(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的mRNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な一本鎖DNAからなる主鎖と、ピューロマイシンを3'末端に有する側鎖とから構成される分岐した核酸リンカーであって、
前記側鎖は、他の一端にデオキシアデニン（dA）が10〜25連続した配列からなるオリゴdA領域を有し、当該オリゴdAを介して前記一本鎖DNAポリヌクレオチド鎖中の修飾塩基である5−メチルデオキシシトシン（5-Me-dC）と共有結合しており、前記オリゴdA領域と前記ピューロマイシンとの間にはスペーサー配列が含まれており、かつ、前記オリゴdA領域と前記スペーサー配列とをあわせた側鎖の前記ピューロマイシンまでの距離が8nm〜20nmであり、
前記主鎖は、5'末端に前記mRNAとライゲーション可能な部位、及び当該部位に隣接して前記mRNAとハイブリダイズし得る領域を有し、かつ3'末端に前記mRNAが逆転写される際のプライマーとなるプライマー部位を有していることを特徴とする、核酸リンカー。
【請求項２】
前記スペーサー配列が、Sp.18（Spacer 18 Phosphoramidite）を2〜8個含む配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸リンカーの製造方法であって、
3'末端側から5'末端側に、ピューロマイシンが結合したタンパク質連結部位、スペーサー配列、オリゴdA配列、5−メチルデオキシシトシン（5-Me-dC）、標的mRNAとハイブリダイズし得る領域、及び前記mRNAとライゲーション可能な部位を含む１本鎖DNAの5-Me-dCと、前記mRNAが逆転写される際のプライマーとなるDNA配列の5'末端のリン酸基とを反応させて、共有結合させることを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の核酸リンカーを介して、標的mRNAと、当該mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されているmRNA−タンパク質融合体。
【請求項５】
前記mRNAが、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有していることを特徴とする、請求項４に記載のmRNA−タンパク質融合体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のmRNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む方法；
（ａ）前記mRNAを標的とする請求項１に記載の核酸リンカーを前記mRNAとアニールさせる工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のＣ末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程。
【請求項７】
前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNA及び前記mRNAと相補的なcDNAからなるmRNA/cDNA複合体と、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されているmRNA/cDNA−タンパク質融合体。
【請求項９】
請求項１または２に記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNAと相補的なcDNA、及び前記mRNAによりコードされるタンパク質が連結されているcDNA−タンパク質融合体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNA及び前記mRNAと相補的なcDNAからなるmRNA/cDNA複合体と、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されている、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｆ）を含む方法；
（ａ）前記核酸リンカーを標的mRNAとアニールさせる工程、
ここで、前記標的mRNAは、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有しているmRNAである工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のＣ末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｄ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｅ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）前記金属マトリックス表面のmRNA/cDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体を溶出する工程。
【請求項１１】
前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属マトリックスが、Ni被覆された磁気性ビーズであることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNAと相補的なcDNAと、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されている、精製cDNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｇ）を含む方法；
（ａ）前記核酸リンカーを標的mRNAとアニールさせる工程、
ここで、前記標的mRNAは、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有しているmRNAである工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のＣ末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｄ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｅ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）mRNA/cDNA−タンパク質融合体にRNA分解酵素を作用させてmRNAを分解し、cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｇ）前記金属マトリックス表面のcDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製cDNA−タンパク質融合体を溶出する工程。
【請求項１４】
前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属マトリックスが、Ni被覆された磁気性ビーズであることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のmRNA/cDNA−タンパク質融合体又は請求項９に記載のcDNA−タンパク質融合体を用いて、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAを選択する方法であって、下記の（ａ）〜（ｃ）及び（ｊ）の工程、もしくは（ａ）〜（ｊ）の工程を含む、方法；
（ａ）前記標的物質を固相表面に固定化させる工程、
（ｂ）前記mRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体を、固定化させた標的物質に接触させて、標的物質と結合するタンパク質を含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体を選定する工程、
（ｃ）選定されたmRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体からタンパク質をコードするcDNAを分離し、得られたcDNA断片をPCR増幅させる工程、
（ｄ）増幅させたcDNA断片を用いて翻訳反応促進に必要な配列及びHis-タグをコードする配列を含むテンプレートDNAを調製し、mRNAに転写して、請求項１または２に記載の核酸リンカーとアニールさせ、前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｅ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて工程（ｄ）のmRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のＣ末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｇ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
または、さらにmRNA/cDNA−タンパク質融合体にRNA分解酵素を作用させてmRNAを分解し、cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｈ）前記金属マトリックス表面のmRNA/cDNA−タンパク質融合体もしくはcDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体もしくは精製cDNA−タンパク質融合体を溶出させる工程、
（ｉ）前記工程（ｂ）以降を繰り返す工程、
（ｊ）前記工程（ｃ）で得られた増幅DNA断片、又は工程（ｂ）〜工程（ｉ）までを１回以上繰り返した後の工程（ｃ）で得られたDNA断片を、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAとして選択する工程。
【請求項１７】
前記工程（ａ）において、標的物質を固定化に先立ちあらかじめビオチン化しておき、かつ固定化させる固相として、ストレプトアビジンを結合させた磁気性ビーズを用いることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的物質と親和性の高いタンパク質を同定、もしくは取得する方法であって、
請求項１６又は１７に記載の方法で選択された、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAを回収し、その塩基配列を決定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、cDNAディスプレイ用の新規なピューロマイシンリンカー  オリゴヌクレオチドに関し、さらに当該ピューロマイシンリンカーを用いた簡便で効率の良いcDNAディスプレイ方法及びハイスループットなインビトロセレクションに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、診断試薬や創薬分野を含む幅広い分野において、望みの機能や性質を有するタンパク質やペプチドをスクリーニングするための技術として、進化分子工学的なディスプレイ技術が注目されている。そのようなディスプレイ技術としては、従来からのファージディスプレイ、細胞表層ディスプレイなどの細胞を用いる手法に加え、最近ではリボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、cDNAディスプレイなどの無細胞翻訳系を利用したディスプレイ技術の進展もめざましく、ペプチド医薬などの新規な機能性ペプチド分子開発に寄与する強力なリサーチツールとしての期待が持たれている（非特許文献１〜３）。
現在最も多く利用されているディスプレイ方法は、ファージディスプレイ法であって（非特許文献４）、多数の成功例がある（非特許文献５〜７）が、ライブラリーサイズを比較してみると、ファージディスプレイ法の場合は最大でも108程度であるのに対して、無細胞翻訳系ディスプレイ技術では1012以上であるから、より高い分子多様性が可能である。また、無細胞翻訳系は、非天然残基のタンパク質／ペプチド内への取り込みが可能であるという柔軟性を有し、ジスルフィドシャッフリング反応等のような翻訳後修飾を行い得る点でも、細胞依存的な方法に勝っている（非特許文献８〜１０）。
しかしながら、このような有益な特性やその後の技術開発（非特許文献１１）にもかかわらず、無細胞翻訳系ディスプレイ技術はファージディスプレイ法ほどには一般的とはなっていない（非特許文献１）。その大きな要因は、無細胞翻訳系と比較してファージディスプレイ法においては、遺伝子型と発現ペプチドとの正確な対応性が確保できることと共に、簡便で迅速な手法がすでに確立されている点にある。ファージディスプレイを用いるセレクション／進化の全過程は一般に約2〜3週間（非特許文献１、４）で達成されるのに対して、無細胞翻訳系ディスプレイ技術では、セレクション／進化の10サイクル以上を含む場合は、全過程で5〜8週間に及ぶ（非特許文献１２〜１４）。
【０００３】
進化工学的手法における自動化技術は、核酸の場合には比較的簡単で、新規リガンド創出のためのインビトロセレクション工程及び進化工程のいずれも自動化に成功し解析の精度もスピードも向上している（非特許文献１５）。これに対してディスプレイされたタンパク質の場合、下流でのカップリング工程の精度に問題があるため、一般に自動化システムを採用することが難しい。例えば、ファージディスプレイなど細胞依存的な方法の場合、細胞を介してのカップリング工程は大きな障害となることが予想される。しかしながら、ファージディスプレイではすでに半自動化及び自動化のハイスループットシステムの報告がある（非特許文献１６、１７）。一方、無細胞翻訳系の特にcDNAディスプレイは本来自動化に適している技術であるはずであるが、ミクロ流体分析技術に基づく自動化の試み（非特許文献１８）はあるが、なかなか完全な自動化技術が進まない。これは、従来、cDNAディスプレイにおいてテンプレートとなるmRNA複合体製造工程やタンパク質との融合工程などでの最適化が優れた新規リガンドの創出に結びついたが、これら最適化の調製手法は自動操作に適さないこと（非特許文献１２〜１４、１８）に起因している。
しかしながら、今後のより迅速な新規リガンド及び試薬の大規模な創出に向けて、cDNAディスプレイの自動化ハイスループットシステムの構築は必須であり、そのための正確でかつ迅速なcDNAディスプレイ技術及び当該cDNAディスプレイ用の核酸リンカーの開発は急務である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２９９４８９号公報
【特許文献２】特許第４３１８７２１号公報
【特許文献３】特開２０１１−８７５７３号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１７７０８号公報
【特許文献５】特開２０１２−１３９１９７号公報
【特許文献６】ＷＯ２０１３／０６５８２７
【特許文献７】特許第４９５９２２６号公報
【特許文献８】ＷＯ２０１０／１０４１１４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bradbury, A.R., et al, Nat. Biotechnol., 2011, 29, 245.
【非特許文献２】Lohse, P.A., et al, Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2001, 4, 198.
【非特許文献３】Rothe, A., et al, Faseb J. 2006, 20, 1599.
【非特許文献４】Smith, G.P., et al, Chem. Rev. 1997, 97, 391.
【非特許文献５】Rowley, M.J., et al, Biotechnol. Annu. Rev. 2004, 10, 151.
【非特許文献６】Brissette, R., et al, Methods Mol Biol. 2007, 383, 203.
【非特許文献７】Rivinoja, A., et al, Methods Mol Biol. 2011, 683, 401.
【非特許文献８】Roberts, R.W., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 268.
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【非特許文献１０】Roberts, R.W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 12297.
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【非特許文献２６】Tabuchi, I., et al, FEBS Lett. 2001, 508, 309.
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【非特許文献３２】Verschoor, A., et al, J Cell Biol. 1996, 133, 495.
【非特許文献３３】Verschoor, A., et al, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 655. 30
【非特許文献３４】Gold, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 4825.
【非特許文献３５】Kinoshita, Y., et al, BMC Biotechnol. 2010, 10, 71.
【非特許文献３６】Olson, C.A., et al, Angew Chem Int Ed Engl 2011, 50, 8295.
