(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異Ｇαｉ１であって、ヒトＧタンパク質αサブユニットの野生型Ｇαｉ１は、以下のアミノ酸配列；
【化１】
0006573972.tif 000005
を有し、少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンでない残基である場合には、該少なくとも１つのアミノ酸残基はアラニンで置換されているか、あるいは少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンである場合には、該少なくとも１つのアミノ酸残基はグリシンで置換されており、ここで、上記少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｒ３２Ａ、Ｋ５１Ａ、Ｋ５４Ａ、Ｉ５５Ａ、Ｉ５６Ａ、Ｈ５７Ａ、Ｒ１７６Ａ、Ｅ２４５Ａ、Ｔ３２７Ａ、Ｎ３３１Ａ、Ｖ３３２ＡおよびＤ３５０Ａの位置でのアミノ酸残基を含む第１の群に含まれるか、あるいはＧ４２Ａ、Ａ５９Ｇ、Ｔ１７７Ａ、Ｄ２００Ａ、Ａ２２６Ｇ、Ｅ２９７Ａ、Ａ３００ＧおよびＦ３３４Ａの位置でのアミノ酸残基を含む第２の群に含まれるか、あるいはＶ５０Ａ、Ａ５９Ｇ、Ｒ１７８ＡおよびＫ１８０Ａの位置でのアミノ酸残基を含む第３の群から含まれることを特徴とする、ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異Ｇαｉ１。
【請求項２】
ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異Ｇαｉ１を含む変異Ｇαタンパク質であって、ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異Ｇαｉ１の少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンでない残基である場合には、該少なくとも１つのアミノ酸残基はアラニンで置換されているか、あるいは少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンである場合には、該少なくとも１つのアミノ酸残基はグリシンで置換されており、かつ、該少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｒ３２Ｇ．ＨＮＳ１．３、Ｋ５１Ｇ．Ｈ１．６、Ｋ５４Ｇ．Ｈ１．９、Ｉ５５Ｇ．Ｈ１．１０、Ｉ５６Ｇ．Ｈ１．１１、Ｈ５７Ｇ．Ｈ１．１２、Ｒ１７６Ｈ．ＨＦ．６、Ｅ２４５Ｇ．Ｈ３．４、Ｔ３２７Ｇ．Ｓ６Ｈ５．４、Ｎ３３１Ｇ．Ｈ５．３、Ｖ３３２Ｇ．Ｈ５．４およびＤ３５０Ｇ．Ｈ５．２２を含む第１の群から選択されるか、または、
Ｇ４２Ｇ．Ｓ１Ｈ１．３、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｔ１７７Ｇ．ＨＦＳ２．１、Ｄ２００Ｇ．Ｓ３．７、Ａ２２６Ｇ．Ｓ４．７、Ｅ２９７Ｇ．Ｈ４．２、Ａ３００Ｇ．Ｈ４．５およびＦ３３４Ｇ．Ｈ５．６を含む第２の群から選択されるか、または、
Ｖ５０Ｇ．Ｈ１．５、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｒ１７８Ｇ．ＨＦＳ２．２およびＫ１８０Ｇ．ＨＦＳ２．４を含む第３の群から選択され、ここで、共通Ｇタンパク質ナンバリングシステムが使用されており、上記共通Ｇタンパク質ナンバリングシステムにおいては、上記残基の番号に隣接する上付き番号は：ｉ）ＧＴＰアーゼ（Ｇ）ドメインかまたはヘリックス（Ｈ）ドメインのいずれか；ｉｉ）各ドメイン内の二次構造要素；および（ｉｉｉ）９７３Ｇタンパク質配列の配列アライメントに従う上記構造要素内の位置；を示すものである、変異Ｇαタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの変異アミノ酸残基を有するヒトＧタンパク質αサブユニットＧαｉ１および他のＧαタンパク質における等価なアミノ酸の位置に関する。
【０００２】
ＧＰＣＲはヒトゲノムにおける最大の内在性膜タンパク質ファミリーであり、様々な外部刺激を認識し、そしてヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化することによりこれらの外部刺激を細胞内シグナルへと変換する。ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、Ｇαサブユニット、ＧβサブユニットおよびＧγサブユニットにより構成される。ＧＰＣＲにより促進されるＧタンパク質の活性化は、ＧαサブユニットにおけるＧＤＰからＧＴＰへの交換によって促進される。このヌクレオチド交換によって、この受容体からＧタンパク質が解放されるとともに、Ｇタンパク質がＧαサブユニットと必須のＧβγサブユニットとに解離し、これらのサブユニットがさらに、下流エフェクターの制御により細胞内シグナル伝達を媒介する。活性化経路における主要な一関与体としてのＧαサブユニットは、古典的なＲａｓタンパク質ファミリーに属してはいるものの、Ｒａｓ様ドメイン（ＧＴＰアーゼドメイン）以外にαヘリックスドメイン（ＨＤドメイン）が存在している点で、他のＧＴＰ結合タンパク質とは異なる。
【０００３】
近年、β２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）−Ｇｓ複合体（β２ＡＲ／Ｇｓ）の結晶構造の出現により、ＧＰＣＲを介したＧタンパク質活性化の解明において著しい進歩が達成されている。これによって、α５−ヘリックスのＣ末端が受容体のための重要な相互作用部位であることが実証され、またα５−ヘリックスの回転やＨＤドメインの変位も確認されている。しかし、複合体構造についての静的な考察や特定の残基に焦点を当てた従来の研究からは、ＧαのＣ末端を介したＧＰＣＲのシグナル伝播によるＧタンパク質のアロステリック活性化の発生やＧＤＰ放出がどのようにして行われるのかについての明瞭なイメージは、未だ提示されていない。
【０００４】
したがって本発明の課題は、少なくとも１つの変異アミノ酸残基を有するヒトＧタンパク質αサブユニットであるＧαｉ１を提供することであって、該変異アミノ酸残基は、野生型と比較してＧＰＣＲへのより高い結合特性を示すものとする。
【０００５】
あるいは、該変異アミノ酸残基は、ＧＰＣＲの非存在下でより高い安定性を示しうるものとする。
【０００６】
