(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程からなる試料中のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（以下、「ＣＫ-ＭＢ」と略記する。）の測定方法；
（１）試料と、クレアチンキナーゼのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体とを反応させた後、ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体及び第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体と反応させる工程（工程１）、
（２）該反応により生じた光学的変化を測定する工程（工程２）、
（３）工程２で得られた結果に基づいて、当該試料中のＣＫ-ＭＢの量を求める工程（工程３）。
【請求項２】
第１抗体又は／及び第２抗体がＣＫ-ＭＢとクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（以下、「ＣＫ-ＢＢ」と略記する。）に結合するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該抗ＣＫ-Ｂ抗体が認識する領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
光学的変化が吸光度変化、濁度変化、又は散乱光強度変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１抗体及び／又は第２抗体が不溶性担体に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
不溶性担体がラテックス粒子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
クレアチンキナーゼのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体で試料を処理することを特徴とする、ＣＫ-ＭＢ測定におけるＣＫ-ＢＢの影響回避方法。
【請求項８】
ＣＫ-ＭＢ測定が、ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体と第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体を用いるものであり、且つ該第１抗体又は／及び第２抗体がＣＫ-ＭＢとＣＫ-ＢＢに結合するものである、請求項７に記載のＣＫ-ＢＢの影響回避方法。
【請求項９】
ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体と、第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体と、クレアチンキナーゼのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体とを含んでなる、ＣＫ-ＭＢ測定用キット。
【請求項１０】
第１抗体又は／及び第２抗体がＣＫ-ＭＢとＣＫ-ＢＢに結合するものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
当該抗ＣＫ-Ｂ抗体を含んでなる第１試薬と、第１抗体と第２抗体を含んでなる第２試薬を含んでなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
当該抗ＣＫ-Ｂ抗体が認識する領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つものである、請求項９に記載のＣＫ-ＭＢ測定用キット。
【請求項１３】
第１抗体及び／又は第２抗体が不溶性担体に固定化されている、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
不溶性担体がラテックス粒子である、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの測定方法及びそれに用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
クレアチンキナーゼ（以下、ＣＫと略記する。）は骨格筋、心筋、平滑筋、脳などに含まれる酵素で、細胞のエネルギー代謝に関連した重要な役割を果たしている。【０００３】
ＣＫは二つのサブユニットから構成される二量体の蛋白質で、そのサブユニットにはＭ型（muscle type, M）とＢ型（brain type, B）の二種類がある。また、ＣＫには、サブユニットの組合せにより、骨格筋に多いＣＫ-ＭＭ、心筋に多いＣＫ-ＭＢ、脳に多いＣＫ-ＢＢの、三種類のアイソザイムが存在する。中でもＣＫ-ＭＢは心筋特異性が高く、心筋傷害が発生すると心筋細胞からＣＫ-ＭＢが逸脱し、血中に流出する。そのためＣＫ−ＭＢは心筋障害（心筋梗塞）マーカーとして、臨床検査において重要な項目となっている。【０００４】
ＣＫ−ＭＢの定量測定には、「酵素活性」を測定する免疫阻害法や「蛋白量」を測定するラテックス比濁法，電気化学発光免疫測定法などがあり、その他、アイソザイム解析の手法として「電気泳動法」が知られている。【０００５】
そのうち免疫阻害法は、汎用自動分析装置を用いて測定が行えるため一般に用いられているが、検体中にＣＫ-ＢＢ等が含まれるとそれらの活性も測定してしまうため、ＣＫ−ＭＢ測定に対する特異性が低く、正しいＣＫ-ＭＢ測定値が得られない、という問題がある。電気化学発光免疫測定法は、ＣＫ-ＢＢの影響を受けずにＣＫ-ＭＢを特異的に測定できる方法であるが、特別の測定機器が必要である、使用する試薬が高価である、等の問題がある。また電気泳動法は迅速性に欠けること、定量性に劣ることなどから、ＣＫ-ＭＢを定量する目的には利用されない。【０００６】
一方、蛋白質量を測定する方法であるラテックス比濁法は、ＣＫ-ＭＢに特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法でＣＫ-ＭＢを蛋白量として定量する方法である。本法は汎用自動分析装置を用いた測定ができ、酵素活性を測定する免疫阻害法と比べて精度が高く、またＣＫ-ＭＢの特異性に優れており、ＣＫ-ＭＢの逸脱量を正確にモニターできる方法であるといわれている。【０００７】
しかし実際には、従来のラテックス比濁法でＣＫ-ＢＢが共存する検体のＣＫ-ＭＢ値を測定すると、ＣＫ-ＢＢも測定してしまい（偽高値の出現）、正しいＣＫ-ＭＢの測定値が得られないという場合があった。その原因としては、使用する抗ＣＫ-ＭＢ抗体の一部が試料中のＣＫ-ＢＢとも結合（交叉）してしまうのではないかと考えられた。【０００８】
そこでこの問題を回避するため、ＣＫ-ＭＭにもＣＫ-ＢＢにも結合しない抗ＣＫ-ＭＢモノクローナル抗体が開発され、これを用いたラテックス比濁法が提案されている（特許文献１）。この方法は、ラテックス粒子上に固定化させた上記した特異性を持つ第１の抗ＣＫ-ＭＢ抗体と、ラテックス粒子上に固定化させた前記第１の抗ＣＫ-ＭＢ抗体とは異なるエピトープに結合でき、且つ上記した特異性を持つ第２の抗ＣＫ-ＭＢ抗体を試料中のＣＫ-ＭＢと反応させ、抗原抗体反応の結果生じた凝集の増加を測定する方法である。しかしながら、実際にはこの方法でＣＫ-ＭＢを測定した場合でも、やはり偽高値が得られてしまう場合があった。【０００９】
また別のラテックス比濁法による測定方法として、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子とＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を用いる方法（特許文献２）がある。この方法は、ラテックス粒子の粒径を調製することによりＣＫ-ＭＢの測定におけるＣＫ-ＢＢの影響を回避しようというものである。しかし、この方法でもＣＫ-ＭＢの測定におけるＣＫ-ＢＢの影響を十分回避することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第２７７４８７５号公報