【非特許文献３７】Nemoto, N., et al, Analytical Chemistry 2014, published on line (DOI: 10.1021/ac501601g)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、自動化ハイスループットシステムに適用可能な、迅速、簡便でかつ正確なcDNAディスプレイ方法及びインビトロセレクション方法を提供すること、及びそのための新規な核酸リンカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
cDNAディスプレイで使用される典型的な核酸リンカーは、ピューロマイシンリンカーであって、主鎖と側鎖（アーム部）からなるＴ字型の一本鎖DNA分子である。主鎖となる一本鎖DNA分子の5'末端側にはmRNAと連結するためのライゲーション部位と共に、ストレプトアビジン固定化ビーズ（SAビーズ）に結合させるためのビオチン部位、及びビオチン部位を挟む形での切断部位が設けられており、3'末端にmRNAの逆転写のためのプライマーを有している。側鎖は、末端にmRNAから合成されたタンパク質を連結するためのピューロマイシンを有し、スペーサー配列を介して主鎖と結合している（特許文献１〜３、非特許文献１３、２２、２８など）。そして、当該リンカーを用いたcDNAディスプレイによるセレクション工程では、まずテンプレートとなるDNAライブラリーから転写されたmRNAとリンカーをライゲーション部位で連結し、得られたmRNA−リンカー連結体を、無細胞翻訳系でタンパク質を生成してピューロマイシンを介してリンカーに連結させ、mRNA−リンカー−タンパク質融合体を製造する。その後、ストレプトアビジンが固定化された固相担体（SAビーズ）に結合させ、SAビーズ上でmRNA−リンカー−タンパク質融合体（以下、mRNAタンパク質融合体とも称する。）の精製及び逆転写酵素によるcDNA合成を行って安定なcDNA−リンカー−タンパク質融合体（以下、cDNAタンパク質融合体、又はcDNAディスプレイとも称する。）を製造する。次いで、核酸リンカーの主鎖の5'末端側のビオチンを挟む近傍にあらかじめ設けられた制限酵素サイトなどの酵素切断部位を制限酵素などで切断することでcDNAディスプレイをSAビーズから切り離し、タンパク質に設けられたHis-タグ精製し、標的物質との結合性を指標としたセレクション工程に供する（特許文献１、非特許文献１３、２２、２３）。その後選択されたタンパク質融合体からのDNAをPCRにより増幅させて変異導入DNAライブラリーとし、同じ一連のセレクション工程を複数回繰り返す。cDNAディスプレイからビオチンを含む領域を切り離す手法としては、核酸リンカーの主鎖の5'末端側のビオチンを挟む近傍にあらかじめ設ける切断部位をリボグアノシンとしてRNA分解酵素で切断する方法（特許文献２、３、非特許文献２９）、デオキシイノシンを導入してDNA修復酵素Endo Vで切断する方法（特許文献５）、光切断部位を設けて光で切断する方法（特許文献６）など様々な改良方法が提案されている。ビオチンを利用しないmRNA−リンカー−タンパク質融合体の無細胞翻訳系からの精製方法として、主鎖とは別の光反応架橋剤（ソラレン）で繋がれたDNA鎖中に設けたポリA配列を利用したdT固定化ビーズによる精製方法（特許文献４、非特許文献３７）が提案されているが、dT固定化ビーズ上での逆転写によるcDNAタンパク質融合体合成は行われていない。このように、従来のピューロマイシンリンカーにおいては、無細胞翻訳系からのmRNAタンパク質融合体の精製工程及び逆転写工程を単一の固相上で効率よく行うためには、リンカー内に設けたビオチンと結合するSAビーズの利用は必須であると考えられていた。
【０００８】
これに対して、本発明者らは、以前からcDNAディスプレイ用のテンプレートDNAの設計に当たっては、タンパク質が終始コドンの最後まで翻訳されていることを担保するために遺伝子コード配列の下流にHis-タグ配列を設けることが一般的であり、あわせてセレクション工程に移行する前の最終的なcDNAディスプレイ（cDNAタンパク質融合体）の精製工程ではHis-タグ配列を利用した金属（Ni）アフィニティ精製が常套手段であることに着目した。そして、無細胞翻訳系からのmRNAタンパク質融合体を精製する段階から、逆転写及びcDNAタンパク質誘導体精製に至る全ての工程を単一の金属（Ni）ビーズ上で行うことができれば、インビトロセレクションの工程の簡略化及び時間短縮が図れると発想した。
しかしながら、His-タグによるアフィニティ精製は、His-タグ配列とビーズ（担体樹脂）表面の金属（Ni）との親和性を利用したものなので、特許文献４の段落［０００９］にも記載されるように、従来、無細胞翻訳系ではmRNAタンパク質融合体の合成量が少ないため、無細胞ライセートからの精製においては、類似するアミノ酸配列を有する夾雑タンパク質の除去が困難であるということが技術常識であった。
【０００９】
そこで本発明者らは、無細胞翻訳系での翻訳効率を高めるために、ピューロマイシンリンカーの設計を鋭意検討した。具体的には、ピューロマイシンを有する側鎖に通常設けられる柔軟なスペーサー配列と付け根部分との間の領域に、オリゴdAを設けることで、硬直なオリゴdAに支えられた柔軟なスペーサー配列を介してピューロマイシンをリボソームRNAのPサイト付近に適切に配置でき（図９ｄ）、翻訳効率が高まるのではないかと着想した。当該着想を確かめるために、長さを変えたオリゴdAを側鎖の付け根領域に設けたピューロマイシンリンカーを同一条件下の無細胞翻訳系に供した結果、十分な長さ（12dA以上）のオリゴdAを設けた場合には無細胞翻訳系であっても高い翻訳効率を達成できることが判明した。そして、無細胞翻訳系で得られたmRNAタンパク質融合体を金属（Ni）磁気性ビーズで精製したところ、高純度にmRNAタンパク質融合体を精製することができた。さらに、そのまま金属（Ni）ビーズ上で逆転写工程に移行することができ、cDNAタンパク質融合体を高純度で取得することに成功した。
また、無細胞翻訳系からの精製にSAビーズを用いないため、リンカー中にビオチンも、ビオチン除去のための切断部位も設ける必要がないことがライゲーション部位付近及びmRNAとのハイブリダイズ領域付近で反応の妨げとなるような立体的障害が除かれることに繋がった。このことがmRNAとのライゲーション効率を高めると共に、mRNAと核酸リンカーとの正確でコンパクトなコンフォメーションの構築に役立ち、結果的に無細胞翻訳系での翻訳効率をより高める要因となった可能性がある。また、本発明のライゲーション工程では、mRNAとリンカーとの反応がほぼ化学量論的に進むために、無細胞翻訳系中に過剰mRNAを存在させる必要が無いので精製が簡単となり、そのことも、His-タグ配列による親和性アフィニティによる精製を可能にする大きな要因となっている。
いずれにしても、ピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチドにおいて、ビオチンを組み込むことなく、側鎖の付け根領域にオリゴdAを設けたことで、ビオチンを含む配列の除去工程が省略でき、あわせてmRNAとの高い融合効率（図４ｃ）、翻訳効率の向上が図られた結果、驚くべきことに従来の常識を覆して、金属（Ni）ビーズによるmRNAタンパク質融合体の無細胞翻訳系からの高純度な精製が可能となった（図１０）。しかも、mRNAタンパク質融合体の精製、逆転写によるcDNAタンパク質融合体の形成、さらにはcDNAタンパク質融合体の精製までの一連の工程を全て単一担体上で行うことができるという、効率よいcDNAディスプレイ方法を提供することができた。
【００１０】
そして当該cDNAディスプレイ方法を用いたインビトロセレクションサイクルを既知の標的（免疫グロブリン、アセチルコリン結合タンパク質及びインターロイキン６受容体）に適用したモデル実験では１回のセレクションサイクルが８時間未満という短時間で行えることを実証し（図１１ａ）、さらに実際にVEGFを標的としたスリーフィンガーライブラリーを用いたインビトロセレクションの結果、抗VEGF抗体にも匹敵するほどのVEGF高親和性ペプチドを提供することができた（表４）。
また、ピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチドの合成方法についても、従来の架橋剤EMCSを用いる方法に変え、分岐デオキシシトシン（5-Me-dC）を用いた簡便な製造方法を提供することができた。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  標的mRNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な一本鎖DNAからなる主鎖と、ピューロマイシンを3'末端に有する側鎖とから構成される分岐した核酸リンカーであって、
前記側鎖は、他の一端にオリゴdA領域を有し、当該オリゴdAを介して前記一本鎖DNAポリヌクレオチド鎖中の修飾塩基と共有結合しており、かつ前記オリゴdA領域と前記ピューロマイシンとの間にはスペーサー領域が含まれており、
前記主鎖は、5'末端に前記mRNAとライゲーション可能な部位、及び当該部位に隣接して前記mRNAとハイブリダイズし得る領域を有し、かつ3'末端に前記mRNAが逆転写される際のプライマーとなるプライマー部位を有していることを特徴とする、核酸リンカー。
〔２〕  前記修飾塩基が5−メチルデオキシシトシン（5-Me-dC）であることを特徴とする、前記〔１〕に記載の核酸リンカー。
〔３〕  前記オリゴdAが、デオキシアデニン（dA）が少なくとも12連続した配列からなることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の核酸リンカー。
〔４〕  前記スペーサー配列が、Sp.18（Spacer 18 Phosphoramidite）を2〜8個含む配列からなることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の核酸リンカー。
〔５〕  前記〔１〕に記載の核酸リンカーの製造方法であって、
3'末端側から5'末端側に、ピューロマイシンが結合したタンパク質連結部位、スペーサー配列、オリゴdA配列、5-メチルデオキシシトシン（5-Me-dC）、標的mRNAとハイブリダイズし得る領域、及び前記mRNAとライゲーション可能な部位を含む１本鎖DNAの5-Me-dCと、前記mRNAが逆転写される際のプライマーとなるDNA配列の5'末端のリン酸基とを反応させて、共有結合させることを特徴とする、製造方法。
〔６〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸リンカーを介して、標的mRNAと、当該mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されているmRNA−タンパク質融合体。
〔７〕  前記mRNAが、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有していることを特徴とする、前記〔６〕に記載のmRNA−タンパク質融合体。
〔８〕  前記〔６〕又は〔７〕に記載のmRNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む方法；
（ａ）前記mRNAを標的とする前記〔１〕に記載の核酸リンカーを前記mRNAとアニールさせる工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のC末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程。
〔９〕  前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNA及び前記mRNAと相補的なcDNAからなるmRNA/cDNA複合体と、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されているmRNA/cDNA−タンパク質融合体。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNAと相補的なcDNA、及び前記mRNAによりコードされるタンパク質が連結されているcDNA−タンパク質融合体。
〔１２〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNA及び前記mRNAと相補的なcDNAからなるmRNA/cDNA複合体と、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されている、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｆ）を含む方法；
（ａ）前記核酸リンカーを標的mRNAとアニールさせる工程、
ここで、前記標的mRNAは、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有しているmRNAである工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のC末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｄ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｅ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）前記金属マトリックス表面のmRNA/cDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体を溶出する工程。
〔１３〕  前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕  前記金属マトリックスが、Ni被覆された磁気性ビーズであることを特徴とする、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸リンカーを含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体であって、前記核酸リンカーを介して、前記mRNAと相補的なcDNAと、前記mRNAによりコードされるタンパク質とが連結されている、精製cDNA−タンパク質融合体を製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｇ）を含む方法；
（ａ）前記核酸リンカーを標的mRNAとアニールさせる工程、
ここで、前記標的mRNAは、タンパク質をコードする配列の下流側にHis-タグをコードする配列を有しているmRNAである工程、
（ｂ）前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記mRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のC末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｄ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｅ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）mRNA/cDNA−タンパク質融合体にRNA分解酵素を作用させてmRNAを分解し、cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｇ）前記金属マトリックス表面のcDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製cDNA−タンパク質融合体を溶出する工程。
〔１６〕  前記工程（ｃ）において、前記mRNA−タンパク質融合体を作製する途中、もしくは作製後に、10分〜2時間高濃度塩の存在下で前記タンパク質を成熟させる工程を設けることを特徴とする、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕  前記金属マトリックスが、Ni被覆された磁気性ビーズであることを特徴とする、前記〔１５〕又は〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕  前記〔１０〕に記載のmRNA/cDNA−タンパク質融合体又は前記〔１１〕に記載のcDNA−タンパク質融合体を用いて、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAを選択する方法であって、下記の（ａ）〜（ｃ）及び（ｊ）の工程、もしくは（ａ）〜（ｊ）の工程を含む、方法；
（ａ）前記標的物質を固相表面に固定化させる工程、
