(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを予測するための方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプルにおける１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、前記バイオマーカーは、
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）［４２：８］
（ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）［３２：５］
（ｉｖ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１８：０／２２：５］
（ｖ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）［１８：０／１６：１］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２０：３／２０：３］
（ｖｉｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２２：５／１８：１］
から選択される、ステップ、及び
（ｂ）前記サンプルにおける前記バイオマーカーのレベルを基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較した前記サンプルにおける前記バイオマーカーのレベルは前記対象におけるＥＡＴのレベルを示し、
前記サンプルは、前記対象から得られた全血又は血液画分を含む、
方法。
【請求項２】
前記対象からの前記サンプルにおける、
（ｉ）ＰＣ［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ＤＡＧ［４２：８］
（ｉｉｉ）ＰＥ−Ｏ［３２：５］
から選択される１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象からの前記サンプルにおける、
（ｉ）ＰＣ［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ＤＡＧ［４２：８］
（ｉｉｉ）ＰＥ−Ｏ［３２：５］
から選択される２つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象からの前記サンプルにおける、
（ｉ）ＰＣ［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ＤＡＧ［４２：８］
（ｉｉｉ）ＰＥ−Ｏ［３２：５］
の各々のレベルを決定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＣ［１６：１／１６：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＣ［１６：１／１６：１］のレベルの減少がＥＡＴのより高いレベルを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＡＧ［４２：８］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＤＡＧ［４２：８］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＥ−Ｏ［３２：５］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＥ−Ｏ［３２：５］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣ［１８：０／２２：５］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＣ［１８：０／２２：５］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、及び／又は
ＰＩ［１８：０／１６：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＩ［１８：０／１６：１］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、及び／又は
ＰＧ［２０：３／２０：３］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＧ［２０：３／２０：３］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、及び／又は
ＰＧ［２２：５／１８：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した前記対象からの前記サンプルにおけるＰＧ［２２：５／１８：１］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルは、前記対象から得られた血清又は血漿を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基準値は、対象の対照集団における前記バイオマーカーの平均レベルに基づくものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーのレベルは質量分析により決定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマーカーのレベルはショットガンリピドミクスにより決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
基準値と比較した前記サンプルにおける前記バイオマーカーのレベルは、心血管障害又は代謝障害を発症するリスクを示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記心血管障害は冠動脈疾患である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを調節するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ
を含み、
前記対象が、ＥＡＴの非健常なレベルを示す前記バイオマーカーのレベルを有する場合に、前記対象の生活習慣が改変されてＥＡＴのレベルが調節される、
方法。
【請求項１６】
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを調節するために前記対象の生活習慣の改変を選択するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ
を含み、
ステップ（ａ）において決定されたバイオマーカーのレベルに基づいて生活習慣における適切な改変が選択される、
方法。
【請求項１７】
ＥＡＴのレベルの調節はＥＡＴのレベルの低減を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象における生活習慣の改変は食事の変更を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
食事の変更は、ＥＡＴの増加を防止する食事の一部である少なくとも１種の栄養製品を前記対象に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
食事の変更は、ＥＡＴの減少を促進する食事の一部である少なくとも１種の栄養製品を前記対象に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
食事の変更は脂肪の消費の低減を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象の生活習慣が改変された後にステップ（ａ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを予測するための方法であって、
（ａ）検出装置を用いて前記対象からのサンプルにおける１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、前記バイオマーカーは、
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）［４２：８］
（ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）［３２：５］
