(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アロースまたはＤ−プシコースを有効成分とすることを特徴とするマラリア原虫の発育阻害剤。
【請求項２】
マラリア原虫が、媒介蚊の体内で発育することを阻害する請求項１に記載のマラリア原虫の発育阻害剤。
【請求項３】
マラリア原虫が、媒介蚊の体内でオオキネート、オオシスト、スポロゾイトのいずれかに発育する段階を阻害する請求項２に記載のマラリア原虫の発育阻害剤。
【請求項４】
Ｄ−アロースまたはＤ−プシコースを媒介蚊に給餌することを特徴とする蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
【請求項５】
１０ｍＭから１００ｍＭの濃度のＤ−アロースまたはＤ−プシコース溶液を媒介蚊に給餌する請求項４に記載の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
【請求項６】
マラリア原虫が、蚊の体内でオオキネート、オオシスト、スポロゾイトのいずれかに発育する段階を阻害する請求項４または５に記載の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
【請求項７】
Ｄ−アロースまたはＤ−アロースおよびＤ−プシコースを有効成分とすることを特徴とするマラリア原虫伝播阻止剤。
【請求項８】
媒介蚊に給餌する請求項７に記載のマラリア原虫伝播阻止剤。
【請求項９】
Ｄ−アロースまたはＤ−アロースおよびＤ−プシコースを１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で含有する請求項７または８に記載のマラリア原虫伝播阻止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は媒介蚊の体内でのマラリア原虫の発育を阻害する薬剤としての希少糖の特性を見出したことに基づいて達成されたものであり、マラリア伝播阻止剤、マラリア原虫の発育阻止剤あるいはこれらの剤を用いたマラリア伝播阻止方法、マラリア原虫発育阻止方法を提供するものである。本発明は、人類最大の寄生原虫感染症といわれ、年間約２億人の感染者数と約１００万人の死亡者が推定されるマラリアの罹病患者の発生を抑制することを可能とするものである。          
【背景技術】
【０００２】
マラリアは蚊によって媒介される伝染病であり、今なお熱帯・亜熱帯の広範な地域において蔓延しており、年間約２億人以上の感染者と６０万人の死亡者（ほとんどがサハラ砂漠以南の５歳以下の子供）をだしている感染性の高い疾患である。世界人口の約４０％がマラリアの流行地域に居住している。結核およびジフテリアと並びマラリアは既に克服されたと考えられていた感染症ではあるが、マラリアの発生地域は、地球温暖化によってこれまで希にしか確認されていなかった温帯地域にも拡大しつつあり、近い将来、日本の本州での流行も懸念されている。これは、グローバリセーション、地球規模での人的移動の拡大と地球温暖化による媒介蚊の生息域が北上していることによるものと考えられる。さらに、マラリア原虫は各種薬剤に対し耐性を獲得し、薬剤耐性原虫の拡散、殺虫剤耐性蚊の増加はマラリアの制圧を困難なものとしている。
このような状況下において、マラリア制圧に向けてワクチンの開発、媒介蚊の生態生理の解明、マラリア原虫の生理機構の解明、ヒトの免疫応答の解析、病理病態解析、新規抗マラリア剤の開発など、あらゆる方面から研究がなされている。中でも、マラリアを根絶する上で有効なワクチンの開発が渇望されている。【０００３】
現在のわが国においてはマラリアの流行はないが、最近のように海外へ出かける機会が多くなるにつれて、現地で感染し帰国後に発病する例が増加している。マラリアは、４種類の原虫を病原体とし、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、および卵型マラリア原虫(Plasmodium ovale)に大別されるが、サルマラリア原虫の一種であるPlamodium knowlesiがヒトに感染（人畜共通感染症）することが分かり、「第５のヒトマラリア」とも言われている。マラリアの特徴的症状は悪寒とそれに続く発熱、さらに多量の発汗である。マラリアの他の徴候は貧血、脾腫、重要臓器への血流低下、血小板減少、および急性腎不全などである。さらに、病変が中枢神経系に及ぶと、せん妄、痙攣、麻痺、昏睡が起こり、治療が遅れると死に至ることがある。臨床的には熱帯熱マラリアが最も病原性が高く、劇症マラリアや脳性マラリアを起し、死亡率も高い。【０００４】
マラリアはハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の蚊によって媒介される。メス蚊がマラリア感染者を吸血する際、蚊体内に取り込まれた雌雄の生殖母体が活性化されて生殖体へと変化し、受精を行う。受精により形成されたザイゴート（融合体）はオオキネート（虫様体）へと分化して中腸を貫通し、中腸基底膜下にオオシスト（胞嚢体）を形成する。その後２週間程度でオオシスト内部に多数のスポロゾイト（感染型虫体）を形成する。形成されたスポロゾイトは体腔へ出た後に次第に唾液腺に集まり、蚊が再びヒトを吸血する際に唾液とともに人体に侵入する。人体内に入ったスポロゾイトは血流に乗って肝臓に運ばれて肝細胞に侵入する。肝細胞内でシャイゾント（分裂体）に発育し、多くのメロゾイトとなって肝細胞を破壊して現れ、今度は赤血球に侵入する。赤血球内では、リング（輪状体または早期栄養体）からトロホゾイト（後期栄養体）、シャイゾントへと進み、赤血球膜を破って再び多数のメロゾイトが現れ、これが新しい赤血球に侵入し、同様のサイクルを繰り返すことにより、増殖していく。赤血球内の発育を繰り返す間に、一部の原虫は生殖母体となり、これは蚊に吸われると前述の有性生殖を営むが、吸われないと早晩死滅する。【０００５】
