(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いた、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づき抗体を分離する方法であって、
Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号３７および配列番号５９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含むヒトＦｃγＲＩＩＩａである、方法。
【請求項２】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号３７および配列番号５９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが糖鎖を有していないヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌で製造されたヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づき抗体を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、モノクローナル抗体が有する特異性を利用した医薬（抗体医薬）の開発が進められている。抗体医薬で用いるヒトＩｇＧのうち、Ｆｃ領域の２９７番目のアスパラギン残基に付加するＮ型糖鎖の違いにより抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が変化することが知られており、特に糖鎖の一種であるフコースを除去した抗体でＡＤＣＣ活性が向上することが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
抗体医薬においては、抗体が有するＡＤＣＣ活性の強さに重要な意味がある。しかしながら、抗体医薬は通常、動物細胞を宿主とした遺伝子組換え技術を用いて製造しており、宿主内での糖鎖付加を制御できないことから、一定のＡＤＣＣ活性を有した抗体を発現させるのは困難である。また発現した抗体の中から、ＡＤＣＣ活性の強さに基づき抗体を分離するには多くの時間と労力が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｗａ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６−３４７３，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づき抗体を分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の強さに基づいて抗体を分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｍ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いた、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づき抗体を分離する方法。
【０００８】
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、（Ａ）に記載の方法。
【０００９】
（Ｃ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドである、（Ｂ）に記載の分離方法。
【００１０】
（Ｄ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４７）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（Ｃ）に記載の方法。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸、グリシン、リジン、スレオニン、アラニン、アルギニンのいずれかに置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシン、イソロイシン、セリンのいずれかに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファンのいずれかに置換
（６）配列番号１の３９番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（７）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の４８番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンまたはロイシンに置換
（９）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンまたはセリンに置換
（１１）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１２）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１４）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１５）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１６）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１７）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１８）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１９）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグリシンに置換
（２０）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２１）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２２）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２３）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２４）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２５）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２６）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１２番目のグルタミンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２９）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（３０）配列番号１の１１７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３２）配列番号１の１１９番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（３３）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３４）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（３５）配列番号１の１４０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３６）配列番号１の１４２番目のロイシンがグルタミンに置換
（３７）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３８）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３９）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（４１）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（４２）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（４３）配列番号１の１７５番目のロイシンがアルギニンに置換
（４４）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（４５）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４６）配列番号１の１８８番目のイソロイシンがバリンに置換
（４７）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
（Ｅ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の（５）のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（Ｄ）に記載の方法。
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファンのいずれかに置換
（Ｆ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（Ｅ）に記載の方法。
【００１１】
（Ｇ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（Ｆ）に記載の方法。
【００１２】
（Ｈ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、さらに以下の（４８）から（５１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（Ｄ）から（Ｇ）のいずれかに記載の方法。
（４８）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４９）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５０）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（５１）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
（Ｉ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（４８）から（５１）のうちから選ばれる１つ以上のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（Ｃ）に記載の方法。
（４８）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４９）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５０）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（５１）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
（Ｊ）Ｆｃ結合性タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（Ｂ）に記載の方法。
【００１３】
（Ｋ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが糖鎖を有していないヒトＦｃγＲＩＩＩａである、（Ｂ）から（Ｊ）に記載の方法。
【００１４】
（Ｌ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌で製造されたヒトＦｃγＲＩＩＩａである、（Ｋ）に記載の方法。
