(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）のＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ菌）を有効成分とする多機能性ＣＤ８Ｔ細胞活性化用結核ワクチン。
【請求項２】
前記ＢＣＧ菌が、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入したＢＣＧ菌である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターである、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチンと、
マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）のＡｇ８５Ｂタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチンで初回免疫を行い、前記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン及びプライムブーストワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核をはじめとして、エボラ出血熱、クリミア・コンゴ熱、南米出血熱、マールブルグ病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マラリア等の様々な重症感染症が知られている。
【０００３】
これらの重症感染症には、有効なワクチンが存在しないものも多い。また、結核ワクチンとして広く用いられている、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチンについても、乳幼児結核と結核性髄膜炎の予防効果は認められているものの、成人の肺結核予防に関しては否定的な見解が存在する（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
したがって、感染症に対するより効果的なワクチンが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Andersen P., Tuberculosis vaccines - an update., Nat. Rev. Microbiol., 5(7), 484-7, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
例えば結核菌のような細胞内寄生菌に対する感染防御には、細胞性免疫が重要である。これに対し、発明者らは、ＢＣＧワクチンによる免疫によって活性化される抗原特異的Ｔ細胞は、主にＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）であり、細胞性免疫に重要なＣＤ８陽性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）はほとんど活性化されないことを見出した。
【０００７】
そこで、本発明は、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の通りである。
（１）病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチン。
（２）前記ＢＣＧ菌が、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入したＢＣＧ菌である、（１）に記載のワクチン。
（３）前記発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターである、（１）又は（２）に記載のワクチン。
（４）結核ワクチンである、（１）〜（３）のいずれかに記載のワクチン。
（５）前記タンパク質が、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）のＡｇ８５Ｂタンパク質である、（１）〜（４）のいずれかに記載のワクチン。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のワクチンと、前記ワクチンの有効成分であるＢＣＧ菌に発現させたタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、（１）〜（５）のいずれかに記載のワクチンで初回免疫を行い、前記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチン。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）全単核細胞群、（ｂ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群、並びに（ｃ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群における、インターフェロン−γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。
【図２】（ａ）は、ｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターの構造を示す図である。
【図３】Ａｇ８５Ｂタンパク質の発現を検討したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図４】（ａ）は、ＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、２９３Ｔ細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５】フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図６】各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。
【図７】（ａ）は、各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞を更に詳細に解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果を円グラフにしたものである。
【図８】各サイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。
【図９】細胞内サイトカイン解析の結果をまとめたグラフである。
【図１０】（ａ）、（ｂ）は、細胞内サイトカイン解析の結果をまとめたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１実施形態において、本発明は、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を有効成分とするＣＤ８Ｔ細胞活性化用ワクチンを提供する。
【００１２】
後述するように、本実施形態のワクチンによれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する（誘導する）ことができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化とは、ワクチンを投与した（免疫した）生体に、上記の病原微生物由来のタンパク質に暴露すると特定のサイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞を形成させることを意味する。したがって、本実施形態のワクチンは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤であるともいえる。上記サイトカインとしては、例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α等が挙げられる。
【００１３】
（病原微生物）
本実施形態のワクチンが対象とする病原微生物には特に制限はない。本実施形態のワクチンは、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるため、効果的なワクチンを得ることが困難とされる病原微生物にも適用することができる。
【００１４】
