(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加していない膵臓リボヌクレアーゼ１を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらず膵臓リボヌクレアーゼ１に結合する抗体との反応に関与させなくする処理を行い、
その試料中の、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらず膵臓リボヌクレアーゼ１に結合する抗体を用いて測定する
ことを特徴とする、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１の測定方法。
【請求項２】
処理が、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加していない膵臓リボヌクレアーゼ１を、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加していない膵臓リボヌクレアーゼ１に特異的に結合する抗体と反応させ除去するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処理が、試料中に、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加していない膵臓リボヌクレアーゼ１に特異的に結合する抗体を共存させるものであり、当該抗体と８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加していない膵臓リボヌクレアーゼ１とが形成した抗原抗体複合体は、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらず膵臓リボヌクレアーゼ１に結合する抗体が結合できないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料中の、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１を、請求項１〜３いずれかに記載の方法により測定し、健常人の測定値と比較することを特徴とする、癌の検出方法。
【請求項５】
下記のＡ，Ｂにより得られる値の比を求め、健常人の値の比と比較することを特徴とする、癌の検出方法。
Ａ：試料中の、８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１を、請求項１〜３いずれかに記載の方法で測定する。
Ｂ：試料中の総膵臓リボヌクレアーゼ１を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらず膵臓リボヌクレアーゼ１に結合する抗体を用いて測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定分野の技術に関する。より詳しくは、試料中の、Ｎ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌の検出方法としては、非侵襲的な生体由来の試料、例えば血液や尿などの比較的採取が容易な体液を被検体とすることが好ましい。現在の膵臓癌の診断の際に使用される血清マーカーとしてＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２などがある。しかしながら、これらのマーカーは臓器特異性が低いことや、遺伝的理由から当該マーカーに反応しない場合があるなど、決定的な確定診断にはならないという欠点がある。
【０００３】
リボヌクレアーゼファミリーの１つである膵臓リボヌクレアーゼ１（以下、膵臓リボヌクレアーゼ１を「ＲＮａｓｅ  １」と称する）は膵臓特異的に発現し、細胞外の体液中に分泌される糖タンパク質である。このタンパク質は、１５６アミノ酸からなるペプチドとして翻訳され、分泌シグナルの除去、糖鎖修飾を受けた後、１２８アミノ酸のペプチド配列（配列番号１）を持つ成熟糖タンパク質として細胞外に分泌される。Ｎ型糖鎖修飾可能部位、即ちＮ型糖鎖修飾を受ける可能性があるアミノ酸残基は、配列番号１における３４番目、７６番目、８８番目アスパラギン残基である。
【０００４】
特許文献１によれば、健常者の血清中のＲＮａｓｅ  １では、８８番目のアスパラギン残基（以下、「Ａｓｎ８８」と称する）において、糖鎖が付加している割合は非常に低い。これに対して、膵臓癌患者から得られた血清中のＲＮａｓｅ  １では、Ａｓｎ８８において糖鎖の付加が増えることが報告されている。さらには、血清中のＲＮａｓｅ  １において、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているものと総ＲＮａｓｅ  １との比を求めることで、膵臓癌患者を検出することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１８７３７１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試料中の、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）  試料中の、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体との反応に関与させなくする処理を行い、
その試料中の、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体を用いて測定する
ことを特徴とする、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １の測定方法。
（２）  処理が、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １を、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体と反応させ除去するものである、（１）に記載の方法。
（３）  （２）に記載の方法において、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体がＲｒｈＲＮ０７２３抗体またはＲｒｈＲＮ１１７抗体である方法。
（４）  処理が、試料中に、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体を共存させるものであり、当該抗体とＡｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １とが形成した抗原抗体複合体は、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体が結合できないものである、（１）に記載の方法。
