(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓水解物を有効成分とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤（但し、メタボリックシンドロームの予防改善剤としての使用を除く）。
【請求項２】
肝臓水解物を有効成分とする血中乳酸低下剤。
【請求項３】
肝臓水解物を有効成分とする乳酸アシドーシス予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤、運動能力向上剤及び血中乳酸低下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、細胞内のエネルギー源であるＡＴＰが減少し、ＡＭＰの割合が増加した際に、ＡＭＰで活性化されるタンパク質リン酸化酵素である。ＡＭＰＫが活性化されることにより、基質タンパク質群の活性が変化し、ＡＴＰ産生の促進とＡＴＰ消費の抑制を誘導して、ＡＴＰレベルを回復させる。すなわち、ＡＭＰＫが活性化されると、糖、脂肪、蛋白質の合成の抑制と、糖、脂肪、蛋白質の分解の増加によりＡＴＰが産生される。そのため、ＡＭＰＫ活性化は、運動をすることと同じように、肥満や２型糖尿病等の予防や治療にも有効とされている。
また、ＡＭＰＫの活性化により、がん抑制遺伝子であるｐ５３が活性化されること、脂肪酸やコレステロールの合成に必要なアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性が阻害されること等から、ＡＭＰＫの活性化はがん細胞の発生や増殖を抑制することも知られている。【０００３】
このようなＡＭＰＫ活性化剤としては、アミノイミダゾールカルボキサミドリボ核酸（ＡＩＣＡＲ）や糖尿病治療薬であるメトホルミン等が知られている（非特許文献１）。また、リジンやローズマリー又はセージの抽出物にもＡＭＰＫ活性化作用があることが知られている(特許文献１、２)。一方、チロシンが持久力向上効果、抗疲労効果を有することも知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２０８０８１号公報
【特許文献２】特開２００８−２４７８５６号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／０４１６４７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.,Vol273,E1107-E1112,1997 J.Clin.Invest.,Vol.108,p.1167-1174,2001
【非特許文献２】ゴスペール(登録商標)レバー腸溶錠  添付文書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のＡＭＰＫ活性化剤には、副作用の危険性があること、またＡＭＰＫ活性化作用が充分ではないことなどの問題があった。
従って、本発明の課題は、安全性の高い新たなＡＭＰＫ活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、新たなＡＭＰＫ活性化剤を開発すべく種々検討したところ、全く意外にも、慢性肝疾患における肝機能の改善薬として知られている肝臓水解物（非特許文献２）が、優れたＡＭＰＫ活性化作用を有し、さらに運動能力向上作用、血中乳酸低下作用、疲労予防改善作用、グリコーゲン温存作用を有することを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２０〕を提供するものである。
〔１〕肝臓水解物を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤。
〔２〕肝臓水解物を有効成分とする運動能力向上剤。
〔３〕肝臓水解物を有効成分とする血中乳酸低下剤。
〔４〕肝臓水解物を有効成分とする乳酸アシドーシス予防剤。
〔５〕肝臓水解物を有効成分とするグリコーゲン温存剤。
〔６〕ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化するための肝臓水解物。
〔７〕運動能力を向上するための肝臓水解物。
〔８〕血中乳酸を低下させるための肝臓水解物。
〔９〕乳酸アシド−シスを予防するための肝臓水解物。
〔10〕グリコーゲンを温存するための肝臓水解物。
〔11〕ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔12〕運動能力向上剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔13〕血中乳酸低下剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔14〕乳酸アシド−シス予防剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔15〕グリコーゲン温存剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔16〕肝臓水解物を投与することを特徴とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼの活性化方法。
〔17〕肝臓水解物を投与することを特徴とする運動能力向上方法。
〔18〕肝臓水解物を投与することを特徴とする血中乳酸低下方法。
〔19〕肝臓水解物を投与することを特徴とする乳酸アシド−シスの予防方法。
