(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の精子及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有する、鳥類の体外受精方法であって、
前記卵活性化因子が、
（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、
（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、
方法。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物は更に外来遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記鳥類がキジ目又はカモ目である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞核及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有する、鳥類のクローン細胞又はクローン個体の作製方法であって、
前記卵活性化因子が、
（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、
（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、
方法。
【請求項６】
前記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鳥類がキジ目又はカモ目である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
鳥類における体外受精、又は、クローン細胞若しくはクローン個体の作製に使用するキットであって、
（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、
（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、
キット。
【請求項９】
前記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記キットが鳥類における体外受精に使用するキットであり、更に単一の精子を含む、請求項８又は９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類の体外受精方法及びクローン細胞又はクローン個体の作製方法、並びにそれらの方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
受精現象は、精子と卵の複雑な相互作用により生じる。多くの動物では単一の精子が卵と融合する。そして、この際に、卵の細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）が一過的に上昇及び変動（カルシウムオシレーション）する。この卵の［Ｃａ２＋］ｉは、卵の活性化において重要な役割を担っている（非特許文献１及び２）。【０００３】
一方、鳥類においては、卵が活性化する前に２０〜６０の複数の精子が卵子内に入り込む多精子受精が行われる（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｃｋｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１１（１９９９），ｐｐ．１５７〜１７６
【非特許文献２】Ｒｕｎｆｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４５（２００２），ｐｐ．２３７〜２５４
【非特許文献３】Ｆｏｆａｎｏｖａら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｖｏｌ．２４（１９６５），ｐｐ．２３９〜２４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、体外受精の方法としては、単一精子を卵に直接注入する卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）が知られており、ヒトを含む哺乳類などで実用化されている。一方、鳥類では、ウズラ卵を用いたＩＣＳＩが行われているが、発生はある程度進行するものの、孵化する個体を得ることはできていなかった。【０００６】
上記問題を解決すべく、発明者らが検討した結果、多精子受精という特徴的な受精を行う鳥類において、単一精子を卵に注入するＩＣＳＩでは、卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇及びオシレーションが起きないため、卵が活性化せず、発生の進行が停止することを突き止めた。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、卵を活性化し、発生が進行し得る、鳥類の体外受精方法を提供することを目的とする。本発明は更に、この技術を応用した、鳥類のクローン細胞又はクローン個体の作製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記体外受精方法、又は、クローン細胞若しくはクローン個体の作製方法に使用することができるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鳥類において、ホスホリパーゼＣ又はイノシトール三リン酸、クエン酸シンターゼ、及びアコニット酸ヒドラターゼを卵に注入することで、多精子受精と同様に、卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇及びオシレーションが起き、卵が活性化することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１０］に関する。
