(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者より得られた尿検体中の3-ヒドロキシプロピルメルカプツール酸（以後、3-HPMAと称する）含有量とクレアチニン（以下、Creと称する）含有量との比（3-HPMA／Cre）、及び／又は、尿検体中のアクロレイン付加アミノ酸（以下、AC-Acroと略称する）含有量とCre含有量との比（AC-Acro／Cre）を指標にする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
【請求項２】
3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creが健常者のものと比較して低いことを指標とする、請求項１に記載の認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
【請求項３】
前記健常者と比較して低いことを指標とすることが、予め設定したカットオフ値と比較して低いことを指標とすることである、請求項２に記載の認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
【請求項４】
前記認知症はアルツハイマー型認知症である請求項１〜３のいずれか１項に記載の認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
【請求項５】
さらに、被験者より得られた血液検体中のアミロイドβ（Aβ）40含有量とAβ42含有量との比（Aβ40／Aβ42）が健常者として比較して高いことを指標とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
【請求項６】
被験者より得られた尿検体中の3-HPMA含有量とCre含有量との比（3-HPMA／Cre）、及び／又は、尿検体中のAC-Acro含有量とCre含有量との比（AC-Acro／Cre）を指標にする、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別することを補助する検査方法。
【請求項７】
3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creが軽度認知障害患者と比較して低いとき、前記被験者はアルツハイマー病であると判定する、請求項６に記載の軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別することを補助する検査方法。
【請求項８】
前記軽度認知障害患者と比較して低いことが、予め設定したカットオフ値と比較して低いことである、請求項７に記載の軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別することを補助する検査方法。
【請求項９】
3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creがアルツハイマー型認知症患者と比較して高いとき、前記被験者は軽度認知障害であると判定する、請求項６に記載の軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別することを補助する検査方法。
【請求項１０】
アルツハイマー型認知症患者と比較して高いことが、予め設定したカットオフ値と比較して高いことである、請求項９に記載の軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別することを補助する検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中の3-ヒドロキシプロピルメルカプツール酸（以後、3-HPMAと略称することがある）、アクロレイン付加アミノ酸（以下、AC-Acroと称することがある）、及びクレアチニン（以下、Creと称することがある）を指標とする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法に関する。また、本発明は、尿中の3-HPMA、AC-Acro、及びCreを指標とする、アルツハイマー型認知症を軽度認知障害と判別する検査方法に関する。より詳しくは、本発明は、尿中の3-HPMA含有量とCre含有量との比、及び／又は、尿中のAC-Acro含有量とCre含有量との比を指標とする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法、並びに、アルツハイマー型認知症を軽度認知障害と判別する検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、後天的な脳の器質的障害により、認知機能が低下した、認知機能障害のある症候群をいう。認知機能障害は、脳内の情報処理によって実現する機能、例えば記憶、言語、思考、知覚、判断などの機能の障害をいい、記憶障害、失語、失行、失認、遂行機能障害などの症状を示す。
【０００３】
認知症は、その原因疾患により、アルツハイマー型認知症（Alzheimer type dementia）、レビー小体型認知症（dementia with Lewy bodies）、及び前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia）などの神経変性性認知症、多発脳梗塞型認知症及び限局性脳梗塞型認知症などの脳血管性認知症（vascular dementia）、並びに正常圧水頭症や甲状腺機能低下などによる治療可能な認知症に分類される。
【０００４】
アルツハイマー型認知症は、一般的にアルツハイマー病（Alzheimer's disease；以下、ADと略称することがある）とも称される神経変性疾患であり、認識機能及び行動の進行性障害を特徴とする。ADは、特に高齢者で、最もよく認められる種類の認知症である（非特許文献1、2）。そのため、ADの評価のために容易に利用できるバイオマーカーなどの、より簡便な診断手段が現在のところ求められている。最近、血漿中のアミロイド−β（以下、Aβと略称する）含有量が見込みのあるマーカーとして同定されている。しかしながら、Aβに関して報告された結果には相容れない報告があるという問題がある。いくつかの研究では、血漿中のAβ40及びAβ42の含有量はAD被験者とコントロールとで有意な差異がなかったと報告された（非特許文献3−6）。一方、別の研究では、血漿中のAβ42含有量又はAβ40に対するAβ42の比（Aβ42／Aβ40レベル）がAD被験者で有意に減少したと報告されている（非特許文献7−10）。
【０００５】
軽度認知障害（mild cognitive impairment：以下、MCIと略称することがある）は、正常老化過程で予想されるよりも認知機能が低下しているが、認知症とは診断されない状態をいう。認知症の前段階にあたるが、認知機能低下よりも記憶機能低下が主兆候である。主観的・客観的に記憶障害を認めるが、一般的な認知機能や日常生活能力はほぼ保たれている。MCIから、認知症と診断される程度に進行するまで、通常5〜10年、平均で6〜7年の期間がある。医療機関を受診したMCI患者のうち、年間10%から15%が認知症に移行するとされる。さらに、単に軽度の記憶障害のみ症例より、他の認知障害を合わせて持つ症例の方が、認知症への進行リスクがはるかに高いことが知られている。具体的には、4年後の認知症への移行率は、記憶障害のみの場合は24%、言語・注意・視空間認知の障害のいずれかの合併例では77%であった。
【０００６】
3-HPMAは、アクロレインとグルタチオン（GSH）との複合体の代謝物である。アクロレイン（CH2=CHCHO）は、生体内でアミノ酸及びポリアミンの代謝過程並びに膜脂質の過酸化過程で生成されることが知られており、また、組織障害時にはポリアミン、特にスペルミンから主に生産される（非特許文献11、12）。スペルミンは細胞中に数mMから数十mMオーダーの濃度で存在し、そしてその大半はポリアミン−RNA複合体で存在する（非特許文献13）。組織が障害を受けると、スペルミンがRNAから遊離し、そしてスペルミンオキシダーゼにより酸化分解を受け、アクロレインと過酸化水素（H2O2）を生じる（非特許文献12）。アクロレインは、反応性が高く、タンパク質のシステイン、リジン、ヒスチジン残基に選択的に反応して、タンパク質を不活化する。また、アクロレインは、細胞障害の原因と考えられているスーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、及びヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種（ROS）（非特許文献14）と比較して、細胞毒性が非常に強いことが知られている（非特許文献15、16）。
【０００７】
アクロレインは、チオール基（SH基）との相互作用が、アミノ基（NH2基）との相互作用よりもはるかに速いことが報告されており（非特許文献16）、SH基を有するGSHなどのチオール化合物と結合すること、及びその代謝がアルデヒドデヒドロゲナーゼなどの酵素により行われていることが知られている。GSHは細胞中で最も豊富にSHを含有する物質であることが知られており、細胞中に数mMから数十mMオーダーの濃度で存在する（非特許文献17、18）。すなわち、アクロレインは、GSHと結合してアクロレイン−GSH抱合体を形成し、酵素による代謝を受けて、3-HPMAに変換されて無毒化され、尿中代謝物として排泄される。そのため産生されるアクロレインは、GSHとの結合により大部分が無毒化される。GSHレベルの低下はアクロレインの代謝を低下させ、その結果、アクロレインとタンパク質や核酸との相互作用を引き起こし、これら物質の不活性化をもたらす。
【０００８】
最近、アクロレイン修飾タンパク質であるタンパク質抱合型アクロレイン（protein-conjugated acrolein：PC-Acro）及びその生産に関わる酵素であるポリアミンオキシダーゼ（スペルミンオキシダーゼ及びアセチルポリアミンオキシダーゼ）の血漿中レベルの増加が、脳卒中に対して有用なバイオマーカーであることが報告されている（非特許文献19、特許文献1−3）。また、血漿中のアクロレインの測定を、アクロレイン付加アミノ酸（以下、AC-Acroと称する）であるNε-（3-ホルミル-3,4-デヒドロピペリジノ）リジン（[Nε-(3-formyl-3,4-dehydropiperidino)lysine]（以下、FDP-リジンと称する））の含有量を測定することにより実施できることが報告されている（特許文献4）。
【０００９】
また、アクロレイン−GSH抱合体の主要代謝物である3-HPMAが脳卒中患者の尿中で減少していることが報告されており（非特許文献20）、この結果は、アクロレインを無毒化する物質である3-HPMAが脳卒中で減少することを示唆する。さらに、尿中3-HPMA含有量、又は尿中3-HPMA含有量を尿中Cre含有量で補正した3-HPMA／Creのレベルが脳卒中・脳梗塞を判定するためのマーカーとなることが開示されている（特許文献4）。
【００１０】
最近、血漿中のPC-Acro含有量及びAβ40／Aβ42レベルがいずれも、MCI及びAD被験者においてコントロール被験者と比較して有意に高いことが報告されている（非特許文献21）。しかしながら、これら2つのバイオマーカーによりMCI被験者とAD被験者とを明確に識別することは困難であった。
【００１１】
また、脳脊髄液（CSF）中のAβ40、Aβ40/PC-Acro及びAβ42/PC-AcroがAD被験者においてMCI被験者と比較して有意に低いことが報告されている（非特許文献22）。しかしながら、脳脊髄液を採取することは比較的困難であり、被験者への負担が大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2005-304476号公報
【特許文献２】国際公開第WO2008/142888号パンフレット
【特許文献３】特表2005-522669号公報
【特許文献４】国際公開第2012/173101号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (2006) Alzheimer's disease. Lancet 368, 387-403.
