(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する方法であって、前記前駆細胞を、第１の固相に固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストと共に培養することを含み、該固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストは、（ｉ）ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体、または（ｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメントであり、前記前駆細胞は、該造血幹細胞または造血前駆細胞である、方法。
【請求項２】
Ｎｏｔｃｈアゴニストと組み合わせた、固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストと共に前記前駆細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前駆細胞がヒト細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体がポリクローナル抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃまたは単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
第１の固相が、組織培養皿の表面である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈアゴニストが第１の固相に固定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎｏｔｃｈアゴニストが、第１の固相ではない第２の固相に固定されている、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈと相互作用する、Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞外ドメインである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
ＮｏｔｃｈアゴニストがＤｅｌｔａｅｘｔ−ＩｇＧである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈ−１に特異的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈ−２に特異的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
培養する工程が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＦｌｔ３−リガンドを含む培地の存在下で行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
培養する工程が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＴＰＯ、線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ１）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む培地の存在下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
培地が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１、ＩＬ−３およびヘパリンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
培養する工程が、レトロネクチンを含む培地の存在下で行われる、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／００２，１０１号および２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，７４６号の利益を請求し、それぞれが、この全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２０１５年５月２１日に作成され、大きさが８０，８９４バイトの「１２６７４−０１２−２２８＿ＳＥＱ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして本出願と共に提出された配列表を参考として組み込む。
【０００３】
１．技術分野
本開示は、被検体における造血細胞移植のために前駆細胞を拡大培養する方法を記載する。この方法は、固定化された高分子量ＬＩＬＲＢ２アゴニストまたはＬＩＬＲＢ２アゴニストをＮｏｔｃｈアゴニストと組み合わせて含有する培地中で前駆細胞を培養する。拡大培養された細胞を使用し、種々の造血障害を治療することができる。
【背景技術】
【０００４】
２．背景技術
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性であり、最終的に、あらゆる種類の最終的に分化した血液細胞になる。ＨＳＣは、自己再生する能力を有するか、または方向性が高まった造血前駆細胞（ＨＰＣ）へと分化する能力を有し、この前駆細胞は、わずか数種類の血液細胞の祖先であることが不可逆的に決定付けられている。例えば、ＨＳＣは、（ｉ）最終的に単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞になる骨髄系前駆細胞、または（ｉｉ）最終的にＴ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と呼ばれるリンパ球様細胞になるリンパ系前駆細胞へと分化する能力を有する。ＨＳＣが骨髄系前駆細胞へと分化すると、この子孫は、リンパ球系統の細胞になることはできず、リンパ系細胞は、骨髄系統の細胞になることはできない。造血およびＨＳＣ分化の一般的な議論については、Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ５，２００６、およびＣｈａｐｔｅｒ  ５  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照。前駆体細胞は、ＨＳＣ、ＨＰＣおよび／またはＨＳＣとＨＰＣの混合物を含んでいてもよい。
【０００５】
前駆細胞の移植は、前駆細胞が移植レシピエントの血液細胞および免疫細胞を元の状態に戻す能力を有するため、重要な治療である。例えば、前駆細胞の移植を使用し、遺伝性の免疫不全または自己免疫疾患および多様な造血障害を患う被検体を治療することができる。長期間にわたる好中球減少症および汎血球減少症は、これらの治療計画の後によく起こるものなので、前駆細胞の移植を使用し、化学療法および放射線治療を受けた患者を治療することもできる。一例として、特に問題となるのは、ＡＭＬを化学療法によって治療すると、現在の抗菌治療の設定において、青年期および若年期の大人の２０％に達する高い死亡率を有することが一般的な感染性合併症を伴う長期間にわたる深刻な好中球減少症が生じる。ヒト骨髄移植法も、現在、白血病、リンパ腫および他の生命を脅かす疾患の治療法として用いられている。
【０００６】
移植において、非常に多数の拡大培養された前駆細胞を摂取する患者では、移植後に好中球が迅速に回復することが観察されている。従って、患者の生存率および回復率にとって重要な迅速で持続する生着を達成するために、高用量の前駆細胞が必要である。これらの知見は、好中球の回復を信頼性良く高める多数の前駆細胞を作製する緊急的な必要性を示唆している。
【０００７】
前駆体細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの効果的な拡大培養に向けた進歩がなされているが、広範囲に使用することができるようにするには、この技術の有効性および再現性の顕著な改良が必要である。従って、新しい手法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ
【非特許文献２】Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ５，２００６
【非特許文献３】Ｃｈａｐｔｅｒ  ５  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
【発明の概要】
【０００９】
３．技術概要
本明細書には、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する方法であって、前記前駆細胞を、第１の固相に固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストと共に培養することを含み、該固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストは、（ｉ）ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体、または（ｉｉ）前記抗体の抗原結合フラグメントであり、この前駆細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である、方法が記載される。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストをＮｏｔｃｈアゴニストと組み合わせ、これと共に前記前駆細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、前駆細胞はヒト細胞である。さらに具体的な実施形態において、前駆細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる。さらに具体的な実施形態において、前駆細胞は、胎児または新生児の血液から得られる。
【００１０】
特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体は、ポリクローナル抗体である。特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃまたは単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２に対する抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体またはキメラ抗体である。具体的な実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する。具体的な実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する。具体的な実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインに結合する。
【００１１】
特定の実施形態において、第１の固相は、組織培養皿の表面である。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、第１の固相に固定化されている。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、第１の固相ではない第２の固相に固定化されている。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、第１の固相に固定化され、第１の固相は、組織培養皿の表面である。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、第１の固相ではない第２の固相に固定化され、第１の固相は、組織培養皿または組織培養フラスコの表面であり、第２の固相はビーズである。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、第１の固相ではない第２の固相に固定化され、第１の固相はビーズであり、第２の固相は、組織培養皿または組織培養フラスコの表面である。
【００１２】
特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈと相互作用する、Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞外ドメインである。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ヒトＤｅｌｔａ−１である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｄｅｌｔａｅｘｔ−ＩｇＧである。さらに具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ダイマー形態である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈモチーフに特異的に結合する抗体である。さらに具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ−１に特異的に結合する抗体である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ−２に特異的に結合する抗体である。
【００１３】
特定の実施形態において、培養する工程は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＦｌｔ３−リガンドを含む培地の存在下で行われる。具体的な実施形態において、培養する工程は、１０−１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５−１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび１０／１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む培地の存在下で行われる。特定の実施形態において、培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。特定の実施形態において、培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む。特定の実施形態において、培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む。特定の実施形態において、培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む。
【００１４】
特定の実施形態において、培養する工程は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＴＰＯ、線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ１）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む培地の存在下で行われる。具体的な実施形態において、培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１、ＩＬ−３およびヘパリンを含む。特定の実施形態において、培地は、１−１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１−１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、１−１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１−１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１−１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１および１−１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む。具体的な実施形態において、培地は、さらに、１−１００μｇ／ｍＬのヘパリンを含む。特定の実施形態において、培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む。具体的な実施形態において、培地は、さらに、１０μｇ／ｍＬのヘパリンを含む。
【００１５】
特定の実施形態において、培養する工程は、レトロネクチンを含む培地の存在下で行われる。具体的な実施形態において、培地は、１−１００μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む。さらに具体的な実施形態において、培地は、５μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む。
【００１６】
本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏの拡大培養によって前駆細胞を生成するための改良された方法を提供する。この方法は、既に利用可能な方法よりも迅速に多くの前駆細胞を生成し、生成した前駆細胞は、免疫不全被検体の初期の骨髄再増殖の向上と、移植後の長期間にわたる再増殖の向上を示す。本明細書に開示される方法は、固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストまたはＬＩＬＲＢ２アゴニストをＮｏｔｃｈアゴニストと組み合わせ、これと共に前駆細胞を培養することに基づく。
【００１７】
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター系の模式図。
【図１Ｂ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。Ａｎｇｐｔｌ２馴化培地が、ＬＩＬＲＢ２キメラレポーター系においてＧＦＰ誘発を刺激することを示す代表的なフローサイトメトリープロフィールと概要。空のベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の馴化培地をコントロールとして使用した。
【図１Ｃ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。左側、ウェスタンブロット分析において、抗ＦＬＡＧ抗体によって検出された、馴化培地中の分泌されたＡｎｇｐｌｔ２およびＨＬＡ−Ｇ−ＥＣＤ。右側、Ａｎｇｐｔｌ２が、等量のＨＬＡ−Ｇ−ＥＣＤよりも良好に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現したＬＩＬＲＢ２に結合することを示す代表的なフローサイトメトリープロット。
【図１Ｄ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。馴化培地から得られた全長（ＦＬ）、コイルドコイルドメイン（ＣＣ）およびフィブリノゲンドメイン（ＦＢＮ）は、抗Ｍ２  Ｆｌａｇ抗体を用いたイムノブロッティングによって決定される場合、還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、独特の移動を示した。空のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の等量の馴化培地から抽出したタンパク質をコントロールとして使用した。
【図１Ｅ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。グルタチオンセファロースによって細菌発現系から精製したＧＳＴ−ヒトＡｎｇｐｔｌ２を、ゲル濾過ＦＰＬＣによってすぐにフラクション化した。分子量は、それぞれ、アポフェリチン（４４３ＫＤ）、アミラーゼ（２００ＫＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ＫＤ）、アルブミン（６６ＫＤ）、炭酸脱水酵素（２９ＫＤ）およびチトクロムｃ（１２．４ＫＤ）のピークによって決定した。
【図１Ｆ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。ＦＰＬＣにおける指定した等量のフラクション化サンプルを１０％未変性ゲルにローディングした。銀染色によって、凝集したＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２、モノマーＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２および開裂したＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２を視覚化した。
【図１Ｇ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。指定のＦＰＬＣフラクション化サンプルを、抗Ｍ２  Ｆｌａｇ抗体を用いるウェスタンブロット分析によって試験した。開裂したＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２フラグメントのＦＬＡＧ（フラクション８；図１Ｇ）は、ウェスタンブロット分析によって検出することができなかった。
【図１Ｈ】高分子量Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達を活性化する。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、コーティングされたフラクション５または可溶性のフラクション５のタンパク質で４８時間処理した。コーティングされたウェルにおいて、フラクション−５からの５μｇ／ｍＬのＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２を、９６ウェルプレートのウェルに３７℃で３時間かけてあらかじめコーティングしておいた。等量のＦＰＬＣバッファーをコントロールとして使用した。ｎ．ｓ．は、優位性がないことを示す。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図２Ａ】Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ５およびＨＬＡ−Ｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の発現構築物の模式図。分泌可能なＡｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ５およびＨＬＡ−Ｇ−ＥＣＤのための構築物。シグナルペプチド（ＳＰ）またはＨＬＡ−Ｇ  ＥＣＤを含まないＡｎｇｐｔｌを、Ｎ末端の最適化されたシグナルペプチド（ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号１））、Ｃ末端のＦＬＡＧタグに融合した。
【図２Ｂ】Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ５およびＨＬＡ−Ｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の発現構築物の模式図。ＬＩＬＲＢ２を発現する２９３Ｔ細胞に対するＡｎｇｐｔｌ５の結合を示すＦＡＣＳプロット。
【図３】Ａｎｇｐｔｌ２によるＬＩＬＲＢ２キメラ受容体レポーターの活性化は、固定化されたＨＬＡ−Ｇによる活性化よりも良好である。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、コーティングされた５μｇ／ｍＬのＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２または１３０μｇ／ｍＬのヒトＨＬＡ−Ｇで２４時間処理した。キメラ受容体を含まないヌル受容体と、ＰＢＳをコントロールとして使用した。
【図４】マウスの組織および臓器におけるｍＡｎｇｐｔｌ２の発現。全細胞溶解物をマウスの脾臓、脂肪、筋肉、心臓、脳および腎臓から抽出した。血漿および血清は、それぞれ、抗凝血剤を用いるか、または用いずに、遠心分離処理によって末梢血から抽出した。ラット抗マウスＡｎｇｐｔｌ２抗体を用い、各サンプル５０μｇを、ウェスタンブロット分析のためにローディングした。ローディングしたサンプルを、クマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ）によって視覚化した。Ｒ、還元型；Ｎ、非還元型；Ｍ、分子量マーカー。矢印は、マルチマー化されたマウスＡｎｇｐｔｌ２を示す。
【図５Ａ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、キメラＬＩＬＲＢ２レポーターを活性化した。固定化された５μｇ／ｍＬのＡｎｇｐｔｌ２によるＧＦＰ誘発が、５μｇ／ｍＬの抗ＬＩＬＲＢ２抗体によって止められたことを示す代表的なフローサイトメトリープロフィール。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂまたはｍＡｂを含む場合と含まない場合で、指定のコーティングされたＡｎｇｐｔｌ２で４８時間処理した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。
【図５Ｂ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、キメラＬＩＬＲＢ２レポーターを活性化した。固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体によってＧＦＰが誘発されたことを示す代表的なフローサイトメトリープロフィール。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、指定のコーティングされた（５０μｌのＰＢＳ中、２５μｇ／ｍＬ）または可溶性の（２５０μｌの細胞培地中、５μｇ／ｍＬ）抗体で４８時間処理した。キメラＬＩＬＲＢ２受容体を含まないレポーター細胞をネガティブコントロールとして使用した。
【図５Ｃ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、キメラＬＩＬＲＢ２レポーターを活性化した。架橋した抗ＬＩＬＲＢ２抗体によってＧＦＰ発現が誘発されたことを示す代表的なフローサイトメトリープロフィール。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、１０μｇ／ｍＬの可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）または等価な架橋したｐＡｂで４８時間処理した。ストレプトアビジンのみをネガティブコントロールとして使用した。
【図５Ｄ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、キメラＬＩＬＲＢ２レポーターを活性化した。コーティングされた抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂを用いる場合または用いない場合の、細胞形質膜上のＬＩＬＲＢ２タンパク質の分布を示すＬＩＬＲＢ２キメラ受容体レポーター細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像。細胞の上部から底部までの１０回の共焦点スキャンを、層−１（Ｌ１）から層−１０（Ｌ１０）まで示した。位相差、Ｃｙ３（ＬＩＬＲＢ２発現を示す）、ＧＦＰ（シグナル伝達の活性化を示す）のパネルの共焦点画像を合わせた。
【図６Ａ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。２９３Ｔ細胞で発現したＬＩＬＲＢ２の全長、個々のＩｇドメイン、Ｉｇ１＋２またはＩｇ３＋４に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合を示す代表的なフローサイトメトリープロット。ｎ＝３。
【図６Ｂ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。パネルＡのデータのまとめ。
【図６Ｃ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＷＴ型ＬＩＬＲＢ２および変異ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合能力のまとめ。示されている変異は、図４Ｂに記載されている。ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１およびＩｇ４の中のＨ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフの模式図。
【図６Ｄ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＷＴ型および変異のＬＩＬＲＢ２のＩｇ１＋２のＡｎｇｐｔｌ２結合能力のまとめ。
【図６Ｅ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。Ｉｇ１＋２および変異ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合を示す代表的なフローサイトメトリープロット。
【図６Ｆ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＷＴ型ＬＩＬＲＢ２および変異ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合を示す代表的なフローサイトメトリープロット。
【図６Ｇ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＷＴ型ＬＩＬＲＢ２および変異ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ５およびＨＬＡ−Ｇの結合能力の比較。ＭＨＣ−Ｓは、以下のＨＬＡ−Ｇ結合部位を示す。ＭＨＣ−Ｓ１、Ｒ５９Ａ／Ｙ６１Ａ；ＭＨＣ−Ｓ２、Ｗ９０Ａ／Ｄ２００Ａ／Ｎ２０２Ａ／Ｙ２０５Ａ；ＭＨＣ−Ｓ１＋２、Ｒ５９Ａ／Ｙ６１Ａ／Ｗ９０Ａ／Ｄ２００Ａ／Ｎ２０２Ａ／Ｙ２０５Ａ。
【図６Ｈ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＬＩＬＲＢ２の個々のＩｇドメイン、Ｉｇ１＋２またはＩｇ３＋４によるキメラ受容体レポーター系のＡｎｇｐｔｌ２により誘発された活性化のまとめ。示されているレポーター細胞は、５μｇ／ｍＬのコーティングされたＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２、またはポリクローナルまたはモノクローナルの抗ＬＩＬＲＢ２抗体である。少なくとも３回の独立した実験が、同様の結果を与えた。
【図６Ｉ】ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン１およびＩｇドメイン４は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および信号活性化にとって重要である。ＷＴ型ＬＩＬＲＢ２および変異ＬＩＬＲＢ２によるキメラ受容体レポーター系のＡｎｇｐｔｌ２により誘発された活性化のまとめ。レポーター細胞を、１０μｇ／ｍＬのコーティングされたＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２、またはポリクローナルまたはモノクローナルの抗ＬＩＬＲＢ２抗体で処理した。少なくとも３回の独立した実験が、同様の結果を与えた。
【図７】ＬＩＬＲＢ２  Ｉｇドメインと抗ＬＩＬＲＢ２抗体の相互作用。マウスＴハイブリドーマ細胞を、全長ＬＩＬＲＢ４  ＥＣＤ（１から４）、個々のＩｇドメイン（第１、第２、第３および第４のＩｇドメイン）および２種類のＩｇドメインの組み合わせ（１＋２および３＋４）に感染させた。空のベクターをネガティブコントロールとして使用した。これらの細胞を、フローサイトメトリー分析のために、モノクローナル（ｍＡＢ）またはポリクローナル（ｐＡＢ）の抗ＬＩＬＲＢ２抗体によって染色した。
【図８Ａ】ＬＩＬＲＢ２（配列番号２）の既知の構造に基づく、可能なリガンド結合界面中のＬＩＬＲＢ２の変異した残基。ヒトＬＩＬＲＢ２のＩｇ１−Ｉｇ２ドメイン（ＰＤＢＩＤ：２ＧＷ５および２ＤＹＰ）（実線の四角で囲まれている。）およびＩｇ３−Ｉｇ４ドメイン（ＰＤＢＩＤ：４ＬＬＡ）（点線の四角で囲まれている。）のＰＤＢ構造に基づき、それぞれのＩｇドメイン上のこの可能なリガンド結合界面中の２４個の大きな疎水性残基を、突然変異誘発試験のために特定し（下線が引かれている。）、これを作製した。
【図８Ｂ】ＬＩＬＲＢ２（配列番号２）の既知の構造に基づく、可能なリガンド結合界面中のＬＩＬＲＢ２の変異した残基。ヒトＬＩＬＲＢ２のＩｇ１−Ｉｇ２ドメイン（ＰＤＢＩＤ：２ＧＷ５および２ＤＹＰ）およびＩｇ３−Ｉｇ４ドメイン（ＰＤＢＩＤ：４ＬＬＡ）のＰＤＢ構造に基づき、それぞれのＩｇドメイン上のこの可能なリガンド結合界面中の２４個の大きな疎水性残基を、突然変異誘発試験のために特定し、これを作製し、一連の変異ＬＩＬＲＢ２を作製した。
【図８Ｃ】ＬＩＬＲＢ２（配列番号２）の既知の構造に基づく、可能なリガンド結合界面中のＬＩＬＲＢ２の変異した残基。ＷＴ型ＬＩＬＲＢ２および変異ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合能力のまとめ。
【図９】フローサイトメトリー分析によって決定される場合、Ａｎｇｐｔｌ２のＦＬが、ヒト臍帯血（ＣＢ）のＬＩＬＲＢ２＋細胞に結合し、ＦＢＮドメインは結合しない。ヒトＣＢ単核細胞を、示したＦＬＡＧタグ化したＡｎｇｐｔｌ２の全長、ＣＣドメインまたはＦＢＮドメインと共にインキュベートし、その後フローサイトメトリー分析において、抗ＦＬＡＧ−ＡＰＣおよび抗ヒトＬＩＬＲＢ２−ＰＥを用いて染色した。
【図１０】Ａｎｇｐｔｌ２の可溶性または固定化された、全長、ＣＣドメインまたはＦＢＮドメインによるＬＩＬＲＢ２キメラ受容体レポーターの活性化。キメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター細胞を、示したＡｎｇｐｔｌ２の可溶性またはコーティングされた、全長、ＣＣドメインまたはＦＢＮドメインで４８時間処理した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。＊、ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．、有意差なし。
【図１１Ａ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。ヒトＣＤ１３３＋臍帯ＣＢ細胞を、ＳＴＦ培地中で、等量のコーティングされた（５０μｌのＰＢＳ中、２５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂまたは可溶性の（２５０μｌのＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂと共に、またはこれらを含まずに培養した。拡大培養の全細胞数を培養１０日後に評価した（ｎ＝３）。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１１Ｂ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。ヒトＣＤ１３３＋臍帯ＣＢ細胞を、ＳＴＦ培地中、等量のコーティングされた（５０μｌのＰＢＳ中、２５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂまたは可溶性の（２５０μｌのＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂと共に、またはこれらを含まずに培養した。拡大培養の全細胞数を培養１０日後に評価した（ｎ＝３）。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１１Ｃ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。培養１０日後のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数を示す代表的なフローサイトメトリープロット。
