(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
包含したタンパク質を、物理的または化学的ストレスから保護し、凝集体形成を抑制して安定に存在させた、チキソトロピー性を有する、ゲル状製剤であって、
前記ゲル状製剤は、タンパク質、希釈剤、１種または２種以上のシクロデキストリンまたはその誘導体、およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含み、
前記ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールの濃度が０．５〜２００ｍｇ／ｍｌであり、
下記式［１］：
【数１】
0006527697.tif 000027
で表されるゲル濃度が、７〜３０ｗｔ／ｖｏｌ％であり、
前記タンパク質が、前記ゲル濃度７〜３０ｗｔ／ｖｏｌ％のゲルに対して、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれる、ゲル状製剤。
【請求項２】
前記物理的ストレスが、熱および振動の少なくとも一方である、請求項１に記載のゲル状製剤。
【請求項３】
前記化学的ストレスが、ｐＨ、酸化および金属触媒反応の少なくとも１つである請求項１に記載のゲル状製剤。
【請求項４】
前記タンパク質が、医療用タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲル状製剤。
【請求項５】
タンパク質を、１種または２種以上のシクロデキストリンまたはその誘導体、およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むゲル状物に包含することを有する、タンパク質安定化方法であって、
前記ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールの濃度が、前記ゲル状物中、０．５〜２００ｍｇ／ｍＬであり、
下記式［１］：
【数２】
0006527697.tif 000028
前記タンパク質が、前記ゲル濃度７〜３０ｗｔ／ｖｏｌ％のゲルに対して、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれる、タンパク質安定化方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、医療用タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を安定化させたゲル状製剤およびタンパク質の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の発達によって、種々の活性タンパク質が製剤として提供されるようになった。特に抗体工学の進展により、キメラ抗体やヒト化抗体が実用化され、医薬品として大きな治療効果を上げており、特に抗体製剤の開発が活発に進められている。タンパク質医薬品は、従来、静脈注射による投与が一般的であったが、近年、患者の利便性を考慮し、自己投与も可能な皮下注射として提供される薬剤が増加している。このような皮下注射のための薬剤は、静脈注射と比較して投与容量が少ないことから、タンパク質を高濃度化することが必須となる。さらに最近は、経済的・実用的な面から、より高濃度化して投与回数を減らそうとする試みも多くなされており、市販される製剤には１００ｍｇ／ｍＬ以上のタンパク質濃度のものも存在する。【０００３】
しかしながら、このような高濃度のタンパク質製剤においては、気液界面への暴露およびタンパク質分子どうしの相互作用の機会が増加し、特に長期保存や輸送中に凝集体が発生する可能性が高い。凝集体の発生は、活性を持つタンパク質分子の量を減少させ、薬物動態を変化させ、さらには、投与後に抗薬物抗体の産生など望まれない免疫反応を惹起する可能性を有する（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，  Ｈ．  Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ２４（１１）：１７２０−１７４０．  ２００２．）。このため、米国ＦＤＡおよび欧州ＥＭＥＡでは、免疫原性の評価に対するガイドラインを設定し、対策を喚起している。また、ペプチドやホルモン等の低濃度のタンパク質製剤においても、種類や製剤によって凝集しやすいものが存在し、溶解時や投与時に激しく振とうしない、フィルターを通すなどの注意をする必要がある。【０００４】
このような背景から、高濃度のタンパク質製剤あるいは凝集しやすいタンパク質製剤において、凝集を低減し、長期間安定に保存できることが求められている。【０００５】
タンパク質製剤に、凝集、変性、分解、不溶性異物の生成、活性の低下などといった問題を生じさせるのは、ｐＨ変化、温度変化、酸化、振動、剪断などの化学的および物理的ストレスである。製剤の保存および輸送中の安定性を得るために、これまでは溶媒の条件をタンパク質に適切なものにする努力がなされてきた。タンパク質の凝集を抑制する一般的な方法としては、適切なｐＨの設定や種々の安定化剤の添加が広く行われており、安定化剤として使用される添加剤は、塩類、ポリオール、界面活性剤、アミノ酸等である。例えば、米国特許第４７８３４４１号明細書および国際公開第２００２／０１３８５９号は界面活性剤のタンパク質に対する安定化効果を開示する。また、米国特許第７６４８７０２号明細書および特許第４２１９９３２号明細書（米国特許第８４９６９３０号明細書）は、アルギニンおよびグリシンのタンパク質安定化効果について示している。【０００６】
これらの添加剤は、可溶性で、人体に毒性のないレベルでのみ使用される必要があり、活性成分であるタンパク質への適合性も考慮すると、これら添加剤の種類や添加量は自ずと制限され、また、タンパク質毎に適切な組成を見出すために多大な努力と時間が必要となる。このような背景から、安定化の方法は、タンパク質製剤に広く応用できる安定化方法が望ましい。【０００７】
長期の安定的な保存を可能にする手段としては、極低温（−８０℃）で凍結してタンパク質を保存する方法や、凍結乾燥された形態でタンパク質を保存する方法等も取られてきた。特に水溶液中で十分なタンパク質安定性が得られない場合、凍結乾燥は最も汎用性のある、実用的な代替手法となる。しかしながら、これらの方法は使用直前に投与形態への再構成を必要とするので、患者の利便性に関して著しい欠点を有するとともに、凍結融解工程や溶解操作がタンパク質の変性をもたらし得る。【０００８】
一方、近年は、結晶化や非水溶性のビヒクルを作製することによるエマルジョン形態での投与などに基づいた高濃度タンパク質の安定化方法も試みられている。例えば、国際公開第２００８／０７６８１９号は、ヒト成長ホルモンの結晶化による安定化の手段を示している。また、国際公開第９９／５５３１０号（米国特許第６５４１６０６号明細書）は、結晶化したタンパク質をポリマー性キャリア内でカプセル化することにより、安定化および薬剤放出制御効果が得られると述べている。
【発明の概要】
【０００９】
しかし、国際公開第２００８／０７６８１９号や国際公開第９９／５５３１０号（米国特許第６５４１６０６号明細書）に記載の技術をもってしても、物理的または化学的ストレスに対してタンパク質を十分安定させるには至っていなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、上記事情を鑑みて、物理的または化学的ストレスに対してタンパク質を安定化できるタンパク質製剤およびタンパク質の安定化方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明の他の目的は、物理的または化学的ストレスに対してタンパク質を長期間にわたり安定化できるタンパク質製剤およびタンパク質の安定化方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、タンパク質を包含したチキソトロピー性を有するゲル状製剤によって上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、包含したタンパク質を、物理的または化学的ストレスから保護し、凝集体形成を抑制して安定に存在させた、チキソトロピー性を有する、ゲル状製剤によって達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】実施例２（２）で得られたゲル状製剤２−１２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１Ｂ】実施例２（２）で得られたゲル状製剤２−３７の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２Ａ】（ａ）シクロデキストリン単独、（ｂ）ポリエチレングリコール単独、（ｃ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）ポリエチレングリコール／シクロデキストリン混合物、（ｅ）ポリエチレングリコール／シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、（ｆ）ヒトＩｇＧ非含有ゲル状製剤、および（ｇ）実施例２（１）で得られたゲル状製剤２−１２（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料２−１２ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図２Ｂ】（ａ）シクロデキストリン単独、（ｂ）ポリエチレングリコール単独、（ｃ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）ポリエチレングリコール／シクロデキストリン混合物、（ｅ）ポリエチレングリコール／シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、（ｆ）ヒトＩｇＧ非含有ゲル状製剤、および（ｇ）実施例２（１）で得られたゲル状製剤２−３７（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料２−３７ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図３Ａ】実施例２で得られたゲル状製剤２−１２の固体試料２−１２ａの粉末Ｘ線回折のピーク値および指数配当の結果を示す図である。
【図３Ｂ】実施例２で得られたゲル状製剤２−３７の固体試料２−３７ａの粉末Ｘ線回折のピーク値および指数配当の結果を示す図である。
【図４Ａ】（ａ）ヒトＩｇＧ単独、（ｂ）シクロデキストリン単独、および（ｃ）実施例２（１）で得られたゲル状製剤２−１２（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料２−１２ａのそれぞれのＦＴ−ＩＲスペクトルを表す図である。
【図４Ｂ】（ａ）ヒトＩｇＧ単独、（ｂ）シクロデキストリン単独、および（ｃ）実施例２（１）で得られたゲル状製剤２−３７（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料２−３７ａのそれぞれのＦＴ−ＩＲスペクトルを表す図である。
【図５Ａ】実施例３のゲル１２に速度一定（１００／ｓ）の応力を加えた際に生じるゲルの粘度変化を表す図である。
【図５Ｂ】実施例３のゲル３７に速度一定（１００／ｓ）の応力を加えた際に生じるゲルの粘度変化を表す図である。
【図６Ａ】実施例４で得られたゲル状製剤４−１２に応力を加えた後のゲルの粘度変化を表す図である。
【図６Ｂ】実施例４で得られたゲル状製剤４−３７に応力を加えた後のゲルの粘度変化を表す図である。
【図７】実施例８で得られたヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤８−１２、ＰＥＧ２００００を除いた製剤（α−ＣｙＤ＋ＩｇＧ）、実施例８で得られたヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤８−３７、ＰＥＧ２００００を除いた製剤（γ−ＣｙＤ＋ＩｇＧ）、シクロデキストリンを除いた製剤（ＰＥＧ＋ＩｇＧ）、シクロデキストリンおよびＰＥＧ２００００を除いた製剤（ＩｇＧ溶液）の振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果を表す図である。
【図８】実施例９における、ヒトＩｇＧを含有した処方２、４、５、６、１１、１２、１８、２６、３３、および３７のゲル状製剤の振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果を表す図である。
【図９】実施例１０における、ヒトＩｇＧを含有する処方２、４、５、６、１１、１２、１６、１８、２５、２６、３３および３７のゲル状製剤の振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果を表す図である。
【図１０】実施例１１における、ヒトＩｇＧを含有した処方１２および３７のゲル状製剤の熱ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果を表す図である。
【図１１】実施例１３における、ヒトＩｇＧを含有した処方４２のゲル状製剤の振動ストレスに対する抑制効果を表す図である。
【図１２】実施例１４における、ヒトＩｇＧを含有した処方５２のゲル状製剤の振動ストレスに対する抑制効果を表す図である。
【図１３Ａ】実施例２４における、ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクを含有した処方４０および５０のゲル状製剤の振動ストレスに対する抑制効果を表す図である。
【図１３Ｂ】実施例２４における、ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクを含有した処方４０および５０のゲル状製剤の振動ストレスに対する抑制効果を表す図である。
【図１４】実施例３２における、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を含有する処方４９および５９のゲル状製剤の振動ストレスによる変性に対する抑制効果を表す図である。
