(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させるための分化誘導剤であって、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導させる幹細胞分化誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチドを有効成分として含み、ここで該幹細胞分化誘導性ペプチド配列が、配列番号１〜６，１６〜２５，２７，２８に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかから設定され、かつ、該幹細胞分化誘導性ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有し、ここで該幹細胞分化誘導性ペプチド配列と該膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個、２個、又は３個のアミノ酸残基を含む又は含まないことを特徴とする幹細胞分化誘導剤。
【請求項２】
前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号７）
を有する、請求項１に記載の幹細胞分化誘導剤。
【請求項３】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸配列が１００以下である、請求項１又は２に記載の幹細胞分化誘導剤。
【請求項４】
前記合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２６）
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２９）
ＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３０）
ＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３１）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＫＬＬＶＬＬＬＬＧＬＴＡＰＡＡＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３２）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３３）
ＭＧＰＡＳＰＡＡＲＧＬＳＲＲＰＧＱＰＰＬＰＬＬＬＰＬＬＬＬＬＬＲＡＱＰＡＩＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３４）
のうちのいずれかを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の幹細胞分化誘導剤。
【請求項５】
前記多能性幹細胞において、内胚葉系細胞への分化の指標として知られているタンパク質であるα−フェトタンパク質又はアルブミンタンパク質の発現を増加させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の幹細胞分化誘導剤。
【請求項６】
多能性幹細胞をインビトロで内胚葉系細胞に分化誘導させる方法であって、
対象とする多能性幹細胞を培養すること、および
前記培養中の多能性幹細胞に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の幹細胞分化誘導剤を少なくとも１回供給すること、
を包含する方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞が、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞（誘導多能性幹細胞）である、請求項６に記載の分化誘導方法。
【請求項８】
多能性幹細胞を含む培養物から肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む培養物をインビトロで生産する方法であって、該培養物中の多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する過程において、請求項１〜５のいずれか一項に記載の幹細胞分化誘導剤を前記多能性幹細胞を含む培養物に少なくとも１回供給することを包含する、生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導し得る或いは分化誘導を促進し得る合成ペプチドとその利用に関する。特に、該ペプチドを有効成分とする幹細胞分化誘導剤（組成物）ならびに該ペプチドを使用して多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導する方法に関する。
なお、本出願は２０１３年１２月２５日に出願された日本国特許出願２０１３−２６８０７１号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野における一つの課題として、未分化状態の多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞、embryonic stem cellともいう）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced pluripotent stem cellともいう）を、高効率に目的の機能を有する細胞に分化誘導する技術の確立が挙げられる（以下の特許文献１〜３および非特許文献１、２参照）。
例えば、多能性幹細胞を未分化の状態で培養（増殖）し、当該培養(増殖)により細胞数が増大した未分化の多能性幹細胞を、高効率に且つ簡便な手法で目的の機能を有する細胞に分化誘導する方法の確立が求められている。例えば、以下の特許文献３には、培養したｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導したとする技術が記載されている。その他、未分化状態の多能性幹細胞を、心筋細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞等に分化誘導する方法が多数報告されている。【０００３】
近年、特に、未分化状態の多能性幹細胞を内胚葉系細胞（内胚葉を構成する細胞、内胚葉から分化した細胞、内胚葉由来の組織を構成する細胞を含む）へ高効率に分化誘導する技術の確立についての要求が高まっている。
例えば、内胚葉由来の組織としては、肝臓、胆のう、膵臓、肺、胃、腸管などが挙げられる。当該内胚葉由来組織が炎症、外傷、癌および生活習慣病等により当該組織が損傷を受ける（例えば機能不全に陥る）と患者のＱＯＬ（生活の質）を著しく損なう場合が多い。そのため、上記内胚葉由来組織の機能不全に対する有効な治療方法のひとつとして再生医療による治療法の確立が求められている。例えば、多能性幹細胞を未分化の状態で培養（増殖）し、当該培養(増殖)により細胞数が増大した未分化の多能性幹細胞を、高効率に且つ簡便な手法で内胚葉系細胞に分化誘導し、該分化誘導により得られた内胚葉系細胞を再生医療に資する技術の確立が求められている。
内胚葉系細胞の中でも特に、高効率に肝細胞を分化誘導する技術への注目度が高い。肝臓は、生体内において例えば代謝、解毒、薬物代謝、排出、体液の恒常性といった極めて多くの機能を果たしている。また、肝臓は沈黙の臓器とも比喩されるとおり自覚症状が現れにくい組織であり、治療開始時には損傷（機能不全）がかなり進行していることが多い。そのため、肝臓移植（肝細胞移植を含む）が有効な治療方法であるが、従来の移植医療はドナー不足や拒絶反応といった課題を有する。したがって、再生医療に資することが可能な肝細胞や肝前駆細胞の提供は、肝臓の損傷（疾患、機能不全）に対する治療の確立の観点からとして期待されている。【０００４】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ高効率に分化誘導する技術の確立は、基礎医学分野、創薬分野、薬理学分野、発生学分野等、再生医療分野以外の多様な分野からも期待されている。例えば、これまで詳細な研究が不可能であった疾患の発症病態解明や治療薬開発について多能性幹細胞から分化誘導した内胚葉系細胞を利用することにより、インビトロ（生体外、in vitro）での試験が可能となる。特に、多能性幹細胞から肝細胞を分化誘導する技術は、医薬品開発研究過程で実施されるヒト初代培養肝細胞を用いた毒性評価が抱える均一な細胞の安定供給といった課題を解決する手段としての期待も高い。また、多能性幹細胞から膵細胞を分化誘導する技術は、糖尿病治療に利用可能なインスリンの供給の観点からも注目されている。【０００５】
しかしながら、現在までに報告されている多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導する方法は、操作が煩雑な方法（例えば複数の外来遺伝子の導入を伴う分化誘導法）であったり、或いは、操作自体は比較的容易な方法（例えば液状の数種の分化誘導性化合物を培地に添加する方法）であってもその分化効率が低いものが多い。さらに、外来遺伝子の導入を伴う分化誘導法には、外来遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれることから安全面の課題があり、分化誘導性化合物の添加による分化誘導法には、高価なサイトカイン等の液性因子を多量に必要とするコスト面の課題がある。また、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導することができたとしても、得られた細胞の機能が十分でない場合も多い。そのため、より簡便で分化効率の高い分化誘導方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特許出願公開２００９−１６５４８１号公報
【特許文献２】日本国特許出願公開２００９−２１５１９１号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００７／１２６０７７号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００９／０９３６９２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】セル・リサーチ(Cell Research)、１９巻、２００９年、ｐｐ．１２３３−１２４２
【非特許文献２】PLOS ONE、６巻（８号）、２０１１年、ｅ２４２２８
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、従前の分化誘導方法とは異なり、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドであって、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する或いは分化誘導を促進（助長）する目的に資する合成ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを有効成分とする幹細胞分化誘導剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する或いは分化誘導を促進（助長）する方法の提供を目的とする。
【０００９】
