(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（F_V1/6）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V2）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V3a）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V3b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V6）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含むＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬、
（F_V1/6）  配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V2）  配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V3a）  配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V3b）  配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V6）  配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
ならびに、
配列番号２２の塩基配列からなり、かつ５’末端のシトシン塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドおよび
配列番号２３の塩基配列からなり、かつ５’末端のシトシン塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
を含むプローブセット、
を含むことを特徴とする、分析試薬キット。
【請求項２】
前記プライマー試薬が、さらに、
下記（F_V8a）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V8b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V4）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V4’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（R_V8a/b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V4/4’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む、請求項１記載の分析試薬キット。
（F_V8a）  配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V8b）  配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V4）  配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V4’）  配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V8a/b）  配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V4/4’）  配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
前記プライマー試薬が、さらに、
下記（F_V5a/b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V7）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V9）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V5b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む、請求項１または２記載の分析試薬キット。
（F_V5a/b）  配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V7）  配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V9）  配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V5b）  配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項４】
前記プライマー試薬が、さらに、
下記（F_KIF/e24）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KIF/e15）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KIF/e17）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KLC1）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_TFG）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析試薬キット。
（F_KIF/e24）  配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KIF/e15）  配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KIF/e17）  配列番号１９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KLC1）  配列番号２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_TFG）  配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項５】
前記ＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬を含む一反応系で、被検試料中の鋳型核酸の増幅を行う工程、および、
前記プローブセットを用いた前記鋳型核酸の増幅の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析試薬キットを用いたＡＬＫ融合遺伝子の分析方法。
【請求項６】
前記プローブセットを用いた検出が、融解曲線解析である、請求項５記載の分析方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＡＬＫ融合遺伝子の分析方法により、ＡＬＫ融合遺伝子を分析する工程、および、
前記ＡＬＫ融合遺伝子の有無に基づいて、薬剤への感受性を試験する工程
を含むことを特徴とする薬剤の薬効を試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＬＫ融合遺伝子を増幅するためのプライマー試薬、それを含むＡＬＫ融合遺伝子の増幅試薬キット、それを用いたＡＬＫ融合遺伝子の増幅方法および分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＫ（Anaplastic  Limphoma  Kinase）は、キナーゼの一種であり、前記ＡＬＫをコードするＡＬＫ遺伝子が、他の遺伝子との間で遺伝子再構成（rearrangement）または転座（translocation）すると、ＡＬＫ融合遺伝子が形成されることが知られている。前記ＡＬＫ融合遺伝子は、肺癌への関与が知られており、また、前記ＡＬＫ融合遺伝子を有する肺癌には、抗癌剤としてキナーゼ阻害剤が有効であることが知られている。このため、患者のＡＬＫ遺伝子がＡＬＫ融合遺伝子か否かを分析することで、例えば、患者の肺癌への罹患の可能性を判断したり、また、患者が肺癌患者の場合は、治療方法として、キナーゼ阻害剤の使用、使用量、他の治療剤への切り替え等を決定できる。
【０００３】
前記ＡＬＫ融合遺伝子としては、例えば、ＥＭＬ４（Echinoderm  Microtubule-associated  protein-Like  4）遺伝子との融合遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）、ＫＩＦ５Ｂ（Kinesin  Family  member  5B）遺伝子との融合遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ）、ＫＬＣ１（Kinesin  Light  Chain  1）遺伝子との融合遺伝子（ＫＬＣ１−ＡＬＫ）、ＴＦＧ遺伝子（TRK-fused  gene）との融合遺伝子（ＴＦＧ−ＡＬＫ）があげられる（特許文献１〜４）。そして、これらの中でも、前記ＥＭＬ４−ＡＬＫのバリアントＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６が、ＡＬＫ融合遺伝子を有する肺癌患者の約７０％を占めることから、これらを簡便に分析できることは、肺癌の診断および治療において有用である。
【０００４】
遺伝子検査の手法としては、一般的に、検出目的の遺伝子における特定の領域にアニーリングするプライマーを用いて、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）等の核酸増幅を行い、増幅の有無によって、検出目的の遺伝子の有無を判断する方法があげられる。しかしながら、前述のように、検出目的の遺伝子について複数のバリアントが存在する場合、それぞれのバリアントに対するプライマーを用いて、それぞれの反応系を調製し、各バリアントの有無を確認することは、手間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４３０３３０３号
【特許文献２】特表２０１０−５０１１７５号
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０８７７０９号国際公開パンフレット
【特許文献４】特開２０１２−１００６２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、遺伝子増幅によりＡＬＫ融合遺伝子の複数のバリアントを一反応系で簡便に検出するための新たなプライマー試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のプライマー試薬は、ＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬であり、
下記（F_V1/6）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V2）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V3a）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V3b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V6）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含むことを特徴する。
【０００８】
（F_V1/6）  配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V2）  配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V3a）  配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V3b）  配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V6）  配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【０００９】
本発明の増幅試薬キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の増幅試薬キットであり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の増幅方法は、ＡＬＫ融合遺伝子の増幅方法であり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬を含む一反応系で、鋳型核酸の増幅を行う工程を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の分析方法は、ＡＬＫ融合遺伝子の分析方法であり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子の増幅方法により、被検試料中の鋳型核酸の増幅を行う工程、および、前記鋳型核酸の増幅の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の分析試薬キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の分析試薬キットであり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の薬剤の薬効を試験する方法は、前記本発明の分析方法により、ＡＬＫ融合遺伝子を分析する工程、および、前記ＡＬＫ融合遺伝子の有無に基づいて、薬剤への耐性または感受性を試験する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプライマー試薬によれば、ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６を、同一反応系において同時に増幅することができる。このため、本発明によれば、一つの反応系を用いることで、簡便にＡＬＫ融合遺伝子の複数種のバリアントを検出できる。したがって、本発明は、例えば、肺癌への罹患可能性の診断および肺癌の治療において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施例Ａ１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例Ａ２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例Ａ３におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例Ａ４におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、
下記（F_V8a）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V8b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V4）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V4’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（R_V8a/b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V4/4’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む。
【００１７】
（F_V8a）  配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V8b）  配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V4）  配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V4’）  配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V8a/b）  配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V4/4’）  配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１８】
本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、
下記（F_V5a/b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V7）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_V9）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
下記（R_V5b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む。
【００１９】
（F_V5a/b）  配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V7）  配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_V9）  配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V5b）  配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２０】
本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、
下記（F_KIF/e24）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KIF/e15）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KIF/e17）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_KLC1）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
下記（F_TFG）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む。
【００２１】
