(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列とハイブリダイズする
【化１】
0006492053.tif 000017
からなるオリゴヌクレオチドであって、
太字は、ＬＮＡ修飾ヌクレオチドを表す、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３】
悪性および／若しくは良性腫瘍、線維症、肝硬変、強皮症若しくは関連する皮膚疾患、またはＣＮＳ疾患の予防および／または治療の方法において使用される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記悪性および／若しくは良性腫瘍は、固形腫瘍、血液生まれの腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、または胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓、子宮頸がん、絨毛癌、脈絡膜癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌の癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌からなる群から選択される、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ポリアルキレンオキサシド−、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび／または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む、ＴＧＦ−ベータ２核酸配列、代替的に、ＴＧＦ−ベータ１またはＴＧＦ−ベータ３核酸配列の選択領域の１０から２０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに向けられる。
【背景技術】
【０００２】
成長因子ベータ形質転換（ＴＧＦ−ベータ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化、および他の機能を制御するタンパク質である。これは、とりわけ免疫、癌、心臓病、糖尿病、マルファン症候群、ロイエス−ディーツ症候群、パーキンソン病、およびＡＩＤＳに関与するサイトカインの一種である。
【０００３】
ＴＧＦ−ベータは、異なる遺伝子によってコードされるが、強力な配列および構造相同性を共有する少なくとも３つのイソ型（ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３）に存在する分泌タンパク質である。ＴＧＦ−ベータは、正常上皮細胞および腫瘍形成の初期段階で抗増殖因子として作用する。しかし、後に腫瘍発生におけるＴＧＦ−ベータは、上皮−間葉転換（ＥＭＴ）の導入、腫瘍の進行、浸潤および転移に寄与すると考えられているプロセスの誘導を含む機構を通じて腫瘍促進になり得る（非特許文献１を参照）。
【０００４】
正常（上皮）細胞において、Ｇ１ステージでＴＧＦ−ベータは細胞周期を停止する（および細胞増殖を停止する）、分化を誘導する、またはアポトーシスを促進する。細胞が癌細胞に形質転換したとき、ＴＧＦ−ベータは、もはや、しばしシグナル伝達経路における変異の結果である細胞増殖を抑制し、癌細胞が増殖する。
【０００５】
間質線維芽細胞の増殖もＴＧＦ−ベータによって誘発される。どちらの細胞もＴＧＦ−ベータの生産を増加させる。このＴＧＦ−ベータは、間質細胞、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および腫瘍微小環境に作用する（非特許文献２を参照）。これにより、血管新生を促進し、免疫細胞の増殖および活性化を抑制することにより、免疫抑制を引き起こす。
【０００６】
ＴＧＦ−ベータ１−欠損マウスは、心臓、肺および胃の炎症により死亡し、ＴＧＦ−ベータは、炎症細胞の活性化および増殖の抑制に増殖重要な役割を担っていることを示唆する。Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−ベータ依存性ダウンストリームシグナル伝達経路における重要な要素の１つである。Ｓｍａｄ３−欠損マウスは、Ｔ細胞活性化および粘膜免疫の機能障害に起因する慢性の粘膜感染症を発症し、これらのプロセスにおけるＴＧＦ−ベータに対する重要な役割を示唆する。癌に関しては、特定の癌細胞によるＴＧＦ−ベータの生産および分泌は、免疫細胞の浸潤の活性を抑制し、それによって、ホスト免疫監視から逃れるために腫瘍を助ける。この免疫抑制効果は、ＴＧＦ−ベータが後期ステージの腫瘍の成長を刺激することにより、他の重要なメカニズムになり得る（非特許文献３を参照）。また、ＴＧＦ−ベータは、通常、炎症性（免疫）反応で癌を攻撃するエフェクターＴ−細胞を、炎症反応をオフにする、規制（抑制）Ｔ−細胞に変換する。
【０００７】
さらに、ＴＧＦ−ベータは、細胞外マトリクスの生産および沈着の最も強力な調節因子の１つである。これは、生産を刺激し、２つの主要なメカニズムによる細胞外マトリクスの接着特性に影響を与える。第１に、ＴＧＦ−ベータは、線維芽細胞および、コラーゲン、フィブロネクチン、およびインテグリンなどの細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着タンパク質を生産する他の細胞を刺激する。第２に、ＴＧＦ−ベータは、コラゲナーゼ、ヘパリナーゼおよびストロメライシンを含む細胞外マトリックスを分解する酵素の生産を減少させ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型とメタロプロテアーゼの組織阻害剤を含む細胞外マトリックスを分解する酵素を阻害するタンパク質の産生を増加させる。これらの変化の正味の効果は、細胞外マトリックスタンパク質の生産を増加させ、且つ細胞の特異的な様式における細胞の接着特性を増加または低下させることのいずれか一方である。多くの癌細胞において、ＴＧＦ−ベータの生産が増加し、タンパク質分解活性の増大および細胞接着分子との結合の促進により細胞の侵襲性を増大させる（非特許文献３を参照）。
【０００８】
したがって、ＴＧＦ−ベータの発現および活性に影響を与えることができる治療薬は、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ関連する疾患の予防および／または治療に使用するために特に不可欠である。例えば、特許文献１および特許文献２は、ＴＧＦ−ベータ１および／またはＴＧＦ−ベータ２のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを開示し、これは、例えば、癌を予防および／または治療するための医薬組成物の製造に使用するのに適している。これらのオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＥＮＡなどような修飾を含まない。
【０００９】
例えば、特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、治療に使用可能な、ＨＩＦ−１Ａ、Ｂｃｌ−２およびＨＥＲ３のそれぞれの阻害に向けられているヌクレオチドの修飾を含むオリゴヌクレオチドを開示している。
【００１０】
オリゴヌクレオチドを選択するための基準は、主に、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧＣ−パーセント、ヘアピン形成、二量体化の傾向および融解温度（Ｔｍ）である。一般的に、高いＴｍ（融解温度）が好ましい。さらに、オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに特異的でなければならず、潜在的なオフターゲット効果を減少させるために、非標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてはいけない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１００８６４９号明細書
【特許文献２】欧州特許第０６９５３５４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００３／８５１１０号
【特許文献４】国際公開第２００５／０６１７１０号
【特許文献５】国際公開第２００８／１３８９０４号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＴＧＦ）−ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ」  ７ｔｈ  ｓｐａｃｅ．ｃｏｍ．２００９−０１−０８．  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ：  ２００９−０１−２９
【非特許文献２】Ｐｉｃｋｕｐｅｔ  ａｌ．，  「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＧＦβ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  （２０１３），  １３：  ７８８−７９９
【非特許文献３】Ｂｌｏｂｅ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｙ  ２０００，  「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２  （１８），  １３５０−１３５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、ＴＧＦ−ベータの発現および／または活性を低減または阻害する治療薬についての高い科学的および医学的要求がある。特に、任意の（深刻な）副作用を起こすことなく、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３を特異的に阻害するオリゴヌクレオチドと同様に、特異的に相互作用して、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３の発現を減少または／および阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドについての長年にわたる要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１（図２参照）のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３５（図１２参照）のＴＧＦ−ベータ１核酸配列の、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３６（図２５参照）のＴＧＦ−ベータ３核酸配列の１０から２０、好ましくは１２から１８のヌクレオチドからなり、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは修飾されているオリゴヌクレオチドを開示する。本発明のオリゴヌクレオチドのいくつかは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３に対応する。好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示される、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２から１４９（ＴＧＦ−ベータ２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５０から３３４（ＴＧＦ−ベータ１）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３７から４０２（ＴＧＦ−ベータ３）の１つを含むまたはからなる。
【００１５】
特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１の核酸ｎｏ．１３８０から１５１０の領域の１０から２０、より好ましくは１２から１８のヌクレオチドを含む、または、からなり、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは修飾されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ２の発現および活性の減少および阻害に非常に有効である。好ましいオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２（例えば、ＡＳＰＨ３６：ＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３（例えば、ＡＳＰＨ８０：ＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４（例えば、ＡＳＰＨ９８：ＧＣＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５（例えば、ＡＳＰＨ１１１：ＡＧＣＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡ）、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６（例えば、ＡＳＰＨ１２１またはＡＳＰＨ１５３：ＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７（例えば、ＡＳＰＨ１５：ＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８（例えば、ＡＳＰＨ１７：ＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９（例えば、ＡＳＰＨ２６またはＡＳＰＨ２７：ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０（例えば、ＡＳＰＨ３７：ＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１（例えば、ＡＳＰＨ５２または５３：ＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２（例えば、ＡＳＰＨ１１２：ＧＧＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＴ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３（例えば、ＡＳＰＨ１１９：ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＣ）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１（例えば、ＡＳＰＨ３０：ＣＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＧＣＡＴ）を含む、または、からなる。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列のｎｏ．２７４０から２８１０の核酸領域の１０から２０、より好ましくは１２から１８のヌクレオチドを含む、または、からなる、オリゴヌクレオチドに言及し、オリゴヌクレオチドの１以上のヌクレオチドは修飾されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ２の発現および活性の減少および阻害に非常に有効である。好ましいヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５７（例えば、ＡＳＰＨ６５：ＴＣＴＧＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７３（例えば、ＡＳＰＨ８２：ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴ）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０３（例えば、ＡＳＰＨ１１５：ＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＴ）を含むまたはからなる。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列のｎｏ．１６６０から１６８０の核酸領域の１０から２０、より好ましくは１２からの１８ヌクレオチドを含む、または、からなる、オリゴヌクレオチドに言及し、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは修飾されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ１および／またはＴＧＦ−ベータ２の発現および活性の減少および阻害に非常に有効である。好ましいオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４（例えば、ＡＳＨＰ０１またはＡＳＰＨ０２：ＡＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５（例えば、ＡＳＰＨ０３またはＡＳＰＨ０４：ＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６（例えば、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６またはＡＳＰＨ０７：ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７（例えば、ＡＳＰＨ０８：ＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ）を含むまたはからなる。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列のｎｏ．２３９０から２４１０の核酸領域の１０から２０、より好ましくは１２から１８、最もこのましくは１３ヌクレオチドを含む、または、からなる、オリゴヌクレオチドに言及し、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは修飾されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３の発現および活性の減少および阻害に非常に有効である。好ましいヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８（例えば、ＡＳＰＨ９またはＡＳＰＨ１０：ＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴ）を含む、または、からなる。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の１０から２０、より好ましくは１２から１８のヌクレオチドを含む、または、からなるオリゴヌクレオチドに言及し、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは修飾されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３、最も好ましくはＴＧＦ−ベータ２の発現および活性の減少および阻害に非常に有効である。好ましいヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９から５６、５８から７２、７４から１０２、１０４から１３８（例えば、ＡＳＨＰ１１−ＡＳＰＨ１４、ＡＳＰＨ１６、ＡＳＰＨ１８−ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ２８−ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３８−ＡＳＰＨ５１、ＡＳＰＨ６０−ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６６−ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８１、ＡＳＰＨ８３−ＡＳＰＨ９７、ＡＳＰＨ９９−ＡＳＰＨ１１０、ＡＳＰＨ１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１６−１１８、ＡＳＰＨ１２０、ＡＳＰＨ１２２−ＡＳＰＨ１５２、ＡＳＰＨ１５４−ＡＳＰＨ１８３、またはＴ−ＬＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４））の１つを含む、または、からなる。
【００２０】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、ＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、およびＡＳＰＨ１９３のいずれかである。
【００２１】
本発明のさらなる好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、表１に示された、ＴＧＦベータ１ｍＲＮＡの発現および／または活性を阻害するＡＳＰＨ１０００からＡＳＰＨ１１３２である。この群の好ましいヌクレオチドは、例えばＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１３９、ＡＳＰＨ１１５０、ＡＳＰＨ１１６２、ＡＳＰＨ１１６３、ＡＳＰＨ１１７５、ＡＳＰＨ１１７８、およびＡＳＰＨ１１８１の群のいずれかである。
