(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体であって、
（ａ）ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ａＶｂ３、ａ５ｂ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ及びテネイシンからなる群から選ばれる腫瘍抗原に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対を含む一価単位、ここで重鎖が、ヒトまたはヒト化のＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含む；及び
（ｂ）ＣＤ３に対して特異性を持つ、配列番号１で表される配列を含む融合ペプチドを含む一本鎖単位
を含み、軽鎖−重鎖対によって認識される腫瘍抗原を発現する細胞に対して、有意な細胞毒性を示す、前記抗体。
【請求項２】
抗体であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対を含む一価単位、ここで一価単位の軽鎖が、配列番号５で表される配列を含み、一価単位の重鎖が、Ｆｃフラグメントを含み、配列番号３で表される配列を含む；及び
（ｂ）ＣＤ３に対して特異性を持つ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＦｃフラグメントと、を含み配列番号１で表される配列を含む融合ペプチドを含む、一本鎖単位
を含む、前記抗体。
【請求項３】
軽鎖が、ジスルフィド結合により重鎖に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖が、１又は２以上のジスルフィド結合により融合ペプチドに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
Ｈｅｒ２発現乳癌細胞と、リンパ球、単球およびマクロファージからなる群から選択される１以上のＣＤ３発現細胞とに結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
請求項２に記載の抗体において、一価単位および一本鎖単位の一方のＦｃフラグメントに、以下のアミノ酸置換：３６６位のトレオニン（Ｔ）のトリプトファン（Ｗ）への置換、３９２位のリジン（Ｋ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換、および４０９位のリジン（Ｋ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換（Ｋａｂａｔの付番システムによる）を導入し、他方のＦｃフラグメントに、以下のアミノ酸置換：３６８位のロイシン（Ｌ）のアルギニン（Ｒ）への置換、３９９位のアスパラギン酸（Ｄ）のリジン（Ｋ）への置換、および４０７位のチロシン（Ｙ）のアラニン（Ａ）への置換（Ｋａｂａｔの付番システムによる）を導入した、抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体及び担体を含む、組成物。
【請求項１０】
担体が、薬物担体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
１又は２以上の抗原に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を含む、複合体。
【請求項１２】
抗体であって、
（ａ）ＣＤ２０、ＣＤ１３３およびＥＦＧＲからなる群から選ばれる腫瘍抗原に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対を含む一価単位、ここで重鎖が、ヒトまたはヒト化のＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含む；及び
（ｂ）ＣＤ３に対して特異性を持つ、配列番号１で表される配列を含む融合ペプチドを含む一本鎖単位
を含み、軽鎖−重鎖対によって認識される腫瘍抗原を発現する細胞に対して、有意な細胞毒性を示す、前記抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は２つ異なる結合特異性を有する抗体または抗体類分子である。ＢｓＡｂは生物医学、特に腫瘍免疫治療において幅広く利用されている。現在、免疫治療研究において注目される焦点は、どのようにＢｓＡｂ細胞媒介性細胞毒性を利用して腫瘍細胞を殺すことである。ＢｓＡｂは、腫瘍細胞とエフェクター細胞を同時に標的とすると同時に、エフェクター細胞を誘発して腫瘍細胞を殺すようにデザインすることができる。
【０００２】
ＢｓＡｂは、例えば、化学工学、細胞工学または遺伝子工学の方法により作製することができる。遺伝子工学のメリットは、抗体を修飾しやすく、二重特異性抗体、タンデム（ｔａｎｄｅｒｍ）ＳｃＦｖ、一本鎖二重特異性抗体およびそれらの誘導体などの多くの異なる形態の二重特異性抗体フラグメントをデザイン・生産することができることである（Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＩｇＧ−Ｌｉｋｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ＲＥ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  （編），  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照）。これらのＢｓＡｂは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインがないため、サイズが小さく、腫瘍への浸透作用が向上されるが、体内における半減期がかなり短く、かつ抗体の定常領域と関係があるＡＤＣＣ作用が不足している。
【０００３】
安定性および治療能力を向上するために、重鎖のヘテロ二量体化を促進し、高いＦｃ含有ＩｇＧ類二重特異性抗体の収量が得られるように重鎖に対して組み換え遺伝子修飾を行う。ヘテロ二量体化、即ち、ジスルフィド結合、塩橋、ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）を形成するための抗体のＣＨ３鎖を修飾する合理的なプランがいくつ提案されている。並列に並べる位置におけるノブ（ｋｎｏｂ）とホール（ｈｏｌｅ）の形成ベースは、ノブとホールとの相互作用がヘテロ二量体の形成に寄与するが、ノブ−ノブおよびホール−ホールの相互作用が、有利な相互作用が欠失することでホモ二量体を形成しにくい。当該ノブ・イントゥー・ホール手段は、重鎖のホモ二量体化という課題を解決したが、２つ異なる抗体由来の軽鎖と重鎖のミスペアリングという課題を解決していない。２つ異なる抗体に対して同じ軽鎖が認識される可能性があるが、同じ軽鎖を有する２つ抗体配列を用いてＢｓＡｂを構築する可能性が非常に低い。
【０００４】
従って、より良く、作製しやすく、優れた臨床安定性および有効性および／又は低減された系統的毒性を有するＢｓＡｂを提供することが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、１つの実施例において、（ａ）腫瘍細胞または微生物に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対、及び、（ｂ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＦｃフラグメントとを含み、免疫細胞に対して特異性を持つ融合ペプチドを含む抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの態様において、該軽鎖−重鎖対が腫瘍抗原に対して特異性を持つ。一態様において、該腫瘍抗原が、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ａＶｂ３、ａ５ｂ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ及びテネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）から選ばれる。一態様において、該軽鎖−重鎖対が腫瘍細胞において対応する非腫瘍細胞と比べて過剰発現されたタンパク質に対して特異性を持つ。
【０００７】
いくつかの態様において、該軽鎖−重鎖対がウイルスまたは細菌に対して特異性を持つ。一態様において、該軽鎖−重鎖対がエンドトキシンに対して特異性を持つ。
いくつかの態様において、該免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球及び肥満細胞から選ばれる。
いくつかの態様において、該融合ペプチドが、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８及びＣＤ６４から選ばれる抗原に対して特異性を持つ。
【０００８】
いくつかの態様において、該軽鎖がジスルフィド結合により該重鎖に結合する。いくつかの態様において、該重鎖が１又は２以上のジスルフィド結合により該融合ペプチドに結合する。一態様において、該重鎖がヒトまたはヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）のＦｃフラグメントを含む。一態様において、該重鎖のＦｃフラグメントがヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを含む。一態様において、該融合ペプチドのＦｃフラグメントがヒトまたはヒト化のＦｃフラグメントを含む。一態様において、該融合ペプチドのＦｃフラグメントがヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、該重鎖及び／又は該融合ペプチドのＦｃフラグメントが、野生型の抗体フラグメントと比べて、１又は２以上の置換を含み、該置換が該重鎖とＦｃフラグメントとの間にイオン結合を形成する。一態様において、該置換が表１から選ばれる。
いくつかの態様において、該重鎖及び／又は該融合ペプチドのＦｃフラグメントが、野生型の抗体フラグメントと比べて、１又は２以上の置換を含み、該置換が該重鎖とＦｃフラグメントとの間にノブ・イントゥー・ホール立体配座対を形成する。一態様において、該置換が表２から選ばれる。
いくつかの態様において、該ＣＨ２ドメインが該ｓｃＦｖフラグメントとＣＨ３ドメインとの間に位置する。一態様において、該融合ペプチドがＣＨ１ドメインを含まない。
【００１０】
本発明は、１つの実施例において、上記いずれかの実施例における抗体を含む組成物を提供する。一態様において、担体が薬物担体である。
他の実施例において、１又は２以上の抗原に結合する上記いずれかの実施例における抗体を含む複合体を提供する。
本発明は、さらに、（ａ）免疫細胞に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対、及び、（ｂ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＦｃフラグメントとを含み、腫瘍細胞に対して特異性を持つ融合ペプチドを混合することを含む抗体の作製方法を提供する。一態様において、本発明は該方法により作製される抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の１つ実施例における二重特異性抗体の構造を示す図である。
【図２】図２は、図１の二重特異性抗体の各鎖の発現ベクターの構造を示す図である。
【図３】図３は、１％アガロースゲル電気泳動図である。レーンＭ：ＤＬ２０００マーカー（ｍａｒｋｅｒ）、レーン１：ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＶＨ、レーン２：ハーセプチンＶＬ、レーン３：ヒトＩｇＧ１  ＣＨドメイン（ＣＨ１＋ヒンジ＋Ｆｃ）、レーン４：ヒトＩｇＣＬ。
【図４】図４は、１％アガロースゲル電気泳動図である。レーンＭ：ＤＬ１０００  ＤＮＡマーカー、レーン１：ヒト化ＯＫＴ３（ＨＯＫＴ３）ＶＨ−リンカー、レーン２：リンカー−ＨＯＫＴ３  ＶＬ。
【図５】図５は、１％アガロースゲル電気泳動図である。レーンＭ：ＤＬ１００００  ＤＮＡマーカー、レーン１：ＨＯＫＴ３一本鎖。
【図６−８】図６〜８は、部位特異的突然変異用プラスミドの制限地図である。
【００１２】
【図９】図９は、６％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ図およびウェスタンブロッティング図（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を示す。サンプルは２９３Ｆ細胞の上清である。レーンＭ：タンパク質マーカー、レーン１：ハーセプチンｍＡｂ、レーン２：Ｔ３６６Ｗで修飾されたＨＯＫＴ３一本鎖＋Ｙ４０７Ａで修飾されたハーセプチン重鎖＋ハーセプチン軽鎖、レーン３：Ｔ３６６Ｗ  Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄ（ＴＫＫ）で修飾されたＨＯＫＴ３一本鎖＋Ｄ３５６Ｋ  Ｄ３９９Ｋ  Ｙ４０７Ａ（ＤＤＹ）で修飾されたハーセプチン重鎖＋ハーセプチン軽鎖、レーン４：Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄ（ＫＫ）で修飾されたＨＯＫＴ３一本鎖＋Ｄ３５６Ｋ  Ｄ３９９Ｋ（ＤＤ）で修飾されたハーセプチン重鎖＋ハーセプチン軽鎖、レーン５：Ｔ３６６Ｗ  Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄ（ＴＫＫ）で修飾されたＨＯＫＴ３一本鎖＋Ｌ３６８Ｒ  Ｄ３９９Ｋ  Ｙ４０７Ａ（ＬＤＹ）で修飾されたハーセプチン重鎖＋ハーセプチン軽鎖、レーン６：Ｔ３６６Ｗ  Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄ（ＴＫＫ）で修飾されたＨＯＫＴ３一本鎖＋Ｄ３９９Ｋ  Ｙ４０７Ａ（ＤＹ）で修飾されたハーセプチン重鎖＋ハーセプチン軽鎖。
【００１３】
【図１０】図１０は、クマシーブリリアントブルーで染色した６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す。レーンＭ：タンパク質マーカー、レーン１：精製されたＭＳＢＯＤＹ、レーン２：ハーセプチン、レーン３：ＨＯＫＴ３一本鎖。
【図１１】図１１は、抗Ｈｅｒ２Ｘ抗ＣＤ３ＭＳＢＯＤＹがＢＴ４７４細胞（Ａ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂ）の細胞表面に結合するフローサイトメトリーの分析結果を示す。グレー線：ＰＢＳ対照、黒実線：ＭＳＢＯＤＹ、黒点線：ハーセプチン。
【図１２】図１２は、４枚の細胞凝集の顕微鏡画像を含む。
【図１３】図１３は、抗体媒介性細胞毒性を示す。
【図１４】図１４は、ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ、ＭＳＢＯＤＹ、又はハーセプチンとＨＯＫＴ３との組み合わせ（すなわち、ハーセプチン＋ＨＯＫＴ３）による抗体誘導性の細胞毒性を示す。
【図１５Ａ−Ｅ】図１５Ａ−Ｅは、実施例４で検出される抗体の構造を示す。Ａ：ＭＳＢＯＤＹ、Ｂ：ＳＭＢＯＤＹ、Ｃ：ＳＳＢＯＤＹ、Ｄ：ハーセプチン一本鎖抗体、Ｅ：ＨＯＫＴ３一本鎖抗体。
【００１４】
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、抗Ｈｅｒ２ｘ抗ＣＤ３  ＭＳＢＯＤＹとＳＭＢＯＤＹをＢＴ４７４細胞（Ａ）とＰＢＭＣ細胞（Ｂ）に結合する様子を示す。
【図１７】図１７は、ＳＭＢＯＤＹと比べてＭＳＢＯＤＹのＢＴ４７４細胞に対する結合活性がより高いことを示す。
【図１８】図１８は、熱チャレンジ分析の結果を示す。
【図１９】図１９は、ＢＴ４７４、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する抗体媒介性細胞毒性の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
なお、数が明確されていない実体限定は、１つまたは複数（種類）の実体を指す。例えば、「二重特異性抗体」は、１つまたは複数（種類）の二重特異性抗体であることを理解すべきである。同様に、用語「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能なものとして使用される。
【００１６】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」、複数の「ポリペプチド」を指し、且つアミド結合（ペプチド結合も呼ばれる）により直鎖状に連結したモノマー（アミノ酸）からなる分子も指す。用語「ポリペプチド」とは、２つ又は複数のアミノ酸のいずれの一本鎖または複数本鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク」、「アミノ酸鎖」、又は２つ又は複数のアミノ酸の一本鎖または複数本鎖を指すのに用いられるいずれの他の用語も「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはそれと交換して使用することもできる。なお、用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質加水分解又は分解、または天然に生じないアミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されなく、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的源から誘導され得るかまたは組み換え技術により生産され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によることを含む、いずれの方法でも作製され得る。
【００１７】