【図１５Ａ】（ａ）α−シクロデキストリン単独、（ｂ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８単独、（ｃ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８／α−シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、および（ｅ）実施例３４で得られたゲル状製剤３４−９７（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料３４−９７ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図１５Ｂ】（ｆ）α−シクロデキストリン単独、（ｇ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７単独、（ｈ）ヒトＩｇＧ単独、（ｉ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７／α−シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、および（ｊ）実施例３４で得られたゲル状製剤３４−９８（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料３４−９８ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図１５Ｃ】（ａ）γ−シクロデキストリン単独、（ｂ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８単独、（ｃ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８／γ−シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、および（ｅ）実施例３４で得られたゲル状製剤３４−１０２（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料３４−１０２ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図１５Ｄ】（ｆ）γ−シクロデキストリン単独、（ｇ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７単独、（ｈ）ヒトＩｇＧ単独、（ｉ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７／γ−シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、および（ｊ）実施例３４で得られたゲル状製剤３４−１０３（ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤）の固体試料３４−１０３ａの粉末Ｘ線回折パターンを表す図である。
【図１６】実施例３５における、ヒトＩｇＧを含有した処方９７および１０２のゲル状製剤３５−９７および３５−１０２の熱ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果を表す図である
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、包含したタンパク質を、物理的または化学的ストレスから保護し、凝集体形成を抑制して安定に存在させた、チキソトロピー性を有する、ゲル状製剤に関する。すなわち、本発明は、タンパク質および前記タンパク質を物理的または化学的ストレスから保護し、タンパク質の凝集を抑制して安定に存在させるためにタンパク質包含するゲル状物を含むゲル状製剤に関する。かような構成を有する本発明のゲル状製剤は、種々のタンパク質に広く応用でき、タンパク質を安定化させることができる。
【００１６】
本発明はまた、タンパク質を、１種または２種以上の環状分子、および１種または２種以上の線状分子を含むゲル状物に包含することを有する、タンパク質安定化方法に関する。
【００１７】
本発明のゲル状製剤および安定化方法によれば、安定化剤の添加等の既存の技術に代えて、またはそれらの技術と組み合わせて用いることができる、タンパク質を包含する安定な組成物が提供される。本発明のゲル状製剤は、特に、熱および振動ストレスに対して生じるタンパク質の凝集を低減する。
【００１８】
なお、本明細書において、「チキソトロピー性」とは、せん断応力を受け続けると粘度が次第に低下し、また静止すると粘度が次第に上昇する性質を意味する。したがって、「チキソトロピー性を有する」とは、せん断応力を受けた際、およびその後静止状態となった際に、粘度を低下、および上昇させる性質を有していればよい。具体的には、応力を受けた際に、１０％以上粘度が低下し、その後静止状態となった際に、１０％以上粘度を上昇させる性質を有することが好ましい。
【００１９】
本発明において、「物理的ストレス」とは、振動、熱などによるストレスを意味し、「物理的ストレスから保護する」とは、振動、熱などによるストレス条件下での包含されたタンパク質の凝集体形成抑制効果を意味する。さらに具体的には、本明細書において、「物理的ストレスから保護する」とは、物理的ストレスを与えた後のタンパク質の残存率（平均値）が、対照よりも１０ポイント以上高いことを意味する。なお、本明細書において、対照とは、タンパク質溶液またはタンパク質＋ゲル構成成分（環状分子および／または線状分子）を指す。ここで、タンパク質の残存率は、６５％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらにより好ましい。
【００２０】
さらに、本発明の「化学的ストレス」とは、ｐＨ、酸化、金属触媒反応などによるストレスを意味し、「化学的ストレスから保護する」とは、ｐＨ、酸化、金属触媒反応などによるストレス条件下での包含されたタンパク質の変性抑制効果およびその結果として生じる凝集体形成抑制効果を意味する。本明細書において、「化学的ストレスから保護する」とは、化学的ストレスを与えた後のタンパク質の残存率が、対照よりも１０ポイント以上高いことを意味する。ここで、タンパク質の残存率は、６５％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらにより好ましい。
【００２１】
本実施形態の一つとしては、ゲル状製剤は、タンパク質、希釈剤、１種または２種以上の環状分子、および１種または２種以上の線状分子を含む。
【００２２】
本実施形態において、環状分子としては、シクロデキストリン（本明細書においては、単に「ＣｙＤ」とも称する）またはその誘導体が好ましい。また、本実施形態において、線状分子としては、親水性ポリマーが好ましい。
【００２３】
すなわち、本発明は、ハイドロゲル（ゲル状物）とタンパク質との複合構造に基づく、タンパク質の新しい安定化の方法を提供する。
【００２４】
上述のように、本実施形態のゲル状製剤は、ゲル状物（例えば、環状分子と線状分子とからなるハイドロゲル）が、タンパク質を物理的に囲み安定形状を構成することによって、タンパク質分子同士の接触またはタンパク質分子の気液界面への曝露の機会を減少させ、長期保存または輸送中に生じる凝集、変性、分解等の望ましくない変化を防ぐことができる。
【００２５】
本実施形態のゲル状製剤がタンパク質を安定化させるメカニズムについては、次のように考えられる。なお、本発明は下記推測に限定されるものではない。すなわち、本実施形態のゲル状製剤のゲル状物は、線状分子に複数の環状分子が貫通し、複数の異なる線状分子に貫通する環状分子が、その環状分子に存在する官能基によって集合することにより、全体としてゲルを形成する。その官能基は、例えば、環状分子がシクロデキストリンの場合にはヒドロキシ基であり、そのヒドロキシ基同士が水素結合する。複数の線状分子は、環状分子の結合によって３次元のネットワークを形成し、そのネットワークで仕切られた空間にタンパク質が存在する。これにより、タンパク質の移動を抑制してタンパク質分子同士の接触または分子の気液界面への曝露の機会を減少させ、長期保存または輸送中に生じる凝集、変性、分解等の望ましくない変化を防ぐことができると考えられる。
【００２６】
また、本実施形態のゲル状物は、応力を加えることによって粘度が減少するため、押圧を加えることにより、複雑な操作をすることなくデバイス中から目的の場所へ送達され得る。例えば、注射筒に充填されたゲル状製剤は、注射剤として直接皮下へ投与することが可能である。
【００２７】
また、本発明に含まれうるタンパク質に特に制限はなく、より好ましくはタンパク質の安定化が求められる医薬品およびその原料などが含まれる。すなわち、タンパク質は、医療用タンパク質であることが好ましい。本発明の方法により、タンパク質製剤を安定化することができ、本発明の方法により安定化したタンパク質原料を用いてタンパク質製剤を調製することもできる。
【００２８】
また、これまでは、タンパク質、特に、高濃度のタンパク質製剤あるいは凝集しやすいタンパク質製剤において、凝集を低減し、長期間安定に保存できるという点で、未だ満足できるタンパク質製剤はなかった。しかしながら、本発明によれば、高濃度のタンパク質製剤あるいは凝集しやすいタンパク質製剤において、凝集を低減し、長期間安定に保存できるタンパク質製剤を提供することができる。
【００２９】
以下、本発明のゲル状製剤を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下では、本発明のゲル状製剤はタンパク質を包含するのに対して、環状分子、線状分子および緩衝液の成分等で構成され、タンパク質を含まない組成物を単に「ゲル」とも称する。
【００３０】
［ゲル状製剤］
本発明のゲル状製剤の一実施形態としては、ゲル状製剤は、タンパク質、希釈剤、１種または２種以上の環状分子、および１種または２種以上の線状分子を含む。
【００３１】
また、本発明において、ゲル状製剤は、下記式［１］：
【００３２】
【数１】
0006527697.tif 000002
【００３３】
で表されるゲル濃度（タンパク質を含まない同一処方のゲルの濃度）が、４ｗｔ／ｖｏｌ％（以下では、ゲル濃度を単に「％」でも表す）以上であることが好ましい。なお、上記式［１］において、ゲルの固形分重量（ｇ）とは、ゲルを遠心分離することによって得られる沈殿物（固形分）の乾燥重量（ｇ）を意味する。ゲル濃度（％）とは、ゲル状製剤１００ｍＬあたりのゲルを形成している環状分子および線状分子の質量（ｇ）を意味する。本明細書中、ゲルの固形分重量とは、環状分子、線状分子および希釈剤を含むゲルの遠心分離により得られる沈殿物（固形分）の乾燥重量（ｇ）を意味し、具体的には以下の方法により求められる。マイクロチューブ内で、それぞれ所定の量の環状分子と線状分子とを、所定の緩衝液  ０．４５ｍＬに２５℃で分散させ、ゲルを調製する。当該ゲルを、１４，０００×Ｇで４５分間遠心分離（４℃）を行い、ゲル状固形分と上清とを分離し、分離した上清を除去し、乾燥する。乾燥物の重量（ｇ）を測定し、当該重量を、製剤の固形分重量とする。なお、所定の緩衝液の一例としては、リン酸水素二ナトリウム  ０．５０ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物  １．４３ｇ、ＮａＣｌ  ２．９２ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩  ２．６３ｇ、スクロース  ５．０ｇを蒸留水０．５Ｌに溶解したリン酸緩衝液（ｐＨ：６．３）が挙げられる。
【００３４】
本発明のゲル状製剤におけるゲル濃度が４％以上であれば、タンパク質を包含し、凝集体を抑制する効果が十分に発揮されるため好ましい。より好ましくは、ゲル濃度は７〜３０％である。
【００３５】
本実施形態のゲル状製剤は降伏値を有し、応力を加えることによって時間とともに粘度が低下し、かつチキソトロピー性を有する製剤である。なお、本明細書中、回転粘度計と直径２．５ｃｍのコーンプレート型スピンドル（ブルックフィールド社製）とを用いて測定した、ゲルを流動させるために必要な力を、タンパク質を包含していないゲルの降伏値とする。タンパク質を包含していないゲルの降伏値は、５０００Ｐａ以下であることが好ましい。タンパク質を包含していないゲルの降伏値は、低いほど好ましいため、タンパク質を包含していないゲルの降伏値の下限は特に制限されないが、５０Ｐａ以上であれば十分である。
【００３６】
［環状分子］
本発明のゲル状製剤に含有される環状分子としては、特に制限されないが、シクロデキストリンまたはその誘導体が好ましい。
【００３７】
シクロデキストリンは、グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。天然に存在するシクロデキストリンは、グルコースの個数により、α（６個）、β（７個）、γ（８個）型に分けられるが、多くの誘導体も合成されている。シクロデキストリンは、原料の供給が安定しており、水溶性で、性質についても解明されている部分が多く、誘導体も容易に合成することができ、生体適合性・生分解性であることから、様々な医薬品・食品に用いられている汎用性のある物質である。
【００３８】
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンが挙げられる。また、これらの誘導体としては、例えば、メチル化シクロデキストリン、マルトシル化シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル化シクロデキストリン、グルコシル化シクロデキストリン、スルホブチル化シクロデキストリン等の修飾されたα−、β−、またはγ−シクロデキストリンが挙げられる。環状分子としては、これらのシクロデキストリンまたはその誘導体から選択される１種であっても、２種以上を組み合わせても用いることができる。本実施形態における好ましい環状分子としては、α−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンである。
【００３９】
これらの環状分子としては、市販のものを使用できる。シクロデキストリンの誘導体としては、市販品で入手したシクロデキストリンに、公知の方法で官能基（例えば、ヒドロキシプロピル基、グルコシル基等）を導入することで合成することができる。
【００４０】
環状分子は、ゲル状製剤中、１〜２０００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、５〜１０００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、１０〜３００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましい。環状分子を２種以上用いる場合は、その合計量が上記範囲にあればよい。
【００４１】
また、環状分子がα−シクロデキストリンの場合、α−シクロデキストリンは、ゲル状製剤中、１０〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、２０〜１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、３０〜１４５ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましく、６０〜１４５ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが最も好ましい。
【００４２】
また、環状分子がγ−シクロデキストリンの場合、γ−シクロデキストリンは、ゲル状製剤中、１０〜３００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、２０〜２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、５０〜２３５ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましく、１００〜２３５ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが最も好ましい。
【００４３】
［線状分子］
本発明において、線状分子としては、特に制限されないが、親水性ポリマーが好ましい。
【００４４】
