(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱水の製剤であって、
（ｉ）ｐＨバッファー；
（ｉｉ）ヒドロキシプロリンおよびベタインからなる群から選択される合成アミノ酸；
（ｉｉｉ）ポリビニルアルコールである水溶性ポリマー；および
（ｉｖ）アラニン−グルタミンジペプチド、
を含む脱水の製剤。
【請求項２】
非還元糖、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、または第２アミノ酸をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の脱水の製剤。
【請求項３】
冷凍の欠如下において周囲温度で１つ以上の細胞を実質的に乾燥保存するための方法であって、該方法は、
（ｉ）上記１つ以上の細胞を少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤でインキュベートする工程；
（ｉｉ）上記１つ以上の細胞から前脱水の製剤を除去する工程；および
（ｉｉｉ）脱水の製剤の存在下で上記１つ以上の細胞を脱水して、１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞を生成する工程、を含み、
上記脱水の製剤は、
（ｉ）ｐＨバッファー；
（ｉｉ）ヒドロキシプロリンおよびベタインからなる群から選択される合成アミノ酸；
（ｉｉｉ）ポリビニルアルコールである水溶性ポリマー；および
（ｉｖ）アラニン−グルタミンジペプチド、
を含む方法。
【請求項４】
脱水の製剤が、アラニン−グルタミン、ベタイン、ビス−トリスおよびポリビニルアルコール、または、アラニン−グルタミン、ベタイン、ＭＥＳおよびポリビニルアルコール、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脱水の製剤が、非還元糖、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、またはアミノ酸をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのアポトーシス阻害剤が、可逆的アポトーシス阻害剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の細胞を上記前脱水の製剤でインキュベートする前に、１つ以上の細胞を固体担体に固定化する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む再水和の製剤を使用して、１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞を再水和する工程を含み、上記前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤が、上記再水和の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤と同じである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤が、再水和の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤とは異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１時間の実質的な乾燥保存後の１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞の再水和で、再水和された細胞は、脱水および実質的な乾燥保存前の細胞中の機能特性と略同じである少なくとも１つの機能特性を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
脱水の製剤がキレート剤をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、グルコン酸ナトリウム，およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脱水の製剤が、アラニン−グルタミン、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびポリビニルアルコールを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨバッファーが、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、スルフォサリチル酸、スルフォイソフタル酸、シュウ酸、ホウ酸塩、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、およびビス−トリス（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）からなる群から選択される、請求項１に記載の脱水の製剤。
【請求項１５】
第２アミノ酸が、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、およびプロリンからなる群から選択される、請求項２に記載の脱水の製剤。
【請求項１６】
少なくとも１つのアポトーシス阻害剤が、可逆的アポトーシス阻害剤である、請求項２に記載の脱水の製剤。
【請求項１７】
製剤が、アラニン−グルタミン、ベタイン、ビス−トリスおよびポリビニルアルコールを含む、請求項１に記載の脱水の製剤。
【請求項１８】
製剤が、アラニン−グルタミン、ベタイン、ＭＥＳおよびポリビニルアルコールを含む、請求項１に記載の脱水の製剤。
【請求項１９】
製剤がキレート剤をさらに含む、請求項１に記載の脱水の製剤。
【請求項２０】
キレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、グルコン酸ナトリウム，およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の脱水の製剤。
【請求項２１】
製剤が、アラニン−グルタミン、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびポリビニルアルコールを含む、請求項１９に記載の脱水の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年６月１３日に出願の、米国仮特許出願第６１／８３４，５１７号の利益を主張し、こは、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞の安定化に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の詳細
有核細胞、例えば、真核細胞の長期間保存は、通常、毒性の凍結保護物質ＤＭＳＯの存在下で極めて冷たい温度を必要とする。冷蔵システムの一般的な失敗によって引き起こされた損失に加えて、冷凍状態からの生細胞の回復は、困難を要するものであり、典型的に、ごくわずかな入れられた細胞のみが生存する。
【０００４】
過去２０年間に、周囲温度での真核細胞の安定化のための代替的な方法の開発に、研究資金で数百万ドルが費やされてきた。これらの試みの原動力は、生物医学的研究、診断学における製品開発および直接の適用、再生医療、治療学、血液供給ロジスティックスおよび細胞移植のための、周囲温度で安定化した真核細胞の保存の利点である。
【０００５】
乾燥状態で長年生存することができる緩歩動物、輪虫類、またはブラインシュリンプなどの極限環境微生物の研究に基づいて、真核細胞の培養物中でこの分子の現象を模倣する技術およびプロトコルが開発され得ることが仮定された。不運にも、研究の数十年間後にさえ、細胞の実際的な乾燥保存の安定化は達成されなかった。最良に表わされる安定化の技術は、乾燥媒体として、トレハロース（非還元糖分子）を使用する。トレハロースを充填した哺乳動物細胞は、乾燥され得るが、ほぼ即時の再水和を必要とし、その後生存は限定される。たとえ数分の乾燥した細胞の保存であっても、完全な細胞死を結果としてもたらすことが示された。
【０００６】
したがって、再水和後に生存可能なままである周囲温度での細胞の実質的な乾燥保存を可能にする、製剤、組成物および方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に記載される製剤、組成物および方法は、細胞を実質的に乾燥した状態で保存されるときに、好都合に生存可能な状態で維持し、その結果、再水和後に、細胞は、少なくとも１時間、および特定の実施形態において、少なくとも１週間の間、乾燥保存後に少なくとも１つの機能特性、例えば、細胞生存性を保持し、冷凍または凍結乾燥を必要とすることなく、生細胞を輸送する且つ保存することに利用可能な時間を著しく増加させる。本発明の一態様では、冷凍なしで又は随意に凍結乾燥なしで実質的に乾燥保存された細胞を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１時間の実質的な乾燥保存後の細胞の再水和で、再水和された細胞は、脱水および実質的な乾燥保存前に、細胞中で略同じである少なくとも１つの機能特性を示す。
【０００８】
特定の実施形態では、組成物は、好ましくは、アミノ酸、合成アミノ酸、ペプチド、非還元糖、キレート剤、水溶性ポリマーおよびテトラヒドロピリミジンから成る群から選択される、少なくとも１つの乾燥保存安定剤を含む。一実施形態では、糖分子（例えば；トレハロース）である安定剤は存在しないか、あるいは糖分子である安定剤が存在する場合には、糖分子でない別の安定剤も存在する。
【０００９】
特定の他の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、好ましくは可逆的アポトーシス阻害剤を含む組成物が提供される。典型的なアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２−α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、カルパイン阻害剤、およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【００１０】
別の態様では、組成物が提供され、ここで、前脱水に、細胞は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤で処置されて、前処理された細胞を生成する。特定の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２−α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＰＩＫ３経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、カルパイン阻害剤、およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【００１１】
一実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２−α阻害剤である。
【００１２】
別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＡＳＫ１阻害剤である。
【００１３】
また別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤である。
【００１４】
さらに別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＧＳＫ３阻害剤である。
【００１５】
一実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。
【００１６】
別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。
【００１７】
また別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。
【００１８】
さらに別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００１９】
一実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＩＲＥ−１阻害剤である。
【００２０】
別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、カルパイン阻害剤である。
【００２１】
また別の実施形態では、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、カスパーゼ−１阻害剤である。
【００２２】
特定の実施形態では、前脱水の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのＥＲシャペロン誘導剤を含む。
【００２３】
特定の他の実施形態では、前脱水の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのオートファジー誘導剤を含む。
【００２４】
また別の実施形態では、前脱水の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つの生存タンパク質を含む。
【００２５】
本発明の別の態様では、再水和された細胞を含む組成物が提供され、ここで、再水和された細胞は、冷凍または凍結乾燥なしで実質的に乾燥保存された細胞であり、少なくとも１時間の実質的な乾燥保存後の細胞の再水和で、再水和された細胞は、脱水および実質的な乾燥保存前に、細胞中で略同じである少なくとも１つの機能特性を示す。
【００２６】
特定の実施形態では、細胞の再水和は、再水和の製剤の存在下で生じ、好ましくは、再水和の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む。
【００２７】
特定の他の実施形態では、再水和のバッファー中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２−α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、カルパイン阻害剤、およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【００２８】
また他の実施形態では、再水和の製剤は、ＥＲシャペロン誘導剤、オートファジー誘導剤および生存タンパク質から成る群から選択されるものの１つ以上である、アポトーシス阻害剤を含む。
【００２９】
一実施形態では、再水和後の少なくとも１つの機能特性は、代謝活性を含む。
【００３０】
特定の実施形態では、代謝活性は、ＡＴＰ含量を決定することによって又はカスパーゼ判定のアッセイによって測定される。
【００３１】
特定の他の実施形態では、再水和後の代謝活性は、細胞を再水和した２４時間後に、細胞を再水和した４８時間後に、細胞を再水和した７２時間後に、または細胞を再水和した１週間後に測定される。
【００３２】
他の実施形態では、組成物は、再水和前の少なくとも２４時間、再水和前の少なくとも４８時間、再水和前の少なくとも７２時間、または再水和前の少なくとも１週間、脱水形態で安定化される。
【００３３】
他の態様では、ｐＨバッファー；合成アミノ酸（水溶性ポリマー）；および第１アミノ酸またはペプチド、を含む脱水の製剤が提供される。特定の実施形態では、脱水の製剤は、非還元糖、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤または第２アミノ酸をさらに含む。
【００３４】
また別の態様では、凍結乾燥の欠如下の周囲温度での１つ以上の細胞の実質的な乾燥保存のための方法が提供され、該方法は、脱水の製剤中で１つ以上の細胞をインキュベートし、脱水の製剤の存在下で１つ以上の前処理された細胞を脱水して、１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞を生成する工程を含む。またさらなる方法では、凍結乾燥の欠如下の周囲温度での１つ以上の細胞の実質的な乾燥保存のための方法が提供され、該方法は、アポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤で１つ以上の細胞をインキュベートし、１つ以上の前処理された細胞を生成して、前脱水の製剤を除去する工程；および脱水の製剤の存在下で１つ以上の前処理された細胞を脱水して、１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞を生成する工程を含む。
【００３５】
一実施形態では、方法に使用される脱水の製剤は、少なくとも１つの乾燥保存安定剤を含み、前脱水の製剤が使用されないときに、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤（一実施形態では可逆的アポトーシス阻害剤）をさらに含んでもよい。
【００３６】
別の実施形態では、方法は、前脱水の製剤で１つ以上の細胞をインキュベートする前に固体担体に１つ以上の細胞を固定化する工程をさらに含む。
【００３７】
また別の実施形態では、方法は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む再水和の製剤を使用して、１つ以上の実質的に乾燥保存した細胞を再水和し、再水和された細胞を生成する工程をさらに含む。
【００３８】
特定の実施形態では、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、再水和の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤と同じであり、他の実施形態では、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、再水和の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤とは異なる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】（Ａ）ＧＲＰ７８結合の不活性化状態の及び（Ｂ）ＧＲＰ７８の放出が活性化ＩＲＥ１を結果的にもたらす、ＥＲストレス経路の３つの近位ＥＲ膜貫通センサーの概略図である。
【図２Ａ】ＥＲストレス経路の概略図である。
【図２Ｂ】アポトーシス阻害剤によって阻害されたＥＲストレス経路のステップおよび標的を遮断した、ＥＲストレス経路の概略図である。
【図３】本明細書に記載される製剤および方法を使用して実質的に乾燥保存した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、再水和後に脂肪細胞（パネルＢ）、骨細胞（パネルＣ）、および軟骨細胞（パネルＤ）へと分化する能力を保持することを示す。
【図４】脱水後および室温での５時間の保存後にＨｅＬａ細胞の長期的な生存率を例証する。（Ａ）５時間の乾燥に続く５日間の再水和後の細胞生存率。（Ｂ）１ｍｌ当たりの生細胞の数。細胞を、新鮮な細胞培養プレートへと播種し、群を、本明細書に開示される一実施形態に従って組成物で処置した。
【図５】未処置の対照に対するカスパーゼ３／７活性化を示す。カスパーゼ活性化を、標準的な組織培養条件下で培養された、未処理の細胞に対する試験サンプル中の活性の比率として計算した。試験細胞を、脱水し、５時間室温で乾燥して保存し、その後５日間の再水和が続いた。
【図６】脱水、乾燥状態での７時間の保存、および保存後の再水和後の細胞の生存率を示す。細胞生存率を、再播種後の３日間および再水和後の合計７日間評価した。異なる安定化の製剤は、細胞生存に加えて細胞増殖にも影響を与える。無保護の対照およびトレハロースで安定化した細胞は、細胞の生存にはつながらなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
