(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及びＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の基質を含む混合物をインキュベートする工程を含み、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であり、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が非特異的ＤＮＡ分解酵素である場合は、前記混合物がさらに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、核酸の増幅方法。
【請求項２】
ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素によりＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖を無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される工程を含む、請求項１に記載の核酸の増幅方法。
【請求項３】
前記混合物がＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を含み、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さない酵素である、請求項１又は２に記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】
前記混合物がＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として非特異的ＤＮＡ分解酵素を含み、非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、及び一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さない酵素である、請求項１又は２に記載の核酸の増幅方法。
【請求項５】
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である、請求項１から４の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素である、請求項３に記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素である、請求項６に記載の核酸の増幅方法。
【請求項８】
非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素である、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】
非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素である、請求項８に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１０】
プライマーが、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー又は配列特異的プライマーの１種以上である、請求項１から９の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１１】
プライマーが、カチオンユニットの修飾によってＴｍ値が上昇しているプライマーである、請求項１から１０の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１２】
プライマーが、Zip Nucleic Acid (ＺＮＡ) プライマーである、請求項１から１１の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１３】
混合物がさらに、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１から１２の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１４】
鋳型ＲＮＡが、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡである、請求項１から１３の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１５】
ＤＮＡシーケンスライブラリ作製に供するｃＤＮＡの増幅のために行う、請求項１から１４の何れか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及びＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の基質を少なくとも含み、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が非特異的ＤＮＡ分解酵素である場合は、さらに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１から１５の何れか１項に記載の核酸の増幅方法を行うためのキット。
【請求項１７】
さらに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
さらにプライマーを含む、請求項１６または１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素と鎖置換活性を用いた核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素を用いて核酸を増幅する方法に関する。さらに本発明は、上記の核酸の増幅方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに多数の核酸増幅方法が報告されている。例えば、Polymerase Chain Reaction (ＰＣＲ)(非特許文献１)、Strand Displacement Amplification (ＳＤＡ)( 非特許文献２)、Multiple Displacement Amplification (ＭＤＡ)( 非特許文献３)、Rolling-Circle Amplification (ＲＣＡ)( 非特許文献４)、Loop-Mediated Isothermal Amplification (ＬＡＭＰ)( 非特許文献５)、Smart Amplification Process (ＳｍａｒｔＡｍｐ)( 非特許文献６)、Helicase-Dependent Amplification (ＨＤＡ)( 非特許文献７)、Ligase Chain Reaction (ＬＣＲ)( 非特許文献８)などが挙げられる。これらは、ＤＮＡを鋳型とした増幅法であり、ＰＣＲ、ＨＤＡ、ＬＣＲを除けば、全てがＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を利用したものである。鎖置換反応を利用した増幅系の中核となるのがＳＤＡである（非特許文献２）。ＳＤＡは、二本鎖ＤＮＡを制限酵素等で片側鎖に切断点（ニック）を入れる。このニックを起点としてＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性で３’  側のＤＮＡ鎖を剥がし、新たな相補鎖ＤＮＡを合成する。ＳＤＡは、この反応を連続的に起こすことで、相補鎖ＤＮＡを増幅させる技術である。また、ランダムヘキサマープライマーを利用したＭＤＡは、鋳型ＤＮＡ上に無作為かつ複数箇所にプライマーがアニーリングすることで、無作為な鎖置換反応を起こすことができ、非常に増幅率の高い方法となっている（非特許文献３）。しかし、ＤＮＡを鋳型とするこれらの増幅法を用いてＲＮＡ配列を増幅させるには、ＲＮＡをＤＮＡに変換する逆転写反応を経る必要がある。また、ＳＤＡは、制限酵素を使って鋳型ＤＮＡにニックを挿入する必要があるため、制限酵素認識配列やデオキシイノシンなどを鋳型に付加する必要がある。また、ＬＡＭＰ、ＳｍａｒｔＡｍｐは、１ターゲットに対して４〜５個の配列特異的なプライマーが必要となる。このため特殊なオリゴプライマーの合成や配列特異的プライマーの設計などが必要となる。さらに、ＰＣＲをはじめとするＤＮＡを鋳型とする増幅法では、以前に行ったＰＣＲ増幅産物や逆転写産物などのサンプルへのキャリーオーバーによって生じる偽陽性や、試薬中に混入しているＤＮＡ、作業環境から混入するＤＮＡなどに由来する非特異的産物が問題となっている（非特許文献９及び１０）。特にＭＤＡにおいては、プライマーがＤＮＡに対して無作為にアニーリングするため、混入ＤＮＡ由来の非特異的産物が増えることが懸念される。ＲＮＡを鋳型とする増幅技術として、制限酵素認識配列を持つ特殊なＤＮＡヘアピンプライマーを利用する方法が提案されている。本方式では、鋳型となるＲＮＡに結合させたＤＮＡヘアピンプライマーに切断点を生じさせ、鎖置換反応を起こすことで相補鎖ＤＮＡを増幅させる。しかしながら、この方式は、鋳型ＲＮＡの３’末端にＤＮＡヘアピンプライマーをライゲーションさせる前処理が必要となり、ライゲーションの条件によって補足できない分子が生じる可能性がある。また鋳型ＲＮＡの３’末端から増幅するため、全長にわたって均等に増幅することが方式上難しいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Mullis K他、Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73.
【非特許文献２】Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Walker GT, 他、Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Jan 1;89(1):392-6.
【非特許文献３】Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Dean FB, 他、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr 16;99(8):5261-6.
【非特許文献４】Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Lizardi PM, 他、Nat Genet. 1998 Jul;19(3):225-32.
【非特許文献５】Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Notomi T, 他、Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
【非特許文献６】Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermal amplification and a new mismatch-suppression technology. Mitani Y, 他、Nat Methods. 2007 Mar;4(3):257-62. Epub 2007 Feb 18.
【非特許文献７】Helicase-dependent isothermal DNA amplification. Myriam Vincent,他、EMBO Rep. 2004 August; 5(8): 795-800.
【非特許文献８】Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Barany F. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jan 1;88(1):189-93.
【非特許文献９】An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications. Champlot S, 他、PLoS One. 2010 Sep 28;5(9).
【非特許文献１０】Novel Sensitive Real-Time PCR for Quantification of Bacterial 16S rRNA Genes in Plasma of HIV-Infected Patients as a Marker for Microbial Translocation. Kramski M, 他、J Clin Microbiol. 2011 Oct;49(10)
【非特許文献１１】A Novel Method for SNP Detection Using a New Duplex-Specific Nuclease From Crab Hepatopancreas. Shagin DA, 他、Genome Res. 2002 Dec;12(12):1935-42
【非特許文献１２】The Enzyme and the cDNA Sequence of a Thermolabile and Double-Strand Specific DNase from Northern Shrimps (Pandalus borealis). Nilsen IW, 他、PLoS One. 2010 Apr 22;5(4):e10295.
【非特許文献１３】Experimental Murine Endometriosis Induces DNA Methylation and Altered Gene Expression in Eutopic Endometrium1. Lee B, 他、Biol Reprod. 2009 Jan;80(1):79-85.
【非特許文献１４】Versatile synthesis of oligodeoxyribonucleotide-oligospermine conjugates. Voirin E, Behr JP, 他、Nat Protoc. 2007;2(6):1360-7.
【非特許文献１５】Oligonucleotide-oligospermine conjugates (zip nucleic acids): a convenient means of finely tuning hybridization temperatures. Noir R, 他、J Am Chem Soc. 2008 Oct 8;130(40):13500-5.
【非特許文献１６】Zip Nucleic Acids: new high affinity oligonucleotides as potent primers for PCR and reverse transcription. Moreau V, 他、Nucleic Acids Res. 2009 Oct;37(19)
【非特許文献１７】DNA "melting" proteins. IV. Fluorescence measurements of binding parameters for bacteriophage T4 gene 32-protein to mono-, oligo-, and polynucleotides. Kelly RC, 他、J Biol Chem. 1976 Nov 25;251(22):7240-50.
【非特許文献１８】Reverse Transcriptase (RT) Inhibition of PCR at Low Concentrations of Template and Its Implications for Quantitative RT-PCR. Chandler DP, 他、Appl Environ Microbiol. 1998 Feb;64(2):669-77.
【非特許文献１９】Increased Yield of PCR Products by Addition of T4 Gene 32 Protein to the SMART-PCR cDNA Synthesis System. Villalva C, 他、Biotechniques. 2001 Jul;31(1):81-3, 86.
【非特許文献２０】An Optimized Protocol for First Strand cDNA Synthesis from Laser Capture Microdissected Tissue. Boylan S, 他、Lab Invest. 2001 Aug;81(8):1167-9.
【非特許文献２１】Extra-embryonic endoderm cells derived from ES cells induced by GATA factors acquire the character of XEN cells. Shimosato D,他、BMC Dev Biol. 2007 Jul 3;7:80.
【非特許文献２２】Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Tuma RS, 他、Anal Biochem. 1999 Mar 15;268(2):278-88.
【非特許文献２３】CRYSTALLINE DESOXYRIBONUCLEASE II. DIGESTION OF THYMUS NUCLEIC ACID (DESOXYRIBONUCLEIC ACID) THE KINETICS OF THE REACTION. Kunitz M, J Gen Physiol. 1950 Mar;33(4):363-77.
【非特許文献２４】The effect of divalent cations on the mode of action of DNase I. The initial reaction products produced from covalently closed circular DNA. Campbell VW, 他、J Biol Chem. 1980 Apr 25;255(8):3726-35.
