(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のサンプルからサブセットのサンプルを選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）複数の第１の画定された領域を含む第１の基板と、（ｉｉ）複数の第２の画定された領域を含む第２の基板と、を含む装置を提供する段階であって、該第１の基板が該第２の基板に連結されている、段階と、
（ｂ）前記複数の第１の画定された領域の中にサンプルを分散する段階と、
（ｃ）前記複数の第１の画定された領域のそれぞれを、前記複数の第２の画定された領域のそれぞれと組み合わせて、前記サンプルを含む複数の組み合わされた領域を形成する段階と、
（ｄ）前記複数の組み合わされた領域を、複数の第１の娘領域および該複数の第１の娘領域にそれぞれ対応する複数の第２の娘領域を含む、娘領域の複数のペアに分割することにより、該複数の組み合わされた領域中のサンプルを分割する段階と、
（ｅ）前記複数の第１の娘領域中のサンプルに基づいて、１または複数の分析を行う段階と、
（ｆ）前記分析に基づいて、複数の第２の娘領域中のサブセットのサンプルを選択する段階と、
を含む方法。
【請求項２】
前記１または複数の分析が、前記サンプルの破壊的または消費的分析である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが細菌細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが複数の種の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の領域で前記細胞を培養する段階をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記複数の第１の画定された領域の中にサンプルを分散する段階が、細胞を確率的に閉じ込める段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルがゲル化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の第１の画定された領域のそれぞれを、前記複数の第２の画定された領域のそれぞれと組み合わせる前に、前記複数の第２の領域にゲル化剤を分散する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の組み合わされた領域を分割する段階が、第２の基板から第１の基板を切り離す段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を確率的に閉じ込める段階が、第１の基板を第２の基板に対して作動させる段階を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の組み合わされた領域を分割する段階が、第１の基板を第２の基板に対して作動させる段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記分割が、前記領域にポンプ力を適用することなく行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記１または複数の分析が、遺伝子アッセイを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記１または複数の分析が、機能的アッセイを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、ウイルスを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、抗生物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、化学療法剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、成長培地を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、成長因子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、阻害剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の第１の娘領域に基づいて１または複数の分析を行う段階が、１または複数の細胞を分析する段階を含む、請求項３記載の方法。
【請求項２４】
サンプル処理の方法であって、
（ａ）１または複数の細胞を含む第１のサンプルを、第１の基板の１または複数の第１の画定された領域に装填する段階と、
（ｂ）前記１または複数の第１の画定された領域を、前記第１の基板に連結された第２の基板の１または複数の第２の画定された領域と組み合わせる段階と、
（ｃ）前記１または複数の第１の画定された領域の内容物を、前記１または複数の第２の画定された領域の内容物と混合して、それにより１又は複数の細胞を含む混合サンプルを生産する段階と、
（ｄ）前記１または複数の第１の画定された領域を、前記１または複数の第２の画定された領域から分離する段階であって、前記混合サンプルの第１の部分が前記１または複数の第１の画定された領域に含まれ、前記混合サンプルの第２の部分が前記１または複数の第２の画定された領域に含まれ、ここで前記第１の基板は前記第２の基板に連結されたままである、段階と、
（ｅ）前記混合サンプルの第１の部分の中の１または複数の細胞に基づいて、少なくとも１つの分析を行う段階と、
（ｆ）前記少なくとも１つの分析に基づいて、前記混合サンプルの第２の部分の中の１または複数の細胞を保存するか否かを決定する段階と、
を含む方法。
【請求項２５】
前記１または複数の第１の画定された領域が、複数の領域を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記１または複数の第２の画定された領域が、複数の領域を含む、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮出願第６１／８１４，０９０号（２０１３年４月１９日出願）、および米国仮出願第６１／９０３，１４６号（２０１３年１１月１２日出願）の利益を主張し、上記出願は、参照により本明細書に引用される。
【０００２】
（政府援助研究に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所による契約番号ＨＧ００５８２６の下、合衆国政府の支援によりなされた。合衆国政府は、本発明における一定の利益を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇｅｌ  Ｍｉｃｒｏ液滴（ＧＭＤ）、小型ペトリ皿、およびマイクロ流体工学を含むが、それらに限定されない、小型化およびコンパートメント化を採用する培養方法は、スループットを増加させ、高密度挙動を開始し、急速に成長する「雑草」細胞からの競合を排除することができる。しかしながら、これらの方法に必要とされる機器は、多くの場合、ほとんどの研究室にとってアクセス可能ではなく、操作が複雑であり、実世界での生物学的アッセイのためのそれらの使用を制限する。
【０００４】
微生物は、土壌および海からヒトの腸に及ぶ環境で重要な役割を果たす。メタゲノミクスおよび単細胞ゲノミクス等の培養非依存性方法は、微生物群の組成および機能についての豊富な情報を明らかにしてきたが、これらの微生物の純粋な培養を得ることは、細胞ゲノミクスおよび生理学を理解することにおいて依然として基本である。細菌が高度に豊富かつ多様であるため、環境から全ての株を培養して分離することは非実用的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、小ボリュームの作成および操作のための方法、デバイス、システム、およびキットが開示される。場合によっては、これらは、液体およびガス環境の両方を含む、微小環境の制御に使用される。場合によって、本明細書で開示される方法、デバイス、システム、およびキットは、並列化サンプル取り扱いに使用される。場合によっては、これらは、有機体の単離または培養に使用される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）第１の画定されたボリュームを備えている基板を提供することであって、該第１の画定されたボリュームは、第１のサンプルを備え、該第１のボリュームは、第２の基板によって覆われている、ことと、ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている、該第２の基板を提供することであって、該第２の画定されたボリュームは、第２のサンプルを備え、該第２の画定されたボリュームは、該第１の基板によって覆われている、ことと、ｃ）該第２の基板から該第１の基板を分離することであって、それによって、該第２の基板は、該第１の画定されたボリュームを覆わなくなり、該第１の基板は、該第２の画定されたボリュームを覆わなくなる、こととを含む。いくつかの実施形態では、該第１のサンプルは、ゲル化剤を含む。いくつかの実施形態では、該第２のサンプルは、ゲル化剤を含む。いくつかの実施形態では、該切り離しは、装置上で行われ、該装置は、該切り離し中、該第２の基板への該第１の基板の整列を維持する。いくつかの実施形態では、該分離は、重力によって生じる。いくつかの実施形態では、該分離は、毛細管圧によって生じる。いくつかの実施形態では、該分離は、加えられた力によって生じる。いくつかの実施形態では、該分離は、該第１の基板および該第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）第１の画定されたボリュームを備えている第１の基板を提供することと、ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板を提供することであって、該第２の基板は、該第１の基板に連結されている、ことと、ｃ）該第１の画定されたボリュームの中へサンプルを装填することと、ｄ）該第１の画定されたボリュームの内容物が該第２の画定されたボリュームに進入することを可能にし、それによって、組み合わされたサンプルを生成することと、ｅ）該第２の基板から該第１の基板を切り離すことであって、該組み合わされたサンプルの第１の部分は、該第１の画定されたボリュームによって含まれたままであり、該組み合わされたサンプルの第２の部分は、該第２の画定されたボリュームによって含まれたままである、こととを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、切り離しに先立って、該第２の画定されたボリュームから該第１の画定されたボリュームを分離することを含み、該組み合わされたサンプルの該第１の部分は、該第１の画定されたボリュームによって含まれ、該組み合わされたサンプルの該第２の部分は、該第２の画定されたボリュームによって含まれ、該第１の基板は、該第２の基板に連結されたままである。いくつかの実施形態では、該第１の画定されたボリュームを該第２の画定されたボリュームと流体接触させることは、装置上で行われる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、装置上で行われ、該装置は、該切り離し中、該第２の基板への該第１の基板の整列を維持する。いくつかの実施形態では、該切り離しは、装置上で行われ、該装置は、該第１の画定されたボリュームおよび該第２の画定されたボリュームにインデックスを付けるためのプレートを備えている。いくつかの実施形態では、該切り離しは、重力によって生じる。いくつかの実施形態では、切り離しは、該毛細管圧によって生じる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、加えられた力によって生じる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、該第１の基板および該第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）第１の画定されたボリュームを備えている第１の基板を提供することと、ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板を提供することであって、該第２の基板は、該第１の基板に連結されている、ことと、ｃ）該第１の画定されたボリュームの中へ第１のサンプルを装填することと、ｄ）該第１の画定されたボリュームを該第２の画定されたボリュームと流体接触させることであって、該第１の基板は、該第２の基板に連結されたままである、ことと、ｅ）該第１の画定されたボリュームの内容物を該第２の画定されたボリュームの内容物と混合し、それによって、混合サンプルを生成することと、ｆ）該第２の画定されたボリュームから該第１の画定されたボリュームを分離することであって、該混合サンプルの第１の部分は、該第１の画定されたボリュームによって含まれ、該混合サンプルの第２の部分は、該第２の画定されたボリュームによって含まれ、該第１の基板は、該第２の基板に連結されたままである、ことと、ｇ）該第２の基板から該第１の基板を切り離すことであって、該混合サンプルの該第１の部分は、該第１の画定されたボリュームによって含まれたままであり、該混合サンプルの該第２の部分は、該第２の画定されたボリュームによって含まれたままである、こととを含む。いくつかの実施形態では、該混合サンプルはさらに、ゲル化剤を含む。いくつかの実施形態では、該混合は、拡散を含む。いくつかの実施形態では、該混合は、超音波処理を含む。いくつかの実施形態では、該第１の画定されたボリュームを該第２の画定されたボリュームと流体接触させることは、装置上で行われる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、装置上で行われ、該装置は、該切り離し中、該第２の基板への該第１の基板の整列を維持する。いくつかの実施形態では、該切り離しは、装置上で行われ、該装置は、該切り離し中、該第２の基板への該第１の基板の整列を維持する。いくつかの実施形態では、該切り離しは、重力によって生じる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、毛細管圧によって生じる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、加えられた力によって生じる。いくつかの実施形態では、該切り離しは、該第１の基板および該第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本デバイスは、ａ）第１の画定されたボリュームおよびチャネルを備えている第１の基板と、ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板であって、第１の基板に連結される、第２の基板と、ｃ）該第１の基板と該第２の基板との間に配置されている非混和性流体層とを備えている。いくつかの実施形態では、該チャネルに含まれているガスは、該非混和性流体層を通した拡散によって、該第１の画定されたボリュームおよび該第２の画定されたボリュームに進入する。いくつかの実施形態では、該チャネルに含まれているガスは、該第１の基板および該第２の基板を通した拡散によって、該第１の画定されたボリュームおよび該第２の画定されたボリュームに進入する。いくつかの実施形態では、該第２の基板はさらに、チャネルを備えている。いくつかの実施形態では、該デバイスはさらに、該第１の基板と該第２の基板との間に位置付けられる、該第１の基板上に配置されている支柱を備えている。いくつかの実施形態では、該デバイスはさらに、該第１の基板と該第２の基板との間に位置付けられる、該第２の基板上に配置されている支柱を備えている。いくつかの実施形態では、該デバイスはさらに、該第１の基板および該第２の基板の温度制御のための手段を備えている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）複数の画定されたボリュームの間でサンプルを分散させることと、ｂ）本質的に同時に、該複数の画定されたボリュームを、複数の第１の娘ボリュームと複数の合致した第２の娘ボリュームとを備えている、複数の合致したペアの娘ボリュームに分割することであって、該分割は、ポンプ力を該画定されたボリュームに加えることなく行われる、ことと、ｃ）該複数の該第１の娘ボリュームに対して少なくとも１つの分析を行うことと、ｄ）該分析に基づいて、該複数の合致した第２の娘ボリュームのサブセットを選択することとを含む。いくつかの実施形態では、該分析は、遺伝的アッセイを含む。いくつかの実施形態では、該分析は、機能的アッセイを含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、細胞を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、細菌細胞を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、哺乳類細胞を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、核酸を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、複数の種の細胞を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、成長培地を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、成長因子を含む。いくつかの実施形態では、該サンプルは、阻害剤を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）コンテナの中へ流体を装填することと、ｂ）該コンテナ内の開口部をサンプル流体ボリュームと接触させることと、ｃ）該サンプル流体ボリュームが、表面張力によって、該コンテナ内の該流体と合併することを可能にし、合併した液体ボリュームを生成することと、ｄ）該コンテナから該合併した液体ボリュームを放出することとを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本デバイスは、以下のプロトコル、すなわち、ａ）コンテナの中へ流体を装填することと、ｂ）コンテナ内の開口部をサンプル流体ボリュームと接触させることと、ｃ）該サンプル流体ボリュームが、表面張力によって、該コンテナ内の該流体と合併することを可能にし、合併した液体ボリュームを生成することと、ｄ）該コンテナから該合併した液体ボリュームを放出することとを自動的に行うことが可能なアセンブリを備えている。いくつかの実施形態では、該プロトコルは、並行して複数のサンプル流体ボリュームに対して行われる。いくつかの実施形態では、該プロトコルは、連続して複数のサンプル流体ボリュームに対して行われる。いくつかの実施形態では、該サンプル流体ボリュームの体積は、５マイクロリットル以下である。いくつかの実施形態では、該サンプル流体ボリュームの体積は、１００ナノリットル未満である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）複数の画定されたボリュームを提供することであって、該複数の画定されたボリュームの各々は、複数のサンプルのうちの１つを含む、ことと、ｂ）該複数の画定されたボリュームから共有コンテナに該複数のサンプルを移送し、それによって、プールされたサンプルを作成することと、ｃ）該プールされたサンプルに対して分析を行うこととを含む。いくつかの実施形態では、該複数の画定されたボリュームは、１つの基板によって画定される。いくつかの実施形態では、該複数の画定されたボリュームは、複数の基板によって画定される。いくつかの実施形態では、該分析は、遺伝的アッセイを含む。いくつかの実施形態では、該分析は、機能的アッセイを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）複数の画定されたボリュームを提供することであって、該複数の画定されたボリュームの各々は、複数のサンプルのうちの１つを含む、ことと、ｂ）該複数のサンプルに一式の条件を受けさせることと、ｃ）該複数のサンプルに対してプロセスを行うことと、ｄ）該複数の画定されたボリュームから共有コンテナに該複数のサンプルを移送し、それによって、プールされたサンプルを作成することと、ｅ）該プールされたサンプルに対して分析を行うことと、ｆ）該分析から、該一式の条件が該プロセスを可能にした程度、または可能にしなかった程度を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、抗生物質の存在を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、化学療法剤の存在を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、所与の温度を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、所与の大気組成を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、所与の有機体の存在を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、成長因子の存在を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、阻害剤の存在を含む。いくつかの実施形態では、該一式の条件は、栄養素の非存在を含む。いくつかの実施形態では、該プロセスは、細胞成長を含む。いくつかの実施形態では、該プロセスは、核酸増幅を含む。いくつかの実施形態では、該分析は、遺伝的アッセイを含む。いくつかの実施形態では、該分析は、機能的アッセイを含む。いくつかの実施形態では、該分析は、乳腺炎に関連付けられている有機体の検出を含む。いくつかの実施形態では、該分析は、ＩＢＤに関連付けられている有機体の検出を含む。いくつかの実施形態では、該分析は、硫酸還元に関連付けられている有機体の検出を含む。いくつかの実施形態では、該分析は、プロバイオティクスとして有用な有機体の検出を含む。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
（ａ）第１の画定されたボリュームを備えている基板を提供することであって、前記第１の画定されたボリュームは、第１のサンプルを備え、前記第１のボリュームは、第２の基板によって覆われている、ことと、
（ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている前記第２の基板を提供することであって、前記第２の画定されたボリュームは、第２のサンプルを備え、前記第２の画定されたボリュームは、前記第１の基板によって覆われている、ことと、
