(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列、及び配列番号２によって与えられるポリペプチド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３によって与えられ、前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号４によって与えられる、請求項１に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項３】
配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードする前記第１のポリヌクレオチド配列とともにかつ前記第１のポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項４】
配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列をコードする前記第１のポリヌクレオチド配列とともにかつ前記第１のポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、またはＳ−タグをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項５】
前記タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｃ−ｍｙｃタグをコードする、請求項３または請求項４に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項６】
前記ｃ−ｍｙｃタグをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８によって与えられる、請求項５に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、配列番号１５によって与えられる前記ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項８】
配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列とともにかつ前記ポリヌクレオチド配列の上流に、または前記適切な検出タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、二本鎖ＤＮＡプラスミドである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の３３型バクテリオファージＭ１３ベクター。
【請求項１１】
バクテリオファージＭ１３粒子を生成するための方法であって、
（ａ）配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列及び配列番号２によって与えられるポリペプチド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む二本鎖３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを細菌宿主細胞へトランスフェクトすることと、
（ｂ）前記細菌宿主細胞を、前記細菌宿主細胞における、前記第１及び第２のポリヌクレオチド配列の発現ならびにバクテリオファージＭ１３粒子の集合に適した条件下でインキュベートすることと、
（ｃ）前記細菌宿主細胞から、前記バクテリオファージＭ１３のコート表面上に独立して提示される配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列を含むバクテリオファージＭ１３粒子を回収することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３によって与えられ、前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号４によって与えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖バクテリオファージＭ１３ベクターが、配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列をコードする前記第１のポリヌクレオチド配列とともにかつ前記第１のポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、または及びＳ−タグをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｃ−ｍｙｃタグをコードする、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃ−ｍｙｃタグをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８によって与えられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記二本鎖Ｍ１３ベクターが、配列番号１５によって与えられる前記ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記二本鎖Ｍ１３ベクターが、配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列とともにかつ前記ポリヌクレオチドの上流に、または前記適切な検出タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌宿主細胞が、Ｆ＋細菌株である、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ファージ粒子コート表面上に独立して提示される、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチドを含む、バクテリオファージＭ１３粒子。
【請求項２１】
前記粒子が、配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列のＮ末端へ融合した適切な検出タグ配列をさらに含む、請求項２０に記載のバクテリオファージＭ１３粒子。
【請求項２２】
前記適切な検出タグ配列が、配列番号７によって与えられる、請求項２１に記載のバクテリオファージＭ１３粒子。
【請求項２３】
前記粒子が、配列番号１のアミノ酸配列によって与えられる前記ポリペプチド配列のＮ末端または前記適切な検出タグ配列のＮ末端へ融合した外来性ポリペプチドをさらに含む、請求項２１または請求項２２に記載のバクテリオファージＭ１３粒子。
【請求項２４】
前記外来性ポリペプチドが、配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列へ、または前記適切な検出タグ配列へ、配列番号１によって与えられる前記ポリペプチド配列のＮ末端または適切な検出タグ配列のＮ末端と、前記外来性ポリペプチドのＣ末端とに融合したペプチドリンカーを介して融合している、請求項２３に記載のバクテリオファージＭ１３粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージディスプレイ技術の分野にある。より具体的には、本発明は、バクテリオファージＭ１３粒子の表面上に表面タンパク質Ｐ．ＩＩＩを含む融合タンパク質を提示する上での使用に適したベクター、ならびに当該ベクターを含む使用方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現行のファージディスプレイ技術は、バクテリオファージ粒子の表面上での異種性ペプチドライブラリの生成及び提示を可能にする。ファージディスプレイの原理は、バクテリオファージ表面コートタンパク質との融合タンパク質の一部としての関心対象のペプチドの提示を基にしている。簡潔には、関心対象のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コート表面の一部としてファージ集合の際に発現するまたは「提示される」融合生成物を生じるために、ファージ表面コートタンパク質をコードする遺伝子とともにインフレームでクローン化されている。次に、発現したペプチドライブラリは、さらなる最適化または親和性成熟のために有力なペプチドリガンドを識別するために、標的または抗原についてスクリーニングされ得る。
【０００３】
