(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する工程、
を含み、
前記サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムが、
熱可塑性樹脂を加熱・溶融する工程、
溶融した熱可塑性樹脂をサンプルと当接させながら冷却する工程、
により形成されたもの（ただし、レーザーマイクロダイセクションにより形成されたものを除く。）、
および、
粒子状の熱可塑性樹脂とサンプルを混合して加熱・溶融する工程、
冷却する工程、
により形成されたもの、
から選択される、サンプル中の成分の分析方法。
【請求項２】
前記サンプルが、生体サンプルである請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、血液である請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、乾燥したものである請求項１〜３の何れか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、薄膜状である請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
前記分析方法により分析されるサンプル中の成分が、ペプチドホルモン又は脂質である請求項１〜５の何れか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する工程、
を含み、
前記サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムが、
熱可塑性樹脂を加熱・溶融する工程、
溶融した熱可塑性樹脂をサンプルと当接させながら冷却する工程、
により形成されたもの（ただし、レーザーマイクロダイセクションにより形成されたものを除く。）、
および、
粒子状の熱可塑性樹脂とサンプルを混合して加熱・溶融する工程、
冷却する工程、
により形成されたもの、
から選択される、サンプル中の成分の特異的分離方法。
【請求項８】
前記サンプルが、生体サンプルである請求項７に記載の特異的分離方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが、血液である請求項８に記載の特異的分離方法。
【請求項１０】
溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、乾燥したものである請求項７〜９の何れか一項に記載の特異的分離方法。
【請求項１１】
溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、薄膜状である請求項１０に記載の特異的分離方法。
【請求項１２】
サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムであって、
前記サンプルが、
生体サンプル、食品、土壌、細菌、および、ウィルスから選択され、且つ、
レーザーマイクロダイセクションにより処理されたものではない、
質量分析用サンプル。
【請求項１３】
前記生体サンプルが、血液である請求項１２に記載の質量分析用サンプル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法及び質量分析用サンプルに関するものである。より具体的には、溶融した熱可塑性樹脂をサンプルと当接させながら冷却することでサンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムを形成し、当該熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を直接照射することで、サンプル中の微量成分を濃縮等の前処理を行うことなく特異的に分離する方法に関するものである。また、サンプル、特に血液等の生体サンプルを用いたサンプル中の成分の分析方法に関するものであり、前記分析方法及び特異的分離方法に用いるための質量分析用サンプルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の現場では、血液や生体組織等に含まれる微量成分を、少ないサンプル量で、短時間で、且つ精度よく分析することが求められている。【０００３】
血液や生体組織等に含まれる生体成分としては、蛋白質、核酸、多糖類等が知られており、医療目的に応じて様々な方法で分析が行われている。例えば、血液中のペプチドホルモンは、様々な疾患に関与していることが知られており、血液中の微量のペプチドホルモンを分析することで、疾患の有無を診断することができる。【０００４】
血液中に含まれるペプチドホルモンの分析方法としては、標的とするペプチドホルモンに特異的に反応する抗体を用いる方法が一般的である。例えば、アルツハイマー病の原因物質として考えられているアミロイドベータ蛋白質（以下、「Ａβ」と記載することがある。）を血液中から分析する方法として、Ａβを特異的に認識する抗体を用いてＥＬＩＳＡにより検出する方法が知られている（特許文献１、２参照）。【０００５】
