(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖促進剤。
【化１】
0006496643.tif 000012
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
【請求項２】
以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するための医薬品。
【化２】
0006496643.tif 000013
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
【請求項３】
以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するためのサプリメント。
【化３】
0006496643.tif 000014
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
【請求項４】
以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するための飲食品。
【化４】
0006496643.tif 000015
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテキン代謝物として報告のある特定の化合物を有効成分とした脳神経細胞増殖促進剤、その化合物を含む医薬品、その化合物を含むサプリメント、及びその化合物を含む飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、人口の高齢化の速度が速くなるにつれて認知症高齢者又はアルツハイマー病の高齢者が増えている。そこで、神経成長因子（ＮＧＦ）様作用及びＮＧＦの作用を増強させる効果を有する神経細胞賦活剤（特許文献１）、アルツハイマー病の予防及び／又は改善薬として有用な、クコ抽出物を有効成分とする脳神経細胞死の予防及び／又は改善剤等が開発されている（特許文献２）。
【０００３】
ところで、カテキン代謝物はいくつかの生理活性があることが知られている。カテキン代謝物の生体内での機能性に関する知見としては、５−フェニル−γ−バレロラクトン及び５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸の血圧上昇抑制作用（特許文献３）、５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−吉草酸の子宮頸癌細胞増殖抑制作用（特許文献４）、５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの抗炎症作用（非特許文献１）、５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの食道扁平上皮がん細胞、ヒト結腸腺がん細胞に対する増殖抑制効果及び抗炎症作用（非特許文献２）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２７２３５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０１８６５６号パンフレット
【特許文献３】特開２０１２−１４４５３２号公報
【特許文献４】特開２０１４−１６６６８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ５３，  ３０５−３１３，  ２０１２
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １５，  ８７３−８７６， ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、カテキン代謝物にはいくつかの生理機能が知られているが、脳神経細胞の増殖促進に対する効果はまだ知られていない。
【０００７】
本発明は、カテキン代謝物を有効成分とする脳神経細胞増殖促進剤を提供するとともに、それを含有した脳機能の維持向上のための医薬品及び／または飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、カテキン類化合物について広範囲な研究を行ったところ、茶カテキン類の代謝物として知られる特定の化合物及びその誘導体に、脳機能に関与する脳神経細胞増促進効果があることを見出し、この化合物を含む脳神経増殖促進剤を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００９】
［１］  以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖促進剤。
【化１】
0006496643.tif 000002
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
［２］  以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するための医薬品。
【化２】
0006496643.tif 000003
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
［３］  以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するためのサプリメント。
【化３】
0006496643.tif 000004
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
［４］  以下の式（Ｉ）で表される化合物の１種又は２種以上を有効成分とする脳神経細胞増殖を促進するための飲食品。
【化４】
0006496643.tif 000005
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。）
【発明の効果】
【００１０】
脳神経増殖促進効果が発見された特定の化合物を用いることで、新規な脳神経増殖促進剤を提供することができる。本発明の脳神経増殖促進剤は、記憶力向上又は認知症の改善などに有効である。また、本発明で使用される特定の化合物は、医薬品、サプリメント、飲食品などにも含有させることができ、これらを摂取することにより、脳神経細胞が増殖することが期待され、記憶力向上又は認知症の改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを使用した場合のＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞増殖率を示す図である。
【図２】図２は、（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを使用した場合のＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞増殖率を示す図である。
【図３】図３は、（Ｒ）−５−［３−（β−Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを使用した場合のＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞増殖率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、上記式（Ｉ）の化合物が、脳神経細胞の増殖促進効果を有することに基づいて達成した。
【００１３】
まず、式（Ｉ）の化合物について説明する。式（Ｉ）の化合物は、以下のとおりである。
【化５】
0006496643.tif 000006
【００１４】
式（Ｉ）中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置であることを表す。したがって、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ体、Ｓ体いずれも包含する。
【００１５】
また、式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水酸基、硫酸基又はその塩、又はグルクロン酸基又はその塩を表す。
【００１６】
本発明の式（Ｉ）の化合物の具体例を示す。
【表１】
0006496643.tif 000007
【００１７】
Ｒ１及びＲ２が水酸基を示す化合物（表中の化合物Ａ）は、エピガロカテキンまたはエピガロカテキンガレートを経口摂取したときに腸内で生成される茶カテキン類の代謝産物として知られている。製造方法についても、すでに公知であり、例えば、特開２０１１−８７４８６号公報には、エピガロカテキンからの微生物による化合物Ａの製造方法、またはその培養菌体の調製物の存在下で行う化合物Ａの製造方法が開示されている。
【００１８】
また、Ｒ１又はＲ２が、硫酸基又はその塩の場合は、Ｒ１又はＲ２が下記のいずれかの置換基であることを言う。