上述したマラリアの治療薬としては、リングやトロホゾイトなどの赤血球内発育ステージを殺しまたは発育を抑制する薬剤が用いられており、かかる薬剤としては、クロロキン、ファンシダール、キニーネ、メフロキンなどが知られている。しかし、これらの薬剤は何れも比較的毒性が高く、胃腸傷害、頭痛、発熱などの副作用を有することから、それらの治療効果、ヒトに対する毒性、副作用の点からは必ずしも満足できるマラリア治療剤ではない。また、これらの薬剤に対して耐性を持つ原虫が増えている問題がある。最近使用されるようになったアルテミシニン系薬剤はマラリア治療薬の最後の砦として重要な役割を担っており、耐性原虫の出現を避けるために必ず他の抗マラリア薬との併用を行うように勧告されている。しかしながら一部地域ではすでにアルテミシニン系薬剤に対する耐性原虫の出現が報告されている。さらに、マラリア原虫におけるワクチン標的抗原の多様性のため、ワクチン開発が困難であるといった問題もある。これらの理由によりマラリア治療に関しては、国毎に治療方針が異なる場合もあるというのが現状である。【０００６】
マラリア治療薬としては、例えば以下の文献を例示することができる。
ω３脂肪酸、例えば、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのアシル残基を有する化合物（具体的にはＤＨＡエチルエステルなど）を有効成分として含有するマラリア治療薬（特許文献１）、キノリンを効率的に原虫内に送り込むことができるD ( + ) -グルコース誘導体からなる新規化合物からなるマラリア治療薬（特許文献２）、ビリベルジンなどのテトラピロール誘導体及びその塩からなり、メロゾイトの赤血球侵入を阻害するとともにリングやトロホゾイトなどの赤血球内発育体の発育を抑制する作用を有する抗マラリア剤（特許文献３）が提案されている。【０００７】
また、次の化合物もマラリアの治療剤として提案されている。
例えば、寄生虫感染治療のための医薬品の製造におけるリミノフェナジンの使用を提供する（特許文献４）、ω３ 脂肪酸と抗酸化剤を含む原虫感染症予防治療薬であって、例えば、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ Ｅ Ｐ Ａ ）または４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ Ｄ Ｈ Ａ ）と、ビタミンＥ を含む原虫感染症予防治療薬（特許文献５）、キジマイシンまたはその塩を有効成分とする殺マラリア原虫剤、およびこれを利用するマラリア疾患の予防および治療薬（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−１４８１４０号公報
【特許文献２】特開平２００８−１６３０号公報
【特許文献３】特開平６−１５７３０８号公報
【特許文献４】特開平８−２３１４０１号公報
【特許文献５】特開２００４−３０７４２８号公報
【特許文献６】特開２００１−２７８７８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】応用糖質科学  第５巻  第１号  ４４−４９（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
医学が発達した現状においても、マラリアは世界三大感染症のひとつとして猛威を振るっている。マラリア予防あるいは対処の具体的方法には３種類あり、防蚊対策、予防内服、罹病後の治療である。マラリア流行地での最も基本的な予防法は、蚊に刺されないための工夫、すなわち防蚊対策である。この方法は安価で、薬剤による人体への影響が殆どなく、しかも徹底して行えば予防効果は高い。マラリア流行地域での防蚊対策は住民全員で実施すべきものであるが、しかし実際には、住居の設備の不備、夕方以降の時間帯での外出が不可避であるなど、防蚊対策を広い地域で完璧に行なうのは困難である。
薬物を用いる手段としては、予防内服（抗マラリア薬を予防目的で服用すること）と罹病後の治療の２種類がある。しかし、いずれも薬剤の副作用の問題を無視することはできない。【００１１】
これまでのマラリア制圧のための研究には次の分野で行われ従来からの問題点を解決する努力が行われてきた。
１．新規診断法の開発：診断には現在でも顕微鏡法が簡便で正確であり広く実施されているが、ＰＣＲなどの遺伝子診断は先進国のみで行われている。また、イムノクロマトグラフィーによる迅速診断キットが有用であるが普及はしていないのが現状である。こうした現状の中で、採血を必要としない診断法の開発が求められている。
２．新規抗マラリア薬の開発：現在主流となりつつあるアルテミシニン系薬剤に対する耐性原虫の発生が既に報告されていることからも、薬剤耐性が生じにくい薬剤の開発が求められているが、製薬企業は研究開発に消極的である。
３．マラリアワクチンの開発：実験室レベルでの効果が確認できても、臨床試験のハードルが高く製薬企業は研究開発に消極的である。
４．媒介蚊対策：殺虫剤の散布は環境への影響、コスト面から大量散布は困難であるとともに、殺虫剤耐性蚊の出現、拡散は避けられない。殺虫剤浸漬蚊帳の使用は効果が高い対策であるがその普及は十分ではない。【００１２】
