(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２１に結合しＩＬ−２１活性を高める抗体または抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントが配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する、前記抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、生体外でＢ細胞のＩＬ−２１媒介増殖を高める、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、生体外でＣＤ８Ｔ細胞のＩＬ−２１媒介細胞毒性を高める、請求項１または請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、生体内でＩＬ−２１半減期を高める、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗原結合ドメインは、
配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに
配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインは、
配列番号１１に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに
配列番号１４に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインは、配列番号２に記載の配列を含むＶＨを含む、請求項６または７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗原結合ドメインは、配列番号３に記載の配列を含むＶＬを含む、請求項６または７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗原結合ドメインは、配列番号２に記載の配列を含むＶＨ、及び配列番号３に記載の配列を含むＶＬを含む、請求項６または７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
少なくとも重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが結合して、抗原結合ドメインを含むＦｖを形成し、前記ＶＨ及びＶＬは、ポリペプチド鎖の単鎖であるか、または、前記ＶＬ及びＶＨは、別々のポリペプチド鎖である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＶＨ及びＶＬが単一のポリペプチド鎖である場合は、前記抗体または抗原結合フラグメントは：
（ｉ）単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジｓｃＦｖ）、
（ｉｉｉ）抗体の定常領域である、Ｆｃ、すなわち、重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に結合される（ｉ）または（ｉｉ）の一方、または
（ｉｖ）免疫エフェクタ細胞に結合するタンパク質に結合される（ｉ）または（ｉｉ）の一方、であり、
または、前記ＶＨ及びＶＬが別々のポリペプチド鎖である場合は、前記抗体または抗原結合フラグメントは：
（ｉ）二重特異性抗体、
（ｉｉ）三重特異性抗体、
（ｉｉｉ）四重特異性抗体、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
（ｖｉ）Ｆｖ、
（ｖｉｉ）抗体の定常領域である、Ｆｃ、すなわち、重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に結合される（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ、
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクタ細胞に結合するタンパク質に結合される（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ、または
（ｉｘ）抗体、
である、請求項１１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、裸の抗体または抗原結合フラグメントである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、及び、ＩＬ−２１ポリペチドを含む、複合体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに一項記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、または、請求項１４に記載の複合体、及び、薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１７】
医療における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、または、請求項１４に記載の複合体、または、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
慢性感染、アレルギー性免疫応答または癌の治療で使用するための、請求項１〜１３のいずれかに一項記載の抗体または抗原結合フラグメント、または、請求項１４に記載の複合体、または、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１３年６月２７日に出願の発明の名称が「ヒトＩＬ−２１に対するスーパー作動薬モノクローナル抗体及び免疫修飾へのその適用」であるオーストラリア仮特許出願番号第２０１３９０２３７７号の優先権を主張するものであり、その内容全体が、参照により、本出願に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）に結合する抗体の抗原結合部位を含むタンパク質、及び、たとえば、治療における等の、その使用、に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、電子形態の配列表と共に出願される。配列表の内容全体が、参照により、本出願に組み込まれ、かつ、明細書の一部を構成する。
【背景技術】
【０００４】
サイトカインは、一般に、造血系統の細胞の増殖または分化を刺激し、または、身体の免疫及び炎症応答メカニズムに関与する。インターロイキンは、免疫応答を媒介するサイトカインのファミリーである。免疫応答の中心はＴ細胞であり、これは多くのサイトカイン及び抗原に対する適応免疫をもたらす。Ｔ細胞により生成されるサイトカインは、ＴＨ１及びＴＨ２に分類されてきた。１型サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＬＴ−αを含み、炎症応答、ウィルス免疫、細胞内寄生体免疫及び同種異系移植片拒絶反応に関与する。２型サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を含み、液性応答、蠕虫免疫及びアレルギー応答に関与する。１型と２型の間の共通サイトカインは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含む。Ｔ細胞個体群を生み出している１型及び２型は、別々のタイプの炎症を起こした組織に優先して移動することを示唆する証拠がいくらかある。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞及びＢ細胞と共通の前駆細胞を有し、免疫を監視する役割を担っている。ＮＫ細胞は、最大で血液リンパ球の１５％を構成し、抗原受容体を発現せず、そして、先天性免疫を構成する要素である。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞及びウィルス感染細胞の認知及び死滅に関与する。生体内では、ＮＫ細胞は、活性化を必要とすると考えられているが、しかしながら、生体外では、ＮＫ細胞は、活性化なしで一部のタイプの腫瘍細胞を死滅させることが示されている。
【０００６】
ＩＬ−２１は、細胞障害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の強力な活性調節因子であることが示されている。ＩＬ−２１は、ＮＫ細胞の拡大を同時刺激することが示されており、また、これらの細胞のエフェクタ機能を高めることが実証されている。Ｔ細胞反応には、記憶Ｔ細胞機能の調節として、一次抗原反応の増強が含まれている。
【０００７】
ＩＬ−２１Ｒノックアウトマウスは、抗原曝露後、正常マウスに比べて、高いレベルのＩｇＥ及び低いレベルのＩｇＧ１を発現することが示されている。マウスにＩＬ−２１を注入した後、ＩｇＥレベルは低下した。これは、アレルギー応答を制御する場合のＩＬ−２１の役割への関連性を有しており、何故なら、過敏性１型反応におけるＩｇＥの役割のためである。
【０００８】
アレルギー応答を緩和するための治療として、ＩＬ−２１が試されてきた。マウスモデルの鼻炎（鼻孔炎）におけるＩｇＥレベルを低下させることに加えて、Ｔ細胞により生成される炎症誘発性サイトカインを低下させることに成功したことが示された。これは、局在性及び全身性アレルギーの両方を制御するためのＩＬ−２１の薬理学的開発に対して、強い関連性を有する。
【０００９】
ヒトＴ細胞の分化プログラミングを調節する場合のＩＬ−２１の役割は、最初に、Ｌｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７５ （４）： ２２６１−９ （２００５））により報告され、そこでは、独自のＣＤ２８＋ＣＤ１２７ｈｉ  ＣＤ４５ＲＯ＋表現型のセントラルメモリ−タイプＣＴＬの個体群に対して、ＩＬ−２生成能力を強化することが示された。ＩＬ−２１の存在下でプライミングにより発生した腫瘍反応抗原特異的ＣＴＬは、安定な「ヘルパー非依存的」表現型をもたらした。
【００１０】
ＩＬ−２１は、転移性黒色腫（ＭＭ）及び腎細胞癌（ＲＣＣ）患者に対する第１相臨床試験に承認された。インフルエンザのような症状の副作用を伴うが、投与について安全性が示された。用量規定毒性は、低いリンパ球、好中球及び血小板カウント、ならびに肝臓毒性を含んでいた。固形腫瘍応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）応答スケールに従い、それぞれ、４７人のＭＭ患者のうち２人、及び１９人のＲＣＣ患者のうち４人が、完全寛解及び部分寛解を示した。さらに、末梢ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞では、パーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ及びＣＸＣＲ３メッセンジャーｍＲＮＡが増加した。このことは、ＩＬ−２１がＣＤ８＋エフェクタ機能を高め、その結果、抗腫瘍反応に至ることを示唆するものである。ＩＬ−２１は、第２相臨床試験まで進み、そこでは、単独で投与され、またはソラフェニブ及びリツキシマブ等の薬物と併用投与された。
【００１１】
ＩＬ−２１は、持続性のウィルス感染の制御の重要な因子となり得る。慢性ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス）に感染しているＩＬ−２１（または、ＩＬ−２１Ｒ）ノックアウトマウスは、正常マウスと比較して、慢性感染を克服することができなかった。その上、損なわれたＩＬ−２１シグナル伝達を有するこれらのマウスでは、ＬＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は劇的に消耗し、そのことは、維持されたＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクタ活性のために、そしてその後、免疫を保持して持続性のウィルス感染を解決するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞により生成されるＩＬ−２１が必要とされることを示唆している。したがって、ＩＬ−２１は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ウィルス感染に対する免疫系応答を調整するメカニズムに関与し得る。
【００１２】
ＨＩＶ感染対象において、ＩＬ−２１が、ＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞応答及びＮＫ細胞機能をきわめて向上させることが報告されている。また、「ＨＩＶコントローラ」（治療せずに、ウィルス複製を制御してＡＩＤＳに進行させない希有な人達）からのＨＩＶ特異的ＣＤ４Ｔ細胞は、進行した人のそれらより顕著に多くのＩＬ−２１を生み出すことができる。さらに、ＩＬ−２１生成ウィルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、ＨＩＶコントローラの人達においても優先的に見出された。
【００１３】
これらのデータ、並びに、ＩＬ−２１刺激ＣＤ８またはＮＫ細胞は、生体外でＨＩＶウィルス複製を阻害することができるという事実は、このサイトカインが、抗ＨＩＶ療法のために潜在的に有用となり得ることをを示すものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＩＬ−２１に向けたモノクローナル抗体が開発されたが、これらの抗体は、ＩＬ−２１の機能を拮抗するまたは阻害することが示されている。これらのアンタゴニスト抗体は、炎症疾患を抑制する際に有用である。ＩＬ−２１活性を拮抗し、または高める抗体の開発に関する刊行物は、現在までなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＩＬ−２１に結合し、かつ、ＩＬ−２１の活性を高める抗体を生み出した。したがって、本発明者らは、ＩＬ−２１作動薬として機能する抗体を、初めて開発した。
【００１６】
一例では、本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を提供し、この抗原結合ドメインは、ＩＬ−２１に、結合または特異的に結合して、ＩＬ−２１活性を高める。
【００１７】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、生体外でまたは生体内で、Ｂ細胞のＩＬ−２１媒介増殖を高める
【００１８】
別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、生体外でまたは生体内で、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２１媒介細胞毒性を高める。
【００１９】
別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、ＮＫ細胞のＩＬ−２媒介増殖を高める。
【００２０】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、ＩＬ−２１作動薬である。
【００２１】
別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、生体内でＩＬ−２１半減期を高める。たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質は、生体内でＩＬ−２１半減期を、数時間から数日へ高め得る。一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、少なくとも２４時間生体内でＩＬ−２１半減期を高める。
【００２２】
別の例では、ＩＬ−２１の活性は、ＩＬ−２１結合タンパク質がない場合のＩＬ−２１活性と比較して、少なくとも５倍に高められる。
【００２３】
本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を、追加的にまたは代替的に提供し、抗原結合ドメインは配列ＳＴＮＡＧＲＲＱＫ（配列番号２３）を含むＩＬ−２１のエピトープに、結合または特異的に結合する。別の例では、ＩＬ−２１は、配列番号１９に記載の配列ＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴを含むエピトープに、結合または特異的に結合する。別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、配列番号２０に記載の配列ＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥを含む、ＩＩ−２１のエピトープに、結合または特異的に結合する。別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、配列番号４に記載の配列ＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥを含む、ＩＬ−２１のエピトープに、結合またはに特異的に結合する。
【００２４】
本開示は、追加的にまたは代替的に、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を提供し、抗原結合ドメインはＩＬ−２１に、結合または特異的に結合し、タンパク質が、抗体２Ｐ２（配列番号２に記載の配列を含むＶＨ及び配列番号３に記載の配列を含むＶＬを含む）のＩＬ−２１への結合を、競合的に阻害する。
【００２５】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体２Ｐ２の、配列番号１９、２０または４に記載のエピトープ配列への結合を、競合的に阻害する。
【００２６】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は哺乳類のＩＬ−２１（ｈＩＬ−２１）に、結合または特異的に結合する。別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、ヒトＩＬ−２１に、結合または特異的に結合する。更なる例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、ネコまたはイヌＩＬ−２１に、結合または特異的に結合する。
【００２７】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、マウスＩＬ−２１に対して、検出可能的に結合しない。
【００２８】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約９ｘ１０−９Ｍ以下の、哺乳類のＩＬ−２１すなわちｈＩＬ−２１の親和定数（ＫＤ）を有する。たとえば、ＫＤは、約８ｘ１０−９Ｍ以下、または約７ｘ１０−９Ｍ以下、または、約６ｘ１０−９Ｍ以下、または、約５ｘ１０−９Ｍ以下である。一例では、ＫＤは約４．８ｘ１０−９Ｍ以下である。
【００２９】
別の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約２ｘ１０−９Ｍ以下の、哺乳類のＩＬ−２１すなわちｈＩＬ−２１の親和定数（ＫＤ）を有する。たとえば、ＫＤは、約１ｘ１０−９Ｍ以下、または、約９ｘ１０−１０Ｍ以下、または、約８ｘ１０−１０Ｍ以下、または、約７ｘ１０−１０Ｍ以下である。一例では、ＫＤは、約５ｘ１０−１０Ｍ以下である。一例では、ＫＤは、約４ｘ１０−１０Ｍ以下である。一例では、ＫＤは、約３ｘ１０−１０Ｍ以下である。一例では、ＫＤは、約２ｘ１０−１０Ｍ以下である。一例では、ＫＤは、約１．５ｘ１０−１０Ｍ以下である。
【００３０】
一例では、前述の例の各々に関して、ＫＤは、０．１ｘ１０−１２Ｍ以上であってもよく、または、１ｘ１０−１２Ｍ以上であってもよい。
【００３１】
一例では、ＫＤは、たとえば表面プラスモン共鳴等によるバイオセンサーを用いて判断される。たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質が固定され、ｈＩＬ−２１すなわち哺乳類のＩＬ−２１への結合のレベルが決定される。
【００３２】
本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を、追加的または代替的に提供し、ここで、抗原結合ドメインは、ＩＬ−２１に結合または特異的に結合し、抗原結合ドメインは、以下の少なくとも１つを含む：
（ｉ）少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号５に記載の配列と同一の配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号６に記載の配列と同一の配列を含むＣＤＲ２、及び、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号７に記載の配列と同一の配列を含むＣＤＲ３、を含むＶＨ；
（ｉｉ）少なくとも約９５％または９６％または９７％または９８％または９９％が、配列番号２に記載の配列と同一の配列を含むＶＨ；
（ｉｉｉ）少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号８に記載の配列と同一の配列を含むＣＤＲ１、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号９に記載の配列と同一の配列を含むＣＤＲ２、及び、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、配列番号１０に記載の配列と同一の配列を含むＣＤＲ３、を含むＶＬ；
（ｉｖ）少なくとも約９５％が配列番号３に記載の配列と同一の配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｖｉ）配列番号２に記載の配列を含むＶＨ；
（ｖｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び、配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号３に記載の配列を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び、配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ；並びに、配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び、配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ；及び
（ｘ）配列番号２に記載の配列を含むＶＨ及び配列番号３に記載の配列を含むＶＬ。
【００３３】
一例では、引用された配列とＩＬ−２１結合タンパク質の差は、置換である。
【００３４】
当業者は、たとえば、可変領域を含有するタンパク質のフレームワーク領域の中など、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質に対する置換のための部位を決定することができるだろう。
【００３５】
また、本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を提供し、抗原結合ドメインはＩＬ−２１に結合または特異的に結合し、ＩＬ−２１シグナル伝達を高め、抗原結合ドメインは、配列番号２に記載の配列を含むＶＨ及び配列番号３に記載の配列を含むＶＬを含む。
【００３６】
