(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダプトマイシン（daptomycin）の生産能を有する、受託番号がＫＣＴＣ１２２６７ＢＰであるストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）菌株。
【請求項２】
前記菌株が、
（１）形態学的特性：連鎖状に配列された円筒状に近い楕円形、胞子形成、グラム陽性、濃いピンクグレーのコロニー（colony）の形成；
（２）生理学的特性：チロシン加水分解酵素（tyrosine  hydrolase）−、ウレアーゼ（urease）＋、アミラーゼ（amylase）＋、カゼイナーゼ（caseinase）＋、ニトラート還元酵素（nitrate  reductase）＋、ゼラチナーゼ（gelatinase）＋、８．５％のＮａＣｌ抵抗性＋、メラニン色素形成の有無； ＩＳＰ−６培地（−）、ＩＳＰ−７培地（＋）；  及び
（３）炭素源利用性：グルコース＋、キシロース＋、フルクトース＋、イノシトール−、ラクトース−、スクロース＋、マンニトール＋、アラビノース−、ラフィノース＋、ガラクトース＋、マンノース＋；の菌学的特性を有することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
請求項１の菌株を培養する段階を含む、ダプトマイシンの生産方法。
【請求項４】
前記方法が、前記培養された菌株またはその培養物からダプトマイシンを得る段階をさらに含む、請求項３に記載の生産方法。
【請求項５】
前記培養が、斜面培養、種培養及び本培養の順に行われる、請求項３に記載の生産方法。
【請求項６】
前記斜面培養が、大豆粉５〜１５ｇ／Ｌ、酵母エキス２〜６ｇ／Ｌ、グルコース２〜６ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム０．５〜３．５ｇ／Ｌ、及び寒天１５〜２０ｇ／Ｌを含有する培地で行われ、
前記種培養が、トリプチケースソイブロス２０〜４０ｇ／Ｌ、デキストリン２０〜５０ｇ／Ｌ、及び酵母エキス１〜５ｇ／Ｌを含有する培地で行われ、
前記本培養が、糖蜜５〜１０ｇ／Ｌ、グルコース５〜１５ｇ／Ｌ、デキストリン５０〜１５０ｇ／Ｌ、酵母エキス５〜１５ｇ／Ｌ、グルテン２〜１０ｇ／Ｌ及び無機塩類０．５〜５ｇ／Ｌを含有する培地において、種菌接種量０．１〜２％、温度２６〜３４℃、ｐＨ５．５〜７．５、攪拌速度１５０〜４００ｒｐｍ及び通気条件０．５〜１．５ｖｖｍの条件で培養する、請求項５に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダプトマイシン（daptomycin）生産能が増進した、新規なストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）菌株及びこれを用いたダプトマイシンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に細菌感染の発生による薬物の誤用・乱用と、それに伴う亜種細菌の急激な増加とよって、既存の薬物を代替する薬効性に優れた新規クラス（class）の抗生物質の開発に対する関心が増大している。そのうち、ダプトマイシン（daptomycin）は、土壌放線菌であるストレプトマイセス・フィラメントサス、別称ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Streptomyces  roseosporus）と呼ばれる菌の培養において生成される二次代謝産物であり、環状リポペプチド物質ある。ダプトマイシンは、１３個のアミノ酸とトリプトファンＮ末端にデカン酸が側鎖で連結された構造を有する。現在グラム陽性菌の複合皮膚及び皮膚組織感染症（complicated  skin  and  skin  structure  infections、cSSSI）の治療薬として販売承認されており、環状リポペプチド抗生物質のユニークな構造でグラム陽性細菌の細胞膜に付着して脱分極化作用を起こし、殺菌効果に優れ、速効性に優れるが、現在全量を輸入に依存しているのが実情である。
【０００３】