（F_KIF/e24）  配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KIF/e15）  配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KIF/e17）  配列番号１９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_KLC1）  配列番号２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（F_TFG）  配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２２】
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の分析方法は、例えば、前記検出工程において、前記鋳型核酸の増幅の検出が、プローブを用いた検出である。
【００２３】
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の分析方法は、例えば、前記プローブを用いた検出が、融解曲線解析である。
【００２４】
本発明の分析試薬キットは、例えば、さらに、前記プライマー試薬による増幅物にハイブリダイズするプローブを含む。
【００２５】
本発明において、以下、フォワードプライマーを「Ｆプライマー」、リバースプライマーを「Ｒプライマー」ともいう。
【００２６】
ＡＬＫ融合遺伝子は、一般に、ＡＬＫ遺伝子の再構成（rearrangement）または転座（translocation）により生じる融合遺伝子を意味する。前記ＡＬＫ融合遺伝子は、例えば、前記ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４遺伝子との融合遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）、前記ＡＬＫ遺伝子とＫＩＦ５Ｂ遺伝子との融合遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ）、前記ＡＬＫ遺伝子とＫＬＣ１遺伝子との融合遺伝子（ＫＬＣ１−ＡＬＫ）、前記ＡＬＫ遺伝子とＴＦＧ遺伝子との融合遺伝子（ＴＦＧ−ＡＬＫ）があげられる。
【００２７】
前記ＡＬＫ融合遺伝子であるＥＭＬ４−ＡＬＫは、例えば、下記表に示すバリアントが例示できる。下記表において、Ｅと数字は、融合しているＥＭＬ４遺伝子のエクソンの番号を示し、Ａと数字は、融合しているＡＬＫ遺伝子のエクソンの番号を示す。例えば、Ｖ１における「E13;A20」は、EML4遺伝子のエクソン１３とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０とが融合していることを意味する。また、ｉｎｓと数字は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の上流に挿入配列が存在することと、前記挿入配列の長さ（塩基長）を示す。例えば、Ｖ６における「E6;ins69  A20」は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン６とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０とが、６９塩基長の挿入を介して融合していることを意味する。また、ｄｅｌと数字は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０において上流側が欠失していることと、前記欠失配列の長さ（塩基長）を示す。例えば、Ｖ７における「E14;del12  A20」は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４と上流側の１２塩基長が欠失したＡＬＫ遺伝子のエクソン２０とが融合していることを意味する。また、各バリアントは、例えば、下記表１〜表３に示すように、各種論文で特定され、または、データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて下記アクセッション番号で登録されている。前記ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントのうち、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６の５種類は、ＡＬＫ融合遺伝子が関与する肺癌の約７０％を占める主要なマーカー群である。
【００２８】
【表１】
0006533128.tif 000002
【００２９】
【表２】
0006533128.tif 000003
【００３０】
【表３】
0006533128.tif 000004
【００３１】
本発明において、最大値と最小値により表す数値範囲の記載は、例えば、前記最大値と前記最小値との間に属する全ての数値を開示するものである。例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する。
【００３２】
（１）プライマー試薬
本発明のプライマー試薬は、前述のように、
前記（F_V1/6）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_V2）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_V3a）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_V3b）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるＲプライマーおよび
前記（R_V6）のオリゴヌクレオチドからなるＲプライマー
を含むことを特徴する。
【００３３】
（F_V1/6）  配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１）    5’-cctgggaaaggacctaaag-3’
（F_V2）  配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２）    5’-gggagactatgaaatattgtacttg-3’
（F_V3a）  配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号３）    5’-ataaagatgtcatcatcaaccaag-3’
（F_V3b）  配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号４）    5’-gcgaaaaaaacagccaag-3’
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号５）    5’-gctccatctgcatggc-3’
（R_V6）  配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号６）    5’-tggcagcctggccc-3’
【００３４】
本発明のプライマー試薬によれば、例えば、前記プライマー試薬を含む同一反応系において、同時に、ＡＬＫ融合遺伝子の主要バリアントであるＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６の増幅を行うことができる。このため、本発明のプライマー試薬によれば、これを用いた一反応系の増幅反応のみで、少なくとも５種類の前記主要バリアントの分析を行うことができる。
【００３５】
融合遺伝子のバリアントを増幅するためのプライマーは、一般的に、約１０００塩基長程度の領域を増幅するように設計されている。これに対して、本発明のプライマー試薬における前記Ｆプライマーおよび前記Ｒプライマーは、それぞれ、各種バリアントの融合点を含む相対的に短い領域（例えば、５０〜１５０塩基長）を増幅するように設計されている。前記相対的に短い領域は、その下限が、例えば、１０塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上であり、その上限が、例えば、２００塩基以下、１７０塩基以下、１６０塩基以下、１５０塩基以下、１４０塩基以下、１３０塩基以下、１２０塩基以下である。このため、例えば、試料中のＲＮＡをターゲットとする場合、前記ＲＮＡは、前記試料中で分解されやすいが、前記ＲＮＡが断片化されている場合であっても、前記Ｆプライマーと前記Ｒプライマーは、前述のように相対的に短い領域を増幅するように設計されているため、前記断片化の影響を回避して、目的の融合点を含む領域の増幅を行うことができる。
【００３６】
前記Ｆプライマー（F_V1/6）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１３にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V2）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２０の融合点から上流側に向かって数えて２３番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて２番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V3a）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン６の融合点から上流側に向かって数えて２４番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて１番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V3b）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン６の融合点から上流側に向かって数えて１８番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて１番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーである。また、前記Ｒプライマー（R_V/multi）は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０にアニーリングするプライマーであり、前記Ｒプライマー（R_V6）は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の上流に隣接するインサーション領域にアニーリングするプライマーである。
【００３７】
前記Ｆプライマー（F_V1/6）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ１におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６４塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V2）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ２におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約８８塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V3a）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ３ａにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６９塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V3b）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ３ｂにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６３塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V1/6）と前記Ｒプライマー（R_V6）とによれば、前記Ｖ６におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６３塩基長である。
【００３８】
本発明のプライマー試薬によれば、例えば、これらのプライマー全てが共存する一つの反応系において、同時に、ＡＬＫ融合遺伝子の５種類のバリアント、すなわちＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６を増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬を用いた増幅を行い、増幅の有無または増幅量を確認することで、前記ＡＬＫ融合遺伝子について、少なくとも主要な５種類の前記バリアントの分析を行うことができる。
【００３９】
本発明のプライマー試薬において、前記４種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーの各添加量は、特に制限されない。前記Ｆプライマーのモル量（Ｆ）と前記Ｒプライマーのモル量（Ｒ）との比（モル比Ｆ：Ｒ）は、検出対象となる１種類のバリアントに対して、例えば、１：１〜１：６であり、具体例としてモル量で１：６である。４種類のＦプライマーの合計添加量および２種類のＲプライマーの合計添加量は、特に制限されない。
【００４０】
前記４種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーは、例えば、以下のようなプライマーセットを使用することで、１種類のバリアントの単独の増幅を行うことができ、また、検出対象となるバリアントに応じた以下のプライマーセットを組み合わせることで、例えば、２種類、３種類、４種類または５種類の複数のバリアントの増幅を行うこともできる。具体例として、Ｖ１とＶ２とを増幅する場合は、例えば、下記Ｖ１用プライマーセットと下記Ｖ２用プライマーセットとを組合せた試薬とすればよく、この場合、Ｒプライマーは共通するため、２種類のＦプライマーと１種類のＲプライマーとの組合せとすることができる。
【００４１】
Ｖ１用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V1/6）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ２用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V2）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ３ａ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V3a）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ３ｂ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V3b）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ６用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V1/6）
前記Ｒプライマー（R_V6）
【００４２】
本発明のプライマー試薬において、前記５種類のバリアント（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６）を増幅できる前記４種類のＦプライマーと前記２種類のＲプライマーとの組合せは、例えば、以下、「Pack1プライマー試薬」ともいう。
【００４３】
本発明のプライマー試薬は、プライマーとして、例えば、前記Pack1プライマー試薬のみを含んでもよいし、さらに、他のプライマーを含んでもよい。
【００４４】
前記他のプライマーとしては、例えば、下記Pack2プライマー試薬、下記Pack3プライマー試薬、下記Pack4プライマー試薬等があげられる。
【００４５】
前記Pack2プライマー試薬は、例えば、
前記（F_V8a）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（F_V8b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（F_V4）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（F_V4’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（R_V8a/b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
前記（R_V4/4’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む。
【００４６】
（F_V8a）  配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号７）    5’-ataggaacgcactcaggc-3’
（F_V8b）  配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号８）    5’-aaatgtggaatgctgccag-3’
（F_V4）  配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号９）    5’-gagatatgctggatgagcc-3’
（F_V4’）  配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１０）  5’-gaaggaaaggcagatcaatttttag-3’
（R_V8a/b）  配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１１）  5’-tacactgcaggtgggtg-3’
（R_V4/4’）  配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１２）  5’-tgtagtcggtcatgatgg-3’
【００４７】
