(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）のＸ染色体の配列番号１の１〜１９番目の塩基配列、および３２〜５０番目の塩基配列であるタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、
前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に用いて突然変異体胚芽を生成する段階を含み、
前記タレン処理によりインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子の配列番号１の２６〜２９番目の塩基配列の単一対立遺伝子欠失が生じる、
インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）対立遺伝子変形を有する免疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産方法。
【請求項２】
前記タレン処理は、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターの形態で当該細胞を形質感染させて行われることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
請求項１に記載の生産方法によって生産されたインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）対立遺伝子変形を有する免疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタ。
【請求項４】
タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の細胞において、
Ｘ染色体の配列番号１の１〜１９番目の塩基配列、および３２〜５０番目の塩基配列であるタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、
前記タレンによりインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子の配列番号１の２６〜２９番目の塩基配列の単一対立遺伝子欠失を有する、
前記対立遺伝子変形が誘導された細胞。
【請求項５】
前記細胞は、ＩＬ２ＲＧノックアウトミニブタ線維芽細胞の、受託番号ＫＣＴＣ１２４９７ＢＰで示される細胞株であることを特徴とする請求項４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子ターゲッティングベクター、そのベクターが導入された兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産とその製造方法および活用に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症複合免疫欠乏症（Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、以下、「ＳＣＩＤ」という）は、ヒトから観察される（非特許文献１）；しかし、治療剤は、ヒトＳＣＩＤタイプを反映する動物モデルに制限されていることによって開発が進まなかった。ブタはヒトと類似の生理的な特性を共有し、げっ歯類モデルに比べてより高い類似性を有する多くのヒト疾患を複製する（非特許文献２）。したがって、ＳＣＩＤブタは、ヒト疾患を複製するモデルを代表することができる。また、ブタＳＣＩＤモデルは、癌研究、細胞移植、および薬物の開発研究に使用できる。
【０００３】
インターロイキン２受容体ガンマ（以下、「ＩＬ２ＲＧ」という）は、Ｘ−リンクされたＳＣＩＤタイプに関係があり、ＩＬ２ＲＧの突然変異は、マウスにおいてＴおよびＮＫ細胞の欠損および機能的に損傷したＢ細胞を引き起こす（非特許文献３）。ＩＬ２ＲＧを妨害して作られたＸ−リンクされたＳＣＩＤブタが最近報告され、ヒトＸ−リンクされたＳＣＩＤ表現型を概要する（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００４−００７４１０８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２２，６２５−６５５（２００４）
【非特許文献２】Ｗｈｙｔｅ，Ｊ．Ｊ．＆Ｐｒａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ７８，８７９−８９１（２０１１）
【非特許文献３】Ｃａｏ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２，２２３−２３８（１９９５）
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ１０，７５３−７５８（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の必要性によってなされたものであって、その目的は、ＳＣＩＤ表現型を引き起こす遺伝工学的ブタを生産する効果的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）のＸ染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に用いて突然変異体胚芽を生成する段階を含む、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタの生産方法を提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、前記タレンは、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターの形態で当該細胞を形質感染させて行われることが好ましいが、これに限定されない。
