(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される化合物であって、
【化１】
0006530056.tif 000045
式中、Ｒ１及びＲ２は水素、
【化２】
0006530056.tif 000046
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも１つが水素ではなく、
Ｒ３が水素であり、及び
Ｒ４が炭素数１〜５のアルキルである、前記化合物、又は、
その薬学的に許容される塩。
【請求項２】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化３】
0006530056.tif 000047
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化４】
0006530056.tif 000048
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化５】
0006530056.tif 000049
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化６】
0006530056.tif 000050
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化７】
0006530056.tif 000051
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化８】
0006530056.tif 000052
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
下記式で表される請求項１に記載の化合物
【化９】
0006530056.tif 000053
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記化合物がナトリウム塩である請求項２〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
骨障害の治療のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物であって、骨障害が、骨折、骨粗鬆症、及びオステオペニアからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月２日に出願された米国仮出願第６１／９８７，７３９号の利益を主張し、当該出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立関節炎・骨格筋・皮膚疾患研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）によって授与されたＡＲ０６５８０８のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
骨粗鬆症は、１０００万人を超えるアメリカ人、高齢女性人口のほぼ５０％及び高齢男性人口の１０％超が罹患する最も一般的な代謝性骨疾患である。（Ｒａｃｈｎｅｒ，Ｔ．Ｄ．ら  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１１，３７７，１２７６−１２８７。Ｓｉｌｖａ，Ｂ．Ｃ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１１  ６２，３０７−３２２。Ｌｙｒｉｔｉｓ，Ｇ．Ｐら  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１０，１２０５，２７７−２８３。Ｋｈｏｓｌａ，Ｓ．ら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１２，９７，２２７２−２２８２。Ａｓｐｒａｙ，Ｔ．Ｊ．ら  Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ２０１２，７１，７６−７８。Ｂｌａｃｋ，Ｄ．Ｍ．ら  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２０５１−２０５３）。オステオペニア（骨量の減少）は、骨粗鬆症を発症する主要危険因子であるが、更に一般的であり、３４００万人のアメリカ人が罹患する。骨折は、骨粗鬆症及びオステオペニアの広範な合併症であり、結果として入院及び能力障害などの大きな社会経済的コストをもたらす。また骨折は、多くの場合、さもなければ健常であり機能する高齢者の劣化及び死の原因となる。加齢性骨粗鬆症による骨量減少及びその結果として生じる合併症は、高齢化する人口において高い罹患率及び死亡率を引き起こす。
【０００４】
成人期の骨の健康は、骨形成骨芽細胞及び骨吸収破骨細胞の同化及び異化細胞作用それぞれの協調的バランスに依存する。多分化能間葉系幹細胞（別名を骨髄間質細胞、ＭＳＣ）は、骨芽細胞及び脂肪細胞を含む種々の細胞型の前駆体集団を形成する。新生骨の形成は、ＭＳＣの骨芽細胞分化により駆動されるが、これは多くの要因によって妨げられ得るプロセスである。加齢、疾患、タバコ及びアルコール乱用などの生活要因が、骨芽細胞分化の代わりに脂肪形成に向けてＭＳＣ集団を推進する傾向にあり、その結果、骨減少性障害が生じ、多くの場合、本格的な骨粗鬆症及び骨折修復不全を招く。ＭＳＣの系統特異的分化の機序は重要である可能性がある。要因が脂肪形成を阻害すると共に骨芽細胞形成を刺激し得る。
【０００５】
２つの考えられる骨粗鬆症の治療戦略である骨量減少／吸収の防止または骨成長の刺激のうち、ビスホスホネート薬剤を用いた抗再吸収治療法がより確立されている。（Ｋｈｏｓｌａ，Ｓ．ら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１２，９７，２２７２−２２８２  Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．；Ｎｏｂｌｅ，Ｓ．；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｄｒｕｇｓ．２００１，６１，９９９−１０３９）。骨粗鬆症の現在行われている治療法のほとんど全てならびに臨床研究中である潜在的な新規の治療の大半は、骨粗鬆症患者における骨吸収のレベルを低減することを目的とする。骨吸収の機序を標的とした、市場におけるあるいは臨床試験中の治療法として、デノスマブ（プロリア）、ゾレドロン酸（Ｚｏｌｅｎｄｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（リクラスト）、オダナカチブ、及びサラカチニブが挙げられる。抗再吸収薬剤治療法は、骨密度の大きな減少がすでに発生している進行型の骨粗鬆症とは異なり、疾患の早期及び軽症例の治療において最も効果的であった。
【０００６】
別の方法として、骨同化剤が、特に進行型の疾患に更なる治療の選択肢を提供し、この分野でのＦＤＡが承認した薬剤が不足しているにもかかわらず、骨粗鬆症への対応を大きく改善し得る。現在、重度の骨粗鬆症患者の治療に使用可能なＦＤＡ承認の骨同化剤は、テリパラチド（フォルテオ）のみであるが、これは副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の組み換え型であり、断続的に連日注射によって投与されなければならない。フォルテオは有意な骨形成をもたらし、骨折のリスクを低減させるが、安全性に対する懸念のためにその使用は厳しく制限されている。骨肉腫のリスク増加などの有害な副作用のため、フォルテオの医薬品表示は患者集団及び使用期間（２４ヶ月未満）に関して極めて制限されている。（Ｃｏｓｍａｎ，Ｆ．ら  Ｃｕｒｒ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｒｅｐ．２０１４，１２，３８５−３９５。Ｍｕｓｃｈｉｔｚ，Ｃ．ら  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０１３，２８，１９６−２０５。Ｖｅｓｃｉｎｉ，Ｆ．ら  Ｃｌｉｎ．Ｃａｓｅｓ  Ｍｉｎｅｒ．Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｂ．２０１２，９，３１−３６）。臨床研究中である他の同化剤として、内因性間欠的ＰＴＨ分泌を刺激するカルシリティック（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）薬剤、スクレロスチンと称する骨芽細胞抑制因子に対する抗体、及びＷｎｔシグナル伝達アンタゴニスト阻害剤が挙げられる。（Ｓｉｌｖａ，Ｂ．Ｃ．ら  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１１  ６２，３０７−３２２）
【０００７】
軽症の骨粗鬆症を有する患者において、ビスホスホネート薬剤（例えば、アレンドロン酸、フォサマックス）は、骨密度の改善や骨折のリスク低減などの有意な利点をもたらすことができる。しかし、アレンドロン酸を含むビスホスホネート薬剤は、絶食条件下で経口摂取された時においても、平均で０．６〜０．７％と低い経口バイオアベイラビリティを示す。食事や飲料（水以外）と共に薬剤摂取した場合、更にバイオアベイラビリティが減少し、また絶食条件下での摂取により大多数の患者に重篤な上部消化管刺激作用を伴う。したがって絶食条件下での、頻回の、多くの場合に毎日の経口投薬は、ビスホスホネート薬剤の送達を薬理学的に達成可能になるまで最大化するために必要であるが、その用量の９９％超が吸収され得ず、身体から使用されないまま排出される。吸収され得る一部のビスホスホネート薬剤は人体において速やかに分配され、その薬剤の約５０％が骨表面に結合し、残りは腎臓を介して変化しないまま排泄される。低い経口吸収の物理化学的根拠は、全てのビスホスホネート薬剤の必須な部分である負電荷を帯びたホスホネート部分に関連すると考えられている。この欠点を克服するために、該ホスホネート電荷の影響を遮蔽することを目的とする脂肪酸と胆汁酸の結合を用いたプロドラッグアプローチを含む戦略が研究されてきた。（Ｂｏｒｔｏｌｉｎｉ，Ｏ．ら  Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，５２，２２１−２２９。Ｖａｃｈａｌ，Ｐ．ら  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，４９，３０６０−３０６３）。
【０００８】
天然に存在するオキシステロールは、ＭＳＣ及び他の多分化能間葉系細胞に影響を有する薬剤様分子として作用することができる。ヒト循環系及び種々の組織に存在するオキシステロールは、コレステロールの代謝変換における短寿命の中間体であり、ステロイドホルモン及び胆汁酸を形成することができる。しかし、受動代謝産物としての役割以外に、天然オキシステロールはシグナル伝達分子として機能することができ、生理的現象の範囲を調節することが可能であり、その中には脂質のホメオスタシス、ならびに分化、炎症及びアポトーシスなどの細胞状態に対する制御がある。すなわち、オキシステロールは組織特異的シグナル伝達の制御因子として役割を担うことができる。オキシステロールに関する初期の研究では、その病理学的な寄与が考慮され、全てのオキシステロールはその異なる化学組成にかかわらず、同様の特性を有すると推察された。オキシステロールの化学型は、細胞状況及びオキシステロールの正確な化学組成に依存した、より個別化した特徴を有し得る。（Ｓｃｈｒｏｅｐｆｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０００，８０，３６２−５５４。Ｇｉｌｌ，Ｓ．ら  Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００８，４７，３９１−４０４。Ｓｏｔｔｅｒｏ，Ｂ．ら  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，１６，６８５−７０５）。オキシステロールのいくつかは酸化ストレスを促進することができる。一方で、骨形成オキシステロールは前駆細胞の骨形成分化に対する酸化ストレスの有害作用を阻害することができる。オキシステロールのいくつかは肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）の内因性リガンドであると考えられている。一方で、オキシステロールの骨形成活性はＬＸＲ活性化の結果ではない可能性があるが、Ｈｈシグナル伝達の活性化を介して媒介され得る。Ｈｈシグナル伝達のオキシステロール誘導活性化はＨｈタンパク質とは無関係に生じることができ、結果として非標準Ｗｎｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化をもたらし得る。基準となるＰＫＡ／ｃＡＭＰ、ＰＫＣ、ＭＡＰＫ、及びＰＩ３キナーゼシグナル伝達は、これらのオキシステロールに対する種々の細胞応答の媒介に関与し得る。（Ｋｈａ，Ｈ．Ｔ．ら  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２００４，１９，８３０−８４０。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７，１００，１１３１−１１４５）。報告されたいくつかのオキシステロールの細胞傷害性にもかかわらず、インビトロで１〜２０μＭで骨細胞前駆細胞を用いて投薬された際に、または、インビボでラット脊椎固定モデルにおける局所投与（４０ｍｇ）の間に、若しくはマウスにおいて、腹腔内投与、５０ｍｇ／ｋｇ、週３回で計８週間投薬された際に、行動変化がみられないことによって特定されるように、骨形成オキシステロールに有毒作用はみられかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒａｃｈｎｅｒ，Ｔ．Ｄ．ら  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１１，３７７，１２７６−１２８７