【００１５】
（Ｍ）（Ａ）から（Ｌ）のいずれかに記載の方法で得られる抗体。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、一例としてＦｃγレセプターである、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂがあげられる。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである場合の例として、
（ｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したポリペプチド
があげられる。前記（ｉｉ）の一態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４７）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特願２０１３−２０２２４５号、特願２０１４−１３３１８１号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸、グリシン、リジン、スレオニン、アラニン、アルギニンのいずれかに置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシン、イソロイシン、セリンのいずれかに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファンのいずれかに置換
（６）配列番号１の３９番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（７）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の４８番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンまたはロイシンに置換
（９）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンまたはセリンに置換
（１１）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１２）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１４）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１５）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１６）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１７）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１８）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１９）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグリシンに置換
（２０）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２１）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２２）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２３）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２４）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２５）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２６）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１２番目のグルタミンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２９）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（３０）配列番号１の１１７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３２）配列番号１の１１９番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（３３）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３４）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかに置換（３５）配列番号１の１４０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３６）配列番号１の１４２番目のロイシンがグルタミンに置換
（３７）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３８）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３９）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（４１）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（４２）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（４３）配列番号１の１７５番目のロイシンがアルギニンに置換
（４４）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（４５）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４６）配列番号１の１８８番目のイソロイシンがバリンに置換
（４７）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
なお野生型Ｆｃ結合性タンパク質には、以下の（４８）から（５１）から選ばれる１つ以上のアミノ酸置換が生じた変異体が知られているが、当該変異体も前記（ｉｉ）の一態様といえる。
（４８）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４９）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５０）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（５１）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
また前記（ｉｉ）の別の態様として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、
前記（１）から（４７）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換、および
前記（４８）から（５１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換
が生じている、ポリペプチド（特願２０１４−１３３１８１号）があげられる。
【００１８】
前記（ｉｉ）の好ましい態様としては、以下の（ａ）から（ｍ）に示すヒトＦｃγＲＩＩＩａがあげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱および酸に対する安定性が向上する点で好ましい。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ（この表記は、配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同様）およびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７ＧｌｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｊ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５５に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｋ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｌ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号６３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｍ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号６７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
【００１９】
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質中、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【００２０】
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ（配列番号７５）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００２１】
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質は、当該Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる組換え体から製造することができる。前記宿主に特に限定はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお本発明におけるＦｃ結合性タンパク質には糖鎖を有していても有していなくても構わない。糖鎖を有するＦｃ結合性タンパク質を得るためには、動物細胞、酵母や昆虫細胞等を宿主として用いればよい。さらに人工的に合成した糖鎖を修飾してもよい。また、糖鎖を有していないＦｃ結合性タンパク質を得るためには、大腸菌等糖鎖付加が起こらない宿主として用いればよい。さらに糖鎖を有したＦｃ結合性タンパク質から糖鎖を除去する操作を行なうことで、糖鎖を有していないＦｃ結合性タンパク質を得ることもできる。
【００２２】
本発明における、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化させるための不溶性担体としては特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００２３】
本発明の分離方法は、例えば、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を充填したカラムに、抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を前記吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、前記吸着した抗体をＡＤＣＣ活性の強さに基づき抗体を分離することができる。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。前記吸着剤に吸着した抗体を、ＡＤＣＣ活性の強さに基づき溶出させるには、抗体とリガンド（Ｆｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。前記吸着剤に吸着した抗体を、ＡＤＣＣ活性の強さに基づき溶出させるための溶出液の具体例として、前記吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質（例えば糖鎖が付加されていないヒトＦｃγＲＩＩＩａ）を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いた抗体の分離方法に係る発明であり、本発明により抗体を抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の強さに基づいて分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を評価した結果を示す図である。図中の野生型はアミノ酸置換の無いＦｃ結合性タンパク質を示している。
