(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の１０から１８のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、
【化１】
0006492054.tif 000005
【化２】
0006492054.tif 000006
【化３】
0006492054.tif 000007
からなる群から選択され、ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、太字で示される、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび選択的に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
悪性および／若しくは良性腫瘍、免疫疾患、線維症、または眼の疾患を予防および／または治療する方法において使用される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記悪性および／若しくは良性腫瘍は、固形腫瘍、血液生まれの腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、または胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓、子宮頸がん、絨毛癌、脈絡膜癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌の癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支/肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支/肺癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌からなる群から選択される、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
【請求項５】
前記眼の疾患は、緑内障、後嚢混濁、ドライアイ、例えば加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑エンドマのような黄斑変性症、白内障、増殖性硝子体網膜症、マルファンおよびロイエス−ディーツ症候群からなる群から選択される、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−ベータ２核酸配列、ＴＧＦ−ベータ1またはＴＧＦ−ベータ３核酸配列とハイブリダイズする１０から１８ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに向けられ、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ポリアルキレンオキシド−、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび／または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含む。
【背景技術】
【０００２】
成長因子ベータ形質転換（ＴＧＦ−ベータ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化、および他の機能を制御するタンパク質である。これは、とりわけ免疫、癌、心臓病、糖尿病、マルファン症候群、ロイエス−ディーツ症候群、パーキンソン病、およびＡＩＤＳに関与するサイトカインの一種である。
【０００３】
ＴＧＦ−ベータは、異なる遺伝子によってコードされるが、強力な配列および構造相同性を共有する少なくとも３つのイソ型（ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３）に存在する分泌タンパク質である。ＴＧＦ−ベータは、正常上皮細胞および腫瘍形成の初期段階で抗増殖因子として作用する。しかし、後に腫瘍発生におけるＴＧＦ−ベータは、上皮−間葉転換（ＥＭＴ）の導入、腫瘍の進行、浸潤および転移に寄与すると考えられているプロセスの誘導を含む機構を通じて腫瘍促進になり得る（非特許文献１を参照）。
【０００４】
正常（上皮）細胞において、Ｇ１ステージでＴＧＦ−ベータは細胞周期を停止する（および細胞増殖を停止する）、分化を誘導する、またはアポトーシスを促進する。細胞が癌細胞に形質転換したとき、ＴＧＦ−ベータは、もはや、しばしシグナル伝達経路における変異の結果である細胞増殖を抑制し、癌細胞が増殖する。
【０００５】
間質線維芽細胞の増殖もＴＧＦ−ベータによって誘発される。どちらの細胞もＴＧＦ−ベータの生産を増加させる。このＴＧＦ−ベータは、間質細胞、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および腫瘍微小環境に作用する（非特許文献２を参照）。これにより、血管新生を促進し、免疫細胞の増殖および活性化を抑制することにより、免疫抑制を引き起こす。
【０００６】
ＴＧＦ−ベータ１−欠損マウスは、心臓、肺および胃の炎症により死亡し、ＴＧＦ−ベータは、炎症細胞の活性化および増殖の抑制に増殖重要な役割を担っていることを示唆する。Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−ベータ依存性ダウンストリームシグナル伝達経路における重要な要素の１つである。Ｓｍａｄ３−欠損マウスは、Ｔ細胞活性化および粘膜免疫の機能障害に起因する慢性の粘膜感染症を発症し、これらのプロセスにおけるＴＧＦ−βに対する重要な役割を示唆する。癌に関しては、特定の癌細胞によるＴＧＦ−ベータの生産および分泌は、免疫細胞の浸潤の活性を抑制し、それによって、ホスト免疫監視から逃れるために腫瘍を助ける。この免疫抑制効果は、ＴＧＦ−ベータが後期ステージの腫瘍の成長を刺激することにより、他の重要なメカニズムになり得る（非特許文献３を参照）。また、ＴＧＦ−ベータは、通常、炎症性（免疫）反応で癌を攻撃するエフェクターＴ−細胞を、炎症反応をオフにする、規制（抑制）Ｔ−細胞に変換する。
【０００７】
さらに、ＴＧＦ−ベータは、細胞外マトリクスの生産および沈着の最も強力な調節因子の１つである。これは、生産を刺激し、２つの主要なメカニズムによる細胞外マトリクスの接着特性に影響を与える。第１に、ＴＧＦ−ベータは、線維芽細胞および、コラーゲン、フィブロネクチン、およびインテグリンなどの細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着タンパク質を生産する他の細胞を刺激する。第２に、ＴＧＦ−ベータは、コラゲナーゼ、ヘパリナーゼおよびストロメライシンを含む細胞外マトリックスを分解する酵素の生産を減少させ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型とメタロプロテアーゼの組織阻害剤を含む細胞外マトリックスを分解する酵素を阻害するタンパク質の産生を増加させる。これらの変化の正味の効果は、細胞外マトリックスタンパク質の生産を増加させ、且つ細胞の特異的な様式における細胞の接着特性を増加または低下させることのいずれか一方である。多くの癌細胞において、ＴＧＦ−ベータの生産が増加し、タンパク質分解活性の増大および細胞接着分子との結合の促進により細胞の侵襲性を増大させる（非特許文献３を参照）。
【０００８】