前記Ｆプライマー（F_V8a）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１７の融合点から上流側に向かって数えて２１番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて４番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V8b）は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント８ｂにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間の挿入配列の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V4）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４の融合点から上流側に向かって数えて３番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて１６番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V4’）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１５の融合点から上流側に向かって数えて３０番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて６番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーである。また、前記Ｒプライマー（R_V8a/b）は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の上流に隣接するインサーション領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｒプライマー（R_V4/4’）は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０にアニーリングするプライマーである。
【００４８】
前記Ｆプライマー（F_V8a）と前記Ｒプライマー（R_V8a/b）のＲプライマーとによれば、前記Ｖ８ａにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約５４塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V8b）と前記Ｒプライマー（R_V8a/b）とによれば、前記Ｖ８ｂにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約５３塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V4）と前記Ｒプライマー（R_V4/4’）とによれば、前記Ｖ４におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約７８塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V4’）と前記Ｒプライマー（R_V4/4’）とによれば、前記Ｖ４’におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６４塩基長である。
【００４９】
本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬の他に前記Pack2プライマー試薬を含む場合、例えば、これらのプライマー全てが共存する一つの反応系において、同時に、ＡＬＫ融合遺伝子の５種類のバリアント（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６）に加えて、さらに４種類のバリアント（Ｖ８ａ、Ｖ８ｂ、Ｖ４およびＶ４’）を増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack2プライマー試薬を含む場合、増幅の有無または増幅量を確認することで、前記ＡＬＫ融合遺伝子について、主要な５種類を含む少なくとも合計９種類の前記バリアントの分析を行うことができる。
【００５０】
前記Pack2プライマー試薬において、前記４種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーの各添加量は、特に制限されない。前記Ｆプライマーの合計モル量（Ｆ）と前記Ｒプライマーの合計モル量（Ｒ）との比（モル比Ｆ：Ｒ）は、例えば、１：１〜１：６であり、具体例としてモル量で１：６である。４種類のＦプライマーの合計添加量および２種類のＲプライマーの合計添加量は、特に制限されない。本発明のプライマー試薬において、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack2プライマー試薬との添加量は、特に制限されない。
【００５１】
前記Pack2プライマー試薬に含まれる前記４種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーは、例えば、以下のようなプライマーセットを使用することで、１種類のバリアントの単独の増幅を行うことができ、また、検出対象となるバリアントに応じた以下のプライマーセットを組み合わせることで、例えば、２種類、３種類または４種類の複数のバリアントの増幅を行うこともできる。具体例として、Ｖ８ａとＶ８ｂとを増幅する場合は、例えば、下記Ｖ８ａ用プライマーセットと前記Ｖ８ｂ用プライマーセットとを組合せた試薬とすればよく、この場合、Ｒプライマーは共通するため、２種類のＦプライマーと１種類のＲプライマーとの組合せとすることができる。本発明のプライマー試薬は、例えば、前記Pack1プライマー試薬に加え、下記Ｖ８ａ用プライマーセット、下記Ｖ８ｂ用プライマーセット、下記Ｖ４用プライマーセットおよび下記Ｖ４’用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含んでもよい。
【００５２】
Ｖ８ａ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V8a）
前記Ｒプライマー（R_V8a/b）
Ｖ８ｂ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V8b）
前記Ｒプライマー（R_V8a/b）
Ｖ４用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V4）
前記Ｒプライマー（R_V4/4’）
Ｖ４’用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V4’）
前記Ｒプライマー（R_V4/4’）
【００５３】
前記Pack3プライマー試薬は、例えば、
前記（F_V5a/b）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（F_V7）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、
前記（F_V9）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーおよび
前記（R_V5b）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー
を含む。
【００５４】
（F_V5a/b）  配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１３）  5’-gtgaaaaaatcagtctcaagtaaag-3’
（F_V7）  配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１４）  5’-gatctgaatsctgaaagagaaatag-3’
sは、g（グアニン）またはｃ（シトシン）
（F_V9）  配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１５）  5’-tgtgatgcgctactcaatag-3’
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号５）    5’-gctccatctgcatggc-3’
（R_V5b）  配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１６）  5’-cctggatctccatatcctcc-3’
【００５５】
前記Ｆプライマー（F_V5a/b）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V7）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４の融合点から上流側に向かって数えて２５番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて１番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_V9）は、ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１８の融合点から上流側に向かって数えて２０番目の塩基と、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の融合点から下流側に向かって数えて１番目の塩基との間の領域にアニーリングするプライマーである。また、前記Ｒプライマー（R_V/multi）は、前述のように、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０にアニーリングするプライマーであり、前記Ｒプライマー（R_V5b）は、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０の上流に隣接するインサーション領域にアニーリングするプライマーである。
【００５６】
前記Ｆプライマー（F_V5a/b）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ５ａにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約７０塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V5b）と前記Ｒプライマー（R_V5b）とによれば、前記Ｖ５ｂにおけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約５９塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V7）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ７におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約５８塩基長である。前記Ｆプライマー（F_V9）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記Ｖ９におけるＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６５塩基長である。
【００５７】
本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬の他に前記Pack3プライマー試薬を含む場合、例えば、これらのプライマー全てが共存する一つの反応系において、同時に、ＡＬＫ融合遺伝子の５種類のバリアント（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６）に加えて、さらに４種類のバリアント（Ｖ５ａ、Ｖ５ｂ、Ｖ７およびＶ９）を増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack3プライマー試薬を含む場合、増幅の有無または増幅量を確認することで、前記ＡＬＫ融合遺伝子について、主要な５種類を含む少なくとも合計９種類の前記バリアントの分析を行うことができる。
【００５８】
前記Pack3プライマー試薬において、前記３種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーの各添加量は、特に制限されない。前記Ｆプライマーの合計モル量（Ｆ）と前記Ｒプライマーの合計モル量（Ｒ）との比（モル比Ｆ：Ｒ）は、例えば、１：１〜１：６であり、具体例としてモル量で１：６である。３種類のＦプライマーの合計添加量および２種類のＲプライマーの合計添加量は、特に制限されない。本発明のプライマー試薬において、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack3プライマー試薬との添加量は、特に制限されない。
【００５９】
前記Pack3プライマー試薬に含まれる前記３種類のＦプライマーおよび前記２種類のＲプライマーは、例えば、以下のようなプライマーセットを使用することで、１種類のバリアントの単独の増幅を行うことができ、また、検出対象となるバリアントに応じた以下のプライマーセットを組み合わせることで、例えば、２種類、３種類または４種類の複数のバリアントの増幅を行うこともできる。具体例として、Ｖ５ａとＶ５ｂとを増幅する場合は、例えば、下記Ｖ５ａ用プライマーセットと前記Ｖ５ｂ用プライマーセットとを組合せた試薬とすればよく、この場合、Ｆプライマーは共通するため、１種類のＦプライマーと２種類のＲプライマーとの組合せとすることができる。本発明のプライマー試薬は、例えば、前記Pack1プライマー試薬に加え、下記Ｖ５ａ用プライマーセット、下記Ｖ５ｂ用プライマーセット、下記Ｖ７用プライマーセットおよび下記Ｖ９用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含んでもよい。また、本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、前記Ｖ８ａ用プライマーセット、前記Ｖ８ｂ用プライマーセット、前記Ｖ４用プライマーセットおよび前記Ｖ４’用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含んでもよい。
【００６０】
Ｖ５ａ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V5a/b）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ５ｂ用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V5a/b）
前記Ｒプライマー（R_V5b）
Ｖ７用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V7）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
Ｖ９用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_V9）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
【００６１】
前記Pack4プライマー試薬は、例えば、
前記（F_KIF/e24）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_KIF/e15）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_KIF/e17）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_KLC1）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマー、
前記（F_TFG）のオリゴヌクレオチドからなるＦプライマーおよび
前記（R_V/multi）のオリゴヌクレオチドからなるＲプライマーを含む。
【００６２】
（F_KIF/e24）  配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１７）  5’-ggcattctgcacagattg-3’
（F_KIF/e15）  配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１８）  5’-agaaataggaattgctgtggg-3’
（F_KIF/e17）  配列番号１９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号１９）  5’-ccagcttcgagcacaag-3’
（F_KLC1）  配列番号２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２０）  5’-gggagtttggttctgtagatg-3’
（F_TFG）  配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２１）  5’-ttccaccaatattcctgaaaatg-3’
（R_V/multi）  配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号５）    5’-gctccatctgcatggc-3’
【００６３】
前記Ｆプライマー（F_KIF/e24）は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のエクソン２４にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_KIF/e15）は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のエクソン１５にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_KIF/e17）は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のエクソン１７にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_KLC1）は、ＫＬＣ１遺伝子のエクソン９にアニーリングするプライマーであり、前記Ｆプライマー（F_TFG）は、ＴＦＧ遺伝子のエクソン３にアニーリングするプライマーである。また、前記Ｒプライマー（R_V/multi）は、前述のように、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０にアニーリングするプライマーである。
【００６４】
前記Ｆプライマー（F_KIF/e24）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記KIF5B  exon24-ALKにおけるＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６３塩基長である。前記Ｆプライマー（F_KIF/e15）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記KIF5B  exon15-ALKにおけるＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６８塩基長である。前記Ｆプライマー（F_KIF/e17）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記KIF5B  exon17-ALKにおけるＫＩＦ５ＢとＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６２塩基長である。前記Ｆプライマー（F_KLC1）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記KLC1-ALKにおけるＫＬＣ１遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６６塩基長である。前記Ｆプライマー（F_TFG）と前記Ｒプライマー（R_V/multi）とによれば、前記TFG-ALKにおけるＴＦＧ遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合点を含む領域を増幅でき、その増幅断片長は、例えば、前記各プライマーの領域を含めて約６８塩基長である。
