(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄を含有するヒトの摂取に適した栄養補助剤を形成する方法であって、
少なくとも１０００ｍｇ／Ｌの鉄を培地に提供するために、農業の副産物又は食品加工の副産物と、無機鉄塩又は鉄化合物とを含む培地を準備することと、
糸状菌中に鉄を有機形態で蓄積するために、前記培地中で糸状菌を培養することと、
少なくとも２００００ｍｇ／ｋｇの鉄を有する真菌バイオマスを含有する栄養補助剤を形成するために、前記糸状菌のバイオマスを採収することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記農業の副産物が、濃縮トウモロコシ可溶性物質（シロップ）、トウモロコシ加工の副産物、小麦加工の副産物及びダイズ加工の副産物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記農業の副産物がシロップである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記食品加工の副産物が、コーンスティープリカー（corn steeping liquor）、コーン蒸留廃液、ダイズホエー、サトウキビ及びビート糖蜜、ダイズ皮及び小麦ふすま又は小麦外皮から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記無機鉄塩又は鉄化合物は、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、及びクエン酸第一鉄からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養補助剤が、２００００〜４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記栄養補助剤が、  ２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、又は４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記糸状菌のバイオマスは、濾過、遠心分離、又は乾燥によって採収される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記糸状菌のバイオマスは、９０℃未満の温度での乾燥によって採収される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記栄養補助剤が、希釈剤又は補成分をさらに含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記補成分が、セレン及び亜鉛から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養補助剤が、１０〜４００ｍｇ／ｋｇのセレン、及び２０〜２００００ｍｇ／ｋｇの亜鉛を含有する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]  本技術は、鉄を含有する栄養補助剤に関し、糸状菌を使用して補助剤を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[002]  世界的な貧血に関する世界保健機関（ＷＨＯ）の報告に基づくと、特に妊娠女性、生殖可能年齢の非妊娠女性、及び就学前年齢の児童で「貧血は富裕国と貧困国との両方で人口に影響する公共医療の問題である」。貧血発症の最も重大な原因は鉄欠乏性貧血（iron deficiency anemia：ＩＤＡ）である。１０億人（世界の人口の約１５％）を超える人々がＩＤＡに罹患していると推定されている。さらに、１０億人が鉄欠乏症（iron deficiency：ＩＤ）又は鉄枯渇である。
【０００３】
[003]  世界的には、ＩＤＡの罹患率はこの３０年間で停滞したままであるか、又はわずかに増加している。他の栄養不良の疾患の罹患率は漸進的に低下しているが、ＩＤ及びＩＤＡ並びに関連する有害作用は残っている。
【０００４】
[004]  鉄は、良好な健康を維持する多くのタンパク質及び酵素に不可欠な役割を有するので、大部分の生命にとって必須である。ヒトでは、鉄は酸素運搬、細胞増殖及び他の機能に関わる赤血球の必須成分である。通常、ＩＤは細胞への酸素送達を制限し、疲労、作業効率の低下、及び免疫の低下をもたらす。しかし、０〜５歳の小児ではＩＤは身体及び認知の発達を阻害し、したがって成人期まで持続することがある。妊娠中における、母体死亡、早産及び乳児喪失の２０〜３０％はＩＤＡの結果であることがある。
【０００５】
[005]  現在のところ、ＷＨＯによって推奨される４タイプの主要なＩＤ／ＩＤＡの克服法がある。すなわち、食品の栄養強化、栄養補助、教育、及び新しい植物育種プログラムである。強化及び補助の戦略は、一般に所与の人口群のＩＤ／ＩＤＡ問題に迅速で直接的な影響を与える。
【０００６】