したがって、ＴＧＦ−ベータの発現および活性に影響を与えることができる治療薬は、それぞれ、ＴＧＦ−β関連する疾患の予防および／または治療に使用するために特に不可欠である。例えば、特許文献１および特許文献２は、ＴＧＦ−ベータ１および／またはＴＧＦ−ベータ２のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを開示し、これは、例えば、癌を予防および／または治療するための医薬組成物の製造に使用するのに適している。これらのオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＥＮＡなどような修飾を含まない。
【０００９】
例えば、特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、治療に使用可能な、ＨＩＦ−１Ａ、Ｂｃｌ−２およびＨＥＲ３のそれぞれの阻害に向けられているヌクレオチドの修飾を含むオリゴヌクレオチドを開示している。
【００１０】
オリゴヌクレオチドを選択するための基準は、主に、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧＣ−パーセント、ヘアピン形成、二量体化の傾向および融解温度（Ｔｍ）である。一般的に、高いＴｍ（融解温度）が好ましい。さらに、オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに特異的でなければならず、潜在的なオフターゲット効果を減少させるために、非標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてはいけない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１００８６４９号明細書
【特許文献２】欧州特許第０６９５３５４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００３／８５１１０号
【特許文献４】国際公開第２００５／０６１７１０号
【特許文献５】国際公開第２００８／１３８９０４号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＴＧＦ）−ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ」  ７ｔｈ  ｓｐａｃｅ．ｃｏｍ．２００９−０１−０８．  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ：  ２００９−０１−２９
【非特許文献２】Ｐｉｃｋｕｐｅｔ  ａｌ．，  「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＧＦβ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  （２０１３），  １３：  ７８８−７９９
【非特許文献３】Ｂｌｏｂｅ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｙ  ２０００，  「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２  （１８），  １３５０−１３５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、ＴＧＦ−ベータの発現および／または活性を低減または阻害する治療薬についての高い科学的および医学的要求がある。特に、任意の（深刻な）副作用を起こすことなく、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３を特異的に阻害するオリゴヌクレオチドと同様に、特異的に相互作用して、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３の発現を減少または／および阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドについての長年にわたる要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１（図１参照）のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の１０から１８のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに言及し、オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドは、修飾されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２から２０の１つを含む、または、からなる好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＴＧＦ−ベータ２発現および活動の減少および阻害に高い効果を奏する。
【００１５】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、ＡＳＰＨ１９３、ＡＳＰＨ１９４、ＡＳＰＨ１９５、ＡＳＰＨ１９６、ＡＳＰＨ１９７、ＡＳＰＨ１９８、ＡＳＰＨ１９９、ＡＳＰＨ２００、ＡＳＰＨ２０１、およびＡＳＰＨ２０２、ＡＳＰＨ２０３、ＡＳＰＨ２０４、ＡＳＰＨ２０５、ＡＳＰＨ２０６、ＡＳＰＨ２０７、ＡＳＰＨ２０８、ＡＳＰＨ２０９、ＡＳＰＨ２１０、ＡＳＰＨ２１１、ＡＳＰＨ２１２、ＡＳＰＨ２１３、ＡＳＰＨ２１４、ＡＳＰＨ２１５、ＡＳＰＨ２１６、ＡＳＰＨ２１７、ＡＳＰＨ２１８、ＡＳＰＨ２１９、ＡＳＰＨ２２０、ＡＳＰＨ２２１、ＡＳＰＨ２２２、およびＡＳＰＨ２２３のいずれかである。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドの、１つ以上のヌクレオチドの修飾は、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび２’−Ｏ−メチルのようなポリアルキレンオキシドからなる群から選択される。修飾は、オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端に位置することが好ましい。そのような修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。
【００１７】
修飾ヌクレオチドは、例えば、１つが直接他の隣にあるように１列に配置され、または異なるパターンで配置され、１以上の未修飾のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドに続く。例えば、オリゴヌクレオチドは、１以上の修飾ヌクレオチドで始まり、次いで、１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは４つの未修飾またはロックされていないヌクレオチドが続き、次いで、再び１つ以上の修飾ヌクレオチドが続く。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドの両末端は、修飾および未修飾またはロックされていないヌクレオチドの同一パターンを含む。別の実施形態において、３’−および５’−末端での修飾パターンは異なり、例えば、一方の末端が修飾ヌクレオチドを含まない。好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは８または９のロックされていない一連のヌクレオチドを含む。
【００１８】
あるいは、オリゴヌクレオチド内の任意の他の位置のヌクレオチドは、修飾され、またはオリゴヌクレオチドの５’−および／若しくは３’−末端並びにオリゴヌクレオチドの他の位置における少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。オリゴヌクレオチドは、修飾の１つのタイプまたは１つ以上の異なる修飾のいずれかを含む。必要に応じて、オリゴヌクレオチドの２つの連続するヌクレオチド（修飾または非修飾）の間の少なくとも１つのリン酸結合は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートである。