理論に縛られることなく、本明細書に記載される特定の実施形態の製剤および組成物は、例えば、前脱水の指定された段階で及び再水和の時間に特異的なＥＲストレス経路を遮断することによって、アポトーシスを遮断しながら、細胞の細胞膜および細胞小器官の完全性を安定化し、少なくとも１時間の間再水和された後に少なくとも１つの機能特性を保持する、周囲温度で保存された実質的に乾燥した細胞を提供する。特定の実施形態では、特異的なＥＲストレス経路は、アポトーシス阻害剤を使用して遮断される。他の実施形態では、特異的なＥＲストレス経路は、ＥＲシャペロン誘導剤と組み合わせてアポトーシス阻害剤を使用することで遮断され、ＥＲストレス経路をアポトーシスよりもむしろ適応反応へと促進する。
【００４１】
特定の実施形態では、細胞は、好ましくは、少なくとも１つの乾燥保存安定剤および少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む、脱水の製剤を使用して脱水される。
【００４２】
特定の他の実施形態では、細胞は、脱水の製剤の存在下で細胞を脱水する前に所定期間（例えば１時間）アポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤を使用して前処理され、実質的に乾燥保存した細胞を生成する。実質的に乾燥保存した細胞は、前脱水の製剤中のアポトーシス阻害剤と同じ又は異なり得る、好ましくは、アポトーシス阻害剤を含む、再水和の製剤の存在下で再水和される。再水和の製剤は、所定期間（例えば１時間）後除去され、細胞は、意図した最終用途に依存して、増殖培地または他の適切な溶液およびバッファー中で再水和されてもよい。
【００４３】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に言及される、すべての特許、特許出願、および公報は、その全体が引用によって組み込まれる。
【００４４】
本明細書で使用されるように、用語「真核細胞」は、真核生物、好ましくは、胎児または成人の、受精卵母細胞、芽球細胞を含む真核細胞の発達の所与の段階および他の胚形成期での、ヒトの体液または組織中に存在する少なくとも１つの有核細胞を指す。本発明の製剤、組成物および方法を使用して、周囲温度で実質的に乾燥保存され得る典型的な細胞は、限定されないが、線維芽細胞、角化細胞、軟骨細胞、メラニン細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、心筋細胞、ニューロン、シュワン細胞、グリア細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、記憶細胞、網状赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、巨核球、樹状細胞、脂肪細胞、島細胞、卵母細胞、精母細胞、胎盤の臍帯血細胞、芽球細胞、接合体、上皮細胞（例えば、乳腺細胞、子宮内膜細胞、膵腺房細胞、杯細胞、ランゲルハンス細胞、エナメル芽細胞およびパネート細胞）、破歯細胞（ｏｄｏｎｔｏｃｙｔｅｓ）、肝細胞、脂肪細胞、旁細胞、肺細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞、網膜視細胞および色素細胞、水晶体細胞、および多能性または全能性の胚性幹細胞、胎生幹細胞、ｉＰＳ細胞、および間葉系幹細胞を含む、幹細胞、あるいはそれらの混合物、を含む。幹細胞は、未分化の又は部分的に分化した状態において周囲温度で実質的に乾燥保存されてもよい。
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「前処理された細胞」は、脱水前に少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤で処理された細胞を指す。前処理された細胞は、アポトーシス阻害剤を予め充填され、それによって、アポトーシス阻害剤を含有している又は欠いている脱水の製剤を使用して、ＥＲストレス経路の活性化なしの前処理された細胞の実質的な乾燥保存が可能となる。特定の実施形態では、アポトーシス阻害剤を含む前脱水の製剤は、脱水の製剤を加える前に、前処理された細胞から除去されるが、アポトーシス阻害剤の細胞内濃度は、ＥＲストレス経路の活性化なしで細胞を実質的に乾燥保存するのに十分な濃度である。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「周囲温度での実質的な乾燥保存」または「周囲温度で実質的に乾燥保存した」は、本発明の製剤、組成物および方法を使用して、冷凍または凍結乾燥なしで再水和された状態で細胞の少なくとも１つの機能特性を維持しながら、周囲温度で細胞を保存する能力を指す。実質的に乾燥保存した細胞は、必ずしもすべての遊離した内水を欠けている必要はないが、好ましくは、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９８％までの遊離した内水が除去される。実質的に乾燥保存した細胞は、乾燥保存される細胞のタイプ、使用される前脱水及び／又は脱水の製剤、および実質的に乾燥保存した細胞のための意図した用途に依存して、様々な期間の間、周囲温度で保存されてもよい。細胞は、次の期間の間、脱水した状態で保存されてもよい：１）例えば、１、２、６、１２または１８時間などの数時間；２）例えば、１日、２日、４日、または６日などの数日；３）例えば、１週、２週、または３週などの数週；４）例えば、１か月、２か月、４か月、６か月、８か月、または１１か月などの数か月；および５）例えば、１年、２年、５年、１０年、２０年、またはそれ以上などの数年さえも。
【００４７】
本明細書で使用されるように、用語「固定化された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」は、固体表面に接着される又はそれに直接接触する、実質的に乾燥保存した細胞を指す。細胞は、脱水の製剤の追加および乾燥前に固定化され得るか、または恐らく、前脱水工程前に固定化され、脱水工程の全体にわたって固定化を維持される。適切な固体表面は、限定されないが、スライドガラス、ビーズ、チップ、膜、シート、メッシュ、カラム、親和性樹脂、スポンジ、９６ウェルのプレート、培養皿およびフラスコを含むプラスチック、チューブ、容器、器、限定されないが、コラーゲンおよびアルギナートのヒドロゲルなどの天然のマトリックス、または細胞が増殖され得る他の基層、を含む
【００４８】
本明細書で使用されるように、「アポトーシス阻害剤」は、ＥＲシャペロン誘導剤、オートファジー誘導剤および内因性または外因性の生存タンパク質を含む、細胞アポトーシスの誘導を防ぐための、所望の酵素の量及び／又は活性、または経路（好ましくは、ＥＲストレス経路におけるステップ）をダウンレギュレートする、減少させる、抑止する、またはさもなければ調節することができる化合物または薬剤を指す。これらの酵素または経路の阻害は、限定されないが、好ましくは可逆的な方法での酵素への直接結合、または酵素または標的をコード化する遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡへの転写、新生ポリペプチドへの翻訳、及び／又は成熟タンパク質への最終的なポリペプチド修飾）の一時的阻害を含む当該技術分野に既知の様々な機構によって達成され得る。アポトーシス阻害剤は、本明細書に記載される特異的なアポトーシス阻害剤を含む。
【００４９】
本明細書に使用されるように、用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」または「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」は、酵素の活性、あるいは酵素またはタンパク質の発現を、少なくとも部分的にダウンレギュレートする、減少させる、低下させる、抑止する、不活性化する、または阻害する化合物または薬剤の能力を指す。好ましくは、阻害は可逆的である。
【００５０】
ＥＲストレス経路
特定の実施形態では、前脱水の製剤、脱水の製剤及び／又は再水和の製剤は、ＥＲストレス経路において少なくとも１つの必須のステップを遮断する少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む。
【００５１】
図１のＡで示されるように、高等真核生物における小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）シグナル伝達は、３つの近位ＥＲ膜貫通センサー、ＰＥＲＫ、キナーゼ／ＲＮａｓｅ ＩＲＥ１、および転写因子ＡＴＦ６によって開始される（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ （２００２） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０： １３８９−１３９８． ｄｏｉ： １０．１１７２／ｊｃｉ０２１６８８６； Ｍｏｒｉ Ｋ （２０００） Ｃｅｌｌ １０１： ４５１−４５４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｓ００９２−８６７４（００）８０８５５−７； Ｒｏｎ Ｄ， Ｗａｌｔｅｒ Ｐ （２００７） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８： ５１９−５２９． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｒｍ２１９を参照）。ＰＥＲＫの活性化は、ｅＩＦ２α、α翻訳開始因子のリン酸化によって全体的規模でタンパク質翻訳の阻害につながる（図１のＢ；Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５： ８９７−９０４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｓ１０９７−２７６５（００）８０３３０−５）。付随的に、ＰＥＲＫは、転写因子ＡＴＦ４の翻訳を増大させることによって、ＵＰＲ特異的遺伝子の転写を促進する。ＩＲＥ１は、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡからイントロンを切除することによって、ＸＢＰ１のオルタナティブスプライシングされた、より強力な形態を生成する（例えば、Ｃａｌｆｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ ４１５： ９２−９６． ｄｏｉ： １０．１０３８／４１５０９２ａを参照）。第３のＵＰＲセンサー、ＡＴＦ６は、その細胞質側に転写活性化ドメインを有するＥＲ膜貫通タンパク質である。
【００５２】
図２Ａで示されるように、ＥＲストレスの事象中に、ＡＴＦ６は、タンパク質分解を受け、それ故、ＥＲ膜からその細胞質のトランス活性化ドメインを遊離する。一度遊離すると、それは、核に入り（Ｈａｚｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １０： ３７８７−３７９９． ｄｏｉ： １０．１０９１／ｍｂｃ．１０．１１．３７８７）、追加のＵＰＲ遺伝子の転写を開始する。ＵＰＲによるＥＲストレスの近位センサーの活性化は、結果として、遺伝子調節の複合パターンをもたらす。したがって、ＵＰＲシグナルは、ＢｉＰ、ＧＲＰ９４、カルレティキュリン、およびＥｒｄｊ４などのＥＲシャペロンのアップレギュレーションを介してタンパク質フォールディングの能力を増大することによって、ＥＲ中の高レベルのミスフォールドされたタンパク質を緩和し低下させることを目的としている（例えば、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３６６： ５８５−５９４． ｄｏｉ： １０．１０４２／ｂｊ２００２０３９１； Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３： ３３７４１−３３７４９． ｄｏｉ： １０．１０７４／ｊｂｃ．２７３．５０．３３７４１を参照）。しかしながら、ＥＲ中の適切なタンパク質フォールディングを回復できない場合には、ＣＨＯＰなどの遺伝子がアップレギュレートされ、結果としてアポトーシス経路の活性化につながる。
【００５３】
１．  ＧＲＰ７８／ＢｉＰ
ＧＲＰ７８／ＢｉＰは、小胞体の完全性およびストレス誘導性のオートファジーに必要とされる分子シャペロンのＨＳＰファミリーのメンバーである。ＧＲＰ７８は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の調節に中心的な役割を果たし、真核細胞中のオートファジーの必須の構成要素であり、細胞順応および発癌生存（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ）に重要な役割を果たし得る。ＧＲＰ７８のクライアントタンパク質の１つは、タンパク質の二本鎖ＲＮＡ活性化されるタンパク質様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）であり、ＰＥＲＫへの結合は、ＰＥＲＫオリゴマー化を除外する。ＩＲＥ１のオリゴマー化およびＡＴＦ６の活性化を防ぐために、ＧＲＰ７８はまた、クライアントタンパク質ＩＲＥ１およびＡＴＦ６に結合する。ＧＲＰ７８は、ＥＲ内の多量体タンパク質複合体の構築を促進する役割を果たす。
【００５４】
２．  ＩＲＥ１
イノシトールを必要とする酵素１（ＩＲＥ１）は、エンドヌクレアーゼ活性を保持するｓｅｒ／ｔｈｒタンパク質キナーゼである。ＩＲＥ１は、小胞体ベースのストレスシグナルへの反応として遺伝子発現を変更する際に重要であり、そのＮ末端ドメインを介して小胞体の内腔で変性タンパク質を感知し、これは、酵素の自己活性化につながる。活性なエンドリボヌクレアーゼドメインは、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡをスプライシングして、新しいＣ末端を生成し、それを強力な変性タンパク質の反応の転写活性化因子（ｕｎｆｏｌｄｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）に転換して、増殖停止およびアポトーシスを引き起こす。キナーゼドメインは、トランス自己リン酸化によって活性化され、キナーゼ活性は、エンドリボヌクレアーゼドメインの活性化に必要とされる。ＩＲＥ１は、遍在的に発現され、膵臓組織で高レベルが観察される。ＩＲＥ１は、ジスルフィド結合したホモダイマーであり、ダイマー形成は、Ｎ末端の内腔ドメイン内で疎水的相互作用によって促進され、ジスルフィド架橋によって安定化される。ＩＲＥ１はまた、変性タンパク質反応の負の調節因子である、ＨＳＰＡ５に結合する。この相互作用は、ホモ二量体化を妨害し、ＩＲＥ１の活性化を防ぎ得る。
【００５５】
３．  ＰＥＲＫ
ＰＲＫＲ様小胞体キナーゼまたはタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）としても知られる、真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ３は、ヒトにおいてＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子によってコード化される酵素である。ＰＥＲＫは、真核生物翻訳開始因子２（ＥＩＦ２）のαサブユニットをリン酸化し、その不活性化に、およびそれ故、翻訳開始の迅速な低減および全体的なタンパク質合成の抑制につながる。それは、小胞体（ＥＲ）に位置するＩ型膜タンパク質であり、ここで、ミスフォールドされた（ｍａｌｆｏｌｄｅｄ）タンパク質によって引き起こされたＥＲストレスによって誘導される。
【００５６】
４．  ＡＴＦ６
この遺伝子は、小胞体（ＥＲ）ストレスの間に小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）のために標的遺伝子を活性化する転写因子をコード化する。それは、転写因子であるが、このタンパク質は、ＥＲに埋め込まれる膜貫通タンパク質として合成されるという点で普通ではない。それは、ＥＲストレスセンサー／トランスデューサーとして機能し、ＥＲストレス誘導性のタンパク質分解後に、ＥＲシャペロンエンをコード化する遺伝子のプロモーター中に存在するシス作用するＥＲストレス応答因子（ＥＲＳＥ）を介して核転写因子として機能する。このタンパク質は、静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）のための生存因子として特定されたが、増殖性の扁平上皮癌細胞ではない。
【００５７】
５．  ＡＳＫ１
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ５（ＭＡＰ３Ｋ５）としても知られる、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）は、ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ・キナーゼファミリーのメンバーであり、それ自体、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の一部分である。ＡＳＫ１は、ＭＫＫ４（ＳＥＫ１）／ＭＫＫ７およびＭＫＫ３／ＭＫＫ６を直接リン酸化し、これは、順に、酸化ストレス、小胞体ストレスおよびカルシウム流入などの、一連のストレスに応じて、Ｒａｆ非依存の方法でｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８ マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化する。
【００５８】
非ストレス条件下では、ＡＳＫ１は、そのＣ末端コイルドコイルドメイン（ＣＣＣ）を介してオリゴマー形成される（その活性化のための要件）が、減少したチオレドキシン（Ｔｒｘ）およびカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）の抑制効果によって不活性型のままある。Ｔｒｘは、そのＮ末端コイルドコイルドメイン（ＮＣＣ）への直接的な結合によってＡＳＫ１キナーゼ活性を阻害する。ＴｒｘおよびＣＩＢ１は、それぞれ、酸化還元感受性またはカルシウム感受性の方法で、ＡＳＫ１活性化を調節する。両方とも、ＴＮＦ−α受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）、ＡＳＫ１活性化因子と競合するようである。その後、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ６は、ＡＳＫ１に動員されて、より大きな分子量複合体を形成する（図２Ａを参照）。続いて、ＡＳＫ１は、ＣＣＣだけでなくＮＣＣも介して、ホモオリゴマー相互作用を形成し、これは、トレオニン８４５での自己リン酸化を介するＡＳＫ１の完全な活性化につながる。
【００５９】
６．  ＪＮＫ
ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ１／２／３）は、哺乳動物細胞において見られるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの３つの主要な群の１つの下流成分であり、他の２つは、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２）およびｐ３８タンパク質キナーゼ（ｐ３８．α，β，γ，，δ）から成る。キナーゼの各群は、ＭＡＰＫを含む３モジュールのカスケード（ｔｈｒｅｅ−ｍｏｄｕｌｅ ｃａｓｃａｄｅ）の部分であり、これは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によるリン酸化によって活性化され、順に、ＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）によるリン酸化によって活性化される。ＪＮＫおよびｐ３８の活性化は、アポトーシスの誘導に関連している。多くの細胞タイプを使用することで、ＪＮＫの持続的活性化が細胞死を誘導し、優性ネガティブ（ＤＮ）阻害剤によるＪＮＫ活性化の遮断が一連のアポトーシス刺激による死滅を防ぐことが示された。アポトーシスにおけるＪＮＫの役割も、ｊｎｋ遺伝子の標的破壊を有するマウスの分析によって文書化される。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の両方を欠くマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、遺伝毒性物質、紫外線、およびアニソマイシンを含む、様々なストレス刺激によるアポトーシスに完全に耐性があり、ｊｎｋ３−／−ニューロンは、興奮毒に対するアポトーシス反応の深刻な欠損を示す。その上、ＪＮＫ２は、未熟な胸腺細胞中の抗ＣＤ３誘導性のアポトーシスに必要とされることが示された。
