(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌、及び／又は
当該酢酸菌の培養液
を含有する、コバエ誘引剤。
【請求項２】
前記酢酸菌が、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する、請求項１に記載のコバエ誘引剤。
【請求項３】
ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌、及び／又は
当該酢酸菌の培養液
の、コバエ誘引剤としての使用。
【請求項４】
コバエ誘引方法であって、
ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌を培養する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記酢酸菌が、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する、請求項３に記載の使用、又は請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された酢酸菌及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトインは、バター又はチーズのような重い臭気を有する揮発性化合物であり、食酢や清酒の不快臭の一つとして知られている。その一方で、アセトインには、ショウジョウバエ等のコバエを誘引する作用があることも知られている。アセトインそのもの、及びアセトインを含有する食酢等が、実際にコバエ誘引剤原料として使用されている（特許文献１）。【０００３】
酢酸菌グルコンアセトバクター  エウロパエウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ；本明細書において、「Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ」と表記することがある）は、高いエタノール酸化能力、並びにエタノール及び酢酸に対する耐性を有し、食酢工業生産において極めて重要な微生物である。近年、同酢酸菌タイプ株のドラフトゲノム配列が決定された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２３３７０９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Andres-Barrao C、Falquet L、Calderon-Copete SP、Descombes P、Ortega Perez R、Barja F「Genome sequences of the high-acetic acid-resistant bacteria Gluconacetobacter europaeus LMG 18890T and G. europaeus LMG 18494 (reference strains), G. europaeus 5P3, and Gluconacetobacter oboediens 174Bp2 (isolated from vinegar).」、J. Bacteriol.、2011年、193、pp. 2670-2671
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、よりコバエ誘引作用の高い新規素材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。具体的には、本発明者らは、昆虫誘引効果の高いアセトイン等の化学薬品を誘引剤として添加する従来の手法とは異なり、昆虫誘引効果の高い物質を高生産する酢酸菌変異株を構築してこれを利用することにより上記課題を解決できることを見出した。さらに試行錯誤の末、本発明者らは、ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌を利用することにより同課題を解決できることを見出した。これらの知見に基づいて本発明者らは本発明を完成させた。【０００８】
さらに具体的には、本発明者らは、以下の検討を経て、本発明を完成させるに至った。まず、本発明者らは、独自に酢酸菌の代謝経路の解析を行った。具体的には、米酢より単離されたＧａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＫＧＭＡ０１１９株のドラフトゲノム解析を行うと同時に、乳酸及びピルビン酸代謝に焦点を絞り研究を行い、その結果、Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓにおける遺伝子破壊系を構築すると同時に、アセトイン合成経路（Akasaka N, Sakoda H, Hidese R, Ishii Y, Fujiwara S. 2013. An efficient method using Gluconacetobacter europaeus to reduce an unfavorable flavor compound, acetoin, in rice vinegar production. Appl. Environ. Microbiol. 79:7334-7342.）、並びに同代謝経路と中間代謝産物を共有する分岐鎖アミノ酸生合成経路（Akasaka N, Sakoda H, Fujiwara S. 2012. Branched-chain amino acid production by an acetic acid bacterium Gluconacetobacter europaeus. Seibutsu Kogaku 90:374-380.）の一端を明らかにした（図１）。図１に示した代謝経路から、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子群の一つであるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＡＩＲ）をコードする遺伝子ｉｌｖＣを破壊することにより、より多くの炭素がアセトイン経路へ流入することが期待された。【０００９】