したがって、病原微生物は、効果的なワクチンを得ることが困難とされる病原微生物であってもよく、例えば、結核の原因菌である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エボラ出血熱の原因ウイルスであるエボラ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ熱の原因ウイルスであるクリミア・コンゴウイルス、南米出血熱の原因ウイルスであるフニンウイルス、サビアウイルス、ガナリトウイルス、マチュポウイルス等のアレナウイルス科のウイルス、マールブルグ病の原因ウイルスであるマールブルグウイルス、マラリアの原因微生物であるマラリア原虫、及び、例えば弱毒株等の、上記の病原微生物の類縁微生物等が挙げられる。
【００１５】
本実施形態のワクチンにおいて、ＢＣＧ菌に発現させる病原微生物由来のタンパク質としては、例えば、上記の病原微生物が感染した場合に発現量の高いタンパク質が挙げられる。より具体的には、結核菌のＡｇ８５Ｂタンパク質、結核菌と同じ抗酸菌であるマイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質、エボラ出血熱ウイルスのエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１４０タンパク質、マラリア原虫のマラリア抗原タンパク質等が挙げられる。
【００１６】
本実施形態のワクチンによれば、ＢＣＧ菌で発現させる病原微生物由来のタンパク質を変更することにより、多種多様な病原微生物に対するワクチンを容易に提供することができる。例えば、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌は、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が可能な結核ワクチンとして使用することができる。
【００１７】
本実施形態のワクチンでは、病原微生物由来のタンパク質を発現させる宿主としてＢＣＧ菌を使用する。ＢＣＧ菌はワクチンとして長年ヒトに接種されてきた実績があり、安全性も確立されているため、本実施形態のワクチンにより、安全なワクチンを簡便に提供することができる。
【００１８】
また、本実施形態のワクチンでは、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を用いることにより、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができる。これに対し、単に病原微生物由来のタンパク質をワクチンとして投与しても、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を効果的に活性化することは困難である。
【００１９】
発明者らは、本実施形態のワクチンの投与によりＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができる理由について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化には、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌が生体内でマクロファージ等の食細胞に貪食され、病原微生物由来タンパク質が細胞中で適切なプロセッシングを受けたうえで抗原提示されることが重要であるためではないかと推測している。
【００２０】
更に、後述するように、本実施形態のワクチンにより、１個の細胞が複数種類のサイトカインを産生する能力、すなわち多機能性を有する、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。多機能性を有するＴ細胞は感染防御能に優れているため、本実施形態のワクチンにより、高い感染防御能を付与することができる。
【００２１】
（発現ベクター）
ＢＣＧ菌を宿主とした病原微生物由来のタンパク質の発現は、ＢＣＧ菌に、病原微生物由来のタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターを導入することにより行うことが好ましい。これにより、ＢＣＧ菌を宿主として病原微生物由来のタンパク質の発現を容易に行うことができる。また、適切なプロモーターを選択したり、エンハンサーを組み合わせたりすることにより、病原微生物由来のタンパク質の発現量を増加させることができる。
【００２２】
また、発現ベクターは、ＢＣＧ菌のゲノムに導入されるのではなく、ＢＣＧ菌内でプラスミドの形態で維持されるものであることが好ましい。これにより、病原微生物由来のタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の品質が安定するため、本実施形態のワクチンの品質管理が容易になる。
【００２３】
ＢＣＧ菌でタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、例えばマイコバクテリウムフォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来のｐＡＬ５０００等が挙げられる。
【００２４】
上記の発現ベクターは、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能な発現ベクターであることが更に好ましい。生体内に投与されたＢＣＧ菌は、マクロファージ等の食細胞に貪食され破壊される。そこで、ＢＣＧ菌の破壊により放出された発現ベクターが、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方で発現が可能なものであると、マクロファージ等の細胞内においても病原微生物由来のタンパク質の発現が継続される。この結果、より多くの病原微生物由来のタンパク質が生体内に供給されることとなり、より効果的に免疫を確立することができる。
【００２５】
本実施形態のワクチンは皮内投与することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり２×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）程度でよい。
【００２６】
（プライムブーストワクチン）
１実施形態において、本発明は、上記ワクチンと、上記ワクチンの有効成分であるＢＣＧ菌に発現させたタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンとの組み合わせからなり、上記ワクチンで初回免疫を行い、上記ＤＮＡワクチンで追加免疫を行うように用いられることを特徴とする、プライムブーストワクチンを提供する。
【００２７】
プライムブーストワクチンとは、初回免疫に用いたワクチンとは別のワクチンで１回以上の追加免疫を行うワクチンの組み合わせ、又はこのようなワクチン投与方法を意味する。
【００２８】
また、ＤＮＡワクチンとは、生体内に投与するとタンパク質に翻訳され、そのタンパク質が免疫の成立に寄与するワクチンである。
【００２９】
本実施形態のプライムブーストワクチンは、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させた組換えＢＣＧ菌で初回免疫を行い、Ａｇ８５Ｂタンパク質の発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンで追加免疫を行うものである。
【００３０】
組換えＢＣＧ菌は皮内投与することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり２×１０６ＣＦＵ程度が挙げられる。
【００３１】
また、ＤＮＡワクチンは筋肉注射することが好ましい。また、投与量は、投与対象により適宜調整すればよいが、例えばマウスの場合には、１頭あたり１００μｇ程度が挙げられる。
【００３２】
ワクチン投与のスケジュールも適宜調整すればよいが、例えば、組換えＢＣＧ菌による初回免疫から３週間後にＤＮＡワクチンによる１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にＤＮＡワクチンによる２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にＤＮＡワクチンによる３回目の追加免疫を行うスケジュール等が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３４】
［実験例１］
モルモットをＢＣＧ菌で免疫し、精製ツベルクリン（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ、以下「ＰＰＤ」という場合がある。）特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＰＰＤ特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
