(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リツキシマブであるＩ型抗ＣＤ２０抗体、又は、オビヌツズマブである低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であるＢＴＫ阻害剤との組み合わせを含む、癌の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
癌が、ＣＤ２０を発現する癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＣＤ２０を発現する癌が、リンパ腫又はリンパ性白血病である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
リンパ腫が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
１種以上のさらなる他の細胞毒性剤、化学療法剤、若しくは抗癌剤、又は、サイトカイン若しくは電離放射線を投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
リツキシマブであるＩ型抗ＣＤ２０抗体、又は、オビヌツズマブである低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と併用投与されることを特徴とする、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であるＢＴＫ阻害剤を有効成分として含む、癌治療剤。
【請求項７】
６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であるＢＴＫ阻害剤と併用投与されることを特徴とする、リツキシマブであるＩ型抗ＣＤ２０抗体、又は、オビヌツズマブである低フコシル化抗ＣＤ２０抗体を有効成分として含む、癌治療剤。
【請求項８】
癌が、ＣＤ２０を発現する癌である、請求項６または７に記載の治療剤。
【請求項９】
ＣＤ２０を発現する癌が、リンパ腫又はリンパ性白血病である、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
リンパ腫が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である請求項９に記載の治療剤。
【請求項１１】
併用投与が、同時的又は連続的な併用投与である請求項６〜１０のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１２】
１種以上のさらなる他の細胞毒性剤、化学療法剤、若しくは抗癌剤、又は、サイトカイン若しくは電離放射線を投与する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０抗体とＢＴＫ阻害剤とを用いた癌の治療のための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低フコシル化（afucosylated）抗体
Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許６，６０２，６８４号に記載されているように、モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、そのオリゴ糖成分を操作することによって高めることができる。癌免疫療法で最も一般的に使用されている抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合型二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋もれていて、ポリペプチド主鎖と広範囲な接触を形成しており、それらの存在は抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するのに必須である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P., et al.. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、二分された（bisected）オリゴ糖の形成を触媒するグリコシル基転移酵素であるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素III（「ＧｎＴIII」）の過剰発現により、生体外における抗体のＡＤＣＣ活性が著しく増加することを示した。Ｎ２９７糖鎖の組成の変化又はその除去も、ＦｃのＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合に影響を与える（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。
【０００３】
抗ＣＤ２０抗体を含む低フコシル化及びフコシル化抗体の活性について考察する研究が報告されている（例えば、Iida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887; Natsume, A., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103; Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294）。
【０００４】
ＣＤ２０及び抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０分子（ヒトＢリンパ球限定分化抗原又はＢｐ３５ともいう）は、多岐にわたり記載されているところの、プレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に位置する疎水性の膜貫通タンパク質である（Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; and Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568）。ＣＤ２０は、９０％超のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）で発現される（Anderson, K.C., et al., Blood 63 (1984) 1424-1433）が、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常形質細胞又は他の正常組織では見いだされていない（Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135 (1985) 973- 979）。
【０００５】
抗ＣＤ２０抗体には２つの異なる種類が存在し、これらはＣＤ２０結合及び生物活性の様式において著しく異なる（Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052）。Ｉ型抗体、例えばリツキシマブ（８５％以上のフコース量を有する非低フコシル化（non-afucosylated）抗体）、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ等は、強い補体依存性細胞傷害作用を有する。
【０００６】
II型抗体、例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０又はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体等は、カスパーゼ非依存性細胞死誘導及びそれに伴うホスファチジルセリン露出により、標的細胞死を効果的に開始する。
【０００７】
ＢＴＫ及びＢＴＫ阻害剤
ブルトン型チロシンキナーゼ又はブルトン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ又はＢＴＫと略す）は、キナーゼのＴＥＣファミリーのメンバーである。ＢＴＫは、原発性免疫不全症Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブルトン型無ガンマグロブリン血症）に関連している。正確な作用機序は知られていない。ＢＴＫ遺伝子は、高親和性ＩｇＥ受容体を介し、肥満細胞活性化としてのＢ細胞の発生や成熟に重要なＢＴＫタンパク質をコードする。Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を有する患者は、骨髄に正常なプレＢ細胞集団を有するが、これらの細胞は成熟することや循環系に進入することができない。ＢＴＫ遺伝子はＸ染色体に位置する。ＢＴＫ遺伝子には４００超もの突然変異が同定されている。
【０００８】
ＢＴＫは、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼであるＢｌｋ、Ｌｙｎ及びＦｙｎによって上流で活性化され、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼなどの必須の細胞生存経路の下流活性化を引き起こす。ＢＴＫは、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）に結合するプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む。ＰＩ（３，４，５）Ｐ３結合は、Ｂｔｋを誘導してホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）をリン酸化させ、次いで、１種のホスファチジルイノシトール、即ちＰＩ（４，５）Ｐ２を、２種類のセカンドメッセンジャー、即ちイノシトール三リン酸（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に加水分解し、次いでＢ細胞シグナル伝達中に下流タンパク質の活性の調整を開始する。その後、Ｃａ２＋が動員され、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼ経路が活性化される。
【０００９】
当該技術分野で報告されているＢＴＫ阻害剤の例としては、不可逆的低分子ＢＴＫ阻害剤であるイブルチニブが挙げられる（PCI-32765; Advani et al.; J Clin Oncol. 2013: Jan 1; 31(1), page 88-94）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は低フコシル化II型抗ＣＤ２０抗体とＢＴＫ阻害剤との組み合わせにより、抗増殖効果が著しく高められることを見出した。驚くべきことに、この組み合わせは相加的作用を超えた作用、即ち高い相乗的作用を有する。
【００１１】
本発明の一態様は、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせで癌の治療に用いるための、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化抗ＣＤ２０抗体である。
【００１２】
本発明の別の態様は、癌の治療薬を製造するための、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせでの使用である。
【００１３】
本発明の別の態様は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化抗ＣＤ２０抗体を、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせで、斯かる治療を必要とする患者に投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法である。
【００１４】
一実施形態では、フコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の４０％〜６０％である。別の実施形態では、フコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の０％である。
【００１５】
一実施形態では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブである。一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の実施形態では、前記癌はＣＤ２０を発現する癌、好ましくはリンパ腫又はリンパ性白血病である。一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。別の実施形態では、前記低フコシル化抗体はII型抗ＣＤ２０抗体である。
【００１６】
一実施形態では、前記ＢＴＫ阻害剤は、国際公開第２０１１／１５２３５１号及び国際公開第２０１３／０８１０１６号に記載されている化合物から選択される化合物である。前記ＢＴＫ阻害剤は、本明細書に開示されている式Ｉに係る化合物又は式Ｉ−１に係る化合物であることが好ましい。前記ＢＴＫ阻害剤は、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であることが好ましい。
【００１７】
一実施形態では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブであり、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であり、かつ前記ＢＴＫ阻害剤は、国際公開第２０１１／１５２３５１号及び国際公開第２０１３／０８１０１６号に記載されている化合物からなる群から選択される。前記ＢＴＫ阻害剤は、本明細書に開示されている式Ｉに係る化合物又は式Ｉ−１に係る化合物であることが好ましい。前記ＢＴＫ阻害剤は、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であり、前記癌はＣＤ２０を発現する癌であり、一実施形態ではリンパ腫又はリンパ性白血病であることが好ましい。
【００１８】
一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫＤにてＣＤ２０に結合する。
【００１９】
本発明の一実施形態は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体（一実施形態ではリツキシマブ）、又は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（一実施形態では低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体）と、ＢＴＫ阻害剤（一実施形態では前記ＢＴＫ阻害剤は、国際公開第２０１１／１５２３５１号及び国際公開第２０１３／０８１０１６号に記載されている化合物からなる群から選択される）との組み合わせを含む医薬組成物である。前記ＢＴＫ阻害剤は、本明細書に開示されている式Ｉに係る化合物又は式Ｉ−１に係る化合物であることが好ましい。前記ＢＴＫ阻害剤は、癌の治療のための６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１（ａ）】抗腫瘍活性研究：皮下にＴＭＤ８細胞を有するマウスの（ａ）平均腫瘍体積曲線及び（ｂ）メジアン腫瘍体積曲線。Ｄ０にマウスに異種移植した。Ｄ１４（図１に示す０日目）に無作為化を行った。マウスに、ビヒクル及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａからなる１回のＰＯ投与を１日２回（Ｑ０．５Ｄ×２４）単独で、あるいは週に１回のＧＡ１０１（１及び３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射（Ｑ７Ｄ×４）と組み合わせて行った。マウスに、リツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射又はＧＡ１０１（１及び３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射を、週に１回（Ｄ１４（０日目）、Ｄ２１（７日目）、Ｄ２８（１４日目）及びＤ３５（２１日目）：Ｑ７Ｄ×４）行った。腫瘍体積を監視し、週に２回記録した。