親水性ポリマーとしては、環状分子と相互作用してゲルを形成できるものであれば特に制限されないが、例えば、ポリエチレングリコール（本明細書においては、単に「ＰＥＧ」とも称する）やポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリビニルエーテル、ポリ乳酸、ポリアミノ酸、スクアレン、カゼイン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリエチレンイミン、ナイロン、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリビニルピロリドン、およびこれらの共重合体、またはこれらの誘導体が挙げられる。共重合体としては、ブロック共重合体でもよいしランダム共重合体でもよい。これらの親水性ポリマーは、１種であっても、２種以上を組み合わせても用いることができる。
【００４５】
本実施形態における好ましい線状分子は、ポリエチレングリコールおよびＰｏｌｏｘａｍｅｒ（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体）である。ポリエチレングリコールの好ましい実施形態としては、平均分子量が好ましくは４００〜３５０００、より好ましくは２０００〜２００００、さらに好ましくは４０００〜２００００のポリエチレングリコールを線状分子として用いる。Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体）の好ましい実施形態としては、平均分子量が２０００〜２００００、酸化エチレンの平均重合度が３〜３００であり、より好ましくは酸化エチレンの平均重合度が２０〜３００のＰｏｌｏｘａｍｅｒ（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体）を線状分子として用いる。
【００４６】
線状分子は、ゲル状製剤中、０．５〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、１〜１８０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、２〜１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましい。線状分子を２種以上用いる場合は、その合計量が上記範囲にあればよい。
【００４７】
線状分子としてポリエチレングリコールを用いる場合、該ポリエチレングリコールは、ゲル状製剤中、０．５〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、より好ましくは１〜１８０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２〜１６０ｍｇ／ｍＬである。
【００４８】
また、線状分子としてＰｏｌｏｘａｍｅｒ（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体）を用いる場合、該Ｐｏｌｏｘａｍｅｒは、ゲル状製剤中、１〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、２〜１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、５〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましい。
【００４９】
また、環状分子がα−シクロデキストリンの場合、線状分子は、ゲル状製剤中、０．５〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、１〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがより好ましく、２〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましい。
【００５０】
また、環状分子がγ−シクロデキストリンの場合、線状分子は、ゲル状製剤中、０．５〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることが好ましく、１〜１８０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましく、２〜１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれることがさらに好ましい。
【００５１】
［希釈剤］
希釈剤としては、水または緩衝液が挙げられる。
【００５２】
緩衝液としては、特に制限されず、目的（例えば、タンパク質の種類など）に応じて適宜選択されるが、通常緩衝液として用いられる緩衝液が同様にしてあるいは適宜修正して使用できる。具体的には、緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、およびその塩類等を含有する溶液等；グリシン、グリシルグリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、およびその塩類等を含有する溶液等が挙げられる。具体的な緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸緩衝液；リン酸緩衝液（ＰＢＳ等）；クエン酸緩衝液；クエン酸−リン酸緩衝液；トリス緩衝液、トリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、トリス−グリシン緩衝液、トリス−トリシン緩衝液などのトリス系緩衝液；グリシン−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液；トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液などのホウ酸系緩衝液；ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液などのＧＯＯＤ緩衝液；またはイミダゾール緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度としては、特に制限されず、目的（例えば、タンパク質の種類など）に応じて適宜選択されうるが、例えば、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１５０ｍＭであることがより好ましい。なお、本発明において緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。また、緩衝液のｐＨは、特に制限されず、目的（例えば、タンパク質の種類など）に応じて適宜選択されうるが、例えば、好ましくはｐＨ３〜１１、より好ましくはｐＨ４〜１０、さらに好ましくはｐＨ５〜９の範囲である。緩衝液のｐＨ調整には、塩酸などの酸性物質や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を用いて適宜調整すればよい。
【００５３】
また、本実施形態の希釈剤には、目的に応じてさらに、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、界面活性剤、溶解補助剤等の添加剤を含むことができる。具体的には、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン等のアミノ酸類；塩酸グアニジン、尿素等の変性剤；スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール等の糖類；ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＨＣｌ、ＮａＯＨ等の電解質類；ポリソルベート８０、ポリソルベート２０等の界面活性剤；プロピレングリコール等の溶解補助剤等が挙げられる。これらの添加剤の濃度は、用いる添加剤の種類により適宜選択されるが、特に電解質類、変性剤、界面活性剤等は、高濃度で用いた場合にタンパク質の安定性を損なう場合があるので注意を要する。
【００５４】
［タンパク質］
本発明において、タンパク質は、医薬上許容されるものであれば特に限定されないが、医療用タンパク質であることが好ましい。本実施形態のゲル状製剤において、タンパク質は、環状分子および線状分子に包含されるが、環状分子および線状分子とタンパク質とは、別々に存在する。すなわち、タンパク質は、環状分子または線状分子に、修飾されて一体化しているタンパク質ではない。
【００５５】
タンパク質としては、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンなどが挙げられる。さらに具体的には、例えば、治療用ペプチド、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、顆粒球−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、インスリン、リゾチーム、アスパラギナーゼ、レプチン、エリスロポエチン、インスリン類似成長因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、組織プラスミノゲンアクチベーターおよびウロキナーゼ、アルブミン、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、融合タンパク質などが挙げられる。治療用ペプチドとしては、具体的には、ペプチドホルモン、がんペプチドワクチン、抗菌ペプチド等が挙げられる。本発明において、好ましい形態のタンパク質は、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、または融合タンパク質であり、より好ましくはモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、または融合タンパク質である。
【００５６】
本発明のゲル状製剤に含有されるタンパク質は、ゲル濃度４（ｗｔ／ｖｏｌ）％以上のゲル状製剤中において、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれることが好ましい。タンパク質は、ゲル濃度４（ｗｔ／ｖｏｌ）％以上のゲル製剤中に、より好ましくは０．１〜４００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２．５〜４００ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは５〜４００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０〜４００ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される。上記タンパク質の濃度は、タンパク質が抗体（特に、ヒトＩｇＧ型抗体）、サイトカインの場合に特に好ましく適用される。本発明のゲル状製剤は、上記範囲のタンパク質を包含した際であっても、タンパク質の凝集を抑制し、タンパク質の安定化効果が発揮される。本発明のゲル状製剤は、上記範囲の高濃度のタンパク質を安定に含有することができるが、タンパク質の濃度が上記の範囲であることで、本発明のゲル状製剤の有効性が特に発揮される。
【００５７】
また、本発明のゲル状製剤に含まれるタンパク質は、分子量が３，０００Ｄａ以上であることが好ましく、より好ましくは２０，０００Ｄａ以上、さらに好ましくは３０，０００Ｄａ以上、特に好ましくは４０，０００Ｄａ以上である。含有されるタンパク質の上限に制限はないが、１，０００，０００Ｄａ以下であることが好ましい。タンパク質の分子量が上記範囲である場合、本発明のゲル状製剤が包含するタンパク質の凝集が効果的に抑制される。
【００５８】
タンパク質は、その性質により、製剤中で凝集しやすいものが多く存在する。また、製剤中のタンパク質濃度が高いほど、タンパク質は製剤中で凝集しやすい傾向がある。本発明のゲル状製剤は、高濃度のタンパク質や凝集しやすい性質のタンパク質を包含する場合においても、ゲル状製剤中でタンパク質を安定化することができる。
【００５９】
本実施形態のゲル状製剤の好ましい形態としては、環状分子が１０〜３００ｍｇ／ｍＬ、線状分子が０．５〜２００ｍｇ／ｍＬ、およびタンパク質が０．１〜４００ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ含有される、ゲル状製剤である。このような範囲であれば、ゲルがタンパク質を効果的に包含し、タンパク質の凝集が効果的に抑制される。
【００６０】
［ゲル状製剤の製造方法］
本実施形態のゲル状製剤は、チキソトロピー性を有しており、ゲルを調製した後であってもかき混ぜることでゲルが流動化するため、ゲル状製剤の製造方法は特に制限されず、環状分子、線状分子、タンパク質、および希釈剤が混合されれば、どのような添加順序でもあってもよい。例えば、本実施形態のゲル状製剤は、環状分子（または線状分子）、およびタンパク質を希釈剤に溶解した後、線状分子（または環状分子）を添加し、混合してゲル状製剤としてもよいし、環状分子、線状分子および希釈剤を混合しゲルを形成した後、タンパク質を添加・混合してもよいし、環状分子、線状分子およびタンパク質を一括して希釈剤に添加し、混合して調製してもよい。
【００６１】
また、本発明のゲル状製剤の好ましい製造方法としては、環状分子と、タンパク質と、希釈剤と、を含む第１のゲル化剤に、線状分子と、タンパク質と、希釈剤と、を含む第２のゲル化剤を混合する工程を含む。
【００６２】
環状分子、線状分子、タンパク質、および希釈剤を混合する温度は、タンパク質が分解・変質しない温度であれば特に制限されない。また、混合する方法としても、特に制限されず、ゲル状製剤が均一となるように混合されればよい。
【００６３】
［ゲル状製剤の用途］
上述のように、本発明のゲル状製剤は、目的（治療しようとする疾患の種類）に応じて、タンパク質を適宜選択することができ、様々な疾患の治療薬として使用することができる。その投与方法は特に制限されず、疾患の予防、処置または治療用の非経口投与製剤、好ましくは皮下投与用製剤に用いることができる。これらの本発明のゲル状製剤は、皮下投与用製剤が好ましいが、病変部局所外用剤、病変部局所注射剤、点鼻薬、点眼薬、眼軟膏、点耳薬、坐薬、静脈注射薬、皮内注射薬、筋肉注射薬、吸入薬、舌下薬、経皮吸収薬等、任意の投与経路が選択できる。本発明のゲル状製剤としては、チキソトロピー性を有しているため、押圧を加えることにより、複雑な操作をすることなくデバイス中から目的の場所へ送達され得る。したがって、例えば、注射筒に充填されたゲル状製剤は、注射剤として直接皮下へ投与することが可能であるため、皮下投与用製剤であるのが好ましい。
【００６４】
本発明のゲル状製剤の投与量は、特に制限されず、目的（治療しようとする疾患の種類）とその程度とに応じて、適宜選択することができる。
【００６５】
［医療用キット］
本発明の他の実施形態は、本発明に係るゲル状製剤と、ゲル状製剤を投与する投与デバイスと、を具備する医療用キットである。
【００６６】
投与デバイスとしては、シリンジ（注射筒および注射針）が好ましい。
【００６７】
本発明の医療用キットにおいて、ゲル状製剤は、バイアル等に封入されていてもよいし、予め注射筒へ充填された状態であってもよい。
【実施例】
【００６８】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特記しない限り、下記操作は、室温（２５℃）で行った。【００６９】
〔実施例１．ゲル濃度の測定〕
ＮａＣｌ  ２．９２ｇ、リン酸水素二ナトリウム  ０．５０ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物  １．４３ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩  ２．６３ｇ、およびスクロース  ５．０ｇを蒸留水０．５Ｌに溶解し、溶液Ａとした。【００７０】