【図１１Ｄ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂを用いて、または用いずに処理した、２５０個の導入に相当するヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の拡大培養物を、ＣＦＵ培地に順次接種した。培養７日後に全ＣＦＵを計測した。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１１Ｅ】固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する。抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂを用いて、または用いずに処理した、２５０個の導入に相当するヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の拡大培養物を、ＣＦＵ培地に順次接種した。培養７日後に全ＣＦＵを計測した。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１２Ａ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ＳＴＦ培地中、等量のコーティングされた（５０μｌのＰＢＳ中、２５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂまたは可溶性の（２５０μｌのＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂと共に、またはこれらを含まずに培養して１０日後、１×１０４個の導入に相当するヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の拡大培養物をＮＳＧマウスに移植した（ｎ＝８）。指定した週での末梢血中のヒト細胞（ヒトＣＤ４５＋）の生着を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１２Ｂ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。３６週目のパネルＡに記載したマウスの骨髄におけるヒトＣＤ４５／ＣＤ７１＋の生着。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝８。
【図１２Ｃ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養したヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の複数系統の寄与。それぞれの群あたり、１匹の一次移植されたマウスから得た骨髄細胞の代表的なフローサイトメトリープロフィールを示す。骨髄系、ＣＤ４５／ＣＤ７１＋ＣＤ１５／ＣＤ６６ｂ＋；リンパ系、ＣＤ１９／ＣＤ２０＋；造血幹細胞／前駆細胞、ＣＤ１９／ＣＤ２０−ＣＤ３４＋。
【図１２Ｄ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣで示したデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１２Ｅ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣで示したデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１２Ｆ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣで示したデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１２Ｇ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。移植から３週間および７週間の二次移植されたマウスの末梢血のヒトＣＤ４５＋細胞の生着を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝３。
【図１２Ｈ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。移植から８週間後の二次移植されたマウスの骨髄のヒト細胞の生着を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１２Ｉ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。移植から８週間後の二次移植されたマウスの骨髄におけるヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の複数系統の寄与を示す代表的なフローサイトメトリープロフィール。
【図１２Ｊ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩに示されるデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１２Ｋ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩに示されるデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１２Ｌ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩに示されるデータからの複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１３Ａ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ＳＴＦ培地中、等量のコーティングされた抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体または可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体と共に、またはこれらを含まずに培養した１０日後に、１×１０４個の導入に相当するヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウスに移植した。８週目の骨髄におけるヒトＣＤ４５／ＣＤ７１＋細胞の生着を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝８。
【図１３Ｂ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の複数系統の寄与。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１３Ｃ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の複数系統の寄与。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１３Ｄ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の複数系統の寄与。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１４Ａ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ＳＴＦ培地中、等量のコーティングされた（２５０μｌのＰＢＳ中、２５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂまたは可溶性の（２５０μｌのＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、５μｇ／ｍＬ）抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂと共に、またはこれらを含まずに培養した１０日後に、１×１０４個の導入に相当するヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞をＮＳＧマウスに移植した。３週目および７週目の末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝４。
【図１４Ｂ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＡに記載するマウスの骨髄における８週目のヒトＣＤ４５／ＣＤ７１＋の生着。ｎ．ｓ．、有意差なし；ｎ＝４。
【図１４Ｃ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の複数系統の寄与。それぞれの群の１匹の一次移植されたマウスからの骨髄細胞の代表的なフローサイトメトリープロフィールを示す。
【図１４Ｄ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣに示したデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；ｎ＝４。
【図１４Ｅ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣに示したデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；ｎ＝４。
【図１４Ｆ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＣに示したデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；ｎ＝４。
【図１４Ｇ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。３週目、７週目、１０週目および３０週目の二次移植されたマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１４Ｈ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。３０週目の二次移植されたマウスの骨髄におけるヒト細胞の生着。ｎ．ｓ．、有意差なし；ｎ＝３。
【図１４Ｉ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。移植から８週後に二次移植されたマウスの骨髄におけるヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の複数系統の寄与を示す代表的なフローサイトメトリープロフィール。
【図１４Ｊ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩからのデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１４Ｋ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩからのデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１４Ｌ】ＮＳＧ移植によって決定されるような、ＮＳＧにおける抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体によるヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。パネルＩからのデータに基づく複数系統の寄与のまとめ。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；ｎ＝３。
【図１５Ａ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養前、２５μｇ／ｍＬのコーティングされた抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡＢと共に培養した後の全有核細胞の数。
【図１５Ｂ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養前、２５μｇ／ｍＬのコーティングされた抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡＢと共に培養した後のＣＤ３４＋細胞の数。
【図１５Ｃ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されていない細胞または拡大培養された細胞を移植されたレシピエントＮＳＧマウスにおける、１ヶ月目および２ヶ月目の末梢血におけるドナーのヒトＣＤ４５＋細胞の割合。
【図１５Ｄ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。培養されていない細胞または拡大培養された細胞を移植されたレシピエントＮＳＧマウスにおける、骨髄におけるドナーのヒトＣＤ４５＋細胞の割合。
【図１５Ｅ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。限界希釈分析によって決定されるような、ＨＳＣの正味の拡大培養。導入時に相当する細胞数を計算に使用した。
【図１５Ｆ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養の前および後のＨＳＣの複数系統の再増殖の比較。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１５Ｇ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養の前および後のＨＳＣの複数系統の再増殖の比較。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１５Ｈ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養の前および後のＨＳＣの複数系統の再増殖の比較。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１５Ｉ】限界希釈分析によって決定されるような、培養されたヒト臍帯ＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の正味のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養。ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養の前および後のＨＳＣの複数系統の再増殖の比較。ｎ．ｓ．、有意差なし；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝８。
【図１６】Ｄｅｌｔａ１を用いたＣＢ始原細胞の臨床グレードの培養によって、骨髄を破壊する二重ＣＢ移植（ＣＢＴ）の設定において、好中球がさらに迅速に回復した。二重ＣＢ移植を受けた患者について、２つの操作されていないユニット（「従来」）、１つのｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養されたユニットおよび１つの操作されていないユニット、または「オフザシェルフ（ｏｆｆ―ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」拡大培養された製品および操作されていないユニットを用い、好中球の絶対数（ＡＮＣ）が≧５００／μｌになる個々の時間点および時間の中央値（実線）。２標本のｔ検定を用いて比較を行った。
【図１７】初期の骨髄生着のためのＣＤ３４細胞投薬量の規定。これを上回ると初期の骨髄の生着が迅速になる（１０日より速くなる）ような細胞投薬量を示すＣＤ３４細胞の投薬量対好中球が生着するまでの時間（ＡＮＣ＞５００）。８００万個を超えるＣＤ３４／ｋｇを摂取した７名のうち６名の患者が（青線）および１０００万個のＣＤ３４／ｋｇを摂取した５名のうち５名の患者（赤線）が初期の生着を示した。
【図１８】Ａｎｇｐｔｌ５存在下でヒトＣＢ造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで再増殖する細胞の拡大培養を刺激する。Ａｎｇｐｔｌ５非存在下で培養していない細胞、培養した細胞（Ｓ＋Ｔ＋Ｆ）、またはＡｎｇｐｔｌ５と共に培養した細胞（Ｓ＋Ｔ＋Ｆ＋Ａ５＋Ｉ）の骨髄におけるヒト再増殖。移植された細胞数は、示された条件より下である（培養した細胞の数は、培養物中で生成した細胞の子孫細胞である。）。
【図１９】Ｄｅｌｔａ１およびＡｎｇｐｌｔ５存在下でＣＢ  ＨＳＰＣを培養すると、始原細胞および骨髄系前駆細胞の再増殖を促進する。Ｄｅｌｔａ１、Ａｎｇｐｔｌ５、またはこれらの組み合わせが存在する状態で培養したＣＤ３４＋ＣＢ  ＨＳＰＣを、免疫不全マウスに移植し（丸は、個々のマウスであり、線は群の生着の中央値である。）、始原細胞（ＣＤ３４）および骨髄（ＣＤ３３）の生着を初期の時間点（移植から２週間後）に評価した。Ｐ値は、２標本のｔ検定をあらわす。
【図２０】Ｎｏｔｃｈのみ、Ａｎｇｐｔｌ５のみ、またはこれらの組み合わせが存在する状態で培養したＣＢ  ＨＳＰＣがＣＤ３４を何倍に拡大培養したのかを示す。Ｄｅｌｔａ１、Ａｎｇｐｔｌ５、またはこれらの組み合わせが存在する状態で、ＣＤ３４＋  ＣＢ  ＨＳＰＣを１６日間培養した。ＣＤ３４が何倍に拡大培養されたか（生成したＣＤ３４細胞／開始時のＣＤ３４細胞の数）を、示した時間点（７日目、１０日目、１６日目）に計算した。
【図２１】ＤｅｌｔａをＡｎｇｐｔｌ５と組み合わせ、Ｄｅｌｔａが介在する拡大培養のために最適化された条件で培養したときに、初期の骨髄再増殖の顕著な向上が見られる。
【図２２】長期間の再増殖も同様に顕著に向上する。再増殖は、顕著に向上した骨髄系およびリンパ系の系統を示す複数系統である。Ｄｅｌｔａが介在する拡大培養のために既に最適化された条件で培養したときに、細胞は、顕著な二次的な生着を起こさなかった。
【図２３Ａ】ＤｅｌｔａおよびＡｎｇｐｔｌ５と、低濃度のサイトカインを用いて培養すると、Ｄｅｌｔａで拡大培養した細胞では以前に見られなかった二次的な生着が生じることを示しており、このことは、これらの条件で、ＤｅｌｔａをＡＮＧＰＴＬ５に加えるとき、長期間にわたって再増殖する細胞の管理／拡大培養を示唆している。
【図２３Ｂ】ＤｅｌｔａおよびＡｎｇｐｔｌ５と、低濃度のサイトカインを用いて培養すると、Ｄｅｌｔａで拡大培養した細胞では以前に見られなかった二次的な生着が生じることを示しており、このことは、これらの条件で、ＤｅｌｔａをＡＮＧＰＴＬ５に加えるとき、長期間にわたって再増殖する細胞の管理／拡大培養を示唆している。
【図２４】Ｄｅｌｔａおよび抗体を、Ａｎｇｐｔｌ５受容体（ＬＩＬＲＢ２またはＣＤ８５）と共に培養すると、Ｄｅｌｔａ単独の場合と比較して、初期の骨髄の生着が向上する傾向がある。この傾向は、この実験で使用した最も高い用量のＣＤ８５で存在する。
【図２５】生着を長時間の時間点（移植から１６週後）で評価した場合、Ｄｅｌｔａおよび抗体をＡｎｇｐｔｌ５受容体（ＬＩＬＲＢ２またはＣＤ８５）に対して培養した細胞の生着は、Ｄｅｌｔａのみの場合よりも多かった。これらの細胞は、リンパ球および骨髄の系統の両方に再増殖させることができる。
【図２６】ＣＤ３４＋臍帯血造血幹細胞／前駆細胞を、Ｄｅｌｔａ１、またはＤｅｌｔａ１と抗ＬＩＬＲＢ２抗体（αＬＩＬＲＢ２）の組み合わせと共に培養した。１０，０００個の出発細胞の子孫細胞をＮＳＧマウスに移植し（丸＝個々のマウス、線＝平均生着）、骨髄生着（ｙ軸：全骨髄中の％ＣＤ３３＋細胞）を２週間目に評価した。Ｐ値は、２標本のｔ検定をあらわす。
【図２７】ＣＤ３４＋臍帯血造血幹細胞／前駆細胞を、Ｄｅｌｔａ１、またはＤｅｌｔａ１と抗ＬＩＬＲＢ２抗体（αＬＩＬＲＢ２）の組み合わせと共に培養した。１０，０００個の出発細胞の子孫細胞をＮＳＧマウスに移植し（丸＝個々のマウス、線＝平均生着）、始原細胞の生着（ｙ軸：全骨髄中の％ＣＤ３４＋細胞）を１０週間目に評価した。Ｐ値は、２標本のｔ検定をあらわす。
【図２８】臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、レトロネクチンと、（ｉ）ＩｇＧ（ヒト）、（ｉｉ）抗ＬＩＬＲＢ２抗体（αＬＩＬＲＢ２）、（ｉｉｉ）Ｄｅｌｔａ１または（ｉｖ）αＬＩＬＲＢ２とＤｅｌｔａ１の組み合わせのいずれかでコーティングされた非組織培養ウェルで４時間培養した。ＨＥＳ１発現をｑＰＣＲによって評価し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）参照遺伝子の発現に対して正規化した。ｙ軸は、ＨＥＳ１発現が、レトロネクチンおよびヒトＩｇＧでコーティングしたウェルから得られた値と比べて何倍増加したかのデータをあらわす。
【図２９】臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、レトロネクチンでコーティングし、さらに、（ｉ）ＩｇＧ（ヒト）、（ｉｉ）抗ＬＩＬＲＢ２抗体（αＬＩＬＲＢ２）とＤｅｌｔａ１の組み合わせ、（ｉｉｉ）マイクロビーズの上に存在する抗ＬＩＬＲＢ２抗体と組み合わせて、Ｄｅｌｔａ１のいずれかでコーティングされた非組織培養ウェルで４時間培養した。ＨＥＳ１発現をｑＰＣＲによって評価し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）参照遺伝子の発現に対して正規化した。ｙ軸は、ＨＥＳ１発現が、レトロネクチンおよびヒトＩｇＧでコーティングしたウェルから得られた値と比べて何倍増加したかのデータをあらわす。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
５．詳細な説明
造血前駆細胞移植は、前駆細胞が移植レシピエントの血液細胞および免疫細胞を元の状態に戻す能力を有するため、重要な治療である。例えば、前駆細胞の移植を使用し、遺伝性の免疫不全または自己免疫疾患および多様な造血障害を患う被検体を治療することができる。長期間にわたる好中球減少症および汎血球減少症は、これらの治療計画の後によく起こるものなので、前駆細胞の移植を使用し、化学療法および放射線治療を受けた患者を治療することもできる。一例として、特に問題となるのは、ＡＭＬを化学療法によって治療すると、現在の抗菌治療の設定において、青年期および若年期の大人の２０％に達する高い死亡率を有することが一般的な感染性合併症を伴う長期間にわたる深刻な好中球減少症が生じる。ヒト骨髄移植法も、現在、白血病、リンパ腫および他の生命を脅かす疾患の治療法として用いられている。
【００２０】
骨髄の生着の遅れは、臍帯血（ＣＢ）移植（ＣＢＴ）レシピエントにとって既知のリスク因子であり、低い全有核細胞数（ＴＮＣ）と１回または２回のＣＢ移植で与えられるＣＤ３４＋細胞の用量に関係がある。これらの患者の非再発死亡率の大部分が、移植後の最初の１００日以内に起こり、感染は、最も一般的な死因である。
【００２１】
移植において、患者の生存率および回復率にとって重要な迅速で持続する生着を達成するために、高用量の前駆細胞が必要である。このことは、ＣＢ前駆細胞を用いるときに特に当てはまる。前駆体細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの効果的な拡大培養に向けた進歩がなされているが、広範囲に使用することができるようにするには、この技術の有効性および再現性の顕著な改良が必要である。
【００２２】
本開示は、最終分化していない前駆細胞の不死化した集合を生産する方法を提供する。特に、本開示は、他の方法では細胞死を引き起こす老化および／または受ける危機に起因して、増殖を停止するか、および／または死亡する期間にわたって培養物中で前駆細胞を成長させる方法を提供する。
【００２３】
本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏの拡大培養によって前駆細胞を拡大培養するための改良された方法を提供する。この方法は、既に利用可能な方法よりも迅速に多くの前駆細胞を生成し、生成した前駆細胞は、免疫不全被検体の初期の骨髄再増殖の向上と、移植後の長期間にわたる再増殖の向上を示す。本明細書に開示される方法は、固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストまたはＬＩＬＲＢ２アゴニストをＮｏｔｃｈアゴニストと組み合わせ、これと共に前駆細胞を培養することに基づく。
【００２４】
好ましくは、拡大培養のために用いられる技術は、拡大培養されたサンプルにおいて、拡大培養されていないＨＳＣサンプルと比較して、前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞のようなＨＳＣの数が増加することが示された技術である。特定の実施形態において、この方法によって、拡大培養されていないサンプルと比較して、拡大培養されたサンプルのＨＳＣの数が５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍（またはもっと多く）増加する。ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６およびＨＬＡ  ＤＲの１つ以上に陽性であってもよく、および／またはＬｉｎおよび／またはＣＤ３８に陰性であってもよい。ある具体的な実施形態において、生着の向上は、例えば、注入から１０日間後、３週間後または９週間後、拡大培養されていないサンプルのアリコートを注入したマウスの骨髄と比較して、拡大培養されたサンプルのアリコートを注入したマウスの骨髄のヒトＣＤ４５＋細胞の割合の増加を検出することによって検出することができる（Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１６（２）：２３２−２３６を参照）。ある実施形態において、この方法によって、拡大培養されていないサンプルと比較して、拡大培養されたサンプルのＣＤ３４＋ＨＳＣの数が５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍（またはもっと多く）増加する。細胞の集合も、好ましくは、ヒト被検体に少なくとも１回注入するのに十分な数の細胞が得られるまで、拡大培養される。
【００２５】
５．１  ＬＩＬＲＢ２およびＮｏｔｃｈアゴニスト
本開示は、前駆細胞を拡大培養するために、Ｎｏｔｃｈアゴニストと組み合わせた、固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび／またはＬＩＬＲＢ２アゴニストの使用を想定する。アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈ経路の機能の活性化を促進する、即ち、生じさせるか、または増加させる薬剤である。「ＬＩＬＲＢ２経路の機能」は、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）が介する抑制および／またはホスファターゼＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２またはＳＨＩＰの動員を含め、ＬＩＬＲＢ２シグナル伝達（シグナル変換）経路を介する機能を意味する。「Ｎｏｔｃｈ経路の機能」は、限定されないが、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインの核内移行、ＲＢＰ−ＪＫまたはこのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓの核内移行、例えば、ＭａｓｔｅｒｍｉｎｄのようなＳｐｌｉｔ複合体のエンハンサーのｂＨＬＨ遺伝子の活性化、ＨＥＳ−１遺伝子またはＫＢＦ２（ＣＢＦ１とも呼ばれる）遺伝子の活性化、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ神経芽細胞分離の抑制、Ｄｅｌｔａタンパク質、Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質、Ｆｒｉｎｇｅ、ＤｅｌｔｅｘまたはＲＢＰ−ＪＫＩ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＨａｉｒｌｅｓｓまたはこれらのホモログもしくはアナログへのＮｏｔｃｈの結合を含め、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達（シグナル変換）経路が介する機能を意味する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路および活性化に対するこの影響についての議論に関しては、一般的に、Ｋｏｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ  １３７：２１６−２３３による総説文献を参照。Ｊａｒｒｉａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７４２３−７４３１も参照。
【００２６】
経路の活性化は、１つ以上のアゴニストに細胞をさらすことによって行われる。アゴニストは、限定されないが、可溶性分子、細胞表面で組み換え発現する分子、前駆細胞がさらされる細胞単層上の分子、または固相に固定化されている分子であってもよい。
【００２７】
本開示のアゴニストとしては、限定されないが、タンパク質およびこのアナログおよび誘導体（フラグメントを含む）；ＬＩＬＲＢ２経路またはＮｏｔｃｈ経路の他の要素であるタンパク質およびこのアナログおよび誘導体（フラグメントを含む）；これらに対する活性化抗体およびこの結合領域を含むこのような抗体のフラグメントまたは他の誘導体；タンパク質および誘導体またはアナログをコードする核酸；およびＬＩＬＲＢ２経路またはＮｏｔｃｈ経路の活性を促進するようにＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈのタンパク質またはＬＩＬＲＢ２経路またはＮｏｔｃｈ経路の中の他のタンパク質に結合するか、または他の方法で相互作用するタンパク質およびこの誘導体およびアナログが挙げられる。このようなアゴニストとしては、限定されないが、関連する細胞内ドメインを含むタンパク質およびこれらの誘導体、上述のものをコードする核酸、ＬＩＬＲＢ２リガンドまたはＮｏｔｃｈリガンドに含まれ、相互作用するドメインを含むタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質、このフラグメントおよび誘導体を組み換え発現させ、単離してもよく、または化学的に合成してもよい。
【００２８】
本明細書に開示される方法と共に使用するための抗体は、全抗体または抗体の結合フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび単鎖Ｆｖフラグメント（ＳｃＦｖ）、またはＬＩＬＲＢ２モチーフまたはＮｏｔｃｈモチーフに特異的に結合する免疫グロブリンの生物学的に有効なフラグメントを含んでいてもよい。
【００２９】
抗体または抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディおよび線形抗体の全てまたは一部を含む。
【００３０】
ヒト由来の抗体またはヒト化抗体は、ヒトにおける免疫原性が下がっているか、または存在せず、非ヒト抗体と比較して、非免疫原性エピトープの数が少ない。抗体およびこのフラグメントは、一般的に、ヒト被検体において抗原性が低いか、または存在しないように選択されるだろう。
【００３１】
ＬＩＬＲＢ２モチーフまたはＮｏｔｃｈモチーフに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体またはヒト化抗体を作製する方法、または当業者に知られているような抗体を産生するように設計されたトランスジェニック動物または植物を用いる方法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号および同第６，２９１，１５８号を参照）。部分的または完全に合成した抗体のファージディスプレイライブラリーが入手可能であり、ＬＩＬＲＢ２モチーフまたはＮｏｔｃｈモチーフに結合することができる抗体またはこのフラグメントについてスクリーニングすることができる。例えば、目的の標的に特異的に結合するＦａｂフラグメントのＦａｂファージディスプレイをスクリーニングすることによって、結合ドメインを特定してもよい（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４、２００５を参照）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも入手可能である。さらに、簡便な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（Ｒ）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭ−マウス（Ｒ）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において免疫原として目的の標的を用いるハイブリドーマ開発のための従来の戦略を使用し、結合ドメインを開発することができる。特定の実施形態において、抗体は、ＬＩＬＲＢ２モチーフまたはＮｏｔｃｈモチーフに特異的に結合し、非特異的な要素または無関係の標的とは交差反応しない。特定したら、この抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を単離および／または決定してもよい。
【００３２】
別の具体的な実施形態において、アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈと拮抗するタンパク質またはこのフラグメントまたはこの誘導体を組み換え発現する細胞である。この細胞は、ＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈの信号変換が活性化される、例えば、細胞表面に分泌され、発現するなどの前駆細胞に利用可能な様式でアゴニストを発現する。
【００３３】
さらに別の具体的な実施形態において、アゴニストは、多くのＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈのシグナル伝達経路に結合するペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子である。このようなアゴニストは、本明細書に記載されるキメラＬＩＬＲＢ２受容体レポーター系および／または当業者が選択する結合アッセイ、例えば、Ｒｅｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ６７：６８７−６９９および国際特許公開第９２１１９７３４号に記載される細胞凝集アッセイによって特定することができる。
【００３４】
好ましい実施形態において、アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈのタンパク質またはフラグメントへの結合に介在するＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈと相互作用する遺伝子によってコードされるタンパク質のフラグメントを少なくとも含むタンパク質であり、フラグメントは、アゴニストタンパク質への結合に関与する領域を含む。
【００３５】
ある実施形態において、アゴニストは、前駆細胞に導入された核酸から組み換え発現する。具体的な実施形態において、組み換え発現されるアゴニストは、受容体の細胞内ドメインと、別のリガンドに結合する表面受容体の細胞外ドメインとを含むキメラタンパク質である。このような実施形態において、ＬＩＬＲＢ２経路またはＮｏｔｃｈ経路は、このような別のリガンドに結合する表面受容体のリガンドにさらされることによって活性化することができる。組み換え発現されるアゴニストは、誘導可能なプロモーターに由来する前駆細胞によって発現させることができる。特定の実施形態において、アゴニストをコードする核酸の発現は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系またはＦＬＰ／ＦＲＴ系の制御下にある。一実施形態において、アゴニストは、Ｃｒｅ部位に隣接している。
