(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、癌、ホモシスチン尿症、高ホモシステイン血症、又はメチオニン、ホモシステイン及びチロシンから選択される血漿若しくは循環基質の枯渇又は減少に感受性がある他の疾患、から選択される疾患あるいは状態を治療するための医薬であって、ここで前記他の疾患が、心血管疾患、中枢神経系の疾患、眼球系の疾患又は骨格の疾患であり、以下：
（ａ）メチオニナーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ及びシスタチオニンβシンターゼから選択される、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）依存性酵素をカプセル化している赤血球の、医薬的に許容される注射可能な懸濁液を含む組成物；及び
（ｂ）非ホスフェート形態のビタミンＢ６であるＰＬＰ前駆体を含む組成物、
の組み合わせを含み、
ここで、前記赤血球及びＰＬＰ前駆体は、それぞれ医薬的に許容される形態であり；前記対象は、前記赤血球及びＰＬＰ前駆体に、逐次又は同時に曝露されるものであり；
ここで、前記組み合わせは、同量の前記ＰＬＰ前駆体及び同量の非カプセル化された遊離形態の前記ＰＬＰ依存性酵素よりも、前記対象において、より高い残存ＰＬＰ依存性酵素活性を生じる、医薬。
【請求項２】
前記ＰＬＰ依存性酵素をカプセル化している赤血球は、有効な量で前記被験体に存在するＰＬＰ及び非ホスフェート形態のビタミンＢ６をさらに含み、赤血球にカプセル化されていない同一のＰＬＰ依存性酵素よりも、カプセル化されたＰＬＰ依存性酵素をそのホロ酵素形態で長く維持する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記医薬が、癌を治療するためのものである、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
前記癌が、メチオニン又はチロシンに対して栄養要求性の腫瘍細胞を含み、前記ＰＬＰ依存性酵素が、メチオニナーゼ及びチロシンフェノールリアーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記医薬が、タイプＩＩチロシン血症としても知られるリヒナー−ハンハルト（Ｒｉｃｈｎｅｒ−Ｈａｎｈａｒｔ）症候群を治療するためのものであって、前記ＰＬＰ依存性酵素が、チロシンアミノトランスフェラーゼである、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項６】
前記赤血球を含む組成物が、注射可能な組成物であり、前記非ホスフェート形態のビタミンＢ６を含む組成物が、経口投与剤形である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項７】
前記赤血球にカプセル化された前記ＰＬＰ依存性酵素の濃度が、０．０５〜６００μｍｏｌである、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項８】
前記ＰＬＰ依存性酵素が、メチオニナーゼである、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項９】
前記メチオニナーゼが、メチオニンガンマリアーゼ（ＭＧＬ）である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記基質はメチオニンであり、前記医薬はメチオニンレベルを十分に低下させて癌を治療するものである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記非ホスフェート形態のビタミンＢ６は、ピリドキサール、ピリドキシン、ピリドキサミン及びその混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項１２】
前記非ホスフェート形態のビタミンＢ６は、ピリドキシンである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記残存ＰＬＰ依存性酵素活性は、前記カプセル化されたＰＬＰ依存性酵素及びビタミンＢ６の投与後少なくとも約１日持続する、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記残存ＰＬＰ依存性酵素活性は、前記カプセル化されたＰＬＰ依存性酵素及びビタミンＢ６の投与後少なくとも約２日持続する、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記残存ＰＬＰ依存性酵素活性は、前記カプセル化されたＰＬＰ依存性酵素及びビタミンＢ６の投与後少なくとも約５日持続する、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記赤血球が、前記対象の血流に存在するＰＬＰ前駆体から十分な量のピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を産生するのに十分な量のＰＮキナーゼ及びＰＮＰオキシダーゼをさらに含み、ホロ酵素の形態で十分な一部の前記ＰＬＰ依存性酵素を維持し、注入後２４時間を超えて酵素活性を保持する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＬＰ依存性酵素、例えばメチオニナーゼ、任意にその補因子、ピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｓｔｅ）（ＰＬＰ又はＰ５Ｐ）、及び／又はＰＬＰのリン酸塩若しくは非リン酸塩前駆体を含む医薬組成物、薬物としてのその使用、その製造方法及びそれに関連する治療的処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、ビタミンＢ６誘導体は、多種多様の酵素に対して使用される補因子である。本明細書において、ＰＬＰ依存性酵素に対して呼ばれる「ＰＬＰ酵素」は、アミノ酸を変換する代謝経路において、それらのほとんどに関与する約１４５の個別の酵素群を形成する。これらの酵素により触媒される反応は、脱炭酸、アミノ基転移（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎｓ）又はさらなる除去反応を含んでいる（Ｐｅｒｃｕｄａｎｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒａｃｈｉ，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｖｏｌ．４  ｎｏ．９，２００３）。
【０００３】
ＰＬＰ酵素群、及び、後者によって触媒される反応群に属する多数の酵素が理由で、ヒトの治療におけるそれらの潜在的な使用が研究されている。ＰＬＰ酵素に関連した治療的介入の異なる機会の中から、癌及び心血管病態の治療におけるそれらの使用が多くの研究の主題となっている（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｄｉａ“Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｐｒｏｆ．Ｙｏｎｇｐｉｎｇ  Ｙｏｕ  ｅｄ．，２０１１）。より具体的には、メチオニナーゼは、血漿メチオニンを枯渇させること、及び、このアミノ酸栄養要求性の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが対象とされている。多くのヒト腫瘍細胞はメチオニンがその前駆体ホモシステインに置換されている場合には増殖することができなかったが、一方で、正常細胞は、そのような培地中で増殖する能力を有することが示された。メチオニンに対するこの依存性は、特に、乳房、肺、結腸、腎臓、膀胱、黒色腫及び膠芽腫の癌由来の細胞株で観察された（Ｄｕｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；９５（１）：６９−７６）。
【０００４】
ＰＬＰ酵素の治療の目的に関わらず、これらの酵素の全身の経路を介した投与に基づいた治療法の開発は、重大な制限が生じている：
【０００５】
・ＰＬＰ酵素は、主に原核生物から得られ、従って、ヒトへ投与する場合、強い免疫原性がある。
・血漿中の半減期が短く、十分な活性を得るようにするために、頻繁な投与又は大量の用量に頼る必要がある。
・血漿中のＰＬＰ補因子の低いバイオアベイラビリティーが、投与後のそれらの活性の急速な低下を引き起こす。
【０００６】
これらの制限は、メチオニナーゼの場合に広く説明された。Ｓｕｎらは、シュードモナス・プチダ細菌から抽出された酵素をコードする遺伝子から大腸菌で組換えメチオニナーゼを生産している。これにより得られたｒＭＥＴアーゼと呼ばれる酵素は、免疫不全マウスに静脈内注射された。注射の２４時間後、ＰＬＰを追加することなしにインビトロで定量された酵素の血漿活性は検出されず、その短い作用期間を示した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，８３７７−８３８３，２００３）。
【０００７】
一年後、同じチームが、マカク（ｍａｃａｑｕｅ）においてｒＭＥＴアーゼを投与した結果を発表した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１０，２１３１−２１３８，２００４）。本研究では、６匹のサルに、１，０００、２，０００及び４，０００ユニット／ｋｇのｒＭＥＴアーゼの用量を静脈内投与した。二回目の注射は最初の２８日後に行われ、２匹のサルでアナフィラキシーショックを引き起こし、２匹の動物のうちの１匹が死んだ。ｒＭＥＴアーゼの免疫原性は、さらに処理された動物の大多数（６匹のうちの４匹）に対しＩｇＧ型（過半数）及びＩｇＭ型の抗ｒＭＥＴアーゼ抗体の発生を引き起こした。これらの抗体の中和特性がインビトロで実証された。
【０００８】
それらのメチオニナーゼの短い半減期及び免疫原性の制限を克服するために、同一の著者らは、その後、それらの酵素のペグ化に頼ることを提案した。ＰＥＧ基のグラフト化は、治療用タンパク質の半減期を増加させ、免疫原性を低減するための公知の技術である。活性化ＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧ−ｒＭＥＴアーゼを得るためにｒＭＥＴアーゼの存在下に導入された。酵素のこの修飾は、マウスにおいて、フリーの酵素での２時間から、ＰＥＧ−ｒＭＥＴアーゼでの３８時間へと半減期の増加を引き起こした。半減期のこの著しい増加は、免疫原性の減少を伴っている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，８３７７−８３８３，２００３）。
【０００９】
ペグ化が部分的に半減期及び免疫原性の問題を満たしたとしても、ＰＬＰ酵素の主要な問題は残る：血漿中の補因子の低いバイオアベイラビリティー。ＰＬＰ酵素は、その補因子、ＰＬＰの存在下で触媒的に活性を有するものであり、これは、その後ホロ酵素と呼ばれる。注射後、ホロ酵素は、ＰＬＰ補因子が減少するために、急速に不活性なアポ酵素に変換される。
【００１０】
外因性の方法でもたらされたＰＬＰは、急速に酵素に利用できず、フリーのＰＬＰの血漿中の半減期はわずか約１５分である。この現象は、ＰＬＰ酵素、チロシンフェノールリアーゼ（ＴＰＬ）の場合に実証された。Ｅｌｍｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ３８；３６６３−３６６７、１９７８）はＴＰＬを精製し、正常マウスにそれを注射した。注入の５時間後、ＴＰＬの活性を測定するために血液サンプルを採取した。この活性アッセイは、二つの条件に従って行った：サンプルの一部はＰＬＰを追加することなくアッセイされ、他の一部分は、アッセイの反応混合物中に最適量のＰＬＰを添加してアッセイされた（これらの両方の条件は、血漿中で実際に測定された活性、及びそのＰＬＰ補因子へアクセスした場合の酵素の潜在的な活性を反映している）。得られた結果の比較は、血漿中において、わずか７％のＴＰＬの潜在的な活性が実際に測定されることを示す。同様の試験がマウス群を用いて実施され、その試験では、ＴＰＬの注射と共に大量のＰＬＰを投与され、その後、毎時間ＰＬＰを再注射が実施された。このシナリオにおいて、アッセイ結果の比較は、血漿中において、潜在的な活性の３７％が実際に測定されることを示している。ＰＬＰの同時投与は、従って、限られた方法で、血漿中のＴＰＬの活性を改善する可能性を与えた。しかし、外因性の方法で提供されたＰＬＰは、ＴＰＬに対して急速に利用できず、フリーのＰＬＰの血漿半減期は約１５分である。従って、溶液中のＰＬＰの反復注射によるＰＬＰの血漿レベルの上昇は、現実的ではない。Ｅｌｍｅｒらは、臀部における筋肉内経路を介して注射される鯨ろう及び落花生油からなるインプラントを介して、長時間にわたって時間をかけた方法でＰＬＰを提供することを提案した。それにも関わらず、この解決策は確証的であることは見出されず、実際に血漿中で測定される活性は、潜在的活性の２５％を超えることを再構築せず、メラノーマＢ−１６腫瘍を移植したマウスにおいて、統計的に有意な方法でＴＰＬの抗腫瘍効果を改善しない。同様の観察は、メチオニナーゼを用いた場合に得られた。Ｓｕｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ６３；８３７７−８３８３、２００３）は、インビトロで、ホロ酵素ＰＬＰ−ｒＭＥＴアーゼは比較的安定しているが、インビボでは安定せず、この複合体は急速に乖離し、ｒＭＥＴアーゼの活性の損失につながることを確認する。著者らは、さらにｒＭＥＴアーゼ並びにＰＥＧ−ｒＭＥＴアーゼを用いて得られるメチオニン枯渇の持続が、ＰＬＰポンプ（ＰＬＰを連続的に投与するポンプ）の移植を介した、ＰＬＰ補充によって改善されうることを示している。それにも関わらず、この連続投与デバイスは、血漿中のＰＬＰの低バイオアベイラビリティーの問題に常に直面する。
