(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６ｍｕｔ）ポリペプチドまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸を含む製剤であって、
該ＡＣ６ｍｕｔが、ＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒しない、または野生型ＡＣ６によるＡＴＰからｃＡＭＰへの触媒活性と比較してＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する能力が損なわれており、
ＡＣ６ｍｕｔをｉｎ  ｖｉｖｏの心筋細胞において発現させた場合に、左心室（ＬＶ）収縮機能が影響を受けずもしくは低下せずまたはＬＶ収縮機能が実質的に影響を受けずもしくは低下もしない、製剤であって、
（１）心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置するため、
（２）心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防するため、あるいは
（３）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させること；または心不全のための入院の頻度を低下させることにおいて使用するため、または
（４）心臓障害または心血管疾患を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防することを必要とする個体または患者における心臓障害または心血管疾患を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防することにおいて使用するため
の製剤であって、該ＡＣ６ｍｕｔがＣａ２＋の取り込みを増加させる、製剤。
【請求項２】
前記ＡＣ６ｍｕｔが、
（ａ）アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コア内の荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドであって、
該非荷電または非極性アミノ酸がアラニン（Ａｌａ）であり、該酸性アミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）である、または該非荷電または非極性アミノ酸がＡｌａであり、かつ該酸性アミノ酸がＡｓｐである、ＡＣポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１６に基づいてマウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの前記触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有する該ＡＣポリペプチド；もしくは
配列番号１１に基づいてＡＣポリペプチドの前記触媒コアの４３６位におけるＡｓｐのアラニン（Ａｌａ）による置換を有するマウスＡＣ６ｍｕｔポリペプチド
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
（ａ）前記ＡＣ６ポリペプチドが、配列番号１０に基づいてＡＣ６ポリペプチドの前記触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有するヒトＡＣポリペプチドを含み；
（ｂ）前記ＡＣ６ｍｕｔポリペプチドが配列番号１７もしくは配列番号１２もしくは配列番号１３を有し；
（ｃ）該ＡＣ６ｍｕｔが、細胞の染色体に安定に挿入されるＡＣ６ｍｕｔコード核酸にコードされるか、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクターもしくは組換えウイルスにコードされ、
ここで、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸が調節性または誘導性転写調節配列に作動可能に連結し、
前記心疾患が心収縮機能障害、うっ血性心不全、心臓線維症、心筋細胞疾患、または心筋細胞機能障害であり；
（ｄ）該ＡＣ６ｍｕｔは、アデノ随伴ウイルス、組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター、ＡＡＶビリオン、アデノウイルスベクター、またはそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体によってコードされ、または
（ｅ）該ＡＣ６ｍｕｔは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；またはそのハイブリッドもしくは誘導体によってコードされる、
請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
（ａ）前記転写調節配列に作動可能に連結した前記ＡＣ６ｍｕｔコード核酸、前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスを、それを必要とする前記個体または患者に、経口投与によって、筋肉内注射によって、静脈内注射によって、皮下注射によって、皮内注射によって、動脈内注射によって、冠内もしくは心臓内注射によって、吸入によって、または微粒子銃粒子送達系によって、または「遺伝子銃」、または空気銃を使用することによって投与または送達するために製造され、
またはコードされる該ＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを組織内の細胞から分泌させ、血流中に放出させるように、前記血流に面するまたは該血流による流出を受ける身体内の任意の細胞、器官、組織または液腔に導入することによって投与または送達するために製造され：または
（ｂ）前記製剤が、該ＡＣ６ｍｕｔの発現を誘導する経口用抗生物質、ドキシサイクリンもしくはラパマイシンを含む、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
（ａ）前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤中にまたは凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤として製剤化され、
（ｂ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが、小胞、ヒドロゲル、ゲル、リポソーム、ナノリポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子を含む、またはその中に製剤化され、
（ｃ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが単離された細胞または培養細胞において製剤化され、場合によって該細胞が哺乳動物細胞、心臓細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞であり、
（ｄ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが医薬品または滅菌物として製剤化され、
（ｅ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが、製造製品、人工臓器または埋没物と一緒に、それの上に、またはそれと共に製剤化または送達され、場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを発現する、
請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記心臓障害または心血管疾患が、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎、結節性多発性動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎、川崎病、リケッチア性血管炎、アテローム硬化性動脈瘤、心筋肥大、先天性心疾患、虚血性心疾患、アンギナ、後天性弁膜症もしくは心内膜疾患、原発性心筋疾患、心筋炎、不整脈、移植片拒絶、代謝性心筋疾患、心筋ミオパチー、うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症、および、心臓移植からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
心疾患の処置あるいは心疾患または心不全を有するリスクの処置において使用するため、あるいは
心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下、
心臓障害、または
心血管疾患
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防することにおいて使用するための、あるいは
心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させる、または心不全のための入院の頻度を低下させることにおいて使用するための、
製剤であって、前記製剤が変異６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６ｍｕｔ）ポリペプチドまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸を含むことを特徴とし、
該ＡＣ６ｍｕｔが、ＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒しない、または野生型ＡＣ６によるＡＴＰからｃＡＭＰへの触媒活性と比較してＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する能力が損なわれており、該ＡＣ６ｍｕｔがＣａ２＋の取り込みを増加させる、
製剤。
【請求項８】
（ａ）前記ＡＣ６ｍｕｔがアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コア内の荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドを含み、
該非荷電または非極性アミノ酸がアラニン（Ａｌａ）であり、該酸性アミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、または該非荷電または非極性アミノ酸がＡｌａであり、かつ該酸性アミノ酸がＡｓｐであり、好ましくは、マウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドは、配列番号１６に基づいて該ＡＣポリペプチドの該触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有し、または
マウスＡＣ６ｍｕｔポリペプチドは配列番号１１に基づいて該ＡＣポリペプチドの該触媒コアの４３６位におけるＡｓｐのアラニン（Ａｌａ）による置換を有し；
（ｂ）ヒトＡＣ６ポリペプチドが、配列番号１０に基づいて該ＡＣポリペプチドの該触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有するヒトＡＣ６ポリペプチドを含み、または該ＡＣ６ｍｕｔポリペプチドが配列番号１７もしくは配列番号１２もしくは配列番号１３を有し；
（ｃ）該ＡＣ６ｍｕｔが、細胞の染色体に安定に挿入されるＡＣ６ｍｕｔコード核酸にコードされるか、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター、ＡＡＶビリオン、アデノウイルスベクター、またはそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体、特に、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；またはそのハイブリッドもしくは誘導体にコードされ；または
該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸が、調節性または誘導性転写調節配列に作動可能に連結し、前記心疾患が心収縮機能障害、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心臓線維症、心筋細胞疾患、または心筋細胞機能障害であり、あるいは
（ｄ）該転写調節配列に作動可能に連結した該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸、該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスは、それを必要とする患者に、
経口投与によって、筋肉内（ＩＭ）注射によって、静脈内（ＩＶ）注射によって、皮下（ＳＣ）注射によって、皮内注射によって、動脈内（ＩＡ）注射によって、冠内もしくは心臓内注射によって、吸入によって、または微粒子銃粒子送達系によって、または「遺伝子銃」、または空気銃を使用することによって投与または送達するためのものであり、
または、コードされる該ＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを組織内の細胞から分泌させ、血流中に放出させ得るように前記血流に面するまたは該血流による流出を受ける身体内の任意の細胞、器官、組織または液腔に導入することによって投与または送達するためのものである、
請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
（ａ）前記製剤が、該ＡＣ６ｍｕｔ発現を誘導する経口用抗生物質、ドキシサイクリンもしくはラパマイシンを含み、
（ｂ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが、凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤中にまたは凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤として製剤化され、
（ｃ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが、小胞、ヒドロゲル、ゲル、リポソーム、ナノリポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）を含む、またはその中に製剤化され、
（ｄ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが単離された細胞または培養細胞において製剤化され、好ましくは、該細胞が哺乳動物細胞、心臓細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞であり、
（ｅ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが医薬品または滅菌物として製剤化され、
（ｆ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスが、製造製品、人工臓器または埋没物と一緒に、それの上に、またはそれと共に製剤化または送達され、あるいは
（ｇ）該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、または組換えウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを発現する、
請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記心臓障害または心血管疾患が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎、結節性多発性動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎、川崎病、リケッチア性血管炎、アテローム硬化性動脈瘤、心筋肥大、先天性心疾患（ＣＨＤ）、虚血性心疾患、アンギナ、後天性弁膜症もしくは心内膜疾患、原発性心筋疾患、心筋炎、不整脈、移植片拒絶、代謝性心筋疾患、心筋ミオパチー、うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症、および、心臓移植からなる群から選択される、請求項７〜９のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
特許協力条約（ＰＣＴ）に基づく本国際出願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもとで、２０１３年６月７日に出願された米国仮出願第６１／８３２，７５９号の優先権の利益を請求する。前記出願は、あらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、細胞分子生物学、遺伝子療法および医学に、より詳細には、心不全または心疾患を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を、環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）タンパク質またはポリペプチド（「ＡＣ６ｍｕｔ」とも称される）、またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸配列を投与することによって処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
心筋細胞および他の細胞の膜貫通タンパク質であるアデニリルシクラーゼは、細胞内ｃＡＭＰの生成によってｐ−アドレナリン作動性シグナル伝達を行う重要なエフェクター分子である。サイクリックＡＭＰは、プロテインキナーゼＡ活性化を含めた下流の事象に関する二次メッセンジャーである。心不全は心機能と密接に関連するｃＡＭＰ産生が損なわれることに関連する。哺乳動物の心筋細胞で発現する優性ＡＣアイソフォームである心臓の６型ＡＣ（ＡＣ６）の増加には不全左心室（ＬＶ）に対する不定形の有益な効果があることが示されている。これらの効果としては、１）心筋症および急性心筋梗塞における生存の増加、２）ＡＶブロックの低下に関連する活動電位持続時間の短縮および房室伝導の容易化、３）ＬＶ拡張および病的肥大の両方の軽減、４）ＳＥＲＣＡ２ａ活性の改善、ホスホランバン活性の上昇によるカルシウムハンドリングに対する有益な効果、ならびに５）心トロポニンＩリン酸化の増加が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ｃＡＭＰの細胞内レベルを上昇させる薬物がいくつか生成されており、心不全の患者において試験されている。しかし、これらの薬物により、一般には死亡率が上昇する。現行のドグマでは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを上昇させる薬物およびタンパク質が不全心臓に対して有害であり、したがって、心不全の処置には不適当であることが示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
代替の実施形態では、本発明は、心疾患または心機能の低下に対して、個体または患者を処置する、好転させるまたは保護する（予防する）ための方法であって、環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）タンパク質もしくはポリペプチド（「ＡＣ６ｍｕｔ」とも称される）、または転写調節配列に作動可能に連結したＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子；またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を含有する発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物を提供し、発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物により、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させることができるステップと、ＡＣ６ｍｕｔ、または転写調節配列に作動可能に連結したＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子、または発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする個体または患者に投与または送達するステップとを含み、それにより、心疾患または心機能の低下に対して個体または患者を処置する、好転させるまたは保護する（予防する）方法を提供する。代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コア内に荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドを含む。
【０００６】
代替の実施形態では、本発明は、
（１）心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置すること、
（２）心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防すること、
（３）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強すること、
（４）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害すること、
（５）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護すること、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させること、または
（６）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させること；または心不全のための入院の頻度を低下させること、
のためのもしくはそれに関する方法およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそのためのもしくはそれに関する方法であって、
（ａ）
（ｉ）環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）タンパク質またはポリペプチド（「ＡＣ６ｍｕｔ」とも称される）であって、場合によって、組換え、合成、ペプチド模倣または単離されたＡＣ６ｍｕｔポリペプチドまたはペプチドであるＡＣ６ｍｕｔ；または
（ｉｉ）ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子であって、
場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が転写調節配列に作動可能に連結しており、場合によって、転写調節配列がプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または心臓細胞に特異的なプロモーターもしくは筋細胞に特異的なプロモーターである；または、
場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が転写調節配列に作動可能に連結しており、場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物に含有され、送達ビヒクル、発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を発現することができ、
場合によって、細胞が心臓細胞または筋細胞である、
ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子
を提供するステップであって、
ＡＣ６ｍｕｔがＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒しない、またはＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する能力が損なわれており、場合によって、ＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する能力が損なわれていることが、ＡＣ６ｍｕｔが、野生型ＡＣ６によるＡＴＰからｃＡＭＰへの触媒活性の約１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％しか有さないと定義され、
ＡＣ６ｍｕｔを心筋細胞において発現させた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける左心室（ＬＶ）機能が影響を受けずもしくは低下せずまたはＬＶ機能が実質的に影響を受けず、低下もしない、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、筋小胞体によるＣａ２＋の取り込みが増加し、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、ＳＥＲＣＡ２ａ活性化についてのＥＣ５０が低下し、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、ホスホランバンタンパク質の発現が減少し、
場合によって、置換により、Ｍｇ２＋の結合が阻害され、触媒コアのＧｓα−媒介性活性化の効率が変更される、
ステップと、
（ｂ）ＡＣ６ｍｕｔ、またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心臓細胞または心筋細胞に送達または投与する、またはＡＣ６ｍｕｔを心臓細胞または心筋細胞において発現させる、またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心臓細胞または心筋細胞において発現させるステップであって、
場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸が転写調節配列に作動可能に連結しており、または場合によって、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を心筋細胞、または、それを必要とする個体もしくは患者に送達または投与し、
場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心臓細胞または心筋細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達または投与することが、心筋もしくは心筋細胞への標的化送達である、または、心臓への直接送達もしくは投与を含む、または、心臓内注射もしくは注入を含む、
ステップと
を含み、
それにより、
心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置すること、
心疾患、心不全、心機能または心拍出量の低下、心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下に対して、個体または患者を処置する、好転させるまたは保護する（予防する）こと、
インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強すること、
心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害すること、
心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護すること、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させること、または
心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させること
のためのもしくはそれに関する方法およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそのためのもしくはそれに関する方法を提供する。
【０００７】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コア内に荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドを含み、
場合によって、非荷電もしくは非極性アミノ酸はアラニン（Ａｌａ）であり、場合によって、酸性アミノ酸はアスパラギン酸（Ａｓｐ）である、または場合によって、非荷電もしくは非極性アミノ酸はＡｌａであり、酸性アミノ酸はＡｓｐである。
【０００８】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔは、
配列番号１６に基づいてマウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有し、配列番号１７がＤ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１６はＤ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）ＡＣポリペプチド；または
配列番号１１に基づいてマウスＡＣ６ｍｕｔポリペプチドの触媒コアの４３６位におけるＡｓｐのアラニン、またはＡｌａによる置換を有し、配列番号１２がＤ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１１はＤ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）ＡＣポリペプチド
を含む。
【０００９】
代替の実施形態では、ＡＣ６は哺乳動物ＡＣ６ポリペプチドである、またはＡＣ６はヒトＡＣ６ポリペプチドである。代替の実施形態では、ヒトＡＣ６ポリペプチドは、配列番号１０に基づいてヒトＡＣ６ポリペプチドの触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有し、配列番号１３がＤ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１０はＤ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）ＡＣポリペプチドを含む。
【００１０】
当該方法の代替の実施形態では、
（ａ）ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子は細胞の染色体に安定に挿入される、
（ｂ）送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター；ＡＡＶビリオン、またはアデノウイルスベクター、または任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体であるまたはそれを含む、
（ｃ）（ｂ）の方法で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター、ＡＡＶビリオン、またはアデノウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；または任意のそのハイブリッドもしくは誘導体であるまたはそれを含む、
（ｄ）ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子は、調節性または誘導性転写調節配列に作動可能に連結している、
（ｅ）（ｄ）の方法で、調節性または誘導性転写調節配列は、調節性または誘導性プロモーターである、
（ｆ）（ａ）から（ｅ）までのいずれかの方法で、転写調節配列に作動可能に連結したＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする個体または患者に投与すると、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔの標的化送達および発現をもたらし、またはＡＣ６ｍｕｔが血流または全身循環中に放出される、または
（ｇ）（ａ）から（ｆ）までのいずれかの方法で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＣ６ｍｕｔレベルの上昇に応答する疾患、感染症または状態は、心収縮機能障害；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞疾患；心筋細胞機能障害または心筋細胞アポトーシスである。
【００１１】
当該方法の代替の実施形態では、
（ａ）転写調節配列に作動可能に連結したＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子；または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする個体または患者に、経口投与によって、筋肉内（ＩＭ）注射によって、静脈内（ＩＶ）注射によって、皮下（ＳＣ）注射によって、皮内注射によって、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）注射によって、動脈内（ＩＡ）注射によって、冠内もしくは心臓内注射によって、眼内注射もしくは塗布によって、吸入によって、または微粒子銃粒子送達系によって、または「遺伝子銃」、空気銃もしくはＨＥＬＩＯＳ（商標）ｇｅｎｅ  ｇｕｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することによって投与または送達し、
場合によって、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子をＡＡＶベクターまたはＡＡＶ−９ベクターの静脈内（ＩＶ）注射によって送達する、または、
（ｂ）転写調節配列に作動可能に連結したＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子；または発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする個体または患者に、血流に面するまたは血流による流出を受ける身体内の任意の細胞、器官、組織または液腔（ｆｌｕｉｄ  ｓｐａｃｅ）に導入することによって投与または送達し、その結果、コードされるＡＣ６ｍｕｔタンパク質を組織内の細胞から分泌させ、血流中に放出させることができる。
【００１２】
当該方法の代替の実施形態では、
（ａ）個体、患者または被験体に、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する、または、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するもしくはその発現を上方制御するプロモーター（例えば、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーター）を誘導もしくは活性化する刺激物またはシグナルを投与する、
（ｂ）個体、患者または被験体にプロモーターの活性化因子の合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与し、場合によって、プロモーターは、ＡＣ遺伝子プロモーター、または筋細胞に特異的なプロモーターである、
（ｃ）個体、患者または被験体に、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に特異的なプロモーターの天然または合成活性化因子の合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与し、場合によって、天然活性化因子は内因性転写因子である、
（ｄ）（ｃ）の方法で、合成活性化因子は、内因性または外因性の標的遺伝子を特異的かつ選択的にオンにするように設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質であり、場合によって、内因性標的は、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子またはＡＣ６ｍｕｔの活性化因子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーターの活性化因子である、
（ｅ）（ａ）から（ｃ）までのいずれかの方法で、刺激物またはシグナルは、生物学的刺激物またはシグナル、光刺激物またはシグナル、化学的刺激物またはシグナルまたは医薬的刺激物またはシグナルを含む、
（ｆ）個体、患者または被験体に、ＡＣ６ｍｕｔの転写後活性化因子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーターの活性化因子の発現を刺激または誘導する刺激物またはシグナルを投与する、または
（ｇ）個体、患者または被験体に、ＡＣ６を発現する核酸もしくは遺伝子の転写抑制因子または転写後抑制因子を阻害するまたはそれの阻害を誘導する刺激物またはシグナルを投与する。
【００１３】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結した調節性もしくは誘導性プロモーターの発現を誘導する化学物質または医薬品は、経口用抗生物質、ドキシサイクリンまたはラパマイシンであるもしくはそれを含む、または、ドキシサイクリンを使用するｔｅｔ調節系を使用してＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子またはその等価物の発現を誘導する。
【００１４】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ）、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤中にまたは凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤として製剤化される。
【００１５】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は、小胞、ヒドロゲル、ゲル、リポソーム、ナノリポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）を含む、またはその中に製剤化される。
【００１６】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は単離された細胞または培養細胞について製剤化されており、場合によって、細胞は、哺乳動物細胞、心臓細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞である。
【００１７】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は医薬品または滅菌物として製剤化される。
【００１８】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を、製造製品、人工臓器または埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）と一緒に（ｗｉｔｈ）、それの上に（ｏｎ）、またはそれと共に（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）製剤化するまたは送達する。
【００１９】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを発現する。
【００２０】
代替の実施形態では、本発明は、ＡＣ６ｍｕｔ応答性の病態、感染症、疾患、疾病、または状態に対して、個体または患者を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防するための方法であって、本発明の方法を実施することを含む方法を提供する。
【００２１】
代替の実施形態では、本発明は、それを必要とする個体または患者における心臓障害または心血管疾患を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防するための方法であって、本発明の方法を実施することを含む方法を提供する。代替の実施形態では、心臓障害または心血管疾患は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群（Churg-Strass  syndrome）；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植を含む。
【００２２】
代替の実施形態では、本発明は、
（１）心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置するための、
（２）心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防するための、
（３）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強するための、
（４）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害するための、
（５）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護する、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させるための、
（６）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させる；または心不全のための入院の頻度を低下させるための、
（７）心臓障害または心血管疾患のための、または
（８）冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植のための
医薬の調製における、
請求項１から１６のいずれかに記載のＡＣ６ｍｕｔ；ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子；送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター；またはアデノウイルスベクター、または任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体を含む使用であって、
場合によって、ＡＡＶまたは組換えＡＡＶウイルスもしくはベクターがＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；または任意のそのハイブリッドもしくは誘導体、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する細胞または心筋細胞を含む、
使用を提供する。
【００２３】
代替の実施形態では、
（１）心疾患、心不全、心機能または心拍出量の低下、心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下の処置において使用するための、またはそれのための、
（２）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強する処置において使用するための、またはそれのための、
（３）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害する処置において使用するための、またはそれのための、
（４）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護する、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させる処置において使用するための、またはそれのための、
（５）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させる；または心不全のための入院の頻度を低下させる処置において使用するための、またはそれのための、
（６）心臓障害または心血管疾患の処置において使用するための、またはそれのための、または
（７）冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植の処置において使用するための、またはそれのための、
本明細書において使用されるもしくは記載される、または本発明の任意の方法における治療用製剤。
【００２４】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、付属図および以下の記載に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、該記載および図から、また特許請求の範囲から明らかになる。
【００２５】
本明細書において引用される、刊行物、特許、特許出願は全て、これによりあらゆる目的について明白に参照により組み込まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（１）心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置すること、
（２）心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防すること、
（３）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強すること、
（４）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害すること、
（５）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護すること、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させること、または
（６）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させること；または心不全のための入院の頻度を低下させること
のためのもしくはそれに関する方法またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそのためのもしくはそれに関する方法であって、
（ａ）
（ｉ）環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）タンパク質またはポリペプチド（「ＡＣ６ｍｕｔ」とも称される）であって、場合によって、組換え、合成、ペプチド模倣または単離されたＡＣ６ｍｕｔポリペプチドまたはペプチドである該ＡＣ６ｍｕｔ；または
（ｉｉ）ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子であって、
場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が転写調節配列に作動可能に連結しており、場合によって、該転写調節配列がプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または心臓細胞に特異的なプロモーターもしくは筋細胞に特異的なプロモーターである；または、
場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が転写調節配列に作動可能に連結しており、場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物に含有され、該送達ビヒクル、発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を発現することができ、
