(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含む核酸であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する核酸。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する塩基配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含む核酸であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する核酸。
（ｃ）配列番号２により表される塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する塩基配列。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸を含むミオグロビン検出用アプタマー。
【請求項４】
請求項３に記載のミオグロビン検出用アプタマーであって、
前記核酸に直接、又はスペーサー配列を介して修飾物質が結合していることを特徴とするミオグロビン検出用アプタマー。
【請求項５】
請求項４に記載のミオグロビン検出用アプタマーであって、
前記修飾物質が、標識性又は耐ヌクレアーゼ性を付与する物質であることを特徴とするミオグロビン検出用アプタマー。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のミオグロビン検出用アプタマーを保持した保持ユニットと、
前記保持ユニットに保持された前記ミオグロビン検出用アプタマーに結合したミオグロビンを、質量変化又は電気的特性の変化に基づき検出する検出ユニットと、
を備えることを特徴とするミオグロビン検出装置。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のミオグロビン検出用アプタマーを保持した保持ユニットと試料とを接触させる工程と、
前記保持ユニットに保持された前記ミオグロビン検出用アプタマーに結合したミオグロビンを、質量変化又は電気的特性の変化に基づき検出する工程と、
を含むことを特徴とするミオグロビン検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、ミオグロビン検出用アプタマー、ミオグロビン検出方法、及びミオグロビン検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオグロビン（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）は心筋梗塞を示すバイオマーカである。ミオグロビンに結合するＤＮＡアプタマーが報告されている（非特許文献１参照）。このＤＮＡアプタマーを、ミオグロビンの検出に用いることが考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qing Wang et al.,(2014) Screening of DNA Aptamers against Myoglobin Using a Positive and Negative Selection Units Integrated Microfluidic Chip and Its Biosensing Application Anal. Chem., 86 (13), pp 6572-6579
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１記載のＤＮＡアプタマーは、ミオグロビンの検出感度が十分ではなかった。本発明は、こうした問題にかんがみてなされたものであり、ミオグロビンの検出感度が高い核酸、ミオグロビン検出用アプタマー、ミオグロビン検出方法、及びミオグロビン検出装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の核酸は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含む核酸であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する核酸である。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する塩基配列。
【０００６】
本発明の第２の核酸は、以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含む核酸であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する核酸である。