本発明者らは、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する目的に資するべく種々のペプチドの研究を鋭意推進したところ、驚くべきことに、従来は細胞分化誘導とは全く関係のない機能で知られていたタンパク質である、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid Precursor Protein：ＡＰＰ）およびＡＰＰの類縁のタンパク質である２種のアミロイド前駆体様タンパク質（Amyloid Precursor-Like Protein 1：ＡＰＬＰ１、Amyloid Precursor-Like Protein 2：ＡＰＬＰ２）のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（以下シグナルペプチド配列ともいう）の全部又は一部のアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）を含むように合成したペプチドが、少なくとも一種の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化させる幹細胞分化誘導能（以下、「幹細胞分化誘導活性」ともいう）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明によって提供される幹細胞分化誘導剤は、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させるための分化誘導剤であって、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導させる幹細胞分化誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチドを有効成分として含み、さらに上記幹細胞分化誘導性ペプチド配列が、以下のアミノ酸配列：
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のファミリーに属するいずれかのタンパク質（典型的にはＡＰＰ、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２のうちのいずれかのタンパク質）のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列；
または、該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部の連続するアミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列；
のうちのいずれかから設定される。
また、上記幹細胞分化誘導剤（薬学的組成物）は、典型的には薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。
なお、本明細書において、幹細胞分化誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチド（即ち幹細胞分化誘導活性を有する合成ペプチド）を「分化誘導性合成ペプチド」とも呼称する。
また、本明細書において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）あるいは２種アミロイド前駆体様タンパク質（ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２）のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列又は該シグナルペプチド配列中の部分アミノ酸配列（即ち上記の一部分の連続した部分配列）を総称して「ＡＰＰシグナルペプチド関連配列」とも呼称する。
【００１１】
ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、単純な構造（典型的には直鎖状のペプチド鎖）の分化誘導性合成ペプチドを有効成分として含むため、例えば、対象の多能性幹細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に該幹細胞分化誘導剤を供給するという簡易な処理を行うことによって、対象の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導することができる。また、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造され得る合成ペプチドを有効成分とするため、所望量の幹細胞分化誘導剤を容易且つ低コストで調製することができる。ここで開示される幹細胞分化誘導剤を用いると、高価なサイトカイン等の液性因子を大量に使用することなく（典型的には液性因子の代替物として）多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導することができるため、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導することにかかるコストの削減を実現することができる。また、外来遺伝子の導入を伴わないので、外来遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれることはない。
【００１２】
また、ここで開示される好ましい一態様の幹細胞分化誘導剤は、上記分化誘導性合成ペプチドに含まれる幹細胞分化誘導性ペプチド配列が、以下のｉ）〜ｖｉ）に示すいずれかのアミノ酸配列から設定されることで特徴付けられる。
ｉ）以下の配列番号１のアミノ酸配列：
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡ（配列番号１）；
または、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１５番目のロイシン残基から２７番目のアラニン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
ｉｉ）以下の配列番号２のアミノ酸配列：
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＫＬＬＶＬＬＬＬＧＬＴＡＰＡＡＡ（配列番号２）；
または、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１６番目のロイシン残基から２７番目のアラニン残基までの１２個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
ｉｉｉ）以下の配列番号３のアミノ酸配列：
ＭＧＰＡＳＰＡＡＲＧＬＳＲＲＰＧＱＰＰＬＰＬＬＬＰＬＬＬＬＬＬＲＡＱＰＡＩＧ（配列番号３）；
または、配列番号３に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１９番目のプロリン残基から３１番目のロイシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、配列番号３に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて２６番目のロイシン残基から３８番目のグリシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
ｉｖ）以下の配列番号４のアミノ酸配列：
ＭＧＰＴＳＰＡＡＲＧＱＧＲＲＷＲＰＰＬＰＬＬＬＰＬＳＬＬＬＬＲＡＱＬＡＶＧ（配列番号４）；
または、配列番号４に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１８番目のプロリン残基から３０番目のロイシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、配列番号４に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて２５番目のロイシン残基から３７番目のグリシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
ｖ）以下の配列番号５のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号５）；
または、配列番号５に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基までの１４個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、配列番号５に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目のアラニン残基までの１５個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
ｖｉ）以下の配列番号６のアミノ酸配列：
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号６）；
または、配列番号６に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基までの１４個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、配列番号６に示すアミノ酸配列の一部分であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目のアラニン残基までの１５個の連続するアミノ酸残基を少なくとも有する部分アミノ酸配列；
または、これらのアミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列。
【００１３】
配列番号１〜６として開示されるアミノ酸配列は、ＡＰＰファミリーに属するタンパク質のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例である。また、配列番号１〜６に示すアミノ酸配列及びここに開示される当該アミノ酸配列の部分アミノ酸配列はＡＰＰシグナルペプチド関連配列の典型例である。これらのアミノ酸配列またはその改変アミノ酸配列は、本発明の実施に好適に採用することができる。
【００１４】
また好ましくは、幹細胞分化誘導剤に含まれる分化誘導性合成ペプチドは、上記幹細胞分化誘導性ペプチド配列のアミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する。
このような膜透過性ペプチド配列を有する上記分化誘導性合成ペプチドを対象の多能性幹細胞に（典型的には培地中に）添加することによって、上記幹細胞分化誘導性ペプチド配列を該多能性幹細胞の外部(細胞膜の外側)から細胞内に高効率に移送することができる。
【００１５】
また好ましくは、幹細胞分化誘導剤に含まれる分化誘導性合成ペプチドは、上記膜透過性ペプチド配列として以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号７）
を有する。
配列番号７としてここで開示されているアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、本発明の実施に好適に採用することができる。
【００１６】
また、ここ開示される幹細胞分化誘導剤に含まれる分化誘導性合成ペプチドの好ましい一態様は、当該ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が１００以下である。このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱性に優れるため、幹細胞分化誘導剤の成分として好ましい。
【００１７】
また好ましくは、幹細胞分化誘導剤に含まれる分化誘導性合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２６）
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２９）
ＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３０）
ＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３１）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＫＬＬＶＬＬＬＬＧＬＴＡＰＡＡＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３２）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３３）