〔20〕肝臓水解物を投与することを特徴とするグリコーゲン温存方法。
〔21〕肝臓水解物を有効成分とする疲労予防改善剤。
〔22〕疲労を予防改善するための肝臓水解物。
〔23〕疲労予防改善剤製造のための肝臓水解物の使用。
〔24〕肝臓水解物を投与することを特徴とする疲労予防改善方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安全で優れたＡＭＰＫ活性化剤、運動能力向上剤、血中乳酸低下剤、乳酸アシドーシス予防剤、疲労予防改善剤、グリコーゲン温存剤、ひいてはメタボリックシンドローム予防改善剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】行動実験プロトコールを示す。
【図２】グリコーゲン測定用サンプル採取プロトコールを示す。
【図３】強制歩行（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｗａｌｋｉｎｇ：ＦＷ）負荷前肝臓水解物（ＬＨ）投与における自発運動量（Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する影響を示す図である。
【図４】強制歩行（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｗａｌｋｉｎｇ：ＦＷ）負荷後肝臓水解物（ＬＨ）投与における自発運動量（Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する影響を示す図である。
【図５】強制歩行（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｗａｌｋｉｎｇ：ＦＷ）負荷前後肝臓水解物（ＬＨ）投与における自発運動量（Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する影響を示す図である。
【図６】強制歩行（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｗａｌｋｉｎｇ：ＦＷ）負荷前後ＡＩＣＡＲ投与(ｉ.ｐ.)における自発運動量（Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する影響を示す図である。
【図７】肝臓及びヒラメ筋ＡＭＰＫリン酸化に対する肝臓水解物（ＬＨ）の影響を示す図である。
【図８】肝臓及びヒラメ筋のグリコーゲン量に対する肝臓水解物（ＬＨ）の影響を示す図である。
【図９】血中乳酸値に対する肝臓水解物（ＬＨ）の影響を示す図である。
【図１０】実施例２の実験プロトコールを示す。
【図１１】肝臓水解物（ＬＨ）投与が自発運動量に対する影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のＡＭＰＫ活性剤、運動能力向上剤、血中乳酸低下剤、乳酸アシドーシス予防剤、疲労予防改善剤、グリコーゲン温存剤（以下、ＡＭＰＫ活性化剤等ともいう）の有効成分は、肝臓水解物である。肝臓水解物は、肝臓加水分解物、肝臓エキス、肝臓分解エキス、肝水解物とも呼ばれるが、肝臓を消化酵素等により加水分解して得られるものであり、肝機能の改善薬として用いられているものである。原料である肝臓としては、ウシ、ブタ、カツオ、クジラ等の新鮮な肝臓が用いられる。得られた加水分解物は、濃縮して用いるのが好ましい。好ましくは、前記医薬品として定められている肝臓水解物が挙げられる。
【００１２】
肝臓水解物には、低分子ペプチドを主成分として各種アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミン、ミネラル等を含む。より詳細には、アミノ酸  １９〜７８質量％、ペプチド及びタンパク  １７〜７３質量％、糖類  １．８〜１１質量％、脂質  ０.００５〜０．０４質量％、核酸  ０.７〜２．５質量％、無機物  １．６〜５．４質量％、ビタミン  ０．０３〜０．２質量％、グルタチオン０.８質量％以下を含むものが好ましい。また、アミノ酸  ２３〜６５質量％、ペプチド及びタンパク  ２０〜６１質量％、糖類  ２．２〜８．６質量％、脂質  ０.００６〜０．０３５質量％、核酸  ０.９〜２．１質量％、無機物  １．９〜４．５質量％、ビタミン  ０．０４〜０．１５質量％、グルタチオン０．７質量％以下を含むものがより好ましく、アミノ酸  ２９〜５２質量％、ペプチド及びタンパク  ２５〜４９質量％、糖類  ２．８〜６．９質量％、脂質  ０.００８〜０．０３質量％、核酸  １．１〜１．７質量％、無機物  ２．４〜３．６質量％、ビタミン  ０．０５〜０．１２質量％、グルタチオン０．６質量％以下を含むものが更に好ましい。
【００１３】
これらの成分のうち、アミノ酸組成としては、Ａｌａ  １７〜６８mg／ｇ、Ａｒｇ  ０．６〜４．４mg／ｇ、Ａｓｐ  ９〜４８mg／ｇ、Ｃｙｓｔｉｎｅ  ５mg／ｇ以下、Ｇｌｕ  １８〜６３mg／ｇ、Ｇｌy １０〜３９mg／ｇ、Ｈｉｓ  ３〜１７mg／ｇ、Ｉｌｅ  １４〜５６mg／ｇ、Ｌｅｕ  ２６〜９８mg／ｇ、Ｌｙｓ  １５〜６５mg／ｇ、Ｍｅｔ  ０．３〜２０mg／ｇ、Ｐｈｅ  １３〜４６mg／ｇ、Ｐｒｏ  １０〜４８mg／ｇ、Ｓｅｒ  １２〜４９mg／ｇ、Ｔｈｒ  １２〜４５mg／ｇ、Ｔｒｐ  ３〜１３mg／ｇ、Ｔｙｒ  １．６〜４１mg／ｇ、Ｖａｌ  １８〜７１mg／ｇが好ましい。また、Ａｌａ  ２１〜５７mg／ｇ、Ａｒｇ  ０．８〜３．