(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｊａｇｇｅｄ１（抗Ｊａｇ１）抗体を含む、肝臓がん治療を必要とする個体における肝臓がんを治療するための医薬であって、
肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項２】
抗Ｊａｇ１抗体を含む、図１１に示されるポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＳｐｐ１遺伝子を発現する細胞を含む肝臓がんを有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬であって、
肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項３】
肝臓がんにおいて、抗Ｊａｇ１抗体が、ＳＰＰ１発現の減少をもたらす、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
哺乳動物はヒトである、請求項２又は３に記載の医薬。
【請求項５】
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を含む、肝臓がんを有する個体を治療するための方法に使用するための医薬であって、前記方法は
（ａ）個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する工程、及び
（ｂ）Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を決定する工程を含み、
治療前のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達と比較した、治療後のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少が、個体における肝臓がんの減少を示し、
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は抗Ｊａｇ１抗体であり、肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達が、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤの核局在化を測定することによって、又はＮｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｈｅｓ又はＨｅｙ１の発現を測定することによって決定される、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
抗Ｊａｇ１抗体を含む、肝臓がんを有する個体における血清ＳＰＰ１タンパク質レベルを減少させるための医薬であって、抗Ｊａｇ１抗体の有効量が個体に投与され、これにより個体における血清ＳＰＰ１濃度を減少させ、肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項８】
個体に抗Ｊａｇ１抗体を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌであるか、又は約８０ｎｇ／ｍｌと約５００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
個体に抗Ｊａｇ１抗体を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが、約８６ｎｇ／ｍｌと約２５０ｎｇ／ｍｌの間であるか、又は約１２０ｎｇ／ｍｌと約１７０ｎｇ／ｍｌの間である、請求項７に記載の医薬。
【請求項１０】
個体に抗Ｊａｇ１抗体を投与することは、８０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルをもたらす、請求項７から９の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
抗Ｊａｇ１抗体を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが、抗Ｊａｇ１抗体を投与する前２４時間に決定される、請求項７から９の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
抗Ｊａｇ１抗体を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが、酵素結合免疫吸着法により決定される、請求項７から１１の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが、抗Ｊａｇ１抗体を投与した後、約１ヶ月、２ヶ月、又は３ヶ月減少する、請求項７から１２の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
Ｊａｇ１に結合する抗体であるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を含む、哺乳動物の肝臓がんを治療的に処置するための医薬であって、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の増殖増強効果に少なくとも一部依存している腫瘍を、Ｊａｇ１に結合する抗体であるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させ、それによって腫瘍を効果的に治療し、肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項１５】
抗体の、がんに対する結合が、Ｎｏｔｃｈ２の増殖増強活性に拮抗する、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
抗Ｊａｇ１抗体を含む、肝臓がんを有する危険性のある個体における肝臓がんを予防するための医薬であって、肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項１７】
抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体であるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を含む、図８Ｃに示されるポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質の増加した発現又は活性と関連した肝細胞増殖性疾患を治療するための医薬であって、肝細胞増殖性疾患はがんであってＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項１８】
抗Ｊａｇ１抗体を含む、分泌型ホスホプロテイン１（ＳＰＰ１）を発現する肝臓がん細胞の増殖を阻害するための医薬であって、抗Ｊａｇ１抗体と細胞を接触させ、それによって細胞の増殖を阻害し、肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、医薬。
【請求項１９】
細胞と当該抗体を接触させることが肝臓がん細胞においてＳＰＰ１発現を減少させる、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
ＳＰＰ１発現を、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％減少させる、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
発現が、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、蛍光インサイツハイブリダイゼーション及びウェスタンブロッティングからなる群から選択される方法により決定される、請求項１９又は２０に記載の医薬。
【請求項２２】
細胞を抗体と接触させることは、（ｉ）細胞によるＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂの少なくとも一の発現の減少をもたらすか、又は（ｉｉ）細胞によるＷｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の発現の増加をもたらす、請求項１８から２１の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２３】
細胞は個体中にある、請求項１８から２２の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２４】
ＳＰＰ１タンパク質が、図１１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７から１３及び１８から２３の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２５】
肝臓がんが、肝細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肝血管肉腫、又は転移性肝臓がんである、請求項１から１４及び１７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２６】
肝臓がんが、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｓｏｘ９、ＣＫ１９、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２、又はＧｌｕｌの少なくとも一を発現する細胞を含む、請求項１から１４、１７、及び２５の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２７】
肝臓がんが、核Ｎｏｔｃｈ２を有する細胞を含むか、又は活性化Ｒａｓを有する細胞を含む；
抗Ｊａｇ１抗体の投与が、細胞におけるＥｐＣＡＭ発現の減少をもたらす；
肝臓がんが、ＡＦＰを発現する細胞を含み、抗Ｊａｇ１抗体の投与が、細胞におけるＡＦＰ発現の減少をもたらす；
肝臓がんにおいて、抗Ｊａｇ１抗体の投与が、抗Ｊａｇ１抗体を投与する前の発現と比較して、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂの少なくとも一の発現の減少をもたらす；又は
肝臓がんにおいて、抗Ｊａｇ１抗体の投与が、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の発現の増加をもたらす、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
抗Ｊａｇ１抗体が、モノクローナル抗体及び／又はアンタゴニスト抗体である、請求項１から２７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２９】
抗Ｊａｇ１抗体が、
（ｉ）
（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体；
（ｉｉ）
（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体；
（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体；又は
（ｉｖ）
（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体
である、請求項１から２８の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３０】
抗体が、
（ｉ）図１８の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖可変ドメインフレームワークＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、軽鎖可変ドメインフレームワークＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４；
（ｉｉ）図１８の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖可変ドメインフレームワークＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、重鎖可変ドメインフレームワークＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４；
（ｉｉｉ）図１９の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖可変ドメインフレームワークＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、軽鎖可変ドメインフレームワークＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４；又は
（ｉｖ）図１９の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖可変ドメインフレームワークＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、重鎖可変ドメインフレームワークＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４を更に含む、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
抗体が、
（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号９６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；
（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｅ）配列番号９７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；
（ｆ）（ｄ）に記載のＶＨ配列及び（ｅ）に記載のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｈ）配列番号９８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｉ）（ｇ）に記載のＶＨ配列及び（ｈ）に記載のＶＬ配列
を含む、請求項２９又は３０に記載の医薬。
【請求項３２】
抗体が、
（ｉ）配列番号９３のＶＨ配列及び／又は配列番号９６のＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号９４のＶＨ配列及び／又は配列番号９７のＶＬ配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号９５のＶＨ配列及び／又は配列番号９８のＶＬ配列
を含む、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
抗Ｊａｇ１抗体が、
完全長ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体であるか、
抗体断片であるか、
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体であるか、
増殖阻害剤にコンジュゲートされているか、又は
任意に毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素から選択される、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされている、
請求項１から３２の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３４】
抗Ｊａｇ１抗体が細菌で産生されるか、又はＣＨＯ細胞で産生される、請求項１から３３の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３５】
抗Ｊａｇ１抗体が、がん細胞死を引き起こす抗体である、請求項１から３４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３６】
少なくとも一の付加的な治療剤を更に含み、場合により付加的な治療剤が化学療法剤又は抗体である、請求項１から３５の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３７】
付加的な治療剤が抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体である、請求項３６に記載の医薬。
【請求項３８】
Ｊａｇ１に対する抗体を含む、哺乳動物の肝臓がん細胞の増殖を阻害するための医薬であって、
哺乳動物の肝臓がん細胞がＪａｇ１に対する抗体を用いて治療され、肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する肝臓がん細胞を含む、医薬。
【請求項３９】
細胞が、ヒトにあるか、又は培地中にある、請求項３８に記載の医薬。
【請求項４０】
（ａ）容器；（ｂ）肝臓がんの治療のための抗Ｊａｇ１抗体及び担体を含む、容器内に含まれる組成物；及び（ｃ）肝臓がんの治療的処置の組成物の使用に言及する、容器に貼付されたラベル又は容器と共に含まれる添付文書を含む、肝臓がんの治療的処置のための製造品であって、
肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する細胞を含む、製造品。
【請求項４１】
肝臓がんの治療のための医薬の調製における、請求項４０に記載される製造品の使用であって、
肝臓がんはＥｐＣＡＭ及び／又はＡＦＰを発現する肝臓がん細胞を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７８９，４７５号の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が記載されるかのように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１４年３月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＰ５５７０Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは１１５，６６６バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、がんなどの病的な状態の治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
肝臓がんは、５番目に最も一般的ながんの形態である。毎年、約７５万例が診断され、毎年約７０万人がその疾患で死亡し、世界中でそれをがんによる死亡の第三番目に最も一般的な原因とならしめている（Ferlay et al., Int. J. Cancer 127:2893-2917 (2010)）。米国では、原発性肝臓がんの発生率は上昇しており、局所的な疾患の検出及び治療においてある程度の進歩がなされているが、末期の肝臓がんの５年生存率は１０％をはるかに下回っている  （American-Cancer-Society. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta: American Cancer Society）。
【０００５】
肝臓がんの確立された治療は、腫瘍を含む肝臓の一部の外科的除去（部分肝切除）、肝移植、肝動脈塞栓術（ＴＡＣＥ）、ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）又は凍結手術などの様々な方法によるその場での腫瘍の破壊、及びソラフェニブの投与を含む。末期肝臓がん患者の治療オプションは限られている。このように、肝臓がんの有効な治療法は、満たされていない医学的必要性のままである。
【０００６】
肝臓がんにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割は十分に理解されていない。Ｑｉらは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は、細胞周期停止及びアポトーシスを誘導することにより、インビトロ及びインビボでヒト肝細胞がん細胞の増殖を阻害することを報告し（Qi et al., Cancer Res. 63:8323 (2003)) 、Ｖｉａｔｏｕｒらは、マウス及びヒトＨＣＣ細胞において、Ｎｏｔｃｈ１の細胞内ドメインの発現は増殖を減少させ、アポトーシスを誘導することを報告している（Viatour et al., J. Exp. Med. 208(10):1963 (2011)）。他の人は、Ｎｏｔｃｈ１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞の浸潤及び遊走を減少させるが生存率は低下させないことを報告している（Zhou et al. Dig. Dis. Sci.）。また他者は、個々のＮｏｔｃｈ経路ファミリーメンバーの阻害は効果がなかったことを報告している。まとめると、肝臓がんにおけるＮｏｔｃｈ経路の役割は十分に理解されていなかった。
【０００７】
要約
肝臓の増殖性障害を有するか又は危険性のある患者を治療するためのＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の使用が提供される。
【０００８】
一態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与する工程を含む、肝臓がん治療を必要とする個体における肝臓がんを治療する方法が提供される。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、胆管がん（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）、肝がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝血管肉腫（ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、又は転移性肝がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）である。幾つかの実施態様において、肝細胞がんは、前駆細胞様又は胆管細胞がん様の肝腫瘍を含む。幾つかの実施態様において、肝臓がんは、難治性がんである。
【０００９】
幾つかの実施態様において、方法は、少なくとも一の付加的な治療剤を投与することを更に含む。付加的な治療剤の例としては、限定されないが、化学療法剤及び抗体を含む。
【００１０】
幾つかの実施態様において、肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１、核のＮｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｓｏｘ９、ＣＫ１９、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２、若しくはＧｌｕｌ、又はそれらの任意の組合せを発現する細胞を含む。特定の実施態様において、肝臓がんは、ＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ＋である細胞を含む。幾つかの実施態様において、肝臓がんは、ＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ−、ＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ＋ ＳＰＰ１＋、ＡＦＰ− ＥｐＣＡＭ＋、ＡＦＰ− ＥｐＣＡＭ＋ Ｎｏｔｃｈ２＋、ＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ− Ｎｏｔｃｈ２＋、ＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ＋ Ｓｏｘ９＋及びＡＦＰ＋ ＥｐＣＡＭ＋ Ｓｏｘ９＋又はＡＦＰ− ＥｐＣＡＭ＋ ＳＰＰ１+である細胞を含む。マーカー発現の代替的組合せを有する細胞を含む肝臓がんが具体的に意図される。
【００１１】
幾つかの実施態様において、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｓｏｘ９、ＣＫ１９、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２又はＧｌｕｌタンパク質の発現の少なくとも一が、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して個体からの試料において検出される。幾つかの実施態様において、発現は、核酸発現である。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、蛍光インサイツハイブリダイゼーション及びウェスタンブロッティングからなる群から選択される方法により決定される。
【００１２】
幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｊａｇ１、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂの少なくとも一の発現の減少をもたらす。幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の発現の増加をもたらす。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、及びウェスタンブロッティングにより決定される。
【００１３】
上記の実施態様の抗体の何れかは、完全長ＩｇＧ１又ｇはＩｇＧ２ａ抗体であってもよい。幾つかの実施態様において、抗体は、がん細胞死、例えば、肝臓がん細胞死を引き起こす。上記実施態様の何れかの抗体は、増殖阻害剤、例えば、細胞障害性薬剤にコンジュゲートすることができる。細胞傷害性薬剤の例としては、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素を含むが、これらに限定されない。上記実施態様の抗体の何れかは、当技術分野で周知の方法によって、例えば、細菌又はＣＨＯ細胞で産生することができる。
【００１４】
一態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与する工程を含む、肝臓がんを有する危険性にある個体における肝臓がんを予防するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、個体は、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、非ウイルス性／非アルコール性脂肪性肝炎、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成からなる群から選択される肝臓の状態を有する。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、抗Ｊａｇ１抗体、例えば抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体である。
【００１５】
