(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造の化合物：
【化１】
0006571214.tif 000032
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル
−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ
］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド、実質
的にジアステレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項２】
下記構造の化合物：
【化２】
0006571214.tif 000033
Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒ
ドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）
−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、実質的に
ジアステレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容される
塩。
【請求項３】
請求項１もしくは２のいずれかに記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステ
レオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病
、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵
巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、
子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、
脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌または腺様嚢胞癌の治療のため
の医薬の製造のための、請求項１もしくは２に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋
なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用。
【請求項５】
肺癌の治療のための医薬の製造のための、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療のための医薬の製造のための、請求項１
もしくは２に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれ
らの薬学的に許容される塩の使用。
【請求項７】
聴覚有毛細胞生成を誘導するための医薬の製造のための、請求項１もしくは２に記載の
化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容さ
れる塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
老化、騒音への暴露、化学薬品への暴露、投薬、疾患、及び遺伝的障害による内耳の感覚有毛細胞の喪失は、毎年多くの人々に聴覚障害を引き起こす。病因に関わらず、蝸牛のコルチ器官内に位置する機械感覚性有毛細胞の死または機能不全は、感音性難聴（ＳＮＨＬ）の主な原因である。聴力損失を抑制するための予防措置は、主に耳栓や騒音の低減、ヘッドフォンの中止などの周辺機器の保護に限定されている。ＳＮＨＬの現在の治療法は、補聴器を用いた音の増幅や、蝸牛インプラントを用いた生存螺旋神経節ニューロンの電気刺激による有毛細胞のバイパスなどの電子技術に主に基づいている。突然の感音性難聴に対して、全身療法または中耳内治療を行うためステロイド投与も提案されている。
【０００２】
蝸牛感覚上皮は、音の振動の検出に適合した有毛細胞を含み、該振動は該有毛細胞の頂端表面にある不動毛によって電気インパルスに変換され、ＶＩＩＩｔｈ脳神経を介して脳に伝達される。哺乳動物において、発達中に産生された聴覚有毛細胞は、分裂終了後（ｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃ）であり、喪失後または正常細胞代謝回転の一部として、置換されない。その結果、聴覚有毛細胞喪失によるＳＮＨＬは不可逆的である。胚期における聴覚有毛細胞の発達には、予定感覚上皮細胞（ｐｒｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）がノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達によって媒介される側抑制のプロセスによって、有毛細胞または支持細胞のいずれかの異なる運命を獲得する、分化が含まれる。予定感覚上皮細胞は、隣接する有毛細胞上のリガンドによって刺激される活性ノッチシグナル伝達によって、有毛細胞に分化することが妨げられる。これらの細胞は支持細胞になる。
【０００３】
ノッチシグナル伝達は、哺乳動物の発生及び組織の恒常性において重要な役割を果たす進化的に保存された経路である。ノッチ受容体及びリガンドは、１回膜貫通ドメインを含有し、細胞表面上で発現されるので、そのような理由で、ノッチシグナル伝達は、これらの受容体及びリガンドを発現する隣接する細胞間の連通を仲介する上で特に重要である。齧歯類及びヒトで判明した４つの既知のノッチ受容体があり、ノッチ１〜ノッチ４と呼ばれる。ノッチ受容体は、最初に単一のポリペプチドとして合成される細胞外及び細胞内ドメインから構成されるヘテロ二量体タンパク質である。受容体−リガンド相互作用は、γ−セクレターゼ活性が関与するノッチ受容体ポリペプチドの一連のタンパク質分解切断を引き起こす。γ−セクレターゼ活性は、転写因子複合体を形成するために核に転位する原形質膜の内部側からノッチ細胞内ドメインを切断する。ノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）は、タンパク質の活性型である。様々なノッチシグナル伝達機能としては、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、遊走、及び自己再生が含まれる。正常組織の発生及び維持中のノッチシグナル伝達のこれらの多様な役割は、色々な種類の癌において異常に活性化される。ノッチシグナル伝達の発癌性機能としては、アポトーシスの阻害及び細胞増殖の促進が含まれる。
【０００４】
γ−セクレターゼは、ノッチ活性化カスケードにおいて中心的役割を果たす。その結果、γ−セクレターゼの阻害剤は、癌治療のためのノッチ受容体活性化をブロックする可能性について積極的に研究されている。臨床試験が継続しているが、市販のノッチ阻害剤化学療法薬は出現していない。
【０００５】
γ−セクレターゼは、ノッチシグナル伝達経路を介して、また、予定感覚細胞（ｐｒｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｅｌｌ）分化の中心的役割を果たす。その結果、γ−セクレターゼの阻害剤は、ＳＮＨＬの治療のためのノッチ受容体活性化をブロックする可能性について積極的に研究されている。全身循環への侵入のための様々な方法論によってノッチ阻害剤を投与して、異常に上昇したレベルで及び長期間、ａｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１またはＭａｔｈ１）発現を誘導するのではなく、蝸牛環境において、より標的化された発現レベル及び期間でＡｔｏｈ１発現を誘導することは有用であり、望ましい。Ａｔｏｈ１を調節できないことは、聴覚有毛細胞の研究及び聴覚有毛細胞再生のための治療法の開発の障害となっている。ＷＯ２０１４／０３９７８１のような研究が続けられているが、聴覚有毛細胞の喪失によって引き起こされる感音性難聴を治療するための市販のノッチ阻害剤は出現していない。
【０００６】
ノッチ経路シグナル伝達阻害活性を有する化合物を見出す必要がある。さらに、γ−セクレターゼ阻害活性によってノッチ経路シグナル伝達を阻害する化合物を見出す必要がある。ノッチ経路シグナル伝達及びγ−セクレターゼ阻害活性に寄与する可能性のある異なる構造的特徴を有する化合物を見出す必要もある。さらなる必要性は、ノッチ経路シグナル伝達を阻害することによってＡｔｏｈ１発現を誘導する化合物を見出すことである。望ましい吸収、分布、代謝及び排泄特性を示す化合物を見出すことがさらに必要である。
【０００７】
本発明の１つの態様は、下記構造の化合物：
【化１】
0006571214.tif 000002
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド、もしくは実質的にジアステレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、下記構造の化合物：
【化２】
0006571214.tif 000003
Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、もしくは実質的にジアストレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩である。
【０００９】
本発明の別の態様は、化合物１、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、または化合物２、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、患者における、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌及び腺様嚢胞癌である癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または、化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、患者の肺癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療を必要とする患者においてそれを行う方法であって、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、聴覚有毛細胞生成の誘導を必要とする患者においてそれを行う方法であって、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、療法に使用するための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、またはその医薬的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌及び腺様嚢胞癌の治療のための医薬の製造のための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマーもしくはそれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１６】
本発明のなおさらなる態様は、肺癌の治療に使用するための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療に使用するための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、聴覚有毛細胞生成を誘導するために使用するための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様は、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌及び腺様嚢胞癌の治療のための医薬の製造のための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、肺癌の治療のための医薬の製造のための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療のための医薬の製造のための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、聴覚有毛細胞生成を誘導するための医薬の製造のための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、イヌコンパニオンアニマルにおける聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴を治療する方法であって、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくは薬学的に許容されるその塩または、化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくは薬学的に許容されるその塩の、治療上有効量を前記イヌコンパニオンアニマルに投与することを含む、方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様は、それを必要とするイヌコンパニオンアニマルにおける聴覚有毛細胞生成を誘導する方法であって、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を、前記イヌコンパニオンアニマルに投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
「化合物１、そのジアステレオマー」という語句は、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド、またはジアステロマーである４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドまたは４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［（１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドを意味する。同様に、「化合物２、そのジアステレオマー」という語句は、Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、またはジアステレオマーであるＮ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミドまたはＮ−（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミドを意味する。
【００２６】
用語「患者」は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」は出生後期間後のヒトを含むが、これに限定されない。ヒトの出生後期間は、出産直後から３０日間の期間である。
【００２７】
「治療有効量」または「有効量」は、化合物１、異性体１もしくは異性体２であるその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩、または、化合物２、異性体１もしくは異性体２である、実質的に純粋なジアステレオマーまたはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか、あるいは上記のいずれかを含む医薬組成物の、癌患者におけるノッチシグナル伝達を阻害し、標的癌細胞を破壊するか、または患者の癌の進行を遅らせもしくは停止させるのに必要な、いずれかの投与量を意味する。同様に、「治療有効量」または「有効量」は、化合物１、異性体１もしくは異性体２であるその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩、または、化合物２、異性体１もしくは異性体２である、その実質的に純粋なジアステレオマーまたはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか、あるいは上記のいずれかを含む医薬組成物の、聴覚有毛細胞喪失または損傷に起因する感音性難聴患者におけるノッチシグナル伝達を阻害し、または聴覚有毛細胞生成を誘導するために必要な、投与量を意味する。