上記課題は、本発明によれば、ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異リガンドＧαｉ１であって、少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンでない残基である場合には、該少なくとも１つのアミノ酸残基はアラニンで置換されており、ここで、該少なくとも１つのアミノ酸残基は、位置Ｒ３２Ａ、Ｋ５４Ａ、Ｉ５５Ａ、Ｉ５６Ａ、Ｈ５７Ａ、Ｒ１７６Ａ、Ｅ２４５Ａ、Ｙ２９６Ａ、Ｔ３２７Ａ、Ｎ３３１Ａ、Ｖ３３２ＡおよびＤ３５０Ａを有するアミノ酸残基を含む第１の群に含まれるか、またはＧ４２Ａ、Ａ５９Ｇ、Ｔ１７７Ａ、Ｄ２００Ａ、Ａ２２６Ｇ、Ｅ２９７Ａ、Ａ３００ＧおよびＦ３３４Ａを含む第２の群に含まれるか、またはＶ５０Ａ、Ａ５９Ｇ、Ｒ１７８ＡおよびＫ１８０Ａを含む第３の群に含まれる、前記ヒトＧタンパク質αサブユニットの変異リガンドＧαｉ１により解決される。
【０００７】
第１の群の変異体（Ｒ３２Ｇ．ＨＮＳ１．３、Ｋ５１Ｇ．Ｈ１．６、Ｋ５４Ｇ．Ｈ１．９、Ｉ５５Ｇ．Ｈ１．１０、Ｉ５６Ｇ．Ｈ１．１１、Ｈ５７Ｇ．Ｈ１．１２、Ｒ１７６Ｈ．ＨＦ．６、Ｅ２４５Ｇ．Ｈ３．４、Ｔ３２７Ｇ．Ｓ６Ｈ５．４、Ｎ３３１Ｇ．Ｈ５．３、Ｖ３３２Ｇ．Ｈ５．４、Ｄ３５０Ｇ．Ｈ５．２２）は、Ｒｈｏ＊−Ｇ複合体を安定化するとともに、活性化プロセス、ドメイン間の界面の安定化もしくは不安定化、または受容体もしくはβγサブユニットとの相互作用に関与する（図９の表１も参照のこと）のに対して、第２の群の８種の変異体（Ｇ４２Ｇ．Ｓ１Ｈ１．３、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｔ１７７Ｇ．ＨＦＳ２．１、Ｄ２００Ｇ．Ｓ３．７、Ａ２２６Ｇ．Ｓ４．７、Ｅ２９７Ｇ．Ｈ４．２、Ａ３００Ｇ．Ｈ４．５、Ｆ３３４Ｇ．Ｈ５．６）は、ＧＤＰ結合状態の安定化に寄与し（図１０の表２も参照のこと）、そして第３の群に含まれる４種の変異体（Ｖ５０Ｇ．Ｈ１．５、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｒ１７８Ｇ．ＨＦＳ２．２、Ｋ１８０Ｇ．ＨＦＳ２．４）は、ＧＴＰ結合状態を安定化する（図１１の表３も参照のこと）。
【０００８】
こうした知見を他のＧαタンパク質と比較し、そして他のＧαタンパク質についても推測できるようにするため、本願全体を通して、Ｆｌｏｃｋら［１］が提唱する共通Ｇタンパク質ナンバリングシステム（ＣＧＮ）を用いる。このシステムにおいては、残基番号に隣接する上付き文字は、以下のものを示す：ｉ）ＧＴＰアーゼ（Ｇ）ドメインかまたはヘリックス（Ｈ）ドメインのいずれか、ｉｉ）各ドメイン内の二次構造要素（例えばヘリックスＮについてはＨＮ、あるいはβシートβ１についてはＳ１）、およびｉｉｉ）９７３のＧタンパク質配列の配列アライメントによる該構造要素内でのその位置（例えば１）。例えば、Ｌ３５３Ｇ．Ｈ５．２５は、Ｇαｉ１におけるＬ３５３、ＧＴＰアーゼドメイン、ヘリックス５、およびユニバーサルアライメントにおける該ヘリックス５の位置２５に相当する。
【０００９】
受容体への結合を安定化する上述の変異体を用いることで、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の構造的および生物物理学的な研究を促進することができ、一方で、Ｇαのヌクレオチド結合状態を安定化する上述の変異体を用いることで、Ｇαと他の相互作用タンパク質との複合体の研究を行うことができる。これらの変異体を用いることで、改変された特性を示す（例えば、応答がより遅いかもしくはより速い、またはシグナル変化がより大きい）Ｇタンパク質活性化のためのバイオセンサを開発することも可能である。
【００１０】
本発明の好ましい例につき、以下に添付の図面を参照してより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体におけるＧαｉ１アラニン変異体の作用をモニタリングするためのＨＴＰアッセイを概略的に示す。
【図２】図２は、ネイティブゲル電気泳動によるＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の可視化を示す。
【図３】図３は、ネイティブゲル電気泳動によるＲ＊−Ｇｉ複合体の熱解離（Ｔｄ）のモニタリングを示す。
【図４】図４は、Ｒ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の統計分析と、ＷＴ  Ｇαｉ１−ＧＤＰまたはＷＴ  Ｇαｉ１−ＧＴＰγＳのＴｍの統計分析と、を示す。
【図５】図５は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成において損なわれるＧαｉ１アラニン変異体の特性決定を示す。
【図６】図６は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体を安定化するＧαｉ１アラニン変異体の特性決定を示す。
【図７】図７は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）によるヘテロ三量体（Ｇｉ）形成の特性決定を示す。
【図８】図８は、図９〜図１１に示す表１〜表３の凡例を示す。
【図９】表１は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体における結合能がＷＴよりも高い、１２種のＧαｉ１変異体を示す。
【図１０】表２は、ＧＤＰ結合状態の安定化能力がＷＴよりも高い、８種のＧαｉ１変異体を示す。
【図１１】表３は、ＧＴＰ結合状態の安定化能力がＷＴよりも高い、４種のＧαｉ１変異体を示す。
【００１２】
本発明により、Ｇαｉ１配列の９９％を網羅するアラニンスキャニング試験を実施して、ロドプシン−Ｇｉ複合体形成と、複合体の安定性と、Ｇαｉ１のＧＤＰおよびＧＴＰγＳ（非加水分解性のＧＴＰ類似体）結合状態の安定性と、に対する各アミノ酸の作用の特性決定を行った。各残基が寄与する作用の比較によって、不活性立体構造と活性立体構造とにおけるＧαサブユニットの機能マップが得られ、これによってＧタンパク質活性化プロセスの解明が大いに進む。このアラニンスキャニング試験を、Ｒ＊−Ｇｉ複合体におけるＧαｉ１アラニン変異体の作用をモニタリングするためのＨＴＰアッセイとして体系的に行った。ＨＴＰ精製により組換えアラニン変異体を調製し、内因性のロドプシンおよびβγサブユニットをウシ網膜から調製した。Ｒ＊−Ｇｉ複合体を形成するために、Ｇαｉ１サブユニットとβγサブユニットとを再構成してＧｉヘテロ三量体とし、次いでロドプシンと混合して光活性化を行った。形成されたＲ＊−Ｇｉ複合体を、ネイティブゲル電気泳動により可視化し、複合体のゲルのバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。各回とも、野生型Ｇαｉ１を常に対照標準として含めた。
【００１３】
