(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、前記組換え細胞が、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有し、前記性能指標値は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ（配列番号９３）を発現する対応する細胞に対する単位活性として計算される、組換え細胞。
【請求項２】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有し、前記性能指標値は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ（配列番号９３）に対する単位活性として計算される、組換え細胞。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも８５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、前記組換え細胞が、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有し、前記性能指標値は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ（配列番号９３）を発現する対応する細胞に対する単位活性として計算される、組換え細胞。
【請求項５】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも８５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有し、前記性能指標値は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ（配列番号９３）に対する単位活性として計算される、組換え細胞。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号３２、又は配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる、請求項４又は５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記組換え細胞を適切な培地中で培養するステップが、エリスロース−４−リン酸の細胞内量、グリセルアルデヒド−３−リン酸の細胞内量、またはリン酸の細胞内量の１つまたは複数を増大させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８】
ホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる、または（ｂ）フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９】
完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えばＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
イソプレンを産生できる組換え細胞であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え細胞が、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が、（ａ）イソプレン収率または（ｂ）イソプレン比生産性のパラメータの１つまたは複数で１．０を超える性能指標値である、イソプレンの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１１】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドである、請求項１０に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記組換え細胞が、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細胞が適切な培地中で培養されて、前記イソプレノイド前駆体を産生する、組換え細胞。
【請求項１４】
イソプレノイドを産生できる組換え細胞であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細胞が、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養がイソプレノイドの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１５】
アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細胞を適切な培地中で培養するステップが、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１６】
核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれ、および、任意に、（ｉ）１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化され、または（ｉｉ）細胞染色体に組み込まれる、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１７】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
前記組換え細胞が、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン（ｓｅｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）、およびポリテルペンからなる群から選択される、請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記アセチルＣｏＡ由来代謝産物が、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される、請求項１５に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
前記アセチルＣｏＡ由来代謝産物が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、プロペン、およびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１５に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
（ａ）請求項１０に記載の組換え細胞をイソプレンを生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項１３に記載の組換え細胞をイソプレノイド前駆体を生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１４に記載の組換え細胞をイソプレノイドを生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法。
【請求項２６】
（ａ）請求項１５に記載の組換え細胞をアセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、そのそれぞれの開示の内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１３年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／８１０，６９６号明細書、および２０１３年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／８３４，３５９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物の生産増大能力がある、異種ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）ポリペプチドを含んでなる培養された組換え細胞、ならびに同細胞を作成して使用する方法に関する。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生産のための、１つまたは複数のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをさらに含んでなる。
【背景技術】
【０００３】
解糖は、炭素源が、ポリケチド、脂肪酸、アミノ酸、ビタミン、イソプレン、イソプレノイド、フェノール類、およびアルカロイドをはじめとする必須生物学的化合物の合成における重要な中間体である、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）などの中間体化合物に、代謝的に変換されるようにする。これらのアセチルＣｏＡ由来代謝産物のいくつかは、工業的有用性を有する。例えば、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な合成ポリマーの、中でも注目すべきことには合成ゴムの、重要な出発原料である。イソプレンは、石油分画によって得られ得る；しかしこの素材の精製は、費用がかさみ時間がかかる。炭化水素のＣ５ストリームの石油分解からは、約１５％のイソプレンのみが製造される。年間およそ８００，０００トンのシスポリイソプレンが、イソプレンの重合から製造される；このポリイソプレンの大部分は、タイヤおよびゴム産業で利用される。イソプレンはまた、履物、機械製品、医療用品、スポーツ用品、およびラテックスなどの他の製品中で、合成エラストマーとして使用するために、共重合される。イソプレンはまた、多様な微生物、植物、および動物種によって、自然に生産され得る。特に、メバロン酸（ＭＶＡ）経路および非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が、イソプレンの天然生合成について同定されている。
【０００４】
イソプレノイドもまた、工業的有用性を実証するアセチルＣｏＡ誘導代謝産物である。例えば、イソプレノイドは、医薬品中で、そしてバイオ燃料、食品添加剤、およびその他の特殊化学薬品として使用される。２９，０００種を超えるイソプレノイド化合物が同定されており、新しいイソプレノイドが毎年発見されている。イソプレノイドは、イソプレノイドの比較的複雑な構造を形成するための基本的構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用する、微生物および植物種などの天然物から単離し得る。イソプレノイドは、ほとんどの生きている生物および細胞に不可欠であり、細胞膜流動性および電子伝達を維持する手段を提供する。自然界では、イソプレノイドは、植物中の天然殺虫剤としての多様な役割において機能し、シナモン、クローブ、およびショウガに付随する香りを与える。さらに、製薬業界および化学産業界は、医薬品、栄養補給食品、着香剤、および農業害虫防除剤として、イソプレノイドを利用する。生物学的システムにおけるそれらの重要性と、広範な用途における有用性を考慮して、イソプレノイドは、科学者によって注視され続けてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、およびイソプレノイドの生産における最近の進歩は、しっかりした商業的工程の要求を満たすのに十分であり得る、速度、力価、および純度で、イソプレンおよびイソプレノイドを生産する方法を開示する（例えば、国際公開第２００９／０７６６７６Ａ２号パンフレット、および米国特許第７，９１５，０２６号明細書を参照されたい）；しかし同物質の生産量および収率を改善する交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）経路が、依然として必要とされる。
【０００６】
例えば、理論的には、アセチルＣｏＡの３つの分子は、可逆反応中の単一グルコース分子に由来し得る。しかし生物は、典型的に、最大２分子のアセチルＣｏＡのみを産生し、残りの質量はＣＯ２として失われる。ＣＯ２の放出は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応である、ピルビン酸からのアセチルＣｏＡ形成中に起こる。１つの炭素原子の損失は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイド分子の生産収率の低下につながる。この反応損失の例外は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ酵素に依存して、嫌気的アセトゲン中で二酸化炭素をアセチルＣｏＡに還元する、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路である。
【０００７】
したがって必要なのは、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、およびイソプレノイドの生産において、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素に依存しない経路を利用して、１分子のグルコースから３分子のアセチルＣｏＡを潜在的に生成し得る、交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）代謝過程を利用する、組換え細胞である。
【０００８】
本明細書に記載される本発明はこれらの問題に対処して、追加的な利点もまた提供する。
【０００９】
本明細書全体を通じて、様々な特許、特許出願およびその他の各種文献（例えば学術誌論文）に言及する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および文献の開示は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書で提供される本発明は、培養組換え細胞；これらの細胞の組成物；およびこれらの細胞を使用して、エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）、およびアセチルリン酸（Ａｃ−Ｐ）などの代謝中間体の生産を増大させ、ならびにイソプレノイド前駆体、イソプレン、イソプレノイド、および／またはアミノ酸などのアセチルＣｏＡ由来分子の生産を増大させる方法を特に開示する。
【００１１】
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通る炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１２】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１３】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１４】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１５】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号５と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１６】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号６と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１７】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号７と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１８】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００１９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号９と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２０】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１０と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２１】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２２】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１２と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２３】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１３と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２４】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１４と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２５】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１５と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２６】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１６と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２７】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１７と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２８】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００２９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号１９と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３０】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２０と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３１】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３２】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２２と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３３】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２３と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３４】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２４と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３５】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２５と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３６】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２６と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３７】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２７と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３８】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００３９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号２９と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４０】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３０と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４１】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４２】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３２と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４３】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３３と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４４】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３４と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４５】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３５と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４６】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３６と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４７】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３７と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４８】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００４９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号３９と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５０】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４０と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５１】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５２】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４２と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５３】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４３と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５４】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４４と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５５】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４５と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５６】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４６と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５７】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４７と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５８】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００５９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号４９と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００６０】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号５０と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００６１】
別の態様では、本明細書で提供されるのはホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは配列番号５１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。
【００６２】
いくつかの態様では、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかでは、適切な培地中の組換え細胞の培養は、エリスロース−４−リン酸の細胞内量、グリセルアルデヒド−３−リン酸の細胞内量、またはリン酸の細胞内量の１つまたは複数を増大させる。その他の態様では、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、キシルロース−５−リン酸から、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。その他の態様では、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトース−６−リン酸から、エリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。
【００６３】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを産生できる、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレンの生産を提供する。上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される細胞の別の態様では、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される細胞の別の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される細胞の別の態様では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドである。上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される細胞の別の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）またはプエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、およびコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からなる群から選択される。上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される細胞の別の態様では、組換え細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。
【００６４】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体を産生できる、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞であって、組換え細胞は、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレノイド前駆体の生産を提供する。
【００６５】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイドを産生できる、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレノイドの生産を提供する。
【００６６】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞であって、適切な培地中の上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞の培養は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を提供する。
【００６７】
いくつかの態様では、上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかでは、核酸は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、核酸は、細胞染色体に組み込まれる。
【００６８】
上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
【００６９】
上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン（ｓｅｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）、およびポリテルペンからなる群から選択される。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、イソプレノイドは、セスキテルペンである。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される。
【００７０】
上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、およびプロペンからなる群から選択される。
【００７１】
上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、適切な培地は、炭素源を含んでなる。上記のおよび／または本明細書のいずれかの実施形態のその他の態様では、炭素源は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、Ｃ６糖、Ｃ５糖、および転化糖からなる群から選択される炭水化物である。
【００７２】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞をイソプレンの生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。
【００７３】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞をイソプレノイド前駆体の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法である。
【００７４】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞をイソプレノイドの生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法である。
【００７５】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）上記のおよび／または本明細書の実施形態のいずれかで開示される組換え細胞をアセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法である。
【００７６】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥があるステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）細胞増殖の存在に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を検出するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を組換え細胞内で検出する方法である。
【００７７】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示される、スクリーニングし、同定し、および／または検出する任意の方法によって作成される、ホスホケトラーゼ活性がある単離ポリペプチドである。
【００７８】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。その他の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。
【００７９】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる。別の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。別の態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。
【００８０】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、適切な培地中の組換え細胞の培養は、エリスロース−４−リン酸の細胞内量、グリセルアルデヒド−３−リン酸の細胞内量、またはアセチルリン酸の細胞内量の１つまたは複数を増大させる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、キシルロース−５−リン酸から、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトース−６−リン酸から、エリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。
【００８１】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかの別の実施形態では、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合して、アセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合して、ＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えばＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。
【００８２】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを産生できる組換え細胞であって、組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養は、（ａ）イソプレン収率または（ｂ）イソプレン比生産性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値がある、イソプレンの生産を提供する。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドである。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、およびコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からなる群から選択される。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。
【００８３】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）は、適切な培地中で培養されて、前記イソプレノイド前駆体を産生する。
【００８４】
その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイドを産生する組換え細胞であって、組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）は、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレノイドの生産を提供する。
【００８５】
なおも別の態様では、本明細書で提供されるのは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞であって、適切な培地中の組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）の培養は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を提供する。
【００８６】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸は、細胞染色体に組み込まれる。
【００８７】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
【００８８】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン（ｓｅｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）、およびポリテルペンからなる群から選択される。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイドは、セスキテルペンである。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される。
【００８９】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、およびプロペンからなる群から選択される。
【００９０】
上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、適切な培地は、炭素源を含んでなる。上述のまたは本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、炭素源は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、Ｃ６糖、Ｃ５糖、および転化糖からなる群から選択される炭水化物である。
【００９１】
その他の態様では、（ａ）組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）をイソプレンの生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法もまた、本明細書で提供される。その他の態様では、（ａ）組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）をイソプレノイド前駆体の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法もまた、本明細書で提供される。
【００９２】
その他の態様では、（ａ）組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）をイソプレノイドの生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法もまた、本明細書で提供される。
【００９３】
その他の態様では、本明細書でまた提供されるのは、（ａ）組換え細胞（本明細書で提供される任意の組換え細胞など）をアセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法である。
【００９４】
その他の態様では、本明細書でまた提供されるのは、（ａ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥があるステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）細胞増殖の存在に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を検出するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を組換え細胞内で検出する方法である。
【００９５】
その他の態様では、本明細書でまた提供されるのは、上述のまたは本明細書の方法のいずれかによって検出されるホスホケトラーゼ活性がある、単離ポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）存在下の操作された代謝経路を描写する。ＰＫＬは、基質選択性に基づいて、Ｘ５Ｐのみに作用するキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ４．１．２．９）と、Ｘ５ＰおよびＦ６Ｐの双方に同等の活性で作用するキシルロース−５−リン酸／フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ４．１．２．２２）の２つのタイプに分類されている。ＰＫＬ触媒反応中でＦ６Ｐおよび／またはＸ５Ｐから形成されるアセチルリン酸（Ａｃ−Ｐ）は、引き続いて、ＭＶＡ経路で使用されるアセチルＣｏＡに変換され、または酢酸に変換され得る。ＰＫＬ触媒反応の他の生成物、すなわち、Ｘ５ＰおよびＦ６Ｐからそれぞれ生成されるグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）およびエリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）は、操作された代謝経路を通じて再循環させ、収率を最大化し得る。アセチルＣｏＡは、ポリケチド、脂肪酸、およびリジンのようなアミノ酸など、多くの生成物に変換され得る。
【図２】同定されたＰＫＬの２２個のクラスターの中心代表的配列の略図である。
【図３】クラスター１の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図４】クラスター２の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図５】クラスター３の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図６】クラスタ−４の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図７】クラスター５の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図８】クラスタ−６の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図９】クラスター７の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１０】クラスター８の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１１】クラスター９の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１２】クラスター１０の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１３】クラスター１１の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１４】クラスター１２の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１５】クラスター１３の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１６】クラスター１４の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１７】クラスター１５の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１８】クラスター１６の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図１９】クラスター１７の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２０】クラスター１８の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２１】クラスター１９の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２２】クラスター２０の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２３】クラスター２１の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２４】クラスター２２の中で同定されたホスホケトラーゼの略図である。
【図２５】エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＣＭＰ１３２１のプラスミドマップを描写する。
【図２６】ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３０のプラスミドマップを描写する。
【図２７】ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３１のプラスミドマップを描写する。
【図２８】ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３２のプラスミドマップを描写する。
【図２９】ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３３のプラスミドマップを描写する。
【図３０】バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３４のプラスミドマップを描写する。
【図３１】クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）最適化ホスホケトラーゼを発現する、ｐＭＣＳ５３５のプラスミドマップを描写する。
【図３２】ホスホケトラーゼを発現する株中のタンパク質発現を示す、一連のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルである。Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＰＫＬ（レーン１）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬ（レーン２）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（レーン３）、Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＰＫＬ（レーン４）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＰＫＬ（レーン５）、Ｂ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（レーン６）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＰＫＬ（レーン７）、Ｂ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰＫＬ（レーン８）、およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）コドン最適化ＰＫＬ（レーン９）を発現する細胞からのＡ）可溶性タンパク質、およびＢ）不溶性タンパク質である。
【図３３】Ａｃ−Ｐ収率によって測定された、Ｆ６Ｐ基質の存在下における、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＰＫＬ、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬ、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ、Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＰＫＬ、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＰＫＬ、Ｂ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＰＫＬ、Ｂ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰＫＬ、およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）コドン最適化ＰＫＬの生体外活性を示すグラフである。
【図３４】トランスケトラーゼ変異株が、６種の芳香族化合物とピリドキシンを含有する補給剤の添加時のみ、グルコース上で増殖したことを示すグラフである。
【図３５】Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのホスホケトラーゼが、補給剤無添加のグルコース上におけるトランスケトラーゼ変異株の増殖を回復させたことを示すグラフである。
【図３６】トランスケトラーゼ変異株が、６種の芳香族化合物とピリドキシンを含有する補給剤添加または無添加のキシロース上で、増殖しなかったことを示すグラフである。
【図３７】Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのホスホケトラーゼが、補給剤無添加のキシロース上におけるトランスケトラーゼ変異株の増殖を回復させたことを示すグラフである。
【図３８】好ましくは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように上方制御された、宿主変異を描写する略図である。炭素流を調節するための関心のある遺伝子としては、リボース−５−リン酸イソメラーゼＡ（ｒｐｉＡ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼＡ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、および／またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）が挙げられる。
【図３９】好ましくは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように下方制御された、宿主変異を描写する略図である。炭素流を調節するための関心のある遺伝子としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ（ｇａｐＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）および／またはｐｔｓオペロンが挙げられる。
【図４０】ＭＤ８９１（ａｃｋＡ−）宿主中の様々なＰＫＬ酵素の累積イソプレン収率を描写する。
【図４１】ＭＤ８９１（ａｃｋＡ−）宿主中の様々なＰＫＬ酵素の発酵終了時（ＥＯＦ）イソプレン力価を描写する。
【図４２】本明細書で開示される組成物、細胞、または方法のいずれかに従った、ＰＫＬ同時発現に適したプラスミドの一般的なプラスミドマップを描写する。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
本明細書で提供される本発明は、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を特に開示する。本発明のホスホケトラーゼ酵素は、下でより詳細に記載されるように、様々な基質を使用し得る。特定の実施形態では、本発明は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。なおも別の実施形態では、本発明はセドヘプツロース−７−リン酸からリボース−５−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。なおも別の実施形態では、本発明は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはフルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはセドヘプツロース−７−リン酸からリボース−５−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するように操作されている組換え細胞内で、アセチル補酵素Ａ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生産するための組成物と方法を提供する。
【００９８】
宿主細胞内で代謝経路を操作するために、組換え的に発現されたホスホケトラーゼが使用されている。米国特許第７，７８５，８５８号明細書を参照されたい。Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，７０：５，２８９２−９７）は、エタノールを過剰産生するためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のホスホケトラーゼの使用を記載する。Ｆｌｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：３，７６９−７６）は、生物が増殖のための唯一の炭素源としてフルクトースを利用する能力を回復させる、改変ラルストニア・オイトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）株中におけるビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ホスホケトラーゼ遺伝子（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、前出）の発現を記載する。
【００９９】
理論的には、アセチルＣｏＡの３つの分子は、可逆反応中の単一グルコース分子に由来し得る。しかし生物は、典型的に、最大２分子のアセチルＣｏＡのみを産生し、残りの質量はＣＯ２として失われる。ＣＯ２の放出は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応である、ピルビン酸からのアセチルＣｏＡ形成中に起こる。１つの炭素原子の損失は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイド分子の生産収率の低下につながる。この反応損失の例外は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ酵素に依存して、嫌気的アセトゲン中で二酸化炭素をアセチルＣｏＡに還元する、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路である。
【０１００】
本発明は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素に依存しない経路を利用して、１分子のグルコースから、３分子のアセチルＣｏＡを潜在的に生成し得る交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）代謝過程を提供する。それに代えて、それは特定の生物に見られるホスホケトラーゼ酵素を使用する［例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（ｅｄ．Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９，ｐ．２９９−３０１；Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１，１８３：９，２９２９−３６；Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，１７：５，８２２−８２９を参照されたい］。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝に見られるピルビン酸酸化を介さない、キシルロース−５−リン酸またはフルクトース−６−リン酸からの（アセチルリン酸を介する）アセチルＣｏＡ形成を可能にする。
【０１０１】
ホスホケトラーゼは、それらの基質選択性に基づいて、Ｘ５Ｐのみに作用するキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）ホスホケトラーゼと、Ｘ５ＰおよびＦ６Ｐの双方に作用するＸ５Ｐ／フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）ホスホケトラーゼの２つのタイプに分類されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｆ６６，２０１０，６６：８，９４１−４３）。ホスホケトラーゼは、無機リン酸（Ｐｉ）を使用して、Ｘ５ＰまたはＦ６Ｐの切断を触媒し、アセチルリン酸（アセチル−Ｐ）、Ｈ２Ｏ、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸またはエリスロース−４−リン酸を生成する。引き続いて高エネルギー代謝産物アセチル−Ｐは、酢酸キナーゼによって酢酸に変換され、経路中のＡＤＰからＡＴＰが生成される（図１）。１つのグルコースあたり３つのアセチルＣｏＡの最大収率を達成し得るように、アセチルリン酸に加えて、操作された代謝経路を通じて、酵素反応から生成されるグリセルアルデヒド−３−リン酸を再循環させ得る。顕著なことに、ホスホケトラーゼによって生成されるアセチルＣｏＡは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ媒介反応で観察されるような炭素（例えばＣＯ２）の損失を排除する。
【０１０２】
ホスホケトラーゼはまた、セドヘプツロース−７−リン酸に作用して、それをリボース−５−リン酸とアセチルリン酸に変換し得る。このようなホスホケトラーゼの非限定的例は、セドヘプツロース−７−リン酸に対する触媒活性を有する、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ホスホケトラーゼである。
【０１０３】
