、最終生成物は依然として幾つかの高分子量及び低分子量不純物を有しており（表２；表３）、一方「ノブ−イントゥ−ホール」変異を保有する同じ分子（分子Ｂ）については、副生成物を完全に除去することができた。
【０２９６】
分子Ｉは、ＣＤ２０結合剤において分子Ｈと異なり、分子Ｈと比較して最終分取サイズ排除クロマトグラフィー後に高い凝集物含有量を示した。ＣＥ−ＳＤＳ分析によって示される最終純度は、分子Ｉよりも分子Ｈのほうが高かった（表３、図３Ｈ及びＩ）。また、分子Ｈの回収率は、分子Ｉの回収率よりも４０％高かった（表２）。この結果は、分子の品質がＴ細胞二重特異性フォーマットで使用される抗体にも依存することを示している。
【０２９７】
分子Ｊ及び分子Ｋの生成物は、良好な収率をもたらした良好な初期力価を有していた。しかし、両方の分子について約２０％の最終回収率は、分子Ｂで達成された４８％を大幅に下回っていた（表２）。両方の分子は、＞９９％のモノマー含有量を有する最終品質で類似している（表２）。非還元ＣＥ−ＳＤＳの純度は、分子Ｊ（これは、ＣＬドメインの１２４位及びＣＨ１ドメインの１４７位で電荷修飾を欠いている）についてはほぼ９９％であり、９０％である分子Ｋ（電荷修飾を有しＣＤ３結合剤中にＶＬ−ＶＨ交換を有する）より良好である（表３、図３Ｎ及び３Ｏ）。分子Ｊは、親和性クロマトグラフィー後の濃縮工程中に一部沈殿を示した。分子Ｋは、ＣＤ２０結合ＦａｂよりむしろＣＤ３結合ＣｒｏｓｓＦａｂにおいて電荷修飾を有する。これは、ＣＥ−ＳＤＳによって示されるように、最終品質に影響を及ぼす（表３、図３０）。品質の違いは、ＳＤＳ−Ｐａｇｅの最初の精製工程後にほとんど見ることができる（図３Ｐ、３Ｑ）。分子Ｋは、分子Ｊよりも１５０ｋＤａ及び７０ｋＤａ（半分の分子及び構築物はおそらく軽鎖を失っている）でより多くの副生成物を含有する。両方の分子は、分子Ｂと同様の熱安定性を有する（表４）。
【０２９８】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢについては、抗ＣＤ２０  Ｆａｂ上に電荷修飾を有する「反転型」バージョン（分子Ｂ）は、最も高い回収率及び最終品質で生成することができるフォーマットである。
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【０２９９】
ＬＣ−ＭＳ分析による分子量確認
脱グリコシル化
分子の均一な調製を確認するために、最終のタンパク質溶液をＬＣ−ＭＳ分析によって分析した。糖によって導入された不均一性を除去するために、構築物をＰＮＧａｓｅＦで処理した。この目的のために、タンパク質溶液のｐＨを、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質２０μｇに２μｌの２ＭのＴｒｉｓを加えることによってｐＨ７．０に調整した。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。
【０３００】
ＬＣ−ＭＳ分析−オンライン検出
ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００で行った。クロマトグラフィー分離はＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（８μｍ粒子サイズ、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）で行った。溶離液Ａは５％アセトニトリル及び０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸の水溶液であり、溶離液Ｂは９５％アセトニトリル、５％水及び０．０５％ギ酸であった。流速は１ｍｌ／分であり、分離は４０℃で、前に記載した処理で得られた６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を用いて行った。
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【０３０１】
最初の４分間、質量分析計の塩汚染を防ぐために、溶出液は廃棄物へ送られた。ＥＳＩ源は、１２ｌ／分の乾燥ガス流、３５０℃の温度及び６０ｐｓｉのネブライザー圧力で運転していた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードで、３８０Ｖのフラグメンター電圧及び７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を用いて取得した。ＭＳデータは、計器のソフトウェアによって４〜１７分で取得される。
【０３０２】
分子Ａの調製物は、誤対合した軽鎖及び微量の遊離又は連結した軽鎖を有する約１０−１５％の分子を有していた。分子Ｂの調製物は、２つのＣＤ３軽鎖を含む微量の分子を有していた。遊離軽鎖や連結軽鎖などの不純物は検出できなかった（表２）。
【０３０３】
静的光散乱による熱安定性
熱安定性は、静的光散乱（ＳＬＳ）によって及び適用された温度ストレスに応答する内因性タンパク質の蛍光を測定することによってモニターした。
【０３０４】
１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する３０μｇの濾過されたタンパク質試料を、Ｏｐｔｉｍ２（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ；ＧＢ）に二通りに適用した。温度を２５℃から８５℃まで０．１℃／分で上昇させ、半径及び全散乱強度を収集した。固有のタンパク質蛍光の測定のために、試料を２９５ｎｍで励起し、発光を２６６と４７３ｎｍの間で収集した。
【０３０５】
全ての分子について熱安定性を測定した。結果を表４に示す。温度勾配を適用した後に動的光散乱によって測定された凝集温度（ＴＡｇｇ）及びタンパク質蛍光によって測定された融解温度（ＴＭ）は５４−５８℃の範囲のＴＡｇｇ及び５６−６０℃の範囲のＴＭを有する全ての分子に匹敵した（表４）。
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【０３０６】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体のＣＤ３及びＣＤ２０への結合
ヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、電荷残基を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体（上記の分子「Ａ」及び「Ｂ」）のＣＤ３への結合を測定した。ＣＤ２０への結合は、ヒトＣＤ２０発現Ｚ−１３８細胞を用いて測定した。懸濁細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｖｉｃｅｌｌを用いて生存率及び細胞密度を決定した。懸濁細胞を２×１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６穴丸底プレートに播種した。各工程は４℃で行った。プレートを３６０×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。抗体希釈液をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で調製した。３０μｌの希釈抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体又はＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加し、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ウェルあたり１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、プレートを３５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。洗浄工程を１回繰り返した。プレートレイアウトに示されているように、３０μｌの予め希釈した二次抗体をウェルごとに添加した。プレートを４℃で更に３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ウェルあたり１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、プレートを３５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。洗浄工程は、この１回の洗浄工程の直後に固定されたＪｕｒｋａｔ細胞を含むプレートを除き、全てのプレートについて１回繰り返された。１ウェルあたり１００μｌのＢＤ固定化緩衝液（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５４６５５）を用いて細胞を４℃で２０−３０分間固定した。細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いたＦＡＣＳ測定のために８０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
この実験の結果を図４に示す。
【０３０７】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体によって誘導されたＣＤ２０発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅時の腫瘍細胞溶解とＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化
Ｚ−１３８及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞について、電荷修飾を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体（上記の分子「Ａ」及び「Ｂ」）によって誘導された標的細胞のＴ細胞媒介性死滅及びＴ細胞の活性化を評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２２時間後に死滅並びにＴ細胞活性化を検出した。簡潔には、標的細胞を回収し、洗浄し、丸底９６ウェルプレートを用いて３０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常なヒトドナーからの新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有相間の上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離（４００ｘｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した（遠心分離工程：３５０ｘｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において（３７℃、５％ＣＯ２）１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）貯蔵した。死滅アッセイのために、指示された濃度で（１０００ｐＭ〜０．１ｐＭの範囲で３通りに）抗体を添加した。最終Ｅ：Ｔ比６：１でＰＢＭＣを標的細胞に添加した。インキュベーション後、プレートを４２０ｘｇで４分間遠心分離し、ＬＤＨ検出のために５０μｌ／ウェルを新しい９６平底プレートに移した。ＬＤＨ検出は、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ＃１１６４４７９３００１）を製造者の指示に従って使用して行った。残りの細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８（ＡＰＣＣｙ７抗ヒトＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０１０１６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００５０６）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの＃３１０９３０）及びＣＤ２５（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２６１２）の表面染色を供給者の指示に従って行った。４℃で３０分後、細胞を０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡを用いて固定した。測定は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて行った。