（ｃ）前記第２の基板から前記第１の基板を分離することであって、それによって、前記第２の基板は、前記第１の画定されたボリュームを覆わなくなり、前記第１の基板は、前記第２の画定されたボリュームを覆わなくなる、ことと
を含む、方法。
［２］
前記第１のサンプルは、ゲル化剤を含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記第２のサンプルは、ゲル化剤を含む、［１］に記載の方法。
［４］
前記切り離しは、装置上で行われ、前記装置は、前記切り離し中、前記第２の基板に対する前記第１の基板の整列を維持する、［１］に記載の方法。
［５］
前記分離することは、重力によって生じる、［１］に記載の方法。
［６］
前記分離することは、毛細管圧によって生じる、［１］に記載の方法。
［７］
前記分離することは、加えられた力によって生じる、［１］に記載の方法。
［８］
前記分離することは、前記第１の基板および前記第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる、［１］に記載の方法。
［９］
（ａ）第１の画定されたボリュームを備えている第１の基板を提供することと、
（ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板を提供することであって、前記第２の基板は、前記第１の基板に連結されている、ことと、
（ｃ）前記第１の画定されたボリュームの中へサンプルを装填することと、
（ｄ）前記第１の画定されたボリュームの内容物が前記第２の画定されたボリュームに進入することを可能にし、それによって、組み合わされたサンプルを生成することと、
（ｅ）前記第２の基板から前記第１の基板を切り離すことであって、前記組み合わされたサンプルの第１の部分は、前記第１の画定されたボリュームによって含まれたままであり、前記組み合わされたサンプルの第２の部分は、前記第２の画定されたボリュームによって含まれたままである、ことと
を含む、方法。
［１０］
前記切り離すことに先立って、前記第２の画定されたボリュームから前記第１の画定されたボリュームを分離することをさらに含み、前記組み合わされたサンプルの前記第１の部分は、前記第１の画定されたボリュームによって含まれ、前記組み合わされたサンプルの前記第２の部分は、前記第２の画定されたボリュームによって含まれ、前記第１の基板は、前記第２の基板に連結されたままである、［９］に記載の方法。
［１１］
前記第１の画定されたボリュームを前記第２の画定されたボリュームと流体接触させることは、装置上で行われる、［９］に記載の方法。
［１２］
前記切り離すことは、装置上で行われ、前記装置は、前記切り離し中、前記第２の基板に対する前記第１の基板の整列を維持する、［９］に記載の方法。
［１３］
前記切り離すことは、装置上で行われ、前記装置は、前記第１の画定されたボリュームおよび前記第２の画定されたボリュームにインデックスを付けるためのプレートを備えている、［９］に記載の方法。
［１４］
前記切り離すことは、重力によって生じる、［９］に記載の方法。
［１５］
前記切り離すことは、毛細管圧によって生じる、［９］に記載の方法。
［１６］
前記切り離すことは、加えられた力によって生じる、［９］に記載の方法。
［１７］
前記切り離すことは、前記第１の基板および前記第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる、［９］に記載の方法。
［１８］
（ａ）第１の画定されたボリュームを備えている第１の基板を提供することと、
（ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板を提供することであって、前記第２の基板は、前記第１の基板に連結されている、ことと、
（ｃ）前記第１の画定されたボリュームの中へ第１のサンプルを装填することと、
（ｄ）前記第１の画定されたボリュームを前記第２の画定されたボリュームと流体接触させることであって、前記第１の基板は、前記第２の基板に連結されたままである、ことと、
（ｅ）前記第１の画定されたボリュームの内容物を前記第２の画定されたボリュームの内容物と混合し、それによって、混合サンプルを生成することと、
（ｆ）前記第２の画定されたボリュームから前記第１の画定されたボリュームを分離することであって、前記混合サンプルの第１の部分は、前記第１の画定されたボリュームによって含まれ、前記混合サンプルの第２の部分は、前記第２の画定されたボリュームによって含まれ、前記第１の基板は、前記第２の基板に連結されたままである、ことと、
（ｇ）前記第２の基板から前記第１の基板を切り離すことであって、前記混合サンプルの前記第１の部分は、前記第１の画定されたボリュームによって含まれたままであり、前記混合サンプルの前記第２の部分は、前記第２の画定されたボリュームによって含まれたままである、ことと
を含む、方法。
［１９］
前記混合サンプルは、ゲル化剤をさらに含む、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記混合することは、拡散を含む、［１８］に記載の方法。
［２１］
前記混合することは、超音波処理を含む、［１８］に記載の方法。
［２２］
前記第１の画定されたボリュームを前記第２の画定されたボリュームと流体接触させることは、装置上で行われる、［１８］に記載の方法。
［２３］
前記切り離すことは、装置上で行われ、前記装置は、前記切り離し中、前記第２の基板に対する前記第１の基板の整列を維持する、［１８］に記載の方法。
［２４］
前記切り離すことは、装置上で行われ、前記装置は、前記切り離し中、前記第２の基板に対する前記第１の基板の整列を維持する、［１８］に記載の方法。
［２５］
前記切り離すことは、重力によって生じる、［１８］に記載の方法。
［２６］
前記切り離すことは、毛細管圧によって生じる、［１８］に記載の方法。
［２７］
前記切り離すことは、加えられた力によって生じる、［１８］に記載の方法。
［２８］
前記切り離すことは、前記第１の基板および前記第２の基板が液体に浸漬されている間に生じる、［１８］に記載の方法。
［２９］
（ａ）第１の画定されたボリュームおよびチャネルを備えている第１の基板と、
（ｂ）第２の画定されたボリュームを備えている第２の基板であって、前記第２の基板は、前記第１の基板に連結されている、第２の基板と、
（ｃ）前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置されている非混和性流体層と
を備えている、デバイス。
［３０］
前記チャネルに含まれているガスは、前記非混和性流体層を通した拡散によって、前記第１の画定されたボリュームおよび前記第２の画定されたボリュームに進入する、［２９］に記載のデバイス。
［３１］
前記チャネルに含まれているガスは、前記第１の基板および前記第２の基板を通した拡散によって、前記第１の画定されたボリュームおよび前記第２の画定されたボリュームに進入する、［２９］に記載のデバイス。
［３２］
前記第２の基板は、チャネルをさらに備えている、［２９］に記載のデバイス。
［３３］
前記第１の基板上に配置され、前記第１の基板と前記第２の基板との間に位置付けられている支柱をさらに備えている、［２９］に記載のデバイス。
［３４］
前記第２の基板上に配置され、前記第１の基板と前記第２の基板との間に位置付けられている支柱をさらに備えている、［２９］に記載のデバイス。
［３５］
前記第１の基板および前記第２の基板の温度制御のための手段をさらに備えている、［２９］に記載のデバイス。
［３６］
（ａ）複数の画定されたボリュームの間でサンプルを分散させることと、
（ｂ）本質的に同時に、前記複数の画定されたボリュームを複数の合致したペアの娘ボリュームに分割することであって、前記複数の合致したペアの娘ボリュームは、複数の第１の娘ボリュームと複数の合致した第２の娘ボリュームとを備え、前記分割することは、ポンプ力を前記画定されたボリュームに加えることなく行われる、ことと、
（ｃ）前記複数の前記第１の娘ボリュームに対して少なくとも１つの分析を行うことと、
（ｄ）前記分析に基づいて、前記複数の合致した第２の娘ボリュームのサブセットを選択することと
を含む、方法。
［３７］
前記分析は、遺伝的アッセイを含む、［３６］に記載の方法。
［３８］
前記分析は、機能的アッセイを含む、［３６］に記載の方法。
［３９］
前記サンプルは、細胞を含む、［３６］に記載の方法。
［４０］
前記サンプルは、細菌細胞を含む、［３６］に記載の方法。
［４１］
前記サンプルは、哺乳類細胞を含む、［３６］に記載の方法。
［４２］
前記サンプルは、ウイルスを含む、［３６］に記載の方法。
［４３］
前記サンプルは、核酸を含む、［３６］に記載の方法。
［４４］
前記サンプルは、複数の種の細胞を含む、［３６］に記載の方法。
［４５］
前記サンプルは、抗生物質を含む、［３６］に記載の方法。
［４６］
前記サンプルは、化学療法剤を含む、［３６］に記載の方法。
［４７］
前記サンプルは、成長培地を含む、［３６］に記載の方法。
［４８］
前記サンプルは、成長因子を含む、［３６］に記載の方法。
［４９］
前記サンプルは、阻害剤を含む、［３６］に記載の方法。
［５０］
（ａ）コンテナの中へ流体を装填することと、
（ｂ）前記コンテナ内の開口部をサンプル流体ボリュームと接触させることと、
（ｃ）前記サンプル流体ボリュームが、表面張力によって、前記コンテナ内の前記流体と合併することを可能にし、合併した液体ボリュームを生成することと、
（ｄ）前記コンテナから前記合併した液体ボリュームを放出することと
を含む、方法。
［５１］
デバイスであって、前記デバイスは、
（ａ）アセンブリであって、前記アセンブリは、以下のプロトコル、すなわち、
（ｉ）コンテナの中へ流体を装填することと、
（ｉｉ）前記コンテナ内の開口部をサンプル流体ボリュームと接触させることと、
（ｉｉｉ）前記サンプル流体ボリュームが、表面張力によって、前記コンテナ内の前記流体と合併することを可能にし、合併した液体ボリュームを生成することと、
（ｉｖ）前記コンテナから前記合併した液体ボリュームを放出することと
を自動的に行うことが可能である、アセンブリを備えている、デバイス。
［５２］
前記プロトコルは、並行して複数のサンプル流体ボリュームに対して行われる、［５１］に記載のデバイス。
［５３］
前記プロトコルは、連続して複数のサンプル流体ボリュームに対して行われる、［５１］に記載のデバイス。
［５４］
前記サンプル流体ボリュームの体積は、５マイクロリットル以下である、［５１］に記載のデバイス。
［５５］
前記サンプル流体ボリュームの体積は、１００ナノリットル未満である、［５１］に記載のデバイス。
［５６］
（ａ）複数の画定されたボリュームを提供することであって、前記複数の画定されたボ
リュームの各々は、複数のサンプルのうちの１つを含む、ことと、
（ｂ）前記複数の画定されたボリュームから共有コンテナに前記複数のサンプルを移送し、それによって、プールされたサンプルを作成することと、
（ｃ）前記プールされたサンプルに対して分析を行うことと
を含む、方法。
［５７］
前記複数の画定されたボリュームは、１つの基板によって画定される、［５６］に記載の方法。
［５８］
前記複数の画定されたボリュームは、複数の基板によって画定される、［５６］に記載の方法。
［５９］
前記分析は、遺伝的アッセイを含む、［５６］に記載の方法。
［６０］
前記分析は、機能的アッセイを含む、［５６］に記載の方法。
［６１］
（ａ）複数の画定されたボリュームを提供することであって、前記複数の画定されたボリュームの各々は、複数のサンプルのうちの１つを含む、ことと、
（ｂ）前記複数のサンプルに一式の条件を受けさせることと、
（ｃ）前記複数のサンプルに対してプロセスを行うことと、
（ｄ）前記複数の画定されたボリュームから共有コンテナに前記複数のサンプルを移送し、それによって、プールされたサンプルを作成することと、
（ｅ）前記プールされたサンプルに対して分析を行うことと、
（ｆ）前記分析から、前記一式の条件が前記プロセスを可能にした程度、または可能にしなかった程度を決定することと
を含む、方法。
［６２］
前記一式の条件は、抗生物質の存在を含む、［６１］に記載の方法。
［６３］
前記一式の条件は、化学療法剤の存在を含む、［６１］に記載の方法。
［６４］
前記一式の条件は、所与の温度を含む、［６１］に記載の方法。
［６５］
前記一式の条件は、所与の大気組成を含む、［６１］に記載の方法。
［６６］
前記一式の条件は、所与の有機体の存在を含む、［６１］に記載の方法。
［６７］
前記一式の条件は、成長因子の存在を含む、［６１］に記載の方法。
［６８］
前記一式の条件は、阻害剤の存在を含む、［６１］に記載の方法。
［６９］
前記一式の条件は、栄養素の非存在を含む、［６１］に記載の方法。
［７０］
前記プロセスは、細胞成長を含む、［６１］に記載の方法。
［７１］
前記プロセスは、核酸増幅を含む、［６１］に記載の方法。
［７２］
前記分析は、遺伝的アッセイを含む、［６１］に記載の方法。
［７３］
前記分析は、機能的アッセイを含む、［６１］に記載の方法。
［７４］
前記分析は、乳腺炎に関連付けられている有機体の検出を含む、［６１］に記載の方法。
［７５］
前記分析は、ＩＢＤに関連付けられている有機体の検出を含む、［６１］に記載の方法。
［７６］
前記分析は、硫酸還元に関連付けられている有機体の検出を含む、［６１］に記載の方法。
［７７］
前記分析は、プロバイオティクスとして有用な有機体の検出を含む、［６１］に記載の方法。
【００１５】
（参照による援用）
本明細書で記述される全ての出版物、特許、および特許出願は、米国出願第６１／５１６，６２８号、米国出願第６１／５１８，６０１号、米国出願第１３／２５７，８１１号、米国出願第１２／６７０，７３９号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８３６１号、米国出願第６１／２６２，３７５号、米国出願第６１／１６２，９２２号、米国出願第６１／３４０，８７２号、米国出願第１３／４４０，３７１号、米国出願第１３／４６７，４８２号、米国出願第１３／８６８，０２８号、米国出願第１３／８６８，００９号、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６３５９４号を含む、各個々の出版物、特許、または特許出願が、参照することにより組み込まれるように具体的かつ個々に示された場合と同一の程度に、ありとあらゆる目的で、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の新規の特徴は、添付の請求項で詳細に記載される。本発明の原理が利用される例証的実施形態を記載する、以下の発明を実施するための形態、および添付図面を参照することによって、本発明の特徴および利点のより深い理解が得られるであろう。
【図１】図１は、３本の整列ピンおよび２つのガラススペーサを伴うホルダを示す。
【図２】図２Ａは、ホルダを用いた分割の側面概略図を示す。図２Ｂは、分割前のデバイスの側面概略図および上面写真を示す。図２Ｃは、分割後のデバイスの側面概略図および上面写真を示す。図２Ｄは、分割後のデバイスの写真を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ピペット先端とともに液体サンプルを含む画定されたボリュームを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ピペット先端とともに液体と合併する液体サンプルを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、液体およびサンプルが除去された、画定されたボリュームを示す。
【図４】図４Ａは、チップ洗浄のためのデバイス上の水溶液の装填を示す。図４Ｂは、チップ洗浄のためのデバイス上のコンパートメント化を示す。図４Ｃは、チップ洗浄のためのデバイス上の残留水溶液の除去を示す。図４Ｄは、区分化されたサンプルのチップ洗浄を可能にするデバイスの作動を示す。
【図５】図５Ａは、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ遺伝子を発現する単一の大腸菌の培養の概略図、大腸菌のＰＣＲ識別の概略図および写真、ならびに大腸菌の蛍光顕微鏡識別の概略図および写真を示す。図５Ｂは、顕微鏡検査およびＰＣＲ結果のモンタージュを示す。図５Ｃは、大腸菌の顕微鏡検査およびＰＣＲ識別の視覚化を示す。
【図６】図６Ａは、デジタルＰＣＲに使用されたスリップチップを示す。図６Ｂは、ガス供給チャネルを伴うスリップチップを示す。
【図７】図７は、スリップチップデバイス上のバクテロイデス・シータイオタオミクロンの嫌気性培養の説明図および写真を示す。
【図８】図８Ａは、細菌培養を装填された垂直ウェルを伴うデバイスの写真を示す。図８Ｂは、細菌培養を装填された垂直ウェルを伴うデバイスの写真を示す。図８Ｃは、高さ９００ｎｍのナノポストを示す。
【図８−１】図８Ｄは、ナノポストがないスリップチップデバイス内の大腸菌の成長を示す。図８Ｅは、高さ４００ｎｍのナノポストを伴うスリップチップデバイス内の大腸菌の成長を示す。図８Ｆは、高さ９００ｎｍのナノポストを伴うスリップチップデバイス内の大腸菌の成長を示す。
【図９】図９Ａは、制御雰囲気瓶の中のデバイスの概略図を示す。図９Ｂは、異なる酸素濃度を伴う３本の瓶の中のデバイスを示す。図９Ｃは、異なる酸素条件下のバクテロイデス・シータイオタオミクロンおよび大腸菌の成長を示す。
【図１０】図１０Ａは、単離されたコンパートメントの線走査を示す。図１０Ｂは、拡散的に接続されたコンパートメントの線走査を示す。図１０Ｃは、単離されたコンパートメントの断面概略図を示す。図１０Ｄは、拡散的に接続されたコンパートメントの断面概略図を示す。
【図１１】図１１は、アナエロスティペス・カカエのみ、および化学コミュニケーションしているバクテロイデス・シータイオタオミクロンを伴う成長を示す。
【図１２】図１２Ａは、重複ウェルおよびチャネルを伴う空のスリップチップを示す。図１２Ｂは、スリップチップの中へ装填されたサンプルを示す。図１２Ｃは、２枚のプレート内のウェルに重複するように滑らされたスリップチップを示す。図１２Ｄは、空気を注がれたチャネルを伴うスリップチップを示す。図１２Ｅは、油を注がれたチャネルを伴うスリップチップを示す。図１２Ｆは、重複ウェルを分離するように滑らされたスリップチップを示す。
【図１３】図１３は、スリップチップ分割後のアガロースがない流体ボリュームを示す。
【図１４】図１４Ａは、微生物群からの低速成長染色の確率的閉じ込めの下の培養を示す。図１４Ｂは、滑りおよび分離後のスリップチップの２つの側面上の細胞の分布を示す。
【図１５】図１５Ａは、１ｘボリュームウェルを伴う希釈デバイスの上層を示す。図１５Ｂは、９ｘボリュームウェルを伴う希釈デバイスの底層を示す。図１５Ｃは、組み立てられた希釈デバイスの上および底層を示す。図１５Ｄは、サンプルで充填された希釈デバイスを示す。図１５Ｅは、導管からウェルを分離するように滑らされた希釈デバイスの上プレートを示す。図１５Ｆは、希釈の第１のステップを示す。図１５Ｇは、希釈の５つのステップ後の１００，０００倍希釈を示す。
【図１６】図１６は、８倍合計希釈のための２倍連続希釈の３つのステップを示す。
【図１７】図１７Ａは、親水性ウェルを製作するためのステップを示す。図１７Ｂは、親水性ウェル中の水溶液を示す。
【図１８】図１８は、オンデバイス希釈の結果を示す。
【図１９】図１９は、スリップチップデバイスの半分の上に１％アガロースを含む流体ボリュームを示す。
【図２０】図２０Ａは、デバイス上の微生物標的有機体の標的化培養および単離のためのシークエンシングの概略図を示す。図２０Ｂは、デバイス上の微生物標的有機体の標的化培養および単離のためのチップ洗浄の概略図を示す。図２０Ｃは、デバイス上の微生物標的有機体の標的化培養および単離のための分割およびＰＣＲの概略図を示す。
【図２１】図２１は、大腸菌を用いたｑＰＣＲのチップ洗浄の結果を示す。
【図２２】図２２Ａは、スリップチップデバイス上のクロストリジウム・シンデンスの成長を示す。図２２Ｂは、スリップチップデバイス上のエンテロコッカス・フェカリスの成長を示す。図２２Ｃは、寒天プレート上のクロストリジウム・シンデンスの成長を示す。図２２Ｄは、寒天プレート上のエンテロコッカス・フェカリスの成長を示す。図２２Ｅは、非成長陰性対照、チップ洗浄方法、およびプレート洗浄方法から収集されたクロストリジウム・シンデンスおよびエンテロコッカス・フェカリスのゲノムＤＮＡを比較するグラフである。
【図２３】図２３は、サンプル収集および閉じ込めの概略図を示す。
【図２４】図２４は、標的特異的プライマーおよび汎用プライマーを用いるｑＰＣＲ結果を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、分割スリップチップ上の陽性および陰性オンチップコロニーＰＣＲを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」の拡大されたコロニーを示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」の単一のコロニーの顕微鏡写真を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」のＴＥＭ画像を示す。
【図２６】図２６は、ＯＴＵ１５８の光学顕微鏡検査を示す。
【図２７】図２７Ａは、「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」の系統発生的提携を示す。
【図２７−１】図２７Ｂは、ＦＩＳＨによる「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」培養の妥当性確認を示す。
【図２８】図２８は、標的有機体の培養および単離の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（Ｉ．概説）
本開示は、サンプルの並行取り扱いのための方法および組成物を提供する。並行サンプル取り扱いは、種々の手段によって行うことができる。例えば、サンプル取り扱いは、スリップチップデバイス上で起こることができる。スリップチップデバイスは、各々が一連のウェル、チャンバ、または他の画定されたボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）を含む２つの対面プレートを備えていることができる。装填すること、混合すること、反応、分離、希釈、結果の提示、および他のステップを含む、サンプル取り扱いは、互に対するスリップチッププレートの作動によって起こることができる。サンプルの並列化は、２枚のプレートを分割し、２枚のプレートの各々の上でサンプルの空間的に順序付けられた合致するセットを生成することによって起こることができる。被分析物を破壊または消費する分析を含む、並行サンプルセットのさらなる分析を、サンプルの一方または両方のセットに対して行うことができる。
