(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセスであって、 
0006571663.tif 000022
Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、６−オキソプリン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−フルオロウラシル、７−デアザ−アデニン、７−デアザアデノシンおよび５−フルオロサイトシンからなる群から選択される１種であり、 
ｎは、整数１００〜約２００であり、 
Ｌは、ヌクレオシドまたは、リンカーまたはスペーサを有するコレステロール、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の２´、５´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の２´、５´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の２´、５´−結合デオキシリボース単位からなる群から選択される非ヌクレオシド配位子であり、 
Ｌは、介在するリン酸塩を介してＲＮＡヌクレオチドの３´末端に付着され、 
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成プロセスは、ＲＮＡヌクレオチドの５´末端から３´末端への方向であり、当該プロセスは、以下のステップを有する。 
（ａ）化学式２で表されるヌクレオシドを使用し、 
0006571663.tif 000023
（化学式２） 
Ｍは、化学式Ｙ−Ｃ（Ｏ）で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につながるリンカーであり、 
ここで、Ｙは、２個の炭素と２０個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして、 
Ｙは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）−および−ＮＲ６−から成り、Ｒ６は、水素ラジカル、または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキルまたは置換アルアルキルであり、 
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、 
Ｒは、 
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり、そして、 
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、Ｒは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、そして、 
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒは存在せず、 
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシン）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、 
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−、１−（５−メチル−ウラシリル）−、１−（５−フルオロ−ウラシリル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−、９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−、および、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、 
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる群から選択されるものであり、 
（ｂ）オリゴヌクレオチド合成装置上の化学式１で表されるホスホラミダイトを配置し、 
0006571663.tif 000024
（化学式１） 
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、 
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され；そして、 
Ｒ４は、 
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒ４はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり；そして、 
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、Ｒ４は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、 
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒ４は存在しないように、 
選択され、 
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）アデニニル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシン）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、 
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−、１−（５−メチル−ウラシリル）−、１−（５−フルオロ−ウラシリル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−、９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−、および、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、 
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる群から選択されるものであり、 
Ｒ１は、アルキルまたはアリールラジカルであり、 
Ｒ２は、アルキルまたはアリールラジカルであり、そして、 
Ｒ３は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルであり、 
Ｂは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基であり、 
（ｃ）化学式２で表されるヌクレオシド固相担体から保護基Ｚを取り除き、 
（ｄ）保護基を少なくとも一つ有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、補助試薬の混合物を用いて、オリゴヌクレオチド合成装置において、化学式２のヌクレオシドおよび式１のホスホラミダイトをカップリングすることにより、ＲＮＡ合成のプロセスを実行し、 
（ｅ）ホスホラミダイトにＬ基を提供し、 
（ｆ）Ｌ基を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、オリゴヌクレオチドの末端に、Ｌ基を伴うホスホラミダイトを加え、 
（ｇ）固相担体からＬ基を有するオリゴヌクレオチドを分離し、 
（ｈ）オリゴヌクレオチドから少なくとも一つの保護基を取り除き、 
（ｉ）オリゴヌクレオチドを生じさせるためにシリル保護基を取り除き、 
（ｊ）オリゴヌクレオチドを沈殿させ、 
（ｋ）純度を決定するためにオリゴヌクレオチドを分析するプロセスにおいて、 
ステップ（ｄ）における補助試薬の混合物は、フェノキシ樹脂無水酢酸／テトラヒドロフラン／ピリジン、１０％のＮ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、３％のトリクロロ酢酸（トルエン中）、０．０５Ｍのヨウ素／ピリジン／水／テトラヒドロフランおよび０．３５Ｍの５−エチルチオ−１−Ｈ−テトラゾール（アセトニトリル中）から成ることを特徴とする、プロセス。 
【請求項２】
Ｌはリンカーまたはスペーサを有するコレステロールであり、そして、ｎは整数１００〜約２００であることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項３】
