(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IB1、IB2及びIA：
【化１】
0006533222.tif 000131
(式IA、IB1及びIB2中、
基：
【化２】
0006533222.tif 000132
は以下のラジカル：
【化３】
0006533222.tif 000133
(式中、Xは、Br又はIである)
から選択され、
基：
【化４】
0006533222.tif 000134
は以下のラジカル：
【化５】
0006533222.tif 000135
(式中、３つの原子(T，Y，Z)は、それぞれ他の２つの原子とは独立して、炭素又は窒素原子を表す)
から選択され、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、１、２又は３に等しく、
rは、０、１又は２に等しく、
r+sは、３に等しいと理解され、
n1は、１に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
Wは、
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル
(ここで、前記リンカーボディLは、以下の一般式III：
【化６】
0006533222.tif 000136
(式中、Kは、n5のアミノ酸(同一であっても異なっていてもよく、天然であっても非天然であってもよく、n5は１〜６の整数を表す)の配列を表す以下のラジカル：
【化７】
0006533222.tif 000137
を表し、
Zは、以下のラジカル：
【化８】
0006533222.tif 000138
からなる群より選択される脱離基又は塩素原子を表す)に対応する)、又は
-  -L-Mラジカル(ここで、Lは、上記の意味を有し、Mは、メトトレキサート、イロメジン、IMID、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、モノメチルオーリスタチンE (MMAE)、モノメチルオーリスタチンF (MMAF)、メイタンシン、DM1、DM4、SN38、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロピリドジアゼピン、ピロロピリドジアゼピン二量体、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター及びリシンから選択される化学療法剤又は毒素である細胞毒性薬である)：
を表し、
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含む、抗体若しくは抗体フラグメント、抗体若しくは抗体フラグメントを含む融合タンパク質であり、
tは、1〜15の整数を表す)
から選択される式Iに対応することを特徴とする生成物並びにそのカルボン酸基誘導体であって塩、エステル又はアミド、コハク酸イミドで形成されたアミドからなる群より選択される誘導体。
【請求項２】
前記抗体が、単一特異的又は二重特異的なキメラ、ヒト化又はヒトのモノクローナル抗体であり、前記抗体フラグメントが、Fab、F(ab)'2、Fc、F'c、pFc'、ScFv、Fv、Fd、Fabc、ダイアボディ、ミニボディ、ScFv-Fc又はScFv-Fvにより構成される群から選択され、前記抗体又は抗体フラグメントが、CD1a、CD3、CD4、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD37、CD39、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD66e、CD70、CD72、CD73、CD74、CD79、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD138、CD194、CD205、CD227又はCD248から選択される分化抗原群(CD)の抗原の１つ；又は、CA125、G250、GD2、HLA-DRβ、MUC1、VEGF、VEGFA、VEGF-R1/2、TRAIL-R2 (DR5)、EpCAM、GPIIb、GPIIIa、TNFα、TNFR、TNT、Lewis Y、EGFR、HER-2、HER-3、HER-3 MM-111、HER-4、AXL、プロテインF、IgE-Fc、VEGF-A、インテグリン4、インテグリンα4β7、インテグリンαV、C5、IL-6R、IL-6Rα、IL12、IL15、IL18、IL23、IL-1β、IL-1、TPO-R、GPNMB、PSMA、PSA、PAP、PSM、インテグリンαv、Cripto、TACSTD2 (TROP2又はEGP1)、CEA、葉酸受容体1、ムチン16、エンドセリン受容体ETB、STEAP1、SLC44A4（AGS-5）、ネクチン4、AGS-16、グアニル酸シクラーゼC、ムチン1、EGFRvIII、メソテリン、IL2R、A33、Can、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TGFβ、TGFβR、FGF、FGF8b、FGFR、PDGF、PDGFR、PDGFRα、PDGFRβ、Ang-1、Ang-2、インテグリン、α2β1、αvβ3、αvβ5、α3β1、α6β4、α2β1、抗インテグリンα4、RANK-L、BLyS、c-MET、DR、DR10、TCRαβ、ICOS、CTLA-4、CAIX (MN)、EphA2、CA6、卵巣がんのCA6、子宮頸がんのCA6、乳がんのCA6、アンジオポエチン2、Cripto、ENPP3、メソテリン、FOLR１、ネクチン-4、TIM-1、Muc-16、組織因子、LIV-1、GM2、α5インテグリン、TLR-7、PD-1、AFP、CA125 (MUC16)、シアリルルイスY、CAMPATH-1、HLA-DR、抗イディオタイプ、がん胎児性抗原(CEA)、TAG-72、葉酸結合タンパク質、A33、G250、ガングリオシド(GD2、GD3、GM2を含む)、LeY、コラーゲン4 (コラーゲンIV)、コラーゲン18 (コラーゲンXVIII)、SC6、CA-125、CA19-9、p185HER2、de2-7 EGFR、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、炭酸脱水酵素、ガレクチン9、アルドラーゼA、eIFγ4、チロシナーゼ、ガレクチン4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、レスチン、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、HGFR、PTK 7、CCK-4、PDGFR、PTP-LAR、CDCP1、CADM1、IGSF4、Lu、 BCAM、CEACAM6、JAM-A、PTGFRN (CD9P-1)、MCAM、MUC18、MCP、EMMPRIN、TfR、TRAILR2、C1qR、hTERT、サバイビン、MDM2、CYP1B1、Melan-A、MART-1、MART-2、メラノソームタンパク質、gp100、neo-PAP、CDC27、MAGE、WT1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、BRAF、TPI、フィブロネクチン、K-ras、β-カテニン、CDK4、カスパーゼ-8、p14ARF、p16INK4a、TGFβRII、bcr-abl、SYT-SSX、TRP-1、TRP-2、GnT-V、チロシナーゼ、FGF5、TEL-AML1、プロテイナーゼ3、HER2/neu、AFP、MUC-1、EBV-EBNA、HTLV-1 tax、HPV16-E7、変異HLA-A2、HA1、SART3、GnT-V、CEACAM5、AGS-16、GPNMB、ESAT-6、RANK、CanAg、フィブリン、TF、PRAME、CA19-9、CA50、CA125、CA195、CAM17.1/WGA、AFP、β-MG、DU-PAN2、HE4、b-2ミクログロブリン、トランスフェリン、トランスチレチン、ApoA1、TROP-2、CTLA-4、GITR、PD-1、PD-L1、c-KIT、CD11b-CD18インテグリンヘテロ二量体、DNA/ヒストンH1、葉酸塩、EpCAM、テネイシン-c、ECM(プロテオグリカン又はフィブロネクチン)、フィブリノーゲン、SV40ラージT抗原、SC6-Ag、SC-Ag、DR4 (細胞死受容体4)、DR5、ESA、ムチン、hPAM4、hRS7、HLA-DR、又はCCR4、一般式MTX1の抗原、MTX2、PECAM、トロンボモジュリン、Tn、カテプシンD、TYRO-3、MER、PF4/ヘパリン複合体により形成される群から選択される抗原の１つを指向する請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
以下の基：
【化９】
0006533222.tif 000139
が、以下のラジカル：
【化１０】
0006533222.tif 000140
(式中、Xは、Br又はＩであり、T、Y及びZは、それぞれC、C及びC、又はN、C及びCを表す)
であり、
以下の基：
【化１１】
0006533222.tif 000141
が、以下のラジカル：
【化１２】
0006533222.tif 000142
(式中、T、Y及びZは、それぞれC、C及びC、又はN、C及びCを表す)
であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生成物。
【請求項４】
前記のラジカル：
【化１３】
0006533222.tif 000143
において、
n5は、１、２、３、４、５又は６に等しく、
AAは、バリン及びシトルリン；フェニルアラニン及びリジン；バリン及びアスパラギン酸；リジン及びメチオニン；リジン及びアスパラギン；プロリン及びイソロイシン；プロリン及びリジン；リジン及びメチオニン；リジン及びアスパラギン；バリン及びリジン；アラニン及びリジン；フェニルアラニン及びリジン；２つのフェニルアラニン及びリジン；アラニン、フェニルアラニン及びリジン；２つのアルギニン；リジン及びアルギニン；グルタミン酸、グリシン及びアルギニン；又は２つのグリシン及びアルギニンを表す請求項１〜３のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項５】
Wが-Lを表す一般式IAに相当する一般式IA1：
【化１４】
0006533222.tif 000144
又は一般式IB1：
【化１５】
0006533222.tif 000145
(これらの式中、X、A、X1、X2、X3、n1、n2、n3、r、s、t、L及びPは、請求項１に記載の意味を有する)
に対応する請求項１〜４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項６】
Wが-LMを表す一般式IAに相当する一般式IA2：
【化１６】
0006533222.tif 000146
又は一般式IB2：
【化１７】
0006533222.tif 000147
(これらの式中、X、A、X1、X2、X3、n1、n2、n3、r、s、t、L、P及びMは、請求項１に記載の意味を有する)
に対応する請求項１〜４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項７】
式(IB2)：
【化１８】
0006533222.tif 000148
(式中、X、A、X1、X2、X3、n1、n2、n3、r、s、t、L、P及びMは、請求項１に記載の意味を有する)
に対応する生成物。
【請求項８】
式IA3：
【化１９】
0006533222.tif 000149
(式中、X、A、X1、X2、X3、r、s、n1、n2及びn3は、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体であって、塩、エステル又はアミド、コハク酸イミドで形成されたアミドからなる群より選択される誘導体と、以下の式：
【化２０】
0006533222.tif 000150
(式中、Lは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA1：
【化２１】
0006533222.tif 000151
の生成物を得、
これと、以下の式：
【化２２】
0006533222.tif 000152
(式中、Mは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA2：
【化２３】
0006533222.tif 000153
の生成物を得、
これと、式P(定義は、請求項１に記載したとおりである)の生成物とを反応させ、式(IB)：
【化２４】
0006533222.tif 000154
(式中、Wは、請求項１で定義したとおりである)
の生成物を得ることを特徴とする請求項１〜４、６及び７のいずれか１つに記載の式IB2の生成物を製造する方法。
【請求項９】
式IA3：
【化２５】
0006533222.tif 000155
(式中、X、A、X1、X2、X3、r、s、n1、n2及びn3は、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体であって、塩、エステル又はアミド、コハク酸イミドで形成されたアミドからなる群より選択される誘導体と、以下の式：
【化２６】
0006533222.tif 000156
(式中、Lは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA1：
【化２７】
0006533222.tif 000157
の生成物を得、
これと、式P(定義は、請求項１に記載したとおりである)の生成物とを反応させ、式(IB)：
【化２８】
0006533222.tif 000158
(式中、Wは、請求項１で定義したとおりである)
の生成物を得ることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の式IB1の生成物を製造する方法。
【請求項１０】
式IA3：
【化２９】
0006533222.tif 000159
(式中、X、A、X1、X2、X3、r、s、n1、n2及びn3は、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体であって、塩、エステル又はアミド、コハク酸イミドで形成されたアミドからなる群より選択される誘導体と、以下の式：
【化３０】
0006533222.tif 000160
(式中、Lは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA1：
【化３１】
0006533222.tif 000161
の生成物を得ることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の式IAに対応する式IA1の生成物を製造する方法。
【請求項１１】
式IA3：
【化３２】
0006533222.tif 000162
(式中、X、A、X1、X2、X3、r、s、n1、n2及びn3は、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体であって、塩、エステル又はアミド、コハク酸イミドで形成されたアミドからなる群より選択される誘導体と、以下の式：
【化３３】
0006533222.tif 000163
(式中、Lは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA1：
【化３４】
0006533222.tif 000164
の生成物を得、
これと、以下の式：
【化３５】
0006533222.tif 000165
(式中、Mは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物とを反応させ、式IA2：
【化３６】
0006533222.tif 000166
の生成物を得ることを特徴とする、請求項１〜４及び６のいずれか１つに記載の式IA2の生成物に対応する式IAの生成物を製造する方法。
【請求項１２】
式IA：
【化３７】
0006533222.tif 000167
(式中、Xは、Br又はIであり、
以下の基：
【化３８】
0006533222.tif 000168
は、以下のラジカル：
【化３９】
0006533222.tif 000169
から選択され、
X1、X2、X3、r、s、n1、n2、n3、W、T、Y、Zは、請求項１に記載の意味を有する)
の生成物と、式P(定義は、請求項１に記載のとおりである)の生成物とを反応させ、式(IB)：
【化４０】
0006533222.tif 000170
(式中、tは、請求項１に記載の定義を有する)
の生成物を得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の式IB1又はIB2の生成物を製造する方法。
【請求項１３】
前記式IA、IA1又はIA2の生成物が、リン酸緩衝液中TCEPの存在下で行われる求核置換反応によって、タンパク質Pにそのジスルフィドブリッジの少なくとも１つで付加される請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
直腸結腸がん、肝細胞がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、大腸がん、K-RAS変異結腸直腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、転移性乳がん、肝がん、頭部及び頸部のがん、キャッスルマン病、甲状腺がん、髄芽腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、肉腫、退形成星細胞腫、腎臓がん、胃がん、悪性腹水、前立腺がん(転移性であるか否かを問わない)、充実性腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、黒色腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫からなる群より選択される腫瘍の治療に用いるための、請求項１に記載の式IB2の生成物。
【請求項１５】
移植片拒絶、リウマチ性関節炎、クローン病、乾癬、多発性硬化症、クリオピリン関連周期性症候群、及び血小板減少性紫斑病からなる群より選択される炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に用いるための、請求項１に記載の式IB2の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の抗体-薬剤コンジュゲート及び治療、特に抗がん治療又は抗炎症治療におけるその使用に関する。また、本発明は、リンカーヘッド及びリンカーボディからなるリンカーとして有用な合成生成物に関する。また、本発明は、リンカーの製造方法及び抗体-薬剤コンジュゲートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体-薬剤コンジュゲートは、特に標的化作用を有する抗がん剤として用いられる新たな形態の薬剤である。治療用抗体は、その特異性に応じて、１以上のタイプの細胞に結合し、従来はその細胞内において、細胞毒性剤を遊離する。