【００１８】
本開示は、ａ）単一細胞からの確率的閉じ込めおよび培養、ｂ）微小コロニーの複製の作成、ｃ）遺伝子ベースのアッセイを使用する微生物の標的化単離、およびｄ）機能ベースのアッセイを使用する微生物の標的化単離のための方法を説明する。本方法は、例えば、スリップチップデバイス上で行うことができる。スリップチップは、場合によっては、複雑な機器を必要としない場合がある、流体ボリューム、例えば、ピコリットル〜ナノリットルサイズの流体ボリュームを操作することができる、マイクロ流体デバイスである。場合によっては、単一細胞が、（例えば、１，０００コンパートメントスリップチップの中に）確率的に閉じ込められ、コロニーの成長を可能にするように培養される。閉じ込めに加えて、微生物の周囲の微小環境は、所望であれば微生物間の相互作用の強度および方向を制御することによって調節することができる。場合によっては、マイクロデバイスからの培養品種を一緒にプールし、１本の管の中へ収集し、高スループット多重化アッセイを実行することができる。場合によっては、デバイスの２枚のプレートが分離されると、各コンパートメント化流体ボリュームは２つに分かれ、対向プレートの各々の上に各個々のコロニーのコピーを作成する。遺伝子ベースのアッセイに対して、目的とする遺伝子を伴うコロニーを含むコンパートメントを識別するために、ＰＣＲ等の反応を第１のプレート上で行うことができる。次いで、目的とする分離株の拡大培養を含むがそれに限定されない、他の用途のために、対応するコロニーを第２のプレートから回収することができる。
【００１９】
（ＩＩ．スリップチップ）
本明細書で開示される方法、組成物、デバイス、およびキットは、スリップチップデバイスとともに使用され得る。スリップチップデバイスは、例えば、２０１０年３月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８３６１号「Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１１年９月２０日に出願された米国出願第１３／２５７，８１１号「Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００９年１１月１８日に出願された米国出願第６１／２６２，３７５号「Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００９年３月２４日に出願された米国出願第６１／１６２，９２２号「Ｓｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１０年３月２２日に出願された米国出願第６１／３４０，８７２号「Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１１年４月５日に出願された米国出願第６１／５１６，６２８号「Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｖｉａ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＲＰＡ）  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ」、および２０１１年５月９日に出願された米国出願第６１／５１８，６０１号「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  （ＲＴ−ＰＣＲ）  Ｏｎ  Ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｌｉｐ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ」で説明されている。
【００２０】
簡潔には、スリップチップデバイスは、互に連結されたプレートを備えていることができる、マイクロ流体デバイスである。各プレートは、複数のウェル、コンパートメント、または他の画定されたボリュームを備えていることができる。プレートは、互に対して移動することができる。プレートの運動は、１枚のプレート上の画定されたボリュームを別のプレート上のウェルと流体接触させるか、または接触から外すこと、あるいは画定されたボリュームを入口または出口チャネルと流体接触させるか、または接触から外すこと等の種々のオンチップ動作をもたらし得る。
【００２１】
スリップチップデバイスは、ガラス、シリコン、ポリマー（例えば、ＰＭＭＡまたはＰＤＭＳ）、あるいは金属等の種々の材料から製作することができる。スリップチップデバイスは、フォトリソグラフィ、ソフトリソグラフィ、熱エンボス加工、レーザアブレーション、ウェットエッチング、プラズマエッチング（例えば、ＲＩＥまたはＤＲＩＥ）、または微小成形等の種々の方法によって製作することができる。
【００２２】
スリップチップデバイスは、ペルフルオロ化合物、鉱油、または他の油等の種々の潤滑相を構成要素間に備えていることができる。
【００２３】
スリップチップデバイスは、シラン化、酸素プラズマ活性化、ポリマーコーティング（例えば、ＰＤＭＳまたはパリレン）、親和性剤、金属、電極、誘電体、タンパク質、親水性コーティングおよび処理、または疎水性コーティングおよび処理等の種々の表面処理を用いて調製することができる。
【００２４】
スリップチップデバイスは、ヒータ、ペルチェデバイス、圧電アクチュエータ、ポンプ、光源、光学センサ、ＣＣＤ、磁石、および他の構成要素を含む、種々の追加の機能的構成要素を備え得る。
【００２５】
（ＩＩＩ．サンプル）
本開示で取り扱われるサンプルは、細胞を含むことができる。サンプルは、単一の種類の細胞、有機体、またはウイルスを含むことができる。サンプルは、複数の種類の細胞、有機体、またはサンプルを含むことができる。サンプルは、複数の種の微生物または微生物コンソーシアを含むことができる。サンプルは、細菌細胞を含むことができる。サンプルは、真菌細胞を含むことができる。サンプルは、哺乳類細胞を含むことができる。サンプルは、昆虫細胞を含むことができる。サンプルは、腫瘍細胞を含むことができる。サンプルは、ウイルスを含むことができる。サンプルは、藻類を含むことができる。サンプルは、古細菌を含むことができる。サンプルは、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、アナエロスティペス・カカエ、バクテロイデス・ブルガタス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、または他の種を含むことができる。サンプルは、ＨｅＬａ、ＮＣＩ６０、ＤＵ１４５、ＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｎｃａｐ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８、ＰＣ３、Ｔ４７Ｄ、ＴＨＰ−１、Ｕ８７、ＳＨＳＹ５Ｙ、またはＳａｏｓ−２等のヒト細胞を含むことができる。サンプルは、Ｖｅｒｏ、ＧＨ３、ＰＣ１２、ＭＣ３Ｔ３、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ＺＦ４、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ＡＢ９、ＭＤＣＫ、またはＸｅｎｏｐｕｓ  Ａ６等の非ヒト動物細胞を含むことができる。サンプルは、幹細胞を含むことができる。サンプルは、以前に発見されていない、または特性評価されていない種を含むことができる。サンプルは、タバコＢＹ−２等の植物細胞を含むことができる。サンプルは、遺伝子、一式の遺伝子、遺伝子マーカーまたは一式の遺伝子マーカー、表現型特性等のマーカーまたは機能、あるいは、セルロース分解、リグニン分解、発酵、感染、硫酸還元等の目的の活動、あるいは、他の活動に基づいて選択される有機体または有機体群を含むことができる。サンプルは、先述の細胞または有機体のうちのいずれからからの分離株を含むことができる。
【００２６】
サンプルは、酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマー、標識、プローブ、粒子、溶解剤、シークエンシングまたは次世代シークエンシングのためのサンプル調製試薬、誘導剤（例えば、ＩＰＴＧ）、抑制因子（例えば、ＬａｃＩ）、信号伝達分子（例えば、ホルモン）、あるいは他の試薬等の試薬を含むことができる。サンプルは、ＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ生成物等の反応生成物を含むことができる。サンプルは、他の反応生成物を含むことができる。サンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、プラスミド、調節または非コードＲＮＡ、あるいは他の核酸等の核酸を含むことができる。
【００２７】
サンプルは、調理肉培地、ＡＭ２培地、ＬＢ培地、ＬＢミラー培地、ＬＢレノックス培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、２ｘ  ＹＴ培地、ＴＢ培地、ＳＢ培地、または他の市販の培地等の培地を含むことができる。
【００２８】
サンプルは、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＢＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、ＳＳＣ、ＭＥＳ、コハク酸、グッドバッファ、または他の市販の緩衝剤等の緩衝剤を含むことができる。
【００２９】
サンプルは、Ｏ２、ＣＯ２、ＣＯ、Ｎ２、ＮＯ、ＮＯ２、Ｈ２Ｏ、または空気等のガスを含むことができる。
【００３０】
サンプルは、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポイエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝臓癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔ信号伝達経路、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ウシ胎仔成長ホルモン（ＦＢＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、または他の成長因子等の成長因子またはサイトカインを含むことができる。
【００３１】
サンプルは、アンピシリン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、Ｄ−サイクロセリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシン、カスガマイシン、ナリジクス酸、ネオマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、または他の抗生物質等の抗生物質を含むことができる。
【００３２】
サンプルは、抗体、抗体断片、またはアプタマーを含むことができる。サンプルは、特定の標的に結合することが可能な結合剤を含むことができる。サンプルは、フルオロフォアを含むことができる。
【００３３】
サンプルは、流体ボリュームを含むことができる。流体ボリュームは、液滴であり得る。流体ボリュームは、完全または部分的に、ウェル、コンパートメント、または他の構造に含むことができる。流体ボリュームは、基板上にあることができる。流体ボリュームは、乳液中にあることができる。流体ボリュームは、表面張力によって画定することができる。流体ボリュームは、１つ以上の固体基板によって画定することができる。流体ボリュームは、１つ以上の非混和性液体によって画定することができる。流体ボリュームは、気相によって画定することができる。流体ボリュームは、固、液、および／または気相の組み合わせによって画定することができる。
【００３４】
（ＩＶ．サンプルの並行取り扱い）
多くのアッセイが、貴重な情報を提供するが、プロセスにおいてそれらの被分析物を破壊または消費し得る。そのようなアッセイに対して、本開示は、画定されたボリューム中で並行サンプル取り扱いを提供し、サンプルの１つの元のセットからサンプルの２つの合致セットを生成する。場合によっては、１つのセットを、その被分析物を破壊または消費する分析に使用することができ、別のセットを、参照、増幅、または成長、あるいはさらなる研究のために保存することができる。いくつかの他の場合においては、１つのセットを、その被分析物を破壊または消費する第１の分析に使用することができ、別のセットを、その被分析物を破壊または消費する第２の分析に使用することができる。例えば、ＰＣＲまたはＦＩＳＨ等の遺伝的アッセイは、多くの場合、それらの遺伝物質を分析するために細胞が溶解させられることを要求するが、微生物単離のために生きている微生物を得ることが望ましい。場合によっては、被分析物のいくつかのコピーが、サンプルの元のセットの中の各画定されたボリュームに提供され、生成されるサンプルの２つの合致セットの各々は、元のボリュームより少ない被分析物を含む。場合によっては、被分析物の少なくとも１つのコピーが、サンプルの元のセットの中の各画定されたボリュームに提供され、被分析物の増幅が、サンプルの２つの合致セットの生成に先立って行われる。増幅は、細胞成長であり得る。増幅は、核酸増幅によるものであり得る。
【００３５】
並行サンプル取り扱いは、スリップチップデバイスによって行うことができる。スリップチップデバイスは、各々が所与の数の画定されたボリュームを伴う、対向プレートを備えていることができる。画定されたボリュームは、コンパートメントまたはウェルであり得る。ウェルは、サンプルを装填することができ、後に、プレートは、１枚のプレート上のコンパートメントまたはウェルを別のプレート上の対応するコンパートメントまたはウェルと接触させるように、互に対して滑らせることができる。例えば、細胞の懸濁液を両方のプレート上のウェルの中へ装填することができ、次いで、ウェルを滑らせることによって寄せ集め、組み合わされたウェルを形成することができる。代替として、細胞の懸濁液を１枚のプレート上のウェルの上へ装填することができ、成長培地等の異なる溶液を別のプレート上のウェルの上へ装填することができ、次いで、ウェルを滑らせることによって寄せ集め、組み合わされたウェルを形成することができる。これらの組み合わされたウェルは、サンプルの元のセットを形成することができる。次いで、ウェルのセットを分離するようにプレートを滑らせることによって、サンプルの合致セットの形成を形成することができる。
【００３６】
並行サンプル取り扱いは、液滴マイクロ流体デバイスによって行うことができる。液滴は、非混和性油相によって区分化される水性液滴であり得る。液滴は、非混和性水相によって区分化される油液滴であり得る。サンプルの元のセットを含む、液滴の集合は、連続液滴分割を受け、娘液滴においてサンプルの２つの合致セットを生成することができる。
【００３７】
並行サンプル取り扱いは、他の画定されたボリュームシステムによって行うことができる。場合によっては、サンプルの元のセットは、マイクロウェルプレート中の水性サンプルを含む。サンプルの２つの合致セットは、サンプルの元のセットから第２のマイクロウェルプレートの中へ元のサンプルボリュームのわずかを移送することによって生成することができる。移送することは、例えば、ピペット移送によって行うことができる。
【００３８】
（Ｖ．スリップチップの分割）
並行サンプル取り扱いは、各々が所与の数の画定されたボリュームを伴う、２つの対向プレートを備えていることができる、スリップチップデバイスによって行うことができる。上記で説明されるように、画定されたボリュームの２つのセットを分離するように２枚のプレートを滑らせることによって、サンプルの元のセットからのサンプルの２つの合致セットの形成を形成することができる（例えば、図２Ｂ、図２Ｃ参照）。これらのサンプルの２つの合致セットは、スリップチップデバイスの２つの対向プレートを分離することによってさらに分離することができ、画定されたボリュームのアレイの中のそれらの物理的場所に基づいて、サンプルの２つの合致セットのメンバー間のペア関係を保ちながら、さらなる分析のための各サンプルへのアクセスを可能にする。
【００３９】
プレートは、最初に第２の画定されたボリュームから第１の画定されたボリュームを分離する必要なく、切り離すことができる。そのような場合において、２つの基板の切り離しは、２つのボリュームの分離を提供する。サンプル内の凝集力は、サンプルと基板との間の粘着力より小さくあり得る。例えば、基板の全体または一部は、親水性であり得、サンプルは、水性であり得る。例えば、ウェルの内側の親水性表面およびウェルの外側の疎水性表面を伴う基板が生成され（図１７Ａ）、水性サンプルが装填された（図１７Ｂ）、図１７を参照されたい。別の実施例では、疎水性表面によって包囲された親水性ウェルがタンパク質アッセイに使用された（Ｗｅｉｓｈａｎ  Ｌｉｕ，Ｄｅｌａｉ  Ｃｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｋｅｖｉｎ  Ｐ．Ｎｉｃｈｏｌｓ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“ＳｌｉｐＣｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０  ８２：３２７６−３２８２を参照）。場合によっては、ボリュームの内側の物質は、基板に対して粘着性であり得る。例えば、物質は、表面に付着する哺乳類細胞であり得る。
【００４０】
場合によっては、１つの基板があるボリュームを含み、別の基板が別のボリュームを含み、これらのボリュームは、流体的に接続されず、同一または異なる内容物を有し得る。２つの基板を切り離すことができる。切り離しは、ボリュームへのアクセスを提供することができる。これは、例えば、スリップチップを使用することによって調製することができる。そのようなボリュームは、混合物を含む組み合わされたボリュームを滑らせて離すことによって調製することができる。一実施例については、図１２を参照されたい。
【００４１】
流体的に接続された、または流体的に接続を断たれたボリュームを含む、ボリュームは、体積が類似し得るか、または異なり得る（Ｆｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｂｉｎｇ  Ｓｕｎ，Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ｅｌｅｎａ  Ｋ．Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｐｏｌｕｒｕ  Ｌ．Ｒｅｄｄｙ，Ｌｏｒｅｎ  Ｊ．Ｊｏｓｅｐｈ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ，”ＪＡＣＳ  ２０１１  １３３：１７７０５−１７７１２、および、Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ｔｏｄｄ  Ｍｕｎｓｏｎ，Ｔｏａｎ  Ｈｕｙｎｈ，Ｆｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  Ｗｉｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１  ８３：８１５８−８１６８を参照）。ボリュームは、核酸増幅反応のために構成することができる（Ｆｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｅｌｅｎａ  Ｋ．Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ｏｌａｆ  Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｖｉａ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１  ８３：３５３３−３５４０、Ｆｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｂｉｎｇ  Ｓｕｎ，Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ｅｌｅｎａ  Ｋ．Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｐｏｌｕｒｕ  Ｌ．Ｒｅｄｄｙ，Ｌｏｒｅｎ  Ｊ．Ｊｏｓｅｐｈ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ，”ＪＡＣＳ  ２０１１  １３３：１７７０５−１７７１２、  Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ｔｏｄｄ  Ｍｕｎｓｏｎ，Ｔｏａｎ  Ｈｕｙｎｈ，Ｆｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｓｓａｙｓ  ｗｉ���ｈ  Ｗｉｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１  ８３：８１５８−８１６８、およびＦｅｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｊａｓｏｎ  Ｅ．Ｋｒｅｕｔｚ，Ａｌｉｃｅ  Ｆｏｋ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ，”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２０１０  １０：２６６６−２６７２を参照）。ボリュームは、本明細書で説明されるような微生物、細胞等の有機体の成長のために構成することができる。ボリュームは、タンパク質結晶化を含むが、それに限定されない、結晶化のために構成することができる（Ｌｉａｎｇ  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｖａｌｖｅｓ，Ｄｒｏｐｌｅｔｓ，ａｎｄ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２０１０  ３９：１３９−１５８、および、Ｌｉａｎｇ  Ｌｉ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｆｒｅｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂａｔｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ＪＡＣＳ  ２０１０  １３２：１１２−１１９を参照）。ボリュームは、タンパク質アッセイのために構成することができる（Ｗｅｉｓｈａｎ  Ｌｉｕ，Ｄｅｌａｉ  Ｃｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｋｅｖｉｎ  Ｐ．Ｎｉｃｈｏｌｓ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“ＳｌｉｐＣｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０  ８２：３２７６−３２８２）。単一細胞および分子を増幅して回収することができる。表面は、親水性または疎水性であり得る（Ｗｅｉｓｈａｎ  Ｌｉｕ，Ｄｅｌａｉ  Ｃｈｅｎ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，Ｋｅｖｉｎ  Ｐ．Ｎｉｃｈｏｌｓ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“ＳｌｉｐＣｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０  ８２：３２７６−３２８２）。