［１］単一の精子及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有する、鳥類の体外受精方法であって、前記卵活性化因子が、（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、方法。
［２］上記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、［１］に記載の方法。
［３］上記混合物は更に外来遺伝子を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］上記鳥類がキジ目又はカモ目である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］細胞核及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有する、鳥類のクローン細胞又はクローン個体の作製方法であって、前記卵活性化因子が、（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、方法。
［６］上記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、［５］に記載の方法。
［７］上記鳥類がキジ目又はカモ目である、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］鳥類における体外受精、又は、クローン細胞若しくはクローン個体の作製に使用するキットであって、（ａ）ホスホリパーゼＣ、クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む、又は、（ｂ）クエン酸シンターゼ及びアコニット酸ヒドラターゼのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにイノシトール三リン酸を含む、キット。
［９］上記ホスホリパーゼＣがホスホリパーゼＣゼータである、［８］に記載のキット。
［１０］上記キットが鳥類における体外受精に使用するキットであり、更に単一の精子を含む、［８］又は［９］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の鳥類の体外受精方法は、所定の卵活性化因子を卵に注入することで、卵を活性化させ、発生を進行させることが可能となるため、孵化する個体を得ることが可能となる。また、この技術を応用することで、本発明の方法は、鳥類のクローン細胞又はクローン個体を作製することが可能となる。また、本発明は、上記体外受精方法、又は、クローン細胞若しくはクローン個体の作製方法に使用することができるキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１の（Ａ）及び（Ｂ）は、卵にイノシトール三リン酸を注入した際の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す蛍光イメージング及びその蛍光強度を示す。図１の（Ｃ）及び（Ｄ）は、卵に可溶性精子抽出物（ＳＥ）を注入した際の卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す蛍光イメージング及びその蛍光強度を示す。
【図２】図２の（Ａ）は、２８０ｎｍにおける、ＳＥをゲルろ過クロマトグラフィーに供した際の吸光度を示す。図２の（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、Ｆｒ２、Ｆｒ３及びＬＣＡレクチン処理したＦｒ３を用いた際の卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す。図２の（Ｅ）は、ＬＣＡレクチン処理したＦｒ３をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色したものを示す。図２の（Ｆ）は、ブタＡＨ及びブタＣＳを用いた際の卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す。
【図３】図３は、各種試薬を用いた時の卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す。
【図４】図４は、ＩＣＳＩによるウズラ胚の発生を示す。図４の（Ａ）は、精子とＩＰ３の混合物とを卵に注入し、ステージ６まで発生したウズラ胚を示す。図４の（Ｂ）は、精子とＳＥとを注入した卵が孵化したことを示す。図４の（Ｃ）は、成長した（Ｂ）の雛とその子を示す。図４の（Ｄ）は、精子とＰＬＣＺ、ＣＳ及びＡＨのｃＲＮＡとを注入した卵が孵化したことを示す。
【図５】図５の（Ａ）及び（Ｂ）は、ステージ３０におけるウズラ胚の顕微鏡写真及び蛍光イメージをそれぞれ示す。図５の（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＰＣＲ法及びサザンブロット法によるＧＦＰ遺伝子の発現をそれぞれ示す。図中、ｓｐはＧＦＰ遺伝子と反応した精子を示し、ｗｔは通常のウズラ胚を示す。
