(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
桑椹子（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）（ｉ）およびブクリョウ皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）（ｉｉ）を桑椹子４ないし７に対してブクリョウ皮１の重量比で含む混合物の抽出物を含有する、退行性神経疾患の予防もしくは治療用の薬学的組成物であって、前記退行性神経疾患は、アルツハイマー型認知症、クロイツフェルトヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症および進行性失調症から選ばれることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２】
桑椹子（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）（ｉ）およびブクリョウ皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）（ｉｉ）を桑椹子４ないし７に対してブクリョウ皮１の重量比で含む混合物の抽出物を含有する、退行性神経疾患の予防もしくは治療用の食品組成物であって、前記退行性神経疾患は、アルツハイマー型認知症、クロイツフェルトヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症および進行性失調症から選ばれることを特徴とする、食品組成物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、空間記憶改善効果（ｉ）、認知記憶改善効果（ｉｉ）、神経核（ＮｅｕＮ）発現増進効果（ｉｉｉ）、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ−Ｂ（ＦＪＢ）発現抑制効果（ｉｖ）、ベータアミロイド生成抑制効果（ｖ）、神経成長因子（ＮＧＦ）生成増進効果（ｖｉ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性抑制効果（ｖｉｉ）、細胞毒性に対する阻害効果（ｖｉｉｉ）、タウリン酸化阻害効果（ｉｘ）もしくはこれらのいずれかを組合せた効果を有することを特徴とする薬学的組成物または食品組成物。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、前記混合物の桑椹子とブクリョウ皮の重量比が、５：１であることを特徴とする薬学的組成物または食品組成物。
【請求項５】
請求項２ないし請求項４のいずれか一項に記載の食品組成物であって、健康機能食品または健康機能飲料である食品組成物。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、前記抽出物が組成物に占める重量パーセントが１０％ないし９０％であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、１００ｍｇの前記抽出物（ａ）、３．０ｍｇのソジウムメタバイサルファイト（ｂ）、０．８ｍｇのメチルパラベン（ｃ）および０．１ｍｇのプロピルパラベン（ｄ）を含有し、注射剤であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、２００ｍｇの前記抽出物（ａ）、１００ｍｇの乳糖（ｂ）、１００ｍｇのデンプン（ｃ）および許容可能な量のステアリン酸マグネシウム（ｄ）を含有し、錠剤であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、１００ｍｇの前記抽出物（ａ）、５０ｍｇの乳糖（ｂ）、１００ｍｇのデンプン（ｃ）、２ｍｇのタルク（ｄ）および許容可能な量のステアリン酸マグネシウム（ｅ）を含有し、カプセル剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、１０００ｍｇの前記抽出物（ａ）、２０ｇの砂糖（ｂ）、２０ｇの異性化糖（ｃ）および許容可能な量のレモン香り（ｄ）を含有し、液剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物を生産する方法であって、前記の抽出物が、水、炭素数１ないし４の低級アルコールもしくはこれらの混合物により抽出されることを特徴とする、薬学的組成物または食品組成物の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記の桑椹子とブクリョウ皮の混合物からの抽出物が６０ないし８０（ｖ／ｖ）％エタノールで抽出されることを特徴とする、薬学的組成物または食品組成物の生産方法。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の方法であって、前記の桑椹子とブクリョウ皮の混合物からの抽出物が７０（ｖ／ｖ）％エタノールで抽出されることを特徴とする、薬学的組成物または食品組成物の生産方法。
【請求項１４】
前記退行性神経疾患はアルツハイマー型認知症であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０及び１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、経口、直腸もしくは静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜もしくは脳血管内注射によって投与され得ることを特徴とする薬学的組成物または食品組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０及び１４〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物または食品組成物であって、投与量が１．０ｍｇ／ｋｇないし３０ｍｇ／ｋｇで投与され得ることを特徴とする薬学的組成物または食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桑椹子（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）とブクリョウ（茯苓）皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）の生薬混合抽出物を含有する退行性神経疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性神経疾患は、神経細胞（ニューロン）の漸進的な構造的、機能的な損失が原因となり発生する精神機能が退化する疾患である。退行性神経疾患は、神経系の特定部位の神経細胞退化が進行されて認知症、錐体外路異常、小脳異常、感覚障害、運動障害などの症状を伴うと同時に多様な部位に異常が現われ、症状が複合的に現れることもある。患者に見られる臨床様相により疾患を診断するが、症状が多様に現れ、また互いに異なる疾患が共通的な臨床症状がみられる場合が多いため、診断に困難がある（Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．４０．Ｎｏ．６，ｐｐ．８４７−８５８，１９９５）。
【０００３】
退行性神経疾患は、疾患の兆候が徐々に現れ、老化と共に発病する場合が多い。一旦発病すると死亡まで数年あるいは数十年にかけて持続的に病気が進行され、根本的な治療が難しいため社会的負担が非常に大きい。発病原因として、家族歴による遺伝的影響が非常に高いことが知られているが、後天的な要因も重要な要因として作用すると判断される。退行性神経疾患は、その臨床症状により大きく進行性認知症（アルツハイマー病など）、および神経学的異常（ピック病など）、姿勢および運動異常（パーキンソン病など）、進行性失調症、筋萎縮および萎弱、感覚および運動障害などに区分される（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．４，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍａｊｏｒ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。
【０００４】
代表的な退行性脳疾患であるアルツハイマー型認知症の直接的な発病原因としてＡβｐｌａｑｕｅとタウ（Ｔａｕ）過リン酸化ｔａｎｇｌｅの細胞毒性が注目されている。