【００６０】
７．  ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ（α、β、γ、およびδ）は、ＭＡＰＫファミリーのメンバーであり、以下の４つのｐ３８ ＭＡＰＫが、高真核生物中でクローン化されている：ｐ３８−Ａｌｐｈａ／ＸＭｐｋ２／ＣＳＢＰ、ｐ３８−Ｂｅｔａ／ｐ３８−Ｂｅｔａ２２、ｐ３８−Ｇａｍｍａ／ＳＡＰＫ３／ＥＲＫ６、およびｐ３８−Ｄｅｌｔａ／ＳＡＰＫ４。これらの４つのタンパク質は、そのアミノ酸配列で６０−７０％同一であり、ＭＫＫ６（ＭＡＰＫキナーゼ−６）によってすべて活性化される。別のＭＡＰＫキナーゼ、ＭＫＫ３（ＭＡＰＫキナーゼ−３）は、ｐ３８−Ｂｅｔａ２を除いて、ｐ３８−Ａｌｐｈａ、ｐ３８−Ｇａｍｍａ、およびｐ３８−Ｄｅｌｔａをリン酸化および活性化すると示された。哺乳動物のｐ３８ ＭＡＰＫファミリーは、ＵＶ照射、熱ショック、および高い浸透ストレスを含む細胞ストレスによって活性化される。
【００６１】
ますます多くの転写因子がｐ３８の直接的な標的となると知られているように、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化はまた、遺伝子転写に直接影響を与え得る。直接的なリン酸化および活性化は、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、およびＡＴＦ−６、ＭＥＦ２Ａ／Ｃ（筋細胞増強因子−２Ａ／Ｃ）、ＳＡＰ１Ａ（シグナル伝達のリンパ球活性化分子関連タンパク質−１Ａ）およびＥｌｋ１（ＥＴＳドメイン転写因子−１）のために記載されている。
【００６２】
８．  ＭＥＫ
「ＭＥＫ１」および「ＭＥＫ２」は、マイトジェン活性化したＥＲＫ活性化キナーゼに対する略語である（ここで、ＥＲＫは、ＭＡＰＫに対する別の呼称である、細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼである）。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、二元機能のセリン／トレオニンおよびチロシンタンパク質キナーゼであり、ＭＡＰキナーゼとしても知られている。Ｒａｓ−ＧＴＰはＲａｆを活性化し、ＲａｆはＭＥＫ１およびＭＥＫ２を活性化し、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２はＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化する。一度活性化されると、Ｒａｆおよび他のキナーゼは、ＭＥＫ−１の場合に、２つの隣接するセリン基、Ｓ２１８およびＳ２２２上でＭＥＫをリン酸化する。これらのリン酸化は、キナーゼとしてのＭＥＫの活性化に必要とされる。順に、ＭＥＫは、単一のアミノ酸によって分離された以下の２つの基上でＭＡＰキナーゼをリン酸化する：チロシン、Ｙ１８５、およびトレオニン、Ｔ１８３。ＭＥＫは、ＭＡＰキナーゼをリン酸化する前にＭＡＰキナーゼと強く関連しているようであり、これは、ＭＥＫによるＭＡＰキナーゼのリン酸化が、２つのタンパク質間の事前の強い相互作用を必要とし得ることを示唆している。
【００６３】
９．  ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路
ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔシグナル経路は、多くのタイプの細胞刺激または毒性の傷害（ｉｎｓｕｌｔｓ）によって活性化され、転写、翻訳、増殖、成長、および生存などの、基礎となる細胞機能を調節する。増殖因子のその受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）またはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）への結合は、それぞれ、クラスＩａおよびＩｂのＰＩ３Ｋアイソフォームを刺激する。ＰＩ３Ｋは、細胞膜でホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸塩（ＰＩＰ３）の産生を触媒する。ＰＩＰ３は、順に、Ａｋｔを活性化する助けとなる二次メッセンジャーとして機能する。一度活性されると、Ａｋｔは、アポトーシス、タンパク質合成、代謝、および細胞周期に伴う基質をリン酸化することによって重要な細胞プロセスを制御することができる。
【００６４】
１０．  ＸＢＰ−１
この遺伝子は、Ｘボックス（Ｘ ｂｏｘ）と呼ばれるプロモーター要素に結合することによって、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を調節する転写因子をコード化する。この遺伝子産物は、ｂＺＩＰタンパク質であり、これも、Ｔ細胞白血病ウイルスタイプ１プロモーターのプロモーターにおいてエンハンサーに結合する細胞転写因子として特定された。小胞体（ＥＲ）中の変性タンパク質の蓄積後に、この遺伝子のｍＲＮＡが、エンドヌクレアーゼのイノシトール要求酵素１（ＩＲＥ１）によって媒介される非従来型のスプライシング機構によって活性型に処理されることが分かった。スプライシングされたｍＲＮＡから結果として生じる２６ｎｔの損失は、フレームシフトおよび機能的に活性な転写因子であるアイソフォームＸＢＰ１（Ｓ）を引き起こす。スプライシングされていないｍＲＮＡによってコード化されたアイソフォーム、ＸＢＰ１（Ｕ）は、構成的に発現され、ＸＢＰ１（Ｓ）の負のフィードバック調節因子として機能すると考えられ、これは、ＥＲストレスの回復期中に標的遺伝子の転写を遮断する。ＸＢＰ１の偽遺伝子が特定され、染色体５に局所化された。
【００６５】
１１．  ｅＩＦ２―α
ｅＩＦ２−アルファは、三元複合体をＧＴＰおよび開始剤ｔＲＮＡで形成することによって、タンパク質合成の初期工程で機能する翻訳開始因子である。この複合体は、４３ｓリボソームサブユニットに結合し、その後ｍＲＮＡ結合が続いて、４０Ｓ前開始複合体が形成される。ｅＩＦ−２に結合したＧＴＰの加水分解およびｅＩＦ−２−ＧＤＰ二元複合体の放出が先行して、８０Ｓ翻訳開始複合体を形成するための６０Ｓリボソームサブユニットの接合が続く。ｅＩＦ−２が開始の別のラウンドを再利用し触媒するために、ｅＩＦ−２に結合したＧＤＰは、ｅＩＦ−２Ｂによって触媒された反応によってＧＴＰに取って代わらなければならない。ｅＩＦ２−アルファは、少なくとも４つのキナーゼ、ＰＥＲＫ、ＧＣＮ２、ＨＲＩおよびＰＫＲによってリン酸化され、リン酸化は、ｅＩＦ−２／ＧＤＰ／ｅＩＦ−２Ｂ複合体を安定化し、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を防ぎ、それ故、連続する開始のラウンド間のｅＩＦ−２の再利用を損なわせ、翻訳の全体的な阻害につながる。
【００６６】
１２．  ＧＳＫ３
グリコゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、グリコーゲン代謝の対照に関係する酵素として最初に特定された。近年、それは、タンパク質合成の開始、細胞増殖、細胞分化、アポトーシスを含む、多様な範囲の細胞機能の調節に重要な役割があることを示され、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの構成要素として胚発生に不可欠である。ＧＳＫ３は、インスリンシグナル経路における中心的な負の調節因子として、インスリン抵抗性において役割を果たす。
【００６７】
１３．  ＮＲＦ２
ＮＦＥ２Ｌ２またはＮＲＦ２としても知られる、核因子（赤血球由来２）様２は、ヒトにおいてＮＦＥ２Ｌ２遺伝子によってコード化される転写因子である。ＮＲＦ２抗酸化反応経路は、酸化ストレスの細胞毒性に対する主要な細胞防御である。ＮＲＦ２は、幾つかの抗酸化酵素の発現を増加させる。
【００６８】
ＮＲＦ２は、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子である。正常な又はストレスのない条件下で、ＮＲＦ２は、ユビキチン化によってＮＲＦ２を分解するＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１（ＫＥＡＰ１）およびコリン３によって細胞質内で保持される。酸化ストレス下で、ＮＲＦ２は、分解されないが、代わりに核に移動し、そこで、抗酸化遺伝子およびそのタンパク質の転写を開始する。
【００６９】
１４．  ＫＥＡＰ１
Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１（ＫＥＡＰ１）は、抗酸化反応の主要制御因子である、ＮＲＦ２と相互作用すると示された。静止条件下で、ＮＲＦ２は、ＫＥＡＰ１に結合することによって細胞質内に固着され、これは、順に、ユビキチン化および続くＮＲＦ２のタンパク質分解を促進する。細胞質内のＮＲＦ２のそのような隔離および更なる分解は、ＮＲＦ２に対するＫＥＡＰ１の抑制作用のための機構である。
【００７０】
１５．  ＡＴＦ４
ＡＴＦ４としても知られる、活性化転写因子４（ｔａｘ−応答エンハンサー因子Ｂ６７（ｔａｘ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂ６７））は、ヒトにおいてＡＴＦ４遺伝子によってコード化されるタンパク質である。この遺伝子は、ＨＴＬＶ−１のＬＴＲ内でｔａｘ−応答エンハンサー因子を結合することができ得る広く発現された哺乳動物ＤＮＡ結合タンパク質として元来特定された転写因子をコード化する。コード化されたタンパク質はまた、単離され、ｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質２（ＣＲＥＢ−２）として特徴づけられた。この遺伝子によってコード化されたタンパク質は、転写因子、ｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質（ＣＲＥＢ）およびＣＲＥＢ様タンパク質のＡＰ−１ファミリーを含む、ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーに属している。これらの転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインとして機能する一連の（ａ ｓｔｒｅｔｃｈ ｏｆ）塩基性アミノ酸に対するＣ末端に位置する、タンパク質間相互作用に関係するロイシンジッパー領域を共有する。同じタンパク質をコード化する２つの代替的な転写物が記載された。２つの偽遺伝子は、大きな逆位重複を包含している領域においてｑ２８でＸ染色体上に位置付けられる。
【００７１】
乾燥保存安定剤
１．  天然および合成のアミノ酸
本明細書に記載されるようにまた、特定の実施形態において、脱水の製剤は、周囲温度での機能細胞の実質的な乾燥保存のための脱水の製剤中に少なくとも１つのアミノ酸または合成アミノ酸を含んでもよい。
【００７２】
特定の実施形態では、天然アミノ酸は、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、およびプロリンからなる群から選択される。
【００７３】
特定の他の実施形態では、脱水の製剤および組成物は、以下の一般式Ｉを有する１つ以上の合成アミノ酸を含有し得：
【００７４】
【化１】
0006604942.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、アリール、アリールアルキル、−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２−ＣＨ３から独立して選択され、ここでＲ１およびＲ２がＣＨ３またはＣＨ２−ＣＨ３であるときに、Ｒ３は、Ｈであるか又は存在せず、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、
【００７５】
【化２】
0006604942.tif 000003
から選択され、
およびＹは、ＣＯＯおよびＳＯ３から選択される。
【００７６】
組成物に有用な典型的な合成アミノ酸は、ＷＯ２０１０１３２５０８および米国特許第８，５１９，１２５号に記載されるものを含み、その内容はその全体が引用によって本明細書に組み込まれる。本発明の組成物とともに利用され得る合成アミノ酸は、ヒドロキシプロリンおよびベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）を含む。
【００７７】
２．  ペプチド
周囲温度での細胞の実質的な乾燥保存のための本明細書に記載された脱水の製剤は、特定の実施形態において、ペプチドを含有し得る。好都合なことに、安定量の小さなジペプチドまたはジペプチドアナログ（例えば、約１０ｍＭと２００ｍＭの間）を含む、表１に明記されるものを含む、特定の脱水の製剤が、予想外に、周囲温度での及び細胞の冷蔵を超過する期間の間の、細胞の実質的な乾燥保存が可能であることが判定された。
典型的なジペプチドは、アミノ酸配列アラニン−グルタミンを有する。
【００７８】
３．  三糖類
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される特定の実施形態において、製剤は、周囲温度での細胞の実質的な乾燥保存のための脱水の製剤または組成物中に少なくとも１つの三糖類を含み得る。三糖類は、３つの単糖類から成るオリゴ糖であり、２つのグリコシド結合がそれらを接続する。グリコシド結合は、構成単糖類上の水酸基間で形成され得、異なる結合の組み合わせ（位置化学）および立体化学（アルファ−またはベータ−）は、結果として、異なる化学的および物理的性質を備えるジアステレオ異性体である三糖類をもたらす。安定した保存組成物に含むための１つ以上の特定の三糖類の選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の通常の実施に従って行われ得、他の製剤成分を含む様々な因子の影響を受け得る。典型的な三糖類は、限定されないが、マルトトリオース（ｍａｌｔｏｔｒｏｓｅ）、イソマルトトリオース（ｉｓｏｍａｌｔｏｔｒｉｏｓ）、ラフィノース、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｒｉｏｓｅ）、ニゲロトリオース（ｎｉｇｅｒｏｔｒｉｏｓｅ）、およびケトースを含む。表１に明記される製剤を含む、細胞の実質的な乾燥保存のための特定の実施形態では、三糖類は、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｔｒｉｏｓｅ）であって、好ましくは約１％−２０％、さらにより好ましくは約５．０−１５％の濃度であり、ここで「約」は、２５％未満、より好ましくは２０％未満、およびより好ましくは１５％、１０％、５％または１％未満、多かれ少なかれ、詳述された量未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。
【００７９】
４．  水溶性ポリマー
本明細書に記載されるように、特定の実施形態は、全血サンプル中の核酸及び／又はポリペプチド分子の実質的に安定した保存のための製剤および組成物中に少なくとも１つの水溶性ポリマーを含み得る。そのような水溶性ポリマーは、ポリビニルピロリジンおよびポリビニルアルコールを含み、本開示から、当業者が、実質的な乾燥保存の製剤および組成物中の使用のために他の水溶性ポリマーを選択し得ることが認識されるが、これらは、利用される組成物の他の成分および保存されている特定の細胞タイプに基づいて様々であり得る。限定されないが、表１に示されるものを含む、特定の実施形態は、約０．１乃至１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、より好ましくは約０．１乃至５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の間、およびさらにより好ましくは１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で水溶性ポリマーを含むことを考慮に入れ、ここで「約」は、５０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、およびより好ましくは２０％、１５％、１０％または５％未満、多かれ少なかれ、詳述された量未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。特定の実施形態では、水溶性ポリマーは、約３０−７０，０００ダルトンの分子量範囲を有する及び約８７−９０％加水分解された、ポリビニルアルコールであり、ここで「約」は、５０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、およびより好ましくは２０％、１５％、１０％または５％未満、多かれ少なかれ、詳述された量未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。
【００８０】
５．  非還元糖
本明細書に記載されるようにまた、特定の実施形態は、周囲温度で前脱水及び／又は脱水の製剤および組成物中に少なくとも１つの非還元糖を含み得る。非還元糖は、機能的なアルデヒド基を欠く炭水化物分子である。典型的な非還元糖は、スクロースおよびトレハロースを含む。細胞の実質的な乾燥保存のための実施形態では、非還元糖は、約１．０−２００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ−２００ｍＭ、およびより好ましくは約１５０ｍＭの濃度で存在するトレハロースであり、ここで「約」は、２５％未満、より好ましくは２０％未満、およびより好ましくは１５％、１０％、５％または１％未満、多かれ少なかれ、詳述された量未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。
【００８１】
６．  ポリエーテル
ポリエーテルは、特定の実施形態に従って、周囲温度での機能細胞の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される脱水の製剤に含まれ得る。ポリエーテルは、一般に、その主鎖に１つを超えるエーテル官能基を含有するポリマーを指す。ポリエーテルは、アルコールの脱水によって形成された比較的安定した化合物である。製剤、組成物および方法に使用するための典型的なポリエーテルは、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリフェニルエーテルを含む。特定の実施形態では、ポリエーテルの分子量は、約５，０００から１５，０００ダルトンの間である。
【００８２】
７．  テトラヒドロピリミジン
特定の実施形態では、乾燥保存安定剤は、テトラヒドロピリミジンである。典型的なテトラヒドロピリミジンは、５−ヒドロキシエクトインである。特定の脱水の製剤および組成物において、５−ヒドロキシエクトインは、約１０ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００８３】
製剤試薬
１．  ｐＨバッファー
特定の実施形態によると、周囲温度での機能細胞の実質的な乾燥保存のための本明細書に記載される脱水の製剤および組成物は、１つ以上のｐＨバッファーを含み得、これは、ｐＨバッファーが存在する水溶液などの溶液のｐＨの変化に抵抗するその能力に関して当該技術分野で知られる大多数の化合物のいずれかであり得る。安定した保存組成物に含むための１つ以上の特定のｐＨバッファーの選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の通常の実施に従って行われ得、維持されることが所望されるｐＨ、生体サンプルの性質、利用される溶媒条件、使用される製剤の他の成分、および他の基準を含む、様々な因子の影響を受け得る。例えば、典型的に、ｐＨバッファーは、バッファーの特徴であるプロトン解離定数（ｐＫａ）の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０のｐＨ単位内にあるｐＨで利用される。
