(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は：
（ａ）前記標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第１の部分に特異的な前記第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において前記標的核酸配列の前記第１の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
（ｃ）第１相増幅反応混合物において、前記第１相増幅反応混合物が、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分と相補的である第２の増幅オリゴヌクレオチドと、前記増幅前ハイブリッドにのみ存在する前記第１の増幅オリゴヌクレオチドとを含むことに起因して、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、前記標的核酸配列を増幅することによって得られる第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第１の増幅産物が、前記標的核酸配列の配列を有し、かつ
前記第１の増幅産物が、前記第１相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
（ｄ）前記第１の増幅産物および前記第２の増幅オリゴヌクレオチドを含むステップ（ｃ）からの前記反応混合物を、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第２相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
（ｅ）前記第２相増幅反応混合物において、第２相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応で、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップと、
（ｆ）前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第２相増幅反応混合物における前記第２の増幅産物の合成を検出するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の増幅オリゴヌクレオチドが、３’標的特異的配列と、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１相の等温性の転写関連増幅反応および前記第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｇ）が、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、前記第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年８月３０日に出願された米国仮出願第６１／６９５，１０６号および２０１３年７月１５日に出願された米国仮出願第６１／８４６，５３８号の利益を主張する。これらの先の出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全般的には、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ユニプレックスおよびマルチプレックス反応の両方における増幅の効率および精度を増加させるために有用であり、定量化の特徴が改善されたより高感度の核酸標的検出ならびにマルチプレックス反応における分析物間のより低い干渉を可能にする、核酸の多相ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
核酸増幅は、相対的に稀なもしくは未知の核酸配列の複数コピーを生成するため、核酸の供給源を同定するため、または容易に検出可能な量の提供に十分な核酸を作製するための手段を提供する。増幅は、多くの応用、例えば、配列決定、診断法、創薬、法医学検査、環境解析や食品検査において有用である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、レプリカーゼ媒介性増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、「ローリングサークル」型の増幅および様々な転写関連増幅方法等、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸配列を増幅するための多くの方法が公知である。これらの公知の方法は、種々の方法を使用することにより通常検出される、増幅された配列を作製する異なる技法を使用する。
【０００４】
ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーおよびサーマルサイクリングを使用して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）またはｃＤＮＡから作製されたｄｓＤＮＡの両方の鎖の複数コピーを合成する（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、２対の相補対の一本鎖プローブの過剰量を使用し、これらのプローブは、近接標的配列にハイブリダイズし、ライゲーションされて本来の標的に相補的な融合されたプローブを形成し、これにより、この融合されたプローブは、複数サイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび変性におけるさらなる融合の鋳型となることができる（米国特許第５，５１６，６６３号およびＥＰ０３２０３０８  Ｂ１）。レプリカーゼ媒介性増幅は、分析物配列に付着した自己複製ＲＮＡ配列およびＱβ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを使用して、Ｑβウイルス配列等、選ばれたレプリカーゼに特異的な自己複製配列のコピーを合成する（米国特許第４，７８６，６００号）。増幅された配列は、分析物配列の代替物またはレポーター分子として検出される。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、これにより、エンドヌクレアーゼは、標的配列を含むヘミ修飾ｄｓＤＮＡの一方の鎖にニックを入れ、続いて一連のプライマー伸長および鎖置換ステップを行うことができる（米国特許第５，４２２，２５２号および第５，５４７，８６１号）。ローリングサークル型の増幅は、環状または連鎖状の核酸構造に依拠し、これは、鋳型から複数の一本鎖コピーを酵素的に複製するために使用される鋳型となる（例えば、米国特許第５，７１４，３２０号および第５，８３４，２５２号）。転写関連増幅は、核酸鋳型から複数の転写物を産生することにより配列を増幅する方法を指す。かかる方法は、一般に、プロモーター配列を提供する１種または複数のオリゴヌクレオチドならびにＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、標的配列付近に機能的なプロモーター配列を作製し、続いて、プロモーターから標的配列を転写する（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、第５，１２４，２４６号、第５，１３０，２３８号、第５，３９９，４９１号、第５，４３７，９９０号、第５，５５４，５１６号および第７，３７４，８８５号；ならびにＰＣＴ国際公開第ＷＯ１９８８／０１０３１５号）。
【０００５】
核酸増幅方法は、特異的標的配列（例えば、遺伝子配列）、関連する標的配列の群またはタグ配列と称することのできる代理配列を増幅することができる。このタグ配列は、検出、さらなる増幅、固定化のための結合タグとして、次世代配列決定等を含む配列決定反応における様々な機能における使用のためのアダプターとして等、種々の目的に使用することができる。分析物標的配列が、反応におけるある時点に存在する場合に限り、タグ配列は、その意図された目的のために機能的である。修飾された核酸増幅方法は、「ユニバーサル」プライマー（複数可）またはユニバーサルプライミングを使用することにより、２種以上の潜在的な標的配列を増幅することができる。ＰＣＲ増幅の一形態は、ＰＣＲ反応において保存された配列に結合して関連する配列を増幅する、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９２年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．７３巻：６７３〜６７９頁、Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０巻：２０９７〜２１０３頁）。ユニバーサルプライマーを使用する方法は、多くの場合、種特異的、遺伝子特異的または型特異的プライマー（単数または複数）の使用とペアにされて、種、遺伝的バリアントまたはウイルス型に特有の増幅された配列を生成し、これは、配列決定または増幅された核酸のその他の特徴の検出により同定することができる。アンカードＰＣＲは、ユニバーサルプライマーまたは「アダプター」プライマーを使用して、部分的にしか公知ではない配列を増幅する、別の修飾されたＰＣＲ方法である。アンカードＰＣＲは、ｃＤＮＡに「アダプター」または「ユニバーサル」配列を導入し、次に、その後の増幅ステップにおいて、導入された配列に結合するプライマーを使用する。一般に、アンカードＰＣＲは、公知の配列を指向するプライマーを使用してｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡに公知の配列（例えば、ポリＧ）を付加するまたはｃＤＮＡにおける共通配列（例えば、ポリＴ）を使用し、ｃＤＮＡにおける付加または共通配列に結合するユニバーサルプライマーおよび下流標的特異的プライマーを使用することによりＰＣＲを行う（Ｌｏｈら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３巻：２１７〜２２０頁；Ｌｉｎら、１９９０年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：１８１８〜１８２１頁）。ネステッドＰＣＲは、分析物標的配列に無関係のユニバーサル配列を含有するプライマー（複数可）を使用して、反応において未知の標的配列から核酸を増幅することができる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９１年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １２巻：１７〜２１頁；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９１年、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５５巻：２６８７〜２６９２頁）。
【０００６】
Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９８８年、１６巻：１１１４１〜１１１５６頁）は、ヒトジストロフィン遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ解析を初めて実証した。マルチプレックス反応は、特異的プライマーの慎重な選択および最適化により達成される。頑強で高感度の特異的なマルチプレックス反応の開発は、多数の特異的な設計検討および経験的な最適化を要求した。今度は、長期の開発期間をもたらし、反応条件を損ない、アッセイ感度を低下させる。また、新たなマルチプレックス診断検査の開発は、非常に費用がかかるものとなる。マルチプレックス反応を限定する多数の特異的な問題が同定された。２種以上の標的のプライマーセットの取り込みは、反応効率の慎重な適合化を必要とする。一方のプライマーが、僅かにより良い効率でその標的を増幅する場合、増幅は、より効率的に増幅された標的に偏るようになり、マルチプレックス反応における他方の標的遺伝子の非効率的な増幅、変動的な感度および完全な失敗の可能性を生じる。これは、「優先的増幅」と呼ばれる。優先的増幅は、全プライマー配列を類似の長さおよびＧＣ含量に慎重に適合させ、プライマー濃度を最適化することにより、例えば、低効率の標的のプライマー濃度を増加させることにより補正される場合もある。プライマー増幅効率を調整する試みにおいて、プライマーへのイノシンの取り込みも使用された（米国特許第５，７３８，９９５号）。別のアプローチは、各プライマーが、配列特異的標的認識に相補的な３’領域およびユニバーサル配列で構成された５’領域を含有する、キメラプライマーを設計することである。ユニバーサル配列プライマーの使用は、異なる標的の増幅効率の正規化を可能にする（Ｓｈｕｂｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９５年、５巻：４８８〜４９３頁；および米国特許第５，８８２，８５６号）。キメラプライマーは、マルチプレックス等温性鎖置換増幅にも利用されている（米国特許第５，４２２，２５２号、第５，６２４，８２５号および第５，７３６，３６５号）。
【０００７】
複数のプライマーセットがマルチプレックス増幅反応に存在するため、マルチプレックス化は、プライマーの交差反応性に起因するアーチファクトにより複雑化されることが多い。標的の数が増加するにつれて、これは非常に複雑となり、プライマー選択を激しく限定するため、全ての可能な組合せを解析する必要がある。慎重に設計されたプライマー組合せであっても、偽陰性または偽陽性結果のいずれかをもたらす偽産物を産生することが多い。２種以上の反応が同時に起こる場合、反応速度論および効率は変更される。異なる検体型毎に、各マルチプレックス化反応は、ＭｇＣｌ２濃度およびデオキシヌクレオチド濃度に対する比、ＫＣｌ濃度、増幅酵素濃度ならびに増幅反応時間および温度について最適化される必要がある。反応の全てがより早くプラトーになるように、マルチプレックス反応における試薬に対する競合が存在する。その結果、マルチプレックス化反応は、一般に、対応するユニプレックス反応よりも感度が低く、より可変性となる傾向があることが多い。
【０００８】
同時増幅反応の別の検討事項は、標的それぞれを識別および検出するための方法が存在しなければならないことである。そこで、マルチプレックス化標的の数は、反応物内で区別できる色素または他の標識部分の数によってさらに限定される。検出されるべき異なる蛍光部分の数が増加するにつれて、光学系および結果解釈に必要なデータ解析プログラムの複雑性も増加する。アプローチの１つは、増幅されたマルチプレックス産物を固相にハイブリダイズさせ、続いて各標的を検出することである。これは、定義されたパターンの捕捉プローブを有する平面ハイブリダイゼーションプラットフォーム（米国特許第５，９５５，２６８号）、またはフローサイトメトリーにより選別され得るビーズセット上の捕捉（米国特許第５，９８１，１８０号）を利用することができる。
【０００９】
記述されている多数の技術的課題のため、マルチプレックス遺伝子検出のための現在の技術は、費用がかかり、解析され得る遺伝子の数および組合せが激しく限定される。一般に、これらの反応は、ほんの２種または３種、最大でも１０種前後の標的をマルチプレックス化する。等温性増幅反応は、ＰＣＲよりも複雑であり、マルチプレックス化がさらにより困難である（Ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９９９年、２７巻：ｅ１５）。米国特許第６，６０５，４５１号は、少量の各プライマー対が第１のＰＣＲ反応ミックスに添加され、第１の指数関数的増幅が行われて反応物における標的核酸の量を増加させる、二段階ＰＣＲマルチプレックス反応を開示する。第１の反応は、対数期の中間で停止され、続いて、それぞれ標的核酸の一方のプライマー対を含有する第２の反応に分けられる。次に、完全な指数関数的増幅が行われる。限定された量のマルチプレックスプライマー対のそれぞれが第１の反応に存在しても、マルチプレックス化に共通の上述の問題が依然として存在する。さらに、これらの様々なプライマー対化学種は、全て二次増幅反応へと移動し、そこでも同様に共通マルチプレックス問題を生じることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、依然として、広範な設計および最適化の制約なしで多数の標的のマルチプレックス化を可能にする方法であって、複数の異なる増幅オリゴヌクレオチド対の存在下におけるマルチプレックス化に共通の問題を回避する方法の必要がある。加えて、マルチプレックスおよびユニプレックス増幅反応の両方の検出および／または定量化の限界において、感度および精度を改善する必要が現在進行中である。本発明は、上述および他の必要に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
当技術分野において実施されている通り、核酸増幅に必要とされる全構成成分は、増幅が開始されるときに反応混合物中に存在する（本明細書において、「単相方法」と称される）。所望の増幅反応と共に通常望ましくない副反応が開始されるという点において、この単相方法は問題を生じる。これらの副反応は、多くの場合、所望の増幅反応と競合し、よって、その全体的性能を劣化させる。さらに、マルチプレックス増幅反応において、他の分析物よりも反応混合物中により多量に存在する分析物またはその全体的な増幅効率がより高い分析物の増幅は、混合物における他の分析物の増幅と不当に競合し、よって、これを劣化させる。
【００１３】
本明細書に開示されている改善された方法は、複数の相で増幅反応を行うことによりこれらの問題に取り組む。この方法を使用すると、所望の反応（単数または複数）が開始されてある特定のレベルまで進む一方、他の競合反応の開始または進行は、この反応条件によって支持されない。このようにして、所望の反応は、本質的に競合反応に先んじ、所望の反応の全体的性能の改善をもたらす。さらに、マルチプレックス増幅反応は、相において全増幅プロセスを行うことにより、互いの競合性を低くすることができる。よって、上述の状況と同様に、より低効率の反応および／またはより低い初期レベルの標的分析物に対応する反応が進められ、他の反応がチェックされずに進行して、これを激しく打ち負かすことはない。本明細書により詳細に記載されている通り、多相増幅の一般原則は、種々の増幅技法に広く適用可能であり、多種多様な異なる様式で具体化することができると企画される。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも２ステップを含む、試料中の標的核酸配列を増幅するための方法を提供する。最初に、標的核酸配列は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の増幅反応に付される。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これはその後、第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で、第２相の増幅反応に付され、これにより、第２の増幅産物を生成する。
【００１５】
上に記す通り、多くの場合、同じ試料中の複数の標的核酸配列を検出および定量化することが望ましい。したがって、第２の態様では、本発明は、少なくとも２ステップを含む、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための方法を提供する。最初に、標的核酸配列は、標的核酸配列のいずれかの指数関数的増幅を支持しないまたはこれを防止する条件下で、第１相の増幅反応に付される。第１相の増幅反応は、複数の第１の増幅産物を生成し、これらはその後、第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で、第２相の増幅反応に付され、これにより、複数の第２の増幅産物を生成する。
【００１６】