【００１１】
従って、ＰＬＰ酵素の治療可能性は、多くの研究活動の対象となっており、とりわけ、メチオニナーゼのパイロット臨床試験の実施を導いているが、これらの酵素の臨床効率の証明は提供できなかった。
【００１２】
従って、ＰＬＰ酵素の治療可能性を利用する目的で、最適かつ利用可能な量のＰＬＰの存在下でこれらの酵素を維持できる解決策を有することが有利であろう。
【００１３】
種々の方法が、赤血球中の活性成分の取り込みを可能とすることについて記載されている。これらの方法のうち、いわゆる溶解・再シール化（ｒｅｓｅａｌｉｎｇ）技術が最も普及している。この技術は３つの選択肢を含み、それは低張透析、低張＜＜前膨潤＞＞及び低張希釈であり、全てが、赤血球の内側と外側との間の浸透圧の差に基づいている。これらの選択肢は、一般的に５つの以下の工程を有している：パックされた赤血球は、生理的緩衝液を用いて１回又は数回洗浄及び遠心分離され、赤血球を低張液媒体と接触させて赤血球膜に孔を生じさせ、活性成分が赤血球に入り、高張緩衝液を用いて孔が閉じらて（＜＜再シール化され＞＞）赤血球の内部に活性成分を閉じ込め、そして、後者はその後、保存液に懸濁される。低張透析技術は、最も興味深い技術であり、工業的な開発の対象となっている。欧州特許第１７７３４５２号明細書に記載のものは、現時点で最も実施されており、それは再現可能であり、有効成分のカプセル化率を向上させるという利点を有している。
【００１４】
酵素の免疫原性に関するリスクを制限し、その半減期を延長する目的における、赤血球中の酵素のカプセル化は、科学的な出版物の対象となった研究活動で既に提案された。酵素、Ｌ−アスパラギナーゼのカプセル化は、欧州特許第１７７３４５２号明細書に記載され、同様に欧州特許第１８７４３４１号明細書においてアルギニンデイミナーゼのカプセル化について記載された。
【００１５】
以前の研究は、補酵素を必要とする酵素に関連するものではなく、ＰＬＰ酵素及びそのＰＬＰ補因子の動態に関する複雑さには取り組んでいない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の目的は、ＰＬＰ酵素を含有する医薬組成物を提供することであり、該酵素が最適かつ利用可能な量のそのＰＬＰ補因子の存在下にある間、酵素の免疫原性に関するリスクの制限、その半減期の延長を可能にする。
【００１７】
本発明の目的は、従って、医薬的に許容される溶媒中における赤血球の懸濁液又は赤血球と医薬的に許容される溶媒とを含む医薬組成物であって、該赤血球はＰＬＰ酵素をカプセル化しているものである。これは、以下で懸濁液及び医薬組成物とを等しく示すために、組成物と呼ぶことにする。＜＜カプセル化をすること（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）＞＞とは、活性成分（酵素及び任意に補因子及び／又は他の分子）が、本質的に又は完全に内部に存在することを意味する。＜＜本質的に＞＞とは、活性成分の少数の割合がそれにも関わらず、膜中に捕捉されたものと見ることができることを意味する。
【００１８】
組成物は、特に、赤血球１ｍL当たりＰＬＰ酵素を０．０１〜３０、好ましくは０．０５〜１０ｍｇ含有する。
【００１９】
第一の実施形態によれば、ＰＬＰ酵素は、メチオニナーゼ、さらに、とりわけＬ−メチオニナーゼ、メチオニナーゼガンマリアーゼ  ＭＧＬ、番号ＥＣ４．４．１．１１、ＣＡＳ番号４２６１６−２５−１である。本発明に従って使用され得るメチオニナーゼの供給源を認識するための記載は、特に、出版Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ  Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）８６：４４５−４６７を参照することができる。
【００２０】
第二の実施形態によれば、ＰＬＰ酵素は、チロシンフェノール−リアーゼ又はＴＰＬ、ＥＣ４．１．９９．２、ＣＡＳ番号９０５８−３１−８、である。Ｈ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５，７：１７６７−７２及び２４５，７：１７７３−７を参照することができる。
【００２１】
第三の実施形態によれば、ＰＬＰ酵素は、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｈＴＡＴａｓｅ）、ＥＣ２．６．１．５、ＣＡＳ９０１４−５５−５、である。Ｒ．Ｒｅｔｔｅｎｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，１３：３５８３−６１を参照することができる。
【００２２】
第四の実施形態によれば、ＰＬＰ酵素はシスタチオニンβ−シンセターゼ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｓｙｎｔｈｅｔｈａｓｅ）又はシンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＥＣ４．２．１．２２、ＣＡＳ９０２３−９９−８、である。Ｊ．Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７８，２５３，１８：６５２３−８を参照することができる。
【００２３】
組成物はさらに、酵素、すなわちＰＬＰの補因子、及び／又はその前駆体を含んでも良く、それは、例えばビタミンＢ６の非リン酸塩形態などの非リン酸塩前駆体であってもよく、及び／又は例えばピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）などのリン酸塩前駆体であってもよい。
【００２４】
ビタミンＢ６は、異なる形態、リン酸塩又は非リン酸塩のいずれかで存在する。ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）とピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）は、そのリン酸塩形態である。対応する非リン酸塩は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）及びピリドキサミン（ＰＭ）である。ビタミンＢ６の非リン酸塩形態は赤血球膜を通過してもよく、そのリン酸塩形態は困難を伴ってのみ通過することができる。主な経路によれば（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９７１，Ｖｏｌ．５０，１９０１−１９０９に記載される）、ピリドキシン（ＰＮ）は、赤血球の内部でＰＮ−キナーゼの作用の下、ＰＮＰへ変換され、ＰＮＰはその後ＰＮＰ−オキシダーゼの作用の下でＰＬＰに変換される。ＰＬＰは、次いでＰＬＰホスファターゼの作用の下でピリドキサール（ＰＬ）へ変換され、ＰＬは赤血球を離れうる。提供された前駆体は、調製方法の間又は組成物の貯蔵の間、赤血球内にて変換され得ることが容易に理解される。
【００２５】
ビタミンＢ６の非リン酸塩形態、とは、本明細書では、ビタミンＢ６の３つの「ビタマー」：ＰＬ、ＰＮ及びＰＭの１つ又は２若しくは３つのビタマーの混合物を意味する。ＰＮ形態が好ましい。それらはまた、塩の形態であってもよい。
【００２６】
組成物は、赤血球中にカプセル化されたＰＬＰを含む。ＰＬＰは、カプセル化手順中に提供されてもよく、その前駆体から赤血球中で完全に又は部分的に得られてもよい。存在する又は形成された、いずれかのＰＬＰは、酵素と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）されてもよい。組成物は、従って、対応するホロ酵素、例えばメチオニナーゼ−ＰＬＰを含み得る。これらの条件の下、活性酵素の半減期は、その基質の血漿の枯渇を持続した実施例で観察されるように、大幅に増加する。本発明の組成物は、特に、投与後２４時間を超えた、特に１、５、１０若しくは１５日又はそれを超えて、酵素活性を維持する可能性を提供する。酵素活性とは、特に、血漿中の基質の２０、３０、４０又は５０％以上の枯渇を意味する。
【００２７】
実施形態において、組成物は、従って、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）及び／又はビタミンＢ６の非リン酸塩形態及び／又はリン酸塩前駆体、ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）及び／又はピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含む。
【００２８】
特徴によれば、ＰＮＰ及び／又はＰＭＰは、組成物内において、赤血球内にカプセル化される。この前駆体は、酵素と共にカプセル化され得る又は完全に若しくは部分的にそれ自身の前駆体から赤血球中で得られ得る。
【００２９】
組成物は、特に、赤血球１リットル（Ｌ）当たり、カプセル化された、約０．０５〜約６００、特に約０．５〜約１００、好ましくは約５〜約５０μｍｏｌのＰＬＰ及び／又はＰＮＰ及び／又はＰＭＰを含む。
【００３０】
特徴によれば、組成物は、赤血球の内部に存在する又は赤血球の内部及び外部に存在する、赤血球にカプセル化された、ＰＬＰ酵素及びＰＬＰ及びさらに非リン酸塩ＰＬＰ前駆体をカプセル化した赤血球を含んでいる。この非リン酸塩前駆体は、ＰＮ、ＰＬ又はＰＭ、好ましくはＰＮ、又はこれらの化合物の２又は３の混合物であってもよい。非リン酸塩前駆体は、赤血球の内部及び／又は外部に存在してもよい。この非リン酸塩前駆体の存在は、この非リン酸塩前駆体の非存在下よりも著しく高い赤血球内のＰＬＰレベルに到達する可能性を提供する。
【００３１】
実施形態において、組成物は、ＰＬＰ酵素及びＰＬＰに加えてそのリン酸塩前駆体、ＰＮＰ、ＰＬＰ及び／又はＰＭＰの１つをカプセル化する赤血球を含む。この同様の組成物は、ちょうど説明されたように、有利に非リン塩前駆体、特にＰＮをさらに含んでもよい。
【００３２】
本発明の組成物は、好ましくは、３５％、４０％若しくは４５％以上のヘマトクリット値を有する。
【００３３】
実施形態によれば、組成物は、赤血球及び医薬的に許容される溶媒を含み、該赤血球は一方で、ＰＬＰ酵素、例えば、メチオニナーゼをカプセル化し、他方では、同時、個別又は逐次投与するための非リン酸塩形態におけるビタミンＢ６、好ましくはＰＮをカプセル化している。組成物は、特に、個別に赤血球（懸濁液）と非リン酸塩形態のビタミンＢ６、好ましくはＰＮ（溶液）とを含む、キットの形態であってもよい。実施形態によれば、医薬的に許容される溶媒は、赤血球のための＜＜保存液＞＞、すなわち、活性成分をカプセル化する赤血球が、それらの注射を待つ間に保存するために、それらの適切な形態で懸濁される溶液である。保存液は、好ましくは、特に、グルコース、デキストロース、アデニン及びマンニトールから選ばれる赤血球の保存を促進する少なくとも一つの薬剤を含む。有利には、保存液は、赤血球内のＰＬＰ−ホスファターゼ酵素の阻害を許容する無機リン酸塩塩を含む。
【００３４】
保存液は、ＮａＣｌと、アデニンと、グルコース、デキストロース及びマンニトールのうちの少なくとも１つの化合物とを含む水溶液であってもよい。特徴によれば、さらに、無機リン酸塩を含む。
【００３５】
保存液は、ＮａＣｌ、アデニン及びデキストロースを含んでもよく、好ましくはＡＳ３培地（ｍｅｄｉｕｍ）である。特徴によれば、さらに、無機リン酸塩を含む。
【００３６】
保存液は、ＮａＣｌ、アデニン、グルコース及びマンニトールを含んでもよく、好ましくはＳＡＧマンニトール又はＡＤｓｏｌ培地である。特徴によれば、さらに、無機リン酸塩を含む。
【００３７】
特に、組成物又は懸濁液は、保存液中で、７２時間、２℃〜８℃に含まれる温度の保存にて、０．５、特に０．３、とりわけ０．２、好ましくは０．１５、より好ましくは０．１ｇ／ｄＬ以下のレベルで維持される細胞外ヘモグロビンレベルで特徴づけられる。
【００３８】
特に、組成物又は懸濁液は、保存液中で、２４時間〜２０日を含む期間、特に２４時間〜７２時間の期間で、２℃〜８℃に含まれる温度の保存にて、０．５、特に０．３、とりわけ０．２、好ましくは０．１５、より好ましくは０．１ｇ／ｄＬ以下のレベルで維持される細胞外ヘモグロビンレベルで特徴づけられる。
【００３９】
