(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基を表面に有するシリカ粒子であって、下記（ａ）及び（ｂ）を満たすシリカ粒子：
（ａ）粒径が２０〜１０００ｎｍである、
（ｂ）シリカ粒子表面における前記チオール基の密度が、０．００２〜０．２個／ｎｍ２である、
（ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０〜０．６０である。
【請求項２】
前記シリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、請求項１に記載のシリカ粒子。
【請求項３】
前記チオール基が、アルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してシリカ粒子表面に結合している、請求項１又は２に記載のシリカ粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシリカ粒子の表面に、前記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子。
【請求項５】
前記生体分子が抗体又は抗原である、請求項４に記載の生体分子複合粒子。
【請求項６】
請求項５に記載の生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシリカ粒子の製造方法であって、下記（ａ）−（ｃ）の工程を含む、製造方法。
（ａ）アンモニア水含有溶媒中で表面に結合水を有するシリカ粒子を形成する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたシリカ粒子に親水性有機溶媒であるアルコールによる洗浄処理を施すことで、シリカ粒子の表面に存在する結合水以外の自由水を除去する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、該結合水により該シランカップリング剤を加水分解する工程
【請求項８】
前記アルコールが、炭素数２以上のアルコールである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、請求項７又は８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。【０００３】
上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる。
標識用粒子と生体分子との結合は、物理的な吸着による他、標識用粒子表面に存在する反応性官能基を介して両者を共有結合させることでも行われる。共有結合を利用することで、より強固で安定な標識生体分子が得られる。シリカ粒子の表面に反応性官能基を導入する方法としては、アンモニア水含有溶媒中でシリカのコア粒子表面に反応性官能基を有するオルガノアルコキシシランを縮重合させる方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２２５３８１号公報
【発明の概要】
【０００５】
シリカ粒子表面に反応性官能基を導入する際には、通常、当該官能基を有するシランカップリング剤と、コアとなるシリカ粒子とを、酸性又は塩基性の水溶液中で混合する手法がとられる。これにより、水溶液中の水分によってシランカップリング剤が加水分解され、続いてシリカ粒子表面の水酸基との間で縮重合反応が起こり、反応性官能基がシリカ粒子表面に導入される。しかし、この方法では、反応性官能基を有するシランカップリング剤同士が縮重合することを避けられない。そのため、コア粒子表面に、反応性官能基を有するシランカップリング剤に由来するシェル層が分厚く形成され、多くの反応性官能基がこのシェル層中に埋もれた状態となってしまう。すなわち従来の方法では、反応性官能基の粒子表面への導入は非効率なものであった。
【０００６】
本発明は、表面にチオール基を特定の密度で有するナノメートルサイズのシリカ粒子であって、当該粒子が有するチオール基の総量に占める当該粒子表面に存在するチオール基の割合を高めたシリカ粒子を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記シリカ粒子表面に上記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子を提供することを課題とする。
また、本発明は、生体分子として抗体又は抗原を結合させた生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、表面に特定の反応性官能基をより効率的に導入することができるシリカ粒子の製造方法を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者らは、シリカ粒子を、その表面に結合水を有する状態で有機溶媒中に分散し、当該有機溶媒中にチオール基等の反応性官能基を有するシランカップリング剤を混合すると、このシリカ粒子表面に当該反応性官能基を効率的に導入できることを見い出した。すなわち、上記結合水によって、粒子表面でのみ上記シランカップリング剤の加水分解と縮重合反応が進行するため、上記シランカップリング剤同士の間の縮重合反応が生じにくく、その結果、反応性官能基を有するシェル層の厚みが大幅に抑えられることを見い出した。
また、こうして得られたシリカ粒子の表面に、当該反応性官能基を介して生体分子を結合させて、イムノクロマト法等の標識試薬として用いると、当該標識試薬の非特異的吸着が抑えられてバックグラウンドシグナルが低下し、これによりシグナル／ノイズ比が大きくなり、より高感度の分析が行えることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００８】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
〔１〕
チオール基を表面に有するシリカ粒子であって、下記（ａ）及び（ｂ）を満たすシリカ粒子：
（ａ）粒径が２０〜１０００ｎｍである、
（ｂ）シリカ粒子表面における前記チオール基の密度が、０．００２〜０．２個／ｎｍ２である、
（ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０〜０．６０である。
〔２〕
前記シリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、〔１〕に記載のシリカ粒子。
〔３〕
前記チオール基が、アルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してシリカ粒子表面に結合している、〔１〕又は〔２〕に記載のシリカ粒子。
〔４〕
〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のシリカ粒子の表面に、前記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子。
〔５〕