一方で本発明者らは、ＫＧＭＡ０１１９株を宿主として用い、ランダム変異導入及びその後の選抜で分岐鎖アミノ酸生産変異株を単離した。この変異株のゲノム解析から、Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓの分岐鎖アミノ酸生合成系は、バリンによるフィードバック阻害機構、及び転写因子ロイシン応答調節タンパク質（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Cho BK, Barrett CL, Knight EM, Park YS, Palsson BO. 2008. Geneme-scale reconstruction of the Lrp regulatory network in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:19462-19467.）（本明細書において、「Ｌｒｐ」と表記することがある；また、Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓにおけるオルソログを「ＧｅＬｒｐ」と表記することがある）を介したロイシンによるフィードバック抑制機構により制御されていることが示唆されていた（図１）。上記の分岐鎖アミノ酸生産菌及び野生株を用いた比較ゲノム解析から、分岐鎖アミノ酸生産菌のＧｅｌｒｐ遺伝子座においてナンセンス変異が検出された（ＧｅｌｒｐのＯＲＦ全長は５７９ｂｐであり、点変異位置はＧ３９６Ａである）。この変異により、同生産菌では二量体形成及びリガンド結合に関与すると推定されるＣ末端領域が欠損した変異型ＧｅＬｒｐが産生されていることが示唆された。大腸菌の研究から、ＬｒｐのＣ末端領域の変異により、変異型Ｌｒｐはリガンドであるロイシンに対して非感受性となり、分岐鎖アミノ酸生合成系における律速酵素アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）の発現が恒常的になることが知られている（Platko JV, Calvo JM. 1993. Mutations affecting the ability of Escherichia coli Lrp to bind DNA, activate transcription, or respond to leucine. J. Bacteriol. 175:1110-1117.）。さらに、分岐鎖アミノ酸生産変異株のトランスクリプトーム解析の結果、生合成遺伝子群（ｉｌｖＩＨ、ｉｌｖＣ及びｉｌｖＤ）の発現量上昇が確認され、分岐鎖アミノ酸生産能と遺伝子発現レベルとの相関が明らかになった。また、これまでの解析から、分岐鎖アミノ酸生産菌は野生株と比較して多くのアセトインを蓄積することが明らかになった。これは、上記ｉｌｖＩＨ遺伝子の発現亢進に伴い、より多くのピルビン酸がα-アセト乳酸へ転換されたことに起因するものと考えられた（図１）。【００１０】
これらの知見を踏まえ、本発明者らは、まず、ｉｌｖＣ及びＧｅｌｒｐ遺伝子の破壊によりアセトイン高生産菌の構築を試み、試行錯誤の末にこれに成功した。さらに本発明者らは、これら菌株の培養液をショウジョウバエ誘引実験に供試し、誘引効果を検証して実際にアセトイン高生産菌株培養液が、野生株と比較して高い誘引効果を有することを確認した。【００１１】
本発明は以下の態様を含む。
項１．
ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌。
項２．
アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する、項１に記載の酢酸菌。
項３．
項１又は２に記載の酢酸菌及び／又は当該酢酸菌の培養液を含有する、コバエ誘引剤。
項４．
項１又は２に記載の酢酸菌及び／又は当該酢酸菌の培養液の、コバエ誘引剤としての使用。
項５．
コバエ誘引方法であって、
項１又は２に記載の酢酸菌を培養する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明を利用することにより、従来より優れたコバエ誘引作用が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓにおけるものとして推定される、アセトイン合成経路及び同代謝経路と中間代謝産物を共有する分岐鎖アミノ酸生合成経路を示す図面である。
【図２】ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した遺伝子破壊方法の一例を示す模式図である。
【図３】実施例で行った遺伝子破壊の模式図である。
【図４】実施例の結果を示す図面である。
【図５】実施例の結果を示す図面である。
【図６】実施例の結果を示す図面である。
【図７】実施例の結果を示す図面である。
【図８】実施例の結果を示す図面である。
【図９】実施例の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．本発明の酢酸菌
１．１  酢酸菌及びオーバーフローメタボリズム関連遺伝子
本発明の酢酸菌は、ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している酢酸菌である。
【００１５】
