(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相溶媒又は添加剤の存在下、当該移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子（Ｍ１）と、当該分子が付加されずにイオン化される分子（Ｍ２）とを含む試料において、前者により生じたイオンと後者により生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合に、当該分子同士を区別して検出する質量分析方法であって、移動相溶媒又は添加剤として少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物を用いる方法。
【請求項２】
前者により生じたイオンが［Ｍ１＋ＨＣＯＯ］−又は［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−であり、後者により生じたイオンが［Ｍ２−Ｈ］−である請求項１記載の質量分析方法。
【請求項３】
前者により生じたイオンが［Ｍ１＋ＮＨ４］＋であり、後者により生じたイオンが［Ｍ２＋Ｈ］＋である請求項１記載の質量分析方法。
【請求項４】
少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物が、重水、メタノール−ｄ４、エタノールｄ６、アセトニトリル−ｄ３、酢酸メチル−ｄ３、酢酸−ｄ４、酢酸ナトリウム−ｄ３、酢酸アンモニウム−ｄ７、ギ酸−ｄ２、ギ酸ナトリウム−ｄ１、アンモニア−ｄ３、アンモニア−１５Ｎ、アンモニア−１５Ｎ，ｄ３、水酸化アンモニウム−ｄ５、クロロホルム−３７Ｃｌから選択される請求項１〜３の何れか１項記載の質量分析方法。
【請求項５】
試料が、高速液体クロマトグラフィーによって質量分析装置に導入される、請求項１〜４の何れか１項記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体標識試薬を用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析は、分子をイオン化し、生じたイオンを、真空中でｍ／ｚ（質量数／電荷）に応じて分離及び検出する手法である。分子をイオン化する際、分子及び条件により生成するイオンの種類が変わる場合が存在する。例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）においては、液体クロマトグラフィーと質量分析装置との間のインターフェイスとして主に大気圧イオン化法（ＡＰＩ）が採用され、試料分子と移動相溶媒との間のプロトン移動によってイオン化が行なわれるが、その際に移動相溶媒由来の分子が試料分子に付加したイオンが生成されることがある。また、ＬＣ／ＭＳに限らず、イオン化効率を上げるためにイオン化促進剤（例えば、酢酸、ギ酸又はそれらの塩）のような添加剤を用いることがあるが、それに起因するイオンが生成することも知られている。
【０００３】
例えば、ポジティブイオンモードでは、アンモニウム塩やアンモニア等の添加によって生成するアンモニウムイオン付加分子（［Ｍ＋ＮＨ４］＋）やナトリウム塩等の添加によって生成するナトリウムイオン付加分子（［Ｍ＋Ｎａ］＋）等が検出され、ネガティブイオンモードでは、酢酸や酢酸アンモニウム等の添加によって生成する酢酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＣＨ３ＣＯＯ］−）やギ酸やギ酸アンモニウム等の添加によって生成するギ酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−）等が検出される。
このような多種のイオン種がイオン化の工程で生成することによって、成分同士のｍ／ｚが重なり質量で分離することが困難な場合がある。また、成分の同位体も同時に検出されるため、ｍ／ｚの差が２以内に隣接する場合でも、質量分離が困難な場合がある。
通常は、液体クロマトグラフィーの分子間相互作用による分離と組み合わせて成分を分離するのが一般的ではあるが、液体クロマトグラフィーによる迅速分析の場合、このような付加分子を分離することは困難な場合がある。
【０００４】
同一ｍ／ｚの化合物を分離する手法としては、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる衝突誘起解離を用いて構造の違いにより分離すること（非特許文献１）、高質量分解能を持つ質量分析計を使用した精密質量により分離を行うこと（非特許文献２）等が知られている。また一般的に使用される添加剤の種類を変更し生成するイオン種を変えることでも分離できる場合がある。
しかしながら、非特許文献１の方法では、ＭＳ／ＭＳが使用可能な高性能装置が必要であるだけでなく、衝突誘起解離が起こりやすい分子のみに限定される。また、非特許文献２では、同一の組成式の分子を分離することができない。また、一般的な添加剤では分離が困難な場合が存在する。
