(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス励起光を出力して試料に照射する励起光源と、前記パルス励起光の照射に伴い前記試料中の蛍光色素から発生した蛍光を検出する検出器と、を備える蛍光測定装置の装置応答関数を測定する方法であって、
前記パルス励起光を透過または鏡面反射させる基板の面の一部領域に拡散反射部を有する装置応答関数測定用部材を、前記蛍光測定装置において試料が配置されるべき位置に、前記励起光源から前記基板へのパルス励起光の照射により生じる鏡面反射光が前記検出器に入射しない方位となるように設置し、
前記励起光源から出力されたパルス励起光を前記装置応答関数測定用部材の前記拡散反射部に照射して、その照射により前記拡散反射部で生じる拡散反射光を前記検出器により検出し、
前記検出器による検出結果に基づいて前記蛍光測定装置の装置応答関数を求める、
装置応答関数測定方法。
【請求項２】
前記装置応答関数測定用部材において前記拡散反射部が設けられる領域を、前記試料における蛍光発生領域に対応したものとする、
請求項１に記載の装置応答関数測定方法。
【請求項３】
前記試料における蛍光発生領域を撮像した結果に基づいて、前記装置応答関数測定用部材において前記拡散反射部が設けられる領域を決定する、
請求項２に記載の装置応答関数測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の装置応答関数測定方法により求めた装置応答関数と、前記試料中の蛍光色素から発生した蛍光について前記検出器による検出結果とに基づいて、蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求める、
蛍光測定方法。
【請求項５】
パルス励起光を出力して試料に照射する励起光源と、前記パルス励起光の照射に伴い前記試料中の蛍光色素から発生した蛍光を検出する検出器と、を備える蛍光測定装置の装置応答関数を測定する方法において用いられ、
前記パルス励起光を透過または鏡面反射させる基板の面の一部領域に拡散反射部を有する、
装置応答関数測定用部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光測定装置の装置応答関数を測定する装置応答関数測定方法、この装置応答関数測定方法により測定された装置応答関数に基づいて蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求める蛍光測定方法、および、この装置応答関数測定方法において用いられる装置応答関数測定用部材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光測定装置は、励起光を出力して試料に照射する励起光源と、この励起光の照射によって試料中の蛍光色素から発生した蛍光を検出する検出器と、を備える。蛍光測定装置は、蛍光強度を検出する場合や、蛍光画像から蛍光色素の分布を取得する場合の他、蛍光減衰曲線を測定する場合にも用いられ、さらに、この蛍光減衰曲線に基づいて蛍光寿命値を測定する場合にも用いられる。
【０００３】
蛍光減衰曲線を測定する場合、理想的には、出力するパルス励起光のパルス幅がゼロである励起光源を用いるとともに、応答時間がゼロである検出器を用いて、励起光源から出力されたパルス励起光を試料に照射し、その試料で発生した蛍光の強度の時間的変化を検出器により測定することが必要である。
【０００４】
しかし、現実には、そのような励起光源や検出器は存在しないので、有限のパルス幅を有するパルス励起光を出力する励起光源を用いるとともに、有限の応答時間を有する検出器を用いざるを得ない。この場合、歪んだ蛍光減衰曲線が得られることになる。
【０００５】
蛍光測定装置の装置応答関数（Instrument Response Function、ＩＲＦ）は、パルス励起光の時間波形と蛍光測定装置の応答とのコンボリューションで表される。測定される蛍光減衰曲線は、この装置応答関数と蛍光応答とのコンボリューションで表される。したがって、装置応答関数が既知であれば、測定された蛍光減衰曲線に基づいてデコンボリューション計算を行うことにより、正しい蛍光減衰曲線を得ることができ、さらには、正しい蛍光寿命値を得ることができる。その為には、蛍光測定装置の装置応答関数を求めておくことが必要である。
【０００６】