【非特許文献２５】Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA. Shamoo Y, 他、Nature. 1995 Jul 27;376(6538):362-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
遺伝子発現解析を行うためにはＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への変換が必要である。ＤＮＡを鋳型とする増幅技術はあるが、特殊な配列を付加するなどの前処理を施さない無処置なＲＮＡを直接鋳型とした増幅技術はない。本発明は、ＤＮＡを鋳型とする既存の増幅方法ではなく、ＲＮＡを鋳型とする核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、操作の簡素化だけでなく、試薬・作業環境からの混入ＤＮＡを起因とする非特異的増幅リスクの排除、微量ＲＮＡの検出感度の上昇と増幅バイアスの低減を実現することができるＲＮＡを鋳型とする核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法（ＲＴ−ＲａｍＤＡ法またはＲａｍＤＡ法とも称する）を発明した。ＲＴ−ＲａｍＤＡ法によれば、ｃＤＮＡの収率を市販のキットよりも１０〜１００倍に増やすことができ、微量ＲＮＡからの遺伝子発現解析において低発現遺伝子の捕捉や検出遺伝子数の拡充が可能となることが判明した。またＲａｍＤＡ法により増幅したｃＤＮＡはＲＮＡシーケンス法など様々な遺伝子解析に適応させることが可能で、分子生物学の基礎技術として幅広い活用が期待される。また、ＤＮＡを鋳型とする既存の増幅系とは異なりＲＮＡを鋳型とすることにより、操作の簡素化だけでなく、試薬・作業環境からの混入ＤＮＡを起因とする非特異的増幅リスクの排除、増幅バイアスの低減を実現することができる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００６】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含み、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素である、核酸の増幅方法。
（２）  ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素によりＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖を無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される工程を含む、（１）に記載の核酸の増幅方法。
（３）  前記混合物がＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を含み、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さない酵素である、（１）又は（２）に記載の核酸の増幅方法。
（４）  前記混合物がＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として非特異的ＤＮＡ分解酵素を含み、非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、及び一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さない酵素である、（１）又は（２）に記載の核酸の増幅方法。
（５）  ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である、（１）から（４）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（６）  二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体である、（３）に記載の核酸の増幅方法。
（７）  二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素が、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体である、（６）に記載の核酸の増幅方法。
（８）  非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体である、（４）に記載の核酸の増幅方法。
（９）  非特異的ＤＮＡ分解酵素が、ウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体である、（８）に記載の核酸の増幅方法。
（１０）  プライマーが、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー又は配列特異的プライマーの１種以上である、（１）から（９）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１１）  プライマーが、カチオンユニットの修飾によってＴｍ値が上昇しているプライマーである、（１）から（１０）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１２）  プライマーが、Zip Nucleic Acid (ＺＮＡ) プライマーである、（１）から（１１）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１３）  混合物がさらに、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、（１）から（１２）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１４）  鋳型ＲＮＡが、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡである、（１）から（１３）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１５）  ＤＮＡシーケンスライブラリ作製に供するｃＤＮＡの増幅のために行う、（１）から（１４）の何れかに記載の核酸の増幅方法。
（１６）  ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素を少なくとも含む、（１）から（１５）の何れかに記載の核酸の増幅方法を行うためのキット。
（１７）  さらに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、（１６）に記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の核酸の増幅方法によれば、ＲＮＡを鋳型として核酸を増幅できることから、操作の簡素化だけでなく、試薬・作業環境からの混入ＤＮＡを起因とする非特異的増幅リスクを排除でき、増幅バイアスの低減を実現することができる。さらに本発明の核酸の増幅方法によれば、既存の逆転写ｃＤＮＡ合成キットと比べて１０倍以上の収量を得ることができ、条件によっては１００倍以上の増幅も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＲＴ−ＲａｍＤＡ（ＲａｍＤＡ）法の模式図を示す。
【図２】図２は、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（ｄｓＤＮａｓｅ）と非特異的ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ  Ｉ）は、二本鎖ＤＮＡだけでなくＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡも切断することを示す。蛍光オリゴヌクレオチドを用いたＦＲＥＴ解析により、ｄｓＤＮａｓｅ、及びＤＮａｓｅ  Ｉの逆転写バッファー条件下でのヌクレアーゼ特性を検証した。ｄｓＤＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ  Ｉに加えて、熱不安定な性質をもつ  ＨＬ−ｄｓＤＮａｓｅ、そして、ＤＮａｓｅを含まないバッファーコントロール（ｂｕｆｆｅｒ）の４条件で、経時的なヌクレアーゼ活性を測定した。Ａ、Ｃは、二本鎖ＤＮＡ中のＤＮＡ、Ｂは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ、Ｄは、ハイブリッド鎖中のＲＮＡでの活性を示す。Ｅ、Ｆはそれぞれ、一本鎖のＤＮＡと一本鎖ＲＮＡでの結果を示す。測定は、３７℃で７０秒毎に１回の検出を５０回行った。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝３）。
【図３】図３は、ｄｓＤＮａｓｅの活性により、ｃＤＮＡの断片化と増幅が起きることを示す。Ａでは、５ｎｇの人工合成ＲＮＡ、Ｔｈｒ  ＲＮＡ（２，０５２ｂ）を鋳型に用いて、標準の逆転写法（ＲａｍＤＡ（−））と、標準の逆転写法にｄｓＤＮａｓｅ、ＺＮＡ−ランダムヘキサマープライマー、Ｔ４ジーン３２プロテインを添加したＲａｍＤＡ（＋）とのｃＤＮＡパターンをアガロースゲル電気泳動で調べた。ｓｓＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒは、ｄｓＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒを熱変性させたものである。矢印は、それぞれ２ｋｂを示す。図中の「−」は、ＲａｍＤＡ（−）、「＋」は、ＲａｍＤＡ（＋）を示す。Ｂでは、１細胞相当のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量であるマウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡに添加した１００ｆｇの人工合成ＲＮＡ、Ｄａｐ  ＲＮＡ（９６，７２５コピー）、及びＴｈｒ  ＲＮＡ（８９，９９１コピー）のｃＤＮＡ量をｑＰＣＲで検出した。ｑＰＣＲには、逆転写産物の１／５０量を用いた。横軸は、３’末端からの距離を示す。検出用のｑＰＣＲ  プライマーは、Ｄａｐ、Ｔｈｒ、それぞれ、５’から３’にかけての１２領域で設計した。ｄＴ：オリゴｄＴプライマー、Ｎ６：ランダムヘキサマープライマー、  Ｎ６Ｚ：ＺＮＡ−ランダムヘキサマープライマー。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝３）。
【図４】図４は、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法は熱不安定性のｄｓＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素で作用することを示す。Ａでは、マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの検出量をｑＰＣＲを用いた相対定量値として示す。値は、ＲａｍＤＡ（−）条件の各遺伝子における検出ｃＤＮＡ量（コピー数）を基準とした相対値を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝４）。Ｂでは、２０ｎｇのMillenniumRNA Markers（０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、９ｋｂ）を鋳型にし、各種逆転写酵素キットを用いて合成したｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。ａ−ｊは、Ｃのグラフ中のａ−ｊと一致している。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖を形成しているバンドは、一本鎖ｃＤＮＡよりも明るく染色されている（非特許文献２１）。伸長反応は、４２℃  ２．５分で行った。Ｃでは、マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの検出量をｑＰＣＲを用いた相対定量値として示す。図中の「−」は、ＲａｍＤＡ（−）、「＋」は、ＲａｍＤＡ（＋）を示し、各酵素のＲａｍＤＡ（−）の値を１とした。ａ−ｃ、ｈ、ｉのＲａｍＤＡ（＋）で２倍以上の増幅が見られる。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝４）。
【図５】図５は、特定の遺伝子においてＲａｍＤＡ−Ｂ、−Ｃは、非常に高い増幅率を示すことを示す。Ａでは、マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡのｑＰＣＲによる検出量（上段）とＲａｍＤＡ（−）を１とした時の相対値（下段）を示す。エラーバーは標準偏差を示す（Ｎ＝４）。Ｂでは、熱サイクル化の効果を示す。マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡのｑＰＣＲによる検出量（上段）と等温条件でのＲａｍＤＡ（−）を１とした時の相対値（下段）を示す。エラーバーは標準偏差を示す（Ｎ＝３）。図中の「ＲａｍＤＡ（−）ｉｓｏ」、「ＲａｍＤＡ（＋）ｉｓｏ」は、等温条件（ＲａｍＤＡ−Ａと同条件）、「ＲａｍＤＡ（−）ｃｙｃｌｅ」、「ＲａｍＤＡ（＋）ｃｙｃｌｅ」は、熱サイクル条件を示す。
【図６】図６は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＫＣｌ濃度依存的にＤＮａｓｅ  Ｉのヌクレアーゼ活性が落ちることを示す。蛍光オリゴヌクレオチドを用いたＦＲＥＴ解析により、ＤＮａｓｅ  Iのヌクレアーゼ活性を測定した。蛍光オリゴヌクレオチドは、ＦＡＭラベルプローブの１色を用いて、３７℃の条件下で1分ごとに蛍光量を測定した。ヌクレアーゼ活性は、反応初期（５−１０分）の蛍光増加率から算出した。DNase I buffer（50 mM Tris-HCl, 75 mM KCｌ、 2 mM MgCl2）中での二本鎖ＤＮＡに対する活性を１とした相対値。Ｎ＝３の平均値を元に算出。#は、DNase I buffer。##は、一般的な逆転写bufferと同じＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＫＣｌ濃度。dsDNA：二本鎖ＤＮＡ, DNA in RNA:DNA hybrid：ＲＮＡとＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ、ssDNA：一本鎖ＤＮＡ、ssRNA：一本鎖ＲＮＡ。