ＭＧＰＡＳＰＡＡＲＧＬＳＲＲＰＧＱＰＰＬＰＬＬＬＰＬＬＬＬＬＬＲＡＱＰＡＩＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３４）
のうちのいずれかを有する。
このような分化誘導性合成ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を内胚葉系細胞に分化誘導する用途に好適である。
【００１８】
また好ましくは、ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞に使用される。ＥＳ細胞よりも比較的入手が容易であるｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞に分化誘導することは、再生医療分野において特に望ましい。
【００１９】
また好ましくは、ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、上記多能性幹細胞において、内胚葉系細胞への分化の指標として知られているタンパク質であるα−フェトタンパク質（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰともいう）又はアルブミンタンパク質（Ａｌｂｕｍｉｎ、ＡＬＢともいう）の発現を増大させることを特徴とする。ＡＦＰまたはＡＬＢの発現量増加は、多能性幹細胞を内胚葉系細胞（典型的には肝前駆細胞または肝臓細胞）に分化誘導したことを示す特徴として把握することができる。
【００２０】
また好ましくは、ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、上記内胚葉系細胞が肝前駆細胞及び肝細胞のすくなくとも一方であることを特徴とする。このような幹細胞分化誘導剤は、特に肝臓疾患に対する再生医療分野への利用価値が極めて高い。
【００２１】
また、本発明は、他の側面として、少なくとも１種の多能性幹細胞（典型的には生体外で培養する多能性幹細胞）をインビトロで内胚葉系細胞に分化誘導させる方法であって、対象とする多能性幹細胞を培養することと、該培養中の多能性幹細胞に、ここで開示されるいずれかの幹細胞分化誘導剤（換言すればここで開示されるいずれかの分化誘導性合成ペプチド）を少なくとも１回供給することを特徴とする方法を提供する。
かかる分化誘導方法によると、上記のとおり、高価な液性因子を使用することなく若しくは使用を削減できるため、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導することにかかるコストの低減或いはコスト増の抑制を実現することがでる。また、対象の多能性幹細胞（典型的には当該細胞の培地中）に幹細胞分化誘導剤（分化誘導性合成ペプチド）を供給するという簡単な手法によって多能性幹細胞を内胚葉系細胞に高効率に分化誘導することが実現できる。
【００２２】
また、ここで開示される上記分化誘導方法は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導する方法として好適に実施することができる。特にヒト由来のｉＰＳ細胞が好ましい。ヒト由来のｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導する本方法は、医療産業上の利用価値が高い。
【００２３】
また好ましくは、ここで開示される上記分化誘導方法は、上記多能性幹細胞において、内胚葉系細胞への分化の指標として知られているタンパク質であるＡＦＰ又はＡＬＢの発現を増大させることを特徴とする。ＡＦＰ又はＡＬＢの発現を増大させることで、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導することができる。
【００２４】
また、本発明は、他の側面として、多能性幹細胞を含む培養物中の当該多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する過程において、ここに開示される幹細胞分化誘導剤を上記多能性幹細胞を含む培養物中に少なくとも一回供給することを包含する、多能性幹細胞を含む培養物から肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む培養物を生産する方法を提供する。
かかる生産方法によると、低コスト且つ簡単な手法によって多能性幹細胞から肝細胞及び／又は肝前駆細胞を効率よく生産することができる。
【００２５】
また、被験体（患者）の患部の修復や再生を促進させる目的に、ここで開示される幹細胞分化誘導方法を好適に実施することができる。即ち、ここで開示される方法は、修復や再生に資する細胞を生体外で高効率に分化誘導（生産）することができるため、本方法の実施によって効率よく生体外で分化誘導した細胞を、被験体（患者）の体内に導入することによって、修復や再生に要する時間を短縮することができる。また、被験体（患者）自身から得た多能性幹細胞を用いることで、ドナー不足や拒絶反応といった課題を解決しうる。
【００２６】
また、被験者（患者）に移植可能な組織や臓器を産生する目的に、ここで開示される幹細胞分化誘導方法を好適に実施することができる。即ち、ここで開示される方法は、内胚葉由来の組織に分化する能力を有する内胚葉系細胞を高効率に分化誘導（生産）する方法であるため、本方法の実施によって効率よく生体外で分化誘導した内胚葉系細胞を、さらに目的の組織体（肝臓、胆のう、膵臓、肺、胃、腸管等または当該組織体の一部）まで増殖、成長させることで、該組織体を高効率に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、一実施形態に係る分化誘導性合成ペプチドを添加して培養したｉＰＳ細胞の形態変化を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】図２は、分化誘導性合成ペプチド無添加で培養したｉＰＳ細胞の形態を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】図３は、一実施形態に係る分化誘導性合成ペプチドを添加して培養したｉＰＳ細胞の幹細胞の分化マーカー遺伝子および三胚葉系細胞の各分化マーカー遺伝子の発現量の定量結果を示すグラフである。グラフの横軸は細胞の培養日数(日)を示し、縦軸はペプチド添加区の各遺伝子の発現量をペプチド無添加区との相対比で示す。
【図４】図４は、一実施形態に係る分化誘導性合成ペプチドを添加して培養したｉＰＳ細胞の培養上清中のＡＦＰ量およびＡＬＢ量を定量した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、一実施形態に係る分化誘導性合成ペプチドを添加して培養したｉＰＳ細胞の培養上清中のＡＦＰ量を測定した結果を示す図面（写真）である。上段から順にサンプル２添加区〜サンプル７添加区およびペプチド無添加区（Control）の結果を示しており、左列から順に各試験区においてペプチド存在下での培養後８日目、１１日目、・・・・２０日目に回収した培養上清をプロットした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００２９】
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えば多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導し得る幹細胞分化誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００３０】
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記分化誘導性合成ペプチドが有する幹細胞分化誘導能や膜透過性ペプチドが有する細胞外から細胞内への移行能）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様に幹細胞分化誘導性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
【００３１】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、１以上、好ましくは２以上の種々の細胞、組織、または臓器に分化し得る細胞をいう。本明細書において、幹細胞はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体性幹細胞（組織性幹細胞ともいう）等であり得るが、上記の能力を有している限り、それらに限定されない。
本明細書において「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胎盤などの胚体外組織を除く、一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化することが可能な能力を有し、さらに、未分化状態で自己複製能を有する幹細胞をいう。本明細書において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞であり得るが、上記の能力を有している限り、それらに限定されない。
【００３２】
本明細書において「内胚葉系細胞」とは、内胚葉を構成する細胞（以下内胚葉細胞ともいう）、内胚葉由来の組織を構成する細胞（以下内胚葉系分化細胞ともいう）、ならびに該内胚葉由来の組織を構成する細胞に分化し得る種々の体性幹細胞および前駆細胞（以下、内胚葉系幹細胞もしくは内胚葉系前駆細胞ともいう）をいう。例えば、内胚葉細胞（典型的には胚体内胚葉細胞）、内胚葉由来の体性幹細胞および前駆細胞、ならびに内胚葉由来の組織を構成する分化細胞（成熟細胞）等が挙げられる。
上記内胚葉由来の組織として、食道上皮、胃上皮、消化管上皮（十二指腸上皮、小腸上皮、大腸上皮、直腸上皮等）、肝臓、膵臓、胆のう、咽喉頭上皮、気管上皮、肺、甲状腺、胸腺、膀胱、尿道、耳管、鼓膜等が例示されるが、本願出願当時に内胚葉から分化することが知られている組織であればこれらに限定されない。また、上記内胚葉系幹細胞（内胚葉系前駆細胞）として、肝幹細胞、肝前駆細胞、肝芽細胞、膵前駆細胞、腸管上皮前駆細胞等が例示されるが、当該細胞についても、本願出願当時に内胚葉由来組織を構成する細胞に分化し得る種々の体性幹細胞および前駆細胞であることが知られている細胞であればこれらに限定されない。
また、本明細書において、「肝前駆細胞」とは、内胚葉細胞（典型的には胚体内胚葉細胞）よりも分化が進んだ細胞であり、肝細胞へ分化し得る能力を有する細胞をいう。
【００３３】
ここで開示される多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導し得る幹細胞分化誘導剤は、所定の多能性幹細胞の培養細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加される）に該細胞を内胚葉系細胞に分化誘導し得る或いは分化誘導を促進し得るという分化誘導活性を有するペプチド（即ち分化誘導性合成ペプチド）の少なくとも1種を有効成分（即ち多能性幹細胞の内胚葉系細胞への分化誘導に関与する物質）として含むことで特徴付けられる組成物である。
【００３４】
上述のとおり、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化誘導させることが本発明者によって見出された幹細胞分化誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチドである。そして、該幹細胞分化誘導性ペプチド配列は、ＡＰＰファミリーに属するいずれかのタンパク質のシグナルペプチド配列又は該シグナルペプチド配列の部分アミノ酸配列（即ち、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列）、又はこれらのアミノ酸配列の改変アミノ酸配列から設定される。