（ｉｖ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１８：０／２２：５］
（ｖ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）［１８：０／１６：１］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２０：３／２０：３］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２２：５／１８：１］
から選択される、ステップ、及び
基準値に対する前記サンプルにおける前記バイオマーカーのレベルに基づいて前記対象におけるＥＡＴのレベルを予測するステップ
を含み、
前記サンプルは、前記対象から得られた全血又は血液画分を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、対象における心外膜脂肪組織のレベルを予測するのに使用することができる数多くの脂質バイオマーカー、及びバイオマーカーの組み合わせを提供する。
【背景】
【０００２】
内臓脂肪組織は心血管代謝障害の重要な予測因子であり、一般的な脂肪の蓄積よりもリスクが高い。
【０００３】
代謝的に有害であり人命を脅かす肥満形態は、内臓脂肪組織における脂肪の蓄積及び臓器における異所性脂肪蓄積に関連する（Ｇｒａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），９８：１１８９−１１９７；Ｄｏｎａｈｕｅ  ａｎｄ  Ａｂｂｏｔｔ，（１９８７），Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２１５；Ｋａｌｋｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １０２：６２１−６２７。詳細には、高度内臓脂肪症（ＶＡ）は、内分泌及び免疫系と相互作用する複雑なシグナル代謝機能により媒介されるアテローム性動脈硬化症を発症する確率の高さと関係する（Ｂａｔｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｍｕｎｄ，（２０１２），Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  ３０：７０−７４；Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１６：３９−４８）。
【０００４】
内臓脂肪には、組織に、すなわち腸間膜及び心外膜脂肪組織に複雑に分布した脂肪蓄積、並びにその他の臓器周辺への末梢蓄積が含まれる（Ｄｕｌｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１−Ｓ３）。これらの内臓組織の代謝には明確な差異が存在することから、結果として疾患の病因に特異的に関与することになる。
【０００５】
心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）は、心臓の周囲に蓄積した特定の形態の内臓脂肪を指す。ＥＡＴは、心臓表面上の心筋と臓側心膜との間に存在し、心臓表面の大部分を覆う。
【０００６】
ＥＡＴの量の増大は偶発性冠動脈疾患及び主要有害心イベントに関連する（Ｍａｈａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  ２；６１（１３）：１３８８−９５）。特に、心外膜脂肪組織は、アテローム性動脈硬化症、内臓脂肪症候群、空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、高血圧、及び真性糖尿病と強い相関を有する。
【０００７】
実際に、ＥＡＴが代謝の健常さについての主要な予測因子になることが知られる子供の生育及び肥満への一般公衆衛生の関心は高まっている。
【０００８】
乾癬患者は、対照群と比較して心外膜脂肪のレベルが高いことも示されている（Ｂａｌｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｏｃｔ２５，ＣＥＤ，１２２１６）。
【０００９】
心外膜脂肪組織は、心エコー、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を含む数多くの撮像技術により計測することができる。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、高額となる場合があり、普段から使用するには適さない。
【００１０】
近年の応用研究により、特異的な代謝産物のプロファイルを、アミノ酸及び種々の脂質種（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リゾリン脂質、スフィンゴミエリン、セラミド）を含む体脂肪分布に関連づけることの実現可能性が示されている（Ｓｚｙｍａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＯＭＩＣＳ  １６：６５２−６６７；Ｙａｍａｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ２：２９−４０）。しかしながら、心外膜脂肪に関連するマーカーは同定されていない。
【００１１】
それゆえ、本発明の目的は、容易に検出可能であり、ＥＡＴの予測を促進する脂質バイオマーカーを提供することであった。このような脂質バイオマーカーは、ＥＡＴのレベルを低減する必要のある対象を特定し、このような対象の生活習慣を適切に改変することにより健康な生活を推進するために使用できる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、血漿リピドームと、血漿リピドームにより総括される特異的な内臓蓄積脂肪に関する情報と、を調査するものである。血漿脂質プロファイルの定量、及び心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）に重点を置いた、特異的な体脂肪蓄積に関する複雑な代謝特性の評価には、ショットガンリピドミクスアプローチが使用されている。
【００１３】
したがって、本発明は、一態様では、
対象におけるＥＡＴのレベルを予測する方法であって、
（ａ）対象からのサンプルにおける１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、バイオマーカーは、
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）［４２：８］
（ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）［３２：５］
（ｉｖ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１８：０／２２：５］
（ｖ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）［１８：０／１６：１］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２０：３／２０：３］
（ｖｉｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２２：５／１８：１］
から選択される、ステップ、及び
（ｂ）サンプルにおけるバイオマーカーのレベルを基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは対象におけるＥＡＴレベルを示す、
方法を提供する。
【００１４】
また、本発明によると、
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを予測する方法であって、
（ａ）検出装置を用いて対象からのサンプルにおける１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、バイオマーカーは、
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）［４２：８］
（ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）［３２：５］
