(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粉化した羊膜を含む、所定の大きさおよび形状の成型脱水胎盤組織組成物を製造する方法であり、前記方法は、微粉化した羊膜を１〜５０００ＭＰａの範囲の圧力で、１０秒〜１０分圧縮する工程を含み、
前記組成物は、１．２ｇ／ｃｍ３〜１０ｇ／ｃｍ３の密度を有し、前記羊膜は脱細胞されておらず、前記組成物は架橋されていない、ことを特徴とする、成型脱水胎盤組織組成物を製造する方法。
【請求項２】
前記組成物は、微粉化した絨毛膜または微粉化した中間層をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物の含水率は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粉化した羊膜は、粒径が、約４００μｍ未満、約３５０μｍ未満、約３００μｍ未満、２００μｍ未満、または１５０μｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
胎盤組織組成物は、創傷の治癒の促進における使用のための、創傷部位または創傷部位の近傍に塗布する用の組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胎盤組織組成物は、皮下に、真皮下に、筋肉内に、または骨膜移植の境界面に投与されるように構成されている、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成型脱水胎盤組織、詳細には、成型脱水胎盤組織組成物に関する。当該組成物は、脱水微粉化胎盤組織から調製される。本発明は、当該組成物の製造および使用方法をも含む。
【背景技術】
【０００２】
胎盤組織は、創傷被覆材および創傷治癒の土台として、当該技術分野で公知である。通常胎盤組織は、選択的帝王切開後に回収される。胎盤は、２つの主要な組織層である羊膜（ａｍｎｉｏｎ）および絨毛膜を有する羊膜嚢（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）からなる。羊膜組織は、羊膜腔の最内層であり、羊水と直接接する。羊膜腔は、羊水を含有し、胎児環境を保護する。組織学的評価は、羊膜の膜層が、単層の上皮細胞、薄い細網線維  （基底膜）、厚い緻密層，および線維芽細胞層からなることを示している。羊膜の線維層（すなわち、基底膜）は、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩＩ型コラーゲン、ならびにフィブロネクチンおよびラミニンを含む細胞接着の生理活性因子を含有する。以前は、胎盤組織成分を含む創傷被覆材または創傷治癒組成物は、通常、その形態を移植片とし、羊膜および／または絨毛膜等の個々の層が、移植片の控え目な成分を形成していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような組織移植片には、医療上の非常に大きな利点があるものの、当該移植片は、非常に薄く、患者の臓器または身体部位への挿入のための非侵襲的手段となるための構造的適格性に欠く。
【０００４】
脱水微粉化胎盤組織成分が、創傷治癒およびその他医学的用途のために、患者の内部または上部へ非侵襲的に導入することができる形状および大きさに成型される独特なアプローチが、本明細書に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部分では、成型脱水微粉化胎盤成分を含む組成物およびその医薬組成物は、単独で、あるいは、創傷被覆材またはインプラントの一部として使用する場合に、大きな利点を与えるという発見に関する。したがって、成型脱水微粉化胎盤成分を含む当該組成物は、多くの医学的用途がある。
【０００６】
一態様では、本発明は、所定の大きさおよび形状の、成型脱水胎盤組織組成物に関する。組成物は、羊膜、絨毛膜、中間組織層、およびそれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の胎盤組織成分を含む。本発明の胎盤組織組成物は、少なくとも、成型脱水胎盤組織組成物が対象に入れられるまで、その大きさおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性を有する。
【０００７】
一実施形態では、成型胎盤組織組成物は、胎盤組織成分が任意の所望の形状に形成されてよく、成型胎盤組織組成物を対象へ導入する間、その形状を維持するのに十分な密度である。例えば、胎盤組織組成物の密度は、少なくとも約１．２ｇ／ｃｍ３〜約１０ｇ／ｃｍ３の範囲である。そのような成型胎盤組織組成物を、本明細書に記載されるように、患者に非侵襲的に導入するか、または従来の侵襲的手段で導入することができる。これにより、当技術分野の技術の範囲内で、治療の目的、患者の年齢および状態、ならびに他の要因を十分に考慮して、患者を治療する上で、担当臨床医に高い柔軟性を与える。
【０００８】
別の実施形態では、成型脱水胎盤組織組成物は、対象へ導入される間に、胎盤組織組成物が壊れず、裂けず、分解せず、断片化しないために十分な凝集性がある。好適な密度および凝集性の大きさは、導入の目的、使用される胎盤組織組成物の量、投与／導入の方式、および投与される特定の身体部位に基づき、当業者により決定することができる、成型脱水胎盤組織組成物の所望の形状は、少なくとも対象に導入されるまで、維持される。
【０００９】
成型脱水胎盤組織組成物は、導入後、滅失するように設計され、その大きさ同様、滅失のための期間は、成型脱水胎盤組織の密度および凝集性の度合いにより、定められる。滅失の間、成長因子および他の生物学的因子は、胎盤組織から経時的に放出され、それにより、投与／導入の場における持続的な放出を提供する。
【００１０】
関連する態様では、所定の大きさおよび形状の胎盤組織組成物は、脱水微粉化胎盤組織成分またはその任意の組み合わせのうち少なくとも１つを好適な圧縮圧下、例えば１〜５０００ＭＰａの範囲の圧力で、所定の時間、例えば、１０秒〜１０分、またはそれ以上の時間、圧縮することにより得られ、得られた胎盤組織は、少なくとも投与または装着までその大きさおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性の大きさを有する。
【００１１】
圧縮前に、微粉化胎盤成分は、非多孔性の型で圧縮を行うことができる範囲まで脱水される。言い換えると、脱水微粉化胎盤成分の含水率は、非多孔性の型で本発明の組成物を形成するための圧縮を行うことができるほどに低い。例えば、脱水微粉化胎盤成分の含水率は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満であることが好ましい。
【００１２】
微粉化された羊膜、絨毛膜、中間組織層、およびそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つを圧縮するために好適な手段を使用することは、当業者の理解の範囲にある。例えば、微粉化胎盤組織は、任意の所望の大きさおよび形状の型を使用することを通して圧縮され、所望の大きさおよび形状を得てもよい。
【００１３】