【００４２】
２枚のスリップチッププレートの分離は、流体の下で行うことができる。流体は、テトラデカン油、ペルフルオロ化油、または任意の他の好適な非混和性液体等の非混和性油を含むことができる。蒸発は、場合によっては、スリップチップ上で低減させられることができるか、または起こることができない。
【００４３】
２枚のスリップチッププレートを分離するために使用される力は、重力であり得る。２枚のスリップチッププレートを分離するために使用される力は、毛細管力であり得る。２枚のスリップチッププレートを分離するために使用される力は、流体力学的であり得る。２枚のスリップチッププレートを分離するために使用される力は、ピンセット、カミソリの刃、または指等の器具を介して加えることができる。
【００４４】
スリップチッププレートは、サンプルボリュームまたは液滴の分離が維持されることを確実にするように、分離中に互に対して定位置で保持することができる。スリップチッププレートは、手動で、定位置で保持することができる。スリップチッププレートは、クランプを用いて定位置で保持することができる。スリップチッププレートは、ホルダを用いて定位置で保持することができる（図１、図２Ａ参照）。
【００４５】
スリップチッププレートの分割はさらに、サンプルボリュームまたは液滴が分割中に位置がずれることを防止するようにサンプルの粘度を増加させることによって、可能にすることができる。サンプルの粘度は、ポリマーの追加によって増加させることができる。サンプルの粘度は、ゲルの追加によって増加させることができる。サンプルの粘度は、高粘度液体の追加によって増加させることができる。サンプルの粘度は、温度変化によって増加させることができる。場合によっては、サンプルの粘度は、グリセロールの追加によって増加させることができる。場合によっては、サンプルの粘度は、アガロースの追加によって増加させることができる。アガロースは、超低ゲル化温度アガロースであり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．１％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．２％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．３％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．４％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．５％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．６％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．７％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．８％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも０．９％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも１．０％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも１．２％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも１．４％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも１．６％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも１．８％であり得る。アガロースの濃度は、少なくとも２．０％であり得る。場合によっては、アガロースは、約０．３％〜約２．０％の濃度でサンプルに追加される。サンプルの温度は、アガロースをゲル化するように低下させることができる。スリップチッププレートは、サンプルのゲル化の後に分割することができる（例えば、図２Ｄ参照）。
【００４６】
場合によっては、一方のスリップチッププレート上の画定されたボリュームは、有機体を含む溶液を装填され、他方のスリップチッププレート上の画定されたボリュームは、アガロースを含む溶液を装填される。有機体は、アガロースの非存在下で培養することができ、有機体成長の後、ボリュームの２つのセットを組み合わせることができる。これらの組み合わされたボリュームは、サンプルの元のセットを形成することができる。次いで、ボリュームの２つのセットを分離するように２枚のプレートを滑らせることによって、サンプルの２つの合致セットの形成を形成することができる。
【００４７】
（ＶＩ．サンプルの回収）
並列化の後に、サンプルをさらなる分析のために回収することができる。サンプルは、表面間移送によって回収することができる。サンプルは、ピペット移送によって回収することができる。ピペット移送は、最初に、画定されたボリュームの中へ緩衝溶液のある体積をピペット移送し、緩衝液がサンプルボリュームと混合することを可能にすることによって、行うことができる。次いで、緩衝液およびサンプルの全ボリュームをピペット移送し、移送することができる。スリップチップ上のウェルの間の間隔は、ウェルの間の二次汚染を防止するように、ピペット先端の外径より大きくあり得る。代替として、ピペット移送は、緩衝液等の溶液で充填されたピペット先端をサンプルボリュームと接触させ、サンプルボリュームがピペット先端内の液体と合併することを可能にすることによって、行うことができる（例えば、図３）。
【００４８】
サンプルは、チップ洗浄方法によって回収することができる。チップ洗浄方法は、種々の条件下でデバイス上の反応または他のプロセスを監視するために使用することができる。画定されたボリュームに含まれるサンプルを、スリップチップデバイス等のデバイスから洗い流し、凝集させることができる。次いで、分析を凝集サンプルに対して行うことができる。分析は、検査される条件が反応または他のプロセスを可能または無効にする程度を決定することができる。分析は、例えば、本プロセスを可能にするための最小条件、本プロセスを可能にするための最適条件、本プロセスを可能にするための中間条件、または本プロセスを無効にするための最小条件を決定することができる。例えば、ＤＮＡを、デバイスまたはチップ上で画定されたボリュームに区分化し、増幅し、組み合わされたボリュームに流し込むことができ、次いで、組み合わされた生成物は、その増幅条件が所望の標的の増幅を支援するかどうかを決定するように分析することができる。別の実施例では、細胞をデバイスまたはチップ上で画定されたボリュームに区分化し、培養し、デバイスから組み合わされたボリュームに流し込むことができ、次いで、使用された培養条件が標的微生物の成長を支援したかどうかを決定するために、シークエンシング、標的特異的プライマー、または両方によって、プール細胞からのＤＮＡを分析することができる。このチップ洗浄方法は、条件が標的のために識別されるまで、連続的に、または並行して繰り返すことができる。例えば、スリップチップベースのマイクロ流体デバイスは、このチップ洗浄方法が、各々が約６ｎＬの規模で最大３，２００回の微生物培養実験を行うことができるように設計することができる。そのようなデバイスは、３つの能力、すなわち、サンプルからの単一細胞の確率的閉じ込め、微生物培養、および培養された細胞の収集を可能にすることができる。そのようなデバイスは、単一の出口を用いてチップ洗浄溶液を収集することを可能にすることができる。本設計は、図４で図示されている。設計特徴の本実施形態は、（例えば、装填のために排出口へ、または収集のために出口へ）水相流を向かわせるために、架橋チャネルを使用することができる。
【００４９】
サンプル回収は、異なる時点で行うことができる。細胞の培養のため等のいくつかの場合において、サンプル回収時点は、サンプル中の異なる細胞の異なる成長速度により、後続の分析の結果に影響を及ぼし得る。例えば、細胞培養のためのバイオマスの最大収率が、成長の後半対数期または成長の初期遅滞期で発生し得る。サンプルの区分化は、バイオマスの収率またはゲノムＤＮＡのようなマーカーの量等におけるサンプル間のバイアスを低減または排除することができる。このバイアスの低減または排除は、サンプルを回収するために特定の時点を待つこと重要性を低減させることができる。
【００５０】
サンプル中の細胞の初期濃度は、プレートカウントまたは顕微鏡検査によって推定することができる。細胞は、ボリュームの中へ封入されることができる。細胞を封入するために使用することができる、いくつかのアプローチがある。例えば、細胞は、確率的閉じ込めによって封入することができる。例えば、微生物懸濁液は、最初に、確率的閉じ込めのプロセスによって、多くの液体マイクロコンパートメントに分離することができる。（Ｍｅｇｈａｎ  Ｅ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｗｅｉｓｈａｎ  Ｌｉｕ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｂ．Ｈａｎｅｙ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ  ｓｉｇｎａｌｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１０  ３９：９７４−９８４．ＤＯＩ：１０．１０３９／ｂ９１７８５１ａ、Ｊａｍｅｓ  Ｑ．Ｂｏｅｄｉｃｋｅｒ，Ｌｉａｎｇ  Ｌｉ，Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｒ．Ｋｌｉｎｅ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｂｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｇ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００８  ８：１２６５−１２７２．ＤＯＩ  １０．１０３９／ｂ８０４９１１ｄ、Ｗｅｉｓｈａｎ  Ｌｉｕ，Ｈｙｕｎ  Ｊｕｎｇ  Ｋｉｍ，Ｅｌｅｎａ  Ｍ．Ｌｕｃｃｈｅｔｔａ  ，Ｗｅｎｂｉｎ  Ｄｕ，ａｎｄ  Ｒｕｓｔｅｍ  Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＦＩＳＨ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｏｄｅ  ａｎｄ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎ，”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００９  ９：２１５３−２１６２．ＤＯＩ：１０．１０３９／ｂ９０４９５８ｄを参照）。例えば、マイクロコンパートメントの数が、微生物細胞の数より大きいとき、ポアソン統計に基づくと、ほとんどのウェルは１または０個の細胞を含むことができる。例えば、１０６または１０５個の細胞／ミリリットルを下回る濃度でサンプルを確率的に閉じ込めるために、１ナノリットルウェルを使用することができる。しかしながら、例えば、能動的に制御された細胞選別によって細胞を封入することができるとき、または自己組織化によって細胞を受動的に封入することができるときに、ポアソン限界を克服することができる（Ｊｏｎ  Ｆ．Ｅｄｄ，Ｄｉｎｏ  Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｊ．Ｈｕｍｐｈｒｙ，Ｓａｒａｈ  Ｋｏｓｔｅｒ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｉｒｉｍｉａ，���ａｖｉｄ  Ａ．Ｗｅｉｔｚ，ａｎｄ  Ｍｅｈｍｅｔ  Ｔｏｎｅｒ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ｄｒｏｐｓ，”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  Ａｕｇｕｓｔ  ２００８，８  （８）：１２６２−１２６４．ＤＯＩ  １０．１０３９／ｂ８０５４５６ｈを参照）。さらに、細胞が、サンプルの他の成分と比べて優先的に捕らえるように設計されている特徴の中に捕らえられることができる（例えば、Ｄｉｎｏ  Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ，Ｌｉｚ  Ｙ．Ｗｕ，ａｎｄ  Ｌｕｋｅ  Ｐ．Ｌｅｅ，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｒｒａｙ，”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００６，６，１４４５−１４４９，ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｂ６０５９３７Ｆ、およびＡｌｉｓｏｎ  Ｍ  Ｓｋｅｌｌｅｙ，Ｏｋｔａｙ  Ｋｉｒａｋ，Ｈｅｉｋｙｕｎｇ  Ｓｕｈ，Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，ａｎｄ  Ｊｏｅｌ  Ｖｏｌｄｍａｎ，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，１４７−１５２  （２００９），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１２９０を参照）。
【００５１】
（ＶＩＩ．サンプルからの有機体の培養）
本開示で説明される方法、組成物、およびデバイスは、サンプルから有機体を培養するために使用することができる。例えば、環境からの有機体をサンプリングし、培養のためにデバイス上に装填することができる。有機体を含むサンプルを、サンプルの元のセットに区分化することができる。サンプルは、有機体のコロニーまたは集団の成長を可能にするように培養することができる。コロニーまたは集団成長の後に、サンプルの元のセットは、各々が有機体のコロニーまたは集団を含むサンプルの合致セットに分割することができる。遺伝子、活性、または目的とする他の特徴を含むものを識別するために、サンプルの１つのセットをアッセイすることができる。次いで、別のセットからの対応するサンプルを、培養、拡大、または他のさらなる研究のために選択することができる。
【００５２】
本開示で説明される並行サンプル取り扱いは、サンプルから標的化有機体を単離して培養するために使用することができる。例えば、目的とする遺伝子を含む環境からの有機体を、さらなる研究のために識別して単離することができる。別の実施例では、目的とする活性を伴う環境からの有機体を、さらなる研究のために識別して単離することができる。そのうちの少なくとも１つが標的にされる、有機体を含むサンプルを、サンプルの元のセットに区分化することができる。サンプルは、有機体のコロニーまたは集合の成長を可能にするために培養することができる。コロニーまたは集団成長の後に、サンプルの元のセットは、各々が有機体のコロニーまたは集団を含むサンプルの合致セットに分割することができる。遺伝子、活性、または目的とする他の特徴を含むものを識別するために、サンプルの１つのセットをアッセイすることができる。次いで、別のセットからの対応するサンプルを、培養、拡大、または他のさらなる研究のために選択することができる。
【００５３】
有機体を含むサンプルを、画定されたボリュームの間で区分化することができる。所与の画定されたボリューム中の細胞または有機体の数は、区分化されているサンプル中の細胞または有機体の初期濃度によって制御することができる。画定されたボリューム中の有機体または細胞の分布を決定するために、ポアソン統計等の統計的方法を使用することができる。培養またはインキュベーションに先立って、画定されたボリュームは、少なくとも１個の細胞または有機体、少なくとも２個の細胞または有機体、少なくとも３個の細胞または有機体、少なくとも４個の細胞または有機体、少なくとも５個の細胞または有機体、少なくとも６個の細胞または有機体、少なくとも７個の細胞または有機体、少なくとも８個の細胞または有機体、少なくとも９個の細胞または有機体、少なくとも１０個の細胞または有機体、少なくとも１５個の細胞または有機体、少なくとも２０個の細胞または有機体、あるいは少なくとも２５個の細胞または有機体を含むことができる。培養またはインキュベーションに先立って、画定されたボリュームは、多くても１個の細胞、多くても２個の細胞または有機体、多くても３個の細胞または有機体、多くても４個の細胞または有機体、多くても５個の細胞または有機体、多くても６個の細胞または有機体、多くても７個の細胞または有機体、多くても８個の細胞または有機体、多くても９個の細胞または有機体、多くても１０個の細胞または有機体、多くても１５個の細胞または有機体、多くても２０個の細胞または有機体、あるいは多くても２５個の細胞または有機体を含むことができる。
【００５４】
有機体を含むサンプルを培養することができる。培養は、種々の培養時間の間、行うことができる。培養時間は、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間であり得る。培養時間は、多くても３０分、多くても１時間、多くても２時間、多くても３時間、多くても４時間、多くても５時間、多くても６時間、多くても７時間、多くても８時間、多くても９時間、多くても１０時間、多くても１１時間、多くても１２時間、多くても１８時間、多くても２４時間、多くても３６時間、または多くても４８時間であり得る。培養は、種々の温度で行うことができる。培養温度は、少なくとも−１０℃、少なくとも−５℃、少なくとも０℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも３７℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃であり得る。培養温度は、多くても−１０℃、多くても−５℃、多くても０℃、多くても５℃、多くても１０℃、多くても１５℃、多くても２０℃、多くても２５℃、多くても３０℃、多くても３５℃、多くても３７℃、多くても４０℃、多くても４５℃、多くても５０℃、多くても５５℃、多くても６０℃、または多くても６５℃であり得る。培養は、室温で行うことができる。培養は、３７℃で行うことができる。
【００５５】
（ＶＩＩＩ．アッセイおよび識別方法）
目的とする有機体および他のサンプルは、種々の手段によって識別することができる。サンプルが依然として並行サンプル取り扱いシステム（例えば、スリップチップデバイス、マイクロ流体液滴デバイス、マイクロウェルアレイ、または他の並行サンプル取り扱いシステム）内にある間に、識別を行うことができる。マイクロ流体液滴デバイスは、例えば、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１２９，０９１，号で説明されている。識別は、並行サンプル取り扱いシステムから除去されたサンプルに対して行うことができる。
【００５６】
目的とする有機体は、遺伝子マーカーによって選択または識別することができる。遺伝子マーカーによる識別は、ＰＣＲによって行うことができる。ＰＣＲを行うために、目的とする遺伝領域（例えば、遺伝子、遺伝子のセット、プロモータ、または遺伝子構築物）を標的にするＰＣＲプライマーを使用することができ、ＰＣＲ生成物の存在が、目的とする遺伝領域の存在を示す。例えば、有機体は、スリップチップ上の元のサンプルボリュームの中へ分散させ、培養し、分割することができる（図５Ａ）。スリップチップの１枚のプレートは、ＰＣＲ試薬を含むスリップチッププレートと組み合わされ、ＰＣＲ生成物を形成するように反応させられることができ、ＰＣＲ生成物の存在は、目的とする遺伝領域の存在を示す（図５Ｂ）。等温増幅方法を使用することができる。遺伝子マーカーの識別をＦＩＳＨによって行うことができる。目的とする遺伝領域を標的にする蛍光プローブをサンプルに追加し、交雑させることができる。非結合プローブを洗い流すことができ、蛍光プローブの存在は、目的とする遺伝領域の存在を示す。遺伝子マーカーの識別は、シークエンシングによるものであり得る。各サンプルからの単一の核酸分子が配列決定されることができる。各サンプルからの核酸分子を増幅させることができ、増幅生成物を配列決定することができる。増幅およびシークエンシングは、特定の領域を標的にすることができるか、またはゲノム全体を標的にすることができる。
【００５７】
機能標的化アプローチも使用することができる。機能的アッセイは、遺伝子ベースの方法で開発された一般的なワークフローを共有することができる。特定の機能を果たすことができる微生物を識別するために、蛍光、比色分析、化学発光、または質量分析アッセイを含む（がそれらに限定されない）アッセイを行うことができる。そのような高スループット機能的アッセイはまた、所望であれば臨床サンプルに対して直接行うこともできる。スリップチップを分割することから作成される微生物細胞マイクロアレイは、例えば、機能的アッセイを行うために（例えば、腸から等の）一片の生物組織と組み合わせることができる。場合によっては、腸からの組織は、目的とする機能のためにＧＦＰレポータを伴う遺伝子導入マウスから得ることができる。組織が微生物細胞アレイと組み合わされて培養された後、標準落射蛍光顕微鏡検査を使用することによって、局所的ＧＦＰ発現を視覚化することができる。所望であれば、次いで、目的とする分離株の拡大培養等の別の目的のために、対応するコロニーを第２のプレートから回収することができる。
【００５８】