【００６５】
本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬の他に前記Pack4プライマー試薬を含む場合、例えば、これらのプライマー全てが共存する一つの反応系において、同時に、ＡＬＫ融合遺伝子の５種類のバリアント（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６）に加えて、ＡＬＫ融合遺伝子の５種類のバリアント（KIF5B-ALK  exon24、KIF5B-ALK  exon15、KIF5B-ALK  exon17、KLC1-ALKおよびTFG-ALK）を増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬が、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack4プライマー試薬を含む場合、増幅の有無または増幅量を確認することで、前記ＡＬＫ融合遺伝子について、主要な５種類を含む少なくとも合計１０種類の前記バリアントの分析を行うことができる。
【００６６】
前記Pack4プライマー試薬において、前記５種類のＦプライマーおよび前記１種類のＲプライマーの各添加量は、特に制限されない。前記Ｆプライマーの合計モル量（Ｆ）と前記Ｒプライマーのモル量（Ｒ）との比（モル比Ｆ：Ｒ）は、例えば、１：１〜１：６であり、具体例としてモル量で１：６である。５種類のＦプライマーの合計添加量は、特に制限さない。本発明のプライマー試薬において、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack4プライマー試薬との添加量は、特に制限されない。
【００６７】
前記Pack4プライマー試薬に含まれる前記５種類のＦプライマーおよび前記１種類のＲプライマーは、例えば、以下のようなプライマーセットを使用することで、１種類のバリアントの単独の増幅を行うことができ、また、検出対象となるバリアントに応じた以下のプライマーセットを組み合わせることで、例えば、２種類、３種類、４種類または５種類の複数のバリアントの増幅を行うこともできる。具体例として、前記KIF5B-ALK  exon24と前記KIF5B-ALK  exon15とを増幅する場合は、例えば、下記KIF5B-ALK  exon24用プライマーセットと下記KIF5B-ALK  exon15用プライマーセットとを組合せた試薬とすればよく、この場合、Ｒプライマーは共通するため、２種類のＦプライマーと１種類のＲプライマーとの組合せとすることができる。本発明のプライマー試薬は、例えば、前記Pack1プライマー試薬に加え、下記KIF5B  exon24-ALK用プライマーセット、下記KIF5B  exon15-ALK用プライマーセット、下記KIF5B  exon17-ALK用プライマーセットおよび下記KLC1-ALK用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含んでもよい。また、本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、前記Ｖ５ａ用プライマーセット、前記Ｖ５ｂ用プライマーセット、前記Ｖ７用プライマーセットおよび前記Ｖ９用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセット、および／または前記Ｖ８ａ用プライマーセット、前記Ｖ８ｂ用プライマーセット、前記Ｖ４用プライマーセットおよび前記Ｖ４’用プライマーセットからなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含んでもよい。
【００６８】
KIF5B  exon24-ALK用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_KIF/e24）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
KIF5B  exon15-ALK用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_KIF/e15）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
KIF5B  exon17-ALK用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_KIF/e17）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
KLC1-ALK用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_KLC1）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
TFG-ALK用プライマーセット
前記Ｆプライマー（F_TFG）
前記Ｒプライマー（R_V/multi）
【００６９】
本発明のプライマー試薬は、前述のように、プライマーとして、前記Pack1プライマー試薬のみを含んでもよいし、前記Pack1プライマー試薬の他に、例えば、前記Pack2プライマー試薬、前記Pack3プライマー試薬および前記Pack4プライマー試薬のうち、いずれか１種類を含んでもよいし、いずれか２種類を含んでもよいし、３種類全てを含んでもよい。本発明のプライマー試薬における組合せは、例えば、下記１〜８が例示できる。
１．  Pack1プライマー試薬
２．  Pack1プライマー試薬/Pack2プライマー試薬
３．  Pack1プライマー試薬/Pack3プライマー試薬
４．  Pack1プライマー試薬/Pack4プライマー試薬
５．  Pack1プライマー試薬/Pack2プライマー試薬/Pack3プライマー試薬
６．  Pack1プライマー試薬/Pack2プライマー試薬/Pack4プライマー試薬
７．  Pack1プライマー試薬/Pack3プライマー試薬/Pack4プライマー試薬
８．  Pack1プライマー試薬/Pack2プライマー試薬/Pack3プライマー試薬/Pack4プライマー試薬
【００７０】
本発明のプライマー試薬が、前記２〜８のいずれかの組合せの場合、前記Pack1プライマー試薬と前記他のプライマー試薬は、例えば、一反応系で同時に使用する一試薬系の形態となってもよいし、それぞれ別個の反応系で別個に使用する多試薬系の形態でもよい。前者の一試薬系の場合、例えば、全てのプライマーが混合された形態が例示できる。この場合、各Packプライマー試薬間で重複するプライマーは、例えば、各Packプライマー試薬におけるプライマーとして、それぞれ含んでもよいし、各Packプライマー試薬のプライマーとして併用してもよい。後者の多試薬系の場合、例えば、各Packプライマー試薬が、それぞれ一試薬系となり、それぞれが別個独立となっている形態が例示できる。
【００７１】
本発明のプライマー試薬において、前述した各プライマーは、例えば、以下に示すオリゴヌクレオチドの意味も含む。
【００７２】
すなわち、前記プライマーは、例えば、前記配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのアニーリング領域と実質的に同一の領域に対してアニーリングするオリゴヌクレオチドの意味を含む。前記１または数個は、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。前記実質的に同一の領域にアニーリングするとは、例えば、前記アニーリング領域と同一の領域へのアニーリングの他に、前記アニーリング領域よりも５’側および３’側の少なくとも一方が数塩基短い領域、前記アニーリング領域よりも５’側および３’側の少なくとも一方が数塩基長い領域へのアニーリングの意味を含む（以下、同様）。前記数塩基とは、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。
【００７３】
また、前記プライマーは、例えば、前記配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに対して、所定の同一性を示す塩基配列からなり、前記配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのアニーリング領域と実質的に同一の領域に対してアニーリングするオリゴヌクレオチドの意味を含む。前記所定の同一性の程度は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００７４】
前記プライマーを構成するオリゴヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基および人工核酸残基があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドがあげられ、前記ヌクレオチドは、例えば、非修飾型でもよいし、修飾型でもよい。前記人工核酸は、例えば、ペプチド核酸であるＰＮＡ（Peptide  Nucleic  Acid）、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Locked  Nucleic  Acid）、架橋化核酸であるＢＮＡ（Bridged  Nucleic  Acid）およびＥＮＡ（2’-O,  4’-C-Ethylenebridged  Nucleic  Acid）等があげられる。本発明におけるプライマーは、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基を含む、または、デオキシリボヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）のプライマーである。
【００７５】
本発明のプライマー試薬は、例えば、溶媒、ならびに増幅反応、逆転写反応等に使用する他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、後述する他の成分の例示を援用できる。
【００７６】
（２）増幅試薬キット
本発明の増幅試薬キットは、前述のように、ＡＬＫ融合遺伝子の増幅試薬キットであり、前記本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。本発明の増幅試薬キットは、前記本発明のプライマー試薬を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の増幅試薬キットによれば、例えば、同一反応系において、前記ＡＬＫ融合遺伝子の複数の前記バリアントを同時に増幅できる。本発明の増幅試薬キットは、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬の記載を援用できる。
【００７７】
本発明の増幅試薬キットは、プライマーとして、前記Pack1プライマー試薬のみを含んでもよいし、さらにその他のプライマーを含んでもよい。前記その他のプライマーは、前述のように、例えば、前記Pack2プライマー試薬、前記Pack3プライマー試薬、前記Pack4プライマー試薬があげられ、具体例として、いずれか１種類でもよいし、いずれか２種類でもよいし、３種類全てでもよい。前記その他のプライマーは、例えば、各プライマー試薬が含むプライマーセットでもよい。
【００７８】
本発明の増幅試薬キットにおいて、前記Pack1プライマー試薬のＦプライマーおよびＲプライマーは、使用時に全てが同一反応系に含まれる形態となっていることが好ましい。
【００７９】
本発明の増幅試薬キットが、さらに、前記Pack2プライマー試薬、前記Pack3プライマー試薬および前記Pack4プライマー試薬からなる群から選択された少なくとも一つを含む場合、前記Pack1プライマー試薬のＦプライマーおよびＲプライマーと、他のPackプライマー試薬のＦプライマーおよびＲプライマーとは、使用時に全てが同一反応系に含まれる形態でもよい。
【００８０】
また、本発明の増幅試薬キットは、例えば、前記Packプライマー試薬毎に、ＦプライマーとＲプライマーの全てが、使用時に同一反応系に含まれる形態となってもよい。すなわち、前記Pack1プライマー試薬と、前記その他のPackプライマー試薬が、それぞれ、別個の試薬系となった形態が例示できる。この場合、各Packプライマー試薬を用いて、それぞれの反応系を準備し、それぞれ別個に増幅反応を行うことができる。前記別個の試薬系となった形態としては、例えば、同じ容器に収容され、各試薬が隔離された形態でもよいし、別の容器に収容された形態でもよい。
【００８１】
本発明の増幅試薬キットは、例えば、溶媒、ならびに増幅反応、逆転写反応等に使用する他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、後述する他の成分の例示を援用できる。また、本発明の増幅試薬キットは、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【００８２】
（３）増幅方法
本発明の増幅方法は、前述のように、ＡＬＫ融合遺伝子の増幅方法であり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子のプライマー試薬を含む一反応系で、鋳型核酸の増幅を行う工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のプライマー試薬を使用することが特徴であって、その他の条件および工程は、何ら制限されない。本発明の増幅方法は、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬の記載を援用できる。
【００８３】
前記増幅工程において、前記鋳型核酸の増幅法は、特に制限されず、プライマーを使用する方法であればよい。前記増幅法は、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence  Based  Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription‐Mediated  Amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法等があげられる。本発明においては、前記増幅工程のプライマーとして、前記本発明のプライマー試薬を使用する。本発明の増幅方法は、例えば、前記本発明のプライマー試薬に代えて、前記本発明の増幅試薬キットを用いてもよい。
【００８４】
前記増幅法の条件は、特に制限されず、例えば、一般的な条件が採用できる。前記増幅法がＰＣＲの場合、例えば、（１）二本鎖ＤＮＡである鋳型核酸の一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）前記プライマーの伸長を、繰り返し行えばよい。前記ＰＣＲは、前記（１）〜（３）を１サイクルとした場合、サイクル数は、特に制限されず、下限が、例えば、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、上限が、例えば、１００サイクル、７０サイクル、５０サイクルであり、範囲が、例えば、３０〜１００サイクル、３０〜７０サイクル、３０〜５０サイクルである。各工程の条件は、特に制限されず、前記（１）の解離工程は、例えば、温度９０〜９９℃で１〜１２０秒、温度９２〜９５℃で１〜６０秒であり、前記（２）のアニーリング工程は、例えば、温度４０〜７０℃で１〜３００秒、５０〜７０℃で５〜６０秒であり、前記（３）の伸長工程は、例えば、５０〜８０℃で１〜３００秒、５０〜７５℃で５〜６０秒である。
【００８５】
前記増幅工程において、前記反応系は、例えば、反応液があげられる。前記反応系の体積は、特に制限されず、例えば、１〜５００μＬ、１〜１００μＬである。前記反応系は、例えば、前記本発明のプライマー試薬および前記鋳型核酸を含み、さらに、溶媒、ならびに増幅反応に使用する他の成分を含む。前記溶媒は、例えば、水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液等があげられ、具体例として、市販のＰＣＲ用緩衝液、市販のＰＣＲキットの緩衝液等があげられる。前記他の成分としては、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール、アルブミン等があげられる。前記アルブミンは、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられる。本発明の増幅方法が後述する逆転写工程を含む場合、前記反応系は、他の成分として、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等の逆転写酵素、還元剤等を含んでもよい。前記ＲＮａｓｅ阻害剤は、例えば、RNase  Inhibitor  Recombinant  type（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社）等があげられる。前記逆転写酵素は、例えば、SuperScriptIII（商品名、Invitrogen社）、ReverTra  Ace（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社）等があげられる。前記還元剤は、例えば、ＤＴＴ等があげられる。前記反応系において、各成分の割合および添加順序は、特に制限されない。
【００８６】
前記ポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、一般的なＤＮＡポリメラーゼが使用できる。前記ポリメラーゼは、例えば、非ヒト由来ポリメラーゼがあげられ、具体的には、耐熱性細菌由来のポリメラーゼがあげられる。前記ポリメラーゼとしては、具体例として、例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（商品名、ニッポンジーン社）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社）、テルムス・アクアティカス（Thermus  aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名、Ｔａｑ  ポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus  thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏ９１／０９９５０）（rTth  DNA  polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus  furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９２／９６８９）（Pfu  DNA  polymerase：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus  litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ０４５５４３０）（商標Vent：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等があげられる。前記反応系において、前記ポリメラーゼの添加量は、特に制限されず、具体例として、前記反応系５０μＬあたり、下限が、例えば、０．００１Ｕ、０．００５Ｕ、０．０１Ｕ、０．０５Ｕ、０．１Ｕ、１Ｕ、５Ｕであり、上限が、例えば、５０Ｕ、８０Ｕ、１００Ｕ、１５０Ｕであり、範囲が、例えば、０．００１〜１５０Ｕ、０．０１〜１００Ｕである。前記ポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００８７】