一例では、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質は、少なくともＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨ及びＶＬが結合して、抗原結合ドメインを含むＦｖを生成する。当業者は、抗原結合ドメインが抗体の結合部を含むことを理解するだろう。
【００３７】
一例では、ＶＨ及びＶＬは、ポリペプチド鎖の単鎖である。たとえば、タンパク質は以下の通りである：
（ｉ）単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域である、Ｆｃ、すなわち、重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に結合される（ｉ）または（ｉｉ）の一方；または
（ｉｖ）免疫エフェクタ細胞に結合するタンパク質に結合される（ｉ）または（ｉｉ）の一方。
【００３８】
一例では、ＶＬ及びＶＨは、別々のポリペプチド鎖である。たとえば、タンパク質は以下の通りである：
（ｉ）二重特異性抗体；
（ｉｉ）三重特異性抗体；
（ｉｉｉ）四重特異性抗体；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）抗体の定常領域である、Ｆｃ、すなわち、重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に結合される（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ；
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクタ細胞に結合するタンパク質に結合される（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ。
【００３９】
前述のタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインと呼ぶこともできる。
【００４０】
一例では、タンパク質は、抗体、たとえば、モノクローナル抗体、である。一例では、抗体は、裸の抗体である。
【００４１】
一例では、タンパク質（または、抗体）は、キメラ、非免疫化、ヒト化、ヒト、または霊長類化である。
【００４２】
一例では、タンパク質または抗体は、ヒトである。
【００４３】
一例では、相補性決定領域配列（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って定義される。
【００４４】
別の例では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムによって定義される。
【００４５】
本明細書でのＩＬ−２１に「結合する」タンパク質または抗体の参照は、ＩＬ−２１に「特異的に結合する」または「結合を特異的にする」タンパク質または抗体の字義通りのサポートを提供する。
【００４６】
また、本開示は、前述の抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントを提供する。
【００４７】
一例では、本明細書に記載されるタンパク質または抗体は、たとえばＩｇＧ定常領域等の、ヒト定常領域を含み、これにはたとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域またはそれらの混合物等が挙げられる。ＶＨ及びＶＬを含む抗体またはタンパク質の場合、ＶＨは、重鎖定常領域に結合可能であり、ＶＬは軽鎖定常領域に結合可能である。
【００４８】
たとえば、抗体またはタンパク質の生成または精製の間に、または、抗体の重鎖をコードする核酸を組み換えで操作することにより、本開示の全抗体の重鎖定常領域のＣ末端リシン（または、定常領域またはＣＨ３を含むＩＬ−２１結合タンパク質）を除去してもよい。したがって、全抗体（または、ＩＬ−２１結合タンパク質）は、すべてのＣ末端リジン残基が除去された個体群、Ｃ末端リジン残基が全く除去されていない個体群、及び／またはＣ末端リジン残基を有するまたは有しないタンパク質の混合物を有する個体群を含んでいてもよい。ある例では、個体群は、重鎖定常領域の１つにおいてＣ末端リジン残基が除去されるタンパク質を追加的に含んでいてもよい。同様に、全抗体の組成物は、Ｃ末端リジン残基を有するまたは有さない、同じまたは同程度の混ざり具合の抗体個体群を含んでいてもよい。
【００４９】
一例では、本明細書に記載されるタンパク質または抗体は、ＩｇＧ４抗体の定常領域またはＩｇＧ４抗体の安定化定常領域を含む。一例では、タンパク質または抗体は、位置２４１（Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７年及び／または１９９１年））にプロリンを有するＩｇＧ４定常領域を含む。
【００５０】
一実施例では、本明細書に記載されるタンパク質または抗体、または、本明細書に記載されるタンパク質または抗体の組成物は、完全にまたは部分的にＣ末端リジン残基を有するまたは有しない配列の混合物を含んだ安定化重鎖定常領域を含む重鎖定常領域を含む。
【００５１】
一例では、本開示の抗体は、（たとえば上記のように）ＩｇＧ４定常領域または安定化ＩｇＧ４定常領域に結合または融合される、本明細書に開示されるＶＨを含み、ＶＬは、カッパ軽鎖定常領域に結合または融合される。
【００５２】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の機能的特性を調査して、これに必要な変更を加えて本開示の抗体に適用することができる。
【００５３】
一例では、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質または抗体は、単離型及び／または組み換え型である。
【００５４】
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体は、検出可能な標識、または、たとえば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン結合タンパク質等の、タンパク質または抗体の半減期を延長する化合物等の、別の化合物に結合される。他の適切な化合物は、本明細書に記載される。
【００５５】
また、本開示は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体をコードしている核酸またはそのポリペチドを提供する。
【００５６】
本開示は、追加的にまたは代替的に、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質を提供し、抗原結合ドメインは、ＩＬ−２１に結合または特異的に結合し、抗原結合ドメインは、以下の少なくとも１つを含む核酸配列によりコードされる：
（ｉ）少なくとも約９５％または９６％または９７％または９８％または９９％が、配列番号１７に記載の配列と同一の配列を含むＶＨ；
（ｉｉ）少なくとも約９５％または９６％または９７％または９８％または９９％が、配列番号１８に記載の配列と同一の配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７に記載の配列を含むＶＨ；
（ｉｖ）配列番号１８に記載の配列を含むＶＬ；及び
（ｖ）配列番号１７に記載の配列を含むＶＨ及び配列番号１８に記載の配列を含むＶＬ。
【００５７】
一例では、このような核酸は、核酸がプロモータに操作可能に結合される発現構築物に含まれる。このような発現構築物は、ベクター、たとえば、プラスミドであってもよい。
【００５８】
単鎖のポリペプチド鎖ＩＬ−２１結合タンパク質に関する本開示の例では、発現構築物は、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に結合されるプロモータを含んでいてもよい。
【００５９】
ＩＬ−２１結合タンパク質を形成する複数のポリペプチド鎖に関する例では、発現構築物は、たとえばプロモータに操作可能に結合されるＶＨを含むポリペチドをコードする核酸、並びに、たとえばプロモータに操作可能に結合されるＶＬを含むポリペチドをコードする核酸を、含む。
【００６０】
別の例では、発現構築物は、たとえば、以下を操作可能に結合した構成要素を５'から３'の順で有する２シストロン性発現構築物である。
（ｉ）プロモータ
（ｉｉ）第１のポリペチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム侵入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペチドをコードする核酸。
ここで、第１のポリペチドはＶＨを含みかつ第２のポリペチドはＶＬを含み、または、その逆も同様である。
【００６１】
また、本開示は、別々の発現構築物を想定し、その一方は、ＶＨを含む第１のポリペチドをコードし、その他方は、ＶＬを含む第２のポリペチドをコードする。たとえば、本開示はまた、以下を含む組成物を提供する：
（ｉ）プロモータに操作可能に結合されるＶＨを含むポリペチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモータに操作可能に結合されるＶＬを含むポリペチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物。
【００６２】
また、本開示は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質を発現する単離型または組み換え型細胞を提供する。
【００６３】
一例では、細胞は、本開示の発現構築物、または：
（ｉ）プロモータに操作可能に結合されるＶＨを含むポリペチドをコードしている核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモータに操作可能に結合されるＶＬを含むポリペチドをコードしている核酸を含む第２の発現構築物、を含み、第１及び第２のポリペチドは、結合して本開示のＩＬ−２１結合タンパク質を形成する。
【００６４】
本開示の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００６５】
本開示はさらに、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を生成する方法を提供する。たとえば、このような方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または抗体の生成に十分な条件下で、本開示の発現構築物を保持することに関与する。
【００６６】
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を生成する方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を生成及び、任意に分泌させるのに十分な条件下で、本開示の細胞を培養することを含む。
【００６７】
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を生成する方法はさらに、タンパク質または抗体を単離すること、及び、任意に、ＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を、医薬品組成物に調製すること、を含む。
【００６８】
本開示は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または抗体、及び、薬学的に許容される担体を含む組成物を、追加的に提供する。
【００６９】
一部の例で、組成物は、以下を含む：
（ｉ）重鎖からのＣ末端リジン残基を含む本開示の抗体；
（ｉｉ）重鎖からのＣ末端リジン残基を有しない本開示の抗体；及び／または
（ｉｉｉ）１つの重鎖上にはＣ末端リジン残基を含み、別の（または他方の）重鎖上にはＣ末端リジン残基は含まない、本開示の抗体、
及び、任意に、薬学的に許容される担体。
【００７０】
また、本開示は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質及びＩＬ−２１を含む複合体を提供する。一例では、ＩＬ−２１は、組換え型ＩＬ−２１である。組換え型ＩＬ−２１の例は、当該技術分野では知られている。
【００７１】
また、本開示は、対象の感染または感染症、アレルギーの免疫応答、または、癌、を治療または予防する方法を提供するものであり、この方法は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を投与することを、含む。この点に関し、ＩＬ−２１結合タンパク質または複合体は、疾患の再発を予防するために用いることができ、これは疾患を防止すると考えられる。
【００７２】
一例では、感染は、慢性感染である。別の例では、感染は、ＨＩＶ感染等のウィルス感染である。
【００７３】
一例では、感染症は、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎である。
【００７４】
典型的な癌としては、血液癌、上皮由来癌、肝癌、膵癌、胃癌、骨肉腫、子宮内膜癌及び卵巣癌が挙げられる。
【００７５】
また、本開示は、対象におけるＩＬ−２１活性を高める方法を提供し、この方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または本開示の複合体を投与することを含む。
【００７６】
一例では、本明細書に記載される方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。たとえば、この方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで、または、０．２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。一例では、この方法は、ＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を、約０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。また、本開示は、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を、医療におけるいずれかの例に使用することを提供する。
【００７７】
また、本開示は、感染症、アレルギー性免疫応答または癌を治療するための薬剤の製造のいずれかの例による、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質または複合体の使用を提供する。
【００７８】
また、本開示は、ＩＬ−２１を発現する細胞に関連するＩＬ−２１媒介疾患を、局所化する、及び／または、検出する、及び／または、診断する、及び／または、予測する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−２１発現細胞に結合される本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質または抗体を、それが存在するならば、生体内で検出することを含み、ここで、ＩＬ−２１結合タンパク質または抗体は、検出可能なタグに結合されている。
【００７９】
一例では、この方法は、対象にＩＬ−２１結合タンパク質を投与することをさらに含む。
【００８０】
また、本開示は、免疫系前駆細胞を含む細胞の個体群を培養して拡大する方法を提供し、この方法は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または複合体の存在下で、生体外でまたは生体外で、細胞の個体群を培養することを含む。
【００８１】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質、または、複合体の存在下で、細胞を培養することにより、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞等の免疫系細胞の増殖及び分化を高めるだろうことが、理解されよう。
【００８２】
一実施形態では、この培養方法はさらに、細胞集団に外因性ＩＬ−２１を付加させることを備える。
【００８３】
免疫系前駆細胞を含む細胞個体群を、哺乳類の対象から取得される生体サンプルから単離してもよい。サンプルは、多数のソースに由来してもよく、その非限定的な例としては、末梢血液、白血球除去血液製品、除去療法血液製品、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、肝臓、免疫性病変（たとえば滑液）の部位、膵臓、及び、脳脊髄液等が挙げられる。ドナー対象は好ましくはヒトであり、また、胎児、新生児、子供、成人であることができ、また、正常、罹病、または着目の疾病に罹患しやすい状態であり得る。
【００８４】
ある実施形態では、細胞サンプルは、血液サンプルからの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等を含む）及び単核細胞を意味する。一般に、ＰＢＭＣは、標準的な技術を用いて患者から単離される。ある実施形態では、赤血球及び多形核白血球の実質的に全てをドナーに残すことまたは戻すことによって、ＰＢＭＣのみが取得される。白血球泳動法等、当該技術分野で知られている方法を用いて、ＰＢＭＣを単離してもよい。一般に、５〜７リットルの白血球泳動法ステップを実行し、それにより、患者からＰＢＭＣを本質的に除去し、残りの血液成分を戻す。サンプルの収集は好ましくは、血液凝固阻止剤（たとえば、ヘパリン）の存在下で実行される。
【００８５】
本明細書に記載されるように、生体外で及び生体外で細胞培養を用いて、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞を増殖させることができることが、理解されよう。
【００８６】
また、本開示は、上記に記載される方法にしたがって、生体外でまたは生体外で増殖された細胞を投与することにより、対象における感染または感染症、アレルギー性免疫応答または癌を治療または予防する方法を提供することが、理解されよう。
【００８７】
上記に開示される方法により得られた、生体外でまたは生体外で増殖された細胞集団を、単独で、または本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または複合体と組み合わせて、用いる事により、疾患の再発を予防することができ、これは疾患を防止すると考えられる。典型的な感染症としては、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎が挙げられる。典型的な癌としては、血液癌、上皮由来癌、肝癌、膵癌、胃癌、骨肉腫、子宮内膜癌及び卵巣癌が挙げられる。
【００８８】
また、本開示は、サンプル中で、ＩＬ−２１またはそれを発現する細胞を検出する方法を提供し、この方法は、サンプルをいずれかの例に従って本明細書に記載されるタンパク質または抗体に接触させることにより複合体を形成すること、及び、この複合体を検出すること、を含み、ここで、複合体の検出は、ＩＬ−２１またはサンプルのそれを発現する細胞を標示するものである。一例では、この方法は、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でまたは生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実行される。
【００８９】
また、本開示は、いずれかの例に従って本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質または複合体を含むキット（たとえば、パッケージまたは製造品）を提供し、これは任意に、本明細書に記載される方法で使用するための説明書付きでパッケージ化される。
【００９０】
配列表の解説
配列番号１：ヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列
配列番号２：抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のアミノ酸配列
配列番号３：抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のアミノ酸配列
配列番号４：２Ｐ２結合エピトープのアミノ酸配列
配列番号５：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０：ＩＭＧＴ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＨ鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６：Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いた抗体２Ｐ２のＶＬ鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７：抗体２Ｐ２のＶＨ鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号１８：抗体２Ｐ２のＶＬ鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号１９：２Ｐ２結合エピトープのアミノ酸配列
配列番号２０：２Ｐ２結合エピトープのアミノ酸配列
配列番号２１：２Ｐ２結合エピトープのアミノ酸配列
配列番号２２：２Ｐ２結合エピトープのアミノ酸配列
配列番号２３：２Ｐ２結合エピトープのコアアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】２ｎｇ／ｎｌのｈＩＬ−２１の存在下で、ｍＡｂ  ２Ｐ２により、用量依存的方法（ｎ＝３±ＳＥＭ）でヒトＩＬ−２１受容体（ＢａＦ３−ｈＩＬ−２１Ｒ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖が増大されることを示す図である。
【図２】ＩＭＧＴ番号付けスキームにより決定される、抗体２Ｐ２のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを示す図表示である
【図３】ｍＡｂ  ２Ｐ２は、Ｂａ／Ｆ３−ｈＩＬ−２１Ｒ細胞の増殖を増大させたが、Ｂａ／Ｆ３−ｍＩＬ−２１Ｒ細胞は増大しなかったこと（Ａ）、並びに、ｍＡｂ  ２Ｐ２は、ｈＩＬ−２１生物活性を１０倍以上増大させたこと（ｂ）（ｎ＝３±ＳＥＭ）を示す図である。
【図４】ｍＡｂ  ２Ｐ２が、ヒトＢ細胞のｈＩＬ−２１媒介増殖を増大させたこと、ならびに５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１プラス１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ  ２Ｐ２により、１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１と同程度の生物活性があったことを実証し、ｍＡｂ  ２Ｐ２によるｈＩＬ−２１生物活性が約２０倍増加したことを、示す図である。
【図５】ｍＡｂ  ２Ｐ２が、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞のｈＩＬ−２１媒介活性化を増大させて、抗ウィルス及び抗腫瘍免疫に重要であるグランザイムＢ及びパーフォリンを含む細胞毒性分子を発現することを示す図である。