【０００３】
抗体-薬剤コンジュゲートは、細胞毒性剤の選択的送達のための手段を構成する。したがって、この技術によれば、抗体による標的化の特異性と、それがコンジュゲートしている剤による強力で新たなエフェクター機能とを組み合わせることが可能になる。
【０００４】
これまでに、20を超える抗体-薬剤コンジュゲートが開発されている(Senter, P. D.ら、Annu. Rev. Med. 2013, 64, 15-29)。
抗体-薬剤コンジュゲートの一般的な構造を図1に記載する。
【０００５】
抗体と薬剤とを連結する生成物は、連結剤又はリンカーと呼ばれる。それは、４つの鎖間ジスルフィドブリッジを形成する８つのシステインの少なくとも１つ又は８つのリジンの少なくとも１つを介して、抗体にグラフティングすることができる。
抗体にグラフティングされた薬剤の分子数が、薬物抗体比(DAR)と呼ばれる比を決定する。
【０００６】
標的抗原への結合後、抗体は、受容体媒介性のエンドサイトーシスにより細胞内に内在化される。小胞はリソソームと融合し、そこで、細胞毒性分子が様々な機序により抗体から遊離される。次いで、活性な細胞毒性剤が細胞に直接作用してその死を誘導し、ときに、輸送により、又は環境中への拡散により、隣接するがん細胞にも作用する。
【０００７】
したがって、抗体は、主にベクターとして用いられ、細胞毒性剤を細胞内に送達する。
「細胞毒性剤」とは、細胞の機能を阻害するか又は妨げることができる分子を意味する。
抗体に結合した細胞毒性剤は、遊離後に、腫瘍細胞内で活性になるプロドラッグである(Jaraczら、2005)。遊離分子の活性は、低濃度であっても、がん細胞を殺傷するのに十分でなければならない。
【０００８】
それらはますます成功しているが、抗体-薬剤コンジュゲートは、対応する元の抗体と比べて、より複雑であり、不均一な構造を有するので、注意すべき欠点がある。リンカーを介しての細胞毒性剤の付加は、抗体の薬物動態及び薬力学(PK-PD)に対して、したがって治療の指標に対して著しい影響を有する。
【０００９】
抗体-薬剤コンジュゲートは、好ましくは、最適な活性のために４の平均DARを有するが、この比は１〜13で変動し得る。このことから、DARについては異なる実体の集団が存在し得ることが知得される。
【００１０】
多くの研究者がこの不均一性について研究している。天然又は非天然のアミノ酸を導入することによって抗体の配列を改変することを目的とした試験がなされてきた(Mallet, W.ら、Nat. Biotechnol. 2008, 26, 925-932及びSchultz, P. G.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 2012, 109, 16101-16106)。しかしながら、この方法は、興味ある抗体それぞれについて設定変更しなければならず、元の抗体について常に研究を要するという不都合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
結果として、先行技術から生ずる技術的課題は、興味ある抗体の配列を改変することなく、細胞毒性剤のグラフティングの制御を可能にする技術的手段‐如何なる抗体にも適用できる技術的手段を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの態様は、リンカーヘッドとして有用な合成生成物である。
本発明の別の態様は、リンカーボディを表す要素Lに結合したリンカーヘッドとして定義される生成物である。
【００１３】
本発明の別の態様は、細胞毒性薬として定義される要素Mに結合したリンカーである。
本発明の別の態様は、細胞毒性薬に結合し、特に抗体又は抗体フラグメントであり得るタンパク質に結合したリンカーである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗体-薬剤コンジュゲートの一般的な構造を表す。
【図２】トラスツズマブのMALDI-TOF質量分析(74095におけるピーク及び破線の矢印により示されるピーク)及び6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカー(スペーサー)で再構築されたグラフト化トラスツズマブのMALDI-TOF質量分析(74846におけるピーク及び実線の矢印により示されるピーク)を表す。
【図３】TCEPにより還元され、次いで6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカーを付加した後、精製及び再構築されたトラスツズマブ抗体24のHIC-HPLCクロマトグラムを表す。
【図４】図4A〜4Cは、種々の異なる抗体フラクションの命名を表す。図4Aは、パパイン(Fc及びF'c)又はペプシン(Fc' = pepF'c)で消化後に得られたIg1フラグメントを表す。図4Bは、Fabc、Fd、Fv及びscFvフラグメントを表す。図4Cは、キメラ抗体及びヒト化抗体の構造を表す。
【図５】実施例5.2において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー7)4抗体24のRP-HPLCクロマトグラムを表す。
【図６】実施例5.3において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー8)425のRP-HPLC分析を表す。
【図７】実施例5.4において得られたトラスツズマブ-(maldiSPh-リンカー26)427のRP-HPLC分析を表す。
【図８】実施例5.5において得られたトラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー20)428のRP-HPLC分析を表す。
【図９】実施例5.6において得られたトラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー22)429のRP-HPLC分析を表す。
【図１０】実施例5.7において得られたトラスツズマブ-(PhdiMediBr-リンカー15)430のRP-HPLC分析を表す。
【図１１】実施例5.8において得られたリツキシマブ-(maldiBr-リンカー7)431のRP-HPLC分析を表す。
【図１２】実施例5.9において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー9-MMAE)432のRP-HPLC分析を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、式IB：
【化１】
0006533222.tif 000002
及び式IA：
【化２】
0006533222.tif 000003
（式中、
Xは、ハロゲン又は脱離基であるか、又は以下の基：
【化３】
0006533222.tif 000004
【化４】
0006533222.tif 000005
（上記において、Xaは、ハロゲン又は脱離基である）
であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化５】
0006533222.tif 000006
【化６】
0006533222.tif 000007
【化７】
0006533222.tif 000008
を表し、
X1は、C=Oであるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、
r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0、1、2又は3に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  -OHラジカル、
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC）、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましく
はAlexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッ
ド、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコ
ンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものと
のコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分析において
用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  -L-Mラジカル(ここで、Lは上記の意味を有し、Mは化学療法剤又は毒素から選択さ
れる細胞毒性薬を表す)：
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
から選択される式Iに対応することを特徴とする生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドに主に基づく。
【００１６】
本発明の意味において、「脱離基」とは、分子から解離可能なイオン又は置換基を意味する。
Aが表し得る炭素環又は複素環のアリールラジカルは、好ましくは、フェニル、ナフチル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、インドリル、ピリミジニル、チアジアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チエニル、キノリニル、ピラジニル、ピロリル、イソチアゾリルラジカルから選択され、１以上のC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、ハロゲン、アミノ又はオキソの基で任意に置換されており、好ましいラジカルは、ジオキソ-ピロリルである。
【００１７】
Aが表し得る炭素環又は複素環のシクロアルキルラジカルは、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル若しくはシクロヘキシルラジカル又は単環式若しくは縮合していてもよい複素環式のシクロアルキル、例えばピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル又はチアジニルから選択される。
【００１８】
ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択され、好ましくはヨウ素である。
塩は、アルカリ塩(特にナトリウム塩又はカリウム塩)、リチウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及びバリウム塩、アンモニウム塩、アミン塩、アミノアルコール(トリエタノールアミン又はモノエタノールアミン等)塩からなる群より選択される。
【００１９】
カルボン酸エステルは、好ましくは、1〜6個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキル、好ましくはtert-ブチルと形成される。
【００２０】
本発明の特定の実施形態においては、式(I)に対応する生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドは、ハロゲンを表す要素X及びアリールラジカルで表される要素A、又はハロゲンで表される要素X及びシクロアルキルで表される要素A、又はハロゲンで表される要素X及び以下の基：
【化８】
0006533222.tif 000009
で表される要素A、又はハロゲンで表される要素X及び以下の基：
【化９】
0006533222.tif 000010
で表される要素A、又はハロゲンで表される要素X及び以下の基：
【化１０】
0006533222.tif 000011
で表される要素A、又は脱離基で表される要素X及びアリールラジカルで表される要素A、又は脱離基で表される要素X及びシクロアルキルで表される要素A、又は脱離基で表される要素X及び以下の基：
【化１１】
0006533222.tif 000012
で表される要素A、又は脱離基で表される要素X及び以下の基：
【化１２】
0006533222.tif 000013
で表される要素A、又は脱離基で表される要素X及び以下の基：
【化１３】
0006533222.tif 000014
で表される要素A、又は以下の基：
【化１４】
0006533222.tif 000015
で表される要素X及びアリールラジカルで表される要素A、又は以下の基：
【化１５】
0006533222.tif 000016
で表される要素X及びシクロアルキルで表される要素A、又は以下の基：
【化１６】
0006533222.tif 000017
で表される要素X及び以下の基：
【化１７】
0006533222.tif 000018
で表される要素A、又は以下の基：
【化１８】
0006533222.tif 000019
で表される要素X及び以下の基：
【化１９】
0006533222.tif 000020
で表される要素A、又は以下の基：
【化２０】
0006533222.tif 000021
で表される要素X及び以下の基：
【化２１】
0006533222.tif 000022
で表される要素A、又は以下の基：
【化２２】
0006533222.tif 000023
で表される要素X及びアリールラジカルで表される要素A、又は以下の基：
【化２３】
0006533222.tif 000024
で表される要素X及びシクロアルキルで表される要素A、又は以下の基：
【化２４】
0006533222.tif 000025
で表される要素X及び以下の基：
【化２５】
0006533222.tif 000026
で表される要素A、又は以下の基：
【化２６】
0006533222.tif 000027
で表される要素X及び以下の基：
【化２７】
0006533222.tif 000028
で表される要素A、又は以下の基：
【化２８】
0006533222.tif 000029
で表される要素X及び以下の基：
【化２９】
0006533222.tif 000030
で表される要素Aから構成され、
ここで、X1は、C=Oであるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、
r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0、1、2又は3に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  -OHラジカル、
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくは
Alexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ア
ロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコンジュ
ゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコン
ジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分析において用いら
れる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  -L-Mラジカル(ここで、Lは上記の意味を有し、Mは化学療法剤又は毒素から選択さ
れる細胞毒性薬を表す)：
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す。
【００２１】
有利には、本発明は、式IB、IB1、IB2及びIA：
【化３０】
0006533222.tif 000031
（式IA及びIB中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化３１】
0006533222.tif 000032
であるか、又は以下の基：
【化３２】
0006533222.tif 000033
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化３３】
0006533222.tif 000034
【化３４】
0006533222.tif 000035
【化３５】
0006533222.tif 000036
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくは
Alexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナ
イルブルーA、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したもの
とのコンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記した
ものとのコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分析に
おいて用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬M、特にモノメチルオーリスタチン
E又はモノメチルオーリスタチンF、
-  -L-Mラジカル(ここで、L及びMは、上記の意味を有する)：
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
から選択される式Iに対応することを特徴とする生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドに関する。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において、要素X1、X2又はX3の少なくとも１つは、単結合でない。
本発明の特定の実施形態において、要素Xは、Br又はIである。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、上記の式(I)に対応することを特徴とする生成物は、その端に、以下の式：
【化３６】
0006533222.tif 000037
に対応する基を有し、これは、以下のラジカル：
【化３７】
0006533222.tif 000038
から選択され、以下の基：
【化３８】
0006533222.tif 000039
は、以下のラジカル：
【化３９】
0006533222.tif 000040
（式中、Xは、ハロゲン又は脱離基であり、
３つの原子(T, Y, Z)は、それぞれ他の２つの原子とは独立して、炭素又は窒素原子を表し、
Hetは、炭素環若しくは複素環のアリールラジカル又は複素環のシクロアルキルラジカルを表し、
CAは、シクロアルキルラジカルを表す）
から選択される。
【００２４】
３つの原子T、Y及びZは、３つの原子(C, C, C)、(N, C, C)、(C, N, C)、(C, C, N)、(C, N, N)、(N, C, N)、(N, N, C)又は(N, N, N)、好ましくは(C, C, C)及び(N, C, C)に対応し得る。
【００２５】