【００８４】
ｐＨバッファーの限定しない例は、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、スルフォサリチル酸、スルフォイソフタル酸、シュウ酸、ホウ酸塩、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、およびビス−トリス（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、を含む。表Ｘに明記される多くのものを含む、本明細書で熟慮される特定の実施形態は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する製剤を特徴とし得、ここで「約」は、１未満、好ましくは０．５未満、好ましくは０．２５未満、およびより好ましくは０．１未満のｐＨ単位、多かれ少なかれ、詳述されたｐＨ値未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。
【００８５】
２．  キレート剤
キレート剤またはキレート化剤は、特定の実施形態によると、血液サンプル中の生存可能な無傷の細胞の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される組成物に含まれ得、金属カチオンと複合する及びその反応性を妨害するその能力に関して当業者に知られている。典型的なキレート剤は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、グルコン酸ナトリウム，およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、を含む。１つのキレート剤は、グルコン酸ナトリウムであり、約１．０−５０ｍＭ、より好ましくは約１０−４０ｍＭ、およびさらにより好ましくは約２５ｍＭの濃度で存在し、ここで「約」は、２５％未満、より好ましくは２０％未満、およびより好ましくは１５％、１０％、５％または１％未満、多かれ少なかれ、詳述された量未満であり得る量的変動を表わすと理解され得る。
【００８６】
【表１−１】
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【００８７】
【表１−２】
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【００８８】
【表１−３】
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【００８９】
【表１−４】
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【００９０】
【表１−５】
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【００９１】
【表１−６】
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【００９２】
【表１−７】
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【００９３】
【表１−８】
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【００９４】
【表１−９】
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【００９５】
【表１−１０】
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【００９６】
【表１−１１】
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【００９７】
脱水工程
本発明のＭＣＳ脱水の製剤は、前脱水の製剤による前処理があってもなくても、脱水プロセス中の細胞膜および細胞小器官ならびに細胞の一般的な形態の完全性を維持することができ、その結果、実質的に乾燥保存された後の細胞の脱水の際に、細胞は脱水前の細胞としての少なくとも一つの機能的特性、例えば細胞の生存度を保持する。
【００９８】
脱水された細胞の乾燥は、例えば単純な目視検査により、すべての湿気が蒸発したか除去されたことを確認するために、判定され得る。いくつかの実施形態において、湿気の指標は、乾燥の達成した度合いを確認するために好ましくは含まれてもよい。細胞を実質的に乾燥させる時間は、ＭＣＳ脱水の製剤中に存在する試薬によって様々である。細胞は、製剤成分および細胞が固定される血管のジオメトリに依存して、約１〜３時間の期間で最適に脱水される。細胞は、約３２℃−約３９℃温度範囲、好ましくは約３７℃で脱水され、インキュベーターにて、または、温度、酸素レベル、および相対湿度を制御するための人工気候室を使用してよりコントロールされた条件下で、脱水され得る。相対湿度の調節によって、脱水の速度が調節され得る。例えば、水溶性ポリマー（例えばＰＶＡ）を含むＭＣＳ製剤中の脱水された細胞は、脱水するのに長い期間を要するので、相対湿度は最適な脱水時間を促進するために低減され得る。さらに、様々な幹細胞の実質的な乾燥保存は、細胞が実質的に免疫学的に未分化な状態で維持されるのを保証するために、５％の酸素濃度にて行われる。
【００９９】
温度および湿度を制御する間、細胞上で活発な空気の移動（ａｉｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）を維持する他の脱水方法が利用され得る。
【０１００】
実質的に乾燥した細胞は、密閉して封ができるカバーまたはパウチを使用して保存され得るので、その結果、内容物は、細胞を脱水するのに使用される類似した気候条件の下で、保存のために密封され得る。実質的に乾燥保存される細胞は、一定温度（例えば室温）で最適に保存される。
【０１０１】
アポトーシス阻害剤
特定の実施形態において、本明細書に記載されている前脱水の製剤、脱水の製剤、及び／又は再水和の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、細胞のアポトーシスの誘導を遮断する。
他の実施形態において、アポトーシス阻害剤は、ＥＲストレス経路の少なくとも１つのステップを遮断し、好ましくは可逆的阻害剤である。
【０１０２】
特定の実施形態において、脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む。他の実施形態において、前脱水の製剤または再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含み、また別の実施形態において、前脱水の製剤および再水和製剤の各々は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含む。前脱水の製剤並びに再水和製剤中に存在する少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、同一であってもよく、異なっていてもよい。特定の他の実施形態において、本明細書に記載されている前脱水の製剤、脱水の製剤、及び／又は再水和の製剤は、少なくとも２つのアポトーシス阻害剤を含む。
【０１０３】
本明細書に例証されるものを含むアポトーシス阻害剤は、限定されないが、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＬＣＬａｂｓ、およびｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓを含む多くの商用製造業者およびサプライヤーを介して、一般に市販で入手可能であるか、または本明細書に開示されるものを含む既知の方法を使用して合成され得る。各アポトーシス阻害剤の最適な濃度は、前脱水の、脱水のおよび／または再水和の製剤のアポトーシス阻害剤の量を滴定することにより判定され得、それは当業者の理解範囲内で適切である。
【０１０４】
典型的なアポトーシス阻害剤は次のものを含む：
１．ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤
【０１０５】
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α アルファ経路を遮断する。典型的なＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α  アルファ経路阻害剤は、サルブリナルであるｓａｌ−００３（３−フェニル−Ｎ−［２，２，２−トリクロロ−１−［（４−クロロフェニル）カルバモチオイルアミノ］エチル］プロプ−２−エナミド、ＧＳＫ２６０６４１４（７−メチル−５−（１−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アセチル｝−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ＧＳＫ２６５６１５７（１−（５−（４−アミノ−７−メチル７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−フルオロインドリン−１−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン）およびＩＳＲＩＢ（トランス−Ｎ，Ｎ’−（シクロヘキサン−１，４−ジイル）ビス（２−（４−クロロフェノキシ）アセトアミドである。
【０１０６】
【化３】
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【０１０７】
サルブリナルはｅＩＦ２―αホスファターゼ酵素の特異的な阻害剤である。サルブリナルは、α‐サブユニットの低減された脱リン酸化の結果としてＥＩＦ２を間接的に阻害し、結果として、酸化ストレスや小胞体における変性タンパク質の蓄積などのイベントによって通常引き起こされるストレス応答経路の活性化をもたらす。
【０１０８】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための特定の実施形態において、サルブリナルは、約１ｎＭ乃至約２．０μＭの間の、好ましくは約１ｎＭと９００ｎＭの間の、より好ましくは約１０ｎＭと２５０ｎＭの間の、およびさらに好ましくは約３０ｎＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１０９】
ＡＳＫ１阻害剤
他の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＡＳＫ１阻害剤であり、それはＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの下流の活性化を遮断する。様々な適切なＡＳＫ１阻害剤が知られており（例えば、米国特許第８，１７８，５５５号；８，３７８，１０８号；８，４４０，６６５号および８，５９８，３６０号）、または例えばＭＬＳ−０３１５７６３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のように市販で入手可能である。典型的なＡＳＫ１阻害剤は、限定されないが、ベンゾジアゼピノン阻害剤（キムら（２００９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４：１５９３−１６０３）、ＮＤＱＩ−１、およびＭＬＳ−０３１５７６３を含む。
【０１１０】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための特定の実施形態において、ＮＤＱＩ−１は、約５０ｎＭ乃至約３．０μＭの間の、好ましくは約２５０ｎＭと２．０μＭの間の、より好ましくは約４００ｎＭと２．０μＭの間の、およびさらに好ましくは約１．０μＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１１１】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための他の特定の実施形態において、ＭＬＳ−０３１５７６３は、約１ｎＭ乃至約５００ｎＭの間の、好ましくは約１ｎＭと２５０ｎＭの間の、より好ましくは約１ｎＭと２５０ｎＭの間の、およびさらに好ましくは約１ｎＭと２５０ｎＭの間の濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１１２】
ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１経路を遮断する。
【０１１３】
典型的なＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１経路の阻害剤は、限定されないが、カルノシン酸（ｃａｒｎｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）、トリ−テルペノイド、スルホラファンおよびｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンを含む。
【０１１４】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための特定の実施形態において、スルホラファンは、約５０ｎＭ乃至約１．０μＭの間の、好ましくは約５０ｎＭと５００ｎＭの間の、より好ましくは約１００ｎＭと４００ｎＭの間の、およびさらに好ましくは２２０ｎＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１１５】
ＪＮＫ阻害剤
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。任意のＪＮＫ阻害剤が、本明細書の製剤、組成物、方法における使用のために考えられる。ＪＮＫ阻害剤は一般的に当業者に既知である（例えば、米国特許第６，９４９，５４４号；７，１２９，２４２号；７，３２６，４１８号、８，１４３，２７１号および８，５３０，４８０号）。
【０１１６】
典型的なＪＮＫ阻害剤は、限定されないが、ＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）、ＪＮＫ−ＩＮ−８（３−［［４−（ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ］−Ｎ−［３−メチル−４−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、およびＪＮＫ阻害剤ＩＸであるＮ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−１−ナフタレンカルボキサミドを含む。
【０１１７】
また更なる実施形態において、ＪＮＫ阻害剤は、ＡＳＫ１の下流の活性化を遮断するためのｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１１８】
５．ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤
特定の他の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は一般に周知である（例えば、米国の特許の番号７，５２１，４６０を参照；７，５９２，４５５；７，７２８，０１３；および７，７９５，２５６）。
【０１１９】
典型的なｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、限定されないが、ＳＢ２０３５８０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（メチルスルフィニル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピリジン）、ＬＹ２２２８８２０（５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン  ジメタンスルフォナート）、ＰＤ１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール、ＰＨ−７９７８０４（３−（４−（２，４−ジフルオロベンジルオキシ）−３−ブロモ−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）、ＳＢ２０２１９０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェノール）、ＢＩＲＢ７９６（ドラマピモド；１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレア）、ＶＸ−７０２（１−（５−カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレア）、ＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］−ベンズアミド）を含む。
【０１２０】
特定の他の実施形態において、前脱水の製剤及び／又は再水和製剤は、ＡＳＫ１依存性のシグナル伝達の下流を遮断するＪＮＫ阻害剤およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む。
【０１２１】
６.ＧＳＫ３阻害剤
特定の実施形態において、前脱水の、及び／又は再水和の製剤は、ＧＳＫ３を遮断するアポトーシス阻害剤を含む。様々なＧＳＫ３阻害剤は、本明細書に記載されている製剤および方法で使用するのに適している。ＧＳＫ３阻害剤は当業者に周知であり（例えば、米国特許第６，０５７，１１７号；６，１５３，６１８号；第６，４１７，１８５号；６，４６５，２３１号；６，４８９，３４４号；６，６０８，６３２号；６，８００，６３２号；６，９４９，５４７号；７，０４５，５１９号；７，０３７，９１８号；７，４２５，５５７号；８，１４３，２７１号および８，６６４，２４４号）、多くのＧＳＫ３阻害剤は市販で入手可能であり、それは例えばＣＨＩＲ９８０１４、Ｎ−６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ；  カタログ番号  Ｓ２７４５）およびバルプロエート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ；  カタログ番号Ｐ４５４３）である。
【０１２２】
特に好ましいＧＳＫ３阻害剤は、限定されないが、ＣＨＩＲ９８０１４、バルプロエート、ＣＴ９９０２１およびＣＴ２００２６を含む。
【０１２３】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための特定の実施形態においてＣＨＩＲ９８０１４は、約０．２５μＭ乃至約３．０μＭの間の、好ましくは約０．５Ｍと２．７５μＭの間の、より好ましくは約１．０μＭと２．０μＭの間の、およびさらに好ましくは約１．２５μＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１２４】
７．ＩＲＥ−１阻害剤
特定の実施形態において、前脱水の、脱水の、及び／又は再水和の製剤は、ＩＲＥ１を遮断するアポトーシス阻害剤を含む。ＩＲＥ１阻害剤は既知である（例えば、米国特許第８，３７２，８６１号を参照）。
【０１２５】
典型的なＩＲＥ１阻害剤は限定されないが、ＩＲＥ１阻害剤Ｉ（Ｎ−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］チオフェン−２−スルホンアミド）、ＩＲＥ１阻害剤ＩＩ（３’―ホルミル−４’−ヒドロキシ５’−メトキシビフェニル−３−カルボキサミド）、およびＩＲＥ１阻害剤ＩＩＩ（８−ホルミル−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン, ７−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−８−カルバルデヒド）を含む。
【０１２６】
８．カスパーゼ−１阻害剤
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカスパーゼ−１阻害剤である。
【０１２７】