酢酸菌としては、特に限定されないが、例えば、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属等に属するものを用いることができる。中でも、グルコンアセトバクター  エウロパエウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）及びアセトバクター  パスツリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）が好ましい。
【００１６】
ｉｌｖＣ遺伝子とは、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子群の一つであるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＡＩＲ）をコードする遺伝子である。その塩基配列を配列番号１に示す。
【００１７】
ｌｒｐ遺伝子とは、大腸菌のロイシン応答調節タンパク質（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｌｒｐ））遺伝子であり、ｌｒｐ遺伝子オルソログとは、酢酸菌におけるｌｒｐ遺伝子のオルソログである。例えば、Ｇａ.  ｅｕｒｏｐａｅｕｓにおけるオルソログはＧｅｌｒｐ遺伝子であり、同遺伝子のコードするタンパク質は、大腸菌Ｌｒｐアミノ酸配列と４０％の同一性を示す。相同性検索の結果から、ＧｅＬｒｐはＬｒｐと同様、Ｎ末端側にＤＮＡ結合ドメイン、Ｃ末端側にシグナル分子（リガンド）結合ドメインを有しており、このことから、同タンパク質は転写調節因子であると推定される。その塩基配列を配列番号２に示す。
【００１８】
本発明の酢酸菌は、ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損しているため、いずれも欠損していない状態と比較してアセトイン生産能が向上している。本発明の酢酸菌を利用することにより、コバエ誘引作用の高い新規素材を提供することができる。
【００１９】
なお、本発明において、「ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログが欠損している」状態には、いずれも欠損していない状態と比較してアセトイン生成能が向上している限りにおいて、これらの遺伝子が一部欠損している状態も含まれ、これらの遺伝子の全部が欠損している状態も含まれる。上記において、アセトイン生成能が向上しているか否かは、公知の方法により評価することができ、特に限定されないが、例えば、対象となる酢酸菌を培養し、培養液中に蓄積したアセトイン量を、ガスクロマトグラフィーにより定量することにより評価することができる。このときの培養条件は、特に限定されないが、例えば、１．０ｗｔ/ｖ％のＬ−乳酸ナトリウムを含むＹＰＤ培地で３４時間培養してもよい。評価手法に限らず、基準と比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上向上しているときにアセトイン生成能が向上していると判定することができる。
【００２０】
ｉｌｖＣ遺伝子、及び／又はｌｒｐ遺伝子オルソログを欠損させる方法は、特に限定されず、従来公知の方法を幅広く採用できる。特に限定されないが、例えば、セルフクローニングによる方法が利用できる。なお、セルフクローニングとは、同一種に属する生物間で核酸を交換することをいう。
【００２１】
セルフクローニングによる方法としては特に限定されないが、具体的には、本発明者らが独自に開発した以下に説明する方法を用いることができる。
【００２２】
まず、内在性のピリミジン生合成系遺伝子を選択マーカーとして用いる。内在性の遺伝子を選択マーカーとするため、目的遺伝子を欠損した酢酸菌であって、外来遺伝子が導入されていない酢酸菌を製造することができる。
【００２３】
ピリミジン生合成系遺伝子とは、ピリミジン塩基（チミン、シトシン及びウラシル）の生合成経路に関わる遺伝子群を指す。この経路はすべてのピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）を合成する６つの酵素反応からなる。６つの酵素（及びそれをコードする遺伝子）とは、すなわち、ＵＭＰ合成経路の上流から順にカルバモイルリン酸合成酵素（ｃａｒＡＢ遺伝子）、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ（ｐｙｒＢ遺伝子）、ジヒドロオロターゼ（ｐｙｒＣ遺伝子）、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒＤ遺伝子）、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）遺伝子、及びオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＦ）である。これらの酵素をコードする遺伝子を保持する株はウラシル原栄養性を示すが、これらの酵素をコードする遺伝子を破壊された株はＵＭＰを生合成できなくなり、ウラシル要求性株となる。
【００２４】
