(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(1)〜(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット。
(1)  配列番号1のアミノ酸配列において、アミノ酸番号14のGlyがAspに置換された変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
(2)  (1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上の同一性を有する、配列番号1のアミノ酸配列と同じ長さのアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、アミノ酸番号14のアミノ酸はAspである。）
(3)  (1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、アミノ酸番号14のアミノ酸はAspである。）
【請求項２】
下記(4)又は(5)の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子。
(4)  配列番号2の塩基配列において、塩基番号40〜42のGGCがGAT又はGACに置換された変異塩基配列からなるからなる遺伝子
(5)  (4)に記載の変異塩基配列と90％以上の同一性を有する、配列番号2の塩基配列と同じ長さの塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、塩基番号40〜42の塩基はGAT又はGACである。）
【請求項３】
請求項１に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌。
【請求項４】
請求項２に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子を有するヒドロゲノフィラス属細菌。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のヒドロゲノフィラス属細菌を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むバリンの製造方法。
【請求項６】
下記(10)又は(11)のハイグロマイシン耐性遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカーとして使用する方法。
(10)  配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
(11)  配列番号4の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【請求項７】
下記(13)又は(14)のカナマイシン耐性遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカーとして使用する方法。
(13)  配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
(14)  配列番号5又は6の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バリン生成能を向上させたヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、この遺伝子組換え体を用いたバリンの製造方法、及び遺伝子組換え体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた化学品製造
2015年採択のパリ協定は、世界全体の温室効果ガスの排出量を迅速に削減することを定めている。これに従い、日本は2030年までに、二酸化炭素やメタンなどの温室効果ガス排出量を2013年に比べて26％削減することを目標としている。【０００３】
世界的に化学品製造の大半は石油原料に依存しており、温室効果ガスの排出量増大といった問題を抱えている。従って、化学品製造の脱石油化が求められており、バイオマスからグリーン化学品を製造するバイオリファイナリーの研究開発が各国で精力的に行われている。しかしながら、微生物発酵の原料とするためのバイオマスの糖類への変換には複雑な工程が必要であり、高コストとなる課題がある。【０００４】
脱石油化の研究の一環として、より高度のサステナビリティを有する炭素原料として二酸化炭素、メタン、一酸化炭素などのガスが注目されており、これらのガスを利用する微生物を用いた有価化学品やバイオ燃料を製造する技術に関心が寄せられている。中でも、温暖化への寄与率が高い二酸化炭素を固定して有効利用することへの期待が高い。【０００５】
バリン製造
必須アミノ酸の一つであるバリンは、医薬、食品、化粧品の成分や、家畜飼料添加物などとして有用な物質である。従来、バリンは、発酵法やタンパク質の加水分解により生産されている。
しかし、再生可能資源を原料とした発酵法によるバリンの生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類からの代謝の反応ステップが非常に多く、また生産物であるバリンにより代謝酵素がフィードバック阻害を受けるなどの理由により、生産性が低いことがバリンの工業生産の難点となっている。【０００６】
微生物において、バリンは、細胞内の重要代謝物であるピルビン酸から4ステップを経て生成される。即ち、アセトラクテートシンターゼ（Acetolactate synthase）の触媒作用によりピルビン酸からアセトラクテートが生成し、次いで、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ketol acid reductoisomerase）の触媒作用によりアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸が生成し、次いで、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Dihydroxy acid dehydratase）の触媒作用により2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸から2-ケトイソ吉草酸が生成し、最後に、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase）の触媒作用によりグルタミン酸から2-ケトイソ吉草酸にアミノ基が転移して、バリンが生成する。【０００７】
バリンの生合成に関与するアセトラクテートシンターゼとして、エシェリヒア  コリ(Escherichia coli)では、I、II、IIIの３つのアイソザイムが知られている。アセトラクテートシンターゼIIはバリンに耐性があるのに対して、アセトラクテートシンターゼI及びアセトラクテートシンターゼIIIはバリンによるフィードバック阻害を受ける。従って、微生物を用いてバリンを製造するためには、バリンによるフィードバック阻害を受けないアセトラクテートシンターゼを高生産させる必要がある。
アセトラクテートシンターゼは大サブユニットと小サブユニットから構成され、大サブユニットは触媒機能を有しており、小サブユニットは調節機能を有している。アセトラクテートシンターゼの酵素活性がバリンによるフィードバック阻害を受けるのは小サブユニットの機能による。【０００８】
微生物におけるバリンの生産性を向上させる技術のうち、バリンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アセトラクテートシンターゼを用いる方法としては、特許文献１、２に記載の技術が挙げられる。
特許文献１は、アセトラクテートシンターゼIの小サブユニットをコードする遺伝子（ilvN遺伝子）を、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させたエシェリヒア  コリを用いて、バリンを製造する技術を開示している。
また、特許文献２は、アセトラクテートシンターゼIIIの小サブユニットをコードする遺伝子（ilvH遺伝子）を、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させたエシェリヒア  コリを用いて、バリンを製造する技術を開示している。
しかし、上記方法は何れも、糖を炭素原料として用いてバリンを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてバリンを生成する方法ではない。【０００９】
ゲノム上の遺伝子の改変
例えば、アセトラクテートシンターゼI又はIIIの小サブユニットをコードする遺伝子について、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させるなどの遺伝子組換えを行う場合、遺伝子組換えに成功した細胞を選別するための目印となる、マーカー遺伝子が利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子などが汎用される。抗生物質耐性遺伝子が導入された細胞は、抗生物質存在下で生育可能となるため、抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子が導入された細胞の選択、即ちポジティブセレクションに用いられる。【００１０】
しかし、マーカー遺伝子の種類は限られているため、ゲノム上の複数の箇所（遺伝子座）で遺伝子の欠失、挿入、置換などの改変を行う場合には、マーカー遺伝子をリサイクルする必要がある。薬剤耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカーを指標にして、目的の遺伝子座が改変された遺伝子組換え体を選択した後、その中から、そのポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を選択できれば、別の遺伝子座において、再度そのポジティブセレクションマーカーを使用することが可能となる。そのため、ポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を効率良く選択する方法が必要である。【００１１】
また、ゲノム上の遺伝子の改変に当たり、改変された細胞の選別のために薬剤耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカー遺伝子がゲノム中に挿入されると、挿入されたポジティブセレクションマーカー遺伝子の発現がその周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼすことがよくある。この場合には、挿入されたポジティブセレクションマーカー遺伝子の発現の影響を排除するために、改変された遺伝子型を維持したまま、ポジティブセレクションマーカー遺伝子のみが消去された細胞を、効率よく選択する必要性が生じる。【００１２】
上記のポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞の選択、即ちカウンターセレクションには、発現することで細胞を死に至らしめる遺伝子マーカー、即ちカウンターセレクションマーカーを用いれば良い。この方法によれば、ポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを連結して使用し、カウンターセレクションマーカーが抜け落ちたために死に至らなかった細胞を選択することで、カウンターセレクションマーカーと共にポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を選択的に取得することができる。【００１３】
