(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（−）−Ｎ４Ｎのハプテン：
【化１】
0006564396.tif 000013
【請求項２】
下記の式（−）−Ｎ４Ｎのハプテン：
【化２】
0006564396.tif 000014
を含むハプテン−キャリアコンジュゲートであって、
前記ハプテンがリンカーを介してキャリアタンパク質に共有結合される、ハプテン−キャリアコンジュゲート。
【請求項３】
患者に投与されるための抗原であって、請求項２に記載されるハプテン−キャリアコンジュゲートを含み、１つまたは複数のアジュバントと組合せてもよい、抗原。
【請求項４】
請求項３に記載される抗原に応答して産生される抗体を含む抗血清であって、前記抗体が（−）−ニコチンに対する免疫学的親和性を有する、抗血清。
【請求項５】
ニコチンまたはタバコの嗜癖または習慣化を処置するための医薬組成物であって、請求項３に記載される抗原を含み、（−）−ニコチンに対する親和性を有する抗体が前記患者において産生されるように投与される、前記医薬組成物。
【請求項６】
ニコチンまたはタバコの嗜癖または習慣化を処置するための医薬組成物であって、請求項４に記載される抗血清を含む、前記医薬組成物。
【請求項７】
下記の式（−）−Ｎ４Ｎの化合物の調製方法であって、
【化３】
0006564396.tif 000015
（Ａ）（−）−（Ｓ）−ニコチンを順番に（ｉ）トリメチルアセチルクロリド、および（ｉｉ）（３−エトキシ−３−オキソプロピル）亜鉛（ＩＩ）ヨード、塩化リチウムおよびシアン化銅の組み合わせと接触させて式３
【化４】
0006564396.tif 000016
の化合物を得る工程、
（Ｂ）式３の化合物をイオウと接触させて式４
【化５】
0006564396.tif 000017
の化合物を得る工程、
（Ｃ）式４の化合物をＮＨ４ＯＨと接触させて式５
【化６】
0006564396.tif 000018
の化合物を得る工程、及び
（Ｄ）式５の化合物を水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムと接触させて式（−）−Ｎ４Ｎの化合物を得る工程を含む、前記調製方法。
【請求項８】
工程（Ａ）において接触をＴＨＦ中において行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（−）−（Ｓ）−ニコチンとトリメチルアセチルクロリドのモル比が１：１である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（Ｂ）を還流キシレン中で行う、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（Ｂ）において、イオウ対式３の化合物のモル比が、１．３：１である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（Ｄ）をトルエン中で行う、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（Ｄ）において、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム対式５の化合物のモル比が４．５：１である、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
世界保健機関によれば、１０億人を超える喫煙者が世界中に存在し、喫煙が、年間６００万人近くの死亡の原因となっている（１）。その経済的影響もまた憂慮すべきものであり、合衆国だけにおいて、喫煙により、３０００億ドル近くが毎年、医療費および生産性の喪失で費やされている（２）。長期間のタバコ使用と、無数の疾患との間における疫学的関連が十分に理解されており、多くの喫煙者が禁煙したいと望んでいるが、現在利用できる中断支援策はほとんど役に立っていない。合成された小分子アゴニストまたは小分子アンタゴニストが、ニコチン依存症に関わる脳内の受容体を標的としている（３〜５）。中枢に作用する場合、これらの医薬品は数々の副作用を生じさせる（６）。
【０００２】
一方、本発明者らは、喫煙者が禁煙しようとする努力を助けるための薬物動態学的な（抗体に基づく）方策を薬物動態学的な（薬物に基づく）方策に代わって追い求め続けてきた（７）。ニコチンは、タバコを吸うことに耽溺させることにおいて中心的な役割を果たしている。ニコチンワクチンは免疫系を刺激して、ニコチンを外来抗原として特定し、これにより、ニコチンの薬物動態学を変化させる抗体を誘発させる。抗ニコチン抗体は血中の遊離ニコチンの濃度を低下させ、遊離ニコチンが中枢神経系に入ることを妨げる。脳内報酬系の活性化を阻止することは、嗜癖行動の消衰を促進させることができ、これにより、より良好な喫煙中止の結果をもたらすことができる。ニコチンワクチンが臨床承認されれば、臨床承認されたニコチンワクチンは、適切に利用される場合には、持続した禁煙の著しくより良好な割合をもたらし得るかもしれない、利用可能なツールに対する相補的な追加となるであろう。
【０００３】
ＮｉｃＶＡＸ（登録商標）が、今日までのところ最も臨床的に進んだニコチンワクチンであり、第ＩＩＩ相を完全に終えている（８〜１１）。このニコチンワクチンは安全であり、かつ、十分に許容され、しかし、臨床試験参加者のほんの一部について効果的であるにすぎなかった（１２、１３）。それにもかかわらず、臨床承認されたニコチンワクチンの期待が非常に大きいことを考慮して、研究が緩むことなく継続している。ＮｉｃＶＡＸ（登録商標）よりも何か良好なものを供給するために、近年では設計および処方の多くの局面が詳しく調べられている。様々な努力には、抗ニコチン抗体結合能を増大させるために、免疫原性をより新しいアジュバントの使用により増強すること（１４〜１７）、実用性を代替投与経路により改善すること（１８）、および、多価戦略を採用すること（１９〜２２）が含まれる。
【０００４】
特定の小分子（例えば、ニコチンなど）に対する防御免疫を付与することを目指すワクチンについては、そのようなワクチンはエピトープの十分な化学的均一性を有することが重要である（２３〜２５）。他のワクチンが、ジフテリア・破傷風・無菌性百日咳（ＤＴａＰ）混合ワクチン、麻疹・ムンプス・風疹（ＭＭＲ）混合ワクチンおよび肺炎球菌の２３価混合ワクチン（２６、２７）の場合のように、多数の一般的なエピトープを同時に標的とするように操作される場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は様々な実施形態において、（−）−ニコチンに対する抗体を惹起させることにおいて使用されるために好適であるハプテン、前記ハプテンを含む抗原、前記ハプテンを含む前記抗原を使用して調製される抗体、前記抗ニコチン抗原を含むワクチン、および、患者におけるタバコの習慣化または嗜癖を処置する方法であって、抗ニコチンワクチン／抗原の使用を含む方法に関する。
【０００６】
上記ハプテンは様々な実施形態において、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の主要な薬物成分であるアルカロイドの（−）−ニコチンとの十分な構造的類似性を有しており、その結果、例えば、ヒト患者において、本発明のハプテンを含む抗原に対して惹起される抗体もまた（−）−ニコチンと反応するようになり、したがって、この抗原は、抗ニコチン抗体を患者の免疫系によって惹起させるために患者に投与するために好適であり得る。そのような抗体は、ニコチン（例えば、吸入形態または噛み形態のタバコなどに由来するニコチン）と結合するために働くことができ、また、患者における薬物嗜癖を強化するために働く患者に対する薬物影響を阻止することができる。さらに、本発明の抗原性ワクチンの使用によって生じる抗体は、（−）−ニコチン（すなわち、（Ｓ）−ニコチン）に対して選択的であることが可能である。
【０００７】
様々な実施形態において、本発明は、下記の式（−）−３’−ＡｍＮｉｃのハプテン：
【化１】
0006564396.tif 000002
【０００８】
（−）−３’−ＡｍＮｉｃを含み、前記（−）−３’−ＡｍＮｉｃハプテンがリンカーを介してキャリアタンパク質に共有結合させられるコンジュゲート化ハプテン；患者に投与されるための抗原であって、前記コンジュゲート化ハプテンを含み、（１または複数の）アジュバントを含んでいてもよい抗原；（−）−ニコチンに対する免疫学的親和性を有する抗体を含む、患者において産生される抗血清；および、ニコチンまたはタバコの嗜癖または習慣化を処置する方法であって、効果的な量の前記コンジュゲート化ハプテンまたは前記コンジュゲート化ハプテンを含む抗原性混合物を、前記嗜癖または習慣化に苦しむ患者に投与することを含み、その結果、（−）−ニコチンに対する親和性を有する抗体が前記患者において産生されるようにすることを含む方法を提供する。
【０００９】
様々な実施形態において、本発明は、下記の式（−）−Ｎ４Ｎの（−）−ニコチンハプテン
【化２】
0006564396.tif 000003
【００１０】
（−）−Ｎ４Ｎを含み、前記（−）−Ｎ４Ｎハプテンがリンカーを介してキャリアタンパク質に共有結合させられるコンジュゲート化ハプテン；患者に投与されるための抗原であって、前記コンジュゲート化ハプテンを含み、（１または複数の）アジュバントを含んでいてもよい抗原；（−）−ニコチンに対する免疫学的親和性を有する抗体を含む、患者において産生される抗血清；および、ニコチンまたはタバコの嗜癖または習慣化を処置する方法であって、効果的な量の前記コンジュゲート化ハプテンまたは前記コンジュゲート化ハプテンを含む抗原性混合物を、前記嗜癖または習慣化に苦しむ患者に投与することを含み、その結果、（−）−ニコチンに対する親和性を有する抗体が前記患者において産生されるようにすることを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（−）−３’−ＡｍＮｉｃおよび（＋）−３’−ＡｍＮｉｃを調製するための合成プロトコルを示す図であり、この場合、（−）−３’−ＡｍＮｉｃおよび（＋）−３’−ＡｍＮｉｃはその後、コハク酸エステルリンカーを介して破傷風毒素（「ＴＴ」）にコンジュゲート化され、（−）−ニコチンに対するそれらの特異性について評価された。
【図２】（−）−Ｎ４Ｎの調製およびコンジュゲート化のための合成プロトコルを示す図である。
【図３】２つの被覆抗原に対して測定される、ワクチン群から得られる抗血清についての相対的なＥＬＩＳＡ力価を示す図である。記号によって示されるそれぞれの値が平均である（ｎ＝７）。（−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＢＳＡ被覆抗原に対する（−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＦｌｉｃ抗血清についての平均力価が１．０に正規化されており、すべての他のデータ点がこの抗血清／被覆抗原の組合せに対しての平均ＥＬＩＳＡ力価を表す。
【図４】（−）−３’−ＡｍＮｉｃおよび（＋）−３’−ＡｍＮｉｃの放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）についての結合親和性曲線を示す図である。
【図５】生理的食塩水コントロールに対する４つのニコチンワクチンのマウスにおける抗侵害受容アッセイから得られる結果をまとめるグラフを示す図である。示されるそれぞれの棒が、エラーバーとしてＳＥＭを用いる平均（ｎ＝７）である。無修正フィッシャーＬＳＤを伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５  （−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＦｌｉｃ対生理的食塩水について。
【図６】ニコチンの影響をマウスにおいて減弱させることにおける４つのニコチンワクチンの効力を測定するための低体温アッセイから得られる結果をまとめる図である。示されるそれぞれの棒が、エラーバーとしてＳＥＭを用いる平均（ｎ＝７）である。ダネット多重比較検定を伴う二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５  注釈ワクチン群対生理的食塩水について；＊＊Ｐ＜０．００５  注釈ワクチン群対生理的食塩水について；＊＊＊Ｐ＜０．０００１  注釈ワクチン群対生理的食塩水について。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のハプテン−キャリアコンジュゲートおよび抗原組成物は（−）−ニコチンのみを特異的かつ選択的に標的としており、したがって、本発明によれば、本明細書中に記載される様々な実施形態によるワクチンは、（−）−ニコチンのみを捕捉することができる抗体を効率的に誘発する。抗体はエナンチオ識別することができるという考えが、一世紀近く前にＬａｎｄｓｔｅｉｎｅｒによって最初に認められ（２８、２９）、今日まで利用され続けている。そのような研究には、エナンチオ選択的な触媒抗体（３０〜３２）、ならびに、ニコチンに対する立体特異的ｍＡｂ（３３）およびコカインに対する立体特異的ｍＡｂ（３４〜３６）が含まれる。ニコチンｍＡｂの研究の場合、ハイブリドーマが、（Ｓ）−（−）−［３Ｈ］ニコチンを使用して選択され、それにより、天然に存在する異性体に対して特異的である抗体について最適化された（３３）。本発明では、抗体はエナンチオ識別することができるということが、ニコチンのためのワクチンを開発することにおいて利用される。
