(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）空間記憶力の増進もしくは回復効果、（ｉｉ）認知記憶力向上もしくは回復効果、（ｉｉｉ）神経細胞保護作用、（ｉｖ）ベータアミロイドの神経細胞への毒性に対する抑制効果、（ｖ）ベータアミロイド生成に対する抑制効果、（ｖｉ）神経成長因子生成促進効果、（ｖｉｉ）アセチルコリンエステラーゼ活性抑制効果、（ｖｉｉｉ）アミロイドベータ４２により誘導される細胞毒性に対する抑制効果、（ｉｘ）タウのリン酸化に対する抑制効果、もしくは（ｘ）これらのいずれかの組合せを有することを特徴とする、茯苓皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、パーキンソン病、ALS、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症および進行性失調症からなる群より選択された疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ｉ）空間記憶力の増進もしくは回復効果、（ｉｉ）認知記憶力向上もしくは回復効果、（ｉｉｉ）神経細胞保護作用、（ｉｖ）ベータアミロイドの神経細胞への毒性に対する抑制効果、（ｖ）ベータアミロイド生成に対する抑制効果、（ｖｉ）神経成長因子生成促進効果、（ｖｉｉ）アセチルコリンエステラーゼ活性抑制効果、（ｖｉｉｉ）アミロイドベータ４２により誘導される細胞毒性に対する抑制効果、（ｉｘ）タウのリン酸化に対する抑制効果、もしくは（ｘ）これらのいずれかの組合せを有することを特徴とする、茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項４】
前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
健康機能食品または健康機能飲料である、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組成物であって、茯苓皮抽出物が組成物に占める重量パーセントが１０％乃至９０％であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組成物であって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱油から選ばれる担体、賦形剤または希釈剤を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組成物であって、経口投与、直腸内投与または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与されることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物であって、１００ｍｇの前記抽出物、３．０ｍｇのソジウムメタビスルフェート、０．８ｍｇのメチルパラベンおよび０．１ｍｇのプロピルパラベンを含有し、注射剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、２００ｍｇの前記抽出物、１００ｍｇの乳糖、１００ｍｇのデンプンおよび薬学的に許容可能な量のステアリン酸マグネシウムを含有し、錠剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、１００ｍｇの前記抽出物、５０ｍｇの乳糖、１００ｍｇのデンプン、２ｍｇのタルクおよび薬学的に許容可能な量のステアリン酸マグネシウムを含有し、カプセル剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物であって、１０００ｍｇの前記抽出物、２０ｇの砂糖、２０ｇの異性化糖および薬学的に許容可能な量のレモン香を含有し、液剤であることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茯苓皮抽出物を含有する退行性神経疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性神経疾患は、神経細胞（ニューロン）の漸進的な構造的、機能的な損失により発生する精神的機能の退化疾患を意味する。退行性神経疾患は、神経系の特定部位に神経細胞退化が進行されて認知症、錐体外路異常、小脳異常、感覚障害、運動障害などの症状を伴うと同時に、多くの部位に異常が現われて症状が複合的に現れることもある。患者が見せる臨床様相により疾患を診断するが、症状が多様に現れ、互いに異なる疾患が共通的な臨床症状の見られる場合が多く診断に困難がある（Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．４０．  Ｎｏ．６，ｐｐ．８４７−８５８，１９９５）。
【０００３】
退行性神経疾患は、疾患の兆候が徐々に現れ、老化と共に発病する場合が多い。発病が始まると死亡まで数年あるいは数十年にかけて持続的に病が進行されて社会的負担が非常に大きい。発病原因に家族歴による遺伝的影響が相当あると知られているが、後天的な要因も大きく作用すると判断される。退行性神経疾患は、その臨床症状により大きく進行性認知症（アルツハイマー病など）、および神経学的異常（ピック病など）、姿勢および運動異常（パーキンソン病など）、進行性失調症、筋萎縮および萎弱、感覚および運動障害などに区分される（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２，  Ｎｏ．４，  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍａｊｏｒ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。
【０００４】
代表的な退行性脳疾患であるアルツハイマー認知症の直接的な発病原因としてＡβ  ｐｌａｑｕｅとタウ（Ｔａｕ）の過リン酸化ｔａｎｇｌｅの細胞毒性が注目されている。
【０００５】
Ａβは、前駆体であるＡＰＰから生成され、β−セクレターゼ（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）、γ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）など酵素の作用で神経細胞外側で作られる。Ａβ濃度が一定水準以上になるとＡβ蛋白質同士で結合して不溶性である老人斑（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）が形成される。この物質は炎症および神経毒性を誘発して周囲の神経細胞を破壊することができる。例えば、アルツハイマー認知症疾患の患者から観察される神経細胞の死滅と微細神経膠腫が老人斑と関連していると知られている。試験管内の実験結果において、Ａβペプチドは、小膠細胞（脳大食細胞）の活性化を誘発することができると示されており、これはアルツハイマー疾患がある患者の脳で発見される微細神経膠腫および脳炎症の原因という架設を支持する。一度Ａβが作られ、老人斑が形成されるとこれを顕著に溶解したりまたは沈着物の形成を防止すると期待される幅広く容認される療法または治療剤は現在までない。
【０００６】