【非特許文献２】Drachman DA (2006) Aging of the brain, entropy, and Alzheimer disease. Neurology 67, 1340-1352.
【非特許文献３】Fukumoto H, Tennis M, Locascio JJ, Hyman BT, Growdon JH, Irizarry MC (2003) Age but not diagnosis is the main predictor of plasma amyloid β-protein levels. Arch Neurol 60, 958-964.
【非特許文献４】Sobow T, Flirski M, Kloszewska I, Liberski PP (2005) Plasma levels of Aβ peptides are altered in amnestic mild cognitive impairment but not in sporadic Alzheimer's disease. Acta Neurobiol Exp (Wars) 65, 117-124.
【非特許文献５】Roher AE, Esh CL, Kokjohn TA, Castano EM, Van Vickle GD, Kalback WM, Patton RL, Luehrs DC, Daugs ID, Kuo YM, Emmerling MR, Soares H, Quinn JF, Kaye J, Connor DJ, Silverberg NB, Adler CH, Seward JD, Beach TG, Sabbagh MN (2009) Amyloid beta peptides in human plasma and tissues and their significance for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement 5, 18-29.
【非特許文献６】Le Bastard N, Leurs J, Blomme W, De Deyn PP, Engelborghs S (2010) Plasma amyloid-β forms in Alzheimer's disease and non-Alzheimer's disease patients. J Alzheimers Dis 21, 291-301.
【非特許文献７】Mehta PD, Pirttila T, Mehta SP, Sersen EA, Aisen PS, Wisniewski HM (2000) Plasma and cerebrospinal fluid levels of amyloid β proteins 1-40 and 1-42 in Alzheimer disease. Arch Neurol 57,100-105.
【非特許文献８】Graff-Radford NR, Crook JE, Lucas J, Boeve BF, Knopman DS, Ivnik RJ, Smith GE, Younkin LH, Petersen RC, Younkin SG (2007) Association of low plasma Aβ42/Aβ40 ratios with increased imminent risk for mild cognitive impairment and Alzheimer disease. Arch Neurol 64,354-362.
【非特許文献９】Lui JK, Laws SM, Li QX, Villemagne VL, Ames D, Brown B, Bush AI, De Ruyck K, Dromey J, Ellis KA, Faux NG, Foster J, Fowler C, Gupta V, Hudson P, Laughton K, Masters CL, Pertile K, Rembach A, Rimajova M, Rodrigues M, Rowe CC, Rumble R, Szoeke C, Taddei K, Taddei T, Trounson B, Ward V, Martins RN, Group AR (2010) Plasma amyloid-beta as a biomarker in Alzheimer's disease: the AIBL study of aging. J Alzheimers Dis 20, 1233-1242.
【非特許文献１０】Yaffe K, Weston A, Graff-Radford NR, Satterfield S, Simonsick EM, Younkin SG, Younkin LH, Kuller L, Ayonayon HN, Ding J, Harris TB (2011) Association of plasma beta-amyloid level and cognitive reserve with subsequent cognitive decline. JAMA 305, 261-266.
【非特許文献１１】Uchida K, Kanematsu M, Morimitsu Y, Osawa T, Noguchi N, Niki E (1998) Acrolein is a product of lipid peroxidation reaction. Formation of free acrolein and its conjugate with lysine residues in oxidized low density lipoproteins. J Biol Chem 273, 16058-16066.
【非特許文献１２】Igarashi K, Kashiwagi K (2011) Protein-conjugated acrolein as a biochemical marker of brain infarction. Mol Nutr Food Res 55, 1332-1341.
【非特許文献１３】Igarashi K, Kashiwagi K (2010) Modulation of cellular function by polyamines. Int J Biochem Cell Biol 42, 39-51.
【非特許文献１４】Giorgio M, Trinei M, Migliaccio E, Pelicci PG (2007) Hydrogen peroxide: a metabolic by-product or a common mediator of ageing signals? Nat Rev Mol Cell Biol 8, 722-728.
【非特許文献１５】Yoshida M, Tomitori H, Machi Y, Hagihara M, Higashi K, Goda H, Ohya T, Niitsu M, Kashiwagi K, Igarashi K (2009) Acrolein toxicity: Comparison with reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun 378, 313-318.
【非特許文献１６】Sharmin S, Sakata K, Kashiwagi K, Ueda S, Iwasaki S, Shirahata A, Igarashi K (2001) Polyamine cytotoxicity in the presence of bovine serum amine oxidase. Biochem Biophys Res Commun 282, 228-235.
【非特許文献１７】Perry TL, Berry K, Hansen S, Diamond S, Mok C (1971) Regional distribution of amino acids in human brain obtained at autopsy. J Neurochem 18, 513-519.
【非特許文献１８】Tomitori H, Nakamura M, Sakamoto A, Terui Y, Yoshida M, Igarashi K, Kashiwagi K (2012) Augmented glutathione synthesis decreases acrolein toxicity. Biochem Biophys Res Commun 418, 110-115.
【非特許文献１９】Tomitori H, Usui T, Saeki N, Ueda S, Kase H, Nishimura K, Kashiwagi K, Igarashi K (2005) Polyamine oxidase and acrolein as novel biochemical markers for diagnosis of cerebral stroke. Stroke 36, 2609-2613.
【非特許文献２０】Yoshida M, Mikami T, Higashi K, Saiki R, Mizoi M, Fukuda K, Nakamura T, Ishii I, Nishimura K, Toida T, Tomitori H, Kashiwagi K, Igarashi K (2012) Inverse correlation between stroke and urinary 3-hydroxypropyl mercapturic acid, an acrolein-glutathione metabolite. Clin Chim Acta 413, 753-759.
【非特許文献２１】Waragai M, Yoshida M, Mizoi M, Saiki R, Kashiwagi K, Takagi K, Arai H, Tashiro J, Hashimoto M, Iwai N, Uemura K, Igarashi K (2012) Increased protein-conjugated acrolein and amyloid-β40/42 ratio in plasma of patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 32, 33-41.
【非特許文献２２】Mizoi M, Yoshida M, Saiki R, Waragai M, Uemura K, Akatsu H, Kashiwagi K, Igarashi K (2014) Distinction between mild cognitive impairment and Alzheimer's disease by CSF amyloid β40 and β42, and protein-conjugated acrolein. Clin Chim Acta 430, 150-155.
【非特許文献２３】O'Bryant SE, Waring SC, Cullum CM, Hall J, Lacritz L, Massman PJ, Lupo PJ, Reisch JS, Doody R (2008) Staging dementia using Clinical Dementia Rating Scale Sum of Boxes scores: a Texas Alzheimer's research consortium study. Arch Neurol 65, 1091-1095.
【非特許文献２４】Eckert E, Drexler H, Goen T (2010) Determination of six hydroxyalkyl mercapturic acids in human urine using hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry (HILIC-ESI-MS/MS). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 878, 2506-2514.
【非特許文献２５】Alarcon RA (1968) Fluorometric determination of acrolein and related compounds with m-aminophenol. Anal Chem 40, 1704-1708.