本発明は、生成物収率を向上させるための、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの生産における、ホスホケトラーゼ酵素の使用を対象とする。具体的には、以下の平衡状態方程式で表わされる、理論的なイソプレン生成物収率が向上する（生物が、１モルのグルコースから６モルのＣＯ２への完全酸化から、ＡＴＰを産生できるという仮説による）：
ＭＶＡ経路のみ
１．５グルコース＋２．００  Ｏ２→１．００イソプレン＋４．００  ＣＯ２＋５．００  Ｈ２Ｏ
理論的収率−０．２５２ｇイソプレン／ｇグルコース
ＤＸＰ経路
１．２５グルコース＋０．５０  Ｏ２→１．００イソプレン＋２．５０  ＣＯ２＋３．５０  Ｈ２Ｏ
理論的収率−０．３０２ｇイソプレン／ｇグルコース
ＭＶＡ＋ホスホケトラーゼ経路
１．２２グルコース＋０．３３  Ｏ２→１．００イソプレン＋２．３３  ＣＯ２＋３．３２  Ｈ２Ｏ
理論的収率−０．３０９ｇイソプレン／ｇグルコース
【０１０４】
メバロン酸依存生合成経路は、例えば、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）などのイソプレノイド前駆体分子の生成に、特に重要である。上方メバロン酸経路の酵素は、グルコースから生成されるアセチルＣｏＡを、３つの酵素反応を通じてメバロン酸に変換する。理論に束縛されることなく、アセチルＣｏＡ生合成を増大させるためのホスホケトラーゼポリペプチドの使用によって生成される細胞内Ｅ４Ｐ、ＧＡＰ、およびＡｃ−Ｐ貯留の増大は、上方メバロン酸依存生合成経路の生産性増大をもたらし得て、それはメバロン酸の生合成と、結果的に、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰなどの下流イソプレノイド前駆体分子の生合成とを実質的に増大させる（図１）。さらに、アセチルＣｏＡの生合成増大は、脂肪酸、アミノ酸、およびアセトンなどのアセチルＣｏＡ由来代謝産物の合成増大をもたらし得る（図１）。したがって、この交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ＰＫＬ経路による、細胞内量ＣｏＡ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｍｏｕｎｔ−ＣｏＡ）生産の増大は、商業的応用に有利である。
【０１０５】
アセトンは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）などの特定の微生物によって産生される。それは、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）による、２分子のアセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合で開始する。次に、アセトアセチルＣｏＡは、酢酸または酪酸との反応によってアセト酢酸に変換されて、アセチルＣｏＡまたはブチリルＣｏＡの生産がもたらされる。この反応は、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）などの酵素によって触媒される。アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）などの様々な生物から知られている。しかし、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．５）またはコハク酸ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．５）などの他の酵素もまた、この反応を触媒し得る。反応の最後のステップでは、アセト酢酸は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）によって触媒される脱炭酸ステップによって、アセトンに変換される。アセトンは、引き続いて、アセトン、イソプレン、およびプロペンに関して、その内容全体を参照によって本明細書に明示的に援用する、国際公開第２０１３／０７７８６号パンフレットに記載されるようにして、イソプロパノール、イソブテンおよび／またはプロペンに変換され得る。
【０１０６】
したがって、特定の態様では、本発明は、増大した細胞内量のエリスロース−４−リン酸、増大した細胞内量のグリセルアルデヒド−３−リン酸、および／または増大した細胞内量のリン酸がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した細胞内量のエリスロース−４−リン酸、増大した細胞内量のグリセルアルデヒド−３−リン酸、および／または増大した細胞内量のリン酸を産生する。
【０１０７】
いくつかの態様では、本発明は、増大した細胞内量のアセチルＣｏＡがある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した細胞内量のアセチルＣｏＡを産生する。
【０１０８】
特定の態様では、本発明は、メバロン酸の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のメバロン酸を産生する。
【０１０９】
その他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のイソプレノイド前駆体を産生する。
【０１１０】
なおも別の態様では、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレンを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
【０１１１】
なおも別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレノイドを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレノイドの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して、増大した量のイソプレノイドを産生する。
【０１１２】
その他の態様では、本発明は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のアセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる。特定の実施形態では、本発明は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞のアセチルＣｏＡ由来代謝産物の産生と比較して、増大した量のアセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生する。
【０１１３】
本明細書の態様のいずれにおいても、本発明は、組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり得て、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をはじめとする遺伝子の１つまたは複数の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が改善するようにさらに操作し得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、（ｉｉｉ）１つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレノイドを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、１つまたは複数の異種核酸と、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、（ｉｉｉ）１つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して、増大した量のイソプレノイドを産生する。
【０１１６】
その他の実施形態では、本発明は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、１つまたは複数の遺伝子の活性が調節されて、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するようにさらに操作され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞のアセチルＣｏＡ由来代謝産物産生と比較して、増大した量のアセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生する。
【０１１７】
一般技術
特に断りのない限り、本発明の実施は、当該分野の技術範囲内である、（組換え技術をはじめとする）従来の分子生物学技術、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学を採用する。このような技術は、文献、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，編，１９９４）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）で詳しく説明され、当業者に、本出願で使用される多くの用語について、一般的指針を提供する。
【０１１８】
定義
「イソプレン」という用語は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃７８−７９−５）を指す。それは、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸除去からの、直接的および最終揮発性Ｃ５炭化水素生成物であり得る。これは、ＩＰＰ分子のＤＭＡＰＰ分子への結合または重合を伴わなくてもよい。「イソプレン」という用語は、本明細書で特に断りのない限り、通常、その生産方法に限定されることは意図されない。
【０１１９】
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、および融合ポリペプチドを含む。
【０１２０】
本明細書の用法では、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、５０以上の異なるポリペプチドライブラリーなどのポリペプチドライブラリーの一部でなく、それが自然界で一緒に存在する少なくとも１つの構成要素から分離される。単離ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得られ得る。
【０１２１】
「異種ポリペプチド」とは、宿主細胞とは異なる生物、種、または株に由来する核酸配列によってコードされる、ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、自然界で同一宿主細胞に見られる、野生型ポリペプチドと同じでない。
【０１２２】
本明細書の用法では、「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のどちらかで、共有結合的に共に連結した２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。
【０１２３】
「組換え核酸」とは、それに関心のある核酸が由来する生物の天然ゲノム中で、関心のある核酸の側面に位置する１つまたは複数の核酸（例えば、遺伝子）を含まない、関心のある核酸を意味する。したがって用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物ゲノムＤＮＡに、組み込まれた組換えＤＮＡ、またはその他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じる、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。
【０１２４】
「異種核酸」は、宿主細胞とは異なる生物、種または株に由来する核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、異種核酸は、天然で同一宿主細胞に見られる野生型核酸と同じでない。例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換するのに使用される核酸は、異種核酸である。
【０１２５】
本明細書の用法では、「ホスホケトラーゼ」、「ホスホケトラーゼ酵素」、または「ホスホケトラーゼポリペプチド」という用語は、同義的に使用されて、５−リン酸（５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸に変換し、および／またはフルクトース−６−リン酸をエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸に変換するポリペプチドを指す。一般に、ホスホケトラーゼは、ケトースに作用する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−５−リン酸から、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース−６−リン酸から、エリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸から、生成物（例えばリボース−５−リン酸）およびアセチルリン酸への変換を触媒する。
【０１２６】
本明細書の用法では、「発現調節配列」は、興味深い核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成的または誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現調節配列は、「天然」または異種であり得る。天然発現調節配列は、発現される遺伝子と同じ生物、種、または株に由来する。異種発現調節配列は、発現される遺伝子と異なる生物、種、または株に由来する。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節下において、活性のプロモーターである。
【０１２７】
「作動可能に連結する」とは、核酸発現制御配列（プロモーターなど）と第２の核酸配列の間の機能的連結を意味し、発現調節配列は、第２の配列に対応する、核酸の転写を誘導する。
【０１２８】
本明細書の用法では、「最少培地（単数）」または「最少培地（複数）」という用語は、細胞増殖で可能な最少栄養素を含有して、通常はアミノ酸が不在である増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、（１）細菌増殖のための炭素源；（２）細菌種および増殖条件間で変動し得る様々な塩；および（３）水を含有する。炭素源は、下でより詳細に考察されるように、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などの他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、著しく変動し得る。塩は、通常、マグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの必須元素を提供して、細胞がタンパク質および核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、特定のプラスミドの維持などについて選択するために、抗生物質などの選択的薬剤によって補足し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性があれば、抵抗性を欠く細胞が増殖するのを防ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択するために、必要に応じて、その他の化合物で補足し得る。
【０１２９】
本明細書の用法では、「イソプレノイド」という用語は、各単位が特定パターンに配列された５つの炭素原子からなる、２つ以上の炭化水素単位から構成される天然有機化合物クラスの大規模かつ多様なクラスを指す。本明細書の用法では、「イソプレン」は、「イソプレノイド」の定義から明示的に除外される。
【０１３０】
本明細書の用法では、「テルペノイド」という用語は、多様な様式で構築および修飾されて、グループ構成員中で使用されるイソプレノイド単位数に基づいてグループ分けされた、五炭素イソプレノイド単位に由来する有機分子の大規模かつ多様なクラスを指す。ヘミテルペノイドは、１つのイソプレノイド単位を有する。モノテルペノイドは、２つのイソプレノイド単位を有する。セスキテルペノイドは、３つのイソプレノイド単位を有する。ジテルペノイドは、４つのイソプレン単位を有する。セスタテルペノイドは、５つのイソプレノイド単位を有する。トリテルペノイドは、６つのイソプレノイド単位を有する。テトラテルペノイドは、８つのイソプレノイド単位を有する。ポリテルペノイドは、８つを超えるイソプレノイド単位を有する。
【０１３１】
本明細書の用法では、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイドまたはイソプレノイドの生合成において、生物によって使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定的例としては、例えば、メバロナート（例えばメバロン酸（ＭＶＡ））、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書の用法では、「質量収率」という用語は、百分率として表される、組換え細胞によって消費されたグルコース質量で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を指す。
【０１３３】
「比生産性」とは、生成物生成時間、細胞密度、および培養物容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
【０１３４】
「力価」は、培養液の容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
【０１３５】
本明細書の用法では、「細胞生産性指標（ＣＰＩ）」という用語は、培養物中に生じた組換え細胞の質量で除した、組換え細胞によって産生された生成物の質量を指す。
【０１３６】
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１３７】
本明細書の用法では、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別段の記載がない限り、複数への言及を含む。
【０１３８】
本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最大数値限界は、あたかもより低い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより低い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体を通じて示されるあらゆる最小数値限界は、あたかもより高い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより高い数値限界を含む。本明細書全体を通じて示されるあらゆる数値範囲は、あたかもより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲に含まれるあらゆるより狭い数値範囲を含む。
【０１３９】
ホスホケトラーゼポリペプチドを発現する組換え細胞
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはフルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸から、生成物（例えばリボース−５−リン酸）およびアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるホスホケトラーゼの発現は、炭水化物源から生成されるアセチルリン酸量の増大をもたらし得る。このアセチルリン酸は、アセチルＣｏＡに変換され得て、次にそれは、ＭＶＡ経路の酵素機能によって使用され、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドが生成され得て、またはそれは、ＭＶＡ経路の酵素機能によって使用されて、アセチルＣｏＡ由来代謝産物が生成され得る。
【０１４０】
本明細書の用法では、「アセチルＣｏＡ由来代謝産物」という用語は、アセチルＣｏＡから前記代謝産物への触媒性変換から生成される、代謝産物を指し得る。変換は、一段階反応または多段階合成反応であり得る。例えば、アセトンは、１）アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによる、２分子のアセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合；２）アセチルＣｏＡまたはブチリルＣｏＡの生成をもたらす、酢酸または酪酸との反応による、アセトアセチルＣｏＡのアセト酢酸への変換；および３）アセト酢酸デカルボキシラーゼによって触媒される脱炭酸ステップによる、アセト酢酸のアセトンへの変換の三段階反応（例えば多段階合成反応）によってアセチルＣｏＡから生成される、アセチルＣｏＡ由来代謝産物である。アセトンは、引き続いてイソプロパノール、イソブテンおよび／またはプロペンに変換され得て、それらもまたアセチルＣｏＡ由来代謝産物であることが、本明細書で明示的に検討される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、およびプロペンからなる群から選択される。したがって炭水化物基質から生成されるこれらの化合物（例えば、アセチルＣｏＡ、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、アセチル−Ｐ、Ｅ４Ｐなど）の量が増大してもよい。
【０１４１】
アセチル−ＰおよびアセチルＣｏＡの生産は、増大をより高い細胞内濃度に反映させずに、増大させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内アセチル−ＰまたはアセチルＣｏＡ濃度は不変であり、または低下することさえある。
【０１４２】
例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸
例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。（例えば、図２〜２４および実施例２を参照されたい）。それに加えて、表１および表２は、本発明の実施形態で使用してもよい、異なる生物種からの特定の例示的なホスホケトラーゼの非限定的一覧を提供する。
【０１４３】
例示的なホスホケトラーゼの生化学的特性としては、タンパク質発現、タンパク質溶解度、および活性が挙げられるが、これに限定されるものではない。ホスホケトラーゼはまた、異なる生物タイプ（例えば、グラム陽性細菌、ラン藻、放線菌）間の多様性、通性低温嫌気性菌、所望の種の近縁種（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、および熱耐性をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の特性に基づいて選択し得る。
【０１４４】
場合によっては、生物のゲノム中にホスホフルクトキナーゼ遺伝子が欠失していれば、特定の生物からのホスホケトラーゼを選択し得る。
【０１４５】
さらに別の実施例では、ホスホケトラーゼは、アミノ酸配列の二次構造および／または実施例１に記載される方法に基づいて選択し得る。
【０１４６】
なおも別の例では、ホスホケトラーゼは、実施例６に記載されるような生体外アッセイに基づいて選択し得る。
【０１４７】
なおも別の例では、ホスホケトラーゼは、実施例７に記載されるような生体内アッセイに基づいて選択し得る。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥があるステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）観察された細胞増殖の量に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定する方法である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ホスホケトラーゼ活性を有することが疑われるポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥があるステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）細胞増殖が観察された場合、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドを同定するステップとを含んでなる、ホスホケトラーゼ活性があるポリペプチドを同定する方法である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる、組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥があるステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）細胞増殖の存在に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を検出するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を組換え細胞内で検出する方法である。
【０１４８】
本明細書で提供されるように、ホスホケトラーゼ活性は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体（例えばＩＰＰ）、イソプレン、および／またはイソプレノイドの生産を改善し得る。本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼを含んでなる組換え宿主であって、細胞は、少なくとも１つの関心のある特性を示して、アセチルＣｏＡ由来代謝産物、イソプレノイド前駆体（例えばＩＰＰ）、イソプレン、および／またはイソプレノイドの生産を改善する。
【０１４９】
いくつかの態様では、少なくとも１つの関心のある特性は、比生産性、収率、力価、および細胞性能指数（例えば増殖）からなる群から選択されるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、「性能指標」は、計算された、親分子と比較した単位当たり活性を指す。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの態様では、性能指標の計算で使用される親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。いくつかの実施形態では、親分子は、定義上、１の性能指標を有する。その他の実施形態では、１を超える性能指標（ＰＩ＞１．０）は、親分子と比較して改善されたホスホケトラーゼ（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）活性を示す。
【０１５０】
特定の実施形態では、本明細書の用途のための適切なホスホケトラーゼとしては、可溶性ホスホケトラーゼが挙げられる。タンパク質溶解度の測定技術は、当該技術分野で周知である。タンパク質溶解度を測定する技術としては、本明細書の実施例で開示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書の用途のためのホスホケトラーゼとしては、少なくとも２０％の溶解度があるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約５％〜約１００％、約１０％〜約１００％、約１５％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約３５％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約４５％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、または約９０％〜約１００％のいずれかである。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約５％〜約１００％である。いくつかの実施形態では、溶解度は、５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ溶解度は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０未満のいずれかであるが、約５％以上である。いくつかの実施形態では、溶解度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％のいずれかを超える。
【０１５１】
所望の動態特性があるホスホケトラーゼは、イソプレンの生産を増大させる。動態特性としては、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、およびＫｍが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．１、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、２０．０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００である。その他の態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．１、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、または１６．６である。
【０１５２】
いくつかの態様では、Ｋｍは、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、または５６である。その他の態様では、ｋｍは、少なくとも約２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、または２２である。
【０１５３】
興味深い特性としては、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較して増大した、細胞内活性、比生産性、収率、および細胞性能指標が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、比生産性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。一実施形態では、比生産性は、約４０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈｒである。いくつかの実施形態では、収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、ＭＶＡ収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、イソプレン収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。
【０１５４】
その他の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドと、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とを含んでなる組換え細胞の（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖、または（ｄ）細胞内アセチルリン酸の産生をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１を超える、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８を超える、または１０を超え、またはそれを上回る。
【０１５５】
その他の実施形態では、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、組換え細胞内の（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドのＦ６Ｐ比活性をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１を超える、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８を超える、または１０を超え、またはそれを上回る。
【０１５６】
その他の実施形態では、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、組換え細胞の（ａ）イソプレン収率、タンパク質溶解度または（ｂ）イソプレン比生産性をはじめとするが、これに限定されるものではない興味深い特性の性能指標値が、ホスホケトラーゼ活性を有する親ポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１を超える、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８を超える、または１０を超え、またはそれを上回る。
【０１５７】
その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１５８】
本明細書で提供されるのは、微生物から単離されたホスホケトラーゼである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、嫌気性細菌、好熱性細菌、好冷細菌、好塩性細菌またはラン藻からなる群から単離される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼは、真菌から単離される。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。その他の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。なおも別の態様では、例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。
【０１５９】
使用し得る他のホスホケトラーゼとしては、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｌ．ロイテリー（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．パラプランタラム（Ｌ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｒ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ブレビ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｇ．バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｍ．パルジス（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｓ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）種、Ｒ．アクアチリス（Ｒ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、Ｎ．パンクチフォルメ（Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、Ｓ．アベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、およびＴ．フスカ（Ｔ．ｆｕｓｃａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。使用し得る追加的なホスホケトラーゼとしては、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６０】
標準法を使用して、ペプチドが、Ｄ−フルクトース−６−リン酸またはＤ−キシルロース−５−リン酸をアセチル−Ｐに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが、ホスホケトラーゼペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。次にアセチル−Ｐは、分光光度法で検出し得るフェリルアセチルヒドロキサム酸に変換し得る（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９−２９３６，２００１）。本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼペプチド活性を有すると同定される任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−５−リン酸から、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース−６−リン酸から、エリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸からリボース−５−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはフルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはセドヘプツロース−７−リン酸からリボース−５−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。
【０１６１】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、ホスホケトラーゼ核酸は、本明細書に記載されるホスホケトラーゼ核酸配列のいずれかと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５２のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５３のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５４のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５５のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５６のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５７のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５８のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ���によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号５９のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６０のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６１のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６２のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６３のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６４のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６５のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６６のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種によってコー���されるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６７のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６８のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号６９のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７０のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７１のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７２のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７３のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７４および７６のいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７５のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７７のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７８のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号７９のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８０のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８１のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８���％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８２のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８３のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８４のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８５のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８６のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８７のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８７％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８８のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８８％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号８９のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・��リセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ホスホケトラーゼ遺伝子によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号９０および９１のいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）によってコードされるホスホケトラーゼ核酸は、配列番号９２のホスホケトラーゼ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または９２％の配列同一性を有し得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号５によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号６によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号７によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号８によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号９によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１０によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号１２によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号１３によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では，ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１４によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では，ホスホケトラーゼポリペプチドは、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１５によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１６によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号１７によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１８によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号１９によってコードされるホスホ��トラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２０によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では，ホスホケトラーゼポリペプチドは、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、はネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号２２によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２３によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２４によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２５によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ���リペプチドは、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２６によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２７によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２８によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号２９によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３０によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３２によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３３によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３４によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３５によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３６によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３７によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、���なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３８によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号３９によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４０によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはエレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはアエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４２によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４３によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ホスホ���トラーゼアミノ酸配列：配列番号４４によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４５によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４６によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列番号４７によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４８によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号４９によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号５０によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチドと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、ま���は７０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、と、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ホスホケトラーゼアミノ酸配列：配列番号５１によってコードされるホスホケトラーゼポリペプチド少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有し得る。
【０１６３】
本明細書で使用し得るホスホケトラーゼ酵素の追加的な例は、特にホスホケトラーゼ酵素に関する全ての開示に関して、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７８５，８５８号明細書および国際公開第２０１１／１５９８５３号パンフレットに記載される。
【０１６４】
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、組換え細胞は、本明細書に記載されるように、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離される。その他の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またははネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離される。その他の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッ��ス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離される。なおも別の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離される。
【０１６５】
本明細書の実施形態のいずれにおいても、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子の活性の１つまたは複数を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をはじめとする遺伝子の１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０１６６】
組換え細胞を使用して増大した量のアセチルＣｏＡおよびアセチル由来代謝産物を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、アセチルＣｏＡを生産する方法である。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡを生産する方法は、（ａ）本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、アセチルＣｏＡを産生できる組換え細胞（上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする）またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡを生産する方法は、アセチルＣｏＡの生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にアセチルＣｏＡを産生させるステップを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡを生産する方法は、アセチルＣｏＡを回収するステップをさらに含んでなる。
【０１６７】
本明細書に記載されるように、アセチルＣｏＡを生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）アセチルＣｏＡを生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、実施例７に記載されるようにして、生体内スクリーニングアッセイから同定されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、アセチルＣｏＡを産生し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０１６８】
本明細書でまた提供されるのは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法である。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法は、（ａ）本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞（上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする）またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にアセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生させるステップとを含んでなる。いくつかの態様では、アセチルＣｏＡを生産する方法は、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を回収するステップをさらに含んでなる。
【０１６９】
本明細書に記載されるように、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞がホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、実施例７に記載されるようにして、生体内スクリーニングアッセイから同定されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０１７０】
本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、または脂肪酸の１つまたは複数であり得る。本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸の１つまたは複数であり得る。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、コハク酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、またはプロペンの１つまたは複数であり得る。
【０１７１】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１７２】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１７３】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１７４】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１７５】
ホスホケトラーゼポリペプチドとＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドとを発現する組換え細胞
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物および特定の細菌に存在する、主要代謝経路である。タンパク質プレニル化、細胞膜保守、タンパク質固着、およびＮ−グリコシル化などの多様なプロセスで使用される分子の生成に重要であるのに加えて、メバロン酸経路は、テルペン、テルペノイド、イソプレノイド、およびイソプレン生合成のための基礎原料の役割を果たす、イソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの主要な供給源を提供する。
【０１７６】
