(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光源からの励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本において発生する光を測定して画像を取得する画像取得部と、
励起光を照射することなく前記画像取得部により取得された第１の画像と、励起光を照射して前記画像取得部により取得された第２の画像とに基づいて、前記第２の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する画像処理部とを備え、
前記第１の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、
前記第２の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である測定装置。
【請求項２】
前記画像取得部が、前記標本において発生する光を分光する分光部を備える請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
前記画像処理部が、前記第２の画像から前記第１の画像を減算する請求項１または請求項２に記載の測定装置。
【請求項４】
前記画像処理部が、前記第１の画像と前記第２の画像とに基づいてアンミキシング処理を行う請求項２に記載の測定装置。
【請求項５】
前記照明光学系が励起光を遮断するシャッタを備え、
該シャッタを閉じて励起光を遮断した状態で、前記画像取得部により取得された画像を第１の画像とし、前記シャッタを開いて励起光を照射した状態で前記画像取得部により取得された画像を第２の画像とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の測定装置。
【請求項６】
励起光を照射することなく標本を撮影して第１の画像を取得する第１のステップと、
励起光を照射した状態で標本を撮影して第２の画像を取得する第２のステップと、
前記第１のステップにおいて取得された第１の画像と、前記第２のステップにおいて取得された第２の画像とに基づいて、第２の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する第３のステップとを含み、
前記第１の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、
前記第２の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である蛍光測定方法。
【請求項７】
前記第１のステップが、前記標本において発生する光を分光して第１の画像を取得し、
前記第２のステップが、前記標本において発生する光を分光して第２の画像を取得する
請求項６に記載の蛍光測定方法。
【請求項８】
前記第３のステップが、前記第２の画像から前記第１の画像を減算する請求項６または請求項７に記載の蛍光測定方法。
【請求項９】
前記第３のステップが、前記第１の画像と前記第２の画像とに基づいてアンミキシング処理を行う請求項７に記載の蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定装置および蛍光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光画像と発光画像とを取得可能な測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この測定装置では、発光物質の発光量が蛍光物質の蛍光量に比べて無視し得るほどの微弱なものであるため、蛍光測定時には発光物質の発光の有無にかかわらず蛍光画像を取得することができた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５１２３６６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、近年のように発光量の大きな発光物質を使用する場合には、蛍光測定時において発光物質の発光量を無視することができず、蛍光画像におけるノイズとなってしまうという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、発光量が大きな発光物質を使用してもノイズの少ない蛍光画像および発光画像を取得することができる測定装置および蛍光測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、励起光源からの励起光を標本に照射する照明光学系と、前記標本において発生する光を測定して画像を取得する画像取得部と、励起光を照射することなく前記画像取得部により取得された第１の画像と、励起光を照射して前記画像取得部により取得された第２の画像とに基づいて、前記第２の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する画像処理部とを備え、前記第１の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、前記第２の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である測定装置を提供する。
【０００６】
