(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変Ｃ５遺伝子を形成するために、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、齧歯類Ｃ５遺伝子配列の、ヒトＣ５遺伝子配列での置き換えを含む齧歯類であって、前記改変Ｃ５遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にあり、前記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含む、齧歯類。
【請求項２】
マウスまたはラットである、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項３】
前記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含む、請求項１または２に記載の齧歯類。
【請求項４】
前記齧歯類が、マウスであり、置き換えられる前記齧歯類遺伝子配列が、マウスＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含み、前記改変Ｃ５遺伝子が、内因性マウスＣ５遺伝子のコーディングエクソン１、およびヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含む、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項５】
マウスＣ５タンパク質を発現することができないマウスである、請求項１から４のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項６】
内因性マウスＣ３遺伝子によりコードされるマウスＣ３タンパク質を発現するマウスである、請求項１から５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項７】
内因性マウスＣ３遺伝子座において、マウスＣ３遺伝子配列の、ヒトＣ３遺伝子の１つまたは複数のエクソンを含むヒトＣ３遺伝子配列での置き換えを含むマウスである、請求項１から５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項８】
改変Ｃ３遺伝子を形成するために、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、齧歯類Ｃ３遺伝子配列の、ヒトＣ３遺伝子配列での置き換えを含む齧歯類であって、
（ｉ）前記改変Ｃ３遺伝子が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子のコーディングエクソン１およびヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含み、前記改変Ｃ３遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にあるか、または
（ｉｉ）前記改変Ｃ３遺伝子が、ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含む、齧歯類。
【請求項９】
マウスまたはラットである、請求項８に記載の齧歯類。
【請求項１０】
マウスＣ３タンパク質を発現することができないマウスである、請求項８に記載の齧歯類。
【請求項１１】
前記齧歯類が、改変Ｃ５遺伝子を形成するために、内因性マウスＣ５遺伝子座において、マウスＣ５遺伝子配列の、ヒトＣ５遺伝子配列での置き換えを含むマウスであり、前記改変Ｃ５遺伝子の発現が、前記内因性マウスＣ５遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、請求項８または１０に記載の齧歯類。
【請求項１２】
マウスであって、マウスのゲノムが、
改変Ｃ５遺伝子を形成するための、内因性マウスＣ５遺伝子座における、マウスＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むマウスＣ５遺伝子配列の、ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むヒトＣ５遺伝子配列での置き換えであって、前記改変Ｃ５遺伝子配列が、前記内因性マウスＣ５遺伝子座においてマウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、置き換え、および
（ｉ）改変Ｃ３遺伝子を形成するための、内因性マウスＣ３遺伝子座における、マウスＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含むマウスＣ３遺伝子配列の、ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含むヒトＣ３遺伝子配列での置き換え、または
（ｉｉ）改変Ｃ３遺伝子を形成するための、内因性マウスＣ３遺伝子座における、マウスＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むマウスＣ３遺伝子配列の、ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むヒトＣ３遺伝子配列での置き換え
を含み、前記改変Ｃ３遺伝子が、前記内因性マウスＣ３遺伝子座においてマウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、マウス。
【請求項１３】
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、齧歯類Ｃ５遺伝子配列を、ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むヒトＣ５遺伝子配列で置き換えて、改変Ｃ５遺伝子を形成するステップを含み、前記改変Ｃ５遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
【請求項１４】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換える前記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記齧歯類が、マウスであり、置き換えられる前記齧歯類Ｃ５遺伝子配列が、マウスＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含み、前記改変Ｃ５遺伝子が、内因性マウスＣ５遺伝子のコーディングエクソン１、およびヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置き換えが、前記ヒトＣ５遺伝子配列を齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入するステップ、ヒト化齧歯類ＥＳ細胞を得るステップであって、前記細胞において、前記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座における前記齧歯類Ｃ５遺伝子配列が、前記ヒトＣ５遺伝子配列によって置き換えられている、ステップ、そして前記ヒト化齧歯類ＥＳ細胞を用いてヒト化齧歯類を作製するステップにより達成される、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、
（ｉ）内因性マウスＣ３遺伝子座において、マウスＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含むマウスＣ３遺伝子配列を、ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１を含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換えて、改変Ｃ３遺伝子を形成するステップ、または
（ｉｉ）内因性マウスＣ３遺伝子座において、マウスＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むマウスＣ３遺伝子配列を、ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換えて、改変Ｃ３遺伝子を形成するステップ
を含み、前記改変Ｃ３遺伝子が、前記内因性マウスＣ３遺伝子座においてマウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
【請求項１９】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記齧歯類がマウスであり、前記置き換えが、前記ヒトＣ３遺伝子配列をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入するステップ、ヒト化マウスＥＳ細胞を得るステップであって、前記細胞において、内因性マウスＣ３遺伝子座におけるマウスＣ３遺伝子配列が、前記ヒトＣ３遺伝子配列によって置き換えられている、ステップ、そして前記ヒト化マウスＥＳ細胞を用いてヒト化マウスを作製するステップにより達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するための方法であって、
ａ．請求項１から１１のいずれか一項に記載の齧歯類または請求項１２に記載のマウスに前記化合物を投与するステップと、
ｂ．前記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかをアッセイし、それにより、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記化合物が、小分子化学化合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、抗体またはタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、阻害性核酸である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８８，５８１号および２０１４年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０６７，８３６号（これら各々の開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本明細書には、ヒト配列を含むＣ３タンパク質および／またはＣ５タンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物、ならびに全体的にまたは部分的にヒトのものであるＣ３および／またはＣ５遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物が開示されている。本明細書には、ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５タンパク質を発現する非ヒト動物、ならびにヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５核酸配列を含む非ヒト動物を使用するための方法も開示されている。
【背景技術】
【０００３】
補体タンパク質Ｃ５およびＣ３は、補体活性化に関連する種々のヒト疾患、障害および状態、例えば、眼の炎症性疾患および網膜変性疾患を処置するための治療標的である。ヒトＣ５またはヒトＣ３タンパク質を特異的に標的化する治療用分子の薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）評価は、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットにおいて常套的に実施されている。しかし、そのような治療用分子のＰＤは、ある特定の非ヒト動物では、これらの治療用分子が内因性Ｃ５またはＣ３タンパク質を標的化しないので、適正に決定することができない。
【０００４】
さらに、活性化された補体系に関連する疾患の種々の非ヒト動物モデルにおけるヒト特異的Ｃ５またはＣ３タンパク質アンタゴニストの治療有効性の評価は、そのような種特異的なアンタゴニストが内因性Ｃ５またはＣ３タンパク質と相互作用しない非ヒト動物では問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、非ヒト動物のＣ５および／またはＣ３遺伝子が、全体的にもしくは部分的にヒト化されたものである、または（例えば、内因性非ヒト遺伝子座において）それぞれヒトもしくはヒト化Ｃ５および／もしくはＣ３タンパク質をコードする配列を含むヒトＣ５および／もしくはＣ３遺伝子で置き換えられている、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えば、マウス動物、例えば、マウスまたはラットが必要とされている。血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を、それぞれ、機能的なＣ５および／またはＣ３タンパク質を発現するが、それぞれヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３遺伝子を含まない齢数を釣り合わせた非ヒト動物の血清中に存在するＣ５および／またはＣ３タンパク質の濃度と同様の濃度で発現するヒト化非ヒト動物が必要とされている。
【０００６】
本明細書全体を通して、種々の特許、特許出願および他の種類の刊行物（例えば、学術論文、電子データベースエントリーなど）が参照されている。本明細書において引用されている全ての特許、特許出願、および他の刊行物の開示は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ヒト配列を含むＣ３および／またはＣ５をコードする核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【０００８】
全体的にまたは部分的にヒトのものであるＣ３および／またはＣ５遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【０００９】
ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５タンパク質を発現する非ヒト動物が提供される。
【００１０】
内因性非ヒト動物Ｃ５および／またはＣ３遺伝子の置き換え（全体的にまたは部分的に）を有する非ヒト動物が提供される。
【００１１】
内因性非ヒトＣ５および／またはＣ３遺伝子座においてＣ５および／またはＣ３ヒト化（全体的にまたは部分的に）を含む非ヒト動物が提供される。
【００１２】
ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３遺伝子を有する非ヒト動物であって、内因性Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を発現せず、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を、それぞれ、機能的内因性Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を発現するが置き換えは含まない齢数を釣り合わせた非ヒト動物の血清中に存在するＣ５および／またはＣ３タンパク質の濃度と同様の濃度で発現する非ヒト動物が提供される。
【００１３】
一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【００１４】
一態様では、内因性Ｃ５および／またはＣ３遺伝子座においてヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質をコードする内因性Ｃ５および／またはＣ３遺伝子の置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において内因性Ｃ５遺伝子のヒトＣ５遺伝子での置き換えを含み、かつ／または、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において内因性Ｃ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子での置き換えを含む齧歯類、例えばマウスまたはラットが提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００１５】
一態様では、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、Ｃ５タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子での置き換えを含む遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットであって、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００１６】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子は、ヒトＣ５遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。
【００１７】
一実施形態では、齧歯類は、マウスＣ５タンパク質を発現することができないマウスである。
【００１８】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ３遺伝子によりコードされるマウスＣ３タンパク質を発現するマウスである。
【００１９】
一実施形態では、齧歯類は、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現するマウスである。
【００２０】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ３遺伝子座において、Ｃ３タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子での置き換えを含むマウスである。
【００２１】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子の発現は、内因性マウスＣ３遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある。
【００２２】
一態様では、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、Ｃ３タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子での置き換えを含む遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットであって、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００２３】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。
【００２４】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。
【００２５】
一実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現することができないマウスである。
【００２６】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によりコードされるマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。
【００２７】
一実施形態では、齧歯類は、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現するマウスである。
【００２８】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子座において、Ｃ５タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子での置き換えを含むマウスである。
【００２９】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子の発現は、内因性マウスＣ５遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある。
【００３０】
一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットであって、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する齧歯類が正常な補体系を含む、例えば、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルが機能的内因性Ｃ５タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルと同様である、齧歯類が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３１】
一態様では、ヒトＣ５遺伝子に由来するＣ５タンパク質を発現し、その血清中にヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットが提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３２】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する齧歯類の血清のＣ５タンパク質のレベルは、機能的内因性Ｃ５タンパク質を発現する齧歯類、例えば、野生型マウスまたはラットのものとほぼ同じである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３３】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を、機能的内因性Ｃ５タンパク質を発現するが内因性マウスＣ５遺伝子座において内因性Ｃ５遺伝子のヒトＣ５遺伝子での置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するＣ５タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％の濃度で発現する。