タウは、Ｎ−末端突出部分、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）凝集ドメイン、微細小器官結合ドメインおよびＣ−末端の４部分から構成されており（Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，  １０３，  ２６−３５，  １９９６）、神経細胞の物理的構造を形成する微細小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）を連結する役割を果たす。中枢神経系の神経細胞内でタウが非正常的に過リン酸化されたり変形される場合、タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）のような退行性脳疾患を誘発すると知られている。アルツハイマー認知症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、１７番染色体関連パーキンソン病随伴前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤＰ−１７）などが代表的なタウオパチーに属する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  １１２１−１１５９，  ２００１；  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ５６，  ７２６−７３４，  １９９７；  Ｂｕｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ５８，  ６６７−６７７，  １９９９；  Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ４３，  １９３−２０４，  １９９８；  Ｉｔｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｔｚ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １２，  ６５−７２，  ２０１１）。
【０００７】
神経栄養因子（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）が退行性神経疾患の治療の可能性を有しているということは１９８０年代のアルツハイマー実験で提起された（Ｎａｔｕｒｅ．  １９８７  Ｓｅｐ  ３−９；３２９（６１３４）：６５−８．  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．）。アルツハイマーの病因として知られた老化により損失された基底前脳のコリン性ニューロンが神経成長因子（ＮＧＦ）の側脳室投与により復旧され、これによる実験動物の記憶能力向上が報告されながら、神経栄養因子を利用して退行性神経疾患を治療しようとする研究が継続して進められた。後続研究として顔面神経と座骨神経の結節で運動神経の機能を損傷させた後、神経栄養因子ファミリー（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）である脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３、ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４、ＮＴ−４）、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＮＴＦ）などで損傷された運動神経の機能を復旧させた研究が進行されて肯定的な結果を得た（Ｎａｔｕｒｅ．  １９９２  Ｄｅｃ  ２４−３１；３６０（６４０６）：７５７−９．  Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｒａｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ．）。また、老化により漸進的に運動ニューロンの数と機能が喪失される疾病を病む遺伝子組み換えマウス（ｗｏｂｂｌｅｒ）を利用した実験ではＢＤＮＦとＣＮＴＦを投与して運動ニューロンの数を増加させ、その機能を向上させた（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９４  Ａｕｇ  １９；２６５（５１７５）：１１０７−１０．  Ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｂｂｌｅｒ  ｍｉｃｅ  ｃｏｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＮＴＦ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ）。前記で言及した研究結果以外にも神経栄養因子が多様な感覚、運動神経病態モデルでニューロンの数と機能を増加させ、実験動物の記憶、認知、行動などの障害を改善させることが多数の研究で報告されている。
【０００８】
茯苓の学名は、Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓであり、分類学的に真正担子菌綱、同担子菌亜綱（帽菌亜綱）、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科に属する。主に松の木で死物寄生をするが、生きている松の木の根と連結されて活物寄生をしたりもする褐色腐朽菌で担子菌類に属する菌類の一種である。菌糸は白色に分枝しながら継続して生長して菌糸同士で互いにかたまりはじまり、温度、湿度など適した環境条件が持続すれば耐久体である固い塊り形態の菌核が形成される。これを茯苓といい、内部の色に応じて白色であれば白茯苓、淡紅色であれば赤茯苓といい、外皮を茯苓皮という。
【０００９】
茯苓は、主要成分として茯苓酸（Ｐａｒｃｈｙｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｃ３３Ｈ５２Ｏ５）、ピニコール酸（Ｐｉｎｉｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｃ３０Ｈ１８Ｏ３）、茯苓新酸（３β−Ｈｙｄｅｒｏｘｙ−ｌａｎｏｓｔａ−７．９（１１）、２４−Ｔｒｉｅｎ−２１−ｏｉｃ  ａｃｉｄとＴｕｍｕｌｏｓｉｃ  ａｃｉｄ（Ｃ３１Ｈ５０Ｏ）Ｅｂｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄ（Ｃ３１Ｈ５０Ｏ３）などを含有しており、茯苓と茯苓皮でトリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）類であるｐｏｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄとその誘導体が分離して報告されたことがある。この他にもパキマ酸、エブリコ酸、ポリポテン酸Ａ、Ｃ、トリテルペノイドなどが入っており、エルゴステロール、レシチン、アデニン、コリン、葡萄糖、果糖および蛋白質と多量の無機物質が入っている。
【００１０】
茯苓は、味が甘く、性質は暖かく、その味と性質が共に軽くて陽性に属する薬剤と言われている。過去の文献では、渇きを緩和し、小便を円滑にし、湿気を除去し、体の状態を適当に調整し、消化器の機能を調和させて元気づけたり、腰を柔らかくすることによって腹部の淤血をよく循環させ、記憶力と関連した処方に主に使用されており、最近の論文で抗糖尿効果、抗癌効果などが報告されている（Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，  Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，  ２０１０）。
