(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール飲料中に含まれるクエン酸を分離回収するクエン酸分離工程、分離回収されたクエン酸の水素安定同位体比を質量分析により測定する測定工程、前記水素安定同位体比の測定値を、クエン酸の添加の有無を判定するための水素安定同位体比の基準値と対比する対比工程を含む、アルコール飲料におけるクエン酸添加の有無を判定する方法。
【請求項２】
アルコール飲料が混成酒である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルコール飲料が果実を原料としたリキュールである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
アルコール飲料が梅を原料としたリキュールである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記基準値が-40‰〜-20‰の範囲から選択されるカットオフ値である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
クエン酸分離工程は、アルコール飲料より有機酸混合物を分離回収し、回収された有機酸混合物からクエン酸を分離回収することにより行なわれる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
クエン酸分離工程中に、又はクエン酸分離工程と前記測定工程との間に、クエン酸をクエン酸塩に変換する工程を含み、測定工程においてクエン酸塩の水素安定同位体比を測定する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
クエン酸塩がクエン酸カルシウムである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記クエン酸分離工程に次いで、分離回収されたクエン酸の炭素安定同位体比を質量分析により測定する第１の測定工程と、前記炭素安定同位体比の測定値を、クエン酸の添加の有無を判定するための炭素安定同位体比の基準値と対比する第１の対比工程とが行われ、第１の対比工程の結果、クエン酸の添加が検出されなかったアルコール飲料について、第２の測定工程及び第２の対比工程として、分離回収されたクエン酸の水素安定同位体比を測定する測定工程、及び水素安定同位体比の測定値を前記水素安定同位体比の基準値と対比する対比工程が行われる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
クエン酸のクエン酸塩への変換が、クエン酸分離工程の後、第２の測定工程の前に行なわれる、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール飲料におけるクエン酸添加の有無を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リキュールは醸造酒や蒸留酒に果実や糖類などを漬け込んだものであり、日本では、ウメ果実を原料に製造されている梅酒が代表的である。ウメ果実の収穫量は、2015年は97,900 tで、このうち70%以上が梅酒や梅干しなどの加工食品に使われている（非特許文献１）。梅酒の出荷量は最近10年間で1.3倍に増加している一方（非特許文献２、３）、梅酒加工用に出荷されているウメは、30％減産している（非特許文献１）。加工用ウメ果実の減産にも関わらず、梅酒出荷量の増加が実現しているのは、原料であるウメ果実の使用量を減らし、酸味料や香料を添加した価格の安い梅酒が寄与しているものと推測される。
【０００３】
2015年1月には日本洋酒酒造組合によって、梅、糖類及び酒類のみを原料として製造された梅酒を本格梅酒とする自主基準が制定された。本格梅酒の偽装表示防止は、消費者の保護だけでなく、原料を供給する梅栽培農家にとっても利点があり、本格梅酒の表示を担保するための判別技術が必要とされている。
【０００４】
果汁飲料においては、安定同位体比分析により糖類や酸味料等の混ぜ物の添加を検出する手法が知られている。非特許文献４には、トウモロコシ等のC4植物を原料とする糖類の添加を炭素安定同位体比分析により検出する方法が記載されている。非特許文献５及び６には、酸味料としてのクエン酸の添加を水素安定同位体比により検出し得ることが記載されている。酸味料として使用されるクエン酸は、トウモロコシ、タピオカ、サツマイモなどの植物から得られるデンプンや糖蜜を発酵させて製造されるが、非特許文献２、３に記載の手法によれば、クエン酸の由来する植物の種類（C3植物かC4植物か）に関わらず、クエン酸の添加を検出することができるとされている。
【０００５】