【図６】図６の（Ａ）は、子宮部由来未受精卵を用いたクローン細胞のステージ８の顕微鏡写真を示す。図６の（Ｂ）は、放卵未受精卵を用いたクローン細胞のステージＩＸの顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
［体外受精方法］
本実施形態の鳥類の体外受精方法は、単一の精子及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有し、上記卵活性化因子が、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）及びアコニット酸ヒドラターゼ（ＡＨ）のタンパク質、又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む。
【００１４】
本実施形態に係る精子は、卵と受精できるものであれば特に限定されるものではない。精子としては、射精された精子であってもよく、精巣内精子であってもよく、凍結融解した精子であってもよい。
【００１５】
本実施形態に係る卵は、精子と受精できる未受精卵であれば特に限定されるものではない。卵としては、卵胞から取り出した卵であってもよく、子宮内から取り出した未受精卵であってもよく、放卵された未受精卵であってもよい。精子及び卵は受精可能であれば異種であってもよいが、同種であることが好ましい。
【００１６】
卵活性化因子であるＰＬＣとしては、卵内でイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を産生できるものであれば、特に限定されるものではない。ＰＬＣは、例えば、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ、イータなどのアイソタイプ、ＰＬＣと同等の機能を有するＰＬＣ様タンパク質などが挙げられる。ＰＬＣとしては、中でも、精子中に含まれる分子であるという観点から、ホスホリパーゼＣゼータ（ＰＬＣＺ）が好ましい。
【００１７】
本実施形態に係る卵活性化因子は、３種類ともタンパク質であってもよく、３種類ともｃＲＮＡであってもよく、任意の種類のタンパク質及びｃＲＮＡの組み合わせであってもよい。これら３種類の卵活性化因子は、精子及び／又は卵と異種由来のものであってもよく、同種由来のものであってもよい。また、これら３種類の卵活性化因子は、鳥類由来でなくてもよく、例えば、ブタを含む哺乳類由来のものであってもよい。これら３種類の卵活性化因子は、任意の動物の任意の組織から抽出することが可能であり、クローニングにより調製することも可能であり、また、市販品を利用してもよい。これらの３種類の卵活性化因子を卵に注入することで、卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇及びオシレーションが起きるため、卵が活性化する。鳥類では、単一の精子を単に注入する従来のＩＣＳＩでは卵の活性化が起こらず、発生が途中で止まり孵化しなかった。一方、本実施形態に係る卵活性化因子を精子と共に卵に注入することで、鳥類においてもＩＣＳＩによって孵化した個体を得ることができる。
【００１８】
卵活性化因子の注入量は、特に限定されるものではなく、卵が活性化し、発生が進行して孵化するように、適宜設定することができる。例えば、ウズラであれば、より発生段階が進行し、孵化の確率が向上する観点から、卵１個あたりのタンパク質又はｃＲＮＡの注入量は、ＰＬＣで４０〜２００ｐｇが好ましく、５０〜１００ｐｇがより好ましく、５５〜６５ｐｇが更に好ましく、ＣＳで８０〜１２０ｐｇが好ましく、９０〜１１０ｐｇがより好ましく、９５〜１０５ｐｇが更に好ましく、ＡＨで８０〜１２０ｐｇが好ましく、９０〜１１０ｐｇがより好ましく、９５〜１０５ｐｇが更に好ましい。
【００１９】
ＰＬＣは、卵内において、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）を分解し、ＩＰ３を産生する。そのため、卵活性化因子としては、ＰＬＣの代わりに、ＩＰ３を用いてもよい。したがって、別の実施形態では、卵活性化因子は、ＣＳ及びＡＨのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにＩＰ３を含む。ＩＰ３の注入量は、特に限定されるものではなく、卵が活性化し、発生が進行して孵化するように、適宜設定することができる。例えば、ウズラであれば、より発生段階が進行し、孵化の確率が向上する観点から、卵一個あたりのＩＰ３の注入量は、５〜２００ｆｍｏｌが好ましく、４０〜１００ｆｍｏｌがより好ましく、４５〜５５ｆｍｏｌが更に好ましい。
【００２０】
上記単一の精子及び卵活性化因子の混合物は、ｐＨ及び塩濃度を調節した緩衝液に含有されていることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などが挙げられる。また、緩衝液のｐＨとしては、例えば、７．０〜７．６の範囲にあることが好ましい。
【００２１】
