(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜２個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に対して、９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１９２８であるベクター。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のベクターによりロドコッカス属微生物を形質転換した形質転換体。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のベクターに目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターによりロドコッカス属微生物を形質転換した形質転換体を、誘導剤を含まない培地で培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを含む、目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロドコッカス属微生物用構成型発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ニトリル代謝酵素遺伝子プロモーターを用いた、ロドコッカス属微生物用誘導型発現ベクターが構築されている。このベクターは、ロドコッカス属微生物を宿主とし、培養時にイソバレロニトリルやε−カプロラクタム等の誘導剤を添加してタンパク質を異種発現させることができるものである（特許文献１）。
【０００３】
しかし、ニトリル代謝酵素遺伝子プロモーターを用いて、ロドコッカス属微生物を宿主とし、培養時に誘導剤を添加せずタンパク質を発現させるベクターの報告例は未だ無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１８０８４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、Ｈ−ＮＨａｓｅ代謝能力を保持しないロドコッカス属微生物でも、誘導剤を添加しない条件下で目的タンパク質を発現することを可能にするベクターを提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ロドコッカス属微生物由来のニトリル代謝酵素遺伝子クラスターを、ニトリル代謝能力を保持しない他のロドコッカス属微生物に導入すると、誘導剤無添加条件でも目的タンパク質が発現することから、ニトリル代謝酵素遺伝子クラスターにマルチクローニングサイトを付与し、大腸菌とロドコッカス属微生物で複製可能なシャトルベクターに連結することで、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡ、又は
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡ
を含むベクターである。
【０００８】
あるいは、本発明は、受領番号がＮＩＴＥ  ＡＰ−０１９２８であるベクターである。
【０００９】
また、本発明は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むベクターにより、ロドコッカス属微生物を形質転換した形質転換体である。
【００１０】
また、本発明は、上記形質転換体を、誘導剤を含まない培地で培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを含む、目的タンパク質の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せず目的タンパク質を発現させることができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プラスミドｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔの構築を示す図である。
【図２】プラスミドｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳ及びベクターｐＲＥＹＨ８１の構築を示す図である。
【図３】ベクターｐＲＥＹＨ８１を示す図である。
【図４】ベクターｐＲＥＹＨ８１へのレポーター遺伝子の挿入とロドコッカス属微生物への形質転換を示す図である。
【図５】ベクターｐＲＥＹＨ８１により発現されたタンパク質の電気泳動を示す図である。
【図６】ベクターｐＲＥＹＨ８１により発現されたタンパク質の電気泳動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）ベクター（ｐＲＥＹＨ８１）に含まれるＤＮＡ
以下、本発明に係るベクターをｐＲＥＹＨ８１と称することがある。
本発明のベクターは、代表的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含む。
配列番号１に示される塩基配列は、プラスミドｐＨＪＫ１９とｐＨＪＫ２０に共通する、Ｈ−ＮＨａｓｅの構成的発現に関与する領域を改変したＤＮＡ配列である。Ｈ−ＮＨａｓｅの構成的発現に関与する領域とは、プラスミドｐＨＪＫ１９のＳｃａＩ−ＳｔｕＩ間で、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ間を欠失した領域である。
【００１４】
配列番号１に示される塩基配列は、以下に示す部位を含む。
15bp/homology/pREHSG298dNBS(XhoI)misc_feature        1..15
mutation for StuIsitemisc_feature                    18..19
nhhC                misc_feature                     437..1522
mutation for SacIdeletionmisc_feature                544..544
mutation for SalIdeletionmisc_feature                694..694
mutation for EcoRIdeletionmisc_feature               913..913
mutation for XhoIdeletionmisc_feature                1417..1417
nhhD                misc_feature                     1573..2019
mutation for NdeIsitemisc_feature                    3719..3719
mutation for NdeIsitemisc_feature                    3721..3721
MCS derived from pET-24a(+)misc_feature              3722..3935
mutation for StuIsitemisc_feature                    4229..4230
mutation for StuIsitemisc_feature                    4233..4234
