(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオプリンターであって、
ａ）１つ以上のプリンターヘッドであって、各プリンターヘッドは少なくとも１個のカートリッジを受け取り、保持するための手段を含み、各カートリッジは分注のオリフィスとバイオインクを含み、該バイオインクは生細胞を含む固形組成物を含むプリンターヘッドと；
ｂ）分注のオリフィスを介して選択されたカートリッジのバイオインクを押し出す圧力の印加によって選択されたカートリッジのバイオインクを分注するための手段と；
ｃ）レーザーおよびレーザー検知器を利用して、空間内で選択されたカートリッジまたは分注のオリフィスの位置を決定するための手段と；
ｄ）選択されたカートリッジの位置を決定するための手段と、バイオインクを分注するための手段に通信でつながれた前記バイオインクの分注を調節するためのコンピューターモジュールと；
ｅ）前記少なくとも１個のカートリッジの押し出されたコンテンツを受け取るための受け面と；
ｆ）受け面の温度を調節および／または維持するための手段であって、受け面はプリンターステージとは離れた構成要素である、手段と；
ｇ）周囲温度、カートリッジの温度、カートリッジのバイオインクの温度、又はそれらの組み合わせを調節および／または維持するための手段と、
を含むバイオプリンター。
【請求項２】
選択されたカートリッジのバイオインクを分注するための手段は、ピストン、圧縮ガス、水圧、またはそれらの組み合わせを介して圧力を印加することを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項３】
受け面の温度を調節および／または維持するための手段は、発熱体であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項４】
受け面の温度を調節および／または維持するための手段は、放射加熱器、対流加熱器、伝導性のヒーター、ファンヒーター、熱交換器、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項３に記載のバイオプリンター。
【請求項５】
受け面の温度を調節および／または維持するための手段は、冷却要素であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項６】
受け面の温度を調節および／または維持するための手段は、冷媒の容器、冷却した液体、氷、放射冷却器、対流冷却器、伝導性の冷却器、ファンクーラー、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項５に記載のバイオプリンター。
【請求項７】
ａ）プリンターステージ、ｂ）受け面、ｃ）分注のオリフィス、ｄ）バイオインク、およびｅ）印刷された構成物、の１つ以上に湿潤剤を適用するための手段をさらに含み、ここで、湿潤剤は、バイオインクが、バイオプリンターによって分注される前、分注と略同時に、および、バイオインクが、バイオプリンターによって分注された後、から選択される１つ以上の時点で適用されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項８】
受け面は、略平ら又は略滑らかであることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項９】
受け面の形は、１つ以上の沈着した構造の、大きさ、形状、または構成、または幾何学的構造に適応するか又は影響を及ぼすように設計されていることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１０】
周囲温度を調節および／または維持する手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１１】
カートリッジの温度を調節および／または維持する手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１２】
カートリッジのバイオインクの温度を調節および／または維持する手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１３】
受け面の温度は約４０℃から約９０℃の間に調節および／または維持されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１４】
受け面の温度は約０℃から約１０℃の間に調節および／または維持されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【請求項１５】
受け面の温度は３７℃に調節および／または維持されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオプリンター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１０年１０月２１日に出願の、米国仮特許出願第６１／４０５，５８２号の利益を主張し、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医療産業は、多くの切迫した問題に直面している。２００９年１２月時点で、１０５，３０５人の患者が、臓器移植を必要とする人として、全米臓器配分ネットワーク（ＵＮＯＳ）に登録されていた。２００９年１月から９月の間に、２１，４２３件の移植のみが行われた。毎年、移植が行われる件数よりも多い患者が、ＵＮＯＳリストに加えられ、その結果、移植を待つ患者の数の純増加をもたらしている。例えば、２００８年の初めに、７５，８３４人が腎臓を必要とする人として登録され、その年の終わりに、数は、８０，９７２人に増大した。１６，５４６件の腎臓移植がその年に行われたが、３３，００５人の新しい患者がリストに加えられた。腎臓を必要とする人としてＵＮＯＳによって登録された患者の２００８年の移植率は、２０％であった。待ちリストの患者の死亡率は７％であった。
【０００３】
さらに、新しい医薬品化合物の研究開発費は、およそ１８億ドルである。Ｐａｕｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｈｏｗ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ Ｒ＆Ｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ： ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ’ｓ ｇｒａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９（３）：２０３−２１４を参照。創薬は、薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。創薬のプロセスは、一般に少なくとも次の工程を含んでいる：治療上の有効性に関する、候補の識別、合成、特徴づけ、スクリーニング、およびアッセイ。技術の進歩および生物系の理解にもかかわらず、創薬はまだ、新しい治療上の発見の率が低い、長く、高価で、非能率的なプロセスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
組織および臓器の緊急の必要性を取り除くための、再生医療および組織工学技術の適用を促進するツールおよび技術が必要とされている。また、持続不可能な研究開発コストを課すことなく、革新的でコスト効率の良い新薬の数および品質を実質的に増加させるツールおよび技術も必要とされている。したがって、本発明者は、組織および臓器を作成するための、デバイス、システム、および方法を本明細書に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、バイオプリンターが記載され、該バイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含み、ここで、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含み、および前記カートリッジは、バイオインクおよび支持物質の１つ以上から選択されるコンテンツ（ｃｏｎｔｅｎｔｓ）を含み、プリンターヘッドはさらに、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段、および少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注する（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）ための手段を含む。１つの実施形態において、本明細書に記載されるプリンターヘッドは、１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるプリンターヘッドは、１つを超えるカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。別の実施形態において、バイオプリンターは、プリンターステージ（ｐｒｉｎｔｅｒ  ｓｔａｇｅ）を更に含む。別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、次のものから選択される：磁気引力、コレット・チャックのグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせ。また別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、コレット・チャックのグリップである。また別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、次のものから選択される。レーザーアライメント、光学的アライメント、機械的アライメント、圧電のアライメント、磁気のアライメント、電場または、静電容量のアライメント、超音波のアライメント、またはそれらの組み合わせ。また別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、レーザーアライメントである。別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段は、ピストンの適用、圧力の適用、圧縮ガスの適用、水圧（ｈｙｄｒａｕｌｉｃｓ）、またはそれらの組み合わせである。また別の実施形態において、少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段は、ピストンの適用である。また別の実施形態において、ピストンの直径は、カートリッジの直径より短い。別の実施形態において、バイオプリンターは、温度を調節するための手段をさらに含む。また別の実施形態において、バイオプリンターは、周囲温度、カートリッジの温度、カートリッジのコンテンツの温度、受け面の温度、またはそれらの組み合わせを調節するための手段をさらに含む。また別の実施形態において、温度を調節するための手段は、発熱体である。また別の実施形態において、温度を調節するための手段は、ヒーターである。また別の実施形態において、温度を調節するための手段は、放射加熱器、対流加熱器、伝導性のヒーター、ファンヒーター、熱交換器、またはそれらの組み合わせである。また別の実施形態において、温度を調節するための手段は、冷却要素である。また別の実施形態において、温度を調節するための手段は、冷媒（ｃｏｏｌａｎｔ）の容器、冷却した液体、氷、放射冷却器、対流冷却器、伝導性の冷却器、ファンクーラー、���たはそれらの組み合わせである。また別の実施形態において、温度は、約４０℃から約９０℃の間に調節される。また別の実施形態において、温度は、約０℃から約１０℃の間に調節される。別の実施形態において、本明細書に記載されるバイオプリンターは、次の１つ以上に湿潤剤を適用するための手段をさらに含む：プリンターステージ； 受け面、沈着のオリフィス（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｒｉｆｉｃｅ）、バイオインク、支持物質、または印刷された構成物。
【０００６】
また本明細書には、沈着のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正する方法が開示され、ここで、該カートリッジはバイオプリンターに取り付けられ、該方法は、少なくとも１つの軸に沿ったカートリッジの位置を較正する工程を含み、ここで、該軸は、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸から選択され、および各較正は、レーザーの使用によって行われる。１つの実施形態において、方法は、レーザーを活性化し、少なくとも１つの実質的に安定した及び／又は実質的に固定されたレーザービームを生じさせる工程を含み、ここで、前記レーザービームは、地面に対して水平である。別の実施形態において、方法は、レーザーを活性化し、少なくとも１つの実質的に安定した及び／又は実質的に固定されたレーザービームを生じさせる工程を含み、ここで、前記レーザービームは、地面に対して垂直である。また別の実施形態において、各較正は、第１および第２のレーザーの使用によって行われる。また別の実施形態において、第１レーザーは、地面に対して垂直であり、第２のレーザーは地面に対して水平である。別の実施形態において、水平方向のレーザーの使用によるｙ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、カートリッジが（ｉ）第１のｙ八分円に位置付けられ、（ｉｉ）分注のオリフィス（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｏｒｉｆｉｃｅ）がレーザービームの上限以下となるように、カートリッジを位置付ける工程、（ａ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第１のｙ位置であり、該較正はさらに、（ｂ）カートリッジが第２のｙ八分円に位置付けられ、分注のオリフィスがレーザービームの上限以下となるように、カートリッジを再び位置付ける工程、（ｃ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第２のｙ位置であり、および該較正はさらにまた、（ｄ）第１のｙ位置と第２のｙ位置との間の中間点を計算する工程を含む。別の実施形態において、水平方向のレーザーの使用によるｘ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、（ａ）（ｉ）第１のｙ位置と第２のｙ位置との間の中間点に、および（ｉｉ）レーザーのセンサー境界（ｓｅｎｓｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）外にカートリッジを位置付ける工程、（ｂ）センサー境界の方へカートリッジを動かし、その動きを、カートリッジがセンサー境界に達するとすぐに止める工程を含み、（ｃ）ここで、カートリッジがカートリッジ幅の半分増加したセンサーに接する位置は、ｘ位置である。別の実施形態において、水平方向のレーザーの使用によるｚ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、（ａ）分注のオリフィスがレーザービーム上に位置するように、カートリッジを位置付けする工程、（ｂ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、ｚ位置である。別の実施形態において、垂直方向のレーザーの使用によるｙ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、（ａ）カートリッジが、（ｉ）第１のｙ八分円に位置付けられ、（ｉｉ）分注のオリフィスがレーザービームのセンサー境界外にあるように、カートリッジを位置付けする工程、（ｂ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第１のｙ位置であり、該較正はさらに、（ｃ）カートリッジが第２のｙ八分円に位置付けられ、分注のオリフィスがレーザービームのセンサー境界外にあるように、カートリッジを再び位置付けする工程、（ｄ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第２のｙ位置であり、該較正はさらにまた、（ｅ）第１のｙ位置と第２のｙ位置との間の中間点を計算する工程、および（ｆ）随意に、（ａ）−（ｅ）を繰り返し、計算された中間点を平均化する工程を含む。別の実施形態において、垂直方向のレーザーの使用によるｘ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、（ａ）カートリッジが、（ｉ）第１のｘ八分円に位置付けられ、（ｉｉ）分注のオリフィスがレーザービームのセンサー境界外にあるように、カートリッジを位置付けする工程、（ｂ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第１のｘ位置であり、該較正はまた、（ｃ）カートリッジが第２のｘ八分円に位置付けられ、分注のオリフィスがレーザービームのセンサー境界外にあるように、カートリッジを再び位置付けする工程、（ｄ）レーザービームの方へカートリッジを動かし、その動きを、レーザービームがカートリッジによって遮断されるとすぐに止める工程を含み、ここで、レーザービームがカートリッジによって遮断される位置は、第２のｘ位置であり、該較正はさらにまた、（ｅ）第１のｘ位置と第２のｘ位置との間の中間点を計算する工程、および（ｆ）随意に、（ａ）−（ｅ）を繰り返し、計算された中間点を平均化する工程を含む。別の実施形態において、垂直方向のレーザーの使用によるｚ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、（ａ）分注のオリフィスがレーザービーム上およびレーザーセンサーの範囲境界の外に位置付けられるようにプリンターヘッドを位置付けする工程、（ｂ）センサー境界が達成されるｚ軸に沿ってプリンターヘッドを動かす工程を含み、ここで、ｚ位置は、レーザーセンサー境界が達成される位置であり、および該較正はさらに、随意に、（ａ）および（ｂ）を繰り返し、平均のｚ位置を計算する工程を含む。別の実施形態において、ｚ軸に沿ったカートリッジの位置の較正は、分注のオリフィスの位置を視覚的に決定する工程を含む。
【０００７】
本明細書にはさらに、分注のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正するためのシステムが記載され、ここで、該カートリッジは、バイオプリンターに取り付けられ、前記システムは、少なくとも１つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正するための手段を含み、ここで、該軸は、ｙ軸、ｘ軸、およびｚ軸から選択される。１つの実施形態において、カートリッジを較正するための手段は、レーザーアライメント、光学的アライメント、機械的アライメント、圧電のアライメント、磁気のアライメント、電場または、静電容量のアライメント、超音波のアライメント、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、カートリッジを較正するための手段は、レーザーアライメントである。また別の実施形態において、レーザーアライメントの手段は、水平方向のレーザーおよび垂直方向のレーザーから選択される、少なくとも１つのレーザーを含む。また別の実施形態において、レーザーアライメントの手段は、水平方向のレーザーおよび垂直方向のレーザーを含む。また別の実施形態において、レーザーアライメントの手段は、垂直軸上では±４０μｍまで及び水平軸上では±２０μｍまで正確である。
【０００８】
さらに本明細書には、組織構成物を作成するための方法が記載され、該方法は、コンピューターモジュールが、所望の組織構成物の視覚表示の入力を受信する工程、コンピューターモジュールが、一連のコマンドを生成する工程を含み、ここで、該コマンドは、視覚表示に基づき、バイオプリンターによって読取り可能であり、該方法はさらに、コンピューターモジュールが、バイオプリンターに一連のコマンドを提供する工程、およびバイオプリンターが、定義された幾何学的配置を有する構成物を形成するために、コマンドに従ってバイオインクおよび支持物質を沈着させる工程を含む。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを含む。さらなる実施形態において、コンピューターモジュールは、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）を含む。またさらなる実施形態において、ユーザーは、コンピューターモジュールによって提供されるＧＵＩを使用して所望の組織構成物の視覚表示を形成するために、１つ以上の対象のコンテンツを定義する。１つの実施形態において、ディスプレイスクリーンは、略同じ形状および略等しい大きさの複数の対象を含むグリッドから本質的に成る。また別の実施形態において、各対象は、円の形状である。また別の実施形態において、ユーザーは、所望の組織構成物の視覚表示を形成するために、１つ以上の対象のコンテンツを定義する。また別の実施形態において、ユーザーに定義された対象のコンテンツは、バイオインクまたは支持物質から選択される。さらなる実施形態において、ディスプレイスクリーンは、ユーザーによって電子的に又は手動で入力される、三次元のレンダリングから成り、それによって、三次元のレンダリングの様々な構成要素は、バイオプリンターにバイオ印刷プロトコルを実行する前に、任意の適切な平面またはベクトルに調節され得る。
【０００９】
さらに本明細書には、カートリッジをバイオプリンターに取り付ける方法が記載され、該方法は、（ａ）カートリッジをコレット・チャックに挿入する工程を含み、ここで、該コレット・チャックは、バイオプリンターのプリンターヘッドに取り付けられ、および該方法はさらに、（ｂ）コレット・チャックの外側のカラーを調節する工程を含み、ここで、該挿入および調節において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。