本発明によれば、励起光源から発せられた励起光を照明光学系によって標本に照射することにより、標本において蛍光物質が励起されることにより蛍光が発生する。標本に発光物質が含まれている場合には、励起光の照射の有無に関わらず発光物質からの発光が発生する。したがって、励起光を照射することなく画像取得部により取得された第１の画像には発光成分のみが含まれており、励起光を照射して画像取得部により取得された第２の画像には発光成分および蛍光成分の両方が含まれている。したがって、第１の画像により、蛍光を含まない発光画像を取得することができ、画像処理部において第１の画像と第２の画像とに基づいて第２の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成することにより、発光量が大きな発光物質を使用してもノイズの少ない蛍光画像を取得することができる。
【０００７】
上記態様においては、前記画像取得部が、前記標本において発生する光を分光する分光部を備えていてもよい。
このようにすることで、標本において発生した光が分光部によって波長ごとに分光された画像として第１の画像および第２の画像を取得することができる。これにより、第２の画像からの発光成分の除去を、分光された画像に基づいて波長ごとに行うことができる。
【０００８】
また、上記態様においては、前記画像処理部が、前記第２の画像から前記第１の画像を減算してもよい。
このようにすることで、発光成分と蛍光成分とを含む第２の画像から発光成分のみを含む第１の画像を減算して、簡易に、発光成分を除去した蛍光画像を生成することができる。
【０００９】
また、上記態様においては、前記画像処理部が、前記第１の画像と前記第２の画像とに基づいてアンミキシング処理を行ってもよい。
このようにすることで、励起光を照射せずに標本において発生した光を分光して得られた第１の画像から発光成分のみのスペクトルを得るとともに、励起光を照射して標本において発生した光を分光して得られた第２の画像から蛍光成分および発光成分の両方を含むスペクトルを得て、これらのスペクトルに基づいてアンミキシング処理をすることにより、蛍光成分と発光成分とを分離し、発光成分を除去した蛍光画像を得ることができる。
【００１０】
また、上記態様においては、前記照明光学系が励起光を遮断するシャッタを備え、該シャッタを閉じて励起光を遮断した状態で、前記画像取得部により取得された画像を第１の画像とし、前記シャッタを開いて励起光を照射した状態で前記画像取得部により取得された画像を第２の画像としてもよい。
このようにすることで、シャッタの開閉によって簡易に第１の画像と第２の画像とを切り替えて取得することができる。
【００１１】
また、本発明の他の態様は、励起光を照射することなく標本を撮影して第１の画像を取得する第１のステップと、励起光を照射した状態で標本を撮影して第２の画像を取得する第２のステップと、前記第１のステップにおいて取得された第１の画像と、前記第２のステップにおいて取得された第２の画像とに基づいて、第２の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する第３のステップとを含み、前記第１の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、前記第２の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である蛍光測定方法を提供する。
【００１２】
上記態様においては、前記第１のステップが、前記標本において発生する光を分光して第１の画像を取得し、前記第２のステップが、前記標本において発生する光を分光して第２の画像を取得してもよい。
また、上記態様においては、前記第３のステップが、前記第２の画像から前記第１の画像を減算してもよい。
また、上記態様においては、前記第３のステップが、前記第１の画像と前記第２の画像とに基づいてアンミキシング処理を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、発光量が大きな発光物質を使用してもノイズの少ない蛍光画像および発光画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る測定装置を示す全体構成図である。
【図２】本発明の第２の実施形態に係る測定装置を示す全体構成図である。
【図３】図２の実施形態に係る測定装置の変形例を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第１の実施形態に係る測定装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る測定装置１は、顕微鏡であって、図１に示されるように、励起光を発生するレーザ光源（励起光源）２と、レーザ光源２に隣接して配置されレーザ光源２からの励起光をオンオフさせるシャッタ３と、標本Ａを搭載するステージ４と、レーザ光源２からの励起光をステージ４上の標本Ａに照射する一方、標本Ａにおいて発生した蛍光および発光を集光する対物レンズ５とを備えている。
【００１６】
また、測定装置１は、対物レンズ５により集光された標本Ａからの蛍光および発光を励起光の光路から分岐するフィルタ６と、該フィルタ６によって分岐された標本Ａからの蛍光および発光を検出して画像を取得する検出器７と、検出器７により取得された画像を処理する画像処理部８と、シャッタ３、検出器７および画像処理部８を制御するコントローラ９とを備えている。シャッタ３および対物レンズ５は照明光学系１０を構成している。また、符号１１は結像レンズである。
【００１７】
フィルタ６は、例えばダイクロイックミラーであり、レーザ光源２からの励起光を反射して、標本Ａからの蛍光および発光を透過する透過率特性を有している。
検出器７は、例えば、ＣＣＤあるいはＣＭＯＳのような撮像素子であり、標本Ａの発光像あるいは蛍光像を撮影するようになっている。
【００１８】
