(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含有する試料中からタンパク質を分離する方法であって、前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離し、
前記第一の沈殿物を除いた前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得て、前記溶液ＩＩから第二の沈殿物及び第二の上清を分離することを特徴とするタンパク質分離方法。
【請求項２】
前記溶液Ｉに含まれる前記アミノ酸の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度である請求項１に記載のタンパク質分離方法。
【請求項３】
前記試料に添加する前記アミノ酸が、前記アミノ酸を含むアミノ酸溶液であり、前記アミノ酸溶液の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度である請求項１又は２に記載のタンパク質分離方法。
【請求項４】
前記溶液Ｉを分離処理することにより、前記第一の沈殿物及び前記第一の上清を分離する請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項５】
前記溶液ＩＩを分離処理することにより、前記第二の沈殿物及び前記第二の上清を分離する請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項６】
前記試料が体液である請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項７】
前記試料が血清又は血漿である請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項８】
前記試料、前記第一の沈殿物、前記第一の上清、前記第二の沈殿物又は前記第二の上清から、アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去する工程をさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法で、
前記第二の沈殿物を分析対象物として得ること、
前記第二の上清を分析対象物として得ること、
前記第二の沈殿物又は前記第二の上清を得て、前記第二の沈殿物又は前記第二の上清からアルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去して分析対象物として得ること、或いは、
前記試料を準備し又は前記第一の上清を得て、前記試料又は前記第一の上清からアルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去して、前記第二の沈殿物、又は前記第二の上清を分析対象物として得ること、の後、
前記分析対象物を分析対象に用いることを特徴とするタンパク質分析方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質分離方法に用いられるタンパク質分離キットであって、アミノ酸を備えることを特徴とするタンパク質分離キット。
【請求項１１】
界面活性剤又はカオトロピック試薬をさらに備える請求項１０に記載のタンパク質分離キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質分離方法、タンパク質分析方法、及びタンパク質分離キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオーム解析は、試料中に含まれるタンパク質を網羅的に解析する手法であり、生体の様々な情報を取得できることから、非常に有用な手法である。
例えば、疾患プロテオーム解析は、病態と正常で発現しているタンパク質の網羅的解析を行い、疾病特異的に異常な挙動（増加、減少、機能変化）を示すタンパク質を見出そうとするものである。比較の対象となる試料は、臓器、細胞、血液、血清、血漿、尿など多岐にわたっている。
なかでも血液は、体内のあらゆる情報を含んでいるため、有用な解析対象物である。しかし、血清又は血漿中のタンパク質分析は組織、臓器に比べて非常に難しく、世界的にも満足な分析が出来ていない。その主な理由は、血清又は血漿中のアルブミン（Alb）やIgGなどの約２０種類の高濃度タンパク質（血清又は血漿中の濃度が数ｍｇ／ｍＬ以上のタンパク質）が総タンパク量の９９％を占めていること。これに対して、解析対象としたい組織由来成分、インターロイキンなどのタンパク質の濃度は非常に小さく（数μｇ／ｍＬ〜数ｐｇ／ｍＬ）、血清又は血漿中のタンパク質の濃度のダイナミックレンジが１０１０〜１０１１と非常に幅広いこと（非特許文献１参照）、さらに、血清又は血漿中のタンパク質の切断や翻訳後修飾は多様であり、非常に多成分で複雑な状態にあることにある。ちなみに、細胞中のタンパク質の濃度のダイナミックレンジは１０５程度である。このため、現在、血清又は血漿を対象としたほぼ全ての研究において、Ａｌｂ、ＡｌｂとＩｇＧ等、Ａｌｂ， ＩｇＧ等を含む３〜１４種類の高濃度タンパク質を除去する除去カラム（主に抗体カラム）が使用されている。このうち、１２〜１４種類の高濃度タンパク質を除去する除去カラムでは、血清又は血漿中の全タンパク質の約９０％以上を除去可能であることが知られている。
【０００３】