場合によって、該細胞が心臓細胞または筋細胞である、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子
を提供するステップであって、
該ＡＣ６ｍｕｔがＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒しない、またはＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する能力が損なわれており、場合によって、ＡＴＰのｃＡＭＰへの分解を触媒する該能力が損なわれていることが、該ＡＣ６ｍｕｔが、野生型ＡＣ６による該ＡＴＰからｃＡＭＰへの触媒活性の約１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％しか有さないと定義され、
前記ＡＣ６ｍｕｔを心筋細胞において発現させた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける左心室（ＬＶ）機能が影響を受けずもしくは低下せずまたはＬＶ機能が実質的に影響を受けず、低下もせず、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、筋小胞体によるＣａ２＋の取り込みが増加し、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、ＳＥＲＣＡ２ａ活性化についてのＥＣ５０が低下し、
場合によって、心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔ発現により、ホスホランバンタンパク質の発現が減少し、
場合によって、置換により、Ｍｇ２＋の結合が阻害され、触媒コアのＧｓα−媒介性活性化の効率が変更される、
ステップと、
（ｂ）該ＡＣ６ｍｕｔ、または該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心臓細胞または心筋細胞に送達または投与する、または該ＡＣ６ｍｕｔを心臓細胞または心筋細胞において発現させる、または該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心臓細胞または心筋細胞において発現させるステップであって、
場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸が転写調節配列に作動可能に連結しており、または場合によって、該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を心筋細胞、または、それを必要とする個体もしくは患者に送達または投与し、
場合によって、該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を該心臓細胞または心筋細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達または投与することが、心筋もしくは心筋細胞への標的化送達である、または、心臓への直接送達もしくは投与を含む、または、心臓内注射もしくは注入を含むステップ
とを含み、
それにより、
心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある該被験体を処置すること、
心疾患、心不全、心機能または心拍出量の低下、心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下に対して個体または患者を処置する、好転させるまたは保護する（予防する）こと、
インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強すること、
心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの該生成を阻害すること、
心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護すること、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させること、または
心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させること
のためのもしくはそれに関する方法またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそのためのもしくはそれに関する方法。
（項目２）
前記ＡＣ６ｍｕｔがアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの前記触媒コア内に荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドを含み、
場合によって該非荷電または非極性アミノ酸がアラニン（Ａｌａ）であり、場合によって該酸性アミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）である、または場合によって該非荷電または非極性アミノ酸がＡｌａであり、該酸性アミノ酸がＡｓｐである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡＣ６ｍｕｔが、
配列番号１６に基づいてマウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの前記触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有し、配列番号１７が該Ｄ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１６は該Ｄ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）該ＡＣポリペプチド；または
配列番号１１に基づいてマウスＡＣ６ｍｕｔポリペプチドの前記触媒コアの４３６位におけるＡｓｐのアラニンまたはＡｌａによる置換を有し、配列番号１２が該Ｄ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１１は該Ｄ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）該ＡＣポリペプチド
を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＣ６が哺乳動物ＡＣ６ポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＡＣ６がヒトＡＣ６ポリペプチドである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ヒトＡＣ６ポリペプチドが、配列番号１０に基づいてヒトＡＣ６ポリペプチドの前記触媒コアの４２６位におけるＡｓｐのＡｌａによる置換を有し、配列番号１３が該Ｄ→Ａ置換後の該ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号１０は該Ｄ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）該ＡＣポリペプチドを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）前記ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が細胞の染色体に安定に挿入されている、
（ｂ）前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター；ＡＡＶビリオン、またはアデノウイルスベクター、または任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体であるまたはそれを含む、
（ｃ）（ｂ）の方法で、該アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター、ＡＡＶビリオン、またはアデノウイルスベクターが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；または任意のそのハイブリッドもしくは誘導体であるまたはそれを含む、
（ｄ）該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子が調節性または誘導性転写調節配列に作動可能に連結している、
（ｅ）（ｄ）の方法で、該調節性または誘導性転写調節配列が調節性または誘導性プロモーターである、
（ｆ）（ａ）から（ｅ）までのいずれかの方法で、転写調節配列に作動可能に連結している該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子、または該送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする個体または患者に投与すると、心筋細胞における前記ＡＣ６ｍｕｔの標的化送達および発現をもたらし、またはＡＣ６ｍｕｔが血流または全身循環中に放出される；または
（ｇ）（ａ）から（ｆ）までのいずれかの方法で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＣ６ｍｕｔレベルの上昇に応答する疾患、感染症または状態が、心収縮機能障害；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞疾患；心筋細胞機能障害または心筋細胞アポトーシスである、
項目１に記載の方法。
（項目８）
（ａ）前記転写調節配列に作動可能に連結した前記ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子；または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする前記個体または患者に、経口投与によって、筋肉内（ＩＭ）注射によって、静脈内（ＩＶ）注射によって、皮下（ＳＣ）注射によって、皮内注射によって、くも膜下腔内注射によって、動脈内（ＩＡ）注射によって、冠内もしくは心臓内注射によって、眼内注射もしくは塗布によって、吸入によって、または微粒子銃粒子送達系によって、または「遺伝子銃」、空気銃もしくはＨＥＬＩＯＳ（商標）ｇｅｎｅ  ｇｕｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することによって投与または送達し、
場合によって、前記ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子をＡＡＶベクターまたはＡＡＶ−９ベクターの静脈内（ＩＶ）注射によって送達する、または
（ｂ）該転写調節配列に作動可能に連結した該ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子；または該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物を、それを必要とする該個体または患者に、前記血流に面するまたは該血流による流出を受ける身体内の任意の細胞、器官、組織または液腔に導入することによって投与または送達し、その結果、コードされる該ＡＣ６ｍｕｔタンパク質を該組織内の細胞から分泌させ、該血流中に放出させることができる、
項目１に記載の方法。
（項目９）
（ａ）前記個体、患者または被験体に、前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する、または、該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するもしくはその発現を上方制御するプロモーター（例えば、該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーター）を誘導もしくは活性化する刺激物またはシグナルを投与する、
（ｂ）該個体、患者または被験体にプロモーターの活性化因子の合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与し、場合によって、該プロモーターがＡＣ遺伝子プロモーター、または筋細胞に特異的なプロモーターである、
（ｃ）該個体、患者または被験体に、該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子または該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に特異的なプロモーターの天然または合成活性化因子の合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与し、
場合によって、該天然活性化因子が内因性転写因子である、
（ｄ）（ｃ）の方法で、該合成活性化因子が内因性または外因性の標的遺伝子を特異的かつ選択的にオンにするように設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質であり、場合によって、該内因性標的が、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子またはＡＣ６ｍｕｔの活性化因子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーターの活性化因子である、
（ｅ）（ａ）から（ｃ）までのいずれかの方法で、該刺激物またはシグナルが、生物学的刺激物またはシグナル、光刺激物またはシグナル、化学的刺激物またはシグナルまたは医薬的刺激物またはシグナルを含む、
（ｆ）該個体、患者または被験体に、ＡＣ６ｍｕｔの転写後活性化因子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結したプロモーターの活性化因子の発現を刺激または誘導する刺激物またはシグナルを投与する、または
（ｇ）該個体、患者または被験体に、ＡＣ６を発現する核酸もしくは遺伝子の転写抑制因子または転写後抑制因子を阻害するまたは阻害を誘導する刺激物またはシグナルを投与する、
項目１から８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する、または該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子に作動可能に連結した前記調節性もしくは誘導性プロモーターの発現を誘導する前記化学物質または医薬品が、経口用抗生物質、ドキシサイクリンもしくはラパマイシンであるもしくはそれを含む、または、ドキシサイクリンを使用するｔｅｔ調節系を使用して該ＡＣ６ｍｕｔまたは該ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子またはその等価物の発現を誘導する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤中にまたは凍結乾燥物、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、散剤、噴霧剤、軟膏剤、または水性もしくは食塩水製剤として製剤化される、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が、小胞、ヒドロゲル、ゲル、リポソーム、ナノリポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）を含む、またはその中に製剤化される、項目１から１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が単離された細胞または培養細胞について製剤化され、場合によって該細胞が哺乳動物細胞、心臓細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞である、項目１から１１のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が医薬品または滅菌物として製剤化される、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物が、製造製品、人工臓器または埋没物と一緒に、それの上に、またはそれと共に製剤化または送達される、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記ＡＣ６ｍｕｔまたは前記ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子、または前記送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを発現する、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
ＡＣ６ｍｕｔ応答性の病態、感染症、疾患、疾病、または状態に対して、個体または患者を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防するための方法であって、項目１から１６のいずれかに記載の方法を実施することを含む方法。
（項目１８）
心臓障害または心血管疾患を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防することを必要とする個体または患者における心臓障害または心血管疾患を処置する、好転させる、逆転させる、保護する、または予防するための方法であって、項目１から１６のいずれかに記載の方法を実施することを含む方法。
（項目１９）
前記心臓障害または心血管疾患が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
（１）心疾患または心不全を有するまたはそれを有するリスクがある被験体を処置するための、
（２）心疾患、
心不全、
心機能または心拍出量の低下、
心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下
に対して個体または患者を処置する、好転させる、その影響を逆転させる、保護する、または予防するための、
（３）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強するための、
（４）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害するための、
（５）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護する、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させるための、
（６）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させる；または心不全のための入院の頻度を低下させるための、
（７）心臓障害または心血管疾患のための、または
（８）冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植のための
医薬の調製における、
項目１から１６のいずれかに記載のＡＣ６ｍｕｔ；ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子；送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター；またはアデノウイルスベクター、または任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体の使用であって、
場合によって、該ＡＡＶまたは組換えＡＡＶウイルスもしくはベクターが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；または任意のそのハイブリッドもしくは誘導体、またはＡＣ６ｍｕｔを発現する細胞または心筋細胞を含む、使用。
（項目２１）
（１）心疾患、心不全、心機能または心拍出量の低下、心臓の感染症または心臓の状態に起因する心機能または心拍出量の低下の処置において使用するための、またはそれのための、
（２）インタクトな心筋細胞における筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇によってインタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングを増強する処置において使用するための、またはそれのための、
（３）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成を阻害する処置において使用するための、またはそれのための、
（４）心筋細胞をプログラム細胞死（アポトーシス）シグナルから保護する、またはアポトーシスシグナル後にプログラム細胞死（アポトーシス）のシグナルを受ける心筋細胞の数を減少させる処置において使用するための、またはそれのための、
（５）心不全患者においてまたは心機能もしくは心拍出量の低下が生じる心臓の感染症もしくは心臓の状態を有する個体において、心機能もしくは心拍出量を増加させ、症状を軽減し、かつ／または死亡率を低下させる；または心不全のための入院の頻度を低下させる処置において使用するための、またはそれのための、
（６）心臓障害または心血管疾患の処置において使用するための、またはそれのための、または、
（７）冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；血管炎、自己免疫性またはウイルス性血管炎；結節性多発性動脈炎；チャーグ・ストラウス症候群；高安動脈炎；川崎病；リケッチア性血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患；アンギナ；後天性弁膜症もしくは心内膜疾患；原発性心筋疾患；心筋炎；不整脈；移植片拒絶；代謝性心筋疾患；心筋ミオパチー；うっ血性心筋症、肥大性心筋症もしくは拘束型心筋症；および／または、心臓移植の処置において使用するための、またはそれのための、
項目１から１６までのいずれかにおいて使用または記載されている治療用製剤。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、下記の実施例１において詳細に考察されている、本発明の例示的なＡＣ６ｍｕｔの設計、発現、活性および細胞分布を例示する図である。図１Ａには、本発明の例示的なマウスＡＣ６ｍｕｔの構築における、Ｃ１ドメイン（細胞内ループ）の４２６位（配列番号１７に基づく位置番号、配列番号１６はＤ→Ａ置換前の配列である）におけるアスパラギン酸（ａｓｐ）のアラニン（ａｌａ）による置換（Ｄ→Ａ置換）の部位を示す図が概略的に例示されている。図１Ｂには、内因性ＡＣ６と導入遺伝子ＡＣ６ｍｕｔに共通のプライマーを使用したｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されるＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡの発現がグラフで例示されている。図１Ｃには、抗ＡＣ５／６抗体を使用してＡＣ６ｍｕｔタンパク質を検出し、抗ＡＵ１タグ抗体を使用して確認した免疫ブロットが例示されている。図１Ｄには、ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイによって測定される、ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における、イソプロテレノールを用いた刺激前（基底）および刺激後のサイクリックＡＭＰ産生がグラフで例示されている。図１Ｅには、抗ＡＵ１抗体（赤色）；抗カベオリン３（Ｃａｖ−３）抗体（緑色、カベオラについて）；抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）抗体（緑色、筋小胞体について）；抗ラミンＡ抗体（緑色、核エンベロープについて）、および抗電位依存性アニオン選択チャネルタンパク質（ｖｏｌｔａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＶＤＡＣ）抗体（緑色、ミトコンドリアについて）を使用した、ＡＣ６ｍｕｔマウスから単離した心筋細胞と、対照マウスから単離した心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔタンパク質の２重免疫蛍光染色が例示されている。核は青色である。