本明細書に記載されている製剤、組成物および方法で使用される典型的なカスパーゼ−１阻害剤は、限定されないが、カスパーゼ−１阻害剤ＩＩ（Ａｃ−ＹＶＡＤ−クロロメチル ケトン、Ｎ−（２−キノリル）バリル−アスパルチル−（２，６−ジフルオロフェノキシ）メチルケトン（ アスパルチル基はα‐メチル化されているか又はα‐メチル化されていない）、ＶＸ−７６５（（Ｓ）（−１−（（Ｓ）（−２−（４−アミノ−３−クロロベンズアミド）−３,３-ジメチルブタノイル）−Ｎ−(（２Ｒ,３Ｓ）−２−エトキシ−５−オキソ−テトラヒドロフラン−３−イル） ピロリジン -2-カルボキサミド)およびZVAD-フルオロメチルケトンを含む。
【０１２８】
９．カルパイン阻害剤
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカルパイン阻害剤である。
カルパイン（カルパイン１−１５）の少なくとも１５の異なるアイソフォームがある。カルパイン阻害剤は、当業者に周知である（例えば、米国特許第５，５４１，２９０号；６，４４８，２４５号；７，００１，７７０号；７，４７６，７５４号および７，９３２，２６６号を参照されたい）。本発明の前脱水の製剤及び／又は再水和製剤は、任意の適切なカルパイン阻害剤またはカルパイン阻害剤の組み合わせを含み得る。
【０１２９】
本明細書に記載されている製剤、組成物および方法で使用される特に好ましいカルパイン阻害剤は、限定されないが、カルパイン阻害剤Ｉ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＩ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＶ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤Ｖ（モルホリノウレイジル（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｕｒｅｉｄｙｌ）；−Ｖａｌ−ホモフェニルアラニン−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤ＶＩ（４−フルオロフェニルスルホニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤Ｘ（Ｚ−Ｌｅｕ−α−アミノ酪酸−ＣＯＮＨＣ２Ｈ５）、カルパイン阻害剤ＸＩ（Ｚ−Ｌ−α−アミノ酪酸―ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−モルホリン）、およびカルパイン阻害剤ＸＩＩ（Ｚ−Ｌ−ノルバリン−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−２−ピリジル）を含む。
【０１３０】
１０．ＭＥＫ阻害剤
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＭＥＫ１またはＭＥＫ２の阻害剤である。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の阻害剤は既知であり（例えば、米国特許第６，３１０，０６０号；第６，４４０，９６６号；６，６３８，９４５号；７，００１，９０５号；７，１６９，８１６号；７，７４５，６６３号；７，８０３，８３９号；７，８９７，６２４号；８，３９４，８２２号；８４９２，４２７号、及び８，６４２，５８４号を参照されたい）、市販で入手可能である。
【０１３１】
典型的なＭＥＫ阻害剤は限定されないが、ＰＤ０３２５９０１，Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド，ＭＥＫ１６２ ，５−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）アミノ］−４−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−カルボキサミド、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ピマセルチブ（（Ｓ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）イソニコチンアミド）、セルメチニブ  （（６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド）、トラメチニブ（（Ｎ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テロラピドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミド））、ＰＤ９８０５９（（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（（２Ｚ，３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリル，エタノール）を含む。
【０１３２】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための他の特定の実施形態において、ＰＤ０３２５９０１は、約１ｎＭ乃至約１．０μＭの間の、好ましくは約１０ｎＭと５００ｎＭの間の、より好ましくは約２０ｎＭと２５０ｎＭの間の濃度範囲で、さらに好ましくは約５０ｎＭで、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１３３】
１１．ＰＩ３Ｋ経路阻害剤
特定の他の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。
【０１３４】
本明細書中に記載される製剤、組成物および方法で使用される典型的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、限定されないが、ダクトリシブ（２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イルイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）フェニル］プロパンニトリル）、ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）、  ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、イデラリシブ（５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン）、ブパルリシブ（５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−アミン）、ＧＤＣ−００３２（４−［５，６−ジヒドロ−２−［３−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］ベンゾオキサゼピン−９−イル］−α，α−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−アセトアミド）、ＰＩ−１０３（３−（４−（４−モルホリニル）ピリド［３’（２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）フェノール）、ＮＵ７４４１（８−（４−ジベンゾチエニル）−２−（４−モルホリニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＧＳＫ２６３６７７１（２−メチル−１−［［２−メチル−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル］−６−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸）、ＩＰＩ−１４５（８−クロロ−２−フェニル−３−［（１Ｓ）−１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル］−１−（２Ｈ）−イソキノリノン、ＸＬ１４７（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール−５−イルアミノ）キノキサリン−２−イル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン  ＰＩＫ−９０（Ｎ−（７，８−ジメトキシ−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル）−ニコチンアミド）、ウォルトマンニン（１１−（アセチルオキシ）−１，６ｂ，７，８，９ａ，１０，１１，１１ｂ−オクタヒドロ−１−（メトキシメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル，（１Ｓ，６ｂＲ，９ａＳ，１１Ｒ，１１ｂＲ）−３Ｈ−フルオロ［４，３，２−ｄｅ］インデノ［４，５−ｈ］−２−ベンゾピラン−３，６，９−トリオン）、ＶＳ−５５８４（５−［８−メチル−９−（１−メチルエチル）−２−（４−モルホリニル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−２−ピリミジンアミン）、およびＴＧ−１００７０３（３−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）−フェノール）を含む。
【０１３５】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための他の特定の実施形態において、ＬＹ２９４００２は、約１０ｎＭ乃至約２．０μＭの間の、好ましくは約２０ｎＭと１．０μＭの間の、より好ましくは約５０ｎＭと５００ｎＭの間の、さらに好ましくは約１２０ｎＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１３６】
ＥＲシャペロン誘導剤
特定の実施形態において、本明細書に記載されている前脱水の製剤、脱水の製剤、及び／又は再水和の製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤およびＥＲシャペロン誘導剤を含む。本明細書に記載されている製剤、組成物および方法で使用される適切なＥＲシャペロン誘導剤は、限定されないが、ＢＩＸ、バルプロエートおよびリチウムを含む。
【０１３７】
ＢＩＸ
ＢｉＰ誘導剤Ｘ（ＢＩＸ）は、ＧＲＰ７８／ＢｉＰの発現を誘導する化合物スクリーニングにおいて同定された。ＢＩＸは、ＧＲＰ９４（９４ｋＤａのグルコースに調整されたタンパク質）、カルレティキュリン、およびＣ／ＥＢＰホモログタンパク質のわずかな誘導を伴って、ＢｉＰを優先的に誘導した。ＢＩＸによるＢｉＰ  ｍＲＮＡの誘動は、ＡＴＦ６（活性化転写因子（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）６）経路を介して、ＢｉＰ遺伝子の上流のＥＲストレス応答因子の活性化によって媒介された。
【０１３８】
バルプロエート
バルプロエート（２−プロピルペンタン酸）は、てんかん、双極性躁病及び片頭痛の予防の処理のために認可されている。バルプロエートは室温で液体であるが、水酸化ナトリウムなど塩基と反応してバルプロエートナトリウム塩を形成し得、それは固体である。バルプロエートの作用機序は完全には理解されていないが、ＣＹＰ２Ｃ９、グルクロニルトランスフェラーゼ、およびエポキシドヒドロラーゼを阻害すること、ならびに脳におけるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルの増加につながることがしめされている。バルプロエートの投与は、ＧＲＰ７８／ＢｉＰの発現を増加させ、それにより３つの近位の膜貫通性のセンサー、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１およびＡＴＦ６を好ましい不活性化状態で安定化させる。
【０１３９】
３．リチウム
元素リチウムは、種々の気分障害を処理するために使用される。リチウムの投与は、ＧＲＰ７８／ＢｉＰの発現を増加させ、それにより３つの近位の膜貫通性のセンサー、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１およびＡＴＦ６を好ましい不活性化状態で安定化させる。
【０１４０】
オートファジー誘導剤
特定の他の態様で、前脱水の製剤、脱水の製剤、及び／又は再水和製剤は、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤およびオートファジー誘導剤を含む。オートファジーの誘導剤は、望ましくない又はミスフォールドしたタンパク質のリソソーム分解を有益に促進し、それによって細胞でのＵＰＲの効果を高める、一連の多様な化合物である。いかなる理論にも束縛されないが、アポトーシス阻害剤とオートファジー誘導剤の組合せはＥＲストレス経路を遮断し、脱水の結果として生じ得るミスフォールドしたタンパク質の分解をさらに促進しながら、細胞での再水和をいくぶんか助けて、脱水前の細胞としての少なくとも１つの機能特性を保持する、と考えられている。
【０１４１】
典型的なオートファジー誘導剤は限定されないが、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジビン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ラパマイシン、レスベラトロルおよびＳＭＥＲを含む。
【０１４２】
２４時間（例えば４８または１２０時間）より長い、細胞の実質的な乾燥保存のための他の特定の実施形態において、ラパマイシンは、約１ｎＭ乃至約１．０μＭの間の、好ましくは約２０ｎＭと２００ｎＭの間の、より好ましくは約２０ｎＭと８０ｎＭの間の、およびさらに好ましくは約２０ｎＭの濃度範囲で、前脱水の及び／又は再水和の製剤に加えられ得る。
【０１４３】
生存タンパク質
別の態様で、前脱水の製剤、脱水及び／又は再水和製剤は、生存タンパク質を含む。
典型的な生存タンパク質はＢｃｌ−ｘＬである。
【０１４４】
Ｂｃｌ−ｘＬはＢＣＬ−２ファミリーのメンバーで、ミトコンドリアにある膜貫通タンパク質である。Ｂｃｌは、長い形体であるＢｃｌ−ＸＬおよび短いスプライスバリアント形体であるＢｃｌ−ＸＳの、２つの形体で存在することが報告されている。Ｂｃｌ−ｘＬは、内因性アポトーシス経路のレベルで機能するが、外因性経路（Ｆａｓ／ＴＮＦ細胞死受容体）はカスパーゼの活性化を直接導き、カスパーゼの活性化につながるシトクロムｃなどのミトコンドリア内容物の放出を妨げる。プロ生存Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質並びに抗生存Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の相対量が、細胞が細胞死を起こすかどうか定めている、ということはアポトーシスの分野で十分に確立された概念である。
【０１４５】
特定の実施形態において、Ｂｃｌ−ｘＬは、Ｂｃｌ−ｘＬの十分な細胞内の取り込みを保証するためのリポソーム製剤を使用して、細胞に送達される。
【０１４６】
前脱水の製剤
特定の態様において、細胞の実質的な乾燥保存のための組成物および方法は、細胞が前脱水の製剤により処理されるという、脱水前のさらなる工程を含む。一実施形態において、前脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を、好ましくは可逆的アポトーシス阻害剤を含む。前脱水の製剤は、含む別の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのＥＲシャペロン誘導剤、少なくとも１つのオートファジー誘導剤または少なくとも１つの生存タンパク質を含む。
【０１４７】
特定の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、カルパイン阻害剤およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【０１４８】
一実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤である。特定の実施形態では、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤は、サルブリナルであるSal-003（３−フェニル−Ｎ−［２，２，２−トリクロロ−１−［（４−クロロフェニル）カルバモチオイルアミノ］エチル］プロプ−２−エナミド）、ＧＳＫ２６０６４１４（７−メチル−５−（１−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アセチル｝−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インドール−５−イル）７−Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ＧＳＫ２６５６１５７（１−（５−（４−アミノ−７−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−フルオロインドリン−１−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン）、およびＩＳＲＩＢ（トランス−Ｎ，Ｎ’−（シクロヘキサン−１，４−ジイル）ビス（２−（４−クロロフェノキシ）アセトアミド）から成る群から選択される。特定の他の実施形態において、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤はサルブリナルである。
【０１４９】
別の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＡＳＫ１阻害剤、好ましくはＮＤＱＩ−１またはＭＬＳ−０３１５７６３である。
【０１５０】
さらに別の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤である。特定の実施形態において、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤は、カルノシン酸、トリ・テルペノイド、スルホラファンおよびｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンから成る群から選択される。
【０１５１】
さらに別の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＧＳＫ３阻害剤である。特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン）、バルプロエート、ＣＴ９９０２１およびＣＴ２００２６から成る群から選択される。
【０１５２】
さらなる実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＭＥＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＭＥＫ１６２（５−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）アミノ］−４−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−カルボキサミド、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ピマセルチブ（（Ｓ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）イソニコチンアミド）、セルメチニブ（（６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド）、トラメチニブ（（Ｎ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テロラピドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミド）、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（（２Ｚ，３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリル，エタノール）から成る群から選択される。
【０１５３】
