(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは１４１個のアミノ酸からなりＰＴＨ様作用により高カルシウム血症をもたらすタンパク質である副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分として含有する筋疾患（但し、加齢に伴う筋力の低下および筋肉量の減少によるものを除く）治療剤または予防剤。
【請求項２】
ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨを有効成分として含有する、請求項１に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項３】
ヒトＰＴＨ（１−３４）を有効成分として含有する請求項２に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項４】
前記筋疾患が筋ジストロフィーである請求項１〜３のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項５】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである請求項４に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項６】
骨粗鬆症の発症前の筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項７】
骨粗鬆治療薬による治療を開始する前の筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項８】
骨粗鬆治療薬を投与されていない筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項９】
前記筋疾患患者が筋ジストロフィー患者である請求項６〜８のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項１０】
前記筋ジストロフィー患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者である請求項９に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項１１】
ステロイド剤と併用せずにデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
【請求項１２】
哺乳動物由来多能性幹細胞を筋細胞へと分化誘導する工程において用いることができる筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは１４１個のアミノ酸からなりＰＴＨ様作用により高カルシウム血症をもたらすタンパク質である副甲状腺ホルモン関連タンパク質を含有する分化誘導促進剤。
【請求項１３】
前記哺乳動物由来多能性細胞がヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１２に記載の分化誘導促進剤。
【請求項１４】
哺乳動物由来筋衛星細胞の筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは１４１個のアミノ酸からなりＰＴＨ様作用により高カルシウム血症をもたらすタンパク質である副甲状腺ホルモン関連タンパク質を含有する分化誘導促進剤。
【請求項１５】
前記ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体が、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨである、請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の分化誘導促進剤。
【請求項１６】
前記ＰＴＨ誘導体がヒトＰＴＨ（１−３４）である請求項１５に記載の分化誘導促進剤。
【請求項１７】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは１４１個のアミノ酸からなりＰＴＨ様作用により高カルシウム血症をもたらすタンパク質である副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分として含有する筋肉再生促進剤または筋線維再生促進剤。
【請求項１８】
前記ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体が、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨである、請求項１７に記載の筋肉再生促進剤または筋線維再生促進剤。
【請求項１９】
前記ＰＴＨ誘導体がヒトＰＴＨ（１−３４）である請求項１８に記載の筋肉再生促進剤または筋線維再生促進剤。
【請求項２０】
上記有効成分が、副甲状腺レセプターと関連して筋細胞への分化誘導を促進することを特徴とする、請求項１７に記載の筋肉再生促進剤または筋線維再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋疾患を治療または予防するための医薬組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、副甲状腺ホルモンを有効成分として含む筋疾患を治療または予防するための医薬組成物に関し、さらには、副甲状腺ホルモンを投与することによる、筋疾患を治療または予防するための方法に関する。本発明はまた、筋細胞への分化を誘導する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋疾患とは、筋力低下、筋の機能低下、骨格筋肉量の減少、筋崩壊などを伴う筋肉の疾患である。筋疾患の症状の大部分は、筋肉、特には骨格筋の萎縮、減少によって起こる筋力の低下であり、筋肉が萎縮または減少する原因として主に２つある。一つは、筋肉自体に問題がある場合（一般に、筋原性疾患という）、もう一つは筋肉を動かす神経に問題がある場合（一般に、神経原性筋疾患という）である。筋原性疾患の典型例は、筋ジストロフィーである。また、現在は一般には筋疾患には分類されていないが、進行性および全身性の骨格筋量および骨格筋力の低下を特徴とするサルコペニアがある。サルコペニアのために、ベッド上安静によりそのまま寝たきりとなって、介護が必要となってくる老人が増加している。現在のところ、これらの筋の疾患や障害に対する根治治療方法は皆無である。【０００３】
脊椎動物の骨格筋内には、筋細胞の基である筋衛星細胞が存在し、壊死などの損傷が起こった際には骨格筋の再生が行われている。筋衛星細胞は筋組織全体に分布しており、損傷または疾患がなければ、有糸分裂における休止状態にある。この細胞は、筋線維の壊死などの損傷が起こると活性化し、ＭｙｏＤ遺伝子が発現して筋線維へ分化が始まる。ＭｙｏＤとは、未熟な細胞を筋分化に誘導可能な転写因子である。その際、筋衛星細胞は分裂し、その数を増す。筋衛星細胞は最終的に、既存の筋線維に置きかわる筋線維を生じるか、または既存の筋線維と融合する。そして、損傷治癒が治まると、再び、その一部の筋衛星細胞は休止の状態となる。このような筋線維の再生機構が十分に機能しなくなると、筋力低下、筋の機能低下、骨格筋肉量の減少などを伴う筋肉の疾患や障害を引き起こす。【０００４】
筋衛星細胞の増殖および分化に関与する因子としては、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｍｙｆ５が報告されている。また、ニューレグリン類タンパク質由来のポリペプチドを用いて、筋組織の疾患、障害を予防する医薬品が提案されている（特許文献１、特許文献２）。【０００５】
筋障害の典型例である筋ジストロフィー、とりわけジストロフィン欠損によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ染色体上の突然変異を原因として、筋細胞の細胞骨格を担うジストロフィンを欠損する重症の遺伝子性筋疾患である。この発症率は出生男児３，５００〜４，０００人に１人と比較的高い上に、３分の１は母体の卵細胞レベルにおける突然変異によるため遺伝相談による予防が必ずしも有効ではない。ＤＭＤでは、上記のような筋線維の再生機構が、壊れる筋線維の数に追いつかず、筋力低下を招いている。ＤＭＤは、筋力低下の進行が早く、筋力低下、呼吸機能、心機能の低下により著しく日常生活に制限を受ける。ＤＭＤの患者は典型的には、３〜５才で筋力低下の症状を表し、９〜１０才で歩行不能となり、そして３０才前後で心不全や呼吸障害で死亡する。このようにＤＭＤは、重症で致死性の遺伝子性筋疾患である。