【０００５】
一方、ＬＣ／ＭＳ等の移動相あるいは添加剤に重水や重水素化メタノール等の安定同位体標識試薬を使用した報告はあるが（非特許文献３）、これは分析対象化合物の構造解析を目的とするものである。また、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）やマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）等の質量分析で、マトリクスを安定同位体標識している報告（特許文献１）もあるが、これはマトリクスと成分を分離するという観点から使用されているものである。斯様に、安定同位体標識試薬を用いて、成分同士の質量分離を行った例はこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１６００８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Analytical Biochemistry, 302(2002)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, Vol. 78, January 2006
【非特許文献３】Journal of Chromatographic Science, Vol. 41, September 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｍ／ｚが同一となる又は隣接するイオンを生成する試料分子の質量分離を可能とする質量分析方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、類似の基本構造を有し総炭素数が異なるセラミド分子において、プロトン脱離イオンが、酢酸や酢酸アンモニウム等の付加によって生じる付加イオンのｍ／ｚと重複して質量分離できない場合であっても、安定同位体標識試薬を用いることにより、それらを質量分離して検出可能であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、移動相溶媒又は添加剤の存在下、当該移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子（Ｍ１）と、当該分子が付加されずにイオン化される分子（Ｍ２）とを含む試料において、前者により生じたイオンと後者により生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合に、当該分子同士を区別して検出する質量分析方法であって、移動相溶媒又は添加剤として少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物を用いる方法、に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、移動相溶媒又はイオン化促進剤の存在下で分子をイオン化した場合に、ｍ／ｚが重複して区別して検出できない分子同士を質量分離することが可能となる。本発明の方法は、脂質等の類似の基本構造を有し且つ広い鎖長分布を持つ成分の質量分離に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】セラミド及びジアシルグリセロールのマススペクトル。左側：移動相として酢酸−ｄ４を使用、右側：移動相として酢酸を使用。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の質量分析方法は、移動相溶媒又は添加剤の存在下、当該移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子と、当該分子が付加されずにイオン化される分子とを含む試料において、前者により生じたイオンと後者により生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合に、当該分子同士を区別して検出するものである。
ＬＣ／ＭＳ等の質量分析法において、分子のイオン化は、通常大気圧イオン化（ＡＰＩ）法等のインターフェイスを用いて行われ、一般的には、ポジティブイオンモードでは［Ｍ＋Ｈ］＋、ネガティブイオンモードでは［Ｍ−Ｈ］−が検出される。この際、分子の種類や条件によっては、移動相溶媒又は添加剤に由来する分子が付加したイオンが生じる場合がある。
本発明において、移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子（Ｍ１とする）とは、イオン化に際して、移動相溶媒又は添加剤に由来する分子が付加されて付加イオンを生じる測定対象分子を意味する。
ここで、移動相溶媒としては、ＬＣ／ＭＳにおける、液体クロマトグラフィーの移動相として用いられる溶媒が挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、２−プロパノール、アセトン、水、テトラヒドロフラン、クロロホルム等が例示される。
