(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、
前記患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
複数の腫瘍関連抗原由来ペプチドを担体に固相化し、前記担体に前記浮遊細胞を添加し、前記浮遊細胞の増殖率が高いｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択工程は、
各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、前記浮遊細胞とを接触させてインキュベートし、前記浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程は、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記患者が、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、
前記浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択する、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ｎは３又は４である、請求項１から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞療法のためのペプチドスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫細胞療法は、外科治療、化学治療、及び放射線治療といった癌の３大治療に続く第４の癌治療として注目を浴びている自己の免疫細胞を用いた治療法である。【０００３】
免疫細胞の１種である細胞障害性Ｔリンパ球細胞（Cytotoxic T Lymphocyte；ＣＴＬ）は、活性化されると細胞障害活性を持つ。より具体的には、細胞傷害活性を持たないナイーブＴ細胞の受容体が、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；ＨＬＡ）に結合した細胞にとっての異物である抗原ペプチドを認識し、同時に共刺激分子からのシグナルが入ることで、ナイーブＴ細胞が当該抗原を発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を持つＣＴＬとなり、当該抗原を発現する細胞を攻撃するようになる。【０００４】
免疫細胞療法では、腫瘍関連抗原（Tumor Associated Antigen；ＴＡＡ）由来ペプチドを単体で投与して体内の樹状細胞に提示させるか、腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示した樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製して投与する。これにより、腫瘍関連抗原由来ペプチドは異物であると認識され、ナイーブＴ細胞が腫瘍関連抗原を発現する癌細胞に対する特異的な細胞傷害活性を持つＣＴＬとなる。このＣＴＬが腫瘍関連抗原を発現する癌細胞を攻撃することで、癌を治療することができる。【０００５】
近年、腫瘍関連抗原は数多く報告されている。その一つ一つに抗原エピトープとなるペプチド候補が多数存在し、それぞれの患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することは非常に困難である。また、ナイーブＴ細胞を活性化するためには、腫瘍関連抗原由来ペプチドが樹状細胞のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ）と結合する必要がある。ＨＬＡ−Ａ〜Ｃには、それぞれ数十種類の異なるアレルが存在し、ペプチド結合部位の分子構造が異なる。そのため、腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いて抗原特異的なＣＴＬを誘導し活性化するためには、通常、癌患者それぞれが有するＨＬＡ型を調べ、そのＨＬＡ型に結合することができる腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する必要があると考えられている（特許文献１、及び２）。最近では、アルゴリズムを用いて、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド配列を予想することができ、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ等の検索サイトよりＨＬＡ分子結合ペプチドを示すことができる。しかしながら、予想されたエピトープペプチドが必ずしも正しいわけではない（非特許文献１）。また、ＨＬＡはアリル間の遺伝子交換の変異で進化してきたため、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ間での抗原エピトープには類似点が多く、ペプチドを受容する位置周辺に集中して共通のアミノ酸配列が存在することが知られている（非特許文献２）。従って、各ＨＬＡ−Ａ型に適合するように設計したペプチドが１対１の対応をするとは限らず、腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニングには、依然として、多くの課題が残っている。一方、癌の分子標的薬に対しては、癌細胞が耐性を生じることがあり、これは標的抗原が変化するためと考えられている（非特許文献３、４）。免疫細胞療法においても同様であり、当初は効果が見られた腫瘍関連抗原由来ペプチドでも長期間使用し続けることにより、免疫原性が高いＴＡＡ程、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇが起こり、癌抗原の消失やＨＬＡの発現低下等、さらには免疫細胞自身も疲弊することによる免疫逃避を招く恐れがある（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再表２００７−０００９３５号公報
【特許文献２】特開２０１３−１１６８９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂａｃｈｉｎｓｋｙ  ＭＭ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ.２００５  Ｍａｒ  ２２；５：６
【非特許文献２】ＭＨＣ  Ｖｏｌ．１８．Ｎｏ１  ３１−４６：公益財団法人ＨＬＡ研究所資料
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３３１（６０２４）：１５６５−１５７０
