(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の検査のための方法であって、以下の段階、すなわち：
ａ）前記試料のデジタル画像の生成；
ｂ）前記デジタル画像を解析して、試料の特徴を示す少なくとも一つの試料パラメータを決定することであって、前記試料パラメータが、所与の領域における特定の細胞型または組織型の局所的な量を示す、こと；
ｃ）前記少なくとも一つの試料パラメータに基づく、前記デジタル画像における関心領域の選択；
ｄ）前記デジタル画像における選択された関心領域に対応する、前記試料からの領域の単離；
ｅ）前記試料から単離された関心領域を用いての分子検定の実行；
ｆ）検定データを対応する試料領域の前記試料パラメータにリンクして、前記検定データおよび前記デジタル画像が同時にアクセスできるようにすること、
を含む、方法。
【請求項２】
試料の検査のための装置であって：
ａ）前記試料のデジタル画像の生成のための画像生成ユニット；
ｂ）前記画像を解析して、試料の特徴を示す少なくとも一つの試料パラメータを決定するための画像解析器であって、前記試料パラメータが、所与の領域における特定の細胞型または組織型の局所的な量を示す、画像解析器；
ｃ）前記少なくとも一つの試料パラメータに基づく、前記デジタル画像における関心領域の選択のための画像選択ユニット；
ｄ）前記デジタル画像における選択された関心領域に対応する、前記試料からの関心領域の単離のための試料単離ユニット；
ｅ）前記試料から単離された関心領域を用いての分子検定の実行のための分子検査ユニット；
ｆ）検定データを、対応する試料領域の前記試料パラメータにリンクして、前記検定データおよび前記デジタル画像が同時にアクセスできるようにするための評価ユニットを有する、
装置。
【請求項３】
前記試料が、前記デジタル画像の前記生成前および／または前記分子検定の前記実行後に染色されることを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記デジタル画像の前記生成の間、前記試料がカバー・スリップによって覆われることを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記画像選択ユニットが、自動画像解析モジュールおよび／またはユーザー・インターフェースを有することを特徴とする、
請求項２記載の装置。
【請求項６】
前記試料パラメータが、所与の領域における腫瘍細胞の絶対数または相対数を示すことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記試料パラメータが、少なくとも部分的には、前記試料で実行される染色検定に基づくことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記デジタル画像における前記関心領域の前記選択が、少なくとも部分的には前記試料パラメータに基づくことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記デジタル画像における前記関心領域の形状および／または大きさが、前記関心領域に対応する領域を前記試料から単離する手段の要求に従って適応されることを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記試料単離ユニットが、レーザー微細切り出し装置および／または印刷装置を有することを特徴とする、
請求項２記載の装置。
【請求項１１】
前記試料が、少なくとも一つのマーカーを有する担体上に配置されることを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項１２】
実行される前記検定が、PCR段階、配列決定段階および／またはマイクロアレイ・ハイブリッド形成または他の分子診断技法を含むことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記画像選択が、前記画像における領域の手動による粗い選択を実行し、該領域を自動的に調節してそれにより前記画像における前記関心領域のより正確な定義を得るアルゴリズムを実行することを含むことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記検定データを対応する試料領域の前記試料パラメータを考慮に入れて自動的に評価する段階をさらに含む、
請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記検定データを対応する試料領域の前記試料パラメータを考慮に入れてユーザーが評価することができるように前記検定データおよび対応する試料領域の前記試料パラメータを出力する段階をさらに含む、
請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料、特に生体組織の試料の検査のための方法および装置に関する。さらに、試料単離ユニットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、生体標本の画像が生成され、細胞学的物質を含む領域を求めて自動的に解析される解析器を開示している。次いでこれらの領域は自動的に人間の操作者に対して、一時的に最適化されたシーケンスにおいて呈示される。
US6159681は、生物学的物質の領域解析を実行する方法を開示している。この方法は生物学的物質に対して確立されるフォトレジスト層を用いる。関心領域が選択され、照射されて、生物学的物質の特定の領域を露光する。露光された生物学的物質は次いで、多様な解析方法の任意のものを使って選択的に解析されてもよい。
Hadano  Sらの"Laser  microdissection  and  single  unique  primer  PCR  allow  generation  of  regional  chromosome  DNA  clones  from  a  single  human  chromosome"、Genomics,  Academic  Press,  San  Diego,  US,  vol.11,  no.2,  1  October  1991,  pp.364-373は、微細切り出しされた染色体を直接的に増幅するための、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アプローチとの関連でのアルゴン・レーザー染色体微細切り出し技法の開発を開示している。
US2011/177518は生物学的細胞物質の微細単離のための装置および方法を開示している。微細単離装置および方法は、DNA破壊照射に対して関心領域を保護するフォトマスクを利用する。
WO01/33190は自動化されたレーザー・キャプチャー微細切り出しのためのシステムおよび方法を開示している。高いスループットの微細切り出しが、関心対象の細胞の事前選択のための細胞入手およびマルチ撮像ツールを使うことによって提供される。
US6194157はフォトレジストを使って生物学的物質を分離する方法を開示している。生物学的試料を固定するためにフォトレジストが使用されたのち、フォトレジストに埋め込まれた生物学的試料から特定の生物学的物質、たとえばある種の細胞または生体高分子を得るために、生物学的物質を覆うフォトレジスト部分を適切な波長をもつ光Lに露光することによって、フォトレジストの属性が変化させられる。変化したフォトレジストに埋め込まれている生物学的物質が回収される。
US2010/081923は、（ａ）生体中で凍結された化学処置された組織の抽出、（ｂ）生物体の組織中に伸ばされるチャンバにおける組織試料の処置および／または（ｃ）生体内で光向上物質が加えられた細胞、を示す画像または他のデータを生成するまたは他の仕方で扱うシステム、方法および他のモダリティを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第6091842号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Falko  Fend,  Mark  Raffeld,  "Laser  capture  microdissection  in  pathology",  J.  Clin.  Pathol.  ,2000,  53:666-672
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料のより多様な検査のための手段を提供することが本発明の目的である。この検査が高い精度および／または効率をもつことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、請求項１に基づく方法、請求項２に基づく装置、請求項１４に基づく試料単離ユニットおよび請求項１５に基づく使用によって対処される。好ましい実施形態は従属請求項において開示される。
【０００７】