Ｇαｉ１の単一の各アラニン変異体が、ロドプシンを介した活性化に対してどのように応答するかを調べるために、ネイティブゲル電気泳動（ＮＰＡＧＥ）をベースとする新規のＨＴＰスクリーニングアッセイを開発した。これによって、Ｇαｉ１の各アラニン変異体を用いて構成される活性化ロドプシン結合複合体（Ｒ＊−Ｇｉ）の相対量（方法を参照のこと）および相対的安定性（方法を参照のこと）の測定および比較が可能であった。最も興味深い結果を、図９〜図１１に提示する表１〜表３に示す。
【００１４】
図８に、図９〜図１１をより良く理解するための凡例を示す。これらの表は例えば、残基番号であって該残基番号の位置のアミノ酸がアラニンでない残基である場合にはアラニンで置換されている残基番号を示し、また、残基番号であって該残基番号の位置のアミノ酸がアラニン残基である場合にはグリシンで置換されている残基番号を示す。これらの表はさらに、Ｇαｉ１のＧＤＰおよびＧＴＰγＳ結合状態の熱安定性に関する実験データと、ｗｔ  Ｇαｉ１に対する複合体形成効率に関する実験データと、高められた温度でのインキュベーション後の該複合体の（ここでもロドプシンとｗｔ  Ｇαｉ１との複合体に対する相対的な）安定性に関する実験データと、を含む。実験手順の詳細な説明および複合体の安定性の定義については、材料および方法の部に示す。
【００１５】
一方で、ヌクレオチド結合状態と比較するため、Ｇαｉ１の単一の各アラニン変異体の熱安定性を、ＧＤＰまたはＧＴＰγＳを付加して測定した（図２も参照のこと）。
【００１６】
図２は、ネイティブゲル電気泳動によるＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の可視化を示す。示されているＲ＊−Ｇｉ複合体は、方法および図１に示す通りに野生型Ｇαｉ１を用いて形成したものである。この複合体をさらに確認するために、このＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）を、２０℃で１００μΜ  ＧＴＰγＳとともに１時間インキュベートした。これらのＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体（＋／−  ＧＴＰγＳ）をネイティブゲル電気泳動により可視化し、さらにＷＴ  Ｇαｉ１、βγサブユニット、Ｇαｉ１βγヘテロ三量体および参照マーカーとしての活性化ロドプシンについても同様に行った。これは、「空のポケット」を有するＲ＊−Ｇｉ複合体が、ＧＴＰγＳの付加に際して解離することを明らかに示している。
【００１７】
図３は、ネイティブゲル電気泳動によるＲ＊−Ｇｉ複合体の熱解離（Ｔｄ）のモニタリングを示す。Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成を、方法および図１に示す通りに行った。野生型Ｇαｉ１（ａ）、Ｒ３２Ａ（ｂ）、Ｉ５５Ａ（ｃ）またはＮ３３１Ａ（ｄ）を用いて形成されたＲ＊−Ｇｉ複合体を、示された温度に加熱し、加熱されたこれらのサンプルを、ネイティブゲル電気泳動によって可視化した。ｅ）各温度での複合体の相対量を１６．４℃での複合体の量で正規化（０〜１００％）し、これにシグモイドボルツマン方程式を当てはめて、Ｔｄ５０値を得た。決定されたＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）のＴｄ５０は、３６．０±０．１２℃である。Ｒ＊−Ｇｉ（Ｒ３２Ａ）、Ｒ＊−Ｇｉ（Ｉ５５Ａ）およびＲ＊−Ｇｉ（Ｎ３３１Ａ）のＴｄ５０は、それぞれ３６．７±０．０８℃、３７．４±０．０５℃および３７．８±０．０８℃である。データ点は、３回の個々の実験からの平均値±ｓ．ｄ．を表す。
【００１８】
図４は、Ｒ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の統計分析と、ＷＴ  Ｇαｉ１−ＧＤＰまたはＷＴ  Ｇαｉ１−ＧＴＰγＳのＴｍの統計分析と、を示す。野生型Ｇαｉ１を用いたＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の形成と、Ｔｍの測定とを、方法および図１に示す通りに行った。ａ）４℃でのＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）の相対量を、３３回の個々の測定から得た。平均値は、１００±３．６１％である。これらの個々の値を３．６１％の幅の間隔でグループ化し、それらの頻度を示す。頻度分布は、０．９８３９のＲ２を有するガウスモデル（破線）に当てはまる。ｂ）３６．３℃でのＲ＊−Ｇｉ（ＷＴ）の相対的安定性を、３８回の個々の測定から決定し、その際、平均値は４３．９±３．２０％であった。ガウスモデルに当てはまる頻度分布は、０．９６３１のＲ２を有する。１ｍＭ  ＧＤＰおよび０．１ｍＭ  ＧＴＰγＳを付加したＷＴ  Ｇαｉ１のＴｍの頻度分布を、それぞれ２５回および２４回の個々の測定から（ｃ）および（ｄ）に示す。ＷＴ  Ｇαｉ１−ＧＤＰまたはＧＴＰγＳのＴｍの平均値は、６３．６８±０．３９℃および７０．５１±０．２６℃である。
【００１９】
図５は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成において損なわれるＧαｉ１アラニン変異体の特性決定を示す。ａ）Ｇαｉ１のＹ３２０Ａ、Ｌ３４８Ａ、Ｇ３５２ＡおよびＬ３５３Ａを有するＲ＊−Ｇｉ複合体の形成を、方法および図１に示す通りに行った。形成された複合体を、３６．３℃で加熱した。４℃でのＲ＊−Ｇｉ複合体と、３６．３℃での加熱されたＲ＊−Ｇｉ複合体とを、ネイティブゲル電気泳動により可視化した。ｂ）複合体の量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた複合体のゲルのバンドの定量化により決定した。４℃での複合体の相対量（％）を、Ｒ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体の量で正規化する。データ点は、３回の個々の実験からの平均値±ｓ．ｄ．を表す。このアッセイは、これら４種のアラニン変異体が、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成において激しく損なわれることを明らかに示している。
【００２０】
図６は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体を安定化するＧαｉ１アラニン変異体の特性決定を示す。ａ）Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成を、方法および図１に示す通りに行った。形成された複合体を、３６．３℃で加熱した。次いで、４℃でのＲ＊−Ｇｉ複合体と、３６．３℃での加熱されたＲ＊−Ｇｉ複合体とを、ネイティブゲル電気泳動により可視化した。ｂ）複合体の量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた複合体のゲルのバンドの定量化により決定した。４℃での複合体の相対量（％）と、３６．３℃での複合体の相対的安定性（％）とを、方法に示す通りに行った。この結果は、これらのＧαｉ１のアラニン変異体が、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の熱安定性を明らかに高めることを示している。ｃ）ヌクレオチド（１ｍＭ  ＧＤＰまたは０．１ｍＭ  ＧＴＰγＳ）を付加したＧαｉ１アラニン変異体のＴｍを、ＤＳＦアッセイにより決定した。データ点は、３回の個々の実験からの平均値±ｓ．ｄ．を表す。