また、通常、自然から分離される野生型菌株は、生産性が低く、類似した物質を複合的に生産する場合が多く、目的抗生物質の生産に適しないため、これを高収率で生産する方法の確保が要求される。これに対し、ダプトマイシン生産能を増加させるためにストレプトマイセス・フィラメントサリボゾーム工学（ribosome  engineering）によってダプトマイシン生産能が増進された菌株を開発することができることが報告されているが（非特許文献１）、この方法による場合でも、親菌株に比べてダプトマイシン生産能は３０％程度のみが増進された菌株を開発できるにすぎないため、ダプトマイシン生産能が画期的に向上した菌株の開発が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biomed  Res  Int.  2013、2013、  Article  ID  479742
【非特許文献２】Methuen  Handbook  of  Colour、Methuen、London、1978
【非特許文献３】Pridham,  T.G  and  D.  Gotrlib,,  J.  Bacteriol.,  56,  pp.  107-114,  1948
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ダプトマイシンの生産性が野生型に比べて増進された菌株を開発するために鋭意努力した結果、ダプトマイシンの生産性が野生型菌株に比べて１２倍程度増進された新規なストレプトマイセス・フィラメントサス変異株を開発し、前記菌株を用いたダプトマイシン生産方法を最適化して商業的にダプトマイシンを大量生産することができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの目的は、ダプトマイシン（daptomycin）の生産能を有する、受託番号がkctc12267bpであるストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）菌株を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記菌株のダプトマイシン生産用途を提供することにある。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、前記菌株を用いてダプトマイシンを生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る変異株ストレプトマイセス・フィラメントサス（Streptomyces  filamentosus）ＤＫＢ１０８は、ダプトマイシン生産能が大幅に向上し、大型タンク発酵にスケールアップ（scale-up）する時、医薬品として使用可能な精製ダプトマイシンを提供することができ、独占的構造によって全量輸入されている国内外のグラム陽性耐性菌株に対する医薬品市場にその波及効果が非常に大きいものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＤＫＢ１０８を形態学的に観察した写真を示したものである。
【図２】本発明のＤＫＢ１０８を最適化された培地及び温度で培養した結果、培養時間による菌体量（ＰＭＶ）、ダプトマイシン濃度及びｐＨの変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一つの態様は、ダプトマイシン（daptomycin）の生産能を有する、受託番号がＫＣＴＣ１２２６７ＢＰであるストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）菌株を提供する。
【００１２】
本発明において、用語「ダプトマイシン」とは、グラム陽性菌によって引き起こされる、全身性であって、生命を脅かす感染症の治療に使用されるリポペプチド抗生物質を意味する。前記ダプトマイシンは、Ａ−２１９７８Ｃ０型の抗生物質においてペプチド部分と共有結合された脂質がデカノイル側鎖からなる、下記化学式（１）の構造を有し、土壌腐生性のストレプトマイセス・フィラメントサス菌から発見される自然に生成される化合物の一種である。また、ダプトマイシンは、グラム陽性菌の複合皮膚及び皮膚組織感染症（cSSSI）の治療剤としても販売承認された化合物であり、その安全性が証明された抗生物質化合物である。