別の実施形態における単一の精子及び卵活性化因子の混合物は、更に外来遺伝子を含む。本明細書において、「外来遺伝子」とは、精子及び卵を提供した生物種が、本来持たないタンパク質を発現する遺伝子のことである。外来遺伝子を精子及び卵活性化因子と共に卵に注入することで、その生物が本来持っていない有用な性質を比較的簡便に導入することができる。例えば、輸卵管で外来遺伝子を発現させた個体を作製すると、卵白中に外来遺伝子に由来する分子が分泌される。そのため、ペプチド、タンパク質及び抗体といったバイオ医薬品などの薬剤を産生する外来遺伝子を輸卵管に発現させることで、薬剤成分が卵白中に分泌され、薬剤の大量生産などを行うことができると考えられる。外来遺伝子としては、インスリン、サイトカイン、モノクローナル抗体、インターフェロン、各種成長因子、ペプチドホルモンなどが挙げられる。また、輸卵管に発現させるためには、オボアルブミンプロモーターなどの輸卵管特異的なプロモーターを利用することができる。
【００２２】
以下、ＩＣＳＩを用いた本実施形態の体外受精方法の一例を説明する。
顕微鏡下において、インジェクション用マイクロピペットで卵活性化因子を吸引し、その後、精子一個を吸引し、卵活性化因子と精子との混合物を調製することができる。未受精卵は、卵管膨大部から採取し、培地（例えば、ＤＭＥＭなど）を入れたプラスチックディッシュに回収する。実体顕微鏡で観察しながら、インジェクターに接続したインジェクション用マイクロピペットを卵の胚盤の中央部に３０〜５０μｍほど差し込み、上記混合物を注入する。このときの注入量は１ｎＬ以下が好ましく、注入速度は６ｎＬ／分以下が好ましい。
【００２３】
精子及び卵活性化因子を注入した卵を、ＤＭＥＭ中４１．５℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養し、その後、ウズラの卵殻内に移す。この卵殻をニワトリ卵由来水溶性アルブミンで満たし、フィムルで封をする。封をした卵殻を９０°の角度で、１回／３０分の頻度で転卵しながら、３７．５℃、相対湿度７０％の条件下で６３時間培養する。その後、培養した卵を、ニワトリの卵殻に移し、フィルムで封をする。封をした卵殻を３０°の角度で、１回／３０分の頻度で、転卵しながら、３７℃の条件下で培養し、卵を孵化させる。
【００２４】
［クローン細胞又はクローン個体の作製方法］
本実施形態の鳥類のクローン細胞又はクローン個体の作製方法は、細胞核及び卵活性化因子の混合物を卵に注入する工程を有し、上記卵活性化因子が、ＰＬＣ、ＣＳ及びＡＨのタンパク質、又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む。
【００２５】
本実施形態に係る細胞核は、特に限定されるものではなく、生殖細胞由来であってもよく、体細胞由来であってもよい。細胞核としては、例えば、胚盤葉細胞由来の細胞核が挙げられる。
【００２６】
卵活性化因子であるＰＬＣとしては、卵内でＩＰ３を産生できるものであれば、特に限定されるものではない。ＰＬＣとしては、例えば、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ、イータなどのアイソタイプ、ＰＬＣと同等の機能を有するＰＬＣ様タンパク質などが挙げられる。ＰＬＣとしては、中でも、精子中に含まれる分子であるという観点から、ＰＬＣＺが好ましい。
【００２７】
本実施形態のクローン細胞又はクローン個体の作製方法に用いられる卵活性化因子は、３種類ともタンパク質であってもよく、３種類ともｃＲＮＡであってもよく、任意の種類のタンパク質及びｃＲＮＡの組み合わせであってもよい。これら３種類の卵活性化因子は、精子及び／又は卵と異種由来のものであってもよく、同種由来のものであってもよい。また、これら３種類の卵活性化因子は、鳥類由来でなくてもよく、例えば、ブタを含む哺乳類由来のものであってもよい。これら３種類の卵活性化因子は、任意の動物の任意の組織から抽出することが可能であり、クローニングにより調製することも可能であり、また、市販品を利用してもよい。これらの３種類の卵活性化因子を卵に注入することで、卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇及びオシレーションが起きるため、卵が活性化する。卵が活性化することで、発生が促され、注入した細胞核のクローン細胞を得ることができる。また、このクローン細胞を培養することで、クローン個体の作製も可能となる。
【００２８】
卵活性化因子の注入量は、特に限定されるものではなく、卵が活性化し、発生が進行するように、適宜設定することができる。例えば、ウズラであれば、より発生段階が進行しやすくする観点から、卵一個あたりのタンパク質若しくはｃＲＮＡの注入量は、ＰＬＣで４０〜２００ｐｇが好ましく、５０〜１００ｐｇがより好ましく、５５〜６５ｐｇが更に好ましく、ＣＳで８０〜１２０ｐｇが好ましく、９０〜１１０ｐｇがより好ましく、９５〜１０５ｐｇが更に好ましく、ＡＨで８０〜１２０ｐｇが好ましく、９０〜１１０ｐｇがより好ましく、９５〜１０５ｐｇが更に好ましい。
【００２９】
別の実施形態では、卵活性化因子は、ＣＳ及びＡＨのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにＩＰ３を含む。ＩＰ３の注入量は、特に限定されるものではなく、卵が活性化し、発生が進行して孵化するように、適宜設定することができる。例えば、ウズラであれば、より発生段階が進行し、孵化の確率が向上する観点から、卵一個あたりのＩＰ３の注入量は、５〜２００ｆｍｏｌが好ましく、４０〜１００ｆｍｏｌがより好ましく、４５〜５５ｆｍｏｌが更に好ましい。
【００３０】
上記細胞核及び卵活性化因子の混合物は、ｐＨ及び塩濃度を調節した緩衝液に含有されていることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などが挙げられる。また、緩衝液のｐＨとしては、例えば、７．０〜７．６の範囲にあることが好ましい。