【００１１】
茯苓皮は、サルノコシカケ科の茯苓菌核の外側皮であり、水を排出させて浮腫を緩和させる効能がある薬材として知られている。特にラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）系トリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）であるｐｏｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄが豊富であり、東医宝鑑で浮腫に処方される五皮散（陳皮、大腹皮、茯苓皮、生姜皮、桑白皮）に使用される生薬であり、最近の論文で利尿、排尿促進、浮腫減少などの効果が報告されている。（Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，  Ｔａｋａａｋｉ  ｔａｉ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，  ３９，５，１９９５；  Ｕｒｉｎａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  ｙｉｎｇ  ｙｏｎｇ  ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １４８，２，２０１３）
【００１２】
このような背景下で、効果的な退行性神経疾患の予防、改善および治療に対する医薬および食品組成物に関する素材に対して鋭意研究を重ねた結果、本発明者は、茯苓皮の神経系活性研究中、茯苓皮抽出物が多様な脳神経傷害または記憶力形成抑制薬品により誘発される脳神経疾患モデルで茯苓皮抽出物が有意義な記憶力回復作用を示すことを確認した。また茯苓皮抽出物が脳内で神経細胞死滅を起こす物質の生成を抑制し、神経細胞再生および分化を促進する蛋白質の発現を促進して神経細胞を保護することを証明して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．４０．  Ｎｏ．６、ｐｐ．８４７−８５８，１９９５
【非特許文献２】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２，  Ｎｏ．４，  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍａｊｏｒ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
【非特許文献３】Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，  １０３，  ２６−３５，  １９９６
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  １１２１−１１５９，  ２００１；  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ５６，  ７２６−７３４，  １９９７；  Ｂｕｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ５８，  ６６７−６７７，  １９９９；  Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ４３，  １９３−２０４，  １９９８；  Ｉｔｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｔｚ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １２，  ６５−７２，  ２０１１
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ．  １９８７  Ｓｅｐ  ３−９；３２９（６１３４）：６５−８．  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ。
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ．  １９９２  Ｄｅｃ  ２４−３１；３６０（６４０６）：７５７−９．  Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｒａｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ．
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９４  Ａｕｇ  １９；２６５（５１７５）：１１０７−１０．  Ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｂｂｌｅｒ  ｍｉｃｅ  ｃｏｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＮＴＦ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ
【非特許文献８】Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，  Ｌｉｎｇ  Ｈｕｉ，  ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，  ２０１０
【非特許文献９】Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ，  Ｔａｋａａｋｉ  ｔａｉ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，  ３９，５，１９９５；  Ｕｒｉｎａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  ｙｉｎｇ  ｙｏｎｇ  ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １４８，２，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、茯苓皮（学名：Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ）抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物と退行性神経疾患の予防および改善用食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、茯苓皮抽出物を含有する退行性神経疾患の予防または治療用薬学組成物および退行性疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の茯苓皮抽出物は、神経細胞死滅を誘発して退行性脳疾患の原因になり得るベータアミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ−β；Ａｂｅｔａ）の生成およびタウのリン酸化を抑制して神経細胞を保護し、アセチルコリンエステラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ；ＡＣｈＥ）を抑制して神経伝導を増加させ、記憶力向上作用を媒介する効果を示すところ、本発明の茯苓皮抽出物は、退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物または健康食品組成物として有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】茯苓皮抽出物を処理した後、スコポラミンで記憶力形成を抑制した実験動物モデルにおける受動回避試験（Ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔａｓｋ）の結果を示すグラフである。