前記生体分子が抗体又は抗原である、〔４〕に記載の生体分子複合粒子。
〔６〕
〔５〕に記載の生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法。
〔７〕
〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のシリカ粒子の製造方法であって、下記（ａ）−（ｃ）の工程を含む、製造方法。
（ａ）アンモニア水含有溶媒中で表面に結合水を有するシリカ粒子を形成する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたシリカ粒子に親水性有機溶媒であるアルコールによる洗浄処理を施すことで、シリカ粒子の表面に存在する結合水以外の自由水を除去する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、該結合水により該シランカップリング剤を加水分解する工程
〔８〕
前記アルコールが、炭素数２以上のアルコールである、〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕
前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、〔７〕又は〔８〕に記載の製造方法。
【０００９】
本発明のシリカ粒子は、表面にチオール基を特定の密度で有し、当該粒子が有するチオール基の総量に占める当該粒子表面のチオール基の割合が大幅に高められている。
本発明の生体分子複合粒子は、本発明のシリカ粒子表面に、チオール基を介して生体分子が結合しており、分析試薬に用いた際の非特異的な吸着が効果的に抑えられ、検出感度をより高めることができる。
本発明のイムノクロマト方法は、本発明の生体分子複合粒子が標識試薬として用いられ、生体分子が結合する標的物質を、高感度に検出することができる。
本発明の製造方法によれば、シリカ粒子表面に特定の反応性官能基をより効率的に導入することができる。
【００１０】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例で用いたイムノクロマト装置のテストストリップの構造を模式的に示した図である。図１中（Ａ）は上面図、（Ｂ）は縦断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明をその好ましい実施態様に基づき以下に詳細に説明する。
【００１３】
本発明のシリカ粒子は、粒径が２０〜１０００ｎｍのシリカ粒子であって、その表面にチオール基を特定の密度で有し、且つ、当該粒子が有するチオール基の総量中、当該粒子表面に存在するチオール基の比率が特定のレベルに高められている。
また、本発明の製造方法は、表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、当該シリカ粒子表面の結合水により、当該シランカップリング剤を加水分解することを含む。
まず最初に、本発明の製造方法の好ましい実施形態について以下に詳説する。
【００１４】
［本発明の製造方法］
（表面に結合水を有するシリカ粒子）
表面に結合水を有するシリカ粒子（以下「コア粒子」ということがある。）は、表面にヒドロキシ基を有し、後述する反応性官能基を有するシランカップリング剤と縮重合反応できれば特に制限はない。シリカ粒子を標識試薬として用いる場合には、蛍光性又は吸光性の色素や放射性物質等の標識物質を含有させることができる。コア粒子は好ましくは蛍光性又は吸光性の色素を含有し、より好ましくは蛍光性色素を含有する。
コア粒子の好ましい実施形態について説明する
【００１５】
蛍光性又は吸光性の色素を含有するコア粒子は、当該色素とシランカップリング剤とを、共有結合、イオン結合その他の化学結合又は物理的吸着により結合させた生成物（蛍光性又は吸光性の色素が結合したオルガノアルコキシシラン）を得、この生成物と１種又は２種以上のシラン化合物（シロキサン成分）とを、例えばアンモニア水含有溶媒中で、加水分解・縮重合させてシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。また、色素に限らず、放射性物質等の他の標識物質を含有するコア粒子についても、標識物質が結合したシランカップリング剤を用いて、同様にして調製することができる。
また、シリカ粒子に標識物質を含有させない場合は、単に上記シラン化合物のみを原料として、アンモニア水含有溶媒中で、加水分解・縮重合させ、コア粒子を得ればよい。
上記アンモニア水含有溶媒としては、例えば、水／エタノールを体積比で１／１０〜１／１とした混合液に、例えば２８％程度のアンモニア水を、アンモニア濃度が０．２〜３ｗｔ％になるように加えた溶液を用いることができる。
前記シラン化合物（シロキサン成分）に特に制限はないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシランのようなテトラアルコキシシランを用いることが好ましく、中でも、ＴＥＯＳを好適に用いることができる。
【００１６】
標識物質とシランカップリング剤とを共有結合させる場合には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する標識物質と、これらの活性基と反応しうる官能基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等）を有するシランカップリング剤を用いることができる。
【００１７】
ＮＨＳエステル基を有する標識物質が蛍光分子である場合の好適な例としては、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式で表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル、下記式で表されるＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
【化１】
0006598681.tif 000002
【００１９】
【化２】
0006598681.tif 000003
【００２０】
標識物質がスクシンイミド基を有する場合には、アミノ基を有するシランカップリング剤と結合させることができる。アミノ基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。中でも、ＡＰＳを好適に用いることができる。
【００２１】
上述のように調製される、標識物質を含むあるいは標識物質不含のシリカ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状であることが好ましい。また、平均粒径は１〜９５０ｎｍであることが好ましく、１８〜４９５ｎｍであることがより好ましく、２８〜２９８ｎｍであることがさらに好ましい。