【００１３】
【化１】
0006527521.tif 000002
【００１４】
前記ダプトマイシンは、グラム陽性菌に対する抗生物質であり、その殺菌効果に優れるが、これを高収率で生産することが困難であった。そこで、本発明では、ダプトマイシン生産能を有するけれども、その生産性が低いストレプトマイセス・フィラメントサスＡＴＣＣ  ３１５６８を親菌株とし、紫外線照射及びＮＴＧ突然変異の方法を用いて、新規なストレプトマイセス・フィラメントサス変異株を製造した。抗生物質ダプトマイシン生成能の確認は指示菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）に対する生育阻止環の大きさの測定方法、即ち、寒天アガーウェル（Agar  well）の方法に微生物培養液を適用した後、その効果を確認し、優れた変異株を選別した。また、選別された変異株に対する力価分布度を継続的に測定し、優れた変異株が自然変異による生産性の退歩を遮断し、安定性が確保された変異株は再び前記のような人工突然変異の方法を繰り返して行って、持続的に生産性が向上した変異株を選抜することができた。本発明者らは、このように選抜された菌株をＤＫＢ１０８と命名し、これを２０１２年８月２０日付でブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国生命工学研究院に寄託して受託番号ＫＣＴＣ１２２６７ＢＰが与えられ（実施例１）。前記ＤＫＢ１０８は、親菌株であるＡＴＣＣ  ３１５６８に比べてダプトマイシン生産能が１２倍程度増進された菌株であり、２．７５ｇ／Ｌのダプトマイシン生産濃度を示す効果を有するだけでなく、複数回の継代培養によってもダプトマイシンの生産能が高く、安定した特徴を有する（実施例３）。また、これをタンク発酵した時、培養２０９時間後にも生存微生物の数が大幅に変化しないながらも２．７５ｇ／Ｌの生産濃度を示す結果を示すため（実施例５）、本発明のＤＫＢ１０８菌株は、ダプトマイシンの商業生産に有用に使用することができる。また、本発明において、前記ＤＫＢ１０８とＫＣＴＣ１２２６７ＢＰとは、互いに混用されてもよい。
【００１５】
また、前記ＤＫＢ１０８菌株は、（１）形態学的特性：連鎖状に配列された円筒状に近い楕円形、胞子形成、グラム陽性、濃いピンクグレーのコロニー（colony）の形成； （２）生理学的特性：チロシン加水分解酵素（tyrosine  hydrolase）−、ウレアーゼ（urease）＋、アミラーゼ（amylase）＋、カゼイナーゼ（caseinase）＋、ニトラート還元酵素（nitrate  reductase）＋、ゼラチナーゼ（gelatinase）＋、８．５％のＮａＣｌ抵抗性＋、メラニン色素形成の有無；  ＩＳＰ−６培地（−）、ＩＳＰ−７培地（＋）；  及び（３）炭素源利用性：グルコース＋、キシロース＋、フルクトース＋、イノシトール−、ラクトース−、スクロース＋、マンニトール＋、アラビノース−、ラフィノース＋、ガラクトース＋、マンノース＋；の菌学的特性を有する。
【００１６】
具体的には、前記ＤＫＢ１０８菌株は、親菌株と同様に連鎖状に配列された円筒状に近い楕円形の菌糸形を有し、胞子を形成し、好気性であるが、親菌株に比べてコロニーの色がより濃いピンクグレー色を表す、形態学的特徴を有する。
【００１７】
また、親菌株と同様にチロシン加水分解酵素は有さず、ウレアーゼ、アミラーゼ、カゼイナーゼ、アミラーゼ、ニトラート還元酵素及びゼラチナーゼなどの酵素を生成するが、８．５％のＮａＣｌで生存しない親菌株とは異なり、８．５％のＮａＣｌでも生存する生理学的特性を示し、ＩＳＰ−６培地では親菌株と同様にメラニン陰性であるが、ＩＳＰ−７培地では親菌株の明るい紫色の色素とは異なり、濃い紫色の水溶性色素を形成するという差異を示す。
【００１８】
特に、本発明のＤＫＢ１０８菌株は、炭素源利用パターンにおいて、グルコース、キシロース、フルクトース、スクロース、マンニトール、ラフィノース、ガラクトース及びマンノースを炭素源として用いるが、イノシトール、ラクトース及びアラビノースの場合には、炭素源として利用できないという結果を示し、ラクトースを炭素源として利用する親菌株とは炭素源利用パターンで多少の差を示した。即ち、本発明のＤＫＢ１０８菌株は、親菌株とコロニーの色、塩化ナトリウム耐性、炭素源利用性などで差異を有する。