【図１（ｂ）】同上
【００２１】
【図２（ａ）】抗腫瘍活性研究：皮下にＴＭＤ８細胞を有するマウスの（ａ）平均腫瘍体積曲線及び（ｂ）メジアン腫瘍体積曲線。Ｄ０にマウスに異種移植した。Ｄ１４（４００〜４５０ｍｍ３：図２に示す０日目）に無作為化を行った。マウスに、ビヒクル及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａからなる１回のＰＯ投与を１日２回（Ｑ０．５Ｄ×２４）単独で、あるいは週に１回のＧＡ１０１／ＲＴＸ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射（Ｑ７Ｄ×４）と組み合わせて行った。マウスに、リツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射又はＧＡ１０１（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射を週に１回（Ｄ１４（０日目）、Ｄ２１（７日目）、Ｄ２８（１４日目）及びＤ３５（２１日目）：Ｑ７Ｄ×４）行った。腫瘍体積を監視し、週に２回記録した。
【図２（ｂ）】同上
【００２２】
【図３】抗腫瘍活性研究：皮下にＴＭＤ８細胞を有するマウスの平均腫瘍体積曲線。Ｄ０にマウスに異種移植した。Ｄ１４（約４５０ｍｍ３：図３に示す０日目）に無作為化を行った。マウスに、０．００３７％（６ｍｇ／ｋｇ／日に変換）の化合物Ａ又は０．０１２％（２０ｍｇ／ｋｇ／日に変換）の化合物Ｂを含む飼料を単独で、あるいは週に１回のＲＴＸ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射（Ｑ７Ｄ×３）と組み合わせて与えた。マウスに、リツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる１回のＩＶ注射を週に１回（Ｄ１４（０日目）、Ｄ２１（７日目）及びＤ２８（１４日目）：Ｑ７Ｄ×３）行った。腫瘍体積を監視し、３日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目及び２１日目に記録した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせで癌の治療に用いられる、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、又はＡｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下であるＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３アイソタイプの低フコシル化抗ＣＤ２０抗体を含む。
【００２４】
本発明は、癌の治療薬を製造するための、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、又は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下であるＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３アイソタイプの低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせでの使用を含む。
【００２５】
一実施形態では、フコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の４０％〜６０％である。
【００２６】
「抗体」という用語は、限定されるものではないが、本発明に係る特有の性質が保持される限り、全抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び、モノクローナル抗体、キメラ抗体又は組換え抗体のような遺伝子操作された抗体、ならびに斯かる抗体の断片を含む、各種形態の抗体を包含する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子調製物を指す。従って、「ヒトのモノクローナル抗体」という用語は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトのモノクローナル抗体は、ヒトの重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物、例えば遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞が、不死化細胞に融合されてなるハイブリドーマによって産生される。
【００２７】
「キメラ抗体」という用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、ある供給源又は生物種に由来する可変領域又は結合領域と、別の供給源又は生物種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含むモノクローナル抗体を指す。マウスの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。斯かるマウス／ヒトキメラ抗体は、マウスの免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡ断片及びヒトの免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡ断片を含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって包含される他の形態の「キメラ抗体」は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変又は変更されているものである。斯かる「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」ともいう。キメラ抗体の産生方法は、従来の組換えＤＮＡ技術及び現在当該技術分野でよく知られている遺伝子導入技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855ならびに米国特許５，２０２，２３８号及び米国特許５，２０４，２４４号各明細書を参照されたい。
【００２８】
「ヒト化抗体」という用語は、親の免疫グロブリンに対して、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、異なる特異性を有する免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスのＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-327及びNeuberger, M.S. et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ及び二重若しくは多重特異性抗体について、上に記載した抗原を認識する配列を表すものに相当する。
【００２９】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。ヒト抗体は、最先端技術でよく知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. in Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。斯かる技術に基づいて、多種多様な標的に対するヒト抗体を産生することができる。ヒト抗体の例は、例えば、Kellermann, S.A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597に記載されている。
【００３０】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え法によって調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体、例えばＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞又はヒトの免疫グロブリン遺伝子が導入された動物（例えばマウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を含むものとする。斯かる組換えヒト抗体は、再構成された形態のヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。本発明に係る組換えヒト抗体は、生体内で体細胞超変異を起こしている。従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来及び関連するが、生体内のヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
【００３１】
本明細書で使用される「二重若しくは多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態によれば、結合特異性のうちの一方はＣＤ２０に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ２０の２つの異なるエピトープに結合してもよい。また、二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬を、ＣＤ２０を発現している細胞に局在化させてもよい。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００３２】
本明細書で使用される「結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、生体外アッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いるプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-Healthcare社、スウェーデンのウプサラ）における、抗体の腫瘍抗原エピトープへの結合を指す。結合親和性は、ｋａという用語（抗体／抗原複合体から得られる抗体の会合速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定められる。「結合する」又は「特異的に結合する」とは、１０−８Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ（一実施形態では１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）を意味する。従って、本発明に係る低フコシル化抗体は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ（一実施形態では１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）にて腫瘍抗原と特異的に結合する。
【００３３】
本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は単鎖又は二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００３４】
「定常領域」は、抗体と抗原との結合に直接は関与しないが、エフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体結合及びＣＤＣ）に関与する。
【００３５】
「可変領域」（本明細書で使用される軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ））は、抗体と抗原との結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを意味する。ヒトの軽鎖及び重鎖の各可変領域は同一の全体構造を有し、各領域は、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、即ちＣＤＲ）によって接続され、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート構造の形を取り、ＣＤＲはβシート構造に接続するループを形成することができる。各鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によってそれらの３次元構造が保持されており、他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成している。
【００３６】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書に定められている超可変領域残基以外のそれらの可変領域である。従って抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４領域を含む。特に重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合への寄与が最も高い領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義、及び／又は、「超可変ループ」由来の残基に従って決定される。
【００３７】
「低フコシル化抗体」という用語は、少ないレベルのフコース残基を有するＡｓｎ２９７のＦｃ領域においてグリコシル化パターンが変化している、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を指す。ヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３のグリコシル化は、最大２つのＧａｌ残基を末端とするコアフコシル化二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化としてＡｓｎ２９７において生じる。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じてＧ０、Ｇ１（α１，６又はα１，３）又はＧ２グリカン残基と呼ばれている（Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207によって記載されている。糖修飾されていないＣＨＯ宿主細胞において組換えで発現されている抗体は、通常少なくとも８５％の量でＡｓｎ２９７においてフコシル化されている。当然のことながら、本明細書で使用される低フコシル化抗体という用語は、そのグリコシル化パターンにおいてフコースを有しない抗体を含む。一般に、抗体内の典型的なグリコシル化残基位置は、ＥＵ付番方式に従って２９７位のアスパラギン（「Ａｓｎ２９７」）であることが知られている。
【００３８】
「ＥＵ付番方式」又は「ＥＵ指数」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す際に一般に使用される（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に報告されているＥＵ指数。これらは参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
