(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症性リウマチの治療剤、慢性炎症性リウマチを発症する危険性のある患者における慢性炎症性リウマチの発症の予防剤、又は、慢性炎症性リウマチ患者の炎症の再発の遅延剤の製造に使用するための組成物であって、２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、食品成分、栄養補助食品または医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は経口または局所投与用である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、カプセル剤、丸薬、トローチ剤、錠剤、軟カプセル剤、粉末剤、懸濁剤、溶液、粒剤、ゲル剤またはクリーム剤の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
別の有効成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞は、胞子形成型および／または栄養型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞は乾燥形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記慢性炎症性リウマチが関節リウマチである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療剤、予防剤又は遅延剤が、細菌の他のあらゆる株を除外して前記組成物を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性疾患の分野に関する。本発明は特に、慢性炎症性疾患、特に慢性炎症性リウマチを処置および／または予防するためのプロバイオティクス株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は身体への内因性または外因性攻撃に反応する身体の防御機構である。物理的、化学的または感染的原因が、炎症の外因性の要因の起源となり得る。代謝の原因、血管新生問題、または異常免疫反応が、炎症の内因性の要因の起源となり得る。これらの要因のうちの１つの存在下で、炎症機構が一連の連続した段階：
−  鬱血（充血）、炎症性水腫および白血球漏出を引き起こす血管滲出反応、
−  炎症性肝肉芽腫の形成からなる細胞反応、
−  病巣精巣術、ならびに
−  損傷部位の修復および治癒
により反応する。
【０００３】
しかしながら、炎症は時折、関節リウマチにおける自己免疫などの病原体または内因性の作用物質の持続性に起因して有害になり得る。その後、身体に対する損傷により、関節組織などの組織の破壊を伴う制御されていない免疫反応および慢性炎症が発症し続ける。
【０００４】
関節リウマチは、対称的に関節に影響を及ぼし、目覚めたときに関節の痛み、腫れおよびこわばりをもたらす、自己免疫、進行性、慢性、炎症性リウマチ疾患である。それは、ほとんどの場合、程度の差はあるが、長期間の鎮静が入り交じる炎症の噴出により進行するので進行性と呼ばれる。それはまた、他の組織においても発生する場合があり、その後、それらの関節外症状は患者の生命を危険にさらす可能性がある。
【０００５】
関節リウマチは、女性に優勢で集団の約１％に影響を及ぼし、男性の症例についてはその３分の１であり、発生率は年齢と共に増加することが知られている。最初の症状は指または足の小さな関節に現れる。時間の経過と共に、慢性炎症は骨および軟骨の破壊ならびに進行性の障害を導く。炎症が持続する場合、軟骨、周囲の骨組織、腱および関節周囲の靱帯を破壊する可能性がある。したがって、この疾患はしばしば関節変形および障害を導く。関節リウマチはより特には、滑液中の炎症細胞の異常な浸潤を導く、関節滑膜の炎症により特徴付けられる。
【０００６】
最初、滑膜および関節内空間内の炎症細胞（ＣＤ４、単球、多形核白血球、好中球を含むリンパ球）の流入を可能にする血管の異常増殖が起こる。次いで、滑膜線維芽細胞の過形成ならびにリンパ球（Ｔ、ＣＤ４およびＢ）およびマクロファージの浸潤により、滑液パンヌスの形成が導かれ、これにより、滑膜炎とも呼ばれる滑膜の炎症がもたらされる。これらの異なる細胞は異常に増殖し、骨および軟骨に侵入し、大量の炎症性サイトカインおよびメタロプロテイナーゼを産生し、破骨細胞の形成および活性化を誘発する。特に豊富な炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α（壊死因子α）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１７であり、用語ＩＬはインターロイキンを指す。
【０００７】
関節の破壊が骨浸食および軟骨変性に続発する。浸食はサイトカインＲＮＡＫＬによって促進されるのに対して、軟骨融解はメタロプロテイナーゼ酵素によって促進される。これらの２つの分子はＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の作用下で滑膜を補う細胞によって産生される。
【０００８】
次いで細胞はこの分解に対抗しようとするが、骨を製造する役割を果たす破骨細胞は、制御されていない様式で骨を産生し、それにより、関節の変形および骨化を引き起こす。
【０００９】
関節リウマチの治療は、関節損傷および変形を防ぐために炎症過程を遅延させるために疾患の発見後、可能な限りすぐに開始されるべきである。
【００１０】
従来の治療は関節の炎症およびサイトカイン産生を抑制するために抗炎症剤を投与することからなる。免疫系の免疫調節医薬も使用される。新たな現在の治療は特にＴＮＦ−αまたはＩＬ−１遮断剤、例えば、エタネルセプト（Ｅｔａｎａｒｃｅｐｔ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）およびセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）に焦点を当てている。