本明細書において、粒径は平均粒径を意味する。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積の合計を画像処理装置によって求め、この占有面積の合計を、選択した複合粒子の個数（５０個）で割って得られる面積に相当する円の直径（平均円相当直径）として算出することができる。前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子は、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いた限外ろ過により得ることができる。また、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿を回収することで得ることもできる。
【００２２】
ヒドロキシ基以外の反応性官能基を導入する前の、表面に結合水を有するシリカ粒子は、水、水溶液もしくは有機溶媒又はこれらの混合液により洗浄しておくことも好ましい。また、水や水溶液を用いて洗浄することにより、不純物の除去と同時に粒子表面に十分な結合水を保持させることもできる。
洗浄操作は具体的には、シリカ粒子の洗浄液中への分散、遠心分離によるシリカ粒子の沈降、及び上清の除去を１〜３サイクル行うことが好ましい。洗浄液に特に制限はないが、例えば、水、水溶液、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘキサノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
水又は水溶液により洗浄して不純物を除去すると同時にシリカ粒子表面に十分量の結合水を保持させた後、アルコール（好ましくはエタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール又はヘキサノール）等の親水性有機溶媒で洗浄し、シリカ粒子表面に存在する結合水以外の余分な水分（自由水）を除去し、表面に結合水を有するシリカ粒子を得ることも好ましい。
また、アンモニア水含有溶媒中でコア粒子を形成した直後であれば、通常、コア粒子表面に十分な結合水が保持されている。したがって、アンモニア水含有溶媒中で形成したコア粒子を親水性有機溶媒で洗浄し、シリカ粒子表面に存在する自由水を除去し、表面に結合水を有するシリカ粒子を得ることができる。
【００２３】
続いて、表面に結合水を有するシリカナノ粒子にヒドロキシ基以外の反応性官能基（以下、「官能基（Ｉ）」という。）を導入する方法について説明する。本発明の製造方法では、官能基（Ｉ）は、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。このような反応性官能基を採用することで、これらの反応性官能基を介して生体分子等を結合させることができる。
【００２４】
（官能基（Ｉ）の導入）
本発明の製造方法は、上記で得られた表面に結合水を有するシリカ粒子と、官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、当該結合水により当該シランカップリング剤を加水分解する工程を含む。
上記で加水分解された官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤は、その加水分解サイトのヒドロキシ基とシリカナノ粒子表面のヒドロキシ基とが縮重合することでシリカナノ粒子表面に結合する。この縮重合反応により水分子が放出されるため、結合水の量は縮重合反応の前後で変化しない。
【００２５】
上記有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−シクロヘキシルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アルコール（好ましくは炭素数２以上、より好ましくは炭素数３〜１０、さらに好ましくは炭素数４〜８のアルコール）が挙げられる。なかでも、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び炭素数４〜８のアルコールから選ばれるものが好ましく、炭素数４〜８のアルコールから選ばれるものがより好ましく、ペンタノール、ヘキサノール及びヘプタノールから選ばれる溶媒がさらに好ましい。
【００２６】
上記官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤において、官能基（Ｉ）とケイ素原子との連結は、連結基を介していることが好ましい。当該連結基としては、アルキレン基又はアルキレンオキシ基であることが好ましい。当該アルキレン基又はアルキレンオキシ基の炭素数は、２〜１０が好ましく、２〜５がより好ましく、２〜４がさらに好ましい。連結基と有機溶媒との間の溶媒和により、官能基をシリカ粒子の表面外側に向けて効果的に配置させることができる。
上記官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤の具体例としては、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（３−クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィド等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
上記方法によりシリカ粒子に官能基（Ｉ）を導入することで、官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤同士の縮重合反応を大幅に抑えることができる。その結果、官能基（Ｉ）を有するシェル層をより薄膜化することができる。このシェル層の薄膜化は、シリカ粒子を分析試薬の標識粒子として用いた際に、検体中に存在する成分等の非特異的な吸着を抑え、感度と精度に優れた分析を可能とする。
また、シェル層を薄膜化できるため、その分、コア粒子の割合を増やすことができる。その結果、１粒子当たりの標識物質（色素等）の量を増やすことができ、分析試薬として用いた際のさらなる感度アップにつながる。
【００２８】
官能基（Ｉ）が導入された機能性分子含有シリカナノ粒子のゼータ（ζ）電位の絶対値は２０〜７０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位の絶対値が上記範囲内である粒子は、凝集が抑制され、分散性がより高まる。
ゼータ電位は、例えば、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ  ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）を用いて測定することができる。
【００２９】
本発明の製造方法により、シリカ粒子が有する官能基（Ｉ）の総量に占める、粒子表面に存在する官能基（Ｉ）の割合を高めることができる。
【００３０】