【０３０８】
この実験の結果を図５、６及び７に示す。両方の分子は、腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性化に関して同等の活性を示す。
【０３０９】
ヒト全血中の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体によって誘導された健常ヒトＢ細胞のＴ細胞媒介死滅時のＢ細胞枯渇とＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化
健常ドナーからのヒト全血を、示された濃度で（５００００ｐＭ〜１ｐＭの範囲で３通りに）、電荷修飾を有する又は有しない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体（上記の分子「Ａ」及び「Ｂ」）とともにインキュベートした。２２時間後、血液を混合し、３５μｌを、ＣＤ８（ＡＰＣＣｙ７抗ヒトＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０１０１６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００５０６）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１０９３０）、ＣＤ２５（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２６１２）、ＣＤ２２（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２５１０）及びＣＤ４５（ＰｅｒＣＰＣｙ５．５抗ヒトＣＤ４５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０４０２８）を含有する２０μｌのＦＡＣＳ抗体混合物を用いた染色のために収集した。室温で１５分間インキュベートした後、血液をＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ溶液（ＢＤ、＃３４９２０２）で固定し、フローサイトメトリーで分析した。Ｂ細胞枯渇を、Ｂ細胞数とＣＤ４＋Ｔ細胞数との比に基づいて計算し、未処理サンプルを０％Ｂ細胞枯渇に設定した。
【０３１０】
この実験の結果を図８及び９に示す。両方の分子は、全血におけるＢ細胞枯渇及びＴ細胞活性化に関して同等の活性を示す。
【０３１１】
ヒトＣＤ２０及びＣＤ３発現標的細胞に対する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体の結合
上記の分子「Ｂ」として示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体の結合を、ヒトＣＤ２０発現びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株（ＷＳＵ  ＤＬＣＬ２、０．５−１ｘ１０６ＣＤ２０結合部位）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に対して試験した。簡潔には、細胞を回収し、計数し、生存率を確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡ）中に１．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（０．１５ｘ１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＣＤ２０  ＴＣＢ（５０ｐＭ−２００ｎＭ）と共に丸底９６ウェルプレート中で３０分間４℃でインキュベートし、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、希釈されたＰＥ−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＰＥ ＃１０９−１１６−１７０）と共に更に３０分間４℃で再インキュベートし、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、２％ＰＦＡの添加により固定し、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングにより分析から死細胞を除外してＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。
【０３１２】
結果を図１０Ａ（ＷＳＵ  ＤＬＣＬ２細胞への結合）及び図１０Ｂ（Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合）に示す。結合曲線及び結合に関連するＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した。ＥＣ５０値は０．９８ｎＭ（ＣＤ２０発現ＷＳＵ  ＤＬＣＬ２細胞への二価結合）及び約１２．５ｎＭ（ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への一価結合）であった。
【０３１３】
ヒト及びカニクイザルＣＤ２０及びＣＤ３発現標的細胞に対する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体の結合
ヒト及びカニクイザルＣＤ２０発現Ｂ細胞並びにＣＤ３発現ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞への結合を評価することにより、上記の分子「Ｂ」として示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０  ＴＣＢ抗体の交差反応性を評価した。簡潔には、健常ドナーからのヘパリン処理されたヒト及びカニクイザルの血液を、密度遠心分離によってＰＢＭＣを単離するために使用した。単離されたＰＢＭＣはカウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌのＰＢＳ  ０．１％のＢＳＡ）中、１ｍｌあたり４ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．４×１０６細胞を含む）を９６ウェルのＵ底プレートに播種し、遠心分離した（４２０×ｇ、４分）。上清を除去した後、ＰＢＭＣを漸増濃度のＣＤ２０  ＴＣＢ−ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（２００ｐＭ−２００ｎＭ）とともに４℃で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ヒト／カニクイザル交差反応性抗体：抗ＣＤ１９（社内、クローン８Ｂ８）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗ＣＤ４（ＢＤ、＃５５２８３８、クローンＬ２００）−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５及び抗ＣＤ８（ＢＤ、＃５５５３６７、クローンＲＰＡ−Ｔ８）−ＰＥとともに更に３０分間４℃で再インキュベートした。３０分後、ＰＢＭＣを冷ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ、＃３４９２０２）で処理した後、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳ分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて結合曲線を得た。
【０３１４】
結果を図１１Ａ（ヒト及びカニクイザルＢ細胞への結合）、図１１Ｂ（ヒト及びカニクイザルＣＤ４Ｔ細胞への結合）及び図１１Ｃ（ヒト及びカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞への結合）に示す。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算したＣＤ２０発現Ｂ細胞への結合に関連するＥＣ５０値は、４．８ｎＭ（ヒトＢ細胞）及び３．３ｎＭ（カニクイザルＢ細胞）であった。
【０３１５】
異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解
異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマット（上記の分子「Ｂ」、「Ａ」「Ｃ」及び「Ｈ」）によって媒介される腫瘍細胞溶解を、Ｚ１３８細胞（マントル細胞リンパ腫、０．０６−０．２３×１０６個のＣＤ２０結合部位）で評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、異なる二重特異性抗体フォーマットとのインキュベーションの２１〜２４時間で腫瘍溶解が検出された。簡潔には、標的細胞を回収し、洗浄し、Ｕ底９６ウェルプレートを用いて５００００細胞／ウェルの密度で蒔いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常なヒトの血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分間、室温、ブレーキ無し）後、ＰＢＭＣ含有相間上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離（３５０ｘｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて洗浄した（３００ｘｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、更なる使用まで（２４時間以内）保管した。腫瘍溶解アッセイのために、抗体を示された濃度で（０．１ｐＭ〜１ｎＭの範囲で３通りに）抗体を添加した。最終Ｅ：Ｔ比６：１でＰＢＭＣを標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２での２１〜２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、腫瘍細胞溶解を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。
【０３１６】
図１２は、異なるＣＤ２０  ＴＣＢ抗体フォーマットが、ＣＤ２０＋標的細胞の強力で標的特異的な溶解を誘導することを示す。パネルＡは、「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、反転型」（上記の分子「Ｂ」）が「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷なし、反転型」（上記の分子「Ａ」）に匹敵する活性を示し、どちらも「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿１＋１＿電荷あり」フォーマット（上記の分子「Ｈ」）よりも強力であることを示している。パネルＢは、「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、反転型」（上記の分子「Ｂ」）が「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、古典型」フォーマット（上記の分子「Ｃ」）よりも強力であることを示している。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算された死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表５に示す。
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【０３１７】
異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解及びその後のＴ細胞活性化