しかしながら、非特許文献４〜６に開示される手法は、アルコールを含有しない果汁飲料に対して適用される手法である。リキュールのようなアルコール飲料において、水素安定同位体比分析により酸味料添加を検出する手法はこれまでに報告がない。果汁飲料中のクエン酸の水素安定同位体比の質量分析による測定値は、NMRによる測定値とずれが生じることが知られており（非特許文献５）、クエン酸の分取工程で溶媒の水の影響を受けているためと考えられる。リキュールのようなアルコール飲料において、水素安定同位体比分析によりクエン酸添加を検出する手法はこれまでに報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】農林水産統計「平成２７年産びわ、おうとう、うめの結果樹面積、収穫量及び出荷量」、農林水産省大臣官房統計部、平成２７年１１月２４日公表、[http://www.maff.go.jp/j/tokei/kouhyou/sakumotu/sakkyou_kazyu/pdf/syukaku_biwa_15.pdf]
【非特許文献２】日本洋酒酒造組合統計、洋酒移出数量調査表、平成10年〜26年分、平成27年2月5日公表、[http://www.yoshu.or.jp/statistics_legal/statistics/data/sta_h10-h26.pdf]
【非特許文献３】日本洋酒酒造組合統計、洋酒移出数量調査表、平成27年11月分、平成28年1月7日公表、[http://www.yoshu.or.jp/statistics_legal/statistics/data/sta_h27-11.pdf]
【非特許文献４】Antolovich et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, vo. 49, p.2623-2626
【非特許文献５】Jamin et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, vol. 53, p.5130-5133
【非特許文献６】Gonzalez, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, vol. 46, p.2200-2205
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、梅酒をはじめとするアルコール飲料において、クエン酸の添加の有無を判別することができる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、梅酒などのリキュールにおいて、クエン酸を単離して水素安定同位体比を測定することにより、クエン酸が添加されたか否かを判別することができること、クエン酸の由来がC3植物かC4植物かを問わずクエン酸添加の有無を判別できることを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、アルコール飲料中に含まれるクエン酸を分離回収するクエン酸分離工程、分離回収されたクエン酸の水素安定同位体比を質量分析により測定する測定工程、前記水素安定同位体比の測定値を、クエン酸の添加の有無を判定するための水素安定同位体比の基準値と対比する対比工程を含む、アルコール飲料におけるクエン酸添加の有無を判定する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、アルコール飲料において水素安定同位体比を指標として酸味料添加の有無を判定する方法が初めて提供される。クエン酸酸味料の原料が、アルコール飲料の原料として用いた植物と同じ光合成回路を有する植物の場合、炭素安定同位体比ではクエン酸の添加を検出できないが、水素安定同位体比によれば、クエン酸の原料植物がC3植物かC4植物かを問わず、クエン酸の添加を検出することができる。製造コストを安価にする目的で原料の使用量を減らして酸味料添加により風味を調整したアルコール飲料製品では、酸味料を一定量以上使用することになるため、水素安定同位体比分析による本発明の方法は十分な検出精度を発揮できると期待される。また本発明の方法によれば、クエン酸の分取量が従来法の10分の1（25 mg）で済むため、アルコール飲料試料及び分析にかかる試薬の使用量の低減も図られ、判別費用も低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】酸味料無添加の梅酒、酸味料表示のある市販の梅酒、及び酸味料として市販されているクエン酸について、クエン酸分子の炭素安定同位体比及び水素安定同位体比を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で対象とするアルコール飲料には、風味の調整等のためにクエン酸を添加される可能性のある各種のアルコール飲料が包含される。クエン酸は、主として酸味を追加するための酸味料として使用される。アルコール飲料の典型例として、醸造酒や蒸留酒に種々の調味料等を加えて製造される混成酒を挙げることができる。混成酒の具体例としては、植物を原料に用いて製造されるリキュールが挙げられ、特に、梅、アンズ、リンゴ、柑橘類（レモン、オレンジ、蜜柑、柚子、金柑、グレープフルーツ等）、カリン等の果実を原料としたリキュールを挙げることができる。中でもとりわけ好ましい例として、酸味が風味に与える影響が強く、製造経費削減の目的でクエン酸の添加が行われやすい、梅や柑橘類を原料としたリキュール、特に梅を原料としたリキュール（梅酒）を挙げることができる。