【００１３】
臨床評価をこれまでに受けてきたニコチンワクチンの多くが、ラセミ体のｔｒａｎｓ−コチニンカルボン酸（（±）−１、図１）の操作とともに出発した。しかしながら、ＮｉｃＶＡＸ（登録商標）になるであろうハプテンータンパク質コンジュゲートの製造ではキラル分離工程（または不斉合成工程）は含まれなかった。本発明は驚くべきことに、抗体の絶妙な立体識別能のために、非ラセミ型の完全な（−）−ニコチンのワクチンコンジュゲートは優れた免疫原であることを示す。
【００１４】
ハプテン
用語「ハプテン」は、本発明において使用される場合、自身では免疫応答を誘発することができない低分子量の有機化合物である。しかしながら、ハプテンは、キャリア分子に結合させられると、免疫応答を誘発することになる。いくつかの実施形態によれば、ハプテンはリンカーを介してキャリアに結合させられる。
【００１５】
１つの実施形態によれば、本発明のハプテンは、ｔｒａｎｓ−３−アミノメチルニコチン（３’ＡｍＮｉｃ）であるニコチン誘導体である。１つの実施形態に従って、例えば、ハプテンはｔｒａｎｓ−３−アミノメチルニコチンのただ一方のエナンチオマーであり、具体的には（−）−３’−ＡｍＮｉｃである。両方のエナンチオマーが下記に示される：
【化３】
0006564396.tif 000004
【００１６】
他の実施形態において、ハプテンは、下記に示されるように、（Ｓ）−３−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−４−イル）プロパン−１−アミン、すなわち、（−）−Ｎ４Ｎである：
【化４】
0006564396.tif 000005
【００１７】
リンカー連結がニコチンのピリジル環のＣ４位に位置することによって、新しいｓｐ３の立体中心が導入されず、このことは、上記で示されるいずれかの３’−ＡｍＮｉｃハプテンにおけるピロリジン環の３’位でのリンカー連結とは対照的である。したがって、さらなる立体化学的複雑性が導入されない。（−）−Ｎ４Ｎのさらなる利点は、（−）−ニコチンを（−）−Ｎ４Ｎ合成の出発物質として使用すること、また、このニコチンハプテンの化学的合成の期間中を通してエナンチオ純度を維持する合成的変換を行う、すなわち、キラル分離工程が不要となっていることに起因する（図２）。加えて、このリンカー自体、すなわち、メチレン（Ｃ４位に結合するＣＨ２）が、ヘテロ原子（例えば、酸素）がこの位置においてニコチンのピリジル環を電子的に乱すようには、これを乱さないため、その性質は優れている。したがって、この新規なニコチンハプテン設計によって、より良好な抗ニコチン抗体応答（より大きい力価または濃度、より大きい親和性および特異性、ニコチンの薬物動態学および薬力学の優れた機能的な拮抗作用）を誘発させることを目標に、立体的および立体電子的な両方の検討が行われる。
【００１８】
コンジュゲート
いくつかの実施形態によれば、ニコチンハプテンが、リンカーを伴って、またはリンカーを伴うことなくキャリアに直接、結合させられる。例えば、ただ１つのニコチンハプテンをキャリアタンパク質表面におけるそれぞれの利用可能なアミン基に結合させることができる。ハプテンを、ホモ二官能性の架橋剤またはヘテロ二官能性の架橋剤を使用してキャリアタンパク質に直接にコンジュゲート化するための様々な一般的方法が、この技術分野では広く知られている：例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、ならびに、ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｃｏｎｔｒｉｂｕ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａｓａｌ（１９８９）、ｖｏｌ．１０、４８−１１４。
【００１９】
二官能性の架橋剤を使用する直接的なコンジュゲート化では一般に、タンパク質に対するハプテンのモル比が、具体的なコンジュゲート化化学反応のためにタンパク質表面において利用可能な官能基の数によって制限されることが生じる。例えば、ｎ個のリシン部分を有するキャリアタンパク質は理論的には、リンカーのカルボキシル基との反応のために利用可能であるｎ＋１個の第一級アミン（末端アミノを含む）を与える。したがって、直接的なコンジュゲート化では、ｎ＋１個のアミド結合の形成、すなわち、最大でｎ＋１個のハプテンが結合することが生じる。当業者は、コンジュゲート化ハプテンの密度が、ニコチンハプテンをキャリアタンパク質にコンジュゲート化するために使用される反応剤の濃度、および、キャリアタンパク質の性質に依存し得ることを認識するであろう。同様に、ニコチン−キャリアコンジュゲートの所与の調製の範囲内において、それぞれの個々のコンジュゲートのハプテン／キャリア比における変動もまた認められるであろう。いくつかの実施形態によれば、ハプテン密度（タンパク質キャリアに対するコンジュゲート化ハプテンのモル比）は約１０から約７０にまで及ぶことが可能であり、約２０から約６０にまで及ぶことが可能であり、また、約３０から約５０にまで及ぶことが可能である。
【００２０】
キャリアタンパク質
ニコチンハプテンが調製されると、本明細書中に記載される実施形態のいずれかによれば、当該ハプテンはその後、ニコチンキャリアコンジュゲートに対する抗体を惹起させるために使用されることになるキャリアタンパク質にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態において、本発明のキャリアタンパク質は一般には、どのようなタンパク質またはポリペプチドであれ、好適な免疫原性タンパク質または免疫原性ポリペプチドである。「免疫原性」分子は、免疫応答を誘発することができる分子である。例えば、１つの実施形態において、キャリアタンパク質はＴ細胞エピトープである。
【００２１】
他の実施形態において、「キャリアタンパク質」は多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であり、この場合、これは分岐状ペプチドである。ＭＡＰを使用することによって、ハプテン密度および結合価が、多数の分岐型アミノ酸残基のために最大になる。ＭＡＰを形成するために使用することができるアミノ酸の例には、リシンが含まれるが、これに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、対象のＴ細胞を刺激することができる少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有する分子であり、ただし、このＴ細胞エピトープはその後、Ｂ細胞に、完全なハプテン−キャリアコンジュゲート分子に対する抗体を産生させるようにする。用語「エピトープ」は、本明細書中で使用される場合、抗体分子とのその特異的な相互作用に関わる抗原上のどのような決定基をも含む。エピトープ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面原子団（例えば、アミノ酸または糖側鎖など）からなり、特異的な三次元の構造的特徴、同様にまた、特異的な電荷特徴を有する。
【００２３】
これらの実施形態および他の実施形態によれば、キャリアタンパク質が、強い免疫原性応答を誘発するその能力に基づいて選択され、その結果、多様な患者集団が本発明のハプテン−キャリアコンジュゲートによって処置されることが可能である。例えば、キャリアタンパク質は、強い免疫応答をワクチンに対して誘発するために十分に異物でなければならない。典型的には、この関連でのキャリアタンパク質は、免疫原性を共有結合で連結されたハプテンに与えることができる大きい分子である。
【００２４】
コンジュゲート型ワクチンにおいて当業者に知られている多くのタンパク質が本発明における使用に好適である。例えば、いくつかの実施形態において、キャリアは、治療用のコンジュゲート型ワクチンの調製において使用されるものである（例えば、病原性細菌の多数の毒素およびそれらのトキソイドなど）。例には、ジフテリア毒素および破傷風毒素ならびにそれらの医療承認された対応するトキソイドが含まれる。他の実施形態において、キャリアはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、これらはともに、動物を用いて実験するときのコンジュゲート型ワクチンの開発においてキャリアとして一般に使用されている。さらに他の実施形態において、タンパク質は鞭毛フィラメントの構造タンパク質（ＦｌｉＣ）である。
【００２５】
さらに他の実施形態によれば、キャリアは、細菌毒素と抗原的に類似しているタンパク質であり、これは多くの場合、交差反応物質（ＣＲＭ）と呼ばれるものである。
【００２６】
ハプテンのキャリアタンパク質へのコンジュゲート化
いくつかの実施形態に従って、本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートは、１つまたは複数のハプテンをキャリアタンパク質と反応させて、ハプテンキャリアコンジュゲートを生じさせることによって調製される。
【００２７】
様々な官能基が、本発明のハプテンへのキャリアの連結またはコンジュゲート化を容易にするために使用される。これらには、タンパク質分子の反応基との共有結合を形成することができる機能的成分（例えば、カルボン酸、無水物、混合無水物、アシルハリド、アシルアジド、アルキルハリド、Ｎ−マレイミド、イミノエステル、イソシアナート、アミン、チオールおよびイソチオシアナートなど）が含まれる。使用される機能的成分に依存して、いくつかの実施形態によれば、反応基は、反応したときには、アミド、アミン、チオエステル、アミジンウレアまたはチオウレアの結合形成をもたらすキャリアタンパク質分子または修飾されたキャリアタンパク質分子の表面におけるリシン残基のアミノ基またはチオール基である。他の好適な活性化基およびコンジュゲート化技術がこの技術分野では広く知られている（Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：１９９６；ならびに、ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｃｏｎｔｒｉｂｕ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａｓａｌ（１９８９）、ｖｏｌ．１０、４８−１１４）。
【００２８】
いくつかの実施形態において、リンカーは、ハプテンをキャリアタンパク質にコンジュゲート化するための線状成分である。例えば、リンカーはスクシニル基である。リンカーの別の一例がアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。
【００２９】
抗血清および抗体
本発明の抗血清は、いくつかの実施形態によれば、抗原に応答して産生される抗体を含み、ただし、この場合、抗原自体が、本明細書中に記載されるようなハプテン−キャリアコンジュゲートを含む。これに関連して、モノクローナル抗体を作製するための様々な技術がこの技術分野では広く知られている。例えば、モノクローナル抗体を、ニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートを含む組成物をマウスに注入すること、その後、抗体産生の存在を、血清サンプルを取り出すことによって確認すること、脾臓を取り出してＢリンパ球を得ること、前記Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製すること、前記ハイブリドーマをクローニングすること、前記ハプテン−キャリアコンジュゲートに対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、前記抗原に対する抗体を産生する前記クローンを培養すること、および、前記抗体を前記ハイブリドーマの培養物から単離することによって得ることができる。
【００３０】
または、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養物から様々な十分に確立された技術によって単離し、精製することができる。これらの技術には、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１頁〜２．７．１２頁および２．９．１頁〜２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓ他、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、ＶＯＬ．１０、７９頁〜１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２））。
【００３１】