第２の態様の修正されたバージョンでは、本発明は、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための方法であって、反応の少なくとも１相において、標的核酸配列の全てではなく一部が線形増幅に付される、および／または標的核酸配列の全てではなく一部が指数関数的増幅に付される方法を提供する。したがって、第１相増幅の少なくとも４通りの可能な変種が企画される：（１）標的配列のいくつかは線形増幅に付され、残りは増幅されない；（２）標的配列のいくつかは指数関数的増幅に付され、残りは増幅されない；（３）標的配列のいくつかは線形増幅に付され、いくつかは指数関数的増幅に付され、残りは増幅されない；および（４）標的配列のいくつかは線形増幅に付され、残りは指数関数的増幅に付される。よって、本発明の本態様では、第１相増幅は、全標的核酸配列（オプション４）またはそのサブセットのみ（オプション１〜３）の増幅をもたらし得る。標的核酸配列のサブセットは、他の標的と比較して、相対的に少量で存在することが公知の標的および／または増幅が困難な標的を表すことができる。第１相の増幅反応は、１種または複数の第１の増幅産物を生成する。続いて、試料中の第１の増幅産物（複数可）および任意の増幅されていない標的核酸配列（複数可）は、その指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に付され、複数の第２の増幅産物を生成する。あるいは、上述の条件１〜４が、最終相を除く全ての相に適用でき、最後の相において、試料中の任意の増幅されていないまたは線形増幅された標的核酸配列（複数可）が、その指数関数的増幅を可能にする条件下で増幅反応に付される、３以上の相が存在し得る。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物を提供する。組成物は、次の構成成分を含む：（ａ）標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズする増幅オリゴヌクレオチド、（ｂ）標的核酸配列の第２の部分にハイブリダイズする任意選択の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび（ｃ）増幅酵素。本組成物の主要な特色の１つは、これが、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１種の構成成分を欠くことである。本願の他の箇所に詳細に説明されている通り、本組成物の利点の１つは、これが、非特異的増幅の低下に役立ち、これにより、標的配列に対して増幅資源を集中させることである。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための代替的な組成物を提供する。組成物は、次の構成成分を含む：（ａ）複数の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする複数の異なる増幅オリゴヌクレオチド複合体であって、各増幅オリゴヌクレオチド複合体が、第２の標的特異的配列を有する第２の増幅オリゴヌクレオチドに連結された、第１の標的特異的配列を有する第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む複合体、（ｂ）標的核酸の第２の部分にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび（ｃ）増幅酵素。再度、組成物は、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１種の構成成分を欠く。
【００１９】
第５の態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列を定量化する方法を提供する。本方法によれば、先ず、（ａ）標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料を、標的核酸配列の第１の部分に特異的な第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップが存在する。次に、（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしなかった第１の増幅オリゴヌクレオチドを全て除去することにより、増幅前ハイブリッドを単離するステップが存在する。これに続き、（ｃ）第１相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された増幅前ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップが行われる。一般的に言えば、第１相増幅反応混合物は、第２の増幅オリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的である。同様に、第１の増幅産物は、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない。次に、（ｄ）第１の増幅産物を含む反応混合物を、第１の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、第１の増幅産物を含む反応混合物から欠如している少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップが存在する。一般に、第２相増幅反応混合物は、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。次に、（ｅ）第２相増幅反応混合物において、第２相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップが存在する。これに続き、（ｆ）配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、第２相増幅反応混合物における第２の増幅産物の合成を検出するステップ、次に、（ｇ）検出ステップ（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化するステップを行う。一般に好ましい一方法において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、３’標的特異的配列およびＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列を含む。好ましい事例において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。別の一般に好ましい一方法において、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される。別の一般に好ましい一方法において、固体支持体は、固定化された捕捉プローブを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ａ）は、試料を、標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、増幅前ハイブリッドは、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした標的核酸配列を含む。別の一般に好ましい一方法において、固体支持体は、磁気的に誘引できる粒子を含む���別の一般に好ましい一方法において、第１および第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれは、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、逆転写酵素は、内在性ＲＮａｓｅＨ活性を含む。別の一般に好ましい一方法において、少なくとも１種の構成成分は、第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｃ）の第１の増幅産物は、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、ステップ（ｅ）の第２の増幅産物は、ＲＮＡ分子である。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｄ）における配列特異的ハイブリダイゼーションプローブは、第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｄ）における配列特異的ハイブリダイゼーションプローブは、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｇ）は、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化するステップを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｃ）は、第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は：
（ａ）前記標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第１の部分に特異的な前記第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において前記標的核酸配列の前記第１の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
（ｃ）第１相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第１相増幅反応混合物が、第２の増幅オリゴヌクレオチドを含み、前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的であり、かつ
前記第１の増幅産物が、前記第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
（ｄ）前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物を、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物から欠如している少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第２相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
（ｅ）前記第２相増幅反応混合物において、第２相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップと、
（ｆ）前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第２相増幅反応混合物における前記第２の増幅産物の合成を検出するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記第１の増幅オリゴヌクレオチドが、３’標的特異的配列と、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列とを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記第１相の等温性の転写関連増幅反応および前記第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、そして
前記逆転写酵素が、内在性ＲＮａｓｅＨ活性を含む、
項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１種の構成成分が、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｃ）の前記第１の増幅産物が、前記試料中の前記標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、そして
ステップ（ｅ）の前記第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、
項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｇ）が、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｃ）が、前記第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、二重相フォワード転写媒介増幅（ＴＭＡ）の実施形態を図解する。本実施形態では、Ｔ７プロモーターを含有する増幅プライマー（「Ｔ７プライマー」）は、標的捕捉において標的核酸配列にハイブリダイズし、続いて過剰なＴ７プライマーが除去される。増幅プロセスは、少なくとも２個の別個の相に分けられる。第１相において、追加的なＴ７プライマー（ＲＴ：逆転写酵素；Ｔ７：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を例外として、必要な増幅および酵素試薬（それぞれＡＲおよびＥＲ）の全てと共に、非Ｔ７プライマーが導入される。逆転写酵素の存在下において、標的にハイブリダイズしたＴ７プライマーが伸長されて、ｃＤＮＡコピーを作製し、標的ＲＮＡ鋳型が、ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ活性により分解される。非Ｔ７プライマーはその後、ｃＤＮＡにハイブリダイズし、続いて伸長され、Ｔ７プライマーのプロモーター領域を埋め、活性な二本鎖鋳型を作製する。次に、Ｔ７ポリメラーゼは、鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生する。非Ｔ７プライマーはその後、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズして伸長され、標的ＲＮＡ鋳型のプロモーターなしのｃＤＮＡコピーを産生する。続いて、ＲＮＡ鎖は、ＲＴのＲＮａｓｅ活性により分解される。相１増幅混合物においてＴ７プライマーを利用できないため、反応は、それ以上進むことができない。次に、Ｔ７プライマーの添加により第２相が始まり、これにより、相１において産生されたｃＤＮＡプールの指数関数的増幅を開始する。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、標準単相フォワードＴＭＡ（図２Ａ）と、本明細書に記載されている実行された実施例の一部において対照として使用された修飾単相フォワードＴＭＡ（図２Ｂ）との間の比較を示す。標準単相フォワードＴＭＡプロトコールは、当技術分野において周知のものであり、本願の他の箇所に詳細に記載されている。修飾単相ＴＭＡプロトコールにおいて、Ｔ７プライマーは、標的捕捉において標的核酸配列にハイブリダイズし、これにより、標的捕捉後の６０℃における通常のＴ７プライマーアニーリングステップを排除する。その後、追加的なＴ７プライマーならびに必要な増幅および酵素試薬の全てと共に、非Ｔ７プライマーが加えられ、これにより、指数関数的増幅を進める。図２Ａおよび図２Ｂから分かる通り、どちらの単相ＴＭＡプロトコールも、ローエンド（ｌｏｗ  ｅｎｄ）において同等の感度を有すると思われ、１００コピー以上のヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）標的鋳型を確実に検出するが、１０コピーの標的鋳型においては不十分である。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｃは、修飾単相フォワードＴＭＡおよび二重相フォワードＴＭＡの間の比較を実証する。図３Ａにおいて、上述の修飾単相ＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図３Ｂにおいて、図１に記載されている二重相ＴＭＡ技法を使用して同じＨＩＶ−１鋳型を増幅した、すなわち、最初にＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、これを第２相において提供して指数関数的増幅を始めた。図３Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図３−２】図３Ａ〜図３Ｃは、修飾単相フォワードＴＭＡおよび二重相フォワードＴＭＡの間の比較を実証する。図３Ａにおいて、上述の修飾単相ＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図３Ｂにおいて、図１に記載されている二重相ＴＭＡ技法を使用して同じＨＩＶ−１鋳型を増幅した、すなわち、最初にＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、これを第２相において提供して指数関数的増幅を始めた。図３Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｄは、増幅の第２相において添加されるＴ７プライマーの濃度の最適化を図解する。図４Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図４Ｂ〜図４Ｄにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相において異なる濃度のＴ７プライマーを提供して、指数関数的増幅を開始した。１ｐｍｏｌ／ｒｘｎ、５ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎ  Ｔ７プライマーにおいて、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。
【図４−２】図４Ａ〜図４Ｄは、増幅の第２相において添加されるＴ７プライマーの濃度の最適化を図解する。図４Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図４Ｂ〜図４Ｄにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相において異なる濃度のＴ７プライマーを提供して、指数関数的増幅を開始した。１ｐｍｏｌ／ｒｘｎ、５ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎ  Ｔ７プライマーにおいて、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｄは、増幅の第１相において添加される非Ｔ７プライマーの濃度の最適化を示す。図５Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図５Ｂ〜図５Ｄにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの非Ｔ７プライマーで、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ非Ｔ７プライマーの存在下におけるシフトは、幾分顕著ではなかった。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｄは、増幅の第１相において添加される非Ｔ７プライマーの濃度の最適化を示す。図５Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。図５Ｂ〜図５Ｄにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎの非Ｔ７プライマーで、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ非Ｔ７プライマーの存在下におけるシフトは、幾分顕著ではなかった。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｃは、全体的なアッセイ性能に対する、第２相増幅における酵素試薬（ＲＴおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の効果を実証する。図６Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。先述の通り、図６Ｂ〜図６Ｃにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図６Ｂにおいて、増幅反応の第１および第２相において等量の酵素試薬を添加した。図６Ｃにおいて、第１相増幅において同じ総量の酵素試薬を添加し、一方、第２相において酵素試薬を添加しなかった。両方の実験で、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｃは、全体的なアッセイ性能に対する、第２相増幅における酵素試薬（ＲＴおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の効果を実証する。図６Ａにおいて、修飾単相フォワードＴＭＡを使用して、ＨＩＶ−１標的鋳型を増幅した。先述の通り、図６Ｂ〜図６Ｃにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図６Ｂにおいて、増幅反応の第１および第２相において等量の酵素試薬を添加した。図６Ｃにおいて、第１相増幅において同じ総量の酵素試薬を添加し、一方、第２相において酵素試薬を添加しなかった。両方の実験で、単相および二重相増幅反応の間の感度および頑強性において同等の有意なシフトが観察された。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｃは、ヒトパピローマウイルスサブタイプ１６（ＨＰＶ１６）標的鋳型を使用した標準単相（図７Ａ）および二重相（図７Ｂ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。ＨＩＶ−１標的鋳型に関して先に検討したように、二重相フォーマットにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図７Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを実証する較正曲線線形適合を描写する。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｃは、ヒトパピローマウイルスサブタイプ１６（ＨＰＶ１６）標的鋳型を使用した標準単相（図７Ａ）および二重相（図７Ｂ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。ＨＩＶ−１標的鋳型に関して先に検討したように、二重相フォーマットにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図７Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを実証する較正曲線線形適合を描写する。