コントローラ９は、シャッタ３を閉じたときと、シャッタ３を開いたときの両方の時点で少なくとも１枚ずつの画像を取得するように検出器７を作動させるようになっている。
画像処理部８は、コントローラ９によってシャッタ３が閉じられたときに取得された第１の画像と、シャッタ３が開かれているときに取得された第２の画像とを検出器７から受け取って、第２の画像から第１の画像を減算することにより、蛍光画像を生成するようになっている。コントローラ９および画像処理部８は、例えば、コンピュータにより実現されている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る測定装置１を用いた蛍光測定方法について以下に説明する。
本実施形態に係る測定装置１を用いて発光画像および蛍光画像を取得するには、ステージ４上に標本Ａを載置し、レーザ光源２を作動させて励起光を射出させた状態で、コントローラ９の作動によってシャッタ３および検出器７を作動させる。
【００２０】
まず、コントローラ９によってシャッタ３を閉じた状態で標本Ａを撮影して第１の画像を取得する（第１のステップＳ１）。
シャッタ３が閉じられている状態では、励起光が標本Ａに照射されないので、標本Ａにおいては発光物質からの発光のみが発せられる。標本Ａから発せられた発光は、対物レンズ５によって集光され、フィルタ６を透過して検出器７により撮影される。これにより、検出器７により取得された第１の画像は、蛍光を含まない発光画像となっており、画像処理部８に送られる。
【００２１】
次に、コントローラ９によってシャッタ３を開いた状態で標本Ａを撮影して第２の画像を取得する（第２のステップＳ２）。
シャッタ３が開かれている状態では、レーザ光源２から発せられた励起光がフィルタ６において偏向されて対物レンズ５によって集光され、ステージ４上の標本Ａに照射される。標本Ａにおいては、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発生するとともに、励起光の有無に関わらず発光物質からの発光も発生している。
【００２２】
標本Ａから発せられた蛍光および発光は、対物レンズ５によって集光され、フィルタ６を透過して検出器７により撮影される。これにより、検出器７により取得された第２の画像は、蛍光および発光を含む蛍光発光画像となっており、画像処理部８に送られる。
【００２３】
画像処理部８は、検出器７から第１の画像および第２の画像が送られてきたときに、コントローラからの指令に従い、第２の画像から第１の画像を減算する処理を行う（第３のステップＳ３）。第１の画像に含まれている発光成分と、第２の画像に含まれている発光成分とは同一なので、第２の画像から第１の画像を減算することにより、第２の画像に含まれている発光成分を除去して蛍光画像を生成することができる。なお、本実施形態においては第１の画像自体が発光画像となる。
【００２４】
このように、本実施形態に係る測定装置１および蛍光測定方法によれば、第２の画像に含まれている発光成分を除去するので、発光量が大きな発光物質を使用してもノイズの少ない蛍光画像を取得することができるという利点がある。また、シャッタ３により励起光を遮断して得られた発光画像には蛍光が含まれていないので、ノイズの少ない発光画像をも同時に取得することができる。
【００２５】
次に、本発明の第２の実施形態に係る測定装置２０について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る測定装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００２６】
本実施形態に係る測定装置２０は、図２に示されるように、フィルタとして、標本Ａから発せられた蛍光および発光を複数の波長帯域に分光する分光部２１を採用している。分光部２１は、例えば、透過率特性の異なる３つのダイクロイックミラー６，２１ａ，２１ｂおよびミラー２１ｃを備え、標本Ａから発せられた蛍光および発光をダイクロイックミラー６によって励起光の光路から分岐した後に、ダイクロイックミラー２１ａ，２１ｂおよびミラー２１ｃによって３つの異なる波長帯域に分光するようになっている。
【００２７】
また、本実施形態に係る測定装置２０は、分光部２１によって３つに分岐された蛍光および発光をそれぞれ検出する３つの検出器７ａ〜７ｃを備えている。３つの検出器７ａ〜７ｃによって波長ごとに取得された画像は画像処理部８に送られて画像処理されるようになっている。
【００２８】
本実施形態においては、画像処理部８において以下の画像処理が行われる。
画像処理部８は、検出器７ａ〜７ｃから送られてきた画像に基づいてスペクトルを生成し、生成されたスペクトルに基づいて発光蛍光画像に対して公知のアンミキシング処理を行うようになっている。
【００２９】
さらに具体的には、まず、コントローラ９によってシャッタ３を閉じた状態で標本Ａを撮影して第１の画像を取得する（第１のステップＳ１）。
シャッタ３が閉じられている状態では、励起光が標本Ａに照射されないので、標本Ａにおいては発光物質からの発光のみが発せられる。
【００３０】
標本Ａから発せられた発光は、対物レンズ５によって集光され、分光部２１によって３つの異なる波長帯域に分離され、それぞれの発光成分が３つの別々の検出器７ａ〜７ｃにより撮影される。これにより、各検出器７ａ〜７ｃにより取得された３つの第１の画像は、蛍光を含まない３種類の波長帯域の異なる発光画像となっており、画像処理部８に送られる。
【００３１】
次に、コントローラ９によってシャッタ３を開いた状態で標本Ａを撮影して第２の画像を取得する（第２のステップＳ２）。