上述のように調製される、表面に官能基（Ｉ）を有するシリカ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状である。本発明の実施において、表面修飾に必要とされる溶媒置換のためには、シリカ粒子を遠心分離できることが必要である。粒径（平均粒径）が２０ｎｍより小さい場合、遠心分離により沈降が困難となり、従って、２０ｎｍ以上であることが好ましい。また、粒径が１０００ｎｍより大きい場合、反応中に粒子が沈降してしまう。そのため、粒径は１０００ｎｍ以下であることが好ましい。よって、粒径は２０〜１０００ｎｍであることが好ましく、２０〜５００ｎｍであることがより好ましく、３０〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。
本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）はチオール基が好ましい。官能基（Ｉ）がチオール基の場合に得られるシリカ粒子について以下に説明する。
【００３１】
官能基（Ｉ）がチオール基である場合には、チオール基を有するシリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、当該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が、０．１０〜０．６０であることが好ましく、０．１５〜０．６０であることがより好ましく、０．２０〜０．６０であることがさらに好ましい。
ここでいう粒子１個当たり（１粒子当たり）とは、所定量のシリカ粒子が有する硫黄元素量あるいはチオール基の量を、その粒子数で割った値である（すなわち平均値である）。ここで、所定量のシリカ粒子の粒子数は、当該所定量のシリカ粒子の総質量を、シリカ粒子１個当たりの質量で除することで求められる。シリカ粒子１個当たりの質量は、シリカ粒子の平均体積とシリカ粒子の比重（２．０ｇ／ｃｍ３）を用いて算出することができる。シリカ粒子の平均体積は、１００００倍のＳＥＭ写真から、画像処理により視野中の所定個数（通常２００個程度）の個々のシリカ粒子の粒径（長径と短径の平均）を求め、これを用いて、個々のシリカ粒子を球体と想定して体積を計算し（体積＝４π×（シリカ粒子の粒径の半分）３／３）、これに基づき総体積を求め、これを上記視野中の所定個数（粒子数）で割ることにより算出することができる。
上記の比（Ｂ／Ａ）は、シリカ粒子の硫黄元素の総重量に対するシリカ粒子表面に露出している硫黄元素の重量の比率と同じ意味である。
【００３２】
また、官能基（Ｉ）がチオール基である場合において、シリカ粒子表面におけるチオール基の密度は、０．００２〜０．２個／ｎｍ２が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ２がより好ましい。また、０．００２〜０．０５個／ｎｍ２であってもよく、０．００３〜０．０２個／ｎｍ２であってもよく、０．００３〜０．０１であってもよい。
シリカ粒子表面におけるチオール基の密度を０．００２個／ｎｍ２以上とすることで、生体分子を十分量結合することができ、例えばイムノクロマトグラフィー等のイムノアッセイに適用した際に検出感度をより高めることができる。
また、シリカ粒子表面におけるチオール基の密度を０．２個／ｎｍ２以下とすることで、粒子の凝集を効果的に抑えることができる。また、生体分子を結合させて分析試薬として用いた際には、非特異的な吸着がさらに抑えられ、偽陽性がより生じにくくなる。
【００３３】
なお、官能基（Ｉ）がチオール基である場合において、粒子表面へのチオール基の導入前のコア粒子が硫黄元素を有する場合には（例えば、色素とシランカップリング剤との連結部に硫黄元素が存在する等）、コア粒子中の硫黄元素の量は、シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａには含まれないものとする。つまり、上記Ａはチオール基の形態で粒子中に存在する硫黄元素の総量となる。粒子表面へのチオール基の導入前のコア粒子は、硫黄元素を有さないことが好ましい。
上記の、表面にチオール基を有するシリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（当該チオール基を有するシリカ粒子１個当たりの量）は、燃焼法により測定することができる。具体的には、Ｎｉカプセル等の金属カプセルにシリカナノ粒子を５〜５０μｇ入れ、燃焼させて生じる二酸化硫黄（ＳＯ２）の量を定量することで硫黄元素の量を測定することができる。
【００３４】
上記の、表面にチオール基を有するシリカ粒子において、粒子表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic  acid)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法は、例えば、Archives  of  Biochemistry  and  Biophysics，1959，vol.82，p.70  に記載されている。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
【００３５】
本発明の製造方法で得られる、表面にチオール基を有するシリカ粒子は、当該チオール基を介して生体分子を結合し、生体分子複合粒子とすることができる。生体分子を結合については後述する。
また、本発明の製造方法において、シリカ粒子が有する官能基（Ｉ）がアミノ基、カルボキシ基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基又はイソチオシアネート基である場合も、得られるシリカ粒子表面に常法により生体分子を結合させることができる。これらの方法は、例えば、特開2009-274923（アミノ基）号公報、特開2009-162537（カルボキシ基）号公報、特開2010-100542（エポキシ基、イソシアネート基）号公報等の記載を参照することができる。
【００３６】
［本発明のシリカ粒子］
本発明のシリカ粒子は、その表面にチオール基を有し、（ａ）粒径が２０〜１０００ｎｍであり、（ｂ）粒子表面における前記チオール基の密度が０．００２〜０．２個／ｎｍ２であり、さらに（ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０〜０．６０である。本発明のシリカ粒子は、通常はその表面にチオール基が均質に存在している。
本発明のシリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、例えば、上述した本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）としてチオール基を採用することにより得ることができる。
【００３７】
本発明のシリカ粒子の好ましい形態は、上述の本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）としてチオール基を採用した場合に得られるシリカ粒子の好ましい形態と同じである。したがって、本発明のシリカ粒子の粒径は、２０〜５００ｎｍであることがより好ましく、３０〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。またシリカ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．１個／ｎｍ２が好ましく、０．００２〜０．０５個／ｎｍ２であってもよく、０．００３〜０．０２個／ｎｍ２であってもよい。また、本発明のシリカ粒子は、上記比（Ｂ／Ａ）が、０．１５〜０．６０であることが好ましく、０．２０〜０．６０であることがより好ましい。