【００２２】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現および／または活性を阻害する。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＡＳＰＨ２０００、ＡＳＰＨ２００１、ＡＳＰＨ２００２、ＡＳＰＨ２００３、ＡＳＰＨ２００４、ＡＳＰＨ２００５、ＡＳＰＨ２００６、ＡＳＰＨ２００７、ＡＳＰＨ２００８、ＡＳＰＨ２００９、ＡＳＰＨ２０１０、ＡＳＰＨ２０１１、ＡＳＰＨ２０１２、ＡＳＰＨ２０１３、ＡＳＰＨ２０１４、ＡＳＰＨ２０１５、ＡＳＰＨ２０１６、ＡＳＰＨ２０１７、ＡＳＰＨ２０１８、ＡＳＰＨ２０１９、ＡＳＰＨ２０２０、ＡＳＰＨ２０２１、ＡＳＰＨ２０２２、ＡＳＰＨ２０２３、ＡＳＰＨ２０２４、ＡＳＰＨ２０２５、ＡＳＰＨ２０２６、ＡＳＰＨ２０２７、ＡＳＰＨ２０２８、ＡＳＰＨ２０２９、ＡＳＰＨ２０３０、ＡＳＰＨ２０３１、ＡＳＰＨ２０３２、ＡＳＰＨ２０３３、ＡＳＰＨ２０３４、ＡＳＰＨ２０３５、ＡＳＰＨ２０３６、ＡＳＰＨ２０３７、ＡＳＰＨ２０３８、ＡＳＰＨ２０３９、ＡＳＰＨ２０４０、ＡＳＰＨ２０４１、ＡＳＰＨ２０４２、ＡＳＰＨ２０４３、ＡＳＰＨ２０４４、ＡＳＰＨ２０４５、ＡＳＰＨ２０４６、ＡＳＰＨ２０４７、ＡＳＰＨ２０４８、ＡＳＰＨ２０４９、ＡＳＰＨ２０５０、ＡＳＰＨ２０５１、ＡＳＰＨ２０５２、ＡＳＰＨ２０５３、ＡＳＰＨ２０５４、ＡＳＰＨ２０５５、ＡＳＰＨ２０５６、ＡＳＰＨ２０５７、ＡＳＰＨ２０５８、ＡＳＰＨ２０５９、ＡＳＰＨ２０６０、ＡＳＰＨ２０６１、ＡＳＰＨ２０６２、ＡＳＰＨ２０６３、ＡＳＰＨ２０６４、ＡＳＰＨ２０６５、およびＡＳＰＨ２０６６のいずれかである。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２若しくはＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２の予期しないほど強く且つ明確な阻害を示す。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３、さらにはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３をも強く且つ特異的に阻害することを示す。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドの、１つ以上のヌクレオチドの修飾は、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび２’−Ｏ−メチルのようなポリアルキレンオキシドからなる群から選択される。修飾は、オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端に位置することが好ましい。そのような修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２５】
修飾ヌクレオチドは、例えば、１つが直接他の隣にあるように１列に配置され、または異なるパターンで配置され、１以上の未修飾のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドに続く。例えば、オリゴヌクレオチドは、１以上の修飾ヌクレオチドで始まり、次いで、１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは４つの未修飾またはロックされていないヌクレオチドが続き、次いで、再び１つ以上の修飾ヌクレオチドが続く。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドの両末端は、修飾および未修飾またはロックされていないヌクレオチドの同一パターンを含む。別の実施形態において、３’−および５’−末端での修飾パターンは異なり、例えば、一方の末端が修飾ヌクレオチドを含まない。好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは８または９のロックされていない一連のヌクレオチドを含む。
【００２６】
あるいは、オリゴヌクレオチド内の任意の他の位置のヌクレオチドは、修飾され、またはオリゴヌクレオチドの５’−および／若しくは３’−末端並びにオリゴヌクレオチドの他の位置における少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。例えば、ＡＳＰＨ１０７１、ＡＳＰＨ１１００、ＡＳＰＨ１１０９、ＡＳＰＨ１１１０、ＡＳＰＨｌｌｌｌ、ＡＳＰＨ１１１５、ＡＳＰＨ１１２６、ＡＳＰＨ１１２７およびＡＳＰＨ１１２８は、例えば、ロックされていないヌクレオチドによって互いに分離された異なるパターンにおけるＬＮＡ、ＥＮＡ等のような修飾ヌクレオチドを含むＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドのようなＴＧＦ−ベータオリゴヌクレオチド群に属する。オリゴヌクレオチドは、修飾の１つのタイプまたは１つ以上の異なる修飾のいずれかを含む。必要に応じて、オリゴヌクレオチドの２つの連続するヌクレオチド（修飾または非修飾）の間の少なくとも１つのリン酸結合は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートである。
【００２７】
さらに、本発明は、たとえ、オリゴヌクレオチドがＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、および／またはＴＧＦ−ベータ３配列に対して１００％相補的でなくても１より多くのＴＧＦ−ベータイソ型の発現と相互作用し、且つ阻害するＴＧＦ−ベータアンチセンスオリゴヌクレオチドに言及する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、例えばＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０９６、ＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２である。例えばＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２のそれぞれに関し、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスのような異なる種のＴＧＦ−ベータ配列と好ましく相互作用する。
【００２８】
別の実施形態のすべてのオリゴヌクレオチドは、悪性腫瘍または良性腫瘍、免疫疾患、線維症（例えば、特発性肺線維症、腎線維症、腎線維症）、硬変（例えば、肝硬変）、強皮症または関連皮膚科疾患、緑内障または後嚢混濁（ＰＣＯ）などの眼の疾患、ＣＮＳ疾患、脱毛を予防および／または治療する方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
実施例
【図１】図１は、ヌクレオチド修飾の例を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３２３８．３）の核酸配列を示す。
【図３ａ】図３ａ）は、ヒトＡ１７２グリオーマ細胞のＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２の発現の阻害を表す。Ａ１７２細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図３ａ）は、ＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、ＡＳＰＨ０８、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０、ＡＳＰＨ１１、ＡＳＰＨ１２、ＡＳＰＨ１３、ＡＳＰＨ１４、ＡＳＰＨ１５、ＡＳＰＨ１６、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ１９、ＡＳＰＨ２０、ＡＳＰＨ２１、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２４、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ２９、ＡＳＰＨ３０、ＡＳＰＨ３１、ＡＳＰＨ３２、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３４、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ３８、ＡＳＰＨ３９、ＡＳＰＨ４０、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４３、ＡＳＰＨ４４、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ５０、ＡＳＰＨ５１、ＡＳＰＨ５２、ＡＳＰＨ５３、およびＡＳＰＨ５４修飾オリゴヌクレオチドに対する結果を表す。実験は、実施例１に記載されている。
【図３ｂ】図３ｂ）は、ヒトＡ１７２グリオーマ細胞のＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２の発現の阻害を表す。Ａ１７２細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図３ｂ）は、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ６０、ＡＳＰＨ６１、ＡＳＰＨ６２、ＡＳＰＨ６３、ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６８、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７０、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７２、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ７４、ＡＳＰＨ７５、ＡＳＰＨ７６、ＡＳＰＨ７７、ＡＳＰＨ７８、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８１、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８３、ＡＳＰＨ８４、ＡＳＰＨ８５、ＡＳＰＨ８６、ＡＳＰＨ８７、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９２、ＡＳＰＨ９３、ＡＳＰＨ９４、ＡＳＰＨ９５、ＡＳＰＨ９６、ＡＳＰＨ９７、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１００、ＡＳＰＨ１０１、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０３、ＡＳＰＨ１０４、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１０６、ＡＳＰＨ１０７、ＡＳＰＨ１０８、ＡＳＰＨ１０９、ＡＳＰＨ１１０、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１２、ＡＳＰＨ１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１６、ＡＳＰＨ１１７、ＡＳＰＨ１１８、およびＡＳＰＨ１１９修飾オリゴヌクレオチドに対する結果を表す。実験は、実施例１に記載されている。
【図３ｃ】図３ｃ）は、ヒトＡ１７２グリオーマ細胞のＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２の発現の阻害を表す。Ａ１７２細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図３ｃ）は、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ１２０、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１２２、ＡＳＰＨ１２３、ＡＳＰＨ１２４、ＡＳＰＨ１２５、ＡＳＰＨ１２６、ＡＳＰＨ１２７、ＡＳＰＨ１２８、ＡＳＰＨ１２９、ＡＳＰＨ１３０、ＡＳＰＨ１３１、ＡＳＰＨ１３２、ＡＳＰＨ１３３、ＡＳＰＨ１３４、ＡＳＰＨ１３５、ＡＳＰＨ１３６、ＡＳＰＨ１３７、ＡＳＰＨ１３８、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４０、ＡＳＰＨ１４１、ＡＳＰＨ１４２、ＡＳＰＨ１４３、ＡＳＰＨ１４５、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１４７、ＡＳＰＨ１４８、ＡＳＰＨ１４９、ＡＳＰＨ１５０、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５２、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１５４、ＡＳＰＨ１５５、ＡＳＰＨ１５７、ＡＳＰＨ１５８、ＡＳＰＨ１６０、ＡＳＰＨ１６１、ＡＳＰＨ１６２、ＡＳＰＨ１６３、ＡＳＰＨ１６４、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１６６、ＡＳＰＨ１６７、ＡＳＰＨ１６８、ＡＳＰＨ１６９、ＡＳＰＨ１７０、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７３、ＡＳＰＨ１７４、ＡＳＰＨ１７５、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７７、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１７９、ＡＳＰＨ１８０、ＡＳＰＨ１８１、ＡＳＰＨ１８２、およびＡＳＰＨ１８３修飾オリゴヌクレオチドに対する結果を表す。実験は、実施例１に記載されている。
【図４ａ】図４ａ）は、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図４ａ）は、ＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、ＡＳＰＨ０８、ＡＳＰＨ１２、ＡＳＰＨ１４、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２０、ＡＳＰＨ２１、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２４、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ２９、ＡＳＰＨ３０、ＡＳＰＨ３１、ＡＳＰＨ３２、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ３８、ＡＳＰＨ３９、ＡＳＰＨ４０、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４３、ＡＳＰＨ４４、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ５０、ＡＳＰＨ５１、およびＡＳＰＨ５２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例２に記載されている。
【図４ｂ】図４ｂ）は、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図４ｂ）は、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ６０、ＡＳＰＨ６１、ＡＳＰＨ６２、ＡＳＰＨ６３、ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６８、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７０、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７２、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ７４、ＡＳＰＨ７５、ＡＳＰＨ７６、ＡＳＰＨ７７、ＡＳＰＨ７８、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８１、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８３、ＡＳＰＨ８４、ＡＳＰＨ８５、ＡＳＰＨ８６、ＡＳＰＨ８７、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９２、ＡＳＰＨ９３、ＡＳＰＨ９４、ＡＳＰＨ９６、ＡＳＰＨ９７、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１００、ＡＳＰＨ１０１、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０３、ＡＳＰＨ１０４、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１０６、ＡＳＰＨ１０７、ＡＳＰＨ１０８、ＡＳＰＨ１０９、ＡＳＰＨ１１０、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１２、ＡＳＰＨ１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１６、ＡＳＰＨ１１７、ＡＳＰＨ１１８、およびＡＳＰＨ１１９修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例２に記載されている。
【図４ｃ】図４ｃ）は、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図４ｃ）は、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ１２０、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１２２、ＡＳＰＨ１２７、ＡＳＰＨ１２８、ＡＳＰＨ１２９、ＡＳＰＨ１３０、ＡＳＰＨ１３１、ＡＳＰＨ１３２、ＡＳＰＨ１３３、ＡＳＰＨ１３５、ＡＳＰＨ１３６、ＡＳＰＨ１３７、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４１、ＡＳＰＨ１４２、ＡＳＰＨ１４３、ＡＳＰＨ１４５、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１４７、ＡＳＰＨ１４９、ＡＳＰＨ１５０、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５２、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１５４、ＡＳＰＨ１５５、ＡＳＰＨ１５７、ＡＳＰＨ１６０、ＡＳＰＨ１６１、ＡＳＰＨ１６２、ＡＳＰＨ１６３、ＡＳＰＨ１６４、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１６６、ＡＳＰＨ１６７、ＡＳＰＨ１６８、ＡＳＰＨ１６９、ＡＳＰＨ１７０、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７３、ＡＳＰＨ１７４、ＡＳＰＨ１７５、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７７、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１７９、ＡＳＰＨ１８０、ＡＳＰＨ１８１、ＡＳＰＨ１８２、およびＡＳＰＨ１８３修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例２に記載されている。
【図５】図５は、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μＭの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理され、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、７２時間後測定された。図５は、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１９、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４０、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１８０、およびＡＳＰＨ１８３修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例４に記載されている。
【図６ａ】図６ａは、Ｐａｎｃ−１細胞のＴＧＦ−ベータ１（図６ａ）ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、ジムノティックデリバリー（つまり、トランスフェクション剤が存在しない）を通じて、１０μＭの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理され、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから４日後に測定された。図６ａ）は、ｍＲＮＡレベル（図７ａ）およびタンパク質レベル（図７ｂ）でのＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７およびＡＳＰＨ４８修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例５に記載されている。