【００２８】
「化合物１または化合物２の実質的に純粋なジアステレオマー」は、他の異性体を実質的に含まない異性体１または異性体２を意味する。化合物１の６位または化合物２の５位で異性体純度が９０％を超える鏡像体過剰率である場合、化合物１または化合物２が「実質的にジアステレオマー的に純粋」である。別の実施形態において、異性体純度は、化合物１の６位または化合物２の５位で９５％を超える鏡像体過剰率である。さらに別の実施形態において、異性体純度は、化合物１の６位または化合物２の５位で９８％を超える鏡像体過剰率である。さらに別の実施形態において、異性体純度は、化合物１の６位または化合物２の５位で９９％以上の鏡像体過剰率である。化合物１または化合物２のジアステレオマー混合物を含む全ての立体異性体は、本発明内で検討される。
【００２９】
癌を治療するための、化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の予想される投薬量は、０．１〜１００ｍｇ／患者／日の範囲にある。好ましい投薬量は、１．０〜７５ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。最も好ましい投薬量は、２．０〜５０ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。聴覚有毛細胞の喪失または損傷によって引き起こされる感音性難聴を治療するため、または聴覚有毛細胞生成を誘導するための、化合物１、そのジアステレオマーまたはそれらの薬学的に許容される塩、またはその化合物２、そのジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の予想される投与量は０．０１〜１００ｍｇ／患者／日の範囲である。好ましい投薬量は、０．１〜１０ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。最も好ましい投薬量は、０．２〜１．０ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。
【００３０】
癌、感音性難聴、または聴覚有毛細胞生成を誘導するために、患者を治療するのに必要な正確な投薬量及び治療時間は、病気の段階及び重症度ならびに個々の患者の特定のニーズ及び応答を考慮して医師によって決定される。１日あたりの投薬量として表されるが、投与レジメンは、患者に対してより最適な治療利益を提供し、薬物関連毒性を管理及び改善するように調整され得る。毎日の投与に加えて、隔日投与（Ｑ２Ｄ）、１日おきに５日間投与し、２日間投与しない（Ｔ．Ｉ．Ｗ．）、３日ごと（Ｑ３Ｄ）、または２１日間の投与サイクルにわたって毎週１回（Ｑ．Ｉ．Ｗ．）または他の投与レジメンが適切であり得る。
【００３１】
用語「治療」、「治療する」及び「治療すること」は、癌、聴覚有毛細胞の喪失もしくは損傷に起因する感音性難聴、または聴覚有毛細胞生成を誘導に対する介入の全範囲を含み、例えば１つ以上の症状を緩和し、遅延または逆転させ、患者が患う、癌または聴覚有毛細胞の喪失もしくは損傷の進行を遅延させまたは患者の有毛細胞生成を誘導するための、活性化合物の投与を含むことを意味する。
【００３２】
「イヌコンパニオンアニマル」とは、ペット、介助犬、救助犬、放牧犬及び家畜犬を含むが、これらに限定されない家畜及び家畜繁殖犬を意味する。
【００３３】
ヒトの「聴覚聴力喪失」、「感音性難聴」または「難聴」とは、患者の聴力閾値（特定の周波数で聞こえる最も弱い音（強度））が、軽度の場合２１〜４０ｄＢ、中等度の場合は４１〜５５ｄＢ、中重度の場合５６〜７０ｄＢ、重度の場合７１〜９０ｄＢ、そして最重度の場合９１ｄＢ以上であることを意味する。試験される強度は、通常、０ｄＢ〜最大１２０ｄＢの範囲である。試験する周波数は、通常２５０、５００、１０００、２０００、４０００及び８０００Ｈｚである。診断聴力評価は、純音平均聴力（ｐｕｒｅ  ｔｏｍｅ  ａｖｅｒａｇｅ）を含む純音聴力検査、語音聴取閾値を含む語音聴力検査、聴性脳幹反応評価（ＡＢＲまたはＢＡＥＲ）、経鼓膜蝸電図法（ＥＣＯＧ）、耳音響放射試験（ＯＡＥ）を含む当業者によって知られ使用される日常的な試験によって行われる。小児及び乳児の評価は、視覚強化聴力検査、遊戯聴力検査、耳音響放射（ＯＡＥ）、及び聴性脳幹反応評価を含む、当業者によって知られ使用される日常的な試験によっても行われる。
【００３４】
本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容される担体を有する医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。癌を治療するためには、好ましくは、このような組成物は、経口投与用のものである。
【００３５】
聴覚有毛細胞の喪失または損傷、または聴覚有毛細胞生成を誘導する感音性難聴を治療するためには、局所または全身療法を提供する経口または非経口投与に適した医薬組成物を調合し、投与してもよい。経口組成物は、錠剤、被覆錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル、溶液、乳液または懸濁液を含む。非経口組成物は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、胸骨内、経鼓膜（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ）、内耳内、または蝸牛内の注射、または注入を含む投与を可能にするように調合され得る。医薬組成物は、組成物の患者への投与時に本発明の化合物を生物学的に利用できるように調合することができ、または医薬有効成分の制御放出または持続放出をもたらすように調合することができる。中耳腔への経鼓膜投与に適した医薬組成物が好ましく、中耳の蝸牛窓小窩への投与も好ましい。内耳内注射及び蝸牛内注射も企図される。難聴治療のための好ましい投与経路は、局所的な経鼓膜注射であるが、これは、全身送達を得るための代わりの投与経路に適した医薬組成物を除外せず、局所的な経鼓膜投与の代替または追加する組成物及び投薬計画を含み得る。放出間隔は、送達ビヒクルまたは、化合物１もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩が関連する送達ビヒクル剤の混合物に依存して、三（３）日から九十（９０）日の範囲であり得る、徐放性局所送達組成物も好ましい。
【００３６】
薬物の標的送達のための医薬組成物、調製方法、及び送達システムは、当技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５），Ｓａｌｔ  ａｎｄ  Ｐｌｏｎｔｋｅ，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ”，Ａｕｄｉｏｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｌ，２００９，（１４），３５０−３６０、Ｒｈｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，０１  Ｎｏｖ．２０１０においてみることができる。医薬組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香味料、浸透圧を変えるための塩、緩衝剤、マスキング剤または酸化防止剤を含有することができる。
【００３７】
本発明の化合物は、多くの無機及び有機酸と反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。このような薬学的に許容される塩及びこれらを調製するための共通方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７においてみることができる。
【００３８】
化合物１、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、または化合物２、その実質的に純粋なジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩は、当技術分野で公知であるならびに以下に記載する、様々な手順によって調製できる。特定の合成工程は、様々な方法で組み合わせて、化合物１、そのジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩、またはその化合物２、そのジアステレオマー、もしくはそれらの薬学的に許容される塩を調製することができる。
【００３９】
化合物１は、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドと称され、及び４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−｛｛１Ｓ）−２−［（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル｝ブタンアミドとも称してもよく；また、ブタンアミド、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−［（２，３，５，６−テトラヒドロ−９−メトキシ）−３，３−ジメチル−５−オキソ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）アミノ］エチル］−とも称してもよく、化合物１を明白に同定するために他の名称を用いることができる。ジアステレオマーは、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド及び４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドと称される。ジアステレオマーの各々を明白に同定するために、他の名称を使用することができる。
【００４０】
化合物２は、Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミドと称され、及びＮ−｛（１Ｓ）−２−［（８、８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル｝−４，４，４−トリフルオロブタンアミドと称してもよく；また、ブタンアミド、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−［（６，８，９，１０−テトラヒドロ−８，８−ジメチル−６−オキソ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ］エチル］−とも称してよく、化合物２を明白に同定するために他の名称を用いることができる。ジアステレオマーは、Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド及びＮ−（（Ｓ）（（（Ｒ）−８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミドと称される。ジアステレオマーの各々を明白に同定するために、他の名称を使用することができる。
【００４１】
化合物１及び化合物２は、２つのキラル中心のうちの１つが固定されて描かれていることが理解されるであろう。本明細書では、（Ｒ）−及び（Ｓ）−のカーン−インゴルド−プレローグ表記が、特定の異性体を指すために用いられる。特定の立体異性体は、エナンチオマー的に純粋なまたは富化された出発物質を用いる立体特異的合成によって調製することができる。化合物１または化合物２を含む出発物質、中間体、またはラセミ混合物のいずれかの特定の立体異性体は、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｅ（Ｉ）Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ  １９９４）及びＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ，ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ  １９９１）に見られるような当該技術分野で周知の技術によって分離することができ、キラル固定相でのクロマトグラフィー、酵素的分割、または分別結晶、またはその目的のために形成されたジアステレオマーの、例えばジアステレオマー塩の、クロマトグラフィーが挙げられる。キラル化合物が単離され、またはその異性体に分割されるが、絶対配置または旋光度が決定されない場合、異性体は、それぞれがキラルクロマトグラフィーから溶出する順序に対応する異性体１及び異性体２として任意に指定され、キラルクロマトグラフィーが合成の初期に開始される場合、同じ指定が後続の中間体及び実施例に適用される。本発明の化合物を含む全ての混合物が本発明の範囲内にあると考えられるが、好ましい実施形態は、化合物１、異性体２、または化合物２、異性体２である。
【００４２】
本発明の化合物の合成において初期出発物質として使用される化合物は周知であり、市販されていない限りにおいて、当業者によって一般的に使用される標準手順によって特定の参照文献を用いて容易に合成されるか、または一般参照テキストで見出される。
【００４３】
既知の手順及び方法の例には、一般的な参照テキストに記載されたものが含まれ、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，１９８９、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１０，１９７４−２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００などであり、そこに引用された参考文献を参照されたい。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、以下の用語が、示される意味を有する：「ｍＡｔｏｈ１」はマウスａｔｏｎａｌ相同体１タンパク質を指し、「ｈＡｔｏｈ１」は、ヒトａｔｏｎａｌ相同体１タンパク質を指し、「基本培地」は、５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋５ｍｌのＮ２  １００Ｘストック及び１０ｍｌのＢ２７  ５０Ｘストック＋５００μｌのアンピシリンストック（１０００×、５０ｍｇ／ｍｌ）及び１６６７μｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（３００Ｘ）を指し、「ＢＦＧＦ」は塩基性線維芽細胞増殖因子を指し、「ＤＭＥＭ」は、ダルベッコ改変イーグル培地を指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＥＧＦ」は表皮成長因子を指し、「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸を指し、ＥＳ／ＭＳエレクトロスプレー質量分光法を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指し、「ＧＦＰ」は緑色蛍光タンパク質に変化し、「ｈ」は時間（ｈｏｕｒまたｈｏｕｒｓ）を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクの平衡塩類溶液を指し、「ＨＥＫ」とは、ヒト胚性腎臓を指し、「ＩＣ５０」は、その薬剤について可能な最大阻害応答の５０％を産生する薬剤の濃度を指し、「ＩｇＧ」は免疫グロブリンＧを指し、「Ｍａｔｈ１」は  ヒト遺伝子ａｔｏｎａｌホモログ１を指し、「培地Ａ」はそれぞれ２０，１０，５０及び５０ｎｇ／ｍｌでの２００ｍｌの基本培地＋ＥＧＦ  ｂＦＧＦ＋ＩＧＦ−１＋ヘパラン硫酸を指し、「ＭＥＭ」は最小限の必須培地を指し、「ｍｉｎ」は分を指し、「ＭＳ」は質量分析を指し、「Ｎ１ＩＣＤ」はＮｏｔｃｈ１細胞内ドメインを指し、「ｎＧＦＰ」は、核緑色蛍光タンパク質を指し、「ＯＣ」はコルチ器官を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝化生理食塩水を指し、「ＰＢＳＴ」は、リン酸緩衝食塩水＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を指し、「ｑＰＣＲ」は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指し、「ｑＲＴ−ＰＣＲ」は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を指し、「ＲＬＴ緩衝液」はＲＮｅａｓｙＬｙｓｉｓ緩衝液を指し、「ＲＴ」は室温を指し、「Ｔｂｐ」はＴＡＴＡ結合タンパク質を指す、