【００３８】
本発明のシリカ粒子は標識物質を含有しなくてもよいが、標識物質を含有することが好ましい。標識物質を含有することにより、標識試薬として好適に用いることができる。標識物質は、蛍光性又は吸光性の色素であることが好ましく、蛍光性色素がより好ましい。当該色素は、チオール基を導入する前の粒子（コア粒子）に含有させることが好ましい。すなわち、標識物質を含有するコア粒子を調製し、その表面に、例えば本発明の製造方法によってチオール基を導入することにより、標識物質を含有する形態の本発明のシリカ粒子を得ることができる。コア粒子の調製は上述したとおりである。上記コア粒子には硫黄元素が含まれないことが好ましい。
【００３９】
［本発明の生体分子複合粒子］
本発明の生体分子複合粒子は、上記本発明のシリカ粒子がその表面に有するチオール基を介して生体分子を結合した形態の粒子である。
生体分子に特に制限はなく、タンパク質、核酸、糖等を広く用いることができる。これらの生体分子はさらに化学修飾されていてもよく、また、一部の構造が化学的に改変されていてもよい。なかでも、生体分子は所望の標的物質との特異的な結合能を有することが好ましい。当該生体分子と標的物質の組み合わせの例として、抗体とその抗原、抗原とその抗体、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）と該核酸に相補的な配列を有する核酸、受容体とそのリガンド、リガンドとその受容体、レクチンと糖鎖、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子、等が挙げられる。生体分子は好ましくは抗体又は抗原であり、より好ましくは抗体である。
【００４０】
上記生体分子が抗体である場合には、本発明の生体分子複合粒子は抗原を検出するための免疫測定試薬として用いることができる。
上記抗体としては、免疫グロブリン（whole抗体）や、それを酵素分解して得られるＦ（ａｂ’）２やＦａｂ、重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）とをリンカーを介してタンデムに連結したｓｃＦｖやｓｃ（Ｆｖ）２、ＶＨとＶＬがリンカーを介して連結したユニット２つからなるダイアボディー、人工的に化学合成した、ＶＨ及びＶＬを含むポリアミノ酸、大腸菌や酵母等を発現系として用いて作製された、ＶＨ及びＶＬを含む組換えタンパク質ないし組換えポリアミノ酸を含む。すなわち、本発明において「抗体」とは、ＶＨ及びＶＬを有する分子ないしユニットを意味し、ＶＨ及びＶＬを有する限り、その形態は限定されない。
【００４１】
本発明のシリカ粒子への生体分子の結合は、粒子表面に存在するチオール基と、生体分子とを、共有結合させるのが好ましい。当該共有結合は常法により行うことができる。例えば、本発明のシリカ粒子と、マレイミド基及びカルボキシ基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより粒子表面のチオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合したシリカ粒子を得る。続いて、前記のリンカー分子が結合したシリカ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記カルボジイミドにより活性エステル化された前記カルボキシ基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる。こうすることで、チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子を得ることができる。
また、表面にチオール基を有するシリカ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これによりチオール基を有するシリカ粒子の当該チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させ、次いでリンカー分子が結合したシリカ粒子を得、続いて、前記のリンカー分子が結合したシリカ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシ基との間でアミド結合を形成させてもよい。
【００４２】
本発明の製造方法で製造された生体分子複合粒子は、粒径（平均粒径）が２０〜１０００ｎｍであることが好ましく、２０〜５００ｎｍであることがより好ましく、３０〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。
【００４３】
本発明の生体分子複合粒子の用途に特に制限はない。例えば、生体分子として抗体又は抗原を用いれば、各種免疫学的検査（イムノアッセイ）の標識試薬として用いることができる。当該イムノアッセイとしては、イムノクロマトグラフィー、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、例えばＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の標識粒子として適用することができる。
また、免疫凝集法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって粒子を凝集させる検査方法）、免疫比濁法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合体の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰を分光光度計で計測して検体に含まれる抗原量を測定する検査方法）、免疫比ろう法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原または抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物を形成させ、その複合物の分散液に光をあて散乱した光を測定することで、検体に含まれる抗原または抗体を定量する検査方法）、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法；抗体を結合した粒子及び酵素標識抗体と抗原を含む検体とを混合し、粒子−抗原−酵素標識抗体の複合体を形成し、未反応物を除去後、発光試薬を添加し、その発光量を測定して検出対象物を定量する検査方法）などにも利用できる。
その他にも、本発明の生体分子複合粒子は、フローサイトメトリーにおける標識粒子や、各種バイオチップ等における標識粒子としても用いることができる。
【００４４】
［本発明のイムノクロマト方法］
本発明のイムノクロマト方法（イムノクマトグラフィー法）の好ましい実施形態について説明する。
（テストストリップ）