場合によっては、識別または標的化されている機能的活性は、酵素である。機能的活性は、可視光または紫外線吸収生成物を生成することができる。酵素方法は、コレステロール酸化酵素活性を検出するためのＣＨＯＤ−ＰＡＰ方法であり得る。酵素方法は、ブドウ糖酸化酵素を検出するためのＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ方法であり得る。酵素方法は、乳酸脱水素酵素を検出するためのものであり得る。酵素活性は、セルロース分解染料を使用する、セルロースの分解であり得る。酵素活性は、リグニン分解染料を使用する、リグニンの分解であり得る。場合によっては、機能的活性は、蛍光発生基質との相互作用によって検出される。例えば、Ｈ２Ｓを検出して硫酸塩還元有機体の活性を検出するために、Ｎ，Ｎ−ジブチルフェニレンジアミンを使用することができる。
【００５９】
場合によっては、識別または標的化されている機能的活性は、抵抗力または一式の抵抗力である。抵抗力は、抗生物質に対するものであり得る。抵抗力は、温度、雰囲気、圧力、他の有機体の存在、または他の条件等の特定の成長条件に対するものであり得る。識別は、選択された条件下での成長の存在、非存在、規模、または速度に基づくことができる。
【００６０】
場合によっては、識別されている機能的活性は、化学物質への応答である。応答は、陰性、例えば、成長の阻害であり得る。応答は、陽性、例えば、成長の助長であり得る。識別は、選択された条件下での成長の存在、非存在、規模、または速度に基づくことができる。
【００６１】
（ＩＸ．ガス制御）
液体培地が微生物の成長を支援するために重要であり得る一方で、気相の内容物を制御することも微生物培養のために重要であり得る。いくつかの微生物は、あるガスの存在により、成長できない場合がある。例えば、偏性嫌気性菌は、酸素に敏感であり、空気へのばく露時に成長しないであろう。いくつかの微生物は、ある種類のガスが成長することを要求する。例えば、ほとんどの古細菌は、ＣＯ２を細胞物質に取り込む独立栄養生物であり、ＣＯ２なしでは成長しないであろう。テルモトガ目からの水素または硫酸塩還元細菌からの硫化水素等の老廃物の蓄積は、それらの成長を阻害し得る。
【００６２】
ガス制御は、嫌気性チャンバ等の制御された環境を伴うチャンバ内にデバイスを位置付けることによって達成することができる。例えば、嫌気性培養との関連で、気相における酸素の部分圧は、通常、嫌気性チャンバまたはＨｕｎｇａｔｅ回転培養管技法によって制御される。嫌気性チャンバの気相における酸素は、パラジウム触媒とともに水素によって還元することができる。この方法は、ヒトの腸からのほとんどの微生物を培養することに適合し、寒天プレートの使用を可能にする。Ｈｕｎｇａｔｅ回転培養管方法は、メタン細菌等のより厳密な嫌気性生物を培養するために広く使用され、ガラス管およびブチルゴムストッパの使用は、容器の中への酸素の拡散を効果的に防止することができる。培養のための環境を提供するために、密閉することができるコンテナまたは瓶であり得る、任意の種類の環境を使用することができる。例えば、デバイスをガラス瓶内に配置することができ、次いで、それに１つまたは複数の所望のガスを注入することができる。
【００６３】
ガス制御は、デバイス自体の上にガス供給チャネルを組み込むことによって達成することができる。例えば、スリップチップデバイス（図６Ａ）は、油および水相を伴うウェルを有することができる。スリップチップデバイスは、ガス供給チャネルを含むように設計することができる（図６Ｂ）。チャネルとウェルとの間の距離は、約数百マイクロメートルであり得、酸素に対して、約数分のデバイス基板を通した特徴的な拡散時間をもたらす。
【００６４】
ガス制御は、デバイスの構成要素間の間隙のサイズを増加させることによって達成することができる。対面プレートを伴うスリップチップデバイスは、スペーサまたは支柱の追加または製作によって増加させられる、プレート間の距離を有することができる。例えば、プレート基板は、プレート間の間隙距離を増加させるための支柱特徴を作成するためにエッチングすることができる。代替として、支柱またはスペーサは、プレート表面への金属、プラスチック、酸化物、またはフォトレジスタの追加によって製作されることができる。支柱またはスペーサの高さは、約１００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約７００ｎｍ以下、約９００ｎｍ以下、約１．５μｍ以下、または約２μｍ以下であり得る。支柱の高さは、約１００ｎｍ以上、約２００ｎｍ以上、約４００ｎｍ以上、約５００ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上、約９００ｎｍ以上、約１．５μｍ以上、または約２μｍ以上であり得る。スペーサまたは支柱は、フッ化水素酸を用いて等、湿式化学エッチングによって製作することができる。スペーサまたは支柱は、反応性イオンエッチングまたはディープ反応性イオンエッチングによって等、プラズマエッチングによって製作することができる。スペーサまたは支柱の製作は、フォトリソグラフィ、ソフトリソグラフィ、レーザアブレーション、微小成形、エンボス加工、または微小加工技法を用いて行うことができる。間隙は、外部雰囲気から、オンチップガス供給チャネルから、または両方からの増加したガス移送を可能にすることができる。細胞成長は、異なる間隙距離によって可能にされるガス移送に基づいて変動し得る。
【００６５】
ガス制御は、デバイス材料の選択によって達成することができる。ガラス、ＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、他のプラスチック、および金属等の異なるデバイス材料は、基板を通した異なる拡散の速度を可能にする。油相が使用される場合、ペルフルオロ化油、鉱油、または他の油等の異なる油が、異なる拡散の速度を可能にする。
【００６６】
制御されるガスは、広範囲の単一のガスまたはガスの組み合わせを含むことができる。ガスの実施例は、Ｏ２、ＣＯ２、ＣＯ、Ｎ２、ＮＯ、ＮＯ２、Ｈ２Ｏ、空気、または他のガスを含む。制御されるガスは、大気圧、大気圧より高い圧力、または大気圧より低い圧力を含む、異なる圧力で提供することができる。
【００６７】
（Ｘ．化学コミュニケーション制御）
デバイスは、画定されたボリュームの間の化学コミュニケーションを可能にしながら、画定されたボリューム内に被分析物を含むように設計することができる。例えば、一対のウェルは、各ウェルの内容物が完全に分離されている（図１０Ａ、図１０Ｃ）よりもむしろ、細胞がそれぞれのウェルに含まれた状態を保ちながら、拡散化学接続を可能にするブリッジ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）によって接続されることができる。
【００６８】
（ＸＩ．オンチップ希釈）
希釈をチップ上で行うことができる。希釈は、線形であり得る。希釈は、対数であり得る。希釈は、単一の希釈ステップを含むことができる。希釈は、複数の希釈ステップを含むことができる。
【００６９】
希釈は、スリップチップデバイスを用いて行うことができる。希釈は、サンプルのボリュームを希釈剤のボリュームと接触させるように、スリップチップを作動させることによって行うことができる。希釈の複数のステップは、サンプルのボリュームを希釈剤の一連のボリュームと接触させるように、スリップチップを複数回作動させることによって行うことができる。スリップチップウェル表面は、親水性または疎水性であり得る。希釈は、１つのデバイス上または複数のデバイス上で行うことができる。
【００７０】
混合は、希釈ステップの間で起こり得る。混合は、超音波処理、渦形成、かき混ぜ、撹拌、電気流体力学的な力、ボリューム内の流動の生成、または他の手段等の加えられた混合力によって、能動的であり得る。混合は、拡散混合のための十分な時間を可能にすることによって等、受動的であり得る。サンプルのボリュームおよび希釈剤のボリュームは、体積が同等あり得るか、または体積が異なり得る。
【００７１】
（ＸＩＩ．自動化）
本開示で提供される方法、デバイス、およびシステムは、自動化機器またはロボットとともに使用することができる。スリップチップデバイス等の並行サンプル取り扱いのためのシステムおよびデバイスの製作を自動化することができる。サンプルの前処理およびデバイス上への装填を自動化することができる。元のサンプルを分割することによる、サンプルの並列化を自動化することができる。混合、分割、希釈間で化学コミュニケーションを可能にすること等のオンデバイス動作を作動させる、スリップチップ構成要素の滑動または作動を自動化することができる。サンプルの培養または増幅を自動化することができる。並列化サンプルを生成するスリップチッププレートの分割を自動化することができる。目的とするサンプルを含む画定されたボリュームを識別するように、アッセイまたは他の技法を行うことを自動化することができる。目的とするサンプルを回収すること、または全てのサンプルを回収してプールするようにチップ洗浄を行うことを自動化することができる。ガス雰囲気、温度、および他のパラメータを含む、サンプル環境を制御することを自動化することができる。例えば、コンピュータ化画像分析方法を使用して、異なる基板上のサンプルの合致セットの識別を自動化することができる。
【００７２】
（ＸＩＩＩ．病原体診断法）
本明細書の方法およびデバイスは、病原性微生物を検出、定量化、または分析し、これらの病原体に関連付けられる症状を診断するために使用することができる。細菌性病原体の例は、エロモナス・ハイドロフィラおよび他の種（ｓｐｐ．）、炭疽菌、セレウス菌、ボツリヌス神経毒素を産生するクロストリジウムの種、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、鼻疽菌（以前はシュードモナス・マレイ）、類鼻疽菌（以前はシュードモナス・シュードマレイ）、カンピロバクター・ジェジュニ、オウム病クラミジア、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、カウドリア・ルミナンチウム（心水病）、コクシエラ・バーネッティイ、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：１−１７（ＥＨＥＣ）、および侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）等の腸内毒性大腸菌群（ＥＥＣ群）、エーリキア・シャフェンシス等のエーリキアの種、野兎病菌、レジオネラ・ニューモフィラ、リベロバクター・アフリカヌス、リベロバクター・アジアティクス、リステリア・モノサイトゲネス、クレブシエラ、エンテロバクター、プロテウス、シトロバクター、アエロバクター、プロビデンシア、およびセラチア等の様々な腸内菌、ウシ型結核菌、ヒト型結核菌、マイコプラズマ・カプリコルム、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、ファコプソラ・パチリジ、プレジオモナス・シゲロイデス、ラルストニア・ソラナケアルム第３種、次亜種２、リケッチア・プロワツェキイ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ種、スクレロープソーラ・レイジアエ・バルゼアエ、赤痢菌種、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌、シンチトリウム・エンドビオチクム、非Ｏ１コレラ菌、Ｏ１コレラ菌、腸炎ビブリオおよび他のビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、イネ白葉枯病菌、キシレラ・ファスティディオーサ（レモン斑紋状白化株）、腸炎エルシニアおよび仮性結核菌、ならびにペスト菌を含むが、それらに限定されない。
【００７３】
有機体のさらなる例は、アフリカ馬疫ウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、アカバネウイルス、鳥インフルエンザウイルス（高度に病原性である）、バンジャウイルス、ブルータングウイルス（外来種）、ラクダ痘ウイルス、オナガザルヘルペスウイルス１、チクングニアウイルス、従来型豚コレラウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、クリミア・コンゴ出血熱イルス、デングウイルス、ジュグベウイルス、エボラウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎およびベネズエラウマ脳炎ウイルス等の脳炎ウイルス、ウマ麻疹ウイルス、フレクサルウイルス、口蹄疫ウイルス、ジャーミストンウイルス、ヤギ痘ウイルス、ハンタンまたは他のハンタウイルス、ヘンドラウイルス、イシク・クルウイルス、クタンゴウイルス、ラッサ熱ウイルス、跳躍病ウイルス、ランピースキン病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、悪性カタル熱ウイルス（外来種）、マールブルグウイルス、マヤロウイルス、メナングルウイルス、サル痘ウイルス、ムカンボウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＷＮＤ）、ニパウイルス、ノーウォークウイルス群、オロポーシェウイルス、オルンゴウイルス、小反芻獣疫ウイルス、ピリウイルス、プラムポックスポチウイルス、ポリオウイルス、ジャガイモウイルス、ポワッサンウイルス、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、ロタウイルス、セムリキ森林ウイルス、ヒツジ痘ウイルス、フレクサル、グアナリト、フニン、マチュポ、およびサビア等の南アメリカ出血熱ウイルス、スポンドウェニ・ウイルス、豚水疱病ウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介脳炎、極東ダニ媒介脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌル森林病、およびオムスク出血熱等のダニ媒介脳炎群（フラビ）ウイルス、大痘瘡ウイルス（天然痘ウイルス）、小痘瘡ウイルス（牛痘）、水胞性口炎ウイルス（外来種）、ベッセルスブロンウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、およびフニン、マチュポ、サビア、フレクサル、およびグアナリト等の南アメリカ出血熱等のウイルスを含む。
【００７４】
有機体のさらなる例は、アカントアメーバおよび他の自由生活性アメーバ、アニサキス属ならびに他の関連回虫およびヒト鞭虫、クリプトスポリジウムパルブム、シクロスポラ・カイエタネンシス、裂頭条虫属、赤痢アメーバ、胃線虫属、ランブル鞭毛虫、ナノフィエタス属、住血吸虫属、トキソプラズマ、フィラリア線虫、およびトリキネラ等の寄生原虫および蠕虫を含む。被分析物のさらなる例は、植物の花粉および小麦グルテン等のアレルゲンを含む。
【００７５】
有機体のさらなる例は、アスペルギウス属、ブラストマイセス・デルマチチジス、カンジダ、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、トウモロコシさび病、イモチ病、稲の褐点病、ライ麦の葉枯れ病、スポロトリックス・シェンキイ、および麦真菌等の真菌を含む。
【００７６】
（ＸＩＶ．微生物叢診断法および単離）
本明細書で説明される方法およびデバイスは、微生物叢の組成および機能に基づく、ヒト疾患の個人化診断法のために有用であり得る。ＩＢＤ、感染症、糖尿病、自己免疫状態、および肥満等の何百万人ものアメリカ人に影響を及ぼすいくつかの疾患が、微生物叢と関連性がある。アレルギー、下痢、乳糖不耐症、コレステロールレベルの制御、血圧の制御、免疫機能および感染症、ヘリコバクターピロリ、炎症、ストレスを受けた細菌成長、過敏性腸症候群および結腸炎、ＨＩＶ感染および他のウイルス感染、壊死性腸炎、ビタミン産生、湿疹、細菌性膣炎、薬物代謝および副作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染、自閉症および他の複雑な神経系障害等の他のプロセスもまた、微生物叢と相関性があり得る。宿主の健常または罹患状態は、分類学的または機能的プロファイルを使用して分類することができる（Ｓｈｉ  Ｈｕａｎｇ，Ｒｕｉ  Ｌｉ，Ｘｉａｏｗｅｉ  Ｚｅｎｇ，Ｔａｏ  Ｈｅ，Ｈｅｌｅｎ  Ｚｈａｏ，Ａｌｉｃｅ  Ｃｈａｎｇ，Ｃｕｎｐｅｉ  Ｂｏ，Ｊｉｅ  Ｃｈｅｎ，Ｆａｎｇ  Ｙａｎｇ，Ｒｏｂ  Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊｉｑｕａｎ  Ｌｉｕ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｊｉａｎ  Ｘｕ，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｖｉａ  ｏｒａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，”ＩＳＭＥ  Ｊ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ  ２０，２０１４；  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｓｍｅｊ．２０１４．３２［印刷に先立つ電子出版］、およびＮｉｃｏｌａ  Ｓｅｇａｔａ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｉｚａｒｄ，Ｌｅｖｉ  Ｗａｌｄｒｏｎ，Ｄｉｒｋ  Ｇｅｖｅｒｓ，Ｌａｒｉｓａ  Ｍｉｒｏｐｏｌｓｋｙ，Ｗｅｎｄｙ  Ｓ  Ｇａｒｒｅｔｔ，ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｓ  Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ，“Ｍｅｔａｇｅｎｏｎｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍ  Ｂｉｏｌ．２０１１；  １２（６）；  Ｒ６０；  ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２０１１−１２−６−ｒ６０を参照）。これは、対象から生存有機体を含むサンプルを取得し、微小加工基板の上にこのサンプルを分布させ、細菌、真菌、古細菌、およびウイルス、ならびに原虫を含む、少なくとも１つの微生物の成長を可能にし、マーカー分類群または機能の相対的および／または絶対的存在量を検出するために遺伝的または機能的アッセイを行い、宿主の健康および疾患状態を決定するため、または以降の段階で予測するために、この情報を使用することによって、行うことができる。場合によっては、この方法およびデバイスはまた、宿主の病歴を決定するために使用することもでき、法医学的用途のために有用であり得る（Ｎｏａｈ  Ｆｉｅｒｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｌ．Ｌａｕｂｅｒ，Ｎｉｃｋ  Ｚｈｏｕ，Ｄａｎｉｅｌ  ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｋ．Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，ａｎｄ  Ｒｏｂ  Ｋｎｉｇｈｔ，“Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ��ｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２０１０  Ａｐｒ  ６；１０７（１４）：６４７７−８１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０００１６２１０７参照）。
【００７７】
本明細書で説明される方法による微生物の単離は、ＩＢＤ、感染症、糖尿病、自己免疫状態、および肥満を含むが、それらに限定されない、何百万もの人々に影響を及ぼす症状に関連して、治療および予防モードでヒトの腸の腸内毒素症を変調することによって、生活の質を向上させ、医療費を削減することができる（Ｅｌａｉｎｅ  Ｏ  Ｐｅｔｒｏｆ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｂ  Ｇｌｏｏｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｊ  Ｖａｎｎｅｒ，Ｓｃｏｔｔ  Ｊ  Ｗｅｅｓｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｃ  Ｄａｉｇｎｅａｕｌｔ，Ｅｒｉｃ  Ｍ  Ｂｒｏｗｎ，Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ，ａｎｄ  Ｅｍｍａ  Ａｌｌｅｎ−Ｖｅｒｃｏｅ，“Ｓｔｏｏｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：‘ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｉｎｇ’  ｔｈｅ  ｇｕｔ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．２０１３  Ｊａｎ  ９；１（１）：３．ｄｏｉ：１０．１１８６／２０４９−２６１８−１−３参照）。いくつかの症状は、微生物叢と関連性があり、本明細書で説明される方法を使用して単離される微生物および微生物群を用いて治療的および／または予防的に処置することができる。これらは、アレルギー、下痢、乳糖不耐症、コレステロールレベルの制御、血圧の制御、免疫機能および感染症、ヘリコバクターピロリ、炎症、ストレスを受けた細菌成長、過敏性腸症候群および結腸炎、ＨＩＶ感染および他のウイルス感染、壊死性腸炎、ビタミン産生、湿疹、細菌性膣炎、薬物代謝および副作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染、自閉症および他の複雑な神経系障害を含むが、それらに限定されない。この方法は、感染症、疾患、治療、中毒、または大腸機能障害成分あるいは副作用を有する状態の改善、安定化、治療および／または予防、あるいは症状の減少または遅延に、便秘の改善、治療、および／または予防に、腹痛、非特異的な腹痛または下痢、薬物副作用または心理学的状態あるいはクローン病、毒、毒素または感染症、毒素を媒介した旅行者の下痢、またはクロストリジウムあるいはウェルシュ菌もしくはクロストリジウム・ディフィシル感染、またはクロストリジウム感染に関連付けられる偽膜性大腸炎によって引き起こされる下痢の治療に、または脊椎関節症、脊椎関節炎、あるいは仙腸骨炎（一方または両方の仙腸関節の炎症）、腎炎症候群、腸または腸管構成要素を有する炎症性または自己免疫状態、狼瘡、過敏性腸症候群（ＩＢＳまたはけいれん性結腸）、または結腸炎、潰瘍性結腸炎またはクローン結腸炎、便秘、自閉症、退行性神経学的疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）またはパーキンソン病（ＰＤ）、ミオクローヌスジストニア、シュタイネルト病、近位筋強直性ミオパシー、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（ＲＡ）または若年性特発性関節炎（ＨＡ）、慢性疲労症候群、良性筋痛性脳脊髄炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性感染性単核球症、流行性筋痛性脳脊髄炎、肥満、低血糖症、前糖尿病症候群、１型糖尿病または２型糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、急性または慢性アレルギー反応、じんましん、発疹、蕁麻疹または��性蕁麻疹、および／または不眠症あるいは慢性不眠症、けいれん大発作または小発作の症状を予防する、または減少あるいは遅延させる、またはこれらの症状がある個人を改善または治療するために使用することができる。本明細書で説明される方法を使用して、ヒトおよび動物の両方の状態を治療的または予防的に処置することができる。
