(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド結合によって結合された、２つのヒト化もしくはヒト免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列を含む抗原提示複合体であって、各重鎖は、ヒンジ領域上でＨＬＡアミノ酸配列と融合されており、
前記複合体は、免疫グロブリン軽鎖も、免疫グロブリン重鎖可変ドメインも含まず、
前記抗原提示複合体は、Ｔ細胞への提示のために前記ＨＬＡに結合した抗原性ペプチドおよびβ２ミクログロブリンペプチドを含み、
前記抗原提示複合体は、ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧポリマーから形成される５０〜２５０ｎｍの範囲のサイズを有するナノ粒子に結合しており、前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子の表面にコンジュゲートしたリンパ球共刺激リガンドをさらに含み、前記共刺激リガンドは、ヒトＩＧＨＶ４−５９テンプレートおよびヒトＩＧＫＶ４−０１テンプレートに移植されたｍＡｂ９．３可変領域を含む抗ＣＤ２８抗体であり、ここで、マウス重鎖フレームワーク残基が、１、３、６、３７、４８、６７、７１、７３、７６、７８、８２、８２ａおよび８２ｃから選択される５またはそれ以上のＫａｂａｔ番号に基く位置において維持されており、マウス軽鎖フレームワーク残基が、３、４、４９、７０、８５、８７および８０から選択される３またはそれ以上のＫａｂａｔ番号に基く位置において維持されている、抗原提示複合体。
【請求項２】
前記ＨＬＡアミノ酸配列はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１である、請求項１に記載の抗原提示複合体。
【請求項３】
前記抗原性ペプチドが腫瘍関連抗原である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項４】
Ｋａｂａｔ番号に基づく残基４７３における不対システインを通じて固定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項５】
前記ナノ粒子が生分解性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項６】
前記抗原提示複合体が、前記ナノ粒子に、スルフヒドリル−マレイミド化学を介してコンジュゲートされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、約２００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項９】
前記抗原提示複合体および前記共刺激リガンドが、５：１〜１：５の比でコンジュゲートしている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
【請求項１０】
患者において抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘導するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原提示複合体を含む組成物。
【請求項１１】
前記患者が癌患者である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記患者が、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤で治療を受けている、または受けたことがある、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗ＣＤ２８抗体が、配列番号２または配列番号４で示される可変重鎖アミノ酸配列および配列番号１２で示される可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原提示複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１３年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／８３８，５４７号、及び２０１４年３月６日に出願された米国仮出願第６１／９４８，９１６号の利益と優先権を主張するものであり、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、遺伝子療法に有用な、医薬組成物を含む組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、それらの表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体中で抗原性ペプチドを処理し、表示する細胞である。Ｔ細胞などのエフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの受容体を使用して、これらのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を認識することができる。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は刺激されて抗原を効率的に提示し、免疫効果細胞の拡張を支持することができ、それによって抗原に対する細胞毒性応答を活性化する、抗原提示細胞の一例である。いくつかの免疫療法では、ＤＣは、患者から採取され、抗原でパルスされるか、またはウイルスベクターでトランスフェクトされる。患者へ注入して戻す際に、これらの活性化細胞はエフェクターリンパ球へ腫瘍抗原を提示する（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞）。適切に実行された場合、この治療法は、（腫瘍抗原を含む）抗原を発現する細胞に対して細胞毒性応答を開始することができる。
【０００５】
しかし、ＤＣ免疫療法は、多くの免疫療法のように、重大な制限に直面している。例えば、エクスビボで検出可能なワクチン接種した癌患者における強力で抗原特異的なＴ細胞応答とわずかの弱い臨床応答の間には不一致がある。Ｊａｎｉｋａｓｈｖｉｌｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０  Ｊａｎ．１；２（１）：５７．
抗原特異的な免疫療法を含む、免疫療法のために有効な（貯蔵安定な医薬組成物を含む）組成物及び方法の必要性が、依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊａｎｉｋａｓｈｖｉｌｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０  Ｊａｎ．１；２（１）：５７．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、患者に抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための貯蔵安定な医薬組成物を含む、免疫療法のための組成物及び方法を提供する。このような組成物は、例えば、癌及び感染症の治療に有用である。いくつかの態様における該組成物は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり、これは、抗原特異的Ｔ細胞の活性化のために適切な前後関係でその存在する１つまたは複数の抗原（例えば、腫瘍抗原）を提示する分子複合体を患者に提供するために、抗原提示複合体とその表面に任意でＴ細胞共刺激シグナルを有する薬学的に許容可能なビーズまたは粒子を含む。ビーズまたは粒子は、活性だけでなく、循環的特性，生体内分布，及び分解速度を含む薬力学的な利点を提供するように設計される。そのようなパラメータは、とりわけ、サイズ，表面電荷，ポリマー組成物，リガンドコンジュゲーション化学，リガンド密度を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナルは抗ＣＤ２８抗体またはその一部であり、これは、ＩｇＧ，ＩｇＤ，ＩｇＡ，またはＩｇＭのアイソタイプから選択される配列を含む、ヒト重鎖アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン配列はヒトＩｇＧの定常及び可変配列を含む。フレームワーク（ＦＷ）配列は、抗原結合部位の完全性を維持するために、重要なまたは所望のマウスフレームワーク残基を含むように修飾され得る。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、多くが知られている、マウス抗体アミノ酸配列（例えば、９．３ｍＡｂ）、または他のＣＤ２８結合配列に基づくことができる。いくつかの実施形態では、抗体重鎖はヒトＩＧＨＶ４（例えば、ＩＧＨＶ４−５９）生殖細胞系列ＦＷの変異体である。いくつかの実施形態では、抗体は軽鎖を含み、その軽鎖はヒトＩＧＫＶ４−０１  ＦＷの変異体である。抗体は定常領域を含むことができ、その定常領域はヒトＩｇＧ４またはその変異体であることができる。
【０００９】
共刺激分子は、抗原特異的Ｔ細胞を誘導するために、抗原提示分子複合体で固体支持体にコンジュゲートさせることができる。抗原提示分子複合体は、ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ複合体、または抗原結合クレフトを含むそれらの一部を含み得る。いくつかの実施形態では、分子複合体は、１つまたは複数のＨＬＡアミノ酸配列を含み（例えば、ＨＬＡの細胞外ドメインまたはその抗原提示部分を含む）、これは、免疫グロブリン配列、または他の二量体化または安定化配列などの、追加の配列を含み得る。いくつかの実施形態におけるＨＬＡ−Ｉｇ二量化融合は、安定性及び／または結合親和性において利点を提供する。
【００１０】
従って、いくつかの実施形態では、本発明はＴ細胞への抗原の提示のためのビーズまたは粒子コンジュゲート分子複合体を提供し、ここで、複合体は、クラスＩまたはクラスＩＩの抗原結合クレフトまたはその一部を形成するアミノ酸配列を含む。抗原提示複合体のアミノ酸配列は、例えば、安定性、親和性、及び立体的な利点を提供するために、異種配列への融合体を含むことができる。いくつかの実施形態では、異種配列は免疫グロブリン配列を含む。いくつかの実施形態では、分子複合体は、免疫グロブリン配列などの異種配列に融合したＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンはヒト重鎖免疫グロブリン配列（例えば、ＩＧＶＨ４）を備え、これは、二量体ＨＬＡを提供するために、免疫グロブリン定常配列を含むことができ、任意選択で列配可変領域を含み得る。可変配列は、もしあれば、任意選択で抗原結合の可能性を低減または排除するために修飾することができ、かつ任意選択でマウスＦＷ残基なしとすることができる。ＨＬＡアミノ酸配列はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＩＭＧＴ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＬＡ００００５）またはその誘導体であることができる。
【００１１】
Ｔ細胞共刺激リガンド及び／または抗原提示複合体（本明細書に開示される他のリガンドと同様に、標的リガンドを含む）は、エクスビボまたはインビボの抗原提示及び抗原特異的Ｔ細胞の活性化のために固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、リガンドを結合するための表面官能基を有するビーズまたは粒子（例えば、ＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子）である。粒子は、活性だけでなく、循環的特性，生体内分布，及び分解速度を含む薬力学的な利点を提供するように設計される。そのようなパラメータは、とりわけ、サイズ，表面電荷，ポリマー組成，リガンドコンジュゲーション化学，リガンド密度を含む。
【００１２】
様々な実施形態における医薬組成物は、さらに、Ｔ細胞への提示のための抗原性ペプチドを含むことができ、これはリガンドコンジュゲートのビーズまたは粒子と共製剤化することができる。様々な実施形態では、医薬組成物は、貯蔵安定であり、投与前に再構成するための凍結乾燥された形態で提供することができるか、あるいは（例えば、非経口投与によって）患者に投与するための他の便利な形式で提供することができる。
【００１３】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、必要とする患者に有効量の組成物を投与することによって、抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘導するための方法において、免疫療法に有用である。具体的には、抗原提示プラットフォームは、感染性疾患、癌、または自己免疫疾患を有する患者を治療するのに、または免疫抑制患者への予防的保護を提供するのに、有用であり得る。
【００１４】
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとともに、それを発現する寄主細胞を提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【００１６】
本発明の詳細は、以下に、添付の明細書及び特許請求の範囲に記載されている。本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および材料がここに記載される。本発明の他の特長、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。文脈が明確に指示しない限り、明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は複数も含む。別途定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１〜３は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変重鎖配列を示す。
【図２】図１〜３は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変重鎖配列を示す。
【図３】図１〜３は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変重鎖配列を示す。
【図４】図４〜６は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変軽鎖配列を示す。
【図５】図４〜６は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変軽鎖配列を示す。
【図６】図４〜６は、抗ＣＤ２８の３つのヒト化可変軽鎖配列を示す。
【図７−１】図７は修飾定常重鎖配列を示す。
【図７−２】図７は修飾定常重鎖配列を示す。
【図８】図８は定常κ軽鎖配列を示す。
【図９】図９は、ＨＬＡ融合を構築するためのヒト化非ＣＤ２８結合可変領域を示す。
【図１０−１】図１０はヒト化ＨＬＡ−ＩｇＧ４ＨＣのアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】図１０はヒト化ＨＬＡ−ＩｇＧ４ＨＣのアミノ酸配列を示す。
【図１０−３】図１０はヒト化ＨＬＡ−ＩｇＧ４ＨＣのアミノ酸配列を示す。
【図１０−４】図１０はヒト化ＨＬＡ−ＩｇＧ４ＨＣのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は軽鎖３（ＬＣ３，またはＶκ３）のアミノ酸配列を示す。
【図１２−１】図１２は重鎖１（ＨＣ１）のアミノ酸配列を示す。
【図１２−２】図１２は重鎖１（ＨＣ１）のアミノ酸配列を示す。
【図１３−１】図１３は重鎖２（ＨＣ２）のアミノ酸配列を示す。
【図１３−２】図１３は重鎖２（ＨＣ２）のアミノ酸配列を示す。
