(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンにおいて、含有金属として、５重量％以上のナトリウムもしくはカリウムと、１重量％以下のカルシウムをそれぞれ乾燥重量として含むことを特徴とするプロテオグリカン。
【請求項２】
プロテオグリカンにおいて、含有金属として、ナトリウムとカリウムを合計で５重量％以上と、１重量％以下のカルシウムをそれぞれ乾燥重量として含むことを特徴とするプロテオグリカン。
【請求項３】
原料のプロテオグリカンを、アルカリ金属イオン型である強酸性陽イオン交換樹脂により処理することを特徴とするプロテオグリカンの製造法。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のプロテオグリカンを０．０１質量％以上含有することを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料や飲食品などで使用されるプロテオグリカンに係り、特に保水性が改善された高保水性プロテオグリカン、高保水性プロテオグリカンを含有する化粧料およびこの高保水性プロテオグリカンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肌を健康的に美しく保つために、乾燥を防ぎ、肌に潤いを与えるなどの手入れが必要である。そのため、肌に塗布するスキンケア製品や化粧料には保水性を有する物質を含んでいるものが多い。また、髪のつややかさを保つため、髪をケアする製品にも保水性物質は使用されている。保水性を有する物質として、グリセリンやセラミドなどの低分子化合物からヒアルロン酸やコラーゲンなどの高分子化合物などが挙げられる。近年、新たな保水性物質としてプロテオグリカンが注目されてきている。プロテオグリカンは保水性以外にも、ＥＧＦ様作用などを有していることが明らかになってきている化合物である。
【０００３】
プロテオグリカンは動物に存在し、結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している。プロテオグリカンはグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物の総称であり、一般の糖タンパク質に比べて、糖含量が極めて多いのが特徴である。プロテオグリカンは天然由来の高分子化合物であり、起源となる原料や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なっており、さまざま分子種が存在する。
【０００４】
プロテオグリカンを単独もしくは、キトサンやコラーゲン、ヒアルロン酸などと併用し、わた体に付着させて使用すること（特許文献１）、美容液や化粧品で、プロテオグリカンの保水性を補うため、１０重量％以上のコラーゲンと併用すること（特許文献２）やアシル化アルカリ処理コラーゲンと併用することが行われている（特許文献３）。しかし、これらの方法では、わた体に付着させてもプロテオグリカン自体の保水能力は変わらず、保水能力を補うにはコラーゲンと併用しなければならないという煩わしさがある。また、水に不溶のコラーゲンを利用するため、透明または清澄な製品への利用は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２５５７２６号  公報
【特許文献２】特開平６−１６６６１６号  公報
【特許文献３】特開平６−１７９６１２号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記課題を鑑み、本発明は、コラーゲンとの併用をしないで保水性が改善された高保水性プロテオグリカン、この高保水性プロテオグリカンを含む化粧料、およびこの高保水性プロテオグリカンの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を達成するために、本発明の一つの態様は、原料のプロテオグリカンをアルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂にて処理することにより得られる高保水性プロテオグリカンであることを要旨とする。
【０００８】
本発明の他の態様は、化粧料にこの高保水性プロテオグリカンを０．０１質量％以上含有させることを要旨とする。
【０００９】
本発明の更に他の態様は、５重量％以上のナトリウムもしくはカリウムと、１重量％以下のカルシウムをそれぞれ乾燥重量として含み、０．４４ｗ／ｖ％水溶液にした場合、純水に対する相対粘度が２６．５℃で５以上である高保水性プロテオグリカンであることを要旨とする。
【００１０】
本発明の更に他の態様は、ナトリウムとカリウムを合計で５重量％以上と、１重量％以下のカルシウムをそれぞれ乾燥重量として含み、０．４４ｗ／ｖ％水溶液にした場合、純水に対する相対粘度が２６．５℃で５以上である高保水性プロテオグリカンであることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、コラーゲンとの併用をしないで保水性が改善された高保水性プロテオグリカン、この高保水性プロテオグリカンを含む化粧料およびこの高保水性プロテオグリカンの製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の、実施例２の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定１に係り、原料の鮭由来プロテオグリカンの濃度と保水性の関係を説明するための図である。
【図２】実施例２の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定１に係り、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【図３】実施例５の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定２に係り、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【図４】実施例８の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定３に係り、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【図５】実施例１１の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定４に係り、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【図６】実施例１４の高保水性プロテオグリカンの保水性の測定５に係り、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性と比較するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。
【００１４】
プロテオグリカンの原料由来としては、牛、鶏、鯨などの哺乳類・鳥類の軟骨や、鮭、鮫、エイなどの魚類の軟骨であり、その種類を問わないものである。また、プロテオグリカンの抽出薬剤についても、酢酸などの有機酸や酸、アルカリ、グアニジン塩酸など様々あるが、本発明では抽出薬剤や温度や時間などの抽出・製造の条件も限定しないものである。
【００１５】
本発明の高保水性プロテオグリカンの製造法としては、原料のプロテオグリカンをアルカリ金属イオン型の強酸性陽イオン交換樹脂にて処理することにより得る。強酸性陽イオン交換樹脂は、担体にスルホン酸基のイオン交換基が導入された水不溶性の高分子樹脂である。担体としてはスチレン系やフェノール系、ビニル系、アクリルアミド系などの合成樹脂やセルロース系、アガロース系、デキストラン系などがある。アルカリ金属イオン型は、強酸性陽イオン交換樹脂をナトリウム、カリウム、リチウムなどの周期表第１族に属するアルカリ金属のイオン型とし、アルカリ雰囲気に保って用いる。金属イオン型としては数種の金属の混合物でも構わない。樹脂を使用する前には、常法により酸やアルカリなどで予備洗浄し、使用する金属イオン型に活性化する必要がある。