【特許文献２】特開２０１３−１２５００５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、従来の蛋白質量を測定することによるＣＫ-ＭＢ測定法は、ＣＫ-ＢＢの影響を回避してＣＫ-ＭＢを特異的に測定することが困難であった。その原因としては、おそらく抗ＣＫ-ＭＢ抗体の特異性が十分ではなく、ＣＫ-ＭＢのみならずＣＫ-ＢＢとも若干交差してしまう（偽高値の出現）ためであると思われる。【００１２】
従って本発明の課題は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、ＣＫ-ＢＢの影響を回避して、ＣＫ-ＭＢを特異的に測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）下記工程からなる試料中のＣＫ-ＭＢの測定方法；
１）試料と、ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体と、第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体と、ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体とを反応させる工程（工程１）、
２）該反応により生じた光学的変化を測定する工程（工程２）、
３）工程２で得られた結果に基づいて、該試料中のＣＫ-ＭＢの量を求める工程（工程３）。
（２）ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体で試料を処理することを特徴とする、ＣＫ-ＭＢ測定におけるＣＫ-ＢＢの影響回避方法。
（３）ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体と、第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体と、ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体とを含んでなる、ＣＫ-ＭＢ測定用キット。【００１４】
本発明者等は、従来の蛋白質量を測定する方法によるＣＫ-ＭＢの測定系に、ＣＫのＢサブユニットの特定領域を認識する抗体（本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体）を共存させたところ、試料中のＣＫ-ＢＢの影響を回避して高精度且つ高感度にＣＫ-ＭＢを測定することができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＣＫ-ＭＢの測定における、試料中に共存するＣＫ-ＢＢの測定値への影響（偽高値の出現）を回避（抑制）でき、より高精度に、高感度にＣＫ-ＭＢの測定を行うことができる。また、本発明の方法によれば、汎用自動分析装置でＣＫ-ＭＢ 蛋白量を測定できるので、特別な機器を用いる必要がない。【００１６】
更に、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、ＣＫ-ＭＢ測定におけるＣＫ-ＢＢの影響を回避するものである。従って本発明は、ＣＫ-ＭＢ測定時のＣＫ-ＢＢの影響回避方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２において、抗ＣＫ-Ｂ抗体としてMAb to CK-BB（Meridian Life Science, Inc.製）を用いて得られた電気泳動図である。
【図２】実施例２において、抗ＣＫ-Ｂ抗体としてCKBB Monoclonal Antibody（Roche Diagnostics K.K.製）を用いて得られた電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法は、
「下記工程からなる試料中のＣＫ-ＭＢの測定方法；
（１）試料と、ＣＫ-ＭＢに対する第１抗体と、第１抗体とは認識するエピトープが異なるＣＫ-ＭＢに対する第２抗体と、ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体とを反応させる工程（工程１）、
（２）該反応により生じた光学的変化を測定する工程（工程２）、
（３）工程２で得られた結果に基づいて、該試料中のＣＫ-ＭＢの量を求める工程（工程３）。」
である。
【００１９】
すなわち、本発明の方法は、二種の抗ＣＫ-ＭＢ抗体を用いたＣＫ-ＭＢの測定方法において、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を加えることにより、ＣＫ-ＢＢの影響を回避し、その結果、ＣＫ-ＭＢを特異的に測定することができる方法である。
【００２０】
本発明がＣＫ-ＢＢの影響を回避できる測定原理について、本発明者等は以下の通りであると推察する。
【００２１】
ＣＫ-ＭＢはＭサブユニットとＢサブユニットのヘテロダイマーである。ＣＫ-ＢＢはＢサブユニットのホモダイマーである。
【００２２】
試料中にＣＫ−ＭＢとＣＫ-ＢＢが共存在する場合、該試料と、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を接触させると、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、該試料中のＣＫ-ＭＢのＢサブユニット及びＣＫ-ＢＢのＢサブユニットに結合する。そして、ＣＫ−ＢＢのＢサブユニットに結合した本発明に係る抗ＣＫ−Ｂ抗体は、第１抗体又は第２抗体がＣＫ-ＢＢに結合するのを阻害すると考えられる。そしてその結果、本発明のＣＫ−ＭＢの測定方法では、試料中に存在するＣＫ-ＢＢの影響を回避して、ＣＫ-ＭＢを特異的に且つ高精度に測定することができると考えられる。
【００２３】
本発明に係るＣＫ-ＭＢに対する第１抗体（以下、単に「第１抗体」と略記する場合がある。）としては、ＣＫ-ＭＢのＭサブユニットとＢサブユニットの両方を認識する抗体が挙げられる。
【００２４】
本発明に係るＣＫ-ＭＢに対する第２抗体（以下、単に「第２抗体」と略記する場合がある。）としては、ＣＫ-ＭＢのＭサブユニットとＢサブユニットの両方を認識するが、第１抗体とは認識するエピトープが異なる抗体が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体としては、ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1(すなわちＮ末端アミノ酸)〜100番アミノ酸の領域を認識する抗体が挙げられる。すなわち、ＣＫのＢサブユニットを認識する抗Ｂサブユニット抗体であって、且つＢサブユニットのＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域中の、特定の領域を認識する抗体のみが、本発明の効果を達成することができるのである。
【００２６】
尚、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、NativeなＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から1〜100番アミノ酸の領域の三次元構造（立体構造）を認識するものがさらに好ましい。
【００２７】
ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域のアミノ酸配列は、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列である。
【００２８】
なお、ＣＫのＢサブユニットの全アミノ酸配列は公知である（NCBI Reference Sequence: NP_001814.2、本明細書の配列番号２）
以下、本発明に係る第１抗体、本発明に係る第２抗体、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体をまとめて、単に「本発明に係る抗体」と記載する場合がある。
【００２９】
本発明に係る抗体は、それぞれ上記した性質を持っているものであればよく、市販品でも常法により適宜調製されたものでもよく、それぞれモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００３０】