また、質量分析装置を用いてＡβを分析する方法も知られている（特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１３−５０５４３８号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１１７３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１、２に記載されている発明は、血液中には様々な生体成分が含まれており、ＥＬＩＳＡによりＡβを検出する際に、それら生体成分が夾雑物となるため、検出感度が低いという問題がある。また、質量分析装置により血液中のＡβを分析する際にも、一般的には、免疫沈降等により夾雑物を除去してＡβを濃縮する必要があり、操作が煩雑で時間がかかるという問題がある。【０００８】
更に、微量検体を多項目同時かつ安価に測定する方法として、抗体チップが知られている。しかしながら、同じ反応条件で特異性が高く、親和性も高い抗体を揃えることは困難であることから、抗体チップを用いた生体成分分析の実用化は困難な状況である。上記のとおり、血液中の微量成分を、少ないサンプル量で、短時間で、且つ精度よく分析する方法は知られていない。【０００９】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、
（１）レーザーマイクロダイセクション装置のダイセクションレーザー光をサンプルに照射してサンプルの切り出しを行う際に、サンプルが溶融した熱可塑性樹脂と当接しながら冷却することで、サンプルを内部に取り込んだ熱可塑性樹脂フィルムを形成していること、
（２）サンプルを内部に取り込んだ熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射すると、熱可塑性樹脂フィルム由来のノイズがないのみでなく、サンプル中の成分を特異的に分離できること、
（３）サンプルの特異的分離により、例えば、血液中のペプチドホルモン等の微量成分を濃縮等の前処理を行うことなく、質量分析装置により分析できること、
を新たに見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明の目的は、サンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法及び質量分析用サンプルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下に示す、サンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法及び質量分析用サンプルに関する。【００１２】
（１）サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する工程、
を含むサンプル中の成分の分析方法。
（２）前記サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムが、
熱可塑性樹脂を加熱・溶融する工程、
溶融した熱可塑性樹脂をサンプルと当接させながら冷却する工程、
により形成されたものである上記（１）に記載の分析方法。
（３）前記サンプルが、生体サンプルである上記（１）又は（２）に記載の分析方法。
（４）前記生体サンプルが、血液である上記（３）に記載の分析方法。
（５）溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、乾燥したものである上記（１）〜（４）の何れか一に記載の分析方法。
（６）溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、薄膜状である上記（５）に記載の分析方法。
（７）前記分析方法により分析されるサンプル中の成分が、ペプチドホルモン又は脂質である上記（１）〜（６）の何れか一に記載の分析方法。
（８）サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する工程、
を含むサンプル中の成分の特異的分離方法。
（９）前記サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムが、
熱可塑性樹脂を加熱・溶融する工程、
溶融した熱可塑性樹脂をサンプルと当接させながら冷却する工程、
により形成されたものである上記（８）に記載の特異的分離方法。
（１０）前記サンプルが、生体サンプルである上記（８）又は（９）に記載の特異的分離方法。
（１１）前記生体サンプルが、血液である上記（１０）に記載の特異的分離方法。
（１２）溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、乾燥したものである上記（８）〜（１１）の何れか一に記載の特異的分離方法。
（１３）溶融した熱可塑性樹脂と当接する前のサンプルが、薄膜状である上記（１２）に記載の特異的分離方法。
（１４）熱可塑性樹脂フィルム、及び
該熱可塑性樹脂フィルム上に積層されたサンプル、
を含む質量分析用サンプル。
（１５）サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムを含む質量分析用サンプル。
（１６）前記サンプルが、生体サンプルである上記（１４）又は（１５）に記載の質量分析用サンプル。