【００２１】
図７は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）によるヘテロ三量体（Ｇｉ）形成の特性決定を示す。Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成において効率的ではない最後の４８種のアラニン変異体とβγサブユニットとを再構成してＧｉを形成させ、これを方法に示す通りにＦＳＥＣによって特性決定する。ＷＴ  Ｇαｉ１の保持時間と、βγサブユニットの保持時間と、再構成されたＧｉの保持時間とは、それぞれ１１．１５分、１１．４５分および１０．２６分である。ａ）およびｂ）は、ヘテロ三量体の再構成において効率的であるアラニン変異体の保持時間を示す。ヘテロ三量体の形成における非効率的なアラニン変異体を、ｃ）およびｄ）に示す。オリゴマー再構成を成す３種のアラニン変異体を、ｅ）およびｆ）に示す。
【００２２】
第１の群の変異体（Ｒ３２Ｇ．ＨＮＳ１．３、Ｋ５１Ｇ．Ｈ１．６、Ｋ５４Ｇ．Ｈ１．９、Ｉ５５Ｇ．Ｈ１．１０、Ｉ５６Ｇ．Ｈ１．１１、Ｈ５７Ｇ．Ｈ１．１２、Ｒ１７６Ｈ．ＨＦ．６、Ｅ２４５Ｇ．Ｈ３．４、Ｔ３２７Ｇ．Ｓ６Ｈ５．４、Ｎ３３１Ｇ．Ｈ５．３、Ｖ３３２Ｇ．Ｈ５．４、Ｄ３５０Ｇ．Ｈ５．２２）は、Ｒｈｏ＊−Ｇ複合体を安定化するとともに、活性化プロセス、ドメイン間の界面の安定化もしくは不安定化、または受容体もしくはβγサブユニットとの相互作用に関与する（図９の表１も参照のこと）のに対して、第２の群における８種の変異体（Ｇ４２Ｇ．Ｓ１Ｈ１．３、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｔ１７７Ｇ．ＨＦＳ２．１、Ｄ２００Ｇ．Ｓ３．７、Ａ２２６Ｇ．Ｓ４．７、Ｅ２９７Ｇ．Ｈ４．２、Ａ３００Ｇ．Ｈ４．５、Ｆ３３４Ｇ．Ｈ５．６）は、ＧＤＰ結合状態の安定化に寄与し（図１０の表２も参照のこと）、そして第３の群に含まれる４種の変異体（Ｖ５０Ｇ．Ｈ１．５、Ａ５９Ｇ．Ｈ１ＨＡ．２、Ｒ１７８Ｇ．ＨＦＳ２．２、Ｋ１８０Ｇ．ＨＦＳ２．４）は、ＧＴＰ結合状態を安定化する（図１１の表３も参照のこと）。
【００２３】
こうした知見を他のＧαタンパク質と比較し、そして他のＧαタンパク質についても推測できるようにするため、本願全体を通して、Ｆｌｏｃｋら［１］が提唱する共通Ｇタンパク質ナンバリングシステム（ＣＧＮ）を用いる。このシステムにおいては、残基番号に隣接する上付き文字は、以下のものを示す：ｉ）ＧＴＰアーゼ（Ｇ）ドメインかまたはヘリックス（Ｈ）ドメインのいずれか、ｉｉ）各ドメイン内の二次構造要素（例えばヘリックスＮについてはＨＮ、あるいはβシートβ１についてはＳ１）、およびｉｉｉ）９７３のＧタンパク質配列の配列アライメントによる該構造要素内でのその位置（例えば１）。例えば、Ｌ３５３Ｇ．Ｈ５．２５は、Ｇαｉ１におけるＬ３５３、ＧＴＰアーゼドメイン、ヘリックス５、およびユニバーサルアライメントにおける該ヘリックス５の位置２５に相当する。
【００２４】
多くの研究によって、ＧαのＣ末端における最後の１１の残基が、同族受容体の認識および係留（anchoring）において重要な役割を果たすことが実証されている。予想通り、本アッセイにおいても、Ｇαｉ１の最後の１１のアミノ酸（３４４〜３５４ａａ）における多くのアラニン変異体が、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成に対して著しく影響を及ぼすことが判明し、特に、受容体との結合において激しく損なわれるＧαｉ１の最Ｃ末端における、２つの不変に保存された残基（Ｌ３４８およびＬ３５３）のアラニン置換体（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）と、Ｇ３５２とのアラニン置換体（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）とが、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成に対して著しく影響を及ぼすことが判明した。熱安定性の結果はさらに、これらのアラニン変異体が、ヌクレオチド結合状態の安定性には影響を及ぼさないものの、受容体結合状態を劇的に不安定化する（Ｄ３５０を除く）ことを明らかに示しており、このことは、活性化ロドプシンにより誘発されるＧαｉ１のＣ末端における局所的な立体構造変化に示されている。このことは、ＧαのＣ末端ペプチドと結合するロドプシンの構造と、β２ＡＲ／Ｇｓの結晶構造とに十分に合致しており、その際、ＧαのＣ末端が再構成されて無秩序なループのα−ヘリックスとなり、これがＧＰＣＲの膜貫通束の細胞質コアを透過する。
【００２５】
受容体を介した応答においては、ＧαのＣ末端以外は、無秩序・秩序立体構造変化を生じ、ＧＴＰアーゼドメインにおける他の実質的な立体構造の改変が、α５−ヘリックスにおいて明らかな剛体回転および並進を伴って示される。これらの結果は、α５−ヘリックスの動きには、ヌクレオチドが結合したＧαｉ１のＧＴＰアーゼドメインにおけるある細胞内安定化ネットワークの遮断が必要であること、そして、α５において再配置される残基には、再構築される細胞内ネットワークの迅速な形成が必要であり、それによりＧＴＰアーゼドメインとＲ＊−Ｇｉ複合体立体構造との双方がさらに安定化されることを示している。Ｇαｉ１のＧＴＰアーゼドメインにおいて観察される細胞内ネットワークは、βシートサンドイッチ（β４、β５およびβ６）を中心とする２つのサブネットワークであると考えることができる。
【００２６】
立体構造における動的な改変を特徴とするＧＴＰアーゼドメインにおけるサブネットワークは、６本鎖βシートとα１とα５とによって囲まれている。Ｇαｉ１のヌクレオチド結合状態において、このサブネットワークは主に、β１−３ストランドからの高度に保存された多くの疎水性残基と、α１−ヘリックスと、α５−ヘリックスの内側残基と、によって形成される。これらの疎水性残基のアラニン置換体によって、ＧＤＰが結合した立体構造（４〜１８℃）が著しく不安定化されるとともに、ＧＴＰγＳ結合状態（２〜５℃）がゆるやかに不安定化される。特に、α５−ヘリックスにおける（Ｇαサブファミリーにおいて不変に保存された）Ｆ３３６のアラニン置換体（ＧＰＣＲのＩＣ２ループと接触するように再配置されたもの）は、Ｇαｉ１がヌクレオチドと結合するのを激しく損ない（表１）、このことは、Ｆ３３６の再配置が、ヌクレオチドが結合したＧα立体構造の劇的な不安定化の要因であると考えられることを示している。