【００３１】
以下、本実施形態のクローン細胞又はクローン個体の作製方法の一例を説明する。
顕微鏡下において、インジェクション用マイクロピペットで卵活性化因子を吸引し、その後細胞核を吸引し、卵活性化因子と細胞核との混合物を調製することができる。子宮部から採取した未受精卵又は放卵された未受精卵を、培地（例えば、ＤＭＥＭなど）を入れたプラスチックディッシュに回収する。実体顕微鏡で観察しながら、インジェクターに接続したインジェクション用マイクロピペットを卵の胚盤の中央部に３０〜５０μｍほど差し込み、上記混合物を注入する。このときの注入量は１ｎＬ以下が好ましく、注入速度は６ｎＬ／分以下が好ましい。
【００３２】
細胞核を注入した卵を、ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂを添加したＤＭＥＭ中４１．５℃、５％ＣＯ２の条件で４時間培養し、その後、ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂを添加していないＤＭＥＭ中４１．５℃、５％ＣＯ２の条件で２０時間培養する。培養後、細胞核を注入した卵をウズラの卵殻内に移す。この卵殻をニワトリ卵由来アルブミンで満たし、フィムルで封をする。封をした卵殻を９０°の角度で、１回／３０分の頻度で転卵しながら、３７．５℃、相対湿度７０％の条件下で６３時間培養する。その後、培養した卵を、ニワトリの卵殻に移し、ニワトリ卵由来水溶性アルブミンで満たしてフィルムで封をする。封をした卵殻を３０°の角度で、１回／３０分の頻度で転卵しながら、３７℃の条件下で培養し、卵を孵化させる。
【００３３】
本実施形態の体外受精方法及びクローン細胞又はクローン個体の作製方法に用いられる鳥類は、特に限定されるものではない。産業上有用であるという観点から、鳥類としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、キジなどのキジ科の鳥を含むキジ目の鳥；カモ、アヒル、ガチョウなどのカモ科の鳥を含むカモ目の鳥が好ましい。
【００３４】
［キット］
本実施形態のキットは、上記の鳥類における体外受精、又は、クローン細胞若しくはクローン個体の作製に用いることができる。本実施形態のキットは、ＰＬＣ、ＣＳ及びＡＨのタンパク質、又はこれらをコードするｃＲＮＡを含む。ＰＬＣ、ＣＳ及びＡＨの３種類の成分に関しては、３種類ともタンパク質であってもよく、３種類ともｃＲＮＡであってもよく、任意の種類のタンパク質及びｃＲＮＡの組み合わせであってもよい。また、別の実施形態では、ＣＳ及びＡＨのタンパク質又はこれらをコードするｃＲＮＡ並びにＩＰ３を含む。
【００３５】
ＰＬＣとしては、卵内でＩＰ３を産生できるものであれば、特に限定されるものではない。ＰＬＣとしては、例えば、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ、イータなどのアイソタイプ、ＰＬＣと同等の機能を有するＰＬＣ様タンパク質などが挙げられる。ＰＬＣとしては、中でも、精子中に含まれる分子であるという観点から、ＰＬＣＺが好ましい。
【００３６】
本実施形態のキットを水溶液として調製する場合は、ｐＨ及び塩濃度を調節した緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などが挙げられる。また、緩衝液のｐＨとしては、例えば、７．０〜７．６の範囲にあることが好ましい。キットにこのような緩衝液を付属させてもよい。
【００３７】
本実施形態のキットを鳥類の体外受精に用いる場合、更に単一の精子を混合してもよい。精子は、卵と受精できるものであれば特に限定されるものではない。精子としては、射精された精子であってもよく、精巣内精子であってもよく、凍結融解した精子であってもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本実施例では、ウズラを用いているが、本発明はウズラに限定されるものではない。【００３９】
以下の実施例において、「精子」・「卵」とは、全てウズラ由来のものを示している。【００４０】
＜実施例１：卵の活性化における［Ｃａ２＋］ｉの変化の測定＞
（可溶性精子抽出物（ＳＥ）の調製）
精子は、ウズラの交尾直後に採取したものを用いた。採取した精子を、ＰＢＳに懸濁し、８００ｇで３分間遠心処理を繰り返すことで、洗浄した。洗浄後の精子は、ＰＢＳに懸濁した。洗浄した精子をホモジナイズ及び超音波処理によって破砕し、２０４００ｇで１０分間遠心して、上清を回収した。回収した上清をＳＥとした。２ｎｇのＳＥは、およそ２００匹分の精子に相当する。【００４１】
（卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化の測定）
卵の［Ｃａ２＋］ｉを測定するために、卵に蛍光カルシウムインジケーター（Ｆｌｕｏ−８Ｈ  ＡＭ、ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）を取り込ませた。この卵の胚盤に５０ｆｍｏｌのＩＰ３又は２ｎｇのＳＥを注入した。卵の蛍光イメージは、蛍光実体顕微鏡（Ｍ１６５、ライカ社製）に接続したＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ、Ｃ９１００−１３、浜松ホトニクス社製）で取り込んだ。取り込んだ画像は、画像処理ソフト（ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ、浜松ホトニクス社製）を用いて、胚盤の外側の蛍光をバックグラウンドとして測定し、胚盤部分の平均蛍光強度を算出した。注入した時の蛍光強度をＦ０値とし、その後、一時間にわたって蛍光強度を測定した（Ｆ値）。Ｆ値とＦ０値の比（Ｆ／Ｆ０）を、卵の［Ｃａ２＋］ｉとした。【００４２】