（ｉｖ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１８：０／２２：５］
（ｖ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）［１８：０／１６：１］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２０：３／２０：３］
（ｖｉｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２２：５／１８：１］
から選択される、ステップ、及び
基準値に対するサンプルにおけるバイオマーカーレベルに基づいて対象におけるＥＡＴレベルを予測するステップ
を含む方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、検出装置は質量分析計である。
【００１６】
好ましくは、方法は、前述の対象からのサンプルにおけるＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］及びＰＥ−Ｏ［３２：５］から選択される１つ以上の脂質のレベルを決定することを含む。
【００１７】
一実施形態では、方法は、前述の対象からのサンプルにおけるＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］及びＰＥ−Ｏ［３２：５］から選択される２つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定することを含む。
【００１８】
別の実施形態では、方法は、前述の対象からのサンプルにおけるＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］及びＰＥ−Ｏ［３２：５］の各々のレベルを決定することを含む。
【００１９】
一実施形態では、ＰＣ［１６：１／１６：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＣ［１６：１／１６：１］のレベルの減少がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２０】
別の実施形態では、ＤＡＧ［４２：８］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＤＡＧ［４２：８］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２１】
別の実施形態では、ＰＥ−Ｏ［３２：５］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＥ−Ｏ［３２：５］の増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２２】
別の実施形態では、ＰＣ［１８：０／２２：５］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＣ［１８：０／２２：５］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２３】
別の実施形態では、ＰＩ［１８：０／１６：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＩ［１８：０／１６：１］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２４】
別の実施形態では、ＰＧ［２０：３／２０：３］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＧ［２０：３／２０：３］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２５】
別の実施形態では、ＰＧ［２２：５／１８：１］のレベルが決定され、基準サンプルと比較した対象からのサンプルにおけるＰＧ［２２：５／１８：１］のレベルの増加がＥＡＴのより高いレベルを示す。
【００２６】
別の実施形態では、方法は、対象からのサンプルにおける、脂質バイオマーカー：ＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］、ＰＥ−Ｏ［３２：５］、Ｐ）［１８：０／２２：５］、ＰＩ［１８：０／１６：１］、ＰＧ［２０：３／２０：３］、及びＰＧ［２２：５／１８：１］のうちの２、３、４、５、６、又はすべてを決定することを含む。
【００２７】
一実施形態では、サンプルは、対象から得られた血清又は血漿を含む。
【００２８】
別の実施形態では、基準値は、対象の対照群におけるバイオマーカーの平均レベルに基づくものである。
【００２９】
別の実施形態では、バイオマーカーのレベルはリピドミクス解析により決定される。
【００３０】
現在使用されている、リピドミクス解析用の主要なプラットフォームは、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ）とタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）との併用に基づくものである。ＥＳＩ−ＭＳに基づくアプローチは、質量分析計に注入する前の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の実施の有無に基づいて２つに分類することができる。
【００３１】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）又はＨＰＬＣ−ＭＳは、液体クロマトグラフィー（又はＨＰＬＣ）の物理的分離能を質量分析法（ＭＳ）の質量分析能と組み合わせた分析化学技術である。
【００３２】
サンプル（例えば有機抽出物）をイオン源に直接注入するアプローチは広くショットガンリピドミクスと呼ばれる。
【００３３】
ショットガンリピドミクスは、濃度変化、クロマトグラフィー時の異常、及びイオン対の変化による困難性を回避するために直接注入を用いる。
【００３４】
別の実施形態では、バイオマーカーのレベルは非標的化ショットガンリピドミクス解析により決定される。
【００３５】
ショットガン解析は、所与の生物学的マトリクスの分子組成について定量的な全体像を迅速に提供する。典型的には、脂質は細胞、体液又は組織から抽出され、クロマトグラフィーによる事前のサンプル調製の必要を完全に回避し質量分析計に直接注入される。ハイブリッド型Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置が兼ね備える１００，０００超の質量分解能とｐｐｍ以下の質量精度とが、ＭＳによるスペクトル調査及びそれらのそれぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルからの脂質種の同定及び定量を可能とする。
【００３６】
従来のトリプル四十極ＭＳによる標的の分析と比較して、このアプローチには、分子組成に何らかの制約を加えることなく、種々の脂質クラスからの個々の脂質種を網羅的に迅速かつ確実に同定及び定量するという利点がある。
【００３７】
一実施形態では、基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、ＥＡＴレベルの上昇に伴って心血管障害又は代謝障害などの疾患を発症するリスクを示す。
【００３８】
別の実施形態では、基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、内臓脂肪症候群  空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、高血圧、及び真性糖尿病などのＥＡＴレベルの上昇に関連する疾患を発症するリスクを示す。
【００３９】
別の実施形態では、基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、心血管障害又は代謝障害を発症する指標となる。
【００４０】
別の実施形態では、基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、内臓脂肪症候群、空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、高血圧、及び真性糖尿病を発症する指標となる。
【００４１】