（５）  Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体が、ＲｒｈＲＮ２０３抗体である、（４）に記載の方法。
（６）  試料中の、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １を、（１）〜（５）いずれかに記載の方法により測定し、健常人の測定値と比較することを特徴とする、癌の検出方法。
（７）  下記のＡ，Ｂにより得られる値の比を求め、健常人の値の比と比較することを特徴とする、癌の検出方法。
Ａ：試料中の、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １を、（１）〜（５）いずれかに記載の方法で測定する。
Ｂ：試料中の総ＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体を用いて測定する。
【０００８】
以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明において、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １を以下「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と称する。またＡｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １を以下「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」と称する。
【０００９】
本発明において試料とは特に限定されるものではないが、例えばヒトから得られた体液、特に、血清、血漿、唾液、尿などがあげられる。また試料としては、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １のいずれか一方又は両方を含むものであってもよい。
【００１０】
本発明では、試料中の、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体との反応に関与させなくする処理を行う。この処理としては特に限定されるものではないが、例えばＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体と反応させ除去する、即ち試料から除去する方法があげられる。この時、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体を、適切な担体に固定化したものを試料と接触させてＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を特異的に除去することができる。
【００１１】
Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体としては特に限定されるものではないが、特許文献１に記載のＲｒｈＲＮ０７２３抗体又はＲｒｈＲＮ１１７抗体が好ましい。ＲｒｈＲＮ１１７抗体は、特許文献１の実施例１に記載の方法で、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体と同様に作製することができる。
【００１２】
本発明では、試料中に存在するＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体を用いて測定する。この測定は、前述の処理の後に行ってもよく、また処理と同時に行ってもよい。このとき用いられる抗体としては特に限定されるものではないが、特許文献１に記載のＲｒｈＲＮ１１１１抗体やＭｒｈＲＮ０６１４抗体が好ましい。
【００１３】
測定法としては特に限定はないが、例えばサンドイッチ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、競合法、それらを利用した自動化免疫測定装置を使用した方法、ウエスタンブロット法などを挙げることができ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。
【００１４】
また本発明では、前述の処理として、試料中に、Ａｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体を共存させるものであり、当該抗体とＡｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ  １とが形成した抗原抗体複合体は、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体が結合できないものをあげることができる。このとき、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体とが形成した抗原抗体複合体に結合できない抗体としては、特に限定されるものではないが、特許文献１に記載のＲｒｈＲＮ１１１１抗体や本明細書に記載のＲｒｈＲＮ２０３抗体が好ましい。
【００１５】
また本発明は、下記のＡ，Ｂにより得られる値の比を求め、健常人の値の比と比較することによる癌の検出方法である。
Ａ：試料中の、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を、前述の（１）又は（２）の方法で測定する。
Ｂ：試料中の総ＲＮａｓｅ  １を、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体を用いて測定する。
【００１６】
この方法では、試料はＡの方法で測定される。また試料はＢの方法で測定される。そして、それらの値の比を求めるというものである。この方法を図１及び図８に示す。このときの試料は前述と同様のものが例示される。また用いられる抗体も前述と同様ものが例示される。
【００１７】
本発明により測定されたＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １や、方法Ａ，Ｂにより得られる値の比を健常人と比較することにより、癌を検出することができる。具体的には、癌患者では健常人と比べて、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の測定値が高く、また方法Ａ，Ｂにより得られる値の比Ａ／Ｂが大きい（Ｂ／Ａが小さいともいえる）。癌としては、例えば膵臓癌、胃癌、胆管癌など検出することができ、特に膵臓癌を検出することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、Ｎ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １に結合する抗体を用いて、試料中のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を測定することができ、また、試料中の総ＲＮａｓｅ  １を測定することもできる。これらは、同じ測定試薬を用いて測定できるため、それぞれに対する別個の測定試薬を用いて測定する場合よりも、測定試薬に起因する性能差・ばらつきを最小限にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法のうち、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を試料から除去する場合の方法を示した図である。