[006]  ヒトの栄養素に適用できる鉄には主に３つのタイプがあり、表１に列挙する。ヘム鉄も非ヘム鉄も食品源に由来する。しかしながら、主に穀類及び豆類に由来する非ヘム鉄は、フィチン酸塩の含有量が高いので吸収率が低い。全体的な栄養を改善すること以外に、主要なＩＤ／ＩＤＡの克服法は、特にヘム鉄源が乏しい発展途上国では、食品中の鉄補助及び強化にある。
【表１】
0006573551.tif 000002
【０００７】
[007]  吸収率が高い硫酸第一鉄などの鉄塩の可溶性化合物は、鉄補助剤として望ましいが、感覚の問題により多くの栄養強化食品で使用することができない。フマル酸第一鉄などの他の形態をマイクロカプセルに入れて半流動体食品に添加することができるが、費用がはるかに高くなる。食品の鉄強化は、世界の多くの領域に鉄を提供するために好ましい方法である。栄養強化食品に使用する鉄製品には多くのタイプがあり、その良好な形態には硫酸第一鉄又はＮＡＦｅＥＤＴＡを強化したアスコルビン酸を含む魚醤及び醤油が含まれる。しかしながら、人口レベルでＩＤの罹患率に対する強化の影響が良好であることが証明されていない。理由の一つは、食品送達媒介物、例えば穀粉における鉄の強化剤に対する阻害物質によるものである。ヨウ素及びビタミンＡとは対照的に、鉄の強化及び補助には、多くの食品システムに適合するために異なる生成物が必要である。したがって、多様な食事の状況にわたる要求に応じるために、より多くの有機形態の非ヘム鉄生成物が求められている。
【０００８】
[008]  ＵＳ８，４８１，２９５号（van Leeuwen）では、アルコール発酵蒸留廃液で糸状菌を培養し、トウモロコシ−エタノールのドライミル生産プラントで水をリサイクルするために有機廃棄物を除去して、動物への給餌及び他の用途のために真菌バイオマスを得る。このような真菌バイオマスは鉄含有率が低く、ミネラル補助剤として使用するには十分でない。現在のトウモロコシ−エタノールのドライミル生産は工業方法であり、食品方法ではないので、真菌バイオマスは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からヒトの直接の摂取用には承認されていない。
【０００９】
[009]  本発明の発明者は、今回、糸状菌を農業の副産物又は食品加工の副産物で培養し、採収して鉄含有量が高い栄養生成物を得られることを発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[010]  鉄を含有する栄養補助剤、及び鉄を含有する栄養補助剤を形成する方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[011]  一実施形態では、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの鉄を有する真菌バイオマスを含む栄養補助剤が提供される。
【００１２】
[012]  栄養補助剤は、約２００〜４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有することが好ましい。
【００１３】
[013]  鉄を含有する栄養補助剤は、希釈剤又はセレン及び亜鉛などの他の補成分を含むことができる。例えば、補助剤は１０〜４００ｍｇ／ｋｇのセレン、及び２０〜２０，０００ｍｇ／ｋｇの亜鉛を含有することができる。
【００１４】
[014]  鉄を含有する栄養補助剤は、粉末、溶液、飲料、カプセル、錠剤、カプレットとして製剤化することができる。粉末状の生成物を食品に添加し、食品の栄養強化成分として使用することもできる。食品の栄養強化には、香辛料、塩、乳児用製剤、及び小麦粉、トウモロコシ及び豆類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
[015]  栄養補助の利点は、副産物に由来する天然の有機鉄を含有することである。栄養補助剤は、糸状菌によって自然に生成されるフィターゼ及び他の酵素をさらに含有するように製剤化することができる。
【００１６】
[016]  栄養補助剤は、糸状菌の増殖中に添加された追加の無機鉄塩又は他の高鉄化合物を含有することができる。その例には、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、クエン酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸第一鉄及びＥＤＴＡ鉄が含まれる。
【００１７】
[017]  一実施形態では、鉄を含有する栄養補助剤を形成する方法であって、
糸状菌の農業又は食品加工の副産物に存在する鉄を蓄積するために、農業の副産物又は食品加工の副産物中で糸状菌を培養する工程と、
少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの鉄を有する真菌バイオマスを含有する栄養補助剤を得るために、糸状菌を採収する工程と、
を含む方法が提供される。
【００１８】
[018]  糸状菌は米コウジ菌（Aspergillus oryzae）又は黒色コウジ菌（Aspergillus niger）から選択することが好ましい。
【００１９】