【０００５】
Ａβは、前駆体のＡＰＰから生成され、β−セクレターゼ（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）、γ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）等酵素の作用により作られて神経細胞の外側に分布する。Ａβ濃度が低い時は溶解された状態で存在するが、一定水準以上になると、Ａβタンパク質同士が結合して不溶性である老人斑（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）を形成する。この物質は炎症および神経毒性を誘発して周囲の神経細胞を破壊し得る。例えば、アルツハイマー型認知症疾患の患者から観察される神経細胞の死滅と微細神経膠症が老人班と関連していると判断される。試験管内の実験結果において、Ａβは微細膠細胞（脳大食細胞）の活性化を誘発し得ることが明らかになった。これはアルツハイマー疾患がある患者の脳で発見される微細神経膠症および脳炎症がＡβによるアルツハイマー型認知症であらわれる病症の主要原因であるという仮説を裏付ける。一度Ａβが作られて老人斑が形成されると、これを顕著に溶解させたり、または沈着物の形成を防止できると期待されるものとして幅広く容認される療法または治療剤は現在までない。
【０００６】
タウは、Ｎ−末端突出部分、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）凝集ドメイン、微小管結合ドメインおよびＣ−末端の４部分で構成されており（Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１０３，２６−３５，１９９６）、神経細胞の物理的構造を形成する微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）を連結する役割を果たす。中枢神経系の神経細胞の中でタウが非正常的に過リン酸化されたり変形される場合、タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）のような退行性脳疾患を誘発すると知られている。アルツハイマー型認知症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、１７番染色体に関連するパーキンソン病随伴前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤＰ−１７）等が代表的なタウオパチーに属する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４，１１２１−１１５９，２００１；Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６，７２６−７３４，１９９７；Ｂｕｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５８，６６７−６７７，１９９９；Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４３，１９３−２０４，１９９８；Ｉｔｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｔｚ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，６５−７２，２０１１）。
【０００７】
神経栄養因子（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）が退行性神経疾患の治療の可能性を有しているということは、１９８０年代のアルツハイマー実験で提起された（Ｎａｔｕｒｅ．１９８７Ｓｅｐ３−９；３２９（６１３４）：６５−８．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．）。アルツハイマーの病因のうちの一つとして知られている老化により失われた基底前脳のコリン性ニューロンが神経栄養因子（ＮＧＦ）の側脳室投与によって復旧され、これによる実験動物の記憶能力の向上が報告され、神経栄養因子を用いて退行性神経疾患を治療しようとする研究が引き続き行われていた。後続研究として顔面神経と座骨神経の結節により運動神経の機能を損傷させた後、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙであるＢｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ），Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３（ＮＴ−３），Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４（ＮＴ−４），Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）等で損傷された運動神経の機能を復旧させた研究が進行されて肯定的な結果が得られた（Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｄｅｃ２４−３１；３６０（６４０６）：７５７−９．Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｒａｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ．）。また、老化により漸進的に運動ニューロンの数と機能が喪失する病気を有する遺伝子再組み合わせマウス（ｗｏｂｂｌｅｒ）を用いた実験ではＢＤＮＦとＣＮＴＦを投与して運動ニューロンの数を増加させ、その機能を向上させた（Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４Ａｕｇ１９；２６５（５１７５）：１１０７−１０．Ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｂｂｌｅｒ  ｍｉｃｅ  ｃｏｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＮＴＦ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ）。前記言及した研究結果の他にも神経栄養因子などが多様な感覚、運動神経病態モデルでニューロンの数と機能を増加させて、実験動物の記憶、認知、行動などの障害を改善させることが多数の研究より報告されている。
【０００８】
桑椹子の学名はＭｏｒｕｓ  ａｌｂａであり、落葉喬木の桑の木の実が紫紅色をあらわす時に取り乾燥した後、漢方材に用いられ、漢方ではめまいと耳鳴り、口渇、消渇などの治療に用いられるものとして知られており、日本では養血去風の効能と風熱を治め、強壮、陣痛薬、不眠症、耳鳴り、めまい、腰痛、便秘などの治療に応用すると知られている（Ｎａｍｂａ，Ｔ．，Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｗａｋａｎ−Ｙａｋｕ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｒ  Ｐｉｃｔｕｒｅｓ  Ｖｏｌ．１  Ｈｏｉｋｕｓｈａ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，１９９３）。東医宝鑑には消渇を治めて五臓を補うため、桑の木の精が集まっていると記されている（東医宝鑑国訳委員会、東医宝鑑、南山堂、ソウル、韓国、２０００）。また、中国薬典（ＣＰ）にはめまい、耳鳴り、不眠症、喉の渇きなどに処方する薬材として収載されている。
【０００９】
桑椹子の主要成分として、アントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）、フェノール酸（ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）等を有しており、抽出物と分離された単一成分で血糖降下、ＭＡＯ（ｍｏｎｏ  ａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）阻害活性、抗酸化効果、神経細胞保護に対する研究結果が報告されている。
【００１０】