【図２】茯苓皮抽出物を処理した後、スコポラミンで記憶力形成を抑制した実験動物モデルにおけるＹ−ｍａｚｅ  ｔａｓｋの結果を示すグラフである。
【図３】茯苓皮抽出物を処理した後、スコポラミンで記憶力形成を抑制した実験動物モデルにおけるＮｏｖｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＮＯＲ）  ｔａｓｋの結果を示すグラフである。
【図４】ベータアミロイドを脳に注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）させてアルツハイマー認知症の症状を誘発させた動物モデルで、茯苓皮抽出物を処理した時、Ｙ−ｍａｚｅ  ｔａｓｋの結果を示すグラフである。
【図５】ベータアミロイドを脳に注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）させてアルツハイマー認知症の症状を誘発させた動物モデルで、茯苓皮抽出物を処理した時、Ｎｏｖｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｓｋ（ＮＯＲＴ）の結果を示すグラフである。
【図６】ベータアミロイドを脳に注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）させてアルツハイマー認知症の症状を誘発させた動物モデルで、茯苓皮抽出物を処理した時、神経細胞染色結果を示すグラフである。
【図７】正常動物に茯苓皮抽出物を処理した後、ベータアミロイドを測定した結果を示すグラフである。
【図８】正常動物に茯苓皮抽出物を処理した後、ＮＧＦ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図９】神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に茯苓皮抽出物を処理した後、ＡＣｈＥ活性を測定した結果を示す。
【図１０】神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に茯苓皮抽出物を処理した後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙで細胞死滅程度を測定した結果を示す。
【図１１】神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に茯苓皮抽出物を処理した後、タウのリン酸化程度を測定した結果を示す。
【図１２】神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に茯苓皮抽出物を処理した後、ＮＧＦ生成を測定した程度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、茯苓皮（学名：Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ）抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【００２０】
本発明の茯苓皮抽出物は、通常の生薬抽出物の製造方法により提供され得るが、具体的には、粗抽出物として水、アルコール、または水とアルコールの混合した溶媒を用いた抽出物を意味する。前記抽出溶媒のうちの一つであるアルコールは、これに限定されるのではないが、炭素数１乃至４の低級アルコール、好ましくはメタノール、エタノール、ブタノールまたは酒精であってもよく、より好ましくはエタノールであってもよい。前記茯苓皮抽出物は、抽出溶媒として酒精を用いて製造され得るが、ここで「酒精」とは、デンプン質原料または糖質原料を発酵させた後、蒸留して作ったエタノールを意味する。また前記水とアルコールの混合溶媒は、特に限定されずに任意の適量比率のとおり混合して用いることができる。
【００２１】
本発明の具体的な一例において、茯苓皮抽出物は、６０乃至８０（ｖ／ｖ）％エタノール、６５乃至７５（ｖ／ｖ）％エタノールまたは７０（ｖ／ｖ）％エタノールで抽出されたものであってもよいが、これに制限されるのではない。
【００２２】
具体的な一実施様態として、本発明の茯苓皮抽出物は、下記のように収得され得る。まず、本発明の茯苓皮をそれぞれ洗浄および乾燥した後、乾燥生薬を切断して切断生薬を得て、前記乾燥切断生薬重量の１から２０倍（ｖ／ｗ）、好ましくは５倍乃至１０倍（ｖ／ｗ）の水、炭素数１乃至４の低級アルコール、または水と炭素数１乃至４の低級アルコールの混合物、好ましくは７０（ｖ／ｖ）％エタノールを入れて、１０℃乃至１００℃、好ましくは常温の抽出温度で１時間乃至７２時間、好ましくは約４８時間にかけて冷浸抽出、熱水抽出、超音波抽出、還流冷却抽出、加熱抽出、超臨界抽出、好ましくは冷浸抽出で１回抽出して減圧濃縮して茯苓皮抽出物を収得することができる。
【００２３】
本発明による茯苓皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ  ｐｅｅｌ）抽出物を有効成分として含有する組成物は、退行性神経疾患の治療に用いることができる。したがって、本発明は、茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防または治療用薬学組成物、退行性神経疾患治療剤の製造のための茯苓皮抽出物の用途、そして治療上有効量の茯苓皮抽出物を対象体に投与する段階を含む退行性神経疾患の治療方法を提供する。
【００２４】
先で言及されたとおり、前記本発明による退行性神経疾患は、神経細胞（ニューロン）の漸進的な構造的、機能的な損失により発生する精神的機能の退化疾患を意味するものであり、具体的には、アルツハイマー認知症、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、パーキンソン病、ＡＬＳ、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症および進行性失調症から選択された疾患などを含む。
【００２５】
本発明の具体的な一例で、前記茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物は、全体薬学組成物１００重量部に対して茯苓皮抽出物を０．０１乃至９０重量部、０．１乃至９０重量部、１乃至９０重量部、または１０乃至９０重量部で含むことができるが、これに限定されるのではなく、患者の状態および疾患の種類および進行程度により変わり得る。
【００２６】
本発明の他の具体的な一例で、前記茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含んで退行性神経疾患の予防および治療用医薬製剤として製剤化することができる。
【００２７】
前記担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトル、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。