６mg／ｇ、Ａｓｐ  １１〜４０mg／ｇ、Ｃｙｓｔｉｎｅ  ４mg／ｇ以下、Ｇｌｕ  ２２〜５３mg／ｇ、Ｇｌｙ  １３〜３２mg／ｇ、Ｈｉｓ  ４〜１４mg／ｇ、Ｉｌｅ  １７〜４７mg／ｇ、Ｌｅｕ  ３２〜８２mg／ｇ、Ｌｙｓ  １８〜５４mg／ｇ、Ｍｅｔ  ０．４〜１７mg／ｇ、Ｐｈｅ  １５〜３８mg／ｇ、Ｐｒｏ  １２〜４０mg／ｇ、Ｓｅｒ  １５〜４１mg／ｇ、Ｔｈｒ  １４〜３８mg／ｇ、Ｔｒｐ  ３．８〜１１mg／ｇ、Ｔｙｒ  １．９〜３４mg／ｇ、Ｖａｌ  ２１〜５９mg／ｇがより好ましく、Ａｌａ  ２６〜４５mg／ｇ、Ａｒｇ  １〜２．９mg／ｇ、Ａｓｐ  １４〜３２mg／ｇ、Ｃｙｓｔｉｎｅ  ３mg／ｇ以下、Ｇｌｕ  ２７〜４２mg／ｇ、Ｇｌy １６〜２６mg／ｇ、Ｈｉｓ  ５〜１１mg／ｇ、Ｉｌｅ  ２１〜４０mg／ｇ、Ｌｅｕ  ４０〜６６mg／ｇ、Ｌｙｓ  ２２〜４３mg／ｇ、Ｍｅｔ  ０．５〜１４mg／ｇ、Ｐｈｅ  １９〜３１mg／ｇ、Ｐｒｏ  １５〜３２mg／ｇ、Ｓｅｒ  １８〜３３mg／ｇ、Ｔｈｒ  １８〜３０mg／ｇ、Ｔｒｐ  ４．８〜８．４mg／ｇ、Ｔｙｒ  ２．４〜２７mg／ｇ、Ｖａｌ  ２７〜４８mg／ｇが更に好ましい。
【００１４】
肝臓水解物は、前記の如く、肝機能の改善効果を有することは知られているが、ＡＭＰＫに対する作用、運動能力に対する作用、及び血中乳酸値に対する作用はいずれも全く知られていない。
【００１５】
後述の実施例に示すように、肝臓水解物は、優れたＡＭＰＫ活性化作用を有する。また、肝臓水解物は、ＡＭＰＫ活性化作用に基づき、肥満や２型糖尿病等のメタボリックシンドロームの予防改善剤としても有用である。また、運動能力向上作用（自発運動促進作用）、血中乳酸低下作用（運動による血中乳酸値上昇抑制作用）、疲労予防改善作用、グリコーゲン温存作用等を有し、さらには乳酸アシドーシス予防効果を有する。従って、肝臓水解物を含有する組成物は、ヒトを含む哺乳類におけるＡＭＰＫ活性化剤、運動能力向上剤、自発運動促進剤、血中乳酸低下剤、乳酸アシドーシス予防剤、肥満、２型糖尿病等のメタボリックシンドローム予防改善剤、疲労予防改善剤、グリコーゲン温存剤として有用である。また、肝臓水解物はメトホルミン等の医薬に比べて安全性が高く、長期間投与できる点で有用である。
【００１６】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤等は、経口投与、経皮投与、経腸投与、経静脈投与等によって投与できるが、経口投与がより好ましい。経口投与用の製剤としては、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられるが、液剤、錠剤が好ましく、液剤がより好ましい。
【００１７】
これらの経口投与製剤とするには、乳糖、マンニトール、トウモロコシデンプン、結晶セルロースなどの賦形剤、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、非イオン界面活性剤等の溶解補助剤、矯味剤、甘味剤、安定化剤、pH調整剤、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等を使用することができる。また、ヒドロキシメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタクリレートコポリマーなどの被覆剤を用いてもよい。
【００１８】
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等には、他の有効成分を配合することもできる。他の有効成分としては、ビタミンＢ1類； チアミン、硝酸チアミン、塩酸チアミン、フルスルチアミン、ビスベンチアミン、ベンホチアミン、チアミンジスルフィド、ジセチアミン、チアミンプロピルジスルフィド及びこれらの誘導体、ビタミンＢ2類； リボフラビン及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ3類； ナイアシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ5類； パンテノール、パントテン酸及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ6類； ピリドキシン及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ12類； シアノコバラミン及び誘導体並びにそれらの塩、その他のビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン、タウリン、コンドロイチン硫酸、ローヤルゼリー、カフェイン、ウコン、マリアアザミ、タンポポ、西洋タンポポ、ゴボウ、ニンニク、キク、西洋ノコギリソウ、クチナシ、ゴマ、田七ニンジン、アスパラガス、タマネギ、チコリ、薬用サルビア、朝鮮アザミ（アーティチョーク）、クコ、マメ科・アヤメ科の植物、ミヤマウズラ、エルバ・デ・パサリーニョ、セテサングリア、アガメガシワ、紅茶、レスベラトロール、カテキン類、ベルベリン、ローズマリー、豆エキス、メトホルミン等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等は、医薬品の外、医薬部外品、特定保健用食品、機能性食品、スポーツ飲料、リハビリ用飲料、ペットフード等としても使用可能である。