【化６】
0006496643.tif 000008
【化７】
0006496643.tif 000009
【００１９】
置換基として、硫酸基又はその塩の少なくとも１つを含む化合物の例は、Ｒ１が硫酸塩であり、Ｒ２が水酸基である化合物（表中の化合物Ｂ）が挙げられる。化合物Ｂは、Ｒ１及びＲ２が水酸基を示す表中の化合物Ａからの誘導体であり、水酸基の１つをスルホン化することにより得ることができる。スルホン化は、三酸化硫黄ピリジンなどを使用することにより、調製することができる。
【００２０】
また、Ｒ１が硫酸塩であり、Ｒ２が硫酸塩である化合物（表中の化合物Ｃ）も、化合物Ａの誘導体であるが、化合物Ａの水酸基の２つをスルホン化することにより得ることができる。スルホン化は、化合物Ｂの化合物と同様に三酸化硫黄ピリジンなどを使用することにより、調製することができる。
【００２１】
置換基として硫酸基又は硫酸塩を含む化合物（化合物Ｂ及び化合物Ｃ）は、化合物Ａのスルホン化により、同時に得られるが、ＨＰＬＣなどによりそれぞれを分離精製することができる。
【００２２】
次に、グルクロン酸又はグルクロン酸塩を含む化合物について説明する。
【００２３】
グルクロン酸又はグルクロン酸塩を含む化合物は、Ｒ１又はＲ２として、下記のいずれかの置換基であることを言う。
【化８】
0006496643.tif 000010
【化９】
0006496643.tif 000011
【００２４】
グルクロン酸又はグルクロン酸塩を含む化合物の例は、例えば、Ｒ１が、グルクロン酸基であり、Ｒ２が水酸基の化合物（化合物Ｄ）が挙げられる。化合物Ｄは、化合物Ａの１つの水酸基に、グルクロン酸の水酸基が脱水して結合した化合物であり、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートを経口摂取した時に尿から検出される茶カテキン類の代謝産物である。したがって、製造方法としては、例えば、ラットに、エピガロカテキンを投与して、尿を回収し、尿中代謝産物をＨＰＬＣなどにより分離後、精製する方法が挙げられる。
【００２５】
このように、本発明に包含される化合物は、いずれもエピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートの代謝物、またはそれらの誘導体である。
【００２６】
エピガロカテキン（（−）−エピガロカテキン）、又はエピガロカテキンガレート（（−）−エピガロカテキンガレート）は、主に緑茶に含まれており、茶の葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子やこれらの混合物もしくはそれらの粉砕物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物等により抽出することにより得られる。茶生葉あるいはその乾燥物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒、これらの混合物等を用いて抽出することにより得られ、抽出物自体の他に、その精製物等があり、形態的には液体、固体（粉末を含む）の別を問わない。
【００２７】
本発明の脳神経細胞増殖促進剤は、上記式（Ｉ）の化合物を含有する。当該化合物を人体に投与する場合は、人体に悪影響がないように投与する。
【００２８】
本発明は、式（Ｉ）の化合物の少なくとも一種を含有する医薬品とすることもできる。
【００２９】
医薬品にする場合の剤形は、投与目的や投与経路等に応じて、錠剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、顆粒剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、クリーム剤等にすることができる。
【００３０】
また、当該医薬品に、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の添加物を含有させることができる。
【００３１】
結合剤の好適な例としてはグアガム、アラビアゴム末などが挙げられる。
【００３２】
賦形剤の好適な例としては、デンプン、トレハロース、デキストリンなどが挙げられる。
【００３３】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。
【００３４】
安定剤の好適な例としては、油脂、プロピレングリコール、シクロデキストリンなどが挙げられる。
【００３５】
乳化剤の好適な例としては、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
【００３６】
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物の少なくとも一種は、飲食品に含有させることもでき、それを飲食した場合に、人体に悪影響がないように含有する。
【００３８】
さらに、式（Ｉ）の化合物の少なくとも一種を飲食品に含ませることによってその食品を、脳神経細胞増殖促進効果を目的とした機能性食品にすることができる。
【００３９】
対象となる食品の種類は、ジュース、清涼飲料水、茶などの飲料、パンやもちなどの加工食品、あめなどの菓子類、カップラーメンなどのインスタント食品、バター、サラダ油などの油脂類、ドレッシング、マヨネーズ、ソース、醤油やみりんなどの調味料、ふりかけ、みそなどの広範な飲食品に含ませることができる。また、サプリメントとして提供することができる。
【００４０】
神経細胞のモデル細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ヒト由来の神経芽種より誘導された細胞株であり、脳神経細胞増殖の確認をする際に用いられる。本発明の実施例においても、これら化合物の脳神経細胞増殖促進効果の確認は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて行った。上記化合物を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖が確認できれば、上記化合物により、脳神経細胞が増殖すると考えられる。
【００４１】
なお、上記化合物が塩の場合、対応するカチオンは、適宜選択されるべきものである。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
【００４３】
製造例１
［（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの製造］
【００４４】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株  （理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室）を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株（ＭＥ９０１２：ＮＢＲＰナショナルバイオリソースプロジェクト）及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピガロカテキン２９０ｍｇを含む２００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＱＤｅｃａＸＰｐｌｕｓサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）分析することで（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。
【００４５】
次に、上記ＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を、（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した前述の培養液に加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行った。その後、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）に供し、得られた上清を上記記載のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ａ）の生成を確認した。ＬＣ／ＭＳ条件を以下に記載する。
【００４６】
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（資生堂（株）社製）、流速：０．２ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：（水／アセトニトリル／酢酸＝１００：２．５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝３５：２．５：６５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、２５分：Ａ０％  Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％  Ｂ０％、３３分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブとした。