【０００９】
また、本発明は、前記本発明の生産方法によって生産されたインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）対立遺伝子変形を有する兔疫細胞欠乏形質転換ミニクローンブタを提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、細胞にブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）のＸ染色体の配列番号１のタレン認知配列部位を認知して当該遺伝子配列またはその周辺の変形を誘導可能なＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ変形酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をコーディングするベクターとモノマー赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）遺伝子、配列番号１からなるプログラム化可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ｎｕｃｌｅａｓｅのターゲット配列、エンハンサー緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびＨ−２ＫＫ遺伝子を含むレポーターベクターを一緒に導入して、前記ＲＦＰ、ＧＦＰおよびＨ−２ＫＫポジティブの細胞をインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）がターゲッティングされた細胞に分類する方法を提供する。
【００１１】
本発明の一実施形態において、前記Ｈ−２ＫＫの検出は、抗体によって行うことが好ましく、
本発明の他の実施形態において、前記ＲＦＰおよびＧＦＰの発現は、流動細胞分析法によって検出することが好ましいが、これに限定されない。
【００１２】
また、本発明は、タレン（ＴＡＬＥＮ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）をブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）のＸ染色体の配列番号１のタレン認知配列部位に処理して対立遺伝子変形を誘導し、前記対立遺伝子変形が誘導された細胞を提供する。
【００１３】
前記細胞は、２０１３年１０月２日、大韓民国大田市儒城区所在の韓国生命工学研究院遺伝子銀行（生物資源センター）に受託番号ＫＣＴＣ１２４９７ＢＰとして寄託した。
【００１４】
以下、本発明を説明する。
【００１５】
本発明において、本発明者らは、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が伴ったＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）−媒介遺伝子ターゲッティングを用いてＳＣＩＤ表現型を引き起こす２つのタイプの遺伝工学的ブタを生産する効果的な方法を報告する。
【００１６】
ブタＩＬ２ＲＧをターゲットするために、特定ＴＡＬＥＮｓを考案し、Ｔｏｏｌｇｅｎ（Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）で合成した。そのＴＡＬＥＮｓはそれぞれＩＬ２ＲＧのＸ染色体上で突然変異を引き起こすように考案した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮ認知部位を含むレポーターをＴＡＬＥＮセットを適切に発現する細胞を同定するのに使用した（図３および図１Ｂ）。考案されたＴＡＬＥＮｓの活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にレポーターを有するＴＡＬＥＮセットを挿入して認証した（図１Ｃ）。認証後、ＴＡＬＥＮｓおよびレポーターをコーディングする構築物を電気穿孔法によってブタ線維芽細胞に挿入した。４８時間後、細胞をＧＦＰ陽性細胞に対して分類し（図３）。９６−ウェルプレートに各ウェルあたり細胞１つずつプレーティングした。１０日後、細胞を継代し、その細胞の半分を遺伝型分析に使用した。
【００１７】
予測されたＴＡＬＥＮ切断部位の、隣接する小さいＰＣＲ切片（約４００ｂｐ）のシーケンシングは、ＩＬ２ＲＧグループでＴＡＬＥＮｓ由来挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）の存在を示した；ＩＬ２ＲＧに対して全体３０コロニーをスクリーニングする（表１のプライマー情報参照）。遺伝子ターゲッティングの効率は、ＩＬ２ＲＧに対しては３０％（９／３０）であった。
【００１８】