【図７】図７は、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法（ＲａｍＤＡ−Ｄ）が、特定の反応液組成に限定されないことを示す。マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法のｃＤＮＡの収量をｑＰＣＲを用いて定量した。#は、DNase I bufferと同じ反応液組成。##は、一般的な逆転写反応液と同じＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＫＣｌ濃度。###は、: FirstStrand buffer等、一般的な逆転写反応液と同じ組成。FS: First-Strand Buffer. PS: PrimeScript Buffer (for Real Time) 。PrimeScript Buffer (for Real Time)を用いたＲａｍＤＡ（−）をコントロール（＊）とし、コントロールでの各遺伝子のｃＤＮＡ検出量を１とした時の相対値を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝４）。ＤＮａｓｅ  Ｉの一本鎖ＤＮＡに対する活性の高いDNase I bufferと同じ組成（#）であっても増幅は起こる。一本鎖ＤＮＡに対する活性の低い条件（##）よりもむしろ増幅率は高い。
【図８】図８は、Ｔ４ジーン３２プロテインが、ＤＮａｓｅ IによるｃＤＮＡの断片化を抑制していることを示す。Ａでは、５ｎｇのＴｈｒ  ＲＮＡ（２，０５２ｂ）を鋳型に用いて、非添加の標準逆転写サンプル、Ｔ４ジーン３２プロテイン単独添加、ＤＮａｓｅ I、または、ｄｓＤＮａｓｅ単独添加、ＤＮａｓｅ I、または、ｄｓＤＮａｓｅとＴ４ジーン３２プロテインを同時添加した条件でｃＤＮＡ分布パターンを比較した。逆転写反応は、通常の2倍量にあたる６ μｌの反応容量で、オリゴｄＴプライマーのみを用いて行った。ｃＤＮＡの分布パターンは２％アガロースゲル電気泳動で調べた。Ｂは、Ａ中のｃＤＮＡの１/２０量をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ６０００ピコキット（Agilent Biotechnology）を用いて解析した結果を示す。図中の数値は、ｃＤＮＡ濃度の相対値を示す。T4GP32：Ｔ４ジーン３２プロテイン。
【図９】図９は、Ｔ４ジーン３２プロテインが、ｃＤＮＡの増幅とその安定性に寄与していることを示す。Universal Human Reference RNA (UHRR)１０ｐｇに添加した１００ｆｇの人工合成ＲＮＡ、Ｄａｐ ＲＮＡ（９６，７２５コピー）、Ｔｈｒ ＲＮＡ（８９，９９１コピー）のｃＤＮＡ量を示す。逆転写反応は、オリゴｄＴプライマーのみで行い、ｃＤＮＡ収量の定量はｑＰＣＲを用いて行った。ＤＮａｓｅ  Ｉ、ｄｓＤＮａｓｅは、それぞれ、０．２Ｕ, ０．４Ｕを、Ｔ４ジーン３２プロテインは、１００ｎｇを１反応に用いた。ｑＰＣＲは、逆転写産物の１／５０量を用いて行った。検出用のｑＰＣＲプライマーは、Ｄａｐ、Ｔｈｒ、それぞれ、５’から３’にかけての１２領域で設計した。Ａは、各領域でのｃＤＮＡの検出量（コピー数）を示す。横軸は、３’末端からの距離を示す。（−）：コントロール(非添加の標準逆転写サンプル)、エラーバーは、標準偏差（Ｎ＝３）を示す。 Ｂは、非添加コントロールサンプル（＊）の各領域での検出量を１とした時の相対値を示す。Ｃは、同一ＲＮＡ上での検出量の相対値（増幅率）の変動を示す。T4GP32：Ｔ４ジーン３２プロテイン。
【図１０】図１０は、蛍光オリゴヌクレオチドを用いたＦＲＥＴ解析により、逆転写反応液中のT４ジーン３２プロテインのヌクレアーゼ活性への作用を示す。蛍光オリゴヌクレオチドは、ＦＡＭまたは、ＨＥＸラベルプローブの二色を使用し、３７℃の条件下で１.５分ごとに蛍光量を測定した。ヌクレアーゼ活性は、反応初期（１.５−９分）の蛍光増加率から算出した（Ｎ＝３の平均値）。逆転写バッファーには、PrimeScript bufferを用いた。Ａは、DNase I buffer中でのＤＮａｓｅ  Ｉの二本鎖ＤＮＡに対する活性を１とした時の相対値を示す。Ｂは、各反応条件における、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ分解活性または、二本鎖ＤＮＡ分解活性に対する、一本鎖ＤＮＡの分解活性比を示す。dsDNA：二本鎖ＤＮＡ, DNA in hybrid：ＲＮＡとＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ、ssDNA：一本鎖ＤＮＡ、ssRNA：一本鎖ＲＮＡ。
【図１１】図１１は、マウスＥＳ細胞の1細胞溶解液を用いたＲａｍＤＡ−Ｄの反応時間依存的なｃＤＮＡ収量の増大を示す。ＲａｍＤＡ−Ｄの反応温度条件のうち３７℃における反応時間を３０分、６０分、１２０分と延長し増幅率への影響を調べた。ＲａｍＤＡ−Ｄ（−）の反応時間３０分をコントロール（*）とし、ｑＰＣＲによる各遺伝子のｃＤＮＡ検出量を１とした時の相対値を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝４）
【図１２】図１２は、ＲａｍＤＡ−Ｄは、逆転写酵素を限定せず、１００細胞相当量の鋳型ＲＮＡでも増幅することを示す。PrimeScriptのＲａｍＤＡ（−）条件をコントロール（*）とし、ｑＰＣＲによる各遺伝子のｃＤＮＡ検出量を１とした時の相対値を示す。鋳型ＲＮＡには、マウスＥＳ細胞由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（１０ｐｇ、２００ｐｇ、１ｎｇ）を用いた。PS: PrimeScript RT Enzyme, SSII: SuperScript II RT Enzyme, SSIII: SuperScript III RT Enzyme, SSIV: SuperScript IV RT Enzyme。エラーバーは、標準偏差を示す（Ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートすることによって行う方法であり、Reverse Transcription with Ramdom Displacement Amplification (ＲＴ−ＲａｍＤＡ)法とも称する。本発明の核酸の増幅方法は、鎖置換反応を利用したＲＮＡを直接鋳型とする増幅逆転写法であり、インビトロで行うことができる。本発明の方法は、エンドヌクレアーゼである二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（double-strand specific DNase：dsDNase） 、又は非特異的ＤＮＡ分解酵素（DNase I）などのＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素のヌクレアーゼ活性を利用してＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド鎖のｃＤＮＡ側を切断し、無作為に鎖置換反応を起こすことによって、逆転写反応中にｃＤＮＡを増幅させる技術である。
【００１０】
本明細書において、増幅とは、核酸の配列のコピー（複製物）の数を増加させることを言う。また、増幅の形態としては、線形増幅、リアルタイム増幅、定量的増幅、半定量的増幅、競合増幅などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００１１】
本発明で使用する混合物は、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物であるが、好ましくは水溶液であり、好ましくは塩を含む水性緩衝液である。
【００１２】
本発明のＲＴ−ＲａｍＤＡ法の一態様の概要を以下に記載する（図１）。
１．ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。
２．二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（ｄｓＤＮａｓｅ）又は非特異的ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ  Ｉ）などのＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素のヌクレアーゼ活性によりＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖に無作為に切断点（ニック）が入れられる。
３．ニック部位が起点となり、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖が剥がされる。剥がされた部分には逆転写酵素により新たなｃＤＮＡが合成される。剥がされたｃＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるT４ジーン３２プロテイン（Ｔ４ＧＰ３２）によって、ヌクレアーゼ活性から保護される。これが連続的に起きることで、ｃＤＮＡの収量を１０倍以上に増やすことが可能となる。
【００１３】
本発明の核酸の増幅方法では、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖がＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素の標的となるため、また、鎖置換増幅反応の鋳型がＲＮＡであることから、使用できる逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性のないものに限定される。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性とは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＲＮＡ鎖のみを無作為に切断するリボヌクレアーゼ活性である。ＲＮａｓｅ  Ｈは非特異的なエンドヌクレアーゼであり、加水分解によってＲＮＡ切断を触媒する。
また、本発明で使用するＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素は、鎖置換活性を有する。ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３'側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。
【００１４】
逆転写とは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）が、鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形成を触媒するプロセスである。逆転写酵素としては、多数の酵素が同定されており、例えば、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｃ ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ、及びＴｔｈポリメラーゼなどがあるが、本発明においては、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素を使用する。
【００１５】
本発明では、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素を使用する。本明細書において用いる「ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素」なる用語は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖（ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖）中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素を指す。ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素としては、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又は非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、カニ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮ）が知られている。この酵素は二本鎖ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖のみを無作為に切断する。本発明においては、この活性を利用することで、逆転写中に形成されるＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド鎖のｃＤＮＡ側を切断し、ＲＮＡを鋳型に鎖置換増幅を起こす方法を考案した。しかしながら、カニ由来ＤＳＮの活性化温度は、６０℃以上と非常に高温で一般的な逆転写反応には不向きである（非特許文献１１）。そこで、低温でも活性のあるエビ由来の熱不安定性ｄｓＤＮａｓｅを用いることで、逆転写反応とＤＮａｓｅによる切断の両立を可能とした（非特許文献１２）。一方で、ＤＮａｓｅ  Ｉのような非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いる際は、一本鎖ＤＮＡ、すなわち鎖置換反応によって剥がされた増幅ｃＤＮＡや逆転写プライマーが分解されてしまう恐れがある。しかしながら、用いるバッファーの組成などの反応条件によってはたとえ酵素が一本鎖ＤＮＡを分解する活性を保持していてもそれが問題とならない可能性がある。使用する酵素や反応条件が適切であるかどうかを本明細書の開示に従って核酸増幅反応を実施することによって確認することができる。また、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を添加することで、一本鎖ＤＮＡの分解活性を抑制させ、逆転写酵素の鎖置換反応によるｃＤＮＡ合成と増幅を進行させることができる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、一本鎖ＤＮＡに結合して本発明の方法による核酸増幅の効率を上昇させる任意のタンパク質を使用することができ、例えば、任意の起源由来のＴ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Single-Stranded DNA Binding Protein）又はその改変体を使用することができる。これにより、むしろｄｓＤＮａｓｅを用いた方法よりも増幅率を上げることが可能である。また、ｄｓＤＮａｓｅやＤＮａｓｅ  Ｉを用いる利点として、反応液中の混入ＤＮＡ、例えば、細胞溶解サンプルにおいては、ゲノムＤＮＡなどの除去も平行して行うことができる。これまでもＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、ＤＮａｓｅ  ＩやｄｓＤＮａｓｅによる混入ＤＮＡの除去法が報告されているが、その多くはヌクレアーゼの不活性化が必須となっており、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法の様に逆転写反応のみの１ステップで行うことはできなかった（非特許文献１３）。