【００１１】
処置に対する反応は個体間および疾患の段階の間で異なる。したがって、既存の処置に対する患者の抵抗性についての新たな解決策を提供するために代替の処置の探索が重要である。
【００１２】
さらに、関節リウマチの処置は、非常に高価な抗炎症治療およびもたらされ得る患者の障害のために社会にとってかなり代償が大きい。実際に、炎症性疾患に対する処置は、結果を得るのに長期間かかる、すなわち疾患の進行、炎症の再発を停止させ、疾患を鎮静の状態に安定化させ、維持するのに長期間かかる。
【００１３】
同様に、患者による抗炎症薬の長期間の使用は、体重増加、胃腸障害ならびに／または骨粗鬆症および高血圧の高い危険性などの副作用を引き起こす可能性がある。
【００１４】
したがって、プロバイオティクスは興味のある代替であり得る。「プロバイオティクス」という用語は、十分な量で組み込まれた場合、従来の栄養学的効果より、健康、快適性および生活に対してプラスの効果を与える、生きている微生物を定義するために使用される。
【００１５】
特許文献１は、抗真菌反応を刺激するため、ならびに自閉症から膣感染症および子宮内膜症に及ぶ多くの非常に異なる病変（それらの中で関節リウマチが言及されている）を処置するために枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）から選択される少なくとも１つの細菌を含む抗真菌組成物の使用を開示している。その文献は、抗真菌組成物に使用できる細菌の特定の菌株を開示していない。
【００１６】
特許文献２は、自閉症から膣感染症および子宮内膜症に及ぶ多くの非常に異なる病変（それらの中で関節リウマチが言及されている）を予防および／または処置するために、細菌の３つの菌株、すなわち、枯草菌、バチラス・コアグランスおよびエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）またはフェカーリスを含む、このような組成物を開示している。その文献は、組成物に使用できる細菌の特定の株を開示していない。
【００１７】
さらに、酵母菌株であるか、細菌株であるかに関わらず、所与の株のプロバイオティクス効果は、この株に特異的であることは知られており、種類またはさらに種は考慮されない。また、既存のものの代わりとして、費用が低く、副作用が少ない、慢性炎症性疾患を予防および／または治療するための新規治療を見つける必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３３１８８号
【特許文献２】国際公開第２００９／０２６３０６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、慢性炎症性疾患の治療および／または予防に使用するための細菌プロバイオティクス株に関する。
【００２０】
本発明者らは驚くべきことに、枯草菌株ＣＵ１が慢性炎症性疾患の処置および／または予防に有益な効果を有することを発見した。枯草菌株ＣＵ１は、ＣＮＣＭ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２５  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５に２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５として寄託された。
【００２１】
枯草菌株ＣＵ１はＦＲ２８３７８３５に初めて記載された。その文献は、免疫系の免疫調節剤として枯草菌株ＣＵ１およびＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する組換え生ワクチンを産生するためのその使用を記載している。
【００２２】
「株」とは、細胞の比較的同種の集団を指す。特に、株は、単一細胞から得られた細胞集団であるクローンの単離から得られる。「枯草菌株ＣＵ１」、「プロバイオティクス株ＣＵ１」、「番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株」および「株ＣＵ１」という用語は同義語である。
【００２３】
したがって、本発明は、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株ＣＵ１に関する。本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞に関する。本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関する。「２００１年１０月２５日に番号Ｉ−２７４５としてＣＮＣＭに寄託された枯草菌株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞」、「バイオマスＣＵ１」、「株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞」または「細胞ＣＵ１」という用語は、本明細書において同義語である。株ＣＵ１および前記株を培養することによって得られる細胞ＣＵ１は、慢性炎症性疾患を予防および／または処置するための代替処置の構成要素となり、費用は低く、従来の処置の副作用を有さない。
【００２４】
「慢性炎症性疾患」という用語は、慢性炎症性リウマチ、乾癬、慢性膵炎、セリアック病、橋本甲状腺炎、クローン病、エリテマトーデス、強皮症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎および血管炎からなる群から選択される疾患を意味する。
【００２５】