【００１９】
別の実施形態のすべてのオリゴヌクレオチドは、悪性若しくは良性腫瘍、免疫疾患、線維症（例えば、特発性肺線維症、腎線維症、腎線維症）、硬変（例えば、肝硬変）、強皮症若しくは関連する皮膚科疾患、または、緑内障若しくは後嚢混濁（ＰＣＯ）のような眼の疾患、ＣＮＳ疾患、脱毛などを予防および／または治療する方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒトＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３２３８．３）の核酸配列を示す。
【図２】図２は、ヌクレオチド修飾の実施例を示す。
【図３ａ】図３ａは、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞およびマウスＲｅｎＣａ腎細胞癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞およびＲｅｎＣａ細胞は、任意のトランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、１．１μΜの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理し、ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２（白カラム）、およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、７２時間後に測定された。図３は、それぞれＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、ＡＳＰＨ１９３、ＡＳＰＨ１９４、ＡＳＰＨ１９５、ＡＳＰＨ１９６、ＡＳＰＨ１９７、ＡＳＰＨ１９８、ＡＳＰＨ１９９、ＡＳＰＨ２００、ＡＳＰＨ２０１、ＡＳＰＨ２０２、ＡＳＰＨ２０３、ＡＳＰＨ２０４、ＡＳＰＨ２０５、ＡＳＰＨ２０６、ＡＳＰＨ２０７、ＡＳＰＨ２０８、ＡＳＰＨ２０９、ＡＳＰＨ２１０、ＡＳＰＨ２１１、ＡＳＰＨ２１２、ＡＳＰＨ２１３、ＡＳＰＨ２１４、ＡＳＰＨ２１５、ＡＳＰＨ２１６、ＡＳＰＨ２１７、ＡＳＰＨ２１８、ＡＳＰＨ２１９、ＡＳＰＨ２２０、ＡＳＰＨ２２１、ＡＳＰＨ２２２、およびＡＳＰＨ２２３修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。図３ａは、Ｐａｎｃ−１細胞におけるこれらのＴＧＦ−ベータオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。
【図３ｂ】図３ｂは、ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞およびマウスＲｅｎＣａ腎細胞癌細胞におけるＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。Ｐａｎｃ−１細胞およびＲｅｎＣａ細胞は、任意のトランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、１．１μΜの用量で異なる修飾オリゴヌクレオチドで処理し、ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２（白カラム）、およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡ発現の阻害は、７２時間後に測定された。図３は、それぞれＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、ＡＳＰＨ１９３、ＡＳＰＨ１９４、ＡＳＰＨ１９５、ＡＳＰＨ１９６、ＡＳＰＨ１９７、ＡＳＰＨ１９８、ＡＳＰＨ１９９、ＡＳＰＨ２００、ＡＳＰＨ２０１、ＡＳＰＨ２０２、ＡＳＰＨ２０３、ＡＳＰＨ２０４、ＡＳＰＨ２０５、ＡＳＰＨ２０６、ＡＳＰＨ２０７、ＡＳＰＨ２０８、ＡＳＰＨ２０９、ＡＳＰＨ２１０、ＡＳＰＨ２１１、ＡＳＰＨ２１２、ＡＳＰＨ２１３、ＡＳＰＨ２１４、ＡＳＰＨ２１５、ＡＳＰＨ２１６、ＡＳＰＨ２１７、ＡＳＰＨ２１８、ＡＳＰＨ２１９、ＡＳＰＨ２２０、ＡＳＰＨ２２１、ＡＳＰＨ２２２、およびＡＳＰＨ２２３修飾オリゴヌクレオチドの結果を表す。図３ｂはＲｅｎＣａ細胞におけるものである。
【図４ａ】図４ａは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。ヒトＰａｎｃ−１細胞は、２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜの修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ４７（図４ａ）でトランスフェクトした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（菱形）およびＴＧＦ−ベータ２（四角）タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図４ｂ】図４ｂは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質の発現に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの阻害効果を表す。陰性対照は、４０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６、０．０５、または０．０２μΜの濃度のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２（図４ｂ）のスクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｃｒＬＮＡ）である。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１（菱形）およびＴＧＦ−ベータ２（四角）タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ、好ましくはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２および／またはＴＧＦ−ベータ３との相互作用に適したオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２によるＴＧＦ−ベータ２核酸の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１によるＴＧＦ−ベータ２核酸の核酸配列の１０から１８ヌクレオチドを含む、または、からなる。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドを含む、または、からなる。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマーまたはスピエゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含む一または二重らせんＲＮＡまたはＤＮＡである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、ＡＳＰＨ１９３、ＡＳＰＨ１９４、ＡＳＰＨ１９５、ＡＳＰＨ１９６、ＡＳＰＨ１９７、ＡＳＰＨ１９８、ＡＳＰＨ１９９、ＡＳＰＨ２００、ＡＳＰＨ２０１、およびＡＳＰＨ２０２、ＡＳＰＨ２０３、ＡＳＰＨ２０４、ＡＳＰＨ２０５、ＡＳＰＨ２０６、ＡＳＰＨ２０７、ＡＳＰＨ２０８、ＡＳＰＨ２０９、ＡＳＰＨ２１０、ＡＳＰＨ２１１、ＡＳＰＨ２１２、ＡＳＰＨ２１３、ＡＳＰＨ２１４、ＡＳＰＨ２１５、ＡＳＰＨ２１６、ＡＳＰＨ２１７、ＡＳＰＨ２１８、ＡＳＰＨ２１９、ＡＳＰＨ２２０、ＡＳＰＨ２２１、ＡＳＰＨ２２２、およびＡＳＰＨ２２３である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、同じオリゴヌクレオチドを表すＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ００４７、ＡＳＰＨ＿４７またはＡＳＰＨ＿００４７のように異なって表現され得る。
