(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＶ）で表される化合物又はその塩。
【化１】
0006583737.tif 000024
［Ｘが、エチレン基又はエテニレン基であるときは、Ｒ１は、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよく、
Ｘが、エチニレン基であるときは、Ｒ１は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］
【請求項２】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である、請求項１記載の化合物又はその塩。
【化２】
0006583737.tif 000025
［Ｒ２は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基及びフェニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］
【請求項３】
Ｒ２がフェニル基又は１−ナフチル基である、請求項２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｘが、エチニレン基であり、Ｒ１が、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｘが、エチレン基であり、Ｒ１が、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物又はその塩を含む、アブシジン酸受容体の阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物又はその塩を含む、植物成長調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブシジン酸誘導体に関する。より詳細には、アブシジン酸受容体アンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
アブシジン酸は、種子の休眠及び環境ストレス応答において重要な役割を担う植物ホルモンである。アブシジン酸受容体は、アブシジン酸との結合によりその立体構造が変化し、プロテインホスファターゼであるＰＰ２Ｃと結合してその酵素活性を阻害することにより、それ以降のシグナル伝達を活性化する。【０００３】
アブシジン酸受容体アンタゴニストは、植物の成長の調節剤として農業分野への応用が期待されており、最近、アブシジン酸の３’位にアルキルスルファニル基を導入したアブシジン酸誘導体がアブシジン酸受容体拮抗作用を有することが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Takeuchi et al., "Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP 2C receptor interactions", Nature Chemical Biology, vol.10, pp.477-482 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新たなアブシジン酸受容体アンタゴニストを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討を行ったところ、アブシジン酸の４’位のオキソ基を置換又は非置換の２−プロパニルオキシ基、２−プロペニルオキシ基、もしくは２−プロピニルオキシ基にしたアブシジン酸誘導体は、アブシジン酸受容体拮抗作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、式（ＩＶ）で表される化合物又はその塩を提供する。
【化１】
0006583737.tif 000002
［Ｘは、エチレン基、エテニレン基、又はエチニレン基であり、Ｒ１は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］【０００８】
また、本発明は、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を提供する。
【化２】
0006583737.tif 000003
［Ｒ２は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基及びフェニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］【０００９】
上記化合物又はその塩において、Ｒ２はフェニル基又は１−ナフチル基であってよい。【００１０】
上記化合物又はその塩は、アブシジン酸受容体の阻害剤として利用することが可能であり、また、植物成長調節剤としても利用することが可能である。
【発明の効果】
【００１１】
式（ＩＶ）又は式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、アブシジン酸受容体拮抗作用を有し、種子の発芽の制御などの植物成長調節剤となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の化合物がシロイヌナズナの種子発芽に及ぼす影響を調べた結果を表すグラフである。
【図２】実施例１及び比較例１の化合物がシロイヌナズナの種子発芽に及ぼす影響を比較した結果を表すグラフである。
【図３】実施例１の化合物がアブシジン酸受容体に及ぼす影響を調べた結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本明細書において使用する用語などを説明し、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を意味し、好ましくはフッ素原子、塩素原子である。
【００１５】
本明細書において、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数が１〜６個の直鎖又は分枝状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基などが挙げられる。Ｃ１−６アルキル基は、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などの、炭素数が１〜３個のアルキル基であるＣ１−３アルキル基である。
【００１６】
本明細書において、「ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基」とは、Ｃ１−６アルキル基における１個又は複数個の水素原子がハロゲン原子で置換された基を意味し、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、１−フルオロエチル、２−フルオロエチル、２−クロロロエチル、１，２−ジフルオロエチル、２，２−ジフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、１−フルオロプロピル、２−フルオロプロピル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピルなどが挙げられる。ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基は、より好ましくは、ハロゲン原子で置換されたＣ１−３アルキル基である。
