(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して前記抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法であって、
Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むヒトＦｃγＲＩＩＩａであり、
前記平衡化液が、塩化ナトリウム５０ｍＭから５００ｍＭ、塩化カリウム１００ｍＭから２００ｍＭ、硫酸ナトリウム１００ｍＭおよび硫酸アンモニウム１００ｍＭから選択される何れかを含む、前記分離方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質が大腸菌を形質転換して得られたヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項２に記載の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体を分離する方法に関する。特に本発明は、アフィニティーリガンドを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いた、抗体を高効率に分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造するが、近年の研究で前記抗体が、酸化、還元、異性化、糖鎖付加等の修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。
【０００３】
抗体医薬に用いる抗体の分子構造を分析する方法として、従来より、ペプチドマッピング、二次元電気泳動による分析や糖鎖の切り出しを含むＬＣ−ＭＳ分析（非特許文献１）が実施されている。しかしながらいずれの方法も非常に煩雑な操作を伴う。より簡便な抗体の分子構造の分析方法としては、クロマトグラフィーによる分析があげられる。具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、抗体を分子量に基づき分離することで凝集体や分解物を分離・定量することが可能である。またイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体分子が有する電荷の違いを分離することができる。しかしながら前述したクロマトグラフィーによる分析では、抗体分子の微小な構造変化を識別できないため、得られる分析結果は限定的であった。
【０００４】
一方、クロマトグラフィーの中でもアフィニティークロマトグラフィーによる分析は、不溶性担体に固定化されたアフィニティーリガンドと抗体との親和性に基づく分析が可能である。そのため抗体分子の微小な構造変化を識別することができる（特許文献１および非特許文献２）。しかしながら特許文献１および非特許文献２に記載の方法を用いて、工業的スケールで抗体分子を分離するのは事実上困難であり、改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１２０９２９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、７２０、２１７−２２５、１９９６
【非特許文献２】ｍＡｂｓ、５（４）、５７６−５８６、２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、アフィニティーリガンドを固定化した担体を用いた抗体の分離方法において、前記抗体を、その分子構造の違いに基づき、簡便かつ高効率に分離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、アフィニティーリガンドを固定化した不溶性担体を充填したカラムの平衡化液に一定濃度の塩化物イオンまたは硫酸イオンを添加することで、抗体の分離能が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（Ａ）から（Ｃ）の態様を包含する：
（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して前記抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法であって、前記平衡化液が３０ｍＭ以上の塩化物イオンまたは硫酸イオンを含む、前記精製方法。
【００１０】
（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（Ａ）に記載の精製方法。
【００１１】
（Ｃ）Ｆｃ結合性タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドである、（Ａ）に記載の精製方法。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明においてＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目までのグルタミンまでの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくともヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチド
があげられる。前記（ｉｉ）の一態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特願２０１３−２０２２４５号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また前記（ｉｉ）の別の態様としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（５７）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特願２０１４−１３３１８１号）があげられる。
（４１）配列番号３の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号３の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号３の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号３の６７番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号３の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号３の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号３の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号３の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号３の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号３の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号３の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号３の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号３の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号３の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号３の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号３の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号３の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
また前記（ｉｉ）のさらに別の態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（５８）から（６１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、天然型ヒトＦｃγＩＩＩａバリアントがあげられる（特願２０１４−１３３１８１号）。
（５８）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（５９）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（６０）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６１）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
本発明において不溶性担体とは、抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
【００１４】
なお担体表面に有する官能基がヒドロキシ基の場合、活性化剤を用いて、当該ヒドロキシ基から、Ｆｃ結合性タンパク質と共有結合可能な活性化基を形成させるとよい。前記活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）があげられる。また、ヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシル基などに変換した後、活性化剤を作用させて活性化する手法を例示することができ、活性化剤の具体例として３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）などを例示することができる。