従って本発明に係る低フコシル化抗体は、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を意味し、ここではフコース量はＡｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の６０％以下である（Ａｓｎ２９７のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも４０％以上が低フコシル化されていることを意味する）。一実施形態では、フコース量は、Ａｓｎ２９７のＦｃ領域のオリゴ糖の４０％〜６０％である。別の実施形態では、フコース量はＡｓｎ２９７のＦｃ領域のオリゴ糖の５０％以下であり、さらに別の実施形態では、フコース量はＡｓｎ２９７のＦｃ領域のオリゴ糖の３０％以下である。本発明に係る「フコース量」は、Ａｓｎ２９７のオリゴ糖（糖類）鎖内の前記オリゴ糖（フコース）の量を意味し、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖（糖類）（例えば複合型、混合型及び高マンノース型）の合計に対するものであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定され、かつ平均値として計算される（フコース量を決定する詳細な手順については、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）。さらに一実施形態では、Ｆｃ領域のオリゴ糖は二分されている。本発明に係る低フコシル化抗体は、Ｆｃ領域内のオリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量のＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を発現するように操作された糖修飾された宿主細胞において発現させることができる。一実施形態では、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは米国特許６，９４６，２９２号によれば、宿主細胞のα１，６−フコシル転移酵素活性を減少させ、或いは排除して、糖修飾された宿主細胞を生成することができる。抗体のフコシル化量は、例えば発酵条件（例えば発酵時間）によって、あるいは異なるフコシル化量を有する少なくとも２種類の抗体の組み合わせにより、予め決定することができる。斯かる低フコシル化抗体及びそれぞれの糖鎖工学法については、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、国際公開第２０００／０６１７３９号に記載されている。これらの糖鎖工学的に操作された抗体は高いＡＤＣＣを有する。本発明に係る低フコシル化抗体が得られる他の糖鎖工学法については、例えばNiwa, R.. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem, 278 (2003) 3466-3473、国際公開第０３／０５５９９３号又は米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に記載されている。
【００４０】
従って本発明の一態様は、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせで癌の治療に用いられる、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、又はＣＤ２０に特異的に結合するＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のＡｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化抗ＣＤ２０抗体である。本発明の別の態様では、癌の治療薬の製造のための、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である、ＣＤ２０に特異的に結合するＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の、ＢＴＫ阻害剤との組み合わせにおける使用である。一実施形態ではフコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の６０％〜２０％である。一実施形態ではフコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の６０％〜４０％である。一実施形態ではフコース量は、Ａｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量の０％である。
【００４１】
ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５及びＬＦ５としても知られており、その配列は、スイスプロットデータベース登録番号Ｐ１１８３６によって特徴づけられる）は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に位置する約３５ｋＤの分子量を有する疎水性の膜貫通タンパク質である（Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568）。対応するヒトの遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られている、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーメンバーは、一般的な構造的特徴及び同様のイントロン／エキソンスプライシング境界を特徴とし、造血細胞及び非リンパ系組織の中で固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の血漿細胞への成長及び分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバー群の中において１１ｑ１２に局在化されている。この遺伝子の他のスプライシングにより、同じタンパク質をコードする２つの転写物変異体が生じる。
【００４２】
「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」という用語は、本明細書では同義で使用され、細胞によって天然に発現されるかＣＤ２０遺伝子を形質移入された細胞で発現されるヒトのＣＤ２０のあらゆる変異体、イソ型及び種相同体（species homolog）を含む。本発明の抗体のＣＤ２０抗原への結合は、ＣＤ２０を不活性化させることによりＣＤ２０を発現している細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現している細胞の死滅は、細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣ及びＣＤＣのうちの１つ以上の機序によって生じ得る。
【００４３】
当該技術分野において認識されているＣＤ２０の同義語としては、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５及びＬＦ５が挙げられる。
【００４４】
本発明に係る「抗ＣＤ２０抗体」という用語は、ＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体である。Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743及びCragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052に従うと、抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０抗原への結合特性及び生物活性に応じ、２種類の抗ＣＤ２０抗体（Ｉ型及びII型抗ＣＤ２０抗体）を識別することができる（表１を参照）。
【表１】
0006478989.tif 000002
【００４５】
II型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えばヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開第２００５／０４４８５９号に開示されているキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、11B8 IgG1（国際公開第２００４／０３５６０７号に開示されているもの）及びAT80 IgG1が挙げられる。典型的にはＩｇＧ１アイソタイプのII型抗ＣＤ２０抗体は、特有のＣＤＣ特性を示す。II型抗ＣＤ２０抗体はＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比較してより少ないＣＤＣを有する（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。
【００４６】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えばリツキシマブ、HI47 IgG3（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、2C6 IgG1（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示されているもの）、2F2 IgG1（国際公開第２００４／０３５６０７号及び国際公開第２００５／１０３０８１号に開示されているもの）及び2H7 IgG1（国際公開第２００４／０５６３１２号に開示されている）が挙げられる。
【００４７】
本発明に係る低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、一実施形態ではII型抗ＣＤ２０抗体であり、別の実施形態では低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００４８】
本発明に係る低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、フコースが減少していない抗ＣＤ２０抗体とは異なり、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００４９】
「高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する低フコシル化抗ＣＤ２０抗体」とは、当業者に知られている任意の好適な方法によって決定される、高いＡＤＣＣを有する低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（この用語は本明細書において定義されている）を意味する。認められている生体外ＡＤＣＣアッセイの１つは、以下のとおりである。
【００５０】
１）本アッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する。
【００５１】
２）本アッセイは、無作為に選択された健康なドナーの血液から単離された、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用する。
【００５２】
３）本アッセイを以下の手順に従って行う。
ｉ）標準的な密度遠心分離手順を用いてＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ細胞培地中に５×１０６細胞／ｍｌで懸濁させる。
ii）標準的な組織培養法によって標的細胞を増殖させ、９０％超の生存度を有する指数増殖期から回収、ＲＰＭＩ細胞培地で洗浄、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培地で２回洗浄、さらに１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培地に再懸濁させる。
iii）１００マイクロリットルの最終の上記標的細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す。
iv）この抗体を細胞培地中に４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌに連続希釈し、得られた５０マイクロリットルの抗体溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート内の標的細胞に添加し、上記全濃度範囲を網羅する各種抗体濃度にて各３回試験する。
ｖ）最大放出（ＭＲ）対照のために、標識された標的細胞を含むプレート内の３つの追加のウェルに、抗体溶液（上記iv時点）の代わりに５０マイクロリットルの２％（ＶＮ）非イオン性界面活性剤（ノニデット、シグマ社、セントルイス）の水溶液を入れる。
vi）自然放出（ＳＲ）対照のために、標識された標的細胞を含むプレート内の３つの追加のウェルに、抗体溶液（上記iv時点）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培地を入れる。
vii）次いで９６ウェルマイクロタイタープレートを１分当たり５０×ｇで遠心分離し、４℃で１時間インキュベートする。
viii）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記ｉ時点）を各ウェルに添加し、２５：１のエフェクター：標的細胞比を得、このプレートを５％ＣＯ２雰囲気下３７℃のインキュベータ内に４時間置く。
ix）各ウェルから細胞を含まない上澄みを回収し、実験的に放出される放射活性（ＥＲ）をガンマカウンタで定量化する。
ｘ）式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲは、その抗体濃度に対して定量化された平均放射活性（上記ix時点を参照）であり、ＭＲは、ＭＲ対照（上記ｖ時点を参照）に対して定量化された平均放射活性（上記ix時点を参照）であり、ＳＲは、ＳＲ対照（上記vi時点を参照）に対して定量化された平均放射活性（上記ix時点を参照）である）に従って、各抗体濃度について特異的溶解率を計算する。
【００５３】
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記試験した抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解における最大率における増加、及び／又は上記試験した抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大率の半分を達成するのに必要な抗体濃度の減少のいずれか一方として定められる。ＡＤＣＣの増加は、当業者に知られている同じ標準的な産生、精製、製剤化及び貯蔵方法を用いて、同じ抗体によって媒介され同じ種類の宿主細胞によって産生されるが、ＧｎＴIIIを過剰発現するように操作された宿主細胞によって産生されていない上記アッセイで測定されるＡＤＣＣに対するものである。
【００５４】
前記「ＡＤＣＣの増加」は前記抗体の糖鎖工学によって得ることができ、これは、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許６，６０２，６８４号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することによりモノクローナル抗体の前記天然の細胞媒介性エフェクター機能を高めることを意味する。
【００５５】