【００１９】
本発明の他の一つの態様は、前記受託番号がＫＣＴＣ１２２６７ＢＰであるストレプトマイセス・フィラメントサス菌株のダプトマイシン生産の用途を提供する。
【００２０】
前記受託番号がＫＣＴＣ１２２６７ＢＰであるストレプトマイセス・フィラメントサス菌株はダプトマイシンの生産能を有するため、ダプトマイシンを生産するのに用いることができる。
【００２１】
本発明の他の一つの態様は、前記受託番号がＫＣＴＣ１２２６７ＢＰであるストレプトマイセス・フィラメントサス菌株を培養する段階を含むダプトマイシンの生産方法を提供する。
【００２２】
また、前記方法は、前記菌株を培養する段階； 及び前記方法は、前記培養された菌株またはその培養物からダプトマイシンを得る段階を含むものであってもよい。
【００２３】
本発明において、用語「培養」とは、微生物を人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明のＤＫＢ１０８菌株を成長させるために使用された培地は、当業界で使用される様々な微生物培地のいずれかであってもよい。しかし、生産における経済性、最適収率、及び発酵生成物から報告された１２種以上の類縁物質と目的産物との分離を容易にするためには、特定の培地を使用して生産に適した培地組成の最適化が必然的である。ダプトマイシンを生産するための大型タンク発酵では、グルコース、キシロース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンノース、綿実粕、大豆粉、トウモロコシ浸漬液、酵母エキス、乾燥酵母、オレイン酸メチル、デカン酸、グリセロール、グルテンなどの培地を使用することができるが、炭素源としては、デキストリン、糖蜜、グルコースを混合して使用するのが好ましい。窒素源としては、乾燥酵母、大豆粉、大豆加水分解物、綿実粕、トウモロコシ浸漬液、グルテン、そしてＬ−アスパラギンのようなアミノ酸なども有用であるが、好ましいものは酵母エキスである。例えば、窒素源として使用される酵母エキスの場合、これと類似した乾燥酵母で代替する場合には、ダプトマイシンの主な類縁物質の生成が多くなり、目的産物の分離が困難になり得る。
【００２４】
以下、本発明における変異株ＤＫＢ１０８のダプトマイシン生産を極大化するための最適培地条件と培養条件は、以下の通りである。
【００２５】
本発明のダプトマイシンの生産方法において、前記培養はＤＫＢ１０８菌株が効果的に生育できるように斜面培養、種培養及び本培養の順に行うことができる。保管された菌の場合、斜面培養及び種培養で保管された菌を活性化させた後、本培養に進めることが望ましい。
【００２６】
前記斜面培養は、培地を斜めに固めて使用する培養法であり、前記斜面培養に使用される培地は、大豆粉５〜１５ｇ／Ｌ、酵母エキス２〜６ｇ／Ｌ、グルコース２〜６ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム０．５〜３．５  ｇ／Ｌ、及び寒天１５〜２０ｇ／Ｌを含有するものであってもよい。
【００２７】
前記種培養は、大量の培地を使用して微生物を培養するとき、種菌接種のために少量の培養液を加えるが、この種菌培養液の培養を言うものであり、本発明における前記種培養は、トリプチケースソイブロス２０〜４０ｇ／Ｌ、デキストリン２０〜５０ｇ／Ｌ、及び酵母エキス１〜５ｇ／Ｌを含有する培地で行うことができる。
【００２８】
ダプトマイシンの生産量を確認するための本培養培地は、糖蜜５〜１０ｇ／Ｌ、グルコース５〜１５ｇ／Ｌ、デキストリン５０〜１５０ｇ／Ｌ、酵母エキス５〜１５ｇ／Ｌ、グルテン２〜１０ｇ／Ｌ及び無機塩類０．５〜５ｇ／Ｌを含有する。
【００２９】
本培養段階では、種菌接種量を制限し、かつ、同一な条件の下で再培養された均質化されたペレットの種菌を接種することによって、生成される１２種以上のダプトマイシン関連の類縁物質を最小化することができる。例えば、均質化されたペレット種菌培養液の接種量が本培養培地体積の０．１〜２％前後である場合、柔軟性物質の生成量が急激に減少する。