本発明で使用されたＴＡＬＥＮｓはターゲット部位に特異的であるので、本発明者らは、オフ（ｏｆｆ）−ターゲット切断を観察することができなかった（図４および表２）。ターゲッティング確認された細胞を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に使用した（図５）。
【００１９】
ＳＣＮＴによって７３３個の突然異を有する初期胚芽を生産して、４匹の代理雌ブタ（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｇｉｌｔｓ）にそれぞれ移植した後、２５日頃、超音波で妊娠の有無をした。１匹生きているＩＬ２ＲＧ突然変異体が生まれた（図６および表３）。遺伝子型は、そのブタはＩＬ２ＲＧのターゲットされた突然変異を有することを示した（図１Ｄ）。ＩＬ２ＲＧにおいて変形はｐｒｅｍａｔｕｒｅ終結コドンを引き起こす４ヌクレオチドの欠損であった；ＩＬ２ＲＧ＋／Δ６９−３６８。
【００２０】
図７は、生産されたＩＬ２ＲＧ＋／−ブタを示す図で、生産されたＩＬ２ＲＧ＋／−ブタと解剖写真であり、
【００２１】
図８は、ＩＬ２Ｒの発現検証図で、生産されたＩＬ２ＲＧ＋／−はｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｙが高く、ＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｓのうち、アルファ、ベータは正常に発現し、ガンマのみ影響を受けたことを、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲとＩＨＣを通して確認した。ＩＬ２ＲＧ（＋／−）ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ  ｐｉｇの特性を分析するために、ｓｐｌｅｅｎでＩＬ２ＲＧの蛋白質の発現を検証した。ＩＬ２ＲＧ＋／−産子のｓｐｌｅｅｎでＩＬ２Ｒ  ａｌｐｈａとＩＬ２Ｒ  ｇａｍｍａの蛋白質の発現を併せて比較した。ＩＬ２ＲＧ＋／−ｓｐｌｅｅｎで先にＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａの発現を確認した結果、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｐｉｇとＩＬ２ＲＧ＋／−のｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｐｉｇでは正常にＩＬ２Ｒａを発現することを確認した。この結果を再確認するために、これら遺伝子のｍＲＮＡの発現を調べた結果は図８Ｃの通りである。これらの結果は、蛋白質の発現傾向と同一に現れたが、すなわち、ＩＬ−２Ｒ  ａｌｐｈａとｂｅｔａの発現ではほぼ差がなく、ｇａｍｍａの発現では４倍以上発現が減少したことを確認することができた。
【００２２】
図９は、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ（ＣＤ２５  ａｎｄ  ＣＤ３）を用いてＣＤ３＋Ｔ  ｃｅｌｌのｓｕｂｓｅｔを確認した。そして、ブタのｔｈｙｍｕｓでＴ  ｃｅｌｌの発達過程について確認した。
【００２３】
図１０は、ＩＬ２ＲＧ＋／−の組織と正常組織を用いたｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃｈｉｐ分析結果を示す図で、ＳｐｌｅｅｎとｔｈｙｍｕｓでのＤＮＡ  ｃｈｉｐ分析後、遺伝子発現を、対照群を用いてｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ後、ｕｐ−ｏｒ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄされた遺伝子を示した結果をまとめた図である。
【００２４】
前記図に示されているように、対照群はＩＬ２ＲＧ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔとは明らかな発現様相の差を見せた。一つ興味深いのは、ｓｐｌｅｅｎに比べてｔｈｙｍｕｓでより明らかな発現の差を見せたが、これはＩＬ２ＲＧ  ＫＯ  ｐｉｇ由来の胸腺の発達が非常に低調であることに起因すると見られる（図１０Ａ）。
【００２５】
ブタのＤＮＡ  ｃｈｉｐ分析において最も難しい部分は、ブタの全体ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅが報告されてはいるものの、各蛋白質を作る機能遺伝子のｓｅｑｕｅｎｃｅ部分の、ｇｅｎｅ  ｂａｎｋへの登録が不足していて、他種間の機能分析がまだ不可能であることである。したがって、マウス遺伝子との比較分析は、ブタの遺伝体分析の限界を克服するために活用可能なため、本研究では、ブタ遺伝子とマウス遺伝子が機能的に一致した遺伝子のみをｓｏｒｔｉｎｇした。その結果、２倍以上ｄｏｗｎされる遺伝子は、ｔｈｙｍｕｓでは４４８７個、ｓｐｌｅｅｎでは１０５０個、４倍以上ｄｏｗｎされる遺伝子は、ｔｈｙｍｕｓでは１２１７個、ｓｐｌｅｅｎでは２３１個が分析された（図１０Ｂ）。
【００２６】
ＩＬ−２ＲＧ  ＫＯ  ｐｉｇは、免疫欠乏を示すため、ＴとＢ、ＮＫ関連遺伝子の発現の比較を進行させるために、マウスで報告された既存の情報を活用してＳｔｕｄｉｏ  ｐａｔｈｗａｙを分析して、Ｔ／Ｂ／ＮＫ細胞の発生と分化に関与する主要遺伝子をスクリーニングした後、これら遺伝子の発現を調べた結果は図１０Ｃの通りである。