このようなマラリア予防、治療に係る医療分野の現状と問題点を考慮することにより、本発明者らは、媒介蚊対策の新たな方策として、媒介蚊に摂取させることにより、蚊体内でマラリア原虫の発育を阻害する薬剤（化合物）を見出すことを目指し、その探索に関しては安全性の面から既存薬（化合物）のリプロファイリングとしての展開を目標として鋭意努力を積み重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、希少糖を有効成分とするマラリア原虫発育阻害剤を提供するものであり、特に、マラリア媒介蚊に希少糖を摂取させることにより媒介蚊体内での原虫の発育を阻害させることができるマラリア伝播阻止薬を提供するものである。
これまでの薬剤によるマラリア予防・治療は、薬剤を人体内に投与してマラリア原虫の殺滅をはかるものであり、副作用発現のリスクを避けられなかったが、本発明のマラリア原虫発育阻害剤では人体への副作用および安全性に対する懸念は避けられる。本発明で使用するＤ−アロースおよびＤ−プシコースは甘味剤としても使用される物質であるから、例えば、子供が本発明のマラリア原虫発育阻害剤を誤飲しても何ら心配はない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下の（１）ないし（４）のマラリア原虫の発育阻害剤を要旨とする。
（１）希少糖を有効成分とすることを特徴とするマラリア原虫の発育阻害剤。
（２）希少糖がＤ−アロースまたはＤ−プシコースである上記（１）に記載のマラリア原虫の発育阻害剤。
（３）マラリア原虫が、媒介蚊の体内で発育することを阻害する上記（１）または（２）に記載のマラリア原虫の発育阻害剤。
（４）マラリア原虫が、媒介蚊の体内でオオキネート、オオシスト、スポロゾイトのいずれかに発育する段階を阻害する上記（３）に記載のマラリア原虫の発育阻害剤。【００１４】
また、本発明は以下の（５）から（８）の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法を要旨とする。
（５）希少糖を媒介蚊に給餌することを特徴とする蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
（６）１０ｍＭから１００ｍＭの濃度の希少糖溶液を媒介蚊に給餌する上記（５）に記載の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
（７）希少糖が、Ｄ−アロースまたはＤ−プシコースである上記（５）または（６）に記載の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。
（８）マラリア原虫が、蚊の体内でオオキネート、オオシスト、スポロゾイトのいずれかに発育する段階を阻害する上記（５）から（７）のいずれかに記載の蚊の体内でのマラリア原虫発育阻害方法。【００１５】
また、本発明は以下の（９）から（１２）のマラリア原虫伝播阻止剤を要旨とする。
（９）希少糖を有効成分とすることを特徴とするマラリア原虫伝播阻止剤。
（１０）媒介蚊に給餌する請求項９に記載のマラリア原虫伝播阻止剤。
（１１）希少糖を１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で含有する上記（９）または（１０）に記載のマラリア原虫伝播阻止剤。
（１２）希少糖が、Ｄ−アロースまたはＤ−プシコースである上記（９）から（１１）のいずれかに記載のマラリア原虫伝播阻止剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、次の効果が奏される。
１．媒介蚊体内でマラリア原虫の発育が阻害されて感染型虫体（スポロゾイト）が形成されない。このため、媒介蚊に刺されてもマラリアに感染しない。
２．マラリア原虫伝播阻止薬、マラリア原虫発育阻害剤の使用は簡便である。
３．有効成分である希少糖は自然界に存在し、現在甘味料などとしても利用されている糖であることから、人体あるいは自然界への影響はきわめて少ない。
４．殺虫剤のように自然環境を乱すことがないことから、媒体蚊に対して広範囲の地域で長期間にわたり継続して適用することが可能となる。
５．既存化合物のリプロファイリングとして展開されるため実用化を容易に行うことが可能である。
６．自然界に存在する化合物であることから希少糖耐性のマラリア原虫の発生の可能性は低い。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マラリア原虫の人体内での生活史を示す。
【図２】マラリア原虫の媒体蚊の体内での生活史を示す。
【図３】希少糖によるマラリア伝播阻止効果を検討するための実験方法を示す。
【図４】実施例1の吸血後１日経過した媒体蚊の中腸内でのオオキネートの数を示す。
【図５】実施例1の吸血後１０日経過した媒体蚊の中腸でのオオシストの数を示す。
【図６】実施例1の吸血後１８日経過した媒体蚊の中腸でのスポロゾイトの数を示す。
【図７】実施例1の吸血後１８日経過した媒介蚊の唾液腺でのスポロゾイトの数を示す。
【図８】実施例３のＤ−アロース濃度が０〜１００ｍＭで吸血後１日経過した媒体蚊の中腸内でのオオキネート数を示す。
【図９】実施例３のＤ−アロース濃度が０〜１００ｍＭで吸血後１０日経過した媒体蚊の中腸でのオオシスト数を示す。
【図１０】実施例３のＤ−アロース濃度が０〜１００ｍＭで吸血後１８日経過した媒体蚊の中腸でのスポロゾイト数を示す。
【図１１】実施例３のＤ−アロース濃度が０〜１００ｍＭで吸血後１８日経過した媒介蚊の唾液腺でのスポロゾイト数を示す。
【図１２】実施例５の吸血後１日経過した媒体蚊の中腸内でのオオキネートの数を示す。