一態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と細胞を接触させ、それによって細胞の増殖を阻害することを含む、分泌型ホスホプロテイン１（ＳＰＰ１）を発現する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。一実施態様において、ＳＰＰ１タンパク質は、図１１に示されるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、細胞内のＳＰＰ１の発現を減少させる。例えば、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、細胞内のＳＰＰ１の発現を、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少させる。ＳＰＰ１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、当該技術分野における任意の方法によって決定することができる。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体、例えば、本明細書に開示される任意の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体などの抗Ｎｏｔｃｈ２の負の調節領域（ＮＲＲ）抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、本明細書に開示される任意の抗Ｊａｇ１抗体などの、抗Ｊａｇ１抗体である。幾つかの実施態様において、細胞は、肝臓がん細胞である。幾つかの実施態様において、肝臓がん細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、ＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１、核Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２，若しくはＧｌｕｌ、又はそれらの任意の組合せを発現する。幾つかの実施態様において、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｊａｇ１、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂ．の少なくとも一の、細胞における発現の減少をもたらす。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の、細胞における発現の増加をもたらす。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、及びウェスタンブロッティングにより決定される。
【００１６】
一態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と細胞を接触させ、それによって細胞の増殖を阻害することを含む、分泌型ホスホプロテイン１（ＳＰＰ１）を発現する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。
【００１７】
一態様において、哺乳動物にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与し、それによって哺乳動物を効果的に治療することを含む、図１１に示されるポリペプチドに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＳｐｐ１遺伝子を発現する細胞を含む肝臓がんを有する哺乳動物を治療するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、細胞は、図１１に示されるポリペプチドに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＰＰ１タンパク質を発現する。
【００１８】
幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、胆管がん（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）、肝がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝血管肉腫（ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、又は転移性肝がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）である。幾つかの実施態様において、肝臓がんは、難治性がんである。本明細書中の抗体の何れかは、完全長ＩｇＧ１又ｇはＩｇＧ２ａ抗体であってもよい。幾つかの実施態様において、抗体は、がん細胞死、例えば、肝臓細胞死を引き起こす。本明細書中の抗体の何れかは、増殖阻害剤、例えば、細胞障害性薬剤にコンジュゲートすることができる。細胞傷害性薬剤の例としては、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素を含むが、これらに限定されない。本明細書中の抗体の何れかは、当技術分野で周知の方法によって、例えば、細菌又はＣＨＯ細胞で産生することができる。
【００１９】
幾つかの実施態様において、方法は、少なくとも一の付加的な治療剤を投与することを更に含む。付加的な治療剤の例としては、限定されないが、化学療法剤及び抗体を含む。
【００２０】
幾つかの実施態様において、肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、ＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１、核Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２，若しくはＧｌｕｌ、又はそれらの任意の組合せを発現する細胞を含む。幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｊａｇ１、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂの少なくとも一の発現の減少をもたらす。幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の発現の増加をもたらす。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、及びウェスタンブロッティングにより決定される。
【００２１】
一態様において、治療を必要とする個体に、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体の有効量を投与し、それによって効果的に肝細胞増殖性疾患を治療することを含む、図８Ｃに示されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質の増加した発現又は活性と関連した肝細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、細胞増殖性疾患は、肝臓がんなどのがんである。幾つかの実施態様において、個体は、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成からなる群から選択される肝臓の状態を有する。
【００２２】
所定の実施態様において、抗Ｊａｇ１抗体は、本明細書に記載される抗体の何れかである。所定の実施態様において、抗Ｊａｇ１抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかは抗体断片である。
【００２３】
一態様において、治療を必要とする個体に、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体の有効量を投与し、それによって効果的に肝細胞増殖性疾患を治療することを含む、図１１に示されるポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質の増加した発現又は活性と関連した肝細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、細胞増殖性疾患は、肝臓がんなどのがんである。幾つかの実施態様において、個体は、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成からなる群から選択される肝臓の状態を有する。
【００２４】
一態様において、個体における血清ＳＰＰ１タンパク質レベルを減少させるための方法であって、個体に、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与し、これにより個体における血清ＳＰＰ１濃度を減少させることを含む方法が提供される。一実施態様において、個体は肝臓がんを有する。一実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌである。所定の実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、約８０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間、約８６ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間、約１２０ｎｇ／ｍｌから約１７０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１６５ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与すると、８０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルをもたらす。特定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の２４時間である。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与前又は後の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイなどの任意の適切な方法によって決定することができる。特定の実施態様において、血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与した後、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１２ヶ月減少する。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肝血管肉腫、又は転移性肝臓がんである。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤又は抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体である。
【００２５】
所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかはモノクローナル断片である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかはヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかは抗体断片である。
【００２６】
幾つかの実施態様において、方法は、少なくとも一の付加的な治療剤を投与することを更に含む。付加的な治療剤の例としては、限定されないが、化学療法剤及び抗体を含む。幾つかの実施態様において、ソラフェニブは、付加的な治療剤である。
【００２７】
幾つかの実施態様において、肝臓がんは、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、ＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１、核Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２，若しくはＧｌｕｌ、又はそれらの任意の組合せを発現する細胞を含む。幾つかの実施態様において、Ｒａｓは変異体Ｒａｓである。幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｊａｇ１、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂの少なくとも一の発現の減少をもたらす。幾つかの実施態様において、肝臓がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の発現の増加をもたらす。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、及びウェスタンブロッティングにより決定される。
【００２８】
一態様において、腫瘍をＮｏｔｃｈ２又はＪａｇ１に結合する抗体と接触させることを含む、哺乳動物における肝臓腫瘍を治療するための方法が提供され、ここで、肝臓腫瘍の増殖は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の増殖増強効果に少なくとも一部依存している。一実施態様において、抗体の、腫瘍に対する結合は、Ｎｏｔｃｈ２の増殖増強活性に拮抗する。幾つかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００２９】
一態様において、血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが上昇している個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与することを含む肝臓がんの治療のための方法が提供される。一実施態様において、個体の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌである。所定の実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、約８０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間、約８６ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間、約１２０ｎｇ／ｍｌから約１７０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１６５ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与すると、８０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルをもたらす。特定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の２４時間である。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与前又は後の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイなどの任意の適切な方法によって決定することができる。特定の実施態様において、血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、個体において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与した後、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１２ヶ月減少する。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肝血管肉腫、又は転移性肝臓がんである。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤又は抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体などのアンタゴニスト抗体である。
【００３０】
幾つかの態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与し、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を決定する工程を含む、肝臓がんを有する個体を治療するための方法が提供され、ここで治療後のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少は、治療前のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達と比較して、個体における肝臓がんの減少を示している。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は、例えば、個体からの肝臓がん試料の免疫組織化学的分析によって、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤの核局在化を測定することによって決定される。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｈｅｓ及びＨｅｙ１からなる群から選択される遺伝子の発現を測定することによって決定される。発現は、任意の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、及びＲＮＡｓｅｑ分析によって決定することができる。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肝血管肉腫、及び転移性肝臓がんである。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤又は抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体などのアンタゴニスト抗体である。
【００３１】
幾つかの態様において、肝臓がん細胞の増殖を阻害するための方法は、Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇ１に対する抗体を用いて、哺乳動物の肝臓がん細胞を治療することを含み、それによって肝臓がん細胞の増殖が阻害される。所定の実施態様において、細胞は患者にある。所定の実施態様において、細胞は培地中にある。所定の実施態様において、細胞は肝臓がん細胞である。所定の実施態様において、抗体は、本明細書に記載される抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体である。所定の実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかは抗体断片である。
【００３２】
本明細書の方法の何れかにおいて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、以下の阻害剤であり得る。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤又は抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２と抗体、例えば、抗Ｎｏｔｃｈ２の負の調節領域（ＮＲＲ）抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、Ｎｏｔｃｈ２以外のＮｏｔｃｈファミリーメンバーには有意に結合しない。幾つかの実施態様において、抗体は、マウスＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ及びヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに、例えば≦１０ｎＭのＫｄで結合する。幾つかの実施態様において、抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００３３】
更なる実施態様において、抗体は、抗Ｊａｇ１抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つＨＶＲを含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００３４】
一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００３５】
所定の実施態様において、本明細書の実施態様に記載の抗体の何れかは、モノクローナル抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかはヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかは抗体断片である。
【００３６】
更なる実施態様において、本明細書の実施態様に記載の任意の抗体は、図１８の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖可変ドメインフレームワークのＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、軽鎖の可変ドメインフレームワークのＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４を更に含む。
【００３７】
更なる実施態様において、本明細書の実施態様に記載の任意の抗体は、図１８の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖可変ドメインフレームワークのＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３及びＨＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、重鎖の可変ドメインフレームワークのＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３及びＨＣ−ＦＲ４を更に含む。
【００３８】
更なる実施態様において、本明細書の実施態様に記載の任意の抗体は、図１９の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖可変ドメインフレームワークのＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、軽鎖の可変ドメインフレームワークのＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３及びＬＣ−ＦＲ４を更に含む。
【００３９】
更なる実施態様において、本明細書の実施態様に記載の任意の抗体は、図１９の、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖可変ドメインフレームワークのＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３及びＨＣ−ＦＲ４のアミノ酸配列を順番に含む、重鎖の可変ドメインフレームワークのＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３及びＨＣ−ＦＲ４を更に含む。
【００４０】
所定の実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号９４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号９７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む、Ｊａｇ１に結合する単離された抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９４のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９７のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９４のＶＨ配列、及び配列番号９７のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号９５のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号９８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９５のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９８のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９５のＶＨ配列、及び配列番号９８のＶＬ配列を含む。
【００４１】
所定の実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号９３のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号９６のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む、Ｊａｇ１に結合する単離された抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９３のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９６のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号９３のＶＨ配列、及び配列番号９６のＶＬ配列を含む。
【００４２】
一態様において、（ａ）容器；（ｂ）肝臓がんの治療のための抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体及び担体を含む容器内に含まれる組成物；及び（ｃ）肝臓がんの治療的処置又は診断的検出のための組成物の使用に言及する、容器に貼付されたラベル又は容器と共に含まれる添付文書を含む製造品が提供される。
【００４３】
一態様において、肝臓がんの治療において使用のための抗Ｎｏｔｃｈ２抗体が提供される。所定の実施態様において、肝臓がんは肝細胞がんである。所定の実施態様において、抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲアンタゴニスト抗体である。一態様において、肝臓がんの治療において使用のための抗Ｊａｇ１抗体が提供される。所定の実施態様において、肝臓がんは肝細胞がんである。所定の実施態様において、抗体は、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体である。
【００４４】
一態様において、肝臓がんの治療的処置のための医薬の調製における抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の使用が提供される。一態様において、肝臓がんの治療のための医薬の調製における抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体の使用が提供される。
【００４５】