【非特許文献２】Ｓｉｌｖａ，Ｂ．Ｃ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１１  ６２，３０７−３２２
【非特許文献３】Ｌｙｒｉｔｉｓ，Ｇ．Ｐら  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１０，１２０５，２７７−２８３
【非特許文献４】Ｋｈｏｓｌａ，Ｓ．ら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１２，９７，２２７２−２２８２
【非特許文献５】Ａｓｐｒａｙ，Ｔ．Ｊ．ら  Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ２０１２，７１，７６−７８
【非特許文献６】Ｂｌａｃｋ，Ｄ．Ｍ．ら  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２０５１−２０５３
【非特許文献７】Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．；Ｎｏｂｌｅ，Ｓ．；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｄｒｕｇｓ．２００１，６１，９９９−１０３９
【非特許文献８】Ｃｏｓｍａｎ，Ｆ．ら  Ｃｕｒｒ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｒｅｐ．２０１４，１２，３８５−３９５
【非特許文献９】Ｍｕｓｃｈｉｔｚ，Ｃ．ら  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０１３，２８，１９６−２０５
【非特許文献１０】Ｖｅｓｃｉｎｉ，Ｆ．ら  Ｃｌｉｎ．Ｃａｓｅｓ  Ｍｉｎｅｒ．Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｂ．２０１２，９，３１−３６
【非特許文献１１】Ｂｏｒｔｏｌｉｎｉ，Ｏ．ら  Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，５２，２２１−２２９
【非特許文献１２】Ｖａｃｈａｌ，Ｐ．ら  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，４９，３０６０−３０６３
【非特許文献１３】Ｓｃｈｒｏｅｐｆｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０００，８０，３６２−５５４
【非特許文献１４】Ｇｉｌｌ，Ｓ．ら  Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００８，４７，３９１−４０４
【非特許文献１５】Ｓｏｔｔｅｒｏ，Ｂ．ら  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，１６，６８５−７０５
【非特許文献１６】Ｋｈａ，Ｈ．Ｔ．ら  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２００４，１９，８３０−８４０
【非特許文献１７】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７，１００，１１３１−１１４５
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一実施形態は、本明細書に示される、例えばＯｘｙ１３３−アレンドロン酸化合物などのオキシステロール−ビスホスホネート化合物を含む組成物である。該組成物は、薬学的に許容される担体または希釈物を含み得、また医薬製剤であり得る。本発明の方法は、骨折、骨粗鬆症、及び／またはオステオペニアを含むがこれらに限定されない骨障害を治療するための、ヒトまたは動物であり得る対象への当該製剤の局所的及び／または全身的送達を含む。本発明の方法は、骨折、骨粗鬆症、及び／またはオステオペニアを含むがこれらに限定されない骨障害を治療するための、オキシステロール−ビスホスホネート化合物を用いた骨芽細胞前駆細胞のインビトロ治療、ならびにそれら（該骨芽細胞前駆細胞）のその後のヒトまたは動物であり得る対象内における局在化及び／または全身送達を含む。本発明の方法は、オキシステロール−ビスホスホネート化合物を含む製剤を製造し、ならびに／または、例えば局所的及び／若しくは全身的に、該製剤を対象に投与することを含み、組織及び／または器官、例えばヘッジホッグシグナル伝達経路の治療的活性化の恩恵を受け得る組織及び／または器官において、ヘッジホッグシグナル伝達経路を刺激する。
【００１１】
一実施形態は、下記式を有する化合物であって、
【化１】
0006530056.tif 000002
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は水素、
【化２】
0006530056.tif 000003
0006530056.tif 000004
からなる群から独立して選択される化合物を含む。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも１つが水素以外であり得る。Ｒ４は炭素数１〜５のアルキルであり得る。該化合物は下記式を有することができる
【化３】
0006530056.tif 000005
該化合物は下記式を有することができ、
【化４】
0006530056.tif 000006
Ｒは、
【化５】
0006530056.tif 000007
0006530056.tif 000008
からなる群から選択される。該化合物は下記式を有することができる
【化６】
0006530056.tif 000009
該化合物は下記式を有することができる
【化７】
0006530056.tif 000010
該化合物は下記式を有することができる
【化８】
0006530056.tif 000011
該化合物は下記式を有することができる
【化９】
0006530056.tif 000012
該化合物は下記式を有することができ、
【化１０】
0006530056.tif 000013
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は水素、
【化１１】
0006530056.tif 000014
からなる群から独立して選択され、ならびにその薬学的に許容される塩を有し得る。該化合物は下記式
【化１２】
0006530056.tif 000015
0006530056.tif 000016
0006530056.tif 000017
を有することができる。
【００１２】
一実施形態は、これらの化合物の薬学的に許容される塩及びこれらの化合物のナトリウム塩を含む。一実施形態は、１つ以上のこれらの化合物及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を含む。
【００１３】
本発明の方法は、骨障害に罹患しているヒト対象または動物対象に、有効量の少なくとも１つのこれらの化合物を投与することによって、該対象を治療することを含む。該化合物は該対象への局所送達または全身送達を達成するように投与され得る。例えば、骨障害は骨折、骨粗鬆症、またはオステオペニアであり得る。骨芽細胞前駆細胞を、例えばインビトロで、有効量の少なくとも１つのこれらの化合物と接触させることができる。該接触させた骨芽細胞前駆細胞は、対象に、例えば局所的にまたは全身的に投与され得る。
【００１４】
細胞を治療するための本発明の方法は、有効量の少なくとも１つのこれらの化合物を該細胞に投与することを含み、従って該細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路が刺激される。該細胞は組織または器官の一部であり得る。該化合物はインビボで投与されることができる。組織または器官におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の治療的活性化の恩恵を受け得るヒト対象または動物対象を治療するための本発明の方法は、組織または器官の細胞を治療することを含み、従って該組織または器官のヘッジホッグシグナル伝達経路が刺激される。
【００１５】
本発明の一実施形態は、骨障害を治療するための１つ以上のこれらの化合物を含む。本発明の一実施形態は、骨障害の治療のための薬剤の製造における１つ以上のこれらの化合物の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、及びオステリックス（ＯＳＸ）に関する骨形成遺伝子発現に及ぼす、Ｍ２細胞におけるＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの６日後の効果を示す（各バー上に示す数は、対照に対する誘導倍率を示す）。
【図２】３０日後にＭ２細胞で観察された石灰化に対するＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの効果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、３１Ｐ−ＮＭＲの視覚化したＨＡＰ結合アッセイ手順及び実験デザインを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＡＰ結合アッセイから得た結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、「多量ＨＡＰ添加」条件でのＨＡＰ６００ｍｇを用いた図３Ａに示す実験記載条件によるＨＡＰ結合アッセイの結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、「少量ＨＡＰ添加」条件でのＨＡＰ１５０ｍｇを用いた図３Ａに示す実験記載条件によるＨＡＰ結合アッセイの結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、「少量ＨＡＰ添加」条件でのＨＡＰ１５０ｍｇを用いた図３Ａに示す実験記載条件によるＨＡＰ結合アッセイの結果を示す。
【図５】本発明の数種の化合物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施形態を以下に詳細に議論する。記載の実施形態において、特定の用語は明確化の目的で使用される。しかし、本発明が、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではない。当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の均等要素が使用され得、及び他の方法が開発され得ることを認識するであろう。
【００１８】
天然に存在するオキシステロールである、２０（Ｓ）-ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）-ヒドロキシコレステロール、及び２２（Ｒ）-ヒドロキシコレステロールは、有望な骨形成剤として使用することができる。一連の強力な骨形成オキシステロール類似体が同定されたが、これらはインビトロ及びインビボの両方において有効である。半合成オキシステロールのこのファミリーのメンバーは、コラーゲンスポンジを介して横突起の間に局所的に適用された場合、ラットにおけるロバストな骨形成及び脊椎固定を誘導する。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１，１１２，１６７３−１６８４）。
【００１９】
オキシステロールは、コレステロール酸化の産物であり、インビボで形成され、細胞分化及びコレステロール代謝を含む種々の生物学的プロセスに関与してきた。天然に存在するオキシステロールは、ヒト及び動物の循環系及び種々の組織において見出され、骨を形成する骨形成特性を有することができる。該オキシステロールを、骨髄間質細胞（間葉系幹細胞、ＭＳＣ）及び胚線維芽細胞を含む多能性間葉系骨細胞前駆細胞に投与することによって、インビトロで、ロバストな骨形成分化及び豊富に石灰化した骨基質の形成をもたらすことができる。理論に拘束されるものではないが、これらの効果は、典型的なＨｈタンパク質とは無関係に、部分的にヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路の活性化を介して媒介される可能性がある。より強力なオキシステロールのファミリーは、それらが由来する天然に存在するオキシステロールを上回る骨形成及び抗脂肪生成活性を有することができる。かかる分子は、インビトロで強力な骨形成活性を示すことができ、インビボでロバストな骨形成及び脊椎固定を刺激することができる。これらは、有意な免疫原性応答を誘発すると予期されていない。
【００２０】