完全ＭＶＡ経路は、上流および下流経路の２つのグループに細分化し得る。ＭＶＡ経路の上流部分では、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性または（ｉｉ）アセトアセチルＣｏＡシンターゼ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、および（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、細胞代謝中に生成されたアセチルＣｏＡがメバロン酸に変換される。最初に、アセチルＣｏＡが、チオラーゼまたはアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを使用する）の作用によって、アセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡが、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用によって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体は、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生産のメバロン酸経路の律速段階である。下流ＭＶＡ経路では、メバロン酸は、次にメバロン酸キナーゼ作用によって、メバロン酸５−リン酸に変換され、それは引き続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性によって、５−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、メバロン酸５−ピロリン酸デカルボキシラーゼ酵素の活性によって、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが生成される。
【０１７７】
したがって特定の実施形態では、本発明の組換え細胞は、ＭＶＡ経路を通じて、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力があるホスホケトラーゼをコードする、異種遺伝子、（ｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種遺伝子、および（ｉｉｉ）宿主細胞内における、アセトアセチルＣｏＡからのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種遺伝子を含んでなる。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）フルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力があるホスホケトラーゼをコードする、異種遺伝子、（ｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種遺伝子、および（ｉｉｉ）宿主細胞内における、アセトアセチルＣｏＡからのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種遺伝子を含んでなる、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。
【０１７８】
上流ＭＶＡ経路ポリペプチド
ＭＶＡ経路の上流部分は、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性または（ｉｉ）アセトアセチルＣｏＡ合成活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、および（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、メバロン酸に変換される最初の基質として、細胞代謝中に生じるアセチルＣｏＡを使用する。最初に、アセチルＣｏＡが、チオラーゼまたはアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを利用する）の作用によって、アセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用によって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生成のメバロン酸経路の律速段階である。
【０１７９】
上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチルＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。上流ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な上流ＭＶＡ経路核酸としては、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。したがって、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする任意の遺伝子を、本発明で使用し得ることが、本明細書で検討される。
【０１８０】
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流ＭＶＡ経路からの１つまたは複数のタンパク質をコードするその他のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。別の実施形態では、本発明の範囲内で、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチドおよび３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードする１つまたは複数のその他の遺伝子との組み合わせで、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が検討される。したがって、特定の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、本明細書で検討される遺伝子組み合わせのいずれかを組換え細胞内で発現させ得る。
【０１８１】
本明細書で使用し得る上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの追加的な非限定的例は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット；国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットに記載される。
【０１８２】
ｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする遺伝子
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流ＭＶＡ経路からの１つまたは複数のタンパク質をコードするその他のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、およびＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）中で、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。事実上、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真正細菌中で発見された最初のＩＰＰ生合成の二機能性酵素、および天然で別のタンパク質に融合するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の最初の例に相当する（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２年４月；１８４（８）：２１１６−２１２２）。他方、ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１８３】
したがって、組換え細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からの１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を発現して、メバロン酸を産生するように改変し得る。１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の異種性発現で、遺伝子の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【０１８４】
例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるポリペプチドのチオラーゼ活性が、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ポリペプチドのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する。例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、ｍｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１８５】
変異ｍｖａＥポリペプチドとしては、ｍｖａＥポリペプチド活性（すなわちアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力、ならびに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的であり得て、このような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされ得て、またはコードされ得ない。標準的な２０のアミノ酸「アルファベット」が、それらの側鎖類似性に基づいて、化学物質ファミリーに分類されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のあるアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。「非保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。
【０１８６】
ｍｖａＥポリペプチド内にアミノ酸置換を導入して、分子の機能性を改善し得る。例えば、基質に対するｍｖａＥポリペプチドの結合親和性を増大させ、またはアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改善するアミノ酸置換をｍｖａＥポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ｍｖａＥポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
【０１８７】
一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、および／またはイソプレノイドを生成するために、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥタンパク質を使用し得る。使用し得る、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥの遺伝子産物の例としては、生物Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）からのものが挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、任意の標準的分子生物学的技術によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中でｍｖａＥタンパク質を発現させて、断片の不在を探し得る。例えば、断片の不在は、Ｈｉｓタグ媒介精製に続いて、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定し得て、またはメバロン酸、イソプレン、またはイソプレノイド産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内で発現される場合は、本明細書に記載される検出方法を使用して同定し得る。
【０１８８】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２年４月；１８４（８）：２１１６−２１２２）に記載されるものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性が、分光光度計によって測定され、アセトアセチルＣｏＡの形成またはチオ開裂に伴う３０２ｎｍにおける吸光度の変化が、モニターされる。アセトアセチルＣｏＡの合成を判定するための各反応の標準アッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ１０．５であり、反応は酵素の添加によって開始される。アッセイは、２００μｌの最終容量を採用し得る。アッセイでは、１酵素単位（ｅｕ）が、１分間の１μｍｏｌアセトアセチルＣｏＡ中の合成またはチオ開裂に相当する。別の例示的なアッセイでは、分光光度計によって、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰ（Ｈ）の出現または消失によって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をモニターし得る。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元脱アシル化を示すために測定される各反応の標準アッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ、および１００ｍＭのＫｘＰＯ４、ｐＨ６．５である。アッセイは、２００μｌの最終容量を採用する。反応は、酵素を添加することで開始される。アッセイでは、１ｅｕは、１分間の１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）中の代謝回転に相当する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡまたはメバロン酸の代謝回転に相当する。
【０１８９】
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号明細書Ａ１を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に、培養物を接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次にプレートをＢｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
【０１９０】
例示的なｍｖａＥ核酸としては、ｍｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＥ核酸としては、例えば、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離されたｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９５と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９６と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９７と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９８と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で開示されたｍｖａＥ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７−１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１９１】
ｍｖａＥ核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＥ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＥ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【０１９２】
例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換し得る。例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、ｍｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１９３】
変異ｍｖａＳポリペプチドとしては、ｍｖａＳポリペプチド活性（すなわちアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子機能性を改善し得る。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの基質に対する結合親和性を増大させ、またはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力を改善するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ｍｖａＳポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
【０１９４】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９−１６４）に記載されるものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、３０３ｎｍにおける吸光度の変化をモニターすることで、アセトアセチルＣｏＡのエノール形態の消失を分光光度的に測定することで、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアッセイし得る。３０℃で、５０ｍｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する、標準１ｍｌアッセイシステム；５ｍＭ−アセチルリン酸、１０，ＭアセトアセチルＣｏＡ、および５μｌの抽出物サンプルを添加し得て、アセチルＣｏＡ（１００μＭ）および１０単位のＰＴＡの同時添加がそれに続く。次にＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアセチルＣｏＡ添加前後の速度差として測定する。使用された条件下（ｐＨ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）におけるアセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義上、１単位の酵素活性は、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡの変換を引き起こす。
【０１９５】
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号明細書Ａ１を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、培養物を、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次に、プレートをＢｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に、１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に、上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
【０１９６】
例示的なｍｖａＳ核酸としては、ｍｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳ核酸としては、例えば、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離されたｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号９９と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１００と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１０１と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１０２と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で開示されたｍｖａＥ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書；Ｔａｂａｔａ、Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７−１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１９７】
ｍｖａＳ核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＳ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＳ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【０１９８】
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（別名ｎｐｈＴ７）は、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有して、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成する最小の活性（例えば、皆無の活性）を有する酵素をコードする遺伝子である。ｎｐｈＴ７に関する教示については、例えば、その内容を本明細書に明示的に援用する、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５−１１２７０（２０１０）を参照されたい。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の放線菌ＣＬ１９０株からのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、特開２００８−６１５０６Ａ号公報および米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号明細書に記載される。アセトアセチルＣｏＡシンターゼはまた、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素とも称され得る。使用し得る代表的なアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（またはアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）は、ＧｅｎｂａｎｋＡＢ５４０１３１．１である。
【０１９９】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれにおいても、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用し得る。このような酵素の非限定的例は、本明細書に記載される。本明細書に記載される特定の実施形態では、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有する、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の放線菌に由来するアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用し得る。このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子の一例は、アミノを有するタンパク質をコードする遺伝子である。このようなタンパク質は、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼに対応する配列番号１０３のアミノ酸配列を有し、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しない。
【０２００】
一実施形態では、配列番号１０３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株の放線菌類から入手されるゲノムＤＮＡをテンプレートとして、および特開第２００８−６１５０６Ａ号公報を参照してデザインし得る１対のプライマーを使用して、核酸増幅法（例えばＰＣＲ）によって得られ得る。
【０２０１】
本明細書に記載されるように、本発明で使用するためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株の放線菌類からの配列番号１０３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に限定されない。マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有して、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成しない、タンパク質をコードする任意の遺伝子を本明細書に記載する方法で使用し得る。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１０３のアミノ酸配列と高度に類似し、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有して、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であり得る。「高度に類似」または「実質的に同一」という表現は、例えば、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％の同一性を指す。上で使用されるように、同一性は、異なるアミノ酸配列および配列番号１０３のアミノ酸配列中のアミノ酸残基間の同一性の百分率に相当し、それは配列類似性を検索するプログラムを使用して、配列番号１０３および異なるアミノ酸配列の、アミノ酸配列のアライメントを実施することで計算される。
【０２０２】
その他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、１つ以上アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって、配列番号１０３のアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有し、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本明細書では、「より多くのアミノ酸」という表現は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
【０２０３】
なおも別の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの部分または全体とハイブリダイズでき、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードできる、ポリヌクレオチドからなってもよい。本明細書では、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションは、６０℃で２回のＳＳＣ洗浄条件下における結合維持に相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載される方法などの従来の既知の方法によって実施し得る。
【０２０４】
本明細書に記載されるように、配列番号１０３のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株から得られたのではない放線菌類などの、潜在的にあらゆる生物から単離し得る。さらに、本明細書の用途のためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、当該技術分野で知られている方法によって、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを改変することで得られ得る。ヌクレオチド配列の変異誘発は、クンケル法またはギャップド二本鎖法、またはそれらのどちらかに類似した方法などの既知の方法によって実施し得る。例えば、変異誘発は、変異誘発キット（例えば製品名；Ｍｕｔａｎｔ−ＫおよびＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ））、部位特異的変異誘発のための製品名；ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ）などを使用して、実施してもよい。
【０２０５】
配列番号１０３のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの活性は、下述するように評価し得る。具体的には、評価されるタンパク質をコードする遺伝子を、その中で遺伝子が発現し得るように、最初に宿主細胞に導入し、クロマトグラフィーなどの技術によるタンパク質の精製がそれに続く。評価される得られたタンパク質含有する緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡを添加し、例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）での培養がそれに続く。反応完了後、失われた基質量および／または生成された生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を判定する。したがって試験されるタンパク質が、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するかどうかを評価し、合成程度を評価することが可能である。このような場合、評価される得られたタンパク質を含有する緩衝液に、基質としてアセチルＣｏＡのみを入れて、失われた基質量および／または生成された生成物量を同様に判定することで、タンパク質が２つのアセチルＣｏＡ分子から、アセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するかどうかを調べることが可能である。
【０２０６】
メバロン酸の生産増大能力がある組換え細胞
本明細書に記載される組換え細胞（例えば組換え細菌細胞）は、本明細書に記載される様々な酵素経路に対する任意の操作なしの同一細胞を上回る量および／または濃度で、メバロン酸を産生し得る。したがって、本明細書に記載される様々な経路の調節のために操作されている組換え細胞（例えば細菌細胞）は、メバロン酸の生産向上に有用である。
【０２０７】
したがって、特定の態様では、本発明は、メバロン酸の生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とを含んでなり、細胞はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のメバロン酸を産生する。
【０２０８】
特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）���エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２０９】
一実施形態では、組換え細胞は、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーをさらに含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと、上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とをさらに含んでなる。
【０２１０】
一実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をはじめとする遺伝子の１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０２１１】
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回る容積生産性で、メバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、２．００ｇ／Ｌ／ｈｒを超えるメバロン酸を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒを超える、ならびにこれらの数字間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。
【０２１２】
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回る力価で、メバロン酸を産生し得る。これらの組換え細胞は、約４８時間の発酵後に、１００ｇ／Ｌを超えるピーク力価のメバロン酸を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、４８時間の発酵後に、包括的に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌを超える、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のピーク力価のメバロン酸を産生し得る。
【０２１３】
その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ＭＶＡ経路に向かう炭素流を増大させ、したがって同様に操作されていない細胞と比較して、より高い力価のメバロン酸を産生する、１つまたは複数の変異をさらに含んでなる。このような実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るピーク力価で、メバロン酸を産生する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をはじめとする遺伝子の１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０２１４】
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るメバロン酸の細胞生産性指数（ＣＰＩ）で、メバロン酸を産生し得る。組換え細胞は、少なくとも約３．０（ｇ／ｇ）のメバロン酸ＣＰＩを有し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）、または３０（ｇ／ｇ）の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸のＣＰＩを有し得る。
【０２１５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ＭＶＡ経路に向かう炭素流を増大させる１つまたは複数の変異をさらに含んでなり、それは、同様に操作されていない細胞と比較して、メバロン酸のより高い細胞生産性指標（ＣＰＩ）をもたらす。さらに、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るＣＰＩを有する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０２１６】
さらに、本明細書に記載される細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るグルコースからのメバロン酸の質量収率を有する。組換え細胞は、グルコースから、少なくとも約２８％のメバロン酸の質量収率を生じ得る。代案としては、組換え細胞は、グルコースから、包括的に、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、または５５％の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸の質量収率を産生し得る。
【０２１７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ＭＶＡ経路に向かう炭素流を増大させる１つまたは複数の変異をさらに含んでなり、それは、同様に操作されていない細胞と比較して、メバロン酸の質量収率をもたらす。さらに、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞を上回るメバロン酸の質量収率を有する。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０２１８】
一態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを欠く同一細胞と比較して、発酵ブロス中により少量の酢酸を蓄積する一方で、メバロン酸を産生する。組換え細胞は、４８時間の発酵中に、４．５ｇ／Ｌ未満の酢酸を発酵ブロス中に蓄積する一方で、増大したメバロン酸レベルを生じ得る。代案としては、組換え細胞は、４８時間の発酵中に、包括的に、約８．０ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７．０ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６．０ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌ未満の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値酢酸を発酵ブロス中に蓄積する一方で、増大したメバロン酸レベルを生じ得る。特定の実施形態では、発酵ブロス中の酢酸蓄積低下は、発酵稼働中の細胞生存率を改善し得る。
【０２１９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、同様に操作されていない細胞と比較して、発酵ブロス中により少量の酢酸を蓄積する一方で、ＭＶＡ経路に向かう炭素流を増大させて、メバロン酸レベルの増大をもたらす、１つまたは複数の変異をさらに含んでなる。特定の実施形態では、発酵ブロス中の酢酸蓄積低下は、発酵稼働中の細胞生存率を改善し得る。
【０２２０】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２２１】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２２２】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２２３】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるメバロン酸産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２２４】
組換え細胞を使用して増大した量のメバロン酸を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、メバロン酸を生産する方法である。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流が増大するように操作された、メバロン酸を産生できる組換え細胞（上述の組換え細胞のいずれかをはじめとする）またはそれらの子孫を含んでなる組成物を培養するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸の生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にメバロン酸を産生させるステップとを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
【０２２５】
本明細書に記載されるように、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏ��ｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
さらに、組換え細胞は、細胞を最少培地中で培養した際に、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る濃度で、メバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅ���ｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、��レモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０２２６】
メバロン酸を生産するための本方法は、２．００ｇ／Ｌ／ｈｒのメバロン酸を超える容積生産性を有する細胞を使用して、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒを超える、ならびにこれらの数字間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
【０２２７】
他の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、４８時間の発酵後に、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回るピーク力価がある、メバロン酸を産生する。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・���ーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え��胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２２８】
メバロン酸を生産する本方法は、４８時間に発酵後に、約１００ｇ／Ｌピーク力価のメバロン酸を超えるピーク力価を生じ得る細胞を使用して、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、４８時間の発酵後に、包括的に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌを超える、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のピーク力価のメバロン酸を産生し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
【０２２９】
他の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞を上回る、メバロン酸のＣＰＩを有する。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏ���ｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／また��図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２３０】
メバロン酸を生産するための本方法は、細胞を使用して、少なくとも約３．０（ｇ／ｇ）のメバロン酸のＣＰＩで、メバロン酸を生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）、または３０（ｇ／ｇ）の、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸のＣＰＩを有し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
【０２３１】
特定の実施形態では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較して、ＯＵＲに最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍または７倍の低下を示す。
【０２３２】
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、メバロン酸の生産を向上させる方法である。細胞によるメバロン酸の生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グ���イー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２３３】
メバロン酸の生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がない、メバロン酸産生細胞によるメバロン酸の生産と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍，約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコ��ドする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２３４】
その他の態様では、本明細書に記載される方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がない、メバロン酸産生細胞によるメバロン酸の生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、メバロン酸の生産向上を提供し得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
【０２３５】
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼ遺伝子を内在性に有しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を３４℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、；（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）��シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から��離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
【０２３６】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２３７】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２３８】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２３９】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、メバロン酸を生産するステップとを含んでなる、メバロン酸を生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０２４０】
イソプレンを産生できる組換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、幅広い用途で利用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造をはじめとする、多数の化学薬品組成物およびポリマーの合成において、中間体または出発原料として用いられる。イソプレンはまた、多数の植物および動物によって天然に合成される重要な生物学的材料である。
【０２４１】
イソプレンは、イソプレンシンターゼの酵素作用によって、ＤＭＡＰＰから生成される。そのため、理論に束縛されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、メバロン酸経路を含んでなる組換え細胞内で、Ｅ４Ｐ、ＧＡＰ、Ａｃ−Ｐ、および／またはアセチルＣｏＡの細胞産生を増大させることは、より大量のイソプレン生産も同様にもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（例えば下流ＭＶＡ経路）の、およびイソプレンおよびイソプレノイド生産のためのその他の適切な酵素の、適切な酵素活性レベルと組み合わせると、グルコースから生成されるイソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。
【０２４２】
本明細書に記載されるように、本発明は、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、１つまたは複数の異種核酸および（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸（すなわち、上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路）および（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、細胞は、回収可能量のイソプレンを産生できる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの生産を向上させる能力がある組換え細胞を提供し、細胞は、（ｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドコードする、１つまたは複数の異種核酸および細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。
【０２４３】
イソプレンの生産はまた、酵素活性が調節されて、メバロン酸生成と、引き続くイソプレノイド前駆体、イソプレノイド、および／またはイソプレン生産に向かう炭素流が増大される、酵素経路操作の１つまたは複数をさらに含んでなる、本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを使用して実施し得る。アセチルＣｏＡ生成のためのホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞をメバロン酸生産と、引き続くイソプレノイド前駆体、イソプレノイド、および／またはイソプレン生産のために使用し得る。一実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０２４４】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成または方法のいずれかに記載される細胞は、下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０２４５】
下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をさらに含んでなり得る。本明細書で提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、１つまたは複数の上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／または１つまたは複数の下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を含んでなり得る。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する；および（ｃ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびＭ．ブルトニイ（Ｍ．Ｂｕｒｔｏｎｉｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群に由来し得る。別の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼである。
【０２４６】
いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、異種下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）からのポリペプチドである。
【０２４７】
下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれ得て、または細胞内で安定して発現され得る。下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
【０２４８】
例示的な下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを以下にさらに提供する：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）。具体的には、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）に由来し得て、より具体的には、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）に由来し得る。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＫポリペプチドは、Ｍ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）に由来し得る。下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの追加的な例は、下流ＭＶＫ経路ポリペプチドおよび下流ＭＶＫ経路ポリペプチド変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書にある。
【０２４９】
下流ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路核酸としては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、より良いイソプレン生産の結果をもたらす、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド変異体もまた使用し得る。
【０２５０】
いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）からのポリペプチドである。いくつかの態様では、ＭＶＫポリペプチドは、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびＭ．ブルトニイ（Ｍ．Ｂｕｒｔｏｎｉｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本明細書に記載されるいずれかのプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるプロモーター）を使用して、本明細書に記載されるＭＶＡポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
【０２５１】
本明細書に記載される細胞のいずれでも、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル二リン酸ΔイソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換し、および／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞内抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを相互転換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＩＤＩ核酸としては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０２５２】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、（本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大するように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）などの雑種からのポリペプチドである。
【０２５３】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０２５４】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレシンターゼンをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０２５５】
例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。
【０２５６】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０−１３０１６，１９９５に記載されるようにして、測定し得る。１つの例示的なアッセイでは、窒素流下で、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を蒸発するまで乾燥させて、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．２中で１００ｍＭの濃度に再水和して、−２０℃で保存し得る。アッセイを実施するために、金属ねじ蓋およびテフロン被覆ケイ素隔壁付き２０ｍｌのＨｅａｄｓｐａｃｅバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内の２５μＬの細胞抽出物に、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭの（２５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５％グリセロール、および２ｍＭのＤＴＴ）の溶液を添加して、振盪しながら３７℃で１５分間培養し得る。反応は、２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することでクエンチし、ＧＣ／ＭＳによって定量化し得る。
【０２５７】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプライソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズイソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドまたはそれらの変異体である。
【０２５８】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ亜科（Ｆａｂｏｉｄｅａｅ）などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００−７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（ｔｒｅｍｕｌａ）（ＣＡＣ３５６９６）など（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３−４８７，２００１）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）など（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０−１３１６，１９９５）、ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒらに付与された国際公開第９８／０２５５０号パンフレット）からのポリペプチドまたは核酸、またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、またはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体）をコードする核酸は、コドン最適化される。