【図６】静注（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）のいずれかで投与される、ＩＬ−２１／２Ｐ２複合体または単独ＩＬ−２１の半減期決定の結果を示す図である（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【図７】小胞Ｂ細胞（Ａ）、周縁帯Ｂ細胞（Ｂ）及び遷移Ｂ細胞（Ｃ）に対して、リンパ節においてＩＬ−２１によって媒介されるＢ細胞増殖の２Ｐ２増強の結果を示す図である（ｎ＝３±ＳＥＭ；＊Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＞０．０１  ＊＊＊Ｐ＞０．００１）。
【図８】小胞Ｂ細胞（Ａ）、周縁帯Ｂ細胞（Ｂ）及び遷移Ｂ細胞（Ｃ）に対して、脾臓においてＩＬ−２１によって媒介されるＢ細胞増殖の２Ｐ２増強の結果を示す図である（ｎ＝３±ＳＥＭ；＊Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＞０．０１＊＊＊Ｐ＞０．００１）。
【図９】構造シミュレーションにより２Ｐ２による結合に関与すると考えられるヒトＩＬ−２１（太字体で示した）の残分を示す図である。ＩＬ−２１らせん領域に位置する残分に下線を引いた。
【図１０】ヒトＩＬ−２１のペプチドフラグメント及び２Ｐ２と、ＥＬＩＳＡにより決定される対照抗体３Ａ３との間の結合を示す図である。
【図１１】（Ａ）ヒトＩＬ−２１またはマウスＩＬ−２１の間の２Ｐ２との結合、及び、（Ｂ）ヒトＩＬ−２１及びマウスＩＬ−２１の間の対照抗体３Ａ３との結合、を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
概説
本明細書を通して、別段に具体的に述べられない限り、または、文脈が別段に要求しない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップのグループまたは物質の組成物のグループに対する言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップのグループまたは物質の組成物のグループの単数または複数（すなわち１つ以上）を含むと理解されよう。したがって、本明細書に用いられる場合において、文脈において明らかに他を指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。たとえば、「ａ」への言及は、単数ならびに２以上を含み、「ａｎ」への言及は、単数ならびに２以上を含み、「ｔｈｅ」への言及は、単数ならびに２以上を含む等である。
【００９３】
当業者には明らかなように、本開示は、具体的に記載されたこと以外の変形及び変更を受け入れる余地がある。本開示は、すべてのこのような変形及び変更を含むと、理解されるべきである。また、本開示は、本明細書で、個別的にまたは全体的に、参照または指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物の全て、並びに、該ステップまたは特徴のすべての組み合わせまたはいずれかの二つ以上を含む。
【００９４】
本開示は、本明細書に記載される具体的な実施例によって、その範囲を限定されるものではなく、これら実施例は、例証のみの目的が意図されるものである。機能的に等価の生成物、組成物及び方法は、明らかに本開示の範囲内である。
【００９５】
本明細書の本開示のいずれかの実施例は、具体的には別段に述べられない限り、必要な変更を加えて本開示のいずれかの他の実施例に適用されるものと、理解されよう。
【００９６】
具体的には別段に定義されない限り、本明細書におけるすべての技術的な及び科学的な用語は、当該技術分野（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学の分野）における通常の知識を有する者に、共通して理解されるのと同じ意味を有すると、理解される。
【００９７】
特に明記しない限り、本開示で利用される組換え型タンパク質、細胞培養及び免疫学的技術は標準的な手順であり、当業者に周知のものである。このような技術は、以下のソースの文献等に記載され説明される。Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９８４）、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ （編者）， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ, Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）、Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ （編者）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ ｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １ −４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９５ ａｎｄ １９９６）、及び、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら（編者）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての最新版を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （編者） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８）、及び、Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら（編者）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての最新版を含む）。
【００９８】
本明細書における可変領域及びその部分、免疫グロブリン、抗体及びフラグメントの説明及び定義については、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９８７ 及び １９９１，Ｂｏｒｋら， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２， ３０９−３２０， １９９４， Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１ −９１７， １９８７，Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４２， ８７７−８８３， １９８９及び／またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３， ９２７−９４８， １９９７における考察によりさらに明らかにされてもよい。
【００９９】
用語「及び／または」、たとえば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」を意味すると理解され、これら両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的なサポートを提供すると理解される。
【０１００】
本明細書を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または、その変形である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと」は、明示された要素、整数若しくはステップ、または、要素、整数若しくはステップのグループを含むことを意味すると理解されるが、いかなる他の要素、整数若しくはステップ、または、要素、整数若しくはステップのグループをも除外するものではない。
【０１０１】
本明細書に用いられる場合において、「から由来する」という語は、特定の整数が、特定のソースから得られてもよいが、そのソースから必ず直接得られる必要はないことを示すと理解されるものである。
【０１０２】
本明細書における、たとえば残分等の範囲の言及は、包括的であると理解される。たとえば、「アミノ酸５６〜６５を含む領域」の言及は、包括的な様式で理解され、すなわち、その領域は、特定の配列で５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５の番号のアミノ酸の配列を含む。
【０１０３】
選択された定義
限定ではなく命名法のみの目的で、ヒトＩＬ−２１の典型的な配列は、配列番号１に設定される。
【０１０４】
「ＩＬ−２１活性を高める」というフレーズは、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、天然に存在するＩＬ−２１の、以下の非限定的な例のいずれか１つ以上の活性を高めることを意味すると理解される。ＮＫ細胞の増殖、細胞毒性または成熟を刺激すること、Ｂ細胞及びＴ細胞の増殖または分化を刺激すること、Ｂ細胞における抗体産生及び親和性成熟を刺激すること、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性を刺激すること、Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるインターフェロンガンマ生成を刺激すること、樹状細胞（ＤＣ）活性化及び成熟を阻害すること、肥満細胞からの炎症媒介物のリリースを阻害すること、マクロファージのファゴサイトーシスを高めること、ＴＲｅｇ細胞の生成または生残性を阻害すること、及び、骨髄前駆細胞の増殖を刺激すること。
【０１０５】
用語「単離タンパク質」または「単離ポリペチド」は、その起源または由来のソースの理由で天然の状態でそれを伴う天然関連成分と関連せず、同じソースからの他のタンパク質が実質的に存在しないタンパク質またはポリペチドである。タンパク質は、天然関連成分が実質的に含まなくてもよく、または、当該技術分野で知られているタンパク質精製技術を用いた単離により実質的に精製されてもよい。「実質的に精製される」とは、タンパク質には、混入物質が実質的に無いこと、たとえば、少なくとも約７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％、混入物質が無いことを意味する。
【０１０６】
「組換え型」という用語が、人工遺伝子組換えの生成物を意味することは、理解されよう。したがって、抗体抗原結合ドメインを含む組換え型タンパク質との関連で、この用語は、Ｂ細胞成熟の間に発生する天然遺伝子組換えの生成物である、対象の体内で天然に発生する抗体を、含まない。しかしながら、このような抗体が単離されれば、それは、抗体抗原結合ドメインを含んだ単離タンパク質と考えられることとなる。同様に、タンパク質をコードする核酸が単離されて、組換え型手段を用いて発現された場合は、得られたタンパク質は、抗体抗原結合ドメインを含む組換え型タンパク質である。また、組換え型タンパク質は、たとえばそれが発現される細胞内、組織内または対象内にある場合に、人工組換え型手段により発現されるタンパク質も、含む。
【０１０７】
「タンパク質」という用語は、一つのポリペプチド鎖、すなわち、共有結合でまたは非共有結合で相互に結合されるペプチド結合またはポリペプチド鎖の列（すなわち、ポリペチド複合体）により結合される連続した一連のアミノ酸、を含むと理解される。たとえば、一連のポリペプチド鎖は、適切な化学またはジスルフィド結合を用いて共有結合させることができる。非共有結合の実施例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及び疎水的相互作用が挙げられる。
【０１０８】
「ポリペチド」または「ポリペプチド鎖」という用語は、前述の段落から理解され、ペプチド結合により結合される一連の連続したアミノ酸を意味する。
【０１０９】
本明細書に用いられる場合において、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に特異的に結合することができる抗体の領域を意味すると理解され、すなわち、ＶＨ若しくはＶＬ、または、ＶＨ及びＶＬの両方を含むＦｖである。抗原結合ドメインは、抗体全体と関連がある必要はなく、たとえば、単離型（たとえば、ドメイン抗体）であってもよく、または、たとえば、本明細書に記載される別の形態（たとえばｓｃＦｖ）であってもよい。
【０１１０】
本開示のための目的のため、「抗体」という用語には、Ｆｖ中に含まれる抗原結合ドメインにより、１個または数個の密接に関連がある抗原（たとえば、ＩＬ−２１）に特異的に結合することができるタンパク質が含まれる。この用語は、４鎖抗体（たとえば、２つの軽鎖及び２つの重鎖）、組換え型または組換え抗体（たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植化抗体、霊長類化抗体、非免疫化された抗体、合成ヒト化抗体、半分の抗体、二重特異性抗体）を含む。抗体は、定常領域を一般に含み、この定常領域は、定常領域または定常フラグメントまたは結晶化可能（Ｆｃ）フラグメントに配列することができる。抗体の典型的な形は、それらの基本的なユニットとして４鎖構造を備える。完全長抗体は、共有結合される２つの重鎖（約５０〜７０ｋＤ）及び２つの軽鎖（各々約２３ｋＤａ）を備える。軽鎖は、一般に可変領域（存在するならば）及び定常領域を含み、哺乳類ではκ軽鎖またはλ軽鎖である。重鎖は、ヒンジ領域により追加の定常領域に結合される可変領域及び１個または２個の定常領域を一般に含む。哺乳類の重鎖は、以下のタイプα、δ、ε、γまたはμの１つである。
【０１１１】
各軽鎖は、重鎖の１つにも共有結合される。たとえば、２つの重鎖及び重及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合及び非共有結合的相互作用により、共に保持される。鎖間ジスルフィド結合の数は、別々のタイプの抗体の間で変えることができる。各鎖は、Ｎ末端可変領域（ＶＨまたはＶＬ、各々約１１０個のアミノ酸の長さである）を有し、かつ、Ｃ末端に１つ以上の定常領域を有する。軽鎖（ＣＬ、約１１０個のアミノ酸の長さである）の定常領域は、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１、３３０〜４４０個のアミノ酸の長さである）と整列配置され、かつ、これにジスルフィド結合される。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列配置される。抗体重鎖は、２つ以上の追加のＣＨドメイン（たとえば、ＣＨ２、ＣＨ３等）を備えることができ、また、ＣＨ１及びＣＨ２定常領域の間に、ヒンジ領域を備えることができる。抗体は、いずれかのタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。一例では、抗体は、ネズミ（マウスまたはラット）抗体または霊長類（たとえば、ヒト）抗体である。一例では、抗体重鎖は、Ｃ末端リジン残基を有しない。一例では、抗体は、ヒト化、合成ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植化、または、非免疫化であれる。
【０１１２】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」または「全抗体」は、抗体のフラグメントを結合する抗原とは対照的に、その実質的にインタクトな形態で抗体のことを指すために、互換可能に用いられる。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常領域は、野生型配列定常領域（たとえば、ヒト野生型配列定常領域）、または、そのアミノ酸配列変異株であってもよい。
【０１１３】
本明細書に用いられる場合において、本明細書に定義されるように、「可変領域」は、抗体の軽及び／または重鎖の部分のことをいい、これは、抗原に特異的に結合可能であり、かつ、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３、及び、フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。たとえば、可変領域は、３個のＣＤＲと共に、３個または４個のＦＲ（たとえば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意にＦＲ４）を含む。ＶＨは、重鎖の可変領域のことをいう。ＶＬは、軽鎖の可変領域のことをいう。
【０１１４】
本明細書に用いられる場合において、用語「相補性決定領域」（同意語としてＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、抗体可変領域のアミノ酸残基のことをいい、その存在は、特異的な抗原結合の主要な貢献者である。各可変領域ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲを典型的に有する。一例では、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、免疫学的に着目したタンパク質のＫａｂａｔ配列、アメリカ国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド、１９８７年及び１９９１年にしたがって、定義される（また、ここでは「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」と称する）。別の例では、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって定義される。Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従い、ＶＨ  ＦＲ及びＣＤＲは、以下の通りに配置される：残基１〜３０（ＦＲ１）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）及び、１０３〜１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従い、ＶＬ  ＦＲ及びＣＤＲは、以下の通りに配置される：残基１〜２３（ＦＲ１）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）及び９８〜１０７（ＦＲ４）。本開示は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されず、全ての番号付けシステムを含み、これは以下を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋの正準番号付けシステム、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１−９１７， １９８７年； Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ８７７−８８３， １９８９年；及び／またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３： ９２７−９４８， １９９７年；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ及びＰｌUｋｔｈｕｎの番号付けシステム、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９： ６５７−６７０， ２００１ 年；またはＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉらにより考察されるＩＭＧＴシステム、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２０６−２１ １ １９９７年。一例では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義される。任意に、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従った重鎖ＣＤＲ２は、本明細書に列挙される５つのＣ末端アミノ酸を含まず、または、それらのアミノ酸のいずれか１つ以上が、別の天然に存在するアミノ酸で置換される。この点に関し、Ｐａｄｌａｎら， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ９： １３３−１３９， １９９５年、では、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸が、一般に、抗原結合に関与しないことが確立された。
【０１１５】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
【０１１６】
本明細書に用いられる場合において、「Ｆｖ」という用語は、ＶＬ及びＶＨが結合し抗原結合ドメインを有する複合体を形成する、すなわち、抗原に特異的に結合することが可能な、複数のポリペチドまたは１つのポリペチドが含まれるか否かにかかわらず、いずれかのタンパク質を意味すると理解される。抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは、一つのポリペプチド鎖内にあってもよく、または、別々のポリペプチド鎖内にあってもよい。さらに、本開示のＦｖ（ならびに本開示のいずれのタンパク質）は、同じ抗原に結合し得るまたは結合できなくてもよい、複数の抗原結合ドメインを有してもよい。この用語が、抗体から直接誘導されるフラグメント、ならびに組換え型手段を用いて生成されるこのようなフラグメントに対応するタンパク質を含むことが理解されよう。一部の例では、ＶＬが軽鎖定常領域（ＣＬ）に結合されず、及び／または、ＶＨは重鎖定常領域（ＣＨ）１に結合されない。典型的なＦｖを含有するポリペチドまたはタンパク質としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体またはより高次の複合体、または、定常領域またはそのドメインに結合される前述のいずれかのもの、たとえば、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン、たとえば、低分子化抗体、等が挙げられる。「Ｆａｂフラグメント」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合性フラグメントから成り、酵素パパインにより全抗体を消化して、インタクト軽鎖及び一部の重鎖からなるフラグメントを発生させることにより生成することができ、または、組換え型手段を用いて生成することができる。抗体の「Ｆａｂ’フラグメント」は、全抗体をペプシンで処理した後に還元し、インタクト軽鎖、並びに、ＶＨ及び単一の定常領域を含む重鎖の一部からなる分子を生成することにより、得ることができる。このように処理される抗体につき、２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、組換えの手段により生成することもできる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２つのジスルフィド結合により一緒に保持される２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーから成り、全抗体分子を酵素ペプシンで処理することにより、以降の還元を行わずに、得られる。「Ｆａｂ２」フラグメントは、たとえばロイシンジッパーまたはＣＨ３ドメインを用いて結合させた２つのＦａｂフラグメントを含む、組換え型フラグメントである。「単一の鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体の可変領域フラグメント（Ｆｖ）を含む組換え分子であり、その軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が、適切なフレキシブルポリペチドリンカーにより共有結合される。