前記ヌクレオチド三リン酸は、一般に、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応系において、前記ヌクレオチド三リン酸の添加量は、特に制限されず、具体例として、下限が、例えば、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌであり、上限が、例えば、１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌであり、範囲が、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００８８】
前記増幅工程における前記鋳型核酸は、例えば、ＤＮＡがあげられる。前記ＤＮＡは、例えば、生体由来の核酸である。前記生体由来のＤＮＡは、例えば、生体試料に含まれるＤＮＡでもよいし、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写により生成されたｃＤＮＡでもよい。前記生体試料に含まれるＲＮＡは、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられる。前記鋳型核酸は、例えば、前記ＡＬＫ融合遺伝子を含む可能性がある鋳型核酸があげられる。
【００８９】
前記生体試料としては、例えば、血液（例えば、全血、白血球等の血球、血漿、血清等）、組織（例えば、大腸、肺等）、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜等）、体細胞（例えば、爪および毛髪等）、生殖細胞、喀痰、羊水、腹膜液、尿、胃液等があげられる。また、前記生体試料としては、その他に、胃洗液、パラフィン包埋組織、培養細胞等の生体由来の試料も例示できる。前記生体試料に含まれる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、例えば、前記生体試料に含まれる細胞から単離することができ、前記単離方法は、例えば、一般的な方法が採用できる。前記生体試料の由来は、例えば、ヒト等があげられる。
【００９０】
前記増幅工程において、前記鋳型核酸は、例えば、前記鋳型核酸を含む被検試料として、反応系に添加してもよい。
【００９１】
前記被検試料は、例えば、前記生体試料をそのまま使用してもよいし、前記生体試料を溶媒に、溶解、懸濁または混合等した希釈液であってもよいし、前記生体試料を前処理したものを使用してもよい。前記前処理は、特に制限されず、例えば、前記生体試料に含まれる細胞から核酸を放出させる処理等があげられる。具体例として、前記生体試料が血液の場合、例えば、前処理として溶血処理を行った溶血試料があげられる。前記溶血試料は、例えば、全血を溶媒で希釈することで調製できる。前記溶媒は、例えば、水および緩衝液等があげられる。前記全血の希釈率（体積）は、特に制限されず、例えば、１００〜２０００倍、２００〜１０００倍である。
【００９２】
前記反応系における前記鋳型核酸の量は、特に制限されない。
【００９３】
前記反応系における前記本発明のプライマー試薬の量は、特に制限されない。具体例として、特定のバリアントに対応するＦプライマーおよびＲプライマーの量は、それぞれ、前記反応系５０μＬあたり、例えば、０．１〜４μｍｏｌ／Ｌ、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌである。すなわち、前記Ｐａｃｋ１プライマー試薬の場合、前記Ｆプライマー（Ｆ＿Ｖ１）、（Ｆ＿Ｖ２）、（Ｆ＿Ｖ３ａ）、（Ｆ＿Ｖ３ｂ）および（Ｆ＿Ｖ６）は、例えば、それぞれ、前記反応系５０μＬあたり、前述の量が例示でき、前記Ｒプライマー（Ｒ＿Ｖ／ｍｕｌｔｉ）は、バリアント４種類に対して共通することから、例えば、前記反応系５０μＬあたり、前述の量の４倍の量が例示でき、前記Ｒプライマー（Ｒ＿Ｖ６）は、前記反応系５０μＬあたり、前述の量が例示できる。また、前記反応系における前記Ｆプライマーと前記Ｒプライマーとの割合は、特に制限されず、例えば、前記本発明のプライマー試薬において例示したモル比が例示できる。
【００９４】
本発明のプライマー試薬は、前述のように、前記Pack1プライマー試薬の他に、前記Pack2プライマー試薬、前記Pack3プライマー試薬および前記Pack4プライマー試薬からなる群から選択された少なくとも一つのプライマー試薬を有してもよい。前記その他のプライマー試薬は、例えば、各プライマー試薬が含むプライマーセットでもよい。前記Pack1プライマー試薬以外のPackプライマーについて、それぞれのＦプライマーおよびＲプライマーの量は、特に制限されず、例えば、前記Pack1プライマー試薬と同様の量が例示できる。
【００９５】
前記Pack1プライマー試薬とその他のPackプライマー試薬とを、同一反応系に混合した場合、例えば、前記一反応系の増幅反応を行うことで、各Packプライマー試薬が対象とするＡＬＫ融合遺伝子のバリアントの増幅を行うことができる。また、前記Pack1プライマー試薬とその他のPackプライマー試薬とを、別個独立の反応系に添加した場合、例えば、それぞれの反応系の増幅反応を行うことで、各反応系において、各Packプライマー試薬が対象とするＡＬＫ融合遺伝子のバリアントの増幅を行うことができる。
【００９６】
本発明の増幅方法は、前述のように、前記増幅工程における増幅反応の鋳型核酸がｃＤＮＡの場合、例えば、さらに、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する逆転写工程を有してもよい。この場合、例えば、前記ＲＮＡは、前記逆転写工程における逆転写反応の鋳型核酸（Ｒｔ）であり、前記逆転写工程で得られたｃＤＮＡは、前記増幅工程における増幅反応の鋳型核酸（Ａｍ）となる。前記ＲＮＡは、前述のように、例えば、生体試料に含まれるＲＮＡがあげられる。
【００９７】
前記逆転写工程と前記増幅工程とは、例えば、別々の反応系で行ってもよいし、同じ反応系で行ってもよい。前者の場合は、例えば、前記逆転写反応の鋳型核酸（Ｒｔ）と任意の逆転写用プライマーとを含む反応系を用いて、逆転写反応を行い、その後、前記逆転写反応の反応系を、前記増幅反応の鋳型核酸（Ａｍ）を含む被検試料とし、前記被検試料と前記本発明のプライマー試薬とを含む新たな反応系を用いて、増幅反応を行うことができる。また、後者の場合は、例えば、前記逆転写反応の鋳型核酸（Ｒｔ）と前記逆転写用プライマーと前記本発明のプライマー試薬とを含む反応系を用いて、前記逆転写反応と前記増幅反応とを行ってもよい。この場合、例えば、前記反応系において、前記逆転写反応により鋳型核酸（Ｒｔ）に基づいてｃＤＮＡが生成され、生成されたｃＤＮＡが前記増幅反応の鋳型核酸（Ａｍ）となって、増幅反応が行われる。
【００９８】
前記逆転写工程の反応系は、例えば、前記任意の逆転写用プライマーおよび前記鋳型核酸（Ｒｔ）を含み、さらに、溶媒、ならびに逆転写反応に使用する他の成分を含む。前記溶媒は、例えば、前記増幅工程における例示を援用できる。前記他の成分としては、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等の逆転写酵素、前記ヌクレオチド三リン酸、前記ＲＮａｓｅ阻害剤、前記還元剤等があげられる。前記反応系において、各成分の割合および添加順序は、特に制限されない。
【００９９】
前記逆転写工程の前記反応系において、前記逆転写反応の鋳型核酸（Ｒｔ）の量は、特に制限されない。
【０１００】
本発明の増幅方法によれば、前述のように、一反応系において、ＡＬＫ融合遺伝子のうち、肺癌に関連性の高い主要な少なくとも５種類のバリアントを増幅することができる。このため、本発明のプライマー試薬を用いた増幅反応によって増幅物が生じているか否かを確認することで、前記５種類のうちいずれかのバリアントが存在するか否かを分析することができる。このため、本発明の増幅方法は、例えば、被検試料中の前記鋳型核酸の増幅を行い、さらに、前記鋳型核酸の増幅の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程を含んでもよい。なお、前記増幅の検出によるＡＬＫ融合遺伝子の分析については、後の本発明の分析方法において説明する。
【０１０１】
（４）分析方法
本発明の分析方法は、前述のように、ＡＬＫ融合遺伝子の分析方法であり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子の増幅方法により、被検試料中の鋳型核酸の増幅を行う工程、および、前記鋳型核酸の増幅の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のプライマー試薬を使用したＡＬＫ融合遺伝子の増幅を行うことが特徴であって、その他の条件および工程は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬および本発明の増幅方法の記載を援用できる。本発明の分析方法は、ＡＬＫ融合遺伝子を検出できることから、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法ということもできる。
【０１０２】
本発明において、前記増幅工程は、例えば、前記本発明の増幅方法の記載を援用できる。
【０１０３】
前記検出工程において、前記鋳型核酸の増幅の検出は、例えば、増幅物の有無の検出でもよいし、増幅物の量の検出でもよい。前者の場合、例えば、定性分析、後者の場合、例えば、定量分析ということもできる。
【０１０４】
前記検出工程において、前記鋳型核酸の増幅の検出方法は、特に制限されず、一般的な方法が採用できる。前記増幅の検出方法は、例えば、プローブを用いた検出方法、インターカレーターを用いた検出方法があげられる。
【０１０５】
まず、前者のプローブを用いた方法は、例えば、目的の増幅物（以下、「被検核酸」ともいう）に対してハイブリダイズ可能なプローブを用いる方法である。この方法によれば、例えば、前記増幅物に対する前記プローブのハイブリダイズの有無、または、前記増幅物にハイブリダイズするプローブの量によって、前記増幅物を検出することができる。
【０１０６】
前記プローブの配列は、特に制限されず、例えば、前記本発明のプライマー試薬により増幅される領域に相補的な配列に設定できる。前記プローブの配列は、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子のセンス鎖に相補的でもよいし、ＡＬＫ融合遺伝子のアンチセンス鎖に相補的な配列でもよい。また、前記鋳型核酸がＡＬＫ融合遺伝子のｃＤＮＡの場合、前記プローブの配列は、前記ｃＤＮＡに相補的でもよいし、前記ｃＤＮＡと同一方向の配列でもよい。
【０１０７】
前記プローブは、例えば、核酸としてオリゴヌクレオチドを含む。前記オリゴヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基および人工核酸残基があげられ、前記プライマーにおける構成単位の説明を援用できる。本発明におけるプローブは、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基を含む、または、デオキシリボヌクレオチド残基からなるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）のプローブである。
【０１０８】
前記プローブの長さは、特に制限されず、下限が、例えば、５塩基長、１０塩基長、上限が、例えば、５０塩基長、３０塩基長であり、範囲が、例えば、５〜５０塩基長、１０〜３０塩基長である。
【０１０９】
前記プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドの他に、標識物質を含んでもよい。この場合、前記プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドが前記標識物質により標識化（修飾）された標識プローブがあげられる。
【０１１０】
前記標識プローブにおいて、前記標識物質による前記オリゴヌクレオチドの標識部位は、特に制限されない。前記標識部位は、具体例として、例えば、前記オリゴヌクレオチドの５’末端領域、３’末端領域、または５’末端領域および３’末端領域の両方であってもよい。前記５’末端領域は、例えば、前記オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて１〜５番目の塩基の領域があげられ、１番目、２番目、３番目、４番目および５番目の塩基のいずれが標識化されてもよく、具体例として、１番目の塩基（５’末端塩基）である。また、前記３’末端領域は、例えば、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から数えて１〜５番目の塩基の領域があげられ、１番目、２番目、３番目、４番目および５番目の塩基のいずれが標識化されてもよく、具体例として、１番目の塩基（３’末端塩基）である。
【０１１１】
前記標識物質の標識化方法は、特に制限されず、例えば、前記オリゴヌクレオチドにおける塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を間接的に標識化してもよい。後者の場合、例えば、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化できる。
【０１１２】
前記標識物質は、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光物質は、例えば、Pacific  Blue（商標名、モレキュラープローブ社）、BODIPY  FL（商標名、モレキュラープローブ社）、FluorePrime（商品名、アマシャムファルマシア社）、Fluoredite（商品名、ミリポア社）、FAM（商標名、ABI社）、Cy3およびCy5（商品名、アマシャムファルマシア社）、TAMRA（商標名、モレキュラープローブ社）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。具体例として、Pacific  Blueは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、TAMRAは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍ、BODIPY  FLは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。
【０１１３】
前記標識プローブは、例えば、単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、前記標識物質に起因するシグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光および呈色等があげられる。前記呈色は、例えば、発色でもよいし、変色でもよい。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。このような標識プローブによれば、例えば、前記シグナルの検出によって、単独であるか、ハイブリッドを形成しているかを分析でき、それにより、前記増幅の分析できる。
【０１１４】
前記標識プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し、且つ、ハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つ、ハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つ、ハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブがあげられる。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれ、この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。このような蛍光消光プローブによれば、例えば、前記蛍光物質のシグナル強度の変動（例えば、蛍光強度の変動）により、前記ハイブリダイズ領域に対する前記プローブのハイブリダイズと、前記ハイブリダイズ領域からの前記プローブの解離とを確認できる。
【０１１５】
前記標識プローブが、いわゆる蛍光消光プローブの場合、例えば、前記５’末端領域および前記３’末端領域の少なくとも一方に、前記被検核酸における前記プローブのハイブリダイズ領域のグアニン塩基に相補的なシトシン塩基を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端塩基または３’末端塩基がシトシン塩基である。そして、前記標識プローブは、例えば、前記シトシン塩基が、前記蛍光物質により標識化されていることが好ましい。このような標識プローブは、一般に、蛍光消光プローブの中でもグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるQProbe（登録商標）として知られている。前記グアニン消光プローブは、例えば、前記被検核酸へのハイブリダイズにより、前記ハイブリダイズ領域のグアニン塩基に、前記プローブのシトシン塩基が近づくと、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる、すなわち、蛍光強度が減少する。このため、前記グアニン消光プローブによれば、例えば、前記蛍光物質のシグナル強度の変動（例えば、蛍光強度の変動）により、前記ハイブリダイズ領域に対する前記プローブのハイブリダイズと、前記ハイブリダイズ領域からの前記プローブの解離とを確認できる。
【０１１６】
前記プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、前記プライマー試薬を用いた増幅工程と、前記プローブを用いた検出工程は、例えば、前記プライマー試薬と前記プローブとが共存する同一反応系で行ってもよい。この場合、３’末端にリン酸基が付加した前記プローブを使用することで、例えば、前記増幅工程において前記プローブ自体が伸長することを十分に防止できる。また、前記プローブは、例えば、３’末端に前記標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【０１１７】