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｃは、前立腺がん抗原３（ＰＣＡ３）標的鋳型を使用した標準単相（図８Ａ）および二重相（図８Ｂ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。ＨＩＶ−１およびＨＰＶ１６標的鋳型に関して先に検討したように、二重相フォーマットにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図８Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを同様に示す較正曲線線形適合を描写する。
【図８−２】図８Ａ〜図８Ｃは、前立腺がん抗原３（ＰＣＡ３）標的鋳型を使用した標準単相（図８Ａ）および二重相（図８Ｂ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。ＨＩＶ−１およびＨＰＶ１６標的鋳型に関して先に検討したように、二重相フォーマットにおいて、相１においてＴ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図８Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを同様に示す較正曲線線形適合を描写する。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｆは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ（アンドロゲン調節性膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）とＥＴＳ転写因子（ＥＲＧ）との遺伝子融合により形成された前立腺がんマーカー）のデュプレックス増幅に使用した、標準単相（図９Ａおよび図９Ｄ）および二重相（図９Ｂおよび図９Ｅ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図９Ａおよび図９Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し、一方、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＰＣＡ３の存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図９Ｃおよび図９Ｆは、デュプレックス増幅文脈における両方の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｆは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ（アンドロゲン調節性膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）とＥＴＳ転写因子（ＥＲＧ）との遺伝子融合により形成された前立腺がんマーカー）のデュプレックス増幅に使用した、標準単相（図９Ａおよび図９Ｄ）および二重相（図９Ｂおよび図９Ｅ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図９Ａおよび図９Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し、一方、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＰＣＡ３の存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図９Ｃおよび図９Ｆは、デュプレックス増幅文脈における両方の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図９−３】図９Ａ〜図９Ｆは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ（アンドロゲン調節性膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）とＥＴＳ転写因子（ＥＲＧ）との遺伝子融合により形成された前立腺がんマーカー）のデュプレックス増幅に使用した、標準単相（図９Ａおよび図９Ｄ）および二重相（図９Ｂおよび図９Ｅ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図９Ａおよび図９Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し、一方、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＰＣＡ３の存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図９Ｃおよび図９Ｆは、デュプレックス増幅文脈における両方の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図９−４】図９Ａ〜図９Ｆは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ（アンドロゲン調節性膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）とＥＴＳ転写因子（ＥＲＧ）との遺伝子融合により形成された前立腺がんマーカー）のデュプレックス増幅に使用した、標準単相（図９Ａおよび図９Ｄ）および二重相（図９Ｂおよび図９Ｅ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図９Ａおよび図９Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し、一方、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＰＣＡ３の存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図９Ｃおよび図９Ｆは、デュプレックス増幅文脈における両方の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−１】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−２】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−３】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−４】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−５】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１０−６】図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＰＣＡ３、Ｔ２−ＥＲＧおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のトリプレックス増幅に使用した、標準単相（図１０Ａ、図１０Ｄおよび図１０Ｇ）および二重相（図１０Ｂ、図１０Ｅおよび図１０Ｈ）フォワードＴＭＡの間の比較を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｔ２−ＥＲＧおよびＰＳＡの存在下におけるＰＣＡ３の検出を示し；図１０Ｄおよび図１０Ｅは、ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示し；図１０Ｇおよび図１０Ｈは、ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡの検出を示す。図１０Ｃ、図１０Ｆおよび図１０Ｉは、トリプレックス増幅文脈における全３種の標的に関する、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、修飾単相リバースＴＭＡおよび二重相リバースＴＭＡの間の比較を実証する。図１１Ａにおいて、修飾単相リバースＴＭＡを使用して、Ｔ２−ＥＲＧ標的鋳型を増幅した。修飾単相リバースＴＭＡにおいて、非Ｔ７プライマーは、標的捕捉において標的核酸配列にハイブリダイズし、これにより、標的捕捉後の６０℃における通常の非Ｔ７プライマーアニーリングステップを排除する。その後、追加的な非Ｔ７プライマーならびに必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に、Ｔ７プライマーを添加し、これにより、指数関数的増幅を進める。図１１Ｂにおいて、二重相リバースＴＭＡプロトコールを使用して、同じＴ２−ＥＲＧ鋳型を増幅し、該プロトコールにおいて、相１において非Ｔ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図１１Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１１−２】図１１Ａ〜図１１Ｃは、修飾単相リバースＴＭＡおよび二重相リバースＴＭＡの間の比較を実証する。図１１Ａにおいて、修飾単相リバースＴＭＡを使用して、Ｔ２−ＥＲＧ標的鋳型を増幅した。修飾単相リバースＴＭＡにおいて、非Ｔ７プライマーは、標的捕捉において標的核酸配列にハイブリダイズし、これにより、標的捕捉後の６０℃における通常の非Ｔ７プライマーアニーリングステップを排除する。その後、追加的な非Ｔ７プライマーならびに必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に、Ｔ７プライマーを添加し、これにより、指数関数的増幅を進める。図１１Ｂにおいて、二重相リバースＴＭＡプロトコールを使用して、同じＴ２−ＥＲＧ鋳型を増幅し、該プロトコールにおいて、相１において非Ｔ７プライマーを増幅混合物から保留し、第２相においてこれを提供して指数関数的増幅を開始した。図１１Ｃは、単相および二重相増幅反応の間の感度の有意なシフトを示す較正曲線線形適合を描写する。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｃは、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）のクアドロプレックス増幅に使用した、修飾単相（図１２Ａ）、１１に記載の二重相フォーマット（図１２Ｂ）および異なる二重相フォーマット（図１２Ｃ）リバースＴＭＡの間の比較を示す。図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図１２Ｂにおいて、全４種の標的を、図１１Ｂに関して記載されたものと同じ二重相リバースＴＭＡに付した。図１２Ｃにおいて、反応の第１相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を線形増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し、第２相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰを指数関数的増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを継続して指数関数的に増幅した（全増幅反応は同じ容器内で進んだ）。
【図１２−２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）のクアドロプレックス増幅に使用した、修飾単相（図１２Ａ）、１１に記載の二重相フォーマット（図１２Ｂ）および異なる二重相フォーマット（図１２Ｃ）リバースＴＭＡの間の比較を示す。図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図１２Ｂにおいて、全４種の標的を、図１１Ｂに関して記載されたものと同じ二重相リバースＴＭＡに付した。図１２Ｃにおいて、反応の第１相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を線形増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し、第２相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰを指数関数的増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを継続して指数関数的に増幅した（全増幅反応は同じ容器内で進んだ）。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）のクアドロプレックス増幅に使用した、修飾単相（図１３Ａ）、二重相（図１３Ｂ）および三重相（図１３Ｃ）リバースＴＭＡの間の比較を示す。図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図１３Ｂにおいて、全４種の標的を図１１Ｂに関して記載されたものと同じ二重相リバースＴＭＡに付した。図１３Ｃにおいて、相１において、Ｔ２−ＥＲＧを線形増幅に付し、他の３種の分析物を増幅せず、相２において、Ｔ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し、３種の他の分析物を増幅せず、相３において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を指数関数的増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを継続して指数関数的に増幅した（全増幅反応は同じ容器内で進んだ）。
【図１３−２】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）のクアドロプレックス増幅に使用した、修飾単相（図１３Ａ）、二重相（図１３Ｂ）および三重相（図１３Ｃ）リバースＴＭＡの間の比較を示す。図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの存在下におけるＴ２−ＥＲＧの検出を示す。図１３Ｂにおいて、全４種の標的を図１１Ｂに関して記載されたものと同じ二重相リバースＴＭＡに付した。図１３Ｃにおいて、相１において、Ｔ２−ＥＲＧを線形増幅に付し、他の３種の分析物を増幅せず、相２において、Ｔ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し、３種の他の分析物を増幅せず、相３において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を指数関数的増幅に付し、Ｔ２−ＥＲＧを継続して指数関数的に増幅した（全増幅反応は同じ容器内で進んだ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
開示内容を明確にするためであって、限定を目的とするものではないが、本発明の詳細な説明は、次のサブセクションに分けられる。
【００２２】
Ａ．定義
他に断りがなければ、本明細書に使用されている科学および技術用語は、技術文献、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）または分子生物学に関する他の周知の技術刊行物に基づく、分子生物学の技術分野の当業者によって一般に理解されている意義と同じ意義を有する。他に断りがなければ、本明細書に用いられているまたは考慮されている技法は、分子生物学の技術分野において周知の標準方法である。開示されている方法および組成物の態様の理解に役立つように、本明細書に記載されている実施形態により、いくつかの用語をより詳細に説明または図解する。
【００２３】
本明細書に言及されている全ての特許、出願、公開出願および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれている。本セクションに表記されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物に表記されている定義に反する、または他の点でそれらと矛盾する場合、本セクションに表記されている定義は、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
【００２４】
本明細書において、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１種」または「１種または複数」を意味する。
【００２５】
本明細書における近似的な語句は、本明細書および特許請求の範囲を通じて、これが関係する基本的な機能に変化を生じることなく許容範囲で変動し得る、任意の定量的または定性的表現の修飾に適用することができる。したがって、「約」または「およそ」等の用語により修飾される値は、規定されている正確な値に限定されるべきではなく、規定の値とは異なる値を含むことができる。
【００２６】
本明細書において、用語「試料」は、分析物におけるまたはそれに由来する核酸配列を含む、対象とする分析物、例えば、微生物、ウイルス、遺伝子等の核酸またはこれらの構成成分を含有し得る検体を指す。試料は、生物学的検体または環境供給源等、いかなる供給源に由来してもよい。生物学的検体は、分析物または分析物におけるもしくはこれに由来する核酸を含有し得る、生きたまたは死んだ生物に由来する任意の組織または材料を含む。生物学的試料の例として、呼吸器組織、滲出液（例えば、気管支肺胞洗浄）、生検材料、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿または他の流体、組織もしくは材料が挙げられる。環境試料の例として、水、氷、土壌、スラリー、デブリ、バイオフィルム、空中浮遊粒子およびエアロゾルが挙げられる。試料は、濾過、遠心分離、沈降またはマトリックスもしくは支持体等の媒体への接着の使用による試料の処理から得られるもの等、加工された検体または材料となり得る。試料の他の加工は、組織、細胞凝集塊または細胞を物理的または機械的に破壊して、核酸を含む細胞内構成成分を、酵素、バッファー、塩、洗浄剤その他等の他の構成成分を含有し得る溶液へと放出させるための処理を含むことができる。
【００２７】
本明細書において、用語「接触」は、２種以上の構成成分を一体にまとめることを意味する。接触は、流体または半流体混合物において全構成成分を混合することにより達成することができる。接触は、固体の組織切片または基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）等、固体表面上において１種または複数の構成成分を１種または複数の他の構成成分と物理的に接触させる際に達成することもできる。
【００２８】