【非特許文献４】生化学，２０１３，８５（６）：４７５−４８３
【非特許文献５】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１８５：３７６８−３７７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明者らは、樹状細胞培養初期の過程で生じる不要な浮遊細胞を用いて腫瘍関連抗原由来ペプチドをスクリーニングする方法を発明した。本発明に係るスクリーニング方法で選択した腫瘍関連抗原由来ペプチドによって刺激された成熟樹状細胞を「変動型分子標的樹状細胞」と呼ぶ。【００１０】
すなわち、本発明は、
〔１〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、
患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法；
〔２〕腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択工程は、
各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、浮遊細胞とを接触させてインキュベートし、浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する、上記〔１〕に記載のスクリーニング方法；
〔３〕浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程は、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択する、上記〔２〕に記載のスクリーニング方法；
〔４〕患者が、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、
浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択する、上記〔２〕又は〔３〕に記載のスクリーニング方法；
〔５〕ｎは３又は４である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法；
〔６〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物の製造方法であって、
接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
未成熟樹状細胞を、上記〔１〕から〔５〕に記載のスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、
を含む製造方法；
〔７〕接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程は、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを培地に添加することによって行う、上記〔６〕に記載の組成物の製造方法；
〔８〕未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化させる工程は、腫瘍関連抗原由来ペプチド及びＯＫ−４３２を培地に添加することによって行う、上記〔６〕又は〔７〕に記載の組成物の製造方法；
に、関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法によれば、樹状細胞培養中に生じる不要な浮遊細胞を用いてスクリーニングすることにより、それぞれの患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチド選択することができるので、かかる腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激することにより、免疫細胞療法に用いる組成物を効率的に得ることができる。また、患者由来癌細胞に耐性が生じた場合も、再度スクリーニングをすることで、適したペプチドを選択しなおすことができる。また、本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法によれば、ＨＬＡ-Ａ型に依存しない腫瘍関連抗原由来ペプチドの探索が可能となるので、より多くの腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択肢の中から患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示する樹状細胞を含む組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明を免疫細胞療法に用いるまでの一態様を示す概念図である。
【図２】図２は、本発明の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）と活性化リンパ球との併用治療成績を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）と活性化リンパ球との併用治療成績（ａ）、および樹状細胞の単独治療成績（ｂ）を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るスクリーニング方法は、免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、図１に示すように、患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、を含む。
【００１４】
本明細書において腫瘍関連抗原とは、癌細胞に特異的に発現しているタンパク質、又は癌細胞において正常細胞より発現が有意に多いタンパク質をいい、例えば、ＣＥＡ（Carcinoembryonic Antigen）、ＰＳＡ（Prostate Specific Antigen）、ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）、Ｈｅｒ２（Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2）、ｈＴＥＲＴ（Human Telomerase Reverse Transcriptase）、ＭＡＧＥ（Melanoma Associated Antigen）、ＭＵＣ１（Mucin 1)、及びＷＴ１（Wilms Tumor 1）等が挙げられる。また、ＶＥＧＦＲ１（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1）、及びＶＥＧＦＲ２（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2）等の腫瘍血管新生に関与するタンパク質も腫瘍関連抗原に含んでもよい。