15bp/homology/pRHSG298dNBS(EcoRI)misc_feature        4235..4249
【００１５】
また、本発明のベクターは、配列番号１に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡを含んでもよい。
【００１６】
ここで、「１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、特定の塩基配列の１〜５個、好ましくは３個、より好ましくは２個のＤＮＡが欠失してもよく、特定の塩基配列の１〜５個、好ましくは３個、より好ましくは２個のＤＮＡが他のＤＮＡに置換してもよく、あるいは特定の塩基酸配列に１〜５個、好ましくは３個、より好ましくは２個のＤＮＡが付加してもよいことを意味する。
【００１７】
また、本発明のベクターは、配列番号１に示される塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつロドコッカス属微生物を宿主として培養時に誘導剤を添加せずに目的タンパク質を発現させ得るＤＮＡを含んでもよい。
【００１８】
ここで、「塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上である。
【００１９】
更に、本発明のベクターには、目的タンパク質をコードするＤＮＡが含まれていてもよい。当該ＤＮＡは、本発明のベクター中に存在するＭＣＳに挿入することができる。本発明において、目的タンパク質は、特に限定されるものではなく、酵素、ホルモン、サイトカイン、調節タンパク質などを任意に挙げることができる。
【００２０】
（２）ベクター（ｐＲＥＹＨ８１）の構築
本発明のベクターｐＲＥＹＨ８１の構築方法を以下に述べる。なお、ベクターｐＲＥＹＨ８１は、平成２６(２０１４)年９月４日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されたものである（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１９２８）。
【００２１】
ニトリル代謝能力を保持しないロドコッカス属微生物内では、誘導剤を添加しない条件でもＨ−ＮＨａｓｅを著量に発現し（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（９），４２６７−４２７２（１９９６）参照）、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＨＪＫ１９（特開２００５−１５１９９９号公報参照）とプラスミドｐＨＪＫ２０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（９），４２６７−４２７２（１９９６）参照）はともに、誘導剤を添加しない条件下で、Ｈ−ＮＨａｓｅを過剰発現する。このことから、プラスミドｐＨＪＫ１９とｐＨＪＫ２０とにおける、Ｈ−ＮＨａｓｅの構成的発現に関与する領域は、これらプラスミドに共通に含まれる領域であることが示唆される。
そこで、その領域を遺伝子合成した改変型プロモーターＤＮＡ断片（配列番号１）を含むプラスミドｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔを作製する（図１）。
【００２２】
一方で、大腸菌とロドコッカスのシャトルベクターｐＲＥＨＳＧ２９８（特許文献１の段落番号［００５１］及び図７参照）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの各制限酵素サイトを破壊したプラスミドｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳを作製する（図２）。
【００２３】
次に、プラスミドｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔをＸｂａＩで切断した後に生じる、外側にｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳと１５ｂｐ一致するＤＮＡ配列を持つ改変型プロモーターＤＮＡ断片を含む断片と、ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後に生じる大きいＤＮＡ断片とを連結し、ｐＲＥＹＨ８１を構築する(図３)。
【００２４】
本発明のベクターｐＲＥＹＨ８１は、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断することが不可能であるため、当該ベクターのマルチクローニングサイト内にあるＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトがユニークサイトとなる。また、上記プラスミドｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳ構築時にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの遺伝子破壊を行っているため、これらの制限酵素サイトもユニークサイトとなる。
【００２５】
（３）形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主を本発明のベクターで形質転換することで作製できる。宿主はロドコッカス属微生物である。形質転換を行うには、常法を用いればよく、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法を用いることができる。
【００２６】
（３）目的タンパク質の製造方法
本発明は、目的タンパク質の製造方法も提供することができる。すなわち、上記（３）の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することにより、目的タンパク質を製造することができる。形質転換体の培養方法は、宿主に用いるロドコッカス属微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
【００２７】
また、本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（例えば１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることができる。
【００２８】
目的タンパク質は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、電気泳動、あるいはゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を単独又は適宜組み合わせることによって、濃縮、精製したものを用いてもよい。
【実施例１】
【００２９】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３０】
＜ベクターｐＲＥＹＨ８１の構築＞
（１）プラスミドｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔの構築