【００３０】
変異株ＤＫＢ１０８は、菌糸の成長速度が非常に速く、ダプトマイシンを生産するためには、水中好気性条件を維持することが必須であり、培養４８時間以内の菌成長期では、溶存酸素量を２０％以上維持することが必須である。変異株ＤＫＢ１０８は、典型的な土壌微生物が示す約２２℃〜３８℃、好ましくは２６〜３４℃の温度で成長することができ、最適なダプトマイシンは約２８℃及び３１℃の温度で生成される。このようなダプトマイシンの生産条件においてｐＨは５．５〜７．５、攪拌速度は１５０〜４００ｒｐｍ及び通気条件０．５〜１．５  ｖｖｍに維持させることが好ましい。
【００３１】
ダプトマイシンの生産は、対数増殖期の中期（PMV  15％以上）で行われるため、この時点で前駆体デカン酸を投入することによって、ダプトマイシン生産量を極大化させることができる。前駆体デカン酸は、脂肪酸オレイン酸メチルと混合したり、アンモニア水またはグリセロールと混合して溶液状態で投入したりすることができる。
【００３２】
また、前記方法は、前記培養された菌株またはその培養物からダプトマイシンを得る段階を含むことができる。
【００３３】
本発明において、用語「培養物」とは、前記の菌株を培養した後に得られた産物を意味し、培養された菌株を含んだり、培養された菌株が削除された形態のいずれをも含む。前記ダプトマイシンを生産するように培養された菌株の培養物をダプトマイシンの分離精製に用いられる通常の方法に適用してダプトマイシンを得ることができ、このような方法の例として分別結晶化、精密ろ過、逆浸透、ＬＰＬＣ（Low  Pressure  Liquid  chromatography）、ＨＰＬＣ（High  Pressure  Liquid  chromatography）、ＦＰＬＣ（Fast  Protein  Liquid  chromatography）、イオン交換クロマトグラフィー（Ion-exchange  chromatography）、ゲル濾過（Gel  filtration）、逆相クロマトグラフィー（Reverse-phase  chromatography）、疎水性クロマトグラフィー（Hydrophobic  chromatography）、またはこれらを組み合わせた方法を適用することができるが、ダプトマイシンを分離精製することができる方法であれば、これに限定されるものではない。
【００３４】
（実施例）
以下、本発明を下記例によって詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものに過ぎず、下記例によって、本発明の範囲が制限されるものではない。
【００３５】
実施例1：紫外線照射による変異株ＤＫＢ１０８の分離
親菌株ストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）ＡＴＣＣ  ３１５６８を、３０℃で１２日間斜面培養により生成された胞子を採集した後に生理食塩水に懸濁し、連続的に１０−２、１０−３、１０−４の希釈倍数で希釈して平板培地に塗抹した。３０℃で２時間前培養（pre-incubation）を行った後、２８０ｎｍの波長の２０Ｗの紫外線灯２つが６５ｃｍの距離で設置された無菌ボックスで１１８秒間照射したが、この時の死滅率は９９．９％であった。光回復による修復（repair）を防止するために、すぐに遮光して４℃で２時間保存して純化させ、３０℃で６日間寒天平板培養で生存したコロニーを採取し、下記実施例４の方法で種菌培養と発酵培養とを行った。発酵は５００ｍｌのバッフルフラスコを使用し、振とう培養器で３０℃、２６０ｒｐｍの条件で７日間行った。
【００３６】