本発明のイムノクロマト方法は、特定のテストストリップを用いて実施される。当該テストストリップは、
（１）試料添加用部材（サンプルパッド）と標識抗体（シリカ粒子が例えば蛍光性又は吸光性の色素を含有する生体分子複合粒子であって、当該生体分子が抗体であるもの）を含有させてなる部材（コンジュゲートパッド）とが、
（２）前記コンジュゲートパッドと、標的物質と標識抗体とを含む複合体を捕捉するための抗体が固定化されたメンブレン（捕捉抗体固定化メンブレン）とが、並びに
（３）前記捕捉抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。
【００４５】
上記捕捉抗体分子は、標的物質と標識抗体とを含む複合体において、標的物質上の、標識抗体が結合している部位以外の部位に結合可能な抗体である。
【００４６】
図１（Ａ）及び（Ｂ）を参照して、上記テストストリップの好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
図１（Ａ）は、上記テストストリップの好ましい一実施形態の平面図を示し、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）で示した上記テストストリップの縦断面図を示す図である。
上記テストストリップ１は、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド３、捕捉抗体固定化メンブレン４、吸収パッド５からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート６により裏打ちされていることが好ましい。
【００４７】
前記捕捉抗体固定化メンブレン４における捕捉抗体固定化部に、標的物質の有無を判定、すなわち陽性／陰性を判定するための抗体が固定化された判定部４１を設ける。捕捉抗体固定化メンブレン４には、標識抗体と結合する分子が固定化されたコントロールライン４２を含むことが好ましい。
【００４８】
次に、上記各部材について説明する。
（サンプルパッド２）
サンプルパッド２は標的物質を含む液体試料を滴下する構成部材である。
【００４９】
（コンジュゲートパッド３）
コンジュゲートパッド３は標識抗体を含有する構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた液体試料に含まれる標的物質が特異的分子認識反応によって標識抗体と液相中で結合して複合体の形成が開始される部分である。
【００５０】
（捕捉抗体固定化メンブレン４）
捕捉抗体固定化メンブレン４は前記複合体を含む溶液が毛細管現象により移動してくる構成部材であり、標的物質と標識抗体とを含む複合体が固定化抗体上に捕捉される捕捉抗体固定化部（判定部）を有する。
前記メンブレンにおける前記捕捉抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、通常には幅０．５〜１．５ｍｍのライン状である。
【００５１】
上記複合体形成反応により、結果的に捕捉抗体固定化部（判定部）に、標識抗体が濃縮される。その結果、蛍光シグナル等の含色素シリカ粒子が有する色素量の程度により標的物質の量を定性又は定量することができる。
【００５２】
前記捕捉抗体固定化部（判定部）における捕捉抗体固定化量に特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たり０．１μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、捕捉抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。捕捉分子はメンブレンに直接固定化されていてもよいし、他の分子を介して間接的に固定化されていてもよい。
前述の捕捉抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記捕捉抗体固定化メンブレン全体にいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥することでブロッキングを行うことができる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
【００５３】
（吸収パッド５）
吸収パッド５は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００５４】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマト用テストストリップに通常用いられる部材が使用できるが、サンプルパッド及びコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましい。また、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００５５】
前記テストストリップの作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、捕捉抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
【００５６】
（検出方法）
次にイムノクロマト法における検出方法について説明する。
【００５７】
標的物質を含有しうる液体試料を上記テストストリップのサンプルパッド２に滴下することで、サンプルパッド２を通過した当該液体試料がコンジュゲートパッド３に浸透して接触し、該コンジュゲートパッド３に保持されていた標識抗体と当該液体試料中の標的物質との結合反応が開始する。液体試料は、前記結合反応により標識抗体と該標的物質とを含む複合体を形成しながら、毛細管現象により捕捉抗体固定化メンブレン４、吸収バッド５へと順次移動していき、試料中に標的物質が含まれる場合には、上述したようにテストライン上に標識抗体が濃縮される。この濃縮された標識抗体に含まれる色素の吸光（プラズモン共鳴）を目視で、又は色素の蛍光を蛍光検出器を用いて検出することで、標的物質の存在を検出することができる。本発明において「検出」とは、定性的な検出と定量的な検出の双方を含む概念である。
滴下する液体試料の量はテストストリップの構成に合わせて適宜調節することができる。
【００５８】
本発明において、標的物質を含有しうる試料に特に制限なく、臨床検体、食品検体、環境サンプリング検体等が挙げられる。
上記臨床検体としては、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等が挙げられるがこれらに限定されず、目的とする標的物質が含まれ得る試料であればよい。
【００５９】
上記食品検体としては、液体飲料、半固形食品、固形食品等が挙げられる。
【００６０】
環境サンプリング検体としては、土壌、河川、海水等の自然界のサンプルの他、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体や、ふき取り検体等も挙げられる。
【００６１】