前記検出工程は、例えば、各バリアントに対してそれぞれのプローブを使用してもよいし、２種類以上のバリアントに対して共通するプローブを使用してもよい。前記プローブが１種類の場合、例えば、前記１種類のプローブを含む反応系で、前記検出工程を行えばよい。また、前記プローブが２種類以上の場合、例えば、プローブごとに別個の反応系を用いて、前記検出工程を行ってもよいし、全プローブを含む反応系を用いて、前記検出工程を行ってもよい。
【０１１８】
前記プローブとして、複数の前記標識プローブを使用する場合、前記各標識プローブにおける標識物質は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、例えば、異なる条件で検出される異なる標識物質であり、具体例として、前記異なる検出波長で検出される異なる標識物質があげられる。このように、前記異なる標識物質を使用した場合、例えば、同一反応系であっても、検出条件を変えることによって、各バリアントの増幅物を別個に検出できる。
【０１１９】
前記プローブの具体例を以下に示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。
【０１２０】
以下に、前記Pack1プライマー試薬で増幅させるＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６に対するプローブセット（以下、Pack1プローブ試薬）の一例を示す。P1-1は、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３ａおよびＶ３ｂを検出するプローブであり、P1-2は、V6を検出するプローブである。前記Pack1プローブ試薬における各プローブは、例えば、それぞれ単独で使用することもできる。
【０１２１】
P1-1  配列番号２２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２２）  5’-caccaggagctgca-3’
P1-2  配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２３）  5’-cctgtgtagtgcttcaa-3’
【０１２２】
以下に、前記Pack2プライマー試薬で増幅させるＶ８ａ、Ｖ８ｂ、Ｖ４およびＶ４’に対するプローブセット（以下、Pack2プローブ試薬）の一例を示す。P2-1は、Ｖ４およびＶ４’を検出するプローブであり、P2-2は、Ｖ８ａおよびＶ８ｂを検出するプローブである。前記Pack2プローブ試薬における各プローブは、例えば、それぞれ単独で使用することもでき、また、前記Pack2プローブ試薬は、例えば、前記Pack1プローブ試薬と別個独立して使用することもできる。
【０１２３】
P2-1  配列番号２４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２４）  5’-agctccgcacctc-3’
P2-2  配列番号２５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２５）  5’-ccatgttgcagctga-3’
【０１２４】
以下に、前記Pack3プライマー試薬で増幅させるＶ５ａ、Ｖ５ｂ、Ｖ７およびＶ９に対するプローブセット（以下、Pack3プローブ試薬）の一例を示す。P3-1は、Ｖ５ａ、Ｖ７およびＶ９を検出するプローブであり、P3-2は、Ｖ５ｂを検出するプローブである。前記Pack3プローブ試薬における各プローブは、例えば、それぞれ単独で使用することもでき、また、前記Pack3プローブ試薬は、例えば、前記Pack1プローブ試薬と別個独立して使用することもできる。
【０１２５】
P3-1  配列番号２６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２６）  5’-caccaggagctgca-3’
P3-2  配列番号２７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２７）  5’-agtaaaggttcagagctc-3’
【０１２６】
以下に、前記Pack4プライマー試薬で増幅させるKIF5B  exon24-ALK、KIF5B  exon15-ALK、KIF5B  exon17-ALK、KLC1-ALKおよびTFG-ALKに対するプローブセット（以下、Pack4プローブ試薬）の一例を示す。P4-1は、KIF5B  exon24-ALK、KIF5B  exon15-ALK、KIF5B  exon17-ALK、KLC1-ALKおよびTFG-ALKを検出するプローブである。前記Pack4プローブ試薬は、例えば、前記Pack1プローブ試薬と別個独立して使用することもできる。
【０１２７】
P4-1  配列番号２８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（配列番号２８）  5’-caccaggagctgca-3’
【０１２８】
前記Pack1プローブ試薬、前記Pack2プローブ試薬、前記Pack3プローブ試薬および前記Pack4プローブ試薬は、例えば、前述のように標識物質で標識化されていることが好ましく、例えば、５’末端および３’末端におけるいずれか一方のシトシン塩基が標識化されていることが好ましい。
【０１２９】
また、本発明の分析方法において、前記本発明のプライマー試薬を用いた前記増幅工程と、前記プローブを用いた前記検出工程とは、例えば、それぞれ別個の反応系で行ってもよいし、同一反応系で行ってもよい。前者の場合は、例えば、前記プライマー試薬を含む反応系で、前記増幅反応を行った後、前記増幅反応の反応系で得られた増幅物と前記プローブとを用いて、新たに、前記検出工程の反応系を調製してもよい。また、前者の場合、前記プライマー試薬を含む反応系で前記増幅反応を行い、前記増幅反応の途中または後で、前記増幅反応の反応系に、さらに前記プローブを添加して前記検出工程を行ってもよい。また、後者の場合は、前記プライマー試薬と前記プローブとが共存する反応系で、前記増幅反応を行い、前記反応系で、さらにそのまま前記検出工程を行ってもよい。後者の方法によれば、例えば、前記プローブ添加のために、前記増幅反応の途中または後で、前記反応系を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応と前記検出工程とを、連続的に行うことができる。
【０１３０】
前記検出工程の反応系において、前記プローブの量は、特に制限されない。具体例として、前記反応系５０μＬあたりの１種類の前記プローブの量は、下限が、例えば、１ｐｍｏｌであり、上限が、例えば、１００μｍｏｌである。前記反応系において、前記プローブの濃度は、例えば、それぞれ、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【０１３１】
前記検出工程が、前記プローブを用いた前記増幅の検出である場合、例えば、融解曲線解析により行うことができる。
【０１３２】
前記融解曲線解析は、一般に、二本鎖核酸が解離する融解温度（Ｔｍ；melting  temperature）を利用した「Ｔｍ解析」ともいう。例えば、二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示す。これによって、融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度（Ｔｍ）は、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【０１３３】
前記Ｔｍ値の理論値は、例えば、ソフトウェア「ＭＥＬＴＣＡＬＣ」（http://www.meltcalc.com/）等により、設定条件「Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ  ｅｑ．［ｍＭ］５０」の条件で算出できる。また、前記Ｔｍ値の理論値は、例えば、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【０１３４】
前記融解曲線解析の場合、本発明の分析方法において、前記検出工程は、例えば、下記（Ｄ１）および（Ｄ２）の工程を含み、前記ハイブリッドの形成の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程であってもよい。
（Ｄ１）前記増幅工程で得られる増幅物と前記プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態（例えば、非ハイブリダイズ状態、解離状態等）を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｄ２）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記増幅物と前記プローブとのハイブリットの形成を検出する工程
【０１３５】
前記（Ｄ１）工程では、例えば、前記増幅工程で得られる二本鎖核酸の増幅物（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ）へ解離し、解離した前記一本鎖核酸と前記プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記プローブの存在下、前記反応系の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記プローブを添加した前記反応系について、増幅反応を行った後、前記反応系を温度変化させることが好ましい。
【０１３６】
前記一本鎖核酸への解離は、加熱処理によって行うことができ、前記加熱温度は、例えば、二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離できる温度があげられる。前記加熱温度は、特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間は、特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは、１秒〜５分である。
【０１３７】
前記解離した前記一本鎖核酸と前記プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることで行える。温度条件は、例えば、４０〜５０℃であり、降下した前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【０１３８】
そして、前記一本鎖核酸と前記プローブとのハイブリダイズを行った前記反応系について、温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応系を加熱し、すなわち、前記一本鎖核酸と前記プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、前記プローブが、末端のシトシン（ｃ）が標識化された前記蛍光消光プローブの場合、前記一本鎖核酸とハイブリダイズした状態では、前記プローブの蛍光が減少（または消光）し、前記一本鎖核酸から解離した状態では、前記プローブは蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１３９】
前記蛍光強度の変動を測定する際、その温度範囲は、特に制限されない。前記開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【０１４０】
前記検出工程における前記（Ｄ１）工程は、前述のように、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程である。前記シグナルの測定は、例えば、前述した２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいし、前記標識物質のシグナルの測定でもよい。具体的には、前記プローブとして、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行ってもよい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つ、ハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つ、ハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルが減少（または消失）し、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（または消失）する。このため、前記標識物質のシグナルの検出によって、２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、例えば、ハイブリッドの融解の進行の検出、Ｔｍ値の決定等を行うことができる。
【０１４１】
前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよい。前記検出条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記標識プローブならびに前記標識物質は、前述のとおりである。
【０１４２】
前記検出工程における前記（Ｄ２）工程は、前述のように、前記（Ｄ１）工程の測定結果である前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの形成を検出する工程である。前記シグナル値の変動からの前記ハイブリッドの形成の検出は、一般的な方法により行うことができる。具体例として、前記シグナル値の変動が確認できる場合は、例えば、ハイブリッドが形成されていると判断でき、前記シグナル値の変動が確認できない場合は、例えば、ハイブリッドが形成されていないと判断できる。そして、この結果に基づけば、ハイブリッドが形成されていない場合は、検出目的のバリアントの増幅物が存在しない、つまり、前記バリアントは増幅されておらず、前記バリアントは前記被検試料に存在しないと判断できる。また、ハイブリットが形成されている場合は、検出目的のバリアントの増幅物が存在する、つまり、前記バリアントが増幅されており、前記バリアントは前記被検試料に存在すると判断できる。
【０１４３】
前記（Ｄ２）工程では、例えば、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔまたはｄ蛍光強度変化量／ｄｔ）を算出し、最も変化した値を示す温度をＴｍ値として決定できる。前記標識プローブが前記蛍光消光プローブの場合、例えば、蛍光強度の増加量を測定し、単位時間当たりの蛍光強度増加量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も低い値を示す温度、または、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も高い値を示す温度を、Ｔｍ値として決定することもできる。一方、前記プローブとして、前記蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合は、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１４４】
つぎに、後者のインターカレーターを用いた方法は、例えば、二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートするインターカレーターを用いた方法である。この方法によれば、例えば、前記増幅物にインターカレートする前記インターカレーターの有無、または、前記増幅物にインターカレートする前記インターカレーターの量によって、前記増幅物を検出することができる。
【０１４５】
前記インターカレーターは、特に制限されず、例えば、SYBR（商標）Green等の一般的なものが使用できる。
【０１４６】
前記インターカレーターを使用する場合、本発明の分析方法において、前記検出工程は、例えば、（Ｄ３）および（Ｄ４）の工程を含み、二本鎖核酸にインターカレートした前記インターカレーターの検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出工程であってもよい。
（Ｄ３）前記増幅工程で得られる増幅物と前記インターカレーターとを含む反応系について、二本鎖核酸とインターカレートした状態を示す前記インターカレーターのシグナル値を測定する測定工程
（Ｄ４）前記シグナル値から、前記増幅物へインターカレートした前記インターカレーターを検出する工程
【０１４７】
また、本発明の分析方法において、前記本発明のプライマー試薬を用いた前記増幅工程と、前記インターカレーターを用いた前記検出工程とは、例えば、それぞれ別個の反応系で行ってもよいし、同一反応系で行ってもよい。前者の場合は、例えば、前記プライマー試薬を含む反応系で、前記増幅反応を行った後、前記増幅反応の反応系で得られた増幅物と前記インターカレーターとを用いて、新たに、前記検出工程の反応系を調製してもよい。また、前者の場合、前記プライマー試薬を含む反応系で前記増幅反応を行い、前記増幅反応の途中または後で、前記増幅反応の反応系に、さらに前記インターカレーターを添加して前記検出工程を行ってもよい。また、後者の場合は、前記プライマー試薬と前記インターカレーターとが共存する反応系で、前記増幅反応を行い、前記反応系で、さらにそのまま前記検出工程を行ってもよい。後者の方法によれば、例えば、前記インターカレーター添加のために、前記増幅反応の途中または後で、前記反応系を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応と前記検出工程とを、連続的に行うことができる。前記増幅工程がＰＣＲの場合、前記後者の方法は、例えば、リアルタイムＰＣＲともいう。
【０１４８】
前記検出工程の反応系において、前記インターカレーターの量は、特に制限されない。
【０１４９】
前記インターカレーターのシグナル検出は、例えば、前記インターカレーターのシグナルに特有の条件で検出すればよい。前記検出条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。
【０１５０】
（５）分析試薬キット
本発明の分析試薬キットは、前述のように、ＡＬＫ融合遺伝子の分析試薬キットであり、前記本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。本発明の増幅試薬キットは、前記本発明のプライマー試薬を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の増幅試薬キットによれば、例えば、同一反応系において、前記ＡＬＫ融合遺伝子の複数の前記バリアントを同時に増幅でき、それによって前記ＡＬＫ融合遺伝子の分析を行うことができる。本発明の分析試薬キットは、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬、増幅試薬キット、増幅方法および分析方法の記載を援用できる。