本発明の特定の実施形態において、上記の式(I)に対応することを特徴とする生成物は、その端に、以下の式：
【化４０】
0006533222.tif 000041
に対応する基を有し、これは、以下のラジカル：
【化４１】
0006533222.tif 000042
から選択され、以下の基：
【化４２】
0006533222.tif 000043
は、以下のラジカル：
【化４３】
0006533222.tif 000044
（式中、Xは、Br又はIであり、
３つの原子(T, Y, Z)は、それぞれ他の２つの原子とは独立して、炭素又は窒素原子を表し、特にTは窒素原子であり、Y及びZはCHを表す）
から選択される。
【００２６】
本発明の特定の実施形態において、式IA及びIBから選択される式(I)に対応することを特徴とする生成物は、-(CH2)5-CO2Hラジカルによって表され得る以下の基：
【化４４】
0006533222.tif 000045
を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、Wが要素Lに対応する式IA及びIBにより構成される一般式(I)に対応する生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドは、以下の一般式IA1：
【化４５】
0006533222.tif 000046
又は一般式IB1：
【化４６】
0006533222.tif 000047
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化４７】
0006533222.tif 000048
であるか、又は以下の基：
【化４８】
0006533222.tif 000049
であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化４９】
0006533222.tif 000050
【化５０】
0006533222.tif 000051
【化５１】
0006533222.tif 000052
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Lは、末端反応性官能基を含むリンカーボディを表し、
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
に対応する。
【００２８】
本発明の意味において、「末端反応性官能基」とは、慣用の有機化学又はコンビナトリアル化学により１以上の分子アセンブリを可能にする原子又は原子群を意味する。
【００２９】
本発明の別の特定の実施形態において、本発明の生成物は、以下の一般式III、IIIa又はIIIb：
【化５２】
0006533222.tif 000053
（式中、Kは、同一であっても異なっていてもよい天然又は非天然アミノ酸のn5の配列を表す以下のラジカル：
【化５３】
0006533222.tif 000054
を表すか、又は
Kは、酵素によって認識される開裂部位を表すか、又は
Kは、以下のラジカル：
【化５４】
0006533222.tif 000055
に任意にカップリングしたヒドラジノラジカルを表すか、又は
Kは、好ましくは、β-グルクロン酸、β-D-ガラクトース、β-D-グルコース、α-D-マンノース、N-アセチル-D-グルコサミニル、N-アセチル-D-ガラクトサミニル、D-グルクロニル、L-イズロニル、D-グルコピラノシル、D-ガラクトピラノシル、D-マンノピラノシル又はL-フコピラノシルから選択される糖の基を表し、
Xは、水素又はNO2基を表し、
Aは、好ましくは、水素原子を表し、
Yは、以下の鎖：
【化５５】
0006533222.tif 000056
、単結合又は、１以上の酸素、硫黄又は窒素原子が任意に介在する1〜30個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキルラジカルにより形成される基から好ましくは選択される化学的スペーサーアーム、例えばポリエチレングリコールを表し、
Zは、脱離基を表し、
n5は、1〜6の整数を表す）
に対応するリンカーボディLを含む。
【００３０】
脱離基Zは、パラニトロフェニルオキシ又はパラシアノフェニルオキシを含む群から選択され得る。好ましくは、脱離基Zは、以下のラジカル：
【化５６】
0006533222.tif 000057
の１つ又は塩素原子である。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、一般式III、IIIa又はIIIbに対応する生成物は、以下のラジカル：
【化５７】
0006533222.tif 000058
（式中、n5は1、2、3、4又は5に等しく、
AAは、一組のアミノ酸であり、該アミノ酸は、バリン、シトルリン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、アスパラギン、プロリン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸により構成される群から選択される）
を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、n5は、2又は3、好ましくは2に等しく、
【化５８】
0006533222.tif 000059
は、バリン及びシトルリン、フェニルアラニン及びリジン、バリン及びアラニン、バリン及びアスパラギン酸、リジン及びメチオニン、リジン及びアスパラギン、プロリン及びイソロイシン、プロリン及びリジン、リジン及びメチオニン、リジン及びアスパラギン、バリン及びリジン、アラニン及びリジン、フェニルアラニン及びリジン、2つのフェニルアラニン及びリジン、又はアラニン、又はフェニルアラニンおよびリジン、又は2つのアルギニン、又はリジン及びアルギニン、又はグルタミン酸、又はグリシン及びアルギニン、又は2つのグリシン及びアルギニンから選択される一組のアミノ酸である。
【００３３】
本発明の特定の実施形態において、式III、IIIa又はIIIbの生成物は、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンDタイプの酵素、プラスミン、リソソームプロテアーゼ、リソソーム酵素、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)、エラスターゼ、プロテイナーゼ3、カテプシンGから選択される酵素による開裂部位を表す要素Kを含む。
【００３４】
また、Kは、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)タイプの酵素による開裂の認識部位を表していてもよい。この場合、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)タイプの酵素は、好ましくは、コラゲナーゼ1、2及び3 (MMP-1、MMP-8、MMP-13)、ゼラチナーゼA及びB (MMP-2及びMMP-9)、ストロメリシン1及び2 (MMP-3及びMMP-10)、マトリライシン1、2及び3 (MMP-7、MMP-26、MMP-11)、マクロファージメタロエラスターゼ(MMP-12)、膜型MMP (MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24及びMMP-25)、エナメリシン(MMP-20)、CA-MMP (MMP-23)、エピライシン(MMP-18)及びPSMAから選択される。
【００３５】
また、Kは、エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、カテプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、マンノシダーゼ、N-アセチル-D-グルコサミニダーゼ又はN-アセチル-D-ガラクトサミニダーゼによる開裂の認識部位を表していてもよい。
【００３６】
本発明との関連において、「開裂部位」とは、酵素によるペプチド鎖の開裂が起こる位置、例えばバリン-シトルリン部位、上記の開裂部位K又は酵素認識が起こる位置を意味する。
【００３７】
本発明の特定の実施形態において、生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドは、一般式IA2：
【化５９】
0006533222.tif 000060
又は式IB2：
【化６０】
0006533222.tif 000061
（式中、Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化６１】
0006533222.tif 000062
であるか、又は以下の基：
【化６２】
0006533222.tif 000063
であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化６３】
0006533222.tif 000064
【化６４】
0006533222.tif 000065
【化６５】
0006533222.tif 000066
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Lは、末端反応性官能基を含むリンカーボディを表し、
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表し、
Mは、化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬である）
に対応する。
【００３８】
本発明の意味において、「細胞毒性薬」とは、細胞の機能を阻害するか、又は妨げることができる天然又は合成の分子を意味する。「細胞毒性」とは、(任意にそれらが破壊されるまで)細胞を変化させる化学的又は生物学的な剤の特性も意味する。
【００３９】
本発明の特定の実施形態において、薬剤Mは、販売認可が得られた、抗がん治療又は抗炎症治療に用いられる化合物から選択される薬剤であり、抗がん治療又は抗炎症治療における臨床的な評価がされた分子である。薬剤Mは、例えば、パクリタキセル(Taxol(登録商標))又はドセタキセル(Taxotere(登録商標))若しくはそれらの誘導体、トポテカン、ボルテゾミブ、ダウノルビシン、ダウノルビシン類似体、ビンクリスチン、マイトマイシンC、レチノイン酸、メトトレキサート、イロメジン、アスピリン、IMID、レナリドミド、ポマリドミドから選択される。
【００４０】
本発明の別の特定の実施形態において、薬剤Mは、デュオカルマイシン及びその類似体、ドラスタチン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、N-アセチル-γ-カリケアマイシン(CMC)、カリケアマイシン誘導体、メイタンシン及びその類似体、DM-I、オーリスタチンE、オーリスタチンEB (AEB)、オーリスタチンEFP (AEFP)、モノメチルオーリスタチンE (MMAE)、モノメチルオーリスタチンF (MMAF)、ツブリシン、ジソラゾール、エポチロン、エキノマイシン、エストラムスチン、セマドチン、エロイテロビン、メソプテリン、アクチノマイシン、マイトマイシンA、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、SN38、メイタンシン、メイタンシノイドタイプの誘導体、DM1、DM4、TK1、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロピリドジアゼピン、ピロロピリドジアゼピン二量体、DNAインターカレーター、ヒストンデアセチラーゼインヒビター又はチロシンキナーゼインヒビターにより構成される群から選択される。
本発明の別の特定の実施形態において、薬剤Mは、シュードモナス外毒素(PE)、デブーガニン、ブーガニン、ジフテリア毒素(DT)及びリシンから選択される。
【００４１】
本発明の別の特定の実施形態において、本発明の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドは、以下の式IB2：
【化６６】
0006533222.tif 000067
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化６７】
0006533222.tif 000068
であるか、又は以下の基：
【化６８】
0006533222.tif 000069
であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化６９】
0006533222.tif 000070
【化７０】
0006533222.tif 000071
【化７１】
0006533222.tif 000072
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は１に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Lは、末端反応性官能基を含むリンカーボディを表し、
Mは、細胞毒性薬又は毒素であり、
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
に対応する。
【００４２】
本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質Pは、アゴニスト若しくはアンタゴニスト、抗体若しくは抗体フラグメント、抗体若しくは抗体フラグメントを含む融合タンパク質、アルブミン又はペプチドから選択される。
「アゴニスト」とは、所定の細胞の受容体に特異的に結合して、天然のリガンドと同じ効果を惹起する分子を意味する。
「アンタゴニスト」とは、所定の細胞の受容体に特異的に結合して、当該内因性リガンドと当該受容体との結合に対抗することにより内因性リガンドの作用をブロックすることができる分子を意味する。
【００４３】
「抗体」(一般には通常「免疫グロブリン」とも呼ばれる)とは、鎖内及び鎖間ジスルフィドブリッジにより結合した、およそ50〜70 kDaの２つの重鎖(「Heavy」を略してH鎖と呼ぶ)及びおよそ25 kDaの２つの軽鎖(「Light」を略してL鎖と呼ぶ)により構成されるヘテロ四量体を意味する。
【００４４】
各々の鎖は、N末端の位置において、軽鎖についてはVL、重鎖についてはVHと呼ばれる可変領域により構成され、C末端の位置において、軽鎖についてはCLと呼ばれる単一のドメイン、重鎖についてはCH1、CH2、CH3、CH4と呼ばれる３つ又は４つのドメインにより構成される定常領域によって構成される。
【００４５】
「抗体フラグメント」とは、酵素的消化により得られるか、又はバイオプロダクションにより得られる免疫グロブリンの一部を意味する。
本発明の抗体は、単一特異的又は二重特異的なキメラ、ヒト化又はヒトのモノクローナル抗体であり得る。
「キメラ抗体」とは、軽鎖及び重鎖の可変領域の配列が、軽鎖及び重鎖の定常領域の配列とは異なる種に属する抗体を意味する。
【００４６】
本発明の目的において、重鎖及び軽鎖の可変領域の配列は、好ましくはネズミ由来のものであるが、重鎖及び軽鎖の定常領域の配列は、ネズミではない種に属する。この点において、定常領域については、ネズミではない哺乳動物の全ての種、特にヒト、サル、旧世界ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ又は鳥類を用いることができるが、これらに限定されない。
【００４７】
好ましくは、本発明のキメラ抗体は、ヒト由来の重鎖及び軽鎖の定常領域の配列及びネズミ由来の軽鎖及び重鎖の可変領域の配列を含む。
「ヒト化抗体」とは、抗原認識に関与する領域(超可変領域又はCDR：相補性決定領域)の配列の一部又は全部及びときにはFR領域(FR：フレームワーク領域)の特定のアミノ酸がヒト由来でないが、抗原認識に関与しない定常領域及び可変領域の配列がヒト由来である抗体を意味する。
「ヒトの抗体」とは、軽鎖の可変領域及び定常領域並びに重鎖の可変領域及び定常領域のいずれについても、ヒトの配列のみを含む抗体を意味する。
【００４８】
本発明の別の特定の実施形態において、タンパク質Pは、抗体フラグメントであり得る。この抗体フラグメントは、Fab、F(ab)'2、Fc、F'c、pFc'、ScFv、Fv、Fd、Fabc、ダイアボディ、ミニボディ、ScFv-Fc又はScFv-Fvにより構成される群から選択される。
【００４９】
パパインによる免疫グロブリンの酵素的消化により、Fabフラグメント(抗原結合フラグメント)と呼ばれる２つの同一のフラグメント及び１つのFcフラグメント(結晶性フラグメント)が生じる。
ペプシンによる免疫グロブリンの酵素的消化により、F(ab')2フラグメント及び複数のペプチドに分かれたFcフラグメントが生じる。
【００５０】
F(ab')2は、鎖間ジスルフィドブリッジにより連結した2つのFab'フラグメントにより形成される。
Fabの部分は、可変領域並びにCH1及びCLドメインにより構成されるが、Fc領域は、2つの球状ドメインCH2及びCH3 (並びに存在するときにはCH4)により構成される。
Fab'フラグメントは、Fab領域及びヒンジ領域により構成される。Fab'-SHとは、ヒンジ領域のシステイン残基に遊離チオール基を有するFab'フラグメントを指す(Carterら、Nature BioTechnology 10: 163-167 (1992))。Fvフラグメントは、ジスルフィドブリッジにより連結したVHドメイン及びVLドメインから構成される。それは、抗原結合活性を保持する最小のフラグメントである。
【００５１】
Fdフラグメントは、VH及びCH1ドメインにより形成される。
「F’c」、「pFc’」及び「Fabc」フラグメントは、図5A〜5Cにおいて定義する。
scFv (単鎖可変フラグメント)は、可変領域VH及びVLのみによって構成されるタンパク質工学技術により作製されるフラグメントである。この構造は、２つのドメインの間に置かれる短いフレキシブルなペプチドアーム(リンカーと呼ばれる)により安定化されている。
【００５２】
ScFvフラグメントは、ScFv-Fcを製造するためにFcフラグメントに結合させるか、又はScFv-Fvを製造するためにFvフラグメントに結合させることができる。
【００５３】
結合性ペプチドのサイズが小さい場合、新たな立体的制約がscFv同士の間に現れる；VHドメイン及びVLドメインは、もはや組み合わさって機能的に構造化することができず、多量体構造(二量体：「ダイアボディ」、三量体：「トリアボディ」及び四量体：「テトラボディ」)が得られる。
【００５４】
本発明との関連において、ダイアボディを用いることができる。それらは、複数の価数及び特異性を有し得る。
用語「価」とは、抗体分子中における決まった数の抗原結合部位の存在を示す。
用語「特異的」とは、同一の抗体に結合し得る抗原の異なるタイプを指す。
【００５５】
よって、本発明において、「ダイアボディ」とは、二価のscFv二量体を意味し、同一であるか又は異なる２つの抗原に結合するかに従って、単一特異的又は二重特異的である。
Fab、Fv及びscFvフラグメントは、一価で単一特異的である。
「ミニボディ」とは、軽鎖とCH3ドメインに結合した重鎖とからなるフラグメントを意味する。
【００５６】