【００４７】
（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した後、２００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。この酢酸エチル層をエバポレーターにより濃縮乾固し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【００４８】
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（資生堂（株）社製）、流速１５ｍｌ/分、溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：５：９０：０．３  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：６５：３０：０．５  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、２０分：Ａ１０％  Ｂ９０％、２５分：Ａ１％  Ｂ９０％、２６分：Ａ８０％  Ｂ２０％、３５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【００４９】
目的とする（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ａ）画分を分取後、エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に５ｍｌの純水を加えて溶解し、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解後、凍結乾燥し、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ａ）４５．０ｍｇを得た。
【００５０】
製造例２
［（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン、及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの製造］
【００５１】
製造例１で得られた（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン１６３．１ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）に、ピリジン１０ｍｌと硫酸ナトリウム５ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した。次に、三酸化硫黄ピリジンを７９０．４ｍｇ（４．６８ｍｍｏｌ）加え、室温で１時間攪拌した。攪拌後、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）を加えて反応停止させ、エバポレーターで減圧濃縮した濃縮残渣を３ｍｌの水で溶解し分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【００５２】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：１９．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：過塩素酸ナトリウム／水（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、溶媒Ｂ：過塩素酸ナトリウム／アセトニトリル（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６分：Ａ１００％  Ｂ０％、２０分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【００５３】
目的物質を含有する画分を分取後、エバポレーターで減圧濃縮することによりアセトニトリルを除去し、（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｂ）及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｃ）の粗精製物をそれぞれ得た。得られた各粗精製物をＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  １５−３０μｍ、１０ｃｍ３）を追加充填したＳＵＰＥＬＣＯ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＤＳＣ−１８カラムに供し、水１６０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル１７５ｍｌにて溶出した。得られたアセトニトリル溶出画分をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥し、白色粉末状の（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン、及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの精製物をそれぞれ１２．５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、収率５．２％）、１４．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ、収率４．４％）得た。
【００５４】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲ（ｐｒｏｔｏｎ−ＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ））で分析したところ以下のケミカルシフト値が得られたことから、目的の化合物であると同定した。
（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２４（２Ｈ，ｓ），６．１９（１Ｈ，ｓ），４．７９（１Ｈ，ｍ），２．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｍ），２．４６（１Ｈ，ｍ），２．３３（１Ｈ，ｍ），２．００（１Ｈ，ｍ）
（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【００５５】
製造例３
［（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンの製造］
【００５６】
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社から購入）６匹を精製飼料で１週間予備飼育し、試験前日より絶食させて試験に用いた。投与サンプルは（−）−エピガロカテキンを生理食塩水に溶解させた溶液とし、各ラットに２０ｍｇ／１．７ｍＬずつ胃内強制投与した。投与は４日間反復して行い、それぞれ投与後６時間〜２４時間の尿を回収した。
【００５７】
回収した尿２５０ｍＬを合一し、エバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮した。次に、得られた濃縮液にメタノール２２５ｍＬを加えてよく混合した後、高速遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、４℃）によりタンパク質沈殿物を除去した。得られた上清をエバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮し、水を加えて４５０ｍＬとした後、酢酸を加えてｐＨ３．０に調整した。０．１Ｍリン酸−クエン酸バッファーでｐＨ３．０に調整したＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製、３５ｃｃ）に、上記溶液（４５０ｍＬ）を通液した後、水１７５ｍＬ、２０％メタノール水溶液１７５ｍＬの順で洗浄した後、４０％メタノール水溶液１７５ｍＬにて（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを含む画分を溶出した。得られた４０％メタノール溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣に水５ｍＬを加えて分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【００５８】