【００３４】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を、機能的内因性Ｃ５タンパク質を発現するが内因性マウスＣ５遺伝子座において内因性Ｃ５遺伝子のヒトＣ５遺伝子での置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ５タンパク質のレベルの約１０％から約２００％の間、約２０％から約１５０％の間、または約３０％から約１００％の間の濃度で発現する。
【００３５】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を、約１０μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの間、約１０μｇ／ｍｌから約１２５μｇ／ｍｌの間、または約１５μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの間の濃度で発現する。
【００３６】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５または１５０μｇ／ｍｌの濃度で発現する。
【００３７】
一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットであって、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類が正常な補体系を含む、すなわち、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルが、機能的内因性Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルと同様である、齧歯類が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３８】
一態様では、ヒトＣ３遺伝子に由来するＣ３タンパク質を発現し、その血清中にヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する遺伝子改変された齧歯類、例えばマウスまたはラットが提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３９】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血清のＣ３タンパク質のレベルは、機能的内因性Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類、例えば、野生型マウスまたはラットのものとほぼ同じである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４０】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質（ｈＣ３）を、機能的内因性Ｃ３タンパク質を発現するが内因性マウスＣ３遺伝子座において内因性Ｃ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子での置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するＣ３タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％の濃度で発現する。
【００４１】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトＣ３タンパク質を、機能的内因性Ｃ３タンパク質を発現するが内因性マウスＣ３遺伝子座において内因性Ｃ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子での置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ３タンパク質のレベルの約１０％から約２００％の間、約２０％から約１５０％の間、または約３０％から約１００％の間の濃度で発現する。
【００４２】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を、約１００μｇ／ｍｌから約１５００μｇ／ｍｌの間、約２００μｇ／ｍｌから約１２５０μｇ／ｍｌの間、または約３００μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌの間の濃度で発現する。
【００４３】
一実施形態では、マウスは、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０または１５００μｇ／ｍｌの濃度で発現する。
【００４４】
一態様では、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、Ｃ５タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子での置き換えを含むヒトＣ５遺伝子を含む遺伝子改変された齧歯類であって、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にあり、齧歯類が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、Ｃ３タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子での置き換えを含むヒトＣ３遺伝子をさらに含み、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にある、遺伝子改変された齧歯類が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４５】
一実施形態では、マウスは、マウスＣ５タンパク質を発現することができず、マウスＣ３タンパク質を発現することができない。
【００４６】
一実施形態では、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座および／または齧歯類Ｃ３遺伝子座における齧歯類制御エレメントまたは配列は、マウスまたはラット由来である。
【００４７】
一実施形態では、齧歯類Ｃ５遺伝子座および／または齧歯類Ｃ３遺伝子座における齧歯類制御エレメントまたは配列は、マウスまたはラット由来である。
【００４８】
一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を発現する非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットであって、ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質が内因性非ヒトＣ５遺伝子座および／または内因性非ヒトＣ３遺伝子座から発現する、非ヒト動物が提供される。ある実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。ある実施形態では、齧歯類はマウスである。ある実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４９】
一態様では、内因性マウスＣ５遺伝子座からヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質が発現する遺伝子改変マウスであって、内因性マウスＣ５遺伝子がヒトＣ５遺伝子で全体的にまたは部分的に置き換えられている遺伝子改変マウスが提供される。
【００５０】
一実施形態では、内因性マウスＣ５遺伝子座において、エクソン２から４２までおよび３’非翻訳配列を含む約７５．８ｋｂを欠失させ、ヒトＣ５遺伝子のエクソン２から４１を含むヒトＣ５遺伝子配列の約９７ｋｂで置き換える。特定の実施形態では、ヒトＣ５遺伝子は、ヒトＢＡＣ  ＣＴＤ−２５５９Ｉ１９のヒトＣ５遺伝子のエクソン２から４２を含む。特定の実施形態では、Ｃ５遺伝子は、マウスＣ５エクソン１およびヒトＣ５エクソン２から４２を含む。
【００５１】
一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスであって、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列で、内因性マウスＣ５タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列が全体的にまたは部分的に置き換えられている、遺伝子改変マウスが提供される。
【００５２】
一態様では、内因性マウスＣ３遺伝子座からヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する遺伝子改変マウスであって、内因性マウスＣ３遺伝子がヒトＣ３遺伝子で全体的にまたは部分的に置き換えられている遺伝子改変マウスが提供される。
【００５３】
一実施形態では、エクソン１からエクソン４１までの上流の５’制御エレメントを含む内因性マウスＣ３遺伝子座の一部を欠失させ、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１までの上流の５’制御エレメントを含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換える。特定の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子は、ヒトＣ３コード領域全体を含む。
【００５４】
一実施形態では、イントロン１の一部およびエクソン２から４１を含む内因性マウスＣ３遺伝子座の一部を欠失させ、ヒトＣ３遺伝子のイントロン１の一部およびエクソン２からエクソン４１を含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換える。特定の実施形態では、Ｃ３遺伝子は、マウスＣ３エクソン１およびヒトＣ３エクソン２から４１を含む。
【００５５】
一態様では、ヒト化Ｃ５齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類Ｃ５タンパク質をコードする齧歯類Ｃ５遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ５遺伝子配列で置き換えるステップを含む方法が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００５６】
一実施形態では、置き換えは内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ５遺伝子配列は、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００５７】
一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、マウスに由来する。一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、ラットに由来する。
【００５８】
一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、齧歯類Ｃ５遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００５９】
一実施形態では、齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換えるヒトＣ５遺伝子配列は、ヒトＣ５遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換えるヒトＣ５遺伝子配列は、ヒトＣ５遺伝子配列の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換えるヒトＣ５遺伝子配列は、ヒトＣ５遺伝子配列の４１個のエクソン全てを含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６０】
一実施形態では、置き換えは内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ５遺伝子配列は、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００６１】
一態様では、ヒト化Ｃ５マウスを作製するための方法であって、マウスＣ５タンパク質をコードするマウスＣ５遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列で置き換えるステップを含む方法が提供される。
【００６２】
一実施形態では、置き換えは内因性マウスＣ５遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子は、内因性マウスＣ５遺伝子座においてマウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００６３】
一実施形態では、置き換えは内因性マウスＣ５遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子は、内因性マウスＣ５遺伝子座において内因性マウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００６４】
一態様では、ヒト化Ｃ３齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類Ｃ３タンパク質をコードする齧歯類Ｃ３遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換えるステップを含む方法が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６５】
一実施形態では、置き換えは内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ３遺伝子配列は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６６】
一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、マウスに由来する。一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、ラットに由来する。
【００６７】
一実施形態では、齧歯類制御エレメントまたは配列は、齧歯類Ｃ３遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６８】
一実施形態では、齧歯類Ｃ３遺伝子配列を置き換えるヒトＣ３遺伝子配列は、ヒトＣ３遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類Ｃ３遺伝子配列を置き換えるヒトＣ３遺伝子配列は、ヒトＣ３遺伝子配列の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換えるヒトＣ３遺伝子配列は、ヒトＣ３遺伝子配列の４１個のエクソン全てを含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６９】
一実施形態では、置き換えは内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ３遺伝子配列は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００７０】
一態様では、ヒト化Ｃ３マウスを作製するための方法であって、マウスＣ３タンパク質をコードするマウスＣ３遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列で置き換えるステップを含む方法が提供される。
【００７１】
一実施形態では、置き換えは内因性マウスＣ３遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子は、内因性マウスＣ３遺伝子座において内因性マウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００７２】
一実施形態では、置き換えは内因性マウスＣ３遺伝子座におけるものであり、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子は、内因性マウスＣ３遺伝子座においてマウス制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している。
【００７３】
種々の態様では、本明細書に記載の遺伝子改変された非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットは、それらの生殖細胞系に遺伝子改変を含む。
【００７４】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットの胚が提供される。
【００７５】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含むドナー細胞を含む非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットの宿主胚が提供される。
【００７６】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む多能性または全能性非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットの細胞が提供される。一実施形態では、細胞は齧歯類細胞である。一実施形態では、細胞はマウス細胞である。一実施形態では、細胞は齧歯類ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はマウスＥＳ細胞である。
【００７７】
一態様では、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットの卵が提供され、非ヒト動物の卵は、異所性非ヒト動物染色体を含み、異所性非ヒト動物染色体は本明細書に記載の遺伝子改変を含む。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００７８】
一態様では、ヒトＣ５遺伝子またはヒトＣ３遺伝子を含むように遺伝子改変されているマウスの胚、卵、または細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスのものである。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）、Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０巻：８３６頁を参照されたい。Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００年）、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合型（ｍｉｘ）である。別の特定の実施形態では、マウスは、上述の１２９系統の混合型である、または上述のＢＬ／６系統の混合型である。特定の実施形態では、混合型の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上述の系統の混合型である。一実施形態では、マウスはＳｗｉｓｓまたはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスである。
【００７９】
さらなる態様では、本明細書では、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するための方法であって、本明細書に開示および記載されている非ヒト動物のいずれか、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットに化合物を投与するステップと、齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかをアッセイし、それにより、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、化合物は、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示されている実施形態のいずれかの別の実施形態では、化合物は、補体活性を増大させることによって補体活性化を調節する。本明細書に開示されている実施形態のいずれかの別の実施形態では、化合物は、補体活性を減少させることによって補体活性化を調節する。本明細書に開示されている実施形態のいずれかの別の実施形態では、齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかを決定するために、齧歯類の血清をアッセイする。さらなる実施形態では、アッセイはＣＨ５０補体スクリーニングアッセイである。
【００８０】
本明細書に記載の態様および実施形態のそれぞれは、実施形態または態様の状況から明確にまたは明白に排除されない限り、一緒に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、マウスＣ５ゲノム遺伝子座（上）およびヒトＣ５ゲノム遺伝子座（下）の一定の拡大比ではない図である。ヒト化Ｃ５マウスを生成するために、それぞれ、欠失させる、および置き換えるマウスＣ５遺伝子およびヒトＣ５遺伝子の領域が示されている。
【００８２】
【図２Ａ】図２は、マウスＣ３ゲノム遺伝子座（ｍＣ３）およびヒト化Ｃ３ゲノム遺伝子座（ｈＣ３）の一定の拡大比ではない図である。（Ａ）それぞれ太い線および矢印によって示される通り、５’制御エレメントおよびエクソン１からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子が欠失し、５’制御エレメントおよびヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置き換えられている。（Ｂ）それぞれ太い線および矢印によって示される通り、イントロン１の一部およびエクソン２からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子が欠失し、イントロン１の一部およびヒトＣ５遺伝子のエクソン２からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置き換えられている。