【００１０】
さらに本明細書には、少なくとも１つのオリフィスを含む、本明細書に記載されるバイオプリンターともに使用するためのカートリッジが記載され、ここで、該オリフィスのエッジは滑らか又は略滑らかである。１つの実施形態において、カートリッジは、キャピラリーチューブ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ）またはマイクロピペットである。別の実施形態において、カートリッジは、バイオインクを含む。また別の実施形態において、カートリッジは、支持物質を含む。また別の実施形態において、オリフィスは、円形または正方形である。また別の実施形態において、カートリッジは、約１μｍから約１０００μｍまでの内径を有している。また別の実施形態において、カートリッジは、約５００μｍの内径を有している。また別の実施形態において、カートリッジは、約１μｌから約５０μｌまでの体積を有している。また別の実施形態において、カートリッジは、約５μｌの体積を有している。また別の実施形態において、カートリッジは、バイオインクの組成物を示すように印が付けられている。また別の実施形態において、カートリッジは、支持物質の組成物を示すように印が付けられている。幾つかの実施形態において、バイオインク及び／又は支持物質がプライミングされる（ｐｒｉｍｅｄ）。さらなる実施形態において、バイオインクは、バイオプリンタープロトコルを開始する前に分注のオリフィスの高さにまでバイオインクを押し出すことによってプライミングされる。さらなる実施形態において、支持物質は、バイオプリンタープロトコルを開始する前に分注のオリフィスの高さにまで支持物質を押し出すことによってプライミングされる。
【００１１】
さらに本明細書には、カートリッジをバイオプリンターに取り付けるためのシステムが記載され、該システムは、カートリッジを受け、バイオプリンターのプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段を含み、ここで、カートリッジを受け固定するための手段の使用において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。幾つかの実施形態において、カートリッジを受け、プリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、次のものから選択される：磁気引力、コレット・チャックのグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせ。１つの実施形態において、カートリッジを受け、プリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、コレットである。
【００１２】
さらに本明細書には、バイオプリンターから分注された１つ以上の構造を受けるための受け面が記載される。１つの実施形態において、受け面は、平らまたは略平らである。別の実施形態において、受け面は、滑らか又は略滑らかである。また別の実施形態において、受け面は、（ａ）平らまたは略平らであり、（ｂ）滑らか又は略滑らかであり、または（ｃ）画定される（ｄｅｆｉｎｅｄ）又は略画定される。別の実施形態において、受け面の形（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）は、１つ以上の沈着された構造の大きさ、形状、または構成、または幾何学的構造に適応するか影響を及ぼすように設計されている。また別の実施形態において、受け面は、固形物、半固形物、またはそれらの組み合わせを含む。また別の実施形態において、受け面は、ガラス、プラスチック、金属、金属合金、またはそれらの組み合わせを含む。また別の実施形態において、受け面は、ゲルを含む。また別の実施形態において、受け面は、１つ以上の構造の接着に抵抗する。また別の実施形態において、受け面は、重合したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、水平方向のレーザーを使用する、カートリッジの較正の限定しない例を示す。
【図２】図２は、垂直方向のレーザーを使用する、カートリッジの較正の限定しない例を示す。
【図３】図３は、キャピラリーのプライミングプロセス（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）の限定しない例を示す。
【図４】図４は、バイオ印刷された組織構成物の二次元の表示の限定しない例を示す。
【図５】図５は、５１０μｍの注射針を有するシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用する、ＰＦ−１２７の連続的な沈着によって生じた三次元の構成物の限定しない例を示し、この事例では、錐体形の構成物を示す。
【図６】図６は、５１０μｍの注射針を有するシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用する、ＰＦ−１２７の連続的な沈着によって生じた三次元の構成物の限定しない例を示し、この事例では、立方体形（左）および中空の立方体形（右）の構成物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、再生医療、組織／臓器の工学、生物学および医療の研究、および創薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、組織および臓器を作成するためのデバイス、そのようなデバイスを較正し使用するためのシステムおよび方法、および本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法によって作成された組織および臓器に関する。
【００１５】
本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含み、ここで、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受け保持するための手段を含み、ここで、前記カートリッジは、バイオインクおよび支持物質の１つ以上から選択されるコンテンツを含み、該バイオプリンターはさらに、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段、および少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段を含む。
【００１６】
また本明細書には、特定の実施形態において、沈着のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正する方法が記載され、ここで、該カートリッジはバイオプリンターに取り付けられ、該方法は、少なくとも１つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正する工程を含み、ここで、該軸は、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸から選択され、および各較正は、レーザーの使用によって行われる。
【００１７】
また本明細書には、特定の実施形態において、沈着のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正するためのシステムが開示され、ここで、該カートリッジはバイオプリンターに取り付けられ、前記システムは、少なくとも１つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正するための手段を含み、ここで、該軸は、ｙ軸、ｘ軸、およびｚ軸から選択される。
【００１８】
また本明細書には、特定の実施形態において、組織構成物を作成するための方法が開示され、該方法は、コンピューターモジュールが、所望の組織構成物の視覚表示の入力を受信する工程、コンピューターモジュールが、一連のコマンドを生じさせる工程を含み、ここで、該コマンドは、視覚表示に基づき、バイオプリンターによって読取り可能であり、該方法はさらに、コンピューターモジュールが、一連のコマンドをバイオプリンターに提供する工程、およびバイオプリンターが、定義された幾何学的構造を有する構成物を形成するためのコマンドに従って、バイオインクおよび支持物質を沈着させる工程を含む。
【００１９】
また本明細書には、特定の実施形態において、カートリッジをバイオプリンターに取り付ける方法が開示され、該方法は、（ａ）カートリッジをコレット・チャックに挿入する工程を含み、ここで、該コレット・チャックは、バイオプリンターのプリンターヘッドに取り付けられ、および該方法はさらに、（ｂ）コレット・チャックの外側のカラーを調節する工程を含み、ここで、該挿入および調節において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。
【００２０】
また本明細書には、特定の実施形態において、カートリッジをバイオプリンターに取り付けるためのシステムが開示され、該システムは、カートリッジを受け、バイオプリンターのプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段を含み、ここで、カートリッジを受け固定するための手段の使用において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。
【００２１】
＜特定の定義＞
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で言及される、すべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それら全体が引用によって組み込まれる。
【００２２】
本明細書及び添付の請求項に使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりと特に指示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸、及び／又は本開示などを読むことで当業者に明らかになるであろう本明細書に記載されるタイプの組成物などを含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「同種移植片」は、レシピエントと同じ種の遺伝的に同一でないメンバーに由来する臓器または組織を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるように「バイオインク」は、液体、半固形、または複数の細胞を含む固形組成物を意味する。幾つかの実施形態において、バイオインクは、細胞溶液、細胞集合体、細胞を含むゲル剤、多細胞体、または組織を含む。幾つかの実施形態において、バイオインクは、支持物質をさらに含む。幾つかの実施形態において、バイオインクは、バイオ印刷を可能にする特異的な生体力学的特性を提供する、細胞構造がない物質をさらに含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「バイオ印刷」は、自動化した、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピングデバイス（例えば、バイオプリンター）と適合性のある方法を介して、細胞の三次元の正確な沈着（例えば、細胞溶液、細胞を含むゲル剤、細胞懸濁液、細胞濃度、多細胞集合体、多細胞体など）を利用することを意味する。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「カートリッジ」は、バイオインクまたは支持物質を受ける（且つ保持する）ことができる任意の対象を意味する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「コンピューターモジュール」は、より大きなコンピューターシステムと相互に作用する（コードのセクションを含む）ソフトウェアコンポーネントを意味する。幾つかの実施形態において、ソフトウェアモジュール（またはプログラムモジュール）は、ファイルの形態で生じ、典型的に、より大きなソフトウェアシステム内の具体的なタスクを処理する。幾つかの実施形態において、モジュールは、１つ以上のソフトウェアシステムに含まれ得る。他の実施形態において、モジュールは、１つ以上の他のモジュールとともに１つ以上のソフトウェアシステムへとシームレスに統合され得る。コンピューターモジュールは、随意に、コードの独立型のセクション、または随意に、別々に識別可能ではないコードである。コンピューターモジュールの重要な特徴は、エンドユーザーが、識別された機能を行うためのコンピューターを使用することを可能にするということである。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「移植可能な」は、生体適合性があり、一時的に又は実質的に永続的にかのいずれかで、有機体に挿入または移植可能であるか、あるいは有機体上に付着可能であることを意味する。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「臓器」は、共通機能に働くように構造ユニットへ連結された組織の集りを意味する。臓器の例は、限定されないが、皮膚、汗腺、脂線、乳腺、骨、脳、視床下部、脳下垂体、松果体、心臓、血管、喉頭、気管、気管支、肺、リンパ管、唾液腺、粘液腺、食道、胃、胆嚢、肝臓、膵臓、小腸、大腸、結腸、尿道、腎臓、副腎、管渠、尿管、膀胱、卵管、子宮、卵巣、精巣、前立腺、甲状腺、副甲状腺、マイボーム腺、耳下腺、扁桃、腺様、胸腺、およびひ臓を含む。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「患者」は、任意の個人を意味する。該用語は、「被験体」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。該用語はどれも、医療専門家（例えば、医師、看護婦、ナースプラクティショナー、医師助手、看護士、ホスピス職員、ソーシャルワーカー、治験担当者など）または科学研究者の監督（常時またはその他）を必要とするものとして解釈されるべきではない。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞を意味する。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、多能性細胞、分化多能性細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および始原細胞を含む。幹細胞は、胚性幹細胞、周産期の幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞であり得る。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網状結締組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、尿生殖器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、内胚葉由来組織、中胚葉由来組織、および外胚葉由来組織を含む。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「異種移植片」は、レシピエントとは異なる種に由来する臓器または組織を意味する。
【００３４】
＜臓器移植の現在の方法＞
現在、新たな（ｄｅ  ｎｏｖｏ）臓器合成のための信頼できる方法はない。臓器は、（例えば、腎臓と肝臓の提供のための）生体ドナー、（例えば、肺と心臓の提供のための）死亡したドナー、および少数例では、動物（例えば、ブタの心臓弁）に由来するだけである。したがって、臓器移植を必要とする患者は、ドナー臓器が入手可能になるのを待たなければならない。これは結果的に入手可能な臓器の不足につながる。さらに、有機体から採取された臓器に頼ることによって、移植拒絶反応の確率が増加する。
【００３５】
＜移植拒絶反応＞
特定の例において、臓器移植を受ける患者は、超急性拒否反応を経験する。本明細書で使用されるように、「超急性拒否反応」は、ドナー臓器に対するレシピエントが有する先在する抗体から結果として生じる、補体媒介性の免疫反応を意味する。超急性拒否反応は、数分内に生じ、血液凝集によって特徴付けられる。移植器官がすぐに取り除かれないと、患者は敗血症になり得る。レシピエントが最初に免疫抑制剤を投与されなければ、異種移植片は超急性拒否反応をもたらす。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、抗原を含まず、それ故、レシピエントの抗体によって認識することができない。
【００３６】
特定の例において、臓器移植を受ける患者は、急性拒絶反応を経験する。本明細書で使用されるように、「急性拒絶反応」は、移植後約１週間から移植後約１年までで始まる免疫反応を意味する。急性拒絶反応は、ドナー臓器上に異質のＨＬＡ分子があることから結果として生じる。特定の例において、ＡＰＣは、異質のＨＬＡを認識し、ヘルパーＴ細胞を活性化する。特定の例において、ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージを活性化する。特定の例において、細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージがあることで、結果的に、異質のＨＬＡを有する細胞の死亡をもたらし、それ故、移植器官の損傷（あるいは死亡）につながる。急性拒絶反応は、腎臓移植の約６０−７５％および肝臓移植の５０−６０％において生じる。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、ＨＬＡを含まず、それ故、結果的にヘルパーＴ細胞の活性化をもたらす。
【００３７】
特定の例において、臓器移植を受ける患者は、慢性拒否反応を経験する。本明細書で使用されるように、「慢性拒否反応」は、移植組織に対する、慢性の炎症反応および免疫反応から結果として生じる移植拒絶反応を意味する。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、抗原または異質のＨＬＡを含まず、それ故、炎症反応または免疫反応を誘発しない。
【００３８】
特定の例において、臓器移植を受ける患者は、慢性同種移植脈管障害（ＣＡＶ）を経験する。本明細書で使用されるように、「慢性同種移植脈管障害」は、移植器官の内部血管の線維化から結果として生じる移植器官の機能の喪失を意味する。特定の例において、ＣＡＶは、移植器官に対する長期的な免疫反応の結果である。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、抗原または異質のＨＬＡを含まず、それ故、免疫反応を結果的にもたらさない。
【００３９】
移植拒絶反応を回避するために、臓器レシピエントは、免疫抑制剤を投与される。免疫抑制剤は、限定されないが、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾンおよびヒドロコルチゾン）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）、抗増殖剤（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、免疫系の特定成分に対する抗体（例えば、バシリキシマブ、 ダクリズマブ（ｄａｃｌｕｚｉｍａｂ））、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、および抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）およびｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムスおよびエベロリムス）を含む。しかしながら、免疫抑制剤は、限定されないが、感染感受性（例えば、ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰＣＰ）、サイトメガロウイルス肺炎（ＣＭＶ）、単純性疱疹ウイルスおよび帯状疱疹ウイルスによる感染）、および悪性細胞の蔓延、高血圧、脂質異常症、高血糖症、消化性潰瘍、肝臓および腎臓の損傷、および他の薬との相互作用を含む、いくつかのマイナスの副作用を有する。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、結果的に免疫反応をもたらさず、それ故、免疫抑制剤の投与を必要としない。
【００４０】
＜感染＞
特定の例において、ドナー臓器は、感染因子によって感染され得る。感染した臓器の移植後、感染因子は、（一つには免疫抑制剤の使用が原因で）ドナーの全体にわたって広がりかねない。限定しない例として、レシピエントは、移植器官から、ＨＩＶ、西ナイルウイルス、狂犬病、Ｃ型肝炎、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、結核、シャガス病、およびクロイツフェルト−ヤコブ病に感染した。このような感染はまれではあるが、それにもかかわらず生じる場合があり、すなわち、死亡したドナーのための社会生活歴は必然的に最近親者に由来するため、多くの場合不正確であり、血清学的検査は、セロコンバージョンが起こらないと、偽陰性結果をもたらし得るか、または輸血後の血液希釈が原因で偽陰性をもたらし得る。さらに、採取された臓器が生存可能である時間が限定されているため、多くの一般的ではない感染因子はスクリーニングされていない。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、感染因子を含まない。
【００４１】
＜ドナーの合併症＞