「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」という用語は、補体の存在下における本発明に係る抗体によるヒトの腫瘍標的細胞の溶解を指す。好ましくは補体の存在下において本発明に係る抗ＣＤ２０抗体により、ＣＤ２０を発現する細胞調製物を処理することによってＣＤＣを測定する。抗体が１００ｎＭ濃度において４時間後に２０％以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を誘導する場合に、ＣＤＣが認められる。好ましくは５１Ｃｒ又はＥｕで標識された腫瘍細胞、及び放出される５１Ｃｒ又はＥｕの測定を用いて本アッセイを行う。対照としては補体を含むが抗体を含まない腫瘍標的細胞のインキュベーションが挙げられる。
【００５６】
「リツキシマブ」抗体（Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトのＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作されたヒトガンマ１定常領域を含む、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００５７】
「リツキシマブ」抗体（Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトのＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作されたヒトガンマ１定常領域を含む、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。このキメラ抗体はヒトのガンマ１定常領域を含み、１９９８年４月１７日に発行されIDEC Pharmaceuticals社に譲渡された米国特許５，７３６，１３７号（Anderson et. al.）においては、「Ｃ２Ｂ８」という名前で特定されている。リツキシマブは再発性／難治性の低悪性度又は濾胞性かつＣＤ２０陽性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者の治療に対して認可されている。生体外作用機序研究により、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すことが分かっている（Reff, M.E., et. al., Blood 83 (1994) 435-445）。さらに、リツキシマブは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を測定するアッセイにおいて有意な活性を示す。リツキシマブは低フコシル化されていない。
【表２】
0006478989.tif 000003
【００５８】
「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」という用語は、ヒトＩｇＧ１の定常領域によるキメラ化及びその後のヒト化（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号を参照）により、マウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウスの重鎖（ＶＨ）可変領域：配列番号１、マウスの軽鎖（ＶＬ）可変領域：配列番号２（S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139を参照)）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す。これらの「ヒト化Ｂ-Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に詳細に開示されている。
【００５９】
一実施形態では「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号３〜配列番号１９（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２〜Ｂ−ＨＨ９及びＢ−ＨＬ８〜Ｂ−ＨＬ１７）の群から選択された重鎖（ＶＨ）可変領域を有する。具体的な一実施形態では斯かる可変領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１５（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）からなる群から選択される。具体的な一実施形態では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号２０の軽鎖（ＶＬ）可変領域（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）を有する。具体的な一実施形態では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７の重鎖（ＶＨ）可変領域（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ６）及び配列番号２０の軽鎖（ＶＬ）可変領域（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）を有する。さらに一実施形態では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体はＩｇＧ１抗体である。本発明に係る斯かる低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号に記載されている手順に従い、Ｆｃ領域において糖鎖操作（ＧＥ）されている。一実施形態では低フコシル化及び糖鎖工学的に操作されたヒト化Ｂ−Ｌｙ１はB-HH6-B-KV1 GEである。一実施形態では抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである（recommended INN, WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453）。本明細書で使用されるオビヌツズマブは、ＧＡ１０１と同義である。その商品名はＧＡＺＹＶＡである。文献WHO Drug Informationは、全ての過去の版（例えば、Vol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）を置き換えており、以前はアフツズマブ（recommended INN, WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176;Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124）として知られていた。
【００６０】
本明細書で使用されるＢＴＫは、「ブルトン型チロシンキナーゼ」又は「ブルトン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ」（Ｂｔｋ又はＢＴＫと略す）であり、キナーゼのＴＥＣファミリーのメンバーである。ＢＴＫ遺伝子は、高親和性ＩｇＥ受容体を介した肥満細胞活性化としてのＢ細胞の発生や成熟に重要なＢＴＫタンパク質をコードする。ＢＴＫ遺伝子はＸ染色体に位置する。ＢＴＫ遺伝子の４００を超える突然変異が同定されている。
【００６１】
本発明に係る「ＢＴＫ阻害剤」という用語は、０．００１μＭ〜約２μＭ、一実施形態では０．００２μＭ〜約２μＭのＩＣ５０でＢＴＫのキナーゼ活性を防止する薬剤を指す。一実施形態ではＢＴＫ阻害剤は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチドである。
【００６２】
別の実施形態ではＢＴＫ阻害剤は、１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量（ＭＷ）を有する低分子量の化合物である。
【００６３】
一実施形態では斯かる低分子量のＢＴＫ阻害化合物は、国際公開第２０１１／１５２３５１号又は国際公開第２０１３／０８１０１６号に記載されている化合物である。
【００６４】
一実施形態では、本発明に係る低分子量のＢＴＫ阻害化合物は、以下の特徴を有する。
下記一般式（Ｉ）の化合物：
【化１】
0006478989.tif 000004
（式中、Ｌは（１）−Ｏ−、（２）−Ｓ−、（３）−ＳＯ−、（４）−ＳＯ２−、（５）−ＮＨ−、（６）−Ｃ（Ｏ）−、（７）−ＣＨ２−Ｏ−、（８）−Ｏ−ＣＨ２−、（９）−ＣＨ２−又は（１０）−ＣＨ（ＯＨ）−を表し、
Ｒ１は（１）ハロゲン原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基、（３）Ｃ１〜４アルコキシ基、（４）Ｃ１〜４ハロアルキル基又は（５）Ｃ１〜４ハロアルコキシ基を表し、
ｒｉｎｇ１は、４〜７員の環状基を表し、それらは、（１）ハロゲン原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基、（３）Ｃ１〜４アルコキシ基、（４）ニトリル、（５）Ｃ１〜４ハロアルキル基及び（６）Ｃ１〜４ハロアルコキシ基からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基によって置換されていてもよく、ここでは２つ以上の置換基がｒｉｎｇ１に存在する場合、これらの置換基はこれらの置換基が結合されているｒｉｎｇ１内の原子と共に４〜７員の環状基を形成していてもよく、
ｒｉｎｇ２は４〜７員の飽和複素環を表し、それらは１〜３つの−Ｋ−Ｒ２で置換されていてもよく、
Ｋは（１）結合手、（２）Ｃ１〜４アルキレン、（３）−Ｃ（Ｏ）−、（４）−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、（５）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、（６）−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は（７）−ＳＯ２−（ここでは、左側の結合がｒｉｎｇ２に結合されている）を表し、
Ｒ２は（１）Ｃ１〜４アルキル、（２）Ｃ２〜４アルケニル又は（３）Ｃ２〜４アルキニル基を表し、それぞれが（１）ＮＲ３Ｒ４、（２）ハロゲン原子、（３）ＣＯＮＲ５Ｒ６、（４）ＣＯ２Ｒ７及び（５）ＯＲ８からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して（１）水素原子又は（２）Ｃ１〜４アルキル基を表し、それらはＯＲ９又はＣＯＮＲ１０Ｒ１１で置換されていてもよく、
Ｒ３及びＲ４はそれらが結合される窒素原子と共に４〜７員の窒素性飽和複素環を形成してもよく、それらはオキソ基又はヒドロキシル基で置換されていてもよく、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して（１）水素原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基又は（３）フェニル基を表し、
Ｒ７は（１）水素原子又は（２）Ｃ１〜４アルキル基を表し、
Ｒ８は（１）水素原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基、（３）フェニル基又は（４）ベンゾトリアゾリル基を表し、
Ｒ９は（１）水素原子又は（２）Ｃ１〜４アルキル基を表し、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立して（１）水素原子又は（２）Ｃ１〜４アルキル基を表し、
ｎは０〜４の整数を表し、
ｍは０〜２の整数を表し、
ｎが２以上である場合、Ｒ１は互いに同じであっても異なっていてもよい）、
その光学異性体あるいはそれらの混合物、その塩、その溶媒和物、そのＮ−オキシド又はそのプロドラッグ。
【００６５】
［２］Ｒ２がＣ２〜４アルケニル基又はＣ２〜４アルキニル基であり、それらがそれぞれ（１）ＮＲ３Ｒ４、（２）ハロゲン原子、（３））ＣＯＮＲ５Ｒ６、（４）ＣＯ２Ｒ７及び（５）ＯＲ８からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基で置換されていてもよい、上記［１］に係る化合物。
【００６６】
［３］ｒｉｎｇ１がベンゼン、シクロヘキサン又はピリジン環であり、それらがそれぞれ（１）ハロゲン原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基、（３）Ｃ１〜４アルコキシ基、（４）ニトリル及び（５）ＣＦ３からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基で置換されていてもよい、上記［１］に係る化合物。
【００６７】
［４］ｒｉｎｇ２が４〜７員の窒素性飽和複素環であり、それらが１〜３つの−Ｋ−Ｒ２で置換されていてもよい、上記［１］に係る化合物。
【００６８】
［５］４〜７員の窒素性飽和複素環がアゼチジン、ピロリジン又はピペリジン環である、上記［４］に係る化合物。
【００６９】
［６］一般式（Ｉ−１）によって表される上記［１］に係る化合物：
【化２】
0006478989.tif 000005
（式中、ｒｉｎｇ１−１はベンゼン、シクロヘキサン又はピリジン環を表し、それらはそれぞれ（１）ハロゲン原子、（２）Ｃ１〜４アルキル基、（３）Ｃ１〜４アルコキシ基、（４）ニトリル及び（５）ＣＦ３からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基で置換されていてもよく、ｒｉｎｇ２−１は４〜７員の窒素性飽和複素環を表し、それらは１〜３つの−Ｋ−Ｒ２で置換されていてもよく、それ以外の記号は上記と同じ定義を有する）。
【００７０】
［７］Ｒ２がＣ２〜４アルケニル基又はＣ２〜４アルキニル基であり、それらがそれぞれ（１）ＮＲ３Ｒ４、（２）ハロゲン原子、（３）ＣＯＮＲ５Ｒ６、（４）ＣＯ２Ｒ７及び（５）ＯＲ８からなる群からそれぞれ独立して選択される１〜５つの置換基で置換されていてもよい、上記［６］に係る化合物。
【００７１】
［８］（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、あるいはその光学異性体又はそれらの混合物である、上記［１］に係る化合物。
【００７２】
本発明に係るＢＴＫ阻害剤は、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であることが好ましい。
【００７３】
本発明に係るＢＴＫ阻害剤の製造は、国際公開第２０１１／１５２３５１号に開示されているとおりに行われる。
【００７４】
「塩」とは薬学的に許容される塩としての当該化合物の塩を指す。斯かる塩の例としては、アルカリ金属（カリウム、ナトリウムなど）との塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）との塩、アンモニウム塩、薬学的に許容される有機アミン（テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなど）との塩、ならびに酸付加塩（無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩など）及び有機酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩など））等が挙げられる。
【００７５】
「ＩＣ５０」とは、特定の測定された活性の５０％を阻害するのに必要な特定の化合物の濃度を指す。ＢＴＫキナーゼ活性を阻害するＢＴＫ阻害剤のＩＣ５０は、とりわけ後述の通りに測定することができる。
【００７６】
本発明に係るＢＴＫ阻害剤のＩＣ５０を決定するための生体外活性アッセイ