細胞外ヘモグロビンレベルは、有利には、Ｇ．Ｂ．Ｂｌａｋｎｅｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｄｉｎｗｏｏｄｉｅ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８，９６−１０２，１９７５に記載の手動の参照方法によって測定される。自動装置もまた、それらに特異的な感度を有する測定が実施可能なものが存在する。
【００４０】
特に、組成物又は懸濁液は、保存液中で、７２時間、２℃〜８℃に含まれる温度の保存にて、２、とりわけ１．５、好ましくは１％以下のレベルで維持される溶血率で特徴づけられる。
【００４１】
特に、組成物又は懸濁液は、保存液中で、２４時間〜２０日を含む期間、特に２４時間〜７２時間で、２℃〜８℃に含まれる温度の保存にて、２、とりわけ１．５、好ましくは１％以下のレベルで維持される溶血率で特徴づけられる。
【００４２】
特に、懸濁液のヘマトクリット値は、３５％、４０％、４５％以上である。
【００４３】
特定の方法によれば、赤血球中のビタミンＢ６の代謝は、赤血球内レベルを増加させるために、ＰＮ−キナーゼ及びＰＮＰ−オキシダーゼの赤血球内レベルを増加させることによって、及び／又は、ＰＬＰ−ホスファターゼの赤血球内レベルを減少させることによって、調節される。
【００４４】
特徴によれば、組成物は、ＰＬＰ酵素、例えば、メチオニナーゼ、及びＰＬＰ若しくはその前駆体に加え、ＰＮ−キナーゼ及び／又はＰＮＰ−オキシダーゼ及び／又はＰＬＰ−ホスファターゼを阻害する薬剤を含む。これらの酵素又は薬剤は、赤血球中にカプセル化されて見出され得る、又は赤血球の外側と内側に見出され得る。
【００４５】
この（これらの）酵素又は薬剤はまた、特に、それが赤血球の懸濁液から分離されている場合、非リン酸塩ビタミンＢ６の製剤と混合されて、別々に投与されてもよい。
【００４６】
本発明の目的は、従って、薬剤として使用するためのそのような組成物である。
【００４７】
本発明の目的は、特に、良好なバイオアベイラビリティーの条件下で、それを必要とする患者に、ＰＬＰ酵素とその補因子とを提供する可能性を与える薬剤であって、それは、該酵素が治療用途において活性がありかつ効果的であるように、ＰＬＰ酵素及びその補因子がそれぞれ有効量で利用可能であることを意味する。薬剤は、特に、酵素の基質の血漿若しくは循環濃度及び／又は臓器における濃度を、枯渇する若しくは低減することを目的とする。
【００４８】
第１の下位目的によれば、薬剤は、メチオニナーゼを含み、それを必要とする患者における血漿若しくは循環メチオニンを枯渇させる又は低減させることができる。薬物は、抗癌剤であり、癌、特にメチオニン栄養要求性の腫瘍細胞を含む癌、特に乳房、肺、大腸、腎臓、膀胱、黒色腫及び膠芽腫癌の治療を可能にする。
【００４９】
第２の下位目的によれば、薬剤はメチオニナーゼを含み、それを必要とする患者における血漿若しくは循環若しくは肝臓ホモシステインを枯渇させる又は低減させることができる。薬剤は、ホモシスチン尿症及び／又は高ホモシステイン血症及び／又は関連する病状、例えば心血管疾患、中枢神経系の、眼システムの及び／又は骨格の治療を可能にする（（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｄｉａ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｆ．Ｙｏｎｇｐｉｎｇ  Ｙｏｕ  ｅｄ．，２０１１）。
【００５０】
本発明の第３の下位目的によれば、薬剤はＴＰＬを含み、それを必要とする患者における血漿若しくは循環チロシンを枯渇させる又は低減させることができる。薬剤は抗癌剤であり、それは、癌、特にチロシン栄養要求性の腫瘍細胞を含む癌、特にメラノーマの治療を可能にする。
【００５１】
本発明の第４の下位目的によれば、薬剤はｈＴＡＴアーゼを含み、それを必要とする患者における血漿若しくは循環及び／又は肝臓チロシンを枯渇させる又は低減させることができる。薬剤は、このＰＬＰ酵素の欠損に関連する稀な疾患、特にリヒナー−ハンハルト（Ｒｉｃｈｎｅｒ−Ｈａｎｈａｒｔ）症候群（タイプＩＩのチロシン血症）の治療を可能にする。
【００５２】
本発明の第5の下位目的によれば、薬剤はシスタチオニンβシンターゼを含み、それを必要とする患者における血漿若しくは循環及び／又は肝臓のホモシステインを枯渇させる又は低減させることができる。薬物は、ホモシスチン尿症及び／又は高ホモシステイン血症及び／又は関連する病状、例えば心血管疾患、中枢神経系の疾患、眼球系の疾患及び／又は骨格の疾患の治療を可能にする。
【００５３】
本発明はまた、ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼ、医薬的に許容される溶媒、及びピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）及び任意にリン酸塩又は非リン酸塩ＰＬＰ前駆体をカプセル化した赤血球を含む医薬組成物を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：任意に、及び好ましくは、赤血球細胞のペレットを、生理的緩衝液を用いて１回又は数回洗浄及び遠心分離し；赤血球懸濁液を低張液媒体と接触させ、赤血球膜に孔を生じさせ；孔を開ける前及び後に、赤血球懸濁液を、次いで、ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼと接触させ；ＰＬＰ酵素、例えば、メチオニナーゼが赤血球に入り；孔が、等張又は高張、有利には高張緩衝液によって閉じられ、そして、ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼを含有する再シール化された赤血球の懸濁液が回収され；任意に、赤血球懸濁液は、最も脆弱な赤血球を除去するために培養され；赤血球懸濁液を保存液で洗浄して、調製されること；を含む方法であって、ここで、方法は：
−ＰＬＰ及び／又は、存在する場合、ＰＬＰのリン酸塩前駆体は、ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼと共にカプセル化され、
−存在する場合、非リン酸塩ＰＬＰ前駆体は、孔を開ける前及び／又は後、赤血球の懸濁液に添加され、及び／又は
−存在する場合、非リン酸塩ＰＬＰ前駆体はインキュベーション中又は保存液へ添加される。
【００５４】
好ましくは、いくつかのＰＬＰは、ＰＬＰ酵素及び、ＰＮ、ＰＬ及び／又はＰＭなどの少なくとも１つの非リン酸塩前駆体と共カプセル化され、孔を開ける前及び／又は後、及び／又はインキュベーション中に赤血球の懸濁液へ、及び／又は保存液へ添加される。好ましくは、非リン酸塩前駆体はＰＮである。
【００５５】
赤血球懸濁液は低張液媒体と接触させ、赤血球膜に孔を生じさせる。溶解−再シール化技術は、３つの選択肢が存在するようであり、それは、低張透析、低張予備膨潤及び低張希釈であって、すべて、赤血球の内部及び外部の間の浸透圧の差に基づいている。低張透析が好ましい。
【００５６】
ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼ、及び任意にＰＬＰ及び／又はＰＬＰ前駆体をカプセル化した赤血球の懸濁液は、特に以下の方法で得ることが可能である：
【００５７】
１−  ６５％以上のヘマトクリット値レベルの等張液に赤血球のペレットを懸濁し、＋１〜＋８℃の間で冷却すること、
２−  ６５％以上のヘマトクリット値レベルの赤血球の懸濁液と、＋１〜＋８℃の間で冷却された低張溶解液とを、透析デバイス、例えばコイル又は透析カートリッジ（カートリッジが好ましい）に通すことを含む、＋１〜＋８℃の間で維持される温度における溶解手順；
３−  溶解前又は溶解中に、＋１〜＋８℃の間で維持される温度で、カプセル化されるように（特に事前構成される溶液中で）、好ましくは徐々に、活性成分（単数又は複数）を溶液中に添加することによってカプセル化する手順；及び
４−  より高い温度、特に、＋３０〜＋４２℃に含まれる温度において、等張又は高張、有利には高張液の存在下で実施される再シール化手順。
【００５８】
好ましい代替の、着想（ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ）は、国際公開第２００６／０１６２４７号（欧州特許第１７７３４５２号明細書）に記載の方法から引き出してもよい：
【００５９】
１−  ６５％以上のヘマトクリット値レベルの等張液中に赤血球のペレットを懸濁し、＋１〜＋８℃の間で冷却すること、
２−  この同一のペレットからの赤血球のサンプルから浸透圧脆弱性を測定すること、
３−  ６５％以上のヘマトクリット値レベルの赤血球の懸濁液と、＋１〜＋８℃の間で冷却された低張溶解液とを、透析デバイス、例えばコイル又は透析カートリッジ（カートリッジが好ましい）に通すことを含む、＋１〜＋８℃の間で維持される温度における溶解手順；溶解パラメータは、以前に測定された浸透圧脆弱性に応じて調整されており：特に、測定された浸透圧脆弱性に応じて、透析デバイスを通過する赤血球懸濁液の流れを調整し又は溶解溶液の浸透圧を調整し；及び
４−  溶解前又は溶解中に、＋１〜＋８℃の間で維持される温度で、カプセル化されるように（特に事前構成される溶液中で）、好ましくは徐々に活性成分（単数又は複数）を溶液中に添加することによってカプセル化する手順；及び
５−  より高い温度、特に、＋３０〜＋４２℃に含まれる温度において、等張又は高張、有利には高張液の存在下で実施される再シール化手順。
【００６０】
特に、透析のために、赤血球のペレットは、高いヘマトクリット値レベル、６５％以上、及び好ましくは７０％以上を有する等張液に懸濁され、この懸濁液が＋１〜＋８℃の間に、好ましくは＋２〜＋６℃、典型的には約＋４℃に冷却される。特定の方法によれば、ヘマトクリット値レベルは６５〜８０％の間、好ましくは７０〜８０％を含む。
【００６１】
測定される場合、浸透圧脆弱性は、有利には、溶解工程の直前に、カプセル化される活性成分（単数又は複数）の存在下で又は非存在下で、好ましくは存在下で、赤血球に対して測定される。それらを含む赤血球又は懸濁液は、有利には、溶解のために選択される温度に近い又は同一の温度である。本発明の別の有利な特徴によれば、浸透圧脆弱性の実施される測定は、迅速に利用され、すなわち、溶解手順は、サンプルを採取した後に短時間で実施される。好ましくは、サンプリングと溶解の開始との間の時間経過は、３０分以下、より好ましくは２５分以下及びさらに２０分以下である。
【００６２】
測定及び浸透圧脆弱性を考慮した、溶解・再シール化手順の実施方法に関し、当業者は、詳細として国際公開第２００６／０１６２４７号を参照することができる。当該文書は参照により本明細書に援用される。
【００６３】
カプセル化技術の強化については、２０１３年５月７日に出願された仏国特許第１３５４２０４号明細書に記載され、当業者が参照可能であり、参照により本明細書に援用される。このように、本実施形態によれば、活性成分、すなわちＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼと、任意に１又は複数の他の活性成分、例えばＰＬＰ及び／又はＰＬＰ前駆体とをカプセル化した赤血球は、溶解・再シール化によって赤血球内への活性成分をカプセル化すること、活性成分と２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧を有する溶液とを取り込んだ赤血球を含む懸濁液又はペレットを得ること、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧で又はインキュベーション溶液添加後に該浸透圧で、ペレット又は懸濁液をインキュベーションすること、を含む方法によって得られる。インキュベーションは、特に３０分以上の期間、とりわけ、１時間以上実施される。その後、インキュベートされた溶液の溶液を除去し、得られた赤血球を患者への溶液の注射を許容する溶液中、好ましくは、患者への溶液の注射を許容する保存液に懸濁する。示された浸透圧は、赤血球が懸濁される溶液の、又は、関連する瞬間におけるペレットの溶液の浸透圧である。
【００６４】
特定の方法によれば、非リン酸塩ＰＬＰ前駆体、特にビタミンＢ６の非リン酸塩形態は、製造若しくは貯蔵方法中に又は最終的な製剤に提供される。この化合物は、例えば、インキュベーション溶液中又は保存液に取り込まれてもよく、さらに、注射前の希釈が実施される場合は注射前に製剤に取り込まれてもよい。
【００６５】
特徴によれば、特に０．１〜２５０、好ましくは１〜５０ｍＭのＰＮ及び／又はＰＬ及び／又はＰＭが、製造又は貯蔵方法中又は最終的な製剤において提供される。上述したように、ビタミンＢ６のこれらの非リン酸塩の誘導体の画分は、赤血球中でＰＬＰに変換される。
【００６６】
＜＜安定化赤血球懸濁液＞＞とは、ヒトでそれを使用するまで、０．２ｇ／ｄｌ以下を維持する細胞外ヘモグロビンを含有する懸濁液を特に意味し、後者は、活性成分を取り込んだ赤血球のバッチを製造した後、特に１〜７２時間介入し得る。
【００６７】
＜＜即時使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）安定化赤血球懸濁液＞＞とは、患者への注射可能にする溶液中、特に保存液中で、安定化した懸濁液を意味する。そのヘマトクリット値は、一般には、３５％、４０％又は４５％以上である。