【００２３】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックを形成し、例えば、核酸塩基（窒素塩基、例えば、プリンまたはピリミジン）、５炭糖（例えば、リボース、２−デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトース（ａｌｔｏｒｓｅ）、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、またはそれらの糖の安定化された修飾）、および１つ以上のリン酸基から構成されている。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。ヌクレオチドの各化合物は修飾可能で、当該化合物は天然存在するものでも、または天然には存在しないものでもよい。後者は、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ２５，  ４４２９−４４４３）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （２０００，  ３  （２）：  ２９３−２１３））に記載されているような、図２に示された、例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ａ２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ポリアルキレンオキシド（例えば、トリエチレングリコール（ＴＥＧ））、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシおよび２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。
【００２４】
ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、リボース部分は、２’酸素と４’炭素（２’−４’リボヌクレオシド）と接続する余分な架橋で修飾されている。架橋は、Ａ型二重鎖でよく見られる３’−エンド（北）立体配置中のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオシドおよびヌクレオチドは、それぞれ、例えば、アルファ−Ｄ−またはベータ−Ｌ−立体配置のチオ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、またはアミノ−ＬＮＡの形態を含み、オリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合され得、且つ組み合わされ得る。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、好ましくは、ＬＮＡおよび／またはＥＮＡを含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳ、および３’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳを含む。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’−末端または３’−末端に１、２、３、若しくは４ＬＮＡまたはＥＮＡＳ、および３’−末端および５’−末端にＴＥＧのようなポリアルキレンオキシドを含む。修飾オリゴヌクレオチドは、それぞれ、悪性または良性腫瘍、免疫疾患、線維症、ドライアイ、緑内障や後嚢混濁（ＰＣＯ）などの眼の疾患、ＣＮＳ疾患の脱毛等の改善された予防および／または治療につながるＴＧＦ−ベータの発現および活性に対して有意に増加した阻害を示す。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ、好ましくはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ３とのハイブリダイゼーションのいずれかによる疾患とリンクしたＴＧＦ−ベータを対象とする。
【００２６】
好ましくは、２以上オリゴヌクレオチドが組み合わされ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、且つ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害する。本発明のオリゴヌクレオチドは、最も好ましくは、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現および／または活性を最も好ましく阻害する。
【００２７】
他の実施形態において、１つのオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３、またはＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ３のような２つのＴＧＦ−ベータイソ型を阻害する。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、およびＴＧＦ−ベータ３の２つまたはすべての３つのイソ型の発現を阻害するオリゴヌクレオチドは、汎特異的オリゴヌクレオチドとして規定される。
【００２８】
さらなる実施形態において、３つ以上のオリゴヌクレオチドが組み合わされ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ１を阻害し、他のオリゴヌクレオチドは特異的にＴＧＦ−ベータ２を阻害し、さらに他のオリゴヌクレオチドは、特異的にＴＧＦ−ベータ３を阻害し、選択的に１つ以上の追加のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ３を阻害する。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、０．１から２０μΜの範囲、好ましくは０．２から１５μΜの範囲、より好ましくは０．４から１０μΜの範囲、さらにより好ましくは０．５から５μΜの範囲のＩＣ５０を有する。
【００３０】
本発明は、活性成分として本発明によるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に言及する。医薬組成物は、少なくとも１つの本発明のオリゴヌクレオチド、および任意にさらなるアンチセンス化合物、抗体、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および／または免疫調節化合物を含む。薬学的に許容される結合剤およびアジュバントは、必要に応じて、医薬組成物により構成される。
【００３１】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、それぞれ、例えば、結合剤、賦形剤、安定剤等を含む溶液の形態で投与ユニットとして処方される。
【００３２】
オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、異なる経路を介して投与可能である。これらの投与経路は、限定されないが、エレクトロポレーション、表皮、皮膚への圧痕、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼内、髄腔内、房内、腹腔内、前立腺内、肺内、脊髄内、気管内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、体の空洞内に配置、鼻吸入、経口、肺吸入（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入によるもので、ネブライザーによるものを含む）、皮下、真皮下、局所（眼を含み、膣および直腸送達を含む粘膜へ）、または経皮を含む。