製造業者によって提供されている手順に基づき、Ｂｔｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び以下の試薬：Ｔｙｒ−１ペプチド、Ｔｈｙ−１リンペプチド、５倍キナーゼ緩衝液、ＡＴＰ、蛍光試薬Ｂ、蛍光緩衝液及び停止試薬を含むＺ’−ＬＹＴＥ（商標）キナーゼアッセイキット−Ｔｙｒ１ペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、Ｂｔｋ酵素阻害活性を測定した。５μＬ／ウェルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈したＢＴＫ阻害溶液又はＤＭＳＯ及び１０μＬ／ウェルの基質／酵素混合物溶液を９６ウェルアッセイプレートに分注し、３０℃で２０分間反応させた。キナーゼ緩衝液（ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ、２．７ｍＭ）、１．３３倍キナーゼ緩衝液）で希釈して４μＭの最終Ｔｙｒ−１ペプチド濃度及び５ｎＭの最終Ｂｔｋ濃度を得ることにより、基質／酵素混合物溶液を調製した。次いで、５μＬ／ウェルのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、最終濃度＝３６μＭ）を添加し、３０℃で１時間反応させた。反応の完了後、蛍光試薬Ｂを蛍光緩衝液で１２８倍に希釈することにより得られた１０μＬの蛍光溶液を添加し、３０℃でさらに１時間反応させた。次いで１０μＬの停止溶液を添加し、酵素反応を停止させた。Fusion Universal Microplate Analyzer（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）蛍光プレートリーダーを用いて、各ウェルにおける４４５ｎｍ及び５２０ｎｍでの蛍光強度を測定した。当該キットによって提供されている手順に従い、４４５ｎｍでの蛍光（クマリン蛍光）の５２０ｎｍでの蛍光（フルオレセイン蛍光）に対する比を用いて、リン酸化率を決定した。
【００７７】
以下の方程式を用いてＢＴＫ阻害剤による阻害率（％）を計算した。
リン酸化阻害率（％）＝１−｛（ＡＣ−ＡＸ）／（ＡＣ−ＡＢ）｝×１００
ＡＸ：ＢＴＫ阻害剤を添加した場合のリン酸化率（％）
ＡＢ：ＡＴＰを添加しない場合（ブランク）のリン酸化率（％）
ＡＣ：ＤＭＳＯのみを添加した場合（対照）のリン酸化率（％）
【００７８】
ＢＴＫ阻害剤の各濃度における阻害率（％）に基づく阻害曲線から、ＢＴＫ阻害剤の５０％阻害値（ＩＣ５０値）を決定した。
【００７９】
オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物活性を含む、治療用糖タンパク質の有効性に関連する性質に著しい影響を与え得る。斯かる性質は、オリゴ糖の存在又は不在だけでなく、オリゴ糖の特定の構造にも依存しうる。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間で、幾つかの一般化を行うことができる。例えば、ある種のオリゴ糖構造は、特定の糖結合タンパク質との相互作用を介して糖タンパク質の血流からの迅速なクリアランスを媒介するが、抗体と結合して望ましくない免疫反応を引き起こし得るものもある（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。
【００８０】
哺乳類細胞は、ヒトへの施用に最も適合可能な形態でタンパク質をグリコシル化することができるため、治療用糖タンパク質の産生にとって優れた宿主である（Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-130; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。細菌は、非常に稀にタンパク質をグリコシル化し、酵母、糸状菌、昆虫及び植物細胞などの他の種類の一般的な宿主のように、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、及びいくつかの特定の事例では生物活性の低下を伴う、グリコシル化パターンを生じさせる。哺乳類細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ここ２０年間の間で最も一般的に使用されている。これらの細胞によれば、好適なグリコシル化パターンを与えるだけでなく、遺伝的に安定且つ非常に生産性の高いクローン細胞株を、一貫して産生することが可能になる。これらの細胞は、無血清培地を用いる単純なバイオリアクタにおいて高密度となるまで培養することができ、安全かつ再現可能なバイオプロセスの開発が可能になる。他の一般的に使用される動物細胞としては、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞が挙げられる。より最近では、遺伝子導入動物からの産生も試験されている（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。
【００８１】
全ての抗体が、重鎖定常領域内の保存された位置に糖鎖構造を含む。各アイソタイプは、異なるＮ結合型糖鎖構造の配列を有し、これらがタンパク質集合、分泌又は機能的活性に様々に影響を与える（Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。結合したＮ結合型糖鎖構造は、プロセシングの程度に応じて大きく異なり、高マンノース型、多分岐型、及び二分岐型の複合オリゴ糖が含まれ得る（Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。典型的には、特定のグリコシル化部位に結合したコアオリゴ糖構造に不均質なプロセシングが存在することにより、モノクローナル抗体でさえ複数の糖型として存在する。同様に、細胞株間には抗体グリコシル化における大きな違いが生じ、異なる培養条件下で培養された所与の細胞株にすら小さな違いが認められることが分かっている（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822）。
【００８２】
単純な産生プロセスを維持し、かつ顕著な望ましくない副作用を潜在的に回避しながら効力の大きな増加を得るための１つの方法は、Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許６，６０２，６８４号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより、モノクローナル抗体の天然の細胞媒介性エフェクター機能を高めることである。癌免疫療法で最も一般的に使用されている抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合された２つの複合型二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋もれていて、ポリペプチド骨格との広範囲な接触を形成しており、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するのに必須である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995)  813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。
【００８３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシル基転移酵素であるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素III（「ＧｎＴIII」）を過剰発現させることにより、操作されたＣＨＯ細胞によって産生される抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）の生体外におけるＡＤＣＣ活性が著しく増加することが従来示されている（Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号を参照。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｃｈＣＥ７抗体は、非結合型モノクローナル抗体の大きなクラスに属する。当該クラスの抗体は、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、ＧｎＴIII酵素を欠失する標準的な産業用細胞株で産生した場合に、臨床的に有用となる効力が非常に少ない（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180）。本研究は、ＧｎＴIIIを発現するように抗体を産生する細胞を操作することにより、ＡＤＣＣ活性の大きな増加を得ることができ、それにより天然に生じる抗体に認められるレベルを超えて、二分された低フコシル化オリゴ糖を含む定常領域（Ｆｃ）に関連する二分されたオリゴ糖の割合も増加させることを示した最初の研究であった。
【００８４】
本明細書で使用される「癌」という用語は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞上皮癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌（uterine cancer）、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、大腸癌、乳癌、子宮癌（uterine cancer）、卵管癌、子宮内膜癌、頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫（上記癌のいずれかの難治性型を含む）又は上記癌の１つ以上の組み合わせを含む。一実施形態では、癌という用語はＣＤ２０を発現する癌を指す。
【００８５】
「ＣＤ２０抗原の発現」という用語は、腫瘍又は癌、好ましくは非固形腫瘍の細胞における、好ましくはＴ細胞又はＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の細胞表面における、有意なレベルのＣＤ２０抗原の発現を表すものとする。「ＣＤ２０を発現する癌」を有する患者は、当該技術分野で知られている標準的なアッセイによって決定することができる。例えばＣＤ２０抗原の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出又はＦＡＣＳを用いるか、あるいは対応するｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出によって評価することができる。
【００８６】
本明細書で使用される「ＣＤ２０を発現する癌」という用語は、癌細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全ての癌を指す。本明細書で使用されるＣＤ２０を発現する癌として好ましくは、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病を指す。斯かるリンパ腫及びリンパ性白血病としては、例えばａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫又はＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫及び脾性辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大型細胞リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、ｊ）ホジキン病が挙げられる。
【００８７】
一実施形態では、ＣＤ２０を発現する癌は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の実施形態では、ＣＤ２０を発現する癌は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、有毛細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症又は中枢神経系原発リンパ腫である。
【００８８】
「治療する方法」又は「治療法」という用語又はその同義語は、例えば癌に用いられる場合、患者における癌細胞の数を減少又は排除するか、あるいは癌の症状を緩和させるように設計された作用手順又は過程を指す。癌又は別の増殖性疾患を「治療する方法」は、癌細胞又は他の障害が実際に排除されること、細胞の数又は障害が実際に減少すること、あるいは癌又は他の障害の症状が実際に緩和させることを必ずしも意味するものではない。癌を治療する方法はしばしば、成功の可能性が低くても行われるが、患者の病歴及び推定される生存余命を考慮すると、全体として有利な作用過程を誘導するものと考えられる。
【００８９】
「組み合わせ」又は「併用投与」又は「併用投与する」という用語は、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０及び前記ＢＴＫ阻害剤を、２種類の別個の製剤として（あるいは１種の単一製剤として）投与することを指す。併用投与はどちらかの順序で同時的又は連続的であってもよく、ここでは両方（又は全て）の有効成分が同時にそれらの生物活性を与える期間が存在することが好ましい。前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記抗ＣＤ２０低フコシル化抗体及び前記ＢＴＫ阻害剤を、同時又は連続的に併用投与する（例えば持続注入による静脈内（i.v.）投与（抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、最終的に前記ＢＴＫ阻害剤を静脈内投与するか、あるいは例えば抗ＣＤ２０抗体を持続注入により静脈内（i.v.）投与し、前記ＢＴＫ阻害剤を経口投与する）。両方の治療薬を連続的に併用投与する場合、それらの用量を同日に２回の別個の投与として投与するか、それらの薬剤のうちの一方を１日目に投与し２つ目を２日目〜７日目、好ましくは２日目〜４日目に併用投与する。従って、一実施形態では、「連続的に」という用語は、第１の成分（抗ＣＤ２０抗体又はＢＴＫ阻害剤）の投与後７日以内、好ましくは第１の成分の投与後４日以内を意味し、「同時に」という用語は、同じ時間であることを意味する。前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体及び前記ＢＴＫ阻害剤の維持量に関する「併用投与」という用語は、治療周期が両方の薬物にとって適当であれば（例えば毎週）、維持量をどちらも同時に併用投与することができることを意味する。あるいは、例えばＢＴＫ阻害剤を１日目〜３日目ごとに投与し、前記低フコシル化抗体を毎週投与する。あるいは、維持量を１日以内又は数日以内のいずれかで連続的に併用投与する。
【００９０】
当該抗体を研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって求められている組織、系、動物又はヒトの生体応答又は医学的応答を誘発するそれぞれの化合物又は組み合わせの量である「治療的有効量」（又は単に「有効量」）で当該患者に投与することは自明である。
【００９１】
前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記抗ＣＤ２０低フコシル化抗体及び前記ＢＴＫ阻害剤の併用投与量及び併用投与のタイミングは、種類（生物種、性別、年齢、体重など）ならびに治療されている患者の状態、及び治療されている疾患又は病気の重症度によって決まる。前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体及び前記ＢＴＫ阻害剤を、１回又は一連の治療中の例えば同日又は翌日に患者に併用投与することが好適である。
【００９２】
投与が静脈内である場合、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体又は前記ＢＴＫ阻害剤の最初の注入時間は、その後の注入時間よりも長くてもよく、例えば最初の注入では約９０分、その後の注入では約３０分（最初の注入の耐性が高ければ）であってもよい。