図１は、卵にＩＰ３（図１の（Ａ）及び（Ｂ））又はＳＥ（図１の（Ｃ）及び（Ｄ））を注入した際の、卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示している。ＩＰ３を卵に注入すると、注入直後に一過的な卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇がみられた（図１の（Ｂ））。一方、ＳＥを卵に注入した場合には、ＩＰ３と同様に卵の［Ｃａ２＋］ｉの一過的な上昇がみられ、更に、注入後２０分あたりから、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションが測定された（図１の（Ｄ））。ＩＰ３又はＳＥを卵に注入した際、卵の［Ｃａ２＋］ｉの変動パターンが異なることから、ＳＥには、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションを引き起こす卵活性化因子を含まれることが示唆された。【００４３】
＜実施例２：ＳＥに含まれる卵活性化因子の同定＞
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
ＳＥに含まれる、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションを引き起こす卵活性化因子を同定するため、ＳＥをゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、ＧＥヘルスケア社製）に供し、８画分に分取した（図２の（Ａ））。分取した画分を用いて、卵の［Ｃａ２＋］ｉの測定を行った。【００４４】
図２の（Ｂ）及び（Ｃ）は、Ｆｒ２及び３を卵に注入した時の卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示したものである。図２の（Ｃ）から、Ｆｒ３には、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションを引き起こす卵活性化因子が含まれていることが判明した。また、図２の（Ｄ）から、Ｆｒ３に含まれる卵活性化因子は、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡ）レクチンに結合することが判明した。Ｆｒ３及びＬＣＡレクチン処理したＦｒ３をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＣＢＢ染色した結果、７０ｋＤａ、４５ｋＤａ及び３０ｋＤａを示すタンパク質がＬＣＡレクチンと結合していた（図２の（Ｅ））。【００４５】
（ｄｅ  ｎｏｖｏプロテインシークエンス解析）
これらのタンパク質について、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ  ｅＬＤ、日立ハイテクノロジー社製）によるｄｅ  ｎｏｖｏプロテインシークエンス解析を行った。プロテインシークエンス解析の結果を解析ソフト（ＰＥＡＫＳ）で処理し、タンパク質を同定した。【００４６】
その結果、７０ｋＤａ及び４５ｋＤａのタンパク質は、それぞれＡＨ及びＣＳであることが明らかになった。また、３０ｋＤａのタンパク質は、ＡＨを含む数種類のタンパク質であることが示された。【００４７】
（ＡＨ及びＣＳによる卵の［Ｃａ２＋］ｉの変化の測定）
ＡＨ及びＣＳによって卵が活性化されるかを調べるため、それぞれ１００ｐｇのブタＡＨ（和光純薬工業社製）及びブタＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の混合物を卵に注入し、卵の［Ｃａ２＋］ｉを測定した。また、ＳＥ中のＡＨ及びＣＳの影響を調べるため、ＳＥに対して抗ＡＨ抗体、抗ＣＳ抗体、又はＩｇＧ抗体（ネガティブコントロール）を処理して、卵の［Ｃａ２＋］ｉの測定を行った。ＳＥ（２ｍｇ／ｍＬ、９μＬ）に対し、抗ニワトリＡＨポリクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ、１μＬ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、抗トリＣＳポリクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ、１μＬ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、又はウサギＩｇＧ抗体（２０μｇ／ｍＬ、１μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ混合し、一晩放置してＳＥ中の抗原を不活化した。【００４８】