生体ドナーは、臓器の提供の結果として合併症も経験し得る。これらの合併症は、院内感染、麻酔に対するアレルギー反応、および手術ミスを含む。さらに、臓器は、提供した臓器をいつか必要となるかもしれない。例えば、腎臓ドナーの残りの腎臓または肝臓ドナーの残りの葉は、損傷しかねない。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、ドナー臓器の必要性を除去し、故にドナーに対する負の副作用を回避する。
【００４２】
入手可能な臓器の不足およびドナー臓器移植後のすべての合併症を考慮すると、組織および臓器の新たな作成の方法が必要とされている。
【００４３】
＜組織工学＞
組織工学は、臓器または組織の増強、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用し、組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性であり、最終的に生物分解性である環境（例えば、スキャフォールド）に生細胞を播種し、その後、始原細胞の個体群がさらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養し、移植後に標的組織をもたらすことである。生物学的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドによって、発展中の組織は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の成熟後の所望の臓器の形態および機能の両方を取り入れ得る。しかしながら、天然の組織のようなアーキテクチャーを有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたる細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされ得る。さらなる困難は、スキャフォールドの生物分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける：
＊  各層が異なる細胞型を含む、多層構造などの複雑な幾何学的構造は、天然の組織のような結果を再生可能に達成するために、具体的なアーキテクチャー内で細胞型の明確で高分解能の配置を必要とし得る。
＊  尺度および幾何学的構造は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
＊  組織の生存能力は、拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれ得る。
【００４４】
本明細書には、特定の実施形態において、三次元の組織構成物を作成する、デバイス、システム、および方法が開示される。本明細書に開示される、デバイス、システム、および方法は、次の三相プロセスを利用する：（ｉ）前処理、あるいはバイオインクの調製、（ｉｉ）処理、すなわち、バイオプリンターによるバイオ用紙へのバイオインク粒子の実際の自動化した送達／印刷、および（ｉｉｉ）後加工、すなわち、バイオリアクターにおける印刷された構成物の成熟／インキュベーション。最終的な構造物形成は、バイオインク粒子の融合によって後加工中に起こる。本明細書に開示される、デバイス、システム、および方法は、以下の利点を有する：
＊  それらは、細胞を含む組織及び／又は臓器をもたらすことができる。
＊  それらは、発生生物学の原則を活用することによって、天然の組織形成プロセスの環境条件を模倣する。
＊  それらは、広範囲の複雑なトポロジー（例えば、多層構造、繰り返しの幾何学模様、セグメント、シート、チューブ、嚢など）を達成することができる。
＊  それらは、製造の自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
【００４５】
バイオ印刷は、組織の修復、組織の増強、組織の置換、および臓器の置換に有用な、細胞を含む移植可能な組織を作成する方法を向上させることができる。さらに、バイオ印刷は、インビトロのアッセイに有用な組織を含むマイクロスケールの組織アナログを作成する方法を向上させることができる。
【００４６】
＜バイオ印刷＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための、デバイス、システム、および方法が開示される。幾つかの実施形態において、デバイスは、バイオプリンターである。幾つかの実施形態において、方法は、バイオ印刷技術の使用を含む。さらなる実施形態において、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法の使用によって作成された組織および臓器は、バイオ印刷される。
【００４７】
幾つかの実施形態において、バイオ印刷された細胞の構成物、組織、および臓器は、三次元の送達装置（例えば、バイオプリンター）によって（例えば、ヒドロゲル及び／又はで多孔質膜で作られた）生体適合性のある表面上に、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃度、多細胞体（例えば、シリンダー、楕円体、リボンなど）、および支持物質を含む、細胞の三次元の、自動化した、コンピューター支援の沈着に基づいた、急速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、組織及び／又は臓器に言及するために使用されるときの、用語「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃縮物、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピューターコードに従うコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって、三次元構造を形成するために位置付けられる。さらなる実施形態において、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態において、三次元の組織構造は、初期の形態形成における自己集合現象に類似した細胞または多細胞体の印刷後の融合を介して形成される。
【００４８】
手動での配置を含む三次元構造をもたらすために、生体適合性のある表面上に、細胞、多細胞集合体、及び／又はそれらの層を配置する多くの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機械による位置決めが利点となっている。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、多細胞集合体及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の計画された又は所定の配向またはパターンを示す構成物をもたらすための、細胞または多細胞体の、急速で、正確で、再生可能な配置を含む。利点はまた、細胞障害を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むことである。
【００４９】
幾つかの実施形態において、バイオ印刷の方法は、連続的及び／又は実質的に連続的である。連続的なバイオ印刷方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ｔｉｐ）（例えば、シリンジ、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。さらに限定しない実施形態において、連続的なバイオ印刷方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンにおいてバイオインクを分注することである。様々な実施形態において、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円、正方形、矩形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的構造を含む、任意の適切な幾何学的構造を有する。さらなる実施形態において、バイオ印刷された機能ユニットの繰り返しのパターンは層を含み、複数の層は、隣接してバイオ印刷され（例えば、積み重ねられ）、操作された組織または臓器を形成する。様々な実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、隣接してバイオ印刷され（例えば、積み重ねられ）、操作された組織または臓器を形成する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、バイオ印刷された機能ユニットは、モザイク模様のパターンで繰り返す。「モザイク模様のパターン」は、平面をオーバーラップや隙間で満たさない図の平面である。連続的な及び／又はモザイク模様のバイオ印刷の利点は、バイオ印刷された組織の増加した作成を含むことができることである。増加した作成は、増加した尺度、増加した複雑性、または減少した時間または生産費用の達成を含むことができる。別の限定しない潜在的な利点は、三次元の構成物のバイオ印刷を完了するのに必要な較正事象の数を減らすことができるということである。連続的なバイオ印刷はまた、随意にシリンジの機構を使用して、バイオインクの大きな貯蔵器からのより大きな組織の印刷を促進し得る。
【００５１】
連続的なバイオ印刷での方法は、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに関連して、最適化及び／又は平衡化することを含み得る。一例では、沈着のためのバイオプリンターのヘッドスピードは３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に関しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に関しては、０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態において、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径と略等しい。限定されることなく、適切な及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に物質が分注針にぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態において、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおいてインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態において、バイオプリンターのバイオインク貯蔵器は、約．０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。ポンプ速度は、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適であり得る。好都合なポンプ速度は、貯蔵器と分注針の断面積の割合に依存し得、割合が大きいと、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態において、適切な及び／又は最適な印刷速度によって、物質の機械的結着性に影響を与えることなく、一様な線路の沈着が可能となる。
【００５２】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される、デバイスおよび方法の速度およびスケーラビリティは、操作された組織及び／又は臓器の作成のために、産業施設及び／又は商業施設を設計し、建築し、かつ経営するために利用される。さらなる実施形態において、操作された組織及び／又は臓器は、例えば、組織損傷、組織障害、及び／又は臓器不全の医学的処置のための、物質、ツール、およびキット、またはバイオアッセイ及び／又は点検としての薬物スクリーニングを行うための、物質、ツール、およびキットとして、作成、保存、分配、売買、広告、および販売される。
【００５３】
＜バイオプリンター＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、バイオ印刷プロセスを自動化する任意の器機である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含み、ここで、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受け保持するための手段を含み、前記カートリッジは、バイオインクおよび支持物質の１つ以上から選択されるコンテンツを含み、該バイオプリンターはさらに、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段、および少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段を含む。
【００５４】
様々な実施形態において、バイオプリンターは、二次元または三次元での所定の幾何学的構造（例えば、位置、パターンなど）において、バイオインク及び／又は支持物質を分注する。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、プリンターヘッドを、プリンターステージまたはバイオ印刷された物質を受けるように適合された受け面に対して動かすことによって、特定の幾何学的構造を達成する。他の実施形態において、バイオプリンターは、プリンターステージまたは受け面を、プリンターヘッドに対して動かすことによって、特定の幾何学的構造を達成する。特定の実施形態において、バイオプリンターは、滅菌環境において維持される。
【００５５】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含む。さらなる実施形態において、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。幾つかの実施形態において、プリンターヘッドは、１つを超えるカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、次のものから選択される：磁気引力、コレット・チャックのグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせ。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、コレット・チャックのグリップである。
【００５６】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、次のものから選択される：レーザーアライメント、光学的アライメント、機械的アライメント、圧電のアライメント、磁気のアライメント、電場または、静電容量のアライメント、超音波のアライメント、またはそれらの組み合わせ。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、レーザーアライメントである。
【００５７】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段は、ピストンの適用、圧力の適用、圧縮ガスの適用、水圧の適用、またはそれらの組み合わせの適用である。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段は、ピストンの適用である。幾つかの実施形態において、ピストンの直径は、カートリッジの直径より短い。
【００５８】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、受け面をさらに含む。さらなる実施形態において、受け面は、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持物質を分注する、無細胞毒性の面である。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、プリンターステージをさらに含む。さらなる実施形態において、受け面は、プリンターステージの面である。他の実施形態において、受け面は、プリンターステージとは離れた構成要素であるが、ステージに付けられるか又は保持される。幾つかの実施形態において、受け面は、平ら又は略平らである。幾つかの実施形態において、受け面は、滑らか又は略滑らかである。他の実施形態において、受け面は、略平ら且つ略滑らかである。またさらなる実施形態において、受け面は、バイオ印刷された構造の形状、大きさ、構成、または幾何学的構造に特に適応するように設計されている。またさらなる実施形態において、受け面は、バイオ印刷された構成物の大きさ、形状、構成、または幾何学的構造を制御するか又はそれらに影響を与える。
【００５９】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、温度を調節するための手段を含む。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、周囲温度を調節する及び／又は維持する。他の様々な実施形態において、温度を調節するための手段は、限定しない例として、プリントヘッド、カートリッジ、カートリッジのコンテンツ（例えば、バイオインク、支持物質など）、プリンターステージ、および受け面の温度を調節及び／又は維持する。
【００６０】
幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、発熱体である。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、ヒーターである。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、放射加熱器、対流加熱器、伝導性のヒーター、ファンヒーター、熱交換器、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、冷却要素である。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、冷媒の包装容器、冷却した液体、氷、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態において、温度を調節するための手段は、放射冷却器、対流冷却器、伝導性の冷却器、ファンクーラー、またはそれらの組み合わせである。
【００６１】
様々な実施形態において、温度を調節するための手段は、温度を、約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０℃まで調節することであり、それらにおいてインクリメントを含む。
幾つかの実施形態において、温度は、約４０℃から約９０℃の間に調節される。他の実施形態において、温度は、約０℃から約１０℃の間に調節される。
【００６２】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、次の１つ以上に湿潤剤を適用するための手段をさらに含む：プリンターステージ；受け面、沈着のオリフィス、バイオインク、支持物質、または印刷された構成物。幾つかの実施形態において、湿潤剤を適用するための手段は、液体を適用する任意の適切な方法（例えば、噴霧器、ピペット、インクジェットなど）である。幾つかの実施形態において、湿潤剤は、水、組織培養培地、緩衝食塩水、血清、またはそれらの組み合わせである。さらなる実施形態において、バイオインクまたは支持物質がバイオプリンターによって分注された後、湿潤剤は適用される。幾つかの実施形態において、湿潤剤は、バイオプリンターによって分注されているバイオインクまたは支持物質とともに、同時または略同時に適用される。幾つかの実施形態において、湿潤剤は、バイオインクまたは支持物質がバイオプリンターによって分注される前に適用される。
【００６３】
＜プリンターヘッド＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための方法が開示される。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含む。さらなる実施形態において、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。またさらなる実施形態において、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジをバイオプリンターに取り付ける。
【００６４】
少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための多くの手段は適切である。少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための適切な手段は、少なくとも１つのカートリッジをバイオプリンターに確実に、正確に、且つ安全に取り付ける手段を含む。様々な実施形態において、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、限定しない例として、磁気引力、コレット・チャックのグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせである。
【００６５】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、１つのカートリッジを受ける且つ保持する。様々な他の実施形態において、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のカートリッジを同時に受ける且つ保持する。さらなる実施形態において、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、受けた且つ保持した複数のカートリッジの中からバイオ印刷に利用されるカートリッジを選択するための手段をさらに含む。