【００１５】
本明細書において腫瘍関連抗原由来ペプチドとは、腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８〜１２のペプチド、及びその類似体をいう。アミノ酸数は、８個、９個、１０個、１１個、１２個のいずれであってもよい。
【００１６】
腫瘍関連抗原由来ペプチド候補及び腫瘍関連抗原由来ペプチドは、市販されているものを用いてもよいし、ＨＬＡ型や腫瘍関連抗原のアミノ酸配列等に基づき、例えば、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ等のコンピュータープログラムを用いて設計し、合成したものを用いることもできる。本発明に係る医薬組成物の製造方法においてｎ≧２の場合、腫瘍関連抗原由来ペプチドとして、１種類の腫瘍関連抗原に由来する、アミノ酸配列の異なる複数のペプチドを用いてもよく、それぞれ複数の腫瘍関連抗原に由来する複数のペプチドを用いてもよい。
【００１７】
腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８〜１２のペプチドの類似体とは、そのペプチドの機能特性を実質的に変えることなく、ペプチドの一方若しくは両方の末端又は内部に、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたペプチドのエピトープをいう。数個とは、２個又は３個をいう。
腫瘍関連抗原由来ペプチドには、一方又は両方の末端に、そのペプチドの生成、精製、安定化、結合、又は検出等に関連する目的のために追加された１又は２以上のアミノ酸が結合していてもよい。
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書においてアミノ酸又はその誘導体としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
本明細書において樹状細胞とは、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩに提示してＴ細胞を活性化する能力を持つ抗原提示細胞をいう。ヒトのＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ: Human Leukocyte Antigen）である。
【００１９】
本明細書において腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激された樹状細胞とは、腫瘍関連抗原由来ペプチドを接触させることによって細胞内において何らかの反応が引き起こされた樹状細胞をいい、例えば、当該腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示した樹状細胞及び／又は成熟状態に分化した樹状細胞をいう。
【００２０】
本明細書において患者とは、癌の治療又は予防を必要とするヒトを含む哺乳類である。癌の治療又は予防とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及び癌と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせることをいう。
【００２１】
本発明に係る組成物が対象とする癌には、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆管癌、子宮癌、乳癌、すい臓癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、悪性リンパ腫、咽頭癌、喉頭癌、癌性胸膜炎及び腹膜炎、並びに骨転移及び転移性癌が含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
本明細書におけるｎ個は、１以上の整数を表し、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個以上であってもよい。
【００２３】
本明細書において単核球細胞(ＰＢＭＣ: Peripheral blood mononuclear cell)とは、単球やリンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＢ細胞）を含む細胞集団であり、顆粒球、赤血球、及び血小板などはほぼ除去された細胞集団を意味する。単核球細胞は、患者から採取した試料より比重遠心分離法等の公知の方法によって得ることができる。患者から採取した試料としては、末梢血、骨髄液、臍帯血等があげられる。
【００２４】
本明細書において単核球細胞を接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程は、細胞接着法等の常法に従って行うことができる。例えば、単核球細胞を培地に再懸濁し、培養用ディッシュに播種してインキュベートした後、ディッシュの上清を回収する。この際にディッシュの培養面に接着している細胞を接着細胞とし、ディッシュの上清と共に回収される、ディッシュの培養面に接着していない細胞及び回収の際に培養面からはがれてしまう弱接着性の細胞を浮遊細胞とする。
【００２５】
分離した接着細胞は、後述する未成熟樹状細胞に分化させる工程に用いることができる。また、分離した浮遊細胞は、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程に用いることができる。
【００２６】
本明細書における細胞の培地は、特に限定されず、例えば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、α−ＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、及びＡＩＭ−Ｖ培地等の細胞培養に使用されている市販の培地を用いることができる。培地には、必要に応じて、ウシ血清、ウシ胎児血清、及びヒト血清等の血清を添加することができる。また、培地には、必要に応じて、各種の添加剤を加えてもよい。
【００２７】