【００１６】
高保水性プロテオグリカンの製造法としては、原料のプロテオグリカンを含む水溶液をアルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂に接触させる。このとき原料のプロテオグリカンを含む水溶液について、原料のプロテオグリカン以外の物質、特にイオン性物質は入っていないほうが好ましい。もしくは、原料のプロテオグリカンを含む水溶液のイオン強度は低いほうが好ましい。
【００１７】
アルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂の接触方法は、カラムなどに樹脂を充填し、原料のプロテオグリカンを含む水溶液をカラムに通過させる方式やバッチ式などがある。接触時間は、数分以上必要であり、接触する温度は室温以下が好ましい。使用するアルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂の量は、樹脂の種類により異なるが、出発原料となる元のプロテオグリカン１ｇ当たり、陽イオン交換樹脂の交換容量２ｍｅｑ量相当の樹脂量に、安全率を乗じた以上の樹脂量は必要である。
【００１８】
次に、アルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させたプロテオグリカンをろ過などの方法により、樹脂から分離する。ろ過後のアルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂を水で洗浄し、樹脂に付着しているプロテオグリカンを回収する。得られたプロテオグリカンは、原料のプロテオグリカンより保水性が向上した高保水性プロテオグリカンである。樹脂から分離された状態は水溶液の状態であり、そのまま使用してもよいが、噴霧乾燥や凍結乾燥などにより粉末化してもよいし、アルコールやアセトンなどの有機溶剤により沈殿、風乾して、粉末化してもよい。
【００１９】
得られた高保水性プロテオグリカンは、試料中に含まれる水分を除いた乾燥重量を基として、５重量％以上のナトリウムもしくはカリウムと、１重量％以下のカルシウムを含むプロテオグリカンであって、２６．５℃で純水の粘度を１としたとき、０．４４ｗ／ｖ％水溶液の粘度が５以上である高保水性プロテオグリカンである。
【００２０】
もしくは、試料中に含まれる水分を除いた乾燥重量を基として、ナトリウムとカリウムを合計で５重量％以上と、１重量％以下のカルシウムを含むプロテオグリカンであって、２６．５℃で純水の粘度を１としたとき、０．４４ｗ／ｖ％水溶液の粘度が５以上である高保水性プロテオグリカンである。
【００２１】
本発明の高保水性プロテオグリカンを化粧料の原料として用いることにより、保水性が向上した製品の提供が可能になる。化粧料としては、皮膚を健全な状態に保ち、肌をケアすることを目的としている皮膚用化粧品やトイレタリー用品などがある。皮膚用化粧品の例として、化粧水や美容液、乳液、クリ−ム、リップ類などが挙げられる。トイレタリー用品としては、シャンプー、リンス、入浴剤、石鹸などが挙げられる。また、本発明のプロテオグリカンは水溶性であることから、健康・美容飲料として飲料に容易に添加が可能であり、食品にも同様に適用できる。
【００２２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（高保水性プロテオグリカンの製造１）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを流下し、樹脂をナトリウムイオン型に活性化した。過剰の水酸化ナトリウムを除くため、脱イオン水２００ｍＬを流下した後、原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１５０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１８０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．３７ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例２】
【００２４】
（高保水性プロテオグリカンの保水性の測定１）
実施例１で用いた原料の鮭由来プロテオグリカン０．３０ｇ、０．２０ｇ、０．１０ｇをそれぞれ脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬずつを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカン水溶液１００ｍＬずつをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００２５】
図１は、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図１中のプロットのうち、「×０．３０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「▲０．１０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．１０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。いずれのプロテオグリカン濃度でも吸水・保水量は経過日数にほぼ比例して増えること、また、プロテオグリカン濃度が０．１０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．３０ｗ／ｖ％と高くなるほど吸水・保水量が多くなることが明らかとなった。
【００２６】
原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬ、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬと実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００２７】
図２は、原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図２中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例１、ナトリウムイオン型）」は実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンは７．５ｇ／日であった。原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンは約２．８倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例３】
【００２８】
（高保水性プロテオグリカンの化学分析１）
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、５．７重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３５．５重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００２９】
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８２１０、（株）リガク製）にて、１２５℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分とした。その結果、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１３重量％であった。同様に、原料の鮭由来プロテオグリカンの水分含量について分析したところ、１７重量％であった。
【００３０】