（１７）前記生体サンプルが、血液である上記（１６）に記載の質量分析用サンプル。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のサンプル中の成分の分析方法は、サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射することで、熱可塑性樹脂フィルムによりサンプル中の夾雑物を分離し、サンプル中の分析対象成分を分析することができる。特に、サンプルとして血液等を用い、血液中のペプチドホルモン等の微量成分を分析する場合、抗体を用いた濃縮等の前処理をすることなく、簡単且つ短時間で血液中のペプチドホルモンを分析することができる。したがって、アルツハイマー病の発症診断等、血液中のペプチドホルモンの量を検出することで疾患発症の初期段階で診断することが可能である。
また、本発明のサンプル中の成分の特異的分離方法は、サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムに質量分析装置のイオン化レーザー光を照射することで、熱可塑性樹脂フィルムによりサンプル中の成分を特異的に分離することができる。したがって、多様なサンプルを前処理することなく、簡単且つ短時間でサンプル中の成分を分離することができる。
更に、本発明の質量分析用サンプルは、サンプルを、熱可塑性樹脂フィルムに積層又は内部に含んだ状態で保管・移動することができる。したがって、サンプルを熱可塑性樹脂フィルムと一体的に取り扱うことができるので、例えば、質量分析装置を有しない病院等で採取された血液等の生体サンプルを、質量分析装置を有する病院・分析センター等に送付して簡単に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、レーザーマイクロダイセクション装置１の概略を示す図である。
【図２】図２（１）〜（３）は、レーザーマイクロダイセクション装置を用いた、サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムの作製原理の一例を示す図である。
【図３】図３（１）及び（２）は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所のサンプルの位置座標と切り出したサンプルを取り込む熱可塑性樹脂フィルムの位置座標の関係を表す図である。
【図４】図４は、図面代用写真で、血液サンプルの薄膜の写真である。
【図５】図５は、実施例２で得られた質量スペクトルを示す。
【図６】図６は、比較例２で得られた質量スペクトルを示す。
【図７】図７（１）〜（４）は、実施例３〜６で得られた質量スペクトルを示す。
【図８】図８（１）〜（４）は、実施例７〜１０で得られた質量スペクトルを示す。
【図９】図９は、実施例１１で得られた質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明のサンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法及び質量分析用サンプルについて詳しく説明する。
【００１６】
先ず、本発明において、「サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルム」とは、熱可塑性樹脂フィルムにサンプルを単に載せたのではなく、熱可塑性樹脂を溶融し、次いで、冷却して固化する過程で、サンプルと熱可塑性樹脂が混ざり合い、フィルム化した熱可塑性樹脂の内部にサンプルが取り込まれた熱可塑性樹脂フィルムを意味する。
【００１７】
本発明に用いられる熱可塑性樹脂は、溶融することでフィルム状になり、サンプルを内部に取り込むことができれば、形態及び原料に制限はない。例えば、フィルム状の熱可塑性樹脂の上にサンプルを載せて加熱・溶融し、次いで冷却することでサンプルを熱可塑性樹脂フィルム内に取り込んでもよい。また、粒子状の熱可塑性樹脂とサンプルを混合して加熱・溶融し、次いで冷却する過程でサンプルが内部に取り込まれた熱可塑性樹脂フィルムにしてもよい。
【００１８】
熱可塑性樹脂は、融点が低い方がサンプルの熱変性を防止できることから、融点が約５０〜７０℃程度までの熱可塑性樹脂を原料に用いることが好ましく、例えば、エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリオレフィン、ポリアミド、アクリル、ポリウレタン等が挙げられる。なお、分離又は分析するサンプルが、熱安定性に優れている場合は、前記温度以上であってもよい。また、後述するように、ダイセクションレーザーを用いてサンプルを切り出し、熱可塑性樹脂フィルムに含ませる場合は、熱可塑性樹脂にダイセクションレーザー光源の波長域のスペクトルを選択的に吸収するため、ナフタレンシアニン染料等の有機染料を添加してもよく、用いるダイセクションレーザー光源の波長域に応じて好適な有機染料を選択すればよい。熱可塑性樹脂としては、上記の熱可塑性樹脂及び有機染料を適宜配合して作製してもよいし、市販の熱可塑性樹脂フィルムを用いてもよい。市販されている熱可塑性樹脂フィルムとしては、例えば、熱可塑性トランスファフィルム（エレクトロシール社製）、熱可塑性ＥＶＡフィルム（シグマ−アルドリッチジャパン社製）等が挙げられる。
【００１９】
サンプルは、溶融した熱可塑性樹脂フィルムに取り込まれることができ、質量分析装置でサンプル中の成分を分析できるものであれば特に制限は無い。サンプルとしては、例えば、生体から採取した血液、唾液、尿等の液状サンプル、筋肉、骨、脳、臓器等の生体組織（以下、生体から採取した液状サンプル及び生体組織を「生体サンプル」と記載することがある。）、食品、土壌、細菌・ウィルス等が挙げられる。