【０２５９】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは核酸（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの天然ポリペプチドまたは核酸）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸でない。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変異体（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変種）である。
【０２６０】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、変種である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変種である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然起源イソプレンシンターゼの変異体であり、天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された安定性（熱安定性など）を有する。
【０２６１】
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、または約９０％〜約９５％のアミノ酸配列同一性のいずれかを有する。
【０２６２】
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼ中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、変異体と、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基など、１つまたは複数であり得る。天然起源イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛イソプレンシンターゼ、ポプライソプレンシンターゼ、ヨーロッパナライソプレンシンターゼ、および柳イソプレンシンターゼなど、植物からの任意のイソプレンシンターゼが挙げられる。いくつかの態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体である。いくつかの態様では、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体は、少なくとも１種のアミノ酸置換、少なくとも１種のアミノ酸挿入、および／または少なくとも１種のアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）イソプレンシンターゼである。いくつかの態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体をコードする核酸は、コドン最適化される（例えば、その中で異種イソプレンシンターゼが発現される宿主細胞に基づいてコドン最適化される）。
【０２６３】
本明細書で提供されるイソプレンシンターゼポリペプチドは、イソプレンシンターゼおよびイソプレンシンターゼ変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２４１４６号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書に記載される、イソプレンシンターゼまたはイソプレンシンターゼ変異体のいずれかであり得る。
【０２６４】
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるいずれかのプロモーター）を使用して、本明細書に記載されるイソプレンシンターゼのいずれかの発現を駆動し得る。
【０２６５】
適切なイソプレンシンターゼとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、およびＡＹ１８２２４１によって同定されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される組成物、またはイソプレンシンターゼをコードする微生物を作成する方法をはじめとする方法のいずれかで、使用し得るイソプレンシンターゼのタイプは、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２４１４６号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレット、国際公開第２０１２／０５８４９４号パンフレット、および米国特許第８，１７３，４１０号明細書にもまた記載される。
【０２６６】
イソプレン生合成経路
イソプレンは、２種の異なるアルコール、３−メチル−２−ブテン−１−オール、および２−メチル−３−ブテン−２−オールから生成され得る。例えば、二段階イソプレン生合成経路では、シンターゼ（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼ）などの酵素によって、ジメチルアリル二リン酸が２−メチル−３−ブテン−２−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼによる、２−メチル−３−ブテン−２−オールのイソプレンへの変換がそれに続いた。別の例として、三段階イソプレン生合成経路では、ジメチルアリル二リン酸を３−メチル−２−ブテン−１−オールに変換できるホスファターゼまたはシンターゼ（例えば、ゲラニオールシンターゼまたはファルネソールシンターゼ）のどちらかによって、ジメチルアリル二リン酸が３−メチル−２−ブテン−１−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼによって、３−メチル−２−ブテン−１−オールが２−メチル−３−ブテン−２−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼによって、２−メチル−３−ブテン−２−オールがイソプレンに変換される。例えば、米国特許出願公開第２０１３０３０９７４２Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０３０９７４１Ａ１号明細書を参照されたい。
【０２６７】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞（本明細書に記載されるように改変された宿主細胞を含む）は、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼ、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼ、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼからなる群から選択される、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞が、野生型細胞と比較して、イソプレン生合成経路の内在性ポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０２６８】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０２６９】
イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０２７０】
例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１オールシンターゼポリペプチドなどの、イソプレン生合成経路のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチド、およびイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレン生合成経路のポリペプチドの変異体（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。
【０２７１】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、ホスファターゼである。例示的なホスファターゼとしては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのホスファターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、テルペンシンターゼ（例えば、ゲラニオールシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、リナロールシンターゼまたはネロリドールシンターゼ）である。例示的なテルペンシンターゼとしては、スイートバジル（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、レモンエゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、シナモマム・テヌイピル（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）からのテルペンシンターゼが挙げられる。追加的な例示的テルペンシンターゼとしては、クラルキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セトエゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｓｅｔｏｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、サルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ）、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｐｏｌｙｇａｍａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｅｓｉａ  ａｎｎｕａ）、スイートバジル（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、ミズハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ａｑｕａｔｉｃａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、エゾヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、またはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）からのテルペンシンターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、テルペンシンターゼは、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。例えば、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から３−メチル−２−ブテン−１−オールへの変換を触媒し得る（例えば、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼ）。いくつかの態様では、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から２−メチル−３−ブテン−２−オールへの変換を触媒し得る（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼ）。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド（例えば、アキンコラ・ターチアリカルボニス（Ａｑｕｉｎｃｏｌａ  ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ）からの２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド）またはその変異体である。いくつかの態様では、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド（例えば、カステラニエラ・デフラグランス（��ａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＦＲ６６９４４７からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド）またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド（例えば、カステラニエラ・デフラグランス（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＦＲ６６９４４７からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド）またはその変異体である。
【０２７２】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが所望のイソプレン生合成経路酵素活性（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼ活性、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼ活性、および３−メチル−２−ブテン−１−オール活性）を有するかどうかを判定し得る。例えば、米国特許出願公開第２０１３０３０９７４２Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０３０９７４１Ａ１号明細書を参照されたい。
【０２７３】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路ポリペプチドは、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドの変異体であり、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドと比較して、改善された安定性（熱安定性など）を有する。
【０２７４】
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、または約９０％〜約９５％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。
【０２７５】
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の変異体と、野生型または天然起源ポリペプチドの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基など、１つまたは複数であり得る。いくつかの態様では、変異体（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）をコードする核酸は、コドン最適化される（例えば、イソプレン生合成経路の異種ポリペプチドがその中で発現される宿主細胞に基づいて、コドン最適化される）。
【０２７６】
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載される本開示の実施例で同定されるプロモーター）のいずれかを使用して、本明細書に記載されるイソプレン生合成経路のポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
【０２７７】
ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、（本明細書に記載されるようにホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸の染色体のコピーをさらに含んでなる。いくつかの態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ＩＤＩポリペプチドおよびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、複数のプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。
【０２７８】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許第２００９／０２０３１０２号明細書、米国特許第２０１０／０００３７１６号明細書、および米国特許第２０１０／００４８９６４号明細書に、より詳細に記載される。
【０２７９】
例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの１つまたは２つ以上の活性を有する、ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、およびポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のいずれかが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路核酸としては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチド、および核酸、およびＤＸＰ経路ポリペプチド活性を測定する方法は、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットにより詳細に記載される。
【０２８０】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチド、および核酸、およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許第２００９／０２０３１０２号明細書、米国特許第２０１０／０００３７１６号明細書、および米国特許第２０１０／００４８９６４号明細書により詳細に記載される。
【０２８１】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８２】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８３】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８４】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８５】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰまたはｃＭＥＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８６】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸を（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰまたはＨＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８７】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０２８８】
下流ＭＶＡ経路、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＰ経路ポリペプチドの起源生物
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／または下流ＭＶＡ経路核酸（およびそれらがコードするポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／または下流ＭＶＡ経路核酸を天然に含有する、任意の生物から得られ得る。イソプレンは、細菌、酵母、植物、および動物などの多様な生物によって、天然に形成される。いくつかの生物が、イソプレンを生成するためのＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼ核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得られ得る。ＭＶＡ経路核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得られ得る。ＩＤＩおよびＤＸＰ経路核酸は、例えば、ＩＤＩおよびＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得られ得る。
【０２８９】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、またはラン藻から単離され得る。例示的な起源生物としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種などの酵母、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種などの細菌、またはメタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）の種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、葛またはポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６）またはアスペン（例えば、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））などの植物が挙げられる。使用し得る例示的なイソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチド起源は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレットにもまた記載される。
【０２９０】
いくつかの態様では、起源生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの酵母である。
【０２９１】
いくつかの態様では、起源生物は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）などのパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）の株、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）またはＳ．ルビギノーサス（Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの株、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）などの古細菌の株などの細菌である。
【０２９２】
本明細書の用法では、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、当業者に知られているような「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」内の全ての種が挙げられる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、分類学の再編成を継続的に受けていることが認識されている。したがって本属は、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（ＧｅｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と命名されている、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、再分類された種を含むことが意図される。酸素の存在下における耐性内生胞子の生成は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を決定付ける特徴と見なされるが、この特徴は、最近命名された、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバシルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびバルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
【０２９３】
いくつかの態様では、起源生物は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、またはＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が挙げられる。いくつかの態様では、起源生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などのグラム陰性細菌である。
【０２９４】
いくつかの態様では、起源生物は、マメ亜科（Ｆａｂｏｉｄｅａｅ）などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からの植物などの植物である。いくつかの態様では、起源生物は、葛、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓなど）、またはヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）である。
【０２９５】
いくつかの態様では、起源生物は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類である。
【０２９６】
いくつかの態様では、起源生物は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である：クロオコッカス目（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）、またはスティゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）。
【０２９７】
イソプレンの生産増大能力がある組換え細胞
（本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組換え細胞は、同一条件下で培養された場合に、異種核酸ホスホケトラーゼポリペプチドの１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を欠く同一細胞を上回る濃度で、イソプレンを産生する能力を有する。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリ��・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えばＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））である。
【０２９８】
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエン���ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０２９９】
いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる異種核酸である。その他の態様では、１つまたは複数の異種核酸は、プラスミドに組み込まれる。なおも別の態様では、１つまたは複数の異種核酸配列の少なくとも１つがプラスミドに組み込まれる一方で、１つまたは複数の異種核酸の少なくとも１つは細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレン産生細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレンを産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高い、ならびにこれらの数の間の任意の数値分高いイソプレンを産生し得る。
【０３００】
本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞である。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。１つまたは複数の異種核酸のいずれでも、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホケトラーゼ、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数を、宿主細胞のゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。１つまたは複数の異種核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
【０３０１】
本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに従った細胞によるイソプレンの生産は、向上させ得る（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチド、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって向上させる）。本明細書の用法では、イソプレンの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレンの細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレンの力価増大、イソプレンの質量収率増大、および／またはイソプレンの比生産性増大を指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＥ４Ｐ、ＧＡＰ、Ａｃ−Ｐ、および／またはアセチルＣｏＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
【０３０２】
本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生産は、約５％から約１，０００，０００倍向上させ得る。特定の態様では、イソプレンの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
【０３０３】
その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
【０３０４】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｅ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｆ）イソプレン比生産性が、さらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３０５】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｄ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｅ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３０６】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｅ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｆ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３０７】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できるイソプレン産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｄ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｅ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３０８】
組換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養するステップを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。一態様では、イソプレンは、本明細書に記載されるような任意のホスホケトラーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養することで、生産し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０３０９】
別の態様では、イソプレンは、本明細書に記載される酵素経路のいずれかの調節と、ホスホケトラーゼペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸とを含んでなる、組換え細胞を培養することで、生産し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。イソプレンは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかによって、生産し得る。グルコースなどの六炭糖および／またはキシロースなどの五炭糖をはじめとするが、これに限定されるものではない炭水化物からイソプレンを生産する目的で、細胞のいずれかを使用し得る。
【０３１０】
したがって、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、ホスホケトラーゼポリペプチドとイソプレンシンターゼとをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０３１１】
細胞は、上述のＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば完全ＭＶＡ経路）、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えばクズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）イソプレンシンターゼ）のいずれかをコードする、１つまたは複数の核酸分子をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれか１つであり得る。本明細書に記載されるイソプレンシンターゼまたはそれらの変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／または本明細書に記載されるベクターのいずれかもまた使用して、本明細書に記載される方法で使用し得る本明細書に記載されるエネルギー源のいずれか（例えば、グルコースまたはキシロース）を使用して、イソプレンを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。
【０３１２】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドと、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、および／またはＩＤＩ）をコードする１つまたは複数の核酸分子、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。
【０３１３】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、および／またはＩＤＩ）をコードする１つまたは複数の核酸分子、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。
【０３１４】
ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞を使用して、イソプレンを生産し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性が増大するようにさらに操作し得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに操作し得る。
【０３１５】
いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク絶対生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク絶対生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク比生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク比生産性は、本明細書で開示される細胞あたりのイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの累積総量が測定される。いくつかの態様では、細胞累積総生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。
【０３１６】
いくつかの態様では、（細胞が培養中にある実施例では）本明細書に記載される細胞のいずれかは、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅイソプレン／ｇ湿潤細胞重量／ｈｒ（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかのイソプレンを産生する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒなど、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０３１７】
いくつかの態様では、培養中の細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇイソプレン／ｇ湿潤細胞重量／ｈｒ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）以上のイソプレンを生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈなどの約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０３１８】
いくつかの態様では、培養中の細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇイソプレン／Ｌブロス（ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む）以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかである、イソプレンの累積力価（総量）を生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈなどの約２〜約１００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。
【０３１９】
いくつかの態様では、培養中の細胞によって産生されるイソプレンは、容量基準で発酵発生気体の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、または２５％を構成する。いくつかの態様では、イソプレンは、発生気体の容量基準で約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％、または約１〜約１０％などの約１〜約２５％を構成する。
【０３２０】
特定の実施形態では、イソプレンを生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内在性に発現しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、細胞が、（ｉ）１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の核酸、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼと並んで、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較して、ＯＵＲに最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍または７倍の低下を示す。
【０３２１】
本明細書でまた提供されるのは、イソプレン生産を向上させる能力がある細胞を含んでなる、イソプレンを生産する方法である。本明細書に記載される細胞によるイソプレンの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。本明細書の用法では、イソプレンの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼポリペプチドＭＶＡ経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレンの細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレンの力価増大、イソプレンの質量収率増大、および／またはイソプレンの比生産性増大を指す。イソプレンの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。イソプレ��の生産は、ホスホケトラーゼ酵素を内在性に発現しないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている、宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
【０３２２】
その他の態様では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される細胞によるイソプレンの生産向上を対象とする（例えばホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上される）。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。イソプレンの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。イソプレンの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。イソプレ��の生産はまた、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレン産生細胞によるイソプレンの生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている、宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、イソプレンの生産向上が提供される。
【０３２３】
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼ遺伝子を内在性に有しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を３４℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、（ｉ）低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種遺伝子の１つまたは複数のコピー、（ｉｉ）ＭＶＡ経路ポリペプチド（上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路）の１つまたは複数のポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を異種性に発現するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。いくつかの実施態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。なおも別の実施形態では、ホスホケトラーゼは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。なおも別の実施態様では、ホスホケトラーゼは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。
【０３２４】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｅ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｆ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３２５】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｄ）イソプレン収率タンパク質溶解度、または（ｅ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３２６】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｅ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｆ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３２７】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。その他の実施形態では、性能指標値パラメータとしては、（ｄ）イソプレン収率タンパク質溶解度または（ｅ）イソプレン比生産性がさらに挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３２８】
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産増大能力がある組換え細胞
イソプレノイドは、多数の生物中で、ＭＶＡ経路の最終生成物であるイソプレノイド前駆体分子の合成から生成され得る。上述のように、イソプレノイドは、重要なクラスの化合物に相当し、例えば、食品および飼料補給剤、フレーバーおよび臭気化合物、および抗がん、抗マラリア、抗真菌、および抗菌化合物を含む。
【０３２９】
分子クラスとして、イソプレノイドは、化合物に含まれるイソプレン単位数に基づいて分類される。モノテルペンは、１０個の炭素または２個のイソプレン単位を含んでなり、セスキテルペンは、１５個の炭素または３個のイソプレン単位を含んでなり、ジテルペンは、２０炭素または４個のイソプレン単位を含んでなり、セステルテルペンは、２５個の炭素または５個のイソプレン単位を含んでなり、以下同じように続く。ステロイド（一般的に約２７個の炭素を含んでなる）は、イソプレノイドの切断または再構成生成物である。
【０３３０】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから生成され得る。これらの多様な化合物は、これらの比較的単純な汎用前駆体から誘導され、保存的ポリプレニルピロリン酸シンターゼのグループによって合成される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。それらの特有の生理学的機能を反映する、これらの直鎖プレニルピロリン酸の様々な鎖長は、一般に、アリル性基質（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ピロリン酸ゲラニル（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、対応する数のイソペンテニルピロリン酸（Ｃ５−ＩＰＰ）との縮合反応を通じて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位によって判定される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。
【０３３１】
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドは、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成増大のための、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる、組換え宿主細胞のいずれかを使用して生成し得る。いくつかの態様では、これらの細胞は、上述のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、および／またはＤＸＰ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とをさらに含んでなる。理論により拘束されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、組換え細胞内で、メバロン酸の細胞産生を増大させることは、同様により大量のイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド生成をもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、およびイソプレンおよびイソプレノイド生成のためのその他の適切な酵素の適切な酵素活性レベルとグルコースを組み合わせると生成される、イソプレンをはじめとするイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。本明細書に記載される、メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する組換え細胞を使用して、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生成し得る。いくつかの態様では、組換え細胞をさらに改変して、ｒｐｉＡ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤからなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させ得る。別の態様では、これらの株をさらに改変して、ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡおよび／またはｐｔｓ遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させ得る。
【０３３２】
イソプレノイドのタイプ
本発明の組換え細胞は、イソプレノイドおよびイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの産生を増大できる。イソプレノイドの例としては、制限なしに、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、より高級なポリテルペノイドが挙げられる。いくつかの態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、またはイソ吉草酸である。いくつかの態様では、モノテルペノイドは、制限なしに、ピロリン酸ゲラニル、ユーカリプトール、リモネン、またはピネンであり得る。いくつかの態様では、セスキテルペノイドは、ピロリン酸ファルネシル、アルテミシニン、またはビサボロールである。いくつかの態様では、ジテルペノイドは、制限なしに、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、またはアフィジコリンであり得る。いくつかの態様では、トリテルペノイドは、制限なしに、スクアレンまたはラノステロールであり得る。イソプレノイドはまた、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択し得る。
【０３３３】
いくつかの態様では、テトラテルペノイドは、リコペンまたはカロテン（カロテノイド）である。本明細書の用法では、「カロテノイド」という用語は、植物の葉緑体および有色体中、藻類などのいくつかのその他の光合成生物の葉緑体および有色体中、ある種の真菌およびいくつかの細菌中に生じる、一群の天然有機色素を指す。カロテノイドとしては、酸素含有キサントフィルおよび酸素非含有カロテンが挙げられる。いくつかの態様では、カロテノイドは、キサントフィルおよびカロテンからなる群から選択される。いくつかの態様では、キサントフィルは、ルテインまたはゼアキサンチンである。いくつかの態様では、カロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチンまたはリコペンである。
【０３３４】
その他の実施形態では、イソプレノイドは、制限なしに、レチノール、レチニルパルミテート、レチノイン酸、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、またはキサントフィルβ−クリプトキサンチンなどのビタミンＡの形態であり得る。なおも別の実施形態では、イソプレノイドは、制限なしに、トコフェロール（例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、またはδトコフェロール）またはトコトリエノール（例えば、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、またはδトコトリエノール）などのビタミンＥの形態であり得る。
【０３３５】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、上述のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ならびにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。代案としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
【０３３６】
いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０３３７】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０３３８】
例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。例示的なシンターゼポリペプチドとしては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、制限なしに、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、または任意のその他の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなどのポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０３３９】
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によってコードされる内在性ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によってコードされる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰシンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
【０３４０】
いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。
【０３４１】
ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ＦＰＰシンターゼをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０３４２】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰを高級イソプレノイドに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号明細書、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０；Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１年４月１２日［印刷前のデジタル出版］；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１年３月２４日［印刷前のデジタル出版］］；Ｋｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１１年３月７日；１１：４３；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０年１１月２１日；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ＆Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０年１２月；１５４（４）：１９９８−２００７；およびＫｏｌｌｎｅｒ＆Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０年８月２０日；７５（１６）：５５９０−６００に記載される。
【０３４３】
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産増大能力がある組換え細胞
（本明細書に記載されるような、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組換え細胞（例えば組換え細菌細胞）は、同一条件下で培養された場合に、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を欠く同一細胞を上回る量および／または濃度で、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する能力を有する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサル��リア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。
【０３４４】