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの各金属含量を、キャピラリー電気泳動装置（Ａｇｉｌｅｎｔ７１００ キャピラリー電気泳動システム、アジレント・テクノロジー（株）製）を用いて定量した。各金属の定量法については、ＵＶ吸収を有する緩衝液で満たしたキャピラリーカラムに、試料を注入して電圧をかけることで、試料中の各金属イオンを分離しながら移動させ、ＵＶ検出部を通過する時のＵＶ吸収の減少分により検出するという間接吸光法を採用した。カラムにフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、有効長５６ｃｍ、アジレント・テクノロジー（株）製）、緩衝液に陽イオン分析バッファ（ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０３、アジレント・テクノロジー（株）製）を用い、電圧２５ｋＶで、陽イオン標準液（５〜１００ｐｐｍ、ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０５、アジレント・テクノロジー（株）製）から作成した検量線より、ナトリウム、カリウム、カルシウム含量を求めた。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．１７４重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．２９重量％であった。測定の結果、ナトリウムは６．５重量％、カルシウムは０．５１重量％であり、カリウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため０．２９重量％未満であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．１６６重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．３０重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、ナトリウムは１．８重量％、カルシウムは５．６重量％であり、カリウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため０．３０重量％未満であった。なお、上記金属含量は、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン中に含まれる水分含量（１３重量％）および原料の鮭由来プロテオグリカンに含まれる水分含量（１７重量％）をそれぞれ除去した乾燥重量を基に計算した。
【００３１】
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度は、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、純水の粘度を基準として測定した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１３重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度は５．１であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同一の相対粘度計を用いて分析した。原料の鮭由来プロテオグリカン２６．３ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。原料の鮭由来プロテオグリカンの水分含量は１７重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、原料の鮭由来プロテオグリカンの相対粘度は４．４であった。
【００３２】
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．５であり、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であった。
【実施例４】
【００３３】
（高保水性プロテオグリカンの製造２）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学（株）））をガラス製カラムに充填し（内径２ｃｍ、高さ８ｃｍ）、１Ｍ塩酸５０ｍＬと脱イオン水２００ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液１００ｍＬを流下し、樹脂をナトリウムイオン型に活性化した。過剰の塩化ナトリウムを除くため、脱イオン水約２００ｍＬを流下した後、原料の鮭由来プロテオグリカン０．３１ｇを脱イオン水２５ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１３０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１５０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２８ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例５】
【００３４】
（高保水性プロテオグリカンの保水性の測定２）
原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬ、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬと実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００３５】
図３は、原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図３中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例４、ナトリウムイオン型）」は実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンは７．４ｇ／日であった。原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例６】
【００３６】
（高保水性プロテオグリカンの化学分析２）
実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、５．２重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３７．６重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００３７】
実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量を上記実施例３と同様に測定したところ、１３重量％であった。また、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの各金属含量を、上記実施例３と同様に測定した。実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．１７４重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．２９重量％であった。測定の結果、ナトリウムは９．３重量％であり、カルシウムとカリウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため、それぞれ０．２９重量％未満であった。なお、上記金属含量は、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカン中に含まれる水分含量（１３重量％）を除去した乾燥重量を基に計算した。
【００３８】
実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度を実施例３と同一の相対粘度計を用いて分析した。実施例４で得られた高保水性プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１３重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度は６．４であった。
【００３９】
実施例４で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．５であり、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であった。
