(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌（ＣＲＣ）を有する対象の予後を予測するための方法であって、
（ａ）単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化レベルに基づいてＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数を決定するステップと、
（ｂ）
参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフに対する相対的ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数に基づいて対象の予後を予測するステップであって、
決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフ未満である場合に、前記対象は良好な予後を有すると予測されるステップと、
を含み、
前記ＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化レベルはそれらのリン酸化レベルに対応し、
前記ＨＥＲ受容体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３からなる群から選択され、
前記対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子に野生型ＫＲＡＳ遺伝子型又はＧ１３Ｄ変異を有する、
方法。
【請求項２】
前記良好な予後はより高い無病生存（ＤＦＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフより大きい場合に、前記対象は不良な予後を有すると予測される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記不良な予後はより低い無病生存（ＤＦＳ）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフは０．２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ１指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ２指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ３指数、又はそれらの組み合わせを決定するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞抽出物におけるＨＥＲ１及びｃＭＥＴのレベルに基づいてＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数を決定するステップと、
（ｉ）参照ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数カットオフに対する相対的ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数、及び
（ｉｉ）参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフに対する相対的ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数
に基づいて対象の予後を予測するステップであって、
決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフ未満であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が前記参照ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数カットオフより大きい場合に、前記対象は良好な予後を有すると予測されるステップと、
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフ未満であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が前記参照ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数カットオフ未満である場合、又は決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が前記参照ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数カットオフより大きく、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が前記参照ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数カットオフ未満である場合に、前記対象は不良な予後を有すると予測される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１３年５月２１日に出願の米国特許仮出願第６１／８２５，９９８号（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に対する優先権を主張する。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]細胞中のシグナル伝達過程は、種々の生物学的機能（多少の例を挙げると、細胞の分裂及び死、代謝、免疫細胞活性化、神経伝達、及び感覚認知（但し、それらに限定されない。））を担う。したがって、細胞中の正常なシグナル伝達の混乱は、糖尿病、心疾患、自己免疫及び癌などのいくつかの疾患状態をもたらす可能性がある。
【０００３】
[0003]１つのよく特徴づけられたシグナル伝達経路はＭＡＰキナーゼ経路であり、それは、細胞で表皮増殖因子（ＥＧＦ）からのシグナルを細胞増殖の促進に変換する役割を担う。ＥＧＦは、ＥＧＦの結合によって活性化される膜貫通受容体連結チロシンキナーゼ、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合は、受容体の細胞質ドメインのチロシンキナーゼ活性を活性化する。このキナーゼ活性化の１つの結果は、チロシン残基上のＥＧＦＲの自己リン酸化である。活性化ＥＧＦＲ上のリン酸化されたチロシン残基は、ＧＲＢ２などのアダプタータンパク質を含有するＳＨ２ドメインの結合のためのドッキング部位を提供する。アダプターとしてのその機能において、ＧＲＢ２はＧＲＢ２上のＳＨ３ドメイン経由でグアニンヌクレオチド交換因子、ＳＯＳにさらに結合する。ＥＧＦＲ−ＧＲＢ２−ＳＯＳの複合体の形成は、ＲａｓからのＧＤＰの除去を促進するグアニンヌクレオチド交換因子へのＳＯＳ活性化につながる。ＧＤＰの除去の結果、ＲａｓはＧＴＰに結合して活性化される。
【０００４】
[0004]活性化の後、Ｒａｓは、ＲＡＦキナーゼ、セリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼに結合してタンパク質キナーゼ活性を活性化する。その後、細胞増殖につながるタンパク質キナーゼカスケードの活性化が続く。概要を述べると、ＲＡＦキナーゼはその後ＭＥＫ、別のセリン／トレオニンキナーゼをリン酸化し、活性化する。活性化ＭＥＫは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化し、活性化する。ＭＡＰＫによるさらなるリン酸化の標的の１つは４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＫ）である。ＭＡＰＫによるＲＳＫのリン酸化はＲＳＫの活性化をもたらし、それはリボソームタンパク質Ｓ６を次にリン酸化する。ＭＡＰＫの別の公知の標的は癌原遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ、細胞増殖にとって重要な遺伝子であり、それは種々の癌で変異している。ＭＡＰＫは別のタンパク質キナーゼ、ＭＮＫもリン酸化して活性化するが、それは転写因子ＣＲＥＢを次にリン酸化する。間接的にではあるが、ＭＡＰＫは、細胞増殖に関与するさらに別の転写因子をコードするＦｏｓ遺伝子の転写も調節する。そのような転写因子のレベル及び活性を変化させることによって、ＭＡＰＫはＥＧＦからの元の細胞外シグナルを、細胞周期進行にとって重要である遺伝子の変化した転写に変換する。
【０００５】
[0005]細胞増殖でシグナル伝達経路が果たす中心的な役割を考えると、細胞増殖経路の異常な活性化をもたらすシグナル伝達構成要素の変異及び他の変化の結果として多くの癌が生じることは、意外でない。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現又は活動過多は、多形性神経膠芽腫、結腸癌及び肺癌を含むいくつかの癌と関連づけられている。これは、肺癌のためのゲフィチニブ及びエルロチニブ並びに結腸癌のためのセツキシマブを含む、ＥＧＦＲに対して向けられた抗癌治療薬の開発を促した。
【０００６】
[0006]セツキシマブは、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインに結合し、こうしてＥＧＦＲチロシンキナーゼを活性化するリガンドの結合を阻止するモノクローナル抗体阻害剤の例である。対照的に、ゲフィチニブ及びエルロチニブは、細胞内に位置するＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する小分子である。キナーゼ活性の非存在下では、ＥＧＦＲは、ＧＲＢ２などの下流アダプタータンパク質の結合の必要条件である、チロシン残基での自己リン酸化を経ることができない。増加のためにこの経路に頼る細胞でシグナル伝達カスケードを停止することによって、腫瘍の増殖及び遊走は減らされる。
【０００７】
[0007]さらに、他の研究は、ヒト黒色腫の約７０％及び他の腫瘍のより小さい割合が、ＭＡＰＫ経路の持続的な活性化につながるＲａｆ遺伝子の点変異（Ｖ５９９Ｅ）を有することを示した（例えば、Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７：９４９〜９５４頁（２００２）を参照）。そのような結果は、伝達経路を特定のシグナル伝達経路の変異が特定の型の腫瘍の特徴であること、及びそのような特異的に変化したシグナル伝達経路が化学療法介入の有望な標的になり得ることを示唆する。
【０００８】
[0008]異なる癌処置、特に癌化学療法が、細胞の増殖又は死に関与する細胞のシグナル伝達経路をそれぞれブロック又は活性化することによって直接的又は間接的に機能することができることを考えると、大腸癌などの特定の形態の癌の所与のシグナル伝達経路の発現及び／又は活性化は、種々の癌処置の有効性の良好な指標の役割をすることができる。したがって、他の必要性を満たすことに加えて、本発明は、個々の大腸癌患者のための潜在的抗癌療法の有効性を評価する方法を提供する。このように、本発明は、患者毎に正しい用量及び正しい時間での大腸癌の処置のための適切な癌療法を選択することにおいて医師を支援する方法を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
[0009]本発明は、大腸癌（ＣＲＣ）を有する対象の生存を予測し、それにより、例えば腫瘍手術の後に、対象が良好な予後（例えば無病生存）を有するか不良な予後（例えば疾患再発）を有するかを決定するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明はまた、ＣＲＣを有する対象における治療的有効性及び／又は抗癌療法、例えば、抗ＨＥＲ療法、抗ＰＩ３Ｋ療法、抗ｃＭＥＴ療法、又はそれらの組み合わせへの反応性を予測し、それにより、対象が反応する可能性のある治療レジメンを選択するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明は、ＣＲＣ腫瘍で活性化されるシグナル伝達バイオマーカーに合わせた特異的治療レジメンを管理することによって、ＣＲＣを有する対象を処置する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＣを有する対象から得た癌細胞中の特異的組み合わせのシグナル伝達分析物の活性化状態又はレベルの検出に依存する。したがって、本明細書に記載される方法は、ＣＲＣ腫瘍で活性化されるシグナル伝達バイオマーカーに特異的に合わせた療法から利益を受ける対象を識別することによって、ＣＲＣを有する対象の生存又は予後を予測するために、並びに腫瘍手術前及び腫瘍手術後の処置決定を導くために特に有用である。
【００１０】
[0010]一部の態様では、本発明は、例えば腫瘍手術の後に、大腸癌（ＣＲＣ）を有する対象の生存を予測するための方法であって、
（ａ）単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベル（例えばｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）に基づいてＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数を決定するステップと、
（ｂ）（第１の）参照指数カットオフ（例えばＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照カットオフ比）に対する相対的なＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数に基づいて対象の生存を予測するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１１】
[0011]一部の実施形態では、ＨＥＲ受容体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、本方法は、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ１指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ２指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ３指数、又はそれらの組み合わせを決定するステップを含む。ある場合には、本方法は、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ３指数を単独で、又はＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ１指数及び／又はＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ２指数と一緒に決定するステップを含む。
【００１２】
[0012]ある特定の実施形態では、対象は、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフ未満である場合に、疾患再発なしの生存のより長い期間又は時間（例えば、より高い無病生存又はＤＦＳ）の良好な予後を有すると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子に野生型ＫＲＡＳ遺伝子型又はＧ１３Ｄ変異を有する。特定の場合には、参照指数カットオフは、約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００１３】
[0013]ある特定の実施形態では、対象は、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフ未満である場合に、疾患再発なしの生存のより短い期間又は時間（例えば、より低い無病生存又はＤＦＳ）の不良な予後を有すると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子にＧ１２変異を有する。ＫＲＡＳ癌遺伝子のＧ１２変異の非限定的な例には、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、及びＧ１２Ｃ変異が含まれる。特定の場合には、参照指数カットオフは、約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００１４】
[0014]ある特定の実施形態では、対象は、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフより大きい場合に、疾患再発なしの生存のより短い期間又は時間（例えば、より低い無病生存又はＤＦＳ）の不良な予後を有すると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子に野生型ＫＲＡＳ遺伝子型又はＧ１３Ｄ若しくはＧ１２変異を有する。ＫＲＡＳ癌遺伝子のＧ１２変異の非限定的な例には、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、及びＧ１２Ｃ変異が含まれる。特定の場合には、参照指数カットオフは、約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００１５】
[0015]他の実施形態では、本方法は、ＰＩ３Ｋの活性化（例えばリン酸化）レベルがＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベルと比較して低い（例えば、ｐＰＩ３ＫレベルがｐＨＥＲ３発現の約１５％〜約３０％である）場合に、対象が、疾患再発なしの生存のより長い期間又は時間（例えば、より高い無病生存またはＤＦＳ）の良好な予後を有すると予測するステップをさらに含む。
【００１６】
[0016]ある特定の実施形態では、本方法は、単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＨＥＲ１及びｃＭＥＴのレベル（例えば、ＨＥＲ１及びｃＭＥＴの発現又は活性化（例えばリン酸化）レベル）に基づいてＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数を決定するステップと、第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）に対する相対的なＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数に基づいて対象の生存をさらに予測するステップと、をさらに含む。そのような実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフ未満（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフ未満）であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）より大きい場合に、対象は、疾患再発なしの生存のより長い期間又は時間（例えば、より高い無病生存又はＤＦＳ）の良好な予後を有すると予測される。他の実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフ未満（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフ未満）であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）未満である場合に、対象は、疾患再発なしの生存のより短い期間又は時間（例えば、より低い無病生存又はＤＦＳ）の不良な予後を有すると予測される。さらなる実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフを超え（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフを超え）、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えば、ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）未満である場合に、対象は、疾患再発なしの生存のより短い期間又は時間（例えば、より低い無病生存又はＤＦＳ）の不良な予後を有すると予測される。特定の場合には、（第１の）ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフは約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、（第１の）ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）、又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。他の特定の場合には、（第２の）ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照指数カットオフは約２の値を含む。さらに他の場合には、（第２の）ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照指数カットオフは約３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の値を含む。
【００１７】
[0017]他の態様では、本発明は、例えば腫瘍手術の後に、対象における大腸癌（ＣＲＣ）の処置のための療法を選択するための方法であって、
（ａ）単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベル（例えばｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）に基づいてＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数を決定するステップと、
（ｂ）（第１の）参照指数カットオフ（例えばＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照カットオフ比）に対する相対的なＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数に基づいて、対象におけるＣＲＣの処置のための適切な療法（例えば、抗ＥＧＦＲ療法、抗ＰＩ３Ｋ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗ＨＥＲ３療法、抗ｃＭＥＴ療法、及び／又はＰＩ３Ｋ活性化を駆動する分子を阻害する標的化薬剤による療法）を選択するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１８】
[0018]一部の実施形態では、ＨＥＲ受容体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、本方法は、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ１指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ２指数、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ３指数、又はそれらの組み合わせを決定するステップを含む。ある場合には、本方法はＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ３指数を単独で、又はＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ１指数及び／又はＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ２指数と一緒に決定するステップを含む。
【００１９】
[0019]ある特定の実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフ未満である場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に反応性であると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子に野生型ＫＲＡＳ遺伝子型又はＧ１３Ｄ変異を有する。特定の場合には、参照指数カットオフは約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）、又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００２０】
[0020]ある特定の実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフ未満である場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に不応性であると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子にＧ１２変異を有する。ＫＲＡＳ癌遺伝子のＧ１２変異の非限定的な例にはＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、及びＧ１２Ｃ変異が含まれる。特定の場合には、参照指数カットオフは約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）、又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００２１】
[0021]ある特定の実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が参照指数カットオフより大きい場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に不応性であると予測される。ある場合には、対象は、ＫＲＡＳ癌遺伝子に野生型ＫＲＡＳ遺伝子型又はＧ１３Ｄ若しくはＧ１２変異を有する。ＫＲＡＳ癌遺伝子のＧ１２変異の非限定的な例にはＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、及びＧ１２Ｃ変異が含まれる。特定の場合には、参照指数カットオフ値は約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）、又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。
【００２２】
[0022]他の実施形態では、本方法は、ＰＩ３Ｋの活性化（例えばリン酸化）レベルがＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベルと比較して低い（例えば、ｐＰＩ３ＫレベルがｐＨＥＲ３発現の約１５％〜約３０％である）場合に、対象が抗ＥＧＦＲ療法におそらく反応性であると予測するステップをさらに含む。
【００２３】
