(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（１）核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体を用いて標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基を測定すること
を含み、
核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること
により行われる、
修飾核酸塩基の測定方法。
【請求項２】
標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸サンプルを含有する溶液に異種核酸プローブを添加して、核酸サンプルおよび異種核酸プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
異種核酸プローブがＲＮＡプローブである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、異種核酸プローブが設計される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、異種核酸プローブが設計される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）ＲＮＡプローブ；および
（ＩＩ）標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体。
【請求項１２】
ＲＮＡプローブが固相への固定を可能にする物質または基で標識されている、請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸塩基の測定方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出において、ビオチン等の物質が人工的に導入された核酸塩基を、抗体を利用したイムノアッセイで検出する技術が、これまでに多数報告されている。また、天然に存在する修飾核酸塩基（例、メチルシトシン、ヒドロキシルメチルシトシン）をイムノアッセイで検出する技術も報告されている（特許文献１、及び非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２３００１９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，３７−４２（２００６）
【非特許文献２】Ｋｕｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０１２，８４，７５３３−７５３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記のような修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系を構築するにあたり、修飾核酸塩基に対する抗体の同種核酸プローブ（標的核酸と同種の核酸から構成されるプローブ）に対する非特異的な結合により、検出シグナルのバックグラウンド値が高くなるという課題が存在することを見出した。したがって、高感度のイムノアッセイ系の構築のためには、バックグラウンド値を抑制する技術の開発が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定において、同種核酸プローブの代わりに異種核酸プローブ（標的核酸に対して異種の核酸から構成されるプローブ）を用いることによりバックグランド値を抑制することなどに成功し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記核酸サンプルを含有する溶液に異種核酸プローブを添加して、核酸サンプルおよび異種核酸プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕異種核酸プローブがＲＮＡプローブである、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、異種核酸プローブが設計される、〔２〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、異種核酸プローブが設計される、〔２〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）異種核酸プローブ；および
（ＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法およびキットによれば、検出シグナルのバックグランド値の低減により、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の方法による標的核酸中の修飾核酸塩基の測定概要の一例を示す図である。Ｒ−Ｎ：修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｎ：核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｒ：核酸塩基が有する置換基。
【図２】図２は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（ノーマルＲＮＡもしくは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。
【図３】図３は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸および核酸プローブは、図２と同様である。Ｓ／Ｎにおいて、Ｓは、標的核酸（＋）、核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示し、Ｎは、標的核酸（−）、核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す。
【図４】図４は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する各種抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。用いた抗体クローンは、次のとおりである。Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３−Ｎ：抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製）；Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３−Ｍ：抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）；Ｃｌｏｎｅ１６２  ３３  Ｄ３：抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）；Ｃｌｏｎｅ１０Ｇ４：抗メチルシトシン抗体（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）。
【図５】図５は、修飾核酸塩基に対する各種抗体および核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸、核酸プローブおよび抗体クローンは、図４と同様である。Ｓ／Ｎは、図３と同様である。
【図６】図６は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（ノーマルＲＮＡもしくは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。
【図７】図７は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸および核酸プローブは、図６と同様である。
【図８】図８は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。
【図９】図９は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸および核酸プローブは、図８と同様である。
【図１０】図１０は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。
【図１１】図１１は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸および核酸プローブは、図１０と同様である。
【図１２】図１２は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（−）、異種または同種の核酸プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。標的核酸：ＤＮＡ；核酸プローブ：異種核酸プローブ（２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）または同種核酸プローブ（ＤＮＡ）。