本明細書において、用語「核酸」は、標準ホスホジエステル結合または他の結合により共有結合した窒素含有複素環塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物を指す。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーまたはこれらのアナログを含む。核酸において、骨格は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合またはこれらの組合せのうち１種または複数を含む種々の結合で構成され得る。核酸における糖部分は、リボース、デオキシリボースまたは置換、例えば、２’メトキシおよび２’ハライド（例えば、２’−Ｆ）置換を有する類似の化合物となり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、これらのアナログ（例えば、イノシン；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５〜３６頁、Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２年）、プリンもしくはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン（ｄｅｏｘｙｇａｕｎｏｓｉｎｅ）、デアザ−もしくはアザ−プリン、デアザ−もしくはアザ−ピリミジン、種々の化学的位置のいずれかにおいて変更されたもしくは置き換え置換基を有するピリミジンもしくはプリン、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジンおよびＯ４−アルキル−ピリミジンまたは未置換もしくは３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン等のピラゾロ−化合物となり得る（例えば、米国特許第５，３７８，８２５号、第６，９４９，３６７号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／１３１２１号））。核酸は、骨格が１個または複数の場所に窒素含有塩基を持たない「脱塩基」位置を含むことができ（米国特許第５，５８５，４８１号）、例えば、１個または複数の脱塩基位置は、別個のオリゴヌクレオチド配列を一体に連結するリンカー領域を形成することができる。核酸は、従来のＲＮＡおよびＤＮＡに存在する従来の糖、塩基および結合のみを含んでいても、または従来の構成成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格により連結された従来の塩基、または従来の塩基および１種もしくは複数のアナログの混合物を含有するポリマー）を含んでいてもよい。用語は、ＲＮＡ模倣糖コンフォメーションにロックされた二環式フラノース単位を有する１個または複数のＬＮＡヌクレオチド単量体を含有し、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡにおける相補的配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する「ロックト核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３巻（４２号）：１３２３３〜４１頁）。
【００２９】
本明細書において、互換的な用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、一般に、約２〜５ヌクレオチド（ｎｔ）の下限および約５００〜９００ｎｔの上限を有するサイズ範囲の核酸ポリマーを含む、１，０００ｎｔ未満で形成された核酸ポリマーを指す。好ましいオリゴヌクレオチドは、５〜１５ｎｔ下限および５０〜５００ｎｔ上限を有するサイズ範囲内であり、特に好ましい実施形態は、１０〜２０ｎｔ下限および２５〜１５０ｎｔ上限を有するサイズ範囲内である。好ましいオリゴヌクレオチドは、任意の周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学または酵素的方法を使用することによる合成により作製され、標準方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することにより合成後に精製され得る。本明細書で検討されている代表的オリゴヌクレオチドは、数例を挙げると、プライミングオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、非Ｔ７プライマー、Ｔ７プロモータープライマー等）、プロモータープロバイダー（ブロック３’末端を含むプロモータープライマーである）、検出プローブオリゴヌクレオチド、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよびブロッカーを含む。プライミングオリゴヌクレオチドおよびプロモータープロバイダーは、一般に「増幅オリゴヌクレオチド」と称される。
【００３０】
「プライミングオリゴヌクレオチド」（またはより単純には、「プライマー」）は、その少なくとも３’末端が核酸鋳型に相補的であり、鋳型と複合体形成して（水素結合形成またはハイブリダイゼーションにより）、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適したプライマー：鋳型複合体を生じるオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合ヌクレオチド塩基を付加することにより伸長され、その塩基は、鋳型に相補的である。その結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドの長さに伸長することができる。適した好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。公知の実質的に全てのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するために、一本鎖鋳型へのオリゴヌクレオチドの複合体形成（「プライミング」）を必要とするが、一方、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー生成）は一般に、プライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長の正にその性質上、プライミングオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング部分を含まない。
【００３１】
本明細書において、用語「増幅オリゴヌクレオチド複合体」は、後述する通り、直接的にまたは間接的に一体に連結した２本の増幅オリゴヌクレオチドを指す。よって、増幅オリゴヌクレオチド複合体は、一体に連結された第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび第２の増幅オリゴヌクレオチドで形成される。
【００３２】
「タグ付けされたオリゴヌクレオチド」は、本明細書において、少なくとも第１の領域および第２の領域を含むオリゴヌクレオチドであって、第１の領域が、対象とする標的核酸配列をハイブリダイズさせる「標的ハイブリダイズ配列」を含み、第２の領域が、標的ハイブリダイズ配列の５’にあり、標的核酸配列を含有する標的核酸に安定的にハイブリダイズまたは結合しない「タグ配列」を含むオリゴヌクレオチドを指す。標的核酸配列への標的ハイブリダイズ配列のハイブリダイゼーションは、「タグ付けされた標的核酸配列」を産生する。標的ハイブリダイズ配列構成成分の特色および設計検討は、本明細書に記述されているプライミングオリゴヌクレオチドと同じものとなるであろう。「タグ配列」または「異種タグ配列」は、対象とする標的核酸配列に安定的にハイブリダイズせず、これにより、任意の配列修飾に先立つ天然の標的（すなわち、生物学的試料に存在すると考えられる）の検出可能な増幅に関与しないのであれば、基本的にいかなる配列であってもよい。タグ配列は、好ましくは、検査されている生物のゲノムに由来するいかなる配列にも、またはより具体的には、反応条件下においていかなる標的核酸にも安定的にハイブリダイズしない。タグ付けされたオリゴヌクレオチドに存在するタグ配列は、好ましくは、その標的配列にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ配列の能力を実質的に損なわないまたはこれに干渉しないように設計されている。さらに、本明細書に記載されている通り、タグ配列の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が初期ＤＮＡプライマー伸長産物に取り込まれたら、タグ特異的プライミングオリゴヌクレオチドを増幅のその後のラウンドに関与するよう使用することができるように、タグ配列は、十分な長さおよび組成のものとなるであろう。本発明のタグ配列は、典型的に、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチドの長さに伸長することができる。当業者であれば、本発明における使用のためのタグ配列およびタグ付けされたオリゴヌクレオチドの設計が、本明細書に記載されている目的および利点を達成しつつも、多数の適した戦略のいずれかに従うことができることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、タグ付けされたオリゴヌクレオチドは、タグ配列および標的ハイブリダイズ配列を含む「タグ付けされたプライミングオリゴヌクレオチド」である。他の実施形態では、タグ付けされたオリゴヌクレオチドは、タグ配列と、標的ハイブリダイズ配列と、タグ配列の５’にあり、そこから転写を開始するのに有効なプロモーター配列とを含む「タグ付けされたプロモーターオリゴヌクレオチド」である。例示的なタグ配列と共に、特に有用なタグ配列を同定する方法は、整理番号６１／４５１，２８５の共同所有されている米国特許仮出願に開示されている。この特許仮出願の開示は、参照により組み込まれている。
【００３３】
酵素的に伸長されないオリゴヌクレオチドは、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドおよびブロッカーオリゴヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするが、酵素ポリメラーゼ活性により鋳型指向性様式で伸長されない。オリゴヌクレオチドの酵素的伸長を防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端は、当技術分野において一般に公知の通り、ブロッキング部分を使用して化学的にまたは構造的にブロックされ得る。ブロックされたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，８２４，５１８号および第７，３７４，８８５号に記載されている。ブロックされたオリゴヌクレオチドは、通常３’末端付近または３’末端に存在し、酵素的手段によるオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防止または妨害する化学的および／または構造的修飾を含むオリゴヌクレオチドを指す。かかる修飾の例として、酵素的伸長を防止する３’非ヌクレオチド部分である３’２’−ジデオキシヌクレオチド塩基の使用、または２個の５’末端を有する最終オリゴヌクレオチドを作製するための、オリゴヌクレオチドへの短い配列の３’から５’の配向性の付着（すなわち、オリゴヌクレオチド同士を３’末端で共有結合により連結することによる、第２の通常、より短い５’から３’のオリゴヌクレオチドに付着した第１の５’から３’のオリゴヌクレオチド）が挙げられる。修飾の別の例は、キャップの５’末端塩基がオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に相補的となるような、オリゴヌクレオチドの３’末端における少なくとも３ｎｔに相補的な配列で構成された「キャップ」である。ブロックされたオリゴヌクレオチドは、酵素的に伸長されないが、例えば、核酸鋳型鎖における特異的な場所にハイブリダイズして、ブロックされたオリゴヌクレオチドが結合している位置を超える相補鎖の合成を妨害することにより、核酸増幅に関与し得る。
【００３４】
増幅オリゴヌクレオチドのサイズは一般に、オリゴヌクレオチドに含まれる機能部分により決定される。プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの構成成分部分は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＰ）に特異的なプロモーター配列を含む。ＲＮＰおよびその対応するプロモーター配列は、周知のものであり、種々の供給源、例えば、ウイルス、バクテリオファージ、真菌、酵母、細菌、動物、植物もしくはヒト細胞に由来する材料から精製することができる、またはこれらを使用することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成により作製することができる。ＲＮＰおよびプロモーターの例として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびそのプロモーター（米国特許第７，２４１，６１８号）、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびそのプロモーターまたはその変異体（米国特許第７，２２９，７６５号および第７，０７８，１７０号）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーター（米国特許第７，１８６，５２５号）、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ由来のＲＮＡポリメラーゼならびに植物指向性ＲＮＰ（米国特許第７，０６０，８１３号）が挙げられる。プロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドは、選ばれたＲＮＰに機能的に連結されたプロモーター配列を含む。プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態は、Ｔ７  ＲＮＰにより使用されるＴ７プロモーター配列を含み、プロモーター配列は、配列番号１（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ）または配列番号２（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ）のプロモーター配列等、２５〜３０ｎｔの範囲内である。
【００３５】
タグ部分を含む増幅オリゴヌクレオチドは、典型的に、５〜４０ｎｔの範囲内、好ましい実施形態では、１０〜２５ｎｔまたは１０〜３０ｎｔまたは１５〜３０ｎｔの範囲内のタグ配列を含む。標的特異的（ＴＳ）部分を含む増幅オリゴヌクレオチドは、典型的に、１０〜４５ｎｔの範囲内、好ましい実施形態では、１０〜３５ｎｔまたは２０〜３０ｎｔの範囲内のＴＳ配列を含む。複数のタグ配列および／または複数のＴＳ配列および／またはプロモーター配列を含む増幅オリゴヌクレオチドは、その個々の機能的配列の長さにより決定されるサイズ範囲内となるであろう。例えば、タグ配列およびＴＳ配列を含むプロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドは、プロモーター、タグおよびＴＳ配列のサイズの合計となり、連結ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（例えば、脱塩基リンカー）を任意選択で含むことができる。本明細書に記載されている複数の機能的構成成分で構成された増幅オリゴヌクレオチドは、異なる機能的部分間で直接的に、標準ホスホジエステル結合、核酸アナログ結合もしくは非核酸結合により共有結合させることができる、または機能的部分間のスペーサーおよび／もしくは結合として機能する追加的な核酸配列もしくは非核酸（例えば、脱塩基結合）化合物を使用することにより、一体に非共有結合することができる。増幅オリゴヌクレオチドの一部の実施形態は、２種以上のオリゴヌクレオチドに含有される相補的配列の直接的なハイブリダイゼーションを含む、オリゴヌクレオチド間の結合対メンバーの相互作用の使用、またはオリゴヌクレオチド複合体の個々の結合対メンバーが結合する連結構成成分（１種または複数の追加的なオリゴヌクレオチドを含む）を介する等、非共有結合を使用することにより、一体に連結して複合体を形成することができる。
【００３６】
本明細書において、標的核酸の「増幅」は、標的核酸配列の少なくとも一部分と同一もしくは相補的な核酸鎖、または標的核酸配列の代理として機能するユニバーサルもしくはタグ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製するプロセスを指し、これら全て、試料に標的核酸が存在する場合のみに作製される。典型的には、核酸増幅は、１種または複数の核酸ポリメラーゼおよび／または転写酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドまたはその断片、あるいは標的ポリヌクレオチドまたはその断片に相補的な配列、あるいは検出ステップ等においてアッセイのある時点における標的ポリヌクレオチドの存在を示すために標的ポリヌクレオチドの代理として機能するよう、または増幅反応におけるさらなるプライミングのための部位として、または配列決定関係のワークフローもしくは配列決定反応における使用のために増幅系に導入されたユニバーサルまたはタグ配列の複数コピーを産生する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技法は、周知のものであり、転写媒介増幅（ＴＭＡ）または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）等の転写関連増幅方法と共に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、レプリカーゼ媒介性増幅およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等の他の方法を含む。
【００３７】
本明細書において、用語「線形増幅」は、反応における標的核酸の量に線形比例した標的核酸の増加を生じるよう設計された増幅機序を指す。例えば、複数のＲＮＡコピーは、転写関連反応を使用してＤＮＡ標的から作製することができ、コピー数の増加は、線形因子（ｌｉｎｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）により表すことができる（例えば、鋳型の出発コピー×１００）。好ましい実施形態では、多相増幅手順における第１相線形増幅は、第２相の増幅反応が始まる前に、標的核酸鎖またはその相補体の出発数を少なくとも１０倍、より好ましくは１００倍、またはさらにより好ましくは１０〜１，０００倍増加させる。線形増幅系の例は、「ＤＮＡのＴ７に基づく線形増幅」（ＴＬＡＤ；Ｌｉｕら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻：論文番号１９、２００３年５月９日を参照）である。他の方法は、本明細書に開示されている。したがって、用語「線形増幅」は、標的核酸配列の指数関数的増幅をもたらさない増幅反応を指す。用語「線形増幅」は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲの場合の様な、単一ｃＤＮＡ分子を生じるＲＮＡ分子の転写等、核酸鎖の単一コピーを単純に作製する方法を指すものではない。
【００３８】
本明細書において、用語「指数関数的増幅」は、反応における標的核酸の量に幾何学的に比例した標的核酸の増加を生じるよう設計された核酸増幅を指す。例えば、ＰＣＲは、本来の標的鎖毎および存在する合成された鎖毎に１本のＤＮＡ鎖を産生する。同様に、転写関連増幅は、本来の標的鎖毎およびその後合成された鎖毎に複数のＲＮＡ転写物を産生する。合成された鎖がその後の増幅ラウンドにおいて鋳型として使用されるため、増幅は指数関数的である。増幅反応がかかる増加を生じるよう設計されているのであれば、増幅反応は、指数関数的増幅と考慮される指数関数的に増加する量の核酸を実際に産生する必要はない。
【００３９】
本明細書において、用語「実質的に等温性の増幅」は、実質的に一定温度で行われる増幅反応を指す。反応の等温性部分は、可変温度における１種または複数のステップ、例えば、第１の変性ステップおよび最終熱失活ステップまたは冷却ステップの前または後に行うことができる。この定義が、温度のある特定の、好ましくは小さい変動を決して除外するものではなく、寧ろ、増幅された産物を生成するために「循環温度」を基本的に利用する当技術分野において公知の他の増幅技法から等温性増幅技法を区別するために使用されることが理解されよう。例えば、ＰＣＲが、加熱による変性と続くより低温におけるプライマーハイブリダイゼーションおよび重合のサイクルを利用するという点において、等温性増幅はＰＣＲと異なる。