【非特許文献２６】Waragai M, Okamura N, Furukawa K, Tashiro M, Furumoto S, Funaki Y, Kato M, Iwata R, Yanai K, Kudo Y, Arai H (2009) Comparison study of amyloid PET and voxel-based morphometry analysis in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Sci 285, 100-108.
【非特許文献２７】McKhann G, Drachman D, Folstein M, Katzman R, Price D, Stadlan EM (1984) Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease. Neurology 34,939-944.
【非特許文献２８】Petersen RC, Smith GE, Waring SC, Ivnik RJ, Tangalos EG, Kokmen E (1999) Mild cognitive impairment: clinical characterization and outcome. Arch Neurol 56, 303-308.
【非特許文献２９】Igarashi K, Ueda S, Yoshida K, Kashiwagi K (2006) Polyamines in renal failure. Amino Acids 31, 477-483.
【非特許文献３０】Shinohara Y, Tohgi H, Hirai S, Terashi A, Fukuuchi Y, Yamaguchi T, Okudera T (2007) Effect of the Ca antagonist nilvadipine on stroke occurrence or recurrence and extension of asymptomatic cerebral infarction in hypertensive patients with or without history of stroke (PICA Study). 1. Design and results at enrollment. Cerebrovasc Dis 24, 202-209.
【非特許文献３１】Ashburner J, Friston KJ (2000)Voxel-based morphometry--the methods. Neuroimage 11, 805-821.
【非特許文献３２】Hirata Y, Matsuda H, Nemoto K, Ohnishi T, Hirao K, Yamashita F, Asada T, Iwabuchi S, Samejima H (2005) Voxel-based morphometry to discriminate early Alzheimer's disease from controls. Neurosci Lett 382, 269-274.
【非特許文献３３】Gao S, Hendrie HC, Hall KS, Hui S (1998) The relationships between age, sex, and the incidence of dementia and Alzheimer disease: a meta-analysis. Arch Gen Psychiatry 55, 809-815.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
認知症やその前段階である軽度認知障害の判定のために容易に利用できるバイオマーカーが求められているが、現状では実用化されているものはない。このようなバイオマーカーとして、血漿中のAβレベルが使用し得ることが報告されているが、報告されている結果には相容れない報告がある。また、血漿は被験者から血液を採取する必要があり、患者への侵襲性という問題があった。
【００１５】
本発明の課題は、認知症やその前段階である軽度認知障害の判定のためのバイオマーカーを見出し、該バイオマーカーを利用したこれら疾患の新規な検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、尿検体中の3-HPMA含有量とCre含有量との比及びAC-Acro含有量とCre含有量との比に着目し、AD症例及びMCI症例の尿検体中の3-HPMA、AC-Acro、及びCreの含有量の解析を行った。その結果、AD症例及びMCI症例の両方を含む群では、健常者と比較して、尿検体中の3-HPMA／Cre及びAC-Acro／Creが有意に低下していた。さらに、AD症例群では、MCI症例群と比較して、尿検体中の3-HPMA／Cre及びAC-Acro／Creの値が有意に低下していた。
【００１７】
これら知見から、尿検体中の3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creを指標とすることにより、認知症患者と非認知症患者との識別、及び、AD被験者とMCI被験者との識別を実施できることを見出し、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するための検査方法、並びに軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別するための検査方法を完成した。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．被験者より得られた尿検体中の3-HPMA／Cre、及び／又は、尿検体中のAC-Acro／Creを指標にする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
２．3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creが健常者のものと比較して低いことを指標とする、前項１に記載の認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法。
３．前記健常者と比較して低いことを指標とすることが、予め設定したカットオフ値と比較して低いことを指標とすることである、前項２の検査方法。
４．前記認知症はアルツハイマー型認知症である前項１〜３のいずれかの検査方法。
５．さらに、被験者より得られた血液検体中のAβ40／Aβ42が健常者として比較して高いことを指標とする前項１〜４のいずれかの検査方法。
６．被験者より得られた尿検体中の3-HPMA／Cre、及び／又は、尿検体中のAC-Acro／Creを指標にする、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別する検査方法。
７．3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creが軽度認知障害患者と比較して低いとき、前記被験者はアルツハイマー病であると判定する、前項６の検査方法。
８．前記軽度認知障害患者と比較して低いことが、予め設定したカットオフ値と比較して低いことである、前項７の検査方法。
９．3-HPMA／Cre及び／又はAC-Acro／Creがアルツハイマー型認知症患者と比較して高いとき、前記被験者は軽度認知障害であると判定する、前項６の検査方法。
１０．アルツハイマー型認知症患者と比較して高いことが、予め設定したカットオフ値と比較して高いことである、前項９の検査方法。
１１．尿検体中の3-HPMA含有量を測定するための試薬を含む、認知症及び／又は軽度認知障害の検査用キット。
１２．さらに、尿検体中のAC-Acro含有量を測定するための試薬を含む、前項１１の検査用キット。
１３．尿検体中の3-HPMA含有量を測定するための試薬を含む、アルツハイマー型認知症を軽度認知障害と判別するための検査用キット。
１４．さらに、尿検体中のAC-Acro含有量を測定するための試薬を含む、前項１３の検査用キット。」
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、認知症及び／又は軽度認知障害の判定を補助することができ、また、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症の判別を補助することができる。本発明に係る検査方法は、検体として尿を使用する検査方法であるため、簡便に、かつ被験者に負担をかけずに実施できるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−Ａ】MCI被験者とAD被験者の両方を含む群（以下、MCI+AD群と称する）及びコントロール被験者群（以下、コントロール群と称する）において、尿検体中の3-HPMA含有量、3-HPMA／Creレベル、Cre含有量、AC-Acro含有量、AC-Acro／Creレベル、及び年齢（Age）を比較した結果を示す図である。各値は中央値（水平の線）±四分位偏差で示した。「p」値は有意確率値を示す。（実施例１）
【図１−Ｂ】同年齢のMCI+AD群及びコントロール群において、尿検体中の3-HPMA含有量、3-HPMA／Creレベル、Cre含有量、AC-Acro含有量、AC-Acro／Creレベル、及び年齢（Age）を比較した結果を示す図である。各値は中央値（水平の線）±四分位偏差で示した。「p」値は有意確率値を示す。（実施例１）
【図２−Ａ】MCI被験者のみからなる群（以下、MCI群と称する）及びAD被験者のみからなる群（以下、AD群と称する）において、尿検体中の3-HPMA含有量、3-HPMA／Creレベル、Cre含有量、AC-Acro含有量、AC-Acro／Creレベル、及び年齢（Age）を比較した結果を示す図である。各値は中央値（水平の線）±四分位偏差で示した。「p」値は有意確率値を示す。（実施例１）
【図２−Ｂ】MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA含有量とAC-Acro含有量との相関を解析した結果を示す図である。図中、「●」及び「△」はそれぞれMCI被験者及びAD被験者の検体を示す。「rs」はスピアマンの順位相関係数を示す。（実施例１）
【図３−Ａ】MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル 、AC-Acro／Creレベル、及びCre含有量と、ミニメンタルステート検査（MMSE）の結果との相関を解析した結果を示す図である。図中、「●」及び「△」はそれぞれMCI被験者及びAD被験者の検体を示す。「rs」はスピアマンの順位相関係数を示す。（実施例１）