第一の側面によれば、本発明は、試料、特にたとえば腫瘍細胞の存在について検査されるべき組織片のような生物由来の試料の検査のための方法によって上記の懸念に対処する。本方法は、以下の段階の少なくとも一つまたはそれらの組み合わせを含み、段階または段階のシーケンスは任意的には一回または複数回反復されることができる：
ａ）試料の画像の生成。
ｂ）前記画像から決定でき、下記では参照のために「試料パラメータ」と呼ばれる少なくとも一つの所与のパラメータに関する前記画像の解析。典型的には、試料パラメータは、空間的に分解された仕方で、すなわち、画像領域または画像ピクセルに依存して決定される。二つ以上の型の試料パラメータが決定された場合、「試料パラメータ」への言及は、以下では、少なくとも一つの試料パラメータへの、好ましくは全部の試料パラメータへの言及を意味する。
ｃ）前述した画像における関心領域（ROI）の選択。ここで、前記関心領域は下記では「画像ROI」と呼ばれる。
ｄ）上述した画像ROIに対応する前記試料からの領域の単離。ここで、前記試料のこの領域は以下では「試料ROI」と呼ばれる。「単離（isolation）」は、試料ROIに属する試料物質が試料の残りの部分から物理的に分離されることを意味する。
ｅ）上述した試料ROIを用いての少なくとも一つの分子検定〔アッセイ〕の実行。
ｆ）検定データの、対応する試料領域の試料パラメータへのリンク。
【０００８】
上述した画像ROIは、画像の単一の連結したパッチであってもよく、あるいは複数の分離したパッチから構成されていてもよい。画像のある点が画像ROIに属するか否かの判断は、試料の意図される検査に依存する。腫瘍治療の用途では、画像ROIはたとえば、腫瘍細胞を示すものと疑われる画像部分を含むことがある。
【０００９】
画像ROIと試料ROIの間の対応は、通例、
ａ）画像ROIに属する画像の各点が、試料ROIに属する試料の位置を示す、および／または
ｂ）試料ROIに属する試料の各点が、画像ROIに属する画像の点によって表わされる
ようなものである。
【００１０】
典型的には、関係ａ）およびｂ）の両方が同時に成り立つ（全単射関係）が、ａ）だけまたはｂ）だけが成り立つ（単射関係）ことも本発明に含まれる。
【００１１】
さらに、「分子検定」という用語は、化学組成に依存する試料ROIの一つまたは複数のパラメータが決定されうる任意の検査、試験または実験を含む広義に理解されるものとする。例として、分子検定は、特定のタンパク質または核酸配列（たとえば腫瘍マーカー）の（定性的または定量的な）検出を含んでいてもよい。
【００１２】
段階ｆ）におけるリンクは、試料ROIについての分子検定において決定された検定データおよび対応する試料領域――すなわち画像ROI――について決定された試料パラメータの値が互いに関連付けられることを意味する。これはたとえば、それらをメモリ、データベースまたはテーブル中の所与の位置に一緒に記憶することによって、あるいはポインタでそれらを参照することによってなされてもよい。このリンクのため、その後、検定データは、自動的におよび／またはユーザーによって、試料の同じ部分に属する試料パラメータを考慮に入れて評価されることができる（あるいは逆に、試料パラメータが、検定データを考慮に入れて評価されることができる）。
【００１３】
第二の側面によれば、本発明は、試料の検査のための装置に関する。当該装置は、以下のコンポーネントの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせを有する：
ａ）試料の画像の生成のための画像生成ユニット。
ｂ）前記画像を少なくとも一つの試料パラメータに関して解析するための画像解析器。
ｃ）前述した画像における関心領域（ROI）の選択のための画像選択ユニット。前記領域は下記では「画像ROI」と呼ばれる。
ｄ）画像中の上述した画像ROIに対応し、以下では「試料ROI」と呼ばれる、前記試料からの関心領域の単離のための試料単離ユニット。
ｅ）前記試料ROIを用いての分子検定〔アッセイ〕の実行のための分子検査ユニット。
ｆ）検定データを、対応する試料領域の試料パラメータにリンクするための評価ユニット。上記の画像解析器、画像選択ユニットおよび／または評価ユニットの機能は任意的には、同じ装置によって、たとえば汎用コンピュータによって提供されてもよい。
【００１４】
本発明の上記第一および第二の側面に基づく方法および装置は、試料中の関心領域がまず試料の画像から選択され、次いで物理的な試料から現実に抽出されて、分子検定にかけられ、対応する画像データおよび検定データが互いにリンクされるという同じ発明概念を含んでいる。特に、上記方法は、記載された上記装置を用いて実行されることができる。よって、該方法について与えられる説明および定義は、装置についても有効であり、逆に装置について与えられる説明および定義は、方法についても有効である。
【００１５】
本方法および装置は、標本が視覚的な観察および分子診断の両方にかけられることができ、それらの結果が空間的に分解された仕方で互いにリンクされるので、試料のより情報に富む検査を許容するという利点がある。さらに、試料ROIの、標的を絞られた定義によって有意でない（わずらわしい）試料物質が含まれるのが最小化され、視覚的な観察および分子検定が（たとえば試料の異なるスライスではなく）同一の物質を参照するので、分子検定の高い精度が達成できる。さらなる利点は、処理段階の多くが、あるいは全部さえもが自動化されることができ、それにより検査手順全体の高い効率を達成するということである。
【００１６】
分子診断（molecular  diagnostics）（「MDx」）解析のための試料物質の解析は、MDx解析の品質にとって決定的であるまたはMDx結果のよりよい解釈を可能にする追加的な情報を提供するパラメータを導出できる。たとえば、選択が個々の細胞に基づいているとき、それらの細胞の安全な識別が要求される。これはたとえば腫瘍細胞であることができ、核と細胞質との間のある種の比のようなパラメータ、核のある種の形状不規則性、細胞膜におけるタンパク質（たとえばHER2）または細胞質におけるタンパク質（サイトケラチン）の特定の免疫染色、核受容体（ERなど）またはある種の遺伝子（たとえばHer2）のコピー数またはmRNAのコピー数のようなゲノム・パラメータまたはそれらの組み合わせによって特徴付けられることができる。ある種の相補的染色が、上皮、間質または免疫細胞などについての特定の免疫染色で腫瘍のような見え方をもつ細胞を同定することによって、誤った判定を排除するために使われることができる。
【００１７】
もう一つの例は、MDx結果の解釈のための画像パラメータ（試料パラメータ）の使用である。q-PCRマイクロ検定、サンガー配列決定法およびNext  Gen配列決定法のような方法で実行されるMDx試験は、ある種の感度および特異性の制限がある。さらに、遺伝子発現パターンを見るとき、特定のプロファイルは解析される細胞の型に依存する。画像および／または画像ROIの解析からの情報を使うことは、発現プロファイルのより正確な解釈を可能にすることができる。発現はたとえば、腫瘍細胞の割合に対してスケーリングされ、他の細胞型（たとえば非悪性）の名目発現プロファイルからの寄与について補正されることができる。配列決定データはたとえば、ROIにおける存在割合に従って非腫瘍細胞から発する参照ゲノム寄与について補正されることができる。MDx試験の結果が曖昧であるある種の場合には、試料選択の役割を考慮に入れることができ、別の、より厳しい選択が助言されることができる。第一のMDx試験からの結論に基づいて代替的なROIを同定するために、試料が再検討されることができる。
【００１８】
以下では、本方法および装置の両方を用いて実現されることのできる、本発明のさまざまな好ましい実施形態について記述する。
【００１９】
検査される試料は特に、身体組織のスライスであってもよい。さらに、関心対象の特定の特徴を（よりよく）見えるようにするために、画像が生成される前に、試料が染色されてもよい。よって、本発明の方法は、任意的には、最初の諸段階として、身体組織のスライスの生成および／または試料の染色を含んでいてもよい。本発明の装置において、これらの段階が実行されることのできる試料準備ユニットが任意的に含められてもよい。
【００２０】
染色は追加的または代替的に、試料の検査全体の間の他の時点においてなされることができる。本発明のいくつかの実施形態では、MDx試験の結果はたとえば、試料セクションに対するフォローアップ染色検定を選ぶために使われることができる。その染色は任意的に、すでに解析され、部分的に除去されている残りの試料セクションに対して実行されることができる。この場合、前の結果は、フォローアップ染色から得られる新しい結果と一緒に（たとえば個々の細胞ベースで）含められることができる。例として、MDx検定は、腫瘍細胞におけるある種のシグナル伝達経路の遺伝的変異および／または活動についての洞察を与えることができる。その経路において役割を演じるタンパク質の存在および／または活性化のための個別的な染色は、遺伝的情報と腫瘍進行および／またはある種の処置療法に対する感受性との間の関係についての重要な情報を提供することができる。