【００２７】
図１１は、ＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒに影響を与える要素とＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒが影響を与える要素に関するもので、ＩＬ−２ＲＧの上段の遺伝子群の場合は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＮＲＨ１、ＩＬ−４、ＤＮＭ２、ＩＬ２１遺伝子群はＩＬ−２ＲＧ遺伝子の影響を受けて発現がｕｐ−ｏｒ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされたが、これら遺伝子群が対照群と異なって現れた結果は追って研究が必要であるが、今のところの解釈は、これら遺伝子群は互いにｃｉｓ−あるいはｔｒａｎｓ−ｓｉｇｎａｌをやり取りしながらＩＬ−２ＲＧの発現に直接間接的に役割を果たすことを示す。ＩＬ−２ＲＧの下段のシグナルに関与する遺伝子群のうち、多数の場合はＰａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって分析された結果と一致したが、ＣＣＬ２、ＩＦＮＧ、ＳＴＡＴ１遺伝子の発現は、Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって分析された結果とは異なる結果を見せた。このような現象は、１）分析したＩＬ−２ＲＧ  ＫＯ  ｐｉｇがｈｅｔｅｒｏｚｙｏｔｉｃ由来の臓器を使用したため、２）ブタの発現機序がマウスのそれとは異なっているため、生じることがある。
【００２８】
本発明において、本発明者らは、ＳＣＮＴによって伴ったＳＣＩＤブタはＴＡＬＥＮ媒介の遺伝子ターゲッティングによって効果的に生産できることを示した。ＴＡＬＥＮ構築物を有するレポーターベクターの使用は、高い比率の変形を誘導した。ターゲッティングベクターがゲノムに挿入される通常の遺伝子ターゲッティングとは異なり、本発明は、ゲノムにいかなる特徴も残さない遺伝工学的ブタを生産可能にする。本発明の間に生成された遺伝工学的ブタは、ヒトにおいてＯｍｅｎｎ症侯群を呈し得る１番目のブタモデルを含むＳＣＩＤ研究のためのモデルとして使用できる（ブタは米国国立ブタ研究資源センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手可能である。http://nsrrc.missouri.edu/）。
【発明の効果】
【００２９】
重症複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ）表現型を有するブタは、幹細胞治療、癌研究および異種移植を開発するのに役立つ。本発明者らは、ＴＡＬＥＮ−媒介ターゲッティングを通して２つのタイプのＳＣＩＤブタ、ＩＬ２ＲＧノックアウトの生成を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＴＡＬＥＮｓを用いたＳＣＩＤブタの生成。（図１Ａ）ＩＬ２ＲＧおよびＲＡＧ２のＴＡＬＥＮ媒介ノックアウトの図式的な説明。（図１Ｂ）ＴＡＬＥＮ認知部位を含む供与体レポーターベクター。供与体レポーターベクターにおけるＴＡＬＥＮ認知部位の切断はＧＦＰの発現を誘導。（図１Ｃ）インビトロで考案されたＴＡＬＥＮｓの認証。ＧＦＰの発現はＴＡＬＥＮｓがＨＥＫ２９３Ｔ細胞で供与体レポーター遺伝子とトランスフェクションされる時にのみ検出できる。（図１Ｄ）遺伝工学的に製造されたブタの遺伝子型。
【図２】図２は、ＴＡＬＥＮｓによってターゲットされた細胞の富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための代替（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）レポーターベクターの構築。（ａ）レポーターベクターは、モノマーＲＦＰ遺伝子、プログラム化可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ｎｕｃｌｅａｓｅのターゲット配列（左および右側半分−部位）、エンハンサーＧＦＰおよびＨ−２ＫＫ遺伝子（ａの上段パネル）。仮に、ＧＦＰおよびＨ−２ＫＫ配列がプログラム化可能なｎｕｃｌｅａｓｅ活性の不存在によってフレームの外にあれば、単にＲＦＰ遺伝子のみが発現する。プログラム化可能なｎｕｃｌｅａｓｅによる二本鎖切断がそのターゲット配列に挿入される時、その切断はＮＨＥＪ（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ）によって復旧され、たびたびフレームシフト突然変異を引き起こす。そのような突然変異はＧＦＰをＲＦＰとフレーム内で作ることができ、ｍＲＦＰ−ｅＧＦＰ−Ｈ−２ＫＫ融合蛋白質の発現を誘導する（ａの下部パネル）。（ｂ）２つのシステム：Ｈ−２ＫＫ抗体による磁石分離およびＲＦＰおよびＧＦＰの発現による流動細胞分析法によって分類されたｍＲＦＰ＋ｅＧＦＰ＋Ｈ−２ＫＫ＋細胞でｎｕｃｌｅａｓｅ−誘導された突然変異の富化。細胞内に、レポータープラスミドおよび染色体ターゲット部位を記載。突然変異を黒いスポットで示す。