特許文献１および非特許文献１には、蛍光測定装置の装置応答関数を測定する技術が記載されている。非特許文献１に記載された装置応答関数測定技術は、試料で発生する蛍光を観測するときと同じ体積からの散乱を利用するものであり、コロイド懸濁液や、アルミニウムまたは銀のホイル等の散乱反射体を、試料に替えて用いる。特許文献１に記載された装置応答関数測定技術は、パルス励起光の一部を検出器へ導く別の光学系を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４４５９３９０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D.V.O'Connor他著、平山鋭他訳、「ナノ・ピコ秒の蛍光測定と解析法」、初版、株式会社学会出版センター、1988年8月30日、第42頁〜第43頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、特許文献１および非特許文献１に記載された技術では、蛍光測定装置の装置応答関数を正確に測定することができないことを見出した。すなわち、コロイド懸濁液を用いる場合には、そのコロイド懸濁液における励起光または蛍光の吸収や多重散乱により測定精度が悪くなる。散乱反射体を用いる場合には、試料における蛍光発生領域より散乱反射体における励起光照射範囲が大きいと、測定精度が悪くなる。特許文献１に記載された技術は、本来の蛍光測定の光学系とは別の光学系を用いて装置応答関数を求めることから、本来の装置応答関数を求めるものではない。
【００１０】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、蛍光測定装置の装置応答関数をより正確に測定することができる装置応答関数測定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、より正確な蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求めることができる蛍光測定方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、装置応答関数測定方法において用いられる装置応答関数測定用部材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の装置応答関数測定方法は、パルス励起光を出力して試料に照射する励起光源と、パルス励起光の照射に伴い試料中の蛍光色素から発生した蛍光を検出する検出器と、を備える蛍光測定装置の装置応答関数を測定する方法であって、パルス励起光を透過または鏡面反射させる基板の面の一部領域に拡散反射部を有する装置応答関数測定用部材を、蛍光測定装置において試料が配置されるべき位置に、励起光源から基板へのパルス励起光の照射により生じる鏡面反射光が検出器に入射しない方位となるように設置し、励起光源から出力されたパルス励起光を装置応答関数測定用部材の拡散反射部に照射して、その照射により拡散反射部で生じる拡散反射光を検出器により検出し、検出器による検出結果に基づいて蛍光測定装置の装置応答関数を求める。
【００１２】
本発明では、装置応答関数測定用部材において拡散反射部が設けられる領域を、試料における蛍光発生領域に対応したものとするのが好適である。また、試料における蛍光発生領域を撮像した結果に基づいて、装置応答関数測定用部材において拡散反射部が設けられる領域を決定するのが好適である。
【００１３】
本発明の蛍光測定方法は、上記の本発明の装置応答関数測定方法により求めた装置応答関数と、試料中の蛍光色素から発生した蛍光について検出器による検出結果とに基づいて、蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求める。
【００１４】
本発明の装置応答関数測定用部材は、パルス励起光を出力して試料に照射する励起光源と、パルス励起光の照射に伴い試料中の蛍光色素から発生した蛍光を検出する検出器と、を備える蛍光測定装置の装置応答関数を測定する方法において用いられ、パルス励起光を透過または鏡面反射させる基板の面の一部領域に拡散反射部を有する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、蛍光測定装置の装置応答関数をより正確に測定することができ、さらに、より正確な蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、蛍光測定装置１０の構成を示す図である。
【図２】図２は、本実施形態の装置応答関数測定用部材２０の構成を示す図である。
【図３】図３は、蛍光測定装置１０において装置応答関数測定用部材２０を配置した構成を示す図である。
【図４】図４は、パルス励起光の大部分が試料を透過するくらい光学的に試料が希薄である場合における拡散反射部２２の設置領域の決定方法を説明する図である。