しかし、上記除去カラムの利用には時間を要すること、除去後の試料の容量が増えているため濃縮操作が必要な場合が多いこと、さらには、非常に高価であることなど、多検体分析を必要とするヒト検体の詳細分析、検査応用においても多くの問題点がある。また、高濃度タンパク質除去法として逆相ＨＰＬＣで分画を試みた場合、スループットが大変悪く、比較分析のための再現性を確保するために多大なる労力と技術を要する。また、ヒト以外の動物に関しては、満足な高濃度除去カラムが市販されておらず、これらの血清・血漿の分析は困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Anderson N L, Anderson N G, Mol Cell Proteomics 2002; 1(11):845-67.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記除去カラムは、血清又は血漿等のサンプル中の高濃度タンパク質を含む全タンパク質の約９０％を除去可能である。この除去率は、一見するとサンプル中のタンパク質分析を行うのに十分であると理解されるかもしれない。しかし、タンパク質を約９０％除去しただけでは、残りのタンパク質を１０倍程度濃縮したにすぎない。タンパク質の濃度のダイナミックレンジが１０１０〜１０１１ある状況下での１０倍の濃縮では、微量タンパク質の分析の困難さについての問題を解決することにはならない。また、サンプル中の高濃度タンパク質が複雑性（切断断片や翻訳後修飾等で個々のタンパク質が多様な分子量を持つ）を有することで、微量タンパク質の分析がさらに困難なものとなっているが、このことについても何の解決も与えない。
【０００６】
また、高濃度タンパク質には、高濃度タンパク質がキャリアタンパク質となって、その他の微量なタンパク質・ペプチドと結合していると考えられる。そのため、上記の除去カラムの利用により高濃度タンパク質に吸着している微量タンパク質は、高濃度タンパク質を除去する際に、高濃度タンパク質と一緒に除去されてしまう。結果、現状のタンパク質除去カラムによって調製されたサンプルを用いた分析では、非常に重要な情報を損失していると考えられる。
【０００７】
このような経緯から、本発明者らは、試料中のタンパク質の「除去方法」ではなく、試料中の微量タンパク質の分析や臨床応用に有用な、新たなタンパク質の「分離方法」の開発が必要であることに思い至った。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料中のタンパク質を簡便に分離可能な、タンパク質分離方法、タンパク質分析方法、及びタンパク質分離キットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、生体試料液に高濃度のアミノ酸を加えると生体試料液に沈殿物が生じることに気づき、試料にアミノ酸を添加することで、試料液中のタンパク質を簡便に分離可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記の特徴を有するタンパク質分離方法、タンパク質分析方法、及びタンパク質分離キットを提供するものである。
【００１０】
（１）タンパク質を含有する試料中からタンパク質を分離する方法であって、前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離し、
前記第一の沈殿物を除いた前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得て、前記溶液ＩＩから第二の沈殿物及び第二の上清を分離することを特徴とするタンパク質分離方法。
（２）前記溶液Ｉに含まれる前記アミノ酸の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度である前記（１）に記載のタンパク質分離方法。
（３）前記試料に添加する前記アミノ酸が、前記アミノ酸を含むアミノ酸溶液であり、前記アミノ酸溶液の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度である前記（１）又は（２）に記載のタンパク質分離方法。
（４）前記溶液Ｉを分離処理することにより、前記第一の沈殿物及び前記第一の上清を分離する前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法。
（５）前記溶液ＩＩを分離処理することにより、前記第二の沈殿物及び前記第二の上清を分離する前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法。
（６）前記試料が体液である前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法。
（７）前記試料が血清又は血漿である前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法。
（８）前記試料、前記第一の沈殿物、前記第一の上清、前記第二の沈殿物又は前記第二の上清から、アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去する工程をさらに含む前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法。
（９）前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法で、
前記第二の沈殿物を分析対象物として得ること、
前記第二の上清を分析対象物として得ること、
前記第二の沈殿物又は前記第二の上清を得て、前記第二の沈殿物又は前記第二の上清からアルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去して分析対象物として得ること、或いは、
前記試料を準備し又は前記第一の上清を得て、前記試料又は前記第一の上清からアルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去して、前記第二の沈殿物、又は前記第二の上清を分析対象物として得ること、の後、
前記分析対象物を分析対象に用いることを特徴とするタンパク質分析方法。
（１０）前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のタンパク質分離方法に用いられるタンパク質分離キットであって、アミノ酸を備えることを特徴とするタンパク質分離キット。