本明細書で使用する、細胞および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する用語「単離された」とは、それぞれ他の天然由来の高分子ＤＮＡまたはＲＮＡから分子を単離することを指す。本明細書で使用する用語「単離された」は、組み換えＤＮＡ技術により生産される時、細胞材料、ウイルス材料または培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、化学合成により作製される時、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことも指す。また、「単離された核酸」は、天然に生じないフラグメントとなり、天然状態で存在しない核酸フラグメントを含むことを指す。本明細書で使用する用語「単離された」は、他の細胞タンパク質または組織から細胞またはポリペプチドを単離することも指す。単離されたポリペプチドは、精製ポリペプチドおよび組み換えポリペプチドを含むことを指す。
【００１８】
本明細書で使用する用語「組み換え」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの場合、自然状態で存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。通常、共に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることにより達成されることが非限定的な例として挙げられる。
「相同性」、「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド鎖分子間または２つの核酸分子間の類似度を指す。相同性は、各配列中の位置を比較することによって決定することができ、アライメントにより比較することができる。比較された配列の位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められるとき、その分子はその位置で相同的である。複数の配列間の相同度は、これらの配列が共有するマッチングまたは相同位置の数の関数である。「無関係」または「非相同の」配列は、本発明の配列の一つと４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を有する。
【００１９】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドドメイン（或いは、ポリペプチドまたはポリペプチドドメイン）が他の配列とあるパーセント（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の「配列同一性」を有することとは、アライメントのとき、この２つの配列が比較される際にこのパーセントの塩基（またはアミノ酸）が同じことを指す。これらのアライメントとパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知されるソフトウェア、例えば、Ａｕｓｕｂｅ１ら．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏ１ｓ  ｉｎ  Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ  Ｂｉｏ１ｏｇｙ．に記載されるソフトウェアにより測定できる。デフォルトパラメータを用いてアライメントを行うことが好ましい。ＢＬＡＳＴは、シーケンスアライメントを行うためのプログラムであり、デフォルトパラメータを使用してもよい。具体的に、プログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ＝  ｓｔａｎｄａｒｄ、  ｆｉ１ｔｅｒ  ＝  ｎｏｎｅ、  ｓｔｒａｎｄ  ＝  ｂｏｔｈ、  ｃｕｔｏｆｆ  ＝  ６０、  ｅｘｐｅｃｔ  ＝  １０、  Ｍａｔｒｉｘ  ＝  ＢＬＯＳＵＭ６２、  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ  ＝  ５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、  ｓｏｒｔ  ｂｙ  ＝  ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ＝  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，  ＧｅｎＢａｎｋ  ＋  ＥＭＢＬ  ＋  ＤＤＢＪ  ＋  ＰＤＢ  ＋  ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓ１ａｔｉｏｎｓ  ＋  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ  ＋  ＳＰｕｐｄａｔｅ  ＋  ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂ１ａｓｔ／Ｂ１ａｓｔ．ｃｇｉ（最終アクセス日：２００８年５月２１日）から入手できる。生物学的等価のポリヌクレオチドとは、前記特定パーセントの相同性を有し、かつ同じまたは類似する生物的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２０】
用語「等価の核酸またはポリヌクレオチド」とは、当該核酸のヌクレオチド配列またはその相補配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列の核酸である。二本鎖核酸の相同物とは、他の核酸またはその相補配列とある程度の相同性を有する特定のヌクレオチド配列を含む核酸である。一態様において、ある核酸の相同体（ｈｏｍｏ１ｏｇｓ）は、当該核酸またはその相補配列とハイブリッドできる。同様に、「等価のポリペプチド」とは、対照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドである。いくつかの態様において、該配列同一性は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である。いくつかの態様において、該等価の配列には、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）が残される。
【００２１】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「過酷」な条件で行うことができる。通常、低い過酷なハイブリダイゼーション反応は、約４０℃で約１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液において行われる。中等過酷なハイブリダイゼーションは、通常、約５０℃で約６×ＳＳＣにおいて行われる。高い過酷なハイブリダイゼーション反応は、通常、約６０℃で約１×ＳＳＣにおいて行われる。ハイブリダイゼーション反応は、当業者がよく知っている「生理条件」で行われてもよい。生理的条件の非制限性の例として、細胞における通常の温度、イオン強度、ｐＨ値およびＭｇ２＋濃度が挙げられる。
【００２２】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力して、バイオインフォマティクス用途、例えば機能性ゲノミクス及び相同性調査などに使用することができる。用語「多型性」とは、２つ以上形態の遺伝子またはその一部が共存することを指す。遺伝子の一部は少なくとも２種類の異なる形態、即ち、２種類の異なるヌクレオチド配列を有する場合、該遺伝子の当該部分は「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は、同一性が異なる対立遺伝子において異なるモノヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはその類似物など、いかなる長さを有するヌクレオチドのポリマーを含む。ポリヌクレオチドは三次元構造を有してもよく、既に知られる機能または知らない機能を有してもよい。下記は、ポリヌクレオチドの非制限性実施例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥ標識）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単独で任意の配列のＤＮＡ、単独で任意の配列のＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化のヌクレオチドおよびヌクレオチド類似物を含む。存在している場合、ポリヌクレオチドを組み立てる前または後に、その塩基構造を修飾する。該ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識成分との結合によりさらに修飾されてもよい。該用語は二本鎖および一本鎖分子も指す。本発明では、特に断らない場合、ポリヌクレオチドのいずれの実施例は、二本鎖の形態をもちろん、二本鎖形態を形成すると予想されるか、または知られている２本の相補的一本鎖形態を包含する。
【００２４】
用語「コードする」とはポリヌクレオチドに適用される場合、その本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたとき、ポリヌクレオチドを、ポリペプチドのｍＲＮＡおよび／またはその断片を産生するように転写および／または翻訳されることができる場合、あるポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補体であり、コードする配列をこれらから推定することができる。
本明細書で使用する用語「検出可能な標識」とは、「標識された」組成物を生成するように検出しようとする組成物（例えば、ポリヌクレオチド又はタンパク質、該タンパク質は、例えば抗体）に直接または間接的に結合され、直接または間接的に検出可能な化合物又は組成物を指す。該用語は、挿入配列の発現によりシグナルを提供する、該ポリヌクレオチドに結合する配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などをさらに含む。標識はそれ自体で検出可能（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）であっても、または酵素標識の場合、基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し、検出可能な生成物をもたらすものであってもよい。
【００２５】
該標識は小規模の検出に適するか、又はハイスループットスクリーニングにより適する。同様に、適当の標識は放射性同位体、蛍光染料、化学発光化合物、染料およびタンパク質（酵素を含む）を含むが、これらに限定されない。該標識は検出のみに用いられてもよく、定量に用いられてもよい。検出のみに用いられる反応は一般に、その存在を証明できるのみの反応を含み、定量に用いられる反応は一般に定量可能な（例えば、デジタルで報告できるような）値、例えば強度、分極及び／またはその他の性質を有する反応を含む。発光又は蛍光アッセイにおいて、検出可能な反応は直接的にアッセイ成分に関連付けられた実際に結合に関する発光体又は蛍光官能基を使用でき、又は間接的に別の（例えばリポーターまたは指示薬）成分と関連している発光体又は蛍光官能基を使用できる。
【００２６】
本明細書で使用する「抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識し、結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体であってもよく、任意の抗原結合フラグメントまたはその一本鎖であってもよい。従って、用語「抗体」は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含むあらゆるタンパク質又はペプチド含有分子を含む。このような例には、重鎖又は軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域またはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用する用語「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は抗体の一部であり、該抗体は、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造にもかかわらず、同じ抗原と結合する抗体フラグメントは完全な抗体と認識される。用語「抗体フラグメント」はアプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）及び二重特異性抗体を含む。用語「抗体フラグメント」は複合体を形成するために、抗体と同様に特定の抗原に結合できるいずれの合成または遺伝子工学によって合成されたタンパク質も含む。
【００２８】
「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」とは、免疫球タンパク質の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様において、これらの領域を１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。該リンカーは可撓性のために、グリシンをリッチに含むことができ、可溶性のために、セリンまたはスレオニンも含み、且つＶＨのＮ−末端をＶＬのＣ末端に連結され、逆も同様である。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入しか行われていなく、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野で公知であり、米国特許５８９２０１９に記載されている。
【００２９】
抗体という用語は、生化学的に認識することができる、種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、及びエプシロン（γ、μ、α、δ、εν）として分類され、それらの中に幾つかのサブクラス（例えば、γ１〜４）を有することを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５等は、よく特徴付けられており、機能的な特異性があることが知られている。本発明を参照して、当業者は、これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾型を容易に認識可能であり、したがって、本発明の範囲内である。免疫グロブリンの全てのクラスが明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の説明は、概してＩｇＧのクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、２本の同一の軽鎖ポリペプチド（これらの分子量は約２３，０００ダルトン）、および２本の同一の重鎖ポリペプチド（これらの分子量は５３，０００〜７０，０００）を含む。一般に、４本の鎖がジスルフィド結合によって「Ｙ」字型に接合され、軽鎖が、「Ｙ」の口から始まって可変領域を通じて重鎖をサポートにしている。
【００３０】
本発明の抗体、抗原結合性ポリペプチド、これら的変異体又は誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインを含有するフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されるフラグメント、及び抗イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示する抗Ｉｄ抗体〜ＬＩＧＨＴ抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。本発明における免疫グロブリン又は抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、免疫グロブリンの任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。
【００３１】
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）として分類される。重鎖の各クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合し、２本の重鎖の「尾」の部分は、これらの免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子改変宿主細胞によって生成されると、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって相互に結合する。該重鎖では、アミノ酸配列が、Ｙ字型構造の分岐した側のＮ末端から、各鎖の下部のＣ末端へと続く。
【００３２】
軽鎖および重鎖の両方が、構造領域および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。ここで、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の両方が、抗原認識および特異性を決定することが、理解されるであろう。逆に、軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を付与する。一般に、定常領域ドメインの数は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるに従って増加する。Ｎ末端部は可変領域であるが、Ｃ末端部には定常領域であり、ＣＨ３およびＣＫドメインは、実際にはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００３３】
上述のように、可変領域によって、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。つまり、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この抗体の四価構造が、Ｙ配置のそれぞれの腕の末端に存在する、抗原結合部位を形成する。より具体的には、該抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＫ鎖（即ち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）のそれぞれの上にある３つのＣＤＲによって定義される。いくつかの例には、例えば、ラクダ種に由来するか、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて修飾された免疫グロブリンであるが、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を伴わず、重鎖のみで構成され得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−ＣａｓｔｅｒｍａｎらのＮａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照する。