【００４０】
開示されている方法の好ましい実施形態は、核酸鋳型から複数の転写物を産生することにより標的配列を増幅する、「転写関連増幅」方法と一般に称される等温性増幅系の態様を使用する。かかる方法は、一般に、その１つがプロモーター配列をもたらす１種または複数のオリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、リボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）ならびにＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、標的配列付近に機能的なプロモーター配列を生成し、続いてプロモーターから標的配列を転写する（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、第５，１２４，２４６号、第５，１３０，２３８号、第５，３９９，４９１号、第５，４３７，９９０号、第５，５５４，５１６号および第７，３７４，８８５号；ならびにＰＣＴ国際公開第ＷＯ１９８８／００１３０２号、第ＷＯ１９８８／０１０３１５号および第ＷＯ１９９５／００３４３０号）。例として、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）および自家持続配列複製法（３ＳＲ）が挙げられる。開示されている好ましい実施形態は、ＴＭＡ（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号）または１プライマー転写関連増幅（米国特許第７，３７４，８８５号、第７，６９６，３３７号および第７，９３９，２６０号）を利用するが、当業者であれば、オリゴヌクレオチド配列のポリメラーゼ媒介性伸長に基づく代替的な増幅方法を、本明細書に記載されている組成物および／または方法ステップと共に使用してもよいことを認めるであろう。
【００４１】
本明細書に開示されている実施形態の一部の理解に役立つように、以前に詳細に記載されたＴＭＡ方法（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号および第５，８２４，５１８号）を簡潔に要約する。ＴＭＡにおいて、増幅しようとする配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸に変換する任意の従来方法を使用することができる。プロモータープライマーは、標的核酸のその標的配列に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長させてｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスを生じる。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスのＲＮＡを消化し、第２のプライマーは、ｃＤＮＡにおけるプロモータープライマー末端の下流のその標的配列に特異的に結合する。次に、ＲＴは、ｃＤＮＡを鋳型として使用して第２のプライマーの３’末端を伸長することにより、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的なプロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを作製する。機能的なプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、初期標的鎖に相補的な約１００〜１０００個のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を産生する。第２のプライマーは、各アンプリコンにおけるその標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、アンプリコンＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作製して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスを産生する。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスからアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列は、新たに合成されたＤＮＡにおけるその相補的配列に結合し、ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端ならびにｃＤＮＡの３’末端を伸長させて、機能的なプロモーターを含有するｄｓＤＮＡを作製し、これにＲＮＡポリメラーゼが結合し、標的鎖に相補的な追加的なアンプリコンを転写する。反応においてこれらのステップを繰り返し使用する自己触媒的サイクルは、初期標的配列の約十億倍の増幅を生じる。アンプリコンは、アンプリコンに含有される配列に特異的に結合するプローブを使用することにより、増幅中に（リアルタイム検出）または反応のエンドポイントにおいて（エンドポイント検出）検出され得る。結合したプローブに起因するシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
【００４２】
標的核酸の存在を示す転写物を作製することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を増幅するために単一のプライマーおよび１種または複数の追加的な増幅オリゴヌクレオチドを使用する転写関連増幅の別の形態は、以前に詳細に記載されている（米国特許第７，３７４，８８５号、第７，６９６，３３７号および第７，９３９，２６０号）。簡潔に説明すると、この単一プライマー方法は、プライミングオリゴヌクレオチドと、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するよう修飾されたプロモーターオリゴヌクレオチド（またはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド）と、任意選択で、標的鎖からのｃＤＮＡの延長を終結するためのブロッカー分子（例えば、３’ブロックオリゴヌクレオチド）とを使用する。この方法は、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、（ｉ）プライマー伸長反応をそこから開始できるように、標的配列の３’末端にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドおよび（ｉｉ）標的配列の５’末端に隣接するまたはその付近の標的核酸に結合するブロッカー分子で処理することにより、複数コピーの標的配列を合成する。プライミングオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、プライマー伸長反応において伸長されて、標的配列に相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を生じ、ＤＮＡプライマー伸長産物は、ブロッカー分子により決定される３’末端を有し、標的配列の５’末端に相補的である。次に、この方法は、標的配列を選択的に分解する酵素を使用することにより、標的配列からＤＮＡプライマー伸長産物を分離し、ＤＮＡプライマー伸長産物の３’領域にハイブリダイズしてプロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる第１の領域と、第１の領域の５’にあるＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである第２の領域で構成されるプロモーターオリゴヌクレオチドであって、プロモーターオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防止するよう修飾されたプロモーターオリゴヌクレオチドで、ＤＮＡプライマー伸長産物を処理する。この方法は、プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドにおけるＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて、プロモーターオリゴヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を付加し、この配列は、プロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用した、ＤＮＡプライマー伸長産物に相補的な複数のＲＮＡ産物の転写に使用される。この方法は、標的配列と実質的に同一のＲＮＡ転写物を産生する。
【００４３】
１プライマー転写媒介増幅方法の実施形態は、標的配列の３’部分中の場所においてプライマーを、また、標的配列の５’部分中の場所において３’ブロックオリゴヌクレオチド（すなわち、ブロッカーオリゴヌクレオチド）を標的ＲＮＡにハイブリダイズさせることにより、複数コピーのＲＮＡ標的配列を合成する。次に、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性は、プライマーの３’末端から伸長を開始して、鋳型鎖とのデュプレックス中のｃＤＮＡ（ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックス）を産生する。結合した３’ブロックオリゴヌクレオチドは、この場所を超えるｃＤＮＡの伸長を妨害するため、３’ブロックオリゴヌクレオチドは、増幅しようとする配列の意図される５’末端に隣接する位置において標的鎖に結合する。すなわち、標的鎖に結合したブロッキング分子に伸長産物が達すると、重合が停止するため、ｃＤＮＡの３’末端は、ブロッカー分子の位置により決定される。当業者であれば、いかなる形態の鎖分離を使用してもよいことを認めるであろうが、ＲＮＡ：ｃＤＮＡデュプレックスは、ＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅ活性（ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ）により分離される。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列と、これがハイブリダイズするｃＤＮＡの３’領域における配列に相補的な３’配列とを含む。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するためのブロッキング部分を含む、修飾された３’末端を有する。ｃＤＮＡにハイブリダイズしたプロモータープロバイダーで形成されるデュプレックスにおいて、ｃＤＮＡの３’末端は、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性を使用することにより伸長され、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの３’末端にプロモーター配列を付加するための鋳型として機能し、これにより、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドにおける配列と、プロモータープロバイダー鋳型から作製された相補的ｃＤＮＡ配列で構成された機能的な二本鎖プロモーターが作製される。プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、機能的なプロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的な、初期標的ＲＮＡ鎖の標的配列と実質的に同一の複数のＲＮＡ転写物を転写する。その結果得られた増幅ＲＮＡは、プライマーを結合し、さらなるｃＤＮＡ産生の鋳型として機能し、試料に存在する初期標的核酸から多くのアンプリコンを最終的に産生することにより、プロセスを再度循環させることができる。単一プライマー転写関連増幅方法の実施形態は、ブロッカー分子として機能する３’ブロックオリゴヌクレオチドの使用を必要とせず、結合分子が含まれない場合、プライマーから作製されたｃＤＮＡ産物は、不確定３’末端を有するが、増幅は、上述と実質的に同様に進む。この増幅方法の性質により、これは、実質的な等温性条件下で、すなわち、ＰＣＲに基づく方法において使用されている通り、鎖を分離するまたはプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、インキュベーション温度を上昇および下降させるサイクルなしで行われる。
【００４４】
本明細書において、用語「タグ」は、標的配列への結合を超えるいくつかの追加的な機能性を付与する目的のために、オリゴヌクレオチドの標的特異的配列に共有結合により付着したヌクレオチド配列を指す。オリゴヌクレオチドタグの非限定例として、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター、プライマー結合部位、配列決定タグ、質量タグ、バーコードタグ、捕捉タグ、その他諸々が挙げられる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、第５，８８２，８５６号、第６，８２８，０９８号およびＰＣＴ国際公開第０５／０１９４７９号）。オリゴヌクレオチドタグは、特定のアッセイの特質に応じて、各標的配列またはユニバーサル（複数の標的配列により共有される、例えば、米国特許第５，１０４，７９２号）に特有のものとなり得る。
【００４５】
本明細書において、増幅された産物の「検出」は、任意の公知の方法を使用することにより達成することができる。例えば、増幅された核酸は、表面に会合することができ、これにより、検出可能な物理的変化（例えば、電気的変化）がもたらされる。増幅された核酸は、溶液相において、またはこれをマトリックス中もしくは上に濃縮し、これに会合した標識（例えば、エチジウムブロマイドまたはサイバーグリーン等、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））を検出することにより検出することができる。他の検出方法は、増幅された産物における配列に相補的なプローブを使用し、プローブ：産物複合体の存在を検出する、またはプローブの複合体を使用して、増幅された産物から検出されたシグナルを増幅する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、第５，４５１，５０３号および第５，８４９，４８１号）。分子ビーコン、分子トーチ（ｔｏｒｃｈ）またはハイブリダイゼーションスイッチプローブにおいて等、標識されたプローブが増幅された産物に結合した場合のみに、シグナルの変化が生じるため、他の検出方法は、シグナル産生が標的配列の存在に関連付けられたプローブを使用する（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、第５，３１２，７２８号、第５，９２５，５１７号、第６，１５０，０９７号、第６，３６１，９４５号、第６，５３４，２７４号、第６，８３５，５４２号、第６，８４９，４１２号および第８，０３４，５５４号；ならびに米国特許出願公開第２００６／０１９４２４０  Ａ１号）。かかるプローブは、典型的に、プローブの一端に付着した標識（例えば、フルオロフォア）と、プローブの別の場所に付着した相互作用化合物（例えば、クエンチャー）を使用することにより、プローブが、増幅された産物にハイブリダイズしていないことを示すあるコンフォメーション（「閉鎖」）であれば、標識からのシグナル産生を阻害するが、プローブが、増幅された産物にハイブリダイズして、そのコンフォメーションを変化させると（「開放」へと）、検出可能なシグナルが産生される。増幅された産物と特異的に会合した、直接的または間接的に標識されたプローブからのシグナルの検出は、増幅された標的核酸の存在を示す。
【００４６】
本明細書において、用語「標識」は、核酸プローブに直接的または間接的に連結され得る、検出され得るまたは検出可能な応答を生じ得る分子部分または化合物を指す。直接的な標識は、共有結合、非共有結合相互作用（水素結合、疎水性およびイオン性相互作用）またはキレートもしくは配位錯体を含む、標識およびプローブを連結するための結合または相互作用を使用することができる。間接的な標識は、直接的または間接的に標識され、シグナルを増幅することができる、架橋部分またはリンカー（例えば、抗体、オリゴヌクレオチドまたは他の化合物）を使用することができる。標識は、任意の検出可能な部分を含む。有用な検出可能部分の例として、放射性核種、ビオチンもしくはアビジン等のリガンド、酵素、酵素基質、反応基、発色団（検出可能な色素、粒子またはビーズ）、フルオロフォアまたは発光化合物（例えば、生物発光、リン光または化学発光標識）が挙げられる。好ましい化学発光標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）およびその誘導体を含む（米国特許第５，６３９，６０４号、第５，６５６，２０７号および第５，６５８，７３７号）。好ましい標識は、ホモジニアスアッセイにおいて検出可能であり、混合物における結合した標識プローブは、非結合型から結合型の物理的な分離を必要とせずに、非結合標識プローブと比較して検出可能な変化、例えば、安定性または差次的分解を呈する（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号および第５，６５８，７３７号）。標識を合成する、標識を核酸に付着させる、および標識を検出する方法は、周知のものである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）、第１０章；米国特許第４，５８１，３３３号、第５，２８３，１７４号、第５，５４７，８４２号、第５，６５６，２０７号および第５，６５８，７３７号）。
【００４７】
特異的結合対（または結合パートナー）のメンバーは、互いに特異的に認識し結合する部分である。メンバーは、第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）および第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と称することができ、これは、特異的に一体に結合する種々の部分を表す。特異的結合対は、受容体とそのリガンド、酵素とその基質、補助因子または補酵素、抗体またはＦａｂ断片とその抗原またはリガンド、糖とレクチン、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジン、リガンドとキレート剤、ヒスチジンとニッケル等のタンパク質またはアミノ酸とその特異的結合金属、完全にまたは部分的に相補的な配列を含む実質的に相補的なポリヌクレオチド配列および相補的ホモポリマー配列により例証される。特異的結合対は、天然に存在（例えば、酵素と基質）、合成（例えば、合成受容体と合成リガンド）または天然に存在するＢＰＭと合成ＢＰＭの組合せとなり得る。
【００４８】
本明細書において、用語「標的捕捉」は、細胞断片、細胞小器官、タンパク質、脂質、炭水化物または他の核酸等、試料混合物の他の構成成分から標的核酸を選択的に分離することを指す。標的捕捉系は、特異的であり、他の試料構成成分から所定の標的核酸を選択的に分離することができる（例えば、企図される標的核酸に特異的な配列を使用することにより）、または非特異的となり、標的の他の特徴（例えば、当該物理的特徴を呈さない他の試料構成成分からこれを区別する標的核酸の物理的形質）を使用することにより、他の試料構成成分から標的核酸を選択的に分離することができる。好ましい標的捕捉方法および組成物は、以前に詳細に記載されている（米国特許第６，１１０，６７８号および第６，５３４，２７３号；ならびに米国特許出願公開第２００８／０２８６７７５  Ａ１号）。好ましい標的捕捉実施形態は、溶液相における標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび支持体に付着された固定化捕捉プローブを使用して、標的核酸と複合体を形成させ、他の構成成分から捕捉された標的を分離する。
【００４９】