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエン���ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞��、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えばＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））である。
【０３４５】
いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる異種核酸である。その他の態様では、１つまたは複数の異種核酸は、プラスミドに組み込まれる。なおも別の態様では、１つまたは複数の異種核酸配列の少なくとも１つがプラスミドに組み込まれる一方で、１つまたは複数の異種核酸の少なくとも１つは細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産細胞と比較して、少なくとも５％高いイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド量を産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高い、ならびにこれらの数の間の任意の数値分高いイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生し得る。
【０３４６】
本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞である。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。１つまたは複数の異種核酸のいずれでも、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホケトラーゼ、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数を、宿主細胞のゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。１つまたは複数の異種核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
【０３４７】
本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに従った細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産は、向上させ得る（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチド、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって向上させる）。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産「向上」とは、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの質量収率増大、および／またはイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＥ４Ｐ、ＧＡＰ、Ａｃ−Ｐ、および／またはアセチルＣｏＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている。
【０３４８】
本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。特定の態様では、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、ａｂｏｕｔ１〜約５０，０００倍、ａｂｏｕｔ１〜約５，０００倍、ａｂｏｕｔ１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産向上が提供される。
【０３４９】
その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ経路を通過するＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、ホスホケトラーゼ経路を通過するメバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産向上が提供される。
【０３５０】
本発明の一態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、１つまたは複数の完全ＭＶＡ経路（すなわち、上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路）ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする１つまたは複数の異種核酸および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞が提供される。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。さらにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰシンターゼポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ��種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラー��をコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えばＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））である。１つまたは複数の異種核酸は、１つまたは複数のベクター上にさらに存在し得る。
【０３５１】
本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産向上を提供し得る組換え細胞である。細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、完全ＭＶＡ経路（すなわち、上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路）の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドはバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来する。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（ＬｅｕｃｏＮｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。別の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。
一実施形態では、組換え細胞は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。さらに別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエン���ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。なおも別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞��、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えばＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））である。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産「向上」は、ホスホケトラーゼ、完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチド、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産細胞生産性指標（ＣＰＩ）の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド力価の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド質量収率の増大、および／またはイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド比生産性の増大を指す。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がない細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されており、それによって、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
【０３５２】
本明細書に記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、向上させ得る（例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸によって向上させる）。
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、天然細胞（例えば、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸とを発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。
【０３５３】
その他の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞はまた、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しないイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド産生組換え細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍数、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで向上させ得る、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産を提供し得る。
【０３５４】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３５５】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３５６】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３５７】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド産生組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３５８】
組換え細胞を使用してイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体分子を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼおよびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞（例えば組換え細菌細胞）を培養するステップを含んでなる、イソプレノイド前駆物質分子および／またはイソプレノイドを生産する方法である。特定の実施形態では、組換え細胞は、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドおよび下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、生産し得る。グルコースなどの六炭糖をはじめとする炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する目的で、細胞のいずれかを使用し得る。
【０３５９】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｓｐ．、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドと、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、および／またはＩＤＩ）をコードする１つまたは複数の核酸分子、および上述のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリプレニルピロリン酸シンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／またはベクター本明細書に記載されるのいずれかもまた使用して、本明細書に記載されるエネルギー源（例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖）のいずれかを使用して、イソプレノイ��前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０３６０】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを生産するのに適した条件で、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｓｐ．、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドと、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法である。細胞は、上述の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、および／またはＩＤＩ）をコードする１つまたは複数の核酸分子、および上述のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリプレニルピロリン酸シンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／または本明細書に記載されるベクターのいずれかもまた使用して、本明細書に記載されるエネルギー源（例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖）のいずれかを使用して、イソプレノイ��前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０３６１】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、同様に、（ａ）ホスホケトラーゼを内在性に有しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を培養するステップであって、組換え細胞が、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと；（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して、より高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する。
【０３６２】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する本方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高いイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０３６３】
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体分子生産を向上させる方法である。細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼをコードしおよび／またはＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって、向上させ得る。本明細書の用法では、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産「向上」は、ホスホケトラーゼ、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチド、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産の細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの質量収率増大、および／またはイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上させ得る。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がない細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている組換え宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
【０３６４】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産もまた、本明細書に記載される方法によって、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現がないイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド産生細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍数、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、向上させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、ＭＶＡ生成に向かう炭素流が増大するようにさらに操作されている組換え宿主細胞を含んでなり、それによって、ホスホケトラーゼペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させるように操作されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産向上が提供される。
【０３６５】
さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載される方法で細胞を培養し得る。例えば、いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子を内在性に有しない、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）組換え細胞を３４℃の最少培地中で培養するステップであって、組換え細胞が、低から中程度のプラスミドコピーで、強力なプロモーター制御下において、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａ��ａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）からのホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなり、いくつかの態様では、方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０３６６】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３６７】
本明細書でまた提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３６８】
本明細書でさらに提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞は、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の生産、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３６９】
本明細書で提供されるのは、ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞を培養するステップと、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産する方法であって、組換え細胞は、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する、組換え細胞。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３７と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３９と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４１と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４４と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４５と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる。その他の実施形態では、前記パラメータのいずれかの前記性能指標値は、親ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼ）と比較して、１．１を超えるなど、１．２を超えるなど、１．４を超える、１．６を超える、１．８を超える、２を超える、２．２を超える、２．４を超える、２．６を超える、２．８を超える、３を超える、３．２を超える、３．４を超える、３．６を超える、３．８を超える、４を超える、４．２を超える、４．４を超える、４．６を超える、４．８を超える、５を超える、５．２を超える、５．４を超える、５．６を超える、５．８を超える、６を超える、６．２を超える、６．４を超える、６．６を超える、６．８を超える、７を超える、７．２を超える、７．４を超える、７．６を超える、７．８を超える、８を超える、８．２を超える、８．４を超える、８．６を超える、８．８、９を超える、９．２を超える、９．４を超える、９．６を超える、９．８、または１０を超えるまたはそれを上回るのいずれかである。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜０．５、約０．２５〜０．７５、約０．５〜１、約０．７５〜１．２５、約１〜１．５、約１．２５〜１．７５、約１．５〜２、約１．７５〜２．２５、約２〜２．５、約２．２５〜２．７５、約２．５〜３、約２．７５〜３．２５、約３〜３．５、約３．２５〜３．７５、約３．５〜４、約３．７５〜４．２５、約４〜４．５、約４．２５〜４．７５、約４．５〜５、約４．７５〜５．２５、約５〜５．５、約５．２５〜５．７５、約５．５〜６、約６．２５〜６．７５、約６．５〜７、約６．７５〜７．２５、約７〜７．５、約７．７５〜８．２５、約８〜８．５、約８．２５〜８．７５、約８．５〜９、約８．７５〜９．２５、約９〜９．５、約９．２５〜９．７５、または約９．５〜１０以上のいずれかを超える。その他の実施形態では、細胞性能指標は、親分子と比較して、約０．１〜２、約１〜３、約２〜４、約３〜５、約４〜６、約５〜７、約６〜８、約７〜９、または約８〜１０以上のいずれかを超える。いくつかの実施形態では、親分子は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのホスホケトラーゼである。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０３７０】
ベクター
本明細書に記載される組成物および方法のいずれかにおいて、適切なベクターを使用し得る。例えば、適切なベクターを使用して、特定の宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で、ホスホケトラーゼ、ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、またはポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードする、遺伝子の１つまたは複数のコピーの発現を最適化し得る。いくつかの態様では、ベクターは選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対する栄養上の利点などの代謝上の利点をもたらす核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼ；ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド；下流ＭＶＡ経路ポリペプチド；Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ核酸；イソプレンシンターゼ；またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸の１つまたは複数のコピーが、選択マーカーなしで宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０３７１】
本明細書で特性解析され、または本開示の実施例で使用される、ベクターのいずれかを本発明で使用し得る。
【０３７２】
形質転換方法
ホスホケトラーゼ、ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／または下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピーを、適切な技術を使用して細胞中に挿入し得る。さらに、形質転換、電気穿孔、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介またはＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質移入または組換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿によるインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルでの高速衝撃、およびプロトプラスト融合などの、宿主細胞にＤＮＡコンストラクトまたはベクターを導入するための標準的な技術を使用して、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸またはそれらを含有するベクターを、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞）中に挿入し得る。一般的形質転換技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれ、または染色体外自己複製配列として維持され得る。形質転換体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって選択し得る。形質転換体を選択する適切な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。
【０３７３】
例示的な宿主細胞
当業者は、発現ベクターが、特定の宿主株について遺伝子発現を最適化する特定構成要素を含有するように、デザインされることを認識するであろう。このような最適化構成要素としては、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書で言及されるベクターおよび構成要素は、例示的な目的のために記載され、本発明の範囲を狭めることは意図されない。
【０３７４】
遺伝子を異種性に発現するのに使用し得る任意の細胞またはそれらの子孫を使用して、１つまたは複数のホスホケトラーゼを発現させ得る。特定の実施形態では、細胞（例えば組換え細胞）は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏ��ｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０３７５】
上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼをコードする異種核酸がある細胞（例えば組換え細胞）はまた、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド（ｅ）、および／またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドを発現する、１つまたは複数の異種核酸によって操作し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）（例えばＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、またはＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えばラクトバチルス属（Ｌ．）種）の株が挙げられる。いくつかの実施形態では、起源生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、またはＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）などのグラム陰性細菌である。
【０３７６】
グラム陽性またはグラム陰性細菌をはじめとする細菌細胞を使用して、上述の異種遺伝子のいずれかを発現させ得る。具体的には、ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタスＢ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞のいずれか１つの中で発現され得る。
【０３７７】
本発明の組成物および方法で宿主細胞として使用し得る、多数のタイプの嫌気性細胞がある。本発明の一態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、偏性嫌気性細胞およびその子孫である。偏性嫌気性菌は、典型的に、酸素が存在する条件では、たとえ増殖したとしても、十分に増殖しない。小量の酸素は存在してもよいものと理解され、すなわち、低レベルの酸素に対して偏性嫌気性菌が有する、いくらかの耐性レベルがある。一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変された偏性嫌気性菌は、本明細書に記載される方法および／または組成物のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない実質的酸素非含有条件下で増殖される。
【０３７８】
本発明の別の態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかで記載されおよび／または使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞およびその子孫である。通性嫌気性菌は、酸素が存在すれば、好気性呼吸（例えば、ＴＣＡ回路の利用）によって細胞ＡＴＰを産生し得る。しかし通性嫌気性菌は、酸素不在下でもまた増殖し得る。これは、より多量の酸素の存在下で死滅し、または不十分に増殖する、偏性嫌気性菌とは対照的である。したがって一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物および／または方法のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変し得る。通性嫌気性宿主細胞は、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない、実質的に酸素非含有の条件下で増殖し得て、または代案としてはより多量の酸素の存在下で増殖し得る。
【０３７９】
宿主細胞はさらに、糸状菌細胞およびその子孫であり得る。（例えば、Ｂｅｒｋａ＆Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７−１５４を参照されたい）。いくつかの態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノース（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、Ｃ．ルクノウェンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）種、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、またはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、Ｆ．ロゼウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．グラミヌム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、Ｆ．セレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）などのフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）などのニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）種、Ｍ．ミーヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）などのケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）種、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種またはエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）種のいずれかであり得る。いくつかの態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アクレアトウス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）である。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０３８０】
宿主細胞はまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの酵母であり得る。いくつかの態様では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３−４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許第７，６５９，０９７号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０３８１】
宿主細胞は、さらに、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類種であり得る。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ＆Ｗａｒｍｂｒｏｄｔ，“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇｉ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ，”（１９９３），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、宿主細胞は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である：クロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）、またはスティゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）。（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０−７９を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２８２５４５号明細書、および国際公開第２０１１／０３４８６３号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０３８２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を使用して、任意の数の生物から１つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素を発現させ得る。特定の実施形態では、細胞（例えば組換え細胞）は、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、および／またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、表１、表２および／または図面３〜２４に列挙される生物から単離されたホスホケトラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０３８３】
これらの細胞はまた、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸によって操作し得る。一態様では、宿主細胞は、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の核酸を発現する、メバロン酸を産生できる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株またはその子孫の組換え細胞である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を欠く同一細胞を上回る、量、ピーク力価、および細胞生産性で、メバロン酸を産生し得る。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と並んで、上述のおよび本明細書のホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現する核酸は、染色体コピーであり得る（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組み込まれる）。その他の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は培養中にある。いくつかの態様では、１つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および／またはエンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）に由来する。任意の態様では、１つまたは複数のホスホケトラーゼ酵素は、本明細書で開示されるような任意のホスホケトラーゼ酵素である。
【０３８４】
例示的な宿主細胞修飾
クエン酸シンターゼ経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡの縮合を触媒して、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝産物である、クエン酸を形成する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：５２４３−５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００−２９０５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、ｇｌｔＡによってコードされるこの酵素は、二量体サブユニットの三量体のように挙動する。六量体形態は、酵素が、ＮＡＤＨによってアロステリックに調節され得るようにする。この酵素は、幅広く試験されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７−１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３−９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５−４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５−５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリックな阻害を回避するために、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼによる置換またはその添加が考察された（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９−２３９）。
【０３８５】
どちらも基質としてアセチルＣｏＡを有するために、クエン酸シンターゼによって触媒される反応は、メバロン酸経路の最初のステップを触媒するチオラーゼと直接競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６−２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させる）、より多くの炭素をメバロン酸経路に流動させ得て、それによってメバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。クエン酸シンターゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下する。いくつかの態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の活性を低下させることで調節される。これは、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子による、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体置換によって、またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を使用することで、達成し得る。クエン酸シンターゼの活性はまた、合成構成的低発現性プロモーターによって内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモーターを置換することで、調節し得る（例えば、低下させる）。クエン酸シンターゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。クエン酸シンターゼの活性の低下は、クエン酸シンターゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。クエン酸シンターゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０３８６】
ホスホトランスアセチラーゼおよび／または酢酸キナーゼが関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（（（ｉ）ｐｔａ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０−５５８  または（ｉｉ）ｅｕｔＤ（Ｂｏｌｏｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４８：６２９−６３６）によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でコードされるが、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の間の可逆的変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でコードされる）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６−９２２）は、アセチル−Ｐを使用して酢酸を形成する。これらの遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でオペロンとして転写され得る。これらは一緒に、ＡＴＰの放出と共に、酢酸の異化を触媒する。したがって、ホスホトランスアセチラーゼの活性を高めることで、アセチルＣｏＡに向かうアセチル−Ｐの量を増大させることが可能である。特定の実施形態では、強化は、上方制御されたプロモーターを染色体中の遺伝子上流に配置させることで、または遺伝子のコピーをプラスミド上の適切なプロモーターの後に配置させることで、達成される。酢酸に向かうアセチルＣｏＡの量を低下させるために、酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を低下させまたは弱め得る。特定の実施形態では、減衰は、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）を欠失させることで達成される。これはクロラムフェニコールカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで実施される。いくつかの態様では、酢酸キナーゼの活性は、内在性酢酸キナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性酢酸キナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。特定の実施形態では、酢酸処理を施したキナーゼ遺伝子の弱力化は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子の発現を妨害することで、実施されるべきである。酢酸は、様々な理由で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって産生される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２−５０）。理論により拘束されることなく、ａｃｋＡの欠失は、（ａｃｋＡはアセチルＣｏＡを利用するので）酢酸生成に転用される炭素量の低下をもたらし得て、したがってメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを増大させる。
【０３８７】
いくつかの態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、弱力化された内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現、または増大されたホスホトランスアセチラーゼを有しない細胞と比較して、低下した量の酢酸を産生する。生成する酢酸の量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。酢酸の量は、内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現またはホスホトランスアセチラーゼ遺伝子発現に分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０３８８】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）の活性は、酵素のその他の分子操作によって増大させ得る。酵素活性の増大は、操作が実施されなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性増大は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％増大する。一実施形態では、ｐｔａの活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。ホスホトランスアセチラーゼイソ酵素の活性調節（例えば、増大）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０３８９】
酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。酢酸キナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０３９０】
場合によっては、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性酢酸遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０３９１】
乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、Ｄ乳酸は、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡによってコードされる  −  図１）を通じて、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７−１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化を伴い、したがって酸素が制限されており、全ての還元当量に対応し得ない場合に、乳酸が生成する。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因になり得る。したがって、メバロン酸生成（および所望ならば、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイド生成）への炭素流動を改善するために、当業者は、酵素の活性を低下させることなどによって、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節し得る。
【０３９２】
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化によって調節し得る。このような弱力化は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失によって達成され得る。当業者に知られている乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を弱力化するその他の方法もまた、使用してもよい。乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路を操作することで、組換え細胞は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、低下した量の乳酸を産生する。生成する乳酸量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。乳酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０３９３】
乳酸デヒドロゲナーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０３９４】
したがって、場合によっては、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０３９５】
グリセルアルデヒド３−リン酸が関与する経路
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）は、グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビスホスホ−Ｄ−グリセリン酸塩への変換を触媒する、解糖の重要な酵素である（Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｇ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｃ．１９８５．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：６１−６６）。
【０３９６】
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させて）、フルクトース６−リン酸およびキシルロース５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下する。または１００％。いくつかの態様では、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、同一反応を触媒するが、ＮＡＤＰＨでなくＮＡＤＨを生じる、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）酵素によって置換され得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の低下は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０３９７】
エントナー・ドウドロフ経路が関与する経路
エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路は、エンデン・メイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路の代替物である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようないくつかの生物がＥＤおよびＥＭＰ経路の双方を持つ一方で、その他の生物はそのどちらか一方のみを有する。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５−３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９−８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５−８０３）。フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）は、エントナー・ドウドロフ経路と相互作用して、フルクトース−１，６−二リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）およびグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）への変換を可逆的に触媒する（Ｂａｌｄｗｉｎ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９７８）１６９（３）：６３３−４１）。
【０３９８】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）が、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸塩から１分子のＨ２Ｏを除去して、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸塩６−リン酸を形成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）は、アルドール切断を触媒する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８−４６４６）。２つの遺伝子は、オペロン中にある。
【０３９９】
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ＥＤ経路にも転用され得る。代謝産物が、ＥＤ経路に失われるのを回避するために、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性が弱力化される。弱力化を達成する一方法は、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることである。これはクロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって片方または双方の遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがってメバロン酸、イソプレンまたはイソプレノイドの収率を増大させる。
【０４００】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。
【０４０１】
場合によっては、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ−２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０４０２】
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ＥＤ経路またはＥＭＰ経路にも転用され得る。代謝産物の欠損を回避して、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）濃度を増大させるために、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（例えば、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ）活性が弱力化される。場合によっては、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。いくつかの態様では、弱力化は、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）を欠失させることで達成される。欠失は、クロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。いくつかの態様では、フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性は、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがって、メバロン酸、イソプレン、またはイソプレノイドの収率を増大させる。フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０４０３】
ペントースリン酸経路の酸化分岐が関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソースとペントースを分解し、細胞様々な同化経路のための中間体を提供する。それはまた、ＮＡＤＰＨの主な産生者でもある。ペントースリン酸経路は、酸化分岐（グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）のような酵素がある）、および非酸化分岐（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）などの酵素がある）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４−３３０）。