【図３−Ｂ】MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル 、AC-Acro／Creレベル、及びCre含有量と、臨床的認知症評価尺度の項目合計スコア（CDR sum of boxes）との相関を解析した結果を示す図である。図中、「●」及び「△」はそれぞれMCI被験者及びAD被験者の検体を示す。「rs」はスピアマンの順位相関係数を示す。（実施例１）
【図３−Ｃ】MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル 、AC-Acro／Creレベル、及びCre含有量と、Z-スコア（Z-score）解析の結果との相関を解析した結果を示す図である。図中、「●」及び「△」はそれぞれMCI被験者及びAD被験者の検体を示す。「rs」はスピアマンの順位相関係数を示す。（実施例１）
【図４】MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル、AC-Acro／Creレベル、及びCre含有量と血漿中のAβ40/42レベルとの相関を解析した結果を示す図である。図中、「●」及び「△」はそれぞれMCI被験者及びAD被験者の検体を示す。「rs」はスピアマンの順位相関係数を示す。（実施例１）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、被験者の尿検体中のアクロレイン代謝物及びCreを指標とする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法に関する。より具体的には、本発明は、被験者の尿検体中の3-HPMA、AC-Acro、及びCreを指標とする、認知症及び／又は軽度認知障害の検査方法に関する。
【００２２】
本発明者らは、後述する実施例に示すように、認知症及び／又は軽度認知障害の患者の尿検体の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルが健常者のものと比較して低いことを明らかにした。また、認知症の患者の尿検体の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルが軽度認知障害と比較して低いことを明らかにした。
【００２３】
すなわち、本検査方法は、被験者の尿検体中の3-HPMA含有量及び／又はAC-Acro含有量、並びにCre含有量を測定し、測定された3-HPMA含有量をCre含有量で補正して得られる3-HPMA／Creレベル、及び／又は測定されたAC-Acro含有量をCre含有量で補正して得られるAC-Acro／Creレベルを指標とする、認知症及び／又は軽度認知障害の判別のための検査方法であり得る。本検査方法は、被験者の尿検体中3-HPMA／Creレベル及び／又は尿検体中AC-Acro／Creレベルが健常者のものと比較して低いことを指標とする。
【００２４】
本検査方法はまた、被験者の尿検体中の3-HPMA含有量及び／又はAC-Acro含有量、並びにCre含有量を測定し、測定された3-HPMA含有量をCre含有量で補正して得られる3-HPMA／Creレベル、及び／又は測定されたAC-Acro含有量をCre含有量で補正して得られるAC-Acro／Creレベルを指標とする、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症とを判別する検査方法に関する。本検査方法では、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又は尿検体中AC-Acro／Creレベルが軽度認知障害患者のものと比較して低いとき、該被験者はアルツハイマー型認知症であると判定できる。また、被験者の尿検体中3-HPMA／Creレベル及び／又は尿検体中AC-Acro／Creレベルがアルツハイマー型認知症患者のものと比較して高く、かつ健常者のものと比較して低いとき、該被験者は軽度認知障害であると判定できる。
【００２５】
（被験者）
本発明の「被験者」とは、ヒトを含む哺乳動物をいう。哺乳動物は、ヒト、家畜、非ヒト霊長類、運動競技用動物（競馬ウマ）、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳類として類別されるいかなる動物も対象とするが、好ましくはヒトである。特に好ましくは、軽度認知障害あるいは認知症に罹患していることが疑われるヒトや、軽度認知障害あるいは認知症に罹患しているか否かの判定を必要とするヒトをいう。
【００２６】
（健常者）
本明細書において健常者というときは、認知機能障害の既往歴のない被験者を意味する。
【００２７】
（認知症及び軽度認知障害）
「認知症」とは、後天的な脳の器質的障害により、認知機能が低下した、認知機能障害のある症候群をいい、その原因疾患により、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、及び前頭側頭型認知症などの神経変性性認知症、多発脳梗塞型認知症及び限局性脳梗塞型認知症などの脳血管性認知症、並びに正常圧水頭症や甲状腺機能低下などによる治療可能な認知症に分類される。認知機能障害とは、脳内の情報処理によって実現する機能、例えば記憶、言語、思考、知覚、判断などの機能の障害をいう。
【００２８】
「軽度認知障害」とは、正常老化過程で予想されるよりも認知機能が低下しているが、認知症とは診断されない状態をいう。認知症の前段階にあたり、記憶機能低下が主兆候である。
【００２９】
本発明に係る検査方法は、認知症及び／又は軽度認知障害、好ましくは認知症、さらに好ましくはアルツハイマー型認知症の判定を補助する方法として使用できる。
【００３０】
また本発明に係る検査方法は、アルツハイマー型認知症と軽度認知障害の判別を補助する方法として好ましく使用できる。
【００３１】
（尿検体）
尿検体とは、尿由来の試料を意味し、未処理尿、薬品添加済尿、及び精製済尿のいずれをも含む。被験者からの尿の採取及び処理は、公知の方法によって実施できる。尿検体は、必要に応じて、試験に使用するまで-80℃で保存することができる。
【００３２】
（本発明に係る検査方法の指標）
本発明において「指標」は、被験者の尿検体中の3-HPMA含有量を尿検体中のCre含有量で補正することにより算出される3-HPMA／Creレベル、及び／又は、尿検体中のAC-Acro含有量を尿検体中のCre含有量で補正することにより算出されるAC-Acro／Creレベルが使用される。好ましくは、3-HPMA／Creレベルが「指標」として使用される。
【００３３】
本発明において、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルが健常者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルと比較して低いとき、好ましくは統計学的に有意に低いときには、該被験者は認知症及び／又は軽度認知障害を罹患している、又は罹患している可能性があると判定できる。
【００３４】
本発明において、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルが、軽度認知障害患者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルと比較して低いとき、好ましくは統計学的に有意に低いときには、該被験者は軽度認知障害ではなく、認知症、例えばアルツハイマー型認知症である、又は認知症、例えばアルツハイマー型認知症の可能性があると判定できる。逆に、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルが、アルツハイマー型認知症患者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルと比較して高く、好ましくは統計学的に有意に高く、かつ健常者と比較して低い、好ましくは統計学的に有意に低いときには、該被験者は軽度認知障害である、又は軽度認知障害の可能性があると判定できる。
【００３５】
統計学的処理を行う場合、その実施には２群比較に一般的に使用されている公知の統計学的処理方法をいずれも使用することができる。具体的には、ウイルコクソンの順位和検定を好ましく例示できる。
【００３６】
本発明に係る検査方法で認知症及び／又は軽度認知障害を罹患している、又は罹患している可能性があると判定された被験者は、MRIによる頭部断層画像の撮影、ミニメンタルステート検査（MMSE）、及び臨床的認知症評価尺度の項目合計スコア（Clinical Dementia Rating Scale Sum of Boxes Scores；CDRsob；非特許文献23）などの従来実施されていた認知症の検査を受けることにより、さらに詳しい評価を得ることができる。
【００３７】
本発明に係る検査方法は、一定の期間をおいて繰り返し実施することが好ましく、それにより尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルの該期間中の変化を検出することができ、ひいては認知症及び／又は軽度認知障害の進行を早期に評価することができる。例えば、軽度認知障害であると診断されている被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルを、その経過観察期間中、一定期間をおいて測定し、該測定で得られた値が、前回測定された3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルと比較して低下したときは、該被験者は、軽度認知障害から認知症に進行した、又は進行した可能性があると判定できる。
【００３８】
本発明に係る検査方法では、好ましくは、カットオフ（Cut off）値を予め設定し、該カットオフ値を基準として認知症及び／又は軽度認知障害の判定をすることができる。
【００３９】