エシェリヒア  コリなど多くの細菌においては、カウンターセレクションマーカーとして、バチルス  サブチリス(Bacillus subtilis)由来のレバンシュクラーゼ遺伝子(sacB)が汎用されている。sacB遺伝子が導入されたエシェリヒア  コリは、ショ糖の存在下では生育できなくなる。この性質を利用して、ショ糖を添加した培地で生育したエシェリヒア  コリを選択することで、sacB遺伝子を保持しないエシェリヒア  コリを選択的に取得することができる。【００１４】
また、エシェリヒア  コリなどにおいて、ストレプトマイシン感受性遺伝子を利用するカウンターセレクションの方法も知られている。
本来、抗生物質であるストレプトマイシンに感受性の細菌であっても、ある頻度でストレプトマイシン耐性株が出現することが知られている。これらのストレプトマイシン耐性株では、S12リボソームタンパク質をコードする遺伝子(rpsL遺伝子)内部に変異が生じており、変異によるS12リボソームタンパク質のアミノ酸置換がストレプトマイシン耐性の要因となっている。この場合、ストレプトマイシン耐性の要因となっている変異rpsL遺伝子（以下、「rpsL*」と呼ぶことがある）は、ストレプトマイシン耐性遺伝子と呼ばれる。
さらに、これらのストレプトマイシン耐性株に野生型（天然型）のrpsL遺伝子を導入すると、宿主細菌はストレプトマイシン感受性となる。即ち、変異型rpsL遺伝子であるrpsL*遺伝子（ストレプトマイシン耐性遺伝子）に対して、野生型のrpsL遺伝子は優性遺伝子である。この場合、rpsL遺伝子をストレプトマイシン感受性遺伝子と呼ぶことがある。
即ち、エシェリヒア  コリなどのストレプトマイシン耐性株を取得し、このストレプトマイシン耐性株を宿主として用い、野生型rpsL遺伝子（ストレプトマイシン感受性遺伝子）をカウンターセレクションマーカーとして用いる、カウンターセレクションの方法が知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開2001-231584号
【特許文献２】特開2008-099668号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Reyrat JM, Pelicic V, Gicquel B, Rappuoli R. Infect. Immun. (1998) 66:4011-4017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくバリンを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、及びこの遺伝子組換え体を用いて効率よくバリンを製造する方法を提供することを第1の課題とする。
本発明は、ヒドロゲノフィラス属細菌において、遺伝子組換え体を効率良く作成する方法を提供することを第2の課題とする。【００１８】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
宿主遺伝子の改変技術
ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属細菌は水素エネルギーを利用して二酸化炭素から有機物質を生成して生育する水素細菌である。一般的に水素細菌の生育速度は極めて遅いが、ヒドロゲノフィラス属細菌は生育速度が速く、植物や光合成細菌に比べて、炭酸固定能力が格段に高い。ヒドロゲノフィラス属細菌は、バリンを生成するが、バリンにより代謝酵素がフィードバック阻害を受けるため、生産性は低い。工業規模でのバリン生成能を付与するためには、バリンを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に変異を導入し、フィードバック阻害を脱感作する必要がある。しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の遺伝子を改変（欠失、置換、付加（挿入を含む）など）する技術は存在しなかった。【００１９】
この点に関して、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌における遺伝子改変の手法を幅広く検討し、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株と野生型rpsL遺伝子（ストレプトマイシン感受性遺伝子）を組み合わせることで、ポジティブセレクションマーカーのリサイクルが可能なヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換えを実施することに成功した。
即ち、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌において、ストレプトマイシン耐性株が単離できること、及び、そのストレプトマイシン耐性株に対し、ヒドロゲノフィラス属細菌のrpsL遺伝子がストレプトマイシン感受性遺伝子として機能でき、カウンターセレクションマーカーとして使用できることを見出した。【００２０】
また、ヒドロゲノフィラス属細菌で使用できるポジティブセレクションマーカーも、これまで知られていない。本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子を導入することにより、ハイグロマイシン耐性を与え、ポジティブセレクションマーカーとして使用できることを見出した。また、ヒドロゲノフィラス属細菌にネオマイシン／カナマイシン リン酸転移酵素の遺伝子、又はカナマイシン ヌクレオチド転移酵素の遺伝子を導入することにより、カナマイシン耐性を与え、ポジティブセレクションマーカーとして使用できることも見出した。【００２１】
ハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子としては、エシェリヒア  コリのhygromycin B phosphotransferaseをコードする遺伝子（hph）などが知られている（Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gritz L, Davies J. Gene (1983) 25:179-188）。
また、カナマイシン耐性を与える遺伝子としては、エシェリヒア  コリのトランスポゾンTn5のneomycin phosphotransferaseをコードする遺伝子（nptII）、スタフィロコッカス  オーレウス(Staphylococcus aureus)のkanamycin nucleotidyltransferaseをコードする遺伝子(knt)などが知られている（Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A. Gene (1994) 145:69-73;  Enzymatic and nucleotide sequence studies of a kanamycin-inactivating enzyme encoded by a plasmid from thermophilic bacilli in comparison with that encoded by plasmid pUB110. Matsumura M, Katakura Y, Imanaka T, Aiba S. J. Bacteriol. (1984) 160:413-420）。
本発明者の研究によれば、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種遺伝子を導入しても発現しない場合が多いが、ハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するタンパク質を発現し、ハイグロマイシン耐性を与えることを見出した。また、ネオマイシン／カナマイシン リン酸転移酵素遺伝子、及びカナマイシン ヌクレオチド転移酵素の遺伝子は、それぞれ、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するタンパク質を発現し、カナマイシン耐性を与えることを見出した。【００２２】
バリン製造
ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上には、アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードするilvH遺伝子が存在する。アセトラクテートシンターゼIIIはバリンによりフィードバック阻害を受けるため、本発明では、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上のアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子に、バリンによるフィードバック阻害が脱感作されると期待される変異の導入を試みた。
その結果、ヒドロゲノフィラス属細菌のアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットのアミノ酸配列である配列番号１において、アミノ酸番号11のAsnをAsp、His、若しくはAlaに置換、アミノ酸番号14のGlyをAsp、若しくはAlaに置換、アミノ酸番号17のSerをPheに置換、アミノ酸番号29のAsnをLys、Tyr、Asp、若しくはHisに置換、アミノ酸番号34のThrをIleに置換、アミノ酸番号36のAlaをValに置換、アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸を欠失、又はアミノ酸番号131のLeuをArgに置換した変異アセトラクテートシンターゼIIIは、バリンによるフィードバック阻害が脱感作されることが分かった。即ち、野生型のヒドロゲノフィラス属細菌は、1 mMのバリンの存在下で生育が阻害されるが、アセトラクテートシンターゼIIIをコードする遺伝子に上記変異が導入されたヒドロゲノフィラス属細菌は、高濃度のバリン存在下でも生育が阻害されず、培養液中にバリンを蓄積する。このヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて一層効率良くバリンを生成する。【００２３】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、バリンの製造方法、及び遺伝子組換え体の製造方法などを提供する。
項１．  下記(1)〜(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット。
(1)  配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)〜(h)の何れかの変異を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
(a)  アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
(b)  アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
(c)  アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
(d)  アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
(e)  アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
(f)  アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
(g)  アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
(h)  アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
(2)  (1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