【００４５】
調製例１
１−ブロモ−３−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）プロパン−２−オン
【化３】
0006571214.tif 000004
窒素下でテトラヒドロフラン（１９７ｍＬ）及びアセトニトリル（１９７ｍＬ）中の２−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）アセチルクロリド（５２ｇ、１９７．３ｍｍｏｌ）の０℃の撹拌溶液に、トリメチルシリルジアゾメタン（１１８．４ｍＬ、２３６．８０ｍｍｏｌ、ヘキサン中２Ｍ）を滴下添加する。１５分後、室温まで温め、窒素下で２時間撹拌する。濃縮して濃厚な赤色油状物（６１ｇ）を得る。酢酸（２６５ｍＬ）中の先のステップからの２−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）アセチルアジドの５℃の撹拌溶液に臭化水素（３６ｍＬ、１９７ｍｍｏｌ、酢酸中３３％）を滴下添加する。添加後、窒素下で室温まで温める。４５分後、氷／水（５００ｍＬ）でクエンチし、褐色の沈殿を得る。固体をろ過し、水（１００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下４５℃で２時間乾燥させて、橙色の油状物として標記化合物を得る（６３．０ｇ、９９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．１７−７．１２（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ）。
【００４６】
調製例２
（３Ｚ）−１−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）−３−（３，３−ジメチルピロリジン−２−イリデン）プロパン−２−オン
【化４】
0006571214.tif 000005
調製例１で得られた中間体、１−ブロモ−３−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）プロパン−２−オン（６０．００ｇ、１８６ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（３１ｇ、８６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）の懸濁液に３，３−ジメチルピロリジン−２−チオン（２６．５ｇ、２０５ｍｍｏｌ）を室温で一度に加え、１時間撹拌する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、固体をろ別し、ろ過ケーキをメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）ですすぎ、１−（２−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）−３−［（（４，４−ジメチル−２，３−ジヒドロピロール−１−イウム−５−イル）スルファニル］プロパン−２−オンヨージドを淡黄色固体（１００ｇ）として得る。アセトニトリル（１Ｌ）中の固体（１００ｇ、２０１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（５６ｍＬ、４０１ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（５８ｇ、２２１ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２．５時間撹拌する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２００ｍｌ）を添加し、固体をろ別する。ろ液を蒸発させ、残留物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２０ｍＬ）で粉砕し、固体をろ別する（２回）。合わせたろ液を蒸発させて、５０ｇの粗製物質を得る。残留物を、ヘキサン中の酢酸エチルの２０〜５０％勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、オフホワイトの固体として標記化合物を得る（４１ｇ、７０％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８．０／３４０．０（Ｍ＋／Ｍ＋２）。
【００４７】
調製例３
９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−Ａ］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン
【化５】
0006571214.tif 000006
調製例２で得られた中間体、（３Ｚ）−１−（２−ブロモ−４−メトキシフェニル）−３−（３，３−ジメチルピロリジン−２−イリデン）プロパン−２−オン（４０．０ｇ，１１８ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２．７ｇ、１２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（７７ｇ、２３７ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１３．７ｇ、２４ｍｍｏｌ）、及びＮ−メチル−２−ピロリドン（１．２Ｌ）の混合物を窒素で脱ガス／フラッシュする（３回）。懸濁液を１５０℃で４時間加熱する。室温に冷却し、固体をろ別し、酢酸エチルで洗浄し、固体を廃棄する。ろ液に酢酸エチル（１Ｌ）及び水（５００ｍＬ）を添加し、固体をケイソウ土を介してろ過して廃棄する。ろ液層を分離し、水性分から酢酸エチル（２×２０ｍＬ）、次いでジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層を５％重炭酸ナトリウム水溶液で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して１００ｍＬの暗褐色油状物を得る。シリカパッドで物質をろ過し、ジクロロメタン、続いて１％メタノール／ジクロロメタンで溶離し、ろ液を濃縮する。残留物を酢酸エチルと５％重炭酸ナトリウム水溶液の間で分配し、酢酸エチルで水性分から逆抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗生成物を暗褐色泡状物として得る。生じた泡を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解し、ＳｉｌｉａＢｏｎｄ  Ｔｈｉｏｌ（登録商標）（８０ｇ）を添加し、室温で一晩撹拌する。固体をろ別し、ろ過ケーキを酢酸エチル及びジクロロメタンで洗浄し、ろ液を濃縮して、明褐色の固体として標記化合物を得る（１９．６ｇ、６５％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５８．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００４８】
調製例４
６−ヒドロキシイミノ−９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン
【化６】
0006571214.tif 000007
テトラヒドロフラン（３３６ｍＬ）中の調製例３で得られた中間体９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［［１，２−Ａ］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン（１６．８ｇ、６５ｍｍｏｌ）の撹拌した０℃の溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１１ｇ、９８ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加して１５分間撹拌する。亜硝酸アミル（１２．２ｍＬ、９１ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を０℃で３０分間撹拌する。反応混合物を氷／水（２００ｍＬ）に注ぎ、混合物を酢酸エチルで抽出する（２×２００ｍＬ）。結晶化した固体をろ過し、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）によりろ液から抽出する。合わせた有機物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、淡褐色の固体を得る。１：１メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘキサンで固体を粉砕し、先に集めた固体と合わせて、淡黄色固体として標記化合物を得る（１６．５ｇ、８８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８７．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００４９】
調製例５
６−アミノ−９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］［１］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン
【化７】
0006571214.tif 000008
ジクロロメタン（２４８ｍＬ）中の調製例４で得られた中間体、６−ヒドロキシイミノ−９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン（１６．５ｇ、５８ｍｍｏｌ）及び亜鉛粉末（１１．３ｇ、１７３ｍｍｏｌ）の攪拌した５℃〜１０℃の懸濁液にトリフルオロ酢酸（１７ｍＬ、２３１ｍｍｏｌ）を、１０分間かけて滴下して加え、次に室温まで温める。ケイソウ土のパッドを通して混合物をろ過し、氷と飽和炭酸ナトリウム水溶液（１：１，５００ｍＬ）との混合物にろ液を注ぐ。得られた懸濁液をケイソウ土を介してろ過し、フィルターパッドをジクロロメタンですすぐ。ジクロロメタン（１００ｍＬ）で水層から抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、淡褐色泡状物として標記化合物を得る（１４．７ｇ、９４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７３．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００５０】
調製例６
ベンジル（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパノエート
【化８】
0006571214.tif 000009
Ｌ−アラニンベンジルエステル塩酸塩（７ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２８ｍＬ、１６２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（７．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（９．３ｇ、４９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１６２ｍＬ）中の４，４，４−トリフルオロ酪酸（７．１ｇ、４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加え、Ｎ２下、室温で２０時間撹拌する。２０％クエン酸水溶液（１５０ｍＬ）でクエンチし、混合物を５分間撹拌し、層を分離し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を用いて水性から抽出する。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、１０．６ｇの淡黄色固体を得る。残留物を、ヘキサン中の酢酸エチルの２５〜５０％勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固体として標記化合物を得る（９．２ｇ、９４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０４．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５１】
調製例７
（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパン酸
【化９】
0006571214.tif 000010
メタノール（８８ｍＬ）中の調製例６で得られた中間体、ベンジル（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパノエート（８．８ｇ、２９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にパラジウム（１．８ｇ、０．８ｍｍｏｌ、Ｃ上５％）室温で加える。混合物を脱気し、水素（バルーン雰囲気）下で５時間撹拌する。混合物をケイソウ土でろ過し、メタノールでパッドを洗浄し、ろ液を濃縮して白色固体を得る。固体をジクロロメタンで粉砕し、真空下、室温で一晩乾燥させて、白色固体として標記化合物を得る（６．１１ｇ、収率９９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００５２】
調製例８
メチル３−（３，３−ジメチル−２−チオキソピロリジン−１−イル）プロパノエート
【化１０】
0006571214.tif 000011
３，３−ジメチルピロリジン−２−チオン（１５．７ｇ、１２２ｍｍｏｌ）及びアクリル酸メチル（１２ｍＬ、１３４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解し、窒素下室温で撹拌した。水酸化ナトリウム（０．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下室温で一晩撹拌した。ブラインで希釈し、酢酸エチルで抽出し、層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して粗固形物２７．５ｇを得る。残留物を、ヘキサン中の酢酸エチルの２０〜５０％勾配で溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体として標記化合物を得る（２５．９ｇ、９９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１６．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５３】