[019]  農業の副産物は、トウモロコシ、小麦、テンサイ、サトウキビ、ダイズ、及び蒸留廃液からの廃棄物、並びにアルコール生産からの固形廃棄物に由来するものでよい。このような生成物の例は、サトウキビ及びビートパルプ、ダイズ皮、ダイズ加工ホエー、小麦外皮、麦芽粕及び蒸留廃液である。農業副産物は濃縮したトウモロコシ可溶物質（シロップ）、トウモロコシ、小麦及びダイズ加工の副産物であることが好ましい。さらに、農業副産物はシロップであることが好ましい。
【００２０】
[020]  食品加工の副産物は、コーンスティープリカー（corn steeping liquor）、コーン蒸留廃液、ダイズホエー、サトウキビ及びビート糖蜜、ダイズ皮及び小麦ふすま及び小麦外皮から選択することが好ましい。
【００２１】
[021]  農業の副産物又は食品加工の副産物に追加の増殖培地を供給して、培養中の糸状菌による鉄の増加及び蓄積を補助することができる。
【００２２】
[022]  糸状菌の増殖中に、追加の無機鉄塩、及び硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸第一鉄を含むが、これらの塩に限定されない他の高鉄化合物を添加し、栄養補助剤の鉄含有量をさらに高めることができる。
【００２３】
[023]  栄養補助剤はさらに、セレン及び亜鉛などの他のミネラル、又はマグネシウム、カルシウム及びクロムなどの他のミネラルを含むことができる。さらなるミネラル補充を達成するために、セレン及び亜鉛の化合物を培養物に添加することができる。適切な化合物には亜セレン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸カルシウム、塩化クロム、及び硫酸マグネシウムが含まれる。
【００２４】
[024]  栄養補助剤はさらに、セレン及び亜鉛を含むことができる。栄養補助剤は１０〜４００ｍｇ／ｋｇのセレン、及び２０〜２０，０００ｍｇ／ｋｇの亜鉛を含有することが好ましい。
【００２５】
[025]  追加の培地又は栄養素を提供して、糸状菌の増殖を補助することができる。その例には、酵母抽出物、アンモニウム塩、尿素、及びリン酸カリウムが含まれる。
【００２６】
[026]  糸状菌は、固体及び液体発酵の両方で使用される発酵容器などの任意の適切な環境で培養することができる。
【００２７】
[027]  糸状菌の培養は、室温で、又は２５〜５５℃などの高温で行うことができる。
【００２８】
[028]  糸状菌は任意の適切な手段で採収することができる。その例には、フィルタプレス、ベルトプレスなどの濾過と、デカンタなどの遠心分離と、回転乾燥機、蒸気乾燥機などの乾燥とが含まれる。乾燥温度は通常、生成物の望ましくないいかなる熱損傷も回避するために、約９０℃未満である。
【００２９】
[029]  採収した糸状菌は、鉄を含有する栄養補助剤を形成するためにさらに加工することができる。さらなる加工には、分離、粉砕、粉砕、分別、抽出、余分な塩を除去するための冷水及び温水での洗浄、又は他の可溶性化合物を除去するためのｐＨ２の緩酸又はｐＨ９〜１０のアルカリでの洗浄が含まれる。
【００３０】
[030]  栄養補助剤は、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有する。栄養補助剤は、約２００〜４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有することが好ましい。鉄含有量は４００００ｍｇ／ｋｇより高くてもよいが、真菌バイオマスの回収率が低下することがあり、実際には経済的でないことがある。
【００３１】
[031]  鉄を含有する栄養補助剤は、希釈剤又はセレン及び亜鉛などの他の補成分を含むことができる。例えば、補助剤は、１０〜４００ｍｇ／ｋｇのセレン、及び２０〜２０，０００ｍｇ／ｋｇの亜鉛を含有することができる。
【００３２】
[032]  栄養補助剤は、糸状菌の成長中に添加される追加の無機鉄塩又は他の高鉄化合物を含有することができる。その例には、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、クエン酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸第一鉄、及びＥＤＴＡ鉄が含まれる。
【００３３】
[033]  栄養補助剤は、ヒト又は動物の使用に合わせて製剤化することができる。
【００３４】
[034]  他の実施形態では、本技術は、記載された方法によって産生される鉄を含有する栄養補助剤に関する。
【００３５】
[035]  別の実施形態では、本技術は、農業の副産物又は食品加工の副産物中で培養した糸状菌に由来するか、又はそこから得た鉄を含有する栄養補助剤に関する。
【００３６】
[036]  本明細書を通して、文脈から他に必要とされていない限り、「含む」又は「含んでいる」という用語又はその変形は、提示された要素、完全体又は工程、又は要素、完全体又は工程のグループを含むことを意味するが、任意の他の要素、完全体又は工程、又は要素、完全体又は工程のグループを排除するものではないと理解される。
【００３７】