バクテリオファージＭ１３は、ファージディスプレイを介した異種性ペプチド及び抗体フラグメントの発現に通常使用されるファージの例である。繊維状Ｍ１３バクテリオファージ集合は、細菌内膜中で生じる。ファージコートタンパク質は、細菌タンパク質合成機械を用いて細胞質中で合成され、次に、異なるシグナルペプチドによって周辺質へと定方位化される。機能的Ｍ１３ファージ粒子は、Ｐ．ＩＩＩ、Ｐ．ＶＩ、Ｐ．ＶＩＩ、Ｐ．ＶＩＩＩ、及びＰ．ＩＸと呼ばれる５つのタイプの表面コートタンパク質を含む。５つのこれらのタンパク質はすべて、Ｍ１３粒子の表面上で外来性ペプチドを提示するために使用されてきたが、微量のコートタンパク質であるＰ．ＩＩＩは、関心対象のペプチドをファージコート表面へ固定するために最も常用される（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７８，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｉｔｋｅｎ編）。Ｐ．ＩＩＩは、Ｍ１３ファージの近位端で５つのコピーにおいて存在し、ファージの感染力、集合、及び安定性において重要な役割を担っている。Ｐ．ＩＩＩは、４０６個のアミノ酸からなるポリペプチドとして発現し、３つの別個の領域、すなわちＮ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、及びＣ末端（ＣＴ）ドメインからなる（Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．）。Ｎ１ドメインは、感染中のウイルスＤＮＡの細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主への移行に関与するのに対し、Ｎ２ドメインは、細菌Ｆ線毛へ結合することによって宿主細胞の認識を与える。ＣＴドメインは、集合の間、Ｐ．ＩＩＩタンパク質をファージコートへと固定するのに関与する（Ｏｍｉｄｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，（２０１５））。
【０００４】
ファージディスプレイ系は、細菌宿主細胞感染に使用されるベクターのタイプによって分類され得る。Ｐ．ＩＩＩ融合生成物の提示については、３型及び３３型のベクターが通常使用される（Ｏｍｉｄｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５））。３型ベクターは、Ｐ．ＩＩＩタンパク質をコードする１コピーの遺伝子（ｇ．ＩＩＩ遺伝子）を含み、当該遺伝子へ関心対象の外来性ペプチドをコードする遺伝子がインフレームでクローン化され得る。結果として、各ペプチドは、各々、発現したＰ．ＩＩＩタンパク質と融合した５つのコピーにおいてファージ上で提示される。３型ベクターの使用は、短いペプチド、例えば、１２個またはそれより少数のアミノ酸を提示するのに効率的な方法であるが、より長いペプチドの提示は実質的に、ファージ感染力、それゆえ、その増殖（力価）を低下させ、したがって、非常に多様なペプチドライブラリの構築を防止する。３３型ベクターは、２コピー、すなわち野生型コピー及び組換えコピーのｇ．ＩＩＩ遺伝子を含む。野生型及び組換えのｇ．ＩＩＩ遺伝子は、同じアミノ酸配列を有するＰ．ＩＩＩタンパク質をコードするが、当該遺伝子は、ヌクレオチド配列において異なり、異なるシグナルペプチド配列を用いて発現する。例えば、野生型ｇ．ＩＩＩによってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質は、内在性の１８個のアミノ酸からなるシグナル配列を用いて発現し得るのに対し、組換えｇ．ＩＩＩによってコードされるＰ．ＩＩＩは、周辺質シグナル配列を用いて発現し得る。
【０００５】
３３型の系を用いて、外来性のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、１コピーのｇ．ＩＩＩ（すなわち、野生型または組換えの遺伝子）とともにインフレームでクローン化することができ、ファージコート表面上で立体障害を低下させながら、関心対象のペプチドの提示を可能にする。したがって、３３型ベクターは、より少数のコピー数であるにもかかわらず、より大きな外来性ペプチドに対して寛容性がある。しかしながら、より少数のコピー数は、標的特異的ペプチドの単離を成功させることについての制限を設け、その理由は、ペプチドが、親和性成熟に先立って、当該ペプチドの標的に対する親和性のより低いことを受けやすいからである。より低い提示レベルと組み合わせたより低い親和性は、ペプチドバリアントの大きなプールからの標的特異的ペプチドの検出を妨げる。
【０００６】
本発明に従って、改善された３３型ファージベクター系及び使用方法は、ペプチド、例えば３５個までのアミノ酸からなる長さのペプチドが複数のコピーにおいてＭ１３ファージ表面上でうまく提示されることができるように確立された。この形において、関心対象のペプチドの改善された提示は、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子における規定された変異を導入することによって達成される。これらの変異は、ファージ表面上の変異した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるポリペプチドの取り込みを低下させる。結果として、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質のより多数のコピーは、ファージ上で提示される。このことは、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子産物へ融合したまたはインフレームでクローン化したとき、関心対象の外来性ペプチドのより高い提示レベルを結果的に生じる。さらに、本発明のベクター及び方法は、３５個までのアミノ酸からなる長さのペプチドがファージコート表面上で提示されるときに、野生型バクテリオファージＭ１３に匹敵するレベルでファージ感染力を維持するバクテリオファージＭ１３粒子の生成を可能にする。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明は、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列及び配列番号２によって与えられるポリペプチド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを提供する。上述のバクテリオファージＭ１３ベクターに対する具体的な実施形態として、当該第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３によって与えられ、当該第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号４によって与えられる。上述のベクターに対する別の具体的な実施形態として、当該ベクターは、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列とともにかつ当該ポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。上述のベクターに対するさらなる具体的な実施形態として、当該ベクターは、配列番号１５によって与えられるポリヌクレオチドを含む。上述のベクターのうちのいずれかに対するなおもさらなる具体的な実施形態として、当該ベクターは、二本鎖ポリヌクレオチド分子である。
【０００８】
別の実施形態として、本発明は、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列とともにかつ当該ポリヌクレオチド配列の上流に、または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、外来性ポリペプチド、特に３５個までのアミノ酸からなる長さの外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、先に説明した３３型バクテリオファージＭ１３ベクターのうちのいずれかを提供する。より具体的には、当該外来性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列とともに、または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列とともに、インフレームで、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列の上流のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を介してクローン化される。より具体的には、当該外来性ポリペプチドは、７〜３５個のアミノ酸の長さである。