【図５】図５は、パルス励起光の試料を透過できないくらい光学的に試料が濃厚である場合における拡散反射部２２の設置領域の決定方法を説明する図である。
【図６】図６は、実施例および比較例それぞれで得られた装置応答関数を示す図である。
【図７】図７は、実施例および比較例で得られた４種類の蛍光色素それぞれの成分量および蛍光寿命値を纏めた表である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【００１８】
先ず、本発明者らが本発明を想到するに至った経緯について説明する。本発明者らは、非特許文献１に記載された技術について検証実験を行った。その結果、測定された蛍光減衰曲線の半値全幅より、得られた装置応答関数の半値全幅が大きくなる場合があった。この傾向は、特に蛍光寿命が短い場合に見られた。このような場合、デコンボリューション計算に基づいて蛍光減衰曲線や蛍光寿命値を正確に求めることができない。すなわち、測定される蛍光減衰曲線の半値全幅より装置応答関数の半値全幅は小さくなければならない。
【００１９】
また、本発明者らは、励起光を吸収する黒色基板の面の一部領域に散乱反射体を有する装置応答関数測定用部材を作製し、これを用いて装置応答関数を求めた。このような装置応答関数測定用部材を用いれば、試料における蛍光発生領域と散乱反射体における励起光散乱領域とを互いに同程度とすることができ、より正しい装置応答関数を得ることができると期待された。しかし、この場合においても、測定された蛍光減衰曲線の半値全幅より、得られた装置応答関数の半値全幅が大きくなる場合があった。
【００２０】
さらに、本発明者らは、上記のような装置応答関数測定用部材を用いた場合の問題発生原因を解明すべく、散乱反射体を設けることなく黒色基板のみを用いて装置応答関数を試みに求めてみた。しかし、この場合においても、測定された蛍光減衰曲線の半値全幅より、得られた装置応答関数の半値全幅が大きくなる場合があった。これは、黒色基板からの拡散反射光が検出器により受光されることに因ると考えられる。
【００２１】
本発明者らは、以上のような知見に基づいて本発明を想到した。以下に、蛍光測定装置の構成について説明するとともに、本実施形態の装置応答関数測定方法、蛍光測定方法および装置応答関数測定用部材について説明する。
【００２２】
図１は、蛍光測定装置１０の構成を示す図である。この蛍光測定装置１０は、本実施形態の装置応答関数測定方法により装置応答関数を測定するのに好適なものである。蛍光測定装置１０は、試料室１１、励起光源１５、検出器１６および処理部１７を備える。試料室１１は、内部に試料９０を配置するもので、開口部１２〜１４を有する。開口部１２は、試料室１１外部に配置された励起光源１５から出力されたパルス励起光ＬＥを試料室１１内部に導く。開口部１３，１４については後述する。検出器１６は、パルス励起光ＬＥの照射に伴い試料９０中の蛍光色素から発生した蛍光ＬＦを検出する。処理部１７は、検出器１６による検出結果に基づいて所要の処理（後述）を行う。
【００２３】
図２は、本実施形態の装置応答関数測定用部材２０の構成を示す図である。図２（ａ）は上面図であり、図２（ｂ）は側面図である。装置応答関数測定用部材２０は、蛍光測定装置１０の装置応答関数を測定する際に用いられる。装置応答関数測定用部材２０は、基板２１、拡散反射部２２およびベース部２３を備える。基板２１は、パルス励起光ＬＥを透過または鏡面反射させる。基板２１は、パルス励起光ＬＥを拡散反射させないか、または、拡散反射が極めて小さい。拡散反射部２２は、基板２１の面の一部領域に配置されており、パルス励起光ＬＥを拡散反射させることができる。拡散反射部２２は、蛍光を有さない白色物質や金属粉末が好ましい。装置応答関数測定用部材２０において拡散反射部２２が設けられる領域は、試料９０における蛍光発生領域に対応したものとするのが好ましい。ベース部２３は、基板２１を保持する。
【００２４】
図３は、蛍光測定装置１０において装置応答関数測定用部材２０を配置した構成を示す図である。本実施形態の装置応答関数測定方法により装置応答関数を測定する際には、装置応答関数測定用部材２０は、蛍光測定装置１０において試料９０が配置されるべき位置に設置される。また、装置応答関数測定用部材２０は、励起光源１５から基板２１へのパルス励起光ＬＥ２の照射により生じる鏡面反射光ＬＲが検出器１６に入射しない方位となるように設置される。
【００２５】