ＡＨ及びＣＳの混合物は、一過的な卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇を引き起こさないが、卵にＳＥを注入したときと同様の卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションを引き起こした（図２の（Ｆ））。また、ＳＥに対して各種抗体処理を行った結果、ＳＥに対してＩｇＧ抗体を処理した場合では卵の［Ｃａ２＋］ｉは特に変化しなかった（図３の（Ｃ））。一方、ＳＥに対して抗ＡＨ抗体又は抗ＣＳ抗体を処理した場合では、ＳＥを注入した際には観測されていた卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションが抑制された（図３の（Ａ）、（Ｂ））。【００４９】
（卵活性化因子の同定）
ウズラのＡＨ、ＣＳ及びＰＬＣＺをコードするｃＲＮＡを作製し、これらのｃＲＮＡを卵に注入した際の卵の［Ｃａ２＋］ｉを測定した。注入したｃＲＮＡの量は、ＰＬＣＺが６０ｐｇ、ＡＨが１００ｐｇ、ＣＳが１００ｐｇである。【００５０】
ＡＨ及びＣＳをコードするｃＲＮＡを卵に注入すると、ブタのＡＨ及びＣＳを用いた時と同様に、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションが測定された（図３の（Ｄ））。ＰＬＣＺのｃＲＮＡを用いた場合には、一過的な卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇が測定された（図３の（Ｅ））。ＰＬＣＺ及びＡＨのｃＲＮＡの混合物、若しくはＰＬＣＺ及びＣＳのｃＲＮＡの混合物を卵に注入した場合では、一過的な卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇は起こるが、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションは起こらなかった（図３の（Ｆ）、（Ｇ））。しかしながら、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳの３種類のｃＲＮＡの混合物を卵に注入した場合、ＳＥを用いた時と同様に、一過的な卵の［Ｃａ２＋］ｉの上昇が起こり、その後、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションも測定された（図３の（Ｈ））。以上の結果から、ＰＬＣＺは卵の［Ｃａ２＋］ｉの初期導入に必要であることが示唆された。また、ＡＨ及びＣＳの両者は共存することで、卵の［Ｃａ２＋］ｉのらせん状のオシレーションに必要であることが示唆された。したがって、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳが、鳥類における卵の活性化因子であると考えられた。【００５１】
＜実施例３：ＩＣＳＩによる発生の確認＞
倒立顕微鏡（ＩＸ  ７０、オリンパス社製）下において、インジェクション用マイクロピペットで各種試薬を吸引し、その後、精子一個を吸引して混合した注入サンプルを調製した。注入サンプルは、いずれも１ｎＬ以下となるように調製した。各試験例における注入サンプルの具体的な組成を、表１及び表２に示す。試験例１の受精卵は、受精したと思われる時間から１時間以内に、卵管膨大部から採取し、ＤＭＥＭ培地を入れたプラスチックディッシュに回収した。未受精卵は、産卵後１時間以内に卵管膨大部から採取し、ＤＭＥＭ培地を入れたプラスチックディッシュに回収した。実体顕微鏡（ＳＺ１１、オリンパス社製）で観察しながら、インジェクター（ＩＭ−９Ｂ、ナリシゲ社製）に接続したインジェクション用マイクロピペットを未受精卵の胚盤の中央部に３０〜５０μｍほど差し込み、６ｎＬ／分以下の注入速度で注入サンプルを注入した。【００５２】
通常の受精卵である試験例１の卵及び注入サンプルを注入した試験例２〜１１の卵を、ＤＭＥＭ中４１．５℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養し、その後、ウズラの卵殻内に移した。この卵殻をニワトリ卵由来アルブミンで満たし、フィムルで封をした。封をした卵殻を９０°の角度で、１回／２０分の頻度で転卵しながら、３７．５℃、相対湿度７０％の条件下で、試験例１〜１１の卵を６３時間培養した。その後、培養した卵を、ニワトリの卵殻に移し、ニワトリ卵由来アルブミンで満たしてフィルムで封をした。封をした卵殻を９０°の角度で、１回／２０分の頻度で転卵しながら、３７℃の条件下で、試験例１〜１１の卵を孵化するまで培養した。【００５３】
培養中の試験例１〜１１の卵を、蛍光実体顕微鏡（Ｍ１６５、ライカ社製）で観察し、Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４９，１９７６，３２１−３３７）及びＨａｍｂｕｒｇｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  ８８，１９５１，４９−９２）の規定に従い、発生ステージを分類した。その結果を、表１及び表２に示す。【００５４】
【表１】
0006583736.tif 000002
【００５５】
【表２】
0006583736.tif 000003
【００５６】
表１及び表２に示されるように、単一の精子とＩＰ３を注入した試験例４の卵は、発生率は８６％と高いが、発生はステージ６までしか進行しなかった（図４の（Ａ））。試験例２、３、６〜８、１０及び１１の卵においても、発生しない、又は途中までしか発生が進行しなかった。一方で、精子とＳＥとを加えた試験例５の卵、及び精子とＰＬＣＺ、ＡＨ、ＣＳの３種類のｃＲＮＡとを加えた試験例９の卵は、発生が進行し、孵化した個体が得られた（表２、図４の（Ｂ）及び（Ｄ））。試験例５の卵から生まれた雛（図４の（Ｂ））は、成長後、通常交配により子を残すことができた（図４の（Ｃ））。実施例３の結果から、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳの３種類の因子を用いることで、鳥類において体外受精が可能であることが判明した。【００５７】