【図６ｂ】図６ｂは、Ｐａｎｃ−１細胞のＴＦＧ−ベータ２（図６ｂ）ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、ジムノティックデリバリー（つまり、トランスフェクション剤が存在しない）を通じて、１０μＭの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理され、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから４日後に測定された。図６ｂ）は、ｍＲＮＡレベル（図７ａ）およびタンパク質レベル（図７ｂ）でのＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７およびＡＳＰＨ４８修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例５に記載されている。
【図７ａ】図７ａは、Ｐａｎｃ−１細胞のＴＧＦ−ベータ１（図７ａ）タンパク質の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、ジムノティックデリバリー（つまり、トランスフェクション剤が存在しない）を通じて、１０μＭの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理され、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）タンパク質の阻害は、トランスフェクション後４日で測定された。実験は、実施例５に記載されている。
【図７ｂ】図７ｂは、Ｐａｎｃ−１細胞のＴＧＦ−ベータ２（図７ｂ）タンパク質の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、ジムノティックデリバリー（つまり、トランスフェクション剤が存在しない）を通じて、１０μＭの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理され、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）タンパク質の阻害は、トランスフェクション後４日で測定された。実験は、実施例５に記載されている。
【図８ａ】図８ａは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現に対するＡＳＰＨ０５とＡＳＰＨ３６修飾オリゴヌクレオチドの用量依存効果を示す。Ｐａｎｃ−１細胞は、トランスフェクション剤の非存在下で、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭまたは０．６２５μＭのＡＳＰＨ０５（デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチド）またはＡＳＰＨ３６（選択的ＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチド）修飾オリゴヌクレオチドで４日間処理された。残りのＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡ（図８ａ）は、４日後に測定された。実験は、実施例６に記載されている。
【図８ｂ】図８ｂは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現に対するＡＳＰＨ０５とＡＳＰＨ３６修飾オリゴヌクレオチドの用量依存効果を示す。Ｐａｎｃ−１細胞は、トランスフェクション剤の非存在下で、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭまたは０．６２５μＭのＡＳＰＨ０５（デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチド）またはＡＳＰＨ３６（選択的ＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチド）修飾オリゴヌクレオチドで４日間処理された。残りのＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ（図８ｂ）は、４日後に測定された。実験は、実施例６に記載されている。
【図９】図９は、マウスＳＭＡ−５６０グリオーマ細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現の阻害を表す。ＳＭＡ−５６０細胞は、１０ｎＭ用量（トランスフェクション剤の存在下で）でＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、またはＡＳＰＨ４８でトランスフェクトされた。ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）ｍＲＮＡの阻害は、トランスフェクションから２４時間後に決定された。実験は、実施例７に記載されている。
【図１０】図１０は、雌の無胸腺ヌードマウスを５日間連続、皮下注射により１４ｍｇ／ｋｇ体重の条件でＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、またはＡＳＰＨ４８で処置したインビボデータを表す。処置後２４時間、マウスを屠殺し、マウスＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡは、腎臓組織溶解物中で定量した。ＴＧＦ−ベータ２のＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対する割合を表すデータは、中央値と最小および最大とを表すボックスプロットで示されている（ＡＳＰＨ４６群ｎ＝３を除いて、データはｎ＝４で表されている）。実験は、実施例８に記載されている。
【図１１】図１１は、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＴＧＦ−ベータ３のｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、任意のトランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクション）の非存在下で、１０μΜの用量のＡＳＰＨ０９で処理し、ＴＧＦ−ベータ３のｍＲＮＡ発現の阻害は、４日後に測定された。ＡＳＰＨ０９は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２（図６ａおよび図６ｂ）と同様に、ＴＧＦ−ベータ３の発現を阻害する汎特異的オリゴヌクレオチドである。実験は、実施例９に記載されている。
【図１２】図１２は、ヒトＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００６６０．４）の核酸塩基配列を表す。
【図１３】図１３は、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞（トランスフェクション剤の存在下で）１０ｎＭの用量において異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定した。図１３は、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００３、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、およびＡＳＰＨ１０６１修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例１２に記載されている。
【図１４】図１４は、マウスＳＭＡ−５６０神経膠腫細胞におけるＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。細胞は、１０ｎＭの用量において異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし（トランスフェクション剤の存在下で）、ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図１４は、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００３、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３７、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、およびＡＳＰＨ１０６２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例１３に記載されている。
【図１５】図１５は、ヒトＡ１７２細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２のｍＲＮＡの発現の阻害を表す。細胞は、１０ｎＭの用量において異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし（トランスフェクション剤の存在下で）ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２のｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図１５は、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、およびＡＳＰＨ１０６２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例１４に記載されている。
【図１６】図１６は、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２のｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、任意のトランスフェクション試薬（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μΜの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理し、ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）の阻害およびＴＧＦ−ベータ２（白カラム）のｍＲＮＡ発現は、７２時間後に測定された。図１６は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３７、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、ＡＳＰＨ１０６２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例１５に記載されている。
【図１７】図１７は、ヒトＡ１７２細胞におけるＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３のｍＲＮＡの発現の阻害を表す。細胞は、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）の用量で異なる修正オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、およびＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。図１７は、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６３、ＡＳＰＨ１０６４、ＡＳＰＨ１０６５、ＡＳＰＨ１０６６、ＡＳＰＨ１０６７、ＡＳＰＨ１０６８、ＡＳＰＨ１０６９、ＡＳＰＨ１０７０、ＡＳＰＨ１０７１、ＡＳＰＨ１０７２、ＡＳＰＨ１０７３、ＡＳＰＨ１０７４、ＡＳＰＨ１０７５、ＡＳＰＨ１０７６、ＡＳＰＨ１０７７、ＡＳＰＨ１０７８、ＡＳＰＨ１０７９、ＡＳＰＨ１０８０、ＡＳＰＨ１０８１、ＡＳＰＨ１０８２、ＡＳＰＨ１０８３、ＡＳＰＨ１０８４、ＡＳＰＨ１０８５、ＡＳＰＨ１０８６、ＡＳＰＨ１０８７、ＡＳＰＨ１０８８、ＡＳＰＨ１０８９、ＡＳＰＨ１０９０、ＡＳＰＨ１０９１、ＡＳＰＨ１０９２、ＡＳＰＨ１０９３、ＡＳＰＨ１０９４、ＡＳＰＨ１０９５、ＡＳＰＨ１０９７、ＡＳＰＨ１０９８、ＡＳＰＨ１０９９、ＡＳＰＨ１１００、ＡＳＰＨ１１０１、ＡＳＰＨ１１０２、ＡＳＰＨ１１０３、ＡＳＰＨ１１０４、ＡＳＰＨ１１０５、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１０７、ＡＳＰＨ１１０８、ＡＳＰＨ１１０９、ＡＳＰＨ１１１０、ＡＳＰＨ１１１１、ＡＳＰＨ１１１２、ＡＳＰＨ１１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１１５、ＡＳＰＨ１１１６、ＡＳＰＨ１１１７、ＡＳＰＨ１１１８、ＡＳＰＨ１１１９、ＡＳＰＨ１１２０、ＡＳＰＨ１１２１、ＡＳＰＨ１１２２、ＡＳＰＨ１１２３、ＡＳＰＨ１１２４、ＡＳＰＨ１１２５、ＡＳＰＨ１１２６、ＡＳＰＨ１１２７、ＡＳＰＨ１１２８、ＡＳＰＨ１１２９、ＡＳＰＨ１１３０、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。実験は、実施例１６に記載されている。
【図１８ａ】図１８ａは、ヒトＰａｎｃ−１およびＲｅｎＣａ細胞において、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。細胞は、任意のトランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μΜの投与用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクションから７２時間後に測定された。図１８ａは、ＡＳＰＨ１０６３、ＡＳＰＨ１０６４、ＡＳＰＨ１０６５、ＡＳＰＨ１０６６、ＡＳＰＨ１０６７、ＡＳＰＨ１０６８、ＡＳＰＨ１０６９、ＡＳＰＨ１０７０、ＡＳＰＨ１０７１、ＡＳＰＨ１０７２、ＡＳＰＨ１０７３、ＡＳＰＨ１０７４、ＡＳＰＨ１０７５、ＡＳＰＨ１０７６、ＡＳＰＨ１０７７、ＡＳＰＨ１０７８、ＡＳＰＨ１０７９、ＡＳＰＨ１０８０、ＡＳＰＨ１０８１、ＡＳＰＨ１０８２、ＡＳＰＨ１０８３、ＡＳＰＨ１０８４、ＡＳＰＨ１０８５、ＡＳＰＨ１０８６、ＡＳＰＨ１０８７、ＡＳＰＨ１０８８、ＡＳＰＨ１０８９、ＡＳＰＨ１０９０、ＡＳＰＨ１０９１、ＡＳＰＨ１０９２、ＡＳＰＨ１０９３、ＡＳＰＨ１０９４、ＡＳＰＨ１０９５、ＡＳＰＨ１０９７、ＡＳＰＨ１０９８、ＡＳＰＨ１０９９、ＡＳＰＨ１１００、ＡＳＰＨ１１０１、ＡＳＰＨ１１０２、ＡＳＰＨ１１０３、ＡＳＰＨ１１０４、ＡＳＰＨ１１０５、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１０７、ＡＳＰＨ１１０８、ＡＳＰＨ１１０９、ＡＳＰＨ１１１０、ＡＳＰＨ１１１１、ＡＳＰＨ１１１２、ＡＳＰＨ１１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１１５、ＡＳＰＨ１１１６、ＡＳＰＨ１１１７、ＡＳＰＨ１１１８、ＡＳＰＨ１１１９、ＡＳＰＨ１１２０、ＡＳＰＨ１１２１、ＡＳＰＨ１１２２、ＡＳＰＨ１１２３、ＡＳＰＨ１１２４、ＡＳＰＨ１１２５、ＡＳＰＨ１１２６、ＡＳＰＨ１１２７、ＡＳＰＨ１１２８、ＡＳＰＨ１１２９、ＡＳＰＨ１１３０、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。
【図１８ｂ】図１８ｂは、ＲｅｎＣａ細胞におけるこれらのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示す。
【図１９】図１９は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡのヒト配列を備えるＡＳＰＨ１０２４およびＡＳＰＨ１０９６の配列アラインメントを表す。両方のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１のヒト配列に対して１００％相同する。ＡＳＰＨ１０２４は、ＴＧＦ−ベータ２のヒト配列を有する３つのミスマッチ（図１９ａ）およびＴＧＦ−ベータ３のヒト配列を有する２つのミスマッチ（図１９ｂ）がある。ＡＳＰＨ１０９６は、ＴＧＦ−ベータ２のヒト配列を持つ１つのミスマッチ（図１９ａ）およびＴＧＦ−ベータ３のヒト配列を持つ１つのミスマッチ（図１９ｂ）がある。両方のオリゴヌクレオチドは、異なるヒトＴＧＦ−ベータイソ型（ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３）の阻害を示す。例えばＡＳＰＨ１０２４は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２の発現および活性を阻害し（図１６参照）、ＡＳＰＨ１０９６は、例えば図１７に示すようにＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３の発現および活性を阻害する。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦベータ３のヒト配列に１００％相同であるＡＳＰＨ００９を対照として使用した。
【図２０】図２０は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡのヒト配列を備えるＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２のアラインメントを表す。両方のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３のヒト配列に対して１００％相同する。ＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２のそれぞれは、ＴＧＦ−ベータ２のヒト配列を持つ１つのミスマッチがある。両方のオリゴヌクレオチドは、例えば図１７に示すようにすべての３つのヒトイソ型の発現を強く阻害する。
【図２１】図２１は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡのマウス配列を備えるＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２のアラインメントを表す。両方のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３のマウス配列に対して１００％相同する。ＡＳＰＨ１１３１およびＡＳＰＨ１１３２のそれぞれは、ＴＧＦ−ベータ２のマウス配列に対して２つのミスマッチがある。ＡＳＰＨ１１３１は、マウスＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３を強力に阻害するが、ＡＳＰＨ１１３２は、例えば図１８ｂに示すように、すべてのマウスのＴＧＦ−ベータイソ型を非常に強力に抑制する。
【図２２】図２２は、皮下ヒト膵臓癌Ｐａｎｃ−１を有するマウスの腎臓におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現を表す。マウスは、５日間指示された処理日程後に１０、３、１および３０ｍｇ／ｋｇのＡＳＰＨ４７で処理された：ＱｌＤｘｌ−ｄ６（１回ＳＣ注射、終了５日後）、ＱｌＤｘ５−ｄ６（５日間毎日ＳＣ注射、終了２４時間後）、およびＱｌＤｘ５−ｄ１０（５日間毎日ＳＣ注射、終了５日後）。ＴＧＦ−ベータ２発現は、ｂＤＮＡアッセイによって検出され、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の割合を表すデータはボックスプロットで表され、そこでは中央値並びに最小値および最大値が表されている（ビヒクルおよび３ｍｇ／ｋｇＱｌＤｘｌ  ｄ６群についてｎ＝９であるが、それ以外はデータはｎ＝１０で表されている）。
【図２３】図２３は、ヒト膵臓癌Ｐａｎｃ−１腫瘍を有するマウスの腎臓におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現を表す。示された処置用量で５日間連続して様々なオリゴヌクレオチドの皮下注射１でマウスを処理した：１，５、１５、または５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの毎日の注射を５日間連続。ＴＧＦ−ベータ２発現は、ｂＤＮＡアッセイによって分析され、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の割合を表すデータはボックスプロットで表され、そこでは中央値並びに最小値および最大値が表されている（データはｎ＝５で表されている）。
【図２４】図２４は、皮下ヒト腎細胞癌７８６−Ｏ腫瘍におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現を表す。マウスは、５日間連続で５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの毎日の注射で処理した。ＴＧＦ−ベータ２およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現は、ｂＤＮＡアッセイによって検出され、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の割合を表すデータはボックスプロットで表され、そこでは中央値並びに最小値および最大値が表されている（ＡＳＰＨ７１群ｎ＝９であるが、それ以外はデータはｎ＝１０で表されている）。