溶液Ａに、α−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンを６０℃付近の水浴上で加温して溶かした後、室温まで冷却した。次に、この溶液に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００００を、下記表１の組成に従って添加し、マイクロチューブ内で混合して、４℃で１２時間以上静置し、処方１〜５９のゲル１〜５９を調製した。【００７１】
また、各平均分子量のポリエチレングリコールを用いて、下記表２の組成に従って処方６０〜９３のゲル６０〜９３を調製した。使用したＰＥＧの平均分子量、シクロデキストリンの種類および各処方の番号を下記表２に示す。【００７２】
下記表１および表２中の空欄は、その成分を含まないことを意味する。【００７３】
なお、ＰＥＧは、ＰＥＧ２００００（製品名：ポリエチレングリコール  ２０，０００、和光純薬工業株式会社製）、ＰＥＧ４００（製品名：ポリエチレングリコール  ４００、関東化学株式会社製）、ＰＥＧ６００（製品名：ポリエチレングリコール  ６００、関東化学株式会社製）、ＰＥＧ１０００（製品名：ポリエチレングリコール  １０００、関東化学株式会社製）、ＰＥＧ２０００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ２０００、メルク社製）、ＰＥＧ３０００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ３０００、メルク社製）、ＰＥＧ４０００（製品名：ポリエチレングリコール  ４０００、関東化学株式会社製）、ＰＥＧ６０００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ６０００、ＳＥＲＶＡ社製）、ＰＥＧ８０００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＭＷ８０００、ＭＰバイオメディカル社製）、ＰＥＧ１００００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  １００００、メルク社製）、ＰＥＧ３５０００（製品名：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ３５０００、メルク社製）を使用した。また、α−シクロデキストリンは製品名：セルデックス（登録商標）Ａ−１００（日本食品化工株式会社製）、γ−シクロデキストリンは製品名：デキシパールγ−１００（塩水港精糖株式会社製）を使用した。【００７４】
次に、得られたゲルのゲル濃度（ｗｔ／ｖｏｌ％）を測定した。上記ゲル１〜９３が入ったマイクロチューブを遠心分離機にセットし、１４，０００×Ｇで４５分間遠心分離（４℃）を行い、ゲル状固形分と上清とを分離し、分離した上清を除去し、１０５℃で５時間乾燥した。残った固形分（乾燥物）の重量（ｇ）を測定した。当該重量と、ゲルの体積とを用いて、下記式［１］に従ってゲル濃度（ｗｔ／ｖｏｌ％）を算出し、表１および表２に示した。【００７５】
【数２】
0006527697.tif 000003
【００７６】
【表１】
0006527697.tif 000004
【００７７】
【表２】
0006527697.tif 000005
【００７８】
表１および表２の結果に示されるように、α−シクロデキストリン  ６４．４〜１３０．５ｍｇ／ｍＬまたはγ−シクロデキストリン  １０６．７〜２０６．２ｍｇ／ｍＬ、α−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンの合計で１３３．４ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ２００００濃度  ２．０〜１５５．６ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ平均分子量  ４００〜３５０００の範囲で、４ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル濃度が得られた。【００７９】
なお、以下の実施例２および４〜３２では、上記処方１〜９３に、所定量のタンパク質を含有させたものをゲル状製剤とする。【００８０】
〔実施例２．ゲル状製剤の物理的特性〕
（１）ゲル状製剤の調製
ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した実施例１の処方１２および３７のゲル状製剤２−１２および２−３７を調製した。処方１２のゲル状製剤２−１２の調製方法としては、溶液Ａ  １ｍＬにα−シクロデキストリン  １４５ｍｇを６０℃付近の水浴上で加温して溶かした後、室温まで冷却した。次に、この溶液に、ヒトＩｇＧ  ０．１３ｇを室温（２５℃）で溶解して、シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ溶液を調製し、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌した。また、ＰＥＧ２００００  １．０ｇを溶液Ａ  １０ｍＬに溶解させ、ＰＥＧ溶液を調製し、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌した。これらのシクロデキストリン／ヒトＩｇＧ溶液  ０．８ｍＬとＰＥＧ溶液  ０．１ｍＬとを、室温（２５℃）で混合した後、４℃で１２時間以上静置し、ヒトＩｇＧを包含するゲル状製剤２−１２を調製した。ゲル状製剤２−３７についてもゲル状製剤２−１２と同様にして調製した。これらのゲル状製剤を、水  １００μＬで洗浄し、室温（２５℃）で少なくとも３日間減圧乾燥した。【００８１】
（２）包接個数の算出（１Ｈ−ＮＭＲ測定）
（１）で得られた乾燥後の固体試料２−１２ａおよび２−３７ａをＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１Ａおよび図１Ｂに、それぞれ、固体試料２−１２ａおよび２−３７ａのスペクトルを示す。シクロデキストリンおよびＰＥＧのプロトンピークの積分値（シクロデキストリン：アノメリックプロトン由来の４．８ｐｐｍのピーク値、ＰＥＧ：エチルプロトン由来の３．５ｐｐｍのピーク値）を比較した結果、ＰＥＧ鎖１本に対してα−およびγ−シクロデキストリンは、約１１３個および約９５個貫通していると考えられた。平均分子量２００００のＰＥＧ鎖１分子には、理論上、α−シクロデキストリン分子が約２２０個、γ−シクロデキストリン分子が約１１０個貫通できることから、α−およびγ−シクロデキストリンの貫通率は、約５１．５％および８６．２％であった。【００８２】
（３）結晶構造の解析（粉末Ｘ線回折測定）
（１）で作製した（ｇ）ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤の固体試料２−１２ａおよび２−３７ａと、比較の固体試料として、（ａ）シクロデキストリン（ＣｙＤ）単独、（ｂ）ＰＥＧ単独、（ｃ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）ＰＥＧ／ＣｙＤ混合物、（ｅ）ＰＥＧ／ＣｙＤ／ヒトＩｇＧ混合物、および（ｆ）ヒトＩｇＧ非含有ゲル状製剤のそれぞれの粉末Ｘ線回折を測定した。なお、比較の固体試料は、それぞれの固体を所定の混合比（それぞれ、処方１２または処方３７の混合比）で混合したものである。（ｆ）ヒトＩｇＧ非含有ゲル状製剤の固体試料としては、（１）のゲル状製剤の調製で、ゲル状製剤にヒトＩｇＧを含有させずに調製した試料である。図２Ａおよび図２Ｂに、ゲル状製剤２−１２および２−３７の固体試料２−１２ａおよび２−３７ａのそれぞれの試料の粉末Ｘ線回折の結果を示す。また、図３Ａおよび図３Ｂに、ゲル状製剤２−１２および２−３７の固体試料２−１２ａおよび２−３７ａの粉末Ｘ線回折のピーク値および指数配当の結果をそれぞれ示す。【００８３】
α−シクロデキストリン系において、ＰＥＧとの物理的混合物はα−シクロデキストリン単独と同様にかご型構造の回折パターンを示したのに対し、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤２−１２（処方１２）の固体試料２−１２ａは２θ＝７．５２°、１３．００°、１９．８２°および２２．５３°に特徴的なピークを与え、ヒトＩｇＧを加えないゲル状製剤（ゲル）の固体試料と同様に筒型構造の回折パターンを示した。また、γ−シクロデキストリン系においても同様にγ−シクロデキストリン単独やＰＥＧとの物理的混合物は、かご型構造の回折パターンを示した。一方、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤２−３７（処方３７）の固体試料２−３７ａは、２θ＝７．３６°、１４．７９°、１６．５５°および２２．０５°に特徴的なピークを与え、ヒトＩｇＧを加えない同処方のゲル状製剤（ゲル）の固体試料と同様に筒型構造の回折パターンを示した。【００８４】
さらに結晶内充填様式の詳細を明らかにするために、α−またはγ−シクロデキストリンを含有したゲル状製剤の回折パターンをそれぞれ六方晶系および正方晶系と仮定し、各回折線の指数配当を行ったところ、各面指数（ｈｋｌ）においてｄｏｂｓ（実測値）とｄｃａｌ（計測値）がよく一致したことから、ＩｇＧを含有したゲル状製剤２−１２ａおよび２−３７ａはそれぞれ六方晶系および正方晶系筒型構造であることが示された。また、固体試料２−１２ａおよび２−３７ａのピーク面積から、それぞれの結晶化度は４９．３２％および２２．６０％であると考えられる。【００８５】
（４）ＦＴ−ＩＲ測定
（ｃ）ＩｇＧ含有ゲル状製剤として（１）で作製した固体試料２−１２ａおよび２−３７ａ、比較の固体試料として、（ａ）ヒトＩｇＧ単独、および（ｂ）シクロデキストリン単独、のそれぞれのＦＴ−ＩＲを測定した。図４Ａに固体試料２−１２ａ、図４Ｂに固体試料２−３７ａのＦＴ−ＩＲの結果を、比較の固体試料のＦＴ−ＩＲの結果と合わせて示す。【００８６】
シクロデキストリン単独で観察されたＯＨ基由来の４２００〜３０００ｃｍ−１のブロードなピークは、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤２−１２および２−３７においてわずかに高波数側にシフトした。これは、ゲル形成に伴い、隣接するシクロデキストリンのＯＨ基同士が水素結合を形成したことに起因すると考えられる。【００８７】
以上（２）〜（４）の結果より、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤は、シクロデキストリンとＰＥＧとが複合体を形成していることが確認された。【００８８】
〔実施例３．ゲルの降伏値と粘度の経時変化〕
実施例１の処方１２および３７の組成を有するゲル１２および３７  １ｍＬに対して、レオメーター  Ｒ／Ｓ  ｐｌｕｓ（ブルックフィールド社製）と直径２．５ｃｍのコーンプレート型スピンドルとを用いて、降伏値および粘度を測定した（２５℃）。なお粘度は、速度一定（１００ｒｐｍ）の応力を加えた際に生じるゲルの粘度変化を、１秒ごとに測定した。【００８９】
表３にゲル１２および３７の降伏値の測定結果を示し、図５Ａおよび図５Ｂに、それぞれのゲルの粘度変化を示す。これらの結果より、ゲル１２および３７は降伏値を有し、応力を加えることによって時間とともに粘度が低下することが示された。【００９０】
【表３】
0006527697.tif 000006
【００９１】
〔実施例４．ゲル状製剤におけるチキソトロピー性の確認〕
ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した処方１２および３７のゲル状製剤４−１２および４−３７  １ｍＬに対して、ＴＶＥ２０Ｈ（東機産業株式会社製）を用いて粘度を測定した（３７℃）。なお、ゲル状製剤４−１２および４−３７の調製方法は、実施例２（１）と同様である。また粘度は、速度一定（１００ｒｐｍ）の応力を加えた際に生じるゲルの粘度変化を、測定開始後１分、２分、３分、４分、５分経過後に測定した。さらに、１回目の粘度測定を行った後、１時間後および３時間後に再度、同様の条件でくり返し測定を行った。【００９２】
結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。１回目の測定から１時間後にはいずれの処方のゲル状製剤も粘度は回復しなかったが、３時間後の測定において、粘度は回復した。これらの結果より、ＩｇＧを含有したゲル状製剤はチキソトロピー性を有することが示された。【００９３】
〔実施例５．ゲル状製剤の活性保持率−１〕
可溶性ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパク  １０．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４０および５０のゲル状製剤５−４０および５−５０を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを７日間冷蔵庫で保存した後、溶液Ａ１ｍＬを加えて穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させ、遠心した後、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中の可溶性ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクについて、ＴＮＦαに対する阻害活性を、細胞を用いたアッセイで測定した。１０ｍｇ／ｍＬの可溶性ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパク溶液を対照とし、Ｎ＝３で行った。【００９４】
結果を下記表４に示す。ゲル状製剤に包含された可溶性ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクは、それぞれ１０９．９％および１１７．１％の活性を保持していることが明らかとなった。【００９５】
【表４】
0006527697.tif 000007
【００９６】
〔実施例６．ゲル状製剤の活性保持率−２〕
溶液Ａの代わりに水を用い、抗ヒトＩｇＥ抗体  ７．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４１および５１のゲル状製剤６−４１および６−５１を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５日間冷蔵庫で保存した後、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させ、遠心した後、上清をメンブランフィルターでろ過し、上清中の抗ヒトＩｇＥ抗体について、以下の方法でヒトＩｇＥ結合阻害活性を測定した。なお、当該実験はＮ＝２で行った。【００９７】
Ｉ．紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、上清に含まれる抗ヒトＩｇＥ抗体の残存率を算出した。【００９８】
ＩＩ．Ｉの結果に基づきタンパク濃度を補正した後、抗ヒトＩｇＥ抗体活性として、ＦＣεＲ１受容体を固相化したプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法により上清中の抗ヒトＩｇＥ抗体のヒトＩｇＥ結合阻害活性を測定した。【００９９】