本発明との関連において、抗体又は抗体フラグメントは、腫瘍抗原又は炎症性抗原を指向する。
本発明の特定の実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、分化抗原群(CD)の抗原の１つを指向する。これらの識別番号は、CD1a〜CD363である；以下のCDが好ましい：CD1a、CD363、CD3、CD4、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD37、CD39、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD66e、CD70、CD72、CD73、CD74、CD79、CD79b、CD80、CD86、CD117、CD138、CD194、CD205、CD227又はCD248。また、抗体又は抗体フラグメントは、CA125、G250、GD2、HLA-DRβ、MUC1、VEGF、VEGFA、VEGF-R1/2、TRAIL-R2 (DR5)、EpCAM、GPIIb、GPIIIa、TNFα、TNFR、TNT、Lewis Y、EGFR、HER-2、HER-3、HER-3 MM-111、HER-4、erbbnファミリー(nは、1〜4である)のメンバーのホモ二量体又はヘテロ二量体、AXL、プロテインF、IgE-Fc、VEGF-A、インテグリンα4、インテグリンα4β7、インテグリンαV、C5、IL-6R、IL-6Rα、IL12、IL15、IL18、IL23、IL-1β、IL-1、TPO-R、GPNMB、PSMA、PSA、PAP、PSM、インテグリンαv、Cripto、TACSTD2 (TROP2又はEGP1)、CEA、葉酸受容体1、ムチン16、エンドセリン受容体ETB、STEAP1、SLC44A4 (AGS-5)、ネクチン4、AGS-16、グアニル酸シクラーゼC、ムチン1、EGFRvIII、メソテリン、IL2R、A33、Can、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TGFβ、TGFβR、FGF、FGF8b、FGFR、PDGF、PDGFR、PDGFRα、PDGFRβ、Ang-1、Ang-2、インテグリン、αvβ3、αvβ5、α3β1、α6β4、α2β1、抗インテグリンα4、RANK-L、BLyS、c-MET、DR、DR10、TCRαβ、ICOS、CTLA-4、CAIX (MN)、EphA2、CA6、卵巣がんのCA6、子宮頸がんのCA6、乳がんのCA6、アンジオポエチン-2、Cripto、ENPP3、メソテリン、FOLR１、ネクチン-4、TIM-1、Muc-16、組織因子、LIV-1、GM2、α5インテグリン、TLR-7、PD-1、AFP、CA125 (MUC16)、シアリルルイスY、CAMPATH-1、HLA-DR、抗イディオタイプ、がん胎児性抗原(CEA)、TAG-72、葉酸結合タンパク質、A33、G250、ガングリオシド(GD2、GD3、GM2を含む)、LeY、コラーゲン4 (コラーゲンIV)、コラーゲン18 (コラーゲンXVIII)、SC6、CA-125、CA19-9、p185HER2、de2-7 EGFR、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、炭酸脱水酵素、ガレクチン9、アルドラーゼA、eIFγ4、チロシナーゼ、ガレクチン4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、レスチン、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、HGFR、PTK 7、CCK-4、PDGFR、PTP-LAR、CDCP1、CADM1、IGSF4、Lu、 BCAM、CEACAM6、JAM-A、PTGFRN (CD9P-1)、MCAM、MUC18、MCP、EMMPRIN、TfR、TRAILR2、C1qR、hTERT、サバイビン、MDM2、CYP1B1、Melan-A、MART-1、MART-2、メラノソームタンパク質、gp100、neo-PAP、CDC27、MAGEs、WT1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、BRAF、TPI、フィブロネクチン、K-ras、β-カテニン、CDK4、カスパーゼ-8、p14ARF、p16INK4a、TGFβRII、bcr-abl、SYT-SSX、TRP-1、TRP-2、GnT-V、チロシナーゼ、FGF5、TEL-AML1、プロテイナーゼ3、HER2/neu、AFP、MUC-1、EBV-EBNA、HTLV-1 tax、HPV16-E7、変異HLA-A2、HA1、SART3、GnT-V、CEACAM5、AGS-16、GPNMB、ESAT-6、RANK、CanAg、フィブリン、TF、PRAME、CA19-9、CA50、CA125、CA195、CAM17.1/WGA、AFP、β2-MG、DU-PAN2、HE4、b-2ミクログロブリン、トランスフェリン、トランスチレチン、ApoA1、TROP-2、CTLA-4、GITR、PD-1、PD-L1、c-KIT、CD11b-CD18インテグリンヘテロ二量体、DNA/ヒストンH1、葉酸塩、EpCAM、テネイシン-c、ECM(プロテオグリカンまたはフィブロネクチン)、フィブリノーゲン、SV40ラージT 抗原、SC6-Ag、SC-Ag、DR4(細胞死受容体4)、DR5、ESA、ムチン、hPAM4、hRS7、HLA-DR、CCR4、MTX1、MTX2、PECAM、トロンボモジュリンTn、カテプシンD、TYRO-3、MERから選択される抗原の１つを指向してもよい。また、抗体又は抗体フラグメントは、PF4/ヘパリン複合体を指向してもよい。
【００５７】
また、本発明は、所望により式IA3：
【化７２】
0006533222.tif 000073
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化７３】
0006533222.tif 000074
であるか、又は以下の基：
【化７４】
0006533222.tif 000075
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化７５】
0006533222.tif 000076
【化７６】
0006533222.tif 000077
【化７７】
0006533222.tif 000078
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、
r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数である）
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドと、式：
【化７８】
0006533222.tif 000079
(式中、Lは、末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す)
の生成物とを反応させ、以下の式IA1：
【化７９】
0006533222.tif 000080
の生成物を得、
所望により、式IA1の生成物と、式：
【化８０】
0006533222.tif 000081
(式中、Mは、化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬を表す)
の生成物とを反応させ、以下の式IA2：
【化８１】
0006533222.tif 000082
の生成物を得るか、又は
所望により、式IA3の生成物と、-FL蛍光ラジカルの残基とを反応させ、以下の式(IA4)：
【化８２】
0006533222.tif 000083
の生成物を得るか、又は
所望により、式IA3の生成物と、-R*放射性ラジカルの残基とを反応させ、以下の式(IA5)：
【化８３】
0006533222.tif 000084
の生成物を得ることを特徴とする、式Iの生成物を製造する方法に関する。
【００５８】
所望により、式IAの生成物に対応する式IA1〜IA5の生成物と、式Pの生成物(ここで、Pは、少なくとも1つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す)とを反応させ、以下の式(IB)：
【化８４】
0006533222.tif 000085
（式中、Wは、以下のいずれかのものを表す：
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくはAlexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナイルブルーA、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分析において用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、HYNIC、
DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能性リガン
ド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、
DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、DOTA-
pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノアミド、p-
NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、NOTA、CHX-A''-
DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、
99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、199Au、
105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、73As、
74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、123I、
131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬、特にモノメチルオーリスタチンE又はモノメチルオーリスタチンF、
-  -L-Mラジカル(L及びMは、上記の意味を有する)）
の生成物を得る。
【００５９】
本発明の特定の実施形態において、本発明の製造方法の式IA1〜IA5の生成物は、典型的にはリン酸緩衝液中TCEP存在下において、求核置換反応によりタンパク質Pにその少なくとも１つのジスルフィドブリッジで付加される。
【００６０】
本発明の特定の実施形態において、式IBの生成物、特に式IB2の生成物は、腫瘍の治療、特に直腸結腸がん、肝細胞がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、大腸がん、K-RAS変異結腸直腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、転移性乳がん、肝がん、頭部及び頸部のがん、キャッスルマン病、甲状腺がん、髄芽腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、肉腫、退形成星細胞腫、腎臓がん、胃がん、悪性腹水、前立腺がん(転移性であるか否かを問わない)、充実性腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、黒色腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫の治療に用いられる。
【００６１】
本発明の別の特定の実施形態において、式IBの生成物、特に式IB2の生成物は、炎症性疾患又は自己免疫疾患、特に移植片拒絶、リウマチ性関節炎、クローン病、乾癬、多発性硬化症、クリオピリン関連周期性症候群、血小板減少性紫斑病の治療に用いられる。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、式Iの生成物は、式IA：
【化８５】
0006533222.tif 000086
及び式IB：
【化８６】
0006533222.tif 000087
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化８７】
0006533222.tif 000088
であるか、又は以下の基：
【化８８】
0006533222.tif 000089
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化８９】
0006533222.tif 000090
【化９０】
0006533222.tif 000091
【化９１】
0006533222.tif 000092
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくは
Alexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナ
イルブルーA、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したもの
とのコンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記した
ものとのコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分
析において用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬M、特にモノメチルオーリスタチン
E又はモノメチルオーリスタチンF、
-  -L-Mラジカル(L及びMは、上記の意味を有する)：
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
により構成され、蛍光検出を含む診断又は分析において用いられる。
【００６３】
本発明の別の特定の実施形態において、式IA4：
【化９２】
0006533222.tif 000093
又は式IB4：
【化９３】
0006533222.tif 000094
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化９４】
0006533222.tif 000095
であるか、又は以下の基：
【化９５】
0006533222.tif 000096
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化９６】
0006533222.tif 000097
【化９７】
0006533222.tif 000098
【化９８】
0006533222.tif 000099
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくは
Alexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナ
イルブルーA、アロフィコシアニン(APC）及びそれと他の蛍光色素、特に上記したも
のとのコンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記し
たものとのコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は
分析において用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬M、特にモノメチルオーリスタチン
E又はモノメチルオーリスタチンF、
-  -L-Mラジカル(L及びMは、上記の意味を有する)：
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
の生成物は、Wが-FL蛍光ラジカルを表す式IA及びIBの生成物に対応し、蛍光検出を含む診断又は分析において用いられる。この場合、FLは、好ましくは、ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy5、Cy5.5、Cy7から好ましくは選択されるCy色素、好ましくはAlexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナイルブルーA、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコンジュゲート、フィコエリトリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したものとのコンジュゲートから選択される蛍光色素、又は蛍光検出を含む診断又は分析に用いられる蛍光色素から選択される蛍光色素である。
放射性元素の使用は、Cutlerらの論文 (Chemical Reviews, 2013, 113, 858-883)により説明されているように、イメージング用途又は治療用途に拘らず、医療分野において非常に幅広い。
【００６４】
本発明の更に別の特定の実施形態においては、式(IA5)：
【化９９】
0006533222.tif 000100
又は式(IB5)：
【化１００】
0006533222.tif 000101
（式中、Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化１０１】
0006533222.tif 000102
であるか、又は以下の基：
【化１０２】
0006533222.tif 000103
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化１０３】
0006533222.tif 000104
【化１０４】
0006533222.tif 000105
【化１０５】
0006533222.tif 000106
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は1、2、3又は4に等しい整数であり、
R*は、放射性ラジカルであり、
Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質であり、
tは、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
の生成物は、放射線検出を含む診断又は分析において用いられる。R*は、好ましくはDOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から選択される任意に二結合様式性の二官能性リガンドを含む。R*は、以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンドを含む。R*は、以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノアミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンドを含む。
【００６５】
R*は、カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤を含む。