【００１７】
本明細書において、「Ｃ１−６アルコキシ基」とは、Ｃ１−６アルキル基が結合したオキシ基であることを意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、１−ブチルオキシ基、２−メチルプロピルオキシ基、１−メチルプロピルオキシ基、１，１−ジメチルエトキシ基などが挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「ナフチル基」とは、１−ナフチル基又は２−ナフチル基を意味する。
【００１９】
本実施形態に係る化合物は、式（ＩＶ）で表される。以下、化合物（ＩＶ）と表す場合もある。
【化３】
0006583737.tif 000004
［Ｘは、エチレン基、エテニレン基、又はエチニレン基であり、Ｒ１は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］
【００２０】
化合物（ＩＶ）は、式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」ともいう。）であってもよい。
【化４】
0006583737.tif 000005
［Ｒ２は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基及びフェニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］
【００２１】
Ｒ１又はＲ２が置換基を有するフェニル基又はナフチル基である場合、置換基の位置はいずれでもよく、また置換基の数も１個でも複数個でもよい。Ｒ１又はＲ２が置換基を有するフェニル基の場合、好ましくは、置換基の数は１であり、置換基の位置はメタ位又はパラ位である。
【００２２】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−アセチルフェニル基、ｐ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−アミノフェニル基、ｐ−アセチルアミノフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ビフェニル基又はｐ−ペンタフルオロスルファニル基である。
【００２３】
Ｒ１は、より好ましくは、水素原子、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−アセチルフェニル基、ｐ−トリル基又はｐ−ペンタフルオロスルファニル基である。
【００２４】
Ｒ１は、最も好ましくは、フェニル基、ｐ−トリル基又は１−ナフチル基である。
【００２５】
Ｒ２は、好ましくは、水素原子、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−アセチルフェニル基、ｐ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−アミノフェニル基、ｐ−アセチルアミノフェニル基、ｐ−クロロフェニル基又はｐ−ビフェニル基である。
【００２６】
Ｒ２は、より好ましくは、水素原子、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−アセチルフェニル基又はｐ−トリル基である。
【００２７】
Ｒ２は、最も好ましくは、フェニル基、ｐ−トリル基又は１−ナフチル基である。
【００２８】
Ｘは、エチレン基、エテニレン基、又はエチニレン基のいずれであってもよく、好ましくは、エチレン基又はエチニレン基である。
【００２９】
化合物（ＩＶ）は塩の形態であってもよい。塩としては、例えば、無機塩基塩及び有機塩基塩が挙げられる。無機塩基塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩の例としては、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
【００３０】
化合物（Ｉ）は、以下の反応スキームにより製造することができる。
【化５】
0006583737.tif 000006
［式中、Ｔｓはトシル基を表す。］
【００３１】
工程１は、アブシジン酸（以下、ＡＢＡと略す場合がある）を還元して化合物（ＩＩ）を得る工程である。ケトンからアルコールへの還元を行い得る還元剤を用いて、還元反応に常用されている反応条件（反応溶媒、反応温度、反応時間など）で工程１の反応を行うことが可能である。還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウムなどが挙げられる。具体的な反応条件としては、例えば、製造例１に示した反応条件が挙げられる。
【００３２】
工程２は、化合物（ＩＩ）及び化合物（ＩＩＩ）を反応させて、化合物（Ｉ）を得る工程である。水素化ナトリウムなどの塩基の存在下で反応を行う。例えば、実施例１に示した反応条件を参考にして、工程２の反応を行うことが可能である。化合物（Ｉ）がフリー体として得られた場合、常法により塩へと変換することができる。また、化合物（Ｉ）が塩として得られた場合も、常法によりフリー体へと変換することができる。
【００３３】
化合物（ＩＩＩ）は、市販の化合物を原料にして、当業者が容易に製造することが可能である。例えば、製造例２に示した反応条件を参考にして、化合物（ＩＩＩ）を製造することが可能である。
【００３４】
化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｉ）と同様の方法により製造することができる。例えば、化合物（ＩＩ）及び式（Ｖ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｖ）」ともいう。）を反応させて、化合物（ＩＶ）を得ることができる。具体的な反応条件としては、例えば、実施例９に示した反応条件が挙げられる。化合物（ＩＶ）がフリー体として得られた場合、常法により塩へと変換することができる。また、化合物（ＩＶ）が塩として得られた場合も、常法によりフリー体へと変換することができる。
【化６】
0006583737.tif 000007
［Ｘは、エチレン基、エテニレン基、又はエチニレン基であり、Ｒ１は、水素原子、フェニル基又はナフチル基であり、フェニル基及びナフチル基は、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセチルアミノ基、フェニル基及びペンタフルオロスルファニル基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。］
【００３５】
化合物（Ｖ）は、市販の化合物を原料にして、当業者が容易に製造することが可能である。例えば、製造例３に示した反応条件を参考にして、化合物（Ｖ）を製造することが可能である。
