(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノアッセイにおけるＦｃ−Ｆｃ相互作用により引き起こされる非特異的結合を減少させるための方法であって、ＩｇＧ４アイソタイプの１つ以上の抗薬物抗体（ＡＤＡ）が、
ａ）溶液を、前記ＡＤＡにより結合され得るＩｇＧ分子が付着した固相に接触させること、
ｂ）前記ＡＤＡを、ＩｇＧ分子に特異的に結合させ、過剰な溶液は除去してもよく、
ｃ）前記ＡＤＡに特異的に結合し得る標識ＩｇＧ４特異的抗体を加えること、
ｄ）過剰な試薬を除去すること、および
ｅ）結合した、または結合していない標識を検出して、溶液中の前記ＡＤＡの存在または濃度を直接的または間接的に測定すること
により、溶液中で解析され、
ステップａ）において、ＩｇＧ分子は、リンカーを介して固相から分離され、前記リンカーは、付着ＩｇＧ分子とＩｇＧ４特異的抗体との間のＦｃ−Ｆｃ相互作用を助長する付着ＩｇＧ分子の構造内における、固相により誘導される変化の程度を、付着ＩｇＧ分子を固相付近から遠ざけることにより減少させる、方法。
【請求項２】
前記ＡＤＡが、ＩｇＧ１薬物に対するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＧ分子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リンカーが、有機分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質由来分子、単糖、オリゴ糖または多糖である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リンカーが、ＩｇＧ分子を、天然ポリマーを含む固相から延びる分子に共有結合させることにより形成される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
天然ポリマーが、セルロースである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩｇＧ分子が、既知の特異性を有する抗体であり、リンカーが、その標的リガンドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＩｇＧ分子が、ビオチンで標識されており、リンカーが、ストレプトアビジンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＩｇＧ分子が、リガンド結合分子とＩｇＧ分子のＦｃ領域との少なくとも１つの融合タンパク質であり、リンカーが、その標的リガンドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
内因的に形成された抗体に結合し得る標識ＩｇＧ４特異的抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶液が、生物学的試料である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
治療用抗体に対する患者の抗体反応をモニターするための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１３】
薬物開発における請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的分析の分野に関し、より詳細には生物製剤の関連において有用である方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物薬剤学は、バイオテクノロジーを用いて製造される医薬品を対象とする研究である。治療での使用が最初に承認されたこのような物質は、組換えＤＮＡ技術により作製された生合成インスリンであった。製薬業界におけるインスリン後の主要な着目点は、他の組換えタンパク質やモノクローナル抗体のような、他の潜在的収益源を見出すことであった。モノクローナル抗体療法には、例えばがん治療において、患者の標的細胞に特異的に結合した後、免疫系を刺激してこれらの細胞を攻撃するモノクローナル抗体の使用が含まれる。細胞外または細胞表面の標的のほぼすべてに特異的なモノクローナル抗体を創製することが可能である。そのため、近年、数多くの深刻な疾病に関するモノクローナル抗体を創製しようとする膨大な数の研究や開発が着手されている。具体的な例としては、関節リウマチの治療において、モノクローナル抗体は、炎症反応の一部である腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）に対する反応を抑制する。別の例としては、多発性硬化症の治療において、モノクローナル抗体を白血球上のある種のインテグリンに対して産生し、これを用いて血液脳関門を通過する白血球の浸潤を予防している。
【０００３】