【図１３】実施例５の吸血後１０日経過した媒体蚊の中腸でのオオシストの数を示す。
【図１４】実施例５の吸血後１８日経過した媒体蚊の中腸でのスポロゾイトの数を示す。
【図１５】実施例５の吸血後１８日経過した媒介蚊の唾液腺でのスポロゾイトの数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
従来は、薬剤の投与によって、人体内に侵入したマラリア原虫の駆除あるいは発育を阻害することによりマラリアの症状を消失させることに重点が置かれたが、本発明は、マラリア媒介蚊の体内でのマラリア原虫の発育を阻害することにより、「たとえ感染蚊に吸血されてもマラリアに羅患しない」状況を可能とするものである。
すなわち、本発明は、マラリア原虫が媒体蚊の体内で発育することを阻害して感染型原虫（スポロゾイト）が形成されなくすることにより、媒体蚊に刺されてもマラリアへの感染がないことを達成したものであり、これはマラリア原虫発育阻害物質として希少糖を媒体蚊に給餌することにより達成される。
【００１９】
マラリアは、熱帯熱マラリア（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア（Plasmodium vivax）、卵型マラリア(Plasmodium ovale)、および四日熱マラリア(Plasmodium malariae)に大別され、それぞれの特徴は次の表１に示すが、特に、熱帯熱マラリアは重篤な合併症を起こすこと、薬剤耐性原虫の出現が深刻な問題となっている。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
［マラリア原虫の人体内での生活史］
マラリア原虫の人体内での生活史を図１に示す。
マラリア原虫に感染した蚊が吸血する際にスポロゾイトが人体に注入される。スポロゾイトは血流によって数十秒から数分で肝細胞に侵入する。マラリア原虫は肝細胞内で無性増殖し、数千個のメロゾイトを生じる。この段階の発育を赤血球外発育といい、その虫体を赤外型原虫という。メロゾイトは肝細胞を破って出てきて、赤血球上の特異的な受容体を認識して、赤血球内に入り込む。赤血球に侵入したメロゾイトは指輪形の輪状体、アメーバ様の栄養体、幼若分裂体、成熟分裂体へと成長し再びメロゾイトが形成される。分裂体が成熟すると赤血球を破壊し、血中にメロゾイトが放出される。メロゾイトは短時間で新たな赤血球に侵入して同様のサイクルを繰り返す。このように、赤血球内に入り込んだメロゾイトは赤血球型原虫へと発育し、激しく増殖する。この急性期における人体での症状は、赤血球の破壊を伴った激しい悪寒と高熱で、熱帯熱マラリア以外のマラリアでは周期的な発熱が繰り返される。赤血球の破壊が進むと患者は貧血・脾腫を引き起こすが、熱帯熱マラリアの場合にはさらに脳症状や腎不全などの致命的な合併症を引き起こすことがある。この過程を赤血球内サイクルという。赤血球内で増殖を繰り返す原虫の一部は生殖母体（ガメトサイト）に分化する。生殖母体には雄性生殖母体、雌性生殖母体があり、媒介蚊に移行した後有性生殖を行う。
【００２２】
［マラリア原虫の媒介蚊体内での生活史］
マラリア原虫の媒介蚊内での生活史を図２に示す。
ヒトの血液とともに媒介蚊の体内に取り込まれた雌雄の生殖母体（ガメトサイト）のうち雄性生殖母体は媒介蚊の中腸内で雄性生殖体を生じ（鞭毛放出）、雌性生殖母体は雌性生殖体になり、両者は合体受精してザイゴート（融合体）となる。ザイゴートは運動性のあるオオキネート（虫様体）へと分化し、オオキネートは中腸壁を貫通しその外側に移行してオオシスト（胞嚢体）を形成する。オオシストは約２週間かけて発育して内部に多数のスポロゾイトが形成される。やがてオオシストが破裂してスポロゾイトが体腔へ遊出する。その後スポロゾイトは唾液腺に移行して、その蚊が再びヒトを吸血する際に人体内に注入される。
媒介蚊の体内に取り込まれた生殖母体は受精後約２４時間後にはオオキネートとなり、約２〜３日後にはオオキネートが中腸を貫通し、約５日後からは中腸壁にオオシストを形成する。約１０日後からはオオシスト内にスポロゾイトを形成してやがてこれが破裂する。約１５日後からは唾液腺にスポロゾイトが集積する。
【００２３】
［媒体蚊への希少糖の摂取］
マラリアを媒介する媒体蚊（ハマダラカ）は幼虫期を水中で過ごした後に蛹となり、蛹から羽化して成虫となる。蚊の成虫は果汁を餌として摂取し、果汁に含まれる糖類により比較的長期間生きることが可能である。ハマダラカで血を吸うのは雌のみであり、これは卵形成に必要な栄養分を血液から得る必要があるからである。
本発明において、希少糖を媒体蚊に給餌するには、例えば、希少糖の水溶液を与えることが簡便である。媒体蚊は糖類をその餌とすることができるためフラクトースやグルコースなどの糖類と希少糖の混合溶液の形態で給餌することができる。媒体蚊に希少糖を給餌する時期には特に限定はなく、希少糖が常に媒体蚊の体内に存在するようにすることが好ましい。希少糖を給餌するには、容器に希少糖溶液を収納し、溶液の中にろ紙などの水分を吸収する物体の一部を浸漬し、希少糖を吸い上げた物体で媒体蚊が容易に希少糖溶液を摂取することができるようにすることが好ましい。
希少糖を媒介蚊に給餌し本発明の作用効果を発揮するには、希少糖溶液の濃度が１０ｍＭから５００ｍＭの範囲であることが必要であり、好ましくは３０ｍＭから３００ｍＭの範囲内である。さらに好ましい範囲は、５０ｍＭから２００ｍＭである。
希少糖によるマラリア原虫生育阻害効果を発揮するには１０ｍＭ以上の濃度が必要であるが、これより濃度が高いほど阻害効果は上昇する。しかしながら、５００ｍＭ以上とすることは経済面あるいは濃度と阻害効果の相関関係からみて適切とは言えない。