【図２５】図２５は、ヒトＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３２３９．２）の核酸配列を示す。
【図２６ａ】図２６ａは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ４７（図２６ａ）の２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜでトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２６ｂ】図２６ｂは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ１０４７（図２６ｂ）の２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜでトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２６ｃ】図２６ｃは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ１１０６（図２６ｃ）の２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜでトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２６ｄ】図２６ｄは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ１１３２（図２６ｄ）の２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜでトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２６ｅ】図２６ａは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ｐａｎｃ−１細胞は、修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ１０４７（図２６ｅ）と組み合わせたＡＳＰＨ４７の２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜでトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２６ｆ】図２６ｆは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。陰性対照は、４０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６、０．０５、または０．０２μΜの濃度のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５（図２６ｆ）のスクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｃｒＬＮＡ）である。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（ダイヤモンド）およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質（四角）レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図２７ａ】図２７ａは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３の発現に対する本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示す。Ｐａｎｃ−１細胞（図２７ａ）は、トランスフェクション剤の非存在下で、３．３μΜの異なるＴＧＦ−ベータ特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから７２時間後に測定された。
【図２７ｂ】図２７ｂは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３の発現に対する本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を示す。ＲｅｎＣａ細胞（図２７ｂ）は、トランスフェクション剤の非存在下で、３．３μΜの異なるＴＧＦ−ベータ特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから７２時間後に測定された。
【図２８】図２８は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３の発現に対する本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。Ａ１７２神経膠腫細胞は、トランスフェクション剤の存在下で、１０ｎΜの異なるＴＧＦ−ベータ特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから２４時間後に測定された。
【図２９ａ】図２９ａは、時間依存性プラズマ（２９ａ）の分析の比較を表す。
【図２９ｂ】図２９ｂは、ＡＳＰＨ＿００４７の５０ｍｇ／ＫｇをＢａｌｂ／ｃマウスに１回皮下ボーラス投与した後、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ（ＰＤプロファイル）の腎臓（２９ｂ）濃度（ＰＫプロファイル；μｇ／ｍＬまたはμｇ／ｇｒで表記された値とともに）および腎臓におけるダウンレギュレーションの比較を表す。
【図３０】図３０は、ＡＳＰＨ＿００４７または対照オリゴヌクレオチドの繰り返し皮下投与後の免疫不全マウスの腎臓における形成した皮下腫瘍（図３０Ａ−Ｄ）または腎臓（図３０Ｅ−Ｆ）のＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡダウンレギュレーションを示す。ＴＧＦ−ベータ２およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現は、ｂＤＮＡにより検出した。結果は、ＴＧＦ−ベータ２／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの割合として表され、そして個々の試験された試料は、中央値を示す線で表されている。
【図３１】図３１は、同所および静脈内マウスＲｅｎｃａ腎臓癌腫モデルにおけるＢａｌｂ／ｃマウスをＡＳＰＨ＿００４７（選択的ＴＧＦ−ｂ２アンチテーゼオリゴヌクレオチド）で全身処置した肺転移への影響を表す。肺転移のレベルは、転移の数または肺重量に基づいて決定された。結果は、ボックスプロットで示され、そこでは中央値、上四分位点および下四分位点、第９０番および第１０番百分位点が示されている。
【図３２】図３２は、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μΜの示されたオリゴヌクレオチドで処理されたヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を表す。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから７２時間後に決定された。
【図３３】図３３は、同所性マウス４Ｔ１乳癌モデルにおけるＡＳＰＨ＿００４７でＢａｌｂ／ｃマウスを全身処理の肺転移に対する効果を表す。個々の動物のデータは、太字黒線で示された中央値とともに示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＴＧＦ−ベータｍＲＮＡとの相互作用に適したオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１によるＴＧＦ−ベータ２核酸、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３５によるＴＧＦ−ベータ１核酸、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３６によるＴＧＦ−ベータ３核酸の核酸配列の１０から２０、より好ましくは１２から１８のヌクレオチドを含む、または、からなる。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のヌクレオチドを含む、または、からなる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１の核酸ｎｏ．１３８０から１５１０（好ましくはｎｏ．１３８０から１４５０および／またはｎｏ．１４８０から１５１０）、１６６０から１６８０、または２３９０から２４１０の領域から選択される。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマーまたはスピエゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含む一または二重らせんＲＮＡまたはＤＮＡである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックを形成し、例えば、核酸塩基（窒素塩基、例えば、プリンまたはピリミジン）、５炭糖（例えば、リボース、２−デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトース（ａｌｔｏｒｓｅ）、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、またはそれらの糖の安定化された修飾）、および１つ以上のリン酸基から構成されている。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。ヌクレオチドの各化合物は修飾可能で、当該化合物は天然存在するものでも、または天然に存在しないものでもよい。後者は、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ２５，  ４４２９−４４４３）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （２０００，  ３  （２）：  ２９３−２１３））に記載されているような、図１に示された、例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ａ２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ポリアルキレンオキシド（例えば、トリエチレングリコール（ＴＥＧ））、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。
【００３２】
ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、リボース部分は、２’酸素と４’炭素（２’−４’リボヌクレオシド）と接続する余分な架橋で修飾されている。架橋は、Ａ型二重鎖でよく見られる３’−エンド（北）立体配置中のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオシドおよびヌクレオチドは、それぞれ、例えば、アルファ−Ｄ−またはベータ−Ｌ−立体配置のチオ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、またはアミノ−ＬＮＡの形態を含み、オリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混和され得、且つ組み合わされ得る。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、好ましくは、ＬＮＡおよび／またはＥＮＡを含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳ、および３’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳを含む。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’−末端または３’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳ、および３’−末端または５’−末端にＴＥＧのようなポリアルキレンオキシドを含む。修飾オリゴヌクレオチドは、それぞれ、悪性または良性腫瘍、線維症（例えば、特発性肺線維症、腎線維症、腎線維症）、硬変（例えば、肝硬変）、強皮症または関連皮膚科疾患、緑内障や後嚢混濁（ＰＣＯ）などの眼の疾患、ＣＮＳ疾患の脱毛等の改善された予防および／または治療につながるＴＧＦ−ベータの発現および活性に対して有意に増加した阻害を示す。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ、好ましくはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ３、代替的にＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡ（つまり、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡ）、またはＴＧＦ−ベータ系に直接または間接的に影響を与える任意の他のものとのハイブリダイゼーションのいずれかによる疾患とリンクしたＴＧＦ−ベータを対象とする。
【００３４】
好ましくは、２以上オリゴヌクレオチドが組み合わされ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害する。
【００３５】
他の実施形態において、１つのオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３のような２つのＴＧＦ−ベータイソ型を阻害する。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、およびＴＧＦ−ベータ３のすべての３つのイソ型の発現を阻害するオリゴヌクレオチドは、汎特異的オリゴヌクレオチドとして規定される。
【００３６】
さらなる実施形態において、３つ以上のオリゴヌクレオチドが組み合わされ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、他のオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、さらにオリゴヌクレオチドは、特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、且つ選択的に１以上の追加のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ３を阻害する。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、０．１から２０μΜの範囲、好ましくは０．２から１５μΜの範囲、より好ましくは０．４から１０μΜの範囲、さらにより好ましくは０．５から５μΜの範囲のＩＣ５０を有する。
【００３８】
本発明は、活性成分として本発明によるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に言及する。医薬組成物は、少なくとも１つの本発明のオリゴヌクレオチド、および任意にさらなるアンチセンス化合物、抗体、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および／または免疫調節化合物を含む。薬学的に許容される結合剤およびアジュバントまたは担体は、必要に応じて、医薬組成物の一部を含む。
【００３９】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、それぞれ、例えば、カプセル剤、錠剤および丸剤等の形態で投与ユニットとして処方され、それぞれ、以下の化合物を含有する。
結合剤としての微結晶性セルロース、ガムまたはゼラチン
賦形剤としてのデンプンまたはラクトース
潤滑剤、種々の甘味剤または香味剤としてのステアリン酸塩
カプセル剤のための投薬ユニットは、脂肪油などの液体担体を含有し得る。同様に、糖または腸溶性剤のコーティングは、投与ユニットの一部であり得る。
【００４０】
オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、異なる経路を介して投与可能である。これらの投与経路は、限定されないが、エレクトロポレーション、表皮、皮膚への圧痕、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼内、髄腔内、房内、腹腔内、前立腺内、肺内、脊髄内、気管内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、体の空洞内に配置、鼻吸入、経口、肺吸入（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入によるもので、ネブライザーによるものを含む）、皮下、真皮下、局所（眼を含み、膣および直腸送達を含む粘膜へ）、または経皮を含む。
【００４１】
非経口、皮下、皮内または局所投与のために、オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば、滅菌希釈剤、緩衝剤、毒性および抗菌の調節剤を含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、制御された放出特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む、体からの分解または即時排除に対して保護する担体で調製される。静脈内投与のために好適な担体は、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。経口投与のためのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水系懸濁駅または水溶液または非水性媒体、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤またはミニ錠剤を含む。例えば非経口、髄腔内、房内または脳室内投与を含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば必要に応じて緩衝液、希釈剤、および／または浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの他の適切な添加剤を含む滅菌水溶液を含有する。
【００４２】
核酸および所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせた場合、薬学的に許容される担体は、例えば、液体または固体であり、且つ所望のバルク、堅さ（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）等を提供するように、投与の計画された方法を考慮して選択される。典型的な薬学的に許容される担体としては、限定されないが、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、フィラー（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）を含む。経口投与剤形のための徐放性経口送達系および／または腸溶コーティングは、米国特許第４７０４２９５号明細書、同第４５５６５５２号明細書、同第４３０９４０６号明細書、および同第４３０９４０４号明細書に記載されている。アジュバントはこれらの表現の下に含まれる。
【００４３】
ヒト疾患の予防および/または治療の方法において使用される他に、本発明のオリゴヌクレオチドおよび/または医薬組成物は、獣医学的動物、爬虫類、鳥類、エキゾチックアニマルおよび哺乳類、げっ歯類等の家畜を含む他の対象を予防および／または治療するための方法においても使用される。哺乳類は、例えば、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、または霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはキツネザル）が含まれる。げっ歯類には、例えば、ラット、ウサギ、マウス、リス、またはモルモットが含まれる。