【０１５１】
本発明の分析試薬キットは、例えば、さらに、前記プライマー試薬による増幅物にハイブリダイゼーションするプローブを含んでもよい。前記プローブは、特に制限されず、前述のようなプローブがあげられる。前記プライマー試薬であるPack1プライマー試薬に対しては、前記Pack1プローブ試薬、Pack2プライマー試薬に対しては、前記Pack2プローブ試薬、前記Pack3プライマー試薬に対しては、前記Pack3プローブ試薬、前記Pack4プライマー試薬に対しては、前記Pack4プローブ試薬を、それぞれ組合せで含むことが好ましい。
【０１５２】
本発明の分析試薬キットは、前記プローブを含む場合、例えば、前記組合せの前記プライマー試薬と前記プローブ試薬とが、使用時に同一反応系に含まれる形態があげられる。
【０１５３】
また、本発明の分析試薬キットが前記Pack1プライマー試薬とその他の前記Pack試薬とを含む場合、本発明の分析試薬キットは、例えば、前記Pack1プライマー試薬および前記Pack1プローブ試薬の組合せと、他のPackプライマー試薬および他のPackプローブ試薬の組合せも、使用時に全てが同一反応系に含まれる形態でもよい。
【０１５４】
また、本発明の分析試薬キットは、例えば、前記Packプローブ試薬毎に、Packプライマー試薬とPackプローブ試薬とが、使用時に同一系に含まれる形態となってもよい。すなわち、前記Pack１プライマー試薬および前記Pack1プローブ試薬の組合せと、前記その他のPackプライマー試薬およびPackプローブ試薬の組合せが、それぞれ別個の試薬系となった形態が例示できる。この場合、各Packプライマー試薬と各Packプローブ試薬との組合せを用いて、それぞれの反応系を準備し、それぞれ別個に増幅工程と検出工程とを行うことができる。
【０１５５】
本発明において、以下、例えば、Pack1プライマー試薬とPack1プローブ試薬とを含む試薬を、Pack1分析試薬といい、Pack2プライマー試薬とPack2プローブ試薬とを含む試薬を、Pack2分析試薬といい、Pack3プライマー試薬とPack3プローブ試薬とを含む試薬を、Pack3分析試薬といい、Pack4プライマー試薬とPack4プローブ試薬とを含む試薬を、Pack4分析試薬という。本発明の分析試薬における組合せは、例えば、下記１〜８があげられる。
１．  Pack1分析試薬
２．  Pack1分析試薬/Pack2分析試薬
３．  Pack1分析試薬/Pack3分析試薬
４．  Pack1分析試薬/Pack4分析試薬
５．  Pack1分析試薬/Pack2分析試薬/Pack3分析試薬
６．  Pack1分析試薬/Pack2分析試薬/Pack4分析試薬
７．  Pack1分析試薬/Pack3分析試薬/Pack4分析試薬
８．  Pack1分析試薬/Pack2分析試薬/Pack3分析試薬/Pack4分析試薬
【０１５６】
（６）薬効判定方法
本発明の薬効判定方法は、前述のように、薬剤の薬効を試験する方法であり、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子の分析方法により、ＡＬＫ融合遺伝子を分析する工程、および、前記ＡＬＫ融合遺伝子の有無に基づいて、感受性を試験する工程を含むことを特徴とする。本発明の薬効判定方法は、前記本発明の分析方法によりＡＬＫ融合遺伝子を分析することが特徴であって、その他の条件および工程等は、特に制限されない。本発明の薬効判定方法は、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬、本発明の増幅方法、本発明の分析方法等が援用できる。
【０１５７】
本発明の薬効判定方法によれば、前記本発明のプライマー試薬を用いた増幅反応を利用することで、感度よく簡便にＡＬＫ融合遺伝子の分析を行い、その分析結果から、薬効を判定できる。前記薬効の判定によって、例えば、薬剤の投与量の減少または増加、他の治療薬への変更等が可能であるため、本発明の薬効判定方法は、例えば、疾病の治療方針を決定するのに有用である。前記薬効判定の対象となる薬剤は、例えば、ＡＬＫ阻害剤を有効成分とする抗がん剤があげられる。前記抗がん剤は、例えば、肺癌治療用の抗癌剤であり、具体例として、例えば、クリゾチニブ等があげられる。
【０１５８】
（７）肺癌の罹患可能性の試験方法
本発明の肺癌の罹患可能性の試験方法は、肺癌の罹患可能性を試験する方法であり、被検者の生体試料について、前記本発明のＡＬＫ融合遺伝子の分析方法により、ＡＬＫ融合遺伝子を分析する工程、および、前記ＡＬＫ融合遺伝子の有無に基づいて、肺癌の罹患可能性を試験する工程を含むことを特徴とする。本発明の試験方法は、前記本発明の分析方法によりＡＬＫ融合遺伝子を分析することが特徴であって、その他の条件および工程等は、特に制限されない。本発明の試験方法は、特に示さない限り、前記本発明のプライマー試薬、本発明の増幅方法、本発明の分析方法等が援用できる。
【０１５９】
本発明の試験方法によれば、前記本発明のプライマー試薬を用いた増幅反応を利用することで、感度よく簡便にＡＬＫ融合遺伝子の分析を行い、その分析結果から、肺癌の罹患可能性を試験できる。
【０１６０】
前記被検者は、例えば、ヒト等があげられる。前記生体試料は、例えば、前述の説明が援用できる。
【０１６１】
本発明の試験方法において、肺癌の罹患可能性の評価方法は、特に制限されず、例えば、前記被検者の生体試料において前記ＡＬＫ融合遺伝子が存在する場合、前記被検者は、肺癌に罹患する可能性があるまたは可能性が高いと評価できる。また、前記被検者の生体試料において前記ＡＬＫ融合遺伝子が存在しない場合、前記被検者は、肺癌に罹患する可能性がないまたは可能性が低いと評価できる。
【０１６２】
（８）その他
本発明のプライマー試薬、増幅試薬キット、増幅方法、分析方法、分析試薬キットおよび薬効判定方法として、前記Pack1プライマー試薬を必須とする形態について説明したが、本発明は、例えば、前記Pack1プライマー試薬に代えて、前記Pack2プライマー試薬、前記Pack3プライマー試薬、前記Pack4プライマー試薬またはこれらを併用する形態であってもよい。
【０１６３】
また、本発明の分析方法、分析試薬キットおよび薬効判定方法は、例えば、プライマーの種類またはプライマーを使用した増幅工程に限定されることなく、前記プローブを用いることを特徴としてもよい。
【０１６４】
この場合、本発明の分析方法は、被検試料中の鋳型核酸の増幅を行う工程、および、プローブを用いた前記鋳型核酸の増幅の検出により、前記被検試料におけるＡＬＫ融合遺伝子を検出する工程を含むことを特徴とする。特に示さない限り、本発明の分析方法は、前述の記載を援用できる。また、本発明の薬効判定方法は、この本発明の分析方法によりＡＬＫ融合遺伝子を分析する以外は、前述の薬効判定方法の記載を援用できる。
【０１６５】
前記増幅工程におけるプライマーは、特に制限されず、例えば、本発明における前記プライマー試薬が使用でき、前記プローブとしては、検出目的のＡＬＫ融合遺伝子のバリアントの種類に応じて、前述した各種プローブ試薬が使用できる。
【０１６６】
また、本発明の分析試薬キットは、例えば、前述したプローブ試薬のうち少なくとも一つを含むことを特徴とする。前記プローブ試薬は、例えば、前記Pack1プローブ試薬、前記Pack2プローブ試薬、前記Pack3プローブ試薬および前記Pack4プローブ試薬からなる群から選択された少なくとも一つであり、一種類でもよいし二種類以上の併用でもよい。また、前記分析試薬キットは、例えば、前記プローブ試薬の種類に応じて、さらに、前述した各種Packプライマー試薬を含んでもよい。
【０１６７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。本発明は、下記実施例により制限されない。
【実施例】
【０１６８】
［実施例Ａ１］
本例では、前記Pack1プライマー試薬を用いてＡＬＫ融合遺伝子の増幅を行い、各種バリアントを増幅できることを確認した。なお、前記増幅の確認は、前記Pack1プローブを用いたＴｍ解析により行った。
【０１６９】
（１）サンプル
ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６と同一配列の下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、それぞれのＲＮＡを合成した。前記各ＲＮＡを、RNase  Free  Waterに混合し、これをサンプルとした。前記サンプルにおける前記各ＲＮＡの濃度は、８０００copies/testとした。
【０１７０】
Ｖ１オリゴヌクレオチド（配列番号３２）
gggaaatatgaaaagccaaaatttgtgcagtgtttagcattcttggggaatggagatgttcttactggagactcaggtggagtcatgcttatatggagcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaaccaccagaacattgttcgctgcattggggtgagcctgcaatccctgccc
【０１７１】
Ｖ２オリゴヌクレオチド（配列番号３３）
gggaaatatgaaaagccaaaatttgtgcagtgtttagcattcttggggaatggagatgttcttactggagactcaggtggagtcatgcttatatggagcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaaggtgtatatcaaatcagcaaacaaatcaaagctcatgatggcagtgtgttcacactttgtcagatgagaaatgggatgttattaactggaggagggaaagacagaaaaataattctgtgggatcatgatctgaatcctgaaagagaaatagaggttcctgatcagtatggcacaatcagagctgtagcagaaggaaaggcagatcaatttttagtaggcacatcacgaaactttattttacgaggaacatttaatgatggcttccaaatagaagtacagggtcatacagatgagctttggggtcttgccacacatcccttcaaagatttgctcttgacatgtgctcaggacaggcaggtgtgcctgtggaactcaatggaacacaggctggaatggaccaggctggtagatgaaccaggacactgtgcagattttcatccaagtggcacagtggtggccataggaacgcactcaggcaggtggtttgttctggatgcagaaaccagagatctagtttctatccacacagacgggaatgaacagctctctgtgatgcgctactcaatagatggtaccttcctggctgtaggatctcatgacaactttatttacctctatgtagtctctgaaaatggaagaaaatatagcagatatggaaggtgcactggacattccagctacatcacacaccttgactggtccccagacaacaagtatataatgtctaactcgggagactatgaaatattgtacttgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaaccaccagaacattgtt
【０１７２】
Ｖ３ａオリゴヌクレオチド（配列番号３４）
tgatgttcaagatcgcctgtcagctcttgagtcacgagttcagcaacaagaagatgaaatcactgtgctaaaggcggctttggctgatgttttgaggcgtcttgcaatctctgaagatcatgtggcctcagtgaaaaaatcagtctcaagtaaaggccaaccaagccctcgagcagttattcccatgtcctgtataaccaatggaagtggtgcaaacagaaaaccaagtcataccagtgctgtctcaattgcaggaaaagaaactctttcatctgctgctaaaagtggtacagaaaaaaagaaagaaaaaccacaaggacagagagaaaaaaaagaggaatctcattctaatgatcaaagtccacaaattcgagcatcaccttctccccagccctcttcacaacctctccaaatacacagacaaactccagaaagcaagaatgctactcccaccaaaagcataaaacgaccatcaccagctgaaaagtcacataattcttgggaaaattcagatgatagccgtaataaattgtcgaaaataccttcaacacccaaattaataccaaaagttaccaaaactgcagacaagcataaagatgtcatcatcaaccaagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaa
【０１７３】
Ｖ３ｂオリゴヌクレオチド（配列番号３５）
tgatgttcaagatcgcctgtcagctcttgagtcacgagttcagcaacaagaagatgaaatcactgtgctaaaggcggctttggctgatgttttgaggcgtcttgcaatctctgaagatcatgtggcctcagtgaaaaaatcagtctcaagtaaaggccaaccaagccctcgagcagttattcccatgtcctgtataaccaatggaagtggtgcaaacagaaaaccaagtcataccagtgctgtctcaattgcaggaaaagaaactctttcatctgctgctaaaagtggtacagaaaaaaagaaagaaaaaccacaaggacagagagaaaaaaaagaggaatctcattctaatgatcaaagtccacaaattcgagcatcaccttctccccagccctcttcacaacctctccaaatacacagacaaactccagaaagcaagaatgctactcccaccaaaagcataaaacgaccatcaccagctgaaaagtcacataattcttgggaaaattcagatgatagccgtaataaattgtcgaaaataccttcaacacccaaattaataccaaaagttaccaaaactgcagacaagcataaagatgtcatcatcaaccaagcaaaaatgtcaactcgcgaaaaaaacagccaagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaac
【０１７４】
Ｖ６オリゴヌクレオチド（配列番号３６）
aatctcatattttcttctggacctggagcggcaattcactaacaagaaaacagggaatttttgggaaatatgaaaagccaaaatttgtgcagtgtttagcattcttggggaatggagatgttcttactggagactcaggtggagtcatgcttatatggagcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaaggaagtggcctgtgtagtgcttcaagggccaggctgccaggccatgttgcagctgaccacccacctgcagtgtaccgccGgaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagca
【０１７５】
（２）試薬
下記組成となるように各種Ｆプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを混合して、Pack1プライマー試薬とPack1プローブ試薬とを含む混合試薬１（以下、「P-mix1」ともいう）を調製した。なお、前記組成において、TBP-F2およびTBP-R2のプライマーセットは、増幅反応が正常に起こっているか否かを確認するためのコントール用プライマーセットであり、5PB-TBP-F2のプローブは、前記コントロール用プライマーセットによる増幅を検出するためのコントロール用プローブである。各プローブにおいて、FL、TAMRA（商標）およびPBは、標識化用の蛍光色素であり、FLは、BODIPY（商標）  FLであり、PBは、Pacific  Blue（商標）である。また、下記組成となるように成分を混合してRT-mixを調製した。
【０１７６】
【表４】
0006533128.tif 000005
【０１７７】
【表５】
0006533128.tif 000006
【０１７８】
前記表５において、RNase  Inhibitorは、TOYOBO社製のRNase  Inhibitor(Recombinant)を使用し、逆転写酵素は、Invitrogen社製のSuperScript（登録商標）IIIを使用した。
【０１７９】
（３）ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析
前記各試薬と、市販の試薬キット（i-densy（商標）  Pack  UNIVERSAL、アークレイ株式会社）、前記P-mix1および前記RT-mixとを用いて反応液を調製し、遺伝子解析装置（i-densy（商標））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的には、前記遺伝子解析装置を使用して、前記試薬キットに添付の説明書にしたがい、３６μＬの前記試薬キット、９μＬの前記P-mix1、１μＬの前記RT-mixおよび４μＬの前記サンプルにより、計５０μＬの混合液を自動で調製し、ＲＴ−ＰＣＲをスタートさせた。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、５５℃で９００秒処理した後、９５℃で１２０秒処理し、９５℃で１秒および５８℃で３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。測定波長は、５１５〜５５５ｎｍ（BODIPY（商標）  ＦＬの検出）、５８５〜７００ｎｍ（TAMRAの検出）および４５０〜７００ｎｍ（Pacific  Blue（商標）の検出）とした。
【０１８０】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、縦軸は、各温度における蛍光強度の変化（以下、「蛍光強度変化量」ともいう）を示す。縦軸の単位は、微分値「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」であり、「−ｄＦ／ｄｔ」と示す。図１において、横軸は、測定時の温度（℃）を示す。増幅物が生成された場合、Ｔｍ解析では、前記増幅物とプローブとの間でハイブリッドが形成されることにより、前記プローブの蛍光は消光し、加熱によって、前記増幅物から前記プローブが解離して、蛍光が生じる。そして、蛍光強度の変化（-ｄＦ／ｄｔ）を示すグラフにおいて、山型ピークは、前記ハイブリッドからの前記プローブの解離を示すため、増幅物が存在すると判断できる。
【０１８１】