本発明に係る抗体がモノクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されず、市販品、あるいは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eur.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生された、上記した如き性質を有するものは全て使用可能である。
【００３１】
本発明に係る抗体がポリクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されないが、例えばウサギ、ラット、マウス、羊、山羊、馬等に由来する、上記した性質を有するものが挙げられる。市販品、あるいは例えば「免疫学実験入門、第2刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法で取得されるものを使用すればよい。
【００３２】
また、本発明に係る抗体には、パパイン等で部分分解して得られるFabフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られる(Fab')２フラグメント、(Fab')２フラグメントを還元処理して得られるFab'等の、いわゆる抗体フラグメントも包含される。
【００３３】
本発明に係る抗体は上記したような自体公知の方法で作成しても得られるが、市販品を用いてもよい。
【００３４】
第１抗体及び第２抗体の市販品としては、抗ＣＫ-ＭＢ抗体として市販されているものの中から、認識するエピトープが互いに異なるものを選択して、使用すればよく、特に限定されない。
【００３５】
本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体の市販品としては、抗ＣＫ-Ｂ抗体や抗ＣＫ-ＢＢ抗体として市販されているものの中から、ＣＫのＢサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から1〜100番アミノ酸の領域を認識するものを選択して使用すればよい。このような市販品としては、例えばMeridian Life Science, Inc.製のMAb to CK-BB、Roche Diagnostics K.K.製のCKBB Monoclonal Antibody、BiosPacific, Inc.製のCK-BB Monoclonal Antibody、Fitzgerald I. I. 製のCKBB antibody等が挙げられる。
【００３６】
第１抗体及び第２抗体は、不溶性担体に固定化（担持）させて用いてもよい。第１抗体を固定化したラテックス粒子及び第２抗体を固定化したラテックス粒子を構成試薬として含む市販のキットを用いれば簡便である。そのような市販のキットとしては、例えば、Lタイプワコー CK-MB mass（和光純薬工業(株)製）等が挙げられる。
【００３７】
第１抗体及び第２抗体を不溶性担体に固定化させて用いる場合に、使用される不溶性担体としては、通常この分野で用いられる担体であれば何れも使用可能であるが、例えばポリスチレン，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリアクリルアミド，ポリグリシジルメタクリレート，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニル，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート，シリコーン樹脂，シリコーンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス，スリガラス，アルミナ，シリカゲル，活性炭，金属酸化物等の無機物質等を材料として調製されたものが好ましいものとして挙げられる。また、これら担体は、ラテックス粒子、ビーズ、チューブ、ディスク状片、微粒子等多種多様の形態で使用し得る。
【００３８】
上記した不溶性担体の中でも、ラテックス粒子は、人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の点から特に好ましい。その材質は特に限定されず、通常この分野で用いられているものであれば特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス粒子等のスチレン系ラテックス粒子、アクリル酸系ラテックス粒子等が好ましいものとして挙げられる。尚、これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子等は、表面の疎水性が強いため、蛋白質或いはペプチドをスムーズに吸着し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有しているので、特に好ましい。また、種々の変性ラテックス粒子（例えば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカルボン酸変性ラテックス粒子）、磁性ラテックス粒子（磁性粒子を内包させたラテックス粒子）等も、必要に応じて使用できる。
【００３９】
第１抗体を固定化させるラテックス粒子と第２抗体を固定化させるラテックス粒子の材質は、上記のようなものであれば同じであってもよく、それぞれ異なっていてもよい。
【００４０】
また、本発明に係るラテックス粒子としては、市販のものを使用してもよいが、単位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体を効率良く感作させることができるので好ましい。具体的には、通常0.05〜2.4 μm、好ましくは0.05〜1.0μm、更に好ましくは0.05〜0.50μmの平均粒径のものが挙げられる。
【００４１】
第１抗体を固定化させるラテックス粒子と第２抗体を固定化させるラテックス粒子は同じ粒径のものでもよいが、上記の範囲の中から選ばれた、平均粒径が異なるものを組み合わせて用いてもよい。
【００４２】
また、第１抗体を固定化させるラテックス粒子は、同じ粒径のものであっても異なるものであってもよい。第２抗体を固定化させるラテックス粒子も、同じ粒径のものであっても異なるものであってもよい。
【００４３】
第１抗体及び第２抗体の不溶性担体への固定化方法としては、各抗体と不溶性担体とを接触させることによってなされればよく、自体公知の固定化方法、例えば共有結合により固定化する方法、物理的に吸着させて固定化する方法等の固定化方法を利用すればよい。
【００４４】
不溶性担体に担持させる第１抗体の量、及び不溶性担体に担持させる第２抗体の量は、その担体により異なるが、担体1 gに対して通常0.5〜2000 mgAb、好ましくは2〜500 mgAbとなるように調製される。担体がラテックス粒子の場合、ラテックス粒子1 gに対して通常0.5〜2000 mgAb、好ましくは2〜500 mgAbである。
【００４５】
第１抗体を固定化した不溶性担体と第２抗体を固定化した不溶性担体は、それぞれ第１抗体のみを固定化したもの及び第２抗体のみを固定化したものであってもよいし、第１抗体と第２抗体を同じ不溶性担体へ固定化したものであってもよい。
【００４６】
本発明では、第１抗体と第２抗体は、不溶性担体に結合させて用いてもよいが、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は不溶性担体に結合させて用いない。例えば不溶性担体としてラテックス粒子を用いて本発明のＣＫ-ＭＢ測定法を実施した場合、試料中のＣＫ-ＭＢとラテックスに固定化された第１抗体とラテックスに固定化された第２抗体とで架橋構造を形成して、光学的変化が生じる。しかし、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、試料中のＣＫ−ＭＢのＢサブユニットに結合はするが、架橋構造の形成には関与しない。
【００４７】
本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法の工程１は、ＣＫ-ＭＢを含有する試料と、第１抗体と、第２抗体と、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体とを反応させる工程である。
【００４８】