【図２Ｂ】図２は、マウスＣ３ゲノム遺伝子座（ｍＣ３）およびヒト化Ｃ３ゲノム遺伝子座（ｈＣ３）の一定の拡大比ではない図である。（Ａ）それぞれ太い線および矢印によって示される通り、５’制御エレメントおよびエクソン１からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子が欠失し、５’制御エレメントおよびヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置き換えられている。（Ｂ）それぞれ太い線および矢印によって示される通り、イントロン１の一部およびエクソン２からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子が欠失し、イントロン１の一部およびヒトＣ５遺伝子のエクソン２からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置き換えられている。
【００８３】
【図３】図３は、マウス補体の活性が溶血アッセイにおいてヒト補体よりも低いことを示す。
【００８４】
【図４】図４は、補体溶血活性が種特異的抗Ｃ５モノクローナル抗体によって種特異的に遮断されることを示す。
【００８５】
【図５Ａ】図５は、ヒト化Ｃ５マウスが機能的マウスＣ５ノックアウトであることを示す。（Ａ）ヒトＣ５またはＣ３タンパク質の添加により、それぞれＣ５またはＣ３が枯渇したヒト血清における溶血活性が再構成される。（Ｂ）Ｃ５−／−マウス血清およびヒト化Ｃ５マウス血清における溶血活性は、マウスＣ５タンパク質によって再構成されるが、ヒトＣ５タンパク質によっては再構成されない。（Ｃ）ヒト化Ｃ５マウス血清中のヒトＣ５タンパク質のレベルはヒト血清中のレベルの３分の１である。（Ｄ）ヒト化Ｃ５マウスにおける投薬前補体Ｃ５レベルが雄と雌との間で変動する。ヒト化Ｃ５マウス血清中には２０〜１００μｇ／ｍＬの範囲のヒトＣ５が存在する。
【図５Ｂ】図５は、ヒト化Ｃ５マウスが機能的マウスＣ５ノックアウトであることを示す。（Ａ）ヒトＣ５またはＣ３タンパク質の添加により、それぞれＣ５またはＣ３が枯渇したヒト血清における溶血活性が再構成される。（Ｂ）Ｃ５−／−マウス血清およびヒト化Ｃ５マウス血清における溶血活性は、マウスＣ５タンパク質によって再構成されるが、ヒトＣ５タンパク質によっては再構成されない。（Ｃ）ヒト化Ｃ５マウス血清中のヒトＣ５タンパク質のレベルはヒト血清中のレベルの３分の１である。（Ｄ）ヒト化Ｃ５マウスにおける投薬前補体Ｃ５レベルが雄と雌との間で変動する。ヒト化Ｃ５マウス血清中には２０〜１００μｇ／ｍＬの範囲のヒトＣ５が存在する。
【図５Ｃ】図５は、ヒト化Ｃ５マウスが機能的マウスＣ５ノックアウトであることを示す。（Ａ）ヒトＣ５またはＣ３タンパク質の添加により、それぞれＣ５またはＣ３が枯渇したヒト血清における溶血活性が再構成される。（Ｂ）Ｃ５−／−マウス血清およびヒト化Ｃ５マウス血清における溶血活性は、マウスＣ５タンパク質によって再構成されるが、ヒトＣ５タンパク質によっては再構成されない。（Ｃ）ヒト化Ｃ５マウス血清中のヒトＣ５タンパク質のレベルはヒト血清中のレベルの３分の１である。（Ｄ）ヒト化Ｃ５マウスにおける投薬前補体Ｃ５レベルが雄と雌との間で変動する。ヒト化Ｃ５マウス血清中には２０〜１００μｇ／ｍＬの範囲のヒトＣ５が存在する。
【図５Ｄ】図５は、ヒト化Ｃ５マウスが機能的マウスＣ５ノックアウトであることを示す。（Ａ）ヒトＣ５またはＣ３タンパク質の添加により、それぞれＣ５またはＣ３が枯渇したヒト血清における溶血活性が再構成される。（Ｂ）Ｃ５−／−マウス血清およびヒト化Ｃ５マウス血清における溶血活性は、マウスＣ５タンパク質によって再構成されるが、ヒトＣ５タンパク質によっては再構成されない。（Ｃ）ヒト化Ｃ５マウス血清中のヒトＣ５タンパク質のレベルはヒト血清中のレベルの３分の１である。（Ｄ）ヒト化Ｃ５マウスにおける投薬前補体Ｃ５レベルが雄と雌との間で変動する。ヒト化Ｃ５マウス血清中には２０〜１００μｇ／ｍＬの範囲のヒトＣ５が存在する。
【００８６】
【図６】図６は、Ｃ５−／−マウス血清における溶血活性がヒトＣ３およびＣ５タンパク質の添加では再構成されるが、ヒトＣ５タンパク質単独での添加では再構成されないことを示す。
【００８７】
【図７】図７は、野生型レベルのマウス溶血活性を達成するためには、ヒト化Ｃ５マウス血清にヒトＣ３タンパク質を添加する必要があることを示す。
【００８８】
【図８−１】図８は、４００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ａ）および８００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ｂ）を使用して、抗ヒトＣ５抗体（Ｃ５Ａｂ）に曝露させたヒト化Ｃ５マウス由来の血清試料に対して実施した溶血アッセイの結果を示す。
【図８−２】図８は、４００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ａ）および８００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ｂ）を使用して、抗ヒトＣ５抗体（Ｃ５Ａｂ）に曝露させたヒト化Ｃ５マウス由来の血清試料に対して実施した溶血アッセイの結果を示す。
【図８−３】図８は、４００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ａ）および８００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ｂ）を使用して、抗ヒトＣ５抗体（Ｃ５Ａｂ）に曝露させたヒト化Ｃ５マウス由来の血清試料に対して実施した溶血アッセイの結果を示す。
【図８−４】図８は、４００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ａ）および８００μｇ／ｍＬのヒトＣ３タンパク質（Ｂ）を使用して、抗ヒトＣ５抗体（Ｃ５Ａｂ）に曝露させたヒト化Ｃ５マウス由来の血清試料に対して実施した溶血アッセイの結果を示す。
【００８９】
【図９−１】図９は、試験における全ての動物について（Ａ）、ならびに雌（上）および雄（下）動物について（Ｂ）の、注射後の時間の関数として抗ヒトＣ５抗体レベルを測定した薬物動態アッセイの結果を示す。
【図９−２】図９は、試験における全ての動物について（Ａ）、ならびに雌（上）および雄（下）動物について（Ｂ）の、注射後の時間の関数として抗ヒトＣ５抗体レベルを測定した薬物動態アッセイの結果を示す。
【図９−３】図９は、試験における全ての動物について（Ａ）、ならびに雌（上）および雄（下）動物について（Ｂ）の、注射後の時間の関数として抗ヒトＣ５抗体レベルを測定した薬物動態アッセイの結果を示す。
【００９０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ヒトＣ３タンパク質を野生型マウス血清に添加することにより、溶血機能を、正常なヒト血清において観察されるのと同程度ではないが、増強できることを示す（マウスからの各データポイントについて、動物３匹からの血清を混合した）。図１０Ｂは、ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、ヒトＣ３タンパク質を補充すると溶血機能を回復させることができることを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、ヒトＣ３タンパク質を野生型マウス血清に添加することにより、溶血機能を、正常なヒト血清において観察されるのと同程度ではないが、増強できることを示す（マウスからの各データポイントについて、動物３匹からの血清を混合した）。図１０Ｂは、ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、ヒトＣ３タンパク質を補充すると溶血機能を回復させることができることを示す。
【００９１】
【図１１】図１１は、ヒトＣ３タンパク質をＣ３ノックアウトマウス由来の血清に添加することにより、溶血機能をレスキューできることを示す（マウスからの各データポイントについて、動物３匹からの血清を混合した）。
【００９２】
【図１２】図１２は、ヒトＣ３タンパク質のみをＣ５ノックアウトマウス血清に添加することでは、溶血機能をレスキューできないことを示す（マウスからの各データポイントについて、動物３匹からの血清を混合した）。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
補体系は、先天免疫系の不可欠な構成要素であり、侵入する病原体に対する防御機構として重要な役割を果たし、適応免疫応答を刺激し、免疫複合体およびアポトーシス細胞の除去を補助する。補体系は多くの防御免疫機能において重要な役割を果たす一方で、補体活性化は、広範囲の自己免疫疾患および炎症性疾患プロセスにおける組織傷害の有意なメディエーターである。
【００９４】
本明細書に記載の本発明は、とりわけ、血清中に、ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を、非ヒト動物における内因性Ｃ５および／またはＣ３タンパク質の野生型発現と同様の濃度で発現する非ヒト動物を提供する。ヒトまたはヒト化Ｃ５および／またはＣ３タンパク質を発現することが可能な非ヒト動物の成功裏の工学的作製により、大規模かつハイスループットな薬物スクリーニングアッセイを適用できる実験動物においてヒト補体系を再現するための必要かつ有用なツールがもたらされる。本明細書では、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するために本明細書に記載の非ヒト動物（齧歯類など）を使用するための方法も提供される。方法は、Ｃ５タンパク質の補体活性は種特異的である（すなわち、ヒトＣ５タンパク質をマウスＣ５タンパク質の代わりに用いることができない）が、ヒトＣ３タンパク質の補体活性を、マウス血清補体活性におけるマウスＣ３タンパク質の代わりに用いることができるという本発明者らの発見に一部基づくものである。
【００９５】
一般的な技法
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２年）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１年）、（本明細書ではまとめて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称される）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、２０１４年までの補遺を含む）；ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編、２０１４年）、Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年、（２０１４年までの補遺を含む）ならびにＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２００３年）などの文献において十分に説明されている。
【００９６】
定義
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、共有結合によってつなぎ合わさった２つまたはそれ超のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。
【００９８】
「作動可能に連結した」とは、核酸発現コントロール配列（プロモーターなど）と第２の核酸配列の間の機能的な連結を意味し、発現コントロール配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導くものである。
【００９９】
「置き換え」という用語は、遺伝子置き換えに関しては、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に配置し、それにより、内因性遺伝子の全部または一部をオルソロガスまたは相同な核酸配列で置き換えることを指す。ある場合では、内因性非ヒト遺伝子またはその断片を対応するヒト遺伝子またはその断片で置き換える。対応するヒト遺伝子またはその断片とは、置き換えられる内因性非ヒト遺伝子またはその断片のオルソログである、ホモログである、または、構造および／もしくは機能が実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。下記の実施例において実証されている通り、内因性非ヒト（例えば、マウスなどの齧歯類）Ｃ３および／またはＣ５遺伝子座のヌクレオチド配列をヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子座に対応するヌクレオチド配列によって置き換えた。別の実施形態では、遺伝子置き換えは、内因性遺伝子を欠失させるか非機能性にし（ミスセンス変異または中途終止コドンを挿入することによってなど）、対応するヒト遺伝子またはその断片を生殖細胞系の別の位置に挿入するときに生じ得る。
【０１００】
「ヒト化」という用語は、「ヒト化Ｃ３対立遺伝子」または「ヒト化Ｃ５対立遺伝子」または「ヒト化Ｃ３遺伝子」または「ヒト化Ｃ５遺伝子」という句の中で使用される場合、これだけに限定されないが、内因性非ヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子の全部または一部がヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子の対応する部分によって置き換えられている実施形態を含む。例えば、一部の実施形態では、「ヒト化」という用語は、内因性非ヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子のコード領域（例えば、エクソン）が、ヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子の対応するコード領域で完全に置き換えられていることを指すが、非ヒト動物の内因性非コード領域（複数可）（例えば、これだけに限定されないが、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（複数可）、エンハンサーエレメントなど）は置き換えられていない。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【０１０１】
「ヒト化タンパク質」は、これだけに限定されないが、コードされる内因性非ヒトＣ３および／またはＣ５タンパク質の全部または一部がヒトＣ３および／またはＣ５タンパク質の対応する部分によって置き換えられている実施形態を含む。一部の実施形態では、「ヒト化タンパク質」は、ヒト化Ｃ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子によりコードされていてよいが、依然として完全ヒトＣ３および／またはＣ５タンパク質をコードするものである（例えば、これだけに限定されないが、内因性非ヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子のコード領域（例えば、エクソン）の全てがヒトＣ３および／またはＣ５遺伝子または対立遺伝子の対応するコード領域によって置き換えられているが、非ヒト動物の内因性非コード領域（複数可）（例えば、これだけに限定されないが、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（複数可）、エンハンサーエレメントなど）は置き換えられていない状況など）。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【０１０２】
「調節する」とは、本明細書で使用される場合、補体系の活性を変更する化合物の能力を指す。一実施形態では、化合物による補体系の調節とは、被験体（例えば、マウスなどの齧歯類）における補体活性化を減少させることを指す。別の実施形態では、化合物による補体系の調節とは、被験体における補体媒介性活性を増大させることを指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「齧歯類」という用語は、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の任意のメンバーを指す。齧歯類の例としては、限定することなく、マウス、ラット、リス、プレーリードッグ、ヤマアラシ、ビーバー、モルモット、およびハムスターが挙げられる。一実施形態では、齧歯類はラットである。別の実施形態では、齧歯類はマウスである。
【０１０４】
別段の定義のない限り、本明細書では、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、単数の用語「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数のものへの言及を含む。
【０１０６】
本明細書全体を通して示される最大の数値限定はいずれも、全てのより低い数値限定を、そのようなより低い数値限定が本明細書において明白に記載されたものとして含むものとする。本明細書全体を通して示される最小の数値限定はいずれも、全てのより高い数値限定を、そのようなより高い数値限定が本明細書において明白に記載されたものとして含む。本明細書全体を通して示される数値範囲はいずれも、そのようなより広い数値範囲に入る、全てのより狭い数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が本明細書において明白に記載されたものとして含む。
【０１０７】
補体系
免疫系の不可欠な構成要素である補体は、古典的経路および副経路の２つの関連する生化学的カスケードに関与する３０種を超える血清タンパク質および細胞タンパク質からなる。補体は、侵入微生物を破壊し、組織恒常性を維持するための免疫系を補助するように機能する。
【０１０８】
しかし、補体の過剰なまたは制御されていない活性化は、組織傷害に寄与し、補体活性化に関連する種々のヒト疾患、障害および状態、例えば、眼の炎症性疾患および網膜変性疾患に関連する（Ｍａｋｒｉｄｅｓ（１９９８年）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０巻（１号）：５９〜８７頁；およびＭｏｌｌｎｅｓら（２００６年）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４３巻：１０７〜１２１頁を参照されたい）。異常な補体活性化に関連することが公知の他の疾患または状態としては、限定することなく、アレルギー性喘息ならびに付随的な気道炎症および気道応答性亢進（ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）（「ＡＨＲ」）、慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺臓炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増多症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発性喘息、汚染誘発性喘息（ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ）、咳喘息（ｃｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｎｔ  ａｓｔｈｍａ）、肺寄生虫症（ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）感染症、パラインフルエンザウイルス（「ＰＩＶ」）感染症、ライノウイルス（「ＲＶ」）感染症およびアデノウイルス感染症、ならびに虚血再灌流傷害が挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２６０１９８号を参照されたい）。
【０１０９】
補体Ｃ５遺伝子およびタンパク質
Ｃ５遺伝子は、炎症プロセスおよび細胞死滅プロセスにおいて重要な役割を果たす血清補体Ｃ５タンパク質をコードする。成熟Ｃ５タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結したα鎖とβ鎖で構成される。Ｃ５タンパク質は、コンバターゼによって切断され、その結果、著しく炎症促進性であるαポリペプチドに由来するアナフィラトキシンである活性化ペプチド、Ｃ５ａ、および、他の補体成分と複合体を形成して標的細胞の浸透圧溶解に関与する膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成するβポリペプチドに由来する高分子切断産物であるＣ５ｂが生じる。
【０１１０】
ヒトＣ５。Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｓｙｍｂｏｌ：Ｃ５；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７２７；Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｏｕｒｃｅ：ＨＧＮＣ：１３３１；ＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡ  ＩＤ：ＮＭ＿００１７３５．２；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０１０３１；Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＧＲＣｈ３８；Ｌｏｃａｔｉｏｎ：ｃｈｒ９：１２０，９５２，３３５−１２１，０５０，２７５−ｓｔｒａｎｄ。
【０１１１】
ヒトＣ５遺伝子は、第９染色体上、９ｑ３３〜ｑ３４に位置する。ヒトＣ５遺伝子は４１個のエクソンを有し、１８アミノ酸のシグナルペプチド、６５５アミノ酸のβ鎖および９９９アミノ酸のα鎖を含めた１６７６アミノ酸の長さの前駆体ポリペプチドをコードする。補体活性化の間にα鎖が切断され、それにより、強力な炎症促進性アナフィラトキシンである７４アミノ酸のＣ５ａが生じる。
【０１１２】
ヒトにおけるＣ５欠損は、重症再発性感染症に対する易罹患性の増大に関連する。
【０１１３】
Ｃ５遺伝子は、霊長類、例えば、チンパンジー、アカゲザル、他の哺乳動物、例えば、イヌ、ウシ、齧歯類、例えば、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルを含めたいくつかの種の間で保存されている。
【０１１４】