微粉化成分を成型型へ入れ、圧力をかけ、圧縮後に胎盤組織組成物を型の形状とする任意の成型技術を選択することは、当業者の理解の範囲にある。成型胎盤組織組成物は、ピン形、釘形、樽形、リベット形、矢形、膜形等の任意の所望な形状とすることができる。特定の実施形態では、得られた成型脱水胎盤組織組成物は、移植片に中空または空洞がある。組成物の空洞は、レーザーの使用により、出来上がり、組成物内にまたは組成物を通る溝を通す。当業者であれば、一度、成型胎盤組織組成物が成形されると、レーザードリルによりキャビテーション等の形成後処理を施され、胎盤組織組成物の表面積を増やされることは、理解できるであろう。
【００１４】
一実施形態では、脱水微粉化胎盤成分の圧縮は、胎盤組織に含まれるタンパク質、成長因子、および他の生物学的因子の変性を最小化するよう制御された温度で行われる。成型は、型内の温度を上昇させることがあるため、成型工程に合わせてヒートシンクが採用され、温度上昇を制御することができる。
【００１５】
また、本発明は、成型胎盤組織組成物を製造するための方法、および使用するための方法にも関する。
【００１６】
本発明のいくつかの利点は、以下の説明に部分的に記載されており、その説明から部分的に明らかになるか、あるいは、以下に記載する態様の実施により知ることができる。以下に記載する利点は、特に添付の特許請求の範囲に示されている要素および組み合わせを用いて実現および達成される。上記一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも単に例示および説明のためのものであり、それらに限定するものではないことを理解されたい。
【００１７】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、以下に記載するいくつかの態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書に記載される成型脱水胎盤組織組成物の製造方法の概略フローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を開示および説明する前に、以下に記載する態様は、特定の組成物、方法またはそのような組成物を調整すること、もしくはその使用に限定されず、従って、当然のことながら変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、単に特定の態様を記述するためのものであって、本発明を限定するものではないことも理解されたい。
【００２０】
本明細書および以下の特許請求の範囲では、多くの用語に触れるが、それらは以下の意味を有するものとする。
【００２１】
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形の「１つ（種）の（ａ）」「１つ（種）の（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別の意を示していない限り、複数の指示物を含む。従って、例えば、「生物活性剤」という場合、２種以上のそのような薬剤の混合物などを含む。
【００２２】
「任意の」または「任意に」とは、その後に記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、その記載は、事象または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含む。例えば、「任意の洗浄工程」という語句は、洗浄工程を行っても行わなくてもよいことを意味する。
【００２３】
本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒト、家畜、飼い慣らされたペット等の哺乳動物対象を含むが、これらに限定されない、任意の脊椎動物生物である。
【００２４】
本明細書で使用する「羊膜」という用語は、中間組織層がそのまま残っているかまたは実質的に除去されている羊膜嚢を含む。
【００２５】
「胎盤組織」という用語は、羊膜、絨毛膜、およびホウォートンゼリーなどを含むが、これらに限定されない、胎盤の公知の構成要素のいずれかおよび全てを指す。１つの好ましい実施形態では、胎盤組織は、臍帯要素（例えば、ホウォートンゼリー、臍帯静脈および動脈、ならびに周囲膜）のうちいずれかを含まない。
【００２６】
「成型する」、「成型された」または「成型すること」は、実際の型の使用、圧力下での押出、スタンピング、および任意の加圧法等の成型の任意の形態を含み、羊膜、絨毛膜、中間組織層、およびそれらの任意の組み合わせなど微粉化胎盤組織成分を圧力下で圧縮し、ｅｘ  ｖｉｖｏまたは  ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて使用される所定の時間、所定の大きさおよび形状である胎盤組織組成物を産生する。成型胎盤組織組成物は、その大きさおよび形状を維持するために十分な密度および凝集性を有する。
【００２７】
本明細書では、読者の便宜上、タイトルまたはサブタイトルを使用している場合もあるが、それらは、本発明の範囲に影響を与えるものではない。さらに、本明細書で使用するいくつかの用語については、以下により具体的に定義する。
【００２８】
Ｉ．成型脱水微粉化胎盤成分を含む組成物
成型脱水胎盤組成物およびその医薬組成物を本明細書に記載する。そのような組成物は、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１２／２４７９８号、ならびに米国仮出願第６１／４４２，３４６号、米国仮出願第６１／５４３，９９５号、および米国仮出願第６１／６８３，７００号に記載される微粉化胎盤組織成分から調製される。これらの出願の開示内容全体が、参照により明確に本明細書に組み込まれる。「微粉化された」という用語が、ミクロンおよびサブミクロンサイズの胎盤組織粒子を含むことを理解されたい。
【００２９】
一態様では、本発明は、（ａ）微粉化された羊膜、絨毛膜、中間組織層、およびそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つを含む成型脱水胎盤組織と、任意に（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
【００３０】
例えば、組成物は、任意の充填剤、安定剤、バッファ、または医薬成分を添加せずに使用できる成型脱水胎盤組織を含む。あるいは、組成物は、成型脱水胎盤組織と、充填剤、安定剤、バッファ、着色剤、および分解剤等の少なくとも１つの医薬賦形剤と、任意に、１つ以上の医薬成分とを含む。着色剤は、胎盤組織の場所を決め、目標治療部位に適切に配置することを容易にするが、それは、ほぼ透明であることもあることが好ましい。分解剤は、成型脱水胎盤組織組成物を対象に入れた後、ｉｎ  ｖｉｖｏにて滅失または分解する割合を変更する。
【００３１】
組成物は、微粉化された羊膜および絨毛膜を含むことが好ましい。また別の態様では、組成部鵜は、微粉化羊膜を含む成型脱水胎盤組織を含む。また別の態様では、組成物は、微粉化羊膜を含む成型脱水胎盤組織を含み、この羊膜からは、上皮層が実質的に除去されている。
【００３２】
当業者であれば、成型胎盤組織組成物の凝集性が、特定の密度を有する大きさである限り、本発明の成型脱水胎盤組織組成物が、任意の形状または大きさに、圧力下で圧縮されることは、理解するであろう。
【００３３】