【００１５】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して前記抗体を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法において、前記平衡化液が３０ｍＭ以上の塩化物イオンまたは硫酸イオンを含むことを特徴としている。本発明により、抗体成分の分離度をＲｓ値換算で１．１倍から１．８倍に向上させることができる。従って、今まで検出できなかった抗体分子構造の微小な差異も検出でき、分析の精度を向上させることができる。なお前記平衡化液に含まれる塩化物イオンまたは硫酸イオンの濃度は３０ｍＭ以上であればよいが、３０ｍＭ以上１５００ｍＭ以下であると好ましく、３０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であるとより好ましく、３０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であるとさらに好ましく、５０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であるとさらにより好ましい。
【００１６】
前記平衡化液を用いて前記吸着した抗体を溶出させるには、前記抗体とＦｃ結合性タンパク質との親和性を弱める溶出液を用いて溶出させればよい。一例として、平衡化液として３０ｍＭ以上の塩化物イオンまたは硫酸イオンを含むｐＨ５．０から６．９の弱酸性緩衝液を、溶出液としてｐＨ２．５から４．５の酸性緩衝液をそれぞれ用いたグラジエント溶出法があげられる。緩衝剤としては公知の緩衝剤の中から、作成する緩衝液のｐＨなどに基づき適宜選択すればよく、一例として、リン酸、酢酸、ギ酸、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸、コハク酸、グリシン、ピペラジンがあげられる。
【００１７】
本発明の分離方法は、Ｆｃ結合性タンパク質と親和性を有する、糖鎖を付加した抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であれば分離することができる。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、糖鎖を付加した抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、糖鎖を付加した抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の分離方法で分離することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の分離方法は、薬効に基づく抗体または抗体のＦｃ領域を含む分子の分離をクロマトグラフィーを用いて簡便、かつ精度よく分離することができる。従って本発明により、抗体医薬の製造工程管理や品質管理をより精度よく行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】塩化ナトリウムを添加した／または添加しない緩衝液（平衡化液）を用いてモノクローナル抗体を分離して得られたクロマトグラフである。
【図２】塩化カリウムを添加した緩衝液（平衡化液）を用いてモノクローナル抗体を分離して得られたクロマトグラフである。
【図３】硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムを添加した緩衝液（平衡化液）を用いてモノクローナル抗体を分離して得られたクロマトグラフである。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの調製
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を培養し、得られた菌体から前記Ｆｃ受容体タンパク質を精製することで、不溶性担体に固定化させるリガンドを調製した。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃ結合性タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃ結合性タンパク質において、以下の（ａ）から（ｄ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質である。
（ａ）配列番号３の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（ｂ）配列番号３の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（ｃ）配列番号３の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ｄ）配列番号３の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（２）ビニルポリマーゲル（粒子径１０μｍ、東ソー社製）が有するヒドロキシ基を常法により官能基変換を行なうことで、ヨードアセチル基にて活性化されたビニルポリマーゲルを得た。
（３）得られた前記活性化されたゲルに（１）で調製したリガンドを反応させることにより、ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを作製した。
（４）得られたゲルをφ４．６×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、分離カラムを作製した。
【００２２】
比較例１  モノクローナル抗体の分離
（１）市販のモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業社製）をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で１ｍｇ／ｍＬに調製し、これをモノクローナル抗体溶液として用いた。
（２）実施例１で作製した分離カラムを２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）（緩衝液Ａ）で平衡化後、（１）で調製したモノクローナル抗体溶液を５μＬ添加した。
（３）モノクローナル抗体溶液添加後２分間は緩衝液Ａを流し、２分から４０分までの間は、緩衝液Ａ１００％−１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）（緩衝液Ｂ）０％から、緩衝液Ａ０％−緩衝液Ｂ１００％とするグラジエントにより、カラムに添加したモノクローナル抗体を分離し溶出した。溶出したモノクローナル抗体の検出はＵＶ検出器（２８０ｎｍの吸収）で行なった。
【００２３】
モノクローナル抗体を分離した結果（クロマトグラム）を図１に示す。３つの大きなピークが検出され、溶出時間の早いピークからピーク１、ピーク２、ピーク３とした。また、それぞれのピークの分離度（Ｒｓ値）を下記の式に従って算出したところ、ピーク１とピーク２との分離度は０．６３に、ピーク２とピーク３との分離度は０．６１に、それぞれなった。
【００２４】
Ｒｓ値＝１．１８×（溶出時間の遅いピークの溶出時間−溶出時間の早いピークの溶出時間）／（溶出時間の早いピークの半値幅＋溶出時間の遅いピークの半値幅）
実施例２  本発明によるモノクローナル抗体の分離（その１）
緩衝液Ａとして、塩化ナトリウムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭまたは１０００ｍＭ添加した２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた他は、比較例１と同様な実験を行なった。結果を図１に示す。溶出時間の早いピークからピーク１、ピーク２、ピーク３とし、比較例１と同様な方法でＲｓ値を算出したところ、表１に示す結果となった。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に塩化ナトリウム（塩化物イオン）を添加することで、ピーク１とピーク２とのＲｓ値、および／またはピーク２とピーク３とのＲｓ値が向上していることがわかる。特に５０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウム（塩化物イオン）を添加した緩衝液では、ピーク１とピーク２とのＲｓ値、およびピーク２とピーク３とのＲｓ値が向上しているため特に好ましいといえる。
【００２５】
【表１】
0006451118.tif 000002
実施例３  本発明によるモノクローナル抗体の分離（その２）
緩衝液Ａとして、塩化カリウムを１００ｍＭまたは２００ｍＭ添加した２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた他は、比較例１と同様な実験を行なった。結果を図２に示す。溶出時間の早いピークからピーク１、ピーク２、ピーク３とし、比較例１と同様な方法でＲｓ値を算出したところ、表２に示す結果となった。この結果から塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウムを用いても、実施例２の結果と同様、ピーク１とピーク２とのＲｓ値、および／またはピーク２とピーク３とのＲｓ値が向上していることがわかる。
【００２６】
【表２】
0006451118.tif 000003
実施例４  本発明によるモノクローナル抗体の分離（その３）
緩衝液Ａとして、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを１００ｍＭ添加した２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた他は、比較例１と同様な実験を行なった。結果を図３に示す。溶出時間の早いピークからピーク１、ピーク２、ピーク３とし、比較例１と同様な方法でＲｓ値を算出したところ、表３に示す結果となった。この結果から塩化物イオンの代わりに硫酸イオンを用いても、実施例２の結果と同様、ピーク１とピーク２とのＲｓ値、またはピーク２とピーク３とのＲｓ値が向上していることがわかる。
【００２７】
【表３】
0006451118.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、従来困難であった、抗体医薬に含まれる抗体または抗体Ｆｃ領域を含む分子の、薬効に基づく分離を簡便、かつ精度よく行なうことができる。従って、本発明により、抗体医薬を製造する際の課題である、品質の向上、すなわちロット間における薬効のバラつきを低減させることができる。
【図１】
0006451118.tif 000005
【図２】
0006451118.tif 000006
【図３】
0006451118.tif 000007
【配列表】
0006451118000001.app