【図２】ＦｃＲ固定化ゲルを用いた抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢの位置を示している。
【図３】ＦｃＲ固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。
【図４】ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢの位置を示している。
【図５】ＦｃＲ５ａ固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。
【図６】ＦｃＲ９固定化ゲルを用いた抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢ、フラクションＣの位置を示している。
【図７】ＦｃＲ９固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００２８】
【表１】
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（２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００２９】
【表２】
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（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００３０】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００３１】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．２６％であった。
【００３２】
【表３】
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（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【００３３】
実施例３  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍に希釈した。希釈した溶液を４５℃で１０分間熱処理を行なった。
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中から野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００３４】
（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、野生型のＦｃ結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００３５】
【表４】
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表４に示す、アミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ２と命名し、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ２と命名した。ＦｃＲ２のアミノ酸配列を配列番号２７に、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２８に示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号２７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目の位置にそれぞれ存在する。
【００３６】
実施例４  アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製（その１）
実施例３で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｇ）に示す７種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ３
（ｂ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ４
（ｃ）ＦｃＲ４に対し、さらにＡｓｎ９２Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ａ
（ｄ）ＦｃＲ４に対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ｂ
（ｅ）ＦｃＲ５ａに対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ａ
（ｆ）ＦｃＲ５ｂに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ｂ
（ｇ）ＦｃＲ６ａに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ７
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００３７】
（ａ）ＦｃＲ３
実施例３で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ３を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ３を作製した。
（ａ−１）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２４および配列番号２９（５’−ＡＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｆとした。
【００３８】
【表５】
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（ａ−２）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型とし、配列番号２３および配列番号３０（５’−ＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ３Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ３Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ３ｐを得た。
【００３９】
【表６】
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（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ３ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ２に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００４０】
【表７】
0006451119.tif 000008
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ３を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００４１】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１に、前記ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３２に示す。なお配列番号３１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目の位置にそれぞれ存在する。
【００４２】
（ｂ）ＦｃＲ４
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ４を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ４を作製した。
（ｂ−１）（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｒを得た。また実施例３で取得した、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を含んだＦｃ結合性タンパク質（表４）を発現するプラスミドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なうことでＰＣＲ産物ｍ４Ｒを得た。
（ｂ−２）（ｂ−１）により得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｒ、ｍ４Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ３Ｒとｍ４Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐとした。
（ｂ−３）（ｂ−２）で得られたＰＣＲ産物ｍ４ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ４を得た。
（ｂ−６）ｐＥＴ−ＦｃＲ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００４３】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ４のアミノ酸配列を配列番号３３に、前記ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３４に示す。なお、配列番号３３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００４４】
（ｃ）ＦｃＲ５ａ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ａを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＡｓｎ９２Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ａを作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３５（５’−ＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＦとした。
（ｃ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号３６（５’−ＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＲとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ａＦ、ｍ５ａＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ５ａＦとｍ５ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ａｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００４５】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ａのアミノ酸配列を配列番号３７に、前記ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３８に示す。なお、配列番号３７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００４６】