【００３６】
ある具体的な実施形態において、細胞をアゴニストにさらすことは、細胞表面でＬＩＬＲＢ２リガンドまたはＮｏｔｃｈリガンドを組み換え発現する他の細胞と共にインキュベートすることによって行われるのではなく（しかし、他の実施形態において、この方法を使用してもよい）、細胞を含まないリガンドにさらされることによって、例えば、ＬＩＬＲＢ２またはＮｏｔｃｈの細胞を含まないリガンドと共にインキュベートすることによって行われ、このリガンドは、固相の表面に固定化され、例えば、組織培養皿の表面に固定化されている。
【００３７】
ある実施形態において、細胞は、第１の固相に固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストと、第２の固相に固定化されたＮｏｔｃｈアゴニストと共に細胞を培養することによって拡大培養され、第１の固相と第２の固相は同じである。
【００３８】
ある実施形態において、細胞は、第１の固相に固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストと、第２の固相に固定化されたＮｏｔｃｈアゴニストと共に細胞を培養することによって拡大培養され、第２の固相は、第１の固相ではない。ある具体的な実施形態において、第１の固相と第２の固相は、異なる種類の固相であり、当該技術分野で知られている任意のものから選択され、限定されないが、培養皿、培養フラスコ、培養プレート、ビーズ、粒子などが挙げられる。具体的な実施形態において、第１の固相は、組織培養皿または組織培養皿フラスコの表面であり、第２の固相は、ビーズ、例えば、磁気マイクロビーズである。他の具体的な実施形態において、第１の固相は、ビーズ、例えば、磁気マイクロビーズであり、第２の固相は、組織培養皿または組織培養皿フラスコの表面である。ＬＩＬＲＢ２アゴニストまたはＮｏｔｃｈアゴニストが異なる固相に固定化されている実施形態において、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストと同時に、または連続して培養されてもよい。
【００３９】
５．２  ＬＩＬＲＢ２アゴニスト
本明細書に開示される方法は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む。特定の実施形態において、アンジオポエチンおよびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）は、例示的なＬＩＬＲＢ２アゴニストを代表するものである。近年まで、Ａｎｇｐｔｌは、受容体が知られていなかったため、「オーファンリガンド」とされていた。２０１２年に、本願発明者の一部が、幾つかのＡｎｇｐｔｌの受容体として、ヒト白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）およびこのマウスオルソログと対になるＩｇ様受容体（ＰｉｒＢ）を特定した。Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８５：６５６−６６０。ＬＩＬＲＢ２およびＰｉｒＢは、ヒトおよびマウスのＨＳＣでそれぞれ発現し、ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助することも発見された。Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８５：６５６−６６０。ＬＩＬＲＢ２の配列情報は、寄託番号：ＮＰ＿００１２６５３３５．２（配列番号３）；寄託番号：ＮＰ＿００１２６５３３４．２（配列番号４）；寄託番号：ＮＰ＿００１２６５３３３．２（配列番号５）；寄託番号：ＮＰ＿００１２６５３３２．２（配列番号６）；および寄託番号：ＡＡＨ３６８２７．１（配列番号７）を含む。
【００４０】
幾つかのＡｎｇｐｔｌは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで前駆細胞（例えば、ＨＳＣ）の活性化を補助する。例えば、幾つかのＡｎｇｐｔｌは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＨＳＣの分化を抑制し、再増殖を促進する。Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１１；９：１１９−１３０；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：４７０−４７９；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８；１５：３０７−３１１；およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１：３４１５−３４２３。ＬＩＬＲＢ２およびＰｉｒＢも、白血球始原細胞の分化を抑制し、自己再生を促進するため、白血病の進行に必要である。Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８５：６５６−６６０。さらに、ＬＩＬＲＢ２／ＰｉｒＢに対するＡｎｇｐｔｌの結合が、ＳＨＰ−２およびＣＡＭＫの活性化を誘発することも示され、この両因子は、ＨＳＣの活性化を補助するのに重要であることが知られている。Ｋｉｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：３３１０１−３３１０８；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６；３４：１２３０−１２３９。
【００４１】
ＬＩＬＲＢ２受容体は、ＩＴＩＭモチーフがホスファターゼＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２またはＳＨＩＰに動員されると、細胞の活性化を負の方向に制御するため、細胞内ドメインにＩＴＩＭを含有し、阻害性受容体に分類される。Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２０１１：２７５３０２；Ｄａｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００８；２２４：１１−４３。重要な疑問は、Ａｎｇｐｔｌの結合がどのようにしてＬＩＬＲＢ２の活性化を引き起こすかである。実施例１において、ＡｎｇｐｔｌとＬＩＬＲＢ２の相互作用に関する分子基盤を記載している。哺乳動物で発現するＡｎｇｐｔｌ２は、ＨＭＷ種として存在し、ＬＩＬＲＢ２の活性化、およびその後のシグナル伝達の活性化に必要であることが示されている。Ａｎｇｐｔｌ２の結合に重要なＬＩＬＲＢ２の第１から第４のＩｇドメインの中の新規モチーフも特定された。さらに、ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合は、別のリガンドＨＬＡ−Ｇの結合よりも強力であり、別のリガンドＨＬＡ−Ｇの結合と全く重なっていないことも示されている。Ａｎｇｐｔｌ／ＬＩＬＲＢ２相互作用の新しい理解に基づき、再増殖するヒトＣＢ前駆細胞を安定的で再現性よくｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養することを補助する、所定のサイトカインと固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体を含有し、血清を含まない培地が開発された。
【００４２】
以上のことに基づき、本開示のＬＩＬＲＢ２アゴニストは、特に、高分子量Ａｎｇｐｔｌを含め、高分子量アゴニスト（２００ｋＤより大きい；２１０ｋＤより大きい；２１５ｋＤより大きい；２２０ｋＤより大きい；２２５ｋＤより大きい；２３０ｋＤより大きい；２３５ｋＤより大きい；２４０ｋＤより大きい；２４５ｋＤより大きい；２５０ｋＤより大きい；２５５ｋＤより大きい；２６０ｋＤより大きい；２６５ｋＤより大きい；２７０ｋＤより大きい；２７５ｋＤより大きい；２８０ｋＤより大きい；２８５ｋＤより大きい；２９０ｋＤより大きい；２９５ｋＤより大きい；または３００ｋＤより大きい）を含んでいてもよい。ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、マルチマー化されたＡｎｇｐｔｌを含め、マルチマー化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストも含んでいてもよい。
【００４３】
特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインの中のモチーフ、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ２ドメインの中のモチーフ、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ３ドメインの中のモチーフ、および／またはＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインの中のモチーフに結合する。さらに特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインの中のモチーフに結合する。さらに特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、Ｉｇ１ドメインの位置９２−１００のアミノ酸に結合する。さらに特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、Ｉｇ４ドメインの位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する。さらに特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、Ｉｇ１ドメインの位置９２−１００のアミノ酸およびＩｇ４ドメインの位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する。さらに特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、Ｉｇ１ドメインの位置９４、９５および９６のアミノ酸およびＩｇ４ドメインの位置３９２および３９４のアミノ酸に結合する。
【００４４】
本開示の中で、Ａｎｇｐｔｌは、アンジオポエチンと構造的に類似する、分泌されるグリコシル化タンパク質のファミリーの任意のメンバーであってもよい（Ｏｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８０：２１−８（２００４））。アンジオポエチンと同様に、Ａｎｇｐｔｌは、Ｎ末端のＣＣドメインと、Ｃ末端のＦＢＮ様ドメインとを含む。アンジオポエチンとは異なり、Ａｎｇｐｔｌは、チロシンキナーゼ受容体Ｔｉｅ２に結合しない。Ａｎｇｐｔｌとしては、Ａｎｇｐｔｌ  ２、３、４、５、６および７が挙げられる。Ａｎｇｐｔｌは、ミクロフィブリル結合糖タンパク質４（Ｍｆａｐ４）およびこのアナログおよび類似体も含む。Ａｎｇｐｔｌ２は、Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４、２６５２３−８）に記載されている。これに加え、Ａｎｇｐｔｌは、市販されている（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐ）。
【００４５】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、寄託番号ＡＡＨ１２３６８（ヒトＡｎｇｐｔｌ２前駆体；配列番号８）、寄託番号ＡＡＨ５８２８７（ヒトＡｎｇｐｔｌ３前駆体；配列番号９）、寄託番号ＡＡＨ２３６４７（ヒトＡｎｇｐｔｌ４；配列番号１０）および寄託番号ＡＡＨ４９１７０（ヒトＡｎｇｐｔｌ５；配列番号１１）といった例示的なＡｎｇｐｔｌが提供される。Ａｎｇｐｔｌ７の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＨ０１８８１（配列番号１２）中に見出される。Ｍｆａｐ４の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ００２３９５（配列番号１３）中に見出される。
【００４６】
Ａｎｇｐｔｌの適切な等価体としては、これらの因子に対する生体活性が野生型Ａｎｇｐｔｌまたは精製したＡｎｇｐｔｌ（例えば、組み換え産生した）と類似するタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。Ａｎｇｐｔｌの適切なアナログとしては、望ましい活性および関連する分子を保持するフラグメントが挙げられる。好ましいアナログの一例は、ＣＣドメイン（例えば、Ａｎｇｐｔｌ２のＣＣドメイン）を含有するＡｎｇｐｔｌのフラグメントである。別のアナログは、ＦＢＮ様ドメインである。Ａｎｇｐｔｌのフラグメント、例えば、ＣＣドメインおよびＦＢＮ様ドメインは、全長タンパク質と比較すると、発現させ、精製するのが容易であろう。対応するＡｎｇｐｔｌ受容体に結合し、この受容体に対するＡｎｇｐｔｌの結合に関連する１つ以上の生体作用を開始することができる分子も、本開示の範囲に含まれる。
【００４７】
ＬＩＬＲＢ２受容体に対する抗体を使用してもよい。例示的な市販の抗体としては、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ、ＢＡＦ２０７８番、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ、１６−５１４９−８５番、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。
【００４８】
ＬＩＬＲＢ２アゴニストの例示的な製造方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００１７７８４号および同第２０１１／０１９６３４３号に記載されている。
【００４９】
特定の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２結合タンパク質（例えば、抗ＬＩＬＲＢ２抗体）がＬＩＬＲＢ２アゴニストであるかどうかを決定するために、前駆細胞、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞を、ＬＩＬＲＢ２結合タンパク質存在下で培養し、次いで、例えば、ｑ−ＰＣＲによってＨｅｓ１発現レベルの増加（ＬＩＬＲＢ２アゴニスト活性を有しないコントロール分子存在下で培養した前駆細胞に対する。）について調べ、ＬＩＬＲＢ２結合タンパク質存在下で培養した細胞におけるＨｅｓ１発現レベルの増加は、このＬＩＬＲＢ２結合タンパク質がＬＩＬＲＢ２アゴニストであることを示す。他の実施形態において、ＬＩＬＲＢ２結合タンパク質（例えば、抗ＬＩＬＲＢ２抗体）がＬＩＬＲＢ２アゴニストであるかどうかを決定するために、前駆細胞、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞を、ＬＩＬＲＢ２結合タンパク質存在下で培養し、次いで、ＮＳＧマウスに注射し、ＮＳＧマウスにおけるＬＩＬＲＢ２結合タンパク質存在下で培養した細胞の生着の増加（ＬＩＬＲＢ２アゴニスト活性を有しないコントロール分子存在下で培養した前駆細胞に対する。）は、このＬＩＬＲＢ２結合タンパク質がＬＩＬＲＢ２アゴニストであることを示す。
【００５０】
５．３  Ｎｏｔｃｈアゴニスト
本開示は、ＡｎｇｐｔｌアゴニストとＮｏｔｃｈアゴニストの組み合わせを用い、前駆細胞を安定的で再現性よくｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養することも記載する。
【００５１】
Ｎｏｔｃｈファミリーのメンバーは、多くの無脊椎系の初期の成長中、細胞−細胞相互作用および細胞の運命の決定に中心的な役割を果たす大きな膜貫通タンパク質をコードする（Ｓｉｍｐｓｏｎ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７３６−７；Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：２２５−２３２；Ｓｉｍｐｓｏｎ、１９９８、Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９：５８１−２；Ｇｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２５：２０３１−２０４０；Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｐｓｏｎ、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：４０３−４０８）。Ｎｏｔｃｈ受容体は、すぐそばに隣接する細胞によってなされる選択に基づいて、さまざまな種類の細胞が、幾つかの選択肢から分化経路を選択することができる、高度に保存された経路の一部である。この受容体は、２つの選択肢となる運命の１つを選ぶための競争を抑制し、これによって、細胞の分化を遅らせるか、または適切な成長信号存在下で、抑制されなかった経路に沿って分化するように方向性が定められることによって、方向性が定まっていない細胞から分化した状態への進化を制御する、定義されていない一般的な工程によって作用すると思われる。
【００５２】
遺伝子研究および分子研究によって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に固有の要素を定める遺伝子群が特定される。これらの種々の要素の特定は、遺伝子ツールを用い、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａから行われるが、初期の誘導と、その後の分析によって、ヒトを含む脊椎動物で相同性を有するタンパク質が特定される。既知のＮｏｔｃｈ経路の要素と、この細胞内局在化との分子の関係は、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２；Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６；およびＫｏｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｃｅｌｌ  １３７：２１６−２３３に記載されている。Ｄｅｌｔａファミリーのタンパク質およびＳｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｒｒａｔｅの哺乳動物ホモログであるＪａｇｇｅｄを含む）ファミリーのタンパク質が、Ｎｏｔｃｈの細胞内リガンドである。Ｎｏｔｃｈに対する結合に関与するＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅの一部は、ＤＳＬドメインと呼ばれ、このドメインは、このタンパク質の細胞外ドメインに位置している。Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインの中の上皮成長因子様リピート（ＥＬＲ）１１および１２は、Ｄｅｌｔａ、ＳｅｒｒａｔｅおよびＪａｇｇｅｄに対する結合に関与している。Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２およびＫｏｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｃｅｌｌ  １３７：２１６−２３３を参照。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関連する例示的な配列としては、寄託番号：Ｐ４６５３１．４（配列番号１４）；寄託番号：ＡＡＧ０９７１６．１（配列番号１５）；寄託番号：２ＫＢ９＿Ａ（配列番号１６）および寄託番号：２ＶＪ２＿Ｂ（配列番号１７）が挙げられる。
【００５３】
本開示は、Ｎｏｔｃｈアゴニストの使用を想定する。本開示で使用が想定されているのは、米国特許第７，３９９，６３３号に開示されるいずれかのＮｏｔｃｈアゴニスト、または当該技術分野で知られている任意の他のＮｏｔｃｈアゴニストである。
【００５４】
Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、限定されないが、細胞内ドメインを含むＮｏｔｃｈタンパク質およびこの誘導体、これらをコードするＮｏｔｃｈ核酸、ＮｏｔｃｈリガンドのＮｏｔｃｈと相互作用するドメイン（例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅの細胞外ドメイン）を含むタンパク質が挙げられる。他のアゴニストとしては、限定されないが、ＲＢＰ  ＪＫＩ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＨａｉｒｌｅｓｓまたはＤｅｌｔｅｘが挙げられる。Ｎｏｔｃｈの活性を高めるために、例えば、Ｄｅｌｔａタンパク質と組み合わせて、Ｆｒｉｎｇｅを使用してもよい。これらのタンパク質、このフラグメントおよびこの誘導体が組み換え発現され、単離されてもよく、または化学合成されてもよい。
【００５５】
好ましい実施形態において、アゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質またはＮｏｔｃｈのフラグメントへの結合に介在するＮｏｔｃｈと相互作用する遺伝子によってコードされるタンパク質のフラグメントを少なくとも含むタンパク質であり、Ｎｏｔｃｈのフラグメントは、アゴニストタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈの内皮成長因子様リピート１１および１２への結合に関与するＮｏｔｃｈの領域を含む。Ｎｏｔｃｈと相互作用する遺伝子とは、Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｊａｇｇｅｄ、ＲＢＰＪＫ、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＨａｉｒｌｅｓｓおよびＤｅｌｔｅｘ、および配列相同性または遺伝子相互作用の観点で特定し得るＤｅｌｔａ／ＳｅｒｒａｔｅファミリーまたはＤｅｌｔｅｘファミリーの他のメンバーの遺伝子を意味し、さらに一般的には、「Ｎｏｔｃｈカスケード」または「Ｎｏｔｃｈグループ」のメンバーの遺伝子を意味し、分子相互作用（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合）または遺伝子相互作用（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて表現型で示されるような）によって特定される。Ｎｏｔｃｈに対する結合に関与する領域を含む、Ｎｏｔｃｈに結合するタンパク質の例示的なフラグメントは、米国特許第５，６４８，４６４号；同第５，８４９，８６９号；および同第５，８５６，４４１号に記載される。本開示の方法によって利用されるＮｏｔｃｈアゴニストは、商業的に得ることができ、組み換え発現によって製造してもよく、または化学合成してもよい。
【００５６】
ある具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質のドミナントアクティブ変異体である（例えば、細胞外のリガンド結合ドメインがないＮｏｔｃｈ受容体）。別の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質のドミナントアクティブ変異体ではない。
【００５７】
ある実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、前駆細胞に導入された核酸から組み換え発現される。Ｎｏｔｃｈアゴニストの組み換え発現に使用可能な方法は、米国特許第７，３９９，６３３号の第５．３章に記載されている。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、前駆細胞で組み換え発現されたＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインを含む、Ｎｏｔｃｈタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスのＮｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３またはＮｏｔｃｈ−４）である。具体的な実施形態において、組み換え発現されるＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインと、別のリガンドに結合する表面受容体（例えば、ＥＧＦ受容体）の細胞外ドメインとを含むキメラＮｏｔｃｈタンパク質である。このような実施形態において、Ｎｏｔｃｈ経路は、このような別のリガンドに結合する表面受容体（例えば、ＥＧＦ）のリガンドにさらされることによって活性化することができる。組み換え発現されるＮｏｔｃｈアゴニストは、誘導可能なプロモーターから前駆細胞によって発現させることができる。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストをコードする核酸の発現は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系またはＦＬＰ／ＦＲＴ系の制御下にある。一実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｃｒｅ部位に隣接している。
【００５８】
別の具体的な実施形態において、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，７８０，３００号に記載されるように、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバーの活性化に必要な成熟工程または処理工程に介在する細胞工程を促進または活性化する試薬、例えば、Ｎｏｔｃｈの処理に必要なツリン様転換酵素Ｋｕｚｂａｎｉａｎ、Ｎｏｔｃｈ経路の上流またはＮｏｔｃｈ経路と並行する経路の活性化に必要であると思われるメタロプロテアーゼ−ジスインテグリン（ＡＤＡＭ）を含み（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｉａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ、１９９９、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１２：３６０３−３６１７）、または、さらに一般的には、細胞のトラフィッキングを行い、細胞を処理するタンパク質、例えば、細胞要素間の移動に必要なＧＴＰａｓｅのｒａｂファミリーを含む（Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅの総説については、Ｏｌｋｋｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｎｍａｒｋ、１９９７、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１７６：１−８５を参照）。アゴニストは、上の工程のいずれかの活性を高める任意の分子であってもよい。例えば、ツリン、Ｋｕｚｂａｎｉａｎまたはｒａｂタンパク質をコードする核酸、またはこのフラグメントまたは誘導体またはドミナントアクティブ変異体、または上のタンパク質に結合し、この機能を活性化するペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子であってもよい。
【００５９】
米国特許第５，７８０，３００号は、さらに、本開示の実施においてＮｏｔｃｈ経路を活性化するために使用可能なＮｏｔｃｈアゴニスト分子の分類（およびこの特定方法）、例えば、ＲＢＰ−ＪＫを用いたＮｏｔｃｈアンキリンリピートの解離の引き金となり、これによって、細胞質から核へのＲＢＰ−ＪＫの転座を促進する分子を開示する。
【００６０】
例示的なＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈの信号変換を活性化する細胞外結合リガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ（例えば、Ｊａｇｇｅｄ）、またはＮｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈの信号変換を活性化するＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ（例えば、Ｊａｇｇｅｄ）のフラグメント（例えば、細胞外ドメイン）である。ＤｅｌｔａファミリーおよびＳｅｒｒａｔｅファミリーのメンバー（例えば、Ｊａｇｇｅｄファミリーのメンバー）の核酸およびアミノ酸の配列は、ヒトを含む幾つかの種から単離され、当該技術分野で知られており、国際特許公開第９３／１２１４１号、同第９６／２７６１０号、同第９７／０１５７１号、Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：７８５−７９４に開示される。Ｊａｇｇｅｄは、Ｓｅｒｒａｔｅの哺乳動物ホモログである。本出願で使用される場合、Ｓｅｒｒａｔｅは、特に述べられていない限り、Ｊａｇｇｅｄを包含すべきである。一実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ＤｅｌｔａｅｘｔＩｇＧであり、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａタンパク質のフラグメントである。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ抗体またはこの抗原結合フラグメントである。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはこの抗原結合フラグメントである。さらに具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−１  ＨＭＮ１−５１９抗体である（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡから市販されている。）。他の具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−２抗体またはこの抗原結合フラグメントである。さらに具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−２  ＨＭＮ２−２５抗体である（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡから市販されている。）。他の具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体と抗Ｎｏｔｃｈ−２抗体の組み合わせである。
【００６２】
公共のデータベースから与えられる配列情報を使用し、本明細書に開示されるタンパク質をコードする核酸配列を特定してもよく、逆も成り立つ。本明細書に開示され、言及される配列の改変体も含まれる。タンパク質の改変体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、以下の保存的置換群のいずれかに見出される置換を含む。１群：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；２群：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）；３群：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；４群：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；５群：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；６群：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）。
【００６３】
さらに、アミノ酸は、同様の機能または化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄を含有する。）によって保存的置換群に分けることができる。例えば、脂肪族の群は、置換の目的のために、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含んでいてもよい。互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸を含有する他の群としては、硫黄を含有するもの：Ｍｅｔおよびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ；小さな脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；極性の負に帯電した残基およびこのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；大きな脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐが挙げられる。さらなる情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ中に見出される。
【００６４】
本明細書に開示され、または参照されるタンパク質配列の改変体は、本明細書に開示され、または参照されるタンパク質配列と少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も含む。
【００６５】
「配列同一性％」は、配列を比較することによって決定されるような２つ以上の配列の関係を指す。当該技術分野において、「同一性」は、このような配列の鎖間のマッチ率によって決定されるようなタンパク質間の配列の関係性の度合いも意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれることも多い）は、（限定されないが）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）に記載される方法を含め、既知の方法によって簡単に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最良のマッチ率を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムでコード化されている。配列アラインメントおよび同一性率の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行われてもよい。配列の複数のアラインメントは、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用い、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を用いて行うこともできる（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１−１５３（１９８９）。関連するプログラムには、ＧＣＧ  ｓｕｉｔｅのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、マディソン、ウィスコンシン）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン）；およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１−２０．編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．発行会社：Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．も挙げられる。本開示の内容の中で、分析に配列分析ソフトウェアを使用する場合、分析結果は、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づく��とが理解されるだろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初に初期化したときにソフトウェアに元々ロードされる任意の一連のパラメータを意味するだろう。
