(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を調製する工程と、
b) 前記複数の試料を相異なる時間帯でクロマトグラフのカラムに通す工程と、
c) 前記カラムを通過した各試料を、複数のパラメータの値で測定することができる検出器で測定し、各試料について且つ各パラメータについてクロマトグラムを得る工程と、
d) 各試料、各パラメータについて得られたクロマトグラムから、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する工程と
を備えることを特徴とするクロマトグラフによる濃度測定方法。
【請求項２】
前記パラメータが、分光測定装置で測定される光の波長であることを特徴とする請求項１に記載の濃度測定方法。
【請求項３】
a) カラムと、
b) 前記カラムを通過した試料を複数のパラメータの値で測定することができる検出器と、
c) 前記検出器からの検出信号に基づき、各パラメータの値についてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
d) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を相異なる時間帯で前記カラムに通過させた結果得られる複数のクロマトグラムより、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する検量線作成部と
を備えることを特徴とするクロマトグラフ。
【請求項４】
前記検出器が分光測定装置を用いた検出器であって、前記パラメータが、該分光測定装置で測定される光の波長であることを特徴とする請求項３に記載のクロマトグラフ。
【請求項５】
複数のパラメータの値で測定することができる検出器を備えるクロマトグラフに用いられるプログラムであって、
a) 前記検出器からの検出信号に基づき、各パラメータの値についてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
b) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を相異なる時間帯で前記クロマトグラフのカラムに通過させた結果得られる複数のクロマトグラムより、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する検量線作成部と
を備えることを特徴とするクロマトグラフ用プログラム。
【請求項６】
前記検出器が分光測定装置を用いた検出器であって、前記パラメータが、該分光測定装置で測定される光の波長であることを特徴とする請求項５に記載のクロマトグラフ用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフや質量分析装置を用いて試料に含まれる成分の濃度を測定する装置に関し、特に、そのための検量線を作成する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含まれる各種成分の濃度を測定する場合、まずガスクロマトグラフや液体クロマトグラフにより各成分を時間的に分離し、その後、分離された各成分について、そのクロマトグラフに現れるピークの面積や高さ等によりその含有量（濃度）を測定する方法がある。クロマトグラフのピークは、分光装置や質量分析装置などを用いて検出され、その面積等が測定されるが、試料中の当該成分の実際の濃度の値を決定するためには、既知の濃度を有する試料（標準試料）を分析することにより、その濃度値と分光装置や質量分析装置などで検出・測定されるピークの面積の値との関係を予め求めておかなければならない。両者の関係は一般に「検量線」と呼ばれる線で表され、保存しておかれる。未知の濃度の成分を含む試料を同じ条件の下で分析したとき、そのクロマトグラフに現れるピークの面積を測定し、その検量線に当てはめることにより、該成分の濃度を決定することができる。
【０００３】
検量線は、クロマトグラフや分光装置、質量分析装置など装置毎に異なるが、一般に直線とはならず、それらの装置に特有の曲線を呈する。そのため、1つの標準試料で1点だけ測定し、検量線を作成することは妥当ではない。
【０００４】