【実施例７】
【００４０】
（高保水性プロテオグリカンの製造３）
高保水性プロテオグリカンの製造にあたって、原料となるプロテオグリカンを常法により鮫から調製した。市販の鮫軟骨粉末１００ｇに対して、５％酢酸（関東化学）を１Ｌ加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により固形分を除去し、溶液を得た。この溶液を分画分子量１０万の限外ろ過膜（ミリポア社）を装着した卓上循環式濃縮装置（（株）トライテック）に通し、加水しながら、分子量１０万以上の成分を集めた。残っている低分子成分を除去するため、透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に分子量１０万以上の画分を入れ、４℃の低温室で、水に対して３日間透析した。外液の水は定期的に交換した。透析用セルロースチューブ内の溶液を凍結乾燥し、固形分の重量を測定したところ、０．８ｇの白色綿状固体である鮫酢酸抽出プロテオグリカンを得た。
【００４１】
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ水酸化カリウム水溶液１５０ｍＬを流下し、樹脂をカリウムイオン型に活性化した。過剰の水酸化カリウムを除くため、脱イオン水約２５０ｍＬを流下した後、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカン０．３１ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１７０ｍＬ流下し、得られた溶出液約２００ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２９ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例８】
【００４２】
（高保水性プロテオグリカンの保水性の測定３）
原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンそれぞれ０．１０ｇを、脱イオン水５０ｍＬに溶解し、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬ、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬを得た。この原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬと実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００４３】
図４は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図４中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例７、カリウムイオン型）」は実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮫酢酸抽出プロテオグリカン」は原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカン１．９ｇ／日に対して、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンは５．１ｇ／日であった。原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと比較して、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例９】
【００４４】
（高保水性プロテオグリカンの化学分析３）
実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、４．５重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３４．５重量％であった。原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は５．９重量％、ウロン酸含量は３３．８重量％であった。これらの結果から、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００４５】
実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．５であり、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは４．２であった。
【実施例１０】
【００４６】
（高保水性プロテオグリカンの製造４）
高保水性プロテオグリカンの製造にあたって、原料となるプロテオグリカンを常法により鮫から調製した。市販の鮫軟骨粉末１００ｇに対して、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を２００ｍＬ加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により固形分を除去し、溶液を得た。この溶液を分画分子量１０万の限外ろ過膜（ミリポア社）を装着した卓上循環式濃縮装置（（株）トライテック）に通し、加水しながら、分子量１０万以上の成分を集めた。残っている低分子成分を除去するため、透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に分子量１０万以上の画分を入れ、４℃の低温室で、水に対して３日間透析した。外液の水は定期的に交換した。透析用セルロースチューブ内の溶液を凍結乾燥し、固形分の重量を測定したところ、０．９５ｇの白色綿状固体である鮫アルカリ抽出プロテオグリカンを得た。
【００４７】
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液４０ｍＬを流下し、樹脂をナトリウムイオン型に活性化した。過剰の水酸化ナトリウムを除くため、脱イオン水約２５０ｍＬを流下した後、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカン０．２９ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１７０ｍＬ流下し、得られた溶出液約２００ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２７ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例１１】
【００４８】
（高保水性プロテオグリカンの保水性の測定４）
原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンと、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンそれぞれ０．１０ｇを、脱イオン水５０ｍＬに溶解し、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬ、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬを得た。この原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬと実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００４９】