【００３６】
化合物（ＩＶ）は、アブシジン酸受容体拮抗作用を有するため、アブシジン酸受容体の阻害剤として利用することが可能である。アブシジン酸受容体は、ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲタンパク質として知られるタンパク質ファミリーに属する任意の受容体を意味する。
通常、植物ではＰＰ２ＣがプロテインキナーゼＳｎＲＫ２を脱リン酸化して不活性状態を維持している。植物がストレスを受けると、アブシジン酸が合成され、標的となる器官に輸送された後にアブシジン酸受容体と結合する。アブシジン酸がアブシジン酸受容体に結合すると、アブシジン酸受容体とＰＰ２Ｃが複合体を形成し、ＰＰ２Ｃによる脱リン酸化が抑制される。その結果、ＳｎＲＫ２が自己リン酸化を起こして活性化状態へと変化し、下流のイオンチャネル及び転写因子などを活性化し、アブシジン酸応答が誘導される。
化合物（ＩＶ）を施用された植物は、ストレスによりアブシジン酸が合成されたとしても、化合物（ＩＶ）が、アブシジン酸とアブシジン酸受容体の結合及びそれに引き続くＰＰ２Ｃとの複合体形成を阻害するため、アブシジン酸応答が誘導されなくなる。このため、化合物（ＩＶ）は植物の成長を調節することが可能となる。
【００３７】
上記の通り、化合物（ＩＶ）は、植物の成長を調節することが可能となる。植物の成長は、植物細胞の通常の分化又は増殖を伴う現象であれば特に限定されず、植物体を構成する器官の伸張、拡大のみならず、種子からの発芽、花芽形成、種子形成なども含まれる。
【００３８】
対象となる植物は特に限定されず、種子植物、シダ植物又はコケ植物でもよく、種子植物としては裸子植物又は被子植物でもよく、被子植物としては単子葉植物でも双子葉植物でもよい。
【００３９】
対象となる植物器官としては、特に限定されず、根、茎、葉、花、生殖器官、種子のいずれでもよく、さらに、培養細胞でもよい。
【００４０】
植物に適用する化合物（ＩＶ）の濃度及び接触方法は、対象となる植物の種類、その器官及び目的等に応じて適宜調整可能である。例えば、対象植物を双子葉植物とし、対象器官を種子とし、種子を発芽させることを目的とする場合、通常の培養液に化合物（ＩＶ）が０．３〜３００μＭとなるように溶解した培養液で栽培することが好ましい。
【００４１】
化合物（ＩＶ）を含む植物成長調節剤は、化合物（ＩＶ）の他に、殺菌剤、防黴剤、殺虫剤、或いは、化合物（ＩＶ）以外の植物成長調節作用を有する化合物を含有していてもよい。さらに、公知の製剤用添加剤を含有していてもよい。このような製剤用添加剤としては、例えば、賦形剤、乳化剤、湿潤剤を使用することができる。また、本発明の植物成長調節剤の剤型は特に限定されないが、例えば、乳剤、水和剤、水溶剤、液剤、粒剤、粉剤、マイクロカプセル、燻蒸剤、燻煙剤、エアゾール、フロアブル剤、ペースト剤、錠剤、塗布剤、微量散布用剤、油剤、複合肥料とすることができ、対象となる植物、その器官及び目的等に応じて、使用者が適宜選択することができる。このような剤型の植物成長調節剤は、公知の方法により製造することができる。
【実施例】
【００４２】
製造例１：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１，４−ジヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化７】
0006583737.tif 000008
Ｓ-アブシジン酸（純度９０％）１１．２ｇ（Ｓ−アブシジン酸として１０ｇ，３７．８ｍｍｏl）をメタノール４００ｍＬに溶解した。塩化セリウム（ＩＩＩ）・７水和物４２．９ｇ（１１５．１ｍｍｏｌ）を加え，溶解した後に，氷浴下水素化ホウ素ナトリウム１４．７ｇ（３８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温に昇温し，１５分間撹拌した後に，氷浴下，飽和塩化アンモニウム水溶液２００ｍＬを加えて反応を終了させ，反応液をエバポレーターで減圧濃縮し，メタノールを除いた。これに２Ｍ塩酸２００ｍＬを加え，ｐＨ試験紙を用いて反応液のｐＨが１−２であることを確認し，蒸留水４００ｍＬを加え，酢酸エチル６００ｍＬで３回分配抽出した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，白色固体１６．８７ｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−３０−５０％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３６５ｇ，４ｃｍ内径×３０ｃｍ長さ）に供し，目的物（白色固体，４．３５ｇ）と，目的物と不純物の混合物（白色固体，６．５８ｇ）を得た後に，不純物との混合物のみを，更にヘキサン−酢酸エチル（０−３０−６５％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９９５ｇ，３ｃｍ内径×３３ｃｍ長さ）に供し，標記化合物を１．３８ｇ（合計５．７３ｇ，収率５６％）得た。
1H NMR (270 MHz, CD3OD):δ  0.81 (3H, s), 0.92 (3H, s), 1.51 (1H, dd, J = 13.2 and 9.9 Hz), 1.55 (3H, d, J = 1.65 Hz), 1.63 (1H, ddd, J = 13.2, 6.6 and 1.3 Hz), 1.92 (3H, d, J = 1.3 Hz), 4.09 (1H, m), 5.43 (1H, m), 5.60 (1H, q, J = 1.0 Hz), 6.12 (1H, dd, J = 16.2 and 0.7 Hz), 7.58 (1H, dd, J = 16.2 and 0.7 Hz)【００４３】
製造例２：４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの合成
【化８】
0006583737.tif 000009
ヨードベンゼン８．０ｇ（３９．２ｍｍｏl）をテトラヒドロフラン５０ｍＬに溶解し，氷浴下にてトリエチルアミン７．９３ｇ（７８．４ｍｍｏｌ），ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド５６６ｍｇ（０．７８４ｍｍｏｌ），およびヨウ化銅（Ｉ）５１９ｍｇ（２．７４ｍｍｏｌ）を加え，３０分間撹拌した。これにプロパルギルアルコール２．２０ｇ（３９．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１０ｍＬを滴下漏斗を用いて加えた後に，室温に昇温し，３０分間撹拌して，ショートカラム（シリカゲル６４−２１０μｍ径，１．５ｃｍ内径×２５ｃｍ高さ）に通して反応を終了した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，褐色油状物質６．２９ｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−２０−１００％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２８９ｇ，２．