【００２７】
一方で活性化受容体との相互作用に際して、この安定性の結果は、α１との接触を劇的に弱めることによって、Ｇαｉ１のヌクレオチド結合状態においてサブネットワークが再構築されることを示しており、Ｇαｉ１−ＧＤＰにおけるα１の係留に関与する残基のアラニン変異体（α１におけるＩ４９、Ｍ５３およびＩ５６、β１のＬ３８、α５のＴ３２９およびＶ３３２）は、Ｇαｉ１−ＧＤＰの安定性を激しく損なうものの、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の相対的安定性には影響を及ぼさない。特に、α５における（不変に保存された）Ｎ３３１Ａおよび隣接する（高度に保存された）Ｖ３３２Ａによって、相対的な複合体の安定性がそれぞれ１８％および２８％だけ明らかに向上しており（表１、図６）、このことは、α５における再配置されたＮ３３１およびＶ３３２の位置が、見かけ上の柔軟性を特徴とすることを示している。
【００２８】
β２ＡＲ／Ｇｓにおいて観察されたα５−ヘリックスの基部におけるヘリシティの緩みの要因が、α１との接触を失うことか、またはＮ３３１およびＶ３３２の再配置である、との結論づけを完全に行うことはできないが、α５−ヘリックスのＮ末端における秩序・無秩序転移によって、ＴＣＡＴループの柔軟性が高まるとともに、隣接するＴＣＡＴ部位とＧＤＰとの間の遮断が促進されるものと考えられる。
【００２９】
一方で、受容体を介した応答は、β４およびβ５との相互作用の強化によって、Ｇαｉ１のヌクレオチド結合状態においてサブネットワークを再構成する。新たに導入された残基のアラニン変異体（β４のＩ２６５、β５のＹ３２０およびＨ３２２、α５のＦ３３４、Ｖ３３５、Ｖ３３９およびＶ３４２）は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体を劇的に不安定化する（１９〜４５％）ものの、一方でヌクレオチド結合状態の安定性には影響を及ぼさないことを特徴とする（表１）。
【００３０】
興味深いことに、このサブネットワークにおいて、ヌクレオチドが結合した立体構造の安定化にとって重要な多くの残基のアラニン変異体は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成には影響を及ぼさない（表１）。しかし、Ｖ３３５ＡおよびＶ３３９Ａを除いて、新たに関与するすべての残基のアラニン置換体（β４のＩ２６５、β５のＹ３２０およびＨ３２２、α５のＦ３３４およびＶ３４２）が形成するＲ＊−Ｇｉ複合体の量は、明らかにより少ない（ＷＴのレベルの１８〜７８％）（表１）。こうしたＲ＊−Ｇｉ複合体の不十分な形成（ＷＴのレベルの２０％未満）が非効率的なヘテロ三量体の再構築によって引き起こされる可能性を排除するために、βγサブユニットを用いたヘテロ三量体再構成の効率を調べた（方法を参照のこと）。その結果、新たに含まれた残基は、ヘテロ三量体の形成に際してＷＴと同様の能力を特徴とすることが判明した（図７を参照のこと）。このことは、これらの残基が、受容体応答の際のＧタンパク質のアロステリック活性化において重要な役割を果たすことを示している。
【００３１】
特に、β５における（Ｇαサブファミリーにおいて不変に保存された）Ｙ３２０のアラニン置換体は、Ｒ＊−Ｇｉ複合体の形成を激しく損なう（図５を参照のこと）。全体的なアラニンスキャニングにおいて、複合体形成において障害を生じさせるＧαｉ１の最Ｃ末端における３種のアラニン変異体（Ｌ３４８Ａ、Ｇ３５２ＡおよびＬ３５３Ａ）を除いては、Ｙ３２０Ａが、受容体と直接的に相互作用しない唯一のアラニン変異体であるが、これは、活性化ロドプシンとの結合においては欠陥を示す（図５）。Ｙ３２０は、受容体を介したＧタンパク質活性化における重要なシグナル受信物質およびシグナル伝達物質の一つであると予測することができる。このことは間接的に、Ｙ３２０ＡがさらにＧαｉ１のＣ末端において十分に保存されたＬ３４８、Ｇ３５２およびＬ３５３を利用して受容体と結合し、そして「予め結合された」Ｒ＊−Ｇｉ（ＧＤＰ）を形成することができることを意味している。しかしこの「予め結合された」立体構造は、即座に分解されることができる。なぜならば、Ｙ３２０Ａは、受容体から伝達されたＧＤＰ放出のシグナルをブロックするためである。これまでの研究によってさらに、イン・ビボ（in vivo）およびイン・ビトロ（in vitro）での「予め結合された」受容体複合体の存在が示されている。
【００３２】
さらに、ＧＴＰアーゼドメインにおいて、βシートサンドイッチを挟んだ他の観察されるサブネットワークα３、α４およびαＧは、高度に保存された多くの疎水性残基を利用して疎水性相互作用を形成し、これによって、ヌクレオチド結合および受容体結合のいずれの立体構造もが安定化される。これらの残基の中で、多くのアラニン変異体は、３℃から１３℃まで（ΔＴｍ）のＧＤＰ結合状態における明らかな不安定化と、３０％から４０％まで（Δ相対的な複合体の安定性）の受容体結合状態における明らかな不安定化と、ＧＴＰγＳ結合状態（１〜５℃）におけるゆるやかな不安定化と、を特徴とする（表１）。さらに、このサブネットワークにおける多くのアラニン変異体を用いて形成されたＲ＊−Ｇｉ複合体の相対量は、ＷＴのレベルの１０〜５６％未満である（表１）。ヘテロ三量体の再構成に関するこれらの結果は、Ｆ２５０Ａ（α３）、Ｌ２６６Ａ、Ｌ２６８Ａ（β５）およびＩ３１９Ａ（β６）が、βγサブユニットとの結合においてＷＴに匹敵する能力を示すことを実証している。これらの残基は受容体結合界面から遠くに位置しているため、このことは、これらの残基がＧタンパク質のアロステリック活性化にも関与しうること、そして、アラニン変異が受容体から伝達されたＧＤＰ放出のシグナルに影響を及ぼしうることを示唆している。
【００３３】
ＧＰＣＲ／Ｇ複合体の形成に際して、ＨＤドメインは、大部分が再びＧＴＰアーゼドメインと置き換えられるとともに、複数の立体構造と動的平衡状態を保つことが観察された。これらの安定性の結果は、Ｇαｉ１のＨＤドメインにおける多くの疎水性残基が疎水性コアパッキングを形成し、それによって、ヌクレオチド結合および受容体結合のいずれの立体構造もが安定化されることを示している。配列アラインメントの結果は、これらの疎水性残基が、Ｇαサブタイプにおいて高度に保存されていることを示している。このことは、観察された固有の疎水性コアパッキングが、受容体結合状態におけるＨＤドメインの動的な立体構造の安定化において重要な役割を果たすものと推測できることを示している。特に、αＥにおけるアラニン変異体は、ヌクレオチド結合状態の安定性に影響を与えることなく、Ｒ＊−Ｇｉ立体構造を明らかに不安定化する。このことは、置き換えられたＨＤドメインの完全性を維持しかつＲ＊−Ｇｉ複合体の「空のポケット」の立体構造を安定化するためには、ＨＤドメインにおけるわずかな内部配置が必要であることを示唆している。