ポリクローナル抗体を調製するための技術もまた、この技術分野では広く知られている。一般には、例えば、動物に免疫原性物質が注射され、その後、抗体に富む血清であって、注射された免疫原の数多くのエピトープに対する抗体の混合物を含有する血清が集められる。抗体を産生させるための好適な宿主哺乳動物には、ヒト、ラット、マウス、ウサギおよびヤギが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態に従って、機能的な抗体フラグメントもまた利用することができる。そのようなフラグメントは、酵素（例えば、ペプシンまたはパパインなど）による消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって製造される。
【００３３】
または、本発明によって包含される抗体フラグメントは、自動化されたペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓなどによって商業的に供給されるペプチド合成機など）を使用して合成することができ、または、この技術分野では広く知られている技術（Ｇｅｙｓｅｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０２：２５９（１９７８））を使用して手作業で製造される場合がある。本発明によるモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を直接に決定することを、従来の技術を使用して行うことができる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によるフラグメントがＦｖフラグメントである。抗体のＦｖフラグメントは、抗体の重鎖の可変領域（Ｖｈ）と、抗体の軽鎖の可変領域（Ｖｌ）とから構成される。抗体のタンパク質分解的切断により、Ｖｈ領域およびＶｌ領域が非共有結合で会合したままであり、かつ、抗原結合能を保持する二重鎖Ｆｖフラグメントを生じさせることができる。Ｆｖフラグメントにはまた、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによってつながれる組換え単鎖抗体分子が含まれる（Ｓｋｅｒｒａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８−４１（１９８８））。本発明の他の実施形態による抗体フラグメントには、無傷な抗体のＦｃフラグメントを欠くＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２が含まれる。
【００３５】
治療方法
ニコチンは、血液脳関門を越えた後でその著しい影響の多くを及ぼすので、本発明は、ニコチンが血液脳関門を越えることを妨げるための治療方法および使用を提供する。具体的には、ニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートが患者に投与されることにより、患者の血流中のニコチンに対する抗体が生じる。
【００３６】
または、好適な宿主哺乳動物において生じた抗ニコチン抗体、および、処置されることになる患者の体外で作製された抗ニコチン抗体を患者に投与することができる。患者が喫煙するならば、患者の血液におけるニコチンが、循環している抗ニコチン抗体によって捕らえられ、これにより、ニコチンが脳に到達することが妨げられることになる。したがって、上記抗体は、脳に起源を有するニコチンの生理学的影響および心理学的影響を防止する。喫煙者はこれらの影響の緩和または中断を経験することになるので、タバコを吸いたいという欲望を失うことになる。本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートにより免疫化された後では、同じ治療効果が、患者が無煙タバコを使用する場合に生じる。加えて、本発明のコンジュゲートおよび抗体は、ニコチンが末梢神経系を刺激し得ることに対して影響を及ぼすことによってそれらの効果を発揮する。
【００３７】
ハプテン−キャリアコンジュゲートの投与
本発明のコンジュゲートは、ニコチン嗜癖を処置するために、また、ニコチン嗜癖を防止するために好適である。ニコチン嗜癖を処置するために、本発明のニコチン−キャリアコンジュゲートが、ニコチン嗜癖に苦しむ患者に投与される。ニコチン嗜癖を防止するために、ニコチン嗜癖を生じさせることの危険性がある患者（例えば、十代の少年少女など）が本発明によるコンジュゲートにより処置される。コンジュゲートの患者への直接投与は「能動免疫化」と呼ばれる。
【００３８】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートを、当該コンジュゲートに対する免疫応答を誘発するための十分な量で含む。ニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートは、その後のニコチン摂取に対抗して活性であるために十分な濃度で体内に留まることができる。
【００３９】
本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートによる最初のワクチン接種により、ニコチンに対して特異的である抗体の大きい力価がもたらされる。ニコチン嗜癖のための処置を必要としている患者に投与されるコンジュゲートの治療効果的な量が当業者によって容易に決定される。好適な投薬量範囲が１〜１０００μｇ／服用である。一般に、患者が抗体を外来抗原に対して生じさせるには１週間〜数週間を必要とする。患者の血液における抗体の産生を、当業者には広く知られている様々な技術を使用することによって、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）およびウエスタンブロッティングの方法などを使用することによってモニターすることができる。治療有効性もまた、ニコチンの様々な身体影響（例えば、血圧など）を評価することによってモニターすることができる。
【００４０】
下記で詳述されるように、本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートは、患者に投与される組成物を提供するために処理することができる。いくつかの実施形態によれば、投与方法には、鼻腔内、気管内、経口、皮膚、経粘膜、皮下注入および静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、最初の注入の後、コンジュゲートの１回または複数回の「追加免疫」が続いて施されることがあることを認識するであろう。追加免疫により、本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートに対する抗体の産生が増大する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物または抗血清組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含む。アジュバントが、キャリアタンパク質の効果が阻害されないように選択される。アジュバントは、ヒトに対して生理学的に許容され得るものであり、これらには、ミョウバン、ＱＳ−２１、サポニンおよびＭＰＬＡ（モノホスホリルリピドＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
他の実施形態によるワクチン組成物は１つまたは複数の医薬的に許容され得る賦形剤を含んでいてもよい。例えば、そのような賦形剤には、無菌水、塩溶液（例えば、生理的食塩水など）、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール系化合物、ポリエチレングリコール、ゼラチン、マンニトール、炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、粘性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロースおよび緩衝剤のうちの１つまたは複数が含まれる。当業者に知られているさらなる賦形剤はどれも、本発明において有用である。
【００４３】
本発明のハプテン−キャリアコンジュゲートは、ニコチン嗜癖の処置または防止を必要としている患者に投与されるための医薬組成物に組み込まれる。本発明のハプテン−キャリアコンジュゲートを含有する組成物が、例えば、注入のために使用されるためのものであるときには、ハプテン−キャリアコンジュゲートは、医薬的に許容され得るｐＨにおいて水性の生理的食塩水溶液に可溶化される。しかしながら、ハプテン−キャリアコンジュゲートの注入可能な懸濁物を使用することが可能である。通常の医薬的に許容され得る賦形剤に加えて、組成物は、純度を保証するために、生物学的利用能を高めるために、かつ／または、浸透を増大させるために、必要に応じた成分を含有することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、少なくとも１つの補助剤（例えば、分散媒体、被覆剤、ミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、脂質、界面活性剤、滑剤、保存剤および安定剤など）を含有していてもよい。当業者に知られているさらなる補助剤はどれも、本発明において有用である。本明細書中において同様に有用であるものが、どのような作用因であれ、本発明のワクチン組成物の効果との相乗作用を示すように作用する作用因である。
【００４５】
本発明の医薬組成物は無菌であり、かつ、貯蔵、配布および使用に耐えるために十分に安定である。加えて、組成物は、組成物を微生物による侵入および微生物の成長から保護するためのさらなる成分を含有する場合がある。例えば、組成物が、投与直前に医薬的に許容され得る希釈剤によって再構成される凍結乾燥粉末の形態で製造される。無菌の注入可能な溶液を調製する様々な方法が当業者に広く知られており、これらには、真空乾燥、凍結乾燥および遠心乾燥が含まれるが、これらに限定されない。これらの技術により、プレミックスに組み込まれるどのようなさらなる賦形剤とでも一緒での有効成分の粉末がもたらされる。
【００４６】
抗体の投与
受動免疫化は、本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートに応答して惹起されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を投与すること、あるいは、本発明のニコチンハプテン−キャリアコンジュゲートに応答して惹起されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に曝されることを含む。そのような抗体を動物またはヒトにおいて生じさせることができる。本発明のニコチンコンジュゲートに応答して惹起される抗体を、ニコチンに対する嗜癖を防止するために投与することができる。例えば、そのような抗体を、ニコチンに対する嗜癖を生じさせることの危険性があると見なされる人々（例えば、十代の少年少女など）に投与することができる。抗体はまた、ニコチン中毒である患者を処置するために好適である。上記で議論されたように、本発明の抗体は血中のニコチンと結合し、ニコチンが血液脳関門を越えることを妨げる。いくつかの実施形態によれば、本発明のハプテン−キャリアコンジュゲートの投与によって惹起される抗体は分子量範囲が約１５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａである。
【００４７】
ニコチン嗜癖のための処置を必要としている患者に投与される本発明の治療用抗体の治療効果的な量が当業者によって容易に決定される。好適な投薬量範囲が１〜１０００μｇ／服用である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態による治療用組成物は、本発明のニコチン−キャリアコンジュゲートに応答して産生される少なくとも１つの抗体を含む。組成物は、１つまたは複数の医薬的に許容され得る賦形剤を含有していてもよい。有用な賦形剤には、無菌水、塩溶液（例えば、生理的食塩水など）、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール系化合物、ポリエチレングリコール、ゼラチン、マンニトール、炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、粘性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロースおよび緩衝剤が含まれる。当業者に知られているさらなる賦形剤はどれも、本発明において有用である。
【００４９】
本発明の抗体は、ニコチン嗜癖の処置または防止を必要としている患者に投与するために、医薬組成物に組み込まれる。抗体を含む組成物は、注射のために、医薬的に許容され得るｐＨにおいて水性の生理的食塩水溶液に配合することができる。しかしながら、抗体の注入可能な懸濁物を使用することが可能である。通常の医薬的に許容され得る賦形剤に加えて、組成物は、純度を保証するために、生物学的利用能を高めるために、かつ／または、浸透を増大させるために、必要に応じた成分を含有する。