（１１）界面活性剤又はカオトロピック試薬をさらに備える前記（１０）に記載のタンパク質分離キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質分離方法によれば、試料中のタンパク質を分離することができる。
本発明のタンパク質分析方法によれば、試料中のタンパク質を高精度に分析することができる。
本発明のタンパク質分離キットによれば、試料中のタンパク質を分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る第１実施形態におけるタンパク質分離方法の手順を模式的に示した図である。
【図２】本発明に係る第２実施形態におけるタンパク質分離方法の手順を模式的に示した図である。
【図３】実施例及び比較例における、血清サンプルの分画の流れを模式的に示した図である。
【図４】実施例において分画された分画物の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析結果を示す写真である。
【図５】実施例において分画された分画物の二次元電気泳動による分析結果を示す写真である。
【図６】実施例において分画された分画物の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜タンパク質分離方法＞
本発明のタンパク質分離方法は、
タンパク質を含有する試料中からタンパク質を分離する方法であって、前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離するものである。
【００１４】
本発明において、分離対象となるタンパク質とは、アミノ酸が多数重合してなる高分子のみならず、２つ以上のアミノ酸が少数重合してなるポリペプチドも包含される。
【００１５】
本発明において、アミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基を有する化合物であり、天然に存在する天然アミノ酸のみならず、人工的に合成されたアミノ酸や、人工的に合成・改変されたアミノ酸誘導体を含む非天然アミノ酸であってもよい。またアミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。また、２種類以上のアミノ酸を組み合わせて用いてもよい。
また、本発明においては、試料中のタンパク質を分離可能な範囲において、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合してなる低分子のポリペプチドを、上記アミノ酸として添加してもよい。当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、２〜５０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個がさらに好ましい。
【００１６】
アミノ酸は、例えば、セリン、チロシン、アスパラギン、アルギニン、システイン等の親水性アミノ酸；アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン等の疎水性アミノ酸；アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸；グルタミン酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸等に分類されるが、本発明に用いられるアミノ酸はいかなる分類に属するものであってもよい。
【００１７】
また、アミノ酸はタンパク質を構成するアミノ酸であることがより好ましい。タンパク質を構成するアミノ酸は、試料に含有されるタンパク質の構成成分であるので、分離されたタンパク質に影響を与えるおそれが少なく、分離されたタンパク質を良好な状態とすることができる。また、後述するタンパク質分析方法により、分離されたタンパク質を分析する際にも、分析結果に影響を与えるおそれが少なく、高精度にタンパク質の分析を行うことができる。タンパク質を構成するアミノ酸は、例えば人工的に合成されたＤ体であってもよい。
【００１８】
本発明において、試料とは、生物、細胞等から得られた生体試料であることが好ましい。生体試料には、生物、細胞等から得られた生体試料の調製物も包含される。生体試料としては、唾液、髄液、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、組織液等の体液であることがより好ましい。なかでも血液は、体内のあらゆる情報を含んでいるため、試料としては、血液がより好ましく、その液体成分である血清又は血漿であることがさらに好ましい。
血清及び血漿中のタンパク質分析は、血液中に含まれるタンパク質の濃度のダイナミックレンジが１０１０〜１０１１と非常に幅広い。血清中には、アルブミンや免疫グロブリンといった２２種類の主要タンパク質が総タンパク質量の９９％を占めている。従って、疾患に関与するタンパク質を発見するためには残り１％に含まれる数千種類の微量なタンパク質を比較解析しなければならない。そのため、血液、血清、及び血漿中のタンパク質分析は、組織、臓器中のタンパク質分析に比べて非常に難しいという問題があった。しかし、本発明のタンパク質分離方法によれば、試料として血液並びにその液体成分である血清及び血漿を用いた場合であっても、簡便に該タンパク質の分離が可能である。
【００１９】
本発明において、タンパク質を含有する試料からタンパク質を分離するとは、タンパク質が試料中に一様に存在する状態から、タンパク質が試料中に分離した状態とすること、又はタンパク質が試料中から取り出されて分離した状態とすることである。タンパク質が試料中に分離した状態とは、例えば、タンパク質が不溶化し、固体成分となって試料中から析出した状態となることである。
【００２０】