【００６８】
＜＜赤血球ペレット＞＞とは、前に懸濁された液体媒体の赤血球を分離後の、回収された赤血球の濃縮物又は濃縮を意味する。分離は、濾過又は遠心分離することによって確保されてもよい。遠心分離は、一般に、このような分離に使用される手段である。ペレットは、液体培地の一定の割合を含む。一般に、ペレットは、７０〜８５％のヘマトクリット値を有する。
【００６９】
＜＜インキュベーション溶液＞＞とは、活性成分をカプセル化する赤血球がインキュベーション工程の間に存在する溶液を意味する。インキュベーションは、ヘマトクリット値の広い範囲にわたって、特に、１０〜８５％のヘマトクリット値が達成されてもよい。
【００７０】
＜＜脆弱な赤血球（ｆｒａｇｉｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）＞＞とは、懸濁液が２〜８℃の間で保存された場合、特に１〜７２時間後、保存液中に懸濁されると、溶解され得る取り込み手順から得られる赤血球を意味する。
【００７１】
＜＜初期ヘマトクリット値＞＞とは、インキュベーション中の脆弱な赤血球の溶解に起因する細胞損失前のヘマトクリット値を意味する。
【００７２】
該方法は、特に、以下の工程を含み得る：
【００７３】
（ａ）低張性媒体と赤血球とを接触すること（赤血球の膜に孔を開けさせる）、活性成分と接触すること（それを赤血球へカプセル化するために）、特に等張若しくは高張、有利には高張媒体を用いて赤血球を再シール化すること、を含む、赤血球内へカプセル化されるように活性成分（単数又は複数）をカプセル化すること（ＰＬＰ酵素、例えば、メチオニナーゼ、及び任意にＰＬＰ及び／又はＰＬＰ前駆体）、
【００７４】
（ｂ）活性成分をカプセル化した赤血球と、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に、約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは、約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧を有する溶液とを含む懸濁液又はペレットを得ること又は調製すること、
【００７５】
（ｃ）工程（ｂ）自体の又はインキュベーション溶液を添加した後の工程（ｂ）のペレット若しくは懸濁液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは、約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧にて、３０分間以上の期間、特に１時間以上、インキュベートすること、
【００７６】
（ｄ）工程（ｃ）のインキュベートされた懸濁液の液体媒体を除去すること、
【００７７】
（ｅ）（ｄ）で得られた赤血球を、患者へ懸濁液の注射を可能にする溶液、好ましくは、患者へ懸濁液の注射を可能にする保存液へ懸濁すること。
【００７８】
非リン酸塩形態のビタミンＢ６は、カプセル化工程の間、工程（ａ）において、又は工程（ｃ）のインキュベーションの間又は保存液中にさらに、添加されてもよい。
【００７９】
第一の方法によれば、溶解・再シール化によるカプセル化後の工程、特に工程（ｂ）は、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液中の、溶解−再シール化工程で若しくは工程（ａ）で得られた懸濁液又はペレットを希釈することによる、少なくとも１回の洗浄サイクル、好ましくは２若しくは３回の洗浄サイクル、及びその後に赤血球のペレット又は懸濁液を得ること、を含んでいる。このペレット又はこの懸濁液は、活性成分を取り込んだ赤血球と２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは、約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液とを含む。以下の工程、例えば（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）が、その後、適用される。
【００８０】
第二の方法によれば、溶解−再シール化工程又は工程（ａ）において、等張若しくは高張媒体を用いる赤血球の再シール化は、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは、約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液中にて、インキュベーションされ得る赤血球の懸濁液、例えば、工程（ｂ）の懸濁液を生産する。換言すれば、溶解−再シール化工程又は工程（ａ）は、赤血球を再シール化するための工程を含み、ここで、活性成分をカプセル化する懸濁された赤血球が、等張若しくは高張、有利には高張の再シール化溶液と混合されるものであり、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは、約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧を有する赤血球の懸濁液を産生する。この方法において、インキュベーション工程又は工程（ｃ）は、再シール化により生じる懸濁液のインキュベーションを含む。インキュベーションは、３０分以上の期間、特に、１時間以上実施される。以下の工程、例えば（ｄ）及び（ｅ）がその後、適用される。
【００８１】
溶解・再シール化した後の工程、例えば、（ｂ）〜（ｅ）は、脆弱な赤血球、又はそれらの大部分、特に、５０、６０、７０、８０又は９０％以上又はそれ以上の溶解を生じる条件下で実施される。これを行うために、インキュベーション時間、インキュベーション温度及び赤血球が懸濁される溶液の浸透圧に対して作用することが可能である。浸透圧が高い程、インキュベーション時間がより長くなり得る。従って、浸透圧がより低ければ、同じ効果を得るためのインキュベートがより短くなる。また、温度が高いほど、インキュベーション時間がより短くなり、その逆もまた同様である。１回又は複数回の洗浄サイクルは、その後、細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）と細胞外ヘモグロビン、並びに細胞外の活性成分の除去を可能にする。
【００８２】
本発明によれば、洗浄サイクルは、赤血球の懸濁液又はペレットを希釈し、次いで赤血球と洗浄液との分離を含んでいる。好ましくは、洗浄工程は、好ましくは２又は３回の希釈−分離サイクルを含む。分離は、任意の適切な手段、例えば、濾過及び遠心分離などによって達成することができる。遠心分離が好ましい。
【００８３】
インキュベーションは、懸濁液のヘマトクリット値に限定されない。この方法において、一般に１０〜８５％の間、特に４０〜８０％を含む初期ヘマトクリット値を有する懸濁液がインキュベートされてもよい。これは、むしろ７０％からはペレット、この値以下は懸濁液と呼ばれる。
【００８４】
除去工程又は工程（ｄ）は、特に細胞破片及び細胞外ヘモグロビン同様、結果的に細胞外の活性成分を除去するために、懸濁液及びインキュベートしたペレットの液体部分を除去することを目的としている。
【００８５】
除去工程又は工程（ｄ）の第一の方法によれば、分離、特に、遠心分離が実施され、これは、特に懸濁液に適用可能である。この分離は、１又は複数回、例えば２又は３回の洗浄サイクルに続き、等張液中で希釈し、その後、分離、特に遠心分離することによって実施されるものであってもよい。
【００８６】
除去工程又は工程（ｄ）の第二の方法によれば、分離、特に遠心分離前に希釈が実施され、これは懸濁液又はペレットに適用可能である。希釈は、特に等張洗浄溶液又は保存液を用いて実施することができる。
【００８７】
最後の工程又は工程（ｅ）は、任意の他の処理を行うことなく、患者に投与できるように、最終懸濁液を調製すること、からなる。
【００８８】
この工程の第一の方法によれば、除去工程又は工程（ｄ）から得られる赤血球ペレットの希釈は、注射液、特に保存液を用いて行われる。
【００８９】
この工程の第二の方法によれば、除去工程又は工程（ｄ）から得られる赤血球ペレットを洗浄するための１又は複数のサイクルは、注射液、特に保存液を用いて、分離に続いて希釈することによって実施される。洗浄後、赤血球は、注射液、特に保存液中に再懸濁される。
【００９０】
本発明の方法は、さらに、以下の特徴の１つ、複数又は全体を含んでもよい：
【００９１】
−インキュベーション工程又は工程（ｃ）は、脆弱な赤血球を確実に溶解するために十分な時間をかけ、約２〜約３９℃に含まれる温度で実施される。
【００９２】
−インキュベーション工程又は工程（ｃ）は、特に約２〜約１０℃、特に約２〜約８℃を含む低温で実施され、約１時間〜約７２時間、特に約６時間〜約４８時間、好ましくは、約１９時間〜約３０時間、持続する；
【００９３】
−インキュベーション工程又は工程（ｃ）は、約２０〜約３９℃、特に室温（２５℃±５℃）を含む高い温度で実施され、約３０分〜約１０時間、特に約１時間〜６時間、好ましくは約２時間〜約４時間、持続し；室温よりも高い温度で作用させることは可能であるが、これは細胞収率、Ｐ５０及び／又は２，３−ＤＰＧ含有量に負の影響を及ぼす可能性がある；
【００９４】
−インキュベーション工程又は工程（ｃ）において、懸濁液は、１０〜８５％、特に４０〜８０％に含まれる初期ヘマトクリット値である；例えば７０〜約８５％のヘマトクリット値を有する、分離したペレット、又は約４０〜７０％を含むヘマトクリット値を有する希釈されたペレットをインキュベートしてもよい；
【００９５】
−インキュベーション工程は、懸濁液の撹拌を含む；
【００９６】
−インキュベーション工程は、任意の撹拌を含まない；
【００９７】
−洗浄及び／又はインキュベーション溶液として、計量された（ｍｅｔｅｒｅｄ）ＮａＣｌ水溶液は、所望の浸透圧を得るために使用される；一例として、溶液は、従って、０．９％のＮａＣｌのを含んでいてもよい；この溶液はまた、特にＮａＣｌに加え、グルコース、特にグルコース一水和物、リン酸一ナトリウム二水和物、リン酸二ナトリウム十二水和物を含んでもよい；一例として、組成物は、０．９％のＮａＣｌ、０．２％のグルコース一水和物、０．０３４％のリン酸一ナトリウム二水和物、０．２％のリン酸二ナトリウム十二水和物を含む；
【００９８】
−最後の工程又は工程（ｅ）における洗浄は、保存液を用いて実施される；
【００９９】
−即時使用可能な懸濁液中の溶液（液体部分）の又は患者に注入可能である浸透圧は、約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇが含まれる；
【０１００】
−即時使用可能な懸濁液の又は患者に注入可能なヘマトクリット値は、３５％、４０％又は４５％以上である；
【０１０１】
−洗浄、インキュベーションの全ての工程は、保存液を用いて実施される；
【０１０２】
−工程（ｂ）の洗浄溶液及び／又は工程（ｅ）の洗浄溶液及び保存液は、同じ組成であり、赤血球の保存を促進する化合物（単数又は複数）を含む；
【０１０３】
−保存液（及び必要な場合、洗浄溶液（単数又は複数）又はインキュベーション溶液）は、ＮａＣｌ、アデニン及びグルコース、デキストロース、及びマンニトールのうちの少なくとも１つの化合物を含む水溶液である；
【０１０４】
−保存液（及び必要な場合、洗浄又はインキュベーション溶液（単数又は複数））は、ＮａＣｌ、アデニン及びデキストロース、好ましくＡＳ３媒体（ｍｅｄｉｕｍ）を含む；
【０１０５】
−保存液（及び必要な場合、洗浄又はインキュベーション溶液（単数又は複数））は、ＮａＣｌ、アデニン、グルコース及びマンニトール、好ましくは、ＳＡＧ−マンニトール又はＡＤｓｏｌ媒体を含む。
【０１０６】
本発明の方法は、特に、以下の工程を含む：
【０１０７】
（ａ）赤血球内へ活性成分をカプセル化することであって、赤血球の膜に孔を開口させる低張媒体と接触させること、赤血球へ活性成分をカプセル化させるために活性成分と接触させること、等張又は高張媒体を用いて赤血球を再シール化すること、を含んでいる。活性成分は、後者の溶解前に赤血球の懸濁液中に存在してもよく、又はさらに溶解中若しくは溶解後に添加されてもよいが、常に再シール化前であることに留意すべきである。この工程（ａ）の実施形態において、本方法は、以下の下位工程を含む；
【０１０８】
（ａ１）６０％又は６５％以上ヘマトクリット値の赤血球の懸濁液を有すること、
（ａ２）当該懸濁液中の赤血球の浸透圧脆弱性を測定すること、
（ａ３）溶解溶液と反対に（counter to a lysis solution)、透析装置、特に透析カートリッジへ赤血球懸濁液を通過させること、（ａ２）で測定された浸透圧脆弱性に応じて、赤血球懸濁液の流動（ｆｌｏｗ）を調節すること又は溶解溶液の流速を調節すること又は溶解溶液の浸透圧の調節すること、を含む、溶解及び活性成分（単数又は複数）の内在化の手順、
（ａ４）赤血球を再シール化する手順。
【０１０９】