(3)  (1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
項２．  下記(4)〜(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子。
(4)  配列番号2の塩基配列において、下記(i)〜(p)の何れかの変異を有する変異塩基配列からなるからなる遺伝子
(i)  塩基番号31〜33のAACのGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(j)  塩基番号40〜42のGGCのGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(k)  塩基番号49〜51のTCGのTTT、又はTTCへの置換
(l)  塩基番号85〜87のAACのAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACへの置換
(m)  塩基番号100〜102のACCのATT、ATC、又はATAへの置換
(n)  塩基番号106〜108のGCAのGTT、GTC、GTA、又はGTGへの置換
(o)  塩基番号250〜252のCGCのTAA、TAG、又はTGAへの置換
(p)  塩基番号391〜393のCTCのCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGへの置換
(5)  (4)に記載の変異塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31〜33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40〜42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49〜51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85〜87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100〜102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106〜108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250〜252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391〜393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
(6)  (4)に記載の変異塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31〜33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40〜42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49〜51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85〜87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100〜102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106〜108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250〜252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391〜393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
項３．  項１に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌。
項４．  項２に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子を有するヒドロゲノフィラス属細菌。
項５．  項３又は４に記載のヒドロゲノフィラス属細菌を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むバリンの製造方法。
項６．  下記(7)、(8)、又は(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用カウンターセレクションマーカー。
(7)  配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)  配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)  配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項７．  項６に記載のカウンターセレクションマーカーとヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株を用いるヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項８．  (A)  ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片の5’末端側領域と3’末端側領域の間に、ストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片と、ポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットが挿入されたラベリング用DNA断片を作製する工程と、
(B)  このラベリング用DNA断片を、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子が上記ラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(C)  ヒドロゲノフィラス属細菌の上記変異標的遺伝子からなるDNA断片を、この遺伝子組換え体に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上の上記ラベリング用DNAの領域が変異標的遺伝子に置換された遺伝子組換え体を選択する工程
を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項９．  ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、項８に記載の方法。
(7)  配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)  配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)  配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１０．  (D)  ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子のDNA断片、及びストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片とポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットを含むラベリング用環状DNAを作製する工程と、
(E)  このラベリング用環状DNAを、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子に、上記ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(F)  その遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上に挿入された上記ラベリング用DNAの領域が脱落した遺伝子組換え体を選択する工程と、
(G)  その遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に変異が導入された遺伝子組換え体を選択する工程
を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項１１．  ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、項１０に記載の方法。
(7)  配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)  配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)  配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１２．  下記(10)、(11)、又は(12)のハイグロマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
(10)  配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
(11)  配列番号4の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(12)  配列番号4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１３．  下記(13)、(14)、又は(15)のカナマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
(13)  配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
(14)  配列番号5又は6の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(15)  配列番号5又は6の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【発明の効果】
【００２４】
二酸化炭素の増加を抑制する対策として、二酸化炭素の排出量の低減と排出された二酸化炭素の固定がある。二酸化炭素の排出量を低減するために、化石エネルギーに代えて太陽、風力、地熱などのエネルギーの利用が行われている。しかし、現実には、このようなエネルギーの利用によっても二酸化炭素の増加を十分に抑制できていない。そこで、排出された二酸化炭素の固定又は資源化を進める必要がある。
二酸化炭素は、物理的又は化学的に固定することもできるが、生物を利用して二酸化炭素を固定すれば、それにより食料、飼料、燃料などとして利用できる有機物を生産することができる。即ち、二酸化炭素そのものを資源として直接的に有価化学品に変換することができる。これにより、二酸化炭素の増加による地球温暖化と、食料、飼料、燃料の確保困難という二つの問題を共に解決できる。【００２５】
水素細菌は、水素と酸素の反応によって生じる化学エネルギーを利用し、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できる細菌であり、酸素、水素、及び二酸化炭素の混合ガスを原料として化学品を製造できるため、二酸化炭素を効率よく有機化することができ、また、単純な培地で培養することができる。一般的に水素細菌の生育は遅いが、水素細菌であるヒドロゲノフィラス属細菌は増殖速度が格段に速い。「三菱総合研究所報  No.34 1999」ではヒドロゲノフィラス属細菌を、『この増殖能力は植物の持つ炭酸固定能力とは比較出来ない程の高い効率であり、微生物の炭酸固定能力の高さを如実に物語っている』と評価している。【００２６】