蚊唾液腺内のスポロゾイト数をゼロとしてマラリアの伝播を阻止するには、希少糖濃度を７５ｍＭ以上とすることが好ましい。
希少糖水溶液を媒体蚊に摂取させるためには、媒介蚊の餌となるフラクトース、グルコース、蔗糖などの糖類を混合して給餌することが好ましく、これらの糖類の濃度は特に限定されないが蚊の好む濃度範囲とすることが好ましい。
【００２４】
［希少糖］
本発明のマラリア原虫の発育阻害剤として使用される希少糖は精製された純物質である必要はなく、各種の希少糖および他の糖類を含むものであってもよい。
本発明における希少糖とは、糖の基本単位である単糖（炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある）のうち、自然界に大量に存在するＤ−グルコース（ブドウ糖）に代表される「天然型単糖」に対して、自然界に微量にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義付けられている。一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ-グルコース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-マンノース、Ｄ-リボース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、Ｄ-フラクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、Ｄ-プシコース、Ｄ-タガトース、Ｄ-ソルボース、Ｌ-フラクトース、Ｌ-プシコース、Ｌ-タガトース、Ｌ-ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ-ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。希少糖の存在量は非常に少なく、例えばＤ−アロースは、Ｄ−グルコース（ブドウ糖）に比べて圧倒的に存在量が少ない。
そのなかでも、現在、大量生産が可能な希少糖は、Ｄ−プシコースとＤ−アロースである。Ｄ−プシコースは、ケトヘキソースに分類されるプシコースのＤ体であり、六炭糖である。また、Ｄ−アロースは、アルドースに分類されるＤ−アロースのＤ体であり、同じく六炭糖である。Ｄ−プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的または生物学的な方法により合成されたもの等を含め、どのような手段により入手してもよい。Ｄ−アロースは、Ｄ−プシコースを含有する溶液にＤ−キシロースイソメラーゼを作用させて、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生成させるなどして入手できるが、この方法に限定せず、どのような手段により入手してもよい。
【００２５】
上記希少糖のうち、例えば、Ｄ−アロースを得る方法としては、Ｌ−ラムノース・イソメラーゼを用いてＤ−プシコースから合成する方法や、Ｄ−プシコース含有溶液にＤ−キシロース・イソメラーゼを作用させて得る方法などが開示されているが、本発明におけるＤ−アロースは、それだけに限られず、化学的な処理方法により異性化されたものなど、何れの方法によって得られたものでも構わない。また、Ｄ−プシコースを得る方法は、現在のところ、フラクトースを酵素（エピメラーゼ）処理して得られる製法が一般的であるが、それだけに限られず、該酵素を生産する微生物を利用した製法により得られたものでも良いし、天然物から抽出されたもの、もしくは天然物中に含まれるものをそのまま用いても良いし、化学的な処理方法により異性化されたものでも良い。また、酵素を利用してＤ−プシコースを精製する方法は公知である。
【００２６】
本発明における希少糖としては、上述の希少糖（例えば、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タガトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−プシコース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース）を適宜選択して用いることができる。特に、希少糖含有シロップの形態で用いることもできる。希少糖含有シロップは、上述の希少糖（例えば、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タガトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−プシコース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース）を適宜選択し、一般的なシロップ（液糖）に適宜混合することでも得られるが、市販品「レアシュガースウィート」（発売元：（株）レアスウィート、販売者：松谷化学工業（株））として、容易に入手することができる。「レアシュガースウィート」は、異性化糖を原料として得られる希少糖を含有するシロップであり、希少糖として主にＤ−プシコースおよびＤ−アロースが含まれるように製造されたものである。当該手法により得られる希少糖含有シロップに含まれる希少糖は、全糖に対する割合でＤ−プシコース０．５〜１７質量％、Ｄ−アロース０．２〜１０質量％であるが、未同定の希少糖も含まれている。このシロップからＤ−アロースやプシコースを分離精製して使用しても良いが、シロップのままでの使用も考えられる。
【００２７】