しかし、すべての患者が、生物学的製剤に対し、期待通りの反応を示すわけではない。生物学的製剤に対する内因的な抗体形成、いわゆる抗薬物抗体（ＡＤＡ）が大きな問題である。それは、このようなＡＤＡは、薬物の作用を中和し、有害反応さえ引き起こすことがあるからである。したがって、ＡＤＡのモニタリングは、医学上の観点、保健経済学的理由のいずれにとっても重要であると考えられてきた。その結果、ＡＤＡ形成の分析は、新規生物学的製剤の開発の重要部分となっており、規制機関から要求されるまでになっている。
【０００４】
ＡＤＡ分析については、様々なアッセイのフォーマットが記載されている。これらには、薬物中和抗体（ＮＡｂ）分析用の細胞アッセイや薬物結合抗体（ＢＡｂ）分析用のクロマトグラフィー法および表面プラズモン共鳴法が含まれる。しかし、使用されているもののほとんどは、簡便で効率的な方法において、ＡＤＡの高い処理能力によるスクリーニングおよび分析のための多様なイムノアッセイの変形である。
【０００５】
一般的に、ＡＤＡの分析に関して記載されているイムノアッセイは、ＡＤＡの多価性を利用して、溶液中の生物学的製剤および／または固相へ付着させた生物学的製剤の複合体を形成する架橋アッセイであり；サンドウィッチ型の抗体免疫吸着アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、これは生物学的製剤を固相に結合させ、そこにＡＤＡを結合させてから検出することに基づく、；および、選択したアイソタイプのすべての免疫グロブリンがそれらの抗原特異性に関係なく、アイソタイプ特異的抗体またはタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇのような捕捉試薬によって固相に結合され、そこで、後にＡＤＡがそれらの薬物結合能により検出される、間接ＥＬＩＳＡまたは液相ＲＩＡとしても既知である逆抗体アッセイである。
【０００６】
ＩｇＧ４抗体は、生物学的製剤の投与を受けている患者を個別に分析するために、特に重要であることが分かっている。アレルギー疾患の臨床試験において広く用いられるイムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４（ｗｗｗ．ｐｈａｄｉａ．ｃｏｍより入手可能）のようなＩｇＧ４抗体の臨床測定では市販の製品が利用できる。
【０００７】
リウマチ因子（ＲＦ）は、ヒトＩｇＧのＦｃ部に対する抗体として定義された自己抗体の名称である。ＲＦは、関節炎の任意の形態を持つことが疑われる患者において評価されることが多く、関節リウマチの一般的な疾病基準の一部である。ＲＦのアイソタイプは通常ＩｇＭであるが、ＩｇＧを含む、免疫グロブリンの任意のアイソタイプが記載されている。
【０００８】
ＷＯ２００９／０７７１２７（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ）は、識別アッセイであって、薬物抗体に対する抗体が、固相にコンジュゲートした薬物抗体である捕捉薬物抗体と、検出標識にコンジュゲートした薬物抗体であるトレーサー薬物抗体とを含むイムノアッセイを用いて、試料中で測定される識別アッセイに関する。この捕捉薬物抗体は、（ｉ）試料、（ｉｉ）モノマー型の薬物抗体を加えた試料、および（ｉｉｉ）オリゴマー型の薬物抗体を加えた試料に、別々に接触させられる。薬物抗体に対する抗体の測定は、（ｉ）においては陽性イムノアッセイ、ならびに（ｉｉ）および（ｉｉｉ）においては陰性イムノアッセイにより行われる。
【０００９】
任意のイムノアッセイの開発において、アッセイのバックグラウンドにより問題が生じることは周知である。抗体の分析に関する免疫吸着アッセイでは、全免疫グロブリンによる干渉が偽陽性の結果および低感受性を起こすことがあり、これは、通常、抗原特異的抗体が、試料中の全免疫グロブリンのわずかな分画としてのみ存在するためである。血清および血漿中のＩｇＧ濃度が高いことから、ＩｇＧ干渉は、ＩｇＧ抗体免疫吸着アッセイにおいて頻発する問題点である。別の干渉問題が抗体の結晶化可能フラグメント（Ｆｃフラグメント）間の相互作用により引き起こされ、よってＦｃ−Ｆｃ相互作用として知られている。例えば、アイソタイプＩｇＧ４のＡＤＡを標的とする免疫吸着アッセイでは、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用は、ＩｇＧ４と、固相に付着した抗体として使用した他のＩｇＧ分子、例えば治療用ＩｇＧ抗体との間で起こることがある。
【００１０】
抗体免疫吸着アッセイにおけるＦｃ−Ｆｃ相互作用を克服する一つの方法は、単純にＦｃフラグメントを有することを避けることであり、その代わりに、固相に付着した抗体としてＩｇＧ分子の酵素で切断したＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂフラグメント精製物を使用することである。別法として、抗体免疫吸着アッセイフォーマットの使用の代わりに、固相に付着したＩｇＧ４特異的試薬によって試料中のすべてのＩｇＧ４を結合し、その後、検出剤または試薬として標識したＩｇＧ全体またはそのフラグメントを加える、逆抗体アッセイの使用が可能である。