【００２１】
試料の生成された画像は好ましくは顕微鏡画像である、すなわち肉眼には見えない詳細を明らかにする。追加的または代替的に、該画像は好ましくはデジタル画像であり、よって多様なデジタル画像処理手順の適用を許容する。さらに、該画像は、走査によって、すなわち試料のより小さな諸部分のサブ画像の逐次的な生成によって、生成されてもよい。したがって、本装置は、上記の特徴の実施形態を許容するために、デジタル顕微鏡、特にデジタル・スキャン顕微鏡を有していてもよい。さらに、生成された顕微鏡画像は、明視野もしくは蛍光画像または異なる画像の組み合わせであることができる。
【００２２】
試料は好ましくは、前記画像の生成の間、カバースリップ（cover  slip）によって覆われる。これはたとえば、デジタル顕微鏡、特にバーチャルスライド・スキャナー（whole  slide  scanner）が使われるときに望ましい。バーチャルスライド・スキャナーからの画像解析は、高い画質を必要とする。病理医は、普通なら顕微鏡での操作から得られるであろうあらゆる情報を抽出できる必要があるからである。高い画質は、試料が包埋され、覆われることを必要とする。カバースリッピング（cover  slipping）と呼ばれる、病理研究室における標準的な手順である。その段階のために商用の設備が市販されている。デジタル病理学では、染色されたスライドの代わりにデジタル・ファイルが記憶され、アーカイブされることができるので、スライドはMDxのための試料の検索のために使用されることができる。これは、解析された組織および細胞と、MDxのための選択された物質との間の100%マッチをもつという利点がある。そうでなければ、画像を、MDxのためのROIが切り出されるもとになった試料（パラフィン・ブロック）からの次のセクションに関係付けるために、投影および補間が必要とされる。
【００２３】
しかしながら、デジタル・ファイルが記録されるもとになった同一の切片から試料を取る可能性をもつことは、追加的な試料準備段階を必要とする。ROIの取り外しのためには、カバー・スリップが障害になる。したがって、好ましくは、試料ROIの単離の前にカバー・スリップが除去される。スライドは、デジタル・スキャンについてと同じ基準（マーカー）に対して物理的に整列されることができる。物理的な試料選択をするために新たな画像は必要とされない。バーチャル画像は、レーザー・ビームまたは試料ROIを捕捉してそれを残りの試料から除去する機械的または他のデバイスを案内するために使われることができる。任意的に、整列および選択を助けるために、より低い品質の画像が、選択装置のその状態において得られ、高品質の記憶されている画像にマッピングされることができる。
【００２４】
ひとたびカバー・スリップが除去されたら、上記の理由により、試料ROIの除去の前および／または後に同じスライドに対して追加的な染色が実行されることができる。カバースリッピング後に、高品質画像が得られることができ、これがすべての以前の試験、最も重要にはMDx試験の結果と一緒に、解析され、解釈される。
【００２５】
画像ROIの選択は、適切な画像処理ルーチンによって自動的に、ユーザーの手動入力によって、あるいは両者の混合によって行なわれてもよい。よって、本装置は好ましくは、画像解析モジュール、たとえばデジタル画像の解析のための関連するソフトウェアを備えたデジタル・マイクロプロセッサを有していてもよい。追加的または代替的に、本装置は、ユーザーが画像ROIの選択を指すデータを入力することができる入力手段を有するユーザー・インターフェースを有していてもよい。典型的には、ユーザー・インターフェースは、出力手段、たとえば試料の画像が、任意的には現在定義されている画像ROIの表現と一緒に、示されることができるディスプレイ（モニタ）をも有する。該出力手段は、好ましくは、調整可能なズーム因子での試料画像の表現を許容してもよい。
【００２６】
前記画像解析器は典型的には、試料パラメータが自動的に決定されることができるようにする適切な画像処理ソフトウェアを備えたデジタル・データ処理ユニットである。
【００２７】
試料パラメータは、一般には、試料の画像から決定できる任意の型のパラメータであってよく、たとえば所与の化学物質の局所的な濃度（たとえば該物質の色を介して明かされる）である。ある好ましい実施形態では、試料パラメータは、特定の細胞型または組織型の局所的な量を示す。試料パラメータはたとえば、所与の領域における腫瘍細胞の絶対数または相対数を表わしてもよい。特に、試料パラメータは画像ROIにおける腫瘍細胞の数および／または割合であってもよい。画像ROIについてこの数を知ることは、この領域を指す検定データの正しい解釈のための重要な手がかりを与えうる。
【００２８】
試料パラメータが（少なくも部分的に）その試料について実行される染色検定に基づく場合に、本発明のもう一つの有利な実施形態が達成される。可能な染色検定は、たとえば、形態についてのH&E（Hematoxylin-Eosin［ヘマトキシリン・エオシン］）、IHC（immuno-histochemistry［免疫組織化学］）、FISH（fluorescence  in  situ  hybridization［蛍光in  situハイブリッド形成法］）、PLA（スウェーデン国Olinkからのproximity  ligation  assay［近接結紮検定］）、PPA（スウェーデン国Olinkからのpadlock  probe  assay［南京錠プローブ検定］）、ローリングサークル増幅（RCA:  rolling  circle  amplification）（スウェーデン国Olink）、分岐DNA信号増幅およびこれらすべての技法または特定の生物学的情報を得るための他の検定の組み合わせを含む。染色は特に、特定の細胞型または組織型および／または細胞の特定の属性または機能または異常を示す分子を識別するのを助けうる。
【００２９】
画像ROIの選択は、少なくとも部分的には、決定された試料パラメータに基づいていてもよい。試料パラメータがたとえば腫瘍細胞の局所的な量を示す場合、画像ROIは、このパラメータが所与の閾値より上である領域を含むように選ばれてもよい。
【００３０】
ほぼ任意の形状および大きさの画像ROIを生成することが通例は可能であるものの、試料ROIについては典型的にはそうではない。実際の物理的な試料について実現される必要があるからである。本発明のある好ましい実施形態では、したがって、画像ROIの大きさおよび／または形状は、可能な試料ROIによって設定される要求に従って適応される。たとえば、画像ROIの大きさおよび／またはその境界の曲率が、それぞれ所与の最小より大きいまたは所与の最大より小さいよう制約されてもよい。この適応は、実際に物理的な試料ROIに転換できるような画像ROIのみが生成され、それにより、分子検定のための試料の意図された選択と実際の選択との間のミスマッチを回避するという利点がある。この適応は好ましくは、適切な（デジタル）画像処理ルーチンによって自動的に、たとえば所与のユーザー選択に基づいて、なされてもよい。
【００３１】
関心対象の細胞からなる純粋な部分を得ることは、時間がかかることがあり、除去に関して高い精細度を要求する。上述したアプローチは、選択のための要求を緩和し、どのくらい簡単なまたは信頼できるセクションが除去できるかを考慮に入れ、選択の全大きさを制御する追加的なパラメータを用いてそれをバランスさせることを許容する。便利な選択のためには、より大きな連続的な諸セクションが好ましい。画像解析は、潜在的な関心領域、たとえば全表面積における、同定された各細胞型の数および割合のような表のパラメータを提供することができる。該領域の形状は、全面積、許容される曲率および接続性のようなパラメータを含む設計基準によって制限されることがある。各MDx検定に固有であることのできるある選択アルゴリズムが与えられて、アルゴリズムに基づいて最適が決定されることができる。このようにして、均一な試料を提供するのではなく、腫瘍細胞の割合のようなMDx試験に関する要求および選択されたROIの幾何学的パラメータのような簡単な単離の要求を満たす、よく特徴付けされた試料が得られる。
【００３２】
試料ROIがどのようにして試料から単離されることができるかについてはいくつかの可能性がある。一つの可能性は、文献から知られているレーザー微細切り出し法の応用である（非特許文献１参照）。もう一つの可能性は、印刷装置を使って、試料ROIの指示が試料自身に印刷されることができ、それにより人間の操作者（または機械）が試料ROIを試料の残りの部分から分離できるようにするというものである。さらなる実施形態によれば、画像ROIは、人間の操作者または機械によって、もとの試料と一緒に見られることができるように、（たとえばデジタル）顕微鏡において表現されることができる。