ブクリョウの学名は、Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓであり、分類学的に真正担子菌綱、同担子菌亜綱（帽菌亜綱）、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科に属する。主に松で死物寄生するが、生きている松の根元と連結されて活物寄生もする茶色腐朽菌として担子菌類に属する菌類の一種である。菌糸は白色で分枝しながら継続して生長し、菌糸同士が互いに固まり始め、温度湿度など適する環境条件が持続されると、耐久体である固い塊り形態の菌核が形成される。これをブクリョウといい、内部の色によって白色であれば白ブクリョウ、淡紅色であれば赤ブクリョウといい、外皮をブクリョウ皮という。
【００１１】
ブクリョウの主要成分として、ブクリョウ酸（Ｐａｒｃｈｙｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｃ３３Ｈ５２Ｏ５）、松苓酸（Ｐｉｎｉｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，Ｃ３０Ｈ１８Ｏ３）、松苓新酸（３β−Ｈｙｄｅｒｏｘｙ−ｌａｎｏｓｔａ−７．９（１１），２４−Ｔｒｉｅｎ−２１−ｏｉｃ  ａｃｉｄとＴｕｍｕｌｏｓｉｃ  ａｃｉｄ（Ｃ３１Ｈ５０Ｏ）、Ｅｂｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄ（Ｃ３１Ｈ５０Ｏ３）等を含有している。その他にもパキマン酸、エブリコ酸、ポリポレン酸Ａ、Ｃ、トリテルペノイドなどが入っており、エルゴステロール、レシチン、アデニン、コリン、葡萄糖、果糖およびタンパク質と多量の無機物質が入っている。
【００１２】
ブクリョウは、味が甘く、性質は暖かく、その味と性質がいずれも軽いため、陽性に属する薬材として伝えられている。過去の文献では、喉の渇きを抑え、小便を円滑にし、かつ湿気を除去し、体調を適切に調整し、消化器機能を調和させて気を整え、腰を柔らかくすることによって腹部の淤血を溶かし、記憶力に関する処方に主に用いられており、最近の論文では抗糖尿効果、抗癌効果などが報告されている（Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，  Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，  ２０１０）。
【００１３】
ブクリョウ皮は、サルノコシカケ科のブクリョウ菌核の外側皮であり、水を排出させて浮腫を治める効能がある薬材として知られている。特にラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）系トリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）であるｐｏｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄが豊富であり、東医宝鑑ではむくみに処方される五皮散（橘皮、大腹皮、ブクリョウ皮、生薑皮、桑白皮）に用いられる生薬として最近、論文で利尿、排尿促進、むくみ減少などの効果が報告されている（Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，Ｔａｋａａｋｉ  ｔａｉ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，３９，５，１９９５；Ｕｒｉｎａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  ｙｉｎｇ  ｙｏｎｇ  ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４８，２，２０１３）。
【００１４】
このような背景下で、効果的な退行性神経疾患の予防、改善および治療に対する医薬および食品組成物に関する素材について研究を行った結果、本発明者は、桑椹子とブクリョウ皮の神経系活性研究中にこれら生薬抽出物が多様な脳神経傷害または記憶力形成抑制薬品によって誘発される脳神経疾患モデルで有意的な記憶力の回復作用をあらわすことを確認した。また、これら生薬抽出物が脳内で神経細胞の死滅を起こす物質の生成を抑制し、神経細胞の再生および分化を促進するタンパク質の発現を促進して神経細胞を保護することを証明して確認し、このような効果は、桑椹子とブクリョウ皮の生薬を一定比率で配合した場合、単一生薬に比べて極大化されることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、桑椹子、ブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物並びに退行性神経疾患の予防および改善用健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記した目的を達成するための一つの様態として、本発明は、桑椹子（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）とブクリョウ皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）の混合抽出物を含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物並びに退行性神経疾患の予防および改善用健康機能食品を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物は、神経細胞の死滅を誘発して退行性脳疾患の原因になるベータアミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ−β；Ａｂｅｔａ）の生成およびタウのリン酸化を抑制し、神経細胞の生存および分化促進因子であるＮＧＦ生成を促進して神経細胞を保護する効果を奏し、また、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を抑制して神経伝導を増加させて記憶力の向上作用を媒介する効果を奏するので、前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物は、認知症をはじめとする退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物または退行性神経疾患の予防および改善用健康食品の開発に効果的に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ベータアミロイドで神経毒性を誘導したモデルで生薬混合抽出物および単一抽出物、対照薬物を投与して神経細胞マーカーであるＮｅｕＮで染めた結果である。
【図２】ベータアミロイドで神経毒性を誘導したモデルで生薬混合抽出物および単一抽出物、対照薬物を投与して細胞死滅マーカーであるＦＪＢに染めた結果である。
【００１９】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、桑椹子（ｍｕｌｂｅｒｒｙ）およびブクリョウ皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【００２０】
本発明による混合抽出物は、通常の生薬抽出物の製造方法により提供され得るが、具体的には、粗抽出物として水、アルコール、または水とアルコールの混合した溶媒を用いた抽出物を意味する。前記抽出溶媒のうちの一つであるアルコールは、これに限定されないが炭素数１ないし４の低級アルコール、好ましくはメタノール、エタノール、ブタノールまたは酒精であり得、さらに好ましくはエタノールであり得る。ここで「酒精」とは、デンプン質原料または糖質原料を発効させた後、蒸留して作ったエタノールを意味する。また、前記水とアルコールの混合溶媒は、特に限定されず、任意の適量比率で混合して用いられ得る。
【００２１】
本発明の一具体例において、桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物は、６０ないし８０％（ｖ／ｖ）エタノール、６５ないし７５（ｖ／ｖ）％エタノールまたは７０（ｖ／ｖ）％エタノールで抽出されたものであり得るが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の他の具体例において、前記桑椹子とブクリョウ皮の重量比が、４ないし７：１、４ないし６：１または５：１であり得るが、これに限定されない。
【００２３】