【図１３−３】図１３は重鎖２（ＨＣ２）のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４〜１６は、ＳＴＡＢＬＥＦＡＳＴ−ＮＳ０細胞株における発現の発現構築物を示す。
【図１５】図１４〜１６は、ＳＴＡＢＬＥＦＡＳＴ−ＮＳ０細胞株における発現の発現構築物を示す。
【図１６】図１４〜１６は、ＳＴＡＢＬＥＦＡＳＴ−ＮＳ０細胞株における発現の発現構築物を示す。
【図１７】図１７は、ヒト化抗ＣＤ２８  ｍＡｂはスーパーアゴニストでないことを示す。
【図１８】図１８は、ヒト化抗ＣＤ２８クローンはヒトＴ細胞株上でＣＤ２８を特異的に染色することを示す。図１８（Ａ）：マウス抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（クロ−ン９．３，アイソタイプＩｇＧ２ａ）による染色；図１８（Ｂ）：ヒト化抗ＣＤ２８（アイソタイプＩｇＧ４）による染色。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
次の略語が全体で使用される：ＢＬＡＳＴ−Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，ＣＤＲ−相補性決定領域，Ｃκ−κ軽鎖定常領域，Ｆｃ−抗体フラグメント結晶化領域，Ｆｗ：−フレームワーク領域（可変領域の），ＨＬＡ−ヒト白血球抗原、ＭＨＣ−主要組織適合性複合体，ＶＨ−可変重鎖，Ｖκ−可変κ軽鎖，及びＶ領域−ＶＨまたはＶκのいずれかの、抗体の可変領域。  
【００１９】
本発明は、患者に抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための貯蔵安定な医薬組成物を含む、免疫療法のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は二量体ＨＬＡ抗原提示複合体を含む。いくつかの実施形態では、組成物はヒト化免疫グロブリン配列またはその一部を含み、これは、患者に１つまたは複数の抗原（例えば、腫瘍抗原）と任意選択で１つまたは複数の共刺激シグナルの提示のための二量体分子複合体を提供するための、人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣｓ）上のリガンドの構成要素として使用することができる。以下に詳細に説明するように、抗原提示プラットフォームは、ラテックスもしくはポリマーのビーズまたは粒子を含む薬学的に許容可能な支持体などの、人工の固体支持体に基くことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナルは抗ＣＤ２８抗体またはその一部である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８抗体は、ＩｇＧ１，ＩＧＧ２，ＩＧＧ３，ＩＧＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭから選択される少なくとも１つのヒト免疫グロブリンアイソタイプの配列を含む。例えば、抗ＣＤ２８抗体はＩｇＧのアイソタイプであることができ、１つまたは複数のＩｇＧ生殖細胞系列フレームワーク配列の配列を含むことができる。例えば、抗ＣＤ２８抗体はヒトＩＧＨＶ４重鎖アミノ酸配列を含むことができ、これは、１〜１５個のアミノ酸修飾によって修飾することができる。修飾は、抗原結合部位の完全性を支援するために、マウスフレームワーク残基を含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態における相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス抗体アミノ酸配列に基いており、これは、任意選択で、１〜５個などの、１〜１０個のアミノ酸修飾を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ，２つ，３つ，またはそれ以上のＣＤＲは、一般に入手可能なマウス９．３ｍＡｂ（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３  １７７：１６５）に基いている。典型的なＣＤＲは、図１〜６に示されている。いくつかの実施形態では、抗体は、９．３ｍＡｂの、フルセットの重鎖及び／またはフルセットの軽鎖のＣＤＲを持つ。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、１つ，２つ，または３つの以下のＣＤＲを含み、これは、任意選択で、それぞれ、１つ，２つ，または３つのアミノ酸の置換、欠失、または付加によって修飾され得る：ＣＤＲ１（ＤＹＧＶＨ），ＣＤＲ２（ＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳ），及びＣＤＲ３（ＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹ）。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、１つ，２つ，または３つの以下のＣＤＲを含み、これは、任意選択で、それぞれ、１つ，２つ，または３つのアミノ酸の置換、欠失、または付加によって修飾され得る：ＣＤＲ１（ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬＭＱ），ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＶＥＳ），及びＣＤＲ３（ＱＱＳＲＫＶＰＹＴ）。
【００２２】
代替ＣＤＲ配列，可変領域，またはＣＤ２８結合リガンド、様々な実施形態で使用することができる。代替リガンド及び抗体は、例えば、ＵＳ特許７，６１２，１７０，ＵＳ特許６，９８７，１７１，及びＵＳ特許６，８８７，４６６に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖はヒトＩＧＨＶ４−５９生殖細胞系列フレームワーク（ＦＷ）の変異体を含み、これは５〜１５個のマウスＦＷ残基を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、抗体は軽鎖アミノ酸配列を含み、その軽鎖配列はヒトＩＧＫＶ４−０１  ＦＷ配列の変異体であることができ、これは３〜１５個のマウスＦＷ残基を含むように修飾され得る。
【００２４】
抗ＣＤ２８ヒト重鎖配列は、例えば、１，３，６，３７，４８，６７，７１，７３，７６，７８，８２，８２ａ，及び８２ｃ（Ｋａｂａｔ番号に基く）の位置に、１つまたは複数（例えば、２またはそれ以上，３またはそれ以上，４またはそれ以上，５またはそれ以上，またはすべて）のマウスＦＷ残基を含むように、修飾され得る。これらの位置におけるマウスＦＷ残基は９．３ｍＡｂにおけるのと同様であり得る。軽鎖は、例えば、３，４，４９，７０，８５，８７，及び８０の位置に、１つまたは複数（例えば、２またはそれ以上，３またはそれ以上，４またはそれ以上，５またはそれ以上，またはすべて）のマウスＦＷ残基を含むように、修飾され得る。選択されたマウスＦＷ残基は、抗原結合部位の完全性を支持することができる。ヒト化抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ２８に対する親和性と９．３ｍＡｂのＴ細胞共刺激活性を維持し、ＣＤ２８結合に対して、少なくとも４０％，５０％，７５％，８０％，９０％，及びいくつかの実施形態では１００％またはそれ以上、９．３ｍＡｂより有効である。様々な実施形態では、抗ＣＤ２８  ｍＡｂはスーパーアゴニストではない。
【００２５】
抗体は定常領域を含むことができ、その定常領域は任意のアイソタイプであることができる。いくつかの実施形態では、抗体定常領域はヒトＩｇＧ４またはその変異体である。いくつかの実施形態では、定常領域は、ＣＨ鎖に導入することができる、１つまたは複数のヒンジ安定化変異（例えば、Ｐで置換され得る、Ｓ２４１）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は定常領域を含み、その定常領域は一つ以上が変異は、抗体を固体支持体に化学的に結合するのに適した１つまたは複数の変異を備える。結合するのに適した１つまたは複数の変異は、不対システイン（例えば、Ｓ４７３）などのアミノ酸側鎖官能基（例えば、チオール、アミン、またはヒドロキシル）を作成することができる。定常領域に対するその他の変更には、Ｆｃガンマ受容体結合を低減するための修飾が含まれる。例えば、ＣＨ鎖はＬ２４８、例えば、Ｌ２４８Ｅで修飾され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂなどの抗体フラグメントであるか、または一本鎖抗体、または他の抗原結合抗体フラグメントである。例えば、抗体フラグメントは、本明細書に記載のヒト化ｍＡｂまたは他の抗ＣＤ２８の一鎖可変フラグメントであることができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、共刺激分子は、本明細書に記載の抗体などの抗ＣＤ２８ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖によって形成された抗原結合ループ、を含む、または、から実質的になる、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体構築物は、ヘッド−ヘッドまたはヘッド−テイル構成において、短ペプチドリンカーによって結合された１つまたはいくつか（２，３，４，または５個）のＶＨ及びＶＬ超可変領域鎖（一緒に３−Ｄ抗原エピトープ結合ポケットを形成する、それぞれの鎖の一部）を含むことができる。このような構築物は、それらの小さいサイズのために、完全に合成的な手段により好都合に産生することができる。さらに、ｓｃＦｖは、免疫原性に対してより低い可能性を示し得る。
【００２８】
他の実施形態では、共刺激リガンドは、共刺激分子リガンドまたは阻害リガンドのｓｃＦｖに結合した１つまたは複数のＨＬＡ分子を含む二重特異性構築物である。抗原提示複合体及び共刺激または阻害リガンドは、二重特異性構築物がナノ粒子表面に共有結合されることを可能にするペプチドテザーを介してコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、ＮＰ表面に独立にそれぞれ結合したＨＬＡ及び共刺激または阻害リガンドのより大きな構築物を含むナノ粒子と同じ活性を生じ、それによって製造上の利点を提供する。
【００２９】
共刺激分子は、抗原特異的Ｔ細胞を誘導するために、抗原提示分子複合体で固体支持体にコンジュゲートさせることができる。抗原提示分子複合体は、ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ複合体、または抗原結合クレフトを含むそれらの一部を含み得る。いくつかの実施形態では、分子複合体は、１つまたは２つのＨＬＡアミノ酸配列を含み、免疫グロブリン配列などの、追加の異種配列を含み得る。代替異種配列には、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎなどの二量体化アミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態におけるＨＬＡ融合は、安定性及び／または結合親和性において追加の利点を提供する。
【００３０】
様々な実施形態では、抗原提示複合体は、ＭＨＣクラスＩ分子複合体またはＭＨＣクラスＩＩ分子複合体のいずれか、あるいはＣＤ１ｄである。ＭＨＣクラスＩ分子複合体は、少なくとも２つの融合タンパク質を含み得る。第１の融合タンパク質は、第１のＭＨＣクラスＩα鎖及び第１の免疫グロブリン重鎖を含み、第２の融合タンパク質は、第２のＭＨＣクラスＩα鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖を含む。第１及び第２の免疫グロブリン重鎖は会合して、ＭＨＣクラスＩ分子複合体を形成する。ＭＨＣクラスＩ分子複合体は、第１ＭＨＣクラスＩペプチド結合クレフトと第２ＭＨＣクラスＩペプチド結合クレフトを含む。ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は少なくとも４つの融合タンパク質を含むことができる。２つの第１融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第２融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖と、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第１及び２つの第２融合タンパク質は、会合してＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を形成する。各第１融合タンパク質のＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインと各第２融合タンパク質のＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインはＭＨＣクラスＩＩペプチド結合クレフトを形成する。抗原性ペプチドはペプチド結合クレフトに結合する。様々な実施形態では、免疫グロブリン配列は、二量体化を支持するためのヒンジ領域を含む部分的重鎖配列である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗原提示複合体は、ナノ粒子へのコンジュゲーションのために、不対システインを含むように設計された、または天然に存在する不対システインを使用する、合成または組換えＨＬＡモノマーである。さらに、共刺激シグナル（または他の抗体ベースのリガンド）は、ＦａｂまたはｓｃＦｖであり得る。このような実施形態では、２つのシグナルは、所望の受容体に結合する抗原結合抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）に連結したＨＬＡ分子を含む単一の多機能構築物に組合せることができる。
【００３２】
他の態様及び実施形態では、本発明は、Ｔ細胞への抗原の提示のための、例えば、ＨＬＡアミノ酸配列などの抗原提示配列に融合したヒト化免疫グロブリン配列またはその一部を含む、ビーズ−または粒子−コンジュゲート分子複合体を提供する。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖配列（例えば、ＩＧＨＶ４フレームワーク）である。可変領域は、ＣＤ２８または他のヒトタンパク質に対する抗原結合活性を含まない。ＨＬＡアミノ酸配列は、１〜１０個、または１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する誘導体などの、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＩＭＧＴＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＬＡ００００５）またはその誘導体もしくはフラグメントであり得る。ヒト化免疫グロブリン配列は、ＨＬＡと免疫グロブリン配列の間にリンカーアミノ酸配列をさらに含むことができる。好ましくは、リンカーは、免疫原性を欠く。分子複合体は、β２ミクログロブリンペプチドをさらに含むことができる。
【００３３】