工程１では、最終的に、試料と第１抗体と第２抗体と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体とを含有する溶液が得られればよいが、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、試料と第１抗体及び第２抗体の少なくとも一つとを接触・反応させる前に加えることが好ましい。言い換えれば、試料と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体とを先に接触させた後に第１抗体と第２抗体を接触させることが好ましい。
【００４９】
工程１では、本発明に係る第１抗体、第２抗体、及び本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体は、緩衝液等の溶液に懸濁させて溶液の形態で用いられる場合が多い。このような試薬溶液を調製するために用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH 5.0〜10.0、好ましくはpH 6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有するものが挙げられる。具体的には、例えばHEPES緩衝剤、ホウ酸、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常10〜1000 mM、好ましくは10〜300 mMの範囲から適宜選択される。
【００５０】
また、第１抗体や第２抗体を固定化したラテックス粒子を構成試薬として含む上記した如き市販のキットを用いる場合は、該キットに添付の緩衝液を用いてもよい。
【００５１】
後述する本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する第１試薬と第１抗体及び第２抗体を含有する第２試薬の二試薬系で測定を行う場合、第１試薬のpHは、安定性を考慮するとpH 6.0〜8.0程度が好ましい。第２試薬のpHも、安定性を考慮して、第１試薬と同様pH 6.0〜8.0程度が好ましい。
【００５２】
上記のような緩衝液に本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を懸濁させた試薬溶液中の本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体の濃度は、試料と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液を混合したときに目的の濃度範囲内になるような濃度であればよい。例えば0.1〜200μg Ab/mL、好ましくは0.5〜50μg Ab/mL、より好ましくは１〜40μg Ab/mL、更に好ましくは１〜20μg Ab/mLであればよい。すなわち、下限値は0.1μg Ab/mL、好ましくは0.5μg Ab/mL、より好ましくは1μg Ab/mLである。またその上限値は200μg Ab/mL、好ましくは50μg Ab/mL、より好ましくは40μg Ab/mL、更に好ましくは20μg Ab/mLである。
【００５３】
また、上記のような緩衝液に第１抗体又は／及び第２抗体を懸濁させた試薬溶液中の第１抗体又は／及び第２抗体の濃度は、測定するＣＫ-ＭＢの濃度により異なるが、通常0.4〜4200 μg/mL、好ましくは2〜4200 μg/mL、より好ましくは2〜420 μg/mLである。
【００５４】
また、上記のような緩衝液に第１抗体及び第２抗体を固定化した不溶性担体を懸濁させた試薬溶液中の各不溶性担体の含量としては、用いられる担体の種類により異なるが、通常0.001〜10 w/v%、好ましくは0.005〜5 w/v%である。担体がラテックス粒子の場合、通常0.1〜10 w/v%、好ましくは0.2〜5 w/v%である。
【００５５】
尚、本発明に係る抗体を含有する溶液には、更に増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
【００５６】
工程１において、試料と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を接触・反応させる際の本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体の反応液中の濃度は、抗ＣＫ-ＭＢ抗体が試料中のＣＫ-ＢＢと結合する反応を抑制・回避してＣＫ-ＭＢ測定におけるＣＫ-ＢＢの影響を回避できる量であればよい。例えば0.1〜200μg Ab/mL、好ましくは0.5〜50μg Ab/mL、より好ましくは１〜40μgAb/mL、更に好ましくは1〜20μg Ab/mLであればよい。すなわち、下限値は0.1μg Ab/mL、好ましくは0.5μg Ab/mL、より好ましくは1μg Ab/mLである。またその上限値は200 μg Ab/mL、好ましくは50 μg Ab/mL、より好ましくは40μg Ab/mL、更に好ましくは20μg Ab/mLである。
【００５７】
また、工程１において試料と第１抗体と第２抗体を接触・反応させる際の第１抗体及び第２抗体の反応開始時の反応液中の濃度は、試料中のＣＫ-ＭＢの濃度により異なり、特に限定されないが、通常0.1〜1000μg Ab/mL、好ましくは0.5〜1000μg Ab/mL、より好ましくは0.5〜100μg Ab/mLである。
【００５８】
また、不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合であって、工程１において試料と第１抗体固定化ラテックスと第２抗体固定化ラテックスを接触・反応させる際の、反応液中のラテックスの濃度は、0.01〜3 w/v%、好ましくは0.01〜1.2 w/v%である。
【００５９】
また、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体、及び第１抗体と第２抗体の該反応時のpHとしては、抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常6.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.0の範囲が挙げられ、反応時の温度も抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃の範囲が挙げられる。また、その反応時間は、用いられる本発明に係る抗体並びにpH及び温度等の反応条件により異なるので、各々に応じて１〜60分、好ましくは1〜15分程度で反応させればよい。
【００６０】
当該工程１の具体的な方法としては、たとえば以下の方法が挙げられる。
（ｉ）本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液と、第１抗体と第２抗体とを含有する溶液をそれぞれ調製し、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体溶液、第１抗体と第２抗体を含有する溶液の順に、試料と混合する方法（二試薬系）、
（ii）本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液と、第１抗体を含有する溶液と、第２抗体を含有する溶液をそれぞれ調製し、試料と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液を混合してから、第１抗体を含有する溶液、第２抗体を含有する溶液を順次混合する方法（第１抗体を含有する溶液と第２抗体を含有する溶液は、どちらを先に加えてもよい。）、
（iii）第１抗体と第２抗体と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液を調製し、試料と該溶液を混合して、これらの成分を一度に作用させる方法。
【００６１】
以上の中でも、たとえば自動分析機を用いた測定を行う場合や作業効率を考慮すると、（ｉ）の方法で、ＣＫ-ＭＢを含有する試料と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体とを反応させた後、第１抗体及び第２抗体を反応させることが好ましい。
【００６２】
尚、試料中の共存物質の影響回避剤等の、試料の前処理液を、本発明に係る抗体より先に試料と接触させてもよい。
【００６３】