これらのうち、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを破壊された株については、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）によるポジティブセレクションが可能である。５−ＦＯＡは、遺伝子破壊を受けていない株においてはまずオロチン酸（ｏｒｏｔａｔｅ）の代わりにピリミジン経路に取り込まれ、最終的にＲＮＡに取り込まれるために正常なＲＮＡの合成が阻害され、菌体は死滅する。これに対して、ｐｙｒＥ破壊株及びｐｙｒＦ破壊株においては５−ＦＯＡは代謝されず、菌体は生存できる。このことを利用すると、５−ＦＯＡ及び十分量のウラシルを含む培地で培養することにより、ｐｙｒＥ破壊株又はｐｙｒＦ破壊株を選別することができる。このため、選択マーカーとして用いる内在性のピリミジン生合成系遺伝子としては、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦが好ましい。ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを用いれば、ウラシル原栄養性を指標として、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦがゲノムに存在する株を選択することができる。また、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを用いれば、５−ＦＯＡ耐性を指標として、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦがゲノムから欠損した株を選択することができる。
【００２５】
目的遺伝子を欠損した酢酸菌の製造方法は、ダブルクロスオーバーを利用した方法であってもよいし、ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法であってもよい。
【００２６】
ダブルクロスオーバーを利用した方法としては、特に限定されないが、例えば以下のような工程（１）及び（２）を含む方法等が挙げられる。
（１）当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が前記ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡで置換されたＤＮＡを含有する、目的遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、該ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株に導入する工程；及び
（２）前記工程（１）により得られた酢酸菌から、ウラシル原栄養性を指標として、目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした目的遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００２７】
前記工程（１）において、目的遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株に導入することにより、ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムに導入される一方で、目的遺伝子をゲノムから欠落させることができる。
これは、当該酢酸菌のゲノム中の、目的遺伝子を含む領域が、前記ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡで置き換わるためである。より詳細には、この置換は、目的遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡがゲノムとダブルクロスオーバーを起こすことによって起こる。このダブルクロスオーバーを起こすためには、目的遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡが、目的遺伝子の上流領域（以下、「５’−ＵＲ」ということがある。）及び下流領域（以下、「３’−ＤＲ」ということがある。）を、ピリミジン生合成系遺伝子を挟むようにしてそれぞれ含んでいる必要がある。これらの５’−ＵＲ及び３’−ＤＲと同一の配列は、それぞれ目的遺伝子を挟むようにしてゲノム中にも存在している。これらの互いに同一の配列同士でダブルクロスオーバーを起こすことにより、結果的にゲノム中の目的遺伝子がピリミジン生合成系遺伝子で置換される。このダブルクロスオーバーを起こすために、５’−ＵＲ及び３’−ＤＲに求められる長さは適宜設定できるが、通常、２００塩基以上であれば十分である。５’−ＵＲ及び３’−ＤＲの長さは、目的遺伝子の破壊効率の面で、好ましくは３００塩基〜２，０００塩基であり、より好ましくは５００塩基〜１，０００塩基である。
【００２８】
目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡは、前述のダブルクロスオーバーを起こすものであればよく、特に限定されない。このＤＮＡは、環状ＤＮＡであってもよいし、直鎖ＤＮＡであってもよい。このＤＮＡの長さは、特に限定されないが、環状ＤＮＡである場合には通常、２ｋｂｐ〜１０ｋｂｐであり、好ましくは４ｋｂｐ〜８ｋｂｐである。
また、同様に直鎖ＤＮＡである場合には通常、１ｋｂｐ〜８ｋｂｐであり、好ましくは２ｋｂｐ〜４ｋｂｐである。
【００２９】
直鎖ＤＮＡである場合、より詳細には、一例として、被破壊遺伝子（目的遺伝子）の上流０．５ｋ〜１ｋの領域、ｐｙｒＥ遺伝子（１．５ｋ）及び被破壊遺伝子の下流０．５〜１．０ｋの領域（すなわち、全長２．５ｋ〜３．５ｋ）のもの等を用いることができるが、特にこれに限定されず、発明の効果が得られる範囲内で幅広く選択できる。
【００３０】
ＤＮＡの酢酸菌への導入方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、大腸菌との接合伝達法（特開２０１２−１２５１６４号公報）及び塩化カルシウム法（Okumura, H. et al.: Agric. Biol. Chem., 49, 1011 (1985)）等により導入することができる。この中でも、特にエレクトロポレーション法が作業の簡便性の面で好ましい。
【００３１】
上記において、ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株は、特に限定されないが、例えば次のような工程を含む方法によって得ることができる。