【００１１】
ＷＯ２０１２／０２７７４（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）は、治療用モノクローナル抗体に結合する抗体の測定のためのアッセイであって、表面に結合された治療用モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントが、治療用モノクローナル抗体に対する抗体を含む試料とインキュベートされるアッセイに関する。
【００１２】
Ｒｉｓｐｅｎｓら（Ｒｉｓｐｅｎｓ  Ｔ、Ｏｏｉｅｖａａｒ−Ｄｅ  ＨＰ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｅ、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  ＫＭ、Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ。Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ＩｇＧ４  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ＩｇＧ１  ｖｉａ  Ｆｃ−Ｆｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年、１８２巻、４２７５−８１頁）は、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の物理化学的側面を研究しており、生物学的および医学的観点から、起こり得る影響を考察している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７７１２７号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２７７４号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｒｉｓｐｅｎｓ  Ｔ、Ｏｏｉｅｖａａｒ−Ｄｅ  ＨＰ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｅ、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  ＫＭ、Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ、「Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ＩｇＧ４  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ＩｇＧ１  ｖｉａ  Ｆｃ−Ｆｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年、１８２巻、４２７５−８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、例えばＦｃ−Ｆｃ相互作用によって引き起こされる非特異的結合を減少し得る新規のアッセイフォーマットが、当分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、先行技術の方法の代案として有用である方法に関する。有利な実施形態において、本発明は、イムノアッセイにおける、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の結果として起こり得る非特異的結合に起因するノイズの低減に使用される。
【００１７】
本発明の第一の態様は、内因的に形成された１つ以上の抗体の溶液における分析のための方法であって、
ａ）溶液を、前記内因的に形成された抗体に結合し得る分子が付着した固相に接触させること、
ｂ）前記内因的に形成された抗体を、付着した分子に特異的に結合させ、任意選択的に、過剰な溶液を除去すること、
ｃ）内因的に形成された抗体と特異的に結合し得る標識したアイソタイプ特異的試薬を加えること、
ｄ）過剰な試薬を除去すること、およびｅ）結合した、または結合していない標識を検出して、溶液中の内因的に形成された抗体の存在または濃度を直接的または間接的に測定すること
を含み、
ステップａ）において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子はリンカーを介して固相に付着している、方法である。
【００１８】
本発明の第二の態様は、治療用抗体に対する患者の抗体反応をモニターするために、本発明による方法を使用することである。
【００１９】