また、通常臨床検査の分野で用いられる抗ＣＫ-ＭＢ抗体を用いるＣＫ-ＭＢ測定用の市販キットを構成する試薬類の何れかに、上記のいずれかの状態となるように、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を存在させて用いてもよい。
【００６４】
本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法の工程２は、工程１の反応により生じた光学的変化を測定する工程である。
【００６５】
この工程２では、自体公知の抗ＣＫ-ＭＢ抗体を用いる測定法に従い、反応により生じた光学的変化の測定を行えばよい。
【００６６】
当該光学的変化としては、吸光度変化、濁度変化、又は散乱光強度変化等が挙げられる。
【００６７】
光学的変化の測定とは、免疫凝集の結果生じる光学的変化を測定することであり、具体的には、免疫比濁法、免疫比ろう法等の免疫凝集法等が挙げられる。これら測定方法は、自体公知の方法に準じて行えばよいが、例えば、免疫比濁法を用いる場合には、「金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.853-854」等に、例えば、免疫比ろう法を用いる場合には「金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.851-853等」等に記載の方法に準じて行えばよい。
【００６８】
中でも免疫比濁法による測定が好ましく、特にラテックス粒子を用いたラテックス比濁法が、測定感度が高く、汎用の自動分析装置を用いた測定が可能であり、簡便で、かつ本発明の効果をより享受できる点で好ましい。
【００６９】
本発明の測定法をラテックス比濁法により実施する場合、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を試料と接触混合させる以外は、自体公知のラテックス比濁法によるＣＫ-ＭＢの測定方法の測定条件（例えば測定波長等）や、測定操作法に準じて実施すればよい。
【００７０】
ラテックス比濁法によるＣＫ-ＭＢの測定を行う場合の吸光度測定のための測定波長は、通常340〜880 nm、好ましくは540〜800 nmである。２波長で測定する場合には、主波長540 nm付近、副波長800 nm付近で測定すればよい。
【００７１】
本発明に係る光学的変化は、例えば以下のように求めればよい。
(１)第１抗体固定化不溶性担体と第２抗体固定化不溶性担体とＣＫ-ＭＢとの反応開始後、反応液の光学的測定を適当な間隔で２回行い、その測定値の差を光学的変化とする（エンド法）。
(２)第１抗体固定化不溶性担体と第２抗体固定化不溶性担体とＣＫ-ＭＢとの反応開始後の反応液の光学的変化率（特に、その最大変化率）を吸光度変化とする（レート法）。
【００７２】
吸光度変化、濁度変化、又は散乱光強度変化の測定は、用手法によって行っても良いことはもちろんであるが、本発明の方法は、自動分析装置を用いた測定系に適用できるので、自動分析装置、分光光度計等の生化学汎用機やレーザーネフェロメーター等の比ろう測定用専用機等を用いて測定を行えばよく、詳しくは各機器のマニュアルに従えばよい。
【００７３】
用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類の組み合わせについては、特に限定はされず、適用する自動分析装置の環境、その他の要因等に合わせて適宜行えば良い。
【００７４】
本発明のＣＫ-ＭＢ測定方法の工程２を、例えばラテックス比濁法によりＣＫ-ＭＢを測定する方法を利用する市販のキットと汎用自動分析装置を用いて実施する場合、キットの構成試薬のいずれかに本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有させて用いればよい。そして、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を他の抗体と同時又は他の抗体より先に試料と接触・反応させる以外は、キットに添付の取扱説明書に従い、及び自動分析装置を用いた通常のＣＫ-ＭＢの測定を行えばよい。
【００７５】
本発明のＣＫ-ＭＢ測定方法の工程３は、「工程２で得られた結果に基づいてＣＫ-ＭＢの量を求める工程」である。
【００７６】
例えば、工程２で測定した光学的変化量を、例えば予めＣＫ-ＭＢ濃度既知の標準液等を試料として用いて同様の測定方法で求めた、ＣＫ-ＭＢ濃度と光学的変化量との関係を示す検量線に当てはめることにより、試料中のＣＫ-ＭＢ量を算出すればよい。
【００７７】
本発明のＣＫ-ＭＢの測定法（工程１〜工程３）を、前記（ｉ）の方法（本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有する溶液、第１抗体と第２抗体を含有する溶液を調製し、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体溶液、第１抗体と第２抗体を含有する溶液の順に、試料と混合する方法。）で、且つラテックス粒子を用いた免疫比濁法により測定する方法を例にとって具体的に示すと、例えば以下の如くなる。
【００７８】
先ず、例えば血液、血清、血漿等のＣＫ-ＭＢを測定すべき試料と、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を0.1〜200μg Ab/mL含有する第一試薬とを接触混合させ、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃で、通常１〜60分間、好ましくは１〜15分、更に好ましくは5分間程度反応させる。次いで、該反応液と、ラテックス粒子に固定化させた第１抗体とラテックス粒子に固定化させた第２抗体とを含有する第２試薬とを混合し、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃で、通常１〜60分間、好ましくは１〜15分、更に好ましくは5分間程度反応させる。その結果生じた抗原抗体反応に起因する反応液の吸光度変化を、例えば340〜880nm、好ましくは540〜800nmの測定波長で測定する。別に例えば予め濃度既知のＣＫ-ＭＢ標準品を試料として用いて同様に測定を行い、ＣＫ-ＭＢ濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成しておく。そして、ＣＫ-ＭＢを測定すべき試料を用いて得られた測定値をその検量線に当てはめてＣＫ-ＭＢの濃度を求めることによって、試料中のＣＫ-ＭＢを定量する。
【００７９】
本発明のＣＫ-ＭＢ測定におけるＣＫ-ＢＢの影響回避方法としては、ＣＫ-ＭＢを含有する試料に本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を加えて、該試料を処理する方法が挙げられる。その際に用いられる試薬及び処理方法の具体例は、上記試料中のＣＫ-ＭＢの測定方法の欄に記載したものが挙げられる。
【００８０】
本発明のＣＫ-ＭＢ測定用キットは、第１抗体、第２抗体、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体とを含む試薬を構成試薬として含んでなるものであればよい。夫々の構成要素の好ましい態様、具体例及び濃度等については、上記の、本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法に関する説明に記載した通りである。
【００８１】
また、当該第１抗体、第２抗体、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含む試薬は、適当な緩衝液中に本発明に係る抗体や、第１抗体固定化不溶性担体、第２抗体固定化不溶性担体、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体等を懸濁させた懸濁液等の溶液状態のもの、若しくはこれを凍結した凍結品や凍結乾燥した凍結乾燥品であってもよい。この目的に用いられる緩衝剤等の具体例、そのpH及び濃度は上記した通りである。
【００８２】
また、これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
【００８３】
また、当該キットが複数の試液で構成される場合、各試液中には、測定対象成分を測定する為に必要な試薬類も含有させるが、これら試薬類は、各試液を混合した時点で目的の成分測定の反応が開始されるように各試液の何れかに適宜分散させて含有させればよい。これら試液を構成する試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