【００１６】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法と同様に鎖置換反応を用いたＤＮＡの増幅法は、これまでに多くの報告が為されている（例えば、非特許文献２〜６）。しかしながら、ＳＤＡに代表されるこれらの増幅法の多くは、鋳型ＤＮＡにニックを挿入するために制限酵素を用いたり、複数の配列特異的プライマーを併用する必要がある。このため、鋳型ＤＮＡに、制限酵素認識配列やデオキシイノシンの付加、配列特異的プライマーの設計・合成が必須となる。また、ターゲットとなる遺伝子も限定される。さらに既存の増幅法のほとんどが、ＤＮＡを鋳型としているため、ＲＮＡ配列を増幅させるには、ＲＮＡをＤＮＡに変換する逆転写反応を経る必要がある。また、以前に行ったＰＣＲ増幅産物や逆転写産物などのサンプルへのキャリーオーバーによって生じる偽陽性や、試薬中に混入したＤＮＡや作業環境から混入するＤＮＡなどに由来する非特異的産物が問題となっている（非特許文献９及び１０）。特にＭＤＡにおいては、プライマーがＤＮＡに対して無作為にアニーリングするため、混入ＤＮＡ由来の非特異的産物が増えるリスクが高い。一方、本発明のＲＴ−ＲａｍＤＡ法は、配列非依存的な鎖置換反応を用いており、配列特異的なプライマーや特殊なプライマーの設計・合成は不要となるだけでなく、全遺伝子をターゲットとすることができる。さらにＲＮＡを直接鋳型とすることで、逆転写から増幅までがわずか１ステップで終了する上、ＤＮＡは鋳型となりにくいため混入ＤＮＡによる非特異的産物の増幅も低減することができる。
【００１７】
本発明で使用する二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、好ましくは、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さない酵素を挙げることができる。二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。
【００１８】
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
【００１９】
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）としては、これまでに以下のものが知られている（特開２０１４−１０３８６７号公報）
（１）Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
（２）Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
（３）Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
（４）Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
（５）Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
（６）その他のＤＳＮホモログ
上記の中でも、タラバガニＤＳＮとズワイガニＤＳＮは至適活性温度が６０℃前後で耐熱性があるのに対して、ホッコクアカエビｄｓＤＮａｓｅは至適温度が３７℃の易熱性酵素である。
本発明においては、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体であることがさらに好ましい。
【００２０】
本明細書において、改変体とは、天然由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、二本鎖特異的ＤＮＡ分解活性を有する酵素、並びに天然由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個）のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、二本鎖特異的ＤＮＡ分解活性を有する酵素である。
【００２１】
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、dsDNase (ArcticZymes)、 Hl-dsDNase (ArcticZymes)、 dsDNase (Thermo scientific)、 Shrimp DNase, Recombinant (affymetrix)、Atlantis dsDNase（Zymo Research）、Thermolabile Nuclease (Roche)などを挙げることができる。
【００２２】
本発明で使用する非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。
【００２３】
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
【００２４】
本発明においては、ウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体であることがさらに好ましい。
【００２５】
本明細書において、改変体とは、天然由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、非特異的ＤＮＡ分解活性を有する酵素、並びに天然由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個）のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、非特異的ＤＮＡ分解活性を有する酵素である。
【００２６】
本発明で用いるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成されており、与えられた条件下で標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。プライマーの鎖長は特に限定されないが、好ましくは５〜５０塩基、より好ましくは５〜３０塩基である。プライマーとしては、好ましくはランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー又は配列特異的プライマーの1種以上を使用することができる。ランダムプライマーを使用する場合、その長さは５〜１０塩基程度が好ましく、６〜８塩基程度がより好ましい。オリゴｄＴプライマーを使用する場合、その長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましい。配列特異的プライマーを使用する場合、その長さは ５〜３０塩基が好ましく、７〜２０塩基がより好ましい。
【００２７】
プライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。本発明によるプライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成することができる。
【００２８】
好ましくは、カチオンユニットの修飾によってＴｍ値が上昇しているプライマーを使用することができ、例えば、Zip Nucleic Acid (ＺＮＡ) プライマーを使用することができる。ＺＮＡは、カチオンユニットによってオリゴヌクレオチドのＴｍ値を上昇させる作用を持っている（非特許文献１４〜１６）。ＺＮＡプライマーなどのカチオンユニットの修飾によってＴｍ値が上昇しているプライマーを使用することによって、増幅効率を上げることができる。特に、ＺＮＡで修飾したランダムヘキサマープライマーを使用することによって、逆転写中の反応温度であってもプライマーが鋳型ＲＮＡにアニールでき、より効率的な鎖置換増幅が可能となる。
【００２９】
本明細書で言う基質とは、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の基質であり、４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）の混合物を使用することができる。但し、基質としては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰの混合物に限定されるわけではなく、ジデオキシヌクレオチド三リン酸を添加してもよく、また修飾されたデオキシリボヌクレオチドを使用してもよい。
【００３０】
本発明においては、反応のための混合物にＴ４ジーン３２プロテインなどの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含めてもよい。Ｔ４ジーン３２プロテインは、増幅の均一性を上げるための補助因子として使用することができる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ジーン３２プロテインは、一本鎖ＤＮＡのみならず、ＲＮＡに対しても作用することが知られている（非特許文献１７〜２０）。Ｔ４ジーン３２プロテインを用いることで、鋳型ＲＮＡの高次構造を緩め、鋳型全長に対してより均一な鎖置換反応を行うことができる。また、非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いる反応の際には、増幅ｃＤＮＡの分解を防ぐことができる。
【００３１】
本発明による核酸の増幅反応は、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。
【００３２】
等温条件で行う場合には、例えば、２５℃〜５０℃の間の所定の温度、好ましくは３０℃〜４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５℃〜４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃において一定時間（例えば５分〜３時間以内、好ましくは１０分〜１５０分）行うことができる。例えば３７℃において反応を行う場合には、反応液を、例えば、２５℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）、次いで３０℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）インキュベートしてから、３７℃にして反応を行うことができる。また、３７℃でインキュベートした後に、５０℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）、次いで８５℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）インキュベートしてもよい。
【００３３】
熱サイクル条件で行う場合には、例えば、２０℃以上３０℃未満の所定の温度Ｔ１（例えば、２５℃）と、３０℃以上４５℃以下の所定の温度Ｔ２（例えば、３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１分〜３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１分〜３分、一例として２分）とを一サイクルとして、これを好ましくは１０サイクル〜４０サイクル、より好ましくは１５サイクル〜３５サイクル繰り返すことにより反応を行うことができる。なお、上記した熱サイクルに先立って、例えば、２５℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）、次いで３０℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）、次いで３７℃で所定の時間（例えば、１分〜５分間）インキュベートしてもよい。また、上記した熱サイクルの後に、５０℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）、次いで８５℃で所定の時間（例えば、５分〜１５分間）インキュベートしてもよい。
【００３４】
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＴ−ｑＰＣＲ法の一部として使用することができる。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＮＡシーケンス法に利用することができる。