本明細書において、用語「標的捕捉オリゴヌクレオチド」は、相補的核酸配列同士またはビオチンとストレプトアビジン等、結合対メンバーを使用することにより、標的核酸および固定化された捕捉プローブを架橋または連結する少なくとも１種の核酸オリゴヌクレオチドを指す。１つのアプローチにおいて、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、標的核酸に非特異的に結合し、これを固体支持体に固定化する。異なるアプローチにおいて、標的捕捉オリゴヌクレオチドの標的特異的（ＴＳ）配列は、標的核酸における配列に特異的に結合する。両方のアプローチにおいて、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、固定化された捕捉プローブに結合する固定化された捕捉プローブ結合領域を含む（例えば、特異的結合対相互作用により）。ＴＳ配列および固定化された捕捉プローブ結合領域が両者共に核酸配列である実施形態では、両者は、互いに共有結合により連結され得る、または１種もしくは複数のリンカーにより連結された異なるオリゴヌクレオチドに存在し得る。
【００５０】
「固定化された捕捉プローブ」は、標的捕捉オリゴヌクレオチドを固体支持体に連結するための手段を提供する。固定化された捕捉プローブは、固体支持体に連結された塩基配列認識分子であり、非結合材料からの結合標的ポリヌクレオチドの分離を容易にする。溶液中に遊離したマトリックスおよび粒子等、任意の公知の固体支持体を使用することができる。例えば、固体支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合型ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、好ましくは、磁気的に誘引できる粒子となり得る。特に好ましい支持体は、単分散（すなわち、サイズが±約５％で均質）の磁性球を含み、これにより一貫した結果をもたらし、これは、自動化アッセイにおける使用に特に有利である。固定化された捕捉プローブは、固体支持体に直接的に（例えば、共有結合またはイオン性相互作用により）または間接的に連結され得る。有用な固体支持体の一般例として、磁性粒子またはビーズが挙げられる。
【００５１】
本明細書において、用語「分離」または「精製」は一般に、混合物における１種または複数の他の構成成分から試料等、混合物の１種または複数の構成成分を取り出すことを指す。試料構成成分は、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質および他の化合物を含み得る一般には水溶液相における核酸を含む。好ましい実施形態は、混合物における他の構成成分から、標的核酸の少なくとも７０％〜８０％、より好ましくは、約９５％を分離または取り出す。
【００５２】
Ｂ．多相増幅の方法
上に記す通り、本発明の第１の態様は、次のステップを含む、試料中の標的核酸配列を増幅するための方法に関する。最初に、標的核酸配列は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の増幅反応に付される。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これはその後、第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で、第２相の増幅反応に付され、これにより、第２の増幅産物を生成する。
【００５３】
本態様では、標的核酸配列は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡ配列となり得る。しかし、好ましい実施形態では、標的配列は、ＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、第１の増幅ステップの前に、試料は、試料中の標的核酸配列の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させることができる。第１の増幅オリゴヌクレオチドは、通常、標的特異的配列と、任意選択で、１種または複数のタグ配列を含む。好ましい実施形態では、タグ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’プロモーター配列、増幅プライマー結合部位、捕捉に使用される特異的結合部位または配列決定プライマー結合部位となり得る。一部の実施形態では、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、第１の増幅ステップの前に、第１の増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。
【００５４】
多くの場合、第１相増幅に先立ち標的核酸配列を単離することが望ましくなり得る。この目的を達成するために、試料は、標的核酸配列の部分への標的捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させることができる。一部の実施形態では、標的核酸は、例えば、固定化された捕捉プローブとの相互作用により直接的に固体支持体上に捕捉される。あるいは、標的核酸は、標的捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸および固定化された捕捉プローブを架橋した、３分子複合体のメンバーとして固体支持体上に捕捉される。いずれのシナリオにおいても、固体支持体は、典型的に、磁場を使用して操作することができる、複数の磁性または磁化可能粒子またはビーズを含む。好ましくは、標的核酸配列を単離するステップは、標的捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸配列ハイブリッドを洗浄して、その後の増幅に干渉し得る望ましくない構成成分を除去するステップも含む。
【００５５】
標的核酸配列を単離するステップは、標的核酸配列の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１の増幅オリゴヌクレオチドと試料を接触させるステップを含む場合がある。一部の実施形態では、第１の増幅オリゴヌクレオチドにより標的化される標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチドにより標的化される部分とは完全に異なっていてよい（例えば、非重複）。あるいは、第１の増幅オリゴヌクレオチドにより標的化される標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチドにより標的化される部分と完全にもしくは部分的に重複することができる、またはそれと同一であってもよい。第１の増幅オリゴヌクレオチドは、通常、標的特異的配列と、任意選択で、１種または複数のタグ配列を含む。好ましい実施形態では、タグ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’プロモーター配列および上述の他の機能的部位となり得る。一部の実施形態では、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列単離ステップにおいて、第１の増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドが、複合体、例えば、直接的ハイブリッド（ＤＨ）複合体を形成し得ることが考慮される。一部の実施形態では、第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、標的特異的配列の５’に位置するタグ配列（例えば、ユニバーサルタグ）を含むことができ、このタグ配列は、第２相増幅において、増幅オリゴヌクレオチドにより標的化され得る。
【００５６】
増幅オリゴヌクレオチドプライマーは、多くの場合、標的捕捉試薬中に提供される。ある特定の好ましい実施形態では、標的捕捉試薬は、第１相の増幅反応における特定の増幅産物の産生において使用するべき増幅オリゴヌクレオチドのうち１種のみを含む。増幅オリゴヌクレオチドは、標的捕捉ステップにおいて、標的核酸にハイブリダイズし、標的配列と共に単離することができる。この方法の利点の１つは、標的捕捉において標的核酸に増幅オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、捕捉された核酸を洗浄して、ハイブリダイズしていない増幅オリゴヌクレオチドプライマー、プロバイダーおよび／または複合体等の試料構成成分を除去することができることである。マルチプレックス反応において、ハイブリダイズしていない増幅オリゴヌクレオチドの除去は、過剰な増幅オリゴヌクレオチドの干渉なしで、マルチプレックス増幅反応を行わせることができ、これにより、マルチプレックス反応に共通の問題を実質的に低下または排除することができる。さらに、増幅オリゴヌクレオチドまたは増幅オリゴヌクレオチド複合体が、タグ配列を含む場合、タグは、第１の増幅産物に取り込まれ、これにより、タグ配列に特異的なプライマーを使用したその後の増幅を可能にする。
【００５７】
上に記す通り、第１相の増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で行われる。好ましい実施形態では、第１相の増幅反応は、線形増幅反応である。第１相の増幅反応は、典型的に、標的核酸配列の約２倍〜約１０，０００倍の増幅、好ましくは、約１０倍〜約１０，０００倍の増幅を生じるであろう。一部の実施形態では、第１相の増幅反応は、実質的に等温性である、すなわち、ＰＣＲおよび他の一般的な増幅技法のサーマルサイクリングの特徴を伴わない。典型的には、第１相の増幅反応は、標的核酸配列の線形増幅を支持し、その指数関数的増幅に必要な少なくとも１種の構成成分を欠く第１相増幅反応混合物と標的核酸配列を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、第１相増幅反応混合物は、逆転写酵素、ポリメラーゼおよびこれらの組合せから選択される増幅酵素を含む。ポリメラーゼは、典型的に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびこれらの組合せから選択される。好ましい実施形態では、第１相増幅反応混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ等のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）またはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素をさらに含む。好ましくは、第１相増幅混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、第１相増幅混合物は、増幅オリゴヌクレオチドを含むこともできる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列および／またはその酵素的伸長を防止するブロック３’末端を含む。加えて、第１相増幅混合物は、所望のエンドポイントを超えた標的核酸配列の酵素的伸長を防止するためのブロッカーオリゴヌクレオチドを含む場合もある。
【００５９】
上に記す通り、第１相の増幅反応の主要な特色は、指数関数的増幅に必要とされる１種もしくは複数の構成成分が欠けている、および／または指数関数的増幅を阻害する薬剤が存在している、および／または反応混合物の温度が指数関数的増幅を助けない等のため、それに指数関数的増幅反応を支持する能力がないことである。限定することなく、指数関数的増幅に必要とされる欠如した構成成分および／または阻害剤および／または反応条件は、次の群から選択することができる：増幅オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列、非プロモーター増幅オリゴヌクレオチドまたはこれらの組合せを含む増幅オリゴヌクレオチド）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、クリベース、ＲＮａｓｅ、ホスホリラーゼ、グリコシラーゼ等）、酵素補助因子、キレーター（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、塩、バッファー、酵素阻害剤、ブロッキングオリゴヌクレオチド、ｐＨ、温度、塩濃度およびこれらの組合せ。場合によっては、欠如した構成成分は、第１相反応に存在する指数関数的増幅の阻害剤の効果を反転させる薬剤等、間接的に関与し得る。
【００６０】
上に記す通り、第２相（または、３相以上が存在する場合はそれ以降の）増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を可能にする条件下で行われる。したがって、好ましい実施形態では、第２相の増幅反応は、指数関数的増幅反応である。第１相の増幅反応と同じく、第２相の増幅反応は、好ましくは、例えば転写関連増幅反応または鎖置換増幅反応等、実質的に等温性反応である。特に好ましい実施形態では、第２相の増幅反応は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。
【００６１】
第２（またはそれ以降の）相増幅は通常、第１相増幅反応混合物と組み合わせると標的核酸配列の指数関数的増幅を支持するであろう第２相増幅反応混合物と、第１の増幅産物を接触させるステップを含む。よって、第２相増幅反応混合物は、典型的に、最小で、第１相増幅反応混合物が欠く指数関数的増幅に必要とされる１種または複数の構成成分を含む。一部の実施形態では、第２相増幅反応混合物は、増幅オリゴヌクレオチド、逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補助因子、キレーター、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、最適ｐＨ、最適温度、塩およびこれらの組合せから選択される構成成分を含む。ポリメラーゼは、典型的に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、第２相増幅反応混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ等のＲＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素をさらに含む。場合によっては、第２相増幅反応混合物は、増幅オリゴヌクレオチド、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００６２】
本発明の方法を使用して、生物学的試料中の標的核酸配列を定量化することができる。この目的を達成するために、第２相の増幅反応は、好ましくは、定量的増幅反応である。典型的には、本方法は、種々の検出技法、例えば、検出プローブ、配列決定反応、電気泳動、質量分析、融解曲線解析またはこれらの組合せを使用した、第２の増幅産物を検出する追加的なステップを含むであろう。好ましくは、第２の増幅産物は、検出プローブを使用して定量化される。一部の実施形態では、定量化ステップは、リアルタイムで行うことができ、例えば、定量化に使用される検出プローブが、分子ビーコン、分子トーチ、ハイブリダイゼーションスイッチプローブまたはこれらの組合せである場合、これを達成することができる。検出プローブは、実質的に等しい成功の程度で、第１および／または第２相の増幅反応に含まれ得る。
【００６３】
一部の実施形態では、本方法は、増幅オリゴヌクレオチド、逆転写酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素）、ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補助因子、キレーター、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、塩およびこれらの組合せから選択される増幅構成成分の別のボーラスと第２の増幅産物を接触させるステップをさらに含む。増幅反応構成成分の一部は、時間と共に枯渇し得るため、この追加的なステップの目的は、第２相の増幅反応に強化をもたらすことである。
【００６４】
本発明の密接に関係する態様は、次のステップを含む、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための方法に関する。最初に、標的核酸配列は、いずれの標的核酸配列の指数関数的増幅も支持しない条件下で、第１相の増幅反応に付される。第１相の増幅反応は、複数の第１の増幅産物を生成し、これらはその後、第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で、第２（またはそれ以降の）相増幅反応に付され、これにより、複数の第２の増幅産物を生成する。
【００６５】
第２の態様の修正されたバージョンでは、本発明は、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための方法であって、標的核酸配列の全てではなく一部が線形増幅に付される、および／または標的核酸配列の全てではなく一部が指数関数的増幅に付される方法を提供する。第１相増幅の少なくとも３通りの変種が考慮される：（１）標的配列のいくつかは線形増幅に付され、残りは増幅されず、（２）標的配列のいくつかは指数関数的増幅に付され、残りは増幅されず、（３）標的配列のいくつかは線形増幅に付され、残りは指数関数的増幅に付される。よって、第１相増幅は、全標的核酸配列（オプション３）またはそのサブセットのみ（オプション１および２）の増幅をもたらし得る。標的核酸配列のサブセットは、他の標的と比較して、相対的に少量で存在することが公知の標的および／または増幅が困難な標的を表すことができる。第１相の増幅反応は、１種または複数の第１の増幅産物を生成する。次に、試料中の第１の増幅産物（複数可）および任意の増幅されない標的核酸配列（複数可）は、その指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に付され、複数の第２の増幅産物を生成する。
【００６６】
多相ユニプレックス（すなわち、単一標的）増幅に関連する上述の様々な任意選択の要素およびパラメータは、本明細書に記載されている多相マルチプレックス増幅様式にも適用可能であることが理解される。
【００６７】
Ｃ．多相増幅のための組成物
上に記す通り、第３の態様では、本発明は、次の構成成分を含む、試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物を提供する：（ａ）標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズする増幅オリゴヌクレオチド、（ｂ）標的核酸配列の第２の部分にハイブリダイズする任意選択の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび（ｃ）増幅酵素。本組成物の主要な特色の１つは、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１種の構成成分を欠くことである。本願の他の箇所に詳細に説明されている通り、本組成物の利点の１つは、非特異的増幅の低下に役立ち、これにより、標的配列に対し増幅資源を集中させることである。
【００６８】
本態様では、標的核酸配列は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡ配列となり得る。一部の実施形態では、第１の増幅オリゴヌクレオチドにより標的化される標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチド（使用される場合）により標的化される部分とは完全に異なっていてよい（例えば、非重複）。あるいは、第１の増幅オリゴヌクレオチドにより標的化される標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチドにより標的化される部分と完全にもしくは部分的に重複することができる、またはこれと同一であってもよい。一部の特殊な事例において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、増幅オリゴヌクレオチドと構造的に同一となり、標的捕捉に加えて増幅機能を行うこともできる。標的捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接的にカップリングすることができる（例えば、共有結合により）。あるいは、組成物は、捕捉プローブが標的捕捉オリゴヌクレオチドの部分にハイブリダイズするように、固体支持体にカップリングした捕捉プローブをさらに含むことができる。固体支持体は、好ましくは、磁場を使用して操作することができる、複数の磁性または磁化可能粒子またはビーズを含む。
【００６９】