【００２８】
また、本発明による組成物は、医薬製剤として製造されるために通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座薬または滅菌注射溶液の剤形で製剤化され得るが、一般に、製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製され得る。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記薬学組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調製され得る。また、単なる賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いることができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。座薬の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ油、ラウリン油、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００２９】
本発明の茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重により変わり得るが、一般に０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは１乃至３０ｍｇ／ｋｇの量を一日１回乃至数回に分けて投与することができる。またその投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率などに応じても増減され得る。したがって、前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
本発明の茯苓皮抽出物を有効成分として含有する退行性神経疾患の予防および治療用薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、人間などのほ乳動物に多様な経路で投与され得る。投与の全ての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得る。
【００３１】
本発明の茯苓皮抽出物は、毒性および副作用は殆どないため、予防の目的で長期間服用時にも安心して用いることができる薬剤である。
【００３２】
また本発明は、前記茯苓皮抽出物を含む食品組成物を提供する。前記茯苓皮抽出物は、脳内で神経細胞死滅を起こす物質の生成を抑制し、神経細胞の再生および分化を促進する蛋白質の発現を促進して神経細胞を保護する効果があるため、特に神経退行性疾患の予防および改善効果を示すことができる健康機能食品および一般食品の製造に有用に用いることができる。
【００３３】
本発明で定義される健康機能食品は、具体的には、韓国の「２００２年健康機能食品に関する法律」を通じて新たに定義された「人体に対する機能性および安全性が十分に確立されて食品医薬品安全庁食品医薬品安全庁告示２００４−１２号に規定された健康機能食品原料または成分認定に関する規定目録集に収載された健康食品」である。
【００３４】
本発明による茯苓皮抽出物を含む食品組成物は、退行性神経疾患の症状緩和のための食品に多様に用いることができる。本発明の生薬抽出物を添加できる食品には、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは飲料である形態に用いることができる。
【００３５】
この時、本発明の食品中の前記茯苓皮抽出物の量は、一般に健康食品組成物の場合、全体食品重量の０．１乃至１５重量％、好ましくは０．２乃至１０重量％で加えることができ、健康飲料組成物の場合、１００ｍｌを基準に０．１乃至３０ｇ、好ましくは０．２乃至５ｇの比率で加えることができる。
【００３６】
本発明による食品組成物が飲料形態で製造される場合、指示された比率に必須成分として前記生薬抽出物を含有する以外には液体成分に特別な制限点はなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。
【００３７】
前述した天然炭水化物の例としては、モノサッカライド；葡萄糖、果糖などジサッカライド；マルトース、スクロースなどポリサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖またはキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前述したもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど））および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に用いることができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の全体健康飲料組成物１００ｍｌ当たり一般に約１乃至２０ｇ、好ましくは約５乃至１２ｇである。
【００３８】
前記以外に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。それ以外に本発明の組成物は、天然果実ジュースおよび果実ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて用いることができる。このような添加剤の比率は特に制限がないが、本発明の全体食品組成物１００重量部当たり０乃至約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００３９】
また他の一つの様態として、本発明は、茯苓皮抽出物を有効成分として含有する組成物を投与する段階を含む、退行性神経疾患の予防、改善または治療方法または退行性神経疾患の予防、改善または治療のための茯苓皮抽出物の用途に関するものである。このような方法または用途のための茯苓皮抽出物を含有する組成物の投与量、投与形態、投与方法などは前記で言及されたとおりである。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例および実験例により詳細に説明する。但し、下記の実施例および実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例および実験例に限定されるのではない。
【００４１】
＜実施例１＞本発明による茯苓皮抽出物の製造
ソウル京東市場の漢方薬商店で乾燥された茯苓皮（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ）を購入して夾雑物を除去し、よく乾燥された状態の生薬を実験に用いた。粉砕した状態の茯苓皮１００ｇに１Ｌの蒸溜水、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を加えて常温で４８時間にかけて冷浸した後に濾過し、これを減圧濃縮した後、凍結乾燥させて茯苓皮生薬抽出物（粗抽出物）を収得し、実施例１とした（表１参照）。
【表１】
0006533294.tif 000002
【００４２】
＜実験例１＞茯苓皮の記憶力向上効能および神経保護作用の確認
＜１−１＞実験動物の準備