１ｃｍ内径×４０ｃｍ長さ）に供し，３−フェニルプロパ−２−イン−１−オール（褐色油状物質，４．５６ｇ）を得た（収率８８％）。３−フェニルプロパ−２−イン−１−オール４．００ｇ（３０．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン８ｍＬに溶解した。これを−１０℃条件下，トリエチルアミン１２．３ｇ（１２１ｍｍｏｌ）とｐ―トルエンスルホン酸クロリド１１．８ｇ（６０．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液２０ｍＬを加えた。０℃に昇温し，９０分間撹拌した後に，酢酸エチル４００ｍＬを入れた分液漏斗に反応液を加え，１Ｍ塩酸２０ｍＬを加え，よく振り，トリエチルアミンを除いた。この操作をもう一度繰り返した後，飽和塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，褐色油状物質１０．０ｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−１０％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９９５ｇ，４．１ｃｍ内径×３８ｃｍ長さ）に供し，標記化合物を３．６０ｇ（収率４２％）得た。
1H NMR (270 MHz, CDCl3):δ  2.39 (3H, s), 4.95 (2H, s), 7.24-7.37 (7H, m), 7.85 (2H, m)【００４４】
製造例３：４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパン−１−イルの合成
【化９】
0006583737.tif 000010
３−フェニル−１−プロパノール２００ｍｇ（１．４７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し，塩化パラトルエンスルホニル３３９．６ｍｇ（１．７８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１７８．１ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間撹拌後，蒸留水８ｍＬと１Ｍ塩酸２ｍＬを加え，酢酸エチル１０ｍＬで３回分配抽出した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥後，綿ろ過してろ液を減圧濃縮し，無色透明の油状物質４７５ｍｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（１：９）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００  ９．２１ｇ，１６ｍｍ内径×９５ｍｍ長さ）に供し，標記化合物を３３９．３ｍｇ（収率７９％）得た。
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ 1.91 (2H, m), 2.45 (3H, s), 2.60 (2H, t, J=7.6 Hz), 4.00 (2H, t, J=6.3 Hz), 7.04-7.23 (5H, m), 7.43 (2H, m), 7.78 (2H, m)【００４５】
実施例１：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１０】
0006583737.tif 000011
水素化ナトリウム（油性６０％）２．７８ｇ（水素化ナトリウムとして１．６７ｇ，６４．８ｍｍｏｌ）をヘキサン１００ｍＬに溶解し，上清を除去した。これにテトラヒドロフラン５０ｍＬを加え，上清を除いた後に，テトラヒドロフラン２００ｍＬを加えた。氷浴下，（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１，４−ジヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸  ５．７２ｇ（２１．５ｍｍｏｌ）を加え，３０分撹拌し，更に４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イル  ３．０９ｇ（１０．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液４０ｍＬを加えた。室温まで昇温して，４４時間撹拌した後に，氷浴下２Ｍ塩酸  １００ｍＬを加えて反応を終了させ，反応液を蒸留水９００ｍＬに入れて，酢酸エチル６００ｍＬで３回分配抽出した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，褐色油状物質８．３４ｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−２０−４０％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０３９ｇ，４．１ｃｍ内径×３９ｃｍ長さ）に供し，不純物と目的物の混合物（褐色油状物質，２．３４ｇ）を得た後に，更にジクロロメタン−酢酸エチル（３０％）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３９８ｇ，２．５ｃｍ内径×４０ｃｍ長さ）に供し，標記化合物を１．３７５ｇ（収率３３％）得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ  0.92 (3H, s, H3-9'), 1.06 (3H, s, H3-8'), 1.67 (3H, m, H3-7'), 1.72 (1H, dd, J = 13.1 and 9.5 Hz, H-5'), 1.90 (1H, m, H-5'), 2.01 (3H, d, J = 0.6 Hz, H3-6), 4.27 (1H, m, H-4'), 4.42 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-1"), 4.47 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-1"), 5.68 (1H, brs, H-3'), 5.71 (1H, s, H-2), 6.21 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-5), 7.31 (3H, m, H-6", 7" and 8"), 7.44 (2H, m, H-5" and 9"), 7.74 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-4)