調製例９
メチル３−［（２Ｚ）−２−（２−エトキシ−２−オキソ−エチリデン）−３，３−ジメチル−ピロリジン−１−イル］プロパノエート
【化１１】
0006571214.tif 000012
トルエン（１５６ｍＬ）中の調製例８で得られた中間体、メチル３−（３，３−ジメチル−２−チオキソピロリジン−１−イル）プロパノエート（４１．４ｇ、１９２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にテトラキス（アセタト）ジロジウム（ＩＩ）（３．７４ｇ、８．５ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下１１０℃に加熱した。エチルジアゾアセテート（８９ｍＬ、８４４ｍｍｏｌ）を約１８時間かけて滴下で加え、次いで１１０℃で一晩加熱する。濃縮し、残留物を、ヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色の油状物として標記化合物を得た（３４．５ｇ、６７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７０．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５４】
調製例１０
エチル（２Ｚ）−２−（３，３−ジメチルピロリジン−２−イリデン）アセテート
【化１２】
0006571214.tif 000013
窒素下３０℃未満の温度に維持した水／氷浴を使用して、テトラヒドロフラン（４３０ｍＬ）中の調製例９で得られた中間体メチル３−［（２Ｚ）−２−（２−エトキシ−２−オキソ−エチリデン）−３，３−ジメチル−ピロリジン−１−イル］プロパノエート（３３．８ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、カリウムヘキサメチルジシラジド（３０１ｍＬ、トルエン中０．５Ｍ、１５１ｍｍｏｌ）を滴下で４５分かけて添加する。添加終了後４０分間攪拌する。重炭酸ナトリウム飽和水溶液（２５０ｍＬ）でクエンチし、次いで濃縮する。ジエチルエーテルとブライン溶液との間で分配し、水性物から酢酸エチル（×４）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して３７ｇの物質を得る。ヘキサン中の１０％酢酸エチルで溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製して、標記化合物を得た（９．１ｇ、４０％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８４．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５５】
調製例１１
エチル（２Ｚ）−２−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−２−ピリジル）ピロリジン−２−イリデン］アセテート
【化１３】
0006571214.tif 000014
反応容器中の１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）溶液に、２−ブロモ−３−メチルピリジン（１．５ｇ、８．７ｍｍｏｌ）、調製例１０で得られた中間体である、エチル（２Ｚ）−２−（３，３−ジメチルピロリジン−２−イリデン）アセテート（１．６ｇ、８．７ｍｍｏｌ）及びｓｙｍ−ジメチルエチレンジアミン（０．７７ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を混ぜ合わせる。１０分間撹拌しながらこの溶液に窒素を通して泡立てる。炭酸カリウム（３．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（０．８３ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を全て一度に加え、密閉し、１２０℃で２日間加熱攪拌する。ジクロロメタンで希釈し、ケイソウ土を介してろ過し、ろ液を濃縮する。ヘキサン中５〜１００％酢酸エチルの勾配で溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製して、淡黄色油状物として標記化合物を得る（１．５８ｇ、６６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７５．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５６】
調製例１２
８，８−ジメチル−９，１０−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６（８Ｈ）−オン
【化１４】
0006571214.tif 000015
反応容器中、調製例１１で得られた中間体、エチル（２Ｚ）−２−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−２−ピリジル）ピロリジン−２−イリデン］アセテート（２．８８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン（６０ｍＬ）の撹拌溶液に、シリンジを介してナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（２２ｍＬ、テトラヒドロフラン中１Ｍ、２２ｍｍｏｌ）を添加する。容器を密閉し、攪拌しながら７０℃で３日間加熱する。室温に冷却し、ブラインでクエンチし、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して、褐色油状物を得る。残留物を、ヘキサン中の５０−１００％酢酸エチルの勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、黄色固体として標記化合物を得た（１．７０ｇ、７１％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２９．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５７】
調製例１３
６−アジド−１０−アザ−３，３−ジメチル−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−５−オン
【化１５】
0006571214.tif 000016
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の調製例１２の中間体、８，８−ジメチル−９，１０−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６（８Ｈ）−オン（１．８５ｇ、８．１ｍｍｏｌ）の撹拌した−７８℃の溶液に、リチウムジイソプロピルアミド（７．０ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、ヘキサン中１．５Ｍ）を１０分間かけて窒素下で添加する。３０分後、シリンジを介して酢酸（２．３ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、次いで窒素下で室温に温める。重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチする。ブラインと酢酸エチルとの間で混合物を分配し、層を分離し、酢酸エチル層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して褐色固体を得る。ヘキサン中５〜６０％酢酸エチルの勾配で溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製して、標記化合物（１．２ｇ、５５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７０．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５８】
調製例１４
５−アミノ−３，３−ジメチル−９，１０−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６（８Ｈ）−オン
【化１６】
0006571214.tif 000017
エタノール（５０ｍＬ）及び水（１５ｍＬ）中の調製例１３で得られた中間体、６−アジド−１０−アザ−３，３−ジメチル−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−５−オン（１．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で、亜鉛末（１．２ｇ、１８ｍｍｏｌ）、続いて塩化アンモニウム（５ｇ、６６ｍｍｏｌ）を添加する。１時間後、酢酸エチルで希釈し、固体をろ別し、ろ液を濃縮する。酢酸エチルとブラインとの間で残留物を懸濁させ、層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮する。ジクロロメタン中５〜４０％の［メタノール／ジクロロメタン中の１０％２Ｍアンモニア］の勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製して、黄色固体として標記化合物を得る（０．７２ｇ、６７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４４．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５９】
調製例１５
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［（１０−アザ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート
【化１７】
0006571214.tif 000018
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の調製例１４で得られた中間体、５−アミノ−３，３−ジメチル−９，１０−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６（８Ｈ）−オン（０．７２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の撹拌された０℃溶液に、（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（０．６９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．５５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．６７ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を、窒素下で加えた。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．６８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素下で室温に温める。２時間後、水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。ブラインで有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮する。ヘキサン中の５０−１００％酢酸エチルの勾配で溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製して、黄色固体として標記化合物を得る（１．０４ｇ、８４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１５．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００６０】
調製例１６
（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（１０−アザ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）プロパンアミド塩酸塩
【化１８】
0006571214.tif 000019
１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）中の調製例１５で得られた中間体、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［（１０−アザ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（１．０４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、塩酸（１２．５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ、ジオキサン中４Ｍ）を添加し、攪拌しながら４５℃まで温める。ＬＣ／ＭＳが完全な反応を示すとき、濃縮して、黄色固体として標記化合物を得る（０．９３ｇ、粗製）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１５．２（Ｍ＋１）。
【００６１】
実施例１
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド
【化１９】
0006571214.tif 000020
パート１
ジアステレオマー４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド
ジクロロメタン（２９４ｍＬ）中の調製例５で得られた中間体、６−アミノ−９−メトキシ−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−５（６Ｈ）−オン及び調製例７で得られた中間体、（２Ｓ）−２−（４，４，４−トリフルオロブタノイルアミノ）プロパン酸（１０．９ｇ、５１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１２．４ｇ、６５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。混合物を５℃に冷却し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８．７５ｇ、６５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０分間撹拌を続ける。混合物を水（３×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して暗色の固体を得る。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで粉砕して、オフホワイトの固体として標記化合物（ジアステレオマーの混合物）を得た（２２．０ｇ、８７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６８．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００６２】
パート２
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド異性体１及び２