図１に示すように、前記Pack1プライマー試薬と前記Pack1プローブ試薬とを使用することによって、Ｖ１のサンプル、Ｖ２のサンプル、Ｖ３ａのサンプル、Ｖ３ｂのサンプルおよびＶ６のサンプルのいずれについても、ピークが確認できた。このことから、前記Pack1プライマー試薬によって、これらのバリアントを増幅でき、また、前記Pack1プローブによって、前記増幅物を検出できることがわかった。
【０１８２】
［実施例Ａ２］
本例では、前記Pack2プライマー試薬を用いてＡＬＫ融合遺伝子の増幅を行い、各種バリアントを増幅できることを確認した。なお、前記増幅の確認は、前記Pack2プローブを用いたＴｍ解析により行った。
【０１８３】
（１）サンプル
ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントＶ８ａ、Ｖ８ｂ、Ｖ４およびＶ４’と同一配列の下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、それぞれのＲＮＡを合成した。前記各ＲＮＡを、RNase  Free  Waterに混合し、これをサンプルとした。前記サンプルにおける前記各ＲＮＡの濃度は、８０００copies/testとした。
【０１８４】
Ｖ８ａオリゴヌクレオチド（配列番号３７）
acagatgagctttggggtcttgccacacatcccttcaaagatttgctcttgacatgtgctcaggacaggcaggtgtgcctgtggaactcaatggaacacaggctggaatggaccaggctggtagatgaaccaggacactgtgcagattttcatccaagtggcacagtggtggccataggaacgcactcaggcaggccatgttgcagctgaccacccacctgcagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactg
【０１８５】
Ｖ８ｂオリゴヌクレオチド（配列番号３８）
caggcaggtgtgcctgtggaactcaatggaacacaggctggaatggaccaggctggtagatgaaccaggacactgtgcagattttcatccaagtggcacagtggtggccataggaacgcactcaggcaggagacaaaaacatgaagtcaattttcccaaaattaaactcattaaaaaatgtggaatgctgccaggccatgttgcagctgaccacccacctgcagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactg
【０１８６】
Ｖ４オリゴヌクレオチド（配列番号３９）
caaatcaaagctcatgatggcagtgtgttcacactttgtcagatgagaaatgggatgttattaactggaggagggaaagacagaaaaataattctgtgggatcatgatctgaatCctgaaagagaaatagagatatgctggatgagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaCcatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaac
【０１８７】
Ｖ４’オリゴヌクレオチド（配列番号４０）
gggaaatatgaaaagccaaaatttgtgcagtgtttagcattcttggggaatggagatgttcttactggagactcaggtggagtcatgcttatatggagcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaaggtgtatatcaaatcagcaaacaaatcaaagctcatgatggcagtgtgttcacactttgtcagatgagaaatgggatgttattaactggaggagggaaagacagaaaaataattctgtgggatcatgatctgaatcctgaaagagaaatagaggttcctgatcagtatggcacaatcagagctgtagcagaaggaaaggcagatcaatttttagtaggcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaaccaccagaacat
【０１８８】
（２）試薬
下記組成となるように各種Ｆプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを混合して、Pack2プライマー試薬とPack2プローブ試薬とを含む混合試薬2（以下、「P-mix2」ともいう）を調製した。
【０１８９】
【表６】
0006533128.tif 000007
【０１９０】
（３）ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析
前記サンプルを使用し、前記P-mix1に代えて前記P-mix2を使用した以外は、前記実施例Ａ１と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
【０１９１】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、縦軸および横軸は、前記実施例Ａ１の図１と同様である。
【０１９２】
図２に示すように、前記Pack2プライマー試薬と前記Pack2プローブ試薬とを使用することによって、Ｖ４のサンプル、Ｖ４’のサンプル、Ｖ８ａのサンプルおよびＶ８ｂのサンプルのいずれについても、ピークが確認できた。このことから、前記Pack2プライマー試薬によって、これらのバリアントを増幅でき、また、前記Pack2プローブによって、前記増幅物を検出できることがわかった。
【０１９３】
［実施例Ａ３］
本例では、前記Pack3プライマー試薬を用いてＡＬＫ融合遺伝子の増幅を行い、各種バリアントを増幅できることを確認した。なお、前記増幅の確認は、前記Pack3プローブを用いたＴｍ解析により行った。
【０１９４】
（１）サンプル
ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントＶ５ａ、Ｖ５ｂ、Ｖ７およびＶ９と同一配列の下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、それぞれのＲＮＡを合成した。前記各ＲＮＡを、RNase  Free  Waterに混合し、これをサンプルとした。前記サンプルにおける前記各ＲＮＡの濃度は、８０００copies/testとした。
【０１９５】
Ｖ５ａオリゴヌクレオチド（配列番号４１）
ttctgctgcaagtacttctgatgttcaagatcgcctgtcagctcttgagtcacgagttcagcaacaagaagatgaaatcactgtgctaaaggcggctttggctgatgttttgaggcgtcttgcaatctctgaagatcatgtggcctcagtgaaaaaatcagtctcaagtaaagtgtaccgccGgaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaa
【０１９６】
Ｖ５ｂオリゴヌクレオチド（配列番号４２）
atttctgctgcaagtacttctgatgttcaagatcgcctgtcagctcttgagtcacgagttcagcaacaagaagatgaaatcactgtgctaaaggcggctttggctgatgttttgaggcgtcttgcaatctctgaagatcatgtggcctcagtgaaaaaatcagtctcaagtaaaggttcagagctcaggggaggatatggagatccagggaggcttcctgtaggaagtggcctgtgtagtgcttcaagggccaggctgccaggccatgttgcagctgaccacccacctgcagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaaccacca
【０１９７】
Ｖ７オリゴヌクレオチド（配列番号４３）
agcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaaggtgtatatcaaatcagcaaacaaatcaaagctcatgatggcagtgtgttcacactttgtcagatgagaaatgggatgttattaactggaggagggaaagacagaaaaataattctgtgggatcatgatctgaatCctgaaagagaaatagagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtg
【０１９８】
Ｖ９オリゴヌクレオチド（配列番号４４）
aaagccaaaatttgtgcagtgtttagcattcttggggaatggagatgttcttactggagactcaggtggagtcatgcttatatggagcaaaactactgtagagcccacacctgggaaaggacctaaaggtgtatatcaaatcagcaaacaaatcaaagctcatgatggcagtgtgttcacactttgtcagatgagaaatgggatgttattaactggaggagggaaagacagaaaaataattctgtgggatcatgatctgaatcctgaaagagaaatagaggttcctgatcagtatggcacaatcagagctgtagcagaaggaaaggcagatcaatttttagtaggcacatcacgaaactttattttacgaggaacatttaatgatggcttccaaatagaagtacagggtcatacagatgagctttggggtcttgccacacatcccttcaaagatttgctcttgacatgtgctcaggacaggcaggtgtgcctgtggaactcaatggaacacaggctggaatggaccaggctggtagatgaaccaggacactgtgcagattttcatccaagtggcacagtggtggccataggaacgcactcaggcaggtggtttgttctggatgcagaaaccagagatctagtttctatccacacagacgggaatgaacagctctctgtgatgcgctactcaatagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatcaccctcattcggggtctgggccatggagcctttggggaggtgtatgaaggccaggtgtccggaatgcccaacgacccaagccccctgcaagtggctgtgaagacgctgcctgaagtGtgctctgaacaggacgaactggatttcctcatggaagccctgatcatcagcaaattcaacca
【０１９９】
（２）試薬
下記組成となるように各種Ｆプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを混合して、Pack3プライマー試薬とPack3プローブ試薬とを含む混合試薬3（以下、「P-mix3」ともいう）を調製した。プライマー（F_V7）において、sは、gおよびcであり、gを有するプライマーとcを有するプライマーは、等モルとした。
【０２００】
【表７】
0006533128.tif 000008
【０２０１】
（３）ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析
前記サンプルを使用し、前記P-mix1に代えて前記P-mix3を使用した以外は、前記実施例Ａ１と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
【０２０２】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、縦軸および横軸は、前記実施例Ａ１の図１と同様である。
【０２０３】
図３に示すように、前記Pack3プライマー試薬と前記Pack3プローブ試薬とを使用することによって、いずれのサンプルについても、ピークが確認できた。このことから、前記Pack3プライマー試薬によって、これらのバリアントを増幅でき、また、前記Pack3プローブによって、前記増幅物を検出できることがわかった。
【０２０４】
［実施例Ａ４］
本例では、前記Pack4プライマー試薬を用いてＡＬＫ融合遺伝子の増幅を行い、各種バリアントを増幅できることを確認した。なお、前記増幅の確認は、前記Pack4プローブを用いたＴｍ解析により行った。
【０２０５】
（１）サンプル
ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントKIF5B  exon24-ALK、KIF5B  exon15-ALK、KIF5B  exon17-ALK、KLC1-ALKおよびTFG-ALKと同一配列の下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、それぞれのＲＮＡを合成した。前記各ＲＮＡを、RNase  Free  Waterに混合し、これをサンプルとした。前記サンプルにおける前記各ＲＮＡの濃度は、８０００copies/testとした。
【０２０６】
KIF5B  exon24-ALKオリゴヌクレオチド（配列番号４５）
gcgacttcgagctacagctgagagagtgaaagctttggaatcagcactgaaagaagctaaagaaaatgcatctcgtgatcgcaaacgctatcagcaagaagtagatcgcataaaggaagcagtcaggtcaaagaatatggccagaagagggcattctgcacagattgtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacat
【０２０７】
KIF5B  exon15-ALKオリゴヌクレオチド（配列番号４６）
ccaaccaccagaaaaaacgagcagctgagatgatggcatctttactaaaagaccttgcagaaataggaattgctgtgggaaataatgatgtaaagccaaccaccagaaaaaacgagcagctgagatgatggcatctttactaaaagaccttgcagaaataggaattgctgtgggaaataatgatgtaaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagt
【０２０８】
KIF5B  exon17-ALKオリゴヌクレオチド（配列番号４７）
caaaaaaatggaagaaaatgaaaaggagttagcagcatgtcagcttcgtatctctcaacatgaagccaaaatcaagtcattgactgaataccttcaaaatgtggaacaaaagaaaagacagttggaggaatctgtcgatgccctcagtgaagaactagtccagcttcgagcacaagtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagt
【０２０９】
KLC1-ALKオリゴヌクレオチド（配列番号４８）
aaccagggcaagtatgaagaagtagaatattattatcaaagagccctcgagatctaccagacaaaactgggacctgatgaccccaacgtggctaagacgaaaaataacctggcatcctgctatttgaaacaaggaaagttcaagcaagcagaaacactgtacaaagagattctcactcgtgcacatgaaagggagtttggttctgtagatgtgtaccgccGgaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaag
【０２１０】
TFG-ALKオリゴヌクレオチド（配列番号４９）
tgaaactgacattatttgttaatggccagccaagaccccttgaatcaagtcaggtgaaatatctccgtcgagaactgatagaacttcgaaataaagtgaatcgtttattggatagcttggaaccacctggagaaccaggaccttccaccaatattcctgaaaatgtgtaccgccggaagcaccaggagctgcaagccatgcagatggagctgcagagccctgagtacaagctgagcaagctccgcacctcgaccatcatgaccgactacaaccccaactactgctttgctggcaagacctcctccatcagtgacctgaaggaggtgccgcggaaaaacatca
【０２１１】
（２）試薬
下記組成となるように各種Ｆプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを混合して、Pack4プライマー試薬とPack4プローブ試薬とを含む混合試薬4（以下、「P-mix4」ともいう）を調製した。
【０２１２】
【表８】
0006533128.tif 000009
【０２１３】
（３）ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析
前記サンプルを使用し、前記P-mix1に代えて前記P-mix4を使用した以外は、前記実施例Ａ１と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
【０２１４】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４において、縦軸および横軸は、前記実施例Ａ１の図１と同様である。
【０２１５】
図４に示すように、前記Pack4プライマー試薬と前記Pack4プローブ試薬とを使用することによって、いずれのサンプルについても、ピークが確認できた。このことから、前記Pack4プライマー試薬によって、これらのバリアントを増幅でき、また、前記Pack4プローブによって、前記増幅物を検出できることがわかった。
【０２１６】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【０２１７】
この出願は、２０１４年９月１日に出願された日本出願特願２０１４−１７７３５６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
以上のように、本発明のプライマー試薬によれば、ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントＶ１、Ｖ２、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ６を、同一反応系において同時に増幅することができる。このため、本発明によれば、一つの反応系を用いることで、簡便にＡＬＫ融合遺伝子の複数種のバリアントを検出できる。したがって、本発明は、例えば、肺癌への罹患可能性の診断および肺癌の治療において有用である。
【図１】
0006533128.tif 000010
【図２】
0006533128.tif 000011
【図３】
0006533128.tif 000012
【図４】
0006533128.tif 000013
【配列表】
0006533128000001.app