パルス励起光ＬＥ２の照射により基板２１で生じる透過光ＬＴは、開口部１３を通過して、試料室１１外部に設けられた光トラップ１８により吸収される。パルス励起光ＬＥ２の照射により基板２１で生じる鏡面反射光ＬＲは、開口部１４を通過して、試料室１１外部に設けられた光トラップ１９により吸収される。これら透過光ＬＴおよび鏡面反射光ＬＲは、検出器１６に入射しない。
【００２６】
検出器１６は、励起光源１５から拡散反射部２２へのパルス励起光ＬＥ１の照射により生じる拡散反射光ＬＳを検出する。処理部１７は、拡散反射光ＬＳを受光した検出器１６から出力される電気信号に基づいて装置応答関数を求め、更に蛍光減衰曲線や蛍光寿命値を求める。
【００２７】
このような構成とすることで、試料９０における蛍光発生領域に対応した領域に設けられた拡散反射部２２からの拡散反射光ＬＳのみが検出器１６により受光されるので、正確な装置応答関数を求めることができる。
【００２８】
なお、上記の構成では光トラップ１８，１９により透過光ＬＴおよび鏡面反射光ＬＲを吸収することとしたが、透過光ＬＴおよび鏡面反射光ＬＲが弱い場合には、開口部１３，１４に替えて暗幕や黒色材を設置して、これにより透過光ＬＴおよび鏡面反射光ＬＲを吸収することとしてもよい。
【００２９】
次に、装置応答関数測定用部材２０において拡散反射部２２が設けられる領域を決める方法の例について、図４および図５を用いて説明する。
【００３０】
図４は、パルス励起光の大部分が試料を透過するくらい光学的に試料が希薄である場合における拡散反射部２２の設置領域の決定方法を説明する図である。図４（ａ）に示されるように、容器３１内の試料３２にパルス励起光ＬＥを入射させたときにパルス励起光ＬＥの大部分が試料３２を透過する場合、試料３２中のパルス励起光の光路の全領域において蛍光が発生することになる。そこで、図４（ｂ）に示されるように、基板３３上において拡散反射部３４は、パルス励起光の光路の全領域に亘って設けられる。基板３３は図２における基板２１に相当し、拡散反射部３４は図２における拡散反射部２２に相当する。
【００３１】
図５は、パルス励起光の試料を透過できないくらい光学的に試料が濃厚である場合における拡散反射部２２の設置領域の決定方法を説明する図である。図５（ａ）に示されるように、容器４１内の試料４２にパルス励起光ＬＥを入射させたときに、パルス励起光ＬＥが途中で吸収されてしまい、試料４２中でパルス励起光が吸収されるまでの光路の領域において蛍光が発生することになる。そこで、図５（ｂ）に示されるように、基板４３上において拡散反射部４４は、パルス励起光が吸収されるまでの光路の領域に設けられる。基板４３は図２における基板２１に相当し、拡散反射部４４は図２における拡散反射部２２に相当する。
【００３２】
試料４２が濃厚である場合、実際には、パルス励起光ＬＥは、試料４２への入射位置で最も強く、試料４２中を進むに従って徐々に弱くなる。実用上は、試料４２への入射位置でのパルス励起光の強度に対し概ね１／２の強度になる位置までの領域に拡散反射部４４を設ければよい。この場合、試料４２の１ｃｍ当りの光学濃度をＯＤとすると、光量が１／２になる距離ｄ（ｃｍ）は下記（１）式で近似的に表される。例えば、ＯＤ＝３である場合、ｄ＝０.１ｃｍであるから、約１ｍｍの大きさの拡散反射部４４を設ければよい。
【００３３】
【数１】
0006564661.tif 000002
【００３４】
なお、検出器１６に替えて撮像器を配置し、試料９０における蛍光発生領域を撮像器により撮像した結果に基づいて、装置応答関数測定用部材２０において拡散反射部２２が設けられる領域を決定するのも好ましい。
【００３５】
次に、本実施形態の蛍光測定方法について説明する。本実施形態の蛍光測定方法は、上記のような装置応答関数測定方法により求めた装置応答関数と、試料９０中の蛍光色素から発生した蛍光について検出器１６による検出結果とに基づいて、蛍光減衰曲線または蛍光寿命値を求めるものであり、処理部１７により以下のようにして行われる。
【００３６】
装置応答関数測定方法により測定された装置応答関数をＥ(t)とする。試料９０中の蛍光色素から発生した蛍光について検出器１６により測定された蛍光減衰曲線をＦ(ｔ)とする。ｔは時間変数である。
【００３７】
また、試料９０中にｎ種類の蛍光分子種が存在する可能性があるとし、これらｎ種類の蛍光分子種のうち第ｉの蛍光分子種の成分量をＡｉとするとともに蛍光寿命値をτｉとする。なお、蛍光分子種とは、試料中に存在する蛍光を発する個々の分子種を意味する。試料中で蛍光色素が単一の分子種として存在する場合、単純に蛍光色素そのものを蛍光分子種と見なすことができる。一方、例えば、タンパク質に結合した蛍光色素のように、蛍光色素が様々な分子種として存在し得る場合は、１つの蛍光色素であっても複数の蛍光分子種を持つ。これらｎ種類の蛍光分子種から発生する蛍光の減衰曲線Ｇ(ｔ)は、下記（２）式で表わされる。