本明細書における浮遊細胞を用いて腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程には、各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、単核球由来の浮遊細胞とを接触させてインキュベートする工程を含む。各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、浮遊細胞とを接触させてインキュベートする工程には、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含む培地中で培養することを含み、例えば、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補をプレート等の担体に固相化して、これに浮遊細胞を添加する方法、または、浮遊細胞を含むプレートに腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を添加する方法等があげられる。腫瘍関連抗原由来ペプチド候補の濃度、インキュベーションの時間・温度、および浮遊細胞の培養および回収の条件などは、当業者により適宜選択される。
【００２８】
本明細書における腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択は、例えば、上記インキュベーションの後に浮遊細胞の増殖率又は生存率を測定し、増殖率又は生存率がより高い腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することによって行うことができる。あるいは、浮遊細胞に対する腫瘍関連抗原由来ペプチド候補の毒性を測定し、毒性がより低いペプチドを選択してもよい。浮遊細胞と腫瘍関連抗原由来ペプチドとの親和性を測定し、親和性がより高いペプチドを選択してもよい。浮遊細胞における特定の遺伝子の発現量を測定し、特定の遺伝子の発現が亢進及び／又は低下しているペプチドを選択してもよい。
【００２９】
浮遊細胞の増殖率を測定して腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択を行う場合、増殖率は、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含まない培地中で培養した生細胞の数と、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含む培地中で培養した生細胞の数とを比較して求めてもよい。
【００３０】
生細胞数の測定方法は特に限定されないが、比色法、コロニー形成法、クリスタルバイオレット法、［３Ｈ］チミジン取り込み法、ＭＴＴ法、及びＷＳＴ法等の方法を用いてもよい。
【００３１】
本明細書における腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を選択する工程には、浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することを含む。ｎ個の中には同じ腫瘍関連抗原由来のペプチドを複数個含めてもよい。
【００３２】
本明細書における浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程には、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択することを含む。例えば、２個のペプチドを選択する場合を以下に示す。まず、増殖率が最も高かったペプチドを１個目のペプチドとして選択する。次に、１個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ａ由来のペプチドであった場合、２個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチドの中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。次に、３個のペプチドを選択する場合を以下に示す。まず、増殖率が最も高かったペプチドを１個目のペプチドとして選択する。次に、１個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ａ由来のペプチドであった場合、２個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチド中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。２個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ｂ由来のペプチドであった場合、３個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ及びＢ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチドの中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。
【００３３】
本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法の一態様では、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含む。
【００３４】
本明細書において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択するとは、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドＸ及びＹで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合である場合には、新たに選択するペプチドには、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドＸ及びＹと少なくとも１つ違う腫瘍関連抗原由来ペプチドを含むように選択することを含む。このとき選択するペプチドの数は特に限定されない。長期間同じペプチドを選択した樹状細胞を患者に投与し続けることにより、免疫細胞が疲弊し癌細胞の増殖を促進する場合があり、少なくとも１つ違うものを含めることで、これを抑制することができうる。
【００３５】
本明細書において、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合とは、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に１回、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上投与されたことがある場合を含む。
【００３６】
本明細書において、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を２回以上投与する場合、１回目の投与と２回目の投与では、同じ腫瘍関連抗原ペプチド刺激した樹状細胞を用いてもよいし、２回目の投与の際、患者から新たに得られた単核球細胞を用いて、改めて腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を用いてもよい。１回目と２回目の投与は、一定期間おいて行ってもよい。この期間は、患者の状態、希望、治療効果等を考慮し、当業者が適宜選択することができる