[0023]ある特定の実施形態では、本方法は、単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＨＥＲ１及びｃＭＥＴのレベル（例えば、ＨＥＲ１及びｃＭＥＴの発現又は活性化（例えばリン酸化）レベル）に基づいてＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数を決定するステップと、第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）に対する相対的なＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数に基づいてＣＲＣの処置のための療法をさらに選択するステップと、をさらに含む。そのような実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフ未満（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフ未満）であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）より大きい場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に反応性であると予測される。他の実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフ未満（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフ未満）であり、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えばＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）未満である場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に不応性であると予測される。さらなる実施形態では、決定されたＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数が第１の参照指数カットオフを超え（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフを超え）、決定されたＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数が第２の参照指数カットオフ（例えば、ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照カットオフ比）未満である場合に、対象は抗ＥＧＦＲ療法に不応性であると予測される。特定の場合には、（第１の）ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフは約０．２（例えば、約２０％又は２／１０）の値を含む。他の場合には、（第１の）ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフは、約０．１（例えば、約１０％又は１／１０）、約０．３（例えば、約３０％又は３／１０）、約０．４（例えば、約４０％又は４／１０）、又は約０．５（例えば、約５０％又は５／１０）の値を含む。他の特定の場合には、（第２の）ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照指数カットオフは約２の値を含む。さらに他の場合には、（第２の）ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照指数カットオフは約３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の値を含む。
【００２４】
[0024]特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ療法の最良の候補は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ指数は低い（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照指数カットオフ未満である）が、ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数は高い（例えば、ＨＥＲ１／ｃＭＥＴ参照指数カットオフより大きい）ＣＲＣを有する対象である。
【００２５】
[0025]さらなる実施形態では、抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ｐＰＩ３Ｋ療法は、ｐＨＥＲ（例えばｐＨＥＲ３）の約１５〜約３０％より大きいｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍により適している。そのような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。他の実施形態では、抗ＰＩ３Ｋ療法の有無に関係なく、抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ｃＭＥＴ療法は、ｐＨＥＲ（例えばｐＨＥＲ３）の約１５〜約３０％より大きいｐＰＩ３Ｋを有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍の処置により適している。そのような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００２６】
[0026]ある場合には、抗ＥＧＦＲ療法には：モノクローナル抗体、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、及びニモツズマブ；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、及びＢＩＢＷ−２９９２；及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００２７】
[0027]他の場合には、抗ＰＩ３Ｋ療法には、ＰＸ−８６６、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、テトロドトキシンクエン酸塩、マレイン酸チオペラミド、ＧＤＣ−０９４１（９５７０５４−３０−７）、ＩＣ８７１１４、ＰＩ−１０３、ＰＩＫ９３、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＴＧＸ−１１５、ＺＳＴＫ４７４、（−）−デグエリン、ＮＵ７０２６、ミリセチン、タンデュチニブ、ＧＤＣ−０９４１ビスメシレート、ＧＳＫ６９０６９３、ＫＵ−５５９３３、ＭＫ−２２０６、ＯＳＵ−０３０１２、ペリホシン、トリシリビン、ＸＬ−１４７、ＰＩＫ７５、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＰＩ８２８、ＸＬ−７６５、及びＷＨＩ−Ｐ１５４、並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【００２８】
[0028]他の場合には、抗ＨＥＲ２療法には：モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００２９】
[0029]他の場合には、抗ＨＥＲ３療法には：モノクローナル抗体、例えば、ＭＭ−１２１、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、及びペルツズマブ（２Ｃ４）；ＭＭ−１１１などの二重特異的抗体；小分子阻害剤、例えば、ＭＰ−４７０（アムバチニブ）、ＡＺＤ８９３１、及びカネルチニブ（ＣＩ１０３３）；及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３０】
[0030]他の場合には、抗ｃ−Ｍｅｔ療法には、ＭＡＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）及びＭｅｔＭａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などの中和抗体、並びにＡＲＱ１９７、ＸＬ１８４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＭＰ４７０、ＭＧＣＤ２６５、ＳＧＸ５２３、ＰＦ０４２１７９０３及びＪＮＪ３８８７７６０５、ＩＮＣＢ２８０６０、ＡＭＧ−４５８、Ｅ７０５０、ＭＫ−２４６１、ＢＭＳ−７７７６０７などのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３１】
[0031]ＰＩ３Ｋを活性化する分子及びそれらの標的化薬剤の非限定的な例には以下のシグナル伝達分子及びその阻害剤が含まれる。
【表Ｘ】
0006478417.tif 000002
【００３２】
[0032]ある特定の場合には、ＰＩ３Ｋ活性化を駆動する分子には、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、他のＲａｓファミリー小ＧＴＰアーゼ、Ｒｈｏファミリー小ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＧ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。他の場合には、ＰＩ３Ｋ活性化を駆動する分子を阻害する標的化薬剤には、ＭＬ１４１（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１阻害剤）、ＡＺＡ１（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１阻害剤）、ＺＣＬ２７８（Ｃｄｃ４２阻害剤）、ＮＳＣ２３７６６（Ｒａｃ阻害剤）、ＥＨｏｐ−０１６／ＣＡＳ  １３８０４３２−３２−５（Ｒａｃ阻害剤）、ＣＡＳ  １０９０８９３−１２−１（Ｒａｃ阻害剤）、ＣＡＳ  １１７７８６５−１７−６（Ｒａｃ阻害剤）、ＥＨＴ  １８６４（Ｒａｃ阻害剤）、Ｗ５６（Ｒａｃ１阻害剤）、サリラシブ（Ｒａｓ阻害剤）、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３３】
[0033]ある特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載されるシグナル伝達分子の１つ又は複数などの１つ又は複数の追加の分析物の（全体の）発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又はステータスを決定することをさらに含む。
【００３４】
[0034]シグナル伝達分子の全体の発現及び活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又はステータスは種々の技術のいずれかを用いて決定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞の細胞抽出物などの試料中のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又は状態は、本明細書に記載されるように、単一検出アッセイ又は近接二重検出アッセイ（例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＥＥＲ（商標））などのイムノアッセイで検出される。
【００３５】
[0035]ＣＥＥＲ（商標）技術は本明細書、及び以下の特許文書（各々、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に記載される：ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００８／０３６８０２、ＷＯ２００９／０１２１４０、ＷＯ２００９／１０８６３７、ＷＯ２０１０／１３２７２３、ＷＯ２０１１／００８９９０及びＷＯ２０１１／０５００６９；及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６６２４。
【００３６】
[0036]本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、実施例１に記載される研究のためのＣＲＣコホート研究スキーマを示す。
【図２】図２は、研究に登録されたＣＲＣ患者の特徴を示す。
【図３】図３は、ＣＥＥＲを用いたＣＲＣ臨床試料のシグナル伝達経路プロファイリングを示す。
【図４】図４は、ＣＲＣ無病生存（ＤＦＳ）における多様性及び不均一性を示す。
【図５】図５は、ＣＲＣ生存の多様性がシグナル伝達経路シグネチャーの多様性と相関することを示す。
【図６】図６は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の低下とＤＦＳに相関があることを示す。
【図７】図７は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数によって分離されたＣＲＣ腫瘍の組成を示す。
【図８】図８は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数によって分離されたＣＲＣ腫瘍が、ＫＲＡＳ野生型腫瘍内の高い及び低い生存の少なくとも２つの亜集団を明らかにすることを示す。
【図９】図９は、ＫＲＡＳ変異ステータスに基づくＤＦＳ分離における有意な差が、低いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有するＣＲＣ腫瘍のみで観察されたことを示す。
【図１０】図１０は、高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有するＣＲＣ腫瘍が、それらのＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく早期に再発することを示す。
【図１１】図１１は、ＣＲＣ腫瘍が、それらが離れた器官に転移するにつれて高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を獲得することを示す。
【図１２】図１２は、図６〜１１に示す実験データの要約図である。
【図１３】図１３は、アグレッシブな（高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の）ＫＲＡＳ野生型ＣＲＣ及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異ＣＲＣにおいてＭＥＴシグナル伝達がより高いことを示す。
【図１４】図１４は、（Ａ）アグレッシブな（高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の）ＣＲＣ及び（Ｂ）転移性ＣＲＣにおいて、ＭＥＴシグナル伝達がＨＥＲ１シグナル伝達より高いことを示す。
【図１５】図１５は、低いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する腫瘍において、ＫＲＡＳ−ＷＴ  ＣＲＣ腫瘍がＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍より有意に高いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数比を示すことを示す。
【図１６】図１６は、適当なＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比カットオフが低ＰＩ３Ｋ集団内のよりアグレッシブなＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍を選び出すことを示す。
【図１７】図１７は、相対的パスウェイシグネチャー＋ＫＲＡＳ変異ステータスを含む本発明の相対的／統合的パスウェイインデックスの要約図である。
【図１８】図１８は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２、及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３の比がすべてＣＲＣにおける再発及び無病生存（ＤＦＳ）と負に及び有意に相関する（例えば、マーカーが高いほど再発が早い）ことを示す。
【図１９】図１９は、より高い（例えば、参照ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数カットオフを超える）ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３発現を有するＣＲＣ試料において、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２がより高いレベルで発現することを示す。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
Ｉ．イントロダクション
[0056]本発明は、大腸癌（ＣＲＣ）を有する対象の生存を予測し、それにより、例えば腫瘍手術の後に、対象が良好な予後（例えば無病生存）を有するか不良な予後（例えば疾患再発）を有するかを決定するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明はまた、ＣＲＣを有する対象における治療的有効性及び／又は抗癌療法、例えば、抗ＨＥＲ療法、抗ＰＩ３Ｋ療法、抗ｃＭＥＴ療法、又はそれらの組み合わせへの反応性を予測し、それにより、対象が反応する可能性のある治療レジメンを選択するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明は、ＣＲＣ腫瘍で活性化されるシグナル伝達バイオマーカーに合わせた特異的治療レジメンを管理することによって、ＣＲＣを有する対象を処置する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＣを有する対象から得た癌細胞中の特異的組み合わせのシグナル伝達分析物の活性化状態又はレベルの検出に依存する。したがって、本明細書に記載される方法は、ＣＲＣ腫瘍で活性化されるシグナル伝達バイオマーカーに特異的に合わせた療法から利益を受ける対象を識別することによって、ＣＲＣを有する対象の生存又は予後を予測するために、並びに腫瘍手術前及び腫瘍手術後の処置決定を導くために特に有用である。
【００３９】
[0057]実施例１は、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく、大腸癌（ＣＲＣ）腫瘍でのホスホＰＩ３Ｋ（ｐＰＩ３Ｋ）対ホスホＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）の比が腫瘍予後及び抗ＥＧＦＲ療法の結果を予測することを実証する。本明細書に記載されるように、抗ＥＧＦＲ療法の最良の候補は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比は低いがＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比は高いＣＲＣであろう。
【００４０】
[0058]実施例１に記載されるように、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数がカットオフ比を超える（例えば、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３＞２０％）場合は、ｐＰＩ３Ｋシグナル伝達はＨＥＲシグナル伝達より大きく、ＣＲＣはＰＩ３Ｋ駆動性と分類される。予後に関しては、カットオフ比を超えるｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく低いＤＦＳを有すると予測される。ＣＲＣ療法選択に関しては、カットオフ比を超えるｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は、抗ＥＧＦＲ療法に不応性である可能性があり、抗ＰＩ３Ｋ療法に反応性であるより高い可能性を有する。ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数がカットオフ比未満（例えば、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３＜２０％）である場合は、ＨＥＲシグナル伝達がより高く、ＣＲＣはＨＥＲ駆動性と分類される。予後に関しては、カットオフ比未満のｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は、ＫＲＡＳ状態がＷＴ又はＧ１３Ｄである場合はより高いＤＦＳを有すると予測されるが、ＫＲＡＳ状態がＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔである場合はより低いＤＦＳを有すると予測される。ＣＲＣ療法の選択に関しては、カットオフ比未満のｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者の一部は、抗ＥＧＦＲ療法に反応性である可能性がある。
【００４１】
[0059]実施例１でさらに記載されるように、ｃＭＥＴシグナル伝達より高いＨＥＲシグナル伝達（例えば、ＨＥＲ１＞ｃＭＥＴ；高いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数又は低いｃＭＥＴシグナル伝達）を有するＨＥＲ駆動性ＣＲＣ腫瘍では、野生型又はＧ１３Ｄ  ＫＲＡＳ状態を有するＣＲＣ患者は良好な予後（例えば、より高いＤＦＳ）を有し、抗ＥＧＦＲ療法に反応する可能性がより高い。しかし、より低いＨＥＲ１シグナル伝達（例えば、ＨＥＲ１＜ｃＭＥＴ；低いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数又は高いｃＭＥＴシグナル伝達）を有するＨＥＲ駆動性ＣＲＣ腫瘍では、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異を有するＣＲＣ患者は不良な予後（例えば、より低いＤＦＳ）を有する。
【００４２】
[0060]したがって、実施例１は、ＣＥＥＲベースのシグナル伝達経路プロファイルが、ＫＲＡＳ変異に基づく分離を超えてＣＲＣの新規の分子サブセットを明らかにしたことを示す。このような分子的分離はＣＲＣのための新規の治療選択戦略を導くことができる。特に、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく、ＣＲＣ腫瘍におけるｐＰＩ３Ｋ発現対ｐＨＥＲ３発現の比（ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）が腫瘍予後及び抗ＥＧＦＲ療法の結果を予測することが発見された。抗ＥＧＦＲ療法の最良の候補は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比は低いがＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比は高いＣＲＣと同定された。低いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達（例えば、ｐＨＥＲ３発現の約１５〜３０％）を有するＣＲＣ腫瘍の二次選択は、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく最良の予後、おそらく抗ＥＧＦＲ療法の結果を有するＣＲＣ腫瘍をさらに予測することができる。抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ｐＰＩ３Ｋ療法は、ｐＨＥＲ３の約１５〜３０％より大きいｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍により適している。このような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。この研究は、一部のＣＲＣでは、ｐＰＩ３Ｋシグナル伝達の増加がｃＭＥＴシグナル伝達の増加による可能性があることも見出した。抗ＰＩ３Ｋ療法の有無に関係なく、抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ｃＭＥＴ療法は、ｐＨＥＲ３の約１５〜３０％より大きいｐＰＩ３Ｋを有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍の処置に有用であり得る。このような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００４３】
[0061]さらに、実施例１は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２の比がＣＲＣにおける再発（例えば、マーカーが高いほど再発が早い）及び無病生存（ＤＦＳ）と負に及び有意に相関することも実証する。注目すべきことに、実施例１は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２の比が、より高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比（例えば、参照ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数カットオフより上）を有するＣＲＣ試料でより高いことをさらに実証する。
【００４４】
[0062]したがって、本発明は、大腸癌に関与する１つ又は複数の脱調節されたシグナル伝達経路を下方制御するために適当な療法を選択するための方法も提供する。したがって、本発明は、所与の患者の大腸腫瘍において、全体の及び／又は活性化されたシグナル伝達タンパク質の集合によって提供される特定の分子サイン単独、又は体細胞変異解析との組み合わせに基づく、パーソナライズされた療法の設計を容易にするために用いることができる。
【００４５】
ＩＩ．定義
[0063]用語「癌」は、異常な細胞の無制御の増殖を特徴とする疾患のクラスのあらゆるメンバーを含むものとする。この用語は、悪性、良性、軟組織又は固形と特徴づけられようがすべての既知の癌及び新生物状態、並びに転移前後の癌を含むすべての段階及びグレードの癌を含む。異なる型の癌の例には：消化器及び胃腸の癌、例えば、大腸癌、胃癌（例えば腹部の癌）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃腸カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び食道癌；乳癌；肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；胆嚢癌；肝癌；膵癌；虫垂癌；前立腺癌、卵巣癌；腎臓癌（例えば腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；神経膠腫；絨毛癌；頭頚部癌；骨原性肉腫；及び血液癌が含まれる（但し、それらに限定されない）。本明細書において、「腫瘍」は１つ又は複数の癌性細胞を含む。
【００４６】
[0064]用語「分析物」には、その存在、量（発現レベル）、活性化状態及び／又は同一性が決定される対象の任意の分子、一般的にはポリペプチドなどの巨大分子が含まれる。
【００４７】