【００５０】
本発明の抗体を含む医薬組成物は無菌であり、かつ、貯蔵、配布および使用に耐えるために十分に安定である。加えて、組成物は、組成物を微生物による侵入および微生物の成長から保護するためのさらなる成分を含有していてもよい。無菌の注入可能な溶液を調製する様々な方法が当業者に広く知られており、これらには、真空乾燥、凍結乾燥および遠心乾燥が含まれるが、これらに限定されない。これらの技術により、プレミックスに組み込まれるどのようなさらなる賦形剤とでも一緒での有効成分の粉末がもたらされる。
【００５１】
［実施例］
下記の実施例は本発明のさらなる実施形態を構成する。したがって、下記の実施例は、本明細書中に記載される発明を例示するために意図され、しかし、本明細書中に記載される発明をいかなる点でも限定するためには意図されない。
【００５２】
一般的手順
化学。すべての反応を、別途言及される場合を除き、無水条件を使用して、乾燥溶媒を用いてアルゴン雰囲気下で行った。ほとんどの化学薬品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、受領時のまま使用した。フラジェリンタンパク質（ＦｌｉＣ）を社内で調製した。破傷風トキソイド（ＴＴ）を、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）から購入した。収率は、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および分光法（１Ｈ  ＮＭＲ）により均質（≧９５％）である物質を示す。反応を、ＵＶ光を可視化手段として使用して、０．２５ｍｍのＥ．Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲルプレート（６０Ｆ−２５４）で行われる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターした。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル（６０、粒子サイズ：０．０４０〜０．０６３ｍｍ）を使用して行った。有機溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下で濃縮し、その後、さらなる排気を、二段メカニカルポンプを使用して行った。ＮＭＲスペクトルを、ＤＣＨ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを伴うＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ＨＤ装置（６００ＭＨｚ）、または、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  ＤＲＸ装置（５００ＭＨｚ）で記録し、残存する非重水素化溶媒を内部標準として使用して校正した（ＯＤ３ＯＤ＠δ４．８７ｐｐｍ  １Ｈ  ＮＭＲ、δ４９．００ｐｐｍ  １３Ｃ  ＮＭＲ）。下記の略号（またはそれらの組合せ）が、１Ｈ  ＮＭＲの多重度を説明するために使用される：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｍ＝多重線。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、エレクトロスプレイイオン化飛行時間リフレクター実験によって、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳＤ  ＴＯＦ質量分析計で記録した。ＩＲスペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３８０  ＦＴＩＲ分光計で記録した。
【００５３】
生物学。それぞれのハプテン−タンパク質コンジュゲートをホスホロチオアート化シトシン−ホスホロチオアート−グアニンのオリゴデオキシヌクレオチド（「ＣｐＧ  ＯＤＮ」）１８２６（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ）と混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。その後、等量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（２％；ｖａｃ−ａｌｕ−５０、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を滴下して加え、その後、１０分間の穏やかな転倒を行った。この様式で調製されたワクチンは、１００μＬの完全な配合物につき、５０μｇのコンジュゲート、５０μｇのＣｐＧおよび２０μＬのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有した。
【００５４】
［実施例１］
（−）−３’−ＡｍＮｉｃの合成
最初に、ラセミ状のｔｒａｎｓ−３’−アミノメチルニコチン（３’−ＡｍＮｉｃ、（±）−２）を市販のラセミ状ｔｒａｎｓ−コチニンカルボン酸（（±）−１）から調製した。次に、キラル超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を使用して、約６００ｍｇの（±）−２を約２５０ｍｇのそれぞれのエナンチオマーに分離した（図１）。
【００５５】
［実施例２］
（−）−３’−ＡｍＮｉｃ破傷風トキソイドコンジュゲートおよびワクチン
Ａ．コンジュゲート。カルボキシラート含有ニコチンハプテンをキャリアタンパク質にコンジュゲート化する本発明者らの以前の実験（３７〜３９）を考慮して、同じことをこの場合に行うことを試みた。このために、実施例１に従って調製される２のそれぞれのエナンチオマーを無水コハク酸でアシル化した。しかしながら、スクシニル化ハプテンを活性化し、破傷風トキソイド（「ＴＴ」）と混合した場合には、ハプテン密度が低いコンジュゲートが得られた。
【００５６】
したがって、本発明者らは代替法（スキーム１、挿入図）を用い、（ハプテンではなく）キャリアタンパク質を最初にスクシニル化した（１７、４０、４１）。したがって、ＴＴを、ｐＨ８．６５のＴｒｉｓ緩衝液において無水コハク酸で処理して、ＳｕｃＴＴを得た。その後、ＳｕｃＴＴを、ｐＨ５．８０の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）緩衝液において１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と（−）−２または（＋）−２のどちらかとにより処理し、最後に、ｐＨ７．４のＰＢＳに対する透析を行った。この手順により、下記で記載されるようなアジュバントとの配合のために好適である（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴおよび（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ（ハプテン密度＞４０、ＭＡＬＩＤ−ＴＯＦ分析による）の個々の量が得られた。
【００５７】
Ｂ．ワクチン。上記で記載されるような２つのハプテン−タンパク質コンジュゲートのそれぞれを、ホスホロチオアート化ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６（４２−４４）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）と混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。その後、等量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（２％；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を注意深く滴下して加え、その後、短期間（１０分間）の穏やかな転倒を行った。この様式で調製されたワクチンは、２００μＬの完全な配合物につき、１００μｇのコンジュゲート、１００μｇのＣｐＧおよび１００μＬのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有した（４５）。
【００５８】
［実施例３］
（Ｓ）−３−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−４−イル）プロパン−１−アミン（（−）−Ｎ４Ｎ、６）の合成
Ａ．３−（３−（（Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル）−１−ピバロイル−１，４−ジヒドロピリジン−４−イル）プロパン酸エチル（３）
【化５】
0006564396.tif 000006
【００５９】
３−ヨードプロピオン酸エチル（５．９３ｇ、２６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解した溶液を亜鉛末（２．０４ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）で処理した。その後、ＴＨＦ（４０ｍＬ）におけるシアン化銅（Ｉ）（１．７９ｇ、２０ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（１．７８ｇ、４２ｍｍｏｌ）を加えた。同時に、別個のフラスコにおいて、ＴＨＦ（８０ｍＬ）における（−）−（Ｓ）−ニコチン（３．２４ｇ、２０ｍｍｏｌ）をトリメチルアセチルクロリド（２．４１ｇ、２０ｍｍｏｌ）で処理した。これら２つのフラスコの内容物を混合し、一晩撹拌した。
【００６０】
反応混合物を０℃に冷却し、その後、反応停止を、１０％のＮＨ４ＯＨ水溶液（１５０ｍＬ）を加えることによって行った。混合物をろ過し、ろ液を真空下で濃縮した。残留する水層をＥｔＯＡｃにより抽出し（１００ｍＬで３回）、一緒にした有機層を、１０％のＮＨ４ＯＨ水溶液（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル、９０：１０：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）により、表題化合物（２．９３ｇ、４２％）を淡黄色の半固体物として得た。Ｒｆ＝０．７０（シリカゲル、９０：１０：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．２３（ｓ、１Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．９８（ｄｄ、Ｊ＝８．０、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．３４（ｓ、９Ｈ）、１．２３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）ポジティブモード：３４９．２［Ｍ＋Ｈ＋］実測値。
【００６１】
Ｂ．（Ｓ）−３−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−４−イル）プロパン酸エチル（４）
【化６】
0006564396.tif 000007
【００６２】
３（２．９３ｇ、８．３２ｍｍｏｌ）をキシレン（１２．５ｍＬ）に溶解した溶液を室温で、イオウ粉末（０．３５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を還流下で９０分間撹拌し、その後、室温に冷却した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル、９０：１０：０→９０：１０：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）により、表題化合物（１．０９ｇ、５０％）を淡黄色のオイルとして得た。Ｒｆ＝０．５８（シリカゲル、９０：１０：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）。［α］Ｄ＝−１１５°（ｃ  ２．００、ＥｔＯＨ）。ＩＲ（純物質）νｍａｘ＝２９６９、２９３９、２７７７、１７３０、１５９２、１１７８、１１５８、１０４２、８３１ｃｍ−１。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．７７（ｓ、１Ｈ）、８．３９（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０５（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、４．１４（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．４６〜３．３６（ｍ、１Ｈ）、３．３４〜３．２６（ｍ、１Ｈ）、３．００（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．３６〜２．２４（ｍ、２Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、２．０６〜１．９５（ｍ、１Ｈ）、１．９０〜１．８０（ｍ、１Ｈ）、１．７７〜１．６６（ｍ、１Ｈ）、１．２５（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７２．４、１４９．５、１４８．０、１４７．３、１３６．７、１２３．３、６５．６、６０．８、５７．０、４０．７、３４．７、３４．６、２６．８、２２．９、１４．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）計算値（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ２Ｈ＋［Ｍ＋Ｈ＋］）：２６３．１７５４、実測値：２６３．１７５５。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）ポジティブモード：２６３．２［Ｍ＋Ｈ＋］実測値。