筋ジストロフィーにおいて頻度の一番高いＤＭＤに対して、唯一厚生労働省が認めている治療法はステロイドの内服である。この治療により、歩行期間が１年延長すると言われている。ただし、ステロイド療法は骨密度を低下させるリスクがあり、脊椎骨折のリスクを高めることが知られている。また、アンチセンスによりエクソンスキップ起こさせ、重症のデュシェンヌ型から良性のベッカー型にする治療法が、国際共同治験で進行中であるが、まだ効果の有無は不明である。さらにその治療法は、テーラーメイド治療で、原因遺伝子のジストロフィン遺伝子の特殊な欠損の患者しか対象とならない。その他に、細胞治療、遺伝子治療、薬物治療などについて動物実験が行われているが、倫理的な問題、副作用などを考えると、まだ十分な治療法とはなり得ていない。そこで、この重症で致死性の遺伝子性筋疾患に対して治療法の開発が求められている。【０００６】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺から分泌される８４アミノ酸から構成されるポリペプチドホルモンであり、血中カルシウム濃度の低下に応答して分泌される。ＰＴＨは、血中で容易に３４−３５位が切断され、活性型１−３４（Ｎ末端側）と不活性型３５−８４（Ｃ末端側）となる。ＰＴＨはまた、破骨細胞を活性化し、骨芽細胞を抑制することにより、骨吸収を促進する。さらに、ＰＴＨは、骨、軟骨の細胞の分化に関与していることが報告されている。そして、ＰＴＨまたはＰＴＨ関連タンパク質を用いた、骨粗鬆症の治療が提案されている（非特許文献１、非特許文献２）。また、ヒトＰＴＨ（１−３４）であるテリパラチドは、日本で骨粗鬆症の治療薬として既に使われている。このように、ＰＴＨの骨に対する作用は数多く報告されている。
また、ＰＴＨタイプ１リセプター（ＰＴＨ１Ｒ）が、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）機能の制御に関与していること、ＶＳＭＣでの促進したＰＴＨ１Ｒレベルがしばしば過形成を伴うが、外来ＰＴＨｒＰ（１−３６）は、ＶＳＭＣの増殖を阻害することが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、筋芽細胞を初めとする筋組織、特に骨格筋に対する作用についての報告はない。【０００７】
ＤＭＤ患者は、ステロイド療法により骨密度が低下し骨折のリスクが増す。ステロイド（グルココルチコイド）療法が行われて骨密度が減少し骨折のリスクが増しているＤＭＤ患者に対して、骨格特性を改善して骨折のリスクを軽減するためにＢｌａｃｋ  Ｂｅａｒ  ＰＴＨの使用が提案されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−４３４３７号公報
【特許文献２】米国特許第８０２６２１３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Esbrit P.ら、Biochem Pharmacol. 2013 May 15;85(10):1417-23.
【非特許文献２】Lombardi G.ら、J Endocrinol Invest. 2011 Jul;34(7 Suppl):18-22.
【非特許文献３】Song G.J.ら、Mol. Endocrinol. 23, 1681-1790 (2009).
【非特許文献４】Sarah K. Gray et al. ,Bone. 2012 September ; 51(3): 578-585.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、筋力低下を伴う筋疾患に広く適用可能な治療または予防に用いることができる医薬組成物または方法を提供することを目的とする。本発明は特には、筋力の増強、または筋力低下の進行を遅延させることができる医薬組成物または方法を提供することを目的とする。本発明はまた、筋疾患の例として、筋ジストロフィーまたはサルコペニアの治療または予防に用いることができる医薬組成物または方法を提供することを目的とする。本発明はさらには、筋細胞への分化を誘導できる組成物または方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、１型副甲状腺レセプター（ＰＴＨ１Ｒ）が哺乳動物由来の多能性幹細胞の筋細胞への分化に必要なタンパク質であることを見出し、筋細胞の分化誘導を、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体、または副甲状腺関連タンパク質が促進するであろうとの知見を得た。そして、本発明者らは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）が、ＥＳ細胞から筋芽細胞に分化する過程で大きな役割を果たしていることを発見し、さらにはＰＴＨが骨格筋の成長に関与していることを発見して、本発明を完成した。
本発明は以下を含むものである。
（１）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分として含有する筋疾患治療剤または予防剤。
（２）ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨを有効成分として含有する、上記（１）に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（３）ヒトＰＴＨ（１−３４）を有効成分として含有する上記（２）に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（４）前記筋疾患が筋ジストロフィーである、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（５）前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、上記（４）に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（６）前記筋疾患がサルコペニアである、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（７）骨粗鬆症の発症前の筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（８）骨粗鬆治療薬による治療を開始する前の筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤、ここで、骨粗鬆治療薬による治療は、例えば、骨密度の低下に伴って開始される。
（９）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１−８４））、その活性型ペプチド（ＰＴＨ（１−３４））または副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分とする骨粗鬆治療薬を投与されていない筋疾患患者に投与されるように用いられることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（１０）前記筋疾患が筋ジストロフィー患者である、上記（７）〜（９）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（１１）前記筋ジストロフィー患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者である、上記（１０）に記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（１２）前記筋疾患がサルコペニアである、上記（７）〜（９）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。