（ｉ）酢酸菌のゲノムにおける、当該ピリミジン生合成系遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、該ピリミジン生合成系遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡを含有する、該ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、酢酸菌に導入する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた酢酸菌から、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として、該ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした該ピリミジン生合成系遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００３２】
上述の方法において、ダブルクロスオーバーによる遺伝子置換のメカニズムは、前記工程（１）及び（２）のメカニズムと同様である。
【００３３】
ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡが、ピリミジン生合成系遺伝子の上流領域及び下流領域をそれぞれどの程度の長さ有していればよいかについても、前記工程（１）及び（２）においてした説明と同様である。
【００３４】
前記工程（２）において、ウラシル原栄養性を指標とする選抜は、目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした目的遺伝子欠損株を選抜する目的で行うものであり、かかる目的が達成される限りにおいて、その詳細な条件については適宜設定することができる。
【００３５】
例えば、極めて低頻度で生じる形質転換体（ウラシル原栄養性株）を、ウラシルを含まない最少培地で集積することにより、目的遺伝子破壊株を選抜することができる。この場合の条件としては、特に限定されないが、最少培地の組成として以下が例示できる。
【００３６】
グルコース ３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム・一水和物 １０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム ０．１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、塩化カリウム ０．１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・二水和物 ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．２５ｇ／Ｌ、塩化鉄(ＩＩＩ) ０．００５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．０５ｇ／Ｌ、モリブデン(ＩＶ)酸二ナトリウム・二水和物 ０．０００５ｇ／Ｌ、ホウ酸 ０．０００５ｇ／Ｌ、硫酸銅・五水和物 ０．００２５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・五水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、塩化コバルト(ＩＩ) ０．０００５ｇ／Ｌ、(＋)−パントテン酸カルシウム ０．００２ｇ／Ｌ、エタノール及び酢酸 ５ｍｌ／Ｌ
【００３７】
目的遺伝子を欠損した酢酸菌の製造方法のうち、ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法としては、特に限定されないが、例えば以下のような工程（１）及び（２）を含む方法等が挙げられる。
（１）当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡ；並びに前記ピリミジン生合成系遺伝子をそれぞれ含有する環状ＤＮＡを、該ピリミジン生合成系遺伝子を欠損する株に導入する工程； 
（２）前記工程（１）により得られた酢酸菌から、ウラシル原栄養性を指標として、前記環状ＤＮＡがｐｏｐ−ｉｎ置換によりゲノムに取り込まれた株を選抜する工程；及び
（３）前記工程（２）により選抜された酢酸菌株から、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として、ｐｏｐ−ｏｕｔ置換により少なくとも一部の目的遺伝子及び該ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムから脱落した目的遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００３８】
ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法の一例を、図２に示す。
【００３９】
工程（１）で使用する環状ＤＮＡは、当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域（５’−ＵＲ）から下流領域（３’−ＤＲ）までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡを含有する。当該環状ＤＮＡは、さらに、ピリミジン生合成系遺伝子を含有する。
【００４０】
続く工程（２）において、ウラシル原栄養性を指標として選抜することにより、ゲノムの５’−ＵＲ又は３’−ＤＲの部分（図２では５’−ＵＲの部分）においてｐｏｐ−ｉｎ置換によりこの環状ＤＮＡの全長がゲノムに取り込まれた株を選抜することができる。
【００４１】