【図２】実施例１の表１をグラフにした図である。
【図３】実施例２の表２のうち、総ＲＮａｓｅ  １量（未処理−Ｒ１１１１測定試薬使用）、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量（ＲｒｈＲＮ０７２３固定磁性微粒子処理−Ｒ１１１１測定試薬使用）、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １量（未処理−Ｒ０７２３測定試薬使用）をグラフにした図である。
【図４】実施例２の表２に示したＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の比をグラフにした図である。
【図５】抗ＲＮａｓｅ  １抗体ＲｒｈＲＮ１１７とＲｒｈＲＮ２０３の、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １に対する反応性をグラフにした図である。
【図６】検出抗体としてアルカリフォスファターゼ標識したＲｒｈＲＮ１１１１抗体またはＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用した測定試薬を用いて、ＲｒｈＲＮ０７２３またはＲｒｈＲＮ１１７を阻害抗体として試料に添加して測定した時の測定値をそれぞれグラフにした図である。
【図７】ＲｒｈＲＮ１１７抗体の濃度を変化させて試料に添加し、検出抗体としてアルカリフォスファターゼ標識したＲｒｈＲＮ２０３を使用した測定試薬での測定結果の相対値をグラフにした図である。
【図８】本発明の方法のうち、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を阻害する場合の方法を示した図である。
【図９】ヒト血清を実施例４に記載の方法で測定した時の、Ｇ３／ｔ比、総ＲＮａｓｅ  １量（阻害抗体未添加測定）、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量（阻害抗体添加測定）をグラフにした図である。
【図１０】実施例４に記載のヒト血清を使用した測定結果のうち癌検体について、本発明に記載の方法で得られたＧ３／ｔ比と、特許文献１に記載の方法により換算によって求めたＧ３／ｔ比を比較した図である。
【実施例】
【００２０】
実施例１  ＲＮａｓｅ  １標準品を使用した、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量の測定
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に、乾燥重量が１００μｇの磁性微粒子（ＭＸ２００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＪＳＲ社製）を１０％の濃度で懸濁し、得られた磁性微粒子懸濁液１ｍｌに５０μｇのＲｒｈＲＮ０７２３抗体を添加し、１６時間混和して磁性微粒子に抗体を吸着させ固定した。ＰＢＳで洗浄したのちに、抗体を固定した磁性微粒子はさらに、３％のウシ血清アルブミンと１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液に懸濁し、３７℃で３時間保温してＲｒｈＲＮ０７２３固定磁性微粒子懸濁液とした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現させた組み換え体ＲＮａｓｅ  １を約５０ｎｇ含む溶液を試料とし、ＲｒｈＲＮ０７２３固定磁性微粒子懸濁液をそれぞれ、１０、２０、４０、８０μｌ使用して、Ｋｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって、試料中のＲＮａｓｅ  １のうち、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を選択的に磁性微粒子に吸着させることにより、試料から除去した。磁性微粒子を除去した試料を特許文献１の実施例５［００５７］と同様にして、試料中のＲＮａｓｅ  １を測定した。なお、アルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を用いたＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １量を測定する試薬を以下「Ｒ０７２３測定試薬」と称し、アルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を用いたＮ型糖鎖の有無にかかわらずＲＮａｓｅ  １量を測定することが可能な試薬を以下「Ｒ１１１１測定試薬」と称する。どちらの測定試薬においても固相側抗体としてＭｒｈＲＮ０６１４抗体を使用している。対照実験として、抗体を固定しない磁性微粒子を用いて、同様の検討を行った。測定結果を、表１、図２に示す。
【００２１】
【表１】
0006604081.tif 000002
表１から、当初の（磁性微粒子による処理前の）試料中のＲＮａｓｅ  １量は、磁性微粒子を添加しない試料（０μｌ添加）の結果より、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １が４４．６５μｌ／ｍｌ、総ＲＮａｓｅ  １が５０．８９ｎｇ／ｍｌであり、これらの値から換算するとＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の比率は、［（５０．８９−４４．６５）／５０．８９］×１００＝１２％であることがわかる。
【００２２】