そこで、特許文献１では、検出器として質量分析装置を使用し、複数の安定同位体が存在する元素を含む物質を標準試料として、1回の分析で2以上の異なる濃度（同位体の存在比に対応する濃度）の測定点を得て、検量線を作成する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2000-065797号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法では、1種の標準試料の1回の測定で2点以上の検量線作成用の測定点を得ることができるが、一般に、分析の対象となる物質が含有する元素は、複数の安定同位体が存在する場合であっても、その存在比は大きく偏っている。例えば、水素は質量数1の1Hが99.984%であるのに対し、質量数2の2Hは0.016%、炭素は12Cが98.894%であるのに対し13Cが1.106%、窒素は14Nが99.634%であるのに対し15Nが0.366%、酸素は16Oが99.762%であるのに対し17Oが0.038%、18Oが0.200%となっている。従って、存在比の大きい方の同位元素が検量線を作成するに適切な濃度となるように標準試料を調製した場合、存在比の小さい方の同位元素の濃度は極めて小さな値となり、クロマトグラムにおいてピークがノイズに埋もれてしまう等により検量線において妥当な点を構成することができない。逆に、存在比の小さい方の同位元素を基準に標準試料を作製しようとしても、存在比の大きい方の同位元素の濃度が100%を超えることになるため、作製が不可能となる。
【０００７】
また、特許文献１に記載の方法は、検出器として質量分析装置の使用を前提としなければならず、分光測定装置等の一般の検出器に適用することはできない。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、測定装置の特性をできるだけ反映した、未知試料の成分の濃度をできるだけ正しく決定することができる検量線を作成するための方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明に係るクロマトグラフによる濃度測定方法は、
a) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を調製する工程と、
b) 前記複数の試料を相異なる時間帯でクロマトグラフのカラムに通す工程と、
c) 前記カラムを通過した各試料を、複数のパラメータの値で測定することができる検出器で測定し、各試料について且つ各パラメータについてクロマトグラムを得る工程と、
d) 各試料、各パラメータについて得られたクロマトグラムから、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する工程と
を備えることを特徴とする。
【００１０】
上記における検量線作成工程では、クロマトグラムから所定の基準によりピークを検出し、各ピークの強度の値を求め、それらピーク強度の値から過大・過小なものを排除して検量線を作成する。ここで、ピークの強度とは、ピークの高さやピークの面積等、目的成分の濃度と相関を有するパラメータのことを言う。
【００１１】
本発明に係る濃度測定方法では、互いに異なる濃度の複数の試料について、クロマトグラフにおいて複数のパラメータの値で測定を行うため、目的成分に関して既知の濃度の多くの点の測定値を得ることができる。そして、それら測定点の中で、強度が高すぎたり低すぎたりするため検量線を構成するに妥当でない点が存在する場合には、それを排除して検量線を作成するため、検出器を含むクロマトグラフの特性を十分に反映した検量線を作成することができる。この検量線を用いることにより、目的成分を含む未知試料の濃度を、低濃度から高濃度までの広い範囲で正しく決定することができるようになる。
【００１２】
上記方法を実施するための本発明に係るクロマトグラフは、
a) カラムと、
b) 前記カラムを通過した試料を複数のパラメータの値で測定することができる検出器と、
c) 前記検出器からの検出信号に基づき、各パラメータの値についてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
d) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を相異なる時間帯で前記カラムに通過させた結果得られる複数のクロマトグラムより、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する検量線作成部と
を備えるものとなる。
【００１３】
さらに、上記方法を実施するための本発明に係るクロマトグラフ用プログラムは、複数のパラメータの値で測定することができる検出器を備えるクロマトグラフに用いられるプログラムであって、
a) 前記検出器からの検出信号に基づき、各パラメータの値についてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