【図１３】図１３は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた標的核酸および核酸プローブは、図１２と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
【００１１】
核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有するサンプル、または当該標的核酸を含有すると疑われるサンプルである。核酸サンプルはまた、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含有する可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。このようなサンプルは、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。
【００１２】
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、ＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域（例、転写調節領域）である。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、異種核酸プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸が含む修飾核酸塩基の数は、１個以上（例、１〜１００個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個）であれば特に限定されない。
【００１３】
本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４〜６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
【００１４】
修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ  Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ２：Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５−カルボキシルシトシン）である。より好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
【００１５】
異種核酸プローブは、標的核酸に対して異種の核酸から構成され、かつハイブリダイゼーションにより標的核酸を検出可能なプローブである。ここで、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として異種核酸プローブが有することを意味する。したがって、異種核酸プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、異種核酸プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、異種核酸プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。標的核酸としてはＤＮＡが好ましいことから、異種核酸プローブは、好ましくは、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブである。
【００１６】
異種核酸プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１〜Ｃ６アルキル化のＣ１〜Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１〜６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル）、ブチル基（例、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブである。
【００１７】
異種核酸プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、異種核酸プローブの長さ）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。異種核酸プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。このような異種核酸プローブは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
【００１８】
異種核酸プローブは、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、異種核酸プローブは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（異種核酸プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（異種核酸プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、捕捉プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。
【００１９】
工程（１）において、インキュベートは、核酸サンプル中に標的核酸が含まれる場合に異種核酸プローブ（遊離、または後述する固相に固定）と核酸サンプル中の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応が可能である条件下で適切な溶液中で行われる。このような溶液としては、例えば、塩（例、クエン酸ナトリウム）およびその他の成分（例、界面活性剤）を含む緩衝液を用いることができる。ハイブリダイゼーション温度は、例えば１５〜９５℃（好ましくは２５〜６５℃）である。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートしても、異種核酸ハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸および異種核酸プローブが反応して、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸および異種核酸プローブが反応して、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
【００２０】
本発明において、異種核酸ハイブリッドは、ハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸および異種核酸プローブの二本鎖構造を有するハイブリダイゼーション複合体である。異種核酸ハイブリッドの構造の例は、以下の表１に記載されるとおりである。二本鎖構造は、（ａ）に示されるように、標的核酸および異種核酸プローブの全体領域で形成されていてもよい。二本鎖構造はまた、（ｂ）〜（ｉ）に示されるように、標的核酸または異種核酸プローブの一部領域で形成されていてもよい。例えば、異種核酸ハイブリッドは、二本鎖構造に加えて、５’末端領域または３’末端領域のいずれかに標的核酸の一本鎖構造を有していてもよく〔例、（ｂ）〜（ｅ）〕、また、５’末端領域および３’末端領域の双方に標的核酸の一本鎖構造を有していてもよい〔例、（ｉ）〕。異種核酸ハイブリッドはまた、二本鎖構造に加えて、５’末端領域または３’末端領域のいずれかに異種核酸プローブの一本鎖構造を有していてもよく〔例、（ｂ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）〕、また、５’末端領域および３’末端領域の双方に標的核酸の一本鎖構造を有していてもよい〔例、（ｈ）〕。一本鎖構造は、異種核酸ハイブリッドを形成した標的核酸または異種核酸プローブのいずれか一方または双方が５’末端および／または３’末端において、１個以上のヌクレオチド残基の非ハイブリダイズ領域を有することにより形成される構造である。
【００２１】
【表１】
0006451632.tif 000002
【００２２】
異種核酸ハイブリッドにおいて、二本鎖構造部分に対応する標的核酸および異種核酸プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、二本鎖構造部分の長さ）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。二本鎖構造部分に対応する標的核酸および異種核酸プローブのヌクレオチド残基の個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。