Ｌはポリエチレングリコールであり、そして、ｎは整数１００〜約２００であることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項４】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１００〜２００―ｍｅｒの長鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項５】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、デオキシ、バックボーン修飾塩基、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ塩基を含むＲＮＡキメラに合成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、末端、分岐点、または、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖内に、一つ以上の５´、２´、２´、３´結合を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、天然および修飾ヌクレオシド、脱塩基部位、逆脱塩基部位、発色団または配位子を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、発色団、配位子、一リン酸エステル基、二リン酸エステル基または三リン酸エステル基を含む、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項９】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、一つ以上のデオキシ、修飾デオキシ、または修飾リボヌクレオシドとの分岐点を含む、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項１０】
ＨＰＬＣゲル電気泳動またはＲＮＡ精製技術を用いる前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製ステップをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
表面への前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの標識および付着のステップをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。 
【請求項１２】
分子生物学研究開発において、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを利用するステップをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本特許協力条約出願は２０１３年９月１４日に出願された、米国仮特許出願第６１／８７７，９８０号の利点に基づき、主張する。これらの特許の開示内容は、参照することによって本願に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、モノマーホスホラミダイトを使用する長いＲＮＡオリゴマの合成、および逆の５´→３´方向でのＲＮＡオリゴヌクレオチド合成に適した対応する固相担体に関する。特に、この発明は、約１００−ｍｅｒ〜約２００−ｍｅｒの長いＲＮＡオリゴマの合成に適応できる実験条件を使用するものを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
３´→５´方向での定義された配列ＲＮＡ合成は、現在ではかなり確立され、非常に多様な治療用グレードのＲＮＡアプタマ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび生物活性ＲＮＡ分子の合成および開発のために近年使用されている。この３´→５´合成アプローチは、オリゴヌクレオチドを生じさせるために、３´−アミダイトおよび３´−担体を利用する。
【０００４】
0006571663.tif 000002
【０００５】
しかしながら３´→５´合成アプローチは、３´−位から２´−位まで、Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の移動で大きなドローバック（ｄｒａｗ  ｂａｃｋ）を有し、逆もまた同じとなる。
【０００６】
0006571663.tif 000003
【０００７】
対照的に、５´→３´合成アプローチ（「逆方向」合成または「逆合成」と呼ばれる）は、Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の移動という問題をうまく回避している。５´→３´合成アプローチは、オリゴヌクレオチドを生じさせるために、５´−アミダイトおよび５´−担体を利用し、以下のようにまとめられる。
【０００８】
0006571663.tif 000004
【０００９】
米国特許第８，３０９，７０７号および米国特許第８，５４１，５６９号には、ＲＮＡ合成のための５´→３´アプローチについての記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８，３０９，７０７号
【特許文献２】米国特許第８，５４１，５６９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
５´→３´アプローチのおかげで、さまざまな長さのＲＮＡ（例えば３１−ｍｅｒ、４３−ｍｅｒ、７４−ｍｅｒおよび７６−ｍｅｒ）が提供される。例えば、
Ａ．３１−ｍｅｒ  Ｇ−ｒｉｃｈ  ＲＮＡキメラ合成（１６のグアノシンを含むオリゴヌクレオチド）（図１を参照）
配列：５´−ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＡＡｍｅＵ  ＧＡＧ  ＧＧｍｅＵ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＧＣＧｍｅ  Ｕ−３´（配列番号Ｎｏ.４）。
「ｍｅＵ」が修飾塩基２´−Ｏ−メチルウリジンである点に注意する。
Ｂ．４３−ｍｅｒ  ＲＮＡ合成（図２を参照）
配列：ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＵＣＣ  ＧＵＧ  ＧＡＧ  ９８８  ８７６  ７７  Ｃ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ８８８  ７６７  ７６  Ｃ  ＧＧＵ  Ｃ（配列番号Ｎｏ.５）：
「６」は、修飾塩基２´−Ｏ−メチルアデノシンを表し；
「７」は、修飾塩基２´−Ｏ−メチルシチジンを表し；
「８」は、修飾塩基２´−Ｏ−メチルグアノシンを表し；
そして、
「９」は、修飾塩基２´−Ｏ−メチルウリジンを表す点に注意。
Ｃ．７４−ｍｅｒ  ＲＮＡ合成（図３を参照）
配列：ＵＣＣ  ＵＣＵ  ＧＵＡ  ＧＵＵ  ＣＡＧ  ＵＣＧ  ＧＵＡ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＡＣＵ  ＵＵＣ  ＡＡＵ  ＣＣＧ  ＵＡＵ  ＧＵＣ  ＡＣＵ  ＧＧＵ  ＵＣＧ  ＡＧＵ  ＣＣＡ  ＧＵＣ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣ（配列番号Ｎｏ.６）。
Ｄ．７６−ｍｅｒ  ＲＮＡ合成（図４を参照）
配列：ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＡＵＡ  ＧＣＵ  ＣＡＧ  ＵＣＧ  ＧＵＡ  ＧＡＧ  ＣＡＵ  ＣＡＧ  ＡＣＵ  ＵＵＵ  ＵＡＵ  ＣＵＧ  ＡＧＧ  ＧＵＣ  ＣＡＧ  ＧＧＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＣＣＣ  ＵＧＵ  ＵＣＧ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  Ａ（配列番号Ｎｏ.７）
【００１２】
しかしながら、特にＲＮＡ合成のための５´→３´アプローチの適用において、さらに長いＲＮＡ（例えば１００−ｍｅｒ〜２００−ｍｅｒ）の合成が達成される必要がある。
【００１３】
並行して、複数の状況により、さらに長いＲＮＡの研究が非常に重要となっている。
（Ａ）非コ−ドＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、哺乳類のＸ染色体不活性化を制御することが公知で、スモールＲＮＡを産生するために加工されてもよい。
（http://genesdev.cshlp.org/content/23/13/1494.long）
（Ｂ）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構は、転写後に遺伝子発現を制御するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の生成における役割を十分に特徴づける。
ｍｒｈｌとして公知の２．４−ｋｂ非スプライス、ポリアデニル化核保持ｎｃＲＮＡは、８０−ｎｔスモールＲＮＡを産生するために、Ｄｒｏｓｈａにより加工される。
（Ｃ）ｍｉＲＮＡおよびｐｉｗｉ−干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が最近最も注目されているが、長いＲＮＡ転写物は、異なる固有とされる機能を有するスモールＲＮＡへ加工する際の制御において、重要な役割を有する。
（Ｄ）長いｎｃＲＮＡは、スモールＲＮＡを産生するために加工可能であるが、他の転写物がどのように加工されるにも影響することができる。（例えば、スモールＲＮＡに切られるそれらの機能を調整するか、またはそれらのｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングパターンを変更することによって）
(Ｅ)ｎｃＲＮＡは、他の転写物にスモールＲＮＡを産生させないようにする。