別の実施形態では、基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、健常な対象におけるＥＡＴレベルの減少に伴って心保護作用を喪失するリスク、又はＥＡＴの高すぎる非健常な対象における心保護作用の回復の指標となる。
【００４２】
本発明のさらなる態様では、対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを調節するための方法であって、上述の方法を用いて、対象が、ＥＡＴの非健常なレベルを示すバイオマーカーのレベルを有するものと既に認定されている場合に、対象の生活習慣を改変してＥＡＴのレベルを調節することを含む方法が提供される。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、
対象におけるＥＡＴレベルを調節するための方法であって、
（ａ）上述の方法を用いてバイオマーカーのレベルを決定するステップ、及び
（ｂ）対象が、ＥＡＴの非健常なレベルを示すバイオマーカーのレベルを有する場合に、対象の生活習慣を改変してＥＡＴレベルを調節するステップ
を含む方法を提供する。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、
対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）レベルを調節するために対象の生活習慣の改変を選択するための方法であって、
（ａ）上述の方法を用いてバイオマーカーのレベルを決定するステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）において決定されたバイオマーカーのレベルに基づいて生活習慣における適切な改変を選択するステップ
を含む方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、「ＥＡＴレベルを調節すること」又は「ＥＡＴレベルの調節」は、ＥＡＴにおける上昇を低減又は予防することを含む。
【００４６】
一実施形態では、対象における生活習慣の改変は食事の変更を含む。好ましくは、食事の変更は、ＥＡＴレベルを調節する、例えば、ＥＡＴの低減を促進し、又はＥＡＴの上昇を予防する食事の一部である少なくとも１種の栄養製品を対象に投与することを含む。
【００４７】
例えば、食事の変更は、脂質の消費の低減及び／又は低脂質食の消費の増加を含み得る。
【００４８】
単なる例示目的のため、低脂質食としては、全粒小麦粉及びパン、オーツポリッジ、高食物繊維の朝食用シリアル、未精白の米及びパスタ、野菜及び果物、乾燥豆類及びレンズ豆、ベイクドポテト、ドライフルーツ、クルミ、白身魚、ニシン、サバ、イワシ、燻製にした魚、マイワシ、鮭及び油の少ない白肉が挙げられ得る。
【００４９】
一実施形態では、方法は、対象の生活習慣を改変した後で、対象におけるＥＡＴレベルを予測するステップを繰り返すことをさらに含む。
【００５０】
本発明の別の態様によると、
対象における心血管障害又は代謝障害の発症リスクを予測するための方法であって、
（ａ）対象からのサンプルにおける１種以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、バイオマーカーは、
（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１６：１／１６：１］
（ｉｉ）ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）［４２：８］
（ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）［３２：５］
（ｉｖ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）［１８：０／２２：５］
（ｖ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）［１８：０／１６：１］
（ｖｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２０：３／２０：３］
（ｖｉｉ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）［２２：５／１８：１］
から選択される、ステップ、及び
（ｂ）サンプルにおけるバイオマーカーのレベルを基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、代謝障害又は心血管障害を発症するリスクを示す、
方法が提供される。
【００５１】
一実施形態では、心血管障害はアテローム性動脈硬化症又は冠動脈心疾患である。
【００５２】
別の実施形態では、代謝障害は、空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、又は真性糖尿病である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１。心外膜脂肪、インスリン抵抗性、及び内臓脂肪症を予測するための関係変数の要約である。説明：ＥＦ，心外膜脂肪；ＨＯＭＡ，ＨＯＭＡ−ＩＲ；Ｒ２，内臓脂肪症。表には、ランダムフォレストによる解析により評価される、心外膜脂肪、内臓脂肪、及びＨＯＭＡ−ＩＲの予測における代謝産物の重要性及び安定性を示す。ｎ＝１００００のランダムフォレスト生成後に収集された精度における平均減少度。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
対象におけるＥＡＴレベルの予測：
本発明は、一態様では、対象における心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）のレベルを予測する方法に関する。特定の実施形態では、方法は、非健常なレベルのＥＡＴの診断、ある期間のＥＡＴレベルのモニター、又はＥＡＴに関連する疾患リスクについての対象の識別に使用できる。
【００５５】
例えば、方法は、対象がＥＡＴに関する疾患を有する若しくは発症する尤度を予測するのに、又は対象における現在のＥＡＴレベルを評価するのに使用することができる。方法を使用して、治療介入がＥＡＴレベルの調節、特に低減を促進する有効性を評価することもできる。例えば、本発明は、生活習慣の変更又は食習慣の変更の有効性をモニターするのに使用することができる。
【００５６】
高ＥＡＴレベルに関する典型的な疾患は当業者に知られているが、心血管障害及び代謝障害を含む。
【００５７】
典型的なＥＡＴ関連性疾患としては、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、内臓脂肪症候群、空腹時血糖異常、インスリン抵抗性、高血圧、及び真性糖尿病が挙げられる。
【００５８】
対象：
本発明の方法は、ヒト以外の対象又はヒト対象を含む任意の対象に実施することができる。一実施形態では、対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。対象は、あるいは例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、又はブタなどの非ヒト哺乳動物であってもよい。一実施形態では、対象は、イヌ又はネコなどのコンパニオンアニマルである。
【００５９】
サンプル：
本発明の方法は、対象から得られたサンプルにおける１つ以上の脂質バイオマーカーのレベルを決定するステップを含む。したがって、本発明の方法は、典型的には、人体又は動物体の外で実施され、例えば、検査する対象から予め得られた体液サンプルに対して実施される。好ましくは、サンプルは血液に由来し、すなわちサンプルは全血又は血液画分を含む。最も好ましくは、サンプルは血漿又は血清を含む。
【００６０】
血液サンプルを回収する技術及び血液画分を分離する技術は当該技術分野で周知である。例えば、注射針を用いて患者から静脈血サンプルを採取し、プラスチック製チューブに入れることができる。採血チューブには、例えば、血清分離のため、噴霧被覆したシリカ及びポリマーゲルを入れることができる。血清は、室温にて１３００ＲＣＦで１０分間遠心分離し、小型のプラスチック製チューブで−８０℃で保存することができる。
【００６１】
サンプルにおける脂質バイオマーカーレベルの決定：
個々の脂質種のレベルを任意の適した方法により決定又は評価することができる。例えば質量分析（ＭＳ）を使用することができる。代替的な実施形態では、その他の分光学的方法、クロマトグラフィー的方法、標識による手法、又は定量化学的方法を使用することもできる。最も好ましくは、サンプルにおける脂質レベルは質量分析、特にショットガン質量分析で決定される。典型的には、サンプルにおける脂質レベルと基準値とは同じ分析法により決定される。