「疾患の処置」という用語は、疾患を治癒させるため、炎症の強さを減少させるか、または鎮静の状態に維持するために疾患を安定化させることなどによって、その症状または不快感を緩和するために疾患を処置することを意味する。
【００２６】
「鎮静の状態」という用語は、炎症が再発する間の間隔を意味する。
【００２７】
「疾患の予防」という用語は、例えば、疾患を発症する危険性のある被験体における疾患の発症の回避、または疾患が既に存在する場合、疾患の炎症の再発の遅延を意味する。
【００２８】
本発明は特に、枯草菌株ＣＵ１もしくは前記株を培養することによって得られる細胞、または慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、前記慢性炎症性疾患は慢性炎症性リウマチであることを特徴とする。「慢性炎症性リウマチ」とは、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、ベーチェット病、強皮症、若年性特発性関節炎および慢性萎縮性多発性軟骨炎からなる群から選択される疾患を意味する。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、関節リウマチの処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関する。本発明者らは驚くべきことに、プロバイオティクス枯草菌ＣＵ１、および特に前記株を培養することによって得られる細胞の使用により、以下が可能になることを見出した：
−  実施例１および２に実証されるように、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７などの炎症性サイトカインの産生を減少させること、
−  実施例２に実証されるように、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生を刺激すること、
−  実施例１に実証されるように、関節リウマチにおける炎症の重症度または罹患関節の数などの肉眼的症状を遅延および／または減少させること、
−  実施例１に実証されるように、滑液中の免疫細胞の浸潤を減少させること、
−  実施例１に実証されるように、軟骨、骨の破壊、および関節の変形を生じる関節損傷を減少させること。
【００３０】
実際に、ＴＮＦ−αならびにインターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１７は、炎症性疾患において中心的な役割を果たす炎症性サイトカインである。それらの過剰分泌は慢性炎症を生じ、関節リウマチの場合、不可逆的関節損傷およびそれらの変形を生じる。
【００３１】
「肉眼的症状」という用語は、１９８７年に改訂されたアメリカリウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ））の基準（Ａｒｎｅｔｔ  ＦＣら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９８８；３１：３１５−２４を参照のこと）に従って、炎症の重症度、炎症により罹患した関節の数、および関節の変形などの裸眼で見ることができる症状を意味する。
【００３２】
「免疫細胞」という用語は、マクロファージ、リンパ球、循環多形核球および単球白血球を指す。関節内、より特には滑膜内への免疫細胞の浸潤は、軟骨および隣接する骨組織の破壊に関与する滑液パンヌスを生じる。
【００３３】
したがって、本発明者らは、ＣＵ１細胞の投与が、実施例１に記載されるように、滑液パンヌスの形成を減少させ、阻止する効果を有することを発見した。
【００３４】
「関節損傷」とは、軟骨基質からのプロテオグリカンの喪失による軟骨、および骨関節の段階的な破壊、ならびに前記関節の段階的な変形を指す。関節の変形は破骨細胞による関節の制御されていない骨化に起因する。この変形は、患者の自律および障害の喪失を引き起こすことによって大きな影響を与える帰結となり得る。
【００３５】
したがって、本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、少なくとも１つの炎症性サイトカインの産生の減少および／または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの増加した産生を誘導することを特徴とする。
【００３６】
炎症性サイトカイン（この産生は、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物によって減少する）は、ＴＮＦ−α、インターロイキンＩＬ−１、インターロイキンＩＬ−１２またはインターロイキンＩＬ−１７からなる群から選択される。
【００３７】
抗炎症性サイトカイン（この産生は、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物によって増加する）は、例えばインターロイキンＩＬ−１０である。
【００３８】
本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、少なくとも２種の炎症性サイトカイン、好ましくは少なくとも３種の炎症性サイトカインの産生の減少、および／または少なくとも１種の抗炎症性サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１０の産生の増加を誘導することを特徴とする。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明は、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、ＴＮＦ−α、インターロイキンＩＬ−１、インターロイキンＩＬ−１２およびインターロイキンＩＬ−１７の産生の減少、ならびにインターロイキンＩＬ−１０の産生の増加を誘導することを特徴とする。
【００４０】