本発明の第三の態様は、免疫吸着アッセイのような固相イムノアッセイにおいて、ＡＤＡまたはＲＦのような内因的に形成された抗体を検出するための部品のキットであって、固相および標識アイソタイプ特異的試薬に付着した少なくとも１つのＩｇＧ分子ならびにその使用指示書が含まれ、前記ＩｇＧ分子は、リンカーを介して固相に付着しており、試薬は前記内因的に形成された抗体に特異的であるキットである。
【００２０】
本発明の第四の態様は、リンカーを介して薬物ＩｇＧ分子が付着した固相を含む免疫センサー装置である。
【００２１】
他の実施形態、利点、および詳細は、添付の特許請求の範囲、また下記の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】既知のＡＤＡについての抗体結合免疫吸着アッセイの既知のフォーマットの原理を示した概略図である。
【図２】Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に起因した、ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイにおけるバックグラウンド増加の問題点を例示する概略図である。
【図３】ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイにおいて、固相付近からＩｇＧ分子を除去するために、本発明によりリンカーをどのように使用し得るかを示す概略図である。
【図４】ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイにおいて、固相付近からＩｇＧ分子を除去するために、本発明により抗体標的をどのように使用し得るかを示す概略図である。
【図５】下記の実験部において説明するように、従来技術により試験した、４つのＡＤＡ陰性試料、アッセイ希釈剤および１つのＡＤＡ陽性試料を示す図である。
【図６Ａ】他のアッセイを用いてインフリキシマブに対しＡＤＡ陽性と定義された７つの血清試料（左から数えて７本の棒）、ＡＤＡ陰性と定義された７つの試料（次の７本の棒）、およびイムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイを用いてインフリキシマブに対するＩｇＧ４抗体を分析したアッセイ希釈剤（最後の棒）を示す図である。
【図６Ｂ】他のアッセイを用いてインフリキシマブに対しＡＤＡ陽性と定義された７つの血清試料（左から数えて７本の棒）、ＡＤＡ陰性と定義された７つの試料（次の７本の棒）、およびイムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイを用いてインフリキシマブに対するＩｇＧ４抗体を分析したアッセイ希釈剤（最後の棒）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
「ＩｇＧ分子」という用語は、本明細書において、免疫グロブリンの、少なくとも１つのＦｃ領域、または非特異的結合を起こし得る少なくとも１つの定常部ドメインを含む任意の分子を意味する。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「結合し得る」という句は、その最も広義で、すなわち、結合に関与し得る、または結合され得るという意味で理解されたい。例えば、「抗体により結合され得る分子」という句は、本明細書において、抗体が前記分子に結合することを含む。
【００２５】
「生物製剤」という用語は、治療用抗体としても既知である抗体に基づくこともある「生物学的製剤」と同義に用いられ、ムロモマブ−ＣＤ３およびトシツモマブなどの全マウスモノクローナル抗体、インフリキシマブおよびセツキシマブなどのヒト／マウスキメラモノクローナル抗体、ナタリズマブおよびオマリズマブなどのヒト化モノクローナル抗体、およびアダリムマブおよびゴリムマブなどの完全ヒトモノクローナル抗体；モノクローナル抗体の標的結合領域；Ｆｃ領域などの抗体の部分から構成される融合タンパク質；およびサイトカイン受容体、例えばエタネルセプトなどの他の分子が含まれるが、それだけに限定されない。
【００２６】
「抗薬物抗体」またはＡＤＡという用語は、上述の「背景技術」の中で広い意味で説明したが、本明細書において、その広義で用いられる。このように、ＡＤＡは、１つ以上の免疫グロブリンＦｃのガンマ鎖のような、抗体の１つ以上の部分またはドメインを含む薬物に対して産生されたと考えられる。別法として、ＡＤＡに対する「ＩｇＧ薬物」抗体は、本明細書において使用される場合、１つ以上の抗体および／もしくは抗原の部分が存在する融合タンパク質であっても、またはこれを含んでいてもよい。本出願において、「に対して産生される」と「に対する」という用語は、抗体がどの分子または化合物に対するものであり、特異的であるかを説明するために、抗体との関連において同義に用いられる。
【００２７】
第一の態様において、本発明は、内因的に形成された１つ以上の抗体の溶液における分析方法であって、
ａ）溶液を、前記内因的に形成された抗体に結合し得る分子が付着した固相に接触させること、
ｂ）前記内因的に形成された抗体を、付着した分子に特異的に結合させ、任意選択的に、過剰な溶液を除去すること、