(Ｆ)非コ−ドＲＮＡおよびホルモン制御は、新生の分野である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
以下の化学式のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセス：
0006571663.tif 000005
ここで、
Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、６−オキソプリン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−フルオロウラシル、７−デアザ−アデニン、７−デアザアデノシンおよび５−フルオロサイトシンからなる群から選択される１種であり；
ｎは、整数１００〜約２００であり；
Ｌは、ヌクレオシドまたは、リンカーまたはスペーサを有するコレステロール、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の２´、５´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の２´、５´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の２´、５´−結合デオキシリボース単位からなる群から選択される非ヌクレオシド配位子であり
ここで、Ｌは、介在するリン酸塩を介してＲＮＡヌクレオチドの３´末端に付着され；そして、
【００１５】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成プロセスは、ＲＮＡヌクレオチドの５´末端から３´末端への方向であり、当該プロセスは、以下のステップを有する。 
（ａ）化学式２で表されるヌクレオシドを使用し、 
0006571663.tif 000006
（化学式２） 
ここで、
Ｍは、化学式Ｙ−Ｃ（Ｏ）で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につながるリンカーであり、 
ここで、Ｙは、２個の炭素と２０個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして、 
Ｙは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）−および−ＮＲ６−から成り、Ｒ６は、水素ラジカル、または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキルまたは置換アルアルキルであり、 
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、 
Ｒは、 
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり、そして、 
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、Ｒは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、そして、 
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒは存在せず、 
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシン）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、 
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−、１−（５−メチル−ウラシリル）−、１−（５−フルオロ−ウラシリル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−、９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−、および、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、 
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる群から選択されるものであり、
【００１６】
（ｂ）オリゴヌクレオチド合成装置上の化学式１で表されるホスホラミダイトを配置し、
0006571663.tif 000007
（化学式１） 
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、 
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、 
Ｒ４は、 
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒ４はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり；そして、 
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、Ｒ４は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され、 
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒ４は存在しないように、 
選択され； 
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）アデニニル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシン）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか、または、 
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−、１−（５−メチル−ウラシリル）−、１−（５−フルオロ−ウラシリル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−、９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−、７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−、および、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり、 
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる群から選択されるものであり、 
Ｒ１は、アルキルまたはアリールラジカルであり、 
Ｒ２は、アルキルまたはアリールラジカルであり、そして、 
Ｒ３は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルであり、 
Ｂは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基である。
【００１７】
（ｃ）化学式２で表されるヌクレオシド固相担体から保護基Ｚを取り除き、
【００１８】
（ｄ）保護基を少なくとも一つ有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、補助試薬の混合物を用いて、オリゴヌクレオチド合成装置において、化学式２のヌクレオシドおよび式１のホスホラミダイトをカップリングすることにより、ＲＮＡ合成のプロセスを実行し、
【００１９】
（ｅ）ホスホラミダイトにＬ基を提供し、 
【００２０】
（ｆ）Ｌ基を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、オリゴヌクレオチドの末端に、Ｌ基を伴うホスホラミダイトを加え、
【００２１】
（ｇ）固相担体からＬ基を有するオリゴヌクレオチドを分離し、
【００２２】
（ｈ）オリゴヌクレオチドから少なくとも一つの保護基を取り除き、
【００２３】
（ｉ）オリゴヌクレオチドを生じさせるためにシリル保護基を取り除き、
【００２４】
（ｊ）オリゴヌクレオチドを沈殿させ、
【００２５】
（ｋ）純度を決定するためにオリゴヌクレオチドを分析する。
【００２６】
ここで、ステップ（ｄ）における補助試薬の混合物は、フェノキシ樹脂無水酢酸／テトラヒドロフラン／ピリジン、１０％のＮ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、３％のトリクロロ酢酸（トルエン中）、０．０５Ｍのヨウ素／ピリジン／水／テトラヒドロフランおよび０．３５Ｍの５−エチルチオ−１−Ｈ−テトラゾール（アセトニトリル中）から成る。
【００２７】
Ｌはリンカーまたはスペーサを有するコレステロールであり、ｎは整数１００〜約２００である、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセス。
【００２８】
Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ｎは整数１００〜約２００である、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセス。