３種の異なる健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを用いて、異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマット（上記の分子「Ｂ」及び「Ｈ」）によって媒介される腫瘍細胞溶解を更にＺ１３８細胞（マントル細胞リンパ腫）において並びにＤＬＢＣＬ株（ＯＣＩ  Ｌｙ−１８（０．０６−０．２×１０６個のＣＤ２０結合部位）、Ｒａｍｏｓ（０．１−０．４×１０６個のＣＤ２０結合部位）、ＳＵ−ＤＨＬ−５（０．１３−０．２１×１０６個のＣＤ２０結合部位）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（アッセイの検出限界未満のＣＤ２０結合部位）、Ｔｏｌｅｄｏ（０．０２×１０６個のＣＤ２０結合部位）及びＵ２９３２（０．０９−０．４×１０６個のＣＤ２０結合部位）細胞株を含む）の広範なパネルにおいて評価した。腫瘍細胞回収、ＰＢＭＣ単離及びアッセイ条件は、前の実施例に記載したものと同一であった。図１３Ａ〜Ｃに示すアッセイのＥ：Ｔ比は６：１であり、図１３Ｄに示すアッセイでは３：１であった。３７℃、５％ＣＯ２での２１時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、腫瘍細胞溶解を評価した。腫瘍細胞溶解時に生じるＴ細胞活性化の評価のために、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、４００ｘｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＡＰＣＣｙ７抗ヒトＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０１０１６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００５０６）及びＣＤ２５（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２６１２）の表面染色を供給者の指示に従って行った。細胞を、０．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄し、２％ＰＦＡ又はＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ、＃３４９２０２）を用いて固定した。試料をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩで分析した。
【０３１８】
図１３は、異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いた腫瘍細胞溶解（パネルＡ、Ｄ）及びＴ細胞活性化（パネルＢ、Ｃ）の両方の検出によって評価されるように、「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、反転型」抗体フォーマット（上記の分子「Ｂ」）は、「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿１＋１」抗体フォーマット（上記の分子「Ｈ」）よりも強力であることを示している。Ｚ１３８細胞の腫瘍溶解及びＴ細胞活性化に関連するＥＣ５０値を表６ａに示す。ＤＬＢＣＬ細胞株のパネルの腫瘍溶解アッセイに関連するＥＣ５０値を表６ｂに示す。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した。
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【０３１９】
異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットによって媒介されるヒト全血におけるＢ細胞枯渇
異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマット（上記の分子「Ｂ」及び「Ｈ」）及びオビヌツズマブによって媒介される正常なＢ細胞枯渇を、健常ボランティアからの新鮮なヒト血液を用いて更に評価した。簡潔に述べると、新鮮な血液をヘパリン含有シリンジに採取した。血液アリコート（１８０μＬ／ウェル）を、ＴＣＢ又は抗体希釈液（１０μＬ／ウェル＋１０μＬ／ウェルのＰＢＳ）を補充した９６穴のウェルプレートに入れ、加湿した細胞インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、血液をピペットで上下に混合し、３５μＬ血液アリコートを９６ウェルＵ底プレートに移し、フローサイトメトリー用に全部で５５μＬの容量の蛍光抗ＣＤ４５（ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０４０３７）抗ＣＤ４（ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＢＤ、＃５５２８３８）、抗ＣＤ８（ＡＰＣＣｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０１０１６）、抗ＣＤ１９（ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０２２０８）、抗ＣＤ２５（ＰＥＣｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０２６１２）及び抗ＣＤ６９（ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９３０）と共にインキュベートした。室温（暗所）で１５分間インキュベートした後、フローサイトメトリーの前に赤血球を枯渇させ、細胞を固定するために、１８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。
【０３２０】
図１４は、ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、反転型（分子Ｂ）は、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）及びＣＤ２０  ＴＣＢ＿１＋１＿電荷あり（分子Ｈ）の双方よりも正常なＢ細胞を枯渇させる点において強力であることを示す。
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【０３２１】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイを用いたＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価されるＴ細胞の活性化
ＣＤ２０発現腫瘍標的細胞とＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを有するＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１）の共培養を用いて、Ｔ細胞架橋及びその後のＴ細胞活性化を誘導する異なる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体フォーマットの能力を評価した。ＣＤ２０抗原（腫瘍細胞上で発現される）及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞上で発現される）に対する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢの同時結合の際に、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現へと導く。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加時に得られる）は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞は懸濁液中で増殖し、ＲＰＭＩ１６４０、２μｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｘＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン中、０．１−０．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで培養された。アッセイのために、腫瘍標的細胞（Ｚ１３８）を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を決定した。５０μｌ／ウェルの希釈抗体又は培地（対照用）を標的細胞に添加した。平底白い壁９６ウェルプレート（＃６５５０９８、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に２００００細胞／ウェルを蒔いた。続いて、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を評価した。ハイグロマイシンＢを含まない細胞培養培地中に２ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞を再懸濁し、０．１×１０６細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加し、５：１の最終Ｅ：Ｔ及び１ウェル当たり１００μｌの最終容量を得た。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、１００μｌ／ウェルのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液（ウェルあたり１：１のＯＮＥ−Ｇｌｏ及びアッセイ培地容量）をウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベートした。発光は、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を用いて、検出時間として５秒／ウェルで検出した。
【０３２２】
図１５は、「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿２＋１＿電荷あり、反転型」（分子Ｂ）は「ＣＤ２０  ＴＣＢ＿１＋１」（分子Ｈ）よりも強いＴ細胞活性化及びＣＤ３の下流のシグナル伝達をもたらすことを示す。
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【０３２３】
健常ＮＯＧマウスにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢの単回投与薬物動態（ＰＫ）
有効性試験（図１６）中の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子「Ｂ」（以下、「ＣＤ２０  ＴＣＢ」と呼ぶ）の曝露を評価するために、単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した。０．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス投与をＮＯＧマウスに投与し、薬物動態評価のために選択した時点で血液試料を採取した。ＣＤ２０  ＴＣＢの総濃度を測定するために、一般的なイムノアッセイを使用した。ＣＤ２０  ＴＣＢの標準曲線の較正範囲は０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌであった（ここでは１５ｎｇ／ｍｌが定量の下限値（ＬＬＯＱ）である）。
【０３２４】
１０日間のベータ半減期（非区画分析）及び８ｍＬ／ｄ／ｋｇのクリアランス（２区画モデル）で二相性低下が観察された。半減期とクリアランスは、正常な非標的ＩｇＧと比較して予想通りであった（表９）。
【０３２５】
Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  ＬｔｄのＰｈｏｅｎｉｘ  ｖ６．２をＰＫ解析、モデリング、シミュレーションに使用した。
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【０３２６】
インビボでの抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢのＢ細胞枯渇活性