ｃ）内因的に形成された抗体と特異的に結合し得る標識したアイソタイプ特異的試薬を加えること、
ｄ）過剰な試薬を除去すること、および
ｅ）結合した、または結合していない標識を検出して、溶液中の内因的に形成された抗体の存在または濃度を直接的または間接的に決定すること
を含み、
ステップａ）において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子はリンカーを介して固相に付着している、方法である。
【００２８】
本方法の一実施形態において、内因的に形成された抗体は、ＩｇＧに対するものである。
【００２９】
一実施形態において、内因的に形成された抗体はＡＤＡである。この実施形態において、ＡＤＡは、生物学的製剤で治療を受けている患者で内因的形成によりまたはインビトロで得られた、組換えタンパク質、融合タンパク質、またはタンパク質フラグメントに対するものであってもよい。ＡＤＡはまた、生物学的製剤の治療を受けていない患者における既存の１つ以上の抗体であってもよい。
【００３０】
当業者であれば理解するように、ＡＤＡのクラスは、ＡＤＡを産生させる生物学的製剤または生物製剤の性質、および製剤形態および投与に依存する。具体的な実施形態において、ＡＤＡは、ＩｇＧ薬物、例えばＩｇＧ１のような生物製剤の一般的な群、に対するものである。
【００３１】
当業者であれば理解するように、ＡＤＡは、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭのようないずれのアイソタイプの抗体であってもよい。有利な実施形態において、ＡＤＡは免疫グロブリンＧである。同様に、ＡＤＡのサブクラスは、免疫グロブリンＧのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からなる群より選択してもよく、有利な実施形態において、サブクラス４である。
【００３２】
したがって、本方法の具体的な実施形態において、ＡＤＡは、ＩｇＧ４のようなＩｇＧ分子である。
【００３３】
別法として、生物製剤以外の物質に対する抗体を分析する。したがって、この実施形態において、内因的に形成された抗体は、関節リウマチに関連する、いわゆるＲＦである。
【００３４】
上記から明らかなように、本発明の一態様は、生物製剤の関連における、特許請求した方法の使用である。したがって、内因的に形成された抗体分子に結合し得る分子は、治療用抗体であってもよい。ＩｇＧは有益にはヒトであるがマウス等のような供給源であってもよい。一実施形態において、ＩｇＧ分子はモノクローナル抗体であり、別の実施形態において、ＩｇＧ分子はポリクローナル抗体である。
【００３５】
内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、ＩｇＧ分子であってもよい。一実施形態において、前記内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される。
【００３６】
一実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、完全なＩｇＧのような完全な抗体である。別の実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、ＩｇＧのような抗体の１つ以上のＦｃ領域のような抗体のフラグメントである。具体的な実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、ＩｇＧの１つ以上の定常部ドメインのような１つ以上の定常部ドメインである。
【００３７】
本発明者らは、前記内因的に形成された抗体に結合し得る分子をリンカーを介して固相へ付着させることが、イムノアッセイにおけるＦｃ−Ｆｃ相互作用によってしばしば起こる非特異的結合を低減し得ることを示した。
【００３８】
いかなる理論にも拘泥するものではないが、前記内因的に形成された抗体に結合し得る前記分子を固相付近から遠ざけると、上記で論じた望ましくないＦｃ−Ｆｃ相互作用を助長するような、固相が誘導する付着分子構造内の変化の程度が低減されると示唆することができる。
【００３９】
本方法において使用されるリンカーは、有機分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質由来分子、単糖、オリゴ糖または多糖のようなこの目的を達成する任意の存在であってもよい。リンカーは、ポリＬ−リジン、デンドリマー、エチレングリコロールのオリゴマー、エチレングリコロールのポリマーのような合成リンカーまたはヒト血清アルブミンのようなタンパク質であってもよい。別法として、リンカーは、本出願の中の他の箇所でさらに詳細に記載したように、本発明により提供される、干渉を有利に低減および／または消失さえし得るいかなる他の分子であってもよい。したがって、一実施形態において、リンカーは、有機分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質由来分子、単糖、オリゴ糖または多糖である。