【００２７】
【図２】図２は、下記の実施例１において詳細に考察されている、ＰＫＡ、ＰＫＳおよびＰＤＥの活性および発現を例示する図である。図２Ａの上のグラフには、刺激していない（基底）またはイソプロテレノールもしくはＮＫＨ４７７を用いて刺激した、単離した心筋細胞におけるＰＫＡ活性のレベルがグラフで例示されており、図２Ａの下の図には、左心室（ＬＶ）ホモジネート中のＰＫＡタンパク質を示すゲル免疫ブロットが例示されている。図２Ｂには、ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウス由来の左心室ホモジネートを使用した、重要なシグナル伝達タンパク質のリン酸化を示す免疫ブロットが例示されている。ホスホ（Ｐ）および総（Ｔ）ＰＫＡ調節性サブユニットＩＩ−αおよびＩＩ−β、ＰＫＣα、３Ａ型ホスホロジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３Ａ）（ＰＤＥ３Ａ）、ホスホトロポニンＩ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）（Ｐ２２／２３−ＴｎＩ）、および総ＴｎＩが示されている。図２Ｃには、各群から単離した心筋細胞の培養物において評価したイソプロテレノール刺激の前後のＲｙＲ２、ＰＬＢおよびＴｎＩのリン酸化を示す免疫ブロットが例示されている。図２Ｄには、ＡＣ６ｍｕｔマウスにおけるイソプロテレノール刺激に伴って心筋細胞におけるＲｙＲ２、ＰＬＢ、およびＴｎＩのリン酸化が増加したことを示す図２Ｃからのデータがグラフで例示されている。データは、ローディング（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化したものである。
【００２８】
【図３】図３は、下記の実施例１において詳細に考察されている、左心室収縮機能をグラフで例示する図である。ＡＣ６ｍｕｔ  ＴＧマウスから単離した心臓（黒塗りの丸）では、広範囲のイソプロテレノール用量によるイソプロテレノール刺激に応答してＬＶ  ｄＰ／ｄｔの保持が示された。白抜きの丸は、導入遺伝子陰性対照マウスを示す。
【００２９】
【図４】図４は、下記の実施例１において詳細に考察されている、ＳＲによるＣａ２＋の取り込み、Ｃａ２＋シグナル伝達タンパク質、および転写因子を例示する図である。図４Ａの上のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔマウスおよびＴＧ陰性同胞対照マウス由来のプールしたＬＶ試料におけるＣａ２＋の取り込み活性がグラフで例示されており、図４Ａの下のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔの発現により、Ｃａ２＋に対するＳＥＲＣＡ２ａの親和性が低下したことがグラフで例示されている。図４Ｂの上のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるホスホランバン（ＰＬＢ）発現が減少したことがグラフで例示されており、図４Ｂの下のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＣＲＥＭ−１タンパク質の発現が増加したことがグラフで例示されている。図４Ｂの下の図には、タンパク質レベルを示すゲルの免疫ブロットが例示されている。データは、ローディング（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化したものである。図４Ｃの上のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＳ１００Ａ１タンパク質の発現が増加したことがグラフで例示されている。図４Ｃの下のグラフには、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＰ１３３−ＣＲＥＢタンパク質の発現が増加したことがグラフで例示されている。図４Ｃの下の図には、タンパク質レベルを示すゲルの免疫ブロットが例示されており、データは、ローディング（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化したものである。図４Ｄには、ＡＣ６ｍｕｔ発現がＳＥＲＣＡ２ａ、カルレティキュリン、カルセケストリンまたはホスホ−Ｓ１６−ＰＬＢタンパク質のＬＶにおける発現に影響を及ぼさなかったことを示すゲルの免疫ブロットが例示されている。図４Ｅには、ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における抗ＡＵ１抗体（赤色）および抗ＣＲＥＭ−１抗体（緑色）または抗ＡＵ１および抗ホスホ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３、緑色）を使用した、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質の２重免疫蛍光染色が例示されており、核は青色で示した。
【００３０】
【図５】図５は、下記の実施例１において詳細に考察されている、ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における細胞質ゾルのＣａ２＋トランジェントを例示する図である。図５Ａには、放出された基底のＣａ２＋（収縮期Ｃａ２＋−拡張期Ｃａ２＋）には、ＡＣ６ｍｕｔと対照の間で群間の差異は示されなかったことを示すデータがグラフで例示されている。図５Ｂには、イソプロテレノールを用いて刺激した心筋細胞における代表的なＩｎｄｏ−１  Ｃａ２＋トランジェント記録が、ＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞の方が高かったことを示すデータがグラフで例示されている；要約データが図５Ｃに示されている。図５Ｃには、イソプロテレノールの存在下で放出されるＣａ２＋がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では増加したことを示すデータがグラフで例示されている。図５Ｄには、イソプロテレノールの存在下でのピークＣａ２＋トランジェントまでの時間がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では短くなったことを示すデータがグラフで例示されている。図５Ｅには、イソプロテレノールの存在下での５０％弛緩までの時間（ｔａｕ）がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では短くなったことを示すデータがグラフで例示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
種々の図における同様の参照記号は同様の要素を示す。
【００３２】
本発明は、組成物、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてインタクトな心筋細胞におけるｃＡＭＰの減少、筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの増加および／または弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇に応答する心疾患、心機能もしくは心拍出量の低下、または心臓の感染症もしくは状態を有する個体を処置する、好転させるまたは保護する（予防または予防法として）ために、環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）タンパク質またはポリペプチド（「ＡＣ６ｍｕｔ」とも称される）、またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を投与するステップを含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける方法を提供する。
【００３３】
代替の実施形態では、本発明は、細胞内ｃＡＭＰを阻害するまたはその量を実質的に減少させる、またはその生成を触媒しないＡＣ６ｍｕｔを提供する。代替の実施形態では、本発明のＡＣ６ｍｕｔにより、細胞内シグナル伝達が、１）インタクトな心筋細胞におけるカルシウムハンドリングが増強される様式、２）心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの生成が阻害される様式、および３）心筋細胞がプログラム細胞死（アポトーシス）から保護される様式で変更される。代替の実施形態では、上記ＡＣ６ｍｕｔが患者の不全心臓において発現するまたはそこに送達されると、心機能が増大し、症状が軽減され、死亡率が低下する。したがって、本発明のＡＣ６ｍｕｔを心臓に送達することにより、ｃＡＭＰ生成に起因する悪影響を伴わずに心機能が増大する。したがって、代替の実施形態では、本発明は、心不全および心機能の低下に対する理想的な療法を提供する。
【００３４】
代替の実施形態では、本発明は、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子、またはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を含む（その中に含有する）発現ビヒクル（例えば、ベクター、組換えウイルスなど）を送達し、発現させ（例えば、制御された発現）、その結果、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質を心筋細胞において選択的に発現させる、または心筋細胞にのみ送達する、あるいは、心血管疾患を処置する場合では、例えば心臓などの身体内に有益な効果があり得る血流または全身循環中に放出させるための組成物および方法を提供する。
【００３５】
代替の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するために、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現のための送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどを提供する。代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔ核酸もしくは遺伝子を発現する送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどを、筋肉内（ＩＭ）注射によって、心臓への直接注射によって、静脈内（ＩＶ）注射によって、皮下注射によって、吸入によって、微粒子銃粒子送達系（例えば、いわゆる「遺伝子銃」）などによって、例えば外来患者として、例えば来院の間に送達することができる。
【００３６】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子（例えばそれらを「ペイロード」として保有する送達ビヒクル（例えばリポソームなどの）、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどを含める）を誘導されたｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣ発現または標的心臓器官における直接発現のために筋細胞、心筋細胞にターゲティングするまたは直接心筋細胞に送達する。
【００３７】
代替の実施形態では、この「末梢」方式の送達、例えば、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどをＩＭ注射またはＩＶ注射することにより、遺伝子または核酸を器官（例えば、心臓、肺または腎臓）自体において直接発現させた場合に遭遇する問題を回避することができる。血流または全身循環中への所望のＡＣ６ｍｕｔタンパク質（複数可）、または送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどの持続分泌により、タンパク質、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどを、身体内での半減期が非常に短い多くのタンパク質、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなどに関して特に問題があり得る注入によって投与することの困難および出費も回避される。
【００３８】
代替の実施形態では、本発明は、目的に合わせる（ｔａｉｌｏｒｅｄ）処置および最適な安全性の確保のために、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子発現を容易にかつ効率的にオンにすることおよびオフにすることができる方法を提供する。
【００３９】
代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸（複数可）または遺伝子（複数可）によって発現されるＡＣ６ｍｕｔタンパク質（複数可）は、それらの部位または作用部位から離れた（例えば、解剖学的に遠隔の）血液または全身循環中に分泌されるにもかかわらず、組織または器官、例えば、心臓、血管、肺、腎臓、または他の標的に対して有益なまたは好都合な効果（例えば、治療的または予防的なもの）を有する。
【００４０】
本発明の例示的な実施形態では、ｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣをコードするＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子を使用して、これに限定されないが、例えば、心疾患、心不全、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心拍出量もしくは機能のあらゆる低下、またはそれらの任意の組合せを処置することを含めた本発明の方法を実施する。
【００４１】
例えば、代替の実施形態では、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなど、例えば長期ウイルス（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｖｉｒｕｓ）またはウイルスベクターを、例えば、全身静脈内に（例えばＩＶ）、または筋肉内（ＩＭ）注射によって、吸入によって、または微粒子銃粒子送達系によって（例えば、いわゆる「遺伝子銃」）、例えば、外来患者として、例えば診察室において、注射することができる。代替の実施形態では、数日または数週間後（例えば、４週間後）に、個体、患者または被験体に、ＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する化学物質または医薬品を投与する（例えば、吸入する、注射するまたは嚥下させる）；例えば、経口用抗生物質（例えば、ドキシサイクリンまたはラパマイシン）を１日１回（またはそれよりも多いもしくは少ない頻度で）投与し、それにより、遺伝子の発現が活性化される。代替の実施形態では、核酸もしくは遺伝子の「活性化」、または発現の誘導（例えば、誘導性プロモーターによる）後、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質が合成され、被験体の循環中（例えば、血液中）に放出され、その後、該タンパク質は、個体または患者に有益な（例えば、心機能に有益な）好都合な生理学的効果、例えば治療的または予防的な生理学的効果を有する。医師または被験体が処置の中止を望んだ場合、被験体は単に活性化用の化学物質または医薬品、例えば、抗生物質の接種を止める。
【００４２】
代替の実施形態では、本発明の適用は、重症低駆出率心不全の処置、肺高血圧症の処置、駆出率が保持された心不全の処置、肺高血圧症および心不全を処置するために入院および血管作用性ペプチドの持続的な静脈内注入を必要とする現行の療法の置換え、ならびにＡＣ６ｍｕｔの発現またはＡＣ６ｍｕｔ核酸もしくは遺伝子の制御により身体内での好都合な効果が促進される他の状態の処置を含む。
【００４３】
核酸の生成および操作
代替の実施形態では、本発明の方法を実施するために、本発明は、単離された、合成のおよび／または組換えのＡＣ６ｍｕｔポリペプチドをコードする核酸もしくは遺伝子を提供する。代替の実施形態では、本発明の方法を実施するために、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現のための発現ビヒクルにおける（例えば、スプライスした）、例えば、ベクター、例えば、ＡＡＶ、もしくは任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体、または組換えウイルスにおける組換え型のＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸もしくは遺伝子を提供する。
【００４４】
代替の実施形態では、哺乳動物、例えば、ヒトまたはマウスのＡＣ６ｍｕｔを使用して本発明を実施することができ、ＡＣ６ｍｕｔは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コア内に荷電または酸性アミノ酸の非荷電または非極性アミノ酸による置換を有するＡＣポリペプチドを含む。ヒトＡＣ６ポリペプチド（配列番号１０）の触媒コア（触媒領域１（Ｃ１）とも称される）は、アミノ酸残基３０７から６７５までである。マウスＡＣ６ポリペプチド（配列番号１１）の触媒コアはアミノ酸残基３１５から６８３までである。
【００４５】
代替の実施形態では、非荷電もしくは非極性アミノ酸はアラニン（Ａｌａ）であり、場合によって、酸性アミノ酸はアスパラギン酸（Ａｓｐ）である、または場合によって、非荷電もしくは非極性アミノ酸はＡｌａであり、酸性アミノ酸はＡｓｐである。
【００４６】
代替の実施形態では、本発明は、マウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コアの４３６位におけるアスパラギン酸、またはＡｓｐ（または「Ｄ」）のアラニン、またはＡｌａ（または「Ａ」）による置換を有するＡＣポリペプチドを含む（マウス）ＡＣ６ｍｕｔポリペプチド（配列番号１２）を提供する。すなわち、この実施形態では、マウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドは、マウスＡＣポリペプチドの触媒コアの４３６位における置換Ｄ→Ａ、またはＡｓｐのＡｌａによる置換を有する（配列番号１１はＤ→Ａ置換前のアミノ酸配列である）。
【００４７】
代替の実施形態では、本発明は、マウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コアの４２６位におけるアスパラギン酸、またはＡｓｐ（または「Ｄ」）のアラニン、またはＡｌａ（または「Ａ」）による置換（すなわち、Ｄ→Ａ置換）を有するＡＣポリペプチドを含む（マウス）ＡＣ６ｍｕｔポリペプチド（配列番号１７）を提供する。配列番号１７ポリペプチドは、配列番号１２ポリペプチドとは、配列番号１７ポリペプチドでは配列番号１２ポリペプチドの最初の１０アミノ酸が欠けているという点で異なり、他の点ではポリペプチドは同一である。配列番号１６はＤ→Ａ置換前のマウスアミノ酸配列である。アミノ末端を欠くアイソフォームは、配列番号１１および配列番号１２の最初の１０アミノ酸が翻訳されない野生型マウスポリペプチドと考えられる。
【００４８】
代替の実施形態では、本発明は、ヒトアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドの触媒コアの４２８位におけるアスパラギン酸、またはＡｓｐ（または「Ｄ」）のアラニン、またはＡｌａ（または「Ａ」）による置換を有するＡＣポリペプチドを含む（ヒト）ＡＣ６ｍｕｔポリペプチド（配列番号１３）を提供する。すなわち、この実施形態では、マウスアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）ポリペプチドはマウスＡＣポリペプチドの触媒コアの４２８位における置換Ｄ→Ａ、またはＡｓｐのＡｌａによる置換を有する。
【００４９】
ヒトＡＣ６核酸コード配列（配列番号１４）とマウスコード配列（配列番号１５）との相同性は８６％である。ヒトＡＣ６ポリペプチド（配列番号１０）とマウスＡＣ６ポリペプチド（配列番号１１）とのアミノ酸レベルでの相同性は９４％である。
【００５０】
以下に例示されている通り、ＡＣ６ｍｕｔ  Ｄ→Ａ置換は、ヒトＡＣ６ｍｕｔの触媒コアとマウスＡＣ６ｍｕｔとで全く同じ相対的な構造的位置にある（以下で下線が引かれている通り野生型がそれでもアスパラギン酸、または「Ｄ」残基を有することを示す：
【化１−１】
0006571069.tif 000002
【化１−２】
0006571069.tif 000003
【００５１】
代替の実施形態では、ヒトＡＣｍｕｔ核酸コード配列（配列番号１３）とマウスＡＣｍｕｔ核酸コード配列（配列番号１２）の両方を、以下に示されている通りアデノシン（または「Ａ」）をシトシン（または「Ｃ」）に変化させることによって作製した。以下で「Ｃ」に変化させる前の「Ａ」残基に下線が引かれている。すなわち、以下には野生型ヒトＡＣ６（配列番号１０）および野生型マウスＡＣ６（配列番号１１）が例示されている：
【化２】
0006571069.tif 000004
【化３】
0006571069.tif 000005
【化４】
0006571069.tif 000006
【化５】
0006571069.tif 000007
【化６】
0006571069.tif 000008
【００５２】
代替の実施形態では、本発明の核酸を、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニングおよび発現、メッセージまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲによる増幅などによって作製、単離および／または操作する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそのハイブリッドを含めた、本発明を実施するために使用する核酸および遺伝子は、種々の供給源から単離すること、遺伝子操作すること、増幅すること、および／または組換えによって発現させること／生成することができる。これらの核酸から生成した組換えポリペプチド（例えば、本発明を実施するために使用するｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣキメラタンパク質）を個別に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。例えば、細菌細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞の発現系または発現ビヒクルを含めた任意の組換え発現系を使用することができる。
【００５３】