本発明において、溶液Ｉから分離される第一の沈殿物とは、必ずしも溶液Ｉ中に沈降した状態でなくともよい。第一の沈殿物は、試料中に溶解していたタンパク質が析出して生じた固体成分であると考えられる。溶液Ｉから上記第一の上清を実質的に除いたものを、第一の沈殿物として取得することできるが、このとき溶液Ｉから完全に第一の上清が除かれている必要はない。また、第一の沈殿物の調製物等（ただし、後述する第二の沈殿物は除く）であっても、第一の沈殿物に由来するものでれば、第一の沈殿物として扱うことができる。
溶液Ｉから分離される第一の上清は、溶液Ｉにおいて、前記第一の沈殿物以外の部分とすることができる。溶液Ｉから上記第一の沈殿物を実質的に除いたものを、第一の上清として取得することできるが、このとき溶液Ｉから完全に第一の沈殿物が除かれている必要はない。また、第一の上清の調製物等（ただし、後述する第二の上清は除く）であっても、第一の上清に由来するものでれば、第一の上清として扱うことができる。
【００２１】
（第１実施形態）
本実施形態のタンパク質分離方法は、タンパク質を含有する試料からタンパク質を分離する方法であって、前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉを分離処理することにより、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離するものである。
【００２２】
図１は、本発明に係る第１実施形態におけるタンパク質分離方法の手順を模式的に示した図である。
【００２３】
試料にアミノ酸を添加する方法は特に制限されず、試料に対してアミノ酸を添加してもよく、アミノ酸に対して試料を添加してもよい。
【００２４】
添加するアミノ酸の形態に特に制限はなく、例えば、乾燥状態のアミノ粉末、乾燥状態のアミノ酸顆粒、アミノ酸を溶かしたアミノ酸溶液などの形態が挙げられる。
【００２５】
試料に添加するアミノ酸の量は、タンパク質を含有する試料中に前記タンパク質の沈殿物を生じさせる程度とすればよい。
試料に添加するアミノ酸がアミノ酸溶液の形態である場合、前記アミノ酸溶液のアミノ酸濃度は、タンパク質を含有する試料中に前記タンパク質の沈殿物を生じさせる程度とすればよい。前記アミノ酸溶液のアミノ酸濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることがより好ましく、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることがさらに好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることが特に好ましい。
試料にアミノ酸溶液を複数回にわけて添加する場合、添加したアミノ酸溶液の合計で、アミノ酸濃度を算出するものとする。
当該アミノ酸溶液において、アミノ酸を溶解する液としては、水、各種緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸溶液は、実質的に水及びアミノ酸からなるアミノ酸の水溶液であってもよい。
【００２６】
前記試料にアミノ酸を添加して得られた前記溶液Ｉに含まれる前記アミノ酸の濃度は、タンパク質を含有する試料中に前記タンパク質の沈殿物を生じさせる程度とすればよい。なお、後述する実施例において示すように、対象となる試料の体積よりも、試料に添加するアミノ酸溶液の体積よりも非常に大きくても、本発明を実施可能であるため、前記試料にアミノ酸を添加して得られた前記溶液Ｉに含まれる前記アミノ酸の濃度は、上記と同様の値を例示でき、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることがより好ましく、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることがさらに好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜飽和濃度であることが特に好ましい。
。ここで、溶液Ｉに含まれる前記アミノ酸の濃度とは、本発明において試料に人為的に添加されたアミノ酸に係る濃度である。例えば、試料が被験者から得られた血清である場合、本来の血清には含まれていない、血清に添加されたアミノ酸に係る濃度である。
【００２７】
溶液ＩのｐＨは、試料の種類や分離対象のタンパク質に応じて適宜設定することができる。
【００２８】
本実施形態では、前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉを分離処理することを行う。
試料にアミノ酸を添加することのみでも、試料中のタンパク質の沈殿物が生じるなどして、タンパク質が分離され得るが、溶液Ｉを分離処理することで、より効率的にタンパク質を分離できる。
【００２９】
分離処理としては、例えば、遠心分離、超遠心分離、濾過、膜分離、吸着分離、上清を吸水する等の吸水処理が挙げられ、遠心分離又は超遠心分離が好ましい。分離処理を行うにあたっては、市販の分離器等の機器を用いてもよい。
【００３０】
分離処理時の溶液Ｉの温度は、試料の種類や分離対象のタンパク質に応じて適宜設定することができ、タンパク質の変性を生じさせない温度範囲内であることが好ましい。分離処理時の溶液Ｉの温度は、０〜７０℃であることが好ましく、４〜４０℃であることがより好ましく、１０〜３０℃の室温であることがさらに好ましい。
【００３１】
溶液Ｉにはプロテアーゼインヒビター（プロテアーゼ阻害剤）が添加されていることが好ましい。プロテアーゼインヒビターは市販のものを使用可能である。
【００３２】
本実施形態では、上記分離処理を行い、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離する。
一例として、分離処理として遠心分離を行った場合、第一の沈殿物は第一の画分とすることができ、前記溶液Ｉから第一の沈殿画分及び第一の上清を分画することとなる。