本発明の混合抽出物は、桑椹子とブクリョウ皮の生薬自体を混合してこの生薬混合物を抽出した抽出物と桑椹子とブクリョウ皮をそれぞれ別途に抽出してそれぞれの生薬抽出物を製造した後、これを混合した抽出物の形態を全て含むものであり、具体的には、桑椹子とブクリョウ皮を前記重量比で混合した後、抽出して収得するか、或いは桑椹子およびブクリョウ皮をそれぞれ適切な方法によって抽出した後、それぞれの抽出物を前記重量比で混合して収得することができる。
【００２４】
より具体的には、本発明の混合抽出物は、下記のとおり収得することができる。まず、本発明の桑椹子とブクリョウ皮をそれぞれ洗浄および乾燥した後、乾燥生薬を切断して切断生薬を得て、前記乾燥切断生薬を桑椹子と０．１ないし１０倍重量のブクリョウ皮と混合し、好ましくは桑椹子：ブクリョウ皮＝４ないし７：１重量比で混合した生薬混合物に生薬混合物重量の１〜２０倍（ｖ／ｗ）、好ましくは５倍ないし１０倍（ｖ／ｗ）体積の水、炭素数１ないし４の低級アルコール、または水と炭素数１ないし４の低級アルコールの混合物、好ましくは７０（ｖ／ｖ）％エタノールを入れて、１０℃ないし１００℃、好ましくは常温の抽出温度で１時間ないし７２時間、好ましくは約４８時間の間冷浸抽出、熱水抽出、超音波抽出、還流冷却抽出、加熱抽出、超臨界抽出、好ましくは冷浸抽出で１回抽出して減圧濃縮して桑椹子とブクリョウ皮の生薬混合抽出物を収得することができる。
【００２５】
本発明による桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する組成物は、退行性神経疾患の治療に用いられ得る。したがって、本発明は、桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物、退行性神経疾患治療剤の製造のための桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物の用途、そして治療上有効量の桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を対象体に投与する段階を含む退行性神経疾患の治療方法を提供する。
【００２６】
前述したとおり、前記本発明による退行性神経疾患は、神経細胞（ニューロン）の漸進的な構造的、機能的な損失によって発生する精神的機能の退化疾患を意味し、具体的には、アルツハイマー、クロイツフェルトヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症および進行性失調症から選ばれた疾患などを含む。
【００２７】
本発明の一具体例において、前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物は、全体薬学組成物１００重量部に対して桑椹子およびブクリョウ皮抽出物を０．０１ないし９０重量部、０．１ないし９０重量部、１ないし９０重量部、または１０ないし９０重量部で含み得るが、これに限定されるものではなく、患者の状態および疾患の種類および進行程度に応じて変わり得る。
【００２８】
本発明の他の具体例において、前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含んで退行性神経疾患の予防および治療用医薬製剤に製剤化することができる。
【００２９】
前記担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。
【００３０】
また、本発明による組成物は、医薬の形態で製造されるため、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エーロゾルなどの経口型剤型、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の剤型で製剤化され得るが、一般に、製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製されることができる。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記薬学的組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調製されることができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられ得る。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、貯蔵剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が含まれ得る。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。坐剤の基材としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられ得る。
【００３１】
本発明は、また、前記桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する薬学的組成物を、治療学的に有効な量で人体を含む哺乳動物に投与することを特徴とする退行性神経疾患の治療方法を提供する。
【００３２】
本発明の桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重に応じて変わり得るが、一般に０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは１ないし３０ｍｇ／ｋｇの量を一日１回ないし数回に分けて投与し得る。また、その投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率などに応じても増減し得る。したがって、前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
本発明の桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を含有する薬学的組成物は、ネズミ、ハツカネズミ、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与され得る。投与のすべての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与され得る。
【００３４】
本発明の桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物は、毒性および副作用はほぼないので、予防を目的として長期間服用時にも安心して用いられ得る薬材である。
【００３５】
また、本発明は、前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を含む食品組成物を提供する。前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物は、脳内で神経細胞の死滅を起こす物質の生成を抑制して神経細胞の再生および分化を促進するタンパク質の発現を促進して神経細胞を保護する効果があるため、特に神経退行性疾患の予防および改善効果を奏する健康機能食品および一般食品の製造に有用に用いられ得る。
【００３６】
本発明において定義される健康機能食品は、具体的には、韓国における「２００２年健康機能食品に関する法律」により新たに定義された「人体に対する機能性および安全性が十分に確立されて食品医薬品安全庁食品医薬品安全庁告示第２００４−１２号に規定した健康機能食品原料または成分認定に関する規定目録集に収載された健康食品」である。
【００３７】
本発明による桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を含む食品組成物は、退行性神経疾患の症状緩和のための食品に多様に用いられることができる。本発明の生薬抽出物を添加できる食品としては、各種食品類、例えば、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能食品および健康機能飲料類などがあり、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは飲料の形態で用いられ得る。
【００３８】
この時、本発明の食品中の前記桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物の量は、一般に本発明が健康機能食品組成物である場合、全体食品重量の０．１ないし１５重量％、好ましくは０．２ないし１０重量％に含まれ得、健康機能飲料組成物の場合、１００ｍｌを基準に０．１ないし３０ｇ、好ましくは０．２ないし５ｇの比率で含まれ得る。