【００７８】
腸内微生物叢の主要な変化は、大腸癌（Ａ．Ｃ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００８−２０１０；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ａｔｌａｎｔａ，２００８．）において、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において等、人々の生活の持続時間および質を有意に減少させ、単独で、米国内で最大１４０万の人々に影響を及ぼす（Ｅ．Ｖ．Ｌｏｆｔｕｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｇｙ．２００４  １２６  １５０４−１５１７）。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、潰瘍性結腸炎およびクローン病の両方を含む。さらに、糖尿病、肥満、および自己免疫疾患もまた、腸内微生物の変化に結び付けられている（Ｌ．Ｗｅｎ，Ｒ．Ｅ．Ｌｅｙ，Ｐ．Ｙ．Ｖｏｌｃｈｋｏｖ，Ｐ．Ｂ．Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｌ．Ａｖａｎｅｓｙａｎ，Ａ．Ｃ．Ｓｔｏｎｅｂｒａｋｅｒ，Ｃ．Ｈｕ，Ｆ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｌ．Ｓｚｏｔ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｖ．Ｃｈｅｒｖｏｎｓｋｙ．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００８  ４５５  １１０９−１１１３）。微生物叢の望ましくない変化は、有益な群、例えば、宿主の上皮の遺伝子発現を調節し、その主要栄養素としての機能を果たす信号である、酪酸塩を産生するものの損失、および宿主に大きく影響を及ぼす潜在的信号である、硫化水素（Ｈ２Ｓ）を産生する硫黄還元細菌等の病原性微生物の繁栄を含む。現在のプロバイオティクス混合物の使用は、臨床試験において驚異的に限定された成功を収めている（Ｖｏｇｅｌ，Ｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｄｅａｔｈｓ  ｐｒｏｍｐｔ  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９，５５７  （２００８）．Ｏ'Ｍａｈｏｎｙ，Ｌ．，Ｆｅｅｎｅｙ，Ｍ．，Ｏ'Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｓ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．，Ｋｉｅｌｙ，Ｂ．，Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｇ．，Ｏ'Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｇ．，Ｓｈａｎａｈａｎ，Ｆ．＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｋ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｌｏｒａ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＩＬ−１０  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，１２１９−１２２５  （２００１）。
【００７９】
微生物は、皮膚または腸等の身体部位から、あるいは便、唾液、または性器綿棒サンプル等の身体的サンプルから単離することができる。微生物は、患者から、あるいは遺伝子プロファイル、年齢、性別、病歴、食事、または環境等の１つ以上の特性において患者に合致したドナーから単離することができる。微生物単離は、先制して（疾患が発現する前に）行うことができ、微生物は、随意に、将来の使用のために保存される。微生物は、疾患進行の任意の段階で単離することができる。これらの目的で単離することができる微生物は、細菌、真菌、古細菌、およびウイルス、原虫を含む。微生物はまた、土壌環境、構築環境、海洋環境を含む、環境から単離することもできる。
【００８０】
微生物の単離は、遺伝的アッセイによって誘導することができる。例えば、単離を標的にするために、特定の種または属の微生物に関連付けられるマーカー遺伝子（１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子等）を使用することができる（Ｓｃｈｌｏｓｓ  Ｐ，Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  Ｊ  （２００５）  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｕｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｏｒｄｉａｎ  ｋｎｏｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（８）：２２９．Ｆｏｄｏｒ  ＡＡ，ＤｅＳａｎｔｉｓ  ＴＺ，Ｗｙｌｉｅ  ＫＭ，Ｂａｄｇｅｒ  ＪＨ，Ｙｅ  Ｙ，Ｈｅｐｂｕｒｎ  Ｔ，Ｈｕ  Ｐ，Ｓｏｄｅｒｇｒｅｎ  Ｅ，Ｌｉｏｌｉｏｓ  Ｋ，Ｈｕｏｔ−Ｃｒｅａｓｙ  Ｈ，Ｂｉｒｒｅｎ  ＢＷ，Ｅａｒｌ  ＡＭ  （２０１２）  Ｔｈｅ  “ｍｏｓｔ  ｗａｎｔｅｄ”ｔａｘａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（７）：ｅ４１２９４．Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｊ，Ｏ'Ｌｅａｒｙ  ＮＤ，Ｋｉｒａｎ  ＧＳ，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ＪＰ，Ｏ'Ｇａｒａ  Ｆ，Ｓｅｌｖｉｎ  Ｊ，Ｄｏｂｓｏｎ  ＡＤＷ  （２０１１）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１１（４）：７８７−７９９．Ｒｏｏｋｓ  ＤＪ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＪＥ，ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＡＪ  （２０１２）  Ｃｈａｐｔｅｒ  ｔｗｅｎｔｙ−ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ  Ｈａｒｒｙ  ＪＧ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），Ｖｏｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５１０，ｐｐ  ３７５−３９４．Ｒｅｄｄｙ  ＢＶＢ，Ｋａｌｌｉｆｉｄａｓ  Ｄ，Ｋｉｍ  ＪＨ，Ｃｈａｒｌｏｐ−Ｐｏｗｅｒｓ  Ｚ，Ｆｅｎｇ  Ｚ，Ｂｒａｄｙ  ＳＦ  （２０１２）  Ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｏｉｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７８（１０）：３７４４−３７５２．Ｒｉｄａｕｒａ  ＶＫ，Ｆａｉｔｈ  ＪＪ，Ｒｅｙ  ＦＥ，Ｃｈｅｎｇ  Ｊ，Ｄｕｎｃａｎ  ＡＥ，Ｋａｕ  ＡＬ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＮＷ，Ｌｏｍｂａｒｄ  Ｖ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ，Ｂａｉｎ  ＪＲ，Ｍｕｅｈｌｂａｕｅｒ  ＭＪ，Ｉｌｋａｙｅｖａ  Ｏ，Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ  ＣＦ，Ｆｕｎａｉ  Ｋ，Ｈａｙａｓｈｉ  ＤＫ，Ｌｙｌｅ  ＢＪ，Ｍａｒｔｉｎｉ  ＭＣ，Ｕｒｓｅｌｌ  ＬＫ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  ＪＣ，Ｖａｎ  Ｔｒｅｕｒｅｎ  Ｗ，Ｗａｌｔｅｒｓ  ＷＡ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ，Ｎｅｗｇａｒｄ  ＣＢ，Ｈｅａｔｈ  ＡＣ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ  （２０１３）  Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｆｒｏｍ  ｔｗｉｎｓ  ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｆｏｒ  ｏｂ���ｓｉｔｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１（６１５０）．Ｆｒａｎｋ  ＤＮ，Ｓｔ．Ａｍａｎｄ  ＡＬ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＲＡ，Ｂｏｅｄｅｋｅｒ  ＥＣ，Ｈａｒｐａｚ  Ｎ，Ｐａｃｅ  ＮＲ  （２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４（３４）：１３７８０−１３７８５．）。例えば、有機体の単離および培養を標的にするために、機能的遺伝子（例えば、炭水化物分解、粘膜接着、短鎖脂肪酸産生、多糖類Ａ、ＰＳＡ等のリポ多糖類の産生、ビタミン産生、抗炎症化合物の産生、非リボソームペプチドの産生、ポリケチド天然生成物の産生に関連付けられる遺伝子）を使用することができる。さらに、酵素活性のアッセイを含む、機能的アッセイを使用することができる。
【００８１】
例えば、高スループットシークエンシング技術を使用するメタゲノム分析によって、標的遺伝子を決定することができる。線虫および類似有機体等の他の有機体を標的にすることができる。臨床設定での個人化細菌単離のための単純な技術は、疾患を診断し、増進した予防および治療的性質を伴うプロバイオティクス治療の開発につながる能力を向上させるための機会を生成し得る。この方法は、患者内の病原性または望ましくない有機体を健常または望ましい微生物叢と置換するために細菌製剤療法を使用する。
【００８２】
疾患（例えば、クロストリジウム・ディフィシル感染等）を治療するために、便微生物叢移植を使用することができる。便微生物叢移植は、腸内微生物叢内の望ましくない有機体を置換するように、健常ドナーから患者に糞便物質を送達する。しかしながら、この方法は、病原体が移植される糞便物質中に存在する場合があり、免疫不全患者にとって危険であり得るため、危険を伴い得る。各個人は、健常または望ましい腸内微生物叢を含み得る、個人化腸内微生物叢を有する。生体有機体を含むサンプルを個人から取得することができる。この方法を使用して、個人用プロバイオティクスを開発することができる。一実施例では、有機体は、病状に先立って個別対象または患者から取得され、単離されて貯蔵され、同一の対象に再び送達され、疾患を治療するか、または個人の健康状態を向上させるために使用され得る。有機体はまた、親戚から取得して患者に投与することもできる。親戚から取得される有機体は、遺伝的特徴、食事、および生活習慣における合致により、患者のために有益であり得る。有機体はまた、ある程度、例えば、人種、遺伝、食事、体格指数、および他のパラメータが患者に合致したドナーから取得することもできる。患者、親戚、または他のドナーから取得される有機体の任意の組み合わせは、疾患を治療するか、または患者の健康状態を向上させるために、この方法とともに使用することができる。
【００８３】
培養非依存性技法は、個人の微生物の遺伝子シグネチャを明らかにすることによって、微生物の生態への洞察を提供することができる。これは、ある微生物が、肥満、炎症、および胃腸の完全性等の宿主表現型に影響を及ぼし得ることを示唆することができる。高スループットシークエンシングからのデータセットは、高い生物医学的重要性を伴う微生物標的を示唆する。これらの標的は、ユーバクテリウム・リモサム、ロゼブリア・インテスティナーリス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ロゼブリア属、ユーバクテリウム・レクタレ、バクテロイデス・オバツス、パラバクロイデス・ジスタソニス、ユーバクテリウム・エリジェンス、ユーバクテリウム・ベントリオスム、ロゼブリア属、ブラウティア属、ドレア属、ルミノコッカス・トルクエス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ユーバクテリウム・ハドルム、アナエロスティペス・コリ、クロストリジウム属アルデネンス、クロストリジウム属ハセワイ、シンビオサム、オルビシンデンス、サーモセルム、シトロニアエ、ルミノコッカス・オベウム、ルミノコッカス・プロダクタス、ルミノコッカス・トルクエス、ルミノコッカス・ブロミイ、ロゼブリア・イヌリノボランス、ブラウティア・コッコイデス、ドレア属、スッテレラ属、ジアリスター・インビサス、ブラウティア・プロダクタ、およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムを含むことができるが、それらに限定されない。これらの標的はまた、真菌、古細菌、ウイルス、または原虫でもあり得る。本明細書で説明される方法は、臨床サンプルからのこれらの微生物の遺伝的標的化単離および培養に使用することができる。患者、親戚、および／または他のドナーに由来し得るサンプルは、ボリュームを含む微小加工基板の上に分布させることができる。以下の２つの方法、すなわち、（ｉ）少量のみで利用可能な成長基板を使用する微生物に対する培養条件の識別、ならびに「チップ洗浄」技法を使用するサンプリングバイアスの補正、および（ｉｉ）オンチップ遺伝的アッセイを行う一方で、個々にアドレス指定可能な複製微生物培養のアレイを作成するように分割技術によって可能にされる、所望の微生物の後続の拡大培養のために生細菌細胞を保存することの一方または両方を使用することによって、少なくとも１つの標的微生物の成長を達成することができる。この方法を使用して、標的微生物のうちの１つ以上の微生物を単離することができる。該目的とする微生物のうちの少なくとも１つは、疾患を予防、治癒、または治療する意図で／健康を向上させる意図でヒトに送達することができる。例えば、それを達成する１つの方法は、結腸内視鏡検査を通したものである。例えば、抗生物質療法を（例えば、２日間）保留することができ、患者は、結腸内視鏡検査の前夜に標準結腸洗浄を受けることができる。翌朝、結腸内視鏡検査中に、該目的とする微生物のうちの少なくとも１つを含む溶液の一方の半分（例えば、５０ｍＬ）を、盲腸／近位上行結腸の領域中に堆積させることができ、結腸鏡が引き抜かれるにつれて、横行結腸の全体を通して他方の半分を振り掛けることができる。繊維が豊富な食事を食べ、プロバイオティクスを含む生成物を消費しないように、患者に指示することができる。便サンプルを取得し、臨床応答を慎重に監視するように、検査看護師によって患者を追跡調査することができる。
【００８４】
（ＸＶ．用途）
本開示で説明される方法および組成物は、目的とする有機体の識別に使用することができる。サンプルを画定されたボリュームの間で分散させ、培養することができる。サンプルを並列化することができ、目的とする有機体を含むサンプルを識別するために、並列化サンプルの１つのセットを分析することができる。分析は、本願で説明されるように、種々の方法によるものであり得る。目的とするサンプルを識別すると、並列化サンプルの第２のセットからの対応するサンプルを選択することができる。
【００８５】
本開示で説明される方法および組成物は、有機体に対する成長条件の識別に使用することができる。サンプルを複数のデバイス上の画定されたボリュームの間で分散させることができる。各デバイスは、成長培地、温度、ガス雰囲気、および／または圧力等の異なる条件を受けることができる。種々の条件下の培養後、サンプルを並列化することができ、所与の一式の条件下で成長を呈する、これらのサンプルは、並列化サンプルの１つのセットの分析を通して識別することができる。
【００８６】
本開示で説明される方法および組成物は、遺伝分析に使用することができる。例えば、核酸を含むサンプルを、デジタルＰＣＲのためのデバイス上の画定されたボリュームの間で分散させることができる。デジタルＰＣＲを行うことができ、サンプルを並列化することができる。陽性信号を伴うこれらのサンプルは、シークエンシングに使用される並列化サンプルの１つのセットを有することができる。
【００８７】
本開示で説明される方法および組成物は、乳腺炎（ウシまたはヒト）の検査または迅速診断に使用することができる。サンプルを乳房組織、乳、または他の起源から採取し、画定されたボリュームの間で分散させて培養することができる。サンプルを並列化することができ、乳腺炎に関連付けられている有機体を識別するために、並列化サンプルの１つのセットを分析することができる。抗生物質感受性を試験するために、抗生物質の存在下で培養を行うことができる。
【００８８】
本開示で説明される方法および組成物は、硫酸塩還元有機体およびパイプライン腐食につながる他の有機体の検査、急速成長、検出、および／または識別に使用することができる。サンプルをパイプライン、有機体の腸、または別の起源から採取し、画定されたボリュームの間で分散させて培養することができる。サンプルを並列化することができ、硫酸還元またはパイプライン腐食に関連付けられている有機体を識別するために、並列化サンプルの１つのセットを分析することができる。
【００８９】
サンプル（例えば、環境または臨床サンプル）からの微生物の混合群（例えば、または本明細書で説明されるような細菌、古細菌、真菌、ウイルス、原虫、またはその他）中の単一細胞またはいくつかの細胞を、デバイスに導入し、あるボリュームに封入することができる。遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を（例えば、多置換増幅またはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、あるいは等温増幅を使用して）ボリュームの内側で増幅することができる。２つの基板は、増幅物質を回収するために分離することができる。この方法は、単一細胞ゲノミクスおよびトランスクリプトミクスに使用することができる。
【００９０】
（実施例）
（実施例１−バクテロイデス・シータイオタオミクロンのためのガス制御）
細胞培養のためのウェルを伴うスリップチップデバイスが、ガラス基板を用いて製作された。バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａ）および調理肉細胞培地が、嫌気性チャンバの内側でデバイス上に装填された。デバイスは、撮像のために密閉されて除去され、次いで、インキュベーションのためにチャンバに戻された。デバイスは、３７℃で８時間培養された。バクテロイデス・シータイオタオミクロン細胞は、高密度微小コロニーまで成長した（図７）。
【００９１】
（実施例２−大腸菌のためのナノポストを介したガス制御）
細胞培養のためのチャンバを伴うスリップチップデバイスが製作された（図８Ａ−Ｂ）。サブミクロンスケールナノポスト（図８Ｃ）が、希釈された緩衝フッ化水素酸（ＨＦ）中の浸漬によって、いくつかのデバイス上で製作された。蛍光標識された大腸菌株が、それぞれ、ナノポストがない、４００ｎｍナノポストを伴う、および９００ｎｍナノポストを伴うデバイス上に装填され（図８Ｄ−Ｆ）、積分蛍光強度が成長を定量化するために使用された。この特定のモデルシステムでは、大腸菌の成長は、酸素の供給によって制限された。２枚のガラスプレート間の間隙を調節し、したがって、油相を通してガス交換を制御することによって、大腸菌のより一様な成長が達成された。
【００９２】
（実施例３−密閉容器を介したガス制御）
ウェルにつき６ｎＬを伴う１６００個のウェルを含む、スリップチップデバイスが、１００ｍＬコーニングガラス瓶の中に収まるように設計および製作された（図９Ａ−Ｂ）。デバイスが、細胞および培地を装填され、瓶の中に配置され、様々な量の酸素（０％、１％、および３％Ｏ２）を伴うガス混合物が瓶に注入された。２つのモデル微生物が、この設定で培養された。無酸素瓶の中の酸素の存在を試験するために、厳密な嫌気性生物種であるバクテロイデス・シータイオタオミクロンが培養された。０％酸素瓶（図９Ｃ、上の行の第１の列）の中のバクテロイデス・シータイオタオミクロンの成長は、容器が十分に密閉されていることを確認した。バクテロイデス・シータイオタオミクロンは、酸素が注入されたときに成長できなかった。陽性対照として、エンテロコッカス・フェカリスが、これらの３つの条件下で成長させられた（図９Ｃ、下の列）。エンテロコッカス・フェカリスは、３つ全ての条件下で成長した。
【００９３】
（実施例４−アナエロスティペス・カカエおよびバクテロイデス・シータイオタオミクロンを用いたオンチップ共培養）