認知症及び／又は軽度認知障害の判定のための検査方法で使用される3-HPMA／Creレベルのカットオフ値の設定は、認知症及び／又は軽度認知障害の既往歴のない被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中の3-HPMA／Creレベルの平均値から算出することにより実施できる。同様に、AC-Acro／Creレベルのカットオフ値の設定は、認知症及び／又は軽度認知障害の既往歴のない被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中のAC-Acro／Creレベルの平均値から算出することにより実施できる。通常、予め設定したカットオフ値の標準偏差の90％以下、好ましくは80％以下、より好ましくは70％以下、さらに好ましくは60％以下、最も好ましくは50％以下の場合には、認知症及び／又は軽度認知障害の可能性があると判定することができる。
【００４０】
認知症、例えばアルツハイマー型認知症と軽度認知障害との判別のための検査方法で使用される3-HPMA／Creレベルのカットオフ値の設定は、軽度認知障害と診断された被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中の3-HPMA／Creレベルの平均値から算出することにより実施できる。同様に、AC-Acro／Creレベルのカットオフ値の設定は、軽度認知障害と診断された被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中のAC-Acro／Creレベルの平均値から算出することにより実施できる。通常、このように設定したカットオフ値の標準偏差の90％以下、好ましくは80％以下、より好ましくは70％以下、さらに好ましくは60％以下、最も好ましくは50％以下の場合には、軽度認知障害ではなく、認知症、例えばアルツハイマー型認知症の可能性があると判定することができる。
【００４１】
あるいは、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症との判別のための検査方法で使用される3-HPMA／Creレベルのカットオフ値の設定は、アルツハイマー型認知症と診断された被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中の3-HPMA／Creレベルの平均値から算出することにより、そのカットオフ値の設定を実施できる。同様に、AC-Acro／Creレベルのカットオフ値の設定は、アルツハイマー型認知症と診断された被験者を比較対象とし、該比較対象の尿検体中のAC-Acro／Creレベルの平均値から算出することにより実施できる。通常、このように設定したカットオフ値の標準偏差の120％以上、好ましくは130％以上、より好ましくは140％以上、さらに好ましくは150％以上の場合には、認知症、例えばアルツハイマー型認知症ではなく、軽度認知障害の可能性があると判定することができる。
【００４２】
カットオフ値を設定する別の方法としては、尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルに基づき、受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic：ROC）曲線を作成し、該ROC曲線からカットオフ値を設定する方法を好ましく挙げることができる。ROC曲線の作成方法及びROC曲線を基にしたカットオフ値の設定方法は周知であり、ROC曲線からカットオフ値を設定する場合、一次スクリーニング等の目的や精査目的など臨床上の使用目的により所望する検出感度や特異度などの条件に応じてカットオフ値を設定することができる。
【００４３】
例えば後述する実施例で測定した尿検体中の3-HPMA／Creレベル（図1A）に基づいて作成したROC曲線を使用して、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値を設定する場合、所望の感度を50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらにより好ましくは90％とすると、カットオフ値はそれぞれ1.54 μmol/g、1.75 μmol/g、2.08 μmol/g、2.81 μmol/g、2.99 μmol/gに設定することができる。尿検体中のAC-Acro／Creレベル（図1A）に基づいて作成したROC曲線を使用して、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値を設定する場合、所望の感度を50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらにより好ましくは90％とすると、カットオフ値はそれぞれ66.0 μmol/g、71.4 μmol/g、92.4 μmol/g、132.1 μmol/g、182.2 μmol/gに設定することができる。被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以下であれば、該被験者は認知症及び／又は軽度認知障害の可能性があると判定することができる。逆に、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以上であれば、該被験者は認知症及び／又は軽度認知障害である可能性がないと判定することができる。3-HPMA／Creレベルのカットオフ値及びAC-Acro／Creレベルのカットオフ値は、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて利用することができる。
【００４４】
また、例えば後述する実施例で測定した尿検体中の3-HPMA／Creレベル（図2A）に基づいて作成したROC曲線を使用して、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症を判定するためのカットオフ値を設定する場合、所望の感度を50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらにより好ましくは90％とすると、カットオフ値はそれぞれ1.29 μmol/g、1.51 μmol/g、1.71 μmol/g、2.31 μmol/g、2.87 μmol/gに設定することができる。尿検体中のAC-Acro／Creレベル（図2A）に基づいて作成したROC曲線を使用して、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症を判定するためのカットオフ値を設定する場合、所望の感度を50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらにより好ましくは90％とすると、カットオフ値はそれぞれ53.7 μmol/g、66.0 μmol/g、69.7 μmol/g、83.3 μmol/g、98.8 μmol/gに設定することができる。被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以下であれば、該被験者は認知症、例えばアルツハイマー型認知症の可能性があると判定することができる。逆に、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以上であり、且つ、上述した認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値以下であれば、該被験者は軽度認知障害の可能性があると判定することができる。3-HPMA／Creレベルのカットオフ値及びAC-Acro／Creレベルのカットオフ値は、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて利用することができる。
【００４５】
また別のカットオフ値を設定する方法としては、尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルに基づき、ボックスプロットとも称される統計的グラフである箱ひげ図を作成し、第1四分位数（25％値）、第2四分位数（中央値；50％値）、及び第3四分位数（75％値）のいずれか1の値をカットオフ値とする方法を挙げることができる。箱ひげ図の作成方法及び第1四分位数、第2四分位数、及び第3四分位数を基にしたカットオフ値の設定方法は周知であり、一次スクリーニング等の目的や精査目的など臨床上の使用目的により所望する検出感度や特異度などの条件に応じてカットオフ値を設定することができる。
【００４６】
例えば後述する実施例で測定した尿検体中の3-HPMA／Creレベル（図1A）に基づいて作成した箱ひげ図を使用して、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値を設定する場合、第3四分位数（75％値）、好ましくは第2四分位数（中央値；50％値）、さらに好ましくは第1四分位数（25％値）にそれぞれ相当する値、2.50 μmol/g、1.54 μmol/g、及び0.78 μmol/gにカットオフ値を設定することができる。尿検体中のAC-Acro／Creレベル（図1A）に基づいて作成した箱ひげ図を使用して、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値を設定する場合、第3四分位数（75％値）、好ましくは第2四分位数（中央値；50％値）、さらに好ましくは第1四分位数（25％値）にそれぞれ相当する値、103.9 μmol/g、66.3 μmol/g、及び43.6 μmol/gにカットオフ値を設定することができる。被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以下であれば、該被験者は認知症及び／又は軽度認知障害の可能性があると判定することができる。逆に、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以上であれば、該被験者は認知症及び／又は軽度認知障害である可能性がないと判定することができる。3-HPMA／Creレベルのカットオフ値及びAC-Acro／Creレベルのカットオフ値は、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて利用することができる。
【００４７】