ヒドロゲノフィラス属細菌は、生存に必要な量のバリンを生成するが、工業的に利用できる量のバリンは生成しない。本発明の遺伝子組換え体は、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上のバリン生成に関わる遺伝子に変異が導入されていることにより、効率よくバリンを生成することができる。
上記の通り、ヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素固定能力を有する生物の中でも、特に優れた二酸化炭素固定能力を有するため、本発明の遺伝子組換え体を用いれば、工業的に、二酸化炭素を固定してバリンを製造することができる。【００２７】
また、本発明によれば、ヒドロゲノフィラス属細菌でポジティブセレクションマーカーとして使用できるハイグロマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子が提供された。また、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株と共に用いてカウンターセレクションマーカーとして使用できるストレプトマイシン感受性遺伝子が提供された。これにより、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え、ゲノム改変の途が開かれた。特に、カウンターセレクションマーカーとして使用できるストレプトマイシン感受性遺伝子を見出したことで、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換えを繰り返し行うことが可能となり、大規模にゲノムを改変できるようになった。また、マーカーが残らないため、ヒドロゲノフィラス属細菌の組換え株を野生株と比較する際に、その表現型、即ち性質の違いを、遺伝子型の違いに直接的に関連付けて考察することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いた、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の一例を示す図である。
【図２】ストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いた、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の他の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体
本発明のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体は、下記(1)〜(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成する。
(1)  配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)〜(h)の何れかの変異を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
(a)  アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
(b)  アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
(c)  アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
(d)  アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
(e)  アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
(f)  アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
(g)  アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
(h)  アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
配列番号1は、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス（Hydrogenophilus thermoluteolus）の天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットのアミノ酸配列である。
【００３０】
(2)  (1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
【００３１】
本発明において、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００３２】
(3)  (1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
【００３３】
本発明において、複数個としては、1〜5個、中でも1〜3個、中でも1〜2個、特に1個が挙げられる。
【００３４】
アセトラクテートシンターゼは、ピルビン酸からアセトラクテートを生成する。本発明において、被験ポリペプチドがアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有することは、アセトラクテートシンターゼIII 大サブユニットの共存下で、アセトラクテートシンターゼ活性が検出されることにより確認する。アセトラクテートシンターゼ活性は、100 mM リン酸カリウム(pH 7.5)、50 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM MgCl2、0.1 mM チアミンピロホスフェート、0.1 mM フラビンアデニンジヌクレオチド、及び被験ポリペプチドを混合し、ピルビン酸の吸収を示す333 nm(ε＝17.5 /M・cm)の吸光度の減少を指標に測定する。
【００３５】
本発明において、被験ポリペプチドがバリンによるフィードバック阻害が抑制されたものであることは、バリン存在下でアセトラクテートシンターゼ活性を検出することにより確認する。被験ポリペプチドが、アセトラクテートシンターゼIII 大サブユニットの共存下で、野生型（天然型）のアセトラクテートシンターゼIIIと比較して、その濃度のバリン存在下で少しでもアセトラクテートシンターゼ活性が向上すれば、バリンによるフィードバック阻害が抑制されたものであると判定する。
【００３６】
本発明のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体としては、下記(4)〜(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子をゲノム上に有するものが挙げられる。
特に、ゲノム上の天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子が下記(4)〜(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子に置き換わったものが挙げられる。
(4)  配列番号2の塩基配列において、下記(i)〜(p)の何れかの変異を有する変異塩基配列からなるからなる遺伝子
(i)  塩基番号31〜33のAACのGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(j)  塩基番号40〜42のGGCのGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(k)  塩基番号49〜51のTCGのTTT、又はTTCへの置換
(l)  塩基番号85〜87のAACのAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACへの置換
(m)  塩基番号100〜102のACCのATT、ATC、又はATAへの置換
(n)  塩基番号106〜108のGCAのGTT、GTC、GTA、又はGTGへの置換
(o)  塩基番号250〜252のCGCのTAA、TAG、又はTGAへの置換
(p)  塩基番号391〜393のCTCのCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGへの置換
配列番号2は、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスの天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子の塩基配列である。
【００３７】
(5)  (4)に記載の変異塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31〜33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40〜42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49〜51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85〜87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100〜102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106〜108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250〜252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391〜393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
【００３８】
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００３９】
(6)  (4)に記載の変異塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31〜33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40〜42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49〜51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85〜87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100〜102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106〜108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250〜252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391〜393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
【００４０】
本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
【００４１】