（ｄ）ＦｃＲ５ｂ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ｂを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ｂを作製した。
（ｄ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９（５’−ＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＦとした。
（ｄ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０（５’−ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＲとした。
（ｄ−３）（ｄ−１）および（ｄ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ｂＦ、ｍ５ｂＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ５ｂＦとｍ５ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐとした。
（ｄ−４）（ｄ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−６）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ−５）（ｄ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを得た。
（ｄ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００４７】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列を配列番号４１に、前記ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４２に示す。なお、配列番号４１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｅ）ＦｃＲ６ａ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ａを作製した。具体的には、（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ａを作製した。
（ｅ−１）（ｃ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＦとした。
（ｅ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＲとした。
（ｅ−３）（ｅ−１）および（ｅ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ａＦ、ｍ６ａＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ａＦとｍ６ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ａｐとした。
（ｅ−４）（ｅ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｅ−５）（ｅ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｅ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを得た。
（ｅ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ６ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００４８】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ａのアミノ酸配列を配列番号４３に、前記ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に示す。なお、配列番号４３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００４９】
（ｆ）ＦｃＲ６ｂ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ｂを作製した。具体的には、（ｄ）で作製したＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ｂを作製した。
（ｆ−１）（ｄ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５（５’−ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＦとした。
（ｆ−２）（ｄ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＲとした。
（ｆ−３）（ｆ−１）および（ｆ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ｂＦ、ｍ６ｂＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ｂＦとｍ６ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐとした。
（ｆ−４）（ｆ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｆ−５）（ｆ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｆ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ６ｂを得た。
（ｆ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ６ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００５０】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列を配列番号４７に、前記ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に示す。なお、配列番号４７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００５１】
（ｇ）ＦｃＲ７
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ７を作製した。具体的には、（ｅ）で作製したＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ７を作製した。
（ｇ−１）（ｅ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｆとした。
（ｇ−２）（ｅ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｒとした。
（ｇ−３）（ｇ−１）および（ｇ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ７Ｆ、ｍ７Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ７Ｆとｍ７Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐとした。
（ｇ−４）（ｇ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ７ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−４）と同様のＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｇ−５）（ｇ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｇ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して７箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ７を得た。
（ｇ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ７のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００５２】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ７のアミノ酸配列を配列番号４９に、前記ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５０に示す。なお、配列番号４９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ７のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４９において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００５３】
実施例５  ＦｃＲ５ａへの変異導入およびライブラリーの作製
実施例４（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例４（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、鋳型にｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを用いた以外は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
【００５４】
実施例６  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）実施例５で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２０倍に希釈し、更に０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）で２０倍に希釈した。その後、希釈した溶液を４０℃で１５分間熱処理を行ない、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（３）（２）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ５ａと比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００５５】