（ｂ）前記mRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体を、固定化させた標的物質に接触させて、標的物質と結合するタンパク質を含むmRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体を選定する工程、
（ｃ）選定されたmRNA/cDNA−タンパク質融合体又はcDNA−タンパク質融合体からタンパク質をコードするcDNAを分離し、得られたcDNA断片をPCR増幅させる工程、
（ｄ）増幅させたcDNA断片を用いて翻訳反応促進に必要な配列及びHis-タグをコードする配列を含むテンプレートDNAを調製し、mRNAに転写して、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーとアニールさせ、前記mRNAの3'末端と前記核酸リンカーの5'末端とをライゲーションさせて、mRNA−核酸リンカーを製造する工程、
（ｅ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて工程（ｄ）のmRNAからタンパク質を合成し、かつ当該タンパク質のＣ末端を前記核酸リンカーにおけるピューロマイシンと結合させることにより、mRNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｆ）His-タグ配列と親和性のある金属マトリックスに前記mRNA−タンパク質融合体を結合させ、洗浄する工程、
（ｇ）前記金属マトリックス表面のmRNA−タンパク質融合体を逆転写反応に供し、mRNA/cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
または、さらにmRNA/cDNA−タンパク質融合体にRNA分解酵素を作用させてmRNAを分解し、cDNA−タンパク質融合体を作製する工程、
（ｈ）前記金属マトリックス表面のmRNA/cDNA−タンパク質融合体もしくはcDNA−タンパク質融合体を洗浄し、精製mRNA/cDNA−タンパク質融合体もしくは精製cDNA−タンパク質融合体を溶出させる工程、
（ｉ）前記工程（ｂ）以降を繰り返す工程、
（ｊ）前記工程（ｃ）で得られた増幅DNA断片、又は工程（ｂ）〜工程（ｉ）までを1回以上繰り返した後の工程（ｃ）で得られたDNA断片を、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAとして選択する工程。
〔１９〕  前記工程（ａ）において、標的物質を固定化に先立ちあらかじめビオチン化しておき、かつ固定化させる固相として、ストレプトアビジンを結合させた磁気性ビーズを用いることを特徴とする、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕  標的物質と親和性の高いタンパク質を同定、もしくは取得する方法であって、
前記〔１８〕又は〔１９〕に記載の方法で選択された、標的物質と親和性の高いタンパク質をコードするDNAを回収し、その塩基配列を決定する工程を含む方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチド（以下、「リンカー−Ｎ」と称する。）は、ビオチン分子及び当該分子を除去するための配列を含まず、ピューロマイシンを有する側鎖の付け根領域にオリゴdAを有している点を主な特徴としている。そのことにより、無細胞翻訳系であっても高い翻訳効率を達成でき、かつmRNAタンパク質融合体の精製から逆転写によるcDNAタンパク質融合体の形成、及びcDNAタンパク質融合体の精製までの一連の工程を、すべて単一の金属（Ni）担体表面で高純度に迅速かつ高収率で行うことができた。また、リンカー中にビオチン分子を設けないことで、ビオチン分子を含む領域の切断工程が省略できた利点と共に、ライゲーション付近の立体障害となる物質が取り除かれたことによるライゲーション反応の効率化及び転写反応の効率化という利点も併せ持つ。本発明のリンカー−Ｎを用いたcDNAディスプレイ法によるインビトロセレクションは、1サイクル6〜8時間で終了し、機能性ペプチド、例えば標的物質に対する結合性ペプチドを取得するための全ラウンドの所要時間も2週間以内に収まる（図１５）。
さらに、本発明では、分岐デオキシシトシン（5-Me-dC）を用いた効率的なピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチドの製造方法を開発した。ビオチン分子を有さないコンパクトなリンカー−Ｎに適用することで、きわめて簡便かつ安価に製造することができる。
本発明のcDNAディスプレイ法をハイスループット自動化システムと組み合わせることで、新規なリガンド及びリード分子の迅速な発見へ大きな寄与が期待できる。実験室規模のスループットのためには、マイクロチューブ／マイクロプレートを用いることで、多数サンプルの平行処理が可能であり、さらにハイスループットシステム（非特許文献３５、３６）と組み合わせることで、コンビナトリアル創薬への重要な支援ツールとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のリンカー−Ｎの構造、及びその製造方法。  （ａ）リンカー−Ｎが有する4つの機能特性；T4 RNAリガーゼによるライゲーションのためのライゲーション部位、合成されたタンパク質の共有結合のためのピューロマイシン部位、スペーサー配列及びオリゴdA部位、及び合成cDNAへの逆転写のためのプライミング部位。（ｂ）リンカー−Ｎの製造方法。図中Cは、5-Me-dCを示す。
【図２】（１）mRNAタンパク質融合体、及び（２）cDNAタンパク質融合体（cDNAディスプレイ）形成の概略図。
【図３】cDNAディスプレイに導入された遺伝子構築物。図中、SP6はSP6プロモーター及びキャップ部位、UTRはXenopusβ−グロビンの5'非翻訳領域、Spcはスペーサー配列を表し、Y-tag配列の3'末端にはさらにリンカーとハイブリダイズするための配列を含む。
【図４】PDO（3F, 6R14, BDA） mRNA及びリンカー−Ｎ（比率、1:1）とのライゲーション反応。  （ａ）PDO mRNAとリンカー−Ｎのライゲーション後のFITCの蛍光検出。図中、Ｍはサイズマーカーを表し、10min、20min、40minはそれぞれライゲーション反応時間を表す。（ｂ）同Sybr Goldによる全核酸成分の検出。（ｃ）3F、6R14及びBDA mRNAとリンカー−Ｎの10分間ライゲーション後の全核酸成分のSybr Green染色、図中左側の3Fは、サイズマーカーとして用いた3F-mRNA。
【図５】PDO（3F, 6R14, BDA） mRNA及びリンカー−Ｎとのライゲーション効率
【図６】リンカー−ＮにおけるオリゴdAの長さの検討。  （ａ）リンカー−Ｎ（18個のA残基）（ｂ）リンカー−Ｎ−１０Ａ（10個のA残基）（ｃ）リンカー−Ｎ−０Ａ（0個のA残基）。
【図７】ウサギ網状赤血球翻訳系におけるオリゴdAの長さの違いによるタンパク質融合体の形成能比較。（ａ）電気泳動分析（Fluorescein蛍光画像）。（ｂ）融合割合（％）比較。
【図８】小麦胚芽抽出液翻訳系におけるオリゴdAの長さの違いによるタンパク質融合体の形成能比較。  （ａ）リンカー−Ｎを用いた場合のタンパク質融合体の形成能に及ぼす高濃度塩存在下での成熟効果。図中、０；10分間翻訳後サンプリング、１；高濃度の塩非存在下1時間成熟化、２；高濃度の塩存在下30分成熟化、３；高濃度の塩存在下1時間成熟化した画分を示す。（ｂ）リンカー−Ｎ−１０Ａ及びリンカー−Ｎ−０Ａを用いた場合のタンパク質融合体の形成能。（ｃ）融合割合（％）比較。
【図９】リンカー内のオリゴdAの存在の効果を示す概念図。  （ａ）リボソームのサイズ。（ｂ）オリゴdAが無い場合（リンカー−Ｎ−０Ａ）。（ｃ）オリゴdAがある場合（リンカー−Ｎ）。（ｄ）タンパク質合成後の溶液内のリボソームの位置の変化に対応し、リンカー−Ｎ内のオリゴdAの「幹」構造が、スペーサーの柔構造の可動域を増大させる効果を示す模式図。
【図１０】cDNAタンパク質融合体のHis-タグを利用した精製。図中、F.T.は通過画分、E1は溶出液1、E2は溶出液2をそれぞれ示し、PDOは逆転写反応していないmRNAタンパク質（PDO）融合体に対応する。mRNAタンパク質融合体はcDNAタンパク質融合体よりも泳動が遅い。そのためPDOのレーンは、濃度比較のために下方にずらして表示している。
【図１１】リンカー−Ｎを用いたcDNAディスプレイ及びそのインビトロセレクションのハイスループットに関する証明。（ａ）小麦胚芽ライセートを用いたcDNAディスプレイを機能させるために必須な工程とその所要時間を示す概略図。テンプレートDNAをmRNAに転写してこれを精製して定量する工程（〜1.5時間）。mRNAをリンカー−Ｎにライゲートする工程（0.2時間）。小麦胚芽ライセート系で翻訳し、高濃度塩の条件下で成熟してディスプレイタンパク質（mRNAタンパク質融合体）とする工程（〜1時間）。Ni-NTA磁性ビーズ上で、mRNAタンパク質融合体を精製し、逆転写を行い、かつcDNAタンパク質融合体の精製を行った後に溶出する工程（0.5時間）。ストレプトアビジン（ＳＡ）マトリックス上に固定化されている標的タンパク質に対しセレクション後、溶出させ、標的タンパク質に対応するDNAを増幅する工程（〜2時間）。PCR増幅物の分析工程（〜1時間）。全工程は6〜8時間で完了できる。（ｂ）PDO及び3F、6R14、BDAのディスプレイタンパク質を用いたインビトロセレクション。非結合性のPDOと結合性のBDAあるいは3Fあるいは6R14の20:1混合物を、(1)BDAに結合するIgG、(2)3Fに結合するAChBP、及び(3)6R14に結合するIL6Rを結合させたSAビーズを用いたセレクション画分をPCR後、電気泳動。（ｃ）（ｂ）で得られたセレクション画分それぞれの、セレクション前後の比率の変化からセレクション効率を「フォールドエンリッチメント数」として表した。
【図１２】8-merペプチドライブラリーからのFLAG-タグ配列セレクション。  （ａ）8-merペプチドライブラリー調製用のDNA構築物。（ｂ）セレクションサイクル。0.1％のFLAG-タグ配列を含む8-merペプチドライブラリー複合混合物を転写のセレクションサイクルプロセスに付し、リンカー−Ｎにライゲーションし、WGE中で翻訳してmRNA融合タンパク質を合成し、His-タグを用いて固相上で、精製し、逆転写してcDNA融合タンパク質を合成後精製し、抗−FLAG M2抗体マトリックス上でセレクションして、PCR増幅する。増幅産物を更に同一プロセスを2サイクル行い、クローニング及び配列決定する。（ｃ）3回のセレクションサイクルの後のPCR増幅産物中のFLAG-タグ配列の比率。比較として示した「puro-Linker」では、同一の複合混合物を非特許文献１３のセレクション手順に適用して、3回セレクションを行った。
【図１３】スリーフィンガー（3F）の構造及び3Fライブラリーの遺伝子構築物。
【図１４】VEGFを標的とする3Fライブラリーを用いたVEGF親和性タンパク質のインビトロセレクションの7ラウンド後のcDNAタンパク質融合体（R7）の結合アッセイ。  （ａ）(1)R7の1/3画分をストレプトアビジンビーズ（SA）に、(2) R7の1/3画分をVEGF固定化ビーズに、(3)R7 cDNA（R7を翻訳せずに逆転写したもの）をVEGF固定化ビーズに、及び(4) R7の1/3画分をFc固定化ビーズに結合させた後、溶出した画分をPCR増幅してゲル電気泳動で分析した。（ｂ）(1)、(2)及び(4)の結合工程の後のそれぞれの溶出画分にELISAを適用してビーズへの結合性を450nm波長吸収量で検出した。
【図１５】短期化を可能にする新規リンカーによる進化工学プロセス  創薬のリード化合物を見いだすための全自動化ハイスループットシステムが、1ラウンド約8時間であり、8〜10ラウンドで行っても約2週間でリード化合物を得ることができることを示している。
【図１６】VEGF結合性ペプチドの推定立体構造図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．リンカー−Ｎについて
（１−１）リンカー−Ｎの構造
本発明のリンカー−Ｎは以下の様に構成される。通常のＴ字型ピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチドの場合と同様に、水平方向のDNA鎖を主鎖、垂直方向のピューロマイシンを有するDNA鎖を側鎖と称すると、主鎖の5'末端側から、mRNAとの「ライゲーション部位」及びmRNAとの「ハイブリダイゼーション領域」及び逆転写のための「プライマー部位」で構成され、側鎖は、付け根部分から、「オリゴdA」、「スペーサー配列」及びピューロマイシンとで構成され、リンカー内にはビオチン分子は含まれない。典型的な配列を図１ａとして示すが、上記各部の塩基配列を限定するものではない。
ここで、本発明のリンカー−Ｎの「ライゲーション部位」付近にはビオチン分子がなく、ビオチン分子をリンカーから除去するための部位も不要なため、直接mRNAとの「ハイブリダイゼーション部位」と共有結合しており、好ましくは、T4 RNAリガーゼによるライゲーション可能な認識配列、たとえば、「CCC」で構成される。「ハイブリダイゼーション部位」は、GC配列を用いて、mRNAと安定にハイブリダイズできる十分な長さと、合成のしやすさなどを考慮して適宜設計される。例えば、10〜50mer、好ましくは12〜30mer、より好ましくは15〜20merである。
側鎖の「スペーサー配列」は、下記（１−２）で述べるように、柔軟な構造を有しており、かつ「オリゴdA」と共に、ピューロマイシンをリボソーム内のPサイト付近に配置するために十分な長さを有するように、適宜設計できる。化学式「PO4(CH2CH2O)5CH2CH2PO4」で表される「Sp.18（Spacer 18 Phosphoramidite）」分子が柔軟性があり立体障害性が低いので好ましく用いられており、本発明では、2〜8個連結させる。好ましくは3〜6個、より好ましくは4〜5個連結する。また、スペーサー配列の途中に、FITC、Fluorescein-dTなどの分子標識用蛍光化合物を結合しておくことが好ましい。典型的な分子標識用蛍光化合物のFluorescein-dTも好ましいが、バッファーを含む環境によって容易に影響を受けないAlexaなどが、より好ましく用いられる。FITCを用いた場合を例として示すと、「(Sp.18×1〜4)(T-FITC)(Sp.18×1〜4)」、好ましくは「(Sp.18×1)(T-FITC)(Sp.18×3)」などの配列を用いることができる。
「スペーサー配列」と「オリゴdA」をあわせた側鎖のピューロマイシンまでの距離は、下記の（１−２）で考察するように、8nm以上、好ましくは10〜20nm、より好ましくは12〜14nmである。
【００１５】
（１−２）オリゴdAについて
本発明では、リンカー−Ｎにおける「オリゴdA」の長さはdA（デオキシアデニン）の個数12以上、好ましくは15〜25、より好ましくは17〜20であり、そのリンカー中の位置は、ピューロマイシンから離れた位置で分岐点付近に設けることが好ましい。そのことにより、（１−３）で示すように無細胞翻訳系での翻訳効果が極めて大きくなる。その点を考察したイメージ図を図９に示した。ピューロマイシンへのタンパク質の結合はリボソームAのPサイトで起こるとされているが、図９ｃにあるように、真核細胞のリボソームRNAのサイズが、高さ25〜30nm（小麦胚芽については、29.4nm）、幅27〜31nmといわれている（非特許文献３２、３３）ので、リボソームRNAに挟み込まれたmRNAとリボソーム内のPサイトまでの距離は約15〜20nmと考えられる。
実施例３では、オリゴdAの長さを変えて、RRL（ウサギ網状赤血球ライセート）及びWGE（小麦胚芽抽出液）を用いた翻訳実験を行っているが、その結果はリンカー中にオリゴdAを設けることがmRNA−タンパク質融合体の生産効率を上げるために重要であることを示している。上記実施例（３−１，２）で用いた「リンカー−Ｎ−０Ａ（0A）」はオリゴdAが欠けているので、非特許文献１３に記載の「puro−リンカー」及び非特許文献２７、３１に記載の「SBPリンカー」と類似した側鎖長を有している。「リンカー−Ｎ−０Ａ」はいずれのライセート中でもタンパク質融合体の生成量は本発明の「リンカー−Ｎ」の場合の20〜30％に留まっているが、この翻訳効率は、非特許文献３１に記載の結果と矛盾しない。
【００１６】
（１−３）リンカー−Ｎの合成法
本発明のリンカー−Ｎの合成法としては、従来の一般的なピューロマイシン−リンカーオリゴヌクレオチドと同様に、主鎖に対して側鎖を既知の手法で結合することもできる。例えば、ピューロマイシン−リンカーオリゴヌクレオチド主鎖の分岐位置にAmino-Modifier C6 dTを設けておき、一方の側鎖の5'末端に設けた5'Tiol-Modifier C6、と架橋剤EMCS（N-（6-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）を用いて結合する方法を適用することができる（例えば、特許文献３など）。