（１３）ステロイド剤と併用せずにデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者に投与されるように用いられることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の筋疾患治療剤または予防剤。【００１２】
（１４）哺乳動物由来多能性幹細胞の筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは副甲状腺ホルモン関連タンパク質を含有する分化誘導促進剤。
（１５）前記哺乳動物由来多能性細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、上記（１４）に記載の分化誘導促進剤。
（１６）哺乳動物由来筋衛星細胞の筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは副甲状腺ホルモン関連タンパク質を含有する分化誘導促進剤。
（１７）前記ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体が、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨである、上記（１４）〜（１６）のいずれか一つに記載の分化誘導促進剤。
（１８）前記ＰＴＨ誘導体がヒトＰＴＨ（１−３４）である上記（１７）に記載の分化誘導促進剤。
（１９）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分として含有する筋肉再生促進剤（または筋線維再生促進剤）。
（２０）前記ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体が、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨである上記（１９）に記載の筋肉再生促進剤（または筋線維再生促進剤）。
（２１）前記ＰＴＨ誘導体がヒトＰＴＨ（１−３４）である上記（２０）に記載の筋肉再生促進剤（または筋線維再生促進剤）。【００１３】
（２２）（例えば、筋力低下、筋の機能低下、骨格筋肉量の低下、遺伝子診断、または筋生検、のいずれかあるいはそれらの組合せにより）筋疾患と診断されたまたは筋疾患と推定されるヒト患者に、治療有効量の、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の１種または２種以上、あるいは副甲状腺ホルモン関連タンパク質を投与することを含む、該患者を処置または治療する方法。
（２３）前記ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体が、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、またはblack bear ＰＴＨである上記（２２）に記載の方法。
（２４）前記ＰＴＨ誘導がヒトＰＴＨ（１−３４）である上記（２３）に記載の方法。
（２５）前記筋疾患が筋ジストロフィーである、上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法。
（２６）前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、上記（２５）に記載の方法。
（２７）前記筋疾患がサルコペニアである、上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法。
（２８）前記筋疾患患者が骨粗鬆症の発症前の筋疾患患者である上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法。
（２９）前記筋疾患患者が骨粗鬆治療薬による治療を開始する前の筋疾患患者である上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法、ここで、骨粗鬆治療薬による治療は、例えば、骨密度の低下に伴って開始される。
（３０）前記筋疾患患者が、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１−８４））、その活性型ペプチド（ＰＴＨ（１−３４））または副甲状腺ホルモン関連タンパク質を有効成分とする骨粗鬆治療薬を投与されていない筋疾患患者である、上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法。
（３１）前記筋疾患が筋ジストロフィー患者である、上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の方法。
（３２）前記筋ジストロフィー患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者である、上記（３１）に記載の方法。
（３２）前記筋疾患がサルコペニアである、上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の方法。
（３３）前記筋疾患患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者であり、かつ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体、または副甲状腺ホルモン関連タンパク質が、ステロイド剤と併用せずに投与される、上記（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、筋力低下を伴う筋疾患に広く適用できる治療剤または予防剤が提供される。本発明によりまた、多能性幹細胞や筋衛星細胞の筋細胞への分化誘導を促進する組成物または方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａは、スーパー標的（super-targeting）により、誘導可能なＭｙｏＤ遺伝子を組み込んだマウスＥＳ細胞（ＺＨＴｃ６−ＭｙｏＤ）の作製方法を示している。Ｂは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）存在下で培養しコロニーを形成させた状態（未分化状態）（左図）とＤｏｘの非存在下で８日間培養して細長い紡錘細胞を形成させた状態（右図）である。
【図２】ＺＨＴｃ６−ＭｙｏＤ細胞を、培養液よりＤｏｘを除去して分化させた後、未分化の細胞をＤｏｘ存在下でさらに培養し、再び培養液よりＤｏｘを除去して分化させた結果を示している。一部の細胞は、分化誘導をかけてもＭｙｏＤが発現しているにも関わらず、再びコロニーを形成している。
【図３】ＤＮＡマイクロアレイ分析による、未分化ＥＳ―ＭｙｏＤ細胞と、分化１３日後の未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞の比較の結果を示している。
【図４】ＤＮＡマイクロアレイ分析による、未分化ＥＳ―ＭｙｏＤ細胞と、分化１３日後のマイオチューブの比較の結果を示している。
【図５】未分化ＥＳ―ＭｙｏＤ細胞、分化１３日後の未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞、およびマイオチューブでの、１型副甲状腺レセプター（ＰＴＨ１Ｒ）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果である。
【図６】ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞の分化誘導時における、ｓｉＲＮＡによるＰＴＨ１Ｒ発現の抑制の効果を確認した結果である。Ａは、実験スケジュールを示している。Ｂは、細胞の状態を示した顕微鏡写真である。
【図７】不死化したヒト由来の筋芽細胞（Immortalized human myogenic cell clone Hu5/KD3）（ＫＤ３）を、ＰＴＨ存在下で分化誘導した結果である。分化誘導後１６日目の細胞の顕微鏡写真である。Ａは、ＰＴＨ非存在下（ＰＴＨ（−））およびＰＴＨ存在下（ＰＴＨ（＋））の結果を示している。ＰＴＨ（＋）の写真中の矢印は、マイオシートの幅を示している。Ｂは、ＰＴＨ（＋）で分化誘導した細胞の拡大写真である。ＰＴＨ存在下で培養すると自己収縮を認めた。