【００６３】
Ｃ．（Ｓ）−３−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−４−イル）プロパンアミド（５）
【化７】
0006564396.tif 000008
【００６４】
４（５２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＮＨ４ＯＨ（０．５ｍＬ）に溶解した溶液を室温で８時間撹拌した。溶液を真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（シリカゲル、９０：１０：０→８０：２０：２のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）により、表題化合物（３５ｍｇ、７４％）を淡黄色のガラス状物として得た。Ｒｆ＝０．１７（シリカゲル、９０：１０：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ）。［α］Ｄ＝−１１０°（ｃ  １．１４、ＥｔＯＨ）。ＩＲ（純物質）νｍａｘ３１８２、２９５４、１６６４、１５９８、１４１１、１０３９、８３６ｃｍ−１。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６６（ｓ、１Ｈ）、８．３７（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０６（ｄ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．８６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、５．５２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．２４（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．１２〜２．９６（ｍ、２Ｈ）、２．５２（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．３３〜２．２１（ｍ、２Ｈ）、２．１７（ｓ、３Ｈ）、２．０１〜１．９２（ｍ、１Ｈ）、１．８７〜１．８０（ｍ、１Ｈ）、１．７３〜１．６５（ｍ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７４．０、１４９．８、１４８．１、１４８．０、１３６．５、１２３．６、６６．２、５７．１、４０．８、３６．１、３４．４、２７．０、２３．０。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）計算値（Ｃ１３Ｈ１９Ｎ３ＯＨ＋［Ｍ＋Ｈ＋］）：２３４．１６０１、実測値：２３４．１６０１。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）ポジティブモード：２３４．２［Ｍ＋Ｈ＋］実測値。
【００６５】
Ｄ．（Ｓ）−３−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−４−イル）プロパン−１−アミン（６、（−）−Ｎ４Ｎ）
【化８】
0006564396.tif 000009
【００６６】
５（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をトルエン（０．６５ｍＬ）に溶解した溶液をＲｅｄ−Ａｌ（トルエンにおける６５ｗｔ％、６４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ、４．５当量）で処理し、室温で９０分間撹拌した。緑色の反応液が得られた。セライト（１１ｍｇ）、Ｄａｒｃｏ  Ｇ−６０（６ｍｇ）およびＨ２Ｏ（１１０μＬ）を加え、混合物をろ過した。調製用薄層クロマトグラフィーによる精製（０．５ｍｍのシリカゲルプレート、４：１のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ−２％ＮＨ４ＯＨ、主バンドのＲｆ＝０．４）により、表題化合物（５．１ｍｇ、４９％）を淡黄色のオイルとして得た。Ｒｆ＝０．３８（シリカゲル、４：１のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ−２％ＮＨ４ＯＨ）。［α］Ｄ＝−１３９°（ｃ  １．２９、ＥｔＯＨ）。ＩＲ（純物質）νｍａｘ３３３２、３２３１、２９４４、２８７３、２３６１、１５９８、１５６０、１４６０、１３２０ｃｍ−１。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．６１（ｓ、１Ｈ）、８．２９（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．４７（ｔ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．２４（ｔ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．８５〜２．７４（ｍ、４Ｈ）、２．３８〜２．３２（ｍ、２Ｈ）、２．１８（ｓ、３Ｈ）、２．０１〜１．９３（ｍ、１Ｈ）、１．９１〜１．８６（ｍ、１Ｈ）、１．８５〜１．８０（ｍ、２Ｈ）、１．６８〜１．６２（ｍ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ１５１．６、１４９．４、１４８．１、１３８．４、１２５．６、６６．５、５７．９、４１．５、４０．８、３５．６、３２．８、２９．９、２３．５。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）計算値（Ｃ１３Ｈ２１Ｎ３Ｈ＋［Ｍ＋Ｈ＋］）：２２０．１８０８、実測値：２２０．１８０８。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）ポジティブモード：２２０．２［Ｍ＋Ｈ＋］実測値。
【００６７】
［実施例４］
ハプテン−キャリアコンジュゲートの調製
上記の実施例２（Ａ）におけるスクシニル化手順の後、（−）−Ｎ４Ｎ（６）および（−）−３’−ＡｍＮｉｃ（（−）−２）のそれぞれを別個に、３つのタンパク質（ＢＳＡ、ＦｌｉＣおよびＴＴ）に対してそれぞれコンジュゲート化した。最終的ハプテン−キャリアコンジュゲートのハプテン密度がおよそ３０〜４０であった。
【００６８】
免疫化および免疫アッセイ
概説。すべての動物飼育および使用が、ＮＩＨ指針に従って、かつ、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝７／群、２５ｇ〜３０ｇ）を所内の施設から得て、ワクチン群または生理的食塩水群に無作為に割り当てた。マウスには、免疫化スケジュール（これは、０日目、２１日目および４２日目での３回（１００μＬ）の皮下注射からなった）の期間中、食物および水を自由に摂取させた。２８日目および４９日目に、血清サンプルを尾静脈採血によって得た。６３日目に、動物に麻酔を施し、動物からの採血を心臓穿刺によって行い、動物を安楽死させた。
【００６９】
［実施例５］
免疫化
実施例２（Ａ）および実施例２（Ｂ）の手順の後、４つのハプテン−タンパク質コンジュゲート（（−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＦｌｉｃ、（−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＴＴ、（−）−３’−ＡｍＮｉｃ−ＳｕｃＦｌｉｃおよび（−）−３’−ＡｍＮｉｃ−ＳｕｃＴＴ）を調製し、その後、抗ニコチン抗体を誘発させるためのワクチン免疫原として評価した。それぞれのコンジュゲートをＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌおよびＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６とともに配合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目、２１日目および４２日目に皮下投与した。血液を、下記に例示されるように、２８日目、４９日目および６３日目に採取した。
【化９】
0006564396.tif 000010
【００７０】
［実施例６］
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ａ．３’−ＡｍＮｉｃコンジュゲート
ＥＬＩＳＡおよび交差反応ＥＬＩＳＡを、上記で記載されるＴＴコンジュゲートと類似した様式で調製される（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡまたは（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡのどちらかを使用して行った。ＥＬＩＳＡのために、血漿サンプルをそれらのそれぞれのハプテンに対して処理した。すなわち、（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群から得られるラット血漿を（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡプレートでアッセイし、（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群から得られるラット血漿を（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡプレートでアッセイした。
【００７１】
交差反応ＥＬＩＳＡのために、血漿サンプルをそれらの対掌体に対して処理した。すなわち、（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群から得られるラット血漿を（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡプレートでアッセイし、（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群から得られるラット血漿を（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡプレートでアッセイした。
【００７２】
ＥＬＩＳＡおよび交差反応ＥＬＩＳＡの結果が、（−）−３’−ＡｍＮｉｃおよび（−）−３’−ＡｍＮｉｃ由来抗原について下記の表１にまとめられる。採血２（４９日目）までに、力価がおよそ１００，０００であった。そのうえ、交差反応ＥＬＩＳＡの結果から、力価におけるおよそ３倍〜５倍の差が明らかにされ、このことは、上記２つの群のラットにおいて産生される血漿中の抗体が測定可能なレベルのエナンチオ識別を有することを示す。重要なことではあるが、（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群から得られる血漿は、（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＢＳＡによって示される天然型（−）−ニコチンに対する優れた結合能を有する。
【表１】
0006564396.tif 000011
【００７３】
Ｂ．同族抗原についての抗血清の特異性
（−）−Ｎ４Ｎ−ＳｕｃＢＳＡおよび（−）−３’−ＡｍＮｉｃ−ＳｕｃＢＳＡをＥＬＩＳＡのための被覆抗原として使用した。図３は、これら２つの被覆抗原に対して測定される、それぞれのワクチン群から得られる抗血清についての相対的なＥＬＩＳＡ力価を示す。
【００７４】
［実施例７］
放射免疫アッセイ
放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）は、可溶性リガンドについての平均結合親和性および平均抗体濃度を測定するための手段を提供する。リガンドは分析環境において可溶性であり、かつ、自由に会合／解離するので、ＲＩＡは、リガンドが、キャリアタンパク質（例えば、ＢＳＡ）にコンジュゲート化されるのは言うまでもなく、プレート表面に固定化されるＥＬＩＳＡを上回る大きな利点を提供する。したがって、ＲＩＡ実験において模擬される平衡環境の方が、タバコ使用期間中の血液および脳に分布する遊離ニコチンの環境にはるかによく似ている。この分野の研究者が、乱用ワクチン配合物の薬物の免疫原性効力を評価するためにＲＩＡを日常的に取り込むことは当然のことである。