【図３】図３は、ＴＡＬＥＮｓを投入した後、ＧＦＰポジティブ細胞のＦＡＣＳソーティング。（図３Ａ）トランスフェクション４８時間後、ＲＦＰおよびＧＦＰの高い同時発現。（図３Ｂ）矢印下段ボックスはＧＦＰポジティブ細胞を示す。強いＧＦＰを発現するトップ１０％の細胞を分類し、９６−ウェルプレートに位置させる。ＧＦＰポジティブ細胞の範囲は２３．０％から３８．０％。スケールバー＝２０μｍ。
【図４】図４は、ＩＬ２ＲＧ突然変異ブタ由来ＩＬ２ＲＧ遺伝子のオフ−ターゲット分析。上段）ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子と最高ホモロジーを有する９ｌｏｃｉで追加的なオフ−ターゲット突然変異を示さない；ＳＭ：サイズマーカー、レーン１：ＬＲＲＩＱ１；２：ＢＮＣ２；３：ＳＬＣ１７Ａ５；４：ＺＮＦ３３４；５：ＴＴＮ；６：ＰＧＲＭＣ２；７：ＡＶＰＲ２．８：ＣＣＤＣ１８；９：ＺＳＷＩＭ２。下段）オフ−ターゲット突然変異を排除するためのＩＬ２ＲＧ関連配列の遺伝子および配列ホモロジー。
【図５】図５は、ＳＣＮＴのための候補細胞コロニーを同定するためのＰＣＲ配列の結果。ＴＡＬＥＮｓの投入はＮＨＥＪによってＴＡＬＥＮ結合部位近傍で多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を誘導。多型性のタイプを分析し、ＳＣＮＴのための細胞コロニーとして使用する。
【図６】図６は、本発明の間に生産されたＳＣＩＤブタモデルのイメージ。ブタの遺伝的背景はＭｉｎｎｅｓｏｔａミニブタ。
【図７】図７は、生産されたＩＬ２ＲＧ＋／−ブタを示す図。
【図８】図８は、ＩＬ２Ｒの発現検証図。
【図９】図９は、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ（ＣＤ２５  ａｎｄ  ＣＤ３）を用いてＣＤ３＋Ｔ  ｃｅｌｌのｓｕｂｓｅｔを確認した図。
【図１０−１】図１０は、ＩＬ２ＲＧ＋／−の組織と正常組織を用いたｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃｈｉｐ分析。
【図１０−２】図１０は、ＩＬ２ＲＧ＋／−の組織と正常組織を用いたｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃｈｉｐ分析。
【図１１−１】図１１は、ＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒに影響を与える要素とＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒが影響を与える要素。
【図１１−２】図１１は、ＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒに影響を与える要素とＩＬ２ｒｅｃｅｐｔｏｒが影響を与える要素。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、非限定的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するための意図で記載されたもので、本発明の範囲は下記の実施例によって制限されると解釈されない。
【００３２】
本発明に使用された動物およびすべての実験は、ミズーリ大学の動物実験倫理委員会の承認を受けた。
【００３３】
実施例１：細胞トランスフェクションおよび遺伝子ターゲッティング
遺伝子ターゲッティングのために、２−３百万の細胞を、レポーターベクターを有するＴＡＬＥＮ構築物でトランスフェクションさせた；２μｇの各構築物／百万細胞あたり。それら細胞をＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、４９０Ｖ、１ｍｓｅｃ、３パルスでその構築物で電気穿孔した。その後、４８時間、Ｔ７５フラスコでプレートした細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰを用いてＧＴＰポジティブ細胞に対して分類した。その分類された細胞を９６−ウェルプレートでプレートした。１０日後、半分の細胞を遺伝子型のために使用した。ＴＡＬＥＮＳを挿入した後、ｉｎｄｅｌの存在を調べるために、ＴＡＬＥＮ切断部位周辺のゲノムＤＮＡの切片をＰＣＲで増幅した。培養細胞由来ゲノムＤＮＡを細胞破砕バッファーを用いて分離した後、そのゲノムＤＮＡをＰＣＲに使用した。増幅のためのＰＣＲ条件は、９５℃で２分の初期変性、３２サイクルの変性のための９４℃で３０秒、アニーリングのための５５℃で３０秒、拡張のための７２℃で３０分を伴った（表１のＰＣＲプライマーセットについては参照）。ＰＣＲ産物の予測された大きさは、ＩＬ２ＲＧに対しては４１７ｂｐであり、ＲＡＧ２に対しては４２６ｂｐであった。そのＰＣＲ産物を、ｉｎｄｅｌの存在を同定するためにシーケンシングした。
【００３４】
実施例２：体細胞核移植（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）