13C NMR (125 MHz, CDCl3):δ  17.7 (C7'), 21.5 (C6), 22.7 (C8'), 25.3 (C9'), 39.7 (C6'), 40.7 (C5'), 56.1 (C1"), 72.3 (C4'), 79.3 (C1'), 85.5 (C2"), 86.0 ( C3"), 117.0 (C2), 122.7 (C4"), 124.6 (C3'), 126.5 (C4), 128.3 (C6" and 8"), 128.4 (C7"), 131.7 (C5" and 9"), 139.1 (C2'), 140.3 (C5), 152.2 (C3), 170.6 (C1)
UVλmax (MeOH) nm(ε): 242.4 (27600), 250.4 (29000)
HRMS (m/z): [M+Na]+ calc'd. for C24H28O4Na, 403.1885; found, 403.1880.【００４６】
実施例２：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（ナフタレン−１−イル）プロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１１】
0006583737.tif 000012
Ｓ−アブシジン酸のかわりに，Ｓ−アブシジン酸−メチルを用いて製造例１と同様に反応させ，メチル（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１，４−ジヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸を８６５．９ｍｇ（収率７５．５％）得た。メチル（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１，４−ジヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸３０．０ｍｇ（０．１０７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１．０ｍＬに溶解し，氷浴下水素化ナトリウム（油性６０％）８．６ｍｇ（水素化ナトリウムとして５．２２ｍｇ，０．２１４ｍｍｏｌ）を加えて３０分間撹拌した。これに１−（３−ブロモプロパ−１−イン−１−イル）ナフタレン２６．２ｍｇ（０．１０７ｍｍｏｌ）を加え，室温に昇温した。４時間撹拌した後に，飽和塩化アンモニウム水溶液３０ｍＬに反応液を加えて反応を終了し，これを酢酸エチル３０ｍＬで３回分配抽出した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，淡黄色油状物質５５．４ｍｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−２０−３０−１００％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５ｇ，０．５ｃｍ内径×２８ｃｍ長さ）に供し，メチル（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（ナフタレン−１−イル）プロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸（淡黄色油状物質，３ｍｇ）を得た（収率３％）。これをメタノール１．５ｍＬに溶解し，氷浴下，１Ｍ水酸化ナトリウム１．８ｍＬを加え，３．５時間撹拌した。これに１Ｍ塩酸２ｍＬを加えて反応を終了させ，蒸留水３０ｍＬを加え，酢酸エチル２０ｍＬで３回分配抽出し，飽和塩化ナトリウムで３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，淡黄色油状物質５．６ｍｇを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（０−３０−４０％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２ｇ，０．５ｃｍ内径×１５ｃｍ長さ）に供し，標記化合物を０．８ｍｇ（収率２７．５％）得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ  0.95 (3H, s, H3-9'), 1.07 (3H, s, H3-8'), 1.70 (3H, dd, J = 1.5 and 1.5 Hz, H3-7'), 1.76 (1H, dd, J = 13.1 and 9.8 Hz, H-5'), 1.92 (1H, ddd, J = 13.1, 6.4 and 1.5 Hz, H-5'), 2.01 (3H, d, J = 1.2 Hz, H3-6), 4.41 (1H, m, H-4'), 4.60 (2H, d, J = 1.5 Hz, OCH2-), 5.70 (1H, brs, H-2), 5.73 (1H, m, H-3'), 6.22 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-5), 7.44 (1H, dd, J = 8.2 and 7.3 Hz, H-6''), 7.54 (2H, m, H-10'' and 11''), 7.65 (1H, dd, J = 7.3 and 1.2 Hz, H-5''), 7.73 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-4), 7.88 (2H, m, H-7'' and 12''), 8.30 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-9'')
13C NMR(125 MHz, CD3OD):δ  18.4 (C7'), 21.4 (C6), 23.3 (C8'), 25.7 (C9'), 40.9 (C6'), 41.7 (C5'), 56.8 (C1''), 74.1 (C4'), 80.2 (C1'), 84.8 (C2''), 91.9 (C3''), 118.8 (C2), 121.5 (C8''), 125.6 (C3'), 126.3 (C6''), 126.9 (C9''), 127.5 (C11''), 127.9 (C10''), 128.2 (C4), 129.4 (C12''), 130.0 (C7''), 131.5 (C5''), 134.6 (C4'‘ or 13''), 134.7 (C4'‘ or 13''), 141.1 (C5), 141.2 (C2'), 151.4 (C3), 169.8 (C1)
UVλmax (MeOH) nm(ε): 226.8 (59700), 262.2 (18000), 297.0 (13700), 310.4 (8410)
HRMS (m/z): [M+Na]+ calc'd. for C28H30O4Na, 453.2042; found 453.2045.【００４７】
実施例３：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１２】
0006583737.tif 000013