【０１１７】
本明細書に用いられる場合において、ＩＬ−２１結合タンパク質またはその抗原結合ドメインの抗原との相互作用に関しての「結合する」という用語は、相互作用が、抗原上の特定の構造（たとえば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。たとえば、抗体は、一般的なタンパク質ではなく、特異的なタンパク質構造を認識して、これに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合は、標識化「Ａ」及びタンパク質を含んでいる反応におけるエピトープ「Ａ」（またはフリーな未標識「Ａ」）を含む分子の存在は、抗体に結合される標識化「Ａ」の量を減少させる。
【０１１８】
本明細書に用いられる場合において、「特異的に結合する」または「特異的に結合する」との用語は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、代替の抗原または細胞に対するよりも、より高頻度で、より迅速に、より長い持続時間で、及び／または、特定の抗原またはそれを発現する細胞に対してより高い親和性で、反応または関与することを意味すると理解される。たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質は、（すなわち、人間で天然に見出される様々な抗原を結合することが知られる天然に存在する抗体により）それが他のインターロイキンに対するより、または、多反応性天然抗体により共通して認識される抗原に対するより、より大きな親和性（たとえば、１．５倍または２倍または５倍または１０倍または２０倍または４０倍または６０倍または８０倍から１００倍または１５０倍又２００の倍）で、ＩＬ−２１（たとえば、ｈＩＬ−２１）に結合する。本開示の実施例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、他のインターロイキンに対するよりも親和性が少なくとも１．５倍または２倍以上（たとえば、５倍または１０倍または２０倍または５０倍または１００倍または２００倍）で、ｈＩＬ−２１に「特異的に結合する」。一般に、しかし必然的ではなく、結合することに対する言及は、特異的な結合を意味し、各用語は、明示的なサポートを他の用語に提供することが理解されよう。
【０１１９】
本明細書に用いられる場合において、用語「検出可能的に結合しない」とは、ＩＬ−２１結合タンパク質、たとえば、抗体等が、１０％未満または８％未満または６％未満または５％未満、バックグラウンドよりも高いレベルで、候補となる抗原に結合することを意味すると理解される。バックグラウンドは、タンパク質がない場合及び／または陰性対照タンパク質（たとえば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で、検出される結合シグナルのレベル、及び／または、陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベル、とすることができる。結合のレベルは、ＩＬ−２１結合タンパク質を固定して抗原に接触させるバイオセンサー分析法（たとえばＢｉａｃｏｒｅ）を用いて、検出される。
【０１２０】
本明細書に用いられる場合において、用語「有意に結合しない」とは、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質のポリペチドへの結合のレベルは、バックグラウンド、たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質がない場合及び／または陰性対照タンパク質（たとえば、アイソタイプ対照抗体）の存在下での結合シグナルのレベル、及び／または、陰性対照ポリペチドの存在下で検出される結合のレベル、よりも統計学的に有意に高くないことを意味すると理解されよう。結合のレベルは、ＩＬ−２１結合タンパク質を固定して抗原に接触させるバイオセンサー分析法（たとえばＢｉａｃｏｒｅ）を用いて、検出される。
【０１２１】
説明の目的で、そして、本明細書に例証された構成要件に基づいて当業者にとって明らかなように、本明細書における「親和性」への言及は、タンパク質または抗体のＫＤへの言及である。
【０１２２】
説明の目的で、そして、この説明に基づく当業者にとって明らかなように、「親和性が少なくとも約」への言及は、親和性（または、ＫＤ）が、引用された値と等しいまたはより高い（すなわち、親和性はより低く引用される）こと、すなわち、２ｎＭの親和性が３ｎＭの親和性のよりも高いこと、を意味することが理解されよう。他の方法で述べるとすれば、この語は、「Ｘ以下の親和性」であってもよく、ここでＸは、本明細書に引用される値である。
【０１２３】
本明細書に用いられる場合において、「エピトープ」という用語（同意語「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質が結合するＩＬ−２１の領域のことを意味すると理解される。この用語は、ＩＬ−２１結合タンパク質が接触する特異的な残基または構造に必ず限定されるというわけではない。たとえば、この語は、ＩＬ−２１結合タンパク質が接触するアミノ酸、並びに、この領域の外の５〜１０個（またはそれ以上）または２〜５個または１〜３個のアミノ酸にまたがっている領域を含んでいる。一部の例では、エピトープは、ＩＬ−２１結合タンパク質が折りたたまれた場合、すなわち「立体配置的エピトープ」の場合に、相互に近接して配置される一連の不連続なアミノ酸を含む。また、当業者は、用語「エピトープ」がペプチドまたはポリペチドに限定されないことを、知っている。たとえば、用語「エピトープ」は、たとえば糖側鎖、ホスホリル側鎖、またはスルホニル側鎖等、分子の化学的に活性な表面グループを含み、また所定の例では、特異的な三次元構造上の特性及び／または特異的な荷電特性を有してもよい。
【０１２４】
用語「競合的に阻害する」とは、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質（または、その抗原結合ドメイン）が、引用された抗体またはＩＬ−２１結合タンパク質の、ＩＬ−２１、たとえば、ｈＩＬ−２１への結合を低下または妨げることを意味すると理解される。これは、ＩＬ−２１結合タンパク質（または抗原結合ドメイン）及び抗体が、同じまたは重なり合うエピトープに結合することが原因であるかもしれない。ＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、むしろ、結合を、統計的に有意な量、たとえば、少なくとも約１０％または２０％または３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または９５％、低下させるだけで十分であることが、前述から明らかである。好ましくは、ＩＬ−２１結合タンパク質は、少なくとも約３０％だけ、さらに好ましくは少なくとも約５０％だけ、さらに好ましくは少なくとも約７０％だけ、またさらに好ましくは少なくとも約７５％だけ、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％または８５％だけ、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％だけ、抗体の結合を低下させる。結合の競合阻害を決定する方法は、当該技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載される。たとえば、抗体は、ＩＬ−２１結合タンパク質の存在下または不存在下で、ＩＬ−２１に曝露される。ＩＬ−２１結合タンパク質の存在下の方が、ＩＬ−２１結合タンパク質の不存在の場合よりも抗体の結合が少ない場合は、そのタンパク質は、抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。一例では、競合阻害は、立体障害によらない。
【０１２５】
２つのエピトープとの関連で「重なる」ことは、２つのエピトープが、１つのエピトープに結合するＩＬ−２１結合タンパク質（または、その抗原結合ドメイン）が、他のエピトープに結合するＩＬ−２１結合タンパク質（または、抗原結合ドメイン）の結合を競合的に阻害することができるのに十分な数のアミノ酸残基を共有することを意味すると理解される。たとえば、「重なり合う」エピトープは、少なくとも１または２または３または４または５または６または７または８または９または２０個のアミノ酸を共有する。
【０１２６】
本明細書に用いられる場合において、用語「拮抗する」は、タンパク質が細胞中のＩＬ−２１媒介シグナル伝達を高めることができることを意味すると理解される。強化された活性を決定する方法は、当該技術分野で知られており、及び／または、本明細書に記載される。
【０１２７】
本明細書に用いられる場合において、用語「疾患」は、正常機能の破壊または障害のことをいい、いずれかの具体的な疾患に限定されず、疾病または疾患を含み得る。
【０１２８】
本明細書に用いられる場合において、期間、「予防すること」、「予防する」または、「予防」は本開示のＩＬ−２１結合タンパク質を投与することにより、疾患の少なくとも１つの症状の発症を停止することまたは妨げることを含む。また、この語は、寛解期にある対象の再発を予防するまたは妨げるための治療も含む。
【０１２９】
本明細書に用いられる場合において、用語「治療すること」、「治療する」または、「治療」は、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質を投与することにより、特定の疾病または状態の少なくとも１つの症状を減少または排除することを含む。
【０１３０】
本明細書に用いられる場合において、語「対象」とは、ヒトを含むいずれかの動物、たとえば哺乳類を意味すると理解される。典型的な対象の非限定的な例としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられる。たとえば、対象はヒトである。
【０１３１】
抗体
一例として、いずれかの例によって本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体である。
【０１３２】
抗体を作成する方法は、当該技術分野で知られており、及び／または、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編集者）抗体：実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）に記載されている。一般に、このような方法では、ＩＬ−２１（たとえばｈＩＬ−２１）またはその領域（たとえば細胞外領域）、または、免疫原性フラグメントまたはそのエピトープ、または、これらを発現し及び示す細胞（すなわち免疫原）は、任意に、あらゆる適切なまたは所望の担体、補助剤または薬学的に許容される賦形剤と共に調製され、非ヒト動物、たとえば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギまたはブタ、に投与される。免疫原は、鼻腔内、筋内、皮下、静注、皮内、腹膜内、または他の既知のルートにより投与されてもよい。
【０１３３】
免疫後のさまざまな時点で、免疫した動物の血液を採集することによって、ポリクローナル抗体の生成をモニタすることができる。所望の抗体価を達成することが要求される場合、１つ以上の更なる免疫処置を行ってもよい。適切な滴定量が達成されるまで、ブースティング及び滴定するプロセスが繰り返される。免疫原性の所望のレベルが得られた場合は、免疫化された動物から採血して、その血清を分離及び保存し、及び／または、その動物を用いて、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する。
【０１３４】
モノクローナル抗体は、本開示により想定される抗体の１つの典型的な形である。「モノクローナル抗体」という用語または「ｍＡｂ」は、同じ抗原、たとえば抗原中の同じエピトープにに結合することができる均一な抗体群のことをいう。この語は、抗体のソースまたは抗体を作製する方法に関して限定することを意図するものではない。
【０１３５】
ｍＡｂの生成のために、多数の既知の技術のいずれか１つ、たとえば米国特許第４,１９６,２６５号または上記のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）で例証される手順を、用いてもよい。
【０１３６】
たとえば、適切な動物は、抗体産生細胞を刺激するに十分な条件下で、免疫原で免疫化される。齧歯動物、たとえばウサギ、マウス及びラットは、典型的な動物である。ヒト抗体を発現するように遺伝子操作され、たとえばネズミ抗体を発現しない、マウスを用いて、本開示の抗体を生成することもできる（たとえば、ＷＯ２００２／０６６６３０に記載されるように）。
【０１３７】
免疫化に続いて、抗体（特異的にＢリンパ球（Ｂ細胞））を生成する可能性を有する体細胞を、ｍＡｂ生成手順で使用するために選択する。これらの細胞は、脾臓、扁桃またはリンパ節の生検から、または、末梢血液サンプルから得ることができる。免疫化された動物からのＢ細胞は、免疫原で免疫化された動物と同じ種から一般に由来する不死の骨髄腫細胞の細胞に、その後融合される。
【０１３８】
組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含んだ選択的培地の培養により、ハイブリッドは増幅される。典型的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート及びアザセリンである。
【０１３９】
増幅されたハイブリドーマは、たとえばフローサイトメトリー及び／または免疫組織化学及び／またはイムノアッセイ（たとえばラジオイムノアッセイ、酵素免疫学的測定法、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイ等）により、抗体特異性及び／または滴定量のための機能的選択を受ける。
【０１４０】
代替的に、ＭＡｂを分泌する細胞株を製造するために、ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ社、マディソン，Ｗｌ ５３７１３、ＵＳＡ）を用いる（たとえば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９７： ８５−９５， １９９６年に記載されるように）。
【０１４１】
たとえば、米国特許第６３０００６４号及び／または米国特許第５８８５７９３号に記載されるように、ディスプレイライブラリ、たとえば、ファージディスプレイライブラリを、スクリーニングすることより、抗体は、生成または単離可能である。たとえば、本発明者らは、ヒト抗体全体をファージディスプレイライブラリから単離した。
【０１４２】
本開示の抗体は、合成抗体であってもよい。たとえば、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成ヒト化抗体、霊長類化抗体または非免疫化された抗体である。
【０１４３】
非免疫化、キメラ、ＣＤＲ移植化、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、ヒト及び複合ＩＬ−２１結合タンパク質
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、ＣＤＲ移植化タンパク質でもよく、このＣＤＲ移植化タンパク質は、ヒト抗体からのＦＲへ移植又挿入される、非ヒト種（たとえば、マウスまたはラットまたは非ヒト霊長類）からの抗体からのＣＤＲを含むか、または、他のタイプの抗体（たとえば、別のタイプのヒト抗体）からのＦＲへ移植または挿入される、抗体の１つのタイプからの抗体（たとえば、ヒト抗体の１つのタイプ）からのＣＤＲを含む。また、この語は、たとえば、１つ以上のＣＤＲ移植化可変領域、及び、１つ以上の、たとえば、ヒト可変領域、キメラ可変領域、合成ヒト化可変領域または霊長類化可変領域等を含む、複合ＩＬ−２１結合タンパク質も含む。
【０１４４】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、ヒト化タンパク質でもよい。
用語「ヒト化タンパク質」は、非ヒト種（たとえば、マウスまたはラットまたは非ヒト霊長類）からの抗体からのＣＤＲを含み、ヒト抗体（この種の抗体は「ＣＤＲ移植化抗体」の種別に入る）からのＦＲに移植または挿入される、ヒト類似可変領域を含んだタンパク質のことをいうものと理解される。また、ヒト化ＩＬ−２１結合タンパク質は、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換により変成されるタンパク質、及び／または、ヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が、対応する非ヒト残基により置換されるタンパク質を、含む。また、ヒト化タンパク質は、ヒト抗体にも非ヒト抗体にも見出されない残基を備えてもよい。タンパク質のあらゆる追加の領域（たとえばＦｃ領域）は、一般にヒトのである。ヒト化は、当該技術分野で知られている方法、たとえば、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第７５６６７７１号または米国特許第５５８５０８９号等、を用いて実行することができる。また、用語「ヒト化タンパク質」は、超ヒト化タンパク質（たとえば、米国特許第７７３２５７８号で定める）も含む。また、この語は、たとえば、１つ以上のヒト化された可変領域、及び、１つ以上のたとえば、ヒト可変領域、キメラ可変領域、合成ヒト化可変領域または霊長類化可変領域等、を含む複合タンパク質も含む。
【０１４５】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、ヒトＩＬ−２１結合タンパク質でもよい。ここで用いられる用語「ヒトタンパク質」は、ヒトから見出される、たとえば、ヒト生殖細胞系、または、体細胞、または、下記領域を使用して生成されるライブラリから見出される、可変抗体領域及び、任意に、定常抗体領域を有するタンパク質のことをいう。「ヒト」タンパク質は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、たとえば、生体外でランダムまたは部位定方向突然変異により導入される突然変異（特に、少数のタンパク質の残基中、たとえばタンパク質の残基の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの中で、保存的置換または突然変異を関与する突然変異）等を含むことができる。これらの「ヒトタンパク質」は、ヒトの免疫応答の結果として必然的に発生する必要はなく、それらは、組換え型手段（たとえば、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングすること）を用い、及び／または、ヒト抗体定常領域及び／または可変領域をコードする核酸を含む遺伝子移入動物（たとえばマウス）により、及び／または、（たとえば、米国特許第５５６５３３２号に記載されている）導かれた選択を使用して、発生させることができる。また、この語は、このような抗体の親和性が成熟した形態を含む。本開示の目的で、ヒトタンパク質は、ヒト抗体またはＦＲからＦＲを含んでいるタンパク質を含むとも考えられ、これは、ヒトＦＲの共通配列から配列を含み、たとえば、米国特許第６３０００６４号や米国特許第６２４８５１６号に記載されているように、そのＣＤＲの１つ以上がランダムなまたはセミランダムである。
【０１４６】
任意に、ＶＨは、重鎖定常領域、たとえば、ＩｇＧ４重鎖定常領域、に結合される。一例では、重鎖定常領域は、Ｃ末端リジン残基が欠如している。
【０１４７】
任意に、ＶＬは、軽鎖定常領域に結合される。
【０１４８】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、合成ヒト化タンパク質であってもよい。用語「合成ヒト化タンパク質」とは、ＷＯ２００７／０１９６２０に記載される方法により調製されるタンパク質のことをいう。合成ヒト化ＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体の可変領域を含み、この可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域からのＦＲ、及び、非新世界霊長類抗体可変領域からのＣＤＲを含む。たとえば、合成ヒト化ＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体の可変領域を含み、この可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域からのＦＲ及びマウスまたはラット抗体からのＣＤＲを含む。一例では、合成ヒト化ＩＬ−２１結合タンパク質は、一方または両方の可変領域がヒト化合成されたＩＬ−２１結合抗体である。また、この語は、たとえば、１つ以上の合成ヒト化可変領域及び１つ以上の、たとえば、ヒト可変領域またはヒト化された可変領域またはキメラ可変領域を含む複合タンパク質も含む。
【０１４９】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、霊長類化タンパク質であってもよい。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類（たとえばカニクイザル）の免疫化の後に発生させた抗体からの可変領域を含む。任意に、非ヒト霊長類抗体の可変領域をヒト定常領域に結合させて、霊長類化抗体を製造する。霊長類化抗体を生成する典型的な方法は、米国特許第６１１３８９８号に記載される。また、この語は、たとえば、１つ以上の霊長類化可変領域及び１つ以上の、たとえば、ヒト可変領域またはヒト化された可変領域またはキメラ可変領域を含む複合タンパク質も含む。
【０１５０】
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、キメラタンパク質である。語「キメラタンパク質」とは、抗原結合ドメインが特定の種（たとえばマウスまたはラット等のネズミ）からまたは特定の抗体種別またはサブクラスに属し、一方で、タンパク質の残部が、他の種（たとえばヒトまたは非ヒト霊長類）に由来するタンパク質から、または他の抗体種別またはサブクラスに属する、タンパク質のことをいう。一例では、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（たとえばマウス抗体）からＶＨやＶＬを含むキメラ抗体であり、抗体の残りの領域はヒト抗体からである。このようなキメラタンパク質の生成は、当該技術分野で知られており、及び、標準手段（たとえば、米国特許第６３３１４１５号；米国特許第５８０７７１５号；米国特許第４８１６５６７号及び米国特許第４８１６３９７号に記載）により達成されてもよい。また、この語は、たとえば、１つ以上のキメラ可変領域及び１つ以上の、たとえば、ヒト可変領域またはヒト化された可変領域またはキメラ可変領域を含む複合タンパク質も含む。
【０１５１】