【００３９】
本発明による食品組成物が飲料形態で製造される場合、指示された比率で必須成分として前記生薬抽出物を含有する以外は、液体成分には特に制限はなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有し得る。
【００４０】
前述した天然炭水化物の例としては、モノサッカライド；葡萄糖、果糖などジサッカライド；マルトース、スクロースなどポリサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖またはキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。詳述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウディオサイドＡ、グリチルリチン））および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に用いることができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の全体組成物１００ｍｌ当たり一般に約１ないし２０ｇ、好ましくは約５ないし１２ｇである。
【００４１】
前記以外に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および重鎮剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有し得る。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有し得る。このような成分は独立的にまたは組み合わせて用い得る。このような添加剤の比率は、特に制限されないが、本発明の全体食品組成物１００重量部当たり、０ないし約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００４２】
また他の一つの様態として、本発明は、桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を有効成分として含有する組成物を投与する段階を含む退行性神経疾患の予防、改善または治療方法または退行性神経疾患の予防、改善または治療のための桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物の用途に関する。このような方法または用途のための桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を含有する組成物の投与量、投与形態、投与方法などは前記で言及したとおりである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明を実施例および実験例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例および実験例は、本発明を例示することだけであり、本発明の内容が下記の実施例および実験例に限定されない。
【００４４】
＜実施例１＞本発明によるブクリョウ皮抽出物の製造
韓国のソウル所在の京東市場の韓薬材商で乾燥桑椹子（Ｍｕｌｂｅｒｒｙ）とブクリョウ皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）を購入して挟雑物を除去してうまく乾燥された状態の生薬を実験に用いた。切断機で粉砕した状態の桑椹子とブクリョウ皮を５：１重量比で３００ｇ混合した後、生薬混合物に３Ｌの７０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を加えて常温で４８時間の間冷浸した後、ろ過してこれを減圧濃縮した後、凍結乾燥させて混合生薬抽出物（粗抽出物）を収得して実施例１とした（表１参照）。
【表１】
0006546281.tif 000002
【００４５】
＜比較例１＞桑椹子抽出物の製造
前記実施例１と同じ生薬材桑椹子２００ｇを実施例１と同様な方法で製造して桑椹子粗抽出物を収得して比較例１とした（表２参照）。
【００４６】
＜比較例２＞ブクリョウ皮抽出物の製造
前記実施例１と同じ生薬材ブクリョウ皮２００ｇを実施例１と同様な方法で製造してブクリョウ皮粗抽出物を収得して比較例２とした（表２参照）。
【表２】
0006546281.tif 000003
【００４７】
＜比較例３ないし８＞桑椹子およびブクリョウ皮混合生薬粗抽出物の製造
前記実施例１に用いられた桑椹子およびブクリョウ皮と同じ生薬を実験に用いた。切断機で粉砕した状態の桑椹子とブクリョウ皮をそれぞれ下記表３に記載されたとおり混合した後、生薬混合物に１０倍数の体積を有する７０％エタノール水溶液を加えて常温で４８時間冷浸抽出した後、ろ過してこれを減圧濃縮した後、凍結乾燥させ混合生薬抽出物（粗抽出物）を収得して比較例３ないし８とした。
【表３】
0006546281.tif 000004
【００４８】
＜実験例１＞生薬混合抽出物の記憶力向上および神経細胞保護効果の確認
＜１−１＞実験動物の準備
スコポラミン誘導記憶力抑制（Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）モデル
【００４９】
６週齢ＩＣＲ  ｍｏｕｓｅを実験に用い、各実験群は８匹の動物で構成した。実施薬品（実施例）、比較薬品（比較例）および対照薬物であるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）を経口投与し、３０分後に１ｍｇ／ｋｇスコポラミンを腹腔投与した。正常（Ｎｏｒｍａｌ）動物には同量の生理食塩水を注射した。
【００５０】
スコポラミン投薬３０分後に行動実験を行った。
【００５１】
Ａβｉｎｆｕｓｉｏｎモデル
実験に６週齢ＩＣＲ  ｍｉｃｅを用いた。実験動物を麻酔させｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に固定させた後、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｍｉｃｒｏ  ｓｙｒｉｎｇｅ（ｆｉｔｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ２６−ｇａｕｇｅ  ｎｅｅｄｌｅ）を用いて３μｌのｖｅｈｉｃｌｅ（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＣＳＦ）またはＡβ４２を６分間の注入した。
【００５２】
Ａβ４２を投与した動物を無作為に分けて実験群を構成した。Ａβ４２投与２日後から実験薬品および陽性対照薬物を１１日間１日１回投薬した。
【００５３】
凍結乾燥した実施薬品、比較薬品および対照薬物を３％ＨＰＭＣ水溶液に懸濁して使用し、薬品は全て実験当日に調剤して用いた。
【００５４】
Ｂｒａｉｎ内タンパク質の測定
神経細胞の死滅誘発物質または細胞保護に関与する物質生成に対する混合生薬抽出物の効能を調べるために６週齢ＩＣＲ  ｍｏｕｓｅに実施薬品、比較薬品および対照薬物を５日間投与した。５日目投薬４時間後に、実験動物を犠牲にさせて動物の脳を取り、小脳と延髄を除いた部分を実験に用いた。
【００５５】
＜１−２＞手動回避実験（Ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔａｓｋ）
手動回避実験は、二つの独立的に分離された明るくて暗い正四角形箱で行った。明るい区域（２０×２０×２０ｃｍ）は５０Ｗ白熱電球で照明した。明るい区域および暗い区域（２０×２０×２０ｃｍ）は１ｃｍ間隔で離隔して２ｍｍステンレススチール棒（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｒｏｄｓ）を設置した。
【００５６】
Ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ段階では二つの区域をギロチンドア（ｇｕｉｌｌｏｔｉｎｅ  ｄｏｏｒ）（５×５ｃｍ）で分離して実験動物を明るい区域に入れた後、３０秒後にギロチンドアを開けた。実験動物が自由に探索するようにし、暗い区域に移動すると、ギロチンドアを閉めて３秒後に実験動物を取り出した。
【００５７】