【００１３】
本発明では、水素安定同位体比の測定は質量分析により行なわれる。分析には、IRMS（Isotope Ratio Mass Spectrometry）として知られる各種手法を採用することができる。IRMSのための質量分析計及び分析システムは各種のものが公知であり、市販品も種々存在するので、水素安定同位体比の測定自体は公知の分析システムを用いて実施可能である。
【００１４】
安定同位体比は、基準として用いる国際標準物質との相対表記で行なわれる。測定対象試料の安定同位体比が標準試料の安定同位体比と比べてどれだけずれているかを千分率偏差（‰）で表記することが一般的であり、水素安定同位体比は、以下の式(I)で表される。本発明においても、式(I)の通りに千分率偏差として水素安定同位体比を表記すればよい。もっとも、2H/1H比（単位ppm）として求めても差し支えない。
【００１５】
δ2H＝ (2H/1H)sample / (2H/1H)standard − 1  ・・・(I)
式中、(2H/1H)sampleは、測定対象試料中に含まれるクエン酸について測定した2H/1H比であり、(2H/1H)standardは、標準試料の2H/1H比である。
【００１６】
標準試料としては、水素安定同位体比分析のための国際標準物質であるVSMOW（Vienna Standard Mean Ocean Water）を使用すればよい。
【００１７】
本発明で測定する水素安定同位体比は、アルコール飲料中に含まれるクエン酸における水素安定同位体比である。従って、本発明の方法では、クエン酸添加の有無を判定すべきアルコール飲料より、クエン酸を分離回収する工程（クエン酸分離工程）が必要となる。アルコール飲料からのクエン酸の分離回収は常法により容易に実施できる。具体的には、例えば、陽イオン交換カラムを用いてアルコール飲料試料中のアミノ酸を除去した後、陰イオン交換カラムを用いて試料から有機酸を分離・回収し、回収された有機酸から逆相カラムを用いたHPLCによりクエン酸を分離・回収することができる。
【００１８】
クエン酸の水素安定同位体比は、クエン酸分子中の全ての水酸基とカルボキシル基中の水素を除去した後に測定することが望ましい。水素安定同位体比の測定に先立ち、クエン酸をクエン酸カルシウムなどの塩に変換することにより、クエン酸分子中の反応可能な水素を除去することができる。クエン酸塩への変換は、クエン酸分離工程中に行なってもよいし、クエン酸分離工程と水素安定同位体比の測定工程との間に行なってもよい。すなわち、クエン酸として単離する前の有機酸混合物の段階で、有機酸混合物に塩化カルシウムなどの塩類を添加してクエン酸塩への変換を行なってもよいし、有機酸混合物からクエン酸を分離回収した後、クエン酸溶液に塩類を添加してクエン酸塩に変換してもよい。クエン酸塩に変換した後には、加熱処理等により余剰の水を除去してから質量分析に供することが望ましい。
【００１９】
アルコール飲料についてクエン酸の水素安定同位体比の測定値を得た後、この測定値を、クエン酸添加の有無を判定するための水素安定同位体比の基準値と対比する。基準値は、複数のクエン酸酸味料について測定された水素安定同位体比の平均値、又は所定のカットオフ値であり得る。後述する通り、基準値よりも高い測定値は、クエン酸添加がないことを示す。
【００２０】
クエン酸酸味料が添加されたアルコール飲料では、酸味料として使用されているクエン酸の水素安定同位体比と同程度の値を示す一方、クエン酸酸味料が添加されていないアルコール飲料では、該飲料中に存在するクエン酸の水素安定同位体比が相対的に高い。具体的には下記実施例に示される通りであり、クエン酸分子の水素安定同位体比は、クエン酸酸味料では-50‰前後、クエン酸添加が明記された梅酒製品では-55‰〜-40‰程度であり、両群に有意差は無い。一方、クエン酸添加されていない梅酒では、クエン酸の水素安定同位体比は-20‰程度以上であり、クエン酸酸味料の水素安定同位体比及びクエン酸添加した梅酒中のクエン酸の水素安定同位体比と比べて有意に高い数値を示す。梅酒以外のアルコール飲料でも同程度の数値になると考えられる。
【００２１】
従って、複数のクエン酸酸味料について測定された水素安定同位体比の平均値を基準値とした場合、アルコール飲料試料についての測定値が当該基準値よりも有意に高いときには、そのアルコール飲料はクエン酸添加されていないと判定することができ、アルコール飲料試料についての測定値と基準値との間で有意差が無いとき又は基準値よりも低いときには、そのアルコール飲料はクエン酸添加あり、ないしはその疑いありと判定することができる。