ＯＸＹ１３３は、増強された骨形成活性を有するシリーズにおける類似体である。ＯＸＹ１３３は、他の類似体と比較して促進的な方法で、培養されたヒト初代間葉系幹細胞における骨形成を誘導し、及びラットにおいて脊椎固定を誘導することができる。ＯＸＹ１３３は、ウサギ脊椎固定モデル及びウサギ頭蓋冠欠損モデルなどの骨疾患非げっ歯類モデルにおけるロバストな骨形成を誘導することができる。ＯＸＹ１３３は、脊椎固定及び癒着不能骨折の修復において潜在用途を有する局所投与用の薬剤開発候補である。（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｓ．Ｒ．ら  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０１４，２９，１８７２−１８８５）。しかし、骨粗鬆症における骨形成を刺激するために、ＯＸＹ１３３などのオキシステロールを潜在的な同化因子として全身投与することを意図した場合、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）における短い半減期（５分未満）及び必ずしも骨組織内の沈着に有利ではない組織分布を考慮しなければならない。更に、考えられる骨形成の機序に起因して、骨組織に対する選択性を増加させる一方でその他の組織への曝露を最小化する、ＭＳＣにおけるＨｈ経路の一時的活性化が賢明である可能性がある。これは、ビスホスホネートアレンドロン酸をオキシステロール分子に連結し、それを骨に選択的に送達することによって達成され得る。
【００２１】
ビスホスホネートは骨吸収を阻害し、及び骨選択的親和性を有することができる。ビスホスホネートは他の薬剤とコンジュゲートされた場合に、骨以外の組織を大部分曝露されないままの状態にするため、骨特異的な薬剤送達剤として機能することができる。
【００２２】
多分化能間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨形成骨芽細胞への細胞分化は、同化骨成長の駆動因子となることができる。天然に存在する特定のオキシステロールは、インビトロでＭＳＣの脂肪生成分化を妨げると共に骨形成を誘導することができ、またインビボでのラット頭蓋冠欠損モデルにおける局所的な骨形成を刺激し得る。天然に存在するオキシステロールよりも高い骨形成活性を有する新規な半合成オキシステロールが、インビトロで、またはインビボでのラット脊椎固定モデルにおいて使用される場合のその合成及び特性解析について報告されている。本発明の一実施形態において、骨粗鬆症の治療のために必要に応じて、全身投薬（ｉｖ（静脈内）、ｉｐ（内部非経口（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ））、ｓｕｂｃｕ（皮下）、または経口）という状況での骨同化剤としての新規な骨形成オキシステロールが記載される。
【００２３】
これらの分子は、全身的に投与された際に、選択的に骨組織に向かって移動し、骨形成を増強する可能性がある。これらの分子は骨粗鬆症の治療のための骨同化剤として使用することができる。骨標的骨形成オキシステロールは、全身的に投与された場合、任意の有意な毒性または免疫原性作用を有するとは予期されない。
【００２４】
本発明の一実施形態は、オキシステロール化合物ＯＸＹ１３３を、ビスホスホネート薬剤であるアレンドロン酸にコンジュゲートすることによって形成される骨形成オキシステロールを含む。ＯＸＹ１３３−アレンドロン酸コンジュゲート類似体は、骨粗鬆症治療用の全身的に活性な骨同化剤として使用することができる。該ＯＸＹ１３３−アレンドロン酸コンジュゲートは、ヒドロキシアパタイトへの結合に対して高い選択性を有し、骨細胞前駆細胞の骨形成分化の刺激において有効性を有することができる。該ＯＸＹ１３３−アレンドロン酸コンジュゲートは、骨粗鬆症における、インビボでの骨細胞前駆細胞の骨形成分化を標的とする処置用に使用することができ、種々の骨格部位にて新生骨形成を刺激する。ビスホスホネートは低い経口アベイラビリティ及び耐容性を示す。オキシステロール−アレンドロン酸コンジュゲートは、改善された薬理学的特性を有することができる。潜在的な副作用を最小化し、骨組織への送達を増強するために、強力な骨形成オキシステロールはアレンドロン酸とコンジュゲートされる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、骨形成オキシステロールであるＯｘｙ１３３と、ビスホスホネート分子のアレンドロン酸の組み合わせである新規なＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲート分子が合成される。以下に示すように、ビスホスホネートリンカーが下記ＯＸＹ１３３の３位、６位及び／または２０位で結合されても良い。
【化１３】
0006530056.tif 000018
【００２６】
骨特異的な薬剤送達は、効能を増大し、副作用を最小化し、適切な投薬を可能するために、骨疾患にわずかに許容される薬剤（例えば、エストラジオール及びジクロフェナク）に適用可能であるだけではない。本発明の一実施形態において、骨特異的な薬剤送達の概念は、全身性骨疾患用に予め試験されていない骨形成分子に適用され、それらを骨粗鬆症のための効果的な治療として提供する。骨形成特性を有するＨｈシグナル伝達のオキシステロール系アゴニストはこのカテゴリーに属することができる。骨特異的な薬剤送達剤は、これらの薬剤分子と加水分解性リンカー結合を介して結合することができる。非加水分解性結合は、骨標的ユニットにコンジュゲートした後に薬剤分子が薬理学的活性を保持している場合に用いることができる。エステル基は、より不安定なチオエステル及びより安定なアミドと比較して好ましい安定性範囲にあるため、用いることができる。（Ｇｉｌ，Ｌ．ら  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，９０１−９１９）。エステル基のインビボでの安定性は、該エステル基に隣接して配置された置換によって更に微調整され得る。従って、Ｏｘｙ１３３−アレンドロン酸エステルコンジュゲートは、骨組織における選択的沈着、その後の酵素によるリンカー加水分解及び骨形成剤であるＯＸＹ１３３の放出を、標的組織内に制御された速度でもたらす全身投薬用（経口、ｉｐ、ｓｕｂｃｕ、またはｉｖ）として使用することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態において、ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは、ＯＸＹ１３３にリンカーを介してＯＸＹ１３３の１つ以上の位置でコンジュゲートされた１つ以上のＡＬＮを含む。本発明の一実施形態において、ＡＬＮはＯＸＹ１３３の３位、６位、及び／または２０位でリンカーを介してＯＸＹ１３３にコンジュゲートされても良い。
【００２８】
例えば、以下に示すように、ＯＸＹ１３３が３位及び／または６位を介してアレンドロン酸にエステルまたはカルバメートリンカー（ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｌｉｎｋｅｒ）ユニットを用いてコンジュゲートされた類似体２、３、及び４は、コハク酸（ａシリーズ）、アスパラギン酸（ｂシリーズ）、グリシンカルバメートリンカー（ｃシリーズ）、または直接連結されたカルバメート（ｄシリーズ）に由来した。カルバメートリンカーは、エステルリンカーと比較してエステラーゼ加水分解に対してより安定であり得、またコハク酸系リンカーは、更に容易にアミノエステル結合の酵素加水分解を受ける可能性があるアスパラギン酸系リンカーと比較して、エステラーゼ加水分解に対してより安定であり得る。エステル加水分解速度における差異は、標的骨組織におけるＯＸＹ１３３の放出を微調整するために有益に利用することができる。該コンジュゲートの完全にプロトン化された形態は便宜上本明細書に示すが、ビスホスホン酸のいかなる塩形態も作製することができる。典型的には、コンジュゲートのナトリウム塩が作製される。
【化１４】
0006530056.tif 000019
【００２９】
最終のＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは異なる合成経路を介して得られても良い。例えば、以下に示すように、Ｏｘｙ１３３−アレンドロン酸コンジュゲート２、３、及び４の合成は、プレグネノロン５から開始しても良く、３−ヒドロキシル基の保護、側鎖の付加、５−アルケンのヒドロホウ素化酸化、次いで、所望の類似体に応じて、ヒドロキシル基の選択的保護または脱保護によって特異的に保護されたＯＸＹ１３３誘導体６に変換され得る。
【化１５】
0006530056.tif 000020
【００３０】
これらの化合物に対するカップリングパートナーは、合成経路によって調製され得る。ＯＸＹ１３３または誘導体６は、３及び／または６−ヒドロキシル基で無水コハク酸、保護されたアスパラギン酸、またはグリシンメチルエステルによりアシル化され、得られたカルボン酸は次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェノール誘導体として活性化され、続いてアレンドロン酸に結合し、該コンジュゲートを得ることができる。
【化１６】
0006530056.tif 000021
【００３１】
ＡＬＮ及び活性化エステル中間体の非相溶性プロファイルに起因して、アレンドロン酸のテトラブチルアンモニウム塩の形成は、ＤＭＦを用いたカップリング反応を成功裏に達成するために必須であった。極めて極性の高いビスホスホネート部分をＯｘｙ１３３に付加することは、得られるコンジュゲートが有機溶媒に不溶性であり、従来の順相クロマトグラフィによって精製することができず、また界面活性剤様の特性を有するために、特有な合成上の挑戦を呈する。ＡＬＮによる直接のアミド結合形成は、ホスホン酸官能基との競合副反応のために可能ではない。従って、ＡＬＮコンジュゲートは、別の工程において塩基性条件でＡＬＮと結合する単離された活性化エステルを用いて形成される。ＡＬＮ塩の形態は操作され、また精製は逆相固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジを用いて行われ、５０〜１００ｍｇ規模での簡便な作製を可能にした。テトラブチルアンモニウム塩の使用によって、ＳＰＥカートリッジでの最終コンジュゲートの保持が大きく向上した。ナトリウム塩は実質的に保持されない一方で、テトラブチルアンモニウム塩は、移動相において十分量のメタノールのみで溶離された。最終的に、残留したテトラブチルアンモニウム塩はＤｏｗｅｘカチオン交換樹脂によりナトリウム塩と交換され、生物学的試験に適切なＯＸＹ−ＡＬＮコンジュゲートをもたらした。
【化１７】
0006530056.tif 000022
【００３２】
本発明の他の実施形態では、完全アシル化条件が用いられ、２０位で第三アルコールのアシル化を達成し、過アシル化（ｐｅｒａｃｙｌａｔｅｄ）オキシステロールビスホスホネートコンジュゲートを形成することができる。ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの完全アシル化により、同じまたは異なるＲ基を用いた３位、６位、及び２０位でのアシル化を有するＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートを生じる。以下は、同じＲ基を用いたＯＸＹ１３３の完全アシル化の３つの例である。
【化１８】
0006530056.tif 000023
【００３３】
本発明の他の実施形態では、ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートが合成された。ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲート及びその合成の実施例を以下に提供する。ＯＸＹ１３３及びＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲート（ＯＸＹ１６６、ＯＸＹ１６７、ＯＸＹ１７４、ＯＸＹ１７５、ＯＸＹ１７６、ＯＸＹ１７７、及びＯＸＹ１７８）の構造の概要を図５に提供する。特定のＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの合成の実施例を以下に提供する。
【実施例】
【００３４】
実施例１：Ｏｘｙ１６６及び中間体の合成
【化１９】
0006530056.tif 000024
ＯＸＹ１６６は、ＯＸＹ１３３の３位及び６位に結合したスクシネートリンカーユニットを有する。ＯＸＹ１６６はＯＸＹ１３３から直接合成でき、また保護基の操作を必要としない。
【化２０】
0006530056.tif 000025
【００３５】