R*は、67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種を含む。
【００６６】
また、式(IA5)及び(IB5)の生成物は、生物系における分布及び機能を測定するための診断に用いられるPET (陽電子放射断層撮影法)又はSPECT (単一光子放射断層撮影法)タイプの非侵襲性のイメージング技術に用いることもできる。
また、式(IA5)及び(IB5)の生成物は、例えばがん治療のために、放射性医薬品としても用いることができる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、式(IA5)及び(IB5)の生成物は、生物系における分布及び機能を測定するための診断に用いられるPET (陽電子放射断層撮影法)又はSPECT (単一光子放射断層撮影法)タイプの非侵襲性のイメージング技術に用いられる。
本発明の別の特定の実施形態において、式(IA5)及び(IB5)の生成物は、例えばがん治療のために、放射性医薬品として用いられる。
【００６８】
また、本発明は、式IA：
【化１０６】
0006533222.tif 000107
（式中、
Xは、Br又はIであるか、又は以下の基：
【化１０７】
0006533222.tif 000108
であるか、又は以下の基：
【化１０８】
0006533222.tif 000109
であり、ここで、Xaは、ハロゲン又は脱離基であり、
Aは、炭素環又は複素環のアリール又はシクロアルキルラジカルのいずれかを表すか、又は
Aは、以下の基：
【化１０９】
0006533222.tif 000110
【化１１０】
0006533222.tif 000111
【化１１１】
0006533222.tif 000112
を表し、
X1は、C=Oであるか、NH基であるか、又は単結合であり、
X2は、NH基であるか、C=Oであるか、又は単結合であり、
X3は、酸素であるか、又は単結合であり、
sは、1、2又は3に等しく、
rは、0、1又は2に等しく、ここで、r+sは、3に等しいと理解され、
n1は、0又は1に等しい整数であり、
n2は、1、2又は3に等しい整数であり、
n3は、1、2又は3に等しい整数であり、
n4は、1、2、3又は4に等しい整数であり、
Wは、以下のいずれかのものを表し：
-  末端反応性官能基を含むリンカーボディを表す-Lラジカル、
-  ローダミン又はその誘導体、好ましくはローダミンB、フルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)、好ましくはCy5、Cy5.5、Cy7から選択されるCy色素、好ましくは
Alexa Fluor 647、700又は750から選択されるAlexa Fluor色素、テキサスレッド、ナ
イルブルーA、アロフィコシアニン(APC)及びそれと他の蛍光色素、特に上記したもの
とのコンジュゲート、フィコエリスリン(PE)及びそれと他の蛍光色素、特に上記した
ものとのコンジュゲートから好ましくは選択される、蛍光検出を含む診断又は分析に
おいて用いられる-FL蛍光体の基、
-  好ましくは以下のもののいずれかを含むR*放射性ラジカル：
DOTA、DTPA、C-DOTA、NODAGA、NETA、C-NETA、DEPA、C-DEPA、TETA、TE2A、
HYNIC、DAT、MAMAの誘導体から好ましくは選択される任意に二結合様式性の二官能
性リガンド；
以下の非環式キレート剤：EDTA、CyEDTA、EDTMP、DTPMP、DTPA、CyDTPA、
Cy2DTPA、DTPA-MA、DTPA-BA、BOPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガ
ンド；
以下の大環状キレート剤：DOTA、TRITA、TETA、DOTA-MA、DO3A-HP、DOTMA、
DOTA-pNB、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTMPE、F-DOTPME、DOTPP、DOTBzP、DOTA-モノア
ミド、p-NCS-DOTA、p-NCS-PADOTA、BAT、DO3TMP-モノアミド、p-NCS-TRITA、
NOTA、CHX-A''-DTPAの１つから好ましくは選択される二官能性リガンド；
カチオン性、アニオン性、中性又は開裂性の二官能性キレート剤；又は
67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、
188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、
199Au、105Rh、165Ho、166Ho、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、
73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、
123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr、211Atから好ましくは選択される放射性核種：
-  化学療法剤又は毒素から選択される細胞毒性薬M、特にモノメチルオーリスタチン
E又はモノメチルオーリスタチンF、
-  -L-Mラジカル(L及びMは、上記の意味を有する)：
特に、以下の基：
【化１１２】
0006533222.tif 000113
は、以下のラジカル：
【化１１３】
0006533222.tif 000114
から選択される）
の生成物並びにそのカルボン酸基誘導体、例えば塩、エステル又はアミド、好ましくはコハク酸イミドで形成されたアミドと、式P (ここで、Pは、少なくとも１つのジスルフィドブリッジを含むタンパク質である)の生成物とを反応させ、以下の式(IB)：
【化１１４】
0006533222.tif 000115
（式中、tは、1〜15、好ましくは1〜6及び13の整数を表す）
の生成物を得ることを特徴とする上記式IBの生成物を製造する方法に関する。
【００６９】
図の説明
図１は、抗体-薬剤コンジュゲートの一般的な構造を表す。
慣用の修飾部位は、以下のとおりである：
・  ４つのリジン
80のうち、８残基が修飾のために利用でき、そのうち修飾されるのは平均４残基(結果的に多数のDAR種)
・  ４つのジスルフィドブリッジ
TCEP (トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)で還元後、８つのシステイン残基が利用でき、結果として、0〜8のDARを有する多数の種
DAR＝薬物抗体比(又は薬物-対-抗体比)
慣用の修飾をもって、平均DARはおよそ4である。
【００７０】
図2は、トラスツズマブのMALDI-TOF質量分析(74095におけるピーク及び破線の矢印により示されるピーク)及び6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカー(スペーサー)で再構築されたグラフト化トラスツズマブのMALDI-TOF質量分析(74846におけるピーク及び実線の矢印により示されるピーク)を表す。
【００７１】
この分析により、反応混合物(74095におけるピーク)が、４つの6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカーを抗体にグラフティングさせて得られる種を89％含み、その平均グラフティングは4.0であることを確認することができる。
【００７２】
【表１】
0006533222.tif 000116
【００７３】
メインピーク(74846におけるピーク)のデコンボリューションによる異なる種の分布の算出。
【００７４】
【表２】
0006533222.tif 000117
【００７５】
図3は、TCEPにより還元され、次いで6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカーを付加した後、精製及び再構築されたトラスツズマブ抗体24のHIC-HPLCクロマトグラムを表す。
少量のDAR=0が残り(MALDI-TOFの結果で確認)、DAR=4が主な種である。
【００７６】
図4A〜4Cは、種々の異なる抗体フラクションの命名を表す。
図4Aは、パパイン(Fc及びF'c)又はペプシン(Fc' = pepF'c)で消化後に得られたIg1フラグメントを表す。
図4Bは、Fabc、Fd、Fv及びscFvフラグメントを表す。
図4Cは、キメラ抗体及びヒト化抗体の構造を表す。
【００７７】
図5は、実施例5.2において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー7)4抗体24のRP-HPLCクロマトグラムを表す。
A:  トラスツズマブ
B:  TCEPにより還元された抗体：トラスツズマブの重鎖及び軽鎖は、RP-HPLC分析の変性的な性質に起因して分離される。
C:  再構成されたトラスツズマブ24 (粗製の反応混合物)：単一のピークが観測される。これは、鎖間ブリッジが6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカー7によって再構築されていることを証明する。
保持時間10分未満のピークは、リンカーの残基を表す。
【００７８】
図6は、実施例5.3において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー8)425のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:   TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカー8により再構築されたトラスツズマブ25
【００７９】
図7は、実施例5.4において得られたトラスツズマブ-(maldiSPh-リンカー26)427のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:  TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:  6-(3,4-ジチオフェニルマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカー26により再構築されたトラスツズマブ27
【００８０】
図8は、実施例5.5において得られたトラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー20)428のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:  TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:  6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサン酸リンカー20により再構築されたトラスツズマブ28
【００８１】
図9は、実施例5.6において得られたトラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー22)429のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:  TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:  6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカー22により再構築されたトラスツズマブ29
【００８２】
図10は、実施例5.7において得られたトラスツズマブ-(PhdiMediBr-リンカー15)430のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:  TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:   6-(2,6-ビス(ブロモメチル)ベンズアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH酸リンカー15により部分的に再構築されたトラスツズマブ30
【００８３】
図11は、実施例5.8において得られたリツキシマブ-(maldiBr-リンカー7)431のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のリツキシマブ
B:  TCEPにより還元されたリツキシマブ
C:  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカー7のにより再構築されたリツキシマブ31
【００８４】
図12は、実施例5.9において得られたトラスツズマブ-(maldiBr-リンカー9-MMAE)432のRP-HPLC分析を表す。
A:  天然のトラスツズマブ
B:  TCEPにより還元されたトラスツズマブ
C:  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-MMAEリンカー9-MMAEにより再構築されたトラスツズマブ32
【実施例】
【００８５】
実施例
実施例1：バリン-シトルリン-アルコールパラ-アミノベンジル基
【化１１５】
0006533222.tif 000118
【００８６】
1.1.   Fmoc-Val-OH (1)の合成
バリン(1.09g、9.31mmol、1 eq)を20 mLの水に溶解させ、次に20 mLのジオキサン及びNaHCO3(1.56 g、18.62 mmol、2 eq)を添加する。媒体を0℃に冷却し、次にFmoc-Cl (2.65 g、10.24 mmol、1.1 eq)を導入し、反応物を0℃で1 h放置し、次いで周囲温度で一晩撹拌する。翌日、反応媒体を、1M HCl溶液でpH＝2に酸性化し、EtOAc (3 x 60 mL)で抽出する。真空下で蒸発後、得られた黄色の油をフラッシュクロマトグラフィー(シクロヘキサン中0〜40％のEtOAc)により精製する。白色の固体が得られる(2.23 g、71%)。
【００８７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.78-7.29 (m, 8H; Ar Fmoc), 5.25 (d, J= 9.0 Hz, 1H; CONH Val), 4.43 (d, J= 7.0 Hz, 2H; CH2 Fmoc), 4.37 (dd, J= 4.5 Hz, J= 9.0 Hz, 1H; Hα Val), 4.24 (t, J= 7.0 Hz, 1H; CH Fmoc), 2.29-2.23 (m, 1H; Hβ Val), 1.02, 0.96 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3Val)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 176.50 (1C, COOH), 156.48 (1C, C=O Fmoc), 143.85, 141.47 (4C, C-Ar Fmoc), 127.89, 127.23, 125.21, 120.16 (8C, CH-Ar Fmoc), 67.27 (1C, CH2 Fmoc), 58.93 (1C, Cα Val), 47.32 (1C, CH Fmoc), 31.15 (1C, Cβ Val), 19.17, 17.59 (2C, CH3Val)
【００８８】
1.2.   Fmoc-Val-OSu (2)の合成
Fmoc-Val-OH (735 mg、2.17 mmol、1 eq)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(375 mg、3.26 mmol、1.5 eq)を5.5 mLのTHFに溶解させる。DCC (448 mg、2.17 mmol、1 eq)を0℃で添加し、反応物をこの温度で2 h撹拌する。次いで、媒体をフリットで濾過し、固体をTHFで洗浄する(3 x 3 mL)。有機相をMgSO4で乾燥させ、真空下で蒸発させ、次いでフラッシュクロマトグラフィー(シクロヘキサン中0〜40％のEtOAc)により精製し、無色のゴム状物質(865 mg、91%)を製造する。
【００８９】
HRMS: m/z 予測値: 437.10671 [M + H]+, 実測値: 437.17074.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.78-7.29 (m, 8H; Ar Fmoc), 5.28 (d, J= 9.0 Hz, 1H; CONH Val), 4.69 (dd, J= 5.0 Hz, J= 9.0 Hz, 1H; HαVal), 4.45 (d, J= 7.0 Hz, 2H; CH2 Fmoc), 4.24 (t, J= 7.0 Hz, 1H; CH Fmoc), 2.84 (s, 4H; NCOCH2), 2.40-2.29 (m, 1H; Hβ Val), 1.07, 1.05 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3 Val)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 168.72, 167.87 (3C, C=O Su, C=O Val), 155.97 (1C, C=O Fmoc), 143.94, 143.72, 141.42 (4C, C-Ar Fmoc), 127.85, 127.23, 125.17, 120.10 (8C, CH-Ar Fmoc), 67.35 (1C, CH2Fmoc), 57.60 (1C, Cα Val), 47.25 (1C, CH Fmoc), 31.75 (1C, CβVal), 25.69 (2C, CH2C(O)NO), 18.82, 17.41 (2C, CH3 Val)
【００９０】
1.3.  Fmoc-Val-Cit-OH (3)の合成
L-シトルリン(84 mg、0.481 mmol、1.05 eq)及びNaHCO3(40 mg、0.481 mmol、1.05 eq)を1.2 mLの水に溶解させ、1.2 mLのDME中のFmoc-Val-OSu (200 mg、0.458 mmol、1 eq)溶液を添加する。可溶性を改善するために、1.2 mLのTHFを添加し、媒体を21 h撹拌する。2.3 mLの15％クエン酸を添加し、媒体から沈殿物を得る；それを10% iProH/EtOAc混合物で抽出する(3 x 3 mL)。合わせた有機相をNaCl溶液で洗浄し(2 x 4.5 mL)、MgSO4で乾燥させ、次いで蒸発させる。得られた白色の固体を適切に乾燥させ、エーテルで洗浄し、静電性の白色の固体(140 mg、62%)を製造する。
【００９１】