対照として、抗ヒトＩｇＥ抗体を７．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解した抗ヒトＩｇＥ抗体溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様の操作を行った。対照の抗ヒトＩｇＥ抗体溶液が持つ活性を基準とし、上清中に含まれるタンパク質の活性保持率を算出した。【０１００】
結果を表５に示す。ゲル状製剤中に包含された抗ヒトＩｇＥ抗体は、それぞれ９６．３％および１０４．１％の活性を保持していることが明らかとなった。【０１０１】
【表５】
0006527697.tif 000008
【０１０２】
〔実施例７．シリンジからのゲル状製剤の押し出し抵抗値評価〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  ８．０、４０．０、８０．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４２のゲル状製剤７−４２（８）、７−４２（４０）、７−４２（８０）、および処方５２のゲル状製剤７−５２（８）、７−５２（４０）、７−５２（８０）、また、ヒトＩｇＧ  ８０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４３および処方５３のゲル状製剤を実施例２（１）の調製方法と同様にして、１ｍＬツベルクリン用シリンジ（テルモ株式会社製）に０．５ｍＬ調製した。冷蔵庫に７日間保存した後、処方４２および５２のゲル状製剤については２５Ｇ注射針（テルモ株式会社製）、処方４３および５３のゲル状製剤については２７Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を用いて２２８ｍｍ／ｍｉｎで押し出した時の押し出し抵抗値を小型卓上オートグラフ（株式会社島津製作所製）にて測定した。摺動抵抗の値は、値がほぼ一定になる４．０秒から８．０秒の間の平均抵抗値（Ｎ）で表した。なお、当該実験はＮ＝２で行った。【０１０３】
結果を表６−１、６−２および６−３に示す。押し出し抵抗値はタンパク濃度に依存する傾向が認められ、８０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤では、処方４２において７．１Ｎ、処方５２において９．９Ｎの押し出し抵抗値であり、手動でのシリンジからの押し出しが可能であることが確認された。【０１０４】
【表６】
0006527697.tif 000009
【０１０５】
〔実施例８．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１〕
ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した処方１２および３７のゲル状製剤８−１２および８−３７を、実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに１００μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、室温（２５℃）、５００ｒｐｍで１週間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、溶液Ａ１ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心分離し、凝集体を沈殿させた後、２８０ｎｍにおける上清の吸光度を紫外分光光度計（装置型式Ｖ−６３０、日本分光製）で測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量（ヒトＩｇＧの残存率）を算出した。なお、当該実験はＮ＝６で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。【０１０６】
また、ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤８−１２および８−３７の対照群として、ゲル状製剤８−３７からシクロデキストリンを除いた製剤（「ＰＥＧ＋ＩｇＧ」）、ゲル状製剤８−１２および８−３７からそれぞれＰＥＧ２００００を除いた製剤（「α−ＣｙＤ＋ＩｇＧ」および「γ−ＣｙＤ＋ＩｇＧ」）、ゲル状製剤８−３７からシクロデキストリンおよびＰＥＧ２００００を除いた製剤（「ＩｇＧ溶液」）を調製し、ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤８−１２および８−３７と同様の操作を行った。【０１０７】
図７に、振動ストレス負荷に対するヒトＩｇＧの残存率の結果を示す。振動ストレスにより対照群の溶液中のヒトＩｇＧは６０％程度に減少したが、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは１００％近い残存率を示した。この結果より、高濃度のヒトＩｇＧ溶液において、ゲル状製剤は振動による凝集に対してヒトＩｇＧを安定化する効果を有することが明らかとなった。【０１０８】
〔実施例９．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果２〕
ヒトＩｇＧ  ５７．８〜１１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した処方２、４、５、６、１１、１２、１８、２６、３３、および３７のゲル状製剤９−２、９−４、９−５、９−６、９−１１、９−１２、９−１８、９−２６、９−３３、および９−３７を、実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに１００μＬ調製した。次に、実施例８と同様に、ゲル状製剤に振動ストレスを負荷した後にＩｇＧを溶出させ、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝３で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、溶液Ａ  １００μＬにヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有させたヒトＩｇＧ溶液（「ＩｇＧ」と表記）について、同様の操作を行った。なお、ゲル状製剤は、また、それぞれのゲル状製剤に含まれるヒトＩｇＧ量は以下の通りである。【０１０９】
ゲル状製剤９−２および９−４：ヒトＩｇＧ  ５７．８ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤９−５および９−６：ヒトＩｇＧ  ６５．０ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤９−１１および９−１２：ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤９−１８：ヒトＩｇＧ  ８６．７ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤９−２６：ヒトＩｇＧ  １０１．１ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤９−３３および９−３７：ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬ含有。【０１１０】
結果を図８に示す。振動ストレスによりヒトＩｇＧ溶液中のヒトＩｇＧ量は６０％以下に減少した。一方、各処方においてゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ溶液と比較して高い残存率を示し、各処方における濃度のシクロデキストリンとＰＥＧとで調製したゲル状製剤は、いずれも振動による凝集に対してヒトＩｇＧを安定化する効果を有することが明らかとなった。【０１１１】
〔実施例１０．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果３〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  ３０．５〜４４．４ｍｇ／ｍＬを含有する処方２、４、５、６、１１、１２、１６、１８、２５、２６、３３、３７のゲル状製剤１０−２、１０−４、１０−５、１０−６、１０−１１、１０−１２、１０−１６、１０−１８、１０−２５、１０−２６、１０−３３、１０−３７を、実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに１００μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、室温（２５℃）、５００ｒｐｍで５日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  １ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを４４．４ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。なお、ゲル状製剤は、また、それぞれのゲル状製剤に含まれるヒトＩｇＧ量は以下である。【０１１２】
ゲル状製剤１０−２、１０−５、１０−６、１０−１１、１０−１２、１０−１８、１０−２６、１０−３３および１０−３７：ヒトＩｇＧ  ４４．４ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤１０−４：ヒトＩｇＧ  ３８．９ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤１０−１６：ヒトＩｇＧ  ３０．５ｍｇ／ｍＬ含有
ゲル状製剤１０−２５：ヒトＩｇＧ  ３３．３ｍｇ／ｍＬ含有。【０１１３】
結果を図９に示す。対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は約２０％であったのに対し、α−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤およびγ−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤に包含されたヒトＩｇＧは、溶出液中に、出発量の８６．９〜９７．１％が残存しており、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１１４】
〔実施例１１．熱ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果〕
ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した処方１２および３７のゲル状製剤１１−１２および１１−３７を、実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに０．５ｍＬ調製した。次に、ゲル状製剤０．５ｍＬを６０℃、１５分温浴で加熱することにより、ゲル状製剤に熱ストレスを与えた。熱ストレス負荷後、溶液Ａ  ３０ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式Ｖ−６３０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、上清中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝４〜８で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。【０１１５】
また、対照として、ゲル状製剤１１−３７からシクロデキストリンを除いた製剤（「ＰＥＧ＋ＩｇＧ」）、ゲル状製剤１１−１２および１１−３７からそれぞれＰＥＧ２００００を除いた製剤（「α−ＣｙＤ＋ＩｇＧ」および「γ−ＣｙＤ＋ＩｇＧ」）、ゲル状製剤１１−３７からシクロデキストリンおよびＰＥＧ２００００を除いた製剤（「ＩｇＧ溶液」）を調製し、ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤１１−１２および１１−３７と同様の操作を行った。【０１１６】
結果を図１０に示す。α−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤およびγ−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤に包含されたヒトＩｇＧは、溶出液中に出発量の１０６．１％および１０６．６％が残存していたのに対し、対照の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は６２．４％であり、ゲル状製剤に包含されたヒトＩｇＧの熱ストレスに対する安定化が明らかとなった。【０１１７】
〔実施例１２．ゲル状製剤からのタンパク質放出の挙動〕
実施例２（１）の調製方法と同様にして、試験管内で、ヒトＩｇＧ  １１５．６ｍｇ／ｍＬを含有した処方１２および３７のゲル状製剤１２−１２および１２−３７  １ｇを調製した。当該試験管に、溶液Ａ  ５ｍＬを添加し、穏やかに振とうした。振とう後、ゲル状製剤の入った試験管を３７℃、１５０ｒｐｍで穏やかに振とうし、上清を経時的にサンプリングし、放出したヒトＩｇＧ量を、２８０ｎｍにおける吸光度を紫外分光光度計（装置型式Ｖ−６３０、日本分光株式会社製）で測定し、含有されていたヒトＩｇＧの出発量を基準として、算出した。コントロールとしてＰＥＧ／シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合溶液を調製し、同様の操作で放出試験を行った。なお、当該実験はＮ＝３で行った。結果を下記表７に示す。【０１１８】
【表７】
0006527697.tif 000010
【０１１９】
〔実施例１３．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果４〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  ４．０、８．０、１６．０、３２．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４２のゲル状製剤１３−４２（４）、１３−４２（８）、１３−４２（１６）、１３−４２（３２）を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで約２４時間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝３で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを４．０、８．０、１６．０、３２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１２０】
結果を図１１に示す。４．０ｍｇ／ｍＬ〜３２．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は８．７〜５８．７％であったのに対し、α−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤に包含された４．０ｍｇ／ｍＬ〜３２．０ｍｇ／ｍＬの溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１００．０〜１０８．２％であり、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは、振動ストレスに対して安定化されていた。【０１２１】