【００２９】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセスによりＲＮＡオリゴヌクレオチドが合成される、ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【００３０】
逆ＲＮＡ合成方法論を用いる１００−ｍｅｒ〜約２００−ｍｅｒの長鎖ＲＮＡのＲＮＡ合成の方法。
【００３１】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、デオキシ、バックボーン修飾塩基、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ塩基を含むＲＮＡキメラに合成される、長鎖ＲＮＡの精製の方法。
【００３２】
末端、分岐点、または、ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖内に、一つ以上の５´、２´、２´、３´結合を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法。
【００３３】
天然および修飾ヌクレオシド、脱塩基部位、逆脱塩基部位、発色団または配位子を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法。
【００３４】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、さらに、発色団、配位子、一リン酸エステル基、二リン酸エステル基または三リン酸エステル基を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法。
【００３５】
一つ以上のデオキシ、修飾デオキシ、または修飾リボヌクレオシドとの分岐点を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法。
【００３６】
ＨＰＬＣゲル電気泳動またはＲＮＡ精製技術を用いるＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製ステップをさらに含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法。
【００３７】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの表面への標識および付着の方法。
【００３８】
分子生物学研究開発において、上記の方法により精製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを利用する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】３１−ｍｅｒＲＮＡ合成を目的とする図である。
【図２】４３−ｍｅｒＲＮＡ合成を目的とする図である。
【図３】７４−ｍｅｒＲＮＡ合成を目的とする図である。
【図４】７６−ｍｅｒＲＮＡ合成を目的とする図である。
【図５】１００−ｍｅｒ合成のトリチルの棒グラフである。
【図６】１５０−ｍｅｒ合成のトリチルの棒グラフである。
【図７】２００−ｍｅｒ合成のトリチルの棒グラフである。
【図８】２００−ｍｅｒ合成のＵＶ分析である。
【図９】それぞれ、ポリリボアデノシン１００−ｍｅｒ合成のＩＥ  ＨＰＬＣ、ポリリボアデノシン１５０−ｍｅｒ合成のＩＥ  ＨＰＬＣ、およびポリリボアデノシン２００−ｍｅｒ合成のＩＥ  ＨＰＬＣである。
【図１０】ポリリボアデノシン１００−ｍｅｒおよび２００−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は概して「長いＲＮＡ」に関連し、それは、おおよそ少なくとも１００−ｍｅｒであり、そして約２００−ｍｅｒもしくはさらに長くできるＲＮＡオリゴヌクレオチドとして、一般に理解されている。用語「長いＲＮＡ」および「より長いＲＮＡ」は、本発明の全体にわたってほとんど同じ意味で使用される。
【００４１】
約１００−ｍｅｒ〜約２００−ｍｅｒの範囲の長いＲＮＡの合成を達成するためには、高効率のカップリングと、低減されたカップリングタイムとの両方が重要となる。
0006571663.tif 000008
【００４２】
約１００−ｍｅｒ〜約２００−ｍｅｒの範囲の長いＲＮＡの合成を達成するためには、その過程で補助剤の新規な組合せを使用することが重要である。実験の詳細は後述する。
【００４３】
表１：ポリリボアデノシンオリゴヌクレオチド１００−ｍｅｒ、１５０−ｍｅｒおよび２００−ｍｅｒの合成
0006571663.tif 000009
ここで、「５」は、５´−末端リン酸塩を表す
【００４４】
本発明によれば、５´から３´方向のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するプロセスは、以下の化学式のＲＮＡオリゴヌクレオチドを目的とする。
0006571663.tif 000010
ここで、
Ｂは、アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシル、イノシン、５−メチル−シトシン、５−メチル−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−アデノシンおよび５−フルオロ−サイトシンからなる群から選択される１種であり；
ｎは、整数１００〜約２００であり；
Ｌは、ヌクレオシド、リンカーまたはスペーサを有するコレステロールからなる群から選択される非ヌクレオシド配位子、ビオチン、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、アミノリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、タンパク質、発蛍光団、クエンチャー色素、一つ以上の２´、５´−結合デオキシヌクレオシド単位、一つ以上の２´、５´−結合リボヌクレオシド単位、および一つ以上の２´、５´−結合デオキシリボース単位であり、
ここで、Ｌは、介在するリン酸塩を介してＲＮＡヌクレオチドの３´末端に付着される。
【００４５】
ＲＮＡのプロセスは、ＲＮＡヌクレオチドの５´末端から３´末端への方向において合成される。そして、プロセスは次の工程を含む：
（ａ）ヌクレオシドに化学式２で表される固相担体を使用し、
0006571663.tif 000011
（化学式２）
ここで、
Ｍは、水素ラジカルまたはリンカーであり；
Ｍがリンカーである場合、化学式Ｙ−Ｃ（Ｏ）で表され、付加的にオリゴヌクレオチド合成に適する固相担体につなげられ、
ここで、Ｙは、２個の炭素と２０個の炭素間の長さを有する炭化水素ジラジカル部分であり、そして、Ｙは、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリールおよびアルアルキルからなる群から選択され、そして、炭化水素ジラジカル部分は、付加的に、介在する−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）−および−ＮＲ６−から成り、Ｒ６は、水素ラジカルであるか、または、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキルまたは置換アルアルキルであり；
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され、そして、
Ｒは、
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり；そして、
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、ＲはＲ５Ｘで表され、ｘは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され；そして、
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒが存在しないように、
選択され；
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）アデニニル）、１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか；または、
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５メチルシトシニル）−１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−５−メチルシトシニル）−１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−１−（５−メチル−ウラシリル）−１−（５−フルオロ−ウラシリル）−１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザアデニル）−９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−そして、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり；
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる保護基である；