【００３４】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する、６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性の環境でその３次元構成をとる時に、抗原結合ドメインを形成するように特定的に位置する、短い、非連続的な配列のアミノ酸である。該抗原結合ドメイン内の残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域と称され、より少ない分子間可変性を示す。該フレームワーク領域は主としてβシート立体構造をとり、且つＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性作用によって、正しい配向へのＣＤＲの位置付けを提供する、足場を形成する役割を果たす。
【００３５】
該位置付けられたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫応答性抗原上のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的表面が、その同族エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、明確に定義されているため、それぞれ任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域について、当業者によって容易に同定され得る（”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照し、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
当技術分野において使用および／または許容される用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、明示的にそうではない旨が記載されていない限り、かかる全ての意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に共に存在する非連続的な抗原結合部位を説明するための、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この具体的な領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、によって説明され、参照することにより本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義は、ＣＤＲは相互に対して比較されると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。しかしながら、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内にあることが意図される。前掲の参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する、適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列および大きさに依存して異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むのか、通常に断定することができる。
【００３７】
【表１】
0006571527.tif 000002
【００３８】
また、Ｋａｂａｔらは、いずれの抗体にも適用可能である、可変ドメイン配列のための付番システムも定義している。当業者は、配列自体を超える、いかなる実験データにも依存することなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔの付番」システムを疑いなく割り当てることができる。本明細書で使用される、「Ｋａｂａｔの付番」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載される付番システムを指す。
【００３９】
上記の表に加えて、Ｋａｂａｔの付番システムはＣＤＲ領域について次のように説明している：ＣＤＲ−Ｈ１は、だいたいアミノ酸３１（すなわち、第一のシステイン残基の約９残基の後）から始まり、約５〜７アミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の終了後、１５番目の残基から始まり、約１６〜１９アミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリシン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の終了後、約３３番目のアミノ酸残基から始まり、３〜２５アミノ酸を含み、配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ただし、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ−Ｌ１は、だいたい残基２４（すなわち、システイン残基の後）から始まり、約１０〜１７残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の終了後、約１６番目の残基から始まり、約７残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の終了後、約３３番目の残基（すなわち、システイン残基の後）から始まり、約７〜１１残基を含み、配列ＦまたはＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ただし、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００４０】
本明細書に開示する抗体は、鳥類および哺乳類を含むあらゆる動物の起源からのものであり得る。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施例において、可変領域が軟骨魚（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）類起源（例えば、サメ由来）であってもよい。
【００４１】
本明細書中で用いる「重鎖定常領域」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖定常領域を含むポリペプチドは次のドメインの少なくとも１つを含む：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくはフラグメント。例えば、本発明で用いる抗原結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを有するポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを有するポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、或いはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖で構成することができる。別の実施例において、本発明のポリペプチドがＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖で構成される。また、本発明で用いる抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いてもよい。上述したように、重鎖定常領域は天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるようにアミノ酸配列を改変しうることが当業者には理解されるだろう。
【００４２】
本明細書で開示する抗体の重鎖定常領域は、さまざまな免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域はＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインとＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含む。別の例では、重鎖定常領域が、ＩｇＧ１分子に一部由来してＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域を含む。別の例では、重鎖部分が、ＩｇＧ１分子に一部由来してＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジを含む。
【００４３】
本明細書で用いる「軽鎖定常領域」には、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、前記軽鎖定常領域は定常κドメインまたは定常λドメインの少なくとも１つを含む。
「軽鎖−重鎖対」とは軽鎖と重鎖の集合を指し、これらは軽鎖のＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間のジスルフィド結合により二量体を形成できる。
先に示したように、さまざまな免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造はよく知られている。本明細書で用いるとき、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の第一の（多くはアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端にある。
【００４４】
本明細書で使用する用語「ＣＨ２ドメイン」は、従来の付番スキームを用いて、例えば抗体の約残基２４４から残基３６０まで延びる一部分の重鎖分子を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ付番システム、および残基２３１〜３４０、ＥＵ付番システム、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）参照）。ＣＨ２ドメインは、それが別のドメインと密接に対を形成しない点で独特である。逆に、インタクトの天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に２つのＮ結合型の分岐糖鎖が介在している。また、ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端へと延びており、約１０８残基で構成されることも十分に立証されている。
【００４５】
本明細書で使用する用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインをつなぐ重鎖分子の部分が含まれる。該ヒンジ領域は約２５残基で構成され、可撓性があるため、２つのＮ末端の抗原結合領域を独立して移動させることができる。ヒンジ領域は３つの明確に区別されるドメイン（すなわち、上部、中間および下部ヒンジドメイン）に分割することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４０８３  （１９９８））。
【００４６】
本明細書で使用する「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸のシステインはメルカプト基を含み、該メルカプト基は第２のメルカプト基とジスルフィド結合または橋を形成することができる。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＫ領域がジスルフィド結合によって連結されており、且つ２本の重鎖がＫａｂａｔ付番システムを用いて２３９と２４２に対応する位置（２２６または２２９位置、ＥＵ付番システム）で２つのジスルフィド結合によって連結されている。
【００４７】
本明細書中で使用する「キメラ抗体」とは、免疫応答性の領域または部位が第１の種から得られるまたは由来し、かつその定常領域（インタクトであっても、部分的であっても、本発明に従って改変されてもよい）が第２の種から得られる、あらゆる抗体を意味するものとする。いくつかの実施例において、標的結合領域または部位が非ヒト源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、且つ定常領域がヒト由来である。
【００４８】
本明細書で使用する「ヒト化パーセント」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインの間でフレームワークアミノ酸の相違（すなわち、非ＣＤＲ相違）数を求めて、その数をアミノ酸の総数から減算し、次にそれをアミノ酸の総数で割って１００を掛けることにより算出される。
「特異的に結合する」又は「…に対して特異性がある」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、そしてその結合が抗原結合ドメインとエピトープの間でいくらかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、それが無作為の無関係なエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープと結合するとき、エピトープと「特異的に結合する」といわれる。用語「特異性」は、ある抗体がエピトープと結合する親和性を表すために本明細書中で用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも特定のエピトープに対して高い特異性をもつとみなすことができ、または、抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合するということができる。
【００４９】
本明細書で使用する「治療」（「ｔｒｅａｔ」又は「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」）とは、治療処置と予防対策の両方を指し、その目的は、被験体に対して、例えば、癌の進行など、望ましくない生理的変化や障害を予防したり、遅くする（軽減する）ことである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出できるかできないかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の退縮、疾患の安定化させる（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存と比べて、生存を延長することもさす。治療が必要な者には、疾患または障害にすでにかかっている患者だけでなく、疾患や障害にかかりやすい者、または疾患や障害を予防すべきである者が含まれる。
【００５０】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後判定または治療が望まれる、あらゆる被験体、特に哺乳動物被験体を指す。哺乳動物被験体は、ヒト、家庭用動物、家畜、動物園、運動競技または愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ネズミ、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、乳牛（ｃｏｗｓ）などを含む。
【００５１】
本明細書で使用する「治療が必要な患者」または「治療が必要な被験体」のような語句には、例えば、検出のために、診断プログラムのために、および／または治療のために使用される本発明の抗体または組成物の投与から利益を得るのであろう被験体、例えば、哺乳動物被験体が含まれる。
【００５２】
二重特異性抗体
本発明の一実施例は２つの異なる抗原結合性ポリペプチド単位を含むヘテロ二量体抗体を提供する。いくつかの態様において、該ヘテロ二量体は対応するホモ二量体と大きさが異なり、大きさの違いは、ヘテロ二量体およびホモ二量体の分離を容易にするために利用することができる。
いくつかの態様において、この２つの抗原結合性ポリペプチド単位の一つは野生型抗体と類似する軽鎖−重鎖対を含む。本発明全体において、該単位を「一価単位」ともいう。いくつかの態様において、他の抗原結合性ポリペプチド単位は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。このようなｓｃＦｖは抗体の定常フラグメント（Ｆｃ）に融合できる。本発明全体において、該融合ペプチドを「一本鎖単位」ともいう。
【００５３】
驚くべきことに、本発明は、このような非対称な抗体が安定であり、高い抗原結合効率を有することを実証している。単鎖抗体であっても、ホモ二量体は、生理学的条件下で不安定であることが実証されているので、これは予想外である。例えば、Ａｈａｍｄ  ｅｔ  ａｌ．，「ｓｃＦｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，」  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２０１２：９８０２５０  （２０１２）は、ｓｃｆｖによるＩｇＧ類抗体は安定ではなく、凝集を低減して安定性を高めるようにさらに修飾される必要があることが示された。
【００５４】
また、非対称性があるため、ヘテロ二量体は、抗原結合性ポリペプチド単位のいずれかで形成するホモ二量体と異なる分子量を有する。ヘテロ二量体およびホモ二量体の分子量の差に基づいて、所望のヘテロ二量体とホモ二量体を容易に分離することができる。
【００５５】
ヘテロ二量体とホモ二量体を容易に分離することは、２つの抗原結合性ポリペプチドの各々は、異なるエピトープに対して特異性を有する二重特異性抗体を作製するために特に有利である。これは、２つのタイプのホモ二量体（即ち、一価単位又は一本鎖単位を含むホモ二量体）が共に所望の双重特異性を有していなく、該ヘテロ二量体が該双重特異性を提供できるからである。