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに、４−メチルベンゼンスルホン酸  プロパ−２−イン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ、標記化合物を得た（収率９％）。
1H NMR (270 MHz, CDCl3):δ  0.92 (3H, s, H3-8’ or 9'), 1.05 (3H, s, H3-8' or 9’), 1.63-1.71 (4H, m, H3-7' and H-5’), 1.86 (1H, ddd, J = 13.2, 6.6 and 1.3 Hz, H-5’), 2.02 (3H, d, J = 1.0 Hz, H3-6), 2.43 (1H, t, J = 2.3 Hz, H-3’’), 4.16-4.23 (3H, m, H-4’ and H2-1’’), 5.64 (1H, m, H-3’), 5.72 (1H, s, H-2), 6.19 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-5), 7.35 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-4)【００４８】
実施例４：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（４−トリフルオロメチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１３】
0006583737.tif 000014
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに、４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−（４−トリフルオロメチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ、標記化合物を得た（収率１８％）。
1H NMR (270 MHz, CDCl3):δ  0.93 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.63-1.73 (4H, m), 1.82-1.93 (1H, m), 2.02 (3H, s), 4.14-4.29 (3H, m), 5.68 (1H, m), 5.71 (1H, s), 6.20 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.52-7.60 (4H, m), 7.74 (1H, d, J = 16.1 Hz)【００４９】
実施例５：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（４−メトキシ）フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１４】
0006583737.tif 000015
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに、４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−（４−メトキシ）フェニルプロパ−２−イン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ、標記化合物を得た（収率３％）。
1H NMR (270 MHz, CDCl3):δ  0.90 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.65 (3H, s), 1.70 (1H, dd, J = 12.5 and 9.6 Hz), 1.89 (1H, dd, J = 12.5 and 6.6 Hz), 1.99 (3H, s), 3.85 (3H, s), 4.24 (1H, m), 4.36-4.48 (2H, m), 5.66 (1H, s), 5.71 (1H, s), 6.16 (1H, s), 6.81-6.87 (2H, m), 7.35-7.41 (2H, m), 7.73 (1H, s)【００５０】
実施例６：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（４−アセチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１５】
0006583737.tif 000016
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに、４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−（４−アセチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ、標記化合物を得た（収率０．５％）。
1H NMR (270 MHz, CDCl3):δ  0.93 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.68 (3H, s), 1.72 (1H, dd, J = 13.5 and 9.6 Hz), 1.90 (1H, dd, J = 13.5 and 6.9 Hz), 2.02 (3H, s), 2.60 (3H, s), 4.25 (1H, m), 4.46 (2H, m), 5.69 (1H, s), 5.72 (1H, s), 6.21 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.50-7.53 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.89-7.92 (2H, m)【００５１】
実施例７：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（４−メチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１６】
0006583737.tif 000017
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに，４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−（４−メチル）フェニルプロパ−２−イン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ，標記化合物を得た（収率１８％）。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.91 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.66 (3H, m), 1.71 (1H, dd, J = 13.1 and 9.8 Hz), 1.89 (1H, m), 2.00 (3H, s), 2.34 (3H, s), 4.26 (1H, m), 4.41(1H, d, J = 15.9 Hz), 4.45(1H, d, J = 15.9 Hz), 5.67 (1H, s), 5.71 (1H, s), 6.19 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.10-7.12 (3H, m), 7.32-7.34 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 15.9 Hz)【００５２】