ここで、ＡＰＰファミリーに属するタンパク質とは、典型的にはＡＰＰ、ＡＰＬＰ１、またはＡＰＬＰ２をいう。ＡＰＰとは、アルツハイマー病の発症機序の一説であるアミロイド仮説において、いわばアルツハイマー病の出発物質ともいうべきタンパク質であり、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２は当該ＡＰＰの類縁タンパク質として知られるタンパク質である。
【００３５】
本発明の実施に当たって好ましく使用されるＡＰＰファミリーに属するタンパク質のシグナルペプチド配列は、配列番号１〜６にそれぞれ示されている。
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成する合計２９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
また、配列番号２のアミノ酸配列は、マウス由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成する合計２９アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
また、配列番号３のアミノ酸配列は、ヒト由来のＡＰＬＰ１のシグナルペプチドを構成する合計３８アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
また、配列番号４のアミノ酸配列は、マウス由来のＡＰＬＰ１のシグナルペプチドを構成する合計３７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
また、配列番号５のアミノ酸配列は、ヒト由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成する合計１７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
また、配列番号６のアミノ酸配列は、マウス由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成する合計１７アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
そして、本発明の分化誘導性合成ペプチドを構成するに当たっては、幹細胞分化誘導性ペプチド配列として、上記配列番号１〜６に示すアミノ酸配列をそのまま適用することができる。
なお、上記の配列番号１〜６には、ヒトもしくはマウス由来のＡＰＰ、ＡＰＬＰ１、若しくはＡＰＬＰ２のシグナルペプチド配列を示したが、当該配列はあくまでも例示であり、利用可能なアミノ酸配列はこれに限定されない。例えば、ラット、モルモット等の齧歯類、ウマ、ロバ等の奇蹄類、ブタ、ウシ等の偶蹄類、チンパンジー、オランウータン、カニクイザル等の霊長類等（典型的には哺乳動物）に由来する種々のＡＰＰ、ＡＰＬＰ１若しくはＡＰＬＰ２のシグナルペプチド配列を使用可能である。
【００３６】
或いは、幹細胞分化誘導性ペプチド配列として、ＡＰＰファミリーに属するタンパク質のシグナルペプチド配列の一部の連続するアミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列（以下単に部分アミノ酸配列ともいう）を使用することができる。例えば、本発明の実施にあたっては、配列番号１６〜２５に示すアミノ酸配列を少なくとも有する部分アミノ酸配列を幹細胞分化誘導性ペプチド配列として好適に使用することができる。
ここで、本明細書において「少なくとも有する」とは、特定の連続したアミノ酸残基（典型的には配列番号１６〜２５に示すいずれかのアミノ酸残基）を必須のアミノ酸配列として有し、それよりもＣ末端側のアミノ酸配列とＮ末端側のアミノ酸配列とは任意であることを意味する。即ち、上記の部分アミノ酸配列は、特定の連続したアミノ酸残基（典型的には配列番号１６〜２５に示すアミノ酸残基）よりもＣ末端に１個、２個、３個、４個、・・・・又はＸＣ個のアミノ酸残基及び／又はＮ末端に１個、２個、３個、４個、・・・・・又はＸＮ個のアミノ酸残基をさらに有するアミノ酸配列であり得る。なお、Ｃ末端側にＸＣ個目のアミノ酸残基とは全長のシグナルペプチド配列のＣ末端のアミノ酸残基のことをいい、Ｎ末端側にＸＮ個目のアミノ酸残基とは全長のシグナルペプチド配列のＮ末端のアミノ酸残基のことをいう。
【００３７】
配列番号１６〜２５に示すアミノ酸配列は、具体的には以下のとおりである。
即ち、配列番号１６に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１５番目のロイシン残基から２７番目のアラニン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号１７に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１６番目のロイシン残基から２７番目のアラニン残基までの１２個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号１８に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１９番目のプロリン残基から３１番目のロイシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号１９に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて２６番目のロイシン残基から３８番目のグリシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２０に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１８番目のプロリン残基から３０番目のロイシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２１に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて２５番目のロイシン残基から３７番目のグリシン残基までの１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２２に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基までの１４個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２３に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目のアラニン残基までの１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２４に示すアミノ酸配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基までの１４個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２５に示すアミノ酸配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目のアラニン残基までの１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
【００３８】
幹細胞分化誘導性ペプチド配列のうちの上記配列番号１６に示すアミノ酸配列を少なくとも有する部分アミノ酸配列の好適例として、配列番号２７および配列番号２８に示すアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号２７に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて７番目のアラニン残基から２９番目のアラニン残基までの合計２３アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。換言すると、配列番号２７に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、配列番号１６に示すアミノ酸配列のＮ末端側にさらに８個のアミノ酸残基を有し、且つ配列番号１６に示すアミノ酸配列のＣ末端側にさらに２個のアミノ酸残基を有する合計２３アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
配列番号２８に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１４番目のアルギニン残基から２９番目のアラニン残基までの合計１６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。換言すると、配列番号２７に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、配列番号１６に示すアミノ酸配列のＮ末端側にさらに１個のアミノ酸残基を有し、且つ配列番号１６に示すアミノ酸配列のＣ末端側にさらに２個のアミノ酸残基を有する合計１６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列である。
【００３９】
或いはまた、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、上述した幹細胞分化誘導性ペプチド配列のみから成るペプチドであってもよいが、幹細胞分化誘導活性の向上の観点からは、Ｎ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドが好ましい。当該膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、特にＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が分化誘導性合成ペプチドの膜透過ペプチドペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。配列番号７〜１５に、上記ＮｏＬＳに関連する膜透過性ペプチド配列および他の膜透過性ペプチド配列（改変アミノ酸配列を含む）の好適例を挙げる。具体的には以下のとおりである。
【００４０】
即ち、配列番号７のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、アデノウイルスのＰＴＰ（新生末端タンパク質：pre-terminal protein）１及びＰＴＰ２由来の合計１３アミノ酸残基からなるＮｏＬＳに対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１２のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１３のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１６アミノ酸配列から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１４のアミノ酸配列は、ポリアルギニンとして、連続した合計９個のアルギニン残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号１５のアミノ酸配列は、ＭｙｏＤ（筋芽細胞決定因子：myoblast determination）ファミリー阻害ドメイン含有タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００４１】
特に、特許文献４にも記載されている配列番号７に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号７に示すアミノ酸配列と上述の幹細胞分化誘導性ペプチド配列とを組み合わせることにより、高い幹細胞分化誘導性を示す合成ペプチドを得ることができる。
【００４２】