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ５ａに対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表８に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３９Ｇｌｙ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ｇｌｙ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ｇｌｎ１１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ａｓｎ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１４２Ｇｌｎ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１７５Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０ＳｅｒおよびＩｌｅ１８８Ｖａｌのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ５ａと比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００５６】
【表８】
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表８に示した、ＦｃＲ５ａからアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｐｈｅ２９ＩｌｅおよびＶａｌ１１７Ｇｌｕのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ７ａと命名し、ＦｃＲ７ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ７ａと命名した。ＦｃＲ７ａのアミノ酸配列を配列番号５１に、ＦｃＲ７ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５２に示す。なお配列番号５１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ７ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００５７】
実施例７  アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製（その２）
実施例６で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｃＲ７ａに集積することで、さらなる安定性向上を行った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ｉ）および（ｉｖ）に示す４種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ｉ）ＦｃＲ７ａに対し、さらにＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ８
（ｉｉ）ＦｃＲ８に対し、さらにＧｌｎ４８Ａｒｇのアミノ酸置換を行ったＦｃＲ９
（ｉｉｉ）ＦｃＲ８に対し、さらにＧｌｎ４８ＡｒｇおよびＴｙｒ５１Ｓｅｒのアミノ酸置換を行ったＦｃＲ１０
（ｉｖ）ＦｃＲ１０に対し、さらにＧｌｎ９０Ａｒｇのアミノ酸置換を行ったＦｃＲ１１
以下に各改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００５８】
（ｉ）ＦｃＲ８
（ｉ−１）実施例６で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ７ａを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２３および配列番号５３（５’−ＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｆとした。
（ｉ−２）実施例６で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ７ａを鋳型とし、配列番号５４（５’−ＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧ−３’）および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｒとした。
（ｉ−３）（ｉ−１）および（ｉ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ８Ｆ、ｍ８Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ８Ｆとｍ８Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ８ｐを得た。
（ｉ−４）（ｉ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ７ａに１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｉ−５）（ｉ−４）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｉ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して８箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ８を得た。
（ｉ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ８のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００５９】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ８のアミノ酸配列を配列番号５５に、前記ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５６に示す。なお配列番号５５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ８のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５５において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６０】
（ｉｉ）ＦｃＲ９
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ４８Ａｒｇを選択し、このアミノ酸置換をＦｃＲ８に導入したＦｃＲ９を作製した。
（ｉｉ−１）（ｉ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２４および配列番号５７（５’−ＧＴＧＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｆとした。
（ｉｉ−２）（ｉ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２３および配列番号５８（５’−ＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｒとした。
（ｉｉ−３）（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ９Ｆ、ｍ９Ｒ）を混合後、（ｉ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ９Ｆとｍ９Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ９ｐとした。
（ｉｉ−４）（ｉｉ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ９ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ｉ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｉｉ−５）（ｉｉ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｉｉ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して９箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９を得た。
（ｉｉ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ９のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６１】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ９のアミノ酸配列を配列番号５９に、前記ＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６０に示す。なお、配列番号５９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５９において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６２】
（ｉｉｉ）ＦｃＲ１０
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ４８ＡｒｇおよびＴｙｒ５１Ｓｅｒを選択し、このアミノ酸置換をＦｃＲ８に導入したＦｃＲ１０を作製した。
（ｉｉｉ−１）（ｉ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２２および配列番号６１（５’−ＴＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｆとした。
（ｉｉｉ−２）（ｉ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２１および配列番号６２（５’−ＧＣＴＡＧＡＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＧＴＣＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｒとした。
（ｉｉｉ−３）（ｉｉｉ−１）および（ｉｉｉ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１０Ｆ、ｍ１０Ｒ）を混合後、（ｉ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ１０Ｆとｍ１０Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１０ｐとした。
（ｉｉｉ−４）（ｉｉｉ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ｉ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｉｉｉ−５）（ｉｉｉ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｉｉｉ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１０箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１０を得た。
（ｉｉｉ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１０のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６３】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１０のアミノ酸配列を配列番号６３に、前記ＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６４に示す。なお、配列番号６３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１０のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６４】
（ｉｖ）ＦｃＲ１１