【００６６】
５．４  固定化された／固体支持材
ある実施形態において、培養する工程中に、前駆細胞は、固定化されたＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニスト存在下で培養され、特定の実施形態において、アゴニストの細胞外ドメイン存在下で培養され、さらに特定の実施形態において、融合対に融合したアゴニストの細胞外ドメイン存在下で培養される。具体的な実施形態において、培養する工程中に、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストでコーティングされた固相の上で培養される。
【００６７】
特定の実施形態において、単離された前駆細胞は、フィブロネクチンまたはこのフラグメント（例えば、ＣＨ−２９６；（Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｂｌｏｏｄ  ９２（１２）：４６１２−２１））またはレトロネクチン（Ｒ）（組み換えヒトフィブロネクチンフラグメント；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、マディソン、ＷＩ））存在下で拡大培養される。特定の実施形態において、フィブロネクチンは、組織培養皿から除外されるか、または別の細胞外マトリックスタンパク質と置き換えられる。前駆細胞の拡大培養のためのさらなる例示的な培養条件について、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，３９９，６３３号も参照。例えば、単離された前駆細胞は、固定化されたフィブロネクチンまたはこのフラグメント（例えば、ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストと同じ固相に固定化されている）存在下で拡大培養されてもよく、またはＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストが固定化されている固相とは異なる固相に固定化されていてもよい。
【００６８】
５．５  成長因子および他の培養要素
ある実施形態において、前駆細胞は、１種類以上の成長因子、２種類以上の成長因子、３種類以上の成長因子、または４種類以上の成長因子存在下で拡大培養される（例えば、流体培地中）。
【００６９】
ある実施形態において、本開示の前駆細胞を拡大培養するのに適した成長因子の量または濃度は、ＨＳＣの増殖を促進するが、ＨＳＣの分化を実質的に促進しないような効果的な量または濃度である。
【００７０】
ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストに細胞をさらす前、さらすのと同時、またはさらした後に、前駆細胞を１種類以上の成長因子にさらしてもよい。ある実施形態において、前駆細胞は、１種類以上の成長因子に少なくとも一部の時間または最短の培養時間、最も好ましくは、培養時間の大部分または全ての期間にわたってさらされ、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストにさらされる。最短の培養時間は、ＬＩＬＲＢ２および／またはＮｏｔｃｈアゴニストおよび成長因子が存在しない状態で細胞が増殖を停止するか、および／または死亡する時間である（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間または２５週間）。具体的な実施形態において、最短の培養時間は、３から４週間である。
【００７１】
具体的で例示的な実施形態において、拡大培養の培地中に存在する成長因子としては、以下の１つ以上の成長因子が挙げられる。幹細胞因子（ＳＣＦ；ｃ−ｋｉｔリガンドまたは巨細胞成長因子としても知られる。）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン成長因子−２（ＩＦＧ−２）および線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ−１）。
【００７２】
ある実施形態において、拡大培養の培地中に存在する成長因子としては、以下の１つ以上の成長因子が挙げられる。ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＩＴ３−Ｌ、ＴＰＯ、エリスロポエチンおよびこれらのアナログ（アナログは、天然に存在する成長因子およびサイトカイン受容体アゴニストの生体活性を有する成長因子の任意の構造改変体を含み、例えば、ＴＰＯ受容体に対するアゴニスト抗体、例えば、ＷＯ２００７１１４５２２７に記載されるＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２）（米国特許第２０１０／０１８３５６４号の１３ページを参照）。一実施形態において、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−ＬおよびＴＰＯを、本明細書で提供される拡大培養方法で使用する。別の実施形態において、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−ＬおよびＴＰＯを、本明細書で提供される拡大培養方法で使用する。ある実施形態において、１種類以上の成長因子を、血清を含まない培地中で使用する。
【００７３】
本開示の前駆細胞を拡大培養するのに適した成長因子の量または濃度は、成長因子の調製物の活性、成長因子と前駆細胞との間の種の対応などに依存して変わるだろう。成長因子の量は、５−１０００ｎｇ／ｍＬの範囲であってもよい。一般的に、成長因子と前駆細胞が同じ種である場合、培地中の成長因子の合計量は、１ｎｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬ、最も好ましくは、約５ｎｇ／ｍＬから２５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【００７４】
特定の実施形態において、上述の成長因子が、前駆細胞を拡大培養するために、以下の濃度で培地条件に存在する。２５−３００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５−３００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３リガンド、２５−１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２５−１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３。さらに具体的な実施形態において、５０、１００または２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０、１００または２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３リガンド、５０または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０または１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を使用してもよい。
【００７５】
一実施形態において、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−リガンドに前駆細胞をさらすことによって拡大培養される。一実施形態において、前駆細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−リガンドに前駆細胞をさらすことによって拡大培養される。別の実施形態において、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−リガンドに前駆細胞を１０日間さらすことによって拡大培養される。
【００７６】
さらなる実施形態において、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニスト、Ｎｏｔｃｈアゴニストおよび５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３リガンド；５０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−６（ＩＬ−６）；５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１；１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３（ＩＬ−３）；および１０μｇ／ｍＬのヘパリンに前駆細胞をさらすことによって拡大培養される。一実施形態において、前駆細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、ＬＩＬＲＢ２アゴニスト、Ｎｏｔｃｈアゴニストおよび５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３リガンド；５０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−６（ＩＬ−６）；５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１；１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３（ＩＬ−３）；および１０μｇ／ｍＬのヘパリンに前駆細胞をさらすことによって拡大培養される。
【００７７】
ＬＩＬＲＢ２アゴニストに細胞をさらす前、さらすのと同時、またはさらした後に、前駆細胞をＮｏｔｃｈアゴニストにさらしてもよい。一実施形態において、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間にわたって、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストの両方にさらされる。ある実施形態において、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する期間の８０％より長く、８５％より長く、９０％より長く、９５％より長く、９８％より長く、または９９％より長い期間にわたって、前駆細胞は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストの両方にさらされる。別の実施形態において、前駆細胞は、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間より短い期間、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストにさらされる。さらに別の実施形態において、前駆細胞は、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間にわたってＬＩＬＲＢ２アゴニストにさらされるが、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間より短い期間（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養期間の１００％より短い、９９％より短い、９８％より短い、９５％より短い、９０％より短い、８５％より短い、８０％より短い、７５％より短い、７０％より短い、６０％より短い、または５０％より短い）、Ｎｏｔｃｈアゴニストにさらされる。または、前駆細胞は、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間にわたってＮｏｔｃｈアゴニストにさらされるが、前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養する全期間より短い期間（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養期間の１００％より短い、９９％より短い、９８％より短い、９５％より短い、９０％より短い、８５％より短い、８０％より短い、７５％より短い、７０％より短い、６０％より短い、または５０％より短い）、ＬＩＬＲＢ２アゴニストにさらされる。
【００７８】
前駆細胞の培養は、米国特許出願公開第２００４／００６７５８３号、米国特許第７，３９９，６３３号または米国特許出願公開第２０１０／０１８３５６４号に記載されるような、または当該技術分野で知られているような任意の適切な培地／条件で行われてもよい（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ＮＹ（１９９４）を参照）。培養時間は、拡大培養された前駆細胞の集合を製造するのに十分な時間である。例えば、前駆細胞は、血清を含まない培地中、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈアゴニストと、場合により、１種類以上の成長因子またはサイトカイン存在下で２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、または３５日間培養されてもよく、または、好ましくは、少なくとも１０日間、または少なくとも１５日間、または少なくとも１６日間培養されてもよい。場合により、培養期間中の任意の時点で、培地を新しい培地と交換してもよく、または新しい培地を加えてもよい。一実施形態において、新しい培地を３日ごとまたは４日ごとに加える。
【００７９】
他の実施形態において、前駆細胞は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間または１０週間培養され、または、好ましくは、前駆細胞は、少なくとも３週間または４週間培養される（ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈアゴニストの組み合わせと、場合により、１種類以上の成長因子存在下で）。さらに他の実施形態において、前駆細胞は、４週間未満培養される（ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈアゴニストの組み合わせと、場合により、１種類以上の成長因子存在下で）。さらに他の実施形態において、前駆細胞は、１０週間より長く、例えば、１２週間、１５週間、１８週間または２０週間または２５週間培養される（ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈアゴニストの組み合わせと、場合により、１種類以上の成長因子存在下で）。
【００８０】
５．６  拡大培養のための前駆細胞の供給源、収集、単離および処理
本開示は、前駆細胞が細胞周期休止または非複製期に入るのを回避するか、または遅らせることによって、前駆細胞を不死化し、場合により分化させるための方法を提供する。本開示の不死化のための前駆細胞は、最終的な分化をしない細胞であり、限定されないが、ヒト、動物、植物、哺乳動物、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、家禽、昆虫、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓを含む任意の種に由来するものであってもよい。最も好ましくは、前駆細胞は、脊椎動物であり、さらに好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態において、前駆細胞は、細胞株に特徴的な「クライシス」または「老化」期（例えば、安定な表現型の変化を生じる形質転換）を経ない（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９４、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−−Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎのｐ．１２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）。好ましい実施形態において、前駆細胞は、初代培養細胞である。「初代培養細胞」という用語は、細胞が、組織供給源（例えば、哺乳動物の被検体）からの移植の後に継代培養されていないことを示す。
【００８１】
一般的に、必須ではないが、前駆細胞は、多能性幹細胞または多能性前駆細胞である。一実施形態において、前駆細胞は、幹細胞である。別の実施形態において、前駆細胞は、始原細胞である。前駆細胞は、所望な場合、不死化の前または後に細胞の集合から単離されてもよい。
【００８２】
ある具体的な実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞である。ある具体的な実施形態において、前駆細胞は、造血始原細胞である。
【００８３】
ある具体的な実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞を豊富に含む細胞の集合である。別の実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞および始原細胞を豊富に含む細胞の集合である。
【００８４】
前駆細胞の供給源としては、限定されないが、臍帯ＣＢ、胎盤血、末梢血（例えば、動員された末梢血）、骨髄（例えば、大腿骨、臀部、肋骨、胸骨および他の骨に由来する。）、胚性細胞（胚性幹細胞および胚性幹細胞から誘導されるＨＳＣの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、リプログラミングによって誘導されるＨＳＣまたは造血前駆体（Ｇａｚｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、Ｖｏｌ．１、２６６−２８０、２０１３）、大動脈−性腺−中腎領域から誘導される細胞、リンパ、肝臓（例えば、胎児の肝臓）、胸腺および脾臓が挙げられる。前駆細胞の供給源としては、さらに、胎児の血液、新生児の血液（誕生から最初の２８日間の乳児に由来する。）、１２月齢までの乳児からの血液、１歳から３歳の幼児からの血液、３歳から１８歳までの子供からの血液、成人の血液（即ち、１８歳より年を取った被検体に由来）が挙げられる。当業者によって理解されるように、全ての集めたサンプルを、受け入れられている現行の標準に従って、望ましくない要素についてスクリーニングし、廃棄し、処理し、使用してもよい。
【００８５】
臍帯ＣＢおよび／または胎盤血は、当該技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。ＣＢ幹細胞の供給源としての臍帯血または胎盤血の使用は、臍帯血および胎盤血を簡単に得ることができ、ドナーの外傷がないため、多くの利点を与える。例えば、ヒトの誕生時に臍帯血および胎盤血を集めることの考察について、米国特許第５，００４，６８１号を参照。一実施形態において、ＣＢの収集は、米国特許第７，１４７，６２６号に開示される方法によって行われる。
【００８６】
収集は、滅菌条件下で行うべきである。収集してすぐに、臍帯血または胎盤血と、抗凝血剤とを混合すべきである。このような抗凝血剤は、限定されないが、ＣＰＯ（クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース）、ＡＣＤ（酸性クエン酸塩−デキストロース）、Ａｌｓｅｖｅｒ溶液（Ａｌｓｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９４１、Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６）、Ｄｅ  Ｇｏｗｉｎ溶液（Ｄｅ  Ｇｏｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．、１９４０、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０）、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ−Ｍｇ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．、１９５９、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３）、Ｒｏｕｓ−Ｔｕｍｅｒ溶液（Ｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ、１９１６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９）、他のグルコース混合物、ヘパリン、ビスクマ酢酸エチルなどを含め、当該技術分野で知られている任意のものであってもよい。一般的に、Ｈｕｍ、１９６８、Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６−１６０を参照。特定の実施形態において、ＡＣＤを使用してもよい。
【００８７】
ＣＢは、好ましくは、臍帯からの直接的な排出によって、および／または根および膨張した静脈での娩出された胎盤からの針による吸引によって得ることができる。一般的に、米国特許第５，００４，６８１を参照。好ましくは、集めたヒトＣＢおよび／または胎盤血には、汚染物質が含まれない。
【００８８】
特定の実施形態において、ＨＳＣは、胎盤穿刺によって、または米国特許第７，３９９，６３３号の第５．４．５章に記載される胎児鏡検査によって、超音波によるガイドが付いた針を用いて、胎盤の根にある胎児の循環から得た胎児の血液から得ることができる。具体的な実施形態において、ＨＳＣは、米国特許第７，３９９，６３３号の第５．４．５章に記載されるようなホウォートンゼリーから得られる。
【００８９】
末梢血は、好ましくは、収集前に動員される。末梢血は、当該技術分野で知られる任意の方法によって動員されてもよい。前駆細胞を収集する被検体を、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られている任意の薬剤で治療し、被検体の末梢血中を循環する前駆細胞の数を増やすことによって、末梢血が動員されてもよい。例えば、ある実施形態において、前駆細胞を収集する被検体を、１種類以上のサイトカインまたは成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチンまたはＧＭ−ＣＳＦ（例えば、サルグラモスチム））で治療することによって、末梢血が動員される。末梢血を動員するための方法で使用可能な異なる種類のＧ−ＣＳＦとしては、限定されないが、フィルグラスチムおよびもっと長く作用するＧ−ＣＳＦ−ペグフィルグラスチムが挙げられる。特定の実施形態において、前駆細胞を収集する被検体を、１種類以上のケモカイン（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−Ｉａ（ＭＩＰ１ａ／ＣＣＬ３））、ケモカイン受容体リガンド（例えば、ケモカイン受容体２リガンドＧＲＯＰおよびＧＲＯＰＭ）、ケモカイン受容体アナログ（例えば、ストロマ細胞由来因子−１ａ（ＳＤＦ−１ａ）ペプチドアナログ、例えば、ＣＴＣＥ−００２１、ＣＴＣＥ−０２１４またはＳＤＦ−１ａ、例えば、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１ｐ）、またはケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００）で治療することによって、末梢血が動員される。ある実施形態において、前駆細胞を収集する被検体を、１種類以上の抗インテグリンシグナル伝達剤（例えば、抗最晩期抗原４（ＶＬＡ−４）抗体または抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）をブロックする機能）で治療することによって、末梢血が動員される。他の実施形態において、前駆細胞を収集する被検体を、１種類以上の細胞毒性薬、例えば、シクロホスファミド、エトポシドまたはパクリタキセルで治療することによって、末梢血が動員される。特定の実施形態において、上に列挙した１種類以上の薬剤を特定の期間、被検体に投与することによって、末梢血が動員されてもよい。例えば、被検体を、注射（例えば、皮下、静脈内または腹腔内）によって１日に１回または１日に２回、前駆細胞を収集する前の１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間、１種類以上の薬剤（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）で治療してもよい。具体的な実施形態において、前駆細胞を、末梢血を動員するために用いられる薬剤を最後に投薬してから１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２０時間以内、または２４時間以内に収集する。ある実施形態において、前駆細胞を収集する被検体を、上述の２種類以上の異なる薬剤、または当該技術分野で知られている２種類以上の異なる薬剤、例えば、成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）およびケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００）、または成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＫＬ）および抗インテグリン剤（例えば、ＶＬＡ−４抗体をブロックする機能）で治療することによって、末梢血が動員される。特定の実施形態において、異なる種類の動員剤を同時に、または連続して投与する。末梢血を動員する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０（１２）：４７７９−４７８８；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３９；Ｐｅｌｕｓ、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｂｌｏｏｄ  ９１（７）：２２３１−２２３９；Ｔｒｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９３（１１）：１７３９−１７４２；Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９を参照）。
【００９０】
骨髄からの前駆細胞は、例えば、針による吸引によって、後腸骨稜の骨髄から直接的に得ることができ（例えば、Ｋｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４）、または骨髄コンパートメントから放出される細胞を誘発するサイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）で前処理した後の血液から得ることができる。末梢血からの前駆細胞は、被検体の静脈に挿入されたシリンジまたはカテーテルを通った血液から集めることができる。例えば、アフェレーシス機を用い、末梢血を集めることができる。アフェレーシス機に入れたカテーテルを通る静脈から血液が流れ、血液の残りの部分から前駆細胞を分離し、次いで、血液を被検体の体内に戻す。十分な前駆細胞が収集されるまで、アフェレーシスを数日間（例えば、１日から５日）行ってもよい。
【００９１】
前駆細胞が単離されるか、または収集されたら、血液を処理し、前駆細胞を濃縮した集合を製造してもよい。臍帯ＣＢまたは胎盤血から作られる、濃縮した前駆細胞は、ＣＢ幹細胞の集合を形成してもよい。好ましくは、濃縮した前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＨＳＣに豊富に含まれる（従って、Ｔ細胞が失われている。）。従って、濃縮は、サンプル中のＨＳＣの割合を高くする工程を指す（濃縮手順前のサンプル中の割合と比較して）。精製は、濃縮の一例である。特定の実施形態において、濃縮手順前のサンプルと比較して、濃縮されたサンプル中の細胞の割合としてのＣＤ３４＋細胞（または他の適切な抗原陽性細胞）の数の増加は、少なくとも２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍であり、好ましくは、１００−２００倍である。好ましい実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、抗体が磁気ビーズに接合しているＣＤ３４に対するモノクローナル抗体と、磁気セル分離デバイスとを用いることによって濃縮され、ＣＤ３４＋細胞を分離する。ある実施形態において、米国特許第７，３９９，６３３号の第５．４．１．１章に記載されるように、抗ＣＤ３４抗体を用いると、ＨＳＣは、正常な骨髄細胞の集合での１−２％から、この集合では約５０−８０％まで濃縮されている。
【００９２】
細胞の分離／選択のために当該技術分野で知られている任意の技術を使用し、ＨＳＣのような種類の細胞の濃縮を行ってもよい。例えば、細胞表面マーカーの異なる発現に依存する方法を使用してもよい。
【００９３】
分離のための手順は、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離；蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）；アフィニティクロマトグラフィー；モノクローナル抗体に接続した細胞毒性剤またはモノクローナル抗体と組み合わせて使用される細胞毒性剤、例えば、相補体と細胞毒素；および固体マトリックス（例えば、プレート）に接続した抗体を用いた「パンニング」、または他の従来の技術を含んでいてもよい。正確な分離／選択を与える技術としては、蛍光活性化細胞分類が挙げられ、例えば、複数のカラーチャンネル、鋭角および鈍角の光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどのさまざまな程度の精密さを有していてもよい。
【００９４】
特定の種類の細胞の分離を容易にするために、抗体を、直接的な分離が可能なマーカー（例えば、磁気ビーズ）、支持材に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて除去することができるビオチン、蛍光活性化細胞分類と共に使用することができる蛍光色素などに接合してもよい。残りの細胞の生存率に過度に悪影響を与えない任意の技術を使用してもよい。一実施形態において、ＨＳＣの濃縮は、前駆細胞サンプルを、抗体が結合した固体基材（例えば、ビーズ、フラスコ、磁気粒子）と接触し、結合していない細胞を除去することによって行われ、ＨＳＣは、固体基材に結合した細胞の中、または使用した抗体に依存して、結合していない細胞の中に見出すことができる。
【００９５】
本開示の一実施形態において、前駆細胞サンプル（例えば、新鮮なＣＢ単位）を処理し、磁気セル分離器、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）と組み合わせた磁気粒子に直接的または間接的に接合した抗ＣＤ３４抗体を用い、ＣＤ３４＋細胞を選択し（即ち、濃縮し）、特定のモノクローナル抗体に連結した、酸化鉄およびデキストランで構成されるナノサイズの超常磁性粒子を使用する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒは、閉じた密閉系であり、１回使用したら廃棄可能な管セットが取り付けられている。
【００９６】
同様に、ＣＤ１３３＋細胞を、抗ＣＤ１３３抗体を用いて濃縮することができる。ある具体的な実施形態において、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞が濃縮される。同様に、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＨＬＡ  ＤＲ、またはこれらの組み合わせを発現する細胞は、抗原に対する抗体を用いて濃縮することができる。
【００９７】
一実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４（ＣＤ３４＋）を発現し、ＣＤ３８を発現しない（ＣＤ３８）。ある実施形態において、ＣＤ３４＋ＣＤ３８細胞について、ＨＳＣが選択され、および／または濃縮される。具体的な実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋およびＣＤ３Ｔ、ＣＤ３８−、ＨＬＡ  ＤＫおよび／または  Ｔｈｙ−１ｌｏである。ある実施形態において、ＣＤ３４＋およびＣＤ３３、ＣＤ３８−、ＨＬＡ  ＤＫおよび／またはＴｈｙ−１ｌｏ細胞について、ＨＳＣが選択され、および／または濃縮される。特定の実施形態において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ４５Ｒａ−、ＣＤ１９−および／またはｃ−ｋｉｔ＋である。ある実施形態において、ＣＤ４５Ｒａ−、ＣＤ１９−および／またはｃ−ｋｉｔ＋細胞について、ＨＳＣが選択され、および／または濃縮される。一実施形態において、ＨＳＣは、血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を発現する。ある実施形態において、ＶＥＧＦＲ２について、ＨＳＣが選択され、および／または濃縮され、これをＨＳＣのマーカーとして使用することができる。
【００９８】
ＨＳＣは、米国特許第７，３９９，６３３号の第５．４．１．１章に記載されるように濃縮することもできる。特に、サンプルを、グリコホリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ２４、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ６６ａおよびＣＤ６６ｂの１つ以上を認識する抗体と共にインキュベートし、抗体に結合した細胞を、抗体に結合していない細胞から分離することによって、ヒトＨＳＣを濃縮することができる。これら幾つかの実施形態において、ＨＳＣについて、抗体に結合していない細胞の集合が濃縮されるだろう。ある実施形態において、Ｍｙ１０およびＨＬＡ−ＤＲを使用し、濃縮されたＨＳＣが得られる。ある実施形態において、例えば、Ｔ細胞抗原と補体を認識するモノクローナル抗体で細胞を前処理することによって、Ｔリンパ球の枯渇を利用し、ＨＳＣを濃縮する。一実施形態において、グリコホリンＡ抗体を使用し、赤血球を選択するか、または赤血球を遠ざける。他の実施形態において、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６６ａおよびＣＤ６６ｂに対する抗体を使用し、単球を選択するか、または単球を遠ざける。他の実施形態において、ＣＤ２４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２に対する抗体を使用し、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ＮＫ細胞を選択するか、または遠ざける。さらに別の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３６に対する抗体を使用し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、血小板、単球、分化した赤血球前駆細胞、およびある程度方向性が定まった成熟始原細胞を選択するか、または遠ざける。ｐｒｅ−Ｂ前駆細胞のマーカーは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原であってもよい。ＣＤ２１は、成熟Ｂ細胞のマーカーである。具体的な実施形態において、ＨＳＣの濃縮に使用可能な抗体としては、Ｍｙ−１０および３Ｃ５（ＣＤ３４を認識する。）またはＲＦＢ−１（ＣＤ９９を認識し、ＢＦＵ−Ｅ細胞の集合を特定する。）が挙げられる。上述の造血抗原に対する他の抗体は、米国特許第５，８７７，２９９号に開示される。