【００６６】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、１つ以上のカートリッジの容積を超えたバイオインク及び／又は支持物質を含むための貯蔵器をさらに含む（または貯蔵器と液体連結している）。さらなる実施形態において、貯蔵器は、分注のオリフィスを介する分注のために、バイオインク及び／又は支持物質を１つ以上のカートリッジに提供する。貯蔵器を含むプリンターヘッドの構成は、連続的または略連続的なバイオ印刷の適用に特に有用である。本明細書に開示される貯蔵器には多くの容積が適している。様々な実施形態において、貯蔵器は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍｌまたはそれ以上の内容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。
【００６７】
幾つかの実施形態において、バイオ印刷は、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに関連して構成するためのコンピューターの使用を含む。さらなる実施形態において、コンピューターコードは、受け面を超えるプリンターヘッドの高さを構成するために、プリンターヘッドの位置を指定する。さらなる実施形態において、コンピューターコードは、バイオインク及び／又は支持物質のための分注特性を構成するために、プリンターヘッドの動作の方向および速度を指定する。
【００６８】
＜カートリッジ＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられたカートリッジは、バイオインクまたは支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。複合組織の構成物を作成するために、バイオプリンターは、正確な速度および均一の量で、バイオインクまたは支持物質を沈着させる。したがって、（ａ）滑らか又は略滑らかな分注のオリフィスおよび（ｂ）滑らか又は略滑らかな内面を有するカートリッジが必要とされている。
【００６９】
本明細書で使用されるように、「カートリッジ」は、バイオインクまたは支持物質を受ける（且つ保持する）ことができる任意の対象を意味する。
【００７０】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるカートリッジは、バイオインクを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるカートリッジは、支持物質を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるカートリッジは、バイオインクおよび支持物質の組み合わせを含む。
【００７１】
本明細書には、特定の実施形態において、少なくとも１つの分注のオリフィスを含む、本明細書に開示されるバイオプリンターとともに使用するためのカートリッジが開示される。幾つかの実施形態において、カートリッジは、１つの分注のオリフィスを含む。様々な他の実施形態において、カートリッジは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の分注のオリフィスを含む。さらなる実施形態において、分注のオリフィスのエッジは滑らか又は略滑らかである。
【００７２】
本明細書に開示される分注のオリフィスには多くの形状が適している。様々な実施形態において、分注のオリフィスに適切な形状は、限定しない例として、円形、卵形、三角形、正方形、矩形、多角形、および不規則な形状を含む。幾つかの実施形態において、分注のオリフィスは、円形である。他の実施形態において、分注のオリフィスは、正方形である。また他の実施形態において、分注のオリフィスは、卵形、長方形、または矩形であり、リボン状の形態で固形または半固形のバイオインク及び／又は支持物質を分注する。
【００７３】
幾つかの実施形態において、カートリッジの内面は、滑らか又は略滑らかである。幾つかの実施形態において、カートリッジは、較正を促進するための剛構造で構成される。幾つかの実施形態において、カートリッジの壁は、細胞の付着に抵抗する物質で構成される。幾つかの実施形態において、カートリッジは、生体適合性である物質で構成される。
【００７４】
多くのタイプのカートリッジは、本明細書に開示されるバイオプリンターとの使用およびバイオプリンターを使用する方法に適している。幾つかの実施形態において、カートリッジは、１つ以上の分注のオリフィスを通って半固形または固形のバイオインクまたは支持物質を押し出すことを含むバイオ印刷と適合性がある。幾つかの実施形態において、カートリッジは、１つ以上の分注のオリフィスを通って、液体または半固形の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃度を分注することを含むバイオ印刷と適合性がある。幾つかの実施形態において、カートリッジは、非連続的なバイオ印刷と適合性がある。幾つかの実施形態において、カートリッジは、連続的及び／又は略連続的なバイオ印刷と適合性がある。
【００７５】
幾つかの実施形態において、カートリッジは、キャピラリーチューブまたはマイクロピペットである。幾つかの実施形態において、カートリッジは、シリンジまたは注射針である。略丸い又は円筒状のカートリッジには多くの内径が適している。様々な実施形態において、適切な内径は、限定しない例として、１、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｍまたはそれ以上を含み、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態において、適切な内径は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｍまたはそれ以上を含み、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態において、カートリッジは、約１μｍから約１０００μｍまでの内径を有している。特定の実施形態において、カートリッジは、約５００μｍの内径を有している。別の特定の実施形態において、カートリッジは、約２５０μｍの内径を有している。本明細書に開示されるカートリッジには多くの内容積が適している。様々な実施形態において、適切な内容積は、限定しない例として、１、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｌまたはそれ以上を含み、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態において、適切な内容積は、限定しない例として、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｌまたはそれ以上を含み、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態において、カートリッジは、約１μｌから約５０μｌまでの容積を有している。特定の実施形態において、カートリッジは、約５μｌの容積を有している。
【００７６】
幾つかの実施形態において、カートリッジは、米国特許第７，０５１，６５４号に記載されるように、受け面上へのバイオインク及び／又は支持物質のインクジェット印刷と適合性がある。さらなる実施形態において、カートリッジは、本明細書に記載されるコンピューターコードの制御下で、電位開口型のノズルまたは注射針の形態で分注のオリフィスを含む。
【００７７】
幾つかの実施形態において、カートリッジはプライミングされる。幾つかの実施形態において、カートリッジをプライミングすることによって、分注、沈着、または押出のプロセスの正確性が増加する。本明細書で使用されるように、「プライミングされる（ｐｒｉｍｅｄ）」は、分注される物質（バイオインクまたは支持物質）が、分注のオリフィスに接する位置に位置付けられるまで、カートリッジのコンテンツを圧縮し、進めることによって、カートリッジのコンテンツが、分注、沈着、または押出の準備がなされることを意味する。幾つかの実施形態において、コンテンツが簡潔または略簡潔であるとき、およびコンテンツがカートリッジのオリフィスと物理的に接触しているときに、カートリッジはプライミングされる。
【００７８】
幾つかの実施形態において、カートリッジは、そのコンテンツの組成物を示すように印が付けられる。さらなる実施形態において、カートリッジは、その中に含まれるバイオインク及び／又は支持物質の組成物を示すように印が付けられる。幾つかの実施形態において、カートリッジの表面は、色付けされている。幾つかの実施形態において、カートリッジの外側表面は、染色される、塗られる、ペンで印が付けられる、ステッカーで印が付けられる、またはそれらの組み合わせである。
【００７９】
幾つかの実施形態において、カートリッジの外側表面は、カートリッジの表面の不透明度を増加させるために（例えば、カートリッジの表面から反射されるレーザービームの量を増加させるために）印が付けられる。幾つかの実施形態において、カートリッジの表面は、色付けされている。幾つかの実施形態において、カートリッジの外側表面は、刻み目が付けられている（ｓｃｏｒｅｄ）。本明細書で使用されように「刻み目が付けられた（ｓｃｏｒｅｄ）」は、表面の平滑性を減少させるためにカートリッジの表面に印を付けることを意味する。カートリッジの表面に刻み目を付けるために、任意の適切な方法が使用される（例えば、酸性の物質の適用、腐食性の物質の適用、研磨物質の適用など）。幾つかの実施形態において、カートリッジの外側表面は、塗られる、磨かれる（例えば、先端熱加工される）、エッチングされる（例えば、レーザーエッチングされる）、ペンで印が付けられる、ステッカーで印が付けられる、またはそれらの組み合わせである。
【００８０】
＜グリップ＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられたカートリッジは、バイオインク及び／又は支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。幾つかの実施形態において、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態において、カートリッジは、コンテンツの押出後にバイオプリンターから取り出される。幾つかの実施形態において、続いて、新しいカートリッジがバイオプリンターに取り付けられる。
【００８１】
複合体構造を作成するために、本明細書に開示されるバイオプリンターは、適切な反復可能な正確性を有するカートリッジからバイオインク及び／又は支持物質を分注する。
様々な実施形態において、適切な反復可能な正確性は、任意の軸上の、約±５、１０、２０、３０、４０、５０μｍの正確性を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、約±２０μｍの反復可能な正確性を有するカートリッジからバイオインク及び／又は支持物質を分注する。しかしながら、カートリッジの制御されない除去および挿入は、結果的に、組織構成物に関してプリンターヘッド（および故にカートリッジ）の位置の変更をもたらし、そのため、新しいカートリッジから沈着した第１バイオインク粒子の配置の精度は、以前のカートリッジから沈着した最近のバイオインク粒子と比べて変わり得る。したがって、カートリッジをプリンターヘッドに取り付け、固定する方法が必要とされ、ここで、前記取り付けおよび固定は、プリンターヘッドの位置の最小の変化をもたらすだけである。
【００８２】
本明細書には、特定の実施形態において、カートリッジをバイオプリンターに取り付ける方法が開示され、該方法は、（ａ）カートリッジをコレット・チャックに挿入する工程を含み、ここで、該コレット・チャックは、バイオプリンターのプリンターヘッドに取り付けられ、および該方法はさらに、（ｂ）コレット・チャックの外側のカラーを調節する工程を含み、ここで、該挿入および調節において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。
【００８３】
本明細書には、特定の実施形態において、カートリッジをバイオプリンターに取り付けるためのシステムが開示され、該システムは、カートリッジを受け、バイオプリンターのプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段を含み、ここで、カートリッジを受け固定するための手段の使用において、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。幾つかの実施形態において、カートリッジを受け、プリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、チャックまたはフェルールである。本明細書で使用されるように、「チャック」は、調節可能な顎から成る把持具を意味する。幾つかの実施形態において、カートリッジを受け、プリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、コレットである。本明細書で使用されるように、「コレット」は、保持される対象のまわりのカラーを形成し強力な締め付けを発揮する、チャックの亜型を意味する。本明細書で使用されるように、「フェルール」は、１つの対象を別の対象に固定するために使用されるバンド（例えば、金属バンド）を意味する。幾つかの実施形態において、カートリッジを受け、プリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、バレルアダプターである。本明細書で使用されるように、「バレルアダプター」は、１つの対象を別の対象に固定するために使用される糸を通したチューブを意味する。
【００８４】
＜受け面＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、バイオインク及び／又は支持物質の、複数の要素、セクション、及び／又は領域を受け面上へと分注する。さらなる実施形態において、分注は、具体的なパターンおよび具体的な位置で生じる。またさらなる実施形態において、バイオプリンターが、バイオインク及び／又は支持物質を受け面上へと沈着する位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。
【００８５】
幾つかの実施形態において、バイオインク及び／又は支持物質の、要素、セクション、及び／又は領域の各々は、３００ｍｍ ｘ ３００ｍｍ ｘ １６０ｍｍ未満の寸法を有している。ほんの一例として、バイオインクまたは支持物質のセクションの寸法は、７５ｍｍ ｘ ５．０ｍｍ ｘ ５．０ｍｍ、０．３ｍｍ ｘ ２．５ｍｍ ｘ ２．５ｍｍ、１ｍｍ ｘ １ｍｍ ｘ ５０ｍｍ、または１５０ｍｍ ｘ １５０ｍｍ ｘ ８０ｍｍであり得る。一般に小規模な各セクション、および幾つかの場合において、必要とされる高い精度が原因で、受け面の微細な欠陥が、結果的に、細胞の構成物、組織、または臓器の欠陥（および潜在的に失敗）をもたらし得る。したがって、バイオインク及び／又は支持物質のセクションを受けることができる、略滑らか且つ略平らな受け面、または画定または略画定された受け面が必要とされている。
【００８６】
本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターによって作成された１つ以上の構造を受けるための受け面が開示される。幾つかの実施形態において、受け面は、平ら又は略平らである。幾つかの実施形態において、受け面は、滑らか又は略滑らかである。幾つかの実施形態において、受け面は、平ら又は略平らである。幾つかの実施形態において、受け面は、画定または略画定される。他の実施形態において、受け面は、具体的なバイオ印刷された構造の、形状、大きさ、構成、または幾何学的構造に特に適応するように設計されている。さらなる実施形態において、受け面は、バイオ印刷された構成物の大きさ、形状、構成、または幾何学的構造を制御するか又はそれらに影響を与える。
【００８７】
幾つかの実施形態において、受け面は、固形物、半固形物、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、受け面は、ガラス、被覆ガラス、プラスチック、被覆プラスチック、金属、金属合金、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、受け面は、ゲルを含む。幾つかの実施形態において、受け面およびその上の任意の被覆は、生体適合性がある。様々な実施形態において、受け面は、本明細書に開示される支持物質及び／又は制限物質のいずれかを含む。具体的な実施形態において、受け面は、重合したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）または重合したアガロース、重合したゼラチン、細胞外マトリックス（またはその構成要素）、コラーゲン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００８８】
＜ソフトウェア＞
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための、バイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられた１つ以上のカートリッジは、バイオインク及び／又は支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。
【００８９】
複合組織の構成物を作成するために、バイオプリンターは、受け面上の正確な位置で（二次元または三次元で）バイオインクまたは支持物質を沈着する。幾つかの実施形態において、バイオプリンターが、バイオインク及び／又は支持物質を沈着させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。さらなる実施形態において、コンピューターコードは、指定されたタスクを行うために書かれた、デジタル加工デバイスの中央処理装置（ＣＰＵ）において実行可能な、一連の命令を含む。幾つかの実施形態において、限定しない例として、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、及び／又は可変的な分注のオリフィスの制御を含む、付加的なバイオ印刷パラメーターは、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。他の実施形態において、このようなバイオ印刷パラメーターは、ユーザー入力によって直接的に定義されないが、本明細書に記載されるコンピューターコードによって他のパラメーターおよび条件から派生する。
【００９０】
本明細書には、特定の実施形態において、組織構成物、組織、および臓器を作成するための方法が開示され、該方法は、コンピューターモジュールが、所望の組織構成物の視覚表示の入力を受信する工程、コンピューターモジュールが、一連のコマンドを生じさせる工程を含み、ここで、該コマンドは、視覚表示に基づき、バイオプリンターによって読取り可能であり、該方法はさらに、コンピューターモジュールが、一連のコマンドをバイオプリンターに提供する工程、およびバイオプリンターが、定義された形状を有する構成物を形成するためのコマンドに従って、バイオインク及び／又は支持物質を沈着させる工程を含む。
【００９１】
＜コンピューター読取り可能な媒体＞
幾つかの実施形態において、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持物質を沈着させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される、デバイス、システム、および方法は、コンピューター読取り可能な媒体またはコンピューター読取り可能なプログラムコードによってコード化された媒体をさらに含む。さらなる実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、バイオプリンター（あるいはその構成要素）またはバイオプリンター（あるいはその構成要素）に接続されたコンピューターなどのデジタル加工デバイスの有形要素である。またさらなる実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、デジタル加工デバイスから随意に除去可能である。幾つかの実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、限定しない例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスク駆動装置、クラウドコンピューティングのシステムおよびサービスなどを含む。
【００９２】
＜コンピューターモジュール＞
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法は、ソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュールを含む。幾つかの実施形態において、「コンピューターモジュール」は、より大きなコンピューターシステムと相互に作用する（コードのセクションを含む）ソフトウェアコンポーネントである。さらなる実施形態において、ソフトウェアモジュール（またはプログラムモジュール）は、１つ以上のファイルの形態で生じ、典型的に、より大きなソフトウェアシステム内の具体的なタスクを処理する。
【００９３】