【０００９】
なおも別の実施形態において、本発明は、バクテリオファージＭ１３粒子を生成するための方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列及び配列番号２によって与えられるポリペプチド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む二本鎖３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを細菌宿主細胞へトランスフェクトすることと、（ｂ）当該細菌宿主細胞を、当該細菌宿主細胞における当該第１及び第２のポリヌクレオチド配列の発現ならびにバクテリオファージＭ１３粒子の集合に適した条件下でインキュベートすることと、（ｃ）当該細菌宿主細胞から、当該バクテリオファージＭ１３のコート表面上に独立して提示される配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列を含むバクテリオファージＭ１３粒子を回収することと、を含む。この実施形態に対してより具体的には、当該第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３によって与えられ、当該第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号４によって与えられる。別の具体的な実施形態として、本発明は、二本鎖のバクテリオファージＭ１３ベクターが、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列とともにかつ当該ポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローン化した、適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。なおも別の具体的な実施形態として、二本鎖のバクテリオファージＭ１３ベクターは、配列番号１５によって与えられるポリヌクレオチド配列を含む。さらにより具体的には、本発明は、二本鎖のＭ１３ベクターが、配列番号１によって与えられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とともにかつ当該ポリヌクレオチド配列の上流に、または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列の上流にインフレームでクローンされた、外来性ポリペプチド、特に３５個までのアミノ酸からなる長さの外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、上述の方法のうちのいずれかを提供する。別の具体的な実施形態として、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列とともに、または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列とともに、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列または適切な検出タグ配列をコードするポリヌクレオチド配列の上流にある、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を介して、インフレームでクローン化される。より具体的には、当該外来性ポリペプチドは、７〜３５個のアミノ酸からなる長さである。上述の方法に対する別の具体的な実施形態として、当該細菌宿主細胞は、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞またはＸＬＯ大腸菌細胞のようなＦ＋細菌株である。
【００１０】
なおも別の実施形態において、本発明は、バクテリオファージＭ１３粒子を提供し、当該粒子は、当該ファージ粒子のコート表面上で独立して提示される配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列を含む。より具体的には、本発明は、上述のバクテリオファージＭ１３粒子が、配列番号１のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端へ融合した適切な検出タグ配列をさらに含む当該ファージ粒子を提供する。より具体的にはさらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端へ、または適切な検出タグ配列のＮ末端へ融合した、外来性ポリペプチド、特に３５個までのアミノ酸からなる長さの外来性ポリペプチドをさらに含む上述のバクテリオファージＭ１３粒子のうちのいずれかを提供する。別の具体的な実施形態において、当該外来性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列へ、または適切な検出タグ配列へ、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端または適切な検出タグ配列のＮ末端と、当該外来性ポリペプチドのＣ末端とに融合したペプチドリンカーを介して融合している。より具体的には、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列へ、または検出タグ配列へ融合した外来性ポリペプチドは、７〜３５個のアミノ酸からなる長さである。
【００１１】
なおも別の実施形態において、本発明は、細菌宿主細胞を、バクテリオファージＭ１３粒子のコート表面上に独立して提示される配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列によって与えられるポリペプチド配列を含むバクテリオファージＭ１３粒子と接触させることを含む、当該細菌宿主細胞を感染させるための方法を提供する。より具体的には、本発明は、当該バクテリオファージＭ１３粒子がさらに、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端へ融合した適切な検出タグ配列をさらに含む、上述の方法を提供する。より具体的にはさらに、本発明は、当該バクテリオファージＭ１３粒子が、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端へ、または適切な検出タグ配列のＮ末端へ融合した外来性ポリペプチド、特に、３５個までのアミノ酸からなる長さの外来性ポリペプチドをさらに含む。より具体的には、当該外来性ポリペプチドは、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列へ、または適切な検出タグ配列へ、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列のＮ末端または適切な検出タグ配列のＮ末端と、当該外来性ポリペプチドのＣ末端とに融合したペプチドリンカーを介して融合している。より具体的には、配列番号１によって与えられるポリペプチド配列へ、または検出タグ配列へ融合した外来性ポリペプチドは、７〜３５個のアミノ酸からなる長さである。上述の方法に対する別の具体的な実施形態として、細菌宿主細胞は、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ大腸菌細胞またはＸＬＯ大腸菌細胞のようなＦ＋細菌株である。
【００１２】
Ｐ．ＩＩＩタンパク質融合生成物の発現及び提示のために３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを使用するとき、野生型及び組換えのｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質は、ファージ粒子への集合のために競合する。当該分野における先行研究は、Ｓｅｃシグナル配列のｃ領域における開裂部位及びｈ領域における一部の残基の修飾は、３＋３ベクター系を用いてファージ粒子上で提示される抗体フラグメントの発現上昇を結果的に生じることができることを実証した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４１１（２０１１）；３４８−３５３）。従来技術とは対照的に、本発明の目的は、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質の利益となるように、周辺質において発現する野生型及び組換えのｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされる遺伝子産物の比に影響を及ぼすこととする。本発明の結果として、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質の相対的な発現及び提示における上昇が達成され、このことは順に、外来性ペプチドをコードするヌクレオチドが、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子とともにインフレームでクローン化されるときに、このような外来性ペプチドの提示の上昇を結果的に生じる。