また、処理時のＲｒｈＲＮ０７２３抗体固定磁性微粒子の添加量に依存して測定値が減少していることが分かる。一方で、抗体を固定化しなかった磁性微粒子を用いて処理した場合は、磁性微粒子の添加量を増加しても測定値は大きく変動していない。このことから、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体固定磁性微粒子の添加量に依存する測定値の減少は磁性微粒子に対する非特異的な結合によるものではなく、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体固定磁性微粒子量に依存的な減少、すなわちＲｒｈＲＮ０７２３抗体量に依存するものであることが確認された。８０μｌのＲｒｈＲＮ０７２３抗体固定磁性微粒子懸濁液を使用した場合に、Ｒ０７２３測定試薬によって検出されるＲＮａｓｅ  １量は、測定の検出限界（２〜１００ｎｇ／ｍｌ）以下であり、試料からＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １が十分に除去されたことが確認された。
【００２３】
ＲｒｈＲＮ０７２３抗体によって試料中の「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」が除去され、次いでＲ１１１１測定試薬を用いて測定されたＲＮａｓｅ  １（６．２７ｎｇ／ｍｌ）は、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １である。また磁性微粒子を添加しない試料（０μｌ添加）の結果から、総ＲＮａｓｅ  １は５０．８９ｎｇ／ｍｌであったことから、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １は、（６．２７／５０．８９）×１００＝１２％であったことがわかる。この比率は、前述のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １と総ＲＮａｓｅ  １から換算して得た値と一致する。以上のように、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量を測定できることが示された。
【００２４】
実施例２  健常者と膵臓癌患者から得られた血清中のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の量の測定
実施例１に記載した方法を用いて健常者と膵臓癌患者から得られた血清（各１０検体）中のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量を測定した。膵臓癌検体はＢｉｏ  Ｔｈｅｍｅ社から入手した診断付検体を使用した。血清は１％のウシ血清アルブンと１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で１１倍に希釈し、２等分した一方の試料をＲｒｈＲＮ０７２３固定磁性微粒子で処理し、もう一方を未処理試料とした。それぞれの試料について、Ｒ０７２３測定試薬またはＲ１１１１測定試薬を使ってＲＮａｓｅ  １量を測定した。測定値は、１１倍に希釈した試料に含まれるＲＮａｓｅ  １量である。それぞれの測定値と、それから求めたＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の比として、換算によって求めたものと本発明の方法によって求めたものを表２に示す。
【００２５】
【表２】
0006604081.tif 000003
また、表２の値をプロットしたグラフを図３と図４に示す。図３には、健常者と膵臓癌患者血清の希釈試料中の、総ＲＮａｓｅ  １量、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １量をそれぞれグラフとして示した。
【００２６】
図４には、換算によって求めた比（１−［（Ａ）／（Ｂ）］）と本発明の方法による比（（Ｄ／（Ｂ））の関係を示した。２つの方法によって、異なる値が得られたが、どちらの方法でも、健常者の群（図中の×）と膵臓癌患者の群（図中の黒丸）を明確に区別することができた。２つの方法による値の差異は、測定に使用される材料に起因するものであると判断される。特に換算によって求めた比では２つの測定試薬（Ｒ０７２３測定試薬とＲ１１１１測定試薬）に対してそれぞれ検量線を作成し、測定値を求めるため、それぞれの検量線に使用する標品となるＲＮａｓｅ  １の品質に起因する誤差が生じやすい。それに対し本発明の方法では、１つの測定試薬（Ｒ１１１１測定試薬）で総ＲＮａｓｅ  １とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を測定しているため、標品となるＲＮａｓｅ  １の品質の影響が少ないと考えられる。
【００２７】
以上の結果から、本発明の方法により、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を測定できることが示された。さらに、健常者と膵臓癌患者を識別できることが示された。
【００２８】
実施例３  測定検体に阻害抗体を添加することによるＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量の測定
「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」の精製
ＣＨＯ細胞に発現させた組み換え体ＲＮａｓｅ  １は、Ａｓｎ８８におけるＮ型糖鎖付加は少なく、細胞から分泌される組み換え体ＲＮａｓｅ  １の約１０％にＮ型糖鎖付加がおきている。精製された「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」を入手するために、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体であるＲｒｈＲＮ０７２３抗体をＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ社製）に結合させたアフィニティ精製カラムを使用した。常法に従ってアフィニティ精製を実施し、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の混入がないＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を取得した。また、アフィニティ精製カラムに結合しなかった画分を繰り返し同アフィニティ精製カラムに掛けてＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １を除去した「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」を取得した。それぞれの試料の純度は、特許文献１の実施例５［００５７］と同様にして、試料中の「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」量と総ＲＮａｓｅ  １量を測定することで確認した。
【００２９】
ＲｒｈＲＮ１１７抗体とＲｒｈＲＮ２０３抗体の抗原結合特異性の検討