[037]  本明細書に含まれる文書、動作、材料、装置、物品などに関するいかなる説明も、単に本発明の事情（context）を提供することを目的とする。これは、これらのもののいずれか又はすべてが先行技術の基礎の一部を形成すると容認されるか、又は本明細書の各請求項の優先権の日付以前に存在していたとして、本発明に関連する分野の普通の一般的知識であったとは見なされない。
【００３８】
[038]  本技術をより明快に理解するために、以下の図面及び実施例を参照しながら好ましい実施形態について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】[039]図１は、本技術の好ましい方法の概略図である。
【図２】[040]図２は、本技術の別の好ましい方法の概略図である。
【図３】[041]図３は、無機鉄塩の添加が真菌バイオマスの鉄含有量に及ぼす影響の結果を示す。
【図４】[042]図４は、硫酸第一鉄を１００％としたときのＣａｃｏ−２細胞のフェリチン形成の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
[043]  酵母は、ＦｅＳＯ４を含有する酵母エキスペプトンデキストローズ（ＹＥＰＤ）プレート上で、鉄を含む多くの微量元素を蓄積させると報告されている。特定の酵母菌株は、細胞１グラム当たり２５ｍｇまでの鉄を取り込むことができ、この鉄の９５％もが、細胞構造中で有機形であると考えられていた。鉄強化酵母バイオマスが動物飼料補助剤として使用され、鉄塩と比較して毒性が低いと考えられている。他の非酵母菌糸体形成真菌では、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、及びＺｎ２＋がグルカン形成を刺激することができる。しかしながら、鉄強化生成物の生成に糸状菌を使用することは実践されていない。本発明の発明者が認識する現在の技術と酵母の鉄強化との基本的な違いは、鉄を強化していない農業及び食品加工の廃棄物及び副産物を増殖培地として使用する場合、米コウジ菌などの糸状菌が、このような廃棄物及び副産物などの自然源からの有機鉄を蓄積する能力を有することである。鉄が豊富で強化された生成物の生産に使用できる米コウジ菌及び黒色コウジ菌など、概ね安全と認識される（Generally Recognized as Safe：ＧＲＡＳ）状態を有する糸状菌が数多くある。別の利点は、糸状菌生成物には酵母生成物と比較して異臭がないことである。
【００４１】
農業副産物の選択及び前処理
[044]  農業及び食品加工から生成される副産物が多くあるが、そのすべてが自然の状態で鉄が豊富なわけではない。表２は、鉄が豊富な真菌生成物の生成に使用することができる北米の鉄豊富な農業副産物の一部を列挙している。小麦ふすま及び外皮、籾殻、モロコシの外皮、及びジャガイモの皮などの他の副産物にも可能性がある。
【表２】
0006573551.tif 000003
【００４２】
[045]  副産物の一部は鉄豊富な材料と認識されているが、多くはヒトが直接に摂取するには適切でない。穀物副産物の鉄の大部分は、フィチン酸塩と結合しており、その結果、天然鉄はヒトに対するバイオアベイラビリティがない。フィチン酸塩を使用してこれらの生成物の鉄バイオアベイラビリティを改善することが十分に理解されているが、鉄状態の改善に基づいてヒトで直接使用するには、１日の必要量が多すぎる。本技術は、動物又はヒトが摂取するのに適切な有機形態に鉄を濃縮する手段として、選択された真菌種を使用することに関する。
【００４３】
[046]  鉄真菌生成物の生成に副産物を使用できるようにするには、その前に微生物腐敗、カビ毒及び重金属汚染の試験を行うことが好ましい。液体原料の場合は希釈が必要なことがある。何故なら、米コウジ菌又は黒色コウジ菌などの真菌種の液体発酵に最適な全固形物は、約３〜１０％だからである。乾燥した原料は、粉砕、浸漬又は煮沸して天然鉄を放出させ、抗発酵要因を減少させることができる。原料からの天然鉄の放出を補助するために、浸漬及び煮沸中にセルロース、ヘミセルロース及びフィターゼなどの酵素を使用することができる。使用可能性及び価格決定に応じて、複数の原料を同時に使用することができる。
【００４４】
方法
[047]  農業の副産物又は食品加工の副産物を使用する好ましい方法の一般的工程を図１に示す。
【００４５】
酵母株
[048]  使用した米コウジ菌の株は、醤油及び味噌の製造に商業的に承認され、採用されているものと同じ株であり、Chinese Center of Industrial Culture Collection (CICC)からの米コウジ菌２３５５及び４０１５１、American Type Culture Collection (ATCC)からの米コウジ菌２２７８７、及びＣＩＣＣからのクエン酸生成用黒色コウジ菌変種２２０６及び１０５５７、及びＡＴＣＣからのフィターゼ生成用黒色コウジ菌６６８７６などであった。
【００４６】
真菌培養