本発明による核酸の増幅方法を利用することによって、大量細胞中の１細胞を検出することが可能である。具体的には、大量細胞中の標的細胞でのみ発現する遺伝子を特異的に増幅することで、大量のＲＮＡ中に含まれるわずかな標的細胞遺伝子の検出が可能となり、標的細胞の含有の有無を判定できる。
【００３５】
本発明はさらに、上記した本発明による核酸の増幅方法を行うためのキットに関する。本発明のキットは、少なくとも、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又は非特異的ＤＮＡ分解酵素などのＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素を含む。好ましくは、本発明のキットはさらに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン）を含む。本発明のキットは、さらに所望により、核酸増幅反応を実施するのに必要な他の試薬、緩衝液など含むものでもよい。他の試薬としては、プライマー、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸などを挙げることができる。
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又は非特異的ＤＮＡ分解酵素などのＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。ＲＴ−ＲａｍＤＡ法においては、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素によりＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖を無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。
ＲａｍＤＡ−Ａは、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素とＴ４ジーン３２プロテインを用いてＲＴ−ＲａｍＤＡ法を行う態様である。
ＲａｍＤＡ−Ｂは、Ｔ４ジーン３２プロテインなしで二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法を行う態様である。
ＲａｍＤＡ−Ｃは、ＲＴ−ＲａｍＤＡ熱サイクル法であり、ＲａｍＤＡ−Ｂと同様の反応溶液組成で、反応温度条件を改変し、アニール行程と伸長反応行程を小刻みに繰り返して反応を行った態様である。
ＲａｍＤＡ−Ｄは、非特異的ＤＮＡ分解酵素とＴ４ジーン３２プロテインを用いてＲＴ−ＲａｍＤＡ法を行う態様である。【００３７】
（材料および方法）
細胞培養
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出用に、５Ｇ６ＧＲマウスＥＳ細胞を用いた。この細胞株は、直鎖化したＧａｔａ６−ＧＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターを  ＥＢ５  ＥＳ細胞にランダムに組み込んで作成したものである（非特許文献２０）。細胞は、Ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅなゼラチン被覆ディッシュ上で、１０％ウシ胎児血清入りGlasgow minimal essential medium (GMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)、 １０００Ｕ／ｍｌleukemia inhibitory factor (ESGRO; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)、 １００μｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール(Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan)、 １×non-essential amino acids (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)、 １ｍｍｏｌ／ｌ ピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)、 ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミン(Nacalai Tesque)、 ０．５×ペニシリン／ストレプトマイシン(Life Technologies)、 及び１０μｇ／ｍｌブラスチシジン (Life Technologies)の条件で培養を行った。【００３８】
ＲＮＡ抽出
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（Qiagen Inc., Valencia, CA, USA）を用いて精製した。ＲＮＡの定量と品質チェックは、Quantus Fluorometer (Promega Corp., Madison, WI, USA)とRNA 6000 Nano Kit (Agilent Biotechnology, Santa Clara, CA, USA)を用いて行った。人工合成ＲＮＡは、ｐＧＩＢＳ−ＤＡＰ、ｐＧＩＢＳ−ＴＨＲ  プラスミド(American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA)からMEGAscript T3 kit (Life Technologies)を用いて合成した。【００３９】
マウスＥＳ細胞１細胞溶解液の調整
培養細胞は、TrypLE Express (Life Technologies)を用いて３７℃で３分間反応させ、1細胞へ解離した。解離後は、直ちにPBS（−）へ置換し反応を止めた。セルソーターを使用して細胞だけを的確に分取するため、解離細胞の生細胞核を、Vybrant Dye Cycle（Life Technologies）を用いて染色標識した。染色条件は、試薬添付の方法を踏襲した。ＳＨ８００セルソーター（Sony Corp., Tokyo, Japan）を用いてVybrant Dye Cycle（検出フィルター：BP450/50）陽性、死細胞蛍光マーカー色素のPI (検出フィルター：BP585/40)陰性を生細胞分画とし、この分画から５０細胞を１μｌのLysis buffer (１Ｕ RNasein plus (Promega)、 ０．３％ NP40 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA), RNase free water(TaKaRa Bio Inc., Otsu, Japan))に分取した。分取後は、直ちにスピンダウンと振とう攪拌を行い、−８０℃で保存した。逆転写反応に使用する際は、融解後に４９μｌのLysis bufferを加え５０倍希釈した細胞溶解液１μｌを1細胞溶解液として用いた。【００４０】
ＦＲＥＴアッセイ
ＦＲＥＴ解析は、Inge W. Nilsen et al （非特許文献１２）の方法を改変して行った。０．６μlの oligonucleotide probe mix (６ｐｍｏｌオリゴＤＮＡ 又はＲＮＡ(Sigma-Aldrich)、 １ｘFirst-Strand buffer (Life Technologies)、 RNase free water (TaKaRa))を調整し、７０℃５分で変性した後、ゆっくりと室温に戻した。解析に用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせは、以下の通りである（配列番号1から１０）。【００４１】
二本鎖ＤＮＡ用デュアルプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1【００４２】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド用デュアルプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1【００４３】
一本鎖ＤＮＡ用シングルプローブ：
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1【００４４】
一本鎖ＲＮＡ用シングルプローブ：
HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1【００４５】
補正用シングルＦＡＭプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
GAACCTCCGATGGCG【００４６】
補正用シングルＨＥＸプローブ：
CGCCATCGGAGGTTC
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1【００４７】
次に５．４μｌの酵素溶液 (１ｘFirst-Strand buffer、 ０．１２Ｕ各ヌクレアーゼ、RNase free water)を調整した。各ヌクレアーゼは、それぞれ、DNase I Amplification Grade (Life Technologies)、 dsDNase (ArcticZymes AS, Tromso,  Norway)、 HL-dsDNase (ArcticZymes)を用いた。コントロールには、酵素の代わりにRNase free waterを加えた。室温に戻したoligonucleotide probe mix ０．６μｌと酵素溶液５．４μｌをPloxiPlate-384F Plus(PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)上で混合し、 EnVision(PerkinElmer)で測定した。測定は、３７℃の条件下でＦＡＭ、ＨＥＸの蛍光強度を７０秒に１回の割合で５０回の測定を行った。ＦＡＭとＨＥＸの蛍光の漏れ込みは、それぞれの補正用シングルプローブの蛍光量を用いて補正した。【００４８】
Ｔ４ジーン３２プロテインのヌクレアーゼ活性への作用の検証実験（図１０）においては、０．６μlの oligonucleotide probe mix (６ｐｍｏｌオリゴＤＮＡ 又はＲＮＡ(Sigma-Aldrich)、 １ｘPrimeScript Buffer (for Real Time) (TaKaRa)、 RNase free water )と５．４μｌの酵素溶液 (１ｘ  PrimeScript Buffer (for Real Time)又は、１ｘ  DNase I reaction Buffer（Life Technologies）、 ０．１２Ｕ各ヌクレアーゼ、RNase free water)を調整した。各ヌクレアーゼは、それぞれ、DNase I Amplification Grade、 dsDNaseを用いた。Ｔ４ジーン３２プロテイン添加サンプルには、１８０ｎｇのＴ４ジーン３２プロテイン(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を酵素溶液に加えた。コントロールには、酵素の代わりにRNase free waterを加えた。測定は、９０秒に1回の割合で５０回の測定を行った。酵素活性は、反応初期（１.５分〜９分）の蛍光増幅率を用いて算出した。【００４９】
ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度依存的なＤＮａｓｅ  Ｉのヌクレアーゼ活性の測定実験（図６）においては、０．６μlの oligonucleotide probe mix (６ｐｍｏｌオリゴＤＮＡ 又はＲＮＡ(Sigma-Aldrich)、 １ｘDNase I reaction Buffer（Life Technologies）、 RNase free water)と５．４μｌの酵素溶液 (自家調整反応液、 ０．１２Ｕ  DNase I Amplification Grade、RNase free water)を調整した。自家調整反応液は、条件に応じて図６中の終濃度になるように調整した。測定は、６０秒に1回の割合で５０回の測定を行った。酵素活性は、反応初期（５分〜１０分）の蛍光増幅率を用いて算出した。解析に用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせは、以下の通りである（配列番号１１から１６）【００５０】
二本鎖ＤＮＡ用シングルプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
GAACCTCCGATGGCG-BHQ1【００５１】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド用シングルプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1【００５２】
ー本鎖ＤＮＡ用シングルプローブ：
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1【００５３】
ー本鎖ＲＮＡ用シングルプローブ：
FAM-rCrGrCrCrArTrCrGrGrArGrGrTrTrC-BHQ1【００５４】
逆転写反応
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法（ＲａｍＤＡ−Ａ）：