【００３３】
試料は好ましくは、扱いやすさを許容するために何らかの担体上で提供されてもよい。たとえば、身体組織のスライスは典型的には、担体としての顕微鏡スライド上で提供される。典型的には、その上で試料が提供されうる担体（または基板）の材料はガラス、透明プラスチックおよび／またはガラスとプラスチックの合成物を含み、任意的には生体試料との所望される相互作用のための表面層をもつ。さらに、担体はカートリッジ、たとえば開いた空洞、閉じた空洞または流体接続チャネルによって他の空洞に接続された空洞をもつカートリッジの形を有していてもよい。
【００３４】
上述した担体は好ましくは少なくとも一つのマーカー、すなわち現実においてかつ試料の画像において容易に位置特定できる担体上の要素を有していてもよい。したがって、マーカーは、（画像平面内の）「画像座標系」を（担体上の実際の試料を指す）「試料座標系」にマッピングすることを許容する基準を提供する。座標のこのマッピングは、画像座標に基づいて物理的な空間で行なう必要のある、試料ROIの適正な単離のために重要である。
【００３５】
試料が担体上で提供されるとき、試料ROIは好ましくは、試料の残りの部分からの単離後または単離中に、前記担体から別個のホルダー（コンテナ、カートリッジ、チューブなど）に移送される。次いで、該別個のホルダーは、該試料ROIについて所望される分子検定を実行するために、さらに分子検査装置に移送される。逆に、試料の残りの部分は、担体上に留まってもよく、たとえば保管または破棄されてもよい。
【００３６】
本発明のさらなる発展によれば、試料ROIの単離後に、試料ROIおよび／または残りの試料の画像が生成される。この画像は、試料全体の画像をも生成した同じ画像生成ユニットで、あるいは別個の装置で生成されてもよい。試料ROIの（または試料の残りの部分の）画像は、試料全体の画像と、特に選択された画像ROIと比較されることができ、それにより、実際の試料ROIが所望される関心領域に対応しているか否かの検証が許容される。
【００３７】
分子検定が、多様な異なる試験の一つまたは複数を含んでいてよいことはすでに述べた。特に、分子検定はPCR（たとえばq-PCR、qRT-PCR、RT-PCR、qrt-PCRまたはデジタルPCR）、配列決定（特に次世代（next  gen）配列決定）またはマイクロアレイ・ハイブリッド形成または別の分子検定技術またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【００３８】
試料全体を（任意的には選択された画像ROIも）示す画像データと、分子検定の間に生成された検定データは、好ましくは、ユーザーにとって同時にアクセス可能な仕方で組み合わされる。特定の組織染色データおよび分子検定データは、個々の細胞機能または特性に対する追加的な情報を提供するために解釈されることができる。よって、本装置は好ましくは、画像データおよび検定データにアクセスできるユーザー・インターフェースを有する。ユーザー・インターフェースはたとえば、上記データのためのメモリと、上記データが、好ましくは検定データがもとになった画像位置のところに示される仕方で、同時に表示されることのできるディスプレイ（モニタ）とを有していてもよい。このように、収集された情報は、ユーザーフレンドリーかつ直観的な仕方で呈示されることができ、その評価が容易になる。
【００３９】
本発明のもう一つの発展によれば、複数の試料ROIが（対応する複数の画像ROIに基づいて）単離され、異なる複数の試料ROIが個々に異なる検定にかけられる。こうして、同じ試料において、たとえばある領域では第一のマーカーを探し別の領域では別のマーカーを探すなど、異なる領域を異なる質問に関して調査することが可能になる。
【００４０】
諸画像ROIおよび諸試料ROIの上述した定義および単離は、並列に（同時に）および／または逐次的に行なわれてもよい。（第二の）画像ROIの選択および対応する（第二の）試料ROIの単離は、たとえば、（第一の）画像ROIおよび対応する（第一の）試料ROIの、前の検査の組み合わされた結果に基づいてなされてもよい。検査のそのようなフォローアップは、二回以上繰り返されてもよい。
【００４１】
第三の側面によれば、本発明は、たとえば腫瘍細胞の存在について検査されるべき組織片のような生物由来の試料において試料ROIを単離するための試料単離ユニットに関する。当該試料単離ユニットは以下のコンポーネントを有する：
・光ビームを生成するための光源。
・上述した光ビームを試料ROI外の諸位置に向き付けして、それらの位置における試料物質が改変されて試料の残りの部分から分離可能になるようにするための光向き付けシステム。
【００４２】
記載される試料単離ユニットは、特に、上記の種類の装置において使用されることができる。該試料単離ユニットは、試料中の関心領域の単純かつ融通がきく単離を、この領域に属さない試料部分を光ビームを用いて適切に処置することによって許容するという利点をもつ。光ビームが制御されることのできる柔軟性および精密さのため、ほとんど任意の形状の試料ROIを単離することが可能である。
【００４３】
第四の側面によれば、本発明は、生体試料からの試料ROIの単離のための方法に関する。該方法は次の段階を含む：
・光ビームを生成する段階。
・上述した光ビームを試料ROI外の諸位置に向き付けして、そこの試料物質が改変されて残りの部分から分離可能になるようにする段階。
【００４４】
上記の試料単離ユニットおよび方法は、同じ発明概念、すなわち光ビームによる試料ROI外の試料領域の処置に基づいている。したがって、試料単離ユニットのために与えられる説明および定義は、方法についても有効であり、逆に方法について与えられる説明は試料単離ユニットについても有効である。以下では、試料単離ユニットおよび方法の両方に関係する本発明のさまざまな好ましい実施形態について述べる。
【００４５】
好ましくは、試料ROI外のすべての位置が、記述される仕方で処置される。換言すれば、試料ROIの補集合全体が処置される。
【００４６】
一般に、試料物質が試料ROIから（すなわち、処置されていない試料物質から）分離可能になるようにする該試料物質の光ビームに対するいかなる反応も、本発明に含まれる。たとえば、試料物質は、その上に試料が提供される担体に固定されて（「焼き込まれて」）もよく、それにより、処置されていない試料ROIの前記担体からの、のちの選択的除去が許容される。
【００４７】
本発明のある好ましい実施形態では、光ビームによる試料ROI外の試料物質の改変は、試料物質のアブレーションを含む。このようにして、所望されない試料物質は単に除去されて、所望される試料ROIをあとに残す。このアプローチの一つの利点は、試料物質のアブレーションは、それぞれの領域に十分な光エネルギーが加えられる限り、ほとんどあらゆる種類の生体組織に関して特に可能であるということである。さらに、試料ROIを他のコンテナまたはホルダーに移送する必要はない。これはさらに作業フローを単純化する。
【００４８】
上述したアプローチのさらなる発展によれば、アブレーションされた試料物質を回収するために廃物貯蔵所（waste  depot）が設けられてもよい。廃物貯蔵所は好ましくは、随時、たとえば試料ROIの各単離後に、刷新されることができるよう、交換可能であってもよい。廃物貯蔵所を設けることで、アブレーションされた試料物質の制御されない堆積の問題が避けられる。そのような問題は、試料ROIの汚染につながることがありうる。
【００４９】
光ビームによる試料物質の改質を可能にするおよび／または支援するために、試料物質は、光処置の前に加えられた光感応性の試薬を含んでいてもよい。試薬はたとえば、顕微鏡調査のために使われる染色剤であって、光によって活性化されて染色された領域を破壊することのできる分子または化学物質が結合されているものであってもよい。
【００５０】
試料ROI外の試料物質の改質のために使われる光ビームは、特に、大パワーLED光ビームまたはレーザー光ビームであってもよい。これは、高強度の空間的によく局在化された印加を許容するという利点がある。
【００５１】
典型的な場合には、印加される光ビームのパワー密度は約0.1mW/μm2より高く、好ましくは約1.0mW/μm2より高い。変調された光ビーム、たとえばパルス・レーザーが印加されるときは、上述した値は、光印加の期間全体にわたって決定される平均パワー密度を指す。
【００５２】
一般に、光ビームの光は、好都合なことに、生体組織によってよく吸収される波長を含むスペクトルをもつ。そのような波長は典型的には、UV（紫外）光（約100nmから380nm）および／またはIR（赤外）光（約800nmから約1mm）を含んでいてもよいが、可視光をも含んでいてもよい。IR光は、（生体）試料物質のアブレーションのために特に好適である。
【００５３】