[049]  米コウジ菌及び黒色コウジ菌の株を、粉砕した全トウモロコシ、小麦ふすま、ダイズ皮、ビート廃糖蜜、サトウキビ及び果汁の加工の副産物、並びにデンプン、糖及びタンパク質で構成された任意の他の食品の加工の副産物で構成された培地中で培養し、維持した。このような原料は、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼなどの酵素で前処理することができる。真菌培地に無機鉄塩を添加し、このような無機鉄塩は、培地１リットル当たり３００〜２０００ｍｇの鉄元素の濃度の硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、クエン酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸第一鉄及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）鉄などであった。
【００４７】
[050]  真菌胞子は、煮沸した米、ダイズ、及びモロコシ、並びにそれらの組み合わせなどの固体培地に植え付け、４０〜７０％の水分で調製した。２〜３週間で、胞子は発芽し、回収の準備が整った。真菌胞子を殺菌した蒸留水中に回収した。予備培養発酵槽は、最終生成発酵槽の１〜１０体積％で調製した。予備培養用培地は、上述したような生成培地と同じものでよい。１８〜２８時間の予備培養発酵時間でのインキュベーションが、胞子を予備培養培地に導入した後に健康な予備培養物を産生するために適切である。予備培養物を生成発酵槽に加え、真菌が鉄を含有する所望の真菌集団を生成するように、真菌が増殖できるようにする。
【００４８】
装置
[051]  任意の適切な発酵槽又は装置で、大規模発酵を実行することができる。鉄強化バイオマスの生成には、好気条件で４８〜７２時間、発酵を行うことが好ましい。発酵期間に殺菌又は濾過した空気を０．５〜１．０ｖｖｍで発酵槽に給送し、成長及び収率を向上させることができる。培養物は、発酵中に攪拌するかかき混ぜることが好ましい。商業用の微生物培養では、発酵槽の空気、攪拌及び設計の組み合わせが十分理解されている。
【００４９】
真菌発酵
[052]  発酵は、４８〜７２時間、又は２８〜３０℃の温度で細胞の自己分解が開始するまで実行することができる。インキュベーションの時間及び温度は、使用する真菌のタイプ及び株によって変化することが認識される。
【００５０】
[053]  原料の栄養特性に応じて、曝気真菌発酵の増殖培地に栄養補助するために、他の栄養素が必要となることがある。これらの栄養素には、有機及び無機窒素源、リン源及び微小ミネラルが含まれる。
【００５１】
鉄補助剤としての鉄強化真菌生成物の生成
[054]  糸状菌などの真菌は、バイオアベイラビリティが相対的に低く、細胞毒性が強力な鉄をさらに取り込む能力を有する。ヒトの食物に可溶性無機鉄塩を直接補充すると、細胞毒性反応をもたらすことがあることに留意されたい。したがって、真菌を使用して無機鉄塩を取り込み、有機形態に変換すると、鉄塩の直接の摂取の副作用を軽減することができる。
【００５２】
[055]  発酵中に無機塩を添加することができる。鉄塩の一般的な選択肢には、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、及びクエン酸第二鉄が含まれる。無機鉄は真菌によって有機形態に変換される。真菌生成物中の鉄レベルを最大化するために、発酵中に所与の鉄塩を段階的に供給することができる。鉄塩の用量は、使用する塩のタイプに依存するが、用量レベルは真菌の増殖を損なわない必要がある。採収後、真菌菌糸体を徹底的に洗浄して、余分な鉄塩を除去することができる。ｐＨ２〜３の緩酸洗浄剤が、この点では効果的になり得る。方法の詳細な工程を図２で説明する。
【００５３】
真菌バイオマスの採収
[056]  発酵後、遠心分離器、ベルトプレスなどの脱水機により、鉄を含有する真菌バイオマスを採収することができる。水及び／又は０．０１Ｍの塩酸などの緩酸での洗浄により、無機鉄の残留物を除去することができる。次に、通風乾燥機、流動床乾燥機などを使用して、鉄強化真菌生成物を６０〜８０℃で乾燥することができる。生成物の最終的な水分は約１０％未満であることが好ましい。
【００５４】
製剤
[057]  例えば、化合物は経口投与用に製剤化することができる。特定の製剤タイプの非限定的な例には、錠剤、カプセル、カプレット、粉末、顆粒、アンプル、バイアル、すぐ使用できる溶液又は懸濁液、飲料、及び凍結乾燥物が含まれる。錠剤又はカプセルなどの固体製剤は、任意の数の適切で許容可能な賦形剤又は担体を含有することができる。
【００５５】
生成物
[058]  栄養補助剤は、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの鉄を有する真菌バイオマスを含む。栄養補助剤は通常、約１００〜４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有する。補助剤は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、又は４００００ｍｇ／ｋｇの鉄を有することができる。
【００５６】