〔実施例１４．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果５〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  １．０、４．０、８．０、１６．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方５２のゲル状製剤１４−５２（１）、１４−５２（４）、１４−５２（８）、１４−５２（１６）を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで５日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：ＵＶ−２４５０、株式会社島津製作所製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝３で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを１．０、４．０、８．０、１６．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１２２】
結果を図１２に示す。１．０ｍｇ／ｍＬ〜１６．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は０．９〜１４．３％であったのに対し、γ−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤に包含された１．０ｍｇ／ｍＬ〜１６．０ｍｇ／ｍＬの溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は９５．８〜１０７．３％であり、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１２３】
〔実施例１５．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果６〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  ２４０．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４１のゲル状製剤１５−４１を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに１ｍＬの水を添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中のヒトＩｇＧについて紫外分光光度計（装置型式：ＵＶ−２４５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液に含まれるヒトＩｇＧの残存率を算出した。ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。対照として、ヒトＩｇＧを２４０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解した溶液について、同様の操作を行った。なお、当該実験はＮ＝３で行った。【０１２４】
結果を下記表８に示す。対照のたんぱく質の残存率は７８．７％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは１０２．５％残存しており、振動ストレスに対して安定化されていることが明らかとなった。【０１２５】
【表８】
0006527697.tif 000011
【０１２６】
〔実施例１６．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果７〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  １．０〜３２．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４２〜４５のゲル状製剤１６−４２〜４５を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを４．０ｍｇ／ｍＬまたは８．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１２７】
結果を下記表９に示す。なお、下記表９および後述の表１０については、ゲル濃度は同じであるがヒトＩｇＧ濃度が異なるゲル状製剤について、枝番を付加して区別し、「１６−４２−１」、「１６−４２−２」というように試料番号を付した。【０１２８】
対照（ヒトＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１５．５〜２２．２％であり、α−シクロデキストリンを用いたゲル濃度２．３ｗｔ／ｖｏｌ％のゲル状製剤１６−４５に包含されたヒトＩｇＧの残存率は１５．４〜１９．１％であったが、ゲル濃度４．１ｗｔ／ｖｏｌ％のゲル状製剤１６−４４に包含されたヒトＩｇＧの残存率は４４．８〜５９．８％と改善された。さらに、ゲル濃度７．３ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル状製剤１６−４２および１６−４３に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９９．８〜１０２．５％であり、振動ストレスに対して安定化されていた。ゲル濃度４ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル状製剤にヒトＩｇＧの安定化効果があることが確認された。【０１２９】
【表９】
0006527697.tif 000012
【０１３０】
〔実施例１７．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果８〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  １．０〜３２．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方５２、および５４〜５６のゲル状製剤１７−５２、１７−５４〜５６を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを１．０ｍｇ／ｍＬまたは４．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１３１】
結果を下記表１０に示す。対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は８．１〜８．４％であり、γ−シクロデキストリンを用いたゲル濃度２．２ｗｔ／ｖｏｌ％のゲル状製剤１７−５６に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９．０％であったが、ゲル濃度４．０ｗｔ／ｖｏｌ％のゲル状製剤１７−５５に包含されたヒトＩｇＧの残存率は３５．６〜４７．３％と改善された。さらに、ゲル濃度８．７ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル状製剤１７−５２および１７−５４に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９２．４％〜１００．９％であり、振動ストレスに対して安定化されていた。ゲル濃度４ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル状製剤にヒトＩｇＧの安定化効果があることが確認された。【０１３２】
【表１０】
0006527697.tif 000013
【０１３３】
〔実施例１８．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果９〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、ＰＥＧ２００００の代わりにＰＥＧ３５０００を用い、ヒトＩｇＧ  ８．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方８０および８１のゲル状製剤１８−８０および１８−８１を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを８．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１３４】
結果を下記表１１−１および表１１−２に示す。８．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１５．０％および１８．４％であったが、α−シクロデキストリンおよびＰＥＧ３５０００を用いたゲル状製剤１８−８０およびγ−シクロデキストリンおよびＰＥＧ３５０００を用いたゲル状製剤１８−８１に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９８．７％および９８．１％であり、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１３５】
【表１１】
0006527697.tif 000014
【０１３６】
〔実施例１９．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１０〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、ＰＥＧ２００００の代わりにＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４００を用い、ヒトＩｇＧ  ８．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方８２〜８９のゲル状製剤１９−８２〜８９を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを８．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１３７】
結果を下記表１２に示す。８．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１４．０％であったが、ゲル状製剤１９−８２〜８９に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９３．０％〜１０１．０％であり、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１３８】
【表１２】
0006527697.tif 000015
【０１３９】
〔実施例２０．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１１〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、ＰＥＧ２００００の代わりにＰＥＧ２００００およびＰＥＧ４０００を用い、ヒトＩｇＧ  ８．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方９０〜９３のゲル状製剤２０−９０〜９３を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを８．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１４０】
結果を下記表１３に示す。８．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ヒトＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１４．０％であったが、ゲル状製剤２０−９０〜９３に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９７．５％〜１０４．４％であり、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１４１】
【表１３】
0006527697.tif 000016
【０１４２】
〔実施例２１．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１２〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、ヒトＩｇＧ  ８．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４６のゲル状製剤２１−４６を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで２日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、ＰＢＳ  ０．７５ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝２で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを８．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに溶解したヒトＩｇＧ溶液について、同様の操作を行った。【０１４３】
結果を下記表１４に示す。８．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含有する対照（ヒトＩｇＧ溶液）の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は１４．０％であったが、ゲル状製剤２１−４６に包含されたヒトＩｇＧの残存率は９９．２％であり、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１４４】
【表１４】
0006527697.tif 000017
【０１４５】
〔実施例２２．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１３〕
溶液Ａの代わりにＬ−ヒスチジン３．９ｍｇ／ｍＬ、グリシン０．１２ｍｇ／ｍＬを含有する溶液Ｂ（ｐＨ６．０）を用い、抗ＲＳウイルス抗体  ４．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４７および処方５７のゲル状製剤２２−４７および２２−５７を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに７５０μＬの溶液Ｂを添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中の抗ＲＳウイルス抗体について紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液に含まれる抗ＲＳウイルス抗体の残存率を算出した。抗ＲＳウイルス抗体の残存率は、出発量を基準とした。対照として、抗ＲＳウイルス抗体を４．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解した抗ＲＳウイルス抗体溶液について、同様の操作を行った。なお、当該実験はＮ＝３で行った。【０１４６】
結果を下記表１５に示す。対照のたんぱく質の残存率は４３．１％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含された抗ＲＳウイルス抗体は１１１．０および１１０．５％残存しており、振動ストレスに対して安定化されていた。【０１４７】
【表１５】