ある実施形態では、光ビームは対象となる完全な試料を同時に照射するよう適応されてもよい。別の実施形態では、光向き付けシステムは、試料またはその一部を横断して光ビームを走査するための走査要素（たとえば、可動ミラーおよび／または可動試料ホルダー）を有していてもよい。この場合、光ビームは一時には試料の小さな限られた部分にのみ到達し、該部分が、試料全体またはその一部にわたって逐次的かつ反復的に動かされる。
【００５４】
上述した実施形態のそれぞれにおいて、光ビームが試料ROI内の諸位置に到達しないよう（あるいは少なくとも所与の閾値より高い強度で到達しないよう）気をつける必要がある。このことは、光向き付けシステムが、試料ROI内の位置に到達するような場合に光ビームの生成および／または伝搬を（完全にまたは部分的に）抑制するための光制御要素を有する場合に達成できる。
【００５５】
光ビームの上述した走査の場合、光制御要素は、光向き付けシステムの走査要素を、光ビームを所望される位置にのみ向けるよう制御してもよい。あるいはまた、走査要素は試料の全面積を走査するよう設計されていてもよく、光ビームが試料ROI内の位置に向けられるような場合に、光制御要素は、光ビームの生成を（たとえば光源をオフにすることによって）、あるいは光ビームの伝搬を（たとえばシャッターを閉じることによって）抑制する。
【００５６】
本発明のもう一つの実施形態によれば、上述した光制御要素は試料ROIを定義する位置データを受領するよう適応されていてもよい。これは、試料単離ユニットに試料ROIの任意の所望される形状を単離させるために、適切なデータが送信される必要があるだけなので、試料単離ユニットの柔軟な適用を許容する。特に、これにより異なる、個別の試料ROIが各試料から単離されることが可能になる。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、以下の事項のうちの少なくとも一つを有する：
・試料ROIの単離後に試料ROIおよび／または残りの試料の画像が生成される。
・試料ROIが担体から別個のホルダーに移送される。
・単離された試料ROIを用いて分子検定が実行される。前記検定は好ましくは、PCR段階、配列決定段階および／またはマイクロアレイ・ハイブリッド形成を含む。
・試料ROIは、試料の画像から選択された「画像ROI」（関心領域）に対応する。
【００５８】
試料単離ユニットおよび対応する方法が特に、本発明の上記第一の側面に基づく方法および上記第二の側面に基づく装置において適用されうることはすでに述べた。よって、試料単離ユニットについてのさらなる情報が、この方法および装置の記述から得られうる。
【００５９】
本発明はさらに、上記の装置または試料単離ユニットを、分子診断、分子病理学のために、特に腫瘍学用途、生体試料分析、化学試料分析、食品分析および／または法科学的分析のために使うことに関する。分子診断はたとえば、標的分子に直接または間接的に取り付けられた磁性ビーズまたは蛍光粒子の助けにより達成されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
本発明のこれらおよび他の側面は、以下に記述される実施形態を参照して明白となり、明快にされるであろう。
【図１】本発明に基づく試料の検査を示す概略図である。
【図２】本発明に基づく試料単離ユニットを示す概略図である。
【図３】望まれない物質のアブレーション後の試料ROIの写真である。
【図４】望まれない物質のアブレーション後の試料ROIの写真である。  図面における同様の参照符号は同一または同様の構成要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
患者物質（組織および細胞）の病理学診断調査は、特に腫瘍治療において多くの処置決定の基礎となる。生検からの標準的な薄いスライスが顕微鏡スライド上で呈されて、組織の形態を視覚化するためのある種のプロトコルに従って染色される。より最近には、疾病特異バイオマーカーの生体内（in  situ）染色が、標的とされる薬のコンパニオン診断のために開発されつつある。評価は明視野顕微鏡を用いてなされてもよい。スライドは、調査後、診断が評価され直す必要がある場合に備えて、バックアップとして、長期間保管される必要がある。
【００６２】
デジタル病理学は、顕微鏡の代わりに、染色された組織セクションを自動的にスキャンし、画像を十分な解像度および色レンダリングをもつデジタル・フォーマットで保存するデジタル・スキャナを使う新たな技術である。病理医は、顕微鏡において直接行なうのと同じ診断をデジタル画像から行なうことができる。これは、デジタル画像が物理的なスライドの代わりになることができることを意味する。スライドの代わりにデジタル画像が保存される。もとの生検試料ももちろん、常に保管される。
【００６３】
上記の形の解析の次に、組織および細胞の生検が、q-PCRおよび配列決定のような分子的な方法（「分子診断」または「MDX」と略称する）でも調査されてもよい。このいわゆる分子病理学は、新たな分子バイオマーカーの登場により重要性を増しつつある。しばしば、病理医は、形態情報に基づいて、正しい療法選択のために癌組織の生物学的特性を同定するべく分子試験を実行する決定をする。多くの分子バイオマーカーは組織上で生体中で定量化されることはできない――あるいは少なくとも必要とされる精度ではできない――ので、PCRまたは配列決定のような別個の分子診断試験が生検から、一般にはすでに生検から取られたものである切片から、取られた試料に対して実行される。この組織セクションは、DNAまたはmRNAマーカーの測定の前に細胞溶解によって処理される。結果として、空間的な情報は失われる。
【００６４】
腫瘍組織は一般に、癌細胞のみならず多くの異なる細胞型からなり、癌細胞でさえ腫瘍の異なる領域では分子構成において大幅に異なることがある。したがって、分子解析の結果は、分子試験のための試料として使われる組織セクションの厳密な組成に依存することになる。癌細胞が希釈されているほど、試験結果は敏感ではなく、決定的ではなくなる。さらに、癌細胞集団内での不均質性もMDX検定におけるノイズを引き起こし、感度および特異性ならびに再現性を低下させる。
【００６５】
近い将来、癌組織スライスをもつスライドから、たとえば特定の型の免疫細胞のような他の細胞型を選択することも重要になるだろう。また、癌以外の疾病からの組織スライドから、分子診断を実行する対象とすべく、特定の細胞型を選択する必要もあるだろう。
【００６６】
デジタル病理学では、現在のところ、生検切片のサブセクションに対して分子試験を実行する可能性はない。切片全体に対する試験は、異なる起源の良性細胞（たとえば内皮、繊維芽細胞および免疫細胞）による標的細胞の希釈および癌細胞の不均質性のため、最適でない精度および感度をもつ。通常の病理学では、分子解析のために精密に組織セクションにマークすることは可能ではない。染色され、観察された試料は保存する必要があるため、分子試験のための試料は新しいスライドに由来する必要があるからである。
【００６７】
分子診断情報は癌（および他の疾病）の正しい診断のために重要性を増しつつあるが、実際上は病理医によって頻繁に使用されるものではない。上記で説明したように、主たる問題は、MDX試験のために、組織生検セクションから、代表的な、よく定義された試料を定義することである。手動の選択は、腫瘍組織（または他の疾病組織）一般の不均質性および腫瘍（または他の疾病）位置に対する当該組織セクションの不正確な位置のため、精密ではない。手動の選択は、汚染を作り出すことがある。特にPCRはごく低濃度の汚染をも増幅してしまう。手動の選択は、MDXのために選択された組織の、よい注釈付けを許容しない。コンピュータによって支援された組織の選択は、連続するスライドの間での参照の喪失の問題がある。該選択が、該選択の基礎である生体内染色のために使われたのと全く同じ組織セクションからなされることはできないからである。
【００６８】
よって、病理画像に基づく、分子試験のための試料物質の精密な選択が必要とされている。
【００６９】
この必要性に対処するため、新たなアプローチが提案される。それによれば、まず試料中の関心領域（ROI）が試料の画像から選択され、次いで物理的な試料から現実において抽出され、分子検定にかけられる。
【００７０】