次に、精製された「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」を使用して、ＲｒｈＲＮ１１７抗体が「Ｎ型糖鎖が付加していない８８番目のアスパラギン残基を持つ膵臓リボヌクレアーゼ１に特異的に結合する抗体」であることを確認した。
【００３０】
ＲｒｈＲＮ１１７抗体とＲｒｈＲＮ２０３抗体は、特許文献１の実施例１に記載の方法で、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体と同様に作製した。
【００３１】
以下に、上記の抗体を評価するために構築した免疫測定系の測定試薬の調製法、評価方法を示す。水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）にＭｒｈＲＮ０６１４を９０ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させ、吸着後ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。水不溶性担体については、１個当たり約１００ｎｇの蛋白質を物理的に吸着可能である。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．５０μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ１１７または０．２５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ２０３を含む緩衝液（１％  ＢＳＡ、２．５％デキストラン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を加え、凍結乾燥した。この試薬を市販の全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて、全自動で、精製された「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」の測定を行った。その測定原理は以下の通りである。即ち、測定サンプルを１００μＬ加え、水不溶性担体を３７°Ｃで１０分間磁石を用いて運動させ、混合液を攪拌した状態で免疫反応させた。反応後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸を加え、該基質添加後２０秒から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。
【００３２】
図５に示したように、ＲｒｈＲＮ１１７抗体とＲｒｈＲＮ２０３抗体は、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に対して抗原量依存的に測定値の上昇が確認され、両抗体とも、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に結合する抗体であることが確認できた。一方で、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １に対しては、ＲｒｈＲＮ２０３抗体は抗原量依存的に測定値の上昇が確認され、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １に結合する抗体であることが確認できたが、ＲｒｈＲＮ１１７抗体はＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １に全く結合しない抗体であることが確認できた。即ち、ＲｒｈＲＮ２０３抗体が、「８８番目のアスパラギン残基へのＮ型糖鎖付加状態に拘わらず膵臓リボヌクレアーゼ１に結合する抗体」であるのに対して、ＲｒｈＲＮ１１７抗体は「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」に特異的に結合する抗体であることが明らかとなった。
【００３３】
ＲｒｈＲＮ０７２３抗体とＲｒｈＲＮ１１７抗体の、ＲｒｈＲＮ２０３抗体及びＲｒｈＲＮ１１１１抗体結合能に対する阻害活性の検討
ＲｒｈＲＮ２０３抗体結合能に対するＲｒｈＲＮ０７２３抗体とＲｒｈＲＮ１１７抗体の阻害能を検討するために、アルカリフォスファターゼ標識したＲｒｈＲＮ２０３抗体を検出抗体とした前述の免疫測定試薬を作製した。「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」の希釈系列を作成し、抗体を含まない希釈液（１％のウシ血清アルブミン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液）、２５μｇ／ｍｌのＲｒｈＲＮ０７２３抗体を含む希釈液、又は２５μｇ／ｍｌのＲｒｈＲＮ１１７抗体を含む希釈液で抗原を希釈した。希釈された抗原は、前述の免疫測定試薬で測定した。またアルカリホスファターゼ標識したＲｒｈＲＮ１１１１抗体を用いて同様に測定した。
【００３４】
図６に示したように、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体又はＲｒｈＲＮ１１７抗体をＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に添加することで、ＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用した試薬によるＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １の測定が阻害されることが明らかとなった。一方、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体又はＲｒｈＲＮ１１７抗体をＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １に添加しても、ＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用した試薬によるＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の測定には、大きな影響を与えないことが明らかとなった。即ち、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体とＲｒｈＲＮ１１７抗体がＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に特異的に結合する抗体であることを考えれば、これらの抗体がＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １と抗原抗体複合体を形成した場合に、ＲｒｈＲＮ２０３抗体のＲＮａｓｅ  １への結合を阻害する抗体であることが確認された。
【００３５】