【００２０】
また、サンプル中の成分としては、質量分析装置により分析できるものであれば特に制限は無い。例えば、サンプルが生体サンプルの場合は、Ａβ、インシュリン等のペプチドホルモン；蛋白質；中性脂質、リン脂質等の脂質；ガラクトース、グルコサミン等の糖類；ＲＮＡ，ＤＮＡ等の核酸が挙げられる。また、食中毒患者や薬物常用者等の血液や尿等の液状サンプルから、病原体、毒素、薬剤等の成分の分析をすることもできる。サンプルが食品の場合は、上記成分の他、食品添加物やビタミンなど栄養成分等の分析をすることができる。サンプルが土壌の場合は、残留農薬等の汚染物質の分析をすることができる。サンプルが細菌やウィルスの場合は、例えば、Ｏ−１５７等の細菌に含まれる毒素、インフルエンザウィルスに含まれる毒性物質等の分析をすることで、抗原抗体反応等を用いなくても簡単に分析することができる。
【００２１】
これらサンプルは、熱可塑性樹脂に取り込まれることができれば、水分を含んでいてもよいが、取り込まれ易くするために、乾燥して用いてもよい。乾燥方法としては、サンプルから水分を飛ばすことができればよく、例えば、乾燥剤を封入した容器内での乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、アルコール乾燥等、公知の乾燥方法を用いればよい。なお、本発明における「乾燥」とは、サンプル中の水分を完全になくすことを意味するのではなく、サンプルが熱可塑性樹脂に取り込まれ易くするためにサンプルの水分を少なくすることを意味し、熱可塑性樹脂に取り込まれる範囲内であれば、サンプルは水分を含んでいてもよい。
【００２２】
質量分析用サンプルは、分析する前に、熱可塑性樹脂フィルムにサンプルが取り込まれていれば、作製方法に特に制限はない。例えば、サンプルを粒子状の熱可塑性樹脂と混合する場合は、サンプルを減圧乾燥、凍結乾燥等により粉末化し、粒子状の熱可塑性樹脂と混合すればよい。また、フィルム状の熱可塑性樹脂を用いる場合は、サンプルも薄膜状のものを用いればよい。薄膜状のサンプルは公知の方法で作製すればよい。例えば、血液や味噌等の粘性のある食品の場合は、スライドガラス上にサンプルを載せ、別のスライドガラスを押圧しながら引くことで、スライドガラス上にサンプルの薄膜を形成することができ、形成した薄膜を減圧乾燥、アルコール乾燥を行えばよい。また、生体組織の場合は包埋剤に入れて凍結ブロックを作製し、凍結ブロックから凍結切片を作製し、得られた切片を減圧乾燥、アルコール乾燥等を行えばよい。
【００２３】
熱可塑性樹脂の加熱は、熱可塑性樹脂を溶融することができれば特に制限は無い。例えば、熱可塑性樹脂フィルム上にサンプルを載せ、ホットプレートで加熱することで熱可塑性樹脂を溶融してもよいし、粉末又は薄膜状のサンプルと熱可塑性樹脂粉末を混合してガラスプレート等の上に載せ、ホットプレートで加熱して熱可塑性樹脂を溶融してもよい。なお、ホットプレートで熱可塑性樹脂（フィルム）を加熱・溶融する場合は、加熱の際にサンプルの水分が減少するので、例えば、血液等の液体サンプルと熱可塑性樹脂とを混合、又は、熱可塑性樹脂フィルムの上に液体サンプルを薄く延ばして加熱してもよい。また、熱可塑性樹脂フィルム上にサンプルを載せ、レーザーマイクロダイセクション装置を用いてサンプルにダイセクションレーザー光を照射し、サンプルの切り出しと熱可塑性樹脂の溶融を同時に行い、熱可塑性樹脂内へ切り出したサンプルの取り込みを行ってもよい。
【００２４】
図１は、レーザーマイクロダイセクション装置１の概略を示す図で、サンプル移動手段２、熱可塑性樹脂フィルム移動手段３、レーザー照射部４、図示しない記憶手段及び移動手段駆動制御部を含んでいる。
【００２５】
図１に示すサンプル移動手段２は、サンプルを載せたスライドガラス２１等を載置することができるサンプル載置台２２と、該サンプル載置台２２を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に移動するための図示しない駆動原及び該駆動原の駆動力をサンプル載置台２２に伝達する駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、倒立顕微鏡等に使われているサンプル載置台を水平方向に駆動するための駆動力伝達機構等、公知のものを用いればよい。
【００２６】
図１に示す熱可塑性樹脂フィルム移動手段３は、熱可塑性樹脂フィルム３１を一端に載置することができ他端はアーム支柱３３に取り付けることができるアーム３２、該アーム３２を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に回転及び垂直方向（Ｚ軸方向）に移動することができるアーム支柱３３、アーム３２を水平方向に回転及び垂直方向に移動するための図示しない駆動原及び該駆動原の駆動力を伝達してアーム３２を回転及び移動するための駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、自動分析装置のサンプル移動用のアーム機構等、水平方向に回転及び垂直方向に移動することができる公知のアーム機構を用いればよい。なお、熱可塑性樹脂フィルム移動手段３は、図１に例示した実施形態に限定されず、熱可塑性樹脂フィルム３１を水平方向及び垂直方向に移動することができれば特に制限は無い。