【００３３】
非経口、皮下、皮内または局所投与のために、オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば、滅菌希釈剤、緩衝剤、毒性および抗菌の調節剤を含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、制御された放出特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む、体からの分解または即時排除に対して保護する担体で調製される。静脈内投与のために好適な担体は、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。経口投与のためのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水系懸濁液または水溶液または非水性媒体、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤またはミニ錠剤を含む。例えば非経口、髄腔内、房内または脳室内投与を含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、例えば必要に応じて緩衝液、希釈剤、および浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの他の適切な添加剤を含む滅菌水溶液を含有する。
【００３４】
核酸および所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせた場合、薬学的に許容される担体は、その他、例えば、液体または固体であり、且つ所望のバルク、堅さ（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）等を提供するように、投与の計画された方法を考慮して選択される。典型的な薬学的に許容される担体としては、限定されないが、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、フィラー（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）を含む。経口投与剤形のための徐放性経口送達系および／または腸溶コーティングは、米国特許第４７０４２９５号明細書、同第４５５６５５２号明細書、同第４３０９４０６号明細書、および同第４３０９４０４号明細書に記載されている。アジュバントはこれらの表現の下に含まれる。
【００３５】
ヒトの疾患の予防および/または治療の方法において使用される他に、本発明のオリゴヌクレオチドおよび/または医薬組成物は、獣医学的動物、爬虫類、鳥類、エキゾチックアニマルおよび哺乳類、げっ歯類等の家畜を含む他の対象を予防および／または治療するための方法においても使用される。哺乳類は、例えば、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、または霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはキツネザル）が含まれる。げっ歯類には、例えば、ラット、ウサギ、マウス、リス、またはモルモットが含まれる。
【００３６】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、多くの異なる疾患、好ましくは良性または悪性腫瘍、免疫疾患、気管支喘息、心臓病、線維症（例えば、肝線維症、特発性肺線維症、肝硬変、腎性肝硬変、強皮症）、糖尿病、創傷治癒、結合組織の疾患（例えば、心臓、血管、骨、関節、マルファンやロイエス・ディーツ症候群のような眼内）、乾癬、眼の疾患（例えば、緑内障、後嚢混濁（ＰＣＯ）、網膜芽細胞腫、ｃｈｏｒｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑変性症などの黄斑変性、または白内障）、ＣＮＳ疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、冠動脈アテローム性動脈硬化症（冠動脈インターベンションまたは冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術や脱毛を予防および／または治療するための方法において使用される。腫瘍は、例えば、固形腫瘍、血液腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、未分化星状細胞腫などの星状細胞腫、聴神経腫瘍、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、血管芽腫（ｈｅｍａｎｇｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ホジキンリンパ腫、髄芽細胞腫（ｍｅｄｕｌｌａｂｌａｓｔｏｍａ）、白血病、一次および／または転移性メラノーマのようなメラノーマ、中皮腫、骨髄腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌（ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍｅ）、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頚癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ、例えば、明細胞ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、色素嫌性ＲＣＣ）、腎臓癌好酸性顆粒細胞腫、移行細胞腎臓癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌の群から選択される。本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、腫瘍を予防および／または治療するための方法において使用されるだけでなく、同転移にも同様に使用される。
【００３７】
本発明は、好ましくは、限定されないが、網膜芽細胞腫、脈絡膜癌、緑内障、後嚢混濁、ドライアイ、例えば、加齢黄斑変性症のような黄斑変性、糖尿病性黄斑エンドマ、白内障、増殖性硝子体網膜症、マルファンまたはロイエス−ディーツ症候群のような眼の疾患の予防および／または治療のための方法において用いられるオリゴヌクレオチド関する。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが予想外に低い毒性を示すことを特徴とし、それ故、異なる生物において十分許容される。それらのオリゴヌクレオチドは、生物において、適切な分配を示し、最高濃度が、腎臓、肝臓、皮膚、および脾臓において測定される。
【００３９】
本発明は、オリゴヌクレオチドの配列の特異的選択およびヌクレオチドの修飾により、各ＴＧＦ−ベータ、特にＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を減少および阻害するのに高効率な多くのオリゴヌクレオチドを提供する。以下の表１は、本発明（修飾ヌクレオシドは、太字で示されている）による多数の好適な修飾オリゴヌクレオチドを示す。各オリゴヌクレオチドはＡＳＰＨとヌクレオシドの特定の配列および修飾によって規定された番号で次のように規定されている。
【００４０】