Ｏｘｙ１３３（２３６ｍｇ、５．６１×１０−４ｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）（６．８ｍｇ、５．６１×１０−５ｍｏｌ、０．１当量）及びトリエチルアミン（５６６ｍｇ、５．６１×１０−３ｍｏｌ、１０当量）と共に５ｍＬのジクロロメタンに溶解した。無水コハク酸（４４９ｍｇ、８．４２×１０−４、８当量）を固体として加え、混合物を室温で一晩撹拌した。朝方に、該溶液を１ＮのＨＣｌ水溶液に希釈し、ジクロロメタンで抽出した。混合ジクロロメタン画分を水で１回洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することにより、粗製の８を得た。粗製の８にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２０８ｍｇ、１．０×１０−３ｍｏｌ、１．８当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０１ｍｇ、１．０×１０−３ｍｏｌ、１．８当量）を加え、次いで２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、一晩強力に撹拌した。朝方に、反応混合物を濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＥｔＯＡｃ中に入れ、再度濾過し、続いてＳｉＯ２クロマトグラフィ（７０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、２６１ｍｇ（２工程にわたり５７％）の２１を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．７３（ｍ，２Ｈ），２．９３−２．８７（ｍ，４Ｈ），２．８３（ｓ，８Ｈ），２．８０−２．７０（ｍ，４Ｈ），２．０６−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．８５（ｍ，１Ｈ），１．７７−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．６６−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．６０−１．５４（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，３Ｈ），１．４６−１．３５（ｍ，３Ｈ），１．３４−１．１８（ｍ，１３Ｈ），１．１５−０．９８（ｍ，４Ｈ），０．９６−０．９０（ｍ，１Ｈ），０．８９−０．８５（ｍ，６Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．６８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【化２１】
0006530056.tif 000026
【００３６】
中間体２１（４５ｍｇ、５．４９×１０−５ｍｏｌ、１当量）を０．３ｍＬ無水ＤＭＦに溶解し、この溶液にアレンドロン酸（２７ｍｇ、１．１０×１０−４ｍｏｌ、２当量）から調製したアレンドロン酸トリス−テトラブチルアンモニウム塩の０．３ｍＬ無水ＤＭＦ溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで濃縮した。過剰なＤＭＦを、ロータリーエバポレーションにより繰り返しトルエンを添加及び除去することによって除いた。得られた粗製混合物を水に溶解して、２ｇのＣ−１８固相抽出カートリッジに装填した。カートリッジは、０％から５０％ＭｅＯＨまで徐々に増加させた水／ＭｅＯＨ混合液で最初に溶離された。所望の化合物を有する画分をプールし、濃縮し、次いでＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４  １００−２００樹脂を用いてナトリウム塩に交換した。水を凍結乾燥によって除去し、３０ｍｇ（約４５％）のＯｘｙ１６６をナトリウム塩として得た。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．５４（ｂｓ，２Ｈ），３．０７（ｔ，６．２Ｈｚ，４Ｈ），２．５１（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｍ，４Ｈ），１．９４−０．６４（ブロード）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ：Ｃ４３Ｈ７７Ｎ２Ｏ２１Ｐ４の計算値［Ｍ−２Ｈ］２−：５４０．１９５１；実測値：５４０．１５７６ｍ／ｚ。
【００３７】
実施例２：Ｏｘｙ１６７及び中間体の合成
ＯＸＹ１６７は、ＯＸＹ１３３の６位に結合したスクシネートリンカーユニットを有する。この結合はＯｘｙ１３３の無水コハク酸へのカップリングによって達成され、中間体１３を得ることができる。水媒体中でアレンドロン酸にカップリングする活性化エステルにより化合物ＯＸＹ１６７を得ることができる。
【化２２】
0006530056.tif 000027
【００３８】
中間体６（３００ｍｇ、５．６１×１０−４ｍｏｌ、１当量）を、５ｍＬのジクロロメタンに、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（６．８ｍｇ、５．６１×１０−５ｍｏｌ、０．１当量）及びトリエチルアミン（２８３ｍｇ、２．２４×１０−３ｍｏｌ、５当量）と共に溶解した。無水コハク酸（８４ｍｇ、８．４２×１０−４、１．５当量）を固体として加え、混合物を室温で一晩撹拌した。朝方に、該溶液を１ＮのＨＣｌ水溶液に希釈し、ジクロロメタンで抽出した。混合ジクロロメタン画分を水で１回洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することにより、３６５ｍｇの粗製の１２を得た。粗製の１２を２ｍＬのＤＣＭ：ＭｅＯＨが１：１の混合液に溶解し、この溶液にパラトルエンスルホン酸一水和物（１１ｍｇ、５．６１×１０−５ｍｏｌ、０．１当量）を固体として加え、反応を室温で３０分間撹拌した。２０ｍＬの飽和ＮａＣＯ３Ｈ水溶液を加え、次いで酢酸エチルで抽出した。混合有機画分をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することにより、更なる精製をせずに使用される粗製の１３を得た。粗製の１３にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２０８ｍｇ、１．０×１０−３ｍｏｌ、１．８当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０１ｍｇ、１．０×１０−３ｍｏｌ、１．８当量）を加え、次いで２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、一晩強力に撹拌した。朝方に、反応混合物を濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＥｔＯＡｃ中に入れ、再度濾過し、続いてＳｉＯ２クロマトグラフィ（７０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、９８ｍｇ（３工程にわたり２８％）の２２を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（主要共鳴）：４．６９（ｄｄｄ，１０．８Ｈｚ，１０．８Ｈｚ，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄｄｄｄ，１０．８Ｈｚ，１０．８Ｈｚ，４．８Ｈｚ，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），２．６０（２，４Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【化２３】
0006530056.tif 000028
中間体２２（５０ｍｇ、８．０９×１０−５ｍｏｌ、１当量）を０．３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、この溶液にアレンドロン酸（２０ｍｇ、８．０９×１０−５ｍｏｌ、１当量）から調製したアレンドロン酸トリス−テトラブチルアンモニウム塩の０．３ｍＬ無水ＤＭＦ溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで濃縮した。過剰なＤＭＦを、ロータリーエバポレーションにより繰り返しトルエンを添加及び除去することによって除いた。得られた粗製混合物を水に溶解して、２ｇのＣ−１８固相抽出カートリッジに装填した。カートリッジは、０％から５０％ＭｅＯＨまで徐々に増加させた水／ＭｅＯＨ混合液で最初に溶離された。所望の化合物を有する画分をプールし、濃縮し、次いでＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４  １００−２００樹脂を用いてナトリウム塩に交換した。水を凍結乾燥によって除去し、３３ｍｇ（約５０％）のＯｘｙ１６７をナトリウム塩として得た。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．６０（ｂｓ，ＨＤＯと重複），３．４１（ｂｓ，１Ｈ），３．０８（ｂｓ，２Ｈ），２．５９−２．３５（ｍ，４Ｈ），２．０１−０．５６（ブロード）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ：Ｃ３５Ｈ６２ＮＯ１２Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：７５０．３７５３；実測値：７５０．３１４９ｍ／ｚ。
【００３９】
実施例３：Ｏｘｙ１７４及び中間体の合成
ＯＸＹ１７４は、ＯＸＹ１３３の３位に結合したスクシネートリンカーユニットを有する。ＯＸＹ１７４は、ＯＸＹ１３３を無水コハク酸と反応させることにより合成され、中間体１０を生成し、これは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２３として活性化された後に、アレンドロン酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩と反応する。
【化２４】
0006530056.tif 000029
【００４０】
ＯＸＹ１３３（８０ｍｇ、１．９×１０−４ｍｏｌ、１当量）の２ｍＬジクロロメタン溶液に、トリエチルアミン（０．０８ｍＬ）、ＤＭＡＰ（約１ｍｇ、０．０５当量）及び無水コハク酸（２０ｍｇ、１．９×１０−４ｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を室温で６時間撹拌し、その後に無水コハク酸の第二分量を加えた（２０ｍｇ、１当量）。室温で１８時間後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を０．５Ｍ  ＨＣｌ溶液及び水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を留去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ、その後１０％ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ溶液）を用いて精製し、回収したステアリング（ｓｔａｒｉｎｇ）物質に富む画分、所望の９に富む画分（４０ｍｇ、３８％）、及び混合画分が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨＺ）δ：４．７１（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．２，１１．２，４．４，４．４Ｈｚ），３．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８，１０．８，４．４Ｈｚ），２．６５（４Ｈ，ｍ），２．１９（１Ｈ，ｍ），２．１０−１．９０（３Ｈ，ｍ），１．８５−１．６０（７Ｈ，ｍ），１．５５−１．３８（７Ｈ，ｍ），１．２５（１１Ｈ，ｂｒｓ），１．２０−０．９５（４Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ）０．６２（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ。
【００４１】
粗製の９（５２０ｍｇ、１．０×１０−３ｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（６ｍＬ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２３０ｍｇ、２．０×１０−３ｍｏｌ、２当量）溶液に、固体のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４１２ｍｇ、２．０×１０−３ｍｏｌ、２当量）を一度に加えた。混合物を室温で６時間撹拌し、その後に溶媒を留去により除去した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に再懸濁し、濾過した。シリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、グラジエント）を用いた精製により、所望の生成物２３（最小極性画分２４０ｍｇ、３８％）、異性体生成物（中間極性画分９０ｍｇ、１４％）、及びＯｘｙ１３３の回収（極性画分１５０ｍｇ、３５％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ：４．７１（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．２，１１．２，４．４，４．４Ｈｚ），３．４０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８，１０．８，４．４Ｈｚ），３．９２（２Ｈ，ｍ），２．７９（４Ｈ，ｓ），２．６２（２Ｈ，ｍ），２．１９（１Ｈ，ｍ），２．１０−１．９０（３Ｈ，ｍ），１．８５−１．６０（７Ｈ，ｍ），１．５５−１．３８（７Ｈ，ｍ），１．２５（１１Ｈ，ｂｒｓ），１．２０−０．９５（４Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ）０．６２（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ。