（ｃ）配列番号２により表される塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ミオグロビンに対する結合親和性を有する塩基配列。
【０００７】
本発明の第１又は第２の核酸を用いれば、ミオグロビンを感度良く検出することができる。
本発明のミオグロビン検出用アプタマーは、上述した第１又は第２の核酸を含む。本発明のミオグロビン検出用アプタマーを用いれば、ミオグロビンを感度良く検出することができる。
【０００８】
本発明のミオグロビン検出装置は、上述したミオグロビン検出用アプタマーを保持した保持ユニットと、保持ユニットに保持されたミオグロビン検出用アプタマーに結合したミオグロビンを、質量変化又は電気的特性の変化に基づき検出する検出ユニットとを備える。本発明のミオグロビン検出装置を用いれば、ミオグロビンを感度良く検出することができる。
【０００９】
本発明のミオグロビン検出方法は、上述したミオグロビン検出用アプタマーを保持した
保持ユニットと試料とを接触させる工程と、保持ユニットに保持されたミオグロビン検出用アプタマーに結合したミオグロビンを、質量変化又は電気的特性の変化に基づき検出する工程と、を含む。本発明のミオグロビン検出方法を用いれば、ミオグロビンを感度良く検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本体部３が洗浄部材５から分離した状態にあるミオグロビン検出装置１の構成を表す側断面図である。
【図２】本体部３が洗浄部材５と結合した状態にあるミオグロビン検出装置１の構成を表す側断面図である。
【図３】保持ユニット１５の構成を表す説明図である。
【図４】ミオグロビン検出用アプタマー_１を使用した場合における蛍光の検出結果を表す写真である。
【図５】ミオグロビン検出用アプタマー_２を使用した場合における蛍光の検出結果を表す写真である。
【図６】ミオグロビン検出用アプタマー_ｒ及びミオグロビン検出用アプタマー_１を使用した場合における蛍光の検出結果を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態を説明する。本発明の第１の核酸は、望ましくはＤＮＡである。本発明の第１の核酸は、（ａ）又は（ｂ）の塩基配列から成る核酸であってもよいし、（ａ）又は（ｂ）の塩基配列における５’末端、又は３’末端にさらに他の塩基配列が続くものであってもよい。
【００１２】
本発明の第２の核酸は、望ましくはＤＮＡである。本発明の第２の核酸は、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列から成る核酸であってもよいし、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列における５’末端、又は３’末端にさらに他の塩基配列が続くものであってもよい。
【００１３】
本発明のミオグロビン検出用アプタマーは、第１又は第２の核酸から成るものであってもよいし、第１又は第２の核酸に加えて、他の成分を含むものであってもよい。
本発明のミオグロビン検出用アプタマーでは、例えば、核酸に直接、又はスペーサー配列を介して修飾物質を結合させることができる。修飾物質が結合する部位は、例えば、核酸の５’末端、又は３’末端である。修飾物質は、例えば、ミオグロビン検出用アプタマーに、標識性又は耐ヌクレアーゼ性を付与する。標識性としては、例えば、光（例えば蛍光）を発する性質が挙げられる。修飾物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＣＹ３蛍光色素、ＣＹ５蛍光色素等が挙げられる。これらの修飾物質はいずれも蛍光を発する性質を有し、標識性を有している。
【００１４】
スペーサー配列としては、例えば、5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’（配列番号３）や、5’-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’（配列番号４）等が挙げられる。
本発明のミオグロビン検出用アプタマーは、ミオグロビンを検出する用途に用いることができる。ミオグロビンは心筋梗塞を示すバイオマーカであるから、本発明のミオグロビン検出用アプタマーは、心筋梗塞の診断の用途に用いることができる。心筋梗塞の診断の対象は、ヒトであってもよいし、ヒト以外の生物（例えば哺乳類）であってもよい。