【００４４】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、多くの異なる疾患、好ましくは良性または悪性腫瘍、免疫疾患、気管支喘息、心臓病、線維症（例えば、肝線維症、特発性肺線維症、肝硬変、腎性肝硬変、強皮症）、糖尿病、創傷治癒、結合組織の疾患（例えば、心臓、血管、骨、関節、マルファンやロイエス・ディーツ症候群のような眼内）、乾癬、眼の疾患（例えば、緑内障、二次白内障として知られている後嚢混濁（ＰＣＯ）、ＣＮＳ疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、冠動脈アテローム性動脈硬化症（冠動脈インターベンションまたは冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術や脱毛を予防および／または治療するための方法において使用される。腫瘍は、例えば、固形腫瘍、血液腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、未分化星状細胞腫などの星状細胞腫、聴神経腫瘍、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、血管芽腫（ｈｅｍａｎｇｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ホジキンリンパ腫、髄芽細胞腫（ｍｅｄｕｌｌａｂｌａｓｔｏｍａ）、白血病、一次および／または転移性メラノーマのようなメラノーマ、中皮腫、骨髄腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、脈絡膜癌、嚢胞腺癌（ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍｅ）、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頚癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ、例えば、明細胞ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、色素嫌性ＲＣＣ）、腎臓癌好酸性顆粒細胞腫、移行細胞腎臓癌、網膜芽腫、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌の群から選択される。本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、腫瘍を予防および／または治療するための方法において使用されるだけでなく、同転移にも同様に使用される。
【００４５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが予想外に低い毒性を示すことを特徴とし（例えば、表５を参照）、それ故、異なる生物において十分許容される。それらのオリゴヌクレオチドは、生物において、適切な分配を示し、最高濃度が、腎臓、肝臓、皮膚、および脾臓において測定される。
【００４６】
本発明は、オリゴヌクレオチドの配列の特異的選択およびヌクレオチドの修飾により、各ＴＧＦ−ベータ、特にＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３の発現を減少および阻害するのに高効率な多くのオリゴヌクレオチドを提供する。以下の表１は、本発明（太字は、修飾ヌクレオシドを示す）による多数の好適な修飾オリゴヌクレオチドを示す。各オリゴヌクレオチドはＡＳＰＨとヌクレオシドの特定の配列および修飾によって規定された番号で次のように規定されている。
【００４７】
【表１−１】
0006492053.tif 000002
【００４８】
【表１−２】
0006492053.tif 000003
【００４９】
【表１−３】
0006492053.tif 000004
【００５０】
【表１−４】
0006492053.tif 000005
【００５１】
【表１−５】
0006492053.tif 000006
【００５２】
【表１−６】
0006492053.tif 000007
【００５３】
【表１−７】
0006492053.tif 000008
【００５４】
【表１−８】
0006492053.tif 000009
【００５５】
【表１−９】
0006492053.tif 000010
【００５６】
【表１−１０】
0006492053.tif 000011
【００５７】
表１は、ヌクレオチドの修飾と同様に本発明の選択されたオリゴヌクレオチドの核酸配列を表し、ＬＮＡ４＋４は、オリゴヌクレオチドの５’−および３’−末端に４ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ４＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に４ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋４は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に４ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋２は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に２ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ２＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に２ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端で３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ２＋２は、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に２ｘＬＮＡが修飾されたことを意味する。あるいは、いくつかのオリゴヌクレオチドは、ＥＮＡ４＋４、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に４ｘＥＮＡが修飾されたもの、または、ＥＮＡ３＋３、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に３ｘＥＮＡが修飾されたものを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル４＋４であって、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に４ｘ２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むもの、または、２’フルオロ４＋４であって、５’−末端および３’−末端に４ｘ２’フルオロ修飾ヌクレオチドを含むもの、を含む。ＬＮＡ３＋ＴＥＧを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に１つのトリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかのオリゴヌクレオチドは、一列には配置されていないが、例えば、３ＬＮＡ＋９Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、２ＬＮＡ＋８Ｎ＋２ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、２ＬＮＡ＋９Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、２ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋２Ｎ＋１ＬＮＡ、３ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、３ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、２ＬＮＡ＋９Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、または２ＬＮＡ＋８Ｎ＋２ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ配列を有する未ロックヌクレオシドによって分けられたＬＮＡを含み、ここで「Ｎ」は、ロックされた修飾のないヌクレオシドである。数字と組み合わされた「ＡＳＰＨ」は、表１に記載されているように異なるオリゴヌクレオチドおよびそれらの異なる修飾を表す。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、例えば以下の実施例に示す実験において試験された。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、同じオリゴヌクレオチドを表すＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ００４７、ＡＳＰＨ＿４７またはＡＳＰＨ＿００４７のように異なって記述され得る。
【００５８】
明確且つ簡潔な説明の目的のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書中に記載されているが、本発明の範囲は、記載した特徴の全部または一部の組合せを有する実施形態を含み得ると理解される。
【００５９】
しかしながら、以下の実施例は、同時に、そのいずれの限定を構成することなく本発明をさらに描くために仕えうる。対照的に、本発明の範囲は、本明細書を読んだ後、本発明の真意から逸脱することなく当業者にそれらが提案され得るような様々な他の実施形態、改変例、およびそれらの同等物に言及していることは明確に理解される。
【００６０】
実施例
以下の実施例において、表１で挙げられたオリゴヌクレオチドの影響は、それぞれＴＧＦ−ベータ１および／またはＴＧＦ−ベータ２発現の減少および阻害の観点から試験されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４（Ｔ−ＬＮＡ：ＣＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡ、５’−末端および３’−末端の３ｘヌクレオチドはＬＮＡである）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５（ｓｃｒ−ＬＮＡ：ＣＧＴＴＴＡＧＧＣＴＡＴＧＴＡＣＴＴ、５’−末端および３’−末端の３ｘヌクレオチドはＬＮＡのある）が対照オリゴヌクレオチドとして使用され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５（陰性対照）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４（陽性対照）のスクランブル形式である。細胞は、トランスフェクション剤（例えば、リポフェクタミン）の存在下、または任意のトランスフェクション剤の非存在下（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドランスフェクションまたはジムノティックデリバリーとして規定される）のいずれかでトランスフェクションされる。ジムノティックデリバリーの場合、細胞へのオリゴヌクレオチドのエントリーがオリゴヌクレオチドおよび細胞との相互作用にもっぱら依存する（化合物／薬品はエントリーをサポートせず）。それ故、ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリーは、インビボでの設定のより良い条件を反映していると考えられる。
【００６１】
実施例１
トランスフェクション剤の存在下で、ヒトＡ１７２神経膠腫細胞をそれぞれ、１０ｎＭのＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、ＡＳＰＨ０８、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０、ＡＳＰＨ１１、ＡＳＰＨ１２、ＡＳＰＨ１３、ＡＳＰＨ１４、ＡＳＰＨ１５、ＡＳＰＨ１６、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ１９、ＡＳＰＨ２０、ＡＳＰＨ２１、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２４、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ２９、ＡＳＰＨ３０、ＡＳＰＨ３１、ＡＳＰＨ３２、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３４、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ３８、ＡＳＰＨ３９、ＡＳＰＨ４０、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４３、ＡＳＰＨ４４、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ５０、ＡＳＰＨ５１、ＡＳＰＨ５２、ＡＳＰＨ５３、およびＡＳＰＨ５４（図３ａを参照）；ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ６０、ＡＳＰＨ６１、ＡＳＰＨ６２、ＡＳＰＨ６３、ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６８、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７０、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７２、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ７４、ＡＳＰＨ７５、ＡＳＰＨ７６、ＡＳＰＨ７７、ＡＳＰＨ７８、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８１、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８３、ＡＳＰＨ８４、ＡＳＰＨ８５、ＡＳＰＨ８６、ＡＳＰＨ８７、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９２、ＡＳＰＨ９３、ＡＳＰＨ９４、ＡＳＰＨ９５、ＡＳＰＨ９６、ＡＳＰＨ９７、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１００、ＡＳＰＨ１０１、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０３、ＡＳＰＨ１０４、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１０６、ＡＳＰＨ１０７、ＡＳＰＨ１０８、ＡＳＰＨ１０９、ＡＳＰＨ１１０、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１２、ＡＳＰＨ１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１６、ＡＳＰＨ１１７、ＡＳＰＨ１１８、およびＡＳＰＨ１１９（図３ｂを参照）、またはＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ１２０、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１２２、ＡＳＰＨ１２３、ＡＳＰＨ１２４、ＡＳＰＨ１２５、ＡＳＰＨ１２６、ＡＳＰＨ１２７、ＡＳＰＨ１２８、ＡＳＰＨ１２９、ＡＳＰＨ１３０、ＡＳＰＨ１３１、ＡＳＰＨ１３２、ＡＳＰＨ１３３、ＡＳＰＨ１３４、ＡＳＰＨ１３５、ＡＳＰＨ１３６、ＡＳＰＨ１３７、ＡＳＰＨ１３８、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４０、ＡＳＰＨ１４１、ＡＳＰＨ１４２、ＡＳＰＨ１４３、ＡＳＰＨ１４５、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１４７、ＡＳＰＨ１４８、ＡＳＰＨ１４９、ＡＳＰＨ１５０、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５２、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１５４、ＡＳＰＨ１５５、ＡＳＰＨ１５７、ＡＳＰＨ１５８、ＡＳＰＨ１６０、ＡＳＰＨ１６１、ＡＳＰＨ１６２、ＡＳＰＨ１６３、ＡＳＰＨ１６４、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１６６、ＡＳＰＨ１６７、ＡＳＰＨ１６８、ＡＳＰＨ１６９、ＡＳＰＨ１７０、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７３、ＡＳＰＨ１７４、ＡＳＰＨ１７５、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７７、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１７９、ＡＳＰＨ１８０、ＡＳＰＨ１８１、ＡＳＰＨ１８２、およびＡＳＰＨ１８３（図３ｃを参照）、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照でトランスフェクトした。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから２４時間後に決定された。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図３ａ）から図３ｃ）に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチドがＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現を有意に阻害するのに対し、デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０ｌ、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、ＡＳＰＨ０８およびＡＳＰＨ０９は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの両方の発現の有意な減少を示す。
【００６２】
実施例２
トランスフェクション剤の存在下で、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞をそれぞれ、１０ｎＭのＡＳＰＨ０ｌ、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、ＡＳＰＨ０８、ＡＳＰＨ１２、ＡＳＰＨ１４、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２０、ＡＳＰＨ２１、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２４、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ２９、ＡＳＰＨ３０、ＡＳＰＨ３１、ＡＳＰＨ３２、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ３８、ＡＳＰＨ３９、ＡＳＰＨ４０、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４３、ＡＳＰＨ４４、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ５０、ＡＳＰＨ５１、およびＡＳＰＨ５２（図４ａを参照）、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ６０、ＡＳＰＨ６１、ＡＳＰＨ６２、ＡＳＰＨ６３、ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６８、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７０、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７２、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ７４、ＡＳＰＨ７５、ＡＳＰＨ７６、ＡＳＰＨ７７、ＡＳＰＨ７８、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８１、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８３、ＡＳＰＨ８４、ＡＳＰＨ８５、ＡＳＰＨ８６、ＡＳＰＨ８７、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９２、ＡＳＰＨ９３、ＡＳＰＨ９４、ＡＳＰＨ９６、ＡＳＰＨ９７、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１００、ＡＳＰＨ１０１、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０３、ＡＳＰＨ１０４、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１０６、ＡＳＰＨ１０７、ＡＳＰＨ１０８、ＡＳＰＨ１０９、ＡＳＰＨ１１０、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１２、ＡＳＰＨ１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１６、ＡＳＰＨ１１７、ＡＳＰＨ１１８、およびＡＳＰＨ１１９（図４ｂを参照）、またはＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７３、ＡＳＰＨ１２０、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１２２、ＡＳＰＨ１２７、ＡＳＰＨ１２８、ＡＳＰＨ１２９、ＡＳＰＨ１３０、ＡＳＰＨ１３１、ＡＳＰＨ１３２、ＡＳＰＨ１３３、ＡＳＰＨ１３５、ＡＳＰＨ１３６、ＡＳＰＨ１３７、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４１、ＡＳＰＨ１４２、ＡＳＰＨ１４３、ＡＳＰＨ１４５、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１４７、ＡＳＰＨ１４９、ＡＳＰＨ１５０、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５２、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１５４、ＡＳＰＨ１５５、ＡＳＰＨ１５７、ＡＳＰＨ１６０、ＡＳＰＨ１６１、ＡＳＰＨ１６２、ＡＳＰＨ１６３、ＡＳＰＨ１６４、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１６６、ＡＳＰＨ１６７、ＡＳＰＨ１６８、ＡＳＰＨ１６９、ＡＳＰＨ１７０、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７３、ＡＳＰＨ１７４、ＡＳＰＨ１７５、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７７、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１７９、ＡＳＰＨ１８０、ＡＳＰＨ１８１、ＡＳＰＨ１８２、およびＡＳＰＨ１８３（図４ｃを参照）、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照でトランスフェクトした。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから２４時間後に決定された。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の有��な減少を図４ａ）から図４ｃ）に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ２オリゴヌクレオチドがＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現を有意に阻害するのに対し、デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０ｌ、ＡＳＰＨ０２、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０４、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０６、ＡＳＰＨ０７、およびＡＳＰＨ０８Ａは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの両方の発現の有意な減少を示す。