幾つかの実施形態において、モジュールは、１つ以上のソフトウェアシステムに含まれる。他の実施形態において、モジュールは、１つ以上の他のモジュールとともに１つ以上のソフトウェアシステムへと統合される。コンピューターモジュールは、随意に、コードの独立型のセクション、または随意に、別々に識別可能ではないコードである。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、単一のアプリケーション内にある。他の実施形態において、コンピューターモジュールは、複数のアプリケーション内にある。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、１つの機械上でホストされる（ｈｏｓｔｅｄ）。他の実施形態において、コンピューターモジュールは、複数の機械上でホストされる。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、１つの位置において複数の機械上でホストされる。他の実施形態において、コンピューターモジュールは、１つ以上の位置において複数の機械上でホストされる。さらに本明細書には、位置と位置決めのデータのフォーマットが記載される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるデータファイルは、限定しない例として、タブ区切り形式、コンマ区切り形式、文字区切り形式、デリミッター区切り形式、ＸＭＬ、ＪＳＯＮ、ＢＳＯＮ、およびＹＡＭＬを含む、任意の適切なデータの整列化形式でフォーマットされる。コンピューターモジュールの重要な特徴は、エンドユーザーが、識別された機能を行うためのコンピューターを使用することを可能にするということである。
【００９４】
＜グラフィックユーザーインタフェース＞
幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）を含む。本明細書で使用されるように、「グラフィックユーザーインタフェース」は、アプリケーションの入出力の画像表示に加え、テキスト表示、および情報が保存される階層的構造または他のデータ構造を使用するユーザー環境を意味する。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを含む。さらなる実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、二次元のＧＵＩを提示する。他の実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、バーチャルリアリティー環境などの三次元のＧＵＩを提示する。幾つかの実施形態において、ディスプレイスクリーンは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンであり、対話型のＧＵＩを提示する。
【００９５】
幾つかの実施形態では、ディスプレイスクリーンは、規則的に間隔を置かれた、略同じ形状と略等しい大きさの対象を含むグリッドから本質的に成るＧＵＩを提示する。提示された対象には任意の適切な形状がある。幾つかの実施形態では、対象に適切な形状は、これらの例に限定されないが、円形、卵形、正方形、矩形、三角形、ダイヤモンド形、多角形、あるいはその組み合わせを含む。
【００９６】
幾つかの実施形態では、ユーザーは、所望組織構成物の二次元又は三次元の視覚表示を形成するために、１以上の対象のコンテンツを定義する。例えば、図４を参照。幾つかの実施形態では、対象のユーザー定義のコンテンツは、これらの例に限定されないが、様々な組成物を有するバイオインク、又は様々な組成物を有する支持物質である。幾つかの実施形態では、ユーザーは、細胞の色又は対象の形状を変更することにより、対象のコンテンツを定義する。
【００９７】
＜バイオインク＞
ある実施形態において、本明細書に記載されているのは、組織と器官を作成するためのデバイス、システム及び方法である。幾つかの実施形態では、デバイスは、随意にバイオインクを含んでいる少なくとも１個のカートリッジを受け、保持するために、１つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、その方法は、バイオインクの使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法の使用により作成された組織と器官は、作成時に、又はその後にバイオインクを含む。
【００９８】
幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞から成る、液体、半固形又は固形の組成物を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体又は半固形細胞溶液、細胞懸濁液、又は細胞濃度を含む。さらなる実施形態では、細胞の溶液、懸濁液又は濃度は、液体又は半固形（例えば、粘性）の担体、及び複数の細胞を含む。またさらなる実施形態では、担体は、本明細書に記載されているもののように、適切な細胞栄養培地である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、半固形又は固形の多細胞の集合体、又は多細胞体を含む。さらなる実施形態では、１）複数の細胞又は細胞集合体と、生体適合性の液体又はゲルを所定の割合で混合し、バイオインクをもたらし、２）バイオインクを圧縮し、所望細胞密度及び粘度を有するバイオインクを製造することにより、バイオインクを製造する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮を、遠心分離、タンジェント流濾過（「ＴＦＦ」）、又はそれらの組み合わせによって達成する。幾つかの実施形態では、バイオインクを圧縮することにより、押し出し可能な組成物が結果として生じ、多細胞の集合体又は多細胞体の成形を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し可能」とは、ノズル又はオリフィス（例えば１つ以上のホール又はチューブ）を通して強制的に（例えば圧力下において）形成され得ることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、細胞を適切な密度になるまで育てることから生ずる。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞、及び製造される組織又は器官に応じて変化する。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞を凝集及び／又は接着する。幾つかの実施形態では、「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ）」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、及び「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、多細胞の集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する、細胞間密着性を指す。さらなる実施形態では、その用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、及び「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と互換的に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持物質、細胞培養培地、細胞外マトリクス（あるいはその成分）、細胞接着薬剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス薬、抗酸化剤、押し出しコンパウンド、及びそれらの組み合わせを含む。
【００９９】
＜細胞＞
様々な実施形態では、本明細書に開示されているのは、複数の細胞から成る液体、半固形又は固形組成物を含むバイオインクである。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体又は半固形細胞溶液、細胞懸濁液、又は細胞濃度を含む。幾つかの実施形態では、いかなる哺乳動物細胞も、バイオインク、及び本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法を使用する組織と器官の生成で使用するのに適している。様々な実施形態では、細胞は任意の適切な細胞である。さらに様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞又はそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された方法の中で使用される細胞のタイプは、生成される細胞構成物、組織又は器官のタイプに依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは１つのタイプの細胞を含む（「相同性のインク（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｋ）」とも呼ぶ）。幾つかの実施形態では、バイオインクは１つを超えるタイプの細胞を含む（「異種のインク（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｋ）」とも呼ぶ）。
【０１００】
さらなる実施形態では、細胞は、これらの例に限定されないが、収縮細胞又は筋細胞（例えば骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば骨細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞、及び造骨細胞、軟骨細胞又はリンパ組織に分化する細胞）、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳房細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、胃腸細胞、肝細胞、膵細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器の細胞、腎臓細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周皮細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば胚細胞、幹細胞及び始原細胞）、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、及びそれらの組み合わせである。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、細胞は成体の、分化細胞である。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、例えば分離時の平滑筋細胞、繊維芽細胞又は内皮細胞と一致する組織特異的な表現型を有する細胞であって、その中で、組織特異的な表現型（あるいは表現型を示す可能性）は、分離時から使用時まで維持される。他の実施形態では、細胞は成体の、未分化細胞である。さらなる実施形態では、「未分化細胞」は、例えば平滑筋細胞、繊維芽細胞、又は内皮細胞の決定的な組織特異的な特性を有していないか、失った細胞である。幾つかの実施形態では、未分化細胞は幹細胞を含む。さらなる実施形態では、「幹細胞」は効力と自己複製を示す細胞である。幹細胞は、これらに限定されないが、全能細胞、多能性細胞、分化多能細胞、少能性細胞、分化単能細胞及び始原細胞を含む。幹細胞は、胚幹細胞、成体幹細胞、羊水幹細胞及び人工多能性幹細胞であってもよい。さらに他の実施形態では、細胞は、成体の分化細胞及び成体の未分化細胞の混合物である。
【０１０２】
＜細胞培養培地＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは細胞培養培地を含む。細胞培養培地は任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、これらの例に限定されないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、Ａｌｓｅｖｅｒ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｓａｌｉｎｅ、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆ−１２  Ｈａｍ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１０  Ｈａｍ  （Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ、ＲＰＭＩ−１６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、Ａｍｅｓ’  Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ−１０６６  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｃｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｗｉｍ’ｓ  Ｓ−７７  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は変更されるか補充される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地はさらに、アルブミン、セレニウム、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン又はそれらの組み合わせを含む。
【０１０３】
＜細胞外マトリクス＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、１つ以上の細胞外マトリクスの成分又はその誘導体を含む。幾つかの実施形態では「細胞外マトリクス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外マトリクス空間に輸送されるタンパク質を含んでおり、そこでそれらは、組織を一緒に保持し、引張力を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進するための補助として役立っている。細胞外マトリクス成分の例は、これらに限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸塩、エラスチン及びプロテオグリカン類を含む。例えば、多細胞の集合体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含み得る。ＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞の集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の誘導体は、ヒト又は動物源から精製され得、又は当該技術分野に既知の組換え方法によって生成され得る。あるいは、ＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌され得るか、又は細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に既知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得、１以上のＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の誘導体、及び／又は１以上の細胞接着分子又は細胞マトリクス接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン及びアドヘリン）の発現レベルを変化させることができる。ＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞の集合体中で、細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、多細胞の集合体を形成するために使用される細胞ペーストに、適切に加えられ得る。その後、フィブリノゲンは、トロンビンの追加によってフィブリンに転換され得る。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば壊死、アポプトーシス又は自己貪食）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、そのバイオインクは、抗アポプトーシス薬をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、これらに限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチボディ又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は次のものから選択される：抗ＴＮＦ薬剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症性タンパク質の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（トランスフォーミング増殖因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤーヌスキナーゼ）の活性を阻害する薬剤、又はそれらの組み合わせ。幾つかの実施形態では、バイオインクは抗酸化剤を含む。
【０１０６】
＜押し出しコンパウンド＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、押し出しコンパウンド（すなわちバイオインクの押し出し特性を変更する化合物）を含む。押し出しコンパウンドの例は、これらに限定されないが、ゲル剤、ヒドロゲル剤、界面活性剤ポリオール（例えば、プルロニックＦ−１２７又はＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリクス成分（及びその誘導体）、コラーゲン、その他の生物学的適合性のある天然又合成ポリマー、ナノファイバー、及び自己組織化ナノファイバーを含む。
【０１０７】
ゲル（ときに、ゼリーとも呼ばれる）は、種々の方法で定義される。例えば、米国薬局方は、ゲルを、液体がしみこんだ小さな無機粒子又は大きな有機分子で構成されている、いずれかの懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲルは、単相系又は二相系を含む。単相ゲルは、分散した高分子と液体との間に明らかな境界が存在しない様式で、液体全体に均一に分布する有機高分子からなる。いくつかの単相ゲルは、合成高分子（例えば、カルボマー）又は天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態において、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコール及び油を用いても生成されるであろう。二相ゲルは、小さな別個の粒子のネットワークからなる。
【０１０８】
ゲルは、疎水性又は親水性に分類することもできる。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基材は、ポリエチレンを有する液体パラフィン又はコロイドシリカでゲル化した脂肪油、あるいは、アルミニウム又は亜鉛石鹸からなる。対照的に、疎水性ゲルの基材は、通常は、水、グリセロール、又は適切なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、及びマグネシウム−アルミニウムシリケート）でゲル化したプロピレングリコールからなる。特定の実施形態では、本明細書に開示する組成物又はデバイスのレオロジーは、擬塑性、可塑性、チキソトロピック、又はダイラタントである。
【０１０９】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン及びそれらの組み合わせから由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）及びその誘導体、ポリ（酸化エチレン）及びそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン及びそれらの組み合わせから由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、支持物質は次のものから選択される：ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、マトリゲル（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピル  ｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、絹、又はそれらの組み合わせ。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押し出しコンパウンドは、熱可逆性ゲル剤（また、熱応答性ゲル剤又はサーモゲルとして知られている）である。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性ヒドロゲルは、室温においては液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、及び約４０℃であって、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃から２５℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されているバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞タイプ、その他の添加剤などを含む）は、室温においては液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、及び約４０℃であって、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは約１０℃から約２５℃である。
【０１１１】
ポリオキシプロピレン及びポリオキシエチレンで構成されるポリマーは、水溶液に組み込まれると、熱可逆性ゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器内で維持することができる温度で、液態からゲル状態まで変化する能力を有している。液態からゲル状態の相転移は、溶液中のポリマー濃度及び成分に依存する。