【００６２】
脂質：
本発明の方法は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−Ｏ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）から選択される脂質バイオマーカーレベルを決定することを含む。
【００６３】
方法は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定することを含む。バイオマーカーの測定値を組み合わせることにより、ＥＡＴの脂質バイオマーカー特性の改善が達成され得る。
【００６４】
ホスファチジルコリン：
一実施形態では、ＰＣ［１６：１／１６：１］及び／又はＰＣ［１８：０／２２：５］構造を有するホスファチジルコリン（ＰＣ）のレベルが決定される。命名法（Ｘ：Ｙ）において、Ｘは分子の脂肪酸部分中の炭素原子の総数を指し、Ｙは分子の脂肪酸部分中の二重結合の総数を定義する。命名法（Ｘ１：Ｙ１／Ｘ２：Ｙ２）は、ＰＣ分子種の第１（１）及び第２（２）の脂肪酸鎖中の炭素原子の数（Ｘ）及び二重結合の数（Ｙ）を指す。したがって、ＰＣ（１８：０／２２：５）は、第１の脂肪酸鎖に１８個の炭素原子を含み、かつ二重結合は含まず、第２の脂肪酸鎖に２２個の炭素原子を含み、かつ二重結合を５つ含む。
【００６５】
ジアシルグリセロール：
一実施形態では、構造［４２：８］を有するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のレベルが決定される（上で定義された命名法（Ｘ：Ｙ）を用いる）。
【００６６】
ホスファチジルエタノールアミンエーテル：
一実施形態では、構造［３２：５］を有するホスファチジルエタノールアミンエーテル（ＰＥ−０）のレベルが決定される（上で定義された命名法（Ｘ：Ｙ）を用いる）。
【００６７】
ホスファチジルイノシトール：
一実施形態では、構造［１８：０／１６：１］を有するホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のレベルが決定される（上で定義された命名法（Ｘ：Ｙ）を用いる）。
【００６８】
ホスファチジルグリセロール：
一実施形態では、［２０：３／２０：３］及び／又は［２２：５／１８：１］を有するホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のレベルが決定される（上で定義された命名法（Ｘ：Ｙ）を用いる）。
【００６９】
バイオマーカーの組み合わせ：
本発明の方法では個々の脂質バイオマーカーが予測値を有し得るが、方法の質及び／又は予測力は、複数の脂質バイオマーカーからの値を組み合わせることによって向上し得る。
【００７０】
したがって、本発明の方法は、上で定義されたもののうちの少なくとも２つの脂質バイオマーカーのレベルを決定することを含み得る。例えば、方法は、上で定義された２、３、４、５、６、又は７つの脂質種のレベルを決定することを含み得る。
【００７１】
ＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］及びＰＥ−Ｏ［３２：５］を含む組み合わせを検出することを含む方法は特に好ましい。
【００７２】
対照との比較：
本発明の方法は、検査サンプルにおける個々の脂質種のレベルを１つ以上の基準値又は対照値と比較するステップをさらに含む。典型的には、方法において決定される各々の脂質種について特異的な基準値が使用される。基準値は、その脂質種の正常レベルとすることができ、例えば、健常な対象における同じ種類のサンプル（例えば、血清又は血漿）の脂質のレベルとすることができる。基準値は、例えば、対象の対照集団における、例えば、５名、１０名、１００名、又は１０００名以上の健常な対象（検査対象と年齢及び／又は性別が一致しているか、不一致であるかのいずれであってもよい。）における脂質種レベルの平均又は中央レベルに基づくものとすることができる。
【００７３】
対象の脂質バイオマーカーレベルと、対応する基準値との差異の度合いは、ある種の治療介入から最大限の効果を得ることのできる対象を特定するのにも有用である。試験サンプルにおける脂質レベルは、例えば、基準値と比較して少なくとも１％、５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも１００％増加又は低下し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、基準値は、同じ対象から以前に得られた値である。これにより、以前の生活習慣と比べて、対象の現在の生活習慣によるＥＡＴに関連する脂質バイオマーカーレベルに対する効果を直接比較することができ、ひいては改善を直接評価できる。
【００７５】
基準値は、試験サンプルにおける脂質レベルを決定する対応する方法によって決定することができ、例えば、健常な対象から採取した１つ以上のサンプルを用いて決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、対照サンプルにおける脂質レベルは、検査サンプルと並行した分析により決定することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、特定の種類のサンプル（例えば、血清又は血漿）における個々の脂質種のレベルについての基準値は既に利用可能なものであり、例えば刊行物から利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、得られた各検査サンプルに関して対応する測定を対照サンプルに実施することなく、基準値はこれまでに決定されたものとすることができ、あるいは算出又は外挿されたものとすることができる。
【００７６】
ＥＡＴと脂質レベルとの関連：
一般的に、基準値と比較しての検査サンプルにおける上記脂質種のレベルの増減は、ＥＡＴレベルの上昇又は低減の指標となり得る。ＥＡＴの合計レベル及び／又はＥＡＴに関連する疾患リスクは、上述のように異なる脂質バイオマーカーのレベルを決定することによって評価することができる。例えば、対象は、対照に対して調節されている脂質種の数及び／又はそれらの上昇度に従って、低度、中等度、高度、及び／又は超高度のＥＡＴレベルが予測されるものとして階級化することができる。
【００７７】
あるいは、対象は、対照に対して調節されている脂質種の数及び／又はそれらの上昇度に従って、ＥＡＴに関連する疾患について、低度、中等度、高度、及び／又は超高度リスク群に階級化することができる。
【００７８】
ＥＡＴの健常レベルを促進する方法：
一態様では、本発明は、対象におけるＥＡＴレベルを調節する方法を提供する。詳細には、方法は、対象におけるＥＡＴに関連する状態若しくは疾患のリスクを低減するのに、又は対象における寿命を向上するのに使用できる。
【００７９】
方法は、上述の方法により、対象における非健常なＥＡＴレベルの尤度を求める第１ステップを含む。対象における非健常なＥＡＴレベルの尤度の評価後、評価したリスクレベルに基づいて、対象に適切な治療介入戦略（例えば、生活習慣及び／又は食習慣における変更）を選択することができる。
【００８０】
典型的には、対象の有するＥＡＴレベルが低いことが予測された場合、治療介入を行う必要はない。例えば、対象に予測されるＥＡＴレベルが閾値レベル以下である場合、医療による治療又は栄養療法は必要とされない。閾値レベルは、例えば、一般集団におけるＥＡＴの健常又は平均レベルに対応させることができる。
【００８１】
あるいは、対象の有するＥＡＴが高レベルであることが予測される場合、方法は、対象の生活習慣を改変するステップをさらに含み得る。対象における生活習慣の改変は、本明細書に記載される任意の変更であってよく、例えば、食習慣を変える、より多く運動するようにする、作業環境及び／又は生活環境を変えるなどとすることができる。
【００８２】
好ましい変更は、それまでに摂取されていない、又は異なる量で摂取されていた少なくとも１つの栄養製品、例えば、ＥＡＴのレベルに作用する、及び／又はＥＡＴ関連疾患の回避に作用する栄養製品の使用である（食品製品、飲料、ペットフード製品、補助食品、栄養補助食品、食品添加物、又は栄養製剤を含む）。特に好ましい実施形態では、食習慣における変更には脂質レベルの低減が含まれる。