【００６３】
実施例３
さらなる実験において、ＡＳＰＨ０ｌ、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ２７、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ６４、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１４０、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１８１、ＡＳＰＨ１８４、ＡＳＰＨ１８５、ＡＳＰＨ１８６、ＡＳＰＨ１８７、ＡＳＰＨ１８８、ＡＳＰＨ１８９、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照の阻害効果を、それぞれ、ヒトＡ１７２膠腫において試験した。トランスフェクション剤の存在下で、Ａ１７２細胞を、それぞれ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０４ｎＭの用量でこれらの修飾オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。残りのＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡは、トランスフェクションから２４時間後に測定された。ＴＧＦ−ベータ２の値は、ＧＡＰＤＨに対して標準化され、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの５０％の減少（＝ＩＣ５０値）をもたらすオリゴヌクレオチド濃度が算出された。すべてのＩＣ５０値は、ＡＳＰＨ＿０３６（ＡＳＰＨ０３６）のＩＣ５０値が０．３３ｎＭであることを参照し、結果は、表２にＡＳＰＨ＿０３６のＩＣ５０値の何倍差として示されている。
【００６４】
【表２−１】
0006492053.tif 000012
【００６５】
【表２−２】
0006492053.tif 000013
【００６６】
すべての修飾オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４の陽性対照オリゴヌクレオチドのＩＣ５０よりも著しく低いナノモルからピコモル範囲のＩＣ５０を示す。；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の陰性対照のＩＣ５０は、計算できなかった。
【００６７】
実施例４
トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、３．３μＭの各ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２５、ＡＳＰＨ３３、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ４８、ＡＳＰＨ４９、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６６、ＡＳＰＨ６７、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ７９、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ８８、ＡＳＰＨ８９、ＡＳＰＨ９０、ＡＳＰＨ９１、ＡＳＰＨ９８、ＡＳＰＨ９９、ＡＳＰＨ１０２、ＡＳＰＨ１０５、ＡＳＰＨ１１１、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１１９、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１３９、ＡＳＰＨ１４０、ＡＳＰＨ１４６、ＡＳＰＨ１５１、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１６５、ＡＳＰＨ１７１、ＡＳＰＨ１７２、ＡＳＰＨ１７６、ＡＳＰＨ１７８、ＡＳＰＨ１８０およびＡＳＰＨ１８３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照でそれぞれ処理した。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現に対する修飾オリゴヌクレオチドの阻害効果はそれぞれ、処理開始から２４時間後に決定された。ジムノティックデリバリー実験条件の下で、オリゴヌクレオチドは細胞に入り、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を強く阻害する。実験結果を図５に示す。
【００６８】
実施例５
さらなる実験において、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞は、１０μＭの修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ３５、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、およびＡＳＰＨ４８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照でそれぞれトランスフェクトした。培地が変更された後、オリゴヌクレオチドが２日間細胞に添加され、オリゴヌクレオチド含有培地において２日間さらなるインキュベーションが行われた。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡ（図６ａ）参照）およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現（図６ｂ参照）を測定し、ＨＰＲＴｌ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）に対して正規化された。細胞上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＴＧＦ−ベータ１（図７ａ参照）およびＴＧＦ−ベータ２（図７ｂ参照）タンパク質について分析した。ジムノティックデリバリー実験条件下では、デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２反応性オリゴヌクレオチドはＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、および汎特異的ＡＳＰＨ０９は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ、およびタンパク質の発現を有意に阻害する。すべての他のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を有意に阻害する。
【００６９】
実施例６
他の実験において、本発明の修飾ヌクレオチド阻害効果の用量依存が試験された。トランスフェクション剤を用いずに、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、または０．６２５μＭのＡＳＰＨ０５若しくはＡＳＰＨ３６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照で処理した。オリゴヌクレオチドは、２日間細胞に添加された。その後、培地が変更され、オリゴヌクレオチド含有培地中で細胞をさらに２日間細胞のインキュベートした。その後（総処理時間：４日）、ＴＧＦ−ベータ１（図８ａ参照）およびＴＧＦ−ベータ２（図８ｂ参照）ｍＲＮＡの発現が測定された。デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０５は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ発現の両方に対して著しく用量に依存した阻害を示し、そして用量依存的にＡＳＰＨ３６はＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する。
【００７０】
実施例７
マウスＳＭＡ−５６０の神経膠腫細胞を、トランスフェクション剤の存在下で、１０ｎＭのＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ１８、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４２、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７、若しくはＡＳＰＨ４８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４および１４５の対照でそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ＴＧＦ−ベータ１（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ２（黒カラム）の発現の阻害が決定された。汎特異的ＡＳＰＨ０９は、マウスＴＧＦ−ベータｍＲＮＡの発現を阻害し、試験された他のオリゴヌクレオチドは、マウスＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を強く阻害する。結果は、図９に示されている。
【００７１】
実施例８
雌の無胸腺ヌードマウス（ＨＳＤ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を、それぞれ、１４ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０１、ＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ２２、ＡＳＰＨ３７、ＡＳＰＨ４１、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４６、ＡＳＰＨ４７またはＡＳＰＨ４８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照または生理食塩水を皮下注射により連続５日間連続して処理した。最後の処理日の後に、マウスを屠殺した。マウスＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡを、腎臓組織溶解物中で定量した。図１０において、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の比率を表すデータはボックスプロットで表され、中央値と最小および最大値が表されている（ＡＳＰＨ４６群ｎ＝３を除いて、ｎ＝４でデータは表されている）。試験した全てのオリゴヌクレオチドは、これらのマウスの腎臓においてＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を阻害した。
【００７２】
実施例９
他の実験において、任意のトランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、１０μΜの修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照でトランスフェクトした。２日間細胞にオリゴヌクレオチドが追加され、培地が変更された後、さらにオリゴヌクレオチド含有培地中で２日間インキュベーションを行った。ＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現（図１１参照）を測定し、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）に対して正規化した。ジムノティックデリバリー実験条件下で、汎特異的オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０９がＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現を有意に阻害する。
【００７３】
実施例１０
トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、１０μＭ、３．３μＭ、１．１μＭ、０．３７μＭおよび０．１２μＭのＡＳＰＨ０３、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ６５、ＡＳＰＨ６９、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ８０、ＡＳＰＨ１１５、ＡＳＰＨ１２１、ＡＳＰＨ１５３、ＡＳＰＨ１８５およびＡＳＰＨ１８９でそれぞれ、処理した。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現に対する修飾オリゴヌクレオチドの阻害効果は、処理開始から７２時間後に決定された。ＴＧＦ−ベータ２の値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの５０％の減少（＝ＩＣ５０値）をもたらすオリゴヌクレオチド濃度を算出した。ジムノティックデリバリー実験条件下で、オリゴヌクレオチドは細胞に入り、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を強く阻害する。実験の結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
0006492053.tif 000014
【００７５】
すべての修飾オリゴヌクレオチドは、それらがトランスフェクション剤を必要とせずに非常に高い効力を有することを示しつつ、低マイクロモルまたはサブマイクロモル（マイクロモルの下のオーダー）の範囲のＩＣ５０を示している。
【００７６】
実施例１１
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で１０μＭ、３．３μＭ、１．１μＭ、０．３７μＭおよび０．１２μＭのＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２およびＡＳＰＨ１９３でそれぞれ処理した。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現に対する修飾オリゴヌクレオチドの阻害効果は、処理開始から７２時間後に決定された。ＴＧＦ−ベータ２の値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの５０％の減少（＝ＩＣ５０値）をもたらすオリゴヌクレオチド濃度を算出した。ジムノティックデリバリー実験条件下で、オリゴヌクレオチドは細胞に入り、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を強く阻害する。実験の結果を表４に示す。
【００７７】
【表４】
0006492053.tif 000015
【００７８】
すべての修飾オリゴヌクレオチドは、それらがトランスフェクション剤を必要とせずに非常に高い効力を有することを示す、サブマイクロモルから低サブマイクロモルの範囲のＩＣ５０を示している。
【００７９】
実施例１２
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、トランスフェクション剤の存在下で、１０ｎＭのＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００３、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨｌＯｌｌ、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、またはＡＳＰＨ１０６１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照でそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションから２４ｈ後にＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を決定した。Ｐａｎｃ−１細胞のＴＧＦ−ベータ１の発現の有意な減少を、図１３に示す。
【００８０】
実施例１３
マウスＳＭＡ−５６０神経膠腫細胞を、トランスフェクション剤の存在下で、１０ｎＭのＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００３、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３７、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、またはＡＳＰＨ１０６２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照でそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションから２４ｈ後にＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を決定した。ＳＭＡ−５６０細胞のＴＧＦ−ベータ１の発現の有意な減少を図１４に示す。
【００８１】
実施例１４
これらの実験では、ヒトＡ１７２神経膠腫細胞を、トランスフェクション剤の存在下で、１０ｎＭのＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００５、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１６、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２３、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３０、ＡＳＰＨ１０３１、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４８、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、またはＡＳＰＨ１０６２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照でそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後にＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を決定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図１５に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドが、ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害するのに対し、デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０５は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの両方の発現を有意に減少させる。