【００４６】
（ｂ）オリゴヌクレオチド合成装置上に、化学式１で表されるホスホラミダイトを配置し、
0006571663.tif 000012
（化学式１）
ここで、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり；
Ｗは、酸素ジラジカル、Ｎ−Ｈジラジカルおよびフッ素ラジカルからなる群から選択され；そして、
Ｒ４は、
Ｗが酸素ジラジカルである場合、Ｒ４はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）またはトリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）であり；そして
ＷがＮ−Ｈジラジカルである場合、Ｒ４はＲ５Ｘで表され、ｘは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、アセチル、アルカノイルおよびアロイルからなる群から選択され；そして、
Ｗがフッ素ラジカルである場合、Ｒ４は存在しないように、
選択され；
Ｂは、９−（Ｎ６−ベンゾイルアデニニル）−、９−（Ｎ６−アセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−フェノキシアセチルアデニニル）−、９−（Ｎ６−イソプロピルフェノキシアセチルアデニニル）−、１−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）アデニニル）１−（Ｎ４−ベンゾイルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）シトシニル）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアセチルシトシン）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、９−（Ｎ２−イソブチルグアニン）−、９−（Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアニン）−、９−（Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチルグアニン）−、１−（Ｎ４−フェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−イソプロピルフェノキシアセチルシトシニル）−、および、１−ウラシリル−からなるヌクレオシド塩基ラジカルからなる群から選択されるか；または、
Ｂは、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−５−メチルシトシニル）−、１−（Ｎ４−アセチル−５−メチルシトシニル）−、１−（５−メチル−ウラシリル）−、１−（５−フルオロ−ウラシリル）−、１−（Ｎ４−ベンゾイル−５−フルオロシトシル）−、９−（Ｎ６−ベンゾイル−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザアデニル）−、９−（Ｎ２−イソブチル−７−デアザグアニル）−、および、９Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル）−７−デアザグアニル）−からなる群から選択される修飾ヌクレオシド塩基ラジカルであり；
Ｚは、ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリフェニル（ＭＭＴ）およびトリメトキシトリフェニル（ＴＭＴ）からなる保護基であり；
Ｒ１は、アルキルまたはアリールラジカルであり；
Ｒ２は、アルキルまたはアリールラジカルであり；そして、
Ｒ３は、シアノエチル、アルキルまたはアリールラジカルである。
Ｂは、水素であるか、または、アミン保護基を有する各一級アミンで付加的に官能基化される核酸塩基である。
【００４７】
（ｃ）化学式２で表されるヌクレオシド固相担体から保護基Ｚを取り除き、
【００４８】
（ｄ）保護基を少なくとも一つ有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、補助試薬の混合物を用いて、オリゴヌクレオチド合成装置において、化学式２のヌクレオシドおよび式１のホスホラミダイトをカップリングすることによりＲＮＡ合成のプロセスを実行し、
【００４９】
（ｄ）Ｌ基を有するホスホラミダイトを提供し、
【００５０】
（ｅ）Ｌ基を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるために、オリゴヌクレオチドの末端に、Ｌ基を有するホスホラミダイトを加え、
【００５１】
（ｆ）固相担体からＬ基を有するオリゴヌクレオチドを分離し、
【００５２】
（ｇ）オリゴヌクレオチドから少なくとも一つの保護基を取り除き、
【００５３】
（ｈ）オリゴヌクレオチドを生じさせるためにシリル保護基を取り除き、
【００５４】
（ｉ）オリゴヌクレオチドを沈殿させ、そして
【００５５】
（ｊ）純度を決定するためにオリゴヌクレオチドを分析する。
【００５６】
補助試薬は、ＣＡＰ  Ａ（フェノキシ樹脂無水酢酸／テトラヒドロフラン／ピリジン）、ＣＡＰ  Ｂ（１０％のＮ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン）、ＤＭＴ除去試薬（３％のＴＣＡ（トルエン中））、酸化溶液（０．０５Ｍのヨウ素／ピリジン／水／テトラヒドロフラン）および活性化試薬（０．３５Ｍの５−エチルチオ−１−Ｈ−テトラゾール（アセトニトリル中））から成る。
【００５７】
本発明によれば、長いＲＮＡは、１００〜２００のモノマーを有するＲＮＡオリゴマである。この目的を達成するために、このプロセスには補助試薬が重要である。ＲＮＡの逆合成（すなわち、５´−から３´−方向）において、補助試薬は、通常、ＴＣＡ／ＤＣＭ、ＤＣＡ／ＤＣＭ，ＴＣＡ／トルエン、ＤＣＡ／トルエン、無水アセトニトリル、ＣＡＰ  Ａ、ＣＡＰ  Ｂ、さまざまな濃度のヨウ素／ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ、適切な硫化試薬の１つ、アセトニトリル溶液としての適切な活性化試薬の１つの組合せである。
【００５８】
補助試薬は完成までモノマー５´−アミダイトの高いカップリングを許容するので、本発明で利用される補助試薬が有用である。従って、カップリングタイムがより短い０．３ＭのＢＭＴ（５−ベンジルチオテトラゾール）または０．５ＭのＥＴＴ（５−チオエチルテトラゾール）のような補助試薬には特に関連しており、異なるカップリングタイムを使用し、より短いＲＮＡオリゴマのために使用される同じ試薬と比較して、高いカップリング効率という固有の結果をもたらす。
【００５９】
本発明の一実施例によれば、Ｌはリンカーまたはスペーサを有するコレステロールであり、そして、ｎは整数１００〜約２００である。
【００６０】
本発明の他の一実施例において、Ｌはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、そして、ｎは整数１００〜約２００である。
【００６１】
本発明の他の実施例は、上記のプロセスにより合成される、ｎ＝１００、１５０または約２００であるＲＮＡオリゴヌクレオチドに関連する。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは５´から３´への方向で合成されるので、「ｍ＋１」種と呼ばれる不純物は存在しない。
【００６２】
両方の方法論により合成される３´−末端の３´−コレステロール抱合を有するオリゴヌクレオチドに関する我々のデータから、すなわち、３´→５´方向および５´→３´方向は、公開された我々の特許ではっきりと示される。
【００６３】
本発明の他の実施例は、逆ＲＮＡ合成方法論を用いた１００−ｍｅｒ〜２００−ｍｅｒの長鎖ＲＮＡのＲＮＡ合成の方法に関連がある。
【００６４】
本発明はまた、デオキシ、バックボーン修飾塩基、修飾ＤＮＡおよび修飾ＲＮＡ塩基から成る、長鎖ＲＮＡキメラを含む。長鎖ＲＮＡは、逆方法論を用いて、末端、分岐点、または、鎖の内で、一つ以上の５´、２´、２´、３´結合を有する。
【００６５】
本発明によれば、他の実施例は、逆合成方法論を用いる、天然および修飾ヌクレオシド、脱塩基部位、逆脱塩基部位、発色団および配位子を含む長鎖ＲＮＡである。
【００６６】
本発明の他の実施例は、逆合成方法論を用いる、発色団、配位子、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステル基から成る長鎖ＲＮＡである。
【００６７】
本発明のさらにもう一つの実施例は、逆ＲＮＡ方法論を用いる、一つ以上のデオキシ−、修飾デオキシ、または修飾リボヌクレオシドとの分岐点を有する長鎖ＲＮＡである。
【００６８】
さらにまた、本発明は、ＨＰＬＣゲル電気泳動または他のＲＮＡ精製技術による、逆方法論により合成される長鎖ＲＮＡの精製の方法を含む。
【００６９】
本発明はまた、逆方法論により合成される長鎖ＲＮＡの、表面（例えばさまざまな種類のチップ、ポリエチレングリコール、合成されるオリゴヌクレオチドの３´−末端を介する担体）への標識および付着の方法を含む。このように、オリゴヌクレオチドへの官能基（例えばアミン官能）の導入は、アルデヒド官能を含むチップまたは表面への付着を許容する。