[0065]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナルトランスデューサ」には、細胞の中での順序良く連続した生化学反応を一般的に含む、細胞外のシグナル又は刺激を細胞が応答に変換する過程を実行するタンパク質及び他の分子が含まれる。シグナル伝達分子の例には：受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、及びＲＴＫ１０６；トランケートされた形態の受容体チロシンキナーゼ、例えば、アミノ末端細胞外ドメインの欠落しているトランケートされたＨＥＲ２受容体（例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎなど）、アミノ末端細胞外ドメインの欠落しているトランケートされたｃＭＥＴ受容体、及びアミノ末端細胞外ドメインの欠落しているトランケートされたＨＥＲ３受容体；受容体チロシンキナーゼダイマー（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４を有するトランケートされたＨＥＲ３受容体；ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ３／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ１／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ４；ＨＥＲ３／ＨＥＲ４など）；非受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ及びＬＩＭＫ；チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの構成成分、例えば、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシン同族体（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ７０  Ｓ６キナーゼスプライスバリアントアルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、��Ｐ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリン；核ホルモン受容体、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、無機質コルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体；核内受容体活性化補助因子及びリプレッサー、例えば、それぞれ乳癌１（ＡＩＢ１）及び核内受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）で増幅されるもの；及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００４８】
[0066]用語「活性化状態」は、特定のシグナル伝達分子が活性化されるかどうかを指す。同様に、用語「活性化レベル」は、特定のシグナル伝達分子がどの程度活性化されるかを指す。活性化状態は、１つ又は複数のシグナル伝達分子のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態に一般的に対応する。活性化状態（括弧で記載される）の非限定的な例には以下のものが含まれる：ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（トランケートされたＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、トランケートされたＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−Ｍｅｔ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ、トランケートされたｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＥＴ：ＨＧＦ複合体）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン硫酸、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥｌ（ｐ−ＴＩＥｌ）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦＫＢ（ｐ−ＮＦＫＢ）、ＩＫＢ（ｐ−ＩＫＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）；ＲＢ（ｐ−ＲＢ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；パキシリン（ｐ−パキシリン）；ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、Ｓｈｃ（ｐ−Ｓｈｃ）、Ｒａｓ（ｐ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１（ｐ−Ｇ���Ｂ１）、ＳＨＰ２（ｐ−ＳＨＰ２）、ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、ＣＲＫＬ（ｐ−ＣＲＫＬ）、ＰＬＣγ（ｐ−ＰＬＣγ）、ＰＫＣ（例えば、ｐ−ＰＫＣα、ｐ−ＰＫＣβ、ｐ−ＰＫＣδ）、アデューシン（ｐ−アデューシン）、ＲＢ１（ｐ−ＲＢ１）、及びＰＹＫ２（ｐ−ＰＹＫ２）。
【００４９】
[0067]用語「癌遺伝子」には、癌を引き起こす潜在能力を有する遺伝子が含まれる。癌遺伝子の非限定的な例には：増殖因子又はマイトジェン、例えばｃ−Ｓｉｓ；受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲ、及びＶＥＧＦＲ；細胞質内のチロシンキナーゼ、例えばＡｂ１、並びにチロシンキナーゼのＳｒｃ−ファミリー、Ｓｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリー、及びＢＴＫファミリーの中のキナーゼ；細胞質内のセリン／トレオニンキナーゼ及びそれらの調節サブユニット、例えば、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、及びＲＡＦ（例えば、ＲＡＦ−１、Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ）；調節ＧＴＰアーゼ、例えばＲＡＳ（例えばＫＲＡＳ）；ＭＹＣなどの転写因子；並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【００５０】
[0068]用語「ＫＲＡＳ変異」には、ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ２又はＲＡＳＫ２と呼ぶこともできる。）遺伝子での任意の１つ又は複数の変異が含まれる。ＫＲＡＳ変異の例には、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００５１】
[0069]用語「ＢＲＡＦ変異」には、ＢＲＡＦ（セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ又はＢ−Ｒａｆと呼ぶこともできる。）遺伝子での任意の１つ又は複数の変異が含まれる。ＢＲＡＦ変異の例には、Ｖ６００Ｅ、Ｒ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｋ６００Ｅ、Ａ７２７Ｖ、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００５２】
[0070]用語「ＰＩＫ３ＣＡ変異」には、ＰＩＫ３ＣＡ（ＰＩ３Ｋ又はｐ１１０−アルファと呼ぶこともできる。）遺伝子での任意の１つ又は複数の変異が含まれる。ＰＩＫ３ＣＡ変異の例には、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、３２０４ｉｎｓＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００５３】
[0071]用語「ＥＧＦＲ変異」には、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１と呼ぶこともできる。）遺伝子での任意の１つ又は複数の変異が含まれる。ＥＧＦＲ変異の例には、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｌ８６１Ｑ及びＳ７６８Ｉなどのエクソン１９での欠失、及びＴ７９０Ｍなどのエクソン２０での挿入、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００５４】
[0072]本明細書において、用語「希釈系列」は、特定の試料（例えば細胞溶解物）又は試薬（例えば抗体）の一連の下降濃度を含むものとする。希釈系列は、開始濃度の試料又は試薬の測定済みの量と希釈剤（例えば希釈バッファー）とを混合して、より低い濃度の試料又は試薬を作製する工程、及び所望の数の連続希釈溶液を得るのに十分な回数この工程を繰り返すことによって一般的に生成される。試料又は試薬は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００又は１０００倍に連続希釈して、試料又は試薬の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０段階の下降濃度を含む希釈系列を生成することができる。例えば、１ｍｇ／ｍｌの開始濃度の捕捉抗体試薬の二倍連続希釈を含む希釈系列は、開始濃度の捕捉抗体のある量と希釈バッファーの等量を混合して０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の捕捉抗体を作製し、この工程を繰り返して０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０３２５ｍｇ／ｍｌなどの捕捉抗体濃度を得ることによって生成することができる。
【００５５】
[0073]本明細書で用いられる用語「優れたダイナミックレンジ」は、わずか１つの細胞又は何千もの細胞中で特定の分析物を検出するアッセイの能力を指す。例えば、本明細書に記載されるイムノアッセイは、捕捉抗体濃度の希釈系列を用いて、約１〜１０，０００個の細胞（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００又は１０，０００個の細胞）中で対象の特定のシグナル伝達分子を有利に検出するので、優れたダイナミックレンジを有する。
【００５６】
[0074]本明細書で用いられる用語「試料」には、患者から得られる任意の生物検体が含まれる。試料には、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば末梢血単核細胞）、管洗浄液、腹水、胸水、乳首吸引液、リンパ（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、大便（すなわち糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、微細針吸引液（例えば、ランダムな乳輪周囲微細針吸引によって収集されるもの）、任意の他の体液、組織試料（例えば腫瘍組織）、例えば、腫瘍（例えば針生検）若しくはリンパ節（例えばセンチネルリンパ節生検）の生検材料、組織試料（例えば腫瘍組織）、例えば、腫瘍の外科切除及びその細胞抽出物が含まれる（但し、それらに限定されない）。一部の実施形態では、試料は、全血又はその分画構成成分、例えば、血漿、血清又は細胞ペレットである。他の実施形態では、試料は、当技術分野で公知である任意の技術を用いて、全血又はその細胞分画から固形腫瘍の循環細胞を単離することによって得られる。さらに他の実施形態では、試料は、（例えば、大腸癌などの固形腫瘍からの）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。特定の実施形態では、試料は、大腸癌の対象から得られる凍結組織から調製される腫瘍の溶解物又は抽出物である。
【００５７】
[0075]用語「対象」又は「患者」又は「個体」には一般的にヒトが含まれるが、他の動物、例えば他の霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどが含まれてもよい。
【００５８】
[0076]「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、固体支持体、例えばガラス（例えばガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は他の任意の適切な基材に固定化又は拘束される捕捉抗体の異なるセット及び／又は希釈系列を含む。捕捉抗体は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子双極子結合）を介して固体支持体に一般に固定化又は拘束される。ある特定の場合には、捕捉抗体は、固体支持体に結合している捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本明細書に記載されるアッセイで用いられるアレイは、異なる既知の／アドレス可能な場所の固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体及び／又は捕捉抗体濃度を一般的に含む。
【００５９】
[0077]用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などの試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、それに結合するか、結合されるか又はそれと複合体を形成する）固定化抗体を含むものとする。特定の実施形態では、捕捉抗体は、アレイの固体支持体に拘束される。種々のシグナル伝達分子のいずれかを固体支持体に固定化するための適切な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【００６０】
[0078]本明細書で用いられる用語「検出抗体」には、試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、それに結合するか、結合されるか又はそれと複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体が含まれる。本用語は、検出可能な標識を含む別の種がその抗体に結合することができる、対象の１つ又は複数の分析物に特異的である抗体も包含する。検出可能な標識の例には、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）標識、化学反応性標識、蛍光性標識、酵素標識、放射性標識、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。種々のシグナル伝達分子のいずれかの活性化状態及び／又は総量を検出するための適切な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。非限定的な例として、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ及びＭＥＫなどのシグナル伝達分子の種々のリン酸化形に対するホスホ特異抗体がＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
【００６１】
[0079]用語「活性化状態依存性抗体」には、試料中の対象の１つ又は複数の分析物の特定の活性化状態に特異的な（すなわち、それに結合するか、結合されるか、又はそれと複合体を形成する）検出抗体が含まれる。好ましい実施形態では、活性化状態依存性抗体は、１つ又は複数のシグナル伝達分子などの１つ又は複数の分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出する。一部の実施形態では、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー間のヘテロダイマー複合体の形成は活性化状態依存性抗体を用いて検出される。特定の実施形態では、活性化状態依存性抗体は、以下のシグナル伝達分子の１つ又は複数における１つ又は複数のリン酸化部位を検出するのに有用である（リン酸化部位はヒトタンパク質配列のアミノ酸の位置に対応する）：ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１（例えばチロシン（Ｙ）１０６８）；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２（例えばＹ１２４８）；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３（例えばＹ１２８９）；ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４（例えばＹ１２８４）；ｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｙ１００３、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５及び／又はＹ１３４９）；ＳＧＫ３（例えば、トレオニン（Ｔ）２５６及び／又はセリン（Ｓ）４２２）；４Ｅ−ＢＰ１（例えばＴ７０）；ＥＲＫ１（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２及び／又はＹ２０４）；ＥＲＫ２（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２及び／又はＹ２０４）；ＭＥＫ（例えば、Ｓ２１７及び／又はＳ２２１）；ＰＩＫ３Ｒ１（例えばＹ６８８）；ＰＤＫ１（例えばＳ２４１）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔ２２９、Ｔ３８９及び／又はＳ４２１）；ＰＴＥＮ（例えばＳ３８０）；ＡＫＴ１（例えば、Ｓ４７３及び／又はＴ３０８）；ＡＫＴ２（例えば、Ｓ４７４及び／又はＴ３０９）；ＡＫＴ３（例えば、Ｓ４７２及び／又はＴ３０５）；ＧＳＫ−３β（例えばＳ９）；ＮＦＫＢ（例えばＳ５３６）；ＩＫＢ（例えばＳ３２）；ＢＡＤ（例えば、Ｓ１１２及び／又はＳ１３６）；ｍＴＯＲ（例えばＳ２４４８）；Ｒｓｋ−１（例えば、Ｔ３５７及び／又はＳ３６３）；Ｊｎｋ（例えば、Ｔ１８３及び／又はＹ１８５）；Ｐ３８（例えば、Ｔ１８０及び／又はＹ１８２）；ＳＴＡＴ３（例えば、Ｙ７０５及び／又はＳ７２７）；ＦＡＫ（例えば、Ｙ３９７、Ｙ５７６、Ｓ７２２、Ｙ８６１及び／又はＳ９１０）；ＲＢ（例えば、Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ６１２及び／又はＳ７８０）；ＲＢ１（例えばＳ７８０）；アデューシン（例えば、Ｓ６６２及び／又はＳ７２４）；ＰＹＫ２（例えば、Ｙ４０２及び／又はＹ８８１）；ＰＫＣα（例えばＳ６５７）；ＰＫＣα／β（例えば、Ｔ３６８及び／又はＴ６４１）；ＰＫＣδ（例えばＴ５０５）；ｐ５３（例えば、Ｓ３９２及び／又はＳ２０）；ＣＲＥＢ（例えばＳ１３３）；ｃ−Ｊｕｎ（例えばＳ６３）；ｃ−Ｓｒｃ（例えばＹ４１６）；並びにパキシリン（例えば、Ｙ３１及び／又はＹ１１８）。
【００６２】
[0080]用語「活性化状態非依存性抗体」には、それらの活性化状態に関係なく試料中の対象の１つ又は複数の分析物に特異的な（すなわち、それに結合するか、結合されるか、又はそれと複合体を形成する）検出抗体が含まれる。例えば、活性化状態非依存性抗体は、１つ又は複数のシグナル伝達分子などの１つ又は複数の分析物のリン酸化体と非リン酸化体の両方を検出することができる。
【００６３】
[0081]用語「インキュベートする」は、「接触させる」及び「曝露する」と同義に用いられ、特に明記しない限り、いかなる特定の時間又は温度の必要条件も意味しない。
【００６４】
[0082]「受容体チロシンキナーゼ」又は「ＲＴＫ」には、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼモチーフを特徴とする５６（５６）個のタンパク質のファミリーが含まれる。ＲＴＫは細胞シグナル伝達で機能し、増殖、分化、接着、移動及びアポトーシスを調節するシグナルを伝える。受容体チロシンキナーゼの変異による活性化及び／又は過剰発現は、細胞を形質転換し、癌の発達で重要な役割をしばしば演ずる。ＲＴＫは、種々の分子標的剤、例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、イマチニブ、ニロチニブなどの標的になっている。１つのよく特徴づけられたシグナル伝達経路はＭＡＰキナーゼ経路であり、それは、細胞で表皮増殖因子（ＥＧＦ）からのシグナルを細胞増殖の促進に伝達する役割を担う。
【００６５】
[0083]用語「遺伝子」及びその変形は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを含み、それは、コード領域の前後の領域、例えばそれぞれプロモーター及び３’非翻訳領域、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００６６】
[0084]用語「遺伝子型」及びその変形は、例えば、対象の１つ又は複数のバリアントアレルについて二倍体生物体がヘテロ接合であるか又はホモ接合であるかどうかを含む、生物体の遺伝組成を指す。
【００６７】
[0085]用語「多型」及びその変形は、集団での２つ以上の遺伝子的に決定された代替配列又はアレルの出現を指す。「多型部位」は、多様化が起こる遺伝子座を指す。好ましい多型部位は少なくとも２つのアレルを有し、それぞれは集団内で特定の頻度で生じる。多型遺伝子座は、わずか１つの塩基対（例えば、一塩基多型すなわちＳＮＰ）であってもよい。多型マーカーには、制限断片長多型、可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、単純配列反復配列及びＡｌｕなどの挿入要素が含まれる。第１の同定されたアレルは参照アレルと恣意的に呼ばれ、他のアレルは代替アレル、「バリアントアレル」又は「バリアンス」と呼ばれる。選択された集団で最も頻繁に生じるアレルは、「野生型」アレルと時には呼ぶことができる。二倍体生物体は、バリアントアレルについてホモ接合又はヘテロ接合であってもよい。バリアントアレルは、バリアントアレルを有する個体において、観察可能な物理的又は生化学的特徴（「表現型」）を提示してもしなくてもよい。例えば、バリアントアレルは、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を変化させることができるか、又は、代わりに、バリアントアレルは、コードされるタンパク質の酵素活性に影響を及ぼさなくてもよい。
【００６８】
[0086]用語「一塩基多型（ＳＮＰ）」及びその変形は、アレルの中を含むポリヌクレオチドの中の、単一のヌクレオチドの変化を指す。これは、別のものよる１つのヌクレオチドの交換、並びに単一のヌクレオチドの欠失又は挿入を含むことができる。最も一般的には、ＳＮＰはバイアレリックなマーカーであるが、トリ及びテトラアレリックなマーカーも存在し得る。非限定的な例として、ＳＮＰ  Ａ＼Ｃを含む核酸分子は多型位置にＣ又はＡを含むことができる。ＳＮＰの組み合わせについては、「ハプロタイプ」という用語、例えば、相互に連結される単一のＤＮＡ鎖中のＳＮＰの遺伝子型が使用される。一部の実施形態では、用語「ハプロタイプ」は、ＳＮＰアレルの組み合わせ、例えば、単一のＤＮＡ分子の上で一緒に見出されるＳＮＰのアレルを記載するために使用することができる。さらなる実施形態では、ハプロタイプのＳＮＰは相互に連鎖不平衡であってもよい。
【００６９】
[0087]本明細書で用いられる用語「無病生存」及び「ＤＦＳ」には、特定の疾患（例えば癌）について、患者が疾患の徴候なしに（例えば、公知の再発なしに）生存する処置後の時間の長さが含まれる。ある特定の実施形態では、無病生存は特定の療法の有効性を評価するために使用される臨床パラメーターであり、それは通常１年又は５年の単位で測定される。
【００７０】
[0088]用語「無増悪生存」には、特定の疾患（例えば癌）について、患者がその疾患のさらなる症状なしにその疾患を抱えて生きている、処置中及び処置後の時間の長さが含まれる。
【００７１】
[0089]用語「全生存」には、癌などの疾患と診断されたか又はそれを処置された後の既定の期間生存する患者を記載する臨床エンドポイントが含まれる。
【００７２】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0090]本発明は、大腸癌からの腫瘍細胞でのシグナル伝達経路の構成成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化レベル）を検出するための組成物及び方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、大腸癌からの腫瘍細胞で１つ又は複数の体細胞変異（例えば一塩基多型（ＳＮＰ））の存在（又は非存在）を検出する（例えば遺伝子タイピングする）ことをさらに含む。ある特定の態様では、本発明は、１つ又は複数の脱調節されたシグナル伝達経路を下方制御又は閉鎖するための適当な療法を選択するための組成物及び方法も提供する。したがって、本発明のある特定の実施形態は、所与の患者の腫瘍（例えば大腸癌）で全体の及び活性化されたシグナル伝達タンパク質及び／又は体細胞変異の集合によって提供される特定の分子サインに基づいて、パーソナライズされた療法の設計を容易にするために用いることができる。
【００７３】
[0091]特定の態様では、本発明は、大腸癌が抗癌剤に好都合に反応することができるか又は反応する可能性があるかどうかの決定又は予測を可能にする分子マーカー（バイオマーカー）を提供する。具体的な実施形態では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ｃＫＩＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ及び／又はＳＨＣの少なくとも１つ又は複数の発現及び／又は活性化のレベルを測定することは、適切な抗癌剤を選択する、及び／又は大腸癌細胞（例えば、大腸腫瘍からの単離癌細胞）などの細胞におけるそれへの反応性を同定若しくは予測するために特に有用である。他の実施形態では、本発明の方法は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ及び／又はＰＩＫ３ＣＡなどの遺伝子で（例えば、これらの遺伝子の１つ又は複数でのＳＮＰなどの１、２、３、４、５又はそれ以上の多型部位での）１つ又は複数のバリアントアレル（例えば体細胞変異）の存在又は非存在について遺伝子タイピングすることをさらに含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルの決定と組み合わされたバリアントアレルの存在又は非存在の決定は、適切な抗癌剤の選択及び／又は大腸癌細胞（例えば、大腸腫瘍からの単離癌細胞）などの細胞におけるそれへの反応性の同定若しくは予測をさらに支援又は改善する。
【００７４】
[0092]一部の態様では、本発明は、例えば腫瘍手術の後に、大腸癌（ＣＲＣ）を有する対象の生存を予測するための方法であって、