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ９０Ａｒｇを選択し、このアミノ酸置換をＦｃＲ１０に導入したＦｃＲ１１を作製した。
（ｉｖ−１）（ｉｉｉ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ１０を鋳型とし、配列番号２２および配列番号６５（５’−ＧＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１Ｆとした。
（ｉｖ−２）（ｉｉｉ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ１０を鋳型とし、配列番号２１および配列番号６６（５’−ＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｉ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１Ｒとした。
（ｉｖ−３）（ｉｖ−１）および（ｉｖ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１１Ｆ、ｍ１１Ｒ）を混合後、（ｉ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ１１Ｆとｍ１１Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１１ｐとした。
（ｉｖ−４）（ｉｖ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１１ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ｉ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｉｖ−５）（ｉｖ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｉｖ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１１箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１１を得た。
（ｉｖ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１１のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６５】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１１のアミノ酸配列を配列番号６７に、前記ＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６８に示す。なお、配列番号６７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１１のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｎ９０Ａｒｇのアルギニンは１０６番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６６】
実施例８  １箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換のうち、配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）、３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）および１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）について、他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を、それぞれ下記の方法で作製した。
【００６７】
（Ａ）配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ａ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号６９（５’−ＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＮＮＫＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＦとした。
（Ａ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号７０（５’−ＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＭＮＮＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＲとした。
（Ａ−３）（Ａ−１）および（Ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（２７ｐＦ、２７ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、２７ｐＦと２７ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を２７ｐとした。
（Ａ−４）（Ａ−３）で得られたＰＣＲ産物２７ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の２７番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ａ−５）（Ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００６８】
結果、Ｖａｌ２７Ｇｌｙ（Ｖ２７Ｇ）、Ｖａｌ２７Ｌｙｓ（Ｖ２７Ｋ）、Ｖａｌ２７Ｔｈｒ（Ｖ２７Ｔ）、Ｖａｌ２７Ａｌａ（Ｖ２７Ａ）、Ｖａｌ２７Ｔｒｐ（Ｖ２７Ｗ）、またはＶａｌ２７Ａｒｇ（Ｖ２７Ｒ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００６９】
（Ｂ）配列番号１の３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ｂ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号７１（５’−ＡＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＮＮＫＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＦとした。
（Ｂ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号７２（５’−ＡＧＣＡＣＧＣＧＭＮＮＣＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＲとした。
（Ｂ−３）（Ｂ−１）および（Ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（３５ｐＦ、３５ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、３５ｐＦと３５ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を３５ｐとした。
（Ｂ−４）（Ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物３５ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の３５番目のチロシンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ｂ−５）（Ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００７０】
結果、Ｔｙｒ３５Ｃｙｓ（Ｙ３５Ｃ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ（Ｙ３５Ｄ）、Ｔｙｒ３５Ｐｈｅ（Ｙ３５Ｆ）、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ（Ｙ３５Ｇ）、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ（Ｙ３５Ｋ）、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ（Ｙ３５Ｌ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ（Ｙ３５Ｎ）、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ（Ｙ３５Ｐ）、Ｔｙｒ３５Ａｒｇ（Ｙ３５Ｒ）、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ（Ｙ３５Ｓ）、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ（Ｙ３５Ｔ）、Ｔｙｒ３５Ｖａｌ（Ｙ３５Ｖ）、またはＴｙｒ３５Ｔｒｐ（Ｙ３５Ｗ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００７１】
（Ｃ）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ｃ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号７３（５’−ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＮＮＫＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＦとした。
（Ｃ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号７４（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＭＮＮＣＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４の（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＲとした。
（Ｃ−３）（Ｃ−１）および（Ｃ−２）により得られた２種類のＰＣＲ産物（１２１ｐＦ、１２１ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、１２１ｐＦと１２１ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を１２１ｐとした。
（Ｃ−４）（Ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物１２１ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施例４（ａ−４）と同様のＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の１２１番目のグルタミン酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ｃ−５）（Ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００７２】
結果、Ｇｌｕ１２１Ｌｙｓ（Ｅ１２１Ｋ）、Ｇｌｕ１２１Ｐｒｏ（Ｅ１２１Ｐ）、Ｇｌｕ１２１Ａｒｇ（Ｅ１２１Ｒ）、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ（Ｅ１２１Ｇ）、Ｇｌｕ１２１Ｈｉｓ（Ｅ１２１Ｈ）、またはＧｌｕ１２１Ｖａｌ（Ｅ１２１Ｖ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００７３】