マウスＣ５。Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｓｙｍｂｏｌ：Ｈｃ；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１５１３９；Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｏｕｒｃｅ：ＭＧＩ：９６０３１；ＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡ  ＩＤ：ＮＭ＿０１０４０６．２；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０６６８４；Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ：ＧＲＣｍ３８；Ｌｏｃａｔｉｏｎ：ｃｈｒ２：３４，９８３，３３１−３５，０６１，４４９−ｓｔｒａｎｄ。
【０１１５】
マウスＣ５遺伝子は、第２染色体上、２  ２３．２２ｃＭに位置する。マウスＣ５遺伝子は、４２個のエクソンを有し、１８アミノ酸のシグナルペプチド、６５６アミノ酸のβ鎖および１００２アミノ酸のα鎖を含めた１６８０アミノ酸の長さの前駆体ポリペプチドをコードする。補体活性化の間にα鎖が切断され、それにより、強力な炎症促進性アナフィラトキシンである７７アミノ酸のＣ５ａが生じる。
【０１１６】
Ｃ５欠損は、Ｃ５の分泌不能をもたらす、ｃＤＮＡの５’末端の近くに共通の２塩基対の欠失を有する実験用マウスのいくつかの一般的な系統において観察され、したがって、これらのマウスは、機能的Ｃ５欠損、すなわち、Ｃ５ノックアウトである（そのような系統の６種はＡ／ＨｅＪ、ＡＫＲ／Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊ、ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ、ＳＷＲ／Ｊ、およびＢ１０．Ｄ２／ｏＳｎＪである）（例えば、Ｗｅｔｚｅｌら（１９９０年）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｆｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （Ｃ５）：  ａ  ２−ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ５’  ｅｘｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５巻：２４３５〜２４４０頁を参照されたい）。Ｃ５ノックアウトマウスは、当技術分野で公知の標準の手順に従って生成することもできる。
【０１１７】
補体Ｃ３遺伝子およびタンパク質
Ｃ３遺伝子は、補体活性化の古典的経路および副経路の活性化において中心的な役割を果たす血清補体タンパク質Ｃ３をコードする。
【０１１８】
ヒトＣ３遺伝子は、第１９染色体上、１９ｐ１３．３〜ｐ１３．２に位置する。ヒトＣ３遺伝子は、４１個のエクソンを有し、２２アミノ酸のシグナルペプチド、６４５アミノ酸のβ鎖および９９２アミノ酸のα鎖を含めた１６６３アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。補体活性化の間にα鎖が切断され、それにより、強力な炎症促進性アナフィラトキシンである７７アミノ酸のＣ５ａを含めた９種の異なるペプチドが生じる。
【０１１９】
ヒトにおけるＣ３欠損は、細菌感染症に対する易罹患性の増大に関連する。
【０１２０】
Ｃ３遺伝子は、霊長類、例えば、チンパンジー、アカゲザル、他の哺乳動物、例えば、イヌ、ウシ、齧歯類、例えば、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルを含めたいくつかの種の間で保存されている。
【０１２１】
マウスＣ３遺伝子は、第１７染色体上、１７  ２９．７２ｃＭ１９に位置する。マウスＣ３遺伝子は、４１個のエクソンを有し、２４アミノ酸のシグナルペプチド、６４２アミノ酸のβ鎖および９９３アミノ酸のα鎖を含めた１６６３アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。補体活性化の間にα鎖が切断され、それにより、強力な炎症促進性アナフィラトキシンである７８アミノ酸のＣ３ａを含めた９種の異なるペプチドが生じる。
【０１２２】
Ｃ３ノックアウトマウスは当技術分野で公知の標準の手順に従って生成されている（例えば、Ｄｒｏｕｉｎら（２００１年）Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ３  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔｈ２  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６７巻：４１４１〜４１４４頁を参照されたい）。
【０１２３】
Ｃ５およびＣ３補体タンパク質の種特異性
本明細書において示されているように、ヒト化Ｃ５マウスは、内因性補体タンパク質の少なくとも一部が種特異性を示す、すなわち、内因性マウス補体タンパク質はヒトＣ５タンパク質と機能的に相互作用することができないので、機能的Ｃ５欠損である。ヒト化Ｃ５マウスまたはＣ５ノックアウトマウスから得た血清を補体活性について試験した；ヒトＣ３タンパク質およびヒトＣ５タンパク質の両方を添加しない限り補体溶血活性は観察されなかった。
【０１２４】
同じく本明細書において示されているように、Ｃ３ノックアウトマウスから得た血清にヒトＣ３を添加することにより、溶血機能をレスキューすることができた；ヒトＣ３タンパク質を血清に添加するとＣ３ノックアウトマウスにおいて補体活性が観察された。
【０１２５】
Ｃ５タンパク質の補体活性は種特異的である、すなわち、マウス血清補体活性（すなわち、溶血）アッセイにおいてヒトＣ５タンパク質をマウスＣ５タンパク質の代わりに用いることはできない。
【０１２６】
対照的に、Ｃ３タンパク質の補体活性は同じように種特異的なものではないと思われる、すなわち、マウス血清補体活性（すなわち、溶血）アッセイにおいてヒトＣ３タンパク質をマウスＣ３タンパク質の代わりに用いることができる。
【０１２７】
補体系の治療的阻害
治療的な補体阻害の２つの標的は、それぞれ補体タンパク質Ｃ５およびＣ３から、古典的経路および副経路の両方において、酵素による切断によって補体が活性化されると生成される補体活性化ペプチドＣ５ａおよびＣ３ａである（Ｍａｒｋｉｄｅｓ（１９９８年）；Ｍｏｌｌｎｅｓら（２００６年）を参照されたい）。
【０１２８】
例えば、抗体、例えば米国特許第６，３５５，２４５号に開示されている抗体によるＣ５切断の遮断は、補体活性化に関連する疾患における補体阻害に対する可能性のある治療戦略である。
【０１２９】
ヒトＣ５およびＣ３阻害剤の種特異性
補体タンパク質Ｃ５またはＣ３を標的化する候補治療用分子は、一般に、薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＫ）について非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットにおいて評価される。そのような治療用分子は、補体活性化に関連するヒト疾患、障害および状態の、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性についても試験される。
【０１３０】
しかし、ヒト補体タンパク質Ｃ５またはＣ３に特異的な治療用分子、すなわち、ヒト特異的Ｃ５またはＣ３阻害剤はＰＤまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性について、齧歯類、特にマウスにおいては、これらの治療用分子の標的がないので、適切に評価することができない。この問題は、ヒトＣ５またはＣ３補体タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットを使用することでは、上記のこれらのタンパク質の種特異性が原因で克服されない。
【０１３１】
したがって、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットにおいてヒト特異的Ｃ５またはＣ３タンパク質アンタゴニストまたは阻害剤のＰＤおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性を評価するためには、内因性Ｃ５および／またはＣ３タンパク質をヒトＣ５および／またはＣ３タンパク質で置き換えることが望ましい。さらに、ヒトＣ５および／またはＣ３タンパク質の過剰発現または過少発現に関する潜在的な問題を回避するために、ヒトＣ５および／またはＣ３遺伝子を、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットのゲノム内の内因性Ｃ５および／またはＣ３遺伝子座に挿入し、少なくとも一部は内因性Ｃ５および／またはＣ３制御エレメントのコントロール下で、ヒトＣ５および／またはＣ３タンパク質を非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットにおいて発現させることが望ましい。
【０１３２】
ヒト化Ｃ３および／またはＣ５非ヒト動物の創出
本発明のヒト化Ｃ３および／またはＣ５動物を生成するための方法は当技術分野で周知である（一般に、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（２０００年）を参照されたい）。一実施形態では、マウスの生成は、任意選択で、マウスＣ３および／またはＣ５遺伝子を破壊し、ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５をコードする遺伝子をマウスゲノムに導入することを伴う。一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５をコードする遺伝子の導入は、内因性マウスＣ３および／またはＣ５遺伝子と同じ位置におけるものである。
【０１３３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、導入遺伝子を動物の生殖細胞系に導入することによって作出することができる。種々の発生段階における胚標的細胞を使用して導入遺伝子を導入することができる。胚標的細胞の発生の段階に応じて異なる方法を使用する。本発明を実施するために使用する任意の動物の特定の系列（複数可）は、全般的な健康が良好であること、胚収量が良好であること、胚における前核可視性が良好であること、および生殖適応度が良好であることについて選択する。トランスジェニックマウスを作出する場合、Ｃ５７ＢＬ／６もしくはＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２  Ｆ１などの系統、またはＦＶＢ系列が多くの場合使用される（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、またはＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓから商業的に得られる）。
【０１３４】
胚への導入遺伝子の導入は、例えば、微量注射、電気穿孔、またはリポフェクションなどの当技術分野で公知の任意の手段によって達成することができる。例えば、導入遺伝子（複数可）は、哺乳動物の受精卵（複数可）の前核に構築物を微量注射して、構築物の１つまたは複数のコピーが、発生する哺乳動物（複数可）の細胞内に保持されるようにすることによって、哺乳動物に導入することができる。導入遺伝子構築物を受精卵に導入した後、卵をｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な時間にわたってインキュベートすること、または代理宿主に再移植すること、またはその両方を行うことができる。成熟までのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるインキュベーションは本発明の範囲内である。一般的な方法の１つは、胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種に応じて約１〜７日間インキュベートし、次いで、代理宿主に再移植することである。
【０１３５】
再移植は標準の方法を使用して達成される。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵管に挿入する。特定の宿主に移植する胚の数は種によって変動するが、通常は、その種が天然に産生する子孫の数と匹敵する。
【０１３６】
レトロウイルスの感染を使用して導入遺伝子を非ヒト動物に導入することもできる。発生中の非ヒト胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて胚盤胞段階まで培養することができる。この時間の間に、割球はレトロウイルスの感染の標的であり得る（Ｊａｅｎｉｃｈ，  Ｒ．（１９７６年）ＰＮＡＳ  ７３巻：１２６０〜１２６４頁）。割球の効率的な感染は、酵素処理して透明帯を除去することによって得られる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｈｏｇａｎ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８６年）。導入遺伝子を導入するために使用するウイルスベクター系は、一般には、導入遺伝子を保有する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら（１９８５年）ＰＮＡＳ  ８２巻：６９２７〜６９３１頁；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら（１９８５年）ＰＮＡＳ  ８２巻：６１４８〜６１５２頁）。
【０１３７】
導入遺伝子を導入するための標的細胞の第３の型は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。ＤＮＡトランスフェクションによって、またはレトロウイルス媒介性形質導入によって導入遺伝子をＥＳ細胞に効率的に導入することができる。そのような形質転換されたＥＳ細胞を、その後、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は胚に定着し（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）、結果得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。
【０１３８】
ヒト化Ｃ３および／またはＣ５を含むトランスジェニック動物と他の動物との交配を行うことができる。調製の様式は、それぞれが所望の構築物または導入遺伝子のうちの１つを含有する一連の哺乳動物を生じさせるものである。そのような哺乳動物を、一連の交配、戻し交配および選択によって一緒に育種して、最終的に、所望の構築物および／または導入遺伝子の全てを含有する単一の哺乳動物を生じさせ、ここで、哺乳動物は、所望の構築物および／または導入遺伝子（複数可）が存在すること以外、他の点では野生型と類遺伝子性（遺伝的に同一）である。一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３および／またはＣ５遺伝子を含むマウスをこのように作出する。
【０１３９】
一般には、交配および戻し交配は、育種プロセスにおける特定のステップのそれぞれの目的に応じて同胞または親系統と子孫を交尾させることによって達成される。ある特定の場合では、適切な染色体上の位置にノックアウト構築物および／または導入遺伝子のそれぞれを含有する単一の子孫を生じさせるために多数の子孫を生じさせる必要があり得る。さらに、最終的に所望の遺伝子型を得るために、いくつかの世代にわたって交配または戻し交配を行う必要があり得る。
【０１４０】
補体系を調節することが可能な化合物を同定するための、ヒト化Ｃ３および／またはＣ５非ヒト動物の使用
一部の態様では、本明細書では、補体活性化を調節することが可能な候補治療用分子（すなわち、化合物）を同定するための方法が提供される。当該方法では、本明細書に開示されているヒト化Ｃ３および／またはＣ５齧歯類（例えば、マウスまたはラット）のいずれかを利用する。一部の実施形態では、補体活性化を実験的に誘導した後（例えば、腎虚血／再灌流モデルにおいて）、候補化合物を齧歯類に直接投与し、前記化合物の、補体系を調節する能力に関する効果を評価する。他の実施形態では、候補化合物をこれらの動物から得た血清と接触させ、任意の一般に使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価技法（これだけに限定されないが、ＣＨ５０アッセイなど）を使用して補体活性を評価する。
【０１４１】
一部の実施形態では、候補化合物は、補体活性化を低下させること、減少させること、または阻害することによって補体活性化を調節することが可能なものである。化合物は、本明細書に開示されている齧歯類のいずれかにおける補体活性化を、候補化合物を用いた処置を受けていない対照齧歯類と比較して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか、低下させることが可能なものである。
【０１４２】
別の実施形態では、候補化合物は、補体活性化を、包括的に（以下の値の間のあらゆる期間を含める）、最大１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または３週間にわたって低下させる、減少させる、または阻害することが可能なものである。
【０１４３】
他の実施形態では、候補化合物は、補体活性を増大させること、増幅すること、または活性化することによって補体活性化をさらに調節することが可能なものである。化合物は、本明細書に開示されている齧歯類のいずれかにおける補体活性化を、候補化合物を用いた処置を受けていない対照齧歯類と比較して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか、増大させることが可能なものである。
【０１４４】
別の実施形態では、候補化合物は、包括的に（以下の値の間のあらゆる期間を含める）、最大１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または３週間にわたって補体活性を増大させる、増幅するまたは活性化することが可能なものである。
【０１４５】
候補化合物は、限定することなく、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。
【０１４６】
１．抗体
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質（これだけに限定されないが、Ｃ５またはＣ３（例えば、Ｃ３ａ）など）に結合する（例えば、優先的に結合するなど）ものであり、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、抗体は、Ｃ５および／またはＣ３アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
【０１４７】
抗体のバリアントを、当技術分野で公知の情報に基づいて、抗体の活性に実質的に影響を及ぼすことなく作製することもできる。例えば、抗体バリアントは、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられたものであり得る。抗体に関して、置換変異誘発について最も興味深い部位は、一般に、超可変領域を含むが、フレームワーク領域（ＦＲ）の変更も意図されている。
【０１４８】
抗体に関して、置換バリアントの１つの型は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択される、結果得られるバリアント（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して生物学的性質が改善されている。そのような置換バリアントを生成するための都合のよいやり方は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させて、各部位において可能性のあるアミノ酸置換の全てを生成する。このように生成された抗体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物としてディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書で開示されているそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。
【０１４９】
抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法によって調製することができる。これらの方法としては、これだけに限定されないが、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および抗体の以前に調製されたバリアントもしくは非バリアントバージョンのカセット変異導入による調製が挙げられる。
【０１５０】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に１つまたは複数のアミノ酸の改変を導入し、それにより、Ｆｃ領域バリアントを生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインのものを含めた１つまたは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸の改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでよい。
【０１５１】
Ｃｌｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が変更された（すなわち、改善されたまたは減弱した）Ｆｃ領域バリアントは、国際特許出願公開第Ｗ０９９／５１６４２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。そのようなバリアントは、Ｆｃ領域のアミノ酸位置のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含んでよい。また、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｃ領域バリアントに関するＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際特許出願公開第Ｗ０９４／２９３５１号を参照されたい。