【００９９】
上述の抗体を単独で使用してもよく、または「パンニング」のような手順と組み合わせて使用し（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３）、または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）と組み合わせて使用し（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１００４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｂｌｏｏｄ  ６８（１）：１２６−１３３）、米国特許第７，３９９，６３３号の第５．４．１．１章に記載されるように、これらの抗体によって認識される表面決定因子を含む細胞を単離してもよい。
【０１００】
ある具体的な実施形態において、ＨＳＣ（例えば、臍帯ＣＢおよび／または胎盤血に由来する）サンプルは、赤血球が枯渇しており、赤血球が枯渇したフラクションの中のＣＤ３４＋細胞の数を計算する。好ましくは、３５０万個より多いＣＤ３４＋細胞を含有するＨＳＣ（例えば、臍帯ＣＢおよび／または胎盤血に由来する）サンプルは、上述の濃縮方法によって濃縮される。上述の濃縮方法または当該技術分野で知られている他の方法に従ってＨＳＣを単離した後、ＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の数を増やすために、濃縮されたＨＳＣを拡大培養してもよい。それほど好ましくはない実施形態において、本明細書に記載される方法は、事前の濃縮なしに適用されてもよく、または濃縮の前に適用されてもよい。
【０１０１】
ある実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養される前駆細胞は、新鮮である。即ち、以前に冷凍保存され、解凍されたものではない。他の実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養される前駆細胞は、冷凍保存され、解凍されたものである。前駆細胞は、例えば、末梢血（例えば、動員された末梢血）、骨髄、臍帯ＣＢまたは胎盤血から誘導されてもよい。
【０１０２】
５．７  使用方法
本明細書に開示される方法は、被検体（ヒト、動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）および研究動物（サル、ラット、マウス、魚等）を、本明細書に開示されるように拡大培養された前駆細胞で治療することを含む。被検体の治療は、治療に有効な量を送達することを含む。治療に有効な量は、有効な量の予防的な治療および／または治療的な治療を与える量を含む。
【０１０３】
「有効な量」は、被検体において望ましい生理学的変化を引き起こすのに必要な前駆細胞の量である。有効な量は、研究目的のために投与されることも多い。特定の実施形態において、有効な量によって、拡大培養されたサンプルを注入したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、拡大培養されていないサンプルと比較して、生着の向上によって示されるように、限界希釈分析によって決定される拡大培養されたサンプルの中の細胞が再増殖するＳＣＩＤの数が増え、拡大培養されていないサンプルと拡大培養されたサンプルは、同じサンプルの異なるアリコートであり、拡大培養されたサンプルには、拡大培養されていないサンプルと異なり、拡大培養技術が行われる。有効な量は、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデルのようなＨＳＣの長期間にわたる移植の可能性のための動物モデルを用いて決定することもでき（Ｋｙｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ７９：１７０４；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５（２）３６８−３７８）、子宮ヒツジモデルを用いて決定することもできる（Ｚａｎｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１１７９））。ヒト造血の動物モデルの総説について、Ｓｒｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．１：１４３−１５３およびそこに引用されている参考文献を参照。有効な量は、５週間後から８週間後のストロマ細胞との同時培養で作られるクローン化可能細胞の数の限界希釈分析に基づく長期間の培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで評価することもできる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：３５８４−３５８８）。ＬＴＣＩＣアッセイは、別の一般的に用いられる幹細胞アッセイである、敷石状の領域を形成する細胞（ＣＡＦＣ）アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期間にわたる移植の可能性と相関関係があることが示されている（Ｂｒｅｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８：１０９５）。
【０１０４】
「予防的な治療」は、不完全な細胞の集合の徴候または症状を示していない被検体または不完全な細胞の集合の初期の徴候または症状しか示していない被検体に投与される治療を含み、不完全な細胞の集合がさらに成長する危険性を減らし、予防し、または減少させる目的のために治療が投与される。従って、予防的な治療は、不完全な細胞の集合に対する予防的な治療として機能する。
【０１０５】
「治療的な治療」は、不完全な細胞の集合の徴候または症状を示す被検体に投与される治療を含み、不完全な細胞の集合の徴候または症状を減らすか、またはなくす目的のために被検体に投与される。治療的な治療は、不完全な細胞の集合の存在を減らすか、制御するか、またはなくすことができる。
【０１０６】
投与のために、まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび／または動物モデル試験の結果に基づき、治療に有効な量（本明細書で投薬量とも呼ばれる。）を概算してもよい。特定の被検体に投与される実際の投薬量は、標的、体重、細胞機能不全の重篤さ、以前または現在の治療介入、被検体の特発性疾患、投与経路を含む物理的因子および生理学的因子のようなパラメータを考慮して、医師、獣医師または研究者が決定することができる。
【０１０７】
治療に有効な量は、数百個（またはもっと少ない）から、数百万またはもっと多い個数の細胞を含んでいてもよい。具体的な実施形態において、治療に有効な量は、１００ｋｇあたり１０３個から１０８個の細胞である。さらなる実施形態において、ヒト被検体では、治療に有効な量は、注入あたり、１００ｋｇにつき１０３個から１０８個の細胞、注入あたり、１００ｋｇにつき１０４個から１０９個の細胞、または注入あたり、１００ｋｇにつき１０５個から１０１３個の細胞を含んでいてもよい。別の実施形態において、治療に有効な量は、注入あたり、１００ｋｇにつき１×１０８個から５×１０１２個の細胞を含んでいてもよい。別の実施形態において、治療に有効な量は、注入あたり、１００ｋｇにつき１×１０９個から５×１０１１個の細胞を含んでいてもよい。例えば、１００ｋｇにつき４×１０９個の細胞から１００ｋｇにつき２×１０１１個の細胞といった投薬量を注入してもよい。
【０１０８】
ある実施形態において、前駆細胞を１回投与する。他の実施形態において、複数回の投与を用いる。３日から７日の連続した日数の初期治療計画のように、周期的に複数回の投与を与え、その他の回数を繰り返してもよい。
【０１０９】
導入方法としては、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外の経路が挙げられる。前駆細胞は、従来の経路、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜のライニングによる吸収（例えば、経口粘膜、直腸粘膜など）によって投与されてもよく、他の生体活性薬剤と共に投与されてもよい。静脈内投与は、他の投与態様よりも容易であり、簡便であり、高いレベルで快適さを与える。特定の用途において、静注による全身投与の方が、全体的に効果的である。別の実施形態において、上腸間膜動脈または腹腔動脈に注入することによって、前駆細胞を個体に投与する。前駆細胞は、レシピエントの気道に潅注するか、または腸粘膜に直接注射することによって、局所的に送達されてもよい。
【０１１０】
拡大培養された前駆細胞を種々の用途に使用してもよい。一実施形態において、前駆細胞を移植、例えば、骨髄移植、遺伝子治療、組織エンジニアリングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官形成に使用する（細胞治療または細胞代替治療と呼ばれることがある。）。一例として、骨髄移植のための造血前駆細胞の拡大培養は、ヒト骨髄培養物の潜在的な用途である。ヒト骨髄の自家移植および同種移植は、現在、白血病、リンパ腫および他の生命を脅かす疾患のような疾患のための治療法として陥られている。しかし、これらの手技のために、生着のための十分な細胞が確実に存在するようにするには、大量のドナー骨髄を取り出さなければならない。本開示の方法は、この問題を回避する。移植方法は、当業者に知られている。
【０１１１】
細胞治療または細胞代替治療としても知られている移植治療に関し、幾つかの用語を本明細書で使用する。自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）などの用語は、細胞のドナーが、細胞代替治療のレシピエントでもある治療を指す。同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）などの用語は、細胞のドナーが、細胞代替治療のレシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない治療を指す。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合性である細胞移植は、同系移植と呼ばれることがある。異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）などの用語は、細胞のドナーが、細胞代替治療のレシピエントと異なる種である治療を指す。
【０１１２】
前駆細胞の移植は、造血障害および造血疾患の治療に有用であろう。一実施形態において、前駆細胞を使用し、正常な血液細胞の産生および成熟の欠陥または機能不全を特徴とする造血障害または造血疾患を治療または予防する。別の実施形態において、前駆細胞を使用し、造血器悪性腫瘍から生じる造血障害または造血疾患を治療または予防する。さらに別の実施形態において、前駆細胞を使用し、免疫抑制、特に、悪性固体腫瘍を患う被検体の免疫抑制から生じる造血障害または造血疾患を治療または予防する。さらに別の実施形態において、前駆細胞を使用し、造血系に影響を与える自己免疫疾患を治療または予防する。さらに別の実施形態において、前駆細胞を使用し、遺伝性または先天性の造血障害または造血疾患を治療または予防する。
【０１１３】
本明細書に開示される方法によって拡大培養される前駆細胞によって治療可能な、特定の造血障害または造血疾患のさらなる例は、（ｉ）正常な血液細胞の産生および成熟の欠陥または機能不全から生じる疾患（例えば、過剰増殖性幹細胞障害；再生不良性貧血；汎血球減少症；無顆粒球症；血小板減少症；赤血球無形成症；薬物、放射線または特発的な感染に起因するＢｌａｃｋｆａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群）；（ｉｉ）造血器悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性（リンパ球性）白血病；慢性リンパ球性白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；急性悪性骨髄硬化症；多発性骨髄腫；真性赤血球増加症；原因不明の骨髄化生；Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫）；（ｉｉｉ）悪性固体腫瘍を患う被検体の免疫抑制（例えば、悪性黒色腫；胃のカルチノーマ；卵巣カルチノーマ；乳房カルチノーマ；小細胞肺カルチノーマ；網膜芽細胞腫；精巣カルチノーマ；膠芽細胞腫；横紋筋肉腫；神経ブラストーマ；ユーイング肉腫；リンパ腫；（ｉｖ）自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ；Ｉ型糖尿病；慢性肝炎；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；（ｖ）遺伝性（先天性）障害（例えば、貧血；家族性再生不良性貧血；Ｆａｎｃｏｎｉ症候群；Ｂｌｏｏｍ症候群；真正赤血球無形成症（ＰＲＣＡ）；先天性異常角化症；Ｂｌａｃｋｆａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群；先天性赤血球異形成症候群Ｉ−ＩＶ；Ｃｈｗａｃｈｍａｎｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群；ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症；ホルムアミノトランスフェラーゼ欠損症；Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群；先天性球状赤血球症；先天性楕円赤血球症；先天性有口赤血球症；先天性Ｒｈヌル疾患；発作性夜間ヘモグロビン尿症；Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）改変体１、２、３；ピルベートキナーゼ欠損症；先天性エリスロポエチン感受性不全；鎌状細胞の疾患および特徴；サラセミアα、β、γ；メトヘモグロビン血症；先天性免疫障害；重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）；不全リンパ球症候群；イオノフォア応答性複合型免疫不全症；キャッピング異常を伴う複合免疫不全；ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；顆粒球アクチン欠損症；小児無顆粒球症；Ｇａｕｃｈｅｒ病；アデノシンデアミナーゼ欠損症；Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群；細網異形成症；先天性白血球機能不全症候群）；（ｖｉ）その他（例えば、大理石骨病；骨髄硬化症；後天性溶血性貧血；後天性免疫不全症；原発性または続発性の免疫不全細胞感染を引き起こす感染性障害（例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｏｓｉｓ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｌｅｐｒｏｓｙ）；寄生虫感染（例えば、マラリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）；真菌感染；加齢に起因するリンパ系細胞の硬化および免疫機能不全における不均衡を伴う傷害；食細胞障害；Ｋｏｓｔｍａｎｎ無顆粒球症；慢性肉芽腫性疾患；Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｃｈｉ症候群；好中球アクチン欠損症；好中球膜ＧＰ−１８０欠損症；代謝性蓄積症；ムコ多糖症；ムコリピドーシス；免疫機構が関与する雑多な障害；Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群；α１−アンチトリプシン欠損症）が挙げられる。
【０１１４】
拡大培養された前駆細胞は、特定の造血系統の細胞供給源としても有用である。拡大培養された造血系細胞から、１つ以上の選択した系統への成熟、増殖および分化は、限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−１３などを含む適切な因子と共に、またはストロマ細胞または幹細胞の再生、方向付けおよび分化に関与する因子を分泌する他の細胞と共に細胞を培養することによって行われてもよい。当業者によって理解されるように、分化した前駆細胞を、本明細書に記載される方法に従って使用してもよい。
【０１１５】
本開示は、治療に有効な量の前駆細胞を含む医薬組成物として被検体に投与するための拡大培養された前駆細胞を配合することを含む。一実施形態において、前駆細胞は、実質的に精製されている。医薬組成物の配合は、当該技術分野でよく知られている。特定の実施形態において、医薬組成物は、医薬として許容される担体または賦形剤、例えば、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。医薬組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤も含んでいてもよい。医薬組成物は、液体溶液、懸濁物またはエマルションであってもよい。特定の実施形態において、医薬組成物は、可溶化剤および／または注射部位の痛みをやわらげるための局所麻酔薬（例えば、リグノカイン）も含んでいてもよい。
【０１１６】
６．例示的な実施形態
１．前駆細胞を拡大培養する方法であって、少なくとも２２５ｋＤの分子量を有する固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、この培養は、少なくとも２２５ｋＤの分子量を有する固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および／または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
【０１１７】
２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、少なくとも２５０ｋＤの分子量を有する、実施形態１に記載の方法。
【０１１８】
３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストがマルチマー化されている、実施形態１または２に記載の方法。
【０１１９】
４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）またはこのフラグメントである、実施形態１、２または３に記載の方法。
【０１２０】
５．Ａｎｇｐｔｌまたはこのフラグメントが、Ａｎｇｐｔｌのコイルドコイルドメインを含む、実施形態４に記載の方法。
【０１２１】
６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ１もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ２もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ３もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ４もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ５もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ７もしくはそのフラグメントまたはＭｆａｐ４もしくはそのフラグメントである、実施形態４または５に記載の方法。
【０１２２】
７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２受容体抗体である、実施形態１に記載の方法。
【０１２３】
８．ＬＩＬＲＢ２抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、実施形態７に記載の方法。
【０１２４】
９．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
１０．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
１１．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインに結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
１２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９２−１００のアミノ酸に結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
１３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９４、９５および／または９６のアミノ酸に結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
１４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
１５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９２および３９３のアミノ酸に結合する、実施形態１−８のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
１６．培地が血清を含まない、実施形態１−１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
１７．培地は、１−１００μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態１−１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１３３】
１８．培地は、２５μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態１７に記載の方法。
【０１３４】
１９．培地が、さらに、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１７または１８に記載の方法。
【０１３５】
２０．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯまたは０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１７または１８に記載の方法。
【０１３６】
２１．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１３７】
２２．培地が、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１３８】
２３．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１３９】
２４．培地が、以下の成長因子：１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１４０】
２５．前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、実施形態１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
２６．前駆細胞が造血幹細胞である、実施形態１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
２７．前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、実施形態１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
２８．前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、実施形態１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
２９．前駆細胞を拡大培養するための方法であって、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、この培養は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および／または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
【０１４５】
３０．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが培地中で固定化されている、実施形態２９に記載の方法。
【０１４６】
３１．Ｎｏｔｃｈアゴニストが培地中で固定化されている、実施形態２９または３０に記載の方法。
【０１４７】
３２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、少なくとも２２５ｋＤの分子量を有するまたは少なくとも２５０ｋＤである、実施形態２９、３０または３１に記載の方法。
【０１４８】
３３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストがマルチマー化されている、実施形態２９−３２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４９】
３４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）またはこのフラグメントである、実施形態２９−３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
３５．Ａｎｇｐｔｌまたはそのフラグメントは、Ａｎｇｐｔｌのコイルドコイルドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。
【０１５１】
３６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ１もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ２もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ３もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ４もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ５もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ７もしくはそのフラグメントまたはＭｆａｐ４もしくはそのフラグメントである、実施形態３４または３５に記載の方法。
【０１５２】
３７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２受容体抗体である、実施形態２９−３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
３８．ＬＩＬＲＢ２抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、実施形態３７に記載の方法。
【０１５４】
３９．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
４０．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
４１．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインに結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
４２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９２−１００のアミノ酸に結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
４３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９４、９５および／または９６のアミノ酸に結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
４４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
４５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９２および３９３のアミノ酸に結合する、実施形態２９−３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
４６．Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈと相互作用する、Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞外ドメインである、実施形態２９−４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
４７．ＮｏｔｃｈアゴニストがＤｅｌｔａｅｘｔ−ＩｇＧである、実施形態２９−４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
４８．Ｎｏｔｃｈアゴニストがダイマー形態である、実施形態２９−４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
４９．培地が血清を含まない、実施形態２９−４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
５０．培地が、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態２９−５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
５１．培地は、２５μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態５０に記載の方法。
【０１６７】
５２．培地が、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．０８、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態５０に記載の方法。
【０１６８】
５３．培地が、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのＮｏｔｃｈアゴニストを含む、実施形態２９−５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
５４．培地は、０．５μｇ／ｍＬから２．５μｇ／ｍＬのＮｏｔｃｈアゴニストを含む、実施形態５３に記載の方法。
【０１７０】
５５．培地が、さらに、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態２９−５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
５６．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態５５に記載の方法。
【０１７２】
５７．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、実施形態５６に記載の方法。
【０１７３】
５８．培地が、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む、実施形態５６に記載の方法。
【０１７４】
５９．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態５６に記載の方法。
【０１７５】
６０．培地が、以下の成長因子：１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態５６に記載の方法。
【０１７６】
６１．培地が、さらに、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１およびＩＬ−３を含む、実施形態２９−５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７７】
６２．培地が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１、ＩＬ−３およびヘパリンを含む、実施形態６１に記載の方法。
【０１７８】
６３．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１および０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む、実施形態６１に記載の方法。
【０１７９】
６４．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのヘパリンを含む、実施形態６３に記載の方法。
【０１８０】
６５．培地が、さらに、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む、実施形態６１に記載の方法。
【０１８１】
６６．培地が、さらに、１０μｇ／ｍＬのヘパリンを含む、実施形態６５に記載の方法。
【０１８２】
６７．培地が、さらに、レトロネクチンを含む、実施形態２９−６６のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
６８．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む、実施形態６７に記載の方法。
【０１８４】
６９．培地が、さらに、５μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む、実施形態６８に記載の方法。
【０１８５】
７０．前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、実施形態２９−６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８６】
７１．前駆細胞が造血幹細胞である、実施形態２９−６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８７】
７２．前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、実施形態２９−６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
７３．前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、実施形態２９−６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
７４．造血細胞移植のための前駆細胞を生産するための方法であって、少なくとも２２５ｋＤの分子量を有する固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、この培養が、投与のために配合され、有効な量で投与されたときに被検体を適切に治療することができる前駆細胞を生産するのに効果的である、方法。
【０１９０】