さらに、工程（３）において、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として選抜することにより、ｐｏｐ−ｏｕｔ置換により少なくとも一部の目的遺伝子及び該ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムから脱落した目的遺伝子欠損株を選抜することができる。
【００４２】
５’−ＵＲ及び３’−ＤＲについての説明は、ダブルクロスオーバーに用いる配列についての説明と同様である。
【００４３】
遺伝子の導入方法、ウラシル原栄養性を指標とする選抜方法、並びに５−ＦＯＡ耐性及びウラシル要求性を指標とする選抜方法についての説明も、ダブルクロスオーバーを利用する方法についての説明と同様である。
【００４４】
ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法の利点としては、最終的に得られる遺伝子破壊株を用いて、さらに別の目的遺伝子を標的として工程（１）〜（３）を繰り返すことにより、別々の遺伝子を順次欠損させていくことができるという点が挙げられる。
【００４５】
２．本発明のコバエ誘引剤
本発明のコバエ誘引剤は、本発明の酢酸菌及び／又は当該酢酸菌の培養液を含有することを特徴とする。
【００４６】
本発明のコバエ誘引剤は、ショウジョウバエ、ノミバエその他のコバエに対する誘引剤である。
【００４７】
本発明のコバエ誘引剤は、本発明の酢酸菌及び／又は当該酢酸菌の培養液を有効成分とするものであり、その他の任意成分をさらに含有していてもよい。特に限定されないが、例えば、炭素数２〜５の有機酸、及びそのエステル等が挙げられる。本発明のコバエ誘引剤は、これらの成分を一種のみ含有していてもよいし、二種以上を含有していてもよい。炭素数2〜5の有機酸、及びそのエステルの具体例としては、特に限定されないが、ジアセチル、イソ酪酸エチル、吉草酸エチル、イソ吉草酸エチル、コハク酸ジメチル、コハク酸ジエチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル、安息香酸エチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸プロピル、酢酸、乳酸、プロピオン酸、パルミチン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸及びエタノール等が挙げられる。
【００４８】
用語「酢酸菌の培養液」は、酢酸菌を培養した後に得られる培養液であって、酢酸菌が培養時に分泌する諸因子を含むものを意味する。酢酸菌の培養液としては、特に限定されないが、通常の条件で培養した後に得られる培養液を用いることができる。特に限定されないが、本明細書に記載の実施例の培養条件のとおりとすることもできる。培養液は、培養後のものをそのまま使用してもよいし、必要に応じて濾過や加熱殺菌等の処理を行ったものを使用することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００５０】
供試株及び培養条件
断りのない限り、実験に用いた富栄養培地(YPD)及び最少培地には0.5% (v/v)のエタノール及び酢酸を添加した(Akasaka N, Sakoda H, Hidese R, Ishii Y, Fujiwara S. 2013. An efficient method using Gluconacetobacter europaeusto reduce an unfavorable flavor compound, acetoin, in rice vinegar production. Appl. Environ. Microbiol. 79:7334-7342.)。また、KGMA5511(ΔpyrE ΔilvC::pyrE)の培養時には、培養液に12mMの分岐鎖アミノ酸(バリン, ロイシン, イソロイシン各々を12mM)を添加した。遺伝子破壊実験の宿主として、KGMA0704株(ΔpyrE)を供試した(Akasaka N (2013))。ショウジョウバエ誘引実験にはKGMA0119株(wild-type)、KGMA5511及びKGMA7203株(ΔpyrE, GelrpΔ(397-511)::pyrE)を供試し、これらの株を30ml YPDL(1.0)(1.0% [wt/v] L-乳酸ナトリウムを含むYPD)で34時間培養した。分岐鎖アミノ酸生産性解析の際には、最少培地(Akasaka N (2013))を用いた。【００５１】
遺伝子操作及びDNAシーケンシング
基本的な遺伝子操作は既報(Green MR, Sambrook JF. 2012. Molecular cloning: a laboratory manual, 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)に従った。PCRにおけるDNAポリメラーゼとしてKOD plus (東洋紡, 大阪)を用いた。
各種制限酵素及び修飾酵素はタカラバイオ(大津, 滋賀)より購入した。DNAシーケンシングは、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, ver. 3.1及びABA3130キャピラリーシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行った。【００５２】
標的遺伝子破壊ベクターの構築及び遺伝子破壊
遺伝子破壊法は既報(Akasaka N (2013)に準拠した。遺伝子破壊ベクター構築に用いたプライマーを表１及び図３に示した。【００５３】
【表１】
0006571010.tif 000002
【００５４】
なお、表１において、制限酵素認識部位は下線部で、ストップコドン導入のためのGelrp2-i2における置換ヌクレオチドは太字で、それぞれ示してある。【００５５】