本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、ヒトおよび獣医学的使用を意図することを特徴とする。獣医学的使用は、ブタ、ウシ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜だけでなく、ネコ、イヌ、ウマまたはウサギなどの飼育動物にも関する。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明は、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、枯草菌株ＣＵ１、または前記株を培養することによって得られる細胞、または前記株を培養することによって得られる細胞を含む組成物に関し、ヒトの使用を意図することを特徴とする。
【００４２】
細胞ＣＵ１は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５版、Ｒ．Ｓｃｒｉｂａｎ、Ｔｅｃ．＆  Ｄｏｃ．Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９９  ＩＳＢＮ：２−７４３０−０３０９−Ｘというタイトルの文献に記載されているように、当業者に周知の方法に従って、培地中で枯草菌ＣＵ１を培養することによって得られる。典型的に、株ＣＵ１を培養することによる細胞ＣＵ１の産生方法は、
−  株ＣＵ１を培地に播種する工程、
−  細胞増殖のために好気性条件下で培養する工程、
−  その培地からバイオマスを分離して細胞ＣＵ１を得る工程
を含む。
【００４３】
このように得られた細胞はほとんど栄養型である。細菌の「栄養型」とは、好適な条件下に置かれる細菌の形態を指す。「主に栄養型」という用語は、細胞の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が栄養型であることを意味する。好適な条件の例は、細菌増殖に好適な温度およびｐＨでの非限定的な培地である。非限定的な培地は、細胞増殖に必要な全ての栄養素を含有する。
【００４４】
細胞ＣＵ１の産生方法はまた、好気性条件下で培養する工程と、その培地からバイオマスを分離する工程との間に好適でない条件に細胞を置く工程からなる中間工程を含んでもよい。そして、このプロセスの終わりに得られた細胞ＣＵ１は主に胞子形成型である。
【００４５】
細菌の「胞子形成型」とは、好適でない条件下に置かれた細菌の形態を指す。
【００４６】
「主に胞子形成型」という表現は、細胞の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が胞子形成型であることを意味する。したがって、胞子形成型は、困難な培地、例えば、栄養素の欠乏、すなわち限られた栄養素の培地、水分ストレス、ｐＨもしくは温度の大きな変化の培地、または消化管を通るときに細胞が耐えることができる抵抗性の形態である。
【００４７】
細胞ＣＵ１を好適でない条件に置くことは、例えば、細菌の培養培地を新しくせず、限られた培養培地を使用して培養培地中への供給物を停止し、温度を変化させ、ｐＨを変化させ、培養培地中で２０％より高いＯ２圧力、および放出気体中で１．５％未満のＣＯ２圧力を維持するようにエアレーションおよび／または撹拌を制御すること、またはこれらの組み合わせによって達成される。約０．７５ｇ／Ｌの量で培養培地中にグルタミン酸を加えることによって主に胞子形態である細胞ＣＵ１を得ることも可能である。
【００４８】
したがって、本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞、または前記細胞を含む組成物に関し、前記細胞が胞子形成型および／または栄養型であることを特徴とする。好ましい実施形態において、細胞ＣＵ１は主に胞子形成型である。細胞ＣＵ１の産生方法はまた、細胞ＣＵ１を乾燥させて乾燥形態の細胞ＣＵ１を得る、後の工程を含んでもよい。乾燥は、例えば、凍結乾燥、流動床乾燥、または噴霧乾燥である。したがって、本発明は、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞、または前記細胞を含む組成物に関し、前記細胞は乾燥形態であることを特徴とする。「乾燥形態の細胞」とは、細胞ＣＵ１の産生方法の終わりに得られるバイオマスが、９０％超の乾燥物質、好ましくは９５％超の乾燥物質を含むことを意味する。
【００４９】
１日用量は、動物の種類、その体重、投与様式および治療または予防のいずれかの処置の種類に依存する。本発明はさらに、ヒトでの使用を意図する場合、１．１０８ＣＦＵ〜１．１０１１ＣＦＵ、好ましくは５．１０８ＣＦＵ〜１．１０１０ＣＦＵの量で細胞ＣＵ１を毎日使用するための、上記に定義した細胞または組成物に関する。本発明はさらに、獣医学的使用を意図する場合、１．１０５ＣＦＵ〜１．１０１１ＣＦＵ、好ましくは１．１０７ＣＦＵ〜１．１０１０ＣＦＵの量で細胞ＣＵ１を毎日使用するための、上記に定義した細胞または組成物に関する。ＣＦＵという用語は、コロニー形成単位を指す。
【００５０】
本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、上記に定義される組成物に関し、その組成物が、食品成分、栄養補助食品または医薬組成物であることを特徴とする。食品成分とは、任意の食品、飲料、または菓子を指定する。食品成分は、例えば、飲料、シリアルバー、チューイングガム、乳製品、例えば、発酵乳製品であってもよい。
【００５１】