一実施例において、このような二重特異性抗体は、腫瘍細胞または微生物に対して特異性を有し、且つ免疫細胞に対して特異性を有することにより、腫瘍細胞または微生物を免疫細胞に近接させることができ、活性化免疫応答により腫瘍細胞または微生物を排除する。
【００５６】
特定の態様において、該一価単位は、腫瘍細胞または微生物に対して特異性を有し、かつ該一本鎖単位は、免疫細胞に対して特異性を有する。そのような配列を有する特異性の非対称な二重特異性抗体は、「一価一本鎖二重特異性抗体」または「ＭＳＢＯＤＹ」とも呼ばれる。これに対し、非対称な二重特異性抗体であって、該一価単位は免疫細胞に対する特異性を有し、且つ一本鎖単位は腫瘍細胞または微生物に対する特異性を有し、該非対称二重特異性抗体を「ＳＭＢＯＤＹ」という。別の二重特異性抗体は２つの一本鎖単位を有し、１つが腫瘍細胞または微生物に対する特異性を有し、もう一つが免疫細胞に対する特異性を有し、該抗体を「ＳＳＢＯＤＹ」という。
【００５７】
本発明の意図していない発見は、ＭＳＢＯＤＹとＳＭＢＯＤＹが同じ結合モチーフと類似の分子量を持っているにもかかわらず、標的腫瘍細胞に結合したとき、ＭＳＢＯＤＹがＳＭＢＯＤＹより高い安定性および親和性を示す。このような場合、興味深いことに、抗Ｈｅｒ／抗ＣＤ３  ＭＳＢＯＤＹとＳＭＢＯＤＹがＨｅｒ２高発現細胞であるＢＴ４７４に対して類似の細胞毒性を示したが、ＭＳＢＯＤＹ構造はＨｅｒ２低発現乳癌細胞系（ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む）に対してより高い細胞毒性を示す。すべての腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞は、必ずしも高いレベルで該抗原を発現しないので、ＭＳＢＯＤＹのそのような能力は、臨床応用において独特の利点を示している。
【００５８】
従って、一実施例において、提供される抗体は、（ａ）腫瘍細胞に対する特異性を持つ軽鎖−重鎖対、及び（ｂ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＦｃフラグメントとを含み、免疫細胞に対して特異性を持つ融合ペプチドを含む。
別の実施例において、提供される抗体は、（ａ）微生物対する特異性を持ち、例えば、ＧＰ１２０がＨＩＶ対して、ＨＡ２がインフルエンザ対して、及び志賀様毒素２Ｂが大腸菌（Ｅ．  Ｃｏ１ｉ）に対して特異性を持つ軽鎖−重鎖対、及び（ｂ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＦｃフラグメントとを含み、免疫細胞に対して特異性を持つ融合ペプチドを含む。
【００５９】
図１は本発明の二重特異性抗体の一実施例を示す。該抗体の左半部分（一価単位）は軽鎖（６）及び重鎖（３と４）からなる。
図１において、一態様において、所述軽鎖（６）はＣＬドメイン及びＶＬドメインを含み、ＶＬａはエピトープ「ａ」にターゲティングすることをさらに示す。同様に、推定のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有することに加え、該重鎖はさらにＣＨ１ドメイン及びＶＨドメインを含み、ＶＨａもエピトープ「ａ」にターゲティングする。一態様において、該軽鎖及び重鎖は例えば、ＣＬ及びＣＨ１の間にジスルフィド結合により結合する。
図１において、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント（５）及びＣＨ２及びＣＨ３を含む定常領域（３）を含む一本鎖単位をさらに示した。該ｓｃＦｖフラグメントはＶＬ（ＶＬｂ）及びＶＨ（ＶＨｂ）ドメインからなり、全てエピトープ「ｂ」にターゲティングし、該エピトープ「ｂ」がエピトープ「ａ」と異なる。
【００６０】
いくつかの態様において、該一価単位の重鎖は１つまたは複数のジスルフィド結合により融合ペプチドに結合する。一態様において、該１つまたは複数のジスルフィド結合は該ＣＨ１（又はＶＬｂ）とＣＨ２ドメインの間のヒンジ領域のアミノ酸残基の間に形成される。
いくつかの態様において、該一本鎖単位のＣＨ２ドメインはｓｃＦｖフラグメントとＣＨ３ドメインの間に位置する。換言すれば、該ｓｃＦｖフラグメントは該ＦｃフラグメントのＣＨ２末端に接続される。いくつかの態様において、該一本鎖単位はＣＨ１ドメインを含まない。
【００６１】
いくつかの態様において、該一価単位及び一本鎖単位の一方又は両方は全てヒト抗体配列またはヒト化の配列を含む。例えば、一態様において、該一価単位の重鎖はヒト又はヒト化のＦｃフラグメントを含む。一具体的な態様において、該重鎖のＦｃフラグメントはヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを含む。
【００６２】
同様に、一態様において、該融合ペプチドのＦｃフラグメントはヒト又はヒト化のＦｃフラグメントを含む。一具体的な態様において、該融合ペプチドのＦｃフラグメントはヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを含む。
さらに抗体の活性を安定化または改善するように抗体を改変できる。例えば、一態様では、野生型抗体フラグメントと比較し、該一価単位重鎖のＦｃフラグメントおよび／または融合ペプチドのＦｃフラグメントは、１つまたは複数の置換を含むことができ、これらの置換同士は、イオン結合を形成する。
【００６３】
一態様では、Ｆｃフラグメントの一つは生理的条件下で正電荷を有するアミノ酸残基により置換する１つまたは複数の置換を含み、別のＦｃフラグメントは、生理学的条件下で負電荷を有するアミノ酸残基により置換する１つまたは複数の置換を含む。一態様では、該正に荷電したアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）であってもよい。別の態様において、負に荷電したアミノ酸残基はアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であってもよい。置換されていてもよいアミノ酸残基はＤ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｄ３９９およびＫ４０９を含むが、これらに限定されない。表１にこれらの置換の組み合わせの非限定的な例を示す。
【００６４】
【表２】
0006571527.tif 000003
【００６５】
いくつかの態様において、野生型の抗体フラグメントと比較し、該一価単位重鎖のＦｃフラグメント及び／又は該融合ペプチドのＦｃフラグメントは１又は２以上の置換を含むことができ、これらの置換の間にノブ・イントゥー・ホール立体配座対を形成する。ノブ・イントゥー・ホール配置は当技術分野で公知である。例えばＲｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．「‘Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７−２１  （１９９６）を参照する。
いくつかの態様において、１つのＦｃフラグメントにおけるＫ３６６は比較的に大きいアミノ酸残基、例えばチロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）により置換される。その後、別のＦｃフラグメントにおけるＹ４０７は比較的に小さいアミノ酸残基、例えばトレオニン（Ｔ）、アラニン（ａ）又はバリン（Ｖ）により置換される。表２にこれらの置換の組み合わせの非限定的な例を示す。
【００６６】
【表３】
0006571527.tif 000004
いくつかの態様において、該抗体はイオン結合又はノブ・イントゥー・ホール構造又は両方を含むことができる。表３に該態様のいくつかの実施例を示す。
【００６７】
【表４−１】
0006571527.tif 000005
【００６８】
【表４−２】
0006571527.tif 000006
【００６９】
いくつかの態様において、本発明の二重特異性抗体の一価単位は腫瘍細胞に対して特異性を有する。いくつかの態様において、該一価単位は腫瘍抗原を特異的に認識する。
「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞において産生される抗原性物質であり、すなわち、宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を同定するのに有用であり、癌を治療するための潜在的な候補である。体内で正常なタンパク質は抗原ではない。しかしながら、腫瘍形成の間に、あるタンパク質が生産または過剰発現され、従って身体に対する「外来」性が示される。これは、よく免疫系から避けられている正常のタンパク質、一般的に非常に少量で生産されるタンパク質、一般的にある発育段階に生産されるタンパク質、またはその構造は突然変異の原因で改変されたタンパク質を含む可能性がある。
【００７０】
多くの腫瘍抗原は当技術分野で公知であり、且つ新たな腫瘍抗原は、容易にスクリーニングすることによって同定することができる。腫瘍抗原の非限定的な例には、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ａＶｂ３、ａ５ｂ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ及びテネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）を含む。
【００７１】
いくつかの態様において、該一価単位は、腫瘍細胞において対応する非腫瘍細胞と比べて過剰発現されたタンパク質に対して特異性を持つ。ここで使用される「対応する非腫瘍細胞」は腫瘍細胞の起源と同じ細胞型の非腫瘍細胞を指す。このようなタンパク質は、必ずしも腫瘍抗原と異ならないことに留意されたい。非限定的な例には、大部分の大腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、及び消化管癌で過剰に発現する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、及び子宮頚癌で過剰に発現することが多いヘレグリン受容体（ＨＥＲ−２、ｎｅｕ又はｃ−ｅｒｂＢ−２）、乳房腫瘍、頭と頚部腫瘍、非小細胞肺腫瘍、及び前立腺腫瘍の一連の固形腫瘍で高度に発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アシアロ糖タンパク質受容体、トランスフェリン受容体、肝細胞で発現するセルピン酵素阻害剤酵素複合体受容体、膵管腺癌細胞に過剰発現される線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、抗血管新生遺伝子治療のための血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、非粘液性卵巣癌の９０％で選択的に過剰発現する葉酸受容体、細胞表面糖衣、炭水化物受容体、及び呼吸上皮細胞への遺伝子送達に有用であり、肺疾患、例えば、嚢胞性線維症の治療について興味が持たれるポリマー免疫グロブリン受容体を含む。
【００７２】
いくつかの態様において、一価単位は、微生物に対して特異性を有する。微生物の非限定的な例としては、微生物表面受容体およびエンドトキシンを含む。エンドトキシンの例としては、リポ多糖（ＬＰＳ）およびリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、該一本鎖単位は免疫細胞対して特異性を有する。いくつかの態様において、該免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球及び肥満細胞から選ばれる。
【００７３】
いくつかの態様において、該一本鎖単位はＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８及びＣＤ６４から選ばれる抗原を特異的に認識する。
本明細書では、二重特異性リガントにおける各ポリペプチド鎖の例示的な配列を提供する。一態様において、該一本鎖単位の融合ペプチドは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。一態様において、該一価単位の重鎖は配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する。一態様において、該一価単位の軽鎖は配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する。
【００７４】
上記に記載された抗体またはポリペプチドのいずれかは、追加のポリペプチド、例えば、本明細書中に記載されるようなコードされるポリペプチド、抗体定常領域における分泌を指示するシグナルペプチド、または本明細書中に記載されるような他の異種性ポリペプチドをさらに含み得る。
本明細書に記載される抗体は、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように改変され得ることも、当業者によって理解されるだろう。例えば、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列と類似であり得、例えば、出発配列とある特定の同一性パーセントを有し、例えば、出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であり得る。
【００７５】
また、「非必須」アミノ酸領域において保存的な置換または変更をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失または挿入が行われ得る。例えば、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１又は２以上の個別のアミノ酸の置換、挿入または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上の個別のアミノ酸の置換、挿入または欠失を除いて、出発配列と同一であり得る。いくつかの実施例において、指定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して、１〜５、１〜１０、１〜１５または１〜２０個の個別のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する。
【００７６】
いくつかの実施例において、抗原結合性ポリペプチドは、抗体に通常結合しないアミノ酸配列または１つまたは複数の基を含む。例示的な改変は、以下でより詳細に記載される。例えば、本発明の一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、可撓性のリンカー配列を含み得るか、または機能的官能基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、薬物、トキシンまたは標識）を付加するために改変され得る。
【００７７】
本発明抗体、その変異体もしくは誘導体は、すなわち、その抗体への任意のタイプの分子の共有結合（共有結合は、その抗体がエピトープに結合するのを妨げない）によって改変された誘導体を含む。例えば、限定されないが、その抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスホ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変され得る。数多くの化学修飾のうちのいずれかが、公知の手法によって行われ、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない。さらに、該抗体は、１又は２以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
他の実施例において、本発明の抗原結合性ポリペプチドは保存的アミノ酸置換を含むことができる。
【００７８】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。したがって、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えられる。別の実施例において、一続きのアミノ酸は、順序および／または側鎖ファミリーメンバーの組成が異なる構造的に類似の一続きのアミノ酸で置き換えられ得る。
以下の表に、アミノ酸の保存的置換を示す非限定的な例が提供される。０以上の類似性スコアは、２つのアミノ酸間に保存的置換があることを示す。
【００７９】
【表５】
0006571527.tif 000007
【００８０】
いくつかの実施例において、前記抗体は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、医薬品またはＰＥＧに結合体化され得る。
該抗体は治療薬にコンジュゲートまたは融合させることができ、該治療薬には、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬または診断薬、細胞毒性薬（薬物でも毒素でもよい）、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組合せ、および当技術分野で知られた他のこのような薬剤が含まれる。
【００８１】
抗体は、それを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。化学発光により標識された抗原結合性ポリペプチドの存在はその後、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【００８２】