７５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、少なくとも２５０ｋＤの分子量を有するである、実施形態７４に記載の方法。
【０１９１】
７６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストがマルチマー化されている、実施形態７４または７５に記載の方法。
【０１９２】
７７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）またはこのフラグメントである、実施形態７４、７５または７６に記載の方法。
【０１９３】
７８．Ａｎｇｐｔｌまたはそのフラグメントが、Ａｎｇｐｔｌのコイルドコイルドメインを含む、実施形態７７に記載の方法。
【０１９４】
７９．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ１もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ２もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ３もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ４もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ５もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ７もしくはそのフラグメントまたはＭｆａｐ４もしくはそのフラグメントである、実施形態７７または７８に記載の方法。
【０１９５】
８０．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２受容体抗体である、実施形態７４に記載の方法。
【０１９６】
８１．ＬＩＬＲＢ２抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、実施形態８０に記載の方法。
【０１９７】
８２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
８３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
８４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインに結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
８５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９２−１００のアミノ酸に結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
８６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９４、９５および／または９６のアミノ酸に結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
８７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
８８．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９２および３９３のアミノ酸に結合する、実施形態７４−８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
８９．培地が血清を含まない、実施形態７４−８８のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
９０．培地が、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態７４−８９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
９１．培地は、２５μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態９０に記載の方法。
【０２０７】
９２．培地が、さらに、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態７４−９１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
９３．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態９２に記載の方法。
【０２０９】
９４．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、実施形態９３に記載の方法。
【０２１０】
９５．培地が、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む、実施形態９３に記載の方法。
【０２１１】
９６．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態９３に記載の方法。
【０２１２】
９７．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態９３に記載の方法。
【０２１３】
９８．前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、実施形態７４−９７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
９９．前駆細胞が造血幹細胞である、実施形態７４−９７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
１００．前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、実施形態７４−９７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
１０１．前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、実施形態７４−９７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
１０２．前駆細胞を拡大培養するための方法であって、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、この培養は、ＬＩＬＲＢ２アゴニストおよびＮｏｔｃｈアゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および／または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
【０２１８】
１０３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが培地中で固定化されている、実施形態１０２に記載の方法。
【０２１９】
１０４．Ｎｏｔｃｈアゴニストが培地中で固定化されている、実施形態１０２または１０３に記載の方法。
【０２２０】
１０５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、少なくとも２２５ｋＤの分子量を有するまたは少なくとも２５０ｋＤを有する、実施形態１０２、１０３または１０４に記載の方法。
【０２２１】
１０６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストがマルチマー化されている、実施形態１０２−１０５のいずれか１つに記載の方法。
【０２２２】
１０７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストは、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）またはそのフラグメントである、実施形態１０２−１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
１０８．Ａｎｇｐｔｌまたはそのフラグメントは、Ａｎｇｐｔｌのコイルドコイルドメインを含む、実施形態１０２−１０７のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
１０９．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ１もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ２もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ３もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ４もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ５もしくはそのフラグメント、Ａｎｇｐｔｌ７もしくはそのフラグメントまたはＭｆａｐ４もしくはそのフラグメントである、実施形態１０２−１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２５】
１１０．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２受容体抗体である、実施形態１０２−１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２６】
１１１．ＬＩＬＲＢ２抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、実施形態１１０に記載の方法。
【０２２７】
１１２．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインに結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
１１３．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメインに結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
１１４．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメインおよびＩｇ４ドメインに結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３０】
１１５．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９２−１００のアミノ酸に結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
１１６．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１ドメイン内の位置９４、９５および／または９６のアミノ酸に結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
１１７．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９０−３９６のアミノ酸に結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
１１８．ＬＩＬＲＢ２アゴニストが、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ４ドメイン内の位置３９２および３９３のアミノ酸に結合する、実施形態１０２−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
１１９．Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈと相互作用する、Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞外ドメインである、実施形態１０２−１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
１２０．ＮｏｔｃｈアゴニストがＤｅｌｔａｅｘｔ−ＩｇＧである、実施形態１０２−１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
１２１．Ｎｏｔｃｈアゴニストがダイマー形態である、実施形態１０２−１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
１２２．培地が血清を含まない、実施形態１０２−１２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
１２３．培地は、０．０２５−１００μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態１０２−１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２３９】
１２４．培地は、２５μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態１２３に記載の方法。
【０２４０】
１２５．培地は、０．０８μｇ／ｍＬから２５μｇ／ｍＬの固定化されたＬＩＬＲＢ２アゴニストを含む、実施形態１０２−１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
１２６．培地が、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのＮｏｔｃｈアゴニストを含む、実施形態１０２−１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
１２７．培地は、０．５μｇ／ｍＬから２．５μｇ／ｍＬのＮｏｔｃｈアゴニストを含む、実施形態１２６に記載の方法。
【０２４３】
１２８．培地が、さらに、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１０２−１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
１２９．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１２８に記載の方法。
【０２４５】
１３０．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、実施形態１２９に記載の方法。
【０２４６】
１３１．培地が、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む、実施形態１２９に記載の方法。
【０２４７】
１３２．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１２９に記載の方法。
【０２４８】
１３３．培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンドを含む、実施形態１２９に記載の方法。
【０２４９】
１３４．培地が、さらに、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１およびＩＬ−３を含む、実施形態１０２−１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
１３５．培地が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＧＦ１、ＩＬ−３およびヘパリンを含む、実施形態１３４に記載の方法。
【０２５１】
１３６．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１および１−１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む、実施形態１０２−１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
１３７．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのヘパリンを含む、実施形態１３６に記載の方法。
【０２５３】
１３８．培地が、さらに、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３−リガンド、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含む、実施形態１３６または１３７に記載の方法。
【０２５４】
１３９．培地が、さらに、１０μｇ／ｍＬのヘパリンを含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０２５５】
１４０．培地が、さらに、レトロネクチンを含む、実施形態１０２−１３９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
１４１．培地が、さらに、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む、実施形態１４０に記載の方法。
【０２５７】
１４２．培地が、さらに、５μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含む、実施形態１４１に記載の方法。
【０２５８】
１４３．前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、実施形態１０２−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５９】
１４４．前駆細胞が造血幹細胞である、実施形態１０２−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
１４５．前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、実施形態１０２−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
１４６．前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、実施形態１０２−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
１４７．キメラ受容体レポーター系であって、ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインとＰＩＬＲβの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む融合タンパク質を発現する細胞を含み、ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメインへの活性化リガンドの結合が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、キメラ受容体レポーター系。
【０２６３】
１４８．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインが、Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ２ドメイン、Ｉｇ３ドメインおよび／またはＩｇ４ドメインである、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６４】
１４９．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインがＩｇ１ドメインである、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６５】
１５０．Ｉｇ１ドメインが、ＬＩＬＢ２のアミノ酸２４−１１９を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６６】
１５１．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインがＩｇ２ドメインである、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６７】
１５２．Ｉｇ２ドメインが、ＬＩＬＢ２のアミノ酸１２０−２１９を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６８】
１５３．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインがＩｇ３ドメインである、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２６９】
１５４．Ｉｇ３ドメインは、ＬＩＬＢ２のアミノ酸２２１−３２０を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７０】
１５５．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインがＩｇ４ドメインである、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７１】
１５６．Ｉｇ４ドメインは、ＬＩＬＢ２のアミノ酸３２１−４５８を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７２】
１５７．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインは、Ｉｇ１ドメインおよびＩｇ２ドメインを含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７３】
１５８．Ｉｇ１ドメインおよびＩｇ２ドメインが、ＬＩＬＢ２のアミノ酸２４−２１９を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７４】
１５９．ＬＩＬＲＢ２の少なくとも１つの細胞外ドメインは、Ｉｇ３ドメインおよびＩｇ４ドメインを含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７５】
１６０．Ｉｇ３ドメインおよびＩｇ４ドメインは、ＬＩＬＢ２のアミノ酸２２１−４５８を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７６】
１６１．融合タンパク質は、ＬＩＬＲＢ２のアミノ酸２４−４５８を含む、実施形態１４７に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７７】
１６２．細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞である、実施形態１４７−１６１のいずれか１つに記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７８】
１６３．レポーター遺伝子の発現がＮＦＡＴ活性化から生じる、実施形態１６２に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２７９】
１６４．レポーター遺伝子の発現が、ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にある、実施形態１６２または１６３に記載のキメラ受容体レポーター系。
【０２８０】
１６５．前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるＨＳＣの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるＨＳＣまたは造血前駆体である、実施形態１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
１６６．前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるＨＳＣの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるＨＳＣまたは造血前駆体である、実施形態２９−６９のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
１６７．前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるＨＳＣの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるＨＳＣまたは造血前駆体である、実施形態７４−９７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
１６８．前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるＨＳＣの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるＨＳＣまたは造血前駆体である、実施形態１０２−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を示すために含まれている。当業者は、本開示の観点で、本明細書に開示される特定の実施形態に対して多くの変更をすることができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、同様の結果または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【０２８５】
７．実施例
７．１  実施例１
外因子とＨＳＣの表面受容体との相互作用のより良い理解は、幹細胞の研究および応用に大きな利益を与えるだろう。近年、数種類のＡｎｇｐｔｌが、免役阻害性受容体ＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化し、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助することが示された。しかし、ＡｎｇｐｔｌとＬＩＬＲＢ２の相互作用に関する分子基盤は不明確であった。実施例１は、哺乳動物細胞で発現するＡｎｇｐｔｌ２が、高分子量（ＨＭＷ）の分子種を生成し、下流のシグナル伝達のためのＬＩＬＲＢ２の活性化のために、リガンドのマルチマー化が必要であることを示す。受容体がＡｎｇｐｔｌ２に結合し、活性化されるのに必要なＬＩＬＲＢ２の第１から第４のＩｇドメインの中の新規モチーフが特定された。ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合は、別のリガンドＨＬＡ−Ｇの結合よりも強力であり、別のリガンドＨＬＡ−Ｇの結合と全く重なっていない。固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、Ａｎｇｐｔｌ２よりもＬＩＬＲＢ２のもっと強力な活性化を誘発する。実施例１は、再増殖するヒトＣＢ  ＨＳＣの正味の拡大培養を補助する、指定のサイトカインと固定化された抗ＬＩＬＲＢ２を含有し、血清を含まない培地を記載する。ＬＩＬＲＢ２に結合するＡｎｇｐｔｌの態様の解明によって、ヒトＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養への新しい手法の開発が可能になった。
【０２８６】
７．１．１  実施例１−方法
キメラ受容体レポーター細胞。ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメインの個々または全てのＩｇ−ドメインまたはこの変異体と、活性化するＰＩＬＲβの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含むキメラ受容体を、レトロウイルスベクターを用いることによって、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター遺伝子およびＤＡＰ１２を有するＴ細胞ハイブリドーマ細胞に感染させた。ｈＬＩＬＲＢ２のアミノ酸２４−４５８を使用し、全長ＬＩＬＲＢ２キメラレポーターを構築した。個々のＩｇドメインまたはＩｇの組み合わせのためのアミノ酸配列は、Ｉｇ１（ａａ  ２４−１１９）、Ｉｇ２（ａａ  １２０−２１９）、Ｉｇ３（ａａ  ２２１−３２０）、Ｉｇ４（ａａ  ３２１−４５８）、Ｉｇ１＋２（ａａ  ２４−２１９）およびＩｇ３＋４（ａａ  ２２１−４５８）である。これらのキメラＬＩＬＲＢ２−ＰＩＬＲβ受容体レポーター細胞（５×１０４／ウェル）を、リガンドと共に所定時間インキュベートし、ＧＦＰをフローサイトメトリーによって分析した。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から集めた馴化培地中のＭ２樹脂またはＡｎｇｐｔｌ２による精製されたＡｎｇｐｔｌ２−ＦＬＡＧを、示したように使用した。コーティングされたウェルを用いた実験のために、特に言及されない限り、示される細菌によって発現したＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ、ＢＡＦ２０７８番、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ、１６−５１４９−８５番、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはコントロール抗体を、３７℃で３時間、９６ウェルプレート上でプレコーティングした。抗体が架橋したら、１０μｇ／ｍＬのｐＡｂを１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンと共に４℃で一晩インキュベートした。
【０２８７】
マウス。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒ  γ−／−（ＮＳＧ）マウスを購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの動物施設で維持した。全ての動物実験は、ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅの承認を得て行った。
【０２８８】
プラスミドおよびタンパク質。野生型または変異型のＬＩＬＲＢ２を、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で構築した。Ａｎｇｐｔｌ２またはＨＬＡ−Ｇ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードし、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有するプラスミドＣＭＶ−Ｋｏｚａｋ−ヒトＡｎｇｐｔｌ２を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用い、２９３Ｔ細胞内でトランスフェクトし、４８時間時点での馴化培地を集めた。Ｍ２樹脂を用い、Ａｎｇｐｔｌ２−ＦＬＡＧを精製した。細菌によって発現するＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌｓ−ＦＬＡＧをｐＧＥＸベクター中で構築し、発現させ、細菌から精製した。Ａｎｇｐｔｌタンパク質の濃度を、フローサイトメトリーに基づく結合実験のために同じ濃度になるように調節した。精製された組み換えＨＬＡ−Ｇは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（ＴＰ３０５２１６番）から購入した。
【０２８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび未変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）。還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、サンプルを、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含む４×ローディングバッファーと混合し、１０％ＳＤＳゲルにローディングした。非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、サンプルを、ＢＭＥを含まない４×ローディングバッファーと混合し、１０％ＳＤＳゲルにローディングした。未変性ＰＡＧＥの場合、ＰＡＧＥゲルは、ＳＤＳを含んでいなかった。サンプルを、ＢＭＥを含まない４×ローディングバッファーと混合した。
【０２９０】
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）。細菌から発現し、精製したＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２を、１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムにローディングし、ＰＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて溶出させた。フラクション（０．６ｍｌ）を集め、それぞれのフラクション中のＡｎｇｐｔｌ２の量をウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２９１】
ヒト細胞の培養。新鮮な冷凍保存されたヒトＣＢ細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。全ての細胞は、プールしておいたドナー由来であった。ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞の純度は、フローサイトメトリーによって分析すると、９０％より高かった。解凍した後、トリパンブルー色素排除によって試験した細胞生存性は、７２％より高かった。解凍した細胞を遠心分離処理し、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中に再懸濁させた後、すぐに移植または培養のために小分けした。５０ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＰＯおよび５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３−Ｌを追加し、可溶性または固定化された抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体（１６−５１４９−８５番、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはポリクローナル抗体（ＢＡＦ２０７８番、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎを培地として使用した。上述の新鮮なヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞または冷凍保存されたＣＤ１３３＋細胞を、２００μｌの指定の培地を含む底がＵ型の９６ウェルプレート（３７９９；Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１個のウェルに５×１０３細胞／ウェルで２日間接種した。３日目に、個々のウェルから細胞をプールし、５×１０４細胞／ｍｌで６ウェルプレートに移した。細胞密度を２×１０５細胞／ｍｌ（４日目）または７×１０５細胞／ｍｌ（７日目）に維持するために、４日目および７日目に新しい培地を加えた。細胞を５％ＣＯ２と通常のＯ２のレベルまたは５％Ｏ２（低Ｏ２）レベルで、３７℃で培養した。移植のために、指定数の細胞をそれぞれのマウスに移植する前に、全ての培養ウェルからの細胞をプールした。
【０２９２】