このアプローチのある例示的な実施形態では、組織スライドは、たとえばHER2免疫組織化学または免疫蛍光染色（IHC）または複数の染色検定の組み合わせにより、ある種の臨床指示に従って、染色されてもよい。次いで、スライドは、デジタル・スキャナによってスキャンされてもよく、結果として得られる画像が、共通の諸特徴の諸領域を同定し、指示するために、コンピュータ・プログラムによって解析されてもよい。それらの領域は、確認および必要なら適応のために、病理医に呈示されてもよい。それらの領域から、MDX試験のために選択される当該試料の部分を表わす「試料ROI」と呼ばれる関心領域が自動的にまたは半自動的にソフトウェア・プログラムによって定義されてもよい。与えられている例におけるHER2の平均表現および該表現の諸細胞にわたる統計的分布およびその選択における細胞組成のような、典型的なパラメータがその試料ROIに対して注釈付けされる。その選択された試料ROIの座標が、MDXのための試料の物理的な選択を扱う試料単離ユニットに伝送されてもよい。選択された「試料ROI」は、移送デバイスに移送されてもよく、あるいは直接的に、MDX試験のために使われる処分可能物である。MDX試験は、試料準備と、qRT-PCR、qrt-PCR、配列決定または次世代配列決定またはマイクロアレイ・ハイブリッド形成またはこれらの組み合わせのような分子解析とを含んでいてもよい。その解析の結果は、最終的に、組織選択アルゴリズムからの情報に関係付けられてもよく、任意的には、解釈され、MDXのために選択された試料ROIも示される組織のデジタル画像とともに、病理医に呈示されてもよい。
【００７１】
図１は、記載される手順に基づく身体組織の試料１１の検査に好適な、本発明に基づく装置１０００を概略的に示している。
【００７２】
検査は、試料準備ユニット１００において始まる。ここでは、身体組織のスライス１１が、担体のはたらきをする顕微鏡スライド１０上に準備される。典型的には、組織試料は、パラフィン包埋生検から約4〜8ミクロンの薄いセクションを切ることによって得られる。このいわゆる切片（coupe）が顕微鏡ガラス・スライド１０上でミクロトームひずみから緩和するために水膜上に置かれ、乾くまでそのままにされる。
【００７３】
さらに、試料１１は、適切な染料１２によって、たとえばヘマトキシリン・エオシン（H&E）またはIHCによって染色される。種々の用途のために利用可能な多数の染色プロトコルがある。染色プロトコルは、試薬を含む種々の溶液に切片をもつスライドを浸すことによって手動で作業台上で実行されることができるが、自動化された仕方で実行されることもできる。
【００７４】
一つまたは複数のマーカーMが、顕微鏡スライド１０上に印刷されているまたは顕微鏡スライド１０に刻み込まれていてもよい。これはのちに、画像座標をスライド１０上の実際の座標に関係付けるための参照点のはたらきをすることができる。さらに、のちのスキャンの際に高い画質を許容するために、試料１１をもつスライド１０は好ましくはカバースリップ（図示せず）で覆われる。
【００７５】
上記準備段階ののち、試料１１をもつスライド１０は、特にデジタル・スキャン顕微鏡であってもよい画像生成ユニット２００に移送される。
【００７６】
試料のデジタル画像Iは、顕微鏡２００によって生成され、試料選択ユニット３００に通信される。試料選択ユニット３００はここでは、ディスプレイ（モニタ）３０１、メモリ３０３およびキーボードおよびマウスのような入力装置３０４をもつワークステーション３０２によって実現されている。試料の画像Iは、病理医による視覚的な観察を許容するために、モニタ３０１上に表示されることができる。病理医は、画像中の関心領域RIを同定し、しかるべくそれにマーク付けすることができる。
【００７７】
この画像ROI  RIの同定は、好ましくは、自動画像解析ルーチンによって、支援されてもよい（あるいは完全に行なわれてもよい）。第一の限定でない例として、ソフトウェア・ツールが個々の細胞を同定し、（任意的にはH&Eスキャンからの情報と重畳された）IHC染色されたスライドのデジタル画像に基づいて問題のバイオマーカーについてのスコアを計算してもよい。このツールは次いで、当該領域（単数または複数）内の細胞の細胞数、スコアの平均およびヒストグラムの、それぞれの統計での同様のまたは同一のスコアの領域を計算する。領域は、病理医によって要求されるところにより、合計サイズ、連続性およびスコア統計について最適化されることができる。任意的には、組織選択技術から生じる制約条件を考慮に入れる。計算の結果として、画像ROI  RIが決定され、これは、試料スライドを見ている間に、対応する統計と一緒に画面３０１上におよび／または顕微鏡２００内で視覚化されてもよい。画像ROI  RIは次いで、カーソルの助けにより病理医によって手動で調節され、選択されることができる。
【００７８】
第二の限定でない例として、画像ROI  RIの同定は、画像ROI  RI内部または外部の領域の粗い選択を病理医がすることによる第一段階において定義されてもよい。この領域はたとえば、該領域を迅速に定義するためにユーザーが行なったある回数のクリックを表わす点を含む境界線の表示によって同定されてもよい。第二段階では、この領域は、前段で今述べたもののようなアルゴリズムにおいて、境界線の位置を洗練するために使用されてもよい。この点で、このアルゴリズムは注目すべきことに、個々の核または細胞の同定を許容する前記領域の粗いセグメンテーションを提供しうる。視野における個々の各細胞について、特徴（たとえば染料取り込み、細胞型、細胞増殖、細胞サイズ、細胞形態など）が計算されてもよい。次いで、画像ROI  RIのより正確な同定につながる前記領域の調節が、当技術分野においてよく知られているように同様の特徴をもつ近隣の細胞または核を探索することによって、実行されてもよい。k近傍（k-nearest  neighbor）またはオンラインの機械学習のようなセグメンテーション技法が使用されることができる。
【００７９】
好ましくは、病理医は任意の倍率において諸位置をマークすることができる。マーク付けは典型的には、病変の悪性さまたは存在する種々の細胞型について判断するための基礎である組織形態に基づいてなされる。選択され、マーク付けされることのできる画像の数は限定されない。終わったとき、上記ソフトウェアは選択された画像ROIの概観を病理医のために適切な倍率において提供し、前記領域を必要な解像度に調節してもよい。これはのちに、分子試験のために試料の物理的な選択／単離を担当する試料単離ユニット４００によって処理されることができる。画像ROI  RI（正の選択および負の選択）の境界の実際の（画像および／または試料）座標と、試料単離ユニット４００によって解釈されることのできる必要な参照とを含むファイルが生成される。
【００８０】
上述したファイルは、たとえば単に後刻除去されることのできる領域を指示するための印刷技術によってまたは別の装置によってこの情報をスライドに転写することのできる装置のための入力として使用されることができ、あるいは指示されたセクションを直接除去し、分子試験設備（または試料準備設備）中に導入できる試料ホルダーに移送することができる試料単離ユニットのための入力として使用されることができる。
【００８１】
図示した実施形態では、試料１１をもつ顕微鏡スライド１０は次に、試料単離ユニット４００に移送される。ここでは、選択された画像ROI  RIに対応する試料ROI  RSが（たとえば正の選択または負の選択によって）単離され、試料の残りの部分から分離される。好ましくは、この試料ROI  RSは別個のホルダー、たとえば試験管２０に移送される。さらに、試料単離ユニットは好ましくは、いくつかの領域を相続いて除去し、それらを別個の分子試験に提出することができてもよい。スライド１０上の試料１１がカバー・スリップで覆われている場合、これは、試料ROIの単離が行なわれる前に除去される。
【００８２】
組織の実際の物理的選択および移送は、いくつかの仕方で実行されることができる。その一つは、レーザー微細切り出し法（LMD:  laser  microdissection）による。LMDは、レーザーによって誘起された、細胞のテープへの移送またはコンテナ中への移送を援用して組織スライドから個々の細胞または組織部分を選択するために使われてもよい技法である。この技術は、組織の精密な移送を許容する。LMDレーザーはスライド上を動くことができ、あるいはまたスライドが定常的なレーザー・ビームの下で動くことができる。後者の場合、全試料が同じスポットにおいて収集されるので、収集装置を非常にコンパクトにできる。
【００８３】
デジタル病理スキャンでは、機器が、対物レンズの下で、対象となるスライドを動かす。スキャン時間を最適化するために、試料が存在する領域を見出すようツールが使われてもよい。そのようなスキャン手順の現在の応用は、物理的な参照座標をもつことを要求する。スライド寸法の公差のため、上述したマークMのように、スライド上にインジケータをもつことが好ましい。それが画像スキャンと同時にデジタル・スキャナによって読まれることができる。一つの代替は、機械的な止め具を使い、再現可能な位置決めのために、スライドを該止め具に押しつけるというものである。もう一つの代替は、前記選択を受け持つ試料単離ユニットにスキャン機能を含め、新たにスキャンされた画像と描かれた表面をもつもとの画像とを特徴認識によって重畳させるためにソフトウェア・ツールを使うことである。
【００８４】
試料ROI  RSの単離後、前記選択を確認し、制御するために、組織スライド１０から新たな画像がスキャンされてもよい。この画像は、もとの画像およびMDX解析の結果と一緒に、ワークステーション３０２上にアーカイブされてもよい。
【００８５】