該抗体は、１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他の金属などの蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて、抗体に結合させることができる。各種の基を抗体にコンジュゲートする技術は公知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （癌治療における薬物のイムノターゲッティングのためのモノクローナル抗体）」，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（編），  ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  （１９８５））、  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （ドラッグデリバリーのための抗体）」，  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （第２版），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（編），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ６２３−５３  （１９８７）、  Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  （癌治療における細胞毒性薬の抗体キャリア：レビュー）」，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（編），  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）、  「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の分析、結果および将来的展望）」，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（編），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ３０３−１６  （１９８５）、  およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  （抗体−毒素コンジュゲートの製造および細胞毒性作用）」，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  （５２：１１９−５８  （１９８２））を参照する。
【００８３】
抗体をコードするポリヌクレオチド及び抗体の作製方法
本発明はさらに、本発明の抗体またはその変異体もしくは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。
例えば、図２は図１に示す抗体の各ペプチド鎖をコードする３つのポリヌクレオチドの構造を示す。
本明細書では、二重特異性配体における各ポリペプチド鎖をコードする例示的な配列を提供する。一態様において、該一本鎖単位の融合ペプチドは配列番号２の核酸配列によりコードされる。一態様において、該一価単位の重鎖は配列番号４の核酸配列によりコードされる。一態様において、該一価単位の軽鎖は配列番号６の核酸配列によりコードされる。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の全体を、同一のポリヌクレオチド分子上に、または別々のポリヌクレオチド分子上にコードすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分を、同一のポリヌクレオチド分子上に、または別々のポリヌクレオチド分子上にコードすることができる。
【００８５】
抗体の作製方法は当技術分野で公知であり、本明細書中で説明される。いくつかの実施例において、本発明の抗原結合性ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、従来技術で記載されかつ本明細書で説明される技術を用いて作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変された（しかし、その内在性遺伝子座が無効にされた）トランスジェニック動物に抗原を投与することによって作製することができる。そのような抗体を作製するために使用できる代表的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号および第６，４２０，１４０号に記載されており、それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【００８６】
いくつかの実施例において、作製された抗体は、治療される動物（例えば、ヒト）において有害な免疫応答を誘発しないものである。一実施例において、本発明の抗原結合性ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体は、当技術分野で認められた技術を用いて、その免疫原性が低下するように改変される。例えば、抗体をヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するまたは実質的に保持するが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト抗体（一般的には、マウスまたは霊長類抗体）である。これは、以下の方法を含めて、さまざまな方法で達成することができる：（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を作製する方法、（ｂ）１又は２以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域（重要なフレームワーク残基を保持するまたは保持しない）にグラフトする方法、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様セクションでそれらを「クローキング」（ｃｌｏａｋｉｎｇ）する方法。
【００８７】
このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５７：６８５１−６８５５  （１９８４）、  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：６５−９２  （１９８８）、  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）、  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２５：４８９−４９８  （１９９１）、  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３１：１６９−２１７  （１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号および第６，１９０，３７０号に開示されており、これらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【００８８】
抗体の免疫原性を低下させるために脱免疫化を用いることも可能である。本明細書中で使用する用語「脱免疫化」とは、Ｔ細胞エピトープを変更するための抗体の改変を含む（例えば、国際出願公開公報ＷＯ／９８５２９７６  Ａ１およびＷＯ／００３４３１７  Ａ２を参照する）。例えば、本発明は、出発抗体由来の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を解析して、その配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）と他のキー残基との関連でエピトープ位置を示す各Ｖ領域からヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を作成する。そのＴ細胞エピトープマップから個々のＴ細胞エピトープを解析して、最終的な抗体の活性を変化させるリスクの低い代替アミノ酸置換を特定する。本発明は、アミノ酸置換の組合せを含むさまざまな代替的可変重鎖および可変軽鎖配列を設計し、次にこれらの配列を各種の結合ポリペプチドに組み込む。通常は、１２〜２４の変異型抗体を作製して、結合性および／または機能性について試験する。その後、変更された可変領域とヒト定常領域を含む完全重鎖／軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、得られたプラスミドを全抗体の産生のために細胞株に導入する。その後、これらの抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイで比較し、最適な変異体を同定する。
【００８９】
本発明の抗原結合性ポリペプチドの結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで決定することができる。
または、一本鎖単位の作製のために記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号、  Ｂｉｒｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２  （１９８８）、  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５５：５８７９−  ５８８３  （１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４  （１９８９））は、本発明の一本鎖単位を作製するために用いられる。一本鎖融合ペプチドは、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを、アミノ酸ブリッジを介して連結して、一本鎖単位を形成することにより得られる。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）内での機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術を用いてもよい（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：  １０３８−１０４１  （１９８８））。
【００９０】
一本鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）および抗体を作製するために使用できる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８  （１９９１）、  Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１９９５−１９９９  （１９９３）、  ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０  （１９８８）に記載される方法などがある。ヒトでの抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出法を含めて、いくつかの用途では、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を用いることが好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を含む抗体である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  （１９８５）、  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４  （１９８６）、  Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２  （１９８９）、  米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、  および第４，８１６３９７号を参照し、それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【００９１】
ヒト化抗体は、目的の抗原と結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子であり、非ヒト種由来の１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する。通常、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基に置換され変更し、抗原結合能力を高める置換が好ましい。これらのフレームワーク置換は当技術分野でよく知られた方法によって認識することができ、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって、抗原結合と配列比較にとって重要なフレームワーク残基を同定し、特定位置の特異なフレームワーク残基を見つける（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５８５，０８９号、  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）を参照し、それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる）。
【００９２】
抗体は当技術分野で知られたさまざまな技術を用いてヒト化することができ、これらの技術として、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ  ２３９，４００、  ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／０９９６７、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、  および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ５９２，１０６、ＥＰ  ５１９，５９６、  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８  （１９９１）、  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４  （１９９４）、  Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３  （１９９４））、及びチェインシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）  （米国特許第５，５６５，３３２号、これらの全内容を参照により本明細書に組み入れる）を含む。
【００９３】
完全ヒト抗体はヒト患者の治療にとって特に望ましいものである。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を含めて、当技術分野で知られたさまざまな方法により作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５およびＷＯ  ９１／１０７４１を参照し、それぞれの全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【００９４】
ヒト抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現する能力がないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生させることも可能である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞にランダムにまたは相同組換えによって導入する。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。相同組換えによって、マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座に非機能性的に別に、または同時に導入されることができる。具体的に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内在性抗体の産生を妨げる。
【００９５】
改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞へのマイクロインジェクションを行ってキメラマウスを作製する。その後キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を得る。そのトランスジェニックマウスを、所定の抗原（例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部）を用いて通常の方法で免疫する。免疫したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて、その抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。該トランスジェニックマウスにより保持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成され、続いてクラススイッチと体細胞変異を受ける。したがって、該技術を用いて、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７３：６５−９３  （１９９５）を参照する。
【００９６】
ヒト抗体とヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術およびそのような抗体を作製するための技術手段の詳細な解説については、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、  第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照し、それらの全内容を参照により本明細書に組み入れる。また、例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）とＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの会社は、上記技術に類似する技術で、所定の抗原に対するヒト抗体を得て提供することができる。
【００９７】
所定のエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導された選択」と呼ばれる技術を用いて作製することもできる。該方法では、所定の非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択へと誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７２：８９９−９０３  （１９８８）。さらに、米国特許第５，５６５，３３２号を参照し、その全内容を参照により本明細書に組み入れる）。
【００９８】