ＳＣＮＴ胚芽を生産するために、雌ブタ由来卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）をＡＲＴ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。その卵母細胞を成熟培地（ＴＣＭ１９９  ｗｉｔｈ  ２．９ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５μｇ／ｍｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌ  ｐ−ＦＳＨ、０．９１ｍＭ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．５ｍＭ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ、１０％ブタ卵胞液、２５ｎｇ／ｍｌ  ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）でオーバーナイト輸送して、２４時間後に新鮮培地にトランスファーした。４０−４２時間の成熟後、卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌｓ）を０．１％ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅの存在下でボルテキシングして、その卵母細胞から除去した。操作の間、卵母細胞を７．０μｇ／ｍｌ  ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂが補充された操作培地に位置させた。中期ＩＩ板（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｐｌａｔｅ）を含む隣接した原形質部分に沿った極体を除去し、供与細胞を薄いガラス毛細管を用いて囲卵腔（ｐｅｒｉｖｉｔｅｌｌｉｎｅ  ｓｐａｃｅ）に位置させた。
【００３５】
次に、再構築された胚芽を融合培地（０．３Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）で、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、１．２ｋＶ／ｃｍで３０μｓｅｃの間に２つのＤＣパルス（１秒間隔）によって融合した。融合後に、融合した胚芽を、暗条件で１０分間２００μＭのｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、そして、８ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌで３０分間完全に活性化させた。その後、胚芽をＰｏｒｃｉｎｅ  Ｚｙｇｏｔｅ  Ｍｅｄｉａ３（ＰＺＭ３）３で０．５μＭヒストンジアセチラーゼ阻害剤のｓｃｒｉｐｔａｉｄで１４−１６時間培養した。翌日、そのＳＣＮＴ胚芽を代理体にトランスファーした。胚盤胞トランスファーのために、その胚芽をｓｃｒｉｐｔａｉｄで洗浄し、ＰＺＭ３で、１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦ２の存在下、さらに５日培養した。ＳＣＮＴ胚芽を代理体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）の膨大腺（ａｍｐｕｌｌａｒｙ−ｉｓｔｈｍｉｃ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に手術的にトランスファーした。
【００３６】
実施例３：免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＩＨＣのために、１０％ホルマリンを有する中性バッファーで固定化された組織を使用した。その組織をＩＨＣのためにスライド上で充填した。内生的なｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を先に３％ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅで抑制した。サンプルをＢｏｒｇ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒで前処理した後、背景Ｓｎｉｐｅｒ溶液でブロッキングした。洗浄後、サンプルをＢ細胞（ＣＤ７９Ａ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−＃Ｍｏｂ１１８、１：１００）またはＴ細胞（ＣＤ３；ＤＡＫＯ−＃Ａ０４５２、１：４００）に特異的な１次抗体で培養した。培養後、サンプルを洗浄し、ＨＲＰ付着した２次抗体で培養した。その後、サンプルを、その信号を見るために、Ｒｏｍｕｌｉｎ  Ｒｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓで染色した。また、サンプルを、背景を提供するために、ＩＰ  ＦＬＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで染色した。Ｔｈｅ  Ｂｏｒｇ、Ｓｎｉｐｅｒ、Ｒｏｍｕｌｉｎ  ＲｅｄおよびＩＰ  ＦＬＸ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎはいずれもＢｉｏｃａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）から購入した。すべての顕微鏡写真はＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０高解像デジタル顕微鏡カメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）が具備されたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得た。