また、例えば後述する実施例で測定した尿検体中の3-HPMA／Creレベル（図2A）に基づいて作成した箱ひげ図を使用して、軽度認知障害とアルツハイマー型認知症を判定するためのカットオフ値を設定する場合、第3四分位数（75％値）、好ましくは第2四分位数（中央値；50％値）、さらに好ましくは第1四分位数（25％値）にそれぞれ相当する値、2.05 μmol/g、1.29 μmol/g、及び0.68 μmol/gにカットオフ値を設定することができる。尿検体中のAC-Acro／Creレベル（図1A）に基づいて作成した箱ひげ図を使用して、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値を設定する場合、第3四分位数（75％値）、好ましくは第2四分位数（中央値；50％値）、さらに好ましくは第1四分位数（25％値）にそれぞれ相当する値、72.5 μmol/g、55.9 μmol/g、及び42.4 μmol/gにカットオフ値を設定することができる。被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以下であれば、該被験者は認知症、例えばアルツハイマー型認知症の可能性があると判定することができる。逆に、被験者の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルがこのように設定されたカットオフ値以上であり、且つ、上述した認知症及び／又は軽度認知障害を判定するためのカットオフ値以下であれば、該被験者は軽度認知障害の可能性があると判定することができる。3-HPMA／Creレベルのカットオフ値及びAC-Acro／Creレベルのカットオフ値は、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて利用することができる。
【００４８】
本発明の尿検体中の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルのカットオフ値は、上記カットオフ値に限定されるものでなく、適宜変更することができる。すなわち、尿検体中の3-HPMA、Cre、及びAC-Acro／Creの定量方法、尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルの対象との比較方法、臨床上の使用目的により所望する検出感度や特異度などの条件に応じてカットオフ値を設定することができる。
【００４９】
（尿検体中のCreの測定方法）
尿検体中のCreの測定方法は、自体公知の方法を利用することができる。また、市販のクレアチニンアッセイキット（Cayman Chemical Co., USA）を使用して、付属の手順書に従って実施することができる。
【００５０】
（尿検体中の3-HPMAの測定方法）
尿検体中の3-HPMAの測定方法は、自体公知の方法を利用することができる（非特許文献24）。例えば、尿検体中の3-HPMA含有量は、自体公知の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（LC-MS/MS）を使用して測定することができる。好ましくは、3-HPMAに特異的な抗体を用いた酵素免疫測定法（ELISA）、ウエスタンブロッティング解析や免疫沈降法などによって測定することができる。測定を行う際に使用される3-HPMAに対する抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも良い。3-HPMAに対するポリクローナル抗体は、例えば通常のペプチド抗体作製の手法を用いてウサギを3-HPMAで免疫することにより、該ウサギの血液から得ることができる。抗体が作製されたことは、ペプチドを投与されたウサギから採血をしてその抗体価を測定することにより、抗体が十分な力価に達しているか検定を行うことによって確認することができる。
【００５１】
（尿検体中のAC-Acroの測定方法）
尿検体中のAC-Acro、すなわちFDP-リジンの含有量は、例えばACR-LYSINE ADDUCT ELISA SYSTEM（日本油脂株式会社）を使用し、添付のマニュアルに従って測定することができる。
【００５２】
（3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルに加えて使用され得る指標）
本発明に係る検査方法では、尿検体中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルを判定の指標にすることに加え、さらに、血液検体、好ましくは血漿中のポリアミン代謝物の含有量及びAβ40／Aβ42レベルを、認知症及び／又は軽度認知障害の判定の指標として使用することができる。指標にするバイオマーカーの種類が多いほど、当該判定の確度は高くなる。
【００５３】
本発明において指標として使用する好適なポリアミン代謝物として、アクロレインが例示されるが、それに限定されるものではない。アクロレインは反応性が高く、タンパク質と反応してPC-Acroの形態で血液中に存在することがあるため、PC-Acroが指標としてより好ましく使用される。
【００５４】
血漿中のPC-Acro含有量及びAβ40／Aβ42レベルは、軽度認知障害及びアルツハイマー型認知症の被験者において健常人より高いこと、よってPC-Acro及び／又はAβ40／Aβ42レベルの測定が軽度認知障害及びアルツハイマー型認知症の被験者の有用な生化学的マーカーになることが報告されている（非特許文献21）。ポリアミンは、第一級アミノ基を二つ以上もつ直鎖の脂肪族炭化水素であり、生体ポリアミンとして、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、1,3-ジアミノプロパン、カルジン、ホモスペルミジン、3-アミノプロピルカダベリン、ノルスペルミン、テルモスペルミン、カルドペンタミンなどが知られている。本発明における指標として好適なポリアミンはプトレッシン、スペルミジン、スペルミンである。ポリアミンは酸化、アセチル化、アミノ基転移、カルバモイル化による代謝を受ける。ポリアミンの酸化に関与する酵素として、ポリアミンオキシダーゼ（アセチルポリアミンオキシダーゼ（AcPAO）及びスペルミンオキシダーゼ（SMO））を好ましく挙げることができる。ポリアミンオキシダーゼとは、ジアミン又はポリアミンを基質として酸化し、過酸化水素を発生する酵素を意味する。ポリアミンは、ポリアミンオキシダーゼによる酸化的脱アミノ化を受け、その結果、過酸化水素とアクロレインなどのアルデヒド体を生成する。
【００５５】
認知症及び／又は軽度認知障害の判定のための検査方法では、血液検体、好ましくは血漿中のアクロレイン含有量やAβ40／Aβ42レベルを、補助的なバイオマーカーとして好ましく使用することができる。血液検体中のアクロレイン含有量やAβ40／Aβ42レベルが、認知症及び／又は軽度認知障害の既往歴のない被験者のものと比較して高ければ、認知症及び／又は軽度認知障害である、あるいは認知症及び／又は軽度認知障害の可能性があると判定できる。
【００５６】
（血液検体中のアクロレインの測定方法）
血液検体、特に血漿中のアクロレイン含有量は、当業者に公知の任意の方法、例えば、アクロレイン付加アミノ酸であるFDP-リジン（N-ホルミルピペリジノ-リジン）の含有量を測定することにより同定することができる。FDP-リジン含有量は、例えばACR-LYSINE ADDUCT ELISA SYSTEM（日本油脂株式会社）を使用し、添付のマニュアルに従って測定することができる。なおアクロレイン含有量はFDP-リジン以外の誘導体の形で測定することも可能である。またアクロレイン含有量を直接測定することも可能であり、このような方法は例えばアラルコン（Alarcon）らの報告（非特許文献25）に記載されている。 具体的には、被験者由来の血漿及び標準液を抗原固定化プレートに50 μL/wellずつ分注し、さらに一次反応抗体液を同量加える。室温で30分間静置した後、液を取り除き、洗浄液で洗浄後、二次反応抗体液を100 μL/well分注する。室温で1時間静置後、洗浄液で洗浄し、発色液100 μL/wellを加え室温で15分間静置することで発色させ、反応停止液を50 μL/wellずつ分注した後、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定する。血漿中アクロレイン量は、血漿1 mL当たりのFDP-リジン含有量（nmol/mL plasma）として表示される。 
【００５７】
（血液検体中のAβ40／Aβ42レベルの測定方法）
血液検体、例えば血漿中のAβ40及びAβ42の定量、並びにAβ40／Aβ42レベルの算出は、既報に記載の公知方法により実施することができる（非特許文献7-10、21）。また、血液検体中のAβ40及びAβ42の定量は、市販のAβ40測定用キット及びAβ42測定用キットを使用して実施することができる。市販の測定用キットとして、ヒトβアミロイド（1-40）ELISAキット  ハイセンシティブII（Wako Chemical Co.）及びヒトβアミロイド（1-42）ELISAキット  ハイセンシティブ（Wako Chemical Co.）を挙げることができる。
【００５８】
（認知症及び／又は軽度認知障害の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法）
認知症及び／又は軽度認知障害の治療に有効である可能性のある候補化合物を実験動物に投与し、該化合物が該実験動物において、3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルを増強するかを測定することにより、認知症及び／又は軽度認知障害の治療・予防に有効である新たな薬剤をスクリーニング（探索）する方法を提供することができる。
【００５９】
（認知症及び／又は軽度認知障害の判定キット）
本発明は、認知症及び／又は軽度認知障害を判定するための検査用キット、及び認知症、例えばアルツハイマー型認知症と軽度認知障害との判別のための検査用キットを提供する。該キットは、尿検体中の3-HPMA含有量及び／又はAC-Acro含有量を測定するための試薬を含む。さらに、必要に応じて、血液検体中や尿検体中のポリアミン代謝物、好ましくはアクロレイン、より好ましくはPC-Acroの含有量を測定するための試薬、並びにAβ40及びAβ42の含有量を測定するための試薬の両方又はいずれか一方を含むことができる。さらに、必要に応じて、当業者に公知の任意の、測定器具・装置、標準液、緩衝液等を含有させることができる。
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、以下の実施例は、各参加者又はその関係者からインフォームドコンセントを得た上で、ヘルシンキ宣言に沿って行った。
【実施例１】
【００６１】
（被験者並びに尿及び血液の採取）