（ａ）単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベル（例えばｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）に基づいてＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数を決定するステップと、
（ｂ）（第１の）参照指数カットオフ（例えばＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照カットオフ比）に対するＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数に基づいて対象の生存を予測するステップと、
を含む方法を提供する。
【００７５】
[0093]他の態様では、本発明は、例えば腫瘍手術の後に、対象における大腸癌（ＣＲＣ）の処置のための療法を選択するための方法であって、
（ａ）単離された癌細胞から生成された細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ受容体の活性化（例えばリン酸化）レベル（例えばｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）に基づいてＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数を決定するステップと、
（ｂ）（第１の）参照指数カットオフ（例えばＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ参照カットオフ比）に対する相対的なＰＩ３Ｋ／ＨＥＲ指数に基づいて、対象におけるＣＲＣの処置のための適切な療法（例えば、抗ＥＧＦＲ療法、抗ＰＩ３Ｋ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗ＨＥＲ３療法、抗ｃＭＥＴ療法、及び／又はＰＩ３Ｋ活性化を駆動する分子を阻害する標的化薬剤による療法）を選択するステップと、
を含む方法を提供する。
【００７６】
[0094]ある特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載されるシグナル伝達分子の１つ又は複数などの１つ又は複数の追加の分析物の（全体の）発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又はステータスを決定することをさらに含む。
【００７７】
[0095]ｉｎ  ｓｉｔｕ活性化状態を保存するために、シグナル伝達タンパク質は、細胞の単離から直に、好ましくは９６、７２、４８、２４、６又は１時間以内に、より好ましくは３０、１５又は５分以内に一般的に抽出される。シグナルトランスデューサ活性化を復活又は刺激するために、単離細胞は通常約１〜３０分、ナノモルからマイクロモル濃度の増殖因子とインキュベートされてもよい（例えば、Ｉｒｉｓｈら、Ｃｅｌｌ、１１８：２１７〜２２８頁（２００４）を参照）。刺激性増殖因子には、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ＴＧＦ−α、ＰＩＧＦ、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、ＮＲＧ１、ＰＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、サイトカインなどが含まれる。個々の患者のための潜在的抗癌療法を評価するために、増殖因子刺激の前、その間及び／又はその後に、単離細胞を種々の用量の１つ又は複数の抗癌剤とインキュベートすることができる。増殖因子刺激は、数分又は数時間（例えば、約１〜５分から約１〜６時間）実施することができる。単離、抗癌剤による処置及び／又は増殖因子刺激の後、当技術分野で公知である任意の技術を使用してシグナル伝達タンパク質を抽出するために細胞は溶解される。好ましくは、細胞溶解は増殖因子刺激から約１〜３６０分後に、より好ましくは２つの異なる時間間隔：（１）増殖因子刺激から約１〜５分後；及び（２）増殖因子刺激から約３０〜１８０分後に開始される。あるいは、溶解物は使用時まで−８０℃に保存することができる。
【００７８】
[0096]一部の実施形態では、抗癌剤は、癌細胞で１つ又は複数の活性化シグナル伝達経路構成成分の機能に干渉する薬剤を含む。このような薬剤の非限定的な例には表１に記載されるものが含まれる。
表１：
【表１−１】
0006478417.tif 000003
【表１−２】
0006478417.tif 000004
【表１−３】
0006478417.tif 000005
【００７９】
[0097]特定の実施形態では、抗癌剤は、抗シグナル伝達剤（すなわち細胞増殖抑制剤）、例えばモノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤；増殖抑制剤；化学療法剤（すなわち細胞毒性薬）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞などの異常な細胞の無制御の増殖を低減又は抑止する能力を有する他の任意の化合物を含む。一部の実施形態では、単離細胞は、少なくとも１つの化学療法剤と併用される、１つ又は複数の抗シグナル伝達剤、増殖抑制剤及び／又はホルモン療法剤で処置される。
【００８０】
[0098]本発明における使用に適した抗シグナル伝達剤の例には：モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、ゲムツズマブ（ミロタルグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））、及びトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（ステント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバー（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、イマチニブメシレート（グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１））、バンデタニブ（ザクチマ（ＺＡＣＴＩＭＡ）（商標）；ＺＤ６４７４）、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、ＨＫＩ−２７２、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００８１】
[0099]例示的な増殖抑制剤には：ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＢＥＺ２３５及びＸＬ７６５；ＡＫＴ阻害剤、例えば、１Ｌ６−ヒドロキシメチル−カイロ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、ＡＰＩ−２、プロトオンコジーンＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５量体ペプチド（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：５３４０７〜５３４１８頁（２００４））、ＫＰ３７２−１、並びにＫｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５：１１４４〜１１４５頁（２００３）、及びＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、４：４６３〜４７６頁（２００３）に記載される化合物；ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、ＰＸ−８６６、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、テトロドトキシンクエン酸塩、マレイン酸チオペラミド、ＧＤＣ−０９４１（９５７０５４−３０−７）、ＩＣ８７１１４、ＰＩ−１０３、ＰＩＫ９３、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＴＧＸ−１１５、ＺＳＴＫ４７４、（−）−デグエリン、ＮＵ７０２６、ミリセチン、タンデュチニブ、ＧＤＣ−０９４１ビスメシレート、ＧＳＫ６９０６９３、ＫＵ−５５９３３、ＭＫ−２２０６、ＯＳＵ−０３０１２、ペリホシン、トリシリビン、ＸＬ−１４７、ＰＩＫ７５、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＰＩ８２８、ＸＬ−７６５、及びＷＨＩ−Ｐ１５４；ＭＥＫ阻害剤、例えば、ＰＤ９８０５９、ＡＲＲＹ−１６２、ＲＤＥＡ１１９、Ｕ０１２６、ＧＤＣ−０９７３、ＰＤ１８４１６１、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１、及びＡＲＲＹ−１４２８８６；並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【００８２】
[0100]全ＨＥＲ阻害剤の非限定的な例には、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８３】
[0101]化学療法剤の非限定的な例には、白金ベースの薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロルエタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソ尿素など）、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ゲムザー（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））など）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドリン酸塩、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、その薬学的に許容される塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８４】
[0102]ホルモン療法剤の例には、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））、レトロゾール（フェマラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））、ボロゾール、エクセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、ホルメスタン（レンタロン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）（登録商標））など）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソホキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド（例えばデキサメタゾン）、フィナステリド、及びゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、例えばゴセレリン、その薬学的に許容される塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、及びそれらの組み合わせが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００８５】
[0103]本発明において有用な癌ワクチンの非限定的な例には、Ａｃｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭ  ＰｈａｒｍａからのＥＰ−２１０１、ＰｈａｒｍｅｘａからのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＩＮＧＮ２２５、及びＢｉｏｍｉｒａ／ＭｅｒｃｋからのＳｔｉｍｕｖａｘが含まれる。
【００８６】
[0104]放射線療法剤の例には、腫瘍抗原に対する抗体に任意選択でコンジュゲートされる、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉなどの放射性核種が含まれる（但し、それらに限定されない）。
【００８７】
[0105]ＨＥＲ２阻害剤の非限定的な例には：モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（登録商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８８】
[0106]ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の非限定的な例には：モノクローナル抗体、例えば、ＡＭＧ１０２及びＭｅｔＭＡｂ；ｃ−Ｍｅｔの小分子阻害剤、例えば、ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＸＬ１８４、ＭＧＣＤ２６５、及びＭＫ−２４６１；及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８９】
[0107]本発明を用いて調べることができるシグナル伝達分子及び経路の非限定的な例には表２に示すものが含まれる。
表２：
【表２−１】
0006478417.tif 000006
【表２−２】
0006478417.tif 000007
【００９０】
[0108]細胞抽出物における発現（例えば総量）レベル及び／又は活性化（例えばリン酸化）レベルについて調べることができるシグナル伝達分子などの分析物の非限定的な例には、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成成分、核ホルモン受容体、核内受容体活性化補助因子、核内受容体リプレッサー、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００９１】
[0109]一実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物における以下の分析物：（１）ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１；（２）ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２；（３）ｐ９５ＨＥＲ２（トランケートされたＨＥＲ２）；（４）ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３；（５）ｃ−Ｍｅｔ；（６）ＩＧＦ１Ｒ；（７）ｃＫｉｔ；（８）ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）；（９）Ｓｈｃ；（１０）Ａｋｔ；（１１）ｐ７０Ｓ６Ｋ；（１２）ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３）及び／又はＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ及び／又はＰＤＧＦＲＢ）；並びに（１３）Ｅｒｋ（例えば、Ｅｒｋ１（ＭＡＰＫ３）及び／又はＥｒｋ２（ＭＡＰＫ１））の少なくとも１つ又は複数の発現レベル（例えば総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化又は複合体形成のレベル）を決定するステップを含む。
【００９２】
[0110]特定の一実施形態では、本発明は、以下の分析物：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ｃＫＩＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、ＡＫＴ、ＥＲＫ（例えば、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）及び／又はＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１））及びＳＨＣの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０個の発現レベル（例えば総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化又は複合体形成のレベル）を決定するステップを含む。
【００９３】
[0111]一部の実施形態では、活性化レベルは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ｃＫＩＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡＫＴ、ＥＲＫ及び／又はＳＨＣのリン酸化レベルに対応する。ある特定の他の実施形態では、活性化レベルは、ＰＩ３Ｋ複合体のレベルに対応する。ＰＩ３Ｋ複合体の例には、二量体化された受容体チロシンキナーゼ対、ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット（例えばＰＩＫ３Ｒ１）、及びＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニット（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ又はＰＩＫ３ＣＢなどのα又はβサブユニット）を含む１つ又は複数の複合体が含まれる（但し、それらに限定されない）（例えば、２０１１年９月２日に出願の米国特許仮出願第６１／５３０，６２１号（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）を参照）。
【００９４】
[0112]ある特定の実施形態では、本発明は、細胞抽出物における１つ又は複数（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上）のさらなる分析物の発現レベル（例えば総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化又は複合体形成のレベル）を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、１つ又は複数（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上）のさらなる分析物は、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成成分、核ホルモン受容体、核内受容体活性化補助因子、核内受容体リプレッサー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分子を含む。
【００９５】
[0113]特定の実施形態では、本発明は、細胞抽出物において以下のさらなる分析物：ＨＥＲ４、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＧＳＫ−３β、Ｒａｆ、ＳＲＣ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴＯＲ、ＥＰＨ−Ａ、ＥＰＨ−Ｂ、ＥＰＨ−Ｃ、ＥＰＨ−Ｄ、ＦＬＴ−３、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ｃ−ＦＭＳ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、ＲＯＮ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、受容体ダイマー、及びそれらの組み合わせのうちの１つ、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上の任意の組み合わせの発現レベル（例えば総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化又は複合体形成のレベル）を決定するステップをさらに含む。
【００９６】
[0114]シグナル伝達分子などの分析物の全体の発現及び活性化（例えばリン酸化）レベルは種々の技術のいずれかを用いて決定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞の細胞抽出物などの試料中のシグナル伝達分子などの分析物の発現及び／又は活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又は状態は、本明細書に記載されるように、単一検出アッセイ又は近接二重検出アッセイ（例えばＣＥＥＲ（商標））などのイムノアッセイで検出される。
【００９７】
[0115]ある特定の実施形態では、１つ又は複数の分析物の発現（例えば全体の）レベルを決定することは、
（ｉ）細胞から生成した細胞抽出物を１つ又は複数の希釈系列の捕捉抗体（例えば、１つ又は複数の分析物に特異的な捕捉抗体）とインキュベートして（例えば接触させて）、複数の捕捉された分析物を形成するステップであって、捕捉抗体は（例えば、細胞抽出物に存在する分析物を分析物及び捕捉抗体を含む捕捉された分析物の複合体に変換するために）固体支持体の上に拘束されるステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体（例えば、１つ又は複数の分析物に特異的な第１及び第２の活性化状態非依存性抗体）を含む検出抗体とインキュベートして（例えば接触させて）、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する（例えば、捕捉された分析物の複合体を捕捉された分析物及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換する）ステップであって、第１の活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーに導かれてそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば接触させて）増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【００９８】
[0116]ある特定の他の実施形態では、トランケートされた受容体（例えばｐ９５ＨＥＲ２）である１つ又は複数の分析物の発現（例えば全体の）レベルを決定することは、
（ｉ）細胞から生成される細胞抽出物を完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）ステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を除去して完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を欠く細胞抽出物を形成する（例えば、細胞抽出物を特異的完全長受容体又は完全長受容体ファミリーを欠く細胞抽出物に変換する）ステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を欠く細胞抽出物を、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして（例えば接触させて）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップであって、捕捉抗体は固体支持体の上に拘束される（例えば、完全長受容体を欠く細胞抽出物に存在するトランケートされた受容体をトランケートされた受容体及び捕捉抗体の複合体に変換する）ステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体を形成する（例えば、捕捉されたトランケートされた受容体の複合体を捕捉されたトランケートされた受容体及び検出抗体を含む検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体の複合体に変換する）ステップであって、第１の活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーに導かれてそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば接触させて）増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【００９９】
[0117]第１の活性化状態非依存性抗体は、促進部分で直接的に標識することができるか、又は例えば、第１の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドと促進部分にコンジュゲートされる相補的なオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを介して促進部分で間接的に標識することができる。同様に、第２の活性化状態非依存性抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接的に標識することができるか、又は例えば、第２の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされる結合対の第１のメンバーとシグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされる結合対の第２のメンバーとの間の結合を介して、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識することができる。ある特定の場合には、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジン又はニュートラアビジンなどのアビジンである。
【０１００】
[0118]一部の実施形態では、促進部分は例えばグルコースオキシダーゼである。ある特定の場合には、グルコースオキシダーゼ及び第１の活性化状態非依存性抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例１６〜１７に記載されるように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００又は７５０ｋＤａ）の分子量を一般的に有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってもよい。さらに他の実施形態では、シグナル増幅対の第１のメンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってもよい。さらなる実施形態では、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えばビオチン−チラミド）であってもよい。増幅されるシグナルは、活性化チラミドを生成するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換する）のが好ましい。活性化チラミドは、直接的に検出するか、又は例えばシグナル検出試薬の添加によって間接的に検出することができる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識蛍光団、及びストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色性試薬との組み合わせが含まれる。