共培養のためのスリップチップデバイスが、図１０に示されるように設計された。このデバイスは、拡散によってマイクロウェル間の化学コミュニケーションを可能にするが、微生物細胞の混合を防止するために十分狭い、ナノメートル深度の親水性ブリッジを提供する。唯一の炭素源としてインスリンを用いて最小培地で培養される嫌気性生物アナエロスティペス・カカエ（Ａ．ｃａｃｃａｅ）は、バクテロイデス・シータイオタオミクロンとともに共培養されるときに成長するが、単独で培養されるときには成長しない。アナエロスティペス・カカエおよびバクテロイデス・シータイオタオミクロンは、スリップチップデバイスの拡散的に接続されたウェルの中へ装填され、最小培地を用いて培養された。比較のために、アナエロスティペス・カカエは、一対の拡散的に接続されたウェルの両方の中へ装填され、最小培地を用いて培養された。バクテロイデス・シータイオタオミクロンを含むウェルに拡散的に接続された、アナエロスティペス・カカエを含むウェルは、アナエロスティペス・カカエを含むウェルに拡散的に接続された、アナエロスティペス・カカエを含むウェル（図１１下）よりも有意に多くの成長を呈した（図１１上）。
【００９４】
（実施例５−アガロースがないスリップチップを分割する動作）
１，０００個のコンパートメントを含むスリップチップデバイスが設計および製作された。各コンパートメントは、第１のプレート上の１つのウェルおよび第２の（対向）プレート上の重複ウェルから成る。培養中に、２つのウェルは、単一のコンパートメントの内側でコロニーの成長を可能にするように組み合わされた。次いで、２枚のプレートが分離され、各コロニーが２つに分割されて、細胞溶解を必要とする破壊アッセイに一方のコピーを使用することができ、生存微生物を保存するために他方のコピーを使用することができるように、スリップチップの両側に各コロニーアレイの同一コピーを作成した。
【００９５】
この技術的プロセスの視覚化を促進するために、培養スリップチップの動作が、赤色染料実験を用いて図示された（図１２）。明確にするために、以下の叙述は、スリップチップの動作中に細胞およびコロニーに何が起こるかを説明するとともに、赤色染料実験の対応する画像も指摘する。本デバイスは、スリップチップの片側のウェルが他方のプレート上のチャネルと重複し、各プレートがウェルおよびチャネルの両方を含むように設計された（図１２Ａ）。最初に、目的とする細胞を含む懸濁液が、チャネルおよびウェルの中へ装填された。この装填は、図１２Ｂで赤色染料の装填として示されている。次いで、装填チャネルおよびウェルが滑らせることによって分離され、単一細菌細胞が確率的にウェルに閉じ込められた。チップの両側の重複ウェルが、１つのコンパートメントとして組み合わされた。このステップは、赤色染料溶液の流体ボリュームの形成として示されている（図１２Ｃ）。装填チャネル中のサンプルは、空気がチャネルを充填して細菌成長を支援することができるように、真空でパージすることによって除去された（図１２Ｄ）。空気をチャネルに導入することができ、（例えば、赤色染料の）水溶液がウェルの中にとどまり、真空によって除去されなかったことが観察された。次いで、本デバイスは、細菌コロニーを成長させるように培養された。インキュベーション中に油および水の損失を最小化するために、本デバイスは、油および水の蒸気で飽和したペトリ皿の中に配置された。後続の分割に先立って、油が空気に取って代わるようにデバイスチャネルの中へ装填された（図１２Ｅ）。次いで、２枚のプレートは、各コンパートメントを構成した２つのウェルを分離するために離れるように滑らされた（図１２Ｆ）。チップは、この位置で、上下のプレートが整列し、制御された分割のためにデバイスがホルダ上に配置されることができるように設計された。
【００９６】
真空を用いて流体を除去することによって、空気が装填チャネルに導入された。スリップチップが結合されないため、２つの半分の間の間隙は、油貯留部としての機能を果たすことができ、真空が放出されたときに油がチャネルに逆流し得ることが観察された。空気供給を維持し、油がチャネルの中へ逆流することを防止するために、繰り返しのパージが行われ、サンプルを装填する前に３〜５回パージすること（図１２Ａ）が、培養中に油が帰還することを防止するために十分であった。
【００９７】
分離のプロセス中に、流体ボリュームは、構造から部分的に放出され得る。同時に、流体ボリュームの蒸発を防止するために使用される非混和性油は、チップの間隙に流入し、流体ボリュームの合併および二次汚染を引き起こし得る。加えて、スリップチップの上下のプレートがずらされて不整列にさせられ得る。これらの問題に対処するために、分離中に上下のプレートが水平にずれることを防ぐために、ホルダが設計された（図１および図２Ａ）。ホルダは、標準機械加工によって製作された。スリップチップを整列させるための３本のピンがホルダに挿入された。ホルダと上プレートとの間の２つのガラススペーサが、厚さ１ｍｍの顕微鏡スライドを小さい断片に切断することによって作製され、５分エポキシを用いて縁の上でホルダに接着された。下プレートの縁もまた、ガラススペーサを伴うホルダの底部分の中に収まるように除去された。ホルダの中心部分が、撮像を促進するように切り取られた。スリップチップ上の貫通穴が、スリップチップをホルダに整列させるように製作された。貫通穴のための位置を画定するマーカーが、フォトマスクの設計に組み込まれ、次いで、フォトリソグラフィおよびウェットエッチングによってデバイスに転写された。貫通穴を作製するために、本デバイスは、最初に、エッチングされたマーカーを使用してレーザステージに整列させられ、次いで、７５ｍｍレンズを使用した８０Ｈｚの繰り返し率を伴う１００ｍＪの一定エネルギーモードを用いて、レーザ機械加工（Ｒｅｓｏｎｅｔｉｃｓ  ＲａｐｉｄＸ２５０システム）によって切除された。スリップチップは、蒸発を防止するようにテトラデカン油槽の下で分離され、分離は、重力によって達成された。
【００９８】
分割中に、油は、２枚のガラスプレート間の間隙を通ってスリップチップに進入した。スリップチップ上の微小構造は、この油流により、各流体ボリュームの位置をもはや保持することができなかった。ホルダは、２枚のガラスプレートを十分に整列させて保つことができたが、マイクロウェル中の水性流体ボリュームは、分割前の位置と同一の位置にとどまらない場合がある（図１３）。流体ボリュームは、油流によってマイクロウェルから押し出され得るか、またはデバイスの反対側にとどまり得るかのいずれかである。
【００９９】
（実施例６−アガロースを伴うスリップチップを分割する動作）
マイクロウェル中で流体ボリュームを保持し、油流からの剪断の効果を最小化するために、超低ゲル化温度アガロースが、実施例５で説明されるようなスリップチップシステム中の流体ボリュームの粘度を増加させるように追加された。アガロースの追加は、図１４Ｂに示されるように、重複コピーの細菌成長または生成を阻害しなかった。この設定が分割中にマイクロウェル中の流体ボリュームを保つことができるかどうかを試験するために、１％アガロース水溶液が、温かい間（約３７℃）にスリップチップ上に装填された。次いで、本デバイスは、テトラデカンの融点（８℃）以上にとどまりながら、アガロースをゲル化するように１０℃の低温プレート上で培養された。次いで、分割は、スリップチップがホルダ上に配置された後の３分以内に起こった。流体ボリュームの形状は、分割中に変化し、流体ボリュームが微小構造から部分的に放出されたことを示した（図２ＢおよびＣ）。２枚のプレートを再び一緒に締め付けることによって、流体ボリューム形状を復元することができたため、この形状変化は、流体ボリュームの蒸発によるものではなかった。デバイス全体の上の２，０００個のウェルが、立体鏡を用いて分析され（図２Ｄはデバイスの一部を示す）、分割中のウェル間の欠落した流体ボリュームまたは二次汚染は観察されなかった。次いで、上記は、０．３〜２％まで様々であるアガロースの濃度で行われた。１％アガロースが、いくつかの予備実験に使用された一方で、０．５％は、確実な結果をもたらした最小濃度であることが分かった。
【０１００】
（実施例７−臨床生検サンプルの培養）
スリップチップデバイスが、０．５％の超低ゲル化温度アガロースが補充されたＡＭ２培地を使用して、嫌気性チャンバ中で調製され、健常ヒトボランティアの結腸からの粘膜生検から取得された微生物懸濁液からの微生物を使用して、嫌気性生物の多様な細菌群を装填された。次いで、本デバイスは、嫌気性チャンバ中で３７℃で８日間培養された。その後、デバイスは、成長する微生物コロニーを視覚化するように顕微鏡で撮像された。健常ヒトボランティアの結腸からの粘膜生検から取得された微生物懸濁液からの細菌は、スリップチップ上で成長することが観察された。また、臨床サンプル中の高速および低速成長細菌が、スリップチップ上でうまく分離された（図１４Ａ）。加えて、成長後に、元の単一細胞が１０個より多くの細胞から成るコロニーを生じる場合、滑らせることは、２つの娘コロニーを生成することに成功した（図１４Ｂ）。
【０１０１】
（実施例８−オンチップ希釈）
スリップチップが、並行して５つの連続希釈ステップを行うように設計および製作された（図１５）。これは、２つの構成要素、すなわち、サンプルを含む一列の浅いウェル、および希釈のための緩衝溶液で充填されている深いウェルのアレイから成る。連続希釈を行うためにスリップチップを使用することは、３つの一般的なステップ、すなわち、（ａ）緩衝液を装填すること、（ｂ）サンプルを装填すること、および（ｃ）希釈するための多段階滑りを伴う。ピペット移送によってスリップチップを充填した後、チップの２枚のプレートは、ウェルから導管を分離するように滑らされる。導管がウェルから分離されると、それらはまた、滑り経路の外へ移動させられる（図１５Ｄおよび１７ｅの差し込み図）。サンプルを含むウェルは、緩衝液を含むウェルと接触させられ、サンプは、希釈される。混合比または希釈係数は、ウェルサイズの比によって決定される。滑りのさらなるステップは、同一の原理によって動作し、したがって、連続希釈が行われる。
【０１０２】
スリップチップは、微小加工ガラスの２つの層から成る。上層は、全ての入口および出口、サンプルのための導管、および緩衝溶液のためのウェルを含む。このデバイスは、一連の２倍希釈を行うように設計された。全てのウェルおよび導管は、深さ６０μｍにエッチングされる。上下のウェルが同一の寸法であるため、滑りおよび混合の各ステップ後に、２倍希釈が得られた。連続希釈デバイスの動作を視覚化するために、赤色染色（０．１Ｍ  Ｆｅ（ＳＣＮ）３）の水溶液がスリップチップ上に装填された。ミリポア水が希釈剤として使用された。３つの滑りステップ後に、図１６の色変化から見ることができるように、２３倍希釈が達成された。Ｆｅ（ＳＣＮ）３溶液の色が１０倍希釈後に褪せたため、２３倍希釈のみが示されている。
【０１０３】
（実施例９−オンチップ対数希釈）
実施例８におけるもの等のスリップチップデバイスが、広いダイナミックレンジにわたって対数連続希釈を行うように設計された。全てのウェルは、深さ７６μｍであり、導管は、深さ３０μｍである。上層は、全ての入口および出口、サンプルのための導管、および緩衝溶液のためのウェルを含む。底層は、サンプルのための１０μｍの浅いウェル、および緩衝溶液のための３０μｍの深い導管を含む。デバイスの表面は、１０μｍの深いウェルを親水性に保ちながら、疎水性であるようにシラン化された。１０μｍの浅いウェルは、ウェルの中および外への拡散時間を減少させるために、ならびに希釈剤ウェルのための容積を最小化するために使用された。親水性ウェルを作製するために、ガラスプレートは、ピラニア洗浄され（体積で１部３０％過酸化水素、３部硫酸）、ミリポア水で２回洗浄され、次いで、２２０℃のホットプレート上で２時間以上脱水させられた。プレートは、室温まで冷却され、ＳＵ８  ３０１０の厚さ２０μｍの層でスピンコーティングされた（図１７Ａ）。次に、プレートは、整列させられ、ウェル中のＳＵ８のみが現像後に残るように、疎水性となるプレート上の領域を保護したフォトマスクで覆われた。ウェル中のＳＵ８は、ウェルを保護するために使用され、それらが疎水性にされることを防止した。最終的に、ガラスは、１２０℃で１５分間焼くことによって乾燥させられた。ガラスプレートは、洗浄され、３００ｍＴｏｒｒで５分間空気プラズマ処理を受け、次いで、表面は、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシランを用いて５分間、真空乾燥機中でシラン化によって疎水性にされた。シラン化後、ガラスプレートは、２０ｍｌ無水トルエンで３回、３０ｍｌ無水エタノールで３回、３０ｍｌエタノール／Ｈ２Ｏ（５０％：５０％、ｖ：ｖ）で３回、３０ｍｌミリポア水で３回すすがれた。プレートは、１２０℃のオーブンの中で１５分間焼成された。最終的に、ウェル中のＳＵ８は、１分未満の間、ピラニア溶液にガラスプレートを浸漬することによって取り去られた。次いで、プレートは、ミリポア水で２回洗浄され、１２０℃で１５分間乾燥させられた。ウェルは、親水性ウェル内の水性流体ボリュームの形状および体積を制御するように、また、浅いウェルからのディウェッティングを防止するように、親水性にされる（図１７Ｂ）。
【０１０４】
蛍光染料の溶液が、このスリップチップ上で広いダイナミックレンジにわたって対数連続希釈の成功を定量化するために使用された。ＰＢＳ緩衝液（１倍、ｐＨ７．４）中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヒドラジド（２ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ピペット移送によってサンプルチャネルの中へ装填された。１倍ＰＢＳ緩衝溶液が、緩衝液チャネルの中へ装填された。スリップチップは、最初に分離された流体ボリュームを形成するように、Ｌｅｉｃａ  ＭＺ  １６立体鏡下で滑らされた。次いで、サンプルウェルは、緩衝液ウェルと連続的して組み合わされた。各滑りステップ後、蛍光染料の拡散を可能にするために、１０分の待機ステップがあった。滑りの５つのステップ後、本デバイスは、２０倍０．７ＮＡ  Ｌｅｉｃａ対物レンズおよびＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡＥＲカメラを伴うＬｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）に迅速に移送された。高いダイナミックレンジにわたって蛍光画像を取得するために、異なる設定が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８溶液中の低濃度および高濃度に使用された。３０ミリ秒の露出時間および１００％ランプ強度を伴うＬ５フィルタが、２０ｎＭ〜２０００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光を収集するために使用された。２ミリ秒の露出時間および３０％ランプ強度を伴うＬ５フィルタが、２０μＭ〜２００μＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光を収集するために使用された。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ撮像システムバージョン６．３ｒ１（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用することによって、画像が取得および分析された。オンチップ希釈からの濃度は、蛍光強度から計算された。顕微鏡を較正するために、Ｌ５フィルタ用の蛍光参照スライドの蛍光強度が記録され、バックグラウンド補正に使用された。ＰＢＳ緩衝液中の２０ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、および２０００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヒドラジド溶液が、較正曲線を取得して濃度範囲の下限での蛍光染料の濃度を決定するために使用された。ＰＢＳ緩衝液中の１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヒドラジド溶液が、別の較正曲線を取得して濃度範囲の上限での蛍光染料の濃度を決定するために使用された。ウェル深度がＶｅｅｃｏ  Ｄｅｋｔａｋ  １５０側面計を用いて測定され、エッチングが等方性であると仮定して、ウェルの体積が計算された。５つの滑りステップ後、実験結果と理論的計算との間の良好な一致を伴って、１０５倍希釈が達成された（図１８）。
【０１０５】
（実施例１０−流体ボリュームの回収）
以前の実施例で説明されるもの等のスリップチップデバイスが分割された後、デバイスの１つのコピーが整列ホルダ上に搭載された（例えば、図１、図２Ａ）。１μＬの水性緩衝溶液が、エッペンドルフ型ピペッタを用いて吸引された。スリップチップ上のウェル間の間隔は、ウェル間の二次汚染を防止するために、ピペット先端の外半径より大きいように設計された。この緩衝溶液ボリュームは、全界面面積を最小化するように、接触させられたときにスリップチップ上の２ｎＬ流体ボリュームと自発的に合併した（図３）。次いで、組み合わされた流体ボリュームは、再びピペット先端の中へ吸引され、プレートを拡散するか、またはＰＣＲおよび後続のシークエンシングを用いて試験するために使用された。この方法は、より高い密度を伴うウェル等、またはピペット移送を正確に制御できないとき等の状況に適応するように修正することができる。この場合、隣接ウェル中の流体ボリュームは、最初に、この方法によって除去することができ、標的流体ボリュームの後続の取り扱いのためにより多くの空間をもたらす。
【０１０６】
（実施例１１−標的コロニーのＰＣＲ識別）
大腸菌細胞が、固定相に達するように、２００ｒｐｍにて回転振とう培養器中で、３４℃で一晩（１２時間）、ＬＢ中の５０μｇｍＬ−１のアンピシリンを用いて濃縮された。細胞を同期させるために、次いで、各種の一晩培養物が、１００倍に希釈され、ＬＢ培地中の１０μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび４０μｍｏｌＬ−１ＩＰＴＧを用いて３時間培養された。次いで、細胞が、３０００×ｇで５分間ペレット化され、１ｍＬの氷のように冷たい１×ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄された。細胞は、最終的に、ＬＢ培地中の１０μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび４０μｍｏｌＬ−１ＩＰＴＧに懸濁させられ、細胞懸濁液は、ＬＢ培地中の０．５％の超低ゲル化温度アガロースを伴う１０μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび４０μｍｏｌＬ−１ＩＰＴＧで連続的に希釈され、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ遺伝子を伴う大腸菌株について、それぞれ、２×１０４および２×１０３ＣＦＵｍＬ−１の最小密度まで混合され、スリップチップデバイス上に装填された。個々の細胞は、コンパートメント化され、スリップチップは、培養のために３４℃で３時間培養され、次いで、娘チップに分割された（図５Ａ）。
【０１０７】
一方のチップは、ＤｓＲｅｄのプラスミドを標的にするプライマーを含むＰＣＲ試薬（図１９）と混合され（図５Ｂ）、他方のチップは、蛍光タンパク質の存在または非存在をチェックするために蛍光顕微鏡を用いて撮像された（図５Ｃ）。蛍光画像が、１０ｘ／０．４ＮＡ  Ｌｅｉｃａ対物レンズおよび１×連結器を伴うＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ−ＥＲカメラを伴うＬｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取得された。５００ミリ秒の露出時間を伴うＬ５フィルタが、画像を収集するために使用された。定量的分析のために、Ｌ５フィルタ用の蛍光参照スライドの蛍光強度が記録され、バックグラウンド補正に使用された。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ撮像システムバージョン６．３ｒ１（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）および米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によるＩｍａｇｅＪを使用することによって、画像が取得および分析された。ＤｓＲｅｄを発現する大腸菌を含む流体ボリュームは、細菌を含まなかった空のウェル、およびＧＦＰ標識大腸菌を含むウェルと比較して、ＰＣＲ陽性であり（図５Ｂ）、標的化遺伝子のみが増幅されたことを示した。ＰＣＲ陽性ウェルが、実際にＤｓＲｅｄのプラスミドに由来したことを確認するために、蛍光顕微鏡検査を使用して、発現された蛍光タンパク質が監視された。ＧＦＰを伴うコロニーを含んだ１２５個のウェルが観察され、赤色蛍光大腸菌を含む１２個のウェルが観察され、ＰＣＲ結果に合致した（図５Ｄおよび５Ｅ）。ＰＣＲ結果で増加した蛍光強度を示した、一方のウェルが観察されたが、いかなる細菌コロニーも他方のコピーで検出されず、ウェルが溶液からの非成長細胞または遊離ＤＮＡを含んでいたことを示す。
【０１０８】
（実施例１２−臨床サンプルからのバクテロイデス・ブルガタスの単離）
Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ嫌気性生物（ＷＣＡ）プレート上で健常ヒトボランティアの結腸からの粘膜生検から取得された凍結微生物懸濁液の培養品種を収集するために、細胞擦過器が使用された。ＤＮＡが、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキットを使用してプール細胞から精製された。５０ｎｇのＤＮＡおよびバクテロイデス・ブルガタス特異的プライマーが、ＰＣＲに使用された。陽性ＰＣＲ生成物が、サンガーシークエンシングによって検証され、ＧｅｎＢａｎｋからのバクテロイデス・ブルガタスの配列に整列させられた。
【０１０９】
以前に説明されたようなスリップチップデバイスが、０．５％超低ゲル化温度アガローを伴うＷＣＡ培地を用いたサンプルの適切な希釈を装填された。スリップチップが１０〜１００個のみの細胞を用いてＰＣＲアッセイを行う能力を有していたため、スリップチップ上の培養は、バクテロイデス・ブルガタスを単離するために一晩（８時間）ほどの短さであった（図５Ｅ）。これは、寒天プレート上でコロニーを形成するために何千〜何百万もの細胞を必要とすることと比較され、通常、原液を作製し、コロニーを用いたアッセイを実行するための十分なバイオマスを取得するために、寒天プレート上のインキュベーションに３〜５日かかる。スリップチップデバイスが分割され、ＰＣＲが、陽性コロニーを識別するように１枚のプレートからのサンプルに対して行われた。５つのコロニーが、ＰＣＲ陽性ウェルのために重複ウェルから選択され、それらのうちの３つが寒天プレート上で拡大された。この実施例が凍結サンプルを用いて行われ、微生物の生存能力が凍結・解凍サイクル中に損なわれるため、これら２つの偽陽性結果は、溶解または非成長細胞に由来し得る。これらの分離株が実際にバクテロイデス・ブルガタスであることを確認するために、シークエンシングが使用された。