鋳型ＲＮＡは、１μｌ Lysis buffer (１Ｕ RNasein plus (Promega)、 １０％  Roche lysis buffer (Roche)、 ０．３％ NP40 (Thermo Fisher), RNase free water) に希釈し、６５℃で２分間の変性処理を行い、使用まで氷上で保管した。逆転写酵素反応液は、ReverTra Ace qPCR RT KIT (TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan)を改変して用いた。１μｌの変性済み希釈鋳型ＲＮＡに２μｌ RT mix (１．５ ｘ ReverTra Ace RT buffer(TOYOBO)、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー(Thermo Fisher)、 ７．８ｐｍｏｌ ランダムヘキサマープライマー(TaKaRa)、 １．５ ｘ ReverTra Ace enzyme mix(TOYOBO)、 RNase free water)、または、２μｌ ＲａｍＤＡ−Ａ mix (１．５ ｘ ReverTra Ace RT buffer、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、 ７．８ｐｍｏｌ ＺＮＡ−ランダムヘキサマープライマー ([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich)、 ０．４Ｕ dsDNase (ArcticZymes)、 １００ｎｇ Ｔ４ジーン３２プロテイン、１．５ ｘ ReverTra Ace enzyme mix、RNase free water)をそれぞれ加え、MixMate(Eppendorf, Westbury, NY, USA)で ２，０００ｒｐｍ、３０秒の撹拌後、サーマルサイクラーＣ１０００(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA))を用いて２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、８５℃５分で反応を行った。【００５５】
Ｔ４ジーン３２プロテインなしのＲＴ−ＲａｍＤＡ法（ＲａｍＤＡ−Ｂ）：
鋳型ＲＮＡを１μｌ lysis buffer (１Ｕ RNasein plus、 ０．３％ NP40、 RNase free water)に希釈し、７０℃で９０秒の変性処理を行った。氷上で冷却後、２μｌ RT mix (１．５ｘReverTra Ace RT buffer、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、７．８ｐｍｏｌ ランダムヘキサマープライマー、１．５ ｘ ReverTra Ace enzyme mix、RNase free water)、または、２ μｌ RamDA-B mix (１．５ ｘ ReverTra Ace RT buffer、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、 ７．８ｐｍｏｌ ＺＮＡ-ランダムヘキサマープライマー([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich)、０．１Ｕ dsDNase)をそれぞれ加え、ＲａｍＤＡ−Ａと同様の操作を行った。【００５６】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ熱サイクル法（ＲａｍＤＡ−Ｃ）：
ＲａｍＤＡ−Ｂと同様の反応溶液組成で、温度条件を変えて逆転写反応を行った。反応条件は以下の通りである。２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃２分の後、２５℃２分、３７℃２分を２９サイクル行った。その後５０℃５分、８５℃５分で処理した。【００５７】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ非特異的ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ  Ｉ）法（ＲａｍＤＡ−Ｄ）：
鋳型ＲＮＡは、１μｌ Lysis buffer (１Ｕ RNasein plus、 １０％  Roche lysis buffer、 ０．３％ NP40, RNase free water) に希釈し、７０℃で９０秒間の変性処理を行い、使用まで氷上で保管した。逆転写酵素反応液は、PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time) (TaKaRa)を改変して用いた。１μｌの変性済み鋳型ＲＮＡに２μｌ RT mix (１．５ ｘ PrimeScript Buffer (for Real Time)、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、 ８ｐｍｏｌランダムヘキサマープライマー、 １．５ ｘ PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase free water)、または、２μｌ RamDA-D mix (１．５ ｘ PrimeScript Buffer (for Real Time)、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、８ｐｍｏｌランダムヘキサマープライマー、 ０．２Ｕ DNase I, Amplification Grade、 １００ｎｇ Ｔ４ジーン３２プロテイン、１．５ ｘ PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase free water)をそれぞれ加え、２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃６０分、５０℃５分、８５℃５分で反応を行った。【００５８】
ＲａｍＤＡ−Ｄを用いた逆転写反応液の組成検討実験：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ＫＣｌ, ＮａＣｌ, ＭｇＣｌ2の濃度を変更した自家調整逆転写反応液または、First-Strand Bufferを用いる際は、これらをRamDA-D mix 中のPrimeScript Buffer (for Real Time)と置き換え、さらに dNTP Mix (Life Technologies) を終濃度で０．５ ｍＭ加えて反応を行った。各bufferの組成は、表１に記載する。【００５９】
【表１】
0006583796.tif 000002
【００６０】
ＲａｍＤＡ−Ｄを用いた人工合成ＲＮＡ（ＤＡＰ，ＴＨＲ）の系：
RamDA-D mix中の逆転写プライマーを、０．６ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）１８プライマーのみとし、条件に応じてRamDA-D mixの組成を変更した。また逆転写反応の温度条件は、ＲａｍＤＡ−Ａと同様とした。【００６１】
ＲａｍＤＡ−Ｄにおける、逆転写酵素の検討：
SuperScript II、SuperScript III、SuperScript IV条件は、RamDA-D mix中の逆転写酵素をPrimeScript RT Enzyme Mix Iの代わりに、３０Ｕ  SuperScript II(Life Technologies), ３０Ｕ  SuperScript III(Life Technologies), ３０Ｕ  SuperScript IV(Life Technologies)と６ＵのRNasein plusを加えた。逆転写反応液はPrimeScript Buffer (for Real Time)を共通で使用した。【００６２】
ｄｓＤＮａｓｅの比較：
ＲａｍＤＡ−Ａの反応液条件で、ヌクレアーゼを０．２Ｕ ４３ｋＤａdsDNase(ArcticZymes)、 ０．２Ｕ ４７ｋＤａ dsDNase(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)、 ０．２Ｕ duplex specific nuclease (DSN; Evrogen JSC, Moscow, Russia)にそれぞれ置き換えて比較した。反応温度条件は、ＲａｍＤＡ−Ａに準じて行い、ｑＰＣＲでｃＤＮＡの増幅率を定量した。【００６３】
逆転写酵素の比較：
１０種類のｑＰＣＲ用ＲＴキット、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)、 ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)、 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)、AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit(Agilent Biotechnology)、QuantiTect Rev. Transcription Kit(Qiagen)、GoScript Reverse Transcription System(Promega)、iScript Select cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)、ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(New England Biolabs, MA, UK)、SuperScript III(Life Technologies)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて比較した。【００６４】
伸長活性試験には、ｐｏｌｙ−Ａ付加された様々な長さのＲＮＡ（０．５−９ｋｂａｓｅ）を含むMillennium RNA Markers(Life Technologies)を用いて逆転写反応を行った。逆転写混合物の調整は、各キットに供給されている試薬を使用し、試薬の配合はキット推奨の条件を用いて１０μｌの反応系で行った。ただし、逆転写プライマーは、全てのキットでオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いた。１．５μｌのRNA-primer mix (２０ｎｇ Millennium RNA Markers、 ２５ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、 lysis buffer(ＲａｍＤＡ−Ａ条件))を６５℃２分で変性させ、８．５μｌの逆転写ｍｉｘと混合し、４２℃２．５分、８５℃５分の条件で反応を行った。反応後はアガロースゲル電気泳動で解析した。【００６５】
ＲａｍＤＡ法の適応試験には、マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写混合物の調整は、それぞれのキットに供給されている試薬を使用し、配合はキット推奨の条件を用いて３μｌの反応系にダウンスケールしたものを使用した。ただし、逆転写プライマーは、ＲａｍＤＡ（−）条件では、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、７．８ｐｍｏｌ ランダムヘキサマープライマー、ＲａｍＤＡ（＋）条件では、０．６ｐｍｏｌ オリゴ（ｄＴ）１８プライマー、７．８ｐｍｏｌ ＺＮＡ-ランダムヘキサマープライマーを用いた。またＲａｍＤＡ（＋）では、さらに０．２Ｕ dsDNase (ArcticZymes)、 １００ｎｇ Ｔ４ジーン３２プロテインを添加した。反応温度条件は、２５℃１０分、３０℃１０分、４２℃３０分、５０℃５分、８５℃５分で行い、ｑＰＣＲでｃＤＮＡの増幅率を定量した。【００６６】
試薬の調整、及び反応は全て、０．２ｍｌ Hi-Tube Flat Cap Recovery (TaKaRa)、EU Semi-domed 8-cap strip (BIOplastics BV, Landgraaf, Netherlands) 、または、RP,LF,SEMI Sk,cutable,96 well plate (BIOplastics BV)上で行った。【００６７】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
人工合成ＲＮＡ（ＤＡＰ，ＴＨＲ）の系では、逆転写反応液をnuclease free water (Qiagen)で希釈し、１／５０量をｑＰＣＲ反応液に用いた。マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの系は、nuclease free waterで希釈し、１／６量、１／８量、または１／１０量をｑＰＣＲ反応液に用いた。ｑＰＣＲはLightCyclar 480 (Roche)、または、ABI 7900HT (Life Technologies)を用いて、以下の条件で行った。ｑＰＣＲ反応液 １０μｌ（1 x Quantitect SybrGreen master mix (Qiagen)、５ｐｍｏｌ フォワードプライマー、 ５ｐｍｏｌ リバースプライマー、 ３μｌ 希釈ｃＤＮＡ、 nuclease free water）を９５℃  １５分で酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性、６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、９５℃１５秒で行った。絶対定量用の検量線作成には、ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡとして、人工合成ＲＮＡ用にＤＡＰ及びＴＨＲのｄｓＤＮＡ混合溶液の５倍希釈シリーズ（３１２５０、６２５０、１２５０、２５０、５０、１０、０コピー）、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ用にmouse genomic DNA (clonetech)の５倍希釈シリーズ（３１２５０、６２５０、１２５０、２５０、５０、１０、０コピー）をそれぞれ用いた。ｃＤＮＡはｓｓＤＮＡであるため、定量値の算出には検出値（ｄｓＤＮＡコピー）ｘ ２で算出した。各プライマー配列は、表２に記載する。データ解析は、LightCycler 480 Software, Version 1.5(Roche)、またはSDS Software 2.1(Life Technologies)を用いて行った。【００６８】
【表２】
0006583796.tif 000003
【００６９】
ゲル電気泳動