【００２３】
異種核酸ハイブリッドにおいて、その５’末端領域または３’末端領域の一本鎖構造部分に対応する標的核酸および異種核酸プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、各一本鎖構造部分の長さ）は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または５０個以上である。このような個数はまた、特に限定されないが、例えば、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。異種核酸プローブは、このような一本鎖構造部分を異種核酸ハイブリッドにおいて５’末端領域または３’末端領域に形成するように設計されてもよい。
【００２４】
一実施形態では、異種核酸プローブは、異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように設計されてもよい。修飾核酸塩基の不対部分は、抗体による修飾核酸塩基の検出を容易にするために導入され得る。このような不対部分の形成のためには、例えば、二本鎖構造部分において、標的核酸に対して完全には相補的ではないヌクレオチド配列を有する異種核酸プローブを使用すればよい。
【００２５】
異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される異種核酸プローブの一例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して相補的なヌクレオチド残基を欠落する異種核酸プローブである〔例、表２の（Ｉ）〕。このような異種核酸プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に相補的な１個のヌクレオチド残基のみを欠落するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ−１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個）の隣接ヌクレオチド残基を欠落するものであってもよい〔例、表２の（Ｉ−２）〕。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の不対部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。なお、このような核酸プローブについては、例えば、特許文献１および非特許文献２を参照のこと。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
【００２６】
【表２】
0006451632.tif 000003
【００２７】
異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される異種核酸プローブの別の例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して非相補的なヌクレオチド残基を有する異種核酸プローブである〔例、表２の（Ｉ’）〕。このような異種核酸プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に非相補的な１個のヌクレオチド残基のみを有するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ’−１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個）の隣接ヌクレオチド残基が非相補的なものであってもよい〔例、表２の（Ｉ’−２）〕。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
【００２８】
【表３】
0006451632.tif 000004
【００２９】
別の実施形態では、異種核酸プローブは、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように設計されてもよい。異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）において、修飾核酸塩基は、５’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩ）〕、５’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩＩ）〕、３’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＶ）〕、または３’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（Ｖ）〕、あるいはこれらの２つ、３つまたは４つの組合せであってもよい。異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）が修飾核酸塩基をこのような様式で含むように、異種核酸プローブが設計されてもよい。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の一本鎖構造部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。あるいは、異種核酸プローブは、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在し、かつ、上述したように、異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分がさらに形成されるように設計されてもよい。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
【００３０】
【表４】
0006451632.tif 000005
【００３１】
本発明の方法は、核酸サンプルを含有する溶液に異種核酸プローブを添加して、核酸サンプルおよび異種核酸プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。異種核酸プローブは、固体の形態、または溶液として、核酸サンプルに添加することができる。
【００３２】
修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルから上述したインキュベーション用溶液が調製される場合、溶液中の標的核酸の濃度は、本発明の方法により検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の標的核酸の濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。例えば、本発明の方法は、溶液中の前記標的核酸の濃度が１ｎＭ以上であるときに特に優れた効果が確認されているので（実施例１を参照）、標的核酸の濃度が１ｎＭ以上であることもまた好ましい。核酸サンプル中の標的核酸の濃度は不明であることも多いので標的核酸の厳密な濃度の設定は難しい場合もあるが、核酸サンプルの種類によっては、核酸サンプルに含有され得る標的核酸の濃度を経験的にある程度予測できることがあり、また、標的核酸の濃度が判明していることもある（例えば、標的核酸のサイズおよび／または濃度が別途測定されているものの、標的核酸中の修飾核酸塩基の有無および標的核酸中の修飾核酸塩基の含有率が不明な場合）ので、そのような場合には、上記のとおり標的核酸の濃度設定を試みてもよい。
溶液中の異種核酸プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の異種核酸プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、異種核酸プローブを溶液に添加してもよい。
【００３３】
好ましい実施形態では、標的核酸は、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸であってもよい。ここで、標的核酸に含まれる可能性がある修飾核酸塩基の個数は、２以上である限り特に限定されないが、例えば、２〜３０個、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個（例、２、３、４もしくは５個）である。標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の個数が複数である場合、標的核酸と異種核酸プローブとのハイブリダイゼーションに用いられる溶液中の標的核酸が極めて低い濃度（例、０．１ｎＭ以上）であっても、修飾核酸を高感度に測定できることが確認されている。したがって、本発明の方法では、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸とハイブリダイズするように設計された異種核酸プローブを用いることができる。測定すべき標的核酸中の修飾される可能性がある核酸塩基の個数が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