あるいは、微粉化胎盤成分は、成型脱水胎盤組織移植片が、型の形状および大きさになるように、所望の形状または大きさの任意の型に圧縮される。所望の形状および大きさを形成するため、シリコン、樹脂、テフロン（登録商標）またはステンレススチール等の好適な型の材料を選択することは、当業者の理解の範囲にある。
【００３４】
有利なことに、本明細書に記載の成型脱水胎盤組織組成物は、吸水性が低く、胎盤組織組成物の形状は、少なくとも患者へ導入される時間にわたって、好ましくは、対象への導入後のｉｎ  ｖｉｖｏでの時間、維持される。胎盤組織組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで滅失し、胎盤組織に含まれている成長因子および他の生物学的因子を放出することを理解されたい。従って、成型脱水胎盤組織の形状の維持は、例え、形状が滅失の対象となるまたは滅失を惹起したとしても、全体の形状を維持することを意味する。
【００３５】
ＩＩ．成型脱水微粉化胎盤成分を含む組成物の製造方法
図１は、成型脱水微粉化胎盤材料の回収、処理および調製工程の概略（１００）および特定の態様を示す。各個々の工程に関するより詳細な説明および考察を以下に記載する。最初に、胎盤組織を、選択的帝王切開後に、承諾している患者から回収する（工程１１０）。この材料を、従来の組織保存法で保存し、検査および評価に適した処理場所または施設に輸送する（工程１２０）。次いで、組織層の総処理、取扱いおよび分離を行う（工程１３０）。次いで、許容可能な組織を汚染除去し（工程１４０）、脱水する（工程１４５）。次いで、胎盤組織成分（例えば、個々のまたは移植片としての、羊膜、中間組織層、および／または絨毛膜）を、汚染除去および脱水後に、微粉化する（工程１５０）。微粉化胎盤成分を所望の形状または大きさに圧力下で圧縮／成型する（工程１６０）。各工程について以下に詳細に説明する。
【００３６】
最初の組織回収（工程１１０）
本明細書に記載の成型脱水胎盤組織組成物を生成するために使用される成分は、胎盤に由来している。胎盤供給源は異なってもよい。一態様では、ヒトおよび他の動物（限定するものではないが、ウシおよびブタなど）等の哺乳類に由来する胎盤を本明細書で使用することができる。ヒトの場合、胎盤の回収は病院で行われ、帝王切開分娩中に胎盤が回収されることが好ましい。提供者（出産間近の母親を指す）は、移植が可能な最も安全な組織を得るために設計された包括的スクリーニングプロセスを自発的に受ける。スクリーニングプロセスは、従来の血清学的検査を用いて、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型に対する（抗ＨＩＶ−１および抗ＨＩＶ−２）抗体、Ｂ型肝炎ウイルスに対する（抗ＨＢＶ）抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体、Ｃ型肝炎ウイルスに対する（抗ＨＣＶ）抗体、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型および２型に対する（抗ＨＴＬＶ−Ｉ、抗ＨＴＬＶ−ＩＩ）抗体、ＣＭＶおよび梅毒に対する抗体について試験する、およびヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）についておよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）について核酸試験をすることが好ましい。当業者には理解されるように、時間の経過または移植片の目的の使用に基づいて、より多くの試験、より少ない試験または異なる試験が望まれたり必要となったりすることがあるため、上記試験の列挙は単に例示である。
【００３７】
提供者の情報の確認およびスクリーニング試験の結果に基づいて、提供者が許容可能であるか否かを判定する。さらに、分娩時に、培養を行い、細菌、例えば、クロストリジウム属菌または連鎖球菌の存在について判定する。提供者の情報、スクリーニング試験および分娩培養物が全て満足のいくものであれば（すなわち、どのようなリスクを示さないか、または許容されるレベルのリスクを示さない場合）、提供者は、医長によって承認され、その組織標本は、初期段階では、さらなる処理および評価のため初期に適格であると判定される。
【００３８】
上記選択基準を満たすヒトの胎盤を、生理食塩水を含む無菌の出荷用袋に入れ、さらなる処理のために処理場所または実験室に出荷するために、湿った氷を含む容器に保管することが好ましい。
【００３９】
スクリーニング試験および分娩培養の結果を得ることを完了する前に胎盤を回収した場合、そのような組織にラベルを付けて、隔離して保存する。胎盤は、必要なスクリーニング評価および分娩培養後にのみ、さらなる処理について承認がなされるものであり、この承認は、当該組織が取扱いおよび使用に安全であり、かつ満足のいくものであり、最終承認が医長から得られたことを示す。
【００４０】
材料の検査および評価（工程１２０）
処理センターまたは実験室に到着すると直ちに、梱包が開封され、滅菌出荷袋／容器がなお密封され、かつ冷却剤の中にあるか、適切な提供者の書類が存在するか、そして、書類上の提供者番号が当該組織を含む滅菌出荷袋上の番号と一致しているかが確認される。次いで、当該組織を含む滅菌出荷袋を、さらなる処理のための準備が整うまで冷蔵庫に保管する。
【００４１】
総組織処理（工程１３０）
組織が、さらなる処理が可能な状態になったら、胎盤組織をさらに処理するのに必要な滅菌用品を制御された環境下の中間準備地に集め、制御された環境に入れる準備を行う。一態様では、胎盤は、室温で処理される。制御された環境が製造フードである場合、滅菌用品を開封して、従来の滅菌技術を用いてフードの中に置く。制御された環境がクリーンルームである場合、滅菌用品を開封して、滅菌ドレープで覆われたカート上に置く。従来の滅菌技術を用いて、全ての作業台を１枚の滅菌ドレープで覆い、従来の滅菌技術を再度用いて、滅菌用品および処理機器を滅菌ドレープ上に置く。
【００４２】
従来の産業認可されている汚染除去手順に従って、処理装置の汚染を除去し、次いで、制御された環境に移す。装置は戦略的に制御された環境内に置いて、この器具を組織標本に近づけたり、不注意で組織標本により汚染したりする確率を最小限に抑える。
【００４３】
次に、胎盤を滅菌出荷袋から取り出し、制御された環境内の無菌処理用洗面器に無菌的に移す。無菌洗面器は、室温またはその前後の高張生理食塩水（例えば、１８％ＮａＣｌ）を含む。胎盤を穏やかに揉んで血餅の分離を助け、胎盤組織を室温に到達させ、それにより、互いから胎盤成分（例えば、羊膜嚢および絨毛膜）の分離を容易にする。次いで、周囲温度まで温めた後（例えば、約１０〜３０分後）、胎盤を無菌処理用洗面器から取り出し、検査のために羊膜嚢層を下に向けた状態で、処理トレイの上に平らに置く。
【００４４】
胎盤は、変色、壊死組織片もしくは他の汚染物、臭いおよび損傷の兆候について調査される。組織の大きさにも留意する。この時点で、組織が、さらなる処理を許容可能であるか否かについて決定する。
【００４５】
次に、羊膜および絨毛膜を慎重に分離する。一態様では、この手順で使用される材料および器具は、処理トレイ、１８％生理食塩水、４×４滅菌スポンジおよび２つの滅菌ナルゲン広口丸形ボトルを含む。次いで、胎盤組織を詳しく調べ、羊膜を絨毛膜から分離することができる領域（通常は、角）を見つける。羊膜は、絨毛膜上に薄い透明な層として現れる。
【００４６】