ＮＳＧ移植。ヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞またはＣＤ３４＋細胞の培養していない子孫または指定日数培養した子孫を一緒にプールし、指定された部分を、亜致死量を照射した（２５０ｒａｄ）８週齢から１０週齢のＮＳＧマウスに、眼窩後経路から静脈注射した。移植してから８週間後または指定期間経過後、移植された動物からの骨髄有核細胞を、ヒト細胞の存在についてフローサイトメトリーによって分析した。二次移植のために、Ｂｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００６；１６９：３３８−３４６に記載されるように、一次レシピエントの片方の後脚から骨髄を抜き取り、これを使用し、２匹の二次レシピエントに移植した。限界希釈実験において、長期間にわたって再増殖する細胞の計算（競争的な再増殖単位、ＣＲＵ）を、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。例えば、Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００６；５７：４０３−４１７；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１０；７：４２７−４２８；およびＤｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０；１６：２３２−２３６を参照。
【０２９３】
限界希釈分析の場合、特に言及されない限り、少なくとも１％（一次移植の場合）または０．１％（二次移植の場合）のＣＤ４５／７１＋ヒト細胞がマウス骨髄細胞から検出された場合に、このマウスはヒトＨＳＣ生着に陽性であるとされた。
【０２９４】
フローサイトメトリー。Ａｎｇｐｔｌ２／ＬＩＬＲＢ２結合を測定するために、ＬＩＬＲＢ２またはＣＭＶプロモーターから誘導される変異体の発現のためのプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。分析のために、４８時間目に細胞を集めた。または、単核ヒトＣＢ細胞をＦｃブロックおよび等量のＦＬＡＧタグ化Ａｎｇｐｔｌ２と共に４℃で６０分間インキュベートし、その後、抗Ｆｌａｇ−ＡＰＣおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した。抗ＬＩＬＲＢ２−ＰＥを指定の通りに使用した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置またはＦＡＣＳＡｒｉａ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のいずれかを用いて分析した。
【０２９５】
ＮＳＧマウスでのヒト造血細胞の生着は、Ｈｉｍｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０；１６：４７５−４８２に記載されるプロトコルに従って評価した。簡単に言うと、レシピエントＮＳＧマウス由来の骨髄細胞を、抗ヒトＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ７１−ＰＥ、ＣＤ１５−ＦＩＴＣおよびＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣで染色し、ヒト造血（ＣＤ４５／７１＋）細胞の全集合と、この集合の中の顆粒球生成（ＣＤ１５／６６ｂ＋）細胞のみの一部集合を定量した。細胞を抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ１９−ＰＥおよびＣＤ２０−ＰＥで染色し、ヒト始原細胞（ＣＤ３４＋）およびＢ系統（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）の集合を定量した。抗ヒトＣＤ３を使用し、ヒトＴ系統の再構築を分析した。抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ９０−ＡＰＣを使用し、培養物中のＣＤ３４＋細胞またはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞を定量した。全ての抗ヒト抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。
【０２９６】
レトロウイルス感染。ＰＣＬ−ＥＣＯ（２：１）を含むレトロウイルスプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。得られたレトロウイルスの上清を４８−７２時間後に集め、感染のために使用した。標的細胞を、４μｇ／ｍＬのポリブレンを含むウイルス上清に再懸濁させ（１×１０５細胞／ｍｌ）、２０００ｒｐｍで１２０分間遠心分離処理した後、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で２４時間培養した。次いで、別の感染経路のために、細胞をウイルス上清に再懸濁させた。
【０２９７】
生存細胞の免疫蛍光および共焦点顕微鏡。ＬＩＬＲＢ２キメラ受容体レポーター細胞を、ＰＢＳまたはコーティングされたモノクローナル抗ＬＩＬＲＢ２抗体を用い、３７℃で６時間処理した。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ラット抗ヒトＬＩＬＲＢ２抗体を用い、４℃で１５分間処理した。細胞をヤギ抗ラットＣｙ３を用い、４℃で１５分間、さらに処理し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡による実験のために、スライド上で計測した。それぞれの画像をＺ−ｓｅｒｉｅｓで細胞の上部から底部までスキャンした。
【０２９８】
７．１．２  実施例１−結果
マルチマー化されたＡｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２を活性化させる。ＬＩＬＲＢが介在するシグナル伝達のための下流の決定的なレポーターが存在しないため、安定なレポーター細胞系を使用し、Ａｎｇｐｔｌ２が、ＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化させるかどうかを調べた。このキメラ受容体レポーター系において、ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＩＴＡＭを含有するアダプタータンパク質ＤＡＰ１２と会合する、対となる免疫グロブリン様受容体β（ＰＩＬＲβ）の膜貫通／細胞内ドメインと融合させる。キメラ受容体が、ＬＩＬＲＢ２のＥＣＤに結合するＡｎｇｐｔｌ２によって活性化される場合、ＺＡＰ７０またはＳｙｋキナーゼが、アダプターＤＡＰ１２のＩＴＡＭに再動員され、活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）を活性化させ、ＮＦＡＴ応答性プロモーターによって発動するＧＦＰ発現を促進する（図１Ａ）。このレポーターの確立は、ＬＩＬＲＢ１レポーター系によって示唆され（Ａｒａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９６：１３２３−１３２６；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４；１０１：８１２６−８１３１）、異なる形態のＡｎｇｐｔｌ２（可溶性、固定化されたもの、モノマーおよびオリゴマーを含む）のシグナル伝達誘発能力の試験を可能にし、さらなるアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするための代替となる感受性の高い系として役立つ。
【０２９９】
哺乳動物細胞で発現するＡｎｇｐｔｌ２が、ＬＩＬＲＢ２によるシグナル伝達を活性化することができるかどうかを調べるために、ＬＩＬＲＢ２レポーター細胞を、Ａｎｇｐｔｌ２を発現する（２μｇ／ｍｌ）ように設計されたプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から集めた馴化培地と共にインキュベートした（図２の模式図）。モックのトランスフェクトを行った２９３Ｔ細胞からの馴化培地は、コントロールとして役立った。２４時間後、Ａｎｇｐｔｌ２で処理されたＬＩＬＲＢ２レポーター細胞は、コントロール細胞よりもＧＦＰ発現を顕著に大きく誘発した（１８．９５±０．９５％対５．３４±１．１９％；図１Ｂ）。固定化されたＨＬＡ−ＧによるＬＩＬＲＢ２の結合／活性化の可能性も、同じＬＩＬＲＢ２レポーター細胞を用いて測定した。ＧＦＰ活性化は、１３０μｇ／ｍＬ程度の多いＨＬＡ−Ｇによっても検出されなかった（図３）。このことは、Ａｎｇｐｔｌ２が、ＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化する能力を有し、この能力は、ＨＬＡ−Ｇより顕著に大きいことを示唆している。並行して、フローサイトメトリー分析を用いたＨＬＡ−Ｇ−ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２／ＬＩＬＲＢ２の結合。この目的のために、Ａｎｇｐｔｌ２発現ベクターと同じシグナルペプチドを用い、分泌可能なＨＬＡ−Ｇ−ＥＣＤ発現ベクターを構築し（図２）、一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の表面で発現するＬＩＬＲＢ２に結合させるために、等量の可溶性ＨＬＡ−Ｇ−ＥＣＤおよびＡｎｇｐｔｌ２を集めた。キメラレポーター系の結果と同様に、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＨＬＡ−Ｇよりも顕著に大きなアフィニティでＬＩＬＲＢ２に結合する（図１Ｃ）。
【０３００】
２９３Ｔ細胞で発現するＡｎｇｐｔｌ２の上述の特性決定において、Ａｎｇｐｔｌ２の全長（ＦＬ）、コイルドコイルドメイン（ＣＣ）およびＦＢＮ様ドメインを、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）処理を行った場合と、行っていない場合で比較した。ＢＭＥ処理は、ジスルフィド結合を還元し、Ａｎｇｐｔｌ２のＨＭＷ形態を安定化させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される場合、Ａｎｇｐｔｌ２の全長およびＣＣドメインの調製は、それぞれ、ＨＭＷバンド（２５０ｋＤより大きい）として、部分的に、または排他的に行われ、一方、ＦＢＮドメインは、ＦＢＮモノマーの予想される大きさに対応する３７ｋＤバンドとして移動した（図１Ｄ）。ＨＭＷ種は、マルチマー化した状態になっているようであった。同様に、マルチマー化されたＡｎｇｐｔｌ２は、マウスの血清および血漿に存在する（図４）。
【０３０１】
細菌発現系によって、大量のＧＳＴタグ化Ａｎｇｐｔｌ２の産生および精製が可能になった（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８５：６５６−６６０）。サイズ排除クロマトグラフィーによってモノマーＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２を精製し、生成物を未変性ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって検出した（図１Ｅ−Ｇ）。マルチマー化されたリガンドは、表面受容体のクラスター化を誘発する能力を有し（Ａｒａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９６：１３２３−１３２６；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４；１０１：８１２６−８１３１）、固定化されたリガンドも、受容体をクラスター化する場合があり、可溶性のモノマーＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２および固定化されたモノマーＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２がＬＩＬＲＢ２レポーター細胞を活性化する能力を比較した。モノマーＧＳＴ−Ａｎｇｐｔｌ２は、組織培養プレートのウェルに固定化されたか、または培地に添加され、ＬＩＬＲＢ２レポーター細胞が添加された。固定化されたモノマー形態のみがＧＦＰ発現を誘発し、可溶性モノマーはＧＦＰ発現を誘発しなかった（２０±２．６５％対３．５６±０．９８％；図１Ｈ）。Ａｎｇｐｔｌ２の自然にマルチマー化されている形態および固定化されたモノマーＡｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２を活性化したが、可溶性のモノマーＡｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２を活性化せず、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２の活性なリガンドとなるためには、マルチマー化されていなければならないと結論付けることができた。
【０３０２】
マルチマー化された形態のＡｎｇｐｔｌ２が、ＬＩＬＲＢ２を活性化するために必要であるかどうかをさらに調べるために、ＬＩＬＲＢ２レポーター細胞に対するモノクローナルおよびポリクローナルの抗ＬＩＬＲＢ２抗体の影響を試験した。可溶性のモノクローナルおよびポリクローナルの抗ＬＩＬＲＢ２は、固定化されたＡｎｇｐｔｌ２によるＬＩＬＲＢ２の活性化を抑制し（１９．９％から０．８１または２．３１％へ；図５Ａ）、このことは、Ａｎｇｐｔｌ２とＬＩＬＲＢ２の結合が、抗ＬＩＬＲＢ２とＬＩＬＲＢ２の結合ほど強力ではないという考えを裏付けている。コントロール抗体も、可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２も、ＧＦＰ発現を刺激せず、固定化されたモノクローナルおよびポリクローナルの抗ＬＩＬＲＢ２は、両方とも、ＧＦＰの上方制御を効果的に誘発した（３．８８％から３３．７または８７％；図５Ｂ）。さらに、ビオチンに接合した抗ＬＩＬＲＢ２と、ストレプトアビジンによって活性化されたＧＦＰ発現が相互に関係している（３．１％から３６．４％；図５Ｃ）。抗ＬＩＬＲＢ２は、ＬＩＬＲＢ２に対する結合アフィニティがＡｎｇｐｔｌ２よりも高いが、固定化された抗体のみがＬＩＬＲＢ２を活性化し、可溶性の抗体は活性化しなかった。固定化されたリガンドが、受容体のクラスター形成を誘発するかどうかを決定するために、固定化されたモノクローナル抗ＬＩＬＲＢ２による治療を行う場合または行わない場合に、細胞表面でのＬＩＬＲＢ２の局在化を調べた。治療を行わないと、大部分のＬＩＬＲＢ２キメラレポーター細胞（８１．２％）は、細胞膜の上にＬＩＬＲＢ２−ＥＣＤが均一に分布し、共焦点顕微鏡で観察すると、「リング」状の形状を有している（図５Ｄ）。対照的に、固定化された抗体で治療すると、ＬＩＬＲＢ２−ＥＣＤの分布は、９７．８％のシグナル伝達によって活性化された細胞（ＧＦＰが誘発された細胞）で、「リング」状から「スポット」状へと変化した（図５Ｄ）。これらの結果は、さらに、マルチマー化されたリガンドが、シグナル伝達の活性化のための受容体ＬＩＬＲＢ２のクラスター形成を誘発するという結論を裏付ける。
【０３０３】
ＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン中のモチーフは、結合および受容体の活性化におけるＡｎｇｐｔｌ２の影響にとって重要である。ＬＩＬＲＢ２は、４つの細胞外の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む。Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２０１１：２７５３０２。これらのＩｇドメインの１つ以上がＡｎｇｐｔｌ２に結合するという仮説を立てた。この仮説を調べるために、フローサイトメトリーによる細胞表面リガンド結合アッセイおよびキメラレポーターアッセイのために、ＬＩＬＲＢ２の多くのドメインおよび部位特異的な変異を作製した。ここから開始するために、ＬＩＬＲＢ２の多くのドメイン変異のＡｎｇｐｔｌ２の結合能力をスクリーニングした。ＬＩＬＲＢ２の個々のＩｇドメインはＡｎｇｐｔｌ２に結合しないが、Ｉｇ１とＩｇ２が組み合わさって、Ｉｇ３とＩｇ４が組み合わさって、それぞれ全長ＬＩＬＲＢ２とＡｎｇｐｔｌ２の最大結合の約５０％および１０％を示した（図６Ａ−Ｂ、図７）。このことは、主なＡｎｇｐｔｌ２結合部位がＬＩＬＲＢ２のＩｇ１およびＩｇ２にあり、Ｉｇ３とＩｇ４は、このタンパク質のＣ末端ドメインの結合を容易にすることを示唆する。
【０３０４】
次に、ＬＩＬＲＢ２  ２８の構造（ＰＤＢ構造２ＧＹ７）に基づきＬＩＬＲＢ２に対するリガンドの結合にとって重要な可能性があるアミノ酸の一連の部位特異的な変異を設計した。ＬＩＬＲＢ２の物理マッピングデータに基づき、Ｉｇ１−Ｉｇ２とＩｇ３−Ｉｇ４の組み合わせによって、Ａｎｇｐｔｌ２との結合活性を維持することができ、このことは、それぞれのＩｇドメインに対する１個の界面が、ＬＩＬＲＢ２結合親和性に必須なものではないことを示す。この種類のＩｇ構造について、結合界面は、おそらく、堅く保存されたβシートではなく、柔軟性がある可変性のループに位置する。Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのＰＤＢ構造（ＰＤＢＩＤ：２ＧＷ５および２ＤＹＰ）およびＩｇ３−Ｉｇ４ドメインのＰＤＢ構造（ＰＤＢＩＤ：４ＬＬＡ）に基づき、それぞれのＩｇドメインの可能な界面を設計した（図８）。４種類のＩｇドメインの全体的な幾何形状は、非常に柔軟性であり、それぞれのいずれかが必須というわけではないため、それぞれのＩｇドメイン上の点変異は、ＬＩＬＲＢ２とＡｎｇｐｔｌ２の全体的な結合を妨害しないだろう。従って、突然変異誘発試験のため、幾つかのさらなる大きな疎水性の残基を特定した（図８Ａ−Ｂ）。しかし、これらの変異ＬＩＬＲＢ２は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合を顕著に下げない（図８Ｃ）。これらの結果は、Ａｎｇｐｔｌ２が、ＬＩＬＲＢ２において、ＨＬＡ−Ｇとはある程度異なる結合ポケットを有し得ることを示唆する（さらなるデータについては、以下を参照）。
【０３０５】
バイオインフォマティクス分析および突然変異誘発試験の結果を合わせ、Ｉｇ１のＡＡ  ９２−１００が、Ａｎｇｐｔｌ２の結合にとって重要であることを発見した。この領域に変異を有するＩｇ１＋２フラグメント（Ｍｕｔ−８ａａ）は、Ａｎｇｐｔｌ２に結合せず、同じ変異を有する全長ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合は、野生型タンパク質と比較して、５０％より多く低下した（図６Ｃ−Ｄ）。さらなる実験は、Ｇ９４、Ｒ９５またはＹ９６の１箇所の変異によって、それぞれ、全長ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合が半分まで低下した（図６Ｅ）ことを示し、このことは、これらの３個のアミノ酸が、Ｉｇ１におけるＡｎｇｐｔｌ２の結合に必須であることを示している。同様のモチーフであるＡＡ  ３９０−３９６が、Ｉｇ４に存在する（図６Ｃ）。Ｙ３９４の１箇所の変異によって、全長ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合が約３０％低下した（図６Ｅ）。さらに、Ｙ９６Ａと組み合わせると、Ｇ３９２ＤまたはＹ３９４Ａの変異によって、全長ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合が完全に失われた（図６Ｅ−Ｆ）。従って、これらの結果は、Ｉｇ２がＩｇ１を補助し、主要なＡｎｇｐｔｌ２結合部位を形成し、Ｉｇ４は、さらに、Ｉｇ１＋２の結合を容易にし、Ｉｇ１およびＩｇ４の中のＨ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフは、ＬＩＬＲＢ２がＡｎｇｐｔｌ２に結合するのに必須であることを示す。
【０３０６】
Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ５およびＨＬＡ−Ｇが、ＬＩＬＲＢ２の同じ領域に結合するかどうかをさらに観察するために、変異ＬＩＬＲＢ２に対するこれらのリガンドの結合を比較した。ＨＬＡ−Ｇは、Ａｎｇｐｔｌ２より低いアフィニティで、Ｈ９２Ｓ、Ｔ９３Ａ、Ｇ９４Ｄ、Ｒ９５Ｅ、Ｑ９９Ｒ、Ｇ３９２Ｄ、Ｔ３９３ＥおよびＨＬＡ−Ｇ結合部位１（ＭＨＣ−Ｓ１）を含む多くの変異ＬＩＬＲＢ２に結合する（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６；１０３：１６４１２−１６４１７；Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３；１００：８８５６−８８６１による構造から）。Ａｎｇｐｔｌ５は、一般的にＨＬＡ−ＧよりもＡｎｇｐｔｌ２に似た状態で変異ＬＩＬＲＢ２に結合する（図６Ｇ、図２Ｂ）。図８Ｃの結果と合わせ、このデータは、ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２またはＨＬＡ−Ｇの結合は部分的に重なっているが、完全には重なっていないことを示唆する。
【０３０７】
フローサイトメトリーに基づく結合分析に加え、キメラレポーター系の固定化された抗体またはＡｎｇｐｔｌ２で処理された種々のＬＩＬＲＢ２変異体の活性化を測定した。Ｉｇ１ドメインとＩｇ２ドメインを組み合わせた場合のみ、結合し、リガンドによって活性化されることがわかった（図６Ｈ）。さらに、Ｙ９６の１箇所の変異によって、ＧＦＰの誘発が顕著に低下し、Ｙ９６Ａの変異と、Ｇ３９２ＤまたはＹ３９４Ａのいずれかの変異を組み合わせると、固定化されたＡｎｇｐｔｌ２によるＧＦＰの誘発が全くなくなった（図６Ｉ）。従って、この結果は、キメラレポーター系を用いた場合に、Ｉｇ１およびＩｇ４のＨ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフが、ＬＩＬＲＢ２がＡｎｇｐｔｌ２に結合するために必須であることを確認した。さらに、これらは、示したモチーフが、ＬＩＬＲＢ２活性化に重要であることを示唆する。
【０３０８】
ＬＩＬＲＢ２に結合するＡｎｇｐｔｌの部位を確認するために、ＬＩＬＲＢ２に対する全長Ａｎｇｐｔｌ２の結合と、Ａｎｇｐｔｌ２のＣＣドメインおよびＦＢＮドメインの結合を比較した。全長タンパク質は、ＬＩＬＲＢ２  ２１を発現した２９３Ｔ細胞に結合したが、ＣＣドメインおよびＦＢＮドメインは結合しなかった。Ａｎｇｐｔｌ２全長タンパク質と、ＣＣドメインはＬＩＬＲＢ２＋ヒトＣＢ単核細胞に結合した（ＦＢＮドメインは結合しなかった。）（図９）。全長Ａｎｇｐｔｌ２、ＦＢＮドメイン、および高濃度の可溶性ＣＣドメインは、ＬＩＬＲＢ２レポーター細胞を活性化させることができた（図１０）。プラスチック皿をコーティングしたＣＣドメインの実際の濃度は、可溶性ＣＣドメインの濃度よりも低いと推測され、従って、この固定化されたＣＣドメインは、ＬＩＬＲＢ２キメラレポーターを活性化するほど十分に高くはなかった。これらの結果は、Ａｎｇｐｔｌ２のＣＣおよびＦＢＮが、両方ともＬＩＬＲＢ２の最適な結合および活性化のために必要であることを示唆している。
【０３０９】
抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、ヒトＣＢ  ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助する。培養物中でＨＳＣを拡大培養するために多くの条件が使用されてきたが、臨床的な適用可能性にとって十分な拡大培養を可能にするような成長因子とサイトカインの最適な混合物は、まだ決定されていない。例えば、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１０；７：４２７−４２８；Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０；１６：２３２−２３６；Ｈｉｍｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０；１６：４７５−４８２；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１１；９：１１９−１３０；Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；３２９：１３４５−１３４８；Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１０；６：２５１−２６４；Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２００７；４４７：１００７−１０１１；Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ．２００２；１０９：３９−４５；Ｄａｈｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；１１７：６０８３−６０９０；Ｋｉｒｏｕａｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；１７：５３８−５４７；およびＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００５；７：２４３−２５０を参照。
【０３１０】
以前、Ａｎｇｐｔｌが、ＨＳＣの拡大培養の成長因子として特定された。Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：４７０−４７９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１：３４１５−３４２３およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６；１２：２４０−２４５。しかし、Ａｎｇｐｔｌは、容易に分解して凝集物を生成する大きなグリコシル化されたタンパク質であるため、発現させ、精製することが困難であり、培養物で使用するための理想的な要素ではない。Ａｎｇｐｔｌの効果を模倣する、安定性が向上し、高い活性を有する分子によって、もっと効果的なＨＳＣ拡大培養系が開発されるだろう。固定化されたＬＩＬＲＢ２に対する抗体が、Ａｎｇｐｔｌ２によって刺激を受ける受容体シグナル伝達を模倣するという知見に基づき（図５）、固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、試験したヒトＣＢ  ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助するだろう。
【０３１１】
まず、ＳＴＦ培地、可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２を含む培地、ポリクローナル（ｐＡｂ）またはモノクローナル（ｍＡｂ）の抗ＬＩＬＲＢ２抗体のいずれかが固定化された培地の中のヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞の培養を比較した。指定の培地に、１×１０４個の冷凍保存されたヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞を接種し、培養から１０日後、全細胞数を決定した。ＳＴＦ培地または可溶性の抗体を含むＳＴＦ培地よりも、固定化されたｐＡｂまたはｍＡｂを含む培養物から多くの拡大培養が得られた（ＳＴＦサンプル値は、それぞれ２３０％および１２５％；図４Ａ−Ｂ）。培養したＨＳＣの中で濃縮されたＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のレベルは、これらの条件で同様であったことを注記しておく（図１１Ｃ）。
【０３１２】
次にコロニー形成アッセイを行った。細胞成長の結果と一致して、固定化された抗体で処理された細胞サンプルは、ＳＴＦサンプルまたは可溶性の抗体サンプルよりも、一次コロニー形成アッセイおよび二次コロニー形成アッセイの両方で、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）が顕著に増加した（図１１Ｄ−Ｅ）。特に、固定化されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体で処理されたサンプルは、それぞれ、二次再接種のＳＴＦサンプルと比べ、３倍および１．６倍を超えるＣＦＵを有していた。
【０３１３】
最後に、これらの同じ条件で培養した細胞を、亜致死量を照射したＮＳＧマウスに移植した（マウスあたり、１×１０４個の導入に相当する細胞数）。固定化された抗ＬＩＬＲＢ２  ｐＡｂと共に培養されたＣＤ１３３＋細胞は、末梢血および骨髄において、分析した移植後の時間点で、抗体処理を行わない対象物または可溶性の抗体で処理された細胞よりも顕著に大きな平均キメラ現象があった（３−３６週間、図５Ａ−Ｂ）。図５Ｃは、異なる状態で培養したヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞を移植した代表的なマウスにおける３６週間でのヒト造血細胞の生着を示す。固定化された抗体の中で培養した細胞を移植されたマウスは、ＳＴＦで培養した細胞または可溶性の抗体と共に培養した細胞を移植されたマウスよりも、全造血細胞（ＣＤ４５／７１＋）（５２．４８±５．４１％対２３．１３±７．９３％；図１２Ｂ）、骨髄（ＣＤ１５／６６ｂ＋）（３．２９±０．４１％対１．１６±０．３８％；図１２Ｄ）、Ｂリンパ球（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）（２７．４３±５．１５％対８．５２±２．５８％；図１２Ｅ）および始原細胞（ＣＤ３４＋）（０．９３±０．２４％対０．２６±０．１０％；図１２Ｆ）のヒト細胞のかなり高い生着を示した（図１２Ｂ、Ｄ−Ｆ）。
【０３１４】
培養後のＳＣＩＤを再増殖する細胞（ＳＲＣ）の自己再生の可能性を測定するために、一次マウスから骨髄を集め、亜致死量を照射した二次レシピエントに移植した。ＳＴＦ培地で培養した細胞または可溶性の抗体と共に培養した細胞の二次レシピエントでの生着はほとんど検出することができなかった。対照的に、固定化された抗体と共に培養された細胞は、二次移植の後、骨髄、Ｂリンパ球および始原細胞の正の生着を示した（図１２Ｇ−Ｌ）。培養のためにヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を用いた別の独立した実験から、同様の結果が得られた（図１３）。
【０３１５】
可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂまたは固定化された抗ＬＩＬＲＢ２  ｍＡｂと共に培養されたＣＤ１３３＋細胞も、亜致死量を照射したＮＳＧマウスに移植した（マウスあたり、１×１０４個の導入に相当する細胞数）。一次移植において、固定化されたモノクローナル抗ＬＩＬＲＢ２で処理された細胞の生着を検出することができたが、抗体処理を行わずに培養した細胞または可溶性の抗ＬＩＬＲＢ２と共に培養した細胞と有意な差はなかった（図１４Ａ−Ｆ）。しかし、二次移植において、固定化された抗ＬＩＬＲＢ２で処理した細胞のみが、正の生着を示した（図１４Ｇ−Ｌ）。これと合わせ、このデータは、初期の培養期間中のＨＳＣの正味の拡大培養を示し、従って、固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体が、ヒトＳＲＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの広範囲にわたる拡大培養を補助すると結論付けられる。
【０３１６】
培養の前および後に、限界希釈アッセイを行い、ＳＲＣの数を定量した。固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体と共に培養したヒトＣＢ  ＣＤ１３３＋細胞（１０日間培養した。）は、導入した細胞と比較して、全有核細胞（ＴＮＣ）が１１２倍に増加しており、ＣＤ３４＋細胞が１９倍に増加した（図１５Ａ−Ｂ）。培養された細胞は、末梢血（図１５Ｃ）および骨髄（図１５Ｄ）よりも大きな平均キメラ現象があった。限界希釈アッセイの一部として、７００−４，０００の培養していないＣＤ１３３＋細胞による生着、および培養後のこれらの細胞の子孫細胞を測定した。４，０００  ＣＤ１３３＋細胞の培養した子孫材料を移植した全てのマウスは、１％より大きなレベルで生着が起こった。図７Ｅは、培養していないＣＤ１３３＋細胞からの再増殖する細胞（ＣＲＵ）が、４５５７細胞あたり１個であることを示す（平均のための９５％信頼区間：３２２２から６４４５、ｎ＝２４）。即ち、Ｐｏｉｓｓｏｎ統計学で計算される場合、このロットの培養していないヒトＣＤ１３３＋細胞から平均で４，５５７の細胞の注射は、移植されたマウスの再増殖に十分であろう（６３％（＝１−１／ｅ））。対照的に、培養後のＣＲＵは、導入した９３２個の細胞あたり１であった（平均のための９５％信頼区間６８９から１２６１、ｎ＝２４）。固定化された抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体を含むＳＴＦ培地中で培養した後のＳＲＣの数が４．９倍に増加していた。これらの培養した細胞は、培養されていない細胞よりも複数系統の生着のレベルがかなり高かった（図１５Ｆ−Ｉ）。
【０３１７】
幾つかのＡｎｇｐｔｌが、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助することが既に示されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１：３４１５−３４２３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６；１２：２４０−２４５；およびＨｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００８；２６：１６２８−１６３５）が、この活性が担う機構は知られていなかった。ここで、哺乳動物が発現するＡｎｇｐｔｌ２は、ＨＭＷ種として存在し、下流のシグナル伝達のためのＬＩＬＲＢ２の活性化のために、リガンドのマルチマー化が必要とされることが示されている。Ａｎｇｐｔｌ２の結合およびシグナル伝達の活性化にとって重要なＬＩＬＲＢ２のＩｇドメイン中のモチーフも特定された。ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合は、別のリガンドＨＬＡ−Ｇの結合よりも強く、完全に重なり合っていない。ヒトＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助するためにＡｎｇｐｔｌより強力で安定なＬＩＬＲＢ２のアゴニストを特定する試みにおいて、固定化されたポリクローナル抗ＬＩＬＲＢ２が、ヒトＣＢ  ＨＳＣの同じｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助することがわかった。従って、この研究は、Ａｎｇｐｔｌ／ＬＩＬＲＢ２相互作用の分子基盤を探求することから開始した。ＨＳＣでのリガンドとＬＩＬＲＢ２の結合の操作が、ＨＳＣの再増殖活性を補助するという機能的な証拠も与え、ＨＳＣに基づく細胞治療における有用性を発見し得る効率的なＨＳＣの拡大培養のための新しい手法を示した。
【０３１８】
ＬＩＬＲＢ２の真のシグナル伝達レポーターは入手可能ではないが、リガンドがＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化させる能力を評価することができるキメラ受容体の代理レポーター系が開発された。上述の研究で示されるように、このレポーター細胞株は、異なる形態のリガンドのシグナル伝達を誘発する能力を比較することができる感受性のある系として働くだろう。このキメラ受容体レポーター系も、ＩＴＩＭを含有する受容体のさらなるアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに有用であろう。ＩＴＩＭを含有する受容体のアゴニストは、幹細胞に基づく再生医薬を容易にし、アンタゴニストは、癌進行の阻害剤として働くだろうと想定される。