１０％アセトニトリル／エタノール（０．２％ジメチルエチルアミン）で溶離するＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤカラムで、実施例１、パート１からのジアステレオマーの混合物を分離して、白色固体として異性体１の化合物（Ｒｔ＝３．２０分）を得（９．８ｇ、３８％）、及び白色固体として異性体２化合物（Ｒｔ＝７．３７分）を得た（９．０ｇ、３６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：両異性体に対し４６８．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００６３】
実施例２
Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド
【化２０】
0006571214.tif 000021
パート１
ジアステレオマーＮ−｛（１Ｓ）−２−［（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル｝−４，４，４−トリフルオロブタンアミド
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の調製例１６によって提供された中間体（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（１０−アザ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］ベンズアゼピン−６−イル）プロパンアミド塩酸塩（０．９３ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の撹拌した０℃の溶液に、４，４，４−トリフルオロブタン酸（０．４５ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．４９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を添加する。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．６１ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素下で１６時間室温に温める。水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。ブラインで有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮する。残留物を、ヘキサン中７５−１００％酢酸エチルの勾配で溶離するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、オフホワイトの固体として標記化合物（ジアステレオマーの混合物）を得る（０．８２ｇ、７１％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３９．２（Ｍ＋１）。
【００６４】
パート２
Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド異性体１及び２
１５％ＭｅＯＨ／ＣＯ２（気体）で溶離するＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラムで、実施例２、パート１からのジアステレオマーの混合物を分離して、白色固体として異性体１（Ｒｔ＝１．６０分）を得（１９４ｍｇ、２４％エピマー化して３２％ＤＥ（ジアステレオマー過剰））、及び白色固体として異性体２（Ｒｔ＝２．３１分）を得る（４６９ｍｇ、５７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：両異性体に対し４３９．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００６５】
癌は、その開始及び進行が、ＤＮＡ複製、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管新生、浸潤、及び細胞ならびに組織微小環境における転移を調節する１つ以上の遺伝子の異常な機能によって誘起される疾患の異種集団としての認識が高まっている。「癌」遺伝子の変異体または異常な機能は、天然発生のＤＮＡ多型、ゲノムコピー数における変化（増幅、欠失、染色体消失、または重複を通して）、遺伝子ならびに染色体構造における変化（染色体転位、逆位、または無秩序な遺伝子発現をもたらす他の再配置を通して）、及び点変異からの結果であり得る。癌性新生物は、１つの異常な遺伝子機能によって誘起され、同じ異常な遺伝子機能によって維持され得るか、または追加の異常な遺伝子機能によって維持及び進行が悪化され得る。
【００６６】
上述した遺伝的染色体異常の他に、癌のそれぞれは、ＤＮＡメチル化、ゲノム刷り込み、及びアセチル化、メチル化、もしくはリン酸化によるヒストン修飾が含まれるゲノムの後成的修飾も含み得る。後成的修飾は、悪性の誘起及び／または維持において役割を果たし得る。
【００６７】
ヒト癌における細胞遺伝学的異常の広範なカタログが編集され、オンラインで維持され定期的に更新されている（Ｔｈｅ  Ｍｉｔｅｌｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｔ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＮＣＩ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）を参照）。このデータベースには、本発明の悪性腫瘍の少なくともいくつかの染色体異常が含まれる。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔは、腫瘍形成に因果関係がある全ヒト遺伝子の詳細なオンライン「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ」ならびにヒト癌の体細胞突然変異のデータベースＣＯＳＭＩＣ（癌の体細胞突然変異のカタログ）を維持している。種々の癌と因果関係を有する細胞遺伝学的変化に関する豊富な情報を含むさらなる情報源は、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙである。
【００６８】
生検、免疫表現型検査及び他の検査による癌の悪性の診断が既知であり、日常的に使用されている。高解像度の染色体分染法及び高度染色体画像法技術に加えて、癌が疑われる場合の染色体異常は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型決定、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）、マルチプレックスＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、一塩基多型アレイ（ＳＮＰチップ）及び当業者に既知でありまた使用される他の診断ならびに分析試験などの細胞遺伝子学的分析を通して決定することができる。
【００６９】
ノッチの発癌性の役割は、ノッチ１細胞内ドメインのＴ細胞受容体−βプロモータ領域への転位を伴い、その結果、ノッチ１細胞内ドメインの過剰発現をもたらすヒトＴ細胞白血病において最初に報告された（Ｇｒａｂｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ，２００６（６）：３４７−３５９；Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４（３０６）：２６９−２７１）．マウスの造血前駆細胞中のノッチ１細胞内ドメインの過剰発現は、ヒトと同様に、マウスにＴ細胞急性リンパ芽球性白血病を生じさせる。Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病に加えて、ノッチシグナルが、受容体増幅及びリガンド及び／または受容体の過剰発現を含む複数の機序を通じて、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病（Ｒｏｓａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００９（１１３）：８５６−８６５）、急性骨髄性白血病（Ｓｌｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ，２０１４（７（３））：８８２−８８９）、慢性骨髄性白血病（Ｎａｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１０（１１５（１４））：２８７２−２８８１）、赤白血病（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００７（２１）：１４９６−１５０３）を含む他の癌において発癌性であるという証拠が増加してある。リガンド及び／または受容体の突然変異または過剰発現に起因する異常な構成的ノッチシグナル伝達はまた、トリプルネガティブ乳癌（Ｓｔｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１４（４）：１１５４−１１６７）、乳癌、卵巣癌（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６（６６）：６３１２−６３１８）、黒色腫（Ｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ，２０１０（４９）：７３３−７４５）、肺癌、非小細胞性肺癌（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，２００９（１０６）：２２２９３−２２２９８）、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、扁平上皮細胞癌（口腔）、皮膚癌及び髄芽腫（Ｒａｎｇａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１１（１１）：３３８−３５１  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓ１（ｔａｂｌｅ））を含むいくつかの固形腫瘍悪性腫瘍に関与する。リガンド及び／または受容体の突然変異または過剰発現に起因する異常な構成的ノッチシグナル伝達も血管肉腫（Ｒａｖｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２００７，（２５（１８Ｓ，Ｊｕｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））：Ａｂｓｔｒａｃｔ  １００３０）、横紋筋肉腫（Ｂｅｌｙｅａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１（１７（２３））：７３２４−７３３６；Ｒｏｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１（１７（３））：５０５−５１３）、脂肪肉腫（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２００９，（２７（１５Ｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））：Ａｂｓｔｒａｃｔ  １０５２６）、悪性線維性組織球腫（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１２，（７２）：１０１３−１０２２）、肝細胞癌（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１２，（１４３）：１６６０−１６６９）、肝内外胆管癌（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ，２０１４，（７（６））：３２７２−３２７９；Ｓｅｋｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２，（１２２（１１））：３９１４−３９１８；Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１１，（１７（３５））：４０２３−４０３０）、及び腺様嚢胞癌（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，（１８）：１０−１３；Ｓｔｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４，（４）：１１５４−１１６７）に関与する。ノッチシグナル伝達の阻害は、構成的ノッチシグナル伝達経路の異常な活性化によって疾患が誘導された癌患者に治療上の利益を提供する魅力的な標的を提示する。Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７（６７）１８７９−１８８２。
【００７０】
内耳有毛細胞発生のための決定的な遺伝子の１つは、基本的ならせん−ループ−へリックス転写因子ａｔｏｎａｌ−１（Ａｔｏｈ１）の哺乳動物相同体である。蝸牛細胞におけるＡｔｏｈ１の発現は、聴覚有毛細胞生成に必要である。Ａｔｏｈｌを発現するコルチ発生器官内の予定感覚上皮細胞は、聴覚有毛細胞に分化し（Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，（１２７（６））：１１８５−１１９６）、及びＡｔｏｈｌは聴覚有毛細胞分化の最も初期のマーカーの１つである。コルチ器官の支持細胞は、繊毛形成（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，（３（６））：５８０−５８６；Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００３，（２３（１１））：４３９５−４４００；Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００５，（１１（３））：２７１−２７６；及び適切な有毛細胞機能（Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００３）を含む有毛細胞の特徴を発生させる可能性を維持する。
【００７１】
蝸牛の各有毛細胞は、有毛細胞及び神経節に対する栄養的及び構造的支持を提供し、ギャップ結合細胞間連絡によってコルチ器官の適切なイオン濃度を維持する上で不可欠である、非感覚的支持細胞によって取り囲まれている。有毛細胞には、内有毛細胞と外有毛細胞の２種類がある。ヒトを含む哺乳動物の蝸牛有毛細胞は、一列の内有毛細胞と三列の外有毛細胞からなる。内有毛細胞は実際の感覚受容体であり、脳に投射する聴神経線維の９５％がこの亜集団から生じる。外有毛細胞の末端は、ほとんど全部が脳の細胞から生じる遠心性の軸索由来のものであり、これらの細胞は、聴覚前置増幅器として機能する。支持細胞は、聴覚有毛細胞の喪失または損傷の後に聴覚有毛細胞生成において重要な役割を果たす。発生中、有毛及び支持細胞は共通の前駆体から発生し、有毛細胞の出現はノッチシグナル伝達経路によって媒介される接触阻害を介して支持細胞になるために細胞を囲むシグナルを示す（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６、（１１）：８３７−８４９。
【００７２】