【０４０４】
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼＡ、リボース−５−リン酸イソメラーゼＢ、および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ）の発現を調節し（例えば、酵素活性を増大させ）、フルクトース６−リン酸およびキシルロース５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによって、メバロン酸、イソプレンおよびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％増大する。いくつかの態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、および（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることで、調節される。これは合成構成的高発現性プロモーターによって、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで達成し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードする遺伝子はまた、適切なプロモーターの後のプラスミド上にクローン化し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性の増大は、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現増大を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
【０４０５】
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。任意の本発明の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。任意の本発明の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソ酵素の活性調節（例えば、低下または増大）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）イソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソ酵素の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。
【０４０６】
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼを調節し得る（例えば、酵素活性を低下させる）。いくつかの態様では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）（例えば、内在性グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子）の活性は、低下または弱力化し得る。特定の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼを欠失させることで、弱力化が達成される。いくつかの態様では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼの活性は、内在性グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
【０４０７】
ホスホフルクトキナーゼが関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、フルクトース−６−リン酸のリン酸化を触媒する、解糖の重要な酵素である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢによってコードされる２つのイソ酵素を有する。細胞内のホスホフルクトキナーゼ活性の大部分は、ｐｆｋＡに起因する（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３８１：２５７−２６８）。
【０４０８】
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ホスホフルクトキナーゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させて）、フルクトース−６−リン酸およびキシルロース−５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレン、およびイソプレノイドの最終生産量を増大させる。ホスホフルクトキナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下される。または１００％。いくつかの態様では、ホスホフルクトキナーゼの活性は、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。ホスホフルクトキナーゼの活性の低下は、ホスホフルクトキナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。
【０４０９】
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、フルクトース−６−リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。フルクトース−６−リン酸イソ酵素の活性調節（例えば低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、フルクトース−６−リン酸イソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
【０４１０】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が関与する経路
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒し、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄＡによってコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、いくつかの調節因子によって調節される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節することで、アセチルＣｏＡを増大させ得る。変化は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性および／または発現の増大（例えば、持続的発現）であり得る。これは、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−λプロモーター、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６、配列番号１４）のような強力な構成的プロモーターを、オペロンの前に配置させる、または１つまたは複数の合成構成的発現プロモーターを使用するなどの異なる方法によって、達成され得る。
【０４１１】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つまたは複数の酵素の活性を増大させることで、調節される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性増大のために、これらの酵素をコードする遺伝子の任意の１、２または３つを操作し得るものと理解される。別の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性の弱力化によって調節し得て、詳細は下述される。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失によって弱力化し得る。
【０４１２】
場合によっては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする１つまたは複数の遺伝子は、内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増大させる別の方法は、細胞に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群からの１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を導入することである。
【０４１３】
これらの方法のいずれかを使用することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節されていない細胞と比較して、組換え細胞は、増大した量のアセチルＣｏＡを生じ得る。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現調節を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
【０４１４】
ホスホトランスフェラーゼ系が関与する経路
ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）は、解糖作用中間体ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によって提供されるエネルギーに依存するプロセス中で、その炭水化物基質を膜を越えて輸送し、同時にリン酸化する多要素システムである。ＰＴＳを調節する遺伝子は、大部分がオペロン中でクラスター化する。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のｐｔｓオペロン（ｐｔｓＨＩｃｒｒ）は、ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の中核を成す３つのタンパク質、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）、酵素Ｉ（ｐｔｓＩ）、およびＥＩＩＩＧｌｃ（ｃｒｒ）タンパク質をコードする、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、およびｃｒｒ遺伝子から構成される。これらの３つの遺伝子は複合オペロンに編成され、その中では、遠位遺伝子ｃｒｒの発現の大部分が、ｐｔｓＩ内のプロモーター領域から開始される。ｐｔｓオペロンの遺伝子に加えて、ｐｔｓＧは、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的輸送体、ｐｔｓＧをコードする。このプロモーター領域からの転写は、異化産物活性化タンパク質（ＣＡＰ）−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の正の制御下にあり、グルコース（ＰＴＳ基質）の存在下における増殖中に増大される。さらにｐｐｓＡ遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の活性に必要なホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を生成するための、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼをコードする。炭素流は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路またはＰＴＳ経路を通じて、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼによって誘導される。その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｐｏｓｔｍａ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９３），５７（３）：５４３−９４）を参照されたい。
【０４１５】
本明細書に記載される特定の実施形態では、オペロンの下方制御（例えば弱力化）は、宿主細胞による酢酸利用を高め得る。ＰＴＳオペロンの下方制御は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、複合体の活性低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。特定の実施形態では、弱力化は、ｐｔｓオペロンを欠失させることで達成される。いくつかの態様では、ＰＴＳ系の活性は、内在性ｐｔｓオペロンの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、ｐｔｓオペロン中の内在性プロモーターを置換することで達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ｐｔｓオペロンの活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ＥＩ（ｐｔｓＩ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。グルコース取り込みのためのＰＥＰプールを増大させながら、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを通じて失われる炭素を低下させるために、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）の活性を増大させ得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）の活性が増大するようにさらに操作された、組換え細胞である。本発明の任意のさらなる態様では、ＰＴＳは下方制御され、グルコース輸送経路は上方制御される。グルコース輸送経路としては、ガラクトース（ｇａｌＰ）およびグルコキナーゼ（ｇｌｋ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ｐｔｓオペロンは下方制御され、ガラクトース（ｇａｌＰ）遺伝子は上方制御され、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子は上方制御される。ＰＴＳのイソ酵素の活性調節（例えば低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸を含んでなり、ＰＴＳイソ酵素の活性が低下するようにさらに操作された、組換え細胞である。
【０４１６】
キシロース利用が関与する経路
本明細書に記載される特定の実施形態では、植物バイオマスに由来する糖を、メバロン酸など、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドなどの所望の生成物に変換するのに、キシロースの利用が望ましい。生物によっては、キシロース利用は、代謝のためのフルクトース−６−リン酸への変換のために、ペントースリン酸経路の利用を必要とする。生物は、グルコースによる異化代謝産物抑制の不活性化、またはその他の生物に見られるキシロースオペロンからの遺伝子の異種性発現のどちらかによる、キシロース利用向上のために、操作し得る。キシルロース経路は、ホスホケトラーゼ経路によるメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの生産を高めるように、下述されるように操作し得る。
【０４１７】
キシロース取り込みの強化、そしてキシルロース−５−リン酸への変換と、それに続くホスホケトラーゼ経路への直接流入は、有利である。理論により拘束されることなく、これは炭素流が、ペントースリン酸経路をバイパスできるようにする（が、必要に応じて、いくらかのグリセルアルデヒド−３−リン酸がＰＰＰ中に循環されてもよい）。キシルロキナーゼの発現向上を利用して、キシルロース−５−リン酸の総生産量を増大させ得る。キシルロキナーゼの発現および活性の最適化を利用して、ホスホケトラーゼ経路のある株中でキシロース利用を高め得る。所望のキシルロキナーゼは、宿主の内在性酵素、または宿主に適合性の任意の異種キシルロキナーゼのどちらであってもよい。一実施形態では、キシロースオペロンのその他の構成要素（例えば、キシロースイソメラーゼ）を過剰発現させて、便益を増大させ得る。別の実施形態では、その他のキシロース経路酵素（例えば、キシロース還元酵素）を弱力化する（例えば、活性低下または欠失）必要があるかもしれない。
【０４１８】
したがって本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素を有するように操作された宿主細胞は、内在性形態または異種形態のどちらかのキシルロースイソメラーゼおよび／またはキシルロキナーゼを過剰発現して、メバロナート、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの全収率および生産性が改善するようにさらに操作し得る。
【０４１９】
ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素が関与する経路
嫌気性またはヘテロ発酵性増殖できるいくつかの微生物は、解糖経路の代わりに、またはそれに加えて、ホスホケトラーゼ経路を組み入れている。この経路は、ペントースリン酸経路酵素である、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの活性に依存する。したがって、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素を有するように操作された宿主細胞は、内在性形態または異種形態のどちらかのトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現して、経路流束を改善し、潜在的に毒性の中間体レベルを低下させ、中間体の非生産的経路への転用を低下させ、メバロナート、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの全収率および生産性が改善するように、さらに操作し得る。
【０４２０】
変異の組み合わせ
本明細書に記載される酵素および／または酵素経路のいずれかについて、本明細書に記載される酵素および／または酵素経路の（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の）任意の組み合わせを調節する分子操作が、明示的に検討されるものと理解される。組み合わせの列挙を容易にするために、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）をＡと表し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）をＢと表し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）をＣと表し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をＤと表し、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐ）をＥと表し、およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ）をＦと表し、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）をＧと表し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）Ｈをと表し、ホスホフルクトキナーゼをＩと表し、トランスアルドラーゼをＪと表し、トランスケトラーゼをＫと表し、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼをＬと表し、リボース−５−リン酸エピメラーゼをＭと表し、キシルロキナーゼをＮと表し、キシロースイソメラーゼをＯと表し、およびキシリトール還元酵素をＰと表し、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）をＱと表し、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）をＲと表し、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓ）をＳと表し、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）をＴと表し、ＥＩ（ｐｔｓＩ）をＵと表し、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）をＶと表し、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）をＷと表し、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をＸと表し、ガラクトース（ｇａｌＰ）をＹと表し、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）をＺと表し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をＡＡと表す。上で考察されるように、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を増大させるために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ酵素を単独で、３酵素の内２つを、または３酵素の内３つを使用し得る。したがって、本明細書でＡ−Ｍと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせが明示的に検討され、Ａ−ＡＡと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせについても同様である。さらに、上述の任意の組み合わせは、本明細書に記載される酵素および／または酵素経路のいずれか（例えば、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド）と組み合わせて使用し得る。
【０４２１】
生成増大のためのその他の制御因子および要素
その他の分子操作を使用して、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させ得る。一方法は、メバロン酸経路に供給する経路に対する負の制御因子の効果を削減し、低下させまたは排除することである。例えば、場合によっては、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロン中にあり、４番目の遺伝子はｐｄｈＲ上流にある。遺伝子ｐｄｈＲは、そのオペロンの転写の負の制御因子である。ピルビン酸不在下では、それはその標的プロモーターに結合して、転写を抑制する。それはまた、ｎｄｈおよびｃｙｏＡＢＣＤを同様に調節する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４−５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子の欠失は、ピルビン酸の供給を改善し得て、したがって、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善する。
【０４２２】
別の実施形態では、結果として得られた上述の株のいずれかをさらに改変して、エントナー・ドウドロフ経路の活性を調節し得る。ホスホグルコン酸デヒドラターゼまたはアルドラーゼをコードする遺伝子は、弱力化または欠失させ得る。別の実施形態では、結果として生じる上述の株のいずれかもまた、酢酸キナーゼまたはクエン酸シンターゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、株のいずれか結果として生じる株はまた、ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、上述の結果として生じる株のいずれかはまた、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節するように改変してもよい。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、その活性を低下させることで調節し得る。別の実施形態では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの、ペントースリン酸経路の非酸化分岐からの酵素を過剰発現させ得る。
【０４２３】
その他の態様では、宿主細胞をさらに改変して、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼおよびセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする異種核酸を導入することで、細胞内アセチル−リン酸濃度を増大させ得る。特定の実施形態では、これらの分子操作を有する宿主細胞は、弱力化されまたは欠失しているトランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）およびホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）遺伝子と組み合わせ得て、それによってエリスロース４−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、およびグリセルアルデヒド３−リン酸のセドヘプツロース７−リン酸およびフルクトース１−リン酸へのより迅速な変換を可能にする（図５を参照）。
【０４２４】
その他の態様では、ＰＧＬが欠失している細胞（様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株など）内への６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の導入を使用して、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善し得る。ＰＧＬは、染色体への組み込みまたはプラスミドなどの染色体外媒介物を使用した、コード遺伝子導入によって、導入してもよい。
【０４２５】
本明細書に記載される様々な酵素経路を調節するための宿主細胞（例えば、細菌宿細胞）変異は、メバロン酸生成に向けて炭素流を増大させるが、それに加えて、本明細書に記載される宿主細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド、ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されない上流および下流ＭＶＡ経路からのその他の酵素をコードする遺伝子を含んでなる。ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＭＶＡ経路ポリペプチドの２つ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路核酸としては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０４２６】
使用し得るＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット；国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットに記載される。
【０４２７】
例示的な細胞培養液
本明細書の用法では、「最少培地」または「最少培地」という用語は、常時ではないが、通常、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸）の存在がない、細胞増殖に可能な最少栄養素を含有する増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、（１）細菌増殖のための炭素源；（２）細菌種および培養条件の間で変動し得る、様々な塩類；および（３）水を含有する。下でより詳細に考察されるように、炭素源は、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などのその他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、顕著に変動し得る。塩類は、概してマグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの不可欠な構成要素を提供し、細胞がタンパク質と核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、抗生物質などの選択的作用因子で補足して、特定のプラスミドの維持などについて選択し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性を示す場合、耐性を欠く細胞が増殖するのを妨ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、必要に応じてその他の化合物で補足して、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択し得る。
【０４２８】
任意の最少培地調合物を使用して、宿主細胞を培養し得る。例示的な最少培地調合物としては、例えば、Ｍ９最少培地およびＴＭ３最少培地が挙げられる。１リットルのＭ９最少培地あたり、以下を含有する：（１）２００ｍｌの無菌Ｍ９塩（１リットルあたり、６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ、および５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４（無菌）；（３）２０ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（またはその他の炭素源）；および（４）１００μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２（無菌）。１リットルのＴＭ３最少培地あたり、以下を含有する：（１）１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４；（２）１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）２ｇのクエン酸一水和物；（５）０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム；（６）３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；（７）０．２ｇの酵母抽出物；および（８）１ｍｌの１０００×微量成分溶液；ｐＨは約６．８に調節され、溶液は濾過滅菌される。１リットルの１０００×微量成分あたり、以下を含有する：（１）４０ｇのクエン酸一水和物；（２）３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ；（３）１０ｇのＮａＣｌ；（４）１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ；（５）１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（６）１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；（７）１００ｍｇのＨ３ＢＯ３；および（８）１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；ｐＨは約３．０に調節される。
【０４２９】
追加的な例示的最少培地は、以下を含む：（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸第二鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母抽出物（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒからの）、（６）１０００×修正微量金属溶液、（７）硫酸５０％ｗ／ｖ、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、および（９）マクロ塩類溶液３．３６ｍｌ。全ての構成要素を脱イオンＨ２Ｏに共に添加して溶解し、次に加熱滅菌する。室温への冷却に続いて、ｐＨを水酸化アンモニウム（２８％）で７．０に調節して、所定容積にする。滅菌およびｐＨ調節後、ビタミン溶液およびスペクチノマイシンを添加する。
【０４３０】
宿主細胞は、任意の炭素源を使用して培養し得る。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる、１つまたは複数の炭素含有する化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するのに使用される細胞培地としては、宿主細胞の生存率維持または増殖に適した任意の炭素源が挙げられる。いくつかの態様では、炭素源は、炭水化物（単糖、二糖類、オリゴ糖、または多糖類など）、または転化糖（例えば、酵素処理スクロースシロップ）である。
【０４３１】
いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物、または酵母抽出物の１つまたは複数の構成要素を含む。いくつかの態様では、酵母抽出物の濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物である。いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物（またはその１つまたは複数の構成要素）と、グルコースなどの別の炭素源との双方を含む。
【０４３２】
例示的な単糖類としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ；例示的なオリゴ糖としては、乳糖およびスクロースが挙げられ；および例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース）およびＣ５糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）が挙げられる。
【０４３３】
例示的な細胞培養条件
本発明の組換え細胞の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、実施例セクションで後述される。細菌培養の維持および増殖に適したその他の材料および方法もまた、技術分野で周知である。例示的な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編），米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）、またはＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．にある。いくつかの態様では、細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド；ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されるものではない上流および下流ＭＶＡ経路からのその他の酵素；宿主細胞中に挿入された核酸によってコードされるイソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、またはＰＧＬポリペプチドの発現ができるようにする条件下で、培地中で培養される。
【０４３４】
標準的細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレットと、その中で引用される参考文献を参照されたい）。いくつかの態様では、細胞は、適切な温度、ガス混合物、およびｐＨ（約２０°Ｃ〜約３７°Ｃ、約６％〜約８４％ＣＯ２、およびｐＨ約５〜約９など）で、増殖され維持される。いくつかの態様では、細胞は、適切な細胞培地中で３５°Ｃで増殖される。いくつかの態様では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０（約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０または約６．５〜約７．０など）である。細胞は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で増殖し得る。さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る。例えば、いくつかの実施形態では、組換え細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など）は、低コピー数から中程度コピー数プラスミド中で、強力なプロモーターの制御下にある、ホスホケトラーゼポリペプチド；ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするが、これに限定されるものではない上流からの酵素；Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする、１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、３４℃で培養される。
【０４３５】
使用し得る標準的培養条件と、バッチ、流加、または連続発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．にある。
【０４３６】
いくつかの態様では、細胞は、グルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコース量の約１０５％以下（約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％など）であることを意味する。特定の態様では、培地に添加されるグルコースの量は、特定期間中に細胞によって消費されるグルコースの量と、ほぼ同じである。いくつかの態様では、細胞増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量が支持し得る速度で、細胞が増殖するように、グルコースの添加量を制限することで制御される。いくつかの態様では、グルコースは、細胞の培養時間中に蓄積されない。様々な態様において、細胞は、グルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、または７０時間以上培養される。様々な態様において、細胞は、細胞が培養される総時間の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％以上にわたって、グルコース制限条件下で培養される。いかなる特定の理論による拘束も意図されないが、グルコース制限条件は、細胞のより良好な制御を可能にすると考えられる。
【０４３７】
いくつかの態様では、組換え細胞は、バッチ培養中で増殖される。組換え細胞はまた、流加培養または連続培養中で増殖させ得る。さらに、組換え細胞は、上述の最少培地のいずれかをはじめとするが、これに限定されるものではない最少培地中で培養し得る。最少培地は、１．０％（ｗ／ｖ）以下のグルコースまたは任意のその他の六炭糖で、さらに補足し得る。具体的には、最少培地は、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。さらに、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）以下の酵母抽出物で補足し得る。具体的には、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。代案としては、最少培地に、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）グルコースおよびｗｉｔｈ０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を添加し得る。
【０４３８】
例示的な精製法
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、生産された化合物を回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレンを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、イソプレンは、吸収ストリッピングによって回収される（例えば、米国特許公開第２０１１／０１７８２６１号明細書を参照されたい）。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、異種ポリペプチドを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、テルペノイドまたはカロテノイドを回収するステップをさらに含む。
【０４３９】
適切な精製法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７Ａ１号明細書に、より詳細に記載される。
【０４４０】
本明細書全体を通じて、様々な特許、特許出願およびその他の各種文献（例えば学術誌論文）に言及する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および文献の開示は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【０４４１】
本発明は、例証として提供され制限を意図するものではない、以下の実施例を参照してさらに理解される得る。
【実施例】
【０４４２】
実施例１：ホスホケトラーゼの同定
組換え細胞内における、アセチル補酵素Ａ由来（アセチルＣｏＡ由来）代謝産物、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの改善された生産のために使用し得るホスホケトラーゼを同定するために、ＮＣＢＩウェブサイトにあるＣＤＡＲＴプログラムを使用して、既知のホスホケトラーゼ領域構造に一致する全ての遺伝子産物を選択した。（Ｇｅｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），“ＣＤＡＲＴ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｄｏｍａｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．”，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（１０）１６１９−２３）。最初の領域構造検索からのｒｅｆｓｅｑ配列を選択することで、配列をさらに精緻化する。次に、配列類似性に基づいて、配列を２２の別個の群にクラスター化した（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｍｅｓｓａｇｅｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｄａｔａ  Ｐｏｉｎｔｓ．Ｂｒｅｎｄａｎ  Ｊ．Ｆｒｅｙ  ａｎｄ  Ｄｅｌｂｅｒｔ  Ｄｕｅｃｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，９７２−９７６，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００７）。簡単に述べると、アミノ酸配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して多重アライメントした。ペアワイズパーセント同一性（ＰＩＤ）を計算した。これは、操作上で定義され、この場合には、整列された残基にわたって同一の残基の数であった。式、Ｋ＝−Ｌｎ（１−Ｄ−（Ｄ．Ｄ）／５）によって、ＰＩＤを距離に変換した（Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒａｌ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃａｍｂ．Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９８３，ｐａｇｅ  ７５）。負の距離は、上のアルゴリズムにおける類似性スコアとして使用された。中程度の類似性は、各データ点の選択性として使用された。この方法を使用して、２２個のクラスターが画定された（図３〜２４）。各クラスターからの中心代表的配列のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成した（図２および表１）。完全ホスホケトラーゼ領域不在のために、クラスターからの中心代表が、活性ホスホケトラーゼを代表しそうにないと判定された場合は、クラスターからの交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ホスホケトラーゼが、ＤＮＡ合成のために選択された（表１）。
【０４４３】
【表１】
0006530375.tif 000002
【０４４４】
【表２】
0006530375.tif 000003
【０４４５】
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼを含有するクラスター８、およびクラスター８と大部分の相同性を共有するクラスター１１中のＣｌｕｓｔａｌＷを使用したペアワイズアラインメントによって、互いに９０％未満同一であるタンパク質配列をコードするＤＮＡが、タンパク質合成のためにデザインされた（表２）。
【０４４６】
【表３】
0006530375.tif 000004
【０４４７】
【表４】
0006530375.tif 000005
【０４４８】
【表５】
0006530375.tif 000006
【０４４９】
【表６】
0006530375.tif 000007
【０４５０】
実施例２：ホスホフルクトキナーゼを欠く細菌ゲノム中のホスホケトラーゼの同定
アノテートされたホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）を有するが、解糖を通過する炭素流にとって重要な酵素であるアノテートされたホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）を有しない、細菌ゲノムの検索を実施した。これらの基準に適合する数種の生物、そしてこの一覧からの５つのＰＫＬ、具体的には、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ（配列番号４７）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬＢ−３０９２９（配列番号４８）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ２００９３（配列番号４９）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１（配列番号５０）、およびビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ２００１５（配列番号５１）からのＰＫＬを、高活性とグルコースからのイソプレンの収率増大研究のために選択した。生物の完全一覧からのＰＫＬの大部分は特徴付けられていないので、選択された５つのＰＫＬは、配列多様性、および文献から得られ得る高活性の最善の状況証拠に基づいた。ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）からのＰＫＬが７の最適ｐＨ値を示す（Ｓｇｏｒｂａｔｉ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  １９７６（４２），４９−５７）、一方で、その他のＰＫＬの至適ｐＨは、典型的に６前後である（Ｈｅａｔｈ  ＥＣ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  １９５７，１００９−１０２９）。ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）は、燃料エタノール工場から汚染菌として単離され、おそらくは細胞量とエネルギーのためのＦ６ＰまたはＸ５Ｐのどちらかに対するＰＫＬの活性によって、グルコースおよびキシロースの双方の上で増殖を示した（Ｌｉｕ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８（３５），７５−８１）。ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）およびビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）の株は、グルコースまたはキシロースのどちらを唯一の炭素源として良好に成長できることから、これらからのＰＫＬが選択された（Ｐａｌｆｒａｍａｎ  ＲＪ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００３（４），７１−７５）。
【０４５１】
実施例３：同定されたホスホケトラーゼ酵素のクローニング
ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）インファンチス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）亜株、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から得られるＰＫＬを酵素活性についてそれぞれアッセイした。ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）インファンチス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）亜株ＰＫＬは、５．７±１．１６ｍＭのＫｍ、４．５６±０．２ｓｅｃ−１のｋｃａｔ、および０．７９±０．２ｍＭ−１ｓｅｃ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを有し、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬは、１０．４±１．０３ｍＭのＫｍ、１．３５±０．０４ｓｅｃ−１のｋｃａｔ、および０．１３±０．１ｍＭ−１ｓｅｃ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを有し、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬは、１０．３±０．６７ｍＭのＫｍ、２．１８±０．０５ｓｅｃ−１のｋｃａｔ、および０．２１±０．０６ｍＭ−１ｓｅｃ−１のｋｃａｔ／Ｋｍを有することが分かった。ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）インファンチス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）亜株、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬをコードするコンストラクトを対照として使用して、生体外および生体内活性について候補ＰＫＬ酵素をスクリーニングした。
【０４５２】
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬのアミノ酸配列（配列番号９３）は、ＧｅｎＢａｎｋから入手されて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の最適化発現について、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ソフトウェアで処理された。ＰＫＬ遺伝子の前に２つの塩基対を付加してＢｓｐＨＩ部位を形成し、ＳａｃＩ部位を停止コドンの直後に挿入した。合成されたＰＫＬ遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローン化した。次に、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬ遺伝子をＮｃｏＩ／ＳａｃＩ−消化ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２１を形成した（表５、図２５）。
【０４５３】
ＡＴＣＣ１５６９７株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）亜株インファンチス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）の染色体ＤＮＡは、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手された。Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＰＫＬをコードする遺伝子は、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のプロトコルに従って、プライマーＣＭＰ２８３：５’−ｃｔｇｔａｔＴＣＡＴＧＡｃｇａｇｔｃｃｔｇｔｔａｔｔｇｇｃａｃｃ−３’およびＣＭＰ２８４：５’−ｃｔｃｔａｔＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧ−３’、およびポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅを使用した、染色体ＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、精製前にＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＨＩ制限酵素で消化した。精製後、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、およそ２５００ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ−消化ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にアセンブルし、プラスミドｐＣＭＰ１０９０を形成した（表５）。
【０４５４】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬをコードする対照プラスミドの構築では、ＡＴＣＣＢＡＡ−９８株の染色体ＤＮＡがＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手された。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬをコードする遺伝子は、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のプロトコルに従って、プライマーＣａｃｅｔｐＴｒｃＨｉｓＢＦ：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃｃａｔｇｃａａａｇｔａｔａａｔａｇｇａａａａｃａｔａａｇｇａｔｇａａｇｇ−３’およびＣａｃｅｔｐＴｒｃＨｉｓＢＲ：５’−ｔｔｃｔａｇａａａｇｃｔｔｃｇｔｔａｔａｃａｔｇｃｃａｃｔｇｃｃａａｔｔａｇｔｔａｔｔｔｃ−３’、およびｔｈｅポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅを使用した、染色体ＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ−消化ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に構築しプラスミドｐＣＭＰ１３６４を形成した（表３）。
【０４５５】
ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（配列番号９４）のそれぞれに由来するＰＫＬタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現についてコドン最適化され、ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって合成された。これらのコドン最適化ＰＫＬ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、製造業者の推奨プロトコルに従ってＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ発現プラスミド中にサブクローニングした。下の表５は、プラスミド構築のために使用されたプライマーｐＭＣＳ５３０〜ｐＭＣＳ５３５を列挙する。ＰＫＬ酵素をＰｔｒｃプロモーター下流にクローン化し、ＩＰＴＧによるホスホケトラーゼ遺伝子の誘導性発現を可能にした（表６、図２６〜３１）。
【０４５６】
【表７】
0006530375.tif 000008
【０４５７】
【表８】
0006530375.tif 000009
【０４５８】
【表９】
0006530375.tif 000010
【０４５９】
表１、表２、およびクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）に列挙される各生物に由来するＰＫＬタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現についてコドン最適化され合成される。これらのコドン最適化ＰＫＬ遺伝子は、Ｐｔｒｃプロモーター下流でｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ発現プラスミドにサブクローニングされて、ＩＰＴＧによるホスホケトラーゼ遺伝子の誘導性発現を可能にする。
【０４６０】
実施例４：生体外実験で同定されたＰＫＬを発現する株の構築
表５に列挙されるプラスミドで、ＣＭＰ１１３３株（ＢＬ２１，Δｐｇｌ  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙｌ，ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ，ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ）を形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリア・ベルターニプレート上でコロニーを選択することで、ＰＫＬ発現株を構築した。製造業者（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって推奨されるプロトコルを使用して、カナマイシンマーカーを除去し、示される株を形成した（表７）。
【０４６１】
【表１０】
0006530375.tif 000011
【０４６２】