0006527697.tif 000018
【０１４８】
〔実施例２３．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１４〕
溶液Ａの代わりに酢酸ナトリウム水和物６．８ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム５．８ｍｇ／ｍＬを含有する溶液Ｃ（ｐＨ６．０）を用い、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体  ４．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４０および処方５０のゲル状製剤２３−４０および２３−５０を、実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２００μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに８００μＬの溶液Ｃを添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中の抗ＥＧＦＲ抗体について紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液に含まれる抗ＥＧＦＲ抗体の残存率を算出した。残存率は、出発量を基準とした。対照として、抗ＥＧＦＲ抗体を４．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶液Ｃに溶解した抗ＥＧＦＲ抗体溶液について、同様の操作を行った。なお、当該実験はＮ＝３で行った。【０１４９】
結果を下記表１６に示す。対照の抗ＥＧＦＲ抗体の残存率は１４．５％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含された抗ＥＧＦＲ抗体は１０６．１および１０７．４％残存しており、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１５０】
【表１６】
0006527697.tif 000019
【０１５１】
〔実施例２４．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１５〕
溶液Ａを用い、ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパク  １０．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４０および処方５０のゲル状製剤２４−４０および２４−５０を実施例２（１）の調製方法と同様にして、２．５ｍＬディスポーザブルシリンジ（テルモ株式会社製）に２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに２５０μＬの溶液Ａを添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中のＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクについてサイズ排除クロマトグラフィー法によりサイズに基づく分析を行った。対照として、ＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクを１０. ０ｍｇ／ｍＬを含有するゲル状製剤２４−５０からシクロデキストリンを除いた製剤（「ＴＮＦα／ＬＴα受容体＋ＰＥＧ」）、ゲル状製剤２４−４０および２４−５０からそれぞれＰＥＧ２００００を除いた製剤（「ＴＮＦα／ＬＴα受容体＋α−ＣｙＤ」および「ＴＮＦα／ＬＴα受容体＋γ−ＣｙＤ」）、ゲル状製剤２４−５０からシクロデキストリンおよびＰＥＧ２００００を除いた製剤（「ＴＮＦα／ＬＴα受容体溶液」）を調製し、同様の操作を行った。残存率は、振動ストレスを付加していないＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパク溶液の単量体ピークの面積を基準とし、ストレスを与えたサンプルの単量体ピークの面積値を％で表した。また、可溶性凝集体ピークの面積値について、総ピーク面積値に対する割合（％）で表した。なお、可溶性凝集対ピークは、分子量マーカーにより分子量６７万以上と推定されるピークとした。当該実験はＮ＝３で行った。【０１５２】
結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。対照の溶液におけるＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクの残存率は９４％以下であったのに対し、ゲル状製剤中に包含されたＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクは１０４．９％および９９．２％残存していた（図１３Ａ）。また、対照の溶液では総面積の１．３〜８．７％の凝集体ピークが認められたのに対し、ゲル状製剤では認められず、ゲル状製剤中のＴＮＦα／ＬＴα受容体融合タンパクは振動ストレスに対して安定化されていた（図１３Ｂ）。【０１５３】
〔実施例２５．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１６〕
溶液Ａの代わりに水を用い、Ｌ−アスパラギナーゼ  ３．８ｍｇ／ｍＬまたは７．５ｍｇ／ｍＬを含有する処方４０および処方５０のゲル状製剤２５−４０および２５−５０を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で７日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに８００μＬの水を添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中のＬ−アスパラギナーゼについてサイズ排除クロマトグラフィー法によりサイズに基づく分析を行った。対照として、Ｌ−アスパラギナーゼを３．８ｍｇ／ｍＬまたは７．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解したＬ−アスパラギナーゼ溶液について、同様の操作を行った。残存率は、振動ストレスを付加していないＬ−アスパラギナーゼ溶液の単量体ピークの面積を基準とし、ストレスを与えたサンプルの単量体ピークの面積値を％で表した。なお、当該実験はＮ＝３で行った。【０１５４】
結果を下記表１７−１および表１７−２に示す。対照（３．８ｍｇ／ｍＬ）中のＬ−アスパラギナーゼの残存率は１１．７％であったのに対し、Ｌ−アスパラギナーゼ（３．８ｍｇ／ｍＬ）を含有したゲル状製剤では１００．９％および１０４．１％が残存していた（表１７−１）。また、対照（７．５ｍｇ／ｍＬ）中のＬ−アスパラギナーゼの残存率が２３．４％であったのに対し、Ｌ−アスパラギナーゼ（７．５ｍｇ／ｍＬ）を含有したゲル状製剤では１０１．２％および１０５．８％が残存しており（表１７−２）、ゲル状製剤中のＬ−アスパラギナーゼは振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１５５】
【表１７】
0006527697.tif 000020
【０１５６】
〔実施例２６．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１７〕
溶液Ａの代わりに水を用い、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片  １．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４０および処方５０のゲル状製剤２６−４０および２６−５０を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で２日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、各サンプルに２５０μＬの水を添加し、穏やかに振とうしてゲル状製剤を崩壊させた。試料を遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、溶出液中の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片についてサイズ排除クロマトグラフィー法によりサイズに基づく分析を行った。対照として、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解した抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片溶液について、同様の操作を行った。残存率は、振動ストレスを付加していない抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片溶液の単量体ピークの面積を基準とし、ストレスを与えたサンプルの単量体ピークの面積値を％で表した。なお、当該実験はＮ＝３で行った。【０１５７】
結果を下記表１８に示す。対照の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片の単量体残存率は８．８％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含された抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体Ｆａｂ断片は１００．６％および１０２．４％残存しており、振動ストレスに対して著しく安定化されていた。【０１５８】
【表１８】
0006527697.tif 000021
【０１５９】
〔実施例２７．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１８〕
溶液Ａの代わりに水を用い、抗ヒトＩｇＥ抗体  ７．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４１および処方５１のゲル状製剤２７−４１および２７−５１を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させ、遠心した後、上清をメンブランフィルターでろ過し、上清中の抗ヒトＩｇＥ抗体について、以下の評価を行った。なお、当該実験はＮ＝２で行った。【０１６０】
Ｉ．紫外分光光度計（装置型式：Ｖ−６５０、日本分光製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、上清に含まれる抗ヒトＩｇＥ抗体の残存率を算出した。対照として、抗ヒトＩｇＥ抗体を７．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解した抗ヒトＩｇＥ抗体溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様の操作を行った。抗ヒトＩｇＥ抗体の残存率は、出発量を基準とした。【０１６１】
ＩＩ．Ｉの結果に基づきタンパク濃度を補正した後、抗ヒトＩｇＥ抗体活性として、ＦＣεＲ１受容体を固相化したプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法により上清中の抗ヒトＩｇＥ抗体のヒトＩｇＥ結合阻害活性を測定した。活性の保持率は、振動ストレスを負荷していない抗ヒトＩｇＥ抗体溶液を基準として算出した。【０１６２】
結果を下記表１９−１および表１９−２に示す。【０１６３】
Ｉ．対照（７．０ｍｇ／ｍＬ  抗ヒトＩｇＥ抗体溶液）における抗ヒトＩｇＥ抗体の残存率は７６．５％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含された抗ヒトＩｇＥ抗体は９７．１％および１０８．２％残存していた（表１９−１）。【０１６４】
ＩＩ．ゲル状製剤に包含された抗ヒトＩｇＥ抗体は、振動ストレスを負荷した後にも９０．６％および９０．３％の活性を保っていた（表１９−２）。【０１６５】
以上の結果より、ゲル状製剤中に包含された抗ヒトＩｇＥ抗体は、振動ストレスに対して安定化されていることが明らかとなった。【０１６６】
【表１９】
0006527697.tif 000022
【０１６７】
〔実施例２８．振動ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果１９〕
溶液Ａの代わりにＤ−マンニトール３７．５ｍｇ／ｍＬ、グリシン５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム溶液９ｍｇ／ｍＬを含有する溶液Ｄ（ｐＨ４．８）を用い、α型ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（以下、α−ｈＡＮＰとも称する）０．１ｍｇ／ｍＬを含有する処方４８のゲル状製剤２８−４８を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに５００μＬ調製した。次に、マイクロチューブを振とう機に設置し、３７℃、５００ｒｐｍで５日間振とうし、ゲル状製剤に振動ストレスを与えた。振動ストレス負荷後、水５００μＬを添加し、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させ、遠心した。上清をメンブランフィルターでろ過して凝集体を除き、ＨＰＬＣ法により溶液中に含まれるα−ｈＡＮＰの量を求めた。なお、当該実験はＮ＝３で行い、α−ｈＡＮＰの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、α−ｈＡＮＰを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶液Ｄに溶解したα−ｈＡＮＰ溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様に操作を行った。【０１６８】
結果を下記表２０に示す。対照（α−ｈＡＮＰ溶液）のα−ｈＡＮＰ残存率は３１．９％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含されたα−ｈＡＮＰは９０．８％残存しており、ゲル状製剤中に包含されたα−ｈＡＮＰは振動ストレスに対して安定化されていた。【０１６９】
【表２０】
0006527697.tif 000023
【０１７０】
〔実施例２９．酸化ストレスに対する凝集抑制効果１〕
溶液Ａの代わりにＤ−マンニトール３７．５ｍｇ／ｍＬ、グリシン５ｍｇ／ｍＬを含有する溶液Ｅ（ｐＨ４．８）を用い、α−ｈＡＮＰ  ０．１ｍｇ／ｍＬを含有する処方４８のゲル状製剤２９−４８を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに５００μＬ調製した。これに、０．２％過酸化水素を５０μＬずつ加えて３７℃で１時間インキュベートした後、速やかに０．４Ｍメチオニン２００μＬおよび水２５０μＬを加え、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させた。これを遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過して凝集体を除き、ＨＰＬＣ法により溶液中に含まれるα−ｈＡＮＰの量を求めた。なお、当該実験はＮ＝２で行い、α−ｈＡＮＰの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、α−ｈＡＮＰを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶液Ｅに溶解したα−ｈＡＮＰ溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様に操作を行った。【０１７１】