スコポラミン誘導記憶力抑制（Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）モデル
６週齢ＩＣＲマウスを実験に用い、各実験群は８匹の動物で構成した。茯苓皮抽出物および対照薬品を投薬し、３０分後に１ｍｇ／ｋｇスコポラミンを腹腔投薬（ｉ．ｐ）した。正常（Ｎｏｒｍａｌ）動物には同量の生理食塩水を注射した。
【００４３】
スコポラミン投薬３０分後に行動実験を行った。
【００４４】
Ａβ注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）モデル
実験に６週齢ＩＣＲマウスを用いた。実験動物を麻酔させ、ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に固定させた後、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｍｉｃｒｏ  ｓｙｒｉｎｇｅ（ｆｉｔｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ２６−ｇａｕｇｅ  ｎｅｅｄｌｅ）を利用して３μｌのｖｅｈｉｃｌｅ（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＣＳＦ）またはＡβ４２を６分間注入した。
【００４５】
Ａβ４２を投与した動物を無作為に分けて実験群を構成した。Ａβ４２投与２日後から実験薬品および陽性対照薬品であるドネペジルを１１日間にかけて１日１回投薬した。
【００４６】
凍結乾燥した茯苓皮エタノール抽出物および対照薬品を３％ＨＰＭＣ水溶液に懸濁して用い、薬品は全て実験当日に調剤して用いた。
【００４７】
Ｂｒａｉｎ内蛋白質の測定
神経細胞死滅誘発物質または細胞保護に関与する物質生成に対する茯苓皮抽出物の効能を調べてみるために６週齢ＩＣＲマウスに茯苓皮抽出物および対照薬品を５日間投与した。５日目の投薬の４時間後に実験動物を犠牲させて動物の脳を取って海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）領域を分離して蛋白質分析に用いた。ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを行ってサンプル内の総蛋白質量を定量し、測定数値を単位蛋白質当たり測定物質値で示した。
【００４８】
＜１−２＞受動回避実験（Ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔａｓｋ）
受動回避実験は、二つの独立的に分離された明るい又は暗い正四角形箱で施行した。明るい区域（２０×２０×２０ｃｍ）は５０Ｗ白熱電球で照明した。明るい区域および暗い区域（２０×２０×２０ｃｍ）は１ｃｍ間隔に離れて２ｍｍのステンレススチール棒（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｒｏｄｓ）を設置した。
【００４９】
Ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ段階では、二つの区域をギロチンドア（ｇｕｉｌｌｏｔｉｎｅ  ｄｏｏｒ）（５×５ｃｍ）で分離して実験動物を明るい区域に入れてから３０秒後にギロチンドアを開けた。実験動物が自由に探索するようにし、暗い区域に越えればギロチンドアを閉めて３秒後に実験動物を取り出した。
【００５０】
２４時間後にアキュジショントライアル（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ）を進行した。薬品および対照薬品投与３０分後に１ｍｇ／ｋｇスコポラミンを腹腔投薬し、再び３０分後に行動実験を進行した。実験ネズミを最初には明るい区域に置き、区域の間にあるドアを３０秒後に開けた。実験ネズミが暗い区域に入ればギロチンドアを閉め、ステンレススチール棒により直ちに電気衝撃（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｏｏｔ  ｓｈｏｃｋ）を０．５ｍＡの強度に２秒間与えた。実験動物が暗い区域に入った時間を特定した。
【００５１】
アキュジショントライアルを施行し、２４時間の休み時間を与えた後、リテンシャルトライアル（Ｒｅｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｉａｌ）測定のために実験動物を明るい区域に置き、暗い区域に入る時までの時間を測定した。アキュジショントライアルおよびリテンシャルトライアル共に明るい部屋から暗い部屋に実験ネズミの四足が全て入る時までかかった時間を測定した。
【００５２】
その結果、図１に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、統計的に有意的な空間記憶力増進効果が現れることを確認した。最も効能の高い茯苓皮７０％エタノール抽出物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として知られたドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、ＤＰＺ）１ｍｇ／ｋｇと類似する程度の効能を示した（図１）。
【００５３】
＜１−３＞Ｙ−ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ
短期空間記憶力に対する影響を調べてみるためにＹ−ｍａｚｅ実験を行った。実験動物をＹ−ｍａｚｅの一側ａｒｍに置いて自由に歩き回れるように８分間放置し、自発的変更行動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）と総進入回数を測定した。連続して３つのａｒｍに進入した時をａｃｔｕａｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎに定義し、ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ比率を次の数式１で計算した。
［数式１］
変更行動（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）比率（％）＝［（変更回数）／（総ａｒｍ進入回数−２）］ｘ１００
【００５４】
その結果、図２に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、スコポラミンで誘導した記憶力形成抑制モデルで空間記憶力向上効能を示しており、図４に示されているように、Ａβ４２投与によるアルツハイマー認知症モデルでも空間記憶力が回復した（図２、４）。
【００５５】
＜１−４＞Ｎｏｖｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＮＯＲ）  ｔａｓｋ
横４５ｃｍ、縦４５ｃｍ、高さ５０ｃｍの黒色箱に大きさは同一であるが模様が異なる２つのプラスチックで作った物体を箱の中に入れた。実験動物が８分間自由に歩き回るように放置し、各物体で消費する時間を測定した（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎ）。２４時間後、ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎで経験した物体一つと新たな物体一つがある箱の内に実験動物を入れて各物体で消費する時間を測定した（ｔｅｓｔ  ｓｅｓｓｉｏｎ）。記録した数値を次の数式２を利用して計算した結果を新たな物体の認識試験結果で示した。