それらの共有された発生経路と共に、聴覚有毛細胞に分化転換する細胞を支持する能力に基づいて、支持細胞は有毛細胞前駆体として機能し得ると仮定されている（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｕｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌｏｇｙ，２００４，（９（２））：７２−８０）。いくつかの研究は、支持細胞における細胞周期阻害を回避することにより、哺乳動物における聴覚有毛細胞生成をもたらし得ることを実証している（Ｌｏｗｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９９，（９６）：４０８４−４０８８；Ｔｏｒｃｈｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，１９９９，（２８（１０−１１））：９１３−９２４；Ｍｉｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ，２００７，（２３２）：４４−５１）。したがって、成体哺乳動物支持細胞は、一旦それらが自由に細胞周期に入ると、聴覚有毛細胞に分化転換する能力を維持する。
【００７３】
聴覚有毛細胞の回復のための薬物治療は、新しいアプローチであり、中耳液、好ましくは蝸牛窓小窩への投与は、実際の蝸牛への注入なしに、治療用量及び適切な時間でＡｔｏｈ１発現を効果的に誘導して、蝸牛における支持細胞の聴覚有毛細胞分化転換を引き起こことができる。Ｍｉｚｕｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１３，（７７（１））：５８−６９は、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＬＹ４１１５７５）の中耳送達を用いて、マウスの音響外傷に冒された聴覚有毛細胞を再生し、支持細胞からの新しい有毛細胞は有意で測定可能な聴力回復をもたらしたことを示した。この研究は、マウスモデルにおける聴覚有毛細胞の生成及び聴覚の回復に対するノッチ経路シグナル伝達阻害の治療効果の概念的証拠を提供し、生理学的効果についての機構的（聴覚有毛細胞への支持細胞分化）説明を提供した。用量制限毒性は、ＬＹ４１１５７５の全身投与中に示された。
【００７４】
以下のインビトロ及びインビボ研究は、特定の癌細胞株に対する、化合物１及び２、またはそれらの実質的に純粋なジアステレオマーのノッチ経路シグナル伝達阻害活性及び有効性を実証する。これらのアッセイは、ヒト臨床化学療法活性を示すものとして当業者に一般的に認識されている。γ−セクレターゼによるノッチ細胞内ドメイン切断の阻害は、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３及びノッチ４受容体のそれぞれに対して有効であると考えられている。ノッチ経路シグナル伝達阻害活性及び効力を証明するアッセイは、実質的に以下のように、または同様のデータを与える同様のアッセイによって実施することができる。
【００７５】
ノッチ１  Ｎ１ＩＣＤ核内蓄積細胞イメージングアッセイ
ＨＥＫ２９３ΔＥ１２細胞（ＨＥＫ２９３細胞は、そのＮ末端に２３アミノ酸のシグナルペプチド配列ＭＰＲＬＬＴＰＬＬＣＬＴＬＬＰＡＬＡＡＲＧＬＲ（配列番号２）を有するアミノ酸１７０３−２１８３、ＮＰ＿０３２７４０．３（全長マウスＮｏｔｃｈ１タンパク質前駆体：配列番号１）をコードするマウスＮｏｔｃｈ１  ｃＤＮＡを安定に発現するように操作される）を、９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種し、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース）中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。細胞を、試験化合物１０００ｎＭ〜０．０５ｎＭの範囲で１：３希釈の１０ポイントでの投与及び０．２％の最終ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度で処理する。２４時間処理した後、細胞プレートを以下のステップで順次処理する：細胞を室温（ＲＴ）で３０分間１００μｌ／ウェルＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤で固定し、室温で２０分間リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｌ／ウェルの０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で細胞を浸透させ、それぞれ１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中１：２０００のウサギ抗Ｎ１ＩＣＤ（ノッチ１細胞内ドメイン）抗体５０μｌ／ウェルを添加して３７℃で１．５時間インキュベートし、それぞれ１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中１：１０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）Ａｌｅｘａ４８８の５０μｌ／ウェルと３７℃で１時間インキュベートし、それぞれ１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの１５μＭヨウ化プロピジウムと５０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  を３０分間添加して核を染色する。プレートをＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーター（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ）でスキャンして、６５５ｎｍ−７０５ｎｍでの蛍光（ＤＮＡ結合ヨウ化プロピジウムの放出）及び５０５ｎｍ−５３０ｎｍでの核領域におけるＮ１ＩＣＤに結合する抗体の蛍光を伴う総細胞核計数／ウェル及び総核面積／ウェルを測定する。主なアッセイ出力は、核Ｎ１ＩＣＤの総蛍光面積対総核面積の比であり、正規化された核Ｎ１ＩＣＤ信号である。相対細胞傷害性プロファイリングを０．２％ＤＭＳＯ対照細胞に対する％細胞数として収集した。切断されたノッチ１またはＮ１ＩＣＤを認識する抗体は、Ｖａｌ１７４４のヒトノッチ１のアミノ末端切断部位に対応するヒトペプチドに対して産生される。未処理の対照細胞では、ノッチ１から生成されたＮ１ＩＣＤが核内に転座して蓄積する。細胞をノッチ１切断阻害化合物で処理すると、核Ｎ１ＩＣＤのシグナルが減少する。濃度応答及びＩＣ５０は、核Ｎ１ＩＣＤシグナルについての４つのパラメータロジスティックにフィットする曲線によって決定され、％細胞数は、細胞傷害性プロファイリングについて同じグラフにプロットされる。本質的に上記のアッセイを実施すると、化合物１、異性体２の平均ＩＣ５０は０．３７ｎＭ（＋／−０．１６；ｎ＝２）であり、化合物２、異性体２では１．５５ｎＭ（＋／−１．１２；ｎ＝��）である。いずれの化合物も１０００ｎＭ濃度まで細胞数に影響を及ぼさない。これらのデータ証拠では、化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２はそれぞれノッチ１に対する親和性を有し、ノッチ１細胞内ドメイン細胞シグナル伝達ペプチドの細胞内蓄積を阻害する。
【００７６】
インビボ標的阻害研究
動物研究
ノッチ処理薬力学（ＰＤ）の阻害に対する化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２のインビボ効果を評価するために、動物研究は非担癌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）で行った。各群につき合計５匹のマウスを使用する。マウスは通常の飼料で自由に飼育される。処理は、化合物またはビヒクル（０．２５％Ｔｗｅｅｎ−８０中の１％Ｎａ−ＣＭＣ）の０．２ｍＬ容量の経口投与（胃管栄養）で開始する。処理後の指定された時点（投与後４または８時間）に、動物はＣＯ２窒息及び頸部脱臼によって屠殺される。組織（肺）を取り出し、切断されたＮ１ＩＣＤによって測定されたＰＤ応答分析に使用する。
【００７７】
Ｎ１ＩＣＤ分析
肺におけるＮ１ＩＣＤレベルを評価するために、凍結組織から約７５ｍｇを切り出し、均質化する前に細かく切り刻む（実際の質量を記録する）。凍結した腫瘍サンプルをＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−Ｄ（商標）チューブに移し、氷冷ＸＹ溶解緩衝液（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１０μｇ／ｍｌトリプシン／キモトリプシン阻害剤、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、６０ｍＭβ−グリセロールリン酸、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、２．５ｍＭピロリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０、５ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）ｐＨ８．０、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭジチオスレイトール、１μＭミクロシスチンＬＲ、１０μｇ／ｍｌ  Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、２ｍＭ  Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（ＴＡＭＥ）、１５ｍＭ  ４−ニトロフェニルリン酸ジ（トリス）塩（ＰＮＰＰ）、０．１ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、５ｍＭベンズアミジン、１μＭオカダ酸）であって１×完全錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｎｏ．１１６９７  ４９８  ００１）及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を質量対体積比７５ｍｇ／ｍｌで含有する、緩衝液中に再懸濁させた。組織を、Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐ  ＦＰ１２０ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で６．０の速度で４℃で３０秒間ホモジナイズし、続いて氷上で１５分間インキュベートする。これを均質化が完了するまで合計２〜３サイクル繰り返す。溶解物を４℃エッペンドルフ遠心分離機で３０，０００ｒｐｍで１５分間回転させて破片を除去する。４００μｌの上清を取り出し、新しいエッペンドルフチューブに移し、凍結／解凍サイクルを行う。試料を４℃エッペンドルフ遠心分離機で３０，０００ｒｐｍで３０分間再度回転させ、１２０μｌの上清を分析のために収集する。Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ（商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して総タンパク質濃度を測定する。Ｎ１ＩＣＤレベルを、カスタムＮ１ＩＣＤ  ＥＬＩＳＡを用いて決定する。分析物を、切断されたノッチ１（Ｖａｌ１７４４）特異的ウサギモノクローナル抗体で捕捉し、Ｃ末端ノッチ１  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）ポリクローナルヒツジ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で検出する。溶解物を、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ｍｉｎｉ  Ｎｏ．１１  ８３６  １５３  ００１）及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）を含有する氷冷ＥＬＩＳＡトリス溶解緩衝液（Ｒ６ＯＴＸ）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）の２μｇ／μｌに溶解し）、２５μｌをＥＬＩＳＡプレートに加える。分析物及び検出抗体を捕捉するために、５０μｇタンパク質溶解物のインキュベーションをそれぞれ室温で１時間行う。プレートを、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）で読み取る。バックグラウンドを差し引いたＮ１ＩＣＤを全タンパク質に対して標準化し、ビヒクル処理群に対する％阻害として示す。化合物１、異性体２または化合物２、異性体２の最後の投与の４時間後に採取した腫瘍におけるＤｕｎｅｔｔ法によって測定したＮ１ＩＣＤ％阻害及び統計学的有意性（ｐ値）は、本質的に上記の通りであり、表１に要約される。
【表１】
0006571214.tif 000022
【００７８】
表１のデータは、マウス肺組織中の化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２によるＮ１ＩＣＤ切断の阻害を証明している。表１のデータはさらに、上記に記載された機能活性データとインビボ相関を提供する。
【００７９】
耳球におけるｍＡｔｏｈ１発現の誘導
一般に、コルチ器官の細胞単離は、主にＯｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；４９３：１４１−１６２の方法により０日目に実施する。細胞の培養及び増殖は３〜４日間行われる。細胞のプレーティング及び試験化合物の処理は、３日目または４日目に行われる。付着と分化は次の７日間にわたり起こる。１０日目または１１日目に、細胞溶解及びＲＮＡ単離を行う。ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲを１２日目に行い、結果をＡｔｏｈ１及びＴｂｐ１発現について１３〜１５日目に分析する。
【００８０】
細胞の単離
両性の生後１〜４日齢の生後マウス（トランスジェニック系統：ｍＡｔｏｈ１−ｄｒｉｖｅｎ  ｎＧＦＰ；Ｌｕｍｐｋｉｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ，２００３；（３６）：３８９−９５から側頭骨錐体部からの周辺組織を取り出す。巻き貝形の蝸牛は、鉗子を用いて前庭器官から分離される。発達のこの段階では、骨迷路は完全に石灰化されておらず、鉗子を用いて容易に解体される。蝸牛の骨迷路を注意深く開き、蝸牛軸の螺旋に沿って一緒に巻き付く、らせん靭帯と付着したコルチ器官を、蝸牛軸からの頂端を巻き戻すことにより、取り出す。基部から開始して、細かい鉗子を使用してコルチ器官かららせん靭帯を分離する。
【００８１】
解体されたコルチ器官（ＯＣ）を、８５０μｌの氷冷ＨＢＳＳで満たされた個々の１．５ｍｌチューブに移す。最大１２個のＯＣ組織を同じチューブに移す。ＯＣ組織をクイックスピンダウンさせ、ＨＢＳＳを除去する。１００μｌの予め温めておいたＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、３７℃で１３分間インキュベートして細胞を分離する。解離したＯＣ組織をクイックスピンダウンさせる。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを除去する。１００μｌの培地Ａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂ２７サプリメント（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びファンギゾン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍｌ）、及びヘパラン硫酸（５０ｎｇ／ｍｌ））を添加する。切開し消化した組織をＰ２００ピペットチップで粉砕する。細胞の凝集物や残骸を取り除き、細胞懸濁液を移し、予め濡らした７０μｍの細胞ストレーナを通して洗浄し、細胞懸濁液を単一の新しい培養管にプールする。解離チューブと細胞ストレーナを十分な培地Ａですすぎ、細胞懸濁液共にプールする。血球計数器またはＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞密度を計数する。新鮮な培地Ａを細胞懸濁液に添加して１．０Ｅ５細胞／ｍｌの最終プレーティング密度を達成し、超低付着培養器Ｔ−７５（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にプレーティングする。