１枚の滅菌ガーゼまたは綿棒と、羊膜の各側面を穏やかに接触させて、線維芽細胞層を特定する。線維芽細胞層は、試験材料に張り付く。羊膜を、基底膜層を下に向けて処理トレイの中に置く。鈍器、セルスクレーパーまたは滅菌ガーゼを用いて、あらゆる残留する血液も除去する。この工程は、羊膜を裂かないように、再度、適切な注意を払って行わなければならない。外見上、羊膜が滑らかで透明な白色になったら、羊膜の洗浄は完了である。
【００４７】
特定の態様では、線維芽細胞層を露出させるため、中間組織層（海綿層とも言う）を羊膜から実質的に除去する。除去される中間組織層の量に関して、「実質的に除去する」という用語は、本明細書においては、羊膜から中間組織層を９０％超、９５％超、または９９％超除去することと定義される。中間組織層を羊膜から剥がすことで、これを行うことができる。あるいは、ガーゼまたは他の好適な拭き取り物で中間組織層を拭き取ることにより、中間組織層を羊膜から除去することができる。その後、得られた羊膜を、以下に記載する工程を用いて汚染除去することができる。
【００４８】
特定の態様では、羊膜の基底層を露出させるため、羊膜に存在する上皮層を実質的に除去する。除去される上皮の量に関して、「実質的に除去する」という用語は、本明細書においては、羊膜から上皮細胞を９０％超、９５％超、または９９％超除去することと定義される。羊膜層に残る上皮細胞の有無を、本技術分野で既知の技術を用いて評価することができる。例えば、上皮細胞層の除去後、代表となる組織試料を、処理ロットから、標準顕微鏡検査用スライドに置く。次いで、組織試料を、Ｅｏｓｉｎ  Ｙ  Ｓｔａｉｎを使用して染色し、以下に記載するように評価する。次いで、試料を覆い、静置させる。染色可能な適切な時間が経過したら、拡大して、目視する。
【００４９】
当該技術分野で公知の技術により、上皮層を除去することができる。例えば、セルスクレーパーを使用して、上皮層を羊膜から削ぎ落とすことができる。他の技術としては、膜の凍結、セルスクレーパーを使用した物理的除去、または非イオン性洗浄剤、陰イオン性洗浄剤、およびヌクレアーゼに上皮細胞を晒すことが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、上皮細胞を除去した組織を評価し、基底膜が傷付けられておらず、無傷のままであると判断する。処理工程の完了後、次の段落で説明する組織の脱水前にこの工程は、行われる。例えば、代表となる試料移植片を顕微鏡分析のために除去する。組織試料を標準的なスライドに置き、Ｅｏｓｉｎ  Ｙで染色し、顕微鏡下で観察する。上皮が存在する場合、敷石状細胞（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｅｌｌ）として現れるであろう。
【００５０】
本明細書に記載の方法は、羊膜の細胞成分の全てを除去するわけではない。この技術は、当技術分野において、「脱細胞」という。一般的に、脱細胞は、上皮細胞および線維芽細胞を含む、羊膜に存在する全ての細胞を物理的および／または化学的に除去することに関する。例えば、中間組織層が除去されたとしても、上皮細胞の除去は、任意であるが、羊膜実質層に存在する線維芽細胞層は無傷である。線維芽細胞は、線維芽細胞層に存在する。
【００５１】
胎盤組織がホウォートンゼリーである場合、以下の例示的な手順を使用することができる。メスまたはハサミを用いて、臍帯を絨毛膜板から切り離す。静脈および動脈を特定したら、静脈または動脈のうちの１つから臍帯を縦方向に下に向かって切り離す。臍帯を切り離したら、手術用ハサミおよび鉗子を使用して、静脈および動脈壁をホウォートンゼリーから切り離すことができる。次に、羊膜を切断することにより、羊膜の外層をホウォートンゼリーから除去する。その際、ホウォートンゼリーが残存する唯一の成分となるよう、臍帯の外膜を除去する。そのため、本明細書で使用するホウォートンゼリーは、外臍帯膜および臍帯血管（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｖｅｓｓｅｌ）を含まない。ホウォートンゼリーを切断して細片にすることができる。一態様では、この細片は、約１〜４ｃｍ×１０〜３０ｃｍの大きさであり、約１．２５ｃｍの厚さである。但し、用途に応じて他の厚さも可能である。
【００５２】
化学的汚染除去（工程１４０）
胎盤組織を以下に記載する技術を使用して、化学的に汚染除去することができる。一態様では、羊膜を室温で汚染除去する。一態様では、工程１３０で生成された羊膜（例えば、中間組織層を含むまたは含まない）を、次の工程のために、滅菌ナルゲン広口丸形ボトルに入れることができる。一態様では、以下の手順を使用して羊膜を洗浄することができる。ナルゲン広口丸形ボトルを、無菌的に１８％高張生理食塩水で満たし、密封する（あるいは、上蓋で密閉する）。次いで、この広口丸形ボトルを振盪台の上に置き、３０〜９０分間撹拌し、これにより、羊膜から夾雑物をさらに除去する。振盪台がクリティカルな環境（例えば、製造フード）内にない場合、ナルゲン広口丸形ボトルを制御／無菌環境に戻してから開ける。滅菌鉗子を用いるか、内容物を無菌的にデカントすることにより、羊膜を、１８％高張生理食塩水を含むナルゲン広口丸形ボトルから穏やかに取り出し、空のナルゲン広口丸形ボトルの中に入れる。次いで、羊膜を含むこの空のナルゲン広口丸形ボトルを、予め混合した抗生物質溶液で無菌的に満たす。一態様では、予め混合した抗生物質溶液は、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシン等の抗生物質の混合物からなる。硫酸ポリミキシンＢおよびバシトラシン等の他の抗生物質または現在入手可能であるか将来入手可能である同様の抗生物質も好適である。さらに、羊膜の温度を変化させないように、添加の際に抗生物質溶液が室温であることが好ましく、そうでなければ羊膜を損傷してしまう。次いで、羊膜および抗生物質を含むこの広口丸形ボトルまたは容器を密閉または閉鎖して、振盪台の上に置き、好ましくは６０〜９０分間撹拌する。抗生物質溶液中の羊膜のそのような振盪または撹拌により、組織から夾雑物および細菌をさらに除去する。任意に、羊膜を洗浄剤で洗浄することができる。一態様では、羊膜を０．１〜１０％、０．１〜５％、０．１〜１％、または０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄溶液で洗浄することができる。
【００５３】
次いで、振盪台がクリティカルな環境（例えば、製造フード）内になければ、羊膜および抗生物質を含むこの広口丸形ボトルまたは容器を重要かつ無菌の環境に戻してから開ける。滅菌鉗子を用いて、羊膜をこの広口丸形ボトルまたは容器から穏やかに取り出し、無菌水または通常の生理食塩水（０．９％生理食塩水）を含む滅菌洗面器に入れる。羊膜を滅菌水／通常の生理食塩水に少なくとも１０〜１５分間浸漬する。羊膜を僅かに撹拌して、抗生物質溶液およびあらゆるその他の夾雑物を組織から除去するのを容易にしてもよい。少なくとも１０〜１５分後に、羊膜は、脱水およびさらなる処理が可能な状態となる。
【００５４】