【００９３】
疾患の種類及び重症度に応じて、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は低フコシル化抗ＣＤ２０抗体を約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）、及び、前記ＢＴＫ阻害剤を１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）投与するのが、両薬物の患者への併用投与における初期候補用量である。一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブ）の好ましい用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のそれらの組み合わせ）の１回以上の用量を患者に併用投与してもよい。一実施形態では、前記ＢＴＫ阻害剤（好ましくは、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩）の好ましい用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ（あるいは任意のそれらの組み合わせ）の１回以上の用量を患者に併用投与してもよい。
【００９４】
患者の種類（生物種、性別、年齢、体重など）及び状態ならびに前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体（好ましくはリツキシマブ）又は低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の種類（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブ）に応じて、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の用量及び投与スケジュールは、前記ＢＴＫ阻害剤とは異なってもよい。例えば、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体を、例えば１〜３週間ごとに投与してもよく、前記ＢＴＫ阻害剤を毎日又は２〜１０日ごとに投与してもよい。また、最初により高い負荷用量を投与し、その後に１回以上のより低い用量を投与してもよい。
【００９５】
一実施形態ではＩ型抗ＣＤ２０抗体（好ましくはリツキシマブ）の好ましい用量は、８週間の投与サイクルの１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７日目に、約１００ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよい。
【００９６】
一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブ）の好ましい用量は、３〜６週間の投与サイクルの１、８、１５日目に８００〜１６００ｍｇ（一実施形態では８００〜１２００ｍｇ）、次いで、３〜４週間の投与サイクルの１日目〜９日目まで４００〜１２００（一実施形態では８００〜１２００ｍｇ）の用量である。
【００９７】
一実施形態では、（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、及び（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンからなる群から選択される前記ＢＴＫ阻害剤の用量は、以下のとおりとする。前記化合物（１）〜（８）の光学異性体及びそれらの混合物からなる群から選択される前記ＢＴＫ阻害剤の用量は、以下のとおりとする。前記ＢＴＫ阻害剤６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩の用量は、以下のとおりとする。本発明に係る前記用量は、経口投与として１日１回又は２日に１回で１０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜５５ｍｇ／ｋｇである。
【００９８】
推奨される用量は、化学療法剤のさらなる併用投与の有無、及び、化学療法剤の種類に応じて異なってもよい。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、癌、好ましくはＣＤ２０を発現する癌に罹患している患者において、転移又はさらなる播種を防止又は減少させるのに有用である。本発明は斯かる患者の生存期間の延長、斯かる患者の無増悪生存期間の延長、奏功期間の延長にとって有用であり、生存期間、無増悪生存期間、奏功率又は奏功期間によって評価した場合に、治療される患者の統計的に有意かつ臨床的に有意な改善が得られる。好ましい実施形態では、本発明は患者群において奏功率を増加させるのに有用である。
【０１００】
本発明の文脈では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と前記ＢＴＫ阻害剤との併用の癌治療において、さらなる他の細胞毒性剤、化学療法剤、若しくは抗癌剤、又は、斯かる薬剤の効果を高める化合物（例えばサイトカイン）若しくは電離放射線を使用してもよい。斯かる分子は、意図した目的に有効な量で、組み合わせて提供することが好適である。一実施形態では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはリツキシマブ又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体、好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブと前記ＢＴＫ阻害剤とを用いた併用治療を、斯かるさらなる他の細胞毒性剤、化学療法剤、若しくは抗癌剤、又は、斯かる薬剤の効果を高める化合物なしで使用する。
【０１０１】
斯かるさらなる薬剤としては、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ、例えばcytoxan（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ、例えばleukeran（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ、例えばplatinol（登録商標））、ブスルファン（例えばmyleran（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣなどのアルキル化剤又はアルキル化作用を有する薬剤、メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６、例えばvepesid（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えばＸｅｌｏｄａ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などの代謝拮抗剤、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ、例えばアドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなどの抗生物質、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなど）などのアルカロイド、パクリタキセル（例えばtaxol（登録商標））及びパクリタキセル誘導体などの他の抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン（ＤＥＸ、例えばdecadron（登録商標））などのグルココルチコイド及びプレドニゾンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシ尿素などのヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼなどのアミノ酸枯渇酵素、ロイコボリン及び他の葉酸誘導体、及び同様の多様な抗腫瘍剤が挙げられる。また、さらなる薬剤として以下の薬剤：アミホスチン（例えばethyol（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えばdoxil（登録商標））、ゲムシタビン（例えばgemzar（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えばdaunoxome（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばtaxotere（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンβ、インターフェロンα、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルを使用してもよい。一実施形態では、前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と前記ＢＴＫ阻害剤とを用いた併用治療を、斯かるさらなる薬剤なしで使用する。
【０１０２】
化学療法治療計画における上記の細胞毒性薬や抗癌剤、ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤等の抗増殖標的特異的抗癌剤の使用は、一般に癌療法分野では十分に特徴づけられており、本明細書におけるそれらの使用は、耐性及び有効性を監視し、かつ若干の調整を行いながら投与経路及び用量を制御するために同じように考慮すればよい。例えば、細胞毒性薬の実際の用量は、抗癌剤感受性試験を用いて決定される患者の培養された細胞応答によって異なってもよい。当該用量は一般的に、さらなる他の薬剤が存在しない場合に使用される量と比較して少ない。
【０１０３】
有効な細胞毒性薬の典型的な用量は、製造業者によって推奨される範囲であってもよく、生体外応答又は動物モデルにおける応答によって示される場合には、約１桁少ない濃度又は量まで減少させることができる。従って、実際の用量は、医師の判断、患者の状態、又は、初代培養悪性細胞又は抗癌剤を投与された組織試料の生体外応答性あるいは適当な動物モデルにおいて観察される応答に基づく、治療法の有効性によって決まる。
【０１０４】
本発明の文脈では、ＣＤ２０を発現する癌の前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と前記ＢＴＫ阻害剤とを用いた併用治療に加えて、有効量の電離放射を行ってもよく、及び／又は、放射性医薬品を使用してもよい。放射線源は、治療されている患者の外部又は内部のどちらにあってもよい。放射線源が患者の外部にある場合、当該治療法は外照射療法（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者の体内にある場合、当該治療は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。本発明の文脈で使用される放射性原子は限定されるものではないが、ラジウム、イットリウム９０、セシウム１３７、イリジウム１９２、アメリシウム２４１、金１９８、コバルト５７、銅６７、テクネチウム９９、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１及びインジウム１１１を含む群から選択することができる。当該抗体を斯かる放射性同位元素で標識することもできる。一実施形態では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と前記ＢＴＫ阻害剤とを用いた併用治療を、斯かる電離放射線なしに使用する。
【０１０５】
放射線療法は、切除不能又は手術不能な腫瘍及び／又は腫瘍転移を制御するための標準的な治療である。放射線療法を化学療法と組み合わせた場合に結果の改善が見られた。放射線療法は、高線量の放射線が標的領域に送達されると、腫瘍及び正常組織の両方において生殖細胞が死滅されるという原理に基づく。放射線量治療計画は、一般的には放射線吸収線量（Ｇｙ）、時間及び分割線量に関して定められ、腫瘍学者によって慎重に定められなければならない。患者が受ける放射線量は、様々な考慮すべき事柄によって決まるが、２つの最も重要な事柄は、体の他の重要な構造物、即ち臓器に対する腫瘍の位置と、腫瘍の広がりの程度である。放射線療法を受ける患者の典型的な治療過程は、約１．８〜２．０Ｇｙの単回１日分割線量として週に５日患者に投与される１０〜８０Ｇｙの総線量を用いる、１〜６週間の期間にわたる治療スケジュールである。本発明の好ましい実施形態では、ヒトの患者の腫瘍を本発明と放射線とを用いた併用治療で治療する場合に相乗作用がある。言い換えると本発明の組み合わせを含む薬剤による腫瘍増殖の阻害は、任意により、さらなる化学療法剤又は抗癌剤と共に放射線と組み合わせると向上する。補助放射線療法のパラメータは、例えば国際公開第９９／６００２３号に含まれている。
【０１０６】
前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、公知の方法に従って、ボーラスとして静脈内投与により、又は、ある期間に亘る持続注入により、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内又はクモ膜下腔内経路で患者に投与する。一実施形態では、当該抗体の投与は、静脈内又は皮下投与である。
【０１０７】
ＢＴＫ阻害剤は、公知の方法に従って、ボーラスとして静脈内投与により、又は、ある期間に亘る持続注入により、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内又はクモ膜下腔内経路で患者に投与する。一実施形態では、ＢＴＫ阻害剤の投与は、静脈内又は経口投与である。
【０１０８】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張剤、吸収遅延剤、ならびに医薬投与に適合可能な他の材料及び化合物を含む、医薬投与に適合可能なありとあらゆる材料を含むものとする。あらゆる従来の媒体又は薬剤が、当該活性化合物に不適合でない限り、本発明の組成物におけるその使用が意図されている。さらなる活性化合物も当該組成物に組み込むことができる。
【０１０９】
医薬組成物
本発明に係る抗ＣＤ２０抗体及び／又はＢＴＫ阻害剤を、薬学的に許容される無機又は有機担体で処理することにより、医薬組成物を得ることができる。ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩などを、例えば錠剤、被覆錠剤、糖衣丸及び硬ゼラチンカプセルなどのための担体として使用することができる。軟ゼラチンカプセルに適した担体は、例えば植物油、蝋、脂肪、半固体及び液体ポリオールなどである。活性物質の性質によっては担体を必要としないが、通常軟ゼラチンカプセルの場合は担体を必要とする。溶液やシロップの生成に適した担体は、例えば水、ポリオール、グリセリン、植物油などである。坐薬に適した担体は、例えば天然油、硬化油、蝋、脂肪、半液体又は液体ポリオールなどである。
【０１１０】