試料ROI  RSをもつ試験管２０は最終段階において、関心対象の検定が試料ROIに関して実行される分子検査ユニット５００に移送される。試料の残りの部分をもつ顕微鏡スライド１０は任意的に、のちのアクセスおよび検証のために保管ユニット６００において保管されることができ、あるいは単に破棄されてもよい。スライド１０を用いたのちの処理段階は特に、フォローアップ検査を含んでいてもよい。フォローアップ検査はたとえば、別の関心領域に関し、少なくとも一つの新たな（特に異なる）染色および／または少なくとも一つの新たな（特に異なる）分子検定を含む。
【００８６】
分子検査ユニット５００では、PCR（q-PCR、RT-PCR、qrt-PCR、デジタルPCRなど、いくつかの技法がこの用語のもとに含まれる）のような選択された試料ROIの解析のためのいくつかの分子技法が利用可能であってもよい。これは、癌細胞における一点遺伝的変異または他の任意のDNA変異、DNA削除、DNA挿入、DNA再配列またはコピー数増幅または他の構造上の変化を検出するため、および／または癌細胞における遺伝子のRNA発現または他の転写されたDNAシーケンスの度合いを決定するため、またはたとえばゲノム全体またはエクソーム全体に対してまたはゲノムのより小さな領域、エクソームまたはトランスクリプトームに標的を絞って、さまざまな深さで、癌細胞における遺伝的変動のより幅広いスペクトルを決定するためのRNAもしくはDNA配列決定（次世代配列決定）のためである。その結果は、癌細胞の遺伝的変異およびその対応するRNA発現プロファイルの点で解釈される。これらは、予後のためあるいはまた標的薬によるようなある種の治療に対する感受性のために、あるいはすでに開始されたまたは終了した治療の効果を実際に評価（治療モニタリング）するために有意である。さらに、そのような分子解析の結果は、同じ試料セクションの画像ベースの解析に結合され、一緒に報告され、また組み合わせて解釈もされることができる。
【００８７】
図２は、本発明に基づく好ましい試料単離ユニット４００を概略的に示している。試料単離ユニット４００は一般に、組織病理学的調査後に薄いセクションから組織試料物質を選択する新たな方法を許容する。このアプローチの本質的な段階は、試料ROIの一部であるべきではないすべての物質の除去である。任意的にはこれに続いて、さらなる解析のための、残っている物質すべての試験管２０への全移送がある。
【００８８】
望まれない物質の除去は、特に、レーザー・アブレーションに基づいていてもよい。上記で説明したように、除去されるべき領域は、組織病理学的染色に続く病理学的観察に基づいてソフトウェア・ツールによって選択されることができる。望まれない物質の除去後に、MDX解析のための入力物質の精密な文書化および特徴付け（たとえば定量化）のために、残っている試料の画像が生成されることができる。
【００８９】
図２に示される特定の試料単離ユニット４００は、たとえば（レーザー）光ビームLを生成する光源４０１を有する。光ビームLは、たとえば可動ミラー４０２および／またはシャッターのような走査要素を有する光向き付けシステムを用いて、スライド１０上に設けられた試料１１に対して向き付けされる。光向き付けシステムはさらに、スライド１０上の所望される試料ROIを定義するデータを受領し、光源４０１のオンおよびオフを切り換えるおよび／または走査要素４０２の動きを制御することのできる制御ユニット４０３を有する。このように、光源および／または光向き付けシステムが、試料ROIの外部の位置のみが光ビームLによって照射されるよう、制御されることができる。
【００９０】
実際上は、約3mW/μm2のパワー密度をもつパルスでパルス・レーザーが使用されてもよい。該レーザーの典型的な波長はたとえば355nmおよび405nmである。より短い波長では、組織の吸収が増すが、閉鎖区画で作業したい場合、基板の吸収も増す。生体物質の吸収は、組織が緑範囲において吸収するラベルをもって染色されない限り、緑において最小になる。IRレーザーが使用される場合、水の吸収は波長とともに増大する。装置および検定に依存して、組織が乾燥しているまたは水で飽和していることができるので、このことは役割を演じる。
【００９１】
負の選択、すなわち望まれない物質の除去は、該物質の可能な劣化を心配しなくていいので、非常に高速であることができる。走査型レーザーまたは合焦された高パワーLEDビームを、該物質のアブレーションのために用いることができる。該アブレーションは、放射の吸収に起因する熱効果に基づく。アブレーションされた物質は、凝縮するまたは廃物貯蔵所または表面４０４上に堆積することができ、廃物貯蔵所または表面４０４は任意的には各実行後に交換することができる。
【００９２】
放射のビームLは、アクチュエータおよびシャッターによって光向き付けシステム４０２において制御されてもよく、任意のパターンを（光路における諸コンポーネントによって決定される）高解像度で描くことができる。残る試料ROIは、機械的手段によってまたは緩衝液によって試験管に移送されることができる。この手順は、閉鎖系または開放系において実行されることができる。レーザー・アブレーションは、のちに別個に手動で選択されることができる複数の領域をマークするために使われることもできる。
【００９３】
記載されるアプローチは、熱アブレーションによって物質を除去する走査ビームに基づいている。細胞が精密に制御された仕方でスライドから基板またはカップに移送されるレーザー微細切り出しとは対照的に、ここでは、最終的な試料において望まれないすべての物質がアブレーションされ、そのため、選択された試料物質（試料ROI）のみがスライド上に残り、スライドは、セクション全体がMDXにかけられるかのうように扱われることができる。これは、下流の手順が、選択が行なわれたか否かとは独立であることを意味する。
【００９４】
光向き付けシステム４０２は、ソフトウェア制御されることができる。ソフトウェア制御は、ズームインまたはズームアウトしながら対話的なコンピュータ画面または等価なツール上で選択された領域の描画を許容するユーザー・フレンドリーな視覚的インターフェースの使用を許容する。画面は、任意的には、IHCまたはISHのような先進的な染色または病理医による正しい選択を支援する他の任意の方法からの画像のオーバーレイと組み合わされる。
【００９５】
使用される光源に依存して、レーザー・ビームを一つまたは二つの次元方向において拡大するために十分なパワーがあることがある。この拡大は、除去される必要のある表面の特徴に依存して変調されることができる。空隙はスキップされることができる。標準的なスライドが使用されることができるが、アブレーション・プロセスまたはMDXへの試料移送またはその両方を容易にするために、専用の基板も可能である。さらに、スキャン手順は、光ビームと試料の相対的な動きを要求するのみであり、よって、（追加的または代替的に）試料ホルダー１０がたとえば可動ステージを介して動かされる実施形態をも含むことができる。
【００９６】
一例では、355nmにおける1WのUVレーザーが標準的な顕微鏡スライドからのFFPE組織をアブレーションするために使用された。図３は、三角形Inv_RSのアブレーション後の試料１１の写真を示している。組織セクションからのシャープな界面をもつ、非常にクリーンな領域が除去されることができることが見て取れる。除去される組織についての分解能は、選ばれた条件において、50マイクロメートルよりよいと結論できる。除去される領域の中間の組織は安定であり、あとに留まる組織と同じ分解能が得られる。使用した組織は、4マイクロメートルの厚さの乳房組織であった。この組織はレーザー・アブレーションの前にH&Eにより染色された。
【００９７】
図４は、（負の）「ミッキーマウス」形をもつより大きな領域のアブレーションの結果を示している。この画像は、大きな領域も容易に、任意の所望される形状で除去できることを実証している。
【００９８】
まとめると、組織病理学染色に基づくMDX解析のために試料物質を選択し、注釈付けするための方法が記述される。細胞ごとの組織化学的スコアが、MDX解析のための試料を表わす染色されたスライド上で関心領域を決定するための選択基準として使われる。選択は、自動化されたアルゴリズムによってなされるおよび／または病理医による手動の調節と組み合わされることができる。あるいはまた、粗い選択が病理医によって手動でなされ、アルゴリズムによる自動的な調節と組み合わされることができる。その選択から、細胞型、数およびスコアについての統計的データが生成されてもよい。この情報は、MDX解析にリンクされる。MDX解析は、精密に、記述された領域の組織物質のみを使用する。これは、（ｉ）（免疫）組織化学およびMDX試料選択のために同じスライドを使用し、（ｉｉ）染色されたスライドが手つかずで保持され、保管される必要がないよう、すべての情報を含むデジタル画像をもつ、ことによって可能にされる。コンピュータによって支援される関心領域の選択は、MDX試料準備および検出技術とインターフェースをもつ自動化された物理的試料除去と組み合わされる。本方法は結果として、MDXのためのよく定義された試料入力を与える。その入力は、MDX結果の評価に関して考慮に入れられる。このようにして、MDX結果は、細胞型および同じ諸細胞の組織化学的スコアに対して注釈付けされることができ、これは病理的診断をより精密かつ再現可能なものとする。それほど有意でない組織を消去することによって、これらの検定の精度および確度が改善し、改善された診断につながる。本アプローチは、診断のために使われる関連する病理画像を記憶することのできるデジタル病理スキャナとの組み合わせにおいて可能であり、のちの参照のための実際のスライドの保管は不要になる。