【００１５】
本発明のミオグロビン検出装置は、例えば、図１〜図３に示す構成を有する。図１、図２に示すように、ミオグロビン検出装置１は、本体部３と、洗浄用部材５とを備える。本体部３は、筐体７と、表示ユニット９と、変換ユニット１１と、検出ユニット１３と、保持ユニット１５とを備える。
【００１６】
筐体７は、基本的には箱型の形態を有し、その上面７Ａに凹部１７が形成されている。凹部１７は、図１における上方から見たとき、円形の凹部である。表示ユニット９は画像を表示可能な液晶ディスプレイであり、上面７Ａに設けられている。変換ユニット１１は、検出ユニット１３の出力信号を数値変換する。変換ユニット１１は、筐体７の内部に収容されている。変換ユニット１１によって変換された数値は表示ユニット９に表示される。
【００１７】
検出ユニット１３は、凹部１７内に収容されている。検出ユニット１３は、表面プラズモン共鳴、または、水晶振動子マイクロバランスを用い、保持ユニット１５の質量変化を検出し、その検出結果を表す信号を出力する。あるいは、検出ユニット１３は、電界効果トランジスタを備え、保持ユニット１５における電気的特性（例えば電位）の変化を検出し、その検出結果を表す信号を出力してもよい。
【００１８】
保持ユニット１５は、上述したミオグロビン検出用アプタマーを保持する。保持ユニット１５は、凹部１７内に収容されており、検出ユニット１３の上に載っている。
保持ユニット１５の具体的な構成を図３に基づき説明する。保持ユニット１５は、金から成る基板１９と、基板１９の表面１９Ａ上に保持されたミオグロビン検出用アプタマー２１とを備える。表面１９Ａは、図１、図２における上側の面である。ミオグロビン検出用アプタマー２１における一方の末端はチオール修飾されており、そのチオール修飾された末端が、表面１９Ａに配位結合している。
【００１９】
また、ミオグロビン検出用アプタマー２１を基板１９に保持する方法は他の方法であってもよい。例えば、ミオグロビン検出用アプタマー２１の末端をビオチンで修飾するとともに、表面１９Ａにストレプトアビジンを固定する。そして、ビオチンとストレプトアビジンとを結合させることで、ミオグロビン検出用アプタマー２１を基板１９に保持する。
【００２０】
また、ミオグロビン検出用アプタマー２１を基板１９に保持する方法は以下の方法であってもよい。表面１９Ａに所定のＤＮＡ配列を形成するとともに、それに相補的な配列をミオグロビン検出用アプタマー２１の末端に付ける。そして、基板１９側のＤＮＡと、ミオグロビン検出用アプタマー２１側の配列とを結合させることで、ミオグロビン検出用アプタマー２１を基板１９に保持する。
【００２１】
表面１９Ａは、ＳＡＭ（self assembled monolayer）材２３により被覆されている。ＳＡＭ材２３は、表面１９Ａにおける非特異的な反応を抑制する機能を有する。ＳＡＭ材２３としては、例えば、アルカンチオール（例えば、Sulfobetaine3-undecanethiol等）が挙げられる。なお、ＳＡＭ材２３による表面１９Ａの被覆はなくてもよい。
【００２２】
図１に戻り、洗浄用部材５は、箱型の筐体２５と、洗浄液吐出口２７と、を備える。筐体２５は、一方の側面２５Ａに凹部２８を備える。凹部２８は、図２に示すように、本体部３のうち、凹部１７が形成された側を挿入可能な大きさを有する。
【００２３】
洗浄液吐出口２７は、凹部２８の内面における一部を構成する天井面２９に設けられている。洗浄液吐出口２７は、図示しない洗浄液供給システムから洗浄液を供給され、吐出することができる。図２に示すように、本体部３を凹部２８の奥まで挿入したとき、洗浄液吐出口２７は、凹部１７、及び保持ユニット１５の上方に位置する。そのため、洗浄液吐出口２７から吐出された洗浄液は、凹部１７内に入り、保持ユニット１５上に落下する。洗浄液としては、例えば、ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）等を用いることができる。
【００２４】
ミオグロビン検出装置１を用い、以下の方法でミオグロビンを検出することができる。まず、図１に示すように、本体部３を洗浄用部材５から分離しておく。この状態で、ヒト
の血液、尿等の体液（試料の一例）を、凹部１７内に滴下する。すると、体液は保持ユニット１５と接触する。このとき、体液中にミオグロビンが存在すれば、保持ユニット１５に保持されたミオグロビン検出用アプタマー２１に結合する。
【００２５】