それぞれ同定されたＰＫＬを発現するＰＫＬ発現株は、表１、表２、およびクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）に列挙されるＰＫＬをコードするプラスミドで、ＣＭＰ１１３３株（ＢＬ２１，Δｐｇｌ  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙｌ，ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ，ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ）形質転換し、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するルリア・ベルターニプレート上で、コロニーを選択することで構築される。製造業者（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって推奨されるプロトコルを使用して、カナマイシンマーカーが除去される。
【０４６３】
実施例５：同定されたＰＫＬの発現および溶解度の比較
ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢＢ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）（ＣＭＰ１１８３株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＣＭＰ１３２８株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＣＭＰ１３６６株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＰＫＬ（ＭＣＳ５４５株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）（ＭＣＳ５４６株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（ＭＣＳ５４７株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＰＫＬ（ＭＣＳ５４８株）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰＫＬ（ＭＣＳ５４９株）、またはｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ最適化（ＭＣＳ５５０株）を発現する株をＬＢ培地中で培養し、約０．５のＯＤ６００で２００μＭのＩＰＴＧによって誘導し、３０℃または３４℃の温度で４時間にわたり誘導した。４ｍｌの培養ブロスを３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理して、細胞を収集した。細胞ペレットを０．１％ＤＮＡａｓｅおよび０．５ｍＭＡＥＢＳＦを添加した２ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に再懸濁した。フレンチ圧力セル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１４，０００ｐｓｉで使用して、細胞懸濁液を溶解した。次に溶解産物をエッペンドルフ５８０４Ｒ遠心分離機内で、４℃、１５，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清およびペレットを分離した。ペレットは、溶解５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０緩衝液に再懸濁した。上清およびペレット化サンプルを４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析した。可溶性−対−ペレット化（不溶性）ホスホケトラーゼ画分を比較することで、溶解度を評価した。
【０４６４】
結果は、最適化Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（図３２Ａ、レーン９）が、コドン最適化されていない（図３２Ａ、レーン３）Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬと比較して、より高いレベルを発現したことを示した。Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）（図３２Ａ、レーン４）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）（図３２Ａ、レーン５）、およびＢ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）（図３２Ａ、レーン６）ＰＫＬは全て、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（図３２Ａ、レーン３）と同様のレベルで発現し、大部分が可溶性であった（図３２Ｂ）。比較すると、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）（レーン７）およびＢ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）（レーン８）は、ほぼ完全に不溶性であった（図３２Ｂ）。
【０４６５】
表１、表２、およびクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）で列挙される同定されたＰＫＬを発現する株をＬＢ培地中で培養し、約０．５のＯＤ６００で、２００μＭ  ＩＰＴＧによって誘導し、３０℃または３４℃の温度で４時間誘導する。４ｍｌの培養ブロスを３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理して、細胞を収集する。細胞ペレットを０．１％ＤＮＡａｓｅおよび０．５ｍＭＡＥＢＳＦを添加した２ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に再懸濁する。フレンチ圧力セル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１４，０００ｐｓｉで使用して、細胞懸濁液を溶解する。次に溶解産物をエッペンドルフ５８０４Ｒ遠心分離機内で、４℃および１５，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する。上清およびペレットを分離する。ペレットは、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０）に再懸濁する。上清およびペレット化サンプルを４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析する。可溶性−対−ペレット化（不溶性）ホスホケトラーゼ画分を比較することで、溶解度を評価する。
【０４６６】
実施例６：同定されたＰＫＬを発現する株中のホスホケトラーゼ活性の生体外スクリーニング
ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）（株ＣＭＰ１１８３）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（株ＣＭＰ１３２８）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（株ＣＭＰ１３６６）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＰＫＬ（株ＭＣＳ５４５）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）（株ＭＣＳ５４６）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ（株ＭＣＳ５４７）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＰＫＬ（株ＭＣＳ５４８）、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｂ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰＫＬ（株ＭＣＳ５４９）、またはｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ  Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬ最適化（株ＭＣＳ５５０）発現する株を、誘導前に３７℃で５０μｇ／ｍｌカルベニシリン添加ＬＢ培地中で培養した。１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、または１００μＭのＩＰＴＧによる誘導に続いて、培養物を３４℃の振盪機の３０分間移した。細胞を４℃および１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して収集した。精製に先だって、細胞ペレットを−８０℃で保存した。精製のために、ＰＫＬ細胞ペレットを５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、５０ｍＭ  ＮａＣＬ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩに再懸濁した。フレンチプレスを繰り返し通過させることで細胞を溶解し、５０，０００ｒｐｍで６０分間の超遠心によって清澄化した。Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｂ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、またはＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのＰＫＬを含有する清澄化溶解産物を５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６で平衡化したＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐＦＦカラムに装入し、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６への勾配で溶出した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＫＬを含有する画分を貯留し、Ｇ２５脱塩カラムを使用して、５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣＬ  ｐＨ６．０中に脱塩した。さらに５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣＬ、ｐＨ６で平衡化したＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＬカラムを使用して、１Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配で、精製を達成した。その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｌ．Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００１，１８３：２９２９−２９３６  ａｎｄ  Ｆｒｅｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２００８，３６：１２１−１２７に記載されるヒドロキサム酸アッセイの規模縮小バージョンを使用して、各ＰＫＬによって形成されるＡｃＰの量を測定した。アッセイは、３７℃で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号９０１７）構成で実施した。各３００μｌの反応物は、１���Ｍ  ＴＰＰ、１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｆ６Ｐ、および濃度２５０ｎＭのＰＫＬを含有した。タイムポイントは、様々な間隔で測定した。反応を停止させるために、６０μｌの反応混合物ｐＨ６．５で６０μｌの２Ｍヒドロキシルアミンと混合し、室温で１０分間インキュベートした。０．１Ｍ  ＨＣｌ中の４０μｌの１５％ＴＣＡ、４０μｌの４ＭＨＣｌ、および４０μｌの５％ＦｅＣｌ３の添加を使用して、タンパク質を沈殿させ、ＡｃＰの検出を可能にした。次にサンプルを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の２００μｌのサンプルをマイクロタイタープレートおよびプレートリーダーに移し、形成されるＡｃＰ量に伴う吸光度の変化を５０５ｎｍでモニターした。
【０４６７】
結果は、最適化Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬが、Ｆ６Ｐ活性を有し、コドン最適化されていないＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬと比較して、より高い量のＡｃＰを生産したことを示した（図３３）。Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）は、コドン最適化されていないＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬと同様のＰＫＬＦ６Ｐ活性を有した。Ｂ．デンチウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）およびＢ．ガリクム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＰＫＬは、顕著なＦ６Ｐ活性を有し、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬのＦ６Ｐ活性と同等であった。比較すると、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＰＫＬ（図３３）およびＢ．フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰＫＬはＦ６Ｐ活性を示さず、これは、これらのＰＫＬがほぼ完全に不溶性であるという発見によって支持された。
【０４６８】
表１、表２、およびクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）中に列挙される同定されたＰＫＬを発現する株を誘発前に、３７℃で５０μｇ／ｍｌカルベニシリン添加ＬＢ培地中で培養する。１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、または１００μＭのＩＰＴＧによる誘導に続いて、培養物を３４℃で振盪機に３０分間移した。細胞を４℃および１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して収集する。精製のために、ＰＫＬ細胞ペレットを５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、５０ｍＭ  ＮａＣＬ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩに再懸濁する。フレンチプレスを繰り返し通過させることで細胞を溶解し、５０，０００ｒｐｍで６０分間の超遠心によって清澄化する。ＰＫＬを含有する清澄化溶解産物を５０ｍＭＭＥＳ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６で平衡化したＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラムに装入し、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６への勾配で溶出する。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。ＰＫＬを含有する画分を貯留し、Ｇ２５脱塩カラムを使用して、５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣＬ  ｐＨ６．０中に脱塩する。さらに５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣＬ、ｐＨ６で平衡化したＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＬカラムを使用して、１Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配で、精製を達成する。Ｌ．Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００１，１８３：２９２９−２９３６、およびＦｒｅｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２００８，３６：１２１−１２７に記載されるヒドロキサム酸アッセイの規模縮小バージョンを使用して、各ＰＫＬによって形成されるＡｃＰの量を測定する。アッセイは、３７℃で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号９０１７）構成で実施される。各３００μｌ反応物は、１ｍＭ  ＴＰＰ、１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｆ６Ｐ、およびＰＫＬ濃度２５０ｎＭを含有する。タイムポイントは、様々な間隔で測定される。反応を停止させるために、６０μｌの反応混合物ｐＨ６．５で６０μｌの２Ｍヒドロキシルアミンと混合し、室温で１０分間インキュベートする。０．１Ｍ  ＨＣｌ中の４０μｌの１５％ＴＣＡ、４０μｌの４ＭＨＣｌ、および４０μｌの５％ＦｅＣｌ３の添加を使用して、タンパク質を沈殿させ、ＡｃＰの検出を可能にする。次にサンプルを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清の２００μｌのサンプルをマイクロタイタープレートおよびプレートリーダーに移し、形成されるＡｃＰ量に伴う吸光度の変化を５０５ｎｍでモニターする。
【０４６９】
実施例７：同定されたホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）を発現する株中のホスホケトラーゼ活性の生体内スクリーニング
トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）活性がない変異株中で、ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）酵素の生体内活性を評価した。トランスケトラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の全ての芳香族ビタミンおよびアミノ酸の基材である、エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）生産に関与する。したがってトランスケトラーゼ活性不在下における、グルコースを炭素源とする最少培地上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖は、芳香族栄養要求性のために可能でない（Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｌｅｒ  １９９４）。トランスケトラーゼはまた、キシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）と、セドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）との相互変換にも関与し、ｔｋｔ活性は、ペントースリン酸経路から解糖に戻る唯一の出口であることから、キシロースを炭素源とする最少培地上のｔｋｔ変異体の増殖もまた可能でない。ホスホケトラーゼは、Ｆ６ＰからＥ４Ｐを生成し、Ｘ５ＰからＧＡＰを生成するので、機能酵素は、グルコース（Ｆ６Ｐ活性を示す）またはキシロース（Ｘ５ＰおよびＦ６Ｐ活性の双方を示す）上での培養に際して、ｔｋｔ変異体の増殖欠陥をレスキューし得る。したがって補足変異体の増殖を利用して、ホスホケトラーゼ酵素の異なる生体内機能を試験し得る。
【０４７０】
株構築
ＰＣＲによるＫｅｉｏコレクションからの変異体を増幅し、Ｐ１形質導入を実施し、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ挿入（製造業者のプロトコル）、ＰＣＲ増幅（Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏまたはＨｅｒｃｕｌａｓｅ、製造業者のプロトコル）を実施し、プラスミドを形質転換し、株を成長および増殖させるための標準分子生物学的技術が使用された。簡単に述べると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には２つのトランスケトラーゼ酵素ゲノムがあるので、トランスケトラーゼヌル変異体を作成するためには、どちらもノックアウトしなくてはならなかった。ｔｋｔＢ中のカナマイシン挿入断片をＫｅｉｏコレクションからのＰＣＲによって増幅し、ＢＬ２１へのリコンビニアリングによって導入した。ｔｋｔＢの中抗生物質耐性カセットをＰＣＲによって確認し、次にｐＣＰ２０プラスミドを使用してループアウトさせた（表５）。次に、同一方法によってｔｋｔＡ変異をＬ２１に導入し、引き続いてＰ１形質導入によってｔｋｔＢ変異体に導入して、トランスケトラーゼヌル変異株を作成した（表６）。このＤＷ８０９株は、芳香族アミノ酸供給に実質的に寄与しないカザミノ酸と、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ｐ−アミノ安息香酸、２−３−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、およびピリドキシンを含む全ての芳香族化合物の追加的補給剤とを添加したＭ９グルコース最少培地上でのみ増殖した（Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｌｅｒ，１９９４で示される）。この６つの芳香族化合物とピリドキシンとの組み合わせは、本明細書で引き続いて「芳香族補給剤」と称される。次に異なるホスホケトラーゼ酵素を保有するプラスミドをトランスケトラーゼ変異株に形質転換して、芳香族補給剤およびカルベニシリンを添加したＭ９グルコースカザミノ酸上の増殖について選択した（表６）。次に、芳香族補給剤なしで、Ｍ９グルコースまたはキシロースのどちらかの上で、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ，ＢＶ）上の増殖について株をアッセイし、ホスホケトラーゼ酵素を発現しない対照株と比較した。ホスホケトラーゼ酵素は、２０μＭおよび６０μＭの２つの異なる濃度のＩＰＴＧによって、トランスケトラーゼヌル変異体中で誘導された。
【０４７１】
トランスケトラーゼヌル変異体株を表１、表２、またはクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）に列挙される同定されたＰＫＬで形質転換して、芳香族補給剤およびカルベニシリンを添加したＭ９グルコースカザミノ酸上の増殖について選択する。次に、芳香族補給剤なしで、Ｍ９グルコースまたはキシロースのどちらかの上で、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ，ＢＶ）上の増殖について株をアッセイし、ホスホケトラーゼ酵素を発現しない対照株と比較する。ホスホケトラーゼ酵素は、２０μＭおよび６０μＭの２つの異なる濃度のＩＰＴＧによって、トランスケトラーゼヌル変異体中で誘導される。
【０４７２】
【表１１】
0006530375.tif 000012
【０４７３】
【表１２】
0006530375.tif 000013
【０４７４】
結果
このアッセイでは、トランスケトラーゼ変異体は、補給剤を添加した場合のみグルコース上で増殖し（図３４）、補給剤添加または無添加のキシロース上では増殖しなかった（図３６）。異なるホスホケトラーゼを発現するトランスケトラーゼヌル変異体の増殖は、これらの酵素の生体内示差挙動を強調した。Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬは、グルコースおよびキシロースのどちらの上でも最良の能力を示し、補給剤不在下でトランスケトラーゼ変異体の増殖を維持するのに十分なＦ６ＰおよびＸ５Ｐ活性を示した（図３５および３７を参照されたい）。Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬもまた、グルコースおよびキシロースのどちらの上でも芳香族補給剤不在下におけるトランスケトラーゼ変異体の増殖を可能にしたが（図３５および３７）、グルコース上での培養に際して、６０μＭのＩＰＴＧ濃度で細胞増殖に対する有害効果を有すると思われた（図３５）。
【０４７５】
実施例８：ＰＫＬ発現株の細胞内アセチルリン酸測定
イソプレン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ  ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ  ２００１５からのホスホケトラーゼ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２からのＰＫＬを発現させる（図面３〜２４を参照されたい）。ホスホケトラーゼを発現しなかった株を対照として使用する。
【０４７６】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。ｐＨ調節および滅菌後、グルコース１０．０ｇおよび抗生物質を添加する。
【０４７７】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分を１つずつ、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０４７８】
（ｉｉ）実験手順
完全ＭＶＡ経路と、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬＢ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ２００１５からのＰＫＬ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２（図３〜２４を参照されたい）からのＰＫＬを発現する細胞をルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で０．０５のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定して、２００μＭのＩＰＴＧを添加する。さらに３．５時間後、１．５ｍｌのサンプルを遠心分離して、上清を廃棄し、ペレットを１００μＬの乾燥氷冷メタノールに再懸濁する。
【０４７９】
（ｉｉｉ）細胞内アセチルリン酸測定
アセチルリン酸を抽出するために、１．５ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を０．５７〜２．２６のＯＤに培養して、遠心分離によって遠心沈殿させて、１００μＬの乾燥氷冷メタノールをペレットに添加する。メタノールでクエンチしたサンプルを−２０℃でで数日間保存する。さらなるサンプル処理は、穏やかな細胞再懸濁、−９℃で５分間の遠心分離、および清浄なバイアルへの上清の吸引を含む。ペレットを７５μＬの含水の２％酢酸で、再度２回抽出する。各抽出後、細胞破片を−９℃における遠心分離によってペレット化し、全ての３回の抽出からの上清を合わせて貯留し、１μＬのトリブチルアミンを添加する。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＬＣＭＳによって、アセチルリン酸の質量分光分析を実施する。ＸＣａｌｉｂｕｒおよびＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ）を使用して、システム制御、データ取得、および質量スペクトルデータ評価を実施する。流速０．４ｍＬ／分のＳｙｎｅｒｇｉ  ＭＡＸ−ＲＰ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１５０×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に移動相勾配を適用する。適用される勾配プロファイルは、ｔ＝０〜１分に９９％Ａおよび１％Ｂ；ｔ＝１１分に８０％Ａおよび２０％Ｂ；ｔ＝１２〜１４分に７５％Ｂおよび２５％Ｃ；ｔ＝１５〜１６分に９９％Ａおよび１％Ｂであり、ここで溶剤Ａは水中の１５ｍＭトリブチルアミン／１０ｍＭ酢酸、溶剤Ｂはメタノール、溶剤Ｃは水である。アセチルリン酸の質量検出は、前駆体イオンのｍ／ｚ値１３８．９で、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）（ＥＳＩスプレー電圧２．５〜３．０ｋＶ、オン移送管温度３９０℃）を使用して実施する。アセチルリン酸の濃度は、ＰＯ３−生成イオンによって生成されるピークの積分強度に基づいて判定される（ｍ／ｚ＝７９．０、衝突エネルギー２０Ｖ、衝突ガス圧力１．７ｍＴｏｒｒ、Ｒｔ＝１３．２分）。アセチルリン酸標準物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の注入によって得られる検量線を使用して、細胞抽出物中の代謝産物濃度を計算する。アセチルリン酸の細胞内濃度は、ＯＤ＝２００の培養物の１ｍＬ中にある全細胞の積算容積は５０ｍＬである、という仮定に基づいて判定される。生成したアセチルリン酸は、ホスホケトラーゼを発現しない対照株と比較して、ＰＫＬを発現する株中で評価される。
【０４８０】
実施例９：小規模でのホスホケトラーゼを発現する組換え宿主細胞内のイソプレン生産
イソプレン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ  ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ  ２００１５からのホスホケトラーゼ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２からのＰＫＬ（図面３〜２４を参照されたい）、完全ＭＶＡ経路およびイソプレンシンターゼを発現させる。ホスホケトラーゼを発現しなかったイソプレン産生株を対照として使用する。
【０４８１】
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての成分を合わせてｄｉＨ２Ｏに溶解する。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。ｐＨ調節および滅菌後、グルコース１０．０ｇおよび抗生物質を添加する。
【０４８２】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分を１つずつ、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０４８３】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で、これらを０．１のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定して、２００μＭのＩＰＴＧを添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、ＯＤ６００を測定をする。また、ガスクロマトグラフ質量分光計（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）ヘッドスペースアッセイを使用して、イソプレン発生気体分析も実施される。全ブロスの１００μｌのサンプルを９６ウェルガラスブロックに入れる。ガラスブロックをアルミホイルで密封し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養する。３０分後に、ブロックを７０℃の水浴内に２分間保持し、ガスクロマトグラフィー質量分析法を使用して、ヘッドスペース測定中のイソプレンレベルを判定する。報告された比生産性は、培養時間（３０分間）および測定されたＯＤ６００で除した、μｇ／Ｌ単位のイソプレン量のＧＣによる読み取りである。
【０４８４】
実施例１０：１５Ｌ規模でのホスホケトラーゼを発現する組換え宿主細胞内のイソプレン生産
イソプレン産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ  ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ  ２００１５からのホスホケトラーゼ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２からのＰＫＬ（図面３〜２４を参照されたい）、完全ＭＶＡ経路およびイソプレンシンターゼを発現させる。イソプレン生産のための１５リットル規模の実験において、ホスホケトラーゼを発現しなかったイソプレン産生株を対照として使用する。
【０４８５】
（ｉ）材料
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：
７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍｌの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ  Ｈ２Ｏに溶解する。この溶液を加熱滅菌する（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にする。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質を添加する。
【０４８６】
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０４８７】
ビタミン溶液（１リットルあたり）：
１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０４８８】
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：
２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
【０４８９】
供給液（１キログラムあたり）：
０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉ  Ｈ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍｌのマクロ塩溶液、６．５５ｍｌのビタミン溶液、０．８２ｍｌの１０００×修正微量金属溶液である。
【０４９０】
（ｉｉ）分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）、およびＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計の２つの質量分光計によって、独立して測定される。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定される。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定される。
【０４９１】
実施例１１：同定されたホスホケトラーゼを発現する株中のアモルファジエンまたはファルネセンの生産
イソプレノイド産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築して、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ  ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ  ２００１５からのホスホケトラーゼ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２からのＰＫＬ（図面３〜２４を参照されたい）、完全ＭＶＡ経路、およびファルネセンシンターゼまたはアモルファジエンシンターゼをコードするコドン最適化遺伝子を発現させる。アモルファジエンまたはファルネセンの生産実験において、イソプレノイド産生ホスホケトラーゼを発現しなかった株を対照として使用する。
【０４９２】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。次に培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。滅菌およびｐＨ調節後、１０．０ｇのグルコースおよび抗生物質を添加する。
【０４９３】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分を１つずつ、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０４９４】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で、これらを０．０５のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。接種前に、先に記載されたようにして、各培養物フラスコに２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のオーバーレイを添加して、揮発性セスキテルペン生成物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００６）。
【０４９５】
２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定して、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、ＯＤ６００を測定をする。また、ドデカンオーバーレイを酢酸エチル中で希釈することで、有機層内のアモルファジエンまたはファルネセン濃度もアッセイされる。ドデカン／酢酸エチル抽出物は、以前記載されたようにして（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６−８０２）、アモルファジエンのための分子イオン（２０４ｍ／ｚ）および１８９ｍ／ｚ断片イオンまたはファルネセンのための分子イオン（２０４ｍ／ｚ）をモニタリングすることで、ＧＣ−ＭＳ方法によって分析される。既知濃度のアモルファジエンまたはファルネセンサンプルを注入して、アモルファジエンまたはファルネセンの標準曲線をそれぞれ作成する。アモルファジエンまたはファルネセン標準曲線をそれぞれ使用して、サンプル中のアモルファジエンまたはファルネセンの量を計算する。
【０４９６】
実施例１２：イソプレン生産のための宿主変異を保有するホスホケトラーゼ発現株の構築
バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ  ２００９３、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１、またはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ  ２００１５からのＰＫＬ、または表１、表２、またはクラスター１〜２２からのＰＫＬを含んでなるイソプレン産生株（図面３〜２４を参照されたい）は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）をはじめとする遺伝子の１つまたは複数の活性が増大して、ホスホケトーラゼ経路を通過する炭素流が改善するように、さらに操作し得る（図３８）。特定の態様では、遺伝子ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、ｔａｌＢ、ｐｐｓＡ、ｅｕｔＤ、および／またはｐｔａの活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大させ得る。一実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。さらに別の実施形態では、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。別の実施形態では、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。なおも別の実施形態では、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）の活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。特定の態様では、遺伝子ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、ｔａｌＢ、ｐｐｓＡ、ｅｕｔＤ、および／またはｐｔａのイソ酵素は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミド��ら発現させることで増大させ得る。
【０４９７】
これらの株は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をはじめとする遺伝子の活性の１つまたは複数を低下させて、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させるように、さらに操作し得る（図３９）。一実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、６−ホスホフルクトキナーゼ−１ＡをコードするｐｆｋＡ遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、グリセルアルデヒドー３−リン酸デヒドロゲナーゼＡをコードするｇａｐＡ遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードするｆｂａ遺伝子が下方制御される。さらに別の実施形態では、クエン酸シンターゼをコードするｇｌｔＡ遺伝子が下方制御される。一実施形態では、酢酸キナーゼをコードするａｃｋＡ遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、ＥＩをコードするｐｔｓＩ遺伝子が下方制御される。一実施形態では、ＨＰｒをコードするｐｔｓＨ遺伝子が下方制御される。別の実施形態では、ＥＩＩＣＢＧｌｃをコードするｐｔｓＧ遺伝子が下方制御される。さらに別の実施形態では、ＥＩＩＡＧｌｃをコードするｃｒｒ遺伝子が下方制御される。ｐｔｓオペロンは、ホスホトランスフェラーゼ系の遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、株は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の活性を低下させ、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させるように操作し得る。いくつかの実施形態では、ＰＴＳは、ｐｔｓオペロンの下方制御によって、下方制御される。特定の態様では、ＰＴＳは下方制御されて、グルコース輸送経路は上方制御される。グルコース輸送経路としては、ガラクトース（ｇａｌＰ）およびグルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ｐｔｓオペロンは下方制御され、ガラクトース（ｇａｌＰ）遺伝子は上方制御され、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子は上方制御される。特定の態様では、遺伝子ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡ、ｔｋｔＡ、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、および／またはｃｒｒによってコードされるタンパク質のイソ酵素を下方制御して、ホスホケトラーゼ経路に向かう炭素流を増大させ得る。いくつかの実施形態では、ｐｆｋＢ遺伝子は下方制御される。いくつかの実施形態では、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＢ（ｇａｐＢ）遺伝子は下方制御される。いくつかの実施形態では、トランスケトラーゼＢ（ｔｋｔＢ）遺伝子は下方制御される。
【０４９８】
実施例１３：小規模での宿主変異を保有するホスホケトラーゼ発現株によるイソプレンの生産
実施例１２に記載されるイソプレン産生株を小規模でのイソプレン生産について評価する。
【０４９９】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての成分を合わせて、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。ｐＨ調節および滅菌後、グルコース１０．０ｇおよび抗生物質を添加する。
【０５００】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分を１つずつ、ｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０５０１】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で、これらを０．１のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定して、２００μＭのＩＰＴＧを添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、ＯＤ６００を測定をする。また、ガスクロマトグラフ質量分光計（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）ヘッドスペースアッセイを使用して、イソプレン発生気体分析も実施される。１００マイクロリットルの全ブロスを密封ＧＣバイアルに入れて、３４℃および２００ｒｐｍで、３０分間の所定時間にわたり培養する。７０℃で７分間のインキュベーションからなる熱殺菌ステップに続いて、サンプルをＧＣに装入する。報告された比生産性は、培養時間（３０分間）および測定されたＯＤ６００で除した、μｇ／Ｌ単位のイソプレン量のＧＣによる読み取りである。
【０５０２】
実施例１４：１５Ｌ規模での宿主変異を保有するホスホケトラーゼ−発現株によるイソプレンの生産
実施例１２に記載されるイソプレン産生株を１５Ｌ規模でのイソプレン生産について評価する。
【０５０３】
（ｉ）材料
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：
７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍｌの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ  Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にした。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質を添加した。
【０５０４】
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５０５】
ビタミン溶液（１リットルあたり）：
１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５０６】
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：
２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
【０５０７】
供給液（１キログラムあたり）：
０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉ  Ｈ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍｌのマクロ塩溶液、６．５５ｍｌのビタミン溶液、０．８２ｍｌの１０００×修正微量金属溶液である。
【０５０８】
（ｉｉ）分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）、およびＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計の２つの質量分光計によって、独立して測定される。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定される。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定される。
【０５０９】
実施例１５：ホスホケトラーゼ小規模評価のために使用された株
ホスホケトラーゼ発現株は、標準分子生物学的技術を使用して作成され、その中ではＭＣＭ−１２２５（ｐＭＣＭ１２２５−−ｐＣＬ  Ｐｔｒｃ−Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍＵｐｐｅｒ  ＭＶＡ））と共に、特定のＰＫＬがＭＤ−８９１（ＢＬ２＋ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ  ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ  ＰＧＬ  ＭＬ＋ＦＲＴ−ＰＬ．２−３ｃｉｓ−ＲＢＳ１００００−ｍｖｋ（ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ａｃｋＡ：：ＦＲＴ）に形質転換される。株を表１０に列挙する。
【０５１０】
【表１３】
0006530375.tif 000014
【０５１１】
【表１４】
0006530375.tif 000015
【０５１２】
実施例１６：同定されたホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）の発現におけるホスホケトラーゼ活性の生体内スクリーニング
実施例７で上述したように、ホスホケトラーゼ活性について生体内スクリーニングを実施した。宿主細胞のバックグラウンドは、プラスミドｐＭＣＳ８１１−ｐＭＣＳ８５２があるＤＷ−８０９であり、特徴的なホスホケトラーゼを含有する。
【０５１３】
このホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）酵素セットの生体内増殖を評価するために、ＩＰＴＧ−誘導性プロモーターからＰＫＬおよびイソプレンシンターゼの双方を発現するプラスミドで、実施例７に記載されるトランスケトラーゼ二重変異体株であるＤＷ８０９株を形質転換した（完全な一覧は、表１１を参照されたい）。芳香族補給剤を添加したＭ９グルコース最少培地プレート上の増殖によって個々の形質転換体を同定し、一晩培養して、次に実施例７に記載されるようにして、芳香族補給剤なしのグルコースまたはキシロースのどちらかの上での増殖能力について、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒの上でアッセイした。誘導のために使用したＩＰＴＧの濃度範囲は、０、２０、４０、６０、８０、１００、２００、および４００μＭであった。グルコースまたはキシロース上の増殖について性能指標（ＰＩ）を計算するために、成長曲線の特定時点（典型的に３０〜４０時間目）における対照のＯＤについて、各実験株のＯＤを正規化した。このアッセイでは、増殖について最大ＰＩを示す実験株が、最も好ましい生体内活性のあるＰＫＬ酵素を発現した一方で、ＰＩの低い株は、同様に良好には機能しないＰＫＬを発現した。０、１００、および４００μＭにおけるＰＩが計算され、異なる誘導レベルにおける総合的増殖能力を代表するものであった。これらは、表１１で例証される。
【０５１４】
【表１５】
0006530375.tif 000016
【０５１５】
【表１６】
0006530375.tif 000017
【０５１６】
実施例１７：ホスホケトラーゼ発現株中のイソプレン収率およびイソプレン比生産性の小規模評価
実施例１５に記載されるイソプレン産生株を小規模でのイソプレン生産について評価した。
【０５１７】
（ｉ）材料と方法
酵母抽出物、ＭｇＳＯ４、グルコース、ＩＰＴＧ、スペクチノマイシン、およびカルベニシリンは、Ｓｉｇｍａから購入された。アルミホイルシール、４８ウェル無菌５ｍＬブロック、Ｂｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒシールメンブレン、９６ウェルマイクロ力価プレート、および９６ウェル円錐底プレートは、ＶＷＲから購入された。９６ウェルガラスブロックは、Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃから購入された。装置：５９７３Ｎ質量分光計を装着したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ、エッペンドルフ遠心分離機５４１７Ｒ、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ。
【０５１８】
成長速度測定
適切な抗生物質と共に３ｍｌＬＢの培地を含有する振盪管に、グリセロール培養物原液を接種した。培養物を３０℃、２２０ｒｐｍで、およそ１５時間培養した。
【０５１９】
ＴＭ３培地（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物なし）、１％グルコース、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足ＴＭ３培地を調製した。２ｍＬの補足ＴＭ３に、４８ウェル無菌ブロックの各ウェル内で、一晩培養物を０．２の最終ＯＤ６００で接種した。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、２時間培養した。２時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤ６００を測定し、様々な濃度のＩＰＴＧによって細胞を誘導した。ＩＰＴＧ誘導後４時間にわたり、ＯＤ６００の読み取りを毎時行った。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＯＤ６００測定値を判定した。
【０５２０】
イソプレン収率アッセイ：
ＴＭ３培地（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物なし）、１％グルコース、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足ＴＭ３培地を調製した。２ｍＬの補足ＴＭ３培地に、４８ウェル無菌ブロックの各ウェル内で、０．２の最終ＯＤ６００で接種した。９６ウェルガラスブロック（Ｚｉｎｓｓｅｒ）内で、グルコースまたは酵母抽出物を含まない９０μＬのＴＭ３培地に、１０μＬの接種培養物を移してアルミホイルで密封し、３４℃および４５０ｒｐｍで２４時間培養した。２４時間後、ヘッドスペース内のイソプレンの量と培地に残留するグルコースの量をＧＣ／ＭＳによって測定し、イソプレン収率を計算した。
【０５２１】
イソプレン比生産性測定：
１００μｌの培養物を９６ウェルガラスブロック内に収集した。ガラスブロックをアルミホイルで密封し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養した。３０分後、ブロックを７０℃の水浴中で２分間インキュベートした。ガラスブロックを室温に放冷し、次にウェルのヘッドスペース内のイソプレンをＧＣ／ＭＳによって測定した。
【０５２２】
グルコース測定：
９６ウェル円錐底プレート内の３００μｌの細胞培養物を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理することで、グルコースサンプルを収集した。上清をＤＩ水で１０倍に希釈し、記載されるグルコースオキシダーゼアッセイを使用して、グルコース濃度を測定した。
【０５２３】
グルコースオキシダーゼアッセイ：
ＡＢＴＳを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５の中で可溶化した。グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を以下の濃度で添加した：２．７４ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳ（粉末）、０．１Ｕ／ｍｌ  ＨＲＰ、１Ｕ／ｍｌ  ＧＯＸ。容器をホイルで包んで遮光し、４℃で最長７日間保存した。所望の濃度範囲にかけて（すなわち、１ｍｇ／ｍｌからの連続２倍希釈）グルコースをミリＱ水に溶解して、グルコース標準物質を調製した。１０μｌの試験サンプル（希釈反応物上清）および／またはグルコース標準物質をマイクロタイタープレートのウェルに入れた。９０μｌのＡＢＴＳ試薬を添加して、プレートミキサー上で迅速に混合した。アッセイプレートをプレートリーダーに移し、吸光度を４２０ｎｍで３〜５分間モニターした。データファイルをＥｘｃｅｌにエクスポートした。グルコース検量線を使用して、各ウェル内のグルコースの量を計算した。
【０５２４】
【表１７】
0006530375.tif 000018
【０５２５】
（ｉｉ）結果
（ｉ）２時間目のイソプレン比生産性；（ｉｉ）４時間目のイソプレン比生産性；（ｉｉｉ）増殖速度；および（ｉｖ）イソプレン収率のそれぞれの性能指標（ＰＩ）を計算するために、成長曲線の特定時点（典型的に１５〜２４時間）における対照の特定のパラメータについて、各実験株を正規化した。このイソプレン生産アッセイでは、これらの評価パラメータについて１．０をｇＰＩ値を示した実験株は、評価されたＰＫＬのより良い能力を示した。
【０５２６】
【表１８】
0006530375.tif 000019
【０５２７】
【表１９】
0006530375.tif 000020
【０５２８】
実施例１８：ＰＫＬ発現株中の細胞内代謝産物の測定
（ｉ）材料と方法
代謝産物抽出：
代謝産物分析のために使用した株は、実施例１７に記載されるのと同一株であった。したがって、これらの株を実施例１７に記載される成長条件下で培養し、４時間の増殖後にサンプルを採取して、選択された細胞代謝産物の相対濃度を測定した。５００μＬの細胞培養物を遠心分離して収集し、上清を廃棄して１００μＬの乾燥氷冷メタノールをペレットに添加し、ペレットの入った試験管をドライアイス中で即座に冷凍して、保存のために−８０℃の冷蔵庫に入れた。代謝産物を抽出するために、細胞ペレットをメタノールで覆い、ガラス棒を用いて再懸濁し、微量遠心機内で試験管を５分間遠心分離して、得られた上清を取り出して清浄な管に入れた。第１の抽出ステップ後に得られた細胞ペレットを４０μＬの５０％メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム混合物に再懸濁し、細胞破片を遠心分離して上清を収集し、第１の抽出後に得られた上清と合わせて貯留した。この抽出処置をもう１度繰り返して、細胞破片からの代謝産物のより完全な除去を確実にした。
【０５２９】
抽出および遠心分離中に、細胞含有サンプルを４℃未満に保ち、代謝産物分解を最小化した。最終貯留抽出物を混合し、次に遠心分離によって透明にした。