【００３７】
実施例４：流動細胞分析法
安楽死させた野生型および二重対立遺伝子型コブタ由来脾臓の部分を１０％ウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に集めて、メス刃で研ぎ、２０ｇａ．針を通して数回吸入し、７０μｍのナイロンメッシュ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通して押出した。その後、脾臓細胞懸濁液を、赤血球を破砕するために、Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５分培養した後、５分間２００×ｇでペレット化した。その上澄液を捨てた後、そのペレットを冷蔵染色バッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に再富化し、細胞をヘマサイトメーターで計数した。その後、細胞を２００μＬの染色バッファーに５×１０６細胞のアリコートに分けた。ＦＩＴＣ−付着したマウスａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＣＤ２１、マウスａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＣＤ３ε、およびマウスａｎｔｉ  Ｔ−２マイコトキシンＩｇＧ１ｋ（ｉｓｏｔｙｐｅ対照群）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を細胞に０．５μｇ／１×１０６細胞として添加し、３０分間、暗条件下、４℃で培養した。その後、細胞を２回洗浄し、新鮮な染色バッファーに再富化した。細胞を、ミズーリ大学のＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ施設でＣｙＡｎ  ＡＤＰ流動細胞分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて分析した。データを、Ｓｕｍｍｉｔ  ｖ４．３ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。
【００３８】
実施例５：オフ（Ｏｆｆ）−ターゲット分析
本発明で使用されたＴＡＬＥＮｓ由来の推定オフターゲット配列を同定するために、バイオインフォマティクス方法を、最近、ブタゲノムアセンブリ（Ｓｓｃｒｏｆａ１０．２）由来の各ＴＡＬＥＮ結合部位に類似の配列を同定するのに使用した。ＰＣＲプライマーをヌクレオチド差の数に基づく隣接した最も類似のオフターゲット部位を考案した。この部位を基盤（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物で増幅し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅアッセイを用いてオフ−ターゲッティングイベントのテストを行った（表２）。ＰＣＲ増幅後、３００−５００ｎｇのＰＣＲ産物（１０−１５μｌ）を新鮮なチューブに伝達し、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒプログラム：（９５℃、２分、９５℃から８５℃まで秒あたり−２℃ずつ、８５℃から２５℃まで秒あたり−０．１℃、無限定的に４℃）に従って変性しリアニーリングした。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅと１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーを添加し、４２℃で３０分間培養した。その後、その反応を氷上に直ちに位置させ、６ＸＳｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ中止バッファーと６Ｘ染料をその反応に添加した。そのサンプルを２．０％アガロースゲル上で電気泳動した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１は、ＴＡＬＥＮｓによって誘導された遺伝型ＩＬ２ＲＧ突然変異に使用されたプライマー。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２は、ブタＩＬ２ＲＧのオフ−サイトターゲッティングを同定するのに使用されたプライマーセット。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
表３は、本発明における核移植の効率。
【受託番号】
【００４５】
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２４９７
受託日付：２０１３１００２
【００４６】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【配列表】
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