【００１３】
定義
「ベクター」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞またはゲノムへとライゲートされた別の核酸配列（または複数の核酸配列）を輸送することができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、典型的には二本鎖の環状ＤＮＡループを指し、当該プラスミドへ追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、この中で、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムへとライゲートされ得る。ある特定のベクターは、当該ベクターが導入された宿主細胞において自動複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター）。その上、ある特定のベクターは、プロモーター配列及びオペレーター配列のような適切な制御配列ならびに複製開始部位と組み合わされるときに操作上連結された遺伝子（例えば、関心対象の外来性のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子）の発現を定方位化することができる。このようなベクターは通常、「発現ベクター」と呼ばれ、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子の挿入のための複数のクローン化部位も含み得る。それに代わるものとして、関心対象のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発のような部位特異的変異誘発技術によって導入され得る（Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｋｕｎｋｅｌ’ｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １８２：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．）。
【００１４】
「３３型バクテリオファージＭ１３ベクター」は、本明細書で使用する場合、バクテリオファージＭ１３ゲノムの核酸配列を宿主細胞またはゲノムへ輸送することができ、かつバクテリオファージＭ１３ゲノムによってコードされる残りのタンパク質（Ｐ．Ｉ、Ｐ．ＩＩ、Ｐ．ＩＶ〜Ｐ．ＸＩ）の各々についてのコード領域に加えて、Ｐ．ＩＩＩ表面タンパク質の２つのコピー（すなわち、野生型及び組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子）についてのコード領域を含む「ベクター」を指す。本発明の３３型バクテリオファージＭ１３ベクターは、（変異していない）野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子及び組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩ表面タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｇ．ＩＩＩ遺伝子の野生型コピーにおいて変異を含有する。
【００１５】
「外来性の」または「外来の」ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該核酸が発現することになっている宿主細胞またはゲノムにおいて通常は存在しない核酸配列によってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００１６】
「適切な検出タグ」または「適切な検出タグ配列」は、本明細書で使用する場合、組換え技術を通じて関心対象の別のタンパク質またはペプチドへ移植され得るまたは融合し得るペプチド配列を指す。関心対象のタンパク質へのタグ配列の移植は、タンパク質の検出を、例えば、タグペプチド配列へ定方位化された抗体の使用によって可能にする。適切な検出タグ配列の決定は十分、当業者の知識内にある。本発明における使用に適した典型的な検出タグ配列には、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、及びＳ−タグが含まれる。
【００１７】
「インフレームでクローン化した」は、本発明で使用する場合、核酸配列（例えば、関心対象の特定のポリペプチドをコードする核酸配列）の、参照核酸または参照遺伝子（例えば、関心対象のポリペプチドが融合することになっている別個のタンパク質をコードする遺伝子）の同じオープンリーディングフレームへの挿入を指す。当業者が認識するように、当該挿入核酸は、参照遺伝子と連続して挿入され得、またはこれもまたインフレームでクローン化したリンカーコード配列の使用を通じて空間的に離れた部位で挿入され得る。さらに、当該挿入核酸は、参照核酸配列の上流または下流のいずれかへ挿入され得る。本明細書で使用する場合、「上流」は、関心対象の配列が翻訳中に参照核酸または参照遺伝子に先立って翻訳されるような、参照核酸または参照遺伝子に対する関心対象の核酸配列の場所または位置を指す。同様に、本明細書で使用する場合の「下流」は、関心対象の配列が翻訳中に参照核酸または参照遺伝子の後に翻訳されるような、参照核酸または参照遺伝子に対する関心対象の核酸配列の場所または位置を指す。
【００１８】
本明細書で使用する場合の「ペプチドリンカー」は、第１のペプチドまたはタンパク質を第２のペプチドまたはタンパク質へ融合させるまたは連結するポリペプチド配列を指す。リンカーポリペプチド配列のＮ末端は、アミド結合を通じて第１のペプチドまたはタンパク質のＣ末端へ共有結合し、一方リンカーポリペプチド配列のＣ末端は、これもまたアミド結合を通じて第２のペプチドまたはタンパク質のＮ末端へ共有結合している。本発明における使用に適した典型的なペプチドリンカーには、−（Ｇ３ＳＧ）ｎ−ペプチド配列及び−（Ｇ４Ｓ）ｎ−ペプチド配列のようなセリン含有ペプチド、ならびに−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−（配列番号３４）、−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＧＧＳ−（配列番号３５）、及び−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＰＰＧＰ−（配列番号３６）のようなαヘリックスリンカーが含まれる。
【００１９】
本明細書に開示されるポリペプチド鎖は、左から右へと読むときに、当該ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端へのアミノ酸配列によって示され、各アミノ酸は、１文字または３文字のいずれかのアミノ酸表記によって表される。アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｎ末端」（またはアミノ末端）は、当該アミノ酸上の遊離アミン基、または当該ポリペプチド鎖の最初のアミノ酸残基上の遊離アミン基を指す。同様に、アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｃ末端（またはカルボキシ末端）」は、当該アミノ酸上の遊離カルボキシ基、または当該ポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基上の遊離カルボキシ基を指す。
【００２０】
ベクター工学
Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発（Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ  Ｕｓｉｎｇ  Ｋｕｎｋｅｌ’ｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １８２：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．）を用いて、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質のＮ１領域の最初の６７個のアミノ酸を、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質へ融合した検出タグ配列、例えば、ｃ−ｍｙｃタンパク質（ＥＱＫＬＩＳＥＥＫＬ：配列番号７）の提示レベルをモニターしながら、異なるアミノ酸へ無作為に分ける。検出タグ配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、ｃ−ｍｙｃコード配列（ｇａｇｃａａａａｇｃｔｃａｔｔａｇｔｇａａｇａｇｇａｔｃｔｔ：配列番号８）を、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子とともにインフレームでクローン化する。機能的ｄＵＴＰアーゼ及びウラシルグリコシラーゼを欠損する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＲＺ１０３２（ＡＴＣＣ３９７３７）を用いて、親３３型バクテリオファージＭ１３ベクターのウラシル含有一本鎖ＤＮＡ（配列番号６）を調製する。６７個の変異原性プライマーを４つの異なるＫｕｎｋｅｌ反応へと分け、３つの反応は１７の変異を網羅し、１つの反応は１６の変異を網羅する。反応群における各プライマーは、完全に無作為に分けられることになっているアミノ酸に対応するＮＮＫコドンを含有し、同じ隣接配列を親ベクターと共有してすべてのプライマーが匹敵する効率性でテンプレートに対してアニールすることを確実にするよう設計される。
【００２１】
親ベクターの変異に続いて、修飾されたベクターをテンプレートとして使用して、二本鎖ＤＮＡを調製し、これを次にバクテリオファージＭ１３粒子の発現のために電気穿孔法によって細菌宿主細胞（例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞）へとトランスフェクトする。Ｍ１３ファージライブラリをスクリーニングするのに先立って、各ライブラリ由来の無作為ファージを配列決定して、各位置が特定のアミノ酸についていかなる偏りもなく、全部で２０個のアミノ酸へと完全に無作為に分けられることを確実にする。
【００２２】
ファージ収集及び力価判定
一晩の増幅後、ファージを次のように収集し得る。感染した細菌宿主細胞（例えば、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞）を３，０００ｒｐｍで約２０分間遠心分離する。次に、４０ｍｌの上清を真新しいフラスコへ移し、１０ｍＬのＰＥＧ溶液（３．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを含む２０％ＰＥＧ）の添加及び４℃で約９０分間のインキュベーションによってファージを沈殿させる。次に、この混合物を１３，０００ｒｐｍで約４５分間遠心分離する。次に、ペレットを１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液、ｐＨ７．４）中で再懸濁し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、残余の細胞片を除去する。次に、上清を真新しいチューブへ移し、２００μｌのＰＥＧ溶液を添加し、この混合物を氷上で約３０分間インキュベートする。次に、この混合物を４℃、１３，０００ｒｐｍで約４５分間回転させる。結果として生じるペレットを２００〜５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１３，０００ｒｐｍで約５分間遠心分離して、残余の細胞片を除去する。次に、この上清を真新しいチューブへ移し、細菌細胞残渣が存在しなくなるまで遠心分離過程を反復する。
【００２３】
次に、この上清を次のような力価測定のために真新しいチューブへ移してもよい。ファージ含有上清の連続希釈物を調製し、次に、１００μｌの各希釈物を真新しいチューブへ入れた後、一晩生育させておいた３００μｌの細菌細胞（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞）を添加する。この混合物を室温で約１５分間インキュベートした後、３ｍｌの軟質寒天を各チューブに添加する（軟質寒天は、次のように調製してもよい。２５０ｍｌボトルを５０ｍｌの溶原性ブロス（ＬＢ）で満たし、２．０８Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ粉末（Ｆｉｓｈｅｒ  ＤＦ０１４０−０１−１）を添加した後、回転混合させる。適量の混合物を追加のＬＢで２５０ｍｌにし、４５分間オートクレーブして、５５℃で保存する）。この混合物をさっとボルテックスした後、ＬＢプレートへ添加し、３７℃で一晩インキュベートする。次に、結果として生じるプラークを計数し、力価をプラーク形成単位（ｐｆｕ）として判定する。
【００２４】
ファージ感染及び増殖
特定のファージクローンの増殖のために、次の手順を採用してもよい。細菌宿主細胞（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の単一のコロニーを、テトラサイクリンを補充した３７℃の５０ｍｌの２ＹＴ培地中で振盪しながら、０．４〜０．６ＯＤ６００の密度まで生育させる。およそ１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）のファージをこの細菌培養物へ添加した後、この混合物を３７℃で約３０分間静置させてインキュベートして、ファージ感染を可能にする。次に、感染した細胞培養物を３７℃で１２〜１５時間振盪しながらインキュベートして、ファージ増殖を可能にする。
【００２５】
バクテリオファージＭ１３スクリーニング
捕捉フィルタ挙上アッセイ
組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩタンパク質へ融合したｃ−ｍｙｃのより多量の提示を結果的に生じる変異を識別するために、捕捉フィルタ挙上アッセイを使用してもよい（Ｗｕ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０１７．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗｅｉｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｓ編）。簡潔には、ニトロセルロースフィルタを２μｇ／ｍｌの抗バクテリオファージＭ１３抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７−９４２０−０１）でコーティングした後、カゼインでブロッキングしてからプラーク挙上を行う。より暗色の色彩で現れるｃ−ｍｙｃタンパク質のより高い提示レベルを提示するプラークとの抗ｃ−ｍｙｃ抗体−アルカリホスファターゼ共役体（ＳＩＧＭＡ  Ａ５９６３）によって、ｃ−ｍｙｃ提示レベルを検出する。次に、ｃ−ｍｙｃタグの提示レベルがより高いプラークを、配列決定のために単離する。より強いｃ−ｍｙｃシグナルを結果的に生じた変異を持っている配列決定したＭ１３ファージを、後でさらに説明するように、単一点のファージ力価依存性ＥＬＳＩＡを含むさらなるスクリーニングのために増幅してもよい。
【００２６】
単一点のファージ力価依存性ＥＬＩＳＡ