【０１１２】
ポロクサマー４０７（プルロニックＦ１２７又はＰＦ‐１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから成る、非イオン性界面活性剤である。その他のポロクサマーは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマー水溶液は、酸、アルカリ、金属イオン存在下で安定である。ＰＦ−１２７は、平均分子量が１３，０００である、一般式Ｅ１０６Ｐ７０Ｅ１０６の市販されているポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーである。そのポリマーは、ポリマーのゲル化性を強化する適切な方法によってさらに精製され得る。それは、およそ７０％のエチレンオキシドを含み、これが親水性を有する。それは一連のポロクサマーＡＢＡ型ブロックコポリマーの一つである。ＰＦ−１２７は、良好な溶解能力を有し、毒性が低く、したがって、適切な押し出しコンパウンドであると考えられる。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、本明細書で提示されるヒドロゲル及びバイオインクの粘度は、本明細書で記載されている任意の手段で測定される。例えば、幾つかの実施形態において、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ  Ｃｏｎｅ  ＰｌａｔｅＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒ及びＣｏｎｅ  Ｓｐｉｎｄｌｅ  ＣＰＥ‐４０は、ヒドロゲル及びバイオインクの粘度を計算するために使用される。他の実施形態において、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドル及びカップ）粘度計は、ヒドロゲル及びバイオインクの粘度を計算するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書で参照する粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書で参照する粘度範囲は、体温（例えば、健康なヒトの平均体温）で測定される。
【０１１４】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００と１，０００，０００センチポイズの間、約７５０と１，０００，０００センチポイズの間；約１０００と１，０００，０００センチポイズの間；約１０００と４００，０００センチポイズの間；約２０００と１００，０００センチポイズの間；約３０００と５０，０００センチポイズの間；約４０００と２５，０００のセンチポイズの間；約５０００と２０，０００センチポイズの間；あるいは約６０００と１５，０００センチポイズの間の粘度を有していることにより、特徴づけられる。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオ印刷に適している細胞及び押し出しコンパウンドを含む。具体的な実施形態では、バイオインクには約１５００  ｍＰａ・ｓの粘度がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７及び細胞形質成分の混合物は、連続的なバイオ印刷に適していてもよい。そのようなバイオインクは、冷たい（４℃）リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に４８時間にわたり、３０％（ｗ／ｖ）まで連続して混合することによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の粉末を溶かし、調製されてもよい。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７も水に溶かされてもよい。細胞は標準的な無菌の細胞培養技術を使用し、培養され膨張してもよい。細胞は、例えば２００ｇでペレット状であって、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７で再懸濁され、その再懸濁液が約１０℃から約２５℃のゲル化温度で凝固することができるバイオプリンターに張り付けられたリザーバーへ吸引されてもよい。バイオ印刷よりも前のバイオインクのゲル化は随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７から成るバイオインクを含むバイオインクは、液体として分注することができる。
【０１１６】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘度及び／又は細胞毒性特性を有する任意の値になり得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の適切な濃度は、またバイオ印刷された時にその形状を保持する間、重量を支持することができ得る。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、あるいは約５０％である。ある実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度が、約３０％と約４０％の間、又は約３０％と約３５％の間である。
【０１１７】
図５は、５１０μｍの針を備えたシリンジと接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用する、ＰＦ−１２７の連続的な沈着によって生じた、三次元の、錐体形の構成物を示す。
【０１１８】
図６は、５１０μｍの針を備えたシリンジと接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用する、ＰＦ−１２７の連続的な沈着によって生じた、三次元の、立方体形（左）と中空の立方体形（右）の構成物を示す。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞構造（例えば押し出しコンパウンドなど）がない成分は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、例えば、ヒドロゲル、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、コラーゲン又は他の生物学的適合性のある天然又は合成ポリマーである。またさらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、又は酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分の割合は、使用時に細胞の成分と関連付けられたままである。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるために、前処理される。例えば、細胞は、バイオインクを形成する前に細胞間相互作用を強めるために、遠心分離の後に遠心管の内部でインキュベートされてもよい。
【０１２１】
＜支持物質＞
一定の実施形態では、本明細書に開示されているのは、組織と器官を作成するためのデバイス、システム及び方法である。幾つかの実施形態では、デバイスは、随意に支持物質を含んでいる少なくとも１個のカートリッジを受け、保持するために、１つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、その方法は、支持物質の使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法の使用により作成された組織と器官は、作成時に、又はその後に支持物質を含む。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、支持物質は、増殖する細胞又はそれに遊走する細胞、あるいはそれに接着する細胞を排除することができる。幾つかの実施形態では、支持物質は、栄養培地に透過性である。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、支持物質の粘度は変わりやすい。幾つかの実施形態では、支持物質の粘度は、支持物質の温度の変更により変化する。幾つかの実施形態では、支持物質の粘度は、支持物質の圧力の変更により変化する。幾つかの実施形態では、支持物質の粘度は、支持物質の濃度の変更により変化する。幾つかの実施形態では、支持物質の粘度は、交差結合（例えば、化学的な架橋剤の使用によって）、あるいは光架橋（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｉｎｋｉｎｇ）（例えば、紫外線暴露によって）により変化する。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、支持物質の透過性は変わりやすい。幾つかの実施形態では、支持物質の透過性は、支持物質の温度又は支持物質の周囲の温度を変えることにより変更される。幾つかの実施形態では、支持物質の透過性は、支持物質を、支持物質の透過性を変更する薬剤と接触させることにより変更される。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、支持物質のコンプライアンス（すなわち、弾性又は硬性）は変更される。幾つかの実施形態では、支持物質のコンプライアンスは、支持物質の温度又は支持物質の周囲の温度を変えることにより変更される。幾つかの実施形態では、支持物質のコンプライアンスは、支持物質を、支持物質のコンプライアンスを変更する薬剤と接触させることにより変更される。
【０１２６】
多くの支持物質は、本明細書に記載されている方法で使用するのに適している。幾つかの実施形態では、ヒドロゲルは、非粘着性、生物学的適合性、押し出し成形される、バイオ印刷可能な、細胞構造がなく、そして適切な強度であることを含む、１つ以上の有利な特性を持つ典型的な支持物質である。幾つかの実施形態では、適切なヒドロゲルは天然ポリマーである。ある実施形態では、制限物質はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成される。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、界面活性剤ポリオール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、フィブリン、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、誘導体又はそれらの組み合わせから由来するものを含む。その他の実施形態において、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン及びそれらの組み合わせから由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、マトリゲル（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピル  ｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、絹、又はそれらの組み合わせから選択される。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、支持物質は、バイオプリンター中に存在する前の細胞を含んでいる。幾つかの実施形態では、支持物質は、細胞の懸濁液を含んでいるヒドロゲルである。幾つかの実施形態では、支持物質は、１を超える細胞型の混合物を含んでいるヒドロゲルである。
【０１２８】
＜支持物質の典型的な使用＞
幾つかの実施形態では、支持物質は、生物学的な構成物（例えば細胞の構成物、組織、器官など）を構成するための成形ユニット（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）として使用される。さらなる実施形態では、支持物質ユニットは、所望構成物の細胞形質成分（すなわち中間の細胞ユニット）を欠くドメインを定義し維持するために使用される。幾つかの実施形態では、支持物質は任意の形状又は大きさを仮定することができる。
【０１２９】
例えば、ある実施形態によると、（元々、バッファーと水で混合された粉末剤相中の）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は、その粘度を減少するために加熱され、所望寸法を有する微量ピペットで（あるいは、ピストンの負の変位によって、所望形状のチェンバで）吸収されてもよい。ピペット（あるいはチェンバ）中のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は、例えば、ピペット（あるいはチェンバ）の外側に空気を押し入れるか、微量ピペットを、冷液を備えた包装容器へ詰めることによって、室温に冷却され得、その結果、それを、所望形状を有するゲル（すなわち支持物質）へ凝固させることができる。結果として生じる支持物質は、特定の細胞の構成物、組織又は器官の構造の間で、ピペット又はチェンバから分注されてもよい。例えば、図４を参照。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、支持物質は、バイオ印刷の後の操作された組織又は器官の生存度を増加させるために使用される。さらなる実施形態では、支持物質は、制限物質（例えば支持物質）の一時的な、又は半永久的な格子を通じて、組織又は器官と栄養培地との間の直接的な接触を提供する。幾つかの実施形態では、組織は多孔性の、又はギャップされた物質（ｇａｐｐｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）で抑制される。組織又は器官の細胞のうち、少なくともいくつかの、栄養に対する直接のアクセスは、組織又は器官の生存度を増加させる。
【０１３１】
さらなる実施形態では、本明細書に開示された方法は、操作された組織又は器官の生存度を増加させるために、次のものを含む、追加的で随意の工程から成る：１）凝集された多細胞の集合体を位置づける前に、制限物質（例えば支持物質）の基層を随意に分注すること；２）随意に周辺の制限物質を分注すること；３）定義された形状内の組織の細胞をバイオ印刷すること；そして、４）格子、メッシュ、又はグリッドのように、制限物質中の隙間をもたらすパターン内で発生期の組織を重ねる、制限物質の伸長体（例えばシリンダー、リボンなど）を分注すること。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、パターンを重ねる隙間は、組織又は器官の表面の周囲で、一様に、又は略一様に分散される。他の実施形態では、隙間は非一様に分散され、それにより組織又は器官の細胞は、非一様に栄養に晒される。一様でない実施形態では、栄養に対する差次的なアクセスは、組織又は器官の１つ以上の特性に影響を及ぼすために利用されてもよい。例えば、バイオ印刷された細胞の構成物、組織又は器官の１つの表面上の細胞を、別の表面上の細胞より速く増殖させることは、望ましいかもしれない。幾つかの実施形態では、栄養に対する組織又は器官の様々な部分の曝露は、組織又は器官の所望エンドポイントへの発達に影響を及ぼすために、様々な時に変化され得る。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、制限物質は、これらに限定されないが、バイオ印刷の直後（例えば１０分以内）、バイオプリントの後（例えば１０分後）、細胞が互いに実質的に凝集する前、細胞が互いに実質的に凝集した後、細胞が細胞外マトリクスを生成する前、細胞が細胞外マトリクスを生成した後、使用する直前などを含む、任意の適切な時に取り除かれる。様々な実施形態では、制限物質は任意の適切な方法によって取り除かれる。例えば、幾つかの実施形態では、制限物質は切除されるか、細胞から引き離すか、消化されるか、溶かされる。
【０１３４】
＜バイオプリンターカートリッジの位置を較正する方法とシステム＞
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、組織と器官を作成するためのバイオプリンターである。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられたカートリッジは、バイオインク及び／又は支持物質を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、具体的な組織構成物を形成するために、具体的なパターンで、具体的な位置に、バイオインク又は支持物質を堆積させる。幾つかの実施形態では、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、コンテンツの押し出し、分注又は沈着の後に、バイオプリンターから放出される。幾つかの実施形態では、新しいカートリッジはバイオプリンターに付けられている。
【０１３５】
複雑な構造を作成するために、本明細書に開示されたバイオプリンターは、バイオインク及び／又は支持物質を、適切で反復可能な精度を有するカートリッジから分注する。様々な実施形態では、適切で反復可能な精度は、任意の軸上で約±５、１０、２０、３０、４０又は５０μｍの精度を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されたバイオプリンターは、バイオインク及び／又は支持物質を、約±２０μｍの反復可能な精度を有するカートリッジから分注する。しかしながら、幾つかの実施形態では、カートリッジの除去及び挿入のために、組織構成物に対するプリンターヘッド（したがってカートリッジ）の位置が変化する。したがって、プリンターステージ、受け面、組織又は器官に対するプリンターヘッド、カートリッジ及び分注のオリフィスの位置を正確に較正する方法が必要である。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、少なくとも１つのレーザーの使用を含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、第１及び第２のレーザーの使用を含む。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、手動の（例えば視覚的な）較正を含む。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、手動の較正及びレーザー較正を含む。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は１つの軸に沿って較正され、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は２つの軸に沿って較正され、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は３つの軸に沿って較正され、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのレーザーの使用によって行われる。さらなる実施形態では、較正は、第１及び第２のレーザーの使用によって行われる。
【０１４１】
＜水平方向のレーザーを使用する較正方法＞
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された方法はさらに、レーザーを活性化し少なくとも１つの略安定した及び／又は略定常的なレーザービームを発生させることを含み、ここで前記レーザービームは地面に水平である。図１を参照。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、その方法は、少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸はＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は、少なくとも２つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は、少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；及び／又は、（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み；ここで、それぞれの軸は、デカルト座標系中の同じ名前の軸に相当する。幾つかの実施形態では、較正は少なくとも１つのレーザーの使用によって行われる。幾つかの実施形態では、較正は第１及び第２のレーザーの使用によって行われる。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）プリンターヘッドが（ｉ）第１のｙ八分円に位置し、（ｉｉ）分注のオリフィスがレーザービームの上限よりも下になるように、プリンターヘッドの位置を決めること； （ｂ）プリンターヘッドをレーザービームの方へ動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること（ここで、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断される位置が、第１のｙ位置である）；（ｃ）プリンターヘッドが第２のｙ八分円に位置し、分注のオリフィスがレーザービームの上限よりも下になるように、プリンターヘッドを再度位置づけること；