しかし、本発明において開発された、分岐デオキシシチジンの5-Me-dC（5'-ジメトキシトリチル-N4-(O-レブリニル-6-オキシヘキシル)-5-メチル-2'-デオキシシチジン）を用いる下記の合成方法を用いてプライマー配列を一本鎖のピューロマイシンオリゴヌクレオチド中に組み込まれた5-Me-dCを結合させることが好ましい。
具体的には、5'-ライゲーション部位／ハイブリダイゼーション領域とピューロマイシン−オリゴdA含有スペーサー配列とが5-Me-dCで連結された一本鎖のピューロマイシンオリゴヌクレオチド、例えば図１（ｂ）に記載の「5'-CCCCCCCGCCGCCCCCCG (5-Me-dC) A18 (Spec18) (Spec18) (Spec18) (F-dT) (Spec18) CC (Puro) -3'」をDNAシンセサイザーなどで合成する。ここで、(F-dT)は(T-FITC)を表す。5-Me-dCのレブリニル保護基を除去後、プライマー配列、例えば「5'-CCTTG-3'」を5-Me-dCに繋ぐことで、簡単に本発明のリンカー−Ｎを製造することができる。「リンカー−Ｎ」が生成できたことは、TOF-MSでもゲル電気泳動でも確認できる。
この合成方法は、架橋剤を用いないため、プライマー配列を繋ぐ一本鎖のピューロマイシンオリゴヌクレオチドを作製する工程は、DNAシンセサイザーを用いることができ、委託合成する場合も安価に行える。そして、本発明のリンカー−Ｎの最終的な収量は、架橋剤を用いる工程を手動で行わざるを得ない従来のピューロマイシンオリゴヌクレオチドリンカーと比較して８倍以上高かった（表１）。時間的にもコスト的にも大幅に減少し、下流のプロセスの再現性を大きく高めることができる。
【００１７】
【表１】
0006478392.tif 000002
【００１８】
２．mRNA−リンカー−Ｎ連結体
（２−１）mRNAライブラリーの調製
本発明のリンカー−Ｎと連結させるmRNAは、mRNAライブラリーの場合を含むが、いずれも通常、調製されたテンプレートとなるDNA又はDNAライブラリーを転写して用いる。
テンプレートDNAとしては、遺伝子をコードする配列の他に、翻訳反応促進に必要な配列及びHis-タグ配列、さらにその他の配列が含まれており、最も3'末端側にはリンカー−Ｎの主鎖に相当するプライマー部位及びハイブリダイゼーション領域に相補的な塩基配列が含まれる（図３）。
遺伝子をコードする配列としては、例えば、分子進化させようとする配列既知の各種機能タンパク質、例えば受容体、イオンチャネル、酵素、抗体、生理活性ペプチド、又はそれらの断片をコードするDNA、または、配列既知の各種構造タンパク質、例えばアクチン、ミオシン、コラーゲン、又はそれらの断片をコードするDNA、または、各種遺伝子ライブラリー、もしくは有機合成、PCR法などによりランダム化された配列を含む各種遺伝子ライブラリー等を挙げることができる。特に、ハイスループットスクリーニング系ポリペプチドライブラリーとして開発された、スリーフィンガー様スキャフォールド(3F)を有し、ループ１〜３領域がランダム化された3FポリペプチドライブラリーをコードするDNA（特許文献７）、又はICKスキャフォールドを有し、ループ１〜３及びテール領域がランダム化されたICKポリペプチドライブラリーをコードするDNA（特許文献８）を用いることが好ましい。なお、ハイスループットスクリーニング系のポリペプチドライブラリーについては、典型的な「3Fペプチドライブラリー」を例として、下記（５−１）で詳細に説明する。
また、cDNAディスプレイ法によるインビトロセレクションに適用する場合は、セレクション工程で得られたPCR増幅物を用いて、このテンプレートDNAが調製される。
【００１９】
遺伝子をコードするmRNAの5'末端には7-メチル化グアノシンキャップ構造、3'末端にはポリA尾部構造を有していることがタンパク質合成効率を高めるために好ましく、翻訳の開始を促進するKozak配列や小麦胚芽ライセート系での翻訳促進効果が知られているオメガ配列（タバコモザイクウィルスの5'非翻訳領域配列）を有することが、さらに好ましい。特に、本発明の実施例でも用いた「SP6（SP6プロモーター及びキャップ部位）、UTR（Xenopus β−グロビンの5'非翻訳領域）、及びKozak配列」を5'末端に設けることが好ましい（図３）。
本発明で用いるmRNAの全長は、リンカーとのライゲーション効率及び無細胞翻訳系での翻訳効率の面から50〜3,000塩基であることが好ましく、200〜1,000塩基であることがさらに好ましい。
【００２０】
（２−２）mRNAとリンカーとの連結方法
mRNAとリンカーとの連結は、公知の手法によりハイブリダイゼーションによるアニーリングの後にライゲーションによる連結を行わせる。ライゲーション反応は、RNA/DNA間ライゲーションを行うRNAリガーゼ又はDNAリガーゼを利用することもできる。例えば、T4 RNAリガーゼ又はTS2126耐熱性ファージ由来DNAリガーゼが好ましく、特にT4 RNAリガーゼが好ましい。
【００２１】
本発明のアニーリング反応及びライゲーション反応のための反応液の組成は、既知の反応液の組成（例えば特許文献３など）を適用することができる。例えば、10〜250 mMのTris-塩酸（pH 7.0〜8.0）; 2.0〜50 mMの塩化マグネシウム; 2.0〜50 mMのジチオスレイトール（DTT）; 0.2〜5.0のmM ATPを含んでおり、アニーリング反応終了後に0.1〜2.5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ及び0.4〜5 U/μlのT4 RNAリガーゼが投入されて、ライゲーション反応を開始させる。
本発明のアニーリング反応条件及びライゲーション反応条件についても、既知の方法が適用できるが、本発明のリンカー−Ｎのライゲーション部位付近には反応時の立体障害となるビオチン分子もビオチン分子を取り除くための配列などがないため、極めて効率的に反応が進むので、通常の反応時間を大幅に短縮することができる。
具体的には、一般的なアニーリング反応は、60〜100℃にて2〜60分間、アルミブロックなど加温用器具にて温めた後、スイッチを切って2〜60分間放置して反応液温を穏やかに低下させ、さらに-5〜10℃に冷却する。ライゲーション反応は、20〜30℃で5〜180分間とする。
本発明ではこのような一般的な方法を、時間を短縮して適用できる。本発明の実施の態様では、アニーリング工程では、85〜94℃にて30秒〜1分間加熱後、-0.1℃/secのプログラムで10分間かけて25℃まで徐冷し、ライゲーション工程では、25℃で10分間行った。
ライゲーション反応を行う反応系の体積は、反応効率の点から20〜40μlとすることが好ましい。
また、反応系中でのRNAとリンカーとの量比は、リンカー10〜20 pmolに対し1/3〜6倍量のmRNAを反応させることができ、好ましくは、リンカー10 pmolに対し10〜15 pmolのmRNAを反応させる。本発明では、ライゲーション効率が極めて高く、ほぼ化学量論的に反応が進むので、mRNAを過剰に存在させておく必要がない。したがって、精製時の余剰mRNAを少なくするために、本発明では、mRNAとリンカー−Ｎとを等モルで反応させることが最も好ましい。
【００２２】
（２−３）本発明のリンカー−Ｎ及びmRNAとのライゲーション効率
本発明のライゲーションの効率及びライゲーション時間を、モデルタンパク質をコードするmRNAを用いて検証した。モデルタンパク質としては、非特許文献２０〜２２に記載されているPDO、Oct-1のPou-結合ドメイン；BDA、プロテインAのBドメイン；3F、スリーフィンガー；及び6R14、インターロイキン6受容体のスリーフィンガー型リガンドを用いた。大きさの異なるこれらのmRNAからのmRNA構築物（図３）をリンカー−Ｎ（図１）と等モル比で反応させたところ、10分以内に急速にライゲートして90〜95％の効率に達したことが分かった（図４ａ〜ｃ）。反応時間を20分間もしくは40分間と長くしてもライゲーション効率は有意に増大しない。ここで、mRNA−リンカー複合体の形成は、RNaseHによるmRNAの消化によって確認された（図４ａ、ｂの「10 min + RNaseH」のレーン）。
リンカー−Ｎは、「puro−リンカー（非特許文献１３、２２など）」のような「ビオチンループ」などの複雑な二次構造を形成しておらず、完全に整列したハイブリダイゼーション領域及び単純化されたライゲーション部位を有している。このことにより、アニーリング反応も速やかに終了し安定化され、ライゲーション時間の短縮化及び高いライゲーション効率が達成できたと考えられる。
【００２３】
下記（表２）には、リンカー−Ｎ（本発明）と従来法の各種のピューロマイシン リンカー−オリゴヌクレオチドとのライゲーションの時間及び効率並びに翻訳効率に関して比較したデータを記載した。すなわち、各リンカーのライゲーション戦略は、スプリントライゲーション法（非特許文献１０、１２、１４）、ソラレン架橋法（非特許文献２４）及びY-ライゲーション法などと呼ばれる方法である（非特許文献１３、１９、２２）。非特許文献１２、１４のmRNAディスプレイで用いられたスプリントライゲーション法は、ライゲーション反応が遅く、ライゲーション効率も低く、さらに未使用のmRNAからのゲル精製にも時間がかかる。非特許文献２４のmRNAディスプレイで用いられたソラレン光架橋法は極めて効率的（mRNA：リンカーに対して1:2のモル比で実施した）で速いが、UV照射がmRNAに損傷を与える可能性があり、また過剰なリンカーの除去工程が必要となる。非特許文献１３、２２及び２５に記載のcDNAディスプレイまたはmRNAディスプレイで用いられたT4 RNAリガーゼの酵素作用によるY-ライゲーションも非常に効率的であるが、ライゲーションの時間及びmRNAとリンカーとの化学量論が多様に報告されている。
なお、（表２）において、ライゲーション効率、翻訳効率だけを比較すると、mRNAディスプレイ用のピューロマイシンリンカーには効率も高いものもあり、かつ精製工程が少なくとも1工程少ないというメリットはあるものの、mRNAディスプレイの場合は、cDNA融合体（cDNAディスプレイ）を形成させた場合と比較して、mRNA自身の分解しやすさ及び二次構造の形成しやすさのため、特にライブラリーのセレクション実験に適用しにくいなどの大きな制約がある（非特許文献１２〜１４、２６）。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
３．mRNAタンパク質融合体の調製
本発明のmRNA−リンカー−Ｎ連結体を無細胞翻訳系と接触させることによって、そのリボソームA内でタンパク質の合成を行うと同時に、ピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質とmRNA−リンカー−Ｎ連結体を融合させ、mRNA−リンカー−Ｎ−タンパク質融合体（以下、mRNAタンパク質融合体ともいう。）を構築する。
本発明で用いることのできる無細胞翻訳系としては、既知のウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物の他、大腸菌、昆虫細胞などを使用することができる。好ましくは、ウサギ網状赤血球及び小麦胚芽抽出物であり、小麦胚芽抽出物が最も好ましい。翻訳効率を高めるために、選択した翻訳系の由来生物種にあわせて、テンプレートDNAを、当該生物種に利用されやすい優先コドンに変更しておくことも有効である。
以下、典型的な小麦胚芽抽出物（WGE）及びウサギ網状赤血球ライセート（RRL）を用いる場合について詳しく説明するが、他の無細胞翻訳系の場合もこれら方法に準じた既知の方法で実施できる。
【００２６】
（３−１）小麦胚芽抽出物（WGE）の場合
前記無細胞翻訳系として小麦胚芽ライセートを利用する場合は、胚乳部分を除いた小麦から胚芽抽出液のS30画分として既知の方法で調製することができるが、すでにPromega社（Madison, WI, USA）などからキットとして市販されている。
WGE内での翻訳反応は、20〜40℃で10〜40分間行う。本発明のリンカー−Ｎを用いた翻訳及び融合効率は極めて高いため、反応時間は25℃10分でも十分であるが、25〜30℃で10〜20分間行うことが好ましい（図４）。
さらに翻訳反応後に高塩濃度条件下での成熟工程を設けることが有効である。具体的には、翻訳反応後、反応系に塩化カリウム及び塩化マグネシウムを添加して高塩濃度条件下とし、そのままの温度、例えば25〜30℃で10分〜2時間、好ましくは30分〜1時間放置する。その間、mRNA−リンカー−Ｎ連結体とタンパク質との融合を完成させると共に、タンパク質の立体構造を正確に配置させることができると考えられる。その際、塩化カリウムを終濃度500〜1,000mM、塩化マグネシウムを終濃度50〜100mMの存在下で行うのが好ましい。例えば、65mMのMgCl2及び750mMのKClを添加して25℃で10分〜1時間成熟させる（図８ａレーン３）。
【００２７】
（３−２）ウサギ網状赤血球ライセート（RRL）の場合
前記無細胞翻訳系としてウサギの血液から得られた網状赤血球細胞のライセートを利用する場合は、ウサギに予めアセチルフェニルヒドラジンを投与して溶血性貧血等を誘導し、数日間飼育後採血することが好ましく、さらに、マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、EGTAによりカルシウムをキレートしてヌクレアーゼを不活化処理することがより好ましい。このようなウサギ網状赤血球ライセートは「IVTキット（Ambion, Austin, TX, USA）」などとして市販されており、本発明の実施例でも当該キットを用いている。
RRLを用いる場合は、「IVTキット」などの使用説明書などの記載に従えば良く、例えば、本発明のmRNA−リンカー−Ｎ連結体を、RRLを含む反応バッファー（例えば、最終濃度：80 mMの酢酸カリウム；0.5 mMの酢酸マグネシウム；10 mMのクレアチンリン酸；各0.05 mMのアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025 mM）内で、20〜40℃で10〜40分間反応させる。必要に応じて、この反応液に、SUPERase RNase inhibitor（Ambion社）などのRNA分解酵素阻害剤を添加してもよい。
また、翻訳後にWGEの場合と同様に高塩濃度条件下での成熟工程を設けることが好ましい。
例えば、翻訳反応を30℃で10分間行った後、37℃で2時間65mMのMgCl2及び750mMのKClの存在下で成熟させる。
【００２８】
（３−３）本発明のmRNA−タンパク質融合体生成率
本発明のmRNA−リンカー−Ｎと翻訳された4種類のモデルタンパク質（PDO, BDA, 3F及び6R14）との融合体の生成率を、以下の式によって計算し、RRLの場合を（図７ｂ）に、WGEの場合を（図８ｃ）に図示した（なお、前記（１−２）で述べたように、それぞれリンカー中のオリゴdAの長さを変えた場合も測定している。）。
融合体形成％＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００
（ここで、ＡはmRNA−タンパク質融合体のSDS-PAGEでのバンド強度、Ｂは反応しなかったmRNA−リンカーのバンド強度である。）
WGEを翻訳系として選択した場合（図８ｃ）と、RRLを翻訳系として用いた場合（図７ｂ）とのそれぞれのタンパク質融合体形成％を比較してみると、リンカー−Ｎを用いた際の値がRRLでは50〜65％であるのに対して、WGEでは90〜95％という極めて高い値を示している。BODタンパク質融合体で示された95％という形成％は、従来のピューロマイシンリンカーを用いた場合（表２）と比較しても群を抜いて高い値である。
【００２９】
ところで、前記（表２）に示されるように、従来のピューロマイシンリンカーを用いた場合（非特許文献１３、２２、２５）も、無細胞翻訳系としてWGEを用いた場合の方がRRLの場合よりもタンパク質融合体形成効率が1.5〜7倍程度高い。
これらの結果は、WGE翻訳系でのリボソームの数が1ml（4μM）あたり、2.5×1015個であるのに対して、RRL翻訳系でのリボソーム数は1ml（0.2μM）あたり、1.2×1014個であるという1オーダー以上もの差異を示すことに起因する、という従来からの説明（非特許文献８、２８〜３０）とも一致している。
リボソームとmRNA−リンカーの比率で考えると、RRLの場合は、1:1〜2:1（0.1〜0.2μMのリボソーム及び0.1μMのmRNA−リンカー）であるのに対して、WGEの場合は、この比が約40:1となる。
これらのことから、本発明のcDNAディスプレイ技術を用いたハイスループットなスクリーニングの系に適用する翻訳系としては、高い融合体生成効率を示すWGE翻訳系を用いることが好ましい。