さらに別の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤は、ＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）、ＪＮＫ−ＩＮ−８（３−［［４−（ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ］−Ｎ−［３−メチル−４−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、およびＪＮＫ阻害剤ＩＸであるＮ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−１−ナフタレンカルボキサミドから成る群から選択される。
【０１５４】
別の実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＳＢ２０３５８０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（メチルスルフィニル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピリジン）、ＬＹ２２２８８２０（５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン  ジメタンスルフォナート）、ＰＤ１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール、ＰＨ−７９７８０４（３−（４−（２，４−ジフルオロベンジルオキシ）−３−ブロモ−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）、ＳＢ２０２１９０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェノール）、ＢＩＲＢ７９６（ドラマピモド；１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレア）、ＶＸ−７０２（１−（５−カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレア）、およびＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］−ベンズアミド）から成る群から選択される。
【０１５５】
さらなる実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤である。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ダクトリシブ（２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イルイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）フェニル］プロパンニトリル）、ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）、  ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、イデラリシブ（５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン）、ブパルリシブ（５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−アミン）、
ＧＤＣ−００３２（４−［５，６−ジヒドロ−２−［３−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］ベンゾオキサゼピン−９−イル］−α，α−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−アセトアミド）、ＰＩ−１０３（３−（４−（４−モルホリニル）ピリド［３’（２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）フェノール）、ＮＵ７４４１（８−（４−ジベンゾチエニル）−２−（４−モルホリニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＧＳＫ２６３６７７１（２−メチル−１−［［２−メチル−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル］−６−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸）、ＩＰＩ−１４５（８−クロロ−２−フェニル−３−［（１Ｓ）−１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル］−１−（２Ｈ）−イソキノリノン、ＸＬ１４７（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール−５−イルアミノ）キノキサリン−２−イル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、ＰＩＫ−９０（Ｎ−（７，８−ジメトキシ−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル）−ニコチンアミド）、ウォルトマンニン（１１−（アセチルオキシ）−１，６ｂ，７，８，９ａ，１０，１１，１１ｂ−オクタヒドロ−１−（メトキシメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル，（１Ｓ，６ｂＲ，９ａＳ，１１Ｒ，１１ｂＲ）−３Ｈ−フルオロ［４，３，２−ｄｅ］インデノ［４，５−ｈ］−２−ベンゾピラン−３，６，９−トリオン）、ＶＳ−５５８４（５−［８−メチル−９−（１−メチルエチル）−２−（４−モルホリニル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−２−ピリミジンアミン）、およびＴＧ−１００７０３（３−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）−フェノール）から成る群から選択される。
【０１５６】
一実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＩＲＥ−１阻害剤である。特定の実施形態において、ＩＲＥ−１阻害剤は、ＩＲＥ１阻害剤Ｉ（Ｎ−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］チオフェン−２−スルホンアミド）、ＩＲＥ１阻害剤ＩＩ（３’―ホルミル−４’−ヒドロキシ５’−メトキシビフェニル−３−カルボキサミド）、およびＩＲＥ１阻害剤ＩＩＩ（８−ホルミル−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン，  ７−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−８−カルバルデヒド）から成る群から選択される。
【０１５７】
一実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカルパイン阻害剤である。特定の実施形態においてカルパイン阻害剤は、カルパイン阻害剤Ｉ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＩ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＶ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤Ｖ（モルホリノウレイジル（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｕｒｅｉｄｙｌ）；−Ｖａｌ−ホモフェニルアラニン−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤ＶＩ（４−フルオロフェニルスルホニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤Ｘ（Ｚ−Ｌｅｕ−α−アミノ酪酸−ＣＯＮＨＣ２Ｈ５）、カルパイン阻害剤ＸＩ（Ｚ−Ｌ−α−アミノ酪酸―ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−モルホリン）、およびカルパイン阻害剤ＸＩＩ（Ｚ−Ｌ−ノルバリン−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−２−ピリジル）から成る群から選択される。
【０１５８】
一実施形態において、前脱水の製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカスパーゼ−１阻害剤である。特定の実施形態においてカスパーゼ−１阻害剤は、カスパーゼ−１阻害剤ＩＩ（Ａｃ−ＹＶＡＤ−クロロメチル ケトン、Ｎ−（２−キノリル）バリル−アスパルチル−（２，６−ジフルオロフェノキシ）メチルケトン（アスパルチル基はα‐メチル化されているか又はα‐メチル化されていない）、ＶＸ−７６５（（Ｓ）（−１−（（Ｓ）（−２−（４−アミノ−３−クロロベンズアミド）−３，３−ジメチルブタノイル）−Ｎ−（（２Ｒ，３Ｓ）−２−エトキシ−５−オキソ−テトラヒドロフラン−３−イル）  ピロリジン  −２−カルボキサミド）およびＺＶＡＤ−フルオロメチルケトンから成る群から選択される。
【０１５９】
別の態様において、前脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのＥＲシャペロン誘導剤を含む。特定の実施形態において、ＥＲシャペロン誘導剤はＢＩＸ、バルプロエートおよびリチウムから成る群から選択される。
【０１６０】
別の態様において、前脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのオートファジー誘導剤を含む。特定の実施形態において、オートファジー誘導剤は、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジビン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ラパマイシン、レスベラトロルおよびＳＭＥＲから成る群から選択される。
【０１６１】
別の態様において、前脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つの生存タンパク質を含む。一実施形態において、生存タンパク質はＢｃｌ−ｘＬである。
【０１６２】
再水和製剤
特定の他の態様において、細胞の実質的な乾燥保存のための組成物および方法は、再水和製剤を用いた、実質的に乾燥保存された細胞の再水和を含む。一実施形態において、再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を、好ましくは可逆的アポトーシス阻害剤を含む。別の実施形態において、再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのＥＲシャペロン誘導剤を含む。
【０１６３】
特定の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ａＰＩ３Ｋ経路阻害剤、カルパイン阻害剤およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【０１６４】
一実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤である。特定の実施形態では、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤は、サルブリナルであるＳａｌ−００３（３−フェニル−Ｎ−［２，２，２−トリクロロ−１−［（４−クロロフェニル）カルバモチオイルアミノ］エチル］プロプ−２−エナミド）、ＧＳＫ２６０６４１４（７−メチル−５−（１−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アセチル｝−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インドール−５−イル）７−Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ＧＳＫ２６５６１５７（１−（５−（４−アミノ−７−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−フルオロインドリン−１−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン）、およびＩＳＲＩＢ（トランス−Ｎ，Ｎ’−（シクロヘキサン−１，４−ジイル）ビス（２−（４−クロロフェノキシ）アセトアミド）から成る群から選択される。
【０１６５】
別の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＡＳＫ１阻害剤、好ましくはＮＤＱＩ−１またはＭＬＳ−０３１５７６３である。
【０１６６】
さらに別の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤である。特定の実施形態において、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤は、カルノシン酸、トリ・テルペノイド、スルホラファンおよびtert−ブチルヒドロキノンから成る群から選択される。
【０１６７】
さらに別の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＧＳＫ３阻害剤である。特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン）、バルプロエート、ＣＴ９９０２１およびＣＴ２００２６から成る群から選択される。
【０１６８】
さらなる実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＭＥＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１，Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド，ＭＥＫ１６２ ，５−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）アミノ］−４−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−カルボキサミド、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ピマセルチブ  （（Ｓ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）イソニコチンアミド）、セルメチニブ  （（６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド）、トラメチニブ（（Ｎ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テロラピドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミド））、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（（２Ｚ，３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリル，エタノール）から成る群から選択される。
【０１６９】
さらに別の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤は、ＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）、ＪＮＫ−ＩＮ−８（３−［［４−（ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ］−Ｎ−［３−メチル−４−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、およびＪＮＫ阻害剤ＩＸであるＮ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−１−ナフタレンカルボキサミドから成る群から選択される。
【０１７０】
別の実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＳＢ２０３５８０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（メチルスルフィニル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピリジン）、ＬＹ２２２８８２０（５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン  ジメタンスルフォナート）、ＰＤ１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール、ＰＨ−７９７８０４（３−（４−（２，４−ジフルオロベンジルオキシ）−３−ブロモ−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）、ＳＢ２０２１９０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェノール）、ＢＩＲＢ７９６（ドラマピモド；１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレア）、ＶＸ−７０２（１−（５−カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレア）、およびＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］−ベンズアミド）からなる群から選択される。
【０１７１】
さらなる実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤である。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、（ダクトリシブ（２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イルイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）フェニル］プロパンニトリル）、ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）、  ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、イデラリシブ（５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン）、ブパルリシブ（５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−アミン）、