逆転写反応液をそれぞれRNase-free TE 緩衝液(Life Technologies)で２０μｌに希釈し、７０℃１０分間の変性処理後直ちに氷上で冷却した。ＤＮＡラダーマーカーには、１μｌのE-Gel 1 Kb Plus DNA Ladder（Life Technologies）をRNase-free TE 緩衝液で２０μlに希釈し、熱変性したものをｓｓＤＮＡラダー、熱変性していないものをｄｓＤＮＡラダーとして用いた。ただし、Millennium RNA Markersを用いた系では、希釈後の熱変性処理を除いた。逆転写反応液とラダーマーカーは、E-Gel EX Agarose Gels、 ２％（Life Technologies）に充填後、E-Gel iBase Power System（Life Technologies）で１０分間泳動した。泳動像は、FAS-Digi（NIPPON Genetics Co.Ltd, Tokyo, Japan）で撮影した。【００７０】
（結果）
ｄｓＤＮａｓｅ、及びＤＮａｓｅ  Ｉは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを選択的に切断する
最初にｄｓＤＮａｓｅやＤＮａｓｅ  Ｉが、標準的な逆転写バッファー条件下でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖のＤＮＡを選択的に切断する活性をもっているのか確かめた。
カニ由来の二本鎖特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖のＤＮＡを切断する活性があることが知られている（非特許文献１１）。しかしながら、この酵素は逆転写中の温度では活性をほとんど持たない（非特許文献１１）。そこで、熱不安定性で知られているエビ由来のｄｓＤＮａｓｅに着目した（非特許文献１２）。この酵素は、３７℃付近で活性を有しており、二本鎖ＤＮＡを特異的に切断するため、プライマーやｃＤＮＡを消化することなく混入したＤＮＡやゲノムＤＮＡなどを除去する作用がある（非特許文献１２及び１３）。しかしながら、鎖置換反応を行うために必須なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖のＤＮＡを切断する活性についての報告はまだない。そこで、Fluorescence resonance energy transfer （ＦＲＥＴ）を用いた解析を行った。すると、二本鎖ＤＮＡに対する活性の半分程度であるが、ｄｓＤＮａｓｅには、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖のＤＮＡ側を選択的に切断する活性があることがわかった（図２Ａ〜Ｃ）。また、ＲＮＡ：ＤＮＡ  ハイブリッド鎖中のＲＮＡ鎖、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡに対しては、ほぼ活性を有していないことも確認した（図２Ｄ〜Ｆ）。ｄｓＤＮａｓｅをさらに熱不安定性にしたHeat-labile double-strand specific DNase (ＨＬ−ｄｓＤＮａｓｅ)でも同様の結果を得たが、ヌクレアーゼ活性は、ｄｓＤＮａｓｅよりも低いことがわかった（図２Ａ〜Ｃ）。一方で、非特異的ＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅ  Ｉを用いた場合、ｄｓＤＮａｓｅと同様にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを選択的に切断する活性を示したが、一本鎖ＤＮＡに対する活性も低いながら示した（図２Ｂ，Ｅ）。このため、まずは一本鎖ＤＮＡに対して分解活性を示さないｄｓＤＮａｓｅを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法の検証を行うことにした。【００７１】
ｃＤＮＡの断片化と鎖置換反応により増幅する
ｄｓＤＮａｓｅが、実際に逆転写反応で合成されたｃＤＮＡに作用し断片化されているのか、また、それにより鎖置換反応が起こりｃＤＮＡが増幅されているのか、これらを確かめるために、ｐｏｌｙ−Ａ付加された約２ｋｂの人工合成ＲＮＡを鋳型に用いて逆転写し、ゲル電気泳動によるｃＤＮＡの断片化の有無と、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてｃＤＮＡ量の収量を測定した。その結果、標準の逆転写法（ＲａｍＤＡ（−））では、オリゴｄＴプライマー、  ランダムヘキサマープライマーいずれも、断片化はほとんど起きていないことが分かった。一方で、ＲａｍＤＡ（＋）では、ｃＤＮＡが断片化し、スメアーな電気泳動像が得られた（図３Ａ）。これは、ｄｓＤＮａｓｅによるＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド鎖中のｃＤＮＡ側の切断作用によるもであることが示唆された。次に、鎖置換反応による増幅を定量的に検出するため、ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの絶対定量を行った。鋳型ＲＮＡには、人工合成ＲＮＡのＤａｐ（１，９１０ｂ）とＴｈｒ（２，０５２ｂ）をそれぞれ  １００ｆｇ（Ｄａｐ：  ９６，７２５コピー、Ｔｈｒ：８９，９９１コピー）ずつマウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（１細胞相当量）に混ぜて逆転写を行った。ｑＰＣＲによる定量は、それぞれの人工合成ＲＮＡに対して、３’末端から５’末端にかけて１２カ所の領域でｑＰＣＲ  プライマーを設計し、各領域における検出量を測定した。その結果、Ｄａｐ、Ｔｈｒともに、ＲａｍＤＡ（−）コントロール条件では、オリゴｄＴプライマー及び、ランダムヘキサマープライマー、どちらの条件においても全領域でほぼ一定の検出量を示した（図３Ｂ）。一方でＲａｍＤＡ（＋）においては、ランダムヘキサマープライマーだけでなく、オリゴｄＴプライマーを用いた条件であっても、３’側から５００ｎｔ以上の領域でｃＤＮＡの検出量がＲａｍＤＡ（−）コントロールと比べて、安定して１０倍近く増加していることが分かった（図３Ｂ）。また、増加量は、３’末端付近で相対的に少ないことが分かった（図３Ｂ）。これらのことから、ＲａｍＤＡ（＋）におけるｃＤＮＡ検出量の増加は、鎖置換反応による増幅であること、さらに、ｄｓＤＮａｓｅによって形成されたｃＤＮＡ側のニックが鎖置換反応の起点となっていることが示唆された。【００７２】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法に利用できるｄｓＤＮａｓｅ酵素と逆転写酵素
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法に利用できるｄｓＤＮａｓｅ酵素と逆転写酵素を調べるため、他のｄｓＤＮａｓｅや種々の逆転写酵素を用いた条件でも増幅効果が得られるかどうかを確かめた。まず、ｄｓＤＮａｓｅについては、ArcticZymes社が販売するｄｓＤＮａｓｅ（４３ｋＤａ）とaffymetrix社のｄｓＤＮａｓｅ（４７ｋＤａ）、 Evrogen社のduplex spesific nuclease (ＤＳＮ)の３つの酵素で比較を行った。１細胞相当のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量であるマウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写を行ったところ、両ｄｓＤＮａｓｅ添加サンプルでｃＤＮＡの検出量に大きな増加が見られた（図４Ａ）。活性温度の違いによりＤＳＮの増幅率は僅かであったが、二本鎖特異的ＤＮａｓｅであれば、特定の酵素に限定されないことがわかった。【００７３】
次に、市販の逆転写酵素を用いてＲＴ−ＲａｍＤＡ法による増幅効果の有無を検証した。最初に酵素の伸長活性を調べるため、ｐｏｌｙ−Ａ付加されたMillennium RNA Markers(Life Technologies)をオリゴｄＴプライマーで逆転写を行い性能試験を行った。その結果、わずか２分３０秒の伸長時間にも関わらず、ほとんどの酵素で２ｋｂ以上の伸長活性があることが分かった（図４Ｂ）。また、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を持たない逆転写酵素は、明瞭なラダーパターン（図４Ｂ、ａ−ｃ、ｈ、ｉ）を示し、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を持つ逆転写酵素では、暗くスメアーなパターン（図４Ｂ、ｅ−ｇ、ｊ）を示した。ＤＮＡ染色色素として使用しているSYBR Gold(Life Technologies)は、一本鎖ＤＮＡの場合、蛍光強度が二本鎖ＤＮＡと比べておよそ半分となる（非特許文献２２）。このことから、泳動パターンの違いは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖の有無を示しているものと推測される。【００７４】
次に、それぞれの逆転写酵素について、ＲＴ−ＲａｍＤＡコンポーネント（ｄｓＤＮａｓｅ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＺＮＡ−ランダムヘキサマープライマー）の添加あり（＋）、なし（−）の条件でマウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写を行いｃＤＮＡの収量をｑＰＣＲで比較した。その結果、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性のない全ての逆転写酵素においてＲａｍＤＡ（＋）で、検出量の増加がみられた（図４Ｃ、ａ−ｃ、ｈ、ｉ）。一方で、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性のある逆転写酵素では、検出量の増加が見られないか、もしくは、低下していた（図４Ｃ、  ｅ−ｇ、ｊ）。また公称では、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性について言及されていないが、AffinityScriptも、ＲａｍＤＡ（＋）で、わずかな増幅を示した（図４Ｂ  ｄ）。しかしながら、電気泳動像では、スメアーなパターンを示していたことから、弱いながらもＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しているものと推測された（図４Ｂ  ｄ）。これらの結果から、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法の増幅作用は、特定のｄｓＤＮａｓｅや特定の逆転写酵素に限定されるものではなく、３７℃付近に活性を持つｄｓＤＮａｓｅ酵素とＲＮａｓｅ  Ｈ活性のない逆転写酵素であれば、広く汎用的に使える技術であることがわかった。また、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性があると増幅効果が見られないことから、直接ＲＮＡを鋳型として鎖置換増幅が起きていることが示された。【００７５】
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法の反応効率を高める方法について
本発明者らは、増幅率の向上に着目した派生法、Ｔ４ジーン３２プロテインなしのＲＴ−ＲａｍＤＡ法（ＲａｍＤＡ−Ｂ）とＲＴ−ＲａｍＤＡ熱サイクル法（ＲａｍＤＡ−Ｃ）を開発した。鎖置換反応において、鋳型の二次構造形成は、増幅の障害となる。本発明者らは、この二次構造を緩める役割としてＲＴ−ＲａｍＤＡ法（ＲａｍＤＡ−Ａ）にＴ４ジーン３２プロテインを導入した。しかしながら、同時にＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド鎖の不安定化をもたらし、ｄｓＤＮａｓｅの活性を抑制していることが推測された。そこで、Ｔ４ジーン３２プロテインなしのＲａｍＤＡ−Ｂを試みることにした。マウスＥＳ細胞由来の１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡ合成を行ったところ、ＲａｍＤＡ−Ｂの条件でＧｎｂ２ｌ１、Ｏｃｔ３／４の検出量が標準逆転写法（ＲａｍＤＡ（−））と比べて４０倍以上になることが分かった（図５Ａ）。一方で、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｅｆ１ｂ２などでは、ＲａｍＤＡ−Ａと大きな差が見られなかった（図５Ａ）。【００７６】
次に、ＲａｍＤＡ−Ｂにおいて、反応温度条件のみを改変し、アニール行程と伸長反応行程を小刻みに繰り返す、ＲａｍＤＡ−Ｃを試した。すると、ＲａｍＤＡ−Ｃでは、標準逆転写法と比べてＧｎｂ２ｌ１、Ｏｃｔ３／４の検出量が１００倍以上になることがわかった（図５Ｂ、ＲａｍＤＡ（＋）ｃｙｃｌｅ）。一方で、標準逆転写法においては、熱サイクルの効果は見られなかった（図５Ｂ、ＲａｍＤＡ（−）ｃｙｃｌｅ）。また、ＲａｍＤＡ−Ａについても熱サイクル化による効果は見られなかった（非掲載）。これらのことから、ＲａｍＤＡ−Ｂ法において、プライマーの再アニーリングがｃＤＮＡの増幅に非常に有効であることが示唆された。特に、ＺＮＡ−ランダムヘキサマープライマーは、カチオンユニットを２つ付加したもので、通常のランダムヘキサマープライマーよりＴｍ値が約２６℃程高く設計されている（非特許文献１４）。このため３７℃の反応中においても、効率的にアニーリングすることが可能となり、さらに熱サイクル化することで、アニーリングがより促進されたものと考えられる。【００７７】
ＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法について