（ｄ）プリンターヘッドをレーザービームの方へ動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること（ここで、レーザービームが遮断される位置が、第２のｙ位置である）；（ｅ）そして、第１のｙ位置と第２のｙ位置の間の中間点を計算すること、を含む。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）プリンターヘッドを（ｉ）第１のｙ位置と第２のｙ位置の間の中間点であって、（ｉｉ）レーザーのセンサー境界の外側に位置付けること；（ｂ）プリンターヘッドをセンサー境界に向けて動かし、プリンターヘッドがセンサー境界に接触するとすぐにその動きを止めること；ここで、プリンターヘッドがプリンターヘッド幅の半分増加したセンサーに接する位置が、ｘ位置である。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの１つの側面の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付けること；（ｂ）レーザービームがプリンターヘッドの反対側の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置づけること；（ｃ）そして、各々の測定間のレーザー位置と測定した距離と関連するように、プリンターヘッドの中間位置を計算すること、を含む。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの１つの側面の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置づけること；（ｂ）レーザービームがプリンターヘッドの反対側の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置づけること；（ｃ）そして、各々の測定間のレーザー位置と測定した距離と関連するように、プリンターヘッドの中間位置を計算すること、を含む。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）分注のオリフィスがレーザービームよりも上に位置するように、プリンターヘッドを位置づけること；（ｂ）プリンターヘッドをレーザービームに向けて動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること（ここで、レーザービームが遮断される位置がｚ位置である）、を含む。
【０１４８】
＜垂直方向のレーザーを使用する較正方法＞
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載された方法はさらに、レーザーを活性化し少なくとも１つの略安定した及び／又は略定常的なレーザービームを発生させることを含み、ここで前記レーザービームは地面に垂直である。図２を参照。
【０１４９】
幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも２つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、その方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；そして、（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み；ここで、それぞれの軸は、デカルト座標系中の同じ名前の軸に相当する。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）プリンターヘッドが（ｉ）第１のｙ八分円に位置し、（ｉｉ）分注のオリフィスがレーザーのセンサー境界の外側になるように、プリンターヘッドの位置を決めること；（ｂ）プリンターヘッドをレーザービームの方へ動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること（ここで、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断される位置が、第１のｙ位置である）；（ｃ）プリンターヘッドが第２のｙ八分円に位置し、分注のオリフィスがレーザーのセンサー境界の外側にあるように、プリンターヘッドを再度位置づけること；（ｄ）プリンターヘッドをレーザービームの方へ動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること（ここで、レーザービームが遮断される位置が、第２のｙ位置である）；（ｅ）そして、第１のｙ位置と第２のｙ位置の間の中間点を計算すること、を含む。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）プリンターヘッドを（ｉ）第１のｙ位置と第２のｙ位置の間の中間点に、及び（ｉｉ）レーザーのセンサー境界の外側に位置付けること；（ｂ）プリンターヘッドをセンサー境界に向けて動かし、プリンターヘッドがセンサー境界に接触するとすぐにその動作を止めること；ここで、プリンターヘッドがプリンターヘッド幅の半分増加したセンサーに接する位置が、ｘ位置である。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）分注のオリフィスがレーザーセンサー範囲限界のちょうど外側になるように、レーザービームよりも上に位置するように、プリンターヘッドを位置づけること；（ｂ）プリンターヘッドをセンサー境界が到達するまで下げること（ここで、レーザーセンサー境界が到達した位置がｚ位置である）、を含む。幾つかの実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は、プリンターヘッドの複数の点で繰り返され、測定された高さがｚ位置を決定するために平均化された。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することは、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの底の１点以上の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付けること；（ｂ）レーザー位置及び既知の測定された距離に基づいて、プリンターヘッドの絶対的な又は平均の部位を計算すること、を含む。
【０１５５】
＜垂直・水平方向のレーザーを用いた較正方法＞
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法であって、ここでプリンターヘッドはバイオプリンターに付けられており、該方法は少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで、軸はＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも２つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸から選択される。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、その方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正すること；そして、（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み；ここで、軸はそれぞれ、デカルト座標系中の同じ名前の軸に相当する。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、較正は、第１のレーザー及び第２レーザーの使用を含む。幾つかの実施形態では、第１のレーザーは垂直方向のレーザーであって、第２のレーザーは水平方向のレーザーである。
【０１５８】
＜レーザーを使用する較正のためのシステム＞
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、沈着のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正するためのシステムであって、ここでカートリッジは、バイオプリンターに付けられ、前記システムは、少なくとも１つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正するための手段を含んでおり、ここで軸は、Ｙ軸、Ｘ軸及びＺ軸から選択される。
【０１５９】
また、特定の実施形態では、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正するためのシステムであって、ここでプリンターヘッドは、バイオプリンターに付けられており、前記システムは、Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段；Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段；またＺ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段を含んでいる。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正するためのシステムは、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段を含む。幾つかの実施形態では、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段は、レーザーアライメント、光学的アライメント、機械的アライメント、圧電のアライメント、磁気のアライメント、電場又は静電容量のアライメント、超音波のアライメント又はそれらの組み合わせである。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正するためのシステムは、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段を含む。幾つかの実施形態では、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段は、レーザーアライメントである。幾つかの実施形態において、レーザーアライメント手段は、少なくとも１つのレーザーを含む。幾つかの実施形態では、レーザーアライメント手段は、複数のレーザーを含む。
【０１６２】
幾つかの実施形態では、レーザーアライメントは、それが任意の適切な精度を有していることを意味する。様々な実施形態では、適切な精度は、任意の軸上で約±５、１０、２０、３０、４０又は５０μｍの精度を含む。幾つかの実施形態では、レーザーアライメント手段は、垂直軸上で±４０μｍ及び水平軸上で±２０μｍまで正確である。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、レーザーの経路は、レーザー源と測定点の間で遮断されない。幾つかの実施形態では、レーザーの経路は、反射面又は光学レンズの使用によって、最大１７９°までで変更される。幾つかの実施形態では、レーザーの経路は９０°までで変更される。幾つかの実施形態では、水平方向のレーザービームは、反射面を使用する偏光によって、垂直の経路において測定するために使用される。幾つかの実施形態では、垂直方向のレーザービームは、反射面を使用する偏光によって、水平の経路で測定するために使用される。
【０１６４】
＜実施例＞
以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、方法はどうであれ、開示されているものの残りを限定するものとして、解釈されるべきではない。さらなる精錬なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその十分な程度まで利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての公報は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。これらに対する引用によって、このような情報の利用可能性及び一般的な普及が証明される。
【０１６５】
実施例１：ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダー
＜細胞培養＞
平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を、３７℃及び５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（すべてＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから）を補った、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で維持し、増殖させた。継代４と８の間のＨＡＳＭＣのコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な培養物を、すべての研究において使用した。
【０１６６】
内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）で補った、Ｍｅｄｉｕｍ２００で維持し増殖した。細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２でフラスコで処理されたゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした組織培養上で増殖させた。継代４と８の間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。
【０１６７】
＜ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールド＞
２％ｗ／ｖのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製：１ｇの低融点ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、５０ｍｌのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶かした。簡潔に言うと、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解するまで、ＤＰＢＳ及びＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱した。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌した。温度が６６．５℃を超えて維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は、液相にとどまった。この温度未満では、相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘度が増加し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が固形ゲルを形成する。
【０１６８】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）モールドの調製：ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作成した。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用し、４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌した。殺菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）の上に置き、しっかりと取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、アセンブリを１時間室温で横に置き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の完全なゲル化が可能となった。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリントを取り除き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加えた。
【０１６９】
＜ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダー＞
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーの作成：混合細胞シリンダーを調製するために、ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下でのインキュベーションによって、培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣの適切な容積を混合し、５、７．５、１０、１２．５、及び１５％のＨＡＥＣ（総細胞集団の％として）を含む、混合した細胞懸濁液を得た。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、及び３７℃及び５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップ及びピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブへ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを得るために、上清培地を吸収し、細胞を吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ，ＩＤ  ０．５ｍｍ，Ｌ  ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）へ移動させた。キャピラリー内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃及び５％のＣＯ２で、ＨＡＳＭＣ培地でインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーを供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールド（ＨＡＳＭＣ培地で覆われた）の溝へと沈着させた。細胞シリンダーを、２４時間及び４８時間、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０１７０】
実施例２：多層の血管のチューブ
＜細胞培養＞
平滑筋細胞：主要なヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ）を、３７℃及び５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（すべて、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）で補った、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持し、増殖させた。継代４と８の間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。
【０１７１】
内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）によって補われた、Ｍｅｄｉｕｍ２００において維持し、増殖させた。細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２でフラスコで処理されたゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした組織培養上で増殖させた。継代４と８の間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。
【０１７２】
線維芽細胞：主要なヒト大動脈の線維芽細胞（ＨＤＦ）を、３７℃及び５％のＣＯ２で、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）によって補われたＭｅｄｉｕｍ１０６において維持し、増殖させた。継代４と８の間のＨＤＦのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。
【０１７３】
＜ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液及びモールド＞
２％及び４％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製：１ｇ又は２ｇ（それぞれ２％又は４％に関する）の低融点のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＭＰ）を、５０ｍｌのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶かした。簡潔に言うと、ＤＰＢＳ及びＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解するまで、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱した。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、１２５℃で２５分間、蒸気滅菌によって殺菌した。温度が６６．５℃を超えて維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は液相にとどまる。この温度未満で相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘度が増加し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が固形ゲルを形成する。