【００８４】
更に、当該キットには、ＣＫ-ＭＢを測定する際に用いられる、検量線作成用のＣＫ-ＭＢ標準品が組み合わされていてもよい。該標準品は、市販の標準品を用いても、公知の方法に従って、製造されたものを用いても構わない。
【００８５】
さらにまた本発明のキットには、ＣＫ-ＭＢを測定する方法の説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
【００８６】
本発明のキットの具体的な実施態様としては、例えば以下の如き構成が挙げられる
（１）本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含んでなる第１試薬と、第１抗体と第２抗体を含んでなる第２試薬とを構成試薬とするもの、
（２）本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含んでなる第１試薬と、第１抗体を含んでなる第２試薬と、第２抗体を含んでなる第３試薬とを構成試薬とするもの、又は
（３）第１抗体と第２抗体と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含んでなる試薬を構成試薬とするもの。
【００８７】
本発明に係る試料としては、ＣＫ-ＭＢを含む試料であればよいが、具体的には、例えば血液、血漿、血清、関節液、肋膜液、リンパ液、骨髄液等の体液や尿、大便、唾液等が挙げられ、中でも血清、血漿等が好ましいものとして挙げられる。
【００８８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
実施例１．
市販のＣＫ-ＭＢ測定キットであるLタイプワコー CK-MB mass（和光純薬工業（株）製）を用い、キットの添付文書の記載に従って、以下のとおり、測定を行った。【００９０】
上記キットは、互いにエピトープの異なる二種の抗ＣＫ-ＭＢ抗体をそれぞれ固定化したラテックス粒子を用い、ラテックス比濁法によりＣＫ-ＭＢを測定する方法に使用するキットである。【００９１】
（１）ＣＫ-ＢＢ試料の調製
ヒト脳由来精製ＣＫ-ＢＢ（Meridian Life Science, Inc.）を400 ng/mLおよび2000 ng/mLとなるようにヒト血清に添加して、ＣＫ-ＢＢ試料とした。
【００９２】
（２）第１試薬の調製
キットに添付の緩衝液に、抗ＣＫ-Ｂ抗体として市販のマウス抗ＣＫ-ＢＢモノクローナル抗体であるMAb to CK-BB(Meridian Life Science, Inc.製 )、又はCKBB Monoclonal Antibody（Roche Diagnostics K.K.製）を加えて、0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160μg/mL濃度の抗体含有緩衝液（第１試薬）を調製した。
【００９３】
尚、CK-BB試料と第１試薬を混合したときの、反応溶液中の抗ＣＫ-Ｂ抗体の濃度は、それぞれ0, 1.2 , 2.3, 4.9, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150 μg/mLである。【００９４】
（３）第２試薬
キットに添付のラテックス試液を第２試薬として用いた。ラテックス試液は、認識するエピトープが互いに異なる２種類の抗ＣＫ-ＭＢ抗体をそれぞれ固定化した、２種類のラテックス粒子を含有する。【００９５】
（４）ＣＫ-ＭＢの測定（２ポイントエンド法）
日立7170自動分析装置（(株)日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、以下の測定を行った。【００９６】
すなわち、上記（１）で調製したＣＫ-ＢＢ試料 10 μLに上記（２）で調製した第１試薬 150 μLを混合し、37℃で5分保温後、第２試薬 50 μLを添加してさらに5分保温した。第２試薬添加後30秒後から5分後までの、660 nmでの吸光度変化を測定した。【００９７】
対照として、第１試薬として抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有しない緩衝液を用いる以外は、同じ試薬、測定機器を用い、同じ方法で、同じ試料中のＣＫ-ＭＢの測定を行った。【００９８】
（５）結果
抗ＣＫ-Ｂ抗体としてMAb to CK-BBを含有する第１試薬を用いた場合の結果を表１に示す。【００９９】
また、表１には、400 ng/mL及び2000 ng/mLのＣＫ-ＢＢ試料を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行って得られた測定値（ＣＫ-ＭＢ測定）と、測定に使用したＣＫ-ＢＢ試料の濃度に対する、その試料を用いてＣＫ-ＭＢ測定を行って得られたＣＫ-ＭＢ測定値の比率を併せて示す（ＣＫ-ＢＢ交差率）。【０１００】
【表１】
0006515923.tif 000002
【０１０１】
本実施例では、ＣＫ-ＭＢを含有しない試料中のＣＫ-ＭＢ値を測定していることになる。しかしながら、表１によると、例えば、400 ng/mLのＣＫ-ＢＢを含有する試料を用い、抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合（抗ＣＫ-Ｂ抗体の添加濃度が0μg/mLの場合）、18.6 ng/mLという測定値が得られた。この試料には400ng/mLのＣＫ-ＢＢが含まれていることから、この測定では18.6 (ng/mL)/400 (ng/mL)×100≒約4.6%の交差率で、ＣＫ-ＢＢを測り込んでしまった（偽高値）ことが判る。同様に、2000 ng/mLのＣＫ-ＢＢを含有する試料を用い、抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合の交差率は5.3%であった。【０１０２】
これに対し、抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行うと、ＣＫ-ＢＢの交差率が顕著に低下した。例えば5 μg/mLの抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合のＣＫ-ＢＢ交差率は400 ng/mLの試料、2000 ng/mLの試料を用いた何れの場合でも0.8%であった。すなわち、抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行うと、抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB）を含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合と比較して、ＣＫ-ＭＢ測定値に対するＣＫ-ＢＢの影響を顕著に抑制することができた。【０１０３】
同様に、抗ＣＫ-Ｂ抗体としてCKBB Monoclonal Antibodyを含有する第１試薬を用いた場合の結果を表２に示す。【０１０４】
【表２】
0006515923.tif 000003
【０１０５】
表２の結果から明らかなように、抗ＣＫ-Ｂ抗体（CKBB Monoclonal Antibody）を含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合も、抗ＣＫ-Ｂ抗体（CKBB Monoclonal Antibody）を含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合と比較して、ＣＫ-ＢＢの影響を顕著に抑制することができた。【０１０６】
以上のことから、従来のラテックス比濁法によるＣＫ-ＭＢの測定系に抗ＣＫ-Ｂ抗体（CKBB Monoclonal Antibody）を加えることにより、試料中に存在するＣＫ-ＢＢの影響を回避して、ＣＫ-ＭＢに特異性の高い測定を行うことができることが判る。【０１０７】