【０１０１】
[0119]ある特定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び第２の活性化状態非依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされてもよい。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｋＤａ）の分子量を有する。
【０１０２】
[0120] トランケートされた受容体は一般的に完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。特定の実施形態では、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にも縛られることなく、例えば、短縮されたＥＣＤを有するトランケートされた受容体又は膜関連若しくはサイトゾルのＩＣＤ断片を含むトランケートされた受容体を形成するために、トランケートされた受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク分解プロセシングを通じて、又は膜貫通ドメインの前方、内部又は後方に位置するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって発生することができる。
【０１０３】
[0121]ある特定の好ましい実施形態では、トランケートされた受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する完全長受容体はＨＥＲ２である。しかし、当業者は、トランケートされたタンパク質を検出するための本明細書に記載される方法が、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ変異体（神経膠芽腫、大腸癌などにおいて結びつけられている）、他のトランケートされた受容体チロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含む（但し、それらに限定されない）いくつかの異なるタンパク質に適用できることを理解するであろう。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例１２は、マルチプレックス、ハイスループット、優れたダイナミックレンジを有する近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを使用して細胞でｐ９５ＨＥＲ２などのトランケートされた受容体を検出するための本発明のアッセイ方法の例示的な実施形態を提供する。
【０１０４】
[0122]一部の実施形態では、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ストレプトアビジンはビーズに結合され、ビオチンは抗体に結合される。ある特定の場合には、抗体は、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１０５】
[0123]一部の実施形態では、捕捉抗体の各希釈系列は、捕捉抗体の一連の下降濃度を含む。ある特定の場合には、捕捉抗体は、少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００又は１０００倍）に連続希釈されて、アレイの上にスポットされる捕捉抗体の設定数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又はそれ以上）の下降濃度を含む希釈系列を生成する。少なくとも２、３、４、５又は６反復の各捕捉抗体希釈がアレイの上にスポットされるのが好ましい。
【０１０６】
[0124]他の実施形態では、固体支持体は、ガラス（例えばガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の適切な基材を含む。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、ニトロセルロースポリマーをコーティングされたガラススライド（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から市販されているＦＡＳＴ（登録商標）スライド）の上に（例えば、共有結合又は非共有相互作用を介して）拘束される。本発明における使用に適した抗体アレイを構築するための例示的な方法は例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に記載されている。
【０１０７】
[0125]さらなる実施形態では、１つ又は複数の分析物の活性化レベルを決定するステップは、細胞抽出物における１つ又は複数の分析物のリン酸化レベルを、検出される分析物の各々のリン酸化された形に特異的である抗体で検出するステップを含む。
【０１０８】
[0126]リン酸化レベル及び／又はステータスは種々の技術のいずれかを用いて決定することができる。例えば、リン酸化されたタンパク質が、タンパク質のリン酸化された形態を特異的に認識する抗体を用いるイムノアッセイによって検出することができることは、当技術分野で周知である（例えば、Ｌｉｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９３：１３７２〜１３８１頁（２００５）を参照）。イムノアッセイは、概して、イムノブロッティング（例えばウエスタンブロット法）、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを含む。イムノアッセイのより具体的なタイプは、抗原捕捉／抗原競合、抗体捕捉／抗原競合、二抗体サンドイッチ、抗体捕捉／抗体過剰、及び抗体捕捉／抗原過剰を含む。抗体の作製方法は、本明細書、及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡに記載されている。ホスホ特異的抗体は新規に作製することができるか、又は民間若しくは非民間の供給者から得られる。リン酸化レベル及び／又はステータスは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ又は［γ−３３Ｐ］ＡＴＰの形態の放射性リン酸で細胞を代謝的に標識することによって決定することもできる。リン酸化されたタンパク質は放射性になり、したがってシンチレーション計数、Ｘ線撮影などを通じて追跡可能及び定量化可能になる（例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：７６０５〜７６０８頁（１９７８）を参照）。例えば、代謝的に標識されたタンパク質を細胞から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、膜に移し、特定の分析物に特異的な抗体で探り、オートラジオグラフィーにかけて３２Ｐ又は３３Ｐを検出することができる。あるいは、膜移転及び抗体プロービングの前にゲルをオートラジオグラフィーにかけることができる。
【０１０９】
[0127]特定の実施形態では、試料中の１つ又は複数の分析物の各々の活性化（例えばリン酸化）レベル及び／又は状態は、本明細書に記載されるように単一検出アッセイ又は近接二重検出アッセイ（例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅイムノアッセイ（ＣＥＥＲ））などのイムノアッセイで検出される。
【０１１０】
[0128]ある特定の実施形態では、１つ又は複数の分析物の活性化（例えばリン酸化）レベルを決定することは、
（ｉ）細胞から生成した細胞抽出物を捕捉抗体（例えば、１つ又は複数の分析物に特異的な捕捉抗体）の希釈系列とインキュベートして（例えば接触させて）、複数の捕捉された分析物を形成するステップであって、捕捉抗体は固体支持体の上に拘束される（例えば、細胞抽出物に存在する分析物を分析物及び捕捉抗体を含む捕捉された分析物の複合体に変換する）ステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体（例えば、１つ又は複数の分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体）及び対応する分析物に特異的な活性化状態依存性抗体（例えば、１つ又は複数の分析物に特異的な活性化状態依存性抗体）を含む検出抗体とインキュベートして（例えば接触させて）、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する（例えば、捕捉された分析物の複合体を捕捉された分析物及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換する）ステップであって、活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば接触させて）増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１１１】
[0129]ある特定の他の実施形態では、トランケートされた受容体（例えばｐ９５ＨＥＲ２）である１つ又は複数の分析物の活性化（例えばリン酸化）レベルを決定することは、
（ｉ）細胞から生成される細胞抽出物を完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば接触させる）ステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を除去して完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を欠く細胞抽出物を形成する（例えば、細胞抽出物を特異的完全長受容体又は完全長受容体ファミリーを欠く細胞抽出物に変換する）ステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）を欠く細胞抽出物を、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な複数の捕捉抗体とインキュベートして（例えば接触させて）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップであって、捕捉抗体は固体支持体の上に拘束される（例えば、完全長受容体を欠く細胞抽出物に存在するトランケートされた受容体をトランケートされた受容体及び捕捉抗体の複合体に変換する）ステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして（例えば接触させて）、複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体を形成する（例えば、捕捉されたトランケートされた受容体の複合体を捕捉されたトランケートされた受容体及び検出抗体を含む検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体の複合体に変換する）ステップであって、活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながり、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば接触させて）増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１１２】
[0130]活性化状態非依存性抗体は、促進部分で直接的に標識することができるか、又は例えば、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドと促進部分にコンジュゲートされる相補的なオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを介して促進部分で間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接的に標識することができるか、又は例えば、活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされる結合対の第１のメンバーとシグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされる結合対の第２のメンバーとの間の結合を介して、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識することができる。ある特定の場合には、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジン又はニュートラアビジンなどのアビジンである。
【０１１３】
[0131]一部の実施形態では、促進部分は、例えばグルコースオキシダーゼであってもよい。ある特定の場合には、グルコースオキシダーゼ及び活性化状態非依存性抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例１６〜１７に記載されるように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００又は７５０ｋＤａ）の分子量を一般的に有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってもよい。さらに他の実施形態では、シグナル増幅対の第１のメンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってもよい。さらなる実施形態では、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えばビオチン−チラミド）であってもよい。増幅されるシグナルは、活性化チラミドを生成するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換する）のが好ましい。活性化チラミドは、直接的に検出するか、又は例えばシグナル検出試薬の添加によって間接的に検出することができる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識蛍光団、及びストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色性試薬との組み合わせが含まれる。
【０１１４】
[0132]ある特定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び活性化状態依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされてもよい。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｋＤａ）の分子量を一般的に有する。
【０１１５】
[0133] トランケートされた受容体は一般的に完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。ある特定の実施形態では、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にも縛られることなく、例えば、短縮されたＥＣＤを有するトランケートされた受容体又は膜関連若しくはサイトゾルのＩＣＤ断片を含むトランケートされた受容体を形成するために、トランケートされた受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク分解プロセシングを通じて、又は膜貫通ドメインの前方、内部又は後方に位置するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって発生することができる。
【０１１６】
[0134]ある特定の好ましい実施形態では、トランケートされた受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する完全長受容体はＨＥＲ２である。しかし、当業者は、トランケートされたタンパク質を検出するための本明細書に記載される方法が、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ変異体（神経膠芽腫、大腸癌などにおいて結びつけられている）、他のトランケートされた受容体チロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含む（但し、それらに限定されない）いくつかの異なるタンパク質に適用できることを理解するであろう。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例１２は、マルチプレックス、ハイスループット、優れたダイナミックレンジを有する近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを使用して細胞でｐ９５ＨＥＲ２などのトランケートされた受容体を検出するための本発明のアッセイ方法の例示的な実施形態を提供する。
【０１１７】
[0135]一部の実施形態では、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ストレプトアビジンはビーズに結合され、ビオチンは抗体に結合される。ある特定の場合には、抗体は、完全長受容体（例えば完全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１１８】
[0136]一部の実施形態では、捕捉抗体の各希釈系列は、捕捉抗体の一連の下降濃度を含む。ある特定の場合には、捕捉抗体は、少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００又は１０００倍）に連続希釈されて、アレイの上にスポットされる捕捉抗体の設定数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又はそれ以上）の下降濃度を含む希釈系列を生成する。少なくとも２、３、４、５又は６反復の各捕捉抗体希釈がアレイの上にスポットされるのが好ましい。
【０１１９】
[0137]他の実施形態では、固体支持体は、ガラス（例えばガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の適切な基材を含む。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、ニトロセルロースポリマーをコーティングされたガラススライド（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から市販されているＦＡＳＴ（登録商標）スライド）の上に（例えば、共有結合又は非共有相互作用を介して）拘束される。本発明における使用に適した抗体アレイを構築するための例示的な方法は例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に記載されている。
【０１２０】
ＩＶ．単一検出アッセイ
[0138]一部の実施形態では、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物における対象の１つ又は複数の分析物の発現及び／又は活性化のレベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重、ハイスループット二抗体アッセイである。非限定的な例として、アッセイで用いられる２つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、及び（２）分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち活性化状態依存性抗体）を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出することが可能である。あるいは、検出抗体は、細胞抽出物における分析物の総量を検出する活性化状態非依存性抗体を含む。活性化状態非依存性抗体は、分析物の活性化体及び非活性化体の両方を検出することが一般に可能である。
【０１２１】
[0139]特定の一実施形態では、対象の分析物の発現又は活性化のレベルを検出するための二抗体アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、検出抗体は分析物の活性化（例えばリン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は分析物の発現レベル（例えば総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含むステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１２２】
[0140]本明細書に記載される二抗体アッセイは、典型的には、異なるアドレス可能な場所の固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体を一定範囲の捕捉抗体濃度で含む抗体ベースのアレイである。本発明における使用に適した固体支持体の例は上述の通りである。
【０１２３】
[0141]捕捉抗体及び検出抗体は、分析物との結合（すなわち、捕捉及び検出抗体の両方はそれらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）に関してそれらの間の競合を最小にするように選択されるのが好ましい。
【０１２４】
[0142]一実施形態では、検出抗体は結合対の第１のメンバー（例えばビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは結合対の第２のメンバー（例えばストレプトアビジン）を含む。結合対メンバーは、当分野で周知の方法を用いて検出抗体に、又はシグナル増幅対の第１のメンバーに直接又は間接的に結合することができる。ある特定の場合には、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨウ素酵素など）であり、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド試薬（例えばビオチン−チラミド）である。これらの場合には、増幅されるシグナルはチラミド試薬のペルオキシダーゼ酸化によって生成され、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化チラミドを生成する。
【０１２５】
[0143]活性化チラミドは直接的に検出されるか、又はシグナル検出試薬、例えば、ストレプトアビジン標識蛍光団、又はストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色性試薬との組み合わせの添加により検出される。本発明における使用に適した蛍光団の例には、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）色素（例えば、アレクサフルオール（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる（但し、それらに限定されない）。ストレプトアビジン標識は、当分野で周知の方法を用いて蛍光団又はペルオキシダーゼに直接又は間接的に結合することができる。本発明における使用に適した発色性試薬の非限定的な例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【０１２６】
[0144]本明細書に記載される二抗体アッセイを実施するための例示的プロトコールは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例３で提供されている。
【０１２７】
[0145]二抗体法の別の実施形態では、本発明は、トランケートされた受容体の発現又は活性化のレベルを検出する方法であって、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な補足されたトランケートされた受容体を形成するステップであって、検出抗体はトランケートされた受容体の活性化（例えばリン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又はトランケートされた受容体の発現レベル（例えば総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含むステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１２８】
[0146]ある特定の実施形態では、トランケートされた受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。ある特定の他の実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合され、ビオチンは抗体に結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０１２９】
[0147]ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の図１４Ａは、対象の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体でコーティングされたビーズが完全長受容体（例えばＨＥＲ２）に結合するが、トランケートされた受容体（例えばｐ９５ＨＥＲ２）に結合せず、アッセイからあらゆる完全長受容体を除去することを示す。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７の図１４Ｂは、トランケートされた受容体（例えばｐ９５ＨＥＲ２）が捕捉抗体に結合すると、次に完全長受容体（例えばＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に特異的な検出抗体によって検出することができることを示す。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接にコンジュゲートすることができる。検出するシグナルを生成するために、次にチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を実施することができる。トランケートされた受容体（例えばｐ９５ＨＥＲ２）の発現レベル又は活性化状態は、例えば、その全体の濃度若しくはそのリン酸化状態、ユビキチン化状態及び／又は複合体生成状態を決定するために調べることができる。
【０１３０】
[0148]別の実施形態では、本発明は、（ａ）固体支持体に拘束される１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系列；及び（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化状態非依存性抗体及び／又は活性化状態依存性抗体）を含む、上記の二抗体アッセイを実施するためのキットを提供する。場合によっては、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現レベル及び／又は活性化状態を検出するためにキットを用いる方法の指示書をさらに含むことができる。キットは、本発明の特定の方法の実施に関して上に記載される追加の試薬、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、洗浄バッファーなどのいずれかを含むこともできる。