２４時間後、アクイジショントライアル（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ）を行った。薬品投与３０分後に１ｍｇ／ｋｇスコポラミンを腹腔投薬して再び３０分後に行動実験を行った。実験ネズミを最初に明るい区域に置いて区域の間にあるドアを３０秒後に開けた。実験ネズミが暗い区域に入るとギロチンドアを閉めて、ステンレススチール棒を介して直ちに電気衝撃（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｏｏｔ  ｓｈｏｃｋ）を０．５ｍＡ強度で２秒間加え、１０秒後に実験動物を取り出した。実験動物が暗い区域に入った時間を測定した。
【００５８】
アクイジショントライアルを行い２４時間休み時間を与えた後、リテンショントライアル（Ｒｅｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｉａｌ）測定のために実験動物を明るい区域に置き、暗い区域に入る時までの時間を測定した。アクイジショントライアルおよびリテンショントライアルのいずれも実験ネズミが明るい部屋から暗い部屋に四足がすべて入った時まで掛かった時間を測定した。
【００５９】
その結果、下記表４、５に示したとおり、それぞれスコポラミンによる記憶力減退モデルとＡβ４２投与によるアルツハイマー型認知症誘発モデルでの記憶力改善効能を確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物の比較例３ないし８に比べて本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物では顕著な空間記憶力の増進効果が奏されることを確認した。実施例１の混合抽出物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として知られたドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）１ｍｇ／ｋｇと同等ないしはそれ以上の効能を奏した。
【表４】
0006546281.tif 000005
【表５】
0006546281.tif 000006
【００６０】
＜１−３＞Ｙ−ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ
短期空間記憶力に対する影響を調べるためにＹ−ｍａｚｅ実験を行った。実験動物をＹ−ｍａｚｅの一側ａｒｍに置いて自由に歩き回れるように８分間放置し、自発的交替（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）と総進入回数を測定した。連続して３個のａｒｍに進入した時を交替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）進入と定義し、その比率を次の数式１で計算した。
【数１】
0006546281.tif 000007
【００６１】
その結果、下記表６、７に示したとおり、それぞれスコポラミンによる記憶力減退モデルとＡβ４２投与によるアルツハイマー型認知症誘発モデルでの記憶力改善効能を確認した。特に、桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて本発明による実施例１の桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物では顕著な認知記憶力増進効果が奏されることを確認した。特に実施例１混合抽出物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として知られたドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）１ｍｇ／ｋｇより優れた効能を奏することが分かった。
【表６】
0006546281.tif 000008
【表７】
0006546281.tif 000009
【００６２】
＜１−４＞Ｎｏｖｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＮＯＲ）ｔａｓｋ
横４５ｃｍ、縦４５ｃｍ、高さ５０ｃｍの黒い色箱に大きさは同じであるが、模様が違う２個のプラスチックで作った物体を箱の中に入れた。実験動物が８分間自由に歩き回るように放置して各物体で消費する時間を測定した（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎ）。２４時間後、ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎで経験した物体１個と新たな物体１個がある箱中に実験動物を入れて各物体で消費する時間を測定した（ｔｅｓｔ  ｓｅｓｓｉｏｎ）。記録した数値を次の数式２を用いて計算した結果を新たな物体の認識試験結果に示した。
【数２】
0006546281.tif 000010
【００６３】
その結果、下記表８、９に示したとおり、それぞれスコポラミンによる記憶力減退モデルとＡβ４２投与によるアルツハイマー型認知症誘発モデルでの記憶力改善効能を確認した。桑椹子とブクリョウ皮の単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物では顕著な認知記憶力増進効果が奏されることを確認した。実施例１混合抽出物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として知られたドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）１ｍｇ／ｋｇと比較した時、スコポラミン誘導記憶力形成抑制モデルでは同等水準の認知記憶力向上効能を、Ａβ４２投与モデルでは同等以上の認知記憶力向上効能を示した。
【表８】
0006546281.tif 000011
【表９】
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【００６４】
＜１−５＞免疫組織化学染色
免疫組織化学染色のために前記実験例＜１−１＞で記述したＡβｉｎｆｕｓｉｏｎ実験動物を１Ｘ  ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）で心臓灌流させて４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた後、脳を摘出した。同じ溶液に一日を固定させて３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に入れて４℃で凍結切片する前まで二日に一回ずつ溶液を取り替えながら保管した。その後、クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）で脳組織を−２０℃でＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物を点じ、十分に凍らせた後、３０μｍ厚さの切片を作って貯蔵額に入れて４℃で保管した。免疫組織染色は、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）部分を有して行い、ＰＢＳで洗浄した組織を１％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理後、非特異な反応を防止するために０．０５Ｍ  ＰＢＳ、１．５％正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）、０．５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）、０．３％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００と一次抗体（ｇｏａｔ  ＮｅｕＮ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，１：５００）を２４時間４℃で反応させた。一次抗体を除去した後、組織をペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が連結された二次抗体（１：２００）に９０分間の反応させた後、ＡＢＣを緩衝液に希釈して常温で約１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０２％ＤＡＢと０．０１％Ｈ２Ｏ２で発色させたものをエタノールとキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）の脱水過程を経てスライドサンプルを作った。
【００６５】