ヒドロゲノフィラス属細菌としては、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス、ヒドロゲノフィラス  ハロラブダス（Hydrogenophilus halorhabdus）、ヒドロゲノフィラス  デニトリフィカンス（Hydrogenophilus denitrificans）、ヒドロゲノフィラス  ハルシ（Hydrogenophilus hirschii）、ヒドロゲノフィラス  アイランディカス（Hydrogenophilus islandicus）、ヒドロゲノフィラス属細菌Mar3株（Hydrogenophilus sp. Mar3）が挙げられる。中でも、炭酸固定微生物としてトップレベルの生育速度ひいては炭酸固定能力を有する点で、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスが好ましい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は地球上のいたる所から簡単に分離できる。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスの好ましい株として、TH-1（NBRC 14978）株が挙げられる。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  TH-1（NBRC 14978）株は、炭酸固定微生物としてトップの生育速度を示す〔Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)〕。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  NBRC 14978株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
【００４２】
（２）バリンの製造方法
上記説明したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体を用いてバリンを製造するに当たっては、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガスを供給しながら、無機培地又は有機培地を用いて形質転換体を培養すればよい。
供給されるガスは、水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスとすることが好ましいが、効率的にバリンを生成できる範囲で異種ガスが混入していてもよい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は、水素をエネルギー源として、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できるため、特に、炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いて（特に、二酸化炭素だけを用いて）上記化合物を製造することにより、効率的に二酸化炭素を固定できる。従って、有機物や炭酸塩などの炭素源を含まない無機培地を用いること、即ち、実質的に二酸化炭素だけを炭素源として（特に、二酸化炭素だけを炭素源として）培養することが好ましい。「炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いる」ことは、不可避の量の他の炭素源が混入する場合も包含する。なお、二酸化炭素を供給せず、糖、有機酸、アミノ酸などの有機物や炭酸塩を含む培地を用いることもできる。
培地のpHは、6.2〜8が好ましく、6.4〜7.4がより好ましく、6.6〜7がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育及び混合ガスの培地中への溶解が良く、バリンを効率よく製造できる。
【００４３】
バッチ培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に封入して静置培養又は振盪培養すればよく、連続培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に連続供給しながら振盪培養するか、又は密閉された培養容器を用いてバブリングにより混合ガスを培地内に導入しながら形質転換体を培養すればよい。混合ガスの培地中への溶解が良くなる点で振盪培養が好ましい。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75〜7.5：1：0.25〜3が好ましく、5〜7.5：1：1〜2がより好ましく、6.25〜7.5：1：1.5がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
混合ガス又は原料ガスの供給速度は、培地1 L当たり、10.5〜60 L／時間、中でも10.5〜40 L／時間、中でも10.5〜21 L／時間とすればよい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、バリンを効率よく製造できると共に、混合ガスの無駄が抑えられる。
培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、バリンを効率よく製造できる。
【００４４】
上記のようにして培養することにより、反応液中に目的化合物であるバリンが生成される。反応液を回収することによりバリンを回収できるが、さらに、公知の方法でバリンを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、活性炭吸着溶離法等が挙げられる。
【００４５】
（３）ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の作製方法
PCR等により変異型遺伝子を作製し、この変異型遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を変異型遺伝子に置換することができる。即ち、染色体上の遺伝子に変異を導入することができる。変異型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が変化している。
このような相同組換えを利用したゲノム上の遺伝子の改変は、ヒドロゲノフィラス属細菌では前例がない。本発明では、ヒドロゲノフィラス属細菌において、ストレプトマイシン耐性株とストレプトマイシン感受性遺伝子を利用するカウンターセレクション法を開発し、相同組換えによる部位特異的なマーカーの組込みと第二段階の相同組換えによるマーカーの脱落を原理とした遺伝子改変を行った。
【００４６】
この方法では、下記(7)、(8)、又は(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いる。これらのストレプトマイシン感受性遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能する。
(7)  配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)  配列番号3の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)  配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【００４７】
(8)及び(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子の例として、下記(r)、(s)、及び(t)の遺伝子が挙げられる。
(r)配列番号3において、塩基番号127〜129のAAAがCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、AAT、AAC、ACT、ACC、ACA、ACG、ATT、ATC、又はATAに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(s)配列番号3において、塩基番号262〜264のAAAがCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、GAA、又はGAGに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(t)配列番号3において、塩基番号271〜273のCCGがTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、CAA、又はCAGに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
【００４８】
ヒドロゲノフィラス属細菌内でマーカー遺伝子を発現させるための好ましいプロモーターとしては、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、又はOxford Genetics社OXB1,OXB11〜OXB20の各プロモーターなどが挙げられ、好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、バクテリオファージλt0転写ターミネーターなどが挙げられる。
【００４９】
被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したストレプトマイシン耐性株が、野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と同程度に、ストレプトマイシンの存在下（50 μg/mL以上）で生育が阻害されることにより確認する。
【００５０】
上記カウンターセレクションマーカーを用いたヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法として、以下の(A)〜(C)の工程を含む方法が挙げられる（第1の方法、図1）。
(A)  ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片の5’末端側領域と3’末端側領域の間に、ストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片と、ポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットが挿入されたラベリング用DNA断片を作製する工程と、
(B)  このラベリング用DNA断片を、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子が上記ラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(C)  ヒドロゲノフィラス属細菌の上記変異標的遺伝子からなるDNA断片を、この遺伝子組換え体に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上の上記ラベリング用DNAの領域が変異標的遺伝子に置換された遺伝子組換え体を選択する工程
【００５１】
(A) ラベリング用DNA断片の作製
標的遺伝子に目的とする変異（置換、欠失、又は付加（挿入を含む）など）を導入する部位特異的変異導入方法は、良く知られている。例えば、一方のプライマーに目的の変異を組み込んだプライマーセットを用いて、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、ヒドロゲノフィラス属細菌の標的遺伝子であって変異が導入されたものを得ることができる。
このとき、標的遺伝子を5’末端側領域と3’末端側領域の2つに分割して、それぞれをPCRで増幅し、何れか一方又は双方の領域に、それぞれ1又は複数の変異を導入すればよい。
さらに、増幅した5’末端側領域と3’末端側領域を、エシェリヒア  コリなどの宿主で使用できるベクターに連結しておけばよい。
【００５２】
次いで、ベクター上の5’末端側領域と3’末端側領域との間に挿入するマーカーカセットを作製する。マーカーカセットは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するストレプトマイシン感受性遺伝子と、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカー遺伝子とが、隣接して又は約10,000塩基対以下のDNAを挟んで連結したものである。