【００４０】
一実施形態において、リンカーを固相の一部として提供して、ＩｇＧまたは他の分子を固相にコンジュゲートさせてもよい。したがって、固相から張り出した分子が本発明による有利な効果を提供するリンカーとして働く。
【００４１】
したがって、本方法の一実施形態において、リンカーは、内因的に形成された抗体に結合し得る分子を、セルロースのような天然ポリマーを含む固相から延びる分子に共有結合させることによって形成される。
【００４２】
当業者は、特定の所望の利点を提供するリンカーを具体的に構築すること、または選択することによって、本発明による方法において有用なアッセイを設計することができる。したがって、一実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、既知の特異性を有する少なくとも１つの抗体であり、リンカーはこの標的リガンドである。
【００４３】
本方法で使用されるリンカーは、周知のストレプトアビジン／ビオチン結合系を用いて提供することができ、より具体的には、周知の手順に従い、ビオチンをＩｇＧ分子に付着させること、および、ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるような吸着、またはイムノＣＡＰ（商標）試験で一般的に用いられるような共有結合により固相に付着させることにより提供することができる。したがって、ここではストレプトアビジン分子がビオチン標識ＩｇＧ分子に結合して、ＩｇＧ分子を固相付近から遠ざけるリンカーとして働き、このことが干渉の低減、特に望ましくないＦｃ−Ｆｃ相互作用のレベルの低減に関して予想外の利点を提供することが、本発明により明らかにされた。したがって、本方法の具体的な実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子はビオチンで標識されており、リンカーはストレプトアビジンである。
【００４４】
様々なタンパク質からの２つ以上の要素、またはタンパク質の様々な部分を含む融合タンパク質を作製する技術は、当分野において周知であり、一般的に用いられている。本発明によれば、融合タンパク質は、本方法において有用な要素を含んで構築してもよい。このように、一実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る分子は、リガンド結合分子とＩｇＧ分子のＦｃ領域との少なくとも１つの融合タンパク質であり、リンカーはこの標的リガンドである。
【００４５】
本方法の一実施形態において、内因的に形成された抗体に結合し得る標識アイソタイプ特異的試薬は、ＩｇＧのようなモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００４６】
本発明により分析された内因性抗体は、治療用抗体のような生物学的製剤を使って治療を受けている個人で産生されたものであってもよい。したがって、一実施形態において、溶液は、血液のような生物学的試料である。
【００４７】
本発明は、例えばＩｇＧ分子に対する抗体、例えばＩｇＧ４などの分析において有用である、新規の原理または方法を記載する。本発明による抗体免疫吸着アッセイは、これによって、新規生物学的製剤の開発における使用のみならず、患者管理に関する臨床判断のためにも使用することができる。
【００４８】
よって、一実施形態において、本発明は、治療用抗体に対する患者の抗体反応をモニターするために、本発明による方法を使用することに関する。
【００４９】
別法として、上記で指摘したように、内因的に形成された抗体はＲＦであってもよい。したがって、本発明による方法は、診断および／または疾患予後において、何らかの関節炎の形態を有することが疑われる患者を評価するために使用することができる。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、薬物開発における上述したイムノアッセイの使用に関する。
【００５１】
本発明のこの態様のさらに別の実施形態において、本発明によるイムノアッセイは、患者試料中のＲＦの存在を分析するために使用される。
【００５２】
本発明によるキットは、以下のフォーマット、すなわち、サンドウィッチ型のアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）または電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）；マルチプレックスアッセイ、例えばマルチアレイベースのアッセイまたは粒子ベースのアッセイ；例えばポイントオブケア用途のラテラルフローアッセイ；プロキシミティアッセイ；凝集法；比濁法；またはネフェロメトリックアッセイのうちのいずれかにおいて使用するために作製することができる。
【００５３】