ＣＤ２０  ＴＣＢの末梢Ｂ細胞枯渇活性を、完全ヒト化ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスで試験した。
循環ヒトＢ細胞及びＴ細胞の生理学的レベルを有する１４週齢の完全ヒト化ＮＯＧマウス（Hayakawa J. et al. (2009),Stem Cells 27(1), 175-182）を、ビヒクル（ｎ＝７）又はＣＤ２０  ＴＣＢ（ｎ＝６）の何れかで１週間に１回静脈内（ｉ．ｖ．）投与される０．５ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。図１７の試験デザインに示されるように、マウスは、Ｂ細胞及びＴ細胞分析のために、最初の治療用注射の１日後と３日後（Ｄ１、Ｄ３）及び２回目の注射の３日後（Ｄ１０）に採血され、その時点で試験が終了した。後者の時点で、Ｂ細胞及びＴ細胞分析のために脾臓も採取した。循環Ｂ細胞及びＴ細胞のカウントのためのベースライン基準として、治療用注射の４日前（Ｄ−４）にマウスをスクリーニングした。図１８は、異なる時点でのビヒクル（左パネル）及びＣＤ２０  ＴＣＢ（右パネル）処置マウスの血液におけるエクスビボフローサイトメトリーによって分析されたＢ細胞及びＴ細胞数を示す。結果は、循環Ｂ細胞がＣＤ２０  ＴＣＢ注射の１日後に既に非常に効率的に枯渇しており、その数は試験期間全体にわたって検出できなかったことを実証している。対照的に、循環Ｔ細胞数は、治療用注射後にＤ１で一時的に低下し、Ｄ３でベースラインレベルに戻り、試験期間全体にわたって安定したままであった。また最初の治療用注射後のＤ３及びＤ１０での処置マウスの血液中において、Ｔ細胞活性化状態を異なるＴ細胞表面マーカー及び増殖マーカーＫｉ６７を用いたエクスビボフローサイトメトリーにより分析した（図１９）。ＣＤ２０  ＴＣＢ処置マウス由来のＴ細胞は、ビヒクル対照からのＴ細胞と比較して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞区画の両方における活性化マーカーＣＤ２５、４−１ＢＢ、ＰＤ−１及びグランザイム−Ｂ（ＧＺＢ）のアップレギュレーションにより、治療用注射後のＤ３で活性化表現型を示した（上のパネル）。処置マウス由来のＴ細胞も、より高いレベルの増殖マーカーＫｉ６７を発現した。最初の治療用注射後のＤ１０では、Ｔ細胞活性化マーカーの大部分は、ＧＺＢ及びＰＤ−１を除いてベースラインレベルに戻っていたが、これらはビヒクル対照と比較して依然としてより高いレベルで発現していた。
【０３２７】
図２０は、試験終了時（Ｄ１０）にビヒクル及びＣＤ２０  ＴＣＢ処置マウスの脾臓で行ったＢ細胞及びＴ細胞分析の結果を示す。ＣＤ２０  ＴＣＢ処置は、この二次リンパ器官においても非常に効率的なＢ細胞枯渇を媒介したが（図２０Ａ）、Ｔ細胞数はビヒクル対照に匹敵するレベルを示した（図２０Ｂ）。Ｔ細胞活性化状態（図２０Ｃ）は血液中で観察されたものと同様であり、ビヒクル対照と比較して処置マウスの脾臓Ｔ細胞においてＧＺＢ及びＰＤ−１の発現が高かった。
【０３２８】
全体として、これらの結果は、ＣＤ２０  ＴＣＢ処置は、治療用注射の１日後に既に末梢Ｂ細胞の非常に効率的な枯渇を媒介することができ、治療終了後（第２の治療用注射の３日後）にＢ細胞が検出されない状態を保つことを実証している。Ｂ細胞もまた、処置されたマウスの脾臓において効率的に枯渇される。Ｂ細胞枯渇活性は、未処置の対照と比較してより高いレベルで発現したままであるＧＺＢ及びＰＤ−１活性化マーカーを除き、治療用注射の３日後にベースラインレベルに戻る処置動物の血液中の一過性Ｔ細胞活性化と並行している。
【０３２９】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２モデルにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＴＣＢの抗腫瘍活性
ヒトびらん大Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２を保有し、ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植されたＮＯＧマウスでＣＤ２０  ＴＣＢの抗腫瘍活性を試験した。簡潔に述べると、メスＮＯＧマウスに、１．５×１０６個のＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（元々は欧州細胞コレクションから得られたもの）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に達したとき、マウスは、供給源ヒトＴ細胞としてヒトＰＢＭＣ（マウスあたり１０×１０６細胞）の腹腔内注射を受けた。２日後、マウスに、１週間に１回投与される０．５ｍｇ／ｋｇの用量でＣＤ２０  ＴＣＢ療法ｉ．ｖ．を投与した。図２１に示すように、ＣＤ２０  ＴＣＢは強力な抗腫瘍活性を示し、試験終了時（３４日目）にほぼ完全な腫瘍退縮が観察された。
【０３３０】
実施例２
電荷修飾を有する又は有しない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３）の調製
この実施例で調製した分子の模式図を図２２に示す。電荷修飾を有しない抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子（この例では「８３Ａ１０−ＴＣＢ」と称する）は、配列番号２２〜２５のアミノ酸配列を含み、電荷修飾を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子（この例では「８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ」と称する）は、配列番号２６〜２９のアミノ酸配列を含む。
【０３３１】
ＢＣＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体ベクターの作製のために、ＩｇＧ１由来二重特異性分子は、２つの異なる抗原決定基ＣＤ３及びＢＣＭＡに特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分からなる。抗原結合部分は重鎖及び軽鎖（それぞれ可変領域及び定常領域を含む）からなるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片の少なくとも１つは、ＶＨとＶＬが交換された「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内のＶＨとＶＬの交換は、異なる特異性のＦａｂ断片が同一のドメイン配置を有しないことを保証する。二重特異性分子の設計は、ＣＤ３については１価であり、１つのＦａｂ断片が内部ＣｒｏｓｓＦａｂ（２＋１）のＮ末端に融合したＢＣＭＡについては２価であった。二重特異性分子は、分子がより長い半減期を有するためにＦｃ部分を含んだ。分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：２：１：１（「ベクターＦｃ（ノブ）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ」：「ベクター重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂ」）の比でトランスフェクトされた。
【０３３２】
二重特異性抗体については、一方の結合アーム「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」に置換／交換を導入すると副生成物が明らかに減少するが、調製物は副生成物が完全には無いわけではない（国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191に詳述される）。従って、第１の抗原に対する軽鎖の第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を更に低減し、二重特異性抗体の収率を改善するために、ａ）１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施態様では、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）によって独立して）置換される第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、及びａ）１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換される第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において；又はｉｉ）ｂ）１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施態様では、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）によって独立して）置換される第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、及びｂ）１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換される第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１においてＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換を導入することによって、分子にさらなるアプローチが適用される。
【０３３３】
二重特異性抗体の生成のために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて懸濁培養したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中のそれぞれの哺乳動物発現ベクターの一過性同時トランスフェクションにより二重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ培地に１．５Ｍｉｏ生存細胞／ｍＬで播種した。最終産物量の各ｍＬについて、２．０Ｍｉｏ生存細胞を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に１μｇのＤＮＡ（比率は重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖＝１：１：２：１）を混合することにより、最終産物量の各ｍＬについてのＤＮＡを調製した。０．２７μＬのＰＥＩ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の添加後、混合物を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁した細胞とＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を一緒にし、振盪装置（３７℃、５％ＣＯ２）に入れた適切な容器に移した。３時間のインキュベーション時間後、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸及び１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した８００μＬのＥｘ−細胞培地を最終産物量１ｍＬごとに添加した。２４時間後、７０μＬのＦｅｅｄ（ＳＦ４０、Ｌｏｎｚａ）を最終産物量１ｍＬごとに添加した。７日後又は細胞生存率が７０％以下である時に、細胞を遠心分離及び滅菌濾過によって上清から分離した。抗体は、陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーとする親和性工程と１つ又は２つの研磨工程（polishing step）によって精製された。必要な場合には、追加の研磨工程を用いた。
【０３３４】