絨毛膜の場合、以下の例示的な手順を使用することができる。絨毛膜を羊膜から分離し、かつ血餅を線維層から除去した後、絨毛膜を１８％生理食塩水で１５分〜６０分間すすぐ。第１のすすぎサイクルの間、溶液温度が約４８℃になるように、１８％生理食塩水を、実験室加熱板を用いて滅菌容器内で加熱する。この溶液をデカントし、絨毛膜組織を滅菌容器に入れ、デカントした生理食塩水をこの容器に注ぎ入れる。この容器を密閉して振盪台の上に置き、１５分〜６０分間撹拌する。１時間の撹拌浴後に、絨毛膜組織を取り出し、さらなる１５分〜６０分間のすすぎサイクルのために、第２の加熱した撹拌浴の中に入れる。任意に、羊膜の汚染除去のため、絨毛膜組織を、上述の洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄溶液）で洗浄することができる。この容器を密閉し、加熱せずに１５分〜１２０分間撹拌する。次に、絨毛膜組織を、すすぎの度に激しく揺らしながら、脱イオン水で洗浄する（２５０ｍＬの脱イオン水×４）。当該組織を取り出し、１×ＰＢＳｗ／ＥＤＴＡ溶液を含む容器の中に入れる。この容器を密閉し、１時間、制御温度で８時間撹拌する。絨毛膜組織を取り出し、滅菌水ですすぐ。あらゆる残留する変色した線維性血液物質を絨毛膜組織から除去するために、目視検査を行う。絨毛膜組織は、茶色がかった変色が全く認められないクリーム状の白色の外観を有していなければならない。
【００５５】
胎盤組織がホウォートンゼリーである場合、以下の例示的な手順を使用することができる。ホウォートンゼリーを、滅菌ナルゲン広口丸形ボトルに移す。次に、室温の１８％高張生理食塩水を添加して当該組織をすすぎ、この広口丸形ボトルを密閉する。この広口丸形ボトルを３０〜６０分撹拌する。温置後、この広口丸形ボトルを汚染除去し、滅菌野に戻す。当該組織をクリーンな滅菌ナルゲン広口丸形ボトルに移し、１８％ＮａＣｌで予め温める（約４８℃）。この容器を密閉して振盪台の上に置き、６０〜９０分間撹拌する。
【００５６】
すすぎ後に、この広口丸形ボトルを汚染除去し、滅菌野に戻す。当該組織を取り出し、抗生物質溶液の中に入れる。この容器を密閉し、振盪台の上で６０〜９０分間撹拌する。温置後、この広口丸形ボトルを、１〜１０℃で最長２４時間冷蔵してもよい。
【００５７】
次に、ホウォートンゼリーを、約２００ｍＬの滅菌水を含む滅菌洗面器に移す。当該組織を１〜２分間すすいで、約３００ｍＬの滅菌水を含む滅菌ナルゲン広口丸形ボトルに移す。この広口丸形ボトルを密閉し、振盪台の上に３０〜６０分置く。温置後、この広口丸形ボトルを滅菌野に戻す。ホウォートンゼリーは、茶色がかった変色が認められないクリーム状の白色の外観を有していなければならない。
【００５８】
脱水（工程１４５）
一態様では、上記のような胎盤組織もしくはその成分、またはそれらの任意の組み合わせを処理して組織移植片（すなわち、積層物）にし、これを、その後に微粉化する。一態様では、胎盤組織またはそれらの個々の成分を個別に脱水し、その後、単独でまたは成分の混合物として微粉化することができる。一態様では、組織（すなわち、個別の膜または移植片）を化学的脱水により脱水され、その後凍結乾燥される。一態様では、組織に存在する残留水を実質的に（すなわち、９０％超、９５％超、または９９％超）または完全に除去するため（すなわち、組織を脱水するため）、羊膜、絨毛膜および／または中間層を極性溶媒と十分な時間および量、接触させることにより化学的脱水工程を行う。溶媒は、プロトン性であっても、非プロトン性であってもよい。本明細書において有用な極性有機溶媒の例としては、アルコール、ケトン、エーテル、アルデヒド、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特に、例としては、限定するものではないが、ＤＭＳＯ、アセトン、テトラヒドロフラン、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一態様では、胎盤組織を極性溶媒と室温で接触させる。付加的に工程は必要とせず、以下に述べるように、組織を凍結乾燥することができる。
【００５９】
化学的脱水後、あらゆる残留数および極性溶媒を除去するため、組織を凍結乾燥する。一態様では、羊膜、絨毛膜、および／または中間層を、凍結乾燥前に、好適な乾燥用固定具の上に置くことができる。例えば、羊膜の１つ以上の細片を好適な乾燥用固定具の上に置くことができる。次に、絨毛膜を羊膜の上部に置く。この態様では、羊膜／絨毛膜組織移植片を生成する。あるいは、羊膜の細片を第１の乾燥用固定具の上に置き、絨毛膜の細片を第２の乾燥用固定具の上に置くことができる。乾燥用固定具は、平たい状態に完全に広げた胎盤組織を受け入れるのに十分な大きさであることが好ましい。一態様では、乾燥用固定具は、テフロン（登録商標）製またはデルリン（登録商標）製（デュポン社で発明および販売されているアセタール樹脂エンジニアリングプラスチックの商品名であり、ジョージア州マリエッタ所在のＷｅｒｎｅｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ社からも市販されている）である。乾燥用固定具のために、湿組織を受け入れるように適当な形状に形成することができる耐熱性かつ耐切性の任意の他の好適な材料を使用することもできる。
【００６０】
組織を乾燥用固定具の上に置いたら、乾燥用固定具を凍結乾燥器に入れる。組織の脱水のための凍結乾燥器の使用は、より効果的であり、加熱脱水等の他の技術と比較して完全であり得る。一般的に、組織の細胞外基質に損傷を与えることがあるため、胎盤組織における氷結晶形成を避けることが望ましい。凍結乾燥前に、胎盤組織を化学的に脱水することにより、この問題を回避することができる。
【００６１】
一態様では、脱水工程は、組織を加熱することを含む。一態様では、羊膜、絨毛膜、および／または中間層を、（上述のした、個別の細片として、または積層物としてのいずれかで）好適な乾燥用固定具の上に置き、乾燥用固定具を滅菌Ｔｙｖｅｘ製（または同様の通気性のある耐熱性で密封可能な材料の）脱水袋に入れて密封する。通気性のある脱水袋により、当該組織があまりに急速に乾燥するのを防ぐ。複数の乾燥用固定具を同時に処理する場合、各乾燥用固定具を、それ自体のＴｙｖｅｘ製袋の中に入れるか、あるいは、その上に複数の乾燥枠を保持するように設計された好適な取付枠の中に置き、次いで、この枠全体を、より大きな単一の滅菌Ｔｙｖｅｘ製脱水袋の中に入れて密封する。
【００６２】
次いで、１つ以上の乾燥用固定具を含むＴｙｖｅｘ製脱水袋を、約３５〜５０℃に予め加熱されている非真空乾燥器または定温器の中に置く。Ｔｙｖｅｘ製袋を、乾燥器の中に３０〜１２０分間置いたままにする。一態様では、約４５℃の温度で４５分間、加熱工程を行い、当該組織を過剰乾燥または燃焼させることなく十分に乾燥させることができる。任意の特定の乾燥器のための具体的な温度および時間は、高度、乾燥器の大きさ、乾燥器温度の正確性、乾燥用固定具のために使用される材料、同時に乾燥する乾燥用固定具の数、乾燥用固定具の単一または複数の枠を同時に乾燥するか否か等の他の因子に基づいて、較正および調節する必要があるであろう。
【００６３】
一態様では、脱水処理の割合および均一性を向上させる脱水装置を使用して、胎盤組織を脱水することができる。胎盤組織移植片を乾燥させるいのに好適で代表的な脱水装置は、２０１２年８月１５日出願の米国仮出願第６１／６８３７００号、および２０１３年１月１７日出願の米国特許第１３／７４４３３２号に記載される。これらの出願の開示内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
微粉化胎盤成分の調製（工程１５０）