上に記す通り、本組成物の増幅オリゴヌクレオチドは、標的特異的配列と、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’プロモーター配列を含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２種の増幅オリゴヌクレオチドを含むことができ、その１種は、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の５’プロモーター配列を含むことができる。プロモーター含有増幅オリゴヌクレオチドは、その酵素的伸長を防止するブロック３’末端をさらに含むことができる。組成物が２種以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む事例において、オリゴヌクレオチドは、複合体、例えば、ＤＨ複合体を形成することができる。ＤＨ複合体は、その５’末端において、ＤＨ複合体の第２の増幅オリゴヌクレオチドに非プロモーター増幅オリゴヌクレオチドを連結するための連結メンバーに連結された標的特異的配列を含む、非プロモーター増幅オリゴヌクレオチドを含むことができる。第２の増幅オリゴヌクレオチドは、典型的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む。単一プライマー増幅に関連して、上により詳細に説明されている通り、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、その酵素的伸長を防止するブロック３’末端を含む場合もある。非プロモーター増幅オリゴヌクレオチドの連結メンバーは、典型的に、第２の増幅オリゴヌクレオチドの部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。第２の増幅オリゴヌクレオチドがプロモーター配列を含む場合、第１の増幅オリゴヌクレオチドの連結メンバーは、好ましくは、第２の増幅オリゴヌクレオチドのプロモーター配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種は、標的特異的配列の５’に位置するタグ配列（例えば、ユニバーサルタグ）を含むことができる。加えて、本組成物は、所望のエンドポイントを超えた標的核酸配列の酵素的伸長を防止するためのブロッカーオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７０】
本組成物の増幅酵素は、逆転写酵素、ポリメラーゼまたはこれらの組合せの形態となり得る。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびこれらの組合せから選択することができる。組成物は、好ましくは、ＲＮａｓｅ  Ｈ等のＲＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素をさらに含む。ある事例において、組成物は、等温性増幅反応をリアルタイムでモニターするための検出プローブをさらに含むことができ、この検出プローブは、分子ビーコン、分子トーチ、ハイブリダイゼーションスイッチプローブおよびこれらの組合せから選択することができる。
【００７１】
上に記す通り、本組成物の主要な特色の１つは、それが、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１種の構成成分を欠くことである。指数関数的増幅に必要とされる欠如した構成成分は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プロモータープライマーまたは非プロモータープライマー）、ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補助因子、キレーター、１種もしくは複数のリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、最適ｐＨ、最適温度、塩、最適塩濃度またはこれらの組合せとなり得る。このリストは、網羅的ではなく、指数関数的増幅反応が進むために必要な他の構成成分を含み得ることが理解される。
【００７２】
マルチプレックス増幅が企図される場合、本組成物は、複数の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする複数の異なる標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび複数の異なる増幅オリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７３】
上に記す通り、本発明は、また、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための代替的な組成物を提供する。この代替的な組成物は、次の構成成分を含む：（ａ）複数の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする複数の異なる増幅オリゴヌクレオチド複合体であって、各増幅オリゴヌクレオチド複合体が、第２の標的特異的配列を有する第２の増幅オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に連結された、第１の標的特異的配列を有する第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む増幅オリゴヌクレオチド複合体、および（ｂ）増幅酵素。再度、組成物は、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１種の構成成分を欠く。
【００７４】
第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドのうち一方は、典型的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む。単一プライマー増幅に関連して、上により詳細に説明されている通り、プロモーター含有増幅オリゴヌクレオチドは、その酵素的伸長を防止するブロック３’末端を含むことができる。一部の実施形態では、第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、標的特異的配列の５’に位置するタグ配列（例えば、ユニバーサルタグ）を含むこともできる。組成物は、所望のエンドポイントを超えた標的核酸配列の酵素的伸長を防止するためのブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００７５】
一部の実施形態では、組成物は、標的核酸配列にハイブリダイズする複数の異なる標的捕捉オリゴヌクレオチドを含むこともできる。標的捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接的にカップリングすることができる（例えば、共有結合により）。あるいは、組成物は、捕捉プローブが標的捕捉オリゴヌクレオチドの部分にハイブリダイズするように、固体支持体にカップリングされた捕捉プローブをさらに含むことができる。固体支持体は、好ましくは、磁場を使用して操作することができる、複数の磁性または磁化可能粒子またはビーズを含む。
【００７６】
上に記す通り、本明細書に開示されている方法および組成物は、試料中の標的核酸の存在を示すために検出され得る増幅された配列を産生するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的核酸配列の増幅に有用である。方法および組成物は、医学的状態の診断および／もしくは予後判断に、環境および／もしくは食品試料の純度もしくは質の検出に、または法医学的証拠の調査に有用な情報を提供するための、増幅された核酸の合成に有用である。方法および組成物は、種々の核酸の合成を可能にし、実施が比較的迅速かつ安価な広いダイナミックレンジにわたり高感度のアッセイを提供し、ハイスループットおよび／または自動化システムにおける使用に適したものとなるため有利である。方法および組成物は、単一標的配列、すなわちユニプレックス増幅系を解析するアッセイに使用することができ、複数の異なる標的配列、すなわちマルチプレックス増幅系を同時に解析するアッセイに特に有用である。好ましい組成物および反応混合物は、使用者に、所望の標的を増幅するためにアッセイにおいて構成成分を一体に使用する方法を効率的に実施させるため、有用な定義されたアッセイ構成成分を含むキットに用意される。
【００７７】
本明細書に記載されている組成物および方法の実施形態は、次の実施例によりさらに理解することができる。実施例において使用される方法ステップは、本明細書に記載されており、次の情報は、より特殊な方法において使用される典型的な試薬および条件を説明する。核酸増幅の技術分野の当業者は、上述に提示されているガイダンスに従う限り、プロセスまたは結果に実質的に影響を与えない他の試薬および条件を使用してよいことを認めるであろう。例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）方法が、後述する実施例に記載されているが、本願発明の方法は、ＴＭＡに基づく実施形態に限定されない。さらに、分子生物学の技術分野の当業者であれば、開示されている方法および組成物は、手作業で、または自動化デバイスにおいて１種もしくは複数のステップ（例えば、ピペッティング、混合、インキュベーションその他）を行うシステムにおいて行うことができる、あるいは任意の型の公知デバイス（例えば、試験管、マルチチューブユニットデバイス、９６ウェルマイクロタイタープレート等のマルチウェルデバイスその他）において使用することができることも理解するであろう。
【実施例】
【００７８】
実施例に記載されている方法において使用される例示的な試薬は、次のものを含む。
【００７９】
「試料輸送培地（Ｓａｍｐｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）」または「ＳＴＭ」は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．７）である。
【００８０】
「標的捕捉試薬」または「ＴＣＲ」は、（ｄＴ）１４オリゴヌクレオチドが共有結合した２５０μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．、インディアナポリス、ＩＮ）と共に、塩化リチウムおよびＥＤＴＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６．４）である。
【００８１】
「標的捕捉洗浄溶液」または「ＴＣ洗浄溶液」は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）無水エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベンおよび０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．５）である。
【００８２】
「増幅試薬」または「ＡＲ」は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、４種のリボヌクレオチド三リン酸（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびｒＵＴＰ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．７）である。プライマーおよび／またはプローブは、増幅試薬における反応混合物に加えることができる、または試薬とは別に加えることができる（プライマーなし増幅試薬）。
【００８３】
増幅または増幅前反応混合物において使用される「酵素試薬」または「ＥＲ」は、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、塩および補助因子を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）である。
【００８４】
（実施例１）
標準単相増幅プロトコール
リアルタイムで結果を検出する標準単相ＴＭＡ反応のための例示的なプロトコールを次に記す。アッセイは、増幅前の標的核酸の精製、増幅および増幅において増幅された産物の検出を含む。
【００８５】
標的捕捉は、実質的に以前に詳細に記載された通りに行われる（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号および第６，５３４，２７３号）。簡潔に説明すると、試料は、公知の量の標的ＲＮＡを含有するよう調製される（水および試料輸送培地の１：１（ｖ：ｖ）混合物の総容量４００ｍｌにおける試料当たり所定のコピーレベルで存在するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物（「ＩＶＴ」））。各試料は、捕捉しようとする分析物核酸に特異的な５ｐｍｏｌの標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）（すなわち、３’標的特異的結合領域）と、固定化プローブ（例えば、常磁性粒子に付着したポリＴオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドを付着した反応当たり１２．５μｇの粒子）に結合するための５’テイル領域（例えば、ｄＴ３Ａ３０配列）とを典型的に含有する１００ｍｌのＴＣＲと混合される。混合物を２５〜３０分間６０±１℃でインキュベートし、次に、２５〜３０分間室温で（２０〜２５℃）インキュベートして、磁性分離（例えば、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６（商標）磁性粒子処理装置、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ）により単離しＴＣ洗浄溶液を使用して１回洗浄した常磁性粒子に標的核酸が結合しているハイブリダイゼーション複合体を形成させる。
【００８６】
増幅において使用される増幅オリゴヌクレオチドと共に０．０７５ｍｌの増幅試薬に粒子を再懸濁する。検出プローブ（例えば、蛍光標識化合物で標識された分子ビーコンまたは分子トーチプローブ）は、増幅オリゴヌクレオチドと共に、または酵素の添加と共に、または酵素の添加後に添加することができる。反応混合物を覆って蒸発を防止し、１〜２分間４２±０．５℃でインキュベートする。これを４２±０．５℃に維持しつつ、混合物の覆いを取って、混合物当たり０．０２５ｍｌの酵素試薬と混合し、再度覆いをして３０〜４０分間４２±０．５℃でインキュベートし、この間に、規則的な時間間隔（例えば、１分間に１回または１分間に数回の読み取り）で蛍光を測定する。これはデータ収集および表示のための「サイクル」と称され、典型的には、検出された蛍光単位対時間のグラフであり、これを基にシグナル出現の時間が決定される（「ＴＴｉｍｅ」、すなわち、試料の蛍光シグナルが所定のバックグラウンドレベルを上回り陽性となる時間）。
【００８７】
（実施例２）
フォワードＴＭＡフォーマットにおける二重相ＨＩＶ−１増幅の評価
本実施例において、ｐｏｌ領域を含有するヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、サブタイプＢ標的鋳型を使用して、二重相フォワードＴＭＡを評価した。
【００８８】
図１に簡潔に要約されている通り、ここで使用される二重相増幅アプローチにおいて、標的捕捉においてＴ７プライマーを標的ＨＩＶ−１配列にハイブリダイズさせ、続いて、過剰なＴ７プライマーを除去した。増幅プロセスを２種の別個の相に分けた。第１相において、追加的なＴ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に非Ｔ７プライマーを導入した。逆転写酵素の存在下において、標的にハイブリダイズしたＴ７プライマーを伸長し、ｃＤＮＡコピーを作製し、逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により標的ＲＮＡ鋳型を分解した。非Ｔ７プライマーは、その後、ｃＤＮＡにハイブリダイズし、続いて伸長されてＴ７プライマーのプロモーター領域を埋め、活性な二本鎖の鋳型を作製した。次に、Ｔ７ポリメラーゼは、鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生した。非Ｔ７プライマーは、その後、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、伸長されて、標的ＲＮＡ鋳型のプロモーターなしのｃＤＮＡコピーを産生した。逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性によりＲＮＡ鎖を分解した。相１増幅混合物においてＴ７プライマーを利用できなかったため、反応は、それ以上進むことができなかった。次に、Ｔ７プライマーの添加と共に第２相を始め、これにより、相１において産生されたｃＤＮＡプールの指数関数的増幅を開始した。
【００８９】
二重相アプローチの初期評価の結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。図３Ａは、二重相フォーマットを模倣するよう修飾された単相増幅実験の結果を示す。より具体的には、標的捕捉ステップにおいてＴ７プライマーを添加した（標準６０℃アニーリングステップをプロトコールから排除することができる）；第１相においてプライマーまたは酵素試薬を添加しなかった；指数関数的増幅の開始のために、第２相に非Ｔ７およびＴ７プライマーならびに酵素試薬を添加した。標準単相対照のためのこの修飾プロトコールが、その性能を幾分損なった可能性があるという懸念に取り組むため、本発明者らは、標準単相フォワードＴＭＡと修飾単相フォワードプロトコールを比較した（図２Ａ〜図２Ｂ）。図２Ａおよび図２Ｂから分かる通り、２種のプロトコールは、高度に類似レベルの検出の精度および感度をもたらした。対照的に、二重相プロトコールは、これらの条件下における標準単相フォーマットと比較して、分析物濃度のローエンドにおいて（ほぼ２０コピー／ｒｘｎ）有意に改善された感度および精度を生じた（図３Ｂ）。特に、二重相フォーマットは、精度およびより短い検出時間の両方の観点から、優れた性能を生じた（図３Ｃ）。
【００９０】
（実施例３）
二重相ＨＩＶ−１増幅パラメータの最適化
最適化プロセスにおける第１の優先順位は、出現時間を遅らせ、個々の標的インプットレベルを分離して、的確かつ正確な定量化を可能にすると共に、非Ｔ７プライマーへのいかなる推定上の干渉も低下させることであった。これは、第２相においてＴ７プライマー濃度を下げつつ用量設定することにより達成された（図３Ｂに描写されている二重相反応において使用された量は、１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎであった）。アッセイは、検査した最低量のＴ７プロバイダーにより（１．０ｐｍｏｌ／ｒｘｎ；図４Ａ〜図４Ｄ）、１０コピー／ｒｘｎ感度および高精度を保持することが示された。
【００９１】
同様に、Ｔ７プライマーを１ｐｍｏｌ／ｒｘｎに一定に維持しつつ、非Ｔ７プライマーも、下方に用量設定した（図３Ｂに描写されている二重相反応において使用された量は、１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎであった）。１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎのレベルは、精度を失わない高感度増幅に十分であることが判明した（図５Ａ）。非Ｔ７プライマーの２ｐｍｏｌ／ｒｘｎのレベルにおいて、１０コピー／ｒｘｎにおける精度は、１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎの非Ｔ７プライマーほどに良好ではないが（図３Ｂ）、アッセイの性能は、単相対照よりも依然として優れていた（図３Ａ）。
【００９２】
よって、本発明者らは、思いがけないことに、二重相増幅フォーマットが、副産物生成およびマルチプレックス干渉を低下させつつ、プライマー濃度を実質的に低下させながらも、単相フォーマットと比較して優れた性能を達成することを見出した。
【００９３】
第２相における酵素の追加的なボーラスの必要も試験した（図６Ａ〜図６Ｃ）。第１相への酵素添加の制限は、検査した分析物濃度のローエンドにおける精度の中等度の改善をもたらした（図６Ｂおよび図６Ｃ）。さらに、各コピーレベルは、酵素試薬が両方の相に存在する二重相フォーマットと比べて、およそ５分間遅れて出現した。しかし、以前に観察された感度の改善は保持された。
【００９４】
（実施例４）
ＨＰＶ１６の二重相増幅