【図８】抗Ｐａｘ７抗体および抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を用いて、マウスの筋組織を免疫組織染色した結果である。Ｐａｘ７陽性は、筋衛星細胞マーカーである。矢印は、それぞれの陽性細胞を確認できた箇所を示している。筋衛星細胞の多くはＰＴＨ１Ｒ陽性細胞であることを示している。
【図９】ＰＴＨを投与したマウスの筋組織における中心核が占める割合を確認した結果である。Ａの写真の下の数値は、ＰＴＨの投与量を示す。Ｂは、正常マウスから採取した腓腹筋を用いた結果である。正常筋細胞においては、核は中心にない。Ｃは、それぞれの投与量における、中心核の割合を示したグラフである。
【図１０】筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）におけるＰＴＨの効果を、ワイヤーハンギングテストで確認した結果である。
【図１１】筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）におけるＰＴＨの効果を、トレッドミルテストで確認した結果である。
【図１２】５９日間ＰＴＨを投与した筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）の第四腰椎を、高解像度Ｘ線マイクロコンピュータ化されたトモグラフィ（ｍＣＴ）画像分を行った結果である。
【図１３】５９日間ＰＴＨを投与した筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）の筋組織の写真である。
【図１４】５９日間ＰＴＨを投与した筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）の筋組織における筋原線維の平均直径を測定した結果である。
【図１５】５９日間ＰＴＨを投与した筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）の筋組織における中心核をもつ筋原線維が占める割合を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。
以下、本明細書において、特に断りのない限りは、あるいは文脈において特定のＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体を意味していることが明らかでない限りは、ＰＴＨなる用語は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびＰＴＨ誘導体を含む意味で用いられる。また本明細書においてＰＴＨなる用語は、文脈においてＰＴＨ関連タンパク質を除いていると明らかでない限りは、ＰＴＨおよびＰＴＨ誘導体に加えさらにＰＴＨ関連タンパク質を含む意味で用いられる。
【００１７】
本発明における副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）とは、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学的手法で製造されたＰＴＨ、化学的に合成されたＰＴＨを包含し、好ましくは８４アミノ酸残基より成るヒトＰＴＨ（ヒトＰＴＨ（１−８４））またはBlack bear parathyroid hormone（ｂｂＰＴＨ）である。また、ＰＴＨ誘導体とは、前記のＰＴＨの部分ペプチドや、ＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したもの、ＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を欠失したもの、およびＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドに１または２以上のアミノ酸を付加したペプチドなどで同様の活性を有するペプチドを意味する。ＰＴＨの部分ペプチドとしては、ヒトＰＴＨの部分ペプチドまたはｂｂＰＴＨの部分ペプチド等をあげることができ、例えば、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）、ウシＰＴＨ（１−３４）等があげられる。ヒトＰＴＨ（１−３４）とはＰＴＨのＮ末端から３４番目のアミノ酸までの３４個のアミノ酸からなるＰＴＨの部分ペプチドを示す。アミノ酸置換の好ましい例としては、８位における構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、１８位における構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、３４位における構成アミノ酸のチロシンへの置換などをあげることができるがこれらに限定されない。
【００１８】
本発明用いられる副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体の好ましい例としては、ヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３８）、ヒトＰＴＨ（１−３７）、ヒトＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ2、ｂｂＰＴＨなどがあげられ、さらに好ましくはヒトＰＴＨ（１−８４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ｂｂＰＴＨであり、最も好ましいものとしてヒトＰＴＨ（１−３４）があげられる。
【００１９】
本発明における副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）とは、１４１個のアミノ酸からなり、ＰＴＨ様作用により高カルシウム血症をもたらす蛋白質であり、天然型のＰＴＨｒＰ、遺伝子工学的手法で製造されたＰＴＨｒＰ、化学的に合成されたＰＴＨｒＰを包含し、好ましくは１４１アミノ酸残基より成るヒトＰＴＨｒＰである。本発明におけるＰＴＨｒＰは、ＰＴＨｒＰそのものに加え、その構成アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したもの、その構成アミノ酸の一部を欠失したもの、およびＰＴＨｒＰに１または２以上のアミノ酸を付加したものなどで同様の活性を有するペプチドを含み、さらには、本発明の目的において同様の活性を有する限り、ＰＴＨｒＰの部分ペプチドおよびそのアミノ酸の一部を置換・欠失またはそれにアミノ酸を付加したものも含む意味で用いられる。
【００２０】
本発明の一つの態様において、本発明は、哺乳動物由来多能性幹細胞の筋芽細胞や筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、ＰＴＨを含有する分化誘導促進剤である。
本発明の別の態様において、本発明は、ＰＴＨを用いて、哺乳動物由来多能性幹細胞を筋芽細胞や筋細胞に分化誘導する方法である。
【００２１】
本発明で用いる「多能性幹細胞」とは、自己複製能を有しインビトロにおいて培養することが可能で、かつ、個体を構成する細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等をあげることができるが、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であり、特に好ましくは、ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞である。
【００２２】
ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）とは、分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞（例えば、線維芽細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（分化多能性因子）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞のことである。「分化多能性因子」としては、多くの因子が報告されており、特に限定しないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの報告が既になされており、それらを参考にすることができる。
【００２３】