【化２５】
0006530056.tif 000030
【００４２】
Ｏｘｙ１７４は、Ｏｘｙ１６７の合成手順に従って、２３（１１０ｍｇ、１．８×１０−４ｍｏｌ、１当量）から合成され、凍結乾燥後に３５ｍｇ（２４％）のＯｘｙ１７４が得られた。ＨＲＭＳ：Ｃ３５Ｈ６２ＮＯ１２Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：７５０．３７５３；実測値：７５０．３７４１ｍ／ｚ。
【００４３】
ＡＬＮ、及び２３などの活性化エステル中間体の非相溶性プロファイルに起因して、アレンドロン酸のテトラブチルアンモニウム塩の形成は、ＤＭＦを用いたカップリング反応を成功裏に達成するために必須であった。極めて極性の高いビスホスホネート部分をＯｘｙ１３３に付加することは、得られるコンジュゲートが有機溶媒に不溶性であり、従来の順相クロマトグラフィによって精製することができず、また界面活性剤様の特性を有するために、特有な合成上の挑戦を呈する。ＡＬＮ塩の形態は操作され、また精製は逆相固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジを用いて行われ、５０〜１００ｍｇ規模での簡便な作製を可能にした。テトラブチルアンモニウム塩の使用によって、ＳＰＥカートリッジでの最終コンジュゲートの保持が大きく向上した。ナトリウム塩は実質的に保持されない一方で、テトラブチルアンモニウム塩は、移動相において十分量のメタノールのみで溶離された。最終的に、残留したテトラブチルアンモニウム塩はＤｏｗｅｘカチオン交換樹脂によりナトリウム塩と交換され、生物学的試験に適切なＯＸＹ１７４をもたらした。
【００４４】
実施例４：Ｏｘｙ１７５及び中間体の合成
【化２６】
0006530056.tif 000031
ＯＸＹ１７５は、ＯＸＹ１３３の６位に結合したカルバメートリンカーユニットを有する。ＡＬＮによる直接のアミド結合形成は、ホスホン酸官能基との競合副反応のために可能ではない。従って、ＡＬＮコンジュゲートは、別の工程において塩基性条件でＡＬＮと結合する単離された活性化エステルを用いて形成される。
【化２７】
0006530056.tif 000032
【００４５】
ＯＸＹ１７５の合成は６から開始し、６（３１５ｍｇ、５．８９×１０−４ｍｏｌ、１当量）をトリホスゲン（５８ｍｇ、１．９６×１０−４ｍｏｌ、１／３当量）と３ｍＬの無水ＴＨＦ中で混合し、室温で撹拌した。ピリジン（２３２ｍｇ、２．９×１０−３、５当量）を注射器で一度に加え、反応混合物を室温で１５分間撹拌した。グリシンメチルエステル塩酸塩（１５１ｍｇ、１．２０×１０−４ｍｏｌ、２当量）を１ＭのＮａＯＨ水溶液に溶解し、その溶液をジクロロメタンで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。得られた遊離アミンを１ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶解し、該反応混合物に注射器で加えた。１時間後、反応を１ＭのＨＣｌ水溶液を用いてクエンチし、酢酸エチルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィ（２０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、１９４（５１％）ｍｇの１４を白色泡状物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．１２（ｄｄ，約５．２Ｈｚ，約５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄｄ，１０．８Ｈｚ，１０．８Ｈｚ，４．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｄ，１８．５Ｈｚ，５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，１８．５Ｈｚ，５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｄｄｄｄ，１０．３Ｈｚ，１０．３Ｈｚ，４．８Ｈｚ，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．５６（ｍ，６Ｈ），１．５３−１．３７（ｍ，５Ｈ），１．３６−１．０７（ｍ，１８Ｈ），１．０５−０．９３（ｍ，３Ｈ），０．９１−０．８６（ｍ，３Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．８３（ｓ，３Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ），０．６２（ｍ，１Ｈ），０．２６（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
【化２８】
0006530056.tif 000033
【００４６】
中間体１４（１９４ｍｇ、２．９８×１０−４ｍｏｌ、１当量）を３ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、パラトルエンスルホン酸一水和物（５．６ｍｇ、２．９８×１０−５ｍｏｌ、０．１当量）を固体として加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。２０ｍＬの飽和ＮａＣＯ３Ｈ水溶液を加え、次いで酢酸エチルで抽出した。混合有機画分をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することにより、更なる精製をせずに使用される１５８ｍｇの１５を白色泡状物として得た。１５（６４ｍｇ、１．１９×１０−４ｍｏｌ、１当量）を、２ｍＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏが９：１の溶液に溶解し、この溶液にＫ２ＣＯ３（６６ｍｇ、４．７６×１０−４、４当量）を固体として加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、１ＮのＨＣｌ水溶液を用いてクエンチし、ＥｔＯＡｃ中に抽出して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することによって、更なる精製をせずに使用される６０ｍｇの粗製の１６を得た。１６（６０ｍｇ、１．１５×１０−４ｍｏｌ）に、固体のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２７ｍｇ、１．３１×１０−４ｍｏｌ、１．１当量）を丸底フラスコ中で加え、そこにパラニトロフェノール（２２ｍｇ、１．５５×１０−４ｍｏｌ、１．３当量）のＤＣＭ溶液２ｍＬを一度に加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解した後に再度濾過した。濃縮の際に、残渣をＳｉＯ２クロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、４６ｍｇ（３工程にわたり６２％）の２５を無色油状物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｄ，９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．４０（ｔ，５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｄ，５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４９（ｍ，１Ｈ），２．０６−１．９９（ｍ，２Ｈ），１．９８−１．８４（ｍ，３Ｈ），１．８１−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．３４（ｍ，３Ｈ），１．３３−１．１７（ｍ，１７Ｈ），１．１５−１．０６（ｍ，２Ｈ），１．０６−０．９６（ｍ，２Ｈ），０．９３−０．８８（ｍ，１Ｈ），０．８７−０．８２（ｍ，６Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ），０．６２（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【００４７】
従って、カルバメートリンカーの付加及びＣ３アルコールの脱保護によって中間体１５を得た。中間体１５をけん化し、ｐ−ニトロフェノールで活性化することによって、貯蔵安定な活性化エステル２５を得、これはアレンドロン酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩との反応の際に、ＡＬＮのアミドアルファにＮＨ−カルボニルを付与した（Ｏｘｙ１７５）。
【化２９】
0006530056.tif 000034
【００４８】
中間体２５（４３ｍｇ、６．７×１０−５ｍｏｌ、１当量）を０．３ｍＬ無水ＤＭＦに溶解し、この溶液にアレンドロン酸（１７ｍｇ、６．７×１０−５ｍｏｌ、１当量）から調製したアレンドロン酸トリス−テトラブチルアンモニウム塩の０．３ｍＬ無水ＤＭＦ溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで濃縮した。過剰なＤＭＦを、ロータリーエバポレーションにより繰り返しトルエンを添加及び除去することによって除いた。得られた粗製混合物を水に溶解して、２ｇのＣ−１８固相抽出カートリッジに装填した。カートリッジは、０％から５０％ＭｅＯＨまで徐々に増加させた水ＭｅＯＨ混合液で最初に溶離された。所望の化合物を有する画分をプールし、濃縮し、次いでＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４  １００−２００樹脂を用いてナトリウム塩に交換した。水を凍結乾燥によって除去し、２５ｍｇ（約４４％）のＯｘｙ１７５をナトリウム塩として得た。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．４６（ｂｓ，１Ｈ），３．７７（ｂｓ，１Ｈ），３．６３（ｂｓ，１Ｈ），３．４１（ｂｓ，１Ｈ），３．１２（ｂｓ，２Ｈ），２．２４−０．１３（ブロード）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ：Ｃ３４Ｈ６１ＮＯ１２Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：７５１．３７０５；実測値：７５１．３３６７ｍ／ｚ。
【００４９】
実施例５：Ｏｘｙ１７６及び中間体の合成
【化３０】
0006530056.tif 000035
【００５０】
ＯＸＹ１７６は、ＯＸＹ１３３の３位及び６位に結合したカルバメートリンカーユニットを有する。ＯＸＹ１７６はＯＸＹ１３３から直接合成することができる。
【化３１】
0006530056.tif 000036
【００５１】
Ｏｘｙ１３３（３００ｍｇ、７．１４×１０−４ｍｏｌ、１当量）及びトリホスゲン（１４１ｍｇ、４．７６×１０−４ｍｏｌ、２／３当量）の無水ＴＨＦ溶液４ｍＬを室温で撹拌した。ピリジン（２３２ｍｇ、２．９×１０−３、５当量）を注射器で一度に加え、反応混合物を１５分間撹拌した。グリシンメチルエステル塩酸塩（２６９ｍｇ、２．１４×１０−３ｍｏｌ、３当量）を１ＭのＮａＯＨ水溶液に溶解し、その溶液をジクロロメタンで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。得られた遊離アミンを１ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶解し、該反応混合物に注射器で加えた。１時間後、反応を１ＭのＨＣｌ水溶液を用いてクエンチし、酢酸エチルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、１３０ｍｇ（約２８％）の１０を油状物として得、これは一部の単官能化された化合物を含み、更なる精製をせずに使用された。１０（約１３０ｍｇ、２．０×１０−４ｍｏｌ、１当量）を２ｍＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（９：１）溶液に溶解し、この溶液にＫ２ＣＯ３（１６５ｍｇ、１．２×１０−４、６当量）を固体として加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、１ＮのＨＣｌ水溶液を用いてクエンチし、酢酸エチルで抽出して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮することによって、粗製の１１を得た。１１（約１００ｍｇ、１．６０×１０−４ｍｏｌ、１当量）を固体のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（７３ｍｇ、３．５３×１０−４ｍｏｌ、２．２当量）と丸底フラスコ中で混合した。この混合物にパラニトロフェノール（５６ｍｇ、４．０×１０−４ｍｏｌ、２．５当量）の無水ＤＣＭ溶液２ｍＬ溶液を加え、室温で一晩強力に撹拌した。朝方に、混合物を濾過し、ＤＣＭをロータリーエバポレーションにより除去し、混合物をＥｔＯＡｃ中に再懸濁し、濾過、濃縮、及びＳｉＯ２クロマトグラフィで精製することによって、３０ｍｇ（約１８％）の所望の２６を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２４（ｄ，９．２Ｈｚ，４Ｈ），７．３０（ｄ，９．２Ｈｚ，４Ｈ），５．３１（ｍ，１Ｈ），５．２２（ｍ，１Ｈ），４．５９（ｍ，２Ｈ），４．２０（ｍ，４Ｈ），２．０６−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．８５（ｍ，１Ｈ），１．７７−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．６６−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．６０−１．５４（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，３Ｈ），１．４６−１．３５（ｍ，３Ｈ），１．３４−１．１８（ｍ，１３Ｈ），１．１５−０．９８（ｍ，４Ｈ），０．９６−０．９０（ｍ，１Ｈ），０．８９−０．８５（ｍ，６Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．６８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【化３２】