【表１−１】
0006492054.tif 000002
【００４１】
【表１−２】
0006492054.tif 000003
【００４２】
表１は、ヌクレオチドの修飾と同様に本発明の選択されたオリゴヌクレオチドの核酸配列を表し、ＬＮＡ４＋４は、オリゴヌクレオチドの５’−および３’−末端に４ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ４＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に４ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋４は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に４ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ３＋２は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に２ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ２＋３は、オリゴヌクレオチドの５’−末端に２ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端で３ｘＬＮＡが修飾されたことを意味し、ＬＮＡ２＋２は、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に２ｘＬＮＡが修飾されたことを意味する。あるいは、いくつかのオリゴヌクレオチドは、ＥＮＡ４＋４、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に４ｘＥＮＡが修飾されたもの、または、ＥＮＡ３＋３、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に３ｘＥＮＡが修飾されたものを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル４＋４であって、オリゴヌクレオチドの５’−末端および３’−末端に４ｘ２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むもの、または、２’フルオロ４＋４であって、５’−末端および３’−末端に４ｘ２’フルオロ修飾ヌクレオチドを含むもの、を含む。ＬＮＡ３＋ＴＥＧを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−末端に３ｘＬＮＡおよびオリゴヌクレオチドの３’−末端に１つのトリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかのオリゴヌクレオチドは、一列には配置されていないが、例えば、１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、３ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、３ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ、３ＬＮＡ＋８Ｎ＋２ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ、２ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋２Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋３Ｎ＋１ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋２Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋４ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋２Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋１Ｎ＋３ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋１Ｎ＋２ＬＮＡ＋８Ｎ＋３ＬＮＡ、１ＬＮＡ＋２Ｎ＋３ＬＮＡ＋８Ｎ＋２ＬＮＡ、または１ＬＮＡ＋２Ｎ＋３ＬＮＡ＋８Ｎ＋１ＬＮＡ＋１Ｎ＋１ＬＮＡ配列を有する未ロック（未修飾）ヌクレオシドによって分けられたＬＮＡを含み、ここで「Ｎ」は、ロックされた修飾のないヌクレオシドである。ＬＮＡヌクレオシドは太字の配列で示され、この表でトリエチレングリコールはＴＥＧとして省略されている。数字と組み合わされた「ＡＳＰＨ」は、表１に記載されているように異なるオリゴヌクレオチドおよびそれらの異なる修飾を表す。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、同じオリゴヌクレオチドを表すＡＳＰＨ４７、ＡＳＰＨ００４７、ＡＳＰＨ＿４７またはＡＳＰＨ＿００４７のように異なって記述され得る。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、次の実施例で示される実験で試験された。
【００４３】
明確且つ簡潔な説明の目的のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書中に記載されているが、本発明の範囲は、記載した特徴の全部または一部の組合せを有する実施形態を含み得ると理解される。
【００４４】
しかしながら、以下の実施例は、同時に、そのいずれの限定を構成することなく本発明をさらに描くために仕えうる。対照的に、本発明の範囲は、本明細書を読んだ後、本発明の真意から逸脱することなく当業者にそれらが提案され得るような様々な他の実施形態、改変例、およびそれらの同等物に言及していることは明確に理解される。
【００４５】
実施例
以下の実施例において、表１で挙げられたオリゴヌクレオチドの影響は、それぞれＴＧＦ−ベータ１および／またはＴＧＦ−ベータ２発現の減少および阻害の観点から試験されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１（Ｔ−ＬＮＡ：ＣＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡ、５’−末端および３’−末端の３ｘヌクレオチドはＬＮＡである）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２（ｓｃｒ−ＬＮＡ：ＣＧＴＴＴＡＧＧＣＴＡＴＧＴＡＣＴＴ、５’−末端および３’−末端の３ｘヌクレオチドはＬＮＡのある）が対照オリゴヌクレオチドとして使用され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２（陰性対照）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１（陽性対照）のスクランブル形式である。細胞は、トランスフェクション剤（例えば、リポフェクタミン）の存在下、または任意のトランスフェクション剤の非存在下（ジムノティックトランスフェクションまたはアンアシステッドランスフェクションまたはジムノティックデリバリーとして規定される）のいずれかでトランスフェクションされる。ジムノティックデリバリーの場合のように、細胞へのオリゴヌクレオチドのエントリーが細胞とのオリゴヌクレオチドの相互作用にもっぱら依存する（どの製剤もエントリーを支持せず）。それ故、ジムノティックデリバリーは、インビボでの設定のより良い条件を反映していると考えられている。
【００４６】
実施例１