実施例９  １アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、および実施例８で作製した１箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実施例３（１）および（２）と同様の方法でそれぞれ培養を行ない、野生型Ｆｃ結合性タンパク質および１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）発現した１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて抗体との結合活性を調べた。
【００７４】
結果を図１に示す。配列番号１の２７番目のバリンをグリシン（Ｖ２７Ｇ）、リジン（Ｖ２７Ｋ）、スレオニン（Ｖ２７Ｔ）、アラニン（Ｖ２７Ａ）、アルギニン（Ｖ２７Ｒ）、に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の２７番目のＶａｌがトリプトファン（Ｖ２７Ｗ）へ置換すると、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
【００７５】
配列番号１の３５番目のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ３５Ｄ）、フェニルアラニン（Ｙ３５Ｆ）、グリシン（Ｙ３５Ｇ）、リジン（Ｙ３５Ｋ）、ロイシン（Ｙ３５Ｌ）、アスパラギン（Ｙ３５Ｎ）、プロリン（Ｙ３５Ｐ）、セリン（Ｙ３５Ｓ）、スレオニン（Ｙ３５Ｔ）、バリン（Ｙ３５Ｖ）、トリプトファン（Ｙ３５Ｗ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＹ３５Ｄ、Ｙ３５Ｇ、Ｙ３５Ｋ、Ｙ３５Ｌ、Ｙ３５Ｎ、Ｙ３５Ｐ、Ｙ３５Ｓ、Ｙ３５Ｔ、Ｙ３５Ｗは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の３５番目のチロシンを、システイン（Ｙ３５Ｃ）、アルギニン（Ｙ３５Ｒ）に置換した場合は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であった。
【００７６】
配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、リジン（Ｅ１２１Ｋ）、アルギニン（Ｅ１２１Ｒ）、グリシン（Ｅ１２１Ｇ）、ヒスチジン（Ｅ１２１Ｈ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＥ１２１Ｇは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、バリン（Ｅ１２１Ｖ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であり、プロリン（Ｅ１２１Ｐ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
【００７７】
実施例１０  Ｆｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製
発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに、配列番号７５（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ）に記載のＰｅｌＢシグナルペプチドのうち６番目のプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換されたシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、シグナルペプチドを含む発現ベクターを作製した。
（１）配列番号７６（５’−ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ−３’）および配列番号７７（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃に５分間加熱後、１分間で１℃毎に温度を下げ、１５℃に達したところで保持することで二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。
（２）（１）で作製した二本鎖オリゴヌクレオチドを、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで処理した発現ベクターｐＴｒｃ９９にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ製）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地により培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３を得た。
【００７８】
実施例１１  システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲＣｙｓ）の作製
（１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２１および配列番号７８（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１０で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ｅＦｃＲＣｙｓを得た。
（４）ｐＴｒｃ−ｅＦｃＲＣｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号７９（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号８０（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００７９】
発現ベクターｐＴｒｃ−ｅＦｃＲＣｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８２にそれぞれ示す。なお配列番号８１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが６番目のプロリンがセリンに置換されたＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００８０】
実施例１２  システインタグを付加したＦｃＲ５ａ（ＦｃＲ５ａＣｙｓ）の作製
（１）実施例４（ｃ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２１および配列番号７８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１１（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（２）実施例１１（２）と同様の方法で（１）で作製したＰＣＲ産物をｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３発現ベクターにライゲーションし大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ５ａＣｙｓを得た。
（４）ｐＴｒｃ−ＦｃＲ５ａＣｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号７９または配列番号８０に記載のオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００８１】
発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ５ａＣｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８３に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８４にそれぞれ示す。なお配列番号８３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが６番目のプロリンがセリンに置換されたＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号３７の３３番目から２０８番目までの領域に相当）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００８２】
実施例１３  システインタグを付加したＦｃＲ９（ＦｃＲ９Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例７（ｉｉ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ９を鋳型とし、配列番号２１および配列番号７８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１１（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（２）実施例１１（２）と同様な方法で（１）で作製したＰＣＲ産物をｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３発現ベクターにライゲーションし大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９Ｃｙｓを得た。
（４）ｐＴｒｃ−ＦｃＲ９Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号７９または配列番号８０に記載のオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００８３】
発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８６に、それぞれ示す。なお配列番号８５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが６番目のプロリンがセリンに置換されたＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９のアミノ酸配列（配列番号５９の３３番目から２０８番目までの領域に相当）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００８４】
実施例１４  ＦｃＲＣｙｓの調製
（１）実施例１１で作製したＦｃＲＣｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラムカラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００８５】
前記精製により、高純度のＦｃＲＣｙｓを約１２ｍｇ得た。
【００８６】
実施例１５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）固定化ゲルの作製と抗体分離
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：トヨパール）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例１４で調製したＦｃＲＣｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ固定化ゲルを得た。
（２）（１）で作製したＦｃＲ固定化ゲル０．５ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲカラムを作製した。
（３）（２）で作製したＦｃＲカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）につなげ、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した。