【０１５２】
２．非抗体結合性ポリペプチド
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質（Ｃ５またはＣ３（例えば、Ｃ３ａ）など）に結合する（優先的に結合するなど）ものであり、非抗体結合性ポリペプチドである。一部の実施形態では、非抗体結合性ポリペプチドは、Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、非抗体結合性ポリペプチドは、Ｃ５および／またはＣ３アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
【０１５３】
結合性ポリペプチドは公知のポリペプチド合成方法体系を使用して化学的に合成することもできるか、または組換え技術を使用して調製し、精製することもできる。結合性ポリペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸の長さ、あるいは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００アミノ酸またはそれ超の長さであり、そのような結合性ポリペプチドは、本明細書で考察した補体タンパク質（例えば、Ｃ５またはＣ３）のいずれかなどの標的に結合することが可能である。
【０１５４】
結合性ポリペプチドは、周知の技法を使用して過度な実験を伴わずに同定することができる。この点について、ポリペプチド標的に結合することが可能な結合性ポリペプチドについてポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８４／０３５０６号および同第ＷＯ８４／０３５６４号；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻：３９９８〜４００２頁（１９８４年）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２巻：１７８〜１８２頁（１９８５年）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１０２巻：２５９〜２７４頁（１９８７年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．ら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４頁；Ｋａｎｇ，  Ａ．Ｓ．ら、（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：８３６３頁、ならびにＳｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．（１９９１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２巻：６６８頁を参照されたい）。
【０１５５】
ペプチドライブラリーを生成し、これらのライブラリーをスクリーニングするための方法は、それぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７２３，２８６号、同第５，４３２，０１８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，４９８，５３０号、同第５，７７０，４３４号、同第５，７３４，０１８号、同第５，６９８，４２６号、同第５，７６３，１９２号、および同第５，７２３，３２３号にも開示されている。
【０１５６】
結合性ポリペプチドは、それらの阻害効果および／または治療効果が増強されるように改変することができる（例えば、親和性の増強、半減期、安定性、およびクリアランス速度などの薬物動態的性質の改善、毒性の低下などを含めた）。そのような改変としては、限定することなく、グリコシル化、ペグ化、天然には存在しないが、機能的に等価のアミノ酸での置換、連結基などが挙げられる。
【０１５７】
３．小分子
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質（Ｃ５またはＣ３（例えば、Ｃ３ａ）など）に結合する（優先的に結合するなど）ものであり、小分子である。一部の実施形態では、小分子は、Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、小分子は、Ｃ５および／またはＣ３アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
【０１５８】
小分子は、本明細書で定義されている結合性ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子であることが好ましい。有機小分子は、公知の方法体系を使用して同定し、化学的に合成することができる（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。有機小分子は、通常、約２０００ダルトン未満のサイズである、あるいは、約１５００ダルトン未満、約７５０ダルトン未満、約５００ダルトン未満、約２５０ダルトン未満または約２００ダルトン未満のサイズであり、本明細書に記載のポリペプチドに結合することが可能な有機小分子は、周知の技法を使用して過度な実験を伴わずに同定することができる。この点について、ポリペプチド標的に結合することが可能な分子について有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。
【０１５９】
有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホネート、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物などであってよい。
【０１６０】
一部の態様では、小分子化学化合物は、コンビナトリアル化学ライブラリーの成分である。コンビナトリアル化学ライブラリーは、より小さなサブユニットまたは単量体で構成される多数の種の化学化合物の集合である。コンビナトリアルライブラリーは、数百から何十万もの異なる種の化学化合物にわたる種々のサイズになる。例えば炭水化物、オリゴヌクレオチド、および小有機分子などの化合物で構成されるオリゴマーライブラリーおよびポリマーライブラリーを含めた、種々のライブラリー型も存在する。そのようなライブラリーには、化学化合物の固定化およびクロマトグラフィーによる分離、ならびに、標的分子（例えば、Ｃ５および／またはＣ３）に結合することまたは目的の生物活性（これだけに限定されないが、補体活性の阻害または活性化など）を媒介することが可能なリガンドを同定し、特徴付けるための使用などの種々の使用がある。
【０１６１】
固相支持体上に化合物のライブラリーを合成するための種々の技法が当技術分野で公知である。固相支持体は、一般には、サブユニットまたは単量体と結合してライブラリーの化合物を形成するように機能性を持たせた表面を有するポリマーの物体である。１つのライブラリーの合成には、一般には、多数の固相支持体を要する。コンビナトリアルライブラリーを作製するために、固相支持体を化合物の１つまたは複数のサブユニットと、および１つまたは複数の試薬と、慎重にコントロールされた所定の順序の化学反応で反応させる。言い換えれば、ライブラリーサブユニットを固相支持体上で「成長させる」。ライブラリーが大きいほど、必要な反応の数が多くなり、それにより、ライブラリーを構成する多数の種の化合物の化学組成を追跡し続ける作業が複雑になる。一部の実施形態では、小分子は、約２０００ダルトン未満のサイズである、あるいは、約１５００ダルトン未満、約７５０ダルトン未満、約５００ダルトン未満、約２５０ダルトン未満または約２００ダルトン未満のサイズである。
【０１６２】
本明細書の態様のいずれかに記載されている小分子薬剤は、固体支持体上で行うことができる任意の型の化学反応に由来するものであってよい。そのような化学反応としては、これだけに限定されないが、ブタジエンのトラッピングを含む２＋２環化付加；イソキサゾリン、フランおよび改変ペプチドの合成を含む［２＋３］環化付加；ジオール、アルデヒドおよびケトンの固定化を含むアセタール形成；アルデヒドの誘導体化、プロパンジオールの合成を含むアルドール縮合；アルデヒドの誘導体化を含むベンゾイン縮合；ベンゾジアゼピンおよびヒダントイン、チアゾリジン、ターン模倣体（ｔｕｒｎ  ｍｉｍｅｔｉｃ）、ポルフィリン、フタロシアニンを含む環化縮合（ｃｙｃｌｏｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）；ジエステルの環化を含むディークマン環化；アクリル酸の誘導体化を含むディールス・アルダー反応；アルケンへのアルコールの付加を含む求電子付加；アルデヒドの誘導体化を含むグリニャール反応；二置換アルケンの合成を含むヘック反応；ｉｎ  ｓｉｔｕにおける酸化ニトリルの合成を含むヘンリー反応（２＋３環化付加を参照されたい）；フェロモンおよびペプチドの合成（アルケンの水素付加）を含む触媒水素添加；スルファニルケトン、ビシクロ［２．２．２］オクタンの合成を含むマイケル反応；アリールエーテル、ホスホン酸ペプチジルおよびチオエーテルの合成を含む光延反応；キノロンの合成を含む求核芳香族置換；アルデヒドおよびケトンの合成を含む酸化；ペンチノールを用いたノルボルナジエンの環化を含むポーソン・カーン環化付加；ヘリセンの合成を含む光化学的環化；アルデヒドおよび塩化アシルの誘導体化を含む、有機金属化合物を用いた反応；カルボニル、カルボン酸、エステルおよびニトロ基の還元を含む、複合水素化物およびスズ化合物を用いた還元；カルボキシル基の還元を含むSoai反応；ビフェニル誘導体の合成を含むスティル反応；置換シクロヘキサノンの合成を含むストーク反応；キノロンの合成を含む還元的アミノ化；フェニル酢酸誘導体の合成を含む鈴木反応；ならびにアルデヒド、フェロモン、およびスルファニルケトンの反応を含むウィッティヒ・ホーナー反応が挙げられる。
【０１６３】
化学ライブラリーの合成ならびにそれらのライブラリーの個々の化合物の個々の固相支持体へのデコンボリューションが開示されている参考文献は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９／００３２５９２号；Ｎｅｅｄｅｌｓら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：１０７００〜１０７０４頁；およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／１５３９０号に見いだすことができる。
【０１６４】
４．阻害性核酸
本発明の一態様では、候補補体調節性化合物は、補体系の成分（ｍＲＮＡなど）に標的化される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである。阻害性核酸は、限定することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはリボザイムのいずれかであってよい。
【０１６５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、補体系のタンパク質成分をコードするｍＲＮＡであってよい。オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに結合し、それらの破壊を媒介することによってまたはタンパク質への翻訳を妨げることによってのいずれかでそれらの機能に干渉する。絶対的な相補性が好ましいが必要ではない。ＲＮＡの一部と「相補的な」オリゴヌクレオチド配列とは、本明細書で言及される場合、ＲＮＡとハイブリダイズし、それにより安定な二重鎖を形成することが可能になるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とオリゴヌクレオチドの長さの両方に左右される。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、含有され得るＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなり、それでも安定な二重鎖が形成される。当業者は、標準の手順を使用してハイブリダイズした複合体の融点を決定することにより、ミスマッチの許容される程度を確認することができる。
【０１６６】
一般に、補体系のタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために製造された相補的なオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域まで、ＡＵＧ開始コドンの相補物まで、または３’非翻訳領域までを含めたｍＲＮＡの任意の領域に標的化される。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドは、これだけに限定されないが、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９巻：１４３７〜１４４１頁、１９９１年；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ペプチド核酸またはＰＮＡ（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８５巻：５６６〜５６８頁、１９９３年；および米国特許第６，６５６，６８７号）、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：３３〜６１頁、１９９３年）、ホスホロジチオエート（Ｃａｐａｌｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８巻：Ｅ４０頁、２０００年）などの、代替のヌクレオシド間連結を有してよい。他のオリゴヌクレオチド類似体としては、これだけに限定されないが、モルホリノ（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１４８９巻：１４１〜１５８頁、１９９９年）、ロックドオリゴヌクレオチド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９７巻：５６３３〜５６３８頁、２０００年）、ペプチド核酸もしくはＰＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９３年；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９６年）、または２−ｏ−（２−メトキシ）エチル改変５’末端および３’末端オリゴヌクレオチド（ＭｃＫａｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７４巻：１７１５〜１７２２頁、１９９９年）などが挙げられる。これらの参考文献は全て、これにより明白に参照により組み込まれる。核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）ヒポキサタニン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含めた塩基の任意の組み合わせを含有してよい。
【０１６８】
本発明による相補的なオリゴヌクレオチドは、これだけに限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含めた群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含んでよい。
【０１６９】
相補的なオリゴヌクレオチドは、これだけに限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分も含んでよい。
【０１７０】
相補的なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであるべきであり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さなど、１０〜約５０ヌクレオチドの長さにわたってよい。
【０１７１】
候補化合物の有効性の評価
所与の非ヒト動物（齧歯類、例えばマウスまたはラットなど）における本発明の候補補体調節性化合物の治療有効性、適切な投薬量、および方法は、当業者に周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体アッセイに従って決定することができる。補体経路では、活性化の正常な経過の間に多数の特異的な産物が生成され、小さな活性化断片Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａならびに大きな活性化断片ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９を含めたこれらの活性化産物の大部分に関して、感度が高く特異的なアッセイが開発されており、商業的に利用可能である。これらのアッセイの大部分では、補体断片上に露出し、それらが形成されるネイティブなタンパク質上には露出していない新しい抗原と反応するモノクローナル抗体を利用し、これにより、これらのアッセイが非常に単純かつ特異的なものになっている。ＥＬＩＳＡ技術が特に一般的なものであるが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）も、Ｃ３ａおよびＣ５ａを検出するために使用される。これらの後者のアッセイでは、プロセシングされていない断片およびそれらのプロセシングされた断片（すなわち、循環中に見いだされる主要な形態）の両方を測定する。Ｃ３ａの測定により、補体活性化の感度の高く経路に依存しない指標がもたらされる。膜攻撃経路活性化の流体相産物であるｓＣ５ｂ−９の検出により、補体が、完了まで活性化されているという証拠がもたらされる。さらに、同様に古典的経路によってＣ４ａが生成され、その測定により、Ｃ３ｂ阻害剤の活性およびそのような阻害剤により古典的経路が活性化されるかどうかに関する情報がもたらされる。
【０１７２】
さらに、補体活性化のいくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデルも、補体系を調節する候補化合物の能力を評価するために当業者が利用可能である。例えば、補体系は、虚血性事象およびその後の血流の回復後に持続する虚血再灌流傷害に関係付けられる。虚血再灌流傷害を引き起こす可能性がある傷害の例としては、限定することなく、心筋梗塞、大脳虚血性事象、腸管虚血、ならびに、血管手術、心臓手術、外傷、および移植の多くの態様が挙げられる。補体系の活性化は、虚血再灌流傷害の炎症性事象において役割を果たす。虚血傷害により、細胞膜の変更が生じ、それにより、外面の脂質、炭水化物、またはタンパク質が影響を受け、したがって、これらの露出したエピトープが変更され、ネオ抗原（改変自己抗原）としての機能を果たし得る。虚血再灌流傷害への補体の古典的経路の関与は、後肢における局所的な傷害からの同等の保護を示す、Ｃ３またはＣ４のいずれかが遺伝的に欠損したマウスおよび傷害の動物モデルによって証明される（Ａｕｓｔｅｎら（２００３年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ  Ｐｈａｒｍ  １６巻：１頁）。さらに、補体活性化は、虚血傷害の腎臓モデルに関与することも示されている（Ｇｕｏら（２００５年）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：８２１頁）。
【０１７３】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに理解することができ、実施例は例示する目的で提示するものであり、限定的なものではない。
【実施例】
【０１７４】
（実施例１）
内因性マウスＣ５遺伝子のヒトＣ５遺伝子での置き換え
ヒトＣ５遺伝子のコーディングエクソン２から４２を含有する９７ｋｂのヒトＣ５遺伝子で、コーディングエクソン２から４１までにわたり、３’非翻訳領域の一部を含む７５．８ｋｂのマウスＣ５遺伝子座を置き換えた。図１を参照されたい。
【０１７５】
単一の標的化ステップでマウスＣ５遺伝子をヒトＣ５遺伝子で置き換えるための標的化構築物を、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術を使用して構築した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。マウスＣ５  ＤＮＡおよびヒトＣ５  ＤＮＡをそれぞれ細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンｂＭＱ−２２７７Ｌ１６およびＣＴＤ−２５５９Ｉ１９から得た。簡単に述べると、ギャップ修復クローニングによって生成した、マウスＣ５上流および下流相同性アームに挟まれたコーディングエクソン２のすぐ上流のイントロン１からコーディングエクソン４１まで延びる９７ｋｂのヒトＣ５配列および３’非翻訳領域（ゲノム座標：ＧＲＣｈ３８：ｃｈｒ９：１２０，９５２，３３５−１２１，０５０，２７６（−ｓｔｒａｎｄ））ならびにｌｏｘＰが導入されたｎｅｏ選択カセットを含有する直線化された標的化構築物を、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９  Ｆ１ハイブリッド）に電気穿孔により導入した。正確に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ７１４０）に、一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔を行って薬物選択カセットを除去した。薬物カセットを有さない標的化されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ７１４１）を８細胞期のＳＷマウス胚にＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。ヒト化Ｃ５遺伝子を担持するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に基本的に完全に由来するＦ０マウス）を、マウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得について対立遺伝子アッセイの改変版を使用して遺伝子型決定によって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）を参照されたい）。