【００８３】
対象の生活習慣の改変には、対象の生活習慣を変更する必要があることを対象に示すことも含まれ、例えば、対象に対して、上述の生活習慣の変更を指示する、推奨する、及び／又は提案することも含まれる。例えば、方法は、上述の少なくとも１つの栄養製品を対象に投与又は提供するステップを含み得る。
【００８４】
ＥＡＴに関連する特定の脂質種のレベルを調節するのに有効である、生活習慣の改変を選択することができる。通常、異なる生活習慣の改変（例えば、個々の栄養製品）は、遺伝的な変動及び環境などの種々の因子に起因して個々の対象における個々の脂質種のプロファイルに対して異なる作用を有し得る。
【００８５】
生活習慣の改変は、対象におけるそれらの個々の脂質種を調節することを目的とした具体的なプログラムと組み合わせて脂質レベルをモニターするなどのように、個別に設定することもできる。例えば、方法は、治療の有効性を評価する目的で、対象における脂質レベルを（再）決定する（すなわち、最初の生活習慣又は食習慣に基づいた治療介入後）、さらなるステップを含み得る。例えば、対象が最初の治療介入フェーズ後にＥＡＴレベルの低減を示した場合、治療介入は低減を維持するよう継続され得る。
【００８６】
しかしながら、対象が最初の治療介入に十分に反応しなかった場合（例えば、特定の脂質レベルにおいて顕著な変化を示さなかった場合）、対象のプログラムは別のものに切り替えることができ、例えば、異なる生活習慣改善法、食習慣、又は栄養剤に切り替えることができる。例えば、最初の栄養管理計画に対して示す反応が乏しかった場合、別の栄養製品を対象に投与することができる。ＥＡＴレベルにおいて所望のレベルの変化が達成されるまで、個々の剤について異なる投与計画を選択することを含むこのプロセスを繰り返すことができる。典型的には、対象には、再度脂質レベルの決定がされるまでの少なくとも１週間、２週間、１か月、又は３か月にわたって特定の栄養管理計画が維持され得る（例えば栄養剤（上で定義されたものなど））。この方法を用いて、生活習慣の変更（食習慣、運動レベル、喫煙、及びアルコール摂取などの変更）による、ＥＡＴに関連する脂質レベルに対する効果をモニターし、ＥＡＴのレベルを調節するのに効果的な因子の組み合わせを特定することができる。
【００８７】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるＥＡＴレベルの調節（又はＥＡＴに関連する疾患の予防若しくは治療）における使用のための、上で定義された栄養剤（例えば、食品製品、飲料、ペットフード製品、食品、栄養補助食品、食品添加物、又は栄養製剤から選択される栄養剤）であって、対象における非健常なレベルのＥＡＴが上述の方法により予測されている栄養剤を提供する。
【００８８】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるＥＡＴレベルを調節する（又はＥＡＴに関連する疾患を予防又は治療する）ための医薬の製造のための、上で定義された栄養剤の使用であって、対象における非健常なレベルのＥＡＴが上述の方法により予測されている使用を提供する。
【００８９】
キット：
さらなる態様では、本発明は、対象におけるＥＡＴレベルを予測するためのキットを提供する。キットは、例えば、本明細書に記載の方法において使用する１つ以上の試薬、標準及び／又は対象サンプルを含む。例えば、一実施形態では、キットは、既定量の（ｉ）ＰＣ［１６：１／１６：１］、（ｉｉ）ＤＡＧ［４２：８］、（ｉｉｉ）ＰＥ−Ｏ［３２：５］、（ｉｖ）ＰＣ［１８：０／２２：５］、（ｖ）ＰＩ［１８：０／１６：１］、（ｖｉ）ＰＧ［２０：３／２０：３］、及び／又は（ｖｉｉ）ＰＧ［２２：５／１８：１］を含む、１つ以上の基準サンプルと、基準サンプルにおける既定量を対象から得られたサンプルにおける脂質レベルと比較することによって対象においてＥＡＴを予測するためのキットの使用についての使用説明書と、を含む。
【００９０】
当業者であれば、開示されている本発明の範囲から逸脱せずとも、本明細書において開示されている本発明のすべての特徴を自在に組み合わせ可能であることを理解するであろう。本発明は、以下、単なる例示目的で具体的な実施形態について説明される。
【実施例】
【００９１】
実施例１（材料及び方法）：
参加者及び実験計画：
スイスのローザンヌ大学病院（ＣＨＵＶ）の肥満外来で、ＣＨＵＶの適切な倫理審査委員会によりインフォームドコンセントを得た後、４０名の健常な肥満白人女性に対して観察研究を実施した。参加者のＢＭＩは２８〜４０、年齢は２５歳齢〜４５歳齢であり、代謝障害の体質は示していなかった。その他の除外基準は、糖尿病、妊娠、試験開始から１か月以内の抗生物質治療、来院日前の１週間の導入期間内の何らかの治療（避妊以外）、及び摂食障害とした。直近３か月間で３キロ以上体重が減少している被験者も除外した。高血圧、耐糖能障害、多嚢胞性卵巣症候群、甲状腺機能障害、及び副腎疾患に罹患している被験者はいなかった。ベースライン（Ｖ０）では、被験者には標準的な医療訪問をさせ、一晩絶食時の血漿サンプルを回収した。一週間後（Ｖ１）、ＣＴ（ＣＨＵＶで取得）及びｉＤＸＡ［Ｎｅｓｔｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｕｎｉｔで取得］で体組成を測定し、間接熱量測定法により安静時エネルギー消費量を測定し、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ブドウ糖７５ｇ）を実施した。一週間後（Ｖ２）、一晩絶食時の血漿及び２４時間の尿サンプルを採取し、メタボノミクス的及びリピドミクス的解析を行った。
【００９２】
化学物質及び標準：
エタノール、クロロホルム、及びイソプロパノール（ＨＰＬＣ等級）はＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。メタノール、水、及び酢酸アンモニウムは、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。合成脂質標準は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから純度９９％超で購入した。個々の脂質化合物の原液はメタノールで調製し、−２０℃で保管した。所望の濃度への希釈溶液は、イソプロパノール／メタノール／クロロホルム４：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）における希釈によって調製した。
【００９３】
臨床的測定、身体測定、及び体組成測定：
これらのパラメータは、既報（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））の通りに測定した。簡単に、標準的な臨床実技により臨床的測定及び身体測定（体重、身長、尻周り）を実施した。全身スキャンを実施して、腹部の脂肪分布及び全身組成の両方を求めた。全身スキャンはＧＥ  Ｌｕｎａｒ  ｉＤＸＡ  ｓｙｓｔｅｍ（ソフトウェア・バージョン：ｅｎＣＯＲＥ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．１０．１１３）により行った。スキャンモードは装置により自動的に決定し、既報の手順を用いた（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。
【００９４】
腹膜内及び皮下脂肪の定量のため、既報（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））の通りに６４ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＣＴ  ｓｃａｎｎｅｒ（ＶＣＴ  Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ，ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＵＳＡ）で腹部のＣＴスキャン測定を行った。被験者は、腕は頭の上に置き、脚はクッションに載せ、仰臥位で横になった。Ｌ４−Ｌ５の椎骨で１回腹部スキャン（１０ｍｍ）を得て、脂肪組織の断面について解析し、平方ｃｍで表した。次の撮像パラメータ：ｚ軸方向の照射線量を１２０Ｋｖ、１００〜２００ｍＡに調節、及び視野５００ｍｍ、を用いた。スライス厚５ｍｍの体軸断層撮影を標準的なカーネルにより再構成した。定量プロセスでは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｗｉｎｄｏｗ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）での皮下脂肪及び腹腔内脂肪の分割のため、準対話型（ｓｅｍｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）の商用アルゴリズムを使用する。Ｄｅｌｔａｔｒａｋ  ＩＩ（Ｄａｔｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、開放式の間接熱量測定で安静時代謝率を測定する。