また、データは示していないが、抗ＣＫ-Ｂ抗体としてBiosPacific, Inc.製のCK-BB Monoclonal Antibody、又はFitzgerald I. I. 製のCKBB antibodyを含有する第１試薬を用いる以外は、上記と同様の方法でＣＫ-ＭＢの測定を行った。その結果、これらの抗体を含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合と比較して、ＣＫ-ＢＢの影響を顕著に抑制することができた。よって、従来のラテックス比濁法によるＣＫ-ＭＢの測定系に、これらのＣＫ-Ｂ抗体（BiosPacific, Inc.製のCK-BB Monoclonal Antibody又はFitzgerald I. I. 製のCKBB antibody）を加えることにより、試料中に存在するＣＫ-ＢＢの影響を回避して、ＣＫ-ＭＢに特異性の高い測定ができることが判る。
【０１０８】
実施例２
実施例１の結果から、実施例１で使用した抗ＣＫ-Ｂ抗体（本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体）が、ラテックス比濁法によるＣＫ-ＭＢ測定時のＣＫ-ＢＢの影響を回避することが確認できたので、これらの抗体の抗原性を、以下の方法で確認した。【０１０９】
（１）ウエスタンブロッティング
0.1mg/mLのヒト脳由来精製ＣＫ-ＢＢ（Meridian Life Science, Inc.）2μLをSuperSepTM(電気泳動用ゲル、和光純薬工業（株）,5-20%のグラジェントゲル)にアプライして、SDS-PAGE電気泳動（定電流25mA）を行った。次いで、泳動後の画分を、セミドライブロッティング法にてＰＶＤＦメンブレンに転写した。
【０１１０】
PBS-T(Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20、pH 7.4、和光純薬工業（株）)に4 w/v%濃度となるようにブロックエース(DSファーマバイオメディカル（株）製)を溶解させてブロッキング液とした。このブロッキング液に上記転写後のＰＶＤＦメンブレンを浸漬させ、1時間室温にてブロッキング処理した。次いで、各画分のレーン毎にＰＶＤＦメンブレンを切断し、それぞれ新しいブロッキング液に浸した。【０１１１】
次いで、ＣＫのＢサブユニットの全アミノ酸配列（配列番号１）のうちの、それぞれ200aa-300aa（Ｎ末端から200〜300番アミノ酸までのアミノ酸配列部分）を抗原とする（認識する）抗ＣＫ-Ｂ抗体、350aa-C末端（Ｎ末端から350番〜Ｃ末端アミノ酸までのアミノ酸配列部分）を抗原とする抗ＣＫ-Ｂ抗体、165aa-357aa（Ｎ末端から165〜357番アミノ酸までのアミノ酸配列部分）を抗原とする抗ＣＫ-Ｂ抗体、又は1aa-100aa（Ｎ末端から１〜100番アミノ酸までのアミノ酸配列部分）を抗原とする抗ＣＫ-Ｂ抗体として、市販のウサギ抗ＣＫ-ＢＢポリクローナル抗体（すべてAbcam plc製）4種をそれぞれＰＶＤＦメンブレンを浸したブロッキング液に添加して、室温で2時間処理した。【０１１２】
次いで、実施例１で使用したものと同じ抗ＣＫ-Ｂ抗体（Mab to CK-BB又はCK-BB Monoclonal Antibody、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体）を、上記のメンブレンを浸したブロッキング液に更に添加し、4℃にて終夜浸した。次いでブロッキング液を十分量のPBS-Tに交換してメンブレンをPBS-Tに10分間浸した後、新しいBPS-Tに交換する方法でメンブレンを3回洗浄した。その後新しいブロッキング液にメンブレンを浸漬させ、Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP（DAKO A/S）をブロッキング液に加えて室温で1時間浸漬させた。次いで、十分量のPBS-Tでメンブレンを洗浄し、ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent(ペルオキシダーゼの化学発光基質、GE Healthcare製)で発光させ、LAS4000(富士フイルム（株）製)を用い、露光時間10秒で検出した。【０１１３】
（２）結果
本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体としてMAb to CK-BBを用いて得られた結果を図１に、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体としてCK-BB Monoclonal Antibodyを用いて得られた結果を図２にそれぞれ示す。【０１１４】
図１及び図２において、ＣＫ-ＢＢの電気泳動画分の位置を矢印で示す。【０１１５】
また、図１及び図２において「添加なし」は、「ウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体を用いた電気泳動画分の前処理を行わなかった」場合を示す。【０１１６】
更に、例えば「200-300」は、「ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から200〜300番アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体と電気泳動画分を先に反応させた後、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体［MAb to CK-BB（図１）又はCKBB Monoclonal Antibody（図２）］と更に反応させた場合」の結果を示す。【０１１７】
「350-Ｃ」は、「ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から350番〜C末端アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体と電気泳動画分を先に反応させた後、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体［MAb to CK-BB（図１）又はCKBB Monoclonal Antibody（図２）］と更に反応させた場合」の結果を示す。【０１１８】
「165-357」は、「ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から165〜357番アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体と電気泳動画分を先に反応させた後、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体［MAb to CK-BB（図１）又はCKBB Monoclonal Antibody（図２）］と更に反応させた場合」の結果を示す。【０１１９】
「1-100」は、「ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から1〜100番アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体と電気泳動画分を先に反応させた後、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体［MAb to CK-BB（図１）又はCKBB Monoclonal Antibody（図２）］と更に反応させた場合」の結果を示す。【０１２０】
図１及び図２から明らかな通り、「1-100」の場合、すなわち「ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から1-100番アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体と電気泳動画分を先に反応させた後、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体［MAb to CK-BB（図１）又はCKBB Monoclonal Antibody（図２）］と更に反応させた場合」のみ、画分の染色の程度が顕著に減少した。【０１２１】