以下の実施例では高齢者の有志を募り、コントロール被験者  74例、MCI  22例、AD  32例の被験者を集めた。コントロール被験者は、健常ボランティアであり、MCIや認知症の明らかな既往歴がなく、自立して生活している。MCI及びADの被験者の診断は、従前の報告に記載されたとおりに実施した（非特許文献26）。具体的には、ADの診断は米国国立神経疾患・脳卒中研究所とアルツハイマー病・関連障害協会（NINCDS-ADRDA）からの基準（非特許文献27）、そしてMCIの診断は論文に記載された基準（非特許文献28）に従って実施した。なお、血漿中PC-Acroは、脳卒中及び慢性腎臓病（CKD）の診断マーカーとして既に報告されている（非特許文献12、13、28）。したがって、脳卒中、CKD、心機能不全、及びその他の動脈硬化などの全身性疾患を有する被験者は全て、血液及び尿検査、脳磁気共鳴画像法（cerebral MRI）、磁気共鳴血管造影法、頸動脈超音波検査（carotid ultrasonography）の結果、及び病歴に基づいて、完全に本研究から除外した。喫煙者は、尿中3-HPMA／Creレベルが高いため、本検討から除外した（非特許文献20）。
【００６２】
ミニメンタルステート検査（MMSE）及び臨床的認知症評価尺度の項目合計スコア（CDRsob）の評価を、被験者の来院時に行った。全てのMCI及びAD被験者は、2〜3年に亘って臨床的な追跡調査を行った。被験者は、必要に応じて、抗コリンエステラーゼ薬を投与された。
【００６３】
被験者からの尿検体の採取は、千葉大学及び東松戸病院の倫理員会の承認を得た手順に従って行われた。採取した尿は試験に使用するまで-80℃で保存した。
【００６４】
被験者からの血液の採取は常法に従ってヘパリンを使用して行った。血漿は、3 U/mlのヘパリンを含む血液を4 ℃にて1500 gで10分間遠心処理することにより取得した。取得した血漿は試験に使用するまで-80 ℃で保存した。
【００６５】
（方法）
頭部断層画像解析、3-HPMA、AC-Acro、Cre、Aβ40、及びAβ42の測定方法、並びに統計解析方法の詳細は以下の通りである。
【００６６】
（MRIによる頭部断層画像解析）
全ての被験者はMRIによる検査を行った。MRIは、1.5テスラMRスキャナー（Toshiba Visart 1.5T MRI）を用いて、T1、T2、及び流体減衰反転回復（FLAIR）シーケンスに関して行った。T1強調フィールドエコー（FE）シーケンス（T1-weighted field echo (FE) sequence）の3次元容積収集により、途切れの無い一連の薄いシグナル切片が作り出された。白質高信号病変（white matter hyperintensity；WMH）は、T2及びFLAIRシーケンスにより、Shinoharaら（非特許文献30）による脳室周囲高信号域（periventicular hyperintensity；PVH）及び深部皮質白質高信号病変（deep and subcortical WMH；DSWMH）の両方におけるグレード付け（グレード1から4）を参考にして評価した。
【００６７】
脳全体における灰白質萎縮の度合いは、ボクセルベースの形態学的MRI（voxel-based morphometric MRI；VBM-MRI）（非特許文献31）により評価した。海馬傍回領域を含む両側の内側側頭葉である関心領域（volume of interest；VOI）の度合いは、Hirataらにより開発されたボクセルベースのアルツハイマー病用特異的局所解析システム（Voxel-Based Specific Regional Analysis System for Alzheimer's Disease；VSRAD）であるVSRADソフトウエア（Eisai, Tokyo, Japan）（非特許文献32）により評価した。被験者の各灰白質画像は、全体平均強度（global mean intensities）に対するボクセル標準化後のボクセル単位のZ-スコア解析（voxel-by-voxel Z-score analysis）を使用して、同年齢の正常データベースの各灰白質画像との比較を行った：Z-スコア＝（コントロールの平均−個別容積）／（コントロールの標準偏差）（非特許文献32）。これらZ-スコアマップを、トモグラフィー断面上に重ねて表示した。VSRADは、3次元T1強調MRIデータを自動的に分析することができ、一連の分割化、解剖学的標準化、及びMatlabプログラムなしにSPM2を使用して補正を行い、そしてVOIのZ-スコア分析をもたらす。このように、MCI及びADにおけるVOI萎縮の重症度を、VSRADを使用してZ-スコアとして評価した。
【００６８】
（尿中の3-HPMA、AC-Acro、及びCreの測定）
3-HPMAの測定はLC-MS/MSにより、Eckertらの方法に従って実施した（非特許文献24）。2 mlの尿検体を、2 mlのギ酸アンモニウム緩衝液（50 mM, pH 2.5）、0.04 mlのギ酸、及び内部標準である0.02 mlの10 mg/ml N-アセチル-d3-S-(3-ヒドロキシプロピル)システイン（d3-3-HPMA）ジシクロヘキシルアンモニウム塩（Tronto Chemicals）と混合した。遠心分離処理を2000 gで5分間行った後、その上清を、あらかじめ6 mlのメタノールと6 mlのギ酸（pH 2.5）により平衡化したSPEカラム（ISOLUTE ENV+, 100 mg, 3 ml）に通過させた。該通過後のカートリッジを従前の報告の記載（非特許文献24）のように洗浄し、そしてSPEカラムを吸引ポンプに接続することにより完全に乾燥させた。メタノールで2%（v／v）にしたギ酸2.5 mlで被検体を溶出し、乾燥し、そして1 mlの溶媒A（アセトニトリル／水（88／12、容量／容量（v／v））で5 mMとした酢酸アンモニウム, pH 6.5）に溶解した。3-HPMAの抽出率は、本実験条件下では、68%であると測定された。遠心分離処理を2000 gで10分間行った後の上清試料0.01 mlをLC-MS/MS分析に使用した。
【００６９】
3-HPMAのLC分離は、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（XBridge HILIC, 粒子径 3.5 μm, 2.1 mm × 150 mm, Waters, MA, USA）及び対応するプレカラム（HILIC, 2.1 mm × 10 mm）を使用して行った。3-HPMAの分離は、アセトニトリル／水（88／12、v／v）で5 mMとしたpH 6.5の酢酸アンモニウムを使用して、0.3 ml/minの一定流速で行った。3〜9分間に溶出した3-HPMAを含むフラクションを、エレクトロスプレー化（ESI）インターフェイス及び10口弁を装備した三連四重極型質量分析計（amaZon SL, Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA）の検出器に注入した。エレクトロスプレーニードルボルテージは、ネガティブイオンモードで-4000 Vに設定した。ターボーヒータは475 ℃に維持した。窒素は、霧化ガス、ターボヒータガス及びカーテンガスとして使用し、ガス圧をそれぞれ45 psi、60 psi及び25 psiに設定した。MS/MSモード用の衝突ガス（窒素）は、3計器ユニットの供給量に設定した。質量分析計は、マルチプルリアクションモニタリングモード（MRM）で使用した。3-HPMAのリテンションタイムは4.8分であり、前駆イオン（Q1）及びプロダクトイオン（Q3）は、それぞれ、220.3 m/z及び91.0 m/zであった。1 mol/l 3-HPMA溶液の日内の相対的標準偏差（RSD）及び日間のRSDはそれぞれ3.0%及び4.5%であった（n = 6）。
【００７０】
AC-Acroである [Nε-（3-ホルミル-3,4-デヒドロピペリジノ）リジン] （[Nε-(3-formyl-3,4-dehydropiperidino)lysine]）の測定は、ACR-リジン付加体酵素結合免疫吸着検定法システム（ACR-LYSINE ADDUCT ELISA SYSTEM；日油株式会社）を使用し、付属の手順書に従って行った。
【００７１】
Creの測定は、クレアチニンアッセイキット（Cayman Chemical CO., Ann Arbor, MI）を使用し、付属の手順書に従って行った。
【００７２】
（Aβ40及びAβ42の測定）
血漿中のAβ40及びAβ42の測定は、それぞれヒトβアミロイド（1-40）ELISAキット  ハイセンシティブII（Wako Chemical Co.）及びヒトβアミロイド（1-42）ELISAキット  ハイセンシティブ（Wako Chemical Co.）を使用して、付属の手順書に従って行った。得られた値を用いて、Aβ40／Aβ42レベル（以下、Aβ40/42と略称することがある）を算出した。
【００７３】
（統計解析）
統計的計算は、グラフパッドプリズム（登録商標）ソフトウエア（GraphPad Prism(R) Software（GraphPad Software））により実行した。各群は、ウイルコクソンの順位和検定を用いて比較した。また、スピアマン順位相関係数により、2つの生化学的マーカー間の統計的相関関係、並びに生化学的マーカーとMMSE、CDRsob、Z-スコア又は血漿Aβ40/42との間の統計的相関関係を調べ、回帰直線を最小二乗法で引いた。
【００７４】
（被験者のベースライン社会人口統計学的変数）
コントロール被験者74例、MCI+AD被験者54例、MCI被験者22例及びAD被験者32例のベースラインの社会人口統計学的変数を、表1に示す。表１の各値は中央値±四分位偏差で示す。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
表1に示すように、MMSE、CDRsob及びZ-スコアの中央値は、MCI+AD被験者群、MCI被験者群及びAD被験者群に関し、それぞれ、21.0、24.0及び18.0；3.5、1.5及び5.0；並びに2.04、1.70及び2.43であった。WMH グレード（PVH及びDSWMH）のグレード0、1-4及び5-8の割合は、MCI+AD被験者群、MCI被験者群及びAD被験者群に関し、それぞれ、1.9％、4.5％及び0％；68.5％、86.4％及び56.2％；並びに29.6％、9.1％及び43.8％であった。女性被験者の割合は、既報告（非特許文献33）のとおり、MCI被験者群及びAD被験者群の両方で高かった。 
【００７７】
（MCI及びADの被験者の尿検体中3-HPMA／Cre及びAC-Acro／Creの減少の検討結果）
MCI及びADの被験者の尿検体中の3-HPMA含有量及びCre含有量を測定し、コントロール被験者の尿検体中の3-HPMA含有量及びCre含有量と比較した。また、Cre含有量に対する3-HPMA含有量の比（3-HPMA／Cre (μmol/g)）を算出した。