【００７０】
本発明は、分子生物学研究開発の逆方法論により合成される長鎖ＲＮＡを使用する方法を更に含む。本発明によるプロセスによって合成されるＲＮＡは、３´→５´−方向における通常のプロセスにより合成されるＲＮＡとは区別される、生化学的性状を所有することを示す。
【００７１】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドＳｅｑ．＃１（配列番号Ｎｏ.１）（１００−ｍｅｒ）、Ｓｅｑ．＃２（配列番号Ｎｏ.２）（１５０−ｍｅｒ）、Ｓｅｑ．＃３（配列番号Ｎｏ.３）が、合成される。Ｓｅｑ．＃２（２００−ｍｅｒまで延長）は、Ｓｅｑ．＃３を除いて、１  ｍｉｃｒｏｍｏｌｅスケ−ルの５´→３´方向のＲＥＶ−ＲＮＡホスホロアミダイト化学を用いて、合成された。Ｓｅｑ．＃３は、０．５υｍｏｌｅスケ−ルで合成された。合成は、標準ＲＮＡを用いてＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００合成装置で実行された。（１υｍｏｌｅサイクル、および固相担体を有するモノマーのカップリングタイム、６．０分）オリゴヌクレオチドにおいて合成５は、汎用ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ３０００Ａ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃａｔ  ＃Ｎ−４０００−３０）を表す。
【００７２】
（１）使用アミダイト
Ｎ６−ｔｂｐａｃ−２´−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３´−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン−５´−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト。
Ｌｏｔ  ＃ＡＴ２３９−９（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃａｔ  ＃ＡＮＰ−３４０７）
【００７３】
（２）使用ＣＰＧ
汎用ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ３０００Ａ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃａｔ  ＃Ｎ−４０００−３０、Ｌｏｔ  ＃ＡＴ１５７−９
【００７４】
（３）使用補助試薬
無水アセトニトリルＲＮ−１４４７
ＣＡＰ  Ａ（フェノキシ酢酸無水物／ＴＨＦ／ピリジン）
ＣＡＰ  Ｂ（１０％のＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ）
ＤＭＴ除去試薬（３％のＴＣＡ（トルエン中））
酸化溶液（０．０５Ｍのヨウ素／ピリジン／Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ）
活性化試薬、５−エチルチオ−１−Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）（０．３５Ｍ（アセトニトリル中））
【００７５】
最初に、６０ｍｌの促進（ｅｘｐｅｄｉｔｅ）ボトルのアミダイトを使用し、溶液０．１５Ｍを生成するために、乾燥アセトニトリルにおいて溶解する。その後、モノマーボトルをポ−ト＃Ａ上の合成装置に取り付ける。
【００７６】
合成の後、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）固相担体は、３．０ｍｌのジエチルエ−テルで洗浄され、２ｍｌのミクロチュ−ブへ移動された。オリゴヌクレオチドは、Ｓｅｑ．＃１の培養により、６５℃で４５分、１．２ｍｌの３３％のメチルアミン（無水エタノ−ル中）で、ＣＰＧと開裂および脱保護された。（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ  ＃５３４１０２−２５０ｍｌ、Ｌｏｔ＃ＳＨＢＣ２９３３Ｖ）
【００７７】
Ｓｅｑ．＃２および３では、６５℃で９０分、１．２ｍｌの３３％のメチルアミン（無水エタノ−ル中）。（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃５３４１０２−２５０ｍｌ、Ｌｏｔ＃ＳＨＢＣ２９３３Ｖ）その後、−２０℃で３０分間、管を冷却する。それから、上澄み液は取り除かれ、そして、ＣＰＧは５００ｕｌの水で洗浄され；上澄み液は、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃに溜められ、乾燥された。超音波浴を使用し４５℃で４時間、ｔ−ブチルジメチルシリル保護基は、１０００ｕｌのトリエチルアミンフッ化水素酸塩での処理により、ＲＮＡ残基から取り除かれた。（Ｏａｋｗｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔ  ＃００３０２９、Ｌｏｔ  ＃Ｆ２９Ｅ）オリゴヌクレオチドは、３．０ｍｌのｎ−ブタノ−ルにより沈殿した。サンプルは−２０℃で１時間、冷却され、それから１０分間、５，０００ｇで遠心分離された。
上澄み液は静かに移され、そして、ペレットはもう一度、ｎ−ブタノ−ルで洗浄された。
最後に、５００ｕｌアセトニトリルで洗浄され、再び、５０００回転数／分で５分間、遠心分離し、上澄み液は静かに移された。ペレットは、１０００ｕｌのＭ．Ｑ水に溶かされ、そして、ＯＤ（Ｃｒｕｄｅ  ｄｅｓａｌｔ）を点検する。
【００７８】
それからオリゴヌクレオチドは、緩衝液Ａ＝（５．０％、１．０ＭのＴＲＩＳおよび１０．０％のメタノ−ル）ｐＨ７．５の過塩素酸ナトリウムの直線勾配を用いて、イオン交換ＨＰＬＣにより精製された。緩衝液Ｂ＝０．５Ｍの過塩素酸ナトリウム（緩衝液Ａ中）。
【００７９】
全てのサンプルは、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ）上に装填され、４０分にわたる直線０％〜８５％の過塩素酸ナトリウム勾配により溶離された。サンプルは２９５ｎｍでモニタされ、そして、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークが集められ、５．０ｖｏｌｕｍｅの２％のＬｉＣｌＯ４（アセトン中）を加えることによって沈殿させる。そして、５，０００ｇで１０分間遠心処理が続いた。上澄み液は、静かに移され；ペレットは、エタノ−ルで洗浄された。
【００８０】
１００−ｍｅｒＲＮＡ合成のトリチルの棒グラフが図５に示される。トリチルの棒グラフでは、オリゴのステップ当たりのカップリング効率が一定の方法で続行し、そして、鎖長が成長しても、カップリングの脱落がないことを意味すると分かる。
【００８１】
１５０−ｍｅｒＲＮＡ合成のトリチルの棒グラフが図６に示される。棒グラフから、１５０−ｍｅｒ合成が重要な脱落もなく、一定してスム−ズに進行していると観察される。
【００８２】
２００−ｍｅｒＲＮＡ合成のトリチルの棒グラフが図７に示される。この種の長いオリゴヌクレオチドであっても、ステップ当たりのカップリング効率が一定の方式で続行し、そして、鎖長が成長してもカップリングの重要な脱落がないと観察される。
【００８３】
１００−ｍｅｒ合成、１５０−ｍｅｒ合成および２００−ｍｅｒ合成のＩＥ  ＨＰＬＣ（図９）予想通りに、１．０υｍｏｌｅスケ−ルで合成される粗製の１００−ｍｅｒは、予想される溶出時間で幅広いピークを示す。予想通りに、１５０−ｍｅｒの粗製のオリゴヌクレオチドのＩＥ  ＨＰＬＣは、予想される溶出時間でより幅広いピークをさらに示す。
２００−ｍｅｒのＩＥ  ＨＰＬＣは、さらにより幅広いピークで、予想される溶出時間で溶離する。
【００８４】
１００−ｍｅｒおよび２００−ｍｅｒＲＮＡ合成のゲル（図１０）は、８０−ｍｅｒマーカよりわずかにゆっくり移動する１００−ｍｅｒの帯域を示す。２００−ｍｅｒは１００−ｍｅｒよりゆっくり、そして、１５０−ｍｅｒより更にゆっくり移動するのが分かる。
【００８５】
本発明の逆ＲＮＡモノマーホスホラミダイトは、３´−ＤＭＴ基をリボヌクレオシドに含み、２´−ｔＢＤシリル（ｔＢＤＳｉ）−５´−シアノエチルホスホロアミダイト（ＣＥＤ）（構造１６）、３´−ＤＭＴ２´−ｔＢＤシリル−５´−スクシニル−Ｉｃａａ  ＣＰＧ−ｎ−保護ヌクレオシド（構造１７）、または３´−ＤＭＴ−２´−トリイソプロピルシリルオキシメチレン（ＴＯＭ）−５´−ＣＥＤホスホラミダイト基（構造１８）を保有する。
【００８６】
0006571663.tif 000013
構造（１６）
３´−ＤＭＴ−２´−ｔＢＤシリル−５´−アミダイト
（逆ＲＮＡ−ｔＢＤシリル−アミダイト）
【００８７】
0006571663.tif 000014
構造（１７）
３´−ＤＭＴ−２´−ｔＢＤシリル−５´−ＣＰＧ
（逆ＲＮＡ−ｔＢＤｓｉｌｙｌ−５´−Ｉｃａａ  ＣＰＧ）
【００８８】
0006571663.tif 000015
構造（１８）
３´−ＤＭＴ−２´−ＴＯＭ（トリイソプロピルシリルオキシメチレン）−５´−アミダイト
（逆ＲＮＡ−ＴＯＭ−５´−アミダイト）
【００８９】