ＦＪＢ（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ−Ｂ）染色のために組織切片を４％パラホルムアルデヒドが含まれているＰＢＳで５分間固定し、−７０℃に貯蔵した。翌日３時間乾燥させたスライドを１０分間０．０６％過マンガン酸カリウム溶液に漬けた。水で洗浄した後に、スライドを０．１％酢酸と０．０００４％ＦＪＢ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に２０分間の浸漬した。スライドを蒸溜水で３回洗浄し、５５℃で１０分間乾燥した。映像化のために多焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を用い、写真はソフトイメージングシステムビデオカメラで撮影した。
【００６６】
その結果、図１に示したとおり、生薬混合抽出物投与によって神経細胞のマーカーであるＮｅｕＮ発現が対照群より高く観察されたが、これは生薬混合抽出物投与群で神経細胞減少が抑制されたことを意味する。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物は、神経細胞保護効果があったが、生薬混合抽出物に比べて効能の程度が微弱であった。対照薬物であるドネペジルは神経細胞保護効果を奏しなかった。
【００６７】
また、図２に示したとおり、生薬混合抽出物によって細胞死滅のマーカーであるＦＪＢの発現が対照群に比べて減少することを確認したが、この結果は、図１で確認された神経細胞数の増加がベータアミロイドによって誘導される神経細胞の死滅抑制作用により媒介されたことを意味する。
【００６８】
＜１−６＞ｂｒａｉｎ耐ベータアミロイド生成測定
アルツハイマー発病の主要原因として知られたベータアミロイド生成に対する生薬混合抽出物の抑制効能を確認するためにＥＬＩＳＡ実験を行った。
【００６９】
実験例＜１−１＞の正常動物の脳を摘出した後、海馬領域を分離してＲｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを加えてこれを機械的に均質に粉砕した。遠心分離により上澄液を取得した後、これをベータアミロイド分析ｋｉｔ（ＩＢＬ）を用いて脳に分布するベータアミロイド濃度を測定した。１ｍｇタンパク質の中のＡβ４０発現量を測定した。
【００７０】
その結果、下記表１０に示したとおり生薬混合抽出物投与によってベータアミロイド生成が顕著に減少することを確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて本発明による実施例１の桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物は、より高いベータアミロイド生成抑制効能を奏した。単一生薬抽出物もベータアミロイド減少効能を奏したが、これらの中、桑椹子抽出物のベータアミロイド生成抑制効能が相対的に高いことが明らかであった。生薬混合抽出物においても桑椹子の重量比が高い時、ベータアミロイド減少効果が大きい傾向性があらわれた。
【００７１】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）は、１ｍｇ／ｋｇ容量でベータアミロイド生成に影響を与えることができなかった。
【表１０】
0006546281.tif 000013
【００７２】
＜１−７＞ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；神経栄養因子）レベル測定
神経細胞再生および分化作用があると知られたＮＧＦ生成に対する混合抽出物の効能を確認するためにＥＬＩＳＡ実験を行った。前記実験例＜１−１＞の正常動物の脳を摘出した後、海馬領域を分離してＲｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを加えてこれを機械的に均質に粉砕した。ＮＧＦ測定のために各脳の重量に対応するｈｉｇｈ  ｓａｌｔ  ｈｉｇｈ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒを加えてこれを機械的に均質に粉砕した。４Ｎ  ＨＣｌを１０μｌ加え、１５分間放置して受容体と結合したＮＧＦを解離させて４Ｎ  ＮａＯＨを加えて再び１５分間放置した。遠心分離により上澄液を取得した後、これをＮＧＦ測定ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脳に分布するＮＧＦ濃度を測定した。１ｍｇタンパク質中のＮＧＦ生成量を表に示した。
【００７３】
その結果、下記表１１に示したとおり、生薬混合抽出物投与によってＮＧＦ生成が顕著に増加することを確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物は、より高いＮＧＦ生成促進効能を奏した。単一生薬抽出物もＮＧＦ生成促進効能を奏したが、これらの中、ブクリョウ皮抽出物のＮＧＦ生成促進効能が相対的に高いことが明らかであった。また生薬混合抽出物においてもブクリョウ皮の重量比が高い時、ＮＧＦ生成促進効果が大きい傾向性があらわれた。
【００７４】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）は、１ｍｇ／ｋｇ容量でＮＧＦ生成に影響を与えることができなかった。
【表１１】
0006546281.tif 000014
【００７５】
＜実験例２＞桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の神経細胞保護効果の確認
＜２−１＞神経細胞株でのアセチルコリンエステラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ、ＡＣｈＥ）の活性測定
アセチルコリンエステラーゼ抑制剤は、神経節内の神経伝達物質であるアセチルコリン濃度を高めてコリン性神経細胞を活性化することによって記憶能力の改善および認知症改善を媒介するので、現在多様なアセチルコリンエステラーゼ抑制剤が開発されて使用されている。生薬混合抽出物のアセチルコリンエステラーゼ阻害効果を確認するためにアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＫＣＬＢ（韓国細胞株銀行）から購入した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄと３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、実施例、比較例（１０μｇ／ｍｌ）および対照薬物（ドネペジル１０μＭ）を処理した。ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いて細胞溶解させた後、タンパク質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。アセチルコリンエステラーゼ酵素活性は、Ｅｌｌｍａｎ方法によりアセチルコリンを基質として用い、アセチルコリンエステラーゼによって生成されるｔｈｉｏｃｈｏｌｉｎｅをＤＴＮＢと反応させてその結果生成される５−ｔｈｉｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏａｔｅを４０５ｎｍで吸光度変化を測定して行った。
【００７６】
その結果、下記表１２に示したとおり、ベータアミロイド処理によって増加したアセチルコリンエステラーゼ活性が生薬混合抽出物投与によって正常化することを確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて、本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物においてアセチルコリンエステラーゼ活性抑制効能が優れていた。比較例１、２の単一生薬抽出物は、若干のアセチルコリンエステラーゼ抑制作用を示したが、二つの生薬抽出物全て生薬混合抽出物の効能より低い水準の効能を奏した。生薬混合抽出物の阻害効能は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）１０μＭと類似の水準であらわれた。
【表１２】
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【００７７】
＜２−２＞神経細胞株での細胞保護効果