添加剤としては、質量分析においてイオン化効率を向上させるためのイオン化促進物質や、分離度を向上するための物質が挙げられであり、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸又はそれらの塩、好ましくは酢酸、酢酸アンモニウム、ギ酸、ギ酸アンモニウム等が例示される。
【００１４】
斯かる移動相溶媒又は添加剤に由来する分子が付加してイオン化されたイオンとしては、例えば、ポジティブイオンモードにおける、［Ｍ１＋ＮＨ４］＋、［Ｍ１＋Ｋ］＋、［Ｍ１＋Ｎａ］＋、［Ｍ１＋Ｈ＋ＣＨ３ＯＨ］＋、［Ｍ１＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ］＋、ネガティブイオンモードにおける、［Ｍ１＋ＨＣＯＯ］−、［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−、［Ｍ１＋Ｃｌ］−等が挙げられる。
【００１５】
一方、移動相溶媒又は添加剤に由来する分子が付加されずにイオン化される分子（Ｍ２とする）とは、イオン化に際し、移動相溶媒又は添加剤が存在する場合であっても、これらに由来する分子が付加する割合が低く、主にプロトン脱離又はプロトン付加（これらからＨ２Ｏが脱離したものも包含する）されてイオン化される測定対象分子を意味する。斯かる分子により生じるイオンとしては、例えば、ポジティブイオンモードにおける、［Ｍ２＋Ｈ］＋、［Ｍ２＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋、ネガティブイオンモードにおける、［Ｍ２−Ｈ］−が挙げられる。
【００１６】
本発明において、上記の測定対象分子は、それぞれの分子から生じたイオンのｍ／ｚ（質量数／電荷）が同一となる又は隣接するものであれば、その種類は特に限定されるものではない。
【００１７】
移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化されて生じたイオンと、当該分子が付加されずにイオン化されて生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合としては、Ｍ２の分子中にＭ１のイオン化の際に付加された移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の構成原子が含まれ、結果としてＭ１から生じた付加イオンとＭ２から生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合が挙げられる。
例えば、Ｍ１が、［Ｍ１＋ＨＣＯＯ］−や［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−を生じる場合、類似の基本構造を有し且つ広い鎖長分布を持つ成分、例えば、セラミド等のスフィンゴ脂質、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール等のアシルグリセロール、ホスファチジルコリン等のリン脂質、脂肪酸や界面活性剤等においては、Ｍ２から生じる［Ｍ２−Ｈ］等とｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合が多く存在すると考えられる。
ここで、ｍ／ｚが隣接するとは、成分中の天然同位体の影響を大きく受けるほどｍ／ｚが近いことを意味し、具体的には成分同士のｍ／ｚの差が２以内であることを意味する。
【００１８】
具体的には、以下に示すＮ−（α−ＯＨ−アシル）−フィトスフィンゴシン・セラミド（ＡＰ型セラミド）は、プロトンが脱離して［Ｍ２−Ｈ］−を生じる分子であり、Ｎ−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミド（ＮＤＳ型セラミド）は、酢酸分子が付加して付加イオン［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−を生じる分子である。そして、スフィンゴシンの炭素数と脂肪酸の炭素数を合計した総炭素数（ＴＣ）４２、４４、４６，４８及び５０のＡＰ型セラミドから生成する［Ｍ２−Ｈ］−と、総炭素数４０、４２、４４、４６及び４８のＮＤＳ型セラミドから生成する［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−のｍ／ｚは、６８３、７１１、７３９，７６７，７９５でそれぞれ同一となる。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
【表１】
0006530657.tif 000003
【００２１】