哺乳動物由来のＥＳ細胞の培養方法は常法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を用い、白血病阻害因子、ＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばＤＭＥＭ培地を用いて維持することができる。
ｉＰＳ細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス線維芽細胞を用いて、ｂＦＧＦ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばＤＭＥＭ/Ｆ１２培地やＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ培地（リプロセル）を用いて維持することができる。
【００２４】
本発明においては、例えば、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を、ＰＴＨを含有する培地で培養することにより、ヒト筋芽細胞またはヒト筋細胞を誘導でき、誘導された細胞は、筋疾患の治療に用いることができる。
本発明の分化誘導促進剤は、その組成および形態は、ＰＴＨを含有しかつそれを安定に保存できれば特に制限がない。
【００２５】
本発明の別の一つの態様において、本発明は、哺乳動物由来筋衛星細胞（サテライト細胞）の筋芽細胞や筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤であって、ＰＴＨを含有する分化誘導促進剤である。
本発明のさらに別の一つの態様において、本発明は、ＰＴＨを用いて、哺乳動物由来の筋衛星細胞（サテライト細胞）を筋芽細胞や筋細胞に分化誘導する方法である。
ヒトから採取した筋衛星細胞を分化誘導する場合は、例えば、筋衛星細胞を、ＰＴＨを含有する培地で培養することにより、ヒト筋芽細胞またはヒト筋細胞へと誘導でき、誘導された細胞は、筋疾患の治療に用いることができる。あるいは、生体（例えばヒト）の筋組織中に存在する筋衛星細胞の筋芽細胞または筋細胞への分化誘導を促進する場合は、以下に記載の筋疾患の治療剤または予防剤と同様にして、ヒトに投与することにより、筋衛星細胞への分化誘導を促進できる。
【００２６】
本発明の他の一つの態様として、本発明は、例えば、ヒトの筋肉（または筋線維）の再生促進剤であって、ＰＴＨを有効成分として含有する筋肉（または筋線維）再生促進剤である。
本発明のさらに他の一つの態様として、本発明は、ＰＴＨを用いて、例えば、ヒトの筋肉（筋線維）を再生する方法である。
筋肉（または筋線維）再生促進剤として用いる場合は、以下に記載の筋疾患の治療剤または予防剤と同様にして、ヒトに投与することにより、筋衛星細胞を活性化して、細胞分裂を促進し、筋線維の再生を引き起こすことにより、筋肉の再生を誘導できる。
【００２７】
本発明の別の一つの態様において、本発明は、ＰＴＨを有効成分として含有する、筋疾患のための治療剤または予防剤である。
本発明のさらに別の一つの態様においては、本発明は、ＰＴＨを用いて、筋疾患を治療または予防する方法である。
本明細書で言う筋疾患とは、筋力低下、筋の機能低下、骨格筋肉量の減少などを伴う筋肉の疾患を意味する。筋疾患の症状の大部分は、筋肉、特には骨格筋の萎縮、減少によって起こる筋力の低下である。筋肉が萎縮または減少する原因は大まかに２つあり、一つは、筋肉自体に問題がある場合（一般に、筋原性疾患という）であり、もう一つは筋肉を動かす神経に問題がある場合（一般に、神経原性筋疾患という）である。筋原性疾患には、進行性筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、遠位型ミオパチーなど）、先天性筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー症、先天性非進行性ミオパチー、皮膚筋炎、糖原病、脂質代謝異常ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、などがある。一方、神経原性筋疾患には、乳児脊髄性筋萎縮症（ウェルドニッヒ・ホフマン病）、クーゲルベルグ・ウェランダー病、ＤＲＰＬＡなどがある。
【００２８】
本発明が対象とする筋疾患は、上記の筋原性疾患および神経原性筋疾患の両者を含み、例えば、それに限定されないが、上記に例示した各疾患を対象とする。現在は一般には筋疾患に分類されていないが、廃用性筋萎縮による筋疾患やサルコペニアも本発明の対象であり、本明細書においては、筋疾患は、廃用性筋萎縮による筋疾患やサルコペニアを含む意味で用いられる。サルコペニアは、進行性および全身性の骨格筋量および骨格筋力の低下を特徴とする症候群であり、筋肉量の低下を伴い、筋力または身体能力の低下のいずれかが当てはまればサルコペニアと診断される。本発明の対象として好ましいのは、骨格筋肉量の減少を伴う筋疾患、特には、進行性筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、とサルコペニアである。
本発明の筋疾患治療剤または予防剤、あるいは筋疾患の治療または予防方法を用いることにより、筋力の増強または筋力低下の遅延を達成することができる。
【００２９】
本発明の薬剤の剤形としてはペプチドの通常の製剤方法により製造される剤形を用いることができ、非経口投与剤および経口投与剤のいずれも可能である。
非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、坐薬、吸入剤（経鼻吸収剤、経肺呼吸剤、経皮吸収剤）、皮膚粘膜投与製剤等が挙げられる。注射剤は、液剤（無菌水又は非水溶液）、乳剤および懸濁剤の形態とすることができ、これらに用いられる非水担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルとしては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機酸エステルが挙げられる。なお、注射剤は、凍結保存または凍結乾燥により保存するのが望ましく、凍結乾燥製剤とした場合は、用時に注射用蒸留水等により溶解して使用される。
経口投与製剤としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性若しくは水性懸濁剤等の液剤を例示でき、賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤等の製剤化に必要な添加物を適宜配合して調製することができる。
さらには、ゲル状のシートに含ませるなど局所化および遅効性を期待した剤形も可能である。
また、血中半減期の増大をねらってポリエチレングリコールで修飾した製剤やペプチドを修飾した製剤も可能である。
【００３０】
製剤化の際には、製薬学的に許容しうる補助成分を添加することができる。
補助成分としては、基剤、安定剤、防腐剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味剤、着色剤、芳香剤、無痛化剤、賦形剤、結合剤、粘稠剤、緩衝剤などがあげられ、具体的には、たとえば、炭酸カルシウム、乳糖、蔗糖、ソルビット、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ脂、注射用蒸留水、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル液、グルコース溶液、ヒト血清アルブミンなどがあげられる。これらの補助成分を用いて、本発明の薬剤を調整する場合には、当該補助成分を適宜選択し、使用すればよい。また、補助成分の使用量は、製剤学的に許容されうる範囲内において、剤形などに応じ、適宜選択すればよい。
【００３１】
本発明の薬剤の投与方法は、全身投与でも局所投与でもよく、好ましい例として、経口投与、皮下投与、経皮投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経肺投与などによる全身投与などがあげられるが、経口投与（例えば、錠剤）、皮下投与（例えば、注射剤）、経皮投与（例えば、テープ剤）がより好ましい。投与期間は、臨床的に筋疾患と判断される期間を原則とし、病因に応じて臨床医の判断により、本発明の薬剤の投与により筋力低下が回復した後も投与を続けることも可能である。さらに、筋疾患により筋力低下が予測される場合、予防的に投与することも可能である。投与頻度は、月１回投与から連日投与が可能であり、好ましくは１回／２週から５回／週程度もしくは連日投与である。