別の実施例において、目的のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡが、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定され得る。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源とする。単離した後、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次に大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞などの、免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞にトランスフェクトする。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載するように合成であってもよい）を用いて、１９９５年１月２５日付けのＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されるように、抗体の製造のために定常および可変領域配列をクローン化することができる。本質的に、これは、所定の細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いるＰＣＲによる増幅を必要とする。この目的に適したプライマーも米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下で詳細に説明するように、目的の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的な供給を提供するために、比較的多量に増殖させることができる。
【００９９】
また、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の抗原結合性ポリペプチドの１又は２以上のＣＤＲを、フレームワーク領域内に、例えば非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域に、挿入することができる。フレームワーク領域は天然のまたは共通のフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７８：４５７−４７９  （１９９８）を参照する）。好ましくは、該フレームワーク領域とＣＤＲを組み合わせて作製されたポリヌクレオチドは、目的のポリペプチド（例えば、ＬＩＧＨＴ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するポリペプチドをコードするものである。好ましくは、１又は２以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で行われ、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を改善するものである。さらに、このような方法は、鎖内ジスルフィド結合に関与する１又は２以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製するために用いられる。ポリヌクレオチドへのその他の改変は本発明の範囲内に含まれ、従来技術の範囲内である。
【０１００】
さらに、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術を使用することができ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ：８５１−８５５  （１９８４）、  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６０４−６０８  （１９８４）、  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４  （１９８５））、キメラ抗体は、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とつなぎ合わせることにより作製される。本明細書で用いるキメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域をもつ抗体である。
【０１０１】
しかしながら、組換え抗体を作製するための別の非常に効率のよい手段は、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １４５５−１４６０  （１９９２）に開示されている。具体的には、この技術は、サル可変ドメインとヒト定常領域を含む霊長類化抗体の作製をもたらす。この文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。さらに、この技術は共同譲渡による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号にも記載され、それぞれを参照により本明細書に組み入れる。
【０１０２】
または、当業者によく知られた技術を用いて、抗体産生細胞系を選択して培養することが可能である。そのような技術はさまざまな実験マニュアルおよび主要刊行物に説明されている。これに関して、以下で説明する本発明において用いるのに適した技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）に記載され、補足を含めて、その全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１０３】
さらに、当業者に公知の標準方法を用いて、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができ、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的変異誘発法およびＰＣＲ介在変異誘発法を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、基準となる重鎖可変領域、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、軽鎖可変領域、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２またはＣＤＲ−Ｌ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、変異は、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体は生物学的活性についてスクリーニングされ、活性を保持する変異体が同定される。
【０１０４】
治療および診断方法
本明細書に記載したように、本発明の抗原結合性ポリペプチド、変異体または誘導体は、癌または感染性の疾患と関連した特定の治療および診断方法において使用される。
本発明はさらに、抗体をベースとした治療方法に関し、その治療は、本明細書に記載する１つまたは複数の疾患または症状を治療するために、動物、哺乳動物、ヒトなどの患者に本発明の二重特異性抗体を投与することを含む。本発明の治療用化合物には、本発明の抗体（本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む）、及び核酸または本発明の抗体（本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む）をコードするポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明の抗体は、以下のような疾患、障害または症状を治療する、抑制する、または予防するために用いることもできる：悪性疾患、障害、またはそのような疾患や障害と関連した症状、例えば細胞の生存増加またはアポトーシスの抑制と関連した疾患、例えば癌（例えば濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍;大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、グリア芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌などを含むが、これらに限定されない）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーヴス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、橋本甲状腺炎、自己免疫性糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎、自己免疫性胃炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および関節リウマチなど）、及びウイルス感染（ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスなど）、炎症、移植片対宿主病（急性および／または慢性）、急性の移植片拒絶、および慢性の移植片拒絶。本発明の抗原結合性ポリペプチド、その変異体または誘導体は、癌、特に、上で挙げたものまたは次の段落で挙げるものの増殖、進行および／または転移を抑制するために用いられる。
【０１０６】
本発明の抗体、その変異体または誘導体を用いて治療、予防、診断および／または予後判定することができる、細胞の生存増加と関連したさらなる疾患または症状には、以下の悪性腫瘍の進行および／または転移とその関連障害が含まれるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び固形腫瘍、肉腫および癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊椎腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、乏突起膠腫、聴神経腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明の抗体は、微生物によって引き起こされる感染症を治療する、または微生物および免疫細胞を標的とすることによって、微生物の除去を達成する微生物を殺すために用いられる。一態様において、微生物は、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原生動物または真菌を含む。以下の表４に感染症と関連する微生物の非限定的な例を提供する。
【０１０８】
【表６−１】
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【０１０９】
【表６−２】
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【０１１０】
【表６−３】
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【０１１１】
【表６−４】
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【０１１２】
【表６−５】
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【０１１３】
【表６−６】
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【０１１４】
【表６−７】
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【０１１５】
【表６−８】
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【０１１６】
個々の患者に対する具体的な用量および治療レジメンはさまざまな要因に依存し、用いる特定の抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与時刻、排泄速度、薬物の組合せ、治療対象の具体的な疾患の重症度を含む。医療従事者によるそうした要因の判断は当分野の通常の技術の範囲内である。その量は、治療しようとする個々の患者、投与経路、製剤の種類、用いる化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果にも左右される。使用量は当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的原則によって決定することができる。
【０１１７】
抗原結合性ポリペプチド、その変異体もしくは誘導体の投与方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、これらに限定されない。該抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、いかなる便利な経路で、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により、投与することができ、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。したがって、本発明の抗原結合性ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、脳槽内に（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、膣内に、腹腔内に、局所的に（例えば、粉末、軟膏、点滴剤または経皮パッチ）、バッカル錠、または経口もしくは鼻腔スプレーとして投与することができる。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「非経口」とは、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む投与方式を指す。
投与は全身投与または局所投与とすることができる。さらに、本発明の抗体は、脳室内およびくも膜下への注入を含む適切な経路で中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注入は、例えばオマヤレザバー（Ｏｍｍａｙａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）などのレザバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進される。また、肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザーとエアロゾル化剤を含む製剤を用いることにより、利用することができる。
【０１１９】
本発明の抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、治療が必要な個所に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯との併用、注射、カテーテル、座剤、またはインプラントによって達成することができ、前記インプラントは、シラスティック膜または繊維を含めて、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様の材料で構成される。本発明のタンパク質（抗体）を含めて、タンパク質を投与する場合は、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意する必要がある。
【０１２０】
別の実施例において、抗原結合性ポリペプチドまたは組成物はベシクル、特にリポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３、  Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  （感染症と癌の治療におけるリポソーム），  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５  （１９８９）、  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，  上掲，  ｐｐ．  ３１７−３２７を参照する）。
【０１２１】
さらに別の実施例において、抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は放出制御系で送達することができる。一実施例において、ポンプが使用される（Ｓｅｆｔｏｎ，  １９８７，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１、  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７、  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４を参照する）。別の実施例において、ポリマー材料が用いられる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  （放出制御の医学的応用），  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（編），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９７４）、  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  （制御された薬物のバイオアベイラビリティ、薬物製品のデザインと性能）  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編），  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４）、  Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ．，  １９８３，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３：６１を参照し、さらに、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０、  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５：３５１、  Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１：１０５も参照する）。さらに別の実施例において、放出制御系を治療標的、すなわち脳の近くに配置することができ、したがって、全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  （放出制御の医学的応用），  上掲，  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．  １１５−１３８  （１９８４）を参照する）。他の放出制御系は、Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）によるレビューで説明されている。