「栄養補助食品」という用語は、その目的が通常の食事を補助し、単独または組み合わせで、濃縮された栄養源であるか、または栄養学的効果もしくは生理学的効果を有する他の物質である、食品を指定する。栄養補助食品は、カプセル剤、トローチ剤、錠剤、丸剤および他の同様の形態、粉末パック、液体が充填されたアンプル、スポイトを備えたバイアルおよび測定される少量の単位で摂取することを意図する液体または粉末製剤の同様の形態などの投薬形態で市販されている。医薬組成物はさらに、薬学的に許容可能な担体を含む。本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、上記に定義される組成物に関し、その組成物は、経口または局所投与、好ましくは経口投与を意図することを特徴とする。したがって、本発明は、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、上記に定義される組成物に関し、その組成物は、カプセル剤、トローチ剤、丸薬、錠剤、軟質カプセル剤、粉剤、懸濁剤、液剤、顆粒、ゲルまたはクリームの形態である。
【００５２】
本発明はまた、慢性炎症性疾患の処置および／または予防に使用するための、上記に定義される組成物に関し、その組成物はさらに別の有効成分を含むことを特徴とする。他の有効成分は好ましくは、抗炎症活性、免疫系の免疫調節活性および／または鎮痛活性を有する有効成分からなる群から選択される。有益な実施形態において、他の有効成分は、枯草菌株ではなく、好ましくは細菌株ではなく、より好ましくはプロバイオティクス株ではない。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、細菌の任意の他の株を排除して株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞を含有する。別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、酵母または細菌の任意の他の株を排除して株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞を含有する。別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、唯一の有効成分として株ＣＵ１を培養することによって得られる細胞を含有する。
【００５４】
本発明はまた、株ＣＵ１を培養することによって得られる有効量の細胞、または前記細胞を含む有効量の組成物を患者に投与することを含む、前記患者における慢性炎症性疾患を処置および／または予防するための方法に関する。本発明はより特には、株ＣＵ１を培養することによって得られる有効量の細胞、または前記細胞を含む有効量の組成物を患者に投与することを含む、前記患者における慢性炎症性疾患を処置および／または予防するための方法に関し、その慢性炎症性疾患は慢性炎症性リウマチである。好ましい実施形態において、本発明は、株ＣＵ１を培養することによって得られる有効量の細胞、または前記細胞を含む有効量の組成物を患者に投与することを含む、前記患者における関節リウマチを処置および／または予防するための方法に関する。
【００５５】
ここで、本発明を、例示の目的として与えられ、限定することを意図していない以下の実施例および図面を使用して例示する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】試験番号１による５０日の研究にわたる一群当たりの全てのラットの累積臨床スコアである。
【図２】試験番号２の間で、最初の免疫付与からＤ＋７までのＧ２およびＧ４群のラットにおける平均臨床スコアの評価である。
【図３】試験番号２による４３日の研究にわたる一群当たりの全てのラットの累積臨床スコアである。
【図４】試験番号３による５０日の研究にわたる一群当たりの全てのラットの累積臨床スコアである。
【図５】試験番号２による各群におけるラットの血清中のＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図６】試験番号３による各群におけるラットの血清中のＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図７】試験番号２による各群におけるラットの血清中のインターロイキンＩＬ−１７（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図８】試験番号３による各群におけるラットの血清中のインターロイキンＩＬ−１７（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図９】マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）によるヒトＰＢＭＣの刺激後に回収した、各群の上清中のＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図１０】マイコバクテリウム・ブチリカムによるヒトＰＢＭＣの刺激後に回収した、各群の上清中のインターロイキン１（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図１１】マイコバクテリウム・ブチリカムによるヒトＰＢＭＣの刺激後に回収した、各群の上清中のインターロイキン１２（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【図１２】マイコバクテリウム・ブチリカムによるヒトＰＢＭＣの刺激後に回収した、各群の上清中のインターロイキン１０（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイである。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ラットにおいて誘導された実験的関節炎モデルに対する枯草菌ＣＵ１の効果
材料および方法
１−動物モデル