本発明の別の目的は、良好なバイオアベイラビリティーの条件下、ＰＬＰ酵素及びその補因子を用いて、それを必要とする患者に提供することを目的とした治療的処置方法であって、酵素とその補因子が、治療用途において活性がありかつ効果があるように相互に、有効量で利用可能であることを意味する。この方法は、特に、酵素の基質の血漿若しくは循環濃度及び／又は臓器での濃度を枯渇させる若しくは減少させることを目的としている。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用を含む。
【０１１０】
第一の下位目的によれば、本発明は、それを必要とする患者における血漿又は循環メチオニンの枯渇又は減少を可能にする治療的処置方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用であって、メチオニナーゼとその補因子を含む。この方法は、癌、特にメチオニン栄養要求性腫瘍細胞、特に乳房、肺、結腸、腎臓、膀胱、黒色腫及び膠芽腫癌を含む癌を治療するための方法である。
【０１１１】
第二の下位目的によれば、本発明は、それを必要とする患者における血漿又は循環又は肝臓ホモシステインの枯渇又は減少を可能にする治療的処置方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用であって、メチオニナーゼとその補因子を含む。この方法は、ホモシスチン尿症及び／又は高ホモシステイン血症及び／又は高ホモシステイン血症に関連する病状、例えば心血管疾患、中枢神経系の疾患、眼のシステムの疾患及び／又は骨格の疾患、を治療するための方法である。
【０１１２】
本発明の第三の下位目的によれば、本発明は、それを必要とする患者における血漿又は循環チロシンの枯渇又は減少を可能にする治療的処置方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用であって、ＴＰＬとその補因子を含む。本方法は、癌、特にチロシン栄養要求性腫瘍細胞、特に黒色腫を含む癌の治療方法である。
【０１１３】
本発明の第四の下位目的によれば、本発明は、それを必要とする患者における血漿若しくは循環又は肝臓チロシンの枯渇又は減少を可能にする治療的処置方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用であって、ｈＴＡＴアーゼとその補因子を含む。この方法は、このＰＬＰ酵素の欠乏に関連するまれな疾患、特にリヒナー−ハンハルト症候群（タイプＩＩのチロシン血症）を治療するための方法である。
【０１１４】
本発明の第五の下位目的によれば、本発明は、それを必要とする患者における血漿若しくは循環及び／又は肝臓のホモシステインの枯渇又は減少を可能にする治療的処置方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量の投与又は本発明のキットの使用であって、シスタチオニンβシンターゼ及びその補因子を含む。この方法は、ホモシスチン尿症及び／又は高ホモシステイン血症及び／又は高ホモシステイン血症に関連する病状、例えば心血管疾患、中枢神経系の疾患、眼のシステムの疾患及び／又は骨格の疾患を治療するための方法である。
【０１１５】
これらの治療用途に使用される組成物は、さらに、このＰＬＰ酵素の補因子、すなわちＰＬＰ、及び／又はその前駆体を含み、それは、非リン酸塩前駆体、例えばビタミンＢ６の非リン酸塩形態、及び／又はリン酸塩前駆体、例えばピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）であってもよい。組成物はまた、ＰＮ−キナーゼ、ＰＮＰ−オキシダーゼ、ＰＬＰ−ホスファターゼを阻害する薬剤を含んでいてもよい。より一般的治療方法は、上記のように、組成物又はキットの投与を含んでもよい。
【０１１６】
治療１ヶ月毎に患者に対し、１回又は複数回の注射で、３５％、４０％又は４５％以上のヘマトクリット値を有する、５０〜３００ｍLの懸濁液又は組成物となる、１又は複数の用量、特に１又は２用量を投与する。これらは、静脈内又は動脈内注射によって、特に、特に灌流によって、投与される。
【０１１７】
あるいは、ＰＬＰ酵素、例えばメチオニナーゼをカプセル化する赤血球を含む組成物の有効量、及びビタミンＢ６の非リン酸塩形態、好ましくはＰＮ形態を含む溶液の有効量が、同一の患者に別々に投与される。このビタミンＢ６の非リン酸塩形態は、注射によって、赤血球の懸濁液と同時に若しくは別々に又は任意の他の経路、特に経口経路を介して投与されてもよい。
【０１１８】
第一の実施形態において、注射前に、１〜７２時間以内、特に１０〜７２時間の期間に調製された、活性成分（単数又は複数）をカプセル化した赤血球の懸濁液が患者に注射される。この懸濁液は、３５％、４０％又は４５％以上のヘマトクリット値を有する。それは、保存液中に見出される。細胞外ヘモグロビンレベルは、０．５ｇ、特に０．３ｇ、特に０．２、好ましくは０．１５、さらに０．１ｇ／ｄＬ以下、及び／又はホモリシスレベル２、特に１．５、好ましくは１％以下である。懸濁液は、注射の前に洗浄されない又は同様操作されない。
【０１１９】
本発明の別の目的は、精製された形態の下、高い収率で、メチオニナーゼを産生するための方法であって、以下の工程を含む：
【０１２０】
（ａ）メチオニナーゼを産生するように形質転換された細菌を培養し、該培養物を遠心分離し、ペレットを回収すること、
（ｂ）溶解緩衝液にペレットを懸濁して細菌細胞を溶解し、遠心分離し、上清を回収すること、
（ｃ）上清を沈殿剤で処理し、沈殿し、ペレットを回収すること、
（ｄ）約２５〜４０℃を含む温度でＰＥＧを使用してペレットを結晶化又は沈殿を２回を適用し、ペレットを回収すること
（ｅ）可溶化緩衝液（例えば［２５ｍＭのトリス、０．５ｍＭのＰ５Ｐ；０．５ｍｇ／ｍLのベータメルカプトエタノール；ｐＨ７．５］）中にペレットを懸濁し、イオン交換クロマトグラフィーにて２回処理し、メチオニナーゼの溶液を回収すること、
（ｆ）メチオニナーゼの溶液をクロマトグラフィーによるポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程へ投入し、精製したメチオニナーゼ液を回収すること。
【０１２１】
好ましい実施形態において、使用はシュードマス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の配列をコードするメチオニナーゼで構成されている。この配列は、生産株に配列を適合させるために最適化されてもよい。生産株は、好ましくは大腸菌、例えば株ＨＭＳ１７４である。メチオニナーゼ配列、好ましくは、最適化されたものを含む発現ベクターは、生産株を形質転換するために使用され、産生するクローンが選択されてもよい。その後、このクローンを使用するメチオニナーゼの製造が、通常の条件下において発酵槽中で行われる。
【０１２２】
好ましくは、工程（ａ）のペレットは、溶解緩衝液中に再懸濁される（例えば［１００ｍＭのリン酸ナトリウム；４．４ｍＭのＥＤＴＡ；３．３ｍＭのＰ５Ｐ；１ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ７．６］）（湿重量のグラム当たり７ｍL）。好ましくは、溶解は、高圧均質化、有利には複数の工程で、好ましくは３段階の高圧均質化によって実施される。典型的な温度は、均質化の各段階の前に約１０℃（９〜１２℃の間）で維持される。好ましくは、溶解した後、遠心分離の前に、細胞溶解物は、カチオン性凝固剤、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して清澄化（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）するために投入される。典型的なＰＥＩ濃度は、約０．０５〜約０．５％（Ｖ／Ｖ）、特に約０．１〜約０．３％、好ましくは０．２％であってもよい。
【０１２３】
工程（ｃ）での沈殿は、硫酸アンモニウムを用いて、典型的には約６０％の飽和で、実施されてもよい。好ましくは、この沈殿の前に、上清は約０．２μＭの膜で濾過される。
【０１２４】
工程（ｄ）では、ＰＥＧは、好ましくはＰＥＧ−６０００である。その最終濃度は、約５〜約２５％（Ｗ／Ｖ）、特に約５〜約１５％であってもよい。最初のラウンドは、好ましくは、硫酸アンモニウムの存在下で実施されてもよい。一般的に、硫酸アンモニウムは、約１０％の飽和（９〜１１％）であってもよい。典型的には、ＰＥＧは、約１０％の最終濃度であってもよい。第二ラウンドは、好ましくは無機塩、典型的にはアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウム、好ましくは塩化ナトリウムの存在下で実施することができる。塩は、約０．２０Ｍ（０．１９〜０．２１の間）の最終濃度であってもよい。典型的には、ＰＥＧは、約１２％の最終濃度であってもよい。温度は、約２５〜約３５℃、特に約２８〜約３２℃、典型的には約３０℃が含まれてもよい。
【０１２５】
工程（ｅ）において、クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥセファロースを用いて実行してもよい。好ましくは、クロマトグラフィーの前に、再懸濁したペレット又は沈殿物は、約０．４５μＭのフィルターを通過させてもよい。
【０１２６】
工程（ｆ）において、ポリッシングは、残留した汚染物質、例えばエンドトキシン、ＨＣＰ及びＤＮＡ等を除去するために実施される。これは、Ｑ膜クロマトグラフィーを用いて実施され得る。
【０１２７】
精製したメチオニナーゼは、その後、濃縮され、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）されてもよい。保存は、凍結乾燥及び約−８０℃の貯蔵を介して実施されてもよい。本発明は、これより非限定的な例として挙げられる実施例の手段及び以下の図面を参照してより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】欧州特許第０９７８５６０号明細書に記載された方法に従った、及び本出願に記載の改良された方法に従った、ＭＧＬを精製する方法の記述。欧州特許第０９７８５６０号明細書に記載された方法に行われた変形は、硫酸アンモニウムによる沈殿工程の後の工程に関する。
【図２】異なる濃度のピリドキシン（ＰＮ）を有するＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ懸濁液のインキュベーション後の、ＰＬＰの赤血球内濃度（図２）及び細胞外濃度（図３）の比較。ピリドキシンの非存在下（０ｍＭ）、室温にて３時間及び２４時間インキュベートしたＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ懸濁液は、約３．９μＭの基礎ＰＬＰレベルを有する。２ｍＭ及び４ｍＭのピリドキシンと懸濁液とのインキュベーションは、３時間のインキュベーション後、赤血球内ＰＬＰ濃度を８μＭに上昇させる可能性を与え（薄い灰色のバー）、２４時間のインキュベーション後には、かなり高いレベル（それぞれ１１μＭ及び１４μＭ）を達成する可能性を与える（濃い灰色のバー）。
【図３】異なる濃度のピリドキシン（ＰＮ）を有するＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ懸濁液のインキュベーション後の、ＰＬＰの赤血球内濃度（図２）及び細胞外濃度（図３）の比較。ピリドキシンの非存在下（０ｍＭ）、室温にて３時間及び２４時間インキュベートしたＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ懸濁液は、約３．９μＭの基礎ＰＬＰレベルを有する。２ｍＭ及び４ｍＭのピリドキシンと懸濁液とのインキュベーションは、３時間のインキュベーション後、赤血球内ＰＬＰ濃度を８μＭに上昇させる可能性を与え（薄い灰色のバー）、２４時間のインキュベーション後には、かなり高いレベル（それぞれ１１μＭ及び１４μＭ）を達成する可能性を与える（濃い灰色のバー）。
【図４】ＭＧＬ−ＰＬＰ複合体を有する赤血球（ＲＣＳ）の薬物動態。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２生成物は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３生成物は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜１２５μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４生成物は、５ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び３３μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５生成物は６ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び１００μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。生成物の蛍光標識（ＣＦＳＥ）は、インビボでのＲＣのトレーサビリティを可能にする。マウスＣＤ１に静脈内注射された生成物（生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３とＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５は８ｍＬ／ｋｇ、生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４は１０ｍＬ／ｋｇ）は、１２０時間、すなわち、投与５日後、注射したＲＣが７５％以上の生存率を有し、優れた安定性を有する。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４生成物は、その生存率が、〜１０日後に７５％未満に低減する。