【００２７】
ダイセクションレーザー光源としては、照射スポットを最小にするためにシングルモードファイバー出力のレーザー光を用いることが好ましく、また、集光の為の近赤外用高ＮＡ長焦点対物レンズを用いることが好ましい。また、パルス幅は０．１ミリ秒〜１００ミリ秒、好ましくは５ミリ秒、波長は７８５ナノメートル〜９００ナノメートル、好ましくは８０８ナノメートル、出力は０．２ワット〜０．３ワット、照射レーザーパワーは０．１％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％のパルスレーザー光を発生できるものが好ましく、具体的には、Ｚ−８０８−２００−ＳＭ（ルシール社製）等が挙げられる。
【００２８】
図２は、レーザーマイクロダイセクション装置を用いた、サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムの作製原理の一例を示す図である。図２（１）に示すようにスライドガラス２１に固定したサンプル２３、及び熱可塑性樹脂フィルム３１を装着した光透過性のアクリル樹脂、ポリカーボネイト樹脂等の樹脂製の支持体を準備する。次に、図２（２）に示すように熱可塑性樹脂フィルム３１をサンプル２３に当接し、支持体及び熱可塑性樹脂フィルム３１を通してダイセクションレーザー光４３をサンプル２３に照射する。次いで、図２（３）に示すように、熱可塑性樹脂フィルム３１をサンプル２３から引き離すと、ダイセクションレーザー光４３を照射して切り出したサンプル２３が、ダイセクションレーザー光４３の照射により溶融した熱可塑性樹脂フィルム３１に包まれるように剥離し、溶融した熱可塑性樹脂フィルムが固化することで、サンプルを内部に含む熱可塑性樹脂フィルムを作製することができる。
【００２９】
なお、本発明は、質量分析の際に、熱可塑性樹脂フィルムを用いてサンプル中の成分を特異的に分離し、そして分離した成分を分析することを特徴としている。そのため、例えば、血液中の微量成分を分析する場合、血液から作製した薄膜サンプルのどの部分に分析対象成分が含まれるのか特定する必要は無いので、図２に示すように、薄膜サンプルの任意の箇所にダイセクションレーザー光を照射すればよい。
【００３０】
一方、脳や臓器等の生体組織の凍結切片の特定領域の生体成分を特異的に分離し、分析する場合は、空間分解能を向上するため、切り出したサンプルの間隔と当該サンプルを取り込む熱可塑性樹脂フィルムの間隔を変えてもよい。図３は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所のサンプルの位置座標と切り出したサンプルを取り込む熱可塑性樹脂フィルム３１の位置座標の関係を表す図で、サンプルを連続的に切り出す場合の例を示している。例えば、図３（１）のサンプル２３をａ、ｂ、ｃ・・・のように連続的に切り出す場合、（ｉ）サンプル移動手段２により、サンプル２３のａの部分をダイセクションレーザー光が照射される位置に移動する。（ｉｉ）次に、熱可塑性樹脂フィルム移動手段３により、図３（２）に示す熱可塑性樹脂フィルム３１の切り出したサンプルａが取り込まれる箇所ａ′を、サンプル２３ａと重なる位置に移動し、アーム３２を垂直方向に下げることで熱可塑性樹脂フィルム３１とサンプル２３を当接する。（ｉｉｉ）ダイセクションレーザー光を照射することで、サンプル２３ａの箇所から切り出したサンプルを熱可塑性樹脂フィルム３１のａ′の位置に接着し、次いで、アーム３２を垂直方向に上げることで熱可塑性樹脂フィルム３１をサンプル２３から離し、熱可塑性樹脂フィルム３１の予め決められた箇所に、サンプル２３ａを取り込ませる。サンプル２３ｂ、ｃ・・・についても、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の手順を繰り返すことで、サンプル２３ｂ、ｃ・・・を、熱可塑性樹脂フィルム３１のｂ′、ｃ′・・・に取り込ませることができる。
【００３１】
サンプル２３から採取するサンプルの大きさＡは、対象とするサンプルや目的に応じて切り出すサンプルの大きさを変えればよい。例えば、細胞下構造体の分析や高空間分解能を得たい場合には１μｍ〜５μｍ、単一細胞を採取する場合には１５μｍ〜３０μｍ、癌や変性部位などを採取する場合は５０μｍ〜１００μｍの大きさのサンプルを、ダイセクションレーザー光を照射してサンプル２３から切り出し採取すればよい。切り出すサンプルの大きさは、照射するダイセクションレーザー光の直径および強度を調整することで、ダイセクションレーザー光の直径と同じ大きさのサンプルを切り出すこともできるし、ダイセクションレーザー光の強度を強くしたり照射時間を長くすることで、ダイセクションレーザー光の直径より大きなサンプルを切り出すこともできる。採取するサンプルに応じて、ダイセクションレーザー光の直径や強度を適宜調整すればよい。ダイセクションレーザー光の直径は、光学絞りや集光レンズ等を用いて焦点を絞ればよい。ダイセクションレーザー光の強度は、可変抵抗などを用いてレーザーの発振体の電圧を変化させれば良い。
【００３２】