[059]  鉄を含有する栄養補助剤は、希釈剤又はセレン及び亜鉛などの他の補成分も含むことができる。例えば、補助剤は、１０〜４００ｍｇ／ｋｇのセレン、及び２０〜２０，０００ｍｇ／ｋｇの亜鉛を含有することができる。補助剤は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０又は４００ｍｇ／ｋｇのセレンを含有することができる。補助剤は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００又は２００００ｍｇ／ｋｇの亜鉛も含有することができる。
【００５７】
[060]  鉄を含有する栄養補助剤は、粉末、溶液、飲料、カプセル、錠剤、カプレットとして製剤化することができる。粉末形の生成物を食品に添加し、食品の栄養強化成分として使用することもできる。食品の栄養強化には香辛料、塩、乳児用製剤、及び小麦粉、トウモロコシ及び豆類が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
[061]  栄養補助剤の利点は、副産物に由来する天然の有機鉄を含有することである。栄養補助剤は、糸状菌によって自然に生成されるフィターゼ及び他の酵素をさらに含有するように製剤化することができる。
【００５９】
[062]  栄養補助剤は、糸状菌の増殖中に添加された追加の無機鉄塩又は他の高鉄化合物を含有することができる。その例には、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、クエン酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸第一鉄及びＥＤＴＡ鉄が含まれる。
【００６０】
[063]  栄養補助剤は、ヒト又は動物が使用するように製剤化することができる。
【００６１】
結果
実施例１
[064]  主要な副産物である濃縮トウモロコシ蒸留可溶物質（シロップ）は、エタノールを生成するトウモロコシの乾燥粉砕から産生される。発酵方法では、トウモロコシ澱粉をエタノールに変換するが、鉄などのトウモロコシからの非デンプン栄養素の主要部分を蒸留廃液として残す。次に、蒸留廃液を濃縮してシロップにし、主に動物の飼料用に使用する。
【００６２】
[065]  現在、シロップは、米コウジ菌及び黒色コウジ菌などの真菌バイオマスを生成するために生存可能な栄養素を含有していることが判明している。
【００６３】
[066]  希釈シロップ（diluted Syrup：ＤＳ）で培地を作成したときの、真菌バイオマス及び残留液（residue liquid：ＳＬ）の鉄含有量を分析すると、結果は、シロップ中の天然鉄の８６．８％が真菌によって濃縮されたことを示した（表３）。しかしながら、ＵＳ８，４８１，２９５号（van Leeuwen）と比較して薄い蒸留廃液に対してシロップを使用することの他の利点は、糖などの他の成分と組み合わせた場合に、シロップはリンが豊富であり、真菌バイオマスは３０％という高い値まで増加できることである。
【表３】
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【００６４】
[067]  トウモロコシ中の天然鉄含有量は地理的位置及び気候条件によって決定されるので、鉄含有量は乾燥トウモロコシで１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、シロップ中の鉄残留物はトウモロコシ−エタノール工場毎に変化する。その結果、様々なエタノール工場のＤＳから生成される真菌バイオマスは、１８０〜３２０ｍｇ／ｋｇの範囲を呈した。
【００６５】
[068]  真菌菌糸体中の鉄が細胞壁に結合していることを実証するために、温水洗浄及びヘキサン抽出を実行した。その結果は、生成物を洗浄することにより可溶性成分が除去されたため、最終乾燥生成物の鉄含有量が実際に上昇することを示した（表４）。結果は、真菌生成物中の鉄が細胞構造に結合していることも示した。トウモロコシ−エタノール工場の大部分は、シロップからのトウモロコシ油の油分離を実施しているので、真菌を培養して鉄が豊富な生成物を得るために、元のシロップに対して還元した油脂シロップを使用することが好ましい。
【表４】
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【００６６】
[069]  米国農務省（ＵＳＤＡ）の鉄強化穀類及び食品製品を含まない食品の栄養データ（USDA National nutrient database for standard reference, release 17: Iron, Fe(mg) content of selected foods per common measure）に基づくと、トウモロコシ−エタノールシロップから生成した真菌バイオマスの鉄含有量は、同じ配膳重量ベースでニワトリのレバーより高く、鉄含有量が最高の食品、すなわち、缶詰ハマグリより１０．６％低いだけであった。鉄含有量は、等しい重量ベースで肉以外の全食品より高かった（表５）。しかしながら、現在の商業用トウモロコシ−エタノール工程では、シロップはヒトが直接摂取するのに適切ではない。このような副産物をヒトが摂取する鉄補助剤の生成に使用できるようにするには、その前に産業がエタノール生産施設及び使用する化学物質及び酵素を食品等級の品質まで改善する必要がある。しかし、鉄が豊富な生成物は家畜に給餌することができ、特に若ブタには適している（Kornievicz d他、2007 Effect of dietary yeast enriched with Cu, Fe and Mn on digestibility of main nutrients and absorption of minerals by growing pigs. Am.J. Agril. Biol.Sci. 2(4), 267-275）。