【００３５】
（免疫）
モルモット（日本エスエルシー株式会社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から１２週間後に採血して検討を行った。
【００３６】
（ＥＬＩＳＰＯＴ法によるインターフェロン−γ産生細胞の検出）
採血した血液を、血球分離溶液（商品名「リンホセパール」、タカラバイオ株式会社）を用いた密度勾配遠心により遠心し、末梢血単核細胞を回収した。続いて、細胞ベースの酵素免疫スポット測定法（ＥＬＩＳＰＯＴ）により、回収した末梢血単核細胞中のインターフェロン−γ産生細胞の割合を測定した。
【００３７】
具体的には、まず、回収した末梢血単核細胞を4つの群に分けた。第１の群（全単核細胞群）はそのまま次の操作に用いた。第２の群（ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。第３の群（ＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。第4の群（ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群）からは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去して次の操作に用いた。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の除去又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去は、セルソーターを用いて行った。
【００３８】
続いて、各群の細胞の培地にＰＰＤ  １μｇ／ｍＬを添加して刺激し、２０時間後に次の操作に用いた。陰性対照として、ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加した群も準備した。また、陽性対照として、ＰＰＤの代わりにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）１μｇ／ｍＬを添加した群も準備した。
【００３９】
続いて、抗インターフェロン−γ抗体を結合させたＰＶＤＦ膜底の９６ウェルマイクロタイタープレートに培地及び上記の各群の細胞を添加し、５時間インキュベートした。この結果、細胞がインターフェロン−γを分泌すると、分泌されたインターフェロン−γが細胞近傍に存在する抗インターフェロン−γ抗体と結合する。その後、細胞を洗い流し、メンブレン上に結合したインターフェロン−γを免疫染色により検出した。その結果、インターフェロン−γ産生細胞が存在していたメンブレン上の部分には、インターフェロン−γの存在を示すスポットが形成された。１つのスポットが１個のインターフェロン−γ産生細胞に対応する。そこで、スポットの数を測定することにより、インターフェロン−γ産生細胞の存在割合を測定することができる。
【００４０】
図１は、全単核細胞群（図１（ａ））、ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群（図１（ｂ））、並びにＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群（図１（ｃ））のインターフェロン−γ産生細胞の存在割合を示すグラフである。
【００４１】
図１（ａ）に示すように、全単核細胞群では、ＰＰＤで刺激するとインターフェロン−γを産生する細胞が誘導されたことが示された。また、図１（ｂ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去すると、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン−γを産生する細胞が大幅に減少することが示された。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去しても、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン−γを産生する細胞の数はほとんど変わらなかった。また、図１（ｂ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去すると、ＰＰＤ刺激によりインターフェロン−γを産生する細胞が大幅に減少することが示された。
【００４２】
以上の結果から、ＢＣＧ菌による免疫の結果誘導されるＰＰＤ特異的なインターフェロン−γ産生細胞は主にＣＤ４陽性Ｔ細胞であり、ＰＰＤ特異的なインターフェロン−γ産生ＣＤ８陽性Ｔ細胞はあまり誘導されていないことが明らかとなった。
【００４３】
［実験例２］
マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質の発現ベクターを作製した。
【００４４】
（ｐ３ＨＡ８５Ｂベクター）
ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現することが可能な発現ベクターであるｐ３ＨＡ８５Ｂを作製した。ｐ３ＨＡ８５Ｂは、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）の上流に、ＢＣＧ菌で作動可能であるｐＡＬ５０００プロモーターを有しており、ｐＡＬ５０００プロモーターの上流に、哺乳動物細胞で作動可能であるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとＨＴＬＶ−１プロモーターを有している。さらに、Ａｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子の下流にｐｏｌｙＡシグナル遺伝子を組み込んだ。図２（ａ）にｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの構造を示す。
【００４５】
（ｐＤＮＡ８５Ｂベクター）
哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現することが可能な発現ベクターである、ｐＤＮＡ８５Ｂを作製した。ｐＤＮＡ８５Ｂは、Ａｇ８５Ｂタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）の上流に、哺乳動物細胞で作動可能であるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有している。図２（ｂ）にｐＤＮＡ８５Ｂベクターの構造を示す。
【００４６】
［実験例３］
発現ベクターｐ３ＨＡ８５ＢをＢＣＧ菌に導入し、マイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を作製した。続いて、ウエスタンブロッティングによりＡｇ８５Ｂタンパク質の発現を確認した。
【００４７】
（ｐ３ＨＡ８５ＢのＢＣＧ菌への導入）
エレクトロポレーション法により、発現ベクターｐ３ＨＡ８５ＢをＢＣＧ菌に導入した。続いて、カナマイシン耐性を指標として、ｐ３ＨＡ８５Ｂが導入されたＢＣＧ菌を選択し、クローニングして、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌を作製した。
【００４８】
（ウエスタンブロッティング）
Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌及び対照である通常のＢＣＧ菌をそれぞれＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて溶解した。
【００４９】
続いて、ＲＣ  ＤＣ  プロテインアッセイ  （Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用いてタンパク量を定量し、同量のタンパクを４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて電気泳動した。
【００５０】
続いて、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に転写し、抗Ａｇ８５Ｂ抗体で免疫染色した。二次抗体にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。シグナルの検出にはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。
【００５１】