希少糖含有シロップを得る方法は、上記手法に限られるものではなく、単糖（Ｄ−グルコースやＤ−フラクトース）にアルカリを作用させ、１９世紀後半に発見された反応、ロブリー・ドブリュイン−ファン  エッケンシュタイン転位反応やレトロアルドール反応とそれに続くアルドール反応を起こさせ（以上の反応をアルカリ異性化反応と呼ぶ）、生じた各種単糖（希少糖含む）を含むシロップを広く「希少糖含有シロップ」と呼ぶことができ、Ｄ−グルコースおよび／もしくはＤ−フラクトースを原料として、Ｄ−グルコースおよび／もしくはＤ−フラクトース含量が５５〜９９質量％になるまでアルカリ異性化したシロップが例示される。非特許文献１によると、上記の市販品「レアシュガースウィート」について、この希少糖を含むシロップの中には、Ｄ−プシコース５．４ｇ／１００ｇ、Ｄ−ソルボース５．３ｇ／１００ｇ、Ｄ−タガトース２．０ｇ／１００ｇ、Ｄ−アロース１．４ｇ／１００ｇ、Ｄ−マンノース４．３ｇ／１００ｇが含まれていたことが報告されている。
【００２８】
［マラリア伝播阻止効果の検討］
本発明は、媒介蚊の体内でマラリア原虫の発育を阻害することにより蚊の体内でスポロゾイトの形成を阻止し、よって人が蚊に刺されてもマラリア原虫が人体内へ侵入することがなく、マラリアの伝播が阻止される。
マラリア伝播を阻止するためには、あらかじめ媒介蚊に希少糖を含有する餌を給餌しておき、次いで、ローデントマラリア原虫（Plasmodium berghei）に感染しているマウスの血液を吸わせることにより生殖母体（ガメトサイト）を媒介蚊の体内に取り込ませる。その後、希少糖を含有する餌を与え続けて、生殖母体を体内に取り込ませた後1日経過した時点で中腸でのオオキネートの数を評価し、１０日後の中腸のオオシストの数、１８日後の中腸スポロゾイトおよび唾液腺スポロゾイトの数を評価することにより、希少糖によるマラリア原虫の発育阻害効果を検討した。
その結果、1日後の中腸オオキネート形成はＤ−プシコースにより幾分抑制されたが、Ｄ−アロースでは抑制されなかった。１０日後の中腸オオシストの形成はＤ−アロースにより抑制された。また、１８日後の中腸および唾液腺スポロゾイトの形成はＤ−アロースにより抑制された。これらの結果により、希少糖であるＤ−アロースあるいはＤ−プシコースによりマラリア原虫の生育に希少糖の給餌が影響することが判明した。
感染マウス吸血の２０日後に、希少糖（Ｄ−アロースあるいはＤ−プシコース）を与えた蚊と、希少糖を与えていない蚊、それぞれの蚊をマウスに吸血させ、マウスへのマラリアの感染性を検討したところ、Ｄ−アロースを与えた蚊に吸血させたグループでは約７０％のマウスでマラリア感染が認められず、希少糖による感染阻害効果が確認された。
【００２９】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。実施例１−４により、希少糖Ｄ−アロースを含有する糖液で飼育したハマダラカに、ローデントマラリア原虫（Plasmodium berghei）感染マウスを吸血させた後、引き続きＤ−アロース含有糖液で飼育を継続すると、蚊体内におけるマラリア原虫の発育が阻害されることを明らかにした。さらに、実施例５−６により、市販されている希少糖含有糖液であるレアシュガースウィート（Ｄ−アロースが含まれる）を用いて同様の実験を行った結果、２．３倍に希釈したレアシュガースウィートが伝播阻止効果を有することを明らかにした。
これらの結果は、個別に調製したＤ−アロース含有糖液に加えて、市販されているＤ−アロース含有希少糖液をも、流行地におけるマラリア伝播阻止薬として応用し得る可能性を示している。
なお、本発明がこれらの実施例により限定されることはない。
【実施例１】
【００３０】
希少糖によるマラリア原虫の発育阻止効果を検討した。図３には、希少糖によるマラリア伝播阻止効果を検討した実験方法を模式的に示した。
まず、約２００匹のハマダラカからなる群を３群用意して第１群には１００ｍＭのＤ−アロースと４４０ｍＭのＤ−フラクトースの混合水溶液を給餌し、第２群には１００ｍＭのＤ−プシコースと４４０ｍＭのＤ−フラクトースの混合水溶液を給餌し、第３群には４４０ｍＭのＤ−フラクトース水溶液を給餌してコントロールとした。これらの水溶液を三角フラスコに入れ、この水溶液中にろ紙の下端部を浸漬し、ろ紙に吸収された水溶液をハマダラカに吸わせることにより給餌した。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）にローデントマラリア原虫(Plasmodium berghei)の感染赤血球を腹腔内投与してマラリアに感染したマウスを用意した。
各群のハマダラカにはそれぞれの水溶液を３日間吸わせておいた後、ローデントマラリア感染マウスを吸血させることにより、ハマダラカの体内にマラリア原虫を取り込ませた。次いで、希少糖を含有するフラクトース水溶液またはフラクトースのみの水溶液を与え続けながら、蚊体内での原虫数を後述するタイミングにおいて評価した。すなわち感染吸血２４時間後に中腸オオキネート数を、１０日後に中腸オオシスト数を、１８日後に中腸および唾液腺のスポロゾイト数をそれぞれカウントして、３群の結果を対比した。その結果を図４から図７に示す。【００３１】
図４には吸血後１日経過した蚊の中腸オオキネートの数をカウントした結果を示す。Ｄ−プシコースによりオオキネートの形成は若干抑制されているが、Ｄ−アロースによる抑制はわずかである。吸血１０日後、すなわちオオキネートが中腸を貫通して形成されたオオシスト数をカウントした結果、Ｄ−アロース給餌群でオオシスト数は、コントロール群の比して９５％抑制されたが、Ｄ−プシコース給餌群では若干促進された（図５）。吸血１８日後の中腸スポロゾイト数は、Ｄ−アロース給餌群ではコントロール群に比べて９８．７％抑制され、Ｄ−プシコース給餌群では約６０％が抑制された。一方、同じく１８日後の唾液腺スポロゾイトでは、Ｄ−アロース給餌群では９８．５％が抑制されたが、Ｄ−プシコース給餌群ではコントロールを若干上回るスポロゾイトの形成が認められた。