【０３１９】
Ａｎｇｐｔｌ２によるＬＩＬＲＢ２活性化に寄与する重要な因子を特定した。第１に、哺乳動物が発現するＡｎｇｐｔｌ２は、受容体に対する結合にとって重要であると思われるＨＭＷ種を形成することが決定された。Ａｎｇｐｔｌ２は、ＣＣドメインとＦＢＮドメインの両方を含む。幾つかの証拠に基づいて、Ａｎｇｐｔｌ２のＣＣドメインもＦＢＮドメインも、単独では全長Ａｎｇｐｔｌ２と同様の強力なＬＩＬＲＢ２への結合は起こらない。ＣＣドメインおよび全長ＬＩＬＲＢ２は、両方ともＨＭＷ種として存在し、一方、ＦＢＮドメインは、ＨＭＷ種ではない。これと一致して、以前の研究は、Ａｎｇｐｔｌ４のＣＣドメインが、マルチマー化に介在することを示した。Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４；２７９：２０３８−２０４５。これらのデータは、ＣＣドメインおよびＦＢＮドメインが、両方とも受容体の結合に関与し、ＣＣドメインが介在するマルチマー化が、ＬＩＬＲＢ２に対する全長Ａｎｇｐｔｌ２の結合を顕著に向上させることを示唆する。Ａｎｇｐｔｌは、血清中の可溶性ホルモンとして観察されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質膜にも豊富に含まれる場合がある（データは示さない）。可溶性のマルチマー化された形態に加え、クラスター形成した細胞表面に結合したＡｎｇｐｔｌがｉｎ  ｖｉｖｏに存在し、ＬＩＬＲＢ２を活性化させると予想される。
【０３２０】
Ａｎｇｐｔｌ２の結合にとって重要なＬＩＬＲＢ２の特徴をさらに特定した。ＬＩＬＲＢ２の第１および第４のＩｇドメインの中の新規Ｈ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフは、Ａｎｇｐｔｌ２の結合にとって必須である。Ａｎｇｐｔｌ２／ＬＩＬＲＢ２結合におけるこのモチーフの重大な必要性は、Ａｎｇｐｔｌ２の結合を５０％低下させるというＩｇ１のＧ９４、Ｒ９５およびＹ９６での部位特異的な変異の影響によって裏付けられる。同様に、Ｉｇ４のＹ３９４での１箇所の変異は、全長ＬＩＬＲＢ２のＡｎｇｐｔｌ２結合を４０％低下させた。Ａｎｇｐｔｌに加え、ＬＩＬＲＢ２は、種々のＭＨＣクラスＩ分子を含め、その他のリガンドを有することが知られている。Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３；１００：８８５６−８８６１。重要な問題は、ＡｎｇｐｔｌおよびＭＨＣクラスＩ分子が、同様な様式ＬＩＬＲＢ２に結合するのか、または異なる様式で結合するのかである。フローサイトメトリーに基づくリガンド結合アッセイが示されたとき、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２に対してＨＬＡ−Ｇよりも大きな結合性を有する。この結果は、上述のレポーター細胞アッセイによって裏付けられる。Ａｎｇｐｔｌ２とは対照的に、かなり多くの用量の固定化されたＨＬＡ−Ｇであっても、ＬＩＬＲＢ２レポーター細胞のＧＦＰ発現を誘発することができない。従って、ＬＩＬＲＢ２キメラ受容体レポーター細胞のＡｎｇｐｔｌ２活性化は、ＨＬＡ−Ｇよりもかなり強力である。しかし、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２に対するＨＬＡ−Ｇの結合と競争するには効果的ではない（データは示さない）。一方、ＨＬＡ−Ｇは、ＬＩＬＲＢ２  ２８の第１の２つのＩｇドメインに結合し、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２のＩｇ１およびＩｇ４の両方に結合する。興味深いことに、ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合にとって重要なＨ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフは、結晶学的研究によって明らかになったように、２つのＭＨＣ結合部位または典型的な界面のループ領域のいずれの中にもなく、βシート構造の中にある。Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６；１０３：１６４１２−１６４１７。上述の結合および活性化の結果に基づき、このモチーフは、Ａｎｇｐｔｌ２による結合および活性化に必要なＬＩＬＲＢ２のＩｇドメインのコンホメーション安定性に必要なはずである。従って、これらの結果は、（１）Ａｎｇｐｔｌ２が、ＭＨＣクラスＩよりも大きな能力でＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化させ、（２）Ａｎｇｐｔｌ２およびＭＨＣクラスＩ分子は、同じ部位への結合について直接的に競争せず、これら２種類の分子は、独立して、またはＬＩＬＲＢ２のシグナル伝達を一緒に制御し得るように協働して作用する場合もある。これにもかかわらず、この２つのリガンドそれぞれの結合は、共通のコンホメーションの変更にある程度必要であろう。例えば、ＬＩＬＲＢ２のＭＨＣ−Ｉ結合部位がほとんど変異しても、Ａｎｇｐｔｌ２の結合に影響を与えなかったが、Ｈ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフ内のＬＩＬＲＢ２のＧ９４Ｄ、Ｒ９５ＥまたはＹ３９４Ａの変異がＡｎｇｐｔｌ２の結合を低下させることが観察��れ、さらに、ＨＬＡ−Ｇの結合の低下も示された。
【０３２１】
興味深いことに、全てのＬＩＬＲＢがＧ＊Ｙ＊Ｃモチーフを含有するが、Ａｎｇｐｔｌ２は、ＬＩＬＲＢ２にのみ結合する。このことは、Ｈ＊Ｇ＊Ｙ＊Ｃモチーフは必要ではあるが、Ａｎｇｐｔｌ２の結合および活性化のためのＬＩＬＲＢ２のコンホメーションを維持するのに十分なものではないことを示唆している。
【０３２２】
ＬＩＬＲＢ２に対するＡｎｇｐｔｌ２の結合部位の上述の特定に基づき、ヒトＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養のために固定化された抗ＬＩＬＲＢ２を使用するための改良された戦略が開発された。固定化された抗体は、Ａｎｇｐｔｌ２と同じＬＩＬＲＢ２の領域に結合する。所定のサイトカインと固定化された抗ＬＩＬＲＢ２を含有する血清を含まない培養系は、一連のＮＳＧの移植および限界希釈分析によって決定されるように、ヒトＣＢ  ＨＳＣの再増殖の正味の拡大培養を補助する。ポリクローナル抗ＬＩＬＲＢ２抗体は、モノクローナル抗ＬＩＬＲＢ２よりも大きなＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養を補助する能力を示し、このことは、ＬＩＬＲＢ２の活性化における複数のリガンド結合部位の可能性を示唆している。これに加え、ＬＩＬＲＢ２の内部化信号ＹＸＸｐｈｉ（Ｋｏｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｆｆｉｃ．２０１０；１１：８４３−８５５）は、ＬＩＬＲＢ２が、可能ならばリガンド結合の後にエンドサイトーシスを受け得ることを示唆している。固定化された抗体が、この事象を防ぎ、受容体の活性化を長期化させ得るため、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養も、固定化された抗体によって向上させ得る。これと合わせて、抗ＬＩＬＲＢ２ポリクローナル抗体は、Ａｎｇｐｔｌよりも簡単に発現し、精製され、安定性が高く、重要なことに、Ａｎｇｐｔｌ２より大きな能力でＬＩＬＲＢ２に結合し、これを活性化させ、この系は、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養に使用するのに大きな利点を有するだろう。
【０３２３】
７．２  実施例２
以前の研究によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）のＮｏｔｃｈによって誘発されるｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養が導かれ、ＣＢ幹細胞移植を受ける患者が直面する長期間にわたる移植後の好中球減少症を減らすための首尾良い使用が導かれた（図１６および１７を参照）。さらに近年、拡大培養された部分的にＨＬＡにマッチするＣＤ３４＋細胞を注入した数と、好中球減少症が回復するまでの時間との関係が観察され、このことは、初期の好中球減少症回復を信頼性良く高めるためにＣＢ  ＨＳＰＣの大きな拡大培養の必要性が大きいことを示唆している。
【０３２４】
骨髄の回復の遅れに関連する危険性を軽減するために、骨髄を破壊する造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の設定で、１つまたは２つの操作されていないＣＢユニットと共に注入されるＣＢ  ＨＳＰＣをｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養するための方法が開発された。これらの方法は、造血の制御におけるＮｏｔｃｈ受容体ファミリーの役割に関する既に記載されている研究と、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１を用いた造血始原細胞のためのＮｏｔｃｈが介在する拡大培養系の前臨床での開発に基づくものである。Ｍｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３（８）：２０５７−２０６２；Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０００；６（１１）：１２７８−１２８１；Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（５）：１７８４−１７８９；Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０６（９）：２６９３−２６９９。この研究の臨床的な解釈が、骨髄を破壊する条件の後にｅｘ  ｖｉｖｏで拡大培養されたＣＢ前駆細胞を用いたＰｈａｓｅ  ＩのＣＢＴ知見でなされた。この知見の結果は、この手法の安全性と、好中球が生着するまでの時間の顕著な短縮を示した。初期の公開以降のこれらの研究の更新結果（Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０；１６（２０）：２３２−２３７）は、同じ治療計画での患者の同時コホート（Ｎ＝２９）と比較して、１１日間の初期のＡＮＣ≧５００／μｌになるまでの中央値の減少を示す（ｐ＜０．０００１、図１６）。顕著なことに、＋１００日の死亡率の危険性の指標となるＡＮＣ＞１００／μｌの達成（Ｄａｈｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（２１）：３０３３）は、従来の二重ＣＢＴ群では１９日だったのに対し、７日目に起こった（ｐ＝０．０００２）。さらに、注入されるＨＳＰＣの数と、生着するまでの時間との関係は、８×１０６個より多いＣＤ３４＋細胞／ｋｇを摂取した７名の患者のうち６名が、１０日以内のＡＮＣ≧５００／μｌの達成（図１７）が観察され、好中球減少症の細胞治療に基づく現象に関し、固有の知見が得られた。この観察された用量の関係は、操作されていないＣＢＴにおける研究を反映しており、ＨＬＡの不均衡の増加を克服し、部分的にＨＬＡがマッチするＣＢＴレシピエントへの生着を可能にするために、もっと高い細胞用量のＣＤ３４＋細胞／ｋｇが必要であることを示している。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００１；３４４（２４）：１８１５−１８２２；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００（５）：１６１１−１６１８。
【０３２５】
本開示の態様は、幹細胞の自己再生および／または生存を高めることができる、因子と組み合わせた内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の誘発による分化の抑制によって、多数の迅速に再増殖するＣＤ３４＋ＨＳＰＣの生成を引き起こすという仮説に基づく。このような因子の１つは、アンジオポエチンアゴニストであり、例えば、Ａｎｇｐｔｌ５を含む。Ａｎｇｐｔｌ５は、前臨床試験において、再増殖する造血細胞の生成を高めることが既に示されているタンパク質のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーである。
【０３２６】
例えば、Ａｎｇｐｔｌｓ  ２、３、５および７と、サイトカインのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養は、マウスの長期間にわたるＨＳＣの再増殖活性を顕著に高める。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６；１２（２）：２４０−２４５。ＡＮＧＰＴＬ５および成長因子（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＧＦ−１、ヘパリンおよびＩＧＦＢＰ２）を用いたＣＢ  ＨＳＰＣの培養によって、移植から２ヶ月後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの再構築を顕著に向上させ（３９．５％の生着対非培養群では０．２−２％、図１８）、二次移植を向上させた。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１（７）：３４１５−３４２３。さらに、分化の変更またはＨＳＣの拡大培養を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏでの証拠は存在しないが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、ＨＳＰＣの自己再生を可能にする分化を抑制し、Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＳＰＣの再増殖を向上させる。従って、本開示の態様は、これらの生理学的リガンドが、２つの別個の機構によって機能するため、この組み合わせによって、もっと効果的に再増殖する細胞が生成され得るという仮説に基づく。Ｄｅｌｔａ１とＡｎｇｐｔｌ（例えば、Ａｎｇｐｔｌ５）を組み合わせた効果をさらに試験し、ＨＳＣの拡大培養を向上させ、臨床的な用途に関連する現在の細胞治療を超える向上を可能にするために、この仮説を実施例２で調べた。
【０３２７】
上述のデータおよび仮説に部分的に基づき、ＮｏｔｃｈアゴニストＤｅｌｔａ  １とＡｎｇｐｔｌ５の組み合わせをさらなる研究のために選択した。しかし、ＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧとＡｎｇｐｔｌ５のために最適化された培養条件は、全く別である。最適なＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧによって誘発される拡大培養は、血清を含まないＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＩＬ−３の存在下、固定化されたＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧとレトロネクチンを用い、１６−１７日培養した後にみとめられた。対照的に、Ａｎｇｐｔｌ５によって誘発される拡大培養は、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中、低用量のサイトカインＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦＧＦ１、ヘパリンおよびＩＧＦＢＰ２を用い、１０日培養した後に最適化された。従って、この組み合わせの成功は予測することができなかった。
【０３２８】
７．２．１  実施例２−方法
細胞の単離。研究のためのヒトＣＢを、同意を得た後、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（Ｓｅａｔｔｌｅ）の承認を得て、通常の郵送によって得た。塩化アンモニウム赤血球細胞溶解バッファー中でサンプルをインキュベートし、洗浄し、２％のヒトのＡＢ型血清を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。細胞を、ＣＤ３４＋免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＡｕｔｏＭＡＣＳを用いて精製し、次いで凍結させた。次いで、個々の実験のためにＣＤ３４＋細胞を解凍した。
【０３２９】
ＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧタンパク質およびＬＩＬＲＢ２抗体（抗ＣＤ８５ｄ）の作製および固定。ヒトＩｇＧ１のｆｃドメインに融合したＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードする構築物を作製し、既に記載されている構築物を用いて電気穿孔したＮＳＯ細胞培地からＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧタンパク質に精製した（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２０００；１１３（ｐｔ２３）：４３１３−４３１８）。ヒトＣＤ８５ｄビオチン化抗体（ポリクローナルヤギＩｇＧ）または正常なヤギＩｇＧビオチン化コントロールをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。組織培養物で処理されていない培養プレートのウェルまたは組織培養処理されていないフラスコを、５μｇ／ｍＬのレトロネクチンと共にＰＢＳで希釈したＤｅｌｔａＥｘｔ−ＩｇＧ（０．５または２．５μｇ／ｍＬ）、ＣＤ８５ｄビオチン化抗体（０．０８から２５μｇ／ｍＬの範囲）またはＩｇＧコントロールと共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで十分に洗浄した。
【０３３０】
細胞培養物。５０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトＦｌｔ３−リガンド、ヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、１０ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン３（ＩＬ−３）、ＦＧＦ１を２０ｎｇ／ｍｌ、ヘパリンを１０μｇ／ｍｌ含み、血清を含まない培地（Ｓｔｅｍｓｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を培養した。移植のための培養を、１×１０５から１．２×１０５個のＣＤ３４＋細胞／フラスコから始め、２５ｃｍ２の組織培養処理されていないフラスコで開始した。細胞密度が約１−１．５×１０６細胞／ｍｌに達したら、７５から１２５ｃｍ２の組織培養処理されていないフラスコの大きさになるまで細胞を拡大培養した。サイトカインを含む新鮮な培地を３−４日ごとに加えた。
【０３３１】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマヌルマウスへのヒト造血細胞の移植。Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって使用承認を得た、亜致死量を照射した（２７５ｒａｄ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγ−ヌルマウス（ＮＳＧ）を移植に使用した。１種類のマウス（５−８マウス／群）に、１×１０５個から始めたＣＤ３４＋細胞から作製した子孫細胞を注入した。再増殖能力（骨髄中のヒトＣＤ４５＋またはＣＤ４５＋３３＋、ＣＤ  ４５＋１９＋、ＣＤ４５＋３４＋の割合）を、麻酔したレシピエントマウスの大腿骨から吸引した骨髄を用い、移植から２週間後および８週間後に評価した。
【０３３２】
統計分析。対応のない２標本のｔ検定を使用し、群間の比較を行った。
【０３３３】
７．２．２［実施例２］−結果
Ｄｅｌｔａ１とＡｎｇｐｔｌ５を組み合わせた効果は、ＣＢによって誘導されるＣＤ３４＋細胞の生成を向上させ、造血手技および分化する骨髄細胞を用い、免疫不全マウスの骨髄を迅速に再増殖させた。特に、Ｄｅｌｔａ１とＡｎｇｐｔｌ５を組み合わせた試験において、ＣＤ３４＋前駆体によってＮＳＧマウスの迅速な（２週間の）再増殖が顕著に向上し（ｐ＝０．０４）、Ｄｅｌｔａ１またはＡｎｇｐｔｌ５のみを用いた場合と比較して、未成熟のＣＤ３３＋骨髄前駆体による再増殖を向上させる方向への明確な傾向（ｐ＝０．０８の２標本ｔ検定、ｐ＝０．０４  可能な非Ｇａｕｓｓｉａｎ分布のためのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）がみとめられた（図１９）。重要なことに、Ｄｅｌｔａ１のみで培養されたＣＢ  ＨＳＰＣを用いたＣＤ３４の同様の全体的な拡大培養でもこの現象が起こった（図２０）。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞またはＣＤ４９ｆ細胞の生成に差はなく、このことは、多数のまれな迅速に再増殖する細胞、または細胞周期、アポトーシス、または転写または後成的特性が改変された細胞の生成を示唆している。注記すべきは、この組み合わせが、複数の系統の生着を移植から８週間維持したことであり、このことは、さらに長い期間、再増殖する細胞の管理または拡大培養を示唆している。
【０３３４】
図２１は、ＤｅｌｔａをＡｎｇｐｔｌ５と組み合わせ、Ｄｅｌｔａが介在する拡大培養のために最適化された条件で培養したときに、初期の骨髄再増殖の顕著な向上を示す。
【０３３５】
図２２は、ＤｅｌｔａをＡｎｇｐｔｌ５と組み合わせ、Ｄｅｌｔａが介在する拡大培養のために最適化された条件で培養したときに、長期間の再増殖も同様に顕著に向上することを示す。再増殖は、顕著に向上した骨髄系およびリンパ系の系統を示す複数系統である。Ｄｅｌｔａが介在する拡大培養のために既に最適化された条件で培養したときに、細胞は、顕著な二次的な生着を起こさなかった。
【０３３６】
図２３Ａおよび２３Ｂは、ＤｅｌｔａおよびＡｎｇｐｔｌ５と、低濃度のサイトカインを用いて培養すると、Ｄｅｌｔａで拡大培養した細胞では以前に見られなかった二次的な生着が生じることを示しており、このことは、これらの条件で、ＤｅｌｔａをＡｎｇｐｔｌ５に加えるとき、長期間にわたって再増殖する細胞の管理／拡大培養を示唆している。
【０３３７】
図２４。Ｄｅｌｔａおよび抗体を、Ａｎｇｐｔｌ５受容体（ＬＩＬＲＢ２またはＣＤ８５）と共に培養すると、Ｄｅｌｔａ単独の場合と比較して、初期の骨髄の生着が向上する傾向がある。この傾向は、この実験で使用した最も高い用量のＣＤ８５で存在する。
【０３３８】
図２５。生着を長時間の時間点（移植から１６週後）で評価した場合、ＤｅｌｔａおよびＣＤ８５と共に培養した細胞の生着は、Ｄｅｌｔａのみの場合よりも多かった。これらの細胞は、リンパ球および骨髄の系統の両方に再増殖させることができる。
【０３３９】
従って、実施例２は、Ｄｅｌｔａ１およびＡｎｇｐｔｌ５をサイトカイン組成物と共に用いてＨＳＣを拡大培養するための培養条件と培養時間の開発を示す。Ｄｅｌｔａ１およびＡｎｇｐｔｌ５で培養したＣＢ造血幹細胞／始原細胞（ＨＳＰＣ）からの免疫不全マウスにおいて、Ｄｅｌｔａ１単独の場合と比較して、初期の骨髄再増殖の顕著な向上が示される。さらに、単独使用する手法と比較して、Ｄｅｌｔａ１およびＡｎｇｐｔｌ５と共に培養した後のＣＢ  ＨＳＰＣの長期間にわたる再増殖の向上を示すデータが与えられる。
【０３４０】
７．３  実施例３
この実験で注目するのは、培養条件だけではなく、Ｄｅｌｔａ１と抗ＬＩＬＲＢ２抗体の提示も観察することによる、ＣＢ造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生成の最適化である。
【０３４１】
ＬＩＬＲＢ２（ＣＤ８５ｄ）、アンジオポエチン様（ＡＮＧＰＴＬ）タンパク質受容体に対する固定化された抗体の使用を観察した。ＬＩＬＲＢ２およびＡＮＧＰＴＬタンパク質の相互作用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの再増殖能力を含め、ＣＢ  ＨＳＰＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養が可能になる。初期の試験において、固定化されたＤｅｌｔａ１と、中間濃度の抗ＬＩＬＲＢ２抗体を組み合わせると、Ｄｅｌｔａ１または抗ＬＩＬＲＢ２抗体のみで培養した場合と比較して、ＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞（ＣＤ９０ｌｏ細胞は、設定したカットオフ値によって決定する場合、少ない量のＣＤ９０を発現する細胞であった。）の生成が増加した（データは示さない）。迅速に骨髄を再増殖する細胞を最大に生成する培養条件を最適化するためのＮＳＧマウスへの移植実験は、既に確立されたサイトカイン培養条件と、１．２５μｇ／ｍＬの濃度での固定化された抗ＬＩＬＲＢ２抗体を用い、細胞の生成の向上が示された（データは示さない）。ＮＳＧマウスに移植すると、ＮｏｔｃｈおよびＬＩＬＲＢ２受容体を合わせて活性化すると、Ｄｅｌｔａ１単独と比較して、迅速に再増殖する骨髄前駆体の生成が向上した（移植から２週間後のＮＳＧマウス中、２９．３％対１８．６％の全ヒトＣＤ３３＋細胞、ｐ＝０．０５）（図２６）。これらの条件での培養は、この組み合わせを用いた始原細胞の生着が大きいことによって示されるように、長期間にわたって再増殖する細胞の生成も向上させるだろう（移植から１０週間後のＮＳＧマウス中、２．９％対１．７％全ヒトＣＤ３４＋細胞）（図２７）。
【０３４２】
Ｄｅｌｔａ１と抗ＬＩＬＲＢ２抗体の組み合わせで培養した細胞において、Ｄｅｌｔａ１単独の場合よりも、Ｈｅｓ１（Ｎｏｔｃｈの標的遺伝子）の発現の向上が観察された。ここで、全ての試薬は、培養皿のプラスチックに固定化されている（図２８）。
【０３４３】
特に、磁気タンパク質Ａ−マイクロビーズに固定化されたアゴニストの有効性を、培養フラスコへの固定の場合と比較して、アゴニスト提示の代替的な方法を観察する試験を行った。データは、Ｄｅｌｔａ１および抗ＬＩＬＲＢ２抗体の提示が、この２つのアゴニストが代替的な手段で提示されたときに、例えば、Ｄｅｌｔａ１がプラスチックに固定化され、抗ＬＩＬＲＢ２抗体がビーズに固定化されたときに、Ｈｅｓ１発現を大きく誘発したことを示唆する（図２９）。
【０３４４】
Ｈｅｓ１の発現の増加に伴うＣＤ７＋細胞の生成における増幅は観察されず、このことは、Ｔ細胞遺伝子の発現が影響を受けていないことを示唆している。具体的な理論によって束縛されないが、これらのデータは、ＡＮＧＰＴＬ５／ＬＩＬＲＢ２経路の活性化が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の効果を増幅させず、Ｎｏｔｃｈと並行して、おそらくＨｅｓ１遺伝子レベルで作用し、骨髄の分化を抑制し、ＨＳＰＣの自己再生を向上させることを示唆している。
【０３４５】
当業者によって理解されるように、本明細書に開示されるそれぞれの実施形態は、特定の述べられている要素、工程、成分または構成要素を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。従って、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む、からなる、またはから本質的になる」を引用していると解釈すべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という移行句は、限定されないが、含むという意味を有し、主要な量であっても、明記されていない要素、工程、成分または構成要素を含むことができる。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という移行句は、明記されていない要素、工程、成分または構成要素を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、実施形態の範囲を、明記されている要素、工程、成分または構成要素と、この実施形態に重大な影響を与えない要素、工程、成分または構成要素に限定する。本明細書で使用される場合、重要な効果は、有効な量に関連して記載されるアッセイによって測定される場合、本明細書に開示される方法によって、前駆細胞の拡大培養が統計学的に有意に低下することであろう。
【０３４６】
特に言及しない限り、明細書および特許請求の範囲に使用する全ての数は、あらゆる場合に「約」という用語によって修正されていると理解すべきである。従って、矛盾する内容が示されていない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる望ましい特性に依存してさまざまに変わり得る概算値である。少なくとも、特許請求の範囲の範囲の均等論の適用を限定しようとするものではないが、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の桁数という観点で、通常の丸め技術を適用することによって解釈すべきである。さらなる明確性が必要な場合、「約」という用語は、記載されている数値または範囲と組み合わせて使用される場合、当業者によって合理的に解釈される意味を有し、即ち、記載されている数値または範囲よりいくらか大きな値またはいくらか小さな値、記載されている値の±２０％；記載されている値の±１９％；記載されている値の±１８％；記載されている値の±１７％；記載されている値の±１６％；記載されている値の±１５％；記載されている値の±１４％；記載されている値の±１３％；記載されている値の±１２％；記載されている値の±１１％；記載されている値の±１０％；記載されている値の±９％；記載されている値の±８％；記載されている値の±７％；記載されている値の±６％；記載されている値の±５％；記載されている値の±４％；記載されている値の±３％；記載されている値の±２％；または記載されている値の±１％までを示している。
【０３４７】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは概算値であるが、具体的な実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、それぞれの試験測定で見出される標準偏差から必然的に得られる特定の誤差を本質的に含む。
【０３４８】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「この（ｔｈｅ）」および本発明を記述するという観点で（特に、以下の特許請求の範囲という観点で）使用される同様の指示語は、本発明に他の意味であると示されておらず、または明確に内容と矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈される。本明細書の値の範囲の引用は、単に、この範囲内に入るそれぞれの別個の値について個々に言及するのを完結にする方法として働くことを意図している。本明細書で特に言及しない限り、それぞれの個々の値は、個々に本明細書に引用されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書で特に言及していない場合、または明確に矛盾する内容が記載されていない限り、本明細書に記載した全ての方法を、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で示される任意の例および全ての例の使用、または例示的な言語（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ））の使用は、本発明を単によりよく説明することを意図したものであり、特許請求の範囲に記載される以外に本発明の範囲を限定することを意図したものではない。明細書中の用語は、本発明の実施に必須の特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものと解釈すべきではない。
【０３４９】
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または実施形態のグループ分けは、限定するものと解釈すべきではない。それぞれのグループの選択肢は、個々に言及され、特許請求の範囲の範囲に記載されていてもよく、または本明細書中に見出されるこのグループの他の選択肢または他の要素と組み合わせて言及され、特許請求の範囲の範囲に記載されていてもよい。ある群の１つ以上の選択肢は、簡便さ、および／または特許性の理由のために、ある群に含まれていてもよく、または削除されてもよい。このように含まれたり、または削除されたりする場合、本明細書は、修正されたように群を含み、添付した特許請求の範囲に使用される全てのマーカッシュ群に記載された内容を充足すると考えられる。
【０３５０】
本発明の特定の実施形態は、本発明を実施するために本願発明者らが知っている最良の態様を含め、本明細書に記載される。もちろん、これらの記載された実施形態の改変は、上述の記載を読めば、当業者には明らかになるだろう。本願発明者らは、当業者が、適切な場合にこのような種々の改変を使用することを予想しており、本願発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用可能な法律が許容する限り、添付する特許請求の範囲に引用される重要な発明特定事項のあらゆる改変および均等物を含む。さらに、本明細書で特に言及していない場合、または明確に矛盾する内容が記載されていない限り、あらゆる可能な変形例における上述の要素の任意の組み合わせが、本発明に包含される。
【０３５１】
さらに、本明細書全体で、多くの参照が、刊行物、特許および／または特許明細書に対してなされている（まとめて「参考文献」）。引用されたそれぞれの参考文献は、特定の引用されている教示のために、個々に本明細書に組み込まれる。
【０３５２】
まとめると、本明細書に開示される本発明の実施形態は、本発明の原理を説明するものであると理解すべきである。使用され得る他の改変例は、本発明の範囲内である。従って、一例として、限定されないが、本発明の代替となる構造を本明細書の教示に従って利用してもよい。従って、本発明は、示され、記載されている内容に正確に限定されるものではない。
【０３５３】
本明細書に示される具体例は、一例であり、本発明の好ましい実施形態の説明的な記載をすることのみを目的としており、最も有用であると考えられる内容を提供するという理由で提示されており、本発明の種々の実施形態の原理および概念的な態様を容易に理解する記載である。この観点で、本発明の構造的な詳細を、本発明の基本的な理解に必要な部分を超えて示そうとはしておらず、本発明の幾つかの形態をどのようにして具現化して実施するかを当業者に明らかにする図面および／または実施例を用いて記載されている。
【０３５４】
本開示に使用される定義および説明は、実施例で明確に、疑問がないように修正されている場合を除き、将来的な構造にも権利が及ぶことを意味し、これを意図しており、または、この意味を適用すると、意味がなくなるか、または本質的に意味がなくなると考えられる場合には、この定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎまたは当業者が知っている辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４）から選択すべきである。
【０３５５】
特許、特許明細書および刊行物のような種々の参考文献が本明細書に引用され、この開示内容は、全体的に本明細書に参考として組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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