実施例２において、３種類のｃＲＮＡを卵に注入した際の卵の［Ｃａ２＋］ｉの挙動が、ＳＥを卵に注入した結果と類似していた。また、実施例３では、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳのｃＲＮＡのうち２種類のみを精子と共に卵に注入した場合では、発生が途中までしか進行しなかった（試験例６〜８）。一方、３種類すべてを精子と共に卵に注入した場合では、発生が孵化まで進行した（試験例９）。これらの結果を考慮すると、鳥類において、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳの３種類の因子が、受精時に、卵を活性化して発生を促すために必要であると考えられる。【００５８】
＜実施例４：外来遺伝子の導入＞
ＩＣＳＩを用いたウズラ胚への外来遺伝子の導入を行った。制限酵素であるＳａｌ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した１０ｎｇのｐＣＸ−ＥＧＦＰを、凍結融解した精子と混合して混合物を調製し、室温で１分間静置した。この混合物に、更に各種試薬を加え、表３に示す組成の注入サンプルを調製した。外来遺伝子を含む注入サンプルを、実施例３に記載した方法で未受精卵に注入し、８日間培養した。ＥＧＦＰが胚に導入されていることを確認するために、ＧＦＰ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応及びサザンブロット解析を行った。【００５９】
精子及び外来遺伝子のみを注入した試験例１２の卵では、発生が認められなかった。精子及び外来遺伝子に加え、更にＩＰ３を加えた試験例１３の卵では、発生が進行するものの途中で停止した。一方、ＩＰ３、ＡＨ及びＣＳを更に加えた試験例１４の卵では、ステージ３０まで発生が進行した（表３、図５の（Ａ））。ステージ３０の胚を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＧＦＰの蛍光が見られた（図５の（Ｂ））。また、試験例１４のステージＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、２、２２、３０の胚を用いて、ＰＣＲ反応及びサザンブロット解析を行った結果、ＧＦＰの蛍光が観察されたすべての胚から、ＧＦＰ遺伝子が検出された（図５の（Ｃ））。上記胚のうちの３個体は、ＧＦＰ遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれていた（図５の（Ｄ））。試験例１４の結果から、体外受精時に、体外遺伝子を導入できる可能性が示唆された。【００６０】
【表３】
0006583736.tif 000004
【００６１】
＜実施例５：クローン細胞の作製＞
ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳの３種類の因子を用いたクローン細胞の作製を行った。クローン化する細胞核を回収するため、放卵された受精卵（ステージＸ）の胚盤葉を採取し、０．１％トリプシン溶液で消化した。胚盤葉を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で洗浄し、酵素反応を停止した。解離した胚盤葉細胞は、顕微注入用のピペットを用いたピペッティング操作により破壊し、細胞核を細胞質ごとピペット内に回収した。未受精卵としては、放卵後１６時間後に子宮部から回収した未受精卵、又は放卵された未受精卵を用いた。回収した細胞核とＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳのｃＲＮＡとを混合し、注入サンプルを調製した。注入したｃＲＮＡの量は、ＰＬＣＺが６０ｐｇ、ＡＨが１００ｐｇ、ＣＳが１００ｐｇである。細胞核を含む注入サンプルを、実施例３に記載した方法で未受精卵に注入した。核移植した卵は、５μｇ／ｍＬのｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂを添加したＤＭＥＭ培地で４時間培養し、その後、３日間体外培養した。【００６２】
子宮由来未受精卵及び放卵未受精卵では、細胞核が消失していた。そのため、ウズラでは、哺乳類でクローン細胞の作製に不可欠な除核操作が不要であることが明らかとなった。子宮由来未受精卵を用いた場合では、２個の卵が発生を開始し、１つはステージ８まで進行した（表４、図６の（Ａ））。また、放卵未受精卵を用いた場合でも、ステージＩＸまで発生が進行した（図６の（Ｂ））。試験例１５及び１６の結果から、細胞核と共に、ＰＬＣＺ、ＡＨ及びＣＳの３種類の因子を未受精卵に注入することで、クローン細胞を作製できることが示唆された。【００６３】
【表４】
0006583736.tif 000005
【図１】
0006583736.tif 000006
【図２】
0006583736.tif 000007
【図３】
0006583736.tif 000008
【図４】
0006583736.tif 000009
【図５】
0006583736.tif 000010
【図６】
0006583736.tif 000011