【００７５】
ニコチン特異的な血漿中の抗体の結合親和性および抗体濃度を、Ｍｕｌｌｅｒ（４６）によって記載される手順の適合化を使用して競合的（ＲＩＡ）によって求めた。最初に、３Ｈ標識されたニコチンの約５０％と結合する血漿希釈度を求めた。その後、親和性定数を非標識ニコチンとの競合によって計算した。血漿サンプルは、上記の実施例５に記載されるそれぞれのワクチン群についてプールされたものであるので、測定された親和性定数はそれぞれの群についての平均親和性である。
【００７６】
図４に示されるように、平均結合親和性（Ｋｄａｖｇ）および平均抗ニコチン抗体濃度（［Ａｂ］ａｖｇ）が得られ、これらを下記の表２にした。採血２までに、［Ａｂ］ａｖｇにおけるおよそ４倍の差が（−）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群と（＋）−３’−ＡｍＮｉｃＳｕｃＴＴ群との間で認められた。採血２で認められる抗体濃度におけるこのおよそ４倍の差が採血３において維持される。ＥＬＩＳＡ／交差反応ＥＬＩＳＡの結果が力価における３倍〜５倍の差を示したことに注目することは驚異深いことであり、一方で、これら２つの免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ）の結果が互いに相関している。
【００７７】
（−）−群は、優れたＥＬＩＳＡ力価およびＲＩＡ抗体濃度を生じさせ、ほぼ４倍の差が期間中を通して認められた。驚くべきことに、親和性が（＋）−群において（−）−ニコチンについてはより大きかった。ＥＬＩＳＡ結果およびＲＩＡ結果の精査により、矛盾する解釈が示唆されるかもしれない。具体的には、ニコチンに対する結合親和性が、（＋）−ワクチンを受けたラットについては優れている（より低いＫｄａｖｇ）ことは、驚くべきことであるように思われる。言い換えれば、（＋）−群の血漿中の抗体は、（−）−ニコチンに対する結合親和性が（−）−群の血漿中の抗体よりもわずかに大きいようである。この特徴は、ヒト抗ニコチンｍＡｂが（−）−ニコチンよりもわずかに大きい親和性により（＋）−ニコチンと結合することを報告した他の研究者の知見（４７）と一致している。ついでながら、このｍＡｂ（Ｎｉｃ１２）は、第ＩＩ相で脱落した別の臨床評価されたニコチンワクチンであるＮｉｃＱβ（４８）に由来するものであった。
【００７８】
測定されたＫｄａｖｇ値についてのこの一見して直感に反する結果は、（コカインおよびヘロインとは異なって）ニコチンが、より大きい立体配座柔軟性を有することを念頭に置くことによって合理的に説明されるかもしれない。これは、ニコチンが、ただ１つだけの炭素−炭素結合を介してつながれる２つの複素環式環からなるからである。この柔軟性を考慮すると、ニコチンのどちらかのエナンチオマーが、抗体の結合部位との非常に重要な結合相互作用を行うために好適である適切な立体配座を取ることができる。ニコチンについて、これらには、水素結合アクセプターとして役立つピリジル窒素、ならびに、電荷−電荷相互作用および／またはカチオン−π相互作用に関わるピロリジニウム窒素が含まれる。
【００７９】
リンカーの結合もまた、抗ハプテン抗体の量および質を支配することにおいて役割を果たすことができる。他の実験では、モルヒネがそのＣ−３位を介してキャリアタンパク質にカップリングされるならば、コデイン（３−メチルモルヒネ）が、生じたモルヒネ抗血清の（モルヒネよりも）より効果的な阻害剤であることが示された（４９）。本研究では、ニコチンがピロリジン環の３’位を介してタンパク質キャリアに連結される。（＋）−３’−ＡｍＮｉｃコンジュゲートにおけるこの３’−連結では、抗体誘発が制約されることがあり、その結果、測定された抗ニコチン抗体が、（予想されるように）より少ない量でありながら、それにもかかわらず、（−）−３’−ＡｍＮｉｃコンジュゲートによって誘発される抗体よりもわずかに大きい親和性を遊離（−）−ニコチンに対して示すようになる。
【表２】
0006564396.tif 000012
【００８０】
平均抗体親和性と平均抗体濃度との間におけるこの一見した不一致を両立させるための手段として、本発明者らは、所与の抗血清プールについて［Ａｂ］ａｖｇ対Ｋｄａｖｇの比として定義される合成パラメーターＸの使用を提案する。ワクチン性能を改善するための２つの方法が、より大きい［Ａｂ］ａｖｇ値（抗体存在量）およびより低いＫｄａｖｇ値（抗体有用性）を引き出すことであると仮定すると、この場合、これらの項のどちらか／または／両方で改善がなされると、比（Ｘ）がより大きくなるであろう。したがって、採血３について、（−）−群のＸは０．４７であり、一方、（＋）−群のＸは０．２７である。目的は、所与のリガンド標的のためにタンパク質設計（「抗体効率」）を最適化することである（しかし、逆のことが医薬品化学では広く適用されており、所与のタンパク質標的のためにリガンド設計（例えば、「リガンド効率」）を最適化する。）。したがって、比（Ｘ）は、抗体効率を評価するための、ひいてはワクチン効率を評価するための手段である。
【００８１】
上記データは、ワクチン設計におけるキラリティーの重要性を明らかにしており、具体的には、小分子が、（−）−コカイン、（−）−ヘロイン、（−）−ニコチン、または、他のどのような標的であれ、小分子の天然型の立体化学を模倣することの重要性を明らかにしている。リガンドとしてのニコチンは、おそらくはニコチン自体の立体配座の柔軟性のために、抗ニコチン抗体の結合部位の内部において様々な配向で結合することができるので、ニコチンの場合には、リンカー設置と同様に、ワクチン設計はより大きな意味合いを有する。それに反して、コカインまたはヘロインにおけるさらなる構造的制約はより大きい立体配座の剛直性を強いており、非天然型エナンチオマーに対する天然型エナンチオマーに対しての抗体の相対的結合親和性については驚くに当たらない結果が認められる。
【００８２】
［実施例８］
抗侵害受容アッセイ
本実施例の目的は、マウスがホットプレートから足を引っ込める潜伏期を測定することによって、ニコチンワクチンの拮抗作用を上記で記載されるようにニコチンに対して明らかにすることである。
【００８３】
４つの試験群のマウスを４つのワクチンによりそれぞれ、かつ、上記において実施例５で記載されるような免疫化スケジュールに従って免疫化した。第５のワクチン無感作群のマウスは生理的食塩水の注入を免疫化スケジュールの期間中に受けた。その後、５つすべての群のマウスにニコチンが投与され、その後、マウスをホットプレートでアッセイして、ホットプレートからの足の引っ込みが測定される潜伏期を測定した。
【００８４】
それぞれのニコチンワクチンについての抗侵害受容を最大可能効果の百分率（「％ＭＰＥ」）として表した。％ＭＰＥ＝（試験−ベースライン）／（カットオフ−ベースライン）×１００、式中、「試験」は、処置後の応答までの潜伏期であり、「ベースライン」は、処置前の応答までの潜伏期であり、「カットオフ」は、応答がない場合に試験を終わらせた事前設定された時間である。ベースライン測定を上記の免疫化スケジュールに先立って５つの群においてそれぞれの動物について得た。
【００８５】
結果が図５にまとめられ、図５には、対象マウス群においてニコチンの鎮痛効果を打ち消すことにおける、ニコチンワクチンの効力が、生理的食塩水に対して示される。
【００８６】
［実施例８］
低体温アッセイ
上記において実施例７で記載される５つの群におけるマウスの体温を、ニコチン投与後１０分、３０分および６０分で測定した。４つの試験されたニコチンワクチンは、ニコチンの影響を、最も顕著な体温低下を経験した生理的食塩水コントロール群と比較して体温低下を抑制することによって打ち消した。結果が表６にまとめられる。
【００８７】
引用文献
（１）世界保健機関。ＷＨＯ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ、２０１１；Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２０１１。
【００８８】
（２）アメリカ合衆国保健福祉省。Ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｓｍｏｋｉｎｇ−５０  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ：Ａ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ；Ａｔｌａｎｔａ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｎ  Ｓｍｏｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ、２０１４。
【００８９】
（３）Ａｕｂｉｎ，Ｈ．Ｊ．；Ｋａｒｉｌａ，Ｌ．；Ｒｅｙｎａｕｄ，Ｍ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ：ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１１、１７、１３４３−５０。
【００９０】
（４）Ｈａｒｍｅｙ，Ｄ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｒ．；Ｋｅｎｎｙ，Ｐ．Ｊ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ｔｏｂ．Ｒｅｓ．、２０１２、１４、１３００−１８。
【００９１】
（５）Ａｕｂｉｎ，Ｈ．Ｊ．；Ｌｕｑｕｉｅｎｓ，Ａ．；Ｂｅｒｌｉｎ，Ｉ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ：ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１４、７７、３２４−３６。
【００９２】
（６）Ｈａｙｓ，Ｊ．Ｔ．；Ｅｂｂｅｒｔ，Ｊ．Ｏ．、Ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ、Ｄｒｕｇｓ、２０１０、７０、２３５７−７２。
【００９３】
（７）Ｇｏｒｅｌｉｃｋ，Ｄ．Ａ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｏｖｅｒｄｏｓｅ  ａｎｄ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１２、４、２２７−４３。
【００９４】
（８）Ｈａｔｓｕｋａｍｉ，Ｄ．Ｋ．；Ｒｅｎｎａｒｄ，Ｓ．；Ｊｏｒｅｎｂｙ，Ｄ．；Ｆｉｏｒｅ，Ｍ．；Ｋｏｏｐｍｅｉｎｅｒｓ，Ｊ．；ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．；Ｈｏｒｗｉｔｈ，Ｇ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｍｏｋｅｒｓ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００５、７８、４５６−６７。
【００９５】
（９）Ｗａｇｅｎａ，Ｅ．Ｊ．；ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．；Ｈｏｒｗｉｔｈ，Ｇ．；ｖａｎ  Ｓｃｈａｙｃｋ，Ｃ．Ｐ．、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｍｏｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｍｏｋｅｒｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  １／２  ｔｒｉａｌ、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ｔｏｂ．Ｒｅｓ．、２００８、１０、２１３−８。
【００９６】
（１０）Ｈａｔｓｕｋａｍｉ，Ｄ．Ｋ．；Ｊｏｒｅｎｂｙ，Ｄ．Ｅ．；Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｄ．；Ｒｉｇｏｔｔｉ，Ｎ．Ａ．；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅ．Ｄ．；Ｏｎｃｋｅｎ，Ｃ．Ａ．；Ｔａｓｈｋｉｎ，Ｄ．Ｐ．；Ｒｅｕｓ，Ｖ．Ｉ．；Ａｋｈａｖａｉｎ，Ｒ．Ｃ．；Ｆａｈｉｍ，Ｒ．Ｅ．；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．；Ｎｉｋｎｉａｎ，Ｍ．；Ｋａｌｎｉｋ，Ｍ．Ｗ．；Ｒｅｎｎａｒｄ，Ｓ．Ｉ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｍｏｋｉｎｇ−ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１１、８９、３９２−９。
【００９７】