親親和性工程のために、６ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。同じ緩衝液による洗浄工程の後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いた段階的溶出によって、抗体をカラムから溶出させた。所望の抗体を含む画分を０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）（１：１０）で直ちに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物を滅菌濾過し、更に陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーにより処理した。
【０３３５】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために、濃縮タンパク質を親和性工程のために使用される溶出緩衝液で１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードした。平衡緩衝液及び洗浄緩衝液、それぞれ２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ５．０及び２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０で２回洗浄した後、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を用いた勾配により溶出した。所望の抗体を含有する画分をプールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、更にサイズ排除工程で処理した。
【０３３６】
サイズ排除工程のために、濃縮タンパク質を、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０をＴｗｅｅｎ２０を含めて又は含めないで製剤緩衝液として注入した。モノマーを含む画分をプールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルに滅菌濾過した。
【０３３７】
抗体濃度の決定は、抗体の０．１％溶液の吸光度の理論値を用いて、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより行った。この値は、アミノ酸配列に基づいており、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅデータ）によって計算された。
【０３３８】
最終タンパク質調製物の純度及びモノマー含量は、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ６．７緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）により決定された。
【０３３９】
最終タンパク質調製物の分子量を確認し、最終タンパク質溶液の分子の均一な調製を確認するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した。脱グリコシル化工程が最初に行われた。糖によって導入された不均一性を除去するために、構築物をＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理した。従って、タンパク質溶液のｐＨを、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質２０μｇに２μｌの２ＭのＴｒｉｓを加えることによってｐＨ７．０に調整した。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。その後、ＬＣ−ＭＳオンライン検出を行った。ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００で行った。クロマトグラフィー分離はＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（８μｍ粒子サイズ、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）で行った。溶離液Ａは５％アセトニトリル及び０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸の水溶液であり、溶離液Ｂは９５％アセトニトリル、５％水及び０．０５％ギ酸であった。流速は１ｍｌ／分であり、分離は４０℃で、前に記載した処理で得られた６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を用いて行った。
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【０３４０】
最初の４分間、溶離液は、塩分汚染から質量分析計を保護するために廃棄物に送られた。ＥＳＩ源は、１２ｌ／分の乾燥ガス流、３５０℃の温度及び６０ｐｓｉのネブライザー圧力で運転していた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードで、３８０Ｖのフラグメンター電圧及び７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を用いて取得した。ＭＳデータは、計器のソフトウェアによって４〜１７分で取得された。
【０３４１】
図２３は、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の異なる精製方法後の最終タンパク質調製物のＣＥ−ＳＤＳ（非還元）グラフを示す。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体に適用されたプロテインＡ（ＰＡ）親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製工程により、純度＜３０％、モノマー含量８２．８％を得た。（Ａ）の最終タンパク質調製物に陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）及び最終サイズ排除クロマトグラフィー（ｒｅ−ＳＥＣ）工程を含む追加の精製工程を適用した場合、純度は９３．４％に増加したが、モノマー含量は同じままであり、収率は０．４２ｍｇ／Ｌに有意に減少した。しかしながら、８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂ  ＣＬ−ＣＨ１、すなわち８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体に特異的な電荷修飾を適用した場合、ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製工程を適用しても（Ｃ）、追加の再ＳＥＣ精製工程を含むにもかかわらず、生産／精製プロファイルは７．９倍低い収率及び１７．２％より低いモノマー含量を示す（Ｂ）と比較して、９５．３％の純度、１００％のモノマー含量及び最大３．３ｍｇ／Ｌの収率によって示されるように、ＴＣＢ分子の優れた生成／精製プロファイルを既に観察することができた。
【０３４２】
次いで、８３Ａ１０−ＴＣＢ対８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の生成／精製プロフィールを比較するために１対１の（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）生産が実施され、抗体に適用されたＣＬ−ＣＨ１電荷修飾の利点を更に評価した。図２４に示すように、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性を並べて測定し、１）ＰＡ親和性クロマトグラフィーのみ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡ親和性クロマトグラフィー、次いでＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）及び３）ＰＡ親和性クロマトグラフィー、次いでＳＥＣ及び再ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の各精製工程後に比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のそれぞれの精製方法後の最終タンパク質溶液のＣＥ−ＳＤＳ（非還元）グラフを図２４に示す。図２４Ａ及び２４Ｂに示すように、ＴＣＢ抗体に電荷変異体を適用することによる改善は、ＰＡ親和性クロマトグラフィーのみによる精製後に既に観察された。この１対１の試験では、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体に適用されたＰＡ親和性クロマトグラフィー精製工程は、６１．３％の純度、２６．２ｍｇ／Ｌの収率及び６３．７％のモノマー含量をもたらした（２４Ａ）。比較すると、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体をＰＡ親和性クロマトグラフィーにより精製すると、８１．０％のより良好な純度、５１．５ｍｇ／Ｌのより良好な収率及び６８．２％のモノマー含量となりすべての特性が改善された（２４Ｂ）。図２４Ａ及び２４Ｂに見られるように、最終的なタンパク質調製物にさらなるＳＥＣ精製工程を適用すると、最大９１．０％及び８３．９％のそれぞれ改善された純度とモノマー含量を有し、１０．３ｍｇ／Ｌの収率である８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと比較して、８３Ａ１０−ＴＣＢは６９．５％の純度、１４．１ｍｇ／Ｌの収率及び７４．７％のモノマー含量が得られた。この特定の実験では、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖについてその収率は８３Ａ１０−ＴＣＢの収率よりわずかに少なかった（すなわち２７％少ない）にも関わらず、正しい分子のパーセンテージはＬＣ−ＭＳにより測定すると８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの方が８３Ａ１０−ＴＣＢよりもそれぞれ９０％対４０〜６０％とはるかに良好であった。第３の１対１の比較では、図２４Ｃ及び２４Ｄからの８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ最終タンパク質調製物を、ＰＡ親和性クロマトグラフィー精製工程のみの後の別の精製バッチからのそれぞれの最終タンパク質調製物（同じ生成物）約１Ｌ（等量）とプールした。次いで、プールされたタンパク質調製物をｃＩＥＸ及びＳＥＣ精製方法により更に精製した。図２４Ｅ及び２４Ｆに示すように、電荷変異体を有しないＴＣＢ抗体と比較した場合、電荷変異体を有するＴＣＢ抗体の生成／精製プロファイルの改善が一貫して観察された。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体を精製するために複数の精製方法の工程（すなわち、ＰＡ  ＋／−  ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ）を使用した後では、わずか４３．１％の純度に達し、９８．３％のモノマー含量を達成することができたが、収率は損なわれ、０．４３ｍｇ／Ｌに減少した。ＬＣ−ＭＳによって測定された正しい分子のパーセンテージは６０〜７０％と依然として良好ではなかった。最終的に、最終タンパク質調製物の品質は、インビトロでの使用のためには��容できなかった。全く対照的に、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体に同じ時間的順序の同じ複数の精製工程を適用した場合、ＬＣ−ＭＳによって測定すると９６．２％の純度及び９８．９％のモノマー含量並びに９５％の正しい分子を得た。しかしながら、収率はまた、ｃＩＥＸ精製工程の後に０．６４ｍｇ／Ｌに大きく減少した。結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体では、２つの標準精製工程、すなわちＰＡ親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣの後においてのみより良好な純度、より高いモノマー含量、正確な分子のより高いパーセンテージ及びより良好な収率を達成することができるが（図２４Ｄ）、一方８３Ａ１０−ＴＣＢでは追加の精製工程が適用されたとしてもこのような特性は達成できなかった（図２４Ｅ）ことを示している。