一態様において、肝臓がんの治療的処置のための医薬の調製における本明細書に記載される製造品の使用が提供される。一態様において、肝細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における本明細書に記載される製造品の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ−Ｆ】図１Ａ−Ｆは、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶ肝臓がんモデルにおける肝臓がんマーカーの発現の特徴付けを示す。図１Ａ−Ｃは、ＡＦＰ＋ＥｐＣＡＭ−（図１Ａ）、ＡＦＰ＋ＥｐＣＡＭ＋（図１Ｂ）及びＡＦＰ−ＥｐＣＡＭ＋（図１Ｃ）である、腫瘍の免疫組織化学的染色を示す。図１Ｄは、全細胞のパーセンテージで表されたマーカー発現の罹患率を示す。図１Ｆは、核におけるＮｏｔｃｈ２タンパク質の局在化によって示される、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の活性化の免疫組織化学染色を示す。図１Ｅは、核Ｎｏｔｃｈ２染色を有する細胞のパーセントを示す。
【図２Ａ−Ｄ】図２Ａ−Ｄは、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体により処置されたＲａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶマウスにおける減少した腫瘍量を示している。図２Ａは、ＨＴＶの日に開始し、アイソタイプ対照抗体（左上）、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体（右上）又は抗Ｊａｇ１抗体（左下）で処置されたＨＴＶマウスから単離された肝臓を示す。図２Ｂは、ＨＴＶ注入の時点で投与された抗体処置後の、体重のパーセントで表されたＲａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶマウスの肝臓重量を示す。図２Ｃは、ＨＴＶ注入後２週間で投与された抗体処置後の、体重のパーセントで表されたＲａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶマウスの肝臓重量を示す（ｐ＜０．０５、ｎ＞８）。図２Ｄは、抗体処置後のＲａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶマウスの肝臓重量を示す（ｐ＜０．０２、ｎ＞６）。
【図３Ａ−Ｈ】図３Ａ−Ｈは、広範囲の腫瘍タイプの発達を妨げるＮｏｔｃｈ阻害性抗体によるＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶ担腫瘍マウスの処置を示している。図３Ａは、抗Ｎｏｔｃｈ２、抗Ｊａｇ１又はアイソタイプ対照抗体で処置された、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの肝臓におけるＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ発現の免疫蛍光分析を示している。図３Ｂ及びＣは、抗Ｎｏｔｃｈ２及び抗Ｊａｇ１処置後の、ＥｐＣＡＭ＋（図３Ｂ；ｐ＜０．００７、ｎ≧７）及びＡＦＰ＋（図３Ｃ；ｐ＜０．０３、ｎ≧７）の面積の減少を示している。図３Ａは、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体で処置された、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの肝臓におけるＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ発現の免疫蛍光分析を示している。図３Ｅは、抗Ｎｏｔｃｈ１、抗Ｎｏｔｃｈ２、抗Ｎｏｔｃｈ３、抗Ｊａｇ１又はアイソタイプ対照抗体によるＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの処置後のＥｐＣＡＭ＋細胞のパーセンテージを示している。図３Ｆは、抗Ｎｏｔｃｈ１、抗Ｎｏｔｃｈ２、抗Ｎｏｔｃｈ３、抗Ｊａｇ１又はアイソタイプ対照抗体によるＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの処置後のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）の相対的発現を示している。図３Ｇは、抗Ｎｏｔｃｈ１、抗Ｎｏｔｃｈ２、抗Ｎｏｔｃｈ３、抗Ｊａｇ１又はアイソタイプ対照抗体によるＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの処置後のＳｏｘ９のＲＮＡを示し、図３Ｈはタンパク質レベルを示す。
【図４Ａ−Ｅ】図４Ａ−Ｅは、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスのＮｏｔｃｈ阻害性抗体による処置は、担腫瘍肝臓におけるＮｏｔｃｈ経路活性化を低下させることを示している。図４Ａは、細胞の数で表されたＮｏｔｃｈ２核免疫組織化学染色を示す。図４Ｂは、ＱＲＴＰＣＲにより決定された、Ｎｏｔｃｈ２の相対的発現を示す。図４Ｃは、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶ担腫瘍肝臓におけるＨｅｓ１の免疫組織化学染色を示す。図４Ｄは、免疫組織化学により決定された、Ｈｅｓ１＋細胞の画分を示す。図４Ｅは、ＱＲＴＰＣＲにより決定された、ＨｅｙＬの相対的発現を示す。
【図５Ａ−Ｉ】図５Ａ−Ｉは、肝臓がんのＡＫＴ／ＲａｓモデルにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現におけるＮｏｔｃｈ阻害性抗体の効果を示す。ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶに供されたマウスは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＪａｇ１に対するアンタゴニスト抗体又は抗ブタクサ陰性対照抗体により処置され、定量的リアルタイムＰＣＲが、Ｎｏｔｃｈ１（図５Ａ）、Ｎｏｔｃｈ２（図５Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ３（図５Ｃ）、Ｎｏｔｃｈ４（図５Ｄ）、Ｊａｇ１（図５Ｅ）、Ｊａｇ２（図５Ｆ）、ＤＬＬ１（図５Ｇ）、ＤＬＬ３（図５Ｈ）、ＤＬＬ４（図５Ｉ）について５週間後に肝臓から単離されたＲＮＡで実施された。
【図６Ａ−Ｉ】図６Ａ−Ｉは、アイソタイプ対照、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体で処置したＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスからの肝臓のＲＮＡｓｅｑ分析からの結果を示す。示されるのは、Ｐｒｏｍ１（図６Ａ）、Ｓｐｐ１（図６Ｂ）、ＦｏｘＭ１（図６Ｃ）、Ｐｌｋ１（図６Ｄ）、ｃｃｎｂ１（図６Ｅ）、Ａｕｒｋｂ（図６Ｆ）、Ｗｎｔ２（図６Ｇ）、Ａｘｉｎ２（図６Ｈ）及びグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｌ、図６Ｉ）に対して正規化された数である。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ−Ｂは、ヒトＨＣＣにおけるＮｏｔｃｈ２の発現を示す。図７Ａは、培養されたヒトＨＣＣ細胞株における、ＲＴ−ＰＣＲにより決定された、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＮｏｔｃｈ３の発現を示す。図７Ｂは、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１及びＨｅｓ１に対するヒトＨＣＣ腫瘍の免疫組織化学染色を示す。
【図８Ａ−Ｄ】図８Ａ−Ｄは、ヒト（Ｃ）及びマウス（Ｄ）のＮｏｔｃｈ２タンパク質、及びヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）のＮｏｔｃｈ２の負の調節領域（ＮＲＲ）の典型的なアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、ヒト及びマウスのＪａｇｇｅｄ １タンパク質の典型的なアミノ酸配列を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ−Ｂは、ファージ抗体ライブラリースクリーニング及び選択のために使用されるペプチドのアミノ酸配列を示す。全てのタンパク質は、ＢＥＶＳ細胞において分泌タンパク質として発現され、それらの配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向にに記載される。図１０Ａは、発現タンパク質のマウスＪａｇｇｅｄ １タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｎ末端の太字は、短いリンカー配列（ＡＤＬＧＳ（配列番号２））を表す。Ｃ末端での太字フォントは、短いリンカー配列（ＥＦＧ）、トロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２６））、Ｇスペーサー及び６−Ｈｉｓタグ（配列番号２７）を表す。図１０Ｂは、発現タンパク質のヒトＪａｇ１−ＤＳＬ−ＥＧＦ１−４のアミノ酸配列を示す。抗原はまた、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位、及びＣ末端での６−Ｈｉｓタグ（配列番号２７）を含んでいたが、Ｊａｇ１配列のみが示されている。
【図１１】図１１は、ヒト分泌型ホスホプロテイン１（ＳＰＰ１）の典型的なアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲアンタゴニスト抗体のＨ１、Ｈ２、及びＨ３重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を示す。アミノ酸位置は、以下に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図１３】図１３は、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲアンタゴニスト抗体のＬ１、Ｌ２、及びＬ３軽鎖ＨＶＲ配列を示す。アミノ酸位置は、以下に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ−Ｂは、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の位置が示される。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａ−Ｂは、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の位置が示される。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、本発明を実施する際に使用するための典型的なアクセプターヒト可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク配列を示す。配列識別子は、次のとおりである：  −  ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク「Ａ」マイナスＫａｂａｔのＣＤＲ（配列番号３２、３３、３４、３５）。  −  ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」マイナス拡張超可変領域（配列番号３６、３７、３４、３５；配列番号３６、３７、３８、３５；及び配列番号３６、３７、３９、３５）。  −  ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク「Ａ」マイナスＫａｂａｔのＣＤＲ（配列番号４０、４１、４２、３５）。  −  ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」マイナス拡張超可変領域（配列番号４３、４４、４２、３５；配列番号４３、４４、４５、３５；及び配列番号４３、４４、４６、及び３５）。  −  ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク「Ａ」マイナスＫａｂａｔのＣＤＲ（配列番号４７、４８、４９、３５）。  −  ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」マイナス拡張超可変領域（配列番号５０、５１、４９、３５；配列番号５０、５１、５２、３５；及び配列番号５０、５１、５３、３５）。  −  ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ａ」マイナスＫａｂａｔのＣＤＲ（配列番号５４、４８、５５、３５）。  −  ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ｂ」及び「Ｃ」マイナス拡張超可変領域（配列番号５０、５１、５５、３５；配列番号５０、５１、５６、３５）。  −  ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ａ」マイナスＫａｂａｔのＣＤＲ（配列番号５４、４８、５７、３５）。  −  ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」マイナス拡張超可変領域（配列番号５０、５１、５７、３５；配列番号５０、５１、５８、３５；及び配列番号５０、５１、５９、３５）。
【図１７】図１７は、本発明を実施する際に使用するための典型的なアクセプターヒト可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク配列を示す。配列識別子は、次のとおりである：  −  ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（κｖ１）：配列番号６０、６１、６２、６３  −  ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（κｖ２）：配列番号６４、６５、６６、６３  −  ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（κｖ３）：配列番号６７、６８、６９、６３  −  ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（κｖ４）：配列番号７０、７１、７２、６３。
【図１８】図１８は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域配列を示す（出現順に、それぞれ、配列番号６０、６１、３０、６３、５０、５１、５９及び３５）。上付き文字の数字は、Ｋａｂａｔに記載のアミノ酸位置を示している。
【図１９】図１９は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖及び重鎖の改変型／変異型フレームワーク領域配列を示す（出現順に、それぞれ、配列番号６０、６１、６２、３１、５０、５１、５３及び３５）。上付き文字の数字は、Ｋａｂａｔに記載のアミノ酸位置を示している。
【図２０】図２０は、実施例に記載されるような、抗Ｊａｇｇｅｄ抗体のＨ１、Ｈ２、及びＨ３重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を示す。アミノ酸位置は、以下に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図２１】図２１は、実施例に記載されるような、抗Ｊａｇｇｅｄ抗体のＬ１、Ｌ２、及びＬ３軽鎖ＨＶＲ配列を示す。アミノ酸位置は、以下に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図２２】図２２は、抗Ｊａｇｇｅｄ抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインフレームワーク配列を示す（出現順に、それぞれ、配列番号６０、６１、６２、７７、５０、９９、５７及び３５）。上付き文字の数字は、Ｋａｂａｔに記載のアミノ酸位置を示している。
【図２３Ａ−Ｂ】図２３Ａ−Ｂは、実施例に記載されるＮｏｔｃｈ２（配列番号１００）（Ｂ？）、Ｎｏｔｃｈ１（配列番号１０１）（Ｙ）、Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１０２）（Ｗ）及びＪａｇ１（配列番号１０３）（Ａ−２）に対する抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４Ａ−Ｂは、実施例で使用されるＮｏｔｃｈ２（配列番号１０４）、Ｎｏｔｃｈ１（配列番号１０５）、Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１０６）及びＪａｇ１（配列番号１０７）に対する抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２５Ａ−Ｂ】図２５Ａ−Ｂは、抗Ｊａｇ１抗体の重鎖（図２５Ａ）及び軽鎖（図２５Ｂ）可変ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の位置が示される。
【００４７】
本発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００４８】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００４９】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つ抗体を指す。
【００５０】
用語「抗Ｊａｇ１抗体」及び「Ｊａｇ１に特異的に結合する抗体」は、抗体がＪａｇ１を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＪａｇ１に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗Ｊａｇ１抗体の、無関係な、非Ｊａｇ１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＪａｇ１への結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、Ｊａｇ１へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。所定の実施態様において、抗Ｊａｇ１抗体は、異なる種由来のＪａｇ１間で保存されているＪａｇ１のエピトープに結合する。
【００５１】
「抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体」は、Ｊａｇ１媒介性シグナル伝達、例えば、Ｊａｇ１媒介性Ｎｏｔｃｈ２とシグナル伝達の減少をもたらす抗Ｊａｇ１抗体である。
【００５２】
用語「抗Ｎｏｔｃｈ２抗体」及び「Ｎｏｔｃｈ２に特異的に結合する抗体」は、抗体がＮｏｔｃｈ２を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＮｏｔｃｈ２に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の、無関係な非Ｎｏｔｃｈ２タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＮｏｔｃｈ２への結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体は、異なる種由来のＮｏｔｃｈ２間で保存されているＮｏｔｃｈ２のエピトープに結合する。
【００５３】
「抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体」は、以下に定義されるように、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少をもたらす抗Ｎｏｔｃｈ２抗体（抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を含む）である。
【００５４】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００５５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００５６】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合を遮断する抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合を遮断するその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００５７】
「遮断抗体」又は「アンタゴニスト抗体」は、結合する抗原の生物学的活性を（部分的又は完全にのどちらかで）著しく阻害する抗体である。
【００５８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００５９】
用語「がん」及び「がん性」は、無秩序な細胞成長／細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。肝臓がんの例としては、肝細胞がん、肝細胞がん、肝芽腫、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肉腫、リンパ腫及び肝血管肉腫を含むが、これらに限定されない。肝臓がんは、肝臓で生じ、身体の別の部分に転移したがんが含まれる。
【００６０】
用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性疾患」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を言う。一実施態様において、肝細胞増殖性疾患はがんである。
【００６１】
「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；アジリジン類、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレトアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）及び９−アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えば、Nicolaou et al.,Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)を参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノ���イシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル（ｔｅｇａｆｕｒ）（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；プリンアナログ、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジア��コン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサマイトシン類（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）のようなメイタンシノイド類（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ Ａ）及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオゾーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ）（Ｒ１１５７７）；オラフィニブ（ｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ−２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ ｓｏｄｉｕｍ）（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
【００６２】
本明細書で定義される化学療法剤には、がんの増殖を促進しうるホルモンの作用を調節、低減、遮断、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びＥＭ８００（このような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる）；アロマターゼ阻害剤、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド系アロマターゼ阻害剤、及びアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、及びボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、メゲストロールアセテート（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール及び４（５）−イミダゾールを含む他のアロマターゼ阻害剤；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【００６３】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００６４】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体に対する補体系（Ｃ１ｑ）の第一の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号（Ｂ１）及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００６５】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤を包含する。
【００６６】
用語「細胞分裂阻害剤」とは、インビトロ又はインビボの何れかにおいて、細胞の増殖を停止する化合物又は組成物を指す。従って、細胞分裂阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を有意に減少させるものであってもよい。細胞分裂阻害剤の更なる例は、Ｇ０／Ｇ１停止又はＭ期停止を誘導することによって、細胞周期の進行を遮断する薬剤を含む。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体のトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））はＧ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の例である。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及び例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編、第一章、表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗がん剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル−マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００６７】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞の活性化を含む。