【実施例２】
【００３２】
上記実施例１で２０日間給餌して飼育した３群のハマダラカをそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に吸血させた。各群５０匹の蚊に５匹のマウスを、それぞれ１分間×５回ずつ吸血させた。吸血２日後から毎日、各マウスの尾より少量採取した血液から塗抹標本を作成してギムザ染色した後に顕微鏡で原虫の有無を調べた。一部のマウスでは吸血３日後の時点で原虫が認められ、以後発症率が上昇していったが、最終的に吸血後１４日の時点での原虫の有無により発症の有無を判定した。
その結果を表２に示す。Ｄ−プシコース給餌群およびコントロールでは１００％の発症率であったが、Ｄ−アロース給餌群では２９％の発症率であった。これはＤ−アロースを給餌したハマダラカによるマラリア伝播能が有意に抑制されたことを示している。【００３３】
【表２】
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【実施例３】
【００３４】
希少糖によるマラリア原虫の発育阻止効果におけるＤ−アロースの濃度依存性を検討した。４群のハマダラカを用意して、第１群から第３群にはそれぞれ１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭのＤ−アロースと、４４０ｍＭのＤ−フラクトースの混合水溶液を給餌し、第４群には４４０ｍＭのＤ−フラクトースの水溶液を給餌した。これらの水溶液中にろ紙の下端部を浸漬し、ろ紙に吸収された水溶液をハマダラカに吸わせることにより給餌した。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）にローデントマラリア原虫(Plasmodium berghei)の感染赤血球を腹腔内投与してマラリアに感染したマウスを用意した。
各群のハマダラカにそれぞれの水溶液を３日間吸わせておいた後、ローデントマラリア感染マウスを吸血させることにより、ハマダラカの体内にマラリア原虫を取り込ませた。その後は、希少糖を含有する水溶液またはフラクトースのみの水溶液を与え続けながら蚊体内での各タイミングにおける原虫数をカウントした。すなわち感染吸血２４時間後に中腸オオキネート数を、１０日後に中腸オオシスト数を、１８日後に中腸および唾液腺のスポロゾイト数をそれぞれカウントして、４群の結果を対比した。その結果を図８から図１１に示す。【００３５】
図８は吸血後１日経過した蚊の中腸オオキネート数をカウントした結果である。１０ｍＭから１００ｍＭのＤ−アロース濃度範囲において、濃度依存的にオオキネートへの発育が抑制された。吸血１０日後、すなわちオオキネートが中腸を貫通して形成されたオオシスト数もＤ−アロースの濃度依存的に抑制され、特に１００ｍＭでは中腸オオシストの発育がほぼ完全に抑制された（図９）。さらに、吸血１８日経過後の中腸スポロゾイト数および唾液腺スポロゾイト数についても同様の傾向を示し、１００ｍＭのＤ−アロースを給餌することによりスポロゾイト形成が完全に抑制されることが判明した（図１０、図１１）。
これらの実験結果から、Ｄ−アロース濃度が１０〜１００ｍＭの範囲で蚊体内でのマラリア原虫の分化発育が抑制されることが実証された。
【実施例４】
【００３６】
上記実施例３で２０日間給餌して飼育した４群のハマダラカをそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に吸血させた。各群５０匹の蚊に５匹のマウスを、それぞれ１分間×５回ずつ吸血させた。吸血２日後から毎日、各マウスの尾より少量採取した血液から塗抹標本を作成してギムザ染色した後に顕微鏡で原虫の有無を調べた。吸血後１４日目の時点で発症の有無を判定した。その結果を表３に示す。１０ｍＭのＤ−アロースを給餌した群、３０ｍＭのＤ−アロースを給餌した群、フラクトース単独給餌群の蚊に吸血させたマウスはいずれも１００％発症したが、１００ｍＭのＤ−アロースを給餌した群の蚊に吸血させたマウスでは全て発症しなかった。Ｄ−アロース３０ｍＭ給餌群も１００％の発症率ではあったが、１０ｍＭのＤ−アロース給餌群およびフラクトース単独給餌群に比べて、発症が１日遅かった。Ｄ−アロース３０ｍＭ給餌群において発症が１日遅れたことは、吸血の際にマウスに接種されたスポロゾイト数がおよそ１０分の１であったことを示唆しており、当該群の唾液腺スポロゾイト数が有意に減少していた結果と一致すると同時に、少数であっても唾液腺にスポロゾイトが存在する限り、吸血によるマラリア伝播率をゼロにすることが難しいことを示している。本実験ではＤ−アロースを給餌したハマダラカによるマラリア伝播能が有意に抑制されたことを示しており、特にＤ−アロース１００ｍＭ給餌群の蚊に吸血させたマウスで１００％の発症抑制を達成したことは、特筆に値する。【００３７】
【表３】
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【実施例５】
【００３８】
実施例１〜２の中で、１００ｍＭのＤ−アロース（＋４４０ｍＭ  Ｄ−フラクトース）がマラリア伝播を完全に阻止することを示したが、実施例５ではすでに一般の店頭で販売されているレアシュガースウィート（ＲＳＳ）について、マラリア伝播阻止効果を検証した。