（４）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７.４）で４．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．３ｍＬ／ｍｉｎにて０．１５ｍＬアプライした。
（５）流速０．３ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（３８分で１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【００８７】
結果（溶出パターン）を図２に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲと相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。
【００８８】
実施例１６  ＦｃＲ固定化ゲルで分離した抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性測定
（１）実施例１５に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図２に記載の溶出パターン中のフラクションＡ（ＦｒＡ）およびフラクションＢ（ＦｒＢ）の領域を分取した。
（２）分取したＦｒＡおよびＦｒＢを限外ろ過膜（メルクミリポア製）で濃縮しながらＰＢＳ（１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．７６ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）（ｐＨ７.４）に緩衝液を交換した。
（３）濃縮、緩衝液交換したＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光で測定した。
（４）以下に示す方法で、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体が有するＡＤＣＣ活性を測定した。
（４−１）１．４ｍＬのＬｏｗ  ＩｇＧ  Ｓｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地とを混合して調製したＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを用いてＦｒＡ、ＦｒＢに含まれるモノクローナル抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体を３μｇ／ｍＬから１／３希釈で８段階の希釈系列を調製した。
（４−２）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにて約５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ウェルプレート（３９１７：コーニング社）に２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
（４−３）Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（２）で調整したＦｒＡ、ＦｒＢ、分離前のモノクローナル抗体、ブランクのＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒのみを２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
（４−４）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（プロメガ社）をＡＤＣＣ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにて約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたｗｅｌｌに２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。その後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に６時間静置した。
（４−５）９６穴プレートを室温で５分から３０分間静置した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ製）を７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で発光を測定した。
【００８９】
実施例１５に記載の溶出条件で分取したＦｒＡおよびＦｒＢならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図３に示す。なお図３の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
【００９０】
分離前のモノクローナル抗体と比較し、ＦｒＡの発光強度は低下している一方、ＦｒＢの発光強度は約１．４倍に向上していた。つまり、ＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体およびＦｃＡと比べてＡＤＣＣ活性が高いことがわかる。またＦｃＲ固定化ゲルからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）フラクション（ＦｒＢ）にＡＤＣＣ活性の強い抗体が含まれていることから、ＦｃＲ固定化ゲルはＡＤＣＣ活性の強さに基づいて分離できることがわかる。
【００９１】
実施例１７  ＦｃＲ５ａ固定化ゲルによる抗体分離
（１）実施例１２で作製したＦｃＲ５ａＣｙｓを発現する形質転換体を用いて実施例１４と同様な方法で調製することで、高純度のＦｃＲ５ａＣｙｓを約２０ｍｇ得た。
（２）実施例１５（１）と同様な方法でＦｃＲ５ａＣｙｓ固定化ゲルを得た後、当該ゲル０．５ｍＬをφ４．０ｍｍ×４０ｍｍのステンレスカラムに充填しＦｃＲ５ａカラムを作製した。
（３）ＦｃＲ５ａカラムを用いて実施例１５の（３）から（５）と同様の方法でモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を分離した。
【００９２】
結果（溶出パターン）を図４に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ５ａと相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。
【００９３】
実施例１８  ＦｃＲ５ａ固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性測定
（１）実施例１７に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図４に記載の溶出パターン中のフラクションＡ（ＦｒＡ）およびフラクションＢ（ＦｒＢ）の領域を分取した。
（２）分取したＦｒＡおよびＦｒＢを実施例１６（２）と同様な方法で濃縮および緩衝液交換を行なった。
（３）濃縮、緩衝液交換したＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光で測定した。
（４）ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体が有するＡＤＣＣ活性を実施例１６（４）と同様の方法にて測定した。
【００９４】
実施例１７に記載の溶出条件で分取したＦｒＡおよびＦｒＢならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図５に示す。なお図５の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
【００９５】
ＦｒＡは分離前のモノクローナル抗体とほぼ同程度の発光強度であることからＡＤＣＣ活性はほぼ同等といえる。一方、ＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体と比べて約３．２倍、ＦｒＡに比べても２．５倍に向上していた。つまり、ＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体およびＦｒＡと比べてＡＤＣＣ活性が高いことがわかる。またＦｃＲ５ａ固定化ゲルからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）フラクション（ＦｒＢ）にＡＤＣＣ活性の強い抗体が含まれていることから、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルはＡＤＣＣ活性の強さに基づいて分離できることがわかる。
【００９６】
実施例１９  ＦｃＲ９固定化ゲルによる抗体分離
（１）実施例１３で作製したＦｃＲ９Ｃｙｓを発現する形質転換体を用いて実施例１４と同様な方法で調製することで、高純度のＦｃＲ９Ｃｙｓを約１５０ｍｇ得た。
（２）実施例１５（１）と同様な方法でＦｃＲ９Ｃｙｓ固定化ゲルを得た後、当該ゲル０．５ｍＬをφ４．０ｍｍ×４０ｍｍのステンレスカラムに充填しＦｃＲ９カラムを作製した。
（３）ＦｃＲ９カラムを用いて実施例１５の（３）から（５）と同様の方法でモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を分離した。
【００９７】
結果（溶出パターン）を図６に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ９と相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。
【００９８】
実施例２０  ＦｃＲ９固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性測定
（１）実施例１９に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図６に記載の溶出パターン中のフラクションＡ（ＦｒＡ）、フラクションＢ（ＦｒＢ）およびフラクションＣ（ＦｒＣ）の領域を分取した。
（２）分取したＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣを実施例１６（２）と同様な方法で濃縮および緩衝液交換を行なった。
（３）濃縮、緩衝液交換したＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光で測定した。
（４）ＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体が有するＡＤＣＣ活性を実施例１６（４）と同様の方法にて測定した。
【００９９】
実施例１９に記載の溶出条件で分取したＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図７に示す。なお図７の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
【０１００】
ＦｒＡおよびＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体よりＡＤＣＣ活性がやや低いといえる。一方、ＦｒＣは分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が約１．６倍に向上していた。つまりＦｒＣはＦｒＡおよびＦｒＢならびに分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が高いことがわかる。またＦｃＲ９固定化ゲルからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）フラクション（ＦｒＣ）にＡＤＣＣ活性の強い抗体が含まれていることから、ＦｃＲ９固定化ゲルはＡＤＣＣ活性の強さに基づいて分離できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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