本医薬組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、隠蔽剤又は抗酸化剤をさらに含んでいてもよい。本医薬組成物は、さらに他の治療上有用な物質も含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明の一実施形態では、本組成物は、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体（好ましくはリツキシマブ）又は６０％以下のフコース量を有する前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブ）と、癌、特にＣＤ２０を発現する癌（好ましくはリンパ腫又はリンパ性白血病、より好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、有毛細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症又は中枢神経系原発リンパ腫）の治療に使用される前記ＢＴＫ阻害剤との両方を含む。
【０１１２】
前記医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明は、（ｉ）有効な第１の量のＩ型抗ＣＤ２０抗体（好ましくはリツキシマブ）、又は６０％以下のフコース量を有する低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体）と、（ii）有効な第２の量のＢＴＫ阻害剤とを含む、例えば癌に使用される医薬組成物をさらに提供する。斯かる組成物は、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を任意に含む。
【０１１４】
本発明に従って単独で使用される前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体の医薬組成物は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、貯蔵用に調製される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤には、用いられる用量及び濃度において、被投与者に対して毒性のない、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤、防腐剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキソメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル若しくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖及び、グルコース、マンノース又はデキストリンなどの他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１１５】
ＢＴＫ阻害剤の医薬組成物は、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体に関して、上に記載したものと同様であってもよい。
【０１１６】
低分子ＢＴＫ阻害剤の医薬組成物としては、経口、経鼻、局所（口腔内及び舌下など）、直腸内、膣内及び／又は非経口投与に適したものが挙げられる。本組成物は、単位剤形で提供でき、かつ薬学の技術分野でよく知られている任意の方法によって調製できると好都合である。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療されている宿主ならびに特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は一般に、治療効果を生じるＢＴＫ阻害剤の量である。一般に、この量は、１００％のうち、有効成分の約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。これらの組成物の調製方法は、ＢＴＫ阻害剤を担体及び必要に応じて１種以上の副成分と会合させる工程を含む。一般にＢＴＫ阻害剤の医薬組成物は、ＢＴＫ阻害剤を液体担体若しくは微粉固体担体又は両方と均一かつ密に会合させ、次いで必要であればその生成物を成形して調製する。経口投与に適した医薬組成物は、それぞれが所定量のＢＴＫ阻害剤を有効成分として含有するカプセル、カシェ剤、小袋、丸剤、錠剤、トローチ剤（着香された基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガントを用いる）、粉末、顆粒の形態で、あるいは水性若しくは非水性液体の溶液又は懸濁液、水中油型若しくは油中水型液体乳濁液、エリキシル剤若しくはシロップ、香錠（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性な基剤を用いる）、及び／又は洗口剤などであってもよい。またＢＴＫ阻害剤を巨丸剤、舐剤又はペースト剤として投与してもよい。
【０１１７】
本発明のさらなる一実施形態では、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体又は前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体及び前記ＢＴＫ阻害剤を、２種類の別個の医薬組成物に製剤化する。
【０１１８】
また有効成分を、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によってそれぞれ調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションとして封入してもよい。斯かる技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０１１９】
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（LUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びロイプロリド酢酸塩からなる注射可能な小球体）など）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１２０】
生体内投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１２１】
一実施形態は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、又はＡｓｎ２９７の総オリゴ糖（糖類）量に対するフコース量が６０％以下である低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体と、癌の治療のための６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩との組み合わせを含む医薬組成物である。
【０１２２】
本発明はさらに、斯かる治療を必要する患者に、（ｉ）有効な第１の量のＩ型抗ＣＤ２０抗体、又は６０％以下のフコース量を有する低フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体）及び（ii）有効な第２の量のＢＴＫ阻害剤を投与する工程を含む癌の治療方法を提供する。
【０１２３】
一実施形態では、フコース量は４０％〜６０％である。
前記癌は、ＣＤ２０を発現する癌であることが好ましい。
前記ＣＤ２０を発現する癌は、リンパ腫又はリンパ性白血病であることが好ましい。
【０１２４】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブであることが好ましい。
前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は。II型抗ＣＤ２０抗体であることが好ましい。
前記抗体は、本明細書に開示されているヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であることが好ましい。
前記抗体は、オビヌツズマブであることが好ましい。
【０１２５】
前記ＢＴＫ阻害剤は、（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、及び（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンからなる群から選択されることが好ましい。また前記ＢＴＫ阻害剤は、前記化合物（１）〜（８）の光学異性体及びそれらの混合物の群から選択されることが好ましい。
【０１２６】
前記ＢＴＫ阻害剤は、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であることが好ましい。
前記塩は塩酸塩であることが好ましい。
【０１２７】
好ましくは、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブである、あるいは前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であり、前記ＢＴＫ阻害剤は、（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、及び（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンからなる群から選択される。また好ましくは、前記ＢＴＫ阻害剤は、前記化合物（１）〜（８）の光学異性体及びそれらの混合物の群から選択される。好ましくは、前記ＢＴＫ阻害剤は６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であり、前記癌はＣＤ２０を発現する癌、好ましくはリンパ腫又はリンパ性白血病である。
【０１２８】
本明細書で使用される「患者」という用語は、好ましくはあらゆる目的のためにＩ型抗ＣＤ２０抗体又は低フコシル化抗ＣＤ２０抗体での治療を必要とするヒト（例えばＣＤ２０を発現する癌に罹患している患者）、より好ましくは癌又は前癌性疾患若しくは病変部を治療するために斯かる治療を必要としているヒトを指す。但し「患者」という用語は特に非ヒト動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの哺乳類及び非ヒト霊長類をも指すことができる。
【０１２９】
本発明は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体、又は６０％以下のフコース量を有する低フコシル化抗ＣＤ２０抗体と、癌の治療に使用されるＢＴＫ阻害剤とをさらに含む。
【０１３０】
前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブであることが好ましい。
前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であることが好ましい。
前記低フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、オビヌツズマブであることが好ましい。
【０１３１】
前記ＢＴＫ阻害剤は、（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、及び（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンからなる群から選択されることが好ましい。また前記ＢＴＫ阻害剤は、前記化合物（１）〜（８）の光学異性体及びそれらの混合物の群から選択されることが好ましい。
【０１３２】
前記ＢＴＫ阻害剤は、６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であることが好ましい。前記化合物は以下の構造によって示される。
【化３】
0006478989.tif 000006
【０１３３】
前記塩は塩酸塩であることが好ましい。
【０１３４】
好ましくは、前記Ｉ型抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブである、あるいは前記低フコシル化抗ＣＤ２０抗体はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体、より好ましくはオビヌツズマブであり、前記ＢＴＫ阻害剤は、（１）９−（１−アクリロイル−３−アゼチジニル）−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（２）６−アミノ−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（３）９−［（１−アクリロイル−４−ピペリジニル）メチル］−６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（４）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（５）６−アミノ−９−｛（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（６）６−アミノ−７−［４−（３−クロロフェノキシ）フェニル］−９−｛（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、（７）６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン、及び（８）６−アミノ−９−｛１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテノイル］−３−ピロリジニル｝−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンからなる群から選択される。また好ましくは、前記ＢＴＫ阻害剤は、前記化合物（１）〜（８）の光学異性体及びそれらの混合物の群から選択される。好ましくは、前記ＢＴＫ阻害剤は６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又はその塩であり、前記癌はＣＤ２０を発現する癌、好ましくはリンパ腫又はリンパ性白血病である。
【０１３５】
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供するものであり、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載のとおりである。当然ながら、本発明の趣旨から逸脱しない限りにおいて、記載されている手順に改変を加えることができる。
【０１３６】
配列表
配列番号１：マウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列
配列番号２：マウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列
配列番号３〜１９：ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体（Ｂ−ＨＨ２〜Ｂ−ＨＨ９、Ｂ−ＨＬ８及びＢ−ＨＬ１０〜Ｂ−ＨＬ１７）の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０：ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＫＶ１の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列
【実施例】
【０１３７】
実験手順
実施例１
ＴＭＤ８（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）細胞が皮下に異種移植されたＳＣＩＤマウスにおける、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせたＢＴＫ阻害剤の抗腫瘍効果の研究
【０１３８】
１．材料及び方法
１．１．試験物質
試験物質６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンの塩酸塩（本明細書では以後「化合物Ａ」という）を周囲温度で密封容器に貯蔵し、光から保護した。
【０１３９】