【００２２】
クエン酸添加の有無を区別する水素安定同位体比のカットオフ値は、-20‰〜-40‰の範囲、例えば-22‰〜-38‰、又は-25‰〜-35‰の範囲から選択することができる。このカットオフ値よりも測定値が高い場合にクエン酸添加なしと判定でき、このカットオフ値よりも測定値が低い場合にクエン酸添加ありないしはその疑いありと判定することができる。
【００２３】
酸味料としてのクエン酸には、食品添加物として使用される各種クエン酸が包含される。酸味料として一般的に使用されているクエン酸は、トウモロコシ、タピオカ、サツマイモなどの植物から得られるデンプンや糖蜜を発酵させて製造されるが、本発明によれば、由来する植物がC3植物かC4植物かCAM植物かを問わず、各種クエン酸酸味料を対象に添加の有無を判定することができる。
【００２４】
本発明においては、アルコール飲料から分離回収されたクエン酸の炭素安定同位体比の測定も組み合わせて実施してよい。この態様においては、例えば、アルコール飲料中に含まれるクエン酸を分離回収するクエン酸分離工程に次いで、分離回収されたクエン酸の炭素安定同位体比を質量分析により測定する第１の測定工程と、前記炭素安定同位体比の測定値を、クエン酸の添加の有無を判定するための炭素安定同位体比の基準値と対比する第１の対比工程とを実施し、まずは炭素安定同位体比によってクエン酸の添加を検出する。これによりクエン酸の添加が検出されなかったアルコール飲料について、第２の測定工程及び第２の対比工程として、上述した通り、分離回収されたクエン酸の水素安定同位体比を測定する測定工程、及び水素安定同位体比の測定値を前記水素安定同位体比の基準値と対比する対比工程を行ない、クエン酸添加の有無を判定する。
【００２５】
炭素安定同位体比の質量分析にも、IRMS（Isotope Ratio Mass Spectrometry）として知られる各種手法を採用することができ、公知の分析システムを用いて炭素安定同位体比を測定することができる。
【００２６】
炭素安定同位体比は、以下の式(II)で表される。炭素の標準物質としては、炭素安定同位体比分析のための国際標準物質であるVPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）を使用すればよい。
δ13C ＝(13C/12C)sample / (13C/12C)standard − 1  ・・・(II)
式中、(13C/12C)sampleは、測定対象試料中に含まれるクエン酸について測定した13C/12C比であり、(13C/12C)standardは、標準試料の13C/12C比である。
【００２７】
アルコール飲料についてクエン酸の炭素安定同位体比の測定値を得た後、この測定値を、クエン酸添加を検出するための炭素安定同位体比の基準値と対比する。基準値としては、所定のカットオフ値を好ましく使用することができる。カットオフ値は、-22‰〜-16‰の範囲、例えば-21‰〜-17‰の範囲、あるいは-20‰〜-18‰の範囲から選択することができる。
【００２８】
下記実施例に示される通り、クエン酸分子の炭素安定同位体比は、C3植物を原料としたクエン酸酸味料では-22‰程度以下と低い値を示す一方、トウモロコシ等のC4植物を原料としたクエン酸酸味料では-15‰程度以上と高い値を示し、両者の間には炭素安定同位体比に明確な差異がある。梅酒は原料である梅がC3植物であり、クエン酸酸味料が添加されていない梅酒では、分離回収したクエン酸の炭素安定同位体比は典型的なC3植物の値を示す。しかしながら、C4植物を原料としたクエン酸酸味料を添加した梅酒においては、分離回収したクエン酸の炭素安定同位体比が高くなり、C4植物由来のクエン酸酸味料と同程度の高い値を示す。C4植物を原料とするアルコール飲料においては、梅酒の場合とは逆に、クエン酸酸味料が添加されていない場合には、分離回収したクエン酸の炭素安定同位体比は典型的なC4植物の値を示し、C3植物由来のクエン酸酸味料を添加したアルコール飲料では、分離回収したクエン酸の炭素安定同位体比が低くなると考えられる。いずれにおいても、アルコール飲料の原料植物と同じ光合成回路を有する植物を原料としたクエン酸が添加されている場合には、炭素安定同位体比に基づいてクエン酸添加を検出することができない。
【００２９】
従って、梅酒のようにC3植物を原料とするアルコール飲料を検査対象とする場合には、アルコール飲料試料についての炭素安定同位体比の測定値が上記したカットオフ値よりも高ければ、そのアルコール飲料へのクエン酸の添加が検出されたことになる。しかしながら、測定値がカットオフ値よりも低いときには、C3植物を原料としたクエン酸酸味料の添加の可能性が残るため、クエン酸の添加なしと判定することができない。
【００３０】