様々な実施形態では、免疫グロブリン融合配列は、ＩｇＧ，ＩｇＤ，ＩｇＡ，またはＩｇＭ  アイソタイプであり、任意のヒト生殖細胞系列フレームワークに由来し得る。生殖細胞系列フレームワークは、抗ＣＤ２８に関して記載した１つまたは複数のマウスフレームワーク残基を含んでも含まなくてもよい、ＩＧＨＶ４（例えば、ＩＧＨＶ４−５９）を含む。いくつかの実施形態では、上記の抗ＣＤ２８抗体の重鎖（マウスフレームワーク残基の有無にかかわらず）は、この態様に従ってＨＬＡに融合され、このような実施形態では、可変領域はＣＤ２８結合を低減するかまたは除去するように修飾される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ融合構築物には可変鎖配列を含まない。例えば、ＨＬＡまたは抗原提示複合体は、二量体ＨＬＡを提供するために、ヒンジ領域の上のＩｇ定常領域配列に融合させることができる。例えば、ＨＬＡまたは抗原提示部分は、そのそれぞれのＩｇＧの重鎖のＣＨ１部分にコンジュゲートさせることができる。すべてのＩｇＧ分子は、ヒンジ領域（上部および下部）にジスルフィド結合によって結合された、２つの同一の重鎖（定数と可変領域）からなる。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ分子または抗原提示複合体はＣＨ１（ヒンジ領域上のＩｇＨ鎖のＮ末端）に融合され、それによって、ＶＨ及びＶＬ軽鎖配列の欠如によってより小さくなっている二量体融合タンパク質を作成する。そのような構築物は、免疫原性のためのより少ない可能性を示すだけでなく、製造上の利点を提供することができる。
【００３５】
さらに他の実施形態では、抗原提示複合体（例えば、ＨＬＡ配列）は、Ｉｇ融合パートナーを含まず、単量体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗原提示複合体またはＨＬＡ分子（例えばＨＬＡ−Ａ２など）のＣ末端は、合成ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミドブロックポリマー、または本明細書に記載の他の粒子）などの固体／半固体の基質上の官能基（例えば、マレイミド部分）に部位指向結合するのに適したペプチドテザー配列を含む。テザー配列は任意の配列を含むことができ、これは、約５個〜約１５個（すなわち約５個〜約１０個のアミノ酸）のテザー内のどこかに組み込まれたシステイン残基とともに、ＧＧＧＳＧまたはＡＡＡＧＧの２つ，３つ，４つ，または５つの繰返しなどの、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，及びＴｈｒなどの親水性残基から主に構成されてもよい。システイン残基は、分子内ジスルフィド結合を形成しないと予測される部位に組込まれるべきである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−Ｉｇ融合体または他のＨＬＡ構築物は、Ｔ細胞への提示のためのＨＬＡに結合した抗原性ペプチドをさらに含む。抗原性ペプチドは、クラスＩまたはクラスＩＩ複合体の提示のために、その内容が、本明細書にその全体が参照により組込まれているＷＯ２００４／００６９５１に記載されているように、１つまたは複数のｈＴＥＲＴ，ＭＡＧＥ−１，ＭＡＧＥ−３，ｇｐ−１００，ＮＹ−ＥＳＯ−１，Ｍｅｌａｎ  Ａ／Ｍａｒｔ−１，ＨＰＶ１６−Ｅ７，ｇｐ７５／ブラウン，ＢＡＧＥ，及びＳ−１００及び／または任意の抗原性ペプチドを含むことができる。ＨＬＡ複合体は、任意選択で共刺激シグナルと共にＴ細胞への提示のために、記載されているビーズまたは粒子などの固体支持体に結合させることができる。
【００３７】
抗原提示複合体に提供され得る他のシグナルには以下が含まれる：ＣＤ８０（Ｂ７−１），ＣＤ８６（Ｂ７−２），Ｂ７−Ｈ３，４−１ＢＢＬ，ＣＤ２７，ＣＤ３０，ＣＤ１３４（ＯＸ−４０Ｌ），Ｂ７ｈ（Ｂ７ＲＰ−１），ＣＤ４０，ＬＩＧＨＴ，（または、そのような分子またはその活性部分の、任意選択で本明細書に記載のようにヒト化される、Ｉｇの融合体），ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体，ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体，ＯＸ４０に特異的に結合する抗体，Ｆａｓに特異的に結合する抗体，ＰＤ１に特異的に結合する抗体，ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体，及び４−１ＢＢに特異的に結合する抗体。
【００３８】
本発明の抗原提示プラットフォームに有用な接着分子は、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆体へのプラットフォームの接着を媒介することができる。本発明で有用な接着分子には、例えば、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３が含まれる。
【００３９】
Ｔ細胞増殖因子は、Ｔ細胞の増殖及び／または分化に影響を与える。Ｔ細胞増殖因子の例には、サイトカイン（例えば、インターロイキン，インターフェロン）及びスーパー抗原が含まれる。特に有用なサイトカインは、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，及びガンマインターフェロンを含む。Ｔ細胞増殖因子は、表面に化学的にコンジュゲートまたは吸着されたビーズまたは粒子の中に封入されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、ナノ粒子はさらに治療用化合物を含むか、または粒子の疎水性コア中に捕捉されたタンパク質／ペプチドを含む（例えば、ＩＬ−２、Ｔ細胞を引き付けるＣＣＬ９のようなケモカイン、及び／または抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ１ペプチドのようなチェックポイント阻害剤分子などの、化学療法剤、サイトカインまたはインターロイキン）。いくつかの実施形態におけるこのようなａＡＰＣは、再プログラミングだけでなく刺激または阻害のために特定的細胞を標的とするように構築される。いくつかの実施形態では、捕捉された化合物は、粒子マトリックスの分解により放出される。このようなａＡＰＣは、標的外相互作用による不要な活動を制限することにより、併用療法をより許容可能で有効なものとすることができるであろう。
【００４０】
本発明の態様に従って提示された抗原は、腫瘍関連抗原を含む。腫瘍関連抗原は、それらが由来する腫瘍によってのみ発現する腫瘍抗原、多くの腫瘍で発現するが、正常な成人の組織では発現しない共有腫瘍抗原（癌胎児性抗原，癌／精巣抗原）、及び腫瘍が生じる正常な組織によっても発現する組織特異的抗原、を含む。腫瘍関連抗原は、胚性抗原、異常な翻訳後修飾を有する抗原、変異した癌遺伝子もしくは腫瘍抑制因子の産物、融合タンパク質、またはオンコウイルスタンパク質、であり得る。様々な腫瘍関連抗原が当該技術分野において公知であり、これらの多くは市販されている。胎児性および胚性抗原は、癌胎児性抗原およびアルファフェトタンパク質（通常は発達する胚においてのみ著しく発現するが、肝臓及び結腸の腫瘍によってそれぞれ頻繁に著しく発現する），胎盤アルカリホスファターゼシアリル−ルイスＸ（腺癌で発現する），ＣＡ−１２５及びＣＡ−１９（胃腸，肝臓，及び婦人科腫瘍で発現する），ＴＡＧ−７２（直腸結腸腫瘍で発現する），上皮糖タンパク質２（多くの癌で発現する），膵臓癌胎児性抗原，５Ｔ４（胃癌で発現する），アルファ胎児タンパク質受容体（複数の腫瘍タイプ、特に乳腺腫瘍で発現する），及びＭ２Ａ（胚細胞腫瘍形成で発現する）、を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＭＡＧＥ−Ａ，Ｂ，及びＣ，ＣＴＡＧ−１，ＣＴＡＧ−４５，ＧＡＧＥ，及びＳＳＸを含み得る癌／精巣（ＣＴ）抗原であり、これは通常は精巣の生殖細胞によって発現するが、正常な成体の体組織では発現しない。しかし、多くのタイプの癌細胞が、メラノーマ、乳房、肝臓、肺、卵巣、及びホジキンリンパ腫を含むＣＴ抗原を発現することが示されている。
【００４２】
腫瘍関連分化抗原は、チロシナーゼ（メラノーマで発現する）及び特定の表面を含む抗原免疫グロブリン（リンパ腫で発現する）を含む。
【００４３】
変異した癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子産物は、両方とも多くの腫瘍タイプにおいて発現するＲａｓ及びρ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（乳房及び婦人科の癌で発現）、ＥＧＦ−Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、網膜芽細胞腫遺伝子産生物、ＭＹＣ（肺癌に関連する）、ＲＡＳ、乳房腫瘍に関連したｐ５３非変異物、ＭＡＧＥ−１、及びＭＡＧＥ−３（メラノーマ、肺癌及び他の癌に関連する）、を含む。
【００４４】
他の腫瘍抗原は、ＢＣＲ−ＡＢＬなどの融合タンパク質を含み、これは、慢性骨髄性白血病、及び子宮頚癌で見出されるＨＰＶタイプ１６、Ｅ６，及びＥ７などのオンコウイルスタンパク質で発現する。組織特異的腫瘍抗原は、メラノトランスフェリン及びＭＵＣＩ（膵臓癌及び乳癌で発現）；ＣＤ１０（一般急性リンパ芽球性白血病抗原、すなわちＣＡＬＬＡとして以前に知られている）または表面免疫グロブリン（Ｂ細胞白血病およびリンパ腫で発現する）；ＩＬ−２受容体、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋のα鎖（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫で発現する）；前立腺特異抗原及び前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺癌で発現する）；ｇｐ１００，ＭｅｌａｎＡ／Ｍ  ａｒｔ−１，チロシナーゼ，ｇｐ７５／ブラウン，ＢＡＧＥ，及びＳ−１００（メラノーマで発現する）；サイトケラチン（様々な癌腫で発現）；及びＣＤ１９，ＣＤ２０，及びＣＤ３７（リンパ腫で発現する）、を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、抗原性ペプチドは、本明細書に記載のＨＬＡ−Ｉｇ融合複合体などの、本明細書に記載のＨＬＡ抗原提示複合体によって提示されるＭＡＲＴ−１，ｇｐ１００，ＮＹ−ＥＳＯ−１，及びＭＡＧＥ−Ａ３を含む。
【００４６】
さらに他の実施形態では、組成物は、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，または１０個の抗原（例えば、２〜１０個または３〜８個の抗原）などの、腫瘍タイプの複数の抗原の混合物を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗原は、自己抗原であり、これは免疫応答を生成するための生物自身の「自己抗原」である。自己抗原は、グッドパスチャー症候群，多発性硬化症，グレーブス病，重症筋無力症，全身性エリテマトーデス，インスリン依存性真性糖尿病，関節リウマチ，尋常性天疱瘡，アジソン病，疱疹状皮膚炎，セリアック病及び橋本甲状腺炎皮膚炎、などの自己免疫疾患に関与している。例えば、糖尿病関連自己抗原は、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、及び例えば、ＩＣＡ５１２／ＩＡ−２タンパク質チロシンホスファターゼ，ＩＣＡ１２，ＩＣＡ６９，プレプロインスリンまたはその免疫学的に活性なフラグメント（例えば、インスリンＢ−鎖，Ａ鎖，Ｃペプチドまたはその免疫学的に活性なフラグメント），ＩＧＲＰ，ＨＳＰ６０，カルボキシペプチダーゼＨ，ペリフェリン，ガングリオシド（例えば、ＧＭ１−２，ＧＭ３）またはその免疫学的に活性なフラグメント、などの他の膵島細胞の自己抗原を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、抗原は、原生動物の成分，細菌，真菌（単細胞および多細胞の両方の），ウイルス，プリオン，細胞内寄生虫，蠕虫，及び免疫応答を誘導することができる他の感染性物質、などの感染性物質のものである。細菌抗原には、家族放線菌科，バチルス，バルトネラセエ，ボルデテラ属，カプトファーガ科，コリネバクテリア，腸内細菌，レジオネラ科，ミクロコッカス科，マイコバクテリウム科，ノカルジア科，パスツレラ科，シュードモナス，スピロヘータ科，ビブリオ属との生物アシネトバクター，ブルセラ菌，カンピロバクター，豚丹毒，腸内細菌，フランシセラ，ガードネレラ，ヘリコバクター，レビネ族，リステリア，ストレプトバチルス及びトロフェリマ属の生物などの、グラム陽性球菌，グラム陽性桿菌，グラム陰性菌，嫌気性菌の抗原が含まれる。原生動物の感染性物質の抗原には、マラリア原虫，リーシュマニア種，トリパノソーマ種及び住血吸虫種の抗原が含まれる。真菌の抗原には、アスペルギルス属，ブラストミセス，カンジダ，コクシジオイデス，クリプトコッカス，ヒストプラズマ，パラコクシジオイデス属，スポロトリクス，オーダーケカビ目の生物，クロモミコーシスと菌腫を誘発する生物，並びに、属白癬菌，小胞子菌，表皮菌，及びマラセチアの生物、の抗原が含まれる。プリオンの抗原は、スクレイピー，ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ），ネコ海綿状脳症，クールー，クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ），ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ），及び致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）の原因となるプリオンのシアロ糖タンパク質ＰｒＰ  ２７−３０を含む。それから抗原性ペプチドが得られる細胞内寄生虫には、クラミジア、マイコプラスマ科、アコレプラズマ科、リケッチア、及び属コクシエラとエールリヒアの生物が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスペプチド抗原には、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、及びＣＭＶが含まれるが、これらに限定されない。特に有用なウイルスペプチド抗原には、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質（膜アンカー（ＭＡ）タンパク質，コアキャプシド（ＣＡ）タンパク質，及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質を含むが、これらに限定されない），ＨＪＶポリメラーゼ，インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド（ＮＰ）タンパク質，Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ），Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ），Ｅ型肝炎タンパク質（ＨＢｅＡｇ），Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ，Ｃ型肝炎抗原，他、などのＨＩＶタンパク質が含まれる。
【００４９】
抗原性ペプチドを含む抗原は、本明細書にその全体が参照により組込まれる米国特許６，２６８，４１１に記載されているように、抗原提示複合体の抗原結合クレフトに能動的にまたは受動的に結合することができる。任意選択で、抗原性ペプチドはペプチド結合クレフトに共有結合することができる。
【００５０】
所望するなら、抗原性ペプチドをペプチド結合クレフトに結合するのにペプチドテザーを使用することができる。例えば、複数のクラスＩＭＨＣ分子の結晶学的解析は、ＭＨＣペプチド結合クレフト内に存在する抗原性ペプチドのカルボキシル末端と、β２Ｍのアミノ末端が非常に近接し、約２０．５Å離れていることを示している。従って、およそ１３個のアミノ酸長のような比較的短いリンカー配列を用いて、ペプチドを、β２Ｍのアミノ末端につなぎ止めることができる。この配列が適している場合には、そのペプチドは、ＭＨＣ結合溝に結合するであろう（米国特許６，２６８，４１１参照）。
【００５１】