６週齢のＬｅｗｉｓメスラットを使用する。アジュバントとして作用する油性溶液中のマイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｂ）エマルションの投与によって関節炎を誘導する。得られたモデルは臨床症状：罹患関節の対称性、優先的に影響を受ける末梢関節、滑膜の過形成、炎症細胞浸潤、周辺関節浸食およびメスにおける疾患へのかかりやすさにより比較的ヒト関節炎に忠実である。また、炎症部位においてインサイチュで発生する免疫−炎症カスケードが存在する。マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）は凍結乾燥形態で購入し、熱により不活化する。それらは続いて、ワセリン油性溶液、Ｔｗｅｅｎ８０およびＰＢＳ緩衝液１ミリリットル当たり１８０ｎｇの殺傷したＭｂの量で乳化される。
【００５８】
２−使用した試料
試験される枯草菌細胞ＣＵ１（本明細書以下ＣＵ１）は胞子形成形態および凍結乾燥形態で使用する。細胞を試験のために生理食塩水中に懸濁し、５×１０９細菌／日の１日用量を摂取によりラットに投与する。
【００５９】
３−処置／プロトコル
５０日の期間にわたって試験を行い、３連で実施する：最初に２回の試験を５匹のラットのバッチで行い、３回目にＣＵ１で処置した１２匹のラットのバッチで行い、３回の試験を時間を空けて行う。
【００６０】
計画：
−  Ｄ０：ラットをいくつかのバッチに分ける：
→  １群（Ｇ１）：陰性対照、健康なラット；
→  ２群（Ｇ２）：ＣＵ１で処置していない実験的関節炎を有するラット；
→  ３群（Ｇ３）：Ｄ０から研究の期間全体を通して摂取により１日用量のＣＵ１を与えている健康なラット；
→  ４群（Ｇ４）：Ｄ０から研究の期間全体を通して摂取により１日用量のＣＵ１を与えている実験的関節炎を有するラット。
−  Ｄ＋７：Ｇ２およびＧ４群におけるラットを、尾の付け根における３００μｌの不活化Ｍｂエマルション、または５４ｎｇ用量の不活化Ｍｂエマルションの最初の皮内注射により免疫化する。
−  Ｄ＋１４：Ｇ２およびＧ４群におけるラットを、同じ条件下で２回目の免疫化をする。
【００６１】
炎症の臨床スコア：
最初の臨床症状は、関節炎を誘導したラットにおいてＤ＋２３に現れた。ラットは、滑液腔内の強い炎症反応と共に末梢関節（主に後足）において関節炎の症状を急速に発症し、罹患した関節の近くの麻痺および破壊的骨組織浸食を生じた。多くの病態モデルのように、動物は顕著な体重損失を示した。炎症症状を所定の臨床スコアに従って「スコア付け」し、表１にまとめる。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
ラットの体重を計り、毎日スコア付けする。
【００６４】
組織学的プロトコル
足を４％ホルムアミド中で固定し、次いで脱灰緩衝液（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｕｔｅａｕ、フランス）中で３時間、電気泳動により脱灰する。次いで、足をパラフィンで包み、ミクロトームを用いて組織切片を得る。慣用のプロトコルを使用して５ｍｍ切片を染色する。
各群について得た組織切片を２つの異なる染料を用いて染色する：
−  ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）による染色、この染色は、コラーゲンを薄いピンクに、筋肉を濃いピンクに、好酸性の細胞質を赤色に、好塩基性細胞質を紫色に、核を青色に、赤血球をチェリーレッドに染色する；
−  結合組織を強調するマロリーアニリンブルーまたはマロリー三重染色（ＭＡ）による染色：コラーゲン線維を青色に、筋線維を赤色に、エラスチン線維をピンクまたは黄色にする。
１００倍および４００倍の倍率にて光学顕微鏡下で切片を観察する。
【００６５】
炎症性サイトカインのアッセイプロトコル
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ、ＵＳＡ）により提供される抗体キットおよび標準物ならびに供給業者によって指定されるプロトコル（ラットＩＬ−１７Ａ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｐ；ラットＴＮＦアルファＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳｅｔーＧｏ）を使用してＥＬＩＳＡによりサイトカインアッセイを実施した。
【００６６】
結果
１−炎症症状：炎症の臨床スコア
プロバイオティクス株を与えているまたは与えていない健康なラット（Ｇ１およびＧ３）は炎症症状を発症せず；したがってそれらの臨床スコアはゼロであり、曲線で示されない。
【００６７】
試験番号１：
２群におけるラットは、Ｍｂによる最初の免疫化から１９日後（Ｄ＋２６）に実験的関節炎を発症する。次いでそれらの臨床スコアは、最初の臨床症状の発症から１０日後（Ｄ＋３３）のみに３から４の間の平均になるように展開する。次いでこのスコアは研究の期間全体にわたって安定で高いままに維持する。対照的に、細胞ＣＵ１を与えている４群のラットは炎症症状を発症しないか、または２群より遅く発症する。さらに、４群の臨床スコアは顕著に低く；罹患した足の重症度および数は２群よりも低いままである。図１によれば、ＣＵ１で処置した４群のラットの２３１に対して、２群におけるラットは４２６の総蓄積スコアに達することが観察される。したがって、ＣＵ１は病理学的兆候の重要度を４６％減少させる。
【００６８】
試験番号２：
２群におけるラットは、Ｍｂによる最初の免疫化の２５日後（Ｄ＋３２）から実験的関節炎を発症する。次いで、最初の臨床症状の発症から１５日後（Ｄ＋３８）のみ、それらの臨床スコアを平均で３になるように迅速に展開する。次いでこのスコアは研究の期間全体にわたって安定で高いままである。また、ＣＵ１を与えている４群におけるラットも、後であるが、２８日（Ｄ＋３５）にかなり低く炎症症状を発症する。３３日に、最初の免疫化後（Ｄ＋４０）、症状は減少し、その後研究の終わりまで安定なままである。炎症を起こしているが、罹患した足の重症度および数は２群より低いままである。したがって、炎症の症状の発症および重症度の有意な相違を観察することができる（図２）。図３によれば、ＣＵ１で処置した４群の４匹のラットの３１に対して、２群におけるラットは１７６の総蓄積スコアに到達することを観察することができる。したがって、ＣＵ１は病理学的兆候の重要度を８２％減少させる。