【００９９】
全体的な手順は次の段階のうちの一つまたは複数を含んでいてもよい：
１．試料をもつスライドの染色（たとえばIHC）。
２．スライドのデジタル・スキャン。
３．結果として得られる画像ファイルの記憶（たとえばPACS、IMS）。
４．画像の解釈（たとえばCADによる）。
５．MDXのための領域（「画像ROI」）の選択（任意的には最適化アルゴリズムを使う）。
６．MDXのための領域の注釈付け（スコア付け統計を含む）。
７．MDXのための領域（「試料ROI」）の物理的な選択。
８．選択後の試料の画像のスキャンおよび記憶。
９．MDXホルダー（単数または複数）（カートリッジ、チューブ、……）への試料の移送。
１０．残りの部分をもつスライドの保管。
１１．選択された試料のMDX解析。
１２．画像のスコア付け統計（６より）によるMDX結果の注釈付け。
１３．MDXの解釈（任意的には、スコア付け統計を解釈アルゴリズムのための入力として使う）。
１４．MDX結果による画像の注釈付け。
１５．染色およびMDXの組み合わされた結果の解釈。
１６．選択およびMDX解析の潜在的な新たなサイクル。
【０１００】
本発明のもう一つの側面によれば、qPCRおよび／または配列決定のようなさらなる解析のために、組織からの試料物質の精密かつ効率的な選択を許容する方法および装置が記述される。この方法は、（選択された物質が影響されないようにする必要がある面倒な正の選択とは対照的に）解析のために選択される部分以外のすべての試料物質を破壊／除去することに基づく。これは、露光された領域において物質を蒸発させるレーザー照射（たとえば走査式のIRレーザー）によって非常に効率的にできる。残りの試料は手またはロボット機構によって簡単に、MDX解析のために試験管またはカートリッジに移送されることができる。本方法は、標準的なガラス・スライド上の調査される組織セクションに対して直接的に適用されることができる。選択された物質は改変されておらず、変位されないので、すぐに選択後の観察を行なうことができる。ソフトウェア制御によって作動される合焦ビームによって、高い分解能が可能である。レーザー・パワー次第では高速が達成できる。本システムは、デジタル病理スキャナならびに関心領域の選択および入力物質の特徴付けのための画像解析ソフトウェアにリンクされることができる。
【０１０１】
提案されるアプローチの重要な利点は、単一の組織セクションである。これは、選択された画像ROIの試料ROIへの100%正確なマッピングおよびMDX試料の100%完全な注釈付けを含意する。さらに、MDX試料の定量化された入力および低下した不均質性のため、より正確かつより再現可能なMDX結果が達成でき、よりよい解釈を許容する。本手順は、必要とされる操作が少なくなり（手動段階なし）、必要とされる組織が少なくなる（単一の切片）。本手順は、染色および選択のデジタル・ファイルを生じ、MDXの結果としてデジタル・ファイルを与え、最終的な解釈は選択されたMDX試料の組織病理学的スコア付けを含む。
【０１０２】
本発明は、分子病理学において、特に、癌細胞における分子的な変化の同定に基づく患者層別化のための腫瘍学用途のために適用されてもよいが、他の疾病の診断／モニタリングのために適用されてもよい。
【０１０３】
本発明について、図面および以上の記述において詳細に図示し、説明してきたが、そのような図示および説明は制約するものではなく、例解または例示するものと考えるべきである。本発明は開示される実施形態に限定されるものではない。開示される実施形態についての他の変形が、特許請求される発明を実施する際に当業者によって、図面、本開示および付属の請求項の吟味から、理解され、実施されることができる。請求項において、「有する／含む」の語は他の要素や段階を排除するものではなく、単数形の表現は複数を排除するものではない。ある種の施策が互いに異なる従属請求項において記述されているというだけの事実がそれらの施策の組み合わせが有利に使用できないことを示すものではない。請求項に参照符号があったとしても、範囲を限定するものと解釈すべきではない。
いくつかの態様を記載しておく。
〔態様１〕
試料の検査のための方法であって、以下の段階、すなわち：
ａ）前記試料の画像の生成；
ｂ）少なくとも一つの試料パラメータに関して前記画像を解析すること；
ｃ）前記画像における、「画像ROI」と呼ばれる関心領域の選択；
ｄ）前記画像ROIに対応する、「試料ROI」と呼ばれる前記試料からの領域の単離；
ｅ）前記試料ROIを用いての分子検定の実行；
ｆ）検定データを対応する試料領域の試料パラメータにリンクすること、
を含む、方法。
〔態様２〕
試料の検査のための装置であって：
ａ）前記試料の画像の生成のための画像生成ユニット；
ｂ）前記画像を少なくとも一つの試料パラメータに関して解析するための画像解析器；
ｃ）前記画像における、「画像ROI」と呼ばれる関心領域の選択のための画像選択ユニット；
ｄ）前記画像ROIに対応し、「試料ROI」と呼ばれる、前記試料からの関心領域の単離のための試料単離ユニット；
ｅ）前記試料ROIを用いての分子検定の実行のための分子検査ユニット；
ｆ）検定データを、対応する試料領域の試料パラメータにリンクするための評価ユニット（３０１、３０２、３０３、３０４）を有する、
装置。
〔態様３〕
前記試料が、前記画像の前記生成前および／または前記分子検定の前記実行後に染色されることを特徴とする、
態様１記載の方法。
〔態様４〕
画像の前記生成の間、前記試料がカバー・スリップによって覆われることを特徴とする、
態様１記載の方法。
〔態様５〕
前記画像選択ユニットが、自動画像解析モジュールおよび／またはユーザー・インターフェースを有することを特徴とする、
態様２記載の装置。
〔態様６〕
前記試料パラメータが、特定の細胞型または組織型の局所的な量を示すことを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様７〕
前記試料パラメータが、少なくとも部分的には、前記試料で実行される染色検定に基づくことを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様８〕
前記画像ROIの前記選択が、少なくとも部分的には前記試料パラメータに基づくことを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様９〕
前記画像ROIの形状および／または大きさが、可能な試料ROIによって設定される要求に従って適応されることを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様１０〕
前記試料単離ユニットが、レーザー微細切り出し装置および／または印刷装置を有することを特徴とする、
態様２記載の装置。
〔態様１１〕
前記試料が、少なくとも一つのマーカーを有する担体上に配置されることを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様１２〕
実行される前記検定が、PCR段階、配列決定段階および／またはマイクロアレイ・ハイブリッド形成または他の分子診断技法を含むことを特徴とする、
態様１記載の方法または態様２記載の装置。
〔態様１３〕
前記画像選択が、前記画像における領域の手動による粗い選択を実行し、該領域を自動的に調節洗練してそれにより前記画像ROIのより正確な定義を得るアルゴリズムを実行することを含むことを特徴とする、
態様１記載の方法。
〔態様１４〕
試料からの「試料ROI」と呼ばれる関心領域の単離のための、特に態様２記載の装置のための試料単離ユニットであって、当該試料単離ユニットは：
・光ビームを生成するための光源；
・前記光ビームを前記試料ROIの外部の諸位置および／または前記試料ROIの内部の諸位置に向け、そこにおける試料が改変されて残りの部分から分離可能になるようにするための光向き付けシステムを有することを特徴とする、
試料単離ユニット。
〔態様１５〕
態様２記載の装置または態様１４記載の資料単離ユニットの、分子病理学のための、特に腫瘍治療用途のための使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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