シャッタ３が開かれている状態では、レーザ光源２から発せられた励起光が対物レンズ５によって集光され、ステージ４上の標本Ａに照射される。標本Ａにおいては、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発生するとともに、励起光の有無に関わらず発光物質からの発光も発生している。
【００３２】
標本Ａから発せられた蛍光および発光は、対物レンズ５によって集光され、分光部２１によって３つの異なる波長帯域に分離され、それぞれの蛍光成分および発光成分が３つの別々の検出器７ａ〜７ｃにより撮影される。これにより、各検出器７ａ〜７ｃにより取得された３つの第２の画像は、蛍光および発光を含む蛍光発光画像となっており、画像処理部８に送られる。
【００３３】
画像処理部８は、検出器７ａ〜７ｃから第１の画像および第２の画像が送られてきたときに、コントローラ９からの指令に従い、画像処理を行う（第３のステップＳ３）。画像処理部８は、まず第１に、３つの第１の画像から発光スペクトルＸを生成し、３つの第２の画像から発光蛍光スペクトルＺを画素毎に生成する。
【００３４】
次いで、画像処理部８は、生成された発光スペクトルＸおよび発光蛍光スペクトルＺと、既知の蛍光スペクトルＹとが以下の関係式を満たすものとしてアンミキシング処理を行い、未知の係数α，βを画素毎に算出する。
αＸ＋βＹ＝Ｚ
なお、既知の蛍光スペクトルＹは、蛍光だけのサンプルで事前に測定するか、蛍光だけが発している部分のスペクトルを使用する。
【００３５】
そして、画像処理部８は、算出された係数α，βを用いて、各画素の信号に含まれている蛍光信号を算出し、蛍光画像を生成する。
すなわち、発光蛍光スペクトルＺに含まれる発光スペクトルＸと蛍光スペクトルＹとの割合が係数α，βの算出によって明らかとなるので、発光成分が除去された蛍光画像を生成することができる。このようにすることで、空間的に蛍光成分と発光成分とが重なっている場合においても発光成分を除去した蛍光画像を生成することができるという利点がある。
【００３６】
なお、本実施形態においては、単一の発光物質および単一の蛍光物質が標本Ａに含有されているものとして説明したが、これに代えて、複数の発光物質および／または複数の蛍光物質が標本Ａに含有されている場合に適用してもよい。
この場合には、それぞれの発光物質の発光スペクトルおよび／またはそれぞれの蛍光物質の蛍光スペクトルを生成する必要がある。
【００３７】
例えば、各発光物質からの発光のみが取得されている画素を抽出して、当該画素における発光の輝度の波長分布をプロットすることにより簡易に発光スペクトルＸ１，Ｘ２，…，Ｘｎを生成することができる。また、各蛍光物質からの蛍光のみが取得されている画素を抽出して、当該画素における蛍光の輝度の波長分布をプロットすることにより簡易に蛍光スペクトルＹ１，Ｙ２，…，Ｙｎを生成することができる。
【００３８】
したがって、下式を用いてアンミキシング処理を行うことにより、各発光スペクトルＸ１，Ｘ２，…，Ｘｎと蛍光スペクトルＹ１，Ｙ２，…，Ｙｎとの混合比率を表す係数α１，α２，…，αｎ，β１，β２，…，βｎを画素毎に算出し、算出された係数α１，α２，…，αｎ，β１，β２，…，βｎに基づいて、発光成分が除去された蛍光画像を生成することができる。
α１Ｘ１＋α２Ｘ２＋…＋αｎＸｎ＋β１Ｙ１＋β２Ｙ２＋…＋βｎＹｎ＝Ｚ
ここで、α１，α２，…，αｎ，β１，β２，…，βｎは未知の係数である。
【００３９】
また、上記各実施形態においては、検出器７ａ〜７ｃとして撮像素子を用いた場合について説明したが、これに代えて、図３に示されるように、光電子増倍管のような光検出器２２ａ〜２２ｃを採用し、レーザ光源２からの光を２次元的に走査するスキャナ２３を備える光走査型共焦点顕微鏡に適用することにしてもよい。この場合には、スキャナ２３による励起光の走査位置と、光検出器２２ａ〜２２ｃにより検出された蛍光および発光の強度とを画像処理部８において対応づけることにより、蛍光画像および発光蛍光画像を生成すればよい。発光画像の取得には、シャッタ３を閉じて励起光を照射することなくスキャナ２３を駆動する、いわゆる、空スキャンによって、標本Ａからの発光強度とスキャナ２３の走査位置とを対応づければよい。
【００４０】
また、本実施形態においては、発光蛍光画像の取得に先立って、シャッタ３を閉じることでレーザ光源２からの励起光を遮断した状態で発光画像を取得することとしたが、アンミキシング処理により発光蛍光画像から蛍光画像を抽出する場合には、シャッタ３は備えられていなくてもよい。すなわち、発光物質の発光スペクトルは、予め励起光を照射することなく取得しておくことができるので、このようにして取得された発光スペクトルを記憶しておき、励起光を照射して取得された発光蛍光スペクトルから蛍光スペクトルを分離する際に、記憶されていた発光スペクトルを用いてアンミキシング処理を行うことにすればよい。
【００４１】
また、分光部２１を複数のダイクロイックミラー２１ａ，２１ｂ等によって構成したものを例示したが、これに代えて、回折格子と可動スリットを備えた分光部や、フィルタを切り替える方式の分光部を採用してもよい。
【符号の説明】
【００４２】
Ａ  標本
１，２０  測定装置
２  レーザ光源（励起光源）
３  シャッタ
７，７ａ，７ｂ，７ｃ  検出器（画像取得部）
８  画像処理部
１０  照明光学系
２１  分光部
２２ａ，２２ｂ，２２ｃ  光検出器（画像取得部）
２３  スキャナ（画像取得部）
【図１】
0006564166.tif 000002
【図２】
0006564166.tif 000003
【図３】
0006564166.tif 000004