【００９５】
心膜内、心膜外、及び縦隔脂肪のさらなるＣＴスキャン測定を実施した。４０名中２８名の被験者において、高分解能で心臓脂肪の蓄積が撮像された。
【００９６】
ショットガンリピドミクス解析：
リピドミクス抽出のため、従来法（Ｍａｔｙａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４９：１１３７−１１４６）にわずかに改変を加え、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ  ｒｏｂｏｔ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用するハイスループットの全自動液体／液体抽出法を社内で開発した。３時間未満で９６標本を抽出した。簡単に、サンプルのクリーンアップには５μＬの血清を使用した。脂質抽出は、５μＭ  ＴＡＧ  ４４：１、０．５μＭ  ＤＡＧ  ２４：０、５μＭ  ＰＣ  ２８：０、１μＭ  ＬＰＣ  １４：０、１μＭ  ＰＥ  ２８：０、０．５μＭ  ＬＰＥ  １４：０、１μＭ  ＰＳ  ２８：０、０．５μＭ  ＬＰＳ  １７：１、１μＭ  ＰＩ  ３２：０、０．５μＭ  ＬＰＩ  １７：１、０．５μＭ  ＰＡ  ２８：０、０．５μＭ  ＬＰＡ  １４：０、１μＭ  ＰＧ  ２８：０、０．５μＭ  ＬＰＧ  １４：０、２μＭ  ＳＭ  ３５：１、１μＭ  Ｃｅｒ  ３２：１の内部標準混合物を添加した７００μＬ  ＭＴＢＥ／ＭｅＯＨ（１０／３）で行った。サンプルを４℃で１時間ボルテックスにかけた後、水１５０μＬを加えて相分離させた。５，０００ｇで１０分間遠心分離後、上層の５００μＬの有機相を９６穴深型プレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、アルミ箔で覆い、分析までの間−２０℃で保管した。ＭＳ分析の前に、７．５ｍＭ酢酸アンモニウムを添加した９０μＬのＭＳ測定用緩衝液（イソプロパノール／メタノール／クロロホルム４：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）で１０μＬの全脂質抽出物を希釈した。
【００９７】
既報の研究に基づいて（Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ４７：９６−１０４、及びＳｃｈｕｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８３：５４８０−５４８７）ショットガンリピドミクスアプローチを社内で開発した。Ｎａｎｏｍａｔｅ  ｎａｎｏｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）に連結したＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）システムで分析を実施した。各サンプル抽出物について、２回の連続した注入をそれぞれネガティブイオンモード及びポジティブイオンモードで実施した。セントロイド処理した高衝突乖離（ＨＣＤ）ネガティブＭＳ／ＭＳをＤＤＡモードで得た。各ＤＤＡサイクルは、目的分解能Ｒｍ／ｚ４００を１００，０００とした１回のＭＳ走査スペクトルと、それに続く分解能Ｒｍ／ｚ４００を３０，０００とした２０  ＨＣＤ  ＦＴ  ＭＳ／ＭＳスペクトルの取得から構成した。１回のＤＤＡ試験は２５分で完了した。予めコンパイルしたインクリュージョンリストの質量と５ｐｐｍの精度でｍ／ｚが一致した場合にのみ、前駆イオンをＭＳ／ＭＳにかけた。目的分解能Ｒｍ／ｚ４００は１００，０００として、ポジティブイオンモードでＭＳスペクトルを取得した。さらなるＭＳ／ＭＳ試験は実施しなかった。ＬＰＡ  １７：０（ｍ／ｚ  ４２４．４９２；ネガティブモード）及びｄ１８：１／１７：０  Ｃｅｒ（ｍ／ｚ  ５５１．５２８；ポジティブモード）を基準ピークとして使用することでロック・マス・オプションが可能となった。
【００９８】
Ｈｅｒｚｏｇ及び共同研究者ら（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １２：Ｒ８）のプロトコルに従って、ＬｉｐｉｄＸｐｌｏｒｅｒにより脂質種を同定した。次にデータを外挿し、社内で開発したソフトウェア・ツールによりさらに加工した。通常通りにデータセットをマージし、サンプル成分に含まれる前駆イオンの量と、抽出前に添加した内部標準とを比較することにより、正規化値（サンプル成分に対する内部標準の比）と絶対濃度とを含むＥｘｃｅｌ式出力ファイルを生成した。
【００９９】
脂質は、脂質マップ分類及び命名システムに従ってアノテーションされている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇ）：ＰＣ，ホスファチジルコリン；ＰＣ−Ｏ，ホスファチジルコリン−エーテル；ＬＰＣ，リゾホスファチジルコリン；ＰＥ，ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ−Ｏ，ホスファチジルエタノールアミン−エーテル；ＬＰＥ，リゾホスファチジルエタノールアミン；ＰＳ，ホスファチジルセリン；ＬＰＳ，リゾホスファチジルセリン；ＰＩ，ホスファチジルイノシトール；ＬＰＩ，リゾホスファチジルイノシトール；ＰＧ，ホスファチジルグリセロール；Ｃｅｒ，セラミド；ＳＭ，スフィンゴミエリン；ＤＡＧ，ジアシルグリセロール；ＴＡＧ，トリアシルグリセロール；ホスファチジン酸，ＰＡ。概して、個々の脂質種は次のようにアノテーションした［脂質クラス］［炭素原子の総数］：［二重結合の総数］。
【０１００】
計量化学：
ソフトウェアパッケージＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（ｖｅｒｓｉｏｎ  １３．０，Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＡＢ，Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及び社内で開発したＭＡＴＬＡＢ法（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）ルーチンを使用して、計量化学分析を行った。心外膜脂肪及び内臓脂肪とリピドミクスプロファイルとの関係を調査するため、主成分分析（ＰＣＡ）（Ｗｏｌｄ  Ｓ，Ｅｓｂｅｎｓｅｎ  Ｋ，Ｇｅｌａｄｉ  Ｐ（１９８７）Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｈｅｍｏｍ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔ  ２：３７−５２）、潜在構造投影方法（Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＰＬＳ）（Ｗｏｌｄ  Ｓ，Ｈｅｌｌｂｅｒｇ  Ｓ，Ｌｕｎｄｓｔｅｄｔ  Ｔ，Ｓｊｏｓｔｒｏｍ  Ｍ（１９８７）ＰＬＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  Ｔｗｏ  ｏｒ  Ｍｏｒｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ．ＰＬＳ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、並びに直交潜在構造投影法（Ｏ−ＰＬＳ）（Ｔｒｙｇｇ  Ｊ，Ｗｏｌｄ  Ｓ（２００３）Ｊ  Ｃｈｅｍｏｍ  １７：５３−６４）を使用した。七分割交差検証を使用してモデルの有効性を評価した（Ｃｌｏａｒｅｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７７：５１７−５２６）。