【００３４】
さらに、このＲ＊との結合アッセイにおいては、αＡのＩ７８ＡおよびαＦのＬ１７５ＡがＲ＊−Ｇｉ複合体形成において軽度の減少（２０％）を示すことを除いては、Ｇαｉ１のＨＤにおけるいずれのアラニン変異体（６３ａａ〜１７６ａａ）も、高度に同等のＲ＊−Ｇｉ複合体を形成する（ＷＴのレベルの９０〜１００％）。このことは、受容体制御応答におけるヘリックスドメインが、Ｇαサブユニットが受容体と結合する全体的な能力に影響を及ぼすことなく、独立した完全性で以て存在する受動的な一関与体として機能しうることを意味する。
【００３５】
受容体によるＧタンパク質活性化の他の顕著な特徴は、ＧＤＰの放出と、これに伴うＧＴＰアーゼドメインとＨＤドメインとの分離である。（αＡ、αＦおよびα１のＮ末端によって構成される）Ｇαｉ１におけるドメイン間の界面の安定性の結果から、関与する残基のアラニン変異体は、ＧＤＰ結合状態（５〜１４℃）を劇的に不安定化するものの、一方でＲ＊−Ｇｉ複合体の相対的安定性には影響を及ぼさないことが判明した。
【００３６】
配列アラインメントは、Ｇαｉ１のドメイン間の界面に位置する残基が、Ｇαサブファミリーにおいて高度に保存されていることを示している。このことは、わずかな立体構造の摂動によって、Ｇα−ＧＤＰのドメイン間の相互作用における不安定化が生じることを意味しており、これによって、Ｇαサブユニットにおけるドメインの分離とＧＤＰの放出とが促進されるものと考えられる。興味深いことに、α１のＫ５１Ａ、Ｋ５４ＡおよびＩ５５Ａは、相対的なＲ＊−Ｇｉ複合体の安定性を、ＷＴのレベルのそれぞれ１７％、２２％および２５％だけ明らかに増加させる。同様のシナリオが、αＦのＮ末端におけるＬ１７５Ａおよび隣接するＲ１７６Ａにおいても観察され、相対的な複合体の安定性の９％および１７％の増分が観察される。
【００３７】
Ｒ＊−Ｇｉ複合体における安定性の向上は、これらの残基により構成される領域の柔軟性の低下に起因することができ、これは、β２ＡＲ／Ｇｓの結晶構造と一致し、その際、ＧｓαにおけるαＡの先頭およびαＦのＮ末端に結合したループは、構造が無秩序でかつ不明である。このことは、αＦのＮ末端およびαＡの先頭において示される柔軟性は、１つの固有の特性であることができ、かつ、これらがループ領域と共にヒンジとして機能することによって、受容体を介した応答におけるＨＤドメインの様々な動的運動が可能となることを示している。
【００３８】
またこれらの結果は、Ｇαｉ１におけるα１−ヘリックスの明らかな安定性の特性を強調している。α１−ヘリックスにおける残基（４６〜５７ａａ）のアラニン置換体は、ＧＤＰが結合した立体構造を激しく不安定化する（Ｓ４７Ａ、Ｖ５０ＡおよびＨ５７Ａを除く）ものの、受容体が結合した立体構造の相対的な安定性には影響を及ぼさず（Ｑ５２Ａを除く）（図６）、逆に、α１の先頭に位置するアラニン変異体は、相対的な複合体の安定性を著しく向上させる。このことは、ＤＸＭＳ分析によるβ２ＡＲを介した応答におけるＧｓαのα１−ヘリックスにおいて観察された、増強された水素交換と一致する。さらに、配列アラインメントは、α１−ヘリックスが、ＫＳＴ（Ｉ／Ｆ）（Ｖ／Ｌ／Ｉ）ＫＱＭ（Ｋ／Ｒ）Ｉ（Ｉ／Ｌ）ＨとしてＧαサブファミリーにおいて完全に保存されていることを示しており、それらのうち、保存されたＫＳＴ配列は、顕著なＰループの一部である。
【００３９】
要約すれば、α１−ヘリックスは、ヌクレオチドが結合した立体構造における中央ハブとして機能し、この中央ハブは、結合されたα５−ヘリックスと一緒でのＧＴＰアーゼドメインの安定化と、ドメイン間の相互作用の結びつけと、結合されたヌクレオチドの封じ込めとにおいて、支配的な役割を果たすものと結論付けることができる。特にα１−ヘリックスは、ＧＤＰが結合した立体構造において準安定状態で存在する。一旦受容体と結合すると、α５−ヘリックスの歪みによってα１−ヘリックスとの相互作用が劇的に遮断され、これによって、α１−ヘリックスが準安定状態から超不安定状態へと遷移する。結果的に、これによってドメイン分離とＧＤＰ放出とが生じる。
【００４０】
要約すると、単一残基分解能でのヌクレオチド結合状態および受容体結合状態の双方におけるＧαｉ１サブユニットの完全な分子マッピングを初めて提供すべく、アラニンスキャニング法が用いられる（図１および表１）。これらの結果から、Ｇαｉ１サブユニットが高度に保存された多くの残基を利用することで、グローバルな相互作用ネットワークが形成され、この相互作用ネットワークによって様々な立体構造状態が安定化されるとともに、Ｇｉタンパク質のアロステリック活性化が制御されることが明らかに判明した。観察に基づくと、受容体はまず、ＧＤＰ結合状態におけるＧαサブユニットの無秩序なＣ末端を感知するものと予想されることができる。ＧαサブユニットのＣ末端が受容体内に捕捉されると、これは「予め結合された」Ｒ＊−Ｇ（ＧＤＰ）立体構造を形成する。それと同時に、受容体から伝達されたＧＤＰ放出のシグナルが、不変のトリプトファンを介してＧαタンパク質に伝播され（β５）、これが、α５−ヘリックスの回転および並進を介したアロステリック活性化ネットワークの形成のトリガとなる。α５−ヘリックスの再配置は、α５のＮ末端の解体によりＴＣＡＴループの柔軟性の向上を引き起こすだけでなく、α１の相互作用を劇的に遮断する。α１における摂動によって、準安定なα１が明らかに不安定となり、これにより、ドメイン間の界面およびＰループが不安定化される。α１のＮ末端が秩序・無秩序遷移を完了する間に、ＨＤドメインはさらに、ＧＤＰの放出に伴って、ＧＴＰアーゼドメインに完全に置き換えられる。
【００４１】
材料および方法の部
１）アラニンスキャニング突然変異誘発
Ｇαｉ１のアラニンスキャニング発現ライブラリーを、以前に報告されている通りに［２］作製した。ヒトＧタンパク質αサブユニット（Ｇαｉ１）をｐＪ４１１ベクター（ＤＮＡ  ２．０）に挿入し、これにＮ末端１０ヒスチジンタグを組み込み、次いでＴＥＶ切断部位を組み込むことにより、野生型（ＷＴ）プラスミドを構築した。このＷＴプラスミドをベースとして、ハイスループット（ＨＴＰ）アラニン突然変異誘発により、以前に報告されている通りに［２］アラニン変異体を作製した。Ｇαｉ１における３５４のすべてのアミノ酸残基を変異させた。アラニンでない残基をすべてアラニンに置換し、アラニン残基をグリシンに置換した。この実験に用いた構築物のタンパク質配列は、以下の通りであった：
【化１】