【００６８】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００６９】
用語「発現」は、遺伝子にコードされる情報の、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への、そしてその後のタンパク質への変換を指す。
【００７０】
ここで、目的のタンパク質を「発現する」試料又は細胞は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はタンパク質（その断片を含む）が、試料又は細胞中に存在すると判断されるものである。
【００７１】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００７２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に次のＶＨ（又はＶＬ）配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００７３】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００７４】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００７５】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００７６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００７７】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００７８】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成するか、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。本明細書における典型的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al.J. Mol.Biol.262:732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せを含む。
【００７９】
一実施態様において、ＨＶＲ残基は、図１２、１３、２０、２１において同定されるものを含む。
【００８０】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００８１】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む。
【００８２】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００８３】
「肝臓がんを有する危険性のある個体」は、肝臓がんを罹患する傾向が平均よりも高い個体を指す。肝臓がんを有する危険性のある個体の例は、限定されないが、肝炎、例えば、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成を有する個体を含む。
【００８４】
「阻害する」とは、基準と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる又は低下させることである。
【００８５】
「細胞の成長及び増殖の阻害」は、細胞の成長及び増殖を少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％減少させることを意味し、かつ細胞死を誘導することを含む。
【００８６】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されているものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００８７】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００８８】
「抗Ｊａｇ１抗体をコードする単離された核酸」又は「抗Ｎｏｔｃｈ２抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００８９】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「Ｊａｇｇｅｄ」又は「Ｊａｇ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型Ｊａｇｇｅｄを指す。その用語は、「完全長」で未処理のＪａｇ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＪａｇｇｅｄを含む。その用語はまた、Ｊａｇｇｅｄの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。
【００９０】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「Ｊａｇｇｅｄ１」又は「Ｊａｇ１」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型Ｊａｇ１を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＪａｇ１、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＪａｇ１を含む。その用語はまた、Ｊａｇ１の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒト及びマウスＪａｇ１のアミノ酸配列が図９に示される。
【００９１】
本明細書において使用される「発現のレベル」又は「発現レベル」なる用語は、生物学的試料中のポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ又はアミノ酸生成物若しくはタンパク質の量を意味する。
【００９２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に存在する変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００９３】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００９４】
「天然型抗体」は、天然に存在する様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。
【００９５】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「Ｎｏｔｃｈ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型Ｎｏｔｃｈを指す。その用語は、「完全長」で未処理のＮｏｔｃｈ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＮｏｔｃｈを含む。その用語はまた、Ｎｏｔｃｈの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。
【００９６】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「Ｎｏｔｃｈ２」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型Ｎｏｔｃｈ２を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＮｏｔｃｈ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＮｏｔｃｈを含む。その用語はまた、Ｎｏｔｃｈ２の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒトＮｏｔｃｈ２のアミノ酸配列が図８に示される。
【００９７】
「Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤」なる用語は、上記に定義されるように、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少をもたらす薬剤を指す。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ２特異的アンタゴニスト及びＪａｇ１特異的アンタゴニストを含む。Ｎｏｔｃｈ２特異的アンタゴニストは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を減少させ、別のＮｏｔｃｈ受容体（哺乳動物におけるＮｏｔｃｈ１、３、又は４）によるシグナル伝達には有意には影響を与えない。Ｎｏｔｃｈ２特異的アンタゴニストの例は、Ｎｏｔｃｈ２リガンドへのＮｏｔｃｈ２の結合を遮断する薬剤を含む。Ｊａｇ１特異的アンタゴニストは、Ｊａｇ１媒介性シグナル伝達を減少させる。Ｊａｇ１特異的アンタゴニストの例は、Ｎｏｔｃｈ２に結合する薬剤を含む。ガンマセクレターゼ阻害剤などのＰａｎ−Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、本明細書に定義されるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤から明示的に除外される。
【００９８】
用語「添付文書」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００９９】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０１００】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍。
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【０１０１】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【０１０２】
「薬学的に許容可能な担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【０１０３】
「再発した」とは、患者の病気のその以前の病的状態への退行、特に、見かけの回復又は部分的な回復後の症状の再発を意味する。他に示されない限り、再発状態は、化学療法及び幹細胞移植治療を含む以前の処置の前の病気へ戻るプロセス又は再発を指す。
【０１０４】
「難治性」とは、治療に対しての、疾患又は状態の抵抗性又は非応答性を指す（例えば、治療が施されたとしても腫瘍性形質細胞の数が増加するなど）。他に示されない限り、用語「難治性」とは、限定されないが、化学療法及び幹細胞移植治療を含む任意の以前の治療に対しての、抵抗性又は非応答性を指す。
【０１０５】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「分泌型ホスホプロテイン」又は「ＳＰＰ１」又は「オステオポンチン」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＳＰＰ１を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＳＰＰ１、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＳＰＰ１を含む。その用語はまた、ＳＰＰ１の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒトＳＰＰ１のアミノ酸配列が図１１に示される。
【０１０６】
本明細書で用いる「実質的に減少」、「実質的に異なる」という句は、当業者が、２つの値の間の差異が、その値（例えばＫｄ値）によって測定される生物学的特性という脈絡の中で、統計学的に有意であると考慮するであろうほどに、２つの数値（一般には、一つは分子に関連するもの、他方は参照／比較分子に関連するもの）の間の十分に高度な違いを指す。
【０１０７】
本明細書で使用される「実質的に同様」又は「実質的に同一」なる用語は、当業者が、該値（例えばＫｄ値）により測定される生物学的特徴の文脈で２つの値の間に、殆ど又は全く生物学的及び／又は統計的に有意な差がないと考えるように、２つの数値間（例えば本発明の抗体に関連する一方と参照／比較抗体に関連する他方）の十分に高い度合いの類似性を指す。
【０１０８】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての新生細胞成長及び増殖、及び全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を意味する。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語はここで意味するように相互排他的ではない。
【０１０９】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１１０】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【０１１２】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、肝臓がんの治療のための、Ｎｏｔｃｈ経路の成分の阻害に一部は基づく。
【０１１３】
一態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与する工程を含む、肝臓がん治療を必要とする個体における肝臓がんを治療する方法が提供される。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、胆管がん（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）、肝がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝血管肉腫（ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、又は転移性肝がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）である。幾つかの実施態様において、肝臓がんは、難治性がんである。
【０１１４】
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の例は、当該分野で周知であり、幾つかは、限定されないが、可溶性Ｎｏｔｃｈ受容体、水溶性Ｎｏｔｃｈリガンドの変異体、例えば、ドミナントネガティブリガンド変異体、Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇ１に結合するアプタマー又はオリゴペプチド、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を特異的に妨害する有機又は無機分子、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体及び抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体を含み、本明細書に例示されている。Ｎｏｔｃｈ２特異的アンタゴニストの例は、米国特許出願公開第２０１０／０１１１９５８号、及びSjoelund et al., J. Clin. Invest. 118(1):217-228 (2008)に記載されるものを含む。
【０１１５】
所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体である。一つのそのような実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体は、Ｎｏｔｃｈ２の細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少をもたらす抗体である。一つのそのような実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体である。抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、限定されないが、国際出願公開番号ＷＯ２０１００３９８３２に開示される任意の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を含み、これはその全体が本明細書に参照により援用される。このような抗体は、限定されないが、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａドメイン及びＨＤ−Ｃドメインに結合する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を含む。例示的な抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｂ−１、抗体Ｂ−２、及び抗体Ｂ−３として本明細書で指定されたモノクローナル抗体である。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体Ｂは、ファージライブラリーから単離されたその抗体は、抗体Ｂ−１、Ｂ−２抗体、及び抗体Ｂ−３を生成するように親和性熟成された。抗体Ｂ、抗体Ｂ−１、抗体Ｂ−２、及び抗体Ｂ−３の重鎖及び軽鎖の超可変領域（ＨＶＲ）の配列は、図１２と１３にそれぞれ示される。抗体Ｂ、抗体Ｂ−１、抗体Ｂ−２、及び抗体Ｂ−３の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列は、図１４と１５に示される。抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体のさらなる実施態様が以下のように提供される。
【０１１６】
一態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合するアンタゴニスト抗体が提供され、ここでその抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６つＨＶＲを含む。
【０１１７】
更なる態様において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、及（ｆ）から選択される少なくとも一、二、三、四、又は五のＨＶＲを含む。更なる態様において、抗体は上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及（ｆ）を含む。（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）に関して、以下の実施態様の何れか一以上が意図される。ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号５−８から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号１０−１３から選択されるアミノ酸配列を含み；及びＨＶＲ−Ｌ３は配列番号１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
別の態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１９】
別の態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、配列番号９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１２０】
次の実施態様は、任意の組合せで意図される：ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号５−８から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号１０−１３から選択されるアミノ酸配列を含み；及びＨＶＲ−Ｌ３は配列番号１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１２１】
一実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１２２】
別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１２３】
別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１２４】
別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで該抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１２５】
所定の実施態様において、上記抗体の何れかは、更に、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク及びＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも一のフレームワークを含む。
【０１２６】
所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、親和性成熟している。例えば、示されたＨＶＲの位置で以下の置換の任意の一以上が、任意の組合せでなされる：
−  ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号５）において：Ｓ２８Ｎ；Ｉ２９Ｎ又はＶ；Ｓ３０Ｒ又はＫ；Ｓ３１Ｒ；Ｙ３２Ｆ
−  ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号１０）において：Ｇ５０Ｒ；Ｓ５３Ｉ又はＴ；Ａ５５Ｅ
−  ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号１５）において：Ｓ９３Ｉ又はＲ；Ｌ９６Ｓ又はＨ。
【０１２７】
本明細書に開示される特定の抗体、抗体Ｂ並びに抗体Ｂ（Ｂ-１、Ｂ-２、及びＢ-３）の親和性成熟形態は、更なる親和性成熟を受けることができる。従って、本明細書に記載される抗体の何れかの親和性成熟形態が提供される。
【０１２８】
所定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体である。一つのそのような実施態様において、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体は、Ｊａｇ１の細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少をもたらす抗体である。一つのそのような実施態様において、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体は、抗Ｊａｇ１ ＥＧＦ１−４抗体である。抗Ｊａｇ１抗体は、限定されないが、本明細書において開示される任意の抗Ｊａｇ１抗体を含む。
【０１２９】
更なる実施態様において、抗体は、抗Ｊａｇ１抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つＨＶＲを含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３０】
一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３１】
一実施態様において、上記ＨＶＲ配列の何れかを有する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体又は抗Ｊａｇ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ及びＪａｇ１のそれぞれに対する結合活性が実質的に保持されるという条件で、更に、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。所定の実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体又は抗Ｊａｇ１抗体は、図１６Ａ及び１６Ｂに示されるＶＨコンセンサスフレームワーク配列の何れかにあるような、ヒト可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク配列を含む。一実施態様において、ＶＨコンセンサスフレームワーク配列は、例えば、図１６Ａ及び１６Ｂに示されるように、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。別の実施態様において、ＶＨコンセンサスフレームワーク配列は、例えば、図１６Ａ及び１６Ｂに示されるように、「アクセプター２」フレームワーク配列を含む。特定の実施態様において、ＶＨフレームワークコンセンサス配列は、アクセプター２Ｂ又はアクセプター２ＤのＦＲ１−ＦＲ４を含み、ここでＦＲ４は、配列番号３５を含み（図１６Ａ及び１６Ｂ）、配列番号３５の最後の残基（Ｓ１１）は、必要に応じて、アラニンで置換されている。更なる特定の実施態様において、ＶＨフレームワークコンセンサス配列は、配列番号５０；５１；５７又は５９；及び３５の配列を含み、ここで配列番号３５のＳ１１は、必要に応じて、アラニンで置換されている。
【０１３２】
所定の実施態様において、上記のＨＶＲ配列の何れかを有する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体又は抗Ｊａｇ１抗体は、図１７に示されるように、ヒト可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク配列を更に含むことができる。一実施態様において、ＶＬコンセンサスフレームワーク配列は、例えば、図１７に示されるように、ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（κｖ１）配列を含む。別の実施態様において、ＶＬフレームワークコンセンサス配列は、図１８又は１９に示されるように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦＲ１−ＦＲ４を含む。特定の実施態様において、ＶＬフレームワークコンセンサス配列は、配列番号６０、６１、６２及び６３の配列を含む。
【０１３３】
別の態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号２０のアミノ酸配列において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。
【０１３４】
別の態様において、配列番号２２−２５から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供される。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号２２−２５から選択されるアミノ酸配列において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号５−８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。別のそのような実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。別のそのような実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。別のそのような実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【０１３５】