ＧＤＣ−００３２（４−［５，６−ジヒドロ−２−［３−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］ベンゾオキサゼピン−９−イル］−α，α−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−アセトアミド）、ＰＩ−１０３（３−（４−（４−モルホリニル）ピリド［３’（２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）フェノール）、ＮＵ７４４１（８−（４−ジベンゾチエニル）−２−（４−モルホリニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＧＳＫ２６３６７７１（２−メチル−１−［［２−メチル−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル］−６−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸）、ＩＰＩ−１４５（８−クロロ−２−フェニル−３−［（１Ｓ）−１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル］−１−（２Ｈ）−イソキノリノン、ＸＬ１４７（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール−５−イルアミノ）キノキサリン−２−イル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、ＰＩＫ−９０（Ｎ−（７，８−ジメトキシ−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル）−ニコチンアミド）、ウォルトマンニン（１１−（アセチルオキシ）−１，６ｂ，７，８，９ａ，１０，１１，１１ｂ−オクタヒドロ−１−（メトキシメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル，（１Ｓ，６ｂＲ，９ａＳ，１１Ｒ，１１ｂＲ）−３Ｈ−フルオロ［４，３，２−ｄｅ］インデノ［４，５−ｈ］−２−ベンゾピラン−３，６，９−トリオン）、ＶＳ−５５８４（５−［８−メチル−９−（１−メチルエチル）−２−（４−モルホリニル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−２−ピリミジンアミン）、およびＴＧ−１００７０３（３−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）−フェノール）から成る群から選択される。
【０１７２】
一実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はＩＲＥ−１阻害剤である。特定の実施形態において、ＩＲＥ−１阻害剤は、ＩＲＥ１阻害剤Ｉ（Ｎ−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］チオフェン−２−スルホンアミド）、ＩＲＥ１阻害剤ＩＩ（３’―ホルミル−４’−ヒドロキシ５’−メトキシビフェニル−３−カルボキサミド）、およびＩＲＥ１阻害剤ＩＩＩ（８−ホルミル−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン，７−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−８−カルバルデヒド）から成る群から選択される。
【０１７３】
一実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカルパイン阻害剤である。特定の実施形態においてカルパイン阻害剤は、カルパイン阻害剤Ｉ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＩ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＶ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤Ｖ（モルホリノウレイジル（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｕｒｅｉｄｙｌ）；−Ｖａｌ−ホモフェニルアラニン−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤ＶＩ（４−フルオロフェニルスルホニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤Ｘ（Ｚ−Ｌｅｕ−α−アミノ酪酸−ＣＯＮＨＣ２Ｈ５）、カルパイン阻害剤ＸＩ（Ｚ−Ｌ−α−アミノ酪酸―ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−モルホリン）、およびカルパイン阻害剤ＸＩＩ（Ｚ−Ｌ−ノルバリン−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−２−ピリジル）から成る群から選択される。
【０１７４】
一実施形態において、再水和製剤中の少なくとも１つのアポトーシス阻害剤はカスパーゼ−１阻害剤である。特定の実施形態においてカスパーゼ−１阻害剤は、カスパーゼ−１阻害剤ＩＩ（Ａｃ−ＹＶＡＤ−クロロメチル  ケトン、Ｎ−（２−キノリル）バリル−アスパルチル−（２，６−ジフルオロフェノキシ）メチルケトン（アスパルチル基はα‐メチル化されているか又はα‐メチル化されていない）、ＶＸ−７６５（（Ｓ）（−１−（（Ｓ）（−２−（４−アミノ−３−クロロベンズアミド）−３，３−ジメチルブタノイル）−Ｎ−（（２Ｒ，３Ｓ）−２−エトキシ−５−オキソ−テトラヒドロフラン−３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド）およびＺＶＡＤ−フルオロメチルケトンから成る群から選択される。
【０１７５】
別の態様において、再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのＥＲシャペロン誘導剤を含む。特定の実施形態において、ＥＲシャペロン誘導剤はＢＩＸ、バルプロエートおよびリチウムから成る群から選択される。
【０１７６】
別の態様において、再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのオートファジー誘導剤を含む。一定の実施形態において、オートファジー誘導剤は、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジビン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ラパマイシン、レスベラトロルおよびＳＭＥＲから成る群から選択される。
【０１７７】
別の態様において、再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つの生存タンパク質を含む。一実施形態において、生存タンパク質はＢｃｌ−ｘＬである。
【０１７８】
方法
本発明の別の態様において、方法は、冷凍または凍結乾燥なしに、周囲温度で１以上の細胞の実質的な乾燥保存のために提供され、該方法は、乾燥保存安定剤を含有する脱水組成物と１以上の細胞をインキュベートする工程、および、脱水の製剤の存在下１以上の前処理された細胞を脱水して、１以上の実質的に乾燥保存された細胞を生成する工程を含む。特定の実施形態において、脱水の製剤は、少なくとも一つのアポトーシス阻害剤をさらに含み、前記方法は、少なくとも一つのアポトーシス阻害剤を含有する再水和のバッファーを用いて、１以上の実質的に乾燥保存された細胞を再水和する工程をさらに含む。
【０１７９】
本発明の別の態様において、方法は、冷凍または凍結乾燥なしに、周囲温度で１以上の細胞の実質的な乾燥保存のために提供され、該方法は、アポトーシス阻害剤を含有する前脱水の製剤と共に１以上の細胞をインキュベートして、１以上の前処理された細胞を生成する工程、前脱水の製剤を除去する工程、および、脱水の製剤の存在下で１以上の前処理された細胞を脱水して、１以上の実質的に乾燥保存された細胞を生成する工程、を含む。特定の実施形態において、脱水の製剤は、少なくとも一つのアポトーシス阻害剤をさらに含み、前記方法は、少なくとも一つのアポトーシス阻害剤を含有する再水和バッファーを用いて、１以上の実質的に乾燥保存された細胞を再水和する工程をさらに含む。
【０１８０】
多くのアポトーシス阻害剤は、高濃度で、または長期間の暴露で、細胞に有害な作用を有し得る。逆に、短すぎる前脱水の製剤又は再水和製剤に対する細胞の暴露、または低すぎる濃度のアポトーシス阻害剤での暴露は、脱水症中に所望の付加的処理効果をもたらさない。したがって、前脱水工程および再水和工程使用する、細胞の実質的な乾燥保存のための方法では、暴露時間は所望の抑制効果を達成するために適切に制御される必要がある。
【０１８１】
特定の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤は、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＲＥ１阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ａＰＩ３Ｋ経路阻害剤、カルパイン阻害剤およびカスパーゼ−１阻害剤から成る群から選択される。
【０１８２】
一実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤である。特定の実施形態では、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤は、サルブリナルであるＳａｌ−００３（３−フェニル−Ｎ−［２，２，２−トリクロロ−１−［（４−クロロフェニル）カルバモチオイルアミノ］エチル］プロプ−２−エナミド）、ＧＳＫ２６０６４１４（７−メチル−５−（１−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アセチル｝−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インドール−５−イル）７−Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン）、ＧＳＫ２６５６１５７（１−（５−（４−アミノ−７−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−フルオロインドリン−１−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン）、およびＩＳＲＩＢ（トランス−Ｎ，Ｎ’−（シクロヘキサン−１，４−ジイル）ビス（２−（４−クロロフェノキシ）アセトアミド）から成る群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２―α阻害剤はサルブリナルである。
【０１８３】
別の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＡＳＫ１阻害剤、好ましくはＮＤＱＩ−１またはＭＬＳ−０３１５７６３である。
【０１８４】
さらに別の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤である。特定の実施形態において、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１阻害剤は、カルノシン酸、トリ・テルペノイド、スルホラファンおよびｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンから成る群から選択される。
【０１８５】
さらに別の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＧＳＫ３阻害剤である。特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン）、バルプロエート、ＣＴ９９０２１およびＣＴ２００２６から成る群から選択される。
【０１８６】
さらなる実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＭＥＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１，Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド，ＭＥＫ１６２ ，５−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）アミノ］−４−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−カルボキサミド、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ピマセルチブ  （（Ｓ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）イソニコチンアミド）、セルメチニブ  （（６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド）、トラメチニブ（（Ｎ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テロラピドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミド））、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（（２Ｚ，３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリル，エタノール）から成る群から選択される。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤は、ＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）、ＪＮＫ−ＩＮ−８（３−［［４−（ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ］−Ｎ−［３−メチル−４−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、およびＪＮＫ阻害剤ＩＸであるＮ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエン−２−イル）−１−ナフタレンカルボキサミドから成る群から選択される。
【０１８８】
別の実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＳＢ２０３５８０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（メチルスルフィニル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピリジン）、ＬＹ２２２８８２０（５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン  ジメタンスルフォナート）、ＰＤ１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール、ＰＨ−７９７８０４（３−（４−（２，４−ジフルオロベンジルオキシ）−３−ブロモ−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）、ＳＢ２０２１９０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェノール）、ＢＩＲＢ７９６（ドラマピモド；１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレア）、ＶＸ−７０２（１−（５−カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレア）、およびＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］−ベンズアミド）からなる群から選択される。
【０１８９】
さらなる実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤である。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ダクトリシブ（２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イルイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）フェニル］プロパンニトリル）、ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）、  ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、イデラリシブ（５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン）、ブパルリシブ（５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−アミン）、ＧＤＣ−００３２（４−［５，６−ジヒドロ−２−［３−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］ベンゾオキサゼピン−９−イル］−α，α−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−アセトアミド）、ＰＩ−１０３（３−（４−（４−モルホリニル）ピリド［３’（２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）フェノール）、ＮＵ７４４１（８−（４−ジベンゾチエニル）−２−（４−モルホリニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＧＳＫ２６３６７７１（２−メチル−１−［［２−メチル−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル］−６−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸）、ＩＰＩ−１４５（８−クロロ−２−フェニル−３−［（１Ｓ）−１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル］−１−（２Ｈ）−イソキノリノン、ＸＬ１４７（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール−５−イルアミノ）キノキサリン−２−イル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、ＰＩＫ−９０（Ｎ−（７，８−ジメトキシ−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル）−ニコチンアミド）、ウォルトマンニン（１１−（アセチルオキシ）−１，６ｂ，７，８，９ａ，１０，１１，１１ｂ−オクタヒドロ−１−（メトキシメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル）−９ａ，１１ｂ−ジメチル，（１Ｓ，６ｂＲ，９ａＳ，１１Ｒ，１１ｂＲ）−３Ｈ−フルオロ［４，３，２−ｄｅ］インデノ［４，５−ｈ］−２−ベンゾピラン−３，６，９−トリオン）、ＶＳ−５５８４（５−［８−メチル−９−（１−メチルエチル）−２−（４−モルホリニル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−２−ピリミジンアミン）、およびＴＧ−１００７０３（３−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）−フェノール）から成る群から選択される。
【０１９０】
一実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はＩＲＥ−１阻害剤である。特定の実施形態において、ＩＲＥ−１阻害剤は、ＩＲＥ１阻害剤Ｉ（Ｎ−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］チオフェン−２−スルホンアミド）、ＩＲＥ１阻害剤ＩＩ（３’―ホルミル−４’−ヒドロキシ５’−メトキシビフェニル−３−カルボキサミド）、およびＩＲＥ１阻害剤ＩＩＩ（８−ホルミル−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン，  ７−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−８−カルバルデヒド）から成る群から選択される。
【０１９１】