HRMS: m/z 予測値: 497.26142 [M + H]+, 実測値: 497.23945.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.50 (br s, 1H; COOH), 8.17 (d, J= 7.5 Hz, 1H; CONH Cit), 7.88-7.27 (m, 9H; Ar Fmoc, CONH Val), 5.91 (t, J= 5.5 Hz, 1H; NH Cit), 5.36 (s, 2H; NH2 Cit), 4.25-4.07 (m, 4H; CH2 Fmoc, CH Fmoc, Hα Cit), 3.89 (dd, J= 7.0 Hz, J= 9.0 Hz, 1H; Hα Val), 2.94-2.88 (m, 2H; NCH2 Cit), 1.97-1.88 (m, 1H; Hβ Val), 1.70-1.31 (m, 4H; CH2 Cit), 0.86, 0.82 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3 Val)
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 173.45, 171.31 (2C, COOH, C=O Val), 158.76 (1C, NH2CO Cit), 156.07 (1C, C=O Fmoc), 143.95, 143.80, 140.72 (4C, C-Ar Fmoc), 127.67, 127.09, 125.43, 120.11 (8C, CH-Ar Fmoc), 65.69 (1C, CH2Fmoc), 59.83 (1C, Cα Val), 51.90 (1C, Cα Cit), 46.69 (1C, CH Fmoc), 38.76 (1C, NCH2 Cit), 30.56 (1C, Cβ Val), 28.38, 26.71 (2C, CH2 Cit), 19.19, 18.24 (2C, CH3 Val)
【００９２】
1.4.  Fmoc-Val-Cit-PAB-OH (4)の合成
Fmoc-Val-Cit-OH (518 mg、1.04 mmol、1 eq)及びp-アミノベンジルアルコール(256 mg、2.08 mmol、2 eq)を18 mLのDCM/MeOH 2/1に溶解させ、EEDQ (514 mg、2.08 mmol、2 eq)を添加する。媒体を暗中周囲温度で15 h撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られた黄色の固体をエーテルで粉砕する。懸濁液を5分間超音波処理し、30分間放置する。次いで、それを濾過し、固体をエーテルで数回リンスし、黄色の粉末(559 mg、89%)を製造する。
【００９３】
HRMS: m/z 予測値: 601.85499 [M + H]+, 実測値: 602.29758.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 9.97 (s, 1H; NH PAB), 8.10 (d, J= 7.0 Hz, 1H; CONH Cit), 7.87-7.18 (m, 13H; Ar Fmoc, Ar PAB, CONH Val), 5.95 (br t, J= 5.5 Hz, 1H; NH Cit), 5.40 (s, 2H; NH2 Cit), 5.09 (t, J= 5.5 Hz, 1H; OH PAB), 5.39 (d, J= 5.5 Hz, 1H; CH2PAB), 4.27-4.19 (m, 4H; CH2Fmoc, CH Fmoc, Hα Cit), 3.89 (dd, J= 8.0 Hz, J= 8.0 Hz, 1H; Hα Val), 3.03-2.84 (m, 2H; NCH2 Cit), 1.98-1.92 (m, 1H; Hβ Val), 1.69-1.27 (m, 4H; CH2 Cit), 0.84, 0.82 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3 Val)
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 171.30, 170.43 (2C, C=O Cit, C=O Val), 158.94 (1C, NH2CO Cit), 156.17 (1C, C=O Fmoc), 143.94, 143.81, 140.75 (4C, C-Ar Fmoc), 137.55, 137.48 (2C, C-Ar PAB), 127.70, 127.13, 125.40, 120.14 (8C, CH-Ar Fmoc), 126.98, 118.91 (4C, CH-Ar PAB), 65.73 (1C, CH2 Fmoc), 62.63 (1C, CH2 PAB), 60.14 (1C, Cα Val), 53.11 (1C, CαCit), 46.72 (1C, CH Fmoc), 38.96 (1C, NCH2 Cit), 30.48 (1C, CβVal), 29.57, 26.81 (2C, CH2 Cit), 19.26, 18.31 (2C, CH3Val)
【００９４】
1.5.  H-Val-Cit-PAB-OH (5)の合成
Fmoc-Val-Cit-PAB-OH (298 mg、0.495 mmol、1 eq)を4 mLのDMFに溶解させ、1 mLのピペリジンを添加する。1 hの反応後、媒体を蒸発させる。得られた粘性の固体をDCMで粉砕し、濾過し、べージュ色の固体(189 mg、100%)を製造する。
【００９５】
HRMS: m/z 予測値: 601.85499 [M + H]+, 実測値: 602.29758.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 10.04 (s, 1H; NH PAB), 8.16 (d, J= 7.5 Hz, 1H; CONH Cit), 7.52, 7.22 (2d, J= 8.5 Hz, 4H; Ar PAB), 5.97 (br t, J= 5.5 Hz, 1H; NH Cit), 5.40 (s, 2H; NH2 Cit), 5.10 (br t, J= 5.5 Hz, 1H; OH PAB), 4.46-4.40 (m, 3H; CH2PAB, Hα Cit), 3.52-3.18 (NH2Val, water), 3.05-2.87 (m, 3H; HαVal, NCH2 Cit), 1.95-1.89 (m, 1H; Hβ Val), 1.71-1.28 (m, 4H; CH2 Cit), 0.87, 0.77 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3 Val)
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 170.48 (2C, C=O Cit, C=O Val), 158.86 (1C, NH2CO Cit), 137.52, 137.43 (2C, C-Ar PAB), 126.94, 118.95 (4C, CH-Ar PAB), 62.59 (1C, CH2 PAB), 59.50 (1C, Cα Val), 52.53 (1C, CαCit), 38.08 (1C, NCH2 Cit), 31.25 (1C, Cβ Val), 30.10, 26.70 (2C, CH2 Cit), 19.46, 16.96 (2C, CH3 Val)
【００９６】
実施例2：バイオコンジュゲーションのヘッドとしてのマレイミド誘導体
【化１１６】
0006533222.tif 000119
【００９７】
2.1.  6-マレイミドヘキサン酸（6）の合成
アルゴン下、15 mLの酢酸中で無水マレイン酸(1.50 g、15.25 mmol、1eq)及び6-アミノカプロン酸(2.00 g、15.25 mmol、1 eq)を撹拌する。反応媒体を還流下で加熱し、一晩撹拌する。翌日、混合物はオレンジ色に変化していた。酢酸を、75 mLのトルエンで3回共蒸発させ、粘性のオレンジ色の油を得る。これを150 mLのDCM中に取り、次いで150 mLの水で洗浄する。水相を再度抽出し(2 x 150 mL)、合わせた有機相をMgSO4で乾燥させ、次いで真空下で蒸発させ、オレンジ色の固体(2.60 g、81%)を製造する。
【００９８】
HRMS: m/z 予測値: 216.95765 [M + H]+, 実測値: 217.09071.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 6.69 (s, 2H; CH=CH), 3.51 (t, J= 7.0 Hz, 2H; NCH2), 2.34 (t, J= 7.5 Hz, 2H; CH2COOH), 1.70-1.55 (m, 4H; NCH2CH2CH2CH2), 1.38-1.28 (m, 2H; NCH2CH2CH2)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 179.53 (1C, COOH), 171.00 (2C, C=O MC), 134.21 (2C, CH=CH), 37.71 (1C, NCH2), 33.86 (1C, CH2COOH), 28.30 (1C, NCH2CH2), 26.24 (1C, NCH2CH2CH2), 24.21 (1C, CH2CH2COOH)
【００９９】
2.2.  6(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸(7)の合成
マレイミドヘキサン酸(200 mg、0.947 mmol、1 eq)及び酢酸ナトリウム(117 mg、1.421 mmol、1.5 eq)をアルゴン下でチューブに入れ、2.9 mLの酢酸を添加する。臭素(0.07 mL、1.421 mmol、1.5 eq)を0℃で添加し、チューブを密封し、次いで還流下で4 h加熱する。次いで、媒体を放置して周囲温度に戻し、16 mLの冷水を添加する。水相をEtOAc (3 x 20 mL)で抽出し、合わせた有機相を40 mLのチオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、トルエンで共蒸発させる。得られた茶色の残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シクロヘキサン中0〜40％のEtOAc)により精製し、黄色の固体(237 mg、68%)を製造する。
【０１００】
HRMS: m/z 予測値: 368.47706 [M + H]+, 実測値: 367.91255
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 3.62 (t, J= 7.0 Hz, 2H; NCH2), 2.36 (t, J= 7.5 Hz, 2H; CH2COOH), 1.72-1.59 (m, 4H; NCH2CH2CH2CH2), 1.42-1.31 (m, 2H; NCH2CH2CH2)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 178.18 (1C, COOH), 164.10 (2C, C=O MC), 129.50 (2C, C=C), 39.63 (1C, NCH2), 33.60 (1C, CH2COOH), 28.25 (1C, NCH2CH2), 26.16 (1C, NCH2CH2CH2), 24.17 (1C, CH2CH2COOH)
【０１０１】
2.3.  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH (8)の合成
6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸(178 mg、0.482 mmol、1 eq)及びHATU (238 mg、0.627 mmol、1.3 eq)を2.2 mLの無水DMFに溶解させ、次いで2,6-ルチジン(73μL、0.627 mmol、1.3 eq)を添加する。媒体を1 h撹拌し、次いでジペプチド(183 mg、0.482 mmol、1 eq)を添加し、反応物を一晩撹拌する。次いで、1.6 mLの1M HClを添加し、水相をEtOAcで2回抽出する。合わせた有機相を飽和NaCl溶液で3回洗浄し、次いで蒸発させる。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(15/1〜9/1のDCM/MeOH溶出液勾配)で精製し、黄色の固体(84 mg、24%)を製造する。
【０１０２】
HRMS: m/z 予測値: 729.15941 [M + H]+, 実測値: 729.12412.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 9.91 (s, 1H; NH PAB), 8.08 (d, J= 8.0 Hz, 1H; CONH Cit), 7.83 (d, J= 8.5 Hz, 1H; CONH Val), 7.54, 7.22 (2d, J= 8.5 Hz, 4H; Ar PAB), 5.98 (br t, J= 5.5 Hz, 1H; NH Cit), 5.42 (s, 2H; NH2Cit), 5.15-5.07 (m, 1H; OH PAB), 4.42-4.33 (m, 3H; CH2 PAB, Hα Cit), 4.19 (dd, J= 7.0 Hz, J= 8.5 Hz, 1H; HαVal), 3.46-3.27 (NCH2 MC, water), 3.05-2.89 (m, 2H; NCH2 Cit), 2.23-2.08 (m, 2H; CH2CO MC), 2.01-1.91 (m, 1H; Hβ Val), 1.73-1.16 (m, 10H; CH2 Cit, NCH2CH2CH2CH2), 0.85, 0.81 (2d, J= 7.0 Hz, 6H; CH3 Val)
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 172.33, 171.28, 170.39, 163.13 (5C, C=O Cit, C=O Val, C=O MC), 158.92 (1C, NH2CO Cit), 137.54, 137.42 (2C, C-Ar PAB), 132.30 (2C, C=C), 126.94, 118.86 (4C, CH-Ar PAB), 62.60 (1C, CH2 PAB), 57.61 (1C, Cα Val), 53.08 (1C, Cα Cit), 38.96 (1C, NCH2 MC), 38.68 (1C, NCH2 Cit), 34.94 (1C, CH2CO MC), 30.39 (1C, Cβ Val), 29.39, 27.55, 26.78, 25.70, 24.91 (5C, NCH2CH2CH2CH2, CH2 Cit), 19.26, 18.18 (2C, CH3Val)
【０１０３】
2.4.  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OCOOPNP (9)の合成
6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH (42 mg、57.5μmol、1 eq)を0.85 mLの無水ピリジンに溶解させる。PNPOCOCl (35 mg、172.5μmol、3 eq)を0.6 mLの無水DCMに溶解させ、次に0℃で、ピリジン中の6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH溶液に添加する。1 h後、元の生成物は存在しない。ピリジンをトルエンで3回共蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー(15/1〜8/2のDCM/MeOH溶出液勾配)で精製し、オレンジ色の固体(5.9 mg、11%)を製造する。
生成物は、興味ある分子(すなわち、薬剤、蛍光色素など)にグラフティングするためにそのまま用いられる。
【０１０４】
2.5.  6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-MMAE (9-MMAE)の合成
6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OCOOPNP (9.0 mg, 10μmol, 1 eq)を25℃、アルゴン下で1 mLの無水DMF/ピリジン混合物(4/1)に溶解させる。この溶液に、DIPEA (1.4μL、1.2 eq)、HOBt (1.83 mg、1 eq)及びMMAE (7.2 mg、10μmol、1eq)を連続的に添加する。(HPLCでモニタリングしながら)混合物を24 h撹拌し、粗製の反応生成物を分取HPLCで精製し、黄色固体の形態にあるリンカー9-MMAE (4.3 mg、29%)を取得する。適合性を質量分析で確認する。
【０１０５】
実施例3：バイオコンジュゲーションのヘッドとしてのベンゼン誘導体
【化１１７】
0006533222.tif 000120
【０１０６】
3.1.  メチル3,5‐ビス(ブロモメチル)ベンゾエート(10)
メチル3,5-ビス(ブロモメチル)ベンゾエート(1.00g、6.09 mmol、1 eq)を無水CCl4（25 mL）中に溶解させ、混合物を還流下で加熱する。NBS (2.38 g、13.40 mmol、2.2 eq)を5等分ずつ8 hかけて添加し、その後数ミリグラムのBz2O2を添加する。混合物を一晩撹拌し、次いで濾過する。濾液を水(50 mL)、飽和NaHCO3溶液(25 mL)及び塩水(30 mL)で洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥させ、蒸発させる。残渣を25 mlの無水THFに溶解させ、亜リン酸ジエチル(1.7 mL、13.40 mmol、2.2 eq)及び無水DIPEA (2.3 mL、13.40 mmol、2.2 eq)を0℃で添加する。次に混合物を周囲温度で2日間撹拌する。蒸発させ、50 mLの冷水を添加し、エーテルで抽出する(3 x 25 mL)。合わせた有機相を1 M HCl溶液(25 mL)、塩水(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させる。減圧下で溶媒を蒸発させ、残渣を製造する。これをフラッシュクロマトグラフィー(シクロヘキサン勾配においてシクロヘキサン中5％ EtOAc)で精製し、白色の固体の形態にある10 (0.83 g、42%)を製造する。
【０１０７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.00 (d, J= 2.0 Hz, 2H; H-2, H-6), 7.62 (t, J= 2.0 Hz, 1H; H-4), 4.50 (s, 4H; CH2Br), 3.94 (s, 3H; COCH3).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 166.07 (1C, COO), 139.09 (2C, C-3, C-5), 134.00 (1C, CH-4), 131.55 (1C, C-1), 130.18 (2C, CH-2, CH-6), 52.57 (1C, OCH3), 31.99 (2C, CH2Br).