【表５】
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【００６７】
実施例２
[070]  補助剤として鉄強化酵母生成物を産生するために様々な酵母を使用できることが報告されてきたが、鉄強化生成物の生成に米コウジ菌種（Aspergillus oryzae var.）は使用されてこなかった。
【００６８】
[071]  ２５．６９％のＦｅ３＋を含む硫酸第二鉄（Ｆｅ２（ＳＯ４）３・２Ｈ２Ｏ）を、トウモロコシ−エタノールシロップを強化する無機塩として使用した。鉄の用量は、真菌バイオマスの鉄含有量と比較できるように、塩の濃度ではなく鉄元素の濃度として計算した。真菌試料はすべて、ＩＣＰ−ＯＥＳ法で試験する前に脱イオン装置の水で徹底的に洗浄した。結果（表６）は、Ｆｅ３＋が１〜２００ｍｇ／Ｌに増加するにつれ、真菌バイオマス中の鉄含有量が劇的に増加することを示した。硫酸第二鉄は、所与の用量では米コウジ菌にとって有毒ではなく、真菌収率を数値的に増加させることも興味深い。
【表６】
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【００６９】
[072]  硫酸第二鉄に加えて、Ｆｅ２＋の含有率が２０．１４％の硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を比較として使用した。図３は、米コウジ菌がＦｅ３＋及びＦｅ２＋無機塩の両方を使用し、鉄の用量が１０００ｍｇ（Ｆｅ）／Ｌを超えるまでその両方を取り込めることを示す。鉄塩は両方とも、真菌バイオマスの鉄含有量を２０，０００ｍｇ／ｋｇに近似するか、又はそれを超える値とする。
【００７０】
[073]  硫酸第一鉄の方が水溶性が高く、鉄補助剤として使用されることが多いが、硫酸第二鉄の結果と異なるようには見えなかった。米コウジ菌が鉄を取り込むメカニズムによれば、鉄含有量を２５７ｍｇ／ｋｇ〜２０，０００ｍｇ／ｋｇを超える値まで増加させることができ、これは４０倍の増加である。これらの鉄レベルを表６に含まれる食品と比較すると、真菌生成物は非常に多量に強化された鉄含有生成物を提供することができる。
【００７１】
実施例３
[074]  鉄補助剤は高い鉄含有量を有することが好ましいが、このような鉄をヒトが吸収できることがさらに重要である。鉄強化真菌生成物（Ａｏ鉄）は、トウモロコシ、小麦ふすま及びダイズ皮を使用し、図２に示した方法で生成した。最終生成物の鉄含有率は、未処理成分及び発酵の最適化の様々な組み合わせにより２〜４％の範囲であった。Ａｏ鉄を粉砕して粉末にし、Glahn（Glahn, R.P.他、1998、Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an In Vitro digestion/Caco-2 cell culture model）によって詳述されたインビトロ消化作用／Ｃａｃｏ−２細胞培養モデル（細胞試験）に適用した。培養細胞であるＣａｃｏ−２細胞は、ＡＴＣＣから１７継代の細胞を得て、２５〜３３継代で実験に使用した。細胞は、コラーゲン処理した６ウェルプレートに１．９×１０５の密度で接種した。細胞は、ウシ胎児血清１０％イーグル培地で増殖させ、５％ＣＯ２の環境中で３７℃に維持した。培地は２日毎に交換した。鉄強化真菌のインビトロ消化は、これもGlahnに詳述された工程に従った。細胞試験では、消化した鉄生成物でインキュベートした細胞中のフェリチン（鉄含有タンパク質）形成を測定し、したがってヒトの鉄利用能の予測量として使用されてきた。細胞試験の基本的工程は、試料の酵素消化（ペプシン及びパンクレアチン胆汁）、（ヒトの大腸からの）Ｃａｃｏ−２細胞層での培養、及び細胞中のフェリチン（鉄含有タンパク質）形成の測定である。酵素消化の前に、Ａｏ鉄を酸性化水（ｐＨ＝２）及びＥＤＴＡで洗浄し、細胞構造の外側に無機塩の残留物がある場合はすべて除去した。
【００７２】
[075]  Ａｏ鉄は水溶性が限定的で、鉄が真菌細胞構造に結合しているので、試料は酵素消化中に無機塩のように希釈することができない。有機材料の高い鉄含有量の細胞試験で使用するために、修正した試料調製手順を開発した。このようなＡｏ鉄試料の重量は、所与の消化量で低く維持されることが認められ、この場合は２２．５ｍＬであった。表７は、消化中に試料の装填量が多すぎると、鉄の可溶性が低下することを示す。このような低い可溶性は、不完全な消化によるものであった。しかしながら、試料重量が極めて小さい場合は、秤量天秤の感度により計量中に誤差が生じることがあるようである。２０〜２５ｍＬの消化量には０．００５〜０．０１グラムの試料が最適であると判定された。これより大きい試料サイズを使用することができるが、消化中の酵素用量も調整しなければならない。