【００２０】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤等における肝臓水解物の含有量は、投与形態によっても異なるが、通常、乾燥重量として０．００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましい。また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等における肝臓水解物の１日投与量は、乾燥重量として１０ｍｇ〜２０００ｍｇが好ましく、５０ｍｇ〜１０００ｍｇがより好ましく、１００ｍｇ〜６００ｍｇがさらに好ましい。
【００２１】
後述の実施例に示すように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等の効果は、経口投与後速やかに得られることから、極めて速効性である。また、リジンやチロシン（特許文献２、３）に比べて低用量で有効である。従って、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等は、運動前、運動中や運動後に飲用して運動能力向上効果、血中乳酸値低下効果、疲労予防改善効果、グリコーゲン温存効果を奏する。また、運動前に４〜１４日間程度連続して飲用してもよい。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２３】
実施例１
Ａ．実験材料及び方法
（１）使用動物
実験には、体重２８〜３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本エスエルシー）を使用し、実験に供ずるまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００〜１９：００、暗期１９：００〜７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０cm×横２０cm×高さ１３cm）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。【００２４】
（２）使用薬物及び調整法
精製水、肝臓水解物（Liver Hydrolysate:以下ＬＨという）を使用し、調製方法はＬＨを精製水に溶解し、３０mg／kg、１００mg／kgの用量にした。これを体重１０ｇ当たり０．１mLの割合で経口投与（ｐ．ｏ）した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群には精製水を経口投与した。参考例として、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲ(5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-D-リボヌクレオシド)は、生理食塩液に溶解し、６．２５mg／kg、１２．５mg／kg、２５mg／kg、５０mg／kgの用量にし、体重１０g当たり０．１mLの割合で腹腔内投与(ｉ.ｐ)した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群は、生理食塩液を腹腔内投与した。
使用した肝臓水解物に含まれる成分及びアミノ酸組成を表１に示した。【００２５】
【表１】
0006451631.tif 000002
【００２６】
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５cmの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４cm×横１７cm×高さ１２cm）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
試薬は、疲労予防効果並びに疲労改善効果を観察するため強制歩行負荷前、後および前後に投与した。
（５）ＡＭＰＫリン酸化量の測定
肝臓及びヒラメ筋１５ｍｇをLysis bufferに溶解した後に９５℃で１０分間熱処理することでウェスタンブロッティング用のサンプルとした。サンプルは１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、分離したタンパク質をpolyvinylidene difluoride（ＰＶＤＦ）膜へセミドライ式トランスファー装置（ＡＴＴＯ）を用いてトランスファーした。トランスファーしたＰＶＤＦ膜を２％スキムミルク含有ＴＢＳＴ（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００mM  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，pH７．４）を用いて室温で３０分間ブロッキングした後、２％スキムミルク含有ＴＢＳＴで希釈した下記の一次抗体とそれぞれ一晩４℃でインキュベーションした。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、ＴＢＳＴで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology，１０，０００倍希釈）を室温にて２時間インキュベーションした後、化学発光検出キット（ECLTM Western Blotting detection reagent，GE Healthcare）を用いて、ＨＲＰと基質により生じた化学発光を化学発光検出フィルム（HyperfilmMP, GE Healthcare）に感光させて検出した。検出後、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用し、定量を行い、これにより算出したＣｏｎｔｒｏｌ群の値を１として、ＡＭＰＫ値を出した。【００２７】