【０１２２】
本発明の組成物がタンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する具体的な実施形態において、核酸は、そのコード化タンパク質の発現を促進するために、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それが細胞内に取り込まれるように投与することにより、インビボ投与することができ、例えば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または直接注入、または微粒子銃の使用（例えば、遺伝子銃、  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，  Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬によるコーティング、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドにそれを結合させて投与する（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）など、によって行うことができる。あるいは、核酸は、細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞のＤＮＡ内に組み込むことが可能である。
【０１２３】
本発明の抗体の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる炎症性、免疫性または悪性の疾患、障害または症状の治療、抑制および予防に有効である。さらに、最適な投与量範囲の特定に役立てるために、場合によりインビトロアッセイを用いることもできる。製剤で使用する正確な用量は、投与経路と、疾患、障害または症状の重症度にも依存し、医師の判断と各患者の具体的な状況に応じて決定されるべきである。有効な用量はインビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿されてもよい。
【０１２４】
一般的な命題として、本発明の抗原結合性ポリペプチドの患者への投与量は、一般的には０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般的に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応により、他の動物種由来の抗体よりも、ヒト体内で長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体のより低い投与量およびより少ない投与回数が可能である。また、本発明の抗体の投与量と投与回数は、例えば脂質化のような修飾によって、抗体の吸収と組織透過性（例えば、脳への透過性）を高めることで減らすことができる。
【０１２５】
本発明の抗体、その変異体の投与を含む感染、または悪性の疾患、障害または症状を治療する方法は一般的に、インビトロで試験され、その後、所望の治療または予防活性について、許容される動物モデルを用いてインビボで試験され、最後にヒトに使用する。トランスジェニック動物をはじめとする、適切な動物モデルが当業者によく知られている。例えば、本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチドの治療上の有用性を実証するインビトロアッセイには、抗原結合性ポリペプチドが細胞系または患者の組織サンプルに及ぼす効果が含まれる。抗原結合性ポリペプチドが細胞系および／または組織サンプルに及ぼす効果は、本明細書の他の個所に開示するアッセイなどの、当業者に公知の技術を利用して測定することができる。本発明によると、特定の抗原結合性ポリペプチドの投与が示唆されるかどうかを判断するために使用できるインビトロアッセイには、インビトロ細胞培養アッセイが含まれ、このアッセイでは、患者の組織サンプルを培養下で増殖させて化合物にさらすか、他の形で組織サンプルに化合物を投与し、その化合物が組織サンプルに及ぼす効果を観察する。
【０１２６】
さまざまな送達系が知られており、本発明の抗体または本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現できる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９８７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などが用いられる。
【０１２７】
別の実施例において、本発明の組成物は抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤もしくは抗生物質、または抗真菌剤と組み合わせて投与される。当技術分野で公知のこれらの薬剤はいずれも、本発明の組成物の中に入れて投与することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の組成物は化学療法剤との併用で投与される。本発明の組成物と共に投与される化学療法剤としては、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびアクチノマイシンＤ）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、フロキシウリジン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）、細胞毒性剤（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン）、ホルモン類（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、２リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）、ステロイドおよびその組合せ（例えば、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム）、及びその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
他の実施例において、本発明の組成物はサイトカインとの併用で投与される。本発明の組成物と共に投与されるサイトカインとして、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＮＦ−αを含むが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は他の治療または予防レジメン、例えば放射線療法、と組み合わせて投与することができる。
【０１３０】
組成物
さらに、本発明は医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療的有効量、および薬学的に許容される担体を含む。一具体的な実施例において、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方、または動物における、特にヒトにおける使用に関する一般に認識された薬局方に収載されていることを意味する。また、「薬学的に許容される担体」は一般に、無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、またはあらゆる種類の処方助剤である。
【０１３１】
用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、水、および石油、動物性油、植物性油、または合成起源の油を含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、無菌の液体などであってもよい。医薬組成物が静脈内に投与される場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射用の溶液用の液体状担体として使用することもできる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含んでもよい。
【０１３２】
抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを使用してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形状をとり得る。該組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体によって坐剤として製剤化することができる。経口製剤には、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。適当な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され、参照により本明細書に組み入れる。このような組成物は、患者へ適切に投与するための剤形を提供するために、適当な量の担体と共に、治療的有効量の抗原結合性ポリペプチド、好ましくは、精製形態のものを含有する。製剤は投与方式に適合させるべきである。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量のバイアルの中に封入することができる。
【０１３３】
一実施例において、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一般的に、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、該組成物は可溶化剤、および注射部位における疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤を含めることができる。一般に、諸成分は別々に供給されるか、または単位剤形として一緒に混合され、例えば、アンプルまたは活性薬剤の量を示す小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉容器に入れた凍結乾燥粉末または水不含の濃縮物として提供される。組成物が注入によって投与される場合は、製薬等級の滅菌水または生理食塩水を含む注入ボトルによって調剤することが免除できる。組成物が注射により投与される場合には、投与前に諸成分を混合するように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１３４】
本発明の化合物は、中性または塩の状態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などの陰イオンによって形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などの陽イオンによって形成される塩を含む。
【０１３５】
実施例
実施例１．抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−抗ＣＤ３二重特異性抗体の作製。
材料
【０１３６】
抗ヒトＨｅｒ２のヒト化のモノクローナル抗体ハーセプチンのＶＬ及びＶＨをコードするポリヌクレオチド、抗ヒトＣＤ３ヒト化のモノクローナル抗体ＨＯＫＴ３のＶＬ及びＶＨをコードするポリヌクレオチド、ＩｇＧ１重鎖定常領域ＣＨ１をコードするポリヌクレオチド、ヒンジのヒンジ領域及びＦｃをコードするポリヌクレオチド、及びＣＬのカッパ鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＯＫＴ３  ＳｃＦｖ、ＶＬ及びＶＨを連結するリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３は、従来の方法を用いて合成した。
【０１３７】
方法と結果
１．発現ベクターの構築
ｐｃＤＮＡ３．１（−）はハーセプチン重鎖発現構築物を作製するために、発現ベクターとして使用した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏはハーセプチン軽鎖発現構築物およびＨＯＫＴ３単鎖構築物を作製するために、発現ベクターとして使用した。プライマーは、ＶＬ、ＶＨ、ＳｃＦｖ、ＣＨ１及びＦｃの配列並びにｐｃＤＮＡ３．１（−）とｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏベクターの多重クローニング部位により設計した（表５）。ＶＬおよびＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１、ＣＨ１およびＦｃ、ＳｃＦｖ  ＶＬおよびＶＨ、ＳｃＦｖおよびＦｃフラグメントはオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により接続した。
【０１３８】
【表７】
0006571527.tif 000016
【０１３９】
ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１のＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間インキュベーションし、その後、９５℃で３０秒変性し、５６℃で３０秒アニーリングし、７２℃で１分間延長し、７２℃で１０分間閉鎖延長することを２５サイクルを行う。図３には、ＰＣＲ産物を示すゲル写真を提供する。
ＦｃおよびＳｃＦｖのＰＣＲ増幅条件は、２５サイクルにける各９５℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の延長を除いて同様であった。図４には、ＰＣＲ産物を示すゲル写真を提供する。
オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いてハーセプチンのＶＨ及びＣＨ１、およびＶＬ及びＣＬを接続した。等量のＶＨ及びＣＨ１、又はＶＬ及びＣＬ、及ＣＨ１及びＦｃを回収し、それぞれテンプレート及びプライマーとして用いられる。他の条件は従来のＰＣＲと似て、２サイクルを行う条件は９５℃で２分間変性し、５５℃で２分間アニーリングし、７２℃で２分間延長することである。その後、ＶＨ５’末端オリゴヌクレオチドプライマー及びＣＬ３’末端プライマーを加え、９５℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の延長という条件で２５サイクルを行う。終了サイクルは７２℃で１０分間の延長を含む。
【０１４０】
ＶＨ−ＣＨ１及びＦｃ、ＳｃＦｖ及びＦｃのためのオーバーラップ伸長ＰＣＲ接続の条件は回収したＶＨＣＨ１および等量のＦｃ、ＳｃＦｖ及びＦｃをテンプレート及びプライマーとして用いられることを含む。最初のインキュベーションは９５℃で２分間変性し、５５℃で２分間アニーリングし、および７２℃で３分間延長する反応を２サイクル含む。その後、ＶＨ５’末端オリゴヌクレオチドプライマー及びＣＬ３’末端プライマーを加え、その後、９５℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の延長という条件で２５サイクルを行う。終了サイクルは７２℃で１０分間の延長を含む。図５には、ＰＣＲ産物を示すゲル写真を提供する。
【０１４１】
ＤＮＡ断片の回収キットを用いてＰＣＲ産物を回収し、且つＮｈｅＩおよびＸｈｏＩの２種類の制限酵素を使用してＤＮＡフラグメントを切断する。その後、該フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターに挿入してｐｃＤＮＡ３．１（−）−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎと命名された。同様に、ＨＯＫＴ３のためのＳｃＦｖ−Ｆｃフラグメント（Ｎｈｅ１及びＸｈｏ１の２種類の制限酵素で切断）、ハーセプチンのＶＬ−ＣＬフラグメント（Ｎｈｅ１及びＢａｍＨＩの２種類の制限酵素で切断）もｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏベクターに挿入してｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ−ＨＯＫＴ３ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎとそれぞれ命名された。
【０１４２】
２．点突然変異
点突然変異はキットＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ及びｐｃＤＮＡ３．１（−）−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ−ＨＯＫＴ３ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎＦｃのプライマー（表６）により行う。該反応は、キットのマニュアルに従って行う。該突然変異は配列決定により確認した（配列決定ベクターが、図６〜８に示されている）。
【０１４３】
【表８】
0006571527.tif 000017
以下の表７には、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−抗ＣＤ３二重特異性抗体の各鎖の配列を示した。
【０１４４】
【表９−１】
0006571527.tif 000018
【０１４５】
【表９−２】
0006571527.tif 000019
【０１４６】
【表９−３】
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【０１４７】
３．増幅