次に、図２に示すように、本体部３の一部を、洗浄用部材５の凹部２８に挿入し、洗浄液吐出口２７から洗浄液を吐出する。洗浄液により、保持ユニット１５上の体液は洗い流される。ただし、ミオグロビン検出用アプタマー２１に結合しているミオグロビンは残留する。洗浄後、洗浄液は適宜選択した方法で凹部１７内から除去する。
【００２６】
次に、検出ユニット１３が、保持ユニット１５に保持されたミオグロビン検出用アプタマー２１に結合したミオグロビンを検出する。検出ユニット１３が質量変化を検出するものである場合は、体液を滴下する前と比べたときの保持ユニット１５の質量変化を検出する。なお、質量の増加は、ミオグロビン検出用アプタマー２１に結合したミオグロビンが存在すること（すなわち、体液中にミオグロビンが存在すること）を意味する。
【００２７】
また、検出ユニット１３が電気的特性の変化を検出するものである場合は、体液を滴下する前と比べたときの保持ユニット１５の電気的特性の変化を検出する。なお、電気的特性の変化は、ミオグロビン検出用アプタマー２１に結合したミオグロビンが存在すること（すなわち、体液中にミオグロビンが存在すること）を意味する。
【００２８】
検出ユニット１３の検出結果（検出ユニット１３が出力する信号）は、変換ユニット１１で数値に変換され、変換後の数値が表示ユニット９に表示される。ユーザは表示ユニット９を見て、体液中にミオグロビンが存在するか否かを知ることができ、体液中にミオグロビンが存在する場合はその量を知ることができる。
【００２９】
本発明のミオグロビン検出方法は、ミオグロビン検出装置１を用いずに行ってもよい。例えば、保持ユニット１５は備えるが、表示ユニット９、変換ユニット１１、及び検出ユニット１３の一部又は全部を備えない装置（器具）を用いて、ミオグロビン検出方法を実施してもよい。
（実施例）
１．ＤＮＡの合成
周知の合成方法により、配列番号１により示される塩基配列から成るＤＮＡを合成した。以下では、このＤＮＡを、ＤＮＡ_１と表記する。ＤＮＡ_１の塩基数は５０である。
【００３０】
また、周知の合成方法により、配列番号２により示される塩基配列から成るＤＮＡを合成した。以下では、このＤＮＡを、ＤＮＡ_２と表記する。ＤＮＡ_２の塩基数は５０である。
【００３１】
２．ミオグロビン検出用アプタマーの製造
ＤＮＡ_１の５’末端にビオチンを結合させた。すなわち、ＤＮＡ_１の５’末端をビオチンで修飾した。修飾後のＤＮＡ_１を、以下では、ミオグロビン検出用アプタマー_１とする。
【００３２】
また、ＤＮＡ_２の５’末端にビオチンを結合させた。すなわち、ＤＮＡ_２の５’末端をビオチンで修飾した。修飾後のＤＮＡ_２を、以下では、ミオグロビン検出用アプタマー_２とする。
【００３３】
３．ミオグロビン検出用アプタマー_１を用いたミオグロビンの検出
上段の２ウェル（ｗｅｌｌ）及び下段の２ウェルにそれぞれ、ポリスチレンプレートを設置した。上段の２ウェルには、ミオグロビンをＰＢＳ（リン酸緩衝整理食塩水）で希釈
した液を５０μＬ滴下した。この液におけるミオグロビンの濃度は２０μｇ／ｍｌである。その結果、上段の２ウェル中のポリスチレンプレートに、ミオグロビンが吸着固定された。また、下段の２ウェルには、ＰＢＳのみを５０μＬ滴下した。
【００３４】
次に、４つのウェルにそれぞれ、ミオグロビン検出用アプタマー_１の溶液を５０μＬ滴下した。この溶液の溶媒は、５％ＢＳＡ  in ＴＢＳ−Ｔ(Wako #20718061)である。また、この溶液におけるミオグロビン検出用アプタマー_１の濃度は１００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【００３５】
２時間静置した後に各ウェルを洗浄した。洗浄方法は、ＴＢＳ−Ｔ  ２００μＬをウェルに加え２〜４回ピペッティングし、溶液を捨てるという工程を３回繰り返す方法である。
【００３６】
次に、各ウェルにアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンの溶液を５０μＬ滴下した。この溶液の溶媒は、５％ＢＳＡ  in ＴＢＳ−Ｔであり、溶液におけるアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンの濃度は２μｇ／ｍＬである。
【００３７】
次に、１時間静置してから、各ウェルを洗浄した。洗浄方法は、ＴＢＳ−Ｔ  ２００μＬをウェルに加え２〜４回ピペッティングし、溶液を捨てるという工程を４回繰り返す方法である。
【００３８】
次に、各ウェルにアルカリフォスファターゼ基質（ECF Substrate(GE healthcare #RPN5785)）を１０μＬ滴下した。