【０１０１】
さらに、パッケージ「ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ」（ＲＦ（商標））（Ｌｉａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｒ  Ｎｅｗｓ  ３：１８−２２）（５００ツリー、５分岐でランダムに変数サンプリング）を使用し、ＲＦ（商標）に実装された変数として重要な特徴（精度／ノード不純度における平均減少度）を利用し、ランダムフォレストによりリピドミクスデータを解析して、総脂肪率又は体脂肪率のいずれかの値を用いて評価した内臓脂肪及び心外膜脂肪と良好に関連する変数を求めた。
【０１０２】
統計的計算ソフトウェア環境Ｒを使用して、スピアマンの自動相関マトリクスを計算し、パッケージＲｇｒａｐｈｖｉｚ  ｖ．１．３２．０を使用して対応するグラフを作成した。単変量での優位性検定もＲで実施した。
【０１０３】
実施例２：
血漿リピドームと、血漿リピドームにより総括される特異的な内臓蓄積脂肪に関する情報と、を調査した。詳細には、磁気共鳴（ＭＲＩ）及びＣＴに基づく最新のイメージング技術により、ＥＡＴを含む内臓脂肪の蓄積について正確な部位特異的な定量を行うことができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ９４：６６２−６６９）。健常な肥満女性の同じコホート研究において、ショットガンリピドミクスアプローチを適用して、血漿脂質プロファイルを定量し、ＶＡ、ＥＡＴ、及びインスリン抵抗性に重点を置いて特異的な体脂肪蓄積に関する複雑な代謝特性を評価した。したがって、本研究は、内臓脂肪の組織分布と健常な肥満女性の血漿リピドームとの関連のしかたがどのように異なるかについて、相補的で新規な見識を提供する。
【０１０４】
心外膜脂肪測定、臨床パラメータ及び体組成パラメータの関係：
コホートの人体測定データ及び臨床データを表１及び２に掲載する。最初のＰＣＡ及びスピアマンの相関分析により、心膜内脂肪、縦隔脂肪、及び心臓周囲脂肪のパラメータは、アンドロイド／ガイノイド脂肪は除き、その他の内臓脂肪量評価と強い相関を示した（例えば、腹腔内脂肪（ＩＰＶＦ）のＬｏｇ１０値（ｒ＝０．５６，ｐ＝０．００２；ｒ＝０．６５，ｐ＜０．００１；ｒ＝０．６６，ｐ＜０．００１）、ＶＡＴ／ＳＡＴ（（ｒ＝０．４９，ｐ＝０．００８；ｒ＝０．５０，ｐ＝０．００６；ｒ＝０．４０，ｐ＝０．０３１）及びＶＡＴ／総腹部脂肪比（ｒ＝０．４９，ｐ＝０．００８；ｒ＝０．４９，ｐ＝０．００６；ｒ＝０．３９，ｐ＝０．０３７）、ＢＭＩ（ｒ＝０．４５，ｐ＝０．０１６；ｒ＝０．５４，ｐ＝０．００３；ｒ＝０．６０，ｐ＜０．００１）、腹部脂肪（ｒ＝０．３９，ｐ＝０．０４０；ｒ＝０．５１，ｐ＝０．００５；ｒ＝０．５６，ｐ＝０．００２）、皮下脂肪（ｒ＝０．６２，ｐ＜０．００１；ｒ＝０．７０，ｐ＜０．００１；ｒ＝０．７１，ｐ＜０．００１）、並びに総脂肪質量（ｒ＝０．４４，ｐ＝０．０１９；ｒ＝０．５２，ｐ＝０．００４；ｒ＝０．５５，ｐ＝０．００２）（図１）。さらに、縦隔脂肪及び心膜内脂肪は、いくつかの除脂肪質量パラメータと相関する。その他の内臓脂肪両評価と同様、心膜内脂肪及び縦隔脂肪はＡＬＡＴ（ｒ＝０．３８，ｐ＝０．０４５；ｒ＝０．４２，ｐ＝０．０２５）、ＡＬＡＴ／ＡＳＡＴ比（ｒ＝０．４９，ｐ＝０．００７；ｒ＝０．５６，ｐ＝０．００２）、血中トリグリセリド（ｒ＝０．４８，ｐ＝０．００９；ｒ＝０．４５，ｐ＝０．０１６）と強く相関した。心外膜脂肪は、主にＡＬＡＴ／ＡＳＡＴ比と相関し（ｒ＝０．４７，ｐ＝０．０１１）、一方すべての心臓脂肪パラメータはＧＧＴ（ｒ＝０．５４，ｐ＝０．０３９；ｒ＝０．５７，ｐ＝０．００１；ｒ＝０．４７，ｐ＝０．０１１）と強く相関した。興味深いことに、その他の内臓脂肪量評価と比較したときに、心臓脂肪パラメータは、絶食時又はＯＧＴＴ中に測定されたブドウ糖及びインスリンパラメータとは統計的には相関しなかった。Ａ及びＢ比は、ＢＭＩ（ｒ＝０．４１，ｐ＝０．０２８；ｒ＝０．４１，ｐ＝０．０２８）、心外膜脂肪（ｒ＝０．４２，ｐ＝０．０２５；ｒ＝０．４２，ｐ＝０．０２５）とは正の相関を有したこと、部位特異的な骨量分布とは負の相関を有したこと（例えば、ガイノイド骨量，ｒ＝−０．４６，ｐ＝０．０１５  ｒ＝−０．４６，ｐ＝０．０１５）を除き、その他のほとんどのパラメータから独立していた。
【０１０５】
心外膜、内臓脂肪症、及びＨＯＭＡ−ＩＲは特異的な血漿脂質組成リモデリングに関係する：
４０名の被験者の血漿リピドームは、１４の異なるクラスに及ぶ２５２の脂質種の相対的定量のため、有効なショットガンリピドミクスアプローチにより特性評価した。解析には、トリアシルグリセロールＴＧ（ｎ＝５０）、ジアシルグリセロールＤＡＧ（ｎ＝１８）、スフィンゴミエリンＳＭ（ｎ＝２４）、セラミドＣｅｒ（ｎ＝１７）、ホスファチジルイノシトールＰＩ（ｎ＝１２）、リソホスファチジルイノシトールＬＰＩ（ｎ＝２）、ホスファチジルグリセロールＰＧ（ｎ＝６）、ホスファチジルエタノールアミンＰＥ（ｎ＝２３）、エーテルホスファチジルエタノールアミンＰＥ−Ｏ（ｎ＝１５）、リゾホスファチジルエタノールアミンＬＰＥ（ｎ＝４）、ホスファチジルコリンＰＣ（ｎ＝４５）、エーテル  ホスファチジルコリンＰＣ−Ｏ（ｎ＝２９）、リソホスファチジルコリンＬＰＣ（ｎ＝６）、及びホスファチジン酸ＰＡ（ｎ＝１）を含む。
【０１０６】
ＯＰＬＳ分析を使用して、内臓脂肪（ＶＡＴ／腹部脂肪比のｌｏｇ１０比，Ｒ２Ｘ＝０．１６，Ｒ２Ｙ＝０．８７、Ｑ２Ｙ＝０．５９）、心臓周囲脂肪（Ｒ２Ｘ＝０．３２，Ｒ２Ｙ＝０．８１，Ｑ２Ｙ＝０．５９、図２）、及びＨＯＭＡ−ＩＲ（Ｒ２Ｘ＝０．３２，Ｒ２Ｙ＝０．５５，Ｑ２Ｙ＝０．２１）について、予測成分１つ及び直交成分１つを用いて３つのモデルを作成した。
【０１０７】
ＶＩＰ及び相関係数に基づくＶｏｌｃａｎｏプロットを用いて影響変数を調査した。並行して、ＲＦ（商標）に実装された変数として重要な特徴を使用して、内臓脂肪、ＨＯＭＡ−ＩＲ、及び心外膜脂肪に最良に関連づけられる代謝情報を特定することができた。
【０１０８】
ＥＡＴの代謝特性を表３に示す。さらに、表３には、ＲＦ（商標）インデックスに基づいて、ＶＡ、ＥＡＴ、及びＨＯＡ−ＩＲについての影響変数の類似性及び相違点を要約する。
【０１０９】
最も顕著な変数はＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］、ＰＥ−Ｏ［３２：５］であった。これらの解析に基づいて、本発明者らはＰＣ［１６：１／１６：１］、ＤＡＧ［４２：８］、ＰＥ−Ｏ［３２：５］、ＰＣ［１８：０／２２：５］、ＰＩ［１８：０／１６：１］、ＰＧ［２０：３／２０：３］、及びＰＧ［２２：５／１８：１］を特徴づけることができる。
【０１１０】
表１：  被験者の体組成についての説明
【表１】
0006527162.tif 000002
注：  ＳＡＴ＝皮下脂肪組織；  ＶＡＴ＝内臓脂肪組織
【０１１１】
表２：  被験者の人体測定パラメータ及び臨床パラメータについての説明
【表２】
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注：  ＢＭＩ＝肥満度指数；  ＨＤＬ−Ｃ＝高密度リポタンパク質コレステロール；  インスリン抵抗性指数＝ＨＯＭＡ−ＩＲ；  ＬＤＬ−Ｃ＝低密度リポタンパク質コレステロール；  ＴＧ＝トリグリセリド；  ＭＡＰ＝平均動脈圧；  ＡＬＡＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ；  ＡＳＡＴ＝アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；  ＧＧＴ＝γ−グルタミルトランスペプチダーゼ；  ＯＧＴＴ＝経口ブドウ糖負荷試験
【０１１２】
表３：  ランダムフォレストによる解析により評価した、ＥＡＴ、ＶＡＴ、及びＨＯＭＡ−ＩＲの予測における代謝産物の重要性及び安定性
【表３】
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説明：  記載の値は、ｎ＝１００００のランダムフォレスト生成後に収集された平均減少度に相当する。変数としての重要な特徴が多くなるほど、正確性において蓄積された平均減少度は高くなる。
【図１】
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