以下に、［Ｍ２−Ｈ］−と、［Ｍ１＋ＨＣＯＯ］−、［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−、［Ｍ１＋Ｃｌ］−のｍ／ｚが同一となる又は隣接する分子、及び［Ｍ２＋Ｈ］＋又は［Ｍ２＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋と、［Ｍ１＋ＮＨ４］＋、［Ｍ１＋Ｋ］＋、［Ｍ１＋Ｈ＋ＣＨ３ＯＨ］＋、［Ｍ１＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ］＋のｍ／ｚが同一となる又は隣接する分子の例を示す。なお、表２に示すＣはグリセリンの炭素数を含まない、グリセリドの脂肪酸骨格の合計炭素数と不飽和度である。
【００２２】
【表２】
0006530657.tif 000004
【００２３】
本発明の方法においては、移動相溶媒又は添加剤として、少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物が用いられる。
斯かる化合物としては、上述した移動相溶媒（メタノール、アセトニトリル、２−プロパノール、アセトン、水等）、緩衝液あるいは添加剤（酢酸、酢酸アンモニウム、ギ酸、ギ酸アンモニウム等）における水素原子、窒素原子、炭素原子を、重水素、１４Ｎ、１５Ｎ、１３Ｃに置換した化合物が挙げられる。
具体的には、重水、メタノール−ｄ４、エタノールｄ６、アセトニトリル−ｄ３、酢酸メチル−ｄ３、酢酸−ｄ４、酢酸ナトリウム−ｄ３、酢酸アンモニウム−ｄ７、ギ酸−ｄ２、ギ酸ナトリウム−ｄ１、アンモニア−ｄ３、アンモニア−１５Ｎ、アンモニア−１５Ｎ，ｄ３、水酸化アンモニウム−ｄ５、クロロホルム-３７Ｃｌ、等が挙げられる。
また、これらを使用することによって、生成し得る付加イオンとしては、例えば、［Ｍ１＋Ｄ］＋、［Ｍ１＋ＮＤ４］＋、［Ｍ１＋ＮＤ３Ｈ］＋、［Ｍ１＋１５ＮＨ４］＋、［Ｍ１＋１５ＮＤ３Ｈ］＋、［Ｍ１＋１５ＮＤ４］＋、［Ｍ１＋Ｄ＋ＣＤ３ＯＤ］＋、［Ｍ１＋Ｄ＋ＣＤ３ＣＮ］＋、［Ｍ１＋４１Ｋ］＋、［Ｍ１＋ＤＣＯＯ］−、［Ｍ１＋ＣＤ３ＣＯＯ］−、［Ｍ１＋３７Ｃｌ］−等が挙げられる。
【００２４】
斯かる標識化合物は、検出すべき測定対象分子や検出モードに合わせて、適宜選択して用いればよいが、基本的には、例えば［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−を生成しやすい分子には、対応する［Ｍ１＋ＣＤ３ＣＯＯ］−を生成する安定同位体標識化合物（酢酸−ｄ４、酢酸ナトリウム−ｄ３）を用いるのが好ましい。
例えば、上述したＮ−（α−ＯＨ−アシル）−フィトスフィンゴシン・セラミド（ＡＰ型セラミド）と、Ｎ−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミド（ＮＤＳ型セラミド）を分離して検出する場合、移動相溶媒として酢酸−ｄ４を用い、Ｎ−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミドを［Ｍ１＋ＣＤ３ＣＯＯ］−として検出することにより、総炭素数４２、４４、４６，４８及び５０のＡＰ型セラミドと、総炭素数４０、４２、４４、４６及び４８のＮＤＳ型セラミドを質量分離することができる。
【００２５】
【表３】
0006530657.tif 000005
【００２６】
本発明の方法において適用される試料は、移動相溶媒又は添加剤の存在下、当該移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子と、当該分子が付加されずにイオン化される分子とをそれぞれ少なくとも１種以上含む試料であれば特に限定されない。例えば、脂質分子を測定する場合には、ヒトや動物等の生物の生体や死体から採取した皮膚、皮膚角質層、毛、臓器、血液、体液、及びそれらから再構成した細胞や組織等を用い、適宜溶媒抽出して目的の分子を含む試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィーに供すればよい。
【００２７】
本発明の質量分析方法は、試料を、移動相溶媒又はイオン化促進剤の存在下、移動相溶媒又はイオン化促進剤に由来する分子が付加したイオンを生じるような、イオン化インターフェイスを装備した質量分析装置に導入することにより行われる。
斯かるインターフェイスとしては、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法等の大気圧イオン化（ＡＰＩ）法や、サーモスプレー（ＴＳＰ）法、パーティクルビーム（ＰＢ）法、フローＦＡＢ法等の真空中イオン化法が挙げられ、このうち大気圧イオン化（ＡＰＩ）法が好ましく、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法がより好ましい。
また、質量分析装置としては、四重極型質量分析装置（Ｑ−ＭＳ）、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）、フーリエ変換型質量分析装置（ＦＴ−ＭＳ）等のシングル型の質量分析装置、Ｑ−ＴＯＦ、ＩＴ−ＴＯＦ等のハイブリッド型質量分析装置、又はトリプル四重極型等のタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ等）等の公知の質量分析装置を用いることができる。