【００３０】
また、前記（１−２）で考察したように、（図７ｂ）、（図８ｃ）において、各タンパク質ごとに用いたリンカー内のオリゴdAの長さに注目してみると、両翻訳系の全タンパク質において、オリゴdAの長さが最も長い場合が最大値を示しており、本発明のmRNA−リンカー−Ｎにおけるこのような高い融合体形成能がリンカー−Ｎ中の長いオリゴdA領域に起因することを裏付けている。
【００３１】
４．mRNAタンパク質融合体の精製／cDNA−リンカー−Ｎ−タンパク質融合体（以下、cDNAタンパク質融合体という。）の作製と精製
（４−１）金属（Ni）ビーズ
本発明のmRNAタンパク質融合体の精製、逆転写反応によるcDNAタンパク質融合体の作製、及び得られたcDNAタンパク質融合体の精製は、全て同一の金属担体又は金属被覆担体が用いられる。金属としては、His-タグ配列との親和性のある金属、例えばNi又はCoが好ましい。担体は各種の形状のものを用いることができるがセレクション工程での取扱い易さからビーズ上が好ましく、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等が好ましく、Niなどの金属を蒸着させて用いることが好ましい。Ni磁性ビーズは、Ni-NTA磁性ビーズ（Qiagen社）などとして市販されている。なお、His-タグ配列というとき、通常はヒスチジン(His)が６個連続する配列（His×6）を指すが、連続するヒスチジン数は、5〜10個、好ましくは6〜8個でも良い。
【００３２】
（４−２）mRNAタンパク質融合体の精製
従来、難しいとされていた無細胞翻訳系からのHis-タグ配列を利用したmRNAタンパク質融合体の精製も、Ni-NTA磁性ビーズなどの金属ビーズを用いて簡単に行える。
具体的には、無細胞翻訳系の反応溶液中に25℃〜30℃の状態で直接Ni-NTA磁性ビーズを、mRNAタンパク質融合体の10〜20pmolに対して600〜1500pmolの吸着容量となる程度投入し、25℃10分間放置してHis-タグを介した結合を生じさせた後、Wash Buffer（WB: 50 mM Na phosphate buffer pH8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole）で3回、続いてPBS緩衝液で１回洗浄する。
【００３３】
（４−３）逆転写工程
洗浄後のNi-NTA磁性ビーズを、そのまま逆転写反応に供する。
具体的には、Ni-NTA磁性ビーズを逆転写酵素反応液、例えば50 mM Tris/HCl pH8.0, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.5 mM dNTPの溶液に懸濁し、逆転写酵素、例えばM-MLVリバーストランスクリプターゼ（タカラ社）を50〜100U添加して、40〜50℃で5〜20分間反応させて、mRNA/cDNAタンパク質融合体を生成させる。反応は、10〜0℃まで急冷することにより停止させる。
【００３４】
（４−４）cDNAタンパク質融合体の精製、溶出
得られたmRNA/cDNAタンパク質融合体をそのまま精製し、cDNAディスプレイとして用いることができ、本発明の実施例では、mRNAを分解せずに、mRNA/cDNAタンパク質融合体のまま用いているが、mRNA/cDNAを形成しているmRNAの分解能を有するRNaseHを用いて、一本鎖cDNAを有するcDNAタンパク質融合体を作製し、続く実験工程に供する選択も可能である。
一般にcDNAディスプレイというときは、mRNA/cDNAタンパク質融合体及びcDNAタンパク質融合体のいずれの場合も指すので、本発明においても両者を区別せずに、cDNAタンパク質融合体という。
【００３５】
cDNAタンパク質融合体を作る場合は、具体的には、例えば、mRNA/cDNAタンパク質融合体を含むNi-NTA磁性ビーズに対してRNaseH（Ambion, Austin, TX, USA）を37℃で30分間反応させてcDNAと相補しているmRNAを分解する。
次いで、金属（Ni）表面のcDNAタンパク質融合体（mRNA/cDNAタンパク質融合体）を緩衝液(例えばWBなど)で洗浄後、イミダゾール含有溶液により溶出する。例えば、Ni-NTA磁性ビーズを、25〜30℃でWBにより3回洗浄した後、250mMのイミダゾールを含有した溶出液（EB：50 mM Na phosphate buffer pH8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole）を用いて25℃で5分間静置後、溶出する。この溶出は、１回〜数回、好ましくは2回行う。溶出液中にはcDNAタンパク質融合体が高純度で精製されている（収率約60％、図１０）。
得られたcDNAタンパク質融合体は、cDNAディスプレイ法に適用し、進化工学的なスクリーニングに供する。その際、cDNAタンパク質融合体を、cDNAディスプレイと呼ぶことがある。
【００３６】
（４−５）本発明の１工程精製のメリットについて
cDNAディスプレイ法の場合、従来から考察されているように、mRNA分解及びmRNAの二次構造の形成（特にライブラリーをセレクションに用いるときに）を低減するために有益である（非特許文献１２〜１４、２６）が、逆転写工程に先立つmRNAタンパク質融合体の無細胞翻訳系ライセートからの精製工程に加え、cDNAタンパク質融合体の精製工程が必須であり、そのことによる収率の減少は免れない。従来のcDNAディスプレイ法の場合は、それぞれの精製に少なくとも２工程要していた。また、mRNAディスプレイの場合でも、無細胞翻訳系ライセートからの分離、リボソーム（終止コドンの非存在による）の除去のための精製工程、及び全長翻訳できずに中途で終始してしまった翻訳物から全長タンパク質を単離するためにC-末端タグを用いた精製工程として、２工程の精製工程を設けることが一般的であり、このような複数の精製工程をとる場合は、最終的収率が0.2〜6.5％となる場合がある（非特許文献１３、１６）。
本発明の大きなメリットの１つは、無細胞翻訳系ライセートから、逆転写及びmRNAの分解を経たcDNAタンパク質融合体の精製を、His-タグを利用した穏やかなアフィニティ精製の１工程のみで行うことができる点であり、cDNAタンパク質融合体を20分未満という短時間でライセートから約60〜80％まで単離できた（図１０）。
前記（表２）にあるように、mRNAタンパク質融合体の形成からから始まりcDNAディスプレイのための精製cDNAタンパク質融合体を得るまでの全工程を考慮すると、本発明の方法は、非特許文献１３、２２及び２７で報告された方法よりもcDNAタンパク質融合体の収量が約60〜300倍多い（表２）。このように、cDNAタンパク質融合体の収率が高いということは、各種ライブラリーに適用した場合、得られる変異タンパク質の多様性に直接影響するので（非特許文献２８、３４）、本発明のcDNAディスプレイ法は機能性タンパク質／ペプチドのインビトロセレクションにとって、きわめて有用であることを示している。さらに、上述の精製工程の省略化、時間の短縮化と共に、磁性マトリックスが利用可能であることも、ハイスループットプラットフォームに適した特性を示している。
【００３７】
５．本発明のcDNAディスプレイ法を用いたインビトロセレクション
（５−１）ランダムポリペプチドライブラリーの調製方法
本発明の別の態様であるcDNAディスプレイ法は、標的物質への相互作用の高いタンパク質を効率的にスクリーニングする方法、特にランダムペプチドライブラリーを用いて作製したcDNAディスプレイを標的物質への相互作用の強さでスクリーニングし、進化工学的に相互作用の強さの高まった、例えば高親和性タンパク質をハイスループットスクリーニングする方法を提供するものである。
ここで、「ランダムポリペプチドライブラリー」としては、前記（２−１）で示した一部にランダム化領域を有する安定なスキャフォールド形成性のポリペプチドライブラリーが好適に使用できる。特に、ハイスループットスクリーニング系ポリペプチドライブラリーとして開発された、スリーフィンガー様スキャフォールド(3F)ペプチドライブラリー（特許文献７）、又はICKスキャフォールドを有するICKポリペプチドライブラリー（特許文献８）が好ましい。
【００３８】
以下、典型的なハイスループットスクリーニング系ポリペプチドライブラリーである、スリーフィンガー様スキャフォールド(3F)ペプチドライブラリーを例として、具体的に説明する。
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）とは、（特許文献７、非特許文献２２）に記載されている通り、ヘビ毒由来のα型神経毒（α-neurotoxin）のいくつかに共通して見いだされる60〜70個アミノ酸という小さいサイズの構造であり、4〜5個のジスルフィド結合、3〜5個のアンチパラレルβシート及びスリーフィンガー構造を形成する３つの突起ループを含む構造をいう。極めて安定性が高い。特に熱安定性が高く60〜70℃にも耐えられる（Biochemistry. 2000 Aug 1;39(30):8705-10）。また、サイズが小さいことから、抗原として認識されにくく、プロテアーゼ分解も受けにくいと考えられるので、血清中での半減期が長いことが予測される。
本発明で、「3Fペプチドライブラリー」、又は「3Fランダムペプチドライブラリー」というとき、（特許文献７、非特許文献２２）において構築された、スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のループI、ループII及びループIIIの特定の領域のアミノ酸を同時にランダム化したランダムペプチドライブラリーを指す。典型的には、コンビナトリアルライブラリーとして用いることが可能なように、3Fペプチドライブラリーを構成する各ペプチドが、それぞれのペプチドをコードするポリヌクレオチド（cDNA）と対応する形で存在しているライブラリー（cDNAディスプレイともいう。）を指す。しかし、当該cDNAディスプレイを製造するために用いたランダム化された3FペプチドライブラリーをコードするmRNAまたはcDNAで構成される3Fポリヌクレオチドライブラリーを含めて「3Fペプチドライブラリー」と称する。
「3Fペプチドライブラリー」におけるループI、ループII及びループIIIの特定の領域のランダム化のための方法は、既知であり、例えば（特許文献７、非特許文献２２）にも詳細に記載されている。
【００３９】
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、構成するアミノ酸が異なっていても、３次元的な構造は高度に保存されているため、例えば（特許文献７）の［表１］に列記されている種々の起源生物由来のニューロトキシンの3Fの骨格を利用して構築されたライブラリーであってもよいが、特に、Micrurus corallinus（Kubo, T., et al., (2002), Program No.137.16., 32nd Annual Meeting of Society for Neuroscience, Washington, DC, 3rd November, 2002）由来のCTx3ペプチドライブラリー（配列番号１５）が好ましい。
【００４０】
（3F）ペプチドライブラリーを、アミノ酸配列を用いて表記すると、以下の通りである。
スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリーであって、以下の領域：
(i)C1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域；
(ii)C3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域；および
(iii)C5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリー。
ここで、スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）中のジスルフィド結合を形成する保存システインを、N末端側から順番にそれぞれC1〜C8と称し、C1とC2の間、C3とC4の間、およびC5とC6の間の領域を、それぞれループI、ループIIおよびループIIIと称する。
【００４１】
そして、最も好ましいCTx3-3Fライブラリーは、下記のアミノ酸配列で示される。
（式１）
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１５）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
【００４２】
（５−２）本発明のcDNAディスプレイ法の対象となる標的物質
本発明の「標的物質」とは、本発明のcDNAディスプレイで提示されるタンパク質と相互作用するか否かを調べるための物質を意味し、具体的には、タンパク質、核酸、糖鎖、脂質、ステロイド、有機あるいは無機物質、低分子化合物などが挙げられる。いずれも、その配列もしくは構造が既知であっても未知であっても良く、またその機能が既知であっても未知であっても良い。微生物や細胞などを丸ごと標的にして、識別分子（群）を創製することもできる。
好ましい標的物質としては、創薬ターゲットとなる疾患原因分子や疾患誘導に関わる分子、または検査や診断のためのバイオマーカーなどが挙げられる。
ここで、これら標的物質と、本発明のcDNAディスプレイで提示されるタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子との間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示す。具体的には、抗原と抗体との結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドとの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子との結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離、その他、脂質とタンパク質、ステロイドとタンパク質、低分子化合物とタンパク質などの結合及び解離なども挙げられる。
【００４３】
（５−３）標的物質の調製、固定化
本発明においては、典型的には標的物質を固相表面に固定化し、液中で本発明のcDNAディスプレイとの結合反応を観察する。なお、cDNAディスプレイのライブラリーを分画してマイクロアレイ化し、標識化した標的物質によりライブラリー分画を濃縮する既知の方法を適用することもできる。しかし、前者の方が圧倒的に多数の母数のライブラリーを相手にでき、ハイスループットなセレクションにとってはきわめて好ましい。
したがって、以下、前者の典型的な方法について説明する。
ここで、固相としては、公知の固定化用担体を用いることができ、例えばスチレンビーズ、ガラスビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ、ガラス基板、プラスチック製の基板、ウエル、メンブレンなど各種の材質、形状のものを用いることができる。好ましくは、磁気性ビーズなどのビーズが好ましい。
標的物質と固相との結合は、公知の結合方法を用いることができ、例えば、ストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、抗体／抗原分子（エピトープペプチド）、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／グルタチオン、配列特異的なDNA又はRNA結合タンパク質／特異配列を有するDNA又はRNA、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質／ATP、エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。これらのうちで、インビトロセレクションの自動化に最も適している組み合わせは、ストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせであり、ビオチン化した標的物質を磁気性ビーズに結合したストレプトアビジンとの親和性を利用することが最も好ましい。
例えば、本発明の実施例７では、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）とその受容体結合を阻害するVEGF結合ペプチドをスクリーニングする場合を示しているが、その際の標的物質としては典型的なVEGFである、配列番号２０に示されるヒトVEGF-A（「VEGF 165」（PeproTech社製, London））をビオチン化し、ストレプトアビジンで被覆された磁気性ビーズに固定化して用いている。
【００４４】