結果を下記表２１に示す。対照（α−ｈＡＮＰ溶液）のα−ｈＡＮＰ残存率は６５．１％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含されたα−ｈＡＮＰは７８．３％残存しており、ゲル状製剤中に包含されたα−ｈＡＮＰの酸化ストレスによる変性およびその結果として生じる凝集体形成に対する抑制効果が示された。【０１７２】
【表２１】
0006527697.tif 000024
【０１７３】
〔実施例３０．酸化ストレスに対する凝集抑制効果２〕
溶液Ａの代わりに水を用い、抗ＴＮＦα抗体  １．１ｍｇ／ｍＬを含有する処方４１のゲル状製剤３０−４１を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに９００μＬ調製した。これに、０．１％過酸化水素を１００μＬ加えて３７℃で１時間インキュベートした後、速やかに０．４Ｍメチオニン２００μＬを加え、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させた。これを遠心し、上清をメンブランフィルターでろ過し、還元アルキル化後、トリプシン消化によるペプチドマッピング（ＨＰＬＣ法）を行い、酸化により減少するピークの面積を求めた。また、対照として、抗ＴＮＦα抗体を１．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解した抗ＴＮＦα抗体溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様に操作を行い、同ピークの面積を求めた。なお、当該実験はＮ＝２で行った。【０１７４】
酸化により減少するピークの面積を比較したところ、ゲル状製剤のピーク面積は対照のピーク面積に比べて約２割大きく、対照のピーク面積に対するゲル状製剤のピーク面積は、１．２１であった。以上より、ゲル状製剤中に包含された抗ＴＮＦα抗体の酸化ストレスによる変性およびその結果として生じる凝集体形成に対する抑制効果が示された。【０１７５】
〔実施例３１．タングステンによる凝集体形成に対する抑制効果〕
プレフィルドシリンジ等に混入する恐れのあるタングステンは、タンパク質の凝集を引き起こし得ることが知られている。そこで、本発明のゲル状製剤が、タングステンによる凝集体形成に対して抑制効果を有するどうかを見るため、以下の実験を行った。【０１７６】
溶液Ａの代わりに酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、ヒトＩｇＧ  １．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方５８のゲル状製剤３１−５８を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに９００μＬ調製した。これに、５００ｐｐｍのタングステン酸（ＶＩ）ナトリウム溶液（ｐＨ５．０、酢酸緩衝液）を１００μＬ加え、４℃で一晩静置することでタングステンによるストレスを負荷した。ストレス負荷後、ミクロスパーテルでゲル状製剤を崩壊させ、遠心した後の上清をメンブランフィルターでろ過して凝集体を除き、紫外分光光度計（装置型式：ＵＶ−２４５０、株式会社島津製作所製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝３で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。また、対照として、ヒトＩｇＧを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したヒトＩｇＧ溶液について、ミクロスパーテルによる崩壊操作以外は同様の操作を行った。【０１７７】
結果を下記表２２に示す。対照（ＩｇＧ溶液）のヒトＩｇＧの残存率は７８．６％であったのに対し、ゲル状製剤中に包含されたＩｇＧは９０．０％残存しており、ゲル状製剤中に包含されたヒトＩｇＧは、タングステンによる凝集に対しての安定化効果が明らかとなった。【０１７８】
【表２２】
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【０１７９】
〔実施例３２．振動ストレスによる変性に対する抑制効果〕
溶液Ａの代わりにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用い、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体  ４．０ｍｇ／ｍＬを含有する処方４９および処方５９のゲル状製剤３２−４９および３２−５９を実施例２（１）の調製方法と同様にして、マイクロチューブに２５０μＬ調製した。これを５００ｒｐｍ、３７℃の条件で５日間振とうし、振動ストレスを負荷した。ストレス負荷後、ＰＢＳ  ３０ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式Ｖ−６３０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、溶出液中に含まれる抗ＥＧＦＲ抗体の濃度を補正し、円二色性分散計（装置型式Ｊ−８２０、日本分光株式会社製）で円二色性スペクトル測定を行った。比較例として、ゲル状製剤３２−５９からシクロデキストリンおよびＰＥＧ２００００を除いた製剤（「抗ＥＧＦＲ抗体溶液」）を調製し、同様の操作を行った。また、振動ストレスを負荷しない抗ＥＧＦＲ抗体溶液について円二色性スペクトル測定を行い、対照とした。【０１８０】
結果を図１４に示す。比較例の振動ストレスを負荷した抗ＥＧＦＲ抗体溶液のＣＤスペクトルは、対照のＣＤスペクトルに対して２００ｎｍ付近のピークが正方向に増大し、２１６ｎｍ付近のピークが負方向に増大していた。これに対し、ゲル状製剤３２−４９および３２−５９では変化が抑制されており、振動ストレスに対して二次構造についても安定化されていた。【０１８１】
〔実施例３３．ゲル濃度の測定（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ処方）〕
ＰＥＧ２００００の代わりに各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ；Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして、下記表２３の組成に従い、処方９４〜１０３のゲル３３−９４〜３３−１０３を調製した。下記表２３中の空欄は、その成分を含まないことを意味する。【０１８２】
なお、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒとしては、ＢＡＳＦ社製のＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １２４（製品名：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ  ４４）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（製品名：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ  ６８）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ２３７（製品名：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ  ８７）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ３３８（製品名：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ  １０８）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７（製品名：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ  １２７）を使用した。また、α−シクロデキストリンは、製品名：セルデックス（登録商標）Ａ−１００（日本食品加工株式会社製）、γ−シクロデキストリンは製品名：デキシパールγ−１００（塩水港精糖株式会社製）を使用した。【０１８３】
次に、実施例１に記載の方法に従い、上記ゲル３３−９４〜３３−１０３のゲル濃度（ｗｔ／ｖｏｌ％）を測定した。ゲル濃度を下記表２３に示す。【０１８４】
【表２３】
0006527697.tif 000026
【０１８５】
上記表２３の結果に示されるように、５種類のＰｏｌｏｘａｍｅｒを用いて４ｗｔ／ｖｏｌ％以上のゲル濃度を有するゲルが得られた。【０１８６】
〔実施例３４．ゲル状製剤の結晶構造の解析（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ処方）〕
（１）ゲル状製剤の調製
ＰＥＧ２００００の代わりに各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ；Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）を用い、実施例１と同様の手順で、ヒトＩｇＧ  １００ｍｇ／ｍＬを含有した実施例３３の表２３の処方９７、９８、１０２および１０３のゲル状製剤３４−９７、３４−９８、３４−１０２および３４−１０３を調製した。【０１８７】
（２）粉末Ｘ線回折測定
（１）で作製したゲル状製剤を、水  １００μＬで洗浄し、室温（２５℃）で少なくとも３日間減圧乾燥した。（ｅ）ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤３４−９７および３４−１０２の固体試料３４−９７ａおよび３４−１０２ａ、および（ｊ）ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤３４−９８および３４−１０３の固体試料３４−９８ａおよび３４−１０３ａと、比較の固体試料として、（ａ）および（ｆ）シクロデキストリン単独、（ｂ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ３３８単独、（ｇ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７単独、（ｃ）および（ｈ）ヒトＩｇＧ単独、（ｄ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ３３８／シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物、（ｉ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７／シクロデキストリン／ヒトＩｇＧ混合物の、それぞれの粉末Ｘ線回折を測定した。【０１８８】
なお、比較の固体試料（ｄ）、（ｉ）は、それぞれの固体を所定の混合比（それぞれ、９７および１０２、９８および１０３の混合比）で混合したものである。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄに、ゲル状製剤固体試料３４−９７ａ、３４−９８ａ、３４−１０２ａ、および３４−１０３ａの粉末Ｘ線回折の結果を示す。【０１８９】
α−シクロデキストリン系において、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒとの物理的混合物はα−シクロデキストリン単独と同様にかご型構造の回折パターンを示したのに対し、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤３４−９７および３４−９８の固体試料３４−９７ａおよび３４−９８ａは、２θ＝７．５°、１３°、２０°および２２°付近に特徴的なピークを与え、六方晶系筒型構造の回折パターンを示し、実施例２においてα−シクロデキストリンとＰＥＧを用いて作製したゲル状製剤２−１２の固体試料２−１２ａと同様の結晶構造であった。また、γ−シクロデキストリン系においても同様に、γ−シクロデキストリン単独やＰｏｌｏｘａｍｅｒとの物理的混合物は、かご型構造の回折パターンを示した。一方、ヒトＩｇＧを含有したゲル状製剤３４−１０３の固体試料３４−１０３ａは、２θ＝７．５°付近に、ゲル状製剤３４−１０２の固体試料３４−１０２ａは、２θ＝７．５°および２１°付近に正方晶系筒型構造に特徴的なピークを与え、実施例２においてγ−シクロデキストリンとＰＥＧを用いて作製したゲル状製剤２−３７の固体試料２−３７ａと同様の結晶構造であった。【０１９０】
〔実施例３５．熱ストレスによる凝集体形成に対する抑制効果（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ処方）〕
溶液Ａの代わりに水、ＰＥＧ２００００の代わりにポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン  ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ；Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８）を用い、ヒトＩｇＧ  １００ｍｇ／ｍＬを含有する処方９７および１０２のゲル状製剤３５−９７および３５−１０２を実施例３３の調製方法と同様にして、マイクロチューブに０．５ｍＬ調製した。ゲル状製剤０．５ｍＬを６０℃、１５分温浴で加熱することにより、ゲル状製剤に熱ストレスを与えた。熱ストレス負荷後、溶液Ａ  ３０ｍＬを加えて、ゲル構造が目視で確認されなくなるまで穏やかに振とうしてゲルを崩壊させ、ヒトＩｇＧを溶出した。このヒトＩｇＧ溶出液を遠心し凝集体を沈殿させた後、紫外分光光度計（装置型式Ｖ−６３０、日本分光株式会社製）で２８０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。この値から、上清中に含まれるヒトＩｇＧ量を算出した。なお、当該実験はＮ＝３で行い、ヒトＩｇＧの残存率は、出発量を基準とした。【０１９１】
また、対照として、ヒトＩｇＧ  １００ｍｇ／ｍＬを含有する「ＩｇＧ溶液」を調製し、ヒトＩｇＧ含有ゲル状製剤３５−９７および３５−１０２と同様の操作を行った。【０１９２】
結果を図１６に示す。α−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤３５−９７およびγ−シクロデキストリンを用いたゲル状製剤３５−１０２に包含されたヒトＩｇＧは、溶出液中に出発量の１００．６％および９２．６％が残存していたのに対し、対照の溶出液中のヒトＩｇＧの残存率は７３．２％であり、ゲル状製剤に包含されたヒトＩｇＧの熱ストレスに対する安定化が明らかとなった。【０１９３】
以上の実施例で示されたように、本発明のゲル状製剤は、タンパク質を包含し、物理的または化学的ストレスから保護し、凝集体形成を抑制して安定に存在させていることがわかる。【０１９４】
なお、本出願は、２０１３年１月２８日に出願された日本特許出願第２０１３−０１３５９６号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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