あるいは、本発明を実施するために使用する核酸は、例えば、Adams（１９８３年）J.  Am.  Chem.  Soc.  １０５巻：６６１頁；Belousov（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.  ２５巻：３４４０〜３４４４頁；Frenkel（１９９５年）Free  Radic.  Biol.  Med.  １９巻：３７３〜３８０頁；Blommers（１９９４年）Biochemistry  ３３巻：７８８６〜７８９６頁；Narang（１９７９年）Meth.  Enzymol.  ６８巻：９０頁；Brown（１９７９年）Meth.  Enzymol.  ６８巻：１０９頁；Beaucage（１９８１年）Tetra.  Lett.  ２２巻：１８５９頁；米国特許第４，４５８，０６６号に記載の通り周知の化学合成技法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。
【００５４】
本発明を実施するために使用する核酸を操作するための技法、例えば、サブクローニング、標識用プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用したランダムプライマーによる標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に十分に記載されている、例えば、Sambrook編、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL（第２版）、１〜３巻、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、（１９８９年）；CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、Ausubel編  John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York（１９９７年）；LABORATORY  TECHNIQUES  IN  BIOCHEMISTRY  AND  MOLECULAR  BIOLOGY:  HYBRIDIZATION  WITH  NUCLEIC  ACID  PROBES、Part  I.  Theory  and  Nucleic  Acid  Preparation、Tijssen編  Elsevier、N.Y.（１９９３年）を参照されたい。
【００５５】
本発明の方法を実施するために使用する核酸を得、操作する別の有用な手段は、ゲノム試料からクローニングし、所望であれば、例えばゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離または増幅された挿入断片をスクリーニングし、再クローニングすることである。本発明の方法において使用する核酸の供給源としては、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）、例えば、米国特許第５，７２１，１１８号；同第６，０２５，１５５号を参照されたい；ヒト人工染色体、例えば、Rosenfeld（１９９７年）Nat.  Genet.  １５巻：３３３〜３３５頁を参照されたい；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体、例えば、Woon（１９９８年）Genomics  ５０巻：３０６〜３１６頁を参照されたい；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ）、例えば、Kern（１９９７年）Biotechniques  ２３巻：１２０〜１２４頁を参照されたい；コスミド、組換えウイルス、ファージまたはプラスミドに含有されるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【００５６】
代替の実施形態では、本発明の方法を実施するために、ＡＣ６ｍｕｔ融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を使用する。任意のＡＣ６ｍｕｔポリペプチドを使用して、本発明を実施することができる。代替の実施形態では、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質を、ポリペプチドを心筋細胞などの所望の細胞型にターゲティングするためのペプチドなどの異種ペプチドまたはポリペプチドと融合することができる。
【００５７】
代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するタンパク質とつながったまたは融合した異種ペプチドまたはポリペプチドは、蛍光による検出、安定性の増大および／または精製の簡易化などの所望の特性をもたらすＮ末端同定ペプチドであってよい。本発明を実施するために使用するペプチドおよびポリペプチドは、組換えによって合成されたペプチドをより容易に単離するため、抗体および抗体発現Ｂ細胞を同定および単離するためなどに、例えば免疫原性がより高いペプチドを生成するために１つまたは複数の追加的なドメインと連結した融合タンパク質として合成し、発現させることもできる。検出および精製を容易にするドメインとしては、例えば、固定化した金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクト（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）およびヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化した免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）で利用されるドメインが挙げられる。精製を容易にするために精製ドメインとモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）などの切断可能なリンカー配列を含める。例えば、発現ベクターは、６つのヒスチジン残基と連結したエピトープコード核酸配列、その後にチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位を含んでよい（例えば、Williams（１９９５年）Biochemistry  ３４巻：１７８７〜１７９７頁；Dobeli（１９９８年）Protein  Expr.  Purif.  １２巻：４０４〜４１４頁を参照されたい）。ヒスチジン残基により検出および精製が容易になり、一方で、エンテロキナーゼ切断部位によりエピトープを融合タンパク質の残りから精製する手段がもたらされる。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関する技術は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Kroll（１９９３年）DNA  Cell.  Biol.、１２巻：４４１〜５３頁を参照されたい。
【００５８】
本発明を実施するために使用する核酸または核酸配列、例えば、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはこれらのいずれかの断片、一本鎖であっても二本鎖であってもよくセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよいゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または天然もしくは合成起源の任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料であってよい。本発明を実施するために使用する化合物は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの任意の断片を含めた「核酸」または「核酸配列」を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、センス鎖であってもアンチセンス鎖でもよいゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、または、例えばｉＲＮＡ、リボ核タンパク質（例えば、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＰ）を含めた天然もしくは合成起源の任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様材料を含む。本発明を実施するために使用する化合物は、核酸、すなわち、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本発明を実施するために使用する化合物は、合成骨格を有する核酸様構造を含む。例えば、Mata（１９９７年）Toxicol.  Appl.  Pharmacol.  １４４巻：１８９〜１９７頁；Strauss-Soukup（１９９７年）Biochemistry  ３６巻：８６９２〜８６９８頁；Samstag（１９９６年）Antisense  Nucleic  Acid  Drug  Dev  ６巻：１５３〜１５６頁を参照されたい。本発明を実施するために使用する化合物は、化学的に合成することができる一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖を含めた「オリゴヌクレオチド」を含む。本発明を実施するために使用する化合物は、５’リン酸を有さず、したがってキナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸が付加されなければ別のオリゴヌクレオチドとライゲーションしない合成オリゴヌクレオチドを含む。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片とライゲーションし得る。
【００５９】
代替の態様では、本発明を実施するために使用する化合物は、ＡＣ６ｍｕｔポリペプチドの産生に関与する遺伝子、またはＤＮＡの任意のセグメントを含む。これは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに適用可能な場合には、個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれ超の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的な関係を指し得る。代替の態様では、「作動可能に連結した」とは、転写調節配列と転写された配列の機能的な関係を指し得る。例えば、プロモーターが適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調整するものであれば、そのプロモーターは本発明を実施するために使用する核酸などのコード配列に作動可能に連結し得る。代替の態様では、プロモーター転写調節配列が転写された配列に物理的に近接している、すなわち、それらがシス作用性であり得る場合、それらは転写された配列に作動可能に連結し得る。代替の態様では、エンハンサーなどの転写調節配列は、それにより転写が増強されるコード配列に物理的に近接しているまたは極めて近傍に位置する必要はない。
【００６０】
代替の態様では、本発明は、核酸、例えば、構造遺伝子または転写物（例えば、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質をコードする）の、そのような配列に適合する宿主における発現に影響を及ぼすことが可能であり得る、本発明を実施するために使用するヌクレオチド配列を含む「発現カセット」の使用を含む。発現カセットは、ポリペプチドコード配列または阻害配列と、および一態様では他の配列、例えば転写終結シグナルと作動可能に連結したプロモーターを少なくとも含むものであってよい。発現をもたらすのに必要なまたは役立つ追加的な因子、例えばエンハンサーも使用することができる。
【００６１】
代替の態様では、本発明を実施するために使用する発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなども包含する。代替の態様では、本発明を実施するために使用する「ベクター」は、細胞に感染させる、トランスフェクトする、一過性にまたは恒久的に形質導入することができる核酸を含んでよい。代替の態様では、本発明を実施するために使用するベクターは、裸の核酸であってもタンパク質または脂質と複合体を形成した核酸であってもよい。代替の態様では、本発明を実施するために使用するベクターは、ウイルスもしくは細菌の核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含んでよい。代替の態様では、本発明を実施するために使用するベクターとしては、これに限定されないが、ＤＮＡの断片を結合させ、複製されるようにすることができるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を挙げることができる。したがって、ベクターとしては、これらに限定されないが、ＲＮＡ、自律的な自己複製性の環状または直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）が挙げられ、発現プラスミドと非発現プラスミドのどちらも含み得る。代替の態様では、本発明を実施するために使用するベクターは、細胞に有糸分裂の間に自律的な構造として安定に複製させることもでき、宿主のゲノム内に組み入れることもできる。
【００６２】
代替の態様では、本発明を実施するために使用する「プロモーター」は、細胞、例えば、心臓細胞、肺細胞、筋肉細胞、神経細胞または脳細胞などの哺乳動物細胞におけるコード配列の転写を駆動することができる全ての配列を含む。したがって、本発明のコンストラクトにおいて使用するプロモーターは、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度の調節または調整に関与するシス作用性の転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、本発明を実施するために使用するプロモーターは、転写調節に関与するエンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、染色体組み込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含めたシス作用性転写制御エレメントであってよい。これらのシス作用性配列は、一般には、タンパク質または他の生体分子と相互作用して転写を行う（オン／オフにする、調節する、調整するなど）。
【００６３】
代替の実施形態では、本発明を実施するために使用する「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生または細胞分化の状態の下で発現を継続的に駆動するものであってよい。代替の実施形態では、本発明を実施するために使用する「誘導性」または「調節可能な」プロモーターは、環境条件、投与される化学薬品、または発生条件の影響の下で本発明の核酸を直接発現させることができるものである。
【００６４】
アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の送達
代替の実施形態では、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルス、または等価物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；組換えＡＡＶウイルス、ベクターもしくはビリオン；または、アデノウイルスベクターであるまたはそれを含む。代替の実施形態では、ＡＡＶ、組換えＡＡＶウイルスもしくはベクター、またはアデノウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、もしくはＡＡＶｒｈ１０；または任意のそのシュードタイプ、ハイブリッドもしくは誘導体であるまたはそれを含む。
【００６５】
代替の実施形態では、これらのベクターのいずれか（または本発明のいずれかの送達ビヒクル）は、特定の細胞、組織もしくは器官に対して向性である、または特定の細胞、組織もしくは器官に特異的に送達するために設計されたものである。例えば、代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＡＶ（または本発明を実施するために使用する任意のベクターもしくは送達ビヒクル）は心臓に対して向性である（または向性を有する）。他の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＡＶ（または任意のベクターまたは送達ビヒクル）は、別の組織または器官、例えば肝臓に対して向性である、または別の組織または器官、例えば肝臓に特異的に送達するために設計されたものである。代替の実施形態では、この「末梢」方式の送達、例えば、送達ビヒクル、ベクター、組換えウイルスなどをＩＭ注射またはＩＶ注射することにより、遺伝子または核酸を器官（例えば、心臓、肺または腎臓）自体において直接発現させた場合に遭遇する問題を回避することができる。例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９は、心臓に対して向性であることが見いだされている。例えば、Fangら、Hum  Gene  Ther  Methods  ２０１２年１０月１７日；Zincarelliら、Clin  Transl  Sci.  ２０１０年６月；３巻（３号）：８１〜９頁を参照されたい。
【００６６】
本発明を実施するために使用するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さな、エンベロープを有さない一本鎖ＤＮＡ動物ウイルスであるＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の任意の非病原性メンバーであり得る。ＡＡＶは複製のためにヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を必要とし、したがって、本発明を実施するために使用するＡＡＶは被験体に投与した際に複製されない。ＡＡＶは比較的広範囲の細胞型に感染し、特にアデノウイルスなどのいくつかの他のウイルスと比較してほんの軽度の免疫応答を刺激することができる。本発明を実施するために使用するＡＡＶ血清型としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２が挙げられる。本発明を実施するために使用するＡＡＶは、例えば、鳥類（例えば、トリＡＡＶまたはＡＡＡＶ）、ウシ（例えば、ウシＡＡＶまたはＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、ヒツジ、およびブタを含めた他の動物由来のものであってよい。
【００６７】
代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムの少なくとも一部分を異種核酸分子で置き換えた組換え核酸分子である。約４．７キロベース（ｋｂ）のＡＡＶゲノムＤＮＡを、例えば、ウイルスの複製遺伝子およびカプシド遺伝子を除去することによって置き換えることができる。代替の実施形態では、異種核酸分子は、単に各末端上のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＩＴＲは複製開始点としての機能を果たし、レスキュー、組み込み、クローニングベクターからの除去、およびパッケージングのために必要なシス作用性エレメントを含有する。代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＡＶは、発現を制御するために異種核酸分子に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【００６８】
ＡＡＶベクターを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞で発現させたヘルパーウイルスまたはヘルパー機能の助けを借りてＡＡＶカプシド内にパッケージングしてＡＡＶビリオンを得ることができる。ウイルスカプシドタンパク質の性質によりＡＡＶビリオンの血清型および細胞の向性が付与される。ＡＡＶベクターおよびＡＡＶビリオンを、分裂細胞と非分裂細胞のどちらも含めた細胞に効率的に形質導入することができる。ＡＡＶベクターおよびビリオンは、安全であること、および長期のｉｎ  ｖｉｖｏにおける持続および種々の細胞型における発現をもたらすことが示されている。
【００６９】
代替の実施形態では、ＩＴＲはＡＣ６ｍｕｔコード核酸分子の５’末端につながっており、ＩＴＲはＡＣ６ｍｕｔコード核酸分子の３’末端につながっていた。ＩＴＲの例としては、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、および当業者に公知の他のＡＡＶ  ＩＴＲが挙げられる。一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ＡＡＶ５  ＩＴＲ、ＡＡＶ６  ＩＴＲ、およびＢＡＡＶ  ＩＴＲから選択される。一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲはＡＡＶ２  ＩＴＲである。一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲはＡＡＶ５  ＩＴＲである。一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲはＡＡＶ６  ＩＴＲである。一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲはＢＡＡＶ  ＩＴＲである。
【００７０】
代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＡＶベクター（および他のベクター、組換えウイルスなど）は、発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびマイクロＲＮＡ結合部位などの他の配列を含む。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＡＡＶプロモーター、例えば、ｐ５、ｐ１９またはｐ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、パピローマウイルスプロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、他のウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、アミラーゼプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、カリクレインプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、内因性プロモーター、ラパマイシンまたは他の小分子によって調節されるプロモーター、他の細胞のプロモーター、および当業者に公知の他のプロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターはＡＡＶプロモーターである。一実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。含める発現制御配列の選択は当業者が成すことができる。
【００７１】
代替の実施形態では、血清型が異なるＡＡＶベクター（そのようなベクター内のＩＴＲの血清型によって決定して）、例えばＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、ＡＡＶ１２ベクター、ＡＡＡＶベクター、およびＢＡＡＶベクターを使用する。代替の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクターまたはＢＡＡＶベクターである。
【００７２】