ＲＴ−ＲａｍＤＡ法において、ｄｓＤＮａｓｅを用いる最大の理由は、ｄｓＤＮａｓｅが、一本鎖ＤＮＡである増幅ｃＤＮＡ，逆転写プライマーに対してヌクレアーゼ活性を持たないためである。しかしながら、非特異的ＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅ  Ｉ自体も、そもそも二本鎖ＤＮＡと比べて一本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性が低く（非特許文献１２）、さらに、Ｋ＋、Ｎａ＋など一価の陽イオン依存的にヌクレアーゼ活性が下がることが知られている（非特許文献２３、２４）。一方で、逆転写に使用される一般的な反応液組成((First-Strand buffer (Life Technologies)、PrimeScript Buffer (for cDNA synthesis ) (TaKaRa)、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis RT-Buffer (Thermo Fisher)、 M-MuLV Reverse Transcriptase Reaction Buffer (New England Biolabs), AffinityScript RT Buffer (Agilent Biotechnology)など)は、50 mM Tris-HCl、75 mM KCl、3 mM MgCl2とＴｒｉｓ−ＨＣｌとＫＣｌの濃度が高い。つまり、逆転写反応液条件下では、ＤＮａｓｅ  Ｉの一本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性が低くＲＴ−ＲａｍＤＡ法が機能するのではないかと予測された。実際にＦＲＥＴ解析を用いて、DNase I reaction Buffer（Life Technologies）の組成である20 mM Tris-HCl、50 mM KCl、2 mM MgClを基準にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌの濃度を上げてヌクレアーゼ活性を測定してみたところ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌともに高濃度条件下では、二本鎖ＤＮＡだけでなく、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中ＤＮＡに対するＤＮａｓｅ  Ｉのヌクレアーゼ活性が大きく阻害されることが分かった（図６）。逆転写反応液と同等のＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ＫＣｌ濃度では、DNase I reaction Bufferの条件と比べて、それぞれ、４３％、１６％、１４％と活性が抑制されていた（図６、＃＃）。【００７８】
次に、非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法の有効性、取り分け、反応液中の塩濃度と増幅率の関係性を調べた。 DNase I reaction Bufferの組成から逆転写反応液の組成へと塩濃度を変化させ、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法が機能するかｑＰＣＲを用いて検証したところ、意外なことに、一本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性が高いDNase I reaction Bufferの条件であっても、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法による増幅が十分量起こることが分かった（図７）。さらに、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度を変更しても増幅率にあまり影響がなかった（図７、a-i）。一方で、逆転写反応液の組成条件におけるＮａＣｌ濃度には、増幅率が大きく影響することが分かった（図７, j-l）。このため、ＮａＣｌを含まない反応液組成が望ましいと推測される。また、自家調整反応液を用いた場合でも、市販のFirst-Strand buffer (Life Technologies)や、PrimeScript Buffer (for Real Time)（TaKaRa）と比較して遜色のない増幅率を示した（図７、ｊ、FS,PS）。このことから、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法の反応液は、特定の反応液組成に限定されることはなく、さらに、塩濃度依存的なヌクレアーゼ活性には非依存的にＲＴ−ＲａｍＤＡ法が機能することが分かった。これらのことから、反応液中の塩濃度以外のファクターが、ｃＤＮＡの分解を抑制している可能性が示唆された。【００７９】
Ｔ４ジーン３２プロテインは、ｃＤＮＡの保護と増幅の安定化に寄与する
Ｔ４ジーン３２プロテインは、一本鎖ＤＮＡに結合することで、ヌクレアーゼから一本鎖ＤＮＡを保護する作用が報告されている（非特許文献２５）。そこで、ｐｏｌｙ−Ａ付加された人工合成ＲＮＡを鋳型に、オリゴｄＴプライマーのみを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法によるｃＤＮＡの断片化状態をＴ４ジーン３２プロテインありなしで検証した（図８）。その結果、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ｄｓＤＮａｓｅ共に、Ｔ４ジーン３２プロテインと組み合わせることで、その泳動パターンから、ＤＮａｓｅ単独の条件よりもｃＤＮＡの断片化が抑制されることが分かった（図８、Ａ）。BioAnalyzerの分析においては、同様の結果を得ただけでなく、ＤＮａｓｅを作用させることで、ｃＤＮＡの収量が１０倍近く増えることが分かった（図８、Ｂ）。これは、鎖置換反応によりｃＤＮＡがグローバルに増幅されていることを示唆するものと考えられる。次に、ｑＰＣＲを用いて、鋳型ＲＮＡにおける３’末端から５’末端への増幅率を検証した（図９）。その結果、ＤＮａｓｅ  Ｉを単独で用いた場合、ほとんど増幅は見られなかったが、Ｔ４ジーン３２プロテインと組み合わた場合、１０倍近い増幅が観察された（図９,Ａ、Ｂ）。さらに、３’末端側での増幅率が、ｄｓＤＮａｓｅと比較して改善されていることが分かった（図９,Ａ）。一方、ｄｓＤＮａｓｅの場合、一本鎖ＤＮＡに対する分解活性が元々ないため、単独で作用させるだけでも高い増幅率を示した。しかしながら、同一ＲＮＡ上での増幅率の変動が大きいという結果となった（図９,Ａ、Ｃ）。この条件は、ＲａｍＤＡ−Ｂとほぼ同等の条件であることから、Ｔ４ジーン３２プロテインがないと、遺伝子間だけでなく、同一遺伝子内での増幅の変動が大きくなることが示唆された。これらのことから、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲａｍＤＡ−Ｄにおいて、Ｔ４ジーン３２プロテインは、ｃＤＮＡの分解を抑制し、遺伝子間、遺伝子内での増幅率の安定化に寄与する２つの役割をもつことが示唆された。【００８０】
Ｔ４ジーン３２プロテインは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性と一本鎖ＤＮＡに対する活性の比を改善させる作用をもつ
ＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲＴ−ＲａｍＤＡ法が機能するには、増幅ｃＤＮＡの分解量が、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ鎖へのニック形成による鎖置換増幅量よりも小さいこと、つまり、一本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡに対する活性よりも十分に小さいことが重要と言える。ｃＤＮＡの断片化と増幅率の実験（図８，９）から、Ｔ４ジーン３２プロテインがこれに寄与していることが推測された。そこで、ＦＲＥＴ解析を用いて逆転写反応液中のＴ４ジーン３２プロテインのヌクレアーゼ活性への作用を検証した（図１０）。その結果、逆転写反応液中にＴ４ジーン３２プロテインを加えることで、一本鎖ＤＮＡに対する活性が、２５％に減少することが分かった。一方、二本鎖ＤＮＡに対してはほぼ変動がなく、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡに対する活性は、６０％ぼどであった（図１０、Ａ）。次にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡへのヌクレアーゼ活性に対する一本鎖ＤＮＡへの活性の比を検証した。すると、Ｔ４ジーン３２プロテインを加えることで、４０％から１４％へと活性比が改善することが分かった（図１０、Ｂ）。この比の改善が、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法を有効にするためのキーファクターであると推測される。一方でｄｓＤＮａｓｅの場合は、Ｔ４ジーン３２プロテインの非存在下においても活性比は７％程度しかなく、このため、Ｔ４ジーン３２プロテインなしのＲａｍＤＡ−Ｂ，−Ｃが十分に機能するものと考えられる（図１０、Ｂ）。【００８１】
ＲａｍＤＡ−Ｄは、反応時間依存的な増幅率をしめす
反応時間依存的に増幅率の改善が見込まれるのか、マウスＥＳ細胞の1細胞溶解液を鋳型に用いて検証した（図１１）。ｑＰＣＲを用いてｃＤＮＡの収量の相対値をみたところ、３７℃における反応時間を３０、６０，１２０分と増やすことで、収量も約１０、２０、３０倍と増えることが分かった（図１１）。この様な現象は、ｄｓＤＮａｓｅを用いたＲａｍＤＡ−Ａでは見られなかった（データ非掲載）。ｄｓＤＮａｓｅは、逆転写反応液中、特にＴ４ジーン３２プロテイン存在下で、著しくヌクレアーゼ活性が阻害されており、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡへのヌクレアーゼ活性は、ＤＮａｓｅ  Ｉと比べて６％程度しかなかった（図１０、Ａ）。このことが、ＤＮａｓｅ  Ｉ とｄｓＤＮａｓｅを用いた際の増幅率の違いとなっているのかもしれない。一方で、ＲａｍＤＡ−Ｄは、細胞溶解液の様な不純物を含むクルードサンプルにおいても問題無く機能することが確認された。さらに逆転写反応中での二本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性についてもｄｓＤＮａｓｅと比べてＤＮａｓｅ  Ｉを用いた方が高いことから、増幅率だけでなく、コンタミネーション除去能力についてもＲａｍＤＡ−Ｄが有効であることが示唆された（図１０、Ａ）。【００８２】
ＲａｍＤＡ−Ｄは、特定のＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素に限定されない。また，１００細胞相当量のＲＮＡに対しても機能する
ＲａｍＤＡ−Ｄが、特定のＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素に限定されるのかどうかを確かめるため、PrimeScript RT Enzyme Mix I 以外にSuperScriptシリーズ（Life Technologies）の逆転写酵素を用いて検証を行った（図１２）。その結果、SuperScript II, IIIでｃＤＮＡの増幅が確認できた。なかでもSuperScript IIは、PrimeScript RT Enzyme Mix Iに匹敵する増幅率を示した（図１２、SSII）。さらにMaxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)や ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)を用いた場合でもＲａｍＤＡ−Ｄが機能することを確認した（データ非掲載）。これらのことから、ＲａｍＤＡ−Ｄは、特定のＲＮａｓｅ  Ｈマイナス型逆転写酵素に限定されないことがわかった。さらに、２００ｐｇ, １ｎｇと、1細胞相当量である１０ｐｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりも多いＲＮＡ量からでも問題なくＲａｍＤＡ−Ｄが機能することが分かった（図１２、200 pg, 1ng）。このことから、少なくとも１００細胞相当量の鋳型ＲＮＡ量を用いても十分に増幅性能が担保されていることが示唆された。【００８３】
以上のことから、ＲＴ−ＲａｍＤＡ法は、微量ＲＮＡの増幅技術としては、非常に有用な手段となり得るもので、特にＲａｍＤＡ−Ｃの増幅率は、特定のターゲット遺伝子を検出する解析において、非常に大きなアドバンテージとなるはずである。一方で、ＲａｍＤＡ−Ｃは遺伝子間での増幅率の変動が大きいため、均一な増幅が必要な解析では、Ｔ４ジーン３２プロテインを加えたＲａｍＤＡ−Ａが有効である。さらに、Ｔ４ジーン３２プロテインと非特異的ＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅ  Ｉを用いたＲａｍＤＡ−Ｄは、増幅率が高く、遺伝子間、遺伝子内の増幅変動も少ない。その上、逆転写反応中の二本鎖ＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性も二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素と比べて高い状態で維持されていることから、ＤＮＡのコンタミネーションの影響をより低減させる効果が期待される。これらのことから、ＲａｍＤＡ−Ｄは、ＲａｍＤＡ−Ａ、−Ｂ、両方の優位性を兼ね備えた方法であり、微量なＲＮＡをターゲットとした逆転写法として非常に有効かつ簡便な方法である。【００８４】
本願は、特願２０１４−２００２５８（２０１４年９月３０日出願）に基づく優先権を主張する出願であり、特願２０１４−２００２５８に記載の内容は全て、引用により本明細書中に取り込むものとする。また、本明細書で引用する特許文献、特許出願及び文献に記載の内容は全て、引用により本明細書中に取り込むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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