一次抗体
・抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）抗体（Cell Signaling Technology，１，０００倍希釈）
・抗ＡＭＰＫα抗体（Cell Signaling Technology，１，０００倍希釈）【００２８】
（６）グリコーゲン量の測定
測定にはGlycogen assay kit（Bio Vision社）を使用し、下記のプロトコールに準じて行った。
ｉ）氷上にてマウスの肝臓又はヒラメ筋１０mgにミリＱを加え、ホモジネートになるまで５分間ボイルし、遠心分離（４℃，１３００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した後、上清にHydrolysis Buffer（１：１００）を加え、これをサンプルとした。
ii）９６穴プレートにグリコーゲン及びHydrolysis Bufferを加え、グリコーゲンスタンダードとした。
iii)さらに、サンプルを加え、Hydrolysis Enzyme Mixをサンプル及びスタンダードに加え、室温で３０分インキュベートした。
iv）Reaction Mixを作成し、サンプル及びスタンダードに加え、光を避けて室温で３０分インキュベートした。
ｖ）Magellan６にて５７０ｍの波長で測定。
vi）スタンダード値から検量線を求め、サンプルのグリコーゲン量を算出した。【００２９】
（７）血中乳酸値の測定
測定にはラクテート・プロ２（アークレイ株式会社）を使用し、付属のプロトコールに準じて行った。【００３０】
（８）行動実験プロトコール
図１のように行った。
（９）ＡＭＰＫ、グリコーゲン測定用サンプル採取プロトコール
図２のように行った。【００３１】
精製水、ＬＨを体重１０ｇ当たり０．１mLの割合でそれぞれ経口投与（ｐ．ｏ）した後、３時間強制歩行を行った。その後、プラスチックケージ（縦２４cm×横１７cm×高さ１２cm）にマウスを入れ、１５分間環境に適応させ後、再び経口投与（ｐ．ｏ）を行った。
３０分後に頸椎脱臼後、１分以内に肝臓及びヒラメ筋を採取し、液体窒素にて急速冷凍した。測定するまで−８０℃にて保管した。
※Ｃｏｎｔｒｏｌ群は強制歩行を行わずに３時間絶食および絶飲させた。
（１０）統計処理
実験結果は、平均値（ｍｅａｎ）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示した。有意差検定は分散分析処理後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ法を行った。Ｐ値５％以下を有意差ありとして判定した。なお、この検定には、Stat view-J 5.0 for Windows（登録商標）を用いた。【００３２】
Ｂ．結果
（１）強制歩行負荷前ＬＨ投与における自発運動量に対する影響
３時間強制歩行前に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Control群）を用いて、自発運動量を測定した。
その結果、図３に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＦＷ／Ｗａｔｅｒ（精製水投与)群では有意な自発運動量の低下が認められた。しかし、ＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較してＬＨ投与群では、有意な自発運動量の増加は認められなかった。【００３３】
（２）強制歩行負荷後ＬＨ投与における自発運動量に対する影響
３時間強制歩行後に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を用いて自発運動量を測定した。
その結果、図４に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＦＷ／Ｗａｔｅｒ群では有意な自発運動量の低下が認められた。
しかし、ＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較してＬＨ投与群では、有意な自発運動量の増加は認められなかった。【００３４】
（３）強制歩行負荷前後ＬＨまたはＡＩＣＡＲ投与（参考例）による自発運動量に対する影響
３時間強制歩行前後に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群を用いて自発運動量を測定した。
その結果、図５に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＦＷ／Ｗａｔｅｒ群では、有意な自発運動量の低下が認められた。また、ＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較し、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kg投与群において自発運動量の有意な増加が認められた。参考例であるＡＩＣＡＲについて、図６に示すように、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲを３時間強制歩行負荷前後にｉ.ｐ.投与したところ３時間強制歩行後の自発運動量の低下をＡＩＣＡＲの１２．５mg／kg及び２５mg／kgの用量において有意に改善した。【００３５】
（４）肝臓及びヒラメ筋ＡＭＰＫのリン酸化に対するＬＨの影響
３時間強制歩行前後に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を用いてＡＭＰＫの変化をウェスタンブロッティング法により行った。