代替の実施形態では、ウイルスベクターに１つまたは複数の所望の機能性をもたらすために、キメラＡＡＶ誘導体、シャッフルＡＡＶ誘導体またはカプシド改変ＡＡＶ誘導体を使用する。代替的な実施形態では、これらの誘導体は、天然に存在するＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルスベクターと比較して、遺伝子送達の効率の上昇、免疫原性（体液性または細胞性）の低下、向性範囲の変更および／または特定の細胞型へのターゲティングの改善を示し得る。代替の実施形態では、遺伝子送達の効率の上昇は、細胞表面における受容体または補助受容体の結合の改善、内部移行の改善、細胞内および核内への輸送の改善、ウイルス粒子の脱外被の改善および／または一本鎖のゲノムの二本鎖形態への変換の改善によって実現される。代替の実施形態では、特定の細胞集団の向性範囲の変更またはターゲティングにより、効率が上昇し、したがって、ベクター用量がそれを必要としない組織への投与によって薄まることがない。
【００７３】
代替の実施形態では、例えば米国特許出願第２０１４０１０７１８６号に記載の通り、カプシドを有さないＡＡＶベクターを使用する。代替の実施形態では、例えば米国特許出願第２０１４００５６８５４号に記載の通り、心臓または肝臓に対して向性であるＡＡＶ９ベクターを使用する。代替の実施形態では、例えば、米国特許出願第２０１３０３１０４４３号；同第２０１３０１３６７２９号に記載されているＡＡＶベクターを使用して本発明を実施する。
【００７４】
代替の実施形態では、例えば米国特許出願第２０１２０２２０４９２号に記載の通り、例えば、ウイルスの向性または他の特徴を改善または変更するために、例えば、性能の改善または変更のためにＡＡＶベクターをシュードタイピングする。例えば、特異的なまたは改善されたターゲティングにより、送達ビヒクル（例えば、ＡＡＶウイルス粒子）を感染が意図された細胞のみに感染させ、治療用核酸（例えば、ＡＣ６ｍｕｔ）を送達し、したがって、遺伝子療法に由来する望ましくない副作用のリスクを減少させ、遺伝子療法の効能を増大させることが可能になる。
【００７５】
代替の実施形態では、ウイルスベクターの投与量は、処置される状態、患者の年齢、体重および健康状態などの因子によって決定され、したがって、患者間で変動し得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投与量は、一般に、ゲノムウイルスベクター約１×１０９個から１×１０１６個の濃度を含有する溶液約０．１ｍｌから約１００ｍｌまでの範囲である。大きな器官（例えば、肝臓、筋肉、心臓および肺）に送達するための例示的なヒト投与量は、約１〜１００ｍＬの体積で１ｋｇ当たりＡＡＶゲノム約５×１０１０〜５×１０１３個であり得る。投与量は治療的利益とあらゆる副作用を釣り合わせるために調整され、そのような投与量は、組換えベクターを使用する治療的適用に応じて変動し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニターして、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターがもたらされる投薬の頻度を決定することができる。
【００７６】
製剤
代替の実施形態では、本発明は、ＡＣ６ｍｕｔをｉｎ  ｖｉｖｏで心筋細胞に送達し、発現させるための組成物および方法を提供する。代替の実施形態では、これらの組成物は、これらの目的のために製剤化されたＡＣ６ｍｕｔコード核酸、例えば、緩衝液中、生理食塩水溶液中、粉末中、エマルジョン中、小胞中、リポソーム中、ナノ粒子中、ナノリポ粒子（ｎａｎｏｌｉｐｏｐａｒｔｉｃｌｅ）中などに製剤化された発現ビヒクルまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸を含む。
【００７７】
代替の実施形態では、組成物は、所望のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける投与の方法などを含めた所望のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける条件に応じて、どのようにでも製剤化することができ、種々の濃度および形態で適用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける製剤化および投与のための技法に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。
【００７８】
本発明を実施するために使用するＡＣ６ｍｕｔコード核酸の製剤および／または担体は当技術分野で周知である。本発明を実施するために使用する製剤および／または担体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける適用に適した錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などの形態であってよい。
【００７９】
代替の実施形態では、本発明を実施するために使用するＡＣ６ｍｕｔコード核酸は、水溶液および／または緩衝溶液の混和物であってもよく、あるいは、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁化剤、および天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）などの分散剤もしくは湿潤剤、アルキレン酸化物と脂肪酸の縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を含む水性懸濁液および／または緩衝懸濁液であってもよい。水性懸濁液は、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸などの１種または複数の防腐剤も含有してよい。製剤は、例えば適切な緩衝液を使用することによって容量オスモル濃度に関して調整することができる。
【００８０】
本発明の実施において、本発明の化合物（例えば、製剤）は、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を医薬的に許容される担体、例えば、水および等張性の塩化ナトリウムであるリンゲル液を含めた使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒に溶解させた溶液を含んでよい。さらに、滅菌不揮発性油を溶媒または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリド、またはオレイン酸などの脂肪酸を含めた任意の不揮発性油を使用することができる。一実施形態では、本発明を実施するために使用する溶液および製剤を滅菌し、望ましくない物質を一般に含まないように製造することができる。一実施形態では、これらの溶液および製剤を従来の、周知の滅菌技法によって滅菌する。
【００８１】
本発明を実施するために使用する溶液および製剤は、生理的条件に近づけるために必要な、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの補助物質を含んでよい。これらの製剤中の活性薬剤（例えば、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子）の濃度は広範に変動し得、選択されたｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける投与の特定の方式および所望の結果、例えばｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＣ６ｍｕｔ発現の増加に応じて、主に液量、粘度などに基づいて選択することができる。
【００８２】
本発明を実施するために使用する溶液および製剤を凍結乾燥することができる。例えば、本発明は、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。一態様では、この製剤は、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子ならびに増量剤、例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびスクロースまたはそれらの混合物を含む溶液を凍結乾燥することによって作製される。安定な凍結乾燥製剤を調製するためのプロセスは、約２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、およびｐＨが５．５超６．５未満のクエン酸ナトリウム緩衝液の溶液を凍結乾燥することを含み得る。例えば、米国特許出願第２００４００２８６７０号を参照されたい。
【００８３】
本発明の組成物および製剤は、リポソームを使用することによって送達することができる（以下の考察も参照されたい）。特に、リポソーム表面に標的細胞、例えば心筋細胞に特異的なリガンドが担持されている、または他のやり方で特定の組織または器官型、例えば心臓を優先的に対象とする場合に、リポソームを使用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける適用において活性薬剤の標的細胞、例えば心筋細胞への送達に取り組むことができる。
【００８４】
ナノ粒子、ナノリポ粒子およびリポソーム
本発明は、本発明の方法を実施するため、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を心筋細胞に送達するために使用する化合物（例えば、ＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子）を含むナノ粒子、ナノリポ粒子、小胞およびリポソーム膜も提供する。代替の実施形態では、これらの組成物を、例えば、所望の細胞型、例えば、哺乳動物心臓細胞、心筋細胞などを標的とするための細胞表面ポリペプチドを含めたポリペプチドなどの生物学的分子を含めた特定の分子を標的とするように設計する。
【００８５】
本発明は、例えば、Parkら、米国特許公開第２００７００８２０４２号に記載の通り、本発明を実施するために使用する化合物を含む多層リポソームを提供する。多層リポソームは、例えば、ｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣコード核酸もしくは遺伝子を閉じ込めるために、スクアラン、ステロール、セラミド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分の混合物を使用して、約２００〜５０００ｎｍの粒子サイズに調製することができる。
【００８６】
リポソームは、例えば、Parkら、米国特許公開第２００７００４２０３１号に記載の通り、活性薬剤（例えば、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子）を封入することによってリポソームを生成する方法であって、第１のレザバー中に水溶液を準備するステップと、第２のレザバー中に有機脂質溶液を準備するステップと、次いで、水溶液と有機脂質溶液を第１の混合領域において混合してリポソーム溶液を生成するステップであって、有機脂質溶液と水溶液を混合して実質的に即時的にリポソーム封入活性薬剤を生成するステップと、次いで、すぐにリポソーム溶液と緩衝溶液を混合して希釈されたリポソーム溶液を生成するステップとを含む方法を含めた、任意の方法を使用して作製することができる。
【００８７】
一実施形態では、本発明を実施するために使用するリポソーム組成物は、例えば米国特許公開第２００７０１１０７９８号に記載の通り、例えば、本発明を実施するために使用する化合物（例えば、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子）を所望の細胞型にターゲティング送達するための置換されたアンモニウムおよび／またはポリアニオンを含む。
【００８８】
本発明は、例えば、米国特許公開第２００７００７７２８６号に記載の通り、本発明を実施するために使用する化合物（例えば、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子）を、活性薬剤を含有するナノ粒子（例えば、二次ナノ粒子）の形態で含むナノ粒子も提供する。一実施形態では、本発明は、二価または三価の金属塩と一緒に作用させるための本発明の脂溶性活性薬剤または脂溶化された水溶性活性薬剤を含むナノ粒子を提供する。
【００８９】
一実施形態では、例えば、米国特許公開第２００５０１３６１２１号に記載の通り、固体脂質懸濁液を使用して、本発明を実施するために使用するＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を製剤化すること、およびそれを哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達することができる。
【００９０】
送達ビヒクル
代替の実施形態では、任意の送達ビヒクルを使用して、本発明の方法または組成物を実施すること、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を送達して本発明の方法を実施することができる。例えば、例えば米国特許公開第２００６００８３７３７号に記載の通り、例えば、ポリエチレンイミン誘導体などのポリカチオン、カチオン性ポリマーおよび／またはカチオン性ペプチドを含む送達ビヒクルを使用することができる。
【００９１】
一実施形態では、例えば、例えば米国特許公開第２００４０１５１７６６号に記載の通り、例えば、乾燥ポリペプチド−界面活性物質複合体を使用して本発明の組成物を製剤化し、この場合、界面活性物質は非共有結合により核酸と会合している。
【００９２】
一実施形態では、例えば米国特許第７，４１３，７３９号に記載の通り、本発明を実施するために使用する核酸をポリマーヒドロゲルまたは水溶性共重合体として細胞に適用することができる。例えば、核酸を強力な求核試薬と、コンジュゲートした不飽和結合またはコンジュゲートした不飽和基との間の求核付加による反応によって重合させることができ、ここで各前駆成分は、少なくとも２つの強力な求核試薬または少なくとも２つのコンジュゲートした不飽和結合もしくはコンジュゲートした不飽和基を含む。
【００９３】
一実施形態では、例えば、米国特許第７，３０６，７８３号；同第６，５８９，５０３号に記載の通り、細胞膜浸透性ペプチドコンジュゲートを伴うビヒクルを使用して核酸を細胞に適用する。一態様では、核酸自体を細胞膜浸透性ペプチドとコンジュゲートする。一実施形態では、核酸および／または送達ビヒクルを、例えば、高度に塩基性でありポリ−ホスホイノシチドに結合する輸送媒介ペプチドが記載されている米国特許第５，８４６，７４３号に記載の通り輸送媒介ペプチドとコンジュゲートする。
【００９４】
一実施形態では、電気による透過処理を、例えば、例えば米国特許第７，１０９，０３４号；同第６，２６１，８１５号；同第５，８７４，２６８号に記載の、例えば任意の電気穿孔系を使用してＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を細胞に送達するための主要なまたは補助的な手段として使用する。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の埋め込み
代替の実施形態では、本発明の方法は、本発明を実施するために使用するＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子を含むまたは発現する細胞、例えば、心臓細胞または心筋細胞を埋め込むまたは生着させるステップも含み、一態様では、本発明の方法は、ＡＣ６ｍｕｔコード核酸もしくは遺伝子（もしくはそれらを発現する細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで血管、組織もしくは器官、例えば、心臓もしくは心筋細胞に埋め込むもしくは生着させるステップ、または、再プログラミングされた分化細胞を、それを必要とする個体に埋め込むもしくは生着させるステップを含む。
【００９６】
本発明の組成物および／または方法を使用した処置を受けた個体から細胞を取り出し、任意の公知の技法またはプロトコールを使用して組織、器官中にまたは個体中に再挿入する（例えば、注射するまたは生着させる）ことができる。例えば、脱分化し再プログラミングされた細胞、幹細胞、または再プログラミングされた分化細胞を、例えば、例えば米国特許第７，４４２，３８９号に記載の通りミクロスフェアを使用して再度埋め込む（例えば、注射するまたは生着させる）ことができ、例えば、一態様では、細胞担体は、混合および送達系内にプレロードされた円形の滑らかなポリメチルメタクリレート微小粒子を含む増量剤ならびにこれらの細胞を含む自己由来の担体を含む。別の実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２００５００２７０７０号に記載の通り、細胞を組織、器官、例えば心臓に、かつ／またはそれを必要とする個体に、生体適合性の架橋結合したマトリックスに入れて再投与する。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の細胞（例えば、本発明の方法を実施することによって作製された細胞）を、例えば、例えば、ＡＣ６ｍｕｔを、一級アミノ基またはチオール基などの複数の求核基を含有するように改変されたポリエチレングリコールとコンジュゲートすることができるプロトコールが記載されている米国特許第６，９６９，４００号に記載の通り、例えば、その表面が生体適合性、非免疫原性コーティングされた合成埋没物の中に入れてまたはそれにより保護して、組織、器官および／またはそれを必要とする個体に再投与する（例えば、注射するまたは生着させる）。
【００９８】
一実施形態では、本発明の細胞（例えば、本発明の方法を実施することによって作製された細胞）を、例えば米国特許第７，４４２，３９０号；同第５，７３３，５４２号に記載されている移植方法を使用して組織、器官および／またはそれを必要とする個体に再投与する（例えば、注射するまたは生着させる）。
【００９９】
ポリペプチド、核酸および／または細胞を組織または器官（例えば、心筋細胞、心臓）に送達するための任意の方法を使用することができ、これらのプロトコールは、例えば、ポリペプチド、核酸および／または細胞の、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける心臓に対する、例えば、冠内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、および／または局所送達（心筋への直接注射）の使用が記載されている米国特許（ＵＳＰＮ）第７，５１４，４０１号に記載の通り、当技術分野で周知である。例えば、代替の実施形態では、肺中および血流中へのエアロゾル薬物粒子、遺伝子療法、持続注入、注射の繰り返しならびに／または持続放出ポリマーを、ポリペプチド、核酸および／または細胞を組織または器官（例えば、肺、腎臓、心臓）に送達するために使用することができる。代替の実施形態では、核酸および／または細胞は、カテーテルを通じて冠状動脈中に、または限定的な開胸術を介して直接注射によって左心房または心室の心筋層内に与えることもでき、心臓カテーテル留置の間に通したカテーテルを通じて心筋層に送達することもでき、心膜腔に送達することもできる。
【０１００】
代替の実施形態では、例えばＵＳＰＮ７，５０１，４８６に記載の通り、組織または器官（例えば、肺、腎臓、心臓）に対する、本発明を実施するために使用する核酸、または本発明を実施するために使用する核酸を含むベクター（例えば、アデノウイルス関連ウイルスもしくはベクター（ＡＡＶ）、またはアデノウイルス遺伝子療法ベクター）、または本発明の小胞、リポソーム、ナノ粒子もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）など。
【０１０１】
本発明を実施するために使用する組成物は、他の治療剤、例えば、血管新生剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗不整脈剤、腫瘍壊死因子阻害剤、エンドセリン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、カルシウムアンタゴニスト、抗生剤、抗ウイルス剤およびウイルスベクターと組み合わせて使用することができる。
【０１０２】
本発明を実施するために使用する組成物は、種々の心臓障害および心血管疾患、例えば、心臓障害および心血管疾患、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；結節性多発性動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、高安動脈炎、川崎病およびリケッチア性血管炎などの、自己免疫性およびウイルス性血管炎を含めた血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；先天性心疾患（ＣＨＤ）；虚血性心疾患およびアンギナ；後天性弁膜症／心内膜疾患；心筋炎を含めた原発性心筋疾患；不整脈；および移植片拒絶；うっ血性心筋症、肥大性心筋症および拘束型心筋症などの代謝性心筋疾患および心筋ミオパチー、ならびに／または心臓移植のいずれかを好転させるまたは処置するために使用することができる。
【０１０３】
キットおよび指示
本発明は、本発明の組成物および方法を含み、その使用のための指示を含むキットを提供する。そのように、本発明の細胞、送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなども提供され得る。
【０１０４】
例えば、代替の実施形態では、本発明は、（ａ）ＡＣ６ｍｕｔコード核酸、（ｂ）本発明の送達ビヒクル、ベクター、発現ベクター、組換えウイルスなど、（ｃ）本発明の液体または水性製剤、または（ｄ）本発明の小胞、リポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子を含む組成物を含むキットを提供する。一態様では、キットは、本発明の任意の方法、例えば、所望のＡＣ６ｍｕｔまたはＡＣ６ｍｕｔを発現する核酸、ベクターなどを心筋細胞に送達するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける方法を実施するための指示をさらに含む。
【０１０５】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに記載する；しかし、本発明はそのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
ｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣの送達により心機能が増大する
この実施例では、本発明の例示的な実施形態：心不全を処置するためにｃＡＭＰ−インコンピテントＡＣを心筋細胞に送達することの有効性が実証される。この研究では、本発明者らは、ＬＶにおけるｃＡＭＰ産生を減少させるＡＣ変異体分子が、Ｃａ２＋ハンドリングに対するその効果のみによって左心室（ＬＶ）機能に対する好都合な効果を有するかどうかを検討した。
【０１０７】
陽性変力物質の多くの臨床試験が失敗しており、現在はｃＡＭＰを増加させる薬剤は不全心臓に対して有害であることが自明である。代替戦略は、ｃＡＭＰに影響を及ぼさない薬剤を使用して心筋のＣａ２＋ハンドリングまたはＣａ２＋に対する筋フィラメント応答を変更させることである。左心室（ＬＶ）機能はアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性と密接に関連するが、ＡＣの有益な効果はｃＡＭＰには依存せず、その代わりにＣａ２＋ハンドリングに対する効果から生じる可能性がある。
【０１０８】