【００６９】
試験番号３：
６匹のラットの２つの群を４群に使用し、ａおよびｂと呼ぶ。図４によれば、２群および４ａ／ｂ群において累積スコアの間に有意な相違を観察する。ＣＵ１で処置した６匹のラット（Ｇ４ａ）の９８、およびＣＵ１で処置した６匹のラット（Ｇ４ｂ）の８０に対して、２群における６匹のラットは２５１の総累積スコアに到達する。したがって、ＣＵ１は病理学的兆候の重要度を６１％（Ｇ４ａ）および６８％（Ｇ４ｂ）減少させる。
【００７０】
２−ラットの後足の視覚分析
異なる群のラットの後足における炎症の存在の目視観測によって視覚分析を実施する。いかなる処置も受けていない１群におけるラットの足は炎症を示さなかった。２群におけるラットの足は目に見える顕著な炎症を示す。４群におけるラットの足は炎症の症状を示さないか、または２群よりもかなり低い。
【００７１】
３−ラットの後足の組織学的分析
ＨＥ染色における２群の切片は、１群および３群と比較して関節組織の破壊および関節における免疫細胞の強力な浸潤を示す。ＨＥ染色における４群の切片の観察は、関節内への免疫細胞の浸潤が低いこと、および全体として結合組織がほとんど変化していないことを示す。ＭＡ染色における２群の切片は、４００倍で見ることができる関節腔内への結合組織侵入および白血球の強力な浸潤、結合アーキテクチャの損失、ならびに骨の浸食を示す。ＭＡ染色における４群の切片の観察は、いくらかの動物が関節への損傷を示さないか、またはほとんど示さないことを示し、病変が存在する場合、それらは、２群の罹患動物において観察された病変と比較して低い。したがって、パンヌスの形成、滑膜の炎症、軟骨の破壊および関節変形が防がれた。
【００７２】
４−ラットの血清における炎症性サイトカインのアッセイ
ＴＮＦ−αのアッセイ
図５および６は、それぞれ試験２および３についての各群のラットの血清におけるＴＮＦ−αのアッセイの結果を示す。各動物の血清は２連でアッセイし、次いで対応する群における全ての動物の全平均を示す。ＴＮＦ−αのアッセイはピコグラム／ミリリットルで表す。
【００７３】
試験番号２：図５によれば、１群および３群は２００ｐｇ／ｍｌに近い低い割合のＴＮＦ−αを示す。２群におけるラットの血清は２０００ｐｇ／ｍｌのオーダーのＴＮＦ−αの割合を示す。４群におけるラットの血清は５００ｐｇ／ｍｌのオーダーのＴＮＦ−αの割合を示し、２群より４倍低い。
【００７４】
試験番号３：図６によれば、１群は約６００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの割合を示し、３群については約１０００ｐｇ／ｍｌを示す。また、４群は、１群および３群と比較して約１４００ｐｇ／ｍｌの低い割合のＴＮＦ−αを示すのに対して、２群は、４群よりも３倍高い４４００ｐｇ／ｍｌの範囲の高い割合のＴＮＦ−αを示すことが観察される。
【００７５】
インターロイキンＩＬ−１７のアッセイ：
図７および８は、試験２および３について各群からのラットの血清におけるＩＬ−１７のアッセイの結果を示す。ＩＬ−１７のアッセイはピコグラム／ミリリットルで表す。
【００７６】
試験番号２：図７によれば、１群および３群におけるラットは、キット検出限界（５０ｐｇ／ｍｌ）付近である、ＩＬ−１７の低い平均の割合を有する。２群におけるＩＬ−１７の平均の割合は約６２５ｐｇ／ｍｌであり、高いのに対して、４群におけるＩＬ−１７の平均の割合は、１００ｐｇ／ｍｌの範囲であり、低いことが観察され得る。
【００７７】
試験番号３：図８によれば、１群および３群におけるラットは、キット検出限界（５０ｐｇ／ｍｌ）付近である、ＩＬ−１７の低い平均の割合を有する。２群におけるＩＬ−１７の平均の割合は、２０００ｐｇ／ｍｌ超であり、高いのに対して、４群におけるＩＬ−１７の平均の割合は２バッチにおいてキット検出限界付近であり、低いことが観察され得る。
【００７８】
結論
使用した関節炎誘導のモデルは、ＣＵ１が疾患の誘導を予防できるか、またはその作用を非常に顕著に減少させることが実証される。一方で、ラットの足が炎症を示さないか、または低い炎症スコアを有することが視覚的に観察できる。したがって、ＣＵ１の投与はこのような病理学的症状の重要度を減少させる。一方で、ラットの足の組織学的分析により、ＣＵ１で処置した関節炎のラット（Ｇ４）は、ＣＵ１で処置しなかったラット（Ｇ２）と比較して、かなり少ない結合損傷の出現、少ない骨の浸食、および関節内の免疫細胞の減少または消失を示すことが明らかになる。さらに、関節炎のラット（Ｇ４）へのＣＵ１の投与の結果、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７）の存在の顕著な減少が生じる。
【００７９】
実施例２：マイコバクテリウム・ブチリカムで刺激した健常なドナーの血液（ＰＢＭＣ）から抽出したヒト免疫細胞に対する枯草菌ＣＵ１の効果
材料および方法
１−使用した細胞モデル