その結果、図７に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群を１としてＡＭＰＫのリン酸化を比較すると、肝臓およびヒラメ筋いずれにおいてもＦＷ／Ｗａｔｅｒ群では有意な増加は認められなかった。一方、ＬＨ１００mg／kg投与群においては肝臓およびヒラメ筋いずれにおいてもＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較し、有意かつ顕著なＡＭＰＫのリン酸化の増加が認められた。【００３６】
（５）肝臓及びヒラメ筋のグリコーゲン量に対するＬＨの影響
３時間強制歩行前後に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を用いて肝臓及びヒラメ筋のグリコーゲン量を測定した。
その結果、図８に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、肝臓およびヒラメ筋いずれにおいてもＦＷ／Ｗａｔｅｒ群において有意なグリコーゲン量の低下が認められた。しかし、肝臓においてはＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較しＬＨ群のＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kg投与群ともに有意差は認められなかった。一方で、ヒラメ筋においては、ＦＷ／Ｗａｔｅｒ群と比較しＬＨ１００mg／kg投与群で有意な増加が認められた。【００３７】
（６）血中乳酸値に対するＬＨの影響
３時間強制歩行前後に精製水、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kgをそれぞれｐ．ｏ．投与した群（ＦＷ群）と強制歩行させずに精製水をｐ．ｏ．投与した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を用いて血中乳酸値を測定した。
その結果、図９に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＦＷ／Ｗａｔｅｒ群では有意な乳酸の増加が認められたが、この乳酸値の上昇は、ＬＨ３０およびＬＨ１００mg／kg投与により完全にＣｏｎｔｒｏｌ群レベルに回復した。【００３８】
実施例２
〔試験方法〕
（１）使用動物
実験には、体重２８〜３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用し、実験に供ずるまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００〜１９：００、暗期１９：００〜７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０cm×横２０cm×高さ１３cm）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。
（２）使用薬物及び調整法
精製水、実施例１と同じ肝臓水解物（Liver Hydrolysate：ＬＨ）を使用し、調製方法はＬＨを精製水に溶解し、１０mg／kgの用量にした。これを体重１０ｇ当たり０．１mLの割合で経口投与（ｐ．ｏ）した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群には精製水を経口投与した。肝臓水解物（１０mg／kg，ｐ．ｏ．）を５日間（１日１回）連続投与し６日目に３時間の強制歩行後、肝臓水解物または水を投与した。
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５cmの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４cm×横１７cm×高さ１２cm）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
（５）統計処理
実験結果は、平均値（ｍｅａｎ）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示した。有意差検定は分散分析処理後、Fisher'のＰＬＳＤ法を行った。Ｐ値５％以下を有意差ありとして判定した。なお、この検定には、Stat view-J 5.0 for Windows（登録商標）を用いた。【００３９】
〔結果〕
疲労予防効果及び疲労改善効果を観察するため、肝臓水解物（１０mg／kg，ｐ．ｏ．）を５日間（１日１回）連続投与し６日目に３時間の強制歩行後、肝臓水解物または水を投与した（図１０）。その結果、図１１に示すように、結果として３時間強制歩行による自発運動量の低下を肝臓水解物（１０mg／kg，ｐ．ｏ．）の慢性投与により有意に改善させた。
【図１】
0006451631.tif 000003
【図２】
0006451631.tif 000004
【図３】
0006451631.tif 000005
【図４】
0006451631.tif 000006
【図５】
0006451631.tif 000007
【図６】
0006451631.tif 000008
【図７】
0006451631.tif 000009
【図８】
0006451631.tif 000010
【図９】
0006451631.tif 000011
【図１０】
0006451631.tif 000012
【図１１】
0006451631.tif 000013