プラスミドｐＨＪＫ１９のＳｃａＩ−ＳｔｕＩ間で、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ間を欠失した領域を遺伝子合成した改変型プロモーターＤＮＡ断片（配列番号１）を含むプラスミドｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔを作製した（図１参照）。
その遺伝子合成の際に、以下の変更を追加した。
(i)  当該領域に含まれるＳａｃＩ（配列番号１の５４４番目）、ＳａｌＩ（配列番号１の６９４番目）、ＥｃｏＲＩ（配列番号１の９１３番目）、ＸｈｏＩ制限酵素サイト（配列番号１の１４１７番目）をＮｈｈＣのアミノ酸配列を変更せずに、かつ各制限酵素サイトを保持しなくなるようにＤＮＡ配列を変更した。
(ii)  ｎｈｈＢＡＧ（Ｈ−ＮＨａｓｅ及びその翻訳後修飾に関わるＮｈｈＧをコードする）をｐＥＴ２４ａ（＋）のマルチクローニングサイトに変更（配列番号１の３７２２−３９３５番目）した。
(iii)  マルチクローニングサイトの最初の配列（配列番号１の３７２２−３７２４番目）がＮｄｅＩサイトの一部になるように、すぐ上流のＤＮＡ配列を変更した（配列番号１の３７１９番目と３７２１番目）。
(iv)  改変型プロモーターＤＮＡ断片の末端の制限酵素サイト（ｐＨＪＫ１９のＳｃａＩ及びＳｔｕＩ部分）をＳｔｕＩサイトに変更した。（配列番号１の１６−２１番目と４２２９−４２３４番目）
(v)  改変型プロモーターＤＮＡ断片の末端の更に外側にｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳと１５ｂｐ一致するＤＮＡ配列をそれぞれ付与した（配列番号１の１−１５番目：ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳのＸｈｏＩサイト周辺）（配列番号１の４２３５−４２４９番目：ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳのＸｈｏＩサイト周辺）。
(vi)  外側にｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳと１５ｂｐ一致するＤＮＡ配列を持つ改変型プロモーターＤＮＡをｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔから切り出せるように、両末端にＸｂａＩサイトを配置した（配列番号１の５’側端と３’側端に、それぞれ塩基配列ＴＣＴＡＧＡを配置）。このＸｂａＩサイトは、最終的に、ベクターｐＲＥＹＨ８１を構築する段階で欠失する。
従って、改変型プロモーターＤＮＡ内にはＸｂａＩサイトは存在しないので、改変型プロモーターＤＮＡ全体を本酵素で切り出せる。
【００３１】
（２）プラスミドｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳの構築
大腸菌とロドコッカスのシャトルベクターｐＲＥＨＳＧ２９８（特許文献１の段落番号［００５１］及び図７参照）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの各制限酵素サイトを破壊したプラスミドｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳを作製した（図２参照）。
各制限酵素の破壊方法は以下のとおりである。
ＮｄｅＩサイトの破壊には、ｐＲＥＨＳＧ２９８をＮｄｅＩで切断し、一般的な反応条件下でＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応を行い（ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用）、切断後の１本鎖ＤＮＡ部分を２本鎖にし、その後ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅにより両末端を連結することで当該プラスミドを作成した。
ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの破壊には、一般的な部位特異的変異法により、ｐＲＥＨＳＧ２９８の複製に関わるタンパク質のアミノ酸配列を変更せずに、かつ各制限酵素サイトを破壊するようにプライマーを設計した。
【００３２】
（３）ベクターｐＲＥＹＨ８１の構築
上記ｐＵＣ−ＲｈｏｄｏＣｏｎｓｔをＸｂａＩで切断した後に生じる、外側に上記ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳと１５ｂｐ一致するＤＮＡ配列を持つ改変型プロモーターＤＮＡ断片を含む断片と、上記ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後に生じる大きいＤＮＡ断片とを、ギブソンアセンブリ法（タカラバイオ社のキットＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のキットＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）を使用）により連結し、ベクターｐＲＥＹＨ８１を構築した（図３参照）。
【００３３】
ベクターｐＲＥＹＨ８１は、連結部分がＥｃｏＲＩでもＸｈｏＩでも切断することが不可能である。そのため、当該ベクターのマルチクローニングサイト内にあるＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトがユニークサイトとなる。ｐＲＥＨＳＧ２９８ΔＮＢＳ構築時にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩの遺伝子破壊を行っているため、これらの制限酵素サイトもユニークサイトとなる。当該ベクターのマルチクローニングサイトはｐＥＴ２４ａ（＋）と一緒であり、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩがユニークサイトとして利用可能である。本プラスミドのマルチクローニングサイト内のＮｄｅＩサイトのＡＴＧはｎｈｈＢ遺伝子のＡＴＧと同じ位置になるように設計し、ｎｈｈＢ遺伝子上流のＳＤ配列は変更していないため、ＮｄｅＩサイトを使用して目的タンパク質遺伝子のＡＴＧコドンから導入した場合にはＮｈｈＢ（Ｈ−ＮＨａｓｅのβサブユニット）と同様の高発現が期待できる。ｐＥＴ２４ａ（＋）のマルチクローニングサイトに含まれるＨｉｓタグ領域を持つため、本Ｈｉｓタグ領域にインフレームで目的タンパク質遺伝子を導入すれば、Ｈｉｓタグ付与の目的タンパク質を発現可能である。更に、マルチクローニングサイト下流にＴ７ターミネーター配列が存在するため、マルチクローニングサイト内に目的タンパク質遺伝子が導入できたかどうかを確認（コロニーＰＣＲ）したり、導入した目的タンパク質遺伝子の塩基配列を決定する際に、Ｔ７ターミネータープライマーが使用可能である。
【実施例２】
【００３４】
＜ベクターｐＲＥＹＨ８１を利用したタンパク質発現＞
（１）ベクターｐＲＥＹＨ８１の機能解析