【０５３０】
代謝産物測定：
代謝産物の分析は、ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｍ三連四重極装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＬＣＭＳによって実施した。システム制御、データ取得、およびデータ解析は、ＸＣａｌｉｂｕｒおよびＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって実行された。製造会社推奨保護カートリッジを装着したＣ１８  Ｓｙｎｅｒｇｉ  ＭＡＸ−ＲＰ  ＨＰＬＣカラム（１５０×２ｍｍ、４ｕＭ、８０Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に、１０μＬのサンプルを装入した。ＭｉｌｌｉＱ等級水中の１５ｍＭの酢酸＋１０ｍＭのトリブチラミン（溶媒Ａ）と、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  ＪａｃｋｓｏｎからのＬＣＭＳ等級メタノール（溶媒Ｂ）との勾配で、カラムを溶出した。２２．５分間の勾配は、次のとおりであった：ｔ＝０分間、５％Ｂ；ｔ＝２分間、５％Ｂ；ｔ＝６分間、１０％Ｂ；ｔ＝１２分間、２０％Ｂ；ｔ＝１８分間、６７％Ｂ；ｔ＝１９分間、９９％Ｂ；ｔ＝２１分間、９９％Ｂ；；ｔ＝２１．５分間、５％Ｂ；ｔ＝２２．５分間、５％Ｂ；流速０．４ｍＬ／分、カラム温度３５℃。質量検出は、３．０〜３．５ｋＶのＥＳＩスプレー電圧およびイオン移動管の温度３５０℃で、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を使用して実施された。関心のある代謝産物のために、以下のＳＲＭ遷移を選択した：グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）では２５９→７９、フルクトース−１，６−二リン酸では３３９→７９、ホスホエノールピルビン酸では１６７→７９、６−ホスホグリセリン酸では２７５→７９、リボース−５−リン酸では２５９→７９ｅＶ、アセチルリン酸では１３９→７９、およびエリスロース−４−リン酸では１９９→７９。各ＳＲＭ遷移のスキャン時間は、０．７ｍ／ｚに設定したスキャン幅で０．１ｓであった。１．７ｍＴｏｒｒの衝突ガスとしてアルゴンを使用し、衝突エネルギーを最適化して、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された対応する標準物質を使用して最大シグナル強度を得た。同一標準物質を使用して、測定された代謝産物の滞留時間を確認した。ＳＲＭ遷移３６９→７９があるピークは、七炭糖−二リン酸に起因した。測定された代謝産物の濃度は、試料採取中に培養物の光学濃度について正規化されたシグナル強度として表される。
【０５３１】
（ｉｉ）結果
アセチルリン酸（ＡｃＰ）の生産について性能指標（ＰＩ）を計算するために、成長曲線の特定時点（典型的に３０〜４０時間）における対照の特定のパラメータについて、それぞれの実験株からの各代謝産物の量を正規化した。このアッセイでは、これらの評価パラメータについて１．０を超えるＰＩ値を示した実験株は、評価されたＰＫＬのより良い能力を示した。
【０５３２】
【表２０】
0006530375.tif 000021
【０５３３】
【表２１】
0006530375.tif 000022
【０５３４】
実施例１９：ホスホケトラーゼのタンパク質発現および溶解度の判定
（ｉ）材料と方法
評価されたホスホケトラーゼのタンパク質発現および溶解度を判定するのに使用された株は、実施例１７に記載されるのと同一株であった。株は、適切な抗生物質を含有するＬＢブロス中で、３４℃で一晩培養した。翌日、１００μＬの一晩培養物を適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＬＢに添加して、ＯＤ（６００）が約０．５になるまで３４℃で培養した。次に培養物を２００μＭのＩＰＴＧによって誘導し、３４℃でさらに６時間培養した。次に細胞を遠心分離して収集し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０５３５】
翌日ペレットを解凍し、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩおよび０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦを添加した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６の中で、それらを４のＯＤ（６００）に再懸濁した。次に細胞をフレンチプレスによって個別に溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。可溶性留分の平均全タンパク質濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによる判定で、０．５６±０．２２ｍｇ／ｍｌであった。遠心分離からのペレットは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６の緩衝液に再懸濁し、各ホスホケトラーゼのパーセント溶解度を判定するために取っておいた。
【０５３６】
次に溶解産物を使用して、総タンパク質単位当たりのフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）に対するホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）活性量を判定した（μｍｏｌ／分／ｍｇ）。Ｆ６Ｐに対するＰＫＬ活性は、生成したアセチルリン酸（ＡｃＰ）の量を追跡することで判定した。反応混合物（２００μＬ）は、１００μＬの溶解産物と共に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６中の１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、１ｍＭチアミン二リン酸、１０ｍＭ  Ｆ６Ｐ、２０ｍＭ  ＮａＦ、８ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭジチオスレイトールを含有する。これらを３４℃で３０分間培養し、６０μＬの反応混合物を６０μＬの２Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ６．５に添加することで、クエンチした。このクエンチ混合物を室温で１０分間培養し、次に０．１Ｍ  ＨＣｌ中の４０μＬの１５％ＴＣＡ、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌ、および４０μＬの５％ＦｅＣｌ３を添加した。次にこの最終混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清（２００μＬ）を取り出して、５０５ｎｍで吸光度を測定した。ＡｃＰの検量線を使用して、ＡｃＰがどのくらい生産されたかを計算した。
【０５３７】
濃度測定によって、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＭＣＳ９０８対照と比較した、各ＰＫＬ変異体の相対的発現および溶解度を判定した。各サンプルの可溶性溶解産物をゲルローディング色素と１：１で混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。フレンチプレスによる溶解後にサンプルの遠心分離から得られた各ペレット（上記を参照されたい）は、ゲルローディング色素で１：１に希釈して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装入した。対照として、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＭＣＳ９０８可溶性溶解産物のサンプルを各ゲルに含めた。クーマシーブリリアントブルー染色を使用してゲルを発色させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ  ｖ２００５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）濃度測定ソフトウェアを使用して分析した。対照株（Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＭＣＳ９０８）と比較して、発現した可溶性タンパク質パーセントおよび可溶性対不溶性パーセントを判定した。
【０５３８】
（ｉｉ）結果
（ｉ）総タンパク質量単位当たり（Ｆ６Ｐ）比活性（μｍｏｌ／分／ｍｇ）；（ｉｉ）発現レベル；および（ｉｉｉ）溶解度のそれぞれの性能指標（ＰＩ）を計算するために、各実験株を対照の特定のパラメータについて正規化した。（ｉ）のＰＩ値を（ｉｉ）のＰＩ値で除算することで、Ｆ６Ｐ比活性（活性／発現レベル）のＰＩを判定した。このアッセイでは、これらの評価パラメータについて１．０を超えるＰＩを示した実験株は、評価されたＰＫＬのより良い能力を示した。
【０５３９】
【表２２】
0006530375.tif 000023
【０５４０】
実施例２０：フルクトース−６−リン酸およびキシルロース−５−リン酸に対するホスホケトラーゼ活性
本実施例は、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）またはキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）上で株を培養した際のＰＫＬ活性を判定した。
【０５４１】
（ｉ）材料と方法
株は、適切な抗生物質を含有するＬＢブロス中で、３４℃で一晩培養した。翌日、２００μＬの一晩培養物を適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＴＭ３に添加して、３４℃で２．５時間培養した。次に培養物を２００μＭのＩＰＴＧによって誘導し、３４℃でさらに４時間培養した。次に細胞を遠心分離して収集し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０５４２】
翌日ペレットを解凍し、それらを０．２ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩおよび０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦを添加した２ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８  に再懸濁した。次に細胞をフレンチプレスによって個別に溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。
【０５４３】
溶解産物調製および酵素活性測定：
次に溶解産物を使用して、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）およびキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）上のホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）活性の量を判定した。Ｆ６ＰおよびＸ５Ｐに対するＰＫＬ活性は、生成したアセチルリン酸（ＡｃＰ）の量を追跡することで判定した。Ｆ６Ｐ反応混合物（２００μＬ）は、１００μＬの溶解産物と共に、１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中の１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、１ｍＭチアミン二リン酸、１０ｍＭ  Ｆ６Ｐ、２０ｍＭ  ＮａＦ、８ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭジチオスレイトールを含有した。これらを３４℃で３０分間培養し、６０μＬの反応混合物を６０μＬの２Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ６．５に添加することで、クエンチした。このクエンチ混合物を室温で１０分間培養し、次に０．１Ｍ  ＨＣｌ中の４０μＬの１５％ＴＣＡ、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌ、および４０μＬの５％ＦｅＣｌ３を添加した。次にこの最終混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清（２００μＬ）を取り出して、５０５ｎｍで吸光度を測定した。ＡｃＰの検量線を使用して、ＡｃＰがどのくらい生産されたかを計算した。同様の方法によってＸ５Ｐ活性を測定した。Ｘ５Ｐ反応混合物（２００μＬ）は、２０μＬの溶解産物と共に、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中の１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、１ｍＭチアミン二リン酸、１０ｍＭリボース−５−リン酸、６０μｇ／ｍＬのリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、２００μｇ／ｍＬのリボース−５−リン酸イソメラーゼＡ、２０ｍＭ  ＮａＦ、８ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭジチオスレイトールを含有した。幅広い活性Ｘ５Ｐに対するのために、活性は未希釈と、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中の５倍希釈との２つの溶解産物濃度で評価した。
【０５４４】
【表２３】
0006530375.tif 000024
【０５４５】
実施例２１：ホスホケトラーゼ発現株中のイソプレン生産の１４Ｌ評価
この実験は、様々なホスホケトラーゼ酵素発現のイソプレン生産に対する影響を評価するために実施した。この実験中の全ての株では、メバロン酸経路由来導入遺伝子、イソプレンシンターゼ、およびホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）を発現する改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（ＢＬ２１誘導産生宿主ＭＤ８９１）が使用され、株の詳細については表１７を参照されたい。これらのイソプレン産生株は全て、１５Ｌ規模の流加培養中で培養した。
【０５４６】
妥当な能力測定基準は、グルコース、およびイソプレン力価に対する累積イソプレン収率である。生産性測定基準は、表１８に要約される。
【０５４７】
【表２４】
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【０５４８】
（ｉ）材料と方法
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：
７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍｌの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ  Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にした。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質（スペクチノマイシンおよびカルベニシリン）を添加して、５０ｍｇ／Ｌの標的濃度にした。
【０５４９】
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５５０】
ビタミン溶液（１リットルあたり）：
１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５５１】
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：
２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
【０５５２】
供給液（１キログラムあたり）：
０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉＨ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍｌのマクロ塩溶液、６．５５ｍｌのビタミン溶液、０．８２ｍｌの１０００×修正微量金属溶液である。目標とする１００μＭ  ＩＰＴＧのために：供給物１キログラムあたり１．８７ｍｌの無菌１０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加する。
【０５５３】
この実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）および温度（３４℃）における、グルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。各実験を開始するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生株の適切な冷凍バイアルを解凍して、トリプトン酵母抽出物（ＬＢ）培地と適切な抗生物質とを含有するフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）における測定で、種菌がほぼ１．０の光学濃度に増殖した後に、５００ｍＬを使用して１５Ｌバイオリアクターに接種し、初期タンク容積を５Ｌにした。
【０５５４】
バイオリアクター背圧を０．７バールゲージに維持し、生産生物に酸素を提供するのに使用される入口ガスは、入口ガスを既知の濃度（７．３〜８．３容積％の酸素）に希釈する、工場内設備によって提供される。
【０５５５】
バッチ添加される培地には、グルコースが９．７ｇ／Ｌでバッチ添加された。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで達成される。細胞のＯＤ５５０が６になったら、ＩＰＴＧの無菌溶液を含有するシリンジを添加して、ＩＰＴＧ濃度を１００μＭにした。ｐＨ上昇によってシグナルされるように、ひとたびグルコースが培養物によって消費されたら、グルコース供給液を１０ｇ／分以下の速度で供給して代謝要求を満たした。溶存酸素制限が確立された後、固定時点において、温度を３４℃から３７℃に１時間かけて上昇させた。グルコース上の最大累積イソプレン質量収率を判定するのに十分長い時間、典型的に、合計６４時間の経過発酵時間（ＥＦＴ）にわたり、発酵を実行した。
【０５５６】
（ｉｉ）結果と分析
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、Ｈｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計によって独立して判定された。
【０５５７】
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。
【０５５８】
発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定された。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定された。
【０５５９】
ＨＰＬＣ情報
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５
カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  カタログ番号１２５−０１４０
カラム温度：５０℃
ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ  ｒｅｆｉｌｌ  ３０ｍｍ×４．６ｍｍカタログ番号１２５−０１２９
ランニング緩衝液：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４
ランニング緩衝液流速：０．６ｍｌ／分
近似ランニング圧力：約１１００〜１２００ｐｓｉ
注入容積：２０マイクロリットル
検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ−２３０１）
実行時間：２６分間
【０５６０】
グルコース上の累積イソプレン収率は、イソプレン総重量（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５８２６）］に等しく、式中、０．５８２６は、グルコース供給液中のグルコースの重量％であり、８３．５は、ｔ＝０で発酵槽にバッチ添加されたこの供給物のグラム数である。単位は、ｇＩｓｏｐｒｅｎｅ／ｇｇｌｕｃｏｓｅ＊１００で、百分率として表される。
【０５６１】
ＩｓｐＥＲは、（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）単位のイソプレン放出速度である。
【０５６２】
比生産性（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＩｓｐＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。
【０５６３】
ＯＤ＝光学濃度＝５５０ｎｍにおける吸光度＊水中希釈係数。
【０５６４】
平滑化比生産性（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝イソプレン毎時生成ミリグラム（８時間間隔で平均化した）の勾配／ブロス容積＊ＯＤ。
【０５６５】
イソプレン力価（ｇＩｓｏｐｒｅｎｅ／Ｌａｖｅｒａｇｅ ｂｒｏｔｈ）は、平均ブロス容積あたりの全発生イソプレンである。これは、ＩｓｐＥＲを積分して、イソプレン単位をｍｍｏｌからグラムに変換することで計算される。
【０５６６】
結果は、図４０および４１のグラフで描写され、表１５で例証される。
【０５６７】
【表２５】
0006530375.tif 000026
【０５６８】
実施例２２：解糖およびペントースリン酸経路がブロックされたＰＫＬ発現株の増殖の生体内評価
解糖およびペントースリン酸経路についてブロックされた株中のＰＫＬ酵素活性の分析では、標準分子生物学的技術を使用して、発現プラスミドのサブセットをＭＤ１０４１株（ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ  ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ  ＰＧＬ  ＭＬ，ＦＲＴ−ＰＬ．２−２ｃｉｓ−ＲＢＳ１００００−ＭＶＫ（ｂｕｒｔｏｎｉｉ），ｔ  ｚｗｆ：：ＦＲＴ，ｔ  ｐｆｋＡ：：Ｆｒｔ＋ｔ  ａｃｋＡ：：ＦＲＴ，ｔ  ｐｆｋＢ：：Ｆｒｔ）に形質転換した。個々の形質転換体をＬＢ中で一晩培養し、炭素源として１％グルコース−６−リン酸（Ｓｉｇｍａ）が添加されたＴＭ３培地中で希釈して、０、２０、４０、６０、８０、１００、２００、または４００μＭＩＰＴＧによって誘導した。任意のＰＫＬを発現せず（したがって増殖しない）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのＰＫＬ酵素を発現する（そしてベースライン性能を代表する）ＭＤ１０４１対照株と比較して、または解糖またはペントースリン酸経路中で代謝ブロックされていないＷＴ株（最適増殖のための対照として）と、比較して、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ上の増殖能力について株をアッセイした。
【０５６９】
増殖の性能指標（ＰＩ）を計算するために、実験的ＰＫＬ酵素を発現したＭＤ１０４１誘導体株をＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのＰＫＬを発現する株であるＭＣＳ１１４８と比較した（株の一覧については表１を参照されたい）。３５時間目の時点および１００μＭのＩＰＴＧ誘導レベルは、成長曲線全体にわたる一般的性能の代表として選択された。アッセイプレート間で値を正規化するために、ＷＴ株の最大ＯＤ値間の差である１．２７９に基づく修正係数が、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬを発現する対照株を含有しないプレート内の全ての値に適用された。次に、３５時間めの時点で、補正実験的ＯＤ値をＭＣＳ１１４８のＯＤ値で除算してＰＩを計算した。したがってＭＣＳ１１４８のＰＩは１．０であって、これよりも高い任意の値は、このアッセイにおける増殖のＸ倍の改善を示唆した。ＰＩ値は、表１９に示される。
【０５７０】
【表２６】
0006530375.tif 000027
【０５７１】
配列
マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）Ｓｐｙｒ１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１】
0006530375.tif 000028
シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）ＯＳ１８５からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２】
0006530375.tif 000029
ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＬＭＳ２−１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３】
0006530375.tif 000030
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＴ１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４】
0006530375.tif 000031
ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ロングム（ｌｏｎｇｕｍ）亜株ＪＤＭ３０１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化５】
0006530375.tif 000032
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）ＫＭ２０からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化６】
0006530375.tif 000033
ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）Ｓ２３３２１種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化７】
0006530375.tif 000034
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１０３９からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化８】
0006530375.tif 000035
ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）ＣＣＭ４９１５からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化９】
0006530375.tif 000036
ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ１１７４１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１０】
0006530375.tif 000037
ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＣＯＨ１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１１】
0006530375.tif 000038
ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）ＲＫＪ３００からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１２】
0006530375.tif 000039
バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ＬＢ４００からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１３】
0006530375.tif 000040
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）ＡＴＣＣ１３９５０からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１４】
0006530375.tif 000041
ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）Ｉｓ７９Ａ３種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１５】
0006530375.tif 000042
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）９７２ｈ−からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１６】
0006530375.tif 000043
ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）亜株Ｊ１８からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１７】
0006530375.tif 000044
ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＳＡ３＿ａｃｔＧ種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１８】
0006530375.tif 000045
ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＡＴＣＣ１１５７７からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化１９】
0006530375.tif 000046
ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ１４６７２からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２０】
0006530375.tif 000047
シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）ＰＣＣ８８０２種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２１】
0006530375.tif 000048
ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＮＲＲＬ１８１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２２】
0006530375.tif 000049
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ１３３０からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２３】
0006530375.tif 000050
リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ２０６０１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２４】
0006530375.tif 000051
エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ＥＣ３０からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２５】
0006530375.tif 000052
マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）Ａ２１ＪＰ２からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２６】
0006530375.tif 000053
カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１７−４種からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２７】
0006530375.tif 000054
メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ＡＴＣＣ３５３１１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２８】
0006530375.tif 000055
テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ１２１７２からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化２９】
0006530375.tif 000056
メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ＤＡＴ５６１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３０】
0006530375.tif 000057
マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）１５８Ｌ３−１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３１】
0006530375.tif 000058
ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＮＥＭ３１６からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３２】
0006530375.tif 000059
マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＰＧ２からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３３】
0006530375.tif 000060
ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）シャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）株ＣＨ１亜系からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３４】
0006530375.tif 000061
キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）ＡＴＣＣ５１１４７からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３５】
0006530375.tif 000062
マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）Ｍ６４からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３６】
0006530375.tif 000063
グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ４９１７５からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３７】
0006530375.tif 000064
マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ２３１１４からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３８】
0006530375.tif 000065
マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）ＭＰ１４５からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化３９】
0006530375.tif 000066
ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種０１４口腔分類群Ｆ０３１４株からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４０】
0006530375.tif 000067
エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）ＡＣＳ−１３９−Ｖ−Ｃｏｌ８からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４１】
0006530375.tif 000068
アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａからのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４２】
0006530375.tif 000069
キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）ＡＴＣＣ２３３３０からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４３】
0006530375.tif 000070
ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ＨＳ−６からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４４】
0006530375.tif 000071
ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ＨＳ−６からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４５】
0006530375.tif 000072
マイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）ＳＦ７からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４６】
0006530375.tif 000073
バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮからのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４７】
0006530375.tif 000074
ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４８】
0006530375.tif 000075
ビフィドバクテリウム・ガリクム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＤＳＭ２００９３からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化４９】
0006530375.tif 000076
ビフィドバクテリウム・デンチウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化５０】
0006530375.tif 000077
ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＩＰＬＡ２００１５からのホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列
【化５１】
0006530375.tif 000078
マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）Ｓｐｙｒ１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５２】
0006530375.tif 000079
シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）ＯＳ１８５からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５３】
0006530375.tif 000080
ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＬＭＳ２−１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５４】
0006530375.tif 000081
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＴ１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５５】
0006530375.tif 000082
ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）ＫＭ２０からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５６】
0006530375.tif 000083
ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）Ｓ２３３２１種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５７】
0006530375.tif 000084
ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）ＣＣＭ４９１５からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５８】
0006530375.tif 000085
ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ１１７４１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化５９】
0006530375.tif 000086
ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）ＲＫＪ３００からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６０】
0006530375.tif 000087
バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ＬＢ４００からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６１】
0006530375.tif 000088
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）ＡＴＣＣ１３９５０からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６２】
0006530375.tif 000089
ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）Ｉｓ７９Ａ３種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６３】
0006530375.tif 000090
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）９７２ｈ−からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６４】
0006530375.tif 000091
ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＡＴＣＣ１１５７７からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６５】
0006530375.tif 000092
ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ１４６７２からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６６】
0006530375.tif 000093
シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）ＰＣＣ８８０２種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６７】
0006530375.tif 000094
ネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＮＲＲＬ１８１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６８】
0006530375.tif 000095
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ１３３０からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化６９】
0006530375.tif 000096
リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ２０６０１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７０】
0006530375.tif 000097
エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ＥＣ３０からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７１】
0006530375.tif 000098
マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）Ａ２１ＪＰ２からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７２】
0006530375.tif 000099
カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１７−４種からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７３】
0006530375.tif 000100
メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ＡＴＣＣ３５３１１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７４】
0006530375.tif 000101
テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ１２１７２からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７５】
0006530375.tif 000102
メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）ＤＡＴ５６１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７６】
0006530375.tif 000103
マイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）１５８Ｌ３−１からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７７】
0006530375.tif 000104
ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＮＥＭ３１６からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７８】
0006530375.tif 000105
マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＰＧ２からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化７９】
0006530375.tif 000106
ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）シャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）株ＣＨ１亜系からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８０】
0006530375.tif 000107
キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）ＡＴＣＣ５１１４７からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８１】
0006530375.tif 000108
マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）Ｍ６４からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８２】
0006530375.tif 000109
グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ４９１７５からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８３】
0006530375.tif 000110
マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ２３１１４からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８４】
0006530375.tif 000111
マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）ＭＰ１４５からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８５】
0006530375.tif 000112
ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種０１４口腔分類群Ｆ０３１４株からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８６】
0006530375.tif 000113
エレモコッカス・コレオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）ＡＣＳ−１３９−Ｖ−Ｃｏｌ８からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８７】
0006530375.tif 000114
アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ）ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａからのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８８】
0006530375.tif 000115
キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）ＡＴＣＣ２３３３０からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化８９】
0006530375.tif 000116
ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ＨＳ−６からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化９０】
0006530375.tif 000117
ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）ＨＳ−６からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化９１】
0006530375.tif 000118
マイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）ＳＦ７からのホスホケトラーゼ酵素をコードする核酸配列
【化９２】
0006530375.tif 000119
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬのアミノ酸配列
【化９３】
0006530375.tif 000120
コドン最適化されたクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＰＫＬのアミノ酸配列
【化９４】
0006530375.tif 000121
Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）ｍｖａＥ核酸配列
【化９５】
0006530375.tif 000122
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ核酸配列
【化９６】
0006530375.tif 000123
Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ｍｖａＥ核酸配列
【化９７】
0006530375.tif 000124
Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ核酸配列
【化９８】
0006530375.tif 000125
Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）ｍｖａＳ核酸配列
【化９９】
0006530375.tif 000126
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ核酸配列
【化１００】
0006530375.tif 000127
Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ｍｖａＳ核酸配列
【化１０１】
0006530375.tif 000128
Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ核酸配列
【化１０２】
0006530375.tif 000129
アセトアセチルＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列
【化１０３】
0006530375.tif 000130
Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＰＫＬ核酸配列
【化１０４】
0006530375.tif 000131
Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＰＫＬアミノ酸配列
【化１０５】
0006530375.tif 000132
【図１】
0006530375.tif 000133
【図２】
0006530375.tif 000134
【図３】
0006530375.tif 000135
【図４】
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【図５】
0006530375.tif 000137
【図６】
0006530375.tif 000138
【図７】
0006530375.tif 000139
【図８】
0006530375.tif 000140
【図９】
0006530375.tif 000141
【図１０】
0006530375.tif 000142
【図１１】
0006530375.tif 000143
【図１２】
0006530375.tif 000144
【図１３】
0006530375.tif 000145
【図１４】
0006530375.tif 000146
【図１５】
0006530375.tif 000147
【図１６】
0006530375.tif 000148
【図１７】
0006530375.tif 000149
【図１８】
0006530375.tif 000150
【図１９】
0006530375.tif 000151
【図２０】
0006530375.tif 000152
【図２１】
0006530375.tif 000153
【図２２】
0006530375.tif 000154
【図２３】
0006530375.tif 000155
【図２４】
0006530375.tif 000156
【図２５】
0006530375.tif 000157
【図２６】
0006530375.tif 000158
【図２７】
0006530375.tif 000159
【図２８】
0006530375.tif 000160
【図２９】
0006530375.tif 000161
【図３０】
0006530375.tif 000162
【図３１】
0006530375.tif 000163
【図３２】
0006530375.tif 000164
【図３３】
0006530375.tif 000165
【図３４】
0006530375.tif 000166
【図３５】
0006530375.tif 000167
【図３６】
0006530375.tif 000168
【図３７】
0006530375.tif 000169
【図３８】
0006530375.tif 000170
【図３９】
0006530375.tif 000171
【図４０】
0006530375.tif 000172
【図４１】
0006530375.tif 000173
【図４２】
0006530375.tif 000174
【配列表】
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