【００３２】
本発明のＰＴＨの投与量は、疾患、症状などにより異なり、適用疾患、症状、患者の状態、投与方法により適宜選択される。例えば、これに限定されないが、全身投与では、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００μｇ程度であり、好ましくは０．１μｇ〜６０μｇ程度であり、さらに好ましくは０．４μｇ〜６０μｇである。投与方法は、限定されないが、連日でも間歇でもよく、週１回、またはそれ以上の期間を空けてもよい。投与方法及び投与量は、患者の症状や状態により適宜選択されるが、例えば、０．４μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜６０μｇ／ｋｇを、週１回、皮下注で投与が可能である。
【００３３】
本発明のＰＴＨを用いた治療剤及び予防剤の特徴は、すべての筋疾患を有する個体に適用可能なことである。そして、本発明の治療剤または予防剤を投与した個体は、筋力の増強、または筋力低下の進行を遅らせることが可能となる。それ故、ヒトにおいては、歩行不能になることを防ぐまたは歩行不能になる時期を遅らせることができ、患者のＱＯＬ（Quality of Life）やＡＤＬ（Activities of Daily Living）を改善できる。
本発明のＰＴＨを用いた治療剤及び予防剤の特徴はまた、横隔膜などの呼吸筋の筋力の改善または維持による呼吸機能障害の改善も期待でき、さらには、ＰＴＨが心筋の分化を促すことにより、骨格筋の改善のみならず、筋疾患に合併する心機能の改善も期待できる。
【００３４】
本発明のＰＴＨを用いた治療剤及び予防剤は、疾患のもととなる特定の原因や機序をターゲットとするものではなく、筋組織機能の改善という効果に基づくものであるので、筋力の低下を伴う筋疾患に広く適用できる。そのため、本発明は、特定の原因に基づく筋に影響を及ぼす疾患ではない、加齢や骨折、癌などによりベッド上で安静を余儀なくされ廃用性筋萎縮をきたすいわゆるサルコペニアなどの治療にも適用できる。本発明により、寝たきりの時間が短縮、また老人の寝たきりになる率の減少が期待される。
【００３５】
筋疾患（サルコペニアを含む）の患者は、早い段階で筋力低下の症状を発症する。筋力低下は、多くの合併症を引き起こすので、この筋力低下の症状を呈した早い段階で、本発明のＰＴＨを用いた治療剤及び予防剤を用いるのが好ましい。
筋疾患（サルコペニアを含む）の患者は、筋力の低下に伴い運動量が減少するため、骨密度の低下を引き起こす。骨密度の低下は骨折のリスクを伴うため、骨密度の低下が顕著な場合は、一般には骨粗鬆薬が患者に投与される。骨粗鬆薬としては、ビスフォスフォネート製剤やＰＴＨ誘導体であるテリパラチドが用いられる。本発明のＰＴＨを用いた治療剤及び予防剤は、患者が骨密度の低下を来す前に投与を開始することが好ましく、それにより、筋力低下による骨密度の低下を防ぐことができる。
【００３６】
以下に本発明の使用態様を例示するが、これに限定されるわけではない。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、一般に、遺伝子診断（ＭＬＰＡ法）および／または抗ジストロフィン抗体を使用した免疫組織染色による筋生検により診断される。これらの診断方法により確定診断された患者は、本発明の治療剤を投与する対象となるが、投与を開始する時期は、特に制限されず、(i)筋力低下の症状が出現する前、(ii)筋力低下の症状が出現したころ、(iii)良く転ぶ、階段が昇れない、登攀性起立などを認めるころ（通常、３〜４歳頃）、(iv)動揺性歩行が目立つ頃（５〜７歳頃）、あるいはそれ以降のいずれでも良いが、好ましくは、(iv)動揺性歩行が目立つ頃である。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者においては、現在ステロイド治療薬の投与が行われるが、ステロイド投与は一般に、(iv)動揺性歩行が目立つ頃（５〜７歳頃）から開始され、次いで、歩行不能となり（１０歳頃）、その後骨粗鬆症の症状を呈することが報告されている。
本発明の治療薬の投与は、骨粗鬆症の症状を呈する遙か以前の、例えば、ステロイド投与の開始と同時期の、(iv)動揺性歩行が目立つ頃（５〜７歳頃）から開始するのが好ましいが、それ以前から開始してもよい。
なお、ステロイドの投与により結果として骨粗鬆症が起こりうるので、ステロイド投与が開始された筋疾患患者には、本発明の筋疾患治療薬を併用することが望ましい。
【００３７】
他の先天性筋ジストロフィーも同様に、一般に、遺伝子診断（たとえば、福山型先天性筋ジストロフィーにおける、フクチン遺伝子（原因遺伝子）へのトランスポゾンの挿入のサザンブッロトやＰＣＲでの検出）や各原因遺伝子の抗体で免疫組織染色による筋生検を行い診断される。これらの診断方法により確定診断された患者は、本発明の治療薬により治療を開始するのが好ましい。あるいは、患者は、生まれて数ヶ月で筋力低下と筋緊張低下が目立ってくるので、筋ジストロフィーとの診断がついたら、本発明の治療薬により治療を開始するのが好ましい。
【００３８】
他の筋ジストロフィーである筋力低下の進行が遅い筋ジストロフィー、例えばベッカー型筋ジストロフィーや肢体型筋ジストロフィーなども、一般に、遺伝子診断（例えば、ベッカー型におけるＭＬＰＡ法）および／または免疫組織染色による筋生検を行い診断される。これらの筋ジストロフィーは、筋力低下の進行が遅く、症状を呈するまでに個人差があり、１０歳代で歩行が出来なくなる患者もいるが、多くは歩行困難が出てくるのは２０歳以上である。従って、これらの患者に対しては、登攀性起立を認めるころ、もしくは動揺性歩行が出現する頃に、本発明の治療薬により治療を開始するのが好ましい。
【００３９】
サルコペニアは、全身性の骨格筋量および骨格筋力の低下を特徴とする疾患であるが、例えば、手術などで長期臥床を余儀なくされ、歩行回復に時間がかかることが予想される患者などが発症する。これらの患者の場合は、リハビリを開始する前に、本発明の治療薬により治療を開始するのが好ましい。また、治療は、例えば、歩行が安定してきたら、中止することが好ましい。
【００４０】
なお、本発明で用いることができるＰＴＨ誘導体であるヒトＰＴＨ（１−３４）は、テリパラチドとして既に医薬品として市販されているので、ヒトへの投与について、安全性が確認されている。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＭｙｏＤ遺伝子発現マウスＥＳ細胞の作成
発明者らの文献（Ozasaら、Biochem. Bioph. Res. Comm. 357, 957-963, 2007）に従って、Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムを利用して、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を除去することにより、ＭｙｏＤ遺伝子を発現させることのできるマウスＥＳ細胞（ＥＳ−ＭｙｏＤ）を作製した。スーパー標的（super-targeting）による、ＺＨＴｃ６−ＭｙｏＤ細胞の作製方法を図１（Ａ）に示す。ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞の維持にはGlasgow minimum essential medium（ＧＭＥＭ）、15% Knockout SR (Gibco)、Leukemia inhibitory factor (LIF) 1000 U/ml、sodium pyruvate 1mM、non-essential amino acids 0.1 mM、2-mercaptethano 0.055 mM、doxycycline 100 ng/mL、Zeocin 10 μg/mLの培養液（維持培地）を使用した。ゼラチンコートデッシュを使用し、維持には３日毎に細胞を０．２５％トリプシン処理し、細胞をはがし、ＰＢＳで洗浄後、播種した。筋細胞分化には、上記の培養液より、Knockout SR、LIF、Zeocin、doxycyclineを除き4% fetal bovine serum (FBS)を添加した（分化培地）。この細胞は培養液からＤｏｘを除去することにより、in vitroでは高率にＥＳ細胞を筋分化させることが出来た（図１（Ｂ））。