抗体またはフラグメント及び／または抗原提示複合体は、エクスビボまたはインビボでの抗原提示のために固体支持体に結合させることができる。様々な固体支持体がＷＯ２００４／００６９５１に記載されており、その内容は本明細書にその全体が参照により組込まれる。いくつかの実施形態では、固体支持体はリガンドの結合のための官能基を有するビーズまたは粒子である。材料は、セルロースまたはデキストランなどの生分解性の有機材料であってもよい。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーを、特異的解剖学的部位へ移送し、特定の間隔にわたって生分解する、すなわち、より長いかもしくはより短い血漿半減期を有するか、またはより長いかもしくは短い組織滞留時間を有するように選択する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ビーズまたは粒子は、シクロデキストリン含有ポリマー，カチオン性シクロデキストリン含有ポチマー，ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ），ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ），エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ），ポリ（乳酸）（ＰＬＡ），ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ），ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ），ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ），ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ），ＰＬＧＡ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＧＡ），ＰＬＬＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＬＡ，ＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＭＡＬ），ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−ＣＯ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリシアノアクラレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ），ポリウレタン，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ），ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ），ポリエチレングリコール，ポリ−Ｌ−グルタミン酸，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ（ヒドロキシ酸），ポリ無水物，ポリオルトエステル，ポリ（エステルアミド），ポリアミド，ポリ（エステルエーテル），ポリカーボネート，ポリアルキレン，ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレングリコール（ＰＥＧ），ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ），ポリ（エチレンテレフタレート），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ポリビニルエーテル，ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル，ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ），ポリビニルピロリドン，ポリシロキサン，ポリスチレン（ＰＳ），ポリウレタン，アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース，ヒドロキシアルキルセルロース，セルロースエーテル，セルロースエステル，ニトロセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，カルボキシメチルセルロース，ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ），ポリ（エチル（メタ）アクリレート），ポリ（ブチル（メタ）アクリレート），ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート），ポリカルボン酸，（ヘキシルのポリマー（メタ）アクリレート），ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート），ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート），ポリ（フェニル（メタ）アクリレート），ポリ（メチルアクリレート），ポリ（イソプロピルアクリレート），ポリ（イソブチルアクリレート），ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸），並びにそれらのコポリマー及び混合物などの，アクリル酸のポリマー，ポリジオキサノン及びそのコポリマー，ポリヒドロキシアルカノエート，ポリプロピレンフマレート），ポリオキシメチレン，ポロキサマー，ポリ（オルト）エステル，ポリ（酪酸），ポリ（吉草酸），ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン），トリメチレンカーボネート，ポリビニルピロリドン，ポリオルトエステル，ポリホスファゼン，及びポリホスホエステル，並びに２つ以上のそのようなポリマーの混合物及び／またはブロック共重合体、の１つまたは複数などのポリマーを含む。ラテックスなどの他の薬学的に許容可能な材料も、固体粒子の支持体として用いることができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、抗原提示複合体と共刺激シグナルは、親水性の外部表面上に化学結合のための官能基を提供するＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド粒子などの、ポリマーの末端に表面官能基（例えば、粒子の表面に向って外側を向く端部）を有するＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、ａＡＰＣは、血液／リンパ交換を介するリンパ節への輸送を含み、標的組織への分布を可能にするのに十分長い末梢血液循環中に存続する。シェルの組成も生体内分布に影響を与え得る。従って、様々な実施形態では、粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーのＰＥＧによって達成することができる親水性のシェルを有する。様々な実施形態では、粒子の電荷は、リガンド粒子の表面に付着した標的リガンドにより貢献される電荷によるのと同様に、例えば、ＰＬＧＡ上のＣＯＯＨ器の組合せによって、僅かに負となる。いくつかの実施形態では、粒子（コジュゲートされたリガンドの有無にかかわらず）は、約０〜−２０ｍＶの表面電荷を持っているか、または、いくつかの実施形態では−５〜−１５ｍＶまたは約−１０ｍＶの表面電荷を持つ。
【００５４】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーを含むナノ粒子は、例えば、米国特許８，４２０，１２３に記載されており、これは本明細書に参照により組込まれる。
【００５５】
粒子は、形状が不規則であることから球状であることまで、及び／または、平たんでないもしくは不規則な表面を有することから滑らかな表面を有することまで、変化し得る。球状粒子は、不規則なサイズの粒子に比べて、より少ない表面積を有する。球状粒子が使用される場合、減少した表面領域により、より少ない試薬が必要である。一方、不規則な形状の粒子は、球状の粒子よりも非常に大きな表面積を有し、これは、表面積及び細胞に対する接触表面積あたりのコンジュゲートタンパク質の含量の利点を提供する。例えば、非対称なナノ粒子は、以下の範囲の１つにある、少なくとも１つの軸に沿った曲率半径を有する少なくとも１つの表面を有することができる：（ａ）約１ｎｍ〜約１０ｎｍ；（ｂ）約１１ｎｍ〜約１００ｎｍ；（ｃ）約１０１ｎｍ〜約４００ｎｍ；（Ｄ）約４０１ｎｍ〜約１μｍ；（ｅ）約１０μｍ〜約２０μｍ；（ｆ）約２０μｍ〜約１００μｍ；及び（ｇ）約１０１μｍ〜約１ｍｍ。いくつかの実施形態では、非対称なナノ粒子は、（ａ）ｘ軸に沿った寸法，（ｂ）ｙ軸に沿った寸法，及び（ｃ）ｚ軸に沿った寸法によって定義される非対称な形状を有することができ、ここで、（ａ），（ｂ）または（ｃ）の少なくとも１つは、少なくとも１つの他の寸法（ａ），（ｂ）または（ｃ）に等しくない。いくつかの実施形態では、非対称な形状は以下の式の１つで記述することができる楕円である：ａ＞ｂ＝ｃ（長楕円）；ａ＞ｂ＞ｃ（三軸楕円体）；及び、ａ＝ｂ＞ｃ（扁平楕円体）。本発明に従って使用することができる非対称ナノ粒子は、ＷＯ  ２０１３／０８６５００に記載されており、これはその全体が本明細書に参照により組込まれる。
【００５６】
粒子のサイズは変化し得る。様々な実施形態における粒子サイズ（呼び径）は０．０５〜５０μｍの範囲にあり、いくつかの実施形態では０．０５〜３５μｍ、またはいくつかの実施形態では０．０５〜１０μｍにあり、そしていくつかの実施形態では、約０．０５〜約３．０，約４．０，または約５．０μｍにある。例えば、いくつかの実施形態では、粒子は、直径または平均直径で５０〜５００ｎｍにある。いくつかの実施形態では、粒子は、より良好な末梢血液循環を可能にするために、約４００ｎｍ未満，約３００ｎｍ未満，約２００ｎｍ未満，約１００ｎｍ未満の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１００ｎｍ，約１５０ｎｍ，または約２００ｎｍの平均サイズ（例えば、直径または最大の軸）を有する。用語「約」は、数値的特徴に関連する場合、±１０％を意味する。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％の粒子は、例えば約１００〜約１５０ｎｍなどの、約５０〜約２５０ｎｍの範囲にある。粒子は、好ましくは上記の平均粒子サイズで、サイズが均一であることができるか、またはサイズが変化することができる。いくつかの実施形態では、粒子は、「ＥＰＲ効果」（強化された透過性及び保持効果）を利用するために、十分小さい。
【００５７】
本明細書に記載のリガンドおよび分子複合体は、利用可能な任意のプロセスを使用して化学的にビーズにコンジュゲートさせることができる。リガンド結合のための官能基は、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ，ＰＥＧ−ＮＨ２，ＰＥＧ−ＳＨまたはそのようなポリシアノアクリレートやポリカプロラクトンなどの異なるポリマーに結合した他の官能基を含む。  
【００５８】
例えば、固体支持体は、タンパク質がその表面に結合される前にコーティングすることができる。コーティングの化学が選択されると、固体支持体の表面は特定のタンパク質分子の特異的結合を可能にするように活性化させることができる。従って、コーティングは、様々な細胞集団との最適な反応性および生体適合性の観点から選択することができる。どんなコーティング化学が使用されても、さらなる活性化化学のために適切なマトリックスが提供されるのが好ましい。多数のこのようなコーティングは、当該技術分野で周知である。例えば、固体支持体は、ヒト血清アルブミン、トリス（３−メルカプトプロピル）−Ｎ−グリシルアミノメタン（米国特許６，０７４，８８４），ゼラチン，アミノデキストラン（米国特許５，４６６，６０９），またはアミノ酸のホモポリマーまたはランダムコポリマーでコーティングすることができる。一実施形態では、ポリ（グルタミン酸，リジン，チロシン）［６：３：１］を含むランダムアミノ酸コポリマーが使用される。このコポリマーは、製品Ｎｏ．Ｐ８８５４としてＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能である。これは、６部のグルタミン酸，３部のリジン，及び１部のチロシンの比率のアミノ酸のグルタミン酸，リジン，及びチロシンの線形ランダムポリマーである。他の実施形態では、４部のリジン対１部のチロシンの比率でリジンとチロシンを含むアミノ酸コポリマーが使用される。さらに他の実施形態では、１部のリジン対１部のアラニンの比率でリジンとアラニンを含むアミノ酸コポリマーが使用される。他の実施形態では、固体支持体は合成ポリマーでコーティングされ、次いで、その合成ポリマーは、タンパク質分子に連結される前に活性化される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、分子は、吸着によるかまたは共有結合を含む直接化学結合によって固体支持体に直接結合している、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｌＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６参照。分子自体は、求核性基、脱離基、または求電子性基を含む様々な化学官能基性で直接活性化することができる。活性化官能基は、アルキルおよびアシルハライド，アミン，スルフヒドリル，アルデヒド，不飽和結合，ヒドラジド類，イソシアネート，イソチオシアネート，ケトン，及び化学結合のために活性化することが知られている他の基、を含む。あるいは、分子は、小分子結合試薬の使用を介して固体支持体に結合させることができる。結合試薬の非限定的な例には、カルボジイミド，マレイミド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，ビスクロロエチルアミン，グルタルアルデヒドなどの二官能性のアルデヒド，無水物などが含まれる。他の実施形態では、当該技術分野において周知のように、分子は、ビオチン−ストレプトアビジン結合または連結などの親和性結合により、固体支持体に結合することができる。例えば、ストレプトアビジンは共有結合または非共有結合によって固体支持体に結合させることができ、ビオチン化分子は、当該技術分野で周知の方法を用いて合成することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、粒子またはビーズは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド、またはエステル末端キャップＰＬＧＡなどのポリマーであり、ここで、表面リガンドのコンジュゲーションのための官能基は、重合中に作成される。マレイミド基は、少なくとも１つの利用可能な遊離スルフヒドリル（−ＳＨ）基を有するリガンドの共有結合のために使用できる、このシェルに結合している官能基とともに、粒子の外側表面に親水性「ステルス」コーティング（ＰＥＧ）が形成された粒子を提供する。例えば、ＨＬＡ−Ｉｇリガンド及び／または抗ＣＤ２８は、ＦｃにおいてＳ４７３Ｃ置換を含有するヒトＩｇＧ４フレームワーク（本明細書に記載される）上に構築することができる。ＨＬＡ−Ｉｇまたは抗ＣＤ２８のいずれかの４７３におけるこの不対システイン残基は、穏かな還元条件下でＰＥＧに付着したマレイミド基にコンジュゲートさせることができる。穏かな還元条件は、タンパク質、特にＨＬＡ−Ｉｇ分子のＨＬＡ−β−２ミクログロブリン部分を不可逆的に変性させることはほとんどない。
【００６１】