【０１７６】
正確に標的化されたＥＳ細胞クローンを、ネイティブ対立遺伝子喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ）（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年）によって同定した。このアッセイでは、ネイティブな改変されていないＣ５遺伝子のコピーの数を、欠失のために標的化されたマウスＣ５遺伝子内の配列に特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定した。ｑＰＣＲアッセイには以下のプライマー−プローブセットを含めた（５’から３’の方向に記載する）：上流フォワードプライマー、ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＡ  ＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴ  ＧＡＴ（配列番号１）；上流リバースプライマー、ＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧ  ＧＴＡＧＡＣＴＴＣＣ  ＣＡ（配列番号２）；上流プローブ、ＦＡＭ−ＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡ  ＣＴＴＴＧＧＴＴＧＴ  ＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡ−ＢＨＱ（配列番号３）；下流フォワードプライマー、ＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧ  ＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣ（配列番号４）；下流リバースプライマー、ＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣ  ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡ  Ａ（配列番号５）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴ  ＴＣＴＧＧＣＣＣＧＧ  ＡＣＣＴ−ＢＨＱ（配列番号６）；ここで、ＦＡＭは、５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱは、ブラックホールクエンチャー型の蛍光クエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を指す。標的化ベクターを取り込み、そのゲノム内に組み入れたＥＳ細胞クローンから精製されたＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、製造者の提言に従って合わせ、ＰＣＲの過程中に蛍光データを収集し、蓄積された蛍光が予め設定した閾値に到達する分別ＰＣＲサイクルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴにおいてサイクルさせた。上流および下流Ｃ５特異的ｑＰＣＲおよび非標的化参照遺伝子についての２回のｑＰＣＲを各ＤＮＡ試料に対して行った。Ｃ５特異的ｑＰＣＲのそれぞれと参照遺伝子ｑＰＣＲのそれぞれの間のＣｔ値の差異（ΔＣｔ）を算出し、次いで、アッセイした全ての試料について各ΔＣｔとΔＣｔの中央値の間の差異を算出して各試料についてのΔΔＣｔ値を得た。各試料中のＣ５遺伝子のコピー数を次式：コピー数＝２×２−ΔΔＣｔから算出した。ネイティブなコピーのうちの１つが喪失した、正確に標的化されたクローンは、１と等しいＣ５遺伝子コピー数を有することになる。ヒト化対立遺伝子において、ヒトＣ５遺伝子配列で、欠失させたマウスＣ５遺伝子配列が置き換えられたことの確認を、以下のプライマー−プローブセット（５’から３’の方向に記載する）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認した：ヒト上流フォワードプライマー、ＴＧＣＴＣＴＴＡＡＡ  ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴ  ＣＡＣ（配列番号７）；ヒト上流リバースプライマー、ＧＴＡＡＡＣＧＧＡＴ  ＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧ  ��ＴＡＧＡ（配列番号８）；ヒト上流プローブ、ＦＡＭ−ＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡ  ＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣ  ＣＡＧＣ−ＢＨＱ（配列番号９）；ヒト下流フォワードプライマー、ＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣ  ＴＡＴＣＡＣＡＧＧＡ  ＡＡＣＡ（配列番号１０）；ヒト下流リバースプライマー、ＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴ  ＴＣＣＡＧＴＣＴＣＴ  ＧＴＴＡ（配列番号１１）；ヒト下流プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣ  ＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴ  ＡＡＣＧＧ−ＢＨＱ（配列番号１２）。
【０１７７】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて尾部生検材料から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＣ５遺伝子型を決定し、ヒト化Ｃ５対立遺伝子が生殖細胞系を通じて伝達されたことを確認する。置き換えについてヘテロ接合性の仔２匹を育種して内因性マウスＣ５遺伝子のヒトＣ５遺伝子による置き換えについてホモ接合性であるマウスを生成する。置き換えについてホモ接合性である仔を表現型決定に使用する。
【０１７８】
マウス遺伝子座とヒトＣ５遺伝子を含有する配列の上流接合部を、５’−ＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴ  ＣＣＡＴＴＡＣＴＡＣ  ＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴ  ＧＣＣＣＡＣＡＧＴＧ  ＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴ  ＣＴＡＴＣＣＴＴＧＴ  ／（ＧＣＧＡＴＣＧＣ）／  ＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＴＡＣＴＡＧＧＣ  ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡ  ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴ  ＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧ  ＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣ  ＣＴＣＴＣＴＴＴＴＧ  ＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴ（配列番号１３）内に入るように設計し、ここで、ヒトＣ５遺伝子の最初のヌクレオチドの前の最後のマウスＣ５ヌクレオチドは、ＣＴＴＧＴの最後のＴであり、ヒトＣ５配列の最初のヌクレオチドはＴＣＴＧＣの最初のＴであり、これはＡｓｉＳＩ部位（括弧内）にわたり、正確な接合部はフォワードスラッシュによって示されている。ヒトＣ５遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰが導入されたｎｅｏ選択カセットの下流接合部を、５’−ＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧ  ＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧ  ＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴ  ＡＡＣＣＣＡＣＡＡＴ  ＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡ  ＡＡＴＡＴＣＡＡＡＧ  ＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴ  ＧＡＡＴＴＡＧＣＣＴ／ＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡ  ＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡ  ＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴ  ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ  ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＣ  ＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧ  ＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣ  ＣＴＣＣＣＧＣＧＧＧ（配列番号１４）内に入るように設計し、ここで、ヒトＣ５配列の最後のヌクレオチドはＡＧＣＣＴのＴであり、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏ選択カセットの最初のヌクレオチドはＣＴＣＧＡの最初のＣであり、正確な接合部はフォワードスラッシュによって示されている。マウスＣ５遺伝子座の配列の下流接合部を、５’−ＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡ  ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡ  ＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ  ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＡ  ＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧ  ＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡ  ＧＣＧＡＧＣＴＡＧＣ／ＣＡＧＧＣＴＡＴＴＡ  ＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣ  ＣＣＣＡＡＣＴＧＴＧ  ＧＴＧＧＣＡＡＡＴＡ  ＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡ  ＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧ  ＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴ  ＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴ（配列番号１５）内に入るように設計し、ここで、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏ選択カセットの最後のヌクレオチドはＣＴＡＧＣの２番目のＣであり、マウスＣ５遺伝子座の最初のヌクレオチドはＣＡＧＧＣの最初のＣであり、正確な接合部はフォワードスラッシュによって示されている。ヒトＣ５遺伝子を含有する配列とマウス遺伝子座の下流接合部を、５’−ＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧ  ＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧ  ＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴ  ＡＡＣＣＣＡＣＡＡＴ  ＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡ  ＡＡＴＡＴＣＡＡＡＧ  ＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴ  ＧＡＡＴＴＡＧＣＣＴ／ＣＴＣＧＡＧ（ＡＴＡＡ  ＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡ  ＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴ  ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）  ＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴ  ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣ  ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧ  ＡＧＣＴＡＧＣ／ＣＡ  ＧＧＣＴＡＴＴＡＧＧ  ＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣ  ＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴ  ＧＧＣＡＡＡＴＡＧＧ  ＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡ  ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴ  ＧＡＡＧＣＣＡＴＡＡ  ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号１６）内に入るように設計し、ここで、ヒトＣ５配列の最後のヌクレオチドはＡＧＣＣＴの「Ｔ」であり、マウ��Ｃ５配列の最初のヌクレオチドはＣＡＧＧＣの最初の「Ｃ」であり、これはｌｏｘＰが導入されたｎｅｏ選択カセットを除去した後に残ったｌｏｘＰ部位（括弧内）にわたり、正確な接合部はフォワードスラッシュによって示されている。
【０１７９】
（実施例２）
内因性マウスＣ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子での置き換え
バージョン１−ヒトＣ３プロモーターおよびコーディングエクソン１から４１を用いた置き換え
５’制御エレメントおよびヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン１から４１までの全てを含有するヒトＣ３遺伝子で、５’制御エレメントおよびコーディングエクソン２から４１までの全てにわたるマウスＣ５遺伝子座を置き換えた。上の実施例１に記載の方法を基本的に使用してマウスＣ３遺伝子配列をヒトＣ３遺伝子配列で置き換えた。図２Ａを参照されたい。
【０１８０】
予備的に、マウスＥＳ細胞において、ポリアデニル化部位に対して３’側の９００ｂｐを含むコーディングエクソン２から４１までを、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏカセットで置き換えることによって２５ｋｂのマウスＣ３遺伝子の標的化欠失を生じさせた。結果得られるマウスＥＳ細胞、１２１３２ＥＳ細胞は、ヘテロ接合性Ｃ３ノックアウトである。１２１３２細胞を使用して、当技術分野で公知の手順に従ってＣ３ノックアウトマウスを生成した。
【０１８１】
マウスＣ３上流および下流相同性アームに挟まれたコーディングエクソン１の上流の５’制御エレメントからコーディングエクソン４１まで延びるヒトＣ３配列および３’非翻訳領域ならびにｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットを含有する標的化構築物を生成し、１２１３２ＥＳ細胞に電気穿孔により導入した。正確に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ６１４８）に、一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔を行って薬物選択カセットを除去した。薬物カセットを有さない標的化されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ６１４９）を８細胞期マウス胚に導入した。ヒト化Ｃ３遺伝子を担持するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを、実施例１に記載の通りマウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型決定によって同定した。
【０１８２】
Ｃ３ノックアウト１２１３２ＥＳ細胞において、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏカセットで、欠失させたマウスＣ３遺伝子配列が置き換えられたことの確認を、以下のプライマー−プローブセット（５’から３’の方向に記載する）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認した：１２１３２ＴＵ、マウスＣ３イントロン１：フォワードプライマー、ＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡ  ＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧ  ＴＣ（配列番号１７）；リバースプライマー、ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＧ  ＧＣＴＧＧＡＡＴＧ（配列番号１８）；プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧ  ＧＣ−ＢＨＱ（配列番号１９）；１２１３２ＴＤ、マウスＣ３エクソン４１の３’：フォワードプライマー、ＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧ  ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２０）；リバースプライマー、ＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡ  ＧＴＡＡＡＧＡＡＣＡ  Ｃ（配列番号２１）；プローブ、ＦＡＭ−ＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴ  ＧＴＧＡＧＣＴＧＣＣ  ＣＡＡＡ−ＢＨＱ（配列番号２２）；ｎｅｏカセット：フォワードプライマー、ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ（配列番号２３）；リバースプライマー、ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ  ＧＣＡＴＣＡＧ（配列番号２４）；プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ  ＣＴＧ−ＢＨＱ（配列番号２５）。
【０１８３】
ヒト化対立遺伝子において、ヒトＣ３遺伝子配列で、欠失させたマウスＣ３遺伝子配列が置き換えられたことの確認を、以下のプライマー−プローブセット（５’から３’の方向に記載する）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認した：ｍＣ３−１、マウスＣ３プロモーター：フォワードプライマー、ＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧ  ＣＣＴＡＣＴＴＣＡ（配列番号２６）；リバースプライマー、ＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣ  ＣＣＡＧＴＴＣＴ（配列番号２７）；プローブ、ＦＡＭ−ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ  ＣＣＴＴＴＡＧＡＴＴ  ＧＣＡ−ＢＨＱ（配列番号２８）；ｍＣ３−２、マウスＣ３  ３’非翻訳領域、フォワードプライマー、ＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡ  ＧＧＴＴＣＡＣＴＡＴ  ＴＧＧＴ（配列番号２９）；リバースプライマー、ＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡ  ＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡ  Ｇ（配列番号３０）；プローブ、ＣＡＬ  Ｏｒａｎｇｅ−ＡＧＴＧＧＧＣＡＴＣ  ＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧ  Ｃ−ＢＨＱ（配列番号３１）；ｈｙｇｒｏカセット：フォワードプライマー、ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴ  ＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号３２）；リバースプライマー、ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴ  ＣＣＴＴＧＣＧＧ（配列番号３３）；プローブ、ＦＡＭ−ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴ  Ｃ−ＢＨＱ（配列番号３４）；ｈＣ３−１、ヒトＣ３プロモーター：フォワードプライマー、ＧＧＧＣＣＴＣＣＴＡ  ＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡ  ＧＴＡＴＣ（配列番号３５）；リバースプライマー、ＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴ  ＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡ  ＴＣ（配列番号３６）；プローブ、ＦＡＭ−ＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡ  ＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣ  ＣＣＡ−ＢＨＱ（配列番号３７）；ｈＣ３−２、ヒトＣ３イントロン１：フォワードプライマー、ＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴ  ＧＧＧＡＧＴＣＡＴＧ（配列番号３８）；リバースプライマー、ＧＣＡＣＴＴＧＣＣＡ  ＡＴＧＣＣＡＴＴＡＴ  Ｃ（配列番号３９）；プローブ、ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴ  ＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧ  ＴＴＧ−ＢＨＱ（配列番号４０）；ｈＣ３−３、ヒトＣ３エクソン４１：フォワードプライマー、ＣＧＡＡＴＧＣＣＡＡ  ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡ  ＡＣ（配列番号４１）；リバースプライマー、ＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡ  ＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴ（配列番号４２）；プローブ、ＣＡＬ  Ｏｒａｎｇｅ−ＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴ  ＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴ  ＣＧＧＣ−ＢＨＱ（配列番号４３）。