しかし、ＥＳ−ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤ−）の培養液よりＤｏｘを除去しても、すべての細胞がマイオチューブへと筋分化するわけでなく、一部の細胞（「ＥＳ−ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤ＋）」と称する）は筋衛星細胞の休止状態と同じ様に未熟の状態を保っていた（図２）。この分化は筋衛星細胞に似ている。【００４２】
実施例２：ＺＨＴｃ６−ＭｙｏＤ細胞の網羅的ＤＮＡマイクロアレイ分析
次いで、未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞と分化１３日後ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞において、網羅的ＤＮＡマイクロアレイにより遺伝子の発現を解析した。
未分化のＥＳ−ＭｙｏＤ細胞を維持培地で培養し、ＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシンではがしてＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した（未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ）。
ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞を維持培地から分化培地に変更し、筋細胞に分化誘導をかけ１３日後、ピペットでマイオチューブに培養液を直接吹きかけ、マイオチューブをディシュよりはがした。多くは簡単にこの操作でマイオチューブははがれていく。その後、コロニーを０．２５％トリプシンではがして，ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収しＲＮＡを抽出した（分化１３日後未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ）。
また、分化誘導後７日後に分化培地にガンシクロビル１ｍＭを入れて未分化な細胞を死滅させ、分化誘導１３日後にマイオチューブのみを採取し、マイオチューブからＲＮＡを抽出した。
抽出したそれぞれのＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ分析を行った。網羅的ＤＮＡアレイはフィルジェン株式会社（日本）に委託した（CodeLink Human Whole genome Bioarray受託解析サービス、単色法３サンプル  Cat.#F-300026-1-3）。
未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞と分化１３日後の未分化ＥＳ−ＭｙｏＤの細胞の比較を図３に、未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞と分化１３日後のマイオチューブの細胞の比較を図４に示す。分化１３日後の未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞では１型副甲状腺レセプター（ＰＴＨ１Ｒ）が高発現していた（図５）。【００４３】
実施例３：ｓｉＲＮＡによるＰＴＨ１Ｒ発現の抑制
ＰＴＨ１Ｒの発現抑制のためのｓｉＲＮＡはＭｎ−ＰＴＨ１Ｒ−５、Ｍｎ−ＰＴＨ１Ｒ−６、Ｍｎ−ＰＴＨ１Ｒ−７、およびＭｎ−ＰＴＨ１Ｒ−８（QIAGEN社、GeneSolution siRNA Cat. No. 1027416）を使用した。ネガテイブコントロールとしてAllSTars Neg siRNA AF488（QIAGEN社、Cat. No. 1027284）を使用した。Death controlとしてAllStars Mm/Rn Cell Death Control siRNA（QIAGEN社、Cat. No. S104939025）を使用した。
トランスフェクション２日前に、ＥＳ−ＭｙｏＤ細胞の培地を分化培地（2% HS DMEM）に変えて分化誘導した。Ｄａｙ０で、分化誘導をかけたＥＳ−ＭｙｏＤ細胞を、トリプシンを用いてディッシュからはがし、ＰＢＳで洗浄後、維持培地で中和して、トランスフェクションの前にコラゲンコートされた６ウェルディシュの１ウェルに２ｘ１０5細胞ずつ播種し、短い時間、２３０μL の分化培地で培養した。マイクロチューブに、１５００ngのｓｉＲＮＡを血清が入っていない培地１００μLを入れ、次いで、１５μL のHiperfect transfection reagent（QIAGEN社、CAT 301704）を入れてボルテックスをして混ぜた。その後、５分から１０分間、室温でインキュベートし、用意した細胞の入ったディシュ（６ウェルディッシュ）に入れた。４８時間後（Ｄａｙ２）に、分化培地に培地交換をした。４８時間後にトランスフェンの効率を蛍光ＡＦ４８８で確認し、death controlでほぼすべての細胞が死んでいることを確認した。トランスフェクション２日後（Ｄａｙ２）および１０日後（Ｄａｙ１０）における細胞の状態を確認した。結果を図６に示す。未分化ＥＳ−ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤ−）細胞が筋分化する際に、ｓｉＲＮＡでＰＴＨ１Ｒを抑制すると、多くの細胞は分化せずに死んでいくことが確認された。【００４４】
実施例４：ＰＴＨによるヒト筋芽細胞の分化誘導
不死化したヒト由来の筋芽細胞（Immortalized human myogenic cell clone Hu5/KD3）（ＫＤ３）細胞におけるＰＴＨ存在化での筋分化誘導を確認した。ＫＤ３の維持培養は、DMEM-Dulbecco’s Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）、20% FBS、2% Utraser G（Life science社、15950-017)（維持培地）を使用した。分化培地は、ＤＭＥＭ、2% horse serum、1% Insulin-Transferrin-Selenium-A（Gibco社、51300-044）を使用した。
維持培地を使用してＫＤ３細胞をコラゲンコートディシュに播種し、翌日、分化培地に培地を入れ替えた。ＰＴＨ（副甲状腺ホルモンフラグメント１−３４ヒト、Cat. No. P3796、シグマ社）を添加する場合は、最終濃度を２．５ｎＭとした。ＫＤ３を、ＰＴＨを添加した培地で培養すると、収縮まで分化がすすむことが確認された。また、分化誘導されたマイオシートの幅が広くなっていることが確認された。結果を図７に示す。
また、ＥＳ細胞を用いて筋細胞への分化誘導を行ったところ、ＰＴＨの添加により分化誘導の促進が確認できた。【００４５】
実施例５：筋組織のＰＴＨ１Ｒ抗体を用いた免疫組織染色
マウスの筋組織に対して、Ｐａｘ７とＰＴＨ１Ｒの２重染色を施行した。実験には、１２週齢のC57BL/10SnSlcマウスの筋組織を用いた。１０μm クライオスタットを使用してマウスの腓腹筋より筋組織を切り出し、常法に従って免疫組織染色を行った。１次抗体としてanti PTH1R（SIGMA-ALDRICH社、rabbit poly）４００倍希釈と、anti Pax7（LifeSpan BioSciences, Inc.、goat poly）３００倍希釈を使用した。２次抗体としては anti rabiit IgG Alexa 488（Molecular Probes社）、anti goat IgG Alexa 555（Molecular Probes社）を使用した。結果を図８に示す。筋組織のPax７陽性を示す筋衛星細胞の一部にＰＴＨ１Ｒの発現する細胞を認めた。ヒトの筋組織を用いて同様の実験を行った結果、マウスと同様の結果を得た。【００４６】
実施例６：筋ジストロフィーモデルマウスに対するＰＴＨの投与
