(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ断片混合物を有効性分として含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物であって、
前記ＤＮＡ断片混合物は魚類の精液または精巣から分離して生成され、
前記ＤＮＡ断片混合物は分子量が５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａである
ことを特徴とする、虚血性腸炎の予防または治療用組成物。
【請求項２】
前記魚類はサケ類であることを特徴とする、請求項１に記載の虚血性腸炎の予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の精液または精巣から分離されたＤＮＡ断片混合物を含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
産業社会が発展するにつれて、各種のストレスと環境的要因によって消化器系統疾患の患者が増加している趨勢である。消化器系統でたくさん起こる疾病には虚血（ischemic）があり、これは血管の収縮または閉塞により誘発される身体器官、組織、または部位への血液供給の減少状態をいう。虚血の後には血液の再灌流（reperfusion）が起こりながら神経細胞が損傷されるなど、多様な後遺症が引き起こされる。虚血は、窮極的に非可逆的な損傷、即ち細胞及び組織の壊死からなることによって、虚血性腸炎のような疾患が表れることがある。
【０００３】
虚血性腸炎（ischemic colitis、ＩＣ）は大腸を侵犯する血管性疾患のうち、最もありふれた形態であり、全体虚血性胃腸管疾患の約５０〜６０％を占める（Suh D.C.et al.,2007:非特許文献1）。虚血性腸炎は、激しくない場合、腹痛と下痢のような非特異的な症状で、大部分は病院を訪ねる前に症状が好転する場合が多く、病院を訪ねる場合には大慨血性下痢と腹痛が主症状であるが、保存的治療により好転する場合が多い。
【０００４】
虚血性腸炎の原因は、大部分は確認し難い場合が多いが、主に壮年層で腸間膜動脈が血栓症や塞栓症により塞がるか、または心筋梗塞や心不全により内臓動脈が収縮して発生する。腸間膜静脈血栓症、血液の過凝固や低血圧を誘発する薬物、血管炎が原因となることもある（Reinus J.F. et al.,981: 非特許文献2;Hunter G.C.et al.,1988:非特許文献3）。虚血性腸炎は病理学的に３つに大別される。第１は、粘膜と粘膜下組織のみに虚血を起こして保存治療だけでも回復可能な一過性の可逆型、第２は、内側円形筋肉まで虚血を起こした慢性型、第３は、全壁層に急激な虚血を起こす電撃型がある（Toursarkissian B et al.,1997:非特許文献4;Bower T.C.,1993:非特許文献5;Deana D.G. et al.,1995:非特許文献6）。虚血性腸炎の半分程度は自然治癒できる一過性の可逆型であるので、保存的治療だけでも充分であるが、残りの半分は臓全層の壊死や腸穿孔に至ることがあり、その場合、死亡率が高くて手術を念頭に置いた積極的な治療が必要である（Green B.T.et al.2005:非特許文献7;Jung S.H.et al.,2008:非特許文献8）。
【０００５】
ここに、本発明者は魚類の精液または精巣から抽出したＤＮＡ断片混合物を用いて研究を進行していたところ、虚血性腸炎マウスモデルでＤＮＡ断片混合物が細胞の壊死を抑制するということを確認することによって、本発明を完成することができた。
【０００６】
従来の先行技術として、韓国登録特許第０８１８７５２号（特許文献１)では、人間ＦＡＦ１蛋白質を抑制するｓｉＲＮＡを有効性分とする虚血性疾患治療用組成物を開示しているが、ＤＮＡ断片混合物が言及されたことがない。また、韓国公開特許第２００３−０００１３７０号（特許文献２)では、ＥＧＦ活性を有するペプチド及び成長ホルモン分泌促進ヘキサペプチドを用いて内臓虚血を治療することができることを開示しているが、本発明のＤＮＡ断片混合物の構成とは差がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第０８１８７５２号
【特許文献２】韓国公開特許第２００３−０００１３７０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Suh D.C.et al.,2007
【非特許文献２】Reinus J.F.et al.,1981
【非特許文献３】Hunter G.C.et al.,1988
【非特許文献４】Toursarkissian B et al.,1997
【非特許文献５】Bower T.C.,1993
【非特許文献６】Deana D.G.et al.,1995
【非特許文献７】Green B.T.et al,2005