【０１７４】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの調製：ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に合うテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作成した。簡潔に言うと、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用し、４５分間モールドを紫外線にさらして、あらかじめ殺菌した。殺菌されたモールドを、１０ｃｍのペトリ皿の上に置き、しっかりと取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を縦に維持し、４５ｍｌのあらかじめ暖められた、無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、アセンブリを１時間室温で横に置き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を完全にゲル化することが可能となった。ゲル化の後、テフロン（登録商標）のプリントを取り除き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーをインキュベートするために、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加えるか、あるいは、１７．５ｍｌのＨＤＦ培地を、ＨＤＦ細胞シリンダーをインキュベートするために、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加える。
【０１７５】
＜細胞シリンダー＞
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーの作成：混合細胞シリンダーを調製するために、ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下で、インキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣの適切な容積を混合し、１５％のＨＡＥＣ及び残部８５％のＨＡＳＭＣ（総細胞集団の割合として）を含む混合した細胞懸濁液を得た。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培地中で再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、及び３７℃及び５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培地中で再懸濁し、数回ピペットアップ及びピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブへ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを得るために、上清培地を吸収し、細胞を吸収によって、キャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ，ＩＤ  ０．５ｍｍ，Ｌ  ７５ｍｍ）へ移動させた。キャピラリー内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃及び５％のＣＯ２で、ＨＡＳＭＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（ＨＡＳＭＣ培地によって覆われた）のモールドの溝へと沈着させた。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０１７６】
ＨＤＦ細胞シリンダーの作成：ＨＤＦシリンダーを、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーを調製するのと類似の方法を使用して調製した。簡潔に言うと、培地をコンフルエントなＨＤＦ培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（０．１％；１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下でインキュベーションによって、培養フラスコの表面から分離した。インキュベーション後に、ＨＤＦ培地をフラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘの容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、６ｍｌのＨＤＦ培地中で再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移動させ、その後、７５分間１５０ｒｐｍで、及び３７℃及び５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＤＦ培地中で再懸濁し、数回ピペットアップ及びピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブの内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブへ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを得るために、上清培地を吸収し、細胞を吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ，ＩＤ  ０．５ｍｍ，Ｌ  ７５ｍｍ）へ移動させた。キャピラリー内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃及び５％のＣＯ２で、ＨＤＦ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーチューブから、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールド（ＨＤＦ培地により覆われていた）の溝へ沈着させた。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０１７７】
＜多層の血管チューブの作成＞
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレートの調製：１０ｍｌのあらかじめ暖められた（＞４０℃）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（２％ｗ／ｖ）を、１０ｃｍのペトリ皿へ分注することにより、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレートを作成した。分注直後に、ディッシュの全体のベースを包含し、均一の層を形成するように、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を平らに広げた。ペトリ皿を、２０分間室温でインキュベートし、それによりＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を完全にゲル化させた。
【０１７８】
多層の血管のチューブ：ＨＤＦの外部層及びＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの内部層から成る血管のチューブを、ＨＤＦシリンダー、及びＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーを利用して作成した。図４に示されるように、幾何学的配置を利用した。簡潔にいうと、２４時間のインキュベーション時間の最後に、成熟したＨＤＦ及びＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダーを吸引し、キャピラリーチューブに戻し、さらなる使用まで適切な培地に置いた。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドから成る支持構造を、以下のように調製した：あらかじめ暖めた２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、キャピラリーチューブ（Ｌ＝５０ｍｍ）へ吸引し、冷たいＰＢＳ溶液（４℃）で急速に冷やした。５ｃｍの長さのゲル化したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを、キャピラリー（プランジャーを使用する）から沈着させ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベースプレートにまっすぐ置いた。第２のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを第１のそれに隣接させ、また、第１層を形成するために、１０のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーが沈着するまで、そのプロセスを繰り返した。ここで、２０μｌのＰＢＳをＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーよりも上に分注し、湿った状態を維持した。さらに、６のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを、図４（層２）に示すような位置で、層１の上に沈着させた。その後、３つのＨＤＦシリンダーを、位置４、５及び６に沈着させ、層２を完成させた。各々のＨＤＦシリンダーを分注した後に、４０μｌのＨＤＦ培地を沈着したシリンダーの上に分注し、細胞のシリンダーの脱水を予防すると同時に、続くシリンダーの沈着を補助した。層３のための次のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを沈着させ、その後、位置３及び６にＨＤＦシリンダーを沈着させた。ＨＤＦ培地を有する構造の再湿潤した後、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合シリンダーを、位置４及び５の中に置いた。続いて、４０μｌのＨＡＳＭＣ培地及び４０μｌのＨＤＦ培地を、細胞シリンダーの上に分注した。位置１及び７でＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを、位置２及び６でＨＤＦシリンダーを、位置３及び５でＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合シリンダーを、そして最後に、位置４で４％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを沈着させることにより、層４を完成させた。層５、６及び７を同様に、図４に示す位置に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーを、その後ＨＤＦシリンダーを、そして最後に、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダーを置くことにより完成させた。一旦全体の構成物が完成すると、０．５ｍｌの暖かいＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、構成物の各々の末端にわたって分注し、それにより、５分間室温でゲル化させた。そのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のゲル化の後に、３０ｍｌのＨＡＳＭＣ培地をペトリ皿（全体の構成物を完全に沈めたことを確実にするため）に加えた。構成物を、３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間インキュベートし、それにより、細胞のシリンダー間の融合を可能とした。
【０１７９】
２４時間の最後に、周囲のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）支持構造を、融合した多層の血管のチューブから除去した。
【０１８０】
実施例３：バイオプリンター
バイオプリンターをアセンブリした。バイオプリンターは、カートリッジを保持するためのコレット・チャックのグリップ、及びカートリッジのコンテンツを分注するためのピストンを有しているプリンターヘッドを含んでいた。使用されるカートリッジは、長さが７５−８５ｍｍである、ガラス製のマイクロキャピラリーチューブだった。バイオインク又は支持物質を必要とする度に、新しいキャピラリーチューブを充填した。
【０１８１】
構造物を印刷するために、印刷プロセスの間、すなわち、プリンターヘッドに新しいキャピラリーが充填されるときに、±２０μｍの分注位置繰り返し精度を必要とする。ｘ―、ｙ―、そしてｚ−方向での同じ点に関する、充填されたキャピラリーチューブの繰り返し精度を維持するために、バイオプリンターは、マイクロキャピラリーチューブの位置の較正するための、レーザー較正システムを含んでいた。レーザー較正システムは、すべてのキャピラリーチップの位置を、一般的な参照位置に較正した。印刷の動作は、すべてこの参照位置に関連するようにした。
【０１８２】
３つの軸（ｘ−、ｙ−、又はｚ−軸）すべてを、単一のレーザー測距センサーの使用を通じて較正した。そのシステムは、レーザーセンサー及びレーザービームを含んでいた。センサー境界は、レーザーセンサーの距離を感知する最大であった。そのセンサーを、あらかじめ定義した境界よりもさらに離れているシグナルはすべて無視するように構成した。そのセンサーは、三角測量を使用し、対象（キャピラリーチップ）に対する距離を測定する。レーザーセンサーを、ビームが垂直（＋Ｚ軸）に照準するように適応させた。
【０１８３】
＜垂直方向のレーザーの較正＞
Ｘ軸での較正：キャピラリーチップを、レーザービームの左（−ｘ）に傾けて、レーザーセンサーの範囲で移動させた。センサーがキャピラリーエッジを検出するまで、キャピラリーを＋Ｘ方向に移動させ、この位置を記録した。上記の工程を反対側から繰り返した（すなわち、チップをレーザービームの右（＋ｘ）に傾け、センサーがキャピラリーエッジを検出するまで、−ｘ方向に移動させる）。両方の工程からの位置を平均し、キャピラリーの中間点を計算した。随意に、上記の工程を、異なるｙ−位置のために繰り返し、また、計算された中間点を平均した。
【０１８４】
Ｙ軸での較正：上記の処置（Ｘ軸での）を、Ｙ軸で繰り返した。
【０１８５】
Ｚ軸での較正：ビームがキャピラリーの底面に当たり、チップをセンサーの範囲境界のちょうど外側にあるように、キャピラリーチップをセンサービームの上に移動させた。センサー境界に到達するまで、キャピラリーを減らし、そしてその位置をｚ―位置として記録した。随意に、上記の工程をキャピラリーチップの表面上の複数の点で繰り返し、測定された高さを平均した。
【０１８６】
＜水平方向のレーザーの較正＞
Ｙ軸での較正：チップがレーザービームの高さのちょうど下になり、キャピラリーを１つ側面方向に離れる（ｙ−方向）ように、キャピラリーを移動させた。キャピラリーをレーザーに向けてｙ−方向に移動させた。レーザーセンサーがキャピラリーに反射されるビームを検出したときに、キャピラリーを止め、この位置を記録した。上記の工程を、レーザーの他の側面方向に離れ、（ｙ−方向）に動いたキャピラリーを動かした。上記の工程からの中間点をｙ−位置として記録した。
【０１８７】
Ｘ軸での較正：Ｙ軸での較正の結果を使用して、レーザーをキャピラリーに集中するように、Ｙ軸を移動させた。キャピラリーを、センサー境界を過ぎて移動させ、センサーに向けて移動させた。キャピラリーがセンサー境界を横切り、センサー出力が変わるとすぐに、キャピラリーを止めた。この位置（プラス１／２のキャピラリー幅（ｙ−較正から））をｘ−位置として記録した。
【０１８８】
Ｚ軸での較正：レーザービームがなくなるまで、キャピラリーをｘ−位置から上に移動させた。キャピラリーチップをレーザービームへ向けて下に移動させ、レーザービームが遮断されるとすぐに止めた（Ｙ軸に対するプロセスと同じプロセスを使用する）。この位置をｚ−位置として記録した。
【０１８９】
＜キャピラリープライミング＞
キャピラリーから印刷する前に、バイオインク又は支持物質がキャピラリーのまさに先端で印刷し始めるように、キャピラリー内部にバイオインク又は支持物質をプライミングした。較正レーザーを、キャピラリーをプライミングするために使用した。キャピラリーチップを、ちょうどレーザービームの上に移動させ、ビームはＹ軸にした。キャピラリーチップはレーザービームの上の２０−１００μｍの間にあった。バイオインク又は支持物質がキャピラリーチップから分注し始め、レーザービームを遮断するまで、プリンターヘッド中の分注ピストンが押し下げられた。ピストンを逆方向（２０−１００μｍ）に駆動させることにより、分注されたバイオインク又は支持物質を吸引し、キャピラリーチューブに戻した。その後、キャピラリーをプライミングし、分注の準備を行った。
【０１９０】
＜ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）キャピラリーの洗浄＞
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を支持物質として使用した。キャピラリーチューブの外側表面に付着する過剰なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を取り除き、過剰なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が印刷品質に影響を与えることを回避するために、過剰なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を取り除いた。除去する特性をバルクのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）容器へ統合した。バルクのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）容器を、隔壁を付けられるように開いた蓋を有する、標準的な医療用バイアルに合わせた。隔壁を、１−２ｍｍの厚いシリコンの中央にある横断線で構成する。隔壁を通してキャピラリーをバルクのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）容器に浸し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を吸引することによって、キャピラリーが容器から出ると、過剰なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）をキャピラリーから除去し、バルク容器内に残った。
【０１９１】
＜血管構造物の印刷＞
バイオプリンター及びカートリッジを上記のように組み立てた。バイオプリンターは、バイオプリンターによって生成された構造を受け取るためのペトリ皿を有するステージを有していた。ペトリ皿をＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングした。
【０１９２】
ユーザーは、血管構造物の２次元の表示（例えば図４を参照）を、バイオプリンターに接続されたコンピューターのソフトウェアプログラムに入力した。血管構造物の２次元の表示を、血管構造物の空間を定義し、血管構造物を取り囲む、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダー、ＨＤＦシリンダー、及びＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドから成った。ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合細胞シリンダーとＨＤＦ細胞シリンダーを、実施例１のように調製し、プリンターヘッドのコレット・チャックに挿入するためにキャピラリーチューブに吸引した。あるいは、キャピラリーチューブをプリンターヘッドに充填し、バルクのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）容器に浸し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）をキャピラリーチューブに吸引した。垂直方向のレーザー較正システムを使用し、キャピラリーチューブを較正した。
【０１９３】
ソフトウェアプログラムからのコマンドがバイオプリンターに提供された時、バイオプリンターは、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣロッドとＨＤＦロッド及びＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドを交互にして、ペトリ皿の上の所定の位置に、三次元構造物を印刷する。実施例２を参照。それぞれのロッドをペトリ皿に置いた後、少量の培地でロッドを湿らせた。一旦、全体の構成物が完成すると、暖かいＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、構成物の各々の末端に分注し、室温でゲル化させ、そして、細胞培養培地をペトリ皿に加え、全体の構成物を沈めた。その後、構成物を、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートし、細胞シリンダー間の融合を可能とした。インキュベーション時間の最後に、周囲のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）支持構造を、融合した多層の血管のチューブから除去した。
【０１９４】
本発明はその具体的な実施形態に関して記載されているが、創造性のある方法論によって、さらなる変更ができることは理解される。この特許出願は、一般に本発明の原則に従い、本発明の属する技術分野において既知あるいは慣行の範囲内であり、前記記載の必須の特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からのこのような逸脱を含んで、本発明の任意の変更、使用、適用を包含するように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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