組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ．Ｃｏ１ｉ）ＴＯＰ１０に形質転換した。単一コロニーを採取して１００  ｍｇ  ／  Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上で増殖させ、３７℃で振動条件下で１６時間培養した。その後、８０００×ｇで１０分間遠心して細菌を集めた。Ｔｉａｎｇｅｎエンドトキシンキット（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｋｉｔ）を用いてプラスミドを単離し、該プラスミドを１ｍｌの溶出ＥＢ緩衝液に溶解した。イソプロパノール１．４２ｍｌ及びＮａＣ１０．４２ｍｌを使用してプラスミドを沈殿させ、その後、７０％エタノール０．５ｍｌで２回洗浄し、その後、超クリーンベンチで空気乾燥した後、滅菌超純水（１ｍＬ）に溶解させた。ＯＤ２６０／２８０でプラスミド濃度を測定した。ＯＤ２６０／２８０値は１．８〜１．９の間にあることは、高純度のプラスミドＤＮＡであることが示唆されている。
【０１４８】
４．哺乳動物細胞２９３ＦにおけるトランスフェクションおよびＭＳＢＯＤＹの発現
トランスフェクションの前の２４時間において、３７℃、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍという条件下で１×１０６の２９３Ｆ細胞を１２５ｍｌのフラスコ内の２８ｍｌの２９３ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地に播種した。１００μｌ  ２９３ｆｅｃｔｉｎを１ｍｌのＯＰｔｉＭＥＭに加え、撹拌条件下で、室温で５分間インキュベーションした。同時に、組み換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ−ＨＯＫＴ３ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ＬＤＹ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ＴＫＫ（−）及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎを３：２：１の割合で混合した。ＤＮＡ全量は３０μｇであり、１ｍｌＯＰｔｉＭＥＭに溶解させた。ＤＮＡ及び２９３ｆｅｃｔｉｎを完全に混合し、且つ全体積を２ｍｌにし、室温で１５分間インキュベーションした。その後、該混合物を細胞培養物に加えた。細胞を、３７℃で且つ５％ＣＯ２を含むインキュベータで、１３０ｒｐｍで５日培養した。細胞上清中の抗体の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（図９）により検出した。該抗体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対して特異性を有する一価軽鎖／重鎖単位及びＣＤ３に対する特異性を有する一本鎖単位を含むＭＳＢＯＤＹを指す。
【０１４９】
５．抗体精製
細胞培地を２０００×ｇで遠心し、上清を集め、０．２２μｍのフィルターでろ過した。回収した液を１０倍（体積で）結合緩衝液（９．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋４０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）で希釈し、その後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社から入手、５ｍｌ体積）、Ｆａｂ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＫＢＰ  Ａｇａｒｏｓｅ  アフィニティーフィラー（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手、５ｍｌ体積）及びＳＰカチオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社から入手、１０ｍｌ）により精製し、メーカーのマニュアルに基づいて行う。精製されたタンパク質を６％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブリリアントブルー染色により検出した（図１０参照）。
【０１５０】
実施例２．二重特異性抗体の結合活性分析
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−抗−ＣＤ３二重特異性抗体（ＭＳＢＯＤＹ）のＨｅｒ２及びＣＤ３を含む細胞に結合する能力はＢＴ４７４及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して検出した。
細胞培養物から３×１０５のＢＴ４７４細胞を集め、５０μｌＰＢＳ、１０ｎＭハーセプチン又は１０ｎＭ二重特異性抗体でインキュベーションした。３０分間後、細胞を１％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回洗浄し、その後、２．５μｌ  ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃと混合した。該混合物を室温下で３０分間インキュベーションし、該細胞を再び１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した。その後、該サンプルをＦＡＣＳ機器により検出した。
【０１５１】
図１１Ａに示すように、ハーセプチン（黒点線）及び抗Ｈｅｒ２Ｘ抗ＣＤ３ＭＳＢＯＤＹ（黒実線）二重特異性抗体は全て乳癌細胞系ＢＴ４７４に結合し、その内、灰色の線は陰性対照である。この結果は、該二重特異性抗体が、効果的にＨｅｒ２発現癌細胞に結合することができることが示される。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もＣＤ３を表現する。１．５×１０６ＰＢＭＣ細胞を作製して５０μｌＰＢＳ、１２．５ｎＭ  ＨＯＫＴ３又は１２．５ｎＭ二重特異性抗体でインキュベーションした。二重特異性リガント（黒実線）により結合されたＰＢＭＣ細胞の存在量はＨＯＫＴ３により結合された細胞（黒点線）と同じ高さである（図１１Ｂ）。
【０１５２】
実施例３．二重特異性抗体ＢＴ−４７４細胞的細胞毒性試験
ＢＴ−４７４細胞を、標的細胞として、９６ウェルプレート（１００００細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、単離したヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を加え、次いで該混合物をＨＯＫＴ３抗体、ＭＳＢＯＤＹ、ヒトＩｇＧタンパク質又はＰＢＳ単独と共にインキュベーションした（４０：１エフェクター細胞−標的細胞（Ｅ−Ｔ）比）。図１２には、各抗体についての細胞凝集を示す画像を提供する。対照サンプル（ＰＢＳ）およびヒトＩｇＧサンプルには、細胞凝集を示さないが、ＭＳＢＯＤＹは誘発下でＨＯＫＴ３と同じ量の細胞凝集を有することが明らかである。
【０１５３】
ＭＳＢＯＤＹ、ハーセプチン、ＨＯＫＴ３、及びハーセプチン＋ＨＯＫＴ３に対する抗体誘導性の細胞毒性を測定し、ヒトＩｇＧを対照として用いられる。ＢＴ−４７４細胞（標的細胞）はまず５μＭ  ＣＦＳＥで染色した後、ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞：Ｅ−Ｔ比：５：１）と混合した。同じ濃度のハーセプチン、ＨＯＫＴ３、ハーセプチン＋ＨＯＫＴ３、ＭＳＢＯＤＹ及びヒトＩｇＧを細胞培養物に加えた。２４時間インキュベーションした後、細胞を集めて１μｇ／ｍｌ  ＰＩで染色し、フローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。細胞がＣＦＳＥ及びＰＩで二重染色される場合、死細胞とカウントした。死細胞数及び細胞全量的比率で細胞死亡率を計算した。測定した細胞死亡率及び自然細胞死亡率の差で細胞毒性を計算した。結果を図１３に示し、ハーセプチン及びＨＯＫＴ３と比べて、ひいてはハーセプチン及びＨＯＫＴ３の組み合わせと比べて、ＭＳＢＯＤＹは最も高い細胞毒性を示した。
【０１５４】
他の細胞毒性研究は、エフェクター細胞としてヒトＴリンパ球を用い、及び標的細胞としてＢＴ−４７４を用いて行った。ＢＴ−４７４細胞はまず５μＭ  ＣＦＳＥで染色した。翌日、ヒトＰＢＭＣを５０ｎＭヒトＩｇＧ、ハーセプチン＋ＨＯＫＴ３、ＭＳＢＯＤＹ又はＰＢＳと混合し、室温で３０分間放置した。細胞を１％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、その後、２０％ＦＢＳで再懸濁した。その後、処理したＰＢＭＣ細胞をＢＴ−４７４細胞に加え、２０：１、１０：１、５：１、２．５：１及び１．２５：１ののＥＴ比で加えた。混合した細胞を４８時間インキュベーションした（図１４）。その後、集めた細胞を染色してカウントした。図１４に示すように、ハーセプチン及びＨＯＫＴ３と予備混合したＰＢＭＣと比べて、ＭＳＢＯＤＹをインキュベーションしたＰＢＭＣは、ほとんどの細胞死につながった。
これにより、該実施例は、ＭＳＢＯＤＹが細胞凝集を引き起こすＨＯＫＴ３と同程度に有効であり、且つハーセプチンとＨＯＫＴ３両方よりも高い細胞毒性を有することが予想外に示された。
【０１５５】
実施例４．抗体間の比較
該実施例はＭＳＢＯＤＹを他のタイプの抗体と比較し、これらの他のタイプの抗体がＨｅｒ２／ｎｅｕ及びＣＤ３の一方又は両方に対しても特異性を有し、該実施例がＭＳＢＯＤＹの予想外に高い活性および安定性を示す。
本実施例で試験した様々なタイプの抗体は図１５Ａ−Ｅに示す。図１５ＡはＭＳＢＯＤＹを示し、一価単位がハーセプチンのＶＨ及びＶＬを含み、且つ一本鎖単位がＨＯＫＴ３のＶＨ及びＶＬを含む。図１５Ｂにける抗体はほとんどＭＳＢＯＤＹの鏡像と呼ばれる「ＳＭＢＯＤＹ」である。該ＳＭＢＯＤＹは一価単位及び一本鎖単位を含み、該一価単位がＨＯＫＴ３のＶＨ及びＶＬを含み、且該一本鎖単位がハーセプチンのＶＨ及びＶＬを含む。
【０１５６】
図１５Ｃにおける抗体は「ＳＳＢＯＤＹ」と呼ばれ、２つの一本鎖単位を含み、１つがハーセプチンのＶＨ及びＶＬを含み、もう一つがＨＯＫＴ３のＶＨ及びＶＬを含む。図に示すように、ＭＳＢＯＤＹ、ＳＭＢＯＤＹ及びＳＳＢＯＤＹは全て任意の塩橋及び「ノブ」−「ホール」構造を含む。
図１５Ｄは２つの一本鎖単位が全てハーセプチンのＶＨ及びＶＬを含む二重一本鎖抗体（「ハーセプチン一本鎖」と呼ばれる）を示す。そのうち、該抗体は単一特異性を有する。最後に、図１５Ｅは、「ＨＯＫＴ３単鎖」と呼ばれるＨＯＫＴ３のＶＨおよびＶＬを含む２つの単鎖単位を有する二重一本鎖抗体を示す。
【０１５７】
Ｈｅｒ２発現細胞に対するＭＳＢＯＤＹ及びＳＭＢＯＤＹの結合親和力比較するために、３×１０５ＢＴ−４７４細胞を、異なる希釈の濃度の精製されたＭＳＢＯＤＹ又はＳＭＢＯＤＹで５０μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清（１％ＦＢＳ−ＰＢＳ）でゆっくり攪拌しながら室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションした。その後、細胞を１％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌ  １０μｇ／ｍｌのＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  ４０９３０４）を含む１％ＦＢＳ−ＰＢＳに３０分間インキュベーションした。細胞を再び２回洗浄し、１％ＦＢＳ−ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリー検査を行った。
【０１５８】
前記の結合解析に使用されるＢＴ−４７４細胞は細胞に結合する抗体を検出するためにフローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により解析した（図１６Ａ及びＢ）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して値及び図表解析が得られた。１部位結合（Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）（双曲線）法によってＫｄを測定するために、測定された平均蛍光強度を抗体濃度の関数としてプロットした。結果を図１７に示し、Ｈｅｒ２発現細胞への結合においてＭＳＢＯＤＹの親和力がＳＭＢＯＤＹよりも約２倍高いことが示された。
【０１５９】
ＳＭＢＯＤＹおよび種々の単鎖抗体と比較し、ＭＳＢＯＤＹの熱安定性は、熱負荷アッセイを用いて測定した。ハーセプチン、ハーセプチン一本鎖、ＭＳＢＯＤＹ及びＳＳＢＯＤＹを、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈して３７℃〜８２℃（５℃ステップ）の範囲の種々の温度で１時間放置した。
【０１６０】
Ｈｅｒ２タンパク質（２．５μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩インキュベーションし、その後、３％ＦＢＳで２時間処理した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、抗体を１ｎＭに希釈してＨｅｒ２と１時間反応した。その後、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（１：１０Ｋ）を加えて反応温度で半時間放置した。その後、該サンプルをＰＢＳＴで５回洗浄してＴＭＢで染色し、ＯＤ４５０で読み取った。図１８は熱負荷曲線を示した。Ｘ軸は温度示し、Ｔ５０は、熱チャレンジ後の抗体の５０％が、Ｈｅｒ２への結合能を保持する温度を示す。該結合曲線は、１００％の最大結合に正規化した。ＭＳＢＯＤＹはＳＭＢＯＤＹ、ＳＳＢＯＤＹ及びハーセプチン一本鎖抗体より高い熱安定性を保持し、フルサイズのハーセプチンに近いことが分かった。この結果は、単鎖抗体が、不安定であることが知られていたので、全く予想外である。
【０１６１】
ヒトＩｇＧを対照としてＭＳＢＯＤＹ及びＳＭＢＯＤＹの抗体誘導性細胞毒性を測定した。Ｈｅｒ２タンパク質を比較的高いレベルで発現する高Ｈｅｒ２  ＢＴ−４７４細胞及びＨｅｒ２タンパク質を比較的低いレベルで発現する低Ｈｅｒ２細胞、例えばＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、まず５μＭ  ＣＦＳＥで染色し、その後、ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）と混合（Ｅ−Ｔ比：５：１）した。同じ濃度のＭＳＢＯＤＹ、ＳＭＢＯＤＹ及びヒトＩｇＧを該細胞培養物に加えた。４８時間インキュベーションした後、細胞を集めて１μｇ／ｍｌ  ＰＩで染色し、フローサイトメトリーでカウントした（ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞がＣＦＳＥ及びＰＩで二重染色される場合、死細胞とカウントした。死細胞数及び細胞全量的比率で細胞死亡率を計算した。測定した細胞死亡率及び自然細胞死亡率の差で細胞毒性を計算した。結果を図１９に示し、ＭＳＢＯＤＹとＳＭＢＯＤＹ両方が高ＨｅｒＢＴ４７４細胞に対して同様の細胞毒性を生じたことを示した。しかし、該ＭＳＢＯＤＹは、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの低Ｈｅｒ２乳癌細胞株に有意に高い細胞毒性を示した。
【０１６２】
実施例５．他の一価一本鎖二重特異性抗体の作製
上記の実施例は特異性一価一本鎖二重特異性抗体（ＭＳＢＯＤＹ）の作製及び試験の方法を示し、該二重特異性抗体はＨｅｒ２／ｎｅｕに対して特異性を有する一価単位及びＣＤ３に対して特異性を有する一本鎖単位を含む。同様の方法を使用し、それぞれ、腫瘍細胞を認識する一価単位及びエフェクター細胞を認識する一本鎖単位を有する他の該ＭＳＢＯＤＹ作製及び使用できる。
【０１６３】
例えば、一つのＭＳＢＯＤＹは、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＡＣ１３３抗体、セツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）の修飾された軽鎖および重鎖を含む一価単位を含むことができる。リツキシマブ配列の重鎖および軽鎖配列を以下の表に記載されている。
【表１０】
0006571527.tif 000021
【０１６４】
抗ＡＣ１３３抗体配列の重鎖及び軽鎖配列を以下の表に記載されている。
【表１１】
0006571527.tif 000022
【０１６５】
セツキシマブの重鎖及び軽鎖を以下の表に記載されている。
【表１２】
0006571527.tif 000023
【０１６６】
以上のような各重鎖は、塩橋および／または「ホール」に「ノブ」を導入するように修飾される。このような修飾の例は、表１〜３に記載されている。
本発明は、本発明の個々の態様の1つの例示として記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に均等の組成物または方法はいずれも本発明の範囲に含まれる。さまざまな修飾および変更を、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の方法および組成物においてなし得ることが、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲に入るという条件で、そうした修飾および変更をカバーするものである。
本明細書中に挙げたすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
0006571527.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006571527.tif 000030
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
0006571527.tif 000040
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
0006571527.tif 000042
【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0006571527.tif 000047
【配列表】
0006571527000001.app