0006530056.tif 000037
【００５２】
Ｏｘｙ１７６は、２３からＯｘｙ１６６を得たのと同様な方法で作製される。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．４０（ｂｓ，２Ｈ），３．７０（ｍ，４Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），２．０１−０．５５（ブロード）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ：Ｃ４１Ｈ７５Ｎ４Ｏ２１Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：１０８３．３３８０；実測値：１０８３．３７５４ｍ／ｚ。
【００５３】
実施例６：Ｏｘｙ１７７及び中間体の合成
ＯＸＹ１７７は、ＯＸＹ１３３の３位に結合したカルバメートリンカーユニットを有する。Ｃ６−ヒドロキシル基をアシル化した後に、ＴＢＳを除去し、中間体１８を得る。続いて、カルバメートを、グリシンメチルエステルを用いて形成することにより１９を得て、これをけん化し、パラニトロフェノールエステル２４として活性化する。２４は、アレンドロン酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩との反応の際に、Ｏｘｙ１７７をもたらす。
【化３３】
0006530056.tif 000038
【００５４】
中間体６（３３０ｍｇ、６．１７×１０−４ｍｏｌ、１当量）を０．６ｍＬ無水ピリジンに溶解し、この溶液に無水酢酸（８８ｍｇ、８．６４×１０−４ｍｏｌ、１．４当量）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応を１ＮのＨＣｌ水溶液を用いて希釈し、エーテル及びヘキサンの５０：５０混合液で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィで精製することによって、２０６ｍｇ（５８％）の１７を得た。１７（２０６ｍｇ、３．５７×１０−４ｍｏｌ、１当量）を２ｍＬのＭｅＯＨ：ＤＣＭが１：１の溶液に溶解し、パラトルエンスルホン酸一水和物（７ｍｇ、３．５７×１０−５ｍｏｌ、０．１当量）を固体として加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。２０ｍＬの飽和ＮａＣＯ３Ｈ水溶液を加え、次いで酢酸エチルで抽出した。混合有機画分をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、ＳｉＯ２（５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）で精製することによって、１０２ｍｇ（６２％）の１８を白色泡状物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．６６（ｄｄｄ，１０．８Ｈｚ，１０．８Ｈｚ，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５３（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｍ，１Ｈ），１，８６（ｍ，１Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ），１．６７−１．６０（ｍ，１Ｈ），１．５９−１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４６−１．３５（ｍ，３Ｈ），１．３４−１．１９（ｍ，１４Ｈ），１．１８−１．０８（ｍ，４Ｈ），１．０６−０．９７（ｍ，２Ｈ），０．９２−０．８４（ｍ，６Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．６６（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【化３４】
0006530056.tif 000039
【００５５】
中間体１９は、１５の合成手順に従って、１８から作製される。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．０８（ｔ，５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６６（ｄｄｄ，１０．７Ｈｚ，１０．７Ｈｚ，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｄ，５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｍ，１Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．７２（ｍ，２Ｈ），１．６４（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｓ，１Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．２１（ｍ，１５Ｈ），１．６７−０．９９（ｍ，５Ｈ），０．９３−０．８５（ｍ，７Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．６８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【化３５】
0006530056.tif 000040
【００５６】
中間体１９（３７ｍｇ、６．４×１０−５ｍｏｌ、１当量）を１ｍＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）溶液に溶解し、３５ｍｇの固体Ｋ２ＣＯ３を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液を用いて希釈し、次いでＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥及び濃縮することによって、更なる精製をせずに使用される粗製の２０を得た。２４は、２４の合成手順に従って、２２から合成され、２３ｍｇ（２工程に対して５３％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２７（ｄ，９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．２３（ｔ，５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄｄｄｄ，１０．９Ｈｚ，１０．９Ｈｚ，４．６Ｈｚ，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｄ，５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄｄｄ，１０．８Ｈｚ，１０．８Ｈｚ，４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．２６（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．９９（ｍ，１Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），１．７４−１．６７（ｍ，３Ｈ），１．６５−１．５９（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．４１（ｍ，５Ｈ），１．３４−１．２２（ｍ，１４Ｈ），１．１７（ｍ，２Ｈ），１．１１−１．０１（ｍ，４Ｈ），０．８９−０．８４（ｍ，８Ｈ），０．６７（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【化３６】
0006530056.tif 000041
【００５７】
Ｏｘｙ１７７は、Ｏｘｙ１７５の合成について記載された手順に従って、２４から作製された。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．４３（ｂｓ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｍ，ＩＨ），３．３７（ｂｓ，１Ｈ），３．１２（ｂｓ，２Ｈ），２．１１−０．４０（ブロード）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ：Ｃ３４Ｈ６１ＮＯ１２Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：７５１．３７０５；実測値：７５１．３６６５ｍ／ｚ。
【００５８】
実施例７：Ｏｘｙ１７８の合成
【化３７】
0006530056.tif 000042
ＯＸＹ１７８は、ＯＸＹ１３３の３位及び６位で、ＯＸＹ１３３とアレンドロン酸の間に直接カルバメート結合を有する。ＯＸＹ１７８はＯＸＹ１３３から直接合成することができ、保護基の操作を必要としないことが可能である。
【化３８】
0006530056.tif 000043
【００５９】
Ｏｘｙ１３３（５２０ｍｇ、１．２×１０−３ｍｏｌ、１当量）の無水ＴＨＦ溶液（６ｍＬ）に、カルボニルジイミダゾール（１．４ｇ、８．４×１０−３ｍｏｌ、７当量）を一度に加えた。室温で１６時間後、混合物を水（２０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離した後、水層をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。粗製の２７（残留イミダゾールを含む）を更なる精製をせずに使用した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨＺ）δ：８．１２，８．０１（２Ｈ，ｓ），７．４，７．３８（２Ｈ，ｓ），７．０６，７．０４，（２Ｈ，ｓ），４．８１（２Ｈ，ｍ），２．１９（１Ｈ，ｍ），２．１０−１．９０（３Ｈ，ｍ），１．８５−１．６０（７Ｈ，ｍ），１．５５−１．３８（７Ｈ，ｍ），１．２５（１１Ｈ，ｂｒｓ），１．２０−０．９５（４Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ）０．６２（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ。
【００６０】
Ｏｘｙ１７８は、Ｏｘｙ１６６の合成手順に従って、粗製の２７（０．２４ｇ、約０．４ｍｍｏｌ）から合成され、凍結乾燥後に６５ｍｇ（１５％）のＯｘｙ１７８が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ主要共鳴（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ）δ：４．４１（２Ｈ，ｍ），３．００（４Ｈ，ｍ），２．１０−０．６２（ブロード）。ＨＲＭＳ：Ｃ３７Ｈ６９Ｎ２Ｏ１２Ｐ２の計算値［Ｍ−Ｈ］−：９６９．３４５０；実測値：９６９．３１００ｍ／ｚ。
【００６１】
下記に示すＯｘｙ１７８のモノカルバメート類似体を作製することができる。
【化３９】
0006530056.tif 000044
【００６２】
本発明は、本明細書に提供される実施例に限定されない。例えば、一実施形態において、ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートはＯＸＹ１３３の２０位でコンジュゲートされても良い。当業者はＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートが異なるリンカーユニットを含んでも良いことを理解するであろう。
【００６３】