更に、サンプルの分析結果に基づき、２次元及び３次元の質量イメージングを行う場合は、切り出したサンプルの位置座標、該切り出したサンプルを取り込む熱可塑性樹脂フィルムの位置座標、及び分析したサンプルの位置座標と分析結果とを関連付け、イメージング処理すればよい。位置座標と分析結果を関連付けることで、従来から使用されている質量分析装置を用いて、安価に質量イメージングを行うことができる。
【００３３】
本発明のサンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法は、質量分析装置のイオン化レーザー光を照射した際に、サンプル中の成分と熱可塑性樹脂フィルムとが何らかの相互作用し、その結果、イオン化した成分の飛び出しに差が出るものと考えられる。したがって、熱可塑性樹脂の種類と分析するサンプル（又は分析対象成分）の組み合わせを適宜設定することで、精度よく分析対象成分の分析を行うことができる。なお、上記のとおり、本発明はサンプル中の成分と熱可塑性樹脂フィルムとの相互作用によりイオン化した成分の飛び出しに差が出ると考えられる。そのため、サンプルと熱可塑性樹脂フィルムの接着面では、予め熱可塑性樹脂フィルムを加熱・溶融しなくても、サンプルと熱可塑性樹脂フィルムが何らかの相互作用をすると考えられるので、例えば、サンプルが非常に薄い場合や、サンプル中に含まれる分析対象成分が多い等の場合は、熱可塑性樹脂フィルムにサンプルを積層して質量分析を行っても、サンプル中の成分の分析を行うことができると考えられる。なお、分析によって得られる質量データは熱可塑性樹脂フィルムの厚みによって初速が変化するため、純品物質での分析値と異なることがある。
【００３４】
本発明に用いられる質量分析装置は、イオン化レーザー光を照射することで生体サンプルをイオン化し、当該イオンを分析するものであれば特に制限は無く、例えば、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）、ＬＣ―ＭＳ（高速液体クロマトグラフ質量分析計）等が挙げられる。
【００３５】
本発明の質量分析用サンプルは、質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する際に、熱可塑性樹脂フィルムにサンプルが取り込まれていればよいので、熱可塑性樹脂にサンプルを積層した状態で保管・移送し、質量分析を行う前に熱可塑性樹脂を加熱・溶融してサンプルを内部に取り込んでもよい。また、熱可塑性樹脂フィルムにサンプルを取り込んだ状態で保管・移送してもよい。したがって、採取したサンプルを熱可塑性樹脂フィルムと一体的に取り扱うことができるので、質量分析装置を有しない病院等で採取されたサンプルを、質量分析装置を有する病院・分析センター等に送付して簡単に分析することができる。また、本発明の質量分析用サンプルは、少なくとも熱可塑性樹脂及びサンプルを含んでいればよいが、必要に応じて、スライドガラス等を含んでいてもよい。
【００３６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３７】
［質量分析用サンプルの作製］
＜実施例１＞
〔血液サンプルの作製〕
マウス（Ｂ５７ＢＬ６、チャールズリバー社）から採取した血液１００μｌに、Ａβ１−４０ペプチド（ペプチド研究所社）の濃度が１０ｎＭとなるように加えることで、血液サンプルを作製した。【００３８】
〔レーザーマイクロダイセクション装置の作製〕
倒立顕微鏡（オリンパス社製ＩＸシリーズ）をベースに、駆動原としてステッピングモータ（Ｂｉｏ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ；ルードル社製）、移動手段駆動制御部として３Ｄ−Ａ−ＬＣＳソフトウエア（ルシール社製）、ダイセクションレーザー光源としてＺ−８０８−２００−ＳＭ（ルシール社製）を取り付けることで、レーザーマイクロダイセクション装置を作製した。【００３９】
〔血液サンプルの熱可塑性樹脂への取り込み〕
上記血液サンプル５μｌを２６ｍｍ×７６ｍｍのスライドガラス上に滴下し、同サイズのスライドガラスを押圧しながら移動させることで、スライドガラス上に血液が均一に広がったスメアを作製した。次に、血液が広がったスライドガラスを、７０％エタノールに１分→１００％エタノールに１分→１００％エタノールに１分→１００％キシレンに１分→１００％キシレンに１分浸漬して乾燥し、血液サンプルの薄膜を作製した。図４は、血液サンプルの薄膜の写真である。次に血液サンプルの薄膜を、以下の手順で、熱可塑性樹脂フィルムに取り込んだ。
（１）レーザーマイクロダイセクション装置の電源を入れ、サンプル載置台の初期化を行った後、得られた血液サンプルの薄膜をレーザーマイクロダイセクション装置のサンプル載置台にセットした。また、先端にＥＶＡフィルム（シグマ−アルドリッチジャパン社製）を装着した中空リングを熱可塑性樹脂フィルム移動手段のアームの先端の孔に挿入した。
（２）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ７（ルシール社製）のプログラムに従い、スライドガラスに固定した血液サンプルの薄膜にダイセクションレーザー光（出力：３００ｍＡ、照射時間：５ｍｓｅｃ、照射径：３０μｍ）を照射し、切り出した血液サンプルをＥＶＡフィルム内に取り込むことで、質量分析用サンプルを作製した。【００４０】
＜比較例１＞