図５は、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンと、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図５中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例１０、ナトリウムイオン型）」は実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮫アルカリ抽出プロテオグリカン」は原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカン４．０ｇ／日に対して、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンは４．６ｇ／日であった。原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンと比較して、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンは約１．２倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例１２】
【００５０】
（高保水性プロテオグリカンの化学分析４）
実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、１０．５重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３１．０重量％であった。原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は１４．１重量％、ウロン酸含量は２６．９重量％であった。これらの結果から、実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００５１】
実施例１０で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．８であり、原料の鮫アルカリ抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは５．７であった。
【実施例１３】
【００５２】
（高保水性プロテオグリカンの製造５）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学（株）））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ塩化カリウム水溶液４００ｍＬを流下し、樹脂をカリウムイオン型に活性化した。過剰の塩化カリウムを除くため、脱イオン水約３５０ｍＬを流下した後、原料の鮭由来プロテオグリカン０．３０ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１５０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１７０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．３０ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例１４】
【００５３】
（高保水性プロテオグリカンの保水性の測定５）
原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬ、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬと実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００５４】
図６は、原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図６中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例１３、カリウムイオン型）」は実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンは７．３ｇ／日であった。原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例１５】
【００５５】
（高保水性プロテオグリカンの化学分析５）
実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、７．０重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、４０．６重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００５６】
実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量を上記実施例３と同様に測定したところ、１４重量％であった。また、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの各金属含量を、上記実施例３と同様に測定した。実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．０６４５重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．７８重量％であった。測定の結果、ナトリウムは１．７重量％、カリウムは１２．０重量％であり、カルシウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため０．７８重量％未満であった。なお、上記金属含量は、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカン中に含まれる水分含量（１４重量％）を除去した乾燥重量を基に計算した。
【００５７】
実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度を実施例３と同一の相対粘度計を用いて分析した。実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカン２５．３ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１４重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度は６．０であった。
【００５８】
実施例１３で得られた高保水性プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であり、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であった。
【実施例１６】
【００５９】
（高保水性プロテオグリカンを含む化粧料の製造）
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンを含む美容液を試作した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン６ｍｇ（水分含量１３重量％）とビタミンＣ２５０ｍｇ、グリセリン１０ｍＬを蒸留水４０ｍＬに溶解し、ガラス瓶に入れ、完成である。得られた美容液は、無色透明、清澄であり、肌に塗布したとき、べたつき感がなくさらさらしているが、しっとり感が感じられるものであった。
【実施例１７】
【００６０】
次に、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンを含むクリ−ムを試作した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン５ｍｇ（水分含量１３重量％）を水１２ｍＬに溶解し、オリ−ブオイル１０ｍＬ、乳化ワックス３ｇを混合し、広口のプラスチックの瓶に入れた。また、プロテオグリカンを含まないクリームを同様に試作した。水１２ｍＬにオリ−ブオイル１０ｍＬ、乳化ワックス３ｇを混合し同様に試作した。結果、両者のクリ−ムを肌に塗布したとき、プロテオグリカンを含むクリームは、含まないクリームよりしっとり感が感じられるものであった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により保水性が改善された高保水性プロテオグリカンが提供されることにより、化粧料産業に広く利用されることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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