【非特許文献８】Jung S.H.et al.,2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、魚類の精液または精巣から分離されたＤＮＡ断片混合物を含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＤＮＡ断片混合物を含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物に関するものである。
【００１１】
前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精液または精巣から分離したＤＮＡ断片混合物でありうる。
【００１２】
前記魚類は、サケ類でありうる。
【００１３】
前記ＤＮＡ断片混合物は、分子量が３０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａでありうる。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
前記ＤＮＡ断片混合物とは、燐酸、４種類の塩基、デオキシリボース（deoxyribose）からなる生体高分子に該当するＤＮＡで、分子量が低減した断片形態に混合されて存在するものを称する。
【００１６】
前記魚類は、サケ類の魚類であって、好ましくはサケまたは鱒であって、最も好ましくはサケでありうる。
【００１７】
前記ＤＮＡ断片混合物は、分子量が３０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａであって、４０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａのものが好ましく、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａのものが最も好ましい。
【００１８】
また、本発明は前記ＤＮＡ断片混合物及び薬剤学的賦形剤を含む虚血性腸炎の予防または治療用薬学組成物を提供する。前記ＤＮＡ断片混合物は、全体組成物の総重量に対し、好ましくは０．００１〜５０重量％、より好ましくは０．００１〜４０重量％、最も好ましくは０．００１〜３０重量％にして添加できる。
【００１９】
前記薬学組成物は、各々通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤型、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤型化して使用できる。前記薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤には、ラクトーズ、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。
【００２０】
本発明に係るＤＮＡ断片混合物を含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物は、経口及び注射剤にて投与することが好ましい。
【００２１】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は本発明の抽出物または化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、またはラクトーズ、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、しばしば使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。
【００２２】
注射剤は通常の方法により滅菌注射溶液の形態に剤型化して使用することができる。好ましくは、注射用水（大韓薬典規格）に溶かして滅菌注射溶液に利用できる。
【００２３】
本発明の治療用組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、疾患の病理状態、病理状態の深刻度、投与経路、及び処方者の判断によって変わる。
【００２４】
前記ＤＮＡ断片混合物は、２ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを投与することができる。好ましくは、２ｍｇ／ｋｇ〜１６ｍｇ／ｋｇの濃度で投与することができる。投与濃度が２ｍｇ／ｋｇ未満の場合には、治療効果を得ることが難しく、２５ｍｇ／ｋｇを超過する場合には、投与量対比治療効果の上昇程度が大きくない。
【００２５】
前記ＤＮＡ断片混合物は、１日１回または数回に分けて投与できる。
【００２６】
本発明の治療用組成物は、虚血性腸炎の予防または治療のために、ネズミ、家畜、及び人間などの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、子宮内隔膜、または脳血管内の注射により投与できる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は魚類の精液または精巣から分離されたＤＮＡ断片混合物を含む虚血性腸炎の予防または治療用組成物に関するものであって、本発明の組成物が虚血性腸炎の予防または治療に優れる効果があることを確認した。また、本発明の虚血性腸炎予防または治療用組成物は、長期間投与時にも安全で、副作用がほとんど無いことを確認した。