導電性スライドガラス（シグマ−アルドリッチ社、Ｃａｔ  Ｎｏ，５７８２７４，  Ｉｎｄｉｕｍ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏａｔｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）の上に、実施例１と同様の手順で血液サンプルの薄膜を作製することで、ＥＶＡフィルムを含まない質量分析用サンプルを作製した。【００４１】
〔作製したサンプルの質量分析〕
＜実施例２＞
実施例１で作製した質量分析用サンプルを、以下の手順で質量分析を行った。
（１）血液サンプルを含む面が上になるようにして、質量分析用サンプルを導電性両面テープに貼り付けた。
（２）ケミカルプリンタを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供するためのマトリックスを質量分析用サンプルの表面に塗布した。マトリクスにはＣＨＣＡ（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）を用い、１００００ｐｌ（１００ｐｌ×５滴／１ｓｐｏｔ×２０回）の量を塗布した。
（３）キャリアブラントには、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ２（Ｍ．Ｗ．１０４６．３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｍ．Ｗ．  ５８０４．６）を用いて、キャリアブラントの位置情報を設定した。
（４）ＥＶＡフィルムをデシケーターに移し、真空ポンプで２０分乾燥させた後、ＡＸＩＭＡ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（株式会社  島津製作所）にて質量分析を行った。質量分析の測定条件は、Ｌａｓｅｒ  Ｐｏｗｅｒ  ６５、Ｐｒｏｆｉｌｅ  １、Ｓｈｏｔｓ  ２００で、ＣｈＩＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔに各パラメーターを設定した。図５は、ＡＸＩＭＡ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅによる分析結果の質量スペクトルを示す。【００４２】
＜比較例２＞
比較例１で作製した質量分析用サンプルを用いた以外は、実施例２と同様の手順で作製したサンプルの質量分析を行った。図６は、比較例２で得られた質量スペクトルを示す。【００４３】
図５及び図６から明らかなように、実施例２のＥＶＡフィルムに血液サンプルを取り込んでイオン化レーザーを照射した場合と、比較例２の血液サンプルに直接イオン化レーザーを照射した場合では、実施例２の方が、８００〜１４００ｍ／ｚのピークが少なくなっており、１６００〜４０００ｍ／ｚ付近のピークが比較的平滑化している。このことは、血液サンプルを直接イオン化した場合と比較して、ＥＶＡフィルムに血液サンプルを取り込ませることで、ＥＶＡフィルムにより、血液サンプル中のイオン化し難い成分とイオン化され易い成分が特異的に分離したためと推測できる。また、Ａβのピークである４３２９．８ｍ／ｚ付近（図５及び図６中の実線矢印）のピークを拡大すると、比較例２では、Ａβのピークは確認されなかったが（点線矢印）、実施例２では、Ａβのピーク（点線矢印）が確認された。血液サンプル中のイオン化し難い成分（夾雑物）がＥＶＡフィルムにより分離されることで分析の感度が向上し、微量のＡβでも分析できることが明らかとなった。なお、この感度は図５及び図６からみて、少なくとも２０倍以上であり、本発明により、微小量の血液サンプルから、短時間でＡβの分析をすることが可能となる。【００４４】
〔熱可塑性樹脂の種類を変えた実験〕
＜実施例３＞
〔血液サンプルの調整〕
Ａβ１−４０ペプチドの濃度が、１μＭとなるように加えた以外は、実施例１と同様の手順で血液サンプルを作製した。【００４５】
〔血液サンプルの熱可塑性樹脂への取り込み〕
導電性スライドガラス（シグマ−アルドリッチ社、Ｃａｔ  Ｎｏ，５７８２７４，  Ｉｎｄｉｕｍ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏａｔｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）の上に、ポリアクリル樹脂フィルム（合資会社  森部商店、ＦＡ−１１５０）を載せた。次いで、ポリアクリル樹脂フィルムの上に、上記血液サンプル５μｌを滴下し、ホットプレート（アズワン社製ＰＣ―４２０Ｄ）を用い、１００℃で５分加熱し、次いで室温で冷却した。十分冷却した後、シリカゲルを充填したデシケーター内で一晩乾燥させることで、血液サンプルを取り込んだポリアクリル樹脂フィルムを作製し、実施例２と同様の手順で質量分析を行った。図７（１）は、実施例３で得られた質量スペクトルを示す。【００４６】
＜実施例４＞
ポリオレフィン樹脂フィルム（合資会社  森部商店、ＦＡ−３０５０）を用いた以外は、実施例３と同様の手順で質量分析を行った。図７（２）は、実施例４で得られた質量スペクトルを示す。【００４７】
＜実施例５＞
ポリエステル樹脂フィルム（合資会社  森部商店、ＦＡ−４１００）を用いた以外は、実施例３と同様の手順で質量分析を行った。図７（３）は、実施例５で得られた質量スペクトルを示す。【００４８】