図３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１は対照のＢＣＧ菌の結果であり、レーン２は、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌の結果である。なお、ここで使用した抗Ａｇ８５Ｂ抗体は、ＢＣＧ菌のＡｇ８５Ｂタンパク質及びマイコバクテリウム・カンサシイのＡｇ８５Ｂタンパク質の双方に結合するものである。
【００５２】
その結果、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂの導入により、ＢＣＧ菌によるＡｇ８５Ｂタンパク質の発現が５０〜１００倍増強したことが確認された。
【００５３】
［実験例４］
発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂにより、哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質の発現が可能か否かを検討した。
【００５４】
ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞に、遺伝子導入試薬（商品名「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００」、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｐ３ＨＡ８５Ｂを導入して発現させた。
【００５５】
続いて、実験例３と同様にしてウエスタンブロッティングによりＡｇ８５Ｂタンパク質の発現を確認した。陽性対照として、実験例３でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させたＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングも行った。
【００５６】
図４（ａ）は、陽性対照であるＢＣＧ菌のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１は陽性対照であるＢＣＧ菌の結果である。また、レーン２は、リコンビナントＡｇ８５Ｂタンパク質をウエスタンブロッティングに供した結果である。また、レーン３は、広く交差反応することが知られているリコンビナントＭＰＢ５９タンパク質をウエスタンブロッティングに供した結果である。
【００５７】
図４（ｂ）は、２９３Ｔ細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン３は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。レーン４は、陰性対照として空のベクターｐ３Ｈ８．３のみを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。レーン５は、陰性対照としてＰＢＳのみをウエスタンブロッティングに供した結果である。また、レーン１及びレーン２は、実験例２で作製したｐＤＮＡ８５Ｂを導入した２９３Ｔ細胞の結果である。
【００５８】
その結果、ｐ３ＨＡ８５Ｂベクターの導入により、ＢＣＧ菌及び哺乳動物細胞の双方において、Ａｇ８５Ｂタンパク質を発現させることが可能であることが確認された。また、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターによって、哺乳動物細胞でＡｇ８５Ｂタンパク質を発現させることが可能であることが確認された。
【００５９】
［実験例５］
マウスをＢＣＧ菌で免疫し、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
【００６０】
（免疫）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
【００６１】
（細胞内サイトカイン解析）
上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２−メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ  １Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で６時間抗原刺激した。抗原としては、１０μｇ／ｍＬのＰＰＤを使用した。
【００６２】
続いて細胞を回収し、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥ−ｃｙ７標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰｅｒＣＰ  ｃｙ５．５標識抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞表面を染色した。更に、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を処理し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ＴＮＦ−α抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥ標識抗インターフェロン−γ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗インターロイキン−２抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖ５００標識抗ＭＩＰ−１α抗体（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞内サイトカインを染色した。染色した細胞はＦＡＣＳｖｅｒｓｅソフトウエア（ＢＤ  ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社）及びＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を用いて解析した。図５は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【００６３】
図６は、各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で刺激した細胞を陰性対照として使用した。その結果、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されたことが示された。
【００６４】
図７（ａ）は、各サイトカインを産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞を更に詳細に解析した結果を示すグラフである。図中、Ｌはインターロイキン−２を表し、Ｇはインターフェロン−γを表し、ＭはＭＩＰ−１αを表し、ＴはＴＮＦ−αを表す。また、「＋」は陽性であることを表し、「−」は陰性であることを表す。その結果、１個のＣＤ４陽性Ｔ細胞が、１〜４種類のサイトカインを産生していることが明らかとなった。すなわち、ＢＣＧ菌による免疫によって多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されたことが示された。また、図７（ｂ）は、図７（ａ）の結果を円グラフにしたものである。
【００６５】
図８は、各サイトカインを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合を示すグラフである。ＰＰＤの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で刺激した細胞を陰性対照として使用した。その結果、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はほとんど誘導されないことが示された。
【００６６】
以上の結果から、ＢＣＧ菌による免疫によって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が誘導されるものの、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はほとんど誘導されないことが明らかとなった。また、誘導されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は多機能性であることが確認された。
【００６７】
［実験例６］
マウスをＢＣＧ菌、又は発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫し、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されるか否かを検討した。
【００６８】