実施例８：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−（４−ペンタフルオロスルファニル）フェニルプロパ−２−イン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１７】
0006583737.tif 000018
（２Ｚ，４Ｅ）−５−（（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸７２．０ｍｇ（２３７ｎｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液２ｍＬに，ヨウ化銅（Ｉ）３．２ｍｇ（１７ｎｍｏｌ），トランス−ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）３．２ｍｇ（４．６  ｎｍｏｌ），トリエチルアミン１．０ｍＬと，４−ヨードフェニルサルファーペンタフルオライド７５．６ｍｇ（２２９ｎｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１ｍＬを加えた。室温で６時間撹拌した後，１Ｍ塩酸水溶液５ｍＬを加え，反応液を酢酸エチル２０ｍＬで３回分配抽出した。これを飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥させ，濃縮し，褐色油状物質１１４ｍｇを得た。これをジクロロメタン−酢酸エチル（０−２０％，ステップグラジエント）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１２ｇ，１４ｍｍ内径×１６０ｍｍ長さ）に供し，目的物と不純物の混合物５３ｍｇを得た。さらにこれを７７％メタノールを溶離液とした高速液体クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ  １８，２０ｍｍ内径×１５０ｍｍ長さ）に供し，標記化合物を３０．３  ｍｇ（収率２５％）得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ 0.94 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.68 (3H, m), 1.69 (1H, dd, J = 13.0 and 9.3 Hz), 1.84 (1H, ddd, J = 13.0, 6.4 and 1.5 Hz), 2.01 (3H, d, J = 0.9 Hz), 4.27 (1H, m), 4.45 (1H, d, J = 16.4 Hz), 4.49 (1H, d, J = 16.4 Hz), 5.66 (1H, m), 5.71 (1H, m), 6.17 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.58-7.60 (2H, m), 7.68 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.79-7.82 (2H, m)【００５３】
実施例９：（２Ｚ，４Ｅ）−５−（１Ｓ，４Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−４−（（３−フェニルプロパン−１−イル）オキシ）シクロヘキス−２−エン−１−イル）−３−メチルペンタ−２，４−ジエン酸の合成
【化１８】
0006583737.tif 000019
４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパ−２−イン−１−イルの代わりに，４−メチルベンゼンスルホン酸  ３−フェニルプロパン−１−イルを用いて実施例１と同様に反応させ，標記化合物を得た（収率４４％）。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.91 (3H, s), 1.00 (3H, s), 1.62 (1H, dd), 1.66 (3H, s), 1.75 (1H, ddd, J=13.2, 6.3 and 1.0 Hz), 1.85 (2H, m), 2.01 (3H, s), 2.68 (2H, t, J=7.3 Hz), 3.49 (2H, m), 3.96 (1H, m), 5.58 (1H, m), 5.73 (1H, brs), 6.17 (1H, d, J=15.2 Hz), 7.20 (5H, m), 7.68 (1H, d, J=15.2 Hz)【００５４】
比較例１：３’−ヘキシルスルファニル−アブシジン酸の合成
【化１９】
0006583737.tif 000020
非特許文献１に記載の方法に従い、標記化合物を合成した。【００５５】
試験例１：シロイヌナズナ種子発芽試験（１）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ｃｏｌ−０）種子を７０％エタノール水溶液５００μＬに３０分，続いて１００％エタノール溶液５００μＬに１分浸漬し，蒸留水１ｍＬで５回洗浄した後に，種子を蒸留水に浸漬させ，暗所下，４℃で３日間春化処理した。試料のメタノール溶液を１．５ｍＬ容マイクロチューブに入れ，減圧下にてメタノールを除去し，７０℃の０．５％寒天水溶液（含１／２ＭＳ培地無機塩類）を加え，撹拌した後に９６穴プレートに入れ，試料を含む培地とした。試料は，実施例１〜９及び比較例１の濃度はいずれも３μＭになるように調製した。また，ＡＢＡを投与する場合，ＡＢＡの濃度が０．３μＭになるように調製した。ここに春化処理済みのシロイヌナズナ種子を２０−３０粒ずつ播種し，２２℃，連続光下で培養して，その発芽数を経時的に観察した。下記式（１）にしたがって発芽率を計算した。なお，メタノールを用いて同様に培地を調製したものをコントロールとして用いた。結果を表１に示す。実施例１〜９の化合物をＡＢＡと共投与すると、ＡＢＡにより低下した種子の発芽率が回復することが明らかとなった。
発芽率（％）＝発芽数（個）／播種数（個）×１００…（１）【００５６】
【表１】
0006583737.tif 000021
【００５７】
試験例２：シロイヌナズナ種子発芽試験（２）
実施例１の化合物の処理濃度を０．３μＭから３０μＭまで変化させて、試験例１と同様の試験を行った。結果を図１に示す。この濃度範囲でも、実施例１の化合物をＡＢＡと共投与すると、ＡＢＡにより低下した種子の発芽率が回復することが確認された。【００５８】
同様に、実施例２の化合物の処理濃度を０．３μＭから３μＭまで変化させて、同様の試験を行った。この濃度範囲でも、実施例２の化合物をＡＢＡと共投与すると、ＡＢＡにより低下した種子の発芽率が回復することが確認された。【００５９】