【０１３１】
Ｖ．近接二重検出アッセイ
[0149]一部の実施形態では、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物における対象の１つ又は複数の分析物の発現及び／又は活性化のレベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重、ハイスループット近接（すなわち三抗体）アッセイである。非限定的な例として、近接アッセイで用いられる３つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち活性化状態依存性抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する検出抗体（すなわち活性化状態非依存性抗体）を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば分析物のリン酸化、ユビキチン化及び／又は複合体生成状態を検出することが可能であるが、活性化状態非依存性抗体は、分析物の総量（すなわち、活性化と非活性化の両方の形）を検出することが可能である。
【０１３２】
[0150]特定の一実施形態では、対象の分析物の活性化のレベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながってそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１３３】
[0151]別の特定の実施形態では、トランケートされた受容体である対象の分析物の活性化のレベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップであって、活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分はシグナル増幅対の第１のメンバーにつながってそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１３４】
[0152]ある特定の実施形態では、トランケートされた受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。ある特定の他の実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合され、ビオチンは抗体に結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０１３５】
[0153]代替の実施形態では、活性化状態依存性抗体は促進部分で標識されてもよく、活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されてもよい。
【０１３６】
[0154]別の非限定的な例として、近接アッセイで用いられる３つの抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）分析物の総量を検出する第１の検出抗体（すなわち第１の活性化状態非依存性抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する第２の検出抗体（すなわち第２の活性化状態非依存性抗体）を含むことができる。好ましい実施形態では、第１及び第２の活性化状態非依存性抗体は分析物上の異なる（例えば別個の）エピトープを認識する。
【０１３７】
[0155]特定の一実施形態では、対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の１つ又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成するステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するステップであって、第１の活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにつながってそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１３８】
[0156]別の特定の実施形態では、トランケートされた受容体である対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去し、それによって完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケートされた受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体を形成するステップであって、第１の活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識され、第２の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにつながってそれと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケートされた受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成される増幅されたシグナルを検出するステップと、
を含む。
【０１３９】
[0157]ある特定の実施形態では、トランケートされた受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。ある特定の他の実施形態では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合され、ビオチンは抗体に結合される（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的な場合）。
【０１４０】
[0158]代替の実施形態では、第１の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されてもよく、第２の活性化状態非依存性抗体は促進部分で標識されてもよい。
【０１４１】
[0159]本明細書に記載される近接アッセイは、典型的には、異なるアドレス可能な場所の固体支持体の表面に結合している１つ又は複数の異なる捕捉抗体を一定範囲の捕捉抗体濃度で含む抗体ベースのアレイである。本発明における使用に適した固体支持体の例は上述の通りである。
【０１４２】
[0160]捕捉抗体、活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体は、分析物との結合（すなわち、すべての抗体はそれらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）に関してそれらの間の競合を最小にするように選択されるのが好ましい。
【０１４３】
[0161]一部の実施形態では、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、又は分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、検出可能な部分をさらに含む。このような場合には、検出可能な部分の量は、細胞抽出物における分析物の１つ又は複数の量と相関する。検出可能な部分の例には、蛍光性標識、化学反応性標識、酵素標識、放射性標識などが含まれる（但し、それらに限定されない）。検出可能な部分は、アレクサフルオール（登録商標）色素（例えばアレクサフルオール（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などの蛍光団であるのが好ましい。検出可能な部分は、当分野で周知の方法を用いて活性化状態非依存性抗体に直接的又は間接的に結合することができる。
【０１４４】
[0162]特定の場合には、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体又は分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は促進部分で直接的に標識される。促進部分は、当分野で周知の方法を用いて活性化状態非依存性抗体に結合することができる。本発明における使用のための適切な促進部分には、促進部分に近接する（すなわち、空間的に近いか近接する）別の分子につながり（すなわち向けられ）、それと反応する（すなわち、結合するか、結合されるか、又は複合体を形成する）酸化剤を生成することが可能であるいかなる分子も含まれる。促進部分の例には、酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、又は電子受容体として分子酸素（Ｏ２）を含む酸化／還元反応を触媒する他の任意の酵素、及び光増感剤、例えば、メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアラート色素、フタロシアニンなどが含まれる（但し、それらに限定されない）。酸化剤の非限定的な例には、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応で酸素原子を渡すか電子を得る他の任意の化合物が含まれる。適切な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下において、促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、その２つの部分が相互に近接する場合にシグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基で保護されるハプテン、酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化される酵素など）につながってそれと反応する酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、単一酸素など）を生成するのが好ましい。
【０１４５】
[0163]他の特定の場合には、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、又は分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーと促進する部分にコンジュゲートされる相補的なオリゴヌクレオチドリンカーとの間のハイブリダイゼーションを介して促進部分で間接的に標識される。オリゴヌクレオチドリンカーは、当分野で周知の方法を用いて促進部分又は活性化状態非依存性抗体に結合することができる。一部の実施形態では、促進部分にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーと１００％の相補性を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションの結果、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれ以上のミスマッチ領域を含む。当業者は、異なる分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体が、同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーにコンジュゲートできることを理解するであろう。
【０１４６】
[0164]促進部分又は活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーの長さは、変更することができる。一般に、リンカー配列は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドであってもよい。一般的に、結合のためにランダムな核酸配列が生成される。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリーは、スペーサードメイン、サインドメイン及びコンジュゲーションドメインの３つの異なる連続したドメインを有するように設計することができる。オリゴヌクレオチドリンカーは、それらがコンジュゲートされる促進部分又は活性化状態非依存性抗体の機能を破壊することのない、効率的な結合のために設計されるのが好ましい。
【０１４７】
[0165]オリゴヌクレオチドリンカー配列は、種々のアッセイ条件の下でいかなる二次構造の形成も阻止又は最小にするように設計することができる。通常、リンカー中のセグメント毎に融点を注意深くモニターして、アッセイ全体へのそれらの関与を可能にする。一般に、リンカー配列のセグメントの融点の範囲は、１〜１０℃である。各リンカー中の３つの異なるドメインの各々を分析するために、規定のイオン濃度の下で融点、二次構造及びヘアピン構造を決定するためのコンピューターアルゴリズム（例えばＯＬＩＧＯ６．０）を使用することができる。合わせた配列全体は、それらの構造特徴づけ及び他のコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカー配列とのそれらの比較のために、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でそれらが相補的なオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするかどうかについて分析することもできる。
【０１４８】
[0166]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域は、オリゴヌクレオチド架橋部位からのコンジュゲーションドメインの十分な分離を提供する。コンジュゲーションドメインは、相補的なオリゴヌクレオチドリンカー配列で標識された分子を、核酸ハイブリダイゼーションを介してコンジュゲーションドメインに連結する働きをする。核酸媒介ハイブリダイゼーションは、抗体−分析物（すなわち抗原）複合体の形成の前又は後に実施することができ、より柔軟なアッセイフォーマットを提供する。多くの直接的な抗体コンジュゲーション方法と異なって、比較的小さなオリゴヌクレオチドを抗体又は他の分子に連結することは、抗体のそれらの標的分析物との特異的親和性に、又はコンジュゲートされる分子の機能に最小限の影響を及ぼす。
【０１４９】
[0167]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーのサイン配列ドメインは、複合多重化タンパク質アッセイで用いることができる。異なるサイン配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーに、複数の抗体をコンジュゲートすることができる。多重イムノアッセイでは、抗体とそれらの抗原との間の交差反応性を多重アッセイフォーマットで検出するために、適当なプローブで標識されたリポーターオリゴヌクレオチド配列を用いることができる。
【０１５０】
[0168]オリゴヌクレオチドリンカーは、いくつかの異なる方法を用いて抗体又は他の分子にコンジュゲートすることができる。例えば、オリゴヌクレオチドリンカーは、５’又は３’末端のチオール基で合成することができる。チオール基は、還元剤（例えばＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を用いて脱保護することができ、生じるリンカーは脱塩スピンカラムを用いることによって精製することができる。生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーは、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能基架橋リンカーを用いて抗体又は他の型のタンパク質の一級アミンにコンジュゲートすることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドの上の５’リン酸基は、水溶性カルボジイミドＥＤＣで処理してリン酸エステルを形成し、その後アミン含有分子に結合することができる。ある特定の場合には、３’リボース残基上のジオールは、アルデヒド基に酸化し、その後還元アミノ化を用いて抗体又は他の型のタンパク質のアミン基にコンジュゲートすることができる。特定の他の場合には、オリゴヌクレオチドリンカーは、３’又は５’末端のビオチン改変で合成して、ストレプトアビジン標識分子にコンジュゲートすることができる。
【０１５１】
[0169]オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：７８４５頁（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：５４３３頁（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３：２６７７〜２６８４頁（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４：５９頁（１９９７）に記載されるものなどの、当技術分野で公知の種々の技術のいずれかを用いて合成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドの合成では、一般的な核酸保護基及び結合基、例えば５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホラミダイトを利用する。オリゴヌクレオチド合成のための適切な試薬、核酸脱保護の方法、及び核酸精製方法は当業者に公知である。
【０１５２】
[0170]特定の場合には、分析物の１つ又は複数の活性化レベルを検出するための活性化状態依存性抗体、又は分析物の１つ又は複数の発現レベルを検出するための第２の活性化状態非依存性抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接的に標識される。シグナル増幅対メンバーは、当分野で周知の方法を用いて、活性化レベルを検出するために活性化状態依存性抗体に、又は発現レベルを検出するために第２の活性化状態非依存性抗体に結合することができる。特定の他の場合には、活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体は、活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされる結合対の第１のメンバーとシグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされる結合対の第２のメンバーとの間の結合を介して、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識される。結合対メンバー（例えばビオチン／ストレプトアビジン）は、当分野で周知の方法を用いて、シグナル増幅対メンバーに、又は活性化状態依存性抗体若しくは第２の活性化状態非依存性抗体に結合することができる。シグナル増幅対のメンバーの例には、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨウ素酵素などが含まれる（但し、それらに限定されない）。シグナル増幅対メンバーの他の例には、保護基によって保護されるハプテン、及び酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化される酵素が含まれる。
【０１５３】
[0171]近接チャネリングの１つの例では、促進部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させると、それは酸化剤（すなわち過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））を生成する。ＨＲＰがＧＯに近接するチャネリングの中にある場合、ＧＯによって生成されるＨ２Ｏ２はＨＲＰとつながって複合体化し、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成するが、それは、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、化学発光基質、例えば、ルミノール若しくはイソルミノール、又は蛍光原基質、例えば、チラミド（例えばビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、又は４−ヒドロキシフェニル酢酸）の存在下で、増幅されたシグナルを生成する。ＧＯ及びＨＲＰを近接アッセイで使用する方法は、例えば、Ｌａｎｇｒｙら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ番号ＵＣＲＬ−ＩＤ−１３６７９７（１９９９）に記載される。ビオチン−チラミドがシグナル増幅対の第２のメンバーとして用いられる場合は、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体はチラミドを酸化して、近くの求核残基と共有結合する反応性チラミドラジカルを生成する。活性化チラミドは直接的に検出されるか、又はシグナル検出試薬、例えばストレプトアビジン標識蛍光団、又はストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色性試薬との組み合わせの添加により検出される。本発明における使用に適した蛍光団の例には、アレクサフルオール（登録商標）色素（例えばアレクサフルオール（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる（但し、それらに限定されない）。ストレプトアビジン標識は、当分野で周知の方法を用いて蛍光団又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的に結合することができる。本発明における使用に適した発色性試薬の非限定的な例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【０１５４】
[0172]近接チャネリングの別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは、特異的結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）へのそのハプテンの結合を阻止する保護基で保護されている複数のハプテンで標識される大きな分子である。例えば、シグナル増幅対のメンバーは、保護されたビオチン、クマリン及び／又はフルオレセイン分子で標識されるデキストラン分子であってもよい。適切な保護基には、フェノキシ、アナリノ、オレフィン、チオエーテル及びセレノエーテルの保護基が含まれる（但し、それらに限定されない）。本発明の近接アッセイにおける使用に適した追加の光増感剤及び保護されたハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載される。光増感剤が光によって励起される場合、それは酸化剤（すなわち一重項酸素）を生成する。ハプテン分子が光増感剤に近接したチャネリングの中にある場合は、光増感剤によって生成される一重項酸素はハプテンの保護基の上のチオエーテルにつながり、それと反応してカルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を生じ、ハプテンから保護基を放出する。保護されていないハプテンは、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成することができる特異的結合パートナー）に特異的に結合するのに利用可能である。例えば、ハプテンがビオチンである場合は、特異的結合パートナーは酵素標識ストレプトアビジンであってもよい。例示的な酵素には、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが含まれる。未結合の試薬を除去するために洗浄した後、検出可能なシグナルは、酵素の検出可能な（例えば、蛍光性、化学発光性、発色性など）基質を加えることによって生成することができ、当技術分野で公知の適切な方法及び装置を用いて検出することができる。あるいは、検出可能なシグナルは、チラミドシグナル増幅を用いて増幅することができ、活性化されたチラミドは、前記の通り直接的に検出するか又はシグナル検出試薬の添加により検出することができる。
【０１５５】
[0173]近接チャネリングのさらに別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素及び阻害剤（例えばホスホン酸標識デキストラン）は、切断可能なリンカー（例えばチオエーテル）によって相互に連結される。光増感剤が光によって励起される場合、それは酸化剤（すなわち一重項酸素）を生成する。酵素−阻害剤複合体が光増感剤に近接するチャネリングの中にある場合は、光増感剤によって生成される一重項酸素は切断可能なリンカーにつながってそれと反応し、酵素から阻害剤を放出し、それによって酵素を活性化する。検出可能なシグナルを生成するために酵素基質が添加され、或いは、増幅されたシグナルを生成するために増幅試薬が添加される。
【０１５６】
[0174]近接チャネリングのさらなる例では、促進部分はＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは前記の通り保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は反応性フェニレンジイミンを生成し、それは、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体につながり、ｐ−アルコキシフェノール保護基と反応して露出したハプテン又は反応性酵素を生じる。増幅されたシグナルは、前記のように生成され、検出される（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び第５，４４５，９４４号を参照）。
【０１５７】
[0175]本明細書に記載される近接アッセイを実施するための例示的プロトコールはＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０８６３７（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）の実施例４で提供されている。
【０１５８】
[0176]別の実施形態では、本発明は、（ａ）固体支持体に拘束される１つ又は複数の捕捉抗体の希釈系列；並びに（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体の組み合わせ及び／又は発現レベルを検出するための第１及び第２の活性化状態非依存性抗体の組み合わせ）を含む上記近接アッセイを実施するためのキットを提供する。一部の場合には、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するためにキットを用いる方法の指示書をさらに含むことができる。キットは、本発明の特定の方法の実施に関して上で記載されている追加の試薬、例えばシグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、促進部分のための基質、洗浄バッファーなどのいずれかを含むこともできる。