［数式２］
新たな物体の認識率（％）＝新たな物体に消費した時間／（新たな物体に消費した時間＋経験した物体に消費した時間）ｘ１００
【００５６】
その結果、図３に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、スコポラミンで誘導した記憶力形成抑制モデルで認知記憶力の向上効能を示しており、図５に示されているように、Ａβ４２投与によるアルツハイマー認知症モデルでも認知記憶力を回復させた（図３、５）。
【００５７】
＜１−５＞免疫組織化学染色
免疫組織化学染色のために前記実験例＜１−１＞で記述したＡβ４２注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）実験動物を１Ｘ  ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）で心筋灌流させ、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた後、脳を摘出した。同じ溶液に一日を固定させ、３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に入れて４℃で凍結切片する前まで二日に一回ずつ溶液を取り替えながら保管した。その後、凍結切片器（ｃｒｙｏｓｔａｔ）で脳組織を−２０℃でＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物を落として十分に凍らせた後、３０μｍ厚さの切片で作って保存液に入れて４℃で保管した。免疫組織染色は海馬領域をもって行い、ＰＢＳで洗浄した組織を１％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理後、非特異的反応を防止するために０．０５Ｍ  ＰＢＳ、１．５％正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、０．３％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００と一次抗体（ｇｏａｔ  ＮｅｕＮ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、１：５００）を２４時間にかけて４℃で反応させた。一次抗体を除去した後、組織をペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が連結された二次抗体（１：２００）に９０分間反応させた後、ＡＢＣを緩衝液に希釈して常温で約１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０２％ＤＡＢと０．０１％Ｈ２Ｏ２で発色させたものをエタノールとキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）脱水過程を経てスライドサンプルを作った。
【００５８】
その結果、図６に示したように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、ベータアミロイド毒性により減少した神経細胞（ＮｅｕＮ陽性）が有意的に増加した（図６）。茯苓皮抽出物は、神経細胞保護作用があり、これによって記憶力を増加させ得ることを確認した。
【００５９】
＜１−６＞ｂｒａｉｎ内Ａβ生成の測定
アルツハイマー発病の主要原因として知られたベータアミロイド生成に対する茯苓皮抽出物の抑制効能を確認するためにＥＬＩＳＡ実験を行った。
【００６０】
実験例＜１−１＞の正常動物の脳を摘出した後、Ｒｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを加え、これを機械的に均質に粉砕した。遠心分離を通じて上澄液を取った後、これをベータアミロイド分析ｋｉｔ（ＩＢＬ）を利用して脳に分布するベータアミロイド濃度を測定した。
【００６１】
その結果、図７に示したように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、脳内ベータアミロイド濃度が有意的に減少した（図７）。以上の結果を通じて、茯苓皮抽出物はアルツハイマー認知症を誘発する病因であるベータアミロイドを除去することを確認した。
【００６２】
＜１−７＞ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；神経成長因子）レベルの測定
神経細胞再生および分化作用があると知られたＮＧＦ生成に対する茯苓皮の効能を確認するためにＥＬＩＳＡ実験を行った。前記実験例＜１−１＞の正常動物の脳を摘出した後、海馬領域を分離し、Ｒｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを加え、これを機械的に均質に粉砕した。ＮＧＦ測定のために各脳の重量に対応するｈｉｇｈ  ｓａｌｔ  ｈｉｇｈ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒを加え、これを機械的に均質に粉砕した。４ＮのＨＣｌを１０μｌ加え、１５分間放置して受容体と結合したＮＧＦを解離させ、４ＮのＮａＯＨを加えて再び１５分間放置した。遠心分離を通じて上澄液を取った後、これをＮＧＦ測定ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用して脳に分布するＮＧＦ濃度を測定した。
【００６３】
その結果、図８に示したように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５％エタノール抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与時、脳内ＮＧＦ濃度が有意的に減少した（図８）。以上の結果を通じて、茯苓皮抽出物はＮＧＦ生成促進を通じて神経細胞保護作用を示すことを確認した。
【００６４】
＜実験例２＞茯苓皮の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）神経細胞保護効果の確認
＜２−１＞神経細胞株におけるＡｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＡＣｈＥ）活性の測定
アセチルコリンエステラーゼ抑制剤は、神経節内神経伝達物質であるアセチルコリン濃度を高めてコリン性神経細胞を活性化することによって、記憶能力の改善および認知症改善を媒介するため、現在多様なアセチルコリンエステラーゼ抑制剤が開発されて使用されている。茯苓皮混合抽出物のアセチルコリンエステラーゼ阻害効果を確認するためにアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。神経細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＫＣＬＢ（韓国細胞株銀行）から購入した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭのレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）と３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、茯苓皮抽出物を１０，１００μｇ／ｍｌの濃度で処理した。Ｒｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いて細胞溶解させた後、蛋白質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。アセチルコリンエステラーゼの酵素活性は、Ｅｌｌｍａｎ方法によりアセチルコリンを基質で用い、アセチルコリンエステラーゼにより生成されるｔｈｉｏｃｈｏｌｉｎｅをＤＴＮＢと反応させ、その結果で生成される５−ｔｈｉｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏａｔｅを４０５ｎｍで吸光度変化を測定して行った。