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２６）
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２９）
ＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３０）
ＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３１）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＫＬＬＶＬＬＬＬＧＬＴＡＰＡＡＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３２）
ＭＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＲＬＬＬＬＬＬＶＧＬＴＡＰＡＬＡＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３３）
ＭＧＰＡＳＰＡＡＲＧＬＳＲＲＰＧＱＰＰＬＰＬＬＬＰＬＬＬＬＬＬＲＡＱＰＡＩＧＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３４）
のうちのいずれかを特に好ましく含む。
配列番号２６に示すアミノ酸配列は、配列番号１６に示すヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号１）の部分アミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とをリンカーとしての１個のグリシン残基（G）を介して組み合わせることにより構築された合計２７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号２９に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すヒト由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計３０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号３０に示すアミノ酸配列は、配列番号２７に示すヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号１）の部分アミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計３６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号３１に示すアミノ酸配列は、配列番号２８に示すヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号１）の部分アミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計２９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号３２に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すマウス由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計４２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号３３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計４２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
配列番号３４に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すヒト由来のＡＰＬＰ１のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列と、上記の配列番号７に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列とを隣接して組み合わせることにより構築された合計５１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
【００４３】
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したような幹細胞分化誘導性ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、幹細胞誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
【００４４】
幹細胞分化誘導活性を失わない限りにおいて、幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分アミノ酸配列としては幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該分化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に分化誘導性合成ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）で多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する幹細胞分化誘導能を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、幹細胞分化誘導剤に適用する分化誘導性合成ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には６０以下（特に３０以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。
【００４５】
全体のアミノ酸配列に対する幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占める幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する幹細胞分化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。幹細胞分化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一形態である。
なお、本発明の分化誘導性合成ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する幹細胞分化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００４６】
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００４７】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて分化誘導性合成ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する分化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の分化誘導性合成ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００４８】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の分化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した分化誘導性合成ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち分化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
【００４９】
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、分化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、分化誘導性合成ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００５０】
ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、上記幹細胞分化誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記幹細胞分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００５１】
ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、有効成分である分化誘導性合成ペプチドをその幹細胞分化誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。幹細胞分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、幹細胞分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
幹細胞分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、分化誘導性合成ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００５２】
ここで開示される幹細胞分化誘導剤（分化誘導性合成ペプチド）の適用対象である多能性幹細胞は特に制限されず、種々の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する(若しくは分化誘導を促進する)ことが可能である。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）由来のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が挙げられる。ここで開示される幹細胞分化誘導剤（分化誘導性合成ペプチド）は、特にｉＰＳ細胞が適用対象として好ましい。
【００５３】
ここで開示される幹細胞分化誘導剤（分化誘導性合成ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、生体外（インビトロ）で培養（継代）している多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞株）を分化誘導させる場合においては、ここで開示される幹細胞分化誘導剤（即ち分化誘導性合成ペプチド）の適当量を、分化誘導を行う対象の多能性幹細胞に対し、培養過程のいずれかの段階（好ましくは未分化状態を維持しつつ所定期間の培養（増殖）や継代を行った後）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。多能性幹細胞を培養する場合、培地中の分化誘導性合成ペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
また、ここで開示される幹細胞分化誘導剤（分化誘導性合成ペプチド）は、対象とする多能性幹細胞の種類や目的（例えば分化誘導する目的の内胚葉系細胞の種類等）に応じ、他の細胞分化誘導因子と併用することができる。係る細胞分化誘導因子としては、例えば、レチノイン酸、種々の骨形成因子（ＢＭＰファミリーに属する因子）、アクチビン等のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する因子、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）等のＦＧＦスーパーファミリーに属する因子、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、コリン作動性神経分化因子（ＣＤＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）その他のサイトカインファミリーに属する因子、各種インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。