Ａβ４２を人為的に集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）させた物質を用いて神経細胞株に対する毒性を起こしたモデルで生薬混合抽出物の細胞保護効果をＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）ａｓｓａｙを用いて測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を９６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）培地で４８時間培養した。１０μＭ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄと３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、実施例、比較例および対照薬物（ドネペジル１０μＭ）処理６時間後、Ａβ４２を処理して総４８時間培養して、２ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ処理４時間後、ＤＭＳＯでＦｏｒｍａｚｏｎを溶かして５９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７８】
その結果、下記表１３に示したとおり、ベータアミロイド処理によって誘導された細胞毒性が生薬混合抽出物投与によって抑制されることを確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて、本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物で細胞保護効能が優れていた。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）は、１０μＭ容量で低い水準の細胞保護効能のみを奏した。
【表１３】
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【００７９】
＜２−３＞神経細胞株でのリン酸化されたタウ測定
生薬混合抽出物のタウ過リン酸化阻害効果を確認するためにリン酸化されたタウレベルを測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートにシーディングし、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄと３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、実施例、比較例（１０μｇ／ｍｌ）および対照薬物（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ  １０μＭ）処理６時間後、Ａβ４２を処理して総４８時間培養した。ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞溶解させた後、タンパク質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで購入したｈｕｍａｎ  Ｔａｕ［ｐＳ１９９］Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ＫＩＴを用いてリン酸化されたタウを測定した。
【００８０】
その結果、下記表１４に示したとおり、ベータアミロイド処理によって誘導されたタウリン酸化増加が生薬混合抽出物によって抑制されることを確認した。桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物である比較例１および２、桑椹子とブクリョウ皮の混合抽出物である比較例３ないし８に比べて、本発明による実施例１である桑椹子、ブクリョウ皮５：１混合物でタウリン酸化抑制効能が優れていた。特に、桑椹子とブクリョウ皮単独抽出物と比較する時、混合抽出物によってタウリン酸化抑制効能が顕著に増加した。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）は、１０μＭ容量でタウリン酸化抑制効能を奏しなかった。
【表１４】
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【００８１】
＜２−４＞神経細胞株でのＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：神経栄養因子）レベル測定
生薬混合抽出物の認知能力改善効果の機転を確認するためにＮＧＦレベルを測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種して、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄと３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、実施例、比較例（１０μｇ／ｍｌ）および対照薬物（ドネペジル１０μＭ）を処理した。ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を溶解した後、タンパク質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。Ａｂｃａｍで購入したｂｅｔａ  Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ＫＩＴを用いてＮＧＦレベルを測定した。
【００８２】
その結果、下記表１５に示したとおり、生薬混合抽出物はＮＧＦ生成を増加させることを確認することができた。この時、ベータアミロイドはＮＧＦ生成に影響を与えなかった。単一生薬抽出物のＮＧＦ生成増加作用を比較した時、ブクリョウ皮抽出物の効能が高いことが明らかであった。また、生薬混合抽出物の中では５：１配合の場合が最も効能が高かった。
【００８３】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてアルツハイマー型認知症疾患に用いられるドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）は、１０μＭ容量でＮＧＦ生成促進効能を奏しなかった。
【表１５】
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【００８４】
以上のように、本発明の生薬混合抽出物の素材である桑椹子抽出物は、特にアルツハイマー型認知症の主要発病原因とされているベータアミロイドを除去して神経細胞の生存を促進してその機能を活性化するものと見られる。他の素材であるブクリョウ皮抽出物は、特に神経細胞保護因子として知られたＮＧＦ生成促進による神経細胞保護効能が卓越したものと考えられる。また、現在主要アルツハイマー型認知症薬品機転であるアセチルコリンエステラーゼ抑制効能において、各生薬抽出物は高い効能を奏しなかったが、これらを混合した場合効能が増加することが明らかになった。以上の結果を総合する時、桑椹子、ブクリョウ皮抽出物は、それぞれ相異なる機転により神経細胞を保護して上昇的で記憶力を増加させるものであると思われ、特に重量比５：１で配合した場合、上昇効能が優れると判断される。
【００８５】
したがって、本発明による生薬混合抽出物は、神経細胞の死滅を起こして退行性脳疾患を誘発するベータアミロイド生成とタウのリン酸化を抑制して病気の発病または進行を抑制させてアセチルコリンエステラーゼを阻害して記憶力を向上させる。また、神経細胞保護作用および神経分化を促進するＮＧＦの生成を促進してアルツハイマー型認知症はもちろんクロイツフェルトヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症、進行性認知症および神経学的異常、姿勢および運動異常、進行性失調症、筋萎縮および萎弱、感覚および運動障害などを含む退行性神経疾患の予防、改善および治療に有用に用いられることができる。
【００８６】
以下、本発明の実施例１の生薬抽出物を含有する組成物の製剤例を説明するが、本発明はこれを限定しようとするためでなく、具体的に説明するためである。
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【図１】
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【図２】
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