【０１８４】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて尾部生検材料から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＣ３遺伝子型を決定し、ヒト化Ｃ３対立遺伝子が生殖細胞系を通じて伝達されたことを確認する。置き換えについてヘテロ接合性の仔２匹を育種して、内因性マウスＣ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子による置き換えについてホモ接合性であるマウスを生成する。置き換えについてホモ接合性である仔を表現型決定に使用する。
【０１８５】
マウスＣ３遺伝子座とヒトＣ３遺伝子を含有する配列の接合部、ヒトＣ３遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットの接合部、およびｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットの配列とマウスＣ３遺伝子座の接合部の配列を実施例１において上記の通り決定する。
【０１８６】
バージョン２−ヒトＣ３コーディングエクソン２から４１を用いた置き換え
ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン２から４１を含有するヒトＣ３遺伝子で、コーディングエクソン２から４１までにわたるマウスＣ５遺伝子座を置き換えた。上の実施例１に記載の方法を基本的に使用してマウスＣ３遺伝子配列をヒトＣ３遺伝子配列で置き換えた。図２Ｂを参照されたい。
【０１８７】
予備的に、マウスＥＳ細胞において、ポリアデニル化部位に対して３’側の９００ｂｐを含むコーディングエクソン２から４１までを、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏカセットで置き換えることによって２５ｋｂのマウスＣ３遺伝子の標的化欠失を生じさせた。結果得られるマウスＥＳ細胞、１２１３２ＥＳ細胞は、ヘテロ接合性Ｃ３ノックアウトである。
【０１８８】
マウスＣ３上流および下流相同性アームに挟まれたコーディングエクソン２の上流からコーディングエクソン４１まで延びるヒトＣ３配列および３’非翻訳領域ならびにｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットを含有する標的化構築物を生成し、１２１３２ＥＳ細胞に電気穿孔により導入した。正確に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ６１５５）に、一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔を行って薬物選択カセットを除去した。薬物カセットを有さない標的化されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ６１５６）を８細胞期マウス胚に導入した。ヒト化Ｃ３遺伝子を担持するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを、実施例１に記載の通りマウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型決定によって同定した。
【０１８９】
Ｃ３ノックアウト１２１３２ＥＳ細胞において、ｌｏｘＰが導入されたｎｅｏカセットで、欠失させたマウスＣ３遺伝子配列が置き換えられたこと、および、ヒト化対立遺伝子において、ヒトＣ３遺伝子配列で、欠失させたマウスＣ３遺伝子配列が置き換えられたことの確認を、バージョン１に関して上記のものと同じプライマー−プローブセット（５’から３’の方向に記載する）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認した。
【０１９０】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて尾部生検材料から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＣ３遺伝子型を決定し、ヒト化Ｃ３対立遺伝子が生殖細胞系を通じて伝達されたことを確認する。置き換えについてヘテロ接合性の仔２匹を育種して、内因性マウスＣ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子による置き換えについてホモ接合性であるマウスを生成する。置き換えについてホモ接合性である仔を表現型決定に使用する。
【０１９１】
マウスＣ３遺伝子座とヒトＣ３遺伝子を含有する配列の接合部、ヒトＣ３遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットの接合部、およびｌｏｘＰが導入されたｈｙｇｒｏ選択カセットの配列とマウスＣ３遺伝子座の接合部の配列を実施例１において上記の通り決定する。
【０１９２】
（実施例３）
マウス血清における補体溶血活性アッセイ
補体は、眼の炎症性疾患および網膜変性疾患に関係付けられている（Ｍｕｌｌｉｎｓら（２０００年）Ｄｒｕｓｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ｅｌａｓｔｏｓｉｓ，  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｄｅｎｓｅ  ｄｅｐｏｓｉｔ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１４巻（７号）：８３５〜８４６頁を参照されたい）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によってＣ５切断を遮断することが、これらの障害に対する可能性のある治療戦略である（Ｃｏｐｌａｎｄら（２００９年）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉ−Ｃ５  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５９巻：３０３〜３１４頁を参照されたい）。Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストなどの、補体に向けられた療法を評価するために、候補治療薬の機能を、補体活性化に関連するヒト疾患、障害および状態の適切なモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで評価するためのアッセイが必要である。
【０１９３】
方法
古典的な補体アッセイＣＨ５０を使用して補体溶血活性を評価した（Ｇｉｌｃａｓら（２００１年）Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ  １３．１）。マウス血液を心臓から採取し、エッペンドルフチューブ中、氷上で１時間凝固させた。血清を遠心分離によって分離し、−７０℃で保管した。ヒツジ赤血球（Ｅ）を、ウサギ抗ヒツジ溶血素と一緒に３７℃で２０分インキュベートすることによって感作させた。感作させた細胞（ＥＡ）を、マウスまたはヒト由来の処理した血清または対照の血清の倍加希釈物と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。インタクトなＥＡ細胞をペレット化し、上清を取り出して、溶血の指標である５４１ｎｍにおける吸光度を測定した。緩衝液のみ（０％溶解）と一緒にインキュベートしたＥＡ細胞、またはｄｄＨ２Ｏ（１００％溶解）と一緒にインキュベートしたＥＡ細胞は、それぞれ陰性対照および陽性対照としての機能を果たした。各ウェルにおける溶血およびＣＨ５０の百分率をｄｄＨ２０対照と比較して算出した（Ｈｏｌｔら（２００１年）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ５９  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ、Ｂｌｏｏｄ、９８巻（２号）：４４２〜４４９頁）。Ｃ５ｈｕ／ｈｕ、Ｃ５−／−、Ｃ３ｈｕ／ｈｕ、Ｃ３−／−、およびそれぞれの対照系統を含めたマウスを、実施例１および２に記載の通りＶｅｌｏｃｉｇｅｎｅ（登録商標）技術を用いて生成した。正常ヒト血清、Ｃ５枯渇ヒト血清、およびＣ３枯渇ヒト血清をＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．から入手し、対照としてまたは比較のために使用した。補体成分を、溶血機能を回復させることが可能であるかを試験するために加えた。試験した血清を補体成分；ヒトＣ５（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．、５０μｇ／ｍｌ）、ヒトＣ３（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．、１０、４００、１２００μｇ／ｍｌ）およびマウスＣ５（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、５０μｇ／ｍｌ）と一緒に４℃で４０分インキュベートした。抗ヒトＣ５  ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣ５  ｍＡｂ（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０μｇ／ｍｌ）を使用して、今後の薬物発見に関するこの系の特異性および有用性を確認した。
【０１９４】
結果
野生型マウス血清の補体溶血活性は正常なヒト血清と比較しておよそ１０分の１である。図３に示されている通り、ＣＨ５０値を使用して決定される補体溶血活性は、正常マウス血清または野生型マウス血清の３ロットにおいて、ヒト血清の２ロットと比較して多くても１０分の１であった。
【０１９５】
抗Ｃ５モノクローナル抗体により、溶血が種特異的に遮断される。図４に示されている通り、抗マウスＣ５モノクローナル抗体（ｍｓＣ５Ａｂ）では、正常なマウス血清における補体溶血活性が遮断され、抗ヒトＣ５  ｍＡｂ（Ｃ５Ａｂ）では、正常なヒト血清、およびヒトＣ５タンパク質を補充したヒトＣ５枯渇血清における溶血活性は遮断されたが、正常なマウス血清における溶血活性は遮断されなかった。
【０１９６】
ヒトＣ５およびＣ３タンパク質は種特異的溶血活性を示す。図５Ａに示されている通り、ヒトＣ５およびＣ３タンパク質により、それぞれヒトＣ５枯渇ヒト血清およびヒトＣ３枯渇ヒト血清の補体溶血活性を再構成することができた。
【０１９７】
図５Ｂに示されている通り、Ｃ５−／−マウス由来の血清およびＣ３−／−マウス由来の血清では補体活性の欠如が示され、ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清では溶血活性は示されず、Ｃ５−／−マウス由来の血清およびＣ３−／−マウス由来の血清と本質的に同等であった。マウスＣ５タンパク質をヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清に添加することにより、補体溶血活性がレスキューされたが、ヒトＣ５タンパク質をヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清に添加することでは補体活性はレスキューされなかった。
【０１９８】
図５Ｃに示されている通り、ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清の補体溶血活性の欠如は、これらのマウスの血清中に存在するヒトＣ５タンパク質の量は正常なヒト血清中に存在するＣ５タンパク質の量の約３分の１であったので、ヒトＣ５タンパク質の欠如に起因するものではないと思われる。図５Ｄは、投薬前補体Ｃ５レベルに関するヒト化Ｃ５マウスの雄と雌の間の変動を示す。これらのマウスの血清中に存在するヒトＣ５タンパク質の範囲は、２０〜１００μｇ／ｍｌにわたり、これは、血清において溶血活性を示すのに十分であった。通常これらの実験において添加したヒトＣ５は５０μｇ／ｍｌであった。
【０１９９】
ヒトＣ５タンパク質とヒトＣ３タンパク質はどちらも、マウスＣ５ノックアウト血清における溶血活性の再構成に必要である。図６に示されている通り、ヒトＣ５タンパク質をＣ５−／−マウス血清に添加することによって補体溶血活性を回復させることはできなかったが、ヒトＣ３タンパク質とヒトＣ５タンパク質を共に添加することにより、Ｃ５−／−マウス血清における溶血がレスキューされた。
【０２００】
ヒトＣ３タンパク質の添加により、Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清における溶血活性がレスキューされる。図７に示されている通り、ヒトＣ３タンパク質は、Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス由来の血清における補体溶血活性を再構成するために十分である。
【０２０１】
上記の結果に基づいて、ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕおよび／またはＣ３ｈｕ／ｈｕマウスは、ヒト特異的Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストのＰＫおよびＰＤを評価するために適した非ヒト動物である。上記の結果に基づいて、二重ヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕおよびＣ３ｈｕ／ｈｕマウス血清は、ヒトＣ５および／またはＣ３タンパク質を補充する必要なく補体溶血活性を示し得、それにより、ヒト特異的Ｃ５および／またはＣ３アンタゴニストの治療有効性のｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験のために適したマウス系統を構成し得る。
【０２０２】
結論
野生型マウス血清の補体溶血活性は、ヒト血清と比較して劇的に低い。ヒトＣ５を発現する遺伝子改変マウスは、おそらくマウスコンバターゼによりヒトＣ５タンパク質を切断することができないことが原因で、機能的マウスＣ５ノックアウトである。ヒト化Ｃ５マウス血清では、野生型レベルの補体溶血活性を達成するためにはヒトＣ３タンパク質の添加が必要である。
【０２０３】
（実施例４）
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスの使用
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスは、ヒト特異的Ｃ５および／またはＣ３化合物（アンタゴニスト、例えば、中和性抗Ｃ５または抗Ｃ３抗体など）の薬力学（ＰＤ）を評価するために有用である。
【０２０４】
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおける薬物動態学（ＰＫ）およびＰＤアッセイを当技術分野で公知の標準の手順に従って、例えば、抗Ｃ５抗体に関する米国特許第６，３５５，２４５号に記載の通り実施する。
【０２０５】
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスは、種々の疾患モデル、例えば、限定するものではなく、ドライ型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）；ウェット型ＡＭＤ；実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎（ＥＡＵ）；高眼圧症；および視神経損傷において、ヒト特異的Ｃ５またはＣ３アンタゴニスト、例えば、中和性抗Ｃ５または抗Ｃ３抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性を試験するために有用である（例えば、補体活性化に関連する疾患、障害および状態のリストについてはＭａｋｒｉｄｅｓ（１９９８年）およびＭｏｌｌｎｅｓら（２００６年）を参照されたい）。
【０２０６】
ドライ型ＡＭＤは、ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおいて高脂肪食および青色光損傷（例えば、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ２００２年、７５巻（５号）：５４３〜５５３頁を参照されたい）、タバコの煙（例えば、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２００６年、４７巻（２号）：７２９〜７３７頁を参照されたい）、カルボキシエチルピロール（ＣＥＰ）（例えば、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ２０１０年、５１巻：１２７６〜１２８１頁；Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２０１２年、１８巻（５号）：７９１〜７９８頁を参照されたい）により誘導することができる。
【０２０７】
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスは、他のトランスジェニックＡＭＤモデル、例えば、ＡｐｏＥ（−／−）（例えば、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ２０００年、４１巻：２０３５〜２０４２頁を参照されたい）、Ｍｄｍ１（例えば、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００８年、１７巻：３９２９〜３９４１頁を参照されたい）、Ｓｏｄ１（−／−）（例えば、ＰＮＡＳ  ２００６年；１０３巻：１１２８２〜１１２８７頁を参照されたい）、ＬＤＬＲ（−／−）（例えば、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２００５年、８９巻：１６２７〜１６３０頁を参照されたい）、およびＤＩＣＥＲ１（−／−）（例えば、Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１１年；４７１巻（７３３８号）：３２５〜３３０頁を参照されたい）などに育種することもできる。
【０２０８】
ウェット型ＡＭＤは、ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおいて、レーザー誘起脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）によって誘導することができる（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２０１３年、８巻（１１号）：２１９７〜２２１１頁を参照されたい）。
【０２０９】
ＥＡＵは、ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおいて誘導することができる（例えば、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１０年、１５９巻（３号）：３０３〜３１４頁を参照されたい）。
【０２１０】
高眼圧症は、ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおいて誘導することができる（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６年、８３巻：６２０〜６２８頁を参照されたい）。
【０２１１】
視神経損傷は、ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスにおいて誘導することができる（例えば、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２００３年、２０巻（９号）：８９５〜９０４頁を参照されたい）。
【０２１２】
ヒト化Ｃ５マウスを使用して、種々の疾患モデル、例えば、限定するものではなく、発作性夜間血尿（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒｎａｌ  ｈｅｍａｔｕｒｉａ）；視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｌｅｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａ）；腎移植；および腎傷害においてヒト特異的Ｃ５アンタゴニストを評価することができる（例えば、米国特許第６，３５５，２４５号を参照されたい）。