本明細書に記載される化合物は、１つ以上の荷電原子を有しても良い。例えば、該化合物は双性イオンであって良いが、全体的に中性であっても良い。他の実施形態は、ｐＨや他の因子に応じて、１つ以上の荷電基を有していても良い。これらの実施形態において、該化合物は好適な対イオンに付随していても良い。塩の作製方法及び対イオン交換方法は当該技術分野で周知である。一般的に、かかる塩は該化合物の遊離酸形態を化学量論量の適切な塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、若しくはＫの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩など）と反応させることによって、または該化合物の遊離塩基形態を化学量論量の適切な酸と反応させることによって作製することができる。かかる反応は典型的には水中で若しくは有機溶媒中で、またはこの２つの混合液中で行なわれる。対イオンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィなどのイオン交換技術によって変換されていても良い。全ての双性イオン、塩、及び対イオンが、該対イオンまたは塩が具体的に示されない限り、対象とされる。特定の実施形態では、該塩または対イオンは対象への投与用に薬学的許容であっても良い。
【００６４】
化学構造の特定の表示において、化合物の完全にプロトン化された形態が示される。特に具体的に示されない限り、かかる化合物が該化合物の塩形態でもあり得ることを理解すべきである。化学構造の特定の表示において、化合物の塩形態が示される。特に具体的に示されない限り、かかる化合物は異なる程度のプロトン付加を有するその塩形態であり得るか、異なる塩形態であり得るか、または該化合物の完全にプロトン化された形態であり得ることが理解されるべきである。
【００６５】
他の実施形態において、本発明のオキシステロール及びオキシステロール−ビスホスホネートコンジュゲートは、骨粗鬆症の治療のための治療剤として使用することができる医薬組成物の一部であり得る。
【００６６】
実施例８：ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの生物学的活性
ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは、Ｍ２−１０Ｂ４骨細胞前駆細胞で試験され、骨形成活性を確認し、及び骨形成分化の誘導におけるこれらの作用機序を確証した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、骨形成分化マーカー遺伝子（ＡＬＰ、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、及びオステリックス（ＯＳＸ））の発現の誘導、及び細胞外マトリックス石灰化の指標としての４５Ｃａの取り込みについて、我々が以前報告したプロトコルによりアッセイした。発明者らは、これらのインビトロアッセイが、種々の動物モデルにおける骨形成のインビボ刺激を説明できることを示した。ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートによって誘導されるＡＬＰ、ＢＳＰ、及びＯＳＸに関する遺伝子発現は、治療の６日後、及び１４日後に測定され、６日後の結果を図１に示す。
【００６７】
スクシネート結合シリーズ（Ｏｘｙ１６６、Ｏｘｙ１６７、Ｏｘｙ１７４）及びカルバメートシリーズ（Ｏｘｙ１７５、Ｏｘｙ１７６、及びＯｘｙ１７７）を群としてアッセイした。ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは、概して、対照の未処置細胞と比較した場合に、またコンジュゲートされていないＯＸＹ１３３よりも少ない程度で、骨形成遺伝子発現を誘導した。骨形成遺伝子発現を誘導するために、ＯＸＹ１３３はＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートから放出されなければならないことが可能性として考えられる。ＯＸＹ１３３−ＡＬＮ化合物は、エステラーゼによる切断に対するリンカーの予想される感受性に応じて、これらのインビトロでの実験で種々のレベルの活性を示した。これは、該リンカーの位置及び各性質に基づく「調整能力」を示す。両シリーズにおいて、Ｃ-６単官能化合物が最も活性が高く（Ｏｘｙ１６７、Ｏｘｙ１７５）、また酵素加水分解に対する相対的な安定性と両立し、スクシネート結合シリーズ（Ｏｘｙ１６７）はカルバメート結合シリーズ（Ｏｘｙ１７５）よりも活性が高かった。この結果は、ＡＬＰ活性誘導実験において同様であった。細胞を４μＭの特異的Ｈｈ経路阻害剤シクロパミンで前処置することにより、全てのオキシステロールによる骨形成遺伝子の誘導が阻害された。このことは、これらの骨形成作用の媒介におけるＨｈ経路の役割を示し、またコンジュゲートされていないＯＸＹ１３３及び他の骨形成オキシステロールに対して観察されるものと同様である。図２に示すように、定量的４５Ｃａ石灰化アッセイを、類似体及びコンジュゲートされていないＯＸＹ１３３を用いてＭ２細胞において３０日のインキュベーション期間にわたり行った。その結果、全ての化合物は有意なレベルの石灰化をもたらし、これは、骨形成分化するためにオキシステロールによって誘導された細胞の長期機能性が良い方向に影響を受ける可能性があることを示唆する。この結果はＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの構造に依存した種々の程度の活性を実証し、また全ての化合物は有意な量の石灰化を伴った。
【００６８】
実施例９：ＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートのヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）結合能の検討
ビスホスホネートの骨結合特性は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）中のカルシウムに対するその親和性に起因する。相対的なＨＡＰ結合能は、分析物の溶液をＨＡＰと共にインキュベートし、上清に残存する化合物の割合を測定することによって評価することができる。このＨＡＰ結合アッセイは、臨床的に強い骨結合を呈することがわかっているビスホスホネートに有効であり、種々の他の化合物に対するインビボでの骨沈着を説明し得る。図３に示すように、これらの試験に類似するがＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの特有の性質に適応したインビトロＨＡＰ結合アッセイを行った。ＡＬＮ及びＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは、紫外／可視不活性であり、ブロードな１Ｈ−ＮＭＲ共鳴を表し、また質量分析法での検出が困難であるため、３１Ｐ−ＮＭＲに基づく方法を、ＨＡＰに結合しなかった分析物の割合を測定するために用いた。このアプローチは、誘導体化及び過度の操作なしに試料を直接分析することができ、またアッセイ条件に曝露されていない外部標準に対して確実に積分することができるために有利である。種々の分析物の信頼できる定量を、インバースゲートデカップリングパルスシーケンス及び十分に長い緩和遅延時間（ｄ１）を使用することにより得ることができる。
【００６９】
ＨＡＰ結合アッセイは以下の条件で行われた：ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス緩衝液中の４ｍＭ分析物１ｍＬをＨＡＰ（または対照としてＨＡＰなし）と１５分間の反転によりインキュベートする。ＨＡＰは穏やかな遠心分離によりペレット化され、上清は積分標準及びＤ２Ｏを含むＮＭＲチューブに直接添加される。３１Ｐ−ＮＭＲは、１２２ＭＨｚで、インバースゲートデカップリング法のパルスシーケンスを用いて、パルス角度３０度及び緩和遅延時間３０秒で得られた（緩和時間を２倍にしても、相対積分面積に影響を与えなかった）。手順を図３Ａに示す。図３Ｂに示すように、３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは対照（Ａ）及びＨＡＰ処理したアレンドロン酸試料（Ｂ）を提示し、これは内部標準に対して積分され、及び一定を維持する。
【００７０】
ＡＬＮと比較した本発明のＯＸＹ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの結合強度が測定され、Ｏｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートの程度（モノ−対ビス−ＡＬＮ結合コンジュゲート）、位置（Ｃ３−ＯＨ対Ｃ６−ＯＨ）、及び性質（スクシネート対グリシネート）によって付与される結合強度の違いが示された。ＡＬＮは陽性対照として使用され、ベンジルホスホン酸（ＢｎＰ）は既定の陰性対照として使用された。６００ｍｇのＨＡＰが「多量ＨＡＰ添加」条件として使用され（図４Ａ）、及び１５０ｍｇのＨＡＰが「少量ＨＡＰ添加」条件として使用された（図４Ｂ）。
【００７１】
実験条件：ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス緩衝液中の４ｍＭ分析物１ｍＬを特定の量のＨＡＰ（または対照としてＨＡＰなし）と１５分間の反転によりインキュベートする。ＨＡＰは穏やかな遠心分離によりペレット化され、上清は積分標準及びＤ２Ｏを含むＮＭＲチューブに直接添加される。３１Ｐ−ＮＭＲは、１２２ＭＨｚで、インバースゲートデカップリング法のパルスシーケンスを用いて、パルス角度３０度及び緩和遅延時間３０秒で得られた（緩和時間を２倍にしても、相対積分面積に影響を与えなかった）。３１Ｐ−ＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）は対照（Ａ−青スペクトル）及びＨＡＰ処理したアレンドロン酸試料（Ｂ−赤スペクトル）を提示し、これは一定を維持する内部標準に対して積分される。
【００７２】
Ｏｘｙ１６６は対照と比較してアッセイされ、ＡＬＮに比してより強力なＨＡＰ結合を示した（図４Ａ）。非結合のＯｘｙ１６６が検出限界に接近していたので、より少量のＨＡＰ添加で、種々のＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートを調べた（図４Ｂ）。３１Ｐ−シグナル広幅化が、カルバメートシリーズの考えられる互変異性型から生じていたため、１Ｈ−ＮＭＲ法が開発された。ＨＡＰ結合アッセイをＤ２Ｏで内部積分標準（マレイン酸）を用いて行うことにより、３１Ｐ法で得られたＡＬＮに対して同一値を得、Ｏｘｙ１７７が他のＯＸＹ−ＡＬＮコンジュゲートシリーズと同等の結合親和性を有することを明らかにした（図４Ｃ）。全てのＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートはＡＬＮ単独よりも高いＨＡＰ結合能を有した。骨親和性部分の近傍の親油性を増加させることによって、インビトロでのＨＡＰ結合性が向上すると思われる。ＡＬＮコンジュゲーションの性質や程度は、ＨＡＰ結合に影響を及ぼさないように思われる。短いリンカーがＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートに用いられたが、従って、これはＨＡＰ表面への結合が限られた「活性ねじれ部位」で生じるというモデルと整合性がある。構造における比較的わずかな変化、例えばリンカー結合の位置化学またはリンカーの種類などが、実際の結合に影響を与えなかったことは、極めて強力なＡＬＮのＨＡＰ結合と整合性があった。このように、Ｏｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートのＨＡＰ結合親和性の測定から、アレンドロン酸結合の程度、部位、または性質とは無関係な強いＨＡＰ結合が観察された。これは、骨におけるＯｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートのインビボ沈着と相関する可能性がある。Ｏｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲート間で類似するこれらのＨＡＰ結合親和性に基づき、Ｏｘｙ１３３−ＡＬＮコンジュゲートは強い骨親和性を示すと考えられ、治療法に有望である。
【００７３】
医薬組成物及び投与
本発明の実施形態に記載の化合物は、本明細書で定義される、治療有効量の本発明の化合物、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて調製された医薬組成物として有用である。
【００７４】
本発明の化合物を医薬組成物として製剤化することができ、及び治療を必要とする対象、例えばヒト対象などの哺乳類に、例えば、経口で、経鼻で、腹腔内に、若しくは非経口で、静脈内に、筋肉内に、局所若しくは皮下経路によって、または組織内への注射によって、などの選択した投与経路に適合した様々な形態で投与することができる。
【００７５】
従って、本発明の化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて経口で、または吸入若しくは注入によって全身的に投与されても良い。該化合物は、ハード若しくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されていても良く、錠剤に圧縮されてもよく、または患者の食事の食物と直接混合されても良い。経口治療用投与として、該化合物は１つ以上の賦形剤と混合されても良く、ならびに摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、及びカシェ剤などの形態で使用されても良い。該化合物は、ｆｍｅ不活性な粉末状担体と混合されても良く、対象により吸入されても、または注入されても良い。かかる組成物及び製剤は少なくとも０．１％の本発明の実施形態に記載の化合物を含むべきである。該組成物及び製剤の割合は当然様々であって良く、及び所与の単位剤形の重量の適宜約２％〜約６０％の間であって良い。かかる治療的有用な組成物における化合物の量は有効用量レベルが得られると考えられる量である。