【００３７】
本発明に係る免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物（以下「本発明に係る組成物」という。）の製造方法は、接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、未成熟樹状細胞を、腫瘍関連抗原ペプチドを選択するためのスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、を含む製造方法を含む。
【００３８】
本明細書における未成熟樹状細胞は、単核球細胞から分離した接着細胞をサイトカイン等で刺激することにより得ることができる。未成熟樹状細胞を誘導するサイトカインとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３が挙げられる。サイトカイン等は細胞の培地に添加すればよい。
【００３９】
本明細書における樹状細胞は、未成熟樹状細胞をサイトカイン等で刺激することにより得ることができる。樹状細胞を誘導するサイトカイン等としては、特に限定されないが、例えば、ＯＫ−４３２（ピシバニール等）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＩＬ−１３、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３が挙げられる。サイトカイン等は細胞の培地に添加すればよい。
【００４０】
本明細書における樹状細胞は、特に断りがない限り、成熟樹状細胞を意味する。ここで、成熟樹状細胞とは、未成熟細胞に比べて分化が進み、Ｔ細胞活性化能力が高い樹状細胞をいう。
【００４１】
本明細書において「未成熟樹状細胞を腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させる」とは、抗原である腫瘍関連抗原由来ペプチドを未成熟樹状細胞に取り込ませることを含む。取り込ませる手段は、公知の方法で行ってもよく、例えば、共培養法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４２】
共培養法とは、未成熟樹状細胞が有する貪食機能により腫瘍関連抗原由来ペプチドを取り込ませる方法である。例えば、腫瘍関連抗原由来ペプチドと未成熟樹状細胞とを同一容器に懸濁して、一定時間以上培養することによって、未成熟樹状細胞に腫瘍関連抗原由来ペプチドを取り込ませることができる。
【００４３】
本明細書において「投与」とは、当業者に公知の方法で患者へ投与することを含む。例えば、罹患部位への直接投与であってもよく、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射、並びにリンパ節への直接注入であってもよい。投与量は、疾患、患者の体格、年齢、性別、症状、投与目的、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することができる。
【００４４】
本明細書における組成物には、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、免疫促進剤、及びアジュバント剤等の医薬上許容される担体又は溶媒などを含むことができる。
【実施例】
【００４５】
１．腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニング
（１）材料
培養用容器は、ディッシュ（培養面積５５ｃｍ２）またはフラスコ（培養面積２５ｃｍ２）を使用した。Ｆｉｃｏｌｌ溶液は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア）を使用した。サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−４をそれぞれ最終濃度５０ｎｇ/ｍＬで使用した。培地は、基礎培地ＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培地にピシバニール（ＯＫ−４３２）を５ＫＥ／２ｍＬの濃度で添加した。【００４６】
（２）単核球細胞の分離
Ｆｉｃｏｌｌ溶液を用いた比重遠心法により、末梢血から単核球分画を採取し、１．０−１．３×１０６個/ｍＬの濃度で細胞を播種した。
培養容器を３０分以上インキュベートし、接着細胞を確認してから浮遊細胞を含む上清を回収し、接着細胞の培地はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４含有培地（１０％自己血漿）へ交換した。【００４７】
（３）腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択
上記（２）の浮遊細胞を含む上清を遠心（１２００ｒｐｍ、５分）した。細胞ペレットを確認し、上清を廃棄した。そこにＩＬ−２（１７５ＩＵ/ｍＬ）含有ＡＩＭ−Ｖを加え、予め腫瘍関連抗原由来ペプチド候補、ＶＥＧＦＲ１を２種類（配列番号：１及び２）、ＶＥＧＦＲ２を４種類（配列番号：３−６）、Ｈｅｒ２を４種類（配列番号：７−１０）、ＥＧＦＲを３種類（配列番号：１１−１３）、及びｈＴＥＲＴを３種類（配列番号：１４−１６）、それぞれ５μｇをコーティングした９６ウェルプレートに、１００μＬ（１×１０４〜１×１０５ｃｅｌｌｓ）／ウェルずつ分注した。７２時間培養後にＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ２．０溶液（プロメガ）を５０μＬ／ウェル添加し、ルミノメーターで生細胞数を測定した。ペプチド非添加ウェルの細胞数を１としたときの、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算した。
様々なＨＬＡ-Ａ型をもつ癌患者１２名の結果を表１に示す。１以上の細胞数を示したウェルの腫瘍関連抗原由来ペプチドを、細胞増殖率が高いペプチドとして選択した。さらにその中より、数値が高く、腫瘍関連抗原の種類が重複しないように３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドを患者ごとに選択した（丸印）。
各ペプチドはＨＬＡ-Ａ型に適合するように設計されたが、ＨＬＡ-Ａ型が適合しなくても細胞増殖促進効果があることがわかった。【００４８】
【表１】
0006604975.tif 000002
【００４９】
２．樹状細胞への刺激