【００５３】
次いで、ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片が挿入されたベクター上の、変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間にマーカーカセットを挿入すればよい。さらに、常法に従い、得られたベクターで宿主を形質転換し、このベクターを形質転換体から抽出すればよい。
次いで、変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間を制限酵素で切断することにより直鎖状にして、ラベリング用DNA断片を得ればよい。切断は、マーカーカセットが変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間に挟まれた状態になるように行う。
【００５４】
ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するストレプトマイシン感受性遺伝子としては、上記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子を用いることができる。
【００５５】
ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカー遺伝子は、これまで全く知られていなかった。本発明では、下記(10)、(11)、又は(12)のハイグロマイシン耐性遺伝子がヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、ポジティブセレクションマーカーとして用い得ることを見出した。
(10)  配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
(11)  配列番号4の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(12)  配列番号4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【００５６】
被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌が、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と比較して、ハイグロマイシンの存在下(100 μg/mL)での生育が向上していること（例えば、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と異なり、ハイグロマイシンの存在下(100 μg/mL)で生育できること）により確認する。
【００５７】
また、本発明では、下記(13)、(14)、又は(15)のカナマイシン耐性遺伝子がヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、ポジティブセレクションマーカーとして用い得ることを見出した。
(13)  配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
(14)  配列番号5又は6の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(15)  配列番号5又は6の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【００５８】
被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌が、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と比較して、カナマイシンの存在下(50 μg/mL)での生育が向上していること（例えば、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と異なり、カナマイシンの存在下(50 μg/mL)で生育できること）により確認する。
【００５９】
(B) ポジティブセレクション
ラベリング用DNA断片による相同組換えにより、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する際は、ポジティブセレクションマーカーの性質を獲得した遺伝子組換え体、例えば、ハイグロマイシン耐性又はカナマイシン耐性となった遺伝子組換え体を選択すればよい。
次工程でストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとしたカウンターセレクションを行うために、宿主は、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株とする。ストレプトマイシンを50〜500 μg/mL程度含む固体培地に、ヒドロゲノフィラス属細菌の菌液を塗布して培養することにより、通常、一定の比率でストレプトマイシン耐性株が現れる。
ストレプトマイシン耐性株にラベリング用DNA断片を導入する操作を行い、ポジティブセレクションマーカーの性質を指標にして、ストレプトマイシン耐性株のゲノム上の標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する。導入するラベリング用DNA断片は、両端（変異標的遺伝子の5’末端側領域の5’末端、及び変異標的遺伝子の3’末端側領域の3’末端）にさらに余分なヌクレオチドが付加されていてもよい。得られる組換え体はストレプトマイシン感受性となる。
【００６０】
ヒドロゲノフィラス属細菌細胞内へのDNAの導入は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、電気パルス法などの公知の方法で行える。
【００６１】
(C) カウンターセレクション
次いで、変異標的遺伝子に挿入されているマーカーカセットを欠失させるために、変異標的遺伝子からなるDNA断片を用いた相同組換えを行う。
ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子が挿入されたベクターを変異標的遺伝子が分断されないように切断して直鎖状にする。この直鎖状DNA断片を、上記ストレプトマイシン感受性株（標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体）に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性となった株を選択すればよい。ストレプトマイシン耐性で、かつポジティブセレクションマーカーの性質を失った株を選択することも好ましい。これにより、変異標的遺伝子に挿入されているマーカーカセットが脱落した遺伝子組換え体、即ち、標的遺伝子に目的とする変異が導入された遺伝子組換え体が得られる。
【００６２】
上記カウンターセレクションマーカーを用いたヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の別の例として、以下の(D)〜(G)の工程を含む方法も挙げられる（第2の方法、図2）。
(D)  ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子のDNA断片、及びストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片とポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットを含むラベリング用環状DNAを作製する工程と、
(E)  このラベリング用環状DNAを、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子に、上記ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(F)  その遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上に挿入された上記ラベリング用DNAの領域が脱落した遺伝子組換え体を選択する工程と、
(G)  その遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に変異が導入された遺伝子組換え体を選択する工程
(D) ラベリング用環状DNAの作製
ヒドロゲノフィラス属細菌の標的遺伝子であって変異が導入されたものと、マーカーカセットを含む環状DNAを作製する。マーカーカセットは、第1の方法の工程(A)で説明した通りである。この環状DNAの大きさは、全体として15,000塩基対程度以下であればよい。
【００６３】
(E) ポジティブセレクション
得られたラベリング用環状DNAをヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、ポジティブセレクションマーカーの性質を獲得した遺伝子組換え体、例えば、ハイグロマイシン耐性又はカナマイシン耐性となった遺伝子組換え体を選択すればよい。これにより、標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域による相同組換えの結果、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の標的遺伝子に、ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体が選択される。即ち、この遺伝子組換え体のゲノム上では、変異標的遺伝子と天然型標的遺伝子との間に、マーカーカセットを含むDNAが挿入されている。従って、得られる組換え体はストレプトマイシン感受性である。
【００６４】
(F) カウンターセレクション
得られた遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性となった株、好ましくは、ストレプトマイシン耐性で、かつポジティブセレクションマーカーの性質を失った株を選択することにより、ゲノム上の変異標的遺伝子と天然型標的遺伝子との間で2回目の相同組換えが起きて、両遺伝子間の領域が脱落した遺伝子組換え体が得られる。得られる組換え体のゲノム上の標的遺伝子は、天然型の場合と変異型の場合がある。標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域のうち1回目の相同組換えが生じた領域と同じ領域で相同組換えが生じると、標的遺伝子は野生型になり、標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域のうち1回目の相同組換えが生じた領域と異なる領域で相同組換えが生じると、標的遺伝子は変異が導入されたものとなる。
【００６５】
(G) 変異標的遺伝子を有する遺伝子組換え体の選択
(F)工程で得られた遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に目的とする変異が導入された株を選択する。得られた遺伝子組換え体の標的遺伝子の塩基配列を決定し、変異が導入されていることを確認すればよい。
標的遺伝子がアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子であり、目的とする変異標的遺伝子が、アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子である場合は、変異に供したヒドロゲノフィラス属細菌の野生株に比べて、バリン存在下での生育が向上した株を選択すればよい。