標的物質をビオチン化する方法は公知の方法が適用でき、例えば標的物質がタンパク質の場合は、ビオチンを結合し得る塩基（例えば、デオキシチミン（dT））もしくはビオチンが結合した塩基（例えば、ビオチン−デオキシチミン（Biotin-dT））、アミノ基によって修飾された塩基（例えば、アミノ修飾デオキシチミン（例、Amino-Modifier C6-dT:Glen Research Search社製））、カルボキシ基によって修飾された塩基（例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン（Carboxy-dT））、チオール基によって修飾された塩基（例えば、チオール修飾デオキシチミン（4-Thio-dT））等でビオチン化することができる。市販のEZ-Link Sulfo-NHS-SS-ビオチン（Pierce, Rockford, USA）を用いることもできる。
ストレプトアビジンを結合した磁気性ビーズは、Ni-NTA磁性ビーズなどビーズ表面に公知の方法でストレプトアビジンを被覆して調製できるが、市販のストレプトアビジン被覆ビーズ（Magnotex-SA（タカラバイオ）又はMagnosphereTM MS300/Streptavidin (タカラバイオ)）を用いても良い。
なお、標的タンパク質をストレプトアビジン被覆ビーズに固定化する際の好適な比率は、対象分子により適宜設定できる。
【００４５】
また、必要に応じ、標的物質は、標識物質により標識して用いることができる。
そのような標識物質としては、蛍光性化合物、抗原のエピトープペプチド等を挙げることができる。蛍光性化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光色素が好ましく、標的物質がタンパク質の場合は、FITC-dTやFluorescein-dTを使用することがより好ましい。
【００４６】
（５−４）相互作用の測定方法
本発明のcDNAディスプレイ法においては、ディスプレイされているタンパク質と標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。タンパク質と標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。
そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Cullen D.C., et al., Biosensors, 3(4), 211-225 (1987-88)）、エバネッセント場分子イメージング法（Funatsu T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995)）、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)：Crowther J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)）、蛍光偏光解消法（Perran J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)）、及び蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)：Eigen M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)）等が挙げられる。
【００４７】
（５−５）cDNAディスプレイされたタンパク質及び／又は標的物質の同定方法
本発明cDNAディスプレイ法においては、必要に応じて、相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、ディスプレイタンパク質及び／又は標的物質を同定する。ディスプレイされたタンパク質の同定は、cDNAタンパク質融合体中のcDNAをPCR増幅し、塩基配列を解析して行う。標的物質の同定は、あらかじめ標識しておいた標識を利用して、NMR、IR、各種質量分析等を用いて行うことができる。標識物質がタンパク質であれば、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできる。
【００４８】
（５−６）インビトロセレクションの全工程図
本発明のリンカー−Ｎを用いたcDNAディスプレイ法を用いたインビトロセレクションは、以下の手順に限られる分けではないが、（図１１ａ）に従って説明する。
（ａ）テンプレートDNA（例えば、ランダムペプチドライブラリー）をmRNAに転写してこれを精製し、必要に応じ適宜し定量する工程（mRNAライブラリー）：〜1.5時間。
（ｂ）mRNAをリンカー−Ｎにライゲートする工程（mRNA−リンカー−Ｎ）：0.2時間。
（ｃ）小麦胚芽ライセート翻訳系で翻訳後、高濃度塩の条件下で成熟する工程（mRNA−タンパク質融合体）：〜1時間。
（ｄ）Ni-NTA磁性ビーズ上で、mRNAタンパク質融合体を精製し、逆転写を行い、かつcDNAタンパク質融合体の精製を行った後に溶出する工程（cDNAタンパク質融合体）：0.5時間。
（ｅ）SAビーズなどに固定化された標的タンパク質にcDNAタンパク質融合体を結合させ、洗浄後、溶出させる工程：〜2時間。
（ｆ）溶出したcDNAタンパク質融合体のcDNAをPCR増幅し、DNA配列を決定する工程、又はテンプレートDNAを調製して再度工程（ａ）に供する工程：
全工程は6〜8時間で完了できる。
【００４９】
（５−７）本発明のセレクション方法の評価
ディスプレイ技術にとって最も重要な、ライブラリー分子中の特異的結合しない分子から、特異的結合する候補分子のみのセレクト能力を評価するための実験を、具体的に以下の様に実施した（実施例６）。
公知のリガンド（FLAGタグ）とランダムな8-merペプチドライブラリーとを1:1000の比率で混合し、評価実験を行った（図１２）。なお、比較のために、「puro−リンカー（非特許文献１３）」を用い、全プロセスを非特許文献１３の方法に従って実施した。固定化した抗−FLAG M2抗体に対して両方法で同時に３回実施したところ、リンカー−Ｎを用いた本発明のcDNAディスプレイ法を適用した場合には、３回のセレクション後80％（16/20）FLAGタグを検出できたのに対し、puro−リンカーでは、20％（4/20）であった。この結果は、リンカー−Ｎを用いたことで特異的結合する候補分子の濃縮率が改善されたことを示している。すなわち、本発明のセレクション工程中では、「ノイズ」となる余剰mRNA−リンカー−Ｎ連結体、mRNAタンパク質融合体などを系から効率よく除去でき、S/N比が減少できたことが示された。
【００５０】
リンカー−ＮのcDNAディスプレイにおけるpuro−リンカー（非特許文献２２）と比較した利点を、下記（表３）のようにまとめた。3Fライブラリーを用いた場合のライブラリーの調製において、puro−リンカーがWGEライセート1ml当り、4×1010分子／1mlであるのに対し、リンカー−Ｎの場合は6×1012分子を得ることができる。なお、用いた3Fライブラリーは終止コドンも含む任意のアミノ酸をコードするNNSコドン（N＝A,T,C又はG；S＝C又はG）によって調製した。puro−リンカーを用いた非特許文献２２では3ml当り1.2×1011サイズのライブラリーが用いられたのに対して、本発明の実施例５では、0.5ml当り3×1012サイズのライブラリーを調製して用いている。両者には、同一の選択性（60〜70％）にまでに収束するのに要したセレクションラウンド数に大きな違いがあり、「puro−リンカー」の場合の10ラウンドと比べてリンカー−Ｎの場合は7ラウンドであり、約25〜30％効率が良いことがわかる。同じ標的（抗FLAG抗体）を用いた本実施例６の結果により、本発明のcDNAディスプレイ法の効率が従来法の４倍であること（図１２ｃ）も実証された。また、後述のように、実施例７のリンカー−Ｎによる3Fランダムペプチドライブラリーを用いたVEGF結合性ペプチドのセレクション実験においては、従来法よりも解離常数（Kd値）において約１オーダーも小さい極めて親和性の高い新規ペプチドを得ることができた（2.1nM：48nM）。それぞれの方法で選択された候補ペプチドで主要集団（最大割合）を占めるペプチドについて親和性を比較したところ、約２オーダーの差が生じていた（2.1nM：152nM）。これは、セレクション成果は初期ライブラリーの多様性に依存しているという理論に一致している。これらの結果は、加速された方法でより低いコスト及び労働で優れた候補を得るためにリンカー−ＮによるcDNAディスプレイを使用できるという利点を明らかにしている。
【００５１】
６．既知のランダムペプチドライブラリーから目的の機能性タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングする方法
ライブラリーサイズが大きないわゆるランダムペプチドライブラリーに適用する場合にも、基本的工程は、（図１１）又は（図１２ｂ）に示されたセレクション全工程図と変わりはない。ライブラリーサイズにもよるが、標的物質への高親和性新規ペプチドをスクリーニングするためには、通常、3〜20ラウンド、好ましくは5〜15ラウンド、より好ましくは7〜10ラウンド行う。
適用できるライブラリーサイズとしては、cDNAディスプレイ分子で1mlあたり1012分子以上、さらには1013以上又は1014以上であっても、ラウンド数を上げることで適用可能である。
本発明の実施例７においては、既知の典型的なランダムペプチドライブラリーである3Fライブラリー（非特許文献２２）に適用し、6×1012/mlのcDNAディスプレイを調製して、磁気性ビーズ表面に固定化したVEGFとの親和性スクリーニングを７ラウンド行うことによって、60％もの高率で新規なVEGF親和性ポリペプチド（Kd＝2.1±0.5nM）がスクリーニングできた（表３、４）。
【００５２】
【表３】
0006478392.tif 000004
【００５３】
【表４】
0006478392.tif 000005
【００５４】
７．VEGF結合性ペプチド
（７−１）スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）を有するVEGF結合性ペプチド
本発明のcDNAディスプレイ法を用いて得られた３種類の新規なVEGF親和性ポリペプチドのうち約60％を占めるG-1グループのポリペプチドは、Kd＝2.1±0.5nMという高親和性を示した（表４）。
VEGF結合性ペプチドは、基本骨格としてスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）(特許文献７、非特許文献２２)を有し、ループI、ループII及びループIIIの特定部分のアミノ酸配列が、それぞれ「PLTRVV（配列番号６）」、「HGDHHTLSEW（配列番号７）」及び「EEPTAHV（配列番号８）」であるアミノ酸配列を有している。
実施例での基本骨格のスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、CTx3（非特許文献１５）由来のCTx3-3Fライブラリーを用いているため、本発明のVEGF結合性ペプチドの1つの態様であるCTx3-3Fを有するVEGF結合性ペプチド（ペプチドG-1）は、下記（式２）のアミノ酸配列で表される。
（式２）
LVCYPLTRVVPGTLETCPDDFTCVHGDHHTLSEWTQYCSHACAIPEEPTAHVCCQTDKCNG（配列番号１６）
当該VGEF結合性ペプチド（ペプチドG-1）は、PCR分析においても、ELISA結合アッセイにおいても高いVEGF特異性を示した。ペプチドG-1についての推定立体構造図は図１６に示される。
【００５５】
（７−２）VEGF結合性ペプチドのサイズの最適化
本発明で用いられたスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、例えば、CTx3由来の3Fの場合、全長61アミノ酸残基から構成されているが、ループI、ループII及びループIIIという３つのループが存在し、それぞれのループは、その末端領域にあたるS-S結合によりしっかり固定された構造となっている。したがって、各ループ構造の末端部S-S結合を形成するためのCysを残して切断した12〜25アミノ酸残基という小さなサイズのペプチド「1Fスキャフォールド」も、もとの立体構造を保持している。そして、非特許文献１４では、ループIを含む1Fのペプチドにおいて、本来の3Fで示したと同様の阻害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性が保たれていることが実証されている。
本発明のVEGF結合性ペプチドについても、3F構造を構成し得る全長ペプチドである必要はなく、ループI、ループII及びループIIIのいずれかを含み、少なくとも「1Fスキャフォールド」を構成し得るペプチドであれば、3F構造を有する全長のVEGF結合性ペプチドと同様のVEGF結合活性を有し、かつVEGF阻害活性が期待できる。そして、全長ペプチドと比較して、小さいサイズであることによって、合成のしやすさに加え、抗原性のなさ、血清半減期の長さなど、サイズの小さいメリットが発揮される。
以上のことから、本発明のVEGF結合性ペプチドは、さらにサイズを小さくする最適化が施されることが好ましく、本発明の他の態様は、下記（式３）〜（式５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるということができる。特に、（式３）〜（式５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであって、（式２）の部分ペプチドである場合がより好ましい。その際、1Fを構成するアミノ酸のうちで、環化に関与しないCysは、他のアミノ酸に変更することが好ましく、非特許文献２２に倣い、（式３）及び（式４）では、途中のCysをGlyに置換している。また、環化に用いられる両端のCysの外側のアミノ酸、例えば（式３）におけるN末側の「Leu-Val」及びC末側の「Val」は他のアミノ酸に置き換えることもできる。
（式３）
LVCYPLTRVVPGTLETGPDDFTCV（配列番号１７）
（式４）
ETCPDDFTGVHGDHHTLSEWTQYCS（配列番号１８）
（式５）
ACAIPEEPTAHVC（配列番号１９）
【００５６】
８．本発明を用いた自動化されたハイスループットシステム
本発明は、前記（５−５）で述べたように、それぞれの工程が極めて単純化され、短時間で行うことができるように設計されているため、創薬のリード化合物を見いだすための全自動化ハイスループットシステムに適用できる（図１５）。例えば、１ラウンド約8時間、8〜10ラウンドで、約2週間でリード化合物を得ることができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００５８】
（実施例１）本発明の核酸リンカー（リンカー−Ｎ）の合成
多機能性の基を組み込んだ、5'-CCCCCCCGCCGCCCCCCG (5-Me-dC) A18 (Spec18) (Spec18) (Spec18) (F-dT) (Spec18) CC (Puro) -3'からなるピューロマイシン−オリゴヌクレオチドを、BEX社（日本）に委託してDNAシンセサイザーABI394(Applied Biosystem, Japan)で合成した。上記ピューロマイシン−オリゴヌクレオチドの5'末端はアセチル化により保護した。式中、記号(5-Me-dC)は5'-ジメトキシトリチル-N4-(O-レブリニル-6-オキシヘキシル)-5-メチル-2'-デオキシシチジン（Glen Research社製）を示す。(Spec18)はC18スペーサー ホスホロアミダイトを、(F-dT)はフルオレセイン-dTを、そして(Puro)はピューロマイシンCPGを示す。
5-Me-dCのレブリニル保護基を1:1のピリジン／酢酸中の0.5Mのヒドラジン水和物で除去して、カラムをさらにピリジン／酢酸（1:1）で、次いでアセトニトリルで洗浄した。プライマー配列5'-CCTTG-3'をピューロマイシン−オリゴヌクレオチド中の5-Me-dCに繋ぎオリゴヌクレオチド鎖を分岐させた。得られたピューロマイシン−分岐オリゴヌクレオチドをメタノール中のK2CO3でカラムから切断して5'末端のアセチル基を脱保護した。この脱保護を完全にするために25%の水酸化アンモニウム中、65℃で1.5時間の反応を実施し、逆相HPLCで精製して本発明のピューロマイシン−リンカーオリゴヌクレオチド（以下、「リンカー−Ｎ」と称す。）を得た（図１）。「リンカー−Ｎ」が生成できたことは、TOF-MS及びゲル電気泳動で確認した。修飾のために用いた全てのホスホロアミダイト試薬はGlen Research社(Sterling, VA, USA)から入手した。
【００５９】
（実施例２）リンカー−Ｎのライゲーション効率
（２−１）テンプレートDNA構築物の調製