【００３３】
本実施形態のタンパク質分離方法は、その他公知のタンパク質の分離方法と組み合わせてもよい。代表的なタンパク質分離方法としては、塩析、硫安沈殿、アルコールによる沈殿、ＴＣＡ沈殿、アセトン沈殿、ＴＣＡ／アセトン沈殿、カプリル酸沈殿、硫酸デキストラン沈殿、ポリビニルピロリドン沈殿等のタンパク質沈殿方法、限外濾過、イオン交換、透析、各種クロマトグラフィー、免疫沈降による分離等を挙げることができる。
【００３４】
本実施形態のタンパク質分離方法によれば、試料中のタンパク質を簡便に分離することができる。本実施形態のタンパク質分離方法では、溶液Ｉを分離処理することで、より効率的にタンパク質を分離できる。
本実施形態のタンパク質分離方法によれば、アルブミン等の高濃度タンパク質を第一の上清として分離可能である。このことは、第一の沈殿物として、アルブミン等の高濃度タンパク質が除去された画分を取得可能である、と言い換えることができる。
【００３５】
更に、本実施形態のタンパク質分離方法によれば、従来法の、除去対象のタンパク質に対する抗体が固定化された除去カラムにより調製されたサンプルからは得ることのできなかったタンパク質を、第一の沈殿物に分離可能である。
前記除去カラムは抗体カラムであるので、生理的な条件下で使用されることが前提となる。生理的な条件下では、例えば、生理的な条件下でアルブミン等の高濃度タンパク質と結合しているタンパク質は、そのままアルブミン等の高濃度タンパク質と結合した状態であり、アルブミン等の高濃度タンパク質が除去されるとともに除去されてしまう。
一方、本実施形態のタンパク質分離方法では、必ずしも生理的な条件に依存することなく実施することが可能である。そのため、除去対象のタンパク質に結合していたタンパク質を、除去対象のタンパク質とは別の分離物として第一の沈殿物に分離可能である。
【００３６】
（第２実施形態）
本実施形態のタンパク質分離方法は、
タンパク質を含有する試料中からタンパク質を分離する方法であって、
前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉを分離処理することにより、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離し、
前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得て、前記溶液ＩＩを分離処理することにより、前記溶液ＩＩから第二の沈殿物及び第二の上清を分離するものである。
【００３７】
本実施形態において、溶液ＩＩから分離される第二の沈殿物とは、必ずしも溶液ＩＩ中に沈降した状態でなくともよい。第二の沈殿物は、試料中に溶解していたタンパク質が析出して生じた固体成分であると考えられる。溶液ＩＩから上記第二の上清を実質的に除いたものを、第二の沈殿物として取得することできるが、このとき溶液ＩＩから完全に第二の上清が除かれている必要はない。また、第二の沈殿物の調製物等であっても、第二の沈殿物に由来するものでれば、第二の沈殿物として扱うことができる。
溶液ＩＩから分離される第二の上清は、溶液ＩＩにおいて、前記第二の沈殿物以外の部分とすることができる。、溶液ＩＩから上記第二の沈殿物を実質的に除いたものを、第二の上清として取得することできるが、このとき溶液ＩＩから完全に第二の沈殿物が除かれている必要はない。また、第二の上清の調製物等であっても、第二の上清に由来するものでれば、第二の上清として扱うことができる。
【００３８】
図２は、本発明に係る第２実施形態におけるタンパク質分離方法の手順を模式的に示した図である。
【００３９】
第２の実施形態のタンパク質分離方法は、前記第１実施形態のタンパク質分離方法に、さらに、前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得て、前記溶液ＩＩを分離処理することにより、前記溶液ＩＩから第二の沈殿物及び第二の上清を分離することを行うものである。なお、前記第１実施形態のタンパク質分離方法と共通する点については、説明を省略する。
【００４０】
本実施形態のタンパク質分離方法では、前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得ることを行う。
界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性化剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ等の非イオン界面活性剤等を挙げることができるが、これらに限定されず、好ましい界面活性剤を適宜選択することができる。なかでも、本実施形態のタンパク質分離方法においては、界面活性剤としては、陰イオン界面活性化剤又は非イオン界面活性剤が好ましい。
【００４１】
また溶液ＩＩ中に含まれるタンパク質量に対して、所定の割合で界面活性剤を添加することが好ましい。
溶液ＩＩ中の界面活性化剤の濃度は、０．０００１〜１（ｗ／ｖ）％であることが好ましく、０．００２〜０．０５（ｗ／ｖ）％であることがより好ましく、０．００５〜０．５（ｗ／ｖ）％以下であることがさらに好ましい。
界面活性剤が陰イオン界面活性化剤、特にＳＤＳである場合、溶液ＩＩ中の界面活性化剤の濃度は、０．００１〜０．０５（ｗ／ｖ）％であることがさらに好ましく、０．００５〜０．００８（ｗ／ｖ）％であることが特に好ましい。
このように比較的低い濃度の界面活性剤を用いることにより、効果的にタンパク質を分離することができる。
【００４２】
カオトロピック試薬としては、カオトロピック効果を生じさせる物質であればよく、例えば、チオシアン酸イオン等のカオトロピック塩であってもよく、尿素、グアニジン塩酸、グアニジンイソチオシアネート等が挙げられる。
【００４３】