上記のような胎盤組織またはその成分を個別にまたは組織移植片の形態で脱水したら、脱水した組織を微粉化する。当該技術分野で公知の機器を使用して、微粉化胎盤成分を生成することができる。例えば、Ｒｅｔｓｃｈ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ４００を使用して、本明細書に記載されている微粉化組成物を生成することができる。本微粉化組成物中の物質の粒径も、本微粉化組成物の用途に応じて異なってもよい。一態様では、本微粉化組成物は、５００μｍ未満、４００μｍ未満、３００μｍ未満、２００μｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満、２５μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満、９μｍ未満、８μｍ未満、７μｍ未満、６μｍ未満、５μｍ未満、４μｍ未満、３μｍ未満、２μｍ、もしくは２μｍ〜４００μｍ、２５μｍ〜３００μｍ、２５μｍ〜２００μｍ、または２５μｍ〜１５０μｍの粒子を有する。一態様では、微粉化組成物は、１５０μｍ未満、１００μｍ未満、または５０μｍ未満の直径の粒子を有する。他の態様では、より大きな直径（例えば、１５０μｍ〜３５０μｍ）を有する粒子が望ましい。全ての場合において、粒子の直径は、その最長の軸に沿って測定している。
【００６５】
一実施形態では、当該粒子の大きさを、ナノ範囲まで減少させてもよい。当業者には理解されるように、胎盤成分のナノ粒子は、創傷に施用すると密度の増加および／または放出速度の上昇が得られるため望ましい。好ましくは、本微粉化粒子の粒径は、約０．０５μｍ〜約２μｍ、約０．１μｍ〜約１．０μｍ、約０．２μｍ〜約０．８μｍ、約０．３μｍ〜約０．７μｍ、または約０．４μｍ〜約０．６μｍである。あるいは、本微粉化粒子の粒径は、少なくとも０．０５μｍ、少なくとも０．１μｍ、少なくとも０．２μｍ、少なくとも０．３μｍ、少なくとも０．４μｍ、少なくとも０．５μｍ、少なくとも０．６μｍ、少なくとも０．７μｍ、少なくとも０．８μｍ、少なくとも０．９μｍまたは少なくとも１μｍである。あるいは、本微粉化粒子の粒径は、１μｍ未満、０．９μｍ未満、０．８μｍ未満、０．７μｍ未満、０．６μｍ未満、０．５μｍ未満、０．４μｍ未満、０．３μｍ未満、０．２μｍ未満、０．１μｍ未満または０．０５μｍ未満である。
【００６６】
一態様では、機械的粉砕または破砕により最初の微粉化を行う。別の態様では、低温粉砕により微粉化を行う。この態様では、粉砕プロセスの前および間に、組織を含む粉砕用広口丸形ボトルを、一体化式冷却システムからの液体窒素で絶えず冷却する。このようにして、試料を脆化させ、揮発性成分を保存する。さらに、羊膜、中間組織層、および／または絨毛膜中のタンパク質の変性を最小限に抑えるか防止する。一態様では、Ｒｅｔｓｃｈ社製のＣｒｙｏＭｉｌｌをこの態様で使用することができる。
【００６７】
本明細書に記載の成型脱水胎盤組織移植片を製造するために使用される成分の選択は、胎盤組織移植片の最終的な使用に応じて異なってもよい。例えば、胎盤組織、および羊膜、絨毛膜、中間組織層、ホウォートンゼリー、またはそれらの任意の組み合わせ等の個々の成分を互いに混合し、その後、微粉化される。別の態様では、１種以上の胎盤組織、羊膜、絨毛膜、中間組織層、またはそれらの任意の組み合わせ（すなわち、積層物）からなる１種以上の組織移植片を微粉化することができる。別の態様では、１種以上の羊膜、絨毛膜、中間組織層、またはそれらの任意の組み合わせからなる１種以上の組織移植片を、個別の成分として、羊膜、絨毛膜、中間組織層、またはそれらの任意の組み合わせと混合し、その後、微粉化することができる。
【００６８】
異なる成分の量は、成型脱水胎盤組織移植片の用途に応じて異なってもよい。一態様では、成型脱水胎盤組織移植片が羊膜（中間組織層を含むまたは含まない）、および中間組織層からなる場合、中間組織層に対する羊膜の重量比は、１０：１〜１：１０、９：１〜１：１、８：１〜１：１、７：１〜１：１、６：１〜１：１、５：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、２：１〜１：１、または約１：１である。別の態様では、成型脱水胎盤組織移植片は、羊膜（中間組織層を含むまたは含まない）および絨毛膜からなる場合、羊膜に対する絨毛膜の重量比は、０：１〜１：１０、９：１〜１：１、８：１〜１：１、７：１〜１：１、６：１〜１：１、５：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、２：１〜１：１、または約１：１である。
【００６９】
粒子の懸濁液を形成することによる、滅菌水中の微粒化材料の分取により、粒径の分離を行うことができる。懸濁液の最上部には、主に、最小粒子が含まれ、懸濁液の最下部には、主に、最重粒子が含まれるであろう。分取は、粒径分離につながり、繰り返し分取を行うことは、微粉化粒子の異なる大きさごとの分離につながるであろう。このように分離された粒子を、成型胎盤組織移植片を製造するために、および所望の医療用途に最も適切な所望の割合の粒径で再度組み合わせることができる。当業者であれば、粒子の大きさが異なることにより、以下に述べる成型胎盤組織移植片の密度および凝集性の大きさが異なることになることを理解するであろう。
【００７０】
成型胎盤組織移植片およびその医薬組成物の調製（工程１６０）
微粉化された、羊膜、絨毛膜、中間組織層、およびそれらの任意の組み合わせ等の脱水微粉化胎盤成分を、好ましくは非多孔性の型に圧力をかけて、型により定められた所望の形状および大きさに成形する。多孔性の型の好ましさは低いが、成型の間、水または他の溶媒を漏出させることができる場合に、多孔性の型を本発明の方法で使用できることも考えられる。成型胎盤組織移植片は、少なくとも成型胎盤組織移植片を対象へ導入するまでにその大きさおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性の大きさを有する。成型胎盤組織移植片の凝集性を、微粉化胎盤成分の粒径により部分的に決定する。例えば、粒径の大きな脱水微粉化胎盤成分は、粒径の小さな脱水微粉化胎盤成分と同様の密度を有する成型胎盤組織移植片を得るために、高い圧縮圧および／またはより長い圧縮時間を必要とする。言い換えると、同様の圧縮条件下で得られた成型脱水胎盤組織組成物において、粒径の大きな組成物は、粒径の小さな組成物と比較して密度が小さく、高確率で分離する。そのため、微粉化胎盤成分の粒径を最適化し、それにより、対象へ投与する際に所望の凝集性および所望の最終的な結果を得ることは、当業者の理解の範囲にある。
【００７１】
任意に、１種以上の接着剤を、型に入れる前に微粉化胎盤成分と混合してもよい。そのような接着剤の例としては、フィブリンシーラント、シアノアクリレート、ゼラチン及びトロンビン生成物、ポリエチレングリコールポリマー、アルブミン、およびグルタルアルデヒドの製品が挙げられるが、これら限定されない。処理で使用される接着剤は、微粉化胎盤成分と混合する前に、脱水されるべきであり、その結果、接着剤と微粉化胎盤成分との混合物は、非多孔性の型での圧縮を可能とするのに十分低い含水率を有する。
【００７２】