例示的実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍから大きくも約５μｍの範囲（例えば、平均直径または最大軸）にあり、インビボで特定の生分解速度に（ＬＡ：ＧＡの比及び／またはＰＬＧＡポリマーのｍＷを調製することにより）調整することができるコア（ＰＬＧＡ）と、リガンド密度の一貫した制御（１分子／マレイミド基の確率論的関係）とコアから離れるリガンドの向きによって表面が官能基化された、血清タンパク質によるオプソニン作用及び（「ＰＥＧブラシ」のように作用する）循環からの除去から保護する親水性外側シェルと、を有する。いくつかの実施形態では、Ｌａ：ＧＡの比率は４０％／６０％〜６０％／４０％であり、いくつかの実施では約５０％／５０％である。いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡは、約２５Ｋ〜約３５Ｋ（例えば、約３０Ｋ）の分子量を有し、ＰＥＧは、約５Ｋなどの、約３Ｋ〜約１０Ｋの分子量を有する。いくつかの実施形態では、コア粒子は、約１５０ｎｍ、または約２００ｎｍの直径を有する。
【００６２】
代替実施形態では、支持体は、典型的にはリンカーを介して、適切な反応剤に共有結合させるために利用可能な１つまたは複数の化学的部分または官能基を含むポリマーでコーティングすることができる。
【００６３】
活性化化学は、固体支持体の表面への分子の特異的な、安定な結合を可能にする。官能基にタンパク質を結合させるに使用できる多くの方法がある。例えば、一般的な架橋剤のグルタルアルデヒドが、タンパク質アミン基をアミノ化固体支持体表面に結合させるのに２段階のプロセスで使用することができる。得られる結合は加水分解的に安定である。他の方法には、タンパク質上のアミンと反応するＮ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む架橋剤，アミン，スルフヒドリル，またはヒスチジン含有タンパク質と反応する活性ハロゲンを含む架橋剤，アミンまたはスルフヒドリル基と反応するエポキシドを含む架橋剤，マレイミド基とスルフヒドリル基との間のコンジュゲーション，及びペンダント糖部分の過ヨウ素酸酸化に続く還元的アミノ化によるタンパク質アルデヒド基の形成、の使用が含まれる。
【００６４】
固体支持体表面への特異的タンパク質の結合は、タンパク質の直接結合または間接的な方法を用いて達成することができる。特定のタンパク質は、直接結合またはコンジュゲーションに適しているが、他のタンパク質または抗体は、抗マウスＩｇＧまたはストレプトアビジンなどのリンカーまたはスペーサータンパク質に結合される場合、より良好な機能的活性を保持する。所望するなら、リンカーまたは結合タンパク質が使用できる。抗原提示複合体及び共刺激分子などのリガンドは、化学的コンジュゲーションを可能にするために、アミノ酸置換によって修飾されてもよい。
【００６５】
同じ固体支持体上の特定のタンパク質の比率は、抗原または抗体の提示における固体支持体の有効性を高めるために変化させることができる。例えば、抗ＣＤ２８に対する抗原提示複合体の比は、少なくとも約３０：１，または約１０：１，約３：１，約１：１，約０．３：１，約０．１：１，及び少なくとも約０．０３：１、であり得る。いくつかの実施形態では、その比は、約５：１，約４：１，約３：１，約２：１，または，約１：１，約１：２，約１：３，約１：４，または約１：５、である。支持体に結合されるタンパク質の総量は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ，少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ，少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ，少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ，少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ，または２００ｍｇ／ｍｌ超、であり得る。いくつかの実施形態では、表面官能基を有するＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子（例えば、マレイミドまたはエステル）を用いたものなど、粒子に結合したタンパク質の総量は、１〜１０μｇ／ｍｇのＰＬＧＡ，またはいくつかの実施形態では、２〜６μｇ／ｍｇのＰＬＧＡ、であり得る。いくつかの実施形態では、粒子のリガンド密度は、約１０３〜約１０５リガンド／μｍ２、またはいくつかの実施形態では約１０４リガンド／μｍ２である。例えば、サイズが１００〜２００ｎｍの範囲のナノ粒子については、ナノ粒子は平均で、約２００〜約１２００リガンド，約４００〜約１０００リガンド、または約５００〜約８００リガンドなどの、約１００〜約１５００リガンドを有する。
【００６６】
様々な実施形態では、本発明は、ポリマービーズまたは粒子、本明細書に記載される抗ＣＤ２８抗体、及び／または、本明細書に記載されるヒト化ＩｇのＨＬＡ融合複合体などの抗原提示複合体、を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物はさらに上記のようにＴ細胞に提示するための抗原性ペプチド含むことができ、これはコンジュゲートされたビーズまたは粒子と共製剤化することができる。様々な実施形態では、医薬組成物は、貯蔵安定性であり、いくつかの実施形態では、投与前に再構成するために凍結乾燥された形態で提供され、または別の「既製」製剤で提供される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧベースの直径又は平均直径が５０〜５０ｎｍのナノ粒子を含み、表面コンジュゲート抗ＣＤ２８抗体と抗原提示複合体を含む医薬組成物を提供する。抗ＣＤ２８抗体は、例えば本明細書に記載されるようなヒト化抗体であることができ、一本鎖可変フラグメントなどの抗体フラグメントであってもよい。いくつかの実施形態における抗原提示複合体は、少なくとも１つのＨＬＡ抗原結合クレフトを含む。抗ＣＤ２８及びＨＬＡ複合体は、粒子に別々に又は同じ反応で一緒に粒子に結合させることができる。医薬組成物は、腫瘍抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１）などの少なくとも１つのペプチド抗原を含むことができ、任意のアクティブなロードプロセスを使わずに、粒子と共製剤化することができる。
【００６８】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、必要とする患者に有効量の組成物を投与することによって抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞を誘導する方法において、免疫療法に有用である。いくつかの実施形態では、患者は癌患者である。
【００６９】
本明細書に記載の粒子ベースの抗原提示プラットフォームは、静脈内投与，動脈内投与，皮下投与，皮内投与，リンパ内投与，及び腫瘍内投与を含む任意の適切な経路によって、患者に投与することができる。患者には、ヒト及び動物の患者が含まれる。
【００７０】
本発明のいくつかの例示的実施形態が以下に記載される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、約１００〜２００ｎｍの範囲のサイズ、約−０〜−２０ｍＶ（及びいくつかの実施形態では−５〜−１５ｍＶ）の表面電荷、及び粒子あたり約１００〜１５００個のタンパク質リガンド、を有するポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態におけるタンパク質リガンドは、それぞれスルフヒドリル−マレイミド化学を介して粒子に結合されている。リガンドは、抗ＣＤ２８抗体リガンドの集団と、Ｔ細胞への提示のためのＨＬＡリガンド及び１つまたは複数の抗原性ペプチドの集団を含む。組成物は、静脈内，動脈内，皮下，皮内，リンパ内，または腫瘍内投与のための薬学的に許容可能な担体を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、粒子は、実質的に球状または概ね球状である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡは、約５０％の乳酸（ＬＡ）と５０％のグリコール酸（ＧＡ）からなるポリマーである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡポリマーは約３０Ｋの分子量を有し、ＰＥＧは、約５Ｋなどの、約３Ｋ〜約１０Ｋの分子量を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、組成物は、粒子あたり４００〜１０００個のリガンドを有する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８抗体リガンドは、５〜１５マウスフレームワーク残基を任意選択で有するヒトＩＧＨＶ４−５９生殖細胞系列と、３〜１５マウスフレームワーク残基を任意選択で有するＩＧＫＶ４−０１生殖細胞系列を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８はｓｃＦｖである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１であり、これは、二量体ＨＬＡ構築物を提供するのに十分なヒンジ領域上の免疫グロブリン配列への融合を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組成物は凍結乾燥される。
【００８０】
特に、抗原提示プラットフォームは、感染疾患、癌、または免疫疾患を有する患者を治療するため、または免疫不全の患者に予防的防衛を提供するのに有用であり得る。
【００８１】
治療することができる感染症には、細菌，ウイルス，プリオン，真菌，寄生虫，蠕虫などにより引き起こされるものが含まれる。このような疾患には、ＡＩＤＳ、肝炎、ＣＭＶ感染、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が含まれる。例えば、ＣＭＶは、臓器移植患者で見られる最も一般的なウイルス病原体であり、骨髄または末梢血幹細胞の移植を受けた患者における罹患率および死亡率の主要な原因である（Ｚａｉａ，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．４，６０３−２３，１９９０）。これは、これらの患者の免疫不全状態によるものであり、これは、血清陽性患者における潜伏ウイルスの再活性化、または、血清反応陰性個体における日和見感染を可能にする。現在の治療は、ガンシクロビルなどの抗ウイルス化合物の使用に集中しているが、これは欠点を有し、その最も顕著なものは薬剤耐性ＣＭＶの発生である。これらの治療に対する有用な代替は、移植手順の開始前に、患者由来の、または適切なドナー由来のウイルス特異的ＣＴＬの生成を伴う予防的免疫療法レジメンである。
【００８２】
ＰＴＬＤは移植患者のかなりの割合で発生し、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染の結果である。ＥＢＶ感染は、米国での成人人口の約９０％に存在すると考えられている（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｈｕｍｍｅｌ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２９，２９１−２）１５，１９９６）。アクティブウイルス複製及び感染は、免疫系によって抑制されるが、ＣＭＶの場合のように、移植療法により免疫不全となった個体は、ウイルスの再活性化を可能にする制御Ｔ細胞集団を失う。これは、移植プロトコルに対する深刻な障害を表す。ＥＢＶは、血液学的および非血液癌の様々な腫瘍促進にも関与し得る。ＥＢＶと鼻咽頭癌の間には強い関連性もある。従って、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞による予防的治療は、現在の治療に対して優れた代替法を提供する。
【００８３】
本発明に従って治療することができる癌は、黒色腫，癌腫，例えば，結腸，頭頸部癌，十二指腸癌，前立腺癌，乳癌，肺癌，卵巣癌，乳管，大腸，肝臓，膵臓，腎臓，子宮，胃、異形成口腔粘膜、ポリープ症、侵襲的口腔癌、非小細胞肺癌、転移性および扁平上皮細胞尿路癌など；神経学的悪性腫瘍，例えば，神経芽細胞腫，神経膠腫，など；血液学的悪性腫瘍，例えば，慢性骨髄性白血病，小児急性白血病，非ホジキンリンパ腫，慢性リンパ球性白血病，悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫，菌状息肉腫，非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫，リンパ腫様丘疹症，Ｔ細胞が豊富な皮膚リンパ過形成，水疱天疱瘡，円板状エリテマトーデス，扁平苔癬，など；などを含む。例えば、Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８６，３８５−９２，２０００；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９３，２４３−５１，２００１；Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２４，６６−７８，２００１；Ｍｅｉｄｅｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（４），２１６１−６９，２００３参照。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗腫瘍活性を有するＴ細胞を活性化するために本明細書に記載の医薬組成物の投与によって、上記の特定された癌を含む、癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療は、ニボルマブ，ペンプロリズマブ，及びイピリムマブなどの、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤と一緒に提供される。いくつかの実施形態では、追加の治療は、抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＰＤ１、または抗ＰＤ−Ｌ１である。追加の治療またはチェックポイント阻害剤は、その従来のレジメンを介して別々に投与することができるか、または、本明細書に記載のナノ粒子への、もしくは別のナノ粒子の集団に結合された、追加のリガンドとして投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤が、最初の治療として提供され、続いて、本明細書に記載のナノ粒子による治療が、例えば、チェックポイント阻害剤による治療の約１〜約８週間後に、またはチェックポイント阻害剤による治療の約２〜約４週間後に、開始される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤は、例えば、治療の開始時と約２週間毎に、または治療の開始時と１つまたは複数のチェックポイント阻害剤については約２週間毎に、及びナノ粒子治療については約４週間ごとに、ナノ粒子治療と同時に提供される。いくつかの実施形態では、患者は、チェックポイント阻害剤治療に対して耐性であるか、または部分的もしくは過渡応答を示すのみであり、本明細書中に記載のａＡＰＣは、これらの患者において腫瘍退縮を強化する。さらに他の実施形態では、チェックポイント阻害剤治療に一般的に耐性のある癌については、本明細書に記載の組成物は、このような癌に対するチェックポイント阻害剤の有効使用を展開する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は、患者の腫瘍の分析に基いて、患者のための個別化されたベースで選択される。例えば、Ｉｏｎｏｖ  Ｙ．，ａ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ＦＯＲ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  １（２）：１４８−１５５（２０１０）（これは、本明細書に参照により組込まれる）に記載されたプロセスまたは他のプロセスが使用され得る。これらの実施形態では、ナノ粒子は（「既成品」ベースで）提供することができ、腫瘍抗原は個別化されたベースで選択され、装填され得る。