【図５】フリーのＭＧＬ酵素の薬動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）。ＭＧＬ酵素は、二つの注射可能な生成物（ＭＧＬ−Ｌ１とＭＧＬ−Ｌ２）を得るために、１０μＭのＰ５Ｐを補充したリン酸カリウム溶液を用いて希釈した。当該生成物は、１）生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２と同じ酵素濃度、すなわち、０．４５ｍｇ／ｍＬのＭＧＬと、２）ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２の２倍の濃度、すなわち、０．９０ｍｇ／ｍＬのＭＧＬが得られるように製造された。両方の生成物は、注射６時間後、ピリドキシンの補充ＩＶと共に、ＣＤ１マウスに静脈内（ＩＶ）投与される（８ｍＬ／ｋｇ）。血漿Ｌ−メチオニンレベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより測定される。非処理のＣＤ１におけるＬ−Ｍｅｔのレベルは６８μＭと評価された。これらの生成物ＭＧＬ−Ｌ１及びＭＧＬ−Ｌ２の両方は、それらの投与後１５分以内に急速に枯渇へと導かれるが、長い時間持続しない。
【図６】短期間のＲＣ−ＭＧＬ−のＰＬＰの薬動力学。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３生成物は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜１２５μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。両生成物は、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２を受け入れるマウスに投与６時間後、ピリドキシンのＩＶ補充と共に、ＣＤ１マウスに静脈内（ＩＶ）投与される（８ｍＬ／ｋｇ）。血漿Ｌ−メチオニンレベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより測定される。未処理ＣＤ１中のＬ−Ｍｅｔのレベルは８２μＭと評価された。両方の生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２とＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３は、それらの投与後１５分で急速な枯渇を導き、Ｌ−Ｍｅｔレベルがそれぞれ１５．０±３．６μＭ及び２２．７±１．５μＭへと減少し、その後、３５μＭでより適度な枯渇を維持するが、４８時間〜１２０時間の間、安定である。
【図７】長期のＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰの薬動力学。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４（０．５ｍｇ／ｍＬ）は、５ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び３３μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。生成物は、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４を受け入れるマウスに投与６時間後、ピリドキシンのＩＶ補充と共に、ＣＤ１マウスに静脈内（ＩＶ）投与される（１０ｍＬ／ｋｇ）。血漿Ｌ−メチオニンレベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより測定される。未処理ＣＤ１中のＬ−Ｍｅｔのレベルは６８μＭと評価された。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４は、投与後１５分で急速に枯渇を導き、〜１０μＭのＬ−Ｍｅｔのレベルへと減少させ、その後、〜２５μＭでより適度な枯渇を維持するが、２４時間〜４８時間の間、安定である。
【図８】循環ＰＬＰ酵素の残存活性。酵素ＭＧＬは、注射可能な生成物ＭＧＬ−Ｌ２を得るために、１０μＭのＰ５Ｐを補充したリン酸カリウム溶液を用いて希釈した。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解−再シール化によって得られる。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３は３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜１２５μＭのＰＬＰのを含む懸濁液の溶解・再シール化によって得られる。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４は、５ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び３３μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解・再シール化によって得られる。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５は６ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び１００μＭのＰＬＰを含む懸濁液の溶解・再シール化によって得られる。生成物は、ＣＤ１マウスに静脈内注射される（生成物ＭＧＬ−Ｌ２、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５は８ｍＬ／ｋｇ、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４は１０ｍＬ）。注射されたＭＧＬ酵素（合計ＲＣＳ）の残存活性は、実施例４に記載の方法に従ってＭＧＬによって産生されるＮＨ3を測定することによって決定される。
【実施例】
【０１２９】
実施例１．メチオニンガンマリアーゼ（ＭＧＬ）の取得及びを特徴付ける方法
株の生産及び高産生クローンの単離：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ８８５５４．１）のＭＧＬの天然配列は、（Ｐ．プチダから生産株の大腸菌へ、由来する配列を適合させるために）稀なコドンを変更することによって最適化した。他の変更は、翻訳開始状況を改善するために実施されている。最後に、サイレント突然変異は、コード配列中の推定の細菌プロモータの一部の３つのエレメントの削除を実施した（ボックス−３５、ボックス−１０及びポジション５６の転写因子の結合部位）。生産株大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）は、最適化された配列を含む発現ベクターｐＧＴＰｃ５０２＿ＭＧＬ（プロモーターＴ７）を用いて形質転換し、産生クローンを選択した。産生クローンは、ＧＹ培地＋０．５％グルコース＋カナマイシンを用いて３７℃で６〜８時間（前培養１）及び１６時間（前培養２）プレ培養される。
【０１３０】
発酵：生産は、その後、光学密度０．０２の前培養２から、攪拌、制御された圧力及びｐＨで、ＧＹ培地を用いて発酵槽において達成される。成長期（３７℃）は、光学密度１０になるまで実施し、発現誘導は、培養培地に１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより２８℃にて達成される。細胞沈殿物は、誘導２０時間後に２つのフェーズで回収される：細胞培養液は、５００ｋＤａの中空糸を通過させた後、５〜１０倍に濃縮され、次いで、細胞ペレットは１５９００×ｇａｎｄにて遠心分離で回収され、その後、−２０℃で保存される。
【０１３１】
精製：細胞ペレットは解凍され、溶解緩衝液（７ｖ／ｗ）中に懸濁される。溶解は、高圧均質化によって１０℃において３工程で行われる（１工程は１０００バール、その後の２工程は６００バール）。細胞溶解物は、その後、１０℃で０．２％ＰＥＩを添加して清澄化し、１５９００×ｇで遠心分離を実施する。可溶性画分は、その後、２０時間かけて、６℃にて硫酸アンモニウム（６０％飽和）で沈殿する前に０．２μｍで滅菌される。二つの結晶化工程は、可溶化緩衝液を用いて再可溶化された沈殿に対して実施され、第一の結晶化工程は、１０％（最終濃度）のＰＥＧ−６０００及び１０％飽和硫酸アンモニウムを添加することで実施され、第二の結晶化は、次に３０℃にて最終濃度１２％のＰＥＧ−６０００及び０．２ＭのＮａＣｌ（最終濃度）を添加することで実現される。ＭＧＬタンパク質を含むペレットは、１５９００×ｇで遠心分離した後に各段階で回収される。ＭＧＬタンパク質を含むペレットは、可溶化緩衝液中で再懸濁され、２つの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファロースＦＦ）に投入される前に０．４５μｍのフィルターに通される。精製されたタンパク質は、その後、ポリッシング工程が行われ、別の汚染物質（エンドトキシン、ＨＣＰ宿主細胞タンパク質、残存ＤＮＡ）を除去するためのＱ膜クロマトグラフィーカプセルを通過させる。最後に、精製されたＭＧＬタンパク質は、４０ｍｇ／ｍLに濃縮され、１０ｋＤａのカットオフタンジェンシャルフロー濾過カセットを使用して、製剤緩衝液中にてダイアフィルトレーションされる（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。物質は、その後、バイアル当たり〜５０ｍｇのタンパク質に分注され、最終的に制御された圧力及び温度下にて凍結乾燥され、−８０℃で保存された。
【０１３２】
評価（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）：酵素の比活性は、実施例４に記載のように、産生されるＮＨ3を測定することによって決定される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される。水で溶解された後のＰＬＰレベルは、実施例５に記載の方法に従って評価された。浸透圧は浸透圧計（マイクロ−スモメータールーザータイプ１５）を用いて測定された。
【０１３３】
以下の表は、ＭＧＬの１生産バッチの主な特徴を要約したものである：
【０１３４】
【表１】
0006563958.tif 000002
【０１３５】
製造方法の考察。実施例１に記載のＭＧＬの精製方法は、欧州特許第０９７８５６０号明細書に記載の方法及び関連する文献（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００６）に基づいて確立される。この選択は、著者らの大規模生産に特に実用的であって、容易に適応できると記載されている結晶化工程の単純性及び頑強性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）によって説明される。この工程は、溶解／清澄化後に得られるＭＧＬ溶液を加熱した後に、ＰＥＧ６０００及び硫酸アンモニウムの使用に基づき、ＰＥＧ６０００／硫酸アンモニウム工程を追加することによる不純物を除去することである。この工程の他の注目すべき点は、ＰＥＧ６０００を用いたＭＧＬ溶液の処置後の遠心分離を達成することによる不純物を除去する工程の間に、高い純度レベルを迅速に得ることができることである。不純物は、再度遠心分離ペレット中に見られ、ＭＧＬは、大部分が、上清の溶液中に見られる。この純度のために、セファクリルＳ２００ＨＲカラムのゲル濾過による精製工程に関連して、単一のクロマトグラフィー工程においてＭＧＬ溶液を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）に通過させて、精製タンパク質を得る可能性を提供する。
【０１３６】
小規模試験に対する特許方法を場所に適用した場合、得られた結果が再現できないようであった。欧州特許第０９７８５６０号明細書によれば、不純物を除去する工程の終わりにて（ＰＥＧ６０００／硫酸アンモニウムでの処理及び遠心分離）、ＭＧＬ酵素は、大部分が可溶性画分に見出され、遠心分離が、ペレット中の不純物の除去を引き起こす。欧州特許第０９７８５６０号明細書中に記載の方法に従って行われた小規模試験の間、ＭＧＬタンパクは、遠心分離ペレット中に、再び大部分が見出された（〜８０％）。以下の表は、可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での濃度測定によって評価されたＭＧＬの割合を示している。
【０１３７】
【表２】
0006563958.tif 000003
【０１３８】