二重相増幅フォーマットが、ＨＩＶ−１検出を超える広い適用性を有するか否か決定するために、これをヒトパピローマウイルスサブタイプ１６（ＨＰＶ１６）において検査した。
【００９５】
二重相増幅プロトコールは、実施例２における上述と基本的に同じであった。簡潔に説明すると、標的捕捉においてＴ７プライマーを標的ＨＰＶ１６配列にハイブリダイズさせ、続いて過剰なＴ７プライマーを除去した。増幅の第１相において、追加的なＴ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に非Ｔ７プライマーを添加した。５分間４２℃に置いた後に、反応混合物にＴ７プライマーを添加して、リアルタイム検出とともに同様に４２℃で実施した、指数関数的増幅相を開始した。実施例１に記載されている標準単相フォワードＴＭＡフォーマットにおいて同じプライマーおよび検出プローブを使用して、単相対照実験を行った。
【００９６】
ＨＰＶ１６増幅実験の結果を図７Ａ〜図７Ｃに示す。図７Ａに示す通り、単相フォーマットは、ほぼ５００コピー／ｍＬ（ほぼ２００コピー／ｒｘｎ）の低さまで標的鋳型を検出することができた一方、二重相フォーマットは、ほぼ３０コピー／ｍＬ（ほぼ１３コピー／ｒｘｎ）まで感度を１５倍超改善した（図７Ｂ）。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下に関連した（図７Ｃ）。
【００９７】
（実施例５）
ＰＣＡ３の二重相増幅
加えて、前立腺がん抗原３（ＰＣＡ３）において二重相増幅フォーマットを検査した。
【００９８】
類似の二重相増幅プロトコールを使用した。簡潔に説明すると、標的捕捉においてＴ７プライマーを標的ＰＣＡ３配列にハイブリダイズさせ、続いて過剰なＴ７プライマーを除去した。増幅の第１相において、追加的なＴ７プライマーおよび分子トーチ検出プローブを例外として、必要な増幅および酵素試薬の全てと共に非Ｔ７プライマーを添加した。５分間４２℃に置いた後に、Ｔ７プライマーおよび検出プローブを反応混合物に添加して、リアルタイム検出とともに同様に４２℃で実施した、指数関数的増幅相を始めた。標準単相ＴＭＡフォーマットにおいて同じプライマーおよび検出プローブを使用して、単相対照実験を行った。
【００９９】
ＰＣＡ３増幅実験の結果を図８Ａ〜図８Ｃに示す。図８Ａ〜図８Ｂから分かる通り、二重相フォーマットは、標準単相フォーマットと比較して、分析物濃度のローエンドにおいて（ほぼ１３０コピー／ｍｌ、ほぼ５０コピー／ｒｘｎに等しい）有意に改善された感度および精度を生じた。加えて、本発明者らの先の観察と同様に、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマット（図８Ｃ）と比較して、検出時間の有意な低下に関連した。
【０１００】
（実施例６）
ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの二重相共増幅
次に、本発明者らは、複数標的の同時増幅のための二重相増幅フォーマットを用いた。本実施例において、二重相フォワードＴＭＡプロトコールを使用してＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ標的鋳型を共増幅して、デュプレックス増幅が、ユニプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した（実施例２〜５）感度および精度における同じ改善をもたらすかどうか、また、標準単相フォーマットにおいて観察されることが多い分析物間の干渉の低下を生じるかどうかを決定した。
【０１０１】
簡潔に説明すると、標的捕捉においてＴ７プライマーを標的ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧ配列にハイブリダイズさせ、続いて過剰なＴ７プライマーを除去した。増幅の第１相において、追加的なＴ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に非Ｔ７プライマーを添加した。５分間４２℃に置いた後、Ｔ７プライマーを反応混合物に添加して、２種の異なる蛍光チャネル（標的毎に１種）におけるリアルタイム検出とともに同様に４２℃で実施した、指数関数的増幅相を開始した。実施例１に記載されている通り標準単相フォワードＴＭＡフォーマットにおいて同じプライマーおよび検出プローブを使用して、単相対照実験を行った。
【０１０２】
Ｔ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３増幅の結果を図９Ａ〜図９Ｃに示す。図９Ａ〜図９Ｂから分かる通り、二重相フォーマットは、標準単相フォーマットと比較して、分析物濃度のローエンドにおいて（ほぼ１，２５０コピー／ｍｌ、ほぼ５００コピー／ｒｘｎに等しい）有意に改善された感度および精度を生じた。これらの結果は、二重相フォーマットが、マルチプレックス反応における分析物−分析物干渉の低下において有効であることを実証する。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下と関連した（図９Ｃ）。
【０１０３】
ＰＣＡ３の存在下におけるＴ２−ＥＲＧ増幅の結果を図９Ｄ〜図９Ｆに示す。図９Ｄに示す通り、単相フォーマットは、ほぼ５００コピー／ｍＬ（ほぼ２００コピー／ｒｘｎ）の低さまで標的鋳型を検出することができた一方、二重相フォーマットは、ほぼ５０コピー／ｍＬ（ほぼ２０コピー／ｒｘｎ）まで感度を少なくとも１０倍改善した（図９Ｅ）。これらの結果は、二重相フォーマットが、マルチプレックス反応における分析物−分析物干渉の低下において有効であることも実証する。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下に関連した（図９Ｆ）。
【０１０４】
特に、マルチプレックス増幅フォーマットにおけるアッセイ感度および精度の改善ならびに競合反応間干渉の低下（すなわち、１．１×１０３コピーが強いシグナルを生じる図８Ａに示す単相フォーマットにおけるＰＣＡ３単独の性能や、１．２５×１０３コピーのＰＣＡ３が弱いシグナルを生じる（Ｔ２の干渉により）図９Ａに示す単相フォーマットにおけるＴ２の存在下におけるＰＣＡ３の性能や、Ｔ２による干渉の有意な低下の結果として１．２５×１０３コピーのＰＣＡ３が非常に強いシグナルを生じる図９Ｂに示す二重相フォーマットにおけるＴ２の存在下におけるＰＣＡ３の性能等、単一分析物および二重分析物性能の比較によって証明される）の利点の組合せは、二重相フォーマット化アッセイの一般的な特色であった。これらの劇的な利点は、この結果より前には予測されていなかった。二重相核酸増幅方法のこの特色の追加的な実証を次に記す。
【０１０５】
（実施例７）
ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＴ２−ＥＲＧの二重相共増幅
本実施例において、二重相フォワードＴＭＡプロトコールを使用して、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＴ２−ＥＲＧ標的鋳型を共増幅して、トリプレックス増幅が、ユニプレックスおよびデュプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した（実施例２〜６）感度および精度の同じ改善をもたらすかどうかを決定した。
【０１０６】
簡潔に説明すると、標的捕捉においてＴ７プライマーを標的ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＴ２−ＥＲＧ配列にハイブリダイズさせ、続いて過剰なＴ７プライマーを除去した。増幅の第１相において、追加的なＴ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共に非Ｔ７プライマーを添加した。５分間４２℃に置いた後、Ｔ７プライマーを反応混合物に添加して、３種の異なる蛍光チャネルにおける（標的毎に１種）リアルタイム検出とともに同様に４２℃で実施した、指数関数的増幅相を開始した。実施例１に記載されている通り、標準単相フォワードＴＭＡフォーマットにおいて同じプライマーおよび検出プローブを使用して単相対照実験を行った。
【０１０７】
ＰＳＡおよびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＣＡ３増幅の結果を図１０Ａ〜図１０Ｃに示す。図１０Ａに示す通り、単相フォーマットは、ほぼ１２，５００コピー／ｍＬ（ほぼ５，０００コピー／ｒｘｎ）の低さまで標的鋳型を検出することができた一方、二重相フォーマットは、ほぼ１，２５０コピー／ｍＬ（ほぼ５００コピー／ｒｘｎ）まで感度を１０倍改善した（図１０Ｂ）。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下に関連した（図１０Ｃ）。
【０１０８】
ＰＣＡ３およびＰＳＡの存在下におけるＴ２−ＥＲＧ増幅の結果を図１０Ｄ〜図１０Ｆに示す。図１０Ｄに示す通り、単相フォーマットは、ほぼ５，０００コピー／ｍＬ（ほぼ２，０００コピー／ｒｘｎ）の低さまで標的鋳型を検出することができた一方、二重相フォーマットは、ほぼ５０コピー／ｍＬ（ほぼ２０コピー／ｒｘｎ）まで感度を１００倍改善した（図１０Ｅ）。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下に関連した（図１０Ｆ）。
【０１０９】
ＰＣＡ３およびＴ２−ＥＲＧの存在下におけるＰＳＡ増幅の結果を図１０Ｇ〜図１０Ｉに示す。図１０Ｇに示す通り、単相フォーマットは、ほぼ１２５，０００コピー／ｍＬ（ほぼ５０，０００コピー／ｒｘｎ）の低さまで標的鋳型を検出することができた一方、二重相フォーマットは、ほぼ１２，５００コピー／ｍＬ（ほぼ５００コピー／ｒｘｎ）まで感度を１０倍超改善した（図１０Ｈ）。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の有意な低下に関連した（図１０Ｉ）。
【０１１０】
（実施例８）
二重相リバースＴＭＡフォーマットにおけるＴ２−ＥＲＧの増幅
本実施例において、本発明者らは、標的鋳型としてＴ２−ＥＲＧを使用して二重相リバースＴＭＡプロトコールを検査した。これは、様々なフォワードＴＭＡプロトコールが用いられる先行する実行された全実施例とは対照的であった。リバースＴＭＡの概要は、単一プライマー増幅に関連して上に表記されている。
【０１１１】
ここで使用される二重相リバースＴＭＡプロトコールにおいて、標的捕捉において非Ｔ７プライマーを標的Ｔ２−ＥＲＧ配列の３’末端にハイブリダイズさせ、続いて過剰な非Ｔ７プライマーを除去した。増幅プロセスを２種の別個の相に分けた。第１相において、追加的な非Ｔ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共にＴ７プロモータープロバイダーを導入した。Ｔ７プロモータープロバイダーを３’末端においてブロックし、これにより、その酵素的伸長を不可能にした。逆転写酵素の存在下において、標的にハイブリダイズした非Ｔ７プライマーが伸長され、ｃＤＮＡコピーを作製し、逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により標的ＲＮＡ鋳型を分解した。Ｔ７プロモータープロバイダーはその後、ｃＤＮＡの３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡの３’末端をさらに伸長させて、Ｔ７プロモータープロバイダーのプロモーター領域を埋め、活性な二本鎖鋳型を作製した。次に、Ｔ７ポリメラーゼは、標的鋳型と同一の鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生した。相１増幅混合物において非Ｔ７プライマーを利用できなかったため、反応は、それ以上進むことができなかった。次に、非Ｔ７プライマーの添加により第２相を始め、これにより、相１において産生されたＲＮＡ転写物プールの指数関数的増幅を開始した。
【０１１２】
二重相リバースＴＭＡ実験の結果を図１１Ｂに示す。図１１Ａは、二重相フォーマットを模倣するよう修飾された対照単相リバースＴＭＡ実験の結果を示す。より具体的には、標的捕捉ステップにおいて非Ｔ７プライマーを添加した（標準６０℃アニーリングステップをプロトコールから排除することができる）；第１相においてプライマーまたは酵素試薬を添加しなかった；指数関数的増幅の開始のために、非Ｔ７プライマーおよびＴ７プロモータープロバイダーならびに酵素試薬を第２相に添加した。図１１Ａおよび図１１Ｂから分かる通り、二重相リバースＴＭＡフォーマットは、修飾単相リバースＴＭＡフォーマットと比較して、分析物濃度のローエンドにおいて（ほぼ５０コピー／ｒｘｎ）有意に改善された感度および精度を生じた。再度、二重相フォーマットは、精度およびより短い検出時間の両方の観点から優れた性能をもたらした（図１１Ｃ）。
【０１１３】
（実施例９）
二重相リバースＴＭＡフォーマットにおけるＴ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの共増幅
本実施例において、２種の異なる二重相リバースＴＭＡプロトコールを使用して、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）標的鋳型を共増幅して、クアドロプレックス増幅が、ユニプレックス、デュプレックスおよびトリプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した（実施例２〜８）感度および精度における同じ改善をもたらすかどうかを決定した。
【０１１４】
他の標的の存在下における低レベルの増幅が困難なことで悪名高いＴ２−ＥＲＧの２５コピー／ｒｘｎの検出を、５００，０００コピー／ｒｘｎのＰＣＡ３、５，０００，０００コピー／ｒｘｎのＰＳＡおよび５，０００コピー／ｒｘｎのＣＡＰの存在下において（白丸）、または５，０００コピー／ｒｘｎのＣＡＰ単独の存在下において（黒菱形）行い、図１２Ａ〜図１２Ｃに示す。図１２Ａは、実施例８における上述の修飾単相リバースＴＭＡフォーマットにおいて行われた対照実験の結果を示す。図１２Ｂは、同様に実施例８に記載されている、二重相リバースＴＭＡフォーマットを使用した二重相実験の結果を示す。簡潔に説明すると、標的捕捉において非Ｔ７プライマーを標的Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ配列にハイブリダイズさせ、続いて過剰な非Ｔ７プライマーを除去した。増幅の第１相において、追加的な非Ｔ７プライマーを例外として、必要な増幅、検出および酵素試薬の全てと共にＴ７プロモータープロバイダーを添加した。５分間４２℃に置いた後、非Ｔ７プライマーを反応混合物に添加して、４種の異なる蛍光チャネル（標的毎に１種）におけるリアルタイム検出とともに同様に４２℃で実施した、指数関数的増幅相を開始した。図１２Ａおよび図１２Ｂから分かる通り、二重相リバースＴＭＡフォーマットは、修飾単相リバースＴＭＡフォーマットと比較して、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの存在下における２５コピー／ｒｘｎ  Ｔ２−ＥＲＧにおいて改善された感度および精度、ならびにＣＡＰ単独の存在下における２５コピー／ｒｘｎ  Ｔ２−ＥＲＧにおいて有意に改善された感度および精度を生じた。これらの結果は、二重相フォーマットが、マルチプレックス反応における分析物−分析物干渉の低下において有効であることも実証する。さらに、本発明者らの先の観察と一貫して、二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の低下に関連した。
【０１１５】
図１２Ｃは、反応の第１相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を線形増幅に付しＴ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し、第２相において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰを指数関数的増幅に付しＴ２−ＥＲＧの指数関数的増幅を継続した（全４種の増幅反応は同じ容器内で行った）、異なる二重相フォーマットの結果を示す。増幅の異なる相間の標的特異的プライマーの配分は、下表１に表記されている。図１２Ａおよび図１２Ｃから分かる通り、この異なる二重相リバースＴＭＡフォーマットは、修飾単相リバースＴＭＡフォーマットと比較して、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ、またはＣＡＰ単独の存在下における２５コピー／ｒｘｎ  Ｔ２−ＥＲＧにおいて有意に改善された感度を生じた。先の実施例に記載されている二重相フォーマットと同様に、これらの結果は、この異なる二重相フォーマットが、マルチプレックス反応における分析物−分析物干渉の低下において有効であることを実証する。さらに、この異なる二重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の低下に関連する。
【０１１６】
【表１】
0006464086.tif 000002
【０１１７】
（実施例１０）
三重相リバースＴＭＡフォーマットにおけるＴ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰの共増幅
本実施例において、二重相および三重相リバースＴＭＡプロトコールを使用して、Ｔ２−ＥＲＧ、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよび内部対照（ＣＡＰ）標的鋳型を共増幅して、三重相増幅が、分析物濃度のローエンドにおいて感度および／または精度に追加的な改善を生じ得るかどうかを決定した。
【０１１８】
５００，０００コピー／ｒｘｎのＰＣＡ３、５，０００，０００コピー／ｒｘｎのＰＳＡおよび５，０００コピー／ｒｘｎのＣＡＰの存在下における（白丸）、または５，０００コピー／ｒｘｎのＣＡＰ単独の存在下における（黒菱形）、１５０コピー／ｒｘｎのＴ２−ＥＲＧの検出を図１３Ａ〜図１３Ｃに示す。図１３Ａは、実施例８における上述の修飾単相リバースＴＭＡフォーマットにおいて行われた対照実験の結果を示す。図１３Ｂは、同様に実施例８に記載されている、二重相リバースＴＭＡフォーマットを使用した二重相実験の結果を示す。二重相フォーマットを使用して、感度および精度が改善された。
【０１１９】
図１３Ｃは、相１において、Ｔ２−ＥＲＧを線形増幅に付し他の３種の分析物を増幅せず、相２において、Ｔ２−ＥＲＧを指数関数的増幅に付し他の３種の分析物を増幅せず、相３において、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ（またはＣＡＰ単独）を指数関数的増幅に付しＴ２−ＥＲＧの指数関数的増幅を継続した（全増幅反応は同じ容器内で進んだ）、三重相実験の結果を示す。増幅の異なる相間の標的特異的プライマーの配分は、下表２に表記されている。図１３Ａおよび図１３Ｃから分かる通り、三重相リバースＴＭＡフォーマットは、修飾単相リバースＴＭＡフォーマットと比較して、ＰＣＡ３、ＰＳＡおよびＣＡＰ、またはＣＡＰ単独の存在下における１５０コピー／ｒｘｎ  Ｔ２−ＥＲＧにおいて、感度および精度の両方に大幅な改善を生じた。これらの結果は、この三重相フォーマットが、マルチプレックス反応における分析物−分析物干渉の低下において有効であることも実証する。さらに、この三重相増幅フォーマットは、単相フォーマットと比較した検出時間の低下に関連した。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
上に図解されている通り、多相増幅フォーマットが開発され、数種類の異なる核酸標的ならびに標的の組合せに対し機能することを実証した。標準単相フォーマットと比較して、多相増幅フォーマットは、検出限界の有意な改善をもたらし、これは、定量化の限界において同等の改善と言い換えることができよう。
【０１２２】
本発明を、ある特定の好ましい実施形態を参照しつつ相当に詳細に記載し、示してきたが、当業者であれば、本発明の他の実施形態を容易に認めることができよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に包含される全ての修正および変動を含むと考慮される。
【図１】
0006464086.tif 000004
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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