また、本開示は、たとえば、国際特許公報ＷＯ２０００／３４３１７及び国際特許公報ＷＯ２００４／１０８１５８に記載されているように、非免疫付与ＩＬ−２１結合タンパク質も想定する。非免疫化された抗体及びタンパク質は、たとえば、除去された（すなわち変異された）Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープ等の１つ以上のエピトープを有することにより、対象が抗体またはタンパク質に対して免疫応答を増加させるという可能性を低下させる。たとえば、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質を分析して、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープを特定し、また、エピトープの中の１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＩＬ−２１結合タンパク質の免疫原性を低下させる。
【０１５２】
「複合」タンパク質は、ＶＨの１つの形態（たとえばヒト）及びＶＬの他の形態（たとえばヒト化）を含むことが、前述の開示から当業者にとって明らかである。本開示は、ＶＨ及びＶＬの形態のすべての組み合わせを明示的に含む。
【０１５３】
相補性決定領域の決定
本明細書に開示される相補性決定領域（ＣＤＲ）は、一例では、Ｌｅｆｒａｎｃ及びその同僚の番号付けシステムに基づいており、これは、免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）番号付けシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅら（１９９９）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２７（１）：２０９−２１２）と呼ばれており、これは、抗体ラムダ及びカッパ軽及び重鎖可変領域、ならびに、Ｔ細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ鎖可変領域を含む、免疫グロブリン可変領域生殖細胞系配列のための統一番号付けシステムである。
【０１５４】
Ｋａｂａｔらの番号付けシステム（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７年及び／または１９９１年）を用いて、ＣＤＲが決定されることもできると、当業者は認識する。この番号付けシステムにより、ＣＤＲ領域は、以下の通りであると決定された：
【０１５５】
可変重鎖
ＣＤＲ１  ＤＹＹＩＨ
ＣＤＲ２  ＷＩＤＰＥＳＧＤＴＥＹＡＰＫＦＱＶ
ＣＤＲ３  ＧＳＧＹ
可変軽鎖
ＣＤＲ１  ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＥＴＹＬＮ
ＣＤＲ２  ＬＶＳＫＬＤＳ
ＣＤＲ３  ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ
【０１５６】
したがって、本開示は、抗体の抗原結合ドメインを含むＩＬ−２１結合タンパク質も含み、ここで、抗原結合性ドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従った上記の重鎖及び軽鎖相補性決定領域配列を含む。
【０１５７】
タンパク質を含む抗体結合ドメイン
単一ドメイン抗体
一部の例では、本開示のタンパク質は、単一ドメイン抗体（用語「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」と互換可能に用いられる）である、または単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全てまたは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。所定の例では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社、ウォルサム、ＭＡ；たとえば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。
【０１５８】
二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体
一部の例では、本開示のタンパク質は、たとえば国際特許公報ＷＯ９８／０４４００１や国際特許公報ＷＯ９４／００７９２１に記載されるような、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体またはより高次のタンパク質複合体である、または、これらを備える。
【０１５９】
たとえば、二重特異性抗体は、２つの関連ポリペプチド鎖を含んでいるタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は、構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨまたはＶＨ−Ｘ−ＶＬを含み、ＶＬは、抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは、抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬが結合できるようにする（またはＦｖを生成する）には不十分な残基を含んでいるリンカーであるか、または、存在せず、１つのポリペプチド鎖のＶＨは、他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合ドメインを生成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することができるＦｖ分子を生成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖で同じであってもよく、または、ＶＬ及びＶＨは、二重特異性の二重特異性抗体（すなわち別々の特異性を有している２つのＦｖを含む）を生成するように、各ポリペプチド鎖では別々であってもよい。
【０１６０】
単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
ｓｃＦｖは、単一のポリペプチド鎖にＶＨ及びＶＬ領域と、ＶＨとＶＬの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を生成することを可能にする（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬを相互に結合させてＦｖを生成する）ポリペチドリンカーとを含んでいることを、当業者は知っているだろう。たとえば、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３で、１２を超えるアミノ酸残基を含み、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。
【０１６１】
また、本開示は、ジスルフィド安定化Ｆｖ（または、ｄｉＦｖまたはｄｓＦｖ）も想定し、ここで、単一のシステイン残基が、ＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲ、及び、ジスルフィド結合により結合されるシステイン残基に導入され、安定なＦｖを生成する。
【０１６２】
代替的に、または追加的に、本開示は、すなわち、非共有結合的または共有結合リンケージにより、たとえば、ロイシンジッパードメイン（たとえばＦｏｓまたはＪｕｎに由来する）により、結合される２つのｓｃＦｖ分子を含んだタンパク質である、二量体ｓｃＦｖを含む。代替的に、２つのｓｃＦｖは、十分な長さのペプチドリンカーにより結合されることにより、両方のｓｃＦｖが形成されて抗原に結合できるようになり、これはたとえば、米国特許第２００６０２６３３６７号に記載されている。
【０１６３】
重鎖抗体
重鎖抗体は、それらが重鎖を備えているが軽鎖を備えていないという限りにおいて、多くの他の形態の抗体とは構造的に異なっている。したがって、これらの抗体は、「重鎖のみの抗体」ともいわれる。たとえば、重鎖抗体は、ラクダ科の動物及び軟骨魚で見出される（ＩｇＮＡＲとも呼ぶ）。
【０１６４】
天然に存在する重鎖抗体に存在する可変領域は、ラクダ科の動物抗体及びＩｇＮＡＲのＶ−ＮＡＲ内では、「ＶＨＨドメイン」と一般にいわれ、これは、従来の４−鎖抗体に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」といわれる）から、及び、従来の４−鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」といわれる）から、これらを区別するためである。
【０１６５】
ラクダ科の動物からの重鎖抗体及びその可変領域、並びに、それらの生成及び／または単離及び／または使用のための方法の、一般的な説明が、以下の引用においてとりわけ見出される：国際特許公報ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９７／４９８０５及びＷＯ９７／４９８０５。
【０１６６】
軟骨魚からの重鎖抗体及びその可変領域、並びに、それらの生成及び／または単離及び／または使用のための方法の、一般的な説明が、以下の引用においてとりわけ見出される：国際特許公報ＷＯ２００５／１１８６２９。
【０１６７】
他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質
本開示は、また、他の抗体及びその抗原結合性ドメインを含むタンパク質を想定し、たとえば：
（ｉ）米国特許第５７３１１６８号に記載の「キー及び穴」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロ結合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）タンパク質、たとえば、米国特許第４６７６９８０号に記載；
（ｉｉｉ）化学架橋剤を用いて生成されるヘテロ結合タンパク質、たとえば、米国特許第４６７６９８０号に記載；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（たとえば、欧州特許ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載）。
【０１６８】
タンパク質に対する突然変異
また、本開示は、ＩＬ−２１結合タンパク質、または、これをコードし本明細書に開示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸を、提供する。一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質または核酸は、少なくとも約８５％または９０％または９５％または９７％または９８％または９９％が、本明細書に開示される配列と同一の配列を含む。
【０１６９】
代替的にまたは追加的に、ＩＬ−２１結合タンパク質は、少なくとも約８０％または８５％または９０％または９５％または９７％または９８％または９９％がいずれかの実施例に従って本明細書に記載されるＶＨまたはＶＬのＣＤＲと同一である、ＣＤＲ（たとえば３つのＣＤＲ）を含む。
【０１７０】
別の例では、本開示の核酸は、少なくとも約８０％または８５％または９０％または９５％または９７％または９８％または９９％が、いずれかの実施例に従って本明細書に記載される機能を有するＩＬ−２１結合タンパク質をコードする配列と同一の、配列を含む。また、本開示は、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質をコードする核酸も含み、これは、遺伝コードの同義性の結果として、本明細書に例証される配列と異なっている。
【０１７１】
核酸またはポリペチドの％同一性は、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８， ４４３−４５３， １９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ形成ペナルティ＝5、及び、ギャップ拡張ペナルティ＝０．３で、決定される。クエリー配列は、少なくとも５０残基の長さを有し、ＧＡＰ分析では、少なくとも５０残基の領域上に、２つの配列を整列配置させる。たとえば、クエリー配列は、少なくとも１００残基の長さを有し、ＧＡＰ分析では、少なくとも１００残基の領域上に、２つの配列を整列配置させる。たとえば、２つの配列が、それら全体の長さにわたって整列配置される。
【０１７２】
また、本開示は、厳しいハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸も想定する。「適度な厳密性」とは、ＳＳＣバッファｘ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５℃〜６５℃の温度範囲、または等価の条件で遂行されるハイブリダイゼーション及び／または洗浄として、本明細書に定義される。「高い厳密性」とは、ＳＳＣバッファｘ０．１、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳまたはより低い塩濃度、少なくとも６５℃の温度、または等価の条件で遂行されるハイブリダイゼーション及び／または洗浄として、本明細書に定義される。特定のレベルの厳密性とは、本明細書では、当業者に知られているＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を用いた、等価の条件を含む。たとえば、二重鎖核酸のストランドが解離する温度（融解温度またはＴｍとして知られる）を計算する方法が、当該技術分野で知られている。核酸のＴｍと同程度（たとえば５℃以内または１０℃以内）またはこれと等しい温度は、高い厳密性を有すると考えられる。核酸のＴｍが、１０℃〜２０℃または１０℃〜１５℃と計算された場合に、中間の厳密性と考えられる。
【０１７３】
また、本開示は、本明細書に述べた配列と比較して保存的アミノ酸置換を１つ以上含む本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の変異形も想定する。一部の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、１０以下の、たとえば、９または８または７または６または５または４または３または２または１の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基は、類似の側鎖及び／またはハイドロパシー指数及び／または親水性を有するアミノ酸残基で置換されたものである。
【０１７４】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び、芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。ハイドロパシー指数は、たとえば Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７： １０５−１３２， １９８２に記載され、親水性指数は、たとえば、米国特許第４５５４１０１号に記載される。
【０１７５】
また、本開示は、非保存的アミノ酸の変更を想定する。たとえば、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸で及び中性または正荷電アミノ酸での置換は、特に興味深い。一部の例で、ＩＬ−２１結合タンパク質は、１０以下、たとえば、９または８または７または６または５または４または３または２または１の非保存的アミノ酸置換を含む。
【０１７６】
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の抗原結合ドメインのＦＲ中で、突然変異が生じる。別の例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質のＣＤＲ中で、突然変異が生じる。
【０１７７】
ＩＬ−２１結合タンパク質の変異形を生成する典型的な方法は、以下を含む：
●ＤＮＡの突然変異誘発（Ｔｈｉｅら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５： ３０９−３２２， ２００９）またはＲＮＡの突然変異誘発（Ｋｏｐｓｉｄａｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．１０７：１６３−１６８， ２００６； Ｋｏｐｓｉｄａｓら ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７： １８， ２００７；及び、国際特許公報ＷＯ１９９９／０５８６６１）；
●ポリペチドをコードする核酸を細胞突然変異誘発遺伝子に導入すること、たとえば、ＸＬ−１ Ｒｅｄ， ＸＬ−ｍｕｔＳ ａｎｄ ＸＬ−ｍｕｔＳ−Ｋａｎｒ細菌性細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
●ＤＮＡシャッフリング、たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−９１ ， １９９４で開示される；及び、
●部位誘導突然変異誘発、たとえば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ （編者） ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ （編者）（Ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＮＹ， １９９５）に記載される。
【０１７８】
本開示の変異体ＩＬ−２１結合タンパク質の生物学的活性度を決定する典型的な方法は、当業者にとって明らかであり、及び／または、たとえば抗原結合等、本明細書に記載される。たとえば、抗原結合、結合の競合阻害、親和性、結合、解離及び治療有効性を決定する方法が、本明細書に記載される。
【０１７９】
定常領域
本開示は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質及び／または抗体を含む。これは、Ｆｃに融合される抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【０１８０】
本開示のタンパク質を生成するために有用な定常領域の配列が、多数の別々のソースから得られてもよい。一部の例では、タンパク質の定常領域またはその部分は、ヒト抗体に由来する。定常領域またはその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、並びに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むあらゆる抗体アイソタイプを含んだ、あらゆる抗体種別に由来してもよい。一例では、定常領域は、ヒトアイソタイプＩｇＧ４または安定化ＩｇＧ４定常領域である。
【０１８１】
一例では、定常領域のＦｃ領域のエフェクタ機能を誘発する能力は、たとえば天然のまたは野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域と比較して、低い。一例では、エフェクタ機能は、抗体依存‐細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）であり、及び／または、抗体依存性細胞媒介ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）であり、及び／または、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）である。タンパク質を含んでいるＦｃ領域のエフェクタ機能のレベルを判断する方法は、当該技術分野で知られており、及び／または、本明細書に記載される。
【０１８２】
一例では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域（すなわち、ＩｇＧ４定常領域から）であり、たとえば、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。適切なＩｇＧ４  Ｆｃ領域の配列は、当業者にとって明らかであり、及び／または、一般公開されているデータベース（たとえば、国立生物工学情報センターから利用できる）で利用できる。
【０１８３】
一例では、定常領域は、安定化ＩｇＧ４定常領域である。「安定化ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換若しくはＦａｂアーム交換を経る傾向、または、半抗体の生成若しくは半抗体を生成する傾向を、低下させるために、組み換えられたＩｇＧ４定常領域を意味することが理解される。「Ｆａｂアーム交換」とは、ＩｇＧ４重鎖及び付属の軽鎖（半分子）を、他のＩｇＧ４分子からの重鎖軽鎖対に交換する、ヒトＩｇＧ４に対するタンパク質修飾の一種のことをいう、したがって、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２本の異なるＦａｂアームを得てもよい（二重特異性分子を得る）。Ｆａｂアーム交換は、生体内では自然に発生し、生体外では、抽出された血球により、または還元グルタチオン等の還元剤により、誘発され得る。ＩｇＧ４抗体が解離して、そのそれぞれが単一の重鎖及び単一の軽鎖を含む２つの分子を生成する際に、「半抗体」は生成される。
【０１８４】
一例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステム（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７年及び／または１９９１年）にしたがって、ヒンジ領域の位置２４１にプロリンを含む。この位置は、ＥＵ番号付けシステムによるヒンジ領域の位置２２８に対応する（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１年；及び、Ｅｄｅｌｍａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ， ６３， ７８−８５， １９６９年）。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般に、セリンである。セリンをプロリンに置換した後は、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含む。この点に関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の２本のＦａｂアームに機動性をもたらすＦｃ及びＦａｂ領域を結合する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチな部分であることを知っている。ヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合が関与するシステイン残基を含む。これは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムにしたがって、Ｇｌｕ２２６からヒトＩｇＧ１のＰｒｏ２４３に伸展すると一般に定義される。重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を生成する第１の及び最後のシステイン残基を、同じ位置に配置することにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域を、ＩｇＧ１配列と整列して配置することができる（たとえば国際特許公報ＷＯ２０１０／０８０５３８を参照）。
【０１８５】