構築したｐＲＥＹＨ８１にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｊ１菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子（ｎｈｈＢＡＧ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  Ｊ１菌由来のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＥ）、並びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｎ１９−２株由来イソニトリルヒドラターゼ遺伝子（ｉｎｈＡ）をレポーター遺伝子として組込み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属における発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認することでその機能性の検討を行った（図４参照）。
【００３５】
組込みの方法としては、まずｐＲＥＹＨ８１をマルチクローニングサイト内のＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した後に生じる大きいＤＮＡ断片をベクターとして用いた。一方で、レポーター遺伝子をＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応（ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＮＥＯ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用）で増幅し、インサート断片を得た。ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応の条件は解離９４ｏＣ（１０秒）、アニーリング  合成６８ｏＣ（６０秒）を１サイクルとし、計３０サイクル行った。このとき使用したプライマー配列を以下に示す。得られたベクターとインサートをＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコールに従った）で連結し、大腸菌ＴＯＰ１０を宿主として形質転換した。得られた形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む５ｍｌの２ＹＴ培地（ポリペプトン１．６％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％）に植菌し３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離によって集菌した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−を用いてプラスミド抽出（ＴＯＹＯＢＯ社のプロトコールに従った）し、シークエンス（ファスマックに委託）によって目的のプラスミドが構築されたことを確認した。
【００３６】
レポーター遺伝子増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号２〜９）である。
【００３７】
ｉｎｈＡ−Ｓ（配列番号２）
ｇａｔｇａａａｇｇａａｔｇａｇｃａｔＡＴＧＧＣＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣ
【００３８】
ｉｎｈＡ−ＡＳ（配列番号３）
ｔｔｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃＴＣＡＧＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＡＧ
【００３９】
ｎｉｔＡ−Ｓ（配列番号４）
ｇａｔｇａａａｇｇａａｔｇａｇｃａｔＡＴＧＧＴＣＧＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＧＧ
【００４０】
ｎｉｔＡ−ＡＳ（配列番号５）
ｔｔｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＧＣＣＣＧＧＴＣ
【００４１】
ｎｈｈＢＡＧ−Ｓ（配列番号６）
ｇａｔｇａａａｇｇａａｔｇａｇｃａｔＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣ
【００４２】
ｎｈｈＢＡＧ−ＡＳ（配列番号７）
ｔｔｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＧＣＧ
【００４３】
ｘｙｌＥ−Ｓ（配列番号８）
ｇａｔｇａａａｇｇａａｔｇａｇｃａｔＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＣＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧ
【００４４】
ｘｙｌＥ−ＡＳ（配列番号９）
ｔｔｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃＴＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＴＴＧ
【００４５】
次に、ｐＲＥＹＨ８１にそれぞれのレポーター遺伝子を連結したプラスミドを用いてＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＤＳＭ４３９８５、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４を宿主として、エレクトロポレーション法（２．５ｋＶ，２５μＦ，４００Ω）により形質転換を行った。得られた形質転換体を、以下の表１に示す抗生物質を含む１０ｍｌの２ＹＴ培地（ポリペプトン１．６％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％）に植菌し、２８℃で３日間振とう培養した。培養後、遠心分離によって集菌し、リン酸カリウム緩衝液を加え、超音波破砕で菌体を破砕した。破砕液を遠心し、回収した上清（無細胞抽出液）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、レポータータンパク質の発現を確認した。更に、同様の方法を用いて、ｐＲＥＹＨ８１にｘｙｌＥを連結したプラスミドをＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４並びにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｅｓ  ＮＢＲＣ１００６２６に導入し、発現を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５及び図６に示す。
【表１】
0006508761.tif 000002
【００４６】
図５において、矢印で示したバンドがレポータータンパク質であり、本発明のベクターを用いることで、誘導剤を培地に添加せずにタンパク質を発現することが確認された。
また、図６のＸｙｌＥのレーンにおいて、分子量マーカーの３０ｋＤａから４５ｋＤａの間にある太いバンドがレポータータンパク質であり、本発明のベクターを用いることで、誘導剤を培地に添加せずにタンパク質を発現することが確認された。
【図１】
0006508761.tif 000003
【図２】
0006508761.tif 000004
【図３】
0006508761.tif 000005
【図４】
0006508761.tif 000006
【図５】
0006508761.tif 000007
【図６】
0006508761.tif 000008
【配列表】
0006508761000001.app