培養終了液は、遠心分離した後、指示菌スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）の生育抑制能力を確認するために、生物学的検証法であるアガーウェル（Agar-well）法を用いた。アガーウェル法は、他の方法に比べて比較的簡単で適用することが容易であり、誤差が少ないと判断されたため、これを分析に適用した。この方法は、試料が寒天ゲルで拡散されたとき、濃度勾配差による拡散速度が決定される原理によって一定時間の拡散距離（阻止環の大きさ）は、濃度値のログ値に比例することが知られており、その原理によって未知試料内の抗生物質の濃度を測定する方法である。この方法は、次のような過程で行った：トリプチケースソイブロス寒天培地が固まる前に指示菌スタフィロコッカス・アウレウスを入れて均等に懸濁させた後、試験容器に入れて固めた。その後、直径５ｍｍのステンレス管で寒天上に穴の痕跡を作って真空状態の管内に、穴の中にある寒天を吸込んだ。寒天ウェルに入れる試料の量は１３０μｌが使用され、対照群ダプトマイシンは０、５０、１００、２００、３００、１０００μｇ／ｍｌの濃度に製造して使用した。
【００３７】
アガーウェル法で１次選抜された変異株は、再びＮＴＧ（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を使用して死滅率７０％を示す条件で、前記ＵＶ照射方法と同様に２次変異を行った。２次突然変異によって選抜された変異株は、実施例４の方法で発酵培養を行い、その培養液をＨＰＬＣ分析と生物学的検証法であるアガーウェル法でダプトマイシン生産能の優れた変異株を選抜した。２次突然変異によって選抜された菌株は、再び数回のＵＶとＮＴＧとが連携した順次の突然変異方法を繰り返して２回以上行うのでダプトマイシン生産性が最も高く、また、数回の継代培養によってもダプトマイシンの生産能が安定した変異株を分離することができた。これをＤＫＢ１０８と命名した。また、前記ＤＫ１０８を２０１２年８月２０日付でブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国生命工学研究院に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ１２２６７ＢＰが付与された。
【００３８】
このように、本発明で明らかにされたＤＫＢ１０８のアガーウェル実験結果を下記表１に示し、本発明のＤＫＢ１０８は親菌株であるＡＴＣＣ  ３１５６８に比べてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）に対する生育抑制効果が１．５倍程度優れていた。
【００３９】
【表１】
0006527521.tif 000003
【００４０】
実施例２：変異株ＤＫＢ１０８の特性
前記実施例１で選抜した変異株ＤＫＢ１０８の培養学的、形態学的及び生理学的特性を調査した。
【００４１】
親菌株ストレプトマイセス・フィラメントサスＡＴＣＣ  ３１５６８及び変異株ＤＫＢ１０８を酵母エキス・麦芽エキス寒天、オートミール寒天、無機塩・澱粉寒天、グリセリン・アスパラギン寒天、ペプトン・酵母エキス・鉄寒天及びチロシン寒天培地（培地）上で３０℃で１４日間培養させたとき、発育状態を光学及び走査型電子顕微鏡で観察した特徴をまとめて表２に示した。色名は、文献[非特許文献２]を用いて示した。
【００４２】
【表２】
0006527521.tif 000004
【００４３】
親菌株と変異株ＤＫＢ１０８のＩＳＰ培地において示された共通の特徴は次の通りである。菌糸の形態は、連鎖状に配列された円筒状に近い楕円形で胞子形成し（図１）、Ｂｕｒｇｅｙｍａｎｕａｌ（１９９４）を参考にしたグラム染色では陽性であった。菌体の成長は、大部分のＩＳＰ培地において良好に示され、ＩＳＰ−１、ＩＳＰ−２培地を除いた大部分の培地において基菌糸の形成が悪いか、または胞子形成が発生しなかった。
【００４４】
一方、変異株ＤＫＢ１０８は、生育裏面の色と可溶性色素で親菌株との差異を示したが、変異株ＤＫＢ１０８は、ＩＳＰ−１、ＩＳＰ−５において生育裏面の色が親菌株より濃い色を示し、そしてＩＳＰ−２、ＩＳＰ−５、ＩＳＰ−７において可溶性色素が親菌株より濃い色を示した。
【００４５】
本発明の変異株ストレプトマイセス・フィラメントサス（Streptomyces  filamentosus）ＤＫＢ１０８と親菌株ストレプトマイセス・フィラメントサスＡＴＣＣ  ３１５６８の生理学的特性を確認するために、ＩＳＰ（international  streptomyces  project）平板培地で進め、培地中の特定の成分の分解を通じてチロシン加水分解酵素、ウレアーゼ、アミラーゼ、カゼイナーゼ、アミラーゼ、ニトラート還元酵素及びゼラチナーゼのような酵素の生成の有無を確認し、塩化ナトリウムに対する浸透圧耐性、メラノイド（melanoid）生成の有無を確認し、下記表３にまとめて示した。