0006573972.tif 000002
【００４２】
アミノ酸番号は、ＷＴタンパク質中の位置（開始：ＭＧＣ・・・）を指す。
【００４３】
２）ネイティブβγサブユニット（Ｇβγ）の調製
Ｇβγを、以前に記載されている通りに［３］、内因性のトランスデューシン（Ｇｔ）から分離した。簡潔には、暗順応ウシ網膜（Ｗ  Ｌ  Ｌａｗｓｏｎ、ＵＳＡ）を、４℃で一晩室内光に曝露した。桿体外節（ＲＯＳ）膜を、２５〜３０％（ｗ／ｗ）のスクロース勾配中で遠心分離により回収した。等張性および低張性の洗浄の後に、ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を付加することによってＧｔをＲＯＳ膜から解離させた。回収したＧｔを、０．２２μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して濾過し、５０％グリセロールを含む透析バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して透析した。Ｇβγをさらに、３０％グリセロールを補充した透析バッファー中での線形塩勾配（０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ）により、ブルーセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上でＧαｔから分離した。Ｇβγを１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【００４４】
３）ウシロドプシンの調製
公知の岡田の方法にしたがって調製した暗順応ＲＯＳ膜から、ウシロドプシンを抽出した。この暗順応ＲＯＳ膜を、８０ｍＭ（４．１％）のβ−ドデシル−Ｄ−ｎ−マルトシド（ＤＤＭ）を補充した可溶化バッファー（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で、４℃で一晩可溶化した。Ｔｉ７０ローター内で３０，０００ｒｐｍで遠心分離した後に、上清を、可溶化バッファーで０．４％のＤＤＭの濃度に希釈した。希釈したこのサンプルを、洗浄バッファー（０．０２％ＤＤＭを補充した可溶化バッファー）で平衡化したＣｏｎＡセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填したカラムにロードした。十分に洗浄した後、ウシロドプシンを、０．０２％  ＤＤＭと０．２Ｍ  α−Ｄ−メチルマンノシドとを補充した可溶化バッファーで溶出した。溶出されたウシロドプシンを１〜４ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【００４５】
４）Ｇαｉ１アラニン変異体のハイスループット（ＨＴＰ）培養および精製
組換えＧαｉ１アラニン変異体を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル中で発現させた。２４ウェルプレート（変異体／ウェル）（ワットマンユニフィルターマイクロプレート、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いることにより、培養物をＴＢ培地（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ社）中で３７℃で成長させた。培養体積は、５ｍｌ／ウェルであった。ＯＤ６００が０．６に達したら、細胞を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、２０℃で２０時間成長させ続けた。これらの細胞を、遠心分離によって回収し、結合バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ、そして９６ウェル深型プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に移した。再懸濁させたこれらの細胞を、８ピンプローブを備えたＳＯＮＩＣＳ  ＶＣＸ−６００ソニケーターを用いて１分間の音波処理により破砕した。
【００４６】
遠心分離によって細胞溶解物を清澄化した後、上清を、５００μｌコバルトキレート樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をプレロードして結合バッファーで平衡化された９６ウェル深型フィルタープレート（１ウェル当たり１変異体）にロードした。結合バッファーで激しく洗浄した後、組換えＧαｉ１アラニン変異体を、溶出バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で溶出した。溶出したタンパク質を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＤＴＴに対して透析した。３５４種のアラニン変異体のうち、精製されたＲ１４２ＡＨ．ＨＤ．９、Ｙ２３０ＡＧ．ｓ４ｈ３．４、Ｋ２７０ＡＧ．ｓ５ｈｇ．１およびＤ２７２ＡＧ．ＨＧ．２は、激しく凝集し、さらなるアッセイにおける使用は不可能であった。ＨＴＰ精製のフローチャートを、図１に示す。
【００４７】
５）ＨＴＰアッセイによる受容体結合状態に対するＧαｉ１アラニン変異体の作用の特性決定
各回とも、ＷＴ  Ｇαｉ１を常にＧαｉ１アラニン変異体［Ｇαｉ１（Ａｌａ）］と並行して調製して、ロドプシン−Ｇｉタンパク質複合体［Ｒｈｏ＊−Ｇｉ（ＷＴ）］を対照標準として形成した。ＨＴＰ精製からの組換えＧαｉ１アラニン変異体（１２．５μΜ）とネイティブＧβγｔ（１０μΜ）とを、氷上での９６ウェルＰＣＲプレート（１ウェル当たり１変異体）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）中での２時間のインキュベートにより再構成して、ヘテロ三量体（Ｇｉ）を形成した。暗室内で薄暗い赤色光下で、精製されたロドプシン（１８μΜ）を加え、氷冷アッセイバッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  ＤＤＭ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１６ｕｎｉｔ／ｍｌアピラーゼ）中のＧｉと混合した。氷上で橙色光（＞４９５ｎｍ）を１０分間照射した後、活性化ロドプシンとＧｉとの結合により四量体複合体Ｒｈｏ＊−Ｇｉ（Ａｌａ）を形成し、形成されたこのＲｈｏ＊−Ｇｉ（Ａｌａ）複合体をさらに、暗所で４℃で一晩インキュベートした。反応体積は、各アラニン変異体について５０μｌであった。各Ｒｈｏ＊−Ｇｉ（Ａｌａ）複合体２０μｌを、別の９６ウェルＰＣＲプレートに移し、ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）内で、３６．３℃で３０分間加熱した。