また、C4植物を原料とするアルコール飲料を検査対象とする場合には、アルコール飲料試料についての炭素安定同位体比の測定値が上記したカットオフ値よりも低ければ、そのアルコール飲料へのクエン酸の添加が検出されたことになる。しかしながら、測定値がカットオフ値よりも高いときには、C4植物を原料としたクエン酸酸味料の添加の可能性が残るため、クエン酸の添加なしと判定することができない。
【００３１】
水素安定同位体比分析と炭素安定同位体比分析を組み合わせて実施する場合には、そのように、炭素安定同位体比に基づいてクエン酸の添加なしと判定することができなかったアルコール飲料、すなわち、クエン酸の添加が検出されなかったアルコール飲料について、分離回収したクエン酸の水素安定同位体比の測定及びその測定値に基づく判定を行なえばよい。
【００３２】
クエン酸のクエン酸塩への変換は、水素安定同位体比の測定のために好ましく行われる工程であり、炭素安定同位体比の測定時にはクエン酸塩への変換は不要である。従って、クエン酸塩への変換を行なう場合には、クエン酸分離工程の後（より具体的には、第１の測定工程の後、又は第１の対比工程の後）、第２の測定工程の前に行なうこととすればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
和歌山県果樹試験場うめ研究所が作成した酸味料無添加の梅酒4点、酸味料表示のある市販梅酒8点、および酸味料として市販されているクエン酸8点の計20点を分析に供した。炭素の標準物質としてVPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）を、水素の標準物質としてVSMOWを用いた。
【００３５】
梅酒は、原液1mlを超純水で2倍〜5倍希釈して分析用試料とした。各試料を陽イオン交換固相抽出カラムに通液してアミノ酸を除去した後、陰イオン交換固相抽出カラムに通液して有機酸を固相抽出カラムに吸着させた。陰イオン固相カラムに吸着した有機酸は3mlの1N塩酸で溶出させ、有機酸を回収した。回収した有機酸は、逆相カラム（YMC-Triart C18）3本を装着した島津製HPLC（LC-20シリーズ）を用いて、有機酸からクエン酸を単離して回収した。
【００３６】
HPLCで単離したクエン酸溶液及び市販クエン酸試料は、凍結乾燥後、超純水100μlで溶解させ、このうち40μlを錫箔に充填し、炭素安定同位体比分析に供した。
【００３７】
水素安定同位体比分析では、HPLCで単離したクエン酸溶液及び市販クエン酸試料に塩化カルシウムを添加してクエン酸をクエン酸カルシウム（C12H10Ca3O14）に変換し、加熱して余剰の水を除去した後、水素安定同位体比分析に供した。
【００３８】
クエン酸の炭素安定同位体比及び水素安定同位体比は、元素分析計を接続した安定同位体比質量分析計（Delta V advantage, Thermo fisher Scientific社）で測定した。測定値は、次式の千分率偏差で表した。
δX ＝Rsample / Rstandard − 1
式中、Xは13C又は2H、Rsampleは試料から単離したクエン酸における13C/12C又は2H/1H、Rstandardは標準物質における13C/12C又は2H/1Hである。
【００３９】
結果と考察
炭素安定同位体比及び水素安定同位体比の測定結果を図１に示す。うめ研究所が作製した酸味料無添加梅酒に含まれているクエン酸の水素安定同位体比（δ2H値）は-0.8〜-19.1‰、炭素安定同位体比（δ13C値）は-21.5〜-22.0‰を示した。一方、酸味料が添加されている梅酒のδ2H値は-54.5〜-39.3‰、δ13C値は-15.3〜-11.7‰と対照的な値を示した。酸味料として販売されているクエン酸８点のδ13C値は、-15.1〜-10.8‰のものと、-25.2〜-22.6‰のものとに分かれ、これらの数値は原料がそれぞれC4植物及びC3植物由来であることを示唆している。またこれら市販のクエン酸８点のδ2H値は、原料がC3植物由来かC4植物由来かにかかわらず、いずれも-56.9〜-31.3‰程度の低い値を示した。
【００４０】
ウメ（Prunus mume）はC3植物であり、酸味料無添加の梅酒に含まれているクエン酸のδ13C値も典型的なC3植物の値を示している。酸味料が添加された梅酒から単離したクエン酸の高いδ13C値は、C4植物を原料としたクエン酸が添加されていることを示している。日本では価格競争力のあるC4植物であるトウモロコシを原料とした中国産のクエン酸が酸味料として一般的に使われているが、C3植物を原料としたクエン酸を酸味料として添加した場合、炭素安定同位体比で酸味料添加の有無を判別するのは困難である。しかし、水素安定同位体比を分析することで、クエン酸の原材料にかかわらず酸味料添加の判別が可能となると考えられる。以上のことから、梅酒中のクエン酸の水素安定同位体比分析により、クエン酸が添加された梅酒を無添加のものと区分できることを示した。
【図１】
0006617880.tif 000002