b) 目的成分の濃度が互いに異なる複数の試料を相異なる時間帯で前記クロマトグラフのカラムに通過させた結果得られる複数のクロマトグラムより、所定の基準を超える強度又は別の所定の基準を下回る強度のピークを排除して目的成分の検量線を作成する検量線作成部と
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る濃度測定方法では、互いに異なる濃度の複数の試料について、クロマトグラフにおいて複数のパラメータの値で測定を行うため、目的成分に関して既知の濃度の多くの点の測定値を得ることができる。そして、それら測定点の中で、強度が高すぎたり低すぎたりするため検量線を構成するに妥当でない点が存在する場合には、それを排除して検量線を作成するため、検出器を含むクロマトグラフの特性を十分に反映した検量線を作成することができる。この検量線を用いることにより、目的成分を含む未知試料の濃度を、低濃度から高濃度までの広い範囲で正しく決定することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るクロマトグラフの一実施形態を示す概略構成図。
【図２】本実施形態のクロマトグラフにより得られるデータに基づいて作成される、標準試料の濃度が異なるクロマトグラムの例(a-1), (a-2)、及びそれらクロマトグラムのピーク強度から作成される検量線の例(b)を示すグラフ。
【図３】本実施形態のクロマトグラフにより得られるデータに基づいて作成される、標準試料の濃度が異なりピーク強度が所定の下限値よりも低いピークを含むクロマトグラムの例(a-1)〜(a-3)、及びそれらクロマトグラムのピーク強度から作成される検量線の例(b)を示すグラフ。
【図４】本実施形態のクロマトグラフにより得られるデータに基づいて作成される、標準試料の濃度が異なりピーク強度が所定の上限値よりも高いピークを含むクロマトグラムの例(a-1)〜(a-3)、及びそれらクロマトグラムのピーク強度から作成される検量線の例(b)を示すグラフ。
【図５】検出器として質量分析装置を用いた場合に作成される、標準試料の濃度が異なるクロマトグラムの例(a-1), (a-2)、及びそれらクロマトグラムのピーク強度から作成される検量線の例(b)を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１〜図５を用いて、本発明に係る濃度測定方法、クロマトグラフ、及びクロマトグラフ用プログラムの一実施形態を説明する。本実施形態では、濃度測定のための構成に特徴を有する高速液体クロマトグラフ、並びに該クロマトグラフにおいて実施される濃度測定方法及びクロマトグラフ用プログラムを例として説明する。
【００１７】
図１は、本実施形態の高速液体クロマトグラフ１０の概略構成を示す図である。高速液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１、送液ポンプ１２、試料注入部１３、カラム１４、検出器１５、データ処理部１６、及び制御部１７を有する。
【００１８】
移動相容器１１は移動相を貯留する容器であり、送液ポンプ１２は移動相容器１１内の移動相を吸引して一定流量で送給するポンプである。試料注入部１３は、標準試料や未知試料といった複数の液体試料から1つの液体試料を選択し、必要な場合には試料に対して希釈又は濃縮等の前処理を行ったうえで、送液ポンプ１２から送給される移動相中に注入するものである。カラム１４は、移動相に注入された試料が通過する間に該試料に含まれる成分を時間的に分離するものである。
【００１９】
検出器１５は、分光測定装置を用いた検出器であって、光源１５１、レンズ１５２、試料セル１５３、スリット１５４、凹面回折格子１５５及びフォトダイオードアレイ１５６を備える。光源１５１は、所定の波長帯内の多数の波長を有する光を生成する。レンズ１５２は、光源１５１からの光を試料セル１５３に集光する。試料セル１５３は、カラム１４から移動相と共に導入される試料が通過すると共に、光源１５１からの光が透過する。試料セル１５３内では、光源１５１からの光が試料に照射され、該試料の成分により定まる波長の光が吸収される。試料セル１５３を通過した光は、スリット１５４を通過した後、凹面回折格子１５５により波長分散される。フォトダイオードアレイ１５６は、多数（例えば1024個）の検出素子が１次元アレイ状に並べられたものであり、検出素子毎に、凹面回折格子１５５で波長分散された光のうち特定の波長の光を検出する。こうして、フォトダイオードアレイ１５６において、波長毎の検出強度が得られる。
【００２０】