本発明はまた、開示された組成物を調製する方法を教示する。最初の塩基（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂａｓｅ）は、イソプロピリデン保護ヌクレオシド２０を産出するヌクレオシド１９を保護した。イソプロピリデン基除去が続くベンゾイル化は、５´−ベンゾイル化ヌクレオシド２２を産する。ピリジンのＴＢＤＭＳ塩化物との連続的なシリル化反応は、それぞれ３：２の比率の２´−および３´−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド（２３および２４）の混合物を提供する。カラムクロマトグラフィ後に、異性体は分離され、％収率で単離された。異性体２３の更なる反応により、３´−ＤＭＴ−２´−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド２６が産出された。
【００９０】
すなわち、３´−ヒドロキシル基の次の官能基化の間に、２´−ＴＢＤＭＳ基の重要な移動があると考えられる。
0006571663.tif 000016
スキ−ム（１）
【００９１】
ＤＭＴ−（４，４−ジメトキシトリチル）を有する３´−ヒドロキシル基の官能基化の間、重要な移動の発生は認められなかった。さらに、３´−ＴＢＤＭＳ保護異性体２４も、ピリジン中の塩化ＤＭＴを有する異性体２３と同じトリチル化反応に関与していた。しかしながら、ヌクレオシド２５はその反応で観察されなかった。したがって、２´−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド２３とその異性体２４のコンタミネ−ションの場合には、不必要な異性体２５はトリチル化条件において形成されず、所望のヌクレオシド２６が高純度で単離できる。３´−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシド２４は、所望のプロダクトの合成において利用することができ、スキ−ム１で概説される異性化法のために２３に変換することができる。
【００９２】
ＣＥＤＰおよびＤＩＰＡテトラゾール酸塩を用いて、ホスフィチル化反応が続く、メタノ−ル中の水酸化ナトリウムによる５´−ベンゾイル基の除去により、最終的な逆ホスホラミダイト１６を産出される。
【００９３】
0006571663.tif 000017
スキ−ム（２）
【００９４】
逆ホスホラミダイトを用いるオリゴヌクレオチド合成は、５´→３´方向で実行された。
【００９５】
以下に設けられる実施例は、本発明をさらに説明する。これらは単に例示的なものであって、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。
【００９６】
特に、以下の実施例は、本発明の化合物を得るための合成法を示す。本発明の化合物を調製するのに役立つ出発原料およびその中間体は、市販であるか、または周知の合成法および試薬を使用して、市販の材料から調製されることができる。すべてのオリゴヌクレオチド配列が左側の５´−末端から右側の３´−末端へ記載される。３´−ＤＭＴ−５´−ＣＥＤホスホラミダイトのカップリング効率はステップ毎に９９％を超えるカップリングを示し、高純度ＲＮＡを導く。多量のホモポリマ−および２０〜２１−ｍｅｒｓオリゴヌクレオチドは、これらのモノマーホスホラミダイトを用いて合成された。
【００９７】
我々のデータは、３´→５´方向の合成の標準的な３´−ＣＥＤホスホラミダイトと比較して、逆ＲＮＡモノマー（５´→３´−方向）を用いるオリゴ合成の間、カップリング効率に差異がないことを示す。
【００９８】
もう一つの実施例では、本発明は、オリゴヌクレオチドの３´−末端での修飾または標識とともにリボ核酸オリゴマの合成のための方法を提供する。親油性、長い鎖状配位子または発色団の蛍光体および消光剤を必要とする３´−末端修飾ＲＮＡの合成は、対応するホスホラミダイトを用いて行うことができる。我々のデータは、通常の方法と比較して、５´→３´−方向合成には、非常に明確な利点を有することを示す。
【００９９】
加えて、固相担体（例えばＨＥＧまたはＰＥＧ−２０００）で利用できない３´−修飾は、５´→３´方向の合成を用いて簡単に導入することができ、逆相ＨＰＬＣにより精製できる。オリゴヌクレオチドはＲＰ  ＨＰＬＣにより精製され、９５〜９８％の純粋なプロダクトを産出した。
【実施例】
【０１００】
下記の注は、さまざまな革新、利点および可能性、およびいくつかのプロダクトおよび本発明のプロセス詳細を要約する。
このリストは、便利で例示的な要約として役立つことを意味し、完全ではなく、網羅的でなく、制限するものではない。
【０１０１】
化学式１の誘導体化されたヌクレオシドおよびホスホラミダイト
0006571663.tif 000018
ここで、
Ｙは、酸素または硫黄であり；
Ｗは、酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり；
Ｗが硫黄でないときに、Ｒ４はＴＢＤＭＳ、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Ｆｍｏｃ、アルキル、アリールまたはアセチルのようなシリルエ−テルであり；
Ｗが硫黄であるときは、Ｒ４はベンゾイル、アセチルまたは二硫化物であり；
Ｚは、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＭＴ保護基であり；
Ｒ１およびＲ２は、アルキルまたはアリール基からそれぞれに選択され；
Ｒ３は、シアノエチル、アルキルまたはアリールである。
【０１０２】
化学式２の固相担体に付着した誘導体化されたヌクレオシド。
0006571663.tif 000019
ここで、
Ｍは、水素ラジカルまたはＹ−ＣＯ−であり；
Ｙは、長さ２〜２０の原子の鎖であり、酸素、窒素および硫黄からなる群から独立して選択される一つ以上のヘテロ原子によって、付加的に置換される炭化水素鎖を主成分としており、または、固相担体への結合に適するいずれかのリンカー（例えば、ＣＰＧ、ポリスチレン、またはオリゴヌクレオチド合成に適する他のいずれかの固相担体）であり；
Ｗは、酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり；
Ｗが硫黄でない場合は、Ｒは、シリルエ−テル（例えばＴＢＤＭＳ、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Ｆｍｏｃ、アルキル、アリール、アミノまたはアセチル）であるか、Ｗが硫黄である場合には、Ｒはベンゾイル、アセチルまたは二硫化物であり；
Ｚは、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＭＴ保護基である。
【０１０３】
合成ＲＮＡオリゴマの化学式１０に示されるオリゴヌクレオチド結合構造の５´から３´方向を介した、逆方向の方法。
ＲＮＡは、天然または修飾された核酸塩基、ｇａｐｍｅｒ、ホスホジエステル、ホスホロチオエ−ト、ホスホロセレン酸塩から成る。合成は自動、半自動のＤＮＡ／ＲＮＡ、または他の合成装置、または手動で行うことができる。合成は、ミクログラムからキログラムスケ−ルといった、さまざまなスケ−ルで行うことができる。
【０１０４】
0006571663.tif 000020
化学式（１０）
【０１０５】
対応するホスホラミダイト（化学式１１）を用いたＲＮＡ分子の３´−末端への修飾の付着の方法であり、Ｌは、ビオチンまたはコレステロールのような修飾であるか、または蛍光体、クエンチャー色素、ポリエチレングリコールおよびペプチドからなる群から選択される。
【０１０６】
0006571663.tif 000021
化学式（１１）
【０１０７】
高純度ＲＮＡを生じさせる逆方向（５´→３´）ＲＮＡ合成を用いた、自動の高純度ＲＮＡの合成。
【０１０８】
コレステロール、ヘキサエチルオキシグリコール（ＨＥＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といた、巨大分子を有するＲＮＡの３´−共役。
【０１０９】
自動化された逆方向（５´→３´）のＲＮＡ合成の応用は、Ｍ＋１オリゴヌクレオチド不純物をなくす。
【０１１０】
前述のこの方法により取り込まれる修飾ヌクレオシドは、５−フルオロ−Ｕ、５−フルオロ  ｄＵ、５−フルオロ−ｄＣ、５−フルオロ−ｒＣ、プソイドウリジン、５−メチル−ｄＵ、５−メチル−ｒＵ、５−メチル−ｄｃ、５−メチル−ｒＣ、５−ブロモ−ｄＵ、５−ブロモ−ｒＵ、５−ブロモ−ｄｃ、５−ブロモ−ｒＣ、
５−ヨ−ド−ｄＵ、５−ヨ−ド−ｒＵ、５−ビニル−ｄＵ、５−ビニル−ｒＵ、５−ビニルチミジン、Ｎ−３メチルデオキシウリジン、Ｎ−３  メチル-リボウリジン、Ｎ−３メチルチミジン、４チオウリジン、４−チオ−２´−デオキシウリジン、２,６−ジアミノプリンデオキシリボシド、Ｎ−３  メチルリボチミジン、２、６−ジアミノプリンリボシド、８−ブロモ２´−デオキシアデノシン、８−ブロモ−ｒ−アデノシン、８−オキソ−デオキシアデノシン、８−オキソ−リボアデノシン、８−オキソ−２´−デオキシ−アデノシン、８−オキソ−リボアデノシン、８−オキソ−デオキシイノシン、８−オキソ−リボ−イノシン、８−ブロモ−デオキシイノシン、８−ブロモ−リボ−イノシン、Ｎ−１メチルリボアデノシン、Ｎ−１メチル２´−デオキシアデノシン、Ｎ−１メチル２´−デオキシイノシン、Ｎ−１メチルリボアデノシン、Ｎ−１メチルデオキシグアノシン、Ｎ−１−メチル−リボグアノシン、エテノアデノシン、エテノ２´−デオキシアデノシン、プリン２´−デオキシリボシド、プリン-ヌクレオシド、２−アミノプリン−２´−デオキシリボシド、２−アミノプリン−リボヌクレオシドに限定されるものではないが、一つ以上のプリンまたはピリミジン修飾から成ることができる。