これは、使用したウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体（ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から1-100番アミノ酸までのアミノ酸配列部分を抗原とするウサギ抗ＣＫ-Ｂ抗体）と本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB及びCKBB Monoclonal Antibody）が、抗原（ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から1-100番アミノ酸までのアミノ酸配列部分）に対して競合したことを示す。【０１２２】
以上のことから、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体（MAb to CK-BB及びCKBB Monoclonal Antibody）は、ＣＫのＢサブユニットの1〜100番アミノ酸の領域を認識する抗体であることが明らかになった。【０１２３】
比較例１． 
以下の方法で、ＣＫのＢサブユニットの「Ｎ末端から1〜100番アミノ酸の領域」以外の領域を認識する抗体が、ＣＫ−ＭＢの測定におけるＣＫ−ＢＢの影響を回避することができるかを調べた。【０１２４】
（１）ＣＫ-ＢＢ試料の調製
実施例１と同じＣＫ-ＢＢ試料を用いた。【０１２５】
（２）第１試薬の調製
キット（Ｌタイプワコー CK-MB mass）に添付の緩衝液に、下記の、各々異なる領域を認識する市販の抗ＣＫ-Ｂ抗体を加えて、5 μg/mL濃度の抗体含有緩衝液（第１試薬）をそれぞれ調製した。各抗体の「抗原」は、各抗体の添付文書の抗原領域に関する記載に基づく。【０１２６】
抗体ａ：ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から200〜300番アミノ酸までのアミノ酸配列を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体（ウサギ抗ＣＫ-ＢＢポリクローナル抗体、Abcam plc製）
抗体ｂ：ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から350番〜Ｃ末端アミノ酸までのアミノ酸配列を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体（ウサギ抗ＣＫ-ＢＢポリクローナル抗体、Abcam plc製）
抗体ｃ：ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から165〜357番アミノ酸までのアミノ酸配列を認識する抗ＣＫ-Ｂ抗体（ウサギ抗ＣＫ-ＢＢポリクローナル抗体、Abcam plc製）
抗体ｄ： MAb to CK-BB(Meridian Life Science, Inc.製、実施例１で使用した本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体。）。
【０１２７】
（３）第２試薬
実施例１で使用したと同じキットに添付のラテックス試液を第２試薬として用いた。【０１２８】
（４）ＣＫ-ＭＢの測定（２ポイントエンド法）
実施例１で使用したと同じ機器を用い、同じ方法で、ＣＫ-ＭＢの測定を行った。【０１２９】
（５）結果
結果を表３に示す。【０１３０】
また、表３には、400 ng/mL及び2000 ng/mLのＣＫ-ＢＢ試料を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行って得られた測定値（ＣＫ-ＭＢ測定）と、測定に使用したＣＫ-ＢＢ試料の濃度に対する、その試料を用いてＣＫ-ＭＢ測定を行って得られたＣＫ-ＭＢ測定値の比率を併せて示す（ＣＫ-ＢＢ交差率）。【０１３１】
【表３】
0006515923.tif 000004
【０１３２】
表３から明らかな通り、抗体ａ〜ｃを含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合は、抗体ａ〜ｃを含有しない第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合と比較して、ＣＫ-ＢＢとの交差率に殆ど変化がなかった。抗体ｄ（本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体）を含有する第１試薬を用いてＣＫ-ＭＢの測定を行った場合のみ、ＣＫ-ＢＢとの交差率が顕著に低下していた。【０１３３】
以上のことから、ＣＫのＢサブユニットのＮ末端から1〜100番アミノの領域以外の領域を認識する抗体（抗体ａ〜ｃ）は、ＣＫ-ＭＢの測定系に対するＣＫ-ＢＢの影響を抑制することができないことがわかる。【０１３４】
実施例３
実施例１で使用したのと同じ市販のＣＫ-ＭＢ測定キットであるLタイプワコーCK-MB mass（和光純薬工業（株））を用い、キットの添付文書の記載の方法に従って、以下の測定を行った。【０１３５】
（１）本発明の方法によるＣＫ-ＭＢの測定
１）測定試料
（株）ベリタス・ニットーボーメディカル（株）や国際バイオ（株）から購入した血清の中でＣＫ-ＢＢが含まれていることを確認したヒト血清を測定試料として用いた。【０１３６】
２）第１試薬の調製
キットに添付の緩衝液に、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体（Mab to CK-BB又はCK-BB Monoclonal Antibody）を加えて、5 μg/mL濃度の抗体含有緩衝液（第１試薬）を調製した。【０１３７】
尚、測定試料と第１試薬を混合したときの、反応溶液中の本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体の濃度は4.7 μg/mLである。【０１３８】
３）第２試薬
実施例１と同じ、キットに添付のラテックス試液を第２試薬として用いた。【０１３９】
４）ＣＫ-ＭＢの測定（２ポイントエンド法）
LAＢOSPECT008自動分析装置（（株）日立ハイテクノロジーズ製）を用い測定を行った。上記１）のＣＫ-ＭＢ含有試料7μLに、上記２）で調製した第１試薬100 μLを混合し、37℃で5分保温後、第２試薬 33 μLを添加してさらに5分保温した。ラテックス 試液添加後30秒後から5分後までの660 nmでの吸光度変化を測定した。【０１４０】
対照として、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を含有しない緩衝液を用いる以外は、同じ試薬、測定機器を用い、同じ方法で、同じ試料中のＣＫ-ＭＢの測定を行った。【０１４１】
（２）従来法（電気化学発光免疫測定法）によるＣＫ-ＭＢの測定
同じ試料中のＣＫ-ＭＢを、電気化学発光免疫測定法によるＣＫ-ＭＢ測定用キットであるエクルーシス試薬  CK-MBII（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を用い、cobas8000（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を用いて測定した。
【０１４２】
（３）結果
結果を下記表４に示す。【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
表４において、ＣＫ-ＭＢ蛋白量の参考基準値「5.0 ng/mL（臨床検査法提要第33版より）」以下のＣＫ-ＭＢ値が得られた場合に影を付けて示した。【０１４５】
表４から明らかな通り、本発明の方法によって得られた測定値（「Mab to CK-BB添加」又は「CKBB Monoclonal Antibody添加」）は、本発明に係る抗ＣＫ-Ｂ抗体を共存させないで行う従来のラテックス比濁法によって得られた測定値（「抗ＣＫ-Ｂ抗体無添加」）と比較して、従来の電気化学発光免疫測定法による測定値とカットオフ判定が完全に一致しており、本発明の方法により得られた測定値の信頼度が高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法は、試料中にＣＫ-ＢＢが共存していても、その影響を回避して、ＣＫ-ＭＢを特異的に測定することができる。また、本発明のＣＫ-ＭＢの測定方法は、汎用自動分析装置にも適用できることから、臨床検査の分野においてＣＫ-ＭＢの測定に使用することができる点で、有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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