ＧＡ１０１（Ｇａｄｚｙｖａ又はＧａｚｙｖａｒｏという商品名で販売されているオビヌツズマブ）（５００ｍｇ）及びリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ及びＭａｂＴｈｅｒａという商品名で販売されているＲＴＸ）（２００ｍｇ）をRoche Glycart社から入手し、４℃で貯蔵した。
【０１４０】
１．２．物質ビヒクル
化合物Ａの重量を測り、乳鉢及び乳棒を用いて、０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース４００ｃＰ溶液（Wako Pure Chemical Industries社、本明細書では以後「０．５％ＭＣ」という）に懸濁させ、１ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得た。この懸濁液を調製後７日以内に使用した。この懸濁液が冷蔵下で７日間安定かつ均一であることを確認し、光から保護し、さらに２４時間周囲温度で室内照明に曝露した。
【０１４１】
ＧＡ１０１（２５ｍｇ／ｍＬ）及びリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）の両方の原液を４℃に維持した。マウスへの投与前にこの原液を０．９％ＮａＣｌを用いて、用量設定試験のために０．３、１及び３ｍｇ／ｍｌに希釈し、組み合わせ試験のために０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１４２】
１．３．薬物投与経路
使い捨て経口投与針（Fuchigami Kikai社）を用い１０ｍｌ／ｋｇの化合物Ａをマウスに１日２回強制経口投与（ＰＯ）した。１０ｍｌ／ｋｇのＧＡ１０１／リツキシマブをマウスの尾静脈に静脈内注射（ＩＶ）した。全ての治療のために、各マウスの個々の体重に最も近い尺度に従い投与体積を採用した。化合物Ａの１日２回群及びビヒクル群に、８時間以上の間隔を空け午前中及び午後に、化合物Ａ及び０．５％ＭＣをそれぞれ与えた。
【０１４３】
２．動物
雌のＣ．Ｂ−１７／ｌｃｒ−ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤＪｃｌマウス（Clea Japan社、実験開始時の年齢：６週齢、本明細書では以後「Ｓｃｉｄマウス」という）を使用した。これらのマウスを、１つのケージ当たり３〜５匹で金属製マウスケージに維持し、実験を行う前に約１週間の順化期間を設けた。本発明者らの施設にいる間これらの動物に、固形飼料であるＣＲＦ−１（Oriental Yeast社）及び水道水（自動補給器から）を自由に与えた。排出物は自動清掃システムで処理した。受け取り時及び順化の完了時に、動物の全身状態を観察した。全身状態に全く問題のない動物を実験に使用した。これらの動物を、温度：２４±２℃、湿気：５５±１５％、換気：１００％新鮮な外気による１５±５サイクル／時間、照明：蛍光灯からの明かりを用いた１２時間の明期／暗期サイクル（明期間：０８：００〜２０：００）の条件で制御された部屋に維持した。
【０１４４】
３．癌細胞株及び培養条件
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者の細胞からＴＭＤ８を確立した（Tohda S et al., Leuk Res., 2006, 30: 1385-90）。１０体積％の不活性化されたＦＢＳ及び１体積％のペニシリン−ストレプトマイシン液（Invitrogen社）を含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Invitrogen社、本明細書では以後「ＲＰＭＩ」という）を調製し、培地として使用した。この培地を５℃で貯蔵した（許容範囲：１℃〜９℃）。１皿当たり４×１０６〜２．０×１０７細胞の細胞懸濁液を、この培地を含む１５０ｍｍの皿に接種した。これらのプレートを５％ＣＯ２及び９５％空気中３７℃でインキュベートした。血球計算盤で細胞を計数するとそれらの生存度は、細胞注射の当日に少なくとも９０％であった。
【０１４５】
４．細胞接種
０日目にこのペレットを予め氷で冷却したＲＰＭＩに懸濁させ、２×１０８細胞／ｍＬの細胞懸濁液を得た。ＲＰＭＩ細胞懸濁液と等体積のＢＤマトリゲルＧＦＲ（BD Biosciences社）とを１つにまとめ、１×１０８細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。これを移植のための細胞懸濁液として使用した。次いで２５ゲージ針（Ｔｅｒｕｍ社）を用いて、０．１ｍＬの細胞懸濁液をペントバルビタール麻酔下においてマウスの右脇腹に皮下注射した。
【０１４６】
５．治療スケジュール
平均腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３及び３００〜４００ｍｍ３に到達した後、マウスをそれらの個々の腫瘍体積に従って８〜１０つの群に無作為化し、治療を開始した。各群の平均腫瘍体積は互いに異なっていなかった（分散分析）。
【０１４７】
６．異種移植片を有する動物の状態観察
ＴＭＤ８の移植後、腫瘍体積を測定するために全ての動物の全身状態を毎日記録した。
【０１４８】
７．腫瘍直径の測定
ＴＭＤ８の移植から２日又は４日ごとに最終の評価日まで、腫瘍の長軸及び短軸を電子測径器（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）で測定した。
８．評価項目及び評価方法
【０１４９】
主要評価項目は最終評価日の腫瘍体積であった。また、治療群のビヒクル群に対する腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ、％）を計算した。０日目からの腫瘍体積及び体重の経時変化を副次的評価項目として使用した。以下の式を用いて腫瘍体積を計算した。
腫瘍体積＝腫瘍の長軸×（腫瘍の短軸）２×０．５
個々の腫瘍体積を小数点第１位まで計算した。
マウスを最終的に屠殺し、腫瘍が最大３，０００ｍｍ３に到達した時点で剖検した。
【０１５０】
９．データの表現及び処理
９．１．データの表現
各群の腫瘍体積及び体重を平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表した。治療群のＴＧＩ（％）を小数点第１位まで表示した。
【０１５１】
９．２．統計分析
Microsoft Office Excel 2007 (SP-1)を使用して平均及び標準誤差を計算し、表及びグラフを作成した。SAS 9.2 TS2M3（SAS Institute Japan社）に基づくEXSUS System Ver. 7.7.1（ＣＡＣ社）を用いて、統計的検定を行った。スチューデントｔ検定を使用し、ＧＡ１０１単剤療法における腫瘍体積と、ＧＡ１０１と化合物Ａとを用いた併用療法における腫瘍体積とを比較した。全ての統計的検定は５％有意水準を用いた両側検定であった。
【０１５２】
１０．結果
実験群の組成
【表３】
0006478989.tif 000007
【０１５３】
図１は、ＴＭＤ８異種移植モデルにおけるＧＡ１０１と組み合わせた化合物Ａの抗腫瘍活性研究結果を示す。平均腫瘍体積が４００〜４５０ｍｍ３であったＤ１４に、マウスを腫瘍体積に従い、１０匹のマウスからなる７つの群に無作為化した。図１に示すように、ＧＡ１０１単剤療法は抗腫瘍効果を示した。但し、併用療法群は対応する単剤療法よりも活性が高いように見えた。１４、１７、２１及び２４日目に統計的有意性が観察された。それらの腫瘍体積が３，０００ｍｍ３よりも大きくなったＤ３５（２１日目）に、４匹のビヒクル処置したマウスを屠殺した。全てのマウスをＤ３８（２４日目）に屠殺した。
【０１５４】
本研究では、ＧＡ１０１と化合物Ａとの組み合わせは指示されている単剤療法よりも著しく良好であった（以下に示す統計分析）。
【０１５５】
驚くべきことに、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａと組み合わせた３ｍｇ／ｋｇのＧＡ１０１群において、Ｄ１４及び２１の個体の一部で腫瘍体積の退縮が観察されたが、単剤療法群においては完全な腫瘍の寛解は観察されなかった。これらの結果は当該併用療法が進行した腫瘍モデルに対して、より有効であり得ることを強く示している。
【０１５６】
実施例２
「物質ビヒクル」及び「治療スケジュール」以外は実施例１に記載されている方法に従い、実施例２の実験を行った。
【０１５７】
１．１．物質ビヒクル
化合物Ａの重量を測り、乳鉢及び乳棒を用いて、０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース４００ｃＰ溶液（Wako Pure Chemical Industries社、本明細書では以後「０．５％ＭＣ」という）に懸濁させ、１ｍｇ／ｍＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）の懸濁液を得た。この懸濁液を調製後７日以内に使用した。この懸濁液が冷蔵下で７日間安定かつ均一であることを確認し、光から保護し、さらに２４時間、周囲温度で室内照明に暴露した。
【０１５８】
ＧＡ１０１（２５ｍｇ／ｍＬ）及びリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）の両方の原液を４℃に維持した。マウスへの投与前に、この原液を本研究のために０．９％ＮａＣｌで０．３ｍｇ／ｍＬ（３ｍｇ／ｋｇ）に希釈した。
【０１５９】
１．２．治療スケジュール
平均腫瘍体積が４００〜４５０ｍｍ３に到達した時点で、マウスをそれらの個々の腫瘍体積に従って６つの群に無作為化し治療を開始した。各群の平均腫瘍体積は互いに異なっていなかった（分散分析）。
【０１６０】
２．結果
実験群の組成
【表４】
0006478989.tif 000008
【０１６１】
図２は、ＴＭＤ８異種移植モデルにおける、ＧＡ１０１／ＲＴＸと組み合わせた化合物Ａの抗腫瘍活性研究結果を示す。平均腫瘍体積が４００〜４５０ｍｍ３であったＤ１４（０日目）に、マウスを腫瘍体積に従い、１０匹のマウスからなる６つの群に無作為化した。図２に示すように、各単剤療法は抗腫瘍効果を示した。ＧＡ１０１及びＲＴＸについては４日目以降、化合物Ａについては１１日目以降に、統計的有意性が観察された。さらに、ＧＡ１０１又はＲＴＸと組み合わせた化合物Ａは、週１回の３ｍｇ／ｋｇの最適以下の用量において、ＴＭＤ８異種移植モデルで腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした。単剤療法と化合物Ａの併用療法との間には統計的有意性も観察された。これは、ＧＡ１０１又はＲＴＸと組み合わせた化合物Ａが、最適以下の用量で単剤療法として与えられた各抗体又は化合物Ａと比べて、顕著に良好であったことを示している。腫瘍体積が３，０００ｍｍ３よりも大きくなったＤ３５（２１日目）に、３匹のビヒクル処置したマウスを屠殺した。Ｄ３９（２５日目）に全てのマウスを屠殺した。
【０１６２】
各群の０、４、７、１１、１４、１８及び２１日目の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を以下に示す。ＧＡ１０１単剤療法はＲＴＸ単剤療法と比較して、腫瘍増殖阻害に関して優れた抗腫瘍活性を示した（ＴＧＩ、２１日目の５４．３％に対して７７．９％）。
【０１６３】
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）
表５
【０１６４】
群の割り当てから３日又は４日ごとに腫瘍直径を測定し、腫瘍体積を計算した。各測定日におけるビヒクル群及び治療群における腫瘍体積に基づく、指示されている治療群における腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ、％）を小数点第１位まで表示する。
【０１６５】
実施例３
以下の「物質ビヒクル」、「薬物投与経路」及び「治療スケジュール」以外は実施例１に記載されている方法に従い、実施例３の実験を行った。
【０１６６】
１．１．試験物質
比較物質であるイブルチニブ（本明細書では以後「化合物Ｂ」という）を周囲温度で密封容器に貯蔵し、光から保護した。
【０１６７】
１．２．薬物投与経路
マウスに、０．００３７％の化合物Ａ（ｗｔ／ｗｔ、ペレットに組み込まれている）又は０．０１２％の化合物Ｂ（ｗｔ／ｗｔ、ペレットに組み込まれている）のいずれか一方をそれぞれ添加した市販の飼料（ＣＲＦ１、Oriental Yeast社）を与えた。化合物Ａ又は化合物Ｂの用量は、６又は２０ｍｇ／体重（ｋｇ）の１日摂取量に対応する。この計算は、１６０〜１８０ｍｇ／体重（ｇ）の範囲の平均１日飼料摂取量に基づく。
１．３．治療スケジュール
【０１６８】
２つの群（ビヒクル及びＲＴＸ）のマウスに通常の飼料（ＣＲＦ１）を与えた。治療群のマウスに、無作為化後に化合物Ａ又は化合物Ｂを含む同じ飼料を与えた。３ｍｇ／ｋｇのリツキシマブを週に１回静脈内投与した。
【０１６９】
２．結果
実験群の組成
【表６】
0006478989.tif 000009
【０１７０】
図３は、ＴＭＤ８異種移植モデルにおけるＲＴＸと組み合わせた化合物Ａ又は化合物Ｂの抗腫瘍活性研究を示す。平均腫瘍体積が約４５０ｍｍ３であったＤ１４（０日目）に、マウスを腫瘍体積に従って、９匹のマウスからなる６つの群に無作為化した。図３に示すように、各単剤療法は抗腫瘍効果を示した。ＲＴＸ及び化合物Ａについては７日目以降、化合物Ｂについては１１日目以降に、統計的有意性が観察された。各間に統計的有意性は認められなかった。従って、化合物Ａ（０．００３７％）の抗腫瘍活性は、化合物Ｂ（０．０１２％）に匹敵している。興味深いことにＲＴＸと組み合わせた化合物Ａは、ＴＭＤ８異種移植モデルにおけるそれぞれの単剤療法においてより有効である。単剤療法とこの併用療法との間に統計的有意性も観察された。一方、ＲＴＸと組み合わせた化合物Ｂとそれぞれの単剤療法との間に統計的有意性は観察されず、これは、ＲＴＸと組み合わせた化合物Ａが相乗効果を実証していることを示している。
【０１７１】
各群の０、３、７、１１、１４、１８及び２１日目における腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を以下に示す。化合物Ａ併用療法は腫瘍増殖阻害に関して、ＲＴＸ単剤療法と比較して優れた抗腫瘍活性を示した（ＴＧＩ、２１日目の６４．２％に対して９１．１％、ｐ＜０．００１）。
表７
【０１７２】
群の割り当てから３日又は４日ごとに腫瘍の直径を測定し、腫瘍体積を計算した。各測定日におけるビヒクル群及び治療群の腫瘍体積に基づき、指示されている治療群における腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ、％）を小数点第１位まで表示する。
【０１７３】
結論
実施例１、実施例２及び実施例３の結果から、化合物ＡとＧＡ１０１又はＲＴＸとの組み合わせは、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬにとって有効な治療であり得る。化合物ＢがＲＴＸ依存性ＮＫ細胞媒介性細胞傷害に拮抗することが報告されている（Kohrt HE et al., Blood. Vol.123, 1957-1960, 2014を参照）。従ってこのＤＬＢＣＬ異種移植モデルにおいては、ＲＴＸ又はＧＡ１０１と組み合わせた化合物Ａが、ＲＴＸと組み合わせた化合物Ｂよりも有効であることが分かり、これは臨床環境においてこれらの組み合わせ（化合物Ａ＋ＲＴＸ又はＧＡ１０１）を使用する論理的根拠を示している。
【図１（ａ）】
0006478989.tif 000010
【図１（ｂ）】
0006478989.tif 000011
【図２（ａ）】
0006478989.tif 000012
【図２（ｂ）】
0006478989.tif 000013
【図３】
0006478989.tif 000014