胎盤組織、羊膜、中間組織層、および絨毛膜に加えて、別の脱水成分を、微粉化の前および／または後に組成物に添加することもできる。一態様では、脱水充填剤を添加することもできる。充填剤の例としては、同種移植心膜、同種移植無細胞真皮、精製異種移植１型コラーゲン、バイオセルロースポリマーまたはコポリマー、生体適合性合成ポリマーまたはコポリマーフィルム、精製小腸粘膜下組織、膀胱無細胞マトリックス、死体筋膜、骨粒子（海綿および皮質骨粒子を含む）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
別の態様では、脱水生物活性剤を、微粉化の前および／または後に添加することができる。生物活性剤の例としては、濃厚血小板由来の天然に生じる増殖因子、自己血液を回収および分離した生成物または期限切れの保存血由来の濃厚血小板、骨髄穿刺液、濃縮されたヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮された羊水幹細胞またはバイオリアクターで増殖された幹細胞由来の幹細胞あるいは抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。生物活性剤を含む成型脱水胎盤組織移植片を目的の領域に施用すると、生物活性剤は、時間をかけてその領域に送達される。そのため、本明細書に記載されている成型脱水胎盤組織移植片は、対象に投与される際の生物活性剤および他の薬品の送達具として有用である。放出特性は、他のもののうち、成型胎盤組織移植片の製造に使用される成分の選択、ならびに胎盤組織移植片に含まれている粒子の大きさに基づき、変更することができる。
【００７４】
また別の態様では、微粒化胎盤成分を、圧縮または成型前に少なくとも１つの可塑剤と混合する。当業者であれば、可塑剤の生物的適合性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの胎盤組織移植片の分解または滅失率への可塑剤の効果、成型／圧縮処理を容易にする混合物の特性への可塑剤の効果に基づき、好適な可塑剤を選択するであろう。例示的な可塑剤としては、ポリ（エチレングリコール）、グルコースモノエステル、部分的脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
別の態様では、成型胎盤組織組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの分解および滅失率、ならびに脱水微粉化胎盤成分の密度および凝集性を、例えば架橋により、変更することができる。羊膜を中間組織層、絨毛膜、または第２の羊膜組織と架橋させることができる。例えば、微粉化の前および／または後に、架橋剤を本組成物（例えば、個別の成分として、および／または組織移植片としての羊膜、絨毛膜、中間組織層、またはそれらの任意の組み合わせ）に添加することができる。一般に、架橋剤は、非毒性かつ非免疫原性である。羊膜、中間組織層および／または絨毛膜（もしくはそれらの組織移植片）を架橋剤で処理する場合、架橋剤は同じであっても異なっていてもよい。一態様では、羊膜、中間組織層および絨毛膜を、架橋剤で別々に処理することができ、あるいは代わりとして、羊膜、中間組織層および絨毛膜を、同じ架橋剤で一緒に処理することができる。特定の態様では、羊膜、中間組織層および絨毛膜を、２種以上の異なる架橋剤で処理することができる。羊膜、中間組織層および絨毛膜を処理するための条件は異なってもよい。他の様態では、羊膜、中間組織層および／または絨毛膜を微粉化することができ、この微粉化組成物をその後に架橋剤で処理することができる。一態様では、架橋剤の濃度は、０．１Ｍ〜５Ｍ、０．１Ｍ〜４Ｍ、０．１Ｍ〜３Ｍ、０．１Ｍ〜２Ｍまたは０．１Ｍ〜１Ｍである。胎盤組織成分が、非多孔性の型での圧縮または成型を可能にするのに十分に低い含水率を有するよう、胎盤組織成分は、脱水前に架橋されることが好ましい。
【００７６】
特定の態様では、成型脱水胎盤組織組成分を、架橋剤で処理することができる。胎盤組織成分の含水率が低いレベル、例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満で維持されるよう、圧縮前、かつ微粉化の前または後に、胎盤組織移植片に気体／蒸気架橋を施すことが好ましい。架橋剤は一般に、タンパク質と反応して共有結合を生成することができる２種以上の官能基を有する。一態様では、架橋剤は、タンパク質に存在するアミノ基と反応することができる基を有する。そのような官能基の例としては、ヒドロキシル基、置換もしくは非置換アミノ基、カルボキシル基およびアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、架橋剤は、例えば、グルタルアルデヒド等のジアルデヒドであってもよい。別の態様では、架橋剤は、例えば、（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミドであってもよい。他の態様では、架橋剤は、酸化デキストラン、Ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］コハク酸イミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサールモノヒドレート、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、ビス−［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオン酸、ジスクシンイミジルスベレート、および１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）であってもよい。
【００７７】
一態様では、糖が架橋剤であり、この場合、糖は、羊膜、中間組織層および絨毛膜中に存在するタンパク質と反応して、共有結合を形成することができる。例えば、糖は、メイラード反応によりタンパク質と反応することができ、この反応は、還元糖によるタンパク質上のアミノ基の非酵素的グリコシル化により開始し、その後に共有結合の形成が生じる。架橋剤として有用な糖の例としては、Ｄ−リボース、グリセロース、アルトロース、タロース、エリトロース（ｅｒｔｈｅｏｓｅ）、グルコース、リキソース、マンノース、キシロース、グロース、アラビノース、イドース、アロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトースまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書に記載されている医薬組成物は、局所もしくは全身治療のいずれが望まれるかによって、および、治療される領域によって、多くの方法で投与することができる。一態様では、投与は、注射により行うことができる。他の様態では、成型脱水胎盤組織組成物を、対象に内服的に投与されるように製剤化することができる。他の様態では、成型脱水胎盤組織組成物を、局所的、真皮下または皮下に投与することができる。
【００７９】
ＩＩＩ．成型微粉化胎盤成分を含む組成物の施用
本明細書に記載されている成型脱水微粉化胎盤成分を含む組成物は、多数多くの医学的用途を有する。例えば、成型脱水胎盤組織組成物を、腱、軟骨、心筋、潰瘍、または病変に、皮膚を切開することなく、局所的に投与または装着することができる。
【００８０】