単一点ＥＬＩＳＡのために、ｃ−ｍｙｃ提示レベルが高くなった個々のバクテリオファージＭ１３ファージ（例えば、フィルタ挙上アッセイによって識別）を、２ｍｌのＸＬ１−ｂｌｕｅ細菌培養物を用いて一晩増殖させる。増殖後、この培養物を回転させて、上清（ファージ含有）を本アッセイにおいて使用する。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートを抗バクテリオファージＭ１３抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７−９４２０−０１）で一晩コーティングし、カゼインでブロッキングする。Ｍ１３ファージ含有上清を入れ、ｃ−ｍｙｃ提示を、アルカリホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ  Ａ５９６３）へ共役した抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって検出する。ｃ−ｍｙｃ提示レベルを、適切な基質を用いて適切な波長でＯＤを測定することによる分光測光によって測定する。より高いｃ−ｍｙｃペプチド提示レベルを示すファージを、個々のクローンについてのｃ−ｍｙｃ提示レベルがある範囲の力価にわたって測定され、親ベクター（すなわち、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子（変異なし）を含有するベクター、及び組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子とともにインフレームでクローン化されるｃ−ｍｙｃタンパク質）のトランスフェクションによって得られるクローンについてのｃ−ｍｙｃ提示レベルと比較される力価依存性ファージＥＬＩＳＡにおいてさらに確認してもよい。
【００２７】
実施例１
バクテリオファージＭ１３表面上でのｃ−ｍｙｃタグ−Ｐ．ＩＩＩ融合体の提示
ｌａｃＺプロモーターの制御下で、各々の遺伝子がＰ．ＩＩＩ表面タンパク質のコピーをコードする野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子（配列番号５）及び組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子（配列番号３）の両方を含む３３型バクテリオファージＭ１３親ベクターを用いて、ならびにそれぞれ内在性Ｐ．ＩＩＩシグナルペプチド及びｐｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１７及び配列番号１９）をそれぞれ用いて、本質的には先に説明したように、野生型ｇ．ＩＩＩのＮ１領域における単一のアミノ酸を無作為に分ける。成熟野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物におけるＬ８Ｐ置換またはＳ１１Ｐ置換をコードする、変異を含む修飾されたベクターを構築し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中へとトランスフェクトして、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子とともにかつ当該遺伝子の上流にインフレームでクローン化したｃ−ｍｙｃタグをコードする配列（配列番号８）を発現させる。本質的には先に説明したように、結果として生じるＰ．ＩＩＩ−ｃ−ｍｙｃ融合タンパク質を、収集したＭ１３粒子の表面上に提示し、ファージ力価依存性ＥＬＩＳＡによってｃ−ｍｙｃディスプレイレベルを検出する。
【００２８】
以下の表１は、親野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子及び変異した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子、ｃ−ｍｙｃタグコード配列、シグナルペプチドコード配列ならびにこれらによってコードされる、結果として生じるアミノ酸配列を提供する。表２は、ファージ力価依存性ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【表１】
0006530863.tif 000002
【表２】
0006530863.tif 000003
【００２９】
表２は、ＰＭＰ／ＡＭＰ基質を用いて、概して先に説明したような力価依存性ＥＬＩＳＡに由来するＯＤ５６０値を提供し、成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物におけるＬ８Ｐ置換またはＳ１１Ｐ置換をコードする変異を含有する３３型Ｍ１３ファージベクターを用いるとき、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩ表面タンパク質へ融合したｃ−ｍｙｃタンパク質の発現亢進が得られることを実証する。
【００３０】
実施例２
ファージＭ１３表面上での検査ペプチド−Ｐ．ＩＩＩ融合体の提示（野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子における８Ｐ置換＋１１Ｐ置換の組み合わせを使用）
成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物（配列番号２）におけるＬ８Ｐ及びＳ１１Ｐの両方の置換をコードする変異を含む、さらに修飾された３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを構築する。当該遺伝子産物をコードする例示的な核酸配列は、配列番号４によって与えられる。同じベクターにおいて、検査ペプチドをコードする核酸配列（後で配列番号１０、１２、及び１４によって与えられる）を個別に、ｃ−ｍｙｃタグコード配列（配列番号８）へ、リンカーペプチドコード配列を介してインフレームでクローン化し、当該ｃ−ｍｙｃタグコード配列を順に、当該ベクターにおける組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子配列（配列番号３）とともにかつ当該組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子配列の上流にインフレームでクローン化する。また、同じ検査ペプチドをコードする核酸配列を各々別個に、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子におけるＬ８ＰまたはＳ１１Ｐをコードするいずれの核酸の変異も含まない（配列番号５は、Ｌ８ＰまたはＳ１１Ｐコード変異がない親の野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子の核酸配列を提供する）親３３型バクテリオファージＭ１３ベクター中へと（先に説明したのと同じ様式及びフォーマットで）クローン化する。
【００３１】
表３は、変異した及び親の野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子、ｃ−ｍｙｃタグコード配列、リンカーペプチドコード配列及び調製した例示的なベクタークローンの検査ペプチドコード配列の核酸配列を提供する。
【００３２】
結果的に生じるベクターを用いて、ＸＬ−１−ｂｌｕｅ細菌細胞から収集したＭ１３バクテリオファージ粒子の表面上に検査ペプチド−Ｐ．ＩＩＩ融合タンパク質を提示した。採用された検査ペプチドは、後でさらに説明するようなヒトＩＬ−６標的タンパク質と結合する。表４は、収集したＭ１３ファージ粒子上で提示された融合タンパク質産物の構成要素の対応するアミノ酸配列を提供する。
【表３】
0006530863.tif 000004
【表４】
0006530863.tif 000005
【００３３】
検査ペプチド−Ｐ．ＩＩＩ融合タンパク質を提示する収集したファージを増殖させ、概して先に説明したように力価判定を実施する。次に、本質的には後で説明するように、検査ペプチド提示レベルを、ファージ力価依存性ＥＬＩＳＡによって判定する。
【００３４】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号：６５００６１）をＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌでの５０μｌ／ウェルのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１０５０）でコーティングし、４℃で一晩静置させる。１００μｌ／ウェルのカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：３７５２８）を室温で１時間添加することによって、過剰部位をブロッキングした。次に、ＰＢＳ中での５０μｌ／ウェルのビオチン化ヒトＩＬ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を各ウェルへ入れ、このプレートを室温で３０分間揺り動かしながらインキュベートする。次に、異なる力価の５０μｌ／ウェルのファージを添加し、このファージをＰＢＳ中の１％ＢＳＡの終濃度で希釈する。次に、プレートを室温で６０分間揺り動かしながらインキュベートする。次に、ＰＢＳ中の０．１％トゥイーン中で１：５，０００に希釈した５０μｌ／ウェルの抗Ｍ１３−ＨＲＰ（Ｇ．Ｅ．、カタログ番号：２７−９４２１−０１）を添加した後、このプレートを室温で６０分間インキュベートする。次に、５０μｌ／ウェルのＵｌｔｒａテトラメチルベンジジン基質（Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：３４０２９）を添加し、６５０ｎｍでＯＤを測定する。