リンカー−Ｎのライゲーション効率を調べるために、リンカー−Ｎと繋ぐmRNAのテンプレートDNAを、既知のプロテインＡのＢ−ドメイン（BDA：非特許文献２０）、Oct-1のPouドメイン（PDO：非特許文献２１）、スリーフィンガー（3F：非特許文献２２）及びIL-6レセプター（6R14：非特許文献２２）をコードするDNAを用いて調製した。
「BDA（プロテインＡのＢ−ドメイン）」は、非特許文献２０に記載のpEFZZ18プロテインＡ融合ベクター（GE Healthcare社）から増幅し、「PDO（Oct-1のPouドメイン）」は、非特許文献２１に従って合成した。そして、非特許文献２２に従って、「3F（スリーフィンガー））は、南アメリカサンゴヘビMicrurus coralinusからクローンし、「6R14」（ヒトIL6レセプターαと結合活性のある3Fペプチド）は、非特許文献２２に記載のpBADThio/TOPOベクターIL6R10-14から得た。
これらDNAの5'末端側に、非特許文献２２に記載の「SP6プロモーターを含むオリゴヌクレオチド／キャップ部位／Xenopus β-globin5'非翻訳領域(UTR)」及び翻訳開始コドン(ATG)を繋ぎ、そして3'末端側には、「スペーサー(G3S)2／His-タグ配列（6×His）／スペーサー(G3S)／Y-タグ配列」を付加してPCRで増幅し、テンプレートDNA構築物を得た（図３）。ここで、スペーサー(G3S)は、「GGGS（G＝グリシン；S＝セリン）」である。PCR増幅は20秒の変性(94℃)工程、15秒のアニーリング(60℃)工程及び30秒のエクステンション工程(72℃)によって実施した。
【００６０】
（２−２）リンカー−Ｎと各種mRNAとのライゲーション
（２−１）で得られた4種類のテンプレートDNA構築物を、それぞれRiboMAX Large Scale Production System(Promega, Madison, WI, USA)において37℃で1時間SP6 RNAポリメラーゼによって転写してキャップ付転写産物を産生し、RNeasy 精製キット(Qiagen)で精製して、BDA-mRNA, PDO-mRNA, 3F-mRNA, 6R14-mRNAを得、260nmの吸光度によって定量した。
次いで、各mRNAとリンカー−Ｎとを比率1:1（50pmol）で、94℃で15〜30分間加熱下アニールした後、4℃まで徐冷した。3UのT4キナーゼ(NEB, USA)及び20UのＴ４RNAリガーゼ(Takara, Japan) を用い、25℃で10分間、20分間及び40分間ライゲーションを実施した。RNA−リンカー複合体が生成されたことは、DNAとハイブリッドしているmRNAをRNaseH(Ambion, Austin, TX,USA)で分解し、変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することで確認できる。
（図４）は、例としてPDO-mRNAとリンカーとをRNaseH存在下もしくは非存在下で10分、20分、及び40分間ライゲーション反応を起こさせ、また10分間ライゲーション反応したものをRNaseH処理したものも合わせて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（6％のゲル及び8Mの尿素）で分離したものである。なお、その結果はリンカー−Ｎに組み込まれたFITCによる蛍光画像（図４ａ）及びSybr Gold(Molecular Probes, USA)による核酸染色画像（図４ｂ）をフルオロイメイジャー(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて取得した。図４ｃには、PDO以外の3F-mRNA, 6R14-mRNA及びBDA-mRNAとリンカー−Ｎとの10分後のライゲーション結果を同様に示す(Sybr Gold染色)。
次いでそれぞれのライゲーション効率を以下の式で計算したところ、PDO  96±4％、3F  91±5％、6R14  95±3％、BDA  96±2％、という結果を得た（図５）。
ライゲーション％＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００
（式中のＡはライゲートされた産物のバンド強度で、Ｂは残余mRNAの強度である）。
以上の結果は、リンカー−Ｎが従来のピューロマイシンリンカーなどのcDNAディスプレイ用又はmRNAディスプレイ用の核酸リンカーと比較して、低いリンカー：mRNA比と高いライゲーション効率を共に達成していることを示している（表２）。
【００６１】
（実施例３）各種無細胞翻訳系でのタンパク質翻訳効率からみたリンカー−Ｎにおける「オリゴdA」の長さの最適化
（３−１）オリゴdAの長さの異なるmRNA−リンカーの合成
リンカー−ＮにおけるオリゴdAの長さを、18個、10個、0個に変えて、前記実施例１と同様にリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）を合成した（図６）。各リンカーを用いて、前記実施例２（２−２）と同様に、各リンカー毎にmRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−リンカー融合体を作製した。
【００６２】
（３−２）ウサギ網状赤血球翻訳系
各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−リンカー融合体をそれぞれ、ウサギ網状赤血球ライセート（Rabbit Reticulocyte Lysate）IVTキット（Ambion, Austin, TX, USA）（以下、RRLと称す。）に供して、各mRNAの翻訳を行い、mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−タンパク質融合体を作製した。
具体的には、非特許文献１３及び２２に従い、mRNA−リンカーの融合体100nMをRRL反応系25μl（ライゼート16.75μl、80mM酢酸カリウム、0.5mM酢酸マグネシウム、10mMクレアチンリン酸、各0.05mMアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025mM））でタンパク質合成反応を30℃で10分間実施した。その後、タンパク質融合体（すなわち、タンパク質のピューロマイシン部分への共有結合）を37℃で2時間65mMのMgCl2及び750mMのKClの存在下で成熟させた。電気泳動分析のサンプリングは10分時点で行った（図７ａ）。
融合体形成の効率は下記の式により計算し、それぞれのmRNAについてリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）での値はPDO（18A, 60±5；10A, 30±2；OA, 20±3）、BDA（18A, 65±3；10A, 35±3；0A, 22±2）、3F（18A, 50±4；10A, 30±3；0A, 18±3）、6R14（18A, 55±5；10A, 35±4；0A, 20±2）であった。
融合体形成％＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００
（ここで、Ａはタンパク質融合体（mRNA−リンカー−タンパク質）のバンド強度で、Ｂは残余mRNA−リンカーのバンド強度である。）
各mRNA−リンカーの融合体形成の能力を図７ｂに示す。
いずれのmRNAの場合もリンカー中のオリゴdAの長さが長いほど翻訳効率が高まることがわかった。
【００６３】
（３−３）小麦胚芽抽出液翻訳系
各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）とリンカー−Ｎとの融合体について、小麦胚芽抽出液（Wheat Germ Extract(Promega, Madison, WI, USA）)（以下、WGEと称す）に供して、上記（３−２）と同様に、各mRNAの翻訳を行い、mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−タンパク質融合体を作製した。
WGE内での翻訳は、mRNA−リンカーの融合体100nMをWGE反応系25μl（ライゼート12.5μl、その他製品プロトコルに従う）でタンパク質合成反応を25℃で10分間実施した後、25℃で１時間65mMのMgCl2及び750mMのKClを添加してタンパク質融合体を成熟させた。高濃度塩の効果を検証するためにコントロールとして、高濃度塩非存在下で1時間成熟させた場合も行った。
電気泳動分析は、10分時点（すなわち高濃度塩の添加前）、30分及び1時間時点（高濃度塩の添加後）にサンプリングを行った（図８ａ）。図８ａ中、０画分は10分翻訳した後にサンプリングした画分を示し、１画分は高濃度の塩なしで１時間培養したコントロール画分を示し、２画分は高濃度の塩と30分、３画分は1時間それぞれ培養した画分を示す。この結果、翻訳工程での高濃度の塩の添加は有効であり、1時間の成熟工程も有効であることがわかる。
次いで、各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）とリンカー−Ｎ１０Ａ及びリンカー−Ｎ０Ａとの融合体を用いて、同様にWGE内で25℃、10分間実施した後、高濃度塩存在下で1時間成熟させた（図８ｂ）。
各mRNAタンパク質融合体形成％を上記式に従って計算したところ、それぞれのmRNAについてリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）での値はPDO（18A, 90±5；10A, 65±3；0A, 30±4）、BDA（18A, 95±4；10A, 60±6；0A, 35±4）、3F（18A, 85±4；10A, 60±4；0A, 30±4）、6R14（18A, 90±6；10A, 60±5；0A, 35±5）であった（図８ｃ）。
【００６４】
WGEを翻訳系として選択した場合（図８ｃ）と、RRLを翻訳系として用いた場合（図７ｂ）とのそれぞれのタンパク質融合体形成％を比較してみると、リンカー−Ｎでの値がRRLでは50〜65％であるのに対して、WGEでは90〜95％という極めて高い値を示している。
1ml(4μM)あたり、2.5×1015個で、RRL翻訳系での1ml(0.2μM)あたり、1.2×1014個という形成量からみて１オーダーもの差異を示している。
これらの結果から、WGEでの翻訳においても、リンカー内のオリゴdAの長さが長いほど翻訳効率が高まることが実証され、少なくともdAが10以上、好ましくは12以上のdA（デオキシアデニン）の個数が必要であることがわかった。
リンカー−Ｎにおける「オリゴdA」が、（図９ｄ）にあるように、柔軟なスペーサー配列を介してピューロマイシンをリボソームＡのPサイト付近に適切に配置するのに寄与していることが裏付けられた。
【００６５】
（実施例４）mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）タンパク質融合体の精製及び逆転写
本発明の各タンパク質融合体は、逆転写（RT）の前に、タンパク質にあらかじめ設けられたHis-タグを利用して、IMAC (Immobilized metal affinity chromatography)の担体の一種であるNi-NTA磁性ビーズ(Qiagen)上に25℃で10分間固定して精製した。
ビーズを1X PBS緩衝液で洗浄して、M-MLV逆転写酵素（Takara, Japan）の20Uを加えて42℃で10分間RTを実施して氷の上に置いた。
数回洗浄した後、融合体を2回、250mMのイミダゾールを用いて25℃で5分間溶出した。
得られた各cDNAタンパク質融合体をRNaseH(Ambion, Austin, TX, USA)と37℃で30分間反応させてmRNA/cDNAの二本鎖を形成しているmRNAを分解除去した。例として、PDOmRNAタンパク質融合体を用いた場合を図１０として示す。各試料は、8M尿素含有12％SDS-PAGEにより分離しフルオロイメイジャーでバンドを確認した。磁気性ビーズからの１回目（E1）及び２回目（E2）溶出液いずれからの逆転写産物からmRNAを除去したものが極めて純度が高いことが見て取れる（図１０）。
このことは、His-タグを利用した簡便なIMACによって、mRNAタンパク質融合体を磁気性ビーズ表面に結合させた状態で、mRNAタンパク質融合体の精製、逆転写、mRNAの分解除去、及びcDNAタンパク質融合体の精製の全工程を効率よく短時間で行うことができ、しかも高純度かつ高収率でcDNAタンパク質融合体を精製することができたことを意味する。
なお、図中、F.T.は濾過画分、E1及びE2は溶出液１及び２を逆転写後RNaseH処理によりmRNAを除去したものであり、PDOはmRNAタンパク質融合体に対応するが、cDNAタンパク質融合体との量比を示すためにPDOバンドの位置を上方にずらして表示している。
【００６６】
（実施例５）インビトロセレクション
本実施例では、BDAが認識するIgG、3Fが認識するAChBP及び6R14が認識するIL6-Rをモデルとして磁気性ビーズに固定化し、それぞれの標的タンパク質が本発明のBDA, 3F及び6R14 cDNAタンパク質融合体と共に、コントロールとしてPDO cDNAタンパク質融合体を用い、本発明のインビトロセレクション効率を評価する。
【００６７】
（５−１）ビオチン標識された標的タンパク質を固定化した磁気性ビーズの調製
セレクションに用いる標的タンパク質のうち、免疫グロブリンG(ウサギIgG)はSigma社から、インターロイキン−６受容体（ヒトIL6Rα）及びVEGF（ヒトVEGF165）はPero Tech社(London, UK)から購入した。アセチルコリン結合タンパク質（AChBP）cDNAはAplysia kurodai[manuscript in preparation]からクローニングし、組換え大腸菌で発現させて精製した。
これらの標的タンパク質を磁気性ビーズに固定化するために、EZ-Link Sulfo-NHS-SS-ビオチン（Pierce, Rockford, USA）をモル比1:10で用いてビオチニル化した。未反応のビオチンは1MのTris-HCl(pH8)で不活性化して4℃で16時間透析して除去した。ビオチニル化された各標的タンパク質をSDS-PAGE及びストレプトアビジン-HRP（GE Healthcare）を用いるウェスタンブロットで確認した。定量的な固定化を、ストレプトアビジビンを被覆した磁性ビーズ（Takara, Japan）の一定量に対して25℃で30分間滴定してチェックした。上澄み液を保管して固定化した標的タンパク質を100mMのジチオスレイトール（DTT;Wako, Japan）を用いて25℃で10分間溶出した。
【００６８】
（５−２）インビトロセレクション
次いで、PDO及びBDA, 3F, 6R14の各cDNAタンパク質融合体を、上記（５−１）で調製した標的タンパク質（IgG, IL6R, AChBP）を固定化した磁気性ビーズに対して反応させる。
非結合性のPDOと結合性のBDA（又は3F, 6R14）のmRNA−（リンカー−Ｎ）複合体を20:1の比率で混合し、実施例４と同様の工程により翻訳、修飾されてcDNAディスプレイタンパク質とした。
ここで、3F及び6R14のようなジスルフィドが豊富なリガンドの場合は、非特許文献２３に従い、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）（インプットテンプレートに対して70％以上の融合体が形成されると仮定して、cDNAディスプレイに対して1:1のモル比）で、10mMの酸化グルタチオン（GSSG）及び1mMの還元グルタチオン（GSH）を存在させて翻訳、リフォールディング及び成熟工程に供した。
実施例４と同様にHis-タグで溶出した各サンプルそれぞれ50μlを150μlのセレクション緩衝液（SB；1×PBS、100mMのNaCl及び0.1％のTween-20）と混合して、25℃で30分間、IgG, IL6R及びAChBPを固定化した磁気性ビーズと共にインキュベートした。なお、各セレクション用に用いる緩衝液からはジチオスレイトール（DTT）を全て除いておく。
同じ緩衝液200μlでビーズを10回洗浄した後、100mMのDTTで溶出し（マイクロ−スピンカラム、GE Healthcare）、脱塩（10mM TrisHCl pH7）した。
「セレクション前」の画分と溶出された「セレクション後」の画分を、それぞれ下記の0.2mMのPS及びPv3Aプライマー（グライナー社に合成依頼）を用いて25サイクル増幅した（変性（94℃）、20秒；アニーリング（60℃）、15秒；延長（72℃）、20秒）。
P S：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCT-3'（配列番号１）及び
Pv3 A：5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3'（配列番号２）