この予想外の結果は、従って、１）ＭＧＬを含む遠心分離ペレットから操作すること、２）ＤＥＡＥカラムにロード後、不純物を除去することを改善する２つの連続した結晶化工程を実施すること、３）ＤＥＡＥカラムのクロマトグラフィーを最適化すること、によって、特許された方法の最適化を導く。
【０１３９】
この最後の工程に対し、ＤＥＡＥセファロースＦＦ樹脂は、試験緩衝液及びｐＨ条件において最終的に十分強力な交換体ではないことが見出される。異なる追加の最適化試験の後、選択は、最終的に、１）方法の頑強性を改善するトリス緩衝液ｐＨ７．６を用いた初期の方法において使用されるリン酸緩衝液を置換すること、及び２）ＭＧＬを損なうことなく、エンドトキシンレベル及びタンパク質の純度を実質的に向上させるために、ＤＥＡＥで第２パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）を実施すること、を指示する（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の０．８ＥＵ／ｍｇ  対  改良方法の０．５７ＥＵ／ｍｇ）。
【０１４０】
最後に、大規模ＧＭＰ生産の要件に適合した方法を得るために、膜Ｑを用いるポリッシング工程が、残留エンドトキシン及びＨＣＰのレベルを減少させるために追加された。ポリッシングのこの最終工程は、工業規模の生産工程で使用することが困難な工程であるＳ２００ゲル濾過クロマトグラフィーの実施（コスト及びクロマトグラフィーの時間）を回避する。
【０１４１】
欧州特許第０９７８５６０号明細書の方法と同様に、本出願の方法の異なる精製工程は、図１に示されている。
【０１４２】
以下の表は、提供される適用が、最初の方法で記載されたものと少なくとも同等の収率を有する精製方法を得ることを導くことを確認する可能性を提供する。
【０１４３】
【表３】
0006563958.tif 000004
【０１４４】
実施例２．マウス赤血球中のＭＧＬとＰＬＰの共カプセル化
ＣＤ１マウス（チャールズリバー）の全血を、血漿及びバフィーコートを除去するために４℃にて、１０分間、１０００×ｇで遠心分離する。ＲＣを、０．９％ＮａＣｌ（ｖ：ｖ）で３回洗浄する。凍結乾燥したＭＧＬは７８．７ｍｇ／ｍLの濃度で水に再懸濁し、ＭＧＬ及びＰＬＰの異なる濃度を含有する７０％のヘマトクリット値を有する最終懸濁液を得るために、赤血球の懸濁液に添加する。懸濁液を１２０ｍL／時の流量で血液透析器にロードし、対向流として１５ｍL／分の流速で低張液に対して透析した。次いで、懸濁液を高張液で再度シール化し、その後、３７℃で３０分間インキュベートした。０．９％ＮａＣｌ、０．２％グルコースで３回洗浄した後、懸濁液を６％のＢＳＡを補充したＳＡＧ−マンニトール保存液中に取り込んだ。得られた生成物はＤ０（調整後２時間以内）及びＤ１（すなわち、２〜８℃で〜１８時間−２４時間の保存後）で性質を調べる。血液学的特性は、獣医学オートマトン（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｏｍａｔｏｎ）（シスメックス、ＰＯＣＨ−１００ｉＶ）で得られる。
【０１４５】
結果：
以下に挙げる別の研究では、完成した生成物中のＭＧＬ活性は、水溶液中のＭＧＬの外部較正範囲に対し、実施例４に記載した方法を用いてアッセイされる。説明的な研究と組み合わせられたこれらの結果は、最終生成物におけるＭＧＬ活性が、該方法に導入される酵素の量と共に増加し、及び、良好な安定性を維持しながら最終生成物１ｍL当たり３２ＩＵのＭＧＬまで容易にカプセル化可能であることを示す。
【０１４６】
別の研究では、３つのマウスの完成した生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３は、以下の方法に従って調製された：
【０１４７】
−ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１：３ｍｇ／ｍLのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰを含む懸濁液由来のＭＧＬ及びＰＬＰの共カプセル化。最終生成物は、最終１０μＭのＰＬＰを補充したＳＡＧマンニトール、６％ＢＳＡ中に取り込んだ。
【０１４８】
−ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２：３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰを含む懸濁液由来のＭＧＬ及びＰＬＰの共カプセル化。最終生成物は、ＳＡＧマンニトール６％ＢＳＡ中に取り込んだ。
【０１４９】
−ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３：この生成物は、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜１２４μＭのＰＬＰを含む懸濁液由来のＭＧＬ及びＰＬＰの共カプセル化に由来する。最終生成物は、ＳＡＧマンニトール６％ＢＳＡ中に取り込んだ。
【０１５０】
第三の研究において、マウスの最終生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４は、以下の方法に従って新しいバッチのＭＧＬから調製された：
【０１５１】
−ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４：５ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３５μＭのＰＬＰを含む懸濁液由来のＭＧＬ及びＰＬＰの共カプセル化。最終生成物は、ＳＡＧマンニトール６％ＢＳＡ中に取り込んだ。
【０１５２】
最後に、第四の研究において、マウス生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５は、以下の方法に従ってＭＧＬの第三のバッチから調製された：
【０１５３】
−ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５：６ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜１００μＭのＰＬＰを含む懸濁液由来のＭＧＬ及びＰＬＰの共カプセル化。最終生成物は、ＳＡＧマンニトール６％ＢＳＡ中に取り込んだ。
【０１５４】
Ｄ０（それらの調製後）における３つの最終生成物の血液学的及び生化学的特徴は、以下の表に詳述される。カプセル化の収率は良好であり、１８．６％〜３０．５％で変化する。
【０１５５】
【表４】
0006563958.tif 000005
【０１５６】
実施例３．工業的方法に従ったメチオニンガンマリアーゼ及びＰＬＰをカプセル化するヒトＲＣの製造
白血球を除去したヒトＲＣのパウチ（「エタブリッセメント  フランチャイス  デュ  サンウ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ）」から提供）を、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄サイクル実施する（ワッシャ  コーベ（ｗａｓｈｅｒ  Ｃｏｂｅ）２９９１）。凍結乾燥ＭＧＬを０．７％ＮａＣｌで再懸濁し、３ｍｇ／ｍＬのＭＧＬ及び〜３０μＭのＰＬＰ（ＭＧＬの製剤に由来する）を含んだ、７０％のヘマトクリット値を有する最終的な懸濁液を得るために、赤血球の懸濁液に添加される。懸濁液を均質化し、欧州特許第１７７３４５２号明細書に記載された方法に従ってカプセル化を実施する。再シール化された懸濁液は、その後、ほとんどの脆弱なＲＣを除去するために、室温で３時間インキュベートする。懸濁液を０．９％のＮａＣｌ、０．２％グルコース溶液（ワッシャ  コーベ２９９１）を用いて３回洗浄し、次いで８０ｍＬの保存液（ＡＳ−３）で再懸濁する。カプセル化されたＭＧＬレベルは、実施例４と同様にアッセイされる。
【０１５７】
【表５】
0006563958.tif 000006
【０１５８】
実施例４．ＲＣにカプセル化されたＭＧＬのアッセイ
細胞懸濁液（総ＲＣ）中の、及び上清中のＭＧＬ活性のアッセイは、ＭＧＬによって生成されるＮＨ3の測定に基づく。ＮＨ3イオンは、ロシュ・ダイアグノスティックスによって市販されるキット（１１８７７９８４）に従って、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の酵素作用によって間接的にアッセイされる。
【０１５９】
標準の準備：異なる濃度のＭＧＬ標準は、マトリックスで（全体又は上清ＲＣ）又は水溶液中で調製した。
・水溶液中の標準に対し、ＭＧＬは、ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸緩衝液中で、２０μＭのＰＬＰの存在下、０〜１２μｇｍＬの様々な濃度で調製される。
・総ＲＣマトリックス標準に対し、１０μＬのＲＣ−ＬＲは、２６０μＭのＰＬＰと、０〜１００μｇ／ｍＬの種々の濃度のＭＧＬとを含む溶液の９０μＬを用いて溶解される。「全ＲＣ」標準は、次に、ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸緩衝液で２０倍に希釈される。
・上清マトリックス基準に対し、ＲＣ−ＬＲの上清１０μＬは、６．４μＭのＰＬＰと、０〜２０μｇ／ｍＬの種々の濃度のＭＧＬとを含む溶液５０μＬで溶解される。
【０１６０】
サンプルの前処理：アッセイされるサンプル（１０μＬ）は、標準と同じ方法で前処理される（ＰＬＰと同一の希釈液を添加するが、ＭＧＬの添加なし）。
【０１６１】
ＭＧＬのアッセイ：７．５μLの標準（ＳＴＤ）又はサンプルをＵＶプレートのウェルに導入する。緩衝溶液中のα−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ及びＧＬＤＨを含む９４μLの試薬Ｒ１（ロシュキット）及び５６μLの試薬Ｒ２（ロシュキット）は、サンプルの内因性ＮＨ3を除去するために添加される。インキュベーションの１０分後、７５μLの７８．３ｍＭ  Ｌ−メチオニンを導入し、反応混合物を３０分間インキュベートする。ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への分解は、連続的に３４０ｎｍの光学密度を測定することによって追跡される。標準及びサンプルに対する、ΔＯＤ／分の値は、３４０ｎｍで得られるＯ．Ｄ．曲線の線形領域で計算される。較正曲線ΔＯＤ／分＝ｆ（標準のＭＧＬ濃度又は活性）は、その後、プロットされる。回帰パラメータは、サンプル中のＭＧＬ濃度の決定を可能にする。この結果は、ｍｇ／ｍLで、又はＩＵ／ｍLで表してもよい（バッチごとに評価される特定のＭＧＬ活性）。赤血球内ＭＧＬレベルは、次の式で計算することにより得られる：［ＭＧＬ］赤血球内＝（［ＭＧＬ］総合−（［ＭＧＬ］上清×（１−ヘマトクリット値／１００））／（ヘマトクリット値／１００）
【０１６２】
実施例５．ＨＰＬＣ法による血液サンプル中のＰＬＰのアッセイ
細胞懸濁液（総ＲＣ）中の、及び、上清中のＰＬＰのアッセイは、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，４１５−４２２、１９９５に記載された方法の適応である。アッセイは、蛍光定量法（ＲＦ−１０ＡＸＬ機器、励起：３００ｎｍ、発光：４００ｎｍ）による検出で、ＲＰ−ＨＰＬＣ（島津製作所ＵＦＬＣ）を用いて実施される。サンプル中に含まれるＰＬＰは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて最終６％で抽出した。遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）後、上清を回収し、次いで移動相Ａ中に希釈する。５０μＬのサンプル容量は、５μＣ−１８ジェミニカラム、２５０×４．６ｍｍ（フェノメネクス社）に注入される。移動相Ａは、３３ｍＭのリン酸二水素カリウム（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と、ＰＬＰのシグナルを増感させるための亜硫酸水素ナトリウム（０．５ｇ／Ｌ）を補充した８ｍＭの１−オクタンスルホン酸ナトリウムと、３３ｍＭのリン酸二水素カリウム及び１７％（ｖ：ｖ）の２−プロパノールからなる移動相Ｂと、からなる。使用した勾配は、移動相Ｂの増加する割合を有する移動相Ａ（１００％）であり、８分間にわたってＢを０％から８％まで増加する。カラムを通過する流れは１ｍＬ／分で維持される。サンプル中のＰＬＰの濃度は、サンプルと同じＴＣＡ処理対象のＰＬＰの外部標準範囲によって決定される。ＰＬＰの保持時間は〜３．４分である。赤血球内ＰＬＰレベルは次の式で計算して得られる：［ＰＬＰ］赤血球内＝（［ＰＬＰ］総合−（［ＰＬＰ］上清×（１−ヘマトクリット値／１００））／（ヘマトクリット値／１００）
【０１６３】
実施例６．ＭＧＬとＰＬＰの共カプセル化によるＲＣのＰＬＰレベルの増加
マウスＲＣの懸濁液は、実施例２に記載のＭＧＬ及びＰＬＰをカプセル化する方法に従う。細胞内ＰＬＰのアッセイは、実施例５に記載の方法に従って実施される。
【０１６４】