【００８２】
実施例１５
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞は、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μＭのＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０００、ＡＳＰＨ１００１、ＡＳＰＨ１００２、ＡＳＰＨ１００４、ＡＳＰＨ１００６、ＡＳＰＨ１００７、ＡＳＰＨ１００８、ＡＳＰＨ１００９、ＡＳＰＨ１０１０、ＡＳＰＨ１０１１、ＡＳＰＨ１０１２、ＡＳＰＨ１０１３、ＡＳＰＨ１０１４、ＡＳＰＨ１０１５、ＡＳＰＨ１０１７、ＡＳＰＨ１０１８、ＡＳＰＨ１０１９、ＡＳＰＨ１０２０、ＡＳＰＨ１０２１、ＡＳＰＨ１０２２、ＡＳＰＨ１０２４、ＡＳＰＨ１０２６、ＡＳＰＨ１０２７、ＡＳＰＨ１０２８、ＡＳＰＨ１０２９、ＡＳＰＨ１０３２、ＡＳＰＨ１０３３、ＡＳＰＨ１０３４、ＡＳＰＨ１０３５、ＡＳＰＨ１０３６、ＡＳＰＨ１０３７、ＡＳＰＨ１０３８、ＡＳＰＨ１０３９、ＡＳＰＨ１０４０、ＡＳＰＨ１０４１、ＡＳＰＨ１０４２、ＡＳＰＨ１０４３、ＡＳＰＨ１０４４、ＡＳＰＨ１０４５、ＡＳＰＨ１０４６、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０４９、ＡＳＰＨ１０５０、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５２、ＡＳＰＨ１０５３、ＡＳＰＨ１０５４、ＡＳＰＨ１０５５、ＡＳＰＨ１０５６、ＡＳＰＨ１０５７、ＡＳＰＨ１０５８、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６０、ＡＳＰＨ１０６１、またはＡＳＰＨ１０６２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５の対照で処理した。処理開始から７２時間後にＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現に対する修飾オリゴヌクレオチドの阻害効果をそれぞれ決定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図１６に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドがＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害するのに対し、デュアルＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０５は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの両方の発現を有意に減少させる。
【００８３】
実施例１６
ヒトＡ１７２膠腫細胞を、１０ｎＭ（トランスフェクション剤の存在下で）のＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６３、ＡＳＰＨ１０６４、ＡＳＰＨ１０６５、ＡＳＰＨ１０６６、ＡＳＰＨ１０６７、ＡＳＰＨ１０６８、ＡＳＰＨ１０６９、ＡＳＰＨ１０７０、ＡＳＰＨ１０７１、ＡＳＰＨ１０７２、ＡＳＰＨ１０７３、ＡＳＰＨ１０７４、ＡＳＰＨ１０７５、ＡＳＰＨ１０７６、ＡＳＰＨ１０７７、ＡＳＰＨ１０７８、ＡＳＰＨ１０７９、ＡＳＰＨ１０８０、ＡＳＰＨ１０８１、ＡＳＰＨ１０８２、ＡＳＰＨ１０８３、ＡＳＰＨ１０８４、ＡＳＰＨ１０８５、ＡＳＰＨ１０８６、ＡＳＰＨ１０８７、ＡＳＰＨ１０８８、ＡＳＰＨ１０８９、ＡＳＰＨ１０９０、ＡＳＰＨ１０９１、ＡＳＰＨ１０９２、ＡＳＰＨ１０９３、ＡＳＰＨ１０９４、ＡＳＰＨ１０９５、ＡＳＰＨ１０９７、ＡＳＰＨ１０９８、ＡＳＰＨ１０９９、ＡＳＰＨ１１００、ＡＳＰＨ１１０１、ＡＳＰＨ１１０２、ＡＳＰＨ１１０３、ＡＳＰＨ１１０４、ＡＳＰＨ１１０５、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１０７、ＡＳＰＨ１１０８、ＡＳＰＨ１１０９、ＡＳＰＨ１１１０、ＡＳＰＨ１１１１、ＡＳＰＨ１１１２、ＡＳＰＨ１１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１１５、ＡＳＰＨ１１１６、ＡＳＰＨ１１１７、ＡＳＰＨ１１１８、ＡＳＰＨ１１１９、ＡＳＰＨ１１２０、ＡＳＰＨ１１２１、ＡＳＰＨ１１２２、ＡＳＰＨ１１２３、ＡＳＰＨ１１２４、ＡＳＰＨ１１２５、ＡＳＰＨ１１２６、ＡＳＰＨ１１２７、ＡＳＰＨ１１２８、ＡＳＰＨ１１２９、ＡＳＰＨ１１３０、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２、または陽性対照ＡＳＰＨ１０４７でそれぞれ処理した。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現をトランスフェクションから２４時間後に決定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図１７に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドが、ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害するのに対し、汎特異的ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０００９、ＡＳＰＨ１０９６、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２は、すべての３つのイソ型の発現を有意に減少させることを示す。
【００８４】
実施例１７
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞（図１８ａ）またはマウスＲｅｎＣａ腎臓細胞癌細胞（図１８ａ）を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μＭのＡＳＰＨ０９、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１０５１、ＡＳＰＨ１０５９、ＡＳＰＨ１０６３、ＡＳＰＨ１０６４、ＡＳＰＨ１０６５、ＡＳＰＨ１０６６、ＡＳＰＨ１０６７、ＡＳＰＨ１０６８、ＡＳＰＨ１０６９、ＡＳＰＨ１０７０、ＡＳＰＨ１０７１、ＡＳＰＨ１０７２、ＡＳＰＨ１０７３、ＡＳＰＨ１０７４、ＡＳＰＨ１０７５、ＡＳＰＨ１０７６、ＡＳＰＨ１０７７、ＡＳＰＨ１０７８、ＡＳＰＨ１０７９、ＡＳＰＨ１０８０、ＡＳＰＨ１０８１、ＡＳＰＨ１０８２、ＡＳＰＨ１０８３、ＡＳＰＨ１０８４、ＡＳＰＨ１０８５、ＡＳＰＨ１０８６、ＡＳＰＨ１０８７、ＡＳＰＨ１０８８、ＡＳＰＨ１０８９、ＡＳＰＨ１０９０、ＡＳＰＨ１０９１、ＡＳＰＨ１０９２、ＡＳＰＨ１０９３、ＡＳＰＨ１０９４、ＡＳＰＨ１０９５、ＡＳＰＨ１０９７、ＡＳＰＨ１０９８、ＡＳＰＨ１０９９、ＡＳＰＨ１１００、ＡＳＰＨ１１０１、ＡＳＰＨ１１０２、ＡＳＰＨ１１０３、ＡＳＰＨ１１０４、ＡＳＰＨ１１０５、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１０７、ＡＳＰＨ１１０８、ＡＳＰＨ１１０９、ＡＳＰＨ１１１０、ＡＳＰＨ１１１１、ＡＳＰＨ１１１２、ＡＳＰＨ１１１３、ＡＳＰＨ１１４、ＡＳＰＨ１１１５、ＡＳＰＨ１１１６、ＡＳＰＨ１１１７、ＡＳＰＨ１１１８、ＡＳＰＨ１１１９、ＡＳＰＨ１１２０、ＡＳＰＨ１１２１、ＡＳＰＨ１１２２、ＡＳＰＨ１１２３、ＡＳＰＨ１１２４、ＡＳＰＨ１１２５、ＡＳＰＨ１１２６、ＡＳＰＨ１１２７、ＡＳＰＨ１１２８、ＡＳＰＨ１１２９、ＡＳＰＨ１１３０、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２、または陽性対照ＡＳＰＨ１０４７で処理した。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現をトランスフェクションから７２時間後に決定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図１７に示す。選択的ＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドがＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害するのに対し、汎特異的ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ０００９、ＡＳＰＨ１０９６、ＡＳＰＨ１１３１、およびＡＳＰＨ１１３２は、すべての３つのイソ型の発現を有意に減少させることを示す。
【００８５】
実施例１８
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌皮下腫瘍を有するマウスは、以下の様々な処理スケジュールの下で、１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇのＡＳＰＨ４７で処理した。
ＱｌＤｘｌ−ｄ６（１回ＳＣ注射、５日後終了）
ＱｌＤｘ５−ｄ６（５日間毎日ＳＣ注射、２４時間後終了）
ＱｌＤｘ５−ｄ１０（５日間毎日ＳＣ注射、５日後終了）
これらの動物の腎臓におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの用量依存ダウンレギュレーションが存在した。１回投与した後だけでさえも、ＴＧＦ−ベータ２のダウンレギュレーションは、ＡＳＰＨ４７での最後の処理後５日まで持続していた。ＴＧＦ−ベータ２発現をｂＤＮＡアッセイ（捕捉されたターゲットＲＮＡからシグナルを増幅するｂＤＮＡ分子を使用するサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション法である、分枝ＤＮＡアッセイ）により検知し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。図２２に示すように、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の比率を表すデータをボックスプロットで表し、中央値と最小および最大値を示す（ビヒクルおよび３ｍｇ／ｋｇＱｌＤｘｌ  ｄ６群についてｎ＝９であることを除いては、ｎ＝１０で表す）。
【００８６】
実施例１９
左右の脇腹にヒトＰａｎｃ−１膵臓癌皮下腫瘍を有するマウスは、５日間連続して、１、５、１５または５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの毎日の皮下注射で処理した。腫瘍は、最後の処理から２４時間後に回収し、スナップ凍結した。腫瘍におけるＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ発現は、ｂＤＮＡアッセイによって検出した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の比率を表すデータをボックスプロットで表し、中央値と最小および最大値を示す（ｎ＝５で表す）。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡは、様々なオリゴヌクレオチド（図２３）で処理された腫瘍にダウンレギュレーションされた。これらの群では、有意なＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡのダウンレギュレーションが存在しなかった（データは示さず）。
【００８７】
実施例２０
左右の脇腹にヒト７８６−Ｏ腎細胞癌皮下腫瘍を有するマウスを、５日間連続の５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの毎日の注射で処理した。腫瘍は、最後の処理から２４時間後に回収し、スナップ凍結した。腫瘍におけるＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ発現をｂＤＮＡアッセイによって検出した。ＡＳＰＨ０５、ＡＳＰＨ１７、ＡＳＰＨ２６、ＡＳＰＨ３６、ＡＳＰＨ４５、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ７１、ＡＳＰＨ８２、ＡＳＰＨ９８、およびＡＳＰＨ１０５でそれぞれ処理された腫瘍におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの有意なダウンレギュレーションが存在した（図２４）。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＧＦ−ベータ２の比率を表すデータをボックスプロットで表し、中央値と最小および最大値を示す（ＡＳＰＨ７１についてｎ＝９であることを除いては、ｎ＝１０で表されている）。
【００８８】
実施例２１
ヒトＰａｎｃ−ｌ膵臓癌細胞を、２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜの修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１１０６、ＡＳＰＨ１１３２、またはＡＳＰＨ１０４７との組み合わせられたＡＳＰＨ４７でトランスフェクトした。結果は、図２６ａから図２６ｅに示されている。陰性対照は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５（図２６ｆ）のスクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｃｒＬＮＡ）である。すべての細胞を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、トランスフェクトした。修飾オリゴヌクレオチドは、３７℃でインキュベートされた細胞に３日間添加された。その後、培地を、培地を含有する新鮮なオリゴヌクレオチドと交換し、細胞を３７℃でさらに４日間インキュベートした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。ＡＳＰＨ４７は、用量依存的にＴＧＦ−ベータ２の発現を特異的に阻害し、ＴＧＦ−ベータ１に対するターゲット阻害効果を全く有しない（図２６ａ）。ＡＳＰＨ１０４７は、ＴＧＦ−ベータ１の発現を特異的に阻害し、ＴＧＦ−ベータ２にたするターゲット阻害効果を全く有しない（図２６ｂ）、または高濃度でもわずかなＴＧＦ−ベータ２の阻害効果しか有しない。また、ＡＳＰＨ１１０６は、用量に依存してＴＧＦ−ベータ１の発現を阻害する（図２６ｃ）。汎特異的ＡＳＰＨ１１３２は、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現の用量依存的な阻害を示す（図２６ｄ）。ＡＳＰＨ４７とＡＳＰＨ１０４７とが組み合わされている場合、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の両方の発現は、用量に依存してに阻害される（図２６ｅ）。ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ１０４７、ＡＳＰＨ１１０６、またはＡＳＰＨ１１３２の各濃度と比較して２倍の濃度（４０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６、０．０５、０．０２μＭ）の場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５のｓｃｒＬＮＡは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２のいずれの発現に対して全く阻害効果を示さない。図２６ａから図２６ｆ中に、ＴＧＦ−ベータ１の結果を菱型で示し、ＴＧＦ−ベータ２の結果を四角で示す。
【００８９】
実施例２２
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞（図２７ａ）またはマウスＲｅｎＣａ腎細胞癌細胞（図２７ｂ）を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μΜのＡＳＰＨ０００９、ＡＳＰＨ１１３２、ＡＳＰＨ２０００、ＡＳＰＨ２００１、ＡＳＰＨ２００２、ＡＳＰＨ２００３、ＡＳＰＨ２００４、ＡＳＰＨ２００５、ＡＳＰＨ２００６、ＡＳＰＨ２００７、ＡＳＰＨ２００９、ＡＳＰＨ２０１０、ＡＳＰＨ２０１２、ＡＳＰＨ２０１３、ＡＳＰＨ２０１４、ＡＳＰＨ２０１５、ＡＳＰＨ２０１６、ＡＳＰＨ２０１７、ＡＳＰＨ２０１８、ＡＳＰＨ２０１９、ＡＳＰＨ２０２０、ＡＳＰＨ２０２１、ＡＳＰＨ２０２３、ＡＳＰＨ２０２４、ＡＳＰＨ２０２５、ＡＳＰＨ２３０２６、ＡＳＰＨ２０２７、ＡＳＰＨ２０２８、ＡＳＰＨ２０２９、ＡＳＰＨ２０３０、ＡＳＰＨ２０３１、ＡＳＰＨ２０３２、ＡＳＰＨ２０３３、ＡＳＰＨ２０３４、ＡＳＰＨ２０３５、ＡＳＰＨ２０３６、ＡＳＰＨ２０３７、ＡＳＰＨ２０３８、ＡＳＰＨ２０３９、ＡＳＰＨ２０４０、ＡＳＰＨ２０４１、ＡＳＰＨ２０４３、ＡＳＰＨ２０４４、ＡＳＰＨ２０４５、ＡＳＰＨ２０４６、ＡＳＰＨ２０４７、ＡＳＰＨ２０４８、ＡＳＰＨ２０４９、ＡＳＰＨ２０５０、ＡＳＰＨ２０５２、ＡＳＰＨ２０５３、ＡＳＰＨ２０５４、ＡＳＰＨ２０５５、ＡＳＰＨ２０５６、ＡＳＰＨ２０５７、ＡＳＰＨ２０６０、ＡＳＰＨ２０６１、ＡＳＰＨ２０６２、ＡＳＰＨ２０６３、ＡＳＰＨ２０６４、ＡＳＰＨ２０６５、またはＡＳＰＨ２０６６で処理した。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現をトランスフェクションから７２時間後に決定した。ＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図２７ａおよび図２７ｂに示す。配列から予想されたように、ヒトＴＧＦ−ベータ１および−ベータ３のｍＲＮＡに対して１００％の相同性を有するが、ＴＧＦ−ベータ２には不一致であるＴＧＦ−ベータ１、−ベータ２と−ベータ３反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ＿０００９（汎選択的）およびＡＳＰＨ＿１１３２は、全３つのイソ型の発現の有意な減少を示す。選択的ＴＧＦ−ベータ３オリゴヌクレオチドは、有意にＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現を阻害するだけである。
【００９０】
実施例２３
ヒトＡ１７２神経膠腫細胞を、１０ｎＭの（トランスフェクション剤の存在下で）ＡＳＰＨ０００９、ＡＳＰＨ１１３２、ＡＳＰＨ２０００、ＡＳＰＨ２００１、ＡＳＰＨ２００２、ＡＳＰＨ２００３、ＡＳＰＨ２００４、ＡＳＰＨ２００６、ＡＳＰＨ２００７、ＡＳＰＨ２００８、ＡＳＰＨ２００９、ＡＳＰＨ２０１０、ＡＳＰＨ２０１１、ＡＳＰＨ２０１２、ＡＳＰＨ２０１３、ＡＳＰＨ２０１４、ＡＳＰＨ２０１６、ＡＳＰＨ２０１７、ＡＳＰＨ２０１８、ＡＳＰＨ２０２０、ＡＳＰＨ２０２１、ＡＳＰＨ２０２２、ＡＳＰＨ２０２３、ＡＳＰＨ２０２４、ＡＳＰＨ２０２５、ＡＳＰＨ２０２６、ＡＳＰＨ２０２７、ＡＳＰＨ２０２８、ＡＳＰＨ２０２９、ＡＳＰＨ２０３０、ＡＳＰＨ２０３１、ＡＳＰＨ２０３２、ＡＳＰＨ２０３３、ＡＳＰＨ２０３４、ＡＳＰＨ２０３５、ＡＳＰＨ２０３６、ＡＳＰＨ２０３７、ＡＳＰＨ２０３８、ＡＳＰＨ２０３９、ＡＳＰＨ２０４０、ＡＳＰＨ２０４１、ＡＳＰＨ２０４２、ＡＳＰＨ２０４３、ＡＳＰＨ２０４４、ＡＳＰＨ２０４５、ＡＳＰＨ２０４７、ＡＳＰＨ２０４９、ＡＳＰＨ２０５０、ＡＳＰＨ２０５１、ＡＳＰＨ２０５２、ＡＳＰＨ２０５３、ＡＳＰＨ２０５４、ＡＳＰＨ２０５６、ＡＳＰＨ２０５７、ＡＳＰＨ２０５８、ＡＳＰＨ２０５９、ＡＳＰＨ２０６０、ＡＳＰＨ２０６１、ＡＳＰＨ２０６２、ＡＳＰＨ２０６３、またはＡＳＰＨ２０６６で２４時間処理した。そして、ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現を、ｂＤＮＡアッセイによって細胞抽出物から決定した。ＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図２８に示す。配列から予想されたように、ヒトＴＧＦ−ベータ１および−ベータ３のｍＲＮＡに対して１００％の相同性を有するが、ＴＧＦ−ベータ２には不一致であるＴＧＦ−ベータ１、−ベータ２と−ベータ３反応性オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ＿０００９（汎選択的）およびＡＳＰＨ＿１１３２は、全３つのイソ型の発現の有意な減少を示す。選択的ＴＧＦ−ベータ３オリゴヌクレオチドは、有意にＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現を阻害するだけである。
【００９１】
実施例２４：ウサギの細胞におけるターゲットｍＲＮＡのダウンレギュレーション