【０１１１】
この方法により合成されるＲＮＡの内部位置の標識は、例えば、フルオレセイン−Ｃ−５  ｄＴ、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）−Ｃ−５チミジン、内部カルボキシル基５−ｄＵ−メチルアクリレ−ト、ビオチンｄＴ（ｄＵのＣ−５へスペーサを介して付着のビオチン）、アミノ−ｄＴ（Ｃ−５  ｄＵにＣ−６スペーサを介して付着の末端アミノ）に限定されるものではないが、発色団によって達成可能である。
【０１１２】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−フルオロリボヌクレオシド（２´−ＦＡＮＡ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、）、イノシン、および２´−フルオロを含む修飾ヌクレオシドから、成ることができる。
【０１１３】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−メトキシリボヌクレオシド（２´−ＯＭｅ−）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２´−メトキシを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【０１１４】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で２´−デオキシ−２´−アミノリボヌクレオシド（２´−ＮＨ２）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２´−アミノを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【０１１５】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−末端アミノリボヌクレオシド（２´−末端ＮＨ２）から成ることができ、ヌクレオシド（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２´−末端アミノを含む修飾ヌクレオシド上の２−１０の原子から、スペーサを介して付着される。
【０１１６】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−メトキシエトキシリボヌクレオシド（２´−ＭＯＥ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２´−ＭＯＥを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【０１１７】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、他の２´−Ｏ−アルキル基（例えば、２´−デオキシ−２´−エトキシ、プロパルギル、ブチンリボヌクレオシド（２´−ＯＥｔ、Ｏ−プロパルギル、２´−Ｏ−ブチン）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ））、イノシン、および２´−２´−ＯＥｔ、Ｏ−プロパルギル、２´−Ｏ−ブチンを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【０１１８】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−フルオロアラビノヌクレオシド（２´−ＦＡＮＡ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２´−ＦＡＮＡを含む修飾ヌクレオシド）から成ることができる。
【０１１９】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置で、２´−デオキシ−２´−フルオロ  ４´−チオアラビノヌクレオシド（４´−Ｓ−ＦＡＮＡ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシンおよび４´−Ｓ−ＦＡＮＡを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【０１２０】
ＲＮＡは、配列の３´−末端、または、配列の５´−末端で、配列内の一つ以上の２´−５´−結合で行われる。
【０１２１】
３´−末端を有するＲＮＡは、この逆付着のデオキシヌクレオシド（例えばｄＴ、ｄｃ、ｄｇ、チミジン）を含む本発明の方法により合成されることができ、それらの３´−ヒドロキシル官能基を介して付着される。
【０１２２】
３´−末端を有するＲＮＡは、この逆付着のリボヌクレオシド（例えばｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）を含む発明の方法により合成されることができ、それらの２´または３´−ヒドロキシル官能基を介して取り付けられる。
【０１２３】
逆ＲＮＡ合成は、２´−トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）保護基を含み、達成されてもよい。
【０１２４】
逆ＲＮＡ合成は、２´−ｔ−ブチルジチオメチル（ＤＴＭ）保護基を含み、達成されてもよい。
【０１２５】
逆ＲＮＡ合成は、２´−デオキシ−２´−フルオロ−ベ−タ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）から成る修飾塩基を含み、達成されてもよい。
【０１２６】
逆ＲＮＡ合成は、４´−チオ−２´−デオキシ−２´−フルオロ−ベ−タ−Ｄ−アラビノ核酸（４´−チオ−ＦＡＮＡ）から成る修飾塩基を含み、達成されてもよい。
【０１２７】
逆ＲＮＡ合成は、２´−Ｏ−メチル修飾を用いた修飾された糖を含み、達成されてもよい。
【０１２８】
逆ＲＮＡ合成は、二環式のロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）を用いて達成されてもよい。
【０１２９】
逆ＲＮＡ合成は、アルトリト−ル糖修飾オリゴヌクレオチド（ＡＮＡ）から成る修飾された糖を使用してもよい。
【０１３０】
逆ＲＮＡ合成は、疎水性部分上のアミダイト官能基を介してか、または、末端アミノ基を有する逆合成されたオリゴヌクレオチドの３´−末端のアミノリンカーを介して、ＲＮＡの３´−末端で、親油性または疎水性基の共役のステップを含むことができる。後の合成は、オリゴヌクレオチドの３´−末端のアミノと、親油性部分上のカルボン酸官能基との間のカップリングステップを必要とする。親油性部分は、さまざまなグリコール（例えばトリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコール、さまざまな脂質）から成る。
【０１３１】
逆ＲＮＡ合成は、この種のペプチドの遊離アミン官能基、または逆合成ＲＮＡ上の３´−末端カルボン酸官能基を用いて、ペプチド（例えば細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）または膜貫通ペプチド（ＭＰＰ））の共役のステップを含むことができる。適切なカルボキシル官能基を有するＣＰＰおよびＭＰＰは、逆合成ＲＮＡの３´−末端の遊離末端アミノ官能基にカップリングされることができる。
【０１３２】
逆ＲＮＡ合成は、配列の３´−末端、または、配列の５´−末端で、配列内の２´−５´−結合ＤＮＡ単位または２´−５´−ＲＮＡ単位を含む。
【０１３３】
当業者は、ル−チンの実験法以上のものを用いなくても、本明細書に記載される本発明の特定の態様には多くの同等物があることを認識するであろうし、または確認することが可能であろう。この種の同等物は、以下の請求項に含まれる。従属クレ−ムにおいて開示される実施例のいかなる組合せも、本発明の範囲内であると考察される。
【０１３４】
本発明は、いくつかの利点を提供する。第１に、逆方向のＲＮＡ合成（すなわち、５´から３´方向）は、３´から５´方向のＲＮＡ合成に存在するＭ＋１不純物を含まないＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じさせる。合成がモノマーの意図した数（Ｍ）で止まらないときに、Ｍ＋１種が現れるが、予想外の数（Ｍ＋１）モノマーへと進む。第２に、粗製のＲＮＡ純度は８９％〜９３％の間で変動し、1ステップにつき約９９．５％のカップリング効率ということを意味する。第３に、粗製のＲＮＡの単一の精製は、９５％〜９８％の純粋なオリゴヌクレオチドを生じさせる。第４には、本発明は、生物医学研究の多くの面で有用である長いＲＮＡの合成を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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