４週齢のｍｄｘマウス（筋ジストロフィーのモデルマウス、ジストロフィン欠損マウス）に、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモンフラグメント１−３４ラット、Cat. No. P3921、シグマ社）を１０、６０、および２００μg/kgの投与量にて、各１匹ずつ連日、２０日間、皮下注射した。コントロールは、生理食塩水を投与した。その後、ワイヤーハンギングテストにて、それぞれの濃度でＰＴＨを投与されたマウスのつかまり時間を測定した。ワイヤーハンギングテストは以下のように行った。HARA&CO.,LTD.（小原医科産業株式会社）製ＷＨ−３００２を使用して行った。マウスを金網に捕まらせて、逆さまにして、つかまれる時間を計測した。その時に、マウスのしっぽに２．８ｇのおもりを負荷した。３回行い最長時間を示した。結果は、生理食塩水、１０、６０、および２００μg/kgの投与量の順に、１３秒、５５秒、２２１秒、および８７秒とＰＴＨ投与群のマウスが長く捕まることができた。なお、ＰＴＨ２００μg/kgを投与したマウスは、高Ｃａ血症を呈していた。【００４７】
実施例７：ＰＴＨ投与マウスの筋組織の中心核率の検討
ＰＴＨ投与マウスの筋組織における中心核が占める割合を、ｍｄｘマウスを用いて確認した。１０、６０、および２００μg/kgの投与量にて、各１匹ずつ連日、２０日間、皮下注射したマウスをジエチルエーテルで麻酔し、頸椎脱臼にて殺し、腓腹筋を採取し、ＨＥ染色を行った。写真を撮影し、中心核の率をカウントした。コントロールは、生理食塩水を投与した。結果を図９に示す。筋組織の中心核の率は、生食投与、１０、６０、および２００μg/kg投与ｍｄｘマウスにおいて、それぞれ９１．０、８８．５、７３．７、および８５．４％であり、ＰＴＨ投与群が中心核の割合の低下を示した。中心核の率が低いほど、細胞の壊死が少ないことを示し、筋の正常化を示す。【００４８】
実施例８：ｍｄｘマウスのＰＴＨの投与による筋力低下の回復
次いで、ｍｄｘマウスにＰＴＨを連日６０μｇ／ｋｇ皮下注射し、１０日目、および３１日目に、それぞれワイヤーハンギングテストと１００分間トレッドミルを施行した。
ワイヤーハンギングテストは、ｍｄｘマウスを用いて、投与１０日目に、生食（生理食塩水）投与ｍｄｘ７匹、ＰＴＨ投与ｍｄｘ６匹を使用し、実施例６と同様にして行った。それぞれの平均は３０．８±２１、１３２±６１で０．０３の有意差を認めた（図１０）。
ＰＴＨ投与３１日目のｍｄｘマウスを用いて、トレッドミル試験を行った。トレッドミル：コントロールＬＥ８７１０（Panlab Harvard社製、スペイン）を使用した。Ｂ１０マウス（正常マウス）４匹、生食投与ｍｄｘマウス３匹、ＰＴＨ６０μg/kg投与ｍｄｘマウス４匹を使用した。２５cm/secで、１００分間走らせた際の、走行距離を測定した。途中で走れなくなったマウスはその時点までの走行した距離を走行距離とした。１００分間走った距離は、それぞれ、１４８８±７．９、３４３±２５１、９７３±３３９メートルであった（図１１）。Ｂ１０とｍｄｘの生食投与群では０．０１以下の有意差を示し、生食投与群とＰＴＨ投与群では０．０４の有意差を示した。よって、ＰＴＨ投与による、筋力の維持もしくは増強効果を認めた。この結果はＰＴＨ、ＰＴＨ誘導体、ＰＴＨ関連タンパクが、筋疾患やサルコペニアの治療に有効であることを示している。【００４９】
実施例９：ｍｄｘマウスのＰＴＨの投与による筋線維および骨に対する効果
ｍｄｘマウス（６匹）にＰＴＨを連日６０μｇ／ｋｇ、５９日間、皮下注射し、骨状態と筋線維の状態を確認した。対照として、正常マウス（Ｂ１０マウス）（５匹）、および生食（生理食塩水）を投与したｍｄｘマウス（７匹）を用いた。
実施例８同様、ワイヤーハンギングテストおよびトレッドミル試験ともに、ＰＴＨ投与群は有意な効果を示し、ＰＴＨ投与による、筋力の維持もしくは増強効果を認めた。
投与５９日目に、各群のそれぞれのマウスの骨密度を確認した。骨密度分析は、以下のようにしておこなった。マススの第四腰椎について、高解像度Ｘ線マイクロコンピュータ化されたトモグラフィ（ｍＣＴ）画像分析を、FLEX Triumph CT scanner（TriFoil Imaging, Northridge, CA, USA）を用いて、４０ｋＶ，７９０ｍＡで操作して行った。Ｘ線透過像は、３６０度にわたる２５６投射を用いて取得した（２５６ms放射/投射，ｘ２倍率，焦点：８４μｍ）。幾何学的照射野は、５１２ｘ５１２マトリックスに対して５９ｘ５９ｍｍとした。各５１２切片のｍＣＴイメージセットを、１１５μｍピクセルサイズを用いて再構成し、３次元イメージを作成した。結果を、図１２に示す。腰椎体のｍＣＴ値（図中の線内の平均密度）は、Image J Softwareを用いて測定した。正常マウス（Ｂ１０）、ＰＴＨ投与群、および生食投与群の平均ｍＣＴ値は、それぞれ、１５２１．８７，１３０４．３４および１２０７．２７ハウンズフィールドユニットであった。ＰＴＨ処理によるジストロフィン欠損マウスの骨化の改善が示唆された。【００５０】
翌日（６０日目）、全てのマウスをジエチルエーテルで麻酔し、頸椎脱臼にて殺し、血液および組織サンプルを採取し、血液学的分および組織学的分析を行った。
血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびカルシウム（Ｃａ）レベルを、Fuji Dri-Chem system（Fuji Film Medical, Tokyo, Japan）を用いて、製造者の操作手順書に従って測定した。ＣＫレベルは、それぞれ、正常マウス（Ｂ１０）が１５５８．６±１３１６．７ ＩＵ／Ｌ（ｎ＝５）、ＰＴＨ投与群が５５０８．８±２１４９．７ ＩＵ／Ｌ（ｎ＝６）、および生食投与群が６６３０．１±３８１１．１ ＩＵ／Ｌ（ｎ＝７）であった。正常マウスのＣＫレベルは、ＰＴＨ投与群および生食投与群のマウスより顕著に低く、ＰＴＨ投与群および生食投与群マウスのＣＫレベルは、統計的に同じであった。ＰＴＨ投与により筋原線維ダメージのバイオマーカーであるＣＫのレベルが減少しなかったことより、ＰＴＨ投与によって筋細胞の細胞膜の安定性が改善されたのではないことが示唆された。従って、ｍｄｘマウスにおけるＰＴＨ投与のおける筋力の増強は、処理していないマウスに比べてより速い筋の再生が起こった結果と考えられる。血清カルシウムレベルは、正常マウス、ＰＴＨ投与群マウス、および生食投与群のマウスにおいて差がなかった。
組織学的分析は、筋原線維の最小の断面直径と筋原線維の中心核の数を、ＨＥ染色切片のデジタルイメージ分析に基づいて、それぞれ、Image J（NIH, Bethesda, MD, USA）およびCell Sense（Olympus, Tokyo, Japan）Software suitesを用いて決定することにより行った。筋線維サイズおよび中心核データの統計的分析は、Microsoft Excel, version 14.2.5 software（REdmond, WA, USA）を用いて行った。
正常マウス（Ｂ１０）、ＰＴＨ投与群、および生食投与群の筋組織の写真を図１３に、筋原線維の平均直径を図１４に、中心核率を図１５に示す。図１３の結果は、実施例７（図９）と同様であった。正常マウスにおいては、筋線維の周辺に位置しているのに対し、ｍｄｘマウスでは核を中心にもつ筋原線維が顕著に出現し、ＰＴＨ投与により改善された。また、生食投与群のマウスの筋原線維は、ＰＴＨ投与群のマウスに比べて、小さく、そしてより丸い線維（再生線維）であった。正常マウス（Ｂ１０）、ＰＴＨ投与群、および生食投与群の筋原線維の平均直径は、それぞれ、３３．６２±１０．６μｍ（ｎ＝５）、３１．１６±１２．９μｍ（ｎ＝６）、および２５．４１±１０．４μｍ（ｎ＝７）であった。中心核をもつ筋原線維の率は、正常マウス（Ｂ１０）、ＰＴＨ投与群、および生食投与群のそれぞれで、０．３４±０．２％（ｎ＝５）、８３．０１±４．０％（ｎ＝６）、および９３．２±２．０％（ｎ＝７）であった。これらの結果は、ＰＴＨ処理により、ｍｄｘマウスの筋線維の構造が顕著に改善されたことを示しており、ＰＴＨ処理は、筋線維の再生を促進することにより筋力弱化を改善したことを示している。【００５１】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のＰＴＨを含む筋疾患治療剤または予防剤は、筋力低下を伴う筋疾患に広く適用でき、筋力の増強または筋力低下の進行を遅延させることができる。適用できる筋疾患としては、例えば、筋ジストロフィーやサルコペニアをあげることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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