【００８６】
治療することができる自己免疫疾患には、喘息，全身性エリテマトーデス，慢性関節リウマチ，Ｉ型糖尿病，多発性硬化症，クローン病，潰瘍性大腸炎，乾癬，重症筋無力症，グッドパスチャー症候群，グレーブス病，尋常性天疱瘡，アジソン病，疱疹状皮膚炎，セリアック病及び橋本甲状腺が含まれる。
【００８７】
抗原特異的ヘルパーＴ細胞は、マクロファージを活性化するか、または、例えば、感染性疾患および癌を治療するため使用することができる特異的な抗体を産生するために、Ｂ細胞を活性化するのに使用することができる。抗体産生Ｂ細胞自体も、この目的のために使用することができる。
【００８８】
本発明は、さらに、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとともにそれを発現するホスト細胞を提供する。
【００８９】
本発明は、さらに、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【００９０】
実施例１：生殖系列ヒト化可変領域及びヒト定常領域配列の設計
本実施例は、特に、マウス抗ＣＤ２８抗体のテンプレートからの生殖系列ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体の設計；Ｓ２４１Ｐ（Ｋａｂａｔ番号）ヒンジ安定化変異、抗体を結合するのに適した、残存Ｆｃガンマ受容体結合及びＣｙｓ残基（Ｓ４７３Ｃ、Ｋａｂａｔ番号）を除去するためのＬ２４８Ｅ（Ｋａｂａｔ番号）変異を含有するヒトＩｇＧ４の設計；ＣＤ２８に潜在的非結合の変異体生殖細胞系列ヒト化抗体のＶドメインの設計；潜在的なＴ細胞エピトープを含まない生殖細胞系列ヒト化抗体のＮ末端へのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の融合のためのリンカー配列の設計、を示す。
【００９１】
開始抗ＣＤ２８抗体は、マウス９．３モノクローナル抗体（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３  １７７：１６５）であった。９．３抗体のＶ領域の構造モデルが、スイスのＰＤＢを用いて作製され、抗体の結合特性に不可欠である可能性があるＶ領域内のアミノ酸を特定するために分析された。多くのフレームワーク残基とともにＣＤＲ（ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義の両方を用いて）内に含まれるすべての残基が結合に対して潜在的な重要性を有すると考えられた。抗ＣＤ２８のＶＨ及びＶκ配列の両方は典型的なフレームワーク（ＦＷ）残基を含み、ＣＤＲ１，２及び３のモチーフは、多くのマウス抗体に匹敵する。
【００９２】
ヒト化のために、ヒトＩＧＨＶ４−５９生殖細胞系列ＦＷが重鎖のテンプレートとして選択された（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２  １６９：１１１９−１１２５によって選択されたＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１０に優先して）。ＩＧＫＶ４−０１生殖細胞系列ＦＷが軽鎖のテンプレートとして選択された。これらのＦＷの両方は、それぞれのマウスＶＨ及びＶκ配列に６２％の相同性を有する。マウスＣＤＲはこれらのＷに移植され、様々な数のマウスＷ残基も、３つのヒト化ＶＨ変異体及び３つのヒト化Ｖκ変異体を作成するのに含まれた（図１〜６）。
【００９３】
重鎖ＦＷについては、ＦＷ１残基１及び３は、結合ポケットに隣接しているので、結合抗原に重要であると考えられ、一方、残基６はβ鎖支持残基１及び３の両方の構造及びＣＤＲ３の構造に影響すると考えられた。したがって、これらのマウスＦＷ残基は、すべての変異体に保持された。
【００９４】
ＦＷ２では、残基３７はＶＨとＶκの間のインターフェースを維持するために重要であると考えられ、一方、残基４８はＣＤＲ２の構造を支持すると考えられた；従って、これらの残基の両方はすべての変異体に保持された。  
【００９５】
ＦＷ３では、残基７３，７６及び７８はＣＤＲ１に直接接触しており、一方残基７１はＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方に接触している；従って、これらの残基は抗原結合に必要である可能性が高く（ＣＤＲ１とＣＤＲ２の寄与に応じて）、従ってすべての変異体に保持された。残基７１は、時には間接的に、残基７１〜７８の構造に影響を与えることによりＣＤＲ１の構造に影響を与え得るが、一方、残基８２ａと８２ｃも間接的ＣＤＲ２の構造に影響を与え得る。従って、これらの残基はＶＨ１のみに保持された。残基６７と８２は３次元構造において隣接しており、ＣＤＲ２の構造に影響を与え、ＣＤＲ１及び３を支持するβ鎖に潜在的に影響を与える空間を充填するように相互作用する。従って、これらの残基は、変異体ＶＨ１とＶＨ２に保持された。
【００９６】
軽鎖ＦＷについては、ＦＷ１残基３は結合ポケットに隣接しており、抗原結合に直接関与することができるが、一方、残基４はＣＤＲ３の構造を直接支持する。従って、これらのマウスＦＷ残基はすべての変異体に保持された。
【００９７】
ＦＷ２では、残基４９はＣＤＲ２の構造を支持し、重鎖ＣＤＲ３の構造を直接支持する重鎖と軽鎖の間のインターフェースにも重要であるので、すべての変異体に保持された。
【００９８】
ＦＷ３では、残基８５及び８７は、重鎖と軽鎖のインターフェースに、かつＣＤＲ３の構造を支持するのにも重要であると考えられ、従ってすべての変異体に保持された。残基８０は、潜在的にＣＤＲ２及び３の構造に間接的な影響を有すると考えられ、Ｖκ１のみに保持された。残基７０は一般には軽鎖残基Ｒ２４と塩橋を形成し、従って、Ｖκドメインに重要な構造的影響を有する。抗ＣＤ２８では、この塩橋は（残基７０はむしろＤよりもＮであるので）存在せず、この相互作用を導入することは不利になり得るであろう；しかし、マウス抗体Ｎ７０は、グリコシル化（ＮＦＳ）されており、ヒト化の際に、これを除去することは有益であろう。従って、マウスＮはＶκ１とＶκ２に保持されたが、Ｖκ３ではＤに変更された。
【００９９】
ヒトＩｇＧ４／κに基く定常領域配列が、ヒンジ安定化変異（Ｓ２４１Ｐ）及び残りのＦｃガンマ受容体結合（Ｌ２４８Ｅ）を除去する下側ヒンジにおける変異を組込むように設計された。システイン残基も、化学結合の目的（Ｓ４７３Ｃ）でＦｃのＣ末端の近くに含まれた。修飾されたＩｇＧ４の重鎖定常領域配列が、κ軽鎖定常領域配列（図８）とともに、図７に示されている。
【０１００】
さらなるＶＨドメインがＣＤ２８への潜在的非結合のために設計され、この配列は図９に示されている。マウスのＶ領域配列の解析（マウスの生殖細胞系列Ｖ領域のκ軽鎖定常領域配列の変異の程度から）は、ＶＨが、ＣＤ２８結合に大きく貢献する可能性があることを示唆した。従って、潜在的非結合ヒト化ＶＨ変異体のみが設計された。この変異体は、正しいＣＤＲの構造を再構成するためのマウスＦＷ残基を何ら含まないが、結合に重要となる可能性が高い残基のＣＤＲＨ３における３つの変異も含有する（Ｙ１００ａ，Ｙ１００ａＡ，Ｙ１００ｂＡ）。
【０１０１】
実施例２：ヒト化抗体へのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の融合のためのリンカーの設計
ヒト化抗ＣＤ２８抗体のＮ末端へのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＩＭＧＴ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＬＡ００００５）の融合のためのリンカーが構築され、潜在的な免疫原性を除去するためにｉＴｏｐｅ（商標）とＴＣＥＤ（商標）による分析が導入された。
【０１０２】
ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、３４ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のオープンエンド結合溝内での、ペプチドのアミノ酸側鎖と特異的結合ポケット（特定のポケット位置；ｐ１，ｐ４，ｐ６，ｐ７及びｐ９における）の間の有利な相互作用を予測する。これらの対立遺伝子は、特定の民族集団で最も広く見出されるものに帰せられる重みづけをせずに、世界全体で見出される最も一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を表す。２０の対立遺伝子は「オープン」ｐ１構成を含み、１４は８３位のグリシンがバリンで置き換えられている「クローズ」構成を含む。キー結合残基の位置は、試験タンパク質配列にわたる一つのアミノ酸だけ重複する９量体ペプチドのインシリコ生成によって達成される。物理的なＭＨＣクラスＩＩ結合実験との比較は、ｉＴｏｐｅ（商標）が、ペプチド間でいずれかがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するかまたは結合しないことを、高精度でうまく識別するのに使用することができる。インシリコＭＨＣクラスＩＩ結合分析の任意の制限は、以前ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）エクスビボＴ細胞エピトープマッピングアッセイでスクリーニングした配列に由来するペプチド（＞１０，０００ペプチド）の大規模なデータベースの配列を含むＴＣＥＤ（商標）を使用して、減少している。従って、ＴＣＥＤ（商標）は、実際のエクスビボでの免疫原性との相関を見出すために、無関係の抗体及びタンパク質配列に対する任意の試験配列を検索するのに使用することができる。
【０１０３】
ｉＴｏｐｅ（商標）を使用するリンカー配列の分析は、３４ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のそれぞれに対して試験されたリンカー配列にわたる９量体を重複させて行われた。各９量体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子との潜在的な「フィット」及び相互作用に基いてスコアがつけられた。ソフトウェアによって計算されたペプチドのスコアは０と１の間にある。高い平均結合スコア（ｉＴｏｐｅ（商標）のスコアリング関数で０．５５超）を生じた非生殖細胞系列ペプチドが強調され、５０％以上のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド（すなわち、３４対立遺伝子のうち１７）が高い親和性（スコア０．６超）を有するなら、そのようなペプチドは「無差別高親和性」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドと定義された（これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むため高リスクであると考えられる）。スコア０．５５超（しかし、０．６超は過半数ではない）を有する５０％以上のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのペプチドは、「無差別中程度の親和性」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドと定義された。配列のさらなる分析は、ＴＣＥＤ（商標）を用いて行われた。無関係なタンパク質の以前前のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）の研究でＴ細胞応答を刺激した無関係なタンパク質からペプチド（Ｔ細胞エピトープ）間の任意の高い配列相同性を同定するために、配列はＢＬＡＳＴ検索によってＴＣＥＤ（商標）を調べるのに使用された。
【０１０４】
Ｓｃｈｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．によって使用された配列は、Ｎ末端シグナル配列と結合するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のＮ末端に１つと、抗ＣＤ２８  ＶＨドメインへの融合のためのＣ末端に１つの（例えば、図９参照）、２つのリンカーを組込んでいた。Ｎ末端リンカーについては、配列は、リンカーを介し、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１成熟タンパク質の最初の８個のアミノ酸を含むシグナル配列切断部位から分析された。Ｃ末端リンカーについては、配列は、リンカーを介し、抗ＣＤ２８  ＶＨドメインの最初の８個のアミノ酸までの、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１α３ドメインの末端の８個のアミノ酸から分析された。
【０１０５】
結合スコア０．６超（高親和性）を有するペプチドは、過半数（１７以上）のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を結合する（無差別高親和性結合因子と呼ばれる）。０．５５と０．６の間の結合スコアを有する中程度の親和性の結合因子は、１７以上のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合する。Ｎ末端リンカーは、１つの高親和性（２位にＰ１アンカーを有する）及び１つの中程度の親和性（４位にＰ１アンカーを有する）の、２つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子結合配列を含むことが見出された。Ｃ末端リンカーは、１１位にＰ１アンカーを有する１つの中程度の親和性のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子結合ペプチドを含むことが見出された。
【０１０６】
以前に特定されたエピトープを有する任意の相同性を決定するために、ｉＴｏｐｅ（商標）分析で使用したのと同じ配列を使用して、ＡｎｔｉｔｏｐｅのＴ細胞エピトープデータベース（ＴＣＥＤ（商標））のＢＬＡＳＴ検索が行われた。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイで試験されている無関係の配列由来のペプチドの大きなデータベース（１０，０００ペプチド超）に対して任意の試験配列を検索するために、ＴＣＥＤ（商標）が使用されている。リンカー配列のいずれも、ＴＣＥＤ（商標）における何の「ヒット」も含まないことがわかった。
【０１０７】
ｉＴｏｐｅ（商標）は、さらに、ＭＨＣクラスＩＩへの結合のそれらの傾向を低減するためにリンカーに対する配列変化を評価するのに使用された。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のＮ末端がｐＢＦＫｓｒベクターに設けられたシグナル配列またはその天然のシグナル配列のどちらかに直接融合されるように、Ｎ末端リンカーは完全に除去することができるであろうと指摘された。これは、融合タンパク質のＮ末端はヒト生殖細胞系列配列だけを含み、Ｔ細胞エピトープの危険性を回避することを保証するであろう。以下に推奨されるリンカー配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を背景残留レベル（任意の９量体によって結合されるもののうちの５未満の対立遺伝子）に低減し、クローニングのための適切な制限部位を提供することが見出された（いずれの配列もベクターの修飾を必要とするであろうが）。
【化１】
0006566938.tif 000002
【０１０８】
実施例３：配列のコドン最適化および発現クローニング
コドンはＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）を使用して最適化され、最適化された配列は、以下に示すように、発現のためにクローニングされた。
【０１０９】