【００４６】
【表３】
0006527521.tif 000005
【００４７】
【表４】
0006527521.tif 000006
【００４８】
変異株ＤＫＢ１０８と親菌株の生理学的特性の調査で確認した多少異なる差異は、具体的には、次の通りである。
【００４９】
ＩＳＰ−７（Shinobu、1958）平板培地に２１日間の培養で変異株ＤＫＢ１０８は２週間が経過した時点で濃い紫色の水溶性色素を形成させたのに対し、親菌株は、明るい紫色の色素を形成させた。しかし、ＩＳＰ−６（Tresner  and  Danga、1958）平板培地では、親菌株と変異株とはいずれもメラニン陰性で示された。
【００５０】
変異株ＤＫＢ１０８は、親菌株と炭素効用のパターンと浸透圧耐性の程度でも多少の差異が示された。炭素源を異にしたトリプチケースソイブロス（Trptic  soy  broth、DifcoTM）を用いた平板培養において試験に使用された大部分の炭素源利用パターンは同一であったが、ラクトース利用においては、むしろ変異株ＤＫＢ１０８の方が成長が低下する傾向を示した。
【００５１】
トリプチケースソイブロスを利用した液体培養の結果、変異株ＤＫＢ１０８の場合には、塩化ナトリウム８．１２５％で生育が可能であったが、親菌株の場合には、生育が起こらなかった。しかし、塩化ナトリウム６．５％の液体培養では生育が起こり、これに対する抵抗性を示した。トリプチケースソイブロスを利用した平板培養では、変異株ＤＫＢ１０８の場合には、塩化ナトリウム８．５％で耐性を有する一方、親菌株は生育が阻害された。ＩＳＰの基準に基づいてモデル菌株及び変異株がいずれも７％の塩化ナトリウムに対する耐性を有することが示された（burgey  manual、1994）。
【００５２】
ＴＬＣを通じた変異株ＤＫＢ１０８細胞壁は、ＬＬ−ジアミノピメリン酸（LL-diaminopimelic  acid）とグリシン（glycine）が観察される1型（type  1）であった。
【００５３】
前記菌株の生長温度は２４〜３７℃で示され、菌体の成長とダプトマイシン生産の最適温度は３０℃であった。また、ストレプトマイセス・フィラメントサスＡＴＣＣ  ３１５６８菌はダプトマイシンの生産性が低く、リポペプチドコンプレックスの形で多数の類縁物質が生成されたのに対し、変異株ＤＫＢ１０８はダプトマイシンが主要生合成の代謝物質として生成する特徴を有した。炭素源利用性の実験は、プリドハムとゴットリーブの方法（非特許文献３）によって行い、３０℃で１２日間培養した後、観察して下記の表４に示した。
【００５４】
このような形態学的及び生化学的特性の調査から、本発明の変異株ストレプトマイセス・フィラメントサスＤＫＢ１０８は、親菌株ストレプトマイセス・フィラメントサスＡＴＣＣ  ３１５６８の特性と大部分同一に示されたが、コロニー形成の大きさと色、塩化ナトリウム耐性、炭素源利用性などで親菌株と多少差がある特性を示した。
【００５５】
実施例３：変異株ＤＫＢ１０８のダプトマイシン生産の確認
ダプトマイシン定量法でカラム（Optimapak  C8  4.6×250mm,  RStech  co.,  Ltd.）とＨＰＬＣ（Waters）を使用し、標準物質としては、キュビシン社で製造販売されているダプトマイシン凍結乾燥物、キュビシン注を使用した。試料の準備は発酵液を遠心分離（５０００  ｒｐｍ、１５分）した後、その上澄液に同量の無水エタノールを添加した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上澄液を０．４５μｍのフィルターでろ過して検液として使用した。ダプトマイシンの確認と定量とは、標準物質１０ｍｇを精密に量り、水に溶かして正確に１０ｍｌとし、標準物質として使用し、次の液体クロマトグラフ方法によって試験した。
【００５６】
検出器：紫外部吸光光度計（測定波長２１４  ｎｍ）
カラム：Optimapak  C8  4.6×250mm  (RStech  co.,  Ltd.,  RStech,  韓国)
流量：１．５  ｍｌ／分
自動注入器温度：３−７℃
測定範囲：３０分
試料注入：２０μｌ