本明細書に記載されている成型脱水胎盤組織組成物は、充填剤として特に有用である。この態様では、成型脱水胎盤組織組成物は、創傷の治癒を促進するための、対象の空洞または穴への充填に有用である。空洞または穴は、外傷または創傷によるものであってもよい。あるいは、空洞または穴は、手術またはレーザードリル等のドリルにより形成してもよい。手術の間、成型脱水胎盤組織組成物は、組織、骨、または他の身体部位間に施用される充填剤として使用されてもよい。当業者であれば、成型胎盤組織組成物を所望の治療領域に施用することができるよう、空洞または穴を対象にあけてもよいことは、理解できるであろう。
【００８１】
他の態様では、成型脱水胎盤組織組成物は、真皮および／または皮下組織に存在する真皮創傷の治癒に効果的である。そのため、成型脱水胎盤組織組成物は、深い皮膚創傷に効果的である。真皮創傷の原因は異なり得る。一態様では、切開、裂傷、擦り傷、穿刺、または熱傷を含むがこれらに限定されない、鋭く開いた創傷を治癒するために成型脱水胎盤組織組成物を使用することができる。別の態様では、尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、または圧迫潰瘍等の慢性創傷の治癒に、成型脱水胎盤組織組成物を使用することができる。
【００８２】
特に、成型脱水胎盤組織組成物は、無負荷空洞充填、特に、不規則な形状に適合する生成物を有することが望ましい場合に、有用であり得る。成型脱水胎盤組織組成物の予め成形された形状および大きさは、治療される面との接触領域を最大化し、治療効果を向上させることができる。
【００８３】
空洞充填に加え、当業者であれば、組成物が対象となる治療領域に達することができるよう、本明細書に記載されている組成物を身体部位にあけられた穴に使用することもできることを理解するであろう。そのため、本発明の組成物は、一般に、特に鋭い創傷の外来治療のための創傷被覆材および創傷治癒に有用である。
【００８４】
他の態様では、成型脱水胎盤組織組成物を、他の任意の胎盤組織生成物と組み合わせて使用することができる。例えば、羊膜、絨毛膜、または羊膜および／または絨毛膜の積層物の層等の１種以上の胎盤組織を、成型胎盤組織組成物に付着させることができる。この態様では、成型胎盤組織組成物を創傷または空洞に挿入することができ、羊膜、絨毛膜、または積層物の層は、創傷の外にあり、成型胎盤組織組成物を包帯などでこの場所に保持する。
【００８５】
実施例
以下の実施例は、本明細書に記載され、かつ特許請求される化合物、組成物および方法の製造および評価方法に関する完全な開示および記載を当業者に提供するために示されており、純粋に例示的なものであって、本発明者らが彼らの発明であるとみなしているものの範囲を限定するものではない。数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、若干の誤差および偏差は考慮されるべきである。特に明記しない限り、部とは重量部であり、温度は、摂氏温度または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその前後の圧力である。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力およびその他の反応範囲ならびに本記載の方法で得られる生成物純度および収率を最適化するために使用することができる条件の数多くの変形および組み合わせが存在する。そのようなプロセス条件を最適化するために、合理的かつ日常的な実験法のみが必要とされる。
【００８６】
微粉化組成物の調製
実施例１
微粉化粒子を生成するために本明細書で使用される羊膜／絨毛膜組織移植片を米国特許出願公開第２００８／００４６０９５号（この開示内容全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載の方法で、生成した。組織移植片（４ｃｍ×３ｃｍ）および２つの９．５ｍｍスチール研削ボールを、５０ｍＬバイアルに入れ、その後、当該バイアルを密封した。当該バイアルをＣｒｙｏ−ｂｌｏｃｋに入れ、当該Ｃｒｙｏ−ｂｌｏｃｋをＣｒｙｏ−ｒａｃｋに入れた。当該Ｃｒｙｏ−ｒａｃｋを液体窒素を含むＤｅｗａｒに入れた。組織試料に、３０〜６０分間以下、気相式冷却を施した。Ｃｒｙｏ−ｒａｃｋをＤｅｗａｒから取り出し、Ｃｒｙｏ−ｂｌｏｃｋを当該Ｃｒｙｏ−ｒａｃｋから取り出した。当該Ｃｒｙｏ−ｂｌｏｃｋ  Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０１０）に入れ、１，５００ｒｐｍで２０分間に設定した。２０分が経過した後、微粉化を確実なものとするため、組織を検査した。必要であれば、十分な微粉化を確実なものとするため、さらに３０〜６０分間、組織をＤｅｗａｒに戻し、さらに２０分間粉砕機に移動させてもよい。組織が十分に微粉化されたら、１セットの米国標準ＡＳＴＭ篩を使用して分類する。篩を３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍ、および１２５μｍの順で置いた。微粉化材料を５０ｍＬバイアルから３５５μｍ  篩に移した。微粉化粒子を完全に分離するため、各篩を個別に揺らした。微粉化粒子が篩を使用して、効果的に分離したら、３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍ、および１２５μｍの粒径を有する微粉化粒子を別のバイアルに回収した。
【００８７】
微粉化粒子を含む成型胎盤組織組成物の調製
実施例２
片側が雌、片側が雄の三日月形状の型を、脱水胎盤組織組成物の調製に使用する。片側の雌に、実施例１で調製した１０ｍｇの微粉化された羊膜／絨毛膜粒子を詰める。片側の雄に微粒子を含有させ、この場所に置くと、型に、好適な時間、好適な圧力をかけ、型の大きさおよび形状を有する成型胎盤組織組成物を得る。
【００８８】
一実施形態では、型は、非多孔性の型であり、脱水胎盤組織の含水率約２５％重量／重量未満である。別の実施形態において、含水率は、２５％重量／重量超であり、多孔性の型を使用し、過剰な水を除去する。あるいは、少量（例えば、１０重量％以下）の生体適合性有機溶媒を脱水胎盤組織に添加し、圧力をかけている間、組成物内の小さな空洞から溶媒の気化を促すこともできる。
【００８９】
本明細書に記載されている化合物、組成物および方法には様々な修正および変形を加えることができる。本明細書に記載されている化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書を検討し、かつ本明細書に開示されている化合物、組成物および方法を実施することにより明らかになるであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとみなすものとする。
【００９０】
好適な架橋剤および手順については、２０１２年８月１５日出願の米国仮出願第６１／６８３，６９７号に詳細に説明され、その開示内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
【００９１】
微粒化胎盤組織については、共に２０１２年８月１５日出願の米国仮出願第６１／６８３，６９８号および米国仮出願第６１／６８３，７００号に詳細に説明されており、それらの開示内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
【図１】
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