【００８２】
懸濁液中で培養してＯＣ球体を増殖させる
解離された単細胞を、培地Ａ中の超低付着培養器（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、３〜４日間培養し、浮遊細胞から第一世代の球体と呼ばれるクローン的に成長した球体を得る。培養期間中に細胞が付着していない皿に付着する場合、穏やかに混合することでそれらを取り除くことができる。
【００８３】
培養の付着と処理
球体を３〜４日間培養した後、球体を顕微鏡で視覚的に計数して、この工程のｍｌ当たりの耳の球体の播種密度を標準化する。遠心分離により細胞を回収し、基本培地中の球体を約２０００球体／ｍｌの濃度で再懸濁する。１ウェル当たり約３００球体を得るために、細胞培養処理した９６ウェルプレートのウェルあたり１５０μｌの容量で球体を播種する。基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２補充液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｂ２７補充液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、２００μｌの最終容量の実験試薬で球体を４回処理する。５％ＣＯ２、３７℃で加湿温度制御インキュベーター内で処理した球体を７日間培養する。培地を除去し、ＲＮＡ抽出を進める。
【００８４】
ＲＮＡ抽出
ウェル当たり１７５μｌの１％β−メルカプトエタノールを補充した緩衝液ＲＬＴ  ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加する。ＲＮＡ抽出の前にＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓで希釈した４ｎｇ／μｌのＲＮＡキャリア（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）２．５μｌを各ウェルに加える。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、メーカーの使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出する。
【００８５】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成のためのランダムヘキサマーを使用するメーカーのプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１８０８０−０５１）を用いてｃＤＮＡ合成を行う。超純粋ヌクレアーゼフリー水２１μｌを加えてｃＤＮＡを５０％希釈する。５μｌの希釈したｃＤＮＡをｑＰＣＲに用いる。
【００８６】
ｑＰＣＲ
処理された球体培養物由来の有毛細胞マーカーの発現を定量するために、目的の遺伝子ｍＡｔｏｈ１及び内在性対照遺伝子を検出するためのプローブを用いたｑＰＣＲを、単一の２色多重反応で行う。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６９０１６）及び目的のプローブ（Ａｔｏｈ１；Ｍｍ００４７６０３５＿ｓ１及び内在性対照プローブ（Ｔｂｐ１；Ｍｍ００４４６９７１＿ｍ１、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの使用説明書に従って用いる。条件は各プローブについて一定に保たれる。処理群間の相対的遺伝子発現をΔΔＣＴ法を用いて分析し、反復測定値を平均する。実験は最低３回実施され、総平均として報告される。
【表２】
0006571214.tif 000023
【００８７】
表２のデータは、３つの濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭ）で、化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２のそれぞれで処理した耳の球体におけるＡｔｏｈ１発現、有毛細胞発生のマーカーの相対定量値（ＲＱ）を示す。データ（±平均の標準誤差、ＳＥＭ）は、陰性対照（ＤＭＳＯ担体）処理した試料と比較した遺伝子発現の誘導倍数（ｆｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を表す。（＊、陰性対照との有意差、ｐ＜０．０５）。
【００８８】
ヒト腫瘍細胞株におけるｈＡｔｏｈ１発現の誘導
ｈＡｔｏｈ１発現を誘導する能力における、化合物１、異性体２及び２、異性体２の効力を評価するために、ヒト腫瘍細胞株を利用する。この細胞株の内因性ノッチシグナル伝達調節は、内耳におけるものと同様である。一般に、このアッセイは、Ｋａｚａｎｊｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０，１３９（３）：９１８−９２８及び  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓの原則に従って実施される。
【００８９】
一般に、標準的な細胞培養技術が用いられる。増殖培地（ＭＥＭ  １０％ＦＢＳ）中に維持された低継代ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１８８）を、９６ウェル組織培養処理プレートに、１ウェルあたり１００μｌのアッセイ培地（ＭＥＭ  １％ＦＢＳ）中の１０，０００個の細胞でプレーティングする。
【００９０】
翌日、１０ｍＭストック試験化合物（１００％ＤＭＳＯで希釈）の半対数段階希釈を実施して、１１種類の減量用量の薬物化合物を得た。最終濃度は１０μＭ〜０．１２７ｎＭに及ぶ。各ウェルのＤＭＳＯ濃度を１００％として、３．１６倍段階希釈を使用する。最初のＤＭＳＯ希釈液のさらに１：１０希釈をアッセイ培地で実行する再びアッセイ培地中に１：１００の別の希釈を行う。
【００９１】
１００μｌの試験化合物希釈物を、細胞及び増殖培地を含む各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で７２時間増殖させる。
【００９２】
４日目にプレートから細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ９６  ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて，メーカーのプロトコールに従って精製する。
【００９３】
ｃＤＮＡ合成は、ｃＤＮＡ合成のためのランダムヘキサマーを用いるメーカーのプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８０８０−０５１）を用いて実施する。２１μｌの超純粋ヌクレアーゼフリー水を加えることによりｃＤＮＡを５０％希釈する。５μｌの希釈したｃＤＮＡをｑＰＣＲに用いる。
ｑＰＣＲ
【００９４】
処理された球体培養物からの有毛細胞マーカーの発現を定量するために、単一の２色多重反応におけるｈＡｔｏｈ１またはＴＢＰ発現を検出するためのｑＰＣＲプローブが実施される。各試料の相対的遺伝子発現を測定するため、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  ４３６９０１６）及び目的のプローブ（ヒトＡｔｏｈ１；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｓｓａｙ  Ｉｄ  Ｈｓ００９４４１９２＿ｓ１）と、内在性対照（ヒトＴＢＰ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｓｓａｙ  Ｉｄ  Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１）を、メーカーの使用説明書に従って使用する。条件は各プローブについて一定に保たれる。処理群間の相対的遺伝子発現をΔΔＣＴ法を用いて分析し、反復測定値を平均する。
【００９５】
４つの別々のアッセイを実施して、各試験化合物のＩＣ５０値を得る。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して、各化合物について分析された１０８の合計点での４．０Ｅ−１１〜１．０Ｅ−６Ｍの濃度範囲にわたる１２の用量に対して、濃度応答データを「ｌｏｇ（アンタゴニスト）対応答（３パラメーター）」モデルにフィッティングすることによって決定される。化合物１、異性体２及び２、異性体２のＩＣ５０値を表３に示す。
【表３】
0006571214.tif 000024
【００９６】
表３のデータは、このアッセイにおける聴覚有毛細胞生成のマーカーであるｈＡｔｏｈ１の相対的発現によって計算される、化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２のＩＣ５０値を示す。
【００９７】
コルチ器官外植アッセイにおける化合物の応答
一般に、Ｃｏｒｔｉ器官の器官外植片培養は、０日目に、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，２０１０，（３６），ｅ１６８５に記載の方法に従って実施する。外植培養を４〜７日間実施し、その時点で培養物をｑＲＴ−ＰＣＲのための細胞溶解または免疫組織化学のための組織固定のいずれかのために調製する。
【００９８】
コルチ器官外植片の単離と培養
両性の生後１〜４日齢の生後マウス（トランスジェニック系統：Ａｔｏｈ１−ｄｒｉｖｅｎ  ｎＧＦＰ；Ｌｕｍｐｋｉｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ，，２００３；（３６）：３８９−９５）から側頭骨錐体部からの骨胞（ｂｕｌｌａ）及び周辺組織を取り出す。コルチ器官をハンクス溶液中で解体し、らせん靭帯を取り出し、ポリ−Ｌ−オルニチン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）及びラミニン（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆されたカバースリップ上に移植片を置き、平坦な蝸牛表面を有する調製物を得る。次いで、各蝸牛外植片を２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の単一ウェルに入れ、５％ウシ胎仔血清、５％ウマ血清、及びペニシリン−ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養する。実験化合物を０日目に培地で添加し、２〜３日ごとに交換する。全ての培養物を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で維持する。
【００９９】
ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析
ＲＮＡ抽出は、１ウェルあたり３５０μｌのＲＬＴ  Ｐｌｕｓ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で外植組織を溶解して行い、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製する。ｃＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行う。有毛細胞マーカー発現の誘導を定量化するために、ｑＰＣＲをＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６９０１６）及び目的遺伝子（例えば、ｈＡｔｏｈ１；アッセイＩＤ  Ｍｍ００４７６０３５＿ｓ１、Ｐｏｕ４ｆ３；アッセイＩＤ  Ｍｍ０４２１３７９５＿ｓ１及びＭｙｏ７ａ；アッセイＩＤ  Ｍｍ０１２７４０１５＿ｍ１，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び内在性対照遺伝子Ｔｂｐ（アッセイＩＤ  Ｍｍ００４４６９７１＿ｍ１、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を検出するためのプローブを使用してアッセイした。処理群間の相対的遺伝子発現をΔΔＣＴ法を用いて分析し、反復測定値を平均する。実験は最低３回実施され、総平均として報告される。
【表４】
0006571214.tif 000025
【０１００】
表４のデータは、化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２で１μＭで処理したコルチ器官外植片における、有毛細胞発生マーカーＡｔｏｈ１、Ｐｏｕ４ｆ３及びＭｙｏ７ａの発現の相対的定量値（ＲＱ）を示す。データ（±ＳＥＭ）は、陰性対照処理試料と比較した遺伝子発現における誘導倍数を表す。
【０１０１】
新しいＡｔｏｈ１発現有毛細胞の免疫染色
外植培養後、組織を２００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）で３０分間２４ウェルプレートに固定し、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳですすぎ、及びＰＢＳＴ中の４％正常ロバ血清とヤギ抗ＧＦＰ（１：２５００；ＡｂＣＡＭ、ａｂ５４５０）及びウサギ抗ミオシンＶＩＩａ（１：１０００；Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃２５−６７９０）からなる一次抗体溶液２００μｌで１時間染色する組織をＰＢＳＴで完全に洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−１１０５５）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００４２）からなる二次抗体溶液で１時間染色する。次いでそれらをＰＢＳＴで完全に洗浄し、顕微鏡スライド上に載せる。個々の有毛細胞は、Ａｔｏｈ１代替マーカーＧＦＰ（緑色）及びミオシンＶＩＩａ（赤色）の発現によって同定され、画像化され、次いで、試験化合物で処理した試料中の新生毛細胞の形成を未処理対照または陰性対照（生物学的不活性化合物）処理試料における有毛細胞数と比較して調べるために、中央頂点領域で１００μＭでの長さを計数した。盲検細胞計数を別々の実験で５回測定する。
【表５】
0006571214.tif 000026
【０１０２】
表５のデータは、１μＭで化合物１、異性体２（ｎ＝１３）または化合物２、異性体２（ｎ＝１５）の存在下で４日間培養し、及びＧＦＰ（代替Ａｔｏｈ１マーカー）及びミオシンＶＩＩａに対する免疫染色した、コルチ器官外植片の器官における外有毛細胞数を示す。有毛細胞のパーセント増加は、陰性対照処理サンプル（ｎ＝１８）と比較される。
【０１０３】
聴覚毒性損傷後の遺伝子発現解析