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ１８  ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学（株）製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒Ａ：メタノール／水／酢酸（５／９５／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：メタノール／水／酢酸（６０／４０／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８．１分：Ａ８０％  Ｂ２０％、２５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【００５９】
分取液をＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン（化合物Ｄ）含有画分を特定した。ＬＣ／ＭＳ条件を以下に記載する。
【００６０】
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）、流速：０．２ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：（水／アセトニトリル／酢酸＝１００：２．５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝３５：２．５：６５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、２５分：Ａ０％  Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％  Ｂ０％、３３分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブとした。
【００６１】
さらに、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれる画分をリサイクルＨＰＬＣに供し、精製を行った。リサイクルＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【００６２】
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ１８  ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学（株）製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒：アセトニトリル／水／酢酸（１５／８５／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【００６３】
（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン含有画分をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍｌの水を加えて溶解した後、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで、有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。最後に、乾固物に水２ｍＬを加えて溶解後、凍結乾燥し、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン精製品２８．０ｍｇを得た。
【００６４】
［実施例１〜３］
つぎに細胞増殖試験について説明する。細胞増殖試験で使用した材料・原料等について列記する。
【００６５】
［細胞］
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞 （ＡＣＴＴ、ＣＲＬ−２２６６株）を使用した。
【００６６】
［培地］
１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ μｇ/ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧを含むＤＭＥＭ：Ｆ−１２ （１：１） 培地（和光純薬工業株式会社）を使用した。
【００６７】
［試薬］
下記の試薬を使用した。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：和光純薬工業株式会社製）
ペニシリン・ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク株式会社製）
トリパンブルー液（０．５％）（コスモ・バイオ株式会社製）
トリプシン（ＴｒｙｐＬＥｋ Ｅｘｐｒｅｓｓ, Ｇｉｂｃｏ社製）
【００６８】
［機器］
セルカウンター（ＴＣ１０ＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ社製）
［細胞増殖試験］
上記のＤＭＥＭ：Ｆ−１２ （１：１）／１０％ ＦＢＳ培地に懸濁したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１．０×１０５  ｃｅｌｌｓ ／ ｍｌ）５００ μＬを２４ウェルプレートの各ウェルに播種した。製造例１乃至３で得られた（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ａ）、（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｂ）、（Ｒ）−５−［（３−β−Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン（化合物Ｄ）は、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、各ウェルに１μＬを添加した。この時、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｄの最終濃度が０〜１．０μＭ になるように適宜希釈した。５％の二酸化炭素存在下で、細胞を３７℃で４８時間培養した。
【００６９】
培地を除去した後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。各ウェルにトリプシン８０μＬを加え接着していた細胞を浮遊させた後、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２ （１：１） /１０％ＦＢＳ培地５００μＬを加えた。細胞懸濁液をサンプルチューブに移し、１２００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除き、細胞にＤＭＥＭ：Ｆ−１２ （１：１） /１０％ ＦＢＳ培地を１００μＬ加えた。得られた細胞懸濁液１０μＬにトリパンブルー液１０μＬを加え、セルカウンターを用いて生細胞数を計数した。
【００７０】
化合物Ａ（実施例１）、化合物Ｂ（実施例２）、化合物Ｄ（実施例３）の増殖率を図１乃至図３に示す。なお、図１乃至図３は、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｄを加えない時（ＤＭＳＯのみ）の細胞数を１００％として、細胞増殖を相対値として示した。統計処理は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較により有意差検定を行った。
【００７１】
結果として、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｄの存在下では、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖が確認され、有意に促進されることがわかった。また、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｄの効果があったため、骨格、置換基が極めて類似している表の化合物も効果があると十分推測できる。なお、図中の記号＊は、ｐ＜０．０５であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、カテキン代謝物として報告されている特定の化合物及びそれらの誘導体は、脳神経細胞増殖促進効果を有し、これらの化合物を有効成分として含む脳神経細胞増殖促進剤、脳神経細胞増殖を促進するための医薬品、脳神経細胞増殖を促進するためのサプリメント、脳神経細胞増殖を促進するための飲食品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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