【０２１３】
ヒト化Ｃ５および／またはＣ３マウスを使用した治療有効性アッセイを、当技術分野で公知の標準の手順に従って、例えば、抗Ｃ５抗体に関する米国特許第６，３５５，２４５号に記載の通り実施する。
【０２１４】
（実施例５）
ヒト化Ｃ５ホモ接合性マウスにおける抗Ｃ５抗体の薬物動態／薬力学的試験
本実施例では、前の実施例に従って調製した雄および雌のヒト化Ｃ５ホモ接合性マウスを利用して、抗Ｃ５抗体の補体活性化を減少させる能力を試験する。
【０２１５】
方法
本試験では合計２５匹のＣ５ｈｕ／ｈｕマウス（雄および雌）を使用した。各指定時点でマウス２匹から血清（２０μＬ）を採取した。指定時点には、「投薬前」時点ならびに１５ｍｇ／ｋｇの抗ヒトＣ５モノクローナル抗体の皮下投与後３時間、６時間、１日、２日、４日、１週間、２週間、４週間の時点が含まれた。試料を、補体活性化の薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）的変更についてアッセイするまで−２０℃で保管した。
【０２１６】
実施例３において上記の通り補体溶血活性を評価した。上記の通り、ヒトＣ３（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．、４００および８００μｇ／ｍｌ）を血清に添加してヒト補体系を再現した。
【０２１７】
結果
図８に示されている通り、１５ｍｇ／ｋｇの抗ヒトＣ５抗体を皮下注射することにより、補体活性化が注射後少なくとも１週間減少した。この効果は、溶血アッセイにおいてヒトＣ３タンパク質を４００μｇ／ｍｌで添加したか（図８Ａ）または８００μｇ／ｍｌで添加したか（図８Ｂ）に関係なく観察された。
【０２１８】
図９に示されている通り、Ｃ５モノクローナル抗体のＰＫ解析により、時間をわたってのこの抗体のクリアランスがマウス５匹のうち２匹で２８日目までに検出不可能なレベルであったことが明らかになった。
【０２１９】
（実施例６）
ヒト補体タンパク質とマウス補体タンパク質の交差活性
本実施例では、ヒトＣ３タンパク質およびＣ５タンパク質とマウスＣ３タンパク質およびＣ５タンパク質との交差活性を、以前の実施例に記載の工学的に作製したマウスを使用して調査した。実施例３において考察されている通り、また、図６に示されている通り、ヒトＣ５タンパク質およびマウスＣ３タンパク質は、内因性Ｃ５を欠くマウスにおける溶血活性を再構成するために十分ではない。本試験では、Ｃ３ノックアウトマウスにおける溶血活性を回復させるマウスＣ５およびヒトＣ３の能力を観察した。
【０２２０】
方法
実施例３に記載の通り補体溶血活性を評価した。
【０２２１】
Ｃ５−／−、Ｃ３−／−、およびそれぞれの対照系統を含めたマウスを、実施例１および２に記載の通りＶｅｌｏｃｉｇｅｎｅ（登録商標）技術を用いて生成した。正常ヒト血清、Ｃ３枯渇ヒト血清をＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．から入手し、対照としてまたは比較のために使用した。補体成分を、溶血機能を回復させることが可能であるかを試験するために加えた。試験した血清を補体成分；ヒトＣ３（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．、５０、１００、５００、１２００μｇ／ｍｌ）；およびヒトＣ５（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．、５０μｇ／ｍｌ））と一緒に４℃で４０分インキュベートした。抗ヒトＣ５  ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣ５  ｍＡｂ（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０μｇ／ｍｌ）を使用して、今後の薬物発見に関するこの系の特異性および有用性を確認した。
【０２２２】
結果
図１０Ａに示されている通り、ヒトＣ３タンパク質を野生型マウス血清に添加することにより、野生型対照において観察されるものに対して溶血機能を増強することができる。しかし、ヒトＣ３タンパク質をＣ３枯渇ヒト血清に添加して戻すことと比較して、観察される増強はヒトにおいて示されるものよりも低い。さらに、図１０Ｂに例示されている通り、溶血百分率は、ヒトＣ３タンパク質を補充したヒト化Ｃ５ｈｕ／ｈｕマウス血清の使用で回復する。
【０２２３】
Ｃ３ノックアウト動物に由来する血清を使用してこの実験を繰り返したところ、ヒトＣ３タンパク質をＣ３−／−血清に添加することにより、特にヒトＣ３を漸増濃度で添加することにより、溶血機能がレスキューされることが示された（図１１）。
【０２２４】
対照的に、図１２は、ヒトＣ３をＣ５ヌル動物由来の血清に添加することによって溶血機能はレスキューされないことを示す。
【０２２５】
結論
要約すると、本実施例から得られたデータにより、ヒトＣ３とマウスＣ５は交差反応することができるが、マウスＣ３とヒトＣ５は同様に交差反応して補体活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現することができないことが実証される。これらの結果の要約を以下の表１に示す。
【表１】
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（項目１）
改変Ｃ５遺伝子を形成するために、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、Ｃ５遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトＣ５遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、上記改変Ｃ５遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類。
（項目２）
マウスまたはラットである、項目１に記載の齧歯類。
（項目３）
ヒトＣ５タンパク質をコードする上記ヒトＣ５遺伝子が、ヒトＣ５遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む、項目１または項目２に記載の齧歯類。
（項目４）
マウスＣ５タンパク質を発現することができないマウスである、項目１から３のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目５）
内因性マウスＣ３遺伝子によりコードされるマウスＣ３タンパク質を発現するマウスである、項目１から４のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目６）
ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現するマウスである、項目１から５のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目７）
上記マウスが、内因性マウスＣ３遺伝子座において、Ｃ３タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトＣ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子での置き換えを含む、項目６に記載の齧歯類。
（項目８）
上記ヒトＣ３遺伝子の発現が、上記内因性マウスＣ３遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、項目６または項目７に記載の齧歯類。
（項目９）
血清中に、ヒトＣ５タンパク質を、機能的内因性マウスＣ５タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ５タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％の濃度で発現するマウスである、項目１から９のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１０）
血清中に、ヒトＣ５タンパク質を、機能的内因性Ｃ５タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ５タンパク質のレベルの約１０％から約２００％の間、約２０％から約１５０％の間、または約３０％から約１００％の間の濃度で発現するマウスである、項目１から１０のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１１）
血清中に、ヒトＣ５タンパク質を、約１０μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの間、約１０μｇ／ｍｌから約１２５μｇ／ｍｌの間、または約１５μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの間の濃度で発現するマウスである、項目１から１１のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１２）
血清中に、ヒトＣ５タンパク質を、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５または１５０μｇ／ｍｌの濃度で発現するマウスである、項目１から１２のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１３）
改変Ｃ３遺伝子を形成するために、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、Ｃ３遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、上記改変Ｃ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類。
（項目１４）
マウスまたはラットである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１５）
ヒトＣ３タンパク質をコードする上記ヒトＣ３遺伝子が、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む、項目１３または項目１４に記載の齧歯類。
（項目１６）
ヒトＣ３タンパク質をコードする上記ヒトＣ３遺伝子が、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む、項目１３から１５のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１７）
マウスＣ３タンパク質を発現することができないマウスである、項目１３から１６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１８）
内因性マウスＣ５遺伝子によりコードされるマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである、項目１３から１７のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１９）
上記マウスが、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質を発現する、項目１８または項目１９に記載の齧歯類。
（項目２０）
上記マウスが、内因性マウスＣ５遺伝子座において、Ｃ５タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトＣ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子での置き換えを含む、項目１９に記載の齧歯類。
（項目２１）
上記ヒトＣ５遺伝子の発現が、上記内因性マウスＣ５遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、項目１９または項目２０に記載の齧歯類。
（項目２２）
血清中に、ヒトＣ３タンパク質を、機能的内因性マウスＣ３タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ３タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％の濃度で発現するマウスである、項目１３から２１のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２３）
血清中に、ヒトＣ３タンパク質を、機能的内因性マウスＣ３タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスＣ３タンパク質のレベルの約１０％から約２００％の間、約２０％から約１５０％の間、または約３０％から約１００％の間の濃度で発現するマウスである、項目１３から２２のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２４）
血清中に、ヒトＣ３タンパク質を、約１００μｇ／ｍｌから約１５００μｇ／ｍｌの間、約２００μｇ／ｍｌから約１２５０μｇ／ｍｌの間、または約３００μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌの間の濃度で発現するマウスである、項目１３から２３のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２５）
血清中に、ヒトＣ３タンパク質を、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０または１５００μｇ／ｍｌの濃度で発現するマウスである、項目１３から２４のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２６）
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類Ｃ５タンパク質をコードする齧歯類Ｃ５遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ５遺伝子配列で置き換えるステップを含み、上記置き換えが内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含む上記ヒトＣ５遺伝子配列が、上記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
（項目２７）
上記齧歯類がマウスまたはラットである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類Ｃ５遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
上記齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子配列の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のエクソンを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ５遺伝子配列が、ヒトＣ５遺伝子配列の４１個のエクソン全てを含む、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記置き換えが内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含む上記ヒトＣ５遺伝子配列が、上記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、項目２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスＣ５タンパク質をコードするマウスＣ５遺伝子配列を、ヒトＣ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子で置き換えるステップを含む、方法。
（項目３５）
上記置き換えが内因性マウスＣ５遺伝子座におけるものであり、そしてヒトＣ５タンパク質をコードする上記ヒトＣ５遺伝子が、上記内因性マウスＣ５遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類Ｃ３タンパク質をコードする齧歯類Ｃ３遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含むヒトＣ３遺伝子配列で置き換えるステップを含み、上記置き換えが内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含む上記ヒトＣ５遺伝子配列が、上記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
（項目３７）
上記齧歯類がマウスまたはラットである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類Ｃ３遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
上記齧歯類Ｃ５遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ３遺伝子配列が、ヒトＣ３遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
上記齧歯類Ｃ３遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ３遺伝子配列が、ヒトＣ３遺伝子配列の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のエクソンを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記齧歯類Ｃ３遺伝子配列を置き換える上記ヒトＣ３遺伝子配列が、ヒトＣ３遺伝子配列の４１個のエクソン全てを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記置き換えが内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子配列の１個または複数のエクソンを含む上記ヒトＣ３遺伝子配列が、上記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、項目３６から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスＣ３タンパク質をコードするマウスＣ３遺伝子配列を、ヒトＣ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子で置き換えるステップを含む、方法。
（項目４５）
上記置き換えが内因性マウスＣ３遺伝子座におけるものであり、そしてヒトＣ３タンパク質をコードする上記ヒトＣ３遺伝子が、上記内因性マウスＣ３遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において、Ｃ５タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードするヒトＣ５遺伝子での置き換えを含むヒト化Ｃ５遺伝子を含む齧歯類であって、ヒトまたはヒト化Ｃ５タンパク質をコードする上記ヒトＣ５遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にあり、そして上記齧歯類が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、Ｃ３タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子での置き換えをさらに含み、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードする上記ヒトＣ３遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にある、齧歯類。
（項目４７）
マウスまたはラットである、項目４６に記載の齧歯類。
（項目４８）
マウスＣ５タンパク質を発現することができず、かつマウスＣ３タンパク質を発現することができないマウスである、項目４６に記載の齧歯類。
（項目４９）
上記内因性齧歯類Ｃ５遺伝子座および／または上記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座における上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目４６に記載の齧歯類。
（項目５０）
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類Ｃ５遺伝子座および／または上記齧歯類Ｃ３遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目４６に記載の齧歯類。
（項目５１）
補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するための方法であって、
ａ．項目１から２５または項目４６から５０のいずれか一項に記載の齧歯類に上記化合物を投与するステップと、
ｂ．上記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかをアッセイし、それにより、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するステップと
を含む、方法。
（項目５２）
上記化合物が、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記化合物が、補体活性を増大させることによって補体活性化を調節する、項目５１または項目５２に記載の方法。
（項目５４）
上記化合物が、補体活性を減少させることによって補体活性化を調節する、項目５１または項目５２に記載の方法。
（項目５５）
上記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかを決定するために、上記齧歯類の血清をアッセイする、項目５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
上記アッセイがＣＨ５０補体スクリーニングアッセイである、項目５５に記載の方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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