【００７６】
該錠剤、トローチ剤、丸剤、及びカプセル剤などが、以下のものを含んでも良く：トラガカント、アカシア、コーンスターチ、若しくはゼラチンなどの結合剤；リン酸水素カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、及びアルギン酸などの崩壊剤；ステリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ならびにスクロース、フルクトース、ラクトース、若しくはアスパラテームなどの甘味剤、またはペパーミント、ウインターグリーン油若しくはチェリー香味などの矯味剤が加えられても良い。単位剤形がカプセルの場合、上述の種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含んでも良い。種々の他の材料が、コーティング剤として、または他の場合には固体単位剤形の物理的形態を改変するために存しても良い。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤がゼラチン、ワックス、セラック、または糖などと共にコーティングされても良い。シロップ剤またはエリキシル剤が、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチェリーまたはオレンジ香味などの矯味剤を含んでも良い。当然、任意の単位剤形の作製に使用されるいかなる材料も薬学的に許容され、及び使用される量において実質的に非毒性であるべきである。更に、該化合物は、徐放性製剤及びデバイスに組み込まれても良い。例えば、該化合物は、徐放性カプセル、徐放性錠剤、徐放性丸剤、及び徐放性ポリマーまたはナノ粒子に組み込まれても良い。
【００７７】
該化合物は、静脈内にまたは腹腔内に、点滴または注射によって投与されても良い。該化合物の溶液は、水で、任意選択的に非毒性の界面活性剤と混合して調製され得る。分散物を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中で、ならびに油剤中で調製することも可能である。通常の保管と使用条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含み得る。
【００７８】
注射または点滴に好適な薬剤の剤形は、滅菌水溶液または分散物、あるいは滅菌注射用溶液若しくは点滴用溶液または分散液の即時調製に適合した、任意選択的にリポソームに封入された化合物を含む滅菌粉末を含み得る。いずれの場合でも、最終の剤形は、製造及び保管の条件下において、無菌で、液体状で、及び安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒または液状分散媒であり得る。適正な流動性は、例えばリポソームの形成によって、分散物の場合には所要粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって保持され得る。微生物の作用の阻止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどの種々の抗菌剤、及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、該組成物における吸収遅延剤の使用、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００７９】
滅菌注射用溶液は、該化合物を所要量、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒に加えることによって調製され、その後に濾過滅菌される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、活性成分の粉末、それに加えて予め滅菌濾過した溶液中に存する任意の付加的な所望成分の粉末を産する真空乾燥及び凍結乾燥方式である。
【００８０】
局所投与の場合、該化合物をそのままの形態で塗布しても良い。しかし、それらを皮膚科学的に許容できる担体であって、固体または液体であっても良い担体と組み合わせた組成物または製剤として皮膚に投与することが望ましい場合がある。
【００８１】
有用な固体担体として、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、及びアルミナなどの微粉化した固体が挙げられる。他の固体担体として、非毒性のポリマーナノ粒子またはマイクロ粒子が挙げられる。有用な液体担体として、水、アルコール、若しくはグリコール、または水／アルコール／グリコール混合液が挙げられ、これらの中に該化合物が有効な濃度で、任意選択的に非毒性の界面活性剤を用いて、溶解されまたは分散され得る。芳香剤及び追加の抗菌剤などのアジュバントが、所与の使用のための特性を最適化するために付加され得る。得られた液体組成物は、吸収パッドより適用され、包帯及び他の包帯材の含浸用に使用され、または患部にポンプ型またはエアゾール噴霧器を用いて噴霧され得る。
【００８２】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、または変性無機物質などの増粘剤を液体担体と共に使用し、直接使用者の皮膚に塗布するための塗り広げられるペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、及び石けん剤などを形成することもできる。
【００８３】
該化合物を皮膚に送達するために使用され得る有用な皮膚科学的組成物の例は、当該技術分野に既知であり、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号），Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。これらの全ての特許は参照により本明細書に援用される。
【００８４】
式Ｉの化合物の有用な用量は、そのインビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿する方法は、当該技術分野に既知であり、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【００８５】
例えば、ローションなどの液体組成物における該化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％、または約０．５〜１０重量％であり得る。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中濃度は、約０．１〜５重量％、または約０．５〜２．５重量％であり得る。
【００８６】
治療における使用に必要な該化合物の量は、選定した特定の塩のみならず投与経路、治療される状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態にも伴って変化し、最終的には担当医師または臨床医の裁量に任されるであろう。
【００８７】
本発明の薬剤の有効用量及び投与経路は従来的なものである。該薬剤の正確な量（有効用量）は、対象により様々であり、例えば、対象の種、年齢、体重、及び全身状態または臨床状態、治療される障害の重症度または機序、使用される特定の薬剤またはビヒクル、ならびに投与方法及びスケジューリングなどに依存する。治療有効用量は当業者に既知の従来の手順により経験的に決定され得る。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ編，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。例えば、有効用量は、まず細胞培養アッセイでまたは適切な動物モデルのいずれかで推定され得る。動物モデルは適正な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用されても良い。かかる情報は、その後、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用することができる。また、治療用量は、同等の治療剤の用量との類似性によって選定され得る。
【００８８】
特定の投与様式及び投与レジメンは、担当臨床医によって、その症例の詳細を考慮して（例えば、対象、疾患、罹患している疾患の状態、及び治療が予防的であるかなど）、選択されるであろう。治療は、数日から数ヶ月または数年にわたる毎日または１日複数回の化合物（複数可）の投薬を伴っても良い。
【００８９】
しかしながら、一般的には、適正な用量は約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、レシピエントの体重１キログラムあたり１日約０．１ｍｇ超、または体重１キログラムあたり１日約１〜約１０ｍｇの範囲などの、体重あたり１日約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であるだろう。例えば、適切な用量は、体重あたり１日約１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであっても良い。
【００９０】
該化合物は、例えば、０．０５〜１００００ｍｇ、０．５〜１００００ｍｇ、５〜１０００ｍｇ、または約１００ｍｇの単位剤形あたりの活性成分を含む単位剤形で適宜投与される。
【００９１】
該化合物は、例えば約０．５〜約７５μＭ、約１〜５０μＭ、約２〜約３０μＭ、または約５〜約２５μＭのピーク血漿中濃度に達するよう投与され得る。例示的な望ましい血漿中濃度は少なくとも０．２５、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、若しくは２００μＭ、またはこれらの値以下を含む。例えば、血漿中濃度は約１〜１００マイクロモル濃度、または約１０〜約２５マイクロモル濃度であっても良い。これは、例えば該化合物の０．０５〜５％溶液を、任意選択的に生理食塩水と共に、静脈内注射することによって、または約１〜１００ｍｇの該化合物を含む巨丸剤として経口投与することによって達成されても良い。望ましい血中濃度は、体重１ｋｇあたり１時間約０．００００５〜５ｍｇ、例えば少なくとも０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、若しくは５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ、またはこれらの値以下を供給する持続点滴によって維持されても良い。あるいは、かかる濃度は、体重１ｋｇあたり約０．０００２〜２０ｍｇの化合物、例えば、少なくとも体重１ｋｇあたり０．０００２、０．００２、０．０２、０．２、２、２０、若しくは５０ｍｇ、またはこれらの値以下の化合物を含む間欠的点滴によって得ることができる。
【００９２】
該化合物は、適正な間隔で、例えば１日あたり１用量または１日あたり２、３、４、若しくはより多くのサブ用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として投与される単回用量または分割用量で、適宜提供されても良い。該サブ用量自体は、例えば吸入器からの複数回吸入などの多数回の不連続で大まかな間隔の投与に、更に分割されても良い。
【００９３】
本出願で記載し、引用し、または参照した学術論文、特許出願、及び特許を含むがこれらに限定されない全ての文書、参考文献、及び情報は、各々が個別に援用された場合と同様に、参照によりその全体が本明細書に援用される。かかる文書として、米国特許出願公開第２００６−０２７０６４５Ａ１号、同第２００６−０２５１７３５Ａ１号、同第２００９−０２０２６６０Ａ１号、同第２００９−０２２０５６２Ａ１号、同第２０１０−００３４７８１Ａ１号、同第２０１０−００４８９４４Ａ１号、同第２０１０−０１０５６４５Ａ１号、同第２０１０−００１２０３０Ａ１号、同第２０１１−０００８２９７Ａ１号、及び同第２０１２−０３０９７３０Ａ１号、ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１４／１７９７５６号、同第ＷＯ２０１３／１６９３９９号、同第ＷＯ２０１３／１６９３９７号、及び同第ＷＯ２０１１／００６０８７号が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書に記載及び論じられた実施形態は、発明者に既知の最良の方法を、本発明を実施するために当業者に教示することのみが意図される。本明細書におけるいずれも、本発明の範囲を制限するものとしてみなされるべきではない。提示される全ての実施例は代表的なものであり、非限定的である。上述の本発明の実施形態は、本発明から逸脱することなく、上述の教示に鑑みて当業者によって理解されるように、修正または変更され得る。従って、本発明が、本特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載された以外の方法で実施され得ることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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