一実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はカルパイン阻害剤である。特定の実施形態においてカルパイン阻害剤は、カルパイン阻害剤Ｉ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＩ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤ＩＶ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤Ｖ（モルホリノウレイジル（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｕｒｅｉｄｙｌ）；−Ｖａｌ−ホモフェニルアラニン−ＣＨ２Ｆ）、カルパイン阻害剤ＶＩ（４−フルオロフェニルスルホニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）、カルパイン阻害剤Ｘ（Ｚ−Ｌｅｕ−α−アミノ酪酸−ＣＯＮＨＣ２Ｈ５）、カルパイン阻害剤ＸＩ（Ｚ−Ｌ−α−アミノ酪酸―ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−モルホリン）、およびカルパイン阻害剤ＸＩＩ（Ｚ−Ｌ−ノルバリン−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−２−ピリジル）から成る群から選択される。
【０１９２】
一実施形態において、方法において使用される少なくとも一つのアポトーシス阻害剤はカスパーゼ−１阻害剤である。特定の実施形態においてカスパーゼ−１阻害剤は、カスパーゼ−１阻害剤ＩＩ（Ａｃ−ＹＶＡＤ−クロロメチル  ケトン、Ｎ−（２−キノリル）バリル−アスパルチル−（２，６−ジフルオロフェノキシ）メチルケトン（アスパルチル基はα‐メチル化されているか又はα‐メチル化されていない）、ＶＸ−７６５（（Ｓ）（−１−（（Ｓ）（−２−（４−アミノ−３−クロロベンズアミド）−３，３−ジメチルブタノイル）−Ｎ−（（２Ｒ，３Ｓ）−２−エトキシ−５−オキソ−テトラヒドロフラン−３−イル）  ピロリジン  −２−カルボキサミド）およびＺＶＡＤ−フルオロメチルケトンから成る群から選択される。
【０１９３】
別の態様において、方法の中で使用される再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つのオートファジー誘導剤を含む。特定の実施形態において、オートファジー誘導剤は、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジビン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ラパマイシン、レスベラトロルおよびＳＭＥＲから成る群から選択される。
【０１９４】
別の態様において、方法の中で使用される再水和製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤および少なくとも１つの生存タンパク質を含む。一実施形態において、生存タンパク質はＢｃｌ−ｘＬである。
【０１９５】
特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は可逆的アポトーシス阻害剤である。方法において、可逆的アポトーシス阻害剤は、保護的な量のアポトーシス阻害剤で細胞を充填するための、例えば１つ以上のＥＲストレス経路の活性化を遮断するための前脱水及び／又は再水和のフェーズ中に、細胞を処理するために使用されてもよく、その結果、前脱水及び／又は再水和製剤の除去ならびに細胞の再懸濁の際に、可逆的阻害剤は、長期の暴露期間を避けるために最終的に細胞から希釈される。
キット
【０１９６】
一定の他の態様において、キットが提供され、該キットは、乾燥保存安定剤を含有する液体の脱水の製剤、実質的な乾燥保存のための１以上の細胞を入れるためのサンプル容器、および、液体の脱水の製剤を用いた１以上の細胞の実質的な乾燥保存について使用するための使用説明書（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ）を含む添付文書（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｉｎｓｅｒｔ）を含む。特定の実施形態において、脱水の製剤は少なくとも１つのアポトーシス阻害剤をさらに含み、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含有する再水和のバッファーをさらに含んでいてもよい。
【０１９７】
特定の他の実施形態において、キットは、脱水の前に１以上の細胞を固定化するための固体担体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含有する前脱水の製剤、１以上の細胞を実質的に乾燥保存するための少なくとも１つの乾燥保存安定剤を含有する脱水の製剤、および、前脱水の製剤と脱水の製剤を使用して１以上の細胞を固体担体に対して固定化するための、ならびに１以上の細胞の実質的な乾燥保存のための使用説明書を含む添付文書、をさらに含む。さらに別の実施形態において、キットは、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含有する再水和のバッファーをさらに含んでいてもよい。
【０１９８】
製剤をスクリーニングするための一般的なプロトコル
以下のプロトコルは、再水和後少なくとも１時間、少なくとも１つの機能特性を保持する細胞の実質的な乾燥保存のための、前脱水の、脱水の、及び／又は再水和の製剤ならびにその組み合わせを、分析し選択するのに利用され得る。簡潔に言えば、細胞は９６ウェルプレートでＤＭＥＭ培地または前脱水の製剤（例えば、ＤＭＥＭ培地＋少なくとも１つのアポトーシス阻害剤）中に播種され（２０，０００細胞／ウェル）、１時間乃至２４時間３７℃でインキュベートされる。インキュベーションの後、培地は細胞から吸引され廃棄され、１０μｌの脱水症製剤が各ウェルに加えられる。開いた９６ウェルプレートは、半分充たされた９６ウェルプレートを乾燥させる場合には７５分間、あるいは充たされた９６ウェルプレートを乾燥させる場合には９５分間、３７℃でインキュベートされる。乾燥された細胞は、室温で１時間保存され、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤を含有する、または完全なＤＭＥＭ培地中の、可変量の再水和の製剤により再水和される。再水和された細胞は、１時間または２４時間の期間、３７°ＣのＣＯ２調整されたインキュベーターでインキュベートされる。指定される時点では、トリパンブルーが再水和された細胞に加えられ、細胞は血球計を使用して数えられる。細胞生存パーセントは、生存不可能な細胞の画分を判定し、その後生存する細胞のパーセントを計算するために、トリパンブルー染色された細胞を総細胞数で割った値で決定される。
【０１９９】
細胞の機能特性を測定するためのアッセイ
本発明の実質的に乾燥保存される細胞は、再水和の際、脱水を受ける前の細胞の少なくとも１つの機能特性を保持している。１つの機能特性は、代謝活性、細胞の生存率、増殖し、分化し、増殖因子によって与えられるようなシグナル伝達の刺激に応答する能力、および、発現は、ＲＮＡ合成、タンパク質など発現が予想される細胞のバイオマーカ、及び／又は分泌機能の群から選択され得る。これらの機能特性は、当業者に既知の他の方法と同様に、本明細書に記載される方法を含む任意の方法を用いて、検知または解析され得る。再水和され乾燥保存された細胞の少なくとも１つの機能特性を検知する典型的な方法が、以下に記載される。
【０２００】
１．細胞の生存率アッセイ
細胞の生存率は、トリパンブルー染色の手順を使用して測定され得る。トリパンブルーは、細胞膜が損なわれない場合に細胞と相互作用しない負電荷の発色団を備えた色素であり、故に、顕微鏡で検査すると、生細胞は色素を排除するが、損傷を受けた細胞は青く見える。細胞計数は、Ｌｅｉｔｚ  Ｆｌｕｏｖｅｒｔ顕微鏡下の３回繰り返しで、グリッド・チャンバ（Ｈｙｃｏｒ）を備える９ｍｍのＫＯＶＡスライドガラス１０において行われた。細胞生存のパーセンテージは未処理の対照細胞に対して報告される。
【０２０１】
２．ＡＴＰ含量アッセイ
ＡＴＰ含量は、メーカーの指示に従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、判定され得る。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  試薬を加えると、細胞内のＡＴＰ量に比例する発光信号を生成する。ＡＴＰ量は培地中に存在する細胞の数に直接比例し、それはさらに、再水和された細胞製剤中で生存可能な（代謝的に活発な）細胞の数を判定する同質の方法である。
【０２０２】
３．カスパーゼ・アッセイ
細胞のアポトーシスの度合いは、製造業者の指示に従ってＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定され得る。簡単に言えば、この前発光カスパーゼ−３／７基質を提供し、それはテトラペプチド配列であるＤＥＶＤを含む。
この基質は、光の産生において使用されるルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリン（ａｍｉｎｏｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を放出するために、開裂する。単一のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７試薬の添加は細胞の溶解をもたらし、続いて基質のカスパーゼ開裂および発光信号の生成が起きる。カスパーゼ活性化倍率（ｆｏｌｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、標準組織培養条件下で培養された未処理の細胞に対する、試験サンプル中の活性の比率として計算された。
【実施例】
【０２０３】
以下の実施例は、例示として、および限定なしで提供される。
＜実施例１＞
典型的な製剤は生細胞を維持し、再水和後５日の実質的に乾燥保存された細胞の細胞アポトーシスを妨げる。
【０２０４】
本実施例は、本明細書に記載されている典型的な前脱水の、脱水の、および再水和の製剤が細胞の生存率を維持し、周囲温度で５時間の実質的な乾燥保存の後、再水和後５日まで、細胞がアポトーシスを誘導するのを妨げる、ということを示す。
【０２０５】
ＨｅＬａ細胞は、予め定められた前脱水の製剤（ＳＣ１、サルブリナル、およびＳＣ３、ＭＬＳ−０３１５７６３）を用いて実質的に乾燥保存され、その後、表１に示された製剤のサブセットにより処理され、および９６ウェルプレート中で脱水され、５時間周囲温度で保存された。細胞は、再水和の製剤（ＲＣ１、サルブリナルおよびＲＣ３、ＭＬＳ−０３１５７６３）を用いて再水和され、ＡＴＰ含量は、９６ウェルプレートに対するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏの添加により測定された。細胞が溶解した後、サンプル５０μｌを、定量化のための白色の３８４ウェルプレートに移した。実質的に乾燥保存された細胞は、ＡＴＰ発光の測定によって、細胞の生存率についてアッセイされた。
【０２０６】
さらに、陽性のＡＴＰ活性を明示する、それらの実質的に乾燥保存された細胞は、ＡＴＰ含量について再水和後５日でアッセイされた。表２に示されるように、製剤なしの対照細胞はすべて５日で生存不能であったが、しかし、本明細書中に記載される製剤および方法を使用して実質的に乾燥保存された、有意な数の細胞が生存可能なままであって、それは、損なわれておらず代謝的に活性化されている細胞の安定化を示す、９０％の細胞生存率と同じくらい高い。
【０２０７】
再水和された細胞を分析は、５日間の実質的な乾燥保存および続いて５日の再水和が、カスパーゼ活性の測定による細胞アポトーシスの誘導をもたらすかどうかを判定した。５日の再水和された細胞は、カスパーゼ３／７の活性を検知するためにＣａｓｐａｓｅ−ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に暴露された。カスパーゼの活性化は、標準組織培養条件（表２）下で培養された未処理細胞に対する、試験サンプル中の活性の比率として計算された。
１以下の結果は、高いカスパーゼ活性の欠如ており、アポトーシスが観察されないことを示す結果であると考えられる。
【０２０８】
【表２】
0006604942.tif 000016
【０２０９】
表２に示されるように、バックグラウンドの値を越えて観察されるカスパーゼ活性を殆どあるいは全く検知できない場合、それは、５日間の乾燥保存とそれに続く少なくとも５日間の再水和の後、アポトーシスが誘導されなかったことを示す。
【０２１０】
＜実施例２＞
典型的な製剤は、再水和後７日で、実質的な乾燥保存後の生細胞を維持する。
本実施例は、本明細書に記載されている典型的な製剤は、再水和後少なくとも７時間の間、生存可能なＨｅＬａ細胞を維持できる、ということを示す。
【０２１１】
簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞は、７時間のあいだ、予め定められた前脱水の製剤（ＳＣ１、サルブリナル、およびＳＣ３、ＭＬＳ−０３１５７６３）、および表１に記載される脱水の製剤のサブセットを用いて実質的に乾燥保存され、その後、以下にリストされる再水和の製剤（ＲＣ１、サルブリナル、およびＲＣ３、ＭＬＳ−０３１５７６３）を使用して再水和される。細胞の生存率、トリパンブルー法を用いて再水和の７日後に評価された。
結果を表３および図４に示す。
【０２１２】
【表３】
0006604942.tif 000017
【０２１３】
表３に示されるように、再水和の７時間後、保護されていない対照およびトレハロースで安定化された細胞は、どんな生細胞中にも存在しないが、本発明の典型的な製剤は、７時間までの間、様々な度合いでＨｅＬａ細胞の生存度を維持し、ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）なトレハロース乾燥細胞を上回る著しい改良をもたらす。
【０２１４】
＜実施例３＞
ＥＲストレス経路を標的とする典型的なアポトーシス阻害剤を含む製剤は、少なくとも１２０時間の期間のあいだ、実質的な乾燥保存中の細胞の生存を維持する。
本実施例は、ＥＲストレス経路の異なるステップを標的とする複数のアポトーシス阻害剤が、本明細書に記載されている製剤、組成物、および方法において使用される時、少なくとも２４時間の期間のあいだ、周囲温度で細胞を実質的に乾燥保存できることを示す。
【０２１５】
簡単に言えば、ヒト新生児の繊維芽細胞を、Ｃａｓｃａｄｅ培地１０６中で懸濁し、９６ウェルプレートにおいて試験あたり１００ｕｌに１００−５０００細胞の密度で播種し、高いＣＯ２レベル（５％−１０％）および３７Ｃの温度を８５−９５％の相対湿度を伴って維持しながら周囲大気の環境でインキュベートした。培養物は、前脱水の製剤および培地の特定の組成に、および各アポトーシス阻害剤の特定の濃度に調節される。細胞は、少なくとも１時間、しかし３時間より長くない期間のあいだ、３７℃でインキュベートされた。前脱水の製剤を徹底的に除去し、１０−１５μｌのＭＣＳ脱水の製剤４１（表１）を各ウェルに加えた。細胞は、９０分の期間にわたって、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％の相対湿度で実質的に空気乾燥させられ、２４、４８または１２０時間の期間のあいだ周囲温度で保存された。適切な時間に、実質的に乾燥保存された細胞は、１００−２００μｌの前脱水の製剤中のアポトーシス阻害剤と同じ濃度を有する再水和の製剤で処理することにより、再水和された。細胞の生存率は、本明細書に記載されるようなＡＴＰ含量を測定することにより判定された。
【０２１６】
結果を、表４に示す。
【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
表４に示されるように、ＥＲストレス経路の様々なステップを標的とする典型的なアポトーシス阻害剤は、乾燥保存後１２０時間で少なくとも１つの機能特性を保持している、生存可能な細胞の実質的な数を維持する。２４時間の乾燥保存によって、未処理の対照およびゴールドスタンダードのトレハロースにより処理される細胞は、生存細胞を殆どあるいは全く維持しなかったが、本明細書に記載される製剤および方法は、顕著な細胞の生存率をもたらし、細胞は実質的な乾燥保存の少なくとも１２０時間のあいだ、生存可能なままである。
【０２１９】
＜実施例４＞
実質的に乾燥保存された間葉系幹細胞は、再水和後少なくとも二週間のあいだ、分化能を保持する
本実施例は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、少なくとも２週の期間のあいだ、周囲温度での実質的な乾燥保存後に、分化能を保持することを示す。
【０２２０】
ＭＳＣは、１００ナノモル濃度−２０００ナノモル濃度のサルブリナルおよび表１中に記されるＭＳＣ製剤２０５を用いて実質的に乾燥保存され、２週間のあいだ室温で保存された。実質的に乾燥保存された細胞は、同様の濃度のサルブリナルを含有する再水和の製剤を含む、再水和の製剤の存在下で再水和され、典型的な培養状態下（３７Ｃ、５％ＣＯ２、８５−９５％ＲＨ）で１時間インキュベートされ、その時間で培地はＭＳＣ増殖培地と交換され、および４８時間で回復し増殖できるようになり、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）により提供されるＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｂ）、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｃ）、およびＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｄ）の各キットの培地製剤への暴露の前に、単一層（図３のＡ−Ｃ）またはマイクロマス培養（図３のＤ）として１２ウェルプレートへ培養され、細胞は、３日ごとの給餌で２１−３０日処理された。未分化のＭＳＣ培養物（Ａ）に対する表現型のはっきりした変化は、（Ｂ）において見て取れる脂肪細胞と一致する明白な脂肪球、（Ｃ）において骨細胞と一致するカルシウムの蓄積、および（Ｄ）において軟骨細胞と一致する円柱状の増殖により明白であり、このことは、本明細書中に記述された製剤が、ＭＳＣの分化能に干渉する能力を維持し、且つこれに干渉しないことを示している。
【０２２１】
文脈が別段必要としない限り、明細書および請求項の全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、開いた、包括的な意味、即ち、「限定されないが．．．を含む」として解釈されるべきである。
【０２２２】
「１つの実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「１つの態様（ａｎ  ａｓｐｅｃｔ）」に対する本明細書における参照は、実施形態に関して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通して様々な箇所で、「一実施形態において（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態において（ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」の句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すものではない。更に、特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅｓ）、構造（ｆｅａｔｕｒｅｓ）、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）は、１以上の実施形態における任意の適切な方法で組み合わせられ得る。
【０２２３】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。多数の変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造が、それによって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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