図６からは、抗体濃度が同じ場合にはＲｒｈＲＮ１１７抗体が、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体よりもやや強くＲｒｈＲＮ２０３抗体やＲｒｈＲＮ１１１１抗体のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １への結合を阻害することが明らかとなり、阻害抗体としてＲｒｈＲＮ１１７抗体を使用し、検出抗体としてＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用した場合に、もっとも阻害効率が高いことが明らかとなった。
【００３６】
ＲｒｈＲＮ２０３抗体のＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １に対する抗原結合を、ＲｒｈＲＮ１１７抗体が阻害する阻害能を、阻害抗体の濃度を変化させて評価すると、反応液中のＲｒｈＲＮ１１７抗体の濃度に依存して阻害することが確認された（図７）。検出抗体として０．２５μｇ／ｍｌのＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用した測定では、ＲｒｈＲＮ１１７抗体濃度を５０μｇ／ｍｌにした場合、「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」の９８．２％を阻害した。即ち、ＲｒｈＲＮ１１７抗体濃度を十分量添加したＲＮａｓｅ  １測定では、検出される「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」量は近似的に０とすることができることが明らかとなった。
【００３７】
以上の結果から、「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」と「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」が混在した試料に対してＲｒｈＲＮ１１７抗体を添加し、検出抗体としてＲｒｈＲＮ２０３抗体を使用してＲＮａｓｅ  １量を測定した場合、「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」とＲｒｈＲＮ１１７抗体は抗原抗体複合体を形成し、それはＲｒｈＲＮ２０３抗体と結合しないため、「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １」量は測定結果に反映されず、測定したＲＮａｓｅ  １量は「Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １」であるということが可能である。
【００３８】
実施例４  ヒト血清中Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量の測定
実施例３に記載した方法で、但し検出用の抗体として０．２５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識抗体ＲｒｈＲＮ２０３を使用して、全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）で測定可能なＲＮａｓｅ  １測定試薬を作製した。この試薬を使用してヒト血清中の、総ＲＮａｓｅ  １量とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量を以下の通り測定した。総ＲＮａｓｅ  １量を測定する場合は、試料を阻害抗体を含まない希釈液（１％のウシ血清アルブミン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液）で１０倍に希釈して測定した。Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量を測定する場合は、阻害抗体としてＲｒｈＲＮ１１７抗体を３０μｇ／ｍｌの濃度で含む希釈液（１％のウシ血清アルブミン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液）で試料を１０倍に希釈して測定した。それぞれの測定方法で得た測定値から、ＲＮａｓｅ  １標準品を使用して決定した検量線を用いてそれぞれの試料に含まれる総ＲＮａｓｅ  １量とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量を換算した。さらに、換算されたＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １量（Ｄ）と総ＲＮａｓｅ  １量（Ｅ）から、試料中の総ＲＮａｓｅ  １に対するＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の比（Ｇ３／ｔ  比）を求めた。
【００３９】
また、対照実験として特許文献１に記載の方法により、Ａｓｎ８８Ｎ型糖鎖未付加ＲＮａｓｅ  １量（Ａ）と総ＲＮａｓｅ  １量（Ｂ）を測定し、試料中の総ＲＮａｓｅ  １に対するＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １の比（Ｇ３／ｔ  比）を求めた。
【００４０】
ヒト健常者３９検体、膵臓癌患者３４検体、胃癌患者１０検体、胆管癌１０検体を上記の方法で測定した結果を図９に示す。膵臓癌、胃癌、胆管癌から得られた血清検体のＧ３／ｔ  比は健常者のものと比べて明らかに高い値が得られた。
【００４１】
図１０には、上述の癌患者計５４検体について、特許文献１に記載の方法により換算によって求めたＧ３／ｔ比（１−［（Ａ）／（Ｂ）］）と本発明の方法によって求めたＧ３／ｔ比（（Ｄ）／（Ｅ））の関係を示した。２つの方法によって異なる数値が得られたが、相関性の強い結果を示しており、本発明の方法によって得られるＧ３／ｔ比が、特許文献１に記載の方法により得られるＧ３／ｔ比が本質的に同等であることを示している。２つの方法による数値の差異は、測定に使用される材料に起因するものであると判断される。特に換算によって求めた比では２つの測定試薬（Ｒ０７２３測定試薬とＲ１１１１測定試薬）に対してそれぞれ検量線を作成し、測定値を求めるため、それぞれの検量線に使用する標品となるＲＮａｓｅ  １の品質に起因する誤差が生じやすい。それに対し本発明の方法では、１つの測定試薬（ＲｒｈＲＮ２０３抗体を標識抗体とする測定試薬）で総ＲＮａｓｅ  １とＡｓｎ８８Ｎ型糖鎖付加ＲＮａｓｅ  １を測定しているため、標品となるＲＮａｓｅ  １の品質に起因する影響が少ないと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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