試料は液体であればそのまま本発明の方法に用いることもできるし、半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に本発明に用いることもできる。
【００６２】
本発明のイムノクロマト方法は５〜４０℃の温度下で行うことが好ましい。
【００６３】
本発明の生体分子複合粒子をイムノクロマト法の標識抗体として用いると、検体中に存在する標的物質以外の成分の、標識抗体に対する非特異的な吸着が生じにくい。その結果、より高感度かつ高精度の分析を行うことが可能になる。
【実施例】
【００６４】
［実施例１］  表面に反応性官能基を有する含色素シリカ粒子の調製
下記工程（ｉ）〜（ｉｖ）を経て表面に反応性官能基としてチオール基を有する含色素シリカ粒子を調製した。【００６５】
−工程（ｉ）：コア粒子の調製−
１４％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍希釈してアンモニア水含有有機溶媒３．５ｍｌを調製した。このアンモニア水含有有機溶媒中に、当該アンモニア水含有有機溶媒１００体積％に対して０．８６体積％のＴＥＯＳと、当該ＴＥＯＳ１００体積％に対して５３体積％のカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳのＤＭＦ溶液とをそれぞれ添加して、４０℃の温度下で攪拌した。ここで、前記カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳは、前記カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させて得たものである。また、前記ＤＭＦ溶液中のカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ濃度は１０ｍＭとした。【００６６】
−工程（ｉｉ）：シェル層の形成−
上記工程（ｉ）で形成されてきた含色素シリカ粒子の分散液に、前記カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳとＴＥＯＳとを追添し、４０℃で３０分間反応させ、シェル層を形成させた。
上記のカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの添加量１００体積％に対して６７体積％、ＴＥＯＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳ添加量と同量とした。
この操作を繰り返してシェル層を積層し、２層のシェル層を有する含色素シリカ粒子を調製した。なお、２回目のカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの添加量１００体積％に対して３３体積％、ＴＥＯＳの追添量も上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳ添加量１００体積％に対して３３体積％とした。【００６７】
−工程（ｉｉｉ）：自由水の除去−
上記工程（ｉｉ）で得られた、２層のシェル層を有する含色素シリカ粒子の分散液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）し、粒子を沈降させた後、直ちに上清を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して、粒子を沈降させ、次いで上清を除去した。【００６８】
−工程（ｉｖ）：反応性官能基の導入−
上記工程（ｉｉｉ）で得られた、表面に結合水を有する含色素シリカ粒子を、下記表１に示す各種溶媒３．５ｍＬに再分散させた（条件１〜条件５）。ここで、条件１は比較例、条件２〜条件５は、本発明例である。次いで、粒子表層にチオール基を導入するために、粒子分散液に３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＭＳ）を投入して４０℃で２０分反応させ、表層にヒドロキシ基およびチオール基を有するシリカナノ粒子を得た。ＭＰＭＳの投入量は、条件１〜４に関しては、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳとカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの総投入量１００体積％に対して３３体積％、条件５に関しては、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳとカルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳの総投入量１００体積％に対して１０体積％とした。【００６９】
【表１】
0006598681.tif 000004
【００７０】
反応終了後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して粒子を沈降させた後、直ちに上清を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）し、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回行い、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。続いて、上記エタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は上記と同様に洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。こうして反応溶媒の異なる５種類のチオール基導入含色素シリカ粒子を得た。【００７１】
（ζ（ゼータ）電位測定とチオール基の定量）
上記で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子を洗浄し、平均粒径、ζ電位測定の測定、燃焼法による硫黄元素量の測定（粒子中に含まれる硫黄量）、及び、ＤＮＴＢによるチオール基の定量を行った。
得られた結果を下記表２に示す。【００７２】
【表２】
0006598681.tif 000005
【００７３】
上記条件１〜５で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子の表面におけるチオール基の密度は、順に、０．００３３個／ｎｍ２、０．００５３個／ｎｍ２、０．００７１個／ｎｍ２、０．００５３個／ｎｍ２、０．００７１個／ｎｍ２となる。【００７４】
上記表２に示されるように、本発明例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子（条件２〜５）において、Ｂ／Ａが顕著に高められた。すなわち、本発明例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子において、ＭＰＭＳが縮重合して形成されたシェル層は、比較例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子（条件１）において、ＭＰＭＳが縮重合して形成されたシェル層に比べて、格段に薄い。