【０３４３】
表１０は、ＰＡ精製工程後に８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した８３Ａ１０−ＴＣＢの特性をまとめたものである。表１１は、ＰＡ及びＳＥＣ精製工程後に８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した８３Ａ１０−ＴＣＢの特性をまとめたものである。表１２は、ＰＡ及びＳＥＣプラスＰＡ単独、次いでｃＩＥＸ及び再ＳＥＣ精製工程の後に８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した８３Ａ１０−ＴＣＢの特性をまとめたものである。表１０〜１２では、太字の値は、８３Ａ１０−ＴＣＢ対８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖの比較で優れた特性を強調している。代表とはなり得ない１つの例外を除いて、３つの１対１の比較実験から得られたすべての生成／精製パラメーター及び値は、８３Ａ１０−ＴＣＢと比較して８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの方が優れていた。全体的な結果は、ＴＣＢ抗体にＣＬ−ＣＨ１電荷修飾を適用することによって生成／精製の特徴における利点を達成することができ、非常に良好な現像特性を有する既に高品質のタンパク質調製物を達成するためには、２つの精製工程（すなわち、ＰＡ親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣ）のみが必要であったことを明らかに実証している。
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【０３４４】
ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株に対する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体の結合（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢ、１３Ａ４−ＴＣＢｃｖ）を、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８ＴＭ）上のヒトＢＣＭＡへの結合についてフローサイトメトリーにより分析した。ＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現しないヒト胃腺癌細胞株）を陰性対照として使用した。簡潔には、培養細胞を回収し、計数し、細胞生存率をＶｉＣｅｌｌを用いて評価した。次いで、生存可能な細胞を、ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌあたり２×１０６細胞に調整した。この細胞懸濁液１００μｌを丸底９６ウェルプレートにウェルごとに更に分注し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体又は対応するＩｇＧ対照と４℃で３０分間インキュベートした。すべての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（及びＴＣＢ対照）を滴定し、１〜３００ｎＭの最終濃度範囲で分析した。その後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、４℃で更に３０分間、蛍光色素結合ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）とインキュベートした。次いで、細胞をＳｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌのＢＤ固定緩衝液（＃ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５４６５５）を用いて４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて分析した。図２５に示すように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の平均蛍光強度を抗体濃度の関数としてプロットした；（Ａ）Ｈ９２９細胞及びＭＫＮ４５細胞における８３Ａ１０−ＴＣＢ、（Ｂ）Ｈ９２９細胞及びＭＫＮ４５細胞における８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ。適用できる場合、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＥＣ５０を計算し、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖのＨ９２９細胞への結合の最大結合の５０％に達するのに必要な抗体濃度を示すＥＣ５０値を表１３にまとめた。図２５Ｃは、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、Ｈ９２９細胞に濃度依存的に同様の効力で結合することを示す。このような結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ分子が、それぞれのＶＬ及びＶＨ可変ドメイン上で同一のＣＤＲ配列を共有することから予想される。ＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体は、蛍光強度中央値の増加の欠如によって測定されるように、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞に結合しなかった。第２の１対１の比較実験において、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖを、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞への結合及びＢＣＭＡ／ＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞への結合の欠如について評価した。図２５Ｄに示されるように、８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞に濃度依存的に同様の効力で結合することを示す。この第２の実験についての８３Ａ１０−ＴＣＢ及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖのＨ９２９細胞への結合に関するＥＣ５０値を���１４に要約する。
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【０３４５】
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導されたＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９骨髄腫細胞の再指向されたＴ細胞細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体もまた、抗原結合部分の細胞上でのＢＣＭＡへの結合を介して構築物を架橋する際の、ＢＣＭＡ高発現骨髄腫細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導する可能性について分析された。簡潔には、ヒトＢＣＭＡ発現Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩに再懸濁した。１ウェルあたり約３０，０００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、抗体構築物のそれぞれの希釈物を所望の最終濃度で添加した（３通り）；最終濃度は０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲である。適切な比較のために、すべてのＴＣＢ構築物及び対照を同じモル濃度に調整した。ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）をウェルに添加して、５：１の最終エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した場合、最終的なＥ：Ｔ比は１０：１を使用した。陰性対照群は、エフェクター又は標的細胞のみによって表された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度で標的細胞をインキュベートし、細胞死を誘導することによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと同時インキュベートした標的細胞、すなわち、Ｔ細胞二重特異性抗体を全く含まない標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした後、アポトーシス／壊死性骨髄腫標的細胞から上清中へのＬＤＨ放出を、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造者の指示に従って測定した。ＬＤＨ放出のパーセンテージを、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対して濃度応答曲線でプロットした。適用できる場合、ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。図２６に示すように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ａ、Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢ、（Ｃ、Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）は、ＬＤＨ放出によって測定されるようにＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の濃度依存的死滅を誘導した。Ｈ９２９細胞の死滅は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しないＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体が、１ｎＭ（Ａ）の最高濃度でさえ、ＬＤＨ放出を誘導しなかったので特異的であった。８３Ａ１０−ＴＣＢ（Ａ、Ｂ）及び８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ｃ、実験１）については、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）統計ソフトウェアを使用してＥＣ５０値を測定できなかったが、ＥＣ５０値の大きさは、非荷電ＴＣＢ分子及び荷電ＴＣＢ分子の両方について、低いピコモル範囲の効力とおよそ推定することができた。第２の実験では、再指向されたＴ細胞死滅アッセイにおいて８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの効果を評価し、ＥＣ５０値を１．５ｐＭまで測定することができた。著者らは、わずかに低いＥＣ５０値（わずかに優れた効力）は、血液ドナーの変動性に起因する可能性があることを排除することはできなかった。しかしながら、Ｈ９２９細胞を死滅させる効力の大きさは、確実に低いピコモル濃度の範囲であった。全体的な結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢ（電荷変異体なし）対８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（電荷変異体あり）が細胞ベースのアッセイにおいて類似の生物学的特性を示すことを示唆している。
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【０３４６】
実施例３
電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３）及び電荷修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗Ｈｅｒ３／抗ＣＤ３）の調製