また、図３において、アステリスクは、ストップコドンを示している。矢印は用いたプライマーを示している。各略号はそれぞれ以下の遺伝子名を意味する。
「ilvI」acetohydroxyacid synthase large subunit
「ilvH」acetohydroxyacid synthase small subunit
「ilvC」acetohydroxyacid isomeroreducatase
「fah」fumaryl acetoacetate hydroxylase
「tr」thioredoxin reductase
「gt」glycosyltransferase【００５６】
全ての遺伝子破壊ベクター構築に用いたpyrEマーカーカセットは、KGMA0119株染色体DNAを鋳型に、プライマーペアEP-F2-E-R4(共に5′末端リン酸化)を用いて増幅した。ilvC遺伝子の上流及び下流約1.0 kbを含む領域を、KGMA0119株染色体DNAを鋳型に、プライマーペアilvC-F1-EcoRI-ilvC-R1-BamHIを用いて増幅した。得られたPCR産物をEcoRI及びBamHIで消化し、pBR322の当該箇所にサブクローニングした。この中間体プラスミドを鋳型に、ilvC-i1-ilvC-i2のプライマーペアを用いてPCRを行い、ilvC ORF中の945 bpを欠失させた。得られたPCR産物とpyrEマーカーカセットを連結し、ilvC破壊ベクター(pBR322-ΔilvC::pyrE [7,710 bp])とした(図３A)。【００５７】
同様に、Gelrp破壊ベクターを以下の手順で作製した。分岐鎖アミノ酸生産菌ABAr1-56株(Akasaka N, Sakoda H, Fujiwara S. 2012. Branched-chain amino acid production by an acetic acid bacterium Gluconacetobacter europaeus. Seibutsu Kogaku 90:374-380.)において点変異が検出された位置(G396A)を起点として、上流及び下流約1.0 kbを含む領域を、KGMA0119株染色体DNAを鋳型とし、Gelrp-F1-HindIII-Gelrp-R1-BamHIのプライマーペアを用いて増幅した。得られたPCR産物をHindIII及びBamHIで消化し、pBR322の当該箇所にサブクローニングした。この中間体プラスミドを鋳型に、Gelrp2-i1、及び5′末端に一塩基置換(C→T)を有するGelrp2-i2をプライマーとしてPCRを行い、C末端領域をコードする115 bpを欠失させると同時に、ABAr1-56株と同様の位置に終止コドンを導入した(TGG→TGA)。得られたPCR産物とpyrEマーカーカセットを連結し、Gelrp破壊ベクター(pBR322-GelrpΔ(397-511)::pyrE [7,389 bp])とした(図３B)。【００５８】
得られた候補株の遺伝子型を、染色体DNAを鋳型としたPCRにより同定した。KGMA5511株のilvC遺伝子座において、野生株及び親株と比較して高分子のシグナルが検出された(図４A)。同様に、Gelrp遺伝子座においても、KGMA7203株では野生株及び親株と比較して高分子のシグナルが検出された(図４B)。これらPCR産物サイズの上方遷移は、全て図３に示した予測と一致していた。また、得られたPCR産物のDNAシーケンス解析の結果、標的遺伝子の破壊が確認された。KGMA7203株では、企図した位置に点変異(G396A)が確かに導入されており、これによりABAr1-56株(Akasaka N, Sakoda H, Fujiwara S. 2012. Branched-chain amino acid production by an acetic acid bacterium Gluconacetobacter europaeus. Seibutsu Kogaku 90:374-380.)と同様の位置に終止コドンを導入する事に成功した。同株は、C末端領域を欠損した変異型GeLrpを産生するものと考えられる。上記2株及びKGMA0119株を以降の実験に供試した。【００５９】
アミノ酸の定性・揮発性成分及び有機酸分析
培養液中のアミノ酸は薄層クロマトグラフィーにより検出・定性した(日本生物工学会編. 2005. 生物工学実験書  改訂版. 培風館, 東京)。アセトインを含めた揮発性成分は、ガスクロマトグラフィー(GC-2014, 島津製作所, 京都)により定量した。昇温プログラムを(60℃ 3分→10℃/分 14分→200℃ 3分)に設定し、解析を行った。培養液中の有機酸は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC Prominence, 島津製作所)により定量した。【００６０】
KGMA5511株におけるilvC遺伝子の破壊が分岐鎖アミノ酸要求性を付与するかどうかを、培養実験により検証した。KGMA5511株を通常のYPD培地で培養すると、野生株KGMA0119株と比較して、比増殖速度が極めて遅く、最終菌体収量も著しく低下した(図５A)。一方、12mMの分岐鎖アミノ酸を添加すると、野生株とほぼ同様の生育挙動を示した(図５A)。なお、図５において、塗りつぶされた点は12mMの分岐鎖アミノ酸（BCAA）を含む場合であり、白抜きの点は分岐鎖アミノ酸を含まない場合である。図中における「BCAAs+」及び「BCAAs-」もそれぞれ、12mMの分岐鎖アミノ酸を含む場合、及び分岐鎖アミノ酸を含まない場合を意味している。また、KGMA5511株を最少寒天培地に塗布したところ、12mMの分岐鎖アミノ酸を含む寒天培地上でのみ生育した(図５B)。これらの結果から、ilvC遺伝子はGa. europaeusにおいて分岐鎖アミノ酸生合成に関与している事が明らかとなった。【００６１】