【００５４】
或いはまた、インビトロで培養（継代）している多能性幹細胞(例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞)から目的の内胚葉系細胞（延いては分化した細胞、組織、器官等）を効率よく分化誘導（生産）することができる。即ち、ここで開示される分化誘導方法（インビトロでの内胚葉系細胞又は該内胚葉系細胞を増殖、成長させた組織体や器官の生産方法）を採用することによって、生体外（インビトロ）で効率よく分化誘導した目的の内胚葉系細胞（或いは該内胚葉系細胞を増殖、成長させた組織体等）を、修復や再生が必要とされる患部に（即ち患者の生体内）に戻すことにより、当該修復や再生を効果的に行うことができる。組織体の再生が有力な治療法となる種々の疾患を効率的に治療することが可能となる。また、ここで開示される分化誘導方法によって生体外で分化誘導された内胚葉系細胞は、例えば肝不全、肝臓がん、糖尿病、膵臓がん、および消化器系のがん等の内胚葉系由来組織が侵される疾患（典型的には当該組織の機能不全）や該組織の損傷を再生医療的アプローチによって治療することに資する医療用資材として使用することができる。
【００５５】
或いはまた、インビトロ培養系で大量に分化誘導された肝前駆細胞や肝細胞を医薬品の毒性及び有効性の評価に資することで、当該評価の効率および精度の向上およびコストの削減が実現可能である。また、インビトロ培養系で大量に分化誘導された内胚葉系細胞（例えば膵細胞等）を利用することで、該細胞由来の生合成物、典型的には分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質（例えばインスリン等）を生産することができる。
【００５６】
或いはまた、インビトロ培養系で大量に分化誘導された内胚葉系細胞材料（内胚葉系細胞、あるいは内胚葉系細胞を含む細胞塊や組織）を試験対象とすることで、従来は評価が困難であった試験の実施が可能となる。例えば、疾患の病態解明や治療薬の研究開発等の分野において、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞材料を利用することで、効率的な研究が実現される。
以上の説明から明らかなように、本発明はまた、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドのいずれかを利用することによって、内胚葉系細胞から分化誘導された細胞、細胞塊、組織、器官等を提供することができる。
【００５７】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００５８】
＜実施例１：ペプチド合成＞
配列番号２６および配列番号２９〜３４に示す各アミノ酸配列から成る計７種類の合成ペプチドを、後述するペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、当該合成ペプチドを配列番号の順番に即してサンプル１〜サンプル７と呼称する。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
【００５９】
【表１】
0006478116.tif 000002
【００６０】
表１に示すように、各サンプルに係るペプチドは、いずれもペプチド鎖のＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有し、該配列に隣接して或いは１個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介して、そのＮ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列を有している。
具体的には、サンプル１は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（配列番号１６）を有し、該配列のＣ末端側に１個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介して膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計２７アミノ酸残基から成るペプチドである。かかるサンプル１に係るペプチドは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。
サンプル２は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＰのシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号５）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計３０アミノ酸残基から成るペプチドである。かかるサンプル２に係るペプチドは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。
サンプル３は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（配列番号２７）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計３６アミノ酸残基から成るペプチドである。
サンプル４は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（配列番号２８）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計２９アミノ酸残基から成るペプチドである。
サンプル５は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてマウス由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号２）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計４２アミノ酸残基から成るペプチドである。
サンプル６は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＬＰ２のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号１）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計４２アミノ酸残基から成るペプチドである。
サンプル７は、Ｎ末端側に幹細胞分化誘導性ペプチド配列としてヒト由来のＡＰＬＰ１のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（配列番号３）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号７）を有する合計５１アミノ酸残基から成るペプチドである。
【００６１】
上記サンプル１〜サンプル７に係るペプチドはいずれも直鎖状のペプチドである。これらのペプチドはいずれも市販のペプチド合成機（Intavis AG社製）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成したペプチドは、ＤＭＳＯを１容量とエタノールを１容量とを混合した溶媒（ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ＝１／１）に溶かし、ストック液を調製した。
【００６２】
＜実施例２：ｉＰＳ細胞形態変化に基づく分化誘導性合成ペプチドの幹細胞分化誘導活性の評価試験＞
上記実施例１で得られた分化誘導性合成ペプチド（サンプル１）について、インビトロで培養・継代したｉＰＳ細胞の形態変化に基づいて評価される分化誘導活性を調べた。また、比較例としてペプチド無添加区を設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００６３】
本実施例で使用するヒト由来のｉＰＳ細胞（クローン名：２０１Ｂ２若しくは２０１Ｂ７、出典元：Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872(2007)）は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたものを使用した。また、該ｉＰＳ細胞の培養に使用するフィーダー細胞として、ｉＰＳ細胞の継代（維持）ではマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を、分化誘導性合成ペプチド（サンプル１）の幹細胞分化誘導活性を評価する試験ではBaylor College of Medicineよりライセンス供与されたマウス胎児線維芽細胞（細胞株ＳＮＬ７６／７）を、それぞれ使用した。
マイトマイシンＣ処理して不活化したフィーダー細胞を、ｉＰＳ細胞を播種する１〜４日前に、ゼラチンコートした２４穴（ウェル）プレートに予め播種しておいた。ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播種する直前に、該フィーダー細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、０．５ｍＬ／ｗｅｌｌのＥＳＣ培地（即ち、１５％のＫＳＲ（Knockout（商標） Serum Replacement：Life Technologies社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ-Ｆ１２培地）に交換することによって、評価用フィーダー細胞とした。
ｉＰＳ細胞は、６ｃｍ培養皿１枚若しくは２枚に適当な細胞数になるまで、マイトマイシンＣ処理したＭＥＦ細胞上にて継代維持した。当該ｉＰＳ細胞をＣＴＫ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Life Technologies社製）、１ｍＭの塩化カルシウム、２０％のＫＳＲを含む０．２５％トリプシン溶液）を用いて、ｉＰＳ細胞のコロニー辺縁部が剥離する程度に剥離処理した。ＣＴＫ溶液をＰＢＳ（−）で洗浄除去し、ＥＳＣ培地２ｍＬを添加した後、セルスクレーパーを用いてｉＰＳ細胞コロニーを完全に剥離した。１５ｍＬ遠心チューブにｉＰＳ細胞コロニーが懸濁した培養皿中のＥＳＣ培地を移し、さらに、培養皿に残ったｉＰＳ細胞コロニーをＥＳＣ培地で洗い込んで該１５ｍＬチューブに回収した。上記１５ｍＬチューブを５分間静置してｉＰＳ細胞コロニーを沈殿させ、上澄みを取り除いた後、新鮮なＥＳＣ培地中にピペッティングにてｉＰＳ細胞コロニーを分散懸濁させ、ｉＰＳ細胞懸濁液を用意した。上記のとおりに作成しておいたＳＮＬ７６／７フィーダー細胞上に、該ｉＰＳ細胞懸濁液を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。ここに、ペプチド濃度が２ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ＝１／１で調製したサンプル１を２．０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し（即ち、ウェル中のペプチド濃度は４．０μＭとなる）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でｉＰＳ細胞の培養を行った。なお、コントロール区として、ペプチドを添加しないペプチド無添加区を設けた。