【０１５９】
ＶＩ．遺伝子タイピング方法
[0177]試料（例えば核酸試料）が特異的なバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプを含有するかどうかを決定するために、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＥＧＦＲ遺伝子などの癌遺伝子の多型部位で個体を遺伝子タイピングするために、種々の手段を使用することができる。例えば、個体からの核酸の酵素増幅は、以降の分析のための核酸を得るために都合よく使用することができる。対象の１つ又は複数の癌遺伝子での特異的バリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在は、酵素増幅なしで個体の核酸から直接的に決定することもできる。ある特定の実施形態では、個体は、対象の１つ又は複数の癌遺伝子での一塩基多型（ＳＮＰ）などの、１、２、３、４、５又はそれ以上の数の多型部位で遺伝子タイピングされる。
【０１６０】
[0178]増幅されたかどうかにかかわらず、個体からの核酸の遺伝子タイピングは、種々の技術のいずれかを使用して実施することができる。有用な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの解析アッセイ、配列解析アッセイ、電気泳動法アッセイ、制限長多型解析アッセイ、ハイブリダイゼーション解析アッセイ、アレル特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアレル特異的伸長／ライゲーション、アレル特異的増幅、一塩基伸張、分子反転プローブ、侵襲的切断、選択的終止、制限長多型、配列決定、単一鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）、単一鎖多型、ミスマッチ切断及び変性勾配ゲル電気泳動などのアッセイが含まれ（但し、それらに限定されない）、それらのすべては単独で又は併用で使用することができる。本明細書において、用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む。）などのポリヌクレオチドを含む。この用語は、天然及び合成起源の核酸分子、並びに天然の核酸分子のセンス又はアンチセンス鎖、又はその両方を表す直鎖状、環状又は分枝状の配置の分子を包含する。そのような核酸は未精製であるか、精製されているか、又は例えばビーズ若しくはカラム基材などの合成材料に付着していてもよいと理解される。
【０１６１】
[0179]特定の実施形態では、対象の１つ又は複数の癌遺伝子でのバリアントアレル（例えば体細胞変異）の存在又は非存在は、２０１１年８月１８日に出願の米国特許仮出願第６１／５２５，１３７号及び２０１２年１月１８日に出願の米国特許仮出願第６１／５８８，１５１号（それらの開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に記載されているように、遺伝子タイピングアッセイを用いて決定される。
【０１６２】
[0180]核酸含有材料は個体からルーチン的に得られる。そのような材料は、核酸を調製することができる任意の生体物質である。非限定的な例として、材料は、核酸を含有する全血、血清、血漿、唾液、頬スワブ、喀痰、又は他の体液若しくは組織であってもよい。一実施形態では、本発明の方法は、非侵襲的手段によって容易に得ることができ、ゲノムＤＮＡの調製のために使用することができる全血で実施される。別の実施形態では、遺伝子タイピングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する個体の核酸の増幅を伴う。核酸の増幅のためのＰＣＲの使用は当技術分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら（編）、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）を参照）。さらに別の実施形態では、ＰＣＲ増幅は１つ又は複数の蛍光標識プライマーを用いて実施される。さらなる実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡ副溝結合剤を含む１つ又は複数の標識又は非標識のプライマーを用いて実施される。
【０１６３】
[0181]本発明の方法でバリアントアレル（例えば体細胞変異）の存在又は非存在を決定するために、種々の異なるプライマーのいずれかを使用してＰＣＲにより個体の核酸を増幅することができる。当業者によって理解されるように、ＰＣＲ解析のためのプライマーは、対象の遺伝子中の対象の多型部位（複数可）に連なっている配列に基づいて設計することができる。非限定的な例として、配列プライマーは、対象の遺伝子中の対象の多型部位の上流又は下流の配列の約１５〜約３０ヌクレオチドを含有することができる。そのようなプライマーは、増幅反応で安定したアニーリング工程を可能にする高い融点を達成するのに十分なグアニン及びシトシン含有量を有するように一般に設計される。ＰＣＲプライマーの設計を助けるために、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔなどのいくつかのコンピュータプログラムが利用できる。
【０１６４】
[0182]Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手できるＴａｑｍａｎ（登録商標）アレル識別アッセイは、多型部位で個体を遺伝子タイピングし、それにより対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アレル識別アッセイでは、各アレルのために特異的蛍光色素標識プローブが構築される。プローブは、各アレルの増幅を識別するために、ＦＡＭ及びＶＩＣ（商標）などの異なる蛍光性リポーター色素を含有する。さらに、各プローブは、蛍光共鳴エネルギー転移によって蛍光をクエンチする失活剤色素を１つの末端に有する。ＰＣＲの間、各プローブは、個体からの核酸中の相補配列に特異的にアニールする。アレルとハイブリダイズするプローブだけを切断するために、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が使用される。切断はリポーター色素を失活剤色素から分離して、リポーター色素による蛍光の増加をもたらす。したがって、ＰＣＲ増幅によって生成される蛍光シグナルは、どのアレルが試料中に存在するかについて示す。プローブとアレルとの間のミスマッチはＴａｑポリメラーゼによるプローブのハイブリダイゼーション及び切断の効率を低減し、蛍光シグナルがほとんど生成されない。当業者は、例えばＫｕｔｙａｖｉｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：６５５〜６６１頁（２０００）に記載されるように、ＤＮＡ副溝結合剤（ＭＧＢ）基をＤＮＡプローブにコンジュゲートすることによってアレル識別アッセイの特異性の改善が達成できることを理解する。副溝結合剤には、ジヒドロシクロピローロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）などの化合物が含まれる（但し、それらに限定されない）。
【０１６５】
[0183]配列解析も、本明細書に記載の方法に従って個体を遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る。当業者に知られているように、対象のバリアントアレルは、対象の遺伝子中の対象の多型部位に連なっている配列に基づいて設計される、適当なプライマーを使用する配列解析によって検出することができる。例えば、対象の遺伝子中のバリアントアレルは、当業者によって設計されるプライマーを使用する配列解析によって検出することができる。追加の又は代替の配列プライマーは、対象の遺伝子中の対象の多型部位の約４０〜約４００塩基対上流又は下流の配列に対応する配列の約１５〜約３０ヌクレオチドを含有することができる。そのようなプライマーは、配列反応で安定したアニーリング工程を可能にする高い融点を達成するのに十分なグアニン及びシトシン含有量を有するように一般に設計される。
【０１６６】
[0184]用語「配列解析」は、核酸中のヌクレオチドの順序が決定される任意の手動又は自動化されたプロセスを含む。例えば、配列解析を使用してＤＮＡ試料のヌクレオチド配列を決定することができる。用語「配列解析」は、ジデオキシ酵素法などの化学的及び酵素的方法（例えば、マクサム−ギルバート及びサンガー配列決定並びにその変形を含む。）を包含する（但し、それらに限定されない）。用語「配列解析」は、毛細管アレイＤＮＡ配列決定をさらに包含し（但し、それに限定されない）、それは、毛細管電気泳動及びレーザー誘起蛍光検出に依存し、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００又はＡＢＩ３７００などの機器を使用して実施することができる。追加の非限定的な例として、用語「配列解析」は：熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：６２６〜６３３頁（１９９２）を参照）；固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：３９〜４２頁（１９９２）を参照）；及び質量分析、例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析による配列決定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３８１〜３８４頁（１９９８）を参照）を包含する。用語「配列解析」はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）をさらに含み（但し、それに限定されない）、それは、配列のセグメントを同定するためにすべての可能な短いオリゴヌクレオチドのアレイに依存する（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０〜６１４頁（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１６４９〜１６５２頁（１９９３）；及びＤｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４〜５８頁（１９９８）を参照）。当業者は、これらの及び追加の変形が本明細書で定義される用語「配列解析」に包含されることを理解する。
【０１６７】
[0185]電気泳動分析も、本発明の方法に従って個体を遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る。増幅された断片などの１つ又は複数の核酸に関して本明細書で用いられる「電気泳動分析」は、荷電分子が電界の影響下で静止媒体中を移動させられる過程を含む。電気泳動遊走は、それらの電荷に主に基づいて核酸を分離し、それはそれらのサイズに比例し、より小さい分子はより速やかに移動する。用語電気泳動分析には、スラブゲル電気泳動を用いる分析、例えばアガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は毛細管電気泳動が含まれる（但し、それらに限定されない）。毛細管電気泳動分析は、数分の分離時間の高い（キロボルトレベル）分離電圧の存在下で、小さい直径（５０〜１００ｍ）の石英毛細管中で一般に起こる。毛細管電気泳動分析を使用すると、核酸はＵＶ吸収又は蛍光標識によって都合よく検出され、数百塩基対までの断片で一塩基分解能を得ることができる。そのような電気泳動分析方法及びその変形は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（補遺４５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されるように当技術分野で周知である。
【０１６８】
[0186]制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析も、本発明の方法に従って個体を遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２．７．１〜２．７．５頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中のＪａｒｃｈｏら；Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照）。本明細書において、「制限断片長多型解析」は、特異的塩基配列、一般に回文又は逆方向反復の認識に続いて核酸の分解を触媒するエンドヌクレアーゼである制限酵素を用いて多型アレルを識別するための任意の方法を含む。当業者は、ＲＦＬＰ解析の使用が、多型部位において野生型又は他のアレルからバリアントアレルを識別することができる酵素に依存することを理解する。
【０１６９】
[0187]さらに、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、本明細書に記載の方法で個体を遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る。アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、例えば、バリアントアレルを含む配列に完全に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適当な条件下で、バリアントアレル特異的プローブはバリアントアレルを含有する核酸とハイブリダイズするが、プローブと比較して１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチを有する１つ又は複数の他のアレルとハイブリダイズしない。所望により、代わりの（例えば野生型）アレルにマッチする第２のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することもできる。同様に、アレル特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術は、バリアントアレルのヌクレオチド配列に完全に相補的であるが、他のアレルと比較して１つ又は複数のミスマッチを有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、例えば、バリアントアレルを選択的に増幅するために使用することができる（Ｍｕｌｌｉｓら、上記）。当業者は、バリアントアレルと他のアレルを区別する１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチが、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションで使用するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中央にしばしば位置することを理解する。対照的に、ＰＣＲ増幅で使用するアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーの３’末端のバリアントと他のアレルを区別する１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチを一般に有する。
【０１７０】
[0188]ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、本発明の方法で遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するために使用できる別の周知のアッセイである。ミスマッチを有するＤＮＡ二重鎖は、ポリアクリルアミドゲルにおいて完全な塩基対の二重鎖の移動度と比較して低い移動度を有するので、ＨＭＡはバリアントアレルの存在を検出するのに有用である（Ｄｅｌｗａｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１２５７〜１２６１頁（１９９３）；Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１２：３０１〜３０６頁（１９９２）を参照）。
【０１７１】
[0189]単一鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）の技術も、本明細書に記載の方法で遺伝子タイピングして、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る（Ｈａｙａｓｈｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．、１：３４〜３８頁（１９９１）を参照）。この技術は、非変性ゲル電気泳動により変化した電気泳動移動度を生じる一本鎖ＤＮＡの二次構造の相違に基づいてバリアントアレルを検出するのに使用される。バリアントアレルは、試験断片の電気泳動パターンの、既知のアレルを含む対応する標準断片との比較によって検出される。
【０１７２】
[0190]変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）も、本発明の方法において、対象の遺伝子中の特定のバリアントアレル（例えば体細胞変異）又はハプロタイプの存在又は非存在を決定するのに有用であり得る。ＤＧＧＥでは、二本鎖ＤＮＡは、増大する変性剤濃度を有するゲルで電気泳動にかけられる；ミスマッチアレルで構成される二本鎖の断片は、より速やかに融解するセグメントを有し、そのため、そのような断片は、完全に相補的な配列と比較して異なる遊走をする（上記のＩｎｎｉｓら、１９９０中の、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」を参照）。
【０１７３】
[0191]個体を遺伝子タイピングするのに有用な他の分子学的な方法は当技術分野で公知であり、本発明の方法において有用である。そのような周知の遺伝子タイピングアプローチには自動化配列決定及びＲＮアーゼミスマッチ技術が含まれる（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：７５７５〜７５７９頁（１９８５）を参照）（但し、それらに限定されない）。さらに、当業者は、複数のバリアントアレルの存在又は非存在が決定される場合、個々のバリアントアレルが分子学的方法の任意の組み合わせによって検出できることを理解する。一般に、Ｂｉｒｒｅｎら（編）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第１巻（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照。さらに、当業者は、複数のバリアントアレルを別々の反応で又は単一の反応（「多重」アッセイ）で検出することができることを理解する。
【０１７４】
ＶＩＩ．抗体生成
[0192]本発明のイムノアッセイに従って腫瘍細胞中のシグナル伝達分子の発現及び活性化のレベルを解析するためのまだ市販されていない抗体の生成及び選択は、いくつかの方法で達成することができる。例えば、１つの方法は当技術分野で公知のタンパク質発現及び精製方法を用いて対象のポリペプチド（すなわち抗原）を発現及び／又は精製することであり、別の方法は、当技術分野で公知の固相ペプチド合成方法を用いて対象のポリペプチドを合成することである。例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｃｈｅｒ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８２巻（１９９０）；Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇｒｅｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２８９巻（１９９７）；Ｋｉｓｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３８：１１９２〜９９頁（１９９０）；Ｍｏｓｔａｆａｖｉら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、１：２５５〜６０頁（１９９５）；及びＦｕｊｉｗａｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４４：１３２６〜３１頁（１９９６）を参照。精製又は合成されたポリペプチドは、例えばマウス又はウサギに次に注射して、ポリクローナル又はモノクローナルの抗体を生成することができる。当業者は、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されているように、抗体生成のために多くの手法が利用できることを認識するであろう。また、当業者は、抗体を模倣する（例えば、その機能的結合領域を保持する）結合断片又はＦａｂ断片も遺伝情報から種々の手法により調製できることを理解するであろう。例えば：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５）；及びＨｕｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：３９１４〜３９２０頁（１９９２）を参照。
【０１７５】
[0193]当業者は、抗体又は結合断片の生成並びに対象の種々のポリペプチドの親和性及び特異性についてのスクリーニング及び選択において多くのアプローチを取ることができるが、これらのアプローチが本発明の範囲を変更しないことを認識するであろう。
【０１７６】
[0194]ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、その断片及び抗体の精製方法のより詳細な説明はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／１３２７２３（その開示の全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。）に見出される。
【０１７７】
ＶＩＩＩ．投与方法
[0195]本発明の方法により、本明細書に記載される抗癌剤は、当技術分野で公知である任意の都合のよい手段によって対象に投与される。本発明の方法は、対象における腫瘍（例えば大腸腫瘍）の処置のための適切な坑癌剤又は抗癌剤の組み合わせを選択するために使用することができる。本発明の方法はまた、対象における坑癌剤又は抗癌剤の組み合わせによる処置への腫瘍（例えば大腸腫瘍）の反応性を確認するために使用することができる。さらに、本発明の方法は、坑癌剤又は抗癌剤の組み合わせによる処置への、腫瘍（例えば大腸腫瘍）を有する対象の反応性を予測するために使用することができる。当業者は、本明細書に記載される抗癌剤を、単独で、又は従来の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、及び／又は外科手術と組み合わせた治療方法の一部として投与することができることを理解するであろう。
【０１７８】
[0196]ある特定の実施形態では、抗癌剤は、抗シグナル伝達剤（すなわち細胞増殖抑制剤）、例えば、モノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤；増殖抑制剤；化学療法剤（すなわち細胞毒性薬）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞などの異常な細胞の無制御の増殖を低減又は抑止する能力を有する他の任意の化合物を含む。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの化学療法剤と併用される、１つ又は複数の抗シグナル伝達剤、増殖抑制剤、及び／又はホルモン療法剤で処置される。例示的なモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、増殖抑制剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、及びワクチンは上に記載されている。
【０１７９】
[0197]一部の実施形態では、本明細書に記載される抗癌剤は、従来の免疫療法剤、例えば、免疫活性化剤（例えば、バシラス・カルメット−ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン２、アルファインターフェロンなど）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素コンジュゲートなど）、及び放射線免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ又は１３１Ｉにコンジュゲートした抗ＣＤ２０モノクローナル抗体など）（但し、それらに限定されない）と同時投与されてもよい。
【０１８０】
[0198]抗癌剤は、必要に応じて適切な医薬賦形剤と一緒に投与でき、容認された投与様式のいずれかで実施できる。したがって、投与は、例えば、経口、口内、舌下、歯肉、口蓋、静脈内、局所、皮下、経皮、経真皮、筋肉内、関節内、非経口、小動脈内、皮内、心室内、脳内、腹腔内、膀胱内、鞘内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣投与であってもよく、又は吸入によってもよい。「同時投与」は、抗癌剤が、第２の薬物（例えば、別の抗癌剤、抗癌剤療法と関連する副作用を低減するのに有用な薬物、放射線療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤など）の投与と同時に、その直前に、又はその直後に投与されることを意味する。
【０１８１】
[0199]抗癌剤の治療的有効量は、繰り返し、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回又はそれ以上の回数投与することができるか、又は用量を連続注入によって投与することができる。用量は、好ましくは正確な用量の単回投与に適した単位剤形での、固体、半固体、凍結乾燥粉末又は液体剤形、例えば、錠剤、ピル剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐薬、停留浣腸、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアゾール剤、フォーム剤などの形態を取ることができる。
【０１８２】
[0200]本明細書において、用語「単位剤形」は、ヒト対象及び他の哺乳動物のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の開始、耐容性及び／又は治療効果を生むように計算された抗癌剤の所定量を、適切な医薬用賦形剤（例えばアンプル）と一緒に含有する。さらに、より希釈された単位剤形を次に生成することができる、より濃縮された剤形を調製することができる。したがって、より濃縮された剤形は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれ以上の倍数の実質的により多くの量の抗癌剤を含有する。