（免疫）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエンタル酵母社）に、２×１０６ＣＦＵ／匹のＢＣＧ菌、又は発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を皮内投与した。免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
【００６９】
（細胞内サイトカイン解析）
上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２−メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ  １Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間抗原刺激した。抗原としては、１０μｇ／ｍＬのＰＰＤを使用した。陰性対照として、抗原刺激を行わない細胞を使用した。
【００７０】
続いて細胞を回収し、実験例５と同様にしてフローサイトメトリーにより細胞内サイトカイン解析を行った。
【００７１】
図９は、解析結果をまとめたグラフである。図中、「組換えＢＣＧ」は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群を意味する。その結果、抗原刺激を行わない場合には、多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞及び多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在は認められなかった。また、抗原刺激を行った結果、ＢＣＧ菌で免疫した群からは多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在が認められなかったのに対し、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群からは多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在が認められた。
【００７２】
また、抗原刺激を行った結果、ＢＣＧ菌で免疫した群、及び発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で免疫した群のいずれにおいても多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在が認められた。
【００７３】
以上の結果から、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を用いた免疫により、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができることが明らかとなった。
【００７４】
［実験例７］
発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で初回免疫を行い、ｐＤＮＡ８５Ｂベクター（ＤＮＡワクチン）で追加免疫を行うプライムブーストワクチンによりマウスを免疫し、多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を検討した。対照としては、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスを用いた。
【００７５】
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエンタル酵母社）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母社）に、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌を、それぞれ１頭あたり２×１０６ＣＦＵずつ皮内投与して初回免疫を行った。続いて、３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して３回目の追加免疫を行った。３回目の追加免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
【００７６】
対象として、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスを用いた。具体的には、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して初回免疫を行った。続いて、３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して１回目の追加免疫を行い、更に３週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して２回目の追加免疫を行い、更に２週間後にｐＤＮＡ８５Ｂベクターを１頭あたり１００μｇずつ筋肉注射して３回目の追加免疫を行った。３回目の追加免疫から３週間後に解剖して検討を行った。
【００７７】
（細胞内サイトカイン解析）
上記の免疫マウスから脾臓細胞を分離し、ウシ胎児血清１０ｖ／ｖ％、２−メルカプトエタノール、ＤＮａｓｅ  １Ｕ／ｍＬ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間抗原刺激した。抗原としては、下記表１に示す、Ａｇ８５Ｂタンパク質のプールペプチド（プール１〜プール６）をそれぞれ使用した。抗原刺激にあたり、プールペプチドは２．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、陰性対照として、抗原刺激を行わない細胞を使用した。続いて細胞を回収し、実験例５と同様にしてフローサイトメトリーにより細胞内サイトカイン解析を行った。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
図１０（ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの解析結果をまとめたグラフである。図１０（ｂ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの解析結果をまとめたグラフである。図中、「組換えＢＣＧ−ＤＮＡ」は、発現ベクターｐ３ＨＡ８５Ｂを導入したＢＣＧ菌で初回免疫し、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターで追加免疫した群（プライムブースト免疫した群）を意味する。また、「ＤＮＡ」は、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫した群を意味する。
【００８０】
その結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウスのいずれの脾臓細胞においても、抗原刺激を行わない場合には、多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞及び多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在はほとんど認められなかった。
【００８１】
また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓細胞において、抗原刺激を行った場合には、プライムブースト免疫したマウスのほうが、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスよりも多機能性のＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在割合が高かった（プール２、５、６等）。
【００８２】
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞において、抗原刺激を行った場合には、プライムブースト免疫したマウスのほうが、ｐＤＮＡ８５Ｂベクターのみで免疫したマウスよりも多機能性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在割合が高かった（プール２等）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、病原微生物由来抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができるワクチンを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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