この研究では、本発明者らは、環状アデノシン一リン酸−インコンピテント（ｃＡＭＰ−インコンピテント）６型アデニリルシクラーゼ（ＡＣ６）ポリペプチド、いわゆる「ＡＣ６変異体」または「ＡＣ６ｍｕｔ」の心臓を対象とする発現を有するトランスジェニックマウスを生成した。これらのＡＣ６ｍｕｔトランスジェニックマウスの心筋細胞ではイソプロテレノールに応答したｃＡＭＰ産生が損なわれたが（７４％の低下；ｐ＜０．００１）、ＬＶのサイズおよび機能は正常であったことが示された。単離した心臓ではイソプロテレノール刺激に応答したＬＶ機能の保持が示された。ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って筋小胞体によるＣａ２＋の取り込みが増加し、ＳＥＲＣＡ２ａ活性化についてのＥＣ５０が低下した。ＡＣ６ｍｕｔマウスから単離した心筋細胞では、イソプロテレノールに応答したＣａ２＋トランジェントの振幅の増加が示された（ｐ＝０．０００１）。ＡＣ６ｍｕｔ発現には、ＬＶにおけるＳ１００Ａ１の発現の増加（ｐ＝０．０３）およびホスホランバンタンパク質の発現の減少（ｐ＝０．０１）も伴った。この研究では、ｃＡＭＰ生成が損なわれているにもかかわらず、ＬＶにおけるＡＣ変異体の発現に正常な心機能が伴うことが決定された。この機構は、ｃＡＭＰの減少にもかかわらず生じる効果であるＣａ２＋ハンドリングに対する効果によるようである。
【０１０９】
以前の研究からのデータにより、哺乳動物の心筋細胞で発現する優性ＡＣアイソフォームである心臓の６型ＡＣ（ＡＣ６）の増加［６］には不全左心室（ＬＶ）に対する不定形の有益な効果があることが示された［７］、［８］、［９］、［１０］、［１１］、［１２］。これらの予想外の有益な効果は、ベータ（β）アドレナリン作動性受容体（βＡＲ）刺激および細胞内ｃＡＭＰの上昇の心臓に対する悲惨な結果と一致するはずである［１３］、［１４］、［１５］、［１６］、［１７］、［１８］。実際に、不全心臓におけるＡＣ６発現の明らかな利益は逆説的なものである。以前の研究からのデータにより、薬理学的阻害剤を使用すると、心臓におけるＡＣ６発現の増加の有益な効果のいくつかはｃＡＭＰ生成の増加に依存するものではないことが示唆される［２］、［３］。培養した心筋細胞における薬理学的阻害を使用した研究の固有の限界が原因で、Ｍｇ２＋の結合を変更させるが、Ｇタンパク質のダイナミクスには影響を及ぼさないことが予測される変化である触媒コアの４２６位（４２６位：配列番号１６に基づく位置番号）におけるＡｓｐのＡｌａによる置換によって、本発明者らは、触媒として不活性なマウスＡＣ６変異体（ＡＣ６ｍｕｔ）分子を生成した［４］。このマウスＡＣ６ｍｕｔ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて研究した場合には、ｃＡＭＰ生成を著しく損なうが、ＡＣ６に関連する細胞分布パターンを保持する［４］。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究は、そのような分子がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて心機能にどのように影響し得るかを確立するには程遠いものである。
【０１１０】
したがって、本発明者らは、心臓を対象とするＡＣ６ｍｕｔの発現を有するトランスジェニックマウス系列を生成した。そのような系列により、インタクトな正常な心臓の機能に対するｃＡＭＰの効果とＣａ２＋ハンドリングの効果の区別に対するさらなる洞察がもたらされることが期待された。さらに、そのような研究により、ＡＣ６ｍｕｔによってｃＡＭＰの増加の潜在的な悪影響がない変力的刺激がもたらされるかどうかも示される可能性があった。本発明者らの仮説は、ｃＡＭＰ生成力の顕著な減少にもかかわらず、ＡＣ６によって付与されるＣａ２＋ハンドリングに対する有益な釣り合わせ効果によりＬＶ機能は正常なままであることであった。
【０１１１】
方法
ＡＣ６ｍｕｔトランスジェニックマウスの生成（図１Ａ）。動物の使用は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅガイドラインに従い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ＶＡ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍに認可されたものであった。心臓を対象とするＡＣ６ｍｕｔの発現を有するマウスを生成するために、Ｃ末端にＡＵ１タグを有するマウスＡＣ６ｍｕｔ  ｃＤＮＡ［４］をα−ミオシン重鎖プロモーターとＳＶ４０ポリＡの間にサブクローニングした。カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏのトランスジェニックマウス設備（近交系Ｃ５７ＢＬ／６）において行われた前核注射のために、発現カセットを含有する９．２ｋｂの断片を使用した。尾部先端から調製したゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってファウンダーマウスを同定した。
【０１１２】
ＡＣ６ｍｕｔ遺伝子を、α−ＭＨＣプロモーターと相同なプライマーを使用して検出した（フォワード：５’ＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＣ）（配列番号１）；リバースプライマーはＡＣ６領域についてのものであった（５’ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣ）（配列番号２）。
【０１１３】
以下のプライマーを使用してＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡを検出し、内因性ＡＣ６  ｍＲＮＡに対してＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡの倍数増加の定量を可能にした：（フォワード：５’ＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号３）；リバース：５’ＴＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣＴＣ）（配列番号４）。
【０１１４】
内因性ＡＣ６  ｍＲＮＡを、その３’非翻訳領域と相同なプライマーを使用して検出した（フォワード：５’ＧＧＣＡＴＴＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴ（配列番号５）；リバース：５’ＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡ）（配列番号６）。この３’非翻訳領域はＡＣ６ｍｕｔ  ｃＤＮＡには存在しないものであり、これにより内因性ＡＣ６の定量が可能になった。
【０１１５】
ファウンダー動物を同じ系統の野生型マウスと交雑し、選択された動物を心臓における導入遺伝子の発現の分析のために使用した。本発明者らは、本発明者らの研究に関して、独立した系列および選択された系列においてＡＣ６ｍｕｔタンパク質の発現が１７倍に増加するという（内因性ＡＣ６に対して）多様な導入遺伝子の発現を実証した。以前に記載の通り定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して２型〜９型のＡＣのＬＶにおける発現レベルを決定した［５］。
【０１１６】
心エコー検査。５％イソフルランを用いて麻酔を誘導し（酸素１Ｌ／分の流速）、酸素中１％イソフルランで維持した。以前に報告されている通り、１６Ｌ  ＭＨｚのリニアプローブおよびＳｏｎｏｓ  ５５００（登録商標）Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）を使用して画像を得た［７］。データを獲得し、群同一性に関する知見を用いずに解析した。
【０１１７】
単離した灌流心臓：ＬＶ収縮機能。以前に報告されている通り、反射活性化または麻酔に影響されない様式でＬＶ収縮機能を評価するために、単離した灌流心臓において心機能を評価した［７］。室内バルーンカテーテルを配置して等容性ＬＶ圧を測定した（ＬＶ拡張終期圧１０ｍｍＨｇ；１．７ｍＭのイオン化Ｃａ２＋）。イソプロテレノールをボーラス用量（０．１ｎＭから３００ｎＭまで）、５分間隔で送達し、ＬＶ圧を記録した。その後、ＬＶ圧の最初の導関数（ＬＶ  ｄＰ／ｄｔ）が得られ、これをＬＶ収縮機能の代用物として使用した。データを獲得し、群同一性に関する知見を用いずに解析した。
【０１１８】
カルシウムの取り込み。ＬＶホモジネートにおけるＡＴＰ依存性の筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋の取り込みの初速度を以前に記載の通り改変Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過技法によって測定した［１１］。
【０１１９】
カルシウムトランジェント。細胞質ゾルのカルシウムトランジェントを以前に記載の通りＩｎｄｏ−１を使用して測定した［１９］。心筋細胞を、ラミニンをコーティングしたカバーガラス上にプレーティングし、ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）および分散剤プルロニックＦ−１２７（０．０２ｍｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を３０分にわたってローディングした。色素をローディングした後、カバーガラスを表面灌流（ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）チャンバーに載せ、すすいで過剰なｉｎｄｏ−１／ＡＭを除去し、モノクロメータを介して励起波長を３６５ｎｍに設定したＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＮＪ）とインターフェースで接続した４０×対物レンズを備えるＮｉｋｏｎ  ＤＩＡＰＨＯＴ（商標）落射蛍光顕微鏡に載せた。蛍光発光を分割し、それぞれ４０５および４８５ｎｍに集中した２０ｎｍのバンドパスフィルタによって２つの光電子増倍管に導いた。Ｆ４０５／Ｆ４８５比は、［Ｃａ２＋］ｉについての測定基準を表す。これらの測定の間に、心筋細胞を、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を用いて表面灌流した。筋細胞を０．３Ｈｚで電界刺激した。イソプロテレノールにより刺激されたＣａ２＋トランジェントを、イソプロテレノール（１０μＭ）を緩衝液に添加することによって決定した。群当たり少なくとも３つの心臓について、心臓当たり少なくとも２０個の細胞からカルシウムトランジェントを記録した。拡張期および収縮期の細胞内Ｃａ２＋レベルを、それぞれサイクル毎の基底のＦ４０５／Ｆ４８５比および最大のＦ４０５／Ｆ４８５比から得た。
【０１２０】
心筋細胞単離。心筋細胞単離を以前に記載の通り実施した［４］。
【０１２１】
サイクリックＡＭＰ測定。単離した心筋細胞をイソプロテレノール（１０μＭ、１０分）または水溶性フォルスコリン類似体ＮＫＨ４７７（１０μＭ、１０分）で刺激し、次いで、溶解させた（２．５％臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８、および０．０２％ウシ血清アルブミン）。以前に報告されている通り、ｃＡＭＰ  ＢＩＯＴＲＡＫ（商標）酵素イムノアッセイ系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用してサイクリックＡＭＰを測定した［４］。
【０１２２】
ＰＫＡ活性アッセイ。単離した心筋細胞をイソプロテレノール（１０μＭ、１０分）またはＮＫＨ４７７（１０μＭ、１０分）で刺激した。心筋細胞を緩衝液Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのプロテアーゼ阻害剤カクテル）中にホモジナイズし、遠心分離した（１４，０００×ｇ、５分、４℃）。上清を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、ＰＫＡビオチン化ペプチド基質（ＳｉｇｎａＴＥＣＴ（登録商標）（ＳＩＧＮＡＴＥＣＴ（登録商標））ｃＡＭＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））と一緒にインキュベートした。ストレプトアビジンマトリックスを用いて３２Ｐ標識したビオチン化基質を回収し、ＰＫＡの特異的活性を決定した。
【０１２３】
心筋細胞におけるリアノジン受容体−２、ＰＬＢ、およびトロポニンＩのイソプロテレノールにより刺激されたリン酸化。本発明者らは、重要なＣａ２＋調節タンパク質の動的リン酸化を決定するために、各群から単離した心筋細胞の培養物におけるＲｙＲ２、ＰＬＢおよびＴｎＩの基底のリン酸化およびイソプロテレノールにより刺激されたリン酸化の研究を行った（図２Ｃ）。これらの研究では培養した心筋細胞（ウェル当たり細胞１００，０００個）を使用し、イソプロテレノール（１０μＭ、１０分）と一緒にインキュベートする前およびその後に免疫ブロッティングを実施した。細胞を溶解緩衝液：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％トリトン、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌのロイペプチン）中に溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質の濃度を測定した。免疫ブロットをＧＡＰＤＨに対して正規化し、比較した（図２Ｄ）。
【０１２４】
ＰＤＥ活性アッセイ。Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ）を使用してホスホジエステラーゼ活性をアッセイした。ＬＶ組織を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの活性化オルトバナジン酸塩、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する緩衝液中にホモジナイズし、微量遠心機中、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した（１０分）。組織ホモジネートを、Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｒｅｓｉｎ（Ｅｎｚｏ）を使用したゲル濾過によって脱塩した。タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）２０μｇを各ウェルに加え、ＰＤＥ活性を測定した。
【０１２５】
免疫蛍光法。単離した心筋細胞をラミニンコーティングした２ウェルチャンバースライドに１時間にわたって付着させ、洗浄し、固定し（１０％ホルマリン、１５分、２３℃）、正常ヤギ血清を用いてブロッキングし（１時間）、抗ＡＵ１抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、１：３００；ＡＣ６ｍｕｔ導入遺伝子タンパク質を検出するため）；抗Ｃａｖ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、１：１００；カベオラを検出するため）；抗ＰＤＩ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００；ＳＲを検出するため）；抗ラミンＡ（Ａｂｃａｍ、１：２００；核エンベロープを検出するため）；抗ＣＲＥＭ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：５０）；または抗ホスホ−ＣＲＥＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、１：１００）と一緒にインキュベートした（４℃、一晩）。心筋細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、二次抗体（Ａｌｅｘｉａ  Ｆｌｕｏ  ４８８または５９４コンジュゲート、１：１０００希釈）と一緒に１時間インキュベートした。核を同定するために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ色素と一緒にインキュベートした（１：１０００希釈、２０分）。次いで、心筋細胞を以前に記載の通り画像化した［２］。
【０１２６】
ｍＲＮＡの検出および免疫ブロッティング。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用してｍＲＮＡを定量し、免疫ブロッティングを使用してタンパク質含有量を定量した［４］。ＲｙＲ２に対するプライマーを含めた（フォワード：５’ＡＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧ）（配列番号７）；および（リバース：５’ＧＡＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＴ）（配列番号８）。
【０１２７】
本発明者らは、抗ＡＣ５／６抗体を使用して内因性ＡＣ６およびＡＣ６ｍｕｔを同定した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：２００希釈）。ＡＣ５／６抗体に対するエピトープはＡＣ６およびＡＣ６ｍｕｔのＣ末端にある（配列：ＫＧＹＱＬＥＣＲＧＶＶＫＶＫＧＫＧＥＭＴＴＹＦＬＮＧＧＰＳＳ（配列番号９）；タンパク質受託番号Ｏ４３３０６およびＱ０１２３４）。本発明者らは、ＡＵ１抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、１：２，０００）を使用してＡＣ６ｍｕｔタンパク質を検出した。使用した追加的な抗体には：カルレティキュリン（ＡＢＲ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ、１：１，０００）；カルセケストリン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：１，０００）；ＧＡＰＤＨ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、１：２０，０００）；ＰＤＥ３Ａ（Ａｄｖａｍ）；ＰＫＡ触媒サブユニット（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、１：１，０００）；ｐ−ＰＫＡ触媒サブユニット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１，０００）；ＰＫＡ−ＲＩＩαおよびＰＫＡ−ＲＩＩβ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、１：１，０００）；ホスホ−ＰＫＡ−ＲＩＩα（Ｓ９６）およびホスホ−ＰＫＡ−ＲＩＩβ（Ｓ１１４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：２００）；ＰＫＣα触媒サブユニット（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：２００）；ＰＬＢ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、１：５，０００）；ホスホＳ１６−ＰＬＢ（Ｂａｄｒｉｌｌａ、１：３，０００希釈）；ホスホ−ＲｙＲ２（Ｓ２８０８）（Ａｂｃａｍ、１：１，０００）；Ｓ１００Ａ１（Ｅｐｉｙｏｍｉｃｓ、１：１，０００）；ＳＥＲＣＡ２ａ（Ｅｎｚｏ、１：１，０００）；トロポニンＩおよびホスホ−ＴｎＩ（Ｓ２２／２３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、それぞれ１：１，０００）が含まれた。
【０１２８】
統計解析。データは平均±ＳＥを示す；ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定、または、適切な場合には、スチューデントのｔ検定（対応のない、両側）のいずれかを使用して群間の差異を統計的有意性について検定した。ｐ＜０．０５の場合に帰無仮説を棄却した。
【０１２９】
結果
ＡＣ６ｍｕｔトランスジェニックマウス。ＡＣ６ｍｕｔマウスは、それらの導入遺伝子陰性同胞とは物理的に区別できなかった。成体マウスの剖検により、体重、脛骨の長さ、ＬＶの重量、および肺の重量に群間の差異は示されなかったことが示された（表１）。
【０１３０】
ＬＶにおけるＡＣ６ｍｕｔの発現。内因性ＡＣ６のレベルに対してＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡは６２倍増加し、タンパク質は１７倍増加し、これは、内因性ＡＣ６と導入遺伝子ＡＣ６ｍｕｔの両方に共通の領域に対するプライマーおよび抗体をＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロッティングにおいて使用して検出した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【０１３１】
内因性ＡＣ型のＬＶにおける発現。内因性ＡＣ２型〜９型のｍＲＮＡに群間の差異は示されなかった（データは示していない）。
【０１３２】
ＬＶにおけるｃＡＭＰ産生。ＡＣ６ｍｕｔマウス由来のＬＶ試料では、イソプロテレノール（７４％の低下；ｐ＜０．００１）または水溶性フォルスコリン類似体であるＮＫＨ４７７（５２％の低下；ｐ＝０．０５）を用いて刺激した場合にｃＡＭＰ産生の減少が示された（図１Ｄ）；基底のｃＡＭＰ産生は変化しなかった。したがって、トランスジェニック系列は、ＡＣ６ｍｕｔ発現の増加の存在下、βＡＲにより刺激されるｃＡＭＰ産生の減少の、ＬＶ機能に対する全体的な効果を試験するために適したものであった。
【０１３３】
ＰＫＡ活性および発現。ＡＣ６ｍｕｔマウスから単離した心筋細胞では、基底のＰＫＡ活性の４８％の低下が示された（ｐ＝０．０１）。さらに、イソプロテレノールにより刺激されたＰＫＡ活性の低下（３８％の低下；ｐ＝０．００６）；およびＮＫＨ４７７により刺激されたＰＫＡ活性の低下（３８％の低下；ｐ＝０．００１）が見られた（図２Ａ、上）。ＡＣ６ｍｕｔ発現により、ＰＫＡ触媒サブユニットのＬＶにおける発現（図２Ａ、下）も、ＰＫＡ−ＲＩＩ−αおよびβの発現、リン酸化も（ホスホ−ＰＫＡ−ＲＩＩα：ＡＣ６ｍｕｔ、０．３２±０．０４ｄｕ；Ｃｏｎ、０．３０±０．０３ｄｕ、ｐ＝０．７；ホスホ−ＰＫＡ−ＲＩＩβ：ＡＣ６ｍｕｔ、７．１±１．１ｄｕ；Ｃｏｎ、１０．６±０１．４ｄｕ；ｐ＝０．０９；図２Ｂ）変更されなかった。ＰＫＣ触媒サブユニットの発現にも群間の差異は示されなかった（ＰＫＣα：ＡＣ６ｍｕｔ、０．８±０．１ｄｕ；Ｃｏｎ、０．７±０．１ｄｕ、ｐ＝０．４；図２Ｂ）。
【０１３４】
心筋細胞におけるリアノジン受容体−２、ＰＬＢおよびトロポニンＩのイソプロテレノールにより刺激されるリン酸化。ＲｙＲ２、ＰＬＢおよびＴｎＩの基底のリン酸化に群間の差異は示されなかった（Ｐ−ＲｙＲ２：ＡＣ６ｍｕｔ、４．４±０．６対Ｃｏｎ、２．４±０．５ｄｕ、ｐ＝０．０６；Ｐ−ＰＬＢ：ＡＣ６ｍｕｔ、０．３±０．０３対Ｃｏｎ、０．２±０．１ｄｕ、ｐ＝０．８；Ｐ−ＴｎＩ：ＡＣ６ｍｕｔ、０．８±０．２対Ｃｏｎ、１．０±０．０１ｄｕ、ｐ＝０．２４、図２Ｃ）。両群でイソプロテレノール刺激に伴ってＲｙＲ２、ＰＬＢ、およびＴｎＩのリン酸化が増加したが（無刺激に対して）、リン酸化の程度は、一般にＡＣ６ｍｕｔマウス由来のＬＶにおいて高かった（Ｐ−ＲｙＲ２：ＡＣ６ｍｕｔ、３０．０±１．１対Ｃｏｎ、７．４±１．１ｄｕ、ｐ＝０．００１；Ｐ−ＰＬＢ：ＡＣ６ｍｕｔ、１６．８±２．４対Ｃｏｎ、５．３±０．１ｄｕ、ｐ＝０．０１；Ｐ−ＴｎＩ：ＡＣ６ｍｕｔ、５．８±１．４対Ｃｏｎ、２．２±０．７ｄｕ、ｐ＝０．０７；図２Ｃ）。ＴｎＩタンパク質の発現は群間で異ならなかった（ＡＣ６ｍｕｔ、０．９±０．１対Ｃｏｎ、０．７±０．２ｄｕ；ｐ＝０．５；図２Ｂ。ＲｙＲ２  ｍＲＮＡの発現に群間の差異は示されなかった。