【０１０８】
3.2.  水酸化リチウムを用いる鹸化のための一般的な方法１
エステル(1 mmol)をTHF (20 mL)に溶解させ、LiOHを添加する(2.5 eq)。反応終了まで(一般的には3 h、TLCでモニタリングして確認)、反応混合物を周囲温度で撹拌する。次いで、溶液のpHが酸性(pH＝2)になるまで1 MのHClを添加し、混合物をEtOAcで抽出する(3 x 25 mL)。合わせた有機相をMgSO4で乾燥させる。減圧下での溶媒の蒸発により、対応する酸を得ることが可能になる。
【０１０９】
3.3.  HATUを用いるペプチドカップリングの一般的な方法2 
アルゴン下で酸(0.2 mmol)を無水DMF (1 mL)に溶解させ、HATU (1.2 eq)及び2,6-ルチジン(1.3 eq)を周囲温度で添加する。反応混合物を周囲温度で15〜40分間撹拌し、次いでDMF (1 mL)中のアミン(1.0 eq)溶液を添加し、反応終了まで(典型的には4時間)、アルゴン下周囲温度で混合物を撹拌する。次いで、15％クエン酸及びEtOAcの溶液を添加することにより混合物を希釈し、次いで濾過する。濾液をEtOacで3回抽出し、NaCl及びNaHCO3のそれぞれの飽和溶液で洗浄する。有機相を乾燥(MgSO4)させ、減圧下で蒸発させる。粗製の生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、所望のアミドを製造する。
【０１１０】
3.4.  三臭化リンを用いる臭素化のための一般的な方法3
アルゴン下でアルコールを無水ACNに溶解させ、次いでPBr3を添加し、反応混合物をアルゴン下60℃で16 h加熱する。冷却後、反応混合物を水で希釈し、EtOAcで3回抽出する。合わせた有機相を塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させる。減圧下で溶媒を蒸発させ、所望の対応する臭素化化合物を製造する。
【０１１１】
3.5.  3-(ブロモメチル)-5-(ヒドロキシメチル)安息香酸（11）
一般的な方法1によって10 (317 mg、0.98 mmol)から化合物11を調製し、白色の固体の形態にある11 (160 mg、66%)を製造する。
【０１１２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.21-7.97 (m, 2H, Harom), 7.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H, Harom), 4.64 (d, J = 3.0 Hz, 2H, CH2OH), 4.53 (d, J= 3.0 Hz, 2H, CH2Br).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 170.10 (1C, COO), 139.34 (1C, C-5), 137.86 (1C, C-3), 134.91 (1C, CH-4), 134.45 (1C, C-1), 130.71 (1C, C-2), 130.28 (1C, C-3), 45.10 (1C, CH2OH), 31.81 (1C, CH2Br).
【０１１３】
3.6.  メチル6-(3-(ブロモメチル)-5-(ヒドロキシメチル)ベンズアミド)ヘキサノエート(12)
一般的な方法2によって11 (50 mg、0.20 mmol)から化合物12を調製し、白色の固体の形態にある12(41 mg、54%)を製造する。
【０１１４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.78-7.50 (m, 3H, Harom), 6.35 (s, 1H, NH), 4.60 (d, J = 3.1 Hz, 2H, CH2OH), 4.49 (d, J= 3.1 Hz, 2H, CH2Br), 3.66 (s, 3H, CH3), 3.47 (dd, J= 13.0, 6.9 Hz, 2H, CH2-5), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2-1), 1.78-1.54 (m, 4H, CH2-2, CH2-3), 1.52-1.33 (m, 2H, CH2-4).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 174.28 (1C, COO), 166.53 (1C, CONH), 139.08 (1C, CAr-5), 138.75 (1C, CAr-3), 136.08 (1C, CAr-1), 131.98 (1C, CAr-2), 127.62 (1C, CAr-2), 127.17 (1C, CAr-6), 51.71 (1C, CH2OH), 45.36 (1C, CH-5), 39.90 (1C, CH-1), 33.88 (1C, CH2Br), 32.19 (1C, CH3), 29.21 (1C, CH-2), 26.40 (1C, CH-3), 24.37 (1C, CH-4).
【０１１５】
3.7.  6-(3-(ブロモメチル)-5-(ヒドロキシメチル)ベンズアミド)ヘキサン酸(13)
一般的な方法1によって12 (215 mg、0.58 mmol)から化合物13を調製し、静電性の白色の固体の形態にある13 (160 mg、77%)を製造する。
【０１１６】
HRMS: m/z 予測値: 356.0576 [M + H]+, 実測値: 356.0578.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.0 (bs, 1H, COOH), 8.57 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NH), 7.92-7.61 (m, 3H, Harom), 4.90-4.67 (m, 4H, CH2Br, CH2OH), 3.24 (dd, J = 12.8, 6.8 Hz, 2H, CH2-5), 2.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2-1), 1.62-1.42 (m, 4H, CH2-2, CH2-3), 1.40-1.23 (m, 2H, CH2-4).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 174.50 (1C, COO), 165.21 (1C, CONH), 138.35 (1C, CAr-5), 135.60 (1C, CAr-3), 133.92 (1C, CAr-1), 131.59 (1C, CAr-2), 127.58 (1C, CAr-6), 45.48 (1C, CH2OH), 39.15 (1C, CH-5), 33.62 (2C, CH-1, CH2Br), 28.81 (1C, CH-2), 26.05 (1C, CH-3), 24.27 (1C, CH-4).
【０１１７】
3.8.  6-(3,5-ビス(ブロモメチル)ベンズアミド)ヘキサン酸(14) 
一般的な方法3によって13 (20 mg、0.006 mmol)から化合物14を調製し、オフホワイトの固体の形態にある14 (24 mg、定量的)を製造する。
【０１１８】
HRMS: m/z 予測値: 419.9732 [M + H]+, 実測値: 419.9808.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.8 (bs, 1H, COOH), 8.57 (s, 1H, NH), 7.92-7.62 (m, 3H, Harom), 4.78 (dd, J = 20.8, 3.3 Hz, 4H, 2 x CH2Br), 3.32-3.06 (m, 2H+water, CH2-5), 2.21 (t, J= 7.3 Hz, 2H, CH2-1), 1.65-1.41 (m, 4H, CH2-2, CH2-3), 1.40-1.23 (m, 2H, CH2-4).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 174.50 (1C, COO), 165.21 (1C, CONH), 138.37 (1C, CAr-5), 135.58 (1C, CAr-3), 132.00 (1C, CAr-1), 131.58 (1C, CAr-2), 127.58 (1C, CAr-6), 45.57 (1C, CH2OH), 39.08 (1C, CH-5), 33.73 (3C, CH-1, CH2Br), 28.89 (1C, CH-2), 26.04 (1C, CH-3), 24.32 (1C, CH-4).
【０１１９】
3.9.  6-(3,5-ビス(ブロモメチル)ベンズアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH (15)
一般的な方法2によって14 (124 mg、0.29 mmol)から化合物15を調製し、ベージュ色の固体の形態にある15(30 mg、13%)を製造する。
【０１２０】
HRMS: m/z 予測値: 781.1846 [M + H]+, 実測値: 781.1907.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 9.95 (s, 1H, NH PAB), 8.71-8.50 (m, 1H, CONHCit), 8.10 (d, J= 7.5 Hz, 1H, CONH Val), 8.04-7.55 (m, 3H, Harom), 7.55, 7.22 (2d, J= 8.5 Hz, 4H, Ar PAB), 6.06 (t, J= 5.6 Hz, 1H, NH Cit), 5.45 (br s, 2H, NH2 Cit), 5.12 (br s, 1H, OHPAB), 4.82 (s, 4H, 2 x CH2Br), 4.46-4.32 (m, 3H, CH2 PAB, Hα Cit), 4.26-4.13 (m, 1H, Hα Val), 3.24 (dd, J= 12.8, 6.6 Hz, CH2-5), 3.10-2.84 (m, 2H, NCH2 Cit), 2.29-2.07 (m, 2H, CH2-1), 1.97 (dq, J= 13.7, 6.6 Hz, 1H, Hβ Val), 1.80-1.05 (m, 10H, CH2CH2 Cit, NCH2CH2CH2CH2), 0.83 (dd, J = 8.9, 7.0 Hz, 6H, CH3Val).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 172.44, 171.29, 170.42, 165.18, 165.02, 158.94, 151.89, 151.12, 139.24, 138.32, 138.28, 137.56, 137.41, 135.59, 135.45, 134.46, 133.79, 132.58, 131.55, 129.41, 128.86, 128.73, 128.60, 127.59, 126.92, 121.31, 120.73, 118.86, 81.78, 62.60, 57.67, 53.08, 48.61, 45.49, 45.36, 38.56, 35.17, 30.37, 29.36, 28.86, 26.79, 26.19, 25.23, 19.26, 18.23.
【０１２１】
実施例4：バイオコンジュゲーションのヘッドとしてのピリジン誘導体
【化１１８】
0006533222.tif 000121
【０１２２】
4.1.  メチル2,6-ビス(ヒドロキシメチル)イソニコチネート(16)
アルゴン下でメチルイソニコチネート(2.12 mL、18 mmol)をMeOH/H2O: 1/1混合物(40 mL)に溶解させ、次いでH2SO4(78μl)を添加し、混合物を30分間撹拌する。次いで、過硫酸アンモニウム(32 g、144 mmol)及び塩化鉄四水和物(0.89 g、4.5 mmol)を0℃で注意深く添加し、混合物を50℃で一晩加熱する。反応混合物を冷却した後、懸濁液を濾過し、固体を少量のEtOAcで洗浄する。MeOHが全て除去されるまで、濾液を減圧下で濃縮する。媒体をNa2CO3で塩基性にし、次いでEtOAcで抽出する。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。粗製の生成物をフラッシュクロマトグラフィー(DCM勾配においてDCM中10％MeOH)で精製し、暗褐色の固体の形態にある16 (0.54g、15%)を製造する。
【０１２３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.82 (s, 2H, Harom), 4.88 (s, 4H, CH2OH), 3.98 (s, 3H, CH3).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 165.57 (1C, COOCH3), 160.00 (1C, C-1), 150.47 (2C, C-3, C-5), 118.77 (2C, C-2, C-6), 64.54 (2C, CH2OH), 52.98 (1C, CH3).
【０１２４】
4.2.  メチル2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチネート(17)
一般的な方法3によって16 (120 mg、0.61 mmol)から化合物17を調製し、明るいピンク色の固体の形態にある17 (141 mg、72%)を製造する。
【０１２５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.92 (s, 2H, Harom), 4.58 (s, 4H, CH2Br), 3.98 (s, 3H, CH3).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 164.8 (1C, COOCH3), 158.0 (1C, C-1), 139.8 (2C, C-3, C-5), 122.3 (2C, C-2, C-6), 53.0 (1C, CH3), 32.8 (2C, CH2Br).