【００３５】
以下の表５は、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子においてＬ８Ｐコード変異及びＳ１１Ｐコード変異をコードする３３型バクテリオファージＭ１３ベクターならびに親３３型バクテリオファージＭ１３ベクター（野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子におけるＬ８Ｐ及びＳ１１Ｐコード変異がない）を用いて個別に各々調製したファージクローン１８−２４、１８−２２、及び１８−４についてのある範囲のファージ力価にわたって得られたＯＤ６５０値を提供する。
【表５】
0006530863.tif 000006
【００３６】
表５におけるＯＤ６５０値は、成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物においてＬ８Ｐ置換及びＳ１１Ｐ置換をコードする３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを用いるとき、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩ表面タンパク質へ（ペプチドリンカーを介して）融合した各検査ペプチドの発現亢進が得られることを実証する。
【００３７】
実施例３
ファージＭ１３表面上でのＦａｂ−Ｐ．ＩＩＩ融合体の提示
それぞれ配列番号２５及び配列番号２６によって与えられるＦａｂ重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列をコードする核酸配列を、成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物におけるＬ８Ｐ置換及びＳ１１Ｐ置換をコードする変異を含む３３型バクテリオファージＭ１３ベクター中へとクローン化する。ＰｈｏＡ１シグナルペプチドコード配列（配列番号３０）を用いて、Ｆａｂ  ＨＣをコードする核酸配列（配列番号２７）を、スペーサーコード配列を介して、ＨＡ−タグコード配列（配列番号３２）及びｃ−ｍｙｃタグコード配列（配列番号８）に対してインフレームで上流にクローン化し、これを順に当該ベクター中の組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子配列（配列番号３）のフレーム及び上流においてクローン化する。Ｆａｂ  ＬＣをコードする核酸配列（配列番号２８）を、ｐｅｌＢシグナルペプチドコード配列（配列番号１９）を用いて当該ベクター中へとクローン化する。ＨＣ及びＬＣの両Ｆａｂコード構成要素の転写は、ｌａｃＺプロモーターの制御下にある。
【００３８】
上に説明したようにＦａｂのＨＣ配列及びＬＣ配列を含む二本鎖ベクターを調製し及び使用して、本質的には先に説明したように大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞へトランスフェクトする。ＬＣ配列（配列番号２６）を細菌周辺質空間中へと分泌させ、当該空間で、ＬＣ配列は、ＨＡ−タグ（配列番号３１）及びｃ−ｍｙｃタグ（配列番号７）を介して組換えＰ．ＩＩＩタンパク質へ融合したＨＣ配列（配列番号２５）とともにＦａｂ二量体を形成する。
【００３９】
Ｆａｂ−Ｐ．ＩＩＩ融合タンパク質を提示する収穫したファージを増殖させ、概して先に説明したように力価判定を実施する。次に、概してＮａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｍ１３，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２（１９９６）：１９７−２０７において説明されるように標的リガンドとしてビオチン化ＴＮＦαを用いたファージ−力価依存性ＥＬＩＳＡによって、Ｆａｂ提示レベルを判定する。
【００４０】
以下の表６は、野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子においてＬ８Ｐコード変異及びＳ１１Ｐコード変異をコードする３３型バクテリオファージＭ１３ベクター、ならびに親３３型バクテリオファージＭ１３ベクター（野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子におけるＬ８Ｐコード変異及びＳ１１Ｐコード変異はない）とともに個別に調製した、Ｆａｂコンストラクトを提示するファージクローンについてのある範囲のファージ力価にわたって得られたＯＤ６５０値を提供する。
【表６】
0006530863.tif 000007
【００４１】
表６におけるＯＤ６５０値は、成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物におけるＬ８Ｐ置換及びＳ１１Ｐ置換をコードする変異を含有する３３型バクテリオファージＭ１３ベクターを用いるとき、組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされるＰ．ＩＩＩ表面タンパク質へ（ペプチドスペーサーを介して）融合したＦａｂの発現の上昇が得られることを実証する。
【００４２】
配列表
配列番号１（組換え及び野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子によってコードされる成熟したファージＭ１３表面タンパク質Ｐ．ＩＩＩ（シグナルペプチドを有しない））
ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＳＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦＨＳＧＦＮＥＤＬＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＱＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＧＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ
配列番号２（変異した野生型ｇ．ＩＩＩによってコードされる成熟した変異したファージＭ１３表面タンパク質Ｐ．ＩＩＩ（Ｌ８Ｐアミノ酸置換＋Ｓ１１Ｐアミノ酸置換）（シグナルペプチドを有しない））
ＡＥＴＶＥＳＣＰＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦＨＳＧＦＮＥＤＬＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＱＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＧＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ
配列番号３（組換えｇ．ＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列（シグナルペプチドコード配列を有しない））
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配列番号４（変異した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｌ８Ｐ＋Ｓ１１Ｐアミノ酸置換をコードする）（シグナルペプチドコード配列を有しない））
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配列番号５（野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列（シグナルペプチドコード配列を有しない））
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配列番号６（組換え及び野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子を有する親３３型プラスミドについてのヌクレオチド配列（Ｌ８Ｐコード変異及びＳ１１Ｐコード変異を有しない）（シグナルペプチドコード配列を含む）
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配列番号７（ｃ−ｍｙｃ検出タグアミノ酸配列）