前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合することにより、前記第一の上清に含まれるタンパク質間の相互作用が弱められ、分離可能なタンパク質の種類が種類を増加させることができる。
血液並びにその液体成分である血清及び血漿中では、アルブミンやＩｇＧなどの約２０種類の高濃度タンパク質が総タンパク量の９９％を占めている。本実施形態のタンパク質分離方法では、試料として、血液、血清、血漿を用いた場合であっても、第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合することで、高濃度タンパク質に結合していたタンパク質と高濃度タンパク質との相互作用が弱められ、分離可能なタンパク質の種類が種類を飛躍的に増加させることができる。
【００４４】
前記溶液ＩＩを分離処理することは、前記溶液Ｉを分離処理することと同様に行えばよく、上記溶液Ｉを分離処理する場合に例示した分離処理の方法及び条件を好適に用いることができる。
【００４５】
本実施形態では、上記分離処理を行い、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離する。
【００４６】
一例として、分離処理として遠心分離を行った場合、第二の沈殿物は第二の画分とすることができ、前記溶液ＩＩから第二の沈殿画分及び第二の上清を分画することとなる。
【００４７】
本実施形態のタンパク質分離方法によれば、試料中のタンパク質を簡便に分離することができる。本実施形態のタンパク質分離方法では、第一の上清に含まれるタンパク質をさらに分離することができる。従来法の、除去対象のタンパク質に対する抗体が固定化された除去カラムにより調製されたサンプルからは、得ることのできなかったタンパク質を、さらに高効率に第二の沈殿物に分離可能である。
【００４８】
（第３実施形態）
本実施形態のタンパク質分離方法は、
タンパク質を含有する試料中からタンパク質を分離する方法であって、
前記試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉを分離処理することにより、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離し、
前記第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して溶液ＩＩを得て、前記溶液ＩＩを分離処理することにより、前記溶液ＩＩから第二の沈殿物及び第二の上清を分離し、
前記第二の上清から、アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去するものである。
【００４９】
第３実施形態のタンパク質分離方法は、前記第２実施形態のタンパク質分離方法を行い、さらに、前記第２実施形態のタンパク質分離方法で得られた前記第二の上清から、アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去する工程を行うものである。なお、前記第２実施形態のタンパク質分離方法と共通する点については、説明を省略する。
【００５０】
上記に挙げたアルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、及びα１−酸性糖タンパク質は、生体試料中に高濃度に存在することが知られているタンパク質である。以下、これらのタンパク質及びその断片をアルブミン等の高濃度タンパク質ということがある。
【００５１】
補体系タンパク質としては、補体タンパクＣ１、補体タンパクＣ２、補体タンパクＣ３、補体タンパクＣ４、補体タンパクＣ５、補体タンパクＣ６、補体タンパクＣ７、補体タンパクＣ８、補体タンパクＣ９、Ｈ因子、Ｉ因子、Ｂ因子、Ｄ因子及びそれらの構成分子を例示できる。
アポリポプロテインとしては、アポリポプロテインＡ-Ｉ、アポリポプロテインＡ-ＩＩ、アポリポプロテインＢ-１００等を例示できる。
【００５２】
本実施形態のタンパク質分離方法において、前記試料は、タンパク質を含有するものであれば特に制限されないが、前記試料が血液、血清、又は血漿であることが好ましい。血液、血清、又は血漿では、これらの試料に含まれるタンパク質のうち、アルブミン等の高濃度タンパク質が占める割合が非常に大きいためである。
【００５３】
アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去する方法としては、例えば、アルブミンと結合するアフィニティー担体によるアルブミンの吸着、限外濾過、イオン交換、透析などが挙げられ、本実施形態においては、アフィニティー担体を用いることが好ましい。アフィニティー担体としては、例えば、アルブミンと結合する抗体が固定化されたアフィニティーカラムやアフィニィービーズなどが挙げられる。
【００５４】
試料中に含まれていたタンパク質のうち、第２実施形態のタンパク質分離方法において第一の沈殿物及び第二の沈殿物として得られたタンパク質以外のタンパク質が、前記第二の上清に残存している。第二の上清から、さらに、上記アルブミン等のタンパク質を除去することによって、第二の上清に含有される上記アルブミン等の高濃度タンパク質以外のタンパク質を、さらに分離することが可能となる。
【００５５】
従来のアルブミン等の高濃度タンパク質を除去する方法では、アルブミン等の高濃度タンパク質の除去時に、アルブミン等の高濃度タンパク質と一緒に、分離したいタンパク質までもが除去されてしまっていた。
しかし、本実施形態のタンパク質分離方法では、第一の上清と界面活性剤又はカオトロピック試薬とを混合して得られた溶液ＩＩから分離された第二の上清をさらに分離するものである。例えば、試料中ではアルブミンと結合していたタンパク質であっても、第二の上清中では、界面活性剤又はカオトロピック試薬の作用より、該タンパク質はアルブミンから解離されている。したがって、第二の上清から、さらに、アルブミン等の高濃度タンパク質を除去する操作を行っても、従来法ではアルブミン除去時にアルブミンと一緒に除去されていたタンパク質を抽出することが可能である。