上記１．（２）の接着細胞は５日間−１０日間培養した後、ＯＫ−４３２を０．０５ＫＥ／ｍＬの濃度で添加し、さらに４８時間培養した。また、ＯＫ−４３２による成熟樹状細胞化刺激を行うのと同時に、上記１．（３）で選択した３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドをそれぞれの患者由来の接着細胞に１０〜２０μｇ/ｍＬ添加した。【００５０】
３．腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニング及び樹状細胞の刺激
上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、１回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
樹状細胞を患者に投与してから一定の期間が経過した後、再度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、２回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
２回目の樹状細胞の投与から一定の期間が経過した後、再々度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、３回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
表２に示すように、患者由来の浮遊細胞と各ペプチドとの反応性は毎回同じ結果にはならず、選択するペプチドの組み合わせは異なるものとなった。従って、この方法を用いれば同じペプチドを長期間使用することによって生じる免疫逃避による治療抵抗性を回避することが可能となる。【００５１】
【表２】
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【００５２】
４．スクリーニング方法で選択したペプチドが及ぼす回収細胞数への効果
健常人被験者の浮遊細胞を用いて上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、数値が最大となった腫瘍関連抗原由来ペプチド（丸印）と最低となったペプチド（三角印）を選択した（表３）。その後、上記２．の方法により、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞の最終回収細胞数を比較したところ、丸印のペプチドを添加した樹状細胞の方が三角印のペプチドを添加した樹状細胞より最終的に回収できた細胞数が多かった（表３）。
また、本発明に係るスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングあり）と、スクリーニングを行わずにＨＬＡ−Ａ型に適合した腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングなし）とで、最終的に回収できた樹状細胞の細胞数を比較したところ、有意差はないものの、スクリーニングありの群で多い傾向が認められた（データ非表示）。
本発明は治療抵抗性のみならず、自己樹状細胞療法における重要な課題の一つである、投与細胞数の増加にも大いに貢献できるものである。【００５３】
【表３】
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【００５４】
５．本発明を用いた治療例
上記１−３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）と活性化リンパ球との併用治療成績を図２（ａ）、図２（ｂ）、および図３（ａ）に示す。また、上記１−３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）を併用療法を用いずに単独で投与した場合の治療成績を図３（ｂ）に示す。活性化リンパ球とは患者由来のＰＢＭＣをＩＬ−２（１７５ＩＵ／ｍＬ）含有のＡＩＭ−Ｖ及びリンパ球拡大培養用培地であるＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙｓ培地（ニプロ）等を用いて２週間培養し、１．２×１０１０個以上まで増殖させたものを生理的食塩水１００ｍＬに溶解し、点滴バックに充填したものを指す。樹状細胞を投与した日を三角印、リンパ球を投与した日を丸印で示した。
症例１の肺がん患者では、２回の投与共に、ＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：９）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択した（図２、ａ）。治療開始から３週間後に腫瘍マーカーであるＳＣＣ（正常値２ｎｇ／ｍＬ以下）の低下と倦怠感および呼吸苦の改善がみられた。
症例２の膵臓がん患者では、前半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択し、後半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１２）のペプチドを選択した（図２、ｂ）。治療開始から４週間後に腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９（正常値３７Ｕ／ｍＬ以下）の低下がみられた。
症例３の乳がん患者では、１回目の投与はＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１４）のペプチドを選択した。約１か月後の２回目投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）のペプチドを選択した。両治療日とも、活性化リンパ球を同時に投与した。２回目の治療日から１週間後のエコー画像により腫瘍径が約半分に縮小したことが確認された（図３、ａ）。
症例４の肺がん患者では、２週間ごとに、併用療法を用いずに、樹状細胞のみを３回投与した。１回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１３）を、２回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）、３回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：９）、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）のペプチドを選択した。３回目を投与した翌日のＣＴの画像により、腫瘍がほぼ消失したことが確認された（図３、ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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