この結果は、有機溶媒中で反応性官能基を有するシランカップリング剤を粒子表面に縮重合させることにより、チオール基を極めて効率的に粒子表面に導入できることを示している。【００７５】
［実施例２］  チオール基を有する含色素シリカ粒子への抗体の導入
工程（ｉｖ）で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加えて遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子を分散させた。これにリンカー分子として３−マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入含色素シリカ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。【００７６】
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。【００７７】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子（生体分子複合粒子）が分散したコロイドを得た。【００７８】
［試験例１］  イムノクロマト試験（インフルエンザ核タンパク質の迅速判定）
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
抗体固定化メンブレンを用いたテストストリップを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約６ｍｍの位置に、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、幅約１ｍｍのＡ型インフルエンザ用テストラインを設けた。【００７９】
続いて、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＫＰ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、幅約１ｍｍのコントロールラインを設けた。その後、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は３ｍｍとした。
前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。【００８０】
（検出装置）
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）で受光する機構を有する。【００８１】
（イムノクロマト試験）
表３に示す濃度のＡ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。この溶液１００μＬと、上記の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子が分散したコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬとの混合液を、テストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。１５分後、目視検査を行った。また、上記検出装置によって測定したテストラインの蛍光強度を数値化した。結果を表３及び表４に示す。
なお、下記表３及び表４には、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子の調製に用いた、各チオール基導入含色素シリカ粒子について、チオールの導入に用いた溶媒を記載している。また、表３中、「−」は検出不可、「＋」は検出可を意味する。【００８２】
【表３】
0006598681.tif 000006
【００８３】
【表４】
0006598681.tif 000007
【００８４】
水を含む溶媒中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いた場合（条件１）に比べて、有機溶媒中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いた場合（条件２〜５）には、目視観察における検出感度が向上しており（表３）、蛍光検出においても、蛍光強度がより高く検出感度に優れていた（表４）。【００８５】
上記表４は、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が０ｎｇ／ｍｌの蛍光強度を０とした場合の蛍光強度を示している。表４には示していないが、比較例（条件１）のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いると、本発明例（条件２〜５）のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いた場合に比べて、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が０ｎｇ／ｍｌのときの蛍光強度（バックグラウンドシグナル）が高かった。
上記表３及び４の結果は、本発明例のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いると、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きく、検出感度に優れることを示している。
本発明例のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いた場合に優れた検出感度が得られた理由として、１）本発明例で調製したチオール基導入含色素シリカ粒子においてＭＰＭＳのシェル層が薄く（上記表２）、これから得られた生体分子複合粒子の非特異的な吸着が抑えられてバックグラウンドシグナルが低下したことの他、２）チオール基溶媒和効果により、導入されたチオール基が粒子の外側に向けて配置し、このチオール基に結合した抗体が、抗原と結合しやすくなったことが考えられる。特に、疎水性の強いヘキサノール中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いると（条件３及び５）、Ｂ／Ａをより高めることができ、検出感度の向上がより顕著であった。【００８６】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【００８７】
本願は、2013年8月12日に日本国で特許出願された特願2013-167902に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【符号の説明】
【００８８】
１    テストストリップ
２    サンプルパッド
３    コンジュゲートパッド
４    抗体固定化メンブレン
４１  判定部（テストライン）
４２  コントロールライン
５    吸収パッド
６    バッキングシート
【図１】
0006598681.tif 000008