【００３８】
【数２】
0006564661.tif 000003
【００３９】
装置応答関数がＥ(ｔ)である蛍光測定装置を用いて蛍光減衰曲線Ｇ(ｔ)を測定したとき、その測定により得られる蛍光減衰曲線Ｉ(ｔ)は、Ｅ(ｔ)とＧ(ｔ)とのコンボリューションにより下記（３）式で表される。この式中のＣは装置の暗雑音を表す。
【００４０】
【数３】
0006564661.tif 000004
【００４１】
このＩ(ｔ)をＦ(ｔ)にフィッティングすることにより、試料９０中に存在する第ｉの蛍光分子種の成分量Ａｉおよび蛍光寿命値τｉを求める。すなわち、非線形最適化法により、下記（４）式で表されるχ２値が最小となるときの成分量Ａｉおよび蛍光寿命値τｉを求める。ここで、ｍ１およびｍ２は、フィッティングを行う時間範囲を表す。
【００４２】
【数４】
0006564661.tif 000005
【００４３】
次に、比較例と対比しつつ実施例について説明する。実施例および比較例において、蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）で染色したＡβアミロイドを試料として用いた。この試料におけるＴｈＴ濃度は５μＭであった。励起波長４０５ｎｍにおける試料の光学濃度ＯＤ値は０.６である。濃度５μＭのＴｈＴの蛍光減衰曲線の半値全幅は２１５ｐｓである。
【００４４】
実施例では、上記（１）式にＯＤ＝０.６を代入して得られるｄ＝５ｍｍの大きさの拡散反射部２２を有する装置応答関数測定用部材２０を作製し、この装置応答関数測定用部材２０を図３に示されるように蛍光測定装置１０に配置して装置応答関数を測定した。基板２１はガラス基板であり、拡散反射部２２はアルミドットであった。比較例では、非特許文献１に記載されている散乱体溶液であるＲｕｄｏｘ懸濁液（シリカの懸濁水溶液）を用いて装置応答関数を測定した。
【００４５】
図６は、実施例および比較例それぞれで得られた装置応答関数を示す図である。この図に示されるように、実施例で得られた装置応答関数の半値全幅（２０４ｐｓ）は、比較例で得られた装置応答関数の半値全幅（２３１ｐｓ）より小さい。
【００４６】
試料を図１に示されるように蛍光測定装置１０に配置して、パルス励起光照射により試料で発生する蛍光を検出器１６により検出した。蛍光を受光した検出器１６から出力された電気信号を処理部１７へ送り、蛍光減衰曲線を得た。そして、試料中に４種類の蛍光分子種が含まれると仮定して、上記の蛍光測定方法により４種類の蛍光分子種それぞれの成分量および蛍光寿命値を求めた。
【００４７】
図７は、実施例および比較例で得られた４種類の蛍光分子種それぞれの成分量および蛍光寿命値を纏めた表である。Ｒｕｄｏｘ懸濁液を用いた比較例では、得られた装置応答関数が不正確であることから、フィッティングの程度の目安であるχ２値が１０以上と大きく、フィッティングとしては不適合であり、或る蛍光分子種の成分量が負値になるなど、信頼性が低い結果となった。これに対して、本実施形態の装置応答関数測定用部材を用いた実施例では、正確な装置応答関数を測定することができたことにより、χ２値が１.４と小さく、各蛍光分子種の成分量が妥当であり、信頼性が高い結果が得られた。
【００４８】
このような本実施例の効果は、装置応答関数を測定する際に用いられる装置応答関数測定用部材において拡散反射部が設けられる領域が試料における蛍光発生領域に対応したものであること、および、拡散反射部以外の他の箇所からの反射光が検出器１６に入射しないようにしたことにより、実現されたものである。
【符号の説明】
【００４９】
１０…蛍光測定装置、１１…試料室、１２〜１４…開口部、１５…励起光源、１６…検出器、１７…処理部、１８，１９…光トラップ、２０…装置応答関数測定用部材、２１…基板、２２…拡散反射部、２３…ベース部、３１…容器、３２…試料、３３…基板、３４…拡散反射部、４１…容器、４２…試料、４３…基板、４４…拡散反射部、９０…試料、ＬＥ，ＬＥ１，ＬＥ２…パルス励起光、ＬＦ…蛍光、ＬＲ…鏡面反射光、ＬＳ…拡散反射光、ＬＴ…透過光。
【図１】
0006564661.tif 000006
【図２】
0006564661.tif 000007
【図３】
0006564661.tif 000008
【図４】
0006564661.tif 000009
【図５】
0006564661.tif 000010
【図６】
0006564661.tif 000011
【図７】
0006564661.tif 000012