ヒトＲＣの懸濁液は、実施例３に記載のＭＧＬ及びＰＬＰをカプセル化する方法に従う。室温でのインキュベーション工程前に、ヒトＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰの部分は、実施例５に記載の方法に従って、細胞内ＰＬＰのアッセイを実施するためにサンプリングされる。
【０１６５】
以下の表は、ヒト又はマウスの赤血球におけるＰＬＰの生理的レベルと、ＭＧＬを用いた後者の共カプセル化によって達成されるレベルとを比較する。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
実施例７．インビトロにおけるピリドキシンを用いたインキュベーションによるＲＣ−ＭＧＬ中のＰＬＰ濃度の増加の実証
ヒトＲＣの懸濁液は、実施例３に記載したＭＧＬをカプセル化する方法に従う。インキュベーション工程の３時間前に、ＲＣの一部を採取し、異なる濃度のピリドキシン（０ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭ）で容量−容量インキュベーション用に３つに分離される。均質化後、これらの懸濁液を室温（ＲＴ）でインキュベートする。３時間及び２４時間のインキュベーション後、細胞懸濁液、及び、上清のサンプル（１０分間、４℃にて１０００×ｇで懸濁液を遠心分離後に得られる）が調製され、実施例５に記載したようにＨＰＬＣによってＰＬＰ濃度を測定するために凍結される。
【０１６８】
得られた結果は図２及び図３に示されている。
【０１６９】
ピリドキシンの非存在下において、赤血球内のＰＬＰレベルは３．９μＭである（ＭＧＬとＰＬＰの共カプセル化から得られるＰＬＰ）。このＰＬＰ濃度は、インキュベーションの３時間及び２４時間後、一定のままである。ＰＬＰ濃度のわずかな減少は２４時間で観察され、インキュベーション終了時の溶血で説明できる細胞外ＰＬＰが同時に発生する。
【０１７０】
ピリドキシンの存在下（２ｍＭ又は４ｍＭ）、ＲＣ−ＭＧＬは、３時間のインキュベーション後には２倍に（〜８μＭのＰＬＰ）、２４時間のインキュベーション後には用量効果の発生を有しながら、ほぼ３倍に増加した（２ｍＭ及び４ｍＭのピリドキシン濃度それぞれに対して１１μＭ及び１４μＭ）赤血球内濃度を有するＰＬＰへと増加する。これらの結果は、ピリドキシン（ＰＮ）とＰＬＰ依存ＰＬＰ酵素をカプセル化しているＲＣ懸濁液のインキュベーションは、長期持続するような方法で、細胞内のＰＬＰレベルを増加させることが可能であることを示している。
【０１７１】
実施例８．マウスにおけるＭＧＬ−ＰＬＰをカプセル化しているＲＣの薬物動態
マウス生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５をＣＦＳＥ（蛍光）で標識し、ＣＤ１マウスに静脈内注射する。様々な時間後（３つの生成物に対してはＤ０＋１５分、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ５、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４に対しては追加的にＤ１４とＤ２８、及び、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５生成物に対してはＤ１４）、マウスを屠殺し、血液をリチウムヘパリン酸塩（ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ）管に回収し、薬物動態を決定するために光から離して＋４℃で維持した。全血中のＣＦＳＥで標識した赤血球の割合はフローサイトメトリー法によって決定される。５μＬの全血、を１ｍＬのＰＢＳ  ０．５％ＢＳＡ中に希釈し、各サンプルはトリプリケートで実施される（ＦＬ−１で１０，０００個の細胞の計数；サイトメーターＦＣ５００、ベックマン・コールター）。ＭＧＬが充填された赤血球の生存率の評価は、異なる時間に、ＣＦＳＥで標識したＲＣの割合を、Ｔ０＋１５分（１００％コントロール）にＣＦＳＥで標識したＲＣの割合へ加えることで得られる。各時間に対し、異なる得られた割合は、グラフ上にコピーされ（図４）、循環しているＭＧＬが充填されたＲＣの割合、対、時間を示している。
【０１７２】
異なる時点での循環する血液中のＣＦＳＥで標識されたＲＣの割合の決定は、注射後１２０時間後まで、マウスのインビボにおいて、４つの生成物の優れた安定性を示している（それぞれ８３．５±０．６％、９４．７±０．６％、８７．３±５．６％及び７６．８±１．３％の生存率）。生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４に対し、２９日間の薬物動態学的研究は、ＭＧＬをカプセル化している赤血球の半減期は〜１２．６日であることを示した。
【０１７３】
実施例９．２４時間におけるＬ−メチオニンの枯渇
実施例２で調製され、特徴づけられたマウス生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３は、８ｍL／ｋｇの投与量でＣＤ１マウスに静脈内注射される。６時間後、〜０．０９ｍｇのピリドキシン（すなわち、２．９ｍＭピリドキシン塩酸溶液１５０μL）は、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２を受け入れたマウスに注射された。Ｌ−Ｍｅｔの血漿レベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより２４時間時点で評価された（Ｐｉｒａｕｄ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ＣｏｍＭｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ．１９，３２８７−９７，２００５）。以下の表は、注射したマウスの種々の群で得られた枯渇を示している。
【０１７４】
【表７】
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【０１７５】
Ｌ−Ｍｅｔの血漿レベルは、コントロールマウスにおいて８２．７±２２．５μＭであると評価された。低ＰＬＰ濃度と共にカプセル化されたＭＧＬを含む生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１は、生成物の投与２４時間後、４４％のＬ−Ｍｅｔ枯渇を導く。我々は、生成物の保存液に添加されたＰＬＰは、酵素ＭＧＬには利用可能ではないという仮説を提唱する。なぜなら、１）それは大部分が保存液中に存在するＢＳＡに結合し、２）それは、ＲＣの膜を通過できないためである。
【０１７６】
結果は、ピリドキシンのＩＶ注射（ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２）、又は、より強力な濃度のＰＬＰのカプセル化のいずれかによる、赤血球中のＰＬＰのより多くの結果の提供が、〜１．５倍Ｌ−Ｍｅｔ枯渇が得られる可能性が高いことを示す（それぞれ７３％及び６４％の枯渇）。
【０１７７】
実施例１０．ＲＣ−ＭＧＬの薬力学
そのフリーの形態のＭＧＬ酵素が、８ｍＬ／ｋｇの投与量でＣＤ１マウスに静脈内注射される。２つのシリーズの注射は、第一に０．４５ｍｇ／ｍＬの酵素濃度で（生成物ＭＧＬ−Ｌ１）、第二に２倍の濃度（０．９０ｍｇ／ｍＬ；生成物ＭＧＬ−Ｌ２）で実施された。注射６時間後、〜０．０９ｍｇのピリドキシン（すなわち、１５０μＬの２．９ｍＭピリドキシン塩酸溶液）を、ＭＧＬ−Ｌ１及びＭＧＬ−Ｌ２を受け入れたマウスに注射される。Ｌ−Ｍｅｔの血漿レベルは、ＭＧＬ−Ｌ１の注射の１５分後、２４時間後、４８時間後及び１２０時間後に、並びに、ＭＧＬ−Ｌ２の注射の１５分後、２４時間後、４８時間後、１２０時間後及び１４４時間後にＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって評価される。図５は、注射したマウスの種々の群で得られた枯渇を示している。
【０１７８】
結果は、両方の実験群で、非常に強力なＬ−メチオニン枯渇（〜４μＭ）及び迅速なオーバータイム（注射１５分後）を示した。しかしながら、このＰ５Ｐの初期供給（希釈液に存在するが、水に取り込まれた酵素の製剤中にも存在する）及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２生成物に実施されるものと同一のビタミンＢ６の補給に関わらず、この枯渇は一過性であり、経時的に維持されず、Ｌ−メチオニンレベルは、注射２４時間後にコントロール値へと回復する。フリーのＭＧＬの活性は、従って、注射の１５分〜２４時間後に消失し、おそらく循環している酵素の迅速な除去によるものである。
【０１７９】
第二フェーズでは、実施例２のように調製され、特徴づけられたマウス生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３は、８ｍＬ／ｋｇの投与量でＣＤ１マウスに静脈内注射される。６時間後、〜０．０９ｍｇのピリドキシン（すなわち、１５０μＬの２．９ｍＭピリドキシン塩酸溶液）がＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２を受け入れたマウスに注射される。Ｌ−Ｍｅｔの血漿レベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより、注射１５分後、２４時間後、４８時間後、及び１２０時間後に評価される。図６及び以下の表は、注射したマウスの種々の群で得られた枯渇を示す。
【０１８０】
結果は、両方の実験群において、Ｌ−メチオニン枯渇が〜３５μＭで安定し、経時的に維持されることを示している（注射４８時間〜１２０時間後）。これらの結果は、ＰＬＰ又はその前駆体（ビタミンＢ６）の補充が、マウスにおいて、注射後少なくとも１２０時間、ＲＣにカプセル化されたＭＧＬの活性を維持する可能性を与えることを示している。指標としての、様々な生成物の注射２４時間後及び１２０時間後における血漿中のＬ−メチオニン濃度（ＭＧＬのフリー形態又はＰＬＰを有する赤血球共カプセル化された形態）は、以下の表に示されている：
【０１８１】
【表８】
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【０１８２】
１２０時間以上の経時的な薬力学を評価するために、最終生成物中において、０．５ｍｇ／ｍＬの酵素のカプセル化されたＭＧＬ濃度を有するマウスの生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４が、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＤ１マウスへ静脈内注射される。６時間後、〜０．０９ｍｇのピリドキシン（すなわち、１５０μＬの２．９ｍＭピリドキシン塩酸溶液）が、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４を受け入れたマウスに注射される。Ｌ−Ｍｅｔの血漿レベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって評価される。図７は、注射１５分後、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ５、Ｄ１４及びＤ２８に得られた枯渇を示す。
【０１８３】
結果は、有意なＬ−メチオニンの枯渇（コントロールに対して〜１０μＭ  対  〜６８μＭ）及び経時的な急速な枯渇（注射１５分後）を示している。しかしながら、この枯渇は、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４注射後、２４時間〜４８時間に、〜２５μＭの値で安定し、約１２日目で最終的にコントロール値となるように５日後に〜４０μＭまで増加する。
【０１８４】
最終的に、注射されたＭＧＬ酵素の残存活性は、ＰＬＰの存在下で、実施例４に記載したアッセイ法によって決定される。以下の図８は、フリーの酵素ＭＧＬ−Ｌ２、様々な生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ及びＴＰＬ酵素（文献からのデータ）に対する、残存活性対時間を示している。
【０１８５】
結果は、マウス赤血球にＭＧＬをカプセル化することによって、２４時間で強い酵素活性を保持する可能があることを示す（〜６０〜１００％の間の残存活性）。この残留活性は、４８時間でわずかに減少し（〜３５〜１００％）、１２０時間まで、すなわち、注射の５日後まで、〜２０及び〜６５％に含まれる値で、維持される。フリー形態におけるＭＧＬの残存活性は、２４時間でほぼゼロになるように、注射の最初の数分後に大幅に低下する（残存活性＜１０％）。比較すると、フリー形態で注射されたＴＰＬの残存活性は、グラフ上に及び注射５時間後でコピーされ、後者は高々３７％である（Ｅｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）。残存活性の測定は、明らかに、それらの酵素活性を維持するために、赤血球中にＰＬＰ酵素がカプセル化されることの利点を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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