上記に提供される変異型ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲ内で生じ得る。そのような実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変をＨＶＲ内で行うことができる。特定の場合において、ＨＶＲの改変は、実際に、抗体の親和性を向上させ得る。そのような改変は、抗体の親和性を増加させるために、ＨＶＲ「ホットスポット」（すなわち、体細胞成熟プロセスの最中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基）において作成され得る。（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008を参照）。上記に与えられた変異型ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは保存されている（改変されていない）か、又はわずか一つのアミノ酸置換、挿入又は欠失が含まれているかの何れかである。
【０１３６】
別の態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号２２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含み、ＶＬは、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３７】
別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号２３−２５から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含み、ＶＬは、（ａ）配列番号６−８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１６−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２３−２５から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３８】
別の態様において、Ｊａｇ１に特異的に結合する抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は配列番号９３−９５から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号９６−９８から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含み、ＶＬは、（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１３９】
別の実施態様において、Ｊａｇ１に特異的に結合する抗Ｊａｇ１抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号９７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含み、ＶＬは、（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４０】
別の実施態様において、Ｊａｇ１に特異的に結合する抗Ｊａｇ１抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号９８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。一つのそのような実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含み、ＶＬは、（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二又は三のＨＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１４１】
所定の実施態様において、上記抗体の何れかの親和性成熟形態が提供される。更なる実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ又はＪａｇ１に特異的に結合する組換えタンパク質が提供され、その組換えタンパク質は、上記抗体の何れかの抗原結合部位を含む。一つのそのような実施態様において、組換えタンパク質は、上記に提供されるＨＶＲの任意の一以上を含む。
【０１４２】
所定の実施態様において、上記抗体の何れかをコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施態様において、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。一実施態様において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物である。一実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を作成する方法が提供され、該方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること及び抗体を単離することを含む。
【０１４３】
別の実施態様において、本明細書において与えられる抗体と同一エピトープに結合する単離された抗体が提供される。一実施態様において、抗体Ｂ、抗体Ｂ−１、抗体Ｂ−２、及び抗体Ｂ−３から選択される抗体と同一エピトープに結合する、単離された抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体が提供される。別の実施態様において、本発明は、抗体Ｂ、抗体Ｂ−１、抗体Ｂ−２、及び抗体Ｂ−３から選択される抗体と、結合を競合する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を提供する。別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２のＬＮＲ−Ａドメイン及びＨＤ−Ｃドメインから選択される少なくとも一のドメインに結合する単離された抗体が提供される。一つのそのような実施態様において、抗体は、ＬＮＲ−Ａドメイン及びＨＤ−Ｃドメインの両方に結合する。別のそのような実施態様において、抗体は、ＬＮＲ−Ｂ及び／又はＨＤ−Ｎドメインに更に結合する。
【０１４４】
一実施態様において、抗体Ａ、抗体Ａ−１、及び抗体Ａ−２から選択される抗体と同一エピトープに結合する、単離された抗Ｊａｇ１抗体が提供される。別の実施態様において、本発明は、抗体Ａ、抗体Ａ−１、及び抗体Ａ−２から選択される抗体と、結合を競合する抗Ｊａｇ１抗体を提供する。別の実施態様において、Ｊａｇ１のＤＳＬドメイン及びＥＧＦドメインから選択される少なくとも一のドメインに結合する単離された抗体が提供される。一つのそのような実施態様において、抗体はＪａｇ１のＥＧＦ１−４に結合する。
【０１４５】
本明細書に与えられるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の何れかは、本明細書に記載される方法で使用され得る。
【０１４６】
また、本発明は、肝臓がんを有する患者に対する治療的処置を選択するための方法を提供し、その方法は、患者から得た試料中のＮｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１及びＳＰＰ１の一以上の発現を測定することを含む。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１及びＳＰＰ１の一以上の発現が患者の試料中で検出される場合、患者は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤による治療のために選択される。幾つかの実施態様において、対照に比べて、患者から得られた試料中のＮｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１及びＳｐｐ１の一以上の発現の上昇は、本明細書に記載されるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を用いた治療を受けるために適切な患者を同定する。幾つかの実施態様において、追加のパラメーター、例えば、医師による検査、生検の組織学的評価、肝臓がんを特徴付ける血清レベルの決定が、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤治療を受けるために患者を同定するために使用される。
【０１４７】
幾つかの実施態様において、患者からの試料又は生検は、当技術分野で周知の方法、例えば定量的ＰＣＲ分析を用いて、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１及びＳｐｐ１の一以上のｍＲＮＡの発現について分析され、対照個体から得られた生検中の同一遺伝子又は遺伝子（複数）の発現と比較され、又は基準値と比較される。幾つかの実施態様において、発現は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定される。幾つかの実施態様において、患者からの試料又は生検は、例えば、本明細書に記載されるようにＮｏｔｃｈ２の活性化形態を検出することにより、Ｎｏｔｃｈ２の活性化について分析される。
【０１４８】
一態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与する工程を含む、肝臓がんを有する危険性にある個体における肝臓がんを予防するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、個体は、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成からなる群から選択される肝臓の状態を有する。幾つかの実施態様において、方法は、少なくとも一の付加的な治療剤を投与することを更に含む。付加的治療剤の例としては、細胞傷害性薬剤、ペプチド、小分子及び抗体のような増殖阻害剤を含む。
【０１４９】
別の態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と細胞を接触させ、それによって細胞の増殖を阻害することを含む、分泌型ホスホプロテイン１（ＳＰＰ１）を発現する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。一実施態様において、ＳＰＰ１タンパク質は、図１１に示されるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、細胞内のＳＰＰ１の発現を減少させる。例えば、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、細胞内のＳＰＰ１の発現を、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％減少させる。ＳＰＰ１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現は、当該技術分野における任意の方法によって決定することができる。幾つかの実施態様において、細胞は、肝臓がん細胞である。幾つかの実施態様において、肝臓がん細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、ＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１、核Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｒａｓ、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１、Ａｕｒｋｂ、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２，若しくはＧｌｕｌ、又はそれらの任意の組合せを発現する。幾つかの実施態様において、細胞をＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤と接触させると、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤ、Ｊａｇ１、Ｐｒｏｍ１、Ｓｐｐ１、ＦｏｘＭ１、Ｐｌｋ１、ｃｃｎｂ１及びＡｕｒｋｂ．の少なくとも一の、細胞における発現の減少をもたらす。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与は、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２及びＧｌｕｌの少なくとも一の、細胞における発現の増加をもたらす。幾つかの実施態様において、発現は、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ分析、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着法、及びウェスタンブロッティングにより決定される。
【０１５０】
別の態様において、哺乳動物にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の治療的有効量を投与し、それによって哺乳動物を効果的に治療することを含む、図１１に示されるポリペプチドに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＳｐｐ１遺伝子を発現する細胞を含む肝臓がんを有する哺乳動物を治療的に処置するための方法が提供される。
【０１５１】
別の態様において、治療を必要とする個体に、抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体の有効量を投与し、それによって効果的に肝細胞増殖性疾患を治療し又は予防することを含む、図８Ｃに示されるポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質の増加した発現又は活性と関連した肝細胞増殖性疾患を治療し又は予防するための方法が提供される。幾つかの実施態様において、細胞増殖性疾患は、肝臓がんなどのがんである。幾つかの実施態様において、個体は、Ｂ型又はＣ型肝炎、肝硬変、良性肝腫瘍、血管腫、肝腺腫、及び限局性結節性過形成からなる群から選択される肝臓の状態を有する。
【０１５２】
一態様において、個体における血清ＳＰＰ１タンパク質レベルを減少させるための方法であって、個体に、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与し、これにより個体における血清ＳＰＰ１濃度を減少させることを含む方法が提供される。幾つかの実施態様において、減少とは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の個体における血清ＳＰＰ１レベルに対するものである。幾つかの実施態様において、減少とは、基準値に対するものである。一実施態様において、個体は肝臓がんを有する。一実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌである。所定の実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、約８０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間、約８６ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間、約１２０ｎｇ／ｍｌから約１７０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１６５ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与すると、８０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルをもたらす。特定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の２４時間である。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与前又は後の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイなどの任意の適切な方法によって決定することができる。特定の実施態様において、血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与した後、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１２ヶ月減少する。
【０１５３】
一態様において、肝臓腫瘍の増殖が、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の増殖増強効果に少なくとも一部依存している、哺乳動物における肝臓腫瘍を治療的に処置するための方法であって、腫瘍をＮｏｔｃｈ２又はＪａｇ１に結合する抗体と接触させ、それによって腫瘍を効果的に治療することを含む方法が提供される。一実施態様において、抗体の、腫瘍に対する結合は、Ｎｏｔｃｈ２の増殖増強活性に拮抗する。
【０１５４】
一態様において、肝臓がんについて治療され、血清ＳＰＰ１タンパク質レベルが上昇している個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の有効量を投与することを含む肝臓がんの再発を防止するための方法が提供される。一実施態様において、個体の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌである。所定の実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与する前の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルは、約８０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの間、約８６ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間、約１２０ｎｇ／ｍｌから約１７０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１６５ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与すると、８０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ＳＰＰ１タンパク質レベルをもたらす。
【０１５５】
幾つかの態様において、個体にＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤を投与し、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を決定する工程を含む、肝臓がんを有する個体を治療するための方法が提供され、ここで治療後のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少は、治療前のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達と比較して、個体における肝臓がんの減少を示している。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は、例えば、免疫組織化学的分析によって、Ｎｏｔｃｈ２ ＩＣＤの核局在化を測定することによって決定される。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ２、Ｊａｇ１、Ｈｅｓ及びＨｅｙ１からなる群から選択される遺伝子の発現を測定することによって決定される。幾つかの実施態様において、肝臓がんは肝細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝芽腫、肝がん、肝血管肉腫、及び転移性肝臓がんである。幾つかの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤又は抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、抗Ｎｏｔｃｈ２アンタゴニスト抗体又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体などのアンタゴニスト抗体である。
【０１５６】
幾つかの態様において、肝臓がん細胞の増殖を阻害するための方法は、Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇ１に対する抗体を用いて、哺乳動物の肝臓がん細胞を治療することを含み、それによって肝臓がん細胞の増殖が阻害される。所定の実施態様において、抗体は、本明細書に記載される抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１アンタゴニスト抗体である。所定の実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。所定の実施態様において、上記実施態様の抗体の何れかは抗体断片である。所定の実施態様では、細胞は患者にある。所定の実施態様では、細胞は培地中にある。
【０１５７】
本発明のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤、例えば抗Ｎｏｔｃｈ２抗体及び抗Ｊａｇ１抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一の追加の治療剤と同時投与され得る。
【０１５８】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明のアンタゴニストの投与が、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０１５９】
アンタゴニストは、例えば、ボーラスとして静脈内投与など任意の既知の方法によって、又はある期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路によってヒト患者に投与することができる。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、タンパク質として又はタンパク質をコードする核酸として投与することができる（例えば、国際出願公開ＷＯ９６／０７３２１を参照）。他の治療レジメンは、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の投与と組み合せることができる。併用投与は、別個の製剤又は単一の薬学的製剤及び何れかの順番での連続投与を用いた、同時投与を含み、ここで好ましくは両方（又は全ての）活性薬剤が同時にその生物学的活性を発揮する期間が存在することを特徴とする。幾つかの実施態様において、そのような併用療法は相乗的な治療効果をもたらす。
【０１６０】
投与の用量及びモードは、周知の基準に従って、医師により選択されるであろう。抗体又は他のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の適量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、抗体、オリゴペプチド又は有機分子が予防を目的としてか治療を目的として投与されるのかどうか、以前の治療法、患者の病歴、及びＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤への反応、及び主治医の判断により決定されるであろう。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は一時的又は一連の治療にわたって患者に投与することができる。
【０１６１】
肝臓がんの治療の成功は、肝臓の機能及び回復のパラメータを評価することによって監視することができる。このようなパラメータには、限定されないが、肝機能検査（例えば、血清アルブミン、ビリルビン、胆汁酸、総タンパク質、凝固時間の評価）の改善、肝酵素（例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）、組織学的外観（例えば、肝アーキテクチャの改善を示す針生検）及び画像診断法（例えば、線維症及び肝臓の大きさについての超音波、磁気共鳴イメージング）が含まれる。治療の成功はまた、ＳＰＰ１タンパク質の血清レベルを測定することによって監視することができ、ここでは、治療前のレベルと比較して、治療される患者における血清レベルの減少は、治療の成功を示す。
【０１６２】
更なる態様にて、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤は、以下のセクション１−７で説明されるように、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込んだ上記実施態様の何れかにおいて使用される抗体である。
【０１６３】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０１６４】
一実施態様において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原により実施される。例えば、非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例として、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。それぞれ最大結合の２０％以下の濃度のＦａｂを選択して競合結合アッセイに用いる。
【０１６５】
別の実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるアッセイが、〜１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ-1ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１６６】
２．抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１６７】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993）を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１６８】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号（Ｂ１）を参照）。
【０１６９】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【０１７０】
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１７１】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１７２】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１７３】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１７４】