【０１１０】
（実施例１３−スリップチップ上のプレート洗浄（「チップ洗浄」））
臨床サンプルからの単一細菌細胞が、確率的に閉じ込められ、以前に説明されたようなスリップチップデバイス上で培養される。次いで、ＤＮＡ抽出のためにマイクロウェルを洗い流すことによって、単一管において微小コロニーが収集される。スリップチップ上で成長させられた培養品種の組成は、そのチップのための培養条件が標的微生物の成長を可能にしたかどうかを決定するために、シークエンシングまたは標的特異的プライマーのいずれかによって分析することができる。このチップ洗浄方法は、標的のための最適な成長条件が見出されるまで繰り返すことができる（例えば、図２０）。
【０１１１】
（実施例１４−大腸菌を用いたスリップチップ上のプレート洗浄（「チップ洗浄」））
ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質で標識された大腸菌細胞が、２００ｒｐｍにて回転振とう培養器中で、３７℃で一晩（１２時間）、ＬＢ中の５０μｇｍＬ−１のアンピシリンを用いて濃縮された。次いで、一晩培養物が、１００倍に希釈され、ＬＢ培地中の１０μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび４０μｍｏｌＬ−１ＩＰＴＧを用いて３．５時間培養された。次いで、細胞が、３０００×ｇで５分間ペレット化され、１ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄された。細胞は、陰性対照として、細菌の成長を支援しない、ＬＢ培地またはＰＢＳ緩衝液中の１０μｇｍＬ−１のアンピシリンおよび４０μｍｏｌＬ−１ＩＰＴＧで１０５の最終濃度まで連続的に希釈され、以前に説明されたようにスリップチップデバイス上に装填された。スリップチップは、３７℃で一晩培養された。ゲノムＤＮＡが、製造業者のプロトコルに従って、ＱｉａＡｍｐマイクロキットを使用してチップ洗浄液から精製された。較正のために、ゲノムＤＮＡが、巨視的液体培養物から精製され、Ｑｕａｎｔｉ−ｉｔ  ＤＮＡ高感度定量化キットによって定量化され、０．０１ｍｇｍＬ−１のＢＳＡを含むＡＥ緩衝液中で連続的に希釈された。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が、２７Ｆおよび５３４Ｒプライマーを用いて行われた。ＤＮＡ濃度の１０，０００倍増加が観察され（図２１）、この特定のモデルシステムについて、非成長細胞がチップ洗浄から回復させられる遺伝物質の０．０１％に寄与することを示唆した。
【０１１２】
（実施例１５−２種モデル群を用いたスリップチップ上のプレート洗浄（「チップ洗浄」））
クロストリジウム・シンデンスおよびエンテロコッカス・フェカリスの混合物が、スリップチップデバイス上および寒天プレート上で５：１比にて培養された。開始接種材料のゲノムＤＮＡおよびチップ洗浄液が、ｑＰＣＲによって抽出および定量化された。チップ洗浄が後に続くチップ上の培養は、非成長対照として使用された開始接種材料からのＤＮＡと比較して、各株のＤＮＡに約１，０００倍増加をもたらし（図２２Ｅ）、微生物成長を検出するためにチップ洗浄を使用できることを示した。
【０１１３】
第１日にコロニーサイズの差異から観察されるように、エンテロコッカス・フェカリスが、寒天プレート上でクロストリジウム・シンデンスより速く成長した（図２２Ｃ−Ｄ）。培地は、２つの株に対して類似積載能力を有する。２つの株が、第１日に同等密度までチップ上で成長した（図２２Ａ−Ｂ）。２つの株から回収されたゲノムＤＮＡの数量によって示されるように、プレート洗浄による第１日のサンプリングが、急速に成長する細菌に向かって約１，０００倍のバイアスをもたらした一方で、チップ洗浄方法は、ゲノムＤＮＡが各株に同等であったため、このバイアスを効果的に補正した（図２２Ｅ）。
【０１１４】
（実施例１６−４種モデル群を用いたスリップチップ上のプレート洗浄（「チップ洗浄」））
４つの成分、すなわち、アナエロスティペス・カカエ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、クロストリジウム・シンデンス、およびエンテロコッカス・フェカリスから成るモデル群が選択された。この群は、成人の遠位腸内微生物叢の２つの主要菌門、すなわち、フィルミクテス門およびバクテロイデス門を表す。シェドラー嫌気性生物肉汁培地が、４つ全ての種の成長を支援するために選択された。スリップチップが４つの種の成長を支援しない可能性を除外するために、４つの種は、異なるデバイスに別々に装填された。スリップチップ上の培養の１日後に、４つ全ての種は高濃度微小コロニーまで成長した。
【０１１５】
次に、アナエロスティペス・カカエ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、クロストリジウム・シンデンス、およびエンテロコッカス・フェカリスは、シェドラー嫌気性生物肉汁培地中で一晩濃縮され、次いで、細胞を対数中期（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）に同期化するように８時間培養された。細胞は、均等に混合され、シェドラー嫌気性生物肉汁培地中で１０５ＣＦＵｍＬ−１まで希釈され、スリップチップ上に装填された。スリップチップは、２４時間培養され、実施例１３または１４のようにチップ洗浄方法を使用して分析された。ゲノムＤＮＡが、製造業者のプロトコルに従って、ＱｉａＡｍｐマイクロキットを使用して精製された。ゲノムＤＮＡが、較正のために、巨視的液体培養物から精製され、Ｑｕａｎｔｉ−ｉｔ  ＤＮＡ高感度定量化キットによって定量化され、連続的に希釈された。非成長対照として開始接種材料を使用することによって、成長からの約１，０００倍増幅が観察された。プレートは、第１日にサンプリングされたときにエンテロコッカス・フェカリスに向かって強くバイアスをかけられたが、クロストリジウム・シンデンスとエンテロコッカス・フェカリスとの間の有意なバイアスはチップ洗浄で観察されなかった（図２２Ｂ）。これは、チップ洗浄方法がスリップチップ上で成長させられた種を確実に検出できることを実証する。
【０１１６】
（実施例１７−ＯＴＵ１５８に対する成長条件の識別）
サンプルが、２つの方法によって盲腸から収集され（図２３）、すなわち、ブラシ粘膜生検がブラッシング技法によって取得され、洗浄流体が洗浄技法によって取得された。洗浄流体は、加圧滅菌器で処理され、培地Ｍ２ＬＣの中へ添加された。ブラシサンプルは、１０５ＣＦＵｍＬ−１でスリップチップ上に装填され、コロニーを成長させるように３日間培養させられた。次いで、実施例１３−１５のように以前に説明されたチップ洗浄方法を使用して、培養品種が収集された。同量の接種材料もまた、比較のために寒天プレート上で培養された。第１胃液が、培地Ｍ２ＧＳＣの中へ添加された。
【０１１７】
培養品種の１６Ｓ高スループットシークエンシング調査が、２つの領域、すなわち、Ｖ４およびＶ１Ｖ３で行われた。チップ洗浄およびプレート洗浄からのＯＴＵテーブルは、サンプルにつき１２５９９の示度値までサブサンプリングされ、族レベルでまとめられた。スリップチップデバイスから成長させられた培養品種は、微生物の組成および相対存在量の両方で、プレート上で成長させられた培養品種とは異なった。例えば、より多くのクロストリジウムＸＩＩＩおよびビフィドバクテリウムをプレート洗浄から観察することができる一方で、ゴードニバクター、アナエロスティペス、オシリバクター、およびシラニモナス等のいくつかの低存在量成分は、チップ洗浄方法のみから観察することができる。この相違は、おそらく、寒天プレート上およびチップ上の細菌成長動態間の差異、ならびに異なる培養条件（管腔流体（ｌｕｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）がオンチップ培養に使用された一方で、第１胃液が寒天プレートに使用された）に起因する。オシリバクターとして分類された示度値は、ＯＴＵ＿１５８＿Ｖ１Ｖ３に割り当てることができた。ＯＴＵ１５８に対する種特異的プラマーを用いたＰＣＲが行われ、結果がサンガーシークエンシングによって検証され、ＯＴＵ１５８を培養品種から見出すことができることを確認した。
【０１１８】
１６Ｓ  Ｖ４高スループットシークエンシングの結果が、ｑＰＣＲによってさらに検証された（図２４）。帰無仮説は、ブランク水、培地Ｍ２ＧＳＣからのプレート洗浄、および培地Ｍ２ＬＣからのチップ洗浄において、ＯＴＵ１５８からのゲノムＤＮＡの濃度が同一であったことであった。ＯＴＵ１５８からのゲノムＤＮＡの濃度は、ブランク陰性対照およびプレート洗浄からの培養品種の両方より高かった。プレート洗浄およびチップ洗浄が細菌ＤＮＡを含んでいたかどうかを試験するために、ｑＰＣＲが１６Ｓ  Ｖ４汎用プライマーを用いて行われた。プレート洗浄およびチップ洗浄液の両方は、ブランク陰性対照より高いＤＮＡ濃度を有し、プレート洗浄液は、わずかにより低いＣｑ値を有した。
【０１１９】
管腔流体がＯＴＵ１５８の成長のために必要とされるかどうかを試験するために、Ｍ２ＧＳＣ培地上で成長させられた培養品種が、チップ洗浄によって取得され、ｑＰＣＲで試験された。培養品種とブランク陰性対照との間の差異は、統計的に有意ではなく、Ｍ２ＧＳＣ培地を用いたチップ洗浄がＯＴＵ１５８を回収できなかったことを示した。Ｍ２ＬＣは、ＯＴＵ１５８を成長させる好適な培地であることが決定された。
【０１２０】
（実施例１８−「カンディダタス・カエココッカス・マイクロフルイディカス」の単離）
培養が、実施例１６で調製されるようなＭ２ＬＣ培地を用いて行われ、以前に説明されたようなスリップチップデバイス上に装填された。培養後、２枚のスリップチッププレートが、以前に説明されたように分離され、コロニーＰＣＲが、目的とするＯＴＵ＿１５８＿Ｖ１Ｖ３（ＯＴＵ１５８）領域を標的にするプライマーを用いて各微小コロニーに対して実行された。２つのＰＣＲ陽性兆候が、約５００個の微生物コロニーを装填された単一のデバイスから観察された（それらのうちの１つが図２５Ａに示されている）。兆候の隣のＰＣＲ陰性ウェルの画像が、図２５Ａで左に示されている。細胞物質がＳＹＢＲグリーンによって染色され、蛍光を示したが、溶液相は明確にＰＣＲ陰性であった。陽性ウェルのうちの１つは、Ｍ２ＧＳＣ寒天上で拡大され、インキュベーションの３日後の無傷の「拡大」培養物の写真が、図２５Ｂで提示されている。培養物は、示されるように、スリップチップから移送させられた複数の種子の存在により、複数の細胞を含んでいた。コロニーＰＣＲが、種特異的および汎用プライマーの両方を用いてこの分離株に対して行われ、ＯＴＵ１５８の存在を確認した。
【０１２１】
プレートが、精製のために標的細胞の単一コロニー（例えば、図２５Ｃ）で繰り返し筋状にされた。プレートを５回筋状にした後、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、培養物の純度を決定するために使用された。以下の修正を伴って、すなわち、Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−１６（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して振とうされた溶解基板Ｂ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ６９１１−５００）を１分間使用して、ビーズ衝打ステップが追加され、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａＡｍｐキットを使用して、ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡが単離された。１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅｒ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲによって増幅された。プライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒが、ＰＣＲ増幅に使用された。ＰＣＲ増幅は、９５℃で２分のインキュベーションを用いて、Ｂｉｏｒａｄサーモサイクラによって行われ、その後に、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の３４サイクルが続く。増幅ＰＣＲ生成物が、ＴＯＰＯベクターにクローン化され、ＬＢ／Ａｍｐ＋培地上でＴＯＰＯ１０大腸菌細胞に形質転換された。プレートは、３７℃で一晩培養され、単一コロニーが液体培養物のために選定された。プラスミドが、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して細胞から精製された。次いで、プラスミドＤＮＡが、上記で説明されるものと同一のプロトコルを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物が、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製され、Ｌａｒａｇｅｎによって配列決定された。
【０１２２】
ＴＥＭが、画像取得のためのＧａｔａｎ  ２ｋ×２ｋ  ＣＣＤカメラを装備したＴＥＣＮＡＩ  １２０  ｋｅＶ  ＴＥＭ（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）上の２００個のメッシュフォルムバール／カーボングリッドを用いて行われた（図２５Ｄ）。分離株の光学顕微鏡検査が、ＰＢＳ緩衝液に細胞を懸濁させることによって得られ、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ）およびＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡＥＲカメラとともに６３倍１．２  ＮＡ  Ｌｅｉｃａ対物レンズを使用して撮像された。桿菌細胞が、ＴＥＭ画像（図２５Ｄ）および光学顕微鏡検査（図２６）の両方から観察された。
【０１２３】
２つの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列型が、培養物から取得された。それらは、互いに９９．４％一致し、クロストリジウム群ＩＶと以前に称された、ルミノコッカス族に関連している。１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的化ＦＩＳＨが、確立されたプロトコルに従って実行された。簡潔には、ホルムアルデヒドおよびエタノール固定サンプルが、ホルムアルデヒドを含む湿潤チャンバ中で４６℃にて１６時間、ＦＡＭおよびＣｙ３標識オリゴヌクレオチドプローブと交雑された。細胞壁消化が蛍光検出および／または標識強度の増加につながるかどうかを試験するために、ハイブリダイゼーションの前に、サンプルは、（ｉ）ＴＥ緩衝液中の１０ｍｇｍＬ−１リゾチーム（湿潤チャンバ中で３７℃にて１時間）、（ｉｉ）、ＴＥ緩衝液中の１５μｇｍＬ−１プロテイナーゼＫ（室温、すなわち、２３℃で１０分）、それに続いて、０．０１Ｍ  ＨＣｌに浸すこと（２３℃で１０分）、または（ｉｉｉ）アセトン：メタノールの１：１混合（２３℃で１５分）のいずれかで前処理された。ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミド濃度、すなわち、プローブ混合ＥＵＢ３３８Ｉ−ＩＩＩおよび対照プローブＮｏｎＥＵＢ３３８については２０〜３５％、プローブＡｒｃｈ９１５については３５％、プローブＥＵＫ５１６については２０％が、推奨された。２つの新たに設計されたプローブ、すなわち、Ｃｌｏｓｔｒ１８３−ＩおよびＣｌｏｓｔｒ１８３−ＩＩが、１５％で交雑された（＞２０％の濃度では蛍光信号が観察されなかった）。同一の結合部位の競合を介して、これらのプローブは、我々の培養物から得られた２つの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列型を区別することができる。ハイブリダイゼーション後、スライドを、４８℃の予熱洗浄緩衝液中で１０分間洗浄した。次いで、それらは、予冷脱イオン水（４℃）に浸され、加圧空気を使用して乾燥させられた。スライドは、ＤＡＰＩ／Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒを用いて搭載され、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１落射蛍光顕微鏡を使用して分析された。顕微鏡製造業者によって提供されるソフトウェアおよびＩｍａｇｅＪを使用して、蛍光画像が分析された。非特異的標識は、対照プローブＮｏｎＥＵＢ３３８がサンプルに適用されたときに観察されなかった。
【０１２４】
全てのＦＩＳＨ陽性細胞は、配列型特異的ＦＩＳＨプローブ（Ｃｌｏｓｔ１８３−ＳＩおよびＣｌｏｓｔ１８３−ＳＩＩ、図２７）、ならびに細菌のほとんどの構成要素を特異的に検出する一般的プローブ混合ＥＵＢ３３８Ｉ−ＩＩＩの両方を結合した。いかなる古細菌または真核細胞も培養物中で検出することができなかった一方で、ＦＩＳＨを介していくつかのＤＡＰＩ染色細胞を染色することができなかった。これがそれぞれの細胞の限定されたアクセス可能性によるものであったことを除外するために、異なる細胞壁浸透性処置が試験された。しかしながら、これらの細胞の成功したＦＩＳＨ染色につながるものはなかった。したがって、それぞれの細胞は、おそらく、それぞれの細胞の胞子形成によるものであり得る、モノＦＩＳＨの検出限界を下回るリボソーム含有量を有する。この着想は、固定相における培養物の分析において、浸透性ステップが行われたときでさえも、ＦＩＳＨを使用してほとんどの細胞を視覚化できないという所見によって支持される。これらのＦＩＳＨ結果は、単一の培養物中のルミノコッカス種の存在を実証する。
【０１２５】
（実施例１９−腸内微生物の培養および分析）
ヒトおよび／マウス腸内生検からの単一微生物細胞が、確率的にデバイス上に閉じ込められ、コロニーの成長を可能にするように培養される。細胞株が、スリップチップデバイス上に装填され、コロニーの成長を可能にするように培養される。細菌培養物からのデバイスの２枚のプレートが分離され、各コンパートメント化流体ボリュームが２つに分かれ、対向プレートの各々の上で各個々のコロニーの同一コピーを作成する。目的とする機能を伴うコロニーを含むコンパートメントを識別するために、細菌細胞を含むガラスプレートを、哺乳類細胞培養物を含むガラスプレートと重複させることによって、機能的アッセイが第１のプレート上で行われる。例えば、蛍光、比色分析、化学発光、または質量分析アッセイ等のアッセイを行うことによって、遺伝子の発現が視覚化される。次いで、対応するコロニーが、目的とする分離株の拡大培養等の他の目的で、第２のプレートから回収される。
【０１２６】
（実施例２０−硫酸塩還元細菌の培養）
硫酸塩還元細菌を含む疑いがあるサンプルが、スリップチップデバイス上に装填され、確率的に閉じ込められる。本デバイスが培養され、コロニーが成長させられる。スリップチップデバイスの２枚のプレートが分離され、各プレートからのペアのウェル中で合致コロニーを産生する。１枚のプレートからのサンプルが、関連遺伝子を標的にする遺伝的アッセイ（例えば、図２８）によって、または（例えば、Ｈ２Ｓを検出するために蛍光発生基質であるＮ，Ｎ−ジブチルフェニレンジアミン（ＤＢＰＤＡ）を使用することによって）硫酸塩還元活性の存在の機能的アッセイによってのいずれかで、硫酸塩還元挙動についてアッセイされる。硫酸塩還元について陽性と見出されたコロニーが注目され、他のスリップチッププレートからのそれらの合致コロニーが、さらなる検査のために培養される。以前は未知であった硫酸塩還元細菌がサンプル中で見出される。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、説明されているが、そのような実施形態は一例のみとして提供されることが、当業者に明白となるであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更、および置換が、当業者に想起されるであろう。本明細書で説明される本発明の実施形態の種々の代替案が、本発明を実践する際に採用され得ることを理解されたい。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、これらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造がそれによって網羅されることが意図される。
【図１】
0006533516.tif 000002
【図２】
0006533516.tif 000003
【図３Ａ】
0006533516.tif 000004
【図３Ｂ】
0006533516.tif 000005
【図３Ｃ】
0006533516.tif 000006
【図４】
0006533516.tif 000007
【図５】
0006533516.tif 000008
【図６】
0006533516.tif 000009
【図７】
0006533516.tif 000010
【図８】
0006533516.tif 000011
【図８−１】
0006533516.tif 000012
【図９】
0006533516.tif 000013
【図１０】
0006533516.tif 000014
【図１１】
0006533516.tif 000015
【図１２】
0006533516.tif 000016
【図１３】
0006533516.tif 000017
【図１４】
0006533516.tif 000018
【図１５】
0006533516.tif 000019
【図１６】
0006533516.tif 000020
【図１７】
0006533516.tif 000021
【図１８】
0006533516.tif 000022
【図１９】
0006533516.tif 000023
【図２０】
0006533516.tif 000024
【図２１】
0006533516.tif 000025
【図２２】
0006533516.tif 000026
【図２３】
0006533516.tif 000027
【図２４】
0006533516.tif 000028
【図２５Ａ】
0006533516.tif 000029
【図２５Ｂ】
0006533516.tif 000030
【図２５Ｃ】
0006533516.tif 000031
【図２５Ｄ】
0006533516.tif 000032
【図２６】
0006533516.tif 000033
【図２７】
0006533516.tif 000034
【図２７−１】
0006533516.tif 000035
【図２８】
0006533516.tif 000036