配列は、ＮＳ０細胞中での発現のために、ＰｍｅＩ制限部位，Ｋｏｚａｋ配列，及びシグナルペプチドで操作された。翻訳はＫｏｚａｋ配列のすぐ下流で開始する。
【０１１０】
ＨＬＡ−ＩｇＧ４ＨＣ融合の完全翻訳アミノ酸配列が、図１０に示されている。
【０１１１】
ＬＣ３（ＶＫ３）の翻訳配列が、図１１に示されている。
【０１１２】
ＨＣ１の翻訳配列が、図１２に示されている。
【０１１３】
ＨＣ２の翻訳配列が、図１３に示されている。
【０１１４】
ヒトβ２ミクログロブリンも発現した。
【０１１５】
実施例４：ＮＳ０細胞における発現
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性データと他の考察に基いて、ＨＣ１：：ＬＣ３およびＨＣ２：：ＬＣ３の重鎖と軽鎖の組合せが、ＳｔａｂｌｅＦａｓｔ−ＮＳ０細胞株開発のために、第１及び第２ｍＡｂ候補として、それぞれ、選択された。
【０１１６】
ＳＴＡＢＬＥＦＡＳＴ−ＮＳ０細胞株を生成するためのｐＢＦｋｓｒ：：  ＨＣ１：：  ＬＣ３シストロン性発現ベクターの最終的なベクトルマップが図１４に示されている。ｐＢＦｋｓｒ：：  ＨＣ１：：  ＬＣ３の構築は、同じ手法を用いて行われた。
【０１１７】
親ＮＳ０細胞を、補充した無血清増殖培地中で増殖させた。健全な培養の確立時に、１０００万の細胞（１０×１０６）が４５μｇの線形化（ΔＰｖｕＩ）発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトされた。細胞は、増殖培地中で、バルク中で２４間回復させた。回復後、細胞補充された無血清選択培地（コレステロール）中で洗浄し、選択培地中で再懸濁し、ウェルあたり２００μＬで４０×９６ウェルプレートに分配した。実際の分配は、ＨＣ１：：ＬＣ３及びＨＣ２：：ＬＣ３に対し、それぞれ、１１４０細胞／ウェル及び８４０細胞／ウェルであった。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２で１週間インキュベートし、フェノールレッドを補充した選択培地を与えた。トランスフェクション後２週間で、多数のウェルは、赤色から黄色への媒体の色の変化に基いて活発に成長した。
【０１１８】
ＨＣ１：：  ＬＣ３トランスフェクションから総量１１２７ウェルが、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ発現のためにスクリーニングされた。ＨＣ２：：  ＬＣ３トランスフェクションから総量６１２ウェルが、スクリーニングされた。ＩｇＧ濃度に基づいて、総量２９０及び１０１の細胞株が、ＨＣ１：：ＬＣ３及びＨＣ２：：ＬＣ３の２４ウェルプレートに、それぞれ、スケールアップされた。２４時間の生産アッセイが、さらなる分析のために最高の発現体を選択するのに使用された。簡潔には、２４ウェルプレートは、５００μＬの新鮮な培地中に５×１０５細胞で播種された。２４時間後、上清はＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。ＩｇＧ濃度に基いて、総量６０及び２４の細胞株が、ＨＣ１：：ＬＣ３及びＨＣ２：：ＬＣ３の６ウェルプレートに、それぞれ、スケールアップされた．
【０１１９】
３日の比生産アッセイが、さらなる分析のために最高の発現体を選択するのに使用された。簡潔には、６ウェルプレートは、１．５ｍＬの新鮮な培地中に４×１０５細胞で播種された。３日後、細胞が計数され、上清はＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。ＩｇＧ濃度及び成長に基いて、ｐｇ／細胞／日の平均比生産速度すなわちＳＰＲを計算することができる。相対ＳＰＲに基いて、総量２０及び１０の細胞株が、ＨＣ１：：ＬＣ３及びＨＣ２：：ＬＣ３のＴ−７５フラスコに、それぞれ、スケールアップされた。３日間のＳＰＲアッセイは、ｍＡｂ生産のための懸濁適応及びスケールアップのための最終細胞株を選択するために、Ｔ−７５スケールで繰返された。
【０１２０】
各ｍＡｂの５細胞株が、３０ｍＬのシェーカー培養にスケールアップされ、ＳＰＲと成長のために再評価された。すべての懸濁株がバンクされた。それぞれのｍＡｂについて最も良好に作用した発現体が、小規模生産用に撹拌培養に調整された。
【０１２１】
ＨＬＡ−ＩｇＧ４融合タンパク質については、ｐＢＦｋｓｒ：：ＨＬＡ−ＩｇＧ４：：  ＬＣ３シストロン性発現ベクターがＳＴＡＢＬＥＦＡＳＴ−ＮＳ０細胞株の生成のために構築された。ベクターマップは図１５に示されている。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子を含む発現カセット及びベクターも、すべての３つの融合タンパク質（ヒトＨＬＡ−ＩｇＧ４重鎖融合，ＣＤ２８軽鎖［ＬＣ３］，及びヒトβ２ミクログロブリン）のサブユニットをコードするトリシストロニック発現ベクターのために作成された。トリシストロニック構築物は、図１６に示されている。すべての３つの遺伝子の発現は、ＥＬＩＳＡによる過渡ＨＥＫ２９３培養及び上清のウエスタンブロット分析で確認された。
【０１２２】
実施例５：機能解析
ＣＤ２８に対するヒト化モノクローナル抗体が、ｍＡｂをコーティングしたプレート上で新たに単離したＰＢＭＣの増殖を誘導する能力について試験された。図１７に示されるように、ヒト化抗ＣＤ２８はスーパーアゴニストではない。
【０１２３】
ヒト化モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞株上でＣＤ２８を染色する能力について試験された。結果は図１８に示されている。図１８（Ａ）は、マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体（クローン９．３，アイソタイプのＩｇＧ２ａ）による染色を示している。黒＝非染色細胞，赤＝抗ＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ，青＝抗ＣＤ２８＋抗ＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ。図１８（Ｂ）は、ヒト化抗ＣＤ２８（アイソタイプＩｇＧ４）による染色を示している。黒＝非染色細胞，赤＝抗ＩｇＧ４ａ  ＰＥ，青＝抗ＣＤ２８（３５ｎｇ）＋抗ＩｇＧ４  ＰＥ，紫＝抗ＣＤ２８（１μｇ）＋抗ＩｇＧ４  ＰＥ。ヒト化抗ＣＤ２８による染色は、クローン９．３ｍＡｂでブロックされ得る（図示せず）。
【０１２４】
ＨＬＡ−Ｉｇの精製後、ペプチドをロードしたタンパク質を捕捉するために、（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２のカレントプロトコルに記載のように）構造依存性の抗ＨＬＡ  ｍＡｂを使用して、ＥＬＩＳＡによって抗原ペプチド負荷効率が確認される）。特異的ペプチドの約９０％の再現性負荷効率（すなわち正しいＭＨＣ制限）が、非特異的ペプチドの０％（すなわち、ＭＨＣミスマッチ）に比較して、予想される。
【０１２５】
参照による組込み
本明細書で参照されるすべての特許および刊行物は、本明細書にその全体が参照により組込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
約１００〜２００ｎｍの範囲内のサイズを有するポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子，約０〜２０ｍＶの表面電荷，及び粒子あたり約１００〜１５００個の、スルフヒドリル−マレイミド化学を介して選択的に結合されているタンパク質リガンド；
抗ＣＤ２８抗体リガンドの集団；
ＨＬＡリガンドの集団；
Ｔ細胞への提示のための１つまたは複数の抗原性ペプチド；及び
静脈内，動脈内，皮下，皮内，リンパ内，または腫瘍内投与のための薬学的に受容可能な担体、
を含む医薬組成物。
（項目２）
前記粒子は実質的に球状又は概ね球状である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記ＰＬＧＡは、約５０％の乳酸（ＬＡ）及び５０％のグリコール酸（ＧＡ）からなるポリマーである、項目１または２に記載の医薬組成物。
（項目４）
前記ＰＬＧＡは約２５Ｋから約３５Ｋの分子量を有し、前記ＰＥＧは約３Ｋから約１０Ｋの分子量を有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５）
粒子あたり４００〜１０００個のリガンドを有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記抗ＣＤ２８抗体リガンドは、任意選択で５〜１５個のマウスフレームワーク残基を有するヒトＩＧＨＶ４−５９生殖系列フレームワーク、及び任意選択で３〜１５個のマウスフレームワーク残基を有するＩＧＫＶ４−０１生殖系列フレームワークを含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目７）
前記抗ＣＤ２８リガンドは抗原結合抗体フラグメントである、項目１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目８）
前記抗ＣＤ２８リガンドはｓｃＦｖを含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目９）
前記ＨＬＡリガンドは二量体である、項目１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１０）
前記ＨＬＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１である、項目９に記載の医薬組成物。
（項目１１）
前記ＨＬＡは免疫グロブリン融合体を含む、項目９または１０に記載の医薬組成物。
（項目１２）
前記抗ＣＤ２８抗体リガンドと前記ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１免疫グロブリン融合体は、Ｓ２４１及びＬ２４８に変異を有し、コドン４７３にシステインを有するＩｇＧ４定常領域を有する、項目１１に記載の医薬組成物。
（項目１３）
前記抗ＣＤ２８抗体リガンドは、免疫グロブリン重鎖のコドン４７３のシステインを介して前記粒子にコンジュゲートされている、項目１２に記載の医薬組成物。
（項目１４）
前記ＨＬＡリガンドは、免疫グロブリン重鎖のコドン４７３のシステインを介して前記粒子にコンジュゲートされている、項目１２または１３に記載の医薬組成物。
（項目１５）
前記ＨＬＡリガンドは、ＨＬＡの細胞外ドメインを含み、前記ＨＬＡ細胞外ドメインのＣ末端に結合したペプチドまたは化学リンカーを介して前記粒子に連結されたＨＬＡモノマーであり、前記ＨＬＡは任意選択的でＨＬＡ−Ａ２である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目１６）
前記ＨＬＡリガンドは、ＨＬＡの細胞外ドメインを含み、前記ＨＬＡ細胞外ドメインのＣ末端に結合したペプチドまたは化学リンカーを介して抗ＣＤ２８リガンドのｓｃＦｖと前記粒子の両方に連結されたＨＬＡモノマーであり、前記ＨＬＡは任意選択でＨＬＡ−Ａ２である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目１７）
前記組成物は凍結乾燥される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１８）
任意選択で１〜１５個のアミノ酸修飾を有するヒトＩＧＨＶ４重鎖アミノ酸配列を含み、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス抗体のアミノ酸配列に基く、抗ＣＤ２８抗体またはその一部。
（項目１９）
前記ＣＤＲは、マウス９．３ｍＡｂに基く、項目１８に記載の抗体。
（項目２０）
前記重鎖はヒトＩＧＨＶ４−５９生殖系列フレームワーク（ＦＷ）の変異体である、項目１８または１９に記載の抗体。
（項目２１）
前記抗体は軽鎖を含み、前記軽鎖はヒトＩＧＫＶ４−０１ＦＷの変異体を含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２２）
前記重鎖は、１，３，６，３７，４８，６７，７１，７３，７６，７８，８２，８２ａ，及び８２ｃから選択される位置に１つまたは複数のマウスＦＷ残基を含む、項目１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２３）
前記軽鎖は、３，４，４９，７０，８５，８７，及び８０から選択される位置に１つまたは複数のマウスＦＷ残基を含む、項目２２に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体はその定常領域またはその一部を含み、前記定常領域は、任意選択でヒトＩｇＧ４の変異体である、項目１８〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２５）
前記定常領域は、１つまたは複数のヒンジ安定化変異を含む、項目２４に記載の抗体。
（項目２６）
前記ヒンジ安定化変異はＣＨ鎖に導入された１つまたは複数の変異を含む、項目２５に記載の抗体。
（項目２７）
前記ＣＨ鎖に導入された前記１つまたは複数の変異はＳ２４１Ｐを含む、項目２６に記載の抗体。
（項目２８）
前記抗体は定常領域を含み、前記定常領域は前記抗体を固体支持体に化学結合させるのに適した１つまたは複数の変異を含む、項目１８〜２７のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２９）
結合に適した前記１つまたは複数の変異は不対システインを作成する、項目２８に記載の抗体。
（項目３０）
前記不対システインはＳ４７３Ｃである、項目２９に記載の抗体。
（項目３１）
前記不対システインは、固体支持体への共有結合を提供する、項目２９または３０に記載の抗体。
（項目３２）
前記固体支持体は、任意選択で共有結合に利用可能なエステル、カルボン酸、マレイミド、アルコールである官能基を任意選択で有する、ビーズまたは粒子である、項目１８〜３１のいずれか１項に記載の抗体。
（項目３３）