（１１）Ｈｏｏｇｓｔｅｄｅｒ，Ｐ．；Ｋｏｔｚ，Ｄ．；Ｖｉｅｃｈｔｂａｕｅｒ，Ｗ．；Ｂｒａｕｅｒ，Ｒ．；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｐ．；Ｋａｌｎｉｋ，Ｍ．；Ｆａｈｉｍ，Ｒ．；Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｐ．Ｖ．；Ｓｃｈａｙｃｋ，Ｏ．Ｖ．、Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＮｉｃＶＡＸ（Ｒ））  ｏｒ  ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ（Ｃｈａｍｐｉｘ（Ｒ））  ｆｏｒ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩｂ，ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ、ＢＭＣ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、２０１２、１２、１０５２。
【００９８】
（１２）Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｎｏｕｎｃｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｆｉｒｓｔ  ＮｉｃＶＡＸ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ：ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｅｄ  ｔｏ  ｍｅｅｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ、Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｊｕｌｙ  １８、２０１１。
【００９９】
（１３）Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｎｏｕｎｃｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄ  ＮｉｃＶＡＸ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ：ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｅｄ  ｔｏ  ｍｅｅｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ、Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ７、２０１１。
【０１００】
（１４）Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｐｈａｓｅ  １  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＳＥＬ−０６８，ａ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｃｌａｓｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２１、２０１１。
【０１０１】
（１５）Ｐｉｔｔｅｔ，Ｌ．；Ａｌｔｒｅｕｔｅｒ，Ｄ．；Ｉｌｙｉｎｓｋｉｉ，Ｐ．；Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．；Ｇａｏ，Ｙ．；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｓ．；Ｋｅｅｇａｎ，Ｍ．；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｌ．；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＥＬ−０６８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ｔＳＶＰ（ＴＭ））  ｆｏｒ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２、１８８。
【０１０２】
（１６）Ｌｏｃｋｎｅｒ，Ｊ．Ｗ．；Ｈｏ，Ｓ．Ｏ．；ＭｃＣａｇｕｅ，Ｋ．Ｃ．；Ｃｈｉａｎｇ，Ｓ．Ｍ．；Ｄｏ，Ｔ．Ｑ．；Ｆｕｊｉｉ，Ｇ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２０１３、２３、９７５−８。
【０１０３】
（１７）ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｒｙｄｅ，Ｄ．Ｃ．；Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｓｔｅａｄ，Ｄ．Ｒ．；Ｚｈａｎｇ，Ｎ．；Ｂｅｎｏｉｔ，Ｍ．；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｉ．Ｊ．；Ｔｈａｒｍａｎａｔｈａｎ，Ｔ．；Ｍｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ３’ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｎｉｃｏｔｉｎｅ−ＤＴ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ＣｐＧ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１３、１６、５０−５６。
【０１０４】
（１８）Ｃｈｅｎ，Ｘ．；Ｐｒａｖｅｔｏｎｉ，Ｍ．；Ｂｈａｙａｎａ，Ｂ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｗｕ，Ｍ．Ｘ．、Ｈｉｇｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｓａｆｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１２。
【０１０５】
（１９）Ｋｅｙｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｒｏｉｋｏ，Ｓ．Ａ．；Ｅａｒｌｅｙ，Ｃ．Ａ．；Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｍ．Ｐ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、８、１５８９−９４。
【０１０６】
（２０）Ｐｒａｖｅｔｏｎｉ，Ｍ．；Ｋｅｙｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｐｉｄａｐａｒｔｈｉ，Ｒ．Ｒ．；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｆ．Ｉ．；Ｒｕｎｙｏｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｍ．Ｐ．；Ｅａｒｌｅｙ，Ｃ．Ａ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１２、８３、５４３−５０。
【０１０７】
（２１）ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｓ．Ｈ．；Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｋ．Ｅ．；Ｔｒｏｓｋａ，Ａ．Ｊ．；Ｐｒａｖｅｔｏｎｉ，Ｍ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ａ  ｄｏｓｅ−ｍａｔｃｈｅｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｈｅｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｕｍ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１３、３１、６１８５−９３。
【０１０８】
（２２）Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｋ．Ｅ．；ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｓ．Ｈ．；Ｐｒａｖｅｔｏｎｉ，Ｍ．；Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｉｆｆｅｒ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１３、８、ｅ８２５５７。
【０１０９】
（２３）Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｎ．、Ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８１、１８、７５１−６３。
【０１１０】
（２４）Ｎｏｗａｋ，Ｍ．Ａ．、Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ：Ａ  ｔｈｅｏｒｙ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ、Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９６、７、８３−９２。
【０１１１】
（２５）Ｌａｎｇｍａｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、３７、５５５−６１。
【０１１２】
（２６）Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ａ．；Ｂａｕｄｎｅｒ，Ｂ．Ｃ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．；Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｄ．Ｔ．、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｇｌｏｂ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１１、３、６３−７２。
【０１１３】
（２７）Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｊ．；Ｗａｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．；Ｇｅｏｒｇｅ，Ｒ．Ｃ．；Ｓｌａｃｋ，Ｍ．Ｐ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．、Ｉｍｐａｃｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ２３−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｉｎ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１２、３０、６８０２−８。
【０１１４】
（２８）Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｋ．；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｅｅｒ，Ｊ．、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｉｃ  ｉｓｏｍｅｒｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２８、４８、３１５−２０。
【０１１５】
（２９）Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｋ．、Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ：Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１９３６。
【０１１６】
（３０）Ｎａｐｐｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ａ  ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７、２３７、１０４１−３。
【０１１７】
（３１）Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．；Ｎａｐｐｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｍｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、５３５５−８。
【０１１８】