【００３４】
修飾核酸塩基は、異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて測定される。測定に際しては、工程（１）で得られた溶液をそのまま用いてもよいが、抗体による修飾核酸塩基の測定により適した溶液において測定を行うため、別の溶液の添加および／または溶液の別の溶液への交換を行ってもよい。このような交換は、例えば、工程（１）で得られた溶液を固相に添加して、溶液中に含有され得る異種核酸ハイブリッドを固相に固定化し、次いで固相から溶液を除去し、必要に応じて洗浄液で洗浄した後、別の溶液（例、修飾核酸塩基に対する抗体を含有する溶液）を添加することにより行うことができる。測定に用いられる溶液は、抗原・抗体反応に適切な溶液である限り特に限定されない。
【００３５】
測定は、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
【００３６】
修飾核酸塩基に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はさらに、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイにおいて１次抗体として用いられるものであってもよく、この場合、２次抗体が併用される。
【００３７】
修飾核酸塩基に対する抗体は、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド（修飾核酸塩基および２’−デオキシリボースもしくはリボースから構成される構造単位）、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチド（修飾核酸塩基、２’−デオキシリボースもしくはリボースおよびホスフェートから構成される構造単位）、あるいは修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチド（例、２〜５個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド）に対する親和性を有していればよい。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、１）２’−デオキシ修飾アデノシン、２’−デオキシ修飾グアノシン、２’−デオキシ修飾シチジンおよび２’−デオキシ修飾チミジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオシドに対する抗体、２）２’−デオキシ修飾アデノシン  ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾グアノシン  ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾シチジン  ５’−ホスフェートおよび２’−デオキシ修飾チミジン  ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３）修飾核酸塩基を有する上記デオキシリボヌクレオチドを含む２以上のデオキシリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、例えば、１’）修飾アデノシン、修飾グアノシン、修飾シチジンおよび修飾ウリジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドに対する抗体、２’）修飾アデノシン  ５’−ホスフェート、修飾グアノシン  ５’−ホスフェート、修飾シチジン  ５’−ホスフェートおよび修飾ウリジン  ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３’）修飾核酸塩基を有する上記リボヌクレオチドを含む２以上のリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。
【００３８】
修飾核酸塩基に対する抗体は、例えば、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド、修飾核酸塩基を有するヌクレオチド、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチドと、キャリアタンパク質（例、ＢＳＡ、ＫＬＨ）との複合体を、抗原として用いて調製された、核酸の主鎖構造の少なくとも一部を認識するものを用いることができる。例えば、このような複合体を用いて調製された修飾核酸塩基に対する種々の抗体が市販されているので、本発明の方法では、市販抗体を用いてもよい。本発明の方法では、修飾核酸塩基に対する抗体はまた、例えば、下記のとおり調製されたものを用いてもよい。
例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４−８９（１９９３））、ＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
【００３９】
修飾核酸塩基に対する抗体は、固相に固定化されて用いられてもよい。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチックおよび金属等の支持体、プレート（例、マルチウェルプレート）等の容器、ならびにデバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法で２次抗体が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識されていてもよい。
【００４０】
修飾核酸塩基に対する抗体による修飾核酸塩基の測定は、定性的または定量的に行われ、修飾核酸塩基の有無または量を評価することができる。なお、本発明において、修飾核酸塩基の測定とは、修飾核酸塩基自体の測定のみならず、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定もまた意図される。
【００４１】
例えば、修飾核酸塩基の有無の測定は、以下により行われてもよい：
（２−１）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２−３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
【００４２】
また、修飾核酸塩基の量の測定は、例えば、バックグランド値の測定とともに行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２−３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２−４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
【００４３】
あるいは、修飾核酸塩基の量の測定は、標品を用いて行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２−３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡにより行われてもよい。例えば、核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、ＥＬＩＳＡによる本発明の方法は、以下により行われてもよい：
（ｉ）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルおよび第１の親和性物質で標識された異種核酸プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ）異種核酸ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定された異種核酸ハイブリッドと反応させて、１次抗体と異種核酸ハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成された異種核酸ハイブリッド（換言すれば、修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること
第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の代わりに、（ｉ’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および固相に固定された異種核酸プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された異種核酸プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された異種核酸プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ）〜（ｖ）を含む本発明の方法は、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
【００４５】
本発明はまた、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下を含む：
（Ｉ）異種核酸プローブ；および
（ＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
異種核酸プローブおよび修飾核酸塩基は、上述したとおりである。例えば、異種核酸プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
【００４６】
本発明のキットは、互いに隔離された形態または混合された形態にて各構成成分を含む。例えば、本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００４８】
実施例１：修飾核酸塩基の測定における異種核酸プローブの使用（１）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１：［Ｃ］は５−メチルシトシンを示す）、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号２、核酸の主鎖はノーマルＲＮＡまたは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、または０．０１ｐｍｏｌ）と異種核酸プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた後（核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、または０．１ｎＭであり、異種核酸プローブの濃度は５０ｎＭである）、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に異種核酸ハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３。本抗体は、５−メチルシトシンのみならず、ＤＮＡの主鎖構造（例、デオキシリボース部分およびリン酸部分の繰り返し単位から構成される構造）の少なくとも一部を認識する抗体である）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、主鎖がノーマルＲＮＡまたは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである同種核酸プローブ（配列番号３：５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’）を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
その結果、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、検出シグナルのバックグラント値を低下させ（表４、図２）、また、各濃度の標的核酸においてＳ／Ｎ値を向上させた（表５、図３）。このことは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の抗体による測定における検出感度の向上には、当該標的核酸に対して異種の核酸プローブの併用が有効であることを示す。特に、標的核酸の量が０．１ｐｍｏｌ以上であるとき（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を１ｎＭ以上にして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたとき）、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された（表５、図３）。【００４９】
【表５】
0006451632.tif 000006
【００５０】
以上より、修飾核酸塩基を含む標的核酸を抗体で測定する場合、異種核酸プローブの併用が有効であることが示された。【００５１】
実施例２：抗体クローンの差異についての検討
実施例１で用いた抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）の代わりに、１００ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）、１００ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ１６２  ３３  Ｄ３）、１０ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製、Ｃｌｏｎｅ１０Ｇ４）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験した。なお、各抗体について異なる濃度を採用した理由は、各抗体の活性が異なり、検出シグナルが大きく変わってしまうことから、同程度の検出シグナルが得られるように調整したためである。【００５２】
その結果、いずれの抗体でも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表６、図４、５）。【００５３】
【表６】
0006451632.tif 000007
【００５４】
以上より、本発明の効果は、特定の抗体クローンに限定されるものではないことが示された。【００５５】
実施例３：修飾核酸塩基の測定における異種核酸プローブの使用（２）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号４：［Ｃ］は５−メチルシトシンを示す）、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号２、核酸の主鎖はノーマルＲＮＡまたは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
また、主鎖がノーマルＲＮＡまたは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである同種核酸プローブ（配列番号３：５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’）を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。【００５６】
その結果、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように、異種核酸プローブを設計した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表７、図６、７）。また、標的核酸の量が０．１ｐｍｏｌ以上であるとき（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を１ｎＭ以上にして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたとき）、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された（表７、図７）。【００５７】
【表７】
0006451632.tif 000008
【００５８】
以上より、修飾核酸塩基を含む標的核酸を抗体で測定する場合、異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計された異種核酸プローブのみならず（実施例１）、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計された異種核酸プローブ（実施例３）もまた、有効であることが示された。【００５９】
実施例４：修飾核酸塩基の測定における異種核酸プローブの使用（３）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号５：［Ｃ］は５−メチルシトシンを示す）、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は５’−ＵＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＵＣＧＡＧＧＣＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６、核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