また、試料を、インターフェイスを装備した質量分析装置に導入する手段としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、シリンジポンプ等を挙げることができるが、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーである。すなわち、本発明の方法を実行するための好適な装置としては、液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）が挙げられる。
【００２８】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００２９】
＜１＞移動相溶媒又は添加剤の存在下、当該移動相溶媒又は添加剤に由来する分子の付加によりイオン化される分子（Ｍ１）と、当該分子が付加されずにイオン化される分子（Ｍ２）とを含む試料において、前者により生じたイオンと後者により生じたイオンのｍ／ｚが同一となる又は隣接する場合に、当該分子同士を区別して検出する質量分析方法であって、移動相溶媒又は添加剤として少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物を用いる方法。
＜２＞前者により生じたイオンが［Ｍ１＋ＨＣＯＯ］−又は［Ｍ１＋ＣＨ３ＣＯＯ］−であり、後者により生じたイオンが［Ｍ２−Ｈ］−である上記＜１＞の質量分析方法。
＜３＞前者により生じたイオンが［Ｍ１＋ＮＨ４］＋であり、後者により生じたイオンが［Ｍ２＋Ｈ］＋又は［Ｍ２＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋である上記＜１＞の質量分析方法。
＜４＞少なくとも１個の原子が安定同位体で標識された化合物が、重水、メタノール−ｄ４、エタノールｄ６、アセトニトリル−ｄ３、酢酸メチル−ｄ３、酢酸−ｄ４、酢酸ナトリウム−ｄ３、酢酸アンモニウム−ｄ７、ギ酸−ｄ２、ギ酸ナトリウム−ｄ１、アンモニア−ｄ３、アンモニア−１５Ｎ、アンモニア−１５Ｎ，ｄ３、水酸化アンモニウム−ｄ５、クロロホルム−３７Ｃｌから選択される上記＜１＞〜＜３＞の何れかの質量分析方法。
＜５＞試料が、高速液体クロマトグラフィーによって質量分析装置に導入される、上記＜１＞〜＜４＞の何れかの質量分析方法。
【００３０】
＜６＞上記＜２＞において、試料は、セラミド等のスフィンゴ脂質、トリアシルグリセロール等のアシルグリセロール、ホスファチジルコリン等のリン脂質、脂肪酸、又は界面活性剤である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
（１）セラミド・ジアシルグリセロールの標準試料の調製
Ｍ２：ＡＰ型セラミド（Ｎ−（２’−（Ｒ）−Ｈｙｄｒｏｘｙｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）−Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を５ｍｇ秤量しエタノール１００ｍＬに溶解した。その後、エタノールで１０μｇ／ｍＬに希釈し、試料溶液を調製した。
Ｍ１：ジアシルグリセロール（１，３−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃａｎｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）を５ｍｇ秤量、エタノール１００ｍＬで溶解し、試料溶液を調製した。
【００３２】
（２）ＬＣ−ＭＳによる分析
（１）で調整した試料溶液を、下記のＬＣ−ＭＳ測定条件にてフローインジェクション分析により、セラミド及びジアシルグリセロールの検出を行った。
【００３３】
（ＬＣ−ＭＳ測定条件）
液体クロマトグラフ：ＬＣ−３０Ａシステム（島津製作所）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入量５μＬ、分析時間２ｍｉｎ
移動相：０．０５％（ｖ／ｖ）酢酸−ｄ４含有エタノール、又は０．０５％（ｖ／ｖ）酢酸含有エタノール
質量分析計：ＬＣＭＳ−２０２０（島津製作所）
イオン化法：ＡＰＣＩ
極性：負イオン
インターフェイス電圧：−４５００Ｖ
イベント時間：０．４０ｓｅｃ
測定開始ｍ／ｚ：６００
測定終了ｍ／ｚ：７５０
マススペクトル積算時間：０−０．５ｍｉｎ
【００３４】
（３）結果
結果を図１に示す。
図１より、酢酸を使用した場合、ジアシルグリセロールの[Ｍ＋ＣＨ３ＣＯＯ]−のｍ／ｚがセラミドの同位体の[Ｍ−Ｈ]−に重複するが、酢酸−ｄ４を使用することにより、ジアシルグリセロールとセラミドとの重複を回避することが可能となる。
【図１】
0006530657.tif 000006