データ処理部１６は、コンピュータの中央演算装置及びプログラム（本発明に係るクロマトグラフ用プログラムの実施形態）により具現化されるものであって、クロマトグラム作成部１６１、検量線作成部１６２、及び未知試料濃度決定部１６３を有する。それら各部の機能は、高速液体クロマトグラフ１０の動作の説明と共に後述する。
【００２１】
制御部１７は、送液ポンプ１２による移動相の吸引及び送給、試料注入部１３による試料の注入、並びに検出器１５の光源１５１における光の生成等の動作を制御する。
【００２２】
以下、高速液体クロマトグラフ１０の動作、及び本発明に係る濃度測定方法の実施形態を説明する。この高速液体クロマトグラフ１０では、濃度が異なる複数の標準試料（それら濃度は既知）の測定結果に基づいて以下のように検量線を作成し、その後、未知試料を測定して該検量線に基づいて該未知試料の成分を定量的に求める。ここで未知試料の測定の動作は、従来の高速液体クロマトグラフと同様である。そのため以下では、濃度が異なる複数の標準試料の測定結果に基づいて検量線を作成する際の動作に絞って説明する。
【００２３】
まず、送液ポンプ１２により移動相を移動相容器１１から吸引して試料注入部１３に送給しつつ、試料注入部１３は、成分の含有率が既知であって所定の第１濃度となるように調製した標準試料を移動相に注入する。ここで標準試料の調製は、オートサンプラで行ってもよいし、分析者が行ってもよい。移動相に注入された標準試料は、カラム１４を通過する間に、該試料に含まれる成分が時間的に分離される。そして、各成分は、時間差をもって検出器１５の試料セル１５３に到達し、以下のように、成分毎に異なる時間（保持時間）に検出される。
【００２４】
検出器１５では、光源１５１から発せられる所定の波長帯内の多数の波長を有する光が試料セル１５３を通過し、その際に試料セル１５３内に存在する標準試料の成分により定まる特定の波長の光のみが吸収され、前述のように凹面回折格子１５５で波長分散されて波長毎にフォトダイオードアレイ１５６で強度が検出される。この波長毎の検出強度の時間変化のデータをフォトダイオードアレイ１５６から得ることにより、クロマトグラム作成部１６１は波長毎のクロマトグラムを作成する。
【００２５】
第１濃度の標準試料の成分が全て検出器１５の試料セル１５３を通過した後のタイミングにおいて、試料注入部１３は、第１濃度とは異なる所定の第２濃度となるように調製した標準試料を移動相に注入する。標準試料の調製の方法は第１濃度の場合と同様である。そして、第１濃度の標準試料と同じ方法で、第２濃度の標準試料について波長毎のクロマトグラムを作成する。以下、必要に応じて、第１濃度及び第２濃度とは異なる濃度の1以上（第１濃度及び第２濃度の標準試料と合わせて3以上）の標準試料について同様の操作を行う。
【００２６】
図２(a-1)に、第１濃度の標準試料の測定で得られた検出強度から作成したクロマトグラムの一例を示し、図２(a-2)に、第１濃度の標準試料の測定で得られた検出強度から作成したクロマトグラムの一例を示す。(a-1)及び(a-2)にはそれぞれ、異なる4つの波長において得られたフォトダイオードアレイ１５６の検出強度に基づいて、それら波長毎に作成された4つのクロマトグラムが示されている。これら4つのクロマトグラムのうち、同図中に「CH1」及び「CH2」と記した2つのクロマトグラムは、標準試料中の同じ成分（「成分A」とする）で吸収された光の異なる2つの波長の検出強度からそれぞれ作成したクロマトグラムである。CH1とCH2のクロマトグラムのピークは、保持時間が同じであって、その強度（ピークトップの高さ、及びピークの積分強度（面積））が相違している。また、同図中に「CH3」及び「CH4」と記した2つのクロマトグラムは、成分Aとは異なる標準試料中の同じ成分（成分B）で吸収された光の異なる2つの波長の検出強度からそれぞれ作成したクロマトグラムである。CH3とCH4のクロマトグラムのピークは、保持時間が同じ（成分Aの保持時間とは異なる）であって強度が相違している。
【００２７】
検量線作成部１６２は、このように標準試料の濃度が異なる(a-1)及び(a-2)からそれぞれ得られたCH1〜CH4のクロマトグラムのピークの強度から、CH1〜CH4のそれぞれについて、図２(b)に示すように、標準試料の濃度と得られたピークの強度の関係を示す検量線を作成する。図２(b)では、横軸を標準試料の濃度として第１濃度及び第２濃度の値のところに、得られたピーク強度の値の点を付したが、標準試料の濃度が既知であり且つ標準試料における成分A及びBの含有率も既知であるため、横軸を成分の濃度に換算することが可能である。
【００２８】