【０１３５】
ＰＤＥ活性およびＰＤＥ３Ａ発現。ＬＶ試料におけるＰＤＥ活性に群間の差異はなかった（ＡＣ６ｍｕｔ：１２５２±２３単位／ｍｇ、ｎ＝７；対照；１２９３±３９単位／ｍｇ、ｎ＝６；ｐ＝０．３８）。ＬＶにおけるＰＤＥ３Ａタンパク質の発現に群間の差異は示されなかった（ＡＣ６ｍｕｔ：０．３±０．１対Ｃｏｎ、０．４±０．１ｄｕ、ｐ＝０．６、図２Ｂ）。
【０１３６】
ＡＣ６ｍｕｔの細胞内分布。ＡＣ６ｍｕｔタンパク質をカベオラ（主に原形質膜に関連する）、ＳＲ、および核エンベロープに関連して同定した（図１Ｅ）。
【０１３７】
心エコー検査。心エコー検査により、基底の心臓の構造および機能は心臓を対象とするＡＣ６ｍｕｔの発現によって変化しないことが示された。ＬＶの寸法は群間で異ならず、基底のＬＶ駆出率および周辺の線維の短縮の速度は同様であった（表２）。したがって、ＡＣ６ｍｕｔマウスではＬＶにおけるｃＡＭＰ生成力の顕著な低下にもかかわらず、ＬＶの構造および基底の機能は変更されなかった。
【０１３８】
イソプロテレノールに応答したＬＶ収縮機能。自律神経の影響、内因性カテコールアミン、および麻酔に依存しない様式での心臓の収縮性を評価するために、単離した灌流心臓におけるＬＶ圧の発生を測定した。ＬＶにおけるｃＡＭＰ生成力の顕著な低下にもかかわらず、基底ＬＶ  ｄＰ／ｄｔおよびイソプロテレノールで刺激したＬＶ  ｄＰ／ｄｔに群間の差異は示されなかった（図３）。
【０１３９】
Ｃａ２＋の取り込みおよびＣａ２＋関連タンパク質。ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび導入遺伝子陰性同胞対照マウス由来のプールしたＬＶホモジネートにおけるＡＴＰ依存性のＳＲによるＣａ２＋の取り込み速度を決定した。ＡＣ６ｍｕｔ発現の増加に伴ってＳＲによるＣａ２＋の取り込みが増加した（図４Ａ、上のパネル）。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋に対する親和性の増加は、最大半量効果に必要なＣａ２＋濃度の低下に反映された（ＥＣ５０：ＡＣ６ｍｕｔ  １．１μｍｏｌ／Ｌ；対照３．７μｍｏｌ／Ｌ、ｎ＝６、図４Ａ、下のパネル）。
【０１４０】
Ｃａ２＋ハンドリングにおけるこれらの生理的変化に伴って、ＳＲによるＣａ２＋の取り込みを調節するタンパク質のＬＶにおける発現が変更された。例えば、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、ＬＶにおけるＰＬＢタンパク質の発現が４３％低下し（ｐ＝０．０１）、ＬＶにおけるＳ１００Ａ１タンパク質含有量が７３％増加した（ｐ＝０．０３）（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＬＶ  ＳＥＲＣＡ２ａ、カルレティキュリン、およびカルセケストリンの含有量は変化せず、Ｓｅｒ１６におけるＰＬＢリン酸化は変化しなかった（図４Ｄ）。
【０１４１】
転写因子。ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、ＣＲＥＭ−１のＬＶにおける発現が２倍増加し（ｐ＝０．０３、図４Ｂ）、Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢのリン酸化が１．７倍増加した（ｐ＝０．０１、図４Ｃ）。総ＣＲＥＢタンパク質含有量は変更されなかった。核においてＣＲＥＭ−１およびホスホ−ＣＲＥＢが増加したかどうかを決定するために、単離した心筋細胞の免疫蛍光染色を、抗ＣＲＥＭ−１抗体および抗ホスホ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３）抗体を使用して実施した。本発明者らは、ＡＣ６ｍｕｔマウスにおいてＣＲＥＭ−１およびホスホ−ＣＲＥＢの核への局在化の増加を検出した（図４Ｅ）。
【０１４２】
カルシウムトランジェント：ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴うＳＲによるＣａ２＋の取り込みの増加が細胞質ゾルの［Ｃａ２＋］ｉに影響を及ぼすかどうかを決定するために、心筋細胞リアルタイム［Ｃａ２＋］ｉを、レシオメトリック色素Ｉｎｄｏ−１を使用して評価した。収縮の間の基底のＣａ２＋放出は変化しなかった（図５Ａ）。しかし、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、イソプロテレノール刺激後のピーク収縮期Ｃａ２＋トランジェント振幅が増加し（ｐ＝０．０００１、図５Ｂおよび５Ｃ）、ピーク振幅までの時間が短くなった（ｐ＝０．０３、図５Ｄ）。さらに、ＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では５０％弛緩までの時間（ｔａｕ）が短くなった（ｐ＝０．０４）（図５Ｅ）。したがって、ＳＥＲＣＡ２ａ活性、ＰＬＢおよびＳ１００Ａ１の発現、ならびにイソプロテレノールにより刺激されるＣａ２＋トランジェントの全てが、ＡＣ６ｍｕｔ発現により、ＬＶ機能に好都合に影響を及ぼす様式で変更された。
【０１４３】
考察
この研究の最も驚くべき重要な知見は、βＡＲにより刺激されるｃＡＭＰ産生を著しく損なう変異体ＡＣ６分子の心臓を対象とする発現に伴ってイソプロテレノール刺激に応答したＬＶ機能が保持されることである。これは心エコー検査および単離した灌流心臓における収縮機能の研究によって確認された。他の状況では心臓におけるｃＡＭＰ生成の顕著な減少に比例してＬＶ収縮機能が低下する。例えば、ｃＡＭＰの損失が一般に５０％低下する心不全の大多数のモデルでは、ＬＶ  ｄＰ／ｄｔおよびβＡＲ応答性が同様に低下する［１０］、［１１］、［１２］、［１３］、［１４］。さらに、ｃＡＭＰ生成力の６０％の低下が伴うＡＣ６の欠失には、ＬＶ収縮機能の同様の低下も伴った［５］。それでは何によってイソプロテレノールで刺激したＬＶ収縮機能の保持が説明されるだろうか。
【０１４４】
ＡＣ６ｍｕｔ系列において、ｃＡＭＰ生成が著しく損なわれているにもかかわらずＬＶ機能が保持されることに関する最も近い機構は、Ｃａ２＋ハンドリングの好都合な変化であった。本発明者らは、ＡＣ６の心臓を対象とする発現により不全心臓の機能が増大するが、ＡＣ６のβＡＲシグナル伝達に対する影響が著しいので、これらの有益な効果がＣａ２＋ハンドリングに対するβＡＲシグナル伝達自体の増強を反映する程度を決定することは不可能であることを以前報告した［１０］、［１１］。ＡＣ６欠失にはＣａ２＋ハンドリングに対して著しい有害作用があるが［５］、ＡＣ６欠失後にはｃＡＭＰ生成力が低下したので、ＡＣ６のＣａ２＋ハンドリングに対する独立した影響を確認するのは難しかったという知見により、ＡＣ６とＣａ２＋ハンドリングの関連が裏付けられる。しかし、ＴＧマウスにおいて、ＡＣ６変異体分子がＣａ２＋ハンドリングに対する親分子の好都合な効果を模倣し、それにより、たとえｃＡＭＰ生成力が著しく減弱していてもＬＶ機能が保持されるようであることが本研究で新たに実証される。Ｃａ２＋ハンドリングに対するＡＣ６の影響は、ｃＡＭＰ生成を必要とせず、したがって、代替機構によって生じるに違いないことは明らかである。
【０１４５】
本発明者らは、ＡＣ６ｍｕｔ発現にＬＶホモジネートにおけるＳＲによるＣａ２＋の取り込みの増加およびインタクトな心筋細胞における弛緩時間の短縮を伴うＣａ２＋トランジェントの上昇が伴うことを見出した。これらの生理的に好都合なＡＣ６ｍｕｔ発現の効果に伴って、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を阻害するＣａ２＋調節物質であるＰＬＢの発現が減少した。ＰＬＢ含有量の減少またはＳｅｒ１６におけるＰＬＢリン酸化の増加に伴って、その阻害効果が低下し、それによりＳＥＲＣＡ２ａ活性が増加する［２０］、［２１］、［２２］。本発明者らは、ＡＣ６またはＡＣ６ｍｕｔを発現する培養した心筋細胞ではＰＬＢ発現が減少することを以前に見いだしたが［４］、本研究はこの効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも認められることを最初に実証するものである（図４Ｂ）。ＡＣ６ｍｕｔマウスから単離した心筋細胞におけるＲｙＲ２、ＰＬＢ、およびより少ない程度に、ＴｎＩのイソプロテレノールにより刺激されるリン酸化の程度の上昇（図２Ｃ）により、ＬＶ収縮機能も増加することが予測される。
【０１４６】
ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーの転写抑制因子であるＣＲＥＭ−１の発現および核移行が増加した（図３Ｂおよび３Ｅ）［２３］。本発明者らは、ＡＣ６発現の状況で、新生児ラット心筋細胞におけるＡＴＦ３の増加により、ＰＬＢプロモーターのＣＲＥ部位を通じてＰＬＢプロモーターが負に調節されることを以前に同定した［２］。本発明者らは、本研究では、ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴うＡＴＦ３発現の増加を認めなかった。しかし、ＡＴＦ３とＣＲＥＭ−１はどちらも同じＣＲＥ部位を認識し、したがって、ＣＲＥＭ−１のＡＣ６ｍｕｔに関連する増加がＰＬＢ発現の減少において機構的に重要であり得ることはもっともらしい。これにはさらなる研究が必要である。
【０１４７】
ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、ＲｙＲ２およびＳＥＲＣＡ２ａを調整することによって収縮機能を増加させるＣａ２＋感受性タンパク質であるＳ１００Ａ１のＬＶにおける発現が予期せず増加した［２４］。ＡＣ６ｍｕｔ発現がＬＶにおけるＳ１００Ａ１発現の増加にどのように関連し得るのだろうか。ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴って、ＣＲＥＢ活性化に必要なプロセスであるＣＲＥＢのリン酸化および核移行が増加した（図４Ｃおよび４Ｅ）。ＣＲＥＢは、多くの遺伝子を、それらのプロモーターのＣＲＥ部位（複数可）を通じて調節する転写活性化因子である［２５］。Ｓ１００Ａ１プロモーターはＣＲＥ部位を有し［２６］、これは、Ｓ１００Ａ１発現がＡＣ６ｍｕｔ発現によって活性化され得たことが妥当であることを示している。さらに、ＰＫＡおよびｃＡＭＰの区画化も因子になり得る［２７］、［２８］。
【０１４８】
Ｃａ２＋ハンドリングの実質的な改善により、ｃＡＭＰ生成の顕著な減少にもかかわらずＬＶ機能が保持されたようである。ＡＣ６ｍｕｔの量の増加が転写調節ならびに最終的に心筋細胞の生理的挙動およびＬＶ機能に影響を及ぼす正確な経路に関してはさらなる研究が必要である。組織学的研究（図１Ｅ）により、相当量の導入遺伝子ＡＣ６ｍｕｔが原形質膜だけではなく複数の細胞内区画に存在することが確認される。これにより、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質が、細胞内シグナル伝達に影響を及ぼし、それにより生理機能に影響を及ぼす重要な細胞内のタンパク質と相互作用することが可能になる。
【０１４９】
Ｃａ２＋ハンドリングに対するＡＣ６の重要性が最近ＡＣ６欠失によって強調された［５］。この状況では、本研究におけるものほどではないとはいえｃＡＭＰ生成力が低下したが、Ｃａ２＋ハンドリングが著しく損なわれた。本研究では、本発明者らは、ｃＡＭＰ生成がより顕著に損なわれるが、Ｃａ２＋ハンドリングが低下するのではなく増加することを認めている。これは、ＡＣ６欠失とは異なり、ｃＡＭＰ生成力が欠損しているとはいえＡＣ６分子がＣａ２＋ハンドリングに影響を及ぼし得る細胞質内に存在するからである。
【０１５０】
本発明者らは、生理学的効果がＡＣ６ｍｕｔ発現のレベルに比例するかどうかを決定するための、ＡＣ６ｍｕｔの発現量が減少しているトランスジェニック系列の調査は行わなかった。ＡＣ６ｍｕｔタンパク質の１７倍の増加（内因性ＡＣ６に対して）が非特異的な様式でシグナル伝達に影響を及ぼす可能性があることを示すことができる。本発明者らのデータではこの可能性を無視することができないが、内因性ＡＣ６が、存在量が非常に少ないタンパク質である−例えばＧｓαのおよそ１００分の１の存在量であることを認識することが重要である［２９］。したがって、内因性ＡＣ６よりも１７倍高いレベルで発現したとしても、なおＧｓαよりも相当に少ない存在量である。さらに、触媒として活性な（正常な）ＡＣ６の同様の増加に伴って、動員可能なｃＡＭＰ産生が顕著に増加する［３０］。これらの観察結果により、この知見が特異的なものであることが示唆される。
【０１５１】
結論。Ｃａ２＋ハンドリングの実質的な改善により、ｃＡＭＰ生成の顕著な減少にもかかわらずＬＶ機能が保持されるようである。免疫蛍光法により、ＡＣ６ｍｕｔが核エンベロープ上に位置し、それによりＡＣ６ｍｕが転写因子の発現および機能に影響を及ぼす機会がもたらされることが示される。転写抑制因子であるＣＲＥＭ−１の増加およびホスホ−ＣＲＥＢの増加（図４Ｅ）がそれぞれＰＬＢおよびＳ１００Ａ１の発現の変更に関与し得る。本発明者らは、ＡＣ６ｍｕｔにより、ｃＡＭＰ生成の減少にもかかわらず、Ｃａ２＋ハンドリングが増加し、タンパク質の発現が変更されることによって心機能が保持されると結論づける。これらの結果により、ＬＶ機能に対するＣａ２＋ハンドリングとβＡＲシグナル伝達の間の相互作用に関する洞察がもたらされ、ＡＣ６ｍｕｔにより、ｃＡＭＰの増加の潜在的な悪影響のない変力的刺激がもたらされ得ることが示される。データにより、心筋細胞アポトーシスの減少に伴って不全心臓においてＡＣ６ｍｕｔが発現することが示され、これは本発明者らの研究室で進行中の研究の焦点である。
【０１５２】
図の説明文
【０１５３】
図１．ＡＣ６ｍｕｔの設計、発現、活性および細胞分布
Ａ．この図には、ＡＣ６ｍｕｔの構築における、Ｃ１ドメイン（細胞内ループ）の４２６位（配列番号１６に基づく位置番号）におけるアスパラギン酸（ａｓｐ）のアラニン（ａｌａ）による置換の部位が示されている。この置換により、Ｍｇ２＋の結合が阻害され、触媒コアのＧｓα媒介性活性化の効率が変更され、これによりＡＣ６の酵素活性が損なわれ、その結果、ｃＡＭＰ産生が減少する。Ｍ１およびＭ２はＡＣ６の膜貫通ドメインであり、Ｃ１およびＣ２は、触媒コアを形成するＡＣ６の細胞質ドメインであり、βＡＲはβ−アドレナリン作動性受容体であり、βＹおよびαは、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）結合性タンパク質、Ｇｓの成分である。
Ｂ．ＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡの発現を内因性ＡＣ６と導入遺伝子ＡＣ６ｍｕｔに共通のプライマーを使用したｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出するためのプライマーをｑＲＴ−ＰＣＲ反応の内部対照として使用した。ＡＣ６ｍｕｔ  ｍＲＮＡは内因性ＡＣ６に対して６２倍増加した。棒中の動物数＋ＳＥ；スチューデントのｔ検定、対応のない、両側。
Ｃ．抗ＡＣ５／６抗体を使用した免疫ブロッティングでＡＣ６ｍｕｔタンパク質を検出し、抗ＡＵ１タグ抗体を使用して確認した。ＡＣ６ｍｕｔタンパク質は内因性ＡＣ６に対して１７倍増加した。
Ｄ．ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における、イソプロテレノール（Ｉｓｏ；１０μＭ、１０分）またはＮＫＨ４７７（ＮＫＨ；１０μＭ、１０分）を用いた刺激前（基底）および刺激後のサイクリックＡＭＰ産生；ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイ。ＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞（Ｍ対Ｃ、対照）ではＩｓｏおよびフォルスコリン類似体であるＮＫＨ４７７に応答したｃＡＭＰ産生が損なわれたことが示された。棒は平均＋ＳＥを示す；一元配置ＡＮＯＶＡ、続くボンフェローニの事後検定からのｐ値（ｎ＝６、各群）。
Ｅ．抗ＡＵ１抗体（赤色）；抗カベオリン３（Ｃａｖ−３）抗体（緑色、カベオラについて）；抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）抗体（緑色、筋小胞体について）；抗ラミンＡ抗体（緑色、核エンベロープについて）、および抗電位依存性アニオン選択チャネルタンパク質（ＶＤＡＣ）抗体（緑色、ミトコンドリアについて）を使用した、ＡＣ６ｍｕｔマウスから単離した心筋細胞と、対照マウスから単離した心筋細胞におけるＡＣ６ｍｕｔタンパク質の２重免疫蛍光染色。核は青色である。ＡＣ６ｍｕｔ導入遺伝子はカベオラ、ＳＲ、および核エンベロープにおいて検出されたが、ミトコンドリアに関連しなかった。
【０１５４】
図２．ＰＫＡ、ＰＫＳおよびＰＤＥの活性および発現
Ａ．上のグラフ：刺激していない（基底）またはイソプロテレノール（Ｉｓｏ；１０μＭ、１０分）もしくはＮＫＨ４７７（ＮＫＨ；１０μＭ、１０分）を用いて刺激した、単離した心筋細胞におけるＰＫＡ活性。ＡＣ６ｍｕｔ発現により、基底のＰＫＡ活性が低下し（ｐ＝０．０１）、Ｉｓｏ活性（ｐ＝０．００１）とＮＫＨ活性（ｐ＝０．００１）の両方も低下した（ｎ＝３、各群）。
下のゲル：ＬＶホモジネート中のＰＫＡタンパク質。ＬＶにおけるＰＫＡ触媒サブユニットタンパク質の発現はＡＣ６ｍｕｔ発現によって変更されなかった。
Ｂ．ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウス由来の左心室ホモジネートを使用した免疫ブロットにおいて、重要なシグナル伝達タンパク質の発現およびそれらのリン酸化が示されている。群間の差異は観察されなかった。ホスホ（Ｐ）および総（Ｔ）ＰＫＡ調節性サブユニットＩＩ−αおよびＩＩ−β、ＰＫＣα、ホスホジエステラーゼ３Ａ型（ＰＤＥ３Ａ）、ホスホトロポニンＩ（Ｐ２２／２３−ＴｎＩ）、および総ＴｎＩが示されている。
Ｃ．イソプロテレノール刺激の前後のＲｙＲ２、ＰＬＢおよびＴｎＩのリン酸化を各群から単離した心筋細胞の培養物において評価した。ＲｙＲ２、ＰＬＢおよびＴｎＩの基底のリン酸化に群間の差異は示されなかった。イソプロテレノール刺激に伴って両群でＲｙＲ２、ＰＬＢ、およびＴｎＩのリン酸化が増加したが、ＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞の方が広範囲にわたった（図２Ｃ）。
Ｄ．ＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞においてイソプロテレノール刺激に伴ってＲｙＲ２、ＰＬＢ、およびＴｎＩのリン酸化が増加したことを示す図２Ｃからのデータがローディング（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化したグラフ形式で示されている。ＴｎＩリン酸化の増加は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０７）。
【０１５５】
図３．左心室収縮機能
ＡＣ６ｍｕｔ  ＴＧマウスから単離した心臓（黒塗りの丸；ｎ＝１１）では、広範囲のイソプロテレノール用量によるイソプロテレノール刺激に応答してＬＶ  ｄＰ／ｄｔの保持が示された。データを獲得し、群同一性に関する知見を用いずに解析した。白抜きの丸、導入遺伝子陰性対照マウス（ｎ＝１２）。群間の差異はなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ）。データ点は平均±ＳＥを示す。
【０１５６】
図４．ＳＲによるＣａ２＋の取り込み、Ｃａ２＋シグナル伝達タンパク質、および転写因子
Ａ．上：ＡＣ６ｍｕｔマウスおよびＴＧ陰性同胞対照マウス由来のプールしたＬＶ試料におけるＣａ２＋の取り込み活性（ｎ＝６、両群）
下：ＡＣ６ｍｕｔの発現により、Ｃａ２＋に対するＳＥＲＣＡ２ａの親和性が低下した。５０％最大効果（ＥＣ５０）のためのＣａ２＋の有効濃度を、異なる遊離のＣａ２＋濃度における最初のＡＴＰ依存性のＣａ２＋の取り込み速度から算出した。
Ｂ．上：ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるホスホランバン（ＰＬＢ）発現が減少した。
下：ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＣＲＥＭ−１タンパク質の発現が増加した。
Ｃ．上：ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＳ１００Ａ１タンパク質の発現が増加した。
下：ＡＣ６ｍｕｔ発現に伴ってＬＶにおけるＰ１３３−ＣＲＥＢタンパク質の発現が増加した。総ＣＲＥＢ発現は両群で同様であった。
Ｄ．ＡＣ６ｍｕｔ発現は、ＳＥＲＣＡ２ａ、カルレティキュリン、カルセケストリンまたはホスホ−Ｓ１６−ＰＬＢタンパク質のＬＶにおける発現に影響を及ぼさなかった（ｎ＝４、両群）。
Ｅ．ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における抗ＡＵ１抗体（赤色）および抗ＣＲＥＭ−１抗体（緑色）または抗ＡＵ１および抗ホスホ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３、緑色）を使用した、ＡＣ６ｍｕｔタンパク質の２重免疫蛍光染色。核は青色で示された。ＡＣ６ｍｕｔ発現により、ＣＲＥＭ−１およびホスホ−ＣＲＥＢの核への局在化が増加した。
グラフ（Ａ、Ｂ、Ｃ）中、棒は平均＋ＳＥを示し、棒の中の数字は群のサイズを示し、棒の上の数字（ｍｅｍｂｅｒ）はスチューデントのｔ検定（対応のない、両側）からのｐ値を示す。
【０１５７】
図５．ＡＣ６ｍｕｔマウスおよび対照マウスから単離した心筋細胞における細胞質ゾルのＣａ２＋トランジェント
Ａ．放出された基底のＣａ２＋（収縮期Ｃａ２＋−拡張期Ｃａ２＋）に群間の差異は示されなかった。
Ｂ．イソプロテレノール（Ｉｓｏ；１０μＭ）を用いて刺激した心筋細胞における代表的なＩｎｄｏ−１  Ｃａ２＋トランジェント記録はＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞の方が高かった。要約データがパネルＣに示されている。
Ｃ．イソプロテレノールの存在下で放出されるＣａ２＋がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では増加した。
Ｄ．イソプロテレノールの存在下でのピークＣａ２＋トランジェントまでの時間がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では短くなった。
Ｅ．イソプロテレノールの存在下での５０％弛緩までの時間（ｔａｕ）がＡＣ６ｍｕｔマウス由来の心筋細胞では短くなった。
実験を４回繰り返した。棒は平均＋ＳＥを示し、棒の中の数字は心筋細胞の数を示し、棒の上の数はスチューデントのｔ検定（対応のない、両側）からのｐ値を示す。
【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【０１５８】
【表１】
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【表２】
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【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態が以下の特許請求の範囲の範囲内に入る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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