また、配列番号2の塩基番号40-42のGGCがGACに置換された塩基配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子は、変異により制限酵素MluIの認識配列が含まれるようになっている。従って、(F)工程で得られた遺伝子組換え体について、コロニーPCRにより標的遺伝子を増幅し、増幅したDNA断片が制限酵素MluIにより切断されることを確認すればよい。
【００６６】
このように、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを組み合わせることで、相同組換えを利用したゲノム上の遺伝子の改変が行えるようになった。
本発明のバリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体も、上記説明した方法で作製することができる。
また、ヒドロゲノフィラス属細菌で使用できるポジティブセレクションマーカーの数は限られているが、ポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを組み合わせることで、繰り返し何度でも、遺伝子組換え操作を行うことができ、ゲノム上の複数の遺伝子の改変を行える。
【００６７】
ヒドロゲノフィラス属細菌は独立栄養条件で生育するが、従属栄養条件でも生育できるため、ヒドロゲノフィラス属細菌の宿主及び遺伝子組換え体の培養に用いる培地は、無機培地及び有機培地の何れであってもよい。糖、有機酸、アミノ酸などを含む有機培地を用いることができる。培地のpHは、6.2〜8程度とすればよい。
何れの場合も、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、好ましくは水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスを供給しながら培養すればよい。有機培地を使用する場合は、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、例えば空気の通気で良い。二酸化炭素ガスを供給しない場合は、炭素源として炭酸塩を含む培地を用いればよい。混合ガスは、密閉された培養容器に封入又は連続供給して、振盪培養することで培地内に溶解させてもよく、培養容器を密閉型又は開放型とし、かつバブリングにより培地内に溶解させてもよい。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75〜7.5：1：0.25〜3が好ましく、5〜7.5：1：1〜2がより好ましく、6.25〜7.5：1：1.5がさらにより好ましい。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は好熱細菌であるため、培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。
【実施例】
【００６８】
（１）ストレプトマイシン耐性株の取得
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  TH-1株(NBRC 14978)（以下、「TH-1株」と言うことがある）をA液体培地〔(NH4)2SO4  3.0 g、KH2PO4  1.0 g、K2HPO4  2.0 g、NaCl  0.25 g、FeSO4・7H2O  0.014 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、CaCl2  0.03 g、MoO3  4.0 mg、ZnSO4・7H2O  28 mg、CuSO4・5H2O  2.0 mg、H3BO3  4.0 mg、MnSO4・5H2O  4.0 mg、CoCl2・6H2O  4.0 mgを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。24時間後の培養液をストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地〔(NH4)2SO4  3.0 g、KH2PO4  1.0 g、K2HPO4  2.0 g、NaCl  0.25 g、FeSO4・7H2O  0.014 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、CaCl2  0.03 g、MoO3  4.0 mg、ZnSO4・7H2O  28 mg、CuSO4・5H2O  2.0 mg、H3BO3  4.0 mg、MnSO4・5H2O  4.0 mg、CoCl2・6H2O  4.0 mg、寒天 15 gを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
その結果、ストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地上で３つのコロニーの形成が確認できた。これらの生育株は、TH-1株のストレプトマイシン耐性株であり、そのうちの１つをNOC269株と命名した。【００６９】
（２）マーカーカセットの構築
(2-1)カウンターセレクションマーカーの調製
TH-1株の野生株（ストレプトマイシン感受性株）から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型として用いて、S12リボソームタンパク質をコードする、ストレプトマイシン感受性遺伝子であるrpsL遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【００７０】
TH-1株の野生型rpsL遺伝子増幅用プライマー
(a-1)  5’-ATACGCGTCCTCCGATGCGTCGTAAGGGAAACGTC-3’（配列番号7）
(b-1)  5’-ATAGTCGACTTATTTCTTGCCCGCAGCGGCGCCCG-3’（配列番号8）
なお、プライマー(a-1)にはMluI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-1)にはSalI制限酵素部位が付加されている。【００７１】
(2-2)ポジティブセレクションマーカーの調製
ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、「hph」と言うことがある）配列を含有するプラスミドpJR225(GenBank: K01193)〔Gene, 25, 179-188 (1983)〕のDNAを鋳型として用いて、hph遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【００７２】
hph遺伝子増幅用プライマー
(a-2) 5’-ATACTCGAGGAGATGACGTTGGAGGGGCAAGGTCG-3’（配列番号9）
(b-2) 5’-ATACGCGTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT-3’（配列番号10）
なお、プライマー(a-2)には、XhoI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-2)には、MluI制限酵素部位が付加されている。【００７３】
上記各PCRで生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、TH-１株のゲノムDNAを鋳型とした場合には、rpsL遺伝子に相当する約0.5-kbpのDNA断片が検出され、pJR225のプラスミドDNAを鋳型とした場合には、hph遺伝子に相当する約1.0-kbpのDNA断片が検出された。
このようにして調製したrpsL遺伝子を含むDNA断片を制限酵素SalIで、hph遺伝子を含むDNA断片を制限酵素XhoIで切断し、制限酵素SmaIで切断した大腸菌プラスミドベクターpUC19(GenBank: M77789.2)と混合して、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50 μg/mL、及びハイグロマイシン50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素MluIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC19ベクターの約2.7-kbpのDNA断片に加え、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結した配列に相当する約1.5-kbpのDNA断片が認められた。
構築された、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結したマーカーカセットを含むプラスミドを、pUC-Sms・Hmrと命名した。【００７４】
(３)変異ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕の構築
(2-1)で抽出したTH-1株の野生株のゲノムDNAを鋳型として用いて、変異型ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕の5’側領域、及び3’側領域を含むDNA断片をそれぞれPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。プライマーがG14D変異に相当する配列を含んでいるため、これらのプライマーでilvH遺伝子の領域を増幅することで、G14D変異が導入された変異ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕のDNA領域を増幅できる。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【００７５】
ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域増幅用プライマー
(a-3)  5’-ATGAATTCCCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3’（配列番号11）
(b-3)  5’-ACAACGCGTCCGATTCGTTTTCCACCAGCAGTGCA-3’（配列番号12）
なお、プライマー(a-3)にはEcoRI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-3)にはMluI制限酵素部位が付加されている。(b-3)の配列番号12の5’末端から9番目のヌクレオチドが変異箇所である。
ilvH(G14D)遺伝子の3’側領域増幅用プライマー
(a-4)  5’-CGGACGCGTTGTCGCGCATCGCCGGGCTCTTTTCG-3’（配列番号13）
(b-4)  5’-TTCTGCAGGCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3’（配列番号14）
なお、プライマー(a-4)にはMluI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-4)にはPstI制限酵素部位が付加されている。(a-4)の配列番号13の5’末端から4番目のヌクレオチドが変異箇所である。【００７６】
上記各PCRで生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域、及び3’側領域に相当する約1.0-kbpのDNA断片がそれぞれ検出された。【００７７】
このようにして調製したilvH(G14D)遺伝子の5’側領域のDNA断片を制限酵素EcoRI及びMluIで、変異ilvH(G14D)遺伝子の3’側領域のDNA断片を制限酵素MluI及びPstIで切断し、制限酵素EcoRI及びPstIで切断したpUC19ベクターと混合して、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン  50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC19ベクターの約2.7-kbpのDNA断片に加え、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域と3’側領域が連結した配列に相当する約2.0-kbpのDNA断片が認められた。