この実施例で調製した分子の模式図を図２７に示す。電荷修飾を有する抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」分子（この例では「Ｈｅｒ２  ＴＣＢ」と称する）は、配列番号２１，５２，５３及び５４のアミノ酸配列を含む。電荷修飾を有する抗Ｈｅｒ３／抗ＣＤ３「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」分子（この例では「Ｈｅｒ３  ＴＣＢ」と称する）は、配列番号２１，５５，５６及び５７のアミノ酸配列を含む。
【０３４７】
分子を調製し、精製し、上記の実施例１に記載のように（単一の分取ＳＥＣ工程を用いて）分析した。
【０３４８】
両方の分子を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー及びＣＥ−ＳＤＳによって示される高い最終品質で精製することができた（表１６，１７）。この調製物におけるＨｅｒ２  ＴＣＢの回収率はＨｅｒ３  ＴＣＢと比較して低かったが、タンパク質は２つの精製工程（プロテインＡ及びＳＥＣ）の後にほぼ純粋であった。ＣＥ−ＳＤＳ分析は、約１６４ｋＤａで１．１８％の低分子量不純物のみを示す（表１７）。１８７．２８ｋＤａで検出された種は、Ｆｃドメイン上のＮ結合グリコシル化を伴わない標的分子に対応する（この種は、真核細胞での生産後にヒトＩｇＧ１についてＣＥ−ＳＤＳによって一般的に検出される）。
【０３４９】
Ｈｅｒ３  ＴＣＢは良好な回収率で精製することができた。最終品質は、最終モノマー含量を比較するとＨｅｒ２  ＴＣＢよりも優れていた。また、１９２．０５ｋＤａで検出されたピークが非グリコシル化Ｆｃ種に対応すると仮定すると、ＣＥ−ＳＤＳは１００％標的タンパク質を示す。
【０３５０】
両方の調製物について、遊離軽鎖（予想される分子量２５ｋＤａ）などの生成物関連の低分子量不純物、１つの軽鎖上にＣＨ１−ＣＬ交換のみを導入することにより起こりうる二量体化軽鎖は（５０ｋＤａで予想される分子量）又は欠失又は非共有結合した軽鎖を有する分子（１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ又は１７５ｋＤａで予想される分子量）が、ＣＥ−ＳＤＳ又は分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって検出されている。
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【０３５１】
Ｈｅｒ２  ＴＣＢ及びＨｅｒ３  ＴＣＢの細胞への結合
Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、生存率をＶｉＣｅｌｌで決定した。
接着性ＫＰＬ−４腫瘍細胞（Ｊ．Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ、川崎医科大学、日本により提供）をＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、ＶｉＣｅｌｌで生存率を測定した。
【０３５２】
丸底９６ウェルプレートのウェルあたり０．２百万個の細胞を蒔き、プレートを４００ｇで４分間遠心分離した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中の１ウェル当たり２５μｌのＴＣＢ希釈物を細胞に添加した。細胞を冷蔵庫で３０分間インキュベートした。その後、ウェル当たり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
【０３５３】
２５μｌの適切に希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１ウェル当たりに加え、プレートを暗所で４℃で更に３０分間染色した。
【０３５４】
プレートをウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。分析は、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて行った。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＴＣＢ分子の濃度に対してプロットした。
【０３５５】
図２９に示すように、両方のＴＣＢは、細胞上のそれぞれの標的抗原に対する濃度依存性の良好な結合を示す。
【０３５６】
Ｈｅｒ３  ＴＣＢによって誘導された、ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性溶解後の、ヒトＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞の活性化
１０：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）及び４８時間のインキュベーション時間を用いて、Ｈｅｒ３  ＴＣＢを用いた古典的腫瘍細胞溶解実験（以下に記載する）のＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞を、ＣＤ６９陽性細胞のパーセンテージについて評価した。
【０３５７】
簡潔には、インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００９０８）及びＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１０９０４）の表面染色を、供給者の指示に従って実施した。細胞を０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡを用いて４℃で２０分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）で分析した。
【０３５８】
図３０に示すように、Ｈｅｒ３  ＴＣＢは、それぞれの標的部分を介してＴ細胞及び腫瘍細胞（ＫＰＬ−４）の架橋を誘発し、Ｔ細胞の活性化を濃度依存的に誘導する。
【０３５９】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイ
腫瘍抗原陽性標的細胞（ＫＰＬ−４）とＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを有するＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１）の共培養を用いて、Ｔ細胞架橋及びその後のＴ細胞活性化を誘導するＨｅｒ２  ＴＣＢ及びＨｅｒ３  ＴＣＢの能力を評価した。ヒトＨｅｒ２、ヒトＨｅｒ３、抗原（腫瘍細胞上で発現される）及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞上で発現される）に対するＴＣＢ分子の同時結合の際に、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現へと導く。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加時に得られる）は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
【０３６０】
アッセイのために、ＫＰＬ−４ヒト腫瘍細胞をＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を測定した。平底の白い壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に２００００細胞／ウェルを播種し、希釈したＴＣＢ又は培地（対照用）を添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を評価した。細胞を細胞培養培地に再懸濁し、腫瘍細胞に添加して、示したように２．５：１（Ｈｅｒ２  ＴＣＢについて）又は５：１（Ｈｅｒ３  ＴＣＢについて）の最終Ｅ：Ｔ及び１００μｌ／ウェルの最終体積を得た。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、１００μｌ／ウェルのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）（ウェルあたり１：１のＯＮＥ−Ｇｌｏ及びアッセイ培地容量）をウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベートした。発光は、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を用いて、検出時間として５秒／ウェルで検出した。
【０３６１】
図３１に示すように、両方のＴＣＢ分子がＣＤ３を介してＴ細胞架橋を誘導し、続いてＴ細胞活性化を誘導する。Ｈｅｒ３  ＴＣＢは、ＫＰＬ−４細胞に対して若干強力であり、このことはこれらの標的細胞上のＨｅｒ２よりも高いレベルのＨｅｒ３によって説明され得る。
【０３６２】
Ｈｅｒ２  ＴＣＢ及びＨｅｒ３  ＴＣＢによって誘導される腫瘍細胞溶解
各ＴＣＢ分子によって誘導されたＨｅｒ２又はＨｅｒ３発現腫瘍標的細胞の腫瘍細胞溶解を、エフェクターとしてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて１０：１のＥ：Ｔで評価した。腫瘍細胞溶解は、示されるように、ＴＣＢとのインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、上清中に放出されたＬＤＨを測定することによって決定した。
【０３６３】
ヒトＰＢＭＣを新鮮な血液又はバフィーコートから単離した。簡潔には、血液をＰＢＳで２：１（新鮮な血液）又は３：１（バフィーコート）に希釈した。約３０ｍｌの血液／ＰＢＳ混合物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｌ上に層状にし、ＲＴでブレーキを掛けずに４５０ｘｇで３０分間遠心分離した。リンパ球を、１０ｍｌのピペットを用いて、ＰＢＳを含む５０ｍｌチューブに集めた。チューブをＰＢＳで５０ｍｌまで満たし、３５０ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。洗浄工程を１回繰り返した。細胞を１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩに再懸濁し、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２でアッセイ開始まで（２４時間を超えない）保存した。
【０３６４】
標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて３０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を加湿インキュベーター中で一晩接着させた。アッセイの日に、アッセイプレートを３５０ｘｇで５分間遠心分離し、培地を吸引した。１００μｌ／ウェルのアッセイ培地を添加した。
【０３６５】
ＴＣＢを指示濃度（Ｈｅｒ３  ＴＣＢについては０．００１ｐＭ〜１ｎＭ、Ｈｅｒ２  ＴＣＢについては０．０１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲で３通り）で添加した。最終Ｅ：Ｔ比１０：１でＰＢＭＣを標的細胞に添加した。２４時間及び４８時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞の死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した。
【０３６６】
別の実験では、マイクロプレートリーダー（ウェルあたり５秒の読み取り時間）で発光を測定することにより、６．５時間後にカスパーゼ３／７活性によって腫瘍細胞溶解を測定した。
【０３６７】