ｉＰＳ細胞の培養開始から２日経過後、４日経過後、６日経過後に培地交換とペプチド添加を行った。具体的には、各ウェルから培地を除去し、新鮮なＥＳＣ培地を１ウェルあたり１ｍＬ注入し且つペプチド濃度が２ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ＝１／１で調製したサンプル１を２．０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。ｉＰＳ細胞の培養開始から計７日間はペプチド存在下で培養を行った。７日目以降は２日毎に培地交換のみ行い、任意の期間の培養を行った。
【００６４】
培養開始から８日経過時点の培養ｉＰＳ細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を図１、２に示す。上記期間培養したｉＰＳ細胞は、コロニーを形成しつつ増殖し、隣接するコロニー同士が融合した状態にある。分化したｉＰＳ細胞即ち当該細胞で構成されるコロニーは、形態が変化（具体的には細胞質が肥大）することで光の透過性が向上し、光学顕微鏡下で白っぽく観察される。一方、未分化のｉＰＳ細胞即ち当該細胞で構成されるコロニーは光透過性が低いため、光学顕微鏡下で黒っぽく観察される。
ペプチド無添加区では、図２に示すように、顕微鏡視野のほとんど（８０％以上）を顕微鏡下で黒っぽく観察される未分化のｉＰＳ細胞で構成されるコロニーが占めることが認められた。また、白っぽく観察される分化したコロニーが視野中に１，２個観察された。培養期間を延長すると当該分化コロニーの数は増加した。当該分化コロニーは、本実施例にかかるペプチド無添加培養条件での培養期間延長に従い自然に分化するｉＰＳ細胞で構成されるコロニーである。
一方、サンプル１添加区では、図１に示すように、顕微鏡視野のほとんど（８０％以上）を顕微鏡下で顕著に白っぽく観察される分化したｉＰＳ細胞で構成させるコロニーが占めることが認められた。図1と図２の比較から、ここで開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が多能性幹細胞の分化誘導を著しく促進することが視覚的に確認された。
【００６５】
＜実施例３：定量ＲＴ−ＰＣＲ法による分化誘導性合成ペプチドの幹細胞分化誘導活性の評価試験＞
上記実施例１で得られた分化誘導性合成ペプチド（サンプル１）の幹細胞分化誘導活性について、幹細胞の分化マーカー遺伝子（即ち、幹細胞マーカー遺伝子）および三胚葉系細胞の各分化マーカー遺伝子の発現量の経時的変化を定量することで評価した。供試細胞として、インビトロで培養・継代したｉＰＳ細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００６６】
ペプチド濃度が４ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ＝１／１で調製したサンプル１を１．５μＬ／ｗｅｌｌ（即ち、ウェル中のペプチド濃度は６．０μＭとなる）添加した以外は実施例２と同様にして、ｉＰＳ細胞（クローン名：２０１Ｂ２若しくは２０１Ｂ７）の培養を行った。なお、比較例として、ペプチド無添加区を設けた。ｉＰＳ細胞の培養開始から２日経過後、４日経過後、６日経過後に培地交換とペプチド添加を行った。具体的には、各ウェルから培地を除去し、新鮮なＥＳＣ培地を１ウェルあたり１ｍＬ注入し且つペプチド濃度が４ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ＝１／１で調製したサンプル１を１．５μＬ／ｗｅｌｌずつ（即ち、ウェル中のペプチド濃度は６．０μＭとなる）添加した。ｉＰＳ細胞の培養開始から計７日間はペプチド存在下で培養を行った。７日目以降は２日毎に培地交換のみ行い、任意の期間の培養を行った。
【００６７】
ｉＰＳ細胞の培養開始後の任意の日にｉＰＳ細胞を回収し、ｉＰＳ細胞のＲＮＡを市販のＲＮＡ抽出・精製キット（High Pure RNA Isolation Kit：Roche Applied Science社製）を用いて抽出し、精製した。操作はすべてＲＮＡ分解酵素（ＲＮase）非存在下で行い、キットに添付のマニュアルどおりに行った。精製したＲＮＡは吸光度を測定することにより定量した。
【００６８】
精製したＲＮＡ２５μｇ〜５０μgを定量ＲＴ−ＰＣＲに供し、幹細胞マーカー遺伝子および三胚葉系細胞の各分化マーカー遺伝子の発現量を定量した。具体的には、幹細胞マーカー遺伝子としてＯｃｔ３／４遺伝子、外胚葉系細胞の分化マーカー遺伝子（即ち外胚葉系細胞マーカー遺伝子）としてＮＥＳ遺伝子、中胚葉系細胞の分化マーカー遺伝子（即ち中胚葉系細胞マーカー遺伝子）としてＢｒｙ遺伝子、そして、内胚葉系細胞の分化マーカー遺伝子（即ち内胚葉系細胞マーカー遺伝子）としてＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＡＦＰの各遺伝子の発現量をそれぞれ調べた。また、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子（内在性コントロール）を採用した。定量ＲＴ−ＰＣＲにはOne Step SYBR（登録商標） PrimeScript（登録商標） PLUS RT-PCR Kit（TaKaRa Bio社製）を用い、添付のマニュアルどおりに行った。リアルタイムＰＣＲシステムとしてABI PRISM（商標） 7700（Life Technologies社製）を用いた。プライマーは、Perfect Real Time サポートシステム（TaKaRa Bio社製）を利用して入手した。定量ＲＴ−ＰＣＲ反応は、４２℃で５分インキュベーションして逆転写反応を行った後、９５℃で１０秒インキュベーションし、続いて９５℃５秒、６３℃３１秒のサイクルを４０サイクルする条件で行った。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは表２に示すとおりである。
【００６９】
【表２】
0006478116.tif 000003
【００７０】
幹細胞マーカー遺伝子および三胚葉系細胞の各分化マーカー遺伝子の発現量を定量した結果を図３に示す。なお、上記遺伝子の発現量は、それぞれ各試験区におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した後、ペプチド無添加区における当該遺伝子の発現量に対するサンプル１添加区における該遺伝子の相対発現量をΔΔＣｔ法により求めた。
【００７１】
図３に示すように、培養開始後１３日目以降のサンプル１添加区のｉＰＳ細胞において、内胚葉マーカー遺伝子であるＡＦＰ遺伝子の相対発現量が他の遺伝子の相対発現量に比べて顕著に増加することを確認した。特に、培養開始後２０日目のサンプル１添加区のｉＰＳ細胞におけるＡＦＰ遺伝子の相対発現量の増加が極めて顕著であることを確認した。これらの結果は、ここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化させる幹細胞分化誘導活性を有することを示している。
また、内胚葉系細胞マーカー遺伝子であるＡＦＰ遺伝子（およびＡＦＰ）は、肝前駆細胞の分化マーカー遺伝子（および分化マーカータンパク質）としても知られる遺伝子（およびタンパク質）であり、多くの文献において、多能性幹細胞から肝前駆細胞および肝細胞へ分化する過程を把握する目的で当該遺伝子発現およびタンパク質発現の経時的な変化が評価されている（非特許文献１、２）。したがって、上記の結果は、ここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を肝前駆細胞に分化させる幹細胞分化誘導活性を有することも示している。
【００７２】
＜実施例４：分化誘導性合成ペプチドの幹細胞分化誘導活性に関するＡＦＰおよびＡＬＢの発現量の評価試験＞
上記実施例１で得られた分化誘導性合成ペプチド（サンプル１）の幹細胞分化誘導活性について、内胚葉系細胞への分化の指標として知られているタンパク質であるＡＦＰおよびＡＬＢの発現量（典型的には細胞外への分泌量）の経時的変化を定量することで評価した。ＡＦＰは内胚葉系細胞の中でも肝前駆細胞に分化した細胞で発現することが知られており、ＡＬＢは実質的に肝細胞の機能を有するまで分化した細胞（即ち肝細胞あるいは肝細胞様細胞）で発現することが知られている。即ち、本実施例では内胚葉系細胞の分化マーカーの中でも、肝前駆細胞の分化マーカータンパク質としてＡＦＰを採用し、肝細胞（或いは肝細胞様細胞）の分化マーカータンパク質としてＡＬＢを採用した。供試細胞として、インビトロで培養・継代したｉＰＳ細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００７３】
実施例３と同様にして、サンプル１添加区（培地中のペプチド濃度は６μＭ）およびペプチド無添加区（比較例）のｉＰＳ細胞（クローン名：２０１Ｂ２若しくは２０１Ｂ７）を培養した。そして、ｉＰＳ細胞の培養開始後の任意の日に、サンプル１添加区およびペプチド無添加区の各ｉＰＳ細胞を培養している培養液（即ち、培養上清）を一部回収し、−８０℃に保存した。
【００７４】
回収した培養上清をＡＦＰおよびＡＬＢを検出する酵素結合免疫測定法（enzyme-linked immunoassay, ＥＩＡもしくはＥＬＩＳＡともいう）に供し、各培養上清中のＡＦＰおよびＡＬＢ濃度を定量した。ＡＦＰのＥＬＩＳＡにはQuantikine ELISA Human AFP  （R&D Systems 社製）を、ＡＬＢのＥＬＩＳＡにはAlbumin Human ELISA kit （abcam社製）を、それぞれ用いて添付のマニュアルどおりに行った。
【００７５】
まず、ＡＦＰのＥＬＩＳＡについて説明する。具体的には、検量線用サンプルとして０．１２から７．５ｎｇ／ｍＬに希釈したヒトＡＦＰ標準タンパク液と、盲検（ブランク）用サンプルとしてＥＳＣ培地と、評価用サンプルとして４０倍から６４０倍にＥＳＣ培地にて希釈した上記培養上清とを、それぞれ準備した。付属の希釈液１００μＬをＥＬＩＳＡ用ウェルに添加後、上記各サンプルをそれぞれＥＬＩＳＡ用ウェルにそれぞれ５０μＬずつ添加し、室温にて２時間静置した。所定時間経過後、ＥＬＩＳＡウェル中のサンプルを除去し、洗浄用バッファーにて４回洗浄した。その後、各ウェルに付属の標識抗体溶液を２００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。所定時間経過後、各ウェルから上記抗体溶液を除去し、洗浄用バッファーにて４回洗浄した。
そして、付属の発色試薬（Ａ）１容量と発色試薬（Ｂ）１容量とを混和した基質溶液を各ウェルに２００μＬずつ添加し、暗所で３０分間静置した。所定時間経過後、付属の反応停止液を各ウェルに５０μＬずつ更に添加し、発色反応を停止した。その後、各ウェル中の反応液について、４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０および５５０ｎｍにおける吸光度Ａ５５０を分光光度計を用いて測定した。
【００７６】
次に、ＡＬＢのＥＬＩＳＡについて説明する。具体的には、検量線用サンプルとして３．１３から１００ｎｇ／ｍＬに希釈したヒトＡＬＢ標準タンパク液と、盲検（ブランク）用サンプルとしてＥＳＣ培地と、評価用サンプルとしてＥＳＣ培地にて１倍から１０倍に希釈した上記培養上清とを、それぞれ準備した。上記各サンプルをそれぞれＥＬＩＳＡ用ウェルに５０μＬ添加し、室温にて１時間静置した。所定時間経過後、ＥＬＩＳＡウェル中のサンプルを除去し、洗浄用バッファーにて４回洗浄した。その後、各ウェルに付属の１×Biotinylated Alubumin Antibody（ビオチン標識抗体溶液）を５０μＬ添加し、室温にて３０分静置した。所定時間経過後、各ウェルから上記抗体溶液を除去し、洗浄用バッファーにて４回洗浄した。その後、各ウェルに付属の１×SP Conjugate（アビジン標識抗体溶液）を５０μＬ添加し、室温にて３０分静置した。所定時間経過後、各ウェルから上記抗体溶液を除去し、洗浄用バッファーにて４回洗浄した。