【０１８３】
[0201]そのような剤形の調製方法は、当業者に公知である（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０）を参照）。剤形は、従来の薬用担体又は賦形剤を一般的に含み、他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織浸透増強剤、可溶化剤などをさらに含むことができる。適当な賦形剤は、当技術分野で周知の方法によって、特定の剤形及び投与経路に合うように調整することができる（例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照）。
【０１８４】
[0202]適切な賦形剤の例には、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカンタ、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えば、カーボポール、例えば、カーボポール９４１、カーボポール９８０、カーボポール９８１などが含まれる（但し、それらに限定されない）。剤形は：潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油；湿展剤；乳化剤；懸濁剤；保存剤、例えば、メチル−、エチル−及びプロピル−ヒドロキシベンゾエート（すなわちパラベン）；ｐＨ調整剤、例えば、無機酸及び有機酸及び塩基；甘味料；及び香味料をさらに含むことができる。剤形は、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン封入複合体を含むこともできる。
【０１８５】
[0203]経口投与については、治療的有効用量は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、ロゼンジ剤、散剤、及び徐放性製剤の形態であってもよい。経口投与のための適切な賦形剤には、医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１８６】
[0204]一部の実施形態では、治療的有効用量は、ピル剤、錠剤又はカプセル剤の形態を取り、したがって、剤形は抗癌剤と一緒に以下のいずれかを含有することができる：希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えば、デンプン又はその誘導体；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；及び結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びその誘導体。抗癌剤は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体中に置かれる坐薬に製剤化されてもよい。
【０１８７】
[0205]液体剤形は、抗癌剤及び任意選択で１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバントを担体、例えば、食塩水（例えば０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに溶解するか又は分散させることによって調製し、例えば、経口、局所又は静脈内投与のための溶液又は懸濁液を形成することができる。抗癌剤は停留浣腸に製剤化されてもよい。
【０１８８】
[0206]局所投与については、治療的有効用量は、乳剤、ローション剤、ゲル剤、フォーム剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏及び経皮パッチの形態であってもよい。吸入による投与については、抗癌剤は、乾燥粉末として、又はネブライザーを通す液剤形態で送達することができる。非経口投与については、治療的有効用量は無菌注射液及び無菌のパッケージされた粉末の形態であってもよい。注射液は約４．５〜約７．５のｐＨで製剤化されるのが好ましい。
【０１８９】
[0207]治療的有効用量は凍結乾燥形態で提供することもできる。そのような剤形は、投与前の再構成のためのバッファー、例えば重炭酸塩を含むことができ、又は、バッファーは、例えば水による再構成のために凍結乾燥剤形態で含まれてもよい。凍結乾燥剤形は、適切な血管収縮剤、例えばエピネフリンをさらに含むことができる。凍結乾燥剤形は、再構成される剤形を対象に直ちに投与することができるように、任意選択で再構成のためのバッファーと一緒にパッケージされている注射器で提供することができる。
【０１９０】
[0208]対象を周期的な時間間隔でモニターして、ある特定の治療レジメンの有効性を評価することもできる。例えば、ある特定のシグナル伝達分子の活性化状態は、本明細書に記載される抗癌剤の１つ又は複数による処置の治療効果に基づいて変化し得る。対象をモニターして、個別のアプローチで反応性を評価し、ある特定の薬物又は処置の効果を理解することができる。さらに、特定の抗癌剤又は抗癌剤の組み合わせに初期に反応する対象は、その薬物又は薬物の組み合わせに不応性になることがあり、これらの対象が後天的な薬剤抵抗性を発達させたことを示す。これらの対象では、現在の療法を中止し、本発明の方法に従って代替処置を処方することができる。
【０１９１】
[0209]ある特定の態様では、本明細書に記載される方法は、種々の集団で大腸癌の予後及び／又は再発の見込みを予測する遺伝子発現マーカーのパネルと一緒に用いることができる。これらの遺伝子パネルは、再発を経験する可能性が低く、したがって補助化学療法から利益を受ける可能性の低い個体を同定するのに有用であり得る。発現パネルは、無病生存及び全生存の結果に負の影響を及ぼさずに補助化学療法を安全に避けることができる個体を同定するために用いることができる。適切な系には、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．からの２１遺伝子パネルであるオンコタイプ（Ｏｎｃｏｔｙｐｅ）ＤＸ（商標）、Ａｇｅｎｄｉａからの７０遺伝子パネルであるＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）、及びＶｅｒｉｄｅｘからの７６遺伝子パネルが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【０１９２】
[0210]さらに、他の特定の態様では、本明細書に記載される方法は、未知の原発の癌（ＣＵＰ）の元の腫瘍を同定する遺伝子発現マーカーのパネルと一緒に用いることができる。これらの遺伝子パネルは、最初に大腸癌と診断された患者に与えられるものと一貫した療法から利益を受けるであろう転移癌患者を同定するのに有用であり得る。適切な系には：Ａｖｉａｒａ  ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ  ＩＤアッセイ、３９個の腫瘍型について原発部位を同定するために９２個の遺伝子を測定するＲＴ−ＰＣＲをベースとした発現アッセイ；及びマイクロアレイ上の１６００個より多い遺伝子の発現を測定して、１５個の既知の組織型のそれらに対して腫瘍の遺伝子発現「サイン」を比較する、パスワーク（Ｐａｔｈｗｏｒｋ）（登録商標）始原組織検査が含まれる（但し、それらに限定されない）。
【０１９３】
ＩＸ．実施例
[0211]以下の実施例は請求される発明を例示するために提供され、それを限定するためではない。
【０１９４】
実施例１（ＣＥＥＲを用いる大腸癌の分子的表現型タイピング：  患者に焦点を当てた治療的標的化との関連）：
[0212]この実施例は、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく、大腸癌（ＣＲＣ）腫瘍でのホスホＰＩ３Ｋ（ｐＰＩ３Ｋ）対ホスホＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）の比が腫瘍予後及び抗ＥＧＦＲ療法の結果を予測することを例証する。本明細書に記載されるように、抗ＥＧＦＲ療法の最良の候補は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比は低いがＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比は高いＣＲＣであろう。この実施例は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２の比がＣＲＣ患者における再発及び無病生存（ＤＦＳ）と負に及び有意に相関することも例証する。本明細書に記載される通り、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２の比は、より高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比（例えば、参照ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数カットオフより上）を有するＣＲＣ試料でより高い。
【０１９５】
[0213]図１は、ＣＲＣコホート研究スキーマを示す。この研究は、１１５の原発性ＣＲＣ腫瘍及び１０の原発性／転移性マッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）腫瘍試料を含んでいた。収集した試料でＣＥＥＲ／変異解析を実施した。Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ（ＣＥＥＲ）イムノアッセイを利用して、ＨＥＲメンバー（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＡＫＴ及びＥＲＫをそれらの発現及び／又は活性化のレベルについて解析した。ＣＥＥＲは、標的タンパク質を囲んでいる三重抗体複合体の形成に依存する、感度及び特異性の高い近接アッセイである。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡ癌遺伝子の中の１４個の異なる変異についても試料を分子的に特徴づけした。図２は、この研究に登録されたＣＲＣ患者の特徴を示す。
【０１９６】
[0214]ＫＲＡＳ変異ステータスに基づくＣＲＣ腫瘍の分離は、予後及び治療結果を予測するために利用できる現在では最良のバイオマーカーである。しかし、ＫＲＡＳ変異ステータスのみに基づくＣＲＣ患者の選択は不完全である。したがって、ＣＲＣ療法の予後を予測しその選択を導くためのよりも良好なバイオマーカーへの満たされていない必要性がＣＲＣ分野に存在する。例えば、ＫＲＡＳ野生型（ＫＲＡＳ−ＷＴ）ＣＲＣ腫瘍は、未知の理由のためにまちまちの術後予後を有する。ＫＲＡＳ−ＷＴ  ＣＲＣ腫瘍はセツキシマブ療法後に不均一な反応性を有する。一部の腫瘍ではＢＲＡＦ変異が理由として示されているが、これらは大多数のセツキシマブ不応性腫瘍を説明するものではない。さらに、理由は明らかでないが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異（ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ）ＣＲＣ腫瘍は概してより不良な術後予後を有する。特に、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ  ＣＲＣ腫瘍は抗ＥＧＦＲ療法に概して反応しない。現在では、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ  ＣＲＣ腫瘍の処置のために利用できる標的療法はない。
【０１９７】
[0215]図３は、ＣＥＥＲを用いたＣＲＣ臨床試料のシグナル伝達経路プロファイリングを示す。８人の異なる患者からの試料例を、全体の及びリン酸化された（ｐｈｏｓ）ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＫＩＴ、ＰＩ３Ｋ及びＳｈｃの発現について解析した。全ＣＫ並びにリン酸化されたＡＫＴ及びＥＲＫも解析した。各試料のＫＲＡＳ変異ステータスが示される。
【０１９８】
[0216]図４は、ＣＲＣ無病生存（ＤＦＳ）における多様性及び不均一性を示す。図５は、ＣＲＣ生存の多様性がシグナル伝達経路シグネチャーの多様性と相関することを示す。特に、図５は、ＣＲＣにおける無病生存の差異が、ＣＥＥＲ技術を通じて発見されるパスウェイシグネチャーに相関することを示す。
【０１９９】
[0217]図６〜１２は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３がＣＲＣの予後マーカーであることを実証する。特に、図６〜８は、ＣＲＣ患者における生存の差異を分離するためにｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３の指数又は比が利用できることを示す。ｐＨＥＲ３に対してｐＰＩ３Ｋレベルが増加するに従って疾患再発の可能性が増加する。図６は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の低下とＤＦＳに相関があることを示す。１／１０（０．１）、２／１０（０．２）、３／１０（０．３）及び４／１０（０．４）の例示的なカットオフ比を試験した。２／１０（０．２）のカットオフ比をさらなる分析のために使用した場合、ｐＨＥＲ３によって説明できるものを超えるより高いｐＰＩ３Ｋを有するＣＲＣ患者の不良な予後が観察された。特定の実施形態では、０．２未満のｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比を有するＣＲＣ患者は、１つ又は複数の抗ＨＥＲ療法の候補であるが、０．２より大きいｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比を有するＣＲＣ患者は１つ又は複数の抗ＰＩ３Ｋ療法の候補である。図７は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数によって分離されたＣＲＣ腫瘍の組成を示す。注目すべきことに、腫瘍ステージ及びＫＲＡＳ変異ステータスに関係なくＣＲＣ腫瘍は分離される。図８は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数によって分離されたＣＲＣ腫瘍が、高生存及び低生存のＫＲＡＳ野生型腫瘍の中に少なくとも２つの亜集団を明らかにすることを示す。しかし、それらのｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数に関係なく、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ  ＣＲＣ腫瘍はより低い生存を有する。言い換えると、ＫＲＡＳ  ＷＴ腫瘍は、それらのｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数比に基づいて、極めて明白なＤＦＳの差異を有する２つのサブセットに明確に分離されたが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍は、それらのｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比に関係なく常にアグレッシブで、低いＤＦＳを有する。このように、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３発現はＣＲＣの新規の予後因子である。
【０２００】
[0218]図９は、ＫＲＡＳ変異ステータスをベースにした予後診断結果が、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数が低いＣＲＣにのみ適用できることを示す。特に、ＫＲＡＳ変異ステータスに基づくＤＦＳ分離における有意な差は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数が低いＣＲＣ腫瘍のみで観察された。図１０は、より高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数がＣＲＣのアグレッシブネスに相関するさらなる証拠を提供する。ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく、より高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達はＣＲＣの早期の再発と相関する。言い換えると、図１０は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の高いＣＲＣ腫瘍が、それらのＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく早期に再発することを示す。図１１は、ｐＰＩ３Ｋシグナル伝達の低いＣＲＣが転移するに従い、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比が増加する（例えば、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３カットオフ比より上に）ことを示す。特に、ＣＲＣ腫瘍は、それらが離れた器官に転移するにつれて高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を獲得する。治療上暗示していることは、標的療法は、それらの経路プロファイリング、例えば抗ＨＥＲ療法及び続く抗ＰＩ３Ｋ療法に基づいて調整する必要があるということである。
【０２０１】
[0219]図１２は、図６〜１１に示す実験データの要約図を提供する。ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数がカットオフ比を超える（例えば、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３＞２０％）場合は、ｐＰＩ３Ｋシグナル伝達はＨＥＲシグナル伝達より大きく、ＣＲＣはＰＩ３Ｋ駆動性と分類される。予後に関しては、カットオフ比を超えるｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく低いＤＦＳを有すると予測される。ＣＲＣ療法の選択に関しては、カットオフ比を超えるｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は抗ＥＧＦＲ療法に不応性である可能性があり、抗ＰＩ３Ｋ療法に反応性であるより高い可能性を有する。ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数がカットオフ比未満（例えば、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３＜２０％）である場合は、ＨＥＲシグナル伝達はより高く、ＣＲＣはＨＥＲ駆動性と分類される。予後に関しては、カットオフ比未満のｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者は、ＫＲＡＳ状態がＷＴ又はＧ１３Ｄである場合はより高いＤＦＳを有すると予測されるが、ＫＲＡＳ状態がＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔである場合はより低いＤＦＳを有すると予測される。ＣＲＣ療法の選択に関しては、カットオフ比未満のｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数を有する患者の一部は抗ＥＧＦＲ療法に反応性である可能性がある。
【０２０２】
[0220]図１３〜１７は、高いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数又は低いｃＭＥＴシグナル伝達が低いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数と相関し、良好な予後を有するＣＲＣのマーカーとなることを実証する。特に、図１３は、アグレッシブな（高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の）ＫＲＡＳ野生型ＣＲＣ及びＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄｍｕｔ  ＣＲＣにおいてＭＥＴシグナル伝達がより高いことを示す。図１４は、（Ａ）アグレッシブな（高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の）ＣＲＣ及び（Ｂ）転移性ＣＲＣにおいて、ＭＥＴシグナル伝達がＨＥＲ１シグナル伝達より高いことを示す。低いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達のＣＲＣが転移するにつれて、ｐＨＥＲ１／ｐＭＥＴ比は低下する。図１５は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の低い腫瘍において、ＫＲＡＳ−ＷＴ  ＣＲＣ腫瘍がＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍より有意に高いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数比を示すことを示す。これは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍よりＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍でのより高いＤＦＳと相関する。対照的に、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数の高いＣＲＣ腫瘍においてＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比に有意差はない。これは、このコホートでの低生存腫瘍と相関する。図１６は、適当なＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比カットオフが低ＰＩ３Ｋ集団内のよりアグレッシブなＫＲＡＳ  Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍を選び出すことを示す。
【０２０３】
[0221]図１７は、相対的パスウェイシグネチャー＋ＫＲＡＳ変異ステータスを含む本発明の相対的／統合的パスウェイインデックスの要約図を提供する。ｃＭＥＴシグナル伝達より高いＨＥＲシグナル伝達（例えば、ＨＥＲ１＞ｃＭＥＴ；高いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数又は低いｃＭＥＴシグナル伝達）を有するＨＥＲ駆動性ＣＲＣ腫瘍では、ＷＴ又はＧ１３Ｄ  ＫＲＡＳ状態を有するＣＲＣ患者は良好な予後（例えば、より高いＤＦＳ）を有し、抗ＥＧＦＲ療法に反応する可能性がより高い。しかし、より低いＨＥＲ１シグナル伝達（例えば、ＨＥＲ１＜ｃＭＥＴ；低いＨＥＲ１／ｃＭＥＴ指数又は高いｃＭＥＴシグナル伝達）を有するＨＥＲ駆動性ＣＲＣ腫瘍では、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異を有するＣＲＣ患者は不良な予後（例えば、より低いＤＦＳ）を有する。
【０２０４】
[0222]図１８は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３の比がすべてＣＲＣにおける再発（例えば、マーカーが高いほど再発が早い）及び無病生存（ＤＦＳ）と負に及び有意に相関することを示す。
【０２０５】
[0223]図１９は、より高いｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３発現（例えば、参照ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数カットオフより上）を有するＣＲＣ試料において、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ１及びｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ２がより高いレベルで発現されることを示す。
【０２０６】
[0224]要約すると、この実施例は、ＣＥＥＲベースのシグナル伝達経路プロファイルが、ＫＲＡＳ変異に基づく分離を超えてＣＲＣの新規の分子サブセットを明らかにしたことを示す。このような分子的分離はＣＲＣのための新規の治療選択戦略を導くことができる。特に、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく、ＣＲＣ腫瘍におけるｐＰＩ３Ｋ発現対ｐＨＥＲ３発現の比（ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３指数）が、腫瘍予後及び抗ＥＧＦＲ療法の結果を予測することが発見された。抗ＥＧＦＲ療法の最良の候補は、ｐＰＩ３Ｋ／ｐＨＥＲ３比は低いがＨＥＲ１／ｃＭＥＴ比は高いＣＲＣと同定された。低いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達（例えば、ｐＨＥＲ３発現の約１５〜３０％）を有するＣＲＣ腫瘍の二次選択は、それらのＫＲＡＳ状態に関係なく最良の予後、おそらく抗ＥＧＦＲ療法の結果を有するＣＲＣ腫瘍をさらに予測することができる。抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ｐＰＩ３Ｋ療法は、ｐＨＥＲ３の約１５〜約３０％より大きいｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍により適している。このような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。この研究は、一部のＣＲＣでは、ｐＰＩ３Ｋシグナル伝達の増加がｃＭＥＴシグナル伝達の増加による可能性があることも見出した。抗ｐＰＩ３Ｋ療法の有無に関係なく、抗ＥＧＦＲ療法に加えられる又はその代わりの抗ＭＥＴ療法は、ｐＨＥＲ３の約１５〜３０％より大きいｐＰＩ３Ｋを有するアグレッシブなＣＲＣ腫瘍の処置に有用であり得る。このような腫瘍には、高いｐＰＩ３Ｋシグナル伝達を有するＫＲＡＳ−ＷＴ腫瘍、ＫＲＡＳ−Ｇ１２ｍｕｔ腫瘍の大部分、ＫＲＡＳ変異ステータスに関係なく転移したＣＲＣ腫瘍などが含まれる（但し、それらに限定されない）。
【０２０７】
[0225]本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許出願は、各刊行物又は特許出願が参照により組み入れられることが具体的に及び個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の発明は、明確な理解のために例を示していくらか詳細に説明されているが、本発明の教示に鑑みて、いくらかの変更及び改変を、添付の特許請求の範囲及びその精神を逸脱することなく本発明に対して行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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