【００２８】
これによって、本発明の虚血性腸炎予防または治療用組成物を用いて安全で、副作用がない、かつ治療効果が優れる虚血性腸炎治療剤を開発することによって、虚血性腸炎治療に大きい助けを与えることができると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】虚血性腸炎の発病に従う患部の温度変化を示している。
【図２】虚血性腸炎が誘発されたネズミにおけるＤＮＡ断片混合物の投与に従う腸組織の変化を肉眼で観察した結果を示している。
【図３】虚血性腸炎が誘発されたネズミにおけるＤＮＡ断片混合物の投与に従う腸の組織学的変化をＨ＆Ｅ染色を通じて示している。
【図４】虚血性腸炎が誘発されたネズミにおけるＤＮＡ断片混合物の投与に従う大腸粘膜の分裂をマッソントリクローム染色を通じて示している。
【図５】虚血性腸炎が誘発されたネズミにおけるＤＮＡ断片混合物の投与に従う細胞死滅関連因子の蛋白質発現を示している。
【００３０】
各々の図面で、（Ａ）は虚血性腸炎が誘発されていない正常群を、（Ｂ）は虚血性腸炎が誘発された群を、（Ｃ）はＤＮＡ断片混合物を２ｍｇ／ｋｇ投与した群を、（Ｄ）はＤＮＡ断片混合物を４ｍｇ／ｋｇ投与した群を、（Ｅ）はＤＮＡ断片混合物を８ｍｇ／ｋｇ投与した群を、（Ｆ）はＤＮＡ断片混合物を１６ｍｇ／ｋｇ投与した群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し、完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
【００３２】
＜実施例１．実験動物の準備＞
実験動物は１８０±５ｇ重さの７週齢のＳ／Ｄ（Sprague Dawley）系列の雄の白ねずみを用いた。
【００３３】
全てのネズミは固型飼料と水を自由に摂取し、２２〜２４℃で湿度が６０％になるように維持し、昼夜の周期が１２時間間隔に調節される実験室環境で飼育した。飼育したネズミは以下の＜表１＞の実験群に分けて、実験群当たり１０頭ずつ使用した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
＜実施例２．虚血性腸炎動物モデルの製造＞
【００３６】
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【００３７】
＜実施例３．薬物投与＞
実施例２の虚血性腸炎動物モデルに本発明のＤＮＡ断片混合物を投与して虚血性腸炎の治療効果を確認した。
【００３８】
0006530828.tif 000004
【００３９】
＜実施例４．患部の温度測定＞
【００４０】
虚血性腸炎誘発の確認は炎症が起こった患部で熱が増加することに起因してレーザー温度計（ＭＴ６、Ｒａｙｔｅｋ Ｃｏ．，ＣＡ．ＵＳ）を用いて虚血性腸炎誘発前と誘発後に１週単位で３回、総４回実施し、その結果を図１に示した。
【００４１】
図１を説明すると、虚血性腸炎の誘発後の患部温度が正常群（Ａ）を除外した全ての実験群で増加することと表れて、２次検査ではＤＮＡ断片混合物濃度依存的に患部の温度が低くなることと表れた。特に、１６ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ断片混合物を投与した群（Ｆ）で最も高い減少効果を示した。ＤＮＡ断片混合物の投与３週後の測定検査でもＤＮＡ断片混合物を投与した集団の患部の温度の統計的に意味ある減少を確認した。
【００４２】
＜実施例５．腸観察＞
【００４３】
0006530828.tif 000005
【００４４】
図２に示すように、虚血性腸炎を誘発させた群（Ｂ）の場合には、虚血させた大腸部位に壊死が増加することと表れて、腸外部の血管出血も観察された。一方、ＤＮＡ断片混合物を投与した場合（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）には、虚血による壊死が好転して正常群（Ａ）の状態と類似な大腸形態を維持していることが分かった。
【００４５】
これを通じて、ＤＮＡ断片混合物の投与が虚血性腸炎により誘発された大腸部位の壊死を抑制または治療できることが分かった。
【００４６】
＜実施例６．組織染色＞
実施例６−１．組織処理
【００４７】
実施例５で、腸組織を撮影したネズミを用いて組織を摘出した。このうち、一部の組織を１００ｍＭ燐酸緩衝液に溶かした４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）固定液に２４時間の間入れて組織固定を実施した。この後、７０％、８０％、９０％、及び１００％エタノールに順次に入れて脱水分させ、キシレン（xylene）で沈着させた後、硬質パラフィン（Leica、ＵＳＡ）溶液を用いて３段階の過程を経て組織にパラフィンを侵襲させた。侵襲が終わった組織は切片を製作するためにブロックを作り、固定されたパラフィン組織をパラフィン切片器（Shandon Finesse 325、Thermo Electron Co., England）を用いて５μｍ厚さに切片を組織した。組織切片をコーティングスライドガラスに付けた後、３７℃スライドオーブンで１６〜１８時間放置した。