ＲＳＳは糖分７０％の液糖であり、原液のままでは蚊に吸わせることが困難であったため、糖分３０％相当となるように２．３倍に希釈して実験に用いた。
Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースを主組成とする混合糖である異性化糖（ブドウ糖果糖液糖）のアルカリ異性化により製造された希少糖を含むシロップ（ＲＳＳ）は、１００ｇ中にＤ−プシコース５．４ｇ、Ｄ−ソルボース５．３ｇ、Ｄ−タガトース２．０ｇ、Ｄ−アロース１．４ｇ、Ｄ−マンノース４．３ｇを含む変換型の異性化糖であり、一般店頭で販売されている「食品」である。
実施例１の第２群（１００ｍＭのＤ−プシコースと４４０ｍＭのＤ−フラクトースの混合水溶液）を、レアシュガースウィート（ＲＳＳ）を純水で２．３倍に希釈したものに変更した以外は、実施例１と同様にして、希少糖によるマラリア原虫の発育阻止効果を検討した。その結果を図１２から図１５に示す。【００３９】
図１２には吸血後１日経過した蚊の中腸オオキネートの数をカウントした結果を示す。レアシュガースウィート（２．３倍希釈）によりオオキネートの形成は、Ｄ−アロース＋フラクトースによる抑制と同様で、わずかである。
吸血１０日後、すなわちオオキネートが中腸を貫通して形成されたオオシスト数をカウントした結果、Ｄ−アロース＋フラクトース給餌群でオオシスト数は、コントロール群に比して１００％抑制されたが、レアシュガースウィート（２．３倍希釈）給餌群では９５．６％抑制された（図１３）。吸血１８日後の中腸スポロゾイト数は、Ｄ−アロース＋Ｄ−フラクトース給餌群ではコントロール群に比べて１００％抑制され、レアシュガースウィート（２．３倍希釈）給餌群では約９９．５％が抑制された。一方、同じく１８日後の唾液腺スポロゾイトでは、Ｄ−アロース＋フラクトース給餌群、レアシュガースウィート（２．３倍希釈）給餌群とも１００％抑制された。
【実施例６】
【００４０】
上記実施例５で２０日間給餌して飼育した３群のハマダラカをそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に吸血させた。各群５０匹の蚊に５匹のマウスを、それぞれ１分間×５回ずつ吸血させた。吸血２日後から毎日、各マウスの尾より少量採取した血液から塗抹標本を作成してギムザ染色した後に顕微鏡で原虫の有無を調べた。一部のマウスでは吸血３日後の時点で原虫が認められ、以後発症率が上昇していったが、最終的に吸血後１４日の時点での原虫の有無により発症の有無を判定した。
その結果を表４に示す。コントロールでは１００％の発症率であったが、レアシュガースウィート（２．３倍希釈）給餌群ではＤ−アロース＋Ｄ−フラクトース給餌群と同様、マラリア伝播が完全に阻害された。【００４１】
【表４】
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【００４２】
驚くべきことに、レアシュガースウィート（ＲＳＳ）の２．３倍希釈液は１００ｍＭのＤ−アロース（＋Ｄ−フラクトース）と同様の完全な伝播阻止効果を示した。一般店頭で販売されている「食品」がマラリア伝播を完全に抑制するという注目に値する結果が得られた。「１００ｍＭ Ｄ−プシコース＋Ｄ−フラクトース」では伝播阻止効果が認められなかったため、どのような相互作用が起きているのか不明ではあるが、混合物としてのＲＳＳの効果は１００ｇ中にＤ−プシコース５．４ｇ、Ｄ−ソルボース５．３ｇ、Ｄ−タガトース２．０ｇ、Ｄ−アロース１．４ｇ、Ｄ−マンノース４．３ｇを含むため、それらの希少糖の混合物の効果であるのかも知れない。希少糖投与によってマラリア感染を防げるか否かについて、一般店頭で販売されている「食品」であることから、投与量を増やすことで、引き続き検討を続け、作用機序の解明し、希少糖による伝播阻止が有効なマラリア対策法として認知されることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
世界三大感染症のひとつであるマラリアは、年間感染者数約２億人、死亡者数60万人に及ぶ国際保健上の最重要課題のひとつであるが、薬剤耐性原虫および殺虫剤耐性蚊の拡散、ワクチン開発の遅れ、さらに地球温暖化による媒介蚊生息域の拡大等により、新たな戦略の開発喫緊の課題である。媒介蚊対策では従来の殺虫剤に依存する方法から、人体や環境へ負荷を与えない、殺虫剤を使用しない方法への転換が求められている。エサである糖液に混ぜて蚊に吸わせることで、蚊体内のマラリア原虫に対して発育阻害効果を示す単糖はこれまでに報告されていない。
本発明のマラリア原虫伝播阻止薬、マラリア原虫発育阻害剤を実施することにより、マラリア媒介蚊に刺されてもマラリアに感染する危険性を低く抑えることができる。このことは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、結核とともに世界三大感染症とされるマラリアによる被害を低く抑えることが可能となり、世界人口の４０％が流行地に居住している人々の生命を守ることに貢献することができる。本発明の有効成分である希少糖は自然界に存在し人体あるいは自然界への影響はきわめて少なく、殺虫剤のように自然環境を乱すことがないことから、媒体蚊に対して広範囲の地域で長期間にわたり継続して適用することが可能となるマラリアの対処法を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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