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞（図３ａ）またはマウスＲｅｎＣａ腎細胞癌細胞（図３ｂ）を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、１．１μΜのＡＳＰＨ１９０、ＡＳＰＨ１９１、ＡＳＰＨ１９２、ＡＳＰＨ１９３、ＡＳＰＨ１９４、ＡＳＰＨ１９５、ＡＳＰＨ１９６、ＡＳＰＨ１９７、ＡＳＰＨ１９８、ＡＳＰＨ１９９、ＡＳＰＨ２００、ＡＳＰＨ２０１、ＡＳＰＨ２０２、ＡＳＰＨ２０３、ＡＳＰＨ２０４、ＡＳＰＨ２０５、ＡＳＰＨ２０６、ＡＳＰＨ２０７、ＡＳＰＨ２０８、ＡＳＰＨ２０９、ＡＳＰＨ２１０、ＡＳＰＨ２１１、ＡＳＰＨ２１２、ＡＳＰＨ２１３、ＡＳＰＨ２１４、ＡＳＰＨ２１５、ＡＳＰＨ２１６、ＡＳＰＨ２１７、ＡＳＰＨ２１８、ＡＳＰＨ２１９、ＡＳＰＨ２２０、ＡＳＰＨ２２１、ＡＳＰＨ２２２、またはＡＳＰＨ２２３で処理した。ＴＧＦ−ベータ１（黒カラム）、ＴＧＦ−ベータ２（白カラム）およびＴＧＦ−ベータ３（ストライプカラム）ｍＲＮＡの発現をトランスフェクションから７２時間後に決定した。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現の有意な減少を図３ａおよび図３ｂに示す。陰性対照は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２のスクランブルＬＮＡ（ｓｃｒ  ＬＮＡ）である。
【００４７】
実施例２
ヒトＰａｎｃ−１膵臓癌細胞を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、１０μΜ、３．３μΜ、１．１μΜ、０．３７μΜおよび０．１２μΜのＡＳＰＨ４７、Ｍ１−ＡＳＰＨ４７、Ｍ２−ＡＳＰＨ４７、Ｍ３−ＡＳＰＨ４７、Ｍ４−ＡＳＰＨ４７、Ｍ５−ＡＳＰＨ４７、Μ６−ＡＳＰＨ４７、Ｍ７−ＡＳＰＨ４７、Ｍ８−ＡＳＰＨ４７、Ｍ９−ＡＳＰＨ４７、Ｍ１０−ＡＳＰＨ４７、Ｍ１１−ＡＳＰＨ４７、Ｍ１２−ＡＳＰＨ４７、Ｍ１３−ＡＳＰＨ４７、Ｍ１４−ＡＳＰＨ４７、またはＭ１５−ＡＳＰＨ４７で処理した。ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現に対する修飾オリゴヌクレオチドの阻害効果を、処理開始から７２時間後に測定した。ＴＧＦ−ベータ２の値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの５０％の減少（＝ＩＣ５０値）をもたらすオリゴヌクレオチド濃度を算出した。ジムノティックトランスフェクション実験条件下で、オリゴヌクレオチドは細胞に入り、ＴＧＦ−ベータ２ｍＲＮＡの発現を強く阻害する。実験結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
0006492054.tif 000004
【００４９】
すべての修飾オリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤を必要とせずに非常に高い効力を有することを示す、サブマイクロモルから低サブマイクロモルの範囲のＩＣ５０を示す。
【００５０】
実施例３
ヒトＰａｎｃ−ｌ膵臓癌細胞を、２０、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８または０．００９μΜの修飾オリゴヌクレオチドＡＳＰＨ４７でトランスフェクトし、結果を図４ａに示す。陰性対照は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２（図４ｂ）のスクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｃｒＬＮＡ）である。細胞を、トランスフェクション剤（ジムノティックトランスフェクションまたはジムノティックデリバリー）の非存在下で、トランスフェクトした。オリゴヌクレオチドは、３７℃でインキュベートされた細胞に３日間添加された。その後、培地を、培地を含有する新鮮なオリゴヌクレオチドと交換し、細胞を３７℃でさらに４日間インキュベートした。細胞上清中のＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。ＡＳＰＨ４７は、用量依存的にＴＧＦ−ベータ２の発現を特異的に阻害し、ＴＧＦ−ベータ１に対するターゲット阻害効果を示さない（図４ａ）。たとえ、ＡＳＰＨ４７の濃度と比較して２倍の濃度（４０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６、０．０５、０．０２μＭ）にしても、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２のｓｃｒＬＮＡは、ＴＧＦ−ベータ１またはＴＧＦ−ベータ２のいずれの発現に対しても全く阻害効果を示さない。図４ａおよび図４ｂ中に、ＴＧＦ−ベータ１の結果を菱形で示し、ＴＧＦ−ベータ２の結果を四角で示す。
［付記］
［付記１］
オリゴヌクレオチドの、１以上のヌクレオチドが修飾され、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡおよび／若しくはＥＮＡ、ポリアルキレンオキシド−、２’−フルオロ−、２’−Ｏ−メトキシ−、並びに／または２’Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドである、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＴＧＦ−ベータ２核酸配列の１０から１８のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［付記２］
前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に位置する、付記１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［付記３］
前記オリゴヌクレオチドは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８．からなる群から選択される配列を含む、または、からなる、付記１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［付記４］
前記オリゴヌクレオチドは、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９０）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（ＡＳＰＨ１９１）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９２）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴ（ＡＳＰＨ１９３）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９４）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９５）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９６）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ１９７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（ＡＳＰＨ１９８）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ１９９）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２００）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