ＥＣＬフォーマットは、洗浄ステップを省略してもよいため、好適であると考えられる。キットは、複数の分析対象の同時検出／測定が可能な系におけるＡＤＡまたはＲＦ分析用に設計してもよい。
【００５４】
キットの一実施形態は、上述した方法を使用する、ＡＤＡまたはＲＦ分析用の、ニトロセルロース膜のような微細孔膜の毛管作用に基づくポイントオブケア（ＰＯＣ）検査である。
【００５５】
キットの別の実施形態は、薬物をある種類の供与体ビーズを意味するビーズのような固相に付着させ、検出試薬を別の種類の受容体ビーズを意味するビーズのような固相に付着させる、プロキシミティイムノアッセイ用である。したがって、このようなキットは、供与体ビーズ、受容体ビーズ、およびビーズが分析対象により錯体化した時にシグナルを発生する手段を含む。このフォーマットの利点は、洗浄ステップを省略できることである。
【００５６】
本発明によるキットは、ＡＤＡまたはＲＦ検出のための取扱説明書、好適な数の適切な大きさの容器、溶媒、試薬等を含んでいてもよい。
【００５７】
第三の態様において、本発明は、部品のキットに関する。
【００５８】
本態様の一実施形態において、本発明によるキットは、親和性のある一対の片方が上述したようにリンカーを介して付着した固相、ＩｇＧ分子のような選択分子への付着に対する標識であって、前記親和性のある一対のもう片方である標識、およびＩｇＧ４特異的試薬溶液を含む。当業者であれば、本明細書および特許請求の範囲の技術に基づき、具体的な適用のために適切な抗体を使用してどのようにキットの他のフォーマットを設計するかを理解し、これによって特定の抗体の存在および／または量を測定することができる。
【００５９】
第四の態様において、本発明は、ＩｇＧ分子がリンカーを介して付着した固相を含む免疫センサー装置に関する。本発明による装置は、本発明による分析方法を有効にするために設計される。したがって、一実施形態において、免疫センサー装置は、上記で論じたように、ＩｇＧ分子のような内因的に形成された抗体に結合し得る薬物分子が、リンカーを介して付着した固相を含む。
【００６０】
図面の詳細な説明
図１は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）についての、固相ＥＬＩＳＡとしても既知の抗体結合免疫吸着アッセイの原理を示す概略図である。
【００６１】
図２は、固相至近における、ＩｇＧ１アイソタイプの治療用抗体であってもよいＩｇＧ分子とＡＤＡ陰性試料中のＩｇＧ４との間のＦｃ−Ｆｃ相互作用に起因した、ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイにおけるバックグラウンド増加の問題点を例示する概略図である。
【００６２】
図３は、ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイの固相付近から、ＩｇＧ１アイソタイプの治療用抗体であってもよいＩｇＧ分子を除去するために、本発明によりリンカーをどのように使用し得るかを示す概略図である。
【００６３】
図４は、ＩｇＧ４抗体免疫吸着アッセイにおける固相付近から、ＩｇＧ１アイソタイプの治療用抗体であってもよいＩｇＧ分子を除去するために、有利には抗原である抗体標的をどのように使用し得るかを示す概略図である。
【００６４】
図５は、様々なインフリキシマブのイムノＣＡＰ（商標）テストの変形形態を用いて、下記の実験部の中で記載したようにイムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイで試験した、４つのＡＤＡ陰性試料、アッセイ希釈剤および１つのＡＤＡ陽性試料を示す図である。
・ＩＦＸ：イムノＣＡＰ（商標）固相に直接結合したインフリキシマブ、
・ＳＡ＋ｂｉｏ−ＩＦＸ：本発明による、ストレプトアビジン固定イムノＣＡＰ（商標）に結合させたビオチン化インフリキシマブ、および
・ＴＮＦ−α＋ＩＦＸ：本発明による、ＴＮＦ−アルファ結合イムノＣＡＰ（商標）に結合させたインフリキシマブ。
後者２つの変形形態は、ＩｇＧ４抗体分析のためにＩｇＧ分子をリンカーを介して固相に付着させる、本発明による実施例である。
【００６５】
図６は、他のアッセイによってインフリキシマブに対しＡＤＡ陽性と定義された７つの血清試料（初めの７本の棒）、ＡＤＡ陰性と定義された７つの試料（次の７本の棒）、および下記の実施例２の中で記載したように分析したアッセイ希釈剤（最後の棒、灰色）を示す図である
【実施例】
【００６６】
実験の部
本実施例は、例示のためにのみ提供され、いかなる方法においても本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願において以下または他の箇所で提示した参照はすべて、これによって参照により本明細書に含まれる。
【００６７】
［実施例１］：Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に起因するアッセイの干渉