【表７】
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【００７３】
[076]  Ａｏ鉄のフェリチン反応を硫酸第一鉄、すなわち、最も広く使用される無機鉄補助剤と比較した。硫酸第一鉄はヒトによる吸収性が非常に高いが、ヒト、特に小児に重大な副作用を引き起こすこともある。反応性が非常に高いので、食品に添加される硫酸第一鉄は食品の酸化を引き起こし、その結果、食品に異臭が生じて保存寿命が短くなる。通常、硫酸第一鉄補助剤は、食品と一緒に摂取するように示唆されてきた。対照的に、Ａｏ鉄中の鉄は、食品なしに摂取できる有機形態である。硫酸第一鉄のフェリチン反応をコントロール（１００％）として使用し、硫酸第一鉄とコーンミール、Ａｏ鉄、及びＡｏ鉄とコーンミールを比較すると、Ａｏ鉄が硫酸第一鉄とトウモロコシに匹敵する結果を示した（図４）。フェリチン反応に対するコーンミールの効果は、Ａｏ鉄よりも硫酸第一鉄に対して劇的であった。また、Ａｏ鉄は無味であり、食品に直接添加することができるが、硫酸第一鉄は大抵ピル又はカプセルの形態で摂取する。Ｃａｃｏ−２細胞におけるフェリチン反応は硫酸第一鉄の５２％であったが、それぞれ２５％及び２０％未満という牛肉及びトウモロコシ中の鉄より良好であった。
【００７４】
実施例４
[077]  食品等級の鉄補助剤を生成するために、米コウジ菌ＡＴＣＣ２２７８７を選択し、コーンフラワー、ダイズ皮及び小麦ふすまで作成した培地中で培養した。コーンフラワー及び小麦ふすまをアミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼの酵素で処理した。培地中の全フラワーとふすまの初期混合率は１０〜２５％の範囲であった。アミラーゼを、オートクレーブ又はジェットクッキングを介して６程度の中性のｐＨで１０５〜１０７℃の温度にて添加し、次に２時間、９５℃に保持した。次の工程は、糖化のためにグルコアミラーゼを適用することである。最後に、フィターゼは、酵素製造業者の仕様によって要求される温度及びｐＨで、コーンと小麦ふすまの混合物を処理するために、必要となることも、ならないこともある。ダイズ皮を使用する場合は、プロテアーゼを酵素製造業者が要求するｐＨにて水中でダイズ皮に適用することが好ましい方法である。酸性範囲の最適ｐＨを有するプロテアーゼが好ましい。酵素処理の後、これらの成分の混合物を形成し、真菌の予備培養及び生成物培地の両方に使用することができる。１４Ｌの攪拌タンク発酵槽では、図１に示すように、ｐＨ４〜６及び２８℃で４８〜７２時間発酵を実行した。２層のナイロン布で作成したフィルタを使用し、ラボラトリにて真菌バイオマスを採収し、生成物を炉内で６０℃にて一晩乾燥させた。最終的な鉄強化生成物真菌の組成を表８に示す。
【表８】
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【００７５】
[078]  また、使用する米コウジ菌株はカビ毒を生成しない微生物である。民間ラボラトリによるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法での毒素試験は、検出可能なカビ毒が存在しないことを示した（表９）。
【表９】
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【００７６】
実施例５
[079]  セレン及び亜鉛などの他の無機ミネラルを使用してセレン又は亜鉛強化酵母を生成することが報告されてきたが、糸状菌の使用は報告されていない。両方の強化形態は、無機物の同等物より良好な機能特性を提供する。同様の方法（図２）を使用して、亜セレン酸ナトリウム又は硫酸亜鉛で強化した米コウジ菌を増殖させた。真菌バイオマスのミネラル含有量と比較できるように、いずれの無機塩の用量も、塩の濃度ではなく元素の濃度として計算した。真菌生成物中の選択したミネラルの含有量の増加を表１０に列挙するが、これは米コウジ菌を使用して有機セレン又は亜鉛強化生成物を生成できることを実証する。しかしながら、セレンの用量が１５ｍｇ／Ｌまで増加するにつれ、真菌収率は大幅に低下した。しかしながら、亜鉛は真菌収率を増加させ、添加した亜鉛元素の６７％超が有機亜鉛に変換された。
【表１０】
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【００７７】
[080]  広義に記載された技術の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示したような技術に様々な変更及び／又は修正ができることが、当業者には認識される。したがって、本実施形態はあらゆる意味で例示的であり、制限的ではないと見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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