ＰＢＭＣ（末梢血中単核細胞）をこの実施例においてモデルとして使用する。血液を、ＨＩＶ感染または肝炎の非存在下で前処置した４人の健常なボランティアドナーから得た（ＥＦＳ  Ａｑｕｉｔａｉｎｅ、Ｂｏｒｄｅａｕｘ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）。ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ（商標）勾配における遠心分離によって単離する。洗浄後、細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で１×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌの濃度にて再懸濁する。それらをマイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｂ）（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）と接触させて炎症反応を誘導する。ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの濃度にて、ＰＢＳ緩衝液中に実施例１の凍結乾燥物を希釈することによってＭｂストック溶液を調製する。次いで、ＰＢＭＣ刺激の間、免疫細胞により１０Ｍｂの割合（ＭＯＩ  １０：１）を使用するように、ストック溶液中のＭｂ細胞の数を、Ｍａｌａｓｓｅｚ細胞を使用して顕微鏡下でカウントする。ＭＯＩという用語は、感染多重度を意味する。
【００８０】
２−使用した試料
試験する枯草菌細胞ＣＵ１（本明細書以下、ＣＵ１）は、胞子形成型（ＣＵｓｐ）または栄養型（ＣＵｖ）で使用した。滅菌生理食塩水中の２×１０８ＣＦＵ／ｍｌの希釈標準溶液を使用する。
【００８１】
３−ＰＢＭＣの刺激
１０個の細菌／免疫細胞の割合でＰＢＭＣおよびＣＵ１株を共培養することによって刺激実験を実施する。リポ多糖（ＬＰＳ）を、サイトカイン産生のためにＰＢＭＣを刺激するための陽性対照として使用した。全ての実験は３連で実施する。接触の１８時間後に回収した培養上清を遠心分離し、サイトカインアッセイ（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０）まで−８０℃にて保存する。
【００８２】
４−種々の試験群の調製
−  １群（Ｇ１）：ＰＢＭＣの存在のみ；
−  ２群（Ｇ２）：ＰＢＭＣを胞子形成型のＣＵ１と接触させる；
−  ３群（Ｇ３）：ＰＢＭＣを栄養型のＣＵ１と接触させる；
−  ４群（Ｇ４）：ＰＢＭＣをＭｂと接触させる；
−  ５群（Ｇ５）：ＰＢＭＣを胞子形成型のＣＵ１およびＭｂと接触させる；
−  ６群（Ｇ６）：ＰＢＭＣを栄養型のＣＵ１およびＭｂと接触させる；
−  ７群（Ｇ７）：Ｍｂを加える前にＰＢＭＣを胞子形成型のＣＵ１と１時間プレインキュベートする；
−  ８群（Ｇ８）：Ｍｂを加える前にＰＢＭＣを栄養型のＣＵ１と１時間プレインキュベートする。
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ、ＵＳＡ）によって提供されるキット、抗体および標準物、ならびに供給業者によって指定されるプロトコルを使用してＥＬＩＳＡによってサイトカインのアッセイを実施した。
【００８３】
結果
１−ＴＮＦ−αのアッセイ
図９は、上記の群の各々についてＰＢＭＣから回収した上清中のＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。２０００ｐｇ／ｍｌのオーダーのＴＮＦ−αの割合を４群において観察したのに対して、ＣＵ１（Ｇ５およびＧ６）と接触させた群において、ＴＮＦ−αの量は半分になった。さらに、Ｍｂを加える１時間前にＣＵ１（Ｇ７およびＧ８）とのプレインキュベーションは最も効果的になり、ＣＵ１が胞子形成型（Ｇ７）である場合、Ｔ ＮＦ−αの割合は約５００ｐｇ／ｍｌまで低下する（４倍低い）ことが観察される。
【００８４】
２−インターロイキンＩＬ−１のアッセイ
図１０は、上述の群の各々についてＰＢＭＣから回収した上清中のＩＬ−１（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。１２５０ｐｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−１の割合を４群において観察したのに対して、５群においてラットは６群と同様に約４００ｐｇ／ｍｌ（３倍低い）である。Ｍｂを加える前、ＣＵ１（Ｇ７およびＧ８）とのプレインキュベーションの場合、改善は観察されなかった。
【００８５】
３−インターロイキンＩＬ−１２のアッセイ
図１１は、上述の群の各々についてＰＢＭＣから回収した上清中のＩＬ−１２（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。３２ｐｇ／ｍｌのオーダーのＩＬ−１２の割合を４群において観察したのに対して、５群および６群においてＣＵ１との接触により、ＩＬ−１２の顕著な減少（１２ｐｇ／ｍｌ未満）が観察される。さらに、ＣＵ１（Ｇ７およびＧ８）とのプレインキュベーションにより、Ｍｂを加える前に、５群および６群と比較してＩＬ−１２の割合がさらに減少することが観察される。
【００８６】
４−インターロイキンＩＬ−１０のアッセイ
図１２は、上述の群の各々についてＰＢＭＣから回収した上清中の抗炎症性サイトカインＩＬ−１０（ｐｇ／ｍｌ）のアッセイを示す。Ｍｂ群において５５ｐｇ／ｍｌのオーダーのＩＬ−１０の割合を観察したのに対して、ＣＵ１と接触させた５群および６群において、１２０ｐｇ／ｍｌ（２倍の増加）のオーダーのこの抗炎症性サイトカインの産生の増加を観察した。さらに、Ｍｂを加える前、ＣＵ１（Ｇ７およびＧ８）とのプレインキュベーションは効果的でないように見えることが観察される。なぜなら、ＩＬ−１０の割合は５群および６群より低いからである（７５〜９５ｐｇ／ｍｌ）。
【００８７】
結論
得られた結果は、概して、枯草菌細胞ＣＵ１の投与が炎症性サイトカインの産生を減少させ、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を増加させることを示す。
【図１】
0006533220.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006533220.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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