また、主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである同種核酸プローブ（配列番号７：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’）を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。【００６０】
その結果、実施例１および実施例３と異なる標的核酸および異種核酸プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表８、図８、９）。また、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、標的核酸が０．０１ｐｍｏｌという非常に少ない量であっても（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を０．１ｎＭにして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたときでさえも）、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブによる明確な改善が認められた。本実施例でこのような改善が認められた実験条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝３、標的核酸の量＝０．０１ｐｍｏｌ）である。一方、実施例３で改善が認められた条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝１、標的核酸の量＝０．１ｐｍｏｌ）である。つまり、修飾核酸塩基の個数の差異が３倍しかないにもかかわらず、標的核酸の量について１０１オーダーも検出感度を向上させた。以上のとおり、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、検出感度が増幅されていたことから、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された（表８、図９）。【００６１】
【表８】
0006451632.tif 000009
【００６２】
実施例５：修飾核酸塩基の測定における異種核酸プローブの使用（４）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｔ［Ｃ］ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧＧ−３’（配列番号８：［Ｃ］は５−メチルシトシンを示す）、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は５’−ＣＣＣＣＣＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号９、核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
また、主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである同種核酸プローブ（配列番号１０：５’−ＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’）を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。【００６３】
その結果、実施例１、実施例３および実施例４と異なる標的核酸および異種核酸プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表９、図１０、１１）。また、標的核酸の量が１ｐｍｏｌ以上であるとき（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を１０ｎＭ以上にして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたとき）、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された（表９、図１１）。【００６４】
【表９】
0006451632.tif 000010
【００６５】
実施例６：修飾核酸塩基の測定における異種核酸プローブの使用（５）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴ［Ｃ］ＧＴ−３’（配列番号１１：［Ｃ］は５−メチルシトシンを示す）、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は５’−ＣＡＣＵＧＡＡＣＡＡＡＵＧＧＣＡＣＵＡＧＵＡＡＡＣＵＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２、核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
また、主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである同種核酸プローブ（配列番号１３：５’−ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’）を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。【００６６】
その結果、実施例１、実施例３、実施例４および実施例５と異なる標的核酸および異種核酸プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１０、図１２、１３）。また、標的核酸の量が１ｐｍｏｌ以上であるとき（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を１０ｎＭ以上にして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたとき）、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された（表９、図１３）。【００６７】
【表１０】
0006451632.tif 000011
【００６８】
以上の実施例１、３〜６で実証されたように、本発明は、標的核酸および異種核酸プローブの種類にかかわらず、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上に有用であることが示された。【００６９】
参考例１：修飾核酸塩基を含む修飾核酸塩基の測定における同種核酸プローブの使用
以下に記載された条件で標的核酸を測定した。その他の実験条件（例、反応系の容量）は、実施例１と同様であった。
標的核酸：配列番号１のヌクレオチド配列からなる、修飾核酸塩基を含むＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）；
核酸プローブ：配列番号３のヌクレオチド配列からなる同種核酸（ＤＮＡ）プローブ（５ｐｍｏｌ）；
修飾核酸塩基に対する抗体：１００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）。
その結果、標的核酸の非存在下（標的核酸（−））において、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブの双方の存在下では、検出シグナル値は高かったが、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブのいずれかの非存在下では、検出シグナルのバックグラウンド値の低下が認められた（表６）。このことは、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブの双方の存在下で計測された高い検出シグナル値がそれらの非特異的結合に起因することを示唆する。【００７０】
【表１１】
0006451632.tif 000012
【００７１】
以上より、抗体と同種核酸プローブの非特異的結合が、検出シグナルのバックグラウンド値の非特異的な上昇を引き起こし得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の方法およびキットは、修飾核酸塩基の測定に有用である。
【図１】
0006451632.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006451632.tif 000024
【図１３】
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【配列表】
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