安定化ＩｇＧ４抗体の追加の例としては、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の位置４０９（ＥＵ番号付けシステムによる）のアルギニンを、リシン、スレオニン、メチオニンまたはロイシンと置換した抗体が挙げられる（たとえば、国際特許公報ＷＯ２００６／０３３３８６に記載）。定常領域のＦｃ領域は、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン及びロイシンから成る群より選択された残基を、４０５に対応する位置（ＥＵ番号付けシステムによる）に、追加的にまたは代替的に含んでもよい。任意に、ヒンジ領域は、位置２４１（すなわちＣＰＰＣ配列）にプロリンを含む（上に述べたように）。
【０１８６】
別の例では、Ｆｃ領域は、エフェクタ機能（すなわち「非免疫賦活性Ｆｃ領域」）を低減するように、組み換えた領域である。たとえば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０及び３３１から成る群より選択された１つ以上の位置での置換を含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。別の例では、Ｆｃ領域は、以下の変化Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３６の欠失の１つ以上、及び／または、以下の変化Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓの１つ以上、を含んだＩｇＧ１  Ｆｃ領域である（Ａｒｍｏｕｒら， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：２６１３−２６２４， １９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６（９）:６５９１ −６０４， ２００１）。非免疫賦活性Ｆｃ領域の追加の例は、たとえば、Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａらに記載される（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７ : １ １２９−１ １３８ ２００６；及び／またはＨｅｚａｒｅｈ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ， ７５: １２１６１ −１２１６８， ２００１）。
【０１８７】
別の例では、Ｆｃ領域は、キメラＦｃ領域であり、これはたとえば、ＩｇＧ４抗体からの少なくとも１つのＣＨ２ドメイン及びそして、ＩｇＧ１抗体からの少なくとも１つのＣＨ３ドメインを含み、ここで、Ｆｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９及び４２７（ＥＵ番号付け）から成る群より選択された１つ以上のアミノ酸位置での置換を含む（たとえば、国際特許公報ＷＯ２０１０／０８５６８２に記載）。典型的な置換は、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９ｓ、及び４２７Ｆを含む。
【０１８８】
付加的な改変
本開示はまた、Ｆｃ領域または定常領域を含んだ抗体またはＩＬ−２１結合タンパク質に追加的な一時変異も想定する。
【０１８９】
たとえば、抗体は、タンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。たとえば、抗体は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の親和性を増大させる１つ以上のアミノ酸置換を含んだＦｃ領域を含む。たとえば、Ｆｃ領域は、より低いｐＨ、たとえば約ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対する親和性を増大させて、エンドソーム内のＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する。一例では、Ｆｃ領域は、約ｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する親和性を、約ｐＨ７．４におけるその親和性と比較して増大させ、これは、細胞リサイクルの後の、Ｆｃの血液への再リリースを容易にする。血液からのクリアランスを低減することによるこれらのアミノ酸置換は、タンパク質の半減期を延長するために有用である。
【０１９０】
典型的なアミノ酸置換は、ＥＵ番号付けシステムにより、Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８ＬまたはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６ＦまたはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含む。追加のまたは代替のアミノ酸置換は、たとえば、米国特許公開公報２００７０１３５６２０または米国特許第７０８３７８４号に記載される。
【０１９１】
タンパク質生成
一例では、たとえば、本明細書に記載されるように、及び／または、当該技術分野で知られていているように、タンパク質の製造するに十分な条件下でハイブリドーマを培養することにより、いずれかの例に従って本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質は生成される。
【０１９２】
組換え型発現
別の例では、いずれかの例に従って本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質は、組換え型である。
【０１９３】
組換え型タンパク質の場合、これをコードする核酸をクローン化して、発現構築物またはベクターとすることができ、そしてそれをその後トランスフェクトして宿主細胞、たとえば大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは、たとえばサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎生期腎臓（ＨＥＫ）細胞等の哺乳動物細胞、または、タンパク質を別段に製造しない骨髄腫細胞等、とする。タンパク質を発現することに用いられる典型的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞またはＨＥＫ細胞である。これらの末端を達成する分子クローニング技術は、当該技術分野で知られており、及び、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，（編者）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての最新版を含む）または、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）に記載される。多種多様なクローン化及び試験管内の増幅方法が、組換え型核酸の構築のために適切である。組換え型抗体を生成する方法は当該技術分野でも知られており、たとえば、米国特許第４８１６５６７号または米国特許第５５３０１０１号を参照されたい。
【０１９４】
単離に続いて、核酸は挿入され、更なるクローン化（ＤＮＡの増幅）のために、または無細胞系または細胞の発現のために、発現構築物または発現ベクター中でプロモータに操作可能に結合される。
【０１９５】
本明細書に用いられる場合において、用語「プロモータ」は、その最も広い文脈で理解されるべきであり、これはゲノム遺伝子の転写調節配列を含んでおり、この転写調節配列は、正確な転写開始のために必要とされるＴＡＴＡボックスまたは開始剤要素を含み、そしてたとえば発生の及び／または外部の刺激に応じて、または組織に特異的な方法で核酸の発現を変更する追加の調整要素（たとえば、上流活性化配列、転写因子結合部、エンハンサ及びサイレンサー）を有するか、または、有しない。本願の文脈では、用語「プロモータ」は、組換え型、合成型または融合型の核酸、または、それが操作可能に結合される核酸の発現を与え、活性化し、または高めるその誘導体を記載するために、用いられる。さらに発現を強化する、及び／または該核酸の空間的発現及び／または時間的発現を変更するため、典型的なプロモータは、１つ以上の特異的な調整要素の追加のコピーを含むことができる。
【０１９６】
本明細書に用いられる場合において、用語「操作可能に結合される」とは、核酸の発現がプロモータにより支配されるように、核酸に相対的にプロモータを配置することを意味する。
【０１９７】
細胞の発現のための多くのベクターが、利用できる。ベクター成分は一般に、以下の１つ以上を非限定的に含む：シグナル配列、タンパク質をコードする配列（たとえば、本明細書に提供される情報に由来する）、エンハンサ要素、プロモータ、及び、転写終了配列。当業者は、タンパク質の発現に適切な配列を知っている。典型的なシグナル配列は、原核分泌シグナル（たとえば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または、耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（たとえば、インベルターゼリーダー、因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダー）、または、哺乳類の分泌シグナル（たとえば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を含む。
【０１９８】
哺乳動物細胞中で活性の典型的なプロモータは、サイトメガロウィルス最初期プロモータ（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト延長因子１−αプロモータ（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモータ（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモータ、シミアンウィルス４０プロモータ（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルスプロモータ（ＲＳＶ）、アデノウィルスメジャー後期プロモータ、β−アクチンプロモータ；ＣＭＶエンハンサ／β−アクチンプロモータまたは免疫グロブリンプロモータまたはその活性フラグメントを含むハイブリッド調整要素を含む。有用な哺乳類の宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により変換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎生期腎臓株（懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされる２９３または２９３の細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；または、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が挙げられる。
【０１９９】
典型的なプロモータは、たとえば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．Ｐｏｍｂｅを含む群より選択される酵母細胞等の、酵母細胞中での発現に適切であり、この非限定的な例としては、ＡＤＨ１プロモータ、ＧＡＬ１プロモータ、ＧＡＬ４プロモータ、ＣＵＰ１プロモータ、ＰＨＯ５プロモータ、ｎｍｔプロモータ、ＲＰＲ１プロモータまたはＴＥＦ１プロモータが挙げられる。
【０２００】
発現のために細胞に単離核酸またはこれを含む発現構築物を導入するための手段は、当業者に知られている。所与の細胞に用いられる技術は、既知の成功した技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段は、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストランにより媒介されるトランスフェクション、たとえば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社、ＭＤ、米国）及び／またはｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社、ＭＤ、米国）を用いることによりリポソームにより媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取込み、たとえばＤＮＡで被覆したタングステンまたは金の粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ社、ＷＩ、米国）を用いることによるエレクトロポーレーション及び微粒子衝撃、等を含む。
【０２０１】
タンパク質を製造するために用いられる宿主細胞は、使用する細胞のタイプにより、様々な培地で培養されてもよい。市販の培地、たとえばＨａｍ’ｓＦＩＯ（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコの改質イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等が、哺乳動物細胞を培養するために適切である。本明細書に考察される他の細胞型を培養するための培地が、当該技術分野で知られている。
【０２０２】
タンパク質の単離
タンパク質を単離する方法は、当該技術分野で知られ、及び／または、本明細書に記載される。
【０２０３】
ＩＬ−２１結合タンパク質が培養培地に分泌される場合、市販のタンパク質濃度フィルタ、たとえば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、このような発現系から上澄を、先ず濃縮することができる。プロテオリシスを阻害するため、前述のステップのいずれかで、ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を含んでもよく、また、偶発汚染物質の成長を予防するために、抗生物質を含んでもよい。代替的にまたは追加的に、たとえば、連続遠心を用いて、タンパク質を発現する細胞からの上澄をろ過または単離できる。
【０２０４】
たとえば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水的相互作用クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィ（たとえば、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィまたはタンパク質Ｇクロマトグラフィ）、または、前述のもののいずれかの組み合わせを用いて、細胞から生成されるＩＬ−２１結合タンパク質を抽出することができる。これらの方法は、当該技術分野で知られており、及び、たとえば国際特許公報ＷＯ９９／５７１３４、または、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （編者） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８年）に記載されている。
【０２０５】
また、たとえば、多ヒスチジンタグ、たとえば、ヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウィルス血球凝集素（ＨＡ）タグ、またはシミアンウィルス５（Ｖ５）タグ、またはフラグタグ、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ等、精製または検出を促進するためのタグを含むように、タンパク質を組み換えることができることを、当業者は知っている。得られたタンパク質は、アフィニティ精製等、当該技術分野で知られている方法を用いて、その後抽出される。たとえば、タンパク質を含んでいるサンプルを、固体のまたは半固体担体上に固定されるｈｅｘａ−ｈｉｓタグに特異的に結合するニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）に接触させ、サンプルを洗浄して未結合のタンパク質を除去し、そして、続いて結合したタンパク質を溶出することにより、ｈｅｘａ−ｈｉｓタグを含むタンパク質が抽出される。代替的にまたは追加的に、タグに結合するリガンドまたは抗体が、親和性精製法で用いられる。
【０２０６】
複合体
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、化合物に結合される。たとえば、化合物は、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、膠質、毒物、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中のＩＬ−２１結合タンパク質の半減期を増加させる化合物、及び、それらの混合物から成る群より選択される。
【０２０７】
他の化合物は、ＩＬ−２１結合タンパク質に直接または間接的に結合することができる（たとえば、間接結合の場合にリンカーを含んでもよい）。化合物の例としては、ラジオアイソトープ（たとえば、沃素１３１、イットリウム９０またはインジウム１１１）、検出可能な標識（たとえば、蛍光体または蛍光ナノクリスタルまたは量子ドット）、治療化合物（たとえば、化学療法剤または抗炎症薬）、コロイド（たとえば、金）、毒物（たとえば、リシンまたは破傷風トキソイド）、核酸、ペプチド（たとえば、血清アルブミン結合ペプチド）、タンパク質（たとえば、抗体または血清アルブミンの抗原結合ドメインを含むタンパク質）、対象中のＩＬ−２１結合タンパク質の半減期を増加させる化合物（たとえば、ポリエチレングリコールまたはこの活性を有する他の水溶性ポリマー）及びこれらの混合物が挙げられる。本開示のＩＬ−２１結合タンパク質に結合されることができる典型的な化合物及びこのような結合のための方法は、当該技術分野で知られており、及び、たとえば国際特許公報ＷＯ２０１０／０５９８２１に記載される。
【０２０８】
ＩＬ−２１結合タンパク質は、ナノ粒子に結合されてもよい（たとえば、Ｋｏｇａｎら， Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｌｏｎｄ） ２： ２８７−３０６， ２００７に検討される）。ナノ粒子は、金属ナノ粒子であってもよい。
【０２０９】
ＩＬ−２１結合タンパク質を、抗体標的化細菌性ミニ細胞（たとえば国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００２０４に記載）に備えてもよい。
【０２１０】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質に結合されることができる典型的な化合物の一部を、表１に列挙する。
【０２１１】
【表１】
0006563389.tif 000002
【０２１２】
ＩＬ−２１結合タンパク質の活性のアッセイ
ＩＬ−２１及びその変異体への結合
本開示の一部のＩＬ−２１結合タンパク質が、ｈＩＬ−２１及びｈＩＬ−２１の特異的な変異形に結合することが、本明細書の開示から当業者にとって明らかである。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野で知られており、たとえば、Ｓｃｏｐｅに記載されている（Ｉｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９４）。このような方法では、ＩＬ−２１結合タンパク質を固定すること、及び、標識化抗原でそれを接触させることが、一般に関与する。洗浄して非特異性結合したタンパク質を除去した後、標識の量及び、その結果として、結合した抗原が、検出される。無論、ＩＬ−２１結合タンパク質を標識化することができ、抗原を固定できる。パニングタイプアッセイを用いることもできる。代替的にまたは追加的に、表面プラスモン共鳴アッセイを用いることができる。
【０２１３】
任意に、固定されたＩＬ−２１結合タンパク質のＩＬ−２１またはそのエピトープに対する解離定数（Ｋｄ）、会合定数（ｋａ）及び／または親和定数（ＫＤ）を決定する。２１結合タンパク質に対する「Ｋｄ」または「ｋａ」または「ＫＤ」は、１つの例では、放射性同位元素識別または蛍光識別ＩＬ−２１結合アッセイにより測定される。「Ｋｄ」の場合、このアッセイでは、未標識ＩＬ−２１の滴定系列の存在下で、標識化ＩＬ−２１の最低の濃度と、ＩＬ−２１結合タンパク質とを平衡させる。洗浄して未結合のＩＬ−２１を除去した後、タンパク質のＫｄを標示する標識の量を決定する。
【０２１４】
他の例に従い、表面プラスモン共鳴アッセイ、たとえばＢＩＡｃｏｒｅ表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ社、ピスカタウェイ、NJ）を、固定されたＩＬ−２１若しくはその領域、または、固定されたＩＬ−２１結合タンパク質と共に用いて、Ｋｄ、ｋａまたはＫＤを測定する。
【０２１５】
一部の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、それがＩＬ−２１への結合と競合すると考えられるので、抗体８Ｅ２と同程度のＫＤまたは向上したＫＤ（すなわちＫＤ値が抗体８Ｅ２より低い）を有している。
【０２１６】
競合結合の決定
抗体２Ｐ２の結合を競合的に阻害するタンパク質を決定するためのアッセイは、当業者にとって明らかである。このような一つの方法は、本明細書に例証される。
【０２１７】
たとえば、抗体は、検出可能な標識、たとえば蛍光標識または放射性標識等に結合される。次いで、標識化抗体及び試験ＩＬ−２１結合タンパク質を混合し、ＩＬ−２１若しくはその領域またはそれを発現する細胞と接触させる。その後標識化抗体のレベルを決定し、これを、ＩＬ−２１結合タンパク質がない場合に標識化抗体をＩＬ−２１、領域または細胞に接触させた場合に決定したレベルと比較する。試験ＩＬ−２１結合タンパク質の存在下の方が、ＩＬ−２１結合タンパク質が無い場合と比較して、標識化抗体のレベルが低下した場合、ＩＬ−２１結合タンパク質は、競合的にＩＬ−２１に対する抗体の結合を阻害すると、考えられる。
【０２１８】
任意に、試験ＩＬ−２１結合タンパク質は、抗体への別々の標識に結合される。この代替標識により、ＩＬ−２１若しくはその領域または細胞に対する試験ＩＬ−２１結合タンパク質の結合のレベルが検出できるようになる。
【０２１９】
作動薬活性の決定
本開示の一部の例では、タンパク質は、ＩＬ−２１活性を高めることができる。
【０２２０】
受容体を通してリガンドのシグナル伝達を強化するタンパク質の能力を判断するための、様々なアッセイが、当該技術分野で知られている。
【０２２１】
一例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、ＩＬ−２１の存在下で培養された、ＩＬ−２１Ｒ及びｇｐ１３０を発現する細胞（たとえばＢａＦ３細胞）の増殖を、高める（たとえば両方のタンパク質を発現するように組み換えられる細胞）。細胞（たとえば、約１ｘ１０４個の細胞）を、ｈＩＬ−２１に対するＩＬ−２１の存在下（たとえば、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５ｎｇ／ｍｌ、たとえば０．５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）、試験ＩＬ−２１結合タンパク質の存在下または不存在下で、培養する。細胞増殖を判断する方法は、当該技術分野で知られており、たとえば、ＭＴＴ還元及び／またはチミジン取込みを含む。ＩＬ−２１結合タンパク質がない場合に観測される量と比較した場合に増殖のレベルが高められたＩＬ−２１結合タンパク質は、ＩＬ−２１シグナル伝達を強化するまたは拮抗すると考えられる。