試験例３：レタス及びチンゲンサイ種子発芽試験
また，シロイヌナズナに代えて、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）及びチンゲンサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を用いて、試験例２と同様の試験を行った。レタス及びチンゲンサイの種子に対しても、実施例１及び２の化合物はＡＢＡ共投与により、ＡＢＡにより低下した種子の発芽率が回復した。【００６０】
試験例４：実施例１の化合物と比較例１の化合物の比較
実施例１の化合物と比較例１の化合物の種子発芽率の回復効果を比較するため、化合物の処理濃度を０．３μＭから３μＭまで変化させて、試験例２と同様の試験を行った。結果を図２に示す。実施例１の化合物は、比較例１の化合物よりも種子発芽率の回復効果に優れることが明らかとなった。【００６１】
試験例５：タンパク質脱リン酸化酵素活性試験
シロイヌナズナのＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲタンパク質（ＰＹＬ，アブシジン酸受容体）又はタンパク質脱リン酸化酵素ＨＡＢ１がコードされたプラスミド（ｐＧｅｘ−２Ｔ−ＧＳＴ−ＨＡＢ１又はｐＥＴ２８−６ｘＨｉｓ−ＰＹＬ）を大腸菌（ＨＡＢ１：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，ＰＹＬ：ＢＬ２１−ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ）に形質転換した。前培養（３０℃，１８０ｒｐｍ，１５時間）と本培養（３０℃，１８０ｒｐｍ，４時間）を行った培養液に，イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加え，タンパク質発現（１６℃，１５０ｒｐｍ，１８時間）した粗酵素液を，ＦＰＬＣを用いて精製し，組換ＰＹＬ（ＰＹＲ１，ＰＹＬ１−６，ＰＹＬ８−１０）及びＨＡＢ１を調製した。９６穴プレートにβ−メルカプトエタノール，塩化マンガン水溶液，ＨＡＢ１，ＰＹＬ，試料のジメチルスルホキシド溶液，超純水を順に加え，２２℃で３０分静置した後に，ＨＡＢ１の人口基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェートを加えて反応を開始し，マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ，インフィニットＴＭ  Ｎ２００  ＮａｎｏＱｕａｎｔ）に入れた。ｐ−ニトロフェニルホスフェートの加水分解産物であるｐ−ニトロフェノールの４０５ｎｍの吸光度を反応開始３分後に測定し，下記式（２）にしたがってＨＡＢ１の活性を計算した。なお，ジメチルスルホキシドのみを加えた画分をコントロールとして，その時の活性を１００％とした。その結果を図３及び表２に示す。実施例１及び４〜９の化合物は、ＡＢＡ受容体のアンタゴニストとして作用することが明らかとなった。
ＨＡＢ１比活性（％）＝サンプル添加時の吸光度／コントロールの吸光度×１００…（２）【００６２】
【表２】
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【００６３】
試験例６：等温滴定型カロリメーターを用いた結合親和性測定試験
試験例５と同様の手順で，組換ＰＹＬ５のリン酸ナトリウムバッファー溶液を調製し，これを等温滴定型カロリメーター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＭｉｃｒｏＣａｌ  ｉＴＣ２００）の反応セルに入れ，実施例１の化合物のリン酸ナトリウムバッファー溶液をシリンジ内に入れた。その後，上記のカロリメーターを２０℃に設定し，測定を行った。実施例７〜９の化合物についても上記と同様の測定を行った。比較対象としてＡＢＡおよび比較例１の化合物のリン酸ナトリウムバッファー溶液を用いた結果を表３に示す。実施例１及び７〜９の化合物の解離定数ＫｄはＡＢＡ及び比較例１の化合物よりも低く、ＡＢＡ受容体へ親和性が強いことが明らかとなった。【００６４】
【表３】
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【００６５】
試験例７：シロイヌナズナ生育試験
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ｃｏｌ−０）種子を５％ブリーチ＋１％ＳＤＳ水溶液５００ｍＬ，７０％エタノール水溶液５００μＬ，７０％エタノール水溶液５００μＬにそれぞれ１分間ずつ順に浸漬し，滅菌水１ｍＬで５回洗浄した後に，０．１％寒天水溶液に懸濁した。オートクレーブで滅菌した発芽培地（含１／２ＭＳ培地無機塩類）を滅菌プラスチックシャーレに２５ｍＬずつ加え，ここに０．１％寒天水溶液に懸濁した種子を６０−８０粒ずつ播種し，暗所下，４℃で３日間春化処理した。これを２２℃，連続光下で１０日間培養した。滅菌した土（有機培養土：バーミキュライト＝１：１）をプラスチックポット（５０ｍｍ×５０ｍｍ×５０ｍｍ，３５ｍｍ底面×３５ｍｍ高さ）に４０ｇずつ加えた。このプラスチックポット６個を３０００ｍＬ容トレーにいれ，１０００倍希釈ＨＹＰＯＮｅＸ（商品名（登録商標），株式会社ハイポネックスジャパン製）水溶液３００ｍＬを加え（深さ１０ｍｍ），シロイヌナズナ実生を５株ずつプラスチックシャーレから移植した。これを２２℃，１６時間明期−８時間暗期下で培養し，０．１％ＤＭＳＯ（実施例７の化合物を含む）＋０．１％アプローチＢＩ（商品名（登録商標），花王株式会社製）水溶液１ｍＬ（実施例７の化合物の最終濃度が５０μＭになるように調製）を１日１回噴霧した。また，１週間ごとに２０００倍希釈ＨＹＰＯＮＥＸ水溶液３００ｍＬを加えた。上記と同様の処理を比較例１の化合物を用いて行った。なお，上記化合物を含まない０．１％ＤＭＳＯ＋０．１％アプローチＢＩ水溶液１ｍＬを１日１回噴霧したものをコントロールとして用いた。さらに，上記と同様の条件で，０．１％ＤＭＳＯ（実施例７の化合物を含む，比較例１の化合物を含む，又はこれらの化合物を含まない）＋０．１％アプローチＢＩ水溶液１ｍＬ（化合物を含む場合には、その最終濃度が５０μＭになるように調製）に，ＡＢＡを添加しＡＢＡの最終濃度が５μＭになるように調製し，これを１日１回噴霧する試験を行った。３週間培養後のシロイヌナズナの生育状態を比較したところ，ＡＢＡのみを投与した場合，シロイヌナズナの生育が顕著に抑制された。これに対し，比較例１の化合物とＡＢＡを共投与した場合，ＡＢＡの生育抑制効果はほとんど改善されなかった。他方で，実施例７の化合物とＡＢＡを共投与した場合，ＡＢＡによる生育抑制効果が著しく改善され，コントロールと同程度までシロイヌナズナの生育が回復した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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