【００６５】
その結果、図９に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１０μｇ／ｍｌ濃度に神経細胞株に処理した時、Ａβ４２により誘導されるアセチルコリンエステラーゼ活性が抑制されて正常水準に回復された（図９）。
【００６６】
＜２−２＞神経細胞株における細胞保護効果
Ａβ４２を人為的に集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）させた物質を利用して神経細胞株に対する毒性を起こして茯苓皮抽出物の細胞保護効果をＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）  ａｓｓａｙを利用して測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を９６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）培地で４８時間培養した。１０μＭのレチノイン酸と３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、茯苓皮抽出物を０．０１、０．１、１、１０、１００または２００μｇ／ｍｌの濃度で処理６時間後、Ａβ４２を処理して総４８時間培養し、２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ処理４時間後、ＤＭＳＯでＦｏｒｍａｚｏｎを溶かして５９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６７】
その結果、図１０に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１０μｇ／ｍｌ濃度で神経細胞株に処理した時、Ａβ４２により誘導される細胞毒性が濃度依存的に抑制されて細胞数が増加することが観察された（図１０）。
【００６８】
＜２−３＞神経細胞株におけるリン酸化されたタウの測定
茯苓皮抽出物のタウの過リン酸化阻害効果を確認するためにリン酸化されたタウレベルを測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭのレチノイン酸と３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、茯苓皮抽出物を１０または１００μｇ／ｍｌの濃度で処理６時間後、Ａβ４２を処理して総４８時間培養した。Ｒｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞溶解させた後、蛋白質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで購入したｈｕｍａｎ  Ｔａｕ［ｐＳ１９９］  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）  ＫＩＴを利用してリン酸化されたタウを測定した。
【００６９】
その結果、図１１に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１０μｇ／ｍｌ濃度で神経細胞株に処理した時、Ａβ４２により誘導されるタウのリン酸化が抑制されて正常水準に回復された。代表的な退行性脳疾患である認知症に幅広く使用されているドネペジルではタウのリン酸化抑制効能が示されなかった（図１１）。
【００７０】
＜２−４＞神経細胞株におけるＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：神経成長因子）レベルの測定
茯苓皮抽出物の認知能力改善効果の機序を確認するためにＮＧＦレベルを測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌ）を６−ｗｅｌｌ培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で４８時間培養した。１０μＭのレチノイン酸と３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて５日間分化させた後、茯苓皮抽出物を１０または１００μｇ／ｍｌの濃度で処理した。Ｒｉｐａ  ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞溶解させた後、蛋白質含有量をＰｉｅｒｃｅ社で購入したＢＣＡ試薬で定量した。Ａｂｃａｍで購入したｂｅｔａ  Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）  ＫＩＴを利用してＮＧＦレベルを測定した。
【００７１】
その結果、図１２に示されているように、茯苓皮０、３０、５０、７０、９５（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を１０μｇ／ｍｌ濃度で神経細胞株に処理した時、ＮＧＦ生成の有意的な増加が観察された。代表的な退行性脳疾患である認知症に幅広く使用されているドネペジルではＮＧＦ生成関連効能が示されなかった（図１２）。
【００７２】
以上のように、本発明による茯苓皮抽出物は、神経細胞死滅を起こして退行性脳疾患を誘発するベータアミロイド生成とタウのリン酸化を抑制して病の発病または進行を抑制させ、アセチルコリンエステラーゼを阻害させて記憶力を向上させる。また神経細胞保護作用および神経分化を促進するＮＧＦの生成を促進してアルツハイマー認知症はもちろん、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、パーキンソン病、ＡＬＳなど、神経細胞の漸次的な死滅による進行性認知症、進行性認知症および神経学的異常、姿勢および運動異常、進行性失調症、筋萎縮および萎弱、感覚および運動障害などを含む退行性神経疾患の予防および治療に有用に用いることができる。
【００７３】
本発明の実施例１の生薬抽出物を含有する組成物の製剤例を説明するが、これは単に本発明を具体的に説明するものに過ぎず、これに限定されるのではない。
0006533294.tif 000003
【図１】
0006533294.tif 000004
【図２】
0006533294.tif 000005
【図３】
0006533294.tif 000006
【図４】
0006533294.tif 000007
【図５】
0006533294.tif 000008
【図６】
0006533294.tif 000009
【図７】
0006533294.tif 000010
【図８】
0006533294.tif 000011
【図９】
0006533294.tif 000012
【図１０】
0006533294.tif 000013
【図１１】
0006533294.tif 000014
【図１２】
0006533294.tif 000015