【００５６】
本実施形態のタンパク質分離方法によれば、試料中のタンパク質を簡便に分離することができる。また、本実施形態のタンパク質分離方法では、一連の分離操作によって、存在量の多いアルブミン等の高濃度タンパク質を除去し、微量タンパク質をさらに分離することができる。
【００５７】
なお、本実施形態においては、第二の上清から、上記アルブミン等の高濃度タンパク質を除去することを例示したが、第一の沈殿物、第一の上清、第二の沈殿物のそれぞれに対して、上記アルブミン等の高濃度タンパク質を除去することを行ってもよい。
また、本実施形態においては、第二の上清から、上記アルブミン等の高濃度タンパク質を除去することを例示したが、試料からアルブミン等の高濃度タンパク質を先ず除去してから、本発明のタンパク質分離方法を行うことを妨げるものではない。
【００５８】
＜タンパク質分析方法＞
本発明のタンパク質分析方法は、本発明のタンパク質分離方法で得られた分離物を分析対象に用いるものである。
本発明のタンパク質分離方法で得られた分離物とは、試料にアミノ酸を添加し、前記アミノ酸及びタンパク質を含む溶液Ｉを得て、前記溶液Ｉから第一の沈殿物及び第一の上清を分離することにより得られた物であって、例えば、上述した第一の沈殿物、第一の上清、第二の沈殿物、第二の上清、並びに第二の上清から、アルブミン、ＩｇＧ、トランスサイレチン、補体系タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、サイロキシン結合グロブリン、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、アンチトリプシン、ハプトグロビン、リポプロテイン、アポリポプロテイン、α１−酸性糖タンパク質、及びそれらの断片からなる群から選ばれる一種以上のタンパク質を除去して得られた物を例示できる。
【００５９】
分離物を分析する方法は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、二次元電気泳動、マイクロアレイ、質量分析等が挙げられ、なかでもマイクロアレイ、又は質量分析が好ましい。分離物を分析する方法は、二種類以上の方法を組み合わせて行ってもよい。
【００６０】
本発明のタンパク質分離方法は、これらに代表されるタンパク質の分析の前処理方法として、好適である。
【００６１】
マイクロアレイとしては、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、細胞マイクロアレイなど各種マイクロアレイを挙げることができる。質量分析は、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などにより行うことが例示でき、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどにより分析することが挙げられる。
【００６２】
本発明のタンパク質分離方法で得られた分離物は、試料にアミノ酸を添加することにより分離されたものである。アミノ酸はタンパク質の構成成分であるので、分離されたタンパク質に影響を与えるおそれが少なく、分離されたタンパク質を良好な状態とすることができる。また、分離されたタンパク質を分析する際に、分析結果に影響を与えるおそれが少なく、高精度にタンパク質の分析を行うことができる。従来法の、除去対象のタンパク質に対する抗体が固定化された除去カラムにより調製されたサンプルからは、分析することのできなかったタンパク質を、分析可能である。
【００６３】
＜タンパク質分離キット＞
本発明のタンパク質分離キットは、本発明のタンパク質分離方法に用いられるタンパク質分離キットであって、アミノ酸を備えるものである。
【００６４】
アミノ酸は、前記＜タンパク質分離方法＞で例示したもの同様のものを用いることができる。アミノ酸の形態に特に制限はなく、例えば、乾燥状態のアミノ粉末、乾燥状態のアミノ酸顆粒、アミノ酸を溶かしたアミノ酸溶液などの形態が挙げられる。
本発明のタンパク質分離キットは、アミノ酸を備えているので、簡便にタンパク質の分離を行うことができる。
【００６５】
また、本発明のタンパク質分離キットは、界面活性剤又はカオトロピック試薬をさらに備えていてもよい。界面活性剤及びカオトロピック試薬は、それぞれ前記＜タンパク質分離方法＞で例示したもの同様のものを用いることができる。界面活性剤及びカオトロピック試薬の形態は特に制限されず、例えば、乾燥状態の界面活性剤粉末、乾燥状態の界面活性剤顆粒、界面活性剤を溶かした界面活性剤溶液などの形態が挙げられる。
本発明のタンパク質分離キットが、さらに界面活性剤を備えることで、タンパク質間の相互作用を低減させるため、分離可能なタンパク質の種類が種類を増加させることができる。
【００６６】
またタンパク質の分離をより簡便にするという観点から、本発明のタンパク質分離キットは、タンパク質の分離に必要な試薬類、器具類等を更に備えていることが好ましい。
このように、タンパク質の分離に必要な試薬類をキット化することにより、本発明のタンパク質分離方法をより簡便に行うことができる。
【実施例】
【００６７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
図３は、実施例及び比較例における血清由来のタンパク質の分画の流れを模式的に示した図である。なお、ＳＦとは、Ｓｅｒｕｍ（血清） Ｆｒａｃｔｉｏｎ（画分）の略である。
【００６９】
（実施例１  ＳＦ１法によるＳＦ１の調製）
ヒトから採取した血清４５ μＬを［溶液１（１００ ｍＭのＣｙｓｔｅｉｎの水溶液）］２ ｍＬに滴下し攪拌後、１７，０００ × ｇ， １５ ｍｉｎ， ４ ℃で遠心し、沈殿物及び上清を得た。上清は後述のＳＦ２法に使用した。得られた沈殿物に前記［溶液１］５００μＬを添加し撹拌後、１９，０００× ｇ， １５ ｍｉｎ， ４ ℃で遠心し、得られた沈殿物をＳＦ１として回収した。