Ｆｃ−Ｆｃ相互作用を供するアッセイの干渉の一例として、実験用イムノＣＡＰ（商標）テストに結合させて市販のイムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイ（ｗｗｗ．ｐｈａｄｉａ．ｃｏｍより入手可能）において使用する、インフリキシマブ（レミケードとしても既知の、自己免疫疾患の治療に用いられる腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）に対するキメラモノクローナル抗体、例えばＪＡＮＳＳＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＩＮＣより入手可能）またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（「Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（関節リウマチにおけるヒトモノクローナル抗体）」、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓより入手可能）のヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する治療用抗体を使用して示すことができる。このアッセイは、検出試薬として、酵素をコンジュゲートしたヒトＩｇＧ１に対するマウスモノクローナル抗体を有する。この検出用抗体は、ヒトＩｇＧ１に対する明確な交差反応性は示さない（データ非表示）。治療用抗体は、この治療用抗体の反応性アミノ基、およびイムノＣＡＰ（商標）テストのカプセル内に配置されたセルローススポンジ基質のＣＮＢｒで活性化された基を使用して、固相に共有結合される。これは、イムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイにおいて、インフリキシマブまたはアダリムマブに対する既知のＡＤＡを持たない陰性対照対象からの試料を試験する際に、イムノＣＡＰ（商標）テストで高レベルのバックグラウンドを引き起こす。（下記の表１。ここでＲＵは反応単位、ｎ／ａは該当なしを意味する。）。
【００６８】
【表１】
0006571660.tif 000002
【００６９】
［実施例２］：リンカーを有するまたは有さない固相へのインフリキシマブの結合
リンカーの長さおよび性質は、各固相およびＩｇＧ分子に対して最適化されなければならない。リンカーは、アッセイのバックグラウンドを低減するために最適化されて、陽性試料について高いＳ／Ｎ比が維持されるべきである。
【００７０】
本実施例は、抗体免疫吸着アッセイの固相へＩｇＧ分子を付着するためにリンカーを使用することの効果を示しており、結果は図５および６に示す。
【００７１】
図５は、本発明による、ストレプトアビジン／ビオチン結合系に基づくリンカーを介して、また腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）であるそのリガンドに基づくリンカーを介して、イムノＣＡＰ（商標）（ｗｗｗ．ｐｈａｄｉａ．ｃｏｍより入手可能）の固相に付着した、ＩｇＧ１アイソタイプの治療用抗体であるインフリキシマブ（ＩＦＸ）（レミケードとしても既知、例えばＪＡＮＳＳＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＩＮＣより入手可能）を使用した実験の結果を示す。イムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイにおける陰性試料のテストの際に、固相への直接的なインフリキシマブの結合では高いバックグラウンドが生じる一方、リンカーを介したインフリキシマブの結合ではバックグラウンドは低く、薬物の免疫応答性は維持される。ＴＮＦ−αと結合したインフリキシマブを使用したイムノＣＡＰ（商標）テストについては、わずかなＳ／Ｎ比の低下が認められる。
【００７２】
図６は、本発明によるリンカーとしてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を介してイムノＣＡＰ（商標）の固相に付着したインフリキシマブ（ＩＦＸ）を使用した実験の結果を示す。イムノＣＡＰ（商標）特異的ＩｇＧ４アッセイにおける陰性試料のテストにおいて、固相への直接的なインフリキシマブの結合では高いバックグラウンドが生じる一方（図６Ａ）、本発明によるリンカーとしてのＨＳＡを介したインフリキシマブの結合ではバックグラウンドは低く、また薬物の免疫応答性は維持される（図６Ｂ）。
【００７３】
［実施例３］：リンカーのサイズの多様性
様々なサイズのリンカーを用意し、本発明によるインフリキシマブアッセイで試験した。結果は下記の表２に示す。
【００７４】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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