KGMA7203株を最少培地で培養し、培養液上清を経時的に採取して、培養液中の分岐鎖アミノ酸を薄層クロマトグラフィーにより検出した。その結果、バリン及びロイシンを蓄積し、マーカーとの比較から、培養96時間で約1mMのバリンを蓄積した(図６)。なお、図６は、ニンヒドリン染色の結果である。これは、ABAr1-56株(Akasaka N, Sakoda H, Fujiwara S. 2012. Branched-chain amino acid production by an acetic acid bacterium Gluconacetobacter europaeus. Seibutsu Kogaku 90:374-380.)とほぼ同等の生産性である。従って、GeLrp C末端領域の欠損のみで分岐鎖アミノ酸生産性が付与される事が明らかとなった。更に、定量PCRの結果、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子群の一つであるilvIH(AHASをコード)の発現量上昇が確認され、前述のトランスクリプトーム解析と一致する結果が得られた。これらの結果から、KGMA7203株の分岐鎖アミノ酸生産性と、同経路に関与する遺伝子発現量との相関が明らかにされた。同時に、分岐鎖アミノ酸生合成がGeLrp制御下にある事も示唆された。一方、KGMA7203株は野生株とほぼ同等の生育特性を示し、比増殖速度の低下等、顕著な差異は見られなかった。【００６２】
続いて、野生株KGMA0119株及び遺伝子破壊株を、YPDL(1.0)培地で34時間培養し、培養液中に蓄積したアセトイン量を、ガスクロマトグラフィーにより定量した。図７Aに示す通り、各種遺伝子破壊株のアセトイン蓄積量は、野生株と比較して顕著に上昇していた。また、高速液体クロマトグラフィーで定量した結果を図７Bに示す。なお、図７はn=3で試験を行った結果の平均値を示している。【００６３】
ショウジョウバエ誘引実験
ボトル側面に捕虫シート(11cm×20cm)を円柱状に貼り(図８C)、この捕虫シートに張り付いたショウジョウバエを、培養液により誘引された個体とみなした。誘引実験は、図８Bに示す、屋外に設置した、2.5m×2.5m×高さ2.5mのテント内に同サイズの蚊帳を張り、50-60 mlの培養液上清を加えた誘引装置を蚊帳内地面から約1mの高さに設置した。誘引装置として、市販の「Fly Magnet」に若干の変更を加え、ボトル側面に捕虫シート(11cm×20cm)を円柱状に貼りつけたものを用いた。飼育器(図８A)中で飼育したショウジョウバエを蚊帳内で放ち、6時間〜一晩放置して、捕虫シートで捕捉された個体数を計測した。【００６４】
図９に示した様に、野生株培養液と比較して、どの遺伝子破壊株の培養液も捕虫力が高く、より効果的にショウジョウバエを誘引する作用を持つ事が明らかとなった。また、アセトイン量と捕虫力との間にある程度の相関は見られたが、アセトイン量がほぼ同等のKGMA5511株及びKGMA7203株間で捕虫量に顕著な差異が見られた。これまでに、様々な昆虫誘引効果を有する有機酸やエステル等の化合物が同定・推定されており(特開2012-1531号公報)、遺伝子破壊株間で見られた差異は、アセトイン以外の発酵産物に起因する事が示唆された。そこで、より詳細に供試培養液組成を明らかにするため、高速液体クロマトグラフィーにより、同培養液中に含まれる有機酸を定性・定量した。その結果、KGMA7203株培養液のみから、極微量のイソ酪酸(0.005% [wt/v])が検出された(図７B)。イソ酪酸のコバエ誘引作用はこれまでに示唆されているが (特開2012-1531号公報)、我々のこれまでの解析から、イソ酪酸水溶液(1.0% [wt/v])はショウジョウバエ誘引効果を有さない事が確認されており、イソ酪酸単独では、コバエ誘引には不十分である事が示唆されている。これらの結果を踏まえると、アセトイン及びイソ酪酸が同時に含有される事、並びに、両化合物の量比がショウジョウバエ誘引において極めて重要である事が示唆された。
他微生物の解析から、イソ酪酸はバリン、またはその前駆体2-オキソイソ吉草酸が分解される事で生じる事が知られている(Hazelwood LA, Daran JM, van Maris AJ, Pronk JT, Dickinson JR. 2008. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl. Environ. Microbiol. 74:2259-2266.)。野生株ドラフトゲノムデータに対する相同性検索の結果、Ga. europaeusも上記と類似の代謝経路を有する事が示唆されている(図１)。KGMA7203株では、前述の通り分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子の発現亢進が認められ、その結果培養液中にバリン(及びロイシン)が蓄積するものと考えられる。従って、同株培養液より検出されたイソ酪酸は、これら過剰バリン、或いはその前駆体が分解された結果生じたと考えられる。
【図１】
0006571010.tif 000003
【図２】
0006571010.tif 000004
【図３】
0006571010.tif 000005
【図４】
0006571010.tif 000006
【図５】
0006571010.tif 000007
【図６】
0006571010.tif 000008
【図７】
0006571010.tif 000009
【図８】
0006571010.tif 000010
【図９】
0006571010.tif 000011
【配列表】
0006571010000001.app