選択されたオリゴヌクレオチドの配列は、ＴＧＦ−ベータ１およびベータ２のウサギｍＲＮＡ配列と連携されていた。ＡＳＰＨ＿００３６（ヒトｍＲＮＡ配列に基づくＴＧＦ−ベータ２選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ウサギＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡと１００％の相同性を示したが、ＡＳＰＨ＿１０５９（ヒトｍＲＮＡ配列に基づく、ＴＧＦ−ベータ１選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ウサギのＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡと１００％の相同性を示した。
【００９２】
ウサギＲａｂ−９皮膚線維芽細胞を、トランスフェクション剤の存在下で、５ｎＭまたは２０ｎＭのＡＳＰＨ＿００３６またはＡＳＰＨ＿１０５９の一方で２４時間処理した。そして、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を、ｂＤＮＡアッセイにより細胞抽出物中で決定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少（それぞれ、５および２０ｎＭで５１および７７％）が、ＡＳＰＨ＿１０５９で達成された。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の有意な減少（それぞれ、５および２０ｎＭで７９および８０％）が、ＡＳＰＨ＿００３６で達成された。
【００９３】
実施例２５：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＡＳＰＨ＿００４７の全身投与後の組織生体内分布およびターゲットｍＲＮＡダウンレギュレーション
【００９４】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、５、２０および５０ｍｇ／ｋｇ動物体重で、ＡＳＰＨ＿００４７（滅菌生理食塩水で製剤化）の一回皮下注射で処理した。血漿および組織を、示された時間（３個体の動物から）に採取し、スナップ凍結し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ法（プラズマ／組織ＰＫ）での分析までまたはｂＤＮＡアッセイによるＴＧＦ−ベータ２およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルの測定のために−８０℃で保存した。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡレベルは、対応するサンプル中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現レベルに対して表された。
【００９５】
データは、５０ｍｇ／ｋｇＡＳＰＨ＿００４７の一回の皮下ボーラス投与が、急速初期排出段階（２４時間以内）を伴う、血漿中の二相性薬物動態プロファイルである、皮下から循環血液コンパートメントへの薬物の迅速な移動をもたらし（〜５から３０分のＴＭＡＸ）、その後、長い半減期（図３０ａ）が続いたことを示す。様々な選択された組織において薬の長期間続く著しい蓄積がさらに実証された。主要なターゲット器官（最高曝露／ＣＭＡＸ）は、腎臓、そして肝臓、皮膚および脾臓であり、脳内では最低である（データは示さず）。図２９ｂにも示すように、ＡＳＰＨ＿００４７は、２４時間から１４日まで薬理的に適切な用量（１０μΜに相当する、５０μｇ／ｇｒ）で、腎臓組織におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの結果的に生じる持続性および著しい抑制を伴い、すくなくとも１４日間観察された効果的〜８０％ターゲットｍＲＮＡダウンレギュレーションを伴いながら、腎臓組織に残った。
【００９６】
実施例２６
免疫不全マウスを、ヒト７８６−Ｏ腎細胞癌細胞（図３０Ａ）、膵臓Ｐａｎｃ１癌細胞（図３０Ｂ、Ｃ）、またはマウスＳＭＡ−５６０神経膠腫細胞（図３０Ｄ）を皮下注射した。皮下腫瘍が１００〜３００ｍｍ３（確立された腫瘍）の大きさに達したとき、動物を、ＱｌＤｘ５、生理食塩水（モック）、対照オリゴヌクレオチド（対照；５０ｍｇ／ｋｇ）、この文脈では不活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＰＨ＿００６５およびＡＳＰＨ＿００７１；５０ｍｇ／ｋｇ）または５０ｍｇ／ｋｇでＡＳＰＨ＿００４７、または示された用量で皮下的に処理した。腫瘍（図３０Ａ−Ｄ）および腎臓（図３０Ｅ−Ｆ）は、最後の投与後２４時間に採取した。次に、腫瘍／腎臓をｂＤＮＡアッセイによりＴＧＦ−ベータ２およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルの決定のためにさらに処理した。これらの実験において、対照オリゴヌクレオチドは、１８−ｍｅｒ、３＋３  ＬＮＡギャップマースクランブル配列であった。結果は、ＴＧＦ−ベータ２／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの比率で表され、個々の試験された試料は、赤い線として示された中央値で表される。記載された実験条件（スケジュールおよび投与経路）下で、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＳＰＨ＿００４７の全身反復投与は、確立された皮下腫瘍および腎臓におけるＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの配列特異的ダウンレギュレーションをもたらした。
【００９７】
実施例２７
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０日目に、腎被膜下に（図３１Ａ、Ｂ）または静脈内投与（ｉ．ｖ．）（図３１Ｃ、Ｄ）によりマウスＲＥＮＣＡ細胞を注射された。ビヒクルまたは示されたオリゴヌクレオチドでの全身治療は、７日目（図３１Ａ；５０ｍｇ／ｋｇ、皮下、週二回）、１日目（図３１Ｂ；１２．５ｍｇ／ｋｇ、皮下、週二回）（２週連続）、または７日目（図３１Ｃおよび３２Ｄ；示された投与量、皮下、週二回）（２６〜２７日間）に開始した。肺転移の数を肉眼で評価し、肺転移のレベルは、転移（図３１Ａ、Ｃ）の数または肺重量（図３１Ｂ、Ｄ）に基づいて決定した。結果を、中央値、上および下四分位、および９０番目および１０番目百分位でボックスプロットとして表す。記載された実験デザインの下、ＡＳＰＨ＿００４７で処理されたＢａｌｂ／ｃマウスは、マウスのＲｅｎｃａ腎細胞癌モデルにおける肺転移の数の減少または肺重量の低下（肺重量は肺転移の程度に関連する）を表す。
【００９８】
実施例２８
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞は、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、３．３μΜの示されたオリゴヌクレオチドで処理した。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現は、トランスフェクションから７２時間後に測定した。ＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図３２に示す。対照オリゴヌクレオチドＬＮＡ−ｓｃｒは、いかなるＴＧＦ−ベータイソ型の発現にも影響を与えないが、ＴＧＦ−ベータ１オリゴヌクレオチドは、有意にＴＧＦ−ベータ１ｍＲＮＡの発現を阻害するだけである。
【００９９】
実施例２９
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０日目の乳房脂肪パッドにマウス４Ｔ１細胞を注射された。動物を犠牲にすると、生理食塩水（モック）、全ＴＧＦ−ベータ抗体（１Ｄ１１）、対照オリゴヌクレオチド（ＬＮＡ−ｓｃｒ）またはＡＳＰＨ＿００４７による全身処理を３日目に開始し（３０ｍｇ／ｋｇ、皮下、週に２回）、Ｄ２８まで続けられた。肺転移の数を肉眼で評価し、肺転移のレベルは、転移（左のパネル）の数によって決定または肺重量（右パネル）に基づいて決定された。記載された実験デザインの下、ＡＳＰＨ＿００４７での処理は、肺への転移を減少させたのに対し、陽性対照、モノクローナルＴＧＦ−ベータ抗体１Ｄ１１は、このモデルにおいて肺転移に影響を及ぼさなかった。
【０１００】
実施例３０
ＣＢ１７  ＳＣＩＤまたはＢａｌｂ／ｃヌードマウス（ＡＳＰＨ＿００１８についてｎ＝１であり、およびＡＳＰＨ＿００３７についてｎ＝２であることを除いて、ｎ＝３〜５で表されている）は、１４〜１５ｍｇ／ｋｇの示されたＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドで４または５日間連続して処理した（ＱｌＤｘ４−５）。血漿は、最後の処理から２４時間後に採取し、ＡＬＴレベルは血漿中で決定された。結果を中央値で表す。
この実験条件下では、試験されたオリゴヌクレオチドの６／４８（１２．５％）だけが、肝毒性を示す血漿ＡＬＴ（＞３００ユニット／ｌ）の著しい増加を誘発した。下記表５は、全身投与されたＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの肝臓毒性を示す。
【０１０１】
【表５】
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［付記］
［付記１］
オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡおよび／若しくはＥＮＡ、ポリアルキレンオキシド−、２’−フルオロ−、２’−Ｏ−メトキシ−、並びに／または２’Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドである、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の１２から１８のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド。
［付記２］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の核酸ｎｏ．１３８０から１５１０、ｎｏ．１６６０から１６８０、ｎｏ．２３９０から２４１０、またはｎｏ．２７４０から２８１０の領域の１２から１８のヌクレオチドからなる、付記１に記載のオリゴヌクレオチド。
［付記３］
前記修飾オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端に位置する、付記１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
［付記４］
前記オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０３からなる群から選択される配列を含む、付記１から３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
［付記５］
前記オリゴヌクレオチドは、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ４７）、ＡＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０１）、ＡＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０２）、ＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０３）、ＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０４）、ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０５）、ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０６）、ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０７）、ＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡ（ＡＳＰＨ０８）、ＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴ（ＡＳＰＨ０９）、ＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴ（ＡＳＰＨ１０）、ＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴ（ＡＳＰＨ１５）、ＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴ（ＡＳＰＨ１７）、ＴＣＧＣＧＣＴＣＧＣＡＧＧＣ（ＡＳＰＨ２２）、ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡ（ＡＳＰＨ２６）、ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＡ（ＡＳＰＨ２７）、ＣＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＧＣＡＴ（ＡＳＰＨ３０）、ＧＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＡＴ（ＡＳＰＨ３５）、ＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡ（ＡＳＰＨ３６）、ＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣ（ＡＳＰＨ３７）、ＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣ（ＡＳＰＨ４５）、ＣＣＴＴＡＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＡ（ＡＳＰＨ４８）、ＴＣＴＧＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣ（ＡＳＰＨ６５）、ＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＣ（ＡＳＰＨ６９）、ＡＧＣＧＴＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＡ（ＡＳＰＨ７１）、ＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴ（ＡＳＰＨ８０）、ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴ（ＡＳＰＨ８２）、ＧＣＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣ（ＡＳＰＨ９８）、ＡＣＣＡＣＴＡＧＡＧＣＡＣＣ（ＡＳＰＨ１０５）、ＡＧＣＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡ（ＡＳＰＨ１１１）、ＧＧＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＴ（ＡＳＰＨ１１２）、ＣＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＴ（ＡＳＰＨ１１５）、ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＣ（ＡＳＰＨ１１９）、ＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴ（ＡＳＰＨ１２１）、ＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴ（ＡＳＰＨ１５３）からなる群から選択される、付記１または４に記載のオリゴヌクレオチド。
［付記６］
付記１から５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［付記７］
悪性および／若しくは良性腫瘍、線維症、肝硬変、強皮症若しくは関連する皮膚疾患、またはＣＮＳ疾患の予防および／または治療の方法において使用される、付記１から５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたは付記６に記載の医薬組成物。
［付記８］
腫瘍は、固形腫瘍、血液生まれの腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、または胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓、子宮頸がん、絨毛癌、脈絡膜癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌の癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌からなる群から選択される、付記７に記載の使用のためのオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
【図１】
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【図２】
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【図２−１】
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【図３ａ）】
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【図３ｂ）】
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【図３ｃ）】
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【図４ａ）】
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【図４ｂ）】
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【図４ｃ）】
0006492053.tif 000026
【図５】
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【図６ａ）】
0006492053.tif 000028
【図６ｂ）】
0006492053.tif 000029
【図７ａ）】
0006492053.tif 000030
【図７ｂ）】
0006492053.tif 000031
【図８ａ）】
0006492053.tif 000032
【図８ｂ）】
0006492053.tif 000033
【図９】
0006492053.tif 000034
【図１０】
0006492053.tif 000035
【図１１】
0006492053.tif 000036
【図１２】
0006492053.tif 000037
【図１２−１】
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【図１３】
0006492053.tif 000039
【図１４】
0006492053.tif 000040
【図１５】
0006492053.tif 000041
【図１６】
0006492053.tif 000042
【図１７】
0006492053.tif 000043
【図１８ａ】
0006492053.tif 000044
【図１８ｂ】
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【図１９】
0006492053.tif 000046
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
0006492053.tif 000049
【図２３】
0006492053.tif 000050
【図２４】
0006492053.tif 000051
【図２５】
0006492053.tif 000052
【図２５−１】
0006492053.tif 000053
【図２６ａ】
0006492053.tif 000054
【図２６ｂ】
0006492053.tif 000055
【図２６ｃ】
0006492053.tif 000056
【図２６ｄ】
0006492053.tif 000057
【図２６ｅ】
0006492053.tif 000058
【図２６ｆ】
0006492053.tif 000059
【図２７ａ）】
0006492053.tif 000060
【図２７ｂ）】
0006492053.tif 000061
【図２８）】
0006492053.tif 000062
【図２９ａ）】
0006492053.tif 000063
【図２９ｂ）】
0006492053.tif 000064
【図３０）】
0006492053.tif 000065
【図３１）】
0006492053.tif 000066
【図３２）】
0006492053.tif 000067
【図３３）】
0006492053.tif 000068
【配列表】
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