【０２２２】
前の段落に記載したと類似のアッセイを、Ｂ９細胞またはＴ１０細胞に対して実行することができる（Ｄａｍｓ−Ｋｏｚｌｏｗｓｋａら， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２： ８， ２０１２年；及び、Ｙｏｋｏｔｅら， Ｊ ＡＯＡＣ， ８３： １０５３−１０５７， ２０００年）。Ｔ１０細胞を利用するアッセイの場合、テトラゾリウム化合物、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリウム］−１，３−−ベンゼン二硫酸塩（ＷＳＴ−１）の還元を比色定量的に検出することにより、増殖を測定することができる。
【０２２３】
ＩＬ−２１シグナル伝達のエンハンスメントを判断する他の方法が、本開示により想定される。
【０２２４】
ＩＬ−２１の半減期の決定
ＩＬ−２１の半減期は、たとえば、薬物動態学の研究、たとえば、Ｋｉｍら， Ｅｕｒ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：５４２， １９９４年、に記載される方法にしたがって、測定することができる。この方法に従い、放射性同位元素で標識したＩＬ−２１を静注でマウスに注入し、その血漿濃度を、時間の関数として、たとえば、注入の後の３分〜７２時間に、周期的に測定する。得られるクリアランス曲線は、したがって、二相、すなわち、アルファ段階及びベータ相となる筈である。タンパク質の生体内での半減期の決定のために、ベータ−段階のクリアランス率を計算して、野生型または未組換えのタンパク質のそれと比較する。
【０２２５】
治療有効性の判断
治療有効性を判断するためのアッセイは、ＩＬ−２１結合タンパク質により中和を決定することに関連して、上記に説明される。
【０２２６】
別の例では、疾患を治療するタンパク質の有効性が、生体内でのアッセイを用いて判断される。
【０２２７】
たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質を、胃癌等の癌のモデルで試験することができる。たとえば、ｇｐ１３０（ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ／Ｙ７５７Ｆ）のＹ７５７Ｆ変異体に対する同種マウスは、胃部腫瘍を発症する（Ｊｅｎｋｉｎｓら， Ｂｌｏｏｄ １０９： ２３８０−２３８８， ２００７年）。マウス（たとえば８週齢のマウス）を、ＩＬ−２１結合タンパク質で処理し、胃部ポリープの数及び／または重量を判断した。ポリープの大きさ及び／または重量を低減するＩＬ−２１結合タンパク質は、癌を治療するために有用であると考えられる。結腸癌に対する効果のために、類似したアッセイを試験に用いることができ、この試験では、ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ／Ｙ７５７Ｆマウスは、アゾキシメタン（ＡＯＭ）で処理された後、Ｇｒｅｔｅｎ（ら、Ｃｅｌｌ、１１８：２８５−２９６（２００４年））に記載の通り、本質的にデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）により処理され、ＩＬ−２１結合タンパク質での治療の前に、結腸癌を誘発させる。
【０２２８】
たとえば、Ｌｉら， Ｏｎｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． ３： ８０２−８０６， ２０１２年、に記載されるように、癌転移または癌関連がある骨疾患のモデルで、追加的にまたは代替的に、ＩＬ−２１結合タンパク質を試験することができる。
【０２２９】
治療されるべき疾患
ＩＬ−２１は、最適なＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫、ＮＫ活性化、及び、抗体産生及びＢ細胞成熟等の最適な液性応答に重要であるＣＤ４＋Ｔ細胞由来サイトカインである。ＩＬ−２１は、多数の炎症誘発性サイトカイン、たとえばＩＬ１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＴＮＦＲＩＩ、ｓＣＤ２５及びＲＡＮＴＥＳ等を誘発することが示されている。
【０２３０】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、癌の治療において有用である。典型的な癌は、嚢胞性及び固体腫瘍、骨及び軟部組織腫瘍を含み、それは、肛門の組織、胆管、膀胱、血球、円錐、腸、脳、胸、カルチノイド、頸部、目、食道、頭頸部、腎臓、喉頭、白血病、肝臓、肺、リンパ節、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、ミエローマ、卵巣、膵臓、ペニス、前立腺、スキン、肉腫、胃、精巣、甲状腺、膣、陰門、の腫瘍が含まれる。軟部組織腫瘍は、良性シュワン細胞腫モノソミー、類腱腫、脂肪芽細胞腫、脂肪腫、子宮平滑筋腫、明細胞肉腫、皮膚線維肉腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、粘液様脂肪肉腫、胞巣状横紋筋肉腫及び滑膜肉腫を含む。具体的な骨腫瘍は、非化骨性線維腫、単房性骨嚢腫、内軟骨腫、動脈瘤性骨嚢腫、骨芽細胞腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、化骨性線維腫及びエナメル上皮腫、巨細胞腫、線維性骨異形成症、ユーイング肉腫好酸球性肉芽腫、骨肉腫、軟骨腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫及び転移性癌を含む。白血病は、急性リンパ芽球、急性骨髄芽球、慢性リンパ性及び、慢性脊髄性を含む。
【０２３１】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、ヒトウィルス感染の治療及び予防に有用である。ウィルス感染の例としては、ＤＮＡウィルス（たとえば、単純ヘルペスウィルス等のヘルペスウィルス。イプシュタイン−バーンウィルス。サイトメガロウィルス；痘瘡（天然痘）ウィルス等のポックスウィルス；ヘパドナウィルス（たとえばＢ型肝炎ウィルス）；パピローマウィルス；アデノウィルス）；ＲＮＡウィルス（たとえば、ＨＩＶ  Ｉ、ＩＩ；ＨＴＬＶ  Ｉ、ＩＩ；ポリオウィルス；Ａ型肝炎；コロナウィルス（たとえば突発性急性呼吸症候群（ＳＡＲＳ））；オルトミクソウィルス（たとえば、インフルエンザウィルス）；パラミクソウィルス（たとえば、はしかウィルス）；狂犬病ウィルス：Ｃ型肝炎ウィルス）、フラビウィルス、インフルエンザウィルス；カリシウィルス；狂犬病ウィルス、牛疫ウィルス、アリーナウィルス、等、により引き起こされる感染症が挙げられる。更に、ＩＬ−２１を用いることができるウィルス関連疾病のタイプの、非限定的な例としては：後天性免疫不全症；肝炎；胃腸炎；出血症；腸炎；心臓炎；脳炎；麻痺；細気管支炎；上下気道疾患；呼吸器乳頭腫症；関節炎；播種性疾病、髄膜炎、単核球症が挙げられる。
【０２３２】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、クラミジア、リステリア、ヘリコバクターピロリ、ミコバクテリア、マイコプラズマ、炭疽菌、サルモネラ菌及び赤痢菌を含む、微生物感染症の治療においても、有用である。
【０２３３】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、急性及び慢性ウィルス感染のため、及び、免疫不全患者のための単独療法としても、有用である。免疫を高める方法は、未解決の感染症患者における回復時間を速めることができる。免疫療法は、小児または高齢者、ならびに、感染症により得た、または、化学療法剤または骨髄切除等の医療行為後に誘発された、免疫不全を患う患者等の、免疫不全患者の部分集合に対して、さらにより大きい影響を有することができる。免疫調節で治療される兆候のタイプの例としては、慢性肝炎のためのＩＦＮ−αの使用、ＨＩＶ感染症の後のＩＬ−２の使用、及び、移植の後、エプスタインバールウィルス感染症を治療するためのインターフェロンの使用が挙げられる。
【０２３４】
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、たとえば、花粉症及び気管支喘息等のアレルギー性鼻炎の治療のための、アレルギー免疫療法としても、有用である。
【０２３５】
組成物
一部の例では、本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質は、経口、非経口、吸入スプレーによる、吸着、生体吸収、局所的、直腸、経鼻、頬側、経膣、脳室内、従来の非毒性薬学的許容担体を含む投薬量製剤を移植した保有宿主を通して、または、他のいずれかの便利な投薬形態により、投与することができる。ここで用いられる「経静脈である」という語は、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内及び頭蓋内注入または注入技術を含む。
【０２３６】
対象への投与のための適切な形態（たとえば医薬品組成物）にＩＬ−２１結合タンパク質を調製する方法は、当該技術分野で知られており、また、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．イーストン、Ｐａ．１９９０年）に記載の方法、及び、米国薬局方：国民医薬品集（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．イーストン、Ｐａ．１９８４年）に含まれる。
【０２３７】
本開示の医薬品組成物は、特に、静脈内投与等の経静脈投与、または体腔または器官の内腔または関節への投与のために有用である。投与のための組成物は、たとえば水性担体等の薬学的に許容される担体に溶解されるＩＬ−２１結合タンパク質の溶液を、共通して備える。たとえば緩衝食塩水等、様々な水性担体を用いることができる。組成物は、必要に応じて、生理学的条件に近づけるための薬学的に許容される補助物質、たとえば、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤等、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を、含んでいてもよい。これらの製剤中の本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の濃度は、広く変更することができ、基本的に、液量、粘度、本体重量等に、基づいて、選択される投与の特定の方法及び患者のニーズに従って選択される。典型的な担体としては、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びエチルオレイン酸塩等の非水系ビヒクルを、用いてもよい。リポソームを、担体として用いてもよい。ビヒクルは、たとえば、バッファ及び防腐剤等、等張性及び化学的安定性を高める添加剤を小量含んでもよい。
【０２３８】
製剤すると、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、投与製剤に適合性のある方法で、及び、治療的に／予防的に有効な量で投与される。製剤は、上記の注射可能な溶液のタイプ等の様々な投薬形態で、容易に投与されるが、他の薬学的に許容される形態、たとえば、錠剤、錠剤、カプセルまたは経口薬投与のための他の固体、坐薬、ペッサリー、経鼻溶液またはスプレー、エアゾール、吸入剤、リポソーム型形態等も想定される。製薬学的に「徐放性」のカプセルまたは組成物を、用いてもよい。徐放性製剤は、長期にわたって一定の薬物レベルを与えるように一般に設計されており、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質を供給するために用いてもよい。
【０２３９】
国際特許公報ＷＯ２００２／０８０９６７は、たとえば喘息等の治療のために抗体を含むエアロゾル化組成物を投与する組成物及び方法を記載し、これは、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の投与のためにも適切である。
【０２４０】
組み合わせ療法
一例では、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質は、本明細書に記載される疾患を治療するために有用な１つ以上の他の化合物と組み合わせて、混合して、または追加の治療ステップで、または治療製剤の追加の成分として、投与される。
【０２４１】
別の例では、他の化合物とは、癌の治療に用いられる化学療法薬剤または他の薬物である。
【０２４２】
別の例では、本明細書に記載されるタンパク質は、癌の治療のために、放射線療法の前後に投与される。
【０２４３】
別の例では、本発明のＩＬ−２１結合タンパク質は、免疫療法と組み合わせて投与される。
【０２４４】
適切な免疫療法の非限定的な例としては、チェックポイント阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤、腫瘍壊死因子受容体阻害剤、サイトカインまたはインターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ワクチン（癌ワクチンまたは感染症）；抗ウィルス薬；腫瘍溶解性ウィルス；ベータグルカン（レンチナン）等の多糖類；及び、養子細胞療法（ＡＣＴ）、たとえば、ヘルパーＴ細胞非依存的方法でＴ細胞を細胞毒性Ｔリンパ球運命に生体外で培養する、またはキメラ抗原リセプター（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子組み替えしたＴ細胞、等が挙げられる。
【０２４５】
適切な免疫療法は、以下を非限定的にターゲットにしてもよい。プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）またはプログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、分化抗原群８０（ＣＤ８０）、分化抗原群８０（ＣＤ８６）、Ｂ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１）、分化抗原群２７６（ＣＤ２７６）、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）、ヘルペスウィルスエントリ媒介物（ＨＶＥＭ）、分化抗原群リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、分化抗原群（ＣＤ７０）、分化抗原群（ＣＤ４０）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、分化抗原群２８（ＣＤ２８）、細胞毒性Ｔリンパ球活性化剤４（ＣＴＬＡ４）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＣＲ、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、死受容体５（ＤＲ５）、分化抗原群１３７（ＣＤ１３７）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４２（ＯＸ４０）、分化抗原群２７（ＣＤ２７）、分化抗原群４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＺａＲ）及びＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン３）。
【０２４６】
適切なチェックポイント阻害剤は、以下を含む：ＰＤ−１阻害剤ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社／小野薬品工業）、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ社）、ピジリツマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａ社）及び、アンピシリン−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）；ＰＤ−Ｌ１阻害剤ＲＧ−７４４６（Ｒｏｃｈｅ社）及びＭＥＤＩ−４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社）；並びに、ＣＴＬＡ−４阻害剤イピリムマブ。適切なチロシンキナーゼ阻害剤は、ソラフェニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、パラディア、エルロチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブを含む。適切な腫瘍壊死因子受容体阻害剤は、ＤＲ５に向けられる抗体を含む。適切なサイトカインまたはインターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２を含む。適切なインターフェロンは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ及びＩＦＮ−ガンマを含む。適切な顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、サルグラモスチムを含む。適切なワクチンは、シプリューセル−Ｔを含み、適切な腫瘍溶解性ウィルスは、タリモジーンラハーパレプベックを含む。
【０２４７】
別の例では、本発明のＩＬ−２１結合タンパク質は、ＤＲ５及び／またはＣＤ１３７に向けられた抗体等の阻害剤と組み合わせて投与される。
【０２４８】
別の例では、本発明のＩＬ−２１結合タンパク質は、免疫調節薬と組み合わせて投与される。
【０２４９】
適切な免疫調節薬は、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ社）、レナリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ社）及びポマリドミド（Ｐｏｍａｌｙｓｔ社）を含む。
【０２５０】
投与量及び投与のタイミング
本開示のＩＬ−２１結合タンパク質の適切な投与量は、特異的なＩＬ−２１結合タンパク質、治療しようとする疾患、及び／または、治療を受ける対象によって変化する。適切な投与量の決定は、熟練した医師の能力の範囲内であり、たとえば、最適状態に及ばない投与量で始まり、投与量を徐々に変えて、最適または有用な投与量を決定する。代替的に、治療／予防のために適切な投与量を決定するため、細胞培養アッセイまたは動物試験からのデータを用い、適切な用量は、殆どまたは全く毒性が無い、活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲の中にある。投与量は、使用される投薬形態及び、利用される投与のルートにより、この範囲の中で変化してもよい。治療的に／予防的に有効な投与量を、細胞培養アッセイから当初は推定することができる。投与量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する化合物の濃度または量）を含む血中血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで調製されてもよい。このような情報は、ヒトにおいてより正確で有用な投与量を決定するために用いることができる。血漿のレベルは、たとえば、高性能液体クロマトグラフィにより、おそらく測定される。
【０２５１】
一部の例では、本開示の方法は、本明細書に記載されるタンパク質を、予防的または治療的に有効な量で投与することを含む。
用語「治療的に有効な量」は、治療が必要な対象に投与される際に、予後及び／または対象の状態を改良し、及び／または、本明細書に記載される臨床疾患の１つ以上の症状を、その疾患の臨床的症候または臨床的特性として観測され及び受け入れられたよりも低いレベルに低減するまたは阻害するような、量である。対象に投与される量は、治療される疾患の特定の特性、治療されている疾患のタイプ及び段階、投与の方法、並びに、公衆衛生、他の疾病、年齢、性別、遺伝子型及び体重等の対象の特性に、依存する。当業者は、これら及びその他の因子により、適切な投与量を決定することができる。したがって、この用語は、たとえばタンパク質の重量または量等、具体的な量に、本開示を限定するものと解釈されるべきではなく、本開示は、対象が明示された結果を達成するに十分ないずれの量のＩＬ−２１結合タンパク質をも含む。
【０２５２】
本明細書に用いられる場合において、「予防的に有効な量」という用語は、臨床疾患の１つ以上の検出可能な症状の発症を、予防し、または阻害し、または遅らせるに十分なタンパク質の量を意味するものと理解される。このような量は、たとえば、投与される特異的なＩＬ−２１結合タンパク質、及び／または特定の対象、及び／または疾患のタイプまたは重症度または量、及び／または（遺伝子的またはその他の）疾患に対する疾病素質に依存して変化することを、当業者は知るものである。したがって、この用語は、たとえばＩＬ−２１結合タンパク質の重量または量等、具体的な量に、本開示を限定するものと解釈されるべきではなく、本開示は、対象が明示された結果を達成するに十分ないずれの量のＩＬ−２１結合タンパク質をも含む。
【０２５３】
本明細書に記載されるＩＬ−２１結合タンパク質の生体内での投与に対し、正常投与量は、１日当たり、個人の体重で約１０ｎｇ／ｋｇから多くとも約１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれ以上で、変化してもよい。数日以上にわたる反復投与に対しては、治療される疾患若しくは異常症の重症度に依存して、症状の所望の抑制が達成されるまで、治療を維持することができる。
【０２５４】
一部の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの間での最初の（または負荷）投与量で投与され、たとえば約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または、約１ｍｇ／ｋｇまたは約２ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇである。そして、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの間でのより低い維持投与量で、その後投与されることができ、たとえば約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、たとえば約０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇである。１０〜１５日毎に等７〜３０日毎に、維持投与量を投与してもよく、これはたとえば、１０日または１１日または１２日または１３日または１４日または１５日毎等である。
【０２５５】