次に、バイオラド社製のケミドックＭＰを使用し、各ウェルにおいて蛍光を検出した。その結果、図４に示すように、上段の２ウェルでは蛍光を検出できた。この蛍光は、ミオグロビンと結合したミオグロビン検出用アプタマー_１（特にビオチンに結合したアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンとアルカリフォスファターゼ基質の反応）により生じるものである。
【００３９】
一方、下段の２ウェルでは蛍光を検出できなかった。このことから、ミオグロビン検出用アプタマー_１は、ミオグロビンに対する結合親和性を有し、ミオグロビンの検出に使用できることが確認できた。
【００４０】
４．ミオグロビン検出用アプタマー_２を用いたミオグロビンの検出
前記「３．ミオグロビン検出用アプタマー_１を用いたミオグロビンの検出」と基本的には同様の方法であるが、ミオグロビン検出用アプタマー_１の代わりに同量のミオグロビン検出用アプタマー_２を用いた。
【００４１】
その結果、図５に示すように、上段の２ウェルでは蛍光を検出できた。この蛍光は、ミオグロビンと結合したミオグロビン検出用アプタマー_２（特にビオチンに結合したアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンとアルカリフォスファターゼ基質の反応）により生じるものである。
【００４２】
一方、下段の２ウェルでは蛍光を検出できなかった。このことから、ミオグロビン検出用アプタマー_２は、ミオグロビンに対する結合親和性を有し、ミオグロビンの検出に使用できることが確認できた。
（参考例）
１．参考例のミオグロビン検出用アプタマーの製造
非特許文献１に記載されたアプタマーであるＭｙｏ４０−７−２７の５’末端にビオチンを結合させた。すなわち、Ｍｙｏ４０−７−２７の５’末端をビオチンで修飾した。修
飾後のＭｙｏ４０−７−２７を、以下では、ミオグロビン検出用アプタマー_ｒとする。
【００４３】
２．ミオグロビン検出用アプタマー_ｒを用いたミオグロビンの検出
基本的には前記実施例と同様の方法であるが、ミオグロビン検出用アプタマー_１又はミオグロビン検出用アプタマー_２の代わりに、同量のミオグロビン検出用アプタマー_ｒを用いる方法で、ミオグロビンの検出を行った。その結果を図６の右半分に示す。上段の２ウェル（ミオグロビンを吸着固定したウェル）においてわずかに蛍光を検出できたが、その強度は低かった。
【００４４】
一方、前記実施例と同様に、ミオグロビン検出用アプタマー_１を用いてミオグロビンの検出を行った結果を図６の左半分に示す。上段の２ウェル（ミオグロビンを吸着固定したウェル）において、強い蛍光を検出した。その蛍光の強度は、ミオグロビン検出用アプタマー_ｒを用いた場合に比べて顕著に高かった。
【００４５】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、種々の形態を採り得る。
（１）上記実施形態における１つの構成要素が有する機能を複数の構成要素として分散させたり、複数の構成要素が有する機能を１つの構成要素に統合させたりしてもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、同様の機能を有する公知の構成に置き換えてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言のみによって特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本発明の実施形態である。
【００４６】
（２）上述したミオグロビン検出装置の他、当該ミオグロビン検出装置を構成要素とするシステム、当該ミオグロビン検出装置の制御ユニットとしてコンピュータを機能させるためのプログラム、このプログラムを記録した媒体等、種々の形態で本発明を実現することもできる。
【符号の説明】
【００４７】
１…ミオグロビン検出装置、３…本体部、５…洗浄用部材、７…筐体、７Ａ…上面、９…表示ユニット、１１…変換ユニット、１３…検出ユニット、１５…保持ユニット、１７…凹部、１９…基板、１９Ａ…表面、２１…ミオグロビン検出用アプタマー、２３…ＳＡＭ材、２５…筐体、２５Ａ…側面、２７…洗浄液吐出口、２８…凹部、２９…天井面
【図１】
0006451408.tif 000002
【図２】
0006451408.tif 000003
【図３】
0006451408.tif 000004
【図４】
0006451408.tif 000005
【図５】
0006451408.tif 000006
【図６】
0006451408.tif 000007
【配列表】
0006451408000001.app