２０１）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２０２）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２０３）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２０４）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ（ＡＳＰＨ２０５）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２０６）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２０７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２０８）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２０９）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１０）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１１）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１２）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１３）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１４）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１５）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１６）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１７）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１８）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２１９）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２２０）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ２２１）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ−ＴＥＧ（ＡＳＰＨ２２２）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ−ＴＥＧ（ＡＳＰＨ２２３）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（Ｍ１−ＡＳＰＨ４７）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴ（Ｍ２−ＡＳＰＨ４７）、ＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣ（Ｍ３−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（Ｍ４−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（Ｍ５−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴ（Ｍ６−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣ（Ｍ７−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（Ｍ８−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（Ｍ９−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴ（Ｍ１０−ＡＳＰＨ４７）、ＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣ（Ｍ１１−ＡＳＰＨ４７）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（Ｍ１２−ＡＳＰＨ４７）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣ（Ｍ１３−ＡＳＰＨ４７）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴ（Ｍ１４−ＡＳＰＨ４７）、ＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣ（Ｍ１５−ＡＳＰＨ４７）、およびＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣ（ＡＳＰＨ４７）からなる群から選択される、付記１または３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［付記５］
付記１から４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび選択的に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［付記６］
悪性および／若しくは良性腫瘍、免疫疾患、線維症、または眼の疾患を予防および／または治療する方法において使用される、付記１から４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは付記５に記載の医薬組成物。
［付記７］
腫瘍は、固形腫瘍、血液生まれの腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、または胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓、子宮頸がん、絨毛癌、脈絡膜癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌の癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支/肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支/肺癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌からなる群から選択される、付記６に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
［付記８］
前記眼の疾患は、緑内障、後嚢混濁、ドライアイ、例えば加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑エンドマのような黄斑変性症、白内障、増殖性硝子体網膜症、マルファンおよびロイエス−ディーツ症候群からなる群から選択される、付記６に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。
【図１】
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【図１−１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【配列表】
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