【００５７】
＜操作条件１＞
移動相：ダプトマイシンのピーク保持時間が約１５分になるように移動相Ａと移動相Ｂとを適当な比率で調整した。
【００５８】
移動相Ａ：リン酸二水素アンモニウム９ｇを量り、水１５００ｍｌを加えて溶かした後、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸でｐＨを３．２５に調整した後、水を入れて２０００ｍｌとした。この溶液１０００ｍｌにアセトニトリル１０００ｍｌを加えて混合した。
【００５９】
移動相Ｂ：リン酸二水素アンモニウム９ｇを量り、水１５００ｍｌを加えて溶かした後、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸でｐＨを３．２５に調整した後、水を入れて２０００ｍｌとした。この溶液１６００ｍｌにアセトニトリル４００ｍｌを加えて混合した。
【００６０】
＜操作条件２＞
移動相：ダプトマイシンのピーク保持時間が約１５分になるように移動相Ａと移動相Ｂを適当な比率で調整した。
【００６１】
移動相Ａ：蒸留水１０００ｍＬにアセトニトリル１０００ｍＬを加えて混合した。
【００６２】
移動相Ｂ：酢酸アンモニウム９ｇを量り、水１５００ｍｌを加えて溶かした後、氷酢酸でｐＨを３．２５に調整した後、水を入れて２０００ｍｌとした。この溶液１６００ｍｌにアセトニトリル４００ｍｌを加えて混合した。
【００６３】
実施例４：変異株ＤＫＢ１０８を用いたダプトマイシン生産
第１段階：斜面培養
凍結乾燥で保存中のストレプトマイセス・フィラメントサス（streptomyces  filamentosus）変異株ＤＫＢ１０８を使用して下記表５の無菌斜面培地に接種した後、３０℃で６日間静置培養した。
【００６４】
【表５】
0006527521.tif 000007
【００６５】
第２段段階：種菌培養
前記斜面培地において胞子形成が豊富であり、灰色及び濃い赤茶色を帯びるコロニーを採取し、下記表６の滅菌された生育活性培地５０ｍｌに接種する。接種された生育活性の培地は、５００ｍｌのバッフルフラスコで３０℃、２６０ｒｐｍで２４時間培養した。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
第３段段階：本培養
前記種菌培地で培養された培養液を下記表７の滅菌された本培養培地５０ｍｌに１％で接種させる。接種された本培養培地は、５００ｍｌのバッフル三角フラスコで３０℃、１５０〜２８０ｒｐｍで８日間培養を行った。変異株ＤＫＢ１０８のダプトマイシン生産量は親菌株に比べて１２倍増加した４８０ｍｇ／ｌの生産濃度を示した（表８）。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
【表８】
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【００７０】
実施例５：変異株ＤＫＢ１０８を用いたタンク発酵におけるダプトマイシン生産
前記実施例４の方法で培養された種菌培養液を、前記表７の滅菌した本培養培地３０ｌに１％で接種した。本培養発酵は、５０Ｌのタンク発酵器（kobiotech  co.,  korea）で３０℃、１ｖｖｍ、ｐＨ  ６．２〜６．８の調節された条件で９日間行った。菌の増殖に伴う水中溶存酸素量（ＤＯ）の急激な減少によってＤＯ２０％以上を維持させるために攪拌速度を最大４００ｒｐｍまで段階的に上昇させて培養した。培養３０時間では、５０％のデカン酸（Decanoic  acid）溶液を連続式で注入し、培養ｐＨが上昇する時点で流加式培養を中断した。変異株ＤＫＢ１０８のダプトマイシン生産量は培養２０９時間で２．７５ｇ／ｌの生産濃度を示した（図２）。
【００７１】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００７２】
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【図１】
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【図２】
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