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１７５】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１７６】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１７７】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【０１７８】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１７９】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載のように如何なる免疫化をも伴うことなく、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することが可能である。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
【０１８０】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１８１】
６．多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＪａｇ１に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＮｏｔｃｈ２に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、Ｊａｇ１の２つの異なるエピトープに結合することができる。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、Ｎｏｔｃｈ２の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた、Ｊａｇ１及び／又はＮｏｔｃｈ２を発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１８２】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１））、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１８３】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号（Ａ１）を参照）。
【０１８４】
本明細書中の抗体又は断片はまた、Ｊａｇ１又はＮｏｔｃｈ２並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１８５】
７．抗体変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１８６】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「望ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
0006527132.tif 000002
【０１８７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１８８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うこととなる。
【０１８９】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１９０】
改変（例えば、置換）を、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接触する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し再選択すことによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーが、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するする別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１９１】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲ中の抗原と接触する残基以外であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１９２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１９３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１９４】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度が増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１９５】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０１９６】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指すが；しかしながら、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004）が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ａ１）、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号（Ａ１）、Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１９７】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６６０２６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１９８】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１９９】
所定の実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. ら、Blood 101:1045-1052 (2003)；並びにCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０２００】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２０１】
ＦｃＲへの改善又は減少した結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０２０２】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０２０３】
幾つかの実施態様において、改変された（即ち、改善され又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０２０４】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Hintonら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。
【０２０５】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２０６】
ｄ）システイン操作抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ（複数）」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基の何れか又は複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０２０７】
ｅ）抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０２０８】
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体、及び非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２０９】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗Ｊａｇ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。一実施態様において、本明細書に記載される抗Ｎｏｔｃｈ２抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクターを含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗Ｊａｇ１抗体を作成する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。一実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を作成する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０２１０】
抗Ｊａｇ１抗体又は抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０２１１】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
【０２１２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０２１３】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０２１４】
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０２１５】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０２１６】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定され、スクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０２１７】
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０２１８】
その他の態様において、競合アッセイを、Ｊａｇ１への結合について抗体Ａ、Ａ−１又はＡ−２と競合する抗体を同定するために用いることができる。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、抗体Ａ、Ａ−１又はＡ２により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。その他の態様において、競合アッセイを、Ｎｏｔｃｈ２への結合について抗体Ｂ、Ｂ−１、Ｂ−２又はＢ−３と競合する抗体を同定するために用いることができる。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、抗体Ｂ、Ｂ−１、Ｂ−２又はＢ−３により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)のMorris (1996) “Epitope Mapping Protocols,"に提供される。
【０２１９】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化Ｊａｇ１は、Ｊａｇ１に結合する第一の標識された抗体（例えば、抗体Ａ、Ａ−１又はＡ−２）、及びＪａｇ１へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化Ｊａｇ１が、未標識の第二の抗体でなく、標識された第一の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。Ｊａｇ１への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたＪａｇ１に結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたＪａｇ１に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、Ｊａｇ１への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。別の典型的な競合アッセイにおいて、固定化Ｎｏｔｃｈ２は、Ｎｏｔｃｈ２に結合する第一の標識された抗体（例えば、抗体Ｂ、Ｂ−１、Ｂ−２又はＢ３）、及びＮｏｔｃｈ２へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化Ｎｏｔｃｈ２が、未標識の第二の抗体でなく、標識された第一の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。Ｎｏｔｃｈ２への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたＮｏｔｃｈ２に結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたＪａｇ１に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、Ｎｏｔｃｈ２への結合において第一の抗体と競合していることを示している。
【０２２０】
２．活性のアッセイ
一態様において、生物学的活性を有する、抗Ｊａｇ１抗体及び抗Ｎｏｔｃｈ２抗体などのＮｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、Ｎｏｔｃｈ２活性、例えばＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害又は減少、Ｊａｇ１媒介性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、例えば、Ｊａｇ１媒介性Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害又は減少を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０２２１】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。所定の実施態様において、本発明の抗体は、Ｓｐｐ１の発現を阻害し、減少させるその能力について試験される。例示的なアッセイは、実施例に提供される。所定の他の実施態様において、本発明の抗体は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達に応答性であるレポーター遺伝子の発現を阻害するその能力について試験される。所定の他の実施態様において、本発明の抗体は、Ｊａｇ１媒介性シグナル伝達、例えば、Ｊａｇ１媒介性Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達に応答性であるレポーター遺伝子の発現を阻害するその能力について試験される。一つの典型的なアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ２により安定的にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞又は他のＮｏｔｃｈ受容体を含むプラスミドにより一過性にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、トランスフェクション効率を制御するために、Ｎｏｔｃｈ応答性ＴＰ−Ｉ（１２Ｘ ＣＳＬ）ホタルルシフェラーゼレポーター及び恒常的に活性なウミシイタケルシフェラーゼレポーター（ＰＲＬ−ＣＭＶ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により同時トランスフェクトされる。細胞は、６時間から一晩でトランスフェクションから回復させる。抗体及びリガンドにより安定的にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の処置が受容体細胞を刺激するために使用される。２０時間後、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼがＤｕａｌ ＧＩｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定される。複製物は、トランスフェクション効率を調節するために、ウミシイタケのシグナルによってホタルのシグナルを分割することにより、各条件について分析される。平均及び標準偏差が計算され、値は、トランスフェクトされたリガンドなしでＮＩＨ−３Ｔ３細胞により刺激された共培養物について計算された値に正規化される。
【０２２２】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでの細胞の成長又は増殖を阻害するその能力について試験される。細胞成長又は増殖の阻害のアッセイは、当該分野で周知である。本明細書中に記載される「細胞の死滅」アッセイによって例示される、細胞増殖についての特定のアッセイは、細胞の生存率を測定する。そのようなアッセイの一つは、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）から市販されている、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイである。そのアッセイは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づき、培養液中で生存細胞の数を決定する。Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88，米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適するように、９６穴形式又は３８４穴形式で行うことができる。Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ法では、直接培養細胞に単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。これにより、細胞溶解とルシフェラーゼ反応により生成した発光シグナルの生成を生じる。発光シグナルは、培養中に存在する生存細胞の数に直接的に比例しているＡＴＰの存在量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ撮像装置によって記録することができる。発光出力は相対光単位（ＲＬＵ）として表される。
【０２２３】
他の細胞増殖アッセイは、「ＭＴＴ」アッセイであり、ミトコンドリア還元酵素による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物のホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭアッセイと同様に、このアッセイは細胞培養中に存在する代謝的に活性な細胞の数を示す。例えば、Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang et al. (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照のこと。
【０２２４】
一態様において、本発明の抗体はインビトロでの細胞死誘導能力について試験される。細胞死を誘導するためのアッセイは、当該分野で周知である。幾つかの実施態様において、そのようなアッセイは、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照）又は７ＡＡＤの取り込みによって示される膜統合性の損失を測定する。例示的なＰＩ取り込みアッセイにおいて、細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：１０％の熱不活性ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２ｍＭＬ−グルタミンが補充されたＨａｍ’ｓ Ｆ−１２（５０：５０）において培養される。したがって、アッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で行われる。細胞は、１００×２０ｍｍのディッシュにおいてディッシュにつき３×１０６の密度で播種され、一晩付着させた。培地は取り除かれ、培地のみ、又は様々な濃度の抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。細胞は、３日間インキューベートされる。処置に続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。細胞は４℃で、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離され、ペレットが３ｍｌの低温Ｃａ２＋結合緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ２）中に再懸濁され、細胞凝集塊の除去のために３５ｍｍの濾過器キャップの（strainer-capped）１２×７５ｍｍのチューブ（１ｍｌ／チューブ、処理群につき３つのチューブ）に等分される。次いで、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を加える。試料はＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析される。ＰＩ取り込みによって決定される統計的に有意な水準の細胞死を誘導する抗体がこのように同定される。
【０２２５】
一態様において、本発明の抗体はインビトロでのアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗体又はイムノコンジュゲートの例示的なアッセイは、アネキシン結合アッセイである。前項で説明したように、典型的なアネキシン結合アッセイでは、細胞が培養され皿に播種される。培地は取り除かれ、培地のみ、又は０．００１から１０μｇ／ｍｌの抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。３日間のインキュベーションに続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。次いで、細胞は遠心分離され、Ｃａ２＋結合緩衝液に再懸濁し、前項で説明したように、チューブに等分される。次いで、チューブは、標識されたアネキシン（例えばアネキシンＶ−ＦＩＴＣ）（１μｇ／ｍｌ）を受け取る。試料はＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析される。コントロールに比較して、アネキシン結合の統計的に有意な水準を誘導する抗体が、このように同定される。アポトーシスを誘導する抗体又はイムノコンジュゲートについてのその他の例示的なアッセイは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム劣化を検出するためのヒストンＤＮＡのＥＬＩＳＡ比色アッセイである。そのようなアッセイは例えば、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行うことができる。
【０２２６】
インビトロアッセイにおいて、上記の何れかで使用するための細胞は、自然にＮｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１を発現するか、又はＮｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１を発現するように操作されている細胞又は細胞株が含まれる。そのような細胞は、同じ組織起源の正常細胞に比較してＮｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１を過剰発現する腫瘍細胞を含む。そのような細胞はまた、Ｎｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１を発現する細胞株（腫瘍細胞株を含む）、及びＮｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１を通常発現しないが、Ｎｏｔｃｈ２及び／又はＪａｇ１をコードする核酸でトランスフェクトされている細胞株を含む。上記のインビトロアッセイの何れかで使用のための本明細書中で提供される典型的な細胞株はＮＩＨ−３Ｔ３細胞を含む。
【０２２７】
一態様において、本発明の抗体は、インビボでの細胞の成長又は増殖を阻害するその能力について試験される。所定の実施態様において、その抗Ｊａｇ１抗体は、インビボでの腫瘍増殖を阻害するその能力について試験される。所定の実施態様において、その抗Ｎｏｔｃｈ２抗体は、インビボでの腫瘍増殖を阻害するその能力について試験される。インビボのモデル系、例えば異種移植モデルを、そうした試験に使用することができる。例示的な異種移植システムでは、ヒト腫瘍細胞は、適当に免疫が低下した非ヒト動物、例えば、無胸腺「ヌード」マウスに導入される。本発明の抗体は、動物に投与される。腫瘍増殖を阻害又は減少させる抗体の能力が測定される。上記の異種移植システムの特定の実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者由来の腫瘍細胞である。このような異種移植モデルはＯｎｃｏｔｅｓｔ社（フライブルク、ドイツ）から市販されている。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＣＬ／ＰＲＦ／５、Ｓｎｕ３８７、Ｓｎｕ３９８、Ｓｎｕ４２３、Ｓｎｕ４４９、Ｓｎｕ４７５、Ｈｕｈ−７、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＪＨＨ１、ＪＨＨ４、ＪＨＨ５及びＪＨＨ７などのヒト腫瘍細胞由来の細胞である。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、乳房脂肪パッドのような適当な部位に皮下注射又は移植によって、適切に免疫不全非ヒト動物に導入される。
【０２２８】
上記のアッセイの何れかが、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われ得ることが理解される。
【０２２９】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２３０】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002）；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０２３１】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