【００４８】
実施例６−２．Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin and eosin）染色
【００４９】
0006530828.tif 000006
【００５０】
図３に示しように、虚血性腸炎誘発群（Ｂ）は正常群（Ａ）に比べて大腸内粘膜部位で凝縮と分裂をはじめとする組織の損傷が観察された。しかしながら、ＤＮＡ断片混合物を投与した群（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）では虚血によって引き起こされた大腸内粘膜の凝縮及び分裂が減少することと表れて、これは投与したＤＮＡ断片混合物濃度依存的であることが分かった。
【００５１】
実施例６−３．マッソントリクローム（Masson's trichrome）染色
【００５２】
虚血性腸炎誘発後、ＤＮＡ断片混合物の投与に従う大腸粘膜の分裂程度を確認するための方法に、総コラーゲン繊維（total collagen fiber）の発現を確認しようとした。これによって、マッソントリクローム染色を実施した。
【００５３】
0006530828.tif 000007
【００５４】
図４に示すように、正常群（Ａ）に比べて虚血性腸炎誘発群（Ｂ）は虚血によって大腸粘膜の分裂が増加した反面に、ＤＮＡ断片混合物を投与した群（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）では虚血によって引き起こされた大腸粘膜の分裂がＤＮＡ断片混合物濃度依存的に減少することを観察することができた。
【００５５】
＜実施例７．細胞死滅関連因子の蛋白質発現確認＞
虚血性腸炎に従う細胞壊死と関連して細胞死滅関連因子の発現程度を確認しようとした。
【００５６】
実施例５で、腸組織を撮影したネズミから摘出した大腸組織を溶解バッファ（lysis buffer）で蛋白質を抽出した後、遠心分離して上層液を得た後、Bio-Radの蛋白質定量試薬を使用して蛋白質濃度を定量して５０μｇの蛋白質を得た。
【００５７】
前記で確保した蛋白質５０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させた後、ニトロセルロースメンブレン（nitrocellulose membrane）で蛋白質をトランスファー（transfer）させた。蛋白質がトランスファーされたメンブレンを５％脱脂粉乳（skim milk）でブロッキング（blocking）させた後、ＢａｘまたはＢｃｌ−２に対抗する１次抗体を４℃で１６〜１８時間の間処理した。この際、定量対照群にＧＡＰＤＨ抗体を用いた。１次抗体を処理したメンブレンをＴＢＳＴ溶液（Tris-buffered saline with 0.05% tween 20）で１０分ずつ３回洗浄した。洗浄したメンブレンに各々の一次抗体に対抗する２次抗体を入れて、常温で１時間の間反応させた後、またＴＢＳＴ溶液で１５分ずつ３回洗浄した。洗浄したメンブレンにＥＣＬ溶液（enhanced chemiluminescence solution）を処理して蛋白質バンドを確認した。その結果を図５に示した。
【００５８】
図５に示すように、細胞死滅因子（apoptotic factor）であるＢａｘの場合、正常群（Ａ）に比べて虚血性腸炎が誘発された群（Ｂ）でその発現が増加することを観察した。２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ断片混合物を投与した場合には、Ｂａｘの発現が増加したが、８ｍｇ／ｋｇ及び１６ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ断片混合物を投与した場合には、濃度依存的にＢａｘの発現が減少することが分かった。一方、抗細胞死滅因子（anti-apoptotic factor）であるＢｃｌ−２の場合には、虚血性腸炎誘発群（Ｂ）と比較した時、ＤＮＡ断片混合物を投与した群（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で発現が増加することが分かった。
【００５９】
これを通じて、ＤＮＡ断片混合物が虚血性腸炎が発生した部位の細胞壊死を抑制することによって、虚血性腸炎が治療できることを予測することができた。
【図１】
0006530828.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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