様々なコルチ器官器官型外植片培養を、聴覚毒性損傷後の続く化合物処理に応答する有毛細胞再生をモデル化するのに使用する。この損傷モデルは、Ｋｏｒｒａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳＯｎｅ，２０１３，８（８），ｅ７３２７６に記載された方法に従って実施され、そこで、中間頂端有毛細胞の９５％の減少が報告されている。０日目に、コルチ器官外植片内の有毛細胞を損傷し選択的に殺すために、アミノグリコシド処理（ゲンタマイシン（１００μＭ））を１８〜２４時間加える。１日目にゲンタマイシンを除去し、５μＭの化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２での処理を開始した。外植片培養を、上記のｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールのために培養物が調製された時点で合計４日間続けられる。ゲンタマイシン誘導損傷の目視確認は、陰性対照化合物で処理した培養物間で容易に観察される。しかしながら、ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた聴覚毒性損傷後の化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２処理に対する応答の定量的測定は、予定感覚有毛細胞（ｐｒｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌ）マーカーＡｔｏｈ１及びＰｏｕ４ｆ３及び有毛細胞マーカーＭｙｏ７Ａの遺伝子発現の増加を測定した。
【表６】
0006571214.tif 000027
【０１０４】
表６のデータは、ゲンタマイシン（１００μＭ）損傷後の、化合物１、異性体２及び化合物２、異性体２を５μＭで処理したコルチ器官外植片における有毛細胞発生マーカーＡｔｏｈ１、Ｐｏｕ４ｆ３及びＭｙｏ７ａのｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の相対的増加を示す。データは、ゲンタマイシン誘導有毛細胞損傷を伴う陰性対照処理サンプルと比較した遺伝子発現増加のパーセントを表す。（＊、陰性対照との有意差、ｐ＜０．０５）
【０１０５】
全耳の迷路骨包培養における有毛細胞マーカーの誘導
蝸牛骨迷路及び前庭器官を含む耳の迷路骨包（耳の迷路骨包外植片）は、両性の生後１〜４日齢のマウス（トランスジェニック株：Ａｔｏｈ１−ｄｒｉｖｅｎ−ｎＧＦＰ、Ｌｕｍｐｋｉｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ，２００３，３（４）：３８９−９５）から、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，２０１０，（３６），ｅ１６８５に一般的に記載される方法に従って解体する。全耳の迷路骨包を頭頂骨から単離し、ＤＭＥＭ、高グルコース、５％ＦＢＳ、５％ウマ血清、１μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する培地中で回転培養システムで最大３日間、エクスビボで維持する。
【０１０６】
耳の迷路骨包外植片は、様々な送達ビヒクル中の試験化合物の内耳への浸透性を評価するために使用する。様々な送達ビヒクル中の化合物１、異性体２（７．２ｍＭ）の組成物を用いて試験を行う。小容積（１００〜２００ｎｌ）は、蝸牛窓小窩に直接適用される。蝸牛を切開し、処理し、１〜２時間インキュベートし、次いで回転培養に入れる。４８時間後。耳の迷路骨包外植片を開き、蝸牛骨迷路からのコルチ器官を取り出し、ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイする。
【０１０７】
組成物を１〜２時間放置し、次いで培地で洗い流す。次いで、耳の迷路骨包外植片を未処理培地中で４８時間培養する。蝸牛を開けて、コルチ器官全体を解体し、定量的ＲＴ−ＰＣＲのために調製して（上記コルチ器官外植片アッセイに記載されているように）Ａｔｏｈ１有毛細胞マーカー発現レベルを測定する。表７は、指定された送達ビヒクル中のＡｔｏｈ１誘導を示す。全ての試験組成物における化合物１、異性体２によるＡｔｏｈ１の発現上昇（２〜３倍、１２〜１７のｎ）が、培養４８時間後のビヒクルのみで対照処理した耳の迷路骨包外植片と比較して測定される。
【表７】
0006571214.tif 000028
【０１０８】
インビボ外リンパ試験化合物の内耳への取り込み
ケタミン／キシラジンの混合物で雌アルビノハートレーモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を麻酔後、全耳迷路骨包培養アッセイについて上記した組成物中の化合物１、異性体２の７０μｌを経鼓膜経路で注射して中耳を完全に満たす。外リンパ（内耳液）試料を注射０．５、１、６、２４及び４８時間後に抽出し、試験化合物の濃度についてＬＣＭＳ（ｎ＝５）によってアッセイする。表８は、これらの送達ビヒクルを用いて中耳に経鼓膜投与した後、試験化合物が内耳に取り込まれたことを示している。
【表８】
0006571214.tif 000029
【０１０９】
アミノ酸配列
配列番号（マウスノッチ１タンパク質前駆体、全長）
ＭＰＲＬＬＴＰＬＬＣＬＴＬＬＰＡＬＡＡＲＧＬＲＣＳＱＰＳＧＴＣＬＮＧＧＲＣＥＶＡＮＧＴＥＡＣＶＣＳＧＡＦＶＧＱＲＣＱＤＳＮＰＣＬＳＴＰＣＫＮＡＧＴＣＨＶＶＤＨＧＧＴＶＤＹＡＣＳＣＰＬＧＦＳＧＰＬＣＬＴＰＬＤＮＡＣＬＡＮＰＣＲＮＧＧＴＣＤＬＬＴＬＴＥＹＫＣＲＣＰＰＧＷＳＧＫＳＣＱＱＡＤＰＣＡＳＮＰＣＡＮＧＧＱＣＬＰＦＥＳＳＹＩＣＲＣＰＰＧＦＨＧＰＴＣＲＱＤＶＮＥＣＳＱＮＰＧＬＣＲＨＧＧＴＣＨＮＥＩＧＳＹＲＣＡＣＲＡＴＨＴＧＰＨＣＥＬＰＹＶＰＣＳＰＳＰＣＱＮＧＧＴＣＲＰＴＧＤＴＴＨＥＣＡＣＬＰＧＦＡＧＱＮＣＥＥＮＶＤＤＣＰＧＮＮＣＫＮＧＧＡＣＶＤＧＶＮＴＹＮＣＲＣＰＰＥＷＴＧＱＹＣＴＥＤＶＤＥＣＱＬＭＰＮＡＣＱＮＧＧＴＣＨＮＴＨＧＧＹＮＣＶＣＶＮＧＷＴＧＥＤＣＳＥＮＩＤＤＣＡＳＡＡＣＦＱＧＡＴＣＨＤＲＶＡＳＦＹＣＥＣＰＨＧＲＴＧＬＬＣＨＬＮＤＡＣＩＳＮＰＣＮＥＧＳＮＣＤＴＮＰＶＮＧＫＡＩＣＴＣＰＳＧＹＴＧＰＡＣＳＱＤＶＤＥＣＡＬＧＡＮＰＣＥＨＡＧＫＣＬＮＴＬＧＳＦＥＣＱＣＬＱＧＹＴＧＰＲＣＥＩＤＶＮＥＣＩＳＮＰＣＱＮＤＡＴＣＬＤＱＩＧＥＦＱＣＩＣＭＰＧＹＥＧＶＹＣＥＩＮＴＤＥＣＡＳＳＰＣＬＨＮＧＨＣＭＤＫＩＮＥＦＱＣＱＣＰＫＧＦＮＧＨＬＣＱＹＤＶＤＥＣＡＳＴＰＣＫＮＧＡＫＣＬＤＧＰＮＴＹＴＣＶＣＴＥＧＹＴＧＴＨＣＥＶＤＩＤＥＣＤＰＤＰＣＨＹＧＳＣＫＤＧＶＡＴＦＴＣＬＣＱＰＧＹＴＧＨＨＣＥＴＮＩＮＥＣＨＳＱＰＣＲＨＧＧＴＣＱＤＲＤＮＳＹＬＣＬＣＬＫＧＴＴＧＰＮＣＥＩＮＬＤＤＣＡＳＮＰＣＤＳＧＴＣＬＤＫＩＤＧＹＥＣＡＣＥＰＧＹＴＧＳＭＣＮＶＮＩＤＥＣＡＧＳＰＣＨＮＧＧＴＣＥＤＧＩＡＧＦＴＣＲＣＰＥＧＹＨＤＰＴＣＬＳＥＶＮＥＣＮＳＮＰＣＩＨＧＡＣＲＤＧＬＮＧＹＫＣＤＣＡＰＧＷＳＧＴＮＣＤＩＮＮＮＥＣＥＳＮＰＣＶＮＧＧＴＣＫＤＭＴＳＧＹＶＣＴＣＲＥＧＦＳＧＰＮＣＱＴＮＩＮＥＣＡＳＮＰＣＬＮＱＧＴＣＩＤＤＶＡＧＹＫＣＮＣＰＬＰＹＴＧＡＴＣＥＶＶＬＡＰＣＡＴＳＰＣＫＮＳＧＶＣＫＥＳＥＤＹＥＳＦＳＣＶＣＰＴＧＷＱＧＱＴＣＥＶＤＩＮＥＣＶＫＳＰＣＲＨＧＡＳＣＱＮＴＮＧＳＹＲＣＬＣＱＡＧＹＴＧＲＮＣＥＳＤＩＤＤＣＲＰＮＰＣＨＮＧＧＳＣＴＤＧＩＮＴＡＦＣＤＣＬＰＧＦＱＧＡＦＣＥＥＤＩＮＥＣＡＳＮＰＣＱＮＧＡＮＣＴＤＣＶＤＳＹＴＣＴＣＰＶＧＦＮＧＩＨＣＥＮＮＴＰＤＣＴＥＳＳＣＦＮＧＧＴＣＶＤＧＩＮＳＦＴＣＬＣＰＰＧＦＴＧＳＹＣＱＹＤＶＮＥＣＤＳＲＰＣＬＨＧＧＴＣＱＤＳＹＧＴＹＫＣＴＣＰＱＧＹＴＧＬＮＣＱＮＬＶＲＷＣＤＳＡＰＣＫＮＧＧＲＣＷＱＴＮＴＱＹＨＣＥＣＲＳＧＷＴＧＶＮＣＤＶＬＳＶＳＣＥＶＡＡＱＫＲＧＩＤＶＴＬＬＣＱＨＧＧＬＣＶＤＥＧＤＫＨＹＣＨＣＱＡＧＹＴＧＳＹＣＥＤＥＶＤＥＣＳＰＮＰＣＱＮＧＡＴＣＴＤＹＬＧＧＦＳＣＫＣＶＡＧＹＨＧＳＮＣＳＥＥＩＮＥＣＬＳＱＰＣＱＮＧＧＴＣＩＤＬＴＮＳＹＫＣＳＣＰＲＧＴＱＧＶＨＣＥＩＮＶＤＤＣＨＰＰＬＤＰＡＳＲＳＰＫＣＦＮＮＧＴＣＶＤＱＶＧＧＹＴＣＴＣＰＰＧＦＶＧＥＲＣＥＧＤＶＮＥＣＬＳＮＰＣＤＰＲＧＴＱＮＣＶＱＲＶＮＤＦＨＣＥＣＲＡＧＨＴＧＲＲＣＥＳＶＩＮＧＣＲＧＫＰＣＫＮＧＧＶＣＡＶＡＳＮＴＡＲＧＦＩＣＲＣＰＡＧＦＥＧＡＴＣＥＮＤＡＲＴＣＧＳＬＲＣＬＮＧＧＴＣＩＳＧＰＲＳＰＴＣＬＣＬＧＳＦＴＧＰＥＣＱＦＰＡＳＳＰＣＶＧＳＮＰＣＹＮＱＧＴＣＥＰＴＳＥＮＰＦＹＲＣＬＣＰＡＫＦＮＧＬＬＣＨＩＬＤＹＳＦＴＧＧＡＧＲＤＩＰＰＰＱＩＥＥＡＣＥＬＰＥＣＱＶＤＡＧＮＫＶＣＮＬＱＣＮＮＨＡＣＧＷＤＧＧＤＣＳＬＮＦＮＤＰＷＫＮＣＴＱＳＬＱＣＷＫＹＦＳＤＧＨＣＤＳＱＣＮＳＡＧＣＬＦＤＧＦＤＣＱＬＴＥＧＱＣＮＰＬＹＤＱＹＣＫＤＨＦＳＤＧＨＣＤＱＧＣＮＳＡＥＣＥＷＤＧＬＤＣＡＥＨＶＰＥＲＬＡＡＧＴＬＶＬＶＶＬＬＰＰＤＱＬＲＮＮＳＦＨＦＬＲＥＬＳＨＶＬＨＴＮＶＶＦＫＲＤＡＱＧＱＱＭＩＦＰＹＹＧＨＥＥＥＬＲＫＨＰＩＫＲＳＴＶＧＷＡＴＳＳＬＬＰＧＴＳＧＧＲＱＲＲＥＬＤＰＭＤＩＲＧＳＩＶＹＬＥＩＤＮＲＱＣＶＱＳＳＳＱＣＦＱＳＡＴＤＶＡＡＦＬＧＡＬＡＳＬＧＳＬＮＩＰＹＫＩＥＡＶＫＳＥＰＶＥＰＰＬＰＳＱＬＨＬＭＹＶＡＡＡＡＦＶＬＬＦＦＶＧＣＧＶＬＬＳＲＫＲＲＲＱＨＧＱＬＷＦＰＥＧＦＫＶＳＥＡＳＫＫＫＲＲＥＰＬＧＥＤＳＶＧＬＫＰＬＫＮＡＳＤＧＡＬＭＤＤＮＱＮＥＷＧＤＥＤＬＥＴＫＫＦＲＦＥＥＰＶＶＬＰＤＬＳＤＱＴＤＨＲＱＷＴＱＱＨＬＤＡＡＤＬＲＭＳＡＭＡＰＴＰＰＱＧＥＶＤＡＤＣＭＤＶＮＶＲＧＰＤＧＦＴＰＬＭＩＡＳＣＳＧＧＧＬＥＴＧＮＳＥＥＥＥＤＡＰＡＶＩＳＤＦＩＹＱＧＡＳＬＨＮＱＴＤＲＴＧＥＴＡＬＨＬＡＡＲＹＳＲＳＤＡＡＫＲＬＬＥＡＳＡＤＡＮＩＱＤＮＭＧＲＴＰＬＨＡＡＶＳＡＤＡＱＧＶＦＱＩＬＬＲＮＲＡＴＤＬＤＡＲＭＨＤＧＴＴＰＬＩＬＡＡＲＬＡＶＥＧＭＬＥＤＬＩＮＳＨＡＤＶＮＡＶＤＤＬＧＫＳＡＬＨＷＡＡＡＶＮＮＶＤＡＡＶＶＬＬＫＮＧＡＮＫＤＭＱＮＮＫＥＥＴＰＬＦＬＡＡＲＥＧＳＹＥＴＡＫＶＬＬＤＨＦＡＮＲＤＩＴＤＨＭＤＲＬＰＲＤＩＡＱＥＲＭＨＨＤＩＶＲＬＬＤＥＹＮＬＶＲＳＰＱＬＨＧＴＡＬＧＧＴＰＴＬＳＰＴＬＣＳＰＮＧＹＬＧＮＬＫＳＡＴＱＧＫＫＡＲＫＰＳＴＫＧＬＡＣＧＳＫＥＡＫＤＬＫＡＲＲＫＫＳＱＤＧＫＧＣＬＬＤＳＳＳＭＬＳＰＶＤＳＬＥＳＰＨＧＹＬＳＤＶＡＳＰＰＬＬＰＳＰＦＱＱＳＰＳＭＰＬＳＨＬＰＧＭＰＤＴＨＬＧＩＳＨＬＮＶＡＡＫＰＥＭＡＡＬＡＧＧＳＲＬＡＦＥＰＰＰＰＲＬＳＨＬＰＶＡＳＳＡＳＴＶＬＳＴＮＧＴＧＡＭＮＦＴＶＧＡＰＡＳＬＮＧＱＣＥＷＬＰＲＬＱＮＧＭＶＰＳＱＹＮＰＬＲＰＧＶＴＰＧＴＬＳＴＱＡＡＧＬＱＨＳＭＭＧＰＬＨＳＳＬＳＴＮＴＬＳＰＩＩＹＱＧＬＰＮＴＲＬＡＴＱＰＨＬＶＱＴＱＱＶＱＰＱＮＬＱＬＱＰＱＮＬＱＰＰＳＱＰＨＬＳＶＳＳＡＡＮＧＨＬＧＲＳＦＬＳＧＥＰＳＱＡＤＶＱＰＬＧＰＳＳＬＰＶＨＴＩＬＰＱＥＳＱＡＬＰＴＳＬＰＳＳＭＶＰＰＭＴＴＴＱＦＬＴＰＰＳＱＨＳＹＳＳＳＰＶＤＮＴＰＳＨＱＬＱＶＰＥＨＰＦＬＴＰＳＰＥＳＰＤＱＷＳＳＳＳＰＨＳＮＩＳＤＷＳＥＧＩＳＳＰＰＴＴＭＰＳＱＩＴＨＩＰＥＡＦＫ
配列番号２（シグナルペプチド）
ＭＰＲＬＬＴＰＬＬＣＬＴＬＬＰＡＬＡＡＲＧＬＲ
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  下記構造の化合物：
【化２１】
0006571214.tif 000030
４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド、実質的にジアステレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩。
［２］  下記構造の化合物：
【化２２】
0006571214.tif 000031
Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、実質的にジアステレオマーとして純粋なその異性体、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩。
［３］  ［１］もしくは［２］のいずれかに記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［４］  患者における、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌及び腺様嚢胞癌である癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれかの治療有効量を投与することを含む、方法。
［５］  肺癌の治療を必要とする患者において肺癌を治療する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれかの治療有効量を投与することを含む、方法。
［６］  聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療を必要とする患者において聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴を治療する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれかの治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
［７］  聴覚有毛細胞生成の誘導を必要とする患者において聴覚有毛細胞生成を誘導する方法であって、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれかの治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
［８］  療法に使用するための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［９］  Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌または腺様嚢胞癌の治療に使用するための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［１０］  肺癌の治療に使用するための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［１１］  聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療に使用するための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［１２］  聴覚有毛細胞生成を誘導するのに使用するための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［１３］  Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、非小細胞性肺癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、皮膚癌、髄芽腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、肝細胞癌、肝内外胆管癌または腺様嚢胞癌の治療のための医薬の製造のための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用。
［１４］  肺癌の治療のための医薬の製造のための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用。
［１５］  聴覚有毛細胞喪失に起因する感音性難聴の治療のための医薬の製造のための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用。
［１６］  聴覚有毛細胞生成を誘導するための医薬の製造のための、［１］もしくは［２］に記載の化合物、もしくはその実質的に純粋なジアステレオマー、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用。
【配列表】
0006571214000001.app