そして、付属のChromogen Substrate Solution（発色試薬）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、暗所で１５分間静置した。所定時間経過後、付属の反応停止液を各ウェルに５０μＬずつ更に添加し、発色反応を停止した。その後、各ウェル中の反応液について、４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０および５５０ｎｍにおける吸光度Ａ５５０を分光光度計を用いて測定した。
【００７７】
ＡＦＰ評価試験群およびＡＬＢ評価試験群の各サンプルについて、それぞれ上記測定により得られた吸光度Ａ４５０から吸光度Ａ５５０を差し引いた吸光度Ａ（４５０−５５０）（即ち、吸光度Ａ（４５０−５５０）＝吸光度Ａ４５０−吸光度Ａ５５０）をそれぞれ算出した。そして、ＡＦＰ評価試験群およびＡＬＢ評価試験群のそれぞれについて、検量線用サンプルの吸光度Ａ（４５０−５５０）から検量線を作成し、当該検量線と評価用サンプルの吸光度Ａ（４５０−５５０）から、各試験区の培養上清中のＡＦＰ濃度（ng/mL）もしくはＡＬＢ濃度（ng/mL）を算出した。結果を図４に示す。
【００７８】
図４に示すように、サンプル１添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量は、同じ期間培養したペプチド無添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量と比較して、ｉＰＳ細胞の培養開始後８日目ごろから培養期間を延長するに従って顕著に増大し、培養開始後２２日目にピークに達した後、培養期間の延長に従って減少することを確認した。
肝前駆細胞におけるＡＦＰ分泌量（即ちＡＦＰ発現量）は肝前駆細胞の分化段階（分化ステージ）で変化することが知られている。具体的には分化ステージが早い細胞（即ち分化度が低い細胞、内胚葉細胞に近い肝前駆細胞、低分化細胞）ではＡＦＰ発現量は少なく、分化ステージが進むに従いＡＦＰ発現量は増加し、更に分化ステージが進んだ細胞（即ち分化度が高い細胞、肝細胞に近い肝前駆細胞、高分化細胞）ではＡＦＰ発現量が減少する。上記サンプル１添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量の顕著な増加とその後の減少は、上記肝前駆細胞の分化ステージの進行に伴うＡＦＰ発現量の推移と一致する。
【００７９】
また、サンプル１添加区から回収した培養上清中のＡＬＢ量は、図４に示すように、同じ期間培養したペプチド無添加区から回収した培養上清中のＡＬＢ量と比較して、ｉＰＳ細胞の培養開始後１６日目ごろから培養期間を延長するに従って顕著に増大し、培養開始後２５日目にピークに達した後、培養期間の延長に従って減少することを確認した。
内胚葉細胞から肝細胞へと分化が進行する過程において、ＡＬＢはＡＦＰよりも遅れて発現し始め、さらに分化ステージが進行するに従ってＡＬＢの分泌量（即ちＡＬＢ発現量）が増加した後で該ＡＬＢ発現量は徐々に減少することが知られている。上記のとおり、サンプル１添加区から回収した培養上清において、ＡＦＰより遅れてＡＬＢが発現し始め、さらに顕著に増加した後に減少するというＡＬＢの発現パターンは、上記内胚葉細胞から肝細胞への分化ステージの進行に伴うＡＬＢ発現量の推移と一致する。
【００８０】
以上の結果より、ここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化させる幹細胞分化誘導活性を有していることを示している。また、上記の結果はここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を肝前駆細胞および肝細胞（肝細胞様細胞）に分化させる幹細胞分化誘導活性を有していることも示している。
【００８１】
また、サンプル１添加区のｉＰＳ細胞では、内胚葉系細胞マーカー遺伝子（胚体内胚葉マーカー遺伝子としても知られる）であるＳＯＸ１７遺伝子、ＧＡＴＡ４遺伝子およびＦＯＸＡ２遺伝子の発現がＡＦＰ遺伝子の発現に先行することも確認した（図３参照）。上記マーカー遺伝子の発現量の推移（マーカー遺伝子の発現プロファイル）は、サンプル１添加区のｉＰＳ細胞がまず内胚葉細胞（典型的には胚体内胚葉細胞）に分化誘導されたことを示している。上記内胚葉系細胞マーカー遺伝子発現細胞が、培養期間を延長するとさらに分化が進んだ内胚葉系細胞（即ち肝前駆細胞、肝細胞）に分化したこと（実施例３、４）からも、当該内胚葉系細胞マーカー遺伝子発現細胞が内胚葉細胞であることは明らかである。このことは、ここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を内胚葉細胞（典型的には胚体内胚葉細胞）に分化させる幹細胞分化誘導活性を有していることを示している。
【００８２】
＜実施例５：分化誘導性合成ペプチドの幹細胞分化誘導活性に関するＡＦＰの発現量の評価試験＞
上記実施例１で得られた分化誘導性合成ペプチド（サンプル２〜７）の幹細胞分化誘導活性について、ＡＦＰの発現量（典型的には細胞外への分泌量）の経時的変化を測定することで評価した。ＡＦＰは内胚葉系細胞の中でも肝前駆細胞に分化した細胞で発現することが知られる分化マーカータンパク質である。供試細胞として、インビトロで培養・継代したｉＰＳ細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００８３】
実施例３と同様にして、ｉＰＳ細胞（クローン名：２０１Ｂ２若しくは２０１Ｂ７）を培養する培地中のペプチド濃度が６．０μＭとなるようにサンプル２〜７に係るペプチドをそれぞれ添加して培養した（サンプル２〜７添加区）。また、コントロール区として、ペプチドを添加することなく上記サンプル２〜７添加区と同様の条件で培養を行うペプチド無添加区（比較例）を設けた。そして、ペプチド存在下でのｉＰＳ細胞の培養開始後の任意の日（８日目、１１日目、１３日目、１５日目、１８日目、および２０日目）に、サンプル２〜７添加区およびペプチド無添加区の各ｉＰＳ細胞を培養している培養液（即ち、培養上清）を一部回収した。
【００８４】
上記回収した培養上清に含まれるＡＦＰを以下のドットブロット法（Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出した。具体的には以下のとおりである。
まず、回収した各培養上清を、ＰＢＳを用いて１００倍希釈した。かかる希釈後の培養上清をそれぞれ２μＬずつニトロセルロース膜（GE Healthcare社製、Amersham（登録商標） Protan Premium NC 0.2、Cat. No. 10600081）上に重ならないように間隔をあけてスポット（滴下）した。そして、当該各培養上清を滴下したニトロセルロース膜を、０．１％のTween20（商標）を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）中で振盪して洗浄した。そして、上記洗浄後のニトロセルロース膜をStartingBlock T20 (PBS) Blocking Buffer（Pierce社製）中に浸し、４℃で一晩（凡そ１６〜２４時間）振盪してブロッキング処理した。ブロッキング処理後のニトロセルロース膜は、ＰＢＳＴ中で振盪して洗浄した。
次いで、上記ニトロセルロース膜上にスポットした培養上清中に含まれるＡＦＰを検出するために、一次抗体としての抗ＡＦＰ抗体（ラビット由来、Dako Cytomation社製、Cat. No. A0008, Lot. No. 00052184）および二次抗体としてのＨＲＰ（Horseradish Peroxidase）で標識した抗ラビットＩｇＧ抗体（ヤギ由来、GE Healthcare社製、Cat. No. NA934V, Lot. No. 399405）を、用いて抗原抗体反応を行った。具体的には、上記一次抗体をCan Get signal（登録商標）immunoreaction enhancer（東洋紡社製）を用いて５０００倍希釈し、該一次抗体希釈液中に上記ニトロセルロース膜を浸して室温（凡そ２５℃）で約１時間反応させた。次いで、一次抗体による抗原抗体反応が終了したニトロセルロース膜をＰＢＳＴ中で振盪して洗浄した。そして、上記二次抗体をCan Get signal（登録商標）immunoreaction enhancer（東洋紡社製）を用いて１００００倍希釈した二次抗体希釈液中に上記洗浄後のニトロセルロース膜を浸して、室温（凡そ２５℃）で約１時間反応させた。
【００８５】
そして、上記二次抗体による抗原抗体反応が終了したニトロセルロース膜にLumina Crescendo Western HRP Substrate（Merck Millipore社製）を滴下してＨＲＰ標識抗体（二次抗体）と基質とを反応させ、Luminescent image analyzer LAS-3000（富士フィルム社製）を用いて目的のタンパク質（ＡＦＰ）を検出した。結果を図５に示す。
【００８６】
図５に示すように、ペプチド無添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量は、ｉＰＳ細胞の培養期間を延長しても変化しなかった。一方で、サンプル２添加区〜サンプル７添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量は、同じ期間培養したペプチド無添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量と比較して、ペプチド存在下での培養期間を延長するに従って顕著に増大することを確認した。特に、サンプル４添加区から回収した培養上清中のＡＦＰ量の増大が顕著であった。即ち、サンプル２〜７（特にサンプル４）に係るペプチドをｉＰＳ細胞（典型的には該ｉＰＳ細胞を培養する培養液中）に供給することで、当該ｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞（典型的には肝前駆細胞）に分化誘導し得ることを確認した。
これらの結果は、ここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化させる幹細胞分化誘導活性を有していることを示している。また、上記の結果はここに開示される分化誘導性合成ペプチド（即ち該ペプチドを含む幹細胞分化誘導剤）が未分化状態の多能性幹細胞を肝前駆細胞および肝細胞（肝細胞様細胞）に分化させる幹細胞分化誘導活性を有していることも示している。
【００８７】
なお、ここで詳細なデータは示さないが、上述したｉＰＳ細胞を用いた分化誘導性合成ペプチドの分化誘導活性を評価する各試験において、使用する培地のロット差やｉＰＳ細胞の培養状態に起因して各遺伝子および各タンパク質の発現日数に多少のずれを生じることを確認した。
【００８８】
＜実施例６：顆粒剤の調製＞
上記サンプル１〜７に係る合成ペプチド（分化誘導性合成ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
上述のように、ここで開示される分化誘導性合成ペプチドは、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化させる幹細胞分化誘導能を有しているため、対象とする多能性幹細胞（特にヒト由来のｉＰＳ細胞）を分化誘導するないしは分化誘導を促進する目的に好適に使用し得る。したがって、ここで開示される幹細胞分化誘導剤は、例えば再生医療用途の組成物として好適に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１〜３４    合成ペプチド
【図１】
0006478116.tif 000004
【図２】
0006478116.tif 000005
【図３】
0006478116.tif 000006
【図４】
0006478116.tif 000007
【図５】
0006478116.tif 000008
【配列表】
0006478116000001.app