【０１２６】
4.3.  2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチン酸(18)
一般的な方法1によって17 (137 mg、0.42 mmol)から化合物18を調製し、オレンジ色の固体の形態にある18(133 mg、定量的)を製造する。
【０１２７】
HRMS: m/z 予測値: 307.88441 [M + H]+, 実測値: 307.8917.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 7.92 (s, 2H, Harom), 4.79 (s, 4H, CH2Br), 3.35 (s, 3H, CH3).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 165.9 (1C, COOCH3), 158.6 (1C, C-1), 141.0 (2C, C-3, C-5), 122.7 (2C, C-2, C-6), 34.3 (2C, CH2Br).
【０１２８】
4.4.  メチル6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサノエート(19)
一般的な方法2によって18 (260 mg、0.84 mmol)から化合物19を調製し、黄色の固体の形態にある19 (218 mg、59％)を製造する。
【０１２９】
HRMS: m/z 予測値: 434.9841 [M + H]+, 実測値: 434.9906.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.70 (s, 2H, Harom), 6.41 (s, 1H, NH), 4.58 (s, 4H, CH2Br), 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.50 (dd, J= 13.5, 7.0 Hz, 2H, CH2-5), 2.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2-1), 1.68 (dq, J = 13.5, 7.0 Hz, 4H, CH2-2, CH2-4), 1.54-1.34 (m, 2H, CH2-3).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ(ppm) 173.1 (1C, COOCH3), 157.8 (1C, CONH), 155.0 (2Cpyridine, C-4, C-6), 120.3 (2Cpyridine, C-3, C-5), 51.7 (1C, CH3), 39.8 (1C, CH2-5), 33.6 (1C, CH2-1), 32.9 (2C, CH2Br), 28.8 (1C, CH2-4), 26.1 (1C, CH2-3), 24.0 (1C, CH2-2).
【０１３０】
4.5.  6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサン酸(20)
一般的な方法1によって19 (216 mg、0.50 mmol)から化合物20を調製し、オフホワイトの固体の形態にある20 (201 mg、96％)を製造する。
【０１３１】
HRMS: m/z 予測値: 420.9684 [M + H]+, 実測値: 420.9748.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.01 (s, 1H, COOH), 8.83 (t, J = 6.2 Hz, 1H, NH), 7.84 (s, 2H, Harom), 4.74 (s, 4H, CH2Br), 3.6 (dd, J = 12.6, 6.2 Hz, 2H, CH2-5), 2.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2-1), 1.67-1.43 (m, 4H, CH2-2, CH2-4), 1.54-1.34 (dd, J= 8.2, 4.6 Hz, 2H, CH2-3).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 174.9 (1C, COOH), 164.3 (1C, CONH), 158.0 (2Cpyridine, C-CH2Br), 144.6 (1Cpyridine, C-CONH), 121.3 (2Cpyridine, CH), 39.5 (1C, CH2-5), 34.6 (2C, CH2Br), 34.0 (1C, CH2-1), 29.0 (1C, CH2-4), 26.4 (1C, CH2-3), 24.7 (1C, CH2-2).
【０１３２】
4.6.  4-ニトロフェニル6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサノエート(21)
アルゴン下周囲温度で、酸20 (70 mg、0.17 mmol)を無水CH2Cl2 (2.1 mL)に溶解させ、この混合物に、DMAP(触媒量)、p-ニトロフェノール(30 mg、1.3 eq)及びDCC (45 mg、1.3 eq)を連続的に添加する。アルゴン雰囲気下周囲温度で16時間反応混合物を撹拌し、次いで濾過する。濾液を減圧下で濃縮し、粗製の生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シクロヘキサン勾配においてシクロヘキサン中40％EtOAc)により精製し、淡黄色の固体の形態にある21 (56 mg、62%)を製造する。生成物は、1H NMRにより確認され、次のステップにおいてそのまま用いられる。
【０１３３】
HRMS: m/z 予測値: 541.9848 [M + M]+, 実測値: 541.9918.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.34-8.21 (m, 2H, Harom PNP), 7.67 (s, 2H, Harom pyridine), 7.35-7.18 (m, 2H, Harom PNP), 6.29 (s, 1H, NH), 4.56 (s, 4H, CH2Br), 3.52 (dd, J = 13.0, 7.0 Hz, 1H, CH2-5), 2.66 (t, J = 7.0 Hz, 1H, CH2-1), 1.91-1.45 (m, 6H, CH2-2, CH2-3, CH2-4).
【０１３４】
4.7.  6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH (22)
アルゴン雰囲気下周囲温度で、4-ニトロフェニル6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサノエート21（56 mg、0.10 mmol）を2.0 mLのDMFに溶解させる。5分後、H-Val-Cit-PAB-OH (20 mg、0.05 mmol)を添加し、反応混合物を5 h撹拌する。次いで、DMFを凍結乾燥により除去し、粗製の生成物をフラッシュクロマトグラフィー(DCM勾配においてDCM中10％MeOH)で精製し、淡黄色の固体の形態にある22(8.5 mg、20%)を製造する。生成物は、1H NMRにより確認され、次のステップにおいてそのまま用いられる。
【０１３５】
HRMS: m/z 予測値: 781.1798 [M + M]+, 実測値: 782.1873.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 9.90 (s, 1H, NH PAB), 8.83 (d, J= 5.7 Hz, 1H, CONH Cit), 8.07 (d, J= 7.5 Hz, 1H, CONH Val), 7.84 (s, 4H, 2CHpyridine), 7.54, 7.22 (2d, J= 8.5 Hz, 4H, Ar PAB), 5.98 (br t, J= 5.7 Hz, 1H, NH Cit), 5.42 (br s, 2H, NH2Cit), 5.11 (br s, 1H, OH PAB), 4.73 (s, 4H, 2 x CH2Br), 4.48-4.31 (m, 3H, CH2 PAB, Hα Cit), 4.19 (dd, J= 7.0 Hz, J= 8.5 Hz, 1H, HαVal), 3.48-3.12 (water, CH2-5), 3.06-2.89 (m, 2H, NCH2 Cit), 2.18 (dd, J = 14.5, 6.5 Hz, 2H, CH2-1), 2.04-1.86 (m, 1H, Hβ Val), 1.79-1.21 (m, 10H, CH2CH2 Cit, NCH2CH2CH2CH2), 0.83 (dd, J = 8.9, 6.8 Hz, 6H, CH3Val).
【０１３６】
4.8.  メチルヒドロクロリド6-アミノヘキサノエート(23)
アルゴン雰囲気下0℃で、SOCl2 (1.22 mL, 16.7 mmol)をMeOH (10 ml)にゆっくりと添加し、反応混合物を20分間撹拌する。この溶液に0℃で6-アミノカプロン酸(1.00 g、7.6 mmol)を添加し、混合物を3.5 h撹拌する。減圧下で揮発性物質を除去し、残渣をヘプタン/EtOAc/MeOH混合物から再結晶させ、所望のエステル23 (1.36 g)を定量的収率で得る。
【０１３７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.84 (s, 1H, NH), 3.58 (s, 3H, OCH3), 2.85-2.65 (m, 2H, CH2-1), 2.30 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2-1), 1.65-1.36 (m, 4H, CH2-2, CH2-4), 1.31 (ddd, J = 11.9, 7.3, 2.3 Hz, 2H, CH2-3).
【０１３８】
実施例5：バイオコンジュゲーション-ジスルフィドブリッジの再構築
5.1.  バイオコンジュゲーションの一般的な方法4
所望の抗体の溶液を取る。TCEPにより鎖間ジスルフィドブリッジを還元し(RP-HPLCにより確認)、適切なリンカーの溶液を添加する。適切な反応時間経過後(軽鎖及び重鎖の消失並びにジスルフィドブリッジの再構築はRP-HPLCでモニタリングする)、修飾された粗製の抗体をSephadex PD-10カラムで精製する。
【０１３９】
【化１１９】
0006533222.tif 000122
【０１４０】
5.2.  トラスツズマブ-(maldiBr-リンカー7)424
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、非開裂性の3,4-ジブロモマレイミドリンカー7を用いて、37℃で1 h修飾する。
【化１２０】
0006533222.tif 000123
【０１４１】
PBS緩衝液中のTCEP (20 eq)溶液をトラスツズマブ溶液に添加する。分析のためのフラクションを採取し、ジスルフィドブリッジの破壊を確認する。混合物を15分間撹拌し、次いでDMSO中の6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸 (20 eq)溶液を添加する。反応混合物を30分間撹拌し、次いでRP-HPLCで分析する(図5)。
MALDI-TOF質量分析(図2)により、反応混合物(緑色)が、４つの6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサン酸リンカーの抗体へのグラフティングにより得られた種を89％含む；平均グラフティングは4.0であることを確認する。
【０１４２】
5.3.  トラスツズマブ-(maldiBr-リンカー8)425
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、開裂性の3,4-ジブロモマレイミドリンカー8を用いて、35℃で1 h修飾する。
【化１２１】
0006533222.tif 000124
【０１４３】
PBS緩衝液中のTCEP (20 eq)溶液をトラスツズマブ溶液に添加する。混合物を15分間撹拌し、次いでDMSO中の6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OH (20 eq)溶液を添加する。反応混合物を30分間撹拌し、次いでPD-10カラムで精製し、化学的試薬を除去した後、混合物をRP-HPLC (図6)及びHIC-HPLC (図3)によって分析する。
【０１４４】
5.4.  トラスツズマブ-(maldiSPh-リンカー26)427
リンカー26を、WO2013132268号と類似の方式で、ジブロモマレイミドリンカー8又はジチオフェニルマレイミドリンカー26を用いるジスルフィドブリッジ再構築の比較のために合成する。
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、開裂性の3,4-ジチオフェニルマレイミドリンカー8を用いて、41℃で48 h修飾する。
【化１２２】
0006533222.tif 000125
【０１４５】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図7)。
【０１４６】
5.5.  トラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー20)428
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、非開裂性の6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサン酸リンカー20を用いて、41℃で24 h修飾する。
【化１２３】
0006533222.tif 000126
【０１４７】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図8)。
【０１４８】
5.6.  トラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー22)429
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、開裂性の6-(2,6-ビス(ブロモメチル)イソニコチンアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカー22を用いて、41℃で24 h修飾する。
【化１２４】
0006533222.tif 000127
【０１４９】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図9)。
【０１５０】
5.7.  トラスツズマブ-(PydiMediBr-リンカー15)430
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、開裂性の6-(3,5-ビス(ブロモメチル)ベンズアミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-OHリンカー15を用いて、41℃で72 h修飾する。
【化１２５】
0006533222.tif 000128
【０１５１】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図10)。
【０１５２】
5.8.  リツキシマブ-(maldiBr-リンカー7)431
リツキシマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、非開裂性のリンカー7を用いて、37℃で1 h修飾する。
【化１２６】
0006533222.tif 000129
【０１５３】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図11)。
【０１５４】
5.9.  トラスツズマブ-(maldiBr-リンカー9-MMAE)432
トラスツズマブを還元し、次いで一般的な方法4に従って、開裂性の6-(3,4-ジブロモマレイミド)ヘキサンアミド-Val-Cit-PAB-MMAEリンカー9-MMAEを用いて、37℃で24 h修飾する。
【化１２７】
0006533222.tif 000130
【０１５５】
次いで、反応混合物をRP-HPLCにより分析する(図12)。
【０１５６】
5.10.  分析用データのための追加実験データ
a- RP-HPLC
AERIS WIDEPORE 3.6μM XB-C8カラム(250 x 4.6 mm)を用いて、変性条件及び還元条件下でADCを分析した。流速1 mL／分、炉温80℃、注入量20μL/サンプルであった。溶出方法に関しては、２つの溶媒を用いた：A, 水中0.05％トリフルオロ酢酸；B, アセトニトリル中0.04％トリフルオロ酢酸。方法は以下のとおりであった：25％Bアイソクラティックを3分間、25〜50％Bの線形勾配を25分間、50〜95％Bの線形勾配を2分間、95％〜25％Bの線形勾配を1分間、その後25％Bアイソクラティックを8分間。
【０１５７】
b- HIC-HPLC
TOSOH BIOSCIENCE 2.5μM T SKgel butyl-NPRカラム (100 x 4.6 mm)を用いて、非変性条件でADCを分析した。流速1 mL/分、炉温80℃、注入量30μL/サンプルであった。溶出方法に関しては、２つの溶媒を用いた：A, 50 mMリン酸緩衝液(pH 7)中1.5 M (NH4)2SO4及びB, 50 mMリン酸緩衝液/iProH混合物：80/20。方法は以下のとおりであった：0％B〜80％Bの線形勾配を44分、次いで80〜0％Bの線形勾配を1分、次いで0％Bアイソクラティックを10分。
【図１】
0006533222.tif 000171
【図２】
0006533222.tif 000172
【図３】
0006533222.tif 000173
【図４】
0006533222.tif 000174
【図５】
0006533222.tif 000175
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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