【００７０】
（実施例２  ＳＦ２法によるＳＦ２の調製）
上記のＳＦ１法で回収した上清２ｍＬに［溶液２（０．５ （ｗ/ｖ）％ ＳＤＳの水溶液）］４５ μＬを滴下し攪拌後、１７，０００ × ｇ， １５ ｍｉｎ， ４ ℃で遠心し、沈殿物及び上清を得た。得られた沈殿物に前記［溶液２］８００μＬを添加し撹拌後、１９，０００× ｇ， １５ ｍｉｎ， ４ ℃で遠心し、得られた沈殿物をＳＦ２として回収した。
【００７１】
（実施例３  ＳＦ３法によるＳＦ３の調製）
上記のＳＦ２法で回収した上清をＡｌｂ/ＩｇＧ除去カラム（シグマ・アルドリッチ社製ProteoPrep immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit）により処理し、これをＳＦ３として回収した。
【００７２】
（比較例１）
ヒトから採取した血清４５ μＬをＡｌｂ/ＩｇＧ除去カラム（シグマ・アルドリッチ社製ProteoPrep immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit）により処理し、これをアルブミン（Ａｌｂ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等が除去されたＡｌｂ／ＩｇＧ除去血清として回収した。
【００７３】
結果
図４に以下の各試料の電気泳動結果を示す。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：未処理血清
レーン３：Ａｌｂ/ＩｇＧ除去血清
レーン４〜６：ＳＦ１
レーン７〜９：ＳＦ２
レーン１０〜１２：ＳＦ３
【００７４】
レーン２〜１２の電気泳動は、全て血清０．５μＬに相当する試料を分析したものである。レーン４〜６、レーン７〜９、レーン１０〜１２の各３レーンの電気泳動は、それぞれ同じ血清から独立に調製した試料を分析したものである。レーン１の矢印ｂはＡｌｂに由来するバンドであり、矢印ａ，ｃ，ｄは、ＩｇＧに由来するバンドである。
【００７５】
図４のＳＦ１（レーン４〜６）、ＳＦ２（レーン７〜９）、ＳＦ３（レーン１０〜１１）で検出されているバンドは、いずれも血清中の比較的高濃度のタンパク質ではあるが、それぞれバンドパターンが異なっており、一連のＳＦ１〜ＳＦ３法によってこれらの高濃度成分が分画されたことがわかる。このことから、微量成分についても分画されているものと推測できる。また、アルブミン／ＩｇＧ除去試料（レーン３）とＳＦ３（レーン１０〜１２）はほぼ同じパターンを示した。このことから、従来のアルブミン／ＩｇＧ除去法（比較例１）ではアルブミン、ＩｇＧ等と共に除去されていた多くの成分が、ＳＦ１及びＳＦ２によって抽出できたことがわかる。さらに、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３の各３レーンの電気泳動のパターンが非常に良く一致していることから、ＳＦ法の再現性が高いことがわかる。
【００７６】
図５に以下の各試料の二次元電気泳動で分離し、ＣＢＢ染色した結果を示す。
（ａ）：Ａｌｂ/ＩｇＧ除去血清
（ｂ）：ＳＦ１
（ｃ）：ＳＦ３
（ｄ）：ＳＦ２
【００７７】
図５中の（ａ）〜（ｄ）の実線で描かれた円は、（ａ）中に見られる主な高濃度タンパク質スポットを示し、（ｂ）〜（ｄ）の破線で描かれた円は、（ａ）では高濃度タンパク質に重なっているが、（ｂ）〜（ｄ）で検出されているスポットを示す。また、（ａ）では観測されていないが、（ｂ）、（ｃ）で観測されているスポットは、Ａｌｂ/ＩｇＧ除去カラムで、Ａｌｂ、ＩｇＧ等と共に除去されている可能性が高い。これらのスポットを一点鎖線で描かれた円で示す。
【００７８】
また、図６に上記の二次元電気泳動で分離されたスポット数を集計した結果を示す。図６中の（ａ）〜（ｄ）のスポット数の集計結果は、それぞれ図５中の（ａ）〜（ｄ）の電気泳動の結果に対応している。
【００７９】
図５及び図６に示す結果から、Ａｌｂ／ＩｇＧ除去血清（図５（ａ））で検出されているＡｌｂ，ＩｇＧ以外の高濃度タンパク質が主にＳＦ１，ＳＦ３で検出されていること。Ａｌｂ／ＩｇＧ除去カラムではアルブミン，ＩｇＧの除去とともに除去されていた多くのタンパク質がＳＦ１法及びＳＦ２法によって観測されていることがわかる。
【００８０】
従来法であるＡｌｂｕｍｉｎ／ＩｇＧ除去法と逆相ＨＰＬＣを組み合わせて調製されたサンプルからは検出することができなかった微量タンパク質が、上記ＳＦ１法〜ＳＦ３法のそれぞれで得られた分画から検出可能であった。
【００８１】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のタンパク質分離方法よれば、試料中のタンパク質を簡便に分離することができるため、血液、尿、唾液、髄液等の体液に含まれるタンパク質の簡便で高効率な分画のための前処理法や、体液を対象とした検査のための前処理法、生体試料、特にヒト血清中のタンパク質を詳細に分析するための前処理法として利用可能である。
【００８３】
本発明のタンパク質キットよれば、試料中のタンパク質を簡便に分離することができるため、血清前処理用キット、検査用の前処理キットとして利用可能である。
【００８４】
また、高濃度タンパク質除去カラムを用いて高濃度タンパク質が除去できない動物の体液を分析するための前処理法としても利用可能である。例えば、従来ヒト、マウス、ラット用に市販されている高濃度タンパク質除去カラムではイヌやネコの血液中のアルブミンは除去できない。したがって、本発明のタンパク質分離方法は、ペットや家畜の血液検査法の開発、検査応用においても利用価値がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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