カスパーゼ３／７活性の測定のために、ＫＰＬ−４−カスパーゼ−３／７  ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ標的細胞（ＧｌｏＳｅｎｓｏｒプラスミドで安定にトランスフェクトされたＫＰＬ−４細胞）を上記のように回収した。ＰＢＳで１回洗浄した後、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０，２％ＦＣＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ）中で濃度を０．３×１０６細胞／ｍｌに調整し、２％ｖ／ｖのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ｃＡＭＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。この標的細胞懸濁液１００μｌ（＝３０，０００細胞）を、白壁の９６平底底プレートの各ウェルに移した。
【０３６８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、上述されるように、健常なヒトドナーから得られた濃縮されたリンパ球製剤（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製した。腫瘍細胞溶解アッセイは、本質的に上記のように実施された。
【０３６９】
図３２Ｃ及び図３３に示される結果は、Ｈｅｒ３  ＴＣＢ分子が、ＫＰＬ−４腫瘍細胞の強力かつ濃度依存的なアポトーシス及び溶解を誘導することを示している。
【０３７０】
図３２Ａ及びＢに示されているＨｅｒ２  ＴＣＢについても同じことが当てはまり、腫瘍細胞の有意な濃度依存性溶解を経時的に示している。それによって、死滅のＥＣ５０は、それぞれの標的細胞上のＨｅｒ２の発現レベルに依存するように見える。発現レベルが高いほど、Ｈｅｒ２  ＴＣＢによる腫瘍細胞死滅は良好である。
【０３７１】
実施例４
電荷修飾を有する又は有しない「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３）の調製
この実施例で調製した分子の模式図を図３４に示す。ＭＣＳＰ結合剤に電荷修飾を有する抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」分子（この実施例では「（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ−ＬＣ００７ｃｖ」と称する）は、配列番号５８，５９及び６０のアミノ酸配列を含む。電荷修飾を有しない抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」分子（この実施例では「（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ」と称する）は、電荷修飾を有しない対応するアミノ酸配列を含む。
【０３７２】
以下の適応により、分子を調製し、精製し、上記の実施例１に記載のように分析した。
【０３７３】
これらの分子の生成のために、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を対応する発現ベクターで１：２：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖抗ＭＳＣＰ  Ｆａｂ」：「ベクター軽鎖抗ＣＤ３  Ｆａｂ」）でトランスフェクションした。
【０３７４】
培養培地中の構築物の濃度は、実施例１に記載したように、ｐＨ８．０でのプロテインＡへのＣＨ１ドメインの部分の結合及びｐＨ２．５からの段階的溶出に基づいて、プロテインＡ−ＨＰＬＣによって決定した。
【０３７５】
分泌タンパク質は、ＣＨ１に結合する親和性クロマトグラフィーを用いた親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製した。
【０３７６】
親和性クロマトグラフィーのために、５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．０で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清をロードした。少なくとも１０カラム容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．０で洗浄することにより、未結合タンパク質を除去した。標的タンパク質を、５０ｍＭトリス、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ２．０までの１０カラム容量勾配で溶出した。タンパク質溶液を、１／４０の２ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする。
【０３７７】
両方の分子を同じ方法で生成し精製した。電荷修飾を有しない分子（「（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ」と比較して、電荷を有する分子の力価は１０倍低かった。それにもかかわらず、最終の回収率は、２つの抗ＭＣＳＰ  Ｆａｂ（「（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ−ＬＣ００７ｃｖ」における電荷修飾を有する分子について約２倍高かった（表１８）。（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ−ＬＣ００７ｃｖ分子は、サイズ排除クロマトグラフィーにより示される９５．８％の最終モノマー含量及びＣＥ−ＳＤＳ分析によって証明された９４．３３％の最終純度に精製することができた。
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【０３７８】
電荷修飾を有する又は有しない「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３）の細胞結合
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ懸濁細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、生存率をＶｉＣｅｌｌで決定した。
【０３７９】
接着性ＭＶ−３腫瘍細胞をＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、ＶｉＣｅｌｌで生存率を測定した。
【０３８０】
丸底９６ウェルプレートのウェルあたり０．２百万個の細胞を蒔き、プレートを４００×ｇで４分間遠心分離した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中の１ウェル当たり２５μｌの一次抗体希釈物を細胞に添加した。細胞を冷蔵庫で３０分間インキュベートした。その後、ウェル当たり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。
【０３８１】
２５μｌの希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１ウェル当たりに加え、プレートを暗所で４℃で更に３０分間染色した。
【０３８２】
プレートをウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。分析は、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて行った。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＴＣＢ分子の濃度に対してプロットした。
【０３８３】
図３６に示すように、（Ｆａｂ）２−ＸＦＡｂ−ＬＣ００７ｃｖ分子は、ＭＶ−３上のヒトＭＣＳＰ及びＪｕｒｋａｔ細胞上のヒトＣＤ３に対する濃度依存的結合を示す。電荷修飾を有しない（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ分子は、（Ｆａｂ）２−ＸＦＡｂ−ＬＣ００７ｃｖと同等のヒトＭＣＳＰへの結合を示す（（Ｆａｂ）２−ＸＦＡｂ−ＬＣ００７ｃｖについて２．３ｎＭのＥＣ５０結合対（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂについてＥＣ５０は１．５ｎＭ）。
【０３８４】
電荷修飾を有する又は有しない「（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ」Ｔ細胞二重特異性抗体（抗ＭＣＳＰ／抗ＣＤ３）によって媒介される腫瘍細胞溶解
ＭＣＳＰ  ＴＣＢ分子によって誘導されたＭＣＳＰ発現ＭＶ−３腫瘍標的細胞の腫瘍細胞溶解はエフェクターとしてＰＢＭＣを用いて１０：１のＥ：Ｔで評価した。腫瘍細胞溶解は、ＴＣＢとのインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、上清中に放出されたＬＤＨを測定することによって決定した。
【０３８５】
簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を加湿インキュベーター中で一晩接着させた。アッセイの日に、アッセイプレートを３５０ｘｇで５分間遠心分離し、培地を吸引した。１００μｌ／ウェルのアッセイ培地を添加した。
【０３８６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を新鮮な血液から単離した。簡単には、血液をＰＢＳで２：１に希釈した。約３０ｍｌの血液／ＰＢＳ混合物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｌ上に層状にし、ブレーキを掛けずに４５０ｘｇで３０分間遠心分離した。リンパ球を、１０ｍｌのピペットを用いて、ＰＢＳを含む５０ｍｌチューブに集めた。チューブをＰＢＳで５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。洗浄工程を１回繰り返した。細胞を１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩに再懸濁し、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２でアッセイ開始まで（２４時間を超えない）保存した。
死滅アッセイのために、指示された濃度で（０．０４ｐＭ〜１０ｎＭの範囲で３通りに）ＴＣＢ分子を添加した。最終Ｅ：Ｔ比１０：１でＰＢＭＣを標的細胞に添加した。２４時間及び４８時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞の死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した。
【０３８７】
図３７に示すように、両方の分子は、ｈＭＣＳＰ発現標的細胞の濃度依存的溶解を示す。（Ｆａｂ）２−ＸＦＡｂ−ＬＣ００７ｃｖ分子（２４時間後にＥＣ５０は２．８ｐＭ及び４８時間後に８．６ｐＭ）の効力は、電荷修飾を有しない（Ｆａｂ）２−ＸＦａｂ分子の効力（２４時間後にＥＣ５０は５．９ｐＭ、４８時間後に４．８ｐＭ）に匹敵する。
【０３８８】
＊  ＊  ＊
前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｎ】
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【図１Ｏ−Ｖ】
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【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図２Ｉ】
0006464255.tif 000033
【図２Ｊ−Ｋ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ−Ｉ】
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【図３Ｊ−Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ−Ｏ】
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【図３Ｐ−Ｑ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３５】
0006464255.tif 000095
【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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