こうして得られた検量線を用いて、未知試料の定量を行う際には、クロマトグラム作成部１６１は、該未知試料の測定によってフォトダイオードアレイ１５６で検出された波長（CH1〜CH4）で得られた検出強度に基づいてクロマトグラムを作成する。そして、未知試料濃度決定部１６３は、該波長で得られたクロマトグラムのピーク強度となるときの濃度を該波長における検量線から読み取ることにより、該波長に対応した成分の濃度を求める。ここで、1つの成分について複数の波長（成分AではCH1及びCH2、成分BではCH3及びCH4）の値で測定することができる。そのため、それら複数の波長で得られた濃度の値を平均すること等により、1つの波長の検量線だけで濃度を求めた場合よりも精度を高くすることができる。
【００２９】
図２(a-1)及び(a-2)に示した例では、クロマトグラムのピークはいずれも、検出困難なほど小さくはなく、且つ、ピークが飽和するほど大きいものでもない。そのため、得られたクロマトグラムのピークを全て検量線の作成に用いた。それに対して、図３(a-1)に示したCH1及びCH2のクロマトグラムのうち後者のもののようにピーク強度が弱すぎると、ピーク強度の値を正確に求めることができない。そこで、CH1及びCH2のそれぞれについて、図３(a-1)に加えて同(a-2)及び(a-3)に示すように濃度がより高い標準試料を用いてクロマトグラムを作成し、それら3つのクロマトグラムで得られたピーク強度のうち所定の下限値よりも大きいものを用いて検量線を作成する。作成した検量線の例を図３(b)に示す。CH1では3つのクロマトグラムで得られたピーク強度を全て用いて検量線を作成しているのに対して、CH2では下限値よりも低いピーク強度（図中の×印）を除外して残りの2点を用いて検量線を作成している。ピーク強度が下限値よりも低いデータは精度が低いため、残りの2点を用いて作成した検量線から外れており、この点を含めると検量線が不正確になってしまうが、本実施形態ではこの点を除外することで検量線の精度の低下を防止している。
【００３０】
また、測定時の成分の濃度が高すぎると、検出器１５のフォトダイオードアレイ１５６の該成分に対応する波長の検出強度を示す信号が飽和してしまう。そうすると、図４(a-3)に示すように、クロマトグラムのピークも飽和してしまう。このような飽和したピークの強度は、真のピーク強度よりも小さくなってしまうため、検量線の作成に使用するとその精度が低くなってしまう。そこで、図４(a-3)に加えて同(a-1)及び(a-2)に示すように濃度がより低い標準試料を用いてクロマトグラムを作成し、それら3つのクロマトグラムで得られたピーク強度のうちピークが飽和していないことを示す所定の上限値よりも小さいものを用いて検量線を作成する。作成した検量線の例を図４(b)に示す。CH4では3つのクロマトグラムで得られたピーク強度を全て用いて検量線を作成しているのに対して、CH3では上限値よりも高いピーク強度（図中の×印）を除外して残りの2点を用いて検量線を作成している。この×印の点を含めてしまうと検量線が不正確になってしまうが、本実施形態ではこの点を除外することで検量線の精度の低下を防止している。
【００３１】
本発明は、上記実施形態には限定されない。
例えば、上記実施形態ではフォトダイオードアレイを備える検出器を使用したが、その代わりに、質量分析装置を検出器として用いてもよい。その場合には、異なる複数の質量電荷比m/zをパラメータとして、濃度の異なる複数の標準試料についてそれぞれ、それら質量電荷比m/z毎にクロマトグラムを作成する。ここで、異なる複数の質量電荷比m/zを得るには、同位体の存在によって質量電荷比m/zが相違することを利用してもよいし（図５(a-1), (a-2)）、質量分析計において目的成分のイオンを開裂させてもよい。作成したクロマトグラムに基づいて、目的成分の検量線を作成することができる（図５(b)）。
【００３２】
また、上記実施形態では高速液体クロマトグラフの場合を例として説明したが、ガスクロマトグラフにおいても同様の濃度測定のための構成、濃度測定方法及びクロマトグラフ用プログラムを適用することができる。
【符号の説明】
【００３３】
１０…高速液体クロマトグラフ
１１…移動相容器
１２…送液ポンプ
１３…試料注入部
１４…カラム
１５…検出器
１５１…光源
１５２…レンズ
１５３…試料セル
１５４…スリット
１５５…凹面回折格子
１５６…フォトダイオードアレイ
１６…データ処理部
１６１…クロマトグラム作成部
１６２…検量線作成部
１６３…未知試料濃度決定部
１７…制御部
【図１】
0006583159.tif 000002
【図２】
0006583159.tif 000003
【図３】
0006583159.tif 000004
【図４】
0006583159.tif 000005
【図５】
0006583159.tif 000006