４℃で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、形成されたＲｈｏ＊−Ｇｉ（Ａｌａ）複合体（４℃）１４μｌと、加熱されたＲｈｏ＊−Ｇｉ（Ａｌａ）複合体（３６．３℃）１４μｌとを、それぞれＮａｔｉｖｅＰＡＧＥサンプルバッファー（４×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ５％Ｇ−２５０サンプル添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合した。これらの混合物を、４〜１６％ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上にロードし、ゲル電気泳動を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプロトコールにしたがって４℃の低温室で行った。タンパク質マーカーを、ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ未染色タンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共に使用した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、Ｒｈｏ＊−Ｇｉ複合体のゲルバンドを積分し、定量化した。Ｒｈｏ＊−Ｇｉ複合体バンドの濃度積分値（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ）［ＩＤＣ（ＡｌａまたはＷＴ）、４℃］を、Ｒｈｏ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体バンドの濃度積分値［ＩＤＣ（ＷＴ）、４℃］で正規化することにより、複合体形成効率（ＣＦ）（％）を得た。Ｒｈｏ＊−Ｇｉ複合体バンドの濃度積分値［ＩＤＣ（ＡｌａまたはＷＴ）、３６．３℃］を、Ｒｈｏ＊−Ｇｉ（ＷＴ）複合体バンドの濃度積分値［ＩＤＣ（ＡｌａまたはＷＴ）、４℃］で正規化したものを、複合体安定性（ＣＳ）（％）と定めた。
【００４８】
【化２】
0006573972.tif 000003
【００４９】
各Ｇαｉ１アラニン変異体のΔＣＦ効率およびΔＣＳの分布および概要を、図２および表１に示す。ＨＴＰアッセイのフローチャート図を、図１に示す。
【００５０】
６）示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）による熱安定性Ｇαｉ１アラニン変異体のＨＴＰ測定
ヌクレオチド結合状態における各Ｇαｉ１アラニン変異体の熱安定性を、ＨＴＰ示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により測定した。サンプルを、氷上で調製した。組換えＧαｉ１アラニン変異体ストック（０．７μｇ／μｌ）１０μｌを、９６ウェルＰＣＲプレート（１ウェル当たり１変異体）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）に分注し、５×ＳＹＰＲＯ−ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とヌクレオチド（１ｍＭ  ＧＤＰまたは１００μΜ  ＧＴＰγＳ）とを含む氷冷アッセイバッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌと混合した。混合後、各アラニン変異体の反応混合物１１０μｌを、３５μｌの３つのサンプルとして、０．２ｍｌのＰＣＲチューブ（Ｑｉａｇｅｎ社）に分けた。３℃／分の速度で２５℃から９５℃へと上昇させることによって、Ｒｏｔｏｒ  ＧｅｎｅＱ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＳＦ実験を行った。Ｒｏｔｏｒ  ＧｅｎｅＱシリーズソフトウェアによって解析した融解曲線の変曲点を、融解温度（Ｔｍ）と定めた。ヌクレオチド付加時の各Ｇαｉ１アラニン変異体のＴｍ値［Ｔｍ（Ａｌａ）］は、３回の個々の実験から平均をとったものである。ΔＴｍ値を、以下の通り定めた：
ΔＴｍ＝Ｔｍ（Ａｌａ）−Ｔｍ（ＷＴ）
各回とも、ＷＴ  Ｇαｉ１を常にＧαｉ１アラニン変異体と並行して対照標準として調製した。
【００５１】
さらに、ＧＤＰおよびＧＴＰγＳの滴定におけるＷＴ  Ｇαｉ１のサーマルシフトも、ＨＴＰ  ＤＳＦを用いて行った。
【００５２】
７）蛍光支援サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）によるヘテロ三量体形成の解析
組換えＧαｉ１アラニン変異体（６μΜ）とＧβγｔ（２μΜ）とを再構成して、氷上で一晩ランニングバッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）１００μｌ中でヘテロ三量体（Ｇｉ）を形成した。再構成されたＧｉ  ８０μｌを、ランニングバッファーで平衡化されたＴｒｉｃｏｒｎ  １０／２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中に充填されたｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００に注入した。溶出プロファイルを、１ｍｌ／分の流量でλｅｘ：２８０ｎｍおよびλｅｍ：３４０ｎｍでのタンパク質固有の蛍光によってモニタリングした。再構成されたＧｉの保持時間を、ＵＮＩＣＯＲＮ  ５．２ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で積算した。
【００５３】
【化３】
0006573972.tif 000004
【図１】
0006573972.tif 000006
【図２】
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【図３】
0006573972.tif 000008
【図４】
0006573972.tif 000009
【図５ａ）】
0006573972.tif 000010
【図５ｂ）】
0006573972.tif 000011
【図６ａ）】
0006573972.tif 000012
【図６ｂ）】
0006573972.tif 000013
【図６ｃ）】
0006573972.tif 000014
【図７】
0006573972.tif 000015
【図８】
0006573972.tif 000016
【図９】
0006573972.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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