（３２）Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．；Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒ  ｏｒ  Ｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４、４３７−４０。
【０１１９】
（３３）Ｂｊｅｒｃｋｅ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｏｏｋ，Ｇ．；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｎ．；Ｇｊｉｋａ，Ｈ．Ｂ．；Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ，Ｈ．；Ｌａｎｇｏｎｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｔｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８６、９０、２０３−１３。
【０１２０】
（３４）Ｐａｕｌａ，Ｓ．；Ｔａｂｅｔ，Ｍ．Ｒ．；Ｆａｒｒ，Ｃ．Ｄ．；Ｎｏｒｍａｎ，Ａ．Ｂ．；Ｂａｌｌ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｒ．、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｃａｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４、４７、１３３−４２。
【０１２１】
（３５）Ｔｒｅｗｅｅｋ，Ｊ．Ｂ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｊ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍａｎｉｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｃａｉｎｅ  ｏｖｅｒｄｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．、２０１１、９８、４７４−８４。
【０１２２】
（３６）Ｔｒｅｗｅｅｋ，Ｊ．Ｂ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ａｎ  ａｎｔｉｄｏｔｅ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｃａｉｎｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１２、９、９６９−７８。
【０１２３】
（３７）Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｓ．；Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｐ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ：ｈａｐｔｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１、６６、４１１５−２１。
【０１２４】
（３８）Ｍｅｉｊｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．；Ａｌｔｏｂｅｌｌ，Ｌ．Ｊ．，３ｒｄ；Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｐ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｈａｐｔｅｎｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００３、１２５、７１６４−５。
【０１２５】
（３９）Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｙ．；Ａｚａｒ，Ｍ．Ｒ．；Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ａ．；Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．；Ｋｏｏｂ，Ｇ．Ｆ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｍｏｄｅｌ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１０、７、４３１−４１。
【０１２６】
（４０）Ｐｅｎｔｅｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｍａｌｉｎ，Ｄ．Ｈ．；Ｅｎｎｉｆａｒ，Ｓ．；Ｈｉｅｄａ，Ｙ．；Ｋｅｙｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｌａｋｅ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｂａｓｈａｍ，Ｌ．Ｅ．；Ｃｏｙ，Ｒ．Ｔ．；Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｗ．；Ｎａｓｏ，Ｒ．；Ｆａｔｔｏｍ，Ａ．、Ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．、２０００、６５、１９１−８。
【０１２７】
（４１）Ｐｒｙｄｅ，Ｄ．Ｃ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｈ．；Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｓｔｅａｄ，Ｄ．Ｒ．；Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｄ．；Ｃｏｅ，Ｊ．Ｗ．；Ｂａｄｌａｎｄ，Ｍ．；Ｂｅａｌ，Ｄ．Ｍ．；Ｇｌｅｎ，Ｒ．；Ｗｈａｒｔｏｎ，Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．；Ｚｈａｎｇ，Ｎ．；Ｂｅｎｏｉｔ，Ｍ．；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｋ．；Ｍｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１３、８、ｅ７６５５７。
【０１２８】
（４２）Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．；Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．；Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｊ．；Ｔｙｇｒｅｔｔ，Ｌ．；Ｓｃｈｏｒｒ，Ｊ．；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．、ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０−６。
【０１２９】
（４３）Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．；Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．Ｄ．；Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．；Ｐａｙｅｔｔｅ，Ｐ．；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｓ．；Ｓｕｐａｒｔｏ，Ｉ．；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｗ．Ｌ．；Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．；Ｓａｊｕｔｈｉ，Ｄ．；Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．、Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣｐＧ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６４、１６１７−２４。
【０１３０】
（４４）Ｂｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｔ．；Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｅ．；Ｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．、Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｒｏｕｔｅ  ａｎｄ  ＴＬＲ９  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐａｃｔ  ｈｅｒｏｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１４、１１、１０７５−８０。
【０１３１】
（４５）Ｃｅｒｖｉ，Ｌ．；Ｂｏｒｇｏｎｏｖｏ，Ｊ．；Ｅｇｅａ，Ｍ．；Ｃｈｉａｐｅｌｌｏ，Ｌ．；Ｍａｓｉｈ，Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  ｕｓｉｎｇ  ｃｒｕｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｏｒ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２００４、９７、９７−１０４。
【０１３２】
（４６）Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｈａｐｔｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８３、９２、５８９−６０１。
【０１３３】
（４７）Ｔａｒｓ，Ｋ．；Ｋｏｔｅｌｏｖｉｃａ，Ｓ．；Ｌｉｐｏｗｓｋｙ，Ｇ．；Ｂａｕｅｒ，Ｍ．；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｐ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１２、４１５、１１８−１２７。
【０１３４】
（４８）Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．；Ｂａｕｅｒ，Ｍ．；Ｂｕｓｅｒ，Ｒ．Ｂ．；Ｇｗｅｒｄｅｒ，Ｍ．；Ｍｕｎｔｗｉｌｅｒ，Ｓ．；Ｍａｕｒｅｒ，Ｐ．；Ｓａｕｄａｎ，Ｐ．；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｐｌａｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００８、１０５、１４３３６−４１。
【０１３５】
（４９）Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｗ．、Ｍｏｒｐｈｉｎｅ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７０、１６８、１３４７−８。
【０１３６】
本明細書中で参照されるすべての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物が、その全体において参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されていたかのようなのと同じ程度に参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１３７】
用いられている用語および表現は、説明する用語として使用され、限定する用語としては使用されず、また、そのような用語および表現の使用では、示される特徴および記載される特徴またはそれらの一部分のどのような均等物をも除外するという意図はなく、しかし、様々な改変が、請求項に記載される発明の範囲内において可能であることが認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態および場合に応じた特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示される概念の様々な改変および変化が当業者によって用いられ得ること、そして、そのような改変および変化は、添付された請求項によって定義されるような本発明の範囲の範囲内であると見なされることが理解されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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