【０２３２】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性複合体を使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２３３】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０２３４】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０２３５】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体の何れかは、生物学的試料中のＮｏｔｃｈ２又はその断片、又はＪａｇ１又はその断片の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的試料は、肝細胞、肝臓がん細胞及び肝腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
【０２３６】
一実施態様において、診断又は検出の方法において使用のための抗Ｎｏｔｃｈ２抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＮｏｔｃｈ２の存在を検出する方法が提供される。所定の態様において、生物学的試料中のＮｏｔｃｈ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体のＮｏｔｃｈ２への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗Ｎｏｔｃｈ２抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗Ｎｏｔｃｈ２抗体とＮｏｔｃｈ２との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であり得る。一実施態様において、例えばＮｏｔｃｈ２、特に活性化Ｎｏｔｃｈ２が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、上述されるように、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体が抗Ｎｏｔｃｈ２抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
【０２３７】
一実施態様において、診断又は検出の方法において使用のための抗Ｊａｇ１抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＪａｇ１の存在を検出する方法が提供される。所定の態様において、生物学的試料中のＪａｇ１の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗Ｊａｇ１抗体のＪａｇ１への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗Ｊａｇ１抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗Ｊａｇ１抗体とＪａｇ１との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であり得る。一実施態様において、例えばＪａｇ１が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、上述されるように、抗Ｊａｇ１抗体が抗Ｊａｇ１抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
【０２３８】
本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害は、肝臓がん、具体的には、肝細胞がんを含む。
【０２３９】
所定の実施態様において、標識された抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇ１抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０２４０】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容可能な担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２４１】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２４２】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、更に、化学療法剤又は抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体を有する別の治療用抗体を提供することが望まれ得る。幾つかの実施態様において、製剤は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体及び抗Ｊａｇ１抗体を含有し得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２４３】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系に（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２４４】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。
【０２４５】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２４６】
Ｇ．治療用組成物
また、本明細書において提供されるのは、（ａ）容器；（ｂ）肝臓がんの治療のための抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体及び担体を含む容器内に含まれる組成物；及び（ｃ）肝臓がんの治療的処置又は診断的検出のための組成物の使用に言及する、容器に貼付されたラベル又は容器と共に含まれる添付文書を含む製造品である。
【０２４７】
本発明の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一の追加の治療剤と同時投与され得る。所定の実施態様において、付加的な治療剤は、化学療法剤である。
【０２４８】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療薬又は薬剤の投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。一実施態様において、抗Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇ１抗体の投与、及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２４９】
本発明の抗体（及び任意の付加的な治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２５０】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。これに関連した考慮因子としては、治療すべき具体的な障害、治療すべき具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２５１】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は一時的又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。初回より高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投薬レジメンは有用でありうる。この治療法の進行は、一般的な技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２５２】
上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体の代わりか又は抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２５３】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベル又は添付文書を含んでなる。例えば、（ａ）容器；（ｂ）肝臓がんの治療のための抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体及び担体を含む容器内に含まれる組成物；及び（ｃ）肝臓がんの治療的処置又は診断的検出のための組成物の使用に言及する、容器に貼付されたラベル又は容器と共に含まれる添付文書を含む製造品が提供される。
【０２５４】
好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達阻害剤、例えば、抗Ｎｏｔｃｈ２と抗体又は抗Ｊａｇ１抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、肝臓がんなどの肝臓の増殖性疾患の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が、肝臓がんなどの肝臓の増殖性疾患を治療することに用いることができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０２５５】
上記の製造品の何れかは、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇ１抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２５６】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２５７】
実施例１
肝臓がんのマウスモデル
ＦＶＢ−Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）は、以前に記載されるように、Ｒａｓ、ＡＫＴ及びのＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをコードするプラスミドの尾静脈水圧注射が施された（Ho et al., C., Hepatology 55:833-845 (2012)）。簡潔には、１０ｕｇのｐＴ３−ＣＡＧＧＳ−ＮＲａｓＶ１２、１０ｕｇのｐＴ３−ＥＦ１Ａ−ＡＫＴ、及び０．８ｕｇのＣＭＶ−ＳＢ（Ho et al., Hepatology 55:833-845 (2012); Yant et al., Mol. Cell. Biol. 24:9239-9247 (2004)）が、生理食塩溶液（０．９％ＮａＣｌ）で約２ｍｌに希釈され、５から８秒でＦＶＢ−Ｎマウスの外側尾静脈に注射された。
【０２５８】
肝臓がんの発生をモデル化するために、上記のようにかつ前述されたように、マウスは、発がん性のＲａｓ及び恒常的に活性なＡＫＴをコードするプラスミドを、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼとともに尾静脈水圧注射を施された（Ho et al., C., Hepatology 55:833-845 (2012)）。このモデルは、肝細胞の効率的かつ安定なトランスフェクションそしてトランスフェクトされたがん遺伝子の信頼性ある発現を可能とする。尾静脈水圧注射後５週間以内に、マウスは、多数の肝臓内腫瘍塊を発生した。正常な肝実質の多くは、腫瘍上皮によって取って代わり、これらのマウスの肝臓は、元のサイズの１０倍もの大きさに拡大した。以前の報告と一致して、これらのマウスで生じた腫瘍は、肝細胞がん（ＨＣＣ）と胆管がん（ＣＣ）を含む、肝臓の腫瘍型の広いスペクトルを含んでいた。腫瘍結節の約８０％が肝細胞がんの組織病理学的基準を満たし、２０％が胆管がんとしての識別のための組織病理学的基準を満たしていた。
【０２５９】
各肝臓は数十の腫瘍から構成され、その各々は、ＡＦＰ（図１Ａ）及びＥｐＣＡＭ（図１Ｃ）のような所定のマーカー又はマーカーの組み合わせを発現した。幾つかの腫瘍は、ＡＦＰとＥｐＣＡＭ（図１Ｂ）の両方を発現する。このモデルにおける腫瘍は、それらの、ＨＣＣ−及びＣＣ−特異的腫瘍マーカーの発現が変化していた（図１Ａ）。ＨＣＣに特異的なα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現は、腫瘍を有しない正常な肝臓における１％未満と比較して、腫瘍を有する肝臓において細胞の約１２．８％で検出された（図１Ｄ）。胆管がんのマーカーであるＥｐＣＡＭの発現は、このモデルではあまり優勢ではなく、腫瘍を有しない正常な肝臓における約１％と比較して、全ての肝細胞の約５％の平均で検出された。ＨＣＣ−及びＣＣ−特異的マーカーの両方を発現する腫瘍もまた観察された（図１Ｃ）。これらの組み合わされたＨＣＣ−ＣＣ（ｃＨＣＣ−ＣＣ）腫瘍は、特に侵襲性が強い臨床的特徴により特徴づけられ（American-Cancer-Society. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta: American Cancer Society）、肝臓前駆細胞と遺伝子発現パターンを共有している（Coulouarn et al., Carcinogenesis 33:1791-1796 (2012)）。
【０２６０】
実施例２
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の活性化
肝臓がんがＮｏｔｃｈ２活性化に関連付けられているかどうかを決定するために、免疫蛍光分析は、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスの肝臓に生じる腫瘍で実施された。肝臓組織を包埋し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．ＴＭ凍結培地（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標））中で凍結され、８μｍで凍結切片化された。切片は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、Ｎｏｔｃｈ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥｐＣＡＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＡＦＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓに対する一次抗体を使用して染色された。画像解析のために、免疫蛍光染色スライドはＡｒｉｏｌスライド走査システム（Ｌｅｉｃａ）を使用してスキャンされた。
【０２６１】
核Ｎｏｔｃｈ２の免疫蛍光検出によって決定される場合、高レベルのＮｏｔｃｈ２活性化が、ＡＦＰ＋／ＥｐＣＡＭ＋腫瘍で観察され（図１Ｅ）、それほどではないにせよＥｐＣＡＭ＋腫瘍で観察された（図１Ｅ、図１Ｆ）。Ｎｏｔｃｈ２活性化についてのそれほど顕著でない染色が、他の腫瘍細胞型で観察された（図１Ｅ）。
【０２６２】
実施例３
抗体の産生
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は肝臓がんの発生や増殖を、特に二重陽性腫瘍において、駆動するために重要であったかどうかを決定するために、実施例１に記載されるように、ＡＫＴ／Ｒａｓコンストラクトによる尾静脈水圧注射が施され、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体、抗Ｊａｇ１抗体、又はアイソタイプ対照（抗ブタクサ）抗体で処置された。
【０２６３】
ａ．抗Ｊａｇ１抗体を同定するためのライブラリー選別とスクリーニング
ヒトＩｇＧレパートリーの天然の多様性を模倣する、選択された相補性決定領域における合成多様性を有するヒトファージ抗体ライブラリーが、Ｍ１３バクテリオファージ粒子の表面上に示されたＦａｂ断片をパニングするために使用された。ヒトＪａｇ１−ＤＳＬ−ＥＧＦ１−４（図１０）がライブラリー選別のための抗原として使用された。Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートは、標的抗原（１０μｇの／ｍｌ）により４℃で一晩コーティングされ、ファージブロッキング緩衝液ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０）を用いて室温にて１時間ブロックした抗体ファージライブラリーＶＨ（Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004を参照）及びＶＨ／ＶＬ（Liang et al., JMB. 366: 815-829, 2007を参照）が別々に抗原プレートに加えられ、室温で一晩インキュベートされた。翌日、抗原でコーティングされたプレートは、ＰＢＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄され、結合したファージを３０分間、５０ｍＭのＨＣｌ及び５００ｍＭのＮａＣｌで溶出し、１ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ７．５）の等量で中和した。回収したファージを大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中で増幅させた。つづく選択ラウンドの間に、抗原被覆プレートとの抗体ファージのインキュベーションは、２〜３時間に減らし、プレート洗浄のストリンジェンシーは徐々に増加された。
【０２６４】
４ラウンドのパニングの後、かなりの濃縮が観察された。９６個のクローンが、ＶＨ及びＶＨ／Ｖｌライブラリー選別からそれぞれ採取され、それらがヒトＪａｇｇｅｄ１に特異的に結合しているかどうかを判断した。これらのクローンの可変領域は、固有な配列クローンを同定するためにＰＣＲで配列決定された。ファージ抗体の親和性は、スポット競合ＥＬＩＳＡを使用してランク付けされた。ファージ抗体のＩＣ５０値は、更に競合的ファージ結合ＥＬＩＳＡを用いて決定された。ヒトＪａｇｇｅｄ１（Ｊａｇｇｅｄ２でない）又はＪａｇｇｅｄ１とＪａｇｇｅｄ２の両方に特異的に結合する固有のファージ抗体が選択され、インビトロ細胞アッセイで評価のために、完全長のＩｇＧに再フォーマットされた。
【０２６５】
目的のクローンは、ヒトκ定常ドメインを含むｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＲＫ．ＬＰＧ３．ＨｕｍａｎＫａｐｐａ）、及び全長ヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードする発現ベクター（ｐＲＫ．ＬＰＧ４．ＨｕｍａｎＨＣ）のそれぞれに、個々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をクローニングすることによってＩｇＧに再フォーマットされた（Shields et al., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604）。次いで、抗体を哺乳動物ＣＨＯ細胞で一過性に発現させ、プロテインＡカラムで精製した。
【０２６６】
ｂ．ＶＨ又はＶＨＶＬライブラリーに由来するクローンの親和性向上のためのライブラリーの構築
全てのＣＤＲ−Ｌ３の位置に停止コドン（ＴＡＡ）を含み、かつＭ１３バクテリオファージの表面に一価のＦａｂを提示する、ファージミドｐＶ０３５０−２ｂ由来のファージミドｐＷ０７０３（Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)は、親和性成熟のためのＶＨライブラリーから目的のクローンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をグラフトするためのライブラリテンプレートとしての機能を果たした。ハード及びソフトランダム化の戦略が、親和性成熟のために使用された。ハードランダム化のために、天然のヒト抗体を模倣するように設計されたアミノ酸を使用して、３つの軽鎖ＣＤＲの選択された位置を含む一つの軽鎖ライブラリーがランダム化され、その設計されたＤＮＡの縮退は、 Lee et al. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)）に記載される通りであった。選択された位置で約５０％の突然変異率を導入されたソフトランダム化条件を達成するために、変異原性ＤＮＡは、野生型ヌクレオチドを好む塩基の７０−１０−１０−１０混合物を用いて合成された（Gallop et al., J.Med. Chem. 37:1233-1251 (1994)）。ソフトランダム化のために、ＣＤＲ−Ｌ３の９１−９６、ＣＤＲ−Ｈ１の３０−３３、３５、ＣＤＲ−Ｈ２の５０、５２、５３−５４，及び５６、ＣＤＲ−Ｈ３の９５−９８が標的とされ；ＣＤＲループの３つの異なる組み合わせ、Ｈ１／Ｌ３、Ｈ２／Ｌ３，及びＨ３／Ｌ３がソフトランダム化のために選択された。
【０２６７】
ＶＨＶＬライブラリから由来するクローンについて、各ＣＤＲに４つの終止コドン（ＴＡＡ）を含み、かつＭ１３バクテリオファージの表面に一価のＦａｂを提示するファージミドが個別に生成され、親和性成熟ライブラリーの構築のためのクンケル突然変異誘発のためのテンプレートとしての役割を果たした。ＣＤＲ−Ｌ３の多様性がナイーブライブラリーに組み込まれているため、ソフトランダム化戦略のみがＶＨＶＬライブラリーに由来するクローンのために使用された。ソフトランダム化条件を達成するために、ＣＤＲ−Ｌ１の２８−３１、ＣＤＲ−Ｌ２の５０、ＣＤＲ−Ｌ３の５３−５５、ＣＤＲ−Ｈの９１−９６、３０−３５、ＣＤＲ−Ｈ２の５０−５６、ＣＤＲ−Ｈ３の９５−１００が標的とされ；ＣＤＲループの４つの異なる組み合わせ、Ｈ１／Ｌ３＊、Ｈ２／Ｌ３＊、及びＨ３／Ｌ３＊及びＬ１／Ｌ２／Ｌ３＊（ここで、＊は、テンプレート上の停止コドンの位置を示す）がランダム化のために選択された。
【０２６８】
ｃ．親和性の向上を生み出すためのファージ選別戦略
親和性向上の選択のために、Ｊａｇ１抗原は、限定試薬条件下で最初にビオチン化された。ファージライブラリーは、ストリンジェンシーを増加させた、一ラウンドのプレート選別及び５ラウンドの溶液選別を受けた。プレート選別の最初のラウンドでは、１０ｕｇ／ｍｌの抗原がＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に最初に塗布され、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で予めブロックされた。ファージインプットのブロッキング緩衝液中の３ＯＤ／ｍｌが、３時間抗原プレートに対してインキュベートされた。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により１０回洗浄した。結合ファージを５０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌの１５０ｕｌ／ウェルで溶出し、続いて１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）の５０ｕｌ／ウェルにより中和し、滴定し、次のラウンドのために増殖された。続くラウンドにおいて、ファージライブラリーのパニングが溶液ファージ中で行われ、ここではファージライブラリーは、室温で２時間、１％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１００μｌの緩衝液中で１００ｎＭのビオチン化標的タンパク質（濃度は親クローンファージのＩＣ５０値に基づく）とインキュベートされた。混合物は１％のスーパーブロックで１０Ｘに更に希釈され、１００μｌ／ウェルをニュートラアビジンでコーティングされたウェル（１０μｇ／ｍｌ）に室温で３０分間穏やかに振盪しながら適用した。バックグラウンド結合を決定するために、ファージを含むコントロールウェルをニュートラアビジンでコーティングされたプレート上に捕獲した。その後、結合したファージは、洗浄し、溶出し、最初のラウンドのために説明したように増殖させた。溶液選別の更なる４回のラウンドが、選別ストリンジェンシーの増加とともに実行された。その最初の２ラウンドは、ビオチン化標的タンパク質濃度を１００ｎＭから０．１ｎＭに減少させることによる会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）選択のためであり、その最後の２回のラウンドは、室温で弱い結合剤を競合するため、過剰量の非ビオチン化標的タンパク質（３００から１０００倍以上）を加えることによる解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択のためのものであった。
【０２６９】
ｄ．ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ（単一スポットコンペティション）
コロニーが第６ラウンドのスクリーニングから採取された。コロニーを９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１×１０１０／ｍｌのＭ１３ＫＯ７を含む２ＹＴ培地の１５０μｌ／ウェル中で、３７℃で一晩増殖させた。同じプレートから、ＸＬ−１に感染した親のファージのコロニーをコントロールとして取り上げた。９６ウェルＮｕｎｃマキシソープ（登録商標）プレートを一晩４℃で、ＰＢＳ中のＪＡｇ１又はＪａｇ２（０．５μｇ／ｍｌ）のどちらかを１００μｌ／ウェルでコーティングした。プレートは１時間、ＰＢＳ２０中に１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１５０μｌでブロックした。
【０２７０】
３５μｌのファージ上清が、５ｎＭのＪａｇ１又はＪａｇ２を含むか又は含まない、７５μｌのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）緩衝液（０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で希釈され、Ｆプレート（ＮＵＮＣ）中で室温で１時間インキュベートさせた。混合物の９５μｌが、抗原でコーティングしたプレートへ並べて移された。プレートを穏やかに１５分間振とうし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１：２５００）中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより定量した。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により２０回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ基質の１００μｌ／ウェルをウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。反応を各ウェルに１００μｌの０．１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって停止させ、室温で５分間インキュベートさせた。各ウェルの黄色のＯ．Ｄ．（光学密度）を標準ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。親ファージのウェル（１００％）のＯＤ４５０ｎｍ減少（％）と比較して、５０％未満のＯＤ４５０ｎｍ減少（％）を有するクローンが配列解析用に選択された。それぞれの親クローンとの比較により、Ｊａｇ１に対する結合親和性（ファージＩＣ５０）を決定するファージ調製のために、ユニークなクローンが選択された。次いで、最も親和性が向上されたクローンは、抗体産生のためにヒトＩｇＧ１に再フォーマットされた。