変性ゲル電気泳動（4.5％のゲル及び8Mの尿素）を行い、Sybr Gold染色によって各モデルタンパク質をコードするDNAの量を定量分析した。
これら一連の工程を図１１ａとして示す。最初のテンプレートDNAからmRNAへの転写工程から、最後の分析工程までのそれぞれの平均的所要時間も付記した。このように、各工程が極めて短時間で行われており、本発明のスクリーニング方法がハイスループットに行われることを実証するものでもある。
モデルとした(1)PDO/BDAとIgGの組み合わせではBDAが、(2)PDO/3FとAChBPの組み合わせではAChBPが、また(3)PDO/6R1とIL6Rとの組み合わせではIL6Rが、それぞれ混合したPDOと比較して選択的に増幅された（図１１ｂ）。(1)〜(3)それぞれのセレクション前後での定量的PCRでの値の変化比率である「フォールドエンリッチメント（Fold Enrichment）数」は、(1)40±5％、(2)30±3％、（3）35±2％であった（図１１ｃ）。
【００６９】
（実施例６）FLAG-タグ配列に対応した8-merペプチド混合物のライブラリーを用いたセレクション
FLAG-タグが抗FLAG M2抗体と結合するために必要な「DYKDDDDK（配列番号３）」に対応する8-merペプチドがランダム化された混合物である8-merペプチドライブラリーを以下の様に調製した。
8-merペプチドライブラリーは、相補する「オーバーラップ配列」を持つ２本のオリゴヌクレオチドを使って構築した。即ち
（１）上流プライマー；最も5'側にはSP6プロモーター及びキャップを有し、それに続いて5'-UTR, Kozak及びATGに続き「オーバーラップ配列」があるオリゴヌクレオチド、
（２）下流プライマー；「オーバーラップ配列」がランダム領域の3'末端側に設けられ、5'末端にHis-タグ及びY-タグ配列を有するように構築されたオリゴヌクレオチド断片
の混合物である（図１２ａ）。
ここで、「オーバーラップ配列」とは、２本のセンスプライマーとランダム配列を入れたアンチセンスプライマーとなる合成オリゴヌクレオチドの3'側の十数ベースを相補的にオーバーラップさせ、PCRでお互いに5'側から3'側に伸長させながらライブラリーを構築する手法である。
ここで用いた２種類のプライマーは、以下の通りである。
上流センスプライマー：（配列番号４）
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCT
CAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3'
下流アンチセンスプライマー：（配列番号５）
5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGGTGGTGAG
ACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNTGAACCTCCCATGGT-3'
ランダム領域は、NNSコドン（N=A,T,C又はG；S=C又はG）でコードして、下流プライマーに含めた。
この２つのプライマー断片を、変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒及び延長（72℃）を30秒のオーバーラップPCR 15サイクルで結合した。
タグ構築物は、ランダムな領域をFLAG-タグ配列で置き換えた以外は同じ方法で調製した。
【００７０】
8-merペプチドライブラリー のmRNAを、実施例（２−２）と同様に、実施例１で得られたリンカー−Ｎにライゲーションして8-merペプチドライブラリーmRNA−リンカー−Ｎを調製した。10pmolの8-merペプチドライブラリーmRNA−リンカー−Ｎを、同様に調製した10fmolのFLAG-タグmRNA−リンカーと混合した。
実施例（３−３）と同様に、小麦胚芽抽出物翻訳系（WGE）中に供して翻訳及び成熟によりmRNAタンパク質融合体を得、実施例４と同様に、His-タグによる精製後に逆転写して溶出し、cDNAタンパク質融合体のライブラリーを得た。
一方、比較のために非特許文献１３に記載の「puro−リンカー」を上記8-merペプチドライブラリーに適用して、非特許文献１３のプロトコルに従ってcDNAタンパク質融合体のライブラリーを調製した。
【００７１】
上記２種類のcDNAタンパク質融合体ライブラリーを、それぞれ実施例（５−１）と同様の手法で磁気性ビーズに固定化させた200nMの抗−FLAG M2抗体（Sigma社製）と共に、200μlのDTTが除かれた緩衝液（SB）中で混合し、25℃で30分間反応させた。実施例（５−２）と同様に、ビーズを等容量の緩衝液（SB）で5回（ラウンド1）、8回（ラウンド2）及び10回（ラウンド3）洗浄して100mMのDTTで溶出した後脱塩した。
溶出した画分をPCR増幅して次のラウンドへ進め、合計3サイクル選択を行った。ラウンド3の後、PCR産物をクローン化して（TAクローニング、Invitrogen）、ランダムピッキングで20クローンを選択し配列決定した。
これらの一連の工程の概念図は図１２ｂに示す。
本発明のリンカー−Ｎを用いた場合と、非特許文献１３のPuro−リンカーを用いた場合のセレクション結果を図１２ｃに示す。
リンカー−Ｎを用いた場合には、3サイクル後には80％がDYKDDDDK（配列番号３）のFLAG-タグ配列を選択できたが、従来のPuro−リンカー（非特許文献１３）を用いた場合は選択されたFLAG-タグ配列は20％に留まった。
【００７２】
このことは、本発明のセレクション工程中では、「ノイズ」となる余剰mRNA−リンカー−Ｎ連結体、mRNAタンパク質融合体などを系から効率よく除去でき、S/N比が減少できたことを示している。
【００７３】
（実施例７）3FライブラリーからのVEGF結合タンパク質スクリーニング
（７−１）3FのcDNAタンパク質融合体ライブラリーの調製
まず、非特許文献２２に従って、下記のスリーフィンガー（3F）のLoop1、Loop2及びLoop3をランダム化させた3Fライブラリー（MicTx-3鋳型：図１３）からmRNAライブラリーを調製した。
なお、「3F」のアミノ酸配列は下記の通りであり、そのランダム領域を最初から順にLoop1、Loop2、Loop3 と称する。
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１５）
次いで、本発明のリンカー−Ｎに対し、前記実施例と同様の手法を適用し、3FライブラリーmRNA−（リンカー−Ｎ）融合体をWGEライセート反応液0.5ml中で翻訳して3F-cDNA融合体を作製した。反応液の組成は次の通りである。
ライブラリーmRNA−リンカー融合体  200nM
WGEライセート(PROMEGA)  250μl
アミノ酸混合液(PROMEGA)  40μl
酢酸カリウム溶液  50mM
RNase inhibitor(PROMEGA)  200unit
Protein Disulfide Isomerase（タカラバイオ）  5μg
酸化型グルタチオン  10mM
還元型グルタチオン  1mM
反応は25℃で15分間行った。
その結果、3F-cDNA融合体として、およそ3×1012分子が得られた。
なお、あらかじめcDNAタンパク質融合体の分子数の見積もりを行うために、濃度標準として既知量の上記3F-mRNA−リンカーを用いてSDS-PAGEで行っている。
【００７４】
（７−２）インビトロセレクション
VEGF（PeproTech社製, London）を実施例（５−１）と同様に磁気性ビーズ（Magnosphere MS300/Streptavidin、タカラバイオ）に固定化した。
上記（７−１）で得られたcDNAタンパク質融合体を、固定化したVEGFと200μlのSB（selection buffer）緩衝液中、25℃で1時間反応させ、続いてSB緩衝液及びWB（wash buffer）緩衝液（1×PBS, 100mMのNaCl及び0.5％のTween-20）でそれぞれ数回洗浄した。洗浄後のビーズに100mMのDTT溶液を投与し、25℃で10分間放置後cDNAを含む上澄み液を得た。
得られた上澄み液をMicro-spin column（GEヘルスヘルスケア社）により脱塩してPCR増幅した（変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒そして延長（72℃）を30秒）。選択圧（selection pressure）を適用するために、VEGFの濃度を1μMから1nMに変化させ、そして洗浄回数をWB洗浄液で漸進的に増大した。7ラウンド（R7）の後に、PCR産物をpCR2.1ベクター（TAクローニング、Invitrogen）にクローンして、ランダムに20クローンを選択し配列決定した。
【００７５】
（７−３）クローンの配列の分析
得られた20クローンの配列を解析した結果、それぞれがコードしているアミノ酸配列でグループ分けすると、G-1配列が60％、G-2配列及びG-3配列が15％ずつであった。各グループの各Loop1〜3のアミノ酸配列は以下の通りである。
G-1：60%(12／20)
Loop1=PLTRVV（配列番号６）、Loop2=HGDHHTLSEW（配列番号７）、Loop3=EEPTAHV（配列番号８）
G-2：15％(3／20)
Loop1＝WEVVLL（配列番号９）、Loop2=AHSVTLAHGH（配列番号１０）、Loop3=TGPGAER（配列番号１１）
G-3：15％(3／20)
Loop1=TLWLSY（配列番号１２）、Loop2=DVPQSGTNLA（配列番号１３）、Loop3=ELTHPVD（配列番号１４）
【００７６】
（７−５）解離定数の測定
非特許文献２３に報告された方法に従って解離定数（Kd）を測定した。一定量の3Fディスプレイタンパク質（〜1nM）を種々の量のVEGF（0.1nM〜1μM）と１時間反応させた。混合物を一定量のVEGF（〜100nM）に適用してさらに30分間培養した。数回洗浄した後、抗His-抗体（R&D systems）を1/2000希釈で加えて１時間反応させた。反応混合物を数回洗浄した後、基質、TMBを加えた。適切なカラー展開の後、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止して、450nmの吸収を測定した。
20クローンのＧ−１、Ｇ−２及びＧ−３グループそれぞれの典型的な配列及びその解離定数（Kd値）を（表４）に示す。特にＧ−１グループは2.1±0.5nMと、ペプチドとしては極めて低い数値を示し、その親和性は市販の抗VEGF抗体 (Chen et al. JMB (1999) 293:865-881)のKd値2.9nMと匹敵している。
【００７７】
【表４】
0006478392.tif 000006
【００７８】
（実施例８）結合特異性の評価
（８−１）
実施例７で得られたR7 mRNA−（リンカー−Ｎ）（200nM）を用い、上記（７−１）と同様の方法で翻訳してcDNAタンパク質融合体を調製した。
得られたこれらの融合体を３つの部分に分けて、
（１）ストレプトアビジンビーズ（何も結合させていない場合）、
（２）VEGFビーズ（200nM）及び
（４）Fcビーズ（200nM）、（Fc固定化ビーズの調製法はVEGFビーズと同様、実施例（５−１）に記載の方法で調製した。）と共に、200μlのSB（selection buffer）緩衝液中、25℃で30分反応させた。なお、「Fc」としては、ヒトIgG1由来Fc（R&D Systems社）を用いた。
（３）のコントロールとしては、R7mRNA−（リンカー−Ｎ）をタンパク質への翻訳工程なしに逆転写したR7cDNA−（リンカー−Ｎ）の等量（200nM）をVEGFビーズと同様の条件で反応させた。
各ビーズを同じ緩衝液で10回洗浄して100mMのDTTで溶出した。溶出した画分を脱塩して以下の条件でPCR増幅した（PCR条件：変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒及び延長（72℃）を30秒）。
上記（１）〜（４）の場合のR7−cDNA融合体について溶出画分をPCR増幅し、ゲル電気泳動で分析した（図１４ａ）。なお、電気泳動条件など他の条件も非特許文献２３と同様。
次に、非特許文献２３に従ってELISA法による分析を行った。
R7-cDNA融合体を３つの部分に分けSAビーズ、200nMのVEGFビーズ及び200nMのFcビーズとPBS-BSA(0.01%BSA)中、25℃で1時間インキュベートした。混合物をPBS-T(0.1%Tween)で洗浄し、続いて抗His抗体(R&D system)とPBS-T中、25℃で30分間反応させた。次いで、混合物をPBS-Tで数回洗浄し、続いて基質、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB;Sigma)を添加した。カラー展開の後、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止し、サンプルを遠心分離して、450nmの吸収を測定した。
その結果、下記（８−２）で詳細に述べるように、明らかにR7-cDNA融合体とVEGFビーズとの高い結合性が示された（図１４ｂ）。
得られたVGEF結合性ペプチド（ペプチドG-1）について、ペプチドG-1とのアミノ酸配列相同性が高く、すでに立体構造解析がなされているスリーフィンガー型ペプチドAdTx1（Dendroaspis angusticeps由来、PDB=4IYE）を鋳型とし、分子構造構築ソフト「Prime」（Schroedinger社）を用いた構造モデリングにより、推定立体構造図を作成した（図１６）。
【００７９】
（８−２）  PCRでの分析結果
PCRで分析した結合アッセイにおいて、R7ライブラリータンパク質融合体はVEGFを含んでいないネガティブコントロールに対しては0.2％未満しか結合しない（図１４ａ（１））。一方、VEGFビーズとは有意な結合（2％以上；図１４ａ（２））を示した。核酸アプタマー、すなわち、mRNA/cDNAハイブリッドを介してライブラリーのエンリッチメントの可能性を検証するためmRNA−リンカーの逆転写によってR7mRNA/cDNAハイブリッドを調製して結合の可能性を試験した。その結果、VEGFに対してmRNA/cDNAハイブリッドを介する結合は観察されなかった（0.2％未満；図１４ａ（３））。R7タンパク質融合体もFcに対する親和性を示さず（0.2％未満；図１４ａ（４））、3Fライブラリーの標的（VEGF）特異的エンリッチメントを示唆した。ELISAによる結合アッセイにおいて、R7タンパク質融合体は、VEGFを含まないSAビーズ（１）及びネガティブコントロールとしてFcが固定されたビーズ（４）と比較してVEGFを固定化したビーズに対しては5倍強いシグナルを示した（図１４ｂ）。この結果もこのライブラリーがVEGFに強く特異的であったことを示唆している。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
１．配列番号１：P S primer
２．配列番号２：Pv3 A primer
３．配列番号３：FLAG-tag
４．配列番号４：8-mer peptide library primer(F)
５．配列番号５：8-mer peptide library primer(R)
６．配列番号６：G-1 Loop1
７．配列番号７：G-1 Loop2
８．配列番号８：G-1 Loop3
９．配列番号９：G-2 Loop1
１０．配列番号１０：G-2 Loop2
１１．配列番号１１：G-2 Loop3
１２．配列番号１２：G-3 Loop1
１３．配列番号１３：G-3 Loop2
１４．配列番号１４：G-3 Loop3
１５．配列番号１５：CTx3-3F peptide
１６．配列番号１６：VEGF binding peptide
１７．配列番号１７：1F-Loop I
１８．配列番号１８：1F-Loop II
１９．配列番号１９：1F-Loop III
２０．配列番号２０：h VEGF-A
【図１】
0006478392.tif 000007
【図２】
0006478392.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
0006478392.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006478392.tif 000015
【図１０】
0006478392.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
0006478392.tif 000018
【図１３】
0006478392.tif 000019
【図１４】
0006478392.tif 000020
【図１５】
0006478392.tif 000021
【図１６】
0006478392.tif 000022
【配列表】
0006478392000001.app