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
配列番号８（ｃ−ｍｙｃ検出タグをコードするヌクレオチド配列）
ｇａｇｃａａａａｇｃｔｃａｔｔａｇｔｇａａｇａｇｇａｔｃｔｔ
配列番号９（クローン１８−２４  ＩＬ−６結合検査ペプチド配列）
ＲＴＦＣＫＥＦＧＲＹＶＡＤＥＴＹＣＡＡＬ
配列番号１０（クローン１８−２４  ＩＬ−６結合検査ペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ａｇｇａｃｔｔｔｔｔｇｔａａｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｇｇｔａｔｇｔｔｇｃｇｇａｔｇａｇａｃｇｔａｔｔｇｔｇｃｔｇｃｇｃｔｔ
配列番号１１（クローン１８−２２  ＩＬ−６結合検査ペプチド配列）
ＩＳＬＣＤＱＰＹＶＫＳＬＮＬＰＬＣＰＬＡ
配列番号１２（クローン１８−２２  ＩＬ−６結合検査ペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ａｔｔｔｃｔｔｔｇｔｇｔｇａｔｃａｇｃｃｇｔａｔｇｔｔａａｇａｇｔｃｔｔａａｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｔｇｔｃｃｇｃｔｔｇｃｔ
配列番号１３（クローン１８−４  ＩＬ−６結合検査ペプチド配列）
ＰＰＬＣＳＷＰＡＹＱＫＦＧＧＰＬＣＴＬＧ
配列番号１４（クローン１８−４  ＩＬ−６結合検査ペプチドをコードするヌクレオチド配列）
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配列番号１５（組換えｇ．ＩＩＩ及び変異した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子を有する３３型プラスミドについてのヌクレオチド配列（Ｌ８Ｐコード変異及びＳ１１Ｐコード変異を有する）（シグナルペプチドコード配列を含む）
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配列番号１６（クローン１８−２４、１８−２２、及び１８−４ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列）
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配列番号１７（内在性バクテリオファージＭ１３  Ｐ．ＩＩＩシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列）
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配列番号１８（内在性バクテリオファージＭ１３  Ｐ．ＩＩＩシグナルペプチドのアミノ酸）
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配列番号１９（ｐｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列）
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配列番号２０（ｐｅｌＢシグナルペプチド）
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配列番号２１（Ｌ８Ｐ置換を含む成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物のアミノ酸配列）（シグナルペプチドを有しない）
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配列番号２２（Ｓ１１Ｐ置換を含む成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物のアミノ酸配列）（シグナルペプチドを有しない）
ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦＨＳＧＦＮＥＤＬＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＱＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＧＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ
配列番号２３（Ｌ８Ｐ置換を含む成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列）（シグナルペプチドを有しない）
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配列番号２４（Ｓ１１Ｐ置換を含む成熟した野生型ｇ．ＩＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列）（シグナルペプチドを有しない）
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配列番号２５（Ｆａｂ＿ＨＣアミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣ
配列番号２６（Ｆａｂ＿ＬＣアミノ酸配列）
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配列番号２７（Ｆａｂ＿ＨＣをコードするヌクレオチド配列）
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配列番号２８（Ｆａｂ＿ＬＣをコードするヌクレオチド配列）
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｔａｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｔｔｇｃｃｇｇｇｃｇａｇｔｃａｇｇｇｃａｔｔｃｇｃａａｔｔａｔｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇａａａｇｃｔｃｃｔａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｇｃｔｇｃａｔｃｃａｃｔｔｔｇｃａａｔｃａｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｔｃｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｔｇａａｇａｔｇｔｔｇｃａａｃｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａａｃｇｃｔａｔａａｃｃｇｔｇｃｃｃｃｔｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａａａｔｃａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
配列番号２９（Ｐｈｏ  Ａシグナルペプチド）
ＶＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＡＫＡ
配列番号３０（Ｐｈｏ  Ａシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ｇｔｇａａａｃａａａｇｃａｃｔａｔｔｇｃａｃｔｇｇｃａｃｔｃｔｔａｃｃｇｔｔａｃｔｇｔｔｔａｃｃｃｃｔｇｔｃｇｃａａａａｇｃｃ
配列番号３１（ＨＡタグペプチド）
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ
配列番号３２（ＨＡタグペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ｔａｃｃｃｇｔａｃｇａｃｇｔｔｃｃｇｇａｔｔａｔｇｃｃａｇｃ
配列番号３３（クローン１８−２４、１８−２２、及び１８−４ペプチドリンカーアミノ酸配列）
ＧＧＧＳＧ
配列番号３４（リンカーペプチド）
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ
配列番号３５（リンカーペプチド）
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＧＧＳ
配列番号３６（リンカーペプチド）
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＰＰＧＰ
【配列表】
0006530863000001.app