＜実施例６＞
ポリウレタン樹脂フィルム（合資会社  森部商店、ＦＡ−７３００）を用いた以外は、実施例３と同様の手順で質量分析を行った。図７（４）は、実施例６で得られた質量スペクトルを示す。【００４９】
図７（１）〜（４）から明らかなように、ポリアクリル樹脂及びポリエステル樹脂を用いた場合はＡβが高感度で検出されたが、ポリオレフィン樹脂を用いた場合は感度が低く、ポリウレタン樹脂を用いた場合はＡβが検出されなかった。以上の結果より、分析対象成分に応じて熱可塑性樹脂フィルムの種類を適宜調整することが望ましいことが明らかとなった。【００５０】
質量分析スペクトルは、最大ピークを１００とした相対値で表される。そのため、上記実施例３〜６の質量分析スペクトルの結果では、Ａβの検出感度により血液自体に含まれる成分のスペクトルの高さが大きく異なることから、熱可塑性樹脂の種類の違いによる血液成分自体の特異的分離が分かりにくい。そのため、Ａβを含まない血液のみをサンプルにして次の実験を行った。【００５１】
＜実施例７〜１０＞
Ａβを含まない血液のみをサンプルとした以外は、実施例３〜６と同様の手順で質量分析を行ったものを、それぞれ、実施例７〜１０とした。図８（１）は実施例７の質量スペクトル、図８（２）は実施例８の質量スペクトル、図８（３）は実施例９の質量スペクトル、図８（４）は実施例１０の質量スペクトルを示す。【００５２】
図８（１）〜（４）から明らかなように、熱可塑性樹脂フィルムの種類を変えることで、サンプル自体の成分の分離特性が異なっていた。したがって、サンプル中の分析対象成分のみでなく、当該分析対象成分を含むサンプルに応じても、熱可塑性樹脂フィルムの種類を適宜調整することが望ましいことが明らかとなった。【００５３】
〔ペプチド以外の成分の分析〕
＜実施例１１＞
〔分析組織の取得〕
分析組織には、以下の手順で取得したＡＰＰ／ＰＳ１マウス（１０ヶ月齢、約２５ｇ）の脳を用いた。
１．マウスをジエチルエーテルで麻酔後、仰臥位にし、四肢を固定した。
２．開腹後、横隔膜を切開し、左右の肋骨を頭部方向へ切開した。
３．剣状突起をつまんで頭部方向へ反転し、鉗子で固定し、心臓を露出させた。
４．左心室に翼状針を刺し、１×ＰＢＳ溶液（生理食塩水）を注入した。
５．剪刀で右心耳を切開し、約７０ｍｌの生理食塩水で脱血・灌流した。
６．灌流後、頭部を切断し、開頭後脳を摘出した。
７．摘出した脳は矢状断で半切し切断面を下面（切削面）に配置後、包埋剤（ＯＣＴコンパウンド）に入れ凍結し、凍結ブロックを作製した。【００５４】
〔試料切片の作製〕
上記の手順で得られた凍結ブロックから、以下の手順で試料切片を作製した。
１．凍結ブロックから１０μｍの厚さで切片を作製した。なお、スライドガラスはコートなしのものを使用した。
２．凍結切片を以下の手順で乾燥させた。
（１）１００％アセトン      １０分
（２）ＰＢＳ                  １分
（３）７０％エタノール        １分
（４）１００％エタノール      １分
（５）１００％エタノール      １分
（６）１００％キシレン        ２分
（７）１００％キシレン        ２分【００５５】
〔切片から試料の切出し及び熱可塑性フィルムへの取り込み〕
レーザーマイクロダイセクション装置を用いて、実施例１と同様の手順で、得られた凍結切片を切り出し、ＥＶＡフィルムに取り込んで、質量分析用サンプルを作製した。【００５６】
〔作製したサンプルの質量分析〕
マトリクスにＤＨＢ−αｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｉｎｎａｍｉｃａ  ａｃｉｄ（シグマアルドリッチ社）を用いた以外は、実施例２と同様に質量分析を行った。図９は、実施例１１で得られた質量スペクトルを示す。【００５７】
図９から明らかなように、生体組織である脳をサンプルとして用いると、アデノシン３リン酸（図中のｍ／ｚ５０６．２９の矢印）、フォスファチジルセリン（図中のｍ／ｚ７０１．５２の矢印は、フォスファチジルセリンからＣ3Ｈ6ＮＯ2が離脱したもの。ｍ／ｚ７８８．５３の矢印は、フォスファチジルセリンからＨが離脱したもの。）、フォスファチジルイノシトール（図中のｍ／ｚ８８５．６４の矢印）、サルファタイド（図中のｍ／ｚ９０４．６４の矢印）等が検出された。本発明により、ペプチドホルモン以外の生体成分も分析できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係るサンプル中の成分の分析方法、サンプル中の成分の特異的分離方法を用いることで、濃縮等の事前処理をすることなく、様々なサンプル中の微量成分を短時間で特異的分離・分析することができる。また、血液等のサンプルを熱可塑性樹脂とともに扱うことで、取り扱いが簡便になり、また、分析センター等への移送も簡単になる。したがって、医療機関や大学医学部などの研究機関、一般病院等において、ベッドサイドでの診断が可能となる。また、質量分析装置を有しない遠隔地の病院、様々な検査機関におけるサンプルを分析センターで分析することができるので、遠隔地の患者の診断やサンプルの分析も行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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