【００７８】
まず、MCI被験者とAD被験者とを区別せずに、両方の被験者を含む群（以下、MCI+AD群と称する）について、コントロール被験者群（以下、コントロール群と称する）と比較したデータ解析を行った。図1-Aに示すように、3-HPMA、3-HPMA/Cre、Cre、AC-Acro、AC-Acro/Cre及び年齢の中央値は、コントロール被験者群及びMCI+AD被験者群に関し、それぞれ、1.48 μmol/l及び 1.42 μmol/l； 2.23 μmol/g及び 1.54 μmol/g； 75.1 mg/dl及び 91.0 mg/dl； 75.1 nmol/ml及び 65.7 nmol/ml；109 μmol/g及び 66.3 μmol/g； 並びに 57.0歳及び 80.5 歳 であった。その結果、図1-Aに示すように、MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Cre（μmol/g）のレベルは、コントロール群の尿検体中の3-HPMA／Creレベルと比較して減少していたが、3-HPMAの減少は認められなかった。そこで、AC-Acroを、アクロレインを無毒化する物質の別の候補として取り上げ、MCI+AD群におけるその変化を試験した。図1-Aに示すように、MCI+AD群の尿検体中のAC-Acro／Creレベルは、コントロール群と比較して有意に低下していた。この結果は、認知症被験者において、AC-Acro／Creレベルの変化が3-HPMA／Creレベルの変化と同じであることを示す。3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルを同年齢群（63-79歳のコントロール被験者22例及びMCI+AD被験者23例）で評価すると、同様の結果が得られた（図1-B）。図1-Bに示すように、3-HPMA、3-HPMA/Cre、Cre、AC-Acro、AC-Acro/Cre及び年齢の中央値は、コントロール被験者群及びMCI+AD被験者群に関し、それぞれ、1.11 μmol/l及び 1.45 μmol/l； 2.40 μmol/g及び 1.63 μmol/g； 62.3 mg/dl及び 90.2 mg/dl； 66.3 nmol/ml及び 65.5 nmol/ml；120 μmol/g及び 68.3 μmol/g； 並びに 71.0歳及び 74.0 歳 であった。
【００７９】
上記結果は、尿中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルがいずれも認知症に関する尿中生化学的マーカーとして使用できることを示す。採尿は採血よりも非侵襲性でありかつ概ねより容易であることから、尿中3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルは従来知られている認知症判定の指標である血漿中のAβ40/42やPC-Acroと比較して、非常に簡便で有用な認知症判定用バイオマーカーであり得る。
【００８０】
（MCI群とAD群との間の尿検体中の3-HPMA／Cre及びAC-Acro／Creの比較結果）
次に、MCI被験者とAD被験者とを区別して、MCI被験者のみからなる群（以下、MCI群と称する）とAD被験者のみからなる群（以下、AD群と称する）とを比較したデータ解析を行った。図2-Aに示すように、3-HPMA、3-HPMA/Cre、Cre、AC-Acro、AC-Acro/Cre及び年齢の中央値は、MCI被験者群及びAD被験者群に関し、それぞれ、1.37 μmol/l及び 1.53 μmol/l； 1.89 μmol/g及び 1.29 μmol/g； 68.6 mg/dl及び 98.1 mg/dl； 58.7 nmol/ml及び 66.9 nmol/ml；92.0 μmol/g及び 55.9 μmol/g； 並びに 80.0歳及び 81.0 歳 であった。その結果、図2-Aに示すように、AD群の3-HPMA／CreレベルもAC-Acro／Creレベルも、MCI群のものより低く、そして、AD群のCreレベルはMCI群のものより高かった。MCI+AD群において、3-HPMAレベルはAC-Acroレベルと良い相関を示した（図2-B）。AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／CreレベルはMCI群と比較して減少しており、それは主にCreの増加によるものであるが、AD被験者における尿検体中のCreの増加のメカニズムは明らかでない。
【００８１】
このように、AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／CreレベルがMCI群のものよりも低いことが明らかになった。採尿は採血よりも非侵襲性でありかつ概ねより容易であることから、尿中3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Cre レベルは、認知症の重症度の評価や、AD被験者とMCI被験者との判別のための非常に簡便で有望なバイオマーカーとして使用できる。
【００８２】
（尿検体中の3-HPMA／Cre 、AC-Acro／Cre、及びCreと、MMSE、CDRsob、画像解析、又は血漿中Aβ40/42との間の相関）
従前の検討において、血漿中PC-AcroはMMSEと相関したが、画像解析、すなわちZ-スコアとは相関しなかった（非特許文献21）。尿中3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルは、血漿中PC-Acroのように、細胞傷害又は組織障害の生化学的マーカーであることから、3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／CreレベルとMMSE、CDRsob又はZ-スコアとの間の関連性を検討した。また、尿中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベル及びCreと血漿中Aβ40/42との間の相関を評価した。
【００８３】
MCI+AD群の3-HPMA／Creレベル又はAC-Acro／Creレベルの減少は、MMSEの減少（図3-A）及びCDRsobの増加（図3-B）とよく相関した。しかしながら、3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／CreレベルはZスコアとは相関しなかった（図3-C）。MCI+AD群のCreレベルの増加は、MMSEの減少及びCDRsobの増加のいずれとも相関したが、Z-スコアと相関しなかった（図3-A、B、及びC）。
【００８４】
図4に示すように、MCI+AD群の3-HPMA／Creレベルは、Aβ40/42とよく逆相関した。しかしながら、AC-Acro／Creレベル及びCreはAβ40/42と相関しなかった。この結果は、尿中の3つのマーカー、すなわち3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベル及びCreのうち、尿中3-HPMA／CreレベルがAD被験者とMCI被験者を識別するための最も信頼できる生化学的マーカーであることを示す。
【００８５】
上記のように、MCI+AD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルがコントロール群と比較して有意に低いこと、及びAD群の尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／CreレベルがMCI群と比較して有意に低いことが判明した。生体内でアクロレインは主にGSHにより無毒化される。すなわち、アクロレインはアクロレイン−GSH抱合体を形成し代謝される。GSHの不足はアクロレインの代謝を低下させ、その結果アクロレインとタンパク質や核酸との相互作用が生じ、これら物質の不活性化をもたらす。したがって、アクロレイン−GSH抱合体の代謝物である3-HPMAの尿検体中含有量をCreの尿検体中含有量で補正した3-HPMA／Creレベルの低下、及びAC-Acroの尿検体中含有量をCreの尿検体中含有量で補正したAC-Acro／Creレベルの低下はいずれも、脳組織障害によって生じる認知症の重要な生化学的マーカーとなる。また、尿検体中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルの低下はいずれも、AD群とMCI群とを区別するための信頼できる生化学的マーカーとして使用できる。
【００８６】
このように、尿中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルは、認知症の診断を補助する検査方法に使用される有用なバイオマーカーになり得る。採尿は採血よりはるかに容易であるため、尿中3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルをマーカーとする検査方法は、被験者への侵襲が少ないという利点を有する。
【００８７】
また、尿中の3-HPMA／Creレベル及びAC-Acro／Creレベルは、MCIとADとの判別を補助する検査方法や、MCIからADなどの認知症への進行や認知症の重篤度を評価するための検査方法に使用される信頼できるバイオマーカーであり得る。最近、脳脊髄液（CSF）中のAβ40、Aβ40/42及びAβ40／PC-AcroのレベルによりAD被験者をMCI被験者と区別できることが報告されている（非特許文献22）。尿の採取は脳脊髄液の採取よりはるかに容易であることから、ADとMCIとを区別するためには、尿中3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベル、あるいはそれらに加えて血漿中のPC-Acro及びAβ40/42をバイオマーカーとして使用する検査方法が有用と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、尿中の3-HPMA／Creレベル及び／又はAC-Acro／Creレベルを指標として、認知障害の判定、並びに認知症と軽度認知障害との判別を補助する検査方法に関するものであり、臨床検査薬産業、試薬産業、医療機器産業への利用が可能である。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図４】
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