前記ビーズまたは粒子は、シクロデキストリン含有ポリマー，カチオン性シクロデキストリン含有ポチマー，ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ），ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ），エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ），ポリ（乳酸）（ＰＬＡ），ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ），ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ），ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ），ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ），ＰＬＧＡ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＧＡ），ＰＬＬＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＬＡ，ＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＭＡＬ），ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−ＣＯ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリシアノアクラレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ），ポリウレタン，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ），ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ），ポリエチレングリコール，ポリ−Ｌ−グルタミン酸，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ（ヒドロキシ酸），ポリ無水物，ポリオルトエステル，ポリ（エステルアミド），ポリアミド，ポリ（エステルエーテル），ポリカーボネート，ポリアルキレン，ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレングリコール（ＰＥＧ），ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ），ポリ（エチレンテレフタレート），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ポリビニルエーテル，ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル，ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ），ポリビニルピロリドン，ポリシロキサン，ポリスチレン（ＰＳ），ポリウレタン，アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース，ヒドロキシアルキルセルロース，セルロースエーテル，セルロースエステル，ニトロセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，カルボキシメチルセルロース，ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ），ポリ（エチル（メタ）アクリレート），ポリ（ブチル（メタ）アクリレート），ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート），ポリカルボン酸，（ヘキシルのポリマー（メタ）アクリレート），ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート），ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート），ポリ（フェニル（メタ）アクリレート），ポリ（メチルアクリレート），ポリ（イソプロピルアクリレート），ポリ（イソブチルアクリレート），ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸），並びにそれらのコポリマー及び混合物などの，アクリル酸のポリマー，ポリジオキサノン及びそのコポリマー，ポリヒドロキシアルカノエート，ポリプロピレンフマレート），ポリオキシメチレン，ポロキサマー，ポリ（オルト）エステル，ポリ（酪酸），ポリ（吉草酸），ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン），トリメチレンカーボネート，ポリビニルピロリドン，ポリオルトエステル，ポリホスファゼン，及びポリホスホエステル，並びに２つ以上のそのようなポリマーの混合物及び／またはブロック共重合体、の１つまたは複数から選択されたポリマーを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３４）
定常領域を含み、前記定常領域は、Ｆｃガンマ受容体結合を低減するために、１つまたは複数の変異を含む、項目１８〜３３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目３５）
Ｆｃガンマ受容体結合を低減するための前記１つまたは複数の変異は、ＣＨ鎖に導入された１つまたは複数の変異を含む、項目３４に記載の抗体。
（項目３６）
前記ＣＨ鎖に導入された前記１つまたは複数の変異はＬ２４８Ｅを含む、項目３５に記載の抗体。
（項目３７）
前記抗体は、Ｔ細胞による認識のために抗原を提示する分子複合体を有する固体支持体にコンジュゲートされている、項目１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目３８）
抗原提示複合体であって、ＨＬＡのアミノ酸配列に融合したヒト化免疫グロブリン重鎖配列を含み、前記複合体は、任意選択で免疫グロブリン軽鎖配列を含まない、抗原提示複合体。
（項目３９）
前記ＨＬＡ−Ｉｇ融合は二量体である、項目３６に記載の抗原提示複合体。
（項目４０）
前記免疫グロブリン配列はＩＧＶ４配列を含む、項目３８または３９に記載の抗原提示複合体。
（項目４１）
前記ＨＬＡアミノ酸配列はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＩＭＧＴ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＬＡ００００５）またはその誘導体である、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
（項目４２）
さらに、前記ＨＬＡと免疫グロブリン配列の間にリンカーを含む、項目３８〜４１のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
（項目４３）
さらに、Ｔ細胞への提示のために前記ＨＬＡに結合した抗原性ペプチドを含む、項目３８〜４２のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
（項目４４）
前記抗原性ペプチドは、チロシナーゼ，ＭＡＧＥ−Ａ１，ＭＡＧＥ−Ａ３，ｇｐ１００，Ｍｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴ−１，ｇｐ７５／ブラウン，ＢＡＧＥ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，及びＳ−１００、のうちの１つまたは複数である、項目４３に記載の抗原提示複合体。
（項目４５）
前記ポリペプチドは、任意選択でビーズまたは粒子である固体支持体に結合している、項目３８〜４４のいずれか１項に記載の抗原提示複合体。
（項目４６）
前記ビーズまたは粒子は、シクロデキストリン含有ポリマー，カチオン性シクロデキストリン含有ポリマー，ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ），ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ），エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ），ポリ（乳酸）（ＰＬＡ），ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ），ＰＬＧＡ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＧＡ），ＰＬＬＡ−ＢＰＥＧ−ＰＬＬＡ，ＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＭＡＬ），ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ），ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ），ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ），ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−ＣＯ−Ｄ，Ｌ−ラクチド），ポリシアノアクラレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ），ポリウレタン，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ），ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ），ポリエチレングリコール，ポリ−Ｌ−グルタミン酸，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ（ヒドロキシ酸），ポリ無水物，ポリオルトエステル，ポリ（エステルアミド），ポリアミド，ポリ（エステルエーテル），ポリカーボネート，ポリアルキレン，ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレングリコール（ＰＥＧ），ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ），ポリ（エチレンテレフタレート），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ポリビニルエーテル，ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル，ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ），ポリビニルピロリドン，ポリシロキサン，ポリスチレン（ＰＳ），ポリウレタン，アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース，ヒドロキシアルキルセルロース，セルロースエーテル，セルロースエステル，ニトロセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，カルボキシメチルセルロース，ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ），ポリ（エチル（メタ）アクリレート），ポリ（ブチル（メタ）アクリレート），ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート），ポリカルボン酸，（ヘキシルのポリマー（メタ）アクリレート），ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート），ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート），ポリ（フェニル（メタ）アクリレート），ポリ（メチルアクリレート），ポリ（イソプロピルアクリレート），ポリ（イソブチルアクリレート），ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸），並びにそれらのコポリマー及び混合物などの，アクリル酸のポリマー，ポリジオキサノン及びそのコポリマー，ポリヒドロキシアルカノエート，ポリプロピレンフマレート），ポリオキシメチレン，ポロキサマー，ポリ（オルト）エステル，ポリ（酪酸），ポリ（吉草酸），ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン），トリメチレンカーボネート，ポリビニルピロリドン，ポリオルトエステル，ポリホスファゼン，及びポリホスホエステル，並びに２つ以上のそのようなポリマーの混合物及び／またはブロック共重合体、の１つまたは複数から選択されたポリマーを含む、項目４５に記載の抗原提示複合体。
（項目４７）
ポリマービーズまたは粒子、項目１８〜３７のいずれか１項に記載の抗体、及び／または項目３８〜４６のいずれか１項に記載の抗原提示複合体を含む医薬組成物。
（項目４８）
約１００〜２００ｎｍの範囲のサイズを有する、任意選択でＰＬＧＡ−ＰＥＧマレイミド粒子である、ポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子を含む、項目４７に記載の医薬組成物。
（項目４９）
前記粒子は、約−０〜−１５ｍＶの表面電荷、及び、任意選択で約−５〜−１５ｍＶの表面電荷を有する、項目４７または４８に記載の医薬組成物。
（項目５０）
スルフヒドリル−マレイミド化学を介して選択的に結合されている、粒子あたり約１００〜１５００個のタンパク質リガンドを含む、項目４７〜４９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５１）
静脈内，動脈内，皮下，皮内，リンパ内，または腫瘍内投与のための薬学的に受容可能な担体を含む、項目４７〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５２）
前記粒子は実質的に球状又は概ね球状である、項目４７〜５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５３）
前記ＰＬＧＡは、約５０％の乳酸（ＬＡ）及び５０％のグリコール酸（ＧＡ）からなるポリマーである、項目４７〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５４）
前記ＰＬＧＡは約２５Ｋから約３５Ｋの分子量を有し、前記ＰＥＧは約３Ｋから約１０Ｋの分子量を有する、項目４７〜５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５５）
粒子あたり４００〜１０００個のリガンドを有する、項目４７〜５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５６）
前記抗ＣＤ２８リガンドは抗原結合抗体フラグメントである、項目４７〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５７）
前記抗ＣＤ２８リガンドはｓｃＦｖを含む、項目４７〜５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５８）
前記ＨＬＡリガンドは二量体である、項目４７〜５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５９）
前記ＨＬＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１である、項目５８に記載の医薬組成物。
（項目６０）
前記ＨＬＡは、免疫グロブリン重鎖融合体を含み、任意選択で免疫グロブリン軽鎖配列を含まない、項目５８または５９に記載の医薬組成物
（項目６１）
さらに、Ｔ細胞への提示のための抗原性ペプチドを含む、項目４７〜６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目６２）
前記医薬組成物は、Ｔ細胞への提示のための抗原性ペプチドと共製剤化される、項目６１に記載の医薬組成物。
（項目６３）
前記抗原性ペプチドは、チロシナーゼ，ＭＡＧＥ−Ａ１，ＭＡＧＥ−Ａ３，ｇｐ１００，Ｍｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴ−１，ｇｐ７５／ブラウン，ＢＡＧＥ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，及びＳ−１００、のうちの１つまたは複数である、項目６１または６２に記載の医薬組成物。
（項目６４）
前記医薬組成物は貯蔵安定性である、項目４７〜６３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目６５）
前記医薬組成物は凍結乾燥される、項目６４に記載の医薬組成物。
（項目６６）
前記組成物は非経口送達のために製剤化される、項目４７〜６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目６７）
患者へ項目４７から６６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘導するための方法。
（項目６８）
前記患者は癌患者である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記患者は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤で治療を受けている、または受けたことがある、項目６７または６８に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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