このプラスミドでは、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域と3’側領域が連結されており、ilvH(G14D)は完全な１つの遺伝子としてクローニングされている。構築された、ilvH(G14D)遺伝子を含むプラスミドを、pUC-ilvH(G14D)と命名した。【００７８】
(４)ilvHラベリング用プラスミドの構築
上記（２）で調製したpUC-Sms・Hmrを制限酵素MluIで切断し、1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した後、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結したマーカーカセットの約1.5-kbpのDNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結及び融解することで、ゲルからDNAを回収した。
回収したマーカーカセットのDNA断片を、制限酵素MluIで切断した（３）で作成したpUC-ilvH(G14D)と混合し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン  50 μg/mL、及びハイグロマイシン  50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素MluIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC-ilvH(G14D)プラスミドの約4.7-kbpのDNA断片に加え、マーカーカセットの配列に相当する約1.5-kbpのDNA断片が認められた。
構築されたilvHラベリング用のプラスミドをpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrと命名した。【００７９】
（５）TH-1株ilvH遺伝子へのG14D変異の導入
(5-1)マーカーカセットによるilvH遺伝子のラベリング（ポジティブセレクション）
（４）で調製した環状プラスミドpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrを制限酵素EcoRIとPstIで切断することで直鎖状にした。得られた直鎖状のpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrで、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、（１）で取得したTH-1株のストレプトマイシン耐性株であるNOC269株を形質転換し、ハイグロマイシン 100 μg/mLを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株を、ハイグロマイシン 100 μg/mL、又はストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地にそれぞれ再ストリークし、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
その結果得られた、ハイグロマイシン耐性かつストレプトマイシン感受性の株を鋳型として用いて、ilvH遺伝子を含むDNA領域をコロニーPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。（３）で用いた(a-3)及び(b-4)のプライマーの組み合わせであり、野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うと、ilvH遺伝子を含む約2.0-kbpのDNA領域が増幅する。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて、常法により行った。
ilvH遺伝子を含む領域増幅用プライマー
(a-3)  5’-ATGAATTCCCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3’（配列番号11）
(b-4)  5’-TTCTGCAGGCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3’（配列番号14）
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ilvHにマーカーカセットが挿入された配列に相当する約3.5-kbpのDNA断片が検出された。このilvH遺伝子にマーカーカセットが挿入された、即ちilvH遺伝子がマーカーによりラベリングされた株をNOC278株と命名した。【００８０】
(5-2)ilvH遺伝子のilvH(G14D)遺伝子による置換（カウンターセレクション）
（３）で調製した環状プラスミドpUC-ilvH(G14D)を制限酵素EcoRIとPstIで切断することで直鎖状にした。得られた直鎖状のpUC-ilvH(G14D)で、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、(5-1)で取得したilvH遺伝子のラベリング株であるNOC278株を形質転換し、ストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株を、ハイグロマイシン 100 μg/mL、又はストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地にそれぞれ再ストリークし、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
その結果得られた、ハイグロマイシン感受性かつストレプトマイシン耐性の株を鋳型として用いて、ilvH遺伝子を含むDNA領域をコロニーPCR法により増幅した。コロニーPCRは (5-1)と同様の方法で行った。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った場合と同様の約2.0-kbpのDNA断片が検出された。即ち、マーカーカセットが抜け落ちた配列に相当する。
この増幅した約2.0-kbpのDNA断片を制限酵素MluIで切断し、1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供したところ、（３）でG14Dの変異と共に導入したMluIサイトで切断された場合に生じる、２本の約1.0-kbpのDNA断片が検出された。野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型とした場合に増幅する約2.0-kbpのDNA断片は、MluIサイトが含まれないため、制限酵素MluIを反応させても切断されず、2.0-kbpのままである。従って、MluIにより切断されて、２本の約1.0-kbpのDNA断片が検出される株は、ilvH遺伝子がilvH(G14D)遺伝子により置換された、即ちilvH遺伝子にG14D変異が導入された株である。このilvH遺伝子のG14D変異株をNOC279株と命名した。【００８１】
（６）バリンによるフィードバック阻害の脱感作の確認
ヒドロゲノフィラス属細菌の野生型ilvH遺伝子のG14D変異株であるNOC279株をそれぞれバリン 1 mM、10 mMを含むA液体培地5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。
野生型のヒドロゲノフィラス属細菌は、1 mMのバリンの存在下で生育が阻害されるが、アセトラクテートシンターゼIIIをコードする遺伝子にG14Dの変異が導入されたNOC279株は、10 mMのバリン存在下でも生育が阻害されなかった。このように、NOC279株はバリンのフィードバック阻害を脱感作している。【００８２】
（７）バリン生成
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのilvH遺伝子のG14D変異株であるNOC279株をA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のバリンの定量を行ったところ、培地上清中に9 mMのバリンが生成していた。なお、野生型のヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス TH-1株を同様に培養し、培養上清のバリンの定量を行った場合は、0.1 mM以下であった。【００８３】
（８）寄託菌株
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNOC279株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）に寄託した。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNOC279株の、受託番号はNITE BP-02829であり、受託日は2018年11月22日である。従って、この菌株は公に利用可能である。【００８４】
また、本明細書に記載した全ての菌株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されているか、条件なく誰でも分譲を受けることができる機関が保有しているか、市販されているか、又はこれらの株の操作により誰でも取得でき、公に利用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の遺伝子組換え体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として、工業規模でバリンを効率よく生成するため、二酸化炭素による地球温暖化を抑制しながら、医薬、食品、化粧品、家畜用飼料添加物などとして利用されるバリンを工業規模で製造することができる。
【要約】
配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)〜(h)
(a)  アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
(b)  アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
(c)  アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
(d)  アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
(e)  アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
(f)  アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
(g)  アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
(h)  アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
の何れかのアミノ酸置換を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくバリンを製造することができる。【図１】
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【図２】
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【配列表】
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