【０２７１】
親抗体Ａ及び親和性成熟抗体Ａ−１及びＡ−２は、ヒト及びマウスＪａｇ１、具体的にはＪａｇ１ ＤＳＬ−ＥＧＦ１−４に特異的に結合したが、ヒト及びマウスＪａｇ２には結合しなかった。
【０２７２】
特定の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の生成及び特性評価は、以前に説明されている。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／０５９０２８を参照。
【０２７３】
実施例４
Ｎｏｔｃｈ２とシグナル伝達阻害剤による治療は、腫瘍量を減少させる
実施例１に記載したように、ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶマウスは、尾静脈水圧注射の日に開始する、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体（１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週）、抗Ｊａｇ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）又はアイソタイプ対照抗体により処置された。肝臓は画像化され、剖検時に標準的な実験室のバランス上で体重測定された。対照抗体で処置したマウスは、尾静脈水圧注射後５週間で重度の腫瘍量を生じ（図２Ａ）、その肝臓は、正常な非担腫瘍マウスでは１．２ｇから体重の５．８％から（図２Ｂ）、最大で約８．９ｇ又は体重のおよそ３１％にまで大きさが増加した。抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体のどちらかによる処置は、腫瘍発生を有意に阻害した（図２Ａ及びＢ；ｐ＜０．０００１、ｎ＞８）。抗Ｎｏｔｃｈ２抗体で処置されたマウスは、その肝臓は平均して５．１ｇ又は体重の１９．３％まで増殖し、有意に小さな腫瘍量を生じた（図２Ｂ）。抗Ｊａｇ１処置はさらに大きな効果があった。これらのマウスでは、最終的な肝臓重量は、平均すると４．３ｇ又は体重の１５．８％であった（図２Ｂ）。
【０２７４】
免疫蛍光による核のＮｏｔｃｈ２の検出によって決定されるように、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達がＥｐＣＡＭ−腫瘍に比べてより高度に活性化される、腫瘍のＥｐＣＡＭ＋及びＡＦＰ＋／ＥｐＣＡＭ＋サブセット（図１Ｅ）は、Ｎｏｔｃｈ２経路阻害に対して非常に感受性であった。ＥｐＣＡＭ＋腫瘍（ＡＦＰ−／ＥｐＣＡＭ＋及びＡＦＰ＋／ＥｐＣＡＭ＋腫瘍）は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体又は抗Ｊａｇ１抗体の何れかによる処置後に面積が有意に減少した（図３Ａ、図３Ｂ）。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達は、ＡＦＰ＋／ＥｐＣＡＭ−腫瘍において高度には活性化されず（図１Ｅ）、これらの腫瘍はＮｏｔｃｈ２経路阻害の影響を受けていない可能性があることを示唆している。しかし、予想に反して、抗Ｎｏｔｃｈ２処置及び抗Ｊａｇ１処置の双方ともにＡＦＰ＋腫瘍面積の有意な低下へと導いた（図３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体処置は、肝臓がんのこのモデルにおいて肝臓腫瘍の広範囲の発生をブロックすることを示している。抗Ｎｏｔｃｈ２及び抗Ｊａｇ１抗体による処置の成功は、抗Ｎｏｔｃｈ２及び抗Ｊａｇ１抗体処置後のＡＦＰ及びＥｐＣＡＭ染色の有意な減少によって示されるように、ＨＣＣ様及び胆管がん様腫瘍の両方を含む全体的な腫瘍量の減少をもたらした。
【０２７５】
実施例５
Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３の阻害
Ｊａｇ１の阻害はＮｏｔｃｈ２の阻害と同様の効果があり、Ｊａｇ１とＮｏｔｃｈ２は同じ経路で作用していること、具体的には、Ｊａｇ１は腫瘍形成を支える上でのＮｏｔｃｈ２に対するリガンドとして作用することを示唆している。他のＮｏｔｃｈ受容体の阻害もまた、肝臓がんの形成や増殖を減少させることができるかどうかを決定するために、実施例１に記載されるように、マウスは、Ｒａｓ／ＡＫＴコンストラクトによる尾静脈水圧注射が施され、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）又は抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体（３０ｍｇ／ｋｇ、３回／週）により処置された。抗Ｎｏｔｃｈ１抗体による処置は、アイソタイプ対照と比較して、Ｒａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶマウスの肝臓重量を減少させたが、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体による処置は、肝臓重量には有意な影響を与えなかった（図２Ｄ；ｐ＜０．０２、ｎ≧７）。抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１処置は、ＥｐＣＡＭの転写物のレベルを減少させたが、（図３Ｅ、ｐ＜０．００５、ｎ≧７）、Ｎｏｔｃｈ１の阻害は、肝臓でのＥｐＣＡＭ陽性腫瘍の断面積を増加させ（図３Ｄ、図３Ｅ、ｐ＜０．０２、ｎ≧７）、胆管がんマーカーのサイトケラチン１９の発現を増加させた（ＣＫ１９；図３Ｆ）。抗Ｎｏｔｃｈ１又は抗Ｎｏｔｃｈ３に対するアンタゴニスト抗体を用いた処置は、肝前駆細胞及び前駆細胞様腫瘍マーカー並びに胆管がん様腫瘍マーカーである、Ｓｏｘ９の発現に影響を及ぼさなかったが、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体による処置は、Ｓｏｘ９を、ｍＲＮＡ（図３Ｇ）及びタンパク質（図３Ｈ）のレベルの両方で、劇的に減少させた。
【０２７６】
したがって、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体又は抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を用いた処置は、有意には腫瘍量を減少させなかった。実際には、Ｎｏｔｃｈ１の阻害は、ＥｐＣＡＭ＋胆管がん様腫瘍によって占有される数と断面積の増加を引き起こした。これらの結果は、抗Ｎｏｔｃｈ１処置後の増加した胆管がん様病変の観察とあわせて、肝臓がんにおけるＮｏｔｃｈ２とＮｏｔｃｈ１において反対の役割があるという結論をサポートしていた。
【０２７７】
実施例６
抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体処置は、Ｎｏｔｃｈ２活性化を減少させる
免疫組織化学的分析のために、組織を、中性緩衝ホルマリン１０％で固定し、パラフィンに包埋し、切片化した。４μｍの厚さのホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織が染色に供された。Ｊａｇ１ ＩＨＣ染色については、全工程は、Ｖｅｎｔａｎａ検出試薬（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いてＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ自動染色機で行った。組織切片をＥＺＰｒｅｐ溶液中で脱パラフィン化し、前処理は、標準的なインキュベーション時間を用いるＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ １を用いて行った。組織切片は、その後、０．２μｇ／ｍｌのヤギポリクローナル抗Ｊａｇ１一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ；Ｃａｔ＃ｓｃ−６０１１）と共に室温で３２分間インキュベートされ、その後、７．５μｇ／ｍｌのビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と室温で３２分間インキュベートされた。一次及び二次抗体の両方とも、３％のＢＳＡ中の１０％正常ヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で希釈された。切片は、その後、室温で１６分間、抗ウサギＯｍｎｉＭＡＰ−ＨＲＰ試薬とともにインキュベートされた。
【０２７８】
Ｎｏｔｃｈ２ ＩＨＣについては、全工程は、Ｖｅｎｔａｎａ検出試薬（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を利用してＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ Ｐｌａｔｆｏｒｍで行った。切片をＥＺＰｒｅｐ溶液中で脱パラフィン化し、前処理は、標準的なインキュベーション時間を用いるＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ １を用いて達成された。次いで、切片は、８μｇ／ｍｌのウサギモノクローナル抗Ｎｏｔｃｈ２一次抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｄ７６Ａ６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）とともに３７℃で６０分間インキュベートされ、その後、抗ウサギＯＭＮＩＭＡＰ−ＨＲＰ試薬とともに３２分間インキュベートされた。
【０２７９】
Ｈｅｓ１については、全工程は、ＤＡＫＯ洗浄緩衝液とＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いてＤａｋｏ自動染色機で実施された。切片を脱パラフィンし、再水和し、２０分間９９℃でＤＡＫＯＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎとインキュベートし、４分間、３％のＨ２Ｏ２でクエンチされ、その後、アビジンビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：ｃａｔ＃ｓｐ−２００１）でブロックされた。切片は、１ｕｇ／ｍｌの抗ＨＥＳ−１（ｃｌｏｎｅ ＮＭ１；ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と室温で４５分間、次いで、５ｕｇ／ｍｌの二次抗体Ｂｔ−ＤＫ抗ラット（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と１５分間インキュベートされ、その後、増幅希釈液中でビオチン化チラミドとともに３分間インキュベートされた。切片はその後、発色性の検出と対比染色のためにＤＡＢ及びヘマトキシリンＩＩ試薬と共にインキュベートされた。スライドを脱水しキシレンで透徹し、カバーガラスで覆った。全ての切片はその後、発色性の検出と対比染色のためにＤＡＢ及びヘマトキシリンＩＩ試薬と共にインキュベートされた。スライドを脱水しキシレンで透徹し、カバーガラスで覆った。画像解析のために、免疫組織化学スライドはＮａｎｏｚｏｏｍｅｒスライド走査システム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用してスキャンされた。
【０２８０】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴＰＣＲ）が、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えた７９００ ＨＴ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる一ステップ反応に対して、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて行われた。使用されるプローブは、Ｎｏｔｃｈ１（Ｍｍ００４３５２４５＿ｍ１、Ｈｓ０１０６２０１４＿ｍ１）、Ｎｏｔｃｈ２（Ｍｍ００８０３０７７＿ｍ１、Ｈｓ０１０５０７１９＿ｍ１）、Ｎｏｔｃｈ３（Ｍｍ００４３５２７０＿ｍ１、Ｈｓ０１１２８５４１＿ｍ１）、Ｎｏｔｃｈ４（Ｍｍ００４４０５２５）、Ｊａｇ１（Ｍｍ００４９６９０２＿ｍ１）、Ｊａｇ２（Ｍｍ０１３２５６２９＿ｍ１）、ＤＬＬ１（Ｍｍ０１２７９２６９＿ｍ１）、ＤＬＬ３（Ｍｍ００４３２８５４＿ｍ１）、ＤＬＬ４（Ｍｍ００４４４６１９）、Ｈｅｙ１（Ｍｍ００５１６５５５＿ｍ１）、ＣＫ１９（Ｍｍ００４９２９８０＿ｍ１）及びＳｏｘ９（Ｍｍ００４４８８４０＿ｍ１）であった。
【０２８１】
腫瘍形成に対するＮｏｔｃｈ２及びＪａｇ１の阻害のより広範な影響に合わせて、免疫蛍光法による核Ｎｏｔｃｈ２タンパク質の検出によって決定されるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達は、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１の何れかで処理した後に担腫瘍肝臓全体にわたって減少した（図４Ａ；ｐ＜０．０５、ｎ≧７）。この減少は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定されるＮｏｔｃｈ２発現の全体的なレベルが変化しなかったため、Ｎｏｔｃｈ２タンパク質の活性化に対する直接的な影響によるものであるように見えた。Ｎｏｔｃｈ２活性化を遮断する抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体処置と一致して、免疫染色は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達経路の下流の転写標的であるＨｅｓ１において減少した。対照で処置されたＲａｓ／ＡＫＴ ＨＴＶ肝臓は、高レベルのＨｅｓ１染色を示した（図４Ｄ）。しかし、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体による処置は、抗体で処置された肝臓におけるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の効果的遮断と一致して、Ｈｅｓ１染色を有意に減少させた（図４Ｃ、図４Ｄ、ｐ≦０．０００１、ｎ＞１０）。Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達が遮断されたことを確認し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｎｏｔｃｈ経路標的遺伝子ＨｅｙＬはまた、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体のどちらかの処置により非常に減少することを明らかにした（図４Ｅ、ｐ＜０．０００１、ｎ＞７）。
【０２８２】
それぞれの場合において、抗Ｊａｇ１抗体処置は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体処置と同じ効果を有しており、Ｊａｇ１は、肝臓がんの形成と増殖を維持する点において、Ｎｏｔｃｈ２を介して、即ち、Ｎｏｔｃｈ２のリガンドとして、主に作用しているとする結論を更に支持している。まとめると、これらの結果は、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体のどちらかによる処置は、Ｎｏｔｃｈ２活性化の減少をもたらしたことを示している。
【０２８３】
実施例７
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路成分の発現に対するＮｏｔｃｈ阻害抗体の効果
ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶを施されたマウスは、Ｎｏｔｃｈ１（１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）、Ｎｏｔｃｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、Ｎｏｔｃｈ３（３０ｍｇ／ｋｇ、３回／週）、又はＪａｇ１（１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）に対するアンタゴニスト抗体で処置された。抗ブタクサ抗体が、陰性対照として３０ｍｇ／ｋｇで３回／週で投与された。５週間後、肝臓が採取され、定量的リアルタイムＰＣＲが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分の転写物に対する処置の効果を決定するために、単離されたＲＮＡについて行われた。個々のＮｏｔｃｈファミリー受容体の阻害は、他のＮｏｔｃｈ受容体ファミリーメンバーの発現の代償性増加をもたらさなかった。
【０２８４】
上述したように、個々のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、及びＮｏｔｃｈ３の阻害は、肝腫瘍発生のＡＫＴ／Ｒａｓモデルにおいて異なる効果を有していた。この結果は、個々のＮｏｔｃｈ受容体は、肝臓がんにおいては必ずしも互いに補わないことを示唆している。Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーメンバーの発現に対する個々のＮｏｔｃｈ受容体の阻害効果及びリガンドの効果を決定するために、発現が、抗Ｎｏｔｃｈ１、抗Ｎｏｔｃｈ２、抗Ｎｏｔｃｈ３、抗Ｊａｇ１抗体又はアイソタイプ対照抗体の何れかを用いて、実施例１に記載したように、ＡＫＴ／Ｒａｓ構築物によるマウスの注射処置後に評価された。個々のＮｏｔｃｈ受容体の何れかについての受容体転写物発現の増加は、３つの阻害抗体の何れかによる阻害の際には認められなかった（図５Ａ−Ｃ）。逆に、特異的阻害抗体によるＮｏｔｃｈ２阻害は、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４の両方の発現レベルの有意な減少をもたらした（ｐ＜０．０５、ｎ≧７）。また、Ｎｏｔｃｈ３の阻害は、それ自身の発現の減少をもたらした（ｐ＜０．００５、ｎ≧７）。これは、Ｎｏｔｃｈ２とＮｏｔｃｈ３の両方がＮｏｔｃｈ３の転写を制御するという以前の観察と一致している（Wang et al., PLoS ONE 7:e37365 (2012); Liu et al., Circulation Research 107:860-870 (2010)）。アンタゴニスト抗体による処置の効果は、ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇ１とＤＬＬ１の発現に関していっそう大きかった。Ｎｏｔｃｈ２阻害は、恐らくはこれらの肝臓におけるＪａｇ１を発現する胆管がん及び前駆細胞様腫瘍の減少の結果として、Ｊａｇ１発現の有意な減少をもたらした（図５Ｅ）。Ｊａｇ１阻害は、同様の効果を有しており、Ｊａｇ１とＮｏｔｃｈ２はこの腫瘍モデルで一緒に機能していることが確認された。対照的に、Ｎｏｔｃｈ１の阻害は、ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇ２及びＤＬＬ１の発現を有意に増加させた（図５Ｆ、図５Ｇ）。この結果は、少なくとも部分的に、抗Ｎｏｔｃｈ１アンタゴニスト抗体で処置された肝臓内の胆管がん様病変において観察された増加を説明するのに役立つ可能性がある。
【０２８５】
要約すると、Ｎｏｔｃｈ２阻害の際に、他のＮｏｔｃｈ受容体の発現の代償性増加は観察されず、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体による処置の成功は、代替的なＮｏｔｃｈシグナル伝達成分の上方制御を介した耐性を生じないことを示唆している。実際には、Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇ１アンタゴニスト抗体の何れかによる処置は、Ｊａｇ１リガンド発現の減少を実際に生じ、抗Ｎｏｔｃｈ２による処置はＮｏｔｃｈ３発現の減少を生じた。
【０２８６】
実施例８
抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体処置は、前駆細胞様及び胆管がん様の肝腫瘍増殖を遮断する。
Ｎｏｔｃｈ２阻害が腫瘍量の減少へと導くメカニズムに取り組むために、ハイスループットＲＮＡ配列分析を行った。ＡＫＴ／Ｒａｓ ＨＴＶを施されたマウスは、Ｎｏｔｃｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、Ｊａｇ１（１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）、又は抗ブタクサ対照（３０ｍｇ／ｋｇ、１回／週）に対するアンタゴニスト抗体で処置された。５週間後、肝臓を採取し、ＲＮＡは、ハイスループット配列決定に供された。
【０２８７】
前駆細胞及び胆管がん様ＨＣＣ発現シグネチャー遺伝子の発現は、抗Ｎｏｔｃｈ２及び抗Ｊａｇ１抗体処置後に、担腫瘍肝臓において下方制御された。ＥｐＣＡＭ及びＣＫ１９の発現は、ＣＤ１３３／Ｐｒｏｍ１（図６Ａ、データ非表示）及びＳｐｐ１（図６Ｂ）（双方とも肝前駆細胞のマーカーである）の発現が下方制御されたように有意に下方制御された。ＦｏｘＭ１は、以前に、一般的に（Xia et al., Carcinogenesis 33:2250-2259 (2012)）、そして特に肝臓がんのＲａｓ／Ａｋｔモデルにおいて特に（Ho et al., Hepatology 55:833-845 (2012)）、ＨＣＣの増殖に役割を果たすことが示されているので、我々はその発現を調べ、Ｎｏｔｃｈ２及びＪｇａ１の両方の阻害が、ＦｏｘＭ１発現の減少を導くことを示すことができた（図６Ｃ）。更に、ＦｏｘＭ１標的遺伝子（Laoukili et al., Nat Cell Biol 7:126-136 (2005)）、ＰＬＫ１（図６Ｄ）、Ｃｃｎｂ１（図６Ｅ）、及びＡｕｒｋｂ（図６Ｆ）はまた、対照と比較して、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体の何れかで処置した担腫瘍肝臓で減少した。Ｗｎｔシグナル伝達のマーカーはＮｏｔｃｈ２又はＪａｇ１阻害により増加した。具体的には、Ｗｎｔ−経路標的遺伝子のＡｘｉｎ２が増加したように（図６Ｈ）、Ｗｎｔ２リガンドは増加した（図６Ｇ）。また、最終的に分化した肝細胞のサブセットのマーカーであるグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｌ；図６Ｉ）の発現は、対照と比較して、抗Ｎｏｔｃｈ２又は抗Ｊａｇ１抗体の何れかで処置した担腫瘍肝臓で増加した。これらの観察は、Ｎｏｔｃｈ２阻害が、ＦｏｘＭ１の下方制御を介した腫瘍細胞増殖の減少を誘導し、かつＷｎｔシグナル伝達の誘導を介した分化した肝細胞運命を誘導することと一致している（Boulter et al., Nat. Med. 18(4):572 (2012)）。肝臓がんにおけるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害は、肝細胞への腫瘍細胞の最終分化に影響を与えることが可能である。この仮説と一致して、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１の阻害は最終的に分化した肝細胞の転写マーカー並びに前駆細胞からの肝細胞の分化に重要であることが知られているＷｎｔシグナル伝達の増加につながった（Boulter et al., Nat. Med. 18(4):572 (2012)）。Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１の阻害はまた、増殖を減少させ、腫瘍細胞死を増加させることによって機能することができる。
【０２８８】
実施例９
ヒト肝細胞がんにおけるＮｏｔｃｈ２の発現と活性化
ヒトＨＣＣ細胞株及び原発性ヒトＨＣＣ腫瘍は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達成分の発現について、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して分析された。ＨＣＣ細胞株のＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＣＬ／ＰＲＦ／５、Ｓｎｕ３８７、Ｓｎｕ３９８、Ｓｎｕ４２３、Ｓｎｕ４４９、Ｓｎｕ４７５は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。ＨＣＣ細胞株のＨｕｈ−７、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＪＨＨ１、ＪＨＨ４、ＪＨＨ５、ＪＨＨ７はＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から入手した。全染色した組織切片は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアを用いて分析された。
【０２８９】
Ｎｏｔｃｈ２は、１６の培養ＨＣＣ細胞株のうち１５において、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ３の何れかよりも高いレベルで発現された（図７Ａ）。多くの場合、Ｎｏｔｃｈ２の発現は、発現が参照遺伝子に対して正規化された場合、１０倍以上、他のＮｏｔｃｈファミリーメンバーの発現を上回っていた（ＲＰＬ１９、図７Ａ）。この結果と一致して、Ｎｏｔｃｈ２の顕著な発現が、ＩＨＣによって決定される７８のヒトの一次ＨＣＣ試料のうち２８において（３７％）認められた。２８のヒト一次ＨＣＣ試料の１５（５４％）において、Ｎｏｔｃｈ２は、Ｎｏｔｃｈ２経路の活性化を示す様々な程度の核局在化を示した（図７Ｂ）。ＩＨＣにより評価されるＪａｇ１発現は、調べられた５９のヒト一次ＨＣＣ試料のうち３４で観察された（図７Ｂ）。Ｎｏｔｃｈ２とＪａｇ１の両方で評価された５６のヒト一次ＨＣＣ試料のうち、１５（２７％）が、Ｎｏｔｃｈ２及びＪａｇ１の両方の発現を有することが見いだされた。重複発現を有する１５の組織のうち１１（７３％）が、活性なＮｏｔｃｈ２シグナル伝達を示すＮｏｔｃｈ２の核局在化をある程度示した。
【０２９０】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
0006527132.tif 000006
【図２Ｂ−Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ−Ｈ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｆ】
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【図５Ｇ−Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｄ】
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【図６Ｆ−Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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