一部の例では、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され、これはたとえば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、等である。たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され、これは、たとえば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、たとえば約０．２ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇまたは１．５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、より高い負荷投与量またはより低い維持投与量無しに）等である。一部の例では、たとえば７〜３０日おきに多数の投与量は投与され、これはたとえば、１０〜２２日おき、たとえば、１０〜１５日おき、たとえば、１０日または１１日または１２日または１３日または１４日または１５日または１６日または１７日または１８日または１９日または２０日または２１日または２２日おきに、等である。たとえば、ＩＬ−２１結合タンパク質は、７日おきにまたは１４日おきにまたは２１日おきに投与される。
【０２５６】
一部の例では、治療を始める時点で、哺乳類は、ＩＬ−２１結合タンパク質を７日連続だけ投与され、または、６日連続または５日連続または４日連続で、投与される。
【０２５７】
治療に適切に応答しない哺乳類の場合、複数の投与量を一週間内で投与してもよい。代替的にまたは付加的に、投与量を増大させて投与してもよい。
【０２５８】
別の例では、有害反応を経験した哺乳類に対しては、最初の（または、負荷）投与量を、１週間の数日間または多数の連続した日に分割してもよい。
【０２５９】
本開示の方法に従ったＩＬ−２１結合タンパク質の投与は、投与の目的が治療または予防及び熟練した施術者に知られている他の因子であるか否かにかかわらず、たとえば、受容者の生理的疾患によっては、連続的または間欠的とすることができる。ＩＬ−２１結合タンパク質の投与は、あらかじめ選択された期間に本質的に連続で行ってもよく、または、たとえば疾患の発症中か発症後のいずれかで、一連の間隔を置いた投与でもよい。
【０２６０】
キット
本開示は、１つ以上の以下を含んでいるキットを追加的に含む：
（ｉ）本開示のＩＬ−２１結合タンパク質またはそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ）本開示の細胞；
（ｉｉｉ）本開示の複合体；または
（ｉｉｉ）本開示の製薬組成物。
【０２６１】
ＩＬ−２１を検出するためのキットの場合、キットは、たとえば、本開示のＩＬ−２１結合タンパク質に結合される検出手段を追加的に備えることができる。
【０２６２】
治療／予防使用のためのキットの場合、キットは、薬学的に許容される担体を追加的に備えることができる。
【０２６３】
任意に、本開示のキットは、いずれかの例によって本明細書に記載される方法で使用するために、説明書付きでパッケージ化される。
【０２６４】
本開示は、以下の非限定的な例を含む。
【実施例】
【０２６５】
方法
ヒトＢ細胞増殖アッセイ
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準技術によって健康なヒトドナーから単離し、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、その後、ＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋  ＩｇＤ−ナイーブＢ細胞及びＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋ＩｇＤ−メモリＢ細胞に仕分けした。仕分けされた細胞を、培養プレートに接種した。その後、２Ｐ２を有するまたは有しない０．５〜５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１で、細胞を刺激した。５日後に、ＣＦＳＥ希釈または３Ｈチミジン増殖アッセイを通して、細胞増殖を決定した。
【０２６６】
生体内での半減期ＥＬＩＳＡアッセイ
ｈＩＬ−２１／２Ｐ２複合体の生体内での半減期を検出するため、ｈＩＬ−２１／２Ｐ２またはｈＩＬ−２１単独を、マウスに、静注または皮下で注入し、ここで、複合体の２Ｐ２を、商用ビオチン化キットを用いてビオチン化した。注入後１時間、３時間、８時間及び２４時間、マウスの採血を行い、血清中のｈＩＬ−２１のレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。プレートを結合のない３Ａ３でコーティングして、ＥＬＩＳＡを行った後、血清でブロッキング及び培養を行った。続いて、ビオチン化２Ｐ２でプレートの培養を行い、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質で検出を行った。
【０２６７】
ＥＬＩＳＡアッセイ
２Ｐ２及び３Ａ３のエピトープを検出するため、ｈＩＬ−２１の別々の領域からなるペプチドを商業的に合成し、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした後、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで非特異的結合部位のブロッキングを行った。その後ビオチン化２Ｐ２または３Ａ３を、ウェルに加え、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質で発症させた。
【０２６８】
その後、完全長ｈＩＬ−２１に対して２Ｐ２または３Ａ３の結合をブロックする能力について、その前の実験から特定されるエピトープをテストした。完全長ｈＩＬ−２１をＥＩＡプレート上にコーティングした後、ＢＳＡによる非特異性結合部位のブロッキングを行った。その後、ビオチン化２Ｐ２または３Ａ３に、対応するペプチドを添加し、プレート上で培養を行った後、ＴＭＢ基質で検出を行った。
【０２６９】
実施例１
抗ＩＬ−２１抗体のスクリーニング
ヒトＩＬ−２１（ｈＩＬ−２１）に対するモノクローナル抗体のライブラリを、本発明者らにより作成した。ヒトＩＬ−２１受容体を発現する一次ヒトＢ細胞（ＢａＦ３細胞）の細胞増殖を強化する能力に関するクローンのスクリーニングを行った（ＢａＦ３−ｈＩＬ−２１Ｒ細胞；Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら （２０００年） Ｎａｔｕｒｅ ４０８：５７−６３）。各々のモノクローナル抗体を、図１で示すように１０倍に系列希釈し、２ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１と混合し、ＣＯ２  ５％、３７℃の加湿チャンバ内でそれぞれＲＰＭＩ−１６４０培地において培養したＢａＦ３−ｈＩＬ−２１Ｒ細胞と共に、培養した。細胞増殖を測定するための［３Ｈ］標識化チミジン取込みアッセイに対して、ＢａＦ３−ｈｕＩＬ−２１Ｒ細胞を、培養培地中、１８時間サイトカインなしで飢餓状態にした後、７２時間培養し、培養の最後の１８時間は、サイトカインの存在下１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ウォルサム、ＭＡ、米国）を添加して行なった。フィルタマット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）上に、細胞を採取し、取り込んだ放射性の核酸を、トップカウントＮＸＴシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、メリデン、ＣＴ、米国）を用いて計数した。結果を、三連の培養に対しての分当たりのカウント（ＣＰＭ）平均として表した。
【０２７０】
図１に実証されるように、モノクローナル抗体２Ｐ２は、用量依存的方法でＢａＦ３−ｈＩＬ−２１Ｒ細胞の増殖を増大させた。したがって、抗体２Ｐ２は、ＩＬ−２１サイトカインの存在下での細胞増殖に対する増強能力を実証し、それは、抗体がヒトＩＬ−２１の作動薬として機能し得ることを示唆した。ＶＨ及びＶＬの重及び軽ＣＤＲを、図２に示す。ＩＭＧＴ番号付けスキームが決定したＣＤＲ配列に下線を付した。
【０２７１】
実施例２
ｍＡｂ２Ｐ２は、ＩＬ−２１受容体を通してｈＩＬ−２１を強化する。
次に、本発明者らは、２Ｐ２モノクローナル抗体の向上させる能力が、ヒトＩＬ−２１受容体に特異的かどうかを決定した。一次ヒトＢａＦ３細胞、マウスＩＬ−２１受容体（ＢａＦ３−ｍＩＬ−２１Ｒ）を発現しているＢａＦ３細胞、及び、ヒトＩＬ−２１受容体（ＢａＦ３−ｈＩＬ−２１Ｒ）を発現しているＢａＦ３細胞を、０．１、１．０及び１０．０μｇ／ｍｌの２Ｐ２抗体（図３Ａ）並びに、２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１の存在下で、播種した。ヒトＩＬ−２１Ｒ（ｈｕＩＬ−２１Ｒ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ（ｍｓＩＬ−２１Ｒ）のためのコード配列を、ＮＭ＿０２１７９８及びＮＭ＿０２１８８７に適合させるように配列させたそれぞれヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリから、ＰＣＲにより、クローン化した。細胞増殖を測定するための［３Ｈ］標識化チミジン取込みアッセイに対して、Ｂａ／Ｆ３−ｈｕＩＬ−２１Ｒ細胞またはＢａ／Ｆ３−ｍＩＬ−２１Ｒ細胞を、培養培地中、１８時間サイトカインなしで飢餓状態にした後、７２ｈ培養し、培養の最後の１８時間は、指示濃度でのサイトカインの存在下１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ウォルサム、ＭＡ、米国）を添加して行なった。フィルタマット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）上に、細胞を採取し、取り込んだ放射性の核酸を、トップカウントＮＸＴシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、メリデン、ＣＴ、米国）を用いて計数した。結果を、三連の培養に対しての分当たりのカウント（ＣＰＭ）平均として表した。
【０２７２】
その結果は、２Ｐ２は、Ｂａ／Ｆ３ｈＩＬ−２１Ｒ細胞の増殖を特異的に増大させたが、Ｂａ／Ｆ３ｍＩＬ−２１ＲまたはＢａ／Ｆ３細胞はしなかったことを実証し、これは、２Ｐ２抗体の活性は、ネズミＩＬ−２１の機能を強化しなかったため、ヒトＩＬ−２１に特異的だったことを示している。図３Ｂは、２Ｐ２によるＢａ／Ｆ３−ｈＩＬ−２１Ｒ細胞（黒丸）及びＢａＦ３−ｍＩＬ−２１Ｒ細胞（白丸）の細胞増殖に対する効果を、ヒトＩＬ−１２（ｎｇ／ｍｌ）に対してプロットしたものを示す。２Ｐ２の濃度が１０μｇ／ｍｌのとき、ヒトＩＬ−２１の生物活性は、１０倍以上に増大された。しかしながら、ネズミＩＬ−２１受容体を発現している細胞の存在下では、ヒトＩＬ−２１の生物活性に対する効果はなかった。
【０２７３】
実施例３
２Ｐ２は、ｈＩＬ−２１媒介ヒトＢ細胞増殖を強化する。
マーカーＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４及びＣＤ４５を用いて健康なドナーの末梢血液単核細胞から、ヒトＢ細胞を濃縮した。標準分析法に従いフローサイトメトリーを用いて、Ｂ細胞増殖を測定した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で細胞を標識し、ヒトＩＬ−２１が０、０．３、１、５、２０及び１００ｎｇ／ｍｌの存在下で、培養を行った。少なくとも１回の分裂を経た細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより決定した。たとえば図４Ａに示されるように、ヒトＩＬ−２１が２０ｎｇ／ｍｌで、ヒトＢ細胞の約６７％が増殖した。図４Ｂでは、フローサイトメトリーデータは、最初の６本のバーとして再現される。残りの４本のバーは、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１並びに０、０．０１、０１及び、１μｇ／ｍｌの２Ｐ２抗体の存在下で増殖されたＢ細胞のパーセンテージを示す。５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１に１μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ２Ｐ２をプラスした場合に、２Ｐ２抗体がない場合の１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１の生物活性に類似した結果を得たことが実証され、その結果、ｍＡｂ  ２Ｐ２は、ｈＩＬ−２１の生物活性を約２０倍増大させたことが実証され、ＩＬ−２１活性の有力な作動薬であったことが示唆された。
【０２７４】
実施例４
２Ｐ２はｈＩＬ−２１媒介ヒトＣＤ８Ｔ細胞活性化を強化する。
図５に示される様々な濃度で、ヒトＣＤ８Ｔ細胞をＩＬ−２１の存在下で培養した。最初の３枚のパネルでは、ＩＬ−２１単独（２ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌ）、及び、ＩＬ−２１プラス２Ｐ２（それぞれ２ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。次のパネルでは、ＩＬ−２１単独（１０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）、及び、ＩＬ−２１プラス２Ｐ２（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を示すグランザイムＢ及びパーフォリンで細胞を染色したが、その理由は、これらの細胞毒性分子の発現が抗ウィルス及び抗腫瘍免疫にとって重要だからである。グランザイムＢ／パーフォリン倍陽性細胞のパーセンテージを、上の右手四半部に示す。図５では、２ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１プラス１μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ２Ｐ２が、２５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１単独のものよりも、Ｔ細胞上でより良好な生物活性を得たことを実証し（２１．８９％の陽性対２０．２９％の陽性）、また、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１プラス１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ２Ｐ２が、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１単独のものよりも、より良好な生物活性を得たことを実証した（３１．７０％対２５．７７％の陽性）を示し、ｍＡｂ  ２Ｐ２によりｈＩＬ−２１生物活性が１０倍超増加したことを示している。
【０２７５】
実施例５
モノクローナル抗体２Ｐ２は、生体内でｈＩＬ−２１半減期を延長する。
ｈＩＬ−２１／２Ｐ２及びｈＩＬ−２１／３Ａ３複合体の血清半減期を、ＥＬＩＳＡアッセイにより生体内で決定した。２５μｇのｈＩＬ−２１；２５μｇのｈＩＬ−２１及び１２５μｇの２Ｐ２−ビオチン；または２５μｇのｈＩＬ−２１及び１２５μｇの３Ａ３−ビオチン、のいずれかを、野生型マウスに静注で注入した。１、３、８及び２４時間に、マウスの頬から採血を行い、１００μｌの血液を得た。その後室温で３０分間血液を培養して、血清を得た。血清中のｈＩＬ−２１のレベルの測定を、ＥＬＩＳＡにより行った。アッセイの検出限界は、１ｎｇ／ｍｌである。図６は、静注（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）で投与したｈＩＬ−２１／２Ｐ２複合体の２４時間での血清からの検出を示す。いずれのルートでも、２Ｐ２の投与により、ｈＩＬ−１２単独投与と比較して、テストしたすべての時点で、ｈＩＬ−２１の血清保持の有意的な増加が見られた。２Ｐ２は、ｈＩＬ−２１の血清ＡＵＣを、皮下に投与したときには５４倍高め（皮下ＩＬ−２１単独はＡＵＣ１１７；皮下ＩＬ−２１／２Ｐ２はＡＵＣ６３４０）、静注で投与したときには１６４倍高めた（静注ＩＬ−２１単独は、ＡＵＣ９１．３６；静注ＩＬ−２１／２Ｐ２はＡＵＣ１４９９３）。
【０２７６】
実施例６
抗体２Ｐ２は、生体内でＩＬ−２１活性を高める。
次いで、本発明者らは、２Ｐ２が生体内でＩＬ−２１活性を高めるか否かを決定した。ｈＩＬ−２１受容体で内因性ｍＩＬ−２１受容体を置換することにより、マウス株を作成した。これらのマウスは、内因性ＩＬ−２１サイトカインを有しておらず、これらをホモ接合ｈＩＬ−２１ＲＫｌ／Ｋｌ及びｈＩＬ２１Ｋｌ／Ｋｌと称する。マウスは、ｈＩＬ−２１Ｒの正常免疫系及び生理的発現を有するため、それらを、生体内でｈＩＬ−２１及び２Ｐ２の機能をテストするために用いることができる。
【０２７７】
Ｄ０、Ｄ２及びＤ４に、ｈＩＬ−２１またはｈＩＬ−２１及び２Ｐ２をマウスに静注で注入した。治療スケジュールは、下記の表２で設定される。
【０２７８】
【表２】
0006563389.tif 000003
【０２７９】
ヒトＩＬ−２１に結合するが、ＩＬ−２１の活性を強化しない抗体３Ａ３（市販）を、対照として用いた。Ｄ５で、マウスを解剖し、それらの脾臓及びリンパ節を採取した。ｈＩＬ−２１／２Ｐ２複合体の投与により、ｈＩＬ−２１Ｒノックインマウスでの組換え型ｈＩＬ−２１単独と比較して、脾臓がより大きい範囲に拡大したことが見出され、生体内２Ｐ２でより良好な免疫賦活性機能が示唆された。
【０２８０】
単一細胞懸濁液を、標準手順に従って調製した。Ｂ細胞検出のために、細胞懸濁液を抗体で染色し、ＦＡＣＳ（ＢＤからのフローサイトメトリーＬＳＲ２）により分析を行った。Ｂ細胞の個体群を、以下の通り分析した。
小胞地帯（ＦＺ）Ｂ細胞−ＣＤ３−Ｂ２２０＋  ＩｇＤ＋；
周縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞−ＣＤ３−Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋  ＣＤ２３−；
遷移性Ｂ細胞−ＣＤ３−Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＡＡ４．１＋。
【０２８１】
リンパ節からのＦＺ、ＭＺ及び遷移性Ｂ細胞の結果を、図７に示し、脾臓からのＦＺ、ＭＺ及び遷移性Ｂ細胞の結果を、図８に示した。一元配置分散分析（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験）を複数のグループの差の分析に用いた統計解析を実行した（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ 社， ラ ホヤ，ＣＡ 米国））。これらの結果は、２Ｐ２の添加が、リンパ節及び脾臓で遷移性Ｂ細胞を有意に増大させ、また、リンパ節の周縁帯Ｂ細胞を有意に増大させたことが、示された。
【０２８２】
【表３】
0006563389.tif 000004
【０２８３】
実施例７
エピトープ改良
次に、本発明者らは、ヒトＩＬ−２１のどの残基が２Ｐ２抗体により結合されたか決定するための調査を行った。図９は、ヒトＩＬ−２１の配列を示し、ここでは、太字体の残基は、構造上のシミュレーション研究によって、抗体２Ｐ２により結合される残基であると予測され、下線の残基は、ＩＬ−２１らせん領域内に位置している。本発明者らは、以下の通りに、そして、図９で示すように、ｈＩＬ−２１の５つのペプチドを作成した：
ペプチド１（Ｐ１、３０ａａ；配列番号１９）：ＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴ
ペプチド２（Ｐ２、２７ａａ；配列番号２０）：ＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＶＳＩＫＫＬＫＲＫＰＰ
ペプチド３（Ｐ３、３０ａａ；配列番号４）：ＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥ
ペプチド４（Ｐ４、２３ａａ；配列番号２１）：ＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥ
ペプチド５（Ｐ５、１５ａａ；配列番号２２）：ＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴ
【０２８４】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、抗体２Ｐ２と３Ａ３の間の結合を調べ、ストレプトアビジン−ＨＲＰは二次的にＰ１〜Ｐ５のペプチド、ｈＩＬ−２１及びＯＶＡペプチドのそれぞれに対する対照とした。図１０に示すように、抗体２Ｐ２に結合したペプチド３が、最も強力であり、ペプチド４及びペプチド５と続く。したがって、抗体２Ｐ２により認識されたエピトープは、９ｍｅｒ〜１５ｍｅｒの最低の配列を含み、そのコア配列はＳＴＮＡＧＲＲＱＫ（配列番号２３）であった。配列ＣＰＳＣＤも存在した場合に結合はより強力であり、そして、配列ＩＫＫＬＫ、ＣＰＳＣＤ及びＳＴＮＡＧＲＲＱＫが存在した場合に、最も強力な結合が観測された。最も強力な結合は、配列ＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥ（配列番号４）を含んでいるペプチド３で観測された（図１０にまとめた）。ペプチド３で２Ｐ２をプレ培養した場合、２Ｐ２は、完全長ｈＩＬ−２１への結合に失敗した（図１１Ａ）。ペプチド３で対照抗体３Ａ３をプレ培養した場合は、完全長ｈＩＬ−２１への結合を阻害しなかった（図１１Ｂ）。これは、ペプチド３内に構成されるエピトープは、ｈＩＬ−２１への２Ｐ２の結合に十分であったことを実証した。
【０２８５】
実施例８
２Ｐ２のｈＩＬ−２１への結合親和力
ダイレクトアミン結合法により、表面血漿共鳴結合反応速度論アッセイを、Ｂｉｏ−ｒａｄ社ＸＰＲ３６システム上で実行した。簡潔に説明すれば、２５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２１ｍＡｂを流入させる前に、ＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド］とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物のフローを用いて、ＧＬＣセンサーチップの細胞表面を活性化させ、その後、エタノールアミンのショットフローを用いて、細胞表面上の残りの活性部位をブロックした。その後、０〜４０ｎＭのＩＬ−２１の系列希釈溶液を、細胞表面上に流入させて、固定された抗ＩＬ−２１ｍＡｂ分子に結合させた。結合反応速度論を、３分の結合時間及び６分の解離時間で、３０μｌ／分の流量で、２５℃で実行した。バッファは、ｐＨ７．４で、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＣｌ、トゥイーン２０、及び１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡから成っていた。サイクル間のフロー細胞再生バッファは、１５ｍＭのリン酸であった。二重の参照を用いて、センサーグラムを処理した。結合曲線は、１：１のラングミュア結合モデルに、全般的に当てはめた。
【０２８６】
２Ｐ２のｈＩＬ−２１への最終的な結合親和力を、ｎ＝５測定の平均から、３．０Ｅ−０９Ｍとして算出した（表６）。ｈＩＬ−２１及び２Ｐ２の親和性は、２．４７Ｘ１０−９〜４．